P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T o A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 6 / 0 1 c J C I R C I D a n D u e p G S o p J S R O L E O F I N F L A M M A T I O N I N T H E S Y N E R G I S T I C H E P A T O T O X I C I T Y O F M O N O C R O T A L I N E A N D B A C T E R I A L L I P O P O L Y S A C C H A R I D E V O L U M E I B y S t e v e n B y r o n Y e e A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y I n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s F o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y 2 0 0 3 A B S T R A C T R O L E O F I N F L A M M A T I O N I N T H E S Y N E R G I S T I C H E P A T O T O X I C I T Y O F M O N O C R O T A L I N E A N D B A C T E R I A L L I P O P O L Y S A C C H A R I D E B Y S t e v e n B y r o n Y e e I n a s m u c h a s n o n i n j u r i o u s d o s e s o f b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) a u g m e n t t h e h e p a t o t o x i c i t y o f a v a r i e t y o f x e n o b i o t i c a g e n t s , e x p o s u r e t o s m a l l a m o u n t s o f L P S c a n b e a n i m p o r t a n t d e t e r m i n a n t o f s u s c e p t i b i l i t y t o c h e m i c a l i n t o x i c a t i o n . T h i s d i s s e r t a t i o n t e s t s t h e h y p o t h e s i s t h a t i n f l a m m a t o r y e v e n t s p a r t i c i p a t e c a u s a l l y i n t h e s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y f r o m c o e x p o s u r e t o t h e f o o d - b o m e h e p a t o t o t o x i n m o n o c r o t a l i n e ( M C T ) a n d L P S . A d m i n i s t r a t i o n o f a s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e o f L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ; i . v . ) 4 h o u r s a f t e r a s m a l l , n o n t o x i c d o s e o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ; i . p . ) l e a d s t o s y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y i n S p r a g u e - D a w l e y r a t s . H e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l ( H P C ) i n j u r y d e v e l o p s b e t w e e n 6 a n d 9 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n a n d i s m a x i m a l b y 1 8 h o u r s . B o t h c e n t r i l o b u l a r ( C L ) a n d m i d z o n a l ( M Z ) l i v e r l e s i o n s o c c u r a n d e x h i b i t c h a r a c t e r i s t i c s s i m i l a r t o l e s i o n s a s s o c i a t e d , r e s p e c t i v e l y , w i t h a l a r g e r , t o x i c d o s e o f M C T o r L P S g i v e n s e p a r a t e l y . T h e n a t u r e o f t h e M C T - l i k e , C L a n d L P S - l i k e , M Z l e s i o n s u g g e s t s t h a t e a c h a g e n t e n h a n c e s t h e i n j u r y o f t h e o t h e r . L o s s o f t h e c e n t r a l v e i n i n t i m a i n C L l e s i o n s a n d d i s r u p t i o n o f s i n u s o i d a l a r c h i t e c t u r e a n d h e m o r r h a g e i n b o t h l e s i o n s s u g g e s t s v a s c u l a r i n j u r y . T h i s w a s c o n f i r m e d b y a p l a s m a b i o m a r k e r f o r s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l ( S E C ) i n j u r y , i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p y . S i n c e S E C a c t i v a t i o n a n d i n j u r y c a n p r o m o t e h e m o s t a s i s , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m w a s e v a l u a t e d . A b i o m a r k e r f o r c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n a n d i n c r e a s e d h e p a t i c f i b r i n d e p o s i t i o n c o n f i r m e d t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . A c c o r d i n g l y , b o t h S E C i n j u r y a n d c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n a r e c h a r a c t e r i s t i c s o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . I n t e r e s t i n g l y , a s t u d y i n i s o l a t e d H P C s c o t r e a t e d w i t h M C T a n d L P S f a i l e d t o r e p r o d u c e t h e s y n e r g i s t i c i n j u r y . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e e n h a n c e d t o x i c i t y d i d n o t r e s u l t f r o m a d i r e c t i n t e r a c t i o n o f M C T a n d L P S w i t h H P C s b u t f r o m a n i n d i r e c t m e c h a n i s m . H e n c e , o t h e r f a c t o r s n o t p r e s e n t i n t h e c e l l c u l t u r e s y s t e m , s u c h a s i n f l a m m a t o r y c e l l s a n d / o r m e d i a t o r s , m a y p l a y a r o l e i n t h e s y n e r g i s t i c i n j u r y i n v i v o . I n d e e d , i n a c t i v a t i o n / d e p l e t i o n o f i n f l a m m a t o r y e v e n t s , s u c h a s K u p f f e r c e l l s ( K C s ) , t u m o r n e c r o s i s f a c t o r ( T N F ) - a , n e u t r o p h i l s ( p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s ; P M N s ) a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a t t e n u a t e d H P C a n d S E C i n j u r y . A l t h o u g h t h e C L a n d M 2 l e s i o n s w e r e q u a l i t a t i v e l y u n c h a n g e d , t h e a r e a o f b o t h l i v e r l e s i o n s d e c r e a s e d w i t h i n a c t i v a t i o n / d e p l e t i o n o f t h e s e i n f l a m m a t o r y e v e n t s . T h u s , K C s , P M N s , T N F - a a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a r e c r i t i c a l c o m p o n e n t s o f t h i s l i v e r i n j u r y m o d e l . I n c o n c l u s i o n , c o e x p o s u r e t o s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e s o f M C T a n d L P S r e s u l t s i n s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y . A c o m p l e x i n f l a m m a t o r y m e c h a n i s m i n v o l v i n g K C s , P M N s , T N F - a a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i s i m p o r t a n t t o t h e p a t h o g e n e s i s o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . T h i s w o r k p r o v i d e s a d d i t i o n a l e v i d e n c e t h a t e x p o s u r e t o s m a l l a m o u n t s o f L P S m a y b e a d e t e r m i n a n t o f s u s c e p t i b i l i t y t o f o o d - h o m e h e p a t o t o x i n s . D e d i c a t i o n s T o m y p a r e n t s , B r u c e a n d E l i z a b e l l e Y e e , w h o a l w a y s b e l i e v e d i n m e , a n d t o A u n t P a u l i n e f o r a l l o f h e r s u p p o r t a n d e n c o u r a g e m e n t . A c k n o w l e d g m e n t s I a m d e e p l y i n d e b t e d t o m y f a m i l y , f r i e n d s a n d c o l l e a g u e s f o r a l l o f t h e i r h e l p a n d s u p p o r t d u r i n g m y d o c t o r a l r e s e a r c h . F i r s t a n d f o r e m o s t , I w a n t t o t h a n k m y t h e s i s a d v i s o r a n d f r i e n d , D r . R o b e r t R o t h . U n d e r h i s e x c e l l e n t m e n t o r s h i p , B o b p r o v i d e d m e w i t h a s u p e r b e n v i r o n m e n t i n w h i c h t o w o r k , s t u d y a n d d e v e l o p a s a s c i e n t i s t . H i s i d e a s , i n v a l u a b l e a d v i c e , e n t h u s i a s t i c s u p p o r t , g u i d a n c e a n d e n c o u r a g e m e n t w e r e g r e a t l y a p p r e c i a t e d . M y t h e s i s c o m m i t t e e m e m b e r s o f D r s . J a c k H a r k e m a , L a r r y F i s c h e r a n d P a t t i G a n e y w e r e o f t r e m e n d o u s h e l p i n p r o v i d i n g i d e a s , i n s i g h t f u l c o m m e n t s a n d t e c h n i c a l e x p e r t i s e . I n a d d i t i o n , I w a n t t o t h a n k D r . J o n H o t c h k i s s f o r a l l o f h i s w o n d e r f u l a d v i c e a n d e x p e r t i s e i n m o r p h o m e t r y a n d E L I S A s . a m f u r t h e r i n d e b t e d t o a l l o f t h e f a c u l t y a n d s t a f f o f t h e D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y w h o , o v e r t h e y e a r s , g a v e m u c h n e e d e d t e c h n i c a l a s s i s t a n c e a n d s u p p o r t . A g r e a t d e a l o f t h a n k s a l s o g o e s t o t h e m e m b e r s o f t h e R o t h a n d G a n e y l a b o r a t o r i e s , b o t h p a s t a n d p r e s e n t , f o r t h e i r e x p e r t i s e a n d c a m a r a d e r i e . T h e y i n c l u d e D r . D w a y n e H i l l , T e r r i S c h m i d t , D r . J i m W a g n e r , D r . R o s i e S n e e d , D r . F r e d e r i c k M o u l i n , D r . C h u c k B a r t o n , E v a B a r t o n , S t e v e B e z d e c n y , D r . B r y a n C o p p l e , D r . J a n e M a d d o x , D r . J e s u s O l i v e r o , J o h n B u c h w e i t z , D r . P a t L a p p i n , D r . U m e s h H a n u m e g o w d a , C a t h y R o n d e l l i , M a r y K i n s e r , J o h n P h i p p s , S t e v e B e z d e c n y a n d J i m L u y e n d y k . I n p a r t i c u l a r , l w a n t t o t h a n k D r . S h a w n K i n s e r f o r h i s f r i e n d s h i p , e x c e l l e n t i d e a s , a s t u t e o b s e r v a t i o n s a n d w i l l i n g n e s s t o h e l p m e o u t a l e a n d U n c w a s B H C I s a n e h e a r a t a m o m e n t s n o t i c e . H e , a l o n g w i t h F r e d o , p r o v i d e d s o m e m u c h n e e d e d c h e e r a n d f u n d u r i n g a l l t h o s e l a t e n i g h t s t u d i e s . I w a n t t o t h a n k m y m o m a n d d a d f o r t h e i r u n c o n d i t i o n a l s u p p o r t a n d l o v e . U n c l e A r t f o r h i s w i s d o m , e n c o u r a g e m e n t , a n d a c c e p t a n c e i n t o h i s f a m i l y w h e n I w a s s o f a r f r o m m i n e . A u n t P a u l i n e f o r h e r t i r e l e s s s u p p o r t a n d e n t h u s i a s t i c e n c o u r a g e m e n t , a n d h e r w e l l t i m e d c a r e p a c k a g e s . F i n a l l y , I w a n t t o t h a n k m y f r i e n d s o u t s i d e o f t h e l a b o r a t o r y f o r k e e p i n g m e s a n e w h i l e I f i n i s h e d m y s t u d i e s a n d f o r m a k i n g s u r e t h e r e w a s l a u g h t e r i n m y h e a r t : J o e , S c o t t , L e e a n d M i c h e l l e , T o m a n d V i c k i , J o h n F . , J o h n W . a n d E r i k . v i ‘ _ A _ . - A _ - A . _ C A _ . T A B I D . T A B L E O F C O N T E N T S L I S T O F T A B L E S L I S T O F F I G U R E S L I S T O F A B B R E V I A T I O N S C H A P T E R 1 G e n e r a l I n t r o d u c t i o n 1 . A . O v e r v i e w 1 . 8 . L i v e r S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n 1 . 0 . B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e 1 . 0 . 1 . S t r u c t u r e 1 . 0 . 2 . S o u r c e s o f L P S i n t h e H o s t 1 . 0 . 3 . H o s t R e s p o n s e t o L P S 1 . 0 . 4 . L P S C e l l S i g n a l i n g 1 . 0 . 5 . L P S C l e a r a n c e 1 . 0 . 6 . I n f l a m m a t o r y R e s p o n s e t o L P S 1 . 0 . 6 . 1 . M o n o c y t e s / M a c r o p h a g e s a n d K u p f f e r C e l l s 1 . 0 . 6 . 1 . 1 . M o n o c y t e s 1 . 0 . 6 . 1 . 1 . 1 . M o n o c y t e C h e m o a t t r a c t a n t P r o t e i n - 1 1 . 0 . 6 . 1 . 2 . K u p f f e r C e l l s 1 . 0 . 6 . 1 . 2 . 1 . T u m o r N e c r o s i s F a c t o r - d 1 . 0 . 6 . 1 2 2 . I n t e r l e u k i n - 1 1 . C . 6 . 1 . 2 . 3 . I n t e r l e u k i n - 6 1 . 0 . 6 . 1 . 2 . 4 . l n t e r l e u k i n - B / C l N C - 1 1 . 0 . 6 . 1 . 2 . 5 . A r a c h i d o n i c A c i d M e t a b o l i t e s 1 . 0 . 6 . 1 . 2 . 6 . P l a t e l e t A c t i v a t i n g F a c t o r 1 . 0 . 6 . 1 . 2 . 7 . R e a c t i v e O x y g e n S p e c i e s 1 . 0 . 6 . 1 . 2 . 8 . N i t r i c O x i d e 1 . 0 . 6 . 2 . N e u t r o p h i l s 1 . 0 . 6 . 3 . P l a t e l e t s , E n d o t h e l i a l C e l l s a n d E p i t h e l i a l C e l l s 1 . 0 . 6 . 3 . 1 . S i n u s o i d a l E n d o t h e l i a l C e l l s 1 . 0 . 6 . 4 . C o a g u l a t i o n S y s t e m a n d T h r o m b i n 1 . 0 . 6 . 5 . S u m m a r y 1 . 0 . 7 . L P S a n d t h e L i v e r 1 . 0 . 8 . L P S A u g m e n t s H e p a t o t o x i c a n t I n j u r y 1 . D . M o n o c r o t a l i n e 1 . D . 1 . P y r r o l i z i d i n e A l k a l o i d s 1 . D . 2 . M C T a s a F o o d - h o m e H e p a t o t o x i c a n t 1 . D . 3 . C h e m i c a l S t r u c t u r e , P r o p e r t i e s a n d M e t a b o l i s m 1 . D . 4 . T o x i c o k i n e t i c s 1 . D . 5 . B i o l o g i c E f f e c t s o f M C T v i i x i i i x i v x v i i 1 . E . S u m m a r y C H A P T E R 2 S y n e r g i s t i c H e p a t o t o x i c i t y f r o m C o e x p o s u r e t o B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e a n d t h e P y r r o l i z i d i n e A l k a l o i d M o n o c r o t a l i n e 2 . A . A b s t r a c t 2 3 . I n t r o d u c t i o n 2 . 0 . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 2 . 0 . 1 . 2 . 0 . 2 . 2 . 0 . 3 . 2 . 0 . 4 . 2 . 0 . 5 . 2 . 0 . 6 . 2 . 0 . 7 . 2 . 0 . 8 . 2 . 0 . 9 . M a t e r i a l s A n i m a l s T r e a t m e n t P r o t o c o l D e t e r m i n a t i o n o f H e p a t o t o x i c i t y H i s t o p a t h o l o g i c E v a l u a t i o n a n d M o r p h o m e t r y T U N E L A s s a y E f f e c t o f L P S o n M C T - I n d u c e d C y t o t o x i c i t y I n V i t r o E h r l i c h A s s a y S t a t i s t i c a l A n a l y s i s 2 . 0 . R e s u l t s 2 . 0 . 1 . 2 . 0 . 2 . 2 . 0 . 3 . 2 . 0 . 4 . 2 . D . 5 . 2 . 0 . 6 . 2 . 0 . 7 . D o s e - R a n g i n g S t u d i e s : M o n o c r o t a l i n e D o s e - R a n g i n g S t u d i e s : L i p o p o l y s a c c h a r i d e H e p a t o t o x i c i t y i n A n i m a l s C o t r e a t e d w i t h M C T a n d L P S T i m e C o u r s e o f I n j u r y i n M C T / L P S - C o t r e a t e d R a t s D o s e R e s p o n s e R e l a t i o n s h i p s f o r M C T a n d L P S C o t r e a t m e n t E f f e c t o f M C T a n d L P S o n H e p a t i c P a r e n c h y m a l C e l l s I n V i t r o D e t e r m i n a t i o n o f P y r r o l e C o n c e n t r a t i o n i n L i v e r s f r o m M C T - t r e a t e d R a t s 2 . E . D i s c u s s i o n C H A P T E R 3 T h e T e m p o r a l R e l a t i o n s h i p b e t w e e n B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e a n d M o n o c r o t a l i n e E x p o s u r e s I n f l u e n c e s T o x i c i t y : S h i f t i n R e s p o n s e f r o m H e p a t o t o x i c i t y t o N i t r i c O x i d e - D e p e n d e n t L e t h a l i t y 3 . A . A b s t r a c t 3 . 3 . I n t r o d u c t i o n 3 . 0 . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 3 . 0 . 1 . 3 . 0 . 2 . 3 . 0 . 3 . 3 . 0 . 4 . 3 . 0 . 5 . 3 . 0 . 6 . 3 . 0 . 7 . 3 . 0 . 8 . M a t e r i a l s A n i m a l s T r e a t m e n t P r o t o c o l E n z y m e A s s a y s N i t r i c O x i d e D e t e r m i n a t i o n E h r l i c h A s s a y H i s t o p a t h o l o g i c E v a l u a t i o n S t a t i s t i c a l A n a l y s i s 3 . D . R e s u l t s v i i i 6 0 6 2 6 3 6 4 6 5 6 6 6 6 6 7 6 9 6 9 7 O 7 1 7 2 7 2 7 8 8 3 8 9 9 2 9 5 1 0 0 1 0 0 1 0 9 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 3 1 1 3 1 1 3 1 1 4 1 1 4 1 1 4 1 1 5 n u u ‘ ) F K T I . L 3 . D . 1 . H e p a t o t o x i c i t y D e v e l o p m e n t : L P S A d m i n i s t e r e d B e f o r e M C T 3 . D . 2 . M C T a n d L P S T e m p o r a l R e l a t i o n s h i p 3 . 0 . 3 . E f f e c t o f A G o n A n i m a l s T r e a t e d w i t h L P S a n H o u r B e f o r e M C T 3 . E . D i s c u s s i o n C H A P T E R 4 E n d o t h e l i a l C e l l I n j u r y a n d C o a g u l a t i o n S y s t e m A c t i v a t i o n D u r i n g S y n e r g i s t i c H e p a t o t o x i c i t y f r o m M o n o c r o t a l i n e a n d B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e C o e x p o s u r e 4 . A . A b s t r a c t 4 . B . I n t r o d u c t i o n 4 . 0 . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 4 . 0 . 1 . M a t e r i a l s 4 . 0 . 2 . A n i m a l s 4 . 0 . 3 . T r e a t m e n t P r o t o c o l I n V i v o 4 . 0 . 4 . A s s e s s m e n t o f H P C I n j u r y a n d P l a s m a F i b r i n o g e n a n d H A C o n c e n t r a t i o n s 4 . 0 . 5 . H i s t o p a t h o l o g i c E v a l u a t i o n 4 . 0 . 6 . l m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 4 . 0 . 7 . Q u a n t i f i c a t i o n o f L i v e r E n d o t h e l i a l C e l l s a n d F i b r i n D e p o s i t i o n 4 . 0 . 8 . L i v e r H e m o g l o b i n 4 . 0 . 9 . S E C S t u d i e s I n V i t r o 4 . 0 . 1 0 . S c a n n i n g E l e c t r o n M i c r o s c o p y 4 . 0 . 1 1 . M C T T r e a t m e n t I n V i t r o a n d E h r l i c h A s s a y 4 . 0 . 1 2 . P r e p a r a t i o n o f M i c r o s o m a l F r a c t i o n a n d I m m u n o b l o t t i n g 4 . 0 . 1 3 . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s 4 . 0 . R e s u l t s 4 . D . 1 . L i v e r E n d o t h e l i a l C e l l I n j u r y i n M C T / L P S - C o t r e a t e d A n i m a l s 4 . D . 2 . S E C s a n d N P - 2 6 C e l l s a r e M o r p h o l o g i c a l l y S i m i l a r a n d F o r m P y r r o l i c M e t a b o l i t e s F r o m M C T 4 . D . 3 . L i v e r H e m o r r h a g e 4 . D . 4 . C o a g u l a t i o n S y s t e m A c t i v a t i o n 4 . E . D i s c u s s i o n C H A P T E R 5 T h e R o l e o f K u p f f e r C e l l s a n d T N F - a i n M o n o c r o t a l i n e a n d B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e - I n d u c e d L i v e r I n j u r y 5 . A . A b s t r a c t 5 8 . I n t r o d u c t i o n 5 . 0 . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 5 . 0 . 1 . M a t e r i a l s 5 . 0 . 2 . A n i m a l s 1 1 5 1 2 3 1 2 4 1 3 2 1 3 9 1 4 0 1 4 1 1 4 2 1 4 2 1 4 3 1 4 4 1 4 4 1 4 5 1 4 5 1 4 7 1 4 8 1 5 0 1 5 0 1 5 0 1 5 1 1 5 2 1 5 2 1 5 2 1 6 2 1 6 5 1 6 5 1 7 0 1 7 8 1 7 9 1 7 9 1 8 1 1 8 1 1 8 2 5 . 0 . 3 . 5 . 0 . 4 . 5 . 0 . 5 . 5 . 0 . 6 . 5 . 0 . 7 . 5 . 0 . 8 . 5 . 0 . 9 . 5 . 0 . 1 0 T r e a t m e n t P r o t o c o l T r e a t m e n t w i t h G a d o l i n i u m C h l o r i d e T r e a t m e n t w i t h P e n t o x i f y l l i n e T r e a t m e n t w i t h a n t i - T N F - a S e r u m T r e a t m e n t w i t h N S - 3 9 8 A s s e s s m e n t o f L i v e r I n j u r y , P l a s m a T N F - d a n d P l a s m a H y a l u r o n i c A c i d H i s t o p a t h o l o g i c E v a l u a t i o n a n d M o r p h o m e t r y . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s 5 . D . R e s u l t s 5 . D . 1 . 5 . D . 2 . 5 . D . 3 . 5 . D . 4 . 5 . 0 . 5 . 5 . 0 . 6 . E f f e c t o f G d 0 l 3 o n M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r I n j u r y P l a s m a T N F - a C o n c e n t r a t i o n E f f e c t o f P T X o n H e p a t o t o x i c i t y f r o m M C T / L P S C o t r e a t m e n t E f f e c t o f A n t i - T N F - a S e r u m o n L i v e r I n j u r y f r o m M C T / L P S C o t r e a t m e n t E f f e c t o f N S - 3 9 8 o n M C T / L P S - l n d u c e d L i v e r I n j u r y M o r t a l i t y 5 . E . D i s c u s s i o n C H A P T E R 6 R o l e o f N e u t r o p h i l s i n t h e S y n e r g i s t i c L i v e r I n j u r y f r o m M o n o c r o t a l i n e a n d B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e E x p o s u r e 6 . A . A b s t r a c t 6 8 . I n t r o d u c t i o n 6 . 0 . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 6 . 0 . 1 . 6 . 0 . 2 . 6 . 0 . 3 . 6 . 0 . 4 . 6 . 0 . 5 . 6 . 0 . 6 . 6 . 0 . 7 . 6 . 0 . 8 . 6 . 0 . 9 . 6 . 0 . 1 0 6 . 0 . 1 1 6 . 0 . 1 2 6 . 0 . 1 3 6 . 0 . 1 4 M a t e r i a l s A n i m a l s T r e a t m e n t P r o t o c o l . N e u t r o p h i l D e p l e t i o n P r o t o c o l A s s e s s m e n t o f H e p a t i c I n j u r y a n d P l a s m a T N F - o a n d C l N C - 1 E h r l i c h A s s a y H i s t o p a t h o l o g i c E v a l u a t i o n a n d M o r p h o m e t r y E n u m e r a t i o n o f H e p a t i c P M N s P M N D i s t r i b u t i o n . l m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . Q u a n t i f i c a t i o n o f L i v e r E n d o t h e l i a l C e l l s . P M N I s o l a t i o n a n d T r e a t m e n t P r o t o c o l . M P O a n d L D H A s s a y s . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s 6 . D . R e s u l t s 6 . D . 1 . 6 . 0 . 2 . 6 . 0 . 3 . M C T / L P S T i m e C o u r s e P l a s m a C l N C - 1 C o n c e n t r a t i o n i n M C T / L P S - T r e a t e d A n i m a l s H e p a t i c P M N A c c u m u l a t i o n i n M C T / L P S - C o t r e a t e d 1 8 2 1 8 2 1 8 3 1 8 3 1 8 3 1 8 3 1 8 4 1 8 5 1 8 6 1 8 6 1 8 9 1 9 4 1 9 7 2 0 0 2 0 0 2 0 3 2 0 9 2 1 0 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 5 2 1 6 2 1 6 2 1 6 2 1 7 2 1 7 2 1 8 2 1 8 2 2 1 6 . D . 4 . 6 . 0 . 5 . 6 . 0 . 6 . 6 . 0 . 7 . A n i m a l s E f f e c t o f P M N D e p l e t i o n o n M C T / L P S - l n d u c e d H e p a t o c e l l u l a r I n j u r y E f f e c t o f P M N D e p l e t i o n o n S E C I n j u r y R e l a t i o n s h i p B e t w e e n T N F - a a n d P M N s i n M C T / L P S - T r e a t e d R a t s E f f e c t o n M C T a n d P M N s I n V i t r o 6 . E . D i s c u s s i o n C H A P T E R 7 T h e C o a g u l a t i o n S y s t e m C o n t r i b u t e s t o S y n e r g i s t i c L i v e r I n j u r y f r o m E x p o s u r e t o M o n o c r o t a l i n e a n d B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e 7 . A . A b s t r a c t 7 8 . I n t r o d u c t i o n 7 . 0 . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 7 . 0 . 1 . 7 . 0 . 2 . 7 . 0 . 3 . 7 . 0 . 4 . 7 . 0 . 5 . 7 . 0 . 6 . 7 . 0 . 7 . 7 . 0 . 8 . 7 . 0 . 9 . M a t e r i a l s A n i m a l s T r e a t m e n t P r o t o c o l T r e a t m e n t w i t h H E P T r e a t m e n t w i t h W A R F A s s e s s m e n t o f H e p a t i c I n j u r y a n d P l a s m a T N F - a a n d M C P - 1 C o n c e n t r a t i o n s A s s e s s m e n t o f P l a s m a F i b r i n o g e n C o n c e n t r a t i o n H i s t o p a t h o l o g i c E v a l u a t i o n a n d M o r p h o m e t r y E n u m e r a t i o n o f H e p a t i c N e u t r o p h i l s 7 . 0 . 1 0 . l m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 7 . 0 . 1 1 . Q u a n t i f i c a t i o n o f H e p a t i c F i b r i n D e p o s i t i o n 7 . 0 . 1 2 . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s 7 . D . R e s u l t s 7 . 0 . 1 . 7 . 0 . 2 . 7 . 0 . 3 . 7 . 0 . 4 . 7 . D . 5 . 7 . D . 6 . 7 . D . 7 . 7 . D . 8 . 7 . D . 9 . A n t i c o a g u l a n t T r e a t m e n t o f M C T / L P S - C o e x p o s e d A n i m a l s E f f e c t o f H E P o n M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r I n j u r y E f f e c t o f W A R F o n M C T / L P S - l n d u c e d L i v e r I n j u r y M o r t a l i t y T h e E f f e c t o f A n t i c o a g u l a n t s o n M C T / L P S - l n d u c e d L i v e r L e s i o n s F i b r i n S t a i n i n g i n L i v e r s f r o m M C T / L P S - C o e x p o s e d A n i m a l s P l a s m a T N F - d C o n c e n t r a t i o n a f t e r A n t i c o a g u l a n t A d m i n i s t r a t i o n i n M C T / L P S - C o e x p o s e d A n i m a l s P M N a c c u m u l a t i o n A f t e r A n t i c o a g u l a n t A d m i n i s t r a t i o n i n M C T / L P S - C o e x p o s e d A n i m a l s P l a s m a M C P - 1 C o n c e n t r a t i o n i n M C T / L P S - C o t r e a t e d A n i m a l s 7 . D . 1 0 . C o a g u l a t i o n S y s t e m A c t i v a t i o n i n A n i m a l s D e p l e t e d o f K C s , T N F - d o r P M N s x i 2 2 2 2 2 2 2 2 7 2 3 7 2 3 7 2 4 4 2 5 6 2 5 7 2 5 8 2 5 9 2 5 9 2 6 0 2 6 0 2 6 1 2 6 1 2 6 1 2 6 2 2 6 2 2 6 3 2 6 3 2 6 3 2 6 3 2 6 4 2 6 4 2 6 4 2 6 9 2 6 9 2 7 2 2 7 2 2 7 5 2 7 5 2 8 0 2 8 5 7 . E . D i s c u s s i o n C H A P T E R 8 S u m m a r y a n d C o n c l u s i o n s 8 . A . M o d e l D e v e l o p m e n t a n d C h a r a c t e r i z a t i o n 8 . B . P r o p o s e d M e c h a n i s m o f I n j u r y 8 . 0 . C o m p a r i s o n t o O t h e r M o d e l s 8 0 . S i g n i f i c a n c e a n d F u t u r e S t u d i e s B I B L I O G R A P H Y x i i 2 8 5 2 9 4 2 9 5 2 9 8 3 0 7 3 1 1 3 1 4 L I S T O F T A B L E S T i t l e T a b l e 2 . 1 I n f l u e n c e o f L P S o n H e p a t i c M C T B i o a c t i v a t i o n I n V i v o T a b l e 3 . 1 L P S I n c r e a s e s H e p a t i c M C T B i o a c t i v a t i o n T a b l e 3 . 2 M C T a n d L P S T e m p o r a l R e l a t i o n s h i p I n f l u e n c e s L e t h a l i t y T a b l e 3 . 3 A G R e d u c e s P l a s m a [ N O X ] a t 6 H o u r s i n A n i m a l s T h a t R e c e i v e d L P S a n H o u r B e f o r e M C T T a b l e 5 . 1 M o r p h o m e t r i c A n a l y s i s o f L i v e r L e s i o n s f r o m M C T / L P S - C o t r e a t e d R a t s F o l l o w i n g A d m i n i s t r a t i o n o f G d C I 3 , P T X o r A T S T a b l e 5 . 2 P l a s m a T N F - a C o n c e n t r a t i o n a f t e r M C T / L P S A d m i n i s t r a t i o n i n S p r a g u e D a w l e y R a t s T a b l e 6 . 1 P M N D e p l e t i o n R e d u c e s L i v e r L e s i o n s i n M C T / L P S - C o t r e a t e d R a t s T a b l e 6 . 2 N A S d o e s n o t I n f l u e n c e M C T B i o a c t i v a t i o n T a b l e 6 . 3 G d C l z , P T X o r A T S R e d u c e s H e p a t i c P M N A c c u m u l a t i o n i n M C T / L P S - C o t r e a t e d R a t s T a b l e 7 . 1 H E P o r W A R F A d m i n i s t r a t i o n R e d u c e s L i v e r L e s i o n s i n M C T / L P S - C o t r e a t e d R a t s T a b l e 7 . 2 P l a s m a M C P - 1 C o n c e n t r a t i o n i s E l e v a t e d A f t e r M C T / L P S - C o e x p o s u r e T a b l e 7 . 3 T r e a t m e n t w i t h N A S b u t N o t w i t h G d C I 3 , P T X , o r A T S P r e v e n t s C o a g u l a t i o n S y s t e m A c t i v a t i o n i n M C T / L P S - C o t r e a t e d A n i m a l s T a b l e 8 . 1 S u m m a r y o f t h e P h a r m a c o l o g i c a l M a n i p u l a t i o n s U s e d t o I n v e s t i g a t e t h e P a t h o g e n e s i s o f M C T / L P S - i n d u c e d L i v e r I n j u r y x i i i P a g e 1 0 2 1 2 0 1 2 6 1 3 1 1 9 1 1 9 3 2 3 1 2 3 3 2 3 9 2 7 4 2 8 4 2 8 7 3 0 0 L I S ' L I S T O F F I G U R E S T i t l e P a g e F i g u r e 1 . 1 S t r u c t u r e o f L P S 9 F i g u r e 1 . 2 I n f l a m m a t o r y R e s p o n s e t o L P S 2 0 F i g u r e 1 . 3 C h e m i c a l S t r u c t u r e o f M C T a n d M C T P 5 2 F i g u r e 2 . 1 D o s e - R e l a t e d H e p a t o t o x i c i t y o f M C T 7 4 F i g u r e 2 . 2 R e p r e s e n t a t i v e P h o t o m i c r o g r a p h s o f L i v e r f r o m a R a t G i v e n a n H e p a t o t o x i c D o s e o f M C T 7 7 F i g u r e 2 . 3 D o s e - R e l a t e d H e p a t o t o x i c i t y o f L P S 8 0 F i g u r e 2 . 4 R e p r e s e n t a t i v e P h o t o m i c r o g r a p h s o f L i v e r f r o m a R a t G i v e n a n I n j u r i o u s D o s e o f L P S 8 2 F i g u r e 2 . 5 D e v e l o p m e n t o f H e p a t o t o x i c i t y i n R a t s C o t r e a t e d w i t h M C T a n d L P S 8 5 F i g u r e 2 . 6 R e p r e s e n t a t i v e P h o t o m i c r o g r a p h s o f L i v e r S e c t i o n s f r o m R a t s T r e a t e d w i t h L P S a n d / o r M C T 8 7 F i g u r e 2 . 7 P h o t o m i c r o g r a p h o f a T U N E L - S t a i n e d L i v e r f r o m a R a t G i v e n M C T / L P S 9 1 F i g u r e 2 . 8 H e p a t o t o x i c i t y f r o m M C T / L P S C o a d m i n i s t r a t i o n : L P S D o s e - R e s p o n s e 9 4 F i g u r e 2 . 9 H e p a t o t o x i c i t y f r o m M C T / L P S C o a d m i n i s t r a t i o n : M C T D o s e - R e s p o n s e 9 7 F i g u r e 2 . 1 0 C y t o t o x i c E f f e c t s o f M C T a n d L P S o n I s o l a t e d H e p a t i c P a r e n c h y m a l C e l l s 9 9 F i g u r e 3 . 1 D e v e l o p m e n t o f H e p a t o t o x i c i t y i n R a t s G i v e n L P S a n H o u r B e f o r e M C T 1 1 7 F i g u r e 3 . 2 D o s e - D e p e n d e n c y o f H e p a t o t o x i c i t y f r o m L P S a n d M C T C o a d m i n i s t r a t i o n 1 2 2 F i g u r e 3 . 3 E f f e c t o f A G o n A n i m a l S u r v i v a l F o l l o w i n g a L e t h a l x i v C o m b i n a t i o n o f L P S a n H o u r B e f o r e M C T F i g u r e 4 . 1 M C T / L P S - l n d u c e d L i v e r I n j u r y F i g u r e 4 . 2 L i v e r R E C A - 1 I m m u n o h i s t o c h e m i c a l S t a i n i n g F i g u r e 4 . 3 R e p r e s e n t a t i v e T E M P h o t o m i c r o g r a p h s f r o m L i v e r S e c t i o n s o f V e h N e h - a n d M C T / L P S - C o t r e a t e d R a t s F i g u r e 4 . 4 P y r r o l e F o r m a t i o n f r o m M C T i n S E C s I n V i t r o F i g u r e 4 . 5 T i m e c o u r s e f o r L i v e r H e m o g l o b i n a n d C o a g u l a t i o n S y s t e m A c t i v a t i o n i n M C T / L P S - C o e x p o s e d R a t s F i g u r e 4 . 6 H e p a t i c F i b r i n D e p o s i t i o n F i g u r e 5 . 1 G d C I a P r o t e c t s A g a i n s t M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r I n j u r y F i g u r e 5 . 2 E f f e c t o f P T X o n M C T / L P S - l n d u c e d L i v e r I n j u r y F i g u r e 5 . 3 A n t i - T N F - a S e r u m P r o t e c t s A g a i n s t H e p a t i c I n j u r y f r o m M C T / L P S - C o t r e a t m e n t F i g u r e 5 . 4 N S - 3 9 8 d o e s n o t P r o t e c t A g a i n s t M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r I n j u r y F i g u r e 6 . 1 T i m e c o u r s e o f E v e n t s a f t e r M C T / L P S C o e x p o s u r e F i g u r e 6 . 2 H e p a t i c P M N D i s t r i b u t i o n i n R a t L i v e r s a t 6 H o u r s F i g u r e 6 . 3 H e p a t i c P M N A c c u m u l a t i o n a f t e r P M N d e p l e t i o n i n A n i m a l s E x p o s e d t o M C T a n d L P S F i g u r e 6 . 4 E f f e c t o f P M N D e p l e t i o n o n M C T / L P S - l n d u c e d H P C I n j u r y F i g u r e 6 . 5 E f f e c t o f P M N D e p l e t i o n o n M C T / L P S - I n d u c e d S E O I n j u r y F i g u r e 6 . 6 E f f e c t o f P M N D e p l e t i o n o n T N F - a C o n c e n t r a t i o n i n M C T / L P S - C o t r e a t e d A n i m a l s F i g u r e 6 . 7 M C T A c t i v a t e s P M N s I n V i t r o F i g u r e 6 . 8 P u t a t i v e S e q u e n c e o f E v e n t s i n t h e P a t h o g e n e s i s o f S y n e r g i s t i c L i v e r I n j u r y f r o m M C T / L P S C o e x p o s u r e 1 2 9 1 5 5 1 5 8 1 6 1 1 6 4 1 6 7 1 6 9 1 8 8 1 9 6 1 9 9 2 0 2 2 2 0 2 2 4 2 2 6 2 2 9 2 3 6 2 4 1 2 4 3 2 5 0 F i g r A c t i ‘ F i g l F i g L F l g L L P S F i g u i n M I I - " I g u M C T F i g u F i g u r e 7 . 1 E f f e c t o f A n t i c o a g u l a n t s o n C o a g u l a t i o n S y s t e m A c t i v a t i o n i n M C T / L P S - C o t r e a t e d A n i m a l s F i g u r e 7 . 2 E f f e c t o f H E P o n M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r I n j u r y F i g u r e 7 . 3 E f f e c t o f W A R F o n M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r I n j u r y F i g u r e 7 . 4 H e p a t i c F i b r i n D e p o s i t i o n i n A n i m a l s C o t r e a t e d w i t h M C T , L P S a n d H E P F i g u r e 7 . 5 E f f e c t o f A n t i c o a g u l a n t s o n P l a s m a T N F - a C o n c e n t r a t i o n i n M C T / L P S - C o t r e a t e d A n i m a l s F i g u r e 7 . 6 E f f e c t o f A n t i c o a g u l a n t s o n P M N A c c u m u l a t i o n i n M C T / L P S - C o t r e a t e d A n i m a l s F i g u r e 8 . 1 P a t h o g e n e s i s o f M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r I n j u r y 2 6 6 2 6 8 2 7 1 2 7 7 2 7 9 2 8 2 3 0 5 A G A L P A L T A N O V A A P - 1 A R E A S T A T S B P I C a C l z C D C I N O - 1 0 L c N O S C O X C O X - 1 C O X - 2 C S 0 V C V E C C Y P D I C D M S O D N A d U D P E C L E G M - 2 E L I S A E R K E U F O C I a G d 0 l 3 G G T G I G R O G S H h r H A H B S S H C I H D L H E P L I S T O F A B B R E V I A T I O N S a m i n o g u a n i d i n e a l k a l i n e p h o s p h a t a s e a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a n a l y s i s o f v a r i a n c e a c t i v a t i n g p r o t e i n - 1 a n t i o x i d a n t r e s p o n s e e l e m e n t a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e a n t i - r a t T N F - a s e r u m b a c t e r i c i d a I / p e r m e a b i l i t y - i n c r e a s i n g p r o t e i n c a l c i u m c h l o r i d e c l u s t e r o f d e s i g n a t i o n c y t o k i n e i n d u c e d n e u t r o p h i l C h e m o a t t r a c t a n t - 1 c e n t r i l o b u l a r c o n s t i t u t i v e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e c y c l o o x y g e n a s e c y c l o o x y g e n a s e - 1 c y c l o o x y g e n a s e - 2 c o n t r o l s e r u m c e n t r a l v e i n c e n t r a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l c y t o c h r o m e P - 4 5 0 d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n d i m e t h y l s u l f o x i d e d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d d e o x y u r i d i n e t r i p h o s p h a t e e n h a n c e d c h e m i l u m i n e s c e n c e e n d o t h e l i a l c e l l m e d i u m e n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y e x t r a c e l l u l a r - s i g n a I - r e g u l a t e d k i n a s e e n d o t o x i n u n i t f e r r i c c h l o r i d e g r a m g a d o l i n i u m c h l o r i d e g a m m a - g l u t a m y l t r a n s f e r a s e g a s t r o i n t e s t i n a l g r o w t h r e l a t e d o n c o g e n e r e d u c e d g l u t a t h i o n e h o u r h y a l u r o n i c a c i d H a n k ' s b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n h y d r o c h l o r i c a c i d h i g h d e n s i t y I i p o p r o t e i n h e p a n n x v i i H P C H P F H R P H V O D I C A M - I ' 9 I L l L - 1 I L - 1 a I L - 1 j 3 l L - 6 l L - 8 i N O S i n I R A K i v J N K K C K D O k 9 L L B P L D H L P F L P S M M A P M C P - 1 M C T M C T P I 1 9 m g M 9 3 0 4 p l m l p m p M m M M O F / M O D S M P O M Z N N 8 H C O a N a O H N A S N F - K B h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l h i g h p o w e r f i e l d h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e h e p a t i c v e n o - o c c l u s i v e d i s e a s e i n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 i m m u n o g l o b u l i n i n t e r l e u k i n i n t e r l e u k i n - 1 i n t e r l e u k i n - 1 a l p h a i n t e r l e u k i n - 1 b e t a i n t e r l e u k i n - 6 i n t e r l e u k i n - 8 i n d u c i b l e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n t r a p e r i t o n e a l l L - 1 r e c e p t o r a s s o c i a t e d k i n a s e i n t r a v e n o u s c - J u n K i n a s e K u p f f e r c e l l 2 - k e t o - 3 — d e o x y - D - m a n n o - o c t o n i c a c i d k i l o g r a m l i t e r L P S b i n d i n g p r o t e i n l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e l o w p o w e r f i e l d l i p o p o l y s a c c h a r i d e m o l a r . m i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i n m o n o c y t e C h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n - 1 m o n o c r o t a l i n e m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e m i c r o g r a m m i l l i g r a m m a g n e s i u m s u l f a t e m i c r o l i t e r m i l l i l i t e r m i c r o m e t e r m i c r o m o l a r m i l l i m o l a r m u l t i p l e o r g a n f a i l u r e / d y s f u n c t i o n s y n d r o m e m y e l o p e r o x i d a s e m i d z o n a l n u m b e r s o d i u m b i c a r b o n a t e s o d i u m h y d r o x i d e n e u t r o p h i l a n t i - s e r u m n u c l e a r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r - k a p p a B x v i i i N fi fl fi n m N O N 0 x N O A E L N P N S - 3 9 8 P A P A F P A R P A R J P B S p 9 P G P o o 2 P G E 1 P G E g P G B P M N P P P T P T X P V R B C R E C A - 1 R N A R O S $ 0 0 1 4 S E C S E M T d T T E M T F T L R T L R 2 T L R 4 T N F - a T U N E L V C A M - I V I I W A R F X I I n u c l e a r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r - i n t e r l e u k i n - 6 n a n o m e t e r n i t r i c o x i d e n i t r a t e a n d n i t r i t e n o o b s e r v e d a d v e r s e e f f e c t l e v e l n o n p a r e n c h y m a l N - ( 2 - c y c l o h e x y l o x y - 4 - n i t r o - p h e n y l ) m e t h a n e s u l f o n a m i d e p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r p r o t e a s e a c t i v a t e d r e c e p t o r p r o t e a s e a c t i v a t e d r e c e p t o r - 1 p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e p i c o g r a m p r o s t a g l a n d i n p r o s t a g l a n d i n D 2 p r o s t a g l a n d i n E 1 p r o s t a g l a n d i n E 2 p r o s t a c y c l i n p o w e r o f h y d r o g e n p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e ; n e u t r o p h i l p e n p o n a l p o r t a l t r i a d p e n t o x i f y l l i n e p o r t a l v e i n r e d b l o o d c e l l r a t e n d o t h e l i a l c e l l a n t i g e n - 1 r i b o n u c l e i c a c i d r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s s o l u b l e C D 1 4 s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p e t i s s u e f a c t o r t o l l - l i k e r e c e p t o r t o l l - l i k e r e c e p t o r 2 t o l l - l i k e r e c e p t o r 4 t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a l p h a t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e - m e d i a t e d d e o x y u r i d i n e t r i p h o s p h a t e n i c k e n d l a b e l i n g u n i t v a s c u l a r c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 p r o c o n v e r t i n w a r f a r i n S t u a r t - P r o w e r f a c t o r H a g e m a n F a c t o r x i x C H A P T E R 1 G e n e r a l I n t r o d u c t i o n 1 . A . t h a t . C Q V a 0 * I f . S " i a l I e a d t h a t ' 1 . A . O v e r v i e w S o m e i n d i v i d u a l s a r e m o r e s u s c e p t i b l e t o c h e m i c a l i n t o x i c a t i o n t h a n o t h e r s . T h e r e a r e a v a r i e t y ' o f d e t e r m i n a n t s t h a t c a n c o n t r i b u t e t o t h i s “ h y p e r s u s c e p t i b i l i t y ” . T h e s e i n c l u d e a g e , s e x , d i e t , d i s e a s e s t a t e , d r u g i n t e r a c t i o n , g e n e t i c s a n d x e n o b i o t i c a b s o r p t i o n a n d m e t a b o l i s m ( G r a n d j e a n , 1 9 9 5 ; R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ; G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . A n o t h e r d e t e r m i n a n t o f s u s c e p t i b i l i t y , a l b e i t a n u n d e r s t u d i e d o n e , i s i n f l a m m a t i o n . A l t h o u g h e x p o s u r e t o a m o d e s t a m o u n t o f a n i n f l a m m a g e n s u c h a s b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) m a y b e i n s u f f i c i e n t t o r e s u l t i n o v e r t t i s s u e i n j u r y , t h e a c c o m p a n y i n g r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s h a s t h e p o t e n t i a l t o a l t e r c e l l u l a r h o m e o s t a s i s ( M i c h i e e t a l . , 1 9 8 8 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ; S p i t z e r a n d M a y e r , 1 9 9 3 ; R o t h 9 ! a l . , 1 9 9 7 ) . T h i s m a y r e s u l t i n t i s s u e s t h a t a r e h y p e r s u s c e p t i b l e t o c h e m i c a l - i n d u c e d i n j u r y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ) . A c c o r d i n g l y , e x p o s u r e t o L P S m a y b e a n i m p o r t a n t d e t e r m i n a n t o f s u s c e p t i b i l i t y t o c h e m i c a l i n t o x i c a t i o n ( R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ; G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . H e p a t o t o x i c c h e m i c a l s c a n i n i t i a t e i n j u r y t h r o u g h a v a r i e t y o f m e c h a n i s m s t h a t c a n i n c l u d e , b u t a r e n o t l i m i t e d t o , o x i d a n t d a m a g e , l i p i d p e r o x i d a t i o n a n d c o v a l e n t b i n d i n g t o c e l l u l a r m a c r o m o l e c u l e s a n d D N A . E x p o s u r e t o l a r g e d o s e s o f t h e s e h e p a t o t o x i c a n t s l e a d s t o o v e r t t i s s u e i n j u r y , w h e r e a s e x p o s u r e t o s m a l l e r d o s e s m a y a l t e r c e l l u l a r h o m e o s t a s i s b y t h e s a m e m e c h a n i s m b u t n o t l e a d t o o v e r t t i s s u e i n j u r y . C o e x p o s u r e t o L P S - i n d u c e d i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s , t h a t i n a n d o f i t s e l f w o u l d b e n o n i n j u r i o u s , m i g h t r e s u l t i n s u b s t a n t i v e i n j u r y i n a U S S U I h e p a d e v e i d o s e : I h h N t h a t h e p a ' d e s e . c h a p t t i s s u e a l r e a d y p r e d i s p o s e d b y h o m e o s t a t i c a l t e r a t i o n s f r o m a s u b t o x i c d o s e o f a n h e p a t o t o x i c a n t ( R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ; G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . T h e o v e r a l l o b j e c t i v e o f t h i s d i s s e r t a t i o n i s t o c h a r a c t e r i z e t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y r e s u l t i n g f r o m c o e x p o s u r e t o s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e s o f m o n o c r o t a l i n e ( M C T ) a n d L P S , a n d t o e x p l o r e t h e m e c h a n i s m s b e h i n d t h i s l i v e r i n j u r y m o d e l . I n p a r t i c u l a r , t h i s d i s s e r t a t i o n t e s t s t h e h y p o t h e s i s t h a t i n f l a m m a t o r y e v e n t s p a r t i c i p a t e c a u s a l l y i n t h e s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y f r o m c o e x p o s u r e t o M C T a n d L P S . C o n s e q u e n t l y , t h i s d i s s e r t a t i o n c a n b e d i v i d e d i n t o t w o s e c t i o n s . T h e f i r s t s e c t i o n , w h i c h c o n s i s t s o f c h a p t e r s 2 , 3 a n d 4 , c h a r a c t e r i z e s t h e d e v e l o p m e n t o f t h e M C T / L P S - c o t r e a t m e n t m o d e l o f l i v e r i n j u r y . F o l l o w i n g a b r i e f o v e r v i e w ( C h a p t e r 1 ) c o n c e r n i n g L P S a n d M C T t o x i c i t y , t h e M C T / L P S - c o t r e a t m e n t m o d e l i s d e v e l o p e d a n d c h a r a c t e r i z e d i n C h a p t e r 2 . T h e e f f e c t o f t h e t e m p o r a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n M C T a n d L P S c o e x p o s u r e o n t o x i c i t y i s e x p l o r e d i n C h a p t e r 3 . N e x t , c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n a n d e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y a r e s h o w n t o b e c h a r a c t e r i s t i c s o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y ( C h a p t e r 4 ) . T h e s e c o n d s e c t i o n , c o n s i s t i n g o f c h a p t e r s 5 , 6 a n d 7 , i n v e s t i g a t e s t h e i n f l a m m a t o r y e v e n t s i n v o l v e d i n t h e p a t h o g e n e s i s o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . E v i d e n c e t h a t K u p f f e r c e l l s ( K 0 5 ) a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r ( T N F ) - o r a r e b o t h c r i t i c a l m e d i a t o r s i n t h i s s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y i s p r e s e n t e d i n C h a p t e r 5 . N e u t r o p h i l s ( p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s ; P M N s ) a r e a l s o s h o w n t o b e c r i t i c a l t o M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . T h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i s d e m o n s t r a t e d t o c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f t h i s m o d e l i n C h a p t e r 7 . F i n a l l y , i n C h a p t e r 8 , t h e r e s u l t s o f t h e s e s t u d i e s a r e X E h e p m m e D i a s s u m m a r i z e d a n d a p r o p o s a l f o r a m e c h a n i s m o f i n j u r y f o r M C T / L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y i s d i s c u s s e d . 1 . 8 . L i v e r S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n T h e l i v e r s e r v e s a s a f i l t e r b e t w e e n b l o o d f r o m t h e p o r t a l v e n o u s s y s t e m ( w h i c h d r a i n s t h e s t o m a c h a n d i n t e s t i n e s ) a n d t h e s y s t e m i c c i r c u l a t i o n . C o n s e q u e n t l y , t h e l i v e r i s e x p o s e d t o s u b s t a n c e s ( e . g . , n u t r i e n t s , f o o d a d d i t i v e s a n d c o n t a m i n a n t s , x e n o b i o t i c s , e t c ) o r i g i n a t i n g f r o m t h e g a s t r o i n t e s t i n a l ( G I ) t r a c t , s o m e o f w h i c h m a y b e p o t e n t i a l l y t o x i c t o t h e l i v e r . T h e l i v e r i s e x t e n s i v e l y v a s c u l a r i z e d a n d r e c e i v e s b l o o d f r o m t w o d i f f e r e n t s o u r c e s . T h e l a r g e s t p r o p o r t i o n o f b l o o d i s s u p p l i e d b y t h e h e p a t i c p o r t a l v e i n . T h i s b l o o d i s f u l l o f n u t r i e n t s b u t i s p o o r l y o x y g e n a t e d . T h e h e p a t i c a r t e r y a l s o d e l i v e r s b l o o d , a l b e i t a s m a l l e r p r o p o r t i o n b u t h i g h l y o x y g e n a t e d , t o t h e l i v e r . B l o o d d r a i n s f r o m t h e l i v e r v i a t h e c e n t r a l v e i n a n d e n t e r s t h e i n f e r i o r v e n a c a v a t o g o o n t o t h e s y s t e m i c c i r c u l a t i o n . A c c o r d i n g l y , d u e t o i t s p o s i t i o n , s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n , t h e l i v e r m a y b e a p o t e n t i a l t a r g e t f o r i n j u r y f r o m t o x i c s u b s t a n c e s . T h e l i v e r h a s a v a r i e t y o f i m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s b e s i d e s x e n o b i o t i c m e t a b o l i s m . T h e s e f u n c t i o n s i n c l u d e v i t a m i n s t o r a g e a n d m e t a b o l i s m , h e m e s y n t h e s i s a n d d e g r a d a t i o n , c o n v e r s i o n o f a m m o n i a ( g e n e r a t e d f r o m p r o t e i n a n d n u c l e i c a c i d c a t a b o l i s m ) t o u r e a ( i . e . , u r e a c y c l e ) , c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m , b i l e s y n t h e s i s a n d s e c r e t i o n , l i p i d a n d c h o l e s t e r o l m e t a b o l i s m , p l a s m a p r o t e i n s y n t h e s i s a n d t h e f i l t r a t i o n o f p a r t i c u l a t e m a t t e r ( e . g . , c e l l d e b r i s , b a c t e r i a , f o r e i g n s u b s t a n c e s , e t c . ) . T h e m a j o r i t y o f t h e s e f u n c t i o n s a r e p e r f o r m e d b y c u b o i d a l e p i t h e l i a l c e l l s , w h i c h a r e a l s o k n o w n a s h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s ( H P C s ) . H P C s m a k e u p a p p r o x i m a t e l y 7 0 % o f t h e c e l l n u m b e r a n d 9 0 % o f t h e m a s s o f t h e l i v e r . T h e r e m a i n i n g l i v e r c e l l s ( i . e . , n o n p a r e n c h y m a l ( N P ) c e l l s ) c o n s i s t o f s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s ( S E C s ; w h i c h m a k e u p 1 5 % o f t h e c e l l s i n t h e l i v e r a n d a b o u t 3 % o f t h e t o t a l l i v e r v o l u m e ) , b i l e d u c t e p i t h e l i a l c e l l s , r e s i d e n t m a c r o p h a g e s ( K u p f f e r c e l l s ; K C s ) , f a t s t o r i n g s t e l l a t e c e l l s ( I t o c e l l s ) a n d p i t c e l l s ( n a t u r a l k i l l e r c e l l s ; L a s k i n , 1 9 9 6 ; V a n d e n b e r g h e , 1 9 9 6 ; P o p p a n d C a t l e y , 1 9 9 8 ) . T h e l i v e r l o b u l e i s t h e b a s i c s t r u c t u r a l u n i t o f t h e l i v e r a n d c o n s i s t s o f c o r d s o f H P C s r a d i a t i n g o u t w a r d f r o m a c e n t r a l v e i n . T h e l o b u l e i s b o r d e r e d b y s e v e r a l p o r t a l t r i a d s , e a c h c o n s i s t i n g o f b r a n c h e s o f t h e p o r t a l v e i n , h e p a t i c a r t e r y a n d b i l e d u c t . H P C s i n t h e i m m e d i a t e v i c i n i t y ( p e r h a p s a s f a r a s 4 t o 6 H P C s a w a y ) o f t h e c e n t r a l v e i n a n d t h e p o r t a l t r i a d r e g i o n s o f t h e l i v e r l o b u l e a r e r e f e r r e d t o a s c e n t r i l o b u l a r ( C L ) a n d p e r i p o r t a l ( P P ) , r e s p e c t i v e l y . H P C s l o c a t e d b e t w e e n t h e C L a n d P P r e g i o n s a r e r e f e r r e d t o a s m i d z o n a l ( M Z ; V a n d e n b e r g h e , 1 9 9 6 ; P o p p a n d C a t l e y , 1 9 9 8 ) . B l o o d e n t e r i n g t h e l i v e r v i a t h e h e p a t i c a r t e r y a n d t h e p o r t a l v e i n p e r c o l a t e s d o w n t h e s p a c e b e t w e e n t h e c o r d s o f H P C s a n d c o l l e c t s i n t o a b r a n c h o f t h e c e n t r a l v e i n . T h e s p a c e b e t w e e n t h e c o r d s o f H P C s i s k n o w n a s t h e s i n u s o i d . S i n u s o i d s a r e c o n s i d e r e d s p e c i a l i z e d c a p i l l a r i e s w i t h d i s c o n t i n u o u s b a s e m e n t m e m b r a n e s a n d a r e l i n e d w i t h f e n e s t r a t e d S E C s . T h e s e c e l l s a c t a s a s i e v e f o r f l u i d s a n d p a r t i c l e s , w h i c h a r e e x c h a n g e d b e t w e e n t h e s i n u s o i d a l l u m e n a r 5 9 o f c a V a l c o r c e l t h e c e : S i n t b i l e b e n t d u c t a n d L C . I . C . 1 ” 9 9 a m a n d 0 I 9 9 8 ; a n d t h e s p a c e o f D i s s e , w h e r e i n l i e H P C s ( W i s s e e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h u s , S E C s s e r v e a s a l e a k y b a r r i e r t o H P C s a n d a r e r e s p o n s i b l e f o r e x c h a n g e a n d t r a n s p o r t o f s u b s t a n c e s b e t w e e n b l o o d a n d H P C s . S E C s a l s o h a v e a h i g h e n d o c y t o t i c c a p a c i t y . C o n s e q u e n t l y , t h e y m a y a s s i s t K C s i n t h e c l e a r a n c e o f L P S ( P r a a n i n g - v a n D a l e n e t a l . , 1 9 8 1 ; N a k a o e t a l . , 1 9 9 4 ; W i s s e e t a l . , 1 9 9 6 ) a n d a r e p r i m a r i l y r e s p o n s i b l e f o r t h e e l i m i n a t i o n o f h y a l u r o n i c a c i d ( H A ) , a g l y c o s a m i n o g l y c a n c o m p o n e n t o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( L a u r e n t a n d F r a z i e r , 1 9 9 2 ) . A n o t h e r N P c e l l t y p e f o u n d i n t h e s i n u s o i d i s t h e K C . T h e s e m a c r o p h a g e s a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e r e m o v a l f r o m t h e c i r c u l a t i o n o f s e n e s c e n t r e d b l o o d c e l l s ( R B C s ) a s w e l l a s c e l l d e b r i s a n d f o r e i g n s u b s t a n c e s , s u c h a s L P S . A l s o , s c a t t e r e d t h r o u g h o u t t h e s i n u s o i d s a r e I t o a n d p i t c e l l s . F i n a l l y , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t H P C s s y n t h e s i z e b i l e a n d s e c r e t e i t i n t o b i l e c a n a l i c u l i , w h i c h a r e f o r m e d f r o m t i g h t j u n c t i o n s b e t w e e n a d j a c e n t H P C s . B i l e f l o w s d o w n t h e s e c a n a l i c u l i a n d e m p t i e s i n t o b i l e d u c t s l o c a t e d i n t h e p o r t a l t r i a d s . F o r m o r e d e t a i l e d r e v i e w s o n l i v e r s t r u c t u r e a n d p h y s i o l o g y , s e e V a n d e n b e r g h e ( 1 9 9 6 ) a n d P o p p a n d C a t l e y ( 1 9 9 8 ) . 1 . 0 . B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e 1 . 0 . 1 . S t r u c t u r e L P S i s a n i n t e g r a l c o n s t i t u e n t o f t h e o u t e r c e l l m e m b r a n e o f G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a , s u c h a s E s c h e r i c h i a c o l i , S a l m o n e l l a , P s u e d o m o n a s , S h i g e l l a , a n d o t h e r s ( R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ; M a y e u x , 1 9 9 7 ; V a a r a , 1 9 9 9 ) . I t i s a n a m p h i p h i l i c m o l e c u l e t h a t v a r i e s i n t h e o n e m o l t L P S n e g ; p o l y : R i e t s p h o s m e m m o s t B r a s e d i r e c t ; a l . , 1 9 r e s i 3 0 r ” 9 9 a m a n d B r L P S 0 . O H Q O S a s u g a r n c h e m i c a l c o m p o s i t i o n a m o n g G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l s p e c i e s . T h e s u r f a c e o f o n e b a c t e r i u m h a s b e e n e s t i m a t e d t o c o n t a i n a p p r o x i m a t e l y 3 . 5 X 1 0 6 L P S m o l e c u l e s ( N i k a i d o , 1 9 9 6 ) . F r o m a b i o l o g i c a l p e r s p e c t i v e , m a m m a l i a n h o s t s u s e L P S a s a n i n d i c a t o r f o r t h e s p e c i f i c r e c o g n i t i o n a n d e l i m i n a t i o n o f i n v a d i n g G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . T h e g e n e r a l a r c h i t e c t u r e o f L P S c o n s i s t s o f t h r e e r e g i o n s : l i p i d A , a c o r e p o l y s a c c h a r i d e a n d a s o m a t i c ( 0 ) a n t i g e n o r O - s p e c i f i c c h a i n ( F i g u r e 1 . 1 ; R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ; M a y e u x , 1 9 9 7 ) . L i p i d A i s a p h o s p h o g l y c o l i p i d c o m p o n e n t o f L P S t h a t a n c h o r s t h e m o l e c u l e t o t h e o u t e r c e l l m e m b r a n e ( H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ; M a y e u x , 1 9 9 7 ) . T h i s c o m p o n e n t i s r e s p o n s i b l e f o r m o s t o f t h e b i o l o g i c e f f e c t s o f L P S , b o t h a d v e r s e a n d b e n e f i c i a l ( R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ) . L i p i d A i s l i n k e d t o t h e O - a n t i g e n v i a a c o r e p o l y s a c c h a r i d e . T h i s c o r e p o l y s a c c h a r i d e c o n s i s t s o f a s h o r t c h a i n o f s u g a r s t h a t c o n t a i n s t w o u n u s u a l s u g a r s , h e p t o p y r a n o s e a n d 2 - k e t o - 3 - d e o x y - D - m a n n o - o c t o n i c a c i d ( K D O ) . K D O i s p r e s e n t i n a l l e n d o t o x i n s a n d d i r e c t l y l i n k s t h e p o l y s a c c h a r i d e t o l i p i d A ( R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ) . L a s t l y , t h e O - a n t i g e n o r O - s p e c i f i c c h a i n i s t h e v a r i a b l e r e g i o n o f L P S r e s p o n s i b l e f o r b o t h d i v e r s i t y o f L P S e f f e c t s a m o n g d i f f e r e n t s t r a i n s o f G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a a n d t h e a n t i g e n i c c o m p o n e n t f o r a p a r t i c u l a r s t r a i n ( R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e O - a n t i g e n i s t h e o u t e r m o s t p o r t i o n o f L P S ( i . e . , i n c o n t a c t w i t h t h e e x t e r n a l e n v i r o n m e n t ) a n d c o n s i s t s o f u p t o 5 0 o l i g o s a c c h a r i d e s , w i t h e a c h o l i g o s a c c h a r i d e c o n s i s t i n g o f b e t w e e n t w o t o e i g h t s u g a r m o n o m e r s ( H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ) . F i g u r e 1 . 1 . S t r u c t u r e o f L P S . L P S r e s i d e s i n t h e o u t e r m e m b r a n e o f G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . L P S c a n b e d i v i d e d i n t o 3 r e g i o n s . L i p i d A i s t h e i n n e r m o s t p o r t i o n o f t h i s m o l e c u l e a n d a t t a c h e s t h e m o l e c u l e o n t o t h e o u t e r c e l l m e m b r a n e . T h e c o r e p o l y s a c c h a r i d e r e g i o n c o n s i s t s o f t w o u n u s u a l s u g a r s , a h e p t o p y r a n o s e a n d K D O . T h i s c o r e r e g i o n l i n k s l i p i d A a n d t h e O - a n t i g e n ( o r O - s p e c i f i c c h a i n ) . T h e o u t e r m o s t r e g i o n i s t h e 0 - a n t i g e n a n d i s m a d e u p o f a v a r i a b l e n u m b e r o f o l i g o s a c c h a r i d e s . M e n P r c O O O O H ‘ O O O O O O I O I O O O W O O O O O O I M n e n e m r b r a n e O - A n t i g e n O O I ( O - S p e c i f i c t I C h a i n ) I L I C o r e — > I L i p i d A — > { ' - , ' O u t e r H . . . I I I I I W M e m b r a n e O 8 3 O O O O O O O O M e m b r a n e ) " . . P r o t e i n s p l a S I l a m a a c fl v a b s o c o n s U E U s d a n c I i s u I S e q l " I G I C I T h e L i m u l u s a m e b o c y t e l y s a t e a s s a y i s o f t e n u s e d t o q u a n t i f y L P S i n p l a s m a . I n t h i s a s s a y , L P S a c t i v a t e s a p r o e n z y m e i n t h e l y s a t e o f a m e b o c y t e s i s o l a t e d f r o m h o r s e s h o e c r a b ( L i m u l u s p o l y p h e m u s ) b l o o d . T h e r e s u l t i n g a c t i v a t e d e n z y m e t h e n c l e a v e s a c h r o m o g e n i c p e p t i d e s u b s t r a t e a n d t h e a b s o r b a n c e i s r e a d . T h e a m o u n t o f L P S i s c o m p a r e d a g a i n s t a s t a n d a r d c u r v e c o n s i s t i n g o f U S . s t a n d a r d e n d o t o x i n . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d i n e n d o t o x i n u n i t s ( E U s ) p e r m l o f p l a s m a . O n e E U i s e q u i v a l e n t t o t h e a c t i v i t y o f 1 0 0 p g o f U S . s t a n d a r d e n d o t o x i n ( O b a y a s h i e t a l . , 1 9 8 5 ; M a y e u x , 1 9 9 7 ) . T h e L P S d o s e u s e d i n s u b s e q u e n t c h a p t e r s o f t h i s d i s s e r t a t i o n i s 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g . H e n c e , t h e d o s e i s e q u i v a l e n t t o 7 . 4 x 1 0 ‘ 3 p g / k g o r 0 . 7 4 m g / k g o f t h e U S . s t a n d a r d e n d o t o x i n . L P S i s e s s e n t i a l f o r t h e g r o w t h a n d s u r v i v a l o f G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . I n c o n j u n c t i o n w i t h t h e o u t e r m e m b r a n e , i t a c t s a s a p e r m e a b i l i t y b a r r i e r t o e x c l u d e h y d r o p h o b i c m o l e c u l e s a n d h y d r o p h i l i c m o l e c u l e s g r e a t e r t h a n 6 0 0 D a l t o n s ( N i k a i d o , 1 9 9 6 ; V a a r a , 1 9 9 9 ) . A s a c o n s e q u e n c e , L P S a f f o r d s p r o t e c t i o n f r o m a v a r i e t y o f t o x i c m e d i a t o r s f r o m t h e e n v i r o n m e n t a n d t h e h o s t ( e . g . , i n t e s t i n a l p h o s p h o l i p a s e s a n d b i l e a c i d s ) . O v e r a l l , L P S i s r e q u i r e d f o r G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l g r o w t h , v i a b i l i t y a n d e f f e c t i v e r e p r o d u c t i o n ( R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ; N i k a i d o , 1 9 9 6 ; V a a r a , 1 9 9 9 ) . I n t e r m s o f n o m e n c l a t u r e , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t L P S i s s o m e t i m e s u s e d i n t e r c h a n g e a b l y w i t h t h e t e r m “ e n d o t o x i n . ” H o w e v e r , t h e r e i s a d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o . E n d o t o x i n c o n s i s t s o f L P S i n c o n j u n c t i o n w i t h o u t e r c e l l m e m b r a n e m a c r o m o l e c u l e s ( p r o t e i n s ) t h a t m a y o r m a y n o t h a v e a d d i t i o n a l 1 0 M o h g L s e t 1 £ L 2 t h a n b a d e e n d o e I a I W e s a n h b R e fi t I n a y 1 9 9 9 c a n 1 9 8 4 I n i e c m e d l b i o l o g i c a c t i v i t i e s ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; V a a r a , ~ 1 9 9 9 ) . T h i s d i s s e r t a t i o n w i l l u s e t h e t e r m L P S w h e n e v e r p o s s i b l e . 1 . 0 . 2 . S o u r c e s o f L P S i n t h e H o s t S y s t e m i c L P S e x p o s u r e c a n o c c u r t h r o u g h a v a r i e t y o f e v e n t s , i n c l u d i n g G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l i n f e c t i o n , r e s p i r a t o r y t r a c t e x p o s u r e t o G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a o r L P S - c o n t a m i n a t e d o r g a n i c p a r t i c l e s a n d L P S t r a n s l o c a t i o n f r o m e n d o g e n o u s G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l f l o r a i n t h e G I t r a c t ( D i t t e r e t a l . , 1 9 8 3 ; R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ) . L P S c a n b e r e l e a s e d e i t h e r f r o m p r o l i f e r a t i n g b a c t e r i a o r f r o m t h e l y s i s o f b a c t e r i a l c e l l w a l l s ( e . g . , v i a a u t o l y s i s , c o m p l e m e n t , p h a g o c y t o t i c c e l l s , o r a n t i b i o t i c s ; R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; M a y e u x , 1 9 9 7 ; R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ) . I r o n i c a l l y , t h o u g h a n t i b i o t i c s a b r o g a t e b a c t e r i a l i n f e c t i o n , L P S m a y g r e a t l y i n c r e a s e a s a r e s u l t o f b a c t e r i a l c e l l d e a t h ( J a c k s o n a n d K r o p p , 1 9 9 9 ) . I t h a s b e e n e s t i m a t e d t h a t b a c t e r i c i d a l a n t i b i o t i c t h e r a p y d u r i n g s e p s i s c a n i n c r e a s e L P S c o n c e n t r a t i o n a s m u c h a s 2 0 0 0 f o l d ( S h e n e p a n d M o r g a n , 1 9 8 4 ; S h e n e p e t a l . , 1 9 8 8 ) . E x o g e n o u s L P S e x p o s u r e c a n a r i s e f r o m l o c i o f G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l i n f e c t i o n s ( w h i c h i n c l u d e s u c h b a c t e r i a l g r o w t h f r o m b i o f i l m s o n i m p l a n t e d m e d i c a l d e v i c e s ) a n d t h r o u g h i n h a l a t i o n o f G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a o r L P S - c o n t a m i n a t e d p a r t i c l e s ( P o t e r a , 1 9 9 6 ; R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ) . I n d e e d , i n h a l a t i o n e x p o s u r e t o L P S i s r e l a t i v e l y c o m m o n . G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l p n e u m o n i a s a c c o u n t f o r a l a r g e n u m b e r o f h o s p i t a l - r e l a t e d d e a t h s ( L e u e t a l . 1 9 8 9 ; R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ) . M o r e o v e r , i n c r e a s e d e x p o s u r e o f t h e r e s p i r a t o r y t r a c t t o L P S c a n 1 1 o c c u r d u r i n g o c c u p a t i o n a l c o n d i t i o n s ( s u c h a s i n t h e p o u l t r y a n d s w i n e i n d u s t r y , w a s t e t r e a t m e n t p l a n t s , g r a i n a n d c o t t o n p r o c e s s i n g a n d o t h e r s ) a n d f r o m a i r f r o m o f f i c e s o r h o u s e h o l d s t h a t c o n t a i n L P S - l a d e n d u s t p a r t i c l e s a n d b i o a e r o s o l s ( a s r e v i e w e d i n R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ) . A c c o r d i n g l y , e x p o s u r e t o e x o g e n o u s s o u r c e s o f L P S i s u b i q u i t o u s , a p p e a r i n g i n m a n y m e d i a ( e . g . , d u s t , a i r , w a t e r a n d s o f o r t h ) , n o t j u s t l o c i o f b a c t e r i a l i n f e c t i o n . E n d o g e n o u s e x p o s u r e t o L P S c a n o c c u r f r o m t h e t r a n s l o c a t i o n o f L P S t h r o u g h t h e i n t e s t i n a l m u c o s a i n t o t h e c i r c u l a t i o n ( D e i t c h , 1 9 9 0 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ; F i n k a n d M y t h e n , 1 9 9 9 ) . L a r g e , e n d o g e n o u s p o p u l a t i o n s o f m i c r o b e s , w h i c h i n c l u d e G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a , e x i s t i n t h e i l e u m a n d c o l o n o f t h e m a m m a l i a n G I t r a c t a n d f u n c t i o n t o a i d i n h o s t d i g e s t i o n ( F i n k a n d M y t h e n , 1 9 9 9 ) . U n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s , i t i s b e l i e v e d t h a t t h e m u c o s a l l i n i n g o f t h e G I t r a c t i s a g o o d b u t n o t i m p e r m e a b l e b a r r i e r t o t r a n s l o c a t i o n . C o n s e q u e n t l y , a s m a l l a m o u n t o f L P S i s k n o w n t o c r o s s t h e G I t r a c t a n d e n t e r t h e c i r c u l a t i o n r e g u l a r l y ( J a c o b e t a l . , 1 9 7 7 ; R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ) . U n d e r a v a r i e t y o f p a t h o l o g i c c o n d i t i o n s , h o w e v e r , i n c r e a s e d b a c t e r i a l a n d L P S t r a n s l o c a t i o n a n d i n t e s t i n a l m u c o s a l p e r m e a b i l i t y a r e o b s e r v e d . T h e s e c o n d i t i o n s i n c l u d e h e m o r r h a g e , t r a u m a , b o w e l i s c h e m i a a n d r e p e r f u s i o n , a l t e r a t i o n s i n d i e t , a l c o h o l c o n s u m p t i o n , l i f e s t y l e c o n d i t i o n s , e x p o s u r e t o c y t o t o x i c c h e m o t h e r a p y a n d e n d o t o x e m i a ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ; F i n k a n d M y t h e n , 1 9 9 9 ) . O n c e L P S t r a n s l o c a t e s a c r o s s t h e G I t r a c t , i t m u s t p a s s t h r o u g h t h e l i v e r b e f o r e e n t e r i n g t h e s y s t e m i c c i r c u l a t i o n . T h e l i v e r h a s a v i t a l r o l e i n L P S c l e a r a n c e v i a K C s a n d , t o a l e s s e r e x t e n t S E C s a n d P M N s , t o p r e v e n t s y s t e m i c 1 2 i n t 1 9 i n t e x : D a t l q u a ( R a e e n d o t o x e m i a ( M c C u s k e y e t a l . , 1 9 8 4 ; M u n f o r d a n d H a l l , 1 9 8 6 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ) . A d d i t i o n a l l y , i t i s k n o w n t h a t L P S b i n d s t o c e r t a i n p l a s m a c o n s t i t u e n t s ( e . g . , l i p o p r o t e i n s ) a s w e l l a s t o n a t u r a l a n t i - L P S a n t i b o d i e s , w h i c h m a y a c t t o n e u t r a l i z e i t , p o s s i b l y s e r v i n g a s a n a d d i t i o n a l p r o t e c t i v e m e c h a n i s m a g a i n s t L P S t o x i c i t y ( U l e v i t c h , 1 9 8 1 ) . T h e r e f o r e , a v a r i e t y o f c e l l s a n d m e d i a t o r s a r e r e s p o n s i b l e f o r c l e a r i n g L P S a n d p r e v e n t i n g i t s t o x i c i t y . I n s u m m a r y , m o d e s t L P S e x p o s u r e ( i . e . , m i l d e n d o t o x e m i a ) i s c o m m o n p l a c e a n d e p i s o d i c , t e n d i n g t o v a r y w i t h t h e c l i n i c a l c o n d i t i o n o f t h e i n d i v i d u a l , l i f e s t y l e , d i s e a s e , a n d o t h e r f a c t o r s ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ) . I n e x t r e m e c o n d i t i o n s ( e g . s e p s i s ) , L P S o r o t h e r i n f l a m m a g e n s c a u s e o v e r t t i s s u e i n j u r y t o o r g a n s . M o r e m o d e s t L P S e x p o s u r e r e s u l t s i n a m i l d i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e b u t w i t h o u t t i s s u e i n j u r y , a n d t h i s c o u l d c o n t r i b u t e t o t h e t o x i c r e s p o n s e t o o t h e r s t r e s s e s ( G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . 1 . 0 . 3 . H o s t R e s p o n s e t o L P S L P S e x p o s u r e , a s i g n a l o f b a c t e r i a l i n f e c t i o n , c a n r e s u l t i n a p o t e n t i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e i n m a m m a l s ( R a e t z e t a l . , 1 9 8 8 ; R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; R o t h e t ‘ a I . , 1 9 9 7 ; M a y e u x , 1 9 9 7 ) . N o r m a l l y , i n f l a m m a t i o n i s p a r t o f a c o n t r o l l e d , n a t u r a l p r o c e s s e l i c i t e d f o r s u r v i v a l , b u t a n e x c e s s i v e i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e t o L P S c a n l e a d t o d e l e t e r i o u s p a t h o p h y s i o l o g i c a l e v e n t s . T h e s e e v e n t s , h o w e v e r , a r e h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e q u a n t i t y , d u r a t i o n a n d r o u t e o f L P S e x p o s u r e , a s w e l l a s t h e b i o a c t i v i t y o f L P S ( R a e t z e t a l . , 1 9 8 8 ; R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ; J a c k s o n a n d K r o p p , 1 9 9 9 ) . 1 3 P a r a d o x i c a l l y , L P S m a y a l s o e n h a n c e t h e h o s t ’ s i m m u n e r e s i s t a n c e t o b a c t e r i a l a n d v i r a l i n f e c t i o n s a n d c a n c e r ( R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ; M a y e u x , 1 9 9 7 ; Z h a n g a n d T r a c e y , 1 9 9 9 ) . I n t h i s r e g a r d , i t i s t h o u g h t t h a t t h e m i n i m a l l e v e l o f L P S t r a n s l o c a t i o n f r o m t h e G I t r a c t i n t o t h e c i r c u l a t i o n m a y b e p a r t o f a n o r m a l p h y s i o l o g i c p r o c e s s . C o n s e q u e n t l y , L P S m a y b e e m p l o y e d i n t h e d e v e l o p m e n t a n d m a i n t e n a n c e o f i n t e s t i n a l a n d s y s t e m i c i m m u n i t y ( D e i t c h , 1 9 9 5 ) , a s w e l l a s i n r e g u l a t i n g t i s s u e h o m e o s t a s i s ( K o m a t s u e t a l . , 2 0 0 0 ; G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . F o r m o r e i n f o r m a t i o n o n t h e b e n e f i c i a l e f f e c t s o f L P S , r e a d R i e t s c h e l a n d B r a s e ( 1 9 9 2 ) a n d D e i t c h ( 1 9 9 5 ) . O f p a r t i c u l a r i n t e r e s t t o m e d i c a l s c i e n c e , h o w e v e r , i s t h e d e t r i m e n t a l p a t h o p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s t o L P S t h a t o c c u r u n d e r c o n d i t i o n s o f a s e v e r e i n f e c t i o n o r l a r g e a c c u m u l a t i o n o f L P S i n t h e c i r c u l a t i o n ( R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ) . T h e s e i n c l u d e c h i l l s , f e v e r , h e a d a c h e , n a u s e a , l e u k o p e n i a , s y s t e m i c h y p o t e n s i o n , c i r c u l a t o r y s h o c k , a d u l t r e s p i r a t o r y d i s t r e s s s y n d r o m e , d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n ( D I C ) , m u l t i p l e o r g a n f a i l u r e / d y s f u n c t i o n s y n d r o m e ( M O P / M O D S ) a n d d e a t h ( H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ; M a y e u x , 1 9 9 7 ; S u f f r e d i n i a n d O ’ G r a d y , 1 9 9 9 ) . S y s t e m i c s e p s i s i s d e f i n e d a s t h e p r e s e n c e o f b a c t e r i a o r i t s t o x i n i n b l o o d o r t i s s u e o f a h o s t o r g a n i s m t h a t i n d u c e s a s y s t e m i c i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e ( M a y e u x , 1 9 9 7 , K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . S e p t i c s h o c k a r i s e s a s a p r o g r e s s i o n o f s e p s i s t o w a r d o r g a n d y s f u n c t i o n w i t h h y p o t e n s i o n t h a t c a n n o t b e c o n t r o l l e d b y t h e a d m i n i s t r a t i o n o f f l u i d s ( M a y e u x , 1 9 9 7 ) . I t h a s b e e n e s t i m a t e d t h a t b e t w e e n 2 0 t o 5 0 % o f t h e 3 0 0 , 0 0 0 t o 5 0 0 , 0 0 0 p a t i e n t s t h a t d e v e l o p s e p s i s i n t h e U n i t e d S t a t e s e a c h y e a r w i l l d e v e l o p s e p t i c s h o c k ( M a y e u x , 1 9 9 7 , K a r i m a e t 1 4 p a t i e A l t h u s h o < p a r t k i d n K a r l 1 . C . L P S ( L e ; K a r i l s u r f s 9 % 0 0 m l ( T L R C D 1 . h o w s U n c l e ” R e l y a l . , 1 9 9 9 ) . O u t o f t h a t n u m b e r , i t i s f u r t h e r e s t i m a t e d t h a t 5 0 - 7 0 % o f t h e s e p a t i e n t s w i l l d i e ( D a l N a g o r e , 1 9 9 1 ; M a y e u x , 1 9 9 7 , K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . A l t h o u g h a m a j o r i t y o f t h e s e d e a t h s r e s u l t f r o m r e f r a c t o r y h y p o t e n s i o n ( i . e . , s e p t i c s h o c k ) , M O P / M O D S a c c o u n t s f o r a s i g n i f i c a n t c o n t r i b u t i o n t o t h e m o r t a l i t y . I n p a r t i c u l a r , o r g a n s w i t h e x t e n s i v e v a s c u l a r b e d s , s u c h a s t h e l i v e r , l u n g s , a n d k i d n e y , a r e e x t r e m e l y s u s c e p t i b l e t o d y s f u n c t i o n a n d f a i l u r e ( M a y e u x , 1 9 9 7 , K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . 1 . 0 . 4 . L P S C e l l S i g n a l l i n g L P S b i n d s t o h i g h - d e n s i t y l i p o p r o t e i n s ( H D L ) i n t h e c i r c u l a t i o n t o f o r m a n L P S - H D L c o m p l e x . R e m o v a l o f L P S f r o m t h i s c o m p l e x b y L P S b i n d i n g p r o t e i n ( L B P ) r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f a n L P S - L B P c o m p l e x ( S c h u m a n n e t a l . , 1 9 9 0 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . L P S - L B P i s k n o w n t o i n t e r a c t w i t h C D 1 4 e x p r e s s e d o n t h e s u r f a c e o f m o n o c y t e s / m a c r o p h a g e s a n d P M N s ( W r i g h t e t a l . , 1 9 9 0 ; W a t s o n e t a l . , 1 9 9 4 ; S u e t a l . , 1 9 9 5 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . C D 1 4 i s a g l y c e r o p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - l i n k e d , p l a s m a m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n t h a t i n c o m b i n a t i o n w i t h L B P b r i n g s L P S t o i t s p u t a t i v e r e c e p t o r , T o l l - l i k e r e c e p t o r 4 ( T L R 4 ; P o l t o r a k e t a l . , 1 9 9 8 ; M e a n s e t a l . , 2 0 0 0 ) . I n t e r e s t i n g l y , L P S r e q u i r e s C D 1 4 a t s m a l l c o n c e n t r a t i o n s t o e l i c i t c e l l u l a r r e s p o n s e s ; a t l a r g e c o n c e n t r a t i o n s , h o w e v e r , L P S c a n s t i m u l a t e c e l l s t h r o u g h a C D 1 4 - i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m . I t i s u n c l e a r w h a t a d d i t i o n a l m o l e c u l e r e c o g n i z e s L P S . A l t h o u g h t h i s m o l e c u l e i s l i k e l y t h e T L R 4 r e c e p t o r , s o m e s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t t h e T L R 2 r e c e p t o r m a y b e i n v o l v e d b u t t h i s r e m a i n s c o n t r o v e r s i a l ( l n g a l l s a n d G o l e n b o c k , 1 9 9 5 ; 1 5 Y a n g e t a l . , 1 9 9 8 ; L i u e t a l . , 2 0 0 1 b ; T a k e d a a n d A k i r a , 2 0 0 1 ; A n d o n e g u i e t a l . , 2 0 0 2 ) F o r c e l l s t h a t d o n o t e x p r e s s C D 1 4 ( e . g . , e n d o t h e l i a l a n d s m o o t h m u s c l e c e l l s ) , t h e L P S - L B P c o m p l e x c a n i n t e r a c t w i t h s o l u b l e C D 1 4 ( s C D 1 4 ) t h a t a c t s a s a s i g n a l b r i d g e f o r t h i s L P S - L B P c o m p l e x ( S u e t a l . , 1 9 9 5 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . s C D 1 4 i s t h o u g h t t o b e s e c r e t e d o r p r o t e o l y t i c a l l y c l e a v e d f r o m m o n o c y t e / m a c r o p h a g e s . s C D 1 4 f a c i l i t a t e s s y s t e m i c c i r c u l a t i o n a n d d i s t r i b u t i o n o f L P S , t h e r e b y p r o m o t i n g i t s s y s t e m i c e f f e c t s ( M a y e u x , 1 9 9 7 ) , a n d a c t s t h r o u g h t h e T L R 4 r e c e p t o r ( B a c k h e d e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h e b i n d i n g o f L P S t o T L R 4 i n i t i a t e s s i g n a l i n g m e c h a n i s m s t h a t r e s u l t i n t h e s t i m u l a t i o n o f i n f l a m m a t o r y c e l l s , a c t i v a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s a n d t h e s y n t h e s i s a n d r e l e a s e o f p r o i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s . T h e T L R - i n d u c e d i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e i s d e p e n d e n t o n a c o m m o n s i g n a l i n g p a t h w a y t h a t i s m e d i a t e d b y t h e a d a p t o r m o l e c u l e M y D 8 8 . T h e r e a r e a l s o a d d i t i o n a l p a t h w a y s t h a t m e d i a t e t h e T L R - i n d u c e d i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e . U p o n s t i m u l a t i o n , M y D 8 8 r e c r u i t s I L - 1 R - a s s o c i a t e d k i n a s e ( I R A K ) . A c t i v a t e d I R A K r e s u l t s i n t h e a c t i v a t i o n o f t h e m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n ( M A P ) k i n a s e ( v i a c - J u n k i n a s e ( J N K ) , e x t r a c e l l u l a r - s i g n a l - r e g u l a t e d k i n a s e ( E R K ) a n d p 3 8 ) s i g n a l i n g p a t h w a y a n d u l t i m a t e l y t h e a c t i v a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s , s u c h a s n u c l e a r f a c t o r K B ( N F K B ; M u k a i d a e t a l . , 1 9 9 6 ; N i c k a t a l . , 1 9 9 6 ; T a k e d a a n d A k i r a , 2 0 0 1 ; T a k e d a e t a l . , 2 0 0 3 ) . A c t i v a t i o n o f t h i s p a t h w a y i s i m p o r t a n t i n r e g u l a t i n g c e l l f u n c t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n ( H i l l a n d T r e i s m a n , 1 9 9 5 ) . M o r e o v e r , a c t i v a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s o f N F K B , a c t i v a t i n g p r o t e i n - 1 ( A P - 1 ) a n d n u c l e a r f a c t o r - i n t e r l e u k i n 6 ( N F - 1 6 “ : 6 ) a d h e : S w e e L P E S n u y e ( 2 0 0 5 1 . C L 5 t h e c 1 9 9 3 T h e ; a n d : e fi n n r a n d i V V a n 1 U S S U E e “ m i r R o t h , " i i / o l e a n d F I - C e . l L - 6 ) a r e i n v o l v e d i n t h e t r a n s c r i p t i o n o f m a n y p r o i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s , a d h e s i o n m o l e c u l e s , t i s s u e f a c t o r ( T F ) a n d i n d u c i b l e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e ( i N O S ; S w e e t a n d H u m e , 1 9 9 6 ; M e n g a n d L o w e l l , 1 9 9 7 ) . A m o r e d e t a i l e d r e v i e w o f t h e L P S s i g n a l i n g p a t h w a y a n d T L R 5 i s b e y o n d t h e s c o p e o f t h i s i n t r o d u c t i o n . F o r m o r e i n f o r m a t i o n , s e e t h e r e v i e w s o f T a k e d a a n d A k i r a ( 2 0 0 1 ) a n d T a k e d a e t a l . ( 2 0 0 3 ) . 1 . 0 . 5 . L P S C l e a r a n c e F o l l o w i n g i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L P S i n r a t s , L P S i s c l e a r e d f r o m t h e c i r c u l a t i o n i n a b i p h a s i c m a n n e r ( W a r n e r e t a l . , 1 9 8 8 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ) . T h e v a s t m a j o r i t y o f L P S i s c l e a r e d w i t h i n s e c o n d s a f t e r a d m i n i s t r a t i o n . T h e r e m a i n d e r o f L P S e l i m i n a t i o n o c c u r s o v e r a p e r i o d o f h o u r s ( i . e . , b e t w e e n 1 a n d 3 0 h o u r s i n r a t s ; F r e u d e n b e r g e t a l . , 1 9 8 4 ; W a r n e r e f a l . , 1 9 8 8 ) . T h i s l a t t e r e l i m i n a t i o n o f L P S i s d e p e n d e n t o n a v a r i e t y o f f a c t o r s s u c h a s d o s e , t y p e o f L P S a n d i n t e r a c t i o n s w i t h p l a s m a c o n s t i t u e n t s ( e . g . , H D L ; F r e u d e n b e r g e t a l . , 1 9 8 0 ; W a r n e r e t a l . , 1 9 8 8 ) . L P S i s f o u n d i n t h e l i v e r , l u n g s , s p l e e n , k i d n e y a n d o t h e r t i s s u e s . C i r c u l a t i n g L P S a c c u m u l a t e s i n t h e l i v e r o f r a t s , w h e r e i t i s p r i m a r i l y e l i m i n a t e d ( P r a a n i n g - V a n I a l e n e t a l . , 1 9 8 1 ; W a m e r e t a l . , 1 9 8 8 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ) . A s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d , K C s , P M N s , a n d S E C s a r e u l t i m a t e l y i n v o l v e d i n c l e a r i n g L P S ( M c C u s k e y e t a l . , 1 9 8 4 ; M u n f o r d a n d H a l l , 1 9 8 6 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ) . 1 . 0 . 6 . I n f l a m m a t o r y R e s p o n s e t o L P S 1 7 T h e i n n a t e i m m u n e s y s t e m i s r e s p o n s i b l e f o r p r o v i d i n g a r a p i d , n o n s p e c i f i c r e s p o n s e t o i n v a d i n g p a t h o g e n s t h a t d o e s n o t r e q u i r e p r i o r e x p o s u r e t o i n i t i a t e i t s a c t i v i t y . L P S i n d i r e c t l y o r d i r e c t l y a c t i v a t e s i n n a t e i m m u n e c e l l s ( i . e . , m o n o c y t e s , m a c r o p h a g e s a n d P M N s a s w e l l a s o t h e r c e l l t y p e s , i n c l u d i n g p l a t e l e t s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s . T h i s r e s u l t s i n t h e r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s s u c h a s i n t e r l e u k i n s ( l L s ) , T N F - a , p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) , a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e s , r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s ( R O S ) , n i t r i c o x i d e ( N O ) a n d l y s o s o m a l e n z y m e s ( F i g u r e 1 . 2 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . L P S c a n a l s o a c t i v a t e c o m p l e m e n t . F i n a l l y , L P S a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i s i m p o r t a n t i n g e n e r a t i n g s o m e o f t h e p a t h o p h y s i o l o g i c r e s p o n s e s t o e n d o t o x e m i a ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 3 ) . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h i s s e c t i o n p r o v i d e s o n l y a b r i e f o v e r v i e w o f t h e c e l l s a n d m e d i a t o r s s t i m u l a t e d b y L P S o r i t s m e d i a t o r s . W h e n e v e r p o s s i b l e , p r i o r i t y i s g i v e n t o e x a m p l e s o f L P S e f f e c t s o n t h e l i v e r . F o r a m o r e c o m p r e h e n s i v e r e v i e w o f t h e i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e t o L P S , p l e a s e r e a d H e w e t t a n d R o t h ( 1 9 9 3 ) , H o l s t e t a l . ( 1 9 9 6 ) , a n d / o r K a r i m a e t a l . ( 1 9 9 9 ) . 1 . 0 . 6 . 1 . M o n o c y t e s / M a c r o p h a g e s a n d K u p f f e r C e l l s M o n o c y t e s / m a c r o p h a g e s a r e p a r t o f t h e n o n s p e c i f i c o r i n n a t e i m m u n e s y s t e m a n d f u n c t i o n b y p h a g o c y t o s i n g a n d k i l l i n g i n v a d i n g b a c t e r i a ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ) . M a c r o p h a g e s a r e p r o d u c e d i n t h e b o n e m a r r o w a n d e n t e r t h e c i r c u l a t i o n a s b l o o d m o n o c y t e s . T h e s e m o n o c y t e s t h e n m i g r a t e t o v a r i o u s t i s s u e s a n d d i f f e r e n t i a t e i n t o t i s s u e m a c r o p h a g e s . L P S - a c t i v a t e d m a c r o p h a g e s 1 8 F i g u r e 1 . 2 . L r fl a m m a t o r v R e s p o n s e t o L P S . L P S c a n i n t e r a c t w i t h a n L B P t o c o m b i n e w i t h C D 1 4 . T h e L P S - L B P - ( s ) C D 1 4 c o m p l e x ( n o t s h o w n ) i n t e r a c t s w i t h T L R 4 i n c e l l s t o g e n e r a t e t h e r e l e a s e o f a p l e t h o r a o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s f r o m s t i m u l a t e d c e l l s . L P S i s a l s o r e s p o n s i b l e f o r t h e d i r e c t ( e . g . , a c t i v a t i o n o f F a c t o r X I I ) a n d i n d i r e c t ( e . g . , t i s s u e f a c t o r ) a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . 1 9 t h a n o w n ) a o f i f o r t o r ) ~ T L R 4 M a c r o p h a g e s N e u t r o p h i l s E n d o t h e l i a l C e l l s E p i t h e l i a l C e l l s C y t o k i n e s C h e m o k i n e s R e a c t i v e O x y g e n S p e c i e s P l a t e l e t A c t i v a t i n g F a c t o r P r o s t a g l a n d i n s L e u k o t r i e n e s T h r o m b o x a n e s N i t r i c O x i d e C o a g u l a t i o n F a c t o r s 2 0 1 9 $ a r e a t 5 m e t s u c r e l e m a t l e l e t h e 1 . 0 a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e r e l e a s e o f a g r e a t m a n y i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s ( M i c h i e e t a l . , 1 9 8 8 ; R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ) . A m o n g s t t h e n u m e r o u s e n d o g e n o u s m e d i a t o r s r e l e a s e d a r e t h e p r o i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s T N F - a , I L - 1 B , l L - 6 , l L - 8 ( o r , i t s e q u i v a l e n t i n r a t s : c y t o k i n e - i n d u c e d n e u t r o p h i l C h e m o a t t r a c t a n t ( C I N C ) - 1 ) , a n d i n t e r f e r o n - y ( R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; H a c k e t a l . , 1 9 9 7 ; R o t h e t a l . , 1 9 9 7 , K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . N O , a l o n g w i t h v a r i o u s R O S , i s a l s o r e l e a s e d ( R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . L i p i d m e d i a t o r s , s u c h a s P A F , p r o s t a g l a n d i n s ( P G s ) , t h r o m b o x a n e s , a n d l e u k o t r i e n e s , a r e r e l e a s e d a s w e l l ( R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . H e n c e , m a c r o p h a g e s p l a y a k e y r o l e i n L P S r e s p o n s e s s i n c e m a n y o f t h e m e d i a t o r s r e l e a s e d b y t h e s e c e l l s a c t i v a t e o r m o d u l a t e t h e e f f e c t o n o t h e r c e l l s i n v o l v e d i n t h e i n f l a m m a t o r y p r o c e s s ( M a r s h a l l a t a l . , 1 9 8 7 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ) . 1 . 0 . 6 . 1 . 1 . M o n o c y t e s M o n o c y t e s o r i g i n a t e i n t h e b o n e m a r r o w f r o m p r o m y o b l a s t s t e m c e l l s a n d d i f f e r e n t i a t e i n t o m a c r o p h a g e s . F o l l o w i n g a n i n f l a m m a t o r y e v e n t i n a t i s s u e ( e . g . , l i v e r , l u n g , e t c . ) , t h e n u m b e r o f m o n o c y t e s i n c r e a s e s g r a d u a l l y o v e r t i m e ( s i g n i f i c a n t l y s l o w e r t h a n P M N a c c u m u l a t i o n ) , r e a c h i n g m a x i m a l a c c u m u l a t i o n w i t h i n a p p r o x i m a t e l y 2 4 h o u r s ( O ’ G r a d y e t a l . , 2 0 0 1 ) . A c t i v a t e d m o n o c y t e s r e l e a s e T N F - a a n d m o n o c y t e C h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n ( M C P ) - 1 a n d e x p r e s s T F , w h i c h c a n c a u s e c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n ( O s t e r u d , 1 9 9 5 ; P o l a c k e t a l . , 1 9 9 7 ) . T F i s a t r a n s m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n t h a t a c t s a s a c e l l r e c e p t o r f o r 2 1 1 . 0 . 6 a c t i r e s ; f a c t w e d e p < l n d u . R O S ( K a r i : a c t i v a t e d f a c t o r V I I . T h e a c t i v a t e d f a c t o r V I I a n d T F f o r m a c o m p l e x t h a t i n t u r n i s r e s p o n s i b l e f o r t h e a c t i v a t i o n o f f a c t o r X , r e s u l t i n g i n a c t i v a t e d f a c t o r X . A c t i v a t e d f a c t o r X c l e a v e s p r o t h r o m b i n t o f o r m a c t i v e t h r o m b i n . H e n c e , T F i n d u c t i o n r e s u l t s i n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , t h r o m b i n g e n e r a t i o n a n d f i b r i n d e p o s i t i o n ( d e P r o s t , 1 9 9 5 ; S h e b u s k i a n d K i l g o r e , 2 0 0 1 ) . I n t e r e s t i n g l y , T F i n d u c t i o n i n m o n o c y t e s m a y b e d e p e n d e n t o n s u p e r o x i d e a n i o n r a d i c a l ( i . e . , R O S ) a n d N O g e n e r a t i o n ( P o l a c k e t a l . , 1 9 9 7 ) . T F h a s a c r i t i c a l r o l e i n D l C ( K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . 1 . 0 . 6 . 1 . 1 . 1 M o n o c y t e C h e m o a t t r a c t a n t P r o t e i n - 1 M C P - 1 i s e x p r e s s e d i n m o n o c y t e s , m a c r o p h a g e s , s t e l l a t e c e l l s , H P C s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s ( D a m b a c h e t a l . , 2 0 0 2 ) . E x p r e s s i o n i s i n d u c e d b y o x i d a t i v e s t r e s s , L P S , t h r o m b i n a n d p r o i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s s u c h a s T N F - a a n d I L - 1 8 . T h i s c h e m o k i n e i s i n v o l v e d i n t h e a t t r a c t i o n a n d a c t i v a t i o n o f m o n o c y t e s a n d i n t h e i n d u c t i o n o f T F e x p r e s s i o n o n t h e s u r f a c e o f m o n o c y t e s a n d m a c r o p h a g e s ( L u s t e r , 1 9 9 8 ; G u e t a l . , 1 9 9 9 ; D a m b a c h e t a l . , 2 0 0 2 ) . A s n o t e d a b o v e , T F c a n l e a d t o a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( O s t e r u d , 1 9 9 5 ; P o l a c k e t a l . , 1 9 9 7 ) . F u r t h e r m o r e , M C P - 1 h a s b e e n i m p l i c a t e d i n t h e e x p r e s s i o n o f i n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e ( I C A M ) - 1 o n r a t e n d o t h e l i a l c e l l s i n V i t r o ( Y a m a g u c h i e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h i s a d h e s i o n m o l e c u l e , w h i c h i s p r e s e n t i n S E C s ( E s s a n i e t a l . , 1 9 9 5 ) , c a n i n t e r a c t w i t h P M N s a n d p r i m e t h e m t o r e l e a s e t o x i c p r o d u c t s ( J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 6 ) . 2 2 1 . C s i n m a a m h e l p h c 1 9 E C l , I L . e l a l . 1 . 0 . 6 . 1 . 2 . K u p f f e r C e l l s K C s a r e t h e r e s i d e n t m a c r o p h a g e o f t h e l i v e r . T h e y r e s i d e i n h e p a t i c s i n u s o i d s w h e r e t h e y h a v e a m a j o r r o l e i n c l e a r i n g t h e p o r t a l b l o o d o f p a r t i c u l a t e m a t t e r , i n c l u d i n g L P S . T h e s e c e l l s r e m o v e t h e p o l y s a c c h a r i d e m o i e t i e s o f L P S a n d s e n d t h e m o d i f i e d L P S t o H P C s t o b e m e t a b o l i z e d f u r t h e r . A d d i t i o n a l l y , K C s h e l p t o m a i n t a i n l i v e r h o m e o s t a s i s b y r e g u l a t i n g p r o t e i n s y n t h e s i s , p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n a n d g l y c o g e n o l y s i s i n n e i g h b o r i n g H P C s ( W e s t a t a l . , 1 9 8 6 , 1 9 8 7 , 1 9 8 8 ; C a s t e l i j n e t a l . , 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 b ) . K C s a r e c r i t i c a l t o t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y f o r a n u m b e r o f d i f f e r e n t x e n o b i o t i c s , i n c l u d i n g c a r b o n t e t r a c h l o r i d e ( B a d g e r e t a l . , 1 9 9 6 ; W u e w e e r a e t a l . , 1 9 9 6 ) , v i n y l i d e n e c h l o r i d e ( W u e w e e r a e t a l . , 1 9 9 6 ) , a c e t a m i n o p h e n ( M i c h a e l o f a l . , 1 9 9 9 ) , D - g a l a c t o s a m i n e ( S t a c h l e w i t z e t a l . , 1 9 9 9 ) , L P S ( l i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ; F u j i t a e t a l . , 1 9 9 5 ; S a r p h i e e t a l . , 1 9 9 6 ; B r o w n a t a l . , 1 9 9 7 ) , a n d e t h a n o l ( A d a c h i e t a l . , 1 9 9 4 ) . A l t h o u g h t h e m e c h a n i s m b y w h i c h K C s c o n t r i b u t e t o i n j u r y i n t h e s e m o d e l s h a s n o t b e e n f u l l y d e f i n e d , i t a p p e a r s t h a t b o t h o x i d a t i v e s t r e s s a n d T N F - a r e l e a s e m a y b e i m p o r t a n t ( l i m u r o e r a l . , 1 9 9 4 ; l s h i y a m a e r a l . , 1 9 9 5 ; H o g l e n e t a l . , 1 9 9 8 ; M i c h a e l e t a I . , 1 9 9 9 ; S t a c h l e w i t z e t a I . , 1 9 9 9 ) . L P S - s t i m u l a t e d K C s b e c o m e s w o l l e n a n d c o n t a i n i n c r e a s e d n u m b e r s o f c y t o p l a s m i c l y s o m a l g r a n u l e s a n d p h a g o c y t i c v a c u o l e s a f t e r L P S s t i m u l a t i o n . I n t h i s a c t i v e s t a t e , K C s p r o d u c e a n d r e l e a s e n u m e r o u s m e d i a t o r s , i n c l u d i n g T N F - o r , I L - 1 8 , l L - 6 , I L - 8 ( i . e . , C l N C - 1 i n r a t s ) , P G E z , P G D 2 , P A F , R O S a n d N O ( M i c h i e e t a I . , 1 9 8 8 ; H o l s t e t a I . , 1 9 9 6 ; D e c k e r , 1 9 9 7 ) . 2 3 S E C T l n e 0 0 L P P I C E D I a l . , t h e a c t l r e s ; 1 . 0 . 6 . 1 . 2 . 1 . T u m o r N e c r o s i s F a c t o r - a L P S e x p o s u r e s t i m u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f v a r i o u s c y t o k i n e s , i n c l u d i n g T N F - a . I t i s t h e f i r s t c y t o k i n e d e t e c t e d i n t h e h o s t a f t e r e x p o s u r e t o G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a o r L P S . A t r a n s i e n t i n c r e a s e i n c i r c u l a t i n g T N F - o r c o n c e n t r a t i o n o c c u r s w i t h i n 1 - 2 h o u r s a f t e r L P S e x p o s u r e ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . A n u m b e r o f s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t T N F - o z m a y c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o p h y s i o l o g i c a l e v e n t s ( e . g . , h y p o t e n s i o n a n d l e t h a l i t y ) o b s e r v e d w i t h t o x i c L P S e x p o s u r e s ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ) . T o v a r y i n g d e g r e e s , T N F - o r i s p r o d u c e d b y m a n y c e l l t y p e s i n c l u d i n g b u t n o t l i m i t e d t o , K C s , P M N s , m o n o c y t e s , e n d o t h e l i a l c e l l s a n d e p i t h e l i a l c e l l s ( V a s s e l l i , 1 9 9 2 ; L o e t a l , 1 9 9 7 ; B r a d h a m e t a l . , 1 9 9 8 ; Z h a n g a n d T r a c e y , 1 9 9 8 ) . K C s a r e t h e m a j o r s o u r c e o f t h i s c y t o k i n e i n t h e l i v e r ( V a s s e l l i , 1 9 9 2 ; Z h a n g a n d T r a c e y , 1 9 9 8 ) . T N F - o r c a n p r i m e a n d / o r a c t i v a t e a n u m b e r o f c e l l s i n t h e l i v e r s u c h a s H P C s , l i v e r e n d o t h e l i a l c e l l s ( e . g . , S E C s ) , P M N s a n d K C s . A c t i v i t i e s o f T N F - o r a r e m e d i a t e d t h r o u g h t w o r e c e p t o r t y p e s f o u n d o n n e a r l y a l l c e l l s , T N F r e c e p t o r t y p e s I a n d I I . T h e t y p e I r e c e p t o r i s r e s p o n s i b l e f o r m a n y o f t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s , a s w e l l a s a c t i v a t i n g a p a t h w a y t o a p o p t o s i s ( Z h a n g a n d T r a c e y , 1 9 9 8 ) . T N F - o r c a n s t i m u l a t e e n d o t h e l i a l c e l l s ( i n c l u d i n g S E C S ) t o i n c r e a s e t h e i r p e r m e a b i l i t y , p r o m o t e c o a g u l a t i o n ( i . e . , v i a T F e x p r e s s i o n ) , a n d r e l e a s e o r e x p r e s s p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r i n h i b i t o r - 1 , N O , l L - 1 , l C A M - 1 , v a s c u l a r c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e ( V O A M ) - 1 , p r o s t a c y c l i n , P A F , a n d N O ( Z h a n g a n d T r a c e y , 1 9 9 8 ) . M a n y o f t h e s e m e d i a t o r s i n h i g h q u a n t i t i e s a r e c a p a b l e o f c r e a t i n g d e l e t e r i o u s e f f e c t s i n n e a r b y c e l l s a n d t i s s u e s . A d d i t i o n a l l y , T N F - o r h a s b e e n 2 4 s h o w n t o h a v e a c y t o t o x i c e f f e c t o n v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s i n V i t r o ( S a t o e t a l . , 1 9 8 6 ; P o h l m a n a n d H a r l a n , 1 9 9 2 ) a s w e l l a s S E C s b o t h i n V i t r o a n d i n v i v o ( M o c h i d a e t a l . , 1 9 9 5 ; K n o l l e e t a I . , 1 9 9 6 ) . I n g e n e r a l , T N F - a c a n e x e r t a v a r i e t y o f e f f e c t s o n c e l l s , r a n g i n g f r o m m i t o c h o n d r i a l d a m a g e a n d o n c o t i c o r a p o p t o t i c n e c r o s i s t o c e l l p r o l i f e r a t i o n ( B r a d h a m e t a l . , 1 9 9 8 ; J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 8 ) . I n d e e d , T N F - d c a n r e n d e r t i s s u e m o r e s e n s i t i v e t o t o x i c i t y a n d / o r c a n p r o m o t e t i s s u e i n j u r y . F o r e x a m p l e , i n V i t r o T N F - a c a n r e n d e r H P C s m o r e s u s c e p t i b l e t o t o x i c i t y ( A d a m s o n a n d B i l l i n g s , 1 9 9 2 ; E l S i s i e t a I . , 1 9 9 3 ; H o e k a n d P a s t o r i n o , 2 0 0 2 ) . A l t e r n a t i v e l y , H P C s a l t e r e d h o m e o s t a t i c a l l y b y t h e a c t i o n s o f h e p a t o t o x i c a n t s m a y b e s e n s i t i v e t o T N F - a - i n d u c e d c e l l k i l l i n g ( L a w s o n e t a I . , 1 9 9 8 ; J a e s c h k e e t a I . , 1 9 9 8 ) . I n a d d i t i o n , T N F - o c m a y p r o m p t t h e a c c u m u l a t i o n o f P M N s b y a c t i v a t i n g e n d o t h e l i a l c e l l s ( V a s s e l l i , ‘ 1 9 9 2 ; B r a d h a m e t a l . , 1 9 9 8 ) a n d c a n i n d i r e c t l y p r o m o t e t o x i c i t y b y p r i m i n g P M N s a n d K C s t o r e l e a s e R O S a n d p r o t e a s e s t h a t d a m a g e n e a r b y c e l l s ( V a d a s a n d G a m b l e , 1 9 9 0 ; N a g a k i e t a l . , 1 9 9 1 ; V a s s e l l i , 1 9 9 2 ; K u s h i m o t o e t a l . , 1 9 9 6 , J o h n s o n e t a l . , 1 9 9 8 ) . A c c o r d i n g l y , b e c a u s e o f i t s r o l e i n a c t i v a t i n g a n d / o r p r i m i n g i n f l a m m a t o r y c e l l s a n d m o d u l a t i n g t h e e f f e c t s o f o t h e r c e l l s , i t i s c o n s i d e r e d t o b e c r i t i c a l i n t h e h o s t r e s p o n s e t o L P S . 1 . 0 . 6 . 1 . 2 . 2 . I n t e r l e u k i n - 1 I L - 1 i s a p o t e n t p r o i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e p r o d u c e d b y a v a r i e t y o f c e l l t y p e s i n c l u d i n g m a c r o p h a g e s , e p i t h e l i a l a n d e n d o t h e l i a l c e l l s ( D i n a r e l l o , 1 9 8 8 ) . T h i s c y t o k i n e h a s e f f e c t s s i m i l a r t o T N F - a a n d e x i s t s i n t w o f o r m s , I L - 1 a a n d I L - 2 5 I I I . I l L - 1 e m o l e c e n h a n m e d i a D u m n 1 1 1 6 3 1 [ 3 . T h e b i o l o g i c a c t i v i t y o f e i t h e r f o r m i s n e a r l y i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h e o t h e r . I L - 1 e n h a n c e s t h e g r o w t h o f T - l y m p h o c y t e s , i n d u c e s t h e e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s o n e n d o t h e l i u m , s t i m u l a t e s r a t h e p a t o c y t e s t o r e l e a s e C I N O - 1 , e n h a n c e s t h e r e s p o n s e o f P M N s t o T N F - o z a n d e l i c i t s t h e r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s s u c h a s P G s , I L - 6 a n d T N F - o z ( K u n k e l e t a l . , 1 9 8 6 ; M o v a t e t a l . , 1 9 8 7 ; D u r u m a n d O p p e n h e i m , 1 9 8 9 ; M a w e t e t a l . , 1 9 9 6 ) . 1 . 0 . 6 . 1 2 3 . I n t e r l e u k i n - 6 l L - 6 i s p r o d u c e d b y a v a r i e t y o f c e l l s s u c h a s m a c r o p h a g e s , e n d o t h e l i a l c e l l s a n d f i b r o b l a s t s ( D u r u m a n d O p p e n h e i m , 1 9 8 9 ) . T h i s c y t o k i n e e n h a n c e s t h e s y n t h e s i s o f a c u t e p h a s e p r o t e i n s ( K i s p e r t , 1 9 9 2 ; D e c k e r , 1 9 9 7 ) , a n d I t s p r o d u c t i o n i s g r e a t l y i n f l u e n c e d b y T N F - o r a n d l L - 1 ( D u r u m a n d O p p e n h e i m , 1 9 8 9 ; B r o u c k a e r t e t a l . , 1 9 9 3 ) . I L - 6 c a u s e s P M N s t o p r o d u c e P A F a n d e n h a n c e s P M N p h a g o c y t i c a n d o x i d a n t p r o d u c t i o n c a p a b i l i t i e s ( M u l l e n e t a l . , 1 9 9 5 ; B i f f l e t a l . , 1 9 9 6 ) . l L - 6 h a s a l s o b e e n i d e n t i f i e d a s a n a c t i v a t o r o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( V a n d e r P o l l e t a l . , 1 9 9 4 ; S t o u t h a r d e t a l . , 1 9 9 6 ) . I n d e e d , l L - 6 c a n i n d u c e m o n o c y t e s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s t o e x p r e s s T F o n t h e i r s u r f a c e s i n V i t r o ( S h e b u s k i a n d K i l g o r e , 2 0 0 1 ) . S o m e r e c e n t r e p o r t s s u g g e s t t h a t l L - 6 m a y h a v e a n t i - i n f l a m m a t o r y p r o p e r t i e s a s w e l l ( M a r c h a n t e t a l . , 1 9 9 9 ) . 1 . 0 . 6 . 