I : “ I I - 5 g A i . f . w l f n i . C . L * . . . , . A A A . A o A Z . A . . . . A . I . . h . u H ? . 3 ) 9 A 9 . . H . ” . . r fi a . i . i fi 4 u $ m r t x x w w 7 h f m M . . A 3 1 . . V » . A . . . a : f i f } : 4 T ' W " ? ' V : “ ' v a n — ‘ g u z . ‘ W T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d E x p l o r i n g t h e U n d e r l y i n g C h e m i c a l B a s i s f o r C o l o r V i s i o n : D e s i g n i n g a P r o t e i n M i m i c o f R h o d o p s i n p r e s e n t e d b y R a c h a e l M . C r i s t h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e P h . D . d e g r e e i n C h e m i s t r y M a j o r P r o f e E E E r ’ s S i g n a t u r e M a y 1 4 , 2 0 0 4 D a t e M S U i s a n A f fi r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n . L c U h n I i i B g v R a e n r A s R S i Y t y t M l a t e P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T o A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 6 / 0 1 c : / C I R C / D a t e O u o . p 8 5 - p . 1 5 E X P L O R I N G T H E U N D E R L Y I N G C H E M I C A L B A S I S F O R C O L O R V I S I O N : D E S I G N I N G A P R O T E I N M I M I C O F R H O D O P S I N V o l u m e I B y R a c h a e l M . C r i s t A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y 2 0 0 4 A B S T R A C T E X P L O R I N G T H E U N D E R L Y I N G C H E M I C A L B A S I S F O R C O L O R V I S I O N : D E S I G N I N G A P R O T E I N M I M I C O F R H O D O P S I N B y R a c h a e l M . C r i s t T h e m e c h a n i s m b y w h i c h w e s e e c o l o r s h a s b e e n l o n g s t u d i e d , b u t s t i l l n o t f u l l y u n d e r s t o o d . T h e r e s e a r c h p e r f o r m e d i n o u r g r o u p d u r i n g t h e p a s t f e w y e a r s , a n d p r e s e n t e d h e r e , h a s b e e n d i r e c t e d t o u n d e r s t a n d t h e u n d e r l y i n g c h e m i c a l r e a s o n s t h a t e n a b l e c o l o r v i s i o n . I n b r i e f , t h e r e a r e f o u r p r o t e i n s i n t h e e y e w h i c h a l l o w u s t o s e e , r o d r h o d o p s i n a n d t h r e e c o n e r h o d o p s i n s , r e d , b l u e , a n d g r e e n . E a c h o f t h e f o u r p r o t e i n s b i n d t h e s a m e c o m p o u n d , l l - c i s - r e t i n a l , a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e w i t h a n a c t i v e s i t e l y s i n e r e s i d u e . T h i s c h r o m o p h o r e i s t h e c o m p o u n d r e s p o n s i b l e f o r v i s i o n . l l - c i s - R e t i n a l a b s o r b s a t 3 8 0 n m , a n d a s t h e S c h i f f b a s e w i t h n - b u t y l a m i n e , a b s o r b s a t 3 6 5 n m . T h e k e y t o c o l o r v i s i o n i s t h a t w h e n t h i s S c h i f f b a s e i s p r o t o n a t e d , i t r e d s h i f t s 7 5 n m , t o 4 4 0 n m . T h i s i s t h e m a n n e r i n w h i c h t h e c h r o m o p h o r e , l l - c i s - r e t i n a l , b i n d s t o e a c h o f t h e f o u r o p s i n p r o t e i n s . T h i s p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e h a s a d i f f e r e n t m a x i m a l a b s o r b a n c e i n e a c h o f t h e f o u r p r o t e i n s r a n g i n g f r o m ~ 4 O O n m t o ~ 6 O O n m ( s p e c i e s d e p e n d e n t ) . I t i s t h e u n i q u e i n t e r a c t i o n s o f t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e