1 2 4 . I n t e r l e u k i n - 8 / C l N C - 1 l L - 8 i s p r o d u c e d b y a g r e a t m a n y h u m a n c e l l t y p e s i n c l u d i n g m o n o c y t e / m a c r o p h a g e s , P M N s , e n d o t h e l i a l c e l l s , f i b r o b l a s t s a n d h e p a t o c y t e s 2 6 ( V a n D a m m e , 1 9 9 4 ) . T h i s c h e m o k i n e i s a p o w e r f u l P M N C h e m o a t t r a c t a n t a n d P M N a c t i v a t o r . I t e n h a n c e s n u m e r o u s f u n c t i o n s s u c h a s d e g r a n u l a t i o n , c h e m o t a x i s , e n d o t h e l i a l c e l l a d h e r e n c e , i n c r e a s e d s u r f a c e e x p r e s s i o n o f k e y r e c e p t o r s a n d i n c r e a s e d l i p o x y g e n a s e p a t h w a y p r o d u c t s ( e . g . , l e u k o t r i e n e s ; O p p e n h e i m e t a l . , 1 9 9 1 ) . I L - 8 i s a p p a r e n t i n h u m a n v o l u n t e e r s w i t h i n 9 0 m i n u t e s o f a d m i n i s t e r i n g L P S a n d b e c o m e s m a x i m a l b y 1 2 0 m i n u t e s ( v a n D e v e n t e r e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e r a t e q u i v a l e n t t o h u m a n I L - 8 i s C l N C - I . T h i s c h e m o k i n e i s p r o d u c e d b y S E C s , K 0 8 a n d h e p a t o c y t e s ( O h k u b o e t a l . , 1 9 9 8 ) . T N F - a a n d l L - 1 i n d u c e C l N C - 1 p r o d u c t i o n b y h e p a t o c y t e s i n v i t r o ( T h o r t o n e t a l . , 1 9 9 1 ; M a w e t e t a l . , 1 9 9 6 ; O h k u b o e t a l . , 1 9 9 8 ) . M o r e o v e r , Z h a n g e t a l . ( 1 9 9 5 ) d e m o n s t r a t e d t h a t a n a n t i - C I N C a n t i b o d y a t t e n u a t e s h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n i n L P S - t r e a t e d r a t s , a n d M a h e r e t a l . ( 1 9 9 7 ) f o u n d t h a t a d e n o v i r u s - m e d i a t e d o v e r e x p r e s s i o n o f C I N C - 1 i n r a t l i v e r r e s u l t s i n P M N a c c u m u l a t i o n . H e n c e , C I N C - 1 i s i m p o r t a n t i n s e v e r a l m o d e l s i n r e c r u i t i n g P M N s i n t o t h e r a t l i v e r ( Z h a n g e t a I . , 1 9 9 5 ; L u s t e r , 1 9 9 8 ) . 1 . 0 . 6 . 1 2 5 . A r a c h i d o n i c A c i d M e t a b o l i t e s A c t i v a t e d m a c r o p h a g e s a n d P M N s c a n p r o d u c e a v a r i e t y o f a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e s c o n s i s t i n g o f t h r o m b o x a n e s , l e u k o t r i e n e s , a n d P G s . T h e s e m e t a b o l i t e s a r e i n v o l v e d i n t h e p r o d u c t i o n o f p a i n a n d f e v e r , i n d u c t i o n o f b l o o d c l o t t i n g , a n d i n f l a m m a t i o n . T h r o m b o x a n e s m e d i a t e m a n y o f t h e v a s c u l a r e f f e c t s a s s o c i a t e d w i t h e n d o t o x i c a n d s e p t i c s h o c k . L e u k o t r i e n e s ( i . e . , m a i n l y l e u k o t r i e n e B 4 ) a r e h i g h l y c h e m o t a c t i c f o r P M N s ( D o i e t a l . , 1 9 9 3 ) , t h o u g h t h e i r 2 7 e x a c t r o l e i n L P S - i n d u c e d i n j u r y r e m a i n s c o n t r o v e r s i a l ( K e p p l e r e t a l . , 1 9 8 7 ; M a t s u c h a k e t a l . , 1 9 9 0 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 7 ) . L a s t l y , P G s h a v e m a n y p h y s i o l o g i c a n d r e g u l a t o r y f u n c t i o n s . F o l l o w i n g L P S e x p o s u r e , P G s a s s i s t i n r e g u l a t i n g t h e p r o d u c t i o n o f p r o i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s ( e . g . , T N F - a , l L - 1 a n d I L - 6 ) a n d i N O S ( K a r c k e t a l . , 1 9 8 8 ; G a l l e r y e t a l . , 1 9 9 0 ; G a i l l a r d e t a l . , 1 9 9 1 ) . L P S a c t i v a t e d - K 0 5 p r o d u c e P G E 1 , P G E 2 , P G D z , P G I 2 , a n d o t h e r P G s ( B o w e r s e t a l . , 1 9 8 5 ; O k u m u r a e t a I . , 1 9 8 7 ; B r o u w e r e t a I . , 1 9 8 8 ) . C y c l o o x y g e n a s e s ( C O X s ) a r e r e s p o n s i b l e f o r P G s y n t h e s i s . C O X h a s t w o i s o f o r m s . C O X - 1 i s c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e d a s a h o u s e k e e p i n g e n z y m e i n m o s t t i s s u e s a n d m e d i a t e s p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s . C O X - 2 i s e x p r e s s e d b y i n f l a m m a t o r y c e l l s ( e . g . , m o n o c y t e s a n d m a c r o p h a g e s , s u c h a s K 0 5 ) a n d c a n b e u p r e g u l a t e d b y v a r i o u s p r o i n f l a m m a t o r y a g e n t s ( i . e . , L P S a n d c y t o k i n e s ) t o e n h a n c e s y n t h e s i s o f P G s ( B r o u w e r e t a l . , 1 9 9 5 ; D i e t e r e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e s e m e d i a t o r s a c t i v a t e a n d / o r m o d u l a t e t h e f u n c t i o n o f H P C s o r t h e e f f e c t s o f n e a r b y i n f l a m m a t o r y c e l l s ( e . g . , P M N s ) t o c o n t r i b u t e t o p a t h o p h y s i o l o g i c a l a l t e r a t i o n s i n t i s s u e s ( C a s t e l e i j n , e t a l . , 1 9 8 8 c ; D e c k e r , 1 9 9 0 , 1 9 9 7 ; G a n e y e t a l . , 2 0 0 1 ) M o r e o v e r , C O X - 2 p r o d u c t s h a v e b e e n f o u n d t o m e d i a t e l i v e r i n j u r y i n s o m e m o d e l s ( G a n e y e t a l . , 2 0 0 1 ) . 1 . 0 . 6 . 1 2 6 . P l a t e l e t A c t i v a t i n g F a c t o r L P S - a c t i v a t e d K C s r e l e a s e P A F . P A F c a n s t i m u l a t e K C s t o r e l e a s e c y t o k i n e s a n d f o r m R O S . P A F c a n a l s o s t i m u l a t e p e r i p h e r a l b l o o d m o n o c y t e s t o p r o d u c e T N F - o r ( L o e t a l . , 1 9 9 7 ; K u i j i p e r s a n d V a n d e r P o l l , 1 9 9 9 ) . P A F m a y b e 2 8 i n v o l v e d i n i n i t i a l P M N i n f i l t r a t i o n o f t h e l i v e r , c h e m o t a x i s , a d h e s i o n t o e n d o t h e l i a l c e l l s , d e g r a n u l a t i o n a n d o x i d a t i v e b u r s t ( L o r a n t e t a l . , 1 9 9 1 ; C o u g h l a n e t a l . , 1 9 9 4 ; Z i m m e r m a n e t a l . , 1 9 9 4 ) . P A F i s a l s o i n v o l v e d i n p l a t e l e t s t i m u l a t i o n , v a s o c o n s t r i c t i o n a n d i n t h e e a r l y s t a g e s o f e n d o t o x e m i a ( Q i a n d J o n e s , 1 9 9 0 ; T e r a s h i t a e t a l . , 1 9 9 2 ; B a l s a e t a l . , 1 9 9 7 ) . I t s r o l e , h o w e v e r , i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i s c o n t r o v e r s i a l ( I m u r a e t a / . , 1 9 8 6 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 7 ) . 1 . 0 . 6 . 1 2 7 . R e a c t i v e O x y g e n S p e c i e s M a c r o p h a g e s , i n c l u d i n g K 0 3 , a n d P M N s p r o d u c e o x y g e n f r e e r a d i c a l s t o d e s t r o y i n v a d i n g p a t h o g e n s . M o l e c u l a r o x y g e n i s c o n v e r t e d t o t h e s u p e r o x i d e a n i o n r a d i c a l , h y d r o g e n p e r o x i d e , a n d u l t i m a t e l y t o t h e h y d r o x y l r a d i c a l . B o t h L P S a c t i v a t e d m a c r o p h a g e s a n d P M N s r e l e a s e a b u r s t o f R O S t o d i r e c t l y i n j u r e / d a m a g e t i s s u e s ( A r t h u r e t a l . , 1 9 8 6 ; A r t h u r e t a l . , 1 9 8 8 ; B a u t i s t a e t a l . , 1 9 9 0 ; M a y e r a n d S p i t z e r , 1 9 9 1 ) . L i v e r i n j u r y i n d u c e d b y R O S o c c u r s i n a n u m b e r o f m o d e l s , a n d w h e n R O S p r o d u c t i o n i s b l o c k e d l i v e r i n j u r y i s l i k e w i s e p r e v e n t e d ( A r t h u r e t a l . , 1 9 8 5 ; S h i r a t o r i e t a l . , 1 9 8 8 ) . R O S c a n d a m a g e c e l l s a n d t i s s u e s t h r o u g h t h e i n i t i a t i o n o f l i p i d p e r o x i d a t i o n a n d o x i d a n t d a m a g e t o m a c r o m o l e c u l e s s u c h a s p r o t e i n s a n d D N A . A l t h o u g h R O S r e l e a s e f r o m m a c r o p h a g e s a n d P M N s c a n l e a d t o t i s s u e i n j u r y d i r e c t l y , i n t r a c e l l u l a r R O S o r o x i d a n t s m a y h a v e o t h e r f u n c t i o n s . T h e y c a n i n d u c e a v a r i e t y o f s i g n a l p a t h w a y s f r o m c e l l d e a t h ( i . e . , a p o p t o t i c a n d o n c o t i c n e c r o s i s ) t o c e l l p r o l i f e r a t i o n . I n g e n e r a l , a c t i v a t i o n o f a p a t h w a y i n v o l v e s t h e d i r e c t m o d i f i c a t i o n o f a p r o t e i n o r o t h e r e l e m e n t o f t h e s i g n a l i n g p a t h w a y b y R O S . 2 9 Droinfla 1 " 1 6 . 1 . R C t y r c s e v a n d i m p l c o n t e n c o C O O r C n u m b a n d f l 2 0 0 0 ; h o w e v D n h n fl , l n S u m m c h o S i g n a l i O I O u t c . “ h e m ; “ C h a i n , R O S c a n i n t e r a c t w i t h a n u m b e r o f s p e c i f i c m o l e c u l a r t a r g e t s i n c l u d i n g p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e , E R K , M A P K , a n t i o x i d a n t r e s p o n s e e l e m e n t ( A R E ) , N F - k B a n d s e v e r a l c a s p a s e s ( W h i t m a r s h a n d D a v i s , 1 9 9 6 ; M a h e r a n d S c h u b e r t , 2 0 0 0 ; L i a n d J a c k s o n , 2 0 0 2 ) . M A P K a c t i v a t i o n ( n a m e l y , J N K a n d p 3 8 ) h a s b e e n i m p l i c a t e d i n i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e s a n d c e l l c y c l e a r r e s t , a n d , w i t h s o m e c o n t r o v e r s y , a p o p t o s i s . A R E i s f o u n d i n t h e p r o m o t e r r e g i o n o f g e n e s w h i c h e n c o d e a n t i o x i d a n t a n d d e t o x i f i c a t i o n p r o t e i n s a n d i s r e s p o n s i b l e f o r t h e c o o r d i n a t e d t r a n s c r i p t i o n o f s u c h g e n e s . F i n a l l y , N F - k B a c t i v a t i o n c a n l e a d t o a n u m b e r o f p r o i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e s i n c l u d i n g i n c r e a s e d T N F - o r t r a n s c r i p t i o n a n d r e l e a s e a n d n e u t r o p h i l a d h e s i o n t o ‘ v a s c u l a r e n d o t h e l i u m i n v i v o ( K i m e t a l . , 2 0 0 0 ; M a h e r a n d S c h u b e r t , 2 0 0 0 ; L i u e t a l . , 2 0 0 1 a ) . T h e r e i s s o m e c o n t r o v e r s y , h o w e v e r , a b o u t w h e t h e r R O S a c t i v a t i o n o f N F - K B i s r e q u i r e d t o g e n e r a t e p r o i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n L P S - a c t i v a t e d m a c r o p h a g e s ( C h a n d e l e t a l . , 2 0 0 0 ) . I n s u m m a r y , a l t h o u g h t h e r e l e a s e o f R O S b y m a c r o p h a g e s a n d P M N s c a n r e s u l t i n c y t o t o x i c e f f e c t s ( i . e . , o x i d a n t i n j u r y ) i n n e a r b y c e l l s , R O S c a n h a v e a r o l e i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n a n d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r a c t i v a t i o n t h a t m a y r e s u l t i n a n u m b e r o f o u t c o m e s f r o m a p o p t o t i c c e l l d e a t h t o a n t i o x i d a n t a c t i v a t i o n t o t h e r e l e a s e o f p r o i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s ( S c h r e c k e t a l . , 1 9 9 1 ; C a n t y e t a l . , 1 9 9 9 ) 1 . 0 . 6 . 1 2 8 . N i t r i c O x i d e N O i s p r o d u c e d b y n i t r i c o x i d e s y n t h a s e ( N O S ) , w h i c h e x i s t s i n t w o f o r m s , c o n s t i t u t i v e ( c N O S ) a n d i n d u c i b l e ( i N O S ) . c N O S i s f o u n d i n m a n y d i f f e r e n t c e l l s i n c l u d i n g e n d o t h e l i a l c e l l s a n d n e u r o n s , w h e r e N O i s c o n s t i t u t i v e l y s y n t h e s i z e d . 3 0 M a c r o p h a g e s ( e . g . , K 0 5 ) a n d P M N s h a v e i N O S , w h i c h c a n b e i n d u c e d b y c y t o k i n e s a n d o t h e r a g e n t s . F o l l o w i n g L P S e x p o s u r e , i N O S i s u p r e g u l a t e d i n m a c r o p h a g e s r e s u l t i n g i n N O p r o d u c t i o n ( G a i l l a r d e t a l . , 1 9 9 1 ; L a s k i n e t a l . , 1 9 9 4 ) . N C , a s o l u b l e f r e e r a d i c a l g a s , h a s m a n y d i f f e r e n t c e l l u l a r e f f e c t s i n c l u d i n g s e r v i n g a s a n i n t r a c e l l u l a r m e s s e n g e r , i n d u c i n g v a s o d i l a t i o n , i n h i b i t i n g p l a t e l e t a g g r e g a t i o n a n d m o d u l a t i n g l e u k o c y t e a d h e s i o n . N O h a s a l s o b e e n r e p o r t e d t o r e l a x c o n t r a c t e d h e p a t i c s t e l l a t e c e l l s a n d t o p o t e n t i a l l y u p r e g u l a t e t h e c a t a l y t i c a c t i v i t y o f C O X , t h o u g h t h i s l a t t e r a b i l i t y i s d e b a t e d ( S a l v e m i n i e t a l . , 1 9 9 3 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . E x c e s s i v e f o r m a t i o n o f N O c a n l e a d t o L P S - i n d u c e d h y p o t e n s i v e s h o c k ( R u e t t e n a n d T h i e m e n n a n n , 1 9 9 6 ; M a y e u x , 1 9 9 7 ; W o l k o w , 1 9 9 8 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) a n d t h i s , a l t h o u g h c o n t r o v e r s i a l , h a s b e e n l i n k e d t o l e t h a l i t y i n e x p e r i m e n t a l a n i m a l s t r e a t e d w i t h a t o x i c d o s e o f L P S ( T a k a n o e t a l . , 1 9 9 7 ; W o l k o w , 1 9 9 8 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . A d d i t i o n a l l y , N O i n t h e p r e s e n c e o f s u p e r o x i d e a n i o n r a d i c a l f o r m s t h e c y t o t o x i c p e r o x y n i t r i t e f r e e r a d i c a l , w h i c h c a n c a u s e c e l l u l a r i n j u r y ( D e c k e r , 1 9 9 7 ) . 1 . 0 . 6 . 2 . N e u t r o p h i l s . P M N s a r e a n o t h e r i m p o r t a n t c o m p o n e n t o f t h e i n n a t e i m m u n e s y s t e m a n d a r e i n v o l v e d i n L P S - i n d u c e d p a t h o p h y s i o l o g i c r e s p o n s e s . P M N s o r i g i n a t e f r o m a n d l a r g e l y m a t u r e i n t h e b o n e m a r r o w b e f o r e b e i n g r e l e a s e d i n t o t h e g e n e r a l c i r c u l a t i o n . T h e y a r e c r i t i c a l i n t h e d e f e n s e a g a i n s t i n v a d i n g p a t h o g e n s a n d a r e t h e f i r s t c e l l s t o m i g r a t e t o t h e s i t e o f i n f l a m m a t i o n a n d p h a g o c y t o s e b a c t e r i a a n d b a c t e r i a l f r a g m e n t s ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ) . M o r e o v e r , 3 1 P I V a c ; a l s < s h t H e r a n d i n v a F o H c d a p i r n e d i H o h t m o d e e l a i , T h e e C o n v e D e r o x y h I ’ D O c j i n n n j ( B a u n s P M N s c a n n e u t r a l i z e L P S t h r o u g h t h e r e l e a s e o f l y s o s o m a l e n z y m e s ( e . g . , a c y l o x a c y l h y d r o l a s e ; L u c h i a n d M u n f o r d , 1 9 9 3 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e y c a n a l s o r e l e a s e b a c t e r i c i d a I / p e r m e a b i l i t y - i n c r e a s i n g p r o t e i n ( B P I ) , w h i c h i s s t r u c t u r a l l y s i m i l a r t o L B P a n d b i n d s t o n e u t r a l i z e L P S ( M a r r a e f a l . , 1 9 9 0 ) . H e n c e , P M N s h a v e a v a r i e t y o f m e c h a n i s m s t o n e u t r a l i z e i n v a d i n g p a t h o g e n s a n d l i m i t L P S t o x i c i t y . A l t h o u g h P M N s h a v e l a r g e l y b e n e f i c i a l a c t i v i t i e s t o p r o t e c t t h e h o s t f r o m i n v a d i n g p a t h o g e n s , t h e y c a n c a u s e H P C i n j u r y a n d n e c r o s i s i n t h e l i v e r . F o l l o w i n g c h e m o t a x i s t o t h e s i t e o f i n f l a m m a t i o n , a d h e r e n c e t o e n d o t h e l i u m a n d d i a p e d e s i s i n t o n e a r b y t i s s u e s , a c t i v a t e d P M N s c a n r e l e a s e p r o t e a s e s a n d o t h e r m e d i a t o r s ( e . g . , R O S ) t o f a c i l i t a t e i n j u r y ( G a l l i n , 1 9 8 9 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ) . I n d e e d , P M N s c o n t r i b u t e t o H P C a n d S E C i n j u r y i n s e v e r a l m o d e l s b o t h i n V i t r o a n d i n v i v o ( M a v i e r e t a l . , 1 9 8 8 ; H e w e t t e f a l . , 1 9 9 2 ; G a n e y e t a l . , 1 9 9 4 ; S a k a m o t o e t a l . , 1 9 9 7 ; O h t s u k a e t a l . , 2 0 0 0 ) . R O S p r o d u c t i o n i n P M N s i s d e p e n d e n t o n N A D P H o x i d a s e a c t i v a t i o n . T h e e n d p r o d u c t o f t h i s e n z y m e i s t h e s u p e r o x i d e a n i o n r a d i c a l , w h i c h c a n b e c o n v e r t e d t o o t h e r c y t o t o x i c f r e e r a d i c a l s s u c h a s t h e h y d r o x y l r a d i c a l a n d p e r o x y n i t r i t e s . W i t h t h e a d d i t i o n a l r e l e a s e o f m y e l o p e r o x i d a s e , t h e o x i d a n t h y p o c h l o r o u s a c i d c a n b e f o r m e d . A s p r e v i o u s l y n o t e d , R O S c a n d a m a g e c e l l s b y i n i t i a t i n g l i p i d p e r o x i d a t i o n a n d c a u s i n g o x i d a n t d a m a g e t o m a c r o m o l e c u l e s ( B a u t i s t a e t a l . , 1 9 9 0 ; S p i t z e r a n d M a y e r , 1 9 9 3 ) . A c t i v a t e d P M N s a l s o r e l e a s e p r o t e a s e s ( M a v i e r e t a l . , 1 9 8 8 ; H a r b r e c h t e t a l . , 1 9 9 3 ; G a n e y e t a l . , 1 9 9 4 ) s u c h a s c a t h e p s i n G a n d e l a s t a s e , w h i c h a r e c y t o t o x i c t o H P C s ( H o e t a l . , 1 9 9 6 ) . 3 2 M o r e o v e r , R O S c a n i n c r e a s e t h e c y t o t o x i c i t y o f t h e s e p r o t e a s e s b y i n h i b i t i n g t h e a c t i v i t y o f p l a s m a a n t i p r o t e a s e s ( J a e s c h k e , 1 9 9 7 ) . F i n a l l y , R O S c a n a c t i v a t e t h e N F - K B p a t h w a y s a n d c o n s e q u e n t l y c o n t r i b u t e t o H P C i n j u r y b y e n h a n c i n g t h e i n f l a m m a t o r y p r o c e s s ( S c h r e c k e t a l . , 1 9 9 1 ; C a n t y e t a l . , 1 9 9 9 ) . A c c o r d i n g l y , s i m i l a r t o K C s , P M N s h a v e a c r i t i c a l r o l e i n L P S - i n d u c e d i n j u r y . 1 . 0 . 6 . 3 . P l a t e l e t s , E n d o t h e l i a l C e l l s , a n d E p i t h e l i a l C e l l s . P l a t e l e t s , e n d o t h e l i a l c e l l s , s m o o t h m u s c l e c e l l s a n d e p i t h e l i a l c e l l s a r e k n o w n t o c o n t r i b u t e t o t h e i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e ( L i b b y e t a l . , 1 9 9 1 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ; S h i b a y a m a e t a l . , 1 9 9 5 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ; ) . A s i d e f r o m p a r t i c i p a t i o n i n c o a g u l a t i o n , p l a t e l e t s c a n r e l e a s e l i p i d m e d i a t o r s , s u c h a s P A F a n d t h r o m b o x a n e A 2 , t h a t c o n t r i b u t e t o t h e a c t i v a t i o n o f o t h e r c e l l s a n d t o t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t i c i n j u r y ( S h i b a y a m a e t a l . , 1 9 9 5 ) . P l a t e l e t s c a n a l s o r e l e a s e p r o t e a s e s , s u c h a s e l a s t a s e a n d c a t h e p s i n s , a n d R O S , w h i c h c a n p r o m o t e t i s s u e i n j u r y ( H o l m s e n a n d D a y , 1 9 7 0 ; J a m e s a t a l . , 1 9 8 5 ; G o r o g a n d K o v a c s , 1 9 9 5 ) . F o l l o w i n g a c t i v a t i o n b y L P S o r c y t o k i n e s s u c h a s I L - 1 a n d T N F a , e n d o t h e l i a l c e l l s p r o d u c e I L - 1 , l L - 6 , I L - 8 / C I N C - 1 a n d T F . M o r e o v e r , t h e y e x p r e s s a d h e s i o n m o l e c u l e s a n d p r o d u c e P G E Z , P G l z , R O S , N O , P A F , a n d i n t e r f e r o n s ( L o p p n o w a n d L i b b y , 1 9 8 9 ; C a m u s s i e t a l . , 1 9 9 5 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ; O h k u b o e f a l . , 1 9 9 8 ) . I n t e r e s t i n g l y , L P S h a s a d i r e c t c y t o t o x i c e f f e c t i n V i t r o o n e n d o t h e l i a l c e l l s a t c o n c e n t r a t i o n s g r e a t e r t h a n 1 p t n g ( H a r l a n e t a l . , 1 9 8 3 ; R i e t s c h e l a n d B r a s e , 1 9 9 2 ) ; i n j u r y m a y b e d u e t o R O S g e n e r a t i o n a n d s u b s e q u e n t l i p i d p e r o x i d a t i o n ( B r i n g h a m e t a l . , 1 9 8 7 ) . L P S - a c t i v a t e d h u m a n e n d o t h e l i a l c e l l s i n V i t r o c a n 3 3 t r H I i n i i n c ( ) h t h e n e i g 1 . C l C h a r a l a c k . I U n c t H P C . 1 9 8 1 m E d i C e l l s ( P o h l a c t i v e a h e c 1 I U F I h e a l . , 1 5 t r i g g e r P M N g r a n u l a r s e c r e t i o n b y u n k n o w n f a c t o r s ( G i l l e t a l . , 1 9 9 8 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t i f s u c h a n e v e n t o c c u r r e d i n v i v o , i t c o u l d i n i t i a t e v a s c u l a r i n j u r y . H e n c e , i t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t S E C s p o t e n t i a l l y c o u l d h a v e a r o l e i n i n i t i a t i n g P M N - i n d u c e d i n j u r y . F i n a l l y , a f t e r L P S s t i m u l a t i o n , e p i t h e l i a l c e l l s c a n i n d u c e I L - 6 , l L - 8 / C I N C - 1 , a n d T N F - o r ( S c h u m a n n e t a l . , 1 9 9 4 ; K h a i r e t a l . , 1 9 9 6 ; O h k u b o e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h e r e f o r e , L P S c a n a f f e c t m a n y d i f f e r e n t c e l l s , r e s u l t i n g i n t h e r e l e a s e o f p r o i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s t h a t m o d u l a t e e f f e c t s o n t h e s e a n d n e i g h b o r i n g c e l l s . 1 . 0 . 6 . 3 . 1 . S i n u s o i d a l E n d o t h e l i a l C e l l s . A s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d , S E C s l i n e t h e s i n u s o i d s o f t h e l i v e r a n d a r e c h a r a c t e r i z e d m o r p h o l o g i c a l l y b y a n a b s e n c e o f t i g h t j u n c t i o n b e t w e e n c e l l s , a l a c k o f b a s a l l a m i n a a n d t h e p r e s e n c e o f f e n e s t r a t i o n s . T h e y p e r f o r m a v a r i e t y o f f u n c t i o n s i n c l u d i n g e x c h a n g e a n d t r a n s p o r t o f s u b s t a n c e s b e t w e e n b l o o d a n d H P C s , a n d a s s i s t i n g K C S i n t h e c l e a r a n c e o f L P S ( P r a a n i n g - v a n D a l e n e t a l . , 1 9 8 1 ; N a k a o e t a l . , 1 9 9 4 ; W i s s e e t a l . , 1 9 9 6 ) . L P S o r L P S - i n d u c e d i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s ( e . g . , l L - 1 , T N F - o r , I L - 8 / C I N C - 1 a n d t h r o m b i n ) c a n a c t i v a t e e n d o t h e l i a l c e l l s t o p r o m o t e i n f l a m m a t i o n , i n i t i a t e c o a g u l a t i o n a n d a f f e c t v a s c u l a r t o n e ( P o h l m a n a n d H a r l a n , 1 9 9 2 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ) . A c c o r d i n g l y , e n d o t h e l i a l c e l l a c t i v a t i o n m a y a l t e r t h e f u n c t i o n o f n e i g h b o r i n g p a r e n c h y m a l c e l l s a n d p o s s i b l y a f f e c t n e a r b y i n f l a m m a t o r y c e l l s l e a d i n g t o s e c o n d a r y i n f l a m m a t o r y e v e n t s t o . f u r t h e r a l t e r o r d a m a g e p a r e n c h y m a l c e l l s ( P o h l m a n a n d H a r l a n , 1 9 9 2 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ) . 3 4 L P S i s k n o w n t o i n d u c e c h a n g e s / i n j u r y t o S E C s i n v i v o a n d i n V i t r o ( D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 4 ; S e t o e t a l . , 1 9 9 8 ; S p a p e n e t a l . , 1 9 9 9 ; H a s e g a w a e t a l . , 2 0 0 1 ) . A f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f a n a c u t e l y t o x i c d o s e o f L P S , s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n s ( e . g . , c e l l s w e l l i n g a n d d e c r e a s e d f e n e s t r a e ) a n d f u n c t i o n a l c h a n g e s ( e . g . , i n c r e a s e d I C A M - 1 e x p r e s s i o n ) a r e o b s e r v e d b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y . T h i s p r o g r e s s e s t o S E C n e c r o s i s . L P S - i n d u c e d s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n o f S E C S i s a c c o m p a n i e d , b u t n o t n e c e s s a r i l y c o r r e l a t e d w i t h , f u n c t i o n a l i m p a i r m e n t o f t h e c e l l . H A u p t a k e , a m a r k e r o f S E O d y s f u n c t i o n / i n j u r y , i s d e c r e a s e d b o t h b e f o r e a n d a f t e r t h e o n s e t o f H P C i n j u r y ( D e a c i u c a n d S p i t z e r , 1 9 9 6 ; Y a c h i d a e t a l . , 1 9 9 8 ) E n d o t h e l i a l c e l l s a c t i v a t e d b y L P S a n d / o r L P S - i n d u c e d m e d i a t o r s p r o d u c e a m y r i a d o f i n f l a m m a t o r y f a c t o r s . I n V i t r o , e n d o t h e l i a l c e l l a c t i v a t i o n i n d u c e s t h e e x p r e s s i o n o f T F a n d p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r i n h i b i t o r - 1 . I n v i v o , a c t i v a t i o n b y T N F - o n a n d l L - 1 i n d u c e s p r o c o a g u l a n t a c t i v i t y ( e . g . , v i a T F e x p r e s s i o n ) . L e u k o c y t e a d h e s i o n m o l e c u l e ( e . g . , l C A M - 1 a n d V C A M - 1 ) e x p r e s s i o n a l s o i n c r e a s e s f o l l o w i n g e n d o t h e l i a l c e l l a c t i v a t i o n ( P o h l m a n a n d H a r l a n , 1 9 9 2 ) . T h e s e m o l e c u l e s p l a y a c r i t i c a l r o l e i n t h e a c c u m u l a t i o n a n d a d h e r e n c e o f P M N s a t t h e s i t e o f i n f l a m m a t i o n . I n d e e d , L P S , T N F - o z a n d / o r l L - 1 c a n d r a m a t i c a l l y i n d u c e l C A M - 1 a n d V C A M - 1 e x p r e s s i o n o n S E C s . I C A M - 1 a n d V C A M - 1 c a n a l s o b e e x p r e s s e d o n H P C s , t h o u g h a t a l e v e l s u b s t a n t i a l l y b e l o w t h a t o b s e r v e d i n e n d o t h e l i a l c e l l s ( E s s a n i e t a l . , 1 9 9 5 ; F a r h o o d e t a l . , 1 9 9 5 ; L a l o r e t a l . , 2 0 0 2 ) . F o r e x a m p l e , K o m a t s u e t a l . ( 1 9 9 4 ) d e m o n s t r a t e d i n t h e g a l a c t o s a m i n e / L P S l i v e r i n j u r y m o d e l t h a t t h e a c c u m u l a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f P M N s , a s w e l l a s t h e 3 5 e n h a r c n h c a l i n fl a n h a n d F J a e s c l I h a t c x c o u n t e n u m b e P A F a r H a n a n , c e H s , j s u n o u n L a s k i n , b U I h t t f c a n D B I i n d U c t i o h m m n I n g r e s t i H e fi c e , c O a Q U l a j m e d e s e n h a n c e d e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s o n h e p a t i c e n d o t h e l i a l c e l l s , a r e c r i t i c a l l y i m p o r t a n t f o r i n j u r y a n d c o u l d b e i n d u c e d b y T N F - o r . F u r t h e r m o r e , o t h e r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s r e l e a s e d b y e n d o t h e l i u m i n c l u d e l L - 1 , l L - 6 , l L - 8 / C I N C - 1 , a n d P A F ( P o h l m a n a n d H a r l a n , 1 9 9 2 ; O h k u b o e t a l . , 1 9 9 8 ) . A d d i t i o n a l l y , J a e s c h k e ( 1 9 9 2 ) f o u n d t h a t L P S r e s u l t e d i n a n e x t r a c e l l u l a r o x i d a n t s t r e s s i n v i v o t h a t c a u s e d i n c r e a s e d S E C e f f l u x o f r e d u c e d g l u t a t h i o n e ( G S H ) p o s s i b l y t o c o u n t e r t h e r e l e a s e o f p o t e n t i a l l y d e l e t e r i o u s R O S g e n e r a t e d b y K C s . F i n a l l y , a n u m b e r o f v a s o a c t i v a t o r s a r e p r o d u c e d i n V i t r o , i n c l u d i n g v a s o c o n s t r i c t o r s , l i k e P A F a n d e n d o t h e l i n - I , a n d v a s o d i l a t o r s , l i k e p r o s t a c y c l i n a n d N O ( P o h l m a n a n d H a r l a n , 1 9 9 2 ) . W i t h s u c h a v a r i e t y o f f a c t o r s r e l e a s e d f r o m a c t i v a t e d e n d o t h e l i a l c e l l s , i t i s p o s s i b l e t h a t e n d o t h e l i a l c e l l a c t i v a t i o n / i n j u r y c o u l d m o d u l a t e s u r r o u n d i n g c e l l s i n c o n d i t i o n s o f e n d o t o x e m i a ( P o h l m a n a n d H a r l a n , 1 9 9 2 ; L a s k i n , 1 9 9 6 ) . A s m e n t i o n e d p r e v i o u s l y , t h e e n d o t h e l i u m i s n o r m a l l y a n t i t h r o m b o g e n i c , b u t i n t h e p r e s e n c e o f L P S o r L P S - i n d u c e d m e d i a t o r s , s u c h a s T N F - a a n d l L - 1 , i t c a n b e c o m e p r o c o a g u l a n t . T h i s p r o c o a g u l a n t a c t i v i t y , i n p a r t , i s d u e t o t h e i n d u c t i o n o f T F a c t i v i t y o n t h e s u r f a c e o f e n d o t h e l i a l c e l l s , w h i c h l e a d s u l t i m a t e l y t o t h r o m b i n f o r m a t i o n ( S t e r n e t a l . , 1 9 8 5 ; r e v i e w e d i n S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h r o m b i n a l s o a c t i v a t e s e n d o t h e l i a l c e l l s ( d e G r o o t e t a l . , 1 9 8 7 ) . H e n c e , e n d o t h e l i a l c e l l s c a n a c t a s a b r i d g e o r l i n k b e t w e e n i n f l a m m a t i o n a n d c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n . E n d o t h e l i u m d a m a g e d d u r i n g i n f l a m m a t i o n p r o v i d e s a s u r f a c e w h e r e b y p r o t e i n s i n v o l v e d i n b o t h c o a g u l a t i o n a n d i n f l a m m a t i o n d e v e l o p m e n t a r e e x p r e s s e d ( C i c a l a a n d C i r i n o , 1 9 9 8 ) . 3 6 A c c o r d i n g l y , i n j u r y t o e n d o t h e l i a l c e l l s i n t h e l i v e r m i c r o v a s c u l a t u r e c a n r e s u l t i n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( M a c h o v i c h , 1 9 8 5 ; R y a n , 1 9 8 6 , H i r a t a e t a l . , 1 9 8 9 ) . C o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n i s c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f H P C i n j u r y i n m a n y l i v e r i n j u r y m o d e l s ( P e r r y , 1 9 8 4 ; F u j i w a r a e t a l . 1 9 8 8 ; Y a m a d a e t a l . 1 9 8 9 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ; A r a i e t a l . , 1 9 9 6 ) . H e n c e , m i c r o c i r c u l a t o r y d i s t u r b a n c e s ( i . e . , s i n u s o i d a l h y p o p e r f u s i o n ) f r o m h e m o r r h a g e a n d / o r i n t r a s i n u s o i d a l f i b r i n d e p o s i t i o n h a v e b e e n p o s t u l a t e d t o c o n t r i b u t e t o H P C i n j u r y v i a i s c h e m i c / h y p o x i c i n j u r y ( S h i b a y a m a , 1 9 8 7 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ; B a e t a l . , 2 0 0 0 ; S a e t r e e t a l . , 2 0 0 0 ; C o p p l e e r a l . , 2 0 0 2 a , 2 0 0 2 b ; H a s e g a w a e t a l . , 2 0 0 1 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e r e l e a s e o f L P S - i n d u c e d p r o i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s a n d p r o c o a g u l a n t a c t i v i t y f r o m S E C s n o t o n l y h a v e t h e p o t e n t i a l t o c o n t r i b u t e t o S E C i n j u r y b u t a l s o m a y c o n t r i b u t e t o i n j u r y i n s u r r o u n d i n g p a r e n c h y m a l c e l l s ( L a s k i n , 1 9 9 6 ) . H e n c e , S E C s i n j u r y m a y b e m o r e t h a n a n e p i p h e n o m e n o n i n s o m e h e p a t o t o x i c i t y m o d e l s . 1 . 0 . 6 . 4 . C o a g u l a t i o n S y s t e m a n d T h r o m b i n L P S c a n a c t i v a t e t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m e i t h e r i n t r i n s i c a l l y t h o u g h s u r f a c e m e d i a t e d r e a c t i o n s ( i . e . , a c t i v a t i o n o f f a c t o r X l l ) o r e x t r i n s i c a l l y t h r o u g h t h e e x p r e s s i o n o f T F s o n e n d o t h e l i a l c e l l s , m o n o c y t e s a n d P M N s ( B o n e e t a l . , 1 9 9 2 ; P o l a c k e t a l . , 1 9 9 7 ; T o d o r o k i e t a l . , 2 0 0 0 ) . W i t h e a c h s t e p i n t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , a p r e v i o u s e n z y m e a c t i v a t e s t h e n e x t o n e . T h i s a c t i v i t y r e q u i r e s a c o f a c t o r s u c h a s c a l c i u m a n d a n o r g a n i z i n g s u r f a c e s u c h a s p l a t e l e t s o r P M N s . 3 7 A t t h e d i s t a l e n d o f t h i s s e r i e s o f r e a c t i o n s , a c t i v a t e d f a c t o r X c a t a l y t i c a l l y c l e a v e s p r o t h r o m b i n i n t o a c t i v e t h r o m b i n . T h r o m b i n , a p r o t e a s e , c o n v e r t s c i r c u l a t i n g f i b r i n o g e n i n t o i n s o l u b l e f i b r i n c l o t s ( B l o o m , 1 9 9 0 ; S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ) . H o w e v e r , i t c a n h a v e o t h e r r o l e s i n a d d i t i o n t o p r o c o a g u l a n t a c t i v i t y . T h r o m b i n h a s b e e n i m p l i c a t e d i n t h e r e l e a s e o f p r o i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s f r o m m o n o c y t e s , m a c r o p h a g e s , e n d o t h e l i a l c e l l s a n d P M N s . I t i s a l s o c o n s i d e r e d a w e a k P M N C h e m o a t t r a c t a n t ( B i z i o s e t a l . , 1 9 8 6 ; H o f f m a n a n d C o o p e r , 1 9 9 5 ; H o l l a n d e t a l . , 1 9 9 8 ) a n d h a s a r o l e i n P M N a c t i v a t i o n / p r i m i n g t h r o u g h e n h a n c i n g R O S p r o d u c t i o n , a d h e r e n c e t o e n d o t h e l i u m a n d t h r o m b o x a n e r e l e a s e ( B i z i o s e t a l . , 1 9 8 7 ; C h a n e t a l . , 1 9 8 8 ; C a r n e y , 1 9 9 2 ) . I n t e r e s t i n g l y , M o u l i n e t a l . ( 2 0 0 1 ) r e c e n t l y f o u n d i n V i t r o t h a t t h r o m b i n d o e s n o t d i r e c t l y p r i m e o r a c t i v a t e r a t P M N s b u t i n s t e a d r e l i e s o n i n d i r e c t m e c h a n i s m s . F u r t h e r , t h r o m b i n i s i n v o l v e d i n m o n o c y t e c h e m o t a x i s ( B a r - S h a v i t e t a l . , 1 9 8 3 a ; M a l i k , 1 9 8 6 ; B i z i o s e t a l . , 1 9 8 7 ) a n d c a n p r o m o t e t h e r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r y c o m p o n e n t s ( i . e . , T N F - o z a n d I L - 1 ) f r o m m o n o c y t e s ( B a r - S h a v i t e t a l . , 1 9 8 3 a ; H o f f m a n a n d C o o p e r , 1 9 9 5 ) . M o r e o v e r , t h r o m b i n i s a p o t e n t c h e m o t a x i n f o r m a c r o p h a g e s a n d c a n a l t e r t h e p r o d u c t i o n o f c y t o k i n e s a n d a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e s ( B a r - S h a v i t e t a l . , 1 9 8 3 b ) . O v e r a l l , t h i s d e m o n s t r a t e s t h a t t h r o m b i n p a r t i c i p a t e s i n a l a r g e r r o l e t h a n c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n a n d f u r t h e r s u g g e s t s t h a t c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n m a y c o n t r i b u t e t o t h e u p r e g u l a t i o n o f p r o i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s ( J o h n s o n e t a l . , 1 9 9 8 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . A s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d , t h r o m b i n c a n a c t i v a t e e n d o t h e l i a l c e l l s . A t p h y s i o l o g i c a l l e v e l s , i t c a n h a v e a d i r e c t p e r r n e a b l i z i n g e f f e c t o n e n d o t h e l i u m 3 8 ( i . e . , b y c a u s i n g e n d o t h e l i a l c e l l r e t r a c t i o n ; M a l i k , 1 9 8 6 ) . F u r t h e r m o r e , t h r o m b i n c a n c a u s e e n d o t h e l i a l c e l l s t o r e l e a s e p r o s t a c y c l i n , p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r i n h i b i t o r , P A F , c h e m o k i n e s ( e . g . , M C P - 1 a n d I L - 8 / C l N C - 1 ) , R O S a n d N O a n d t o i n c r e a s e t h e e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n g l y c o p r o t e i n s o n e n d o t h e l i u m ( V e n t u r i n i a n d K a p l a n , 1 9 9 2 ; C o l o t t a e t a I . , 1 9 9 4 ; U e n o e t a I . , 1 9 9 6 ) . I t i s l i k e l y t h a t m o s t , i f n o t a l l , o f t h e e f f e c t s o f t h r o m b i n o n e n d o t h e l i a l c e l l s ( e . g . , S E C S ) a n d o n K C s i s d u e t o t h r o m b i n a c t i v a t i o n o f t h e G - c o u p l e d r e c e p t o r , p r o t e a s e - a c t i v a t e d r e c e p t o r ( P A R ) - 1 o n t h e s e c e l l s . I n d e e d , a c t i v a t e d P A R - 1 i n i t i a t e s i n t r a c e l l u l a r s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s t h a t c a n c o n t r i b u t e t o p r o i n f l a m m a t o r y e f f e c t s b y s t i m u l a t i n g v a s o d i l a t i o n , i n c r e a s i n g v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y t o p l a s m a p r o t e i n s , i n c r e a s i n g e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s o n e n d o t h e l i u m ( e . g . , l C A M - 1 a n d V C A M - 1 ) a n d c a u s i n g r e l e a s e o f c y t o k i n e s s u c h a s l L - 6 a n d c h e m o k i n e s ( e . g . , l L - 8 ; V e r g n o l l e e t a l . , 2 0 0 1 ; D e r i a n e t a l . , 2 0 0 2 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h r o m b i n h a s r o l e s o t h e r t h a n i t s p r o c o a g u l a n t a c t i v i t y a n d m a y b e i m p o r t a n t f o r c h e m o t a x i s , a d h e s i o n m o l e c u l e e x p r e s s i o n a n d t h e r e l e a s e o f p r o i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n e n d o t o x e m i a . 1 . 0 . 6 . 5 . S u m m a r y A w i d e r a n g e o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i s r e l e a s e d u p o n a c t i v a t i o n o f i n f l a m m a t o r y c e l l s b y L P S a n d / o r L P S - d e r i v e d m e d i a t o r s . C o m b i n a t i o n o f t h e s e m e d i a t o r s , a l o n g w i t h c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n , c a n r e s u l t i n v a r i o u s p a t h o p h y s i o l o g i c r e s p o n s e s t o e n d o t o x e m i a ( e . g . , s h o c k a n d l e t h a l i t y ) . M o r e o v e r , s o m e m e d i a t o r s - l i k e T N F a , P A F , a n d t h r o m b i n - c o u l d c o n t r i b u t e t o 3 9 e n h a n c i n g c o n c u r r e n t i n j u r y v i a d i s r u p t i o n o f b l o o d f l o w a n d a c c u m u l a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f P M N s a n d m a c r o p h a g e s . A c c o r d i n g l y , a n u n d e r l y i n g i n f l a m m a t o r y s t a t e c o u l d c o n t r i b u t e o r e n h a n c e i n j u r y t o t i s s u e s a l r e a d y p r e d i s p o s e d b y c h e m i c a l - i n d u c e d h o m e o s t a t i c a l t e r a t i o n s . 1 . 0 . 7 . L P S a n d t h e L i v e r N u m e r o u s s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t L P S h a s a n h e p a t o t o x i c e f f e c t o n t h e l i v e r ( L e v y e t a l . , 1 9 6 7 ; U t i l i e t a l . , 1 9 7 7 ; H i r a t a e t a l . , 1 9 8 0 ) . L a r g e , a c u t e l y t o x i c d o s e s o f L P S p r o d u c e m u l t i f o c a l M Z c o a g u l a t i v e n e c r o s i s w i t h n e u t r o p h i l i c i n f i l t r a t e , m i n i m a l h e m o r r h a g e a n d S E C i n j u r y ( S h i b a y a m a , 1 9 8 7 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; S e t o e t a l . , ~ 1 9 9 8 ) . L i v e r i n j u r y i s b o t h t i m e - a n d d o s e - d e p e n d e n t ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . F o r a m o r e d e t a i l e d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n L P S - i n d u c e d l i v e r l e s i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 . P r o g r e s s i v e f u n c t i o n a l a n d m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o c c u r i n H P C s a n d S E C s a f t e r e x p o s u r e i n v i v o t o a n a c u t e l y t o x i c d o s e o f L P S ( L e v y e t a l . , 1 9 6 7 ; H i r a t a e t a l . , 1 9 8 0 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 , R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ; S e t o e t a l . , 1 9 9 8 ) . I n H P C s , a f t e r L P S e x p o s u r e t h e r e i s a g e n e r a l d e c r e a s e i n p r o t e i n s y n t h e s i s i n V i t r o ( K e l l e r e t a l . , 1 9 8 5 ) , a n d c y t o c h r o m e P 4 5 0 e x p r e s s i o n ( M o r g a n , 1 9 9 3 ) a n d m e t a b o l i s m i n v i v o ( S h e d l o f s k y , 1 9 9 4 ) . L i k e w i s e , a l t e r a t i o n s i n p r o t e i n , D N A a n d R N A s y n t h e s i s , a n d f u n c t i o n a l i m p a i r m e n t ( i . e . , H A u p t a k e ) a r e o b s e r v e d i n S E C s i n v i v o ( P o b e r a n d C o l t r a n , 1 9 9 0 ; D e a c i u c a n d S p i t z e r , 1 9 9 6 ; Y a c h i d a e t a l . , 1 9 9 8 ) . I n i t i a l m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s t o H P C s i n v i v o i n c l u d e s w e l l i n g o f m i c r o v i l l i o n t h e s i n u s o i d a l b o r d e r , m o d e r a t e d i l a t i o n o f o r g a n e l l e s a n d d i l a t i o n o f 4 0 b h e c a i n h n t c h a n g c h a n g a l , 1 9 c d n n r R e fi t b i l e c a n a l i c u l i . I n i t i a l m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s t o S E C s , b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y , i n c l u d e c e l l s w e l l i n g a n d d e c r e a s e d f e n e s t r a e i n v i v a . I n i t i a l f u n c t i o n a l c h a n g e s t o S E C s i n c l u d e i n c r e a s e d I C A M - 1 e x p r e s s i o n . T h e s e m o r p h o l o g i c c h a n g e s l a t e r p r o g r e s s t o S E C n e c r o s i s ( D e a c i u c a n d S p i t z e r , 1 9 9 6 ; Y a c h i d a e t a l . , 1 9 9 8 ) . S u b s e q u e n t c h a n g e s i n H P C s b e c o m e p r o g r e s s i v e l y m o r e a p p a r e n t , c u l m i n a t i n g i n h e p a t o c e l l u l a r d e g e n e r a t i o n a n d c o a g u l a t i v e n e c r o s i s ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ) . S e v e r a l h o s t i n f l a m m a t o r y c e l l s a n d e n d o g e n o u s m e d i a t o r s h a v e k e y r o l e s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . K C s ( A r t h u r e t a l . , 1 9 8 5 , A r t h u r e t a l . , 1 9 8 6 ; B r o w n a t a l . , 1 9 9 7 ) , P M N s ( J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 1 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ; J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 3 ) a n d p l a t e l e t s ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) a p p e a r t o b e i m p o r t a n t t o t h i s i n j u r y . I n a c t i v a t i o n o r e l i m i n a t i o n o f t h e s e c e l l s p r i o r t o a d m i n i s t r a t i o n o f h e p a t o t o x i c d o s e s o f L P S r e s u l t s i n m a r k e d a t t e n u a t i o n o f l i v e r i n j u r y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ; B r o w n e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e s e c e l l s a r e c r i t i c a l t o t h e p a t h o g e n e s i s . M o r e o v e r , s e v e r a l c y t o k i n e s i n c l u d i n g T N F - o r , I L - 1 a n d l L - 6 h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y ( C h e s n u e e t a l . , 1 9 9 1 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . L i p i d m e d i a t o r s ( W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ) a n d c o a g u l a t i o n f a c t o r s , e s p e c i a l l y t h r o m b i n ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ; M o u l i n e t a l . , 1 9 9 6 ; P e a r s o n e t a I . , 1 9 9 6 b ) , a l s o p l a y a r o l e i n t h i s p a t h o g e n e s i s . T h e r o l e o f t h r o m b i n i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i s i n d e p e n d e n t o f c l o t f o r m a t i o n ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ; M o u l i n e t a l . , 1 9 9 6 ) . H e p a r i n , w a r f a r i n , o r h i r u d i n r e d u c e d t h r o m b i n a c t i v i t y a n d l i v e r i n j u r y i n v i v o d u r i n g e n d o t o x e m i a ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 6 b ) . C o n v e r s e l y , t r e a t m e n t w i t h 4 1 a n c r o d p r e s u n i n j u r y c o n j u n a c t s O I e n h a n i a d h e s i c h e m c ( V e r g r " i v y . f 0 r r n a t a l . , 2 0 1 b U I d o 0 0 3 9 W I I 9 9 4 . ‘ a c t i v a t e a n c r o d , a t h r o m b i n - l i k e a n t i c o a g u l a n t e n z y m e , d e p l e t e d c i r c u l a t i n g f i b r i n o g e n p r e s u m a b l y p r e v e n t i n g t h e f o r m a t i o n o f c l o t s b u t d i d n o t p r o t e c t a g a i n s t l i v e r i n j u r y ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ; M o u l i n e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e s e s t u d i e s , i n c o n j u n c t i o n w i t h r e s u l t s o f i s o l a t e d p e r f u s e d l i v e r s t u d i e s , i n d i c a t e t h a t t h r o m b i n a c t s o n P A R - 1 ( M o u l i n e t a l , 1 9 9 6 , 2 0 0 1 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h i s m a y l e a d t o e n h a n c e m e n t o f p r o i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s ( e . g . , i n c r e a s i n g e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s o n e n d o t h e l i u m a n d c a u s i n g t h e r e l e a s e o f c y t o k i n e s a n d c h e m o k i n e s s u c h a s l L - 6 a n d I L - 8 / C I N C - 1 ) t h a t c o n t r i b u t e t o H P C i n j u r y ( V e r g n o l l e e t a l . , 2 0 0 1 ; D e r i a n e t a l . , 2 0 0 2 ) . C o n s e q u e n t l y , i n L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , t h e i m p o r t a n c e o f c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n m a y n o t b e i n f i b r i n c l o t f o r m a t i o n b u t i n t h r o m b i n a c t i v a t i o n o f P A R - 1 ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ; M o u l i n e t a l . , 2 0 0 1 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 3 ) . F u r t h e r m o r e , t h r o m b i n c a n a c t a s a P M N C h e m o a t t r a c t a n t ( B i z i o s e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h i s r o l e , h o w e v e r , i s c o n t r o v e r s i a l i n L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 6 b ; W o o d m a n e t a l . , 2 0 0 0 ) , t h o u g h t h r o m b i n m a y b e i m p o r t a n t i n P M N e x t r a v a s a t i o n ( J a e s c h k e , 1 9 9 7 ) . H e n c e , L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i s d e p e n d e n t o n c e l l s f r o m t h e i n n a t e i m m u n e s y s t e m a s w e l l a s p l a t e l e t s a n d o t h e r p r o i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s a n d c y t o t o x i c f a c t o r s . E x p o s u r e t o a m o d e s t d o s e o f L P S d o e s n o t r e s u l t i n o v e r t t i s s u e i n j u r y b u t d o e s g e n e r a t e a n i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e . H e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n i s o b s e r v e d a t n o n i n j u r i o u s d o s e s o f L P S ( S p i t z e r a n d M a y e r , 1 9 9 3 ; S p i t z e r e t a l . , 1 9 9 4 ; S h i b a y a m a e t a l . , 1 9 9 5 ) . I n v i t r o , K 0 3 a n d o t h e r m a c r o p h a g e s a r e a c t i v a t e d , r e s u l t i n g i n t h e r e l e a s e o f T N F - o r , P G s a n d o t h e r s o l u b l e m e d i a t o r s 4 2 2 0 : 3 0 0 ( M i c h i e e t a l . , 1 9 8 8 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ; R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ) . I t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t t h e s e m e d i a t o r s c a n a l t e r p a r e n c h y m a l c e l l h o m e o s t a s i s ( r e v i e w e d i n R o t h e t a I . , 1 9 9 7 ) . I n s u m m a r y , e x p o s u r e t o a n a c u t e l y t o x i c d o s e o f L P S r e s u l t s i n t h e a c t i v a t i o n o f i n f l a m m a t o r y c e l l s , r e l e a s e o f p r o i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s a n d c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n u l t i m a t e l y l e a d i n g , t h r o u g h a c o m p l e x i n t e r a c t i o n o f t h e s e f a c t o r s , t o l i v e r i n j u r y ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ) . E x p o s u r e t o a s m a l l e r , n o n i n j u r i o u s d o s e o f L P S r e s u l t s i n t h e p r e s e n c e o f i n f l a m m a t o r y c e l l s a n d p r o d u c t i o n o f p r o i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s a t l e v e l s t h a t d o n o t c a u s e o v e r t i n j u r y b u t c a n a l t e r c e l l u l a r h o m e o s t a s i s . T h i s m i l d i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e i n c o n j u n c t i o n w i t h h e p a t i c c e l l s t h a t a l r e a d y h a v e u n d e r g o n e x e n o b i o t i c - i n d u c e d c e l l u l a r h o m e o s t a t i c a l t e r a t i o n s c a n p r o d u c e f r a n k i n j u r y ( R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ; G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . 1 . 0 . 8 . L P S P o t e n t i a t e s H e p a t o t o x i c a n t - I n d u c e d I n j u r y L P S p o t e n t i a t i o n o f h e p a t o t o x i c a n t - i n d u c e d i n j u r y o c c u r s i n a n u m b e r o f m o d e l s ( r e v i e w e d i n R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ; G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) , w i t h h e p a t o t o x i c a n t s s u c h a s c a r b o n t e t r a c h l o r i d e ( F o r m a l e t a l . , 1 9 6 0 ) , c a d m i u m ( C o o k e t a l . , 1 9 7 4 ) , g a l a c t o s a m i n e ( G a l a n o s e t a l . , 1 9 7 9 ) , e t h a n o l ( N o l a n e t a l . , 1 9 8 0 ; B h a g w a n d e e n e t a l , 1 9 8 7 ) , h a l o t h a n e ( L i n d e t a I . , 1 9 8 4 ) , T - 2 t o x i n ( T a i a n d P e s t k a , 1 9 8 8 ) , a l l y l a l c o h o l ( S n e e d e t a l . , 1 9 9 7 ) , a f l a t o x i n B 1 ( B a r t o n 9 ! a l . , 2 0 0 0 6 ) , a n d c o c a i n e ( L a b i b e t a l . , 2 0 0 2 ) . O t h e r i n f l a m m a g e n s ( s u c h a s v i t a m i n A a n d C o r y n e b a c t e r i u m p a r v e m ) i n a d d i t i o n t o L P S c a n a l s o p o t e n t i a t e l i v e r i n j u r y 4 3 a l l B I i n : H a s L G I ! i n c o n j u n c t i o n w i t h h e p a t o t o x i c a n t c o e x p o s u r e ( R a i f o r d a n d T h i g p e n , 1 9 9 4 ; W u e w e e r a e t a l . , 1 9 9 6 ; G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . D e s p i t e t h e s e h e p a t o t o x i c a n t s b e i n g m e c h a n i s t i c a l l y d i v e r s e a n d c a u s i n g i n j u r y t o d i f f e r e n t r e g i o n s o f t h e l i v e r l o b u l e , L P S c o e x p o s u r e a u g m e n t s t h e l i v e r d a m a g e . F u t h e r r n o r e , f o r e a c h o f t h e s e t h e o v e r a l l m e c h a n i s m o f i n j u r y a p p e a r s t o i n v o l v e a s p e c t s o f t h e i n f l a m m a t o r y s y s t e m , i n c l u d i n g , b u t n o t l i m i t e d t o , K C s , T N F a , P M N s , C O X - 2 , P A F a n d o t h e r s ( r e v i e w e d i n G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h L P S a u g m e n t s h e p a t o t o x i c a n t - i n d u c e d i n j u r y a p p e a r s t o b e c o m p l e x a n d n o t n e c e s s a r i l y u n i v e r s a l . F o r e x a m p l e , i n t h e a l l y l a l c o h o l / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l , K C s , P M N s a n d C O X - 2 p r o d u c t s a r e c r i t i c a l f a c t o r s , b u t T N F - o r i s n o t ( S n e e d e t a l . , 1 9 9 7 ; K i n s e r e t a l . , 2 0 0 0 ; G a n e y e t a l . , 2 0 0 1 ) . C o n v e r s e l y , i n t h e a f l a t o x i n B 1 / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l , P M N s a n d T N F - o r a r e i m p o r t a n t i n t h e m e c h a n i s m o f i n j u r y b u t C O X - 2 p r o d u c t s a r e n o t ( B a r t o n e t a l . , 2 0 0 0 a ; B a r t o n e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e r e a s o n f o r t h e s e d i f f e r e n c e s i n c r i t i c a l i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s w i t h t h e s e m o d e l s i s u n c l e a r b u t m a y h a v e t o d o w i t h t h e m e c h a n i s t i c c o n t r i b u t i o n o f t h e p a r t i c u l a r h e p a t o t o x i c a n t ( i . e . , a l l y l a l c o h o l o r a f l a t o x i n B 1 ) t o t h e o v e r a l l i n j u r y m e c h a n i s m ( G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . L P S p o t e n t i a t i o n o f h e p a t o t o x i c a n t - i n d u c e d i n j u r y d e p e n d s o n t h e e x p o s u r e t i m e b e t w e e n L P S a n d t h e h e p a t o t o x i c a n t . L P S p r e t r e a t m e n t a d a y o r m o r e b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f c a r b o n t e t r a c h l o r i d e , a c e t a m i n o p h e n o r o r - n a p h t h y l i s o t h i o c y a n a t e , f o r e x a m p l e , p r o t e c t s a g a i n s t l i v e r i n j u r y ( C a l c a m u g g i e t a l . , 1 9 9 2 ; L i u e t a l . , 2 0 0 0 ) , w h e r e a s c o n c u r r e n t L P S e x p o s u r e e n h a n c e s c a r b o n t e t r a c h l o r i d e - i n d u c e d l i v e r i n j u r y ( F e r m a l e t a I . , 1 9 6 0 ) . T h i s d e c r e a s e d t o x i c i t y , o r c r o s s - t o l e r a n c e , i s t h o u g h t t o d e v e l o p f r o m d e c r e a s e d c y t o c h r o m e P 4 5 0 l e v e l s o r a n i n c r e a s e d a m o u n t o f a n t i o x i d a n t s t h a t d e v e l o p i n p a r t f r o m t h e d o w n r e g u l a t i o n o f p r o i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s ( L i u e t a l . , 2 0 0 0 ) . C o n s e q u e n t l y , a u g m e n t e d t o x i c i t y d e v e l o p s w h e n L P S i s a d m i n i s t e r e d c l o s e r i n t i m e ( e . g . , w i t h i n a f e w h o u r s ) t o a d m i n i s t r a t i o n o f t h e h e p a t o t o x i c a n t ( G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . I n t e r e s t i n g l y , f o r l i v e r i n j u r y t o d e v e l o p i n t h e a l l y l a l c o h o l / L P S c o t r e a t m e n t m o d e l i t d o e s n o t m a t t e r w h e t h e r L P S a d m i n i s t r a t i o n i m m e d i a t e l y ( i . e . , w i t h i n a f e w h o u r s ) p r e c e d e s o r o c c u r s s h o r t l y a f t e r a l l y l a l c o h o l a d m i n i s t r a t i o n f o r l i v e r i n j u r y t o d e v e l o p . H o w e v e r , i n t h e L P S / c o c a i n e - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l , i f L P S a d m i n i s t r a t i o n f o l l o w s ( i . e . , a b o u t 4 h o u r s ) c o c a i n e a d m i n i s t r a t i o n , l i v e r i n j u r y d e v e l o p s ( L a b i b e t a l . , 2 0 0 2 ) , w h e r e a s w h e n L P S a d m i n i s t r a t i o n p r e c e d e s c o c a i n e a d m i n i s t r a t i o n b y 3 t o 6 h o u r s l i v e r i n j u r y d o e s n o t d e v e l o p ( R e i d a n d B o m h e i m , 2 0 0 1 ) . M o r e o v e r , a l t e r a t i o n s i n t h e s e q u e n c e o f h e p a t o t o x i c a n t a n d L P S a d m i n i s t r a t i o n c a n c h a n g e t h e n a t u r e o f t h e t o x i c i t y ( i . e . , f r o m h e p a t o t o x i c i t y t o e x t r a h e p a t i c t o x i c i t y ) . T h i s c h a n g e h a s b e e n o b s e r v e d i n s e v e r a l m o d e l s o f L P S a u g m e n t a t i o n o f i n j u r y , s u c h a s w i t h c a d m i u m ( C o o k e t a l . , 1 9 7 4 , 1 9 7 5 ) , l e a d ( S e l y e e t a l . , 1 9 6 6 ; T r e j o e t a l . , 1 9 7 2 ) a n d g a l a c t o s a m i n e ( G a l a n o s e t a l . , 1 9 7 9 ) . I n t h e s e m o d e l s , t h e g r e a t e s t m o r t a l i t y o c c u r r e d w h e n r a t s w e r e t r e a t e d w i t h h e p a t o t o x i c a n t a n d L P S s i m u l t a n e o u s l y r a t h e r t h a n h o u r s a p a r t . I n a p r i m a t e m o d e l , 1 0 0 % l e t h a l i t y w a s o b s e r v e d u p o n t h e s i m u l t a n e o u s a d m i n i s t r a t i o n o f n o n l e t h a l d o s e s o f L P S a n d l e a d a c e t a t e . D e a t h f r o m t h i s c o e x p o s u r e w a s l i k e l y d u e t o c i r c u l a t o r y s h o c k ( H o l p e r e t a l . , 1 9 7 3 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e t e m p o r a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n L P S a n d h e p a t o t o x i c a n t e x p o s u r e 4 5 s e e m s t o d i c t a t e t h e t a r g e t o r g a n ( i . e . , e x t r a h e p a t i c i n j u r y ) a n d w h e t h e r t h e r e w i l l b e a u g m e n t a t i o n i n l i v e r i n j u r y o r a p r o t e c t i v e e f f e c t . L P S h a s a p o t e n t i a l t o d e c r e a s e t h e t h r e s h o l d f o r t o x i c i t y f o r a n u m b e r o f m e c h a n i s t i c a l l y d i v e r s e h e p a t o t o x i c a n t s . I n d e e d , e x p o s u r e o f a n i m a l s t o a n a c u t e , m o d e s t , n o n i n j u r i o u s d o s e o f L P S m a y e n h a n c e i n j u r y i n l i v e r c e l l s h o m e o s t a t i c a l l y a l t e r e d b y a h e p a t o t o x i c a n t ( R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ; G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . T o e l u c i d a t e f u r t h e r t h i s p h e n o m e n o n , m o n o c r o t a l i n e ( M C T ) , a p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d ( P A ) , w a s s e l e c t e d a s t h e c h e m i c a l o f i n t e r e s t . 1 . D . M o n o c r o t a l i n e 1 . D . 1 . P y r r o l i z i d i n e A l k a l o i d s P A s e n c o m p a s s a g r o u p o f s t r u c t u r a l l y r e l a t e d p l a n t c o m p o u n d s c o n s i s t i n g o f a p y r r o l i z i d i n e n u c l e u s w i t h v a r i o u s f u n c t i o n a l g r o u p s a t t a c h e d ( M c L e a n , 1 9 7 0 ) . T h e p y r r o l i z i d i n e n u c l e u s c o n s i s t s o f t w o f u s e d , f i v e - m e m b e r e d r i n g s c o n n e c t e d b y a s i n g l e n i t r o g e n a t o m a t t h e c e n t e r o f t h e m o l e c u l e . S i d e c h a i n s o f v a r i o u s l e n g t h s a n d c o m p o s i t i o n s a r e a t t a c h e d t o t h e 1 a n d / o r 7 p o s i t i o n o f t h e p y r r o l i z i d i n e n u c l e u s ( H u x t a b l e , 1 9 7 9 ; P r a k a s h e t a l . , 1 9 9 9 ) . P A s o f t e n o c c u r a s f r e e a l k a l o i d s o r a l k a l o i d N - o x i d e s . N e a r l y f o u r h u n d r e d P A s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n o v e r 6 , 0 0 0 p l a n t s — c h i e f l y o f t h e B o r a g i n a c e a e , C o m p o s i t a e , a n d L e g u m i n o s a e f a m i l i e s — s p a n n i n g t h e g l o b e ( H u x t a b l e , 1 9 8 9 ; S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ) . M o s t o f t h e s e p l a n t s c o n t a i n v a r i o u s m i x t u r e s o f P A s a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s a n d w i t h d i f f e r e n t t o x i c i t i e s . F o r p l a n t s , t h e s e p h y t o t o x i n s m a y 4 6 p l a y a n i m p o r t a n t d e f e n s i v e r o l e a g a i n s t i n s e c t h e r b i v o r e s . I n t e r m s o f m a m m a l i a n t o x i c i t y , h o w e v e r , P A - c o n t a i n i n g p l a n t s r e p r e s e n t a n o f t e n “ u n d e r s t u d i e d , b u t p o t e n t i a l l y i m p o r t a n t s o u r c e o f e x p o s u r e t o p l a n t t o x i n s a n d c a r c i n o g e n s ” f o r a n i m a l s a n d h u m a n s ( H u x t a b l e , 1 9 8 9 ; S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ) P A - c o n t a i n i n g p l a n t s a r e r e s p o n s i b l e f o r l i v e s t o c k a n d h u m a n m o r b i d i t y a n d m o r t a l i t y , e s p e c i a l l y i n t h i r d - w o r l d c o u n t r i e s . T h e y a r e o f t e n c o n s i d e r e d n o x i o u s w e e d s t h a t c a n e a s i l y i n v a d e f i e l d s a n d c r o p s . H o w e v e r , s o m e P A - c o n t a i n i n g p l a n t s h a v e a g r i c u l t u r a l u s e s . G r e t a / a r i a s p e c t a b i l i s , f o r e x a m p l e , h a s b e e n e m p l o y e d a s a l e g u m i n o u s c o v e r c r o p t o p r e v e n t s o i l e r o s i o n a n d t o i n c r e a s e s o i l n i t r o g e n c o n t e n t ( C h e e k e , 1 9 8 9 ; S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ; S t e g e l m e i e r e t a l . , 1 9 9 9 ) . W i l d l i f e a n d l i v e s t o c k g r a z i n g o n P A - c o n t a i n i n g p l a n t s o f t e n f i n d t h e m t o b e u n p a l a t a b l e a n d s u b s e q u e n t l y d o n o t u s u a l l y f o r a g e o n t h e m . H o w e v e r , t h e y m a y b e e x p o s e d t o t h e s e p l a n t s t h r o u g h a c c i d e n t a l g r a z i n g o r b y c o n s u m i n g t h e m o u t r i g h t w h e n n o o t h e r f o r a g e i s a v a i l a b l e . A m o r e c o m m o n w a y f o r l i v e s t o c k t o b e e x p o s e d t o P A s i s t h r o u g h t h e c o n s u m p t i o n o f p r e p a r e d f e e d s o r g r a i n c o n t a m i n a t e d w i t h P A s ( S t e g e l m e i e r e r a l . , 1 9 9 9 ) . I n s o m e a r e a s o f t h e U S , a s i g n i f i c a n t p o r t i o n o f l i v e s t o c k h a s b e c o m e c r i t i c a l l y i l l o r d i e d a s a r e s u l t o f l i v e r d i s e a s e f r o m g r a z i n g o n P A - c o n t a i n i n g p l a n t s . I n t h e U S . a l o n e i n t h e 1 9 7 0 ’ s , l o s s e s t o c a t t l e m a n a n d o t h e r l i v e s t o c k o w n e r s w a s e s t i m a t e d t o b e i n t h e t e n s o f m i l l i o n s o f d o l l a r s e a c h y e a r ( H u x t a b l e , 1 9 7 9 ) . 4 7 H u m a n e x p o s u r e t o P A s o c c u r s t h r o u g h t h e c o n s u m p t i o n o f c o n t a m i n a t e d f o o d s t u f f s ( s u c h a s c e r e a l g r a i n , c o o k i n g o i l s , m i l k , a n d p o s s i b l y h o n e y ) a n d t h r o u g h t h e i n g e s t i o n o f a l t e r n a t i v e m e d i c i n e s . A c c i d e n t a l c o n t a m i n a t i o n o f c e r e a l c r o p s i n t h e p a s t h a s l e d t o e p i d e m i c P A p o i s o n i n g s i n T a d j i k i s t a n , U z b e c k i s t a n , J a p a n , N i g e r i a , A f g h a n i s t a n , I n d i a , S r i L a n k a , S o u t h A f r i c a , I r a q , a n d t h e C a r i b b e a n . T h e l a r g e s t r e p o r t e d i n c i d e n t o f P A p o i s o n i n g o c c u r r e d i n A f g h a n i s t a n i n 1 9 7 4 . A p p r o x i m a t e l y 7 , 8 0 0 i n d i v i d u a l s w e r e a f f e c t e d o u t o f a p o p u l a t i o n o f 3 5 , 0 0 0 i n n e a r l y 1 0 0 v i l l a g e s f r o m t h e c o n s u m p t i o n o f w h e a t f l o u r h e a v i l y c o n t a m i n a t e d w i t h s e e d s f r o m t h e P A - c o n t a i n i n g H e l i o t r o p i u m g e n u s . M a n y d e a t h s r e s u l t e d f r o m t h i s e x p o s u r e , p r i m a r i l y d u e t o h e p a t i c v e n o — o c c l u s i v e d i s e a s e ( H V O D ; P r a k a s h e t a l . , 1 9 9 9 ; S t e g e l m e i e r e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h i s i s n o t s u r p r i s i n g s i n c e t h e m a j o r t a r g e t o r g a n f o r h u m a n s p o i s o n e d w i t h P A i s t h e l i v e r ( K a s t u r i e t a l . , 1 9 7 9 ) . H V O D i s c h a r a c t e r i z e d b y t h e o c c l u s i o n o f c e n t r a l v e i n s o f t h e h e p a t i c c i r c u l a t i o n t h a t l e a d s t o c i r r h o s i s a n d l i v e r f a i l u r e ( S t e g e l m e i e r e f a l . , 1 9 9 9 ) . A m o r e c o m p r e h e n s i v e c h a r a c t e r i z a t i o n o f H V O D i s p r o v i d e d i n t h e n e x t s e c t i o n . B e s i d e s H V O D , h e p a t o m e g a l y a n d m e g l a o c y t o s i s a l s o o c c u r ( S c h o e n t a l a n d H e a d , 1 9 5 5 ; M c L e a n , 1 9 7 0 ; M a t t o c k s , 1 9 8 6 ) . A l t h o u g h e p i d e m i c p o i s o n i n g s h a v e b e c o m e l e s s o f a p r o b l e m i n r e c e n t y e a r s d u e t o t h e u s e o f h e r b i c i d e s a n d t o g r a i n i n s p e c t i o n i n m o r e m o d e r n i z e d c o u n t r i e s , P A - p o i s o n i n g i n h u m a n s a n d l i v e s t o c k m a y s t i l l b e a n a r e a o f c o n c e r n i n l e s s d e v e l o p e d r e g i o n s . H u m a n s c a n a l s o b e p o i s o n e d a f t e r c o n s u m i n g P A - c o n t a i n i n g p l a n t s i n a l t e r n a t i v e m e d i c i n e s , s u c h a s h e r b a l t e a s . P r e v i o u s l y i n J a m a i c a , H V O D w a s e n d e m i c b e c a u s e o f t h e c o n s u m p t i o n o f t e a s p r e p a r e d f r o m l e a v e s o f w i l d s c r u b 4 8 f r o m I t 1 9 7 0 ’ s w i d e l y ( S t i l l m e i n a l t e r i d e n t i t i q N u m e r c a c c i d e r c o n s u m O f fi c i n a l m o n t h ; C o n s u m . A d e n o s j d e V G I O p g W e i g h t i F e d e I a l W i l d i n g h a V e b e r e m e d l e t h e r a I D G I T p h I ’ S i o l o a n d I O I a f r o m t h e S e n e c i o o r C r a t e / a r i a g e n e r a ( H u x t a b l e , 1 9 7 9 ) . I n t h e U S . d u r i n g t h e 1 9 7 0 ’ s , P A p o i s o n i n g a l s o o c c u r r e d i n A r i z o n a d u e t o t h e c o n s u m p t i o n o f a w i d e l y u s e d a n d c o m m e r c i a l l y m a r k e t e d h e r b a l t e a c a l l e d g o r d o l o b a y e r b a ( S t i l l m a n e t a l . , 1 9 7 7 ) . W i t h i n t h e l a s t d e c a d e t h e r e h a s b e e n i n c r e a s i n g i n t e r e s t i n a l t e r n a t i v e m e d i c i n e s , e s p e c i a l l y t h e u s e o f h e r b a l r e m e d i e s . P A s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n t r a d i t i o n a l h e r b a l m e d i c i n e s o f S o u t h A m e r i c a , A f r i c a a n d C h i n a . N u m e r o u s P A - r e l a t e d p o i s o n i n g s h a v e o c c u r r e d t h r o u g h d e l i b e r a t e i n g e s t i o n o r a c c i d e n t a l c o n t a m i n a t i o n o f h e r b a l p r e p a r a t i o n s . I n o n e c a s e , a n i n d i v i d u a l c o n s u m i n g a p o w d e r s u p p o s e d l y c o n t a i n i n g g r o u n d c o m f r e y r o o t ( S y m p h y t u m o f f i c i n a l e ) , f o r u s e a s a d i e t a r y s u p p l e m e n t , c o n s u m e d 8 5 m g o f P A o v e r a s i x - m o n t h p e r i o d w i t h t h e r e s u l t o f H V O D . I n a n o t h e r c a s e , a n 1 8 - m o n t h - o l d b o y c o n s u m e d a n h e r b a l t e a m i x t u r e c o n t a m i n a t e d w i t h t h e P A - c o n t a i n i n g p l a n t A d e n o s l y l e s a l l i a r i a e ( m i s t a k e n f o r c o l t s f o o t ) f o r 1 5 m o n t h s t o a i d i n t h e h e a l t h y d e v e l o p m e n t o f t h e c h i l d . T h e c h i l d c o n s u m e d a p p r o x i m a t e l y 6 0 u g / k g b o d y w e i g h t p e r d a y f o r 1 5 m o n t h s w i t h t h e r e s u l t o f H V O D . R e c e n t l y , t h e G e r m a n F e d e r a l H e a l t h D e p a r t m e n t l i m i t e d t h e u s e o f o v e r 6 0 0 h e r b a l r e m e d i e s , i n c l u d i n g s e v e r a l t h a t c o n t a i n e d l a r g e c o n c e n t r a t i o n s o f P A s . S i m i l a r r e g u l a t i o n s h a v e b e e n p r o p o s e d w o r l d w i d e . F u r t h e r m o r e , d u e t o P A t o x i c i t y , s e v e r a l h e r b a l r e m e d i e s i n t r a d i t i o n a l C h i n e s e m e d i c i n e a r e n o l o n g e r r e c o m m e n d e d f o r t h e r a p e u t i c u s e ( P r a k a s h e t a I . , 1 9 9 9 ; S t e g e l m e i e r e t a I . , 1 9 9 9 ; R o e d e r , 2 0 0 0 ) . T h e t o x i c e f f e c t s o f P A s t e n d t o v a r y w i t h s p e c i e s , a g e , g e n d e r , p h y s i o l o g i c a l a n d n u t r i t i o n a l s t a t e , p l a n t s p e c i e s c o n s u m e d , d u r a t i o n o f e x p o s u r e , a n d t o t a l d o s e o f a l k a l o i d c o n s u m e d ( M c L e a n , 1 9 7 0 ; H u x t a b l e , 1 9 8 9 ) . I n j u r y 4 9 f r o m c s p l e n o t r a c t , o c c u r r c a n c e r a n i m a l 1 . D 2 . c a r d I O p ! t h e f o l i a M a j o r 5 c o m m o n C m m h n L i C e r e a l 9 W h e r e a s p y r r o l i z i d f r o m c h r o n i c P A p o i s o n i n g i s n o t l i m i t e d t o t h e c l a s s i c f e a t u r e s o f H V O D , h e p a t o - s p l e n o m e g a l y a n d e m a c i a t i o n , b u t a l s o i n c l u d e s i n j u r y t o t h e l u n g s , h e a r t , G I t r a c t , p a n c r e a s , a n d k i d n e y s . I n a d d i t i o n , t e r a t o g e n e s i s a n d c a r c i n o g e n e s i s h a v e o c c u r r e d i n s o m e e x p e r i m e n t a l a n i m a l s a s a r e s u l t o f P A e x p o s u r e . N o c a s e s o f c a n c e r h a v e b e e n r e p o r t e d f r o m P A e x p o s u r e i n h u m a n s o r d o m e s t i c a t e d a n i m a l s , h o w e v e r ( M a t t o c k , 1 9 8 6 ; P r a k a s h e t a l . , 1 9 9 9 ; S t e g e l m e i e r e t a l . , 1 9 9 9 ) . 1 . 0 . 2 . M o n o c r o t a l i n e a s a F o o d - b o r n e H e p a t o t o x i c a n t M C T i s a P A p h y t o t o x i n t h a t i s w e l l k n o w n f o r h e p a t i c a n d c a r d i o p u l m o n a r y t o x i c i t y ( F i g u r e 1 . 3 ; S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ) . M C T o c c u r s i n t h e f o l i a g e a n d s e e d s o f p l a n t s f r o m t h e g e n u s , C r o t a l a r i a ( H u x t a b l e , 1 9 8 9 ) . M a j o r s o u r c e s o f M C T i n c l u d e C r o t a l a n ' a s p e c t a b i l i s o r r a t t l e b o x ( t h e m o s t c o m m o n s o u r c e o f M C T i n t h e U S ; m o s t l y s o u t h e r n a n d s o u t h e a s t e r n s t a t e s ) , C r o t a l a r i a r e t u s a , C r o t a l a r i a r e c t a a n d C r o t a l a n ' a s e r i c e a ( I A R C , 1 9 7 6 ) . L i k e o t h e r P A s , h u m a n e x p o s u r e t o M C T o c c u r s t h r o u g h c o n s u m p t i o n o f c e r e a l g r a i n s , c o o k i n g o i l s , a n d h e r b a l t e a s a n d m e d i c i n e s ( H u x t a b l e , 1 9 8 9 ) , w h e r e a s a n i m a l e x p o s u r e o c c u r s p r i m a r i l y t h r o u g h g r a z i n g o n p a s t u r e s w i t h p y r r o l i z i d i n e - c o n t a i n i n g p l a n t s ( M c L e a n , 1 9 7 0 ) . 5 0 F i g u r e 1 . 3 . C h e m i c a l S t r t g L u r e o f M C T a n d M C T P . M C T o r 1 2 8 , 1 3 B - d e h y d r o x y - 1 2 0 , 1 3 d , 1 4 d - t r i m e t h y I - c r o t a l - 1 - e n i n e i s a P A p h y t o t o x i n t h a t i s a m a c r o c y c l i c d i e s t e r o f r e t r o n e c i n e t o w h i c h m o n o c r o t a l i c a c i d i s e s t e r i f i e d a t t h e 1 a n d 7 p o s i t i o n . I t i s n o r m a l l y s t a b l e a n d n o n t o x i c . M C T m u s t b e b i o a c t i v a t e d b y t h e c y t o c h r o m e P 4 5 0 ( C Y P ) 3 A s u b f a m i l y t o M C T P t o p r o d u c e t o x i c i t y . 5 ] H a l 5 2 M C T c a u s e s h e p a t i c i n j u r y , w h i c h i s c l i n i c a l l y e v i d e n t a s H V O D ( B r a s e t a l . , 1 9 5 4 ) . M C T i s o f t e n u s e d e x p e r i m e n t a l l y t o g e n e r a t e a r e p r o d u c i b l e H V O D m o d e l ( M c L e a n , 1 9 7 0 ) . A l t h o u g h H V O D s t i l l a r i s e s i n h u m a n s a n d a n i m a l s f r o m P A p o i s o n i n g , m o s t c a s e s o f H V O D a r e t h e r e s u l t o f h i g h - d o s e c y t o r e d u c t i v e t h e r a p y i n b o n e m a r r o w a n d s t e m c e l l t r a n s p l a n t a t i o n ( B e a r r n a n , 2 0 0 0 ; C a r r e r a s , 2 0 0 0 , D e L e v e , 2 0 0 1 ) . M o r e o v e r , H V O D i s o n e o f t h e l e a d i n g c a u s e s o f m o r t a l i t y i n b o n e m a r r o w t r a n s p l a n t p a t i e n t s ( D e L e v e , 2 0 0 1 ) . I n t h e r a t m o d e l f o r H V O D , e a r l y H V O D ( i . e . , d a y 3 t o 5 ) i s c h a r a c t e r i z e d b y c e n t r i l o b u l a r n e c r o s i s , s e v e r e s i n u s o i d a l i n j u r y , s e v e r e s i n u s o i d a l h e m o r r h a g e , a n d s e v e r e d a m a g e t o t h e c e n t r a l v e i n e n d o t h e l i u m ( D e L e v e e t a l . , 1 9 9 9 ) . I n l a t e H V O D ( i . e . , d a y s 6 a n d 7 ) , l i v e r s a r e c h a r a c t e r i z e d b y s u b e n d o t h e l i a l a n d a d v e n t i a l f i b r o s i s o f t h e c e n t r a l v e i n , d a m a g e t o t h e c e n t r a l v e i n e n d o t h e l i u m w i t h s u b e n d o t h e l i a l h e m o r r h a g e , a n d s o m e r e c o v e r y o f t h e s i n u s o i d a l w a l l ( D e L e v e e t a l . , 1 9 9 9 ) . A c c o r d i n g l y , w h i l e M C T m a y r a i s e c o n c e r n a s a f o o d - b o m e h e p a t o t o x i n , i t i s a l s o u s e f u l f o r g e n e r a t i n g a r e p r o d u c i b l e H V O D m o d e l i n r a t s t o s t u d y c l i n i c a l H V O D p o t e n t i a l l y a r i s i n g f r o m b o n e m a r r o w t r a n s p l a n t a t i o n ( D e L e v e e t a I . , 1 9 9 9 ) . P r i o r t o t h e 1 9 8 0 ’ s , d i a g n o s i s o f P A p o i s o n i n g ( a n d c o n s e q u e n t l y M C T p o i s o i n i n g ) w a s o f t e n m a d e o n e p i s o d i c , c i r c u m s t a n t i a l e v i d e n c e a n d o b s e r v a t i o n o f c h a r a c t e r i s t i c l i v e r l e s i o n s . H e n c e , d e t e r m i n a t i o n o f t h e e x a c t d o s e o f M C T , f o l l o w i n g c h r o n i c e x p o s u r e , n e e d e d t o p r o d u c e H V O D i n h u m a n s i s d i f f i c u l t . F o r e x a m p l e , H u x t a b l e ( 1 9 8 9 ) r e p o r t e d t h a t g r a i n c o n t a m i n a t i o n i n c e n t r a l I n d i a l e d t o h u m a n s y m p t o m s o f H V O D . I n f o r t y - t w o p e r c e n t o f t h e 6 7 c a s e s s t u d i e d , p o i s o n i n g r e s u l t e d i n d e a t h . C o n t a m i n a t i o n o f g r a i n w a s d u e t o C r a t e / a r i a n a n a , 5 3 a P A - c o n t a i n i n g s p e c i e s c o n s i s t i n g o f M C T a n d f u l v i n e . I t i s e s t i m a t e d t h a t v i l l a g e r s c o n s u m e d o n a v e r a g e l e s s t h a n 4 0 m g o f P A s p e r d a y ( H u x t a b l e , 1 9 8 9 ) . A d d i t i o n a l l y , M a t t o c k s ( 1 9 8 6 ) e s t i m a t e d t h a t a c u m u l a t i v e d o s e ( t a k e n w i t h i n a f e w w e e k s ) o f P A s f r o m C r o t a l a r i a e x c e e d i n g 1 0 m g / k g w o u l d r e s u l t i n H V O D . C h i l d r e n a p p e a r t o b e m o r e s u s c e p t i b l e t o P A - i n d u c e d t o x i c i t y t h a n a d u l t s ( M a t t o c k s , 1 9 8 6 ) . 1 . 0 . 3 . C h e m i c a l , S t r u c t u r e , P r o p e r t i e s a n d M e t a b o l i s m M C T o r 1 2 8 , 1 3 8 - d e h y d r o x y — 1 2 a , 1 3 0 , 1 4 a - t r i m e t h y l - c r o t a l - 1 - e n i n e i s a m a c r o c y c l i c d i e s t e r o f r e t r o n e c i n e t o w h i c h m o n o c r o t a l i c a c i d i s e s t e r i f i e d a t p o s i t i o n s 1 a n d 7 ( F i g u r e 1 . 3 ; S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ) . T h e c h e m i c a l s t r u c t u r e o f M C T h a s b e e n c o n f i r m e d b y i n f r a r e d , n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e , a n d m a s s s p e c t r o m e t r y ( C u l v e n o r a n d D a l B o n , 1 9 6 4 ; P r a k a s h e t a l . , 1 9 9 9 ) . W h e n p u r i f i e d , t h i s b i t t e r - t a s t i n g c o m p o u n d h a s a m o l e c u l a r w e i g h t o f 3 2 5 . 3 g a n d a m e l t i n g p o i n t o f 2 0 2 - 2 0 3 ° C ( s e e I A R C , 1 9 7 6 f o r m o r e c h e m i c a l a n d p h y s i c a l d a t a ; S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ) . M C T i s c h e m i c a l l y s t a b l e a n d n o n t o x i c . W i t h i n t h e l i v e r , M C T c a n u n d e r g o N - o x i d a t i o n , h y d r o x y l a t i o n a n d e s t e r h y d r o l y s i s t o f o r m n o n t o x i c p r o d u c t s . M C T m a y a l s o u n d e r g o d e h y d r o g e n a t i o n t o r e s u l t i n a t o x i c p r o d u c t ( M c L e a n , 1 9 7 0 ; M a t t o c k s a n d W h i t e , 1 9 7 1 ; M a t t o c k s , 1 9 8 6 ; S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ) . I n d e e d , f o r i n j u r y t o o c c u r , M C T m u s t b e m e t a b o l i z e d b y c y t o c h r o m e P 4 5 0 ( C Y P ) t o i t s t o x i c m e t a b o l i t e , m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e ( M C T P o r d e h y d r o m o n o c r o t a l i n e ; F i g u r e 1 . 3 ; M a t t o c k s , 1 9 6 8 ; M c L e a n , 1 9 7 0 ) . W h e n i n h i b i t o r s o r i n d u c e r s o f C Y P s a r e 5 4 a d m i n i s t e r e d i n v i v o , t o x i c i t y a n d t i s s u e c o n c e n t r a t i o n s o f p y r r o l e s a r e a l t e r e d a c c o r d i n g l y ( i . e . , d e c r e a s e d o r i n c r e a s e d , r e s p e c t i v e l y ; M a t t o c k s a n d W h i t e , 1 9 7 1 ; A l l e n e t a l . , 1 9 7 2 ; M a t t o c k s , 1 9 7 2 ; S c h u l l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ) . T h e C Y P 3 A s u b f a m i l y i s t h e p r i m a r y C Y P i s o z y m e f a m i l y r e s p o n s i b l e f o r t h e b i o a c t i v a t i o n o f M C T ( K a s a h a r a e r a l . , 1 9 9 7 ; R e i d e t a l . , 1 9 9 8 ) . C u r r e n t l y , i t i s u n c l e a r w h i c h s p e c i f i c i s o z y m e ( s ) o f t h e s u b f a m i l y i s i n v o l v e d i n M C T b i o a c t i v a t i o n . F o r t h e r e l a t e d P A s e n e c i o n i n e , C Y P 3 A 2 ( P C N - E ) w a s f o u n d t o r e s p o n s i b l e f o r b i o a c t i v a t i o n ( W i l l i a m s , e t a l . , 1 9 8 9 ) . F i n a l l y , t h e E h r l i c h a s s a y i s o f t e n u s e d t o e s t i m a t e t h e f o r m a t i o n o f p y r r o l e s i n l i v e r , w h i c h m a y s e r v e a s a m a r k e r o f b i o a c t i v a t i o n o f M C T t o t o x i c p y r r o l e m e t a b o l i t e s ( s u c h a s M C T P ; M c L e a n , 1 9 7 0 ) . T h e g e n e r a t i o n o f M C T P i s a m a j o r m e t a b o l i c p a t h w a y f o r M C T , a n d t h e r e i s a s t r o n g c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e a m o u n t o f M C T P f o u n d i n t i s s u e s ( e . g . , l i v e r , l u n g , e t c . ) a n d t i s s u e i n j u r y ( M a t t o c k s , 1 9 7 2 ; C h e s n e y e t a l . , 1 9 7 4 ) . I n d e e d , M C T P h a s b e e n i m p l i c a t e d a s a c a u s a t i v e a g e n t i n H V O D ( H u x t a b l e , 1 9 8 9 ) . I t i s t h o u g h t t h a t M C T P , f o r m e d i n t h e l i v e r , i s r e s p o n s i b l e f o r h e p a t o t o x i c i t y a s w e l l a s e x t r a h e p a t i c t o x i c i t y ( s u c h a s p n e u m o t o x i c i t y ; H u x t a b l e , 1 9 9 0 ; L a m e e t a l . , 1 9 9 1 ; Y a n a n d H u x t a b l e , 1 9 9 5 ; S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ) . C h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d M C T P , w h e n a d m i n i s t e r e d v i a t h e t a i l v e i n ( i . e . , b y p a s s i n g t h e l i v e r ) r e s u l t s i n l u n g l e s i o n s i n r a t s , b u t w h e n M C T P i s a d m i n i s t e r e d v i a t h e m e s e n t e r i c v e i n ( i . e . , w h i c h g o e s d i r e c t l y t o t h e l i v e r ) l i v e r i n j u r y d e v e l o p s ( B u t l e r , 1 9 7 0 ; B r u n e r e t a l . , 1 9 8 3 , 1 9 8 6 ) . M C T P i s a r e a c t i v e e l e c t r o p h i l e t h a t i s c a p a b l e o f c a u s i n g t i s s u e i n j u r y v i a c o v a l e n t b i n d i n g w i t h n u c l e o p h i l i c m a c r o m o l e c u l e s s u c h a s D N A , p r o t e i n s a n d G S H ( R o b e r t s o n e r a l . , 1 9 7 7 ; S e a w r i g h t , 1 9 9 5 ; 5 5 ( n S t e g e l m e i e r e t a l . , 1 9 9 9 ) . A d d i t i o n a l l y , M C T P c a n a c t a s a b i f u n c t i o n a l c r o s s l i n k i n g a g e n t t h a t b i n d s m a c r o m o l e c u l e s i n c l u d i n g D N A a n d p r o t e i n s ( P e t r y e t a I . , 1 9 8 4 ; H i n c k s e t a I . , 1 9 9 1 ; H o o m e t a I . , 1 9 9 3 ) . H e n c e , b i o a c t i v a t i o n o f M C T t o M C T P i s r e s p o n s i b l e f o r l i v e r i n j u r y a s w e l l a s i n j u r y i n o t h e r t i s s u e s . 1 . D . 4 . T o x i c o k i n e t i c s M e t a b o l i c b i o a c t i v a t i o n o f M C T t o M C T P b e g i n s e a r l y a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n a n d i s e v i d e n t a s i n c r e a s e d p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n i n l i v e r f o r m o r e t h a n 2 4 h o u r s ( A l l e n e t a l . , 1 9 7 2 ; L a m e e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e p e a k l e v e l o f m e t a b o l i c p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n o c c u r s w i t h i n 1 . 5 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n a n d t h e n t a p e r s o f f o v e r t i m e . B y 4 h o u r s , t h e c o n c e n t r a t i o n o f M C T P i s a p p r o x i m a t e l y 5 0 % o f i t s p e a k v a l u e , d e c r e a s i n g t o 2 5 % b y 2 4 h o u r s a n d c o n t i n u i n g t o b e p r e s e n t a t l o w l e v e l s b y 4 8 h o u r s ( A l l e n e t a l . , 1 9 7 2 ) . F o l l o w i n g a d m i n i s t r a t i o n o f r a d i o l a b e l e d M C T , 9 0 % o f r a d i o a c t i v i t y a p p e a r e d i n t h e u r i n e a n d b i l e b y 7 h o u r s ( E s t e p e t a l . , 1 9 9 1 ) . D a t a f r o m t h e s t u d y b y E s t e p e t a l . ( 1 9 9 1 ) s u g g e s t t h a t e r y t h r o c y t e s m a y s e r v e a s c a r r i e r s o f M C T m e t a b o l i t e s , a n d t h i s m a y b e i n v o l v e d i n p u l m o n a r y t o x i c i t y . I n d e e d , L a m e e t a l . ( 1 9 9 7 ) d e t e r m i n e d t h a t h e m o g l o b i n a n d o t h e r e r y t h r o c y t e p r o t e i n s c o u l d s e r v e a s c a r r i e r s f o r r e a c t i v e p y r r o l i c m e t a b o l i t e s . S u b s e q u e n t l y , t h e s e r e a c t i v e m e t a b o l i t e s t r a v e l t o o t h e r t i s s u e s ( e . g . , l u n g ) a n d i n d u c e i n j u r y . P y r r o l e s f o r m e d i n t h e l i v e r f r o m P A s r e a c t w i t h a n u m b e r o f c e l l u l a r n u c l e o p h i l e s , e s p e c i a l l y t h o s e w i t h s u l f h y d r y l g r o u p s , s u c h a s G S H a n d p r o t e i n s ( M a t t o c k s , 1 9 8 6 , M a t t o c k s a n d J u k e s , 1 9 9 0 ; S e a w r i g h t , 1 9 9 5 ) . T h e s e t h i o l 5 6 a d d u c t s m a y e x i s t f o r s o m e t i m e a f t e r t h e i r f o r m a t i o n ( M a t t o c k s a n d J u k e s , 1 9 9 2 ) . A G S H - c o n j u g a t e d p y r r o l e h a s b e e n i d e n t i f i e d i n b l o o d a n d u r i n e o f r a t s t r e a t e d w i t h r a d i o l a b e l e d M C T ( E s t e p e t a l . , 1 9 9 0 , 1 9 9 1 ) . A s p r e v i o u s l y n o t e d , s o m e a d d u c t s h a v e t h e p o t e n t i a l t o f u r t h e r d a m a g e t o c e l l s w h e n t h e y b i n d t o m o r e s i g n i f i c a n t m a c r o m o l e c u l e s l i k e p r o t e i n s a n d . D N A . 1 . D . 5 . B i o l o g i c E f f e c t s o f M o n o c r o t a l i n e M C T c a u s e s t o x i c i t y i n a v a r i e t y o f a n i m a l s p e c i e s , i n c l u d i n g c a t t l e , h o r s e s , d o g s , c a t s , p o u l t r y , r a b b i t s , m i c e , r a t s , n o n - h u m a n p r i m a t e s a n d h u m a n s ( r e v i e w e d i n S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ) . M C T a f f e c t s a n u m b e r o f o r g a n s o t h e r t h a n t h e l i v e r , d e p e n d i n g o n t h e d o s e , r o u t e o f a d m i n i s t a t i o n a n d p o s t - t r e a t m e n t t i m e . H o w e v e r , t h e f o c u s o f t h i s d i s s e r t a t i o n i s o n t h e a c u t e l i v e r i n j u r y f o l l o w i n g c o e x p o s u r e t o s m a l l , n o n t o x i c d o s e s o f L P S a n d M C T . T h e r e f o r e , a d i s c u s s i o n o n t h e b i o l o g i c a l e f f e c t s o f M C T i n k i d n e y , h e a r t , l u n g a n d o t h e r o r g a n s i s b e y o n d t h e s c o p e o f t h i s d i s s e r t a t i o n . T h e r e a d e r i s r e f e r r e d t o s e v e r a l r e v i e w s , i n c l u d i n g : H u x t a b l e , 1 9 9 0 ; W i l s o n e t a l . , 1 9 9 2 ; S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 . A t a c u t e l y t o x i c d o s e s , M C T - i n d u c e d l i v e r l e s i o n s a r e c h a r a c t e r i z e d b y c e n t r i l o b u l a r h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s , d i l a t e d a n d c o n g e s t e d s i n u s o i d s , h e m o r r h a g e a n d i n j u r e d c e n t r a l v e n o u s e n d o t h e l i a l c e l l s a n d S E C S ( S c h o e n t a l a n d H e a d , 1 9 5 5 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 , 1 9 9 9 ; Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . T w e n t y - f o u r h o u r s a f t e r a t o x i c d o s e o f M C T , m o n o c y t e s i n c r e a s e i n t h e l i v e r w i t h a n o t i c e a b l e d e c r e a s e i n t h e p r e s e n c e o f K u p f f e r c e l l s ( D e L e v e e t a l . , 5 7 1 9 9 9 ) . F o r a m o r e d e t a i l e d c h a r a c t e r i z a t i o n o f M C T - i n d u c e d l i v e r l e s i o n s , r e f e r t o C h a p t e r 2 . M C T c a n c a u s e e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y b o t h i n v i v o ( S c h o e n t a l a n d H e a d , 1 9 5 5 ; A l l e n e t a l . , 1 9 7 2 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 9 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 0 a ) a n d i n V i t r o ( R e i n d e l a n d R o t h , 1 9 9 1 ; R e i n d e l e t a l . , 1 9 9 1 ; H o o m e t a l . , 1 9 9 3 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ) . I n v i t r o , M C T P i s c a p a b l e o f i n d u c i n g e n d o t h e l i a l c e l l d y s f u n c t i o n ( T a y l o r e t a l . , 1 9 9 6 ) . M C T P b i n d s t o e n d o t h e l i a l c e l l u l a r D N A a n d c a n i n d u c e a p o p t o s i s ( T h o m a s e t a l . , 1 9 9 6 , 1 9 9 8 ) . M o r e o v e r , M C T h a s b e e n r e p o r t e d t o b e s e l e c t i v e l y m o r e t o x i c t o S E C s t h a n t o H P C s i n v i t r o , a n d t h i s S E C t o x i c i t y m a y o r i g i n a t e f r o m p r o f o u n d G S H d e p l e t i o n ( D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ) . M C T t o x i c i t y i n H P C s i s l a r g e l y u n a f f e c t e d b y d e p l e t i o n o f G S H , b u t t h i s i s n o t t h e c a s e w i t h S E C s ( P a n e t a l . , 1 9 9 3 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ; R e i d e t a l . , 1 9 9 9 ) . M C T t o x i c i t y t o S E C S i s a t t e n u a t e d b y t h e a d d i t i o n o f e x o g e n o u s G S H ( D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ) . I t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t a s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e o f M C T c o u l d d e c r e a s e G S H c o n c e n t r a t i o n i n S E C s w i t h o u t r e s u l t i n g i n o v e r t i n j u r y . P r o o x i d a n t i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s e v o k e d b y L P S ( a s d i s c u s s e d i n 1 . 0 . 6 . 3 . 1 . ) c o u l d p r e c i p i t a t e o v e r t i n j u r y i n t h e s e S E C s w h e r e i n G S H h a s b e e n d e c r e a s e d . A l t e r n a t i v e l y , a s p r e v i o u s m e n t i o n e d , L P S - i n d u c e d e x t r a c e l l u l a r o x i d a n t s t r e s s m i g h t r e s u l t i n a n i n c r e a s e d e f f l u x o f G S H f r o m S E C s t o c o u n t e r t h e r e l e a s e o f d e l e t e r i o u s R O S f r o m p h a g o c y t i c c e l l s ( J a e s c h k e , 1 9 9 2 ) . H e n c e , L P S e x p o s u r e c o u l d f u r t h e r d e c r e a s e G S H i n S E C s t h a t h a v e b e e n e x p o s e d t o t h i s s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e o f M C T . T h e r e f o r e , i t s e e m s p o s s i b l e t h a t t h e c o m b i n e d l o s s 5 8 o f G S H f r o m S E C s c o e x p o s e d t o s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e s o f M C T a n d L P S c o u l d l e a d t o o v e r t S E C i n j u r y . A d d i t i o n a l l y , M C T c a n e l i c i t o x i d a t i v e s t r e s s i n p u l m o n a r y v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s i n v i t r o , a n d s u b s e q u e n t t r e a t m e n t w i t h d i m e t h y l t h i o u r e a , a n o x y g e n r a d i c a l s c a v e n g e r , p r e v e n t e d M C T - i n d u c e d i n c r e a s e i n c e l l u l a r o x i d a t i o n ( A z i z e t a l . , 1 9 9 9 ) . R e c e n t l y , B a y b u t t a n d M o l t e n i ( 1 9 9 9 ) s h o w e d t h a t t r e a t m e n t w i t h t h e a n t i o x i d a n t B - c a r o t e n e i n v i v o r e s u l t e d i n d e c r e a s e d h e m o r r h a g e a n d p r o t e c t i o n o f l i v e r p a r e n c h y m a a f t e r a t o x i c d o s e o f M C T . T h i s d e c r e a s e i n h e m o r r h a g e m a y s u g g e s t t h a t B - c a r o t e n e o f f e r e d s o m e p r o t e c t i o n t o S E C S . C o n s e q u e n t l y , S E C i n j u r y m a y b e d u e i n p a r t t o o x i d a t i v e s t r e s s , t h o u g h t h i s i s c o n t r o v e r s i a l ( D e L e v e e t a l . , 1 9 9 9 ) . C o p p l e e t a l . ( 2 0 0 0 b ) h a v e r e c e n t l y f o u n d t h a t c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n i s i n v o l v e d i n H P C b u t n o t i n S E C i n j u r y i n r a t l i v e r s a f t e r a n a c u t e l y t o x i c d o s e o f M C T . F i b r i n d e p o s i t i o n i n t h e m i c r o v a s c u l a t u r e s u r r o u n d i n g a n d w i t h i n t h e c e n t r i l o b u l a r l e s i o n w a s p o s t u l a t e d t o l e a d t o l o c a l h y p o p e r f u s i o n ( i . e . , m i c r o c i r c u l a t o r y d i s t u r b a n c e s ) a n d s u b s e q u e n t h y p o x i c / i s c h e m i c c e l l u l a r i n j u r y ( C o p p l e e t a l . , 2 0 0 0 a , 2 0 0 0 b ) . T a k e n t o g e t h e r , i t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t t h e i n i t i a l t a r g e t f o r M C T t o x i c i t y i s S E C S a n d t h a t s u b s e q u e n t i n j u r y t o t h e s e c e l l s r e s u l t s i n c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n a n d f i b r i n d e p o s i t i o n , l e a d i n g t o l o c a l h y p o p e r f u s i o n t h a t c o n t r i b u t e s t o H P C i n j u r y ( D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 0 a , 2 0 0 0 b ) . H e n c e , b o t h H P C a n d S E C i n j u r y o c c u r i n M C T - i n d u c e d t o x i c i t y , a n d S E C i n j u r y c a n p o t e n t i a l l y c o n t r i b u t e t o H P C i n j u r y . 5 9 I n c o n c l u s i o n , l i v e r i n j u r y i n d u c e d b y a n a c u t e l y t o x i c d o s e o f M C T r e s u l t s f r o m M C T P e f f e c t s o n H P C s a n d S E C s . S E C i n j u r y m a y b e a n e p i p h e n o m e n o n o r c o u l d c o n t r i b u t e t o H P C i n j u r y t h r o u g h c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n a n d s u b s e q u e n t f i b r i n d e p o s i t i o n r e s u l t i n g i n l o c a l h y p o p e r f u s i o n l e a d i n g t o h y p o x i c / i s c h e m i c i n j u r y . M C T w a s c h o s e n a s t h e h e p a t o t o x i c a n t o f i n t e r e s t f o r t h i s d i s s e r t a t i o n b e c a u s e i t i s k n o w n t o b e p o i s o n o u s t o b o t h a n i m a l s a n d h u m a n s a n d b e c a u s e o f i t s p o t e n t i a l t o d a m a g e t h e l i v e r v a s c u l a t u r e , w h i c h h a s n o t b e e n c h a r a c t e r i z e d w e l l i n o t h e r m o d e l s o f L P S a u g m e n t a t i o n o f h e p a t o t o x i c a n t - i n d u c e d i n j u r y . H e n c e , i n v e s t i g a t i o n o f l i v e r i n j u r y r e s u l t i n g f r o m M C T / L P S - c o t r e a t m e n t m a y o f f e r a d d i t i o n a l p e r s p e c t i v e s i n t o t h i s i n t e r e s t i n g p h e n o m e n o n . 1 . E . S u m m a r y I n f l a m m a t i o n c a n d e c r e a s e t h e t h r e s h o l d f o r t o x i c i t y , m a k i n g a n i n d i v i d u a l m o r e s u s c e p t i b l e t o h e p a t o t o x i c a n t s ( R o t h e t a l , 2 0 0 1 ; G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . T o u n d e r s t a n d t h i s p h e n o m e n o n b e t t e r , L P S p o t e n t i a t i o n o f M C T - i n d u c e d t o x i c i t y w a s e x p l o r e d . T h e f o c u s o f t h i s d i s s e r t a t i o n i s t o c h a r a c t e r i z e t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y r e s u l t i n g f r o m c o e x p o s u r e t o s m a l l n o n i n j u r i o u s d o s e s o f M C T a n d L P S a n d t o e x p l o r e t h e m e c h a n i s m s b e h i n d t h i s l i v e r i n j u r y m o d e l . I n p a r t i c u l a r , t h e h y p o t h e s i s i s t e s t e d t h a t i n f l a m m a t o r y e v e n t s p a r t i c i p a t e c a u s a l l y i n t h e s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y f r o m c o e x p o s u r e t o M C T a n d L P S . “ S y n e r g y ” i s d e f i n e d a s t h e c o n d i t i o n i n w h i c h t h e c o a d m i n i s t r a t i o n o f t w o a g e n t s c a u s e s a 6 0 c h a n g e i n a t o x i c b i o m a r k e r ( e . g . , p l a s m a a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ) t h a t i s g r e a t e r t h a n t h e s u m o f e f f e c t s o c c u r r i n g w h e n e a c h a g e n t i s g i v e n a l o n e . “ S y n e r g y " i n c l u d e s t h e a p p e a r a n c e o f t o x i c i t y f r o m t h e c o a d m i n i s t r a t i o n o f d o s e s o f t w o a g e n t s t h a t a r e n o n t o x i c w h e n g i v e n a l o n e . I n t h e f o l l o w i n g c h a p t e r s , d e v e l o p m e n t a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a m o d e l f o r a c u t e , s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y f r o m c o e x p o s u r e t o s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e s o f M C T a n d L P S i s d e s c r i b e d . F u r t h e r , i t i s d e m o n s t r a t e d t h a t a l t e r a t i o n s i n t h e s e q u e n c e o f M C T a n d L P S c o e x p o s u r e c h a n g e s t h e n a t u r e o f t o x i c i t y a n d t h a t S E C i n j u r y a n d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a r e b o t h c h a r a c t e r i s t i c s o f t h i s m o d e l . F i n a l l y , e v i d e n c e i s p r e s e n t e d t h a t K C s , T N F - o r , P M N s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a r e c a u s a l t o t h e p a t h o g e n e s i s o f M C T / L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y . 6 1 C H A P T E R 2 S y n e r g i s t i c H e p a t o t o x i c i t y f r o m C o e x p o s u r e t o B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e a n d t h e P y r r o l i z i d i n e A l k a l o i d M o n o c r o t a l i n e 6 2 2 . A . A b s t r a c t I n d i v i d u a l s a r e c o m m o n l y e x p o s e d t o , b a c t e r i a l e n d o t o x i n ( l i p o p o l y s a c c h a r i d e ; L P S ) t h r o u g h G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l i n f e c t i o n a n d f r o m i t s t r a n s l o c a t i o n f r o m t h e g a s t r o i n t e s t i n a l l u m e n i n t o t h e c i r c u l a t i o n . I n a s m u c h a s n o n i n j u r i o u s d o s e s o f L P S a u g m e n t t h e h e p a t o t o x i c i t y o f c e r t a i n x e n o b i o t i c a g e n t s , e x p o s u r e t o s m a l l a m o u n t s o f L P S m a y b e a n i m p o r t a n t d e t e r m i n a n t o f s u s c e p t i b i l i t y t o c h e m i c a l i n t o x i c a t i o n . M o n o c r o t a l i n e ( M C T ) i s a p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d p h y t o t o x i n t h a t a t l a r g e d o s e s p r o d u c e s c e n t r i l o b u l a r l i v e r l e s i o n s i n r a t s . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e f o o d - b o m e t o x i n M C T w a s c o a d m i n i s t e r e d w i t h L P S t o d e t e r m i n e i f L P S w o u l d e n h a n c e i t s h e p a t o t o x i c i t y . D o s e s o f M C T ( 1 0 0 m g / k g , i . p . ) a n d L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g , i . v . ) , w h i c h w e r e n o n h e p a t o t o x i c w h e n a d m i n i s t e r e d s e p a r a t e l y , p r o d u c e d s i g n i f i c a n t l i v e r i n j u r y i n m a l e , S p r a g u e - D a w l e y r a t s , w h e n g i v e n i n c o m b i n a t i o n . W i t h i n 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n , t h i s c o t r e a t m e n t r e s u l t e d i n e n h a n c e d p l a s m a a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a n d a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t i e s , t w o m a r k e r s o f l i v e r i n j u r y . H i s t o l o g i c a l l y , o v e r t h e m o r r h a g e a n d n e c r o s i s a p p e a r e d b e t w e e n 1 2 a n d 1 8 h o u r s . T h e l e s i o n s w e r e c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l a n d e x h i b i t e d c h a r a c t e r i s t i c s s i m i l a r t o l e s i o n s a s s o c i a t e d w i t h l a r g e r d o s e s o f M C T a n d L P S , r e s p e c t i v e l y . I n t h e p r e s e n c e o f L P S , t h e t h r e s h o l d f o r M C T t o x i c i t y w a s r e d u c e d t o 1 3 — 3 3 % o f t h e d o s e r e q u i r e d f o r t o x i c i t y w i t h M C T a l o n e . A s t u d y i n i s o l a t e d , h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s r e v e a l e d n o i n t e r a c t i o n b e t w e e n M C T a n d L P S i n p r o d u c i n g c y t o t o x i c i t y . I n s u m m a r y , c o e x p o s u r e o f r a t s t o n o n i n j u r i o u s d o s e s o f M C T a n d L P S r e s u l t e d i n p r o n o u n c e d l i v e r i n j u r y . R e s u l t s i n V i t r o s u g g e s t t h a t 6 3 t h e e n h a n c e d t o x i c i t y d o e s n o t r e s u l t f r o m a d i r e c t i n t e r a c t i o n o f M C T a n d L P S w i t h h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s . T h e s e r e s u l t s p r o v i d e a d d i t i o n a l e v i d e n c e t h a t e x p o s u r e t o s m a l l a m o u n t s o f L P S m a y b e a d e t e r m i n a n t o f s u s c e p t i b i l i t y t o f o o d - b o m e h e p a t o t o x i n s . 2 . 8 . I n t r o d u c t i o n I n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n , n o n i n j u r i o u s d o s e s o f L P S w e r e a d m i n i s t e r e d t o r a t s i n c o n j u n c t i o n w i t h n o n t o x i c d o s e s o f M C T t o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t L P S e x p o s u r e a u g m e n t s t h e h e p a t o t o x i c i t y o f M C T . I n t h i s s t u d y , w e d e v e l o p e d a n d c h a r a c t e r i z e d a n a n i m a l m o d e l f o r L P S a n d M C T i n t e r a c t i o n . T h i s m o d e l i n c l u d e d e l u c i d a t i o n o f d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s a n d o f d e v e l o p m e n t o f a c u t e t o x i c i t y . F i n a l l y , w e e x p l o r e d w h e t h e r t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n L P S a n d M C T c o u l d b e r e p r o d u c e d i n h e p a t o c e l l u l a r p r e p a r a t i o n s i n V i t r o . 2 . 0 . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 2 . 0 . 1 . M a t e r i a l s L P S ( E s c h e r i c h i a c o l i , s e r o t y p e 0 1 2 8 : 8 1 2 ) , h e p a r i n ( T y p e I I , d i s o d i u m s a l t ) , m e r c u r i c c h l o r i d e , p - d i m e t h y l a m i n o b e n z a l d e h y d e , b o r o n t r i f l u o r i d e i n m e t h a n o l , h y d r o g e n p e r o x i d e , 3 , 3 ’ - d i a m i n o b e n z i d i n e , p r o t e i n a s e K ( E C 3 . 4 . 2 1 . 6 4 ) , d e o x y r i b o n u c l e a s e I ( E 0 3 . 1 . 2 1 . 1 ) , h e m a t o x y l i n s o l u t i o n ( G i l l N o . 3 ) , c o l l a g e n a s e ( T y p e I I ) , a n d d i a g n o s t i c k i t s 5 8 U V , 5 9 U V , 2 4 5 , a n d 4 1 9 f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A S T ) , a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A L T ) , a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( A L P ) , a n d y - g l u t a m y l t r a n s f e r a s e ( G G T ) a c t i v i t i e s , r e s p e c t i v e l y , w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . M C T w a s o b t a i n e d f r o m T r a n s W o r l d C h e m i c a l s ( R o c k v i l l e , M D ) . A b s o l u t e e t h a n o l w a s p u r c h a s e d f r o m Q u a n t u m C h e m i c a l C o m p a n y ( T u s c o l a , I L ) . S t e r i l e s a l i n e w a s a c q u i r e d f r o m A b b o t t L a b o r a t o r i e s ( N o r t h C h i c a g o , I L ) . I n s i t u c e l l d e a t h d e t e c t i o n k i t w i t h h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e w a s p u r c h a s e d f r o m B o e h r i n g e r - M a n n h e i m B i o c h e m i c a l s ( l n d i a n a p o l i s , I N ) . W i l l i a m s ’ M e d i u m E a n d g e n t a m i c i n w e r e a c q u i r e d f r o m G I B C O ( G r a n d I s l a n d , N Y ) . F e t a l c a l f s e r u m w a s p u r c h a s e d f r o m l n t e r g e n ( P u r c h a s e , N Y ) . F o r m a l i n f i x a t i v e w a s o b t a i n e d f r o m S u r g i p a t h M e d i c a l I n d u s t r i e s , I n c . ( R i c h m o n d , I L ) . 2 . 0 . 2 . A n i m a l s M a l e , S p r a g u e - D a w l e y r a t s ( C r l : C D B R ( S D ) V A F / P l u s , C h a r l e s R i v e r , P o r t a g e , M I ) w e i g h i n g 2 0 0 — 3 0 0 g w e r e u s e d i n a l l s t u d i e s . A n i m a l s w e r e a l l o w e d f o o d ( R o d e n t C h o w / T e k 8 6 4 0 , H a r l a n T e k l a d , M a d i s o n , W I ) a n d w a t e r a d I i b i t u m . T h e y w e r e h o u s e d n o m o r e t h a n t h r e e t o a c a g e o n A s p e n c h i p b e d d i n g ( N o r t h e a s t e r n P r o d u c t s C o m p a n y , W a r r e n b u r g , N Y ) . T h e a n i m a l s w e r e m a i n t a i n e d o n a 1 2 - h r l i g h t / d a r k c y c l e i n a c o n t r o l l e d t e m p e r a t u r e ( 1 8 - 2 1 ° C ) a n d h u m i d i t y ( 5 5 i 5 % ) e n v i r o n m e n t f o r a p e r i o d o f 1 w e e k b e f o r e u s e . A l l p r o c e d u r e s o n a n i m a l s f o l l o w e d t h e g u i d e l i n e s f o r h u m a n e t r e a t m e n t s e t b y t h e A m e r i c a n A s s o c i a t i o n o f L a b o r a t o r y A n i m a l S c i e n c e s a n d t h e U n i v e r s i t y L a b o r a t o r y A n i m a l R e s e a r c h u n i t a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . 6 5 2 . 0 . 3 . T r e a t m e n t P r o t o c o l R a t s w e r e g i v e n M C T i n t r a p e r i t o n e a l l y a t d o s e s i n d i c a t e d i n t h e t e x t a n d f i g u r e s o r a n e q u i v a l e n t v o l u m e o f s t e r i l e s a l i n e v e h i c l e ( V e h ) . M C T w a s d i s s o l v e d i n s t e r i l e s a l i n e m i n i m a l l y a c i d i f i e d b y 0 . 2 M H C I . T h e p H w a s b r o u g h t t o 7 b y a d d i t i o n o f 2 M N a O H a n d t h e v o l u m e a d j u s t e d w i t h s t e r i l e s a l i n e t o t h e a p p r o p r i a t e f i n a l c o n c e n t r a t i o n . F o u r h o u r s a f t e r t r e a t m e n t w i t h M C T o r i t s v e h i c l e , L P S d i l u t e d i n s t e r i l e s a l i n e o r e q u i v a l e n t v o l u m e o f s t e r i l e s a l i n e V e h w a s i n j e c t e d i n t r a v e n o u s l y v i a t a i l v e i n a t t h e d o s e s i n d i c a t e d . H e p a t o t o x i c i t y w a s a s s e s s e d a t t h e t i m e s s p e c i f i e d i n t h e t e x t a n d f i g u r e s . A l l e n e t a l . ( 1 9 7 2 ) r e p o r t e d t h a t p e a k m e t a b o l i c b i o a c t i v a t i o n o f M C T o c c u r r e d 9 0 m i n u t e s a f t e r a d m i n i s t r a t i o n . L P S w a s g i v e n 4 h o u r s f o l l o w i n g M C T t o r e d u c e t h e p o s s i b i l i t y o f a l t e r i n g M C T b i o a c t i v a t i o n . I n a d d i t i o n , p r e l i m i n a r y s t u d i e s r e v e a l e d t h a t t h i s d o s i n g p r o t o c o l r e s u l t e d i n e n h a n c e d l i v e r i n j u r y w i t h o u t s u b s t a n t i a l m o r t a l i t y . I n c o n t r a s t , c o n c u r r e n t a d m i n i s t r a t i o n o f M C T a n d L P S r e s u l t e d i n c o n s i d e r a b l e m o r t a l i t y , a p p a r e n t l y t h r o u g h e x t r a h e p a t i c m e c h a n i s m s ( Y e e e t a I . , 1 9 9 8 ) . 2 . 0 . 4 . D e t e r m i n a t i o n o f H e p a t o t o x i c i t y A t v a r i o u s t i m e s a f t e r t r e a t m e n t w i t h M C T o r i t s v e h i c l e ( i . e . , 1 2 , 1 8 , o r 2 4 h o u r s ) , r a t s w e r e a n e s t h e t i z e d w i t h s o d i u m p e n t o b a r b i t a l ( 5 0 m g / k g , i . p . ) . A m i d l i n e a b d o m i n a l i n c i s i o n w a s m a d e , b l o o d w a s c o l l e c t e d f r o m t h e i n f e r i o r v e n a c a v a i n t o a s y r i n g e c o n t a i n i n g h e p a r i n ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n , 5 0 U / m l ) , a n d a n i m a l s w e r e e u t h a n i z e d b y e x s a n g u i n a t i o n . H e p a t o c e l l u l a r i n j u r y w a s e s t i m a t e d a s 6 6 i n c r e a s e s i n a c t i v i t y o f p l a s m a A L T a n d A S T . B i l i a r y i n j u r y w a s e s t i m a t e d a s i n c r e a s e d p l a s m a A L P a n d G G T a c t i v i t i e s . L i v e r s w e r e r e m o v e d i n t a c t a n d f i x e d b y i m m e r s i o n i n 1 0 % n e u t r a l b u f f e r e d f o r m a l i n f o r a m i n i m u m o f 3 d a y s . 2 . 0 . 5 . H i s t o p a t h o l o g i c E v a l u a t i o n a n d M o r p h o m e t r y T w o t r a n s v e r s e s e c t i o n s f r o m t h e m i d d l e o f t h e l e f t l a t e r a l l i v e r l o b e a n d o n e f r o m t h e r i g h t l a t e r a l l o b e w e r e p r o c e s s e d f o r l i g h t m i c r o s c o p y . P a r a f f i n - e m b e d d e d s e c t i o n s w e r e c u t a t 5 p m , s t a i n e d w i t h h e m a t o x y l i n a n d e o s i n , a n d e v a l u a t e d f o r l e s i o n s i z e a n d s e v e r i t y . A c o m p u t e r i z e d i m a g e a n a l y s i s s y s t e m w a s e m p l o y e d t o q u a n t i f y t r e a t m e n t - i n d u c e d c h a n g e s i n l i v e r m o r p h o l o g y . T h i s s y s t e m c o n s i s t e d o f a l i g h t m i c r o s c o p e ( O l y m p u s A X - 8 0 T , O l y m p u s C o r p . , L a k e S u c c e s s , N Y ) i n t e r f a c e d w i t h a h i g h r e s o l u t i o n C C D c o l o r c a m e r a ( O L Y - 7 5 0 , O l y m p u s - A m e r i c a , l n c . , M e l v i l l e , N Y ) , a c o l o r m o n i t o r , a n d a P o w e r M a c i n t o s h 9 6 0 0 / 3 0 0 c o m p u t e r w i t h t h e p u b l i c d o m a i n N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h i m a g e a n a l y s i s p r o g r a m ( d e v e l o p e d b y t h e U S . N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h a n d a v a i l a b l e o n t h e i n t e m e t a t h t t p : / / r s b . i n f o . n i h . g o v / n i h - i m a g e ) . D i g i t i z e d c o l o r i m a g e s o f h e m a t o x y l i n - a n d e o s i n - s t a i n e d l i v e r s e c t i o n s w e r e e v a l u a t e d w i t h a 2 5 - p o i n t l a t t i c e g r i d ( S t e r e o l o g y T o o l b o x , M o r p h o m e t r i x , D a v i s , C A ) t o d e t e r m i n e ( 1 ) t h e t o t a l a r e a o f l i v e r a n a l y z e d , ( 2 ) t h e a r e a o f l e s i o n , ( 3 ) t h e a r e a o f n o r m a l p a r e n c h y m a , a n d ( 4 ) t h e a r e a o f n o n - p a r e n c h y m a l s p a c e . A l e s i o n w a s d e f i n e d a s h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s w i t h e i t h e r s w o l l e n , e o s i n o p h i l i c c y t o p l a s m a n d k a r y o l y t i c o r p y k n o t i c n u c l e i ( i . e . , o n c o s i s ) , o r c e l l s w i t h s h r u n k e n c y t o p l a s m a n d k a r y o r r h e x i c n u c l e i o r a p o p t o t i c b o d i e s ( i . e . , a p o p t o s i s ; L e v i n e t a l . , 1 9 9 9 ) . N o n - 6 7 p a r e n c h y m a l s p a c e w a s d e f i n e d a s n o n - p a r e n c h y m a l t i s s u e , v e s s e l l u m e n , a n d r e g i o n s o u t s i d e t h e p e r i m e t e r o f t h e l i v e r s e c t i o n . T h e a r e a o f e a c h o b j e c t ( c a t e g o r y ) o f i n t e r e s t w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e f o l l o w i n g e x p r e s s i o n ( C r u z - D r i v e , 1 9 8 2 ) : A r e a m t e r e s t = 2 P o i n t s j m e r e s t X A r e a / P o i n t A r e a / P o i n t = ( D i s t a n c e B e t w e e n P o i n t s ) 2 D i s t a n c e b e t w e e n p o i n t s w a s 7 0 u m . A c c o r d i n g l y , t h e a r e a r e p r e s e n t e d b y e a c h p o i n t w a s 4 9 0 0 u m z . O n e s e c t i o n f r o m t h e l i v e r o f e a c h a n i m a l i n a t r e a t m e n t g r o u p w a s s y s t e m a t i c a l l y s c a n n e d u s i n g a d j a c e n t , n o n - o v e r l a p p i n g m i c r o s c o p i c f i e l d s . T h e f i r s t i m a g e f i e l d a n a l y z e d i n e a c h s e c t i o n w a s c h o s e n u s i n g a r a n d o m n u m b e r t a b l e ( i . e . , a n y i m a g e f i e l d b e t w e e n 1 a n d 2 0 ) . T h e r e a f t e r , e v e r y 2 0 t h f i e l d c o n t a i n i n g h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s w a s e v a l u a t e d ( m i n i m u m o f 1 0 f i e l d s m e a s u r e d / s e c t i o n ) . T h e m e a s u r e d f i e l d s r e p r e s e n t e d a p p r o x i m a t e l y 5 % o f t h e t 0 t a l a r e a o f e a c h l i v e r s e c t i o n . A m i n i m u m o f 1 0 a n i m a l s p e r g r o u p w a s a n a l y z e d . P e r c e n t l e s i o n a r e a w a s e s t i m a t e d b a s e d o n t h e f o l l o w i n g f o r m u l a : [ A r e a L e s i o n / ( A l ' e a L e s i o n + A f e a p a r e n c h y m a I I X 1 0 0 - F o l l o w i n g t h e r e c o m m e n d a t i o n s o f t h e S o c i e t y o f T o x i c o l o g i c P a t h o l o g i s t s ’ C o m m i t t e e o n t h e N o m e n c l a t u r e o f C e l l D e a t h ( L e v i n e t a l . , 1 9 9 9 ) , t h e t e r m “ n e c r o s i s ” i s u s e d t o d e s c r i b e c e l l d e a t h , r e g a r d l e s s o f t h e p a r t i c u l a r p a t h w a y b y W h i c h c e l l d e a t h o c c u r r e d . T h e t e r m s “ a p o p t o s i s ” a n d “ o n c o s i s ” a r e u s e d t o d i s t i n g u i s h n e c r o t i c c e l l s b a s e d o n m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s l a r g e l y d e s c r i b e d i n L e v i n e t a l . ( 1 9 9 9 ) . A p o p t o t i c n e c r o s i s c h a r a c t e r i z e s i n d i v i d u a l o r a g g r e g a t e s o f s h r u n k e n c e l l s w i t h c o n d e n s e d a n d m a r g i n a t e d n u c l e a r c h r o m a t i n 6 8 o r k a r y o r r h e x i s a n d c e l l f r a g m e n t s w h i c h w e r e e i t h e r a n u c l e a r o r c o n t a i n e d c o n d e n s e d n u c l e a r f r a g m e n t s ( M a j n o a n d J o r i s , 1 9 9 5 ; L e v i n e t a l . , 1 9 9 9 ) . O n c o t i c n e c r o s i s i s d e f i n e d b y s w o l l e n p a r e n c h y m a l c e l l s w i t h i n t e n s e l y e o s i n o p h i l i c c y t o p l a s m , i n d i s t i n c t b o r d e r s a n d p y k n o t i c o r k a r y o l y t i c n u c l e i ( M a j n o a n d J o r i s , 1 9 9 5 ; L e v i n e t a I . , 1 9 9 9 ) . [ A l l p h o t o m i c r o g r a p h s i n t h i s c h a p t e r w e r e t a k e n b y J a c k R . H a r k e m a ] . 2 . 0 . 6 . T U N E L A s s a y A n i n s i t u t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e ( T d T ) - m e d i a t e d d e o x y u r i d i n e t r i p h o s p h a t e ( d U T P ) n i c k e n d l a b e l i n g ( T U N E L ) a s s a y w a s u s e d t o d e t e r m i n e i f D N A s t r a n d b r e a k a g e w a s a s s o c i a t e d w i t h c e l l d e a t h . I n b r i e f , l i v e r s e c t i o n s f r o m p a r a f f i n - e m b e d d e d t i s s u e w e r e d e p a r a f f i n i z e d a n d r e h y d r a t e d . A f t e r t r e a t m e n t w i t h p r o t e i n a s e K , l i v e r s e c t i o n s w e r e s u b s e q u e n t l y t r e a t e d w i t h f l u o r e s c e i n - c o n j u g a t e d d U T P l a b e l a n d T d T ( i . e . , T U N E L r e a c t i o n m i x t u r e ) f o l l o w e d b y a h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e c o n j u g a t e d a n t i - f l u o r e s c e i n a n t i b o d y f r o m a n i n s i t u c e l l d e a t h d e t e c t i o n k i t ( B o e h r i n g e r - M a n n h e i m B i o c h e m i c a l s , I n d i a n a p o l i s , I N ) . S l i d e s w e r e t r e a t e d w i t h t h e c h r o m a g e n 3 , 3 ’ - d i a m i n o b e n z i d i n e a n d c o u n t e r s t a i n e d w i t h h e m a t o x y l i n . L i v e r s e c t i o n s w e r e a n a l y z e d b y l i g h t m i c r o s c o p y . O n l y T U N E L p o s i t i v e n u c l e i t h a t a l s o m e t t h e m o r p h o l o g i c c r i t e r i a o f a p o p t o s i s w e r e c l a s s i f i e d a s h a v i n g u n d e r g o n e a p o p t o t i c n e c r o s i s ( L e v i n e t a l . , 1 9 9 9 ) . 2 . 0 . 7 . E f f e c t o f L P S o n M C T - i n d u c e d C y t o t o x i c i t y I n V i t r o 6 9 H e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s ( H P C s ) w e r e i s o l a t e d f r o m r a t s b y c o l l a g e n a s e ( t y p e I I ; 0 . 2 4 m g / m l ) d i g e s t i o n a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f S e g l e n ( 1 9 7 3 ) , a s m o d i f i e d b y K l a u n i g e t a l . ( 1 9 8 1 ) . T h e c e l l p e l l e t w a s w a s h e d t w i c e w i t h W i l l i a m s ’ M e d i u m E , t h e n t h e c e l l s w e r e s u s p e n d e d i n W i l l i a m s ’ M e d i u m E c o n t a i n i n g 1 0 % f e t a l c a l f s e r u m a n d 1 % g e n t a m i c i n a n d p l a c e d i n 6 - w e l l F a l c o n , P r i m a r i a p l a t e s ( B e c t o n D i c k i n s o n & C o m p a n y , L i n c o l n P a r k , N J ) a t 1 x 1 0 6 H P C s / w e l l . G r e a t e r t h a n 9 5 % o f t h e c e l l s i n t h e f i n a l p r e p a r a t i o n w e r e h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s a s d e t e r m i n e d b y l i g h t m i c r o s c o p y . T h e v i a b i l i t y o f t h e i s o l a t e d H P C s w a s g r e a t e r t h a n 9 0 % ( v i a t r y p a n b l u e e x c l u s i o n ) . A f t e r H P C s w e r e s t a b i l i z e d i n c u l t u r e f o r 4 h o u r s a t 3 7 ° C i n 9 2 . 5 % 0 2 / 7 . 5 % 0 0 2 , t h e w e l l s w e r e w a s h e d w i t h m e d i u m , a n d M C T w a s a d d e d t o t h e f r e s h m e d i u m ( 0 , 0 . 0 4 , 0 . 4 , o r 1 m M , f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) . A f t e r 4 h o u r s o f i n c u b a t i o n , L P S w a s a d d e d ( 0 , 7 . 4 x 1 0 3 , 7 . 4 x 1 0 4 , o r 7 . 4 x 1 0 5 E U / m l ) , a n d t h e c e l l s w e r e i n c u b a t e d f o r a n a d d i t i o n a l 2 0 h r s . C o n c e n t r a t i o n s o f M C T w e r e b a s e d o n t h o s e u s e d b y D e L e v e e t a l . ( 1 9 9 6 ) . C o n c e n t r a t i o n s o f L P S w e r e c h o s e n t o s p a n t h a t e x p e c t e d t o o c c u r i n v i v o a s s u m i n g a d o s e o f 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g d i s t r i b u t e d i n i t i a l l y i n t o p l a s m a v o l u m e . A f t e r i n c u b a t i o n , t h e m e d i u m w a s c o l l e c t e d , a n d H P C s w e r e l y s e d w i t h 2 m l 1 % T r i t o n X - 1 0 0 . P e r c e n t A L T r e l e a s e w a s a s s e s s e d b y d i v i d i n g A L T r e l e a s e d i n t o t h e m e d i u m b y t h e A L T m e a s u r e d i n t h e m e d i u m p l u s t h e c e l l l y s a t e s . 2 . 0 . 8 . E h r l i c h A s s a y 7 0 T h e E h r l i c h a s s a y w a s u s e d t o m e a s u r e t h e c o n c e n t r a t i o n o f p y r r o l e s i n l i v e r a s a m a r k e r o f b i o a c t i v a t i o n o f M C T t o t o x i c p y r r o l i c m e t a b o l i t e s ( M a t t o c k s a n d W h i t e , 1 9 7 0 ) . M o n o c r o t a l i n e p y r r o l e s y n t h e s i z e d f r o m M C T w a s u s e d t o g e n e r a t e a s t a n d a r d c u r v e ( M a t t o c k s , 1 9 6 9 ; M a t t o c k s e t a l . , 1 9 8 9 ) . A l i v e r s a m p l e ( 0 . 5 g ) f r o m t h e l e f t a n d r i g h t l a t e r a l l o b e s w a s h o m o g e n i z e d i n 5 % m e r c u r i c c h l o r i d e a n d t h e n c e n t r i f u g e d . T h e r e s u l t i n g p e l l e t w a s w a s h e d w i t h a b s o l u t e e t h a n o l a n d c e n t r i f u g e d a g a i n . T h e p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n a 1 : 1 s o l u t i o n o f a b s o l u t e e t h a n o l a n d E h r l i c h ’ s r e a g e n t ( 3 % 4 - d i m e t h y l a m i n o b e n z a l d e h y d e i n m e t h a n o l i c 1 4 % b o r o n t r i f l u o r i d e ) . T h e s o l u t i o n w a s h e a t e d t o 9 0 ° C f o r 1 m i n u t e a n d t h e n a l l o w e d t o c o o l t o r o o m t e m p e r a t u r e . S o l i d s w e r e p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n , a n d t h e a b s o r b a n c e o f t h e s u p e r n a t a n t a t 5 6 5 a n d 6 2 5 n m w a s m e a s u r e d . T h e A m a x o f t h e E h r l i c h p y r r o l e c o m p l e x i s 5 6 5 n m . T h e M a x o f E h r l i c h r e a g e n t - t r e a t e d b l o o d i s 6 2 5 n m . A b s o r b a n c e v a l u e s w e r e c o r r e c t e d f o r t h e p r e s e n c e o f r e s i d u a l b l o o d i n t h e l i v e r ( M a t t o c k s a n d W h i t e , 1 9 7 0 ) , a n d s a l i n e / s a l i n e c o n t r o l l i v e r s w e r e u s e d t o c o r r e c t f o r p r e s e n c e o f e n d o g e n o u s p y r r o l e s u n r e l a t e d t o M C T t r e a t m e n t . 2 . 0 . 9 . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n s i s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n ( S E M ) . W h e n v a r i a n c e s w e r e n o t h o m o g e n e o u s , d a t a w e r e l o g - t r a n s f o r m e d b e f o r e a n a l y s i s . D a t a f o r s i n g l e c o m p a r i s o n s w e r e a n a l y z e d b y S t u d e n t ’ s t - t e s t ( S t e e l e t a l . , 1 9 9 7 ) . M u l t i p l e c o m p a r i s o n s w e r e a n a l y z e d b y o n e - w a y , t w o - w a y o r t h r e e - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) , a s a p p r o p r i a t e , a n d g r o u p m e a n s w e r e 7 1 c o m p a r e d u s i n g T u k e y ’ s o m e g a p o s t h o c t e s t . D a t a e x p r e s s e d a s p e r c e n t a g e s w e r e t r a n s f o r m e d b y a r c s i n e s q u a r e r o o t p r i o r t o a n a l y s i s ( S t e e l 9 1 ‘ a l . , 1 9 9 7 ) . T h e c r i t e r i o n f o r s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e w a s p s 0 . 0 5 f o r a l l c o m p a r i s o n s . 2 . D . R e s u l t s 2 . D . 1 . D o s e - R a n g i n g S t u d i e s : M o n o c r o t a l i n e I n a d o s e - r a n g i n g s t u d y t o d e t e r m i n e a n o n t o x i c M C T d o s e f o r f u r t h e r e x a m i n a t i o n , M C T ( 0 - 3 0 0 m g / k g ) w a s a d m i n i s t e r e d i . p . t o r a t s a n d f o l l o w e d 4 h o u r s l a t e r b y i n t r a v e n o u s s a l i n e . A t 2 4 h o u r s , l i v e r i n j u r y w a s a s s e s s e d f r o m i n c r e a s e s i n p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s ( F i g u r e 2 . 1 ) . H e p a t o t o x i c i t y w a s d o s e - d e p e n d e n t , a n d t h e t h r e s h o l d ( i . e . , s t a r t ) f o r t o x i c i t y w a s b e t w e e n 1 0 0 a n d 1 5 0 m g M C T / k g . A d o s e o f 1 0 0 m g / k g w a s d e t e r m i n e d t o b e n o n i n j u r i o u s u s i n g p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s a s c r i t e r i a . U p o n h i s t o p a t h o l o g i c e x a m i n a t i o n m i n o r c o n g e s t i o n w a s o b s e r v e d i n f r e q u e n t l y i n t h e s i n u s o i d s o f c e n t r i l o b u l a r r e g i o n s . W i t h i n t h i s r e g i o n , m i n i m a l a p o p t o t i c n e c r o s i s o f p a r e n c h y m a l c e l l s w a s o b s e r v e d a t 2 4 h o u r s . T y p i c a l l y , o n e o r t w o s u c h i n d i v i d u a l a p o p t o t i c c e l l s o r c e l l f r a g m e n t s w e r e o b s e r v e d a r o u n d a c e n t r a l v e i n . A T U N E L a s s a y c o n f i r m e d t h e o b s e r v a t i o n o f a m i l d i n c r e a s e i n a p o p t o t i c n e c r o s i s c o m p a r e d t o t h e s a l i n e / s a l i n e c o n t r o l ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e p e r i p o r t a l a n d m i d z o n a l r e g i o n s h a d n o r m a l h e p a t i c s i n u s o i d a l a r c h i t e c t u r e a n d p a r e n c h y m a l c e l l s . 7 2 F i g u r e 2 . 1 . D o s e - R e l a t e d H e p a t o t o x i c i t y o f M p _ T . R a t s w e r e g i v e n a s i n g l e a d m i n i s t r a t i o n o f M C T ( 0 — 3 0 0 m g / k g ) i . p . t h e n a n i v . i n j e c t i o n o f s t e r i l e s a l i n e V e h 4 h o u r s l a t e r . H e p a t o t o x i c i t y w a s e v a l u a t e d 2 4 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n b y p l a s m a A L T ( A ) a n d A S T ( B ) a c t i v i t i e s . E r r o r b a r s f o r S E M t h a t a r e s m a l l e r t h a n s y m b o l s a r e n o t s h o w n . N = 4 — 3 0 a n i m a l s . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p s 0 . 0 5 ) f r o m c o n t r o l s g i v e n o n l y V e h . 7 3 s s s s A I s 1 a 7 4 P l a s m a A S T A c t i v i t y ( U I L ) O J P l a s m a A L T A c t i v i t y ( U I L ) > . 5 . a N N 0 | 0 0 1 0 ( I I ' 8 ( d c 8 O O 5 0 0 0 4 0 0 0 ' 1 0 0 0 ' 0 0 5 0 5 0 M C T ( " I Q / k 9 ) 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 M C T ( m g / k g ) 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 A t 2 0 0 m g M C T / k g ( F i g u r e 2 . 2 ) , m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r a p o p t o t i c n e c r o s i s o c c u r r e d i n c e n t r i l o b u l a r a r e a s , b u t h e p a t o c y t e s w i t h o n c o t i c o r d e g e n e r a t i v e c h a r a c t e r i s t i c s , s u c h a s s h r u n k e n o r o v e r t l y p y k n o t i c n u c l e i a n d i n d i s t i n c t c e l l b o r d e r s , w e r e a l s o v i s i b l e . D i s r u p t i o n o f t h e v a s c u l a r i n t i m a t y p i f i e d c e n t r a l v e n u l e s . T h i s w a s a s s o c i a t e d w i t h s e v e r e h e m o r r h a g e a n d l o s s o f t i s s u e a r c h i t e c t u r e i n s u r r o u n d i n g p a r e n c h y m a . I n d e e d , s o m e c e n t r a l v e i n s w e r e o b s c u r e d b y m a r k e d h e m o r r h a g e a n d c e n t r i l o b u l a r n e c r o s i s . M i n i m a l i n f l a m m a t o r y c e l l a c c u m u l a t i o n ( i . e . , n e u t r o p h i l s a n d m o n o c y t e s ) w a s o b s e r v e d i n s i n u s o i d s . T h e s e c e n t r i l o b u l a r l e s i o n s w e r e n o t u n i f o r m , h o w e v e r , a n d s o m e t i m e s e x h i b i t e d p r o j e c t i o n s o f i n j u r y r a d i a t i n g t o w a r d t h e m i d z o n a l r e g i o n , r e s u l t i n g i n o c c a s i o n a l b r i d g i n g o f l e s i o n s . T h e m i d z o n a l a n d p e r i p o r t a l r e g i o n s r e m a i n e d l a r g e l y n o r m a l , a l t h o u g h t h e r e w a s s l i g h t c o n g e s t i o n i n b o t h r e g i o n s . A t a l a r g e r d o s e o f M C T ( 3 0 0 m g / k g ) , m a r k e d t o s e v e r e n e c r o s i s w a s o b s e r v e d i n t h e c e n t r i l o b u l a r r e g i o n s o f l i v e r l o b u l e s . N e c r o s i s a l s o e x t e n d e d t o t h e m i d z o n a l a n d , o c c a s i o n a l l y , p e r i p o r t a l r e g i o n s . A f f e c t e d h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s e x h i b i t e d p r e d o m i n a n t l y a p o p t o t i c m o r p h o l o g y , a l t h o u g h l e s i o n s c o n t a i n e d p a r e n c h y m a l c e l l s w i t h o n c o t i c c h a r a c t e r i s t i c s . C o m p a r e d t o t h e 2 0 0 m g M C T / k g d o s e t h e r e w a s i n c r e a s e d h e m o r r h a g e a n d l o s s o f c e n t r a l v e n u l a r i n t i m a a n d s i n u s o i d a l a r c h i t e c t u r e . A n i n c r e a s e d p r e s e n c e o f n e u t r o p h i l s a n d m o n o c y t e s w a s a l s o o b s e r v e d w i t h i n t h e a f f e c t e d c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l r e g i o n s . M o r t a l i t y w a s 6 6 % i n r a t s t r e a t e d w i t h 3 0 0 m g M C T / k g b y 2 4 h o u r s . N o a n i m a l s d i e d w i t h i n 2 4 h o u r s a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f s m a l l e r d o s e s o f M C T . B a s e d o n 7 5 F i g u r e 2 . 2 . R e p r e s e n t a t i v e P h o t o m i c r o g g g h s o f l i v e r f r o m R a t G i v e n a n H e p a t o t o x i c D o s e o f M C T . C e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l r e g i o n s o f l i v e r l o b u l e s f r o m a n a n i m a l t r e a t e d w i t h 2 0 0 m g M C T / k g a n d s t e r i l e s a l i n e V e h 4 h o u r s l a t e r . T w e n t y - f o u r h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n m a r k e d , c e n t r i l o b u l a r a p o p t o t i c n e c r o s i s ( w i d e o p e n a r r o w s ) i s a p p a r e n t . T h i s c e n t r i l o b u l a r l e s i o n i s a s s o c i a t e d w i t h s e v e r e h e m o r r h a g e ( c u r v e d o p e n a r r o w ) , l o s s o f s i n u s o i d a l a r c h i t e c t u r e , a n d d i s r u p t i o n o f t h e v a s c u l a r i n t i m a o f t h e c e n t r a l v e i n . T h e r e m a i n d e r o f t h e l i v e r l o b u l e a p p e a r s n o r m a l . C V = C e n t r a l V e i n . P V = P o r t a l V e i n . B a r i n d i c a t e s 3 0 u m . [ I m a g e s i n t h i s d i s s e r t a t i o n a r e p r e s e n t e d i n c o l o r ] . 7 6 7 7 M i d z o n a l C e n t r i l o b u l a r p l a s m a e n z y m e m a r k e r s a n d h i s t o p a t h o l o g y , 1 0 0 m g M C T / k g w a s c h o s e n a s a m i n i m a l l y t o x i c d o s e f o r i n i t i a l c o t r e a t m e n t s t u d i e s . 2 . D - 2 . D o s e - R a n g i n g S t u d i e s : E n d o t o x i n A s i m i l a r d o s e - r a n g i n g s t u d y w a s c o n d u c t e d f o r L P S . L P S ( 0 — 5 0 x 1 0 ° E U / k g ) w a s a d m i n i s t e r e d b y t a i l v e i n i n j e c t i o n t o a n i m a l s w h i c h h a d r e c e i v e d a n i n j e c t i o n o f s a l i n e ( i . p . ) 4 h o u r s e a r l i e r . H e p a t o t o x i c i t y w a s a s s e s s e d a t 2 4 h o u r s v i a p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s ( F i g u r e 2 . 3 ) . I n c r e a s e s i n t h e s e p l a s m a e n z y m e a c t i v i t i e s w e r e a p p a r e n t a t d o s e s e x c e e d i n g 1 5 x 1 0 ° E U L P S / k g . A f t e r a d o s e o f 7 . 4 x 1 0 ° E U L P S / k g , a p p r o x i m a t e l y o n e q u a r t e r o f t h e a n i m a l s t r e a t e d e x h i b i t e d o c c a s i o n a l , m i l d t o m o d e r a t e , m i d z o n a l c o a g u l a t i v e ( o n c o t i c ) n e c r o s i s w i t h a n a s s o c i a t e d i n f l u x o f n e u t r o p h i l s a t 2 4 h o u r s . A t t h i s s m a l l d o s e , t h e l e s i o n s w e r e a p p a r e n t p r e d o m i n a n t l y i n t h e s u b s e r o s a l a r e a s o f t h e l i v e r s e c t i o n s . H o w e v e r , a p p r o x i m a t e l y t h r e e - q u a r t e r s o f t h e a n i m a l s t r e a t e d a t t h i s d o s e h a d n o r m a l l i v e r s o r s m a l l , i n f r e q u e n t h e p a t i c l e s i o n s r e s t r i c t e d t o t h e m i d z o n a l r e g i o n s . A w i d e s p r e a d i n c r e a s e i n n e u t r o p h i l s a n d a m i l d i n c r e a s e i n m o n o n u c l e a r c e l l s w e r e a p p a r e n t i n h e p a t i c s i n u s o i d s . A t d o s e s g r e a t e r t h a n 7 . 4 x 1 0 6 L P S E U / k g , m i d z o n a l c o a g u l a t i v e n e c r o s i s w a s p r e s e n t . N e u t r o p h i l i c i n f i l t r a t i o n w a s a s s o c i a t e d w i t h t h e h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s . A t 5 0 x 1 0 ° E U L P S / k g ( F i g u r e 2 . 4 ) , m o d e r a t e t o m a r k e d m i d z o n a l C o a Q U I a t i v e h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s w a s o b s e r v e d , w i t h a m i x e d i n f l a m m a t o r y c e l l i n fi ' t r a t e o f m o n o n u c l e a r c e l l s a n d n e u t r o p h i l s a n d m i n i m a l h e m o r r h a g e . B o t h t h e c a - . . . . n t m o b u l a r a n d p e r i p o r t a l r e g i o n s o f t h e l i v e r l o b u l e s r e m a i n e d n o r m a l . 7 8 F i g u r e 2 . 3 . D o s e - R e l a t e d H e p a t o t o x i c i t v o f 3 % . S t e r i l e s a l i n e V e h w a s a d m i n i s t e r e d i . p . t o r a t s f o l l o w e d 4 h o u r s l a t e r b y a s i n g l e i . v . a d m i n i s t r a t i o n o f L P S ( 0 — 5 0 x 1 0 ° E U / k g ) . H e p a t o t o x i c i t y w a s a s s e s s e d 2 4 h o u r s a f t e r s a l i n e V e h a d m i n i s t r a t i o n b y p l a s m a A L T ( A ) a n d A S T ( B ) a c t i v i t i e s . E r r o r b a r s f o r S E M t h a t a r e s m a l l e r t h a n s y m b o l s a r e n o t s h o w n . N = 4 — 3 0 a n i m a l s . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p s 0 . 0 5 ) f r o m V e h N e h c o n t r o l . 7 9 F 8 V E S A < = < z 6 o 0 0 > — . _ 0 0 . . _ 6 > 0 9 0 » a 0 8 0 m m E 0 8 5 : 2 . 0 . 7 5 I 2 : 2 . I . . . m > » a m m E 8 0 L P S ( 1 0 ° E U l k g ) 0 0 5 0 0 o 0 0 0 L P S ( 1 o 6 E U I k g ) . I P I 0 0 1 5 0 0 i F i g u r e 2 . 4 . M s e n t a t i v e P h o t o m i c r o g r a p h s o f L i v e r f r o m a R a t G i v e n fl M u s fi o s e o f L P S . C e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l r e g i o n s o f l i v e r l o b u l e s f r o m a n a n i m a l t r e a t e d w i t h 5 0 x 1 0 6 E U L P S / k g 4 h o u r s a f t e r s t e r i l e s a l i n e V e h i n j e c t i o n . T w e n t y - f o u r h o u r s a f t e r s a l i n e a d m i n i s t r a t i o n , m o d e r a t e t o m a r k e d m i d z o n a l h e p a t o c e l l u l a r c o a g u l a t i v e n e c r o s i s ( w i d e c l o s e d a r r o w s ) i s a p p a r e n t , w h e r e a s t h e c e n t r i l o b u l a r a n d p e r i p o r t a l ( n o t s h o w n ) r e g i o n s a p p e a r n o r m a l . I n c r e a s e d n u m b e r s o f n e u t r o p h i l s ( c u r v e d c l o s e d a r r o w s ) a r e p r e s e n t . C V = C e n t r a l V e i n . B a r i n d i c a t e s 3 0 u m . [ I m a g e s i n t h i s d i s s e r t a t i o n a r e p r e s e n t e d i n c o l o r ] . 8 1 . t « J a . . . n . « a w . . 3 . . C e n t r i l o b u l a r M i d z o n a l N . s , 8 2 I n t h i s s t u d y , L P S d o s e s o f 1 1 . 1 a n d 3 0 x 1 0 ° E U / k g r e s u l t e d i n 8 % a n d 1 4 % m o r t a l i t y ( i . e . , o n e a n i m a l d e a t h p e r g r o u p ) , r e s p e c t i v e l y , w h e r e a s n o a n i m a l s d i e d w i t h i n 2 4 h o u r s a t t h e o t h e r d o s e s . A d o s e o f 7 . 4 x 1 0 ° E U L P S / k g w a s c h o s e n f o r i n i t i a l M C T / L P S c o t r e a t m e n t s t u d i e s . T h i s d o s e w a s d e s i g n a t e d “ n o n i n j u r i o u s ” b e c a u s e i t d i d n o t p r o d u c e a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n p l a s m a a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t i e s a n d i t r e s u l t e d i n a m i n i m a l t o m i l d i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e , w i t h a n a b s e n c e o f h i s t o l o g i c l e s i o n s i n a m a j o r i t y o f a n i m a l s . 2 . D . 3 . H e p a t o t o x i c i t y i n A n i m a l s C o t r e a t e d w i t h M C T a n d L P S H e p a t o t o x i c i t y i n a n i m a l s c o t r e a t e d w i t h n o n i n j u r i o u s d o s e s o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) a n d L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) w a s a s s e s s e d 2 4 h o u r s a f t e r M C T t r e a t m e n t ( F i g u r e 2 . 5 ) . H i s t o l o g i c a l l y , l i v e r s f r o m V e h N e h - t r e a t e d r a t s h a d n o e v i d e n c e o f i n j u r y ( F i g u r e 2 . 6 A ) . L i v e r s f r o m t h e V e h / L P S - t r e a t e d a n i m a l s h a d n o r m a l l i v e r a r c h i t e c t u r e a s w e l l ( F i g u r e 2 . 6 8 ) , a l t h o u g h m i n i m a l m i d z o n a l l e s i o n s w e r e a p p a r e n t i n s o m e a n i m a l s . A m i l d i n c r e a s e i n n e u t r o p h i l s i n h e p a t i c s i n u s o i d s W a s a p p a r e n t i n l i v e r s f r o m a l l a n i m a l s i n t h i s t r e a t m e n t g r o u p . A n i m a l s t r e a t e d W i t h M C T N e h h a d m i n i m a l t o n o c e n t r i l o b u l a r h i s t o p a t h o l o g i c c h a n g e ( F i g u r e 2 . 6 0 ) , a s n o t e d i n t h e d o s e - r a n g i n g s t u d y a b o v e , a n d m i d z o n a l a n d p e r i p o r t a l r e g i o n s w e r e n o r m a l . N o s i g n i f i c a n t i n c r e a s e s i n p l a s m a a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t i e s w e r e o b s e r v e d f o r t h e e i t h e r V e h / L P S o r M C T N e h t r e a t m e n t g r o u p s c 3 0 m p a r e d t o t h e V e h N e h g r o u p ( F i g u r e 2 . 5 ) o r t o n a i v e a n i m a l s ( d a t a n o t s h o w n ) . 8 3 F i t . . . i n F i g u r e 2 . 5 . D e v e l o p m e n t o f H e p a t o t o x j c i t v i n M o t r e a t e q w i t h M C T a n d L P S . A n i m a l s w e r e g i v e n 7 . 4 x 1 0 ° E U L P S / k g o r s a l i n e V e h , i v , 4 h o u r s a f t e r i . p . i n j e c t i o n o f 1 0 0 m g M C T / k g o r s a l i n e V e h . H e p a t o t o x i c i t y w a s e v a l u a t e d a t 1 2 , 1 8 o r 2 4 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n b y p l a s m a A L T ( A ) a n d A S T ( B ) a c t i v i t i e s . N = 6 — 3 0 a n i m a l s . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p s 0 . 0 5 ) f r o m a l l o t h e r g r o u p s a t t h e s a m e t i m e . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p s 0 . 0 5 ) f r o m M C T / L P S g r o u p s a t b o t h o f t h e o t h e r t i m e s . 8 4 t _ E — > A g a a I < . _ < 2 n O N E ( ! s : — l I - ) 1 2 0 6 3 0 0 0 0 0 o < . , 2 8 0 0 E ‘ 2 0 0 0 ‘ § a : : : 3 ‘ V M V e C e h t / h L e P h S T / L P S - M C T ( h r s s 4 % ) 2 b « A 1 2 T T V V M M e e C C h h T - t % / \ 8 1 r e i m e A f \ a / N / L N e L P e h S h P S 1 2 T i m e A f t e 8 1 r 2 4 M C T ( h r s ) 1 6 0 0 J 1 2 0 0 1 4 0 0 I P l a s m a A S T A c t i v i t y ( U I L ) a ) 8 5 F i g u r e 2 . 6 . R e p r e s e n t a t i v e P h o t o m i c r o g g p h s o f I _ . _ i v e r S e c t i o n s f r o m R a t s T r e a t e d w i t L l _ . P S a n c fi x M 0 1 ; A n i m a l s w e r e g i v e n 1 0 0 m g M C T / k g o r V e h a n d 4 h o u r s l a t e r 7 . 4 x 1 0 ° E U L P S / k g o r V e h . L i v e r s w e r e r e m o v e d 2 4 h o u r s a f t e r M C T o r i t s V e h a d m i n i s t r a t i o n a n d p r o c e s s e d f o r h i s t o p a t h o l o g y . P h o t o m i c r o g r a p h s o f c e n t r i l o b u l a r ( C L ) a n d m i d z o n a l ( M Z ) r e g i o n s o f l i v e r f r o m e a c h g r o u p a r e p r e s e n t e d . ( A ) L i v e r f r o m a n a n i m a l t r e a t e d w i t h V e h N e h a p p e a r s n o r m a l ; ( B ) L i v e r f r o m a n a n i m a l t r e a t e d w i t h V e h a n d 7 . 4 x 1 0 ° E U L P S / k g . E x c e p t f o r a m i l d i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f n e u t r o p h i l s i n t h e s i n u s o i d s ( c u r v e d c l o s e d a r r o w s ) , m o s t l i v e r s w e r e n o r m a l . A b o u t o n e q u a r t e r o f t h e l i v e r s h a d m i n i m a l M Z c h a n g e s ( i . e . , o c c a s i o n a l c o a g u l a t i v e n e c r o s i s ) ; ( 0 ) L i v e r f r o m a n a n i m a l t r e a t e d w i t h 1 0 0 m g M C T / k g a n d V e h . T h e a r c h i t e c t u r e o f t h e l i v e r l o b u l e i s n o r m a l . O c c a s i o n a l l y , s i n g l e , s c a t t e r e d p a r e n c h y m a l c e l l s a r o u n d t h e c e n t r a l v e i n h a d c h a r a c t e r i s t i c s o f a p o p t o s i s ( w i d e o p e n a r r o w s ) . N o h i s t o p a t h o l o g i c a l c h a n g e s a r e a p p a r e n t i n t h e M 2 o r p e r i p o r t a l ( n o t s h o w n ) r e g i o n s ; ( D ) L i v e r f r o m a n a n i m a l c o t r e a t e d w i t h 1 0 0 m g M C T / k g a n d 7 . 4 x 1 0 ° E U L P S / k g . “ H y b r i d ” l e s i o n c o n s i s t s o f m o d e r a t e C L l e s i o n a n d d i s t i n c t l y d i f f e r e n t , m a r k e d M Z l e s i o n . C L l e s i o n e x h i b i t s c h a r a c t e r i s t i c s o f a p o p t o t i c n e c r o s i s ( w i d e o p e n a r r o w s ) a n d h e m o r r h a g e . T h e M 2 l e s i o n e x h i b i t s c o a g u l a t i v e n e c r o s i s ( w i d e c l o s e d a r r o w s ) w i t h a c o n s p i c u o u s i n f l u x o f n e u t r o p h i l s ( c u r v e d c l o s e d a r r o w s ) . T h e p e r i p o r t a l r e g i o n o f t h e l i v e r l o b u l e i s n o r m a l ( n o t s h o w n ) . C V = C e n t r a l v e i n . B a r i n d i c a t e s 3 0 u m . [ I m a g e s i n t h i s d i s s e r t a t i o n a r e p r e s e n t e d i n c o l o r ] . 8 6 C e n t r i l o b u l a r M i d z o n a l " W W a x i a w “ . _ ‘ 3 ‘ ‘ 0 . ' E I B ‘ fl f , . 1 . g ‘ . l g : P 1 ' ‘ 3 1 , » ) a " I ‘ ‘ ’ . a , T . “ r . . L " . ' . L P . i . a . , . ’ . ; . ' I . ' u ‘ ' ~ . ' a q . . p . g g . . . ‘ . ' a “ J P . ‘ I . Q , 5 ; ‘ . a - . . . . . _ . . y ' 6 ‘ - . - ‘ a n - 9 - - ‘ 9 1 8 7 I n c o n t r a s t , M C T / L P S c o t r e a t m e n t r e s u l t e d i n b o t h m i d z o n a l a n d c e n t r i l o b u l a r i n j u r y ( F i g u r e 2 . 6 D ) . G e n e r a l l y , t h e e f f e c t o f t h e c o t r e a t m e n t w a s m o r e p r o n o u n c e d i n t h e m i d z o n a l r e g i o n o f t h e l i v e r l o b u l e t h a n t h e c e n t r i l o b u l a r . T h e m i d z o n a l l e s i o n s c o n s i s t e d o f m o d e r a t e t o m a r k e d c o a g u l a t i v e n e c r o s i s s i m i l a r t o t h a t p r o d u c e d b y l a r g e , h e p a t o t o x i c d o s e s o f L P S . T h e m i d z o n a l l e s i o n i n t h e s e M C T / L P S c o t r e a t e d r a t s c o r r e s p o n d e d m o s t c l o s e l y t o t h e l e s i o n p r o d u c e d b y 3 0 x 1 0 ° E U L P S / k g g i v e n a l o n e , e x c e p t t h a t h e m o r r h a g e a d j a c e n t t o t h e a r e a s o f n e c r o s i s w a s m o r e p r o n o u n c e d . A t t h e l e s i o n p e r i p h e r y , o c c a s i o n a l c e l l s w i t h a p o p t o t i c m o r p h o l o g y ( i . e . , m a r g i n a t e d c h r o m a t i n a n d p o s i t i v e T U N E L s t a i n i n g ) w e r e o b s e r v e d . I n c e n t r i l o b u l a r a r e a s o f l i v e r s f r o m r a t s t r e a t e d w i t h t h e M C T / L P S c o m b i n a t i o n , l e s i o n s v a r i e d i n s i z e f r o m o n e a n i m a l t o a n o t h e r . I n m o s t l i v e r s , t h e r e w a s p a r t i a l t o c o m p l e t e l o s s o f i n t i m a i n m a n y o f t h e c e n t r a l v e n u l e s . T h i s w a s t y p i c a l l y a s s o c i a t e d w i t h p e r i c e n t r a l h e m o r r h a g e a n d l o s s o f s i n u s o i d a l a r c h i t e c t u r e . I n s o m e a r e a s , c e n t r a l v e i n s w e r e o b s c u r e d b y t h e s e c h a n g e s . I n O t h e r l i v e r s , d i l a t e d s i n u s o i d s a n d c o n g e s t i o n w e r e m o r e t y p i c a l , w i t h l o s s o f S i r ‘ U S O i d a l a r c h i t e c t u r e i n s o m e c e n t r i l o b u l a r a r e a s . C e n t i l o b u l a r h e p a t o c e l l u l a r c h a n g e s i n c l u d e d m o d e r a t e t o m a r k e d a p o p t o t i c n e c r o s i s a n d o t h e r c h a n g e s ” 0 ‘ 9 9 a b o v e i n l i v e r s o f a n i m a l s t r e a t e d w i t h l a r g e r d o s e s o f M C T . H e p a t O c e l l u l a r d e g e n e r a t i o n w i t h s m a l l e r t h a n n o r m a l , f a i n t l y s t a i n i n g n u c l e i w e r e O b s e r V e d w i t h i n t h i s r e g i o n o f t h e l i v e r l o b u l e . M o d e r a t e a c c u m u l a t i o n o f n e l “ ' " O D I ' t i l s a n d m o n o c y t e s w a s a n o t h e r p r o m i n e n t f e a t u r e o f t h e l e s i o n . I i ' I e p a ' t O c y t e s w i t h a p o p t o t i c m o r p h o l o g y a n d t h e a c c u m u l a t i o n o f i n f l a m m a t o r y 8 8 c e l l s i n c e n t r i l o b u l a r a r e a s w a s m o r e p r o n o u n c e d t h a n i n t h e l i v e r s o f r a t s g i v e n t h e s a m e d o s e o f M C T a l o n e . I n d e e d , t h e c e n t r i l o b u l a r l e s i o n s i n t h i s c o t r e a t e d g r o u p r e s e m b l e d i n s e v e r i t y t h e c e n t r i l o b u l a r l e s i o n s i n t h e l i v e r s o f r a t s g i v e n d o s e s o f M C T a l o n e o f 1 5 0 — 2 0 0 m g / k g ( s e e F i g u r e 2 . 2 ) . P o s i t i v e T U N E L s t a i n i n g ( F i g u r e 2 . 7 ) c o r r o b o r a t e d t h e p r e s e n c e o f a p o p t o t i c n e c r o s i s a p p a r e n t i n t h e H & E s e c t i o n s . M o r p h o m e t r i c a n a l y s i s s u p p o r t e d t h e p r o n o u n c e d i n c r e a s e i n l i v e r i n j u r y i n M C T / L P S c o t r e a t e d r a t s . T h e m i n o r i n j u r y f o u n d i n r a t s t r e a t e d e i t h e r w i t h M C T N e h o r w i t h V e h / L P S w a s d u e p r e d o m i n a n t l y t o i n d i v i d u a l c e l l n e c r o s i s a n d c o m p r i s e d l e s s t h a n 2 % o f t h e a r e a i n l i v e r s e x a m i n e d ( 1 . 7 i : 0 . 3 a n d 1 . 1 i 0 . 2 , r e s p e c t i v e l y ) . B y c o n t r a s t , 2 2 i 2 % o f t h e l i v e r a r e a w a s i n j u r e d i n a n i m a l s t r e a t e d w i t h M C T a n d L P S . A N O V A r e v e a l e d a s i g n i f i c a n t i n t e r a c t i o n b e t w e e n M C T a n d L P S t r e a t m e n t s . 2 . 0 . 4 . T i m e C o u r s e o f I n j u r y i n M C T / L P S - C o t r e a t e d R a t s M C T / L P S c o t r e a t m e n t p r o d u c e d n o c h a n g e i n p l a s m a a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t i e s b y 1 2 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 2 . 5 ) . L i v e r s r e m o v e d f r o m t h e s e r a t s h a d e i t h e r n o i n j u r y o r i n f r e q u e n t , m i l d h i s t o p a t h o l o g i c c h a n g e . I n t h e c e n t r i l o b u l a r a r e a , t h e r e w a s s l i g h t c o n g e s t i o n a n d m i l d a p o p t o t i c n e c r o s i s . T h e i n t i m a o f t h e c e n t r a l v e i n s r e m a i n e d i n t a c t . M i d z o n a l l y , m i l d t o m o d e r a t e , m i x e d a p o p t o t i c a n d c o a g u l a t i v e n e c r o s i s w a s o b s e r v e d i n f r e q u e n t l y . A s l i g h t i n c r e a s e i n n u m b e r s o f n e u t r o p h i l s w a s o b s e r v e d m i d z o n a l l y . T h e p e r i p o r t a l r e g i o n s r e m a i n e d n o r m a l . M C T / s a l i n e a n d s a l i n e / L P S c o n t r o l s a t 1 2 h o u r s r e v e a l e d 8 9 F i g u r e 2 . 7 . P h o t o m i c r o g r a p h o f a T U N E L - S t a i n e d L i v e r f r o m a R a t G i v e n M C T / L P S . T U N E L a s s a y w a s p e r f o r m e d o n l i v e r f r o m a n a n i m a l c o t r e a t e d w i t h 1 0 0 m g M C T / k g a n d 7 . 4 x 1 0 6 E U L P S / k g . T U N E L - p o s i t i v e s t a i n i n g ( w i d e o p e n a r r o w s ) i n t h e c e n t r i l o b u l a r r e g i o n w a s a s s o c i a t e d w i t h b o d i e s h a v i n g m o r p h o l o g i c a l f e a t u r e s o f a p o p t o s i s . A n i n c r e a s e i n a p o p t o s i s w a s o b s e r v e d i n t h e c e n t r i l o b u l a r r e g i o n r e l a t i v e t o l i v e r s f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h V e h N e h , M C T N e h , o r V e h / L P S . C V = C e n t r a l V e i n . B a r i n d i c a t e s 3 0 u m . [ I m a g e i n t h i s d i s s e r t a t i o n i s p r e s e n t e d i n c o l o r ] . 9 0 $ ' D 5 1 2 j . 0 3 Z 3 1 I I ? ‘ 9 " 1 3 m “ ! 9 , , a g u i v f b e : ‘ ' , 1 . \ . a , ‘ I ; " O ; m . 9 ] n o r m a l l i v e r a r c h i t e c t u r e , a l t h o u g h t h e l a t t e r g r o u p s h o w e d a m i l d i n c r e a s e i n n e u t r o p h i l s . H e p a t o t o x i c i t y a s d e t e r m i n e d b y i n c r e a s e s i n p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s w a s o b s e r v e d a t 1 8 a n d 2 4 h o u r s i n r a t s c o t r e a t e d w i t h M C T a n d L P S ( F i g u r e 2 . 5 ) . P r o n o u n c e d c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l l e s i o n s w e r e p r e s e n t b y 1 8 h o u r s . L e s i o n c h a r a c t e r i s t i c s w e r e t h e s a m e a s t h o s e d e s c r i b e d f o r c o t r e a t e d a n i m a l s e v a l u a t e d a t 2 4 h o u r s . T h r o u g h o u t t h e 1 2 , 1 8 , a n d 2 4 - h o u r t i m e p o i n t s , n o s i g n i f i c a n t t r e a t m e n t - r e l a t e d i n c r e a s e i n p l a s m a A L P o r G G T a c t i v i t i e s w a s o b s e r v e d ( d a t a n o t s h o w n ) . 2 . D . 5 . D o s e R e s p o n s e R e l a t i o n s h i p s f o r M O T a n d L P S C o t r e a t m e n t T o c h a r a c t e r i z e f u r t h e r t h e M C T / L P S i n t e r a c t i o n , v a r i o u s d o s e s o f L P S w e r e a d m i n i s t e r e d t o r a t s t h a t h a d r e c e i v e d e i t h e r 1 0 0 m g M C T / k g o r s a l i n e V e h i c l e 4 h o u r s e a r l i e r ( F i g u r e 2 . 8 ) . H e p a t o t o x i c i t y w a s a s s e s s e d 2 4 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . R a t s r e c e i v i n g o n l y L P S h a d n o s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n p ' a s m a A L T a c t i v i t y a t a n y o f t h e L P S d o s e s t e s t e d . B y c o n t r a s t , a d o s e - r e l a t e d i " ‘ < = I ’ e a s e i n p l a s m a A L T a c t i v i t y o c c u r r e d i n L P S - t r e a t e d a n i m a l s t h a t w e r e c o t r e a t e d w i t h 1 0 0 m g M C T / k g . A s i g n i f i c a n t e l e v a t i o n i n p l a s m a A L T a c t i v i t y ° C C u r r e d w i t h 1 . 8 5 x 1 0 6 E U L P S / k g i n c o t r e a t e d r a t s . T h e m a x i m a l e f f e c t o c c u r r e d a t 3 . 7 x 1 0 ‘ 5 E U L P S / k g . A t e a c h o f t h e L P S d o s e s t h a t r e s u l t e d i n S i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d A L T a c t i v i t y ( F i g u r e 2 . 8 ) , m i d z o n a l a n d c e n t r i l o b u l a r l i v e r ‘ G S i o n s q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r t o t h o s e d e s c r i b e d a b o v e w e r e o b s e r v e d . M o r t a l i t y W a s a p p r o x i m a t e l y 2 0 % i n c o t r e a t e d r a t s g i v e n d o s e s o f L P S l e s s t h a n 7 . 4 x 1 0 6 9 2 F i g u r e 2 . 8 . M t o t o x i c i t v f r o m M C T / I _ _ _ P S C o z fl m i n i s t r a t i o n fi j o s e - R e s p o n s e . A n i m a l s w e r e g i v e n 1 0 0 m g M C T / k g o r i t s s a l i n e V e h a n d t h e n 4 h o u r s l a t e r L P S ( 0 — 1 1 . 1 x 1 0 6 E U / k g ) . H e p a t o t o x i c i t y w a s a s s e s s e d 2 4 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n f r o m p l a s m a A L T a c t i v i t y . N = 4 — 2 0 a n i m a l s . 8 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p s 0 . 0 5 ) f r o m v a l u e a t t h e s a m e d o s e o f L P S . 9 3 P l a s m a A L T A c t i v i t y ( U I L ) . 5 8 O a o o ‘ s o o - 4 0 0 J 2 0 0 ' . + V e h / L P S ’ — < > — M C T / L P S a Z . o a o fl 4 a L P S D o s e ( 1 o 6 E U l k g ) 9 4 1 2 E U / k g . M o r t a l i t y o f 5 0 % o c c u r r e d i n a n i m a l s r e c e i v i n g t h e c o t r e a t m e n t o f M C T w i t h L P S a t a d o s e o f 1 1 . 1 x 1 0 6 E U / k g . T h e d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p f o r M C T w a s a l s o e l u c i d a t e d i n a n i m a l s t r e a t e d w i t h M C T a n d t h e n g i v e n 4 h o u r s l a t e r e i t h e r a n o n t o x i c d o s e o f L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) o r i t ’ s V e h ( F i g u r e 2 . 9 ) . W h e n g i v e n a l o n e , n o n e o f t h e d o s e s o f M C T t e s t e d ( 0 — 1 0 0 m g / k g ) p r o d u c e d s i g n i f i c a n t i n c r e a s e s i n p l a s m a a m i n o t r a n s f e r a s e s a t 2 4 h o u r s . H o w e v e r , w h e n c o a d m i n i s t e r e d w i t h L P S , i n c r e a s e d p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s o c c u r r e d a t M C T d o s e s o f 5 0 m g / k g a n d g r e a t e r . M o r t a l i t y w a s a p p r o x i m a t e l y 1 5 % i n t h e s e g r o u p s . E a c h o f t h e M C T d o s e s t h a t c a u s e d s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d p l a s m a A L T a c t i v i t y a l s o p r o d u c e d m i d z o n a l a n d c e n t r i l o b u l a r l e s i o n s q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r t o t h o s e d e s c r i b e d a b o v e . W h e n r a t s w e r e c o t r e a t e d w i t h t h e s m a l l e s t d o s e s o f M C T a n d L P S t h a t p r o d u c e d s i g n i f i c a n t h e p a t o t o x i c i t y i n t h e d o s e - r e s p o n s e s t u d i e s a b o v e ( i . e . , 5 0 m g M C T / k g [ F i g u r e 2 . 9 ] a n d 1 . 8 5 x 1 0 6 E U L P S / K g [ F i g u r e 2 . 8 ] ) , n o i n c r e a s e i n p l a s m a A L T o r s u b s t a n t i a l h i s t o p a t h o l o g i c c h a n g e r e s u l t e d ( d a t a n o t s h o w n ) . 2 $ 3 . 6 . E f f e c t o f M C T a n d L P S o n H e p a t i c P a r e n c h y m a l C e l l s i n V i t r o [ T h i s s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w a s c o n d u c t e d b y S h a w n K i n s e r ] . M C T a n d / o r L P S w e r e a p p l i e d t o i s o l a t e d H P C s ( F i g u r e 2 . 1 0 ) f o l l o w i n g t h e t r e a t m e n t P r e t o c o l d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . C y t o t o x i c i t y w a s e v a l u a t e d a t 2 4 h O u r s f r o m A L T r e l e a s e d i n t o t h e m e d i u m . A l t h o u g h e i t h e r M C T o r L P S c a u s e d S i Q r t i f i c a n t c y t o t o x i c i t y a t l a r g e c o n c e n t r a t i o n s , A N O V A r e v e a l e d n o s i g n i f i c a n t i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e s e a g e n t s . 9 5 F i g u r e 2 . 9 . H e p a t o t o x i c i t y f r o m M C T / L P S M m i n i s t g t i o n : M C T Q g § _ e _ - R e s p o n s e . 7 . 4 x 1 0 6 E U L P S / k g o r i t s s t e r i l e s a l i n e V e h w a s g i v e n t o a n i m a l s 4 h o u r s a f t e r M C T ( 0 — 1 0 0 m g / k g ) . H e p a t o t o x i c i t y w a s a s s e s s e d 2 4 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n f r o m p l a s m a A L T a c t i v i t y . N = 4 — 2 0 a n i m a l s . 3 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p s 0 . 0 5 ) f r o m v a l u e a t t h e s a m e d o s e o f M C T . 9 6 : V 3 I a 3 < _ < ' G g 2 n 3 3 2 — l . 6 3 0 0 « - 0 0 O + — < > — M M C C T T N / a . h S e L a P ’ a ’ ? x ’ ‘ 0 . 0 . o s . 0 0 1 . 5 0 1 9 0 0 M C T D o s e ( m g / k g ) 9 7 F i g u r e 2 . 1 0 . C v t o t o x i c i f f e c t s o f M C T a i l — L P S o n I s o l a t e d , H e p a t i c P a r e n c h y m a l C e l l s . H P C s w e r e i s o l a t e d a n d t r e a t e d a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . C y t o t o x i c i t y w a s e v a l u a t e d a s p e r c e n t A L T r e l e a s e 2 4 h o u r s a f t e r a p p l i c a t i o n o f M C T t o i s o l a t e d H P C s . L P S ( 0 — 7 . 4 x 1 0 5 E U / m L ) w a s a d m i n i s t e r e d t o i s o l a t e d h e p a t o c y t e s 4 h o u r s a f t e r M C T ( 0 - 1 m M ) . N = 7 l i v e r i s o l a t i o n s . A N O V A r e v e a l e d t h a t M C T a n d L P S e a c h c a u s e d s i g n i f i c a n t c y t o t o x i c i t y ( p s 0 . 0 5 ) , b u t t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e t w o t r e a t m e n t s . [ T h e w o r k i n t h i s f i g u r e w a s c o m p l e t e d b y S h a w n K i n s e r ] . 9 8 , 3 1 s P c U wE | o m 0 m w L . R m 7 4 | . s n o a I n | m m s L o m m . _ . . . § . w . 7 4 . \ ” 7 4 o . d 0 0 d 0 0 d 0 O d I O O d V 0 0 d o n o V u \ o V n \ o / n \ o / n \ o / u \ o / n \ o / u \ o / n / \ n o / \ n o / \ n o _ o . \ 9 o o \ d / 0 / \ u o n / o u \ o / n \ o / n \ o / < m E m . u 0 d o r \ 0 V u . \ n / \ 6 d O o l r \ n u o \ O d O / \ I / Q m \ u d O o l \ u \ d O o l a O n “ . / \ u O o \ d \ / O u o / O l l \ n / o \ n o \ d / \ O o O u / O \ d / \ o O n . l d l O o \ n o \ / O \ n / d / O o . 0 \ n \ O l o l O d \ u \ O / o / d O \ O u \ l l o O d \ u \ O / / o O d \ n \ 0 o 0 . _ / \ n / o n \ / o u \ o / n / \ o u o . 0 . 4 0 . 0 4 M C T C o n c e n t r a t i o n ( m M ) 9 9 2 . D . 7 . D e t e r m i n a t i o n o f P y r r o l e C o n c e n t r a t i o n i n L i v e r s f r o m M C T - T r e a t e d R a t s L i v e r p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n w a s m e a s u r e d t o d e t e r m i n e i f L P S e x p o s u r e a l t e r e d t h e b i o a c t i v a t i o n o f M C T t o M C T P . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h 7 . 4 x 1 0 6 E U L P S / k g o r V e h 4 h o u r s a f t e r 1 0 0 m g M C T / k g a c c o r d i n g t o t h e p r o t o c o l d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . A s d e s c r i b e d e a r l i e r ( F i g u r e 2 . 5 ) , t h i s r e g i m e n w a s h e p a t o t o x i c . T w e n t y - f o u r h o u r s a f t e r M C T t r e a t m e n t , l i v e r s w e r e r e m o v e d a n d h o m o g e n i z e d f o r p y r r o l e d e t e r m i n a t i o n b y t h e E h r l i c h a s s a y . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S d i d n o t i n c r e a s e t h e t i s s u e E h r l i c h a c t i v i t y t h a t r e s u l t e d f r o m M C T t r e a t m e n t ( T a b l e 2 . 1 ) . 2 . E . D i s c u s s i o n L a r g e h e p a t o t o x i c d o s e s o f e i t h e r M C T o r L P S r e s u l t i n t h e r e l e a s e o f l i v e r e n z y m e s s u c h a s A L T a n d A S T i n t o t h e p l a s m a . H o w e v e r , M C T e x p o s u r e a t l a r g e d o s e s r e s u l t s i n a n a c u t e h e p a t i c l e s i o n d i s t i n c t f r o m t h a t p r o d u c e d b y L P S . I n d o s e - r a n g i n g s t u d i e s , M C T g i v e n a t a n h e p a t o t o x i c d o s e c a u s e d a c e n t r i l o b u l a r l e s i o n c h a r a c t e r i z e d b y p r e d o m i n a n t l y a p o p t o t i c n e c r o s i s , h e p a t o c e l l u l a r d e g e n e r a t i o n a n d v a s c u l a r i n j u r y . P a r e n c h y m a l c e l l c h a n g e s w e r e a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d p l a s m a a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t i e s , a s h a s b e e n r e p o r t e d i n o t h e r m o d e l s o f l i v e r i n j u r y i n w h i c h a p o p t o s i s o c c u r r e d ( L e v i n a t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e v a s c u l a r i n j u r y i n c l u d e d l o s s o f i n t i m a i n c e n t r a l v e i n s a n d c o n g e s t i o n a n d h e m o r r h a g e i n s i n u s o i d s ( F i g u r e 2 . 2 ; S c h o e n t a l a n d H e a d , 1 9 5 5 ; M c L e a n , 1 9 7 0 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 9 ) . A t d o s e s e q u a l t o o r g r e a t e r t h a n 2 0 0 m g M C T / k g , 1 0 0 T a b l e 2 . 1 . I n f l u e n c e o f L P S o n H e a t i c M C T B i o a c t i v a t i o n i n V i v o . L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ; i . v . ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( V e h ) w a s a d m i n i s t e r e d t o r a t s 4 h o u r s a f t e r i . p . i n j e c t i o n o f 1 0 0 m g M C T / k g . L i v e r s a m p l e s w e r e t a k e n 2 4 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n a n d h o m o g e n i z e d f o r a n a l y s i s o f p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n b y t h e E h r l i c h a s s a y a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . R e s u l t i n g v a l u e s w e r e c o r r e c t e d f o r e n d o g e n o u s p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n b y s u b t r a c t i n g v a l u e s f r o m a n i m a l s g i v e n t h e V e h N e h c o m b i n a t i o n ( i . e . , 2 4 . 9 p g p y r r o l e / g l i v e r ) . D a t a a r e e x p r e s s e d a s m e a n : t S E M . N = 5 a n i m a l s . T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ( p > 0 . 0 5 ) b e t w e e n M C T N e h a n d M C T / L P S g r o u p s . 1 0 1 P 5 y n m o 5 ? ; “ " ? T M M r C C e T a t T N m e e n t h / L P S P Y T T O I G ( M Q ’ Q l i v e r ) 3 3 7 5 i i 4 2 @ . L P S 1 : a t s 4 t o m l O U f S a t ? I f a n t r a l ! " i n . > d s . [ l e s s b y S ' J C f l E I ’ , 1 0 2 A t d o s e s e q u a l t o o r g r e a t e r t h a n 2 0 0 m g M C T / k g , l e s i o n s r a d i a t e d i n t o t h e m i d z o n a l a n d p e r i p o r t a l r e g i o n s o f t h e l i v e r l o b u l e . S o m e c e n t r a l v e i n s w e r e o b s c u r e d b y m a r k e d h e m o r r h a g e a n d c e n t r i l o b u l a r h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s . T h i s m a y h a v e r e s u l t e d f r o m d i s r u p t i o n o f v a s c u l a r i n t i m a a n d o f s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l i n t e g r i t y ( D e L e v e e t a l . , 1 9 9 9 ) . B y c o n t r a s t , L P S c a u s e d s t r i c t l y m i d z o n a l l e s i o n s e v e n a t l a r g e d o s e s . T h e s e c o m p r i s e d w e l l - d e f i n e d a r e a s o f c o a g u l a t i v e n e c r o s i s o f p a r e n c h y m a l c e l l s w i t h p r o n o u n c e d n e u t r o p h i l i n f i l t r a t i o n . I n s u m m a r y , a t t o x i c d o s e s L P S p r o d u c e s a m i d z o n a l l e s i o n w i t h n e u t r o p h i l i n v o l v e m e n t w h e r e a s M C T c a u s e s a d i s t i n c t l y d i f f e r e n t l e s i o n t h a t o r i g i n a t e s c e n t r i l o b u l a r l y w i t h m o r e p r o n o u n c e d c o n g e s t i o n a n d h e m o r r h a g e . T h i s s t u d y e m p l o y e d d o s e s o f L P S a n d M C T w h i c h , w h e n a d m i n i s t e r e d s e p a r a t e l y t o r a t s , w e r e d e e m e d n o n i n j u r i o u s u s i n g a s c r i t e r i a a l a c k o f e l e v a t i o n i n p l a s m a a m i n o t r a n s f e r a s e e n z y m e s a t 2 4 h o u r s a n d m i n i m a l h e p a t i c h i s t o p a t h o l o g i c a l c h a n g e s . I n t e r e s t i n g l y , a 1 0 0 m g / k g d o s e o f M C T i n d u c e d i n f r e q u e n t a p o p t o t i c n e c r o s i s o f i n d i v i d u a l c e n t r i l o b u l a r h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s . T U N E L s t a i n i n g s u p p o r t e d t h e m o r p h o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o n o f a p o p t o s i s . T h i s f i n d i n g i s i n a c c o r d w i t h e v i d e n c e i n V i t r o t h a t M C T c a n i n d u c e a p o p t o s i s i n o t h e r c e l l t y p e s ( T h o m a s , e t a l . , 1 9 9 8 ) . W h e n t h e s e s m a l l d o s e s o f M C T a n d L P S w e r e c o a d m i n i s t e r e d t o r a t s , p r o n o u n c e d l i v e r i n j u r y r e s u l t e d w i t h i n 2 4 h o u r s . T h i s w a s r e f l e c t e d a s i n c r e a s e s i n p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s . F o r t h e s e m a r k e r s o f i n j u r y , h e p a t o t o x i c i t y w a s e v i d e n t b e t w e e n 1 2 a n d 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . H i s t o p a t h o l o g i c a l l y , h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y a p p e a r e d 1 0 3 i n f r e q u e n t l y a s e a r l y a s 1 2 h o u r s i n a n i m a l s r e c e i v i n g t h e M C T / L P S c o t r e a t m e n t a n d b e c a m e o v e r t a n d t y p i c a l b y 1 8 h o u r s . I n M C T / L P S c o t r e a t e d r a t s , c e n t r i l o b u l a r a r e a s s h o w e d e n h a n c e d h e p a t o c e l l u l a r a p o p t o t i c n e c r o s i s r e l a t i v e t o c o n t r o l s t r e a t e d w i t h e i t h e r a g e n t a l o n e . C o n g e s t i o n a n d h e m o r r h a g e w i t h i n t h e c e n t r i l o b u l a r l e s i o n s w e r e p r e v a l e n t . H e p a t o c e l l u l a r d e g e n e r a t i o n w a s a l s o o b s e r v e d . T h u s , t h e c e n t r i l o b u l a r l e s i o n r e s e m b l e d t h a t s e e n a f t e r a l a r g e r d o s e o f M C T ( b e t w e e n 1 5 0 — 2 0 0 m g M C T / k g ) g i v e n a l o n e , s u g g e s t i n g t h a t L P S e n h a n c e d t h e h e p a t o t o x i c i t y o f M C T . T h e m i d z o n a l r e g i o n , h o w e v e r , w a s e v e n m o r e s e v e r e l y a f f e c t e d . L e s i o n s m i d z o n a l l y r e v e a l e d f r e q u e n t , w e l l d e f i n e d a r e a s o f h e p a t o c e l l u l a r c o a g u l a t i v e n e c r o s i s a c c o m p a n i e d b y n e u t r o p h i l i n f i l t r a t i o n w i t h c o n g e s t i o n a n d h e m o r r h a g e . T h e m i d z o n a l l e s i o n c l o s e l y r e s e m b l e d t h a t w h i c h o c c u r r e d a f t e r a l a r g e d o s e o f L P S ( i . e . , 3 0 x 1 0 6 E U L P S / k g ) w a s g i v e n a l o n e , s u g g e s t i n g p r o f o u n d , M C T - i n d u c e d e n h a n c e m e n t o f t h e e f f e c t s o f L P S . A c c o r d i n g l y , t h e o v e r a l l h i s t o p a t h o l o g i c a l p i c t u r e s u g g e s t e d t h a t e a c h o f t h e a g e n t s e n h a n c e d t h e e f f e c t s o f t h e o t h e r , r e s u l t i n g i n a “ h y b r i d ” l e s i o n t h a t f a v o r e d m i d z o n a l i n j u r y . T o e l u c i d a t e t h e d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p o f t h e M C T / L P S i n t e r a c t i o n , a n o n i n j u r i o u s d o s e o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) w a s c o a d m i n i s t e r e d w i t h v a r i o u s d o s e s o f L P S . S i g n i f i c a n t h e p a t o t o x i c i t y w a s o b s e r v e d i n t h e s e c o t r e a t e d r a t s a t L P S d o s e s ( 1 . 8 5 — 2 . 8 x 1 0 6 E U / k g ) w h i c h g i v e n a l o n e p r o d u c e d n o p l a s m a a m i n o t r a n s f e r a s e i n c r e a s e o r h i s t o p a t h o l o g i c c h a n g e . T h e L P S t h r e s h o l d d o s e f o r t h i s c o t r e a t m e n t w a s b e t w e e n 0 . 7 4 x 1 0 6 a n d 1 . 8 5 x 1 0 6 E U / k g ( F i g u r e 2 . 8 ) . T h e r e f o r e , i n t h e p r e s e n c e o f M C T , t h e t h r e s h o l d d o s e f o r L P S t o x i c i t y , a s 1 0 4 d e t e r m i n e d b y c h a n g e s i n p l a s m a A L T a c t i v i t y , w a s 2 - 6 % o f t h a t w h e n L P S w a s g i v e n a l o n e ( i . e . , 3 0 x 1 0 6 E U / k g ) . I n F i g u r e 2 . 8 , t h e d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p a p p e a r e d t o b e b i m o d a l , w i t h a m a x i m a l e f f e c t o c c u r r i n g a t a n L P S d o s e o f 3 . 7 x 1 0 6 E U / k g . I t i s i m p o r t a n t t o n o t e , h o w e v e r , t h a t t h e r e w e r e n o s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s a m o n g t h e e l e v a t e d A L T v a l u e s ( i . e . , i n t h e r a n g e o f 3 . 7 - 1 1 . 6 x 1 0 6 E U L P S / k g ) . M o r e o v e r , m o r t a l i t y w a s c o n s i d e r a b l y g r e a t e r a t t h e l a r g e s t L P S d o s e s t u d i e d . S i n c e p l a s m a A L T a c t i v i t y w a s m e a s u r e d o n l y i n t h e s u r v i v o r s , t h e a n i m a l s t h a t d i e d a n d w h i c h m a y h a v e h a d m o r e s e v e r e l y a f f e c t e d l i v e r s w e r e n o t r e p r e s e n t e d i n t h e d a t a s e t . T h u s , t h e b i m o d a l a p p e a r a n c e o f t h e d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p d e p i c t e d i n F i g u r e 8 m a y h a v e r e s u l t e d f r o m g r e a t e r m o r t a l i t y a t g r e a t e r L P S d o s e s ; f u r t h e r m o r e , a b i m o d a l r e l a t i o n s h i p w a s n o t s u p p o r t e d b y s t a t i s t i c a l a n a l y s i s . W h e n a n o n i n j u r i o u s d o s e o f L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) w a s c o a d m i n i s t e r e d w i t h v a r i o u s M C T d o s e s , s i g n i f i c a n t h e p a t o t o x i c i t y o c c u r r e d w i t h a n M C T d o s e a s s m a l l a s 5 0 m g / k g . T h u s , t h e t h r e s h o l d f o r M C T w a s b e t w e e n 2 0 a n d 5 0 m g / k g ( F i g u r e 2 . 9 ) . S i n c e 1 5 0 m g M C T / k g w a s n e a r t h e t h r e s h o l d f o r t o x i c i t y f o r M C T w h e n g i v e n a l o n e , t h i s i n d i c a t e s t h a t L P S r e d u c e d t h e t h r e s h o l d f o r M C T , a s d e t e r m i n e d b y p l a s m a A L T a c t i v i t i e s , t o 1 3 — 3 3 % o f t h a t w h i c h o c c u r r e d i n t h e a b s e n c e o f t h i s i n f l a m m a g e n . A l t h o u g h m i d z o n a l a n d c e n t r i l o b u l a r l e s i o n s w e r e n o t q u a n t i f i e d i n t h e d o s e - r e s p o n s e s t u d i e s , i t i s c l e a r t h a t t h e t h r e s h o l d f o r a p p e a r a n c e o f e a c h o f t h e s e l e s i o n s w a s r e d u c e d w h e n M O T a n d L P S w e r e g i v e n i n c o m b i n a t i o n . 1 0 5 H e n c e , t h e t h r e s h o l d f o r t o x i c i t y f o r e i t h e r a g e n t w a s r e d u c e d i n t h e p r e s e n c e o f t h e o t h e r . A s t u d y w a s p e r f o r m e d i n V i t r o t o d e t e r m i n e w h e t h e r L P S a n d M C T a c t s y n e r g i s t i c a l l y i n c a u s i n g d a m a g e t o i s o l a t e d , h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s . T h e s a m e t r e a t m e n t p r o t o c o l e m p l o y e d i n v i v o w a s u s e d ( i . e . , M C T a p p l i c a t i o n w a s f o l l o w e d 4 h o u r s l a t e r b y L P S ) . E x p o s u r e e i t h e r t o M C T o r t o L P S r e s u l t e d i n c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t c y t o t o x i c i t y , w h i c h w a s s i g n i f i c a n t a t l a r g e r c o n c e n t r a t i o n s . H o w e v e r , t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t i n t e r a c t i o n b e t w e e n M C T a n d L P S w h e n t h e y w e r e g i v e n t o g e t h e r . T h u s , t h e c o t r e a t m e n t d i d n o t r e s u l t i n a s y n e r g i s t i c r e s p o n s e l i k e t h a t o b s e r v e d i n v i v o . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t o t h e r f a c t o r s n o t p r e s e n t i n t h e c u l t u r e s y s t e m , s u c h a s i n f l a m m a t o r y c e l l s a n d / o r s o l u b l e i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s , m a y p l a y a r o l e i n t h e s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y o b s e r v e d i n v i v o . M C T - i n d u c e d l i v e r i n j u r y r e q u i r e s t h e b i o a c t i v a t i o n o f M C T b y c y t o c h r o m e s P 4 5 0 t o M C T P ( M a t t o c k s , 1 9 6 8 ; M c L e a n , 1 9 7 0 ) . T h i s m e t a b o l i c b i o a c t i v a t i o n o f M C T t o r e a c t i v e p y r r o l e b e g i n s e a r l y a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n a n d i s e v i d e n t a s i n c r e a s e d p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n i n l i v e r f o r m o r e t h a n 2 4 h o u r s ( A l l e n e t a l . , 1 9 7 2 ; L a m e e t a l . , 1 9 9 1 ) . T o t e s t t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e a b i l i t y o f L P S t o a u g m e n t M C T h e p a t o t o x i c i t y w a s t h e r e s u l t o f e n h a n c e d p r o d u c t i o n o f M C T P , a n E h r l i c h a s s a y w a s p e r f o r m e d t o d e t e c t p y r r o l i c m e t a b o l i t e s i n t h e l i v e r ( M a t t o c k s a n d W h i t e , 1 9 7 0 ; T a b l e 2 . 1 ) . N o s i g n i f i c a n t e f f e c t o f L P S t r e a t m e n t o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f h e p a t i c p y r r o l e s o c c u r r e d i n r a t s g i v e n M C T . A l t h o u g h t h e s e r e s u l t s d o n o t e l i m i n a t e t h e p o s s i b i l i t y t h a t L P S a f f e c t s M C T m e t a b o l i s m , t h e y d o 1 0 6 s u g g e s t t h a t L P S d i d n o t a u g m e n t M C T h e p a t o t o x i c i t y b y e n h a n c i n g i t s b i o a c t i v a t i o n . T h i s r e s u l t m i g h t b e e x p e c t e d f r o m t h e o b s e r v a t i o n t h a t l i v e r p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n p e a k s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( a p p r o x i m a t e l y 9 0 m i n ) b e f o r e t h e t i m e w h e n L P S w a s g i v e n ( A l l e n e t a l . , 1 9 7 2 ) . L P S a n d M C T e a c h h a v e e f f e c t s o n v a s c u l a r e n d o t h e l i u m , a n d i t i s p o s s i b l e t h a t s u c h e f f e c t s c o n t r i b u t e t o t h e e n h a n c e d l i v e r i n j u r y . D o s e - d e p e n d e n t a c t i v a t i o n a n d d e s t r u c t i o n o f e n d o t h e l i a l c e l l s i s a w e l l k n o w n e f f e c t o f L P S ( P o b e r a n d C o t r a n , 1 9 9 0 ; P o h l m a n a n d H a r l a n , 1 9 9 2 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ; M a y e u x , 1 9 9 7 ) . M C T c a n c a u s e e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y b o t h i n v i v o ( S c h o e n t a l a n d H e a d , 1 9 5 5 ; M c L e a n , 1 9 7 0 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 9 ) a n d i n V i t r o ( D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ) . I n M C T / L P S c o t r e a t e d r a t s , t h e m i d z o n a l l e s i o n s a p p e a r e d s i m i l a r t o t h o s e t h a t o c c u r f r o m l a r g e r d o s e s o f L P S a l o n e , e x c e p t t h a t h e m o r r h a g e w a s m o r e p r o n o u n c e d . T h e g r e a t e r h e m o r r h a g e s u g g e s t s t h a t M C T p r o m o t e d s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y ( D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ) . I t m a y h a v e b e e n t h a t t h i s d i s r u p t i o n o f t h e m i c r o v a s c u l a t u r e t h a t e n h a n c e d t h e p o t e n t i a l f o r i n f l a m m a t o r y i n j u r y t o p a r e n c h y m a l c e l l s w a s i n i t i a t e d b y L P S . I n t h e c e n t r i l o b u l a r a r e a s , l o s s o f v e n u l a r i n t i m a a n d t h e c o l l a p s e o f s u r r o u n d i n g s i n u s o i d a l a r c h i t e c t u r e c h a r a c t e r i z e d d a m a g e f r o m l a r g e d o s e s o f M C T . I n a n i m a l s r e c e i v i n g a s m a l l d o s e o f M C T , s u c h c h a n g e s w e r e e n h a n c e d b y t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S . I t s e e m s p o s s i b l e t h a t L P S - i n d u c e d i n f l a m m a t i o n m a y h a v e c o n t r i b u t e d t o t h i s v a s c u l a r d a m a g e , w i t h t h e r e s u l t b e i n g d i s r u p t i o n o f l o c a l b l o o d f l o w a n d c o n s e q u e n t h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . 1 0 7 I n s u m m a r y , a s m a l l d o s e o f L P S a u g m e n t s t h e h e p a t o t o x i c i t y o f t h e f o o d - b o m e h e p a t o t o x i n , M C T . H i s t o l o g i c a l l y , l i v e r l e s i o n s t h a t r e s u l t f r o m t h e c o t r e a t m e n t e x h i b i t b o t h L P S - l i k e a n d M C T - l i k e c h a r a c t e r i s t i c s , s u g g e s t i n g t h a t e a c h a g e n t e n h a n c e s t h e h e p a t o t o x i c e f f e c t s o f t h e o t h e r . R e s u l t s o f a s t u d y i n i s o l a t e d , h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s s u g g e s t t h a t t h e e n h a n c e m e n t e f f e c t i s m e d i a t e d i n d i r e c t l y , p e r h a p s t h r o u g h i n f l a m m a t o r y a n d / o r v a s c u l a r e v e n t s . T h e s e r e s u l t s p r o v i d e e v i d e n c e t h a t m o d e s t L P S e x p o s u r e m a y e n h a n c e s e n s i t i v i t y t o p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s a n d p o s s i b l y o t h e r h e p a t o t o x i n s . T h e f i n d i n g s r a i s e t h e p o s s i b i l i t y t h a t p e o p l e e x p e r i e n c i n g a n i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e w h o c o n c u r r e n t l y c o n s u m e a l t e r n a t i v e m e d i c i n e s c o n t a i n i n g p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s m a y b e p a r t i c u l a r l y s u s c e p t i b l e t o l i v e r i n j u r y . 1 0 8 C H A P T E R 3 T h e T e m p o r a l R e l a t i o n s h i p b e t w e e n B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e a n d M o n o c r o t a l i n e E x p o s u r e s I n f l u e n c e s T o x i c i t y : S h i f t i n R e s p o n s e f r o m H e p a t o t o x i c i t y t o N i t r i c O x i d e - D e p e n d e n t L e t h a l i t y 1 0 9 3 . A . A b s t r a c t L i v e r i n j u r y f r o m a v a r i e t y o f h e p a t o t o x i c a n t s , i n c l u d i n g t h e f o o d - b o m e p h y t o t o x i n m o n o c r o t a l i n e ( M C T ) , c a n b e a u g m e n t e d b y e x p o s u r e t o a n o n i n j u r i o u s d o s e o f t h e i n f l a m m a g e n , b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) . I n a p r e v i o u s s t u d y , a n o n t o x i c d o s e o f L P S g i v e n f o u r h o u r s a f t e r M C T r e s u l t e d i n s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y w i t h i n 1 2 - 1 8 h o u r s . T h e p r e s e n t s t u d y w a s d e s i g n e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t e m p o r a l d i f f e r e n c e s i n M C T a n d L P S e x p o s u r e a f f e c t t o x i c i t y . W h e n L P S ( 3 . 4 x 1 0 6 E U / k g ; i . v . ) w a s g i v e n o n e h o u r b e f o r e M C T ( 1 0 0 m g / k g ; i . p . ) , h e p a t o t o x i c i t y d e v e l o p e d b e t w e e n 4 a n d 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n , a n d m o r t a l i t y w a s m u c h g r e a t e r t h a n w h e n L P S w a s a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s a f t e r M C T . T o e x p l o r e t h i s d i f f e r e n c e , t h e t e m p o r a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n L P S a n d M C T e x p o s u r e ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g a n d 1 0 0 m g / k g , r e s p e c t i v e l y ) w a s a l t e r e d . T w e n t y - f o u r - h o u r s u r v i v a l w a s h i g h i n a n i m a l s t h a t r e c e i v e d L P S 4 h o u r s b e f o r e ( 8 6 % ) o r a f t e r ( 8 8 % ) M C T , b u t i t d e c r e a s e d m a r k e d l y w h e n L P S w a s a d m i n i s t e r e d a n h o u r b e f o r e M C T ( 1 7 % ) . U s i n g t h i s l a t t e r d o s i n g r e g i m e n , a n i m a l s b e c a m e m o r i b u n d a s e a r l y a s 4 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . S i n c e l i v e r i n j u r y w a s s i m i l a r f r o m r e g i m e n s t h a t d i f f e r e d g r e a t l y i n m o r t a l i t y , d e a t h a p p e a r e d t o r e s u l t f r o m e x t r a h e p a t i c c a u s e s . T o e x p l o r e a r o l e f o r n i t r i c o x i d e ( N O ) - i n d u c e d s h o c k i n t h i s r e g i m e n , a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h a m i n o g u a n i d i n e ( A G ) , a n i n h i b i t o r o f i n d u c i b l e N O s y n t h a s e , p r i o r t o a d m i n i s t r a t i o n o f L P S g i v e n a n h o u r b e f o r e M C T . I n t h e c o t r e a t e d a n i m a l s , A G s i g n i f i c a n t l y a t t e n u a t e d m o r t a l i t y a n d d e c r e a s e d p l a s m a n i t r a t e / n i t r i t e c o n c e n t r a t i o n s , m a r k e r s o f N O 1 1 0 b i o s y n t h e s i s . H e n c e , t h e p r i m a r y t a r g e t o f t o x i c i t y f r o m M C T a n d L P S c o t r e a t m e n t a p p e a r e d t o s h i f t f r o m t h e l i v e r t o a n e x t r a h e p a t i c s i t e ( s ) a s e x p o s u r e t o t h e s e a g e n t s o c c u r r e d c l o s e r t o g e t h e r t e m p o r a l l y . N O a p p e a r s t o b e c a u s a l l y i n v o l v e d i n t h e d e a t h s o f a n i m a l s t r e a t e d w i t h L P S a n h o u r b e f o r e M C T . 3 . 8 . I n t r o d u c t i o n I n C h a p t e r 2 , i t w a s d e m o n s t r a t e d t h a t s y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y r e s u l t e d w h e n a n o n i n j u r i o u s d o s e o f L P S w a s a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s a f t e r a s m a l l , n o n - h e p a t o t o x i c d o s e o f M C T . H i s t o p a t h o l o g i c a l a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t l i v e r l e s i o n s w e r e b o t h c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l , e x h i b i t i n g c h a r a c t e r i s t i c s s i m i l a r t o l e s i o n s a s s o c i a t e d w i t h l a r g e r , t o x i c d o s e s o f M C T o r L P S , r e s p e c t i v e l y . T h i s s t u d y p r o v i d e d e v i d e n c e t h a t e x p o s u r e t o m o d e s t d o s e s o f L P S m a y e n h a n c e s u s c e p t i b i l i t y t o i n t o x i c a t i o n f r o m P A s a n d p e r h a p s o t h e r f o o d - b o m e h e p a t o t o x i n s . I n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n , t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n L P S a n d M C T w a s c h a r a c t e r i z e d f u r t h e r . S p e c i f i c a l l y , t h e h y p o t h e s i s w a s t e s t e d t h a t t o x i c i t y w a s a f f e c t e d b y c h a n g e s i n t h e t e m p o r a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n L P S a n d M C T e x p o s u r e s . R e s u l t s s h o w e d t h a t L P S a n d M C T a d m i n i s t r a t i o n l e d t o s u b s t a n t i a l l y g r e a t e r l e t h a l i t y w h e n t h e a g e n t s w e r e g i v e n c o n c u r r e n t l y t h a n w h e n s e p a r a t e d b y s e v e r a l h o u r s . T h e i n c r e a s e i n m o r t a l i t y d i d n o t a p p e a r t o r e s u l t d i r e c t l y f r o m l i v e r i n j u r y , a n d i t s n a t u r e s u g g e s t e d a n e n h a n c e d s e n s i t i v i t y t o 1 1 1 c i r c u l a t o r y s h o c k . A c c o r d i n g l y , t h e i n v o l v e m e n t o f n i t r i c o x i d e ( N O ) i n t h e e n h a n c e d m o r t a l i t y w a s e x p l o r e d . 3 . 0 . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 3 . C . 1 . M a t e r i a l s A m i n o g u a n i d i n e h e m i s u l f a t e s a l t ( A G ) , b o r o n t r i f l u o r i d e i n m e t h a n o l , p - d i m e t h y l a m i n o b e n z a l d e h y d e , h e p a r i n ( T y p e I I , d i s o d i u m s a l t ) , L P S ( E s c h e r i c h i a c o l i , s e r o t y p e 0 1 2 8 : 8 1 2 , 1 . 7 x 1 0 6 E U / m g ) , m e r c u r i c c h l o r i d e , a n d s o d i u m c i t r a t e w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . D i a g n o s t i c k i t s 5 8 U V a n d 5 9 U V f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A S T ) a n d a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A L T ) a c t i v i t i e s , r e s p e c t i v e l y , w e r e a l s o p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . T o t a l N i t r i c O x i d e ( N O ) C o r r e l a t e A s s a y k i t w a s a c q u i r e d f r o m A s s a y D e s i g n , I n c ( A n n A r b o r , M I ) . M C T w a s o b t a i n e d f r o m T r a n s W o r l d C h e m i c a l s ( R o c k v i l l e , M D ) . A b s o l u t e e t h a n o l w a s p u r c h a s e d f r o m Q u a n t u m C h e m i c a l C o m p a n y ( T u s o o l a , I L ) . S t e r i l e s a l i n e w a s a c q u i r e d f r o m A b b o t t L a b o r a t o r i e s ( N o r t h C h i c a g o , I L ) . F o r m a l i n f i x a t i v e w a s o b t a i n e d f r o m S u r g i p a t h M e d i c a l I n d u s t r i e s , I n c . ( R i c h m o n d , I L ) . 3 . C . 2 . A n i m a l s A n i m a l s t h a t w e r e c l e a r l y m o r i b u n d ( i . e . , r e c u m b e n t , n o n r e s p o n s i v e a n d l a c k i n g r i g h t i n g r e f l e x ) w e r e e u t h a n i z e d . O t h e n l v i s e , f o r m o r e i n f o r m a t i o n o n t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 1 1 2 3 . C . 3 . T r e a t m e n t P r o t o c o l A G ( 1 5 m g / k g ; 2 m l / k g ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d i n t r a v e n o u s l y 1 0 m i n u t e s p r i o r t o L P S a d m i n i s t r a t i o n . S u r v i v a l a n d e n z y m i c m a r k e r s w e r e a s s e s s e d a t t h e t i m e s s p e c i f i e d i n t h e f i g u r e s a n d t a b l e s . O t h e n N i s e , f o r m o r e i n f o r m a t i o n o n t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 3 . C . 4 . E n z y m e A s s a y s L i v e r i n j u r y w a s a s s e s s e d b y a n a l y z i n g p l a s m a f o r i n c r e a s e d a c t i v i t y o f A L T a n d A S T , t w o e n z y m i c m a r k e r s o f h e p a t o c e l l u l a r d a m a g e . O t h e r w i s e , f o r m o r e i n f o r m a t i o n o n t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 3 . C . 5 . N i t r i c O x i d e D e t e r m i n a t i o n l n p l a s m a s a m p l e s a n t i c o a g u l a t e d w i t h s o d i u m c i t r a t e , N O w a s d e t e r m i n e d f r o m c o n c e n t r a t i o n s o f n i t r a t e a n d n i t r i t e ( N O x ) u s i n g a s p e c t r o p h o t o m e t r i c m e t h o d b a s e d o n t h e G r i e s s r e a c t i o n ( G r e e n a t a l . , 1 9 8 2 ) . U s i n g t h e T o t a l N i t r i c O x i d e C o r r e l a t e A s s a y K i t , p l a s m a s a m p l e s w e r e d i l u t e d 1 : 4 i n r e a c t i o n b u f f e r ( H e p e s ) a n d u l t r a f i l t e r e d t h r o u g h a 1 0 , 0 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t c u t - o f f f i l t e r . S a m p l e s a n d s t a n d a r d s ( s o d i u m n i t r a t e ) w e r e i n c u b a t e d i n a 9 6 - w e l l m i c r o t i t e r p l a t e f o r 3 0 m i n u t e s a t 3 7 ° C w i t h n i t r a t e r e d u c t a s e a n d N A D H t o c o n v e r t n i t r a t e i n t o n i t r i t e . G r i e s s r e a g e n t ( a 1 : 1 m i x t u r e o f s u l f a n i l a m i d e i n 2 M h y d r o c h l o r i c a c i d a n d N - ( 1 - n a p h t h y l ) e t h y l e n e d i a m i n e i n 2 M h y d r o c h l o r i c a c i d ) 1 1 3 w a s a d d e d t o e a c h o f t h e w e l l s a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e f o r 1 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e a b s o r b a n c e o f t h e c o l o r e d a z o - r e a c t i o n p r o d u c t w a s r e a d a t 5 4 0 n m . 3 . C . 6 . E h r l i c h A s s a y F o r m o r e i n f o r m a t i o n o n t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 3 . C . 7 . H i s t o p a t h o l o g i c E v a l u a t i o n L i v e r s w e r e r e m o v e d i n t a c t a n d f i x e d i n 1 0 % n e u t r a l b u f f e r e d f o r m a l i n f o r a t l e a s t 3 d a y s b e f o r e b e i n g p r o c e s s e d f o r h i s t o l o g i c a n a l y s i s . S e r i a l t r a n s v e r s e l i v e r s e c t i o n s f r o m t h e l e f t a n d r i g h t l a t e r a l l i v e r l o b e s w e r e u s e d f o r l i g h t m i c r o s c o p y . P a r a f f i n - e m b e d d e d s e c t i o n s w e r e c u t a t 4 p m a n d s t a i n e d w i t h h e m a t o x y l i n a n d e o s i n . S l i d e s w e r e c o d e d , r a n d o m i z e d , a n d e v a l u a t e d b y l i g h t m i c r o s c o p y . T h e f o l l o w i n g h i s t o p a t h o l o g y g r a d i n g s c a l e w a s u s e d t o s c o r e e a c h o f s e v e r a l c a t e g o r i e s : ( 0 ) n o n e , ( : l : ) m i n i m a l , ( + ) m o d e s t , ( + + ) m o d e r a t e , ( + + + ) m a r k e d , a n d ( + + + + ) s e v e r e e f f e c t . C a t e g o r i e s i n c l u d e d : h e m o r r h a g e / c o n g e s t i o n , s i n u s o i d a l a r c h i t e c t u r e l o s s , i n f l a m m a t i o n ( n e u t r o p h i l p r e s e n c e ) , p a r e n c h y m a l c e l l i n j u r y ( c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l ) a n d d i s r u p t i o n o f c e n t r a l v e i n i n t i m a . 3 . C . 8 . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s 1 1 4 R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n s i S . E . M . W h e n v a r i a n c e s w e r e n o t h o m o g e n e o u s , d a t a w e r e l o g - t r a n s f o n ' n e d b e f o r e a n a l y s i s . S i n g l e c o m p a r i s o n s w e r e a n a l y z e d b y S t u d e n t ’ s t - t e s t . C o m p a r i s o n s o f p e r c e n t a g e s w e r e a n a l y z e d b y F i s h e r ’ s e x a c t t e s t ( M o t u l s k y , 1 9 9 5 ; S t e e l e t a l . , 1 9 9 7 ) . M u l t i p l e c o m p a r i s o n s w e r e a n a l y z e d b y o n e - w a y o r t w o - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) , a s a p p r o p r i a t e , a n d g r o u p m e a n s w e r e c o m p a r e d u s i n g T u k e y ’ s o m e g a p o s t h o c t e s t ( S t e e l e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e c r i t e r i o n f o r s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e w a s p s 0 . 0 5 f o r a l l c o m p a r i s o n s . 3 . D . R e s u l t s 3 . D . 1 . H e p a t o t o x i c i t y D e v e l o p m e n t : L P S A d m i n i s t e r e d b e f o r e M C T Y e e e t a l . ( 2 0 0 0 b ) p r e v i o u s l y r e p o r t e d t h a t 7 . 4 x 1 0 6 E U L P S / k g a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s a f t e r 1 0 0 m g M C T / k g r e s u l t e d i n s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y w i t h i n 1 2 - 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , 3 . 4 x 1 0 6 E U L P S / k g w a s a d m i n i s t e r e d o n e h o u r b e f o r e 1 0 0 m g M C T / k g . H e p a t o t o x i c i t y d e v e l o p e d b e t w e e n 4 a n d 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n a n d w a s a p p a r e n t u n t i l t h e f i n a l e x a m i n a t i o n t i m e o f 1 8 h o u r s ( F i g u r e 3 . 1 A ) . C h a n g e s i n p l a s m a A S T a c t i v i t i e s ( d a t a n o t s h o w n ) w e r e s i m i l a r t o t h o s e s h o w n f o r A L T . I n L P S / M C T - c o t r e a t e d a n i m a l s , s u r v i v a l a t 1 2 h o u r s w a s 8 4 % . H o w e v e r , s u r v i v a l d e c r e a s e d m a r k e d l y t o 3 1 % b y 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 3 . 1 B ) . T o t e s t t h e p o s s i b i l i t y t h a t l i v e r i n j u r y f r o m t h e c o t r e a t m e n t r e g i m e n o f L P S a n h o u r b e f o r e M C T w a s t h e r e s u l t o f L P S - i n d u c e d e n h a n c e m e n t o f M C T 1 1 5 F i g u r e 3 . 1 . D e v e l o p m e n t o f H e p a t o t o x i c i t y i n R a t s G i v e n L P S a n H o g : B e f o r e M C T . R a t s w e r e g i v e n 3 . 4 x 1 0 6 E U L P S / k g o r s a l i n e V e h , i . v . , a n h o u r b e f o r e 1 0 0 m g M C T / k g o r s a l i n e V e h , i . p . ( A ) H e p a t o t o x i c i t y w a s e v a l u a t e d a t v a r i o u s t i m e s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n a s i n c r e a s e s i n p l a s m a A L T a c t i v i t y . ( B ) P e r c e n t s u r v i v a l o f a n i m a l s c o t r e a t e d w i t h L P S a n d M C T w a s a s s e s s e d u p t o 1 8 h o u r s a f t e r M C T c o t r e a t m e n t . E r r o r b a r s f o r S E M t h a t a r e s m a l l e r t h a n t h e s y m b o l s a r e n o t s h o w n . N = 6 - 3 0 a n i m a l s . 3 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l l o t h e r g r o u p s a t t h e s a m e t i m e . 1 1 6 T i m e A f t e r M C T ( h r s ) . P S a n H o u r A V e h , i . v . , a n I ? t o x i c i t y w a s 3 1 0 0 0 . V e h N e h a V l c r e a s e s i n 2 ‘ 8 0 0 - I . M E S / 1 M 3 : a . . 2 + L P S / M C T e d w x t h P S 4 5 6 0 0 ‘ < . E r r o r b a r s | _ _ | 4 0 0 ' a I I : 5 - 3 0 < “ 3 . g 2 0 0 N 4 E 0 . . . . 0 4 8 1 2 1 6 2 0 T i m e A f t e r M C T ( h r s ) 8 1 0 0 - E 8 0 : . 2 a s o - 3 a : 4 0 - o \ 2 0 - 0 . . . . 0 4 8 1 2 1 6 2 0 1 1 7 b i o a c t i v a t i o n , t h e c o n c e n t r a t i o n o f p y r r o l i c m e t a b o l i t e ( s ) i n t h e l i v e r w a s d e t e r m i n e d . P e a k p r o d u c t i o n o f M C T P o c c u r s 9 0 m i n u t e s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( A l l e n e t a l . , 1 9 7 2 ) , a c c o r d i n g l y l i v e r s a m p l e s f o r a n a l y s i s w e r e c o l l e c t e d a t t h a t t i m e . A s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n p y r r o l e p r o d u c t i o n , a n i n d i c a t o r o f M C T b i o a c t i v a t i o n , w a s o b s e r v e d i n l i v e r s f r o m a n i m a l s c o t r e a t e d w i t h L P S a n d M C T ( T a b l e 3 . 1 ) . H i s t o p a t h o l o g i c l e s i o n s i n l i v e r s f r o m r a t s t h a t r e c e i v e d L P S a n h o u r b e f o r e M C T w e r e s i m i l a r t o t h o s e o b s e r v e d i n l i v e r s t h a t h a d b e e n g i v e n L P S 4 h o u r s a f t e r M C T ( d a t a n o t s h o w n [ s i m i l a r g r a d i n g b e t w e e n t w o t r e a t m e n t r e g i m e n s ] ) . B o t h c o t r e a t m e n t r e g i m e n s r e s u l t e d i n l i v e r l e s i o n s t h a t r e s e m b l e d a c o m b i n a t i o n o f c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l l e s i o n s s e e n w i t h M C T a n d L P S , r e s p e c t i v e l y , w h e n g i v e n b y t h e m s e l v e s a t l a r g e r d o s e s ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ) . T h e c e n t r i l o b u l a r l e s i o n e x h i b i t e d m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r a p o p t o t i c a n d o n c o t i c n e c r o s i s , d e g e n e r a t i o n , c o n g e s t i o n / h e m o r r h a g e a n d v a s c u l a r i n j u r y . T h e m i d z o n a l l e s i o n c o n s i s t e d o f w e l l - d e f i n e d a r e a s o f m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r c o a g u l a t i v e n e c r o s i s a c c o m p a n i e d b y n e u t r o p h i l i n f i l t r a t i o n w i t h c o n g e s t i o n a n d h e m o r r h a g e . T o e l u c i d a t e t h e d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p o f t h e L P S / M C T i n t e r a c t i o n s , v a r i o u s d o s e s o f L P S w e r e a d m i n i s t e r e d a n h o u r b e f o r e M C T ( 1 0 0 m g / k g ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e . H e p a t o t o x i c i t y w a s a s s e s s e d 1 2 h o u r s a f t e r M C T o r v e h i c l e a d m i n i s t r a t i o n . A d o s e - r e l a t e d i n c r e a s e i n p l a s m a A L T a c t i v i t y w a s o b s e r v e d i n a n i m a l s c o t r e a t e d w i t h L P S a n d M C T ( F i g u r e 3 . 2 A ) . P l a s m a A L T a c t i v i t y w a s 1 1 8 T a b l e 3 . 1 . i s I n c r e a s e s H e p a t i c M C T B i o a c t i v a t i o n . L P S ( 3 . 4 x 1 0 6 E U / k g , i . v . ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( V e h ) w a s a d m i n i s t e r e d t o r a t s a n h o u r b e f o r e M C T ( 1 0 0 m g / k g , i . p . ) . L i v e r s a m p l e s w e r e t a k e n 1 . 5 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n a n d h o m o g e n i z e d f o r a n a l y s i s o f p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n b y t h e E h r l i c h a s s a y . R e s u l t i n g v a l u e s w e r e c o r r e c t e d f o r e n d o g e n o u s p y r r o l e b y s u b t r a c t i n g t h e a v e r a g e v a l u e ( i . e . , 1 0 u g p y r r o l e / g l i v e r ) f r o m a n i m a l s g i v e n t h e V e h N e h c o m b i n a t i o n . N = 5 a n i m a l s . 8 ‘ S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m V e h / M C T g r o u p . 1 1 9 I h o u r s a t e 1 1 3 . 1 1 0 1 l e v e l s r ) f o r . T r e a t m e n t P y r r o l e ( p g / g l i v e r ) V e h / M C T 1 8 6 : l : 1 2 L P S / M C T 2 7 0 : l : 6 ' 1 2 0 F i g u r e 3 . 2 : D o s e - D e p e n d e n c y o f H e p a t o t o x i c i t y f r o m £ 5 . a n d M C T n g g m i n i s t r a t i o n . H e p a t o t o x i c i t y w a s a s s e s s e d 1 2 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . ( A ) T o d e t e r m i n e t h e d e p e n d e n c e o n L P S d o s e , r a t s w e r e g i v e n t h e i n d i c a t e d d o s e s o f L P S a n h o u r b e f o r e 1 0 0 m g M C T / k g o r i t s s a l i n e V e h . P l a s m a A L T a c t i v i t y f o r t h e V e h N e h c o n t r o l g r o u p ( n o t s h o w n o n g r a p h ) w a s 5 6 i 1 1 U / L . ( B ) T o e x a m i n e t h e i n f l u e n c e o f M C T d o s e , a n i m a l s w e r e g i v e n 3 . 4 x 1 0 6 E U L P S / k g o r i t s s a l i n e V e h a n h o u r b e f o r e t h e i n d i c a t e d M C T d o s e s . E r r o r b a r s f o r S E M t h a t a r e s m a l l e r t h a n t h e s y m b o l s a r e n o t s h o w n . N = 6 - 3 0 a n i m a l s . 5 ' S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m V e h N e h c o n t r o l g r o u p . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m v a l u e a t t h e s a m e d o s e o f L P S . ° S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m v a l u e a t t h e s a m e d o s e o f M C T . 1 2 1 p ) L I U ( y t i v i t c A T L A a m s a l P W ) L n o O O I U ( y t ’ i 0 O O v i t c A b a O O T L A a m s a N O O l O P 1 2 2 M C T ( m g / k g ) 2 0 0 1 0 0 L P S D o s e ( 1 o 6 E U l k g ) - I — V e h / M C T + L P S / M C T a 3 0 0 0 . 0 1 0 . 1 1 0 1 0 0 0 0 0 + L P S N e h - + L P S / M C T s i g n i f i r a n g i r e x c e e a c t i v i t y L P S I p l a s m T h u s 1 f o l d . b e f o r e 0 t 5 0 0 t 5 0 n o t h e ” l g / k c t h a t ” r e d U c 3 . 0 . 2 t r e a t ” 0 1 L } : t r e a t r s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d i n M C T - t r e a t e d a n i m a l s p r e t r e a t e d w i t h d o s e s o f L P S r a n g i n g f r o m 0 . 0 9 - 3 . 4 x 1 0 6 E U / k g . L e t h a l i t y i n t h e s e c o t r e a t e d a n i m a l s d i d n o t e x c e e d 3 0 % . B y c o m p a r i s o n , t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t c h a n g e i n p l a s m a A L T a c t i v i t y i n t h e a b s e n c e o f M C T i n r a t s r e c e i v i n g L P S u p t o 2 9 . 6 x 1 0 6 E U / k g . A n L P S d o s e o f 4 4 . 4 x 1 0 6 E U / k g , h o w e v e r , p r o d u c e d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n p l a s m a A L T a c t i v i t y . N o m o r t a l i t y o c c u r r e d i n a n i m a l s t h a t r e c e i v e d L P S / s a l i n e . T h u s , i n t h e p r e s e n c e o f M C T , t h e s e n s i t i v i t y t o L P S t o x i c i t y i n c r e a s e d a b o u t 5 0 0 f o l d . W h e n a n o n i n j u r i o u s d o s e o f L P S ( 3 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) w a s g i v e n a n h o u r b e f o r e v a r i o u s d o s e s o f M C T , s i g n i f i c a n t t o x i c i t y w a s o b s e r v e d w i t h M C T d o s e s o f 5 0 m g / k g o r g r e a t e r ( F i g u r e 3 . 2 B ) . N o m o r t a l i t y w a s o b s e r v e d a t M C T d o s e s o f 5 0 m g / k g o r l e s s i n c o n j u n c t i o n w i t h L P S p r e t r e a t m e n t . I n c o n t r a s t , M C T w a s n o t h e p a t o t o x i c i n t h e a b s e n c e o f L P S p r e t r e a t m e n t a t d o s e s s m a l l e r t h a n 3 0 0 m g / k g . L i k e w i s e , n o m o r t a l i t y o c c u r r e d i n t h e s e V e h / M C T c o t r e a t e d a n i m a l s . I n t h e p r e s e n c e o f L P S , t h e n o o b s e r v e d a d v e r s e e f f e c t l e v e l ( N O A E L ) f o r M C T w a s r e d u c e d t o a p p r o x i m a t e l y 1 0 % o f t h e N O A E L f o r M C T a l o n e . 3 . D . 2 . M C T a n d L P S T e m p o r a l R e l a t i o n s h i p T h e r e m a r k a b l y h i g h m o r t a l i t y i n t h i s s t u d y ( F i g u r e 3 . 1 B ) p r o m p t e d a n e x a m i n a t i o n o f a n i m a l d e a t h s i n o u r a t t e m p t s t o e x p l o r e h e p a t o t o x i c M C T / L P S t r e a t m e n t r e g i m e n s . I n t h e s e s t u d i e s , a n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h t h e s a m e d o s e s o f L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) a n d M C T ( 1 0 0 m g / k g ) b u t a t d i f f e r e n t t i m e s b e t w e e n t r e a t m e n t s . P e r c e n t s u r v i v a l w a s d e t e r m i n e d 2 4 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n 1 2 3 ( T a b l e 3 d 2 4 a d n m n s s h o h c e o d y l ? a d n m k 3 1 1 3 . m a t s r a d n fi n h t e s fl a b h o r fi g n h i V e h n i [ h o o t a fi s e l S h 0 d G l e n i ” b i b i T h g fl q ( T a b l e 3 . 2 ) . W h e n L P S w a s a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s b e f o r e o r a f t e r M C T , s u r v i v a l a t 2 4 h o u r s w a s a b o u t 8 6 a n d 8 8 % , r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , a s t h e a d m i n i s t r a t i o n s o f M C T a n d L P S w e r e m o v e d c l o s e r t o g e t h e r t e m p o r a l l y , s u r v i v a l s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d . F o r e x a m p l e , w h e n L P S w a s g i v e n a n h o u r b e f o r e M C T , o n l y 1 7 % o f a n i m a l s s u r v i v e d u n t i l 2 4 h o u r s . L i k e w i s e , w h e n L P S a n d M C T w e r e a d m i n i s t e r e d c o n c u r r e n t l y , o n l y 2 0 % o f a n i m a l s s u r v i v e d t o 2 4 h o u r s . 3 . D . 