o f 1 1 - c i s - r e t i n a l w i t h e a c h o f t h e f o u r p r o t e i n s t h a t r e s u l t i n t h e o p s i n s h i f t a n d u l t i m a t e l y a l l o w s u s t o s e e t h e e n t i r e v i s i b l e s p e c t r u m f r o m a p p r o x i m a t e l y 4 0 0 n m t o 7 0 0 n m . D e t e r m i n i n g t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h c o l o r v i s i o n i s m e d i a t e d , i . e . , t h e p r o t e i n / s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n s r e s p o n s i b l e f o r t h e d i f f e r e n c e i n r e t i n a l a b s o r b a n c e b e t w e e n t h e f o u r o p s i n p i g m e n t s , i s w h a t I h a v e b e g u n t o a d d r e s s a n d p r e s e n t h e r e w i t h i n t h e t e x t o f i t s t h e s i s . D ' m e m b r a n e - h i c . m m a t e m i o i H u t h a : m m l o a s < i r s i . a l a n C } i n i s h a d d i t z o n . 3 d e t l ' a l i i ‘ e s tl p r o t e i n s . a n d “ M 1 1 6 3 g l h 1 t h i s t h e s i s . D u e t o t h e d i f fi c u l t i e s i n e x p r e s s i n g , h a n d l i n g , a n d s t u d y i n g m a m m a l i a n , m e m b r a n e - b o u n d p r o t e i n s , s u c h a s r h o d o p s i n , I h a v e s o u g h t o u t t o e n g i n e e r a p r o t e i n m i m i c , i . e . , a p r o t e i n t h a t w i l l b i n d r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e , y e t h a s i t s t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e s o l v e d , a n d i s m u c h e a s i e r t o m a n i p u l a t e a n d m o d i f y . M u t a g e n e s i s o f H u m a n C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n 1 1 ( C R A B P I I ) h a s a f f o r d e d a p r o t e i n t h a t w i l l i n f a c t b i n d r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e v i a a n e n g i n e e r e d l y s i n e r e s i d u e . I n a d d i t i o n , s y n t h e t i c e f f o r t s h a v e r e s u l t e d i n t h e p r o d u c t i o n o f b o t h r e t i n a l a n d m o d e l d e r i v a t i v e s t h a t m a y b e u s e d w i t h b o t h t h e a f o r e m e n t i o n e d r h o d o p s i n m i m i c s , C R A B P I I p r o t e i n s , a n d t h e n a t i v e m a m m a l i a n r h o d o p s i n p r o t e i n s t o a i d i n u n c o v e r i n g t h e m o d e s o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n . D e d i c a t e d t o m y p a r e n t s f o r t h e i r c o n t i n u o u s s u p p o r t o f a l l m y d r e a m s . i v . u w ' u ' u - I - g - I - s ; I G r e s e a r c h a t p h y s i c a l l y . F o r : d i c t a t e d i n u n c h a r t e d t b o t h m a r i a ; m e n t o r i n g i t h e n h e 1 6 e n c o u n t e r s U l i ' i l l O l . b u C ‘ P e fi e n c e I u C o u n t l e s s c m d fi b l fi d I C D i d - 1 1 5 { E S E a l l t h e H i s . 1 “ S i g h t . B i t e m t h e j m fl l e c m a r L i m e S p e n t A C K N O W L E D G N I E N T S G r e a t a p p r e c i a t i o n g o e s o u t t o a l l o f p e o p l e w h o h e l p e d m e a c c o m p l i s h t h e r e s e a r c h a n d e d u c a t i o n a l g o a l s I h a v e a c h i e v e d t h r o u g h o u t m y c a r e e r , w h e t h e r i t w a s p h y s i c a l l y , e m o t i o n a l l y , o r s p i r i t u a l l y . F o r e m o s t I w o u l d l i k e t o t h a n k B a b a k , w i t