3 . E f f e c t o f A G o n A n i m a l s T r e a t e d w i t h L P S a n H o u r B e f o r e M C T O b s e r v a t i o n o f a n i m a l s t h a t r e c e i v e d L P S a n h o u r b e f o r e M C T r e v e a l e d t h a t s o m e o f t h e a n i m a l s b e c a m e m o r i b u n d a s e a r l y a s 4 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . A g r o s s e x a m i n a t i o n o f t h e b r a i n , h e a r t , k i d n e y s , l u n g s , s m a l l i n t e s t i n e a n d s p l e e n o f a n i m a l s e u t h a n i z e d a t t h i s t i m e r e v e a l e d n o o b v i o u s a b n o r m a l i t i e s . P l a s m a A L T a c t i v i t y 4 h o u r s a f t e r M C T w a s m o d e s t l y , b u t s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d o v e r c o n t r o l s ( V e h N e h , 6 4 i 1 2 ; L P S N e h , 1 1 6 i 4 ; V e h / M C T , 6 6 i 7 ; L P S / M C T , 3 0 9 i 4 5 U / L ) . T h e m o d e s t n a t u r e o f l i v e r i n j u r y a n d l a c k o f g r o s s a b n o r m a l i t i e s i n m o r i b u n d a n i m a l s g i v e n t h i s t r e a t m e n t r e g i m e n s u g g e s t e d t h a t d e a t h m i g h t h a v e a r i s e n f r o m e x t r a h e p a t i c c i r c u m s t a n c e s , p e r h a p s c i r c u l a t o r y s h o c k . I n a s m u c h a s s h o c k c a u s e d b y l a r g e d o s e s o f L P S i s m e d i a t e d b y N O ( T r a c e y e t a l . , 1 9 9 5 ; W u e t a l . , 1 9 9 5 ; T a k a n o e t a l . , 1 9 9 7 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) , t h e e f f e c t o f a N O S i n h i b i t o r o n l e t h a l i t y f r o m L P S / M C T c o a d m i n i s t r a t i o n w a s e x a m i n e d . A G ( 1 5 m g / k g , i . v . ) o r i t s s a l i n e V e h w a s a d m i n i s t e r e d 1 0 m i n u t e s b e f o r e L P S ( W u e t a l . , 1 2 4 T a b l e 3 . F l a t s w e S u r v i v a l L P S w e . t a b l e . I s t u d i e s t a S i g n i f i c o r a f t e r E x a c t T I T a b l e 3 . 2 . M C T a n d L P S T e m m r a l R e l a t i o n s h i p I n f l p e n c e s p m . R a t s w e r e g i v e n 7 . 4 x 1 0 6 E U L P S / k g ( i . v . ) a n d 1 0 0 m g M C T / k g ( i . p . ) . S u r v i v a l w a s e v a l u a t e d 2 4 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( i . e . , t i m e z e r o ) . L P S w a s a d m i n i s t e r e d a t v a r i o u s t i m e s r e l a t i v e t o M C T a s s p e c i f i e d i n t h e t a b l e . D a t a r e p r e s e n t f i n d i n g s w h i c h a r o s e f r o m s e v e r a l p r e l i m i n a r y s t u d i e s t o d e t e r m i n e h e p a t o t o x i c d o s i n g r e g i m e n s . 8 ‘ S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m s u r v i v a l w h e n L P S w a s g i v e n 4 h o u r s b e f o r e o r a f t e r M C T a s d e t e r m i n e d b y B o n f e r r o n i ’ s C o r r e c t i o n o f t h e F i s h e r ' s E x a c t T e s t . 1 2 5 ( R e l a ‘ L P S A d m i n i s t r a t i o n % S u r v i v a l N ( R e l a t i v e t o M C T a t t = 0 h o u r ) a t 2 4 H o u r s - 4 h o u r 8 5 . 7 7 - 1 h o u r 1 6 . 6 “ l 5 3 0 h o u r 2 0 . 0 l l 5 1 h o u r 4 0 . 0 5 4 h o u r 8 7 . 5 3 2 1 2 6 1 9 9 5 ; b e f o r e h o u r s w a s V e h / L i n c r e e ( T a b l e h o u r s m a r k e h o u r s P o s s i b a fi e c t L P S / I v A G / L F V e h / L l F u n h e o f M C C o p p h V a l u e s a f t e r N O v e r 1 5 1 9 9 5 ; T a k a n o e t a l . , 1 9 9 7 ) , a n d L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) w a s a d m i n i s t e r e d a n h o u r b e f o r e M C T ( 1 0 0 m g / k g ) . A G s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e d s u r v i v a l ( F i g u r e 3 . 3 ) . A t 1 . 5 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n , p l a s m a [ N O x ] i n L P S / M C T c o t r e a t e d a n i m a l s w a s s m a l l a n d u n a f f e c t e d b y A G t r e a t m e n t ( A G / L P S / M C T , 6 4 i 1 4 ; V e h / L P S / M C T , 6 0 i 1 3 u M ) . B y 6 h o u r s , L P S / M C T t r e a t m e n t r e s u l t e d i n a l a r g e i n c r e a s e i n p l a s m a [ N O X ] , w h i c h w a s s i g n i f i c a n t l y a t t e n u a t e d b y A G p r e t r e a t m e n t ( T a b l e 3 . 3 ) . T h e A G - m e d i a t e d r e d u c t i o n i n p l a s m a [ N O x ] r e m a i n e d t h r o u g h 2 4 h o u r s ( i . e . , V e h / L P S / M C T , 8 0 1 i 1 8 6 ; A G / L P S / M C T , 2 2 3 i 4 3 u M ) . A l t h o u g h A G m a r k e d l y a t t e n u a t e d l e t h a l i t y , i t h a d n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o n p l a s m a A L T a c t i v i t y 6 h o u r s a f t e r L P S / M C T a d m i n i s t r a t i o n ( T a b l e 3 . 3 ) . B e c a u s e A G a f f o r d e d p r o t e c t i o n f r o m L P S / M C T - i n d u c e d l e t h a l i t y , i t w a s p o s s i b l e t h a t A G d e c r e a s e d M C T b i o a c t i v a t i o n . P r e t r e a t m e n t w i t h A G d i d n o t a f f e c t E h r l i c h a c t i v i t y i n l i v e r s a m p l e s t a k e n e i t h e r a t 1 . 5 o r 6 h o u r s a f t e r L P S / M C T ( a t 1 . 5 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n : V e h / L P S / M C T , 2 5 5 i 2 8 , a n d A G / L P S / M C T , 2 9 6 i 4 0 p g p y r r o l e / g l i v e r ; a t 6 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n : V e h / L P S / M C T , 3 0 9 i 2 0 , a n d A G / L P S / M C T , 3 0 9 i 3 5 p g p y r r o l e / g l i v e r ) . F u r t h e r m o r e , w h e n A G w a s g i v e n t o r a t s 1 0 m i n u t e s b e f o r e a n h e p a t o t o x i c d o s e o f M C T ( 3 0 0 m g / k g [ T h i s s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w a s c o n d u c t e d b y B r y a n L . C o p p l e ] ) , n o c h a n g e i n M C T - i n d u c e d l i v e r i n j u r y w a s o b s e r v e d ( p l a s m a A L T v a l u e s : V e h / M C T , 1 1 5 1 i 2 8 2 ; A G / M C T , 1 1 3 1 i 1 9 2 U / L ; m e a s u r e d 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ) . A t t h i s d o s e o f M C T , p l a s m a [ N O X ] d i d n o t i n c r e a s e o v e r 1 8 h o u r s ( d a t a n o t s h o w n ) . 1 2 7 F i g u r e 3 . 3 : E f f e c t o f A G o n A n i m a l S p r v i v J a l F o l l o w i n g a L e t h a l C o m b i n a t i o n o f g i a n H o u r B e f o r e M C T . A n i m a l s w e r e g i v e n 1 5 m g A G / k g o r i t s s a l i n e V e h i v . 1 0 m i n u t e s b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n . 7 . 4 x 1 0 6 E U L P S / k g ( i . v . ) w a s a d m i n i s t e r e d a n h o u r b e f o r e 1 0 0 m g M C T / k g ( i . p . ) . P e r c e n t s u r v i v a l w a s a s s e s s e d u p t o 2 4 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . N = 1 4 f o r A G / L P S / M C T a n d 1 7 f o r V e h / L P S / M C T c o t r e a t e d a n i m a l s . ' 3 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m o t h e r g r o u p . 1 2 8 % S u r v i v a l 1 0 0 i 8 0 ' 6 0 ‘ 4 0 ‘ 2 0 ' 0 + V e h / L P S I M C T + A G / L P S I M C T 6 1 2 1 e 2 4 T i m e A f t e r M C T ( h r s ) 1 2 9 T a b l e 3 . 3 . A G R e d u c e s P l a s m a [ N 0 5 1 a t 6 I fl r r s i n A n i m a l s T h a t R e c e i v e d L E § a n H o u r B e f o r e M C T . R a t s w e r e g i v e n 1 5 m g A G / k g o r i t s s a l i n e V e h ( i . v . ) t e n m i n u t e s b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n . L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ; i . v . ) w a s a d m i n i s t e r e d a n h o u r b e f o r e M C T ( 1 0 0 m g / k g ; i . p . ) , a n d p l a s m a [ N O x ] ( u M ) w a s a s s e s s e d 6 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . N = 3 - 6 a n i m a l s / g r o u p b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m V e h / L P S / M C T g r o u p . 1 3 0 T r e a t m e n t G r o u p P l a s m a [ N O x ] ( u M ) P l a s m a A L T ( U I L ) . t V e h N e h N e h 3 9 : I : 6 6 4 : I : 1 2 A G N e h N e h 2 8 d : 5 9 6 : I : 1 7 V e h / L P S I M C T 4 0 9 i 3 7 3 7 7 : I : 3 2 A G I L P S I M C T 2 6 8 : I : 4 0 “ 3 4 8 : I : 9 1 1 3 1 3 . E C h e r h o u r h o u r 2 0 0 i a d m b e t v r A L T 3 . 1 8 I I V e r s i m i l W h e y 3 . E . D i s c u s s i o n E x p o s u r e t o m o d e s t a m o u n t s o f L P S e n h a n c e s t h e s u s c e p t i b i l i t y t o c h e m i c a l i n t o x i c a t i o n ( R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ) . T r e a t m e n t w i t h L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) 4 h o u r s a f t e r M C T ( 1 0 0 m g / k g ) r e s u l t s i n s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y w i t h i n 1 2 - 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n a n d m i n i m a l l e t h a l i t y ( i . e . , 1 2 % ) ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , a s m a l l e r d o s e o f L P S ( 3 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) a d m i n i s t e r e d a n h o u r b e f o r e M C T ( 1 0 0 m g / k g ) c a u s e d l i v e r i n j u r y t h a t d e v e l o p e d b e t w e e n 4 a n d 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 3 . 1 A ) . B y 1 8 h o u r s , A L T a c t i v i t y r e m a i n e d e l e v a t e d a n d m o r t a l i t y w a s p r o n o u n c e d ( i . e . , 6 9 % ; F i g u r e 3 . 1 8 ) . T h u s , a l t h o u g h a s m a l l e r d o s e o f L P S w a s g i v e n i n t h e p r e s e n t s t u d y , l i v e r i n j u r y w a s e a r l i e r i n o n s e t . I n a d d i t i o n , p l a s m a A L T a c t i v i t i e s i n c r e a s e d t o a s i m i l a r d e g r e e i n b o t h t r e a t m e n t r e g i m e n s , y e t m o r t a l i t y w a s c o n s i d e r a b l y g r e a t e r w h e n t h e e x p o s u r e s t o M C T a n d L P S o c c u r r e d c l o s e r i n t i m e . H i s t o p a t h o l o g i c a l a n a l y s i s o f l i v e r s o f r a t s t h a t h a d r e c e i v e d L P S a n h o u r b e f o r e M C T r e v e a l e d b o t h a c e n t r i l o b u l a r a n d a m i d z o n a l c o m p o n e n t t o t h e l e s i o n s . T h e s e l e s i o n s w e r e s i m i l a r t o l e s i o n s o b s e r v e d w h e n L P S w a s g i v e n 4 h o u r s a f t e r M C T ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ) . H o w e v e r , u n l i k e t h e l a t t e r t r e a t m e n t r e g i m e n , i n w h i c h t h e m i d z o n a l l e s i o n ( i . e . , t h e L P S - l i k e l e s i o n ) w a s m o r e p r o n o u n c e d , n e i t h e r l e s i o n p r e d o m i n a t e d i n s i z e n o r f r e q u e n c y w h e n L P S w a s a d m i n i s t e r e d a n h o u r b e f o r e M C T , s u g g e s t i n g t h a t a g r e a t e r d e g r e e o f M C T - i n d u c e d l i v e r i n j u r y o c c u r r e d u s i n g t h i s r e g i m e n . W h y t h e M C T - l i k e l e s i o n w a s 1 3 2 r e l a t i i p r o d L m o r e a f t e r ~ w a s 2 m a r k s 1 9 7 0 ) . h o u r s 3 . 1 ) . m i g h t I 3 . 1 w e S h O W e i t h a t r m r a t s w j a h e r C O l l C e r i S O Z y n r a t s ( k d e c r e e a n d N r e l a t i v e l y m o r e a p p a r e n t i n t h i s r e g i m e n r e m a i n s u n c l e a r , b u t t h e t i m i n g o f t h e p r o d u c t i o n a n d e x p o s u r e t o c r i t i c a l i n f l a m m a t o r y f a c t o r s m a y b e i n v o l v e d . I n l i g h t o f t h e i n c r e a s e i n t h e s e v e r i t y o f t h e c e n t r i l o b u l a r l e s i o n a n d o f t h e m o r e r a p i d d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y c o m p a r e d t o w h e n L P S w a s g i v e n 4 h o u r s a f t e r M C T , a n E h r l i c h a s s a y w a s u s e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r M C T m e t a b o l i s m w a s a f f e c t e d u n d e r t h i s a l t e r e d r e g i m e n . T i s s u e E h r l i c h a c t i v i t y i s a n i n d i r e c t m a r k e r o f M C T b i o a c t i v a t i o n t o i t s t o x i c m e t a b o l i t e , M C T P ( M a t t o c k s a n d W h i t e , 1 9 7 0 ) . A s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n l i v e r p y r r o l e w a s o b s e r v e d a t 1 . 5 h o u r s a f t e r L P S / M C T c o t r e a t m e n t c o m p a r e d t o t r e a t m e n t w i t h M C T a l o n e ( T a b l e 3 . 1 ) . A l t h o u g h t h e e n h a n c e d p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n i n t h i s n o n s p e c i f i c a s s a y m i g h t b e a t t r i b u t e d t o s o u r c e s o t h e r t h a n M C T P , t h e v a l u e s p r e s e n t e d i n T a b l e 3 . 1 w e r e c o r r e c t e d f o r e n d o g e n o u s p y r r o l e , a n d t h e L P S - t r e a t m e n t c o n t r o l s h o w e d m i n i m a l p y r r o l e f o r m a t i o n ( 6 i 2 u g p y r r o l e / g l i v e r ) . T h e r e s u l t s u g g e s t s t h a t m o r e M C T P w a s p r o d u c e d a n d / o r r e m a i n e d i n t h e l i v e r a f t e r p r e t r e a t m e n t o f r a t s w i t h L P S . T h i s i s i n c o n t r a s t t o t h e r e g i m e n i n w h i c h L P S w a s g i v e n 4 h o u r s a f t e r M C T , w h i c h y i e l d e d n o L P S - a s s o c i a t e d c h a n g e i n h e p a t i c p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ) . C y t o c h r o m e P 4 5 0 ( C Y P ) S A h a s b e e n i d e n t i f i e d a s t h e p r e d o m i n a n t i s o z y m e r e s p o n s i b l e f o r t h e m e t a b o l i s m o f M C T t o M C T P i n S p r a g u e - D a w l e y r a t s ( K a s a h a r a e t a l . , 1 9 9 7 ) . C Y P 3 A 2 m R N A a n d p r o t e i n e x p r e s s i o n a p p e a r t o d e c r e a s e w i t h i n t w e n t y - f o u r h o u r s a f t e r L P S t r e a t m e n t i n F i s c h e r 3 4 4 r a t s ( S e w e r a n d M o r g a n , 1 9 9 8 ) . C Y P 3 A m e t a b o l i c a c t i v i t y a l s o d e c r e a s e s i n S p r a g u e - D a w l e y r a t s a f t e r t r e a t m e n t w i t h L P S ( M u l l e r e t a l . , 1 9 9 6 ) . I n d e e d , s e v e r a l 1 3 3 d u d i C Y F ’ a n d r u e s t h a n e x p r a c h v c o n t 1 9 9 ‘ c o n c o n k D r o h r n o o e t , - g a l a O C C L t l " t a n S h o t e t a : a d r n S U Q C \ - s t u d i e s i n r a t s h a v e i n d i c a t e d t h a t w i t h i n 6 - 2 4 h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n C Y P 3 A e x p r e s s i o n i s n o t i n d u c e d ( M u l l e r e f a l . , 1 9 9 6 ; S e w e r e t a l . , 1 9 9 6 ; S e w e r a n d M o r g a n , 1 9 9 8 ) . H o w e v e r , t h e a p p a r e n t i n c r e a s e i n l i v e r p y r r o l e i n t h e p r e s e n t s t u d y o c c u r r e d m u c h e a r l i e r ( i . e . , 2 . 5 h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n ) t h a n t h e t i m e s e v a l u a t e d b y t h e s e i n v e s t i g a t o r s , s o i t i s p o s s i b l e t h a t e n z y m e e x p r e s s i o n o r a c t i v i t y i s i n c r e a s e d b y L P S a t t h i s e a r l i e r t i m e . M o r e o v e r , t h e a c t i v i t y o f t h e L P S u s e d i n t h e s e s t u d i e s w a s n o t r e p o r t e d , m a k i n g i t d i f f i c u l t t o c o m p a r e d o s e s a m o n g s t u d i e s o n t h e b a s i s o f L P S a c t i v i t y ( S h e d l o f s k y e t a l . , 1 9 9 4 ) . A c c o r d i n g l y , i t i s n o t p o s s i b l e t o r u l e o u t t h a t t h e i n c r e a s e d l i v e r p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( T a b l e 3 . 1 ) a r o s e f r o m a n e f f e c t o f L P S o n M C T b i o a c t i v a t i o n a n d / o r a d e c r e a s e d l o s s o f M C T P f r o m t h e l i v e r . A l t e r a t i o n i n t h e s e q u e n c e o f M C T a n d L P S a d m i n i s t r a t i o n r e s u l t e d i n a p r o f o u n d e f f e c t o n l e t h a l i t y ( T a b l e 3 . 2 ) . T h i s e f f e c t h a s b e e n o b s e r v e d i n o t h e r m o d e l s o f L P S a u g m e n t a t i o n o f x e n o b i o t i c t o x i c i t y , s u c h a s w i t h c a d m i u m ( C o o k e t a l . , 1 9 7 4 , 1 9 7 5 ) , l e a d ( S e l y e e t a l . , 1 9 6 6 ; T r e j o e t a l . , 1 9 7 2 ) , a n d g a l a c t o s a m i n e ( G a l a n o s e t a l . , 1 9 7 9 ) . I n t h e s e m o d e l s , t h e g r e a t e s t m o r t a l i t y o c c u r r e d w h e n r a t s w e r e t r e a t e d w i t h x e n o b i o t i c a n d L P S s i m u l t a n e o u s l y r a t h e r t h a n h o u r s a p a r t . I n a p r i m a t e m o d e l , 1 0 0 % m o r t a l i t y w a s o b s e r v e d u p o n t h e s i m u l t a n e o u s a d m i n i s t r a t i o n o f n o n l e t h a l d o s e s o f L P S a n d l e a d a c e t a t e ( H o l p e r e t a l . , 1 9 7 3 ) . D e a t h o c c u r r e d i n o n e a n i m a l a s e a r l y a s t h r e e h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , a n d t h e o t h e r s e x h i b i t e d h y p o t e n s i o n b e t w e e n 6 a n d 2 4 h o u r s , s u g g e s t i n g t h a t d e a t h m a y h a v e b e e n d u e t o c i r c u l a t o r y s h o c k . 1 3 4 A p p r o x i m a t e l y 1 0 % o f a n i m a l s g i v e n L P S a n h o u r b e f o r e M C T b e c a m e m o r i b u n d w i t h i n 6 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . A f e w b e c a m e m o r i b u n d a s e a r l y a s 4 h o u r s . A n a l y s i s o f l i v e r i n j u r y a t 4 h o u r s a f t e r M C T r e v e a l e d t h a t , a l t h o u g h l i v e r i n j u r y w a s p r e s e n t , i t w a s l e s s p r o n o u n c e d t h a n t h a t w h i c h o c c u r r e d i n M C T / L P S r e g i m e n s i n w h i c h m o r t a l i t y w a s m i n i m a l . A c c o r d i n g l y , i t s e e m s u n l i k e l y t h a t l i v e r i n j u r y w a s t h e c a u s e o f t h e p r o f o u n d a n d r e l a t i v e l y r a p i d l e t h a l i t y . T h i s s u g g e s t s t h a t r a t s t h a t d i e d u p o n c o t r e a t m e n t w i t h L P S a n h o u r b e f o r e M C T s u c c u m b e d t o a n e x t r a h e p a t i c e f f e c t . T h e l a c k o f g r o s s l y a p p a r e n t i n j u r y t o t i s s u e s a n d t h e e a r l y d e a t h s s u g g e s t t h a t a n i m a l s m a y h a v e s u c c u m b e d t o r a p i d l y d e v e l o p i n g , s e v e r e h y p o t e n s i o n . T h e p a t h o p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s t o l a r g e r d o s e s o f L P S m a y p r o v i d e a c l u e t o t h e u n d e r l y i n g c a u s e o f t h e p r o n o u n c e d l e t h a l i t y t h a t w a s o b s e r v e d . L a r g e d o s e s o f L P S l e a d t o s y s t e m i c h y p o t e n s i o n t h a t c a n p r o g r e s s q u i c k l y t o c i r c u l a t o r y f a i l u r e a n d d e a t h ( T r a c e y e t a l . , 1 9 9 5 ; W u e t a l . , 1 9 9 5 ; M a y e u x , 1 9 9 7 ; T a k a n o e t a l . , 1 9 9 7 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . E n h a n c e d f o r m a t i o n o f N O f o l l o w i n g t h e e x p r e s s i o n o f i n d u c i b l e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e ( i N O S ) i s k n o w n t o o c c u r i n t h e p a t h o g e n e s i s o f h y p o t e n s i v e s h o c k ( R u e t t e n a n d T h i e m e r m a n n , 1 9 9 6 ; M a y e u x , 1 9 9 7 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . L P S i s a p o t e n t i n d u c e r o f i N O S , t h e a c t i v i t y o f w h i c h l e a d s t o p r o d u c t i o n o f v a s o d i l a t o r y N O a n d t o h y p o t e n s i o n ( M a y e u x , 1 9 9 7 ; W o l k o w , 1 9 9 8 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . I n d e e d , d e a t h s f r o m l a r g e d o s e s o f L P S a p p e a r t o o c c u r f r o m e n h a n c e d N O p r o d u c t i o n ( K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ; T a k a n o , 1 9 9 7 ) , a l t h o u g h t h i s c o n c l u s i o n r e m a i n s c o n t r o v e r s i a l ( W o l k o w , 1 9 9 8 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . 1 3 5 p l a s ; l n d l c l n h i ‘ l a r g h Y P s e l l L P ! t r e e m a b e t h e r 2 4 L P a r i : c c ! a n I n : a l . r e s L P T r e a t m e n t w i t h L P S a n h o u r b e f o r e M C T r e s u l t e d i n s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r p l a s m a [ N O x ] t h a n o c c u r r e d i n v e h i c l e - t r e a t e d a n i m a l s ( T a b l e 3 . 3 ) . T h i s i n d i c a t e d t h a t N O w a s p r o d u c e d a f t e r L P S / M C T c o t r e a t m e n t . A G i s a s e l e c t i v e i n h i b i t o r o f i N O S a n d p r e v e n t s h y p o t e n s i o n a n d d e a t h i n a n i m a l s t r e a t e d w i t h l a r g e , l e t h a l d o s e s o f L P S ( W u e t a l . , 1 9 9 5 ; S o u t h a n a n d S z a b o , 1 9 9 6 ; T a k a n o e t a l . , 1 9 9 7 ) . A d o s e o f A G w a s u s e d t h a t p r o v i d e s p r o t e c t i o n f r o m L P S - i n d u c e d h y p o t e n s i o n ( T r a c e y e t a I . , 1 9 9 5 ; W u e t a l . , 1 9 9 5 ; T a k a n o e t a l . , 1 9 9 7 ) a n d t h a t i s s e l e c t i v e f o r i N O S i n h i b i t i o n ( S c o t t a n d M c C o r m a c k , 1 9 9 9 ) . S i x h o u r s a f t e r L P S / M C T c o a d m i n i s t r a t i o n , p l a s m a [ N O x ] w a s s i g n i f i c a n t l y a t t e n u a t e d b y t r e a t m e n t w i t h A G ( T a b l e 3 . 3 ) , a n d i t r e m a i n e d a t t e n u a t e d a t 2 4 h o u r s . A G m a r k e d l y e n h a n c e d s u r v i v a l i n a n i m a l s g i v e n t h e l e t h a l t r e a t m e n t o f L P S a n h o u r b e f o r e M C T ( F i g u r e 3 . 3 ) . S u r v i v a l w a s s i g n i f i c a n t l y e n h a n c e d s t a r t i n g a t 1 2 h o u r s , a n d p r o t e c t i o n c o n t i n u e d t h r o u g h o u t t h e 2 4 - h o u r e x a m i n a t i o n p e r i o d . A t 2 4 h o u r s , 7 1 % o f A G - c o t r e a t e d r a t s h a d s u r v i v e d c o m p a r e d t o 1 8 % i n t h e L P S / M C T g r o u p t h a t d i d n o t r e c e i v e A G . T h e p r o t e c t i v e e f f e c t o f A G d i d n o t a r i s e f r o m i n h i b i t i o n o f M C T b i o a c t i v a t i o n b e c a u s e A G d i d n o t d e c r e a s e t h e c o n c e n t r a t i o n o f p y r r o l i c m e t a b o l i t e s i n l i v e r t h a t a r o s e f r o m M C T a d m i n i s t r a t i o n a n d b e c a u s e A G d i d n o t p r o t e c t a g a i n s t l i v e r i n j u r y f r o m a l a r g e r d o s e o f M C T . I n d e e d , o t h e r s h a v e r e p o r t e d t h a t A G d o e s n o t i n h i b i t C Y P 3 A a c t i v i t y ( M u l l e r e t a l . , 1 9 9 6 ; K a s a h a r a e t a l . , 1 9 9 7 ; S e w e r a n d M o r g a n , 1 9 9 8 ) . T o g e t h e r , o u r r e s u l t s s u g g e s t t h a t v a s o d i l a t o r y N O m a y c a u s e l e t h a l h y p o t e n s i o n i n t h i s L P S / M C T m o d e l . 1 3 6 L P S / M T m s h ' t h e e t d i s s e r c l o t t i r t l b t i m s l o w i w i t h c i r c u 1 9 9 4 h e s i n r e d e c r i n t e - i N Q h e r a r m L P : l e t i C O b s I t i s p o s s i b l e t h a t i n c r e a s e d b u t n o n l e t h a l h y p o t e n s i o n a l s o o c c u r r e d i n t h e L P S / M C T t r e a t m e n t r e g i m e n o f 3 . 4 x 1 0 6 E U L P S / k g a n h o u r b e f o r e 1 0 0 m g / k g . T h i s h y p o t e n s i o n m a y h a v e r e s u l t e d i n d e c r e a s e d M C T P t r a n s p o r t o u t o f t h e l i v e r t h e r e b y a c c o u n t i n g f o r t h e i n c r e a s e d p y r r o l e o b s e r v e d i n T a b l e 3 . 1 . I t i s t e m p t i n g t o f u r t h e r s p e c u l a t e t h a t a n o t h e r c o n t r i b u t o r t o t h e l e t h a l i t y i s d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n ( D I C ) . D I C h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d a s a c l o t t i n g d e f e c t t h a t s i m u l t a n e o u s l y r e s u l t s i n t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n a n d f i b r i n o l y t i c s y s t e m s , l e a d i n g t o t h e f o r m a t i o n o f m i c r o t h r o m b i , v e s s e l o b s t r u c t i o n , s l o w i n g o f b l o o d f l o w a n d i n t e r n a l h e m o r r h a g e ( K o r b u t e t a l . , 1 9 9 4 ) . D I C , a l o n g w i t h s y s t e m i c h y p o t e n s i o n , h a s b e e n i m p l i c a t e d a s a f a c t o r r e s p o n s i b l e f o r c i r c u l a t o r y s h o c k a n d d e a t h e v o k e d b y L P S a n d i n s e p t i c s h o c k ( K o r b u t e t a l . , 1 9 9 4 ; H a r d a w a y a n d W i l l i a m s , 1 9 9 6 ) . I n t e r e s t i n g l y , a s t u d y b y K o r b u t e f a l . ( 1 9 9 4 ) i n d i c a t e d t h a t t h e u s e o f t h e N O S i n h i b i t o r N G - n i t r o - L - a r g i n i n e m e t h y l e s t e r i n r a t s g i v e n a l a r g e d o s e o f L P S a t t e n u a t e d s y m p t o m s o f D I C , i n c l u d i n g a d e c r e a s e i n h e m o r r h a g e / c o n g e s t i o n i n t h e l u n g s , h e a r t , s p l e e n , k i d n e y s a n d i n t e s t i n e s . T h u s , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e t r e a t m e n t w i t h A G , a s p e c i f i c i n h i b i t o r o f i N O S , i n t h e L P S / M C T m o d e l r e s u l t e d i n a d e c r e a s e i n v a s o d i l a t o r y N O ( a n d h e n c e i n s y s t e m i c h y p o t e n s i o n ) a n d a d e c r e a s e i n D I C , w h i c h t o g e t h e r i m p r o v e d a n i m a l s u r v i v a l . S i n c e t h e l i v e r i n j u r y o b s e r v e d i n t h i s m o d e l e x h i b i t e d a d i s t i n c t L P S c o m p o n e n t , i t s e e m e d p o s s i b l e t h a t D I C m a y h a v e b e e n a c o m p o n e n t o f t h e l e t h a l i t y . H o w e v e r , t h e a b s e n c e o f g r o s s h e m o r r h a g i c l e s i o n s i n t h e o r g a n s e x a m i n e d a r g u e s a g a i n s t t h i s . A d d i t i o n a l l y , n o h e m o r r h a g e / c o n g e s t i o n w a s o b s e r v e d b y l i g h t m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f t h e l u n g s , h e a r t o r k i d n e y s o f 1 3 7 a n i r r D I C c o n r c h e e t a h a v t r e a c o n m e r w h c i n f l e w h e a n e x p h O L a r e a d n M c - f r o ” a n i m a l s r e c e i v i n g t h e l e t h a l L P S / M C T c o t r e a t m e n t . H e n c e , i t s e e m s u n l i k e l y t h a t D I C w a s s o l e l y r e s p o n s i b l e f o r t h e l e t h a l i t y i n t h i s m o d e l ; h o w e v e r , i t c a n n o t b e c o n c l u s i v e l y r u l e d o u t a s a c o n t r i b u t o r . C o n c u r r e n t e x p o s u r e t o i n f l a m m a t i o n i n c r e a s e s t h e s u s c e p t i b i l i t y t o c h e m i c a l i n t o x i c a t i o n f r o m n u m e r o u s x e n o b i o t i c a g e n t s ( R o t h e t a l . , 1 9 9 7 ; S n e e d e f a l . , 1 9 9 7 ; B a r t o n e t a l . , 2 0 0 0 b ; Y e e e t a l , 2 0 0 0 b ; L a b i b e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h i s m a y h a v e p a r t i c u l a r i m p l i c a t i o n i n a s s e s s i n g r i s k f r o m c h e m i c a l e x p o s u r e a n d i n t r e a t m e n t o f c h e m i c a l i n t o x i c a t i o n s . I n p a r t i c u l a r , M C T i s a f o o d - b o m e c o n t a m i n a n t t h a t a f f e c t s b o t h a n i m a l s a n d p e o p l e ; i t i s a l s o f o u n d i n a l t e r n a t i v e m e d i c i n e s s u c h a s N o n g j i I i , Z i x i a o r o n g a n d o t h e r s ( R o e d e r , 2 0 0 0 ) . I n d i v i d u a l s w h o c o n s u m e P A s m a y b e p a r t i c u l a r l y s u s c e p t i b l e t o t o x i c i t y d u r i n g t i m e s o f i n f l a m m a t o r y c o n d i t i o n s , a n d t h i s s h o u l d p e r h a p s b e a p r e c a u t i o n f o r p e o p l e w h e n u s i n g a l t e r n a t i v e m e d i c i n e s ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ; G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . I n s u m m a r y , t h e t e m p o r a l r e l a t i o n s h i p o f e x p o s u r e s t o M C T a n d L P S h a s a n i m p o r t a n t i n f l u e n c e o n l e t h a l i t y . T h a t i s , l e t h a l i t y i s m u c h g r e a t e r w h e n t h e e x p o s u r e s o c c u r c l o s e t o g e t h e r i n t i m e t h a n w h e n t h e y a r e s e p a r a t e d b y s e v e r a l h o u r s . T h e p r e d o m i n a n t t a r g e t o f t o x i c i t y s h i f t s f r o m l i v e r w h e n L P S a n d M C T a r e a d m i n i s t e r e d s e v e r a l h o u r s a p a r t t o a n e x t r a h e p a t i c s i t e ( s ) w h e n t h e y a r e a d m i n i s t e r e d i n c l o s e t e m p o r a l p r o x i m i t y . N O a p p e a r s t o h a v e a c a u s a l r o l e i n M C T / L P S - i n d u c e d l e t h a l i t y , a n d t h i s s u g g e s t s t h e p o s s i b i l i t y t h a t a n i m a l s d i e f r o m e n h a n c e m e n t b y M C T o f L P S - i n d u c e d c i r c u l a t o r y c o l l a p s e . 1 3 8 C H A P T E R 4 E n d o t h e l i a l C e l l I n j u r y a n d C o a g u l a t i o n S y s t e m A c t i v a t i o n D u r i n g S y n e r g i s t i c H e p a t o t o x i c i t y f r o m M o n o c r o t a l i n e a n d B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e C o e x p o s u r e 1 3 9 4 . A . E U / I 1 0 0 M C ' a r e h e r s u e t h e i n j : h i 4 . A . A b s t r a c t A s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e o f b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ; 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s a f t e r a s m a l l , n o n t o x i c d o s e o f m o n o c r o t a l i n e ( M C T ; 1 0 0 m g / k g ) p r o d u c e s s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y i n r a t s w i t h i n 6 t o 1 2 h o u r s a f t e r M C T e x p o s u r e . T h e r e s u l t i n g c e n t r i l o b u l a r ( C L ) a n d m i d z o n a l ( M Z ) l i v e r l e s i o n s a r e c h a r a c t e r i z e d b y h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l ( H P C ) n e c r o s i s . P r o n o u n c e d h e m o r r h a g e , d i s r u p t i o n o f s i n u s o i d a l a r c h i t e c t u r e a n d l o s s o f c e n t r a l v e i n i n t i m a s u g g e s t t h a t a n a d d i t i o n a l c o m p o n e n t t o i n j u r y m a y b e t h e l i v e r v a s c u l a t u r e . I n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n , t h e h y p o t h e s i s t h a t s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l ( S E C ) i n j u r y a n d c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n o c c u r i n t h i s m o d e l w a s t e s t e d . P l a s m a h y a l u r o n i c a c i d ( H A ) c o n c e n t r a t i o n , a b i o m a r k e r f o r S E C i n j u r y , w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d i n c o t r e a t e d a n i m a l s b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y a n d r e m a i n e d e l e v a t e d t h r o u g h t h e t i m e o f m a x i m a l H P C i n j u r y ( i . e . , 1 8 h o u r s ) . S E C i n j u r y w a s c o n f i r m e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p y . P y r r o l i c m e t a b o l i t e s w e r e p r o d u c e d f r o m M C T b y S E C s i n v i t r o , w h i c h s u g g e s t s t h a t M C T m a y i n j u r e S E C s d i r e c t l y t h r o u g h t h e f o r m a t i o n o f i t s t o x i c m e t a b o l i t e , m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e . I n a s m u c h a s S E C a c t i v a t i o n a n d i n j u r y c a n p r o m o t e h e m o s t a s i s , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m w a s e v a l u a t e d . C o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n , a s m a r k e d b y a d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n , o c c u r r e d b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y . F u r t h e r m o r e , e x t e n s i v e f i b r i n d e p o s i t i o n w a s o b s e r v e d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l y w i t h i n C L a n d M 2 r e g i o n s a f t e r M C T / L P S c o t r e a t m e n t . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t S E C i n j u r y a n d 1 4 0 c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n a r e c o m p o n e n t s o f t h e s y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y r e s u l t i n g f r o m M C T a n d L P S c o e x p o s u r e . 4 . 8 . I n t r o d u c t i o n Y e e e f a l . ( 2 0 0 0 b ) r e c e n t l y d e m o n s t r a t e d t h a t a s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e o f L P S g i v e n t o r a t s 4 h o u r s a f t e r a s m a l l , n o n h e p a t o t o x i c d o s e o f M C T r e s u l t s i n s y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y t h a t i s m a x i m a l 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . L i v e r l e s i o n s w e r e b o t h c e n t r i l o b u l a r ( C L ) a n d m i d z o n a l ( M Z ) , e x h i b i t i n g c h a r a c t e r i s t i c s s i m i l a r t o l e s i o n s a s s o c i a t e d w i t h l a r g e r , t o x i c d o s e s o f M C T o r L P S g i v e n s e p a r a t e l y . M C T - l i k e , C L l e s i o n s c o n s i s t e d o f m o d e r a t e t o m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r a p o p t o t i c a n d o n c o t i c n e c r o s i s , h e m o r r h a g e a n d l o s s o f c e n t r a l v e i n ( C V ) i n t i m a . L P S - l i k e , M Z l e s i o n s c o m p r i s e d m a r k e d b u t m o r e f r e q u e n t a n d w e l l d e f i n e d a r e a s o f h e p a t o c e l l u l a r c o a g u l a t i v e n e c r o s i s a c c o m p a n i e d b y P M N i n f i l t r a t i o n , d i s r u p t i o n o f s i n u s o i d a l a r c h i t e c t u r e , a n d h e m o r r h a g e . V a s c u l a r i n j u r y c a n b e i n f e r r e d f r o m t h e l o s s o f c e n t r a l v e i n i n t i m a ( i . e . , c e n t r a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l ; C V E C ) i n t h e C L l e s i o n a n d t h e d i s r u p t i o n o f s i n u s o i d a l a r c h i t e c t u r e a n d h e m o r r h a g e i n b o t h t h e C L a n d M 2 l e s i o n s i n t h i s m o d e l ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ) . I n j u r y t o e n d o t h e l i a l c e l l s i n t h e m i c r o v a s c u l a t u r e c a n r e s u l t i n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( M a c h o v i c h , 1 9 8 5 ; R y a n , 1 9 8 6 , H i r a t a e t a l . , 1 9 8 9 ) . C o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n i s c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l ( H P C ) i n j u r y i n o t h e r l i v e r i n j u r y m o d e l s ( P e r r y , 1 9 8 4 ; F u j i w a r a e t a l . 1 9 8 8 ; Y a m a d a e t a l . 1 9 8 9 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ; A r i a e t a l . , 1 9 9 6 ) . I n 1 4 1 a d d i t i o n , m i c r o c i r c u l a t o r y d i s t u r b a n c e s f r o m h e m o r r h a g e a n d / o r i n t r a s i n u s o i d a l f i b r i n d e p o s i t i o n h a v e b e e n p o s t u l a t e d t o c o n t r i b u t e t o H P C i n j u r y ( S h i b a y a m a , 1 9 8 7 ; D e L e v e e f a l . , 1 9 9 6 ; B a e t a l . , 2 0 0 0 ; S a e t r e e t a l . , 2 0 0 0 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a , 2 0 0 2 b ) . C V E C a n d S E C i n j u r y o c c u r s i n t h e l i v e r s o f r a t s a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f a l a r g e , a c u t e l y t o x i c d o s e o f M C T ( D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) , l e a d i n g t o c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n a n d f i b r i n d e p o s i t i o n ( C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . S i m i l a r c h a n g e s a t m o r e m o d e s t M C T d o s e s i n t h e a b s e n c e o r p r e s e n c e o f a d d i t i o n a l s u s c e p t i b i l i t y f a c t o r s h a v e n o t b e e n r e p o r t e d . A c c o r d i n g l y , t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n w a s d e s i g n e d t o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t i n j u r y t o S E C s a n d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m o c c u r d u r i n g c o e x p o s u r e t o n o r m a l l y n o n t o x i c d o s e s o f M C T a n d L P S . 4 . 0 . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 4 . C . 1 . M a t e r i a l s l s o p e n t a n e , L P S ( E s c h e r i c h i a c o l i , s e r o t y p e 0 1 2 8 : 8 1 2 , 1 . 7 x 1 0 6 e n d o t o x i n . u n i t s ( E U s ) / m g ) , p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) , s o d i u m c i t r a t e a n d s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( S D S ) w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . M o u s e a n t i - r a t e n d o t h e l i a l c e l l a n t i g e n ( R E C A ) - 1 w a s a c q u i r e d f r o m S e r o t e c , I n c . ( R a l e i g h , N C ) . R a b b i t a n t i - r a t C Y P 4 5 0 3 A 2 w a s o b t a i n e d f r o m B D G e n t e s t ( W o b u m , M A ) . H o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ( H R P ) l a b e l e d a n t i - r a b b i t s e c o n d a r y a n t i b o d y w a s a c q u i r e d f r o m S a n t a C r u z B i o t e c h ( S a n t a C r u z , C A ) . G o a t a n t i - r a t f i b r i n o g e n w a s p u r c h a s e d f r o m I C N P h a r m a c e u t i c a l s ( A u r o r a , O H ) . 1 4 2 G o a t a n d h o r s e s e r a w e r e o b t a i n e d f r o m V e c t o r L a b o r a t o r i e s ( B u r l i n g a m e , C A ) . G o a t a n t i - m o u s e s e c o n d a r y a n t i b o d y c o n j u g a t e d t o A l e x a 5 9 4 a n d d o n k e y a n t i - g o a t s e c o n d a r y a n t i b o d y c o n j u g a t e d t o A l e x a 5 9 4 w e r e a c q u i r e d f r o m M o l e c u l a r P r o b e s ( E u g e n e , O R ) . E n h a n c e d c h e m i l u m i n e s c e n c e ( E C L ) f o r i m m u n o b l o t t i n g w a s o b t a i n e d f r o m A v e r s h a m B i o s c i e n c e ( P i s c a t a w a y , N J ) . A c r y l a m i d e / B i s s o l u t i o n w a s p u r c h a s e d f r o m B i o - R a d L a b o r a t o r i e s ( H e r c u l e s , C A ) . N i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e w a s p r o c u r e d f r o m S c h l e i c h e r a n d S c h u e l l I n c . ( K e e n e , N H ) . M C T w a s a c q u i r e d f r o m T r a n s W o r l d C h e m i c a l s ( R o c k v i l l e , M D ) . A b s o l u t e e t h a n o l w a s p u r c h a s e d f r o m Q u a n t u m C h e m i c a l C o m p a n y ( T u s c o l a , I L ) . S t e r i l e s a l i n e w a s a c q u i r e d f r o m A b b o t t L a b o r a t o r i e s ( N o r t h C h i c a g o , I L ) . F o r m a l i n f i x a t i v e w a s p r o c u r e d f r o m S u r g i p a t h M e d i c a l I n d u s t r i e s , I n c . ( R i c h m o n d , I L ) . S o d i u m c a c o d y l a t e b u f f e r w a s a c q u i r e d f r o m E l e c t r o n M i c r o s c o p y S c i e n c e s ( F o r t W a s h i n g t o n , P A ) . L i v e r p e r f u s i o n , l i v e r d i g e s t i o n a n d h e p a t o c y t e w a s h m e d i u m s w e r e p u r c h a s e d f r o m L i f e T e c h n o l o g i e s , I n c . ( R o c k v i l l e , M D ) . E n d o t h e l i a l c e l l m e d i u m ( E G M - 2 ) w a s a c q u i r e d t h r o u g h B i o w h i t t a k e r , I n c . ( W a l k e r s v i l l e , M D ) . D i a g n o s t i c k i t s 5 9 U V a n d 8 8 6 - A f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A L T ) a c t i v i t y a n d f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n , r e s p e c t i v e l y , a n d T o t a l H e m o g l o b i n K i t s w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . E n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) k i t f o r h y a l u r o n i c a c i d ( H A ) w a s a c q u i r e d f r o m C o r g e n i x , I n c . ( W e s t m i n s t e r , C O ) . A l l o t h e r m a t e r i a l s w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) 4 . C . 2 . A n i m a l s 1 4 3 M a l e , S p r a g u e - D a w l e y r a t s ( C r l : C D ( S D ) I G S B R , C h a r l e s R i v e r , P o r t a g e , M I ) w e i g h i n g 1 7 5 - 2 0 0 g o r 2 0 0 - 3 0 0 g w e r e u s e d f o r s t u d i e s i n V i t r o a n d i n v i v o , r e s p e c t i v e l y . O t h e r w i s e , f o r m o r e i n f o r m a t i o n o n t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 4 . C . 3 . T r e a t m e n t P r o t o c o l I n V i v o N o m o r t a l i t y o c c u r r e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s w i t h i n 1 2 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n , b u t a p p r o x i m a t e l y 2 0 % o f r a t s d i e d b y 1 8 h o u r s . N o a n i m a l s t h a t r e c e i v e d s a l i n e V e h , M C T o r L P S a l o n e d i e d . O t h e r w i s e , f o r m o r e i n f o r m a t i o n o n t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 4 . C . 4 . A s s e s s m e n t o f H P C I n j u r y a n d P l a s m a F i b r i n o g e n a n d H A C o n c e n t r a t i o n s A t t h e t i m e s i n d i c a t e d i n t h e f i g u r e l e g e n d s , r a t s w e r e a n e s t h e t i z e d w i t h s o d i u m p e n t o b a r b i t a l ( 5 0 m g / k g , i . p . ) . A m i d l i n e a b d o m i n a l i n c i s i o n w a s m a d e , b l o o d w a s c o l l e c t e d f r o m t h e i n f e r i o r v e n a c a v a i n t o a s y r i n g e c o n t a i n i n g s o d i u m c i t r a t e ( 0 . 3 8 % f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) , a n d a n i m a l s w e r e e u t h a n i z e d b y e x s a n g u i n a t i o n . H P C i n j u r y w a s e v a l u a t e d b y i n c r e a s e s i n p l a s m a A L T a c t i v i t y . A B B L f i b r o m e t e r ( B e c t o n , D i c k s o n a n d C o m p a n y , H u n t V a l l e y , M D ) a n d a f i b r i n o g e n d i a g n o s t i c k i t w e r e u s e d t o d e t e r m i n e p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n . A n E L I S A k i t w a s u s e d t o m e a s u r e p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n , a b i o m a r k e r o f h e p a t i c S E C i n j u r y ( D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 b , 1 9 9 4 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . 1 4 4 O m e r M e u u 4 1 1 5 h d h q u d m h o g w e n ; b d o n t h e l e s e c h c l e d o r w h h o l a m a ; h O u r : U fi n g O R ) . 3 3 8 1 3 4 . C . 6 O t h e r w i s e , f o r m o r e i n f o r m a t i o n o n t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 4 . C . 5 . H i s t o p a t h o l o g i c E v a l u a t i o n A o n e - c m 3 p o r t i o n o f t h e l i v e r f o r i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g w a s c u t f r o m t h e m i d d l e o f t h e l e f t l a t e r a l l o b e a n d f r o z e n i n i s o p e n t a n e i m m e r s e d i n l i q u i d n i t r o g e n . F u r t h e r , a s e c o n d p o r t i o n o f t h i s l o b e w a s s n a p f r o z e n i n l i q u i d n i t r o g e n f o r e v a l u a t i o n o f t i s s u e h e m o g l o b i n . T h e r e m a i n i n g p o r t i o n s o f t h e l i v e r w e r e f i x e d b y i m m e r s i o n i n 1 0 % n e u t r a l b u f f e r e d f o r m a l i n f o r a t l e a s t 3 d a y s b e f o r e b e i n g p r o c e s s e d f o r h i s t o l o g i c a n a l y s i s . S e r i a l t r a n s v e r s e s e c t i o n s f r o m t h e l e f t l a t e r a l l i v e r l o b e w e r e p r o c e s s e d f o r l i g h t m i c r o s c o p y . P a r a f f i n - e m b e d d e d s e c t i o n s w e r e c u t a t 4 p m , s t a i n e d w i t h h e m a t o x y l i n a n d e o s i n , a n d e v a l u a t e d f o r l e s i o n s i z e a n d s e v e r i t y . T i s s u e s e c t i o n s w e r e a n a l y z e d u s i n g a l i g h t m i c r o s c o p e w i t h o u t k n o w l e d g e o f t h e t r e a t m e n t g r o u p . A d d i t i o n a l l y , a t h i n s e c t i o n ( 1 - 2 m m ) o f t h e l i v e r f r o m t h e m i d d l e o f t h e l e f t l a t e r a l l o b e w a s f i x e d i n 4 % g l u t a r a l d e h y d e i n 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r f o r 2 4 h o u r s , p r o c e s s e d , a n d a n a l y z e d b y t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M ) u s i n g a P h i l i p s 3 0 1 t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p e ( F E I C o m p a n y , H i l l s b o r o , O R ) . [ A l l t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s w e r e t a k e n b y S t e v e n Y e e w i t h t h e a s s i s t a n c e o f R a l p h C o m m o n s a n d D o n n a C r a f t ] . 4 . C . 6 . l m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 1 4 5 F o r e n d o t h e l i a l c e l l i m m u n o s t a i n i n g , 8 p m - t h i c k s e c t i o n s o f f r o z e n l i v e r w e r e f i x e d i n a c e t o n e ( 4 ° C ) f o r 5 m i n u t e s . S e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n u t e s w i t h P B S c o n t a i n i n g 1 0 % g o a t s e r u m ( i . e . , b l o c k i n g s o l u t i o n ) a n d t h e n w i t h m o u s e a n t i - r a t R E C A - 1 d i l u t e d ( 1 : 2 0 ) i n b l o c k i n g s o l u t i o n o v e r n i g h t a t 4 ° C . T h e R E C A - 1 a n t i b o d y b i n d s t o r a t e n d o t h e l i u m b u t n o t t o o t h e r c e l l t y p e s ( D u i j v e s t i j n e t a l . , 1 9 9 2 ) . I n t h e l i v e r , R E C A - 1 a n t i b o d y s t a i n s b o t h S E C s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s f r o m l a r g e r v e s s e l s . A f t e r i n c u b a t i o n w i t h R E C A - 1 a n t i b o d y , t h e s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d f o r 3 h o u r s w i t h g o a t a n t i - m o u s e s e c o n d a r y a n t i b o d y c o n j u g a t e d t o A l e x a 5 9 4 ( 1 : 5 0 0 ) i n b l o c k i n g s o l u t i o n c o n t a i n i n g 2 % r a t s e r u m . S e c t i o n s w e r e w a s h e d 3 t i m e s f o r 5 m i n u t e s e a c h w i t h P B S a n d v i s u a l i z e d u s i n g f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . F o r f i b r i n i m m u n o s t a i n i n g , 8 u m - t h i c k s e c t i o n s o f f r o z e n t i s s u e w e r e f i x e d i n 1 0 % b u f f e r e d f o r m a l i n c o n t a i n i n g 2 % a c e t i c a c i d f o r 3 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h i s f i x a t i o n p r o t o c o l s o l u b i l i z e s a l l f i b r i n o g e n a n d f i b r i n s p e c i e s e x c e p t f o r c r o s s - l i n k e d f i b r i n . T h u s , o n l y c r o s s - l i n k e d f i b r i n i s s t a i n e d i n l i v e r s e c t i o n s ( S c h n i t t e r a l . , 1 9 9 3 ) . S e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n u t e s w i t h P B S c o n t a i n i n g 1 0 % h o r s e s e r u m ( i . e . , b l o c k i n g s o l u t i o n ) a n d t h e n w i t h g o a t a n t i - r a t f i b r i n o g e n d i l u t e d ( 1 : 1 0 0 0 ) i n b l o c k i n g s o l u t i o n o v e r n i g h t a t 4 ° C . N e x t , t h e s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d f o r 3 h o u r s i n b l o c k i n g s o l u t i o n w i t h d o n k e y a n t i - g o a t s e c o n d a r y a n t i b o d y c o n j u g a t e d t o A l e x a 5 9 4 ( 1 : 1 0 0 0 ) . L i v e r s e c t i o n s w e r e w a s h e d 3 t i m e s f o r 5 m i n u t e s e a c h w i t h P B S a n d v i s u a l i z e d u s i n g f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . 1 4 6 F o r b o t h p r o t o c o l s , n o s t a i n i n g w a s o b s e r v e d i n t h e c o n t r o l s i n w h i c h t h e p r i m a r y o r s e c o n d a r y a n t i b o d y w a s o m i t t e d f r o m t h e s t a i n i n g p r o t o c o l . A l l m o r p h o m e t r i c a l l y c o m p a r e d t r e a t m e n t g r o u p s w e r e s t a i n e d a t t h e s a m e t i m e a n d e v a l u a t e d o n t h e s a m e d a y . 4 . C . 7 . Q u a n t i f i c a t i o n o f L i v e r E n d o t h e l i a l C e l l s a n d F i b r i n D e p o s i t i o n E n d o t h e l i a l c e l l s a n d f i b r i n d e p o s i t i o n i n t h e l i v e r w e r e q u a n t i f i e d m o r p h o m e t r i c a l l y b y a n a l y z i n g t h e a r e a o f i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g f o r e a c h l i v e r s e c t i o n ( C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . A d e c r e a s e i n t h e e n d o t h e l i a l c e l l s t a i n i n g s u g g e s t s a l o s s o f t h e s e c e l l s f r o m t h e l i v e r . A n i n c r e a s e i n t h e a r e a o f f i b r i n s t a i n i n g i n t h e l i v e r i n d i c a t e s f i b r i n d e p o s i t i o n . F l u o r e s c e n t s t a i n i n g o f l i v e r s e c t i o n s w a s v i s u a l i z e d u s i n g a n O l y m p u s A X - 8 0 T m i c r o s c o p e ( O l y m p u s , L a k e S u c c e s s , N Y ) . F o r m o r p h o m e t r i c a n a l y s i s o f t o t a l e n d o t h e l i a l c e l l o r f i b r i n d e p o s i t i o n i n a l i v e r s e c t i o n , d i g i t a l i m a g e s o f 5 r a n d o m l y c h o s e n 1 0 0 X f i e l d s p e r t i s s u e s e c t i o n w e r e c a p t u r e d u s i n g a S P O T l l c a m e r a a n d S P O T A d v a n c e d S o f t w a r e ( D i a g n o s t i c I n s t r u m e n t s , S t e r l i n g H e i g h t s , M I ) . S a m p l e s w e r e c o d e d s o t h a t t h e e v a l u a t o r w a s n o t a w a r e o f t h e t r e a t m e n t , a n d t h e s a m e e x p o s u r e t i m e w a s u s e d f o r a l l c a p t u r e d i m a g e s . E a c h d i g i t a l i m a g e e n c o m p a s s e d a t o t a l a r e a o f 1 . 4 m m 2 a n d c o n t a i n e d s e v e r a l C L , M 2 a n d p e r i p o r t a l ( P P ) r e g i o n s . T h e a r e a o f i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g ( n u m b e r o f p i x e l s ) w i t h i n t h e C L , M 2 a n d P P r e g i o n s w a s q u a n t i f i e d u s i n g S c i o n I m a g e s o f t w a r e ( S c i o n C o r p o r a t i o n , F r e d e r i c k , M D ) . F o r e n d o t h e l i a l c e l l q u a n t i f i c a t i o n , a d e n s i t y s l i c e w a s t a k e n f r o m a n i n v e r t e d , g r a y - s c a l e d i g i t a l i m a g e o f a l i v e r s e c t i o n f r o m a 1 4 7 V e h N e h - t r e a t e d r a t . A d e n s i t y s l i c e a l l o w s a n a l y s i s o f p i x e l s i n a d e f i n e d r a n g e o f g r a y v a l u e s ( i . e . , d e n s i t i e s ) . N e x t , t h e t h r e s h o l d w a s a d j u s t e d s o t h a t b a c k g r o u n d s t a i n i n g w a s e l i m i n a t e d f r o m t h e a n a l y s i s a n d o n l y e n d o t h e l i a l s t a i n i n g w a s v i s u a l i z e d . F o r q u a n t i f i c a t i o n o f f i b r i n d e p o s i t i o n , t h e t h r e s h o l d w a s s e l e c t e d s o t h a t m i n i m a l p o s i t i v e s t a i n i n g w a s p r e s e n t i n V e h N e h - t r e a t e d c o n t r o l s . T h e s a m e t h r e s h o l d v a l u e w a s u s e d t o a n a l y z e d i g i t a l i m a g e s f r o m a l l t r e a t m e n t g r o u p s . F o r q u a n t i f i c a t i o n o f e n d o t h e l i a l c e l l s o r f i b r i n , t h e a r e a o f p o s i t i v e s t a i n i n g w a s m e a s u r e d a n d d i v i d e d b y t h e t o t a l a r e a o f t h e i m a g e . A n a l y s i s o f e n d o t h e l i a l c e l l s o r f i b r i n d e p o s i t i o n i n t h e C L , M 2 a n d P P r e g i o n s w a s c o n d u c t e d b y d r a w i n g a 1 4 5 [ r m - d i a m e t e r c i r c l e a r o u n d t h e C V o r v e s s e l s o f t h e p o r t a l t r i a d . T h e c i r c u m f e r e n c e o f t h e c i r c l e w a s a b o u t 4 - 6 h e p a t o c y t e s a w a y f r o m t h e C V o r p o r t a l t r i a d v e s s e l s , a n d t h i s a r e a w a s a r b i t r a r i l y d e f i n e d a s t h e C L a n d P P r e g i o n . T h e M 2 r e g i o n w a s d e f i n e d a s t h e c e n t e r o f a r e a b e t w e e n t h e C L a n d P P r e g i o n u s i n g t h e s a m e c i r c l e c i r c u m f e r e n c e , w i t h o u t h a v i n g o v e r l a p o f t h e s e a r b i t r a r y c i r c l e s . T h e a r e a o f e n d o t h e l i a l c e l l s o r f i b r i n s t a i n i n g i n e a c h r e g i o n w a s m e a s u r e d a s d e s c r i b e d a b o v e a n d d i v i d e d b y t h e t o t a l a r e a o f t h e i m a g e . R e s u l t s f r o m t h e r a n d o m f i e l d s a n a l y z e d f o r e a c h l i v e r s e c t i o n w e r e a v e r a g e d a n d c o u n t e d a s a r e p l i c a t e ( i . e . , e a c h r e p l i c a t e r e p r e s e n t i n g a d i f f e r e n t r a t ) . F o r t h e t i m e - c o u r s e s t u d i e s , V e h N e h - t r e a t e d r a t s a t v a r i o u s t i m e s w e r e c o m b i n e d i n t o o n e g r o u p f o r s t a t i s t i c a l a n a l y s i s , s i n c e n o d i f f e r e n c e s o c c u r r e d a m o n g t h e s e g r o u p s . 4 . C . 8 . L i v e r H e m o g l o b i n 1 4 8 f . - L i v e r h e m o g l o b i n c o n c e n t r a t i o n w a s u s e d a s a b i o m a r k e r f o r h e m o r r h a g e ( J a e s c h k e e t a l . , 2 0 0 0 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . A 2 0 % h o m o g e n a t e w a s m a d e f r o m s a m p l e s o f f r o z e n l i v e r i n 5 0 m M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( 1 2 0 m M s o d i u m c h l o r i d e , 1 0 m M e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d ) . S a m p l e s w e r e c e n t r i f u g e d ( 1 6 , 0 0 0 X g r a v i t y ) f o r 1 0 m i n a t 4 ° C , a n d 2 0 0 p l o f t h e s u p e r n a t a n t w a s d i l u t e d i n D r a b k i n ’ s s o l u t i o n . F o l l o w i n g a 1 5 - m i n u t e i n c u b a t i o n , t h e a b s o r b a n c e w a s m e a s u r e d a t 5 4 0 n m , a n d t h e h e m o g l o b i n c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d f r o m a s t a n d a r d c u r v e . 4 . C . 9 . S E C S t u d i e s I n V i t r o P r i m a r y S E C s w e r e i s o l a t e d f r o m r a t l i v e r a s d e s c r i b e d i n B r a e t e f a l . ( 1 9 9 4 ) . B r i e f l y , t h e l i v e r f r o m a n a n a e s t h e t i z e d r a t w a s d i g e s t e d b y i n s i t u s e q u e n t i a l p e r f u s i o n w i t h l i v e r p e r f u s i o n a n d l i v e r d i g e s t i o n m e d i a . C e l l s w e r e r e l e a s e d b y g e n t l e s c r a p i n g a n d s u s p e n d e d i n h e p a t o c y t e w a s h m e d i u m . T h e c e l l s u s p e n s i o n w a s c e n t r i f u g e d ( 1 0 0 X g r a v i t y ) f o r 5 m i n u t e s , a n d t h e s u p e r n a t a n t c o n t a i n i n g t h e n o n p a r e n c h y m a l ( N P ) f r a c t i o n w a s c o l l e c t e d . T h e N P f r a c t i o n w a s l a y e r e d o n t o p o f a t w o - l a y e r p e r c o l l g r a d i e n t ( 5 0 % a n d 2 5 % ) a n d c e n t r i f u g e d ( 9 0 0 X g r a v i t y ) f o r 2 0 m i n u t e s . T h e S E C - e n r i c h e d z o n e b e t w e e n t h e p e r c o l l g r a d i e n t s w a s c o l l e c t e d , w a s h e d w i t h P B S a n d p l a t e d . A d d i t i o n a l l y , a r a t l i v e r s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l l i n e , N P - 2 6 , w a s u s e d i n s t u d i e s i n V i t r o . T h e N P - 2 6 c e l l l i n e w a s e s t a b l i s h e d f r o m a n e n r i c h e d f r a c t i o n o f l i v e r S E C s t r a n s f e c t e d w i t h S V 4 0 l a r g e - T a n t i g e n ( M a r u e t a l . , 1 9 9 8 ) . 1 4 9 4 . C . 1 0 . S c a n n i n g E l e c t r o n M i c r o s c o p y P r i m a r y S E C s a n d N P - 2 6 c e l l s w e r e p l a t e d o n 1 2 m m - d i a m e t e r c o l l a g e n - c o a t e d c o v e r s l i p s a n d c u l t u r e d f o r 2 4 h o u r s i n E G M - 2 . S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n B r a e t e t a l . ( 2 0 0 2 ) , w i t h m i n o r m o d i f i c a t i o n s . B r i e f l y , c e l l s w e r e r i n s e d t w i c e w i t h P B S a n d f i x e d f o r 1 2 h o u r s w i t h 2 % g l u t a r a l d e h y d e i n 0 . 1 M s o d i u m c a c o d y l a t e b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 1 M s u c r o s e ( p H 7 . 4 ) . T h e f i x e d c e l l s w e r e s u b s e q u e n t l y t r e a t e d w i t h f i l t e r e d 1 % t a n n i c a c i d i n 0 . 1 5 M s o d i u m c a c o d y l a t e b u f f e r ( p H 7 . 4 ) f o r 1 h o u r a n d p o s t f i x e d w i t h 1 % o s m i u m t e t r o x i d e i n 0 . 1 M s o d i u m c a c o d y l a t e ( p H 7 . 4 ) f o r a n o t h e r h o u r . T h e s a m p l e s w e r e f u r t h e r d e h y d r a t e d i n a g r a d e d e t h a n o l s e r i e s , c r i t i c a l p o i n t d r i e d a n d s p u t t e r - c o a t e d w i t h g o l d . T h e c e l l s w e r e e x a m i n e d u s i n g a J S M 6 4 0 0 V s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e ( J E O L U S A I n c . , P e a b o d y , M A ) . [ S c a n n i n g e l e c t r o n p h o t o m i c r o g r a p h s w e r e t a k e n b y U m e s h M . H a n u m e g o w d a w i t h t h e a s s i s t a n c e o f E w a D a n i e l e w i c z ] . 4 . C . 1 1 . M C T t r e a t m e n t I n V i t r o a n d E h r l i c h A s s a y T h e a b i l i t y o f S E C s t o c o n v e r t M C T t o p y r r o l i c m e t a b o l i t e ( s ) w a s e v a l u a t e d i n v i t r o . I s o l a t e d p r i m a r y S E C S w e r e r o u t i n e l y g r e a t e r t h a n 9 0 % p u r e a s d e t e r m i n e d b y m o r p h o l o g y ; t h e y w e r e c o n t a m i n a t e d w i t h a p p r o x i m a t e l y 1 0 % h e p a t o c y t e s . T o c o r r e c t f o r t h e c o n t r i b u t i o n o f t h e s e c o n t a m i n a t i n g h e p a t o c y t e s t o M C T m e t a b o l i s m i n S E C c u l t u r e s , M C T m e t a b o l i s m i n a n e q u i v a l e n t n u m b e r o f h e p a t o c y t e s w a s e x a m i n e d . H e p a t o c y t e s w e r e i s o l a t e d b y t h e c o l l a g e n a s e p e r f u s i o n a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y b y S e g l e n ( 1 9 7 3 ) a n d K l a u n i g e t a l . ( 1 9 8 1 ) . 1 5 0 P r i m a r y S E C s , N P - 2 6 c e l l s o r h e p a t o c y t e s w e r e p l a t e d o n c o l l a g e n - c o a t e d , 1 2 - w e l l p l a t e s a n d c u l t u r e d f o r 2 4 h o u r s . M C T w a s a d d e d t o t h e s e r u m - f r e e c u l t u r e m e d i u m t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 , 1 , 2 o r 4 m M , a n d c e l l s w e r e i n c u b a t e d f o r 4 h o u r s . M e d i u m w a s t h e n c o l l e c t e d a n d e v a l u a t e d f o r p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n b y a m o d i f i e d E h r l i c h r e a c t i o n a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y b y M a t t o c k s a n d W h i t e ( 1 9 7 0 ) . B r i e f l y , o n e m l o f i n c u b a t i o n m e d i u m w a s m i x e d w i t h o n e m l o f 5 % a s c o r b i c a c i d i n 8 0 % e t h a n o l . O n e m l o f E h r l i c h r e a g e n t w a s a d d e d , a n d t h e m i x t u r e w a s h e a t e d i n a w a t e r b a t h f o r 1 m i n u t e . A f t e r c o o l i n g t o r o o m t e m p e r a t u r e , 0 . 1 m l o f F e C l a s o l u t i o n w a s a d d e d t o i n h i b i t f a d i n g o f t h e E h r l i c h - p y r r o l e c o m p l e x c o l o r . A b s o r b a n c e w a s m e a s u r e d a t 5 6 5 n m a n d c o m p a r e d a g a i n s t a s t a n d a r d c u r v e . T h e a m o u n t s o f p y r r o l i c M C T m e t a b o l i t e ( s ) f o r m e d b y p r i m a r y S E C s w a s c o r r e c t e d f o r p y r r o l e s p r o d u c e d f r o m c o n t a m i n a t i n g h e p a t o c y t e s b y s u b t r a c t i n g t h e a m o u n t o f p y r r o l i c M C T m e t a b o l i t e ( s ) f o r m e d f r o m a n e q u a l n u m b e r o f h e p a t o c y t e s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s p g p y r r o l e p e r m g o f c e l l u l a r p r o t e i n . P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s e v a l u a t e d a s d e s c r i b e d b y B r a d f o r d ( 1 9 7 6 ) i n c e l l s t h a t w e r e s o l u b i l i z e d w i t h 1 % T r i t o n X - 1 0 0 a n d s o n i c a t e d . 4 . C . 1 2 . P r e p a r a t i o n o f M i c r o s o m a l F r a c t i o n a n d I m m u n o b l o t t i n g M i c r o s o m e s w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d b y C o f f m a n e t a l . ( 1 9 9 9 ) . B r i e f l y , c u l t u r e d N P - 2 6 c e l l s o r i s o l a t e d r a t h e p a t o c y t e s w e r e s u s p e n d e d i n h o m o g e n i z a t i o n b u f f e r ( 0 . 2 5 M s u c r o s e i n 5 m M H E P E S b u f f e r , p H 7 . 4 ) . C e l l s w e r e d i s r u p t e d b y s o n i c a t i o n a n d t h e n c e n t r i f u g e d ( 9 , 0 0 0 X g r a v i t y ) f o r 2 0 m i n . T h e s u p e r n a t a n t w a s r e c o v e r e d a n d t h e n c e n t r i f u g e d ( 1 0 0 , 0 0 0 X g r a v i t y ) f o r 1 h . 1 5 1 T h e r e s u l t i n g p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n h o m o g e n i z a t i o n b u f f e r . P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e m e a s u r e d a s d e s c r i b e d b y B r a d f o r d ( 1 9 7 6 ) , a n d C Y P 3 A 2 p r o t e i n w a s i d e n t i f i e d b y i m m u n o b l o t t i n g a s d e s c r i b e d b y S h a r p e t a l . ( 2 0 0 1 ) . M i c r o s o m a l p r o t e i n s ( 0 . 5 p g f r o m h e p a t o c y t e s a n d 5 p g f r o m N P - 2 6 c e l l s ) w e r e e l e c t r o p h o r e s e d o n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l w i t h S D S a n d t h e n t r a n s f e r r e d o n t o a n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e . T h e m e m b r a n e s w e r e b l o c k e d w i t h 5 % n o n f a t d r y m i l k , w a s h e d w i t h P B S - T w e e n , p r o b e d w i t h a n t i - C Y P 3 A 2 a n t i b o d y ( 1 : 1 0 0 0 ) a n d s u b s e q u e n t l y r e a c t e d w i t h H R P - c o n j u g a t e d a n t i - r a b b i t s e c o n d a r y a n t i b o d y ( 1 : 5 0 0 0 ) . T h e p r o t e i n b a n d s w e r e v i s u a l i z e d b y E C L . 4 . C . 1 3 . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s A l l r e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n i S . E . M . D a t a e x p r e s s e d a s f r a c t i o n s w e r e a r c s i n e s q u a r e r o o t - t r a n s f o r m e d b e f o r e a n a l y s i s . W h e n v a r i a n c e s w e r e n o t h o m o g e n e o u s , d a t a w e r e l o g - t r a n s f o r m e d b e f o r e a n a l y s i s . H o m o g e n e o u s d a t a w e r e a n a l y z e d b y o n e - w a y o r t w o - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) , a s a p p r o p r i a t e , a n d g r o u p m e a n s w e r e c o m p a r e d u s i n g S t u d e n t - N e w m a n - K e u l s p o s t h o c t e s t ( S t e e l e e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e c r i t e r i o n f o r s i g n i f i c a n c e w a s p s 0 . 0 5 f o r a l l c o m p a r i s o n s . 4 . D . R e s u l t s 4 . D . 1 . L i v e r E n d o t h e l i a l C e l l I n j u r y i n M C T / L P S - C o t r e a t e d A n i m a l s 1 5 2 A s m a r k e d b y i n c r e a s e d A L T a c t i v i t y i n p l a s m a , H P C i n j u r y f r o m M C T / L P S - c o e x p o s u r e o c c u r r e d b e t w e e n 6 a n d 1 2 h o u r s a n d w a s m a x i m a l b y 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 4 . 1 A ) . M C T - l i k e , C L a n d L P S - l i k e , M Z l i v e r l e s i o n s d e v e l o p e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d b y Y e e e t a l . ( 2 0 0 0 b ) . A l t h o u g h n o p a r e n c h y m a l l e s i o n s w e r e a p p a r e n t 6 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n , s o m e d i s r u p t i o n o f c e n t r a l v e i n i n t i m a w a s o b s e r v e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s a t t h i s t i m e . L o s s o f c e n t r a l v e i n i n t i m a , d i s r u p t i o n o f s i n u s o i d a l a r c h i t e c t u r e a n d t h e p r e s e n c e o f h e m o r r h a g e w i t h i n l e s i o n s a t 1 2 a n d 1 8 h o u r s s u g g e s t e d v a s c u l a r i n j u r y . H e p a t i c S E C s r e m o v e H A f r o m t h e c i r c u l a t i o n , a n d i m p a i r m e n t o f t h i s f u n c t i o n r e s u l t s i n i n c r e a s e d H A c o n c e n t r a t i o n i n t h e p l a s m a ( D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 b , 1 9 9 4 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . A c c o r d i n g l y , t o e s t i m a t e h e p a t i c S E C d y s f u n c t i o n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s m e a s u r e d . N o e l e v a t i o n i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s o b s e r v e d f o r V e h N e h o r M C T N e h t r e a t m e n t g r o u p s a t a n y o f t h e t i m e s a n a l y z e d ( F i g u r e 4 . 1 8 ) . A l t h o u g h n o e l e v a t i o n i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s o b s e r v e d i n t h e V e h / L P S t r e a t m e n t g r o u p a t 6 a n d 1 2 h o u r s , a m o d e s t b u t s i g n i f i c a n t i n c r e a s e o c c u r r e d a t 1 8 h o u r s . B y 6 h o u r s , p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s , a n d t h i s i n c r e a s e b e c a m e p r o g r e s s i v e l y m o r e p r o n o u n c e d w i t h t i m e ( F i g u r e 4 . 1 8 ) . T h i s e l e v a t i o n i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n o c c u r r e d b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y . 1 5 3 F i g u r e 4 . 1 . M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r l n i u r v . L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) o r s a l i n e v e h i c l e ( V e h ) w a s a d m i n i s t e r e d t o r a t s i v . 4 h o u r s a f t e r i . p . a d m i n i s t r a t i o n o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) o r V e h . R a t s w e r e k i l l e d a t 6 , 1 2 , a n d 1 8 h o u r s a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f M C T o r i t s V e h . H P C i n j u r y ( A ) w a s m e a s u r e d a s i n c r e a s e s i n p l a s m a A L T a c t i v i t y . S E C i n j u r y ( B ) w a s e s t i m a t e d a s i n c r e a s e s i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n . N = 4 — 7 a n i m a l s p e r g r o u p a t e a c h t i m e . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l l o t h e r g r o u p s a t t h e s a m e t i m e . 1 5 4 . ( 7 . 4 x 1 0 6 E U - l g l i h o u r i s d a l e r t ) . 72, a r e , r i e r y / A a u u r y ( B M o r w a s l . e l e d . n , j i j - . v . a r e H E ’ y P C = 4 i . l k C i n 4 7 9 . A o E3 A d a 5 5 < I . < E ' - r 1 1 2 0 8 6 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 o - « - 1 - 0 + - + — O v - — V V M M e e C C / / h h T T V L N e P e h S h / L P S . s a u 2 1 a v e 1 2 4 ) l m l g n A ( H n o a i m t s a a r l t P n e c n o C § N8 H o u r s a f t e r M C T A d m i n i s t r a t i o n + V e h N e h a - O — V e h / L P S 5 0 ° ‘ + M C T N e h — V — M C T / L P S O s 1 2 1 8 2 4 H o u r s a f t e r M C T A d m i n i s t r a t i o n O 1 5 5 R E C A - 1 i m m u n o s t a i n i n g o f l i v e r s e c t i o n s h a s b e e n u s e d t o v i s u a l i z e a n d q u a n t i f y t h e l o s s o f e n d o t h e l i a l c e l l s i n t h e l i v e r ( C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . R e p r e s e n t a t i v e p h o t o m i c r o g r a p h s o f R E C A - 1 i m m u n o s t a i n i n g i n l i v e r s f r o m a V e h N e h - t r e a t e d a n d a M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t a t 1 8 h o u r s c a n b e s e e n i n F i g u r e 4 . 2 A . T h e l i v e r s e c t i o n f r o m a V e h N e h t r e a t e d r a t e x h i b i t e d p a n l o b u l a r R E C A - 1 s t a i n i n g o f s i n u s o i d s a n d t h e i n t i m a o f C V s a n d v e s s e l s o f t h e p o r t a l t r i a d . R E C A — 1 s t a i n i n g d e c r e a s e d i n t h e s i n u s o i d s a n d i n C V i n t i m a i n - l i v e r s f r o m M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t s b u t n o t i n t h e e n d o t h e l i u m i n t h e p o r t a l t r i a d . M o r p h o m e t r y c o n d u c t e d o n 1 8 h o u r l i v e r s a m p l e s ( F i g u r e 4 . 2 8 ) r e v e a l e d a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n R E C A - 1 s t a i n i n g i n t h e C L a n d M 2 r e g i o n s o f l i v e r s f r o m M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . N o d e c r e a s e i n R E C A - 1 i m m u n o s t a i n i n g w a s o b s e r v e d i n t h e l i v e r s f r o m V e h , M C T o r L P S t r e a t m e n t g r o u p s . A t i m e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n t o t a l R E C A - 1 i m m u n o s t a i n i n g w a s o b s e r v e d i n t h e l i v e r s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 4 . 2 C ) . T h i s d e c r e a s e w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t b y 1 2 h o u r s a n d r e m a i n e d a t 1 8 h o u r s . Z o n a l a n a l y s i s o f t h e l i v e r l o b u l e s f r o m M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s r e v e a l e d a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n R E C A - 1 i m m u n o s t a i n i n g w i t h i n t h e C L r e g i o n o f t h e l i v e r l o b u l e s t a r t i n g a t 6 h o u r s a n d w i t h i n t h e M 2 r e g i o n b y 1 2 h o u r s ( F i g u r e 4 . 2 0 ) . 1 5 6 F i g u r e 4 . 2 . L i v e r R E C A - 1 I m m u n o h i s t o c h e m i c a l S t a i n i n g . R a t s W e r e t r e a t e d w i t h M C T a n d / o r L P S a n d k i l l e d a t t h e i n d i c a t e d t i m e s , a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 4 . 1 l e g e n d . L i v e r s w e r e r e m o v e d a n d p r o c e s s e d f o r R E C A - 1 i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . R E C A - 1 i s a n a n t i b o d y s e l e c t i v e f o r e n d o t h e l i a l c e l l s . ( A ) R e p r e s e n t a t i v e p h o t o m i c r o g r a p h s o f R E C A - t - i m m u n o s t a i n e d l i v e r s e c t i o n s f r o m a V e h N e h - a n d a M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t a t 1 8 h o u r s . R E C A - 1 i m m u n o s t a i n i n g ( s h o w n i n b l a c k ) i s p r o m i n e n t i n t h e c e n t r a l v e i n ( C V ) a n d s i n u s o i d a l e n d o t h e l i u m a n d v e s s e l s o f t h e p o r t a l t r i a d ( P T ) . B a r = 5 0 p m . ( 8 ) T h e z o n a l d i s t r i b u t i o n o f R E C A — 1 i m m u n o s t a i n i n g w a s e v a l u a t e d a t 1 8 h o u r s f o r a l l t r e a t m e n t g r o u p s . A d d i t i o n a l l y , t i m e c o u r s e s f o r t o t a l l i v e r R E C A - 1 i m m u n o s t a i n i n g ( C ) a n d i t s z o n a l d i s t r i b u t i o n ( D ) i n t h e l i v e r s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s w e r e e x a m i n e d . N = 4 - 7 a n i m a l s . F o r ( C ) a n d ( D ) , V e h N e h - t r e a t e d a n i m a l s w e r e c o m b i n e d i n t o o n e g r o u p ( N = 1 2 ) , s i n c e n o d i f f e r e n c e s O < > ¢ “ " ° d a m o n g V e h N e h - t r e a t e d g r o u p s a t t h e v a r i o u s t i m e s . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l l o t h e r g r o u p s i n s a m e l o b u l a r r e g i o n - ° S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m V e h N e h g r o u p . 1 5 7 - 2 _ ’ C P e e n i r t i r i l o b u l a r z p o o n r a t l a l 5 0 0 . ‘ ' 6 a n E A i E g . a N I - . u v 0 0 . 2 1 0 . 0 g 3 E E 5 1 ' I o : n M L C P T S - - + - « g 0 2 ” < = 8 : i 5 ' I ' + 1 1 1 ; r L E 0 c s S > g v 0 '9“ l . ' 1 + 4 0 2 0 g 0 0 o ' ,,,. 4 2 0 0 o . . - . o - ‘ fi e ‘ v ' , 1 1 — » . , 4 - \ r : 7 ’ - . ‘ b b V e h N e h # u H o r s m m M C T A d m l n l s t n t l o n c a r B - g E g v l g S - E 8 6 t g ‘ w c 3 o 5 n 0 . 1 5 . . 1 0 “ n 0 n o + " + V - l a r e e l n t r r d l z C P M l p l o o r b u m o n a l b 1 3 2 4 .. b 1 2 b v 3 M u n g R a t t l e r 9 i n d i c a t e d t h e i r ; a d a n d j i m m y f i b o d y s e l e c t / i i t r a p h s o f H E C l - l - Z T / L P S c o l r e a t e i ' i s p r o m / " r a i l r ( s o f t / r e p u t e o f R 5 6 1 " i n t g r o u t C / a r i e ( 9 W i c e M C T / L P S / H o u r s a f t e r M C T A d m i n i s t r a t l o n 1 5 8 R e p r e s e n t a t i v e T E M p h o t o m i c r o g r a p h s f r o m l i v e r s o f V e h N e h a n d M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s a t 1 8 h o u r s a r e s h o w n i n F i g u r e 4 . 3 . C V E C s a s w e l l a s S E C s i n C L a n d M 2 r e g i o n s o f l i v e r l o b u l e s f r o m V e h N e h - t r e a t e d r a t s e x h i b i t e d n o r m a l m o r p h o l o g y ( F i g u r e 4 . 3 A ) . C V E C s f o r m e d a d i s t i n c t , c o n t i n u o u s b a r r i e r w i t h w e l l - d e f i n e d o r g a n e l l e s . M Z r e g i o n s h a d l a r g e l y c o n t i n u o u s S E C S w i t h c l e a r l y d e f i n e d s p a c e s o f D i s s e . H P C s w i t h i n C L a n d M 2 r e g i o n s w e r e w e l l d e f i n e d a n d h a d d i s t i n c t , n o r m a l - a p p e a r i n g o r g a n e l l e s . B y c o m p a r i s o n , C V E C s a s w e l l a s S E C s f r o m b o t h C L a n d M 2 r e g i o n s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t s w e r e m a r k e d l y a l t e r e d o r a b s e n t ( F i g u r e 4 . 3 8 ) . T h e C V s i n C L r e g i o n s h a d h i g h l y v a c u o l a t e d r e m n a n t s o f C V E C s w i t h o u t d i s c e r n i b l e o r g a n e l l e s , o r w e r e c o m p l e t e l y d e n u d e d o f C V E C s . H P C s c o n t a i n e d n u m e r o u s f a t d r o p l e t s , r o u n d e d m i t o c h o n d r i a a n d i n d i s t i n c t p l a s m a m e m b r a n e s . W i t h i n t h e M 2 r e g i o n s , S E C s w e r e i n d i s t i n c t a n d d i s c o n t i n u o u s w i t h a t t e n u a t e d a n d e l e c t r o n - l u c e n t c y t o p l a s m . I n o t h e r M Z a r e a s , t h e S E C s w e r e c o m p l e t e l y l o s t . T h e s i n u s o i d s w e r e n a r r o w e d a n d c o n t a i n e d f i b r i n d e p o s i t s , r e d b l o o d c e l l s ( R 8 0 3 ) a n d P M N s . R 8 0 3 a n d c e l l f r a g m e n t s w e r e v i s i b l e i n t h e r e m a i n i n g s p a c e o f D i s s e . H P C s h a d i n d i s t i n c t p l a s m a m e m b r a n e s a n d d i s r u p t e d m i t o c h o n d r i a . H e n c e , i n t h e l i v e r s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s , C V E C s , S E C s a n d H P C s w e r e i n j u r e d b y 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . S u c h i n j u r y w a s a l s o e v i d e n t a t 1 2 h o u r s ( d a t a n o t s h o w n ) . 1 5 9 F i g u r e 4 . 3 . R e p r e s e n t p t i v e T E M P h o t o m i c r o g g p h s f r o m L i v e r S e c t i o n s o f V e h N e h - a _ n d M C T / L P S - C o t r e p t e d R a t s . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h M C T a n d L P S a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 4 . 1 l e g e n d . T h e y w e r e k i l l e d 1 8 h o u r s a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f M C T o r i t s V e h , a n d l i v e r s w e r e r e m o v e d a n d f i x e d f o r T E M a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . ( A ) T h e c e n t r a l v e i n ( C V ) a n d a m i d z o n a l ( M Z ) s i n u s o i d f r o m a V e h N e h - t r e a t e d r a t h a v e n o r m a l e n d o t h e l i a l m o r p h o l o g y . ( B ) T h e C V a n d a M Z s i n u s o i d f r o m a M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t s h o w a h i g h l y v a c u o l a t e d r e m n a n t o f a c e n t r a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l ( C V E C ) a n d a b s e n c e o f s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s ( S E C S ) , r e s p e c t i v e l y . R B C , r e d b l o o d c e l l ; P M N , p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e . M a g n i f i c a t i o n i n ( A ) i s 1 2 , 1 8 0 X f o r C V r e g i o n a n d 1 4 . 8 2 0 X f o r M 2 r e g i o n a n d i n ( B ) i s 1 9 , 1 7 0 X f o r C V r e g i o n a n d 1 2 , 1 5 0 X f o r M 2 r e g i o n - 1 6 0 h s f r o m LiverSecl’ai w e r e t r e a t e d with I l l e killed f i l m w e r r e . y a r e T e h d i r e d i l i c W m o v e d a e c e n t r a l v r a t h a v e m ‘ f r o m a M C T / I F S . a central a n d o l h e / r ‘ a / 4 * n i o r p l l m w 14,320X Ii i l l / 9 W A V e h N e h - C V 1 6 1 4 . 0 . 2 . S E C S a n d N P - 2 6 C e l l s a r e M o r p h o l o g i c a l l y S i m i l a r a n d F o r m P y r r o l i c M e t a b o l i t e s F r o m M C T [ T h i s s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w a s c o n d u c t e d b y U m e s h M . H a n u m e g o w d a ] P r e v i o u s l y , D e L e v e e t a l . ( 1 9 9 6 ) ‘ d e m o n s t r a t e d t h a t M C T i s t o x i c t o S E C S i n V i t r o a n d s u g g e s t e d t h a t t h e t o x i c i t y m i g h t b e d u e t o t h e p r o d u c t i o n o f a t o x i c m e t a b o l i t e ( i . e . , M C T P ) . T o d e t e r m i n e i f M C T i s m e t a b o l i z e d b y S E C S , a n E h r l i c h a s s a y w a s u s e d t o e s t i m a t e t h e f o r m a t i o n o f p y r r o l i c m e t a b o l i t e ( s ) i n p r i m a r y S E C i s o l a t e s a n d i n a t r a n s f o r m e d r a t S E C l i n e ( i . e . , N P - 2 6 c e l l s ) . A f t e r i n c u b a t i o n w i t h M C T , p r i m a r y S E C S p r o d u c e d p y r r o l e i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r ( F i g u r e 4 . 4 A ) . T h e a m o u n t o f p y r r o l e p r o d u c e d f r o m p r i m a r y S E C S w a s c o r r e c t e d f o r t h e c o n t r i b u t i o n b y c o n t a m i n a t i n g h e p a t o c y t e s . S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n a l y s i s o f N P - 2 6 c e l l s r e v e a l e d f e n e s t r a t i o n s ( F i g u r e 4 . 4 0 ) , a h a l l m a r k o f S E C m o r p h o l o g y ( F i g u r e 4 . 4 0 ) . P y r r o l e p r o d u c t i o n a l s o o c c u r r e d i n N P - 2 6 c e l l s i n a M C T c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r ( F i g u r e 4 . 4 A ) . I m m u n o b l o t t i n g o f m i c r o s o m a l p r o t e i n s w i t h a n a n t i - C Y P 3 A 2 s p e c i f i c a n t i b o d y r e v e a l e d a p r o t e i n o f ~ 7 2 k D a i n b o t h N P - 2 6 c e l l s a n d r a t h e p a t o c y t e s ( F i g u r e 4 . 4 8 ) . 1 6 2 F i g u r e 4 . 4 . P v r r o l e F o n n a r t i o n f r o m M C T i n S E C S i n V i t r o - ( A ) D u r i n g i n c u b a t i o n w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f M C T , p y r r o l i c m e t a b o l i t e s a r e f o r m e d b y p r i m a r y S E C S a n d N P - 2 6 c e l l s . P y r r o l e f o r m a t i o n i n p r i m a r y S E C S w a s c o r r e c t e d f o r t h e c o n t r i b u t i o n o f c o n t a m i n a t i n g h e p a t o c y t e s ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . ( 8 ) R e p r e s e n t a t i v e i m m u n o b l o t r e v e a l i n g C Y P 3 A 2 p r o t e i n i n t h e m i c r o s o m a l f r a c t i o n o f h e p a t o c y t e s ( L a n e 1 ) a n d N P - 2 6 c e l l s ( L a n e 2 ) . R e p r e s e n t a t i v e s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c p h o t o m i c r o g r a p h s a r e d e p i c t e d f o r N P - 2 6 c e l l s ( C ) a n d p r i m a r y S E C S ( D ) , d e m o n s t r a t i n g f e n e s t r a e o n t h e c e l l s u r f a c e ( s o l i d b l a c k a r r o w s ) . B a r = 2 p m . N = 3 — 4 a n i m a l s . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m V e h c o n t r o l . [ T h e w o r k i n t h i s f i g u r e w a s c o m p l e t e d b y U m e s h M . H a n u m e g o w d a ] . 1 6 3 m . w i . A B E ‘ 1 . 5 4 — - e — P r l s e c 1 2 a b o l l l i s a r e l e g ‘ 3 1 2 . - o — " 1 : 3 2 3 . . . ' a a . t r i m S E Q ! 0 ' 0 . 9 ” g a 8 5 k D a - r . . . w e e a a - ~ — 6 . . A 2 § 0 . 3 ~ 1 p r o t e r r ! b . - n > . ' o . o < , . - 4 0 ' 7 k D a i c e l l s I L “ : 0 1 2 3 4 5 M o n o c r o t a l i n e ( m M ) 1 5 a r e d e b i t ? e s t r a e o r t r i C N P - 2 6 C e l l . 1 " - . i w d a ] . 4 . D . 3 . L i v e r H e m o r r h a g e T o q u a n t i f y t h e d e g r e e o f h e m o r r h a g e i n t h e l i v e r s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s , t h e c o n c e n t r a t i o n o f t i s s u e h e m o g l o b i n w a s d e t e r m i n e d . A t i m e - d e p e n d e n t i n c r e a s e i n l i v e r h e m o g l o b i n b e g a n w i t h i n 1 2 h o u r s i n t h e M C T / L P S - c o t r e a t e d g r o u p a n d r e m a i n e d s i g n i f i c a n t a t 1 8 h o u r s ( F i g u r e 4 . 5 A ) . N o o t h e r t r e a t m e n t g r o u p e x h i b i t e d i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n o f l i v e r h e m o g l o b i n . 4 . D . 4 . C o a g u l a t i o n S y s t e m A c t i v a t i o n D u r i n g a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , f i b r i n o g e n i s c o n v e r t e d t o f i b r i n , r e s u l t i n g i n a d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n . H e n c e , p l a s m a f i b r i n o g e n i s a b i o m a r k e r f o r a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . N o d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n w a s o b s e r v e d a t a n y t i m e i n g r o u p s t r e a t e d w i t h V e h , L P S o r I V I C T a l o n e . B y c o n t r a s t , p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s b y 6 h o u r s ( F i g u r e 4 . 5 8 ) . T h i s d e c r e a s e o c c u r r e d b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y ( F i g u r e 4 . 1 A ) . P l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n f r o m M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s r e m a i n e d s i g n i f i c a n t l y d e p r e s s e d a t 1 2 a n d 1 8 h o u r s . T o d e t e r m i n e i f t h e d e c r e a s e p l a s m a f i b r i n o g e n w a s a s s o c i a t e d w i t h d e p o s i t i o n o f i n s o l u b l e f i b r i n i n t h e l i v e r , h e p a t i c f i b r i n w a s e x a m i n e d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l y . L i t t l e f i b r i n i m m u n o s t a i n i n g w a s o b s e r v e d i n t h e s i n u s o i d s o f l i v e r s e c t i o n s f r o m V e h N e h - t r e a t e d r a t s a t 1 8 h o u r s ( F i g u r e 4 . 6 A ) . H o w e v e r , s o m e s t a i n i n g o c c u r r e d i n t h e i n t i m a o f l a r g e r v e s s e l s , w h i c h r e s u l t s f r o m f i b r i n d e p o s i t i o n t h a t o c c u r s a f t e r a n i m a l s a c r i f i c e ( C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . B y 1 6 5 F i g u r e 4 . 5 . T i m e c o u r s e f o r L i v e r H e m o g l o b i n E d C o a g u l a t i o n s t t e m A c t i v fi a t i o n i n M C T / L P S - C o e x p o s e d R a t s _ . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h M C T a n d / o r L P S , a n d k i l l e d a t t h e i n d i c a t e d t i m e s , a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 4 . 1 l e g e n d . ( A ) L i v e r s w e r e r e m o v e d a n d a n a l y z e d f o r t i s s u e h e m o g l o b i n , a b i o m a r k e r o f h e m o r r h a g e . ( 8 ) P l a s m a f i b r i n o g e n , a b i o m a r k e r f o r c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n , w a s a l s o a n a l y z e d . N = 3 — 7 a n i m a l s - a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l l o t h e r g r o u p s a t t h e s a m e t i m e . 1 6 6 i t i o r i S y s t e o d w i t h M C . A i F i g u r e t t h 4 0 0 0 + V e h / V e h + M C T N e h m o g l o c r a 5 - O - V e h / L P S - v — M C T / L P S m 3 0 0 . . \ i m a r i e r b ! E ' 8 2 0 0 . t r i a l s . 3 , 2 0 1 0 0 . : I : g 0 . - . 0 6 1 2 1 8 2 4 H o u r s a f t e r M C T A d m i n i s t r a t i o n 8 § - O — V e h N e h + M C T N e h - O — V e h I L P S - v — M C T / L P S ‘ 3 ' P l a s m a F i b r i n o g e n ( m g l d l ) é a ( i : E i 0 s 1 2 1 e 2 4 H o u r s a f t e r M C T A d m i n i s t r a t i o n 1 6 7 F i g u r e 4 . 6 . H e p a t i c F i b r i n D e p o s i t i o n . A n i m a l s w e r e t r e a t e d w i t h M C T a n d / o r L P S , a n d k i l l e d a t t h e i n d i c a t e d t i m e s , a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 1 l e g e n d . L i v e r s w e r e r e m o v e d a n d p r o c e s s e d f o r fi b r i n i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . ( A ) R e p r e s e n t a t i v e p h o t o m i c r o g r a p h s o f l i v e r s e c t i o n s f r o m a V e h N e h - a n d a M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t a t 1 8 h o u r s i m m u n o s t a i n e d f o r f i b r i n d e p o s i t s , w h i c h a p p e a r b l a c k . C V , c e n t r a l v e i n ; P T , p o r t a l t r i a d . B a r = 5 0 p m . ( 8 ) Z o n a l d i s t r i b u t i o n o f f i b r i n i m m u n o s t a i n i n g w a s e v a l u a t e d a t 1 8 h o u r s . T i m e c o u r s e s f o r t o t a l l i v e r f i b r i n i m m u n o s t a i n i n g ( C ) a n d i t s z o n a l f i b r i n d i s t r i b u t i o n ( D ) i n t h e l i v e r s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s w e r e d e t e r m i n e d . N = 4 - 7 a n i m a l s - F o r ( C ) a n d ( D ) , V e h N e h - t r e a t e d a n i m a l s w e r e c o m b i n e d i n t o o n e g r o u p ( N = 1 2 ) - s i n c e n o d i f f e r e n c e s o c c u r r e d a m o n g V e h N e h - t r e a t e d g r o u p s a t t h e v a r i o u s t i m e s . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l l o t h e r g r o u p s i n s a m e l o b u l a r r e g i o n - ° S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m V e h N e h g r o u p . 1 6 8 9 0 d a t p a 0 8 t o r I f 1 ‘ F I C 0 1 . 5 " d t 1 . 1 7 o 8 3 f 1 . F . 8 i J 7 o E ' 3 ' : e : w r 3 t A . , Q , . - 9 \ c v , 8 . ‘ , P T 9 4 / 2 f r : l : » g c v “ a . “ . _ p g . 4 a , e v , z . - ( E x . , é “ C . 4 ‘ — - ) l o r t a n e o r C A h n e l r V b / l h F e V % ( s a t e d i r ' : I I C ' r f o r t o t a l i f N O i n t h e h e a d " ' 1 ’ . . . . i 0 . 1 2 . a ” 4 r m a l s . F o r ? . 2 . 5 i . « - e w - , . c c . . . M 5 ; . . . 2 % . . . E u . . E r 0 , 0 3 - V 0 . 0 1 b [ C U P S 8 1 i t 0 . 0 0 J 0 . 0 0 M C T - + - + L P S - - + + H o u r s a f t e r M C T A d m l n l s t r a t l o n a g i o n . + C e n t r i l o b u l a r + P e r l p o r l s l + M i d z o n a l A 3 A 0 - . . . 0 6 1 2 1 8 2 4 H o u r s a f t e r M C T A d m i n i s t r a t i o n 1 6 9 c o n t r a s t , i n t e n s e f i b r i n s t a i n i n g o c c u r r e d i n t h e s i n u s o i d s o f C L a n d M 2 r e g i o n s o f l i v e r s f r o m r a t s t r e a t e d w i t h M C T / L P S ( F i g u r e 4 . 6 A ) . F i b r i n s t a i n i n g w a s m i n i m a l i n t h e P P r e g i o n s . M o r p h o m e t r i c a n a l y s i s c o n f i r m e d a S i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n f i b r i n s t a i n i n g a t 1 8 h o u r s i n t h e C L a n d M 2 r e g i o n s i n l i v e r s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 4 . 6 8 ) . N o i n c r e a s e i n f i b r i n s t a i n i n g w a s o b s e r v e d i n t h e o t h e r t r e a t m e n t g r o u p s a t t h i s t i m e . F u r t h e r m o r e , a t i m e - d e p e n d e n t i n c r e a s e i n t o t a l f i b r i n s t a i n i n g o c c u r r e d i n t h e l i v e r s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s ; t h i s w a s s i g n i f i c a n t a t 1 2 h o u r s a n d r e m a i n e d e l e v a t e d a t 1 8 h o u r s ( F i g u r e 4 . 6 0 ) . Z o n a l a n a l y s i s o f h e p a t i c f i b r i n s t a i n i n g r e v e a l e d a t i m e - d e p e n d e n t i n c r e a s e t h a t b e c a m e s i g n i f i c a n t a t 1 2 h o u r s i n b o t h C L a n d M 2 r e g i o n s o f l i v e r s f r o m M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 4 . 6 0 ) . 4 . E . D i s c u s s i o n L a r g e , a c u t e l y t o x i c d o s e s o f L P S c a u s e d o s e - d e p e n d e n t a c t i v a t i o n a n d i n j u r y t o e n d o t h e l i a l c e l l s ( P o b e r a n d C o l t r a n , 1 9 9 0 ; P o h l m a n a n d H a r l a n , 1 9 9 2 ; S e t o e t a l . , 1 9 9 8 ) . A c u t e l y h e p a t o t o x i c d o s e s o f M C T a l s o c a u s e e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y b o t h i n v i v o ( S c h o e n t a l a n d H e a d , 1 9 5 5 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 9 ; C o p p l e e t a l . 2 0 0 2 a ) a n d i n V i t r o ( D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ) . T o e x p l o r e h e p a t i c e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y i n a m o d e l o f s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y i n v o l v i n g c o e x p o s u r e t o s m a l l , n o n t o x i c d o s e s o f M C T a n d L P S , a p l a s m a b i o m a r k e r f o r S E C i n j u r y , i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d T E M w e r e u s e d . 1 7 0 H A i s a g l y c o s a m i n o g l y c a n c o m p o n e n t o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x t h a t i s t o n i c a l l y r e l e a s e d i n t o b l o o d ( L a u r e n t a n d F r a z i e r , 1 9 9 2 ) . O v e r 9 0 % o f c i r c u l a t i n g H A i s r e m o v e d a n d d e g r a d e d b y h e p a t i c S E C S t h r o u g h r e c e p t o r - m e d i a t e d e n d o c y t o s i s ( L a u r e n t a n d F r a z i e r , 1 9 9 2 ; K o b a y a s h i e t a l . , 1 9 9 9 ) . S E C i n j u r y i m p a i r s t h e a b i l i t y o f t h e s e c e l l s t o c l e a r H A , r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n . C o n s e q u e n t l y , s u c h i n c r e a s e s h a v e b e e n u s e d i n v i v o a s a b i o m a r k e r f o r S E C d y s f u n c t i o n a n d i n j u r y ( S h i m i z u e f a l . , 1 9 9 4 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . I n c r e a s e s i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n c o r r e l a t e d w e l l w i t h h i s t o p a t h o l o g i c e v i d e n c e o f S E C i n j u r y a n d d e s t r u c t i o n i n r a t s g i v e n a l a r g e , h e p a t o t o x i c d o s e o f e i t h e r M C T ( C o p p l e e t a l . 2 0 0 2 a ) o r L P S ( D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 4 ; S e t o e t a l . , 1 9 9 8 ; S p a p e n e t a l . , 1 9 9 9 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n o c c u r r e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s w i t h i n 6 h o u r s , a n d t h e c o n c e n t r a t i o n r e m a i n e d e l e v a t e d u n t i l 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 4 . 1 8 ) . T h e p r o n o u n c e d r i s e i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n p r e c e d e d t h e o n s e t o f I - I P C i n j u r y ( F i g u r e 4 . 1 A ) , s u g g e s t i n g t h a t S E C d y s f u n c t i o n m i g h t b e c a u s a l l y i n v o l v e d i n H P C i n j u r y . A d d i t i o n a l l y , a m o d e s t i n c r e a s e i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s o b s e r v e d a t 1 8 h o u r s i n r a t s g i v e n o n l y L P S ( F i g u r e 4 . 1 8 ) . T h i s i n c r e a s e s u g g e s t s f u n c t i o n a l i m p a i r m e n t o f S E C S ( D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 a ; T a k e u c h i e t a l . , 1 9 9 4 ; S a r p h i e e t a l . , 1 9 9 6 ) , b u t i n r a t s t r e a t e d o n l y w i t h L P S t h i s w a s n o t a c c o m p a n i e d b y H P C i n j u r y a t 1 8 h o u r s o r t i m e s t h e r e a f t e r ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b , 2 0 0 3 c ) . T h e r e f o r e , e i t h e r t h e e x t e n t o f S E C d y s f u n c t i o n t h a t o c c u r r e d i n r a t s g i v e n L P S a l o n e w a s o f i n s u f f i c i e n t m a g n i t u d e t o p r o d u c e H P C i n j u r y o r H P C i n j u r y d e p e n d e d o n f a c t o r s i n a d d i t i o n t o S E C d y s f u n c t i o n t h a t a r e 1 7 1 a b s e n t i n a n i m a l s t r e a t e d w i t h L P S a l o n e . A l t e r n a t i v e l y , H P C i n j u r y i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s m a y o c c u r i n d e p e n d e n t l y o f S E C i n j u r y . R E C A - 1 i m m u n o s t a i n i n g o f l i v e r s e c t i o n s r e v e a l e d t h a t e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y w a s e x t e n s i v e i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . A p p r o x i m a t e l y 2 5 % o f e n d o t h e l i a l c e l l s t a i n i n g w a s l o s t w i t h i n 1 2 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n , a n d t h i s l o s s i n c r e a s e d t o 4 0 % b y 1 8 h o u r s . R e d u c t i o n i n R E C A - 1 s t a i n i n g w a s p r o n o u n c e d w i t h i n C L r e g i o n s b y 6 h o u r s a n d w i t h i n M Z r e g i o n s b y 1 2 h o u r s ( F i g u r e 4 . 2 0 ) . T h e C L a n d M 2 l o c a t i o n o f t h i s d e c r e a s e c o r r e s p o n d s t o t h e r e g i o n s w h e r e i n H P C n e c r o s i s o c c u r s . T h e r e d u c t i o n i n R E C A - 1 s t a i n i n g , h o w e v e r , w a s n o t o b s e r v e d i n t h e g r o u p g i v e n L P S a l o n e a t 1 8 h o u r s , a n d t h e r e w a s n o r e d u c t i o n i n t o t a l R E C A - 1 s t a i n i n g i n t h e M C T / L P S g r o u p a t 6 h o u r s . S i n c e i n c r e a s e s i n p l a s m a H A o c c u r r e d u n d e r b o t h o f t h e s e c o n d i t i o n s , p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n a p p e a r s t o b e a m o r e s e n s i t i v e b i o m a r k e r f o r S E C i n j u r y t h a n l o s s o f R E C A - 1 s t a i n i n g . A s i m i l a r d i f f e r e n c e i n s e n s i t i v i t y w a s o b s e r v e d i n a s t u d y o f h e p a t o t o x i c d o s e s o f M C T ( C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . T E M o f l i v e r s f r o m M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s w a s u s e d t o c o n f i r m h e p a t i c v a s c u l a r i n j u r y . B y 1 8 h o u r s , t h e s i n u s o i d s a n d C V S f r o m t h e l i v e r s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s e i t h e r c o n t a i n e d r e m n a n t s o f S E C S o r C V E C S o r w e r e d e v o i d o f e n d o t h e l i a l c e l l s a l t o g e t h e r ( F i g u r e 4 . 3 ) . F i b r i n d e p o s i t i o n , R B C S i n t h e s p a c e o f D i s s e ( i . e . , h e m o r r h a g e ) a n d P M N S w e r e f o u n d i n s i n u s o i d s w i t h i n C L a n d M 2 r e g i o n s . T h e s e c h a n g e s w e r e a p p a r e n t b y 1 2 h o u r s ( d a t a n o t s h o w n ) . A c c o r d i n g l y , e n d o t h e l i a l d a m a g e , a s d e t e r m i n e d b y p l a s m a H A 1 7 2 c o n c e n t r a t i o n , i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a n d T E M , i s a p r o n o u n c e d c o m p o n e n t o f s y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y i n d u c e d b y M C T / L P S - o o t r e a t m e n t . T h e c a u s e o f S E C i n j u r y i n M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t s i S n o t f u l l y u n d e r s t o o d . D e L e v e e t a l . ( 1 9 9 6 ) p o s t u l a t e d t h a t S E C S i n V i t r o c a n b i o a c t i v a t e M C T t o i t s t o x i c m e t a b o l i t e ( i . e . , M C T P ) , r e s u l t i n g i n S E C i n j u r y . A l t h o u g h S E C S a r e k n o w n t o e x p r e s s s o m e C Y P S ( L e s t e r e t a l . , 1 9 9 3 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 7 ) , i t i s n o t k n o w n i f t h e p a r t i c u l a r C Y P s u b f a m i l y ( i . e . , C Y P 3 A ) r e s p o n s i b l e f o r M C T b i o a c t i v a t i o n i s e x p r e s s e d i n t h e s e c e l l s ( K a s a h a r a e t a l . , 1 9 9 7 ; R e i d e t a l . , 1 9 9 8 ) . H o w e v e r , b o t h i s o l a t e d p r i m a r y S E C S a n d t h e N P - 2 6 r a t S E C c e l l l i n e p r o d u c e d p y r r o l i c m e t a b o l i t e ( s ) f r o m M C T i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r ( F i g u r e 4 . 4 A ) . I n a d d i t i o n , a ~ 7 2 k D a p r o t e i n r e c o g n i z e d b y t h e C Y P 3 A 2 S p e c i f i c a n t i b o d y i s e x p r e s s e d i n t h e m i c r o s o m a l f r a c t i o n s i n N P - 2 6 c e l l s ( F i g u r e 4 . 4 8 ) . T h i s c o n f i r m s t h a t a n i s o z y m e f r o m t h e C Y P 3 A s u b f a m i l y i s p r e s e n t i n t h e s e c e l l s ( i . e . , N P - 2 6 c e l l s ) . M o r e o v e r , i t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t M C T P c a u s e s i n j u r y t o e n d o t h e l i a l c e l l s i n v i t r o . F o r e x a m p l e , t r e a t m e n t o f p u l m o n a r y a r t e r y e n d o t h e l i a l c e l l s w i t h l o w c o n c e n t r a t i o n s o f M C T P i n V i t r o r e s u l t s i n e n h a n c e d c e l l d e t a c h m e n t ( i . e . , d i s r u p t i o n o f m o n o l a y e r i n t e g r i t y ) , d e r a n g e m e n t o f a c t i n p o l y m e r i z a t i o n , a n d a p o p t o t i c n e c r o s i s ( R e i n d e l a n d R o t h , 1 9 9 1 ; T h o m a s e t a l . , 1 9 9 8 ; W i l s o n e t a l . , 1 9 9 8 ) . H e n c e , S E C S m a y b e a b l e t o m e t a b o l i z e M C T . T h e c o n s e q u e n t p r o d u c t i o n o f M C T P w o u l d h a v e a d v e r s e e f f e c t s o n t h e s e c e l l s t h a t c o u l d e x p l a i n w i d e s p r e a d S E C d e s t r u c t i o n i n v i v o . N o S E C i n j u r y w a s o b s e r v e d i n v i v o w h e n t h e d o s e o f M C T u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y w a s g i v e n b y i t s e l f . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e d e g r e e o f b i o a c t i v a t i o n 1 7 3 b y S E C S a n d H P C S c o m b i n e d w a s i n s u f f i c i e n t t o c a u s e o v e r t i n j u r y ( F i g u r e 4 . 1 8 ) . H o w e v e r , a t t h e s m a l l M C T d o s e u s e d , M C T b i o a c t i v a t i o n m i g h t a l t e r S E C h o m e o s t a s i s t o r e n d e r t h e s e c e l l s m o r e s u s c e p t i b l e t o t o x i c i t y f r o m i n f l a m m a t o r y f a c t o r s e v o k e d b y c o n c u r r e n t L P S e x p o s u r e ( W a r d a n d V a r a n i , 1 9 9 0 ; J a e s c h k e a n d F a r h o o d , 1 9 9 1 ; S p r i n g e r , 1 9 9 4 ; S a r p h i e e t a l . , 1 9 9 6 ; Y a c h i d a e t a l . , 1 9 9 8 ) . Y e e e t a l . ( 2 0 0 3 a , 2 0 0 3 c ) d e m o n s t r a t e d t h a t K u p f f e r c e l l i n a c t i v a t i o n , T N F - a n e u t r a l i z a t i o n a n d P M N d e p l e t i o n w e r e e a c h e f f e c t i v e i n a t t e n u a t i n g H P C i n j u r y i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s , b u t t h e s e m a n i p u l a t i o n s w e r e o n l y m o d e s t l y s u c c e s s f u l i n a t t e n u a t i n g S E C i n j u r y . H e n c e , i t i s p r o b a b l e t h a t S E C i n j u r y i n t h i s m o d e l d e v e l o p s i n p a r t f r o m t h e i n t e r a c t i o n o f M C T w i t h L P S o r w i t h a n u n k n o w n i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r ( s ) e v o k e d b y L P S . O n e p o s s i b l e i n t e r a c t i o n c o u l d i n v o l v e d e p l e t i o n o f g l u t a t h i o n e ( G S H ) i n e n d o t h e l i a l c e l l s b y b i o a c t i v a t e d M C T ( P a n e t a l . , 1 9 9 3 ; R e i d e t a l . , 1 9 9 9 ) . D e L e v e e t a l . ( 1 9 9 6 ) s h o w e d t h a t M C T i s m o r e t o x i c t o S E C S t h a n t o H P C S i n V i t r o a n d t h a t t o x i c i t y m a y r e q u i r e p r o f o u n d G S H d e p l e t i o n . I t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t t h e s m a l l d o s e o f M C T u s e d i n t h i s m o d e l d e c r e a s e s G S H c o n c e n t r a t i o n i n S E C S w i t h o u t r e s u l t i n g i n o v e r t i n j u r y . P r o o x i d a n t i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s e v o k e d b y L P S m i g h t p r e c i p i t a t e o v e r t i n j u r y t o t h o s e S E C S i n w h i c h G S H h a s b e e n d e c r e a s e d b y M C T . F u r t h e r s t u d y i s r e q u i r e d t o e x p l o r e t h i s p o s s i b i l i t y . A c t i v a t i o n o f S E C S b y L P S o r L P S - i n d u c e d i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s ( e . g . , T N F - a ) r e s u l t s i n S E C S b e c o m i n g p r o c o a g u l a n t ( S t e r n e t a l . , 1 9 8 5 ; T a k e u c h i e t a l . , 1 9 9 4 ) . M o r e o v e r , S E C i n j u r y o r d e s t r u c t i o n c a n r e s u l t i n t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( M a c h o v i c h , 1 9 8 5 ; R y a n , 1 9 8 6 ; H i r a t a e t a l . , 1 9 8 9 ; C o p p l e a t 1 7 4 a l . , 2 0 0 2 a ) . I n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s , p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y b y 6 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n a n d r e m a i n e d d e p r e s s e d t h r o u g h 1 8 h o u r s ( F i g u r e 4 . 5 8 ) . A c o n s e q u e n c e o f c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n i s t h e f o r m a t i o n o f i n s o l u b l e f i b r i n . F i b r i n d e p o s i t i o n i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y i n t h e l i v e r s o f M C T / L P S c o t r e a t e d a n i m a l s b y 1 2 h o u r s a n d r e m a i n e d e l e v a t e d a t 1 8 h o u r s ( F i g u r e 4 . 6 C ) . B o t h C L a n d M 2 r e g i o n s o f t h e l i v e r l o b u l e e x p e r i e n c e d f i b r i n d e p o s i t i o n a t t h e s e t i m e s ( F i g u r e 4 . 6 0 ) . T E M c o n f i r m e d t h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l e v i d e n c e o f f i b r i n d e p o s i t i o n i n t h e s i n u s o i d s ( F i g u r e 4 . 3 8 ) . T h e o b s e r v a t i o n s t h a t t h e r e d u c t i o n i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n p r e c e d e d H P C d a m a g e a n d t h a t f i b r i n d e p o s i t s l o c a l i z e d t o C L a n d M 2 r e g i o n s t h a t u l t i m a t e l y e x p e r i e n c e d a m a g e s u g g e s t t h e p o s s i b i l i t y o f a c a u s a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d H P C i n j u r y . H e m o r r h a g e a n d f i b r i n d e p o s i t i o n c a u s e d b y i n j u r y o r l o s s o f S E C S c a n r e s u l t i n t h e i m p a i r m e n t o f s i n u s o i d a l b l o o d f l o w ( H i r a t a e t a l . , 1 9 8 9 ; V o l l m a r e t a l . 1 9 9 3 ; Y a c h i d a e t a l . , 1 9 9 8 ) . M o r e o v e r , a c t i v a t i o n o f S E C S b y T N F - a o r o t h e r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s r e s u l t s i n a d h e s i o n o f P M N S t o t h e s e c e l l s a n d t o c e l l s w e l l i n g t h a t c a n n a r r o w s i n u s o i d a l l u m e n s a n d c o n t r i b u t e t o s u c h i m p a i r m e n t o f b l o o d f l o w ( S p r i n g e r , 1 9 9 4 ; V o l l m a r e t a l . , 1 9 9 6 a ; Y a c h i d a e t a l . , 1 9 9 8 ) . I t h a s b e e n p o s t u l a t e d t h a t c o n s e q u e n t s i n u s o i d a l h y p o p e r f u s i o n l e a d s t o i s c h e m i c / h y p o x i c i n j u r y t o H P C S w i t h i n a f f e c t e d r e g i o n s ( F u j i w a r a e t a l . , 1 9 8 8 ; H i r a t a e t a l . , 1 9 8 9 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ; M o c h i d a e t a l . , 1 9 9 9 ; Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . C o n s i s t e n t w i t h t h i s h y p o t h e s i s i s t h e o b s e r v a t i o n i n M C T / L P S - t r e a t e d r a t s t h a t b o t h S E C i n j u r y ( F i g u r e 4 . 1 8 ) a n d c o a g u l a t i o n s y s t e m 1 7 5 a c t i v a t i o n ( F i g u r e 4 . 5 8 ) p r e c e d e l i v e r h e m o r r h a g e ( F i g u r e 4 . 5 A ) , f o r m a t i o n o f f i b r i n d e p o s i t s a n d t h e o n s e t o f H P C i n j u r y . I n a d d i t i o n , t h r o m b i n a n d o t h e r c o a g u l a t i o n f a c t o r s m i g h t a c t o n p r o t e a s e - a c t i v a t e d r e c e p t o r s t o p r o m o t e l i v e r i n j u r y , a s o c c u r s a f t e r a n h e p a t o t o x i c d o s e o f L P S ( C o p p l e e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h e r e f o r e , d a m a g e t o S E C S m a y l e a d t o H P C i n j u r y t h r o u g h a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m r e s u l t i n g i n f i b r i n d e p o s i t i o n i n t h e l i v e r a n d h y p o x i c i n j u r y t o H P C s O t h e r m e c h a n i s m s e x i s t b y w h i c h S E C i n j u r y c o u l d c o n t r i b u t e t o H P C i n j u r y . F o r e x a m p l e , S E C S p e r f o r m v a r i o u s f u n c t i o n s i n t h e l i v e r , i n c l u d i n g f i l t r a t i o n , e n d o c y t o s i s a n d p u t a t i v e r e g u l a t i o n o f S i n u s o i d a l b l o o d f l o w ( W i s s e e t a l . , 1 9 9 6 ; A r i i a n d l m a m u r a , 2 0 0 0 ) . A S d e s c r i b e d a b o v e , t r e a t m e n t o f e n d o t h e l i a l c e l l s w i t h M C T P r e s u l t s i n d e t r i m e n t a l c y t o s k e l e t a l , j u n c t i o n a l b a r r i e r a n d p e r m e a b i l i t y c h a n g e s ( R e i n d e l a n d R o t h , 1 9 9 1 ; T h o m a s e t a l . , 1 9 9 8 ; W i l s o n e t a l . , 1 9 9 8 ) . I f S i m i l a r c h a n g e s o c c u r i n S E C S i n v i v o a f t e r M C T / L P S c o e x p o s u r e , s u c h d i s r u p t i o n o f t h e S E C b a r r i e r c o u l d p e r m i t a c c e s s t o H P C S o f i n j u r i o u s p r o d u c t s f r o m a c t i v a t e d P M N S a n d K u p f f e r c e l l s , r e s u l t i n g i n H P C i n j u r y ( A r i a e t a l . , 1 9 9 3 ; F a r h o o d e t a l . , 1 9 9 5 ; J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 6 ; Y a c h i d a e t a l . , 1 9 9 8 ; Y o s h i d o m e e t a l . , 2 0 0 0 ) . H e n c e , i n j u r y o r d e s t r u c t i o n o f S E C S m i g h t l e a d t o H P C i n j u r y t h r o u g h a v a r i e t y o f m e c h a n i s m s . A c c o r d i n g l y , S E C S m a y b e a n i m p o r t a n t i n i t i a l t a r g e t i n t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y i n t h i s m o d e l , a s i t a p p e a r s t o b e i n o t h e r s ( D e a c i u c a n d S p i t z e r , 1 9 9 6 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ; S a r p h i e e t a l . , 1 9 9 7 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . H o w e v e r , f u r t h e r s t u d i e s w i l l b e n e e d e d t o d e t e r m i n e i f 1 7 6 S E C S h a v e a c a u s a l r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f H P C i n j u r y i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . I n s u m m a r y , M C T / L P S c o t r e a t m e n t r e s u l t s i n e x t e n s i v e , t i m e - d e p e n d e n t i n j u r y t o h e p a t i c e n d o t h e l i a l c e l l s . D e s t r u c t i o n o f C V E C S i s e v i d e n t b y l i g h t a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p y a s w e l l a s i n t h e l o s s o f i n t i m a l R E C A - 1 i m m u n o s t a i n i n g . S i m i l a r l y , e l e v a t e d p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n , d e c r e a s e d S i n u s o i d a l R E C A - l i m m u n o s t a i n i n g a n d T E M r e s u l t s a l l i n d i c a t e i n j u r y t o S E C S . S E C i n j u r y p r e c e d e s h e p a t i c f i b r i n d e p o s i t i o n , h e m o r r h a g e a n d H P C i n j u r y . O v e r a l l , t h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y f r o m c o e x p o s u r e t o s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e s o f M C T a n d L P S i n v o l v e s p r o n o u n c e d S E C d y s f u n c t i o n a n d i n j u r y a n d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . 1 7 7 W 1 2 9 P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 6 / 0 1 c J C I R C I D a n D u o . p e s - p . 1 5 R O L E O F I N F L A M M A T I O N I N T H E S Y N E R G I S T I C H E P A T O T O X I C I T Y O F M O N O C R O T A L I N E A N D B A C T E R I A L L I P O P O L Y S A C C H A R I D E V O L U M E I I B y S t e v e n B y r o n Y e e A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y I n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s F o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y 2 0 0 3 C H A P T E R 5 T h e R o l e o f K u p f f e r C e l l s a n d T N F - a i n M o n o c r o t a l i n e a n d B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e - I n d u c e d L i v e r I n j u r y I 7 8 5 . A . A b s t r a c t C o e x p o s u r e t o s m a l l , n o n - i n j u r i o u s d o s e s o f t h e p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d p h y t o t o x i n m o n o c r o t a l i n e ( M C T ) a n d b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) r e s u l t s i n s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y . B o t h c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l l i v e r l e s i o n s o c c u r a n d a r e s i m i l a r t o t h o s e s e e n f r o m l a r g e , t o x i c d o s e s o f M C T a n d L P S , r e s p e c t i v e l y . T h e n a t u r e o f t h e l e s i o n s i n v i v o a n d r e s u l t s f r o m s t u d i e s i n v i t r o s u g g e s t t h a t i n j u r y i s m e d i a t e d i n d i r e c t l y r a t h e r t h a n f r o m a s i m p l e i n t e r a c t i o n o f M O T a n d L P S w i t h h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s . A c c o r d i n g l y , t h e r o l e o f i n f l a m m a t o r y f a c t o r s , s u c h a s K u p f f e r c e l l s a n d T N F - a , i n t h e d e v e l o p m e n t o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y w a s i n v e s t i g a t e d . I n S p r a g u e - D a w l e y r a t s , M C T ( 1 0 0 m g / k g , i . p . ) w a s a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s b e f o r e L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g , i . v . ) . P r e t r e a t m e n t o f t h e s e a n i m a l s w i t h g a d o l i n i u m c h l o r i d e , a n i n h i b i t o r o f K u p f f e r c e l l f u n c t i o n , a t t e n u a t e d l i v e r i n j u r y 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . A n i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - a p r e c e d e d t h e o n s e t o f h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l i n j u r y , r a i s i n g t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h i s i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e c o n t r i b u t e s t o t o x i c i t y . E i t h e r p e n t o x i f y l l i n e , a n i n h i b i t o r o f c e l l u l a r T N F - a s y n t h e s i s , o r a n t i - T N F - a s e r u m c o a d m i n i s t e r e d t o M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s s i g n i f i c a n t l y a t t e n u a t e d l i v e r i n j u r y . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t K u p f f e r c e l l s a n d T N F - a a r e i m p o r t a n t m e d i a t o r s i n t h e s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y r e s u l t i n g f r o m M C T a n d L P S c o e x p o s u r e . 5 . 3 . I n t r o d u c t i o n 1 7 9 Y e e e t a l . ( 2 0 0 0 b ) r e c e n t l y d e m o n s t r a t e d t h a t s y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y r e s u l t e d w h e n a n o n i n j u r i o u s d o s e o f L P S w a s a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s a f t e r a s m a l l , n o n h e p a t o t o x i c d o s e o f M C T . F a i l u r e t o r e p r o d u c e s y n e r g i s t i c i n j u r y i n i s o l a t e d h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s ( H P C s ) i n v i t r o s u g g e s t e d t h a t t h e e n h a n c e d t o x i c i t y r e s u l t e d n o t f r o m d i r e c t i n t e r a c t i o n o f M O T a n d L P S w i t h H P C s , b u t r a t h e r f r o m a n i n d i r e c t m e c h a n i s m ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ) . I n a s m u c h a s L P S i s a n i n f l a m m a g e n , t h e p r e s e n t s t u d y w a s d e s i g n e d t o i d e n t i f y i n f l a m m a t o r y f a c t o r s c r i t i c a l t o t h e s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y i n t h i s m o d e l . K C s a r e t h e r e s i d e n t m a c r o p h a g e s o f t h e l i v e r . W h e n a c t i v a t e d b y L P S , t h e y p r o d u c e a n d r e l e a s e n u m e r o u s m e d i a t o r s , i n c l u d i n g c y t o k i n e s ( T N F - a , l L - 1 , a n d l L - 6 ) a n d r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s ( M i c h i e e t a l . , 1 9 8 8 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ) . C y c l o o x y g e n a s e - 2 ( C O X - 2 ) i s a l s o i n d u c e d , l e a d i n g t o t h e e n h a n c e d s y n t h e s i s o f p r o s t a g l a n d i n s ( P G s ) t h a t h a v e p r o i n f l a m m a t o r y a c t i o n s ( B r o u w e r e f a l . , 1 9 9 5 ; D i e t e r a t a l . , 1 9 9 9 ) . M a n y o f t h e s e m e d i a t o r s f u r t h e r a c t i v a t e o r m o d u l a t e t h e e f f e c t s o f n e a r b y c e l l s i n v o l v e d i n t h e i n f l a m m a t o r y p r o c e s s a n d c a n c o n t r i b u t e t o t h e d e v e l o p m e n t o f i n j u r y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ; H o l s t e t a l . , 1 9 9 6 ) . I n a c t i v a t i o n o f K C s w i t h g a d o l i n i u m c h l o r i d e ( G d C I s ) i n r a t s g i v e n a l a r g e , h e p a t o t o x i c d o s e o f L P S s i g n i f i c a n t l y a t t e n u a t e s h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s , s u g g e s t i n g t h a t K C s a r e c r i t i c a l t o t h e p a t h o g e n e s i s o f L P S - i n d u c e d i n j u r y ( B r o w n e t a l . , 1 9 9 7 ) . T N F - a i s a p o t e n t i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e p r o d u c e d b y a c t i v a t e d m a c r o p h a g e s a n d t o a l e s s e r d e g r e e b y o t h e r c e l l t y p e s ( V a s s e l l i , 1 9 9 2 ; B r a d h a m a t a l . , 1 9 9 8 ) . T h i s c y t o k i n e c a n e x e r t a v a r i e t y o f e f f e c t s o n c e l l s r a n g i n g f r o m m i t o c h o n d r i a l d a m a g e a n d o n c o t i c o r a p o p t o t i c n e c r o s i s t o c e l l 1 8 0 p r o l i f e r a t i o n ( B r a d h a m e t a l . , 1 9 9 8 ) . T N F - o t m a y a l s o p r o m p t t h e a c c u m u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s ( P M N s ) b y a c t i v a t i n g e n d o t h e l i a l c e l l s ( V a s s e l l i , 1 9 9 2 ; B r a d h a m e t a l . , 1 9 9 8 ) . I t c a n i n d i r e c t l y p r o m o t e t o x i c i t y b y p r i m i n g P M N s t o r e l e a s e r e a c t i v e o x y g e n a n d n i t r o g e n s p e c i e s a n d p r o t e a s e s t h a t d a m a g e n e a r b y c e l l s ( N a g a k i e t a l . , 1 9 9 1 ; V a s s e l l i , 1 9 9 2 ) . I n h i b i t i o n o f T N F - o r s y n t h e s i s o r a c t i v i t y a t t e n u a t e s i n j u r y c a u s e d b y a n h e p a t o t o x i c d o s e o f L P S , i n d i c a t i n g t h a t T N F — a i s a c r i t i c a l f a c t o r i n t h e p a t h o g e n e s i s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o i n v e s t i g a t e t h e r o l e o f i n f l a m m a t o r y f a c t o r s i n t h e s y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y t h a t o c c u r s f o l l o w i n g c o e x p o s u r e t o s m a l l d o s e s o f M C T a n d L P S . S p e c i f i c a l l y , t h e h y p o t h e s i s t h a t K 0 5 a n d T N F - o r p l a y c a u s a l r o l e s i n t h e h e p a t o t o x i c i t y w a s t e s t e d . I n a d d i t i o n , t h e i m p o r t a n c e o f C O X - 2 p r o d u c t s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f i n j u r y w a s e v a l u a t e d . 5 . C . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 5 . C . 1 . M a t e r i a l s L P S ( E s c h e r i c h i a c o l i , s e r o t y p e 0 1 2 8 : 8 1 2 , 1 . 7 x 1 0 6 e n d o t o x i n u n i t s ( E U s ) / m g ) , p e n t o x i f y l l i n e , a n d s o d i u m c i t r a t e w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . S e r u m d i r e c t e d a g a i n s t T N F - o r ( a n t i - r a t T N F - a s e r u m ; A T S ) w a s p r o d u c e d i n N e w Z e a l a n d W h i t e r a b b i t s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . G d C l 3 - 6 H 2 0 w a s p u r c h a s e d f r o m A l d r i c h C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . T h e s e l e c t i v e C O X - 2 i n h i b i t o r N — ( 2 - c y c l o h e x y l o x y - 4 - n i t r o - p h e n y l ) m e t h a n e s u l f o n a m i d e ( N S - 3 9 8 ) w a s a c q u i r e d f r o m C a y m a n C h e m i c a l C o . ( A n n A r b o r , M I ) . 1 8 1 M C T w a s o b t a i n e d f r o m T r a n s W o r l d C h e m i c a l s ( R o c k v i l l e , M D ) . S t e r i l e s a l i n e w a s a c q u i r e d f r o m A b b o t t L a b o r a t o r i e s ( N o r t h C h i c a g o , I L ) . F o r m a l i n f i x a t i v e w a s o b t a i n e d f r o m S u r g i p a t h M e d i c a l I n d u s t r i e s , I n c . ( R i c h m o n d , I L ) . D i a g n o s t i c k i t s 5 8 U V a n d 5 9 U V f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A S T ) a n d a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A L T ) a c t i v i t i e s , r e s p e c t i v e l y , w e r e a l s o p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . E L I S A k i t f o r h y a l u r o n i c a c i d w a s a c q u i r e d f r o m C o r g e n i x , I n c . ( W e s t m i n s t e r , C O ) . E L I S A k i t f o r r a t T N F - o r w a s p u r c h a s e d f r o m B i o s o u r c e l n t e m a t i o n a l , I n c . ( C a m a r i l l o , C A ) . 5 . C . 2 . A n i m a l s M a l e , S p r a g u e - D a w l e y r a t s ( C r l : C D ( S D ) I G S B F I , C h a r l e s R i v e r , P o r t a g e , M I ) w e i g h i n g 2 0 0 - 3 0 0 g w e r e u s e d i n a l l s t u d i e s . O t h e r w i s e , f o r m o r e i n f o r m a t i o n o n t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h p d s . 5 . C . 3 . T r e a t m e n t P r o t o c o l F o r m o r e i n f o r m a t i o n o n t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 5 . C . 4 . T r e a t m e n t w i t h G a d o l i n i u m C h l o r i d e R a t s w e r e t r e a t e d w i t h 1 0 m g G d C l a - G H Z O / k g ( p H 3 . 5 ) o r s a l i n e v e h i c l e ( V e h ) i n t r a v e n o u s l y 2 4 h o u r s b e f o r e t h e a d m i n i s t r a t i o n o f L P S o r i t s v e h i c l e . T h i s t r e a t m e n t p r o t o c o l h a s b e e n s h o w n t o i n a c t i v a t e K C f u n c t i o n ( B r o w n e t a l . , 1 9 9 7 ) . 1 8 2 5 . C . 5 . T r e a t m e n t w i t h P e n t o x i f y l l i n e R a t s r e c e i v e d 1 0 0 m g P T X / k g o r i t s s a l i n e V e h i n t r a v e n o u s l y 1 h o u r b e f o r e L P S t r e a t m e n t . T h i s t r e a t m e n t r e g i m e n p r e v e n t s t h e L P S - i n d u c e d i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - a a c t i v i t y ( B a r t o n a t a l . , 2 0 0 1 ) . 5 . C . 6 . T r e a t m e n t w i t h A n t i - T N F - d S e r u m R a t s w e r e t r e a t e d i n t r a v e n o u s l y w i t h r a b b i t A T S ( 1 m l ) o r c o n t r o l r a b b i t s e r u m ( C S ; 1 m l ) 1 h o u r b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h i s t r e a t m e n t p r o t o c o l h a s b e e n s h o w n t o p r e v e n t L P S - i n d u c e d i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - a a c t i v i t y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ; B a r t o n e t a l . , 2 0 0 1 ) . 5 . 0 . 7 . T r e a t m e n t w i t h N S - 3 9 8 N S - 3 9 8 i s a s e l e c t i v e i n h i b i t o r o f C O X - 2 ( F u t a k i e t a l . , 1 9 9 4 , 1 9 9 7 ) . R a t s w e r e g i v e n 5 m g N S — 3 9 8 / k g o r o l i v e o i l i n t r a p e r i t o n e a l l y 1 h o u r b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n . 5 . C . 8 . A s s e s s m e n t o f L i v e r I n j u r y , P l a s m a T N F - a a n d P l a s m a H y a l u r o n i c A c i d . H P C i n j u r y w a s e s t i m a t e d b y i n c r e a s e s i n t h e a c t i v i t i e s o f p l a s m a A L T a n d A S T . A n E L I S A w a s u s e d t o m e a s u r e p l a s m a h y a l u r o n i c a c i d ( H A ) , a m a r k e r o f h e p a t i c S E C i n j u r y ( D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 b , 1 9 9 4 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . P l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d v i a a r a t T N F - a E L I S A k i t . 1 8 3 5 . C . 9 . H i s t o p a t h o l o g i c E v a l u a t i o n a n d M o r p h o m e t r y S e r i a l t r a n s v e r s e s e c t i o n s f r o m t h e l e f t l a t e r a l l i v e r l o b e w e r e p r o c e s s e d f o r l i g h t m i c r o s c o p y . P a r a f f i n - e m b e d d e d s e c t i o n s w e r e c u t a t 4 p m , s t a i n e d w i t h h e m a t o x y l i n a n d e o s i n , a n d e v a l u a t e d f o r l e s i o n s i z e a n d s e v e r i t y . T i s s u e s e c t i o n s w e r e a n a l y z e d h i s t o l o g i c a l l y w i t h o u t k n o w l e d g e o f t h e t r e a t m e n t g r o u p . D i g i t i z e d c o l o r i m a g e s o f h e m a t o x y l i n a n d e o s i n - s t a i n e d l i v e r s e c t i o n s w e r e v i s u a l i z e d w i t h a n O l y m p u s A X - 8 0 T l i g h t m i c r o s c o p e ( O l y m p u s C o r p . , L a k e S u c c e s s , N Y ) i n t e r f a c e d w i t h a h i g h - r e s o l u t i o n C C D c o l o r c a m e r a ( O L Y - 7 5 0 , O l y m p u s - A m e r i c a , l n c . , M e l v i l l e , N Y ) t o q u a n t i f y t r e a t m e n t - i n d u c e d c h a n g e s i n l i v e r m o r p h o l o g y . I m a g e s w e r e e v a l u a t e d w i t h S c i o n I m a g e s o f t w a r e ( S c i o n C o r p o r a t i o n , F r e d e r i c k , M D ) e m p l o y i n g a 6 4 - p o i n t l a t t i c e g r i d t o d e t e r m i n e ( 1 ) t h e t o t a l a r e a o f l i v e r a n a l y z e d , ( 2 ) t h e a r e a o f c e n t r i l o b u l a r l e s i o n , ( 3 ) t h e a r e a o f m i d z o n a l l e s i o n , ( 4 ) t h e a r e a o f n o r m a l p a r e n c h y m a , a n d ( 5 ) t h e a r e a o f n o n p a r e n c h y m a l s p a c e . A l e s i o n w a s d e f i n e d a s h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s w i t h e i t h e r s w o l l e n , e o s i n o p h i l i c c y t o p l a s m a n d k a r y o l y t i c o r p y k n o t i c n u c l e i ( i . e . , o n c o s i s ) , o r c e l l s w i t h s h r u n k e n c y t o p l a s m a n d k a r y o r r h e x i c n u c l e i o r a p o p t o t i c b o d i e s ( i . e . , a p o p t o s i s ; M a j n o a n d J o r i s , 1 9 9 5 ; L e v i n e t a l . , 1 9 9 9 ) . N o n p a r e n c h y m a l s p a c e w a s d e f i n e d a s n o n p a r e n c h y m a l t i s s u e , v e s s e l l u m e n , a n d r e g i o n s o u t s i d e t h e p e r i m e t e r o f t h e l i v e r s e c t i o n . T h e a r e a o f e a c h o b j e c t ( c a t e g o r y ) o f i n t e r e s t ( i . e . , l e s i o n ) w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e f o l l o w i n g e x p r e s s i o n ( C r u z - O r i v e , 1 9 8 2 ) : A r e a m r e s , = 2 P o i n t s m m s t X A r e a / P o i n t A r e a / P o i n t = ( D i s t a n c e B e t w e e n P o i n t s ) 2 1 8 4 D i s t a n c e b e t w e e n p o i n t s w a s 5 5 u m . A c c o r d i n g l y , t h e a r e a r e p r e s e n t e d b y e a c h p o i n t w a s 3 0 2 5 m g . O n e s e c t i o n f r o m t h e l i v e r o f e a c h a n i m a l i n a t r e a t m e n t g r o u p w a s s y s t e m a t i c a l l y s c a n n e d u s i n g a d j a c e n t , n o n - o v e r l a p p i n g m i c r o s c o p i c f i e l d s . T h e f i r s t i m a g e f i e l d a n a l y z e d i n e a c h s e c t i o n w a s c h o s e n u s i n g a r a n d o m n u m b e r t a b l e ( i . e . , a n y i m a g e f i e l d b e t w e e n 1 a n d 1 0 ) . T h e r e a f t e r , e v e r y 1 0 t h f i e l d c o n t a i n i n g h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l s w a s e v a l u a t e d ( m i n i m u m o f 2 0 f i e l d s m e a s u r e d / s e c t i o n ) . T h e m e a s u r e d f i e l d s r e p r e s e n t e d a p p r o x i m a t e l y 1 0 % o f t h e t o t a l a r e a o f e a c h l i v e r s e c t i o n . E i g h t a n i m a l s p e r g r o u p w e r e a n a l y z e d . P e r c e n t l e s i o n a r e a w a s e s t i m a t e d b a s e d o n t h e f o l l o w i n g f o r m u l a : [ A r e a L e s i o n o f I n t e r e s t / ( A r e a A l l L e s i o n s + A r e a P a r e n c h y m a ) ] X 1 0 0 - 5 . C . 1 0 . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n s : I : S . E . M . D a t a e x p r e s s e d a s p e r c e n t a g e s w e r e t r a n s f o r m e d b y a r c s i n e s q u a r e r o o t p r i o r t o a n a l y s i s . D a t a f o r s i n g l e c o m p a r i s o n s w e r e a n a l y z e d b y S t u d e n t ’ s t - t e s t o r , w h e n a p p r o p r i a t e , F i s h e r ' s e x a c t t e s t ( S t e e l e e t a l . , 1 9 9 7 ) . H o m o g e n e o u s d a t a w e r e a n a l y z e d b y o n e - w a y o r t w o - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) , a s a p p r o p r i a t e , a n d g r o u p m e a n s w e r e c o m p a r e d u s i n g S t u d e n t - N e w m a n - K e u l s p o s t h o c t e s t ( S t e e l e e t a l . , 1 9 9 7 ) . W h e n v a r i a n c e s w e r e n o t h o m o g e n e o u s , d a t a w e r e a n a l y z e d u s i n g t h e K r u s k a I - W a l l i s n o n p a r a m e t r i c A N O V A , a n d D u n n ’ s M u l t i p l e C o m p a r i s o n t e s t w a s u s e d t o c o m p a r e g r o u p m e a n s ( S t e e l e e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e c r i t e r i o n f o r s i g n i f i c a n c e w a s p s 0 . 0 5 f o r a l l c o m p a r i s o n s . 1 8 5 5 . D . R e s u l t s 5 . 0 . 1 . E f f e c t o f G d C I 3 o n M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r I n j u r y T o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t K C s a r e i m p o r t a n t f o r t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y i n t h e M C T / L P S m o d e l , r a t s w e r e p r e t r e a t e d w i t h t h e K C i n a c t i v a t o r G d C l a , a t a d o s e t h a t i n h i b i t s K C - m e d i a t e d p h a g o c y t o s i s ( B r o w n a t a l . , 1 9 9 7 ) . A s f u r t h e r v e r i f i c a t i o n o f G d C l a e f f i c a c y , p l a s m a T N F - o r c o n c e n t r a t i o n w a s m o n i t o r e d ( F i g u r e 5 . 1 A ) . P l a s m a T N F - o t c o n c e n t r a t i o n w a s e l e v a t e d i n t h e M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s , a n d t h i s i n c r e a s e w a s r e d u c e d w i t h G d C l a p r e t r e a t m e n t . P l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n w a s n o t e l e v a t e d i n a n i m a l s r e c e i v i n g e i t h e r v e h i c l e s o r G d C l a a l o n e . P l a s m a A L T a c t i v i t y w a s e l e v a t e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 5 . 1 8 ) . G d C l a p r e t r e a t m e n t m a r k e d l y a t t e n u a t e d t h i s i n c r e a s e . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b s e r v e d w i t h p l a s m a A S T a c t i v i t y ( F i g u r e 5 . 1 C ) . P l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s a l s o e l e v a t e d i n a n i m a l s t h a t r e c e i v e d M C T / L P S c o t r e a t m e n t . T h i s i n c r e a s e w a s a t t e n u a t e d s l i g h t l y b u t s i g n i f i c a n t l y i n G d C l a - p r e t r e a t e d r a t s ( F i g u r e 5 . 1 0 ) . N o e l e v a t e d p l a s m a A L T o r A S T a c t i v i t y o r p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s o b s e r v e d i n c o n t r o l a n i m a l s t h a t r e c e i v e d v e h i c l e s o r G d C l a a l o n e . M C T / L P S - c o t r e a t e d c o n t r o l a n i m a l s e x h i b i t e d c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l l i v e r l e s i o n s a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d b y Y e e e t a l . ( 2 0 0 0 b ) . C e n t r i l o b u l a r l e s i o n s c o n s i s t e d o f m o d e r a t e t o m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r a p o p t o t i c a n d o n c o t i c n e c r o s i s , d e g e n e r a t i o n , h e m o r r h a g e a n d v a s c u l a r i n j u r y . M i d z o n a l l e s i o n s i n t h e M C T / L P S - c o t r e a t e d g r o u p c o m p r i s e d m a r k e d b u t m o r e f r e q u e n t a n d w e l l - d e f i n e d 1 8 6 F i g u r e 5 . 1 . G d C I g P r o t e c t s A g a i n s t M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r I n j u r y . L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) o r s a l i n e v e h i c l e ( V e h ) w a s a d m i n i s t e r e d i . v . t o r a t s 4 h o u r s a f t e r i . p . a d m i n i s t r a t i o n o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) o r s a l i n e v e h i c l e . R a t s w e r e p r e t r e a t e d w i t h 1 0 m g G d C l 3 - 6 H 2 0 / k g o r s a l i n e v e h i c l e , i . v . , 2 4 h o u r s b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n . T N F - o c c o n c e n t r a t i o n ( A ) , A L T ( B ) a n d A S T ( C ) a c t i v i t i e s , a n d H A c o n c e n t r a t i o n ( D ) w e r e e v a l u a t e d i n p l a s m a 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . N = 4 f o r V e h N e h N e h , 4 f o r G d C l a N e h N e h , 1 4 f o r V e h / M C T / L P S , 1 3 f o r G d C l 3 / M C T / L P S . 8 ‘ S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m V e h / M C T / L P S g r o u p . 1 8 7 > W ) L ) I l U m / a g p - ( F N n o 8 I i a t m a 8 s r t a n 8 l e P c n o C 8 0 O ) L u I U ( y g t A i n v ( i a t . A H n § c o 5 . L I A T S A a m s a l P a i A m t s a § a r l t P n e A c § n o C ° ( y t i v i t c A T L A ¢ : . O : . O : . O : 0 0 o . 0 0 o . 0 0 o . 9 0 0 o . 0 0 o . 0 0 o . 0 a 0 m s a l P ) l m § l g o . 0 0 o . . 0 : 0 0 o . 0 0 o . 0 0 . A . 0 . A . . 0 . . A 0 . . . 0 A . . . 0 A . . 0 . A . . 0 . A . . 0 . A . . 0 . A 0 . . . . ‘ . 0 h . . 0 . ‘ . 0 . 3 ‘ . . . . . 0 . . . 0 ‘ . . 0 l . . l . . 0 . . O . ‘ . A . . . . O . . O . a ‘ 1 8 8 V e h N e h M C T / L P S V e h / V e h M C T / L P S A a n V O I ‘ I . — G d C I , - — ‘ “ V 0 ? ! — G d C l , U L d m V O I I 5 ? I g V e h / V e h M C T / L P S A d o 8 A A L A I A a n V a h — G d C I , V e h / V e h M C T / L P S a r e a s o f h e p a t o c e l l u l a r c o a g u l a t i v e n e c r o s i s a c c o m p a n i e d b y n e u t r o p h i l i n f i l t r a t i o n w i t h c o n g e s t i o n a n d h e m o r r h a g e . L i v e r l e s i o n s f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h G d C l 3 / M C T / L P S e x h i b i t e d q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l l e s i o n s ; h o w e v e r , t h e s e l e s i o n s w e r e b o t h s m a l l e r i n s i z e a n d l e s s f r e q u e n t . T h e G d C l g - i n d u c e d r e d u c t i o n i n l e s i o n s i z e a n d f r e q u e n c y w a s m o r e p r o n o u n c e d i n t h e m i d z o n a l r e g i o n s . M o r p h o m e t r i c a n a l y s i s o f l i v e r l e s i o n s s u p p o r t e d t h e o b s e r v a t i o n t h a t G d C I 3 p r e t r e a t m e n t r e d u c e d t h e l i v e r a r e a a f f e c t e d b y c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l l e s i o n s ( T a b l e 5 . 1 ) . F u r t h e r m o r e , t h e n u m b e r o f h e p a t i c P M N s w a s s m a l l e r i n M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s t h a t r e c e i v e d G d C I a p r e t r e a t m e n t c o m p a r e d t o M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s t h a t d i d n o t . H i s t o l o g i c a l l y , n o e v i d e n c e o f l i v e r i n j u r y w a s o b s e r v e d i n a n i m a l s t r e a t e d w i t h v e h i c l e s o r G d C I a a l o n e . 5 . 0 . 2 . P l a s m a T N F - a C o n c e n t r a t i o n P l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n w a s a s s e s s e d a t v a r i o u s t i m e s a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f M C T o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( T a b l e 5 . 2 ) . I t d i d n o t i n c r e a s e a f t e r V e h N e h o r M C T N e h c o t r e a t m e n t s a t a n y o f t h e t i m e s e v a l u a t e d b u t w a s e l e v a t e d 2 h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n i r r e s p e c t i v e o f M C T - t r e a t m e n t . W h e r e a s p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n i n V e h / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s r e t u r n e d t o b a s e l i n e w i t h i n t h e n e x t 8 h o u r s , p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s r e m a i n e d m o d e s t l y b u t s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d 1 4 h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . 1 8 9 T a b l e 5 . 1 . M o m h o m e t r i c A n a l y s i s o f L i v e r l : e s i o n s f r o m M C T / L P S - C o t r e j t e d R a t s F o l l o w i n g A d m i n i s t r a t i o n o f G d C l g , P T X , o r A T S . 7 . 4 x 1 0 6 E U L P S / k g o r i t s s a l i n e v e h i c l e ( V e h ) w a s a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s a f t e r 1 0 0 m g M C T / k g o r s a l i n e v e h i c l e . I n a d d i t i o n , r a t s w e r e t r e a t e d w i t h G d C l a , P T X , A T S o r t h e i r v e h i c l e s a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 5 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . A l l l i v e r s w e r e r e m o v e d f r o m r a t s 1 8 h o u r s a f t e r M C T t r e a t m e n t , f i x e d i n f o r m a l i n a n d p r o c e s s e d f o r l i g h t m i c r o s c o p y . M o r p h o m e t r i c a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 5 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . N = 9 f o r V e h / M C T / L P S , 1 3 f o r G d C l a l M C T / L P S , 8 f o r M C T N e h / L P S , 8 f o r M C T / P T X / L P S , 6 f o r M C T / C S / L P S , a n d 5 f o r M C T / A T S / L P S . 8 ‘ S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f p h a r m a c o l o g i c a l t r e a t m e n t ( i . e . , G d C I 3 , P T X o r A T S ) . 1 9 0 T r e a t m e n t P e r c e n t L e s i o n A r e a C e n t r i l o b u l a r M i d z o n a l G d C l a S t u d y V e h / M C T / L P S 3 . 7 i 0 . 8 9 . 3 i 1 . 8 G d C l 3 / M C T / L P S 1 . 2 i 0 . 2 " ” 1 1 . 4 i 0 . 3 a P T X S t u d y M C T N e h / L P S 2 . 4 i 0 . 6 1 0 . 3 i 1 . 3 M C T / P T X / L P S 0 . 8 i 0 . 2 3 1 . 1 i 0 . 4 a A T S S t u d y M C T / C S / L P S 3 . 3 i 0 . 8 1 2 . 0 i : 1 . 6 M C T / A T S / L P S 0 . 6 i 0 . 2 a 1 . 5 : 0 . 4 ‘ i l 1 9 1 T a b l e 5 . 2 . M T N F - a C o n c e n t r a t i o n a f t e r M C T / L P S A d m i n i s t r a t i o n i n S a r a g u e - D a w l e y R a t s . L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) o r s a l i n e v e h i c l e ( V e h ) , i . v . , w a s a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s a f t e r M C T ( 1 0 0 m g fl < g ) o r s a l i n e v e h i c l e , i . p . R a t s w e r e k i l l e d a t t h e t i m e s i n d i c a t e d a f t e r M C T o r M C T v e h i c l e a d m i n i s t r a t i o n . P l a s m a T N F - o r c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d b y E L I S A . A t 6 a n d 1 2 h o u r s N = 4 f o r V e h N e h , V e h / L P S a n d M C T N e h , a n d 6 f o r M C T / L P S . A t 1 8 h o u r s N = 4 f o r V e h N e h , 6 f o r V e h / L P S a n d M C T N e h , a n d 1 2 f o r M C T / L P S . 8 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e s i n t h e a b s e n c e o f L P S . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l l o t h e r g r o u p s a t t h e i n d i c a t e d t i m e . 1 9 2 H o u r s A f t e r M C T o r P l a s m a T N F - a i t s V e h i c l e C o n c e n t r a t i o n ( p g / m l ) 6 H o u r s V e h N e h 1 3 i 9 V e h / L P S 1 5 7 8 i 1 4 1 a M C T N e h 3 2 i 1 5 M C T / L P S 1 3 0 1 i 1 6 2 3 1 2 H o u r s V e h N e h 2 0 i 9 V e h / L P S 2 3 i 5 M C T N e h 1 7 i 2 M C T / L P S 1 7 0 i 3 7 b 1 8 H o u r s V e h N e h 9 . + . 3 V e h / L P S 4 i 0 . 3 M C T N e h 1 6 i 5 M C T / L P S 8 7 j ; 2 1 b 1 9 3 5 . 0 . 3 . E f f e c t o f P T X o n H e p a t o t o x i c i t y f r o m M C T / L P S C o t r e a t m e n t P T X d e c r e a s e s t h e s y n t h e s i s o f T N F - o a t t h e m R N A l e v e l ( D e z u b e e t a l . , 1 9 9 3 ) a n d w a s u s e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r T N F - a h a s a c a u s a l r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y . C o n t r o l a n i m a l s t r e a t e d w i t h v e h i c l e s o r P T X a l o n e d i d n o t h a v e d e t e c t a b l e p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n s a t 1 8 h o u r s ( F i g u r e 5 . 2 A ) . T h e r i s e i n p l a s m a T N F - c x c o n c e n t r a t i o n i n M C T / L P S - t r e a t e d c o n t r o l a n i m a l s w a s m a r k e d l y a t t e n u a t e d b y P T X t r e a t m e n t . A s d e t e r m i n e d b y p l a s m a A L T ( F i g u r e 5 . 2 3 ) a n d A S T ( F i g u r e 5 . 2 0 ) a c t i v i t i e s , H P C i n j u r y w a s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d i n a n i m a l s t h a t r e c e i v e d P T X . P l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n , h o w e v e r , w a s n o t s i g n i f i c a n t l y a f f e c t e d b y P T X i n M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 5 . 2 0 ) . N o e l e v a t e d p l a s m a A L T o r A S T a c t i v i t y o r p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s o b s e r v e d i n c o n t r o l a n i m a l s t h a t r e c e i v e d v e h i c l e s o r P T X a l o n e . H i s t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n o f t h e l i v e r s f r o m a n i m a l s t h a t r e c e i v e d t h e M C T / P T X / L P S t r e a t m e n t r e v e a l e d l e s i o n s q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r t o t h o s e o b s e r v e d i n a n i m a l s t h a t r e c e i v e d M C T / L P S a l o n e , b u t t h e y w e r e s m a l l e r i n s i z e a n d l e s s f r e q u e n t . M i d z o n a l l e s i o n s e x h i b i t e d t h e g r e a t e s t r e d u c t i o n i n s i z e a n d f r e q u e n c y a n d d e m o n s t r a t e d l e s s c o n g e s t i o n a n d h e m o r r h a g e . T h e s e o b s e r v a t i o n s w e r e c o n s i s t e n t w i t h t h e m o p h o m e t r i c a n a l y s i s o f l e s i o n s i n t h i s s t u d y ( T a b l e 5 . 1 ) . H e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n w a s a l s o r e d u c e d b y P T X t r e a t m e n t . N o l e s i o n s w e r e o b s e r v e d i n l i v e r s f r o m a n i m a l s t h a t w e r e g i v e n v e h i c l e s o r P T X a l o n e . 1 9 4 F i g u r e 5 . 2 . E f f e c t o f P T X o n M C T / L P S - l n d u c e d L i v e r I n i u r v . L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d i . v . t o r a t s 4 h o u r s a f t e r i . p . a d m i n i s t r a t i o n o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) o r i t s v e h i c l e . P T X ( 1 0 0 m g / k g ) o r s a l i n e v e h i c l e w a s g i v e n i . v . t o r a t s 1 h o u r b e f o r e L P S . P l a s m a T N F - o r c o n c e n t r a t i o n ( A ) , A L T ( B ) a n d A S T ( C ) a c t i v i t i e s , a n d H A c o n c e n t r a t i o n ( 0 ) w e r e e v a l u a t e d 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . N = 4 f o r V e h N e h N e h , 4 f o r V e h / P T X N e h , 1 3 f o r M C T N e h / L P S , a n d 8 f o r M C T / P T X / L P S . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m M C T N e h / L P S g r o u p . 1 9 5 : : 3 1 m 2 5 3 . B u . n . — 2 . . 5 . : C a 2 c 2 a o . : 1 0 m w h n x a ” . o n . e . “ o . n e . e ' s o . o u . 3 . 2 . 8 w 2 6 m h i . w O . o O O . o O o . o . o . o O o ‘ o O o . e O o ' o 0 o . o O O . o c O — e . u n 8 — 5 0 c : 3 v 2 . 3 . 3 5 < 2 : 8 . . . . u . e o O . o n ’ o . n o ' o O l O . w o e w . e o “ 3 o . “ . o . n o s n . o . n . e o “ H . m . o . n 9 o . n o 9 u . o 0 u . e 3 u . o u . o . u . e 0 n 3 o n 3 s 3 n 3 . 2 w 2 5 2 . . o D : 5 9 : . ‘ 0 O 0 ‘ 0 . 4 . . . O . o C w . e . s . . 0 . . . . O . . O s 0 9 z H . O O 0 O H < . 1 5 0 : : 8 O “ O O N O O H O O H O O ” O O H 3 O O 6 2 ? — 8 : 0 0 H O O H O O H s O N O O O N O H O O H O O O H O O H O O H O H H , A m _ a m a s s . . . a n V fl h M C T / L P S V e h / V e h V e h N e h M C T / L P S a l l : V e h m _ T m d m V O N , m , — P r x ‘ 2 1 1 m M C T / L P S V e h N e h M C T / L P S V e h N e h 1 9 6 5 . 0 . 4 . E f f e c t o f A n t i - T N F - a S e r u m o n L i v e r I n j u r y f r o m M C T / L P S C o t r e a t m e n t . M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s w e r e g i v e n A T S b e f o r e L P S t r e a t m e n t t o c o n f i r m t h e c a u s a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n T N F - a a n d M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . A T S g i v e n t o M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s p r e v e n t e d t h e i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n a t 1 8 h o u r s ( F i g u r e 5 . 3 A ) . A T S t r e a t m e n t b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n m a r k e d l y a t t e n u a t e d l i v e r i n j u r y i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . P l a s m a A L T ( F i g u r e 5 . 3 8 ) a n d A S T ( F i g u r e 5 . 3 C ) a c t i v i t i e s w e r e s i g n i f i c a n t l y l e s s i n M C T / A T S / L P S - t r e a t e d a n i m a l s c o m p a r e d t o c o n t r o l s t h a t r e c e i v e d M C T / C S / L P S . A T S t r e a t m e n t c a u s e d a s m a l l b u t s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n i n M C T / L P S - t r e a t e d r a t s ( F i g u r e 5 . 3 0 ) . N o e l e v a t i o n i n p l a s m a A L T o r A S T a c t i v i t y o r p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s o b s e r v e d i n c o n t r o l a n i m a l s t h a t r e c e i v e d v e h i c l e s o r A T S a l o n e . A n i m a l s t r e a t e d w i t h M C T / A T S / L P S h a d l i v e r l e s i o n s q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r t o t h o s e i n r a t s g i v e n M C T / C S / L P S , a l t h o u g h t h e l e s i o n s w e r e r e d u c e d i n s i z e a n d f r e q u e n c y . M i d z o n a l l i v e r l e s i o n s f r o m M C T / A T S / L P S - t r e a t e d a n i m a l s e x h i b i t e d l e s s c o n g e s t i o n a n d h e m o r r h a g e t h a n l i v e r s f r o m M C T / C S / L P S a n i m a l s . M o r p h o m e t r i c a n a l y s i s o f l i v e r l e s i o n s s u p p o r t s t h e o b s e r v a t i o n t h a t A T S t r e a t m e n t l e s s e n e d t h e c e n t r i l o b u l a r , M C T - l i k e a n d m i d z o n a l , L P S - l i k e l e s i o n s ( T a b l e 5 . 1 ) . F u r t h e r m o r e , h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n w a s r e d u c e d i n M C T / A T S / L P S - t r e a t e d a n i m a l s c o m p a r e d t o a n i m a l s g i v e n M C T / C S / L P S . N o 1 9 7 F i g u r e 5 . 3 . A n t i - T N F - o i S e r u m P r o t e c t s A g a i n s t H e p a t i c l n i g r v f r o m M _ C _ fl . P S - @ t r e a _ t a n e n t . L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) o r s a l i n e v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d i v t o r a t s 4 h o u r s a f t e r i . p . a d m i n i s t r a t i o n o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) o r s a l i n e v e h i c l e . A 1 m l d o s e o f e i t h e r A T S o r C S w a s a d m i n i s t e r e d i . v . 1 h o u r b e f o r e L P S . P l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n ( A ) , A L T ( B ) a n d A S T ( C ) a c t i v i t i e s , a n d H A c o n c e n t r a t i o n ( 0 ) w e r e e v a l u a t e d 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . N = 4 f o r V e h / C S N e h , 4 f o r V e h / A T S N e h , 8 f o r M C T / C S / L P S , a n d 5 f o r M C T / A T S / L P S . 3 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m M C T N e h / L P S g r o u p . 1 9 8 I 8 ) l m l g a p - ( e F n ' ‘ o o 0 _ ' o ) L I U ( y t i v A : E i N o t o o _ ' o o T e _ i s a t m a s r t a a n l e P c e n o ' o o o . ' o o o _ ' o o e . ' o o o , ' o o o _ ' o o o _ ' o e o , ' o o o _ ' o o o , ' o o ' o o o ' o . 4 c o ’ o A o ' o A o " A ’ e o ’ o A o " o ‘ A e ' o A " o A o o . A . o ' 0 A c A 5 A £ T L 5 L £ A . e a m ; A a s a 0 A . e ‘ 9 A . o 0 A ‘ 0 o ‘ 9 A 9 e ' 9 . e . 0 ‘ . C o 9 o o _ ‘ ’ 0 l 0 5 c P 3 G O ) E L ; I U ( y t i g i v i . i I i i t c A . i u i T S A a 5 A : m i A i s a l P , C d ) l g m l g n A ( g H n o a i s m t s a a r l t g P n e c g n o C . - 0 0 0 0 0 0 9 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 0 0 . 0 0 0 . 0 . 0 0 0 0 . . 0 0 0 . . 9 0 . . 0 0 , 1 9 9 V e h N e h M C T / L P S V e h N e h M C T / L P S A A I 8 . — A T s - A T S I a U V e h / V e h M C T / L P S V e h / V e h M C T / L P S d ! a " - l 1 o o o i — A 1 ’ s O m > i n j u r y w a s o b s e r v e d h i s t o l o g i c a l l y i n t h e l i v e r s o f a n i m a l s t h a t r e c e i v e d t r e a t m e n t w i t h v e h i c l e s o r A T S a l o n e . 5 . 0 . 5 . E f f e c t o f N S - 3 9 8 o n M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r I n j u r y A m o n g t h e v a r i o u s m e d i a t o r s r e l e a s e d b y L P S - a c t i v a t e d K C s a r e m e t a b o l i t e s o f a r a c h a d o n i c a c i d , i n c l u d i n g P G E 2 a n d P 6 0 2 . ( D e c k e r , 1 9 9 0 ; G a n e y a t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e s e P G s a r e p r o d u c e d v i a t h e i n f l a m m a t i o n - i n d u c i b l e C O X - 2 e n z y m e a n d h a v e a v a r i e t y o f e f f e c t s o n o t h e r i n f l a m m a t o r y c e l l s a n d o n H P C s t h a t c a n c o n t r i b u t e t o p a t h o p h y s i o l o g i c a l a l t e r a t i o n s i n t i s s u e s ( C a s t e l e i j n , e t a l . , 1 9 8 8 c ; D e c k e r , 1 9 9 0 ; G a n e y e t a l . , 2 0 0 1 ) . N S - 3 9 8 , a s e l e c t i v e C O X - 2 i n h i b i t o r , w a s a d m i n i s t e r e d 1 h o u r b e f o r e L P S a t a d o s e t h a t r e d u c e s P G p r o d u c t i o n i n v i v o ( G a n e y e t a l . , 2 0 0 1 ) . N S - 3 9 8 d i d n o t a t t e n u a t e p l a s m a A L T ( F i g u r e 5 . 4 A ) o r A S T ( F i g u r e 5 . 4 3 ) a c t i v i t y i n M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s . P l a s m a A L T o r A S T a c t i v i t y w a s u n a f f e c t e d i n a n i m a l s r e c e i v i n g t r e a t m e n t w i t h N S - 3 9 8 a l o n e . H i s t o l o g i c a l l y , l i v e r l e s i o n s a p p e a r e d t h e s a m e i n t h e M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s g i v e n N S - 3 9 8 o r i t s v e h i c l e . N o l i v e r l e s i o n s w e r e o b s e r v e d i n c o n t r o l a n i m a l s t h a t r e c e i v e d v e h i c l e s o r N S - 3 9 8 a l o n e . 5 3 . 6 . M o r t a l i t y M o r t a l i t y r a n g e d f r o m 1 9 t o 2 7 % i n M C T / L P S - c o t r e a t e d c o n t r o l a n i m a l s a n d f r o m 0 t o 3 3 % i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s t h a t r e c e i v e d a d m i n i s t r a t i o n o f P h a r m a c o l o g i c a g e n t ( i . e . , G d C l a , P T X , A T S o r N S - 3 9 8 . ) N o n e o f t h e 2 0 0 F i g u r e 5 . 4 . m m e s N o t P r o t e c t A g a i n s t M C T / L P S - l n d u c e d L i v e r 1 . 0 . 1 9 3 6 L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) o r i t s s a l i n e v e h i c l e w a s a d m i n i s t e r e d i . v . t o r a t s 4 h o u r s a f t e r i . p . a d m i n i s t r a t i o n o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) o r i t s v e h i c l e . R a t s w e r e g i v e n 5 m g N S - 3 9 8 / k g o r o l i v e o i l v e h i c l e i . p . 1 h o u r b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n . P l a s m a A L T ( A ) a n d A S T ( B ) a c t i v i t i e s w e r e e v a l u a t e d 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . N = 3 f o r V e h N e h N e h , 3 f o r V e h / N S - 3 9 8 N e h , 7 f o r M C T N e h / L P S , a n d 4 f o r M C T / N S - 3 9 8 / L P S . 8 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . 2 0 1 > ) L I U ( y t i v ‘ i 2 ' O t c A T L A a m s a l P m ) L I U ( y t i v i t c A T S A a m s a l P . 5 0 ’ O O s z z a ‘ V e h a 1 4 0 ° ' — N S - 3 9 8 2 0 0 ' O V e h N e h M C T / L P S 5 0 0 0 m a V e h a 4 0 0 0 q — N S - 3 9 8 3 0 0 0 - 2 0 0 0 ' 1 0 0 0 1 V e h N e h M C T / L P S 2 0 2 p h a r m a c o l o g i c a g e n t s s i g n i f i c a n t l y a f f e c t e d s u r v i v a l i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . N o a n i m a l s d i e d t h a t r e c e i v e d v e h i c l e s o r a n y p h a r r n a c o l o g i c a g e n t a l o n e . 5 . E . D i s c u s s i o n I n a s m u c h a s K C s h a v e p r o v e n t o b e c r i t i c a l i n t h e p a t h o g e n e s i s o f s o m e i n f l a m m a t o r y t i s s u e i n j u r i e s ( A d a c h i e f a l . , 1 9 9 4 ; S t a c h l e w i t z e t a l . , 1 9 9 9 ) , t h e h y p o t h e s i s t h a t K C s " a r e c a u s a l l y i m p o r t a n t i n t h e s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y f r o m M C T / L P S c o t r e a t m e n t w a s t e s t e d . I n h i b i t i o n o f K C f u n c t i o n b y G d C l 3 i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s r e s u l t e d i n p r o n o u n c e d a t t e n u a t i o n o f H P C i n j u r y ( F i g u r e s 5 1 8 a n d 5 . 1 0 ) , s u g g e s t i n g t h a t K C s a r e c a u s a l l y i n v o l v e d i n t h e p a t h o g e n e s i s . T h e d o s e o f G d C I 3 u s e d i n t h i s s t u d y w a s e f f e c t i v e i n i n a c t i v a t i n g K C s ( B r o w n e t a l . , 1 9 9 7 ) a n d i n h i b i t i n g t h e i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - a C o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 5 . 1 A ) . I n t h i s m o d e l o f l i v e r i n j u r y , p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n i s e l e v a t e d b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y , r a i s i n g t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h i s c y t o k i n e m i g h t h a v e a c a u s a l r o l e i n i n j u r y d e v e l o p m e n t ( T a b l e 5 . 2 ) . E i t h e r i n h i b i t i o n o f T N F - a S Y I ' I t h e s i s b y P T X ( F i g u r e s 5 . 2 8 a n d 5 . 2 0 ) o r n e u t r a l i z a t i o n o f T N F - d a c t i v i t y b y A T S ( F i g u r e s 5 . 3 B a n d 5 . 3 0 ) r e s u l t e d i n t h e a t t e n u a t i o n o f H P C i n j u r y . B o t h P T X a n d A T S d e c r e a s e d p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n i n M C T / L P S c o t r e a t e d a n i m a l s , C o n f i r m i n g t h a t t h e a g e n t s w e r e e f f e c t i v e i n r e d u c i n g T N F - a ( F i g u r e s 5 . 2 A a n d 2 0 3 5 . 3 A ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t T N F - a i s c a u s a l l y i n v o l v e d i n t h e h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . I n r a t s t r e a t e d w i t h a s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e o f L P S 4 h o u r s a f t e r a s m a l l , n o n t o x i c d o s e o f M C T , m o r p h o l o g i c e v i d e n c e o f l i v e r l e s i o n s d e v e l o p w i t h i n 1 2 - 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n , c o n s i s t e n t w i t h e l e v a t e d p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s ( Y e e a t a l . , 2 0 0 0 b ) . B o t h c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l l i v e r l e s i o n s r e s u l t a n d a r e q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r t o l e s i o n s t h a t c h a r a c t e r i z e l a r g e r , t o x i c d o s e s o f M C T a n d L P S , r e s p e c t i v e l y . C e n t r i l o b u l a r l i v e r l e s i o n s c o m p r i s e m o d e r a t e t o m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r a p o p t o t i c a n d o n c o t i c n e c r o s i s , d e g e n e r a t i o n , c o n g e s t i o n , h e m o r r h a g e a n d v a s c u l a r i n j u r y . M i d z o n a l l e s i o n s c o n s i s t o f f r e q u e n t , w e l l - d e f i n e d a r e a s o f m a r k e d ' h e p a t o c e l l u l a r c o a g u l a t i v e n e c r o s i s , a c c o m p a n i e d b y n e u t r o p h i l i n f i l t r a t i o n , c o n g e s t i o n a n d h e m o r r h a g e ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ) . S E C i n j u r y i s a p p a r e n t i n b o t h l e s i o n s ( Y e e e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h e o b s e r v a t i o n t h a t b o t h M C T - l i k e a n d L P S - l i k e l e s i o n s d e v e l o p s u g g e s t s t h a t e a c h a g e n t e n h a n c e s t h e e f f e c t o f t h e o t h e r i n t h i s m o d e l ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ) . A d m i n i s t r a t i o n o f G d C l a , P T X o r A T S t o M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s r e d u c e d t h e s i z e a n d f r e q u e n c y o f l i v e r l e s i o n s . M o r p h o m e t r i c a n a l y s i s o f t h e s e l e s i o n s d e m o n s t r a t e d t h a t K u p f f e r c e l l i n a c t i v a t i o n o r T N F - a d e p l e t i o n i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d t h e a r e a o f t h e c e n t r i l o b u l a r , M C T - l i k e a n d m i d z o n a l , L P S - l i k e l e s i o n s ( T a b l e 5 . 1 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t p h a r r n a c o l o g i c m a n i p u l a t i o n a m e l i o r a t e d t h e i n t e r a c t i v e e f f e c t o f t h e s e a g e n t s . I n t h i s m o d e l o f s y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y , L P S c a u s e d a n e x p e c t e d , e a r l y r i s e i n p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n . A s s e e n p r e v i o u s l y ( B a r t o n e t a l . , 2 0 0 1 ) , t h i s 2 0 4 i n c r e a s e w a s t r a n s i e n t i n r a t s t r e a t e d w i t h L P S a l o n e . U n e x p e c t e d l y , h o w e v e r , p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n r e m a i n e d s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d f o r a t l e a s t 1 2 h o u r s i n r a t s t r e a t e d w i t h M C T / L P S ( T a b l e 5 . 2 ) . T h i s p r o l o n g e d e l e v a t i o n c o n t r a s t s w i t h a n o t h e r m o d e l o f L P S p o t e n t i a t i o n o f h e p a t o t o x i c i t y i n w h i c h t h e L P S - i n d u c e d i n c r e a s e w a s n o t p r o l o n g e d b y a f l a t o x i n B 1 c o t r e a t m e n t ( B a r t o n e t a l . , 2 0 0 1 ) . E v e n a t a l a r g e r , h e p a t o t o x i c d o s e o f L P S , t h e e l e v a t i o n i n p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n r e m a i n s t r a n s i e n t ( I i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ; P e a r s o n , a t a l . , 1 9 9 6 a ) . I t i s n o t e w o r t h y t h a t M C T g i v e n b y i t s e l f t o r a t s , e i t h e r a t t h e n o n t o x i c d o s e u s e d i n t h i s s t u d y ( T a b l e 5 . 2 ) o r a t a l a r g e r , h e p a t o t o x i c d o s e ( 3 0 0 m g / k g ; u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n ) , d o e s n o t i n c r e a s e p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n . T h u s , t h e i n t e r a c t i o n o f t h e s e t w o a g e n t s i s r e q u i r e d f o r t h i s p r o l o n g e d e f f e c t i n M C T / L P S t r e a t e d r a t s . U n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s , a p p r o x i m a t e l y 9 0 % o f H A c i r c u l a t i n g i n t h e b l o o d i s r e m o v e d a n d d e g r a d e d b y S E C s i n t h e l i v e r ( K o b a y a s h i e t a l . , 1 9 9 9 ) . S E C i n j u r y i m p a i r s t h e a b i l i t y o f t h e s e c e l l s t o c l e a r H A f r o m t h e c i r c u l a t i o n , a n d t h i s r e s u l t s i n i n c r e a s e d p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n . S u c h i n c r e a s e s h a v e b e e n u s e d a s a b i o m a r k e r o f S E C i n j u r y i n v i v o a f t e r e x p o s u r e o f a n i m a l s t o t o x i c a n t s . A n i n c r e a s e i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n c o r r e l a t e s w i t h h i s t o p a t h o l o g i c e v i d e n c e o f S E C i n j u r y a n d d e s t r u c t i o n i n r a t s g i v e n a n h e p a t o t o x i c d o s e o f e i t h e r M C T ( C o p p l e a t a l . , 2 0 0 2 a ) o r L P S ( D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 4 ; S p a p e n a t a l . , 1 9 9 9 ) . S i m i l a r l y , M C T / L P S - c o e x p o s u r e r e s u l t s i n i n c r e a s e d p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n i n r a t s , a n d t h i s c o r r e l a t e s w i t h S E C i n j u r y ( Y e e a t a l . , 2 0 0 2 ) . T h e e l e v a t i o n i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s s l i g h t l y b u t s i g n i f i c a n t l y s m a l l e r a f t e r 2 0 5 c o a d m i n i s t r a t i o n o f G d C l a o r A T S t o M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e s 5 . 1 0 a n d 5 . 3 0 ) . A d m i n i s t r a t i o n o f P T X t o M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s r e s u l t e d i n a t r e n d t o w a r d a d e c r e a s e t h a t w a s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t ( F i g u r e 5 . 2 0 ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t K C i n a c t i v a t i o n o r T N F - a n e u t r a l i z a t i o n i n M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s s i g n i f i c a n t l y b u t i n c o m p l e t e l y a t t e n u a t e d S E C i n j u r y . T h e a t t e n u a t i o n o f H P C a n d S E C i n j u r y i n t h i s m o d e l w a s l i k e l y n o t t h e r e s u l t o f G d C l 3 , P T X o r A T S a d m i n i s t r a t i o n i n t e r f e r i n g w i t h M C T b i o a c t i v a t i o n . I n a n i m a l s g i v e n a l a r g e , h e p a t o t o x i c d o s e o f M C T ( 3 0 0 m g / k g ) n e i t h e r G d C I a n o r P T X p r e t r e a t m e n t o f r a t s a l t e r e d l i v e r i n j u r y ( u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e s e a g e n t s d o n o t i n t e r f e r e w i t h M C T b i o a c t i v a t i o n . B a d g e r a t a l . ( 1 9 9 7 ) d e m o n s t r a t e d t h a t G d C l 3 p r e t r e a t m e n t o f r a t s c a u s e d a m o d e s t d e c r e a s e i n h e p a t i c c y t o c h r o m e P 4 5 0 ( C Y P ) ; h o w e v e r , t h i s r e d u c t i o n c o u l d b e e x p l a i n e d b y a d e c r e a s e i n t h e C Y P 2 E 1 i s o f o r r n ( B a d g e r a t a l . , 1 9 9 7 ) , a n d s i n c e M C T i s b i o a c t i v a t e d b y a d i f f e r e n t i s o f o r r n ( i . e . , C Y P 3 A f a m i l y ) ( K a s a h a r a e f a l . , 1 9 9 7 ) , i t i s u n l i k e l y t h a t G d C l a r e d u c e d i n j u r y i n t h i s m o d e l b y d e c r e a s i n g C Y P c o n c e n t r a t i o n . I n t h e p r e s e n t s t u d y , P T X a n d A T S w e r e g i v e n t o M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s a t a t i m e w h e n m o s t o f t h e a d m i n i s t e r e d M C T h a s b e e n m e t a b o l i z e d ( A l l e n e t a l . , 1 9 7 2 ) . N e i t h e r G d C l a ( M i m u r a e t a l . , 1 9 9 5 ; V o l l m a r a t a l . , 1 9 9 6 b ) n o r P T X ( H e l l e r e t a l . , 1 9 9 9 ) i n t e r f e r e s w i t h L P S c l e a r a n c e . A c c o r d i n g l y , i t i s u n l i k e l y t h a t t h e p h a r m a c o l o g i c a l a g e n t s u s e d i n t h i s s t u d y r e d u c e d i n j u r y b y i n t e r f e r i n g w i t h M C T b i o a c t i v a t i o n o r a f f e c t i n g L P S m e t a b o l i s m . R o s e e t a l . ( 2 0 0 1 ) d e m o n s t r a t e d t h a t G d C I a c a u s e d a t r a n s i e n t a c t i v a t i o n o f N F K B a n d e n h a n c e d h e p a t o c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n i n t h e l i v e r . H o w e v e r , N F K B 2 0 6 a c t i v a t i o n r e t u r n e d t o b a s e l i n e w i t h i n 2 4 h o u r s a f t e r G d C l a a d m i n i s t r a t i o n ; t h e r e f o r e , i t i s u n l i k e l y t h a t N F K B a c t i v a t i o n i n f l u e n c e d t h e r e s u l t s i n t h i s s t u d y , s i n c e M C T / L P S - c o t r e a t m e n t c o m m e n c e d a t t h i s t i m e . T h e p o s s i b i l i t y t h a t G d C I 3 h a d e f f e c t s i n d e p e n d e n t o f i t s a b i l i t y t o i n a c t i v a t e K u p f f e r c e l l s c a n n o t b e e x c l u d e d ; h o w e v e r a s i m i l a r d e g r e e o f h e p a t o t o x i c i t y f r o m a l a r g e , t o x i c d o s e o f M C T ( 3 0 0 m g / k g ) w a s u n a f f e c t e d b y G d C l 3 ( u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n ) , s u g g e s t i n g t h a t i t i s u n l i k e l y t o p r o t e c t t h r o u g h n o n s e l e c t i v e m o d e s o f a c t i o n s u c h a s e n h a n c i n g c e l l p r o l i f e r a t i o n . T N F - o c a n p r o m o t e l i v e r i n j u r y i n a n u m b e r o f w a y s . F o r e x a m p l e , i n v i t r o T N F - a r e n d e r s h e p a t o c y t e s m o r e s u s c e p t i b l e t o t o x i c i t y ( A d a m s o n a n d B i l l i n g s , 1 9 9 2 ; E l S i s i e t a l . , 1 9 9 3 ; l - l o e k a n d P a s t o r i n o , 2 0 0 2 ) . L i k e w i s e , H P C s a l t e r e d h o m e o s t a t i c a l l y b y t h e a c t i o n s o f h e p a t o t o x i c a n t s m a y b e c o m e m o r e s e n s i t i v e t o T N F - a - i n d u c e d c e l l k i l l i n g ( L a w s o n e t a l . , 1 9 9 8 ; J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 8 ) . I n a d d i t i o n , T N F - a c a n p r i m e P M N s t o r e l e a s e t o x i c p r o d u c t s ( i . e . , R O S a n d p r o t e a s e s ) t h a t c a n d a m a g e n e a r b y c e l l s ( N a g a k i e f a l . , 1 9 9 1 ; V a s s e l l i , 1 9 9 2 ; K u s h i m o t o a t a l . , 1 9 9 6 ) . F u r t h e r s t u d y w i l l b e r e q u i r e d t o u n d e r s t a n d h o w T N F - a a c t s t o p r o m o t e h e p a t o t o x i c i t y i n t h i s m o d e l . I n a d d i t i o n t o T N F - o , o t h e r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s a r e r e l e a s e d b y K C s t h a t m a y h a v e d e l e t e r i o u s e f f e c t s o n l i v e r ( H o l s t e f a l . , 1 9 9 6 ) . F o r e x a m p l e , C O X - 2 p r o d u c t s m e d i a t e l i v e r i n j u r y i n o t h e r m o d e l s . N S - 3 9 8 , a s e l e c t i v e C O X - 2 i n h i b i t o r , w a s a d m i n i s t e r e d t o r a t s u s i n g a t r e a t m e n t p r o t o c o l t h a t i n h i b i t s C O X - 2 i n v i v o a n d a f f o r d s p r o t e c t i o n f r o m l i v e r i n j u r y i n a P G - d e p e n d e n t m o d e l ( G a n e y e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e i n c r e a s e s i n p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s i n M C T / L P S - 2 0 7 c o t r e a t e d a n i m a l s w e r e n o t a t t e n u a t e d b y N S - 3 9 8 , w h i c h s u g g e s t s t h a t C O X - 2 p r o d u c t s a r e n o t n e e d e d f o r H P C i n j u r y i n t h i s m o d e l ( F i g u r e 4 A a n d 4 B ) . A s i m i l a r r e s u l t w a s o b s e r v e d i n a m o d e l o f L P S — p o t e n t i a t e d a f l a t o x i n B 1 h e p a t o t o x i c i t y ( B a r t o n e t a l . , 2 0 0 1 ) ; i n c o n t r a s t , a s i g n i f i c a n t p r o t e c t i v e e f f e c t o c c u r r e d i n r a t s t r e a t e d w i t h L P S a n d a l l y l a l c o h o l ( G a n e y e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e s e c o n t r a s t i n g r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e c r i t i c a l m e d i a t o r s o f L P S - p o t e n t i a t e d h e p a t o t o x i c r e s p o n s e s d i f f e r w i t h d i f f e r e n t h e p a t o t o x i c a n t s . I n t e r e s t i n g l y , i n h i b i t i o n o f C O X - 2 i n t h e M C T / L P S - c o t r e a t m e n t m o d e l r e s u l t e d i n a t r e n d t o w a r d a n i n c r e a s e i n t o x i c i t y , w h i c h w o u l d s u g g e s t t h a t C O X - 2 p r o d u c t s ( e . g . , P G E z ) m i g h t h a v e a p r o t e c t i v e e f f e c t . F u r t h e r s t u d y w i l l b e r e q u i r e d t o e l u c i d a t e t h i s f i n d i n g . I n s u m m a r y , G d C l a a d m i n i s t e r e d t o M C T / L P S - t r e a t e d r a t s a t a d o s e t h a t i n h i b i t s K C f u n c t i o n r e d u c e d H P C a n d S E C i n j u r y . M o r e o v e r , t h e a d m i n i s t r a t i o n o f T N F - a d e p l e t i n g a g e n t s t o M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t s a l s o p r o t e c t e d a g a i n s t H P C i n j u r y a n d c a u s e d a m o d e s t a t t e n u a t i o n o f S E C i n j u r y . A c c o r d i n g l y , K 0 5 a n d T N F - o a p p e a r t o p l a y i m p o r t a n t r o l e s i n t h e s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y f r o m M C T / L P S e x p o s u r e i n r a t s . 2 0 8 C H A P T E R 6 R o l e o f N e u t r o p h i l s i n t h e S y n e r g i s t i c L i v e r I n j u r y f r o m M o n o c r o t a l i n e a n d B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e E x p o s u r e 2 0 9 6 . A . A b s t r a c t S y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y d e v e l o p s i n S p r a g u e - D a w l e y r a t s f r o m a d m i n i s t r a t i o n o f a s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e o f b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ; 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) g i v e n 4 h o u r s a f t e r a n o n t o x i c d o s e o f t h e p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d , m o n o c r o t a l i n e ( M C T ; 1 0 0 m g / k g ) . P r e v i o u s s t u d i e s d e m o n s t r a t e d t h a t l i v e r i n j u r y i s m e d i a t e d t h r o u g h i n f l a m m a t o r y f a c t o r s , s u c h a s K u p f f e r c e l l s a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r ( T N F ) - a , r a t h e r t h a n t h r o u g h s i m p l e i n t e r a c t i o n b e t w e e n M C T a n d L P S . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e h y p o t h e s i s t h a t n e u t r o p h i l s ( P M N s ) a r e c a u s a l l y i n v o l v e d i n t h i s i n j u r y m o d e l i s t e s t e d , a n d t h e i n t e r d e p e n d e n c e b e t w e e n P M N s a n d o t h e r i n f l a m m a t o r y c o m p o n e n t s i s e x p l o r e d . H e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n a n d t h e a p p e a r a n c e o f c y t o k i n e - i n d u c e d n e u t r o p h i l c h e m o a t t r a c t a n t - I i n p l a s m a p r e c e d e d t h e o n s e t o f l i v e r i n j u r y , s u g g e s t i n g t h a t P M N s c o n t r i b u t e t o t o x i c i t y . H e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n w a s p a r t i a l l y d e p e n d e n t o n T N F - a . P r i o r d e p l e t i o n o f P M N s i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s r e s u l t e d i n a t t e n u a t i o n o f b o t h h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l ( H P C ) a n d s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l ( S E C ) i n j u r y a t 1 8 h o u r s . P M N d e p l e t i o n d i d n o t , h o w e v e r , p r o t e c t a g a i n s t e a r l y S E C i n j u r y t h a t o c c u r r e d b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y a t 6 h o u r s . T h i s o b s e r v a t i o n s u g g e s t s t h a t S E C i n j u r y i s n o t e n t i r e l y d e p e n d e n t o n P M N s i n t h i s m o d e l . I n v i t r o , M C T c a u s e d P M N s t o d e g r a n u l a t e i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . T h e s e r e s u l t s p r o v i d e e v i d e n c e t h a t P M N s a r e c r i t i c a l t o t h e H P C i n j u r y c a u s e d b y M C T / L P S c o t r e a t m e n t a n d c o n t r i b u t e t o t h e p r o g r e s s i o n o f S E C i n j u r y . 2 1 0 6 . B . I n t r o d u c t i o n P M N s a r e b l o o d - b o r n e i n f l a m m a t o r y c e l l s t h a t a r e i m p o r t a n t i n t h e d e f e n s e a g a i n s t b a c t e r i a l i n f e c t i o n . H o w e v e r , t h e r e l e a s e o f c y t o t o x i c m e d i a t o r s f r o m P M N s , s u c h a s p r o t e a s e s a n d o t h e r f a c t o r s ( e . g . , r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s ) , c a n h a v e d e l e t e r i o u s e f f e c t s o n h o s t t i s s u e s . I n d e e d , P M N s a r e c a u s a l l y i n v o l v e d i n H P C a n d S E C i n j u r y i n s e v e r a l m o d e l s b o t h i n v i t r o a n d i n v i v o ( M a v i e r e t a l . , 1 9 8 8 ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ; G a n e y e t a l . , 1 9 9 4 ; S a k a m o t o e t a l . , 1 9 9 7 ; O h t s u k a e f a l . , 2 0 0 0 ) . T h e p r e s e n t s t u d y w a s d e s i g n e d t o i n v e s t i g a t e t h e r o l e o f P M N s i n t h i s m o d e l o f i n f l a m m a t i o n - e n h a n c e d h e p a t o t o x i c i t y . T h e t i m e c o u r s e s f o r a p p e a r a n c e o f c h e m o a t t r a c t a n t i n p l a s m a a n d h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n a n d l o c a l i z a t i o n w e r e e x a m i n e d . E f f e c t s o f P M N d e p l e t i o n o n H P C a n d S E C i n j u r y w e r e e x p l o r e d i n v i v o , a n d t h e a b i l i t y o f M C T t o a c t i v a t e P M N s w a s s t u d i e d i n v i t r o . 6 . C . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 6 . C . 1 . M a t e r i a l s A c e t o n e , a m m o n i u m c h l o r i d e , b o r o n t r i f l u o r i d e i n m e t h a n o l , c a l c i u m c h l o r i d e , o - d i a n i s i d i n e d i h y d r o c h l o r i d e , p - d i m e t h y l a m i n o b e n z a l d e h y d e , g l y c o g e n , H a n k s ’ b a l a n c e d s a l t s , h y d r o g e n p e r o x i d e , i s o p e n t a n e , L P S ( E s c h e r i c h i a c o l i , s e r o t y p e 0 1 2 8 : B 1 2 , 1 . 7 x 1 0 6 e n d o t o x i n u n i t s ( E U S ) / m g ) . m a g n e s i u m s u l f a t e , 2 1 1 m e r c u r i c c h l o r i d e , p e n t o x i f y l l i n e ( P T X ) , p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) , p y r r o l e , s o d i u m c i t r a t e a n d s o d i u m b i c a r b o n a t e w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . G a d o l i n i u m c h l o r i d e - 6 H 2 0 ( G d C I a ) w a s p u r c h a s e d f r o m A l d r i c h C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . S e r u m d i r e c t e d a g a i n s t T N F - o c ( a n t i - r a t T N F - o t s e r u m ; A T S ) w a s p r o d u c e d i n N e w Z e a l a n d W h i t e r a b b i t s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . R a b b i t a n t i - r a t n e u t r o p h i l a n t i b o d y ( n e u t r o p h i l a n t i - s e r u m ( N A S ) ) a n d c o n t r o l r a b b i t s e r u m ( C S ) w e r e o b t a i n e d f r o m I n t e r - C e l l T e c h n o l o g i e s , I n c . ( H o p e w e l l , N J ) . M o u s e a n t i - r a t e n d o t h e l i a l c e l l a n t i g e n ( R E C A ) - 1 w a s p u r c h a s e d f r o m S e r o t e c , I n c . ( R a l e i g h , N C ) . G o a t s e r u m w a s o b t a i n e d f r o m V e c t o r L a b o r a t o r i e s ( B u r l i n g a m e , C A ) . G o a t a n t i - m o u s e s e c o n d a r y a n t i b o d y c o n j u g a t e d t o A l e x a 5 9 4 w a s p u r c h a s e d f r o m M o l e c u l a r P r o b e s ( E u g e n e , O R ) . M C T w a s a c q u i r e d f r o m T r a n s W o r l d C h e m i c a l s ( R o c k v i l l e , M D ) . A b s o l u t e e t h a n o l w a s p u r c h a s e d f r o m Q u a n t u m C h e m i c a l C o m p a n y ( T u s c o l a , I L ) . S t e r i l e s a l i n e w a s a c q u i r e d f r o m A b b o t t L a b o r a t o r i e s ( N o r t h C h i c a g o , I L ) . F o r r n a l i n f i x a t i v e w a s o b t a i n e d f r o m S u r g i p a t h M e d i c a l I n d u s t r i e s , I n c . ( R i c h m o n d , I L ) . D i a g n o s t i c k i t s 5 8 U V a n d 5 9 U V f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A S T ) a n d a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A L T ) a c t i v i t i e s , r e s p e c t i v e l y , w e r e a l s o p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . E n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) k i t f o r h y a l u r o n i c a c i d ( H A ) w a s a c q u i r e d f r o m C o r g e n i x , I n c . ( W e s t m i n s t e r , C O ) . E L I S A k i t f o r r a t T N F - a w a s p u r c h a s e d f r o m B i o s o u r c e l n t e m a t i o n a l , I n c . ( C a m a r i l l o , C A ) . E L I S A k i t f o r r a t g r o w t h r e l a t e d o n c o g e n e ( G R O ) / c y t o k i n e - 2 1 2 i n d u c e d n e u t r o p h i l c h e m o a t t r a c t a n t - 1 ( C I N C - 1 ) ( r a t i n t e r l e u k e n - 8 ) w a s o b t a i n e d f r o m A s s a y D e s i g n s , I n c . ( A n n A r b o r , M I ) . 6 . C . 2 . A n i m a l s M a l e , S p r a g u e - D a w l e y r a t s ( C r l : C D ( S D ) I G S B R , C h a r l e s R i v e r , P o r t a g e , M I ) w e i g h i n g 2 0 0 - 3 0 0 g w e r e u s e d f o r a l l i n v i v o s t u d i e s . M a l e , S p r a g u e - D a w l e y , r e t i r e d b r e e d e r r a t s w e r e u s e d f o r t h e i n v i t r o P M N s t u d i e s . O t h e r w i s e , f o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 6 . C . 3 . T r e a t m e n t P r o t o c o l F o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 6 . C . 4 . N e u t r o p h i l D e p l e t i o n P r o t o c o l R a t s w e r e p r e t r e a t e d i n t r a p e r i t o n e a l l y w i t h N A S ( 1 m l a n d 0 . 5 m l , r e s p e c t i v e l y ) o r C S 2 4 h o u r s a n d 8 h o u r s b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h i s t r e a t m e n t p r o t o c o l h a s p r e v i o u s l y b e e n s h o w n t o d e p l e t e P M N s e f f e c t i v e l y f r o m b l o o d a n d l i v e r ( B a r t o n e t a l . , 2 0 0 0 a ) . F o u r h o u r s a f t e r M C T t r e a t m e n t , L P S w a s a d m i n i s t e r e d . R a t s w e r e k i l l e d a n d l i v e r i n j u r y w a s a s s e s s e d a t 6 o r 1 8 h o u r s a f t e r M C T t r e a t m e n t . 6 . C . 5 . A s s e s s m e n t o f H e p a t i c I n j u r y a n d P l a s m a T N F - a a n d C l N C - 1 2 1 3 H P C i n j u r y w a s e v a l u a t e d b y i n c r e a s e s i n t h e a c t i v i t i e s o f A L T a n d A S T i n p l a s m a . A n E L I S A k i t w a s u s e d t o m e a s u r e p l a s m a H A , a m a r k e r o f h e p a t i c S E C i n j u r y ( D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 b , 1 9 9 4 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . P l a s m a T N F - a a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d w i t h a r a t T N F - o E L I S A k i t . P l a s m a C l N C - 1 a c t i v i t y w a s m e a s u r e d u s i n g a r a t G R O / C l N C - 1 E L I S A k i t . O t h e r w i s e , f o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 6 . C . 6 . E h r l i c h A s s a y P y r r o l e w a s u s e d t o g e n e r a t e t h e s t a n d a r d c u r v e . O t h e n i v i s e , f o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 6 . C . 7 . H i s t o p a t h o l o g i c E v a l u a t i o n a n d M o r p h o m e t r y F o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t h i s t o p a t h o l o g i c e v a l u a t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . F o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t m o r p h o m e t r y , r e f e r t o C h a p t e r 5 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 6 . 0 . 8 . E n u m e r a t i o n o f H e p a t i c P M N s P a r a f f i n - e m b e d d e d l i v e r t i s s u e ( 3 s e r i a l l i v e r s e c t i o n s p e r s l i d e ) w a s c u t i n t o 6 u m - t h i c k s l i c e s . P a r a f f i n w a s r e m o v e d f r o m t h e l i v e r t i s s u e s w i t h x y l e n e b e f o r e s t a i n i n g . P M N s w i t h i n l i v e r s e c t i o n s w e r e s t a i n e d w i t h a r a b b i t a n t i - P M N l g , i s o l a t e d f r o m s e r u m o f r a b b i t s i m m u n i z e d w i t h r a t P M N s a s d e s c r i b e d b y H e w e t t e t a l . ( 1 9 9 2 ) . A f t e r i n c u b a t i o n w i t h t h e p r i m a r y a n t i b o d y , t i s s u e s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d w i t h b i o t i n y l a t e d g o a t a n t i - r a b b i t l g G , a v i d i n - c o n j u g a t e d a l k a l i n e 2 1 4 p h o s p h a t a s e , a n d V e c t o r R e d s u b s t r a t e t o s t a i n P M N s . [ P M N i m m u n o s t a i n i n g w a s c o n d u c t e d b y t h e H i s t o t e c h n o l o g y C e n t e r , D i v i s i o n o f H u m a n P a t h o l o g y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ] . H e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n w a s a s s e s s e d b y a v e r a g i n g t h e n u m b e r s o f P M N s e n u m e r a t e d i n 3 0 r a n d o m l y s e l e c t e d , h i g h p o w e r f i e l d s ( H P F s ; 4 0 0 X ) i n e a c h s l i d e ( i . e . , 1 0 H P F s p e r l i v e r s e c t i o n ) . T h e a n a l y z e d f i e l d s r e p r e s e n t e d b e t w e e n 5 t o 1 0 % o f t h e t o t a l a r e a o f e a c h l i v e r s e c t i o n . A n a l y z e d f i e l d s w e r e u n b i a s l y s e l e c t e d f r o m g r o s s r e g i o n s t o c o v e r t h e e n t i r e l i v e r s e c t i o n . P M N s w e r e i d e n t i f i e d b y p o s i t i v e s t a i n i n g a n d c e l l m o r p h o l o g y . H e p a t i c P M N s w e r e e n u m e r a t e d a t t h e t i m e s i n d i c a t e d i n t h e f i g u r e l e g e n d s i n t h e t i m e c o u r s e a n d P M N d e p l e t i o n s t u d i e s d e s c r i b e d a b o v e . I n a d d i t i o n , t h e y w e r e e n u m e r a t e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s t h a t h a d u n d e r g o n e K C i n a c t i v a t i o n o r T N F - a d e p l e t i o n . I n t h e K C i n a c t i v a t i o n s t u d y , 1 0 m g G d C l a l k g w a s a d m i n i s t e r e d t o r a t s 2 4 h o u r s b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n . I n t h e T N F - a d e p l e t i o n s t u d i e s , e i t h e r P T X ( 1 0 0 m g / k g ) o r A T S ( 1 m I / r a t ) , w e r e a d m i n i s t e r e d 1 h o u r b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h e s e t r e a t m e n t r e g i m e n s w e r e e f f e c t i v e i n p r e v e n t i n g K C a c t i v a t i o n a n d t h e L P S - i n d u c e d i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - a a c t i v i t y , r e s p e c t i v e l y . N o n e o f t h e s e t h r e e p h a r m a c o l o g i c a l a g e n t s i n t e r f e r e w i t h M C T b i o a c t i v a t i o n ( Y e e e t a l . , 2 0 0 3 a ) . 5 . C . 9 . P M N D i s t r i b u t i o n H e p a t i c P M N d i s t r i b u t i o n w a s a s s e s s e d i n M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s 6 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . P M N s w e r e e n u m e r a t e d i n 1 5 r a n d o m l y 2 1 5 s e l e c t e d , l o w p o w e r f i e l d s ( L P F s ; 1 0 0 X ) i n e a c h s l i d e ( i . e . , 5 L P F s p e r l i v e r s e c t i o n ) . I n e a c h f i e l d , P M N s w e r e c o u n t e d f r o m a r a n d o m l i v e r l o b u l e c o n s i s t i n g o f a c l e a r l y d e f i n e d c e n t r i l o b u l a r , p e r i p o r t a l a n d m i d z o n a l r e g i o n . C e n t r i l o b u l a r a n d p e r i p o r t a l l i v e r r e g i o n s w e r e d e f i n e d a s a r e a s u p t o 5 H P C s a w a y f r o m t h e c e n t r a l v e i n a n d p o r t a l t r i a d , r e s p e c t i v e l y . M i d z o n a l r e g i o n s w e r e a r b i t r a r i l y d e t e r m i n e d t o c o n s t i t u t e t h e H P C s c e n t r a l l y l o c a t e d b e t w e e n c e n t r i l o b u l a r a n d p e r i p o r t a l r e g i o n s . A p p r o x i m a t e l y 5 % o f t h e l i v e r l o b u l e s w e r e e x a m i n e d i n e a c h l i v e r s e c t i o n . 6 . C . 1 0 . l m m u n o h i s t o c h e m i s t r y F o r m o r e - i n f o r m a t i o n a b o u t R E C A - 1 l m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , r e f e r t o C h a p t e r - 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 6 . C . 1 1 . Q u a n t i f i c a t i o n o f L i v e r E n d o t h e l i a l C e l l s F o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 6 . C . 1 2 . P M N I s o l a t i o n a n d T r e a t m e n t P r o t o c o l P M N s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e p e r i t o n e a l c a v i t y o f r e t i r e d b r e e d e r r a t s b y g l y c o g e n e l i c i t a t i o n a s d e s c r i b e d b y G a n e y e t a l . ( 1 9 9 4 ) . T h e p e r c e n t y i e l d o f P M N s a n d t h e i r v i a b i l i t y w a s r o u t i n e l y g r e a t e r t h a n 9 5 % . I s o l a t e d P M N s w e r e r e s u s p e n d e d i n H a n k s ’ b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n ( H B S S ) , p H 7 . 3 5 , w i t h 1 . 6 m M C a C l z , 0 . 6 8 m M M 9 8 0 4 a n d 1 4 m M N a H C O a . T h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f c e l l s i n 2 1 6 a l l s t u d i e s w a s 2 . 5 X 1 0 6 c e l l s / m l . M C T w a s p r e p a r e d i n H 3 8 8 a n d a d d e d t o P M N s a t a f i n a l c o n c e n t r a t i o n r a n g i n g f r o m 0 t o 0 . 8 m M . T h e c e l l s u s p e n s i o n w a s i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n a t 3 7 ° C a n d t h e n c e n t r i f u g e d . A l i q u o t s f r o m t h e c e l l - f r e e s u p e r n a t a n t w e r e t a k e n f o r m e a s u r e m e n t o f m y e l o p e r o x i d a s e ( M P O ) a c t i v i t y a n d l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e ( L D H ) r e l e a s e . 6 . 0 . 1 3 . M P O a n d L D H A s s a y s M P O a c t i v i t y w a s u s e d a s a m a r k e r o f P M N a c t i v a t i o n . M P O a c t i v i t y i n t h e c e l l - f r e e s u p e r n a t a n t w a s m e a s u r e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f H a r a d a e t a l . ( 2 0 0 0 ) w i t h m i n o r m o d i f i c a t i o n . B r i e f l y , 2 0 0 p l o f p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 0 ) c o n t a i n i n g 0 . 1 6 7 m g / m l o - d i a n i s i d i n e d i h y d r o c h l o r i d e a n d 0 . 0 0 0 5 % h y d r o g e n p e r o x i d e w a s a d d e d t o 1 0 u l o f s u p e r n a t a n t . T h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e a t 4 6 0 n m o v e r 3 m i n w a s m e a s u r e d i n a 9 6 - w e l l p l a t e r e a d e r . M P O a c t i v i t y w a s r e p o r t e d a s f o l d - i n c r e a s e o f t h e v e h i c l e c o n t r o l ( 0 m M M C T ) . T h e r e l e a s e o f t h e c y t o s o l i c e n z y m e , L D H , b y P M N s i n t o t h e m e d i u m w a s u s e d a s a m a r k e r o f c y t o t o x i c i t y a n d w a s m e a s u r e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f B e r g m e y e r a n d B e m t ( 1 9 7 4 ) . A s e p a r a t e a l i q u o t o f P M N s w a s l y s e d b y s o n i c a t i o n , a n d t o t a l L D H a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d i n t h e c e l l - f r e e s u p e r n a t a n t . L D H r e l e a s e w a s e x p r e s s e d a s t h e p e r c e n t o f t o t a l c e l l u l a r L D H r e l e a s e d i n t o t h e m e d i u m . 6 . 0 . 1 4 . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s 2 1 7 R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n s i S . E . M . W h e n v a r i a n c e s w e r e n o t h o m o g e n e o u s , d a t a w e r e l o g - t r a n s f o r m e d b e f o r e a n a l y s i s . D a t a e x p r e s s e d a s p e r c e n t a g e s w e r e t r a n s f o r m e d b y a r c s i n e s q u a r e r o o t p r i o r t o a n a l y s i s . D a t a f o r s i n g l e c o m p a r i s o n s w e r e a n a l y z e d b y S t u d e n t ’ s t - t e s t o r , w h e n a p p r o p r i a t e , F i s h e r ’ s e x a c t t e s t ( S t e e l e e t a l . , 1 9 9 7 ) . M u l t i p l e c o m p a r i s o n s o f h o m o g e n e o u s d a t a w e r e a n a l y z e d b y o n e - w a y o r t w o - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) , a s a p p r o p r i a t e , a n d g r o u p m e a n s w e r e c o m p a r e d u s i n g T u k e y ’ s o m e g a p o s t h o c t e s t ( S t e e l e e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e c r i t e r i o n f o r s i g n i f i c a n c e w a s p s ” 0 . 0 5 f o r a l l c o m p a r i s o n s . 6 . 0 . R e s u l t s 6 . 0 . 1 . M C T / L P S - C o t r e a t m e n t T i m e ‘ C o u r s e S y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y f r o m a s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e o f L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s a f t e r a s m a l l , n o n t o x i c d o s e o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) i s m a x i m a l b y 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ) . A d e t a i l e d t i m e c o u r s e s t u d y w a s i n i t i a t e d t o d e f i n e m o r e p r e c i s e l y e a r l y a n d l a t e e v e n t s i n t h i s m o d e l o f l i v e r i n j u r y . I n c r e a s e s i n p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s o c c u r r e d b e t w e e n 6 a n d 9 h o u r s a n d c o n t i n u e d t o b e s i g n i f i c a n t u n t i l 7 2 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e s . 6 . 1 A a n d 6 . 1 B ) . B y 9 6 h o u r s , v a l u e s h a d r e t u r n e d t o c o n t r o l l e v e l s . C e n t r i l o b u l a r , M C T - l i k e a n d m i d z o n a l , L P S - l i k e l e s i o n s w e r e o b s e r v e d i n l i v e r s f r o m M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s s t a r t i n g a t 9 h o u r s a n d w e r e s t i l l a p p a r e n t b y 7 2 h o u r s . D u r i n g t h i s t i m e , c o a g u l a t i v e n e c r o t i c s u b s e r o s a l 2 1 8 F i g u r e 6 . 1 . T i m e c o u r s e o L E v e n t s a f t e r M C T / L P S E x p o s u r e . L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) o r s a l i n e v e h i c l e ( V e h ) w a s a d m i n i s t e r e d i v . t o r a t s 4 h o u r s a f t e r i . p . a d m i n i s t r a t i o n o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) o r s a l i n e v e h i c l e . P a n e l s A a n d B p r e s e n t t h e t i m e c o u r s e o f H P C i n j u r y a s e s t i m a t e d b y c h a n g e s i n p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s , r e s p e c t i v e l y . N o s i g n i f i c a n t e f f e c t o f M C T o r L P S r e l a t i v e t o V e h N e h a n i m a l s w a s o b s e r v e d . P a n e l s C a n d D d e p i c t t i m e c o u r s e c h a n g e s i n t h e p l a s m a c o n c e n t r a t i o n o f t h e P M N c h e m o a t t r a c t a n t C l N C - 1 a n d i n h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n , r e s p e c t i v e l y . I n P a n e l C , b o t h g r o u p s t h a t r e c e i v e d L P S w e r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h o s e g r o u p s t h a t d i d n o t a t a l l t i m e s e v a l u a t e d . I n P a n e l 0 , t h e g r o u p r e c e i v i n g V e h / L P S w a s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m b o t h g r o u p s n o t r e c e i v i n g L P S a t t i m e s e n c o m p a s s i n g 6 t o 2 4 h o u r s , w h e r e a s t h e g r o u p r e c e i v i n g M C T / L P S w a s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e s e t w o g r o u p s a t a l l t i m e s . N = 4 — 2 4 a n i m a l s . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l l o t h e r g r o u p s . b S i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n V e h / L P S a n d M C T / L P S g r o u p s . 2 1 9 > ) L I U ( y t i v A i t c A T L A a m s a l P A A P l a s m a C I N C - 1 C o n c e n t r a t i o n ( p g / m l ) 0 d d d d d A d A fi fi 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2 8 4 “ H o u r s A f t e r M C T A d m i n i s t r a t i o n ‘ — b + V O I ‘ I N I h b - O - V O h I L P S ‘ + M C T N O h - v - M C T / L P S 0 O 1 2 1 8 H o u r s A f t e r M C T A d m l n i s t r a t i o n 2 2 0 A 2 4 0 0 S a + V a h N a h fi r m , — O " V M P S > 1 e o o « 8 : 1 2 0 0 - i n < s o o - E ‘ 4 0 m 3 0 - 0 4 . r - T o n u s s u s o n u e s H o u r s A f t e r M C T A d m l n l s t r a t l o n s o u + V a h N a h a ” , b - O - V o h I L P 8 g + M C T I V a h g m , - v - M C T I L P S n . 3 , ) , 6 fi t 0 5 " “ 5 1 m 2 0 4 1 2 2 4 3 ' 5 4 ' . £ 0 1 ' : H o u r s A f t e r M C T A d m i n i s t r a t l o n l e s i o n s i n t h e s e l i v e r s w e r e a l s o o b s e r v e d . L e s i o n c h a r a c t e r i s t i c s w e r e t h e s a m e a s d e s c r i b e d b y Y e e e t a l . ( 2 0 0 0 b ) . C e n t r i l o b u l a r l e s i o n s c o n s i s t e d o f m o d e r a t e t o m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r a p o p t o t i c a n d o n c o t i c n e c r o s i s , d e g e n e r a t i o n , h e m o r r h a g e a n d v a s c u l a r i n j u r y . M i d z o n a l l e s i o n s c o m p r i s e d w e l l d e f i n e d a r e a s o f m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r c o a g u l a t i v e n e c r o s i s a c c o m p a n i e d b y P M N i n f i l t r a t i o n w i t h c o n g e s t i o n a n d h e m o r r h a g e . H i s t o p a t h o l o g i c a l l y , n o f r a n k l e s i o n s w e r e o b s e r v e d a t 6 h o u r s , a l t h o u g h s o m e d i s r u p t i o n o f c e n t r a l v e i n i n t i m a w a s o b s e r v e d . P M N a c c u m u l a t i o n w a s a p p a r e n t a t t h i s t i m e i n l i v e r s o f a n i m a l s t h a t r e c e i v e d L P S i r r e s p e c t i v e o f M C T - t r e a t m e n t . N o m o r t a l i t y o c c u r r e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s w i t h i n 1 2 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n , b u t a p p r o x i m a t e l y 2 0 % o f r a t s d i e d b y 2 4 h o u r s , w i t h n o d e a t h s t h e r e a f t e r . N o a n i m a l s t h a t r e c e i v e d s a l i n e v e h i c l e s , M C T o r L P S a l o n e d i e d . 6 . 0 . 2 . P l a s m a C I N C - 1 C o n c e n t r a t i o n i n M C T / L P S - T r e a t e d A n i m a l s C l N C - 1 , t h e r a t e q u i v a l e n t t o h u m a n i n t e r l e u k i n - 8 , i s a P M N c h e m o a t t r a c t a n t ( Z h a n g e t a l . , 1 9 9 5 ; L u s t e r , 1 9 9 8 ) . P l a s m a C I N C - 1 c o n c e n t r a t i o n w a s a s s e s s e d a t v a r i o u s t i m e s a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f M C T o r i t s V e h i c l e ( V e h ) ( F i g u r e 6 . 1 0 ) . N o i n c r e a s e w a s o b s e r v e d i n V e h N e h o r M C T N e h c o t r e a t m e n t s a t a n y o f t h e t i m e s e v a l u a t e d , b u t p l a s m a C I N C - 1 c o n c e n t r a t i o n w a s s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d 2 h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , i r r e s p e c t i v e o f M C T - t r e a t m e n t , a n d d e c l i n e d t h e r e a f t e r . T h e d e c l i n e w a s s i g n i f i c a n t l y m o r e r a p i d i n V e h / L P S - t r e a t e d r a t s t h a n i n t h o s e c o t r e a t e d w i t h M C T / L P S , s o t h a t b y 1 8 h o u r s 2 2 1 p l a s m a C l N C - 1 c o n c e n t r a t i o n w a s f i v e t i m e s a s g r e a t i n M C T / L P S - t r e a t e d r a t s ( n o t e l o g s c a l e i n F i g u r e 6 . 1 C ) . 6 . 0 . 3 . H e p a t i c P M N A c c u m u l a t i o n i n M C T / L P S - C o t r e a t e d A n i m a l s Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f l i v e r s e c t i o n s i m m u n o s t a i n e d f o r P M N s r e v e a l e d t h a t a c c u m u l a t i o n o f t h e s e i n f l a m m a t o r y c e l l s o c c u r r e d b y 6 h o u r s i n l i v e r s f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h e i t h e r L P S a l o n e o r M C T / L P S ( F i g 6 . 1 D ) . P M N n u m b e r s i n t h e l i v e r s o f a n i m a l s t r e a t e d w i t h L P S a l o n e h a d b e g u n t o d e c l i n e b y 1 2 h o u r s a n d r e t u r n e d t o b a s e l i n e b y 4 8 h o u r s . B y c o n t r a s t , P M N a c c u m u l a t i o n r e m a i n e d s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d i n l i v e r s f r o m M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s u n t i l t h e f i n a l a n a l y s i s t i m e o f 7 2 h o u r s . H e p a t i c n e u t r o p h i l d i s t r i b u t i o n a t 6 h o u r s w a s p a n l o b u l a r i n l i v e r s f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h e i t h e r L P S a l o n e o r M C T / L P S ( F i g u r e 6 . 2 ) . W h e r e a s P M N n u m b e r s w e r e e l e v a t e d a t 6 h o u r s t h r o u g h o u t a l l t h e r e g i o n s o f t h e l i v e r l o b u l e s i n M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s , b y 9 h o u r s m o s t P M N s w e r e l o c a l i z e d w i t h i n l e s i o n s ( i . e . , c e n t r i l o b u l a r , a n d m i d z o n a l ) . 6 . D . 4 . E f f e c t o f P M N D e p l e t i o n o n M C T / L P S - I n d u c e d H e p a t o c e l l u l a r I n j u r y T o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t P M N s a r e i m p o r t a n t i n t h e p a t h o g e n e s i s o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , r a t s w e r e p r e t r e a t e d w i t h N A S t o d e p l e t e P M N s . N A S p r e t r e a t m e n t o f M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s m a r k e d l y r e d u c e d ( b y 8 2 % ) h e p a t i o P M N a c c u m u l a t i o n ( F i g u r e 6 . 3 B ) a n d p r a c t i c a l l y e l i m i n a t e d t h e i n c r e a s e s I n p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s c a u s e d b y M C T / L P S e x p o s u r e 1 8 h o u r s a f t e r 2 2 2 F i g u r e 6 . 2 . H e p a t i c P M N D i s t r i b u t i o n i n R a t L i v e r s a t 6 H o u r s . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h M C T a n d / o r L P S a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 6 . 1 l e g e n d . H e p a t i c P M N d i s t r i b u t i o n i n r a t l i v e r s w a s d e t e r m i n e d 6 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . N = 4 — 6 a n i m a l s . 3 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m b o t h V e h N e h a n d M C T N e h g r o u p s i n s a m e l o b u l a r r e g i o n . 2 2 3 m e ” . 5 e % i . e ? . ? e . ? o o . g n o o i u o o . u o o . n o o . V / u o fl o . g w e l o . o / u . o e fi u t m o o / w 0 o . a 0 o . w . o d w N o ¢ w o o < w o o . w o o « w o o « w s o q w s o ¢ w o o ¢ m e . J u i o i u l o fi / d u o 6 u - o 0 m . o 0 u . o 0 . u . h . / / / / / / / 2 o o / n . o . n . o e u . o 9 u . o o u . / / / / / % o ¢ . u / o 0 . u o o . u e o . u o h . o o / fl / / u . / . . , o . . . o . o . o . e . o . o . o . o . o . o . o . o . o . o . o . o . o . o 6 . 0 . 9 . 9 . “ . . . “ 9 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 . . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 o o o o o o o o o o o o o o o o e o o o o . : D P D D D D O D P I D D D D ’ P D O P P O D D D D P . . . . . . . . . . . . . . o o o o o o o o o o e o o . V w o w o w e w o w o w o w o w e w o w o w o w o w . Z / C Z ! C e n t r i l o b u l a r M i d z o n a l m P e r i p o r t a l w G q 1 " 5 4 3 2 — 2 . “ h o . 3 5 3 2 2 2 4 l : i g u r e 6 . 3 . H e a a t i c P M N A c c u m u l a t i o n a f t e r P M N D e p l e t i o n i n A n i m a l s E x g o s e c fl o M C T a n d L P S . N e u t r o p h i l a n t i - s e r u m ( N A S ) o r c o n t r o l ( n o n i m m u n e ) s e r u m ( C S ) w a s g i v e n i . p . t o r a t s 2 4 a n d 8 h o u r s b e f o r e L P S . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h M C T a n d / o r L P S a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 6 . 1 l e g e n d . P a n e l s A a n d B p r e s e n t h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n a t 6 a n d 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n , r e s p e c t i v e l y . H e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n w a s e v a l u a t e d t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t i v e n e s s o f P M N d e p l e t i o n b y N A S . N = 4 — 1 3 a n i m a l s . 8 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m C S / M C T / L P S g r o u p . 2 2 5 F P H / s N M P f o r e b m u N F P H / s N M P f o r e b m u N > 5 0 u m C S 6 h r p o s t M C T 4 0 j — N A S 3 0 . 3 2 ° ‘ e : 1 0 - 2 : 2 3 b o T T - ' 9 3 . ? V e h N e h M C T / L P S 5 0 4 0 1 — N A S a 3 0 . 2 0 . 1 0 - 0 M C T / L P S 2 2 6 a 6 H U d l . t e 0 . A s o i s p y n r n 5 C . o g s e r c t o E r e h f o l i c b f n e f t M e r c a s e C t T t o i i H m o e e ( f o a p t C c t P a h o n i M t o p i a d p v a t i D S N c n s l d , e o e e E i S n t p m p l C m E C a l r e . u o t n n i , d i 2 j o i u o u h n 0 t y u c j r n i 0 s o h t y a s 2 r o a n o ) f s c h S h a M C C e m i E b e s o r L T e P b i n c a e S n j i n e l q ( n i a v n y l u r u l y e a t o e b a D r i s s c t f e i i s e s d d r e v u i c a t u e ( T t r d t c e e h e a o a a l u s , f . b l e 6 . 2 ) . g e e h d r 1 9 9 i n c R 4 a l E r ; C g r e S e A , a - 1 s h e e d p p a p e p t t l a i a n o e t f s i a o n x l a . c m g i . , s a n M C T a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e s 6 . 4 A a n d 6 . 4 3 ) . M o r t a l i t y w a s 2 4 % i n M C T / L P S - c o t r e a t e d c o n t r o l a n i m a l s a n d 1 7 % i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s t h a t r e c e i v e d N A S p r e t r e a t m e n t . N o a n i m a l s t r e a t e d w i t h C S o r N A S a l o n e d i e d . N A S p r e t r e a t m e n t d i d n o t s i g n i f i c a n t l y a f f e c t s u r v i v a l i n M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s . M C T / L P S - c o t r e a t e d c o n t r o l a n i m a l s e x h i b i t e d c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l l i v e r l e s i o n s a s d e s c r i b e d a b o v e . L i v e r s f r o m M C T / L P S - c o e x p o s e d a n i m a l s p r e t r e a t e d w i t h N A S d e m o n s t r a t e d q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l l e s i o n s ; h o w e v e r , t h e s e l e s i o n s i n b o t h r e g i o n s w e r e s m a l l e r i n s i z e a n d c o n s i d e r a b l y l e s s f r e q u e n t . M i d z o n a l l e s i o n s a p p e a r e d t o h a v e a g r e a t e r r e d u c t i o n i n s i z e a n d f r e q u e n c y . M o r p h o m e t r i c a n a l y s i s c o n f i r m e d t h e o b s e r v e d d e c r e a s e i n t h e a r e a o f t h e c e n t r i l o b u l a r ( 8 3 % d e c r e a s e ) a n d m i d z o n a l ( 8 8 % d e c r e a s e ) l e s i o n s i n l i v e r s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s t h a t w e r e p r e t r e a t e d w i t h N A S ( T a b l e 6 . 1 ) . H i s t o l o g i c a l l y , n o i n j u r y w a s o b s e r v e d i n a n i m a l s g i v e n C S o r N A S a l o n e . F i n a l l y , a n E h r l i c h a s s a y r e v e a l e d t h a t N A S p r e t r e a t m e n t d i d n o t 2 2 7 F i g u r e 6 . 4 . E f f e c t o f P M N Q a p l e t i o n o n M C fl / _ L E § - l r L d ; u c e g H P C I n l a y , N A S o r C S w a s g i v e n t o r a t s 2 4 a n d 8 h o u r s b e f o r e L P S . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h M C T a n d / o r L P S a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 6 . 1 l e g e n d . P a n e l s A a n d B d e p i c t p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s a s t w o b i o m a r k e r s o f H P C i n j u r y , 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . N = 4 - 1 3 a n i m a l s . 3 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m C S / M C T / L P S g r o u p . 2 2 8 O O . 0 : . 9 0 D ' O O O O m ) L I 3 U 8 ( 3 y 6 8 t 1 i v 6 8 i t c A T S A a m s a l P é m c s ‘ — N A S v O I 0 ’ . O . o z . G O O O O A v 0 O V O A O O v 0 O O O V O O . O V O A V V O . ; . . A A 4 0 0 ‘ ' 9 ' 0 O O O O O A v . 0 O 2 0 0 ' O 0 v 0 A v v a " : A 5 . . P l a s m a A L T A c t i v i t y ( U I L ) > o r 8 0 v O V e h N e h M C T / L P S m o s _ N A S 7 4 O . A O A V . 0 v : 0 . v 0 O . A v Q V : v A A O 1 2 0 0 4 v 0 O 6 v 0 . O l V 0 . 0 0 . 0 v . 0 O V . 0 A O O A v : 0 . O 0 v 0 A v 0 . . A a , b w 8 I O O O A V O O v . 0 . O V e h N e h M C T / L P S C 2 2 9 T a b l e 6 . 1 . P M N D e p l a d i o n R e g u c e s L i v e r L e s i o n s i n M C T / I g fl g g g t r e a t e d R a t s . N e u t r o p h i l a n t i - s e r u m ( N A S ) o r c o n t r o l ( n o n i m m u n e ) s e r u m ( C S ) w a s g i v e n i . p . t o r a t s 2 4 a n d 8 h o u r s b e f o r e L P S . L P S ( 7 . 4 x 1 O 6 E U / k g ) w a s a d m i n i s t e r e d i . v . t o r a t s 4 h o u r s a f t e r i . p . a d m i n i s t r a t i o n o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) . L i v e r s w e r e t a k e n 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n a n d p r o c e s s e d f o r m o r p h o m e t r i c a n a l y s i s . N = 8 a n i m a l s . 8 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m C S / M C T / L P S g r o u p . 2 3 0 T r e a t m e n t P e r c e n t L e s i o n A r e a C e n t r i l o b u l a r M i d z o n a l C S I M C T I L P S 2 . 3 i 0 . 3 8 . 2 i 1 . 6 N A S / M C T I L P S 0 . 4 i 0 . 1 a 1 . 0 i 0 . 3 a 2 3 1 T a b l e 6 . 2 . N A S g o e s n o t I n f l u e n c e M C T _ B i o a c t i v a t i o n . N A S o r C S w a s g i v e n i . p . t o r a t s 2 4 a n d 8 h o u r s b e f o r e L P S . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h M C T a n d / o r L P S a s d e s c r i b e d i n T a b l e 6 . 1 l e g e n d . L i v e r s a m p l e s w e r e t a k e n 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n a n d a n a l y z e d f o r p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n b y E h r l i c h a s s a y . R e s u l t i n g v a l u e s w e r e c o r r e c t e d f o r e n d o g e n o u s p y r r o l e b y s u b t r a c t i n g t h e a v e r a g e v a l u e ( i . e . , 1 . 4 p g p y r r o l e / g l i v e r ) f r o m a n i m a l s g i v e n t h e C S N e h N e h c o m b i n a t i o n . N = 5 a n i m a l s . 2 3 2 T r e a t m e n t P y r r o l e ( p g / g l i v e r ) C S I M C T I L P S 6 . 3 i 0 . 4 N A S / M C T I L P S 6 . 4 i 0 . 2 2 3 3 i n t e n s i t y i n c o m p a r i s o n t o l i v e r s f r o m M C T / L P S - c o n t r o l a n i m a l s a t e i t h e r 6 o r 1 8 1 9 9 9 ) . I n M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s S E C i n j u r y o c c u r s b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y ( Y e e e t a l . , 2 0 0 2 ) . T o d e f i n e t h e i m p o r t a n c e o f P M N s i n S E C i n j u r y i n M C T / L P S - c o e x p o s e d a n i m a l s , r a t s w e r e p r e t r e a t e d w i t h N A S , a n d i n j u r y w a s a s s e s s e d 6 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( i . e . , b e f o r e t h e o n s e t o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y ) . N A S p r e t r e a t m e n t e l i m i n a t e d h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 6 . 3 A ) . B y 6 h o u r s , p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s i n c r e a s e d i n M C T / L P S c o t r e a t e d a n i m a l s ; h o w e v e r , N A S p r e t r e a t m e n t f a i l e d t o a f f e c t t h i s i n c r e a s e ( F i g u r e 6 . 5 A ) . N o m o r t a l i t y o c c u r r e d i n c o n t r o l o r c o t r e a t e d a n i m a l s a t t h i s t i m e . A t 1 8 h o u r s , t h e i n c r e a s e i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n p e r s i s t e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s , a n d t h e i n c r e a s e r e m a i n e d i n N A S p r e t r e a t e d r a t s b u t w a s l e s s p r o n o u n c e d ( F i g u r e 6 . 5 0 ) . T o c o n f i r m t h e e f f e c t o f P M N d e p l e t i o n o n S E C i n j u r y , e n d o t h e l i a l c e l l s w e r e s t a i n e d i m m u n h i s t o c h e m i c a l l y w i t h R E C A - 1 a n t i b o d y , w h i c h s e l e c t i v e l y b i n d s t o r a t e n d o t h e l i a l c e l l s ( D u i j v e s t i j n e t a l . , 1 9 9 2 ) . R E C A - 1 s t a i n i n g o f l i v e r s e c t i o n s h a s b e e n u s e d t o v i s u a l i z e a n d q u a n t i f y t h e l o s s o f e n d o t h e l i a l c e l l s i n t h e l i v e r ( C o p p l e , e t a l . , 2 0 0 2 ) . I n l i v e r s e c t i o n s o f r a t s t r e a t e d w i t h C S o r N A S a l o n e , i n t e n s e R E C A - 1 s t a i n i n g w a s p r e s e n t a l o n g t h e s i n u s o i d s a n d l i n e d t h e m a j o r v e s s e l s o f t h e l i v e r . T o t a l R E C A - 1 s t a i n i n g i n t e n s i t y d i d n o t d i f f e r f r o m c o n t r o l v a l u e s i n l i v e r s f r o m a n i m a l s t h a t r e c e i v e d M C T / L P S - c o t r e a t m e n t a t 6 h o u r s ( F i g u r e 6 . 5 8 ) ; h o w e v e r , i t d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y b y 1 8 h o u r s ( F i g u r e 6 - 5 D ) - N A S p r e t r e a t m e n t d i d n o t r e s u l t i n a c h a n g e i n t o t a l R E C A - 1 s t a i n i n g 2 3 4 F i g u r e 6 . 5 . E f f e c t o f P M N [ _ ) _ e _ p l e t i o n o n M C T / L P S - l n d u c e d S E C l n i u m . N A S o r C S w a s g i v e n t o r a t s 2 4 a n d 8 h o u r s b e f o r e L P S . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h M C T a n d / o r L P S a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 6 . 1 l e g e n d . P a n e l s A a n d 8 s h o w p l a s m a h y a l u r o n i c a c i d ( H A ) c o n c e n t r a t i o n , a b i o m a r k e r o f S E C i n j u r y , a n d t h e t o t a l a r e a o f R E C A - 1 ( a n a n t i b o d y s e l e c t i v e f o r e n d o t h e l i a l c e l l s ) i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g i n l i v e r s e c t i o n s 6 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n , r e s p e c t i v e l y . P a n e l s C a n d 0 p r e s e n t t h e s a m e m a r k e r s 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . N o t e o r d i n a l s c a l e d i f f e r e n c e s i n P a n e l 5 A a n d P a n e l 5 0 . N = 3 - 6 a n i m a l s . 3 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m C S I M C T I L P S g r o u p . 2 3 5 > ) l 5 I 8 m ) I 5 3 l g n A ( § H n o a ” r A t o T a l e a l f a o i l A . I . a o m t s a . s o n l . A . e : A v s e o a : h O l ¢ . O . O f O f O O O . . , 0 . 0 . ' A o . . ' A s 0 . ' A 0 e . ' A 0 e . ' A 0 s . ' A r l v e : O . t . t s . ' A 0 0 t s 0 0 U P n e c n s o C . I A I - l a m s a l P o . A v e o . O . o A : a A . : 0 O . o . . 0 A : . 0 O : . 0 A : . 0 A v v v v v v o c d a n r E F ( O O O O , . O ? O , . O ? O O , Q _ O s . ' A 0 o . ' A 0 o . ' A 0 o . ' A 0 o . ' A 0 o . ' A 0 o . ' A 0 o . ' s 5 ) a l e a r t A o T l f a o i A l n v o e v v v v h i t t o c d A a n r E F ( V e h N e h M C T / L P S C o n c e n t r a t i o n ( n g l m l ) C D : 5 i i : 5 a ! A A A A - o § 3 I I 5 8 . . . . . . o e 0 . 0 0 0 2 0 9 % } A A A A A 0 O O . O O 1 8 h r p o s t M C T 9 . o 9 . o 8 8 3 1 5 ‘ U 0 . ” O : O : O : O : O : O : 0 . 0 : O . 0 , . . O _ 0 , 0 , 0 _ O , j _ 1 8 h r p o s t M C T 6 h r p o s t M C T 8 3 A A 0 . 1 5 . 0 . 0 0 - § 0 . 0 . . 9 . 0 9 0 . . . . 0 . 0 . 0 . 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 . . . ‘ 6 h r p o s t M C T h o u r s . N o e f f e c t o f N A S p r e t r e a t m e n t o n l i v e r z o n a l d i s t r i b u t i o n ( i . e . , c e n t r i l o b u l a r , m i d z o n a l , o r p e r i p o r t a l ) o f R E C A - 1 s t a i n i n g i n t e n s i t y w a s o b s e r v e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s a t 6 o r 1 8 h o u r s ( d a t a n o t s h o w n ) . 6 . 0 . 6 . R e l a t i o n s h i p B e t w e e n T N F - a a n d P M N s i n M C T / L P S - T r e a t e d R a t s L P S c a n a c t i v a t e K C s t o r e l e a s e i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s s u c h a s T N F - a ( M i c h i e e t a l . , 1 9 8 8 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 3 ) . I n a n e a r l i e r s t u d y ( Y e e e t a l . , 2 0 0 3 a ) , K C d e p l e t i o n b y G d C l a o r a t t e n u a t i o n o f t h e T N F - a r e s p o n s e b y e i t h e r P T X o r A T S w a s f o u n d t o p r o t e c t a g a i n s t H P C i n j u r y i n M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t s . A s s e e n i n T a b l e 3 , e a c h o f t h e s e t r e a t m e n t s a l s o r e d u c e d h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n . B y c o n t r a s t , P M N d e p l e t i o n w a s w i t h o u t s i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h e i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n t h a t a c c o m p a n i e d M C T / L P S t r e a t m e n t a t 6 o r 1 8 h o u r s ( F i g u r e s 6 . 6 A a n d 6 . 6 8 ) . 6 . 0 . 7 . E f f e c t o f M C T o n P M N s I n V i t r o [ T h i s s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w a s c o n d u c t e d b y U m e s h M . H a n u m e g o w d a . ] T o d e t e r m i n e i f M C T c a u s e d P M N a c t i v a t i o n i n v i t r o , i s o l a t e d P M N s w e r e e x p o s e d t o v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f M C T ( 0 t o 0 . 8 m M ) f o r 3 0 m i n . M C T t r e a t m e n t r e s u l t e d i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t i n c r e a s e i n M P 0 r e l e a s e ( F i g u r e 6 . 7 A ) f r o m P M N s w i t h o u t a c o n c u r r e n t i n c r e a s e i n L D H r e l e a s e ( F i g u r e 6 . 7 8 ) . 2 3 7 T a b l e 6 . 3 . G d C I g , P T X o r A T S R e d _ u c e H e p a t i c P M N A c c u m l a t i o n i n M P S - T r e a t e d R a t s . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h M C T a n d / o r L P S a s d e s c r i b e d i n T a b l e 6 . 1 l e g e n d . I n a d d i t i o n , r a t s w e r e t r e a t e d w i t h G d C l a ( K C i n a c t i v a t o r ) , P T X ( i n h i b i t o r o f T N F - o s y n t h e s i s ) o r A T S ( i n a c t i v a t o r o f T N F - a ) o r t h e i r v e h i c l e s a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . P M N s w e r e c o u n t e d i n i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l y s t a i n e d s e c t i o n s o f l i v e r r e m o v e d f r o m r a t s 1 8 h o u r s a f t e r M C T t r e a t m e n t . N = 4 - 1 3 a n i m a l s . 3 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f p h a r m a c o l o g i c a l t r e a t m e n t ( i . e . , G d C l a , P T X o r A T S ) . 2 3 8 T r e a t m e n t P M N s p e r H P F G d C I a S t u d y V e h N e h N e h 2 . 2 i 0 . 4 G d C l 3 / V e h N e h 2 . 2 i 0 . 2 V e h / M C T / L P S 3 0 . 1 i 3 . 1 3 G d C I 3 / M C T / L P S 1 8 . 3 a : 1 . 0 “ - b P T X S t u d y V e h N e h N e h 2 . 1 i 0 . 3 V e h / P T X / V e h 2 . 0 i 0 . 4 M C T N e h / L P S 3 7 . 0 i 2 . 1 ’ 3 M C T / P T X / L P S 1 7 . 2 i 1 . 5 “ A T S S t u d y V e h / C S N e h 2 . 3 i 0 . 4 V e h / A T S N e h 2 . 1 i 0 . 2 M C T / C S / L P S 5 3 . 1 i 1 1 . 7 3 M C T / A T S / L P S 2 2 . 1 i 3 2 8 - ” 2 3 9 F i g u r e 6 . 6 . _ E j f e c t o f P M N M I e t i o n o n T N F - a C o n c e n t r a t i o n i n M _ C T / L P S - § o t r e a t e g A n i m fi a fi N A S o r C S w a s g i v e n t o r a t s 2 4 a n d 8 h o u r s b e f o r e L P S . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h M C T a n d / o r L P S a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 6 . 1 l e g e n d . P a n e l s A a n d 8 p r e s e n t p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n a t 6 a n d 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n , r e s p e c t i v e l y . N o t e t h e o r d i n a l s c a l e d i f f e r e n c e s i n t h e s e p a n e l s . N = 3 — 1 3 a n i m a l s . 8 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . 2 4 0 C s 1 a m N m . t d a u — z . _ . G e n a — n — . . O 0 . D . O . 0 D . O . . D O O O . D O O O . D O O O ‘ D O O Q . D O O D O . O O O . O O O O . D O O D O ‘ Q O D O . O O D . . I . O . , , 6 h r p o s t M C T 1 8 h r p o s t M C T C O . . 0 . C V . . 0 . . . ‘ V . V . V . V . . ‘ . . V O . 0 0 . . . . 9 9 . 9 0 9 0 0 9 9 9 0 0 0 0 0 0 9 V e h / V e h M C T / L P S — N A S S C . . . . . . . . . o w w w w w m o m m m m m m c E B S c o z u z c o o c o o A 9 E 9 : 2 0 2 2 2 6 2 6 0 3 8 . . . . 2 . . . u E a a E 2 4 1 V e h N e h M C T / L P S F i g u r e 6 . 7 . M C T A c t i v a t e s P M N s I n V i t r o . P M N s w e r e i n c u b a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f M C T ( 0 t o 0 . 8 m M ) f o r 3 0 m i n a t 3 7 ° C . P a n e l A s h o w s M P O a c t i v i t y r e l e a s e d i n t o t h e i n c u b a t i o n m e d i u m , a m a r k e r o f P M N d e g r a n u l a t i o n . M P O a c t i v i t y i s p r e s e n t e d a s f o l d i n c r e a s e o v e r v e h i c l e c o n t r o l ( 0 m M M C T : 1 . 2 i 0 . 1 m O D / m i n ) . P a n e l 8 d e p i c t s L D H r e l e a s e i n t h e c e l l - f r e e s u p e r n a t a n t . D a t a a r e e x p r e s s e d a s m e a n 1 S E M . N = 5 — 6 a n i m a l s . 8 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m v e h i c l e c o n t r o l . [ T h e w o r k i n t h i s f i g u r e w a s c o n d u c t e d b y U m e s h M . H a n u m e g o w d a ] . 2 4 2 ’ f ‘ ) e s a T " e r c ° . n ° I d ’ T ' l o F ( ‘ " d 8 e s a e l e 8 R ° H ° D ' L % " 2 4 3 M C T ( m M ) 0 . 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 0 0 0 0 A O O M C T ( m M ) 0 . 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 O M P O A c t i v i t y A > 6 . E . D i s c u s s i o n P r e v i o u s l y , Y e e e t a l . ( 2 0 0 0 b ) r e p o r t e d t h a t s y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y d e v e l o p s w i t h i n 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n i n a m o d e l i n w h i c h a s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e o f L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) i s a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s a f t e r a n o r m a l l y n o n t o x i c d o s e o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) . T h i s d o s e o f L P S e v o k e s m o d e s t h e p a t i c i n f l a m m a t i o n b u t l i t t l e o r n o h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . A m o r e d e t a i l e d t i m e c o u r s e s t u d y h a s r e v e a l e d t h a t a f t e r M C T / L P S - c o t r e a t m e n t l i v e r i n j u r y d e v e l o p s b e t w e e n 6 a n d 9 h o u r s a n d c o n t i n u e s t o b e s i g n i f i c a n t u n t i l 7 2 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e s 6 . 1 A a n d 6 . 1 8 ) . H e p a t o c e l l u l a r i n j u r y w a s m a x i m a l b y 1 8 h o u r s a s m a r k e d b y i n c r e a s e s i n p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s . N o H P C i n j u r y w a s o b s e r v e d i n M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s a t 6 h o u r s . H e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n a n d i n c r e a s e s i n p l a s m a C I N C - 1 a n d T N F - a c o n c e n t r a t i o n s i n L P S - t r e a t e d a n i m a l s c o n f i r m e d t h a t t h e a n i m a l s w e r e u n d e r g o i n g a n i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e a t t h i s t i m e ( F i g u r e s 6 1 0 , 6 . 1 0 a n d 6 . 6 A , r e s p e c t i v e l y ) . I n a n i m a l s g i v e n L P S a l o n e , t h e r i s e i n h e p a t i c P M N n u m b e r s g r a d u a l l y d e c r e a s e d t o v e h i c l e c o n t r o l l e v e l s b y 4 8 h o u r s , a n d l i v e r i n j u r y d i d n o t d e v e l o p . I n c o n t r a s t , i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s t h e i n c r e a s e d n u m b e r o f h e p a t i c P M N s w a s s u s t a i n e d t h r o u g h 7 2 h o u r s , a n d l i v e r i n j u r y o c c u r r e d . T h e s i g n i f i c a n t e l e v a t i o n i n h e p a t i c P M N n u m b e r s i n t h e c o t r e a t e d a n i m a l s b e f o r e t h e o n s e t o f i n j u r y s u g g e s t e d t h a t t h e s e i n f l a m m a t o r y c e l l s m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s . T o t e s t t h i s h y p o t h e s i s , N A S w a s u s e d i n a t r e a t m e n t r e g i m e n k n o w n t o r e d u c e t h e n u m b e r o f P M N s i n b l o o d a n d l i v e r ( B a r t o n e t a l . , 2 0 0 0 a ) . 2 4 4 N A S e f f e c t i v e n e s s w a s c o n f i r m e d b y t h e m a r k e d r e d u c t i o n o f h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 6 . 3 8 ) . N A S p r e t r e a t m e n t r e s u l t e d i n p r o n o u n c e d a t t e n u a t i o n o f t h e i n c r e a s e i n p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s ( F i g u r e s 6 . 4 A a n d 6 . 4 8 ) , s u g g e s t i n g t h a t P M N s p l a y a c a u s a l r o l e i n t h e h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . T h e d i s t r i b u t i o n o f P M N s a t 6 h o u r s w a s p a n l o b u l a r i n l i v e r s o f L P S - t r e a t e d a n i m a l s . N o z o n a l d i f f e r e n c e s i n P M N d i s t r i b u t i o n i n L P S - t r e a t e d a n i m a l s w e r e o b s e r v e d , r e g a r d l e s s o f M C T a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e 6 . 2 ) . T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e p r e s e n c e o f P M N s w a s n o t a r e s p o n s e t o i n j u r y , s i n c e i n j u r y o c c u r r e d o n l y i n c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l r e g i o n s , w h e r e a s P M N a c c u m u l a t i o n w a s p a n l o b u l a r . M o r e o v e r , P M N a c c u m u l a t i o n w i t h o u t l i v e r i n j u r y o c c u r r e d i n r a t s t r e a t e d w i t h L P S a l o n e . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t a c t i v a t i o n o f t h e s e c e l l s f o l l o w s t h e i r a c c u m u l a t i o n a n d i s r e q u i r e d f o r h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y t o o c c u r . A s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d , c o t r e a t m e n t o f r a t s w i t h n o r m a l l y n o n t o x i c d o s e s o f M C T a n d L P S r e s u l t s i n l i v e r l e s i o n s c o n s i s t i n g o f a c e n t r i l o b u l a r , M C T - l i k e l e s i o n a n d a m i d z o n a l , L P S - l i k e l e s i o n ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ) . N A S p r e t r e a t m e n t o f t h e s e a n i m a l s d i d n o t a f f e c t t h e q u a l i t a t i v e n a t u r e o f t h e l e s i o n s . H o w e v e r , b o t h c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l l e s i o n s i z e a n d f r e q u e n c y w e r e g r e a t l y a t t e n u a t e d ( T a b l e 6 . 1 ) . M o r e o v e r , t h e a m o u n t o f h e m o r r h a g e a n d c o n g e s t i o n w i t h i n c e n t r i l o b u l a r a n d e s p e c i a l l y m i d z o n a l a r e a s w a s r e d u c e d b y N A S p r e t r e a t m e n t . O v e r a l l , t h i s s u g g e s t s t h a t N A S p r e t r e a t m e n t o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s r e s u l t s i n a r e d u c t i o n o f b o t h m i d z o n a l a n d c e n t r i l o b u l a r l e s i o n s . 2 4 5 T o d e m o n s t r a t e t h a t t h e a t t e n u a t i o n o f H P C i n j u r y w a s n o t t h e r e s u l t o f N A S p r e t r e a t m e n t i n t e r f e r i n g w i t h M C T b i o a c t i v a t i o n , a n E h r l i c h a s s a y w a s p e r f o r m e d o n l i v e r h o m o g e n a t e s . T h i s a s s a y h a s b e e n u s e d t o m o n i t o r h e p a t i c a c c u m u l a t i o n o f p y r r o l i c b i o a c t i v a t i o n p r o d u c t s o f M C T ( M a t t o c k s a n d W h i t e , 1 9 7 0 ; Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b ) . N A S p r e t r e a t m e n t o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s d i d n o t r e d u c e l i v e r p y r r o l e c o n c e n t r a t i o n i n c o m p a r i s o n t o a n i m a l s p r e t r e a t e d w i t h C S ( T a b l e 6 . 2 ) . T h u s , N A S p r e t r e a t m e n t d o e s n o t a p p e a r t o i n t e r f e r e w i t h M C T b i o a c t i v a t i o n . O v e r 9 0 % o f c i r c u l a t i n g H A i s r e m o v e d a n d d e g r a d e d b y h e p a t i c S E C s ( K o b i y a s h i e f a l . , 1 9 9 9 ) . S E C i n j u r y i m p a i r s t h e a b i l i t y o f t h e s e c e l l s t o c l e a r c i r c u l a t i n g H A , r e s u l t i n g i n a n i n c r e a s e i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n . C o n s e q u e n t l y , s u c h i n c r e a s e s h a v e b e e n u s e d a s a b i o m a r k e r o f S E C i n j u r y i n v i v o . T h e i n c r e a s e i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n c o r r e l a t e d w e l l w i t h h i s t o p a t h o l o g i c e v i d e n c e o f S E C i n j u r y a n d d e s t r u c t i o n i n r a t s g i v e n a l a r g e , h e p a t o t o x i c d o s e o f e i t h e r M C T ( C o p p l e e f a l . , 2 0 0 2 a ) o r L P S ( D e a c u i c e t a l . , 1 9 9 4 ; S p a p e n e t a l . , 1 9 9 9 ) . I n t h i s a n d p r e v i o u s s t u d i e s ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b , 2 0 0 2 ) ; c o e x p o s u r e t o d o s e s o f M O T a n d L P S t h a t a r e b y t h e m s e l v e s n o n t o x i c r e s u l t e d i n a n i n c r e a s e i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n , a n d t h i s i n c r e a s e w a s c o n s i s t e n t w i t h h i s t o p a t h o l o g i c e v i d e n c e o f e n d o t h e l i a l i n j u r y . I n c r e a s e d p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s o b s e r v e d b y 6 h o u r s , w e l l b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y , a n d b e c a m e m o r e p r o n o u n c e d b y 1 8 h o u r s ( F i g u r e s 6 . 5 A a n d 6 . 5 C , r e s p e c t i v e l y ) . T o d e t e r m i n e i f P M N s w e r e r e s p o n s i b l e f o r t h i s e a r l y i n j u r y t o S E C s , M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s w e r e e x a m i n e d a t 6 h o u r s . 2 4 6 N A S p r e t r e a t m e n t o f t h e s e a n i m a l s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n ( F i g u r e 6 . 3 A ) b u t d i d n o t a f f e c t t h e e l e v a t i o n i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n a t t h i s t i m e ( F i g u r e 6 . 5 A ) . ' R E C A - 1 i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g w a s n o t a b l e t o d e t e c t t h e s u b t l e c h a n g e s i n S E 0 3 6 h o u r s a f t e r M C T / L P S c o t r e a t m e n t ( F i g u r e 6 . 5 8 ) . T h i s l e s s e r s e n s i t i v i t y o f R E C A - 1 a s a b i o m a r k e r o f S E C i n j u r y c o m p a r e d t o p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n h a s b e e n o b s e r v e d p r e v i o u s l y ( C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . T h e i n a b i l i t y o f N A S p r e t r e a t m e n t t o r e d u c e t h e i n c r e a s e i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n a t 6 h o u r s s u g g e s t s t h a t P M N s a r e n o t r e s p o n s i b l e f o r t h e e a r l y S E C i n j u r y . A t l a t e r s t a g e s i n t h e p r o g r e s s i o n o f l i v e r i n j u r y , P M N s a p p e a r t o c o n t r i b u t e t o t h e i n j u r y t o S E C s . I n d e e d , o t h e r s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t P M N s c a n c a u s e S E C i n j u r y i n v i v o ( S a k a m o t o e t a l . , 1 9 9 7 ; O h t s u k a e t a l . , 2 0 0 0 ) . N A S p r e t r e a t m e n t o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s r e s u l t e d i n a s m a l l b u t s i g n i f i c a n t a t t e n u a t i o n o f p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n a t 1 8 h o u r s ( F i g u r e 6 . 5 C ) . l m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g c o n f i r m e d e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s a s a d e c r e a s e i n R E C A - 1 s t a i n i n g i n N A S - t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 6 . 5 0 ) . R e g a r d l e s s o f N A S p r e t r e a t m e n t , M C T / L P S t r e a t m e n t r e d u c e d R E C A — 1 s t a i n i n g i n b o t h c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l r e g i o n s o f l i v e r l o b u l e s ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , R E C A - 1 i m m u n o s t a i n i n g w a s n o t s e n s i t i v e e n o u g h t o r e f l e c t t h e m o d e s t d i f f e r e n c e s i n p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n t h a t o c c u r r e d a t 1 8 h o u r s i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s w h i c h d i d a n d d i d n o t r e c e i v e N A S p r e t r e a t m e n t . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t P M N d e p l e t i o n i n M C T / L P S - c o e x p o s e d a n i m a l s p a r t i a l l y b u t i n c o m p l e t e l y a t t e n u a t e d l a t e - 2 4 7 d e v e l o p i n g S E C i n j u r y . O v e r a l l , t h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t S E C i n j u r y e a r l y i n t h e p a t h o g e n e s i s o c c u r s i n d e p e n d e n t l y o f P M N s , b u t t h a t P M N s c o n t r i b u t e t o t h e p r o g r e s s i o n o f S E C i n j u r y a t l a t e r t i m e s ( F i g u r e 6 . 8 ) . T h e c a u s e o f t h e e a r l y i n j u r y t o S E C S i n M C T / L P S - t r e a t e d r a t s i s n o t u n d e r s t o o d . A l t h o u g h S E C S e x p r e s s c y t o c h r o m e s P 4 5 0 ( L e s t e r e t a l . , 1 9 9 3 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 7 ) , i t i s n o t k n o w n i f t h e p a r t i c u l a r P 4 5 0 f a m i l y ( i . e . , 3 A ) r e s p o n s i b l e f o r M C T b i o a c t i v a t i o n i s e x p r e s s e d i n t h e s e c e l l s ( K a s a h a r a e t a l , 1 9 9 7 ) . D e L e v e e t a l . ( 1 9 9 6 ) o b s e r v e d t h a t M C T i s t o x i c t o S E C S i n v i t r o a n d s u g g e s t e d t h a t t h e t o x i c i t y m i g h t b e d u e t o t h e p r o d u c t i o n o f a t o x i c m e t a b o l i t e ( i . e . , M C T P ) . I n d e e d , p y r r o l i c m e t a b o l i t e s o f M C T a r e p r o d u c e d b y S E C S i n v i t r o ( u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n ) , s u p p o r t i n g t h e p o s s i b i l i t y t h a t M C T m a y i n j u r e S E C S d i r e c t l y t h r o u g h t h e f o r m a t i o n o f M C T P . I t i s p o s s i b l e t h a t b i o a c t i v a t i o n p r o d u c t s o f M C T , p r o d u c e d e i t h e r b y H P C s o r S E C S , w o r k i n c o m b i n a t i o n w i t h i n f l a m m a t o r y f a c t o r ( s ) t o c a u s e e a r l y S E C i n j u r y i n d e p e n d e n t l y o f P M N s ( F i g u r e 8 ) . T h i s p o s s i b i l i t y r e m a i n s u n t e s t e d . I n t h i s r e g a r d , i t i s i n t e r e s t i n g t h a t t h e M C T / L P S c o t r e a t m e n t c a u s e s a n e a r l y a n d s u s t a i n e d e l e v a t i o n i n T N F - a a n d , l i k e e a r l y S E C i n j u r y , t h i s w a s n o t r e d u c e d b y P M N d e p l e t i o n . T h e p o s s i b i l i t y t h a t e a r l y S E C i n j u r y i n t h i s m o d e l m a y b e d u e t o i n f l a m m a t o r y f a c t o r s s u c h a s L P S i t s e l f o r T N F - a a c t i n g o n M C T - c o m p r o m i s e d S E C S d e s e r v e s f u r t h e r a t t e n t i o n . 2 4 8 F i g u r e 6 . 8 . fl i t a t i v e S e g u f e n c e o f g fi n t s i n t h e P a t h a g e n e s i s o f S v n e L l i s t i c L j v e r l n i u a n r f r o m M C E P S C o e x p _ o s u _ r e . M C T i s b i o a c t i v a t e d t o i t s t o x i c m e t a b o l i t e ( M C T P ) b y H P C s a n d S E C S . A t a s u b t h r e s h o l d M C T d o s e , M C T P i n d u c e s a h o m e o s t a t i c c h a n g e i n H P C s a n d S E C S b u t n o t f r a n k i n j u r y ; h o w e v e r , t h e c h a n g e m a k e s t h e s e c e l l s m o r e s u s c e p t i b l e t o i n j u r y . L P S a c t s i n c o n c e r t w i t h M C T P t o c a u s e e a r l y S E C i n j u r y b y a n u n k n o w n m e c h a n i s m t h a t i s i n d e p e n d e n t o f P M N s . C i r c u l a t i n g L P S a l s o a c t i v a t e s K C s t o r e l e a s e T N F - a a n d p e r h a p s C l N C - 1 ( n o t s h o w n ) . A c t i v a t e d S E C S a n d H P C s p r o d u c e C l N C - 1 a n d p e r h a p s o t h e r f a c t o r s ( n o t s h o w n ) t h a t w o r k i n c o m b i n a t i o n w i t h T N F - a t o e n h a n c e m i g r a t i o n o f P M N s i n t o p a r e n c h y m a a n d p r o m o t e t h e i r a c t i v a t i o n . M C T i t s e l f m a y c o n t r i b u t e t o P M N a c t i v a t i o n , w h i c h r e s u l t s i n t h e r e l e a s e o f p r o t e a s e s a n d p o s s i b l y o t h e r c y t o t o x i c f a c t o r s t h a t d a m a g e H P C s a n d c a u s e a d d i t i o n a l i n j u r y t o S E C S . [ I m a g e i n t h i s d i s s e r t a t i o n i s p r e s e n t e d i n c o l o r ] . 2 4 9 S i n u s o l d T o F a c t o r s M 1 0 1 0 M A p p r o x i m a t e T i m e ( h r ) — — — > 2 5 0 . o t c . ) . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 . 0 O I O . . , . 2 2 > : [ I n j u r y ] : 7 . . a a i O 0 l l 8 i f T o u n d e r s t a n d b e t t e r t h e i n t e r d e p e n d e n c e b e t w e e n P M N s a n d o t h e r i n f l a m m a t o r y f a c t o r s , t h e e f f e c t o f P M N d e p l e t i o n o n p l a s m a T N F - a w a s s t u d i e d . I n r a t s g i v e n a n a c u t e l y t o x i c d o s e o f L P S , P M N d e p l e t i o n s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . H o w e v e r , i n t h i s s t u d y , p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s a t 6 a n d 1 8 h o u r s w a s u n a f f e c t e d b y P M N d e p l e t i o n ( F i g u r e s 6 . 6 A a n d 6 . 6 8 , r e s p e c t i v e l y ) . T h i s s u g g e s t s t h a t P M N s a r e n o t n e e d e d t o p r o v o k e o r m a i n t a i n T N F - d r e l e a s e i n t h i s m o d e l . T r e a t m e n t o f r a t s w i t h T N F - a - d e p l e t i n g a g e n t s o r w i t h G d C l a , a K C i n a c t i v a t o r , d e c r e a s e d h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n ( T a b l e 6 . 3 ) . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t T N F - d r e l e a s e d b y a c t i v a t e d K C s c o n t r i b u t e s t o P M N a c c u m u l a t i o n a n d / o r r e t e n t i o n i n l i v e r ( F i g u r e 6 . 8 ) . T h i s f i n d i n g i s d i f f e r e n t f r o m o b s e r v a t i o n s i n r a t s g i v e n a l a r g e r , h e p a t o t o x i c d o s e o f L P S ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ) o r i n a m o d e l o f L P S p o t e n t i a t i o n o f a f l a t o x i n B 1 h e p a t o t o x i c i t y ( B a r t o n e t a l . , 2 0 0 1 ) , i n w h i c h n o c h a n g e i n h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n o c c u r r e d a f t e r T N F - o d e p l e t i o n . H o w e v e r , i n a l i v e r / i s c h e m i a r e p e r f u s i o n m o d e l , G d C I a t r e a t m e n t r e s u l t e d i n a d e c r e a s e i n P M N i n f i l t r a t i o n ( M o s h e r e t a l . , 2 0 0 1 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e e f f e c t s o f T N F - a d e p l e t o r s o n h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n w e r e m e a s u r e d a t 1 8 h o u r s ( T a b l e 6 . 3 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t i n i t i a l i n f l u x o f P M N s i n t o l i v e r s o c c u r s i n d e p e n d e n t l y o f T N F - a b u t t h a t t i s s u e r e t e n t i o n o f P M N s i s m e d i a t e d b y t h i s c y t o k i n e . I n t e r e s t i n g l y , t h e i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n i s s h o r t l i v e d ( a b o u t 2 h o u r s ) i n t h e o t h e r m o d e l s n o t e d a b o v e , w h e r e a s a p r o l o n g e d i n c r e a s e i n T N F - d o c c u r s i n t h i s m o d e l ( F i g u r e 6 . 6 8 ) . I t m a y b e t h a t t h e s u s t a i n e d r e l e a s e o f T N F - o u n d e r l i e s t h e 2 5 1 p r o l o n g e d a c c u m u l a t i o n o f P M N s . I n d e e d , i n a n i m a l s g i v e n o n l y L P S , i n w h i c h t h e e l e v a t i o n i n p l a s m a T N F - a i s t r a n s i e n t ( C h e n s u e e t a l . , 1 9 9 1 ; l i m u r o e t a l . , 1 9 9 4 ) , t h e a c c u m u l a t i o n o f P M N s i n t h e l i v e r i s r e l a t i v e l y s h o r t - l i v e d ( F i g u r e 6 . 1 0 ) . T N F - a m i g h t b e i n v o l v e d i n p r o m o t i n g h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n / r e t e n t i o n i n t h i s m o d e l b y a c t i v a t i n g S E C S ( V a s s e l l i , 1 9 9 2 ; B r a d h a m e t a l . 1 9 9 8 ; S a k a m o t o e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h i s c y t o k i n e c a n i n c r e a s e t h e e x p r e s s i o n o n e n d o t h e l i a l c e l l s o f a d h e s i o n m o l e c u l e s t h a t p r o m o t e P M N r e t e n t i o n ( M a y a n d G n o s h , 1 9 9 8 ; S a k a m o t o e t a l . , 2 0 0 2 ) . M o r e o v e r , P M N s c a n b e a c t i v a t e d b y i n t e r a c t i o n w i t h a d h e s i o n m o l e c u l e s e x p r e s s e d o n e n d o t h e l i a l c e l l s ( C r o c k e t t - T o r a b i , 1 9 9 8 ; L a w s o n , e t a l . , 2 0 0 0 ) , a n d s u c h a c t i v a t i o n m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e l a t e S E C i n j u r y t h a t a p p e a r e d t o h a v e a P M N - d e p e n d e n t c o m p o n e n t ( F i g u r e 6 . 8 ) . I t s h o u l d b e n o t e d , h o w e v e r , t h a t t h e b i o l o g i c s i g n i f i c a n c e o f t h e p r o l o n g e d b u t s m a l l i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - a ( F i g u r e 6 . 6 8 ) i s u n c l e a r . L o c a l t i s s u e T N F - a c o n c e n t r a t i o n m a y b e s u b s t a n t i a l l y g r e a t e r t h a n t h a t c i r c u l a t i n g i n p l a s m a . F u r t h e r s t u d y w i l l b e r e q u i r e d t o a s c e r t a i n i f t h e s m a l l c o n c e n t r a t i o n s d e t e c t e d h a v e a c o n t r i b u t o r y r o l e i n t h e p a t h o g e n e s i s i n t h i s m o d e l . ' S i n c e t h e d e c r e a s e i n P M N a c c u m u l a t i o n c a u s e d b y T N F - a - d e p l e t i n g a g e n t s w a s n o t c o m p l e t e , o t h e r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n a d d i t i o n t o T N F - a m a y b e i n v o l v e d . C l N C - 1 , a r a t n e u t r o p h i l c h e m o a t t r a c t a n t ( Z h a n g e t a l . , 1 9 9 5 ; L u s t e r , 1 9 9 8 ) , w a s s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d i n p l a s m a 2 h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , r e g a r d l e s s o f M C T t r e a t m e n t ( F i g u r e 6 . 1 0 ) . T h i s r e s u l t s u g g e s t s 2 5 2 t h a t C I N C - 1 c o n t r i b u t e s t o t h e r e c r u i t m e n t o f h e p a t i c P M N s ( F i g u r e 6 . 8 ) . P l a s m a C I N C - 1 c o n c e n t r a t i o n d e c l i n e d a f t e r 2 h o u r s b u t r e m a i n e d s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d i n t h e L P S - t r e a t e d a n i m a l s ; h o w e v e r , t h e d e c l i n e i n C l N C - 1 w a s m u c h s l o w e r i n r a t s c o t r e a t e d w i t h M C T . T h i s m a i n t e n a n c e o f C l N C - 1 p r o d u c t i o n m a y c o n t r i b u t e t o t h e g r e a t e r p e r s i s t e n c e o f P M N s i n t h e l i v e r s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t s . I t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t t h e p r o l o n g e d e l e v a t i o n i n C I N C - 1 a n d i n h e p a t i c P M N s i n M C T / L P S - t r e a t e d r a t s i s t h e r e s u l t o f C l N C - 1 g e n e e x p r e s s i o n m a i n t a i n e d b y p e r s i s t e n t l y e l e v a t e d p r o d u c t i o n o f c y t o k i n e s s u c h a s T N F - a ( D e u t s c h m a n e t a l . , 1 9 9 6 ; O h k u b o e t a l . , 1 9 9 8 ; C a l k i n s e t a l . , 2 0 0 2 ) . T N F - d h a s b e e n s h o w n t o i n d u c e C I N C - 1 p r o d u c t i o n b y h e p a t o c y t e s i n v i t r o ( T h o r t o n e t a l . , 1 9 9 1 ; O h k u b o e t a l . , 1 9 9 8 ) . M o r e o v e r , Z h a n g e t a l . ( 1 9 9 5 ) d e m o n s t r a t e d t h a t a n a n t i - C I N C a n t i b o d y a t t e n u a t e s h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n i n L P S - t r e a t e d r a t s , a n d M a h e r e t a l . ( 1 9 9 7 ) f o u n d t h a t a d e n o v i r u s - m e d i a t e d o v e r e x p r e s s i o n o f C l N C - 1 i n r a t l i v e r r e s u l t s i n P M N a c c u m u l a t i o n . A c c o r d i n g l y , C l N C - 1 i s i m p o r t a n t i n s e v e r a l m o d e l s i n r e c r u i t i n g P M N s i n t o t h e l i v e r . T N F - d d e p l e t i o n i n t h i s m o d e l r e s u l t s i n r e d u c e d l i v e r i n j u r y ( Y e e e t a l . , 2 0 0 3 a ) . I n a d d i t i o n t o i t s a p p a r e n t r o l e i n P M N a c c u m u l a t i o n ( T a b l e 6 . 3 ) , t h i s c y t o k i n e m i g h t p r o m o t e i n j u r y b y p r i m i n g P M N s t o r e l e a s e t o x i c p r o d u c t s t h a t c a n d a m a g e n e a r b y c e l l s ( N a g a k i e t a l . , 1 9 9 1 ; V a s s e l l i , 1 9 9 2 ; K u s h i m o t o e t a l . , 1 9 9 6 ; F i g u r e 6 . 8 ) . H o w e v e r , a d d i t i o n a l i n f l a m m a t o r y f a c t o r s m u s t b e r e q u i r e d , s i n c e L P S a l o n e r e s u l t e d i n e l e v a t e d p l a s m a T N F - a a n d h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n b u t d i d n o t p r o d u c e h e p a t i c i n j u r y ( F i g u r e 6 . 1 0 ) . I n d e e d , o n e a c t i o n o f T N F - d m i g h t b e t o r e n d e r t h e H P C s m o r e s u s c e p t i b l e t o i n j u r y ( A d a m s o n a n d B i l l i n g s , 1 9 9 2 ; 2 5 3 i n t e r a c t i o n s a m o n g t o x i c a n t s . F o r e x a m p l e , a l c o h o l c o n s u m p t i o n c a n r e s u l t i n B r a d h a m e t a l . , 1 9 9 8 ; X u e t a l , 1 9 9 8 ; J o n e s e t a l . , 2 0 0 0 ; H o e k a n d P a s t o r i n o , 2 0 0 2 ) M C T w a s a b l e t o i n d u c e P M N d e g r a n u l a t i o n i n v i t r o a t n o n - t o x i c c o n c e n t r a t i o n s ( F i g u r e s 6 . 7 A a n d 6 . 7 8 ) . T r e a t m e n t o f i s o l a t e d P M N s w i t h 0 . 4 a n d 0 . 8 m M M C T r e s u l t e d i n a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n M P O a c t i v i t y b u t n o c h a n g e i n L D H r e l e a s e . A s s u m i n g t h a t M C T i s r a p i d l y a b s o r b e d a n d d i s t r i b u t e d i n t o t o t a l b o d y w a t e r , a d o s e o f 1 0 0 m g / k g c o u l d p r o d u c e a t r a n s i e n t p l a s m a M C T c o n c e n t r a t i o n a p p r o a c h i n g 0 . 5 m M , w h i c h i s i n t h e r a n g e n e e d e d t o c a u s e P M N a c t i v a t i o n i n v i t r o . T h e 1 0 0 m g M C T / k g d o s e d i d n o t b y i t s e l f r e s u l t i n H P C o r S E C i n j u r y o r r e s u l t i n h e p a t i c P M N s e q u e s t r a t i o n . I t i s p o s s i b l e t h a t i n t h e p r e s e n c e o f P M N s r e c r u i t e d b y L P S , t h i s o t h e r w i s e n o n t o x i c d o s e o f M C T p r o m o t e s P M N a c t i v a t i o n , r e s u l t i n g i n t h e r e l e a s e o f t o x i c f a c t o r s t h a t p r e c i p i t a t e i n j u r y ( F i g u r e 8 ) . H o w e v e r , M C T e l i m i n a t i o n b y m e t a b o l i s m i s r a p i d i n v i v o ( A l l e n e t a l . , 1 9 7 2 ) ; t h e r e f o r e , w h e t h e r t i s s u e M C T c o n c e n t r a t i o n r e m a i n s e l e v a t e d f o r a p e r i o d s u f f i c i e n t t o c o n t r i b u t e t o P M N a c t i v a t i o n i s u n c e r t a i n . I t i s c o n c e i v a b l e t h a t e a r l y e x p o s u r e o f c i r c u l a t i n g P M N s t o M C T p r i m e s t h e m t o r e s p o n d w i t h h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y t o o t h e r s t i m u l i ( N a g a k i e t a l . , 1 9 9 1 ; V a s s e l l i , 1 9 9 2 ; K u s h i m o t o e t a l . , 1 9 9 6 ) . E p i s o d i c e x p o s u r e t o L P S a n d p r o b a b l y o t h e r i n f l a m m a g e n s i s c o m m o n p l a c e , a n d r e s u l t i n g , m o d e s t i n f l a m m a t i o n m a y b e a n i m p o r t a n t f a c t o r g o v e m i n g s u s c e p t i b i l i t y o f i n d i v i d u a l s t o i n t o x i c a t i o n b y a v a r i e t y o f c h e m i c a l s ( G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ) . M o r e o v e r , m o d e s t i n f l a m m a t i o n m a y p l a y a r o l e i n 2 5 4 e n d o t o x e m i a i n p e o p l e a n d a n i m a l s ( T a r a o e t a l . , 1 9 7 7 ; B o d e e t a l . , 1 9 8 7 ) , a n d i t i s c o n c e i v a b l e t h a t t h i s m a y c o n t r i b u t e t o e t h a n o l - d r u g i n t e r a c t i o n s b y l o w e r i n g t h e t h r e s h o l d f o r d r u g t o x i c i t y . R e s u l t s o f t h e p r e s e n t s t u d y s u g g e s t t h a t p e o p l e e x p e r i e n c i n g a m i l d i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e d u e t o a l c o h o l c o n s u m p t i o n o r o t h e r c o n d i t i o n s m a y b e a t p a r t i c u l a r r i s k f o r i l l n e s s f r o m f o o d s o r a l t e r n a t i v e m e d i c i n e s t h a t c o n t a i n P A S o r o t h e r p o t e n t i a l l y h e p a t o t o x i c c o m p o u n d s . I n s u m m a r y , P M N d e p l e t i o n i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s p r o t e c t e d a g a i n s t H P C i n j u r y a n d c a u s e d a m o d e s t a t t e n u a t i o n o f l a t e - o n s e t S E C i n j u r y . A c c o r d i n g l y , P M N s a p p e a r t o b e c r i t i c a l l y i m p o r t a n t i n t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y i n t h i s m o d e l . F i g u r e 6 . 8 d e p i c t s a s e r i e s o f e v e n t s t h a t c o u l d e x p l a i n t h e r o l e t h a t P M N s a n d o t h e r i n f l a m m a t o r y f a c t o r s p l a y i n t h e s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y r e s u l t i n g f r o m M C T a n d L P S . C o e x p o s u r e t o t h e s e t w o a g e n t s l i k e l y c a u s e s e a r l y S E C a c t i v a t i o n a n d i n j u r y b y u n k n o w n m e c h a n i s m s . T h i s r e s u l t s i n a r r e s t o f P M N s i n s i n u s o i d s . C o n c u r r e n t a c t i v a t i o n o f K C s a n d p e r h a p s o t h e r c e l l s c a u s e s r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r y f a c t o r s s u c h a s T N F - d a n d C I N C - 1 , w h i c h p r o m p t P M N m i g r a t i o n a n d a c t i v a t i o n i n p a r e n c h y m a . A c t i v a t i o n o f P M N s m a y b e e n h a n c e d b y M C T . A c t i v a t e d P M N s r e l e a s e t o x i c f a c t o r s t h a t d a m a g e H P C s s e n s i t i z e d t o i n j u r y b y M C T e x p o s u r e a n d c a u s e p r o g r e s s i o n o f S E C i n j u r y . A l t h o u g h c o n s i s t e n t w i t h a v a i l a b l e e v i d e n c e ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 a ; Y e e e t a l . , 2 0 0 3 a ) , t h i s s c e n a r i o r e p r e s e n t s a n h y p o t h e s i s t h a t r e q u i r e s a d d i t i o n a l t e s t i n g . N e v e r t h e l e s s , i t i s c l e a r t h a t P M N s , a l o n g w i t h T N F - a , K C s , a n d o t h e r i n f l a m m a t o r y c o m p o n e n t s , a r e p a r t o f a n a r r a y o f f a c t o r s c o n t r i b u t i n g t o t h e s y n e r g i s t i c , h e p a t o t o x i c i n t e r a c t i o n b e t w e e n M C T a n d L P S . 2 5 5 C H A P T E R 7 T h e C o a g u l a t i o n S y s t e m C o n t r i b u t e s t o S y n e r g i s t i c L i v e r I n j u r y f r o m E x p o s u r e t o M o n o c r o t a l i n e a n d B a c t e r i a l L i p o p o l y s a c c h a r i d e 2 5 6 7 . A . A b s t r a c t C o e x p o s u r e t o a s m a l l , n o n - i n j u r i o u s d o s e o f b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ; 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) a n d a s m a l l , n o n t o x i c d o s e o f t h e f o o d - b o m e t o x i n m o n o c r o t a l i n e ( M C T ; 1 0 0 m g / k g ) l e a d s t o s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y i n S p r a g u e - D a w l e y r a t s . I n f l a m m a t o r y f a c t o r s , s u c h a s K u p f f e r c e l l s ( K C s ) , t u m o r n e c r o s i s f a c t o r ( T N F ) - a a n d n e u t r o p h i l s ( p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s ; P M N s ) , a r e c r i t i c a l t o t h e p a t h o g e n e s i s . I n a s m u c h a s a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l ( S E C ) i n j u r y p r e c e d e h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l ( H P C ) i n j u r y a n d s i n c e f i b r i n d e p o s i t i o n o c c u r s w i t h i n l i v e r l e s i o n s , t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m m i g h t b e a c r i t i c a l c o m p o n e n t o f i n j u r y . I n t h i s s t u d y , t h i s h y p o t h e s i s i s t e s t e d , a n d t h e i n t e r d e p e n d e n c e o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d i n f l a m m a t o r y f a c t o r s i s e x p l o r e d . A d m i n i s t r a t i o n o f t h e a n t i c o a g u l a n t s h e p a r i n o r w a r f a r i n t o M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s a t t e n u a t e d H P C a n d S E C i n j u r y . M o r p h o m e t r i c a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t a n t i c o a g u l a n t t r e a t m e n t s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d t h e a r e a o f c e n t r i l o b u l a r a n d m i d z o n a l l e s i o n s . H e p a r i n t r e a t m e n t a l s o r e d u c e d f i b r i n d e p o s i t i o n i n t h e s e r e g i o n s . F u r t h e r m o r e , a n t i c o a g u l a n t t r e a t m e n t d e c r e a s e d ' - h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n b u t d i d n o t a f f e c t p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n . N e i t h e r K C i n a c t i v a t i o n n o r T N F - a d e p l e t i o n p r e v e n t e d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . P M N d e p l e t i o n , h o w e v e r , p r e v e n t e d c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n , s u g g e s t i n g t h a t P M N s a r e n e e d e d f o r t h i s r e s p o n s e . T h e s e r e s u l t s p r o v i d e e v i d e n c e t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d i t s i n t e r p l a y w i t h P M N s a r e i m p o r t a n t i n t h e p a t h o g e n e s i s o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . 2 5 7 7 . 8 . I n t r o d u c t i o n H i s t o p a t h o l o g i c a l e x a m i n a t i o n r e v e a l e d p r o n o u n c e d c o n g e s t i o n , h e m o r r h a g e a n d f i b r i n d e p o s i t i o n i n t h e h e p a t i c l e s i o n s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t s ( Y e e e t a l . , 2 0 0 0 b , 2 0 0 3 b ) . T h e s e r e s u l t s r a i s e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m h a s a c a u s a l r o l e i n h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s i n t h i s m o d e l ( Y e e e t a l . , 2 0 0 3 b ) . A c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n c a s c a d e o c c u r s e i t h e r i n t r i n s i c a l l y v i a s u r f a c e - m e d i a t e d r e a c t i o n s o r e x t r i n s i c a l l y t h r o u g h a t i s s u e f a c t o r ( T F ) - d e r i v e d p a t h w a y . A t t h e d i s t a l e n d o f t h e c a s c a d e , a c t i v a t e d f a c t o r X c o n v e r t s p r o t h r o m b i n i n t o a c t i v e t h r o m b i n . T h r o m b i n i n t u r n c a n c o n v e r t c i r c u l a t i n g f i b r i n o g e n i n t o i n s o l u b l e f i b r i n c l o t s ( B l o o m , 1 9 9 0 ; S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ) . I t h a s b e e n p o s t u l a t e d t h a t f i b r i n d e p o s i t i o n i n t h e l i v e r l e a d s t o l o c a l s i n u s o i d a l h y p o p e r f u s i o n , w h i c h m i g h t c o n t r i b u t e t o H P C i n j u r y ( D e l e v e e t a l . , 1 9 9 6 ; B a e t a l . , 2 0 0 0 ; S a e t r e e t a l . , 2 0 0 0 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . L P S a c t i v a t e s t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m p r i m a r i l y t h r o u g h t h e e x p r e s s i o n o f T F o n e n d o t h e l i a l c e l l s , m o n o c y t e s a n d P M N s ( B o n e , 1 9 9 2 ; P o l a c k e t a l . , 1 9 9 7 ; T o d o r o k i e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h r o m b i n h a s b e e n i m p l i c a t e d i n t h e r e l e a s e o f p r o i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s a n d o t h e r f a c t o r s f r o m m a c r o p h a g e s , m o n o c y t e s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s a n d i s a w e a k P M N c h e m o a t t r a c t a n t ( B i z i o s e t a l . , 1 9 8 6 ; H o f f m a n a n d C o o p e r , 1 9 9 5 ; M o u l i n e t a l . , 1 9 9 6 ; H o l l a n d e t a l . , 1 9 9 8 ) . A c c o r d i n g l y , t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m m i g h t b e i n v o l v e d i n t h e u p r e g u l a t i o n o f 2 5 8 p r o i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s , i n a d d i t i o n t o f o r m i n g f i b r i n c l o t s . I n d e e d , a t a c u t e l y t o x i c d o s e s o f L P S , a n a c t i v a t e d c o a g u l a t i o n s y s t e m i s c r i t i c a l f o r l i v e r p a t h o g e n e s i s , a n d i t a p p e a r s t h a t i n t e r p l a y b e t w e e n t h r o m b i n a n d i n f l a m m a t o r y f a c t o r s i s i m p o r t a n t ( M o u l i n e t a l . , 2 0 0 1 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h e d e g r e e t o w h i c h t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m h a s a r o l e i n t h e s y n e r g i s t i c i n j u r y f r o m t h e c o m b i n a t i o n o f s m a l l d o s e s o f M C T a n d L P S h a s n o t b e e n e x p l o r e d . A c c o r d i n g l y , t h e p r e s e n t s t u d y w a s d e s i g n e d t o i n v e s t i g a t e i t s r o l e i n M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y a n d t o e x p l o r e t h e i n t e r d e p e n d e n c e b e t w e e n t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d i n f l a m m a t o r y f a c t o r s t h a t a r e c r i t i c a l f o r t h e t o x i c r e s p o n s e . 7 . 0 . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 7 . C . 1 . M a t e r i a l s D i m e t h y l s u l f o x i d e ( D M S O ) , h e p a r i n ( T y p e I I , d i s o d i u m s a l t ; H E P ) , i s o p e n t a n e , L P S ( E s c h e r i c h i a c o l i , s e r o t y p e 0 1 2 8 : B 1 2 , 1 . 7 x 1 0 6 e n d o t o x i n u n i t s ( E U s ) / m g ) , p e n t o x i f y l l i n e ( P T X ) , p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) , s o d i u m c i t r a t e , a n d w a r f a r i n ( 3 - ( d - a c e t o n y l b e n z y l ) - 4 - h y d r o x y c o u m a r i n ; W A R F ) w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . G a d o l i n i u m c h l o r i d e - 6 H 2 0 ( G d C l a ) w a s p u r c h a s e d f r o m A l d r i c h C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . S e r u m d i r e c t e d a g a i n s t T N F - o t ( a n t i - r a t T N F - a s e r u m ; A T S ) w a s p r o d u c e d i n N e w Z e a l a n d W h i t e r a b b i t s ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 3 ) . R a b b i t a n t i - r a t n e u t r o p h i l a n t i b o d y ( n e u t r o p h i l a n t i - s e r u m ( N A S ) ) a n d c o n t r o l r a b b i t s e r u m ( C S ) w e r e o b t a i n e d f r o m 2 5 9 I n t e r - C e l l T e c h n o l o g i e s , I n c . ( H o p e w e l l , N J ) . G o a t a n t i - r a t f i b r i n o g e n w a s p u r c h a s e d f r o m I C N P h a r m a c e u t i c a l s ( A u r o r a , O H ) . H o r s e s e r u m w a s o b t a i n e d f r o m V e c t o r L a b o r a t o r i e s ( B u r l i n g a m e , C A ) . D o n k e y a n t i - g o a t s e c o n d a r y a n t i b o d y c o n j u g a t e d t o A l e x a 5 9 4 w a s p u r c h a s e d f r o m M o l e c u l a r P r o b e s ( E u g e n e , O R ) . M C T w a s a c q u i r e d f r o m T r a n s W o r l d C h e m i c a l s ( R o c k v i l l e , M D ) . S t e r i l e s a l i n e w a s a c q u i r e d f r o m A b b o t t L a b o r a t o r i e s ( N o r t h C h i c a g o , I L ) . F o r r n a l i n f i x a t i v e w a s o b t a i n e d f r o m S u r g i p a t h M e d i c a l I n d u s t r i e s , I n c . ( R i c h m o n d , I L ) . D i a g n o s t i c k i t s 5 8 U V a n d 5 9 U V f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A S T ) a n d a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A L T ) a c t i v i t i e s , r e s p e c t i v e l y , a n d d i a g n o s t i c k i t 8 8 6 - A f o r d e t e r m i n a t i o n o f f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n w e r e a l s o p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y ( S t . L o u i s , M O ) . E n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) k i t f o r h y a l u r o n i c a c i d ( H A ) w a s a c q u i r e d f r o m C o r g e n i x , I n c . ( W e s t m i n s t e r , C O ) . E L I S A k i t s f o r r a t T N F - o r a n d r a t m o n o c y t e c h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n — 1 ( M O P - 1 ) w e r e p u r c h a s e d f r o m B i o s o u r c e l n t e m a t i o n a l , I n c . ( C a m a r i l l o , C A ) . 7 . C . 2 . A n i m a l s M a l e , S p r a g u e - D a w l e y r a t s ( C r l : C D ( S D ) I G S 8 R , C h a r l e s R i v e r , P o r t a g e , M I ) w e i g h i n g 2 0 0 - 3 0 0 g w e r e u s e d f o r a l l s t u d i e s . O t h e r w i s e , f o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 7 . 0 . 3 . T r e a t m e n t P r o t o c o l 2 6 0 F o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 2 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 7 . 0 . 4 . T r e a t m e n t w i t h H E P R a t s w e r e g i v e n H E P ( 2 0 0 0 U / k g ) o r s a l i n e V e h i n t r a v e n o u s l y 1 . 5 h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h i s t r e a t m e n t h a s b e e n s h o w n t o i n a c t i v a t e t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d p r e v e n t i n j u r y f r o m a n h e p a t o t o x i c d o s e o f L P S ( M o u l i n e t a l . , 1 9 9 6 ) . R a t s w e r e k i l l e d a n d l i v e r i n j u r y w a s a s s e s s e d 1 8 h o u r s a f t e r M C T t r e a t m e n t . 7 . 0 . 5 . T r e a t m e n t w i t h W A R F R a t s w e r e p r e t r e a t e d w i t h W A R F ( 7 . 5 m g / k g ) o r a n e q u i v a l e n t v o l u m e o f D M S O V e h i n t r a p e r i t o n e a l l y 3 4 a n d 1 0 h o u r s b e f o r e M C T a d m i n i s t r a t i o n . T h i s t r e a t m e n t h a s b e e n s h o w n t o i n a c t i v a t e t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 b ) . R a t s w e r e k i l l e d a n d l i v e r i n j u r y w a s a s s e s s e d 1 8 h o u r s a f t e r M C T t r e a t m e n t . 7 . 0 . 6 . A s s e s s m e n t o f H e p a t i c I n j u r y a n d P l a s m a T N F - a a n d M O P - 1 C o n c e n t r a t i o n s H P C i n j u r y w a s e v a l u a t e d b y i n c r e a s e s i n t h e a c t i v i t i e s o f A L T a n d A S T i n p l a s m a . A n E L I S A k i t w a s u s e d t o m e a s u r e p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n , a m a r k e r o f h e p a t i c S E C i n j u r y . P l a s m a T N F - a a n d M C P - 1 c o n c e n t r a t i o n s w e r e 2 6 1 d e t e r m i n e d w i t h a r a t T N F - o a n d a r a t M C P - I E L I S A k i t , r e s p e c t i v e l y . O t h e r w i s e , f o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t t h i s s e c t i o n r e f e r t o C h a p t e r 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 7 . C . 7 . A s s e s s m e n t o f P l a s m a F i b r i n o g e n C o n c e n t r a t i o n P l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n w a s e v a l u a t e d w i t h a B B L f i b r o m e t e r ( B e c t o n , D i c k s o n a n d C o m p a n y , H u n t V a l l e y , M D ) a n d a f i b r i n o g e n d i a g n o s t i c k i t . P l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d i n t h e H E P a n d W A R F s t u d i e s w i t h M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s , a s w e l l a s i n c o t r e a t e d a n i m a l s t h a t u n d e n i v e n t K C i n a c t i v a t i o n o r T N F - a o r P M N d e p l e t i o n . I n t h e K C i n a c t i v a t i o n s t u d y , G d C I 3 ( 1 0 m g / k g ) w a s a d m i n i s t e r e d t o r a t s 2 4 h o u r s b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n . I n t h e T N F - d d e p l e t i o n s t u d i e s , e i t h e r P T X ( 1 0 0 m g / k g ) o r A T S ( 1 m V r a t ) w a s a d m i n i s t e r e d 1 h o u r b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n . I n t h e P M N d e p l e t i o n s t u d y , a n i m a l s w e r e p r e t r e a t e d w i t h N A S 2 4 ( 1 m V r a t ) a n d 8 ( 0 . 5 m l / r a t ) h o u r s b e f o r e L P S a d m i n i s t r a t i o n . T h e s e t r e a t m e n t r e g i m e n s w e r e e f f e c t i v e i n p r e v e n t i n g K C a c t i v a t i o n , t h e L P S - i n d u c e d i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - a a c t i v i t y a n d h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n , r e s p e c t i v e l y ( Y e e e t a l . , 2 0 0 3 a , 2 0 0 3 0 ) . A d m i n i s t r a t i o n o f G d C l 3 _ P T X , A T S , o r N A S d i d n o t i n t e r f e r e w i t h M C T b i o a c t i v a t i o n ( Y e e e t a l . , 2 0 0 3 a , 2 0 0 3 c ) . 7 . 0 . 8 . H i s t o p a t h o l o g i c E v a l u a t i o n a n d M o r p h o m e t r y F o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t h i s t o p a t h o l o g i c e v a l u a t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . F o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t m o r p h o m e t r y , r e f e r t o C h a p t e r 5 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 2 6 2 7 . 0 . 9 . E n u m e r a t i o n o f H e p a t i c N e u t r o p h i l s F o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 6 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 7 . 0 . 1 0 . l m m u n o h i s t o c h e m i s t r y F o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t f i b r i n d e p o s i t i o n l m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , r e f e r t o C h a p t e r 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 7 . 0 . 1 1 . Q u a n t i f i c a t i o n o f H e p a t i c F i b r i n D e p o s i t i o n F o r m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t t h i s s e c t i o n , r e f e r t o C h a p t e r 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . 7 . 0 . 1 2 . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n i S . E . M . W h e n v a r i a n c e s w e r e n o t h o m o g e n e o u s , d a t a w e r e l o g - t r a n s f o r m e d b e f o r e a n a l y s i s . D a t a e x p r e s s e d a s p e r c e n t a g e s w e r e t r a n s f o r m e d b y a r c s i n e s q u a r e r o o t p r i o r t o a n a l y s i s . D a t a f o r s i n g l e c o m p a r i s o n s w e r e a n a l y z e d b y S t u d e n t ’ s t - t e s t o r , w h e n a p p r o p r i a t e , F i s h e r ’ s e x a c t t e s t ( S t e e l e e t a l . , 1 9 9 7 ) . M u l t i p l e c o m p a r i s o n s o f h o m o g e n e o u s d a t a w e r e a n a l y z e d b y o n e - w a y o r t w o - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) , a s a p p r o p r i a t e , a n d g r o u p m e a n s w e r e c o m p a r e d u s i n g T u k e y ’ s o m e g a p o s t h o c t e s t ( S t e e l e e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e c r i t e r i o n f o r s i g n i f i c a n c e w a s p s 0 . 0 5 f o r a l l c o m p a r i s o n s . 2 6 3 7 . 0 . R e s u l t s 7 . 0 . 1 . A n t i c o a g u l a n t T r e a t m e n t o f M C T / L P S - C o e x p o s e d A n i m a l s T w o a n t i c o a g u l a n t s , H E P a n d W A R F , w e r e u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e r o l e o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . T h e s e a n t i c o a g u l a n t s i n h i b i t t h e t h r o m b i n - c a t a l y z e d c o n v e r s i o n o f c i r c u l a t i n g f i b r i n o g e n t o f i b r i n b y d i f f e r e n t m e c h a n i s m s ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ) . H E P e n h a n c e s t h e b i n d i n g o f a n t i t h r o m b i n I I I t o t h r o m b i n t o i n h i b i t t h r o m b i n a c t i v i t y . I n c o n t r a s t , W A R F i n h i b i t s t h e f o r m a t i o n o f v i t a m i n K - d e p e n d e n t c o a g u l a t i o n f a c t o r s ( i . e . , t h r o m b i n p r e c u r s o r s ; M a j e r u s e f a l . , 1 9 9 6 ) . D u r i n g a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , p l a s m a f i b r i n o g e n i s c o n v e r t e d t o f i b r i n r e s u l t i n g i n a d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n ( C o p p l e e t a l . , 2 0 0 0 a ) , a n d t h i s d e c r e a s e w a s u s e d a s a b i o m a r k e r f o r a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d a s a m o n i t o r o f a n t i c o a g u l a n t e f f e c t i v e n e s s . P l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n w a s s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d i n r a t s t r e a t e d w i t h M C T / L P S . B o t h H E P a n d W A R F p r e v e n t e d t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n M C T / L P S - c o e x p o s e d a n i m a l s ( F i g u r e s 7 . 1 A a n d 7 . 1 8 , r e s p e c t i v e l Y ) . c o n f i r m i n g t h e i r e f f e c t i v e n e s s . 7 . 0 . 2 . E f f e c t o f H E P o n M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r I n j u r y P l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s , t w o b i o m a r k e r s o f H P C i n j u r y , w e r e e l e v a t e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e s 7 . 2 A a n d 7 . 2 8 , r e s p e c t i v e l y ) . H E P t r e a t m e n t a t t e n u a t e d t h e i n c r e a s e i n 2 6 4 F i g u r e 7 . 1 . E f f e c t o f A n t i c o a g a l a n t s o n C o a g u l a t i o n S y s t e m A c t i v a t i o n i n M C T / L P S - C o t r e a t e d A n i m a l s . E i t h e r H E P o r V e h i c l e ( V e h ) w a s a d m i n i s t e r e d 1 . 5 h o u r s a f t e r L P S ( P a n e l A ) , o r W A R F o r V e h w a s a d m i n i s t e r e d 1 0 a n d 3 4 h o u r s b e f o r e M C T a d m i n i s t r a t i o n ( P a n e l B ) . L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) o r V e h w a s a d m i n i s t e r e d t o r a t s 4 h o u r s a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) o r i t s V e h . P l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n , a b i o m a r k e r f o r c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n , w a s d e t e r m i n e d 1 8 h o u r s a f t e r M C T o r i t s V e h w a s a d m i n i s t e r e d . N = 4 - 1 4 a n i m a l s . 8 ‘ S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l l o t h e r g r o u p s . 2 6 5 - % ) l n d e l g g o m n ( i r n b o i i F t a a r m t s n a e l c n P o C ) l n d e l g ) g a o m ( O O n ( i r n b o i i M O O F t a a r m t s n a e c l n P o C 2 6 6 V e h N e h M C T / L P S O 4 0 0 1 0 0 1 = V e h — W A R F V e h N e h M C T / L P S N ( a ) O O O O 4 0 0 O 1 0 0 1 c : V e h — H E P > F i g u r e 7 . 2 . E f f f e c t o f H E P o n M C T / L P S - l n d u c e d L i v e r I n j u r y . M C T / L P S - c o e x p o s e d r a t s w e r e t r e a t e d w i t h H E P a n t i c o a g u l a n t a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 7 . 1 l e g e n d . A L T ( A ) a n d A S T ( 8 ) a c t i v i t i e s , p l a s m a b i o m a r k e r s f o r H P C i n j u r y , a n d p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n ( C ) , a b i o m a r k e r f o r S E C i n j u r y , w e r e e v a l u a t e d 1 8 h o u r s a f t e r M C T o r i t s V e h . N = 5 — 1 4 a n i m a l s . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m M C T / L P S N e h g r o u p . 2 6 7 > ) L I U ( y t i v i t c A T L A a m s a l P I I I ) o L t I U ( § y N t i § v i I t - c A § T S a § A a m § s a l P o O ) l m § / g n A ( § H n o a i m t s § a a r l t P n e § c n o C 2 6 8 V e h N e h M C T / L P S 0 . 8 L = V e h — H E P a , b V e h N e h M C T / L P S = V e h ‘ — H E P V e h N e h M C T / L P S i O 0 i S = 3 V e h — H E P a , b b o t h o f t h e s e b y a p p r o x i m a t e l y 8 0 % . H e p a t i c S E C S r e m o v e H A f r o m t h e c i r c u l a t i o n , a n d i m p a i r m e n t o f t h i s f u n c t i o n r e s u l t s i n e n h a n c e d H A c o n c e n t r a t i o n i n t h e p l a s m a . A c c o r d i n g l y , p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n h a s b e e n u s e d a s a b i o m a r k e r f o r h e p a t i c S E O i n j u r y ( D e a c i u c e t a l . , 1 9 9 3 b , 1 9 9 4 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . I n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s , p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s e l e v a t e d ( F i g u r e 7 . 2 0 ) , a n d H E P t r e a t m e n t m o d e s t l y r e d u c e d t h e e l e v a t i o n ( 4 8 % d e c r e a s e ) . 7 . 0 . 3 . E f f e c t o f W A R F o n M C T / L P S - l n d u c e d L i v e r I n j u r y W A R F t r e a t m e n t s i g n i f i c a n t l y a t t e n u a t e d t h e i n c r e a s e i n p l a s m a A L T a n d A S T a c t i v i t i e s c a u s e d b y M C T / L P S c o a d m i n i s t r a t i o n b y 8 9 % a n d 7 5 % , r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e s 7 . 3 A a n d 7 . 3 8 ) . P l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n w a s a l s o p a r t i a l l y a t t e n u a t e d ( 4 2 % d e c r e a s e ) w i t h W A R F t r e a t m e n t ( F i g u r e 7 . 3 0 ) . 7 . 0 . 4 . M o r t a l i t y M o r t a l i t y w a s 1 3 % i n a n i m a l s g i v e n M C T / L P S N e h a n d 7 % i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s t h a t r e c e i v e d H E P t r e a t m e n t . M o r t a l i t y w a s 1 1 % i n V e h / M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s a n d 2 7 % i n a n i m a l s g i v e n W A R F / M C T / L P S c o a d m i n i s t r a t i o n . N o a n i m a l s t r e a t e d w i t h V e h o r a n t i c o a g u l a n t a l o n e d i e d . A n t i c o a g u l a n t a d m i n i s t r a t i o n d i d n o t s i g n i f i c a n t l y a f f e c t s u r v i v a l i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . 2 6 9 F i g u r e 7 . 3 . E fl e c t o f W A R F o n M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r I n i u m . M C T / L P S - c o e x p o s e d r a t s w e r e t r e a t e d w i t h W A R F a n t i c o a g u l a n t a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 7 . 1 l e g e n d . A L T ( A ) a n d A S T ( 8 ) a c t i v i t i e s , p l a s m a b i o m a r k e r s f o r H P C i n j u r y , a n d p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n ( 0 ) , a b i o m a r k e r f o r S E O i n j u r y , w e r e e v a l u a t e d 1 8 h o u r s a f t e r M C T o r i t s V e h . N = 4 — 8 a n i m a l s . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m V e h / M C T / L P S g r o u p . 2 7 0 > ) L I U ( fl . . y a _ t _ i . v l i t t c A T a L A a m i s a l P A H a m s a l P 3 ‘ , - W A R F 0 = 3 V e h a , b L J L V e h N e h M C T / L P S B A 2 4 0 0 S = V e h a ‘ 5 2 0 0 0 4 — W A R F j - E 1 6 0 0 ‘ E F 1 2 0 0 « i n t : 8 0 0 1 a , b i t E 0 r 1 . V e h N e h M C T / L P S C 1 0 0 0 2 = V e h a g 8 0 0 A — W A R F _ L c 8 6 0 0 - a , b 1 ' 6 a “ . - 4 0 0 ‘ c o ‘ c ’ 2 0 0 4 8 o _ A V e h N e h M C T / L P S 2 7 1 7 . 0 . 5 . T h e E f f e c t o f A n t i c o a g u l a n t s o n M C T / L P S - I n d u c e d L i v e r L e s i o n s M C T / L P S - c o t r e a t e d c o n t r o l a n i m a l s e x h i b i t e d M C T - l i k e , 0 L a n d L P S - l i k e , M Z l i v e r l e s i o n s a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d b y Y e e e t a l . ( 2 0 0 0 b ) . 0 L l e s i o n s c o n s i s t e d o f m o d e r a t e t o m a r k e d h e p a t o c e l l u l a r d e g e n e r a t i o n a n d a p o p t o t i c a n d o n c o t i c n e c r o s i s , h e m o r r h a g e a n d l o s s o f c e n t r a l v e i n i n t i m a . 0 L l e s i o n s a l s o e x h i b i t e d a m o d e r a t e a c c u m u l a t i o n o f P M N s a n d m o n o c y t e s . M Z l e s i o n s c o m p r i s e d m a r k e d a n d m o r e f r e q u e n t , w e l l d e f i n e d a r e a s o f h e p a t o c e l l u l a r c o a g u l a t i v e n e c r o s i s a c c o m p a n i e d b y P M N a n d m o n o n u c l e a r c e l l i n f i l t r a t i o n . P r o n o u n c e d c o n g e s t i o n a n d h e m o r r h a g e w e r e a l s o p r e s e n t i n t h e s e l e s i o n s . L i v e r s f r o m M C T / L P S - c o e x p o s e d a n i m a l s g i v e n e i t h e r a n t i c o a g u l a n t e x h i b i t e d q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r 0 L a n d M 2 l e s i o n s ; h o w e v e r , b o t h l e s i o n t y p e s w e r e s m a l l e r a n d c o n s i d e r a b l y l e s s f r e q u e n t . T h e M 2 l e s i o n s h a d a s l i g h t l y g r e a t e r r e d u c t i o n i n s i z e a n d f r e q u e n c y t h a n t h e C L l e s i o n s ( T a b l e 7 . 1 ) . S i g n i f i c a n t d e c r e a s e s i n t h e a r e a s o f C L ( 7 7 % d e c r e a s e ) a n d M 2 ( 8 7 % d e c r e a s e ) l e s i o n s w e r e f o u n d i n t h e l i v e r s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s t h a t w e r e t r e a t e d w i t h H E P . S i m i l a r d e c r e a s e s w e r e f o u n d i n C L ( 6 2 % ) a n d M 2 ( 8 5 % ) l e s i o n s i n l i v e r s f r o m M C T / L P S - c o e x p o s e d a n i m a l s g i v e n W A R F . N o h i s t o l o g i c e v i d e n c e o f i n j u r y w a s o b s e r v e d i n a n i m a l s g i v e n V e h o r a n t i c o a g u l a n t a l o n e . 7 . 0 . 6 . F i b r i n S t a i n i n g i n L i v e r s f r o m M C T / L P S - C o e x p o s e d A n i m a l s T o d e m o n s t r a t e t h a t H E P t r e a t m e n t o f M C T / L P S - c o e x p o s e d a n i m a l s d e c r e a s e d i n s o l u b l e f i b r i n c l o t s i n t h e l i v e r , h e p a t i c f i b r i n d e p o s i t i o n w a s 2 7 2 T a b l e 7 . 1 . fi E P o r W A R F A g m i n i s t r a t i o n R e d a c e s fl e r fi L e s i o n s i n M P S - C o t r e a t e d R a t s . W A R F o r V e h i c l e ( V e h ) w a s a d m i n i s t e r e d 1 0 a n d 3 4 h o u r s b e f o r e M C T a d m i n i s t r a t i o n , w h e r e a s , i n a s e p a r a t e s t u d y , H E P o r V e h w a s a d m i n i s t e r e d 1 . 5 h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n . L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U / k g ) o r V e h w a s a d m i n i s t e r e d i v . t o r a t s 4 h o u r s a f t e r i . p . a d m i n i s t r a t i o n o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) o r V e h . L i v e r s w e r e t a k e n 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n a n d p r o c e s s e d f o r m o r p h o m e t r i c a n a l y s i s . N = 6 — 7 a n i m a l s . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f a n t i c o a g u l a n t t r e a t m e n t . 2 7 3 T r e a t m e n t P e r c e n t L e s i o n A r e a C e n t r i l o b u l a r M i d z o n a l H E P S t u d y M C T / L P S N e h 3 . 9 i 0 . 7 7 . 7 i 1 . 6 M C T / L P S / H E P 0 . 9 i 0 . 2 8 1 . 0 i 0 . 3 “ W A R F S t u d y V e h / M C T / L P S 4 . 2 i 0 . 9 7 . 4 i 0 . 8 W A R F / M C T / L P S 1 . 6 i 0 . 6 a 1 . 1 : t 0 . 3 8 2 7 4 e x a m i n e d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l y ( C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . N o f i b r i n i m m u n o s t a i n i n g w a s o b s e r v e d i n t h e s i n u s o i d s o f l i v e r s e c t i o n s f r o m V e h N e h N e h - t r e a t e d r a t s , a l t h o u g h s o m e s t a i n i n g o c c u r r e d i n t h e i n t i m a o f l a r g e r v e s s e l s . T h i s s t a i n i n g m a y h a v e b e e n t h e r e s u l t o f f i b r i n d e p o s i t i o n t h a t o c c u r r e d a f t e r a n i m a l s a c r i f i c e ( C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . B y 1 8 h o u r s , i n t e n s e f i b r i n s t a i n i n g w a s o b s e r v e d i n t h e l i v e r s f r o m t h e M C T / L P S N e h - c o t r e a t e d a n i m a l s ( F i g u r e 7 . 4 A ) . H E P t r e a t m e n t o f M C T / L P S - c o e x p o s e d a n i m a l s r e t u r n e d h e p a t i c f i b r i n s t a i n i n g t o c o n t r o l ( V e h N e h N e h - t r e a t e d ) l e v e l s . Z o n a l a n a l y s i s r e v e a l e d p r e v e n t i o n o f f i b r i n i m m u n o s t a i n i n g i n t h e C L a n d M 2 r e g i o n s o f M C T / L P S - c o e x p o s e d a n i m a l s t r e a t e d w i t h H E P ( F i g u r e 7 . 4 8 ) . 7 . 0 . 7 . P l a s m a T N F - d C o n c e n t r a t i o n a f t e r A n t i c o a g u l a n t A d m i n i s t r a t i o n i n M C T / L P S - C o e x p o s e d A n i m a l s T h e p r o i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e T N F - a i s i m p o r t a n t i n t h e p a t h o g e n e s i s o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y ( Y e e e t a l . , 2 0 0 3 a ) . T o e x p l o r e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p l a s m a T N F - d a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t h i s m o d e l , p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n w a s a s s e s s e d a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f a n t i c o a g u l a n t t o M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . N e i t h e r H E P ( F i g u r e 7 . 5 A ) n o r W A R F t r e a t m e n t ( F i g u r e 7 . 5 8 ) h a d a n e f f e c t o n p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n . 7 . 0 . 8 . P M N A c c u m u l a t i o n a f t e r A n t i c o a g u l a n t A d m i n i s t r a t i o n i n M C T / L P S - C o e x p o s e d A n i m a l s 2 7 5 F i g u r e 7 . 4 . m a t i c F i b r i n D e p o s i t i o n i n A n i m a l s g o t r e a t e d w l t p M 0 1 , L P S a n d H E P . M C T / L P S - c o e x p o s e d r a t s w e r e t r e a t e d w i t h H E P a n t i c o a g u l a n t a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 7 . 1 l e g e n d . L i v e r s w e r e r e m o v e d f r o m a n i m a l s 1 8 h o u r s a f t e r M C T o r i t s V e h w a s a d m i n i s t e r e d a n d p r o c e s s e d f o r i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . T o t a l a r e a ( A ) a n d z o n a l d i s t r i b u t i o n ( 8 ) o f f i b r i n i m m u n o s t a i n i n g i n l i v e r s e c t i o n s w e r e e x a m i n e d . N = 3 — 5 a n i m a l s . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l l o t h e r g r o u p s . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l l o t h e r g r o u p s w i t h i n s a m e r e g i o n o f t h e l i v e r l o b u l e . 2 7 6 ) l a t O a o e T s r f A o n n a O i o r i b i F t c a r F ( a O a _ I ' 0 l ) O F 3 l a t o T f o n o i t c a r F O 8 O 8 ( 0 8 2 7 7 M C T / L P S H E P Z Z Z ! M i d z o n a l S S S ! P e r l p o r t a l ' 8 F i b r i n A r e a 0 . 1 5 i = 1 C e n t r i l o b u l a r V e h N e h M C T / L P S A = 3 V e h — H E P > F i g u r e 7 . 5 . E f f e c t o f A n t i c o a g u l a n t s o n P l a s m a T N F - d C o n c e n t r a t i o n i n M C T / L P S - C o t r e a t e d A n i m a l s . M C T / L P S - c o e x p o s e d r a t s w e r e t r e a t e d w i t h H E P ( A ) o r W A R F ( B ) a n t i c o a g u l a n t s a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 7 . 1 l e g e n d . P l a s m a T N F - d c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d i n M C T / L P S - t r e a t e d a n i m a l s 1 8 h o u r s a f t e r M C T o r i t s V e h w a s g i v e n . N = 4 - 1 4 a n i m a l s . a S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . 2 7 8 s l _ C O ) l m / A . N O i g o p - ( F N n 9 A ' O T o i a t m a s r a t l n e P 3 A 0 C c A 0 C ) n o C m ) l m / O O G O c g o p - ( F N n ’ 0 O T o i a t m a s r g a t l n e P c N O n o C O 2 7 9 V e h N e h M C T / L P S = V e h , — W A R F I ' L L - E 1 : : V e h ‘ — H E P V e h N e h M C T / L P S > P M N s a r e a n i m p o r t a n t c o m p o n e n t i n M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y ( Y e e e t a l . , 2 0 0 3 0 ) . T o e x a m i n e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n P M N s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t h i s m o d e l , h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n w a s a s s e s s e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s g i v e n a n t i c o a g u l a n t s . T r e a t m e n t w i t h e i t h e r H E P ( F i g u r e 7 . 6 A ) o r W A R F ( F i g u r e 7 . 6 8 ) a t t e n u a t e d h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n b y a p p r o x i m a t e l y 6 0 % . 7 . 0 . 9 . P l a s m a M O P - 1 C o n c e n t r a t i o n i n M C T / L P S - C o t r e a t e d A n i m a l s T h e c h e m o k i n e M O P - 1 c a u s e s m o n o c y t e a t t r a c t i o n a n d a c t i v a t i o n ( L u s t e r , 1 9 9 8 ; G u e t a l . , 1 9 9 9 ) , a n d e v i d e n c e i n v i t r o s u g g e s t s t h a t t h i s c h e m o k i n e m a y b e i n v o l v e d i n i n c r e a s i n g e x p r e s s i o n o f i n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 o n r a t e n d o t h e l i a l c e l l s ( Y a m a g u c h i e t a l . , 1 9 9 8 ) . A c t i v a t e d m o n o c y t e s e x p r e s s T F , w h i c h c a n c a u s e c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n ( O s t e r u d , 1 9 9 5 ; P o l a c k e t a l . , 1 9 9 7 ) . P l a s m a M C P - 1 c o n c e n t r a t i o n w a s a s s e s s e d a t v a r i o u s t i m e s a f t e r M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s ( T a b l e 7 . 2 ) . M C T a d m i n i s t r a t i o n c a u s e d n o c h a n g e a t a n y o f t h e t i m e s e v a l u a t e d . B y c o n t r a s t , a n e l e v a t i o n i n p l a s m a M O P - 1 c o n c e n t r a t i o n o c c u r r e d 2 h o u r s a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n , i r r e s p e c t i v e o f M C T - t r e a t m e n t . P l a s m a M O P - 1 r e m a i n e d e l e v a t e d i n V e h / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s a t a l l t i m e s e x a m i n e d . B y 1 2 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n , p l a s m a M O P - 1 w a s n e a r l y t w i c e a s g r e a t i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s c o m p a r e d t o a n i m a l s t h a t r e c e i v e d L P S a l o n e . 2 8 0 F i g u r e 7 . 6 . E f f e c t o f A n t i c o a g u l a n t s o n P M N A c c u m u l a t i o n i n M C T / i 8 - 0 0 t r e a t e d A n i m a l s . M C T / L P S - c o e x p o s e d r a t s w e r e t r e a t e d w i t h H E P ( A ) o r W A R F ( B ) a n t i c o a g u l a n t s a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 7 . 1 l e g e n d . H e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n ( i . e . , n u m b e r o f P M N s p e r h i g h p o w e r e d f i e l d ( H P F ) , 4 0 0 X ) w a s d e t e r m i n e d i n M C T / L P S t r e a t e d a n i m a l s 1 8 h o u r s a f t e r M C T o r i t s V e h w e r e a d m i n i s t e r e d . N = 4 — 1 4 a n i m a l s . 8 ‘ S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e M C T / L P S v a l u e i n t h e a b s e n c e o f a n t i c o a g u l a n t t r e a t m e n t . 2 8 1 > F P H / s N M P f o r e b m u N F P H / s N M P f o r e b m u N O O . 5 O N O O 6 0 4 0 « 2 0 - = V e h — H E P a , b r 1 - V e h N e h M C T / L P S c : : i V e h — W A R F m i a , b V e h N e h M C T / L P S 2 8 2 T a b l e 7 . 2 . P l a s m a M Q P - 1 C o n c e n t r a t i o n i s E l e v a t e d a f t e r M C T / L P S - Q o e x p o s u r e . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h M C T a n d / o r L P S a s d e s c r i b e d i n T a b l e 7 . 1 l e g e n d . N = 3 — 6 a n i m a l s . 8 ’ S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e s i n t h e a b s e n c e o f L P S a t t h e i n d i c a t e d t i m e . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l l o t h e r g r o u p s a t t h e i n d i c a t e d t i m e . 2 8 3 T i m e A f t e r M C T o r P l a s m a M C P - 1 M C T V e h i c l e C o n c e n t r a t i o n ( p g / m l ) 6 H o u r s V e h N e h 3 2 i 7 V e h / L P S 9 3 4 i 1 0 8 a l M C T N e h 3 2 i 6 M C T / L P S 8 9 4 : t 3 4 ‘ 1 2 H o u r s V e h N e h 3 2 i 6 V e h / L P S 9 4 1 i 1 1 3 “ M C T N e h 4 9 i 1 2 M C T / L P S 1 5 5 2 : 8 0 ‘ " b 1 8 H o u r s V e h N e h 3 8 i 1 5 V e h / L P S 7 9 8 i 1 5 0 “ l M C T N e h 4 0 i 1 2 M C T / L P S 1 4 6 2 i 1 3 7 “ . ” 2 8 4 7 . 0 . 1 0 C o a g u l a t i o n S y s t e m A c t i v a t i o n i n A n i m a l s D e p l e t e d o f K C s , T N F - a o r P M N s Y e e e t a l . ( 2 0 0 3 a , 2 0 0 3 c ) d e m o n s t r a t e d t h a t K 0 d e p l e t i o n b y G d 0 l 3 , a t t e n u a t i o n o f t h e T N F - d r e s p o n s e b y e i t h e r P T X o r A T S , o r P M N d e p l e t i o n b y N A S d i m i n i s h e d H P C a n d S E O i n j u r y i n M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t s . T o e x p l o r e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e s e i n f l a m m a t o r y c o m p o n e n t s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , p l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n w a s a s s e s s e d ( T a b l e 7 . 3 ) . N e i t h e r K 0 i n a c t i v a t i o n n o r a t t e n u a t i o n o f T N F - d r e s p o n s e a f f e c t e d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . H o w e v e r , P M N d e p l e t i o n p r e v e n t e d t h e d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s a t 6 ( d a t a n o t s h o w n ) a n d 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n . 7 . E . D i s c u s s i o n T h i s i n v e s t i g a t i o n t e s t e d t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m p l a y s a c a u s a l r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y a n d e x p l o r e d t h e i n t e r d e p e n d e n c e b e t w e e n t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d c r i t i c a l i n f l a m m a t o r y f a c t o r s . A n t i c o a g u l a n t t h e r a p y i n v o l v e d e i t h e r H E P o r W A R F a d m i n i s t r a t i o n . A l t h o u g h H E P i s w e l l k n o w n f o r a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y , i t h a s a n t i i n f l a m m a t o r y e f f e c t s a s w e l l . T h e s e e f f e c t s i n c l u d e i n h i b i t i o n o f P M N a d h e s i o n , c h e m o t a x i s a n d p r o d u c t i o n o f s u p e r o x i d e a n i o n a n d n i t r i c o x i d e ( M a t z n e r e t a l . , 1 9 8 4 ; S i l v e s t e r o e t a l . , 1 9 9 4 ; R i e s e n b e r g e f a l . , 1 9 9 5 ; S h i n e t a l . , 1 9 9 7 ; B e l t r a n e t a l . , 1 9 9 9 ) . B e c a u s e P M N s a r e c r i t i c a l t o t h e p a t h o g e n e s i s o f 2 8 5 T a b l e 7 . 3 . T r e a t m e n t w i t _ h N A § _ b u t N o t w i t h — G A G E , P T X o r A T S P r e v e n t s C o a g u l a t i o n S y s t e m A c t i v a t i o n i n M C T / L P i 0 o t r e a t e d A n i m a l s . R a t s w e r e t r e a t e d w i t h M C T a n d / o r L P S a s d e s c r i b e d i n T a b l e 7 . 1 l e g e n d . I n a d d i t i o n , r a t s w e r e g i v e n G d 0 l 3 ( K u p f f e r c e l l i n a c t i v a t o r ) , P T X ( T N F - d s y n t h e s i s i n h i b i t o r ) , A T S ( T N F - d d e p l e t o r ) o r N A S ( P M N d e p l e t o r ) o r t h e i r V e h s a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . P l a s m a f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n , a b i o m a r k e r o f c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n , w a s d e t e r m i n e d . 1 8 h o u r s a f t e r M C T o r i t s V e h a d m i n i s t r a t i o n . N = 3 - 1 3 a n i m a l s . 3 S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m r e s p e c t i v e v a l u e i n t h e a b s e n c e o f M C T / L P S . b S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l l o t h e r g r o u p s . 2 8 6 T r e a t m e n t P l a s m a F i b r i n o g e n C o n c e n t r a t i o n ( m g l d l ) G d C I a S t u d y V e h N e h N e h G d C I 3 I V e h N e h V e h / M C T / L P S G d C l g / M C T / L P S P T X S t u d y V e h N e h N e h V e h / P T X N e h M C T N e h / L P S M C T / P T X / L P S A T S S t u d y V e h / C S N e h V e h / A T S N e h M C T / C S / L P S M C T / A T S / L P S N A S S t u d y C S N e h N e h N A S N e h N e h C S I M C T I L P S N A S / M C T / L P S 2 5 7 : 1 9 2 4 7 : 1 7 1 1 5 i 1 Z a 1 2 9 i 7 a 2 3 4 : 7 2 2 7 : 1 2 7 2 : 1 0 a 1 0 9 : 2 2 " 3 2 5 : 2 5 3 2 4 : 2 6 7 7 : 1 0 ‘ i l 1 1 9 : 1 4 a 3 0 1 : 7 3 1 0 : 2 8 1 0 1 : 1 0 b 3 3 6 : 4 9 2 8 7 M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y ( Y e e e t a l . , 2 0 0 3 c ) , H E P c o u l d h a v e e f f e c t s i n d e p e n d e n t o f i t s a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y . C o n s e q u e n t l y , W A R F , a d r u g t h a t p r e v e n t s c o a g u l a t i o n b y a d i f f e r e n t m e c h a n i s m , w a s a l s o u s e d i n t h i s i n v e s t i g a t i o n . E i t h e r H E P ( F i g u r e 7 . 1 A ) o r W A R F ( F i g u r e 7 . 1 8 ) t r e a t m e n t o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s p r e v e n t e d t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , c o n f i r m i n g t h e e f f e c t i v e n e s s o f t h e s e a g e n t s . A n t i c o a g u l a n t t r e a t m e n t c a u s e d a m a r k e d d e c r e a s e i n H P C i n j u r y b u t o n l y a m o d e s t d e c r e a s e i n S E C i n j u r y 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n ( F i g u r e s 7 . 2 a n d 7 . 3 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m o n l y p a r t i a l l y c o n t r i b u t e s t o S E C i n j u r y a n d t h a t a d d i t i o n a l f a c t o r s a r e l i k e l y i n v o l v e d . Z o n a l a n a l y s i s o f l i v e r s e c t i o n s r e v e a l e d t h a t a n t i c o a g u l a n t t r e a t m e n t s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d t h e a r e a s o f 0 L a n d M 2 l e s i o n s ( T a b l e 7 . 1 ) . A c c o r d i n g l y , t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a p p e a r s t o c o n t r i b u t e c a u s a l l y t o M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . M C T i s n o n t o x i c a n d m u s t b e b i o a c t i v a t e d b y t h e c y t r o c h r o m e s o f t h e P 4 5 0 3 A f a m i l y t o i t s t o x i c m e t a b o l i t e , m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e ( M C T P ) , i n o r d e r t o p r o d u c e l i v e r i n j u r y ( W h i t e a n d M a t t o c k s , 1 9 7 2 ; K a s a h a r a e t a l . , 1 9 9 7 ; S t e g e l m e i e r e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h i s c o n v e r s i o n h a p p e n s r a p i d l y , w i t h p e a k M C T P p r o d u c t i o n o c c u r r i n g w i t h i n 2 h o u r s a f t e r M C T e x p o s u r e ( A l l e n e t a l . , 1 9 7 2 ) . T h u s , H E P w a s g i v e n t o M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s a f t e r t h e b i o a c t i v a t i o n o f M C T t o M C T P w a s n e a r l y c o m p l e t e ( i . e . , 5 . 5 h o u r s a f t e r M C T ) . A r e c e n t s t u d y b y C o p p l e e t a l . ( 2 0 0 2 b ) d e m o n s t r a t e d t h a t W A R F d o e s n o t i n t e r f e r e w i t h M C T 2 8 8 b i o a c t i v a t i o n . T h e r e f o r e , i t i s u n l i k e l y t h a t e i t h e r a n t i c o a g u l a n t r e d u c e d i n j u r y b y i n t e r f e r i n g w i t h M C T m e t a b o l i s m . T h e r e a r e a v a r i e t y o f m e c h a n i s m s b y w h i c h t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e l i v e r i n j u r y o f t h i s m o d e l . F u j i w a r a e t a l . ( 1 9 8 8 ) a n d o t h e r s ( A r i a e t a l . , 1 9 9 6 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ; B a e t a l . , 2 0 0 0 ; S a e t r e e t a l . , 2 0 0 0 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) h a v e p o s t u l a t e d t h a t f i b r i n c l o t s i n t h e l i v e r c a u s e l o c a l h y p o p e r f u s i o n a n d c a n t h e r e b y r e s u l t i n c e l l u l a r i n j u r y . C o n s i s t e n t w i t h t h i s h y p o t h e s i s , H E P s u b s t a n t i a l l y r e d u c e d f i b r i n d e p o s i t i o n i n C L a n d M 2 r e g i o n s o f l i v e r l o b u l e s ( F i g u r e 7 . 4 8 ) f r o m M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t s . H e n c e , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e r e d u c t i o n i n h e p a t i c f i b r i n d e p o s i t i o n w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e d e c r e a s e i n l i v e r i n j u r y . H o w e v e r , i n l i v e r i n j u r y c a u s e d b y a n h e p a t o t o x i c d o s e o f L P S , t h r o m b i n a p p e a r s t o b e t h e c r i t i c a l f a c t o r , a c t i n g i n d e p e n d e n t l y o f f i b r i n c l o t f o r m a t i o n ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ; M o u l i n e t a l . , 1 9 9 6 , 2 0 0 1 ) . T h r o m b i n c a n c o n t r i b u t e t o l i v e r i n j u r y b y c a u s i n g t h e s t i m u l a t i o n a n d a g g r e g a t i o n o f p l a t e l e t s ( W i s e e t a l . , 1 9 8 0 ; S i n h a e t a l . , 1 9 8 3 ; K i t o e t a l . , 1 9 8 5 ; S h u m a n , 1 9 8 6 ) , b y i n d u c i n g P M N c h e m o t a x i s ( B i z i o s e t a l . , 1 9 8 6 ) a n d / o r b y e n h a n c i n g M O P - 1 r e l e a s e f r o m l i v e r s t e l l a t e c e l l s , m o n o c y t e s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s ( C o l o t t a e t a l . , 1 9 9 4 ; M a r r a e t a l . , 1 9 9 5 ) . M o r e o v e r , t h r o m b i n ’ s a c t i o n o n a p r o t e a s e - a c t i v a t e d r e c e p t o r p r e s e n t o n K C S a n d S E C S i n l i v e r m i g h t c o n t r i b u t e t o H P C i n j u r y , a s i t d o e s a f t e r a l a r g e , h e p a t o t o x i c d o s e o f L P S ( M o u l i n e t a l . , 2 0 0 1 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 3 ) . I n d e e d , a c t i v a t i o n o f p r o t e a s e - a c t i v a t e d r e c e p t o r - 1 b y t h r o m b i n r e s u l t s i n t h e r e l e a s e o f v a r i o u s c y t o k i n e s a n d g r o w t h f a c t o r s a s w e l l a s t h e e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s o n e n d o t h e l i u m t h a t c o u l d c o n t r i b u t e t o i n f l a m m a t o r y l i v e r i n j u r y 2 8 9 ( D e r i a n e t a l . , 2 0 0 2 ) . I n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s , f u r t h e r s t u d y w i l l b e n e e d e d t o d e f i n e f u l l y t h e m e c h a n i s m b y w h i c h a n a c t i v a t e d c o a g u l a t i o n s y s t e m p r o m o t e s h e p a t o t o x i c i t y . T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d o t h e r i n f l a m m a t o r y f a c t o r s w a s e x p l o r e d . A l t h o u g h n e i t h e r K 0 i n a c t i v a t i o n n o r T N F - a d e p l e t i o n p r e v e n t e d t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , P M N d e p l e t i o n d i d ( T a b l e 7 . 3 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t P M N s p r o m o t e c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n i n t h i s m o d e l . P M N s c a n a f f e c t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m t h r o u g h a n u m b e r o f m e c h a n i s m s , i n c l u d i n g t h e e x p r e s s i o n o f T F o n t h e i r s u r f a c e s ( T o d o r o k i e t a l . , 2 0 0 0 ) a n d t h e r e l e a s e o f c a t h e p s i n G ( B r a y e t a l . , 1 9 8 7 ) . T F a c t i v a t e s t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , l e a d i n g t o t h r o m b i n f o r m a t i o n ( O s t e r u d a n d R a p a p o r t , 1 9 7 7 ; S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ) . I n a d d i t i o n t o i t s c y t o t o x i c p r o t e a s e a c t i v i t y ( H o e t a l . , 1 9 9 6 ) , c a t h e p s i n G a c t i v a t e s F a c t o r X , w h i c h c o n v e r t s p r o t h r o m b i n t o t h r o m b i n ( B r a y e t a l . , 1 9 8 7 ; P l e s c i a a n d A l t i e r i , 1 9 9 6 ; G o e l a n d D i a m o n d , 2 0 0 1 ) . H e n c e , t h e c r i t i c a l r o l e o f P M N s m a y d e r i v e b o t h f r o m t h e i r a b i l i t y t o r e l e a s e c y t o t o x i c m e d i a t o r s a n d t h e i r p a r t i c i p a t i o n i n a c t i v a t i n g t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . A l t h o u g h P M N s a p p e a r n e c e s s a r y f o r a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t h i s m o d e l , t h e y m a y n o t b e s u f f i c i e n t . A n o t h e r n e c e s s a r y f a c t o r m a y b e d a m a g e t o S E C S , w h i c h i s k n o w n t o a c t i v a t e t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n o t h e r m o d e l s ( H i r a t a e t a l . , 1 9 8 9 ; S e t o e t a l . , 1 9 9 8 ; C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 a ) . S E O i n j u r y o c c u r s c o n c u r r e n t l y w i t h a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( Y e e e t a l . , 2 0 0 3 b ) , b u t f u r t h e r s t u d y w i l l b e n e e d e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r b o t h P M N a c c u m u l a t i o n 2 9 0 a n d S E O i n j u r y a r e r e q u i r e d e v e n t s a n d , i f s o , h o w t h e y i n t e r a c t t o p r o m o t e c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n . T h e i n v o l v e m e n t o f T N F - a i n c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n v a r i e s w i t h d i f f e r e n t m o d e l s o f i n f l a m m a t i o n . A f t e r a l a r g e , h e p a t o t o x i c d o s e o f L P S , T N F - a d e p l e t i o n p r e v e n t s a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ) . I n t h a t m o d e l , T N F - o i s i m p o r t a n t f o r c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n t h r o u g h e i t h e r s t i m u l a t i o n o f T F a c t i v i t y o n e n d o t h e l i a l c e l l s ( B e v i l a c q u a e t a l . , 1 9 8 6 ; K i r c h h o f e r e t a l . , 1 9 9 4 ; E s m o n , 2 0 0 0 ) o r t h r o u g h a c t i v a t i o n o f P M N s ( K l e b a n o f f e t a l . , 1 9 8 6 ; T o d o r o k i e t a l . , 2 0 0 0 ; G o e l a n d D i a m o n d , 2 0 0 1 ) . B y c o n t r a s t , i n t h e M C T / L P S - c o t r e a t m e n t m o d e l T N F - a d o e s n o t a p p e a r t o b e n e c e s s a r y f o r a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( T a b l e 7 . 3 ) . L i k e w i s e , K C i n a c t i v a t i o n i n t h i s m o d e l f a i l e d t o p r e v e n t c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n , a r e s u l t c o n s i s t e n t w i t h t h e l a c k o f e f f e c t o f T N F - a d e p l e t i o n , s i n c e a c t i v a t e d K C S a r e a m a j o r p r o d u c e r o f T N F - d i n t h e l i v e r . A l t h o u g h b o t h K 0 a n d T N F - a a r e c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f M C T / L P S - i n d u c e d i n j u r y ( Y e e e t a l . 2 0 0 3 a ) , t h e i r i n v o l v e m e n t i s a p p a r e n t l y n o t t h r o u g h a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . I n M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t s , a n e a r l y , p r o n o u n c e d i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n o c c u r s , a n d t h i s i s f o l l o w e d b y a m o r e m o d e s t b u t s u s t a i n e d e l e v a t i o n t h a t c o n t i n u e s t h r o u g h 1 8 h o u r s ( Y e e e t a l . , 2 0 0 3 a , 2 0 0 3 c ) . A n t i c o a g u l a n t a d m i n i s t r a t i o n t o M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s d i d n o t a f f e c t t h i s l a t e r , s u s t a i n e d p h a s e o f i n c r e a s e d p l a s m a T N F - d c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e s 7 . 5 A a n d 7 . 5 8 ) , s u g g e s t i n g t h a t a n a c t i v a t e d c o a g u l a t i o n s y s t e m i s n o t n e e d e d f o r s u s t a i n e d T N F - a r e l e a s e . A l t h o u g h i t c a n n o t b e r u l e d o u t t h a t t h e c o a g u l a t i o n 2 9 1 s y s t e m i n f l u e n c e d T N F - a f o r m a t i o n a t a n e a r l i e r t i m e , t h e s e r e s u l t s p r o v i d e a d d i t i o n a l e v i d e n c e t h a t T N F - a g e n e r a t i o n a n d c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n a r e n o t i n t e r d e p e n d e n t . A n t i c o a g u l a n t a d m i n i s t r a t i o n r e d u c e d h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n ( F i g u r e . 7 . 6 A a n d 7 . 6 8 ) . T h e c o a g u l a t i o n s y s t e m c o u l d a f f e c t P M N i n f l u x i n t o l i v e r t i s s u e t h r o u g h t h e c h e m o t a c t i c a c t i v i t y o f t h r o m b i n ( B i z i o s e t a l . , 1 9 8 6 ) . P M N a c c u m u l a t i o n , h o w e v e r , w a s n o t c o m p l e t e l y e l i m i n a t e d b y a d m i n i s t r a t i o n o f a n t i c o a g u l a n t , s u g g e s t i n g t h a t t h r o m b i n m a y w o r k i n c o n j u n c t i o n w i t h o t h e r P M N c h e m o a t t r a c t a n t s ( e . g . , c y t o k i n e - i n d u c e d n e u t r o p h i l c h e m o a t t r a c t a n t - 1 ; Z h a n g e t a l . , 1 9 9 5 ; L u s t e r e t a l . , 1 9 9 8 ) . O v e r a l l , t h e r e s u l t s p r o v i d e e v i d e n c e o f i n t e r p l a y b e t w e e n t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d P M N s i n c o n t r i b u t i n g t o H P C i n j u r y i n t h i s m o d e l . M O P - 1 c a n a t t r a c t a n d a c t i v a t e m o n o c y t e s a n d i n d u c e t h e e x p r e s s i o n o f T F o n t h e s u r f a c e s o f t h e s e c e l l s ( L u s t e r , 1 9 9 8 ; G u e t a l . , 1 9 9 9 ) . F u r t h e r m o r e , M C P - 1 h a s b e e n i m p l i c a t e d i n t h e e x p r e s s i o n o f i n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 o n r a t e n d o t h e l i a l c e l l s i n v i t r o ( Y a m a g u c h i e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h i s a d h e s i o n m o l e c u l e , w h i c h i s p r e s e n t i n h e p a t i c S E C S ( E s s a n i e t a l . , 1 9 9 5 ) , c a n i n t e r a c t w i t h P M N s a n d p r i m e t h e m t o r e l e a s e t o x i c p r o d u c t s ( J a e s c h k e e t a l . , 1 9 9 6 ) . A c c o r d i n g l y , M C P - 1 m a y b e a n i m p o r t a n t c h e m o k i n e i n t h e d e v e l o p m e n t o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . I n t h i s m o d e l , e l e v a t e d p l a s m a M C P - 1 w a s o b s e r v e d e a r l y i n L P S - t r e a t e d a n i m a l s , i r r e s p e c t i v e o f M C T t r e a t m e n t ( T a b l e 7 . 2 ) . B y 1 8 h o u r s , M O P - 1 r e m a i n e d e l e v a t e d i n b o t h g r o u p s o f L P S - t r e a t e d a n i m a l s , b u t t h e i n c r e a s e w a s m u c h g r e a t e r i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . 2 9 2 S i n c e , t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i s n o t a c t i v a t e d i n V e h / L P S a n i m a l s ( Y e e e t a l . , 2 0 0 3 b ) a n d s i n c e t h e s a m e l e v e l o f M C P - 1 i s s e e n i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s a t 6 h o u r s w h e n c o a g u l a t i o n a c t i v a t i o n o c c u r s , i t s e e m s u n l i k e l y t h a t M O P - 1 a l o n e c o n t r i b u t e s t o t h e e a r l y a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . H o w e v e r , M C P - I i n d u c e d T F e x p r e s s i o n m i g h t c o n t r i b u t e t o l i v e r i n j u r y a t a l a t e r t i m e b y e n h a n c i n g f i b r i n d e p o s i t i o n ( O r v i m e t a l . , 1 9 9 4 ; S h e b u s k i a n d K i l g o r e , 2 0 0 1 ; F a l a t i e t a l . , 2 0 0 2 ) . F u r t h e r s t u d y w i l l b e n e e d e d t o d e t e r m i n e t h e f u n c t i o n o f M O P - 1 i n t h i s m o d e l . I t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e b a s e d o n t h e s u s t a i n e d i n c r e a s e i n M O P - 1 a t 1 8 h o u r s t h a t i t m a y h e l p p r o l o n g P M N a d h e s i o n ( Y a m a g u c h i e t a l . , 1 9 9 8 ) a n d s u s t a i n m o n o c y t e a c c u m u l a t i o n i n l i v e r . I n s u m m a r y , a n t i c o a g u l a n t t h e r a p y r e d u c e d f i b r i n d e p o s i t i o n i n C L a n d M 2 r e g i o n s o f l i v e r l o b u l e s , p r e v e n t e d H P C i n j u r y a n d c a u s e d a m o d e s t a t t e n u a t i o n i n S E C i n j u r y i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . T h e s e r e s u l t s p o i n t t o a c r i t i c a l r o l e o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . M o r e o v e r , P M N s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a p p e a r t o c o o p e r a t e i n i n d u c i n g H P C i n j u r y i n t h i s m o d e l o f s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y . 2 9 3 S u m m a r y a n d C o n c l u s i o n s C H A P T E R 8 2 9 4 w e r e u n d e r g o i n g a n i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e s t a r t i n g a r o u n d 6 h o u r s ( i . e . , 2 h o u r s 8 . A . M o d e l D e v e l o p m e n t a n d C h a r a c t e r i z a t i o n T o e l u c i d a t e f u r t h e r t h e m e c h a n i s m t h r o u g h w h i c h i n f l a m m a t i o n a u g m e n t s x e n o b i o t i c i n j u r y , L P S w a s u s e d a s t h e i n f l a m m a g e n a n d M C T , a w e l l - k n o w n h e p a t o t o x i c a n t , w a s u s e d a s t h e m o d e l x e n o b i o t i c a g e n t . A d m i n i s t r a t i o n o f a s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e o f L P S 4 h o u r s a f t e r a s m a l l , n o n t o x i c d o s e o f M C T r e s u l t e d i n s y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y i n r a t s 1 8 h o u r s a f t e r M C T e x p o s u r e . U n l i k e o t h e r m o d e l s i n w h i c h L P S e n h a n c e d t h e h e p a t o t o x i c a n t - i n d u c e d l i v e r l e s i o n , t w o d i s t i n c t l i v e r l e s i o n s d e v e l o p e d . T h e s e l e s i o n s w e r e 0 L a n d M Z , e x h i b i t i n g c h a r a c t e r i s t i c s s i m i l a r t o l e s i o n s a s s o c i a t e d w i t h l a r g e r , t o x i c d o s e s o f M C T a n d L P S g i v e n s e p a r a t e l y . M o r e o v e r , t h e n a t u r e o f t h e M C T - l i k e , C L l e s i o n s a n d t h e L P S - l i k e , M Z l e s i o n s s u g g e s t e d t h a t e a c h a g e n t e n h a n c e d t h e i n j u r y o f t h e o t h e r . A n i n v i t r o s t u d y , h o w e v e r , f a i l e d t o r e p r o d u c e t h i s s y n e r g i s t i c i n j u r y i n i s o l a t e d H P C s c o t r e a t e d w i t h M C T a n d L P S . T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e e n h a n c e d t o x i c i t y w a s n o t t h e r e s u l t o f a d i r e c t i n t e r a c t i o n o f M C T a n d L P S o n H P C s , b u t a r o s e r a t h e r f r o m a n i n d i r e c t m e c h a n i s m . H e n c e , o t h e r f a c t o r s n o t p r e s e n t i n t h e c u l t u r e s y s t e m , s u c h a s i n f l a m m a t o r y c e l l s a n d / o r s o l u b l e m e d i a t o r s , p l a y a r o l e i n t h e s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y o b s e r v e d i n v i v o . A d e t a i l e d t i m e c o u r s e e v a l u a t i o n r e v e a l e d t h a t s i g n i f i c a n t H P C i n j u r y ( a s m a r k e d b y i n c r e a s e s i n p l a s m a A L T a n d A S T c o n c e n t r a t i o n s ) f i r s t a p p e a r e d b e t w e e n 6 a n d 9 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n , r e a c h e d m a x i m a l i n j u r y b y 1 8 h o u r s a n d c o n t i n u e d t o 7 2 h o u r s . E l e v a t e d h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n a n d P l a s m a T N F - d a n d 0 | N 0 - 1 c o n c e n t r a t i o n s c o n f i r m e d t h a t L P S - t r e a t e d a n i m a l s 2 9 5 f o r t h i s L P S / M C T - i n d u c e d l e t h a l i t y . T o a v o i d c o m p l i c a t i o n s p r o d u c e d f r o m t h e a f t e r L P S a d m i n i s t r a t i o n a n d b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y ) . E l e v a t e d h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n a n d p l a s m a T N F - d a n d C l N C - 1 c o n c e n t r a t i o n s d e c r e a s e d t o w a r d b a s e l i n e o v e r t i m e . T h e d e c r e a s e w a s m u c h m o r e r a p i d i n a n i m a l s t r e a t e d w i t h L P S a l o n e t h a n i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . A c c o r d i n g l y , s u s t a i n e d e l e v a t i o n i n P M N a c c u m u l a t i o n a n d p l a s m a T N F - a a n d C I N C - 1 c o n c e n t r a t i o n s w e r e c h a r a c t e r i s t i c s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . A l t e r a t i o n s t o t h e s e q u e n c e o f M C T a n d L P S e x p o s u r e s w e r e e x p l o r e d d u r i n g m o d e l d e v e l o p m e n t . T h e p u r p o s e w a s t o d e t e r m i n e w h e t h e r t e m p o r a l d i f f e r e n c e s i n M O T a n d L P S a d m i n i s t r a t i o n s a f f e c t e d t o x i c i t y . T w e n t y - f o u r h o u r s u r v i v a l w a s h i g h ( a b o u t 8 5 % ) w h e n L P S w a s a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s b e f o r e o r a f t e r M C T . S u r v i v a l d r o p p e d s i g n i f i c a n t l y t o a b o u t 2 0 % , h o w e v e r , w h e n L P S w a s a d m i n i s t e r e d c o n c u r r e n t l y o r a n h o u r b e f o r e M C T . S o m e a n i m a l s b e c a m e m o r i b u n d e a r l y ( i . e . , 6 h o u r s ) , b u t l i v e r i n j u r y p r o v e d t o b e m i n i m a l a t t h i s t i m e . T h i s r e s u l t s u g g e s t e d t h a t e x t r a h e p a t i c f a c t o r s w e r e i n v o l v e d i n t h e d e c r e a s e d s u r v i v a l . L P S i s k n o w n t o c a u s e s y s t e m i c h y p o t e n s i o n t h r o u g h N O - i n d u c e d s h o c k ( R u e t t e n a n d T h i e m e r r n a n n , 1 9 9 6 ; W o l k o w , 1 9 9 8 ; K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) , a n d e l e v a t e d p l a s m a N O w a s o b s e r v e d i n r a t s g i v e n L P S a n h o u r b e f o r e M C T . T r e a t m e n t w i t h a n i N O S i n h i b i t o r r e s u l t e d i n a d e c r e a s e i n p l a s m a N O a s w e l l a s a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n m o r t a l i t y . H e n c e , t h e p r e d o m i n a n t t a r g e t o f t o x i c i t y S h i f t e d f r o m t h e l i v e r w h e n L P S a n d M C T w e r e a d m i n i s t e r e d s e v e r a l h o u r s a p a r t t o a n e x t r a h e p a t i c s i t e ( s ) w h e n t h e y w e r e a d m i n i s t e r e d i n c l o s e t e m p o r a l P r o x i m i t y . N O - i n d u c e d c i r c u l a t o r y f a i l u r e ( i . e . , h y p o t e n s i o n ) m a y b e r e s p o n s i b l e 2 9 6 c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n a r e b o t h c h a r a c t e r i s t i c s o f M C T / L P S - i n d u c e d h i g h l e t h a l i t y , t h e t r e a t m e n t r e g i m e n o f L P S a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s a f t e r M C T w a s c h o s e n f o r f u r t h e r s t u d y . H i s t o p a t h o l o g i c a n a l y s i s o f 0 L a n d M 2 l i v e r l e s i o n s f r o m r a t s g i v e n L P S 4 h o u r s a f t e r M C T s u g g e s t e d t h a t i n j u r y t o t h e l i v e r v a s c u l a t u r e w a s o c c u r r i n g . I n p a r t i c u l a r , t h e l o s s o f c e n t r a l v e i n i n t i m a i n C L l e s i o n s a n d t h e d i s r u p t i o n o f s i n u s o i d a l a r c h i t e c t u r e a n d h e m o r r h a g e i n b o t h l e s i o n s s u g g e s t e d v a s c u l a r i n j u r y . I n d e e d , p l a s m a H A c o n c e n t r a t i o n , a m a r k e r f o r S E O i n j u r y , s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y a n d r e m a i n e d e l e v a t e d t o 1 8 h o u r s . F u r t h e r , i m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i s o f l i v e r s f r o m M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t s r e v e a l e d a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n s t a i n i n g w i t h a n a n t i b o d y s p e c i f i c f o r r a t e n d o t h e l i a l c e l l s ( i . e . , R E C A - 1 ) . T h i s i n d i c a t e d a l o s s o f e n d o t h e l i a l c e l l s i n C L r e g i o n s b y 6 h o u r s a n d i n M 2 r e g i o n s o f t h e l i v e r l o b u l e b y 1 2 h o u r s . C o n g e s t i o n a n d h e m o r r h a g e i n b o t h l e s i o n s a l o n g w i t h f i b r i n d e p o s i t i o n i n t h e s i n u s o i d s o f l e s i o n e d a r e a s ( o b s e r v e d v i a e l e c t r o n m i c r o s c o p y ) s u g g e s t e d t h a t a n a c t i v a t e d c o a g u l a t i o n s y s t e m m i g h t b e a n o t h e r c h a r a c t e r i s t i c o f t h i s m o d e l . C o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n a s m a r k e d b y a d e c r e a s e i n p l a s m a f i b r i n o g e n o c c u r r e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d r a t s b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y . M o r e o v e r , i m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i s o f f i b r i n d e p o s i t i o n i n l i v e r s f r o m t h e s e a n i m a l s r e v e a l e d h e p a t i c f i b r i n d e p o s i t i o n i n 0 L a n d M 2 r e g i o n s o f l i v e r l o b u l e s b y 1 2 h o u r s . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e d t h a t S E C i n j u r y a n d S y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y . 2 9 7 I n s u m m a r y , M C T a n d L P S c o e x p o s u r e r e s u l t s i n s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y , w i t h i n j u r y o c c u r r i n g t o b o t h H P C S a n d S E C S . E a r l y a n d s u s t a i n e d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , p r o l o n g e d e l e v a t i o n i n P M N a c c u m u l a t i o n a n d p l a s m a T N F - a a n d C I N O - 1 c o n c e n t r a t i o n s a r e a l l f e a t u r e s o f M C T / L P S - s y n e r g y a n d p r o v i d e c l u e s a s t o h o w t h i s l i v e r i n j u r y m i g h t o c c u r . 8 . 8 . P r o p o s e d M e c h a n i s m o f I n j u r y E v i d e n c e s u g g e s t e d t h a t t h e s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y f r o m M C T a n d L P S c o e x p o s u r e a r o s e f r o m t h e i n v o l v e m e n t o f f a c t o r s o t h e r t h a n a s i m p l e M C T - L P S i n t e r a c t i o n . T h e p r e s e n c e o f a n i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e ( e . g . , P M N a c c u m u l a t i o n a n d i n c r e a s e d p l a s m a T N F - d a n d 0 l N 0 - 1 c o n c e n t r a t i o n s ) b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y a n d t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e L P S - l i k e , M Z l e s i o n i n t h e l i v e r s o f M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s s u g g e s t e d t h a t t h e s y n e r g i s t i c i n j u r y r e s u l t e d , i n p a r t , f r o m t h e a b i l i t y o f L P S t o s t i m u l a t e t h e i n f l a m m a t o r y s y s t e m . C o n s e q u e n t l y , t h e m e c h a n i s m f o r L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y w a s u s e d c o m p a r a t i v e l y t o e l u c i d a t e t h e p a t h o g e n e s i s o f M C T / L P S - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y . L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i s d e p e n d e n t u p o n K C s , T N F - o , P M N s , a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( i . e . , t h r o m b i n ; H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 , 1 9 9 3 ; F u j i t a e f a l . , 1 9 9 5 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ; M o u l i n e t a l . , 1 9 9 6 ; B r o w n e t a l . , 1 9 9 7 ) . A c c o r d i n g l y , e a c h o f t h e s e f a c t o r s ( T a b l e 8 . 1 ) w a s i n v e s t i g a t e d i n t h e M C T / L P S - c o t r e a t m e n t m o d e l . I n a c t i v a t i o n o f K C S a n d d e p l e t i o n o f T N F - d p r e v e n t e d H P C i n j u r y b u t o n l y m O d e s t l y d e c r e a s e d S E O i n j u r y i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . M o r p h o m e t r i c 2 9 8 T a b l e 8 . 1 . _ $ _ t _ i m m a r v o f t h e P h a r m a g l o g i c a l M a n i a u l a t i o n s U s e d t o I n v e s t i g a t e t h e P a t h o g e n e s i s o f M C T / E P S - i n d u c e d l . _ i y _ e r . L P S ( 7 . 4 x 1 0 6 E U L P S / k g ) w a s a d m i n i s t e r e d i n t r a v e n o u s l y t o r a t s 4 h o u r s a f t e r i n t e r p e r i t o n e a l a d m i n i s t r a t i o n o f M C T ( 1 0 0 m g / k g ) . I n a d d i t i o n , r a t s w e r e t r e a t e d w i t h G d 0 l 3 ( K C i n a c t i v a t o r ) , P T X ( i n h i b i t o r o f T N F - a s y n t h e s i s ) A T S ( i n a c t i v a t o r o f T N F - a ) , N A S ( P M N i n a c t i v a t o r ) , H E P ( a n t i c o a g u l a n t ) o r W A R F ( a n t i c o a g u l a n t ) a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s o f C h a p t e r s 5 , 6 a n d 7 . V a r i o u s m a r k e r s w e r e o b s e r v e d 1 8 h o u r s a f t e r M C T a d m i n i s t r a t i o n t o d e t e r m i n e i f a p r o t e c t i v e ( P R O T ) e f f e c t o c c u r r e d w i t h t h e a d d i t i o n o f a p h a r r n a c o l o g i c a g e n t t o M C T / L P S - c o t r e a t m e n t o r n o t ( N O T ) . T h e m a r k e r s o b s e r v e d w e r e H P C a n d S E C i n j u r y , p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n , c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n a n d l i v e r P M N a c c u m u l a t i o n . a M o d e s t b u t s i g n i f i c a n t d e c r e a s e . b N o t s i g n i f i c a n t , b u t t r e n d t o w a r d d e c r e a s e . 2 9 9 A g e n t N A S G a o l , P T X A T S H E P W A R F I n t e n d e d E f f e c t P M N D e p l e t i o n K C I n a c t i v a t i o n T N F - a S y n t h e s i s I n h i b i t i o n T N F - a N e u t r a l i z a t i o n A n t i c o a g u l a n t ( T h r o m b i n I n h i b i t i o n ) A n t i c o a g u l a n t H P C l n j u g l n | u _ r _ y C o n c . A c t i v . P R O T P R O T P R O T P R O T P R O T P R O T 3 0 0 S i g n i f i c a n t M a r k e r C h a n g e S E C T N F - o t P F I O T ‘ I N O T a n o n P R O T N O T ” P R O T P R O T “ l P R O T P R O T “ N O T P R O T ‘ I N O T C o a g . P R O T N O T N O T N O T P R O T P R O T L i v e r P M N s e e m . P R O T P R O T P R O T P R O T P R O T P R O T a n a l y s i s c o n f i r m e d t h a t K C i n a c t i v a t i o n a n d T N F - a d e p l e t i o n d e c r e a s e d b o t h C L a n d M 2 l e s i o n a r e a s . T h e p a r t i a l p r o t e c t i o n f r o m S E O i n j u r y i n t h i s m o d e l s u g g e s t e d t h a t o t h e r f a c t o r s w e r e a l s o i n v o l v e d i n t h i s i n j u r y . A d d i t i o n a l l y , a s p e c i f i c i n h i b i t o r o f t h e C O X - 2 e n z y m e g i v e n t o M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s f a i l e d t o p r e v e n t H P C i n j u r y . T h i s i n d i c a t e d t h a t C O X - 2 p r o d u c t s , w h i c h a r e k n o w n t o m e d i a t e l i v e r i n j u r y i n o t h e r L P S a u g m e n t a t i o n m o d e l s ( G a n e y e t a l . , 2 0 0 1 ) , w e r e n o t n e e d e d f o r H P C i n j u r y i n t h i s m o d e l . I n s u m m a r y , K C S a n d T N F - c x a r e c r i t i c a l t o M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , b u t C O X - 2 p r o d u c t s a r e n o t . T h e e l e v a t i o n i n h e p a t i c P M N n u m b e r s b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y s u g g e s t e d t h a t P M N s c o n t r i b u t e d t o M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . P M N d e p l e t i o n p r e v e n t e d H P C i n j u r y a t 1 8 h o u r s a n d m o d e s t l y d e c r e a s e d S E C i n j u r y a s w e l l . M o r p h o m e t r i c a n a l y s i s r e v e a l e d a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n C L a n d M 2 l e s i o n a r e a f o l l o w i n g P M N d e p l e t i o n i n c o t r e a t e d a n i m a l s . I n t e r e s t i n g l y , P M N d e p l e t i o n f a i l e d t o p r e v e n t e a r l y S E O i n j u r y ( i . e . , b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y ) . T h i s s u g g e s t e d t h a t P M N s w e r e r e q u i r e d f o r H P C i n j u r y , b u t S E O i n j u r y w a s n o t e n t i r e l y d e p e n d e n t o n P M N s . T h a t i s , e a r l y S E C i n j u r y w a s i n d e p e n d e n t o f t h e a c t i o n s o f P M N s , b u t i n l a t e r s t a g e s o f t h e p r o g r e s s i o n o f S E O i n j u r y , P M N s c o n t r i b u t e d . T h e c a u s e o f t h i s e a r l y S E C i n j u r y i s u n c l e a r . H o w e v e r , b o t h i s o l a t e d S E C S i n v i t r o a n d a r a t S E C c e l l l i n e w e r e a b l e t o m e t a b o l i z e M C T t o t o x i c D Y r r o l i c m e t a b o l i t e s . T h i s s u g g e s t e d t h a t M C T m a y i n j u r y S E C S d i r e c t l y t h r o u g h t h e f o r m a t i o n o f i t s t o x i c m e t a b o l i t e , M C T P . M o r e o v e r , a n i s o z y m e o f t h e C Y P 3 A s u b f a m i l y w a s d e t e c t e d i n t h e r a t S E O c e l l l i n e . l s o z y m e ( s ) o f t h e C Y P 3 A 3 0 1 s u b f a m i l y a r e r e s p o n s i b l e f o r b i o a c t i v a t i n g M C T . T a k e n t o g e t h e r , t h i s r a i s e d t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e e a r l y S E C i n j u r y o b s e r v e d i n M C T / L P S c o t r e a t e d a n i m a l s w a s d u e t o a n i n t e r a c t i o n o f M C T P p r o d u c e d b y S E C S t h e m s e l v e s w i t h L P S o r a n L P S - d e r i v e d m e d i a t o r ( e . g . , T N F - a ) . I t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t M C T P p r o d u c e d i n S E C S l o w e r s G S H c o n c e n t r a t i o n l e v e l s i n t h e s e c e l l s , a n d t h e e f f e c t s o f L P S a n d / o r T N F - a f u r t h e r d e c r e a s e G S H , r e s u l t i n g i n o v e r t S E C i n j u r y ( J a e s c h k e , 1 9 9 2 ; D e L e v e e t a l . , 1 9 9 6 ) . A s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d , s u s t a i n e d e l e v a t i o n s i n p l a s m a T N F - o a n d C I N C - 1 w e r e o b s e r v e d i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . I t i s p o s s i b l e t h a t b o t h m e d i a t o r s m o d u l a t e t h e p r o l o n g e d a c c u m u l a t i o n a n d p e r h a p s a c t i v a t i o n o f P M N s i n t h i s i n j u r y m o d e l . T o u n d e r s t a n d f u r t h e r t h e i n t e r d e p e n d e n c e o f T N F - a a n d h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n , t h e e f f e c t o f P M N d e p l e t i o n o n p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n a n d t h e e f f e c t o f K 0 i n a c t i v a t i o n a n d T N F - a d e p l e t i o n o n h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n w e r e s t u d i e d . P M N d e p l e t i o n d i d n o t r e s u l t i n a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e p l a s m a T N F - a c o n c e n t r a t i o n , w h i c h s u g g e s t e d t h a t P M N s w e r e n o t n e e d e d t o p r o v o k e o r m a i n t a i n p l a s m a T N F - a r e l e a s e i n t h i s m o d e l . K 0 i n a c t i v a t i o n o r T N F - d d e p l e t i o n d e c r e a s e d h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n , w h i c h s u g g e s t e d t h a t K C - d e r i v e d T N F - a c o n t r i b u t e d t o P M N a c c u m u l a t i o n / r e t e n t i o n i n t h e l i v e r . A c c o r d i n g l y , P M N s p l a y a c r i t i c a l r o l e i n M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , a n d T N F - a m a y b e i n v o l v e d i n P M N a c c u m u l a t i o n / r e t e n t i o n i n t h i s c o t r e a t m e n t m o d e l . F i n a l l y , t h e r o l e o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m w a s e x p l o r e d . A c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m o c c u r r e d b e f o r e t h e o n s e t o f H P C i n j u r y . 3 0 2 I m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i s o f l i v e r s f r o m M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s r e v e a l e d h e p a t i c f i b r i n d e p o s i t i o n , w h i c h f u r t h e r s u g g e s t e d a c o n t r i b u t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t h i s l i v e r i n j u r y m o d e l . I n d e e d , i n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m w i t h a n t i c o a g u l a n t s p r e v e n t e d H P C i n j u r y b u t o n l y m o d e s t l y d e c r e a s e d S E C i n j u r y . M o r p h o m e t r i c a n a l y s i s o f l e s i o n s i z e r e v e a l e d t h a t a n t i c o a g u l a n t s S i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d t h e C L a n d M 2 l e s i o n s i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s . H e n c e , t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i s a n o t h e r c r i t i c a l c o m p o n e n t o f t h i s l i v e r i n j u r y m o d e l . N e i t h e r K 0 i n a c t i v a t i o n n o r T N F - a d e p l e t i o n p r e v e n t e d c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n , b u t P M N d e p l e t i o n d i d . T h i s s u g g e s t e d t h a t P M N s p r o m o t e c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n ( e . g . , p e r h a p s t h r o u g h t h e i n d u c t i o n o f T F ) a n d / o r , p e r h a p s , m o d u l a t e o t h e r c e l l s ( i . e . , S E C S ) t o b e c o m e p r o c o a g u l a n t i n t h i s m o d e l . M o r e o v e r , p r e v e n t i o n o f c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n d i d n o t a f f e c t t h e s u s t a i n e d i n c r e a s e i n p l a s m a T N F - d , w h i c h i n d i c a t e d t h a t a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m w a s n o t n e e d e d f o r T N F - a r e l e a s e . A n t i c o a g u l a n t a d m i n i s t r a t i o n d i d , h o w e v e r , d e c r e a s e P M N a c c u m u l a t i o n , f u r t h e r s u g g e s t i n g i n t e r p l a y b e t w e e n t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a n d P M N s i n c o n t r i b u t i n g t o H P C i n j u r y . O v e r a l l , t h e r e s u l t s o f t h i s d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h s u g g e s t t h a t K C s , T N F - a , P M N s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a r e i n t e r d e p e n d e n t c o m p o n e n t s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . A s i m p l i f i e d m e c h a n i s m o f i n j u r y f o r t h i s m o d e l i s p r o p o s e d i n F i g u r e 8 . 1 . T o s u m m a r i z e , c o e x p o s u r e t o M O T a n d L P S r e s u l t s i n e a r l y a c t i v a t i o n o f a n d 3 0 3 F i g u r e 8 . 1 . fi t h o g e n e s i s o f M C T / E F § - i n d u c e d L i v e r I n j u r y . A t a s u b t h r e s h o l d M C T d o s e , M C T P i n d u c e s a h o m e o s t a t i c c h a n g e i n H P C S a n d S E C S b u t n o t o v e r t i n j u r y , a l t h o u g h t h e c h a n g e m a k e s t h e s e c e l l s m o r e s u s c e p t i b l e t o o t h e r i n s u l t s . L P S o r a n u n k n o w n L P S - d e r i v e d m e d i a t o r ( s ) w o r k s i n c o n j u n c t i o n w i t h M C T P p r o d u c e d i n H P C S a n d / o r S E C S t o c a u s e e a r l y S E O i n j u r y t h a t i s i n d e p e n d e n t o f P M N s . A c t i v a t i o n o f / i n j u r y t o S E C S r e s u l t s i n t h e a c t i v a t i o n o f p r o c o a g u l a n t s u r f a c e a n d i n t h e e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s . P M N s a r e t h e r e b y a r r e s t e d i n t h e s i n u s o i d s . C o n c u r r e n t a c t i v a t i o n o f K C s r e s u l t s i n t h e r e l e a s e o f T N F - o , C I N C - 1 , a n d o t h e r m e d i a t o r s . A c t i v a t e d S E C S a n d H P C S p r o d u c e C I N O - 1 a n d p o s s i b l y o t h e r f a c t o r s t h a t w o r k i n c o m b i n a t i o n w i t h T N F - a t o e n h a n c e m i g r a t i o n o f P M N s i n t o t h e p a r e n c h y m a a n d p r o m o t e t h e i r a c t i v a t i o n . O n e s u c h f a c t o r m a y b e t h r o m b i n ( d a s h e d a r r o w ) a r i s i n g f r o m t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m b y p r o c o a g u l a n t S E C S a n d P M N s . T h r o m b i n f o r m a t i o n m a y l e a d t o f i b r i n c l o t f o r m a t i o n p o s s i b l y r e s u l t i n g i n l o c a l h y p o p e r f u s i o n c a u s i n g i s c h e m i c / h y p o x i c i n j u r y t o n e a r b y H P C S a n d S E C S . T h i s m a y w o r k i n c o n j u n c t i o n w i t h i n j u r y c a u s e d b y a c t i v a t e d P M N s , w h i c h r e l e a s e p r o t e a s e s a n d o t h e r c y t o t o x i c f a c t o r s t o d a m a g e H P C S a n d r e s u l t s i n f u r t h e r p r o g r e s s i o n o f S E C i n j u r y . [ I m a g e i n t h i s d i s s e r t a t i o n i s p r e s e n t e d i n c o l o r ] . 3 0 4 S y s t e m A c t i v a t i o n ' > F i a n C l o t H y p o p e r f u s l o n O . a a P 0 : : I E - r l v l n l u r v l : 5 [ m - I n j u r y ] : . O O O O O O D O O O O O O . . O a a a a o a a a a a a s o o o a o o : O A O A O O A O A p p r o x i m a t e T i m e ( h r ) — — — > 3 0 5 i n j u r y t o S E C S , p o s s i b l y b y t h e d i r e c t i n t e r a c t i o n o f L P S a n d M C T P g e n e r a t e d f r o m S E C S a n d / o r H P C S . A c t i v a t i o n o f S E C S r e s u l t s i n i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f T F ( i . e . , S E C S b e c o m e p r o c o a g u l a n t ) a n d a d h e s i o n m o l e c u l e s , t h e r e b y l e a d i n g t o t h e a r r e s t o f P M N s i n t h e s i n u s o i d s . C o n c u r r e n t a c t i v a t i o n o f K C S a n d p o s s i b l y o t h e r c e l l s r e s u l t s i n t h e r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r y f a c t o r s s u c h a s T N F - a a n d C l N C - 1 , w h i c h p r o m p t s P M N m i g r a t i o n a n d a c t i v a t i o n i n p a r e n c h y m a . A c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m r e s u l t s f r o m S E C a n d / o r P M N a c t i v a t i o n ( v i a i n d u c t i o n o f T F ) a n d i s r e s p o n s i b l e f o r t h e f o r m a t i o n o f t h r o m b i n . T h r o m b i n c a u s e s f i b r i n c l o t f o r m a t i o n , p o s s i b l y l e a d i n g t o h y p o p e r f u s i o n a n d i s c h e m i c / h y p o x i c i n j u r y t o S E C S a n d H P C S . I n a d d i t i o n , t h r o m b i n c a n h a v e o t h e r r o l e s b e s i d e s f i b r i n c l o t f o r m a t i o n , i n c l u d i n g s e r v i n g a s a P M N c h e m o a t t r a c t a n t ( B i z i o s e t a l . , 1 9 8 6 ; H o f f m a n a n d C o o p e r , 1 9 9 5 ; H o l l a n d e t a l . , 1 9 9 8 ) . A c t i v a t e d P M N s r e l e a s e t o x i c f a c t o r s ( i . e . , R O S a n d p r o t e a s e s ) t h a t d a m a g e H P C S s e n s i t i z e d t o i n j u r y b y M C T e x p o s u r e a n d f u r t h e r t h e p r o g r e s s i o n o f S E C i n j u r y . A l t h o u g h n o t e v e r y m e c h a n i s t i c q u e s t i o n i n v o l v e d i n M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y w a s a n s w e r e d , i n e s s e n c e , t h e h y p o t h e s i s o f t h i s t h e s i s h a s b e e n s u p p o r t e d . T h a t i s , i n f l a m m a t o r y e v e n t s ( i . e . , K C s , T N F - d a n d P M N s ; a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ) p a r t i c i p a t e c a u s a l l y i n t h e s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y f r o m c o e x p o s u r e t o M C T a n d L P S . A f i n a l q u a l i f i e r m a y b e n e c e s s a r y h o w e v e r , a s t h e s e f i n d i n g s o n l y a p p l y t o a c o t r e a t m e n t m o d e l o f L P S a d m i n i s t e r e d 4 h o u r s a f t e r M C T . I t i s p o s s i b l e t h a t d i f f e r e n t c o m b i n a t i o n s o f i n f l a m m a t o r y c e l l s a n d / o r m e d i a t o r s a r e n e c e s s a r y t o i n d u c e l i v e r i n j u r y d e p e n d i n g o n t h e t e m p o r a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n M C T a n d L P S a d m i n i s t r a t i o n . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n w i l l b e 3 0 6 n e e d e d t o d e t e r m i n e i f K C s , T N F - d , P M N s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a r e a l s o c r i t i c a l i n o t h e r d o s i n g p a r a d i g m s f o r M C T / L P S c o t r e a t m e n t ( e . g . , L P S a d m i n i s t e r e d a n h o u r b e f o r e M C T ) . 8 . 0 . C o m p a r i s o n t o O t h e r M o d e l s T h e m e c h a n i s m f o r M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i s s i m i l a r t o t h a t o f L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , t h o u g h s o m e d i f f e r e n c e s e x i s t . I n t h e L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l , K C S , P M N s , T N F - a a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( i . e . , t h r o m b i n ) a r e i n v o l v e d i n H P C i n j u r y ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 , 1 9 9 3 ; F u j i t a e t a l . , 1 9 9 5 ; H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ; M o u l i n e t a l . , 1 9 9 6 ; B r o w n e t a l . , 1 9 9 7 ) . A l t h o u g h S E C i n j u r y i s k n o w n t o o c c u r , i t i s u n c l e a r w h a t i n f l a m m a t o r y f a c t o r s c a u s e t h i s i n j u r y ( Y a c h i d a e t a l . , 1 9 9 8 ) . S i m i l a r l y , i n t h e M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l , P M N s , K C S , T N F - a a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a r e i n v o l v e d i n H P C i n j u r y a n d l a t e - s t a g e S E O i n j u r y . T h e r o l e o f p l a t e l e t s a n d t h e s p e c i f i c m e c h a n i s m o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d i n t h e L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l b u t n o t i n t h e M C T / L P S - c o t r e a t m e n t m o d e l ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . I n t h e L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l , p l a t e l e t s a n d t h r o m b i n a c t i v a t i o n ( i . e . , P A R - 1 a c t i v a t i o n ) b u t n o t f i b r i n c l o t f o r m a t i o n w e r e f o u n d t o b e c r i t i c a l f o r t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ; M o u l i n e t a l . , 1 9 9 6 ; C o p p l e e t a l , 2 0 0 3 ) . M o r e o v e r , n e i t h e r K C i n a c t i v a t i o n n o r T N F - o d e p l e t i o n d e c r e a s e h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n ( H e w e t t e t a l . , 1 9 9 2 ) , i n d i c a t i n g t h a t K 0 5 a n d T N F - d a r e n o t i n v o l v e d i n P M N a c c u m u l a t i o n / r e t e n t i o n i n t h e L P S - 3 0 7 i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l a s t h e y a r e i n t h e M C T / L P S - c o t r e a t m e n t m o d e l . A n o t h e r d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e t w o m o d e l s e x i s t s i n t h e r o l e o f T N F - a i n c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n . I n t h e L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l , T N F - d d e p l e t i o n p r e v e n t e d a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ) , b u t K C i n a c t i v a t i o n h a d n o e f f e c t o n c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 6 a ) . T h i s r e s u l t i n d i c a t e s t h a t T N F - o i s i n v o l v e d i n c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n . C o n v e r s e l y , i n t h e M C T / L P S c o t r e a t m e n t m o d e l n e i t h e r T N F - a d e p l e t i o n n o r K 0 i n a c t i v a t i o n p r e v e n t s a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . F i n a l l y , i n t h e L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l , t h e a n t i c o a g u l a n t h e p a r i n d i d n o t r e d u c e h e p a t i c P M N a c c u m u l a t i o n ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ) , b u t i n t h e M C T / L P S - c o t r e a t m e n t m o d e l a n t i c o a g u l a n t a d m i n i s t r a t i o n d i d . H e n c e , t h i s s u g g e s t e d t h a t t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m w a s i n v o l v e d i n P M N r e c r u i t m e n t i n t h e M C T / L P S - c o e x p o s u r e m o d e l b u t n o t n e c e s s a r i l y i n t h e L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l . A c c o r d i n g l y , t h o u g h a s i m i l a r m e c h a n i s m o f i n j u r y o c c u r r e d i n t h e s e t w o m o d e l s , i t i s l i k e l y t h a t d i f f e r e n c e s i n t h e M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l a r o s e f r o m t h e c o n t r i b u t i o n o f M C T t o t h e i n j u r y . M e c h a n i s t i c a l l y , M C T - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i s d i f f e r e n t f r o m L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . K C s , P M N s a n d T N F - a a r e n o t r e q u i r e d f o r H P C i n j u r y i n t h e M C T - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l . H o w e v e r , a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i s i m p o r t a n t f o r t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y . P M N d e p l e t i o n a n d i n a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , o n t h e o t h e r h a n d , f a i l e d t o p r e v e n t S E C i n j u r y ( C o p p l e e t a l . , 2 0 0 2 b ) . I t i s n o t k n o w n w h a t e f f e c t s K C S o r T N F - a h a v e o n S E C i n j u r y . H e n c e , b a s e d o n t h e p r e s e n t e v i d e n c e , i t d o e s n o t a p p e a r t h a t 3 0 8 e l e m e n t s o f t h e i n f l a m m a t o r y s y s t e m a r e r e q u i r e d f o r i n j u r y i n t h e h i g h d o s e M C T m o d e l . A s a r e l a t e d a s i d e , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e r e h a v e b e e n n o d i r e c t s t u d i e s t o d e m o n s t r a t e t h a t M C T P a l t e r s t h e h o m e o s t a s i s o f S E C S a n d H P C s t o m a k e t h e s e c e l l s m o r e s u s c e p t i b l e t o L P S . F u t u r e s t u d i e s m a y b e w a r r a n t e d t o c o n f i r m t h e p r e s u m p t i o n t h a t M C T P e n h a n c e s t h e s u s c e p t i b i l i t y o f t h e s e l i v e r c e l l s t o L P S o r i t s m e d i a t o r s . T a k e n t o g e t h e r , i t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t i n t h e M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l i n i t i a l e x p o s u r e t o a s m a l l d o s e o f M C T r e s u l t s i n t h e h o m e o s t a t i c a l t e r a t i o n o f H P C S a n d S E C S i n C L r e g i o n s o f t h e l i v e r l o b u l e . T h i s a l t e r a t i o n i n H P C S a n d / o r S E C S p r e d i s p o s e s t h e s e c e l l s t o i n j u r y a n d c a u s e s t h e r e l e a s e o f m e d i a t o r ( s ) w h i c h , u p o n i n t e r a c t i n g w i t h a m o d e s t l y s t i m u l a t e d i n f l a m m a t o r y s y s t e m ( i . e . , a f t e r e x p o s u r e t o L P S ) , g e n e r a t e s a p r o f o u n d i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e . T h e i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e c a u s e s H P C a n d S E C n e c r o s i s i n C L a n d M 2 r e g i o n s o f t h e l i v e r l o b u l e . C L l e s i o n s l i k e l y f o r m a s H P C S a n d S E C S p r o g r e s s f r o m a l t e r e d h o m e o s t a s i s t o f r a n k i n j u r y d u e t o t h e m o l e c u l a r e f f e c t s o f L P S o r L P S - d e r i v e d m e d i a t o r s o n t h e s e s e n s i t i z e d c e l l s . M Z l e s i o n s m a y f o r m d i r e c t l y a s a r e s u l t o f t h e i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e i n d u c i n g d e g e n e r a t i o n a n d n e c r o s i s i n H P C S a n d S E C S . I t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e f u r t h e r t h a t M C T e x p o s u r e a l s o a l t e r e d t h e h o m e o s t a s i s o f H P C S a n d S E C S i n t h e M 2 r e g i o n o f t h e l i v e r l o b u l e , a l b e i t t o a l e s s e r d e g r e e t h a n i n t h e C L r e g i o n , a n d t h i s s e n s i t i z e d t h e s e c e l l s t o i n f l a m m a t i o n - i n d u c e d i n j u r y . S i n c e t h e h i s t o p a t h o l o g y o f t h e M 2 l e s i o n s h o w e d a n u n u s u a l a m o u n t o f c o n g e s t i o n a n d h e m o r r h a g e i n M C T / L P S - c o t r e a t e d a n i m a l s , i t i s p o s s i b l e t h a t S E C S w i t h i n t h i s r e g i o n w e r e 3 0 9 p a r t i c u l a r l y s e n s i t i z e d t o d e s t r u c t i o n b y L P S . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t p h a r m a c o l o g i c m a n i p u l a t i o n o f t h i s m o d e l t o i n a c t i v a t e o r d e p l e t e K C s , P M N s , T N F - d o r t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m r e s u l t e d i n a r e d u c t i o n i n b o t h l e s i o n a r e a s , i n d i c a t i n g t h a t t h e i n f l a m m a t i o n - i n d u c e d i n j u r y w a s c r i t i c a l t o b o t h l e s i o n s . O n e i n t r i g u i n g q u e s t i o n t h a t a r i s e s f r o m t h i s s u p p o s i t i o n i s : w h a t i s t h e r o l e o f S E C i n j u r y i n t h e M C T / L P S - c o t r e a t m e n t m o d e l ? I s S E C a c t i v a t i o n fi n j u r y a n e p i p h e n o m e n o n a s i t r e l a t e s t o H P C d e s t r u c t i o n , o r i s i t i n d i r e c t l y r e s p o n s i b l e ( i . e . , t h r o u g h t h e r e l e a s e o f m e d i a t o r s ) f o r m o d u l a t i o n o f e f f e c t s i n H P C S a n d i n f l a m m a t o r y c e l l s ? F u r t h e r s t u d y w i l l b e n e e d e d t o a d d r e s s t h i s q u e s t i o n . F i n a l l y , t h e m e c h a n i s m o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i s s i m i l a r t o o t h e r m o d e l s o f L P S - i n d u c e d a u g m e n t a t i o n o f h e p a t o t o x i c a n t i n j u r y . I n t h e a l l y l a l c o h o l / L P S m o d e l , K C S , P M N s , C O X - 2 p r o d u c t s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a r e c r i t i c a l t o i n j u r y b u t T N F - a i s n o t ( S n e e d e t a l . , 1 9 9 7 ; S n e e d e t a l . , 2 0 0 0 ; K i n s e r e t a l . , 2 0 0 0 , 2 0 0 2 ; G a n e y e t a l . , 2 0 0 1 ) . L i k e w i s e , i n t h e a f l a t o x i n 8 1 / L P S m o d e l , P M N s , T N F - a , a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , b u t n o t C O X - 2 p r o d u c t s , a r e i n v o l v e d i n H P C i n j u r y ( B a r t o n e t a l . , 2 0 0 0 a ; 2 0 0 1 ; L u y e n d y k e t a l . , 2 0 0 3 ) . O v e r a l l , w h i l e s i m i l a r i t i e s i n t h e m e c h a n i s m w i t h o t h e r L P S - p o t e n t i a t i o n m o d e l s e x i s t , e s p e c i a l l y i n t h e r o l e o f P M N s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , t h e r e a r e a l s o d i f f e r e n c e s . A c c o r d i n g l y , t h e m e c h a n i s m f o r L P S a u g m e n t a t i o n o f h e p a t o t o x i c a n t - i n d u c e d i n j u r y i s n o t u n i v e r s a l a c r o s s t o x i c a n t s b u t d o e s d e p e n d o n c o m p o n e n t s o f i n f l a m m a t i o n . D i f f e r e n c e s i n t h e c r i t i c a l i n f l a m m a t o r y c o m p o n e n t s m a y v a r y d e p e n d i n g o n t h e p a r t i c u l a r h e p a t o t o x i c a n t a n d h o w t h a t h e p a t o t o x i c a n t m e c h a n i s t i c a l l y c o n t r i b u t e s t o i n j u r y . 3 1 0 8 . 0 . S i g n i f i c a n c e a n d F u t u r e S t u d i e s T h e r e s u l t s o f t h i s d i s s e r t a t i o n , w h i l e a d d r e s s i n g t h e o r i g i n a l h y p o t h e s i s , h a v e g e n e r a t e d a n u m b e r o f q u e s t i o n s a n d i n t h e p r o c e s s h a v e l a i d d o w n t h e f o u n d a t i o n f o r a d d i t i o n a l r e s e a r c h i n t o m e c h a n i s m s o f i n j u r y . A n s w e r i n g t h e s e q u e s t i o n s m a y b e b e n e f i c i a l i n e l u c i d a t i n g t h e m e c h a n i s m b y w h i c h i n f l a m m a t i o n a c t s a s a d e t e r m i n a n t o f s u s c e p t i b i l i t y t o c h e m i c a l i n t o x i c a t i o n . M o r e o v e r , s u c h a n s w e r s m a y h a v e c l i n i c a l a p p l i c a t i o n i n t h e t r e a t m e n t o f i n d i v i d u a l s s u f f e r i n g f r o m c h e m i c a l i n s u l t a s w e l l a s c o n t r i b u t e t o m o r e a c c u r a t e p r e d i c t i o n o f c o n d i t i o n s t h a t c o u l d c a u s e t h e e n h a n c e m e n t o f x e n o b i o t i c t o x i c i t y . O n e q u e s t i o n a r i s i n g f r o m t h i s d i s s e r t a t i o n c o n c e r n s t h e r o l e o f S E C i n j u r y i n c o n t r i b u t i n g t o H P C i n j u r y i n t h i s c o t r e a t m e n t m o d e l . A l t h o u g h t h i s w a s a d d r e s s e d i n t h e p r e v i o u s s e c t i o n , i t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t S E C S m a y b e a n i m p o r t a n t b u t o v e r l o o k e d c o m p o n e n t i n m o d e l s i n v o l v i n g L P S a u g m e n t a t i o n o f h e p a t o t o x i c a n t s . A n o t h e r q u e s t i o n c o n c e r n s t h e c a u s a l r o l e o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t h e M C T / L P S - c o t r e a t m e n t m o d e l . T h a t i s , w h a t i s t h e r o l e o f t h r o m b i n a n d p a r t i c u l a r l y f i b r i n c l o t f o r m a t i o n i n t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r i n j u r y ? I n t h e L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l , t h r o m b i n ’ s e f f e c t i s i n d e p e n d e n t o f f i b r i n c l o t f o r m a t i o n ( H e w e t t a n d R o t h , 1 9 9 5 ) . H e n c e , i n t h e M C T / L P S - c o t r e a t m e n t m o d e l , i s t h r o m b i n i n v o l v e d i n f i b r i n c l o t f o r m a t i o n , P M N c h e m o t a x i s , p r o i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e a n d / o r a c t i v a t i o n o f P A R - 1 r e c e p t o r a n d h o w d o t h e s e u l t i m a t e l y a p p l y t o H P C a n d S E C i n j u r y ? I n p a r t i c u l a r , i s f i b r i n c l o t f o r m a t i o n n e c e s s a r y f o r l i v e r 3 1 1 i n j u r y ? I n t h e M C T / L P S c o t r e a t m e n t m o d e l , b a s e d o n t h e f o r m a t i o n o f h e p a t i c f i b r i n d e p o s i t s , s u g g e s t s t h a t c l o t f o r m a t i o n m a y l e a d t o l o c a l h y p o p e r f u s i o n a n d s u b s e q u e n t i n j u r y . F i b r i n c l o t f o r m a t i o n m a y t h u s b e a n i m p o r t a n t c o n t r i b u t i n g c o m p o n e n t t o t h e s y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y t h a t o c c u r s i n t h i s m o d e l ( F i g u r e 8 . 1 ) . F i n a l l y , w h a t i s t h e r o l e o f p l a t e l e t s a n d T F i n M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y ? I n t h e L P S ~ i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l , i t w a s p o s t u l a t e d t h a t p l a t e l e t s w e r e c r i t i c a l f o r l i v e r i n j u r y d u e t o t h e r e l e a s e o f m e d i a t o r s r a t h e r t h a n t h r o u g h c l o t f o r m a t i o n ( P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 6 ) . O n e s u c h m e d i a t o r r e l e a s e d i s P A F . I f p l a t e l e t a c t i v a t i o n i s i m p o r t a n t i n t h e M C T / L P S c o t r e a t m e n t m o d e l , t h e n P A F c o u l d b e a c r i t i c a l m e d i a t o r i n t h i s l i v e r i n j u r y . A l t h o u g h t h e r o l e o f P A F i n L P S - i n d u c e d i n j u r y i s c o n t r o v e r s i a l , P A F , c a n p r o m o t e P M N c h e m o t a x i s , a g g r e g a t i o n , e n d o t h e l i a l c e l l a d h e s i o n , g r a n u l a r s e c r e t i o n a n d s u p e r o x i d e p r o d u c t i o n ( l m u r a e t a l . , 1 9 8 6 ; L o r a n t , e t a l . , 1 9 9 1 ; C o u g h l a n e t a l . , 1 9 9 4 ; Z i m m e r m a n e t a l . , 1 9 9 4 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 7 ) . S i n c e P M N s a r e c r i t i c a l t o t h e p a t h o g e n e s i s o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y , i t i s p o s s i b l e t h a t P A F i s a n i m p o r t a n t m o d u l a t o r o f P M N a c t i v i t y i n t h i s m o d e l . F u r t h e r m o r e , i n d u c t i o n o f T F i s i m p o r t a n t f o r t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t h e L P S m o d e l ( K a r i m a e t a l . , 1 9 9 9 ) . I t i s k n o w n t h a t T F i s i n d u c e d o n t h e s u r f a c e o f S E C a n d P M N s , a n d t h i s m a y h a v e a r o l e i n a c t i v a t i n g t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m ( S t e r n e t a l . , 1 9 8 5 ; B r a y e t a l . , 1 9 8 7 ; S c h u l t z e a n d R o t h , 1 9 9 8 ; T o d o r o k i e t a l . , 2 0 0 2 ) . A c c o r d i n g l y , d o e s T F h a v e a r o l e i n a c t i v a t i n g t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n t h e M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y m o d e l ? O t h e r p o s s i b l e a c t i v a t o r s o f t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i n c l u d e m o n o c y t e s a n d p l a t e l e t s ( O s t e r u d , 3 1 2 1 9 9 5 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 9 5 ; P o l a c k e t a l . , 1 9 9 7 ) . A r e t h e s e f a c t o r s i n v o l v e d a s w e l l ? I n c o n c l u s i o n , c o e x p o s u r e o f r a t s t o s m a l l , n o n i n j u r i o u s d o s e s o f M C T a n d L P S r e s u l t e d i n s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y . K C s , T N F - o , P M N s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m a l l p l a y c r i t i c a l r o l e s i n t h e d e v e l o p m e n t o f M C T / L P S - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . B y d i s c e r n i n g t h e f a c t o r s i n v o l v e d a n d n o t i n g t h e s i m i l a r i t i e s b e t w e e n t h e m e c h a n i s m o f i n j u r y i n t h i s m o d e l a n d o t h e r m o d e l s o f L P S p o t e n t i a t i o n o f x e n o b i o t i c t o x i c i t y , a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e e n h a n c e m e n t p h e n o m e n o n c a n b e a c h i e v e d . F o r e x a m p l e , b a s e d o n s o m e m o d e l s y s t e m s e x a m i n e d ( e . g . , a l l y l a l c o h o l / L P S , a f l a t o x i n B 1 / L P S , g a l a c t o s a m i n e / L P S a n d o t h e r L P S p o t e n t i a t i o n m o d e l s ) , t h e i n v o l v e m e n t o f P M N s a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m f r e q u e n t l y a p p e a r t o b e c r i t i c a l c o m p o n e n t s i n L P S p o t e n t i a t i o n o f h e p a t o t o x i c a n t s ( r e v i e w e d i n G a n e y a n d R o t h , 2 0 0 1 ; K i n s e r e t a l . , 2 0 0 0 , 2 0 0 2 ; B a r t o n e t a l . , 2 0 0 0 a ; L u y e n d y k e e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h i s k n o w l e d g e m a y b e u s e f u l c l i n i c a l l y i n t r e a t i n g i n d i v i d u a l s s u f f e r i n g f r o m c h e m i c a l t o x i c i t i e s t h a t m a y b e e n h a n c e d b y i n f l a m m a t i o n . I n t h e e x a m p l e n o t e d a b o v e , i t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t i n h i b i t o r s o f P M N s o r a n t i c o a g u l a n t s m a y b e u s e f u l i n t r e a t i n g s u c h i n j u r y . M o r e o v e r , t h i s w o r k e m p h a s i z e s t h e i m p o r t a n c e o f c o n s i d e r i n g t h e e f f e c t s o f u n d e r l y i n g i n f l a m m a t i o n i n f o r m u l a t i n g r i s k a n d s a f e t y a s s e s s m e n t s f o r h e p a t o t o x i c a n t s . R e s u l t s o f t h i s s t u d y s u g g e s t t h a t i n d i v i d u a l s e x p e r i e n c i n g a m i l d i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e m a y b e a t p a r t i c u l a r r i s k f o r i l l n e s s f r o m f o o d s o r a l t e r n a t i v e m e d i c i n e s c o n t a i n i n g P A s o r o t h e r p o t e n t i a l l y h e p a t o t o x i c c o m p o u n d s . 3 1 3 B I B L I O G R A P H Y 3 1 4 B I B L I O G R A P H Y A d a c h i , Y . , B r a d f o r d , B . U . , G a o , W . , B o j e s , H . K . , a n d T h u r m a n , R . G . ( 1 9 9 4 ) . I n a c t i v a t i o n o f K u p f f e r c e l l s p r e v e n t s e a r l y a l c o h o l - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . H e p a t o l o g y 2 0 , 4 5 3 - 4 6 0 . A d a m s o n , G M , a n d B i l l i n g s , R E . ( 1 9 9 2 ) . T u m o r n e c r o s i s f a c t o r i n d u c e d o x i d a t i v e s t r e s s i n i s o l a t e d m o u s e h e p a t o c y t e s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 9 4 , 2 2 3 - 2 2 9 . A l l e n , J . R . , C h e s n e y , C . F . , a n d F r a z e e , W . J . ( 1 9 7 2 ) . M o d i f i c a t i o n s o f ~ p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d i n t o x i c a t i o n r e s u l t i n g f r o m a l t e r e d h e p a t i c m i c r o s o m a l e n z y m e s . T o x i c o l . A p p l . P h a r r n a c o l . 2 3 , 4 7 0 - 4 7 9 . A n d o n e g u i , G . , G o y e r t , S M , a n d K u b e s , P . ( 2 0 0 2 ) . L i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d l e u k o c y t e - e n d o t h e l i a l c e l l i n t e r a c t i o n s : A r o l e f o r 0 0 1 4 v e r s u s t o l l - l i k e r e c e p t o r 4 w i t h i n m i c r o v e s s e l s . J . I m m u n o l . 1 6 9 , 2 1 1 1 - 2 1 1 9 . A r i a , M . , M o c h i d a , S . , O h n o , A . , a n d F u j i w a r a , K . ( 1 9 9 6 ) . B l o o d c o a g u l a t i o n i n t h e h e p a t i c s i n u s o i d s a s a c o n t r i b u t i n g f a c t o r i n l i v e r i n j u r y f o l l o w i n g o r t h o t o p i c l i v e r t r a n s p l a n t a t i o n i n t h e r a t . T r a n s p l a n t a t i o n 6 2 , 1 3 9 8 - 1 4 0 1 . A r i a , M . , M o c h i d a , S . , O h n o , A . , O g a t a , l . , a n d F u j i w a r a , K . ( 1 9 9 3 ) . S i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l d a m a g e b y a c t i v a t e d m a c r o p h a g e s i n r a t l i v e r n e c r o s i s . G a s t r o e n t e r o l o g y 1 0 4 , 1 4 6 6 - 1 4 7 1 . A r i i , S . , a n d l m a m u r a , M . ( 2 0 0 0 ) . P h y s i o l o g i c a l r o l e o f s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s a n d K u p f f e r c e l l s a n d t h e i r i m p l i c a t i o n i n t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r i n j u r y . J . H e p a t o b i l i a r y P a n c r e a t . S u r g . 7 , 4 0 - 4 8 . A r t h u r , M . J . P . , B e n t l e y , I . S . , T a n n e r , A . R . , K a w o l s k i - S a u n d e r s , P . , M i l l w a r d - S a d l e r , C H , a n d W r i g h t , R . ( 1 9 8 5 ) . O x y g e n - d e r i v e d f r e e r a d i c a l s p r o m o t e h e p a t i c i n j u r y i n t h e r a t . G a s t r o e n t e r o l o g y 8 9 , 1 1 1 4 - 1 1 2 2 . A r t h u r , M . J . P . , K a w o l s k i - S a u n d e r s , P . , a n d W r i g h t , R . ( 1 9 8 6 ) . C o r y n e b a c t e r i u m p a r v u m - e l i c i t e d h e p a t i c m a c r o p h a g e d e m o n s t r a t e e n h a n c e d r e s p i r a t o r y b u r s t a c t i v i t y c o m p a r e d w i t h r e s i d e n t K u p f f e r c e l l s i n t h e r a t . G a s t r o e n t e r o l o g y 9 1 , 1 7 4 - 1 8 1 . A r t h u r , M . J . P . , K a w o l s k i - S a u n d e r s , P . , a n d W r i g h t , R . ( 1 9 8 8 ) . E f f e c t o f e n d o t o x i n o n r e l e a s e o f r e a c t i v e o x y g e n i n t e r m e d i a t e s b y r a t h e p a t i c m a c r o p h a g e s . G a s t r o e n t e r o l o g y 9 5 , 1 5 8 8 - 1 5 9 4 . 3 1 5 A z i z , S . M . , T o b o r e k , M . , H e n n i g , 8 . , E n d e a n , E . , a n d L i p k e , D . W . ( 1 9 9 7 ) . P o l y a m i n e r e g u l a t o r y p r o c e s s e s a n d o x i d a t i v e s t r e s s i n m o n o c r o t a l i n e - t r e a t e d p u l m o n a r y a r t e r y e n d o t h e l i a l c e l l s . C e l l B i o l . I n t . 2 1 , 8 0 1 - 8 1 2 . B a , Z . F . , W a n g , P . , K o o , D . J . , C i o f f i , W . G . , B l a n d , K L , a n d C h a u d r y , l . H . ( 2 0 0 0 ) . A l t e r a t i o n s i n t i s s u e o x y g e n c o n s u m p t i o n a n d e x t r a c t i o n a f t e r t r a u m a a n d h e m o r r h a g i c s h o c k . C r i t . C a r e . M e d . 2 8 , 2 8 3 7 - 2 8 4 2 . B a c k h e d , F . , M e i j e r , L . , N o r m a r k , S . , a n d R i c h t e r - D a h l f o r s , A . ( 2 0 0 2 ) . T L R 4 - d e p e n d e n t r e c o g n i t i o n o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e b y e p i t h e l i a l c e l l s r e q u i r e s S 0 0 1 4 . C e l l M i c r o b i a l . 4 , 4 9 3 - 5 0 1 . B a d g e r , D . A . , K u e s t e r , R . K . , S a u e r , J . - M . , a n d S i p e s , L G . ( 1 9 9 7 ) . G a d o l i n i u m c h l o r i d e r e d u c e s c y t o c h r o m e P 4 5 0 : R e l e v a n c e t o c h e m i c a l i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y . T o x i c o l o g y 1 2 1 , 1 4 3 - 1 5 3 . B a d g e r , D . A . , S a u e r , J . M . , H o g l e n , N . C . , J o l l e y , 0 . 8 . , a n d S i p e s , L G . ( 1 9 9 6 ) . T h e r o l e o f i n f l a m m a t o r y c e l l s a n d c y t o c h r o m e P 4 5 0 i n t h e p o t e n t i a t i o n o f C C I 4 - i n d u c e d l i v e r i n j u r y b y a s i n g l e d o s e o f r e t i n a l . T o x i c o l . A p p l . P h a r r n a c a l . 1 4 1 , 5 0 7 - 5 1 9 . B a l s a , 0 . , M e r l o s , M . , G i r a l , M . , F e r r a n d o , R . , G a r c i a - R a f a n e l l , J . , a n d P o r n , J . ( 1 9 9 7 ) . E f f e c t o f e n d o t o x i n a n d p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r o n r a t v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y : R o l e o f v a s o a c t i v e m e d i a t o r s . J . L i p i d M e d i a t o r C e l l S i g n a l 1 7 , 3 1 - 4 5 . B a r - S h a v i t , R . , K a h n , A . , F e n t o n , J r . , J . W . , a n d W i l n e r , J . D . ( 1 9 8 3 a ) . C h e m o t a c t i c r e s p o n s e o f m o n o c y t e s t o t h r o m b i n . J . C e l l . B i o l . 9 6 , 2 8 2 - 2 8 5 . B a r - S h a v i t , R . , K a h n , A . , F e n t o n , J r . , J . W . , a n d W i l n e r , J . D . ( 1 9 8 3 b ) . R e c e p t o r - m e d i a t e d c h e m o t a c t i c r e s p o n s e o f a m a c r o p h a g e c e l l l i n e ( J 7 7 4 ) t o t h r o m b i n . L a b I n v e s t . 4 9 , 7 0 2 - 7 0 7 . B a r t o n , 0 . 0 . , B a r t o n E . X . , G a n e y , P . E . , K u n k e l , S . L . , a n d R o t h R A ( 2 0 0 1 ) . B a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e e n h a n c e s a f l a t o x i n B 1 h e p a t o t o x i c i t y i n r a t s b y a m e c h a n i s m t h a t i s d e p e n d e n t o n t u m o r n e c r o s i s f a c t o r a t . H e p a t o l o g y 3 3 , 6 6 - 7 3 . B a r t o n , 0 . 0 . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R . A . ( 2 0 0 0 a ) . L i p o p o l y s a c c h a r i d e a u g m e n t s a f l a t o x i n 8 1 - i n d u c e d l i v e r i n j u r y t h r o u g h n e u t r o p h i l - d e p e n d e n t a n d - i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s . T o x i c o l . S c i . 5 8 , 2 0 8 - 2 1 5 . B a r t o n , 0 0 . , H i l l , D . A . , Y e e , S . B . , B a r t o n , E . X . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R . A . ( 2 0 0 0 b ) . B a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e e x p o s u r e a u g m e n t s a f l a t o x i n 8 , - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . T o x i c o l . S c i . 5 5 , 4 4 4 - 4 5 2 . 3 1 6 B a u t i s t a , A . P . , M e s z a r o s , K . , B o j t a , J . , a n d S p i t z e r , J . J . ( 1 9 9 0 ) . S u p e r o x i d e a n i o n g e n e r a t i o n i n t h e l i v e r d u r i n g t h e e a r l y s t a g e o f e n d o t o x e m i a i n r a t s . J . L e u k o c . B i o l . 4 8 , 1 2 3 - 1 2 8 . B a y b u t t , R . G . , a n d M o l t e n i , A . ( 1 9 9 9 ) . D i e t a r y B - c a r o t e n e p r o t e c t s l u n g a n d l i v e r p a r e n c h y m a o f r a t s t r e a t e d w i t h m o n o c r o t a l i n e . T o x i c o l o g y 1 3 7 , 6 9 - 8 0 . B e a r r n a n , S J . ( 2 0 0 0 ) . V e n o - o c c l u s i v e d i s e a s e o f t h e l i v e r . C u r r . O p i n . O n c o l . 1 2 , 1 0 3 - 1 0 9 . B e l t r a n , A . E . , C o n c e p c i o n , F . , M a n z a n a r e s , 0 . , G a r r i d o , G . , G l a r i a , L A , a n d R o j a s , A . ( 1 9 9 9 ) . H e p a r i n a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t h e p a r i n d e c r e a s e n i t r i c o x i d e p r o d u c t i o n b y h u m a n p o l y m o r p h o n u c l e a r c e l l s . A r c h . M e d . F i e s . 3 0 , 1 1 6 - 1 1 9 . B e r g m e y e r , H . V . , a n d B e m t , E . ( 1 9 7 4 ) . L a c t a t e d e h y d r o g e n a s e U V a s s a y w i t h p y r u v a t e a n d N A D H . I n M e t h o d s o f E n z y m a t i c A n a l y s i s ( H . V . B e r g m e y e r , E d . ) , p p . 5 2 4 - 5 7 9 . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . B e v i l a c q u a , M . P . , P o b e r , J . S . , M a j e a u , G . R . , F i e r s , W . , C o t r a n , 8 . 8 . , a n d G i b r o n e M . A . , J r . ( 1 9 8 6 ) . R e c o m b i n a n t t u m o r n e c r o s i s f a c t o r i n d u c e s p r o c o a g u l a n t a c t i v i t y i n c u l t u r e d h u m a n v a s c u l a r e n d o t h e l i u m : C h a r a c t e r i z a t i o n a n d c o m p a r i s o n w i t h t h e a c t i o n s o f i n t e r l e u k i n - 1 . P r a c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 8 3 , 4 5 3 3 - 4 5 3 7 . B h a g w a n d e e n , B . S . , A p t e , M . , M a n w a r r i n g , L . , a n d D i c k e s o n , J . ( 1 9 8 7 ) . E n d o t o x i n - i n d u c e d h e p a t i c n e c r o s i s i n r a t s o n a n a l c o h o l d i e t . J . P a t h o l . 1 5 2 , 4 7 - 5 3 . B i f f l , W . L . , M o o r e , E . E . , M o o r e , E A , B a r n e t t , 0 . 0 . , J r . , S i l l i m a n , 0 . 0 . , a n d P e t e r s o n , V . M . ( 1 9 9 6 ) . I n t e r l e u k i n - 6 s t i m u l a t e s n e u t r o p h i l p r o d u c t i o n o f p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r . J . L e u k o c . B i o l . 5 9 , 5 6 9 - 5 7 4 . B i z i a s , R . , L a i , L . , F e n t o n , J . W . , I I , a n d M a l i k , A B . ( 1 9 8 6 ) . T h r o m b i n - i n d u c e d c h e m o t a x i s a n d a g g r e g a t i o n o f n e u t r o p h i l s . J . C e l l . P h y s i o l . 1 2 8 , 4 8 5 - 4 9 0 . B l o o m , A L . ( 1 9 9 0 ) . P h y s i o l o g y o f b l o o d c o a g u l a t i o n . H a e m a s t a s i s 2 0 , 1 4 - 2 9 . B o d e , 0 . , K u g l e r , V . , a n d B o d e , J G . ( 1 9 8 7 ) . E n d o t o x e m i a i n p a t i e n t s w i t h a l c o h o l i c a n d n o n a l c o h o l i c c i r r h o s i s a n d i n s u b j e c t s w i t h n o e v i d e n c e o f c h r o n i c l i v e r d i s e a s e f o l l o w i n g a c u t e a l c o h o l e x c e s s . J . H e p a t o l . 4 , 8 - 1 4 . B o n e , R . G . ( 1 9 9 2 ) . M o d u l a t o r s o f c o a g u l a t i o n : A c r i t i c a l a p p r a i s a l o f t h e i r r o l e i n s e p s i s . A r c h . l n t e m . M e d . 1 5 2 , 1 3 8 1 - 1 3 8 9 . 3 1 7 B o w e r s , G . J . , M a c V i t t i e , T . J . , H i r s c h , E . F . , C o n k l i n , J . C . , N e l s o n , 8 0 . , R o e t h e l , R . J . , a n d F i n k , M P . ( 1 9 8 5 ) . P r o s t a n o i d p r o d u c t i o n b y l i p o p o l y s a c c h a r i d e - s t i m u l a t e d K u p f f e r c e l l s . J . S u r g . R e s . 3 8 , 5 0 1 - 5 0 8 . B r a d f o r d , M . M . ( 1 9 7 6 ) . A r a p i d a n d s e n s i t i v e m e t h o d f o r t h e q u a n t i t a t i o n o f m i c r o g r a m q u a n t i t i e s o f p r o t e i n u t i l i z i n g t h e p r i n c i p l e o f p r o t e i n - d y e b i n d i n g . A n a l . B i o c h e m . 7 2 , 2 4 8 - 2 5 4 . B r a d h a m , C . A . , P l i i m p e , J . , M a n n s , M . P . , B r e n n e r , D A , a n d T r a u t w e i n , C . ( 1 9 9 8 ) . M e c h a n i s m s o f h e p a t i c t o x i c i t y . I . T N F - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . A m . J . P h y s i o l . 2 7 5 , 6 3 8 7 - 3 9 2 . B r a e t , F . , D e Z a n g e r , R . , S a s a o k i , T . , B a e k e l a n d , M . , J a n s s e n s , P . , S m e d s r e d , 8 . , a n d W i s s e , E . ( 1 9 9 4 ) . A s s e s s m e n t o f a m e t h o d o f i s o l a t i o n , p u r i f i c a t i o n a n d c u l t i v a t i o n o f r a t l i v e r s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s . L a b . I n v e s t . 7 0 , 9 4 4 - 9 5 2 . B r a e t , F . , S p e c t o r , l . , S h o c h e t , N . , C r e w s , P . , H i g a , T . , M e n u , E . , D e Z a n g e r , R . , a n d W i s s e , E . ( 2 0 0 2 ) . T h e n e w a n t i - a c t i n a g e n t d i h y d r o h a l i c h o n d r a m i d e r e v e a l s f e n e s t r a e - f o r r n i n g c e n t e r s i n h e p a t i c e n d o t h e l i a l c e l l s . B M C C e l l B i o l o g y 3 , 7 . B r a s , G . , J e l l i f f e , 0 . 8 . , a n d S t u a r t , K L . ( 1 9 5 4 ) . V e n o - o c c l u s i v e d i s e a s e o f t h e l i v e r w i t h n o n - p o r t a l t y p e c i r r h o s i s o c c u r r i n g i n J a m a i c a . A r c h . P a t h o l . 5 7 , 2 8 5 - 3 0 0 . B r a y , M . A . , M c K e a m - S m i t h , C . , M e t z - V i r c a , G , B o d m e r , J . L . , a n d V i r c a , G D . ( 1 9 8 7 ) . S t i m u l a t e d r e l e a s e o f n e u t r a l p r o t e i n a s e s e l a s t a s e a n d c a t h e p s i n G f r o m i n f l a m m a t o r y r a t p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s . I n f l a m m a t i o n . 1 1 , 2 3 - 3 7 . B r i n g h a m , K . L . , M e y r i c k . 8 . , B e r r y , J r . , L C , a n d R e p i n e , J . E . ( 1 9 8 7 ) . A n t i o x i d a n t s p r o t e c t c u l t u r e d b o v i n e l u n g e n d o t h e l i a l c e l l s f r o m i n j u r y b y e n d o t o x i n . J . A p p l . P h y s i o l . 6 3 , 8 4 0 - 8 5 0 . B r o u c k a e r t , P . , L i b e r t , C . , E v e r a e r d t , 8 . , T a k a h a s h i , M , C a u w e l s , A . , a n d F i e r s W . ( 1 9 9 3 ) . T u m o r n e c r o s i s f a c t o r , i t s r e c e p t o r , a n d t h e c o n n e c t i o n w i t h i n t e r l u e k i n 1 a n d i n t e r l e u k i n 6 . l m m u n a b i a l . 1 8 7 , 3 1 7 - 3 2 9 . B r o u w e r , A . , B a r e l d s , R . J . , d e L e e u w , A . M . , B l a u w , E . , P l a s , A . Y a p , S . H . , v a n d e n B r o e k , A . M . , a n d K n o o k , D . L . ( 1 9 8 8 ) . I s o l a t i o n a n d c u l t u r e o f K u p f f e r c e l l s f r o m h u m a n l i v e r . U l t r a s t r u c t u r e , e n d o c y t o s i s a n d p r o s t a g l a n d i n s y n t h e s i s . J . H e p a t o l . 6 , 3 6 - 4 9 . B r o u w e r , A . , P a r k e r , S . G . , H e n d r i k s , H . F . J . , G i b b o n s , L . , a n d H o r a n , M A . 3 1 8 ( 1 9 9 5 ) . P r o d u c t i o n o f e i c o s a n o i d s a n d c y t o k i n e s b y K u p f f e r c e l l s f r o m y o u n g a n d o l d r a t s s t i m u l a t e d b y e n d o t o x i n . C l i n . S c i . 8 8 . 2 1 1 - 2 1 7 . B r o w n , A . P . , H a r k e m a , J . R . , S c h u l t z e , A . E . , R o t h , R A , a n d G a n e y , P E . ( 1 9 9 7 ) . G a d o l i n i u m c h l o r i d e p r e t r e a t m e n t p r o t e c t s a g a i n s t h e p a t i c i n j u r y b u t p r e d i s p o s e s t h e l u n g s t o a l v e o l i t i s a f t e r l i p o p o l y s a c c h a r i d e a d m i n i s t r a t i o n . S h o c k 7 , 1 8 6 - 1 9 2 . B r u n e r , L . H . , C a r p e n t e r , L . J . , H a m l o ' w ; P . , a n d R o t h , R A . ( 1 9 8 6 ) . E f f e c t o f a m i x e d f u n c t i o n o x i d a s e a n d i n h i b i t o r o n m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e p n e u m o t o x i c i t y . T o x i c o l . A p p l . P h a r r n a c a l . 8 5 , 4 1 6 - 4 2 7 . B r u n e r , L . H . , H i l l i k e r , K S , a n d R o t h , R A . ( 1 9 8 3 ) . P u l m o n a r y h y p o t e n s i o n a n d E C G c h a n g e s f r o m m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e i n t h e r a t . A m . J . P h y s i o l . 2 4 5 , H 3 0 0 - H 3 0 6 . B u t l e r , W . H . ( 1 9 7 0 ) . A n u l t r a s t r u c t u r a l s t u d y o f t h e p u l m o n a r y l e s i o n i n d u c e d b y p y r r o l e d e r i v a t i v e s o f t h e p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s . J . P a t h o l . 1 0 2 , 1 5 - 1 9 . C a l c a m u g g i , G . , L a n z i o , M . , D u g h e r a , L . , B a b i n i , G . , a n d E m a n u e l l i , G . ( 1 9 9 2 ) . E n d o t o x i n t o l e r a n c e a n d p o l y m i x i n B m o d i f y l i v e r d a m a g e a n d c h o l e s t a s i s i n d u c e d b y a s i n g l e d o s e o f c i - n a p h t h y l i s o t h i o c y a n a t e i n t h e r a t . A r c h . T o x i c o l . 6 6 , 1 2 6 - 1 3 0 . C a l k i n s , C . M . , B e n s a r d , 0 . 0 . , S h a m e s , B . D . , P u l i d o , E . J . , A b r a h a m , E . , F e r n a n d e z , N . , M e n g , X . , D i n a r e l l o , C A , a n d M c I n t y r e , R . G . , J r . ( 2 0 0 2 ) . I L - 1 r e g u l a t e s i n v i v o C - X - C c h e m o k i n e i n d u c t i o n a n d n e u t r o p h i l s e q u e s t r a t i o n d u r i n g e n d o t o x e m i a . J . E n d o t o x i n R e s . 8 , 5 9 - 6 7 . C a l l e r y , M . P . , M a n g i n o , M . J . , K a m e i , T . , a n d F l y e , M W . ( 1 9 9 0 ) . I n t e r l e u k i n - 6 p r o d u c t i o n b y e n d o t o x i n - s t i m u l a t e d K u p f f e r c e l l i s r e g u l a t e d b y p r o s t a g l a n d i n E 2 . J . S u r g . R e s . 4 8 , 5 2 3 - 5 2 7 . C a m u s s i , G . , M a r i a n o , F . , B i a n c o n e , L . , D e M a r t i n o , A . , B u s s o l a t i , B . , M o n t r u c c h i o , G . , a n d T o b i a s , P S . ( 1 9 9 5 ) . L i p o p o l y s a c c h a r i d e b i n d i n g p r o t e i n a n d C D 1 4 m o d u l a t e t h e s y n t h e s i s o f p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r b y h u m a n m o n o c y t e s a n d m e s a n g i a l a n d e n d o t h e l i a l c e l l s s t i m u l a t e d b y l i p o p o l y s a c c h a r i d e . J . I m m u n o l . 1 5 5 , 3 1 6 - 3 2 4 . C a n t y , T . G . J . , B o y l e , E . M . J . , F a r r , A . , M o r g a n , E . N . , V e r r i e r , E D , a n d P o h l m a n , T H . ( 1 9 9 9 ) . O x i d a t i v e s t r e s s i n d u c e d N F - k a p p a B n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n w i t h o u t d e g r a d a t i o n o f I k a p p a B a l p h a . C i r c u l a t i o n 1 0 0 , 1 1 3 6 1 - 1 1 3 6 4 . 3 1 9 C a r n e y , D H . ( 1 9 9 2 ) . P o s t c l o t t i n g c e l l u l a r e f f e c t s o f t h r o m b i n m e d i a t e d b y i n t e r a c t i o n w i t h h i g h - a f f i n i t y o f t h r o m b i n r e c e p t o r s . I n T h r o m b i n : S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n ( L . J . B e r l i n e r , E d . ) , p p . 3 5 1 . P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k . C a r r e r a s , E . ( 2 0 0 0 ) . V e n o - o c c l u s i v e d i s e a s e o f t h e l i v e r a f t e r h e m o p o i e t i c c e l l t r a n s p l a n t a t i o n . E u r . J . H a e m a t o l . 6 4 , 2 8 1 - 2 9 1 . C a s t e l e i j n , E . , K u i p e r , J . , V a n R o o i j , H . C . J . , K a m p s , J . A . , K o s t e r , J . F . , V a n B e r k e l , T . J . C . ( 1 9 8 8 a ) . H o r m o n a l c o n t r o l o f g l y c o g e n o l y s i s i n p a r e n c h y m a l l i v e r c e l l s b y K u p f f e r a n d e n d o t h e l i a l l i v e r c e l l s . J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 2 6 9 9 - 2 7 0 3 . C a s t e l e i j n , E . , K u i p e r , J . , V a n R o o i j , H . C . J . , K o s t e r , J . F . , V a n B e r k e l , T . J . C . ( 1 9 8 8 b ) . C o n d i t i o n e d m e d i a o f K u p f f e r a n d e n d o t h e l i a l l i v e r c e l l s i n f l u e n c e p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n i n p a r e n c h y m a l l i v e r c e l l s . I n v o l v e m e n t o f p r o s t a g l a n d i n s . B i o c h e m . J . 2 5 2 , 6 0 1 - 6 0 5 . C a s t e l e i j n , E . , K u i p e r , J . , V a n R o o i j , H . C . , K a m p s , J . A . , K o s t e r , J . F . , a n d V a n B e r k e l , T . J . ( 1 9 8 8 c ) . E n d o t o x i n s t i m u l a t e s g l y c o g e n o l y s i s i n t h e l i v e r b y m e a n s o f i n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 6 9 5 3 - 6 9 5 5 . C h a n , K . L . , B i z i a s , R . , a n d M a l i k , A B . ( 1 9 8 8 ) . T h r o m b i n e n h a n c e s o p s o n i z e d z y m o s a n - i n d u c e d c h e m i l u m i n e s c e n c e o f n e u t r o p h i l s . T i s s u e C e l l 2 0 , 1 3 - 1 7 . C h a n d e l , N . S . , T r z y n a , W . C . , M c C l i n t o c k , 0 . 8 . , a n d S c h u m a c k e r , P T . ( 2 0 0 0 ) . R o l e o f o x i d a n t s i n N F - k B a c t i v a t i o n a n d T N F - o r g e n e t r a n s c r i p t i o n i n d u c e d b y h y p o x i a a n d e n d o t o x i n . J . I m m u n o l . 1 6 5 , 1 0 1 3 - 1 0 2 1 . C h e e k e , P R . ( 1 9 8 9 ) . P y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d t o x i c i t y a n d m e t a b o l i s m i n l a b o r a t o r y a n i m a l s a n d l i v e s t o c k . I n T a x i c a n t s o f P l a n t O r i g i n ( P . R . C h e e k e , E d . ) , V o l . 1 , p p . 2 - 2 2 . C R C P r e s s , B o c a R a t o n . C h e s n e y , C . F . , A l l e n , J R , a n d H s u , L C . ( 1 9 7 4 ) . R i g h t v e n t r i c u l a r h y p e r t r o p h y i n m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e - t r e a t e d r a t s . E x p . M a l . P h a r m a c o l . 2 0 , 2 5 7 - 2 6 8 . C h e s n u e , S . W . , T e r e b u h , P . D . , R e m i c k . D . G . , S c a l e s , W . E . , a n d K u n k e l , S . L . ( 1 9 9 1 ) . I n v i v o b i o l o g i c a n d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i s o f i n t e r l e u k i n - 1 a l p h a , b e t a a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r d u r i n g e x p e r i m e n t a l e n d o t o x e m i a . K i n e t i c s , K u p f f e r c e l l e x p r e s s i o n , a n d g l u c o c o r t i c o i d e f f e c t s . A m . J . P a t h o l . 1 3 8 , 3 9 5 - 4 0 2 . - C i c a l a , 0 . , a n d C i r i n o , G . ( 1 9 9 8 ) . L i n k a g e b e t w e e n i n f l a m m a t i o n a n d c o a g u l a t i o n : A n u p d a t e o n t h e m o l e c u l a r b a s i s o f t h e c r o s s t a l k . L i f e S c i . 6 2 , 1 8 1 7 - 1 8 2 4 . 3 2 0 C o f f m a n , B . L . , R i o s , G . R . , T e p h l y , T . R . ( 1 9 9 9 ) . P r e p a r a t i o n o f m i c r o s o m e s f r o m c u l t u r e d c e l l s . I n C u r r e n t P r o t o c o l s i n T a x i c a l a g y ( M . D . M a i n e s , E d . ) , p p . 4 . 3 . 1 - 4 . 3 . 1 5 J o h n W i l e y a n d S o n s , N e w Y o r k . C o l o t t a , F . , S c i a c c a , F . L . , S i r o n i , M . , L u i n i , W . , R a b i e t , M . J . , a n d M a n t o v a n i , A . ( 1 9 9 4 ) . E x p r e s s i o n o f m o n o c y t e c h e m o t a c t i c p r o t e i n - 1 b y m o n o c y t e s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s e x p o s e d t o t h r o m b i n . A m . J . P a t h o l . 1 4 4 , 9 7 5 - 9 8 5 . C o o k , J . A . , D i L u z i o , N R , a n d H o f f m a n n , E 0 . ( 1 9 7 5 ) . F a c t o r s m o d i f y i n g s u s c e p t i b i l i t y t o b a c t e r i a l e n d o t o x i n : t h e e f f e c t o f l e a d a n d c a d m i u m . C R C C r i t . R e v . T a x i c a l . 3 , 2 0 1 - 2 2 9 . C o o k , J . A . , M a r c o n i , E A , a n d D i L u z i o , N R . ( 1 9 7 4 ) . L e a d , c a d m i u m , e n d o t o x i n i n t e r a c t i o n : e f f e c t o n m o r t a l i t y a n d h e p a t i c f u n c t i o n . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 2 8 , 2 9 2 - 3 0 2 . . . C o p p l e , B . L . , B a n e s , A . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R . A . ( 2 0 0 2 a ) . E n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y a n d f i b r i n d e p o s i t i o n i n r a t l i v e r a f t e r m o n o c r o t a l i n e e x p o s u r e . T o x i c o l . S c i . 6 5 , 3 0 9 - 3 1 8 . C o p p l e , B . L . , W o o l l e y , B . , B a n e s , A . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R . A . ( 2 0 0 2 b ) . A n t i c o a g u l a n t s p r e v e n t m o n o c r o t a l i n e - i n d u c e d h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l i n j u r y b u t n o t e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y i n t h e r a t . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 8 0 , 1 8 6 - 1 9 6 . C o p p l e , B . L . , M o u l i n , F . , H a n u m e g o w d a , U . , G a n e y , R E , a n d R o t h , R A . ( 2 0 0 3 ) . T h r o m b i n a n d P A R - 1 a g o n i s t s p r o m o t e l i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y i n p e r f u s e d l i v e r s . J . P h a r r n a c a l . E x p . T h e r . I n p r e s s C o u g h l a n , A . F . , H a u , H . , D u n l a p , L . C . , B e m d t , M C , a n d H a n c o c k , W W . ( 1 9 9 4 ) . P - s e l e c t i n a n d p l a t e l e t - a c t i v a t i n g f a c t o r m e d i a t e i n i t i a l e n d o t o x i n - i n d u c e d n e u t r o p e n i a . J . E x p . M e d . 1 7 9 , 3 2 9 - 3 3 4 . C r o c k e t t - T o r a b i , E . ( 1 9 9 8 ) . S e l e c t i n s a n d m e c h a n i s m s o f s i g n a l t r a n s d u c t i o n . J . L e u k o c y t e . B i o l . 6 3 , 1 - 1 4 . C r u z - O r i v e , L . M . ( 1 9 8 2 ) . T h e u s e o f q u a d r a t s a n d t e s t s y s t e m s i n s t e r e o l o g y , i n c l u d i n g m a g n i f i c a t i o n c o r r e c t i o n s . J . M i c r o s c . 1 2 5 , 8 9 - 1 0 2 . C u l v e n o r , C . C . J . , a n d D a l B o n , R . ( 1 9 6 4 ) . C a r b o n y l s t r e t c h i n g f r e q u e n c i e s o f p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d . A u s t . J . C h e m . 1 7 , 1 2 9 6 - 1 3 0 0 . D a l N o g a r e , A R . ( 1 9 9 1 ) . S o u t h w e s t e r n i n t e m a l m e d i c i n e c o n f e r e n c e : S e p t i c s h o c k . A m . J . M e d . S c i . 3 0 2 , 5 0 . D a m b a c h , D . M . , W a t s o n , L . M . , G r a y , K . R . , D u r h a m , S K , a n d L a s k i n , D . L . 3 2 1 ( 2 0 0 2 ) . R o l e o f C C R 2 i n m a c r o p h a g e m i g r a t i o n i n t o t h e l i v e r d u r i n g a c e t a m i n o p h e n - i n d u c e d h e p a t o t o x i c i t y i n t h e m o u s e . H e p a t o l o g y . 3 5 , 1 0 9 3 - 1 1 0 3 . D e a c i u c , | . V . , B a g b y , G . J . , L a n g 0 . H . , S k r e p n i k , N , a n d S p i t z e r , J . J . ( 1 9 9 3 a ) . G r a m n e g a t i v e b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e i m p a i r s h y a l u r o n a n c l e a r a n c e i n v i v o a n d i t s u p t a k e b y i s o l a t e d , p e r f u s e d r a t l i v e r . H e p a t o l o g y 1 8 , 1 7 3 - 1 7 9 . ' - . D e a c i u c , | . V . , B a g b y , G . J . , N e i s m a n , M . R . , S k r e p n i k , N . , a n d S p i t z e r , J . J . ( 1 9 9 4 ) . M o d u l a t i o n o f h e p a t i c s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l f u n c t i o n b y K u p f f e r c e l l s : A n e x a m p l e o f i n t r a c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n i n t h e l i v e r . H e p a t o l o g y 1 9 , 4 6 4 - 4 7 0 . D e a c i u c , I . V . , M c D o n o u g h , K . H . , B a g b y , G . J . , a n d S p i t z e r , J . J . ( 1 9 9 3 b ) . A l c o h o l c o n s u m p t i o n i n r a t s p o t e n t i a t e s t h e d e l e t e r i o u s e f f e c t s o f g r a m - n e g a t i v e s e p s i s o n h e p a t i c h y a l u r o n a n u p t a k e . A l c o h o l C l i n . E x p . R e s . 1 7 , 1 0 0 2 - 1 0 0 8 . D e a c i u c , W . , a n d S p i t z e r , J . J . ( 1 9 9 6 ) . H e p a t i c s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l i n a l c o h o l e m i a a n d e n d o t o x e m i a . A l c o h o l C l i n . E x p . R e s . 2 0 , 6 0 7 - 6 1 4 . D e c k e r , K . ( 1 9 9 0 ) . B i o l o g i c a l l y a c t i v e p r o d u c t s o f s t i m u l a t e d l i v e r m a c r o p h a g e s ( K u p f f e r c e l l s ) . E u r . J . B i o c h e m . 1 9 2 , 2 4 5 - 2 6 1 . D e c k e r , K . ( 1 9 9 7 ) . B a c t e r i a l E n d o t o x i n . I n : C o m p r e h e n s i v e T o x i c o l o g y : H e p a t i c a n d G a s t r o i n t e s t i n a l T o x i c o l o g y ( R S . M c C u s k e y a n d D . L . E a r n e s t , E d s ) , V o l . 9 , p p . 4 1 5 - 4 2 8 . E l s e v i e r S c i e n c e : N e w Y o r k , N Y . d e G r o o t , P . G . , R e i n d e r s , J . H . , a n d S i x m a , J . J . ( 1 9 8 7 ) . P e r t u b a t i o n o f h u m a n e n d o t h e l i a l c e l l s b y t h r o m b i n o r P M A c h a n g e s t h e r e a c t i v i t y o f t h e i r e x t r a c e l l u l a r m a t r i x t o w a r d p l a t e l e t s . J . C e l l . B i o l . 1 0 4 , 6 9 7 - 7 0 4 . D e i t c h , E A ( 1 9 9 0 ) . B a c t e r i a l t r a n s l o c a t i o n o f t h e g u t f l o r a . J . T r a u m a 3 0 , $ 1 8 4 - $ 1 8 8 . D e i t c h , E A . ( 1 9 9 5 ) . M i c r o b i a l g a s t r o i n t e s t i n a l t r a n s l o c a t i o n . I n S u r g i c a l I n f e c t i o n s ( D . E . F r y , E d . ) , p p . 7 0 7 - 7 1 5 : L i t t l e , B r o w n a n d 0 0 . , B o s t o n . D e L e v e , L . D . ( 2 0 0 1 ) . H e p a t i c v e n o o c c l u s i v e d i s e a s e : A m a j o r c o m p l i c a t i o n o f h e m a t o p o i e t i c s t e m c e l l t r a n s p l a n t a t i o n i n c a n c e r p a t i e n t s . T u m o r i . 8 7 , 8 2 7 - 8 2 9 . D e L e v e , L . D . , M c C u s k e y , R . S . , W a n g , X . , H u , L . , M c C u s k e y , M . K . , E p s t e i n , R B , a n d K a n e l , G O ( 1 9 9 9 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a r e p r o d u c i b l e r a t m o d e l o f h e p a t i c v e n o - o c c l u s i v e d i s e a s e . H e p a t o l o g y 2 9 , 1 7 7 9 - 1 7 9 1 . 3 2 2 D e l D e L e v e , L . D . , W a n g , X . , K a p l o w i t z , N . , S h u l m a n , H . M . , B a r t , J . A . , a n d v a n d e r H o e k , A . ( 1 9 9 7 ) . S i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s a s a t a r g e t f o r a c e t a m i n o p h e n t o x i c i t y : D i r e c t a c t i o n v e r s u s r e q u i r e m e n t f o r h e p a t o c y t e a c t i v a t i o n i n d i f f e r e n t m o u s e s t r a i n s . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 5 3 , 1 3 3 9 - 1 3 4 5 . D e L e v e , L . D . , W a n g , X . , K u h l e n k a m p , J . F . , a n d K a p l o w i t z , N . ( 1 9 9 6 ) . T o x i c i t y o f a z a t h i o p r i n e a n d m o n o c r o t a l i n e i n m u r i n e s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s a n d h e p a t o c y t e s : T h e r o l e o f g l u t a t h i o n e a n d r e l e v a n c e t o h e p a t i c v e n o o c l u s i v e d i s e a s e . H e p a t o l o g y 2 3 , 5 8 9 - 5 9 9 . d e P r o s t , D . ( 1 9 9 5 ) . P e n t o x i f y l l i n e : A p o t e n t i a l t r e a t m e n t f o r t h r o m b o s i s a s s o c i a t e d w i t h a b n o r m a l t i s s u e f a c t o r e x p r e s s i o n b y m o n o c y t e s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s . J . C a r d i o v a s c . P h a r r n a c a l . 2 5 , $ 1 1 4 - $ 1 1 8 . - D e r i a n , C . K . , D a m i a n o , B . P . D ’ A n d r e a , M R , a n d A n d r a d e - G o r d o n , P . ( 2 0 0 2 ) . T h r o m b i n r e g u l a t i o n o f c e l l f u n c t i o n t h r o u g h p r o t e a s e - a c t i v a t e d r e c e p t o r s : I m p l i c a t i o n f o r t h e r a p e u t i c i n t e r v e n t i o n . B i o c h e m i s t r y ( M o s c o w ) . 6 7 , 5 6 - 6 4 . D e u t s c h m a n , 0 . 8 . , H a b e r , 8 . A . , A n d r e j k o , K . , C r e s s m a n , D . E . , H a r r i s o n , R . , E l e n k o , E . , a n d T a u b , R . ( 1 9 9 6 ) . I n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f c y t o k i n e - i n d u c e d c h e m o a t t r a c t a n t i n s e p t i c r a t l i v e r . A m . J . P h y s i o l . 2 7 1 , 8 5 9 3 - R 6 0 0 . D e z u b e , B . J . , S h e r m a n , M . L . , F r i d o v i c h - K e i l , J . L . , A l l e n - R y a n , J . , a n d P a r d e e , A B . ( 1 9 9 3 ) . D o w n - r e g u l a t i o n o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r e x p r e s s i o n b y p e n t o x i f y l l i n e i n c a n c e r p a t i e n t s : A p i l o t s t u d y . C a n c e r I m m u n o l . l m m u n a t h e r . 3 6 , 5 7 - 6 0 . D i e t e r , P . , H e m p e l , U . , K a m i o n k a , S . , K o l a d a , A . , M a l e s s a , B . , F i t z k e , E . , a n d T r a n - T h i , T A ( 1 9 9 9 ) . P r o s t a g l a n d i n E 2 a f f e c t s d i f f e r e n t l y t h e r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s f r o m r e s i d e n t m a c r o p h a g e s b y L P S a n d m u r a m y l t r i p e p t i d e s . M e d i a t o r s l n f l a m m . 8 , 2 9 5 - 3 0 3 . D i n a r e l l o , C A ( 1 9 8 8 ) . B i o l o g y o f i n t e r l e u k i n 1 . F A S E B J . 2 , 1 0 8 - 1 1 5 . D i t t e r , 8 . , U r b a s c h e k , R . , a n d U r b a s c h e k , B . ( 1 9 8 3 ) . A b i l i t y o f v a r i o u s a d s o r b e n t s t o b i n d e n d o t o x i n i n v i t r o a n d t o p r e v e n t o r a l l y i n d u c e d e n d o t o x e m i a i n m i c e . G a s t r o e n t e r o l o g y 8 4 , 1 5 4 7 - 1 5 5 2 . D o i , F . , G o y a , T . a n d T o r i s u , M . ( 1 9 9 3 ) . P o t e n t i a l r o l e o f h e p a t i c m a c r o p h a g e s i n n e u t r o p h i l - m e d i a t e d l i v e r i n j u r y i n r a t s w i t h s e p s i s . H e p a t o l o g y 1 7 , 1 0 8 6 - 1 0 9 4 . 3 2 3 D u i j v e s t i j n , A . M . , v a n G o o r , H . , K l a t t e r , F . , M a j o o r , G . D . , v a n B u s s e l , E . , a n d v a n B r e d a V r i e s m a n , P . J . ( 1 9 9 2 ) . A n t i b o d i e s d e f i n i n g r a t e n d o t h e l i a l c e l l s : R E C A - 1 , a p a n - e n d o t h e l i a l c e l l - s p e c i f i c m o n o c l o n a l a n t i b o d y . L a b . I n v e s t . 6 6 , 4 5 9 - 4 6 6 . D u r u m , S K , a n d O p p e n h e i m , J . J . ( 1 9 8 9 ) . M a c r o p h a g e - d e r i v e d m e d i a t o r s : I n t e r l e u k i n 1 , t u m o r n e c r o s i s f a c t o r , i n t e r l e u k i n 6 , a n d r e l a t e d c y t o k i n e s . I n F u n d a m e n t a l I m m u n o l o g y ( W . E . P a u l , E d . ) , 2 " d e d i t i o n , p p . 6 3 9 - 6 6 1 . R a v e n P r e s s , N e w Y o r k . E l S i s i , A . E . D . , E a r n e s t , D . L . , a n d S i p e s , L G . ( 1 9 9 3 ) . V i t a m i n A p o t e n t i a t i o n o f c a r b o n t e t r a c h l o r i d e - i n d u c e d l i v e r i n j u r y : R o l e o f l i v e r m a c r o p h a g e s a n d a c t i v e o x y g e n s p e c i e s . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 1 9 , 2 9 5 - 3 0 1 . E s m o n , C T ( 2 0 0 0 ) . D o e s i n f l a m m a t i o n c o n t r i b u t e t o t h r o m b o t i c e v e n t s ? H a e m a s t a s i s 3 0 , 3 4 - 4 0 . E s s a n i , N . A . , M c G u i r e , G . M . , M a n n i n g , A . M . , a n d J a e s c h k e , H . ( 1 9 9 5 ) . D i f f e r e n t i a l i n d u c t i o n f o r m R N A o f I C A M - 1 a n d s e l e c t i n s i n h e p a t o c y t e s , K u p f f e r c e l l s , a n d e n d o t h e l i a l c e l l s d u r i n g e n d o t o x e m i a . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 2 1 1 , 7 4 - 8 2 . E s t e p , J . E . , L a m é , M . W . , J o n e s , D A , a n d S e g a l l , H . J . ( 1 9 9 0 ) . N - A c e t y l c y s t e i n e - c o n j u g a t e d p y r r o l e i d e n t i f i e d i n r a t u r i n e f o l l o w i n g a d m i n i s t r a t i o n o f t w o p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s , m o n o c r o t a l i n e a n d s e n e c i o n i n e . T o x i c o l . L e t t . 5 4 , 6 1 - 6 9 . E s t e p , J . E . , L a m é , M . W . , M o r i n , 0 . , J o n e s , A D , W i l s o n , D . W . , a n d S e g a l l , H . J . ( 1 9 9 1 ) . [ 1 4 C ] m o n o c r o t a l i n e k i n e t i c s a n d m e t a b o l i s m i n t h e r a t . D r u g M e t a b . D i s p o s . 1 9 , 1 3 5 - 1 3 9 . F a l a t i , 3 . , G r o s s , P . , M e r r i l l - S k o l o f f , G ‘ . , F u r i e , 8 . 0 . a n d F u r i e , B . ( 2 0 0 2 ) . R e a l - t i m e i n v i v a i m a g i n g o f p l a t e l e t s , t i s s u e f a c t o r , a n d f i b r i n d u r i n g a r t e r i a l t h r o m b u s f o r m a t i o n i n t h e m o u s e . N a t . M e d . 8 , 1 1 7 5 - 1 1 8 0 . F a r h o o d , A . , M c G u i r e , G . M . , M a n n i n g , A . M . , M i y a s a k a , M . , S m i t h , C . W . , a n d J a e s c h k e , H . ( 1 9 9 5 ) . l n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 ( I C A M - 1 ) e x p r e s s i o n a n d i t s r o l e i n n e u t r o p h i l - i n d u c e d i s c h e m i a r e p e r f u s i o n i n j u r y i n r a t l i v e r . J . L e u k o c . B i o l . 5 7 , 3 6 8 - 3 7 4 . F i n k , M . P . , a n d M y t h e n , M G . ( 1 9 9 9 ) . T h e r o l e o f g u t - d e r i v e d e n d o t o x i n i n t h e p a t h o g e n e s i s o f m u l t i p l e o r g a n d y s f u n c t i o n . I n E n d o t o x i n i n H e a l t h a n d D i s e a s e . ( H . B r a d e , S . M . O p a l , S . N . V o g e l , a n d 0 . 0 . M o r r i s o n 0 . 0 , E d s ) , p p . 8 5 5 - 8 6 4 . M a r c e l - D e k k e r , N e w Y o r k . F o r m a l , S . B . , N o y e s , H E , a n d S c h n e i d e r , H . ( 1 9 6 0 ) . E x p e r i m e n t a l s h i g e l l a 3 2 4 i n f e c t i o n s . I l l . S e n s i t i v i t y o f n o r m a l , s t a r v e d , a n d c a r b o n t e t r a c h l o r i d e t r e a t e d g u i n e a p i g s t o e n d o t o x i n . P r a c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 0 3 , 4 1 5 - 4 1 8 . F r e u d e n b e r g , M . A . , B o g - H a u s e r , T . C . , B a c k , U . , a n d G a l a n o s , C . ( 1 9 8 0 ) . I n t e r a c t i o n o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e s w i t h p l a s m a h i g h - d e n s i t y I i p o p r o t e i n s i n r a t s . I n f e c t . l m m u n . 2 8 , 3 7 3 - 3 8 0 . F r e u d e n b e r g , M . A . , K l e i n e , K . , a n d G a l a n o s , C . ( 1 9 8 4 ) . T h e f a t e o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e i n r a t s : E v i d e n c e f o r c h e m i c a l a l t e r a t i o n s i n t h e m o l e c u l e . R e v . I n f e c t . D i s . 6 , 4 8 3 - 4 8 7 . F u j i t a , S . , A r i l , S . , M o n d e n , K . , A d a c h i , Y . , F u n a k i , N . , H i g a s h i t s u j i , H . , F u r u t a n i , M . , M i s e , M . , l s h i g u r o , S . , a n d K i t a o , T . ( 1 9 9 5 ) . P a r t i c i p a t i o n o f h e p a t i c m a c r o p h a g e s a n d p l a s m a f a c t o r s i n e n d o t o x i n - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . J . S u r g . R e s . 5 9 , 2 6 3 - 2 7 0 . F u j i w a r a , H . , O g a t a , l . , O h t a , Y . , H i r a t a , K . , O k a , Y . , Y a m a d a , S . , S a t o , Y . , M a s a k i , N , a n d O k a , H . ( 1 9 8 8 ) . l n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n i n a c u t e l i v e r f a i l u r e i n r a t s a n d i t s t r e a t m e n t s w i t h a n t i - t h r o m b i n I l l . G u t 2 9 , 1 1 0 3 - 1 1 0 8 . F u t a k i , M , T a k a h a s h i , S . , K i t i g a w a , T . , Y a m a k a w a , Y . , T a n a k a , M . , a n d H i g u c h i , S . ( 1 9 9 7 ) . S e l e c t i v e i n h i b i t i o n o f c y c l o o x y g e n a s e - 2 b y N S - 3 9 8 i n e n d o t o x i n s h o c k r a t s i n v i v o . I n f l a m m . R e s . 4 6 , 4 9 6 - 5 0 2 . F u t a k i , N . , T a k a h a s h i , S . , Y o k o y a m a , M . , A r a i , l . , H i g u c h i , S . , a n d O t o m o , S . ( 1 9 9 4 ) . N S - 3 9 8 , a n e w a n t i — i n f l a m m a t o r y a g e n t , s e l e c t i v e l y i n h i b i t s p r o s t a g l a n d i n G / H s y n t h a s e / c y c l o o x y g e n a s e ( C O X - 2 ) a c t i v i t y i n v i t r o . P r a s t a g l a n d i n s 4 7 , 5 5 - 5 9 . G a i l l a r d , T . , M u l s c h , A . , B u s s e , R . , K l e i n , H . a n d D e c k e r , K . ( 1 9 9 1 ) . R e g u l a t i o n o f n i t r i c o x i d e p r o d u c t i o n b y s t i m u l a t e d r a t K u p f f e r c e l l s . P a t h a b i a l a g y 5 9 , 2 8 0 - 2 8 3 . G a l a n o s , 0 . , F r e u d e n b e r g , M A , a n d R e u t t e r , W . ( 1 9 7 9 ) . G a l a c t o s a m i n e - i n d u c e d s e n s i t i z a t i o n t o t h e l e t h a l e f f e c t s o f e n d o t o x i n . P r a c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 6 , 5 9 3 9 - 5 9 4 3 . G a l l i n , J . l . ( 1 9 8 9 ) . I n f l a m m a t i o n . I n F u n d a m e n t a l I m m u n o l o g y ( W . E . P a u l , E d ) , 2 " d e d . , p p . 7 2 1 - 7 3 3 . R a v e n P r e s s , N e w Y o r k . G a n e y , P . E . , B a i l i e , M . B . , V a n C i s e , S . , C o l l i g a n , M . E . , M a d h u k a r , B . V . , R o b i n s o n , J . P . , a n d R o t h , R A . ( 1 9 9 4 ) . A c t i v a t e d n e u t r o p h i l s f r o m r a t i n j u r e d i s o l a t e d h e p a t o c y t e s . L a b . I n v e s t . 7 0 , 5 3 — 6 0 . G a n e y , P . E . , B a r t o n , Y . - W . , K i n s e r , S . , S n e e d , R . A . , B a r t o n 0 . 0 . , a n d R o t h R . A . 3 2 5 ( 2 0 0 1 ) . I n v o l v e m e n t o f c y c l o o x y g e n a s e - 2 i n t h e p o t e n t i a t i o n o f a l l y l a l c o h o l - i n d u c e d l i v e r i n j u r y b y b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e . T o x i c o l . A p p l . P h a r r n a c a l . 1 7 4 , 1 1 3 - 1 2 1 . G a n e y , P E , a n d R o t h , R A ( 2 0 0 1 ) . C o n c u r r e n t i n f l a m m a t i o n a s a d e t e r m i n a n t o f s u s c e p t i b i l i t y t o t o x i c i t y f r o m x e n o b i o t i c a g e n t s . T o x i c o l o g y 1 6 9 , 1 9 5 - 2 0 8 . . . G i l l , E . A . , l m i a z u m i , T . - A . C a v e t h , H . , T o p h a m , M . K . , T a r b e t , E . B . , M c i n t y r e , T . M . , P r e s c o t t , S M , a n d Z i m m e r m a n , G A ( 1 9 9 8 ) . B a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e i n d u c e s e n d o t h e l i a l c e l l s t o s y n t h e s i z e d e g r a n u l a t i n g f a c t o r f o r n e u t r o p h i l s . F A S E B J . 1 2 , 6 7 3 - 6 8 4 . G o e l , M S , a n d D i a m o n d , S . L . ( 2 0 0 1 ) . N e u t r o p h i l e n h a n c e m e n t o f f i b r i n d e p o s i t i o n u n d e r f l o w t h r o u g h p l a t e l e t - d e p e n d e n t a n d - i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s . A r t e r i a s c l e r . T h r o m b . V a s c . B i o l . 2 1 , 2 0 9 3 - 2 0 9 8 . G o r o g , P . , a n d K o v a c s , L B . ( 1 9 9 5 ) . L i p i d p e r o x i d a t i o n b y a c t i v a t e d p l a t e l e t s : A p o s s i b l e l i n k b e t w e e n t h r o m b o s i s a n d a r t h e r o g e n e s i s . A r t h e r a s c l e r a s i s 1 1 5 , 1 2 1 - 1 2 8 . G r a n d j e a n , P . ( 1 9 9 5 ) . I n d i v i d u a l s u s c e p t i b i l i t y i n o c c u p a t i o n a l a n d e n v i r o n m e n t a l t o x i c o l o g y . T o x i c o l . L e t t . 7 7 , 1 0 5 - 1 0 8 . G r e e n , L . C . , W a g n e r , D . A . , G l o g o w s k i , J . , S k i p p e r , P . L . , W i s h n o k , J . S . , a n d T a n n e n b a u m , S R . ( 1 9 8 2 ) . A n a l y s i s o f n i t r a t e , n i t r i t e , a n d [ 1 5 N ] - n i t r a t e i n b i o l o g i c a l f l u i d s . A n a l . B i o c h e m . 1 2 6 , 1 3 1 - 1 3 8 . C u , L . , T s e n g , 8 . 0 . , a n d R o l l i n s , B . J . ( 1 9 9 9 ) . M o n o c y t e c h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n - 1 . C h e m . I m m u n o l . 7 2 , 7 - 2 9 . H a c k , C . E . , A a r d e n , L A , a n d T h i j i s , L G . ( 1 9 9 7 ) . R o l e o f c y t o k i n e s i n s e p s i s . A d v . I m m u n o l . 5 6 , 1 0 1 - 1 9 5 . H a r a d a , N . , O k a j i m a , K . , M u r a k a m i , K . , U s u n e , S . , S a t o , 0 . , O h s h i m a , K . , a n d K a t s u r a g i , T . ( 2 0 0 0 ) . A d e n o s i n e a n d s e l e c t i v e A 2 A r e c e p t o r a g o n i s t s r e d u c e i s c h e m i a / r e p e r f u s i o n i n j u r y o f r a t l i v e r m a i n l y b y i n h i b i t i n g l e u k o c y t e a c t i v a t i o n . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r a p . 2 9 4 , 1 0 3 4 - 1 0 4 2 . H a r b r e c h t , B . G . , B i l l i a r , T . R . , C u r r a n , R . D . , S t a d l e r , J . , a n d S i m m o n s , B L . ( 1 9 9 3 ) . H e p a t o c y t e i n j u r y b y a c t i v a t e d n e u t r o p h i l s i n v i t r o i s m e d i a t e d b y p r o t e a s e s . A n n . S u r g . 2 1 8 , 1 2 0 - 1 2 8 . H a r d a w a y , R M , a n d W i l l i a m s , C H . ( 1 9 9 6 ) . D i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n : A n u p d a t e . C a m p r . T h e r . 2 2 , 7 3 7 - 7 4 3 . 3 2 6 H a H a H a r l a n , J . M . , H a r k e r , L . K . , R e i d y , M . A . , G a j d u s e k , C . M . , S c h w a r t z , S M , a n d S t r i k e r , G E . ( 1 9 8 3 ) . L i p o p o l y s a c c h a r i d e - m e d i a t e d e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y i n v i t r o . L a b I n v e s t . 4 8 , 2 6 9 - 2 7 4 . H a s e g a w a , T . , N a k a n o , M . , H a s h i m o t o , T . , H i r a i s h i , K . , S u z u k i , K . , a n d K u w a n o , H . ( 2 0 0 1 ) . S i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y b y s u p e r o x i d e a n i o n a n d i r o n i n t h e P r a p i a n i b a c t e r i u m a c n e s - p r e t r e a t e d a n d l i p o p o l y s a c c h a r i d e - s t i m u l a t e d r a t l i v e r . L i v e r 2 1 , 4 1 5 - 4 2 4 . H e l l e r , S . , W e b e r , K . , H e l l e r , A . , U r b a s c h e k , R . , a n d K o c h , T . ( 1 9 9 9 ) . P e n t o x i f y l l i n e i m p r o v e s b a c t e r i a l c l e a r a n c e d u r i n g h e m o r r h a g e a n d e n d o t o x e m i a . C r i t . C a r e M e d . 2 7 , 7 5 6 - 7 6 3 . H e w e t t , J . A . , J e a n , P . A . , K u n k e l , S . L . , a n d R o t h , R A . ( 1 9 9 3 ) . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - 0 : a n d n e u t r o p h i l s i n e n d o t o x i n - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . A m . J . P h y s i o l . 2 6 5 , G 1 0 1 1 - G 1 0 1 5 . H e w e t t , J . A . , a n d R o t h , R A . ( 1 9 9 3 ) . H e p a t i c a n d e x t r a h e p a t i c p a t h o b i o l o g y o f b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e s . P h a r r n a c a l . R e v . 4 5 , 3 8 1 - 4 1 1 . H e w e t t , J . A . , a n d R o t h , R A ( 1 9 9 5 ) . T h e c o a g u l a t i o n s y s t e m , b u t n o t c i r c u l a t i n g f i b r i n o g e n , c o n t r i b u t e s t o l i v e r i n j u r y i n r a t s e x p o s e d t o l i p o p o l y s a c c h a r i d e f r o m G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . J . P h a r m a c o l . E x p e r . T h e r a p . 2 7 2 , 5 3 - 6 2 . H e w e t t , J . A . , S c h u l t z e , A . E . , V a n C i s e , 8 . , a n d R o t h , R A . ( 1 9 9 2 ) . N e u t r o p h i l d e p l e t i o n p r o t e c t s a g a i n s t l i v e r i n j u r y f r o m b a c t e r i a l e n d o t o x i n . L a b I n v e s t . 6 6 , 3 4 7 - 3 6 1 . H i l l , 0 . 8 . , a n d T r e i s m a n , R . ( 1 9 9 5 ) . T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n b y e x t r a c e l l u l a r s i g n a l s : M e c h a n i s m s a n d s p e c i f i c i t y . C e l l 8 0 , 1 9 9 - 2 1 1 . H i n c k s , J . R . , K i m , H . Y . , S e g a l l , H . J . , M o l y n e u x , R . J . , S t e r r n i t z , F . R . , a n d C o u l o m b e , R A . ( 1 9 9 1 ) . D N A c r o s s - l i n k i n g i n m a m m a l i a n c e l l s b y p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s s t r u c t u r e - a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 1 1 , 9 0 - 9 8 . H i r a t a , K . , K a n e k o , A . , O g a w a , K . , H a y a s a k a , H . , a n d O n o e , T . ( 1 9 8 0 ) . E f f e c t o f e n d o t o x i n o n r a t l i v e r . A n a l y s i s o f a c i d p h o s p h a t a s e i s o z y m e s i n t h e l i v e r o f n o r m a l a n d e n d o t o x i n - t r e a t e d r a t s . L a b . I n v e s t . 4 3 , 1 6 5 - 1 7 1 . H i r a t a , K . , O g a t a , l . , O h t a , Y . , a n d F u j i w a r a , K . ( 1 9 8 9 ) . H e p a t i c s i n u s o i d a l c e l l d e s t r u c t i o n i n t h e d e v e l o p m e n t o f i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n i n a c u t e l i v e r f a i l u r e o f r a t s . J . P a t h o l . 1 5 8 , 1 5 7 - 1 6 5 . H o , J . S . , B u c h w e i t z , J . P . , R o t h , R A , a n d G a n e y , P E . ( 1 9 9 6 ) . I d e n t i f i c a t i o n o f 3 2 7 f a c t o r s f r o m r a t n e u t r o p h i l s r e s p o n s i b l e f o r c y t o t o x i c i t y t o i s o l a t e d h e p a t o c y t e s . J . L e u k o c . B i o l . 5 9 , 7 1 6 - 7 2 4 . H o e k , J 8 , a n d P a s t o r i n o , J . G . ( 2 0 0 2 ) . E t h a n o l , o x i d a t i v e s t r e s s , a n d c y t o k i n e - i n d u c e d l i v e r c e l l i n j u r y . A l c o h o l 2 7 , 6 3 - 6 8 . H o f f m a n , M . , a n d C o o p e r , S T . ( 1 9 9 5 ) . T h r o m b i n e n h a n c e s m o n o c y t e s e c r e t i o n o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r a n d i n t e r l e u k i n - 1 b e t a b y t w o d i s t i n c t m e c h a n i s m s . B l o o d C e l l s M a l . D i s . 2 1 , 1 5 6 - 1 6 7 . H o g l e n , N . C . , Y o u n i s , H . S . , H a r t l e y , D . P . , G u n a w a r d h a n a , L . , L a n t z , R C , a n d S i p e s , L G . ( 1 9 9 8 ) . 1 , 2 - D i c h I o r o b e n z e n e - i n d u c e d l i p i d p e r o x i d a t i o n i n m a l e F i s c h e r 3 4 4 r a t s i s K u p f f e r c e l l d e p e n d e n t . T o x i c o l . S c i . 4 6 , 3 7 6 - 3 8 5 . H o l l a n d , J . A . , M e y e r , J . W . , C h a n g , M . M . , O ’ D o n n e l l , R . W . , J o h n s o n , O K , a n d Z i e g l e r , L . M . ( 1 9 9 8 ) . T h r o m b i n s t i m u l a t e d r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s p r o d u c t i o n i n c u l t u r e d h u m a n e n d o t h e l i a l c e l l s . E n d a t h e l i u m 6 , 1 1 3 - 1 2 1 . H o l m s e n , H . , a n d D a y , H . J . ( 1 9 7 0 ) . T h e s e l e c t i v i t y o f t h r o m b i n - i n d u c e d p l a t e l e t r e l e a s e r e a c t i o n : S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f r e l e a s e d a n d r e t a i n e d c o n s t i t u e n t s . J . L a b . C l i n . M e d . 7 5 : 8 4 0 - 8 5 5 . H o l p e r , K . , T r e j o R . A . , B r e t t s c h n e i d e r , L . , a n d D i L u z i o N R . ( 1 9 7 3 ) . E n h a n c e m e n t o f e n d o t o x i c s h o c k i n t h e l e a d s e n s i t i z e d s u b h u m a n p r i m a t e s . S u r g . G y n e c o l . O b s t . 1 3 6 , 5 9 3 — 6 0 1 . H o l s t , O . , U l m e r , A . J . , B r a d e , H . , F l a d , H . - D . , a n d R i e t s c h e l , E T . ( 1 9 9 6 ) . B i o c h e m i s t r y a n d c e l l b i o l o g y o f b a c t e r i a l e n d o t o x i n s . F E M S I m m u n o l . M e d . M i c r o b i a l . 1 6 , 8 3 - 1 0 4 . H o o m , C . M . , W a g n e r , J . M . , a n d R o t h , R A ( 1 9 9 3 ) . E f f e c t s o f m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e o n c u l t u r e d r a t p u l m o n a r y e n d o t h e l i u m . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 2 0 , 2 8 1 - 2 8 7 . H u x t a b l e , R . J . ( 1 9 7 9 ) . N e w a s p e c t s o f t h e t o x i c o l o g y a n d p h a r m a c o l o g y o f p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s . G e n . P h a r m a c o l . 1 0 , 1 5 9 - 1 6 7 . H u x t a b l e , R . J . ( 1 9 8 9 ) . H u m a n h e a l t h i m p l i c a t i o n o f p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s a n d h e r b s c o n t a i n i n g t h e m . I n T a x i c a n t s o f P l a n t O r i g i n ( P . R . C h e e k e , E d . ) , V o l . 1 , p p . 4 1 - 8 6 . C R C P r e s s , B o c a R a t o n . H u x t a b l e , R . J . ( 1 9 9 0 ) . A c t i v a t i o n a n d p u l m o n a r y t o x i c i t y o f p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s . ( T . E . G r a m s , S p e c i a l E d . ) P h a r m a c o l . T h e r . 4 7 , 3 7 1 - 3 8 9 . I A R C ( 1 9 7 6 ) . M o n o c r o t a l i n e m o n o g r a p h o n e v a l u a t i o n o f c a r c i n o g e n i c r i s k o f 3 2 8 . - A . . " i : 4 1 1 c h e m i c a l s i n m a n . I A R C 1 0 , 2 9 1 - 3 0 2 . l m u r a , Y . , T e r a s h i t a , Z . , a n d N i s h i k a w a , K . ( 1 9 8 6 ) . P o s s i b l e r o l e o f p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ( P A F ) i n d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n ( D I C ) , e v i d e n c e d b y u s e o f a P A F a n t a g o n i s t , C V - 3 9 8 8 . L i f e S c i . 3 9 , 1 1 1 - 1 1 7 . l i m u r o , Y . , Y a m a m o t o , M . , K o h n o , H . , I t a k u r a , J . , F u j i i , H . , a n d M a t s u m o t o , Y . ( 1 9 9 4 ) . B l o c k a d e o f l i v e r m a c r o p h a g e s b y g a d o l i n i u m c h l o r i d e r e d u c e s l e t h a l i t y i n e n d o t o x e m i a r a t e s — a n a l y s i s o f m e c h a n i s m s o f l e t h a l i t y i n e n d o t o x e m i a . J . L e u k o c . B i o l . 5 5 , 7 2 3 - 7 2 8 . l n g a l l s , R R , a n d G o l e n b o c k , D . T . ( 1 9 9 5 ) . C D 1 1 c / C D 1 8 , a t r a n s m e m b r a n e s i g n a l i n g r e c e p t o r f o r l i p o p o l y s a c c h a r i d e . J . E x p . M e d . 1 8 1 , 1 4 7 3 - 1 4 7 9 . l s h i y a m a , H . , O g i n o , K . , a n d H o b a r a , T . ( 1 9 9 5 ) . R o l e o f K u p f f e r c e l l s i n r a t l i v e r i n j u r y i n d u c e d b y d i e t h y l d i t h i o c a r b a m a t e . E u r . J . P h a r m a c o l . 2 9 2 , 1 3 5 - 1 4 1 . J a c k s o n , J . J . , a n d K r o p p , H . ( 1 9 9 9 ) . A n t i b i o t i c - i n d u c e d e n d o t o x i n r e l e a s e : i m p o r t a n t p a r a m e t e r s d i c t a t i n g r e s p o n s e s . I n E n d o t o x i n i n H e a l t h a n d D i s e a s e . ( H . B r a d e , S . M . O p a l , S . N . V o g e l , a n d 0 . 0 . M o r r i s o n 0 . 0 , E d s . ) , p p . 6 7 - 7 5 . M a r c e l - D e k k e r , N e w Y o r k . J a c o b , A . I . , G o l d b e r g , P . K . , B l o o m , N . , D e g e n s h e i n , G A , a n d K o z i n n , P . J . ( 1 9 7 7 ) . E n d o t o x i n a n d b a c t e r i a i n p o r t a l b l o o d . G a s t r o e n t e r o l o g y 7 2 , 1 2 6 8 - 1 2 7 0 . J a e s c h k e , H . ( 1 9 9 2 ) . E n h a n c e s s i n u s o i d a l g l u t a t h i o n e e f f l u x d u r i n g e n d o t o x i n - i n d u c e d o x i d a t i v e s t r e s s i n v i v o . A m . J . P h y s i o l . 2 6 3 , G 6 0 - G 6 8 . J a e s c h k e , H . ( 1 9 9 7 ) . C e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e s : R e g u l a t i o n a n d f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r d i s e a s e . A m . J . P h y s i o l . 2 7 3 , 6 6 0 2 - 6 6 1 1 . J a e s c h k e , H . , a n d F a r h o o d , A . ( 1 9 9 1 ) . N e u t r o p h i l a n d K u p f f e r c e l l - i n d u c e d o x i d a n t s t r e s s a n d i s c h e m i a - r e p e r f u s i o n i n j u r y i n r a t l i v e r . A m . J . P h y s i o l . 2 6 0 , G 3 5 5 - 6 3 6 2 . J a e s c h k e , H . , F a r h o o d , A . , B a u t i s t a , A . P . , S p o l a r i c s , Z . , S p i t z e r , J . J . , a n d S m i t h , C W . ( 1 9 9 3 ) . F u n c t i o n a l i n a c t i v a t i o n o f n e u t r o p h i l s w i t h a M A C - 1 ( C D 1 1 b / C D 1 8 ) m o n o c l o n a l a n t i b o d y p r o t e c t s a g a i n s t i s c h e m i a - r e p e r f u s i o n i n j u r y i n r a t l i v e r . H e p a t o l o g y 1 7 , 9 1 5 - 9 2 3 . J a e s c h k e , H . , F a r h o o d , A . , C a i , S . X . , T s e n g , B . L . , a n d B a j t , M L . ( 2 0 0 0 ) . 3 2 9 P r o t e c t i o n a g a i n s t T N F - i n d u c e d l i v e r p a r e n c h y m a l c e l l a p o p t o s i s d u r i n g e n d o t o x e m i a b y a n o v e l c a s p a s e i n h i b i t o r i n m i c e . T o x i c o l . A p p l . P h a n n a c a l . 1 6 9 , 7 7 - 8 3 . J a e s c h k e , H . , F a r h o o d , A . , a n d S m i t h , C W . ( 1 9 9 1 ) . N e u t r o p h i l - i n d u c e d l i v e r c e l l i n j u r y i n e n d o t o x i c s h o c k i s a C D I 1 b / C D 1 8 - d e p e n d e n t m e c h a n i s m . A m . J . P h y s i o l . 2 6 1 , G 1 0 5 1 - 1 0 5 6 . J a e s c h k e , H . , F i s h e r , M . A . , L a w s o n , J . A . , S i m m o n s , C . A . , F a r h o o d , A . , a n d J o n e s , D A ( 1 9 9 8 ) . A c t i v a t i o n o f c a s p a s e 3 ( 0 P P 3 2 ) - l i k e p r o t e a s e s i s e s s e n t i a l f o r T N F - a l p h a - i n d u c e d h e p a t i c p a r e n c h y m a l c e l l a p o p t o s i s a n d n e u t r o p h i l m e d i a t e d n e c r o s i s i n a m u r i n e e n d o t o x i n s h o c k m o d e l . J . I m m u n o l . 1 6 0 , 3 4 8 0 - 3 4 8 6 . J a e s c h k e , H . , S m i t h , C . W . , C l e m e n s , M . G . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R A ( 1 9 9 6 ) . M e c h a n i s m s o f i n f l a m m a t o r y l i v e r i n j u r y : A d h e s i o n m o l e c u l e s a n d c y t o t o x i c i t y o f n e u t r o p h i l s . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 3 9 , 2 1 3 - 2 2 6 . J a m e s , H . L . , W a c h t f o g e l , Y . T . , J a m e s , P . L . , Z i m m e r m a n , J . M . , C o l m a n , R . W . , a n d C o h e n , A B . ( 1 9 8 5 ) . A u n i q u e e l a s t a s e i n h u m a n b l o o d p l a t e l e t s . J . C l i n . I n v e s t . 7 6 , 2 3 3 0 - 2 3 3 7 . J o h n s o n , K . , C h o i , Y . , D e G r o o t , E . , S a m u e l s , l . , C r e a s e y , A . , a n d A a r d e n , L . ( 1 9 9 8 ) . P o t e n t i a l m e c h a n i s m s f o r a p r o - i n f l a m m a t o r y v a s c u l a r c y t o k i n e r e s p o n s e t o c o a g u l a t i o n a c t i v a t i o n . J . I m m u n o l . 1 6 0 , 5 1 3 0 - 5 1 3 5 . J o n e s , B . E . , L o , C . R . , L i u , H . , S r i n i v a s a n , A . , S t r e e t z , K . , V a l e n t i n o , K . L . , a n d C z a j a , M . J . ( 2 0 0 0 ) . H e p a t o c y t e s e n s i t i z e d t o t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a l p h a c y t o t o x i c i t y u n d e r g o a p o p t o s i s t h r o u g h c a s p a s e - d e p e n d e n t a n d c a s p a s e - i n d e p e n d e n t p a t h w a y s . J . B i o l . C h e m . 2 7 5 , 7 0 5 - 7 1 2 . K a r c k , U . , P e t e r s , T . , a n d D e c k e r , K . ( 1 9 8 8 ) . T h e r e l e a s e o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r f r o m e n d o t o x i n - s t i m u l a t e d r a t K u p f f e r c e l l s i s r e g u l a t e d b y p r o s t a g l a n d i n E 2 a n d d e x a m e t h a s o n e . J . H e p a t o l . 7 , 3 5 2 - 3 6 1 . K a r i m a R . , M a t s u m o t o S . , H i g a s h i H . , a n d M a t s u s h i m a K ( 1 9 9 9 ) . T h e m o l e c u l a r p a t h o g e n e s i s o f e n d o t o x i c s h o c k a n d o r g a n f a i l u r e . M a l M e d T o d a y 5 , 1 2 3 - 1 3 2 . K a s a h a r a , Y . , K i t a t a k e , K . , T a t s u m i , K . , S u g i t o , K . , K a k u s a k a , l . , Y a m a g a t a , S . , O h m o r i , S . , K i t a d a , M . , a n d K u r i y a m a , T . ( 1 9 9 7 ) . B i o a c t i v a t i o n o f m o n o c r o t a l i n e b y P - 4 5 0 3 A i n r a t l i v e r . J . C a r d i o v a s c . P h a r r n a c a l . 3 0 , 1 2 4 - 1 2 9 . 3 3 0 r 1 K a s t u r i , T . E . , M a n c h a n d a , S . C . , T a n d o n , R . K . , R a j a n i , M . , a n d B h a t i a , M L . ( 1 9 7 9 ) . H a e m o d y n a m i c s t u d i e s i n v e n o - o c c l u s i v e d i s e a s e o f t h e l i v e r . B r i t . H e a r t J . 4 1 , 5 9 4 - 5 9 9 . K e l l e r , G . A . , W e s t , M A , C e r r a , F 8 , a n d S i m m o n s , R . L . ( 1 9 8 5 ) . M u l t i p l e s y s t e m s o r g a n f a i l u r e : M o d u l a t i o n o f h e p a t o c y t e p r o t e i n s y n t h e s i s b y e n d o t o x i n a c t i v a t e d K u p f f e r c e l l s . A n n . S u r g . 2 0 1 , 8 7 - 9 5 . K e p p l e r , 0 . , H a g m a n n , W . , a n d R a p p , S . ( 1 9 8 7 ) . R o l e o f l e u k o t r i e n e s i n e n d o t o x i n a c t i o n i n v i v a . R e v . I n f e c t . D i s . 9 , 8 5 8 0 - 5 8 4 . K h a i r , O . A . , D a v i e s , R . J . , a n d D e v a l i a , J . L . ( 1 9 9 6 ) . B a c t e r i a l - i n d u c e d r e l e a s e o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s b y b r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l s . E u r . R e s p i r . J . 9 , 1 9 1 3 - 1 9 2 2 . K i m , 0 . 0 . , K i m , Y . K . , L e e , S H , a n d H o n g , K . W . ( 2 0 0 0 ) . R e b a m i p i d e i n h i b i t s n e u t r o p h i l a d h e s i o n t o h y p o x i a / r e o x y g e n a t i o n - s t i m u l a t e d e n d o t h e l i a l c e l l s v i a n u c l e a r f a c t o r - K B - d e p e n d e n t p a t h w a y . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 2 9 4 , 8 6 4 - 8 6 9 . K i n s e r , 8 . , C o p p l e , B . L . , R o t h , R A , a n d G a n e y , P E . ( 2 0 0 2 ) . E n h a n c e m e n t o f a l l y l a l c o h o l h e p a t o t o x i c i t y b y e n d o t o x i n r e q u i r e s e x t r a h e p a t i c f a c t o r s . T a x i c a l . S c i . 6 9 , 4 7 0 - 4 8 1 . K i n s e r , S . , S n e e d , R . A . , R o t h , R A , a n d G a n e y , P E . ( 2 0 0 0 ) . H e p a r i n o r n e u t r o p h i l d e p l e t i o n a t t e n u a t e s e n d o t o x i n - i n d u c e d p o t e n t i a t i o n o f a l l y l a l c o h o l h e p a t o t o x i c i t y . T a x i c a l . S c i . 5 4 , 1 3 9 ( A b s t r a c t ) . K i r c h h o f e r , 0 . , T s c h o p p , T . B . , H a d v a r y , P . , a n d B a u m g a r t n e r , H R . ( 1 9 9 4 ) . E n d o t h e l i a l c e l l s s t i m u l a t e d f r o m t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a l p h a e x p r e s s v a r y i n g a m o u n t s o f t i s s u e f a c t o r r e s u l t i n g i n i n h o m o g e n o u s f i b r i n d e p o s i t i o n i n a n a t i v e b l o o d f l o w s y s t e m . E f f e c t s o f t h r o m b i n i n h i b i t o r s . J . C l i n . I n v e s t . 9 3 , 2 0 7 3 - 2 0 8 3 . K i s p e r t , P H . ( 1 9 9 2 ) . T h e r o l e o f K u p f f e r c e l l s i n c o n t r o l o f a c u t e p h a s e p r o t e i n s y n t h e s i s . I n H e p a t o c y t e a n d K u p f f e r C e l l I n t e r a c t i o n s ( T . B i l l i a r a n d R D . C u r r a n , E d s . ) , p p . 4 - 1 9 . C R C P r e s s , B o c a R a t o n . K i t o , M . , N a r i t a , H . , l s h i n a g a , M . , P a r k H . J . , a n d T a k a m u r a , H . ( 1 9 8 5 ) . P h o s p h o i n o s i t i d e b r e a k d o w n a s a n i n d i r e c t l i n k b e t w e e n s t i m u l a t i o n a n d a g g r e g a t i o n o f r a t p l a t e l e t s b y t h r o m b i n a n d c o l l a g e n . J . B i o c h e m . ( T a k y a ) 9 7 , 7 6 5 - 7 7 2 . K l a u n i g , J . E . , G o l d p l a t t , P . J . , H i n t o n , D . E . , L i p s k y , M . M . , C h a c k o , J . , a n d T r u m p , B . F . ( 1 9 8 1 ) . M o u s e l i v e r c e l l c u l t u r e . I . H e p a t o c y t e I s o l a t i o n . I n V i t r o 1 7 , 9 1 3 - 9 2 5 . 3 3 1 K l e b a n o f f , S . J . , V a d a s , M . A . , H a r l a n , J . M . , S p a r k s , L . H . , G a m b l e , J . R . , A g o s t i , J . M . , a n d W a l t e r s d o r p h , A M . ( 1 9 8 6 ) . S t i m u l a t i o n o f n e u t r o p h i l s b y t u m o r n e c r o s i s f a c t o r . J . I m m u n o l . 1 3 6 , 4 2 2 0 - 4 2 2 5 . K n o l l e , P . A . , G e r k e n , G . , L b s e r , E . , D i e n e s , H . - P . , G a n t n e r , F . , T i e g s , 6 . , M e y e r z u m B i ' i s c h e n f e l d e , K . - H . , a n d L o h s e , A W . ( 1 9 9 6 ) . R o l e o f s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s o f t h e l i v e r i n c o n c a n a v a l i n - A - i n d u c e d h e p a t i c i n j u r y i n m i c e . H e p a t o l o g y 2 4 , 8 2 4 - 8 2 9 . K o b a y a s h i , H . , H o r i k o s h i , K . , Y a m a t a k a , A . , Y a m a t a k a , T . , O k a z a k i , T . , L a n e , G . J . , a n d M i y a n o , T . ( 1 9 9 9 ) . H y a l u r o n i c a c i d : A s p e c i f i c p r o g n o s t i c i n d i c a t o r o f h e p a t i c d a m a g e i n b i l i a r y a t r e s i a . J . P e d i a t r . S u r g . 3 4 , 1 7 9 1 - 1 7 9 4 . K o m a t s u , S . , B e r g , R . D . , R u s s e l , J . M . , N i m u r a , Y . , G r a n g e r , O N . ( 2 0 0 0 ) . E n t e r i c m i c r o f l o r a c o n t r i b u t e t o c o n s t i t u t i v e l C A M - 1 e x p r e s s i o n o n v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s . A m . J . P h y s i o l . 2 7 9 , G 1 8 6 - 1 9 1 . K o m a t s u , Y . , S h i r a t o r i , Y . , K a w a s e , T . , H a s h i m o t o , N . , H a n , K . , S h i i n a , S . , M a t s u m u r a , M . , N i w a , Y . , K a t o , N . , T a d a , M . , I k e d a , Y . , T a n a k a , M . , a n d O m a t a , M . ( 1 9 9 4 ) . R o l e o f p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s i n g a l a c t o s a m i n e h e p a t i t i s : M e c h a n i s m o f a d h e r e n c e t o h e p a t i c e n d o t h e l i a l c e l l s . H e p a t o l o g y 2 0 , 1 5 4 8 - 1 5 5 6 . K o r b u t , R . , W a r n e r , T . D . , G r y g l e w s k i , R . J . , a n d V a n e J R ( 1 9 9 4 ) . T h e e f f e c t o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n h i b i t i o n o n p l a s m a f i b r i n o l y t i c s y s t e m i n s e p t i c S h o c k r a t s . B r . J . P h a r m a c o l . 1 1 2 , 2 8 9 - 2 9 1 . K u i j p e r s , T . W . , a n d v a n d e r P o l l , T . ( 1 9 9 9 ) . T h e r o l e o f p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r i n e n d o t o x i n - r e l a t e d d i s e a s e . I n : E n d o t o x i n i n H e a l t h a n d D i s e a s e . ( H . B r a d e , S . M . O p a l , S . N . V o g e l , a n d 0 . 0 . M o r r i s o n 0 . 0 , E d s ) , p p . 4 4 9 - 4 6 2 . M a r c e l - D e k k e r : N e w Y o r k , N Y . K u n k e l , S . L . , C h e n s u e , S W . a n d P h a n , S H . ( 1 9 8 6 ) . P r o s t a g l a n d i n a s e n d o g e n o u s m e d i a t o r s o f i n t e r l e u k i n 1 p r o d u c t i o n . J . I m m u n o l . 1 3 6 , 1 8 6 - 1 9 2 . K u s h i m o t o , S . , O k a j i m a , K . , U c h i b a , M . , M u r a k a m i , K . , H a r a d a , N . , O k a b e , H . , a n d T a k a t s u k i . K . ( 1 9 9 6 ) . R o l e o f g r a n u l o c y t e e l a s t a s e i n i s c h e m i a / r e p e r f u s i o n i n j u r y o f r a t l i v e r . C r i t . C a r e M e d . 2 4 , 1 9 0 8 - 1 9 1 2 . L a b i b , R . , T u r k a l l , R . , a n d A b d e l - R a h m a n , M S . ( 2 0 0 2 ) . E n d o t o x i n p o t e n t i a t e s t h e h e p a t o t o x i c i t y o f c o c a i n e i n m a l e m i c e . J . T a x i c a l . E n v i r o n . H e a l t h A . 6 5 , 9 7 7 - 9 9 3 . 3 3 2 L a l o r , P . F . , S h i e l d s , P . , G r a n t , A . J . , a n d A d a m s , D H . ( 2 0 0 2 ) . R e c r u i t m e n t o f l y m p h o c y t e s t o t h e h u m a n l i v e r . I m m u n o l . C e l l B i o l . 8 0 , 5 2 - 6 4 . L a m é , M . W . , J o n e s , A . D . , M o r i n , D . , a n d S e g a l l , H . J . ( 1 9 9 1 ) . M e t a b o l i s m o f [ 1 4 C ] m o n o c r o t a l i n e b y i s o l a t e d p e r f u s e d r a t l i v e r . D r u g M e t a b . D i s p o s . 1 9 , 5 1 6 - 5 2 4 . L a m é , M . W . , J o n e s , A . D . , M o r i n , D . , W i l s o n , D . W . , a n d S e g a l l , H . J . ( 1 9 9 7 ) . A s s o c i a t i o n o f d e h y d r o m o n o c r o t a l i n e w i t h r a t r e d b l o o d c e l l s . C h e m . R e s . T o x i c o l . 1 0 , 6 9 4 - 7 0 1 . L a s k i n , D . L . ( 1 9 9 6 ) . S i n u s o i d a l l i n i n g c e l l s a n d h e p a t o t o x i c i t y . T o x i c o l . P a t h o l . 2 4 , 1 1 2 - 1 1 8 , 1 9 9 6 . L a s k i n , D . L . , H e c k D . E . , G a r n e r , C . R . , F e d e r , L S , a n d L a s k i n , J D . ( 1 9 9 4 ) . D i s t i n c t p a t t e r n s o f n i t r i c o x i d e p r o d u c t i o n i n h e p a t i c m a c r o p h a g e s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s f o l l o w i n g a c u t e e x p o s u r e o f r a t s t o e n d o t o x i n . J . L e u k o c . B i o l . 5 6 , 7 5 1 - 7 5 8 . L a u r e n t , T . C . , a n d F r a z i e r , J . R . E . ( 1 9 9 2 ) . H y a l u r o n a n . F A S E B J . 6 , 2 3 9 7 - 2 4 0 4 . L a w s o n , J . A . , B u r n s , A . R . , F a r h o o d , A . , B a j t , M . L . , C o l l i n s , R . G . , S m i t h , C . W . , a n d J a e s c h k e , H . ( 2 0 0 0 ) . P a t h o p h y s i o l o g i c i m p o r t a n c e o f E - a n d L - s e l e c t i n f o r n e u t r o p h i l - i n d u c e d l i v e r i n j u r y d u r i n g e n d o t o x e m i a i n m i c e . H e p a t o l o g y 3 2 , 9 9 0 - 9 9 8 . L a w s o n , J . A . , F i s h e r , M . A . , S i m m o n s ; C . A . , F a r h o o d , A . , a n d J a e s c h k e H . ( 1 9 9 8 ) . P a r e n c h y m a l c e l l a p o p t o s i s a s a s i g n a l f o r s i n u s o i d a l s e q u e s t r a t i o n a n d t r a n s e n d o t h e l i a l m i g r a t i o n o f n e u t r o p h i l s i n m u r i n e m o d e l s o f e n d o t o x i n a n d F a s - a n t i b o d y - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . H e p a t o l o g y 2 8 , 7 6 1 - 7 6 7 . L e s t e r , S . M . , B r a u n b e c k , T . A . , T h e , S . J . , S t e g e m a n , J . J . , M i l l e r , M R , a n d H i n t o n , D E . ( 1 9 9 3 ) . H e p a t i c c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f c y t o c h r o m e P - 4 5 0 I A 1 i n r a i n b o w t r o u t ( O n c o r h y n c h u s m y k i s s ) : A n i m m u n i h i s t o - a n d c y t o c h e m i c a l s t u d y . C a n c e r R e s . 5 3 , 3 7 0 0 - 3 7 0 6 . L e u , H . K a i s e r , D . L . , M o r i , M . , W o o l s o n , R R , a n d W e n z e l , R P . ( 1 9 8 9 ) . H o s p i t a l - a c q u i r e d p n e u m o n i a . A t t r i b u t a b l e m o r t a l i t y a n d m o r b i d i t y . A m . J . E p i d e m i o l . 1 2 9 , 1 2 5 8 - 1 2 6 7 . L e v i n , S . , B u c c i , T . J . , C o h e n , S . M . , F i x , A . S . , H a r d i s t y , J . F . , L e G r a n d , E . K . , M a r o n p o t , R R , a n d T r u m p , B . F . ( 1 9 9 9 ) . T h e n o m e n c l a t u r e o f c e l l d e a t h : R e c o m m e n d a t i o n o f a n a d h o c c o m m i t t e e o f t h e s o c i e t y o f t o x i c o l o g i c p a t h o l o g i s t s . T o x i c o l . P a t h o l . 2 7 , 4 8 4 - 4 9 0 . 3 3 3 L e v y , E . , P a t h , F . C . , a n d R u e b n e r , B . H . ( 1 9 6 7 ) . H e p a t i c c h a n g e s p r o d u c e d b y a s i n g l e d o s e o f e n d o t o x i n i n t h e m o u s e . L i g h t m i c r o s c o p y a n d h i s t o c h e m i s t r y . I n V i t r o 1 7 , 9 1 3 - 9 2 5 . L i , C . , a n d J a c k s o n , R M . ( 2 0 0 2 ) . R e a c t i v e s p e c i e s m e c h a n i s m s o f c e l l u l a r h y p o x i a - r e o x y g e n a t i o n i n j u r y . A m . J . P h y s i o l . C e l l P h y s i o l . 2 8 2 , C 2 2 7 - C 2 4 1 . L i b b y , P . , L o p p n o w , H . , F l e e t , J . C . , P a l m e r , H . , L i , H . M . , W a r n e r , S . J . C . , S a l o m o n , R N , a n d C l i n t o n , S K . ( 1 9 9 1 ) . P r o d u c t i o n o f c y t o k i n e s b y v a s c u l a r c e l l s — a n u p d a t e a n d i m p l i c a t i o n o f a t h e r o g e n e s i s . I n F i r s t A l t s c h u l S y m p o s i u m — A t h e r o s c l e r o s i s : C e l l u l a r a n d M o l e c u l a r I n t e r a c t i o n s i n t h e A r t e r y W a l l ( A . l . G o t l i e b , B . L . L a n g i l l e , a n d S . F e d e r o f f , E d s . ) , p p . 1 6 1 - 1 6 9 . P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k . L i n d , R . C . , G a n d o l f i , A . J . , S i p e s , L G , a n d B r o w n , B R . ( 1 9 8 4 ) . T h e i n v o l v e m e n t o f e n d o t o x i n i n h a l o t h a n e - a s s o c i a t e d l i v e r i n j u r y . A n e s t h e s i o l o g y 6 1 , 5 4 4 - 5 5 0 . L i u , J . , S e n d e l b a c h , L . E . , P a r k i n s o n , A . K l a a s s e n , C D . ( 2 0 0 0 ) . E n d o t o x i n p r e t r e a t m e n t p r o t e c t s a g a i n s t h e p a t o t o x i c i t y o f a c e t a m i n o p h e n a n d c a r b o n t e t r a c h l o r i d e : R o l e o f c y t o c h r o m e P 4 5 0 s u p p r e s s i o n . L i u , T . Z . , L e e , K . T . , C h e m C . L . , C h e n g , J . T . , S t e r n , A . , a n d T s a i , L . Y . ( 2 0 0 1 a ) . F r e e r a d i c a l t r i g g e r e d h e p a t i c i n j u r y o f e x p e r i m e n t a l o b s t r u c t i v e j a u n d i c e o f r a t s i n v o l v e d o v e r p r o d u c t i o n o f p r o i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s a n d e n h a n c e d a c t i v a t i o n o f n u c l e a r f a c t o r k a p p a B . A n n . C l i n . L a b . S c i . 3 1 , 3 8 3 - 3 9 0 . L i u , Y . , W a n g , Y . , Y a m a k u c h i , M . , l s o w a k i , S . , N a g a t a , E . , K a n m u r a , Y . , K i t a j i m a , l . , a n d M a r u y a m a , l . ( 2 0 0 1 b ) . U p r e g u l a t i o n o f t o l l - l i k e r e c e p t o r 2 g e n e e x p r e s s i o n i n m a c r o p h a g e r e s p o n s e t o p e p t i d o g l y c a n a n d h i g h c o n c e n t r a t i o n o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e i s i n v o l v e d i n N F - k a p p a b a c t i v a t i o n . I n f e c t . I m m u n . 6 9 , 2 7 8 8 - 2 7 9 6 . L o , C . J . , C r y e r , H . G . , F u , M . , a n d K i m , B . ( 1 9 9 7 ) . E n d o t o x i n - i n d u c e d m a c r o p h a g e g e n e e x p r e s s i o n d e p e n d s o n p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r . A r c h . S u r g . 1 3 2 , 1 3 4 2 - 1 3 4 7 . L o p p n o w , H . , a n d L i b b y , P . ( 1 9 8 9 ) . A d u l t h u m a n v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s e x p r e s s t h e | L 6 g e n e d i f f e r e n t i a l l y i n r e s p o n s e t o L P S o r l L - 1 . C e l l I m m u n o l . 1 2 2 , 4 9 3 - 5 0 3 . L o r a n t , D . E . , P a t e l , K . D . , M c I n t y r e , T . M . , M c E v e r , R . P . , P r e s c o t t , S M . a n d 3 3 4 Z i m m e r m a n , G A ( 1 9 9 1 ) . C o e x p r e s s i o n o f G M P - 1 4 0 a n d P A F b y e n d o t h e l i u m s t i m u l a t e d b y h i s t a m i n e o r t h r o m b i n : A j u x t a c r i n e s y s t e m f o r a d h e s i o n a n d a c t i v a t i o n o f n e u t r o p h i l s . J . C e l l B i o l . 1 1 5 , 2 2 3 - 2 3 4 . L u c h i , M . , a n d M u n f o r d , R S . ( 1 9 9 3 ) . B i n d i n g , i n t e r n a l i z a t i o n a n d d e a c y l a t i o n o f b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e b y h u m a n n e u t r o p h i l s . J . I m m u n o l . 1 5 1 : 9 5 9 - 9 6 9 . - L u s t e r , A D . ( 1 9 9 8 ) . C h e m o k i n e s : C h e m o t a c t i c c y t o k i n e s t h a t m e d i a t e i n f l a m m a t i o n . N . E n g . J . M e d . 3 3 8 , 4 3 6 - 4 4 5 . L u y e n d y k , J . P . , C o p p l e , B . L . , B a r t o n , C . C . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R A . ( 2 0 0 3 ) . A u g m e n t a t i o n o f a f l a t o x i n b ( 1 ) h e p a t o t o x i c i t y b y e n d o t o x i n : I n v o l v e m e n t o f e n d o t h e l i u m a n d t h e c o a g u l a t i o n s y s t e m . T o x i c o l . S c i . 7 2 , 1 7 1 - 1 8 1 . M a c h o v i c h , R . ( 1 9 8 5 ) . B l o o d c o a g u l a t i o n - f i b r i n o l y t i c s y s t e m a n d e n d o t h e l i a l c e l l s . A c t a B i o c h i m . B i o p h y s . A c a d . S c i . H u n g . 2 0 , 1 3 5 - 1 5 3 . M a h e r , J . J . , S c o t t , M . K . , S a i t o , J . M . , a n d B u r t o n , M C . ( 1 9 9 7 ) . A d e n o v i r u s - m e d i a t e d e x p r e s s i o n o f c y t o k i n e - i n d u c e d n e u t r o p h i l c h e m o a t t r a c t a n t i n r a t l i v e r i n d u c e d a n e u t r o p h i l i c h e p a t i t i s . H e p a t o l o g y 2 5 , 6 2 4 - 6 3 0 . M a h e r , P . , a n d S c h u b e r t , D . ( 2 0 0 0 ) . S i g n a l l i n g b y r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s i n t h e n e r v o u s s y s t e m . C e l l . M o l . L i f e S c i . 5 7 , 1 2 8 7 - 1 3 0 5 . M a j e r u s , P . W . , B r o z e , G . J . , J r . , M i l e t i c h , J P , a n d T o l l e f s e n , 0 M . ( 1 9 9 6 ) . A n t i c o a g u l a n t , t h r o m b o l y t i c , a n d a n t i p l a t e l e t d r u g s . I n G o o d m a n a n d G i l m a n ’ s T h e P h a r m a c o l o g i c a l B a s i s o f T h e r a p e u t i c s ( J . G . H a r d m a n , L . E . L i m b i r d , P . B . M o l i n o f f , R . W . R u d d o n , a n d A G . G i l m a n , E d s . ) , 9 t h e d . , p p . 1 3 4 6 - 1 3 5 0 . M c G r a w - H i l l , N e w Y o r k . M a j n o , G . , a n d J o r i s , I . A p o p t o s i s , o n c o s i s , a n d n e c r o s i s . A n o v e r v i e w o f c e l l d e a t h . A m . J . P a t h o l . 1 4 6 , 3 - 1 5 . M a l i k , A B . ( 1 9 8 6 ) . T h r o m b i n - i n d u c e d e n d o t h e l i a l i n j u r y . S e m i n . T h r o m b . H e m o . 1 2 , 1 8 4 - 1 9 6 . M a r c h a n t , A . , G o l d m a n , M . , a n d v a n d e r P o l l , T . ( 1 9 9 9 ) . I n t e r l e u k i n - 1 0 a n d o t h e r s u p p r e s s i v e c y t o k i n e s . I n E n d o t o x i n i n H e a l t h a n d D i s e a s e . ( H . B r a d e , S . M . O p a l , S . N . V o g e l , a n d D C . M o r r i s o n D . C , E d s . ) , p p . 5 8 1 - 5 9 0 . M a r c e l - D e k k e r , N e w Y o r k . M a r r a , F . , G r a n d a l i a n o , G . , V a l e n t e , A . J . , a n d A b b o u d , H E . ( 1 9 9 5 ) . T h r o m b i n s t i m u l a t e s p r o l i f e r a t i o n o f l i v e r f a t - s t o r i n g c e l l s a n d e x p r e s s i o n o f m o n o c y t e c h e m o t a c t i c p r o t e i n - 1 : P o t e n t i a l r o l e i n l i v e r i n j u r y . H e p a t o l o g y 2 2 , 7 8 0 - 7 8 7 . 3 3 5 M a r r a , M . N . , W i l d e , C . G . , G r i f f i t h , J . E . , S n a b l e , J . L . , a n d S c o t t , R . W . ( 1 9 9 0 ) . B a c t e r i c i d a l / p e r m e a b i l i t y - i n c r e a s i n g p r o t e i n h a s e n d o t o x i n - n e u t r a l i z i n g a c t i v i t y . J . I m m u n o l . 1 4 4 , 6 6 2 - 6 6 6 . M a r s h a l l , J . C . , L e e , C . , M e a k i n s , J . L . , M i c h e l , R R , a n d C h i s t o u , N V . ( 1 9 8 7 ) . K u p f f e r c e l l m o d u l a t i o n o f t h e s y s t e m i c i m m u n e r e s p o n s e . A r c h . S u r g . 1 2 2 , 1 9 1 - 1 9 6 . M a r u , Y . , Y a m a g u c h i , S . , T a k a h a s h i , T . , U e n o , H . , a n d S h i b u y a , M . ( 1 9 9 8 ) . V i r a l l y a c t i v a t e d R a s c o o p e r a t e s w i t h i n t e g r i n t o i n d u c e t u b u l o g e n e s i s i n s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l l i n e s . J . C e l l P h y s i o l . 1 7 6 , 2 2 3 - 2 3 4 . M a t s u c h a k , G . M . , P i n s k y , M . R . , K l e i n , E . C . , v a n T h i e l , D H , a n d R i n a l d o , J . E . ( 1 9 9 0 ) . E f f e c t s o f D - g a l a c t o s a m i n e - i n d u c e d a c u t e l i v e r i n j u r y o n m o r t a l i t y a n d p u l m o n a r y r e s p o n s e s t o E s c h e r i c h i a c o l i l i p o p o l y s a c c h a r i d e . M o d u l a t i o n s b y a r a c h a d o n i c a c i d a n d m e t a b o l i t e s . A m . R e v . R e s p . D i s . 1 4 1 , 1 2 9 6 - 1 3 0 6 . M a t t o c k s , A . R . ( 1 9 6 8 ) . T o x i c i t y o f p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s . N a t u r e 2 1 7 , 7 2 3 - 7 2 8 . M a t t o c k s , A . R . ( 1 9 6 9 ) . D i h y d r o p y r r o l i z i d i n e d e r i v a t i v e s f r o m u n s a t u r a t e d p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s . J . C h e m . S o c . [ P e r k i n 1 ] 8 , 1 1 5 5 - 1 1 6 2 . M a t t o c k s , A . R . ( 1 9 7 2 ) . A c u t e h e p a t o t o x i c i t y o f p y r r o l i c m e t a b o l i t e s i n r a t s d o s e d w i t h p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s . C h e m - B i o l . I n t e r a c t . 5 , 2 2 7 - 2 4 2 . M a t t o c k s , A . R . ( 1 9 8 6 ) . M e t a b o l i s m , d i s t r i b u t i o n , a n d e x c r e t i o n o f p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s . I n C h e m i s t r y a n d T o x i c o l o g y o f P y r r o l i z i d i n e A I k a n i d s , p p . 1 5 8 - 1 9 0 . A c a d e m i c P r e s s , L o n d o n . M a t t o c k s , A . R . , a n d J u k e s , R . ( 1 9 9 0 ) . R e c o v e r y o f t h e p y r r o l i c n u c l e u s o f p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s m e t a b o l i t e s f r o m s u l f u r c o n j u g a t e s i n t i s s u e a n d b o d y f l u i d s . C h e m - B i o l . I n t e r a c t . 7 5 , 2 2 5 - 2 3 9 . M a t t o c k s , A . R . , J u k e s , R . , a n d B r o w n , J . ( 1 9 8 9 ) . S i m p l e p r o c e d u r e s f o r p r e p a r i n g p u t a t i v e t o x i c m e t a b o l i t e s o f p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s . T o x i c o n . 2 5 , 5 6 1 - 5 6 7 . M a t t o c k s , A . R . , a n d W h i t e , l . N . H . ( 1 9 7 0 ) . E s t i m a t i o n o f m e t a b o l i t e s o f p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s i n a n i m a l t i s s u e s . A n a l . B i o c h e m . 3 8 , 5 2 9 - 5 3 5 . M a t t o c k s , A . R . , a n d W h i t e , l . N . H . ( 1 9 7 1 ) . T h e c o n v e r s i o n o f p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s t o N - o x i d e s a n d t o d i h y d r o p y r r o l i z i d i n e d e r i v a t i v e s b y r a t l i v e r m i c r o s o m e s . C h e m - B i o l . I n t e r a c t . 3 , 3 8 3 - 3 9 6 . M a t z n e r , Y . , M a r x , G . , D r e x l e r , R . , a n d E l d o r , A . ( 1 9 8 4 ) . T h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f 3 3 6 h e p a r i n r e l a t e d g l y c o s a m i n o g l y c a n s o n n e u t r o p h i l c h e m o t a x i s . T h r o m b . H a e m o s t . 5 2 , 1 3 4 - 1 3 7 . M a v i e r , P . , P r e a u x , A . M . , G u i g u i , B . , L e s c s , M . C . , Z a f r a n i , E S , a n d D h u m e a u x , D . ( 1 9 8 8 ) . I n v i t r o t o x i c i t y o f p o l y m o r p h o n u c l e a r n e u t r o p h i l s t o r a t h e p a t o c y t e s : E v i d e n c e f o r a p r o t e i n a s e - m e d i a t e d m e c h a n i s m . H e p a t o l o g y 8 , 2 5 4 - 2 5 8 . M a w e t , E . , S h i r a t o r i , Y . , H i k i b a , Y . , T a k a d a , H . , Y o s h i d a , H . , O k a n o , K . , K o m a t s u , Y . , M a s t u m u r a , M . , N i w a , Y . , a n d O m a t a , M . ( 1 9 9 6 ) . C y t o k i n e - i n d u c e d n e u t r o p h i l c h e m o a t t r a c t a n t r e l e a s e f r o m h e p a t o c y t e s i s m o d u l a t e d b y K u p f f e r c e l l s . H e p a t o l o g y 2 3 , 3 5 3 - 3 5 8 . M a y , M . J . , a n d G h o s h , S . ( 1 9 9 8 ) . S i g n a l t r a n s d u c t i o n t h r o u g h N F - K B . I m m u n o l . T o d a y 1 9 , 8 0 - 8 8 . M a y e r , A . M . S . , a n d S p i t z e r , J . A . ( 1 9 9 1 ) . C o n t i n u o u s i n f u s i o n o f E s c h e r i c h i a c o l i e n d o t o x i n i n v i v o p r i m e s i n v i t r o s u p e r o x i d e a n i o n r e l e a s e i n r a t p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s a n d K u p f f e r c e l l s i n a t i m e - d e p e n d e n t m a n n e r . I n f e c t . I m m u n . 5 9 , 4 5 9 0 - 4 5 9 8 . M a y e u x , P R . ( 1 9 9 7 ) . P a t h o p h y s i o l o g y o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e . J . T o x i c o l . E n v i r o n . H e a l t h 5 1 , 4 1 5 - 4 3 5 . M c C u s k e y , R . S . , M c C u s k e y , P . A . , U r b a s c h e k , R . , a n d U r b a s c h e k , B . ( 1 9 8 4 ) . K u p f f e r c e l l f u n c t i o n i n h o s t d e f e n s e . R e v . I n f e c t . D i s . 9 , 8 6 1 6 - 6 1 9 . M c L e a n , E . K . ( 1 9 7 0 ) . T h e t o x i c a c t i o n s o f p y r r o l i z i d i n e ( S e n e c i o ) A l k a l o i d s . P h a r m a c o l . R e v . 2 2 , 4 2 9 - 4 6 3 . M e a n s , T . K . , G o l e n b o c k , D . T . , a n d F e n t o n , M . J . ( 2 0 0 0 ) . S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f T o l l - l i k e r e c e p t o r p r o t e i n s . L i f e S c i . 6 8 , 2 4 1 - 2 5 8 . M e n g , F . , a n d L o w e l l , C A . ( 1 9 9 7 ) . L i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) - i n d u c e d m a c r o p h a g e a c t i v a t i o n a n d s i g n a l t r a n s d u c t i o n i n t h e a b s e n c e o f S r c - f a m i l y k i n a s e s H c k , F g r , a n d L y n . J . E x p . M e d . 1 8 5 , 1 6 6 1 - 1 6 7 0 . M i c h a e l , S . L . , P u m f o r d , N . R . , M a y e u x , P . R . , N i e s m a n , M R . a n d H i n s o n , J . A . ( 1 9 9 9 ) . P r e t r e a t m e n t o f m i c e w i t h m a c r o p h a g e i n a c t i v a t o r s d e c r e a s e s a c e t a m i n o p h e n h e p a t o t o x i c i t y a n d t h e f o r m a t i o n o f r e a c t i v e o x y g e n a n d n i t r o g e n s p e c i e s . H e p a t o l o g y 3 0 , 1 8 6 - 1 9 5 . M i c h i e , H . R . , M a n o g u e , K . B . , S p r i g g s , D . R . , R e v h a u g , A . , O ’ D w y e r , S . , D i n a r e l l o , C . A . , C e r a m i , A . , W o l f f , S M , a n d W i l m o r e , D . W . ( 1 9 8 8 ) . D e t e c t i o n o f c i r c u l a t i n g t u m o r n e c r o s i s f a c t o r a f t e r e n d o t o x i n a d m i n i s t r a t i o n . N . E n g . J . M e d . 3 1 8 , 1 4 8 1 - 1 4 8 6 . 3 3 7 M i m u r a , Y . , S a k i s a k a , S . , H a r a d a , M . , S a t a , M . , a n d T a n i k a w a , K . ( 1 9 9 5 ) . R o l e o f h e p a t o c y t e s i n d i r e c t c l e a r a n c e o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e i n r a t s . G a s t r o e n t e r o l . 1 0 9 , 1 9 6 9 - 1 9 7 6 . M o c h i d a , S . , A r a i , M . , O h n o , A . , Y a m a n o b e , F . , l s h i k a w a , K . , M a t s u i , A . , M a r u y a m a , l . , K a t o , H . , a n d F u j i w a r a , K . ( 1 9 9 9 ) . D e r a n g e d b l o o d c o a g u l a t i o n e q u i l i b r i u m a s a f a c t o r o f m a s s i v e l i v e r n e c r o s i s f o l l o w i n g e n d o t o x i n a d m i n i s t r a t i o n i n p a r t i a l l y h e p a t e c t o m i z e d r a t s . H e p a t o l o g y 2 9 , 1 5 3 2 - 1 5 4 0 . M o c h i d a , S . , O h n o , A . , A r a i , M . , a n d F u j i w a r a , K . ( 1 9 9 5 ) . R o l e o f a d h e s i o n b e t w e e n a c t i v a t e d m a c r o p h a g e s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s i n t h e d e v e l o p m e n t o f t w o t y p e s o f m a s s i v e h e p a t i c n e c r o s i s i n r a t s . J . G a s t r o e n t e r o l . H e p a t o l . 1 0 , S 3 8 - S 4 2 . M o r g a n , E T . ( 1 9 9 3 ) . D o w n - r e g u l a t i o n o f m u l t i p l e c y t o c h r o m e P 4 5 0 g e n e p r o d u c t s b y i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n v i v o . I n d e p e n d e n c e f r o m t h e h y p o t h a l a m - p i t u i t a r y a x i s . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 4 5 , 4 1 5 - 4 1 9 . M o s h e r , B . , D e a n , R . , H a r k e m a , J . , R e m i c k , D . , P a l m a , J . , a n d C r o c k e t t , E . ( 2 0 0 1 ) . I n h i b i t i o n o f K u p f f e r c e l l s r e d u c e d C X C c h e m o k i n e p r o d u c t i o n a n d l i v e r i n j u r y . J . S u r g . R e s . 9 9 , 2 0 1 - 2 1 0 . M o t u l s k y , H . ( 1 9 9 5 ) . I n t u i t i v e S t a t i s t i c s , p p . 2 3 3 - 2 3 6 . O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s , N e w Y o r k M o u l i n , F . , C o p p l e , B . L . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R A . ( 2 0 0 1 ) . H e p a t i c a n d e x t r a h e p a t i c f a c t o r s c r i t i c a l f o r l i v e r i n j u r y d u r i n g l i p o p o l y s a c c h a r i d e e x p o s u r e . A m . J . P h y s i o l . G a s t r o i n t e s t . L i v e r . P h y s i o l . 2 8 1 , G 1 4 2 3 — 1 4 3 1 . M o u l i n , F . , P e a r s o n , J . M . , S c h u l t z e , A . E . , S c o t t , M . A . , S c h w a r t z , K . A . , D a v i s , J . M . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R A . ( 1 9 9 6 ) . T h r o m b i n i s a d i s t a l m e d i a t o r o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i n t h e r a t . J . S u r g . R e s . 6 5 , 1 4 9 - 1 5 8 . M o v a t , H . Z . , C y b u l s k y , M . l . , C o l d i t z , I . G . , C h a n , M . K . , a n d D i n a r e l l o , C A ( 1 9 8 7 ) . A c u t e i n f l a m m a t i o n i n G r a m - n e g a t i v e i n f e c t i o n : E n d o t o x i n , i n t e r l e u k i n 1 , t u m o r n e c r o s i s f a c t o r , a n d n e u t r o p h i l s . F e d . P r o c . 4 6 , 9 7 - 1 0 4 . M u l l e n , P . G . , W i n d s o r , A . C . , W a l s h , C . J . , F o w l e r , A . A . , I l l , a n d S u g a r m a n , H . J . ( 1 9 9 5 ) . T u m o r n e c r o s i s f a c t o r - 0 : a n d i n t e r l e u k i n - 6 s e l e c t i v e l y r e g u l a t e n e u t r o p h i l f u n c t i o n i n v i t r o . J . S u r g . R e s . 5 8 , 1 2 4 - 1 3 0 . M u l l e r , C . M . , S c i e r k a , A . , S t i l l e r , R . L . , K i m , Y . - M . , C o o k , D . R . , L a n c a s t e r , J . R . , 3 3 8 a n d B u f f i n g t o n , C W . ( 1 9 9 6 ) . N i t r i c o x i d e m e d i a t e s h e p a t i c c y t o c h r o m e P 4 5 0 d y s f u n c t i o n i n d u c e d b y e n d o t o x i n . A n e s t h e s i o l o g y 8 4 , 1 4 3 5 - 1 4 4 2 . M u k a i d a , N . , l s h i k a w a , Y . , I k e d a , M , F u j i o d a , N . , W a t a n a b e , S . , K u n o , K . , a n d M a t s u s h i m a , K . ( 1 9 9 6 ) . N o v e l i n s i g h t i n t o m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f e n d o t o x i c s h o c k : B i o c h e m i c a l a n a l y s i s o f L P S r e c e p t o r s i g n a l i n g i n a c e l l f r e e s y s t e m t a r g e t i n g N F K B a n d r e g u l a t i o n o f c y t o k i n e p r o d u c t i o n / a c t i o n t h r o u g h 8 2 i n t e g r i n i n v i v o . J . L e u k o c y t e B i o l . 5 9 , 1 4 5 - 1 5 1 . M u n f o r d , R S , a n d H a l l , C L . ( 1 9 9 6 ) . D e t o x i f i c a t i o n o f b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( e n d o t o x i n ) b y a h u m a n n e u t r o p h i l e n z y m e . S c i e n c e 2 3 4 , 2 0 3 - 2 0 5 . N a g a k i , M . , M u t o , Y . , O h n i s h i , H . , a n d M o r i w a k i , H . ( 1 9 9 1 ) . S i g n i f i c a n c e o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r ( T N F ) a n d i n t e r l e u k i n - 1 ( I L - 1 ) i n t h e p a t h o g e n e s i s o f f u l m i n a n t h e p a t i t i s : P o s s i b l e i n v o l v e m e n t o f s e r i n e p r o t e a s e i n T N F - m e d i a t e d l i v e r i n j u r y . G a s t r o e n t e r o l . J p n . 2 6 , 4 4 8 - 4 5 5 . N a k a o , A . , T a k i , S . , Y a s u i , M . , K i m u r a , Y . , N o n a m i , T . , H a r a d a , A . , a n d T a k a g u , H . ( 1 9 9 4 ) . T h e f a t e o f i n t r a v e n o u s l y i n j e c t e d e n d o t o x i n i n n o r m a l r a t s a n d i n r a t s w i t h l i v e r f a i l u r e . H e p a t o l o g y . 1 9 , 1 2 5 1 - 1 2 5 6 . N i c k , J . A . , A v d i , N . J . , G e r v v i n s , P . , J o h n s o n , G . L . , a n d W o r t h e n s , G S . ( 1 9 9 6 ) . A c t i v a t i o n o f t h e p 3 8 m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e i n h u m a n n e u t r o p h i l s b y l i p o p o l y s a c c h a r i d e . J . I m m u n o l . 1 5 6 , 4 8 6 7 - 4 8 7 5 . N i k a i d o , H . ( 1 9 9 6 ) . O u t e r m e m b r a n e . I n E s c h e r i c h i a c o l i a n d S a l m o n e l l a t y o h i m u r i u m , C e l l u l a r a n d M o l e c u l a r B i o l o g y ( F . C . N e i d h a r d t , R . C u r t i s I l l , J . L . I n g r a h a m , E . C . C . L i n , K . B . L o w J r . , B . M a g a s i n i k , W . S . R e z n i k o f f , M . R i l e y , M . S c h a e c h t e r , a n d H E . U m b a r g e r , E d s . ) , 2 " d e d . , p p . 2 9 - 4 7 . A m e r i c a n S o c i e t y o f M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n . N o l a n , J . P . , L e i b o w i t z , A . I . , a n d V l a d u t i u , A D . ( 1 9 8 0 ) . I n f l u e n c e o f a l c o h o l o n K u p f f e r c e l l f u n c t i o n a n d p o s s i b l e s i g n i f i c a n c e i n l i v e r i n j u r y . I n T h e R e t i c u l o e n d o t h e l i a l S y s t e m a n d t h e P a t h o g e n e s i s o f L i v e r D i s e a s e , p p . 1 2 5 - 1 3 6 . E l s e v i e r / N o r t h , H o l l a n d . O b a y a s h i , T . , T a m u r a , H , T a n a k a , S . , O h k i , M . , T a k a h a s h i , S . , A r a i , M . , M a s u d a , M a n d K a w a i , T . ( 1 9 8 5 ) . A n e w c h r o m o g e n i c e n d o t o x i n - s p e c i f i c a s s a y u s i n g r e c o m b i n e d L i m q u s c o a g u l a t i o n e n z y m e s a n d i t s c l i n i c a l i m p l i c a t i o n s . C l i n . C h i m . A c t a 1 4 9 , 5 5 - 6 5 . O ’ G r a d y , N . P . , P r e a s , H . L . , P u g i n , J . , F i u z a , C . , T r o p e a , M . , R e d a , D . , B a n k s , S M , a n d S u f f r e d i n i , A F ( 2 0 0 1 ) . L o c a l i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e s f o l l o w i n g b r o n c h i a l e n d o t o x i n i n s t i l l a t i o n s i n h u m a n s . A m . J . R e s p i r . C r i t . C a r e . M e d . 1 6 3 , 1 5 9 1 - 1 5 9 8 . 3 3 9 O h k u b o , K . , M a s u m o t o , T . , H o r i i k e , N . , a n d O n j i , M . ( 1 9 9 8 ) . I n d u c t i o n o f C I N C ( i n t e r l e u k i n - 8 ) p r o d u c t i o n i n r a t l i v e r s b y n o n - p a r e n c h y m a l c e l l s . J . G a s t r o e n t e r o l . H e p a t o l . 1 3 , 6 9 6 - 7 0 2 . O h t s u k a , M . , M i y a z a k i , M . , K u b o s a w a , H . , K o n d o , Y . , I t o , H . , S h i m i z u , H . , S h i m i z u , Y . , N o z a w a , S . , F u r u y a , S . , a n d N a k a j i m a , N . ( 2 0 0 0 ) . R o l e o f n e u t r o p h i l s i n s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y a f t e r e x t e n s i v e h e p a t e c t o m y i n c h o l e s t a t i c r a t s . J . G a s t r o e n t e r o l . H e p a t o l . 1 5 , 8 8 0 - 8 8 6 . O k u m u r a , Y . , l s h i b a s h i , H . , S h i r a h a m a , M . , K o r u k a w a , 8 . , K u d o , J . , O k u b o , H . , a n d N i h o , Y . ( 1 9 8 7 ) . K u p f f e r c e l l s m o d u l a t e n a t u r a l k i l l e r c e l l a c t i v i t y i n v i t r o b y p r o d u c i n g p r o s t a g l a n d i n s . C e l l . I m m u n o l . 1 0 7 , 8 9 - 9 8 . O p p e n h e i m , J . J . , Z a c h a r i e a , C . O . C . , M u k a i d a , N , a n d M a t s u s h i m a , K . ( 1 9 9 1 ) . P r o p e r t i e s o f t h e n o v e l p r o i n f l a m m a t o r y s u p e r g e n e “ l n t e r c r i n e ” c y t o k i n e f a m i l y . A n n . R e v . I m m u n o l . 9 , 6 1 7 - 6 4 8 . O r v i m , U . , R o a l d , H . E . , S t e p h e n s , R . W . , R o o s , N . , a n d S a k a r l a s s e n , K S . ( 1 9 9 4 ) . T i s s u e f a c t o r - i n d u c e d c o a g u l a t i o n t r i g g e r s p l a t e l e t t h r o m b u s f o r m a t i o n a s e f f i c i e n t l y a s f i b r i l l a r c o l l a g e n a t a r t e r i a l b l o o d f l o w c o n d i t i o n s . A r t e r i o s c l e r . T h r o m b . 1 4 , 1 9 7 6 - 1 9 8 3 . O s t e r u d , B . ( 1 9 9 5 ) . C e l l u l a r i n t e r a c t i o n s i n t i s s u e f a c t o r e x p r e s s i o n b y b l o o d m o n o c y t e s . B l o o d C o a g u l . F i b r i n o l y s i s 6 , 8 2 0 - 8 2 5 . O s t e r u d , B . , a n d R a p a p o r t , S J . ( 1 9 7 7 ) . A c t i v a t i o n b y f a c t o r I X b y t h e r e a c t i o n p r o d u c t o f t i s s u e f a c t o r a n d f a c t o r V I I : A d d i t i o n a l p a t h w a y f o r i n i t i a t i n g b l o o d c o a g u l a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 7 4 , 5 2 6 0 - 5 2 6 4 . P a n , L . C . , W i l s o n , D . W . , L a m é , M . W . , J o n e s , A . D . , a n d S e g a l l , H . J . ( 1 9 9 3 ) . C o r p u l m o n a l e i s c a u s e d b y m o n o c r o t a l i n e a n d d e h y d r o m o n o c r o t a l i n e , b u t n o t b y g l u t a t h i o n e o r c y s t e i n e c o n j u g a t e s o f d i h y d r o p y r r o l i z i d i n e . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 1 8 , 8 7 - 9 7 . P e a r s o n , J . M . , B a i l i e , M . B . , F i n k , G . D . , a n d R o t h , R A . ( 1 9 9 7 ) . N e i t h e r p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r n o t l e u k o t r i e n e s a r e c r i t i c a l m e d i a t o r s o f l i v e r i n j u r y a f t e r l i p o p o l y s a c c h a r i d e a d m i n i s t r a t i o n . T o x i c o l o g y 1 2 1 , 1 8 1 - 1 8 9 . P e a r s o n , J . M . , B r o w n , A . P . , S c h u l t z e , A . E . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R . A . ( 1 9 9 6 a ) . G a d o l i n i u m c h l o r i d e t r e a t m e n t a t t e n u a t e s h e p a t i c p l a t e l e t a c c u m u l a t i o n a f t e r l i p o p o l y s a c c h a r i d e a d m i n i s t r a t i o n . S h o c k 5 , 4 0 8 - 4 1 5 . P e a r s o n , J . M . , S c h u l t z e , A . E . , J e a n , P A , a n d R o t h , R A . ( 1 9 9 5 ) . P l a t e l e t p a r t i c i p a t i o n i n l i v e r i n j u r y f r o m g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e i n t h e r a t . S h o c k 4 , 1 7 8 - 1 8 6 . 3 4 0 P e a r s o n , J . M . , S c h u l t z e , A . E . , S c h w a r t z , K . A . , S c o t t , M . A . , D a v i s , J . M . , a n d R o t h , R . A . ( 1 9 9 6 b ) : T h e t h r o m b i n i n h i b i t o r , h i r u d i n , a t t e n u a t e s I i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i n t h e r a t . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 2 7 8 , 2 7 8 - 2 8 3 . P e r r y , E . W . ( 1 9 8 4 ) . A l e t h a l s y n d r o m e i n m i c e f o l l o w i n g a d m i n i s t r a t i o n o f c a r b o n t e t r a c h l o r i d e a n d c y c l o h e x i m i d e , a n d i t s p r e v e n t i o n b y h e p a r i n t r e a t m e n t . J . C o m p . P a t h o l . 9 4 , 5 0 5 - 5 0 8 . P e t r y , T . W . , B o w d e n , G . T . , H u x t a b l e , R . J . , a n d S i p e s , L G . ( 1 9 8 4 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f h e p a t i c D N A d a m a g e i n d u c e d i n r a t s b y t h e p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d m o n o c r o t a l i n e . C a n c e r R e s . 4 4 , 1 5 0 5 - 1 5 0 9 . P l e s c i a , J . , a n d A l t i e r i , D C . ( 1 9 9 6 ) . A c t i v a t i o n o f M a c - 1 ( C D 1 1 b / C D 1 8 ) - b o u n d f a c t o r X b y r e l e a s e d c a t h e p s i n G d e f i n e s a n a l t e r n a t i v e p a t h w a y o f l e u k o c y t e i n i t i a t i o n o f c o a g u l a t i o n . B i o c h e m . J . 3 1 9 , 8 7 3 - 8 7 9 P o b e r , J . S . , a n d C o t r a n , R S . ( 1 9 9 0 ) . T h e r o l e o f e n d o t h e l i a l c e l l s i n i n f l a m m a t i o n . T r a n s p l a n t a t i o n 5 0 , 5 3 7 - 5 4 4 . P o h l m a n , T . H . , a n d H a r l a n , J . M . ( 1 9 9 2 ) . E n d o t o x i n - e n d o t h e l i a l c e l l i n t e r a c t i o n s . I n B a c t e r i a l E n d o t o x i n L i p o p o l y s a c c h a r i d e s : M o l e c u l a r B i o c h e m i s t r y a n d C e l l u l a r B i o l o g y ( D . C . M o r r i s o n , a n d J R R y a n , E d s . ) , V o l . 1 , p p . 3 4 7 - 3 7 1 . C R C P r e s s , B o c a R a t o n . P o l a c k , B . , P e r n o d , G . , B a r r o , C . , a n d D o u s s i e r e J . ( 1 9 9 7 ) . R o l e o f o x y g e n r a d i c a l s i n t i s s u e f a c t o r i n d u c t i o n b y e n d o t o x i n i n b l o o d m o n o c y t e s . H a e m a s t a s i s 2 4 , 1 9 3 - 2 0 0 . P o l t o r a k , A . , H e , X . , S m i m o v a , | . , L u i , M . Y . , H u f f e l , C . V . , D u , X . , B i r d w e l l , D . , A l e j o s , E . , S i l v a , M . , G a l a n o s , C . , F r e u d e n b e r g , M . , R i c c i a r d i - C a s t a g n o l i , P . , L a y t o n , B . , a n d B e u t l e r , B . ( 1 9 9 8 ) . D e f e c t i v e L P S s i g n a l i n g i n C 3 H / H e J a n d C S 7 B L / 1 O S c C r m i c e : M u t a t i o n s i n T L R 4 g e n e . S c i e n c e 2 8 2 , 2 0 8 5 - 2 0 8 8 . P o p p , J . A . , a n d C a t t l e y , R C . ( 1 9 9 8 ) . H e p a t o b i l i a r y s y s t e m . I n F u n d a m e n t a l s o f T o x i c o l o g i c P a t h o l o g y ( W . M . H a s c h e k W M a n d C G . R o u s s e a u x , E d s . ) , p p . 1 2 7 - 1 5 1 . A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o . P o t e r a , C . ( 1 9 9 6 ) . B i o f i l m s i n v a d e m i c r o b i o l o g y . S c i e n c e . 2 7 3 , 1 7 9 5 - 1 7 9 7 . P r a a n i n g - v a n D a l e n , D . P . , B r o u w e r , A . , a n d K n o o k , D . L . ( 1 9 8 1 ) . C l e a r a n c e c a p a c i t y o f r a t l i v e r K u p f f e r c e l l , e n d o t h e l i a l , a n d p a r e n c h y m a l c e l l s . G a s t r o e n t e r o l o g y 8 1 , 1 0 3 6 - 1 0 4 4 . 3 4 1 P r a k a s h , A . S . , P e r e i r a , T . N . , R e i l l y , P . E . B . , a n d S e a w r i g h t , A A . ( 1 9 9 9 ) . P y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s i n h u m a n d i e t . M u t a t . R e s . 4 4 3 , 5 3 - 6 7 . Q i , M . , a n d J o n e s , S B . ( 1 9 9 0 ) . C o n t r i b u t i o n o f p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r t o h e m o d y n a m i c s a n d s y m p a t h e t i c r e s p o n s e s t o b a c t e r i a l e n d o t o x i n i n c o n s c i o u s r a t s . C i r c . S h o c k 3 2 , 1 5 3 - 1 6 3 . R a e t z , C . R . H . , B r o z e k , K . A . , C l e m e n t z , T . , C o l e m a n , J . D . , G a l l o w a y , S . M . , G o l e n b o c k , D . T . , a n d H a m p t o n , R . Y . ( 1 9 8 8 ) . G r a m - n e g a t i v e e n d o t o x i n : A b i o l o g i c a l l y a c t i v e l i p i d . C o l d S p r i n g H a r b . S y m p . Q u a n t . B i o l . 5 3 , 9 7 3 - 9 8 2 . R a i f o r d , O S , a n d T h i g p e n , M C . ( 1 9 9 4 ) . K u p f f e r c e l l s t i m u l a t i o n w i t h C o r y n e b a c t e r i u m p a r v u m r e d u c e s s o m e c y t o c h r o m e P 4 5 0 d e p e n d e n t a c t i v i t i e s a n d d i m i n i s h e s a c e t a m i n o p h e n a n d c a r b o n t e t r a c h l o r i d e - i n d u c e d l i v e r i n j u r y i n t h e r a t . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 2 9 , 3 6 - 4 5 . R e i d , J . M . , a n d B o m h e i m , L . M . ( 2 0 0 1 ) . T h e e f f e c t s o f p h e n c y c l i d i n e p r e t r e a t m e n t o n c o c a i n e - m e d i a t e d h e p a t o t o x i c i t y i n m i c e . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 7 2 , 1 9 4 - 2 0 2 . R e i d , M . J . , D u n s t o n , S . K . , L a m é , M . W . , W i l s o n , D . W . , M o r i n , D . , a n d S e g a l l , H . J . ( 1 9 9 9 ) . E f f e c t o f m o n o c r o t a l i n e m e t a b o l i t e s o n g l u t a t h i o n e l e v e l s i n h u m a n a n d b o v i n e p u l m o n a r y a r t e r y e n d o t h e l i a l c e l l s . R e s . C o m m u n . M o l P a t h o l P h a r m a c o l . 9 9 , 5 3 - 6 8 . R e i d , M . . , J L a m é , M . . , W M o r i n , D . W , i | s o n , D . W . , a n d S e g a l l , H . . J ( 1 9 9 8 ) . I n v o l v e m e n t o f c y t o c h r o m e P 4 5 0 3 A i n t h e m e t a b o l i s m a n d c o v a l e n t b i n d i n g o f 4 C - m o n o c r o t a l i n e i n r a t l i v e r m i c r o s o m e s . J . B i o c h e m . M o l e c . T o x i c o l . 1 2 , 1 5 7 - 1 6 4 . R e i n d e l , J . F . , H o o m , C . M . , W a g n e r , J . G . , a n d R o t h , R A . ( 1 9 9 1 ) . C o m p a r i s o n o f r e s p o n s e o f b o v i n e a n d p o r c i n e p u l m o n a r y a r t e r i a l e n d o t h e l i a l c e l l s t o m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e . A m . J . P h y s i o l . 2 6 1 , L 4 0 6 - L 4 1 4 . R e i n d e l , J . F . , a n d R o t h , R A . ( 1 9 9 1 ) . T h e e f f e c t s o f m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e o n c u l t u r e d b o v i n e p u l m o n a r y e n d o t h e l i a l a n d s m o o t h m u s c l e c e l l s . A m . J . P a t h o l . 1 3 8 , 7 0 7 - 7 1 9 . R i e s e n b e r g , K . , S c h l a e f f e r , F . , K a t z , A . , a n d L e v y , R . ( 1 9 9 5 ) . I n h i b i t i o n o f s u p e r o x i d e p r o d u c t i o n i n h u m a n n e u t r o p h i l s b y c o m b i n a t i o n s o f h e p a r i n a n d t h r o m b o l y t i c a g e n t s . B r . H e a r t J . 7 3 , 1 4 - 1 9 . R i e t s c h e l , E T , a n d B r a s e , H . ( 1 9 9 2 ) . B a c t e r i a l e n d o t o x i n s . S c i e n t i f i c A m e r i c a n 2 6 7 , 5 4 - 6 1 . 3 4 2 R o b e r t s o n , K . A . , S e y m o u r , J . L . , H s i a , M . T . , a n d A l l e n , J R . ( 1 9 7 7 ) . C o v a l e n t i n t e r a c t i o n o f d e h y d r o r e t r o n e c i n e , a c a r c i n o g e n i c m e t a b o l i t e o f t h e p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d m o n o c r o t a l i n e , w i t h c y s t e i n e a n d g l u t a t h i o n e . C a n c e r R e s . 3 7 , 3 1 4 1 - 3 1 4 4 . R o e d e r , E . ( 2 0 0 0 ) . M e d i c i n a l p l a n t s i n C h i n a c o n t a i n i n g p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s . P h a r r n a z i e 5 5 , 7 1 1 - 7 2 6 . R o s e , M . L . , B r a d f o r d , B . U . , G e r r n o l e c , D . R . , L i n , M . , T s u k a m o t o , H . , a n d T h u r m a n , R . G . ( 2 0 0 1 ) . G a d o l i n i u m c h l o r i d e - i n d u c e d h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n i s p r e v e n t e d b y a n t i b o d i e s t o t u m o r n e c r o s i s f a c t o r ( J . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 7 0 , 3 9 - 4 5 . R o t h , R . A . , H a r k e m a , J . R . , P e s t k a , J P , a n d G a n e y P E . ( 1 9 9 7 ) . I s e x p o s u r e t o b a c t e r i a l e n d o t o x i n a d e t e r m i n a n t o f s u s c e p t i b i l i t y t o i n t o x i c a t i o n f r o m x e n o b i o t i c a g e n t s . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 4 7 , 3 0 0 - 3 1 1 . R u e t t e n , H . , a n d T h i e m e r r n a n n , C . ( 1 9 9 6 ) . P r e v e n t i o n o f t h e e x p r e s s i o n o f i n d u c i b l e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e b y a m i n o g u a n i d i n e o r a m i n o e t h y l - i s o t h i o u r e a i n m a c r o p h a g e s a n d i n t h e r a t . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 2 2 5 , 5 2 5 - 5 3 0 . R y a n , U S . ( 1 9 8 6 ) . T h e e n d o t h e l i a l s u r f a c e a n d r e s p o n s e s t o i n j u r y . F e d . P r o c . 4 5 , 1 0 1 - 1 0 8 . S a e t r e , T . , L i n d g a a r d , A K , a n d L y b e r g , T . ( 2 0 0 0 ) . S y s t e m i c a c t i v a t i o n o f c o a g u l a t i o n a n d f i b r i n o l y s i s i n a p o r c i n e m o d e l o f s e r o g r o u p A s t r e p t o c o c c a l s h o c k . B l o o d C o a g u l . F i b r i n o l y s i s 1 1 , 4 3 3 - 4 3 8 . S a k a m o t o , S . , O k a n o u e , T . , I t o h , Y . , N a k a g a w a , Y . , N a k a m u r a , H . , M o r i t a , A . , D a i m o n , Y . , S a k a m o t o , K . , Y o s h i d a , N . , Y o s h i k a w a , T . , a n d K a s h i m a , K . ( 2 0 0 2 ) . I n v o l v e m e n t o f K u p f f e r c e l l s i n t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n n e u t r o p h i l s a n d s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s i n r a t s . S h o c k 1 8 , 1 5 2 - 1 5 7 . S a k a m o t o , S . , O k a n o u e , T . , l t o h , Y . , S a k a m o t o , K . , N i s h i o j i , K . , N a k a g a w a , Y . , Y o s h i d a , N . , Y o s h i k a w a , T . , a n d K a s h i m a , K . ( 1 9 9 7 ) . l n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 a n d C D 1 8 a r e i n v o l v e d i n n e u t r o p h i l a d h e s i o n a n d i t s c y t o t o x i c i t y t o c u l t u r e d s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s i n r a t . H e p a t o l o g y 2 6 , 6 5 8 - 6 6 3 . S a l v e m i n i , D . , M i s k o , T . P . , M a s f e r r e r , J . L . , S e i b e r t , K . , C u r r i e , M G , a n d N e e d l e m a n , P . ( 1 9 9 3 ) . N i t r i c o x i d e a c t i v a t e s c y c l o o x y g e n a s e e n z y m e s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 9 0 , 7 2 4 0 - 7 2 4 4 . 3 4 3 i . S a r p h i e , T . G . , D ’ S o u z a , M B , a n d D e a c i u c , I V . ( 1 9 9 6 ) . K u p f f e r c e l l i n a c t i v a t i o n p r e v e n t s l i p o p o l y s a c c h a r i d e i n d u c e d s t r u c t u r a l c h a n g e s i n t h e r a t l i v e r s i n u s o i d s : A n e l e c t r o n - m i c r o s c o p i c s t u d y . H e p a t o l o g y 2 3 , 7 8 8 - 7 9 6 . S a t o , M , G o t o , T . , a n d H a r a n a k i , K . ( 1 9 8 6 ) . A c t i o n s o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r o n c u l t u r e d v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s : M o r p h o l o g i c m o d u l a t i o n s , g r o w t h i n h i b i t i o n , a n d c y t o t o x i c i t y . J . N a t l . C a n c e r I n s t . 7 6 , 1 1 1 3 - 1 1 2 1 . S c h n i t t , S . J . , S t i l l m a n , I . E . , O w i n g s , D . V . , K i s h i m o t o , C . , D o r v a k , H R , a n d A b e l m a n n , W . H . ( 1 9 9 3 ) . M y o c a r d i a l f i b r i n d e p o s i t i o n i n e x p e r i m e n t a l v i r a l m y o c a r d i t i s t h a t p r o g r e s s e s t o d i l a t e d c a r d i o m y o p a t h y . C i r c . R e s . 7 2 , 9 1 4 - 9 2 0 . S c h o e n t a l , R . , a n d H e a d , M A . ( 1 9 5 5 ) . P a t h o l o g i c a l c h a n g e s i n r a t s a s a r e s u l t o f t r e a t m e n t w i t h m o n o c r o t a l i n e . B r . J . C a n c e r 9 , 2 2 9 - 2 3 7 . S c h r e c k , R . , R i e b e r , P . , a n d B a e u e r l e , R A . ( 1 9 9 1 ) . R e a c t i v e o x y g e n i n t e r m e d i a t e s a s a p p a r e n t l y w i d e l y u s e d m e s s e n g e r s i n t h e a c t i v a t i o n o f t h e N F - k a p p a B t r a n s c r i p t i o n f a c t o r a n d H I V - 1 . E M B O J . 1 0 , 2 2 4 7 - 2 2 5 8 . S c h u l t z e , A . E . , a n d R o t h , R A . ( 1 9 9 8 ) . C h r o n i c p u l m o n a r y h y p e r t e n s i o n - t h e m o n o c r o t a l i n e m o d e l a n d t h e i n v o l v e m e n t o f t h e h e m o s t a t i c s y s t e m . J . T o x i c o l . E n v i r o n . H e a l t h 1 , 2 7 1 - 3 4 6 . S c h u m a n n , R . R . , L e o n g , S . R . , F l a g g s , G . W . , G r a y , P . W . , W r i g h t , S . D . , M a t h i s o n , J . C . , T o b i a s , P S , a n d U l e v i t c h , R . J . ( 1 9 9 0 ) . S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e b i n d i n g p r o t e i n . S c i e n c e 2 4 9 , 1 2 2 9 - 1 2 3 1 . S c h u m a n n , R . R . , R i e t s c h e l , E T , a n d L o p p n o w , H . ( 1 9 9 4 ) . T h e r o l e o f C D 1 4 a n d l i p o p o l y s a c c h a r i d e - b i n d i n g p r o t e i n ( L B P ) i n t h e a c t i v a t i o n o f d i f f e r e n t c e l l t y p e s b y e n d o t o x i n . M e d . M i c r o b i o l . I m m u n o l . 1 8 3 , 2 7 9 - 2 9 7 . S c o t t , J . A . , a n d M c C a n n a c k , 0 . 6 . ( 1 9 9 9 ) . S e l e c t i v e i n v i v a i n h i b i t i o n o f i n d u c i b l e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n a r a t m o d e l o f s e p s i s . J . A p p l . P h y s i o l . 8 6 , 1 7 3 9 - 1 7 4 4 . S e a w r i g h t , A . A . ( 1 9 9 5 ) . D i r e c t l y t o x i c e f f e c t s o f p l a n t c h e m i c a l s w h i c h m a y o c c u r i n h u m a n a n d a n i m a l f o o d s . N a t u r a l T o x i n s 3 , 2 2 7 - 2 3 2 . S e g l e n , P O . ( 1 9 7 3 ) . P r e p a r a t i o n o f l i v e r c e l l s . l l l . E n z y m a t i c r e q u i r e m e n t s f o r t i s s u e d i s p e r s i o n . E x p e r . C e l l R e s . 8 2 , 3 9 1 - 3 9 8 . S e l y e , H . , T u c h w e b e r , B . , a n d B e r t o k , L . ( 1 9 6 6 ) . E f f e c t o f l e a d a c e t a t e o n s u s c e p t i b i l i t y o f r a t s t o b a c t e r i a l e n d o t o x i n s . J . B a c t e r i o l . 9 1 , 8 8 4 - 8 9 0 . S e t o , S . , K a i d a , T . , Y a m a a k a , S . , Y o s h i k a w a , A . , A r i i , S . , N a k a m u r a , T . , N i w a n o , 3 4 4 M . , a n d l m a m u r a , M . ( 1 9 9 8 ) . H e p a t o c y t e g r o w t h f a c t o r p r e v e n t s l i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d h e p a t i c s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y a n d i n t r a s i n u s o i d a l f i b r i n d e p o s i t i o n i n r a t s . J . S u r g . R e s . 8 0 , 1 9 4 - 1 9 9 . S e w e r , M . B . , K o o p , D . R . , a n d M o r g a n , E T . ( 1 9 9 6 ) . E n d o t o x e m i a i n r a t s i s a s s o c i a t e d w i t h t h e i n d u c t i o n o f t h e P 4 5 0 4 A s u b f a m i l y a n d s u p p r e s s i o n o f s e v e r a l o t h e r f o r m s o f c y t o c h r o m e P 4 5 0 . D r u g M e t a b . D i s p o s . 2 4 , 4 0 1 - 4 0 7 . S e w e r , M B , a n d M o r g a n , E T . ( 1 9 9 8 ) . D o w n - r e g u l a t i o n o f t h e e x p r e s s i o n o f t h r e e m a j o r r a t l i v e r c y t o c h r o m e P 4 5 0 5 b y e n d o t o x i n i n v i v a o c c u r s i n d e p e n d e n t l y o f n i t r i c o x i d e p r o d u c t i o n . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 2 8 7 , 3 5 2 - 3 5 8 . S h a r p , J . G . , B i s h o p , M . R . , C o p p l e , B . , G r e i n e r , T . C . , l v e r s e n , P . L . , J a c k s o n , J . D . , J o s h i , S . S . , B e n n e r , E . J . , M a n n , S . L . , R a o , A . K . , a n d V a s e , J . M . ( 2 0 0 1 ) . O l i g o n u c l e o t i d e e n h a n c e d c y t o t o x i c i t y o f l d a r u b i c i n f o r l y m p h o m a c e l l s . L e u k . L y m p h o m a 4 2 , 4 1 7 - 4 2 7 . S h e b u s k i , R . J . , a n d K i l g o r e , K S . ( 2 0 0 1 ) . R o l e o f i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s i n t h r a m b o g e n e s i s . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 3 0 0 , 7 2 9 - 7 3 5 . S h e d l o f s k y , S . l . , l s r e a l , B . C . , M c C l a i n , G . J . , H i l l , D B , a n d B l o u i n , R A . ( 1 9 9 4 ) . E n d o t o x i n a d m i n i s t r a t i o n t o h u m a n s i n h i b i t s h e p a t i c c y t o c h r o m e P 4 5 0 - m e d i a t e d d r u g m e t a b o l i s m . J . C l i n . I n v e s t . 9 4 : 2 2 0 9 - 2 2 1 4 . S h e n e p , J . L . , F l y n n , P . M . , B a r r e t t , F . F . , S t i d h a m , G . L . , a n d W e s t e n k i r c h n e r , D . F . ( 1 9 8 8 ) . S e r i a l q u a n t i t a t i o n o f e n d o t o x e m i a a n d b a c t e r e m i a d u r i n g t h e r a p y f o r g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l s e p s i s . J . I n f e c t . D i s . 1 5 7 , 5 6 5 - 5 6 8 . S h e n e p , J . L . , a n d M o r g a n , K . A . ( 1 9 8 4 ) . K i n e t i c s o f e n d o t o x i n r e l e a s e d u r i n g a n t i b i o t i c t h e r a p y f o r e x p e r i m e n t a l g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a l s e p s i s . J . I n f e c t . D i s . 1 5 0 , 3 8 0 - 3 8 8 . S h i b a y a m a , Y . ( 1 9 8 7 ) . S i n u s o i d a l c i r c u l a t o r y d i s t u r b a n c e b y m i c r o t h r o m b o s i s a s a c a u s e o f e n d o t o x i n - i n d u c e d h e p a t i c i n j u r y . J . P a t h o l . 1 5 1 , 3 1 5 - 3 2 1 . S h i b a y a m a , Y . , A s a k a , S . , U r a n o , T . , A r a k i , M . , a n d O d a , K . ( 1 9 9 5 ) . R o l e o f n e u t r o p h i l s a n d p l a t e l e t s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f f o c a l h e p a t o c e l l u l a r n e c r o s i s i n e n d o t o x e m i a . E x p . T a x i c a l . P a t h o l . 4 7 , 3 5 - 3 9 . S h i m i z u , H . , H e , W . , G u a , P . , D z i a d k o v i e c , I . , M i y a z a k i , M , a n d F a l k , R E . ( 1 9 9 4 ) . S e r u m h y a l u r o n a t e i n t h e a s s e s s m e n t o f l i v e r e n d o t h e l i a l c e l l f u n c t i o n a f t e r o r t h o t o p i c l i v e r t r a n s p l a n t a t i o n i n t h e r a t . H e p a t o l o g y . 2 0 , 1 3 2 3 - 1 3 2 9 . 3 4 5 S h i n , C . S . , H a n , J . U . , K i m , J . L . , S c h e n a r t s , P . J . , T r a b e r , L . D . , H a w k i n s , H . , a n d T r a b e r , D . L . ( 1 9 9 7 ) . H e p a r i n a t t e n u a t e d n e u t r o p h i l i n f i l t r a t i o n b u t d i d n o t a f f e c t r e n a l i n j u r y i n d u c e d b y i s c h e m i a r e p e r f u s i o n . Y o n s e i M e d . J . 3 8 , 1 3 3 - 1 4 1 . S h i r a t o r i , Y . , K a w a s e , T . , S h i i n a , S . , O k a n o , K . , S u g i m o t o , T . , T e r a o k a , H . , M a t a n o , S . , M a t s u m o t o , K . , a n d K a m i i , K . ( 1 9 8 8 ) . M o d u l a t i o n o f h e p a t o t o x i c i t y b y m a c r o p h a g e s i n t h e l i v e r . H e p a t o l o g y 8 , 8 1 5 - 8 2 1 . S h u m a n , M A . ( 1 9 8 6 ) . T h r o m b i n - c e l l u l a r i n t e r a c t i o n s . A n n . N Y A c a d . S c i . 4 8 5 , 2 2 8 - 2 3 9 . S i l v e s t e r o , L . , V i a n o , l . , M a c a r i o , M . , C o l a n g e l o , D . , G u i s e p p e , M . , P a c i n o , S . , a n d F a n t a z z i , R . ( 1 9 9 4 ) . E f f e c t o f h e p a r i n a n d i t s d e s u l f a t e d d e r i v a t i v e s o n l e u k o c y t e - e n d o t h e l i a l a d h e s i o n . S e m i n . T h r o m b . H e m o s t . 2 0 , 2 5 4 - 2 5 8 . S i n h a , A . K . , W i l l i s , J . , a n d C o l m a n , R . W . ( 1 9 8 3 ) . I n h i b i t i o n o f t h r o m b o x a n e A 2 s y n t h e s i s i n h u m a n p l a t e l e t s b y c o a g u l a t i o n f a c t o r X a . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 8 0 , 6 0 8 6 - 6 0 9 0 . S n e e d , R . A . , B u c h w e i t z , J . P . , J e a n , R A , a n d G a n e y , P E . ( 2 0 0 0 ) . P e n t a x i f y l l i n e a t t e n u a t e s b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d e n h a n c e m e n t o f a l l y l a l c o h o l h e p a t o t o x i c i t y . T o x i c o l . S c i . 5 6 , 2 0 3 - 2 1 0 . S n e e d , R . A . , G r i m e s , S . D . , S c h u l t z e , A . E . , B r o w n , A . P . , a n d G a n e y , P E . ( 1 9 9 7 ) . B a c t e r i a l e n d o t o x i n e n h a n c e s t h e h e p a t o t o x i c i t y o f a l l y l a l c o h o l . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 4 4 , 7 7 - 8 7 . S o u t h a n , G . J . , a n d S z a b o , C . ( 1 9 9 6 ) . S e l e c t i v e p h a r m a c o l o g i c a l i n h i b i t i o n o f d i s t i n c t n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i s o f o n n s . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 5 1 , 3 8 3 - 3 9 4 . S p a p e n , H . , Z h a n g , H . , W i s s e , E . , B a e k e l a n d , M . , S e y n a e v e , C . , E d d a u k s , M , a n d V i n c e n t , J . L . ( 1 9 9 9 ) . T h e 2 1 - a m i n o s t e r o i d U 7 4 3 8 9 G e n h a n c e d h e p a t i c b l o o d f l o w a n d p r e s e r v e s s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l f u n c t i o n a n d s t r u c t u r e i n e n d o t o x i n - s h o c k e d d o g s . J . S u r g . R e s . 8 6 , 1 8 3 - 1 9 1 . S p i t z e r , J . A . , a n d M a y e r , A . M . S . ( 1 9 9 3 ) . H e p a t i c n e u t r o p h i l i n f l u x : E i c a s a n o i d a n d s u p e r o x i d e f o r m a t i o n i n e n d o t o x e m i a . J . S u r g . R e s . 5 5 , 6 0 - 6 7 . S p i t z e r , J . A . , Z h a n g , P . , a n d M a y e r , A . M . S . ( 1 9 9 4 ) . F u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f p e r i p h e r a l c i r c u l a t i n g a n d l i v e r r e c r u i t e d n e u t r o p h i l s i n e n d o t o x i c r a t s . J . L e u k o c y t e . B i o l . 5 6 , 1 6 6 - 1 7 3 . S p r i n g e r , T A . ( 1 9 9 4 ) . T r a f f i c s i g n a l s f o r l y m p h o c y t e r e c i r c u l a t i o n a n d l e u k o c y t e e m i g r a t i o n : t h e m u l t i s t e p p a r a d i g m . C e I I 7 6 , 3 0 1 - 3 1 4 . 3 4 6 S t a c h l e w i t z , R . F . , S e a b r a , V . , B r a d f o r d , 8 . , B r a d h a m , C . A . , R u s y n , l . , G e r r n o l e c , D . a n d T h u r m a n , R . G . ( 1 9 9 9 ) . G l y c i n e a n d u r i d i n e p r e v e n t D - g a l a c t o s a m i n e h e p a t o t o x i c i t y i n t h e r a t : R o l e o f K u p f f e r c e l l s . H e p a t o l o g y 2 9 , 7 3 7 - 7 4 5 . S t e e l , R . G . D . , T o r r i e , J . H . , a n d D i c k e y , D A . ( 1 9 9 7 ) . P r i n c i p l e s a n d P r o c e d u r e s i n S t a t i s t i c s : A B i o m e t r i c A p p r o a c h 3 r d e d . , p p . 1 - 6 0 3 . M c G r a w - H i l l , N e w Y o r k . S t e g e l m e i e r , B . L . , E d g a r , J . A . , C o l e g a t e , S . M . , G a r d n e r , D . R . , S c l o c h , T . K . , C o u l o m b e , R A , a n d M o l y n e u x , R . J . ( 1 9 9 9 ) . P y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d p l a n t s , m e t a b o l i s m a n d t o x i c i t y . J N a t . T o x i n s 8 , 9 5 - 1 1 6 . S t e r n , D . , N a w r o t h , P . , H a n d l e y , D . , a n d K i s i e l , W . ( 1 9 8 5 ) . A n e n d o t h e l i a l c e l l - d e p e n d e n t p a t h w a y o f c o a g u l a t i o n . P r a c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 2 , 2 5 2 3 - 2 5 2 7 . S t i l l m a n , A . E . , H u x t a b l e , R . , C o n s r o e , P . , K o h n e n , P . , a n d S m i t h , S . ( 1 9 7 7 ) . H e p a t i c v e n o o c c l u s i v e d i s e a s e d u e t o p y r r o l i z i d i n e p o i s o n i n g i n A r i z o n a . G a s t r o e n t e r o l o g y 7 3 , 3 4 9 - 3 5 2 . S t o u t h a r d , J . M . , L e v i , M . , H a c k , C . E . , V e e n h o f , C . H . , R o m j i n , H . A . , S a u e r w e i n , H P , a n d v a n d e r P o l l , T . ( 1 9 9 6 ) . I n t e r l e u k i n - 6 s t i m u l a t e s c o a g u l a t i o n , n o t f i b r i n o l y s i s , i n h u m a n s . T h r o m b . H a e m o s t . 7 6 , 7 3 8 - 7 4 2 . S u , G . L . , S i m m o n s , R . L . , a n d W a n g , S C . ( 1 9 9 5 ) . L i p o p o l y s a c c h a r i d e b i n d i n g p r o t e i n p a r t i c i p a t i o n i n c e l l u l a r a c t i v a t i o n b y L P S . C r i t . R e v . I m m u n o l . 1 5 , 2 0 1 - 2 1 4 . S u f f r e d i n i , A . F . , a n d O ’ G r a d y , N P . ( 1 9 9 9 ) . P a t h o p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s t o e n d o t o x i n s i n h u m a n s . I n E n d o t o x i n i n H e a l t h a n d D i s e a s e . ( H . B r a d e , S . M . O p a l , S . N . V o g e l , a n d 0 . 0 . M o r r i s o n D . C , E d s . ) , p p . 8 1 7 - 8 3 0 . M a r c e l - D e k k e r , N e w Y o r k . S w e e t , M . J . , a n d H u m e , D A . ( 1 9 9 6 ) . E n d o t o x i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n i n m a c r o p h a g e s . J . L e u k o c y t e B i o l . 6 0 , 8 - 2 6 . T a i , J . H . , a n d P e s t k a , J . J . ( 1 9 8 8 ) . S y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e t r i c h o t h e c e n e T - 2 t o x i n a n d S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m l i p o p o l y s a c c h a r i d e i n C 3 H / H e N a n d C S H / H e J m i c e . T a x i c i a l . L e t t . 4 4 , 1 9 1 - 2 0 0 . T a k a n o , H . , Y o s h i k a w a , T . , Y a m a g u c h i , T . , H o n g o , H . , F u j i i , T . , B a k u , Y . , Y o s h i d a , N . , Y a m a m o t o , H . , N a k a h a s h i , Y . , Y a n a g i s a w a , R . , a n d K o n d o , M . ( 1 9 9 7 ) . E f f e c t s o f a m i n o g u a n i d i n e o n s y s t e m i c i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e 3 4 7 s y n d r o m e i n d u c e d b y p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r a n d b y l i p o p o l y s a c c h a r i d e i n r a t s . E u r . J . P h a r m a c o l . 3 2 3 , 1 0 7 - 1 1 0 . T a k e d a , K . , a n d A k i r a , S . ( 2 0 0 1 ) . R o l e s o f T o l l - l i k e r e c e p t o r s i n i n n a t e i m m u n e r e s p o n s e s . G e n e s t a C e l l s 6 , 7 3 3 - 7 4 2 . T a k e d a , K . , K a i s h o , T , a n d A k i r a , S . ( 2 0 0 3 ) . T o l l - l i k e r e c e p t o r s . A n n u . R e v . I m m u n o l . 2 1 , 3 3 5 - 3 7 6 . T a k e u c h i , M . , N a k a s h i m a , Y . , M i u r a , Y . , N a k a g a w a , K . , U r a g o h , K . , l w a n a g a , S . H o r i , Y . , a n d S u e i s h i , K . ( 1 9 9 4 ) . T h e l o c a l i z a t i o n o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e i n a n e n d o t o x e m i c r a t l i v e r a n d i t s r e l a t i o n t o s i n u s o i d a l t h r o m b o g e n e s i s : L i g h t a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s . P a t h . R e s . P r a c t . 1 9 0 , 1 1 2 3 - 1 1 3 3 . T a r a o , K . , S o , K . , M o r a l , T . , I k e u c h i , T . , a n d S u y a m a , T . ( 1 9 7 7 ) . D e t e c t i o n o f e n d o t o x i n i n p l a s m a a n d a s c i t i c f l u i d o f p a t i e n t s w i t h c i r r h o s i s : I t s c l i n i c a l s i g n i f i c a n c e . G a s t r o e n t e r o l o g y 7 3 , 5 3 9 - 5 4 2 . T a y l o r , D . W . , W i l s o n , D . W . , L a m é , M . W . , D u n s t a n , S . D . , J o n e s , A . D . , a n d S e g a l l , H . J . ( 1 9 9 6 ) . C o m p a r a t i v e c y t o t o x i c i t y o f m o n o c r o t a l i n e a n d i t s m e t a b o l i t e s i n c u l t u r e d p u l m o n a r y e n d o t h e l i a l c e l l s . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 4 3 , 1 9 6 - 2 0 4 . T e r a s h i t a , Z . - l . , K a w a m u r a , M . , T a k a t a n i , M , T s u s h i m a , S . , l m u r a , Y . , a n d N i s h i k a w a , K . ( 1 9 9 2 ) . B e n e f i c i a l e f f e c t s o f T C V - 3 0 9 , a n o v e l p o t e n t a n d s e l e c t i v e p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r a n t a g o n i s t i n e n d o t o x i n a n d a n a p h y l a c t i c s h o c k i n r o d e n t s . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 2 6 0 , 7 4 8 - 7 5 5 . T h o m a s , H . C . , L a m é , M . W . , D u n s t a n , S . K . , S e g a l l , H . J . , a n d W i l s o n , D . W . ( 1 9 9 8 ) . M o n o c r o t a l i n e p y r r o l e i n d u c e s a p o p t o s i s i n p u l m o n a r y a r t e r y e n d o t h e l i a l c e l l s . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 5 1 , 2 3 6 - 2 4 4 . T h o m a s , H . C . , L a m é , M . W . , W i l s o n , D . W . , a n d S e g a l l , H . J . ( 1 9 9 6 ) . C e l l c y c l e a l t e r a t i o n a s s o c i a t e d w i t h c o v a l e n t b i n d i n g o f m o n o c r o t a l i n e p y r r o l e t o p u l m o n a r y a r t e r y e n d o t h e l i a l c e l l D N A . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 4 1 , 3 1 9 - 3 2 9 . T h o r t a n , A . J . , H a m , J . , a n d K u n k e l S . L . ( 1 9 9 1 ) . K u p f f e r c e l l - d e r i v e d c y t o k i n e s i n d u c e t h e s y n t h e s i s o f a l e u k o c y t e c h e m o t a c t i c p e p t i d e , i n t e r l e u k i n - 8 , i n h u m a n h e p a t o m a a n d p r i m a r y h e p a t o c y t e c u l t u r e s . H e p a t o l o g y . 1 4 , 1 1 1 2 - 1 1 2 2 . T o d o r o k i , H . , N a k a m u r a , S . , H i g u r e , A . , O k a m o t o , K . , T a k e d a , S . , N a g a t a , N . , l t o h , H . , a n d O h s a t o , K . ( 2 0 0 0 ) . N e u t r o p h i l s e x p r e s s t i s s u e f a c t o r i n a m o n k e y m o d e l o f s e p s i s . S u r g e r y 1 2 7 , 2 0 9 - 2 1 6 . 3 4 8 T r a c e y , W . R . , T s e , J . , a n d C a r t e r , G . ( 1 9 9 5 ) . L i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d c h a n g e s i n p l a s m a n i t r i t e a n d n i t r a t e c o n c e n t r a t i o n s i n r a t s a n d m i c e : P h a r m a c o l o g i c a l e v a l u a t i o n o f n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n h i b i t o r s . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 2 7 2 , 1 0 1 1 - 1 0 1 5 . T r e j o , R . A . , D i L u z i o , N . R . , L o o s e , L . D . , a n d H o f f m a n , E C . ( 1 9 7 2 ) . R e t i c u l o e n d o t h e l i a l a n d h e p a t i c f u n c t i o n a l a l t e r a t i o n s f o l l o w i n g l e a d a c e t a t e a d m i n i s t r a t i o n . E x p . M o l . P a t h o l . 1 7 , 1 4 5 - 1 5 8 . U e n o , A . , M u r a k a m i , K . , Y a m a n o u c h i , K . , W a t a n a b e , M . , a n d K o n d o , T . ( 1 9 9 6 ) . T h r o m b i n s t i m u l a t e s p r o d u c t i o n o f i n t e r l e u k i n - 8 i n h u m a n u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l s . I m m u n o l . 8 8 , 7 6 - 8 1 . U l e v i t c h , R . J . , J o h n s t o n , A . R . , a n d W e i n s t e i n , D B . ( 1 9 8 1 ) . N e w f u n c t i o n f o r h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n ( H D L ) : I I . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e - H D L c o m p l e x f o r m e d i n r a b b i t p l a s m a . J . C l i n . I n v e s t . 6 7 , 8 2 7 - 8 3 7 . U t i l i , R . , A b e r n a t h y , C O , a n d Z i m m e r m a n , H . J . ( 1 9 7 7 ) . E n d o t o x i n a n d t h e l i v e r . L i f e S c i e n c e s 2 0 : 5 5 3 - 5 6 6 . V a a r a , M . ( 1 9 9 9 ) . L i p o p o l y s a c c h a r i d e a n d t h e p e r m e a b i l i t y o f t h e b a c t e r i a l o u t e r m e m b r a n e . I n E n d o t o x i n i n H e a l t h a n d D i s e a s e . ( H . B r a d e , S . M . O p a l , S . N . V o g e l , a n d D C . M o r r i s o n D . C , E d s . ) , p p . 3 1 - 3 8 . M a r c e l - D e k k e r , N e w Y o r k . V a d a s , M A , a n d G a m b l e , J R . ( 1 9 9 0 ) . R e g u l a t i o n o f t h e a d h e s i o n o f n e u t r o p h i l s t o e n d o t h e l i u m . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 4 0 , 1 6 8 3 - 1 6 8 7 . V a n D a m m e , J . ( 1 9 9 4 ) . I n t e r l e u k i n - 8 a n d r e l a t e d c h e m o t a c t i c c y t o k i n e s . I n T h e C y t o k i n e H a n d b o o k ( A . W . T h o m s o n , E d . ) , 2 " d e d i t i o n , p p . 1 8 5 - 2 0 8 . A c a d e m i c P r e s s , L o n d o n . V a n d e n b e r g h e J . ( 1 9 9 6 ) . H e p a t o t o x i c o l o g y : S t r u c t u r e , f u n c t i o n , a n d t o x i c o l o g i c a l p a t h o l o g y . I n T o x i c o l o g y : P r i n c i p l e s a n d A p p l i c a t i o n s ( R . J . M . N i e s i n k , J . d e V r i e s , a n d M A . H o l l i n g e r , E d s . ) , p p . 6 6 9 - 7 0 0 . C R C P r e s s , B o c a R a t o n . V a n d e r P o l l , T . , L e v i , M . , H a c k , C . E . , t e n C a t e , H . , v a n D e v e n t e r , S . J . , E e r e n b e r g , A . J . , d e G r o o t , E . R . , J a n s e n , J . , G a l l a t i , H . , a n d B u l l e r , H R ( 1 9 9 4 ) . E l i m i n a t i o n o f i n t e r l e u k i n 6 a t t e n u a t e s c o a g u l a t i o n a c t i v a t i o n i n e x p e r i m e n t a l e n d o t o x e m i a i n c h i m p a n z e e s . J . E x p . M e d . 1 7 9 , 1 2 5 3 - 1 2 5 9 . V a n D e v e n t e r , S . J . H . , H a r t , M . , v a n d e r P o l l , T . , H a c k , C E , a n d A a r d e n , L A . ( 1 9 9 3 ) . E n d o t o x i n a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - d - i n d u c e d i n t e r l e u k i n - 8 r e l e a s e i n h u m a n s . J . I n f e c t . D i s . 1 6 7 , 4 6 1 - 4 6 4 . 3 4 9 V a s s a l l i , P . ( 1 9 9 2 ) . T h e p a t h o p h y s i o l o g y o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r . A n n u . R e v . I m m u n o l . 1 0 , 4 1 1 - 4 5 2 . V e n t u r i n i , O M , a n d K a p l a n , J . E . ( 1 9 9 2 ) . T h r o m b i n i n d u c e s p l a t e l e t a d h e s i o n t o e n d o t h e l i a l c e l l s . S e m . T h r o m b . H a e m o . 1 8 , 2 7 5 - 2 8 3 . V e r g n o l l e , N . , W a l l a c e , J . L . , B u n n e t t , N . W . , a n d H o l l e n b e r g , M D . ( 2 0 0 1 ) . P r o t e a s e - a c t i v a t e d r e c e p t o r s i n i n f l a m m a t i o n , n e u r o n a l s i g n a l i n g a n d p a i n . T r e n d s P h a r m a c o l . S c i . 2 2 , 1 4 6 - 1 5 2 . V o l l m a r , B . , L a n g , G . , P o s t , 8 . , M e n g e r , M D , a n d M e s s m e r , K . ( 1 9 9 3 ) . M i c r o c i r c u l a t i o n o f t h e l i v e r i n h e m o r r h a g i c s h o c k i n t h e r a t a n d i t s s i g n i f i c a n c e f o r e n e r g y m e t a b o l i s m a n d f u n c t i o n . Z e n t r a l b l . C h i r . 1 1 8 , 2 1 8 - 2 2 5 . V o l l m a r , B . , R i c h t e r , S . , a n d M e n g e r , M . D . ( 1 9 9 6 a ) . L e u k o c y t e s t a s i s i n h e p a t i c s i n u s o i d s . A m . J . P h y s i o l . 2 7 0 , G 7 9 8 - G 8 0 3 . V o l l m a r , B . , R i i t t i n g e r , D . , W a n n e r , G . A , L e i d e r e r , R . , a n d M e n g e r , M . D . ( 1 9 9 6 b ) . M o d u l a t i o n o f K u p f f e r c e l l a c t i v i t y b y g a d o l i n i u m c h l o r i d e i n e n d o t o x e m i c r a t s . S h o c k 6 , 4 3 4 - 4 4 1 . W a r d , P A , a n d V a r a n i , J . ( 1 9 9 0 ) . M e c h a n i s m s o f n e u t r o p h i l - m e d i a t e d k i l l i n g o f e n d o t h e l i a l c e l l s . J . L e u k o c . B i o l . 4 8 , 9 7 - 1 0 2 . W a r n e r , A . E . , D e C a m p , M . M . , M o l i n a , R M , a n d B r i a n , J D . ( 1 9 8 8 ) . P u l m o n a r y r e m o v a l o f c i r c u l a t i n g e n d o t o x i n r e s u l t s i n a c u t e l u n g i n j u r y i n s h e e p . L a b . I n v e s t . 5 9 , 2 1 9 - 2 3 0 . W a t s o n , R . W . G . , R e d m o n d , H P , a n d B o u c h i e r — H a y e s , D . ( 1 9 9 4 ) . R o l e o f E n d o t o x i n i n m o n o n u c l e a r p h a g o c y t e i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e s . J . L e u k o c y t e B i o l . 5 6 , 9 5 - 1 0 3 . W e s t , M . A . , B i l l a r , T . R . , H y l a n d , B . J . , J o r d a n , M . L . , a n d S i m m o n s , R . L . ( 1 9 8 7 ) . R e g u l a t i o n o f K u p f f e r c e l l - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s i n h e p a t o c y t e p r o t e i n s y n t h e s i s i n v i t r o . C u r r . S u r g . 4 4 , 4 6 7 - 4 6 9 . W e s t , M . A . , B i l l a r , T . R . , M a z u s k i , J . E . , C u r r a n , R . J . , C e r r a , R B , a n d S i m m o n s , R . L . ( 1 9 8 8 ) . E n d o t o x i n m o d u l a t i o n i n h e p a t o c y t e s e c r e t a r y a n d c e l l u l a r p r o t e i n s y n t h e s i s i s m e d i a t e d b y K u p f f e r c e l l s . A r c h . S u r g . 1 2 3 , 1 4 0 0 - 1 4 0 5 . W e s t , M . A . , K e l l e r , G . A . , H y l a n d , B . J . , C e r r a , R B , a n d S i m m o n s , R . L . ( 1 9 8 6 ) . F u r t h e r c h a r a c t e r i z a t i o n o f K u p f f e r c e l l / m a c r o p h a g e - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s i n h e p a t o c y t e p r o t e i n s y n t h e s i s . S u r g e r y . 1 0 0 , 4 1 6 - 4 2 2 . 3 5 0 W h i t e , l . N . H . , a n d M a t t o c k s , A . R . ( 1 9 7 2 ) . R e a c t i o n o f d i h y d r o p y r r o l i z i d i n e s w i t h d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d s i n v i t r o . B i o c h e m . J . 1 2 8 , 2 9 1 - 2 9 7 . W h i t m a r s h , A . J . , a n d D a v i s , R . J . ( 1 9 9 6 ) . T r a n s c r i p t i o n f a c t o r A P - 1 r e g u l a t i o n b y m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s . J . M o l . M e d , 7 4 , 5 8 9 - 6 0 7 . W i l l i a m s , D . E . , R e e d , R . L . , K e d z i e r s k i , B . , D a n n a n , G . A . , G u e n g e r i c h , P P , a n d B u h l e r , D R . ( 1 9 8 9 ) . B i o a c t i v a t i o n a n d d e t o x i f i c a t i o n o f t h e p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s e n e c i o n i n e b y c y t o c h r o m e P - 4 5 0 e n z y m e s i n r a t l i v e r . D r u g M e t a b . D i s p o s . 1 7 , 3 8 7 - 3 9 2 . W i l s o n , D . W . , L a m é , M . W . , D u n s t a n , S . K . , T a y l o r , D . W . , a n d S e g a l l , H . J . ( 1 9 9 8 ) . M o n o c r o t a l i n e p y r r o l e i n t e r a c t s w i t h a c t i n a n d i n c r e a s e s t h r o m b i n - m e d i a t e d p e r m e a b i l i t y i n p u l m o n a r y a r t e r y e n d o t h e l i a l c e l l s . T a x i c a l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 5 2 , 1 3 8 - 1 4 4 . W i l s o n , D . W . , S e g a l l , H . J . , P a n , L . C . , L a m e , M . W , E s t e p , J . E . , a n d M o r i n , D . ( 1 9 9 2 ) . M e c h a n i s m s a n d p a t h o l o g y o f m o n o c r o t a l i n e p u l m o n a r y t o x i c i t y . C r i t . R e v . T o x i c o l . 2 2 , 3 0 7 - 3 2 5 . W i s e , W . C . , C o o k , J . A . , H a l u s h k a , P . V . , a n d K n a a p , D R . ( 1 9 8 0 ) . P r o t e c t i v e e f f e c t s o f t h r o m b o x a n e s y n t h e s i s i n h i b i t o r s i n r a t s i n e n d o t o x i c s h o c k . C i r c . R e s . 4 6 , 8 5 4 - 8 5 9 . W i s s e , E . , B r a e t , F . , L u o , D . , D e Z a n g e r , R . , J a n s , D . , C r a b b e , E . , a n d V e r r n o e s e n , A . ( 1 9 9 6 ) . S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f s i n u s o i d a l l i n i n g c e l l s i n t h e l i v e r . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 2 4 , 1 0 0 - 1 1 1 . W o l k o w , P P . ( 1 9 9 8 ) . I n v o l v e m e n t a n d d u a l e f f e c t s o f n i t r i c o x i d e i n s e p t i c s h o c k . I n f l a m m . R e s . 4 7 , 1 5 2 - 1 6 6 . W o o d m a n , R . C . , T e c h , 0 . , P a y n e , 0 . , K u b e s , P . ( 2 0 0 0 ) . T h r o m b i n a n d l e u k o c y t e r e c r u i t m e n t i n e n d o t o x e m i a . A m . J . P h y s i o l . H e a r t C i r c . P h y s i o l . 2 7 9 , H 1 3 3 8 - H 1 3 4 5 . W r i g h t , S . D . , R a m o s , R . A . , T o b i a s , P . S . , U l e v i t c h , R . J . , a n d M a t h i s o n , J . C . ( 1 9 9 0 ) . C D 1 4 : A r e c e p t o r f o r c o m p l e x e s o f l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) a n d L P S b i n d i n g p r o t e i n . S c i e n c e 2 4 9 , 1 4 3 1 - 1 4 3 3 . W u , C . - C . , C h e n , S . - J . , S z a b o , C . , T h i e m e r r n a n n , C . , a n d V a n e , J R . ( 1 9 9 5 ) . A m i n o g u a n i d i n e a t t e n u a t e s t h e d e l a y e d c i r c u l a t o r y f a i l u r e a n d i m p r o v e s s u r v i v a l i n r o d e n t m o d e l s o f e n d o t o x i c s h o c k . B r . J . P h a r m a c o l . 1 1 4 , 1 6 6 6 - 1 6 7 2 . 3 5 1 W u e w e e r a , J . B . , G a n d o l f i , A . J . , B a d g e r , D . A . , S i p e s , L G , a n d B r e n d e l , K . ( 1 9 9 6 ) . V i t a m i n A p o t e n t i a t i o n o f v i n y l i d e n e c h l o r i d e h e p a t o t o x i c i t y i n r a t s a n d p r e c i s i o n - c u t r a t l i v e r s l i c e s . F u n d . A p p l . T a x i c a l . 3 4 , 7 3 - 8 3 . X u , Y . , J o n e s , B . E . , N e u f e l d , 0 . 8 . , a n d C z a j a , M . J . ( 1 9 9 8 ) . G l u t a t h i o n e m o d u l a t e s r a t a n d m o u s e h e p a t o c y t e s e n s i t i v i t y t o t u m o r n e c r o s i s f a c t o r t o x i c i t y . G a s t r o e n t e r o l o g y . 1 1 5 , 1 2 2 9 - 1 2 3 7 . Y a c h i d a , S . , K a k u d o , Y . , W a k a b a y a s h i , H . , M a e b a , T . , K e n a d a , K . , a n d M a e t a , H . ( 1 9 9 8 ) . M o r p h o l o g i c a l a n d f u n c t i o n a l a l t e r a t i o n s t o s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s i n t h e e a r l y p h a s e o f e n d o t o x i n - i n d u c e d l i v e r f a i l u r e a f t e r p a r t i a l h e p a t e c t o m y i n r a t s . V i r c h o w s A r c h . 4 3 3 , 1 7 3 - 1 8 3 . Y a m a d a , S . , O g a t a , l . , H i r a t a , K . , M o c h i d a , S . , T o m i y a , T . , a n d F u j i w a r a , K . ( 1 9 8 9 ) . l n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n i n t h e d e v e l o p m e n t o f m a s s i v e h e p a t i c n e c r o s i s i n d u c e d b y C o r y n e b a c t e r i u m p a r v u m a n d e n d o t o x i n i n r a t s . S c a n d . J . G a s t r o e n t e r o l . 2 4 , 2 9 3 - 2 9 8 . Y a m a g u c h i , Y . , M a t s u m u r a , F . , T a k e y a , M . , l c h i g u c h i , O . , K u r a t s u , J . - l . , H o r i u c h i , T . , A k i z u k i , E . , M a t s u d a , T . , O k a b e , K . , O h s h i r o , H . , L i a n g , J . , M a r i , K . , Y a m a d a , S . , T a k a h a s h i , K . , a n d O g a w a , M . ( 1 9 9 8 ) . M o n o c y t e c h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n - 1 e n h a n c e s e x p r e s s i o n o f i n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 f o l l o w i n g i s c h e m i a - r e p e r f u s i o n o f l i v e r s i n r a t s . H e p a t o l o g y 2 7 , 7 2 7 - 7 3 4 . Y a n , C O , a n d H u x t a b l e , R . J . ( 1 9 9 5 ) . T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d m o n o c r o t a l i n e a n d t h e p a t t e r n o f m e t a b o l i t e s r e l e a s e d f r o m t h e i s o l a t e d l i v e r . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 3 0 , 1 - 8 . Y a n g , R . B . , M a r k , M . R . , G r a y , A . , H u a n g , A . , X i e , M . H . , Z h a n g , M . , G o d d a r d , A . , W o o d , W . | . , G u r n e y , A . L . , a n d G o d a w s k i , P . J . ( 1 9 9 8 ) . T o l l - l i k e r e c e p t o r - 2 m e d i a t e s I i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d c e l l s i g n a l i n g . N a t u r e . 3 9 5 , 2 8 4 - 2 8 8 . Y e e , S . B . , C o p p l e , B . L . , G a n e y , P E , a n d R o t h R A . ( 2 0 0 2 ) . S i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y d u r i n g h e p a t o t o x i c i t y f r o m m o n o c r o t a l i n e a n d b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e c o e x p a s u r e . T o x i c o l . S c i . 6 6 , 3 5 2 ( A b s t r a c t ) . Y e e , S . B . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R A . ( 1 9 9 8 ) . T e m p o r a l r e l a t i o n s h i p s i n t h e a u g m e n t a t i o n o f m o n o c r o t a l i n e h e p a t o t o x i c i t y b y b a c t e r i a l e n d o t o x i n . T a x i c a l . S c i e n c e s 4 2 , 3 6 6 ( A b s t r a c t ) . Y e e , S . B . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R . A . ( 2 0 0 0 a ) . H e p a t o t o x i c i t y f r o m c o a d m i n i s t r a t i o n o f s m a l l , s y n e r g i s t i c d o s e s o f m o n o c r o t a l i n e a n d b a c t e r i a l e n d o t o x i n i s a t t e n u a t e d b y h e p a r i n . T o x i c o l . S c i . 5 4 , 1 4 0 ( A b s t r a c t ) . 3 5 2 Y e e , S . B . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R . A . ( 2 0 0 3 a ) . T h e r o l e o f K u p f f e r C e l l s a n d T N F - a i n m o n o c r o t a l i n e a n d b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e - i n d u c e d l i v e r i n j u r y . T o x i c o l . S c i . 7 1 , 1 2 4 - 1 3 2 . Y e e , S . B . , H a n u m e g o w d a , U . M . , C o p p l e , B . L . , M a s a b u m i , S . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R . A . ( 2 0 0 3 b ) . E n d o t h e l i a l c e l l i n j u r y a n d c o a g u l a t i o n s y s t e m a c t i v a t i o n d u r i n g s y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y f r o m m o n o c r o t a l i n e a n d b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e c o e x p o s u r e . T o x i c o l . S c i . S u b m i t t e d . Y e e , S . B . , H a n u m e g o w d a , U . M . , H o t c h k i s s , J . A . , G a n e y , P E , a n d R o t h , R . A . ( 2 0 0 3 0 ) . R o l e o f n e u t r o p h i l s i n t h e s y n e r g i s t i c l i v e r i n j u r y f r o m m o n o c r o t a l i n e a n d b a c t e r i a l l i p o p o l y s a c c h a r i d e e x p o s u r e . T o x i c o l . S c i . 7 2 , 4 3 - 5 6 . Y e e , S . B . , K i n s e r , S . H . , H i l l , D . A . , B a r t o n , C . C . , H o t c h k i s s , J . A . , H a r k e m a , J . R . , G a n e y , P E , a n d R o t h R . A . ( 2 0 0 0 b ) . S y n e r g i s t i c h e p a t o t o x i c i t y f r o m c o e x p o s u r e t o b a c t e r i a l e n d o t o x i n a n d t h e p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d m o n o c r o t a l i n e . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l . 1 6 6 , 1 7 3 - 1 8 5 . Y o s h i d o m e , H . , M i y a z a k i , M . , S h i m i z u , H . , I t o , H . , N a k a g a w a , K . , A m b i r u , S . , N a k a j i m a , N . , E d w a r d s , M . J . , a n d L e n t s c h , A B . ( 2 0 0 0 ) . O b s t r u c t i v e j a u n d i c e i m p a i r s h e p a t i c s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l f u n c t i o n a n d r e n d e r s l i v e r s u s c e p t i b l e t o h e p a t i c i s c h e m i a / r e p e r f u s i o n . J . H e p a t o l . 3 3 , 5 9 - 6 7 . Z h a n g , M . , a n d T r a c e y , K . J . ( 1 9 9 8 ) . T u m o r n e c r o s i s f a c t o r . I n T h e C y t o k i n e H a n d b o o k ( A . T h o m s o n , E d ) , 3 r d e d . , p p . 5 1 7 - 5 4 8 . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . Z h a n g , M . , a n d T r a c e y , K . J . ( 1 9 9 9 ) . E n d o t o x i n a n d c a n c e r . I n E n d o t o x i n i n H e a l t h a n d D i s e a s e . ( H . B r a d e , S . M . O p a l , S . N . V o g e l , a n d D C M o r r i s o n D C , E d s . ) , p p . 9 1 5 - 9 2 8 . M a r c e l - D e k k e r , N e w Y o r k . Z h a n g , P . , X i e , M . , Z a g o r s k i , J . , a n d S p i t z e r , J . A . ( 1 9 9 5 ) . A t t e n u a t i o n o f h e p a t i c n e u t r o p h i l s e q u e s t r a t i o n b y a n t i - C I N C a n t i b o d y i n e n d o t o x i c r a t s . S h o c k 4 , 2 6 2 - 2 6 8 . Z i m m e r m a n , B . J . , P a u l s o n , J . C . , A r r h e n i u s , T . S . , G a e t a , F . C . A . a n d G r a n g e r O N . ( 1 9 9 4 ) . T h r o m b i n r e c e p t o r p e p t i d e - m e d i a t e d l e u k o c y t e r o l l i n g i n r a t m e s e n t e r i c v e n u l e s : R o l e s o f P - s e l e c t i n a n d s i a l y l L e w i s X . A m . J . P h y s i o l . 2 6 7 , H 1 0 4 9 - H 1 0 5 3 . 3 5 3