h o u t w h o m n o n e o f t h e r e s e a r c h d i c t a t e d i n t h i s m a n u s c r i p t w o u l d h a v e b e e n p o s s i b l e . W e b e g a n a n a d v e n t u r e p r e v i o u s l y u n c h a r t e d t o e i t h e r o f u s , a n d a l t h o u g h t h e r e w e r e m a n y o b s t a c l e s a l o n g t h e w a y , w e h a v e b o t h m a n a g e d t o l e a r n a n d g r o w t h r o u g h t h i s e x p e r i e n c e . I a m v e r y a p p r e c i a t i v e f o r t h e m e n t o r i n g h e h a s p r o v i d e d m e o v e r t h e l a s t s i x y e a r s , b u t m o r e g r a t e f u l f o r t h e t i m e s w h e n h e l e t m e m a k e m y o w n d e c i s i o n s a n d m i s t a k e s , a n d w o r k t h r o u g h t h e d i l e m m a s e n c o u n t e r e d b y w a y o f m y o w n p e r s i s t e n c e a n d d e d i c a t i o n . N o t o n l y h a s h e b e e n a g r e a t m e n t o r , b u t a l s o a n e x c e p t i o n a l f r i e n d . T h i s f r i e n d s h i p h a s h e l p e d t o m a k e m y t i m e a n d e x p e r i e n c e a t M S U e x t r e m e l y m e m o r a b l e . I w o u l d a l s o l i k e t o e x t e n d m y g r a t i t u d e t o a l l t h e m e m b e r s o f t h e l a b f o r c o u n t l e s s d a y s a n d n i g h t s o f e n t e r t a i n m e n t a n d n e w l y f o u n d f r i e n d s h i p s . I a m e s p e c i a l l y i n d e b t e d t o s e v e r a l c o l l e a g u e s w h o p u t f o r t h t r e m e n d o u s e f f o r t s , a i d i n g i n v a r i o u s a s p e c t s o f t h i s r e s e a r c h . C h r y s o u l a V a s i l e i o u , w h o n o t o n l y s u p p l i e d t h e M A L D I - T O F d a t a f o r a l l t h e H i s - t a g g e d C R A B P I I p r o t e i n s , b u t h a s a l s o b e e n a c o n s t a n t s o u r c e o f w i s d o m a n d i n s i g h t . B o t h t h e p r o g r e s s a n d l e v e l o f u n d e r s t a n d i n g f o r t h i s r e s e a r c h h a v e b e n e fi t e d f r o m t h e i n t e l l e c t u a l f o r e s i g h t o f C h r y s o u l a . C o u r t n e y O l m s t e d p e r f o r m e d a l l o f t h e m o l e c u l a r m o d e l i n g a n d s u p p l i e d a l l o f t h e p i c t u r e s p r e s e n t e d i n t h i s m a n u s c r i p t . H e r t i m e s p e n t o n p r o t e i n m i n i m i z a t i o n s h a s p r o v i d e d i n v a l u a b l e i n f o r m a t i o n i n h e l p i n g t o a s a o t h K t i h l y v n n a e h p h e a l t p i a a l l o f a l l e p n S e a e i s b i l s e o m f l o f f o b u t 1 r t a h t n K c h t h e fi a h l a n t s o f e s e S i n c m e . r P r o f e u d e m s E O Y t h e ” a C E e c e s s r l r , e t . l m n n a l y z e t h e r e h o r n d E l E 0 S f t a H g i D S O l r k i l l K s I C Q U p m e m a : ” - L ' 7 B i o c h e m i s t r t T h e : [ W e l s h - y ) T m a s s S P e C t r - d . ‘ a n a l y z e t h e r e s u l t s o f t h e r e t i n a l b i n d i n g a s s a y s . M o n t s e r r a t R a b a g o - S m i t h p e r f o r m e d t h e s y n t h e s i s o f 1 1 - c i s — r e t i n a l f o r b i n d i n g a n a l y s i s w i t h t h e C R A B P I I p r o t e i n s , a n d w a s a l s o a v a i l a b l e f o r h e l p f u l d i s c u s s i o n s . D r . P u l g a m V e e r a R e d d y p e r f o r m e d t h e s y n t h e s i s o f o n e o f t h e m o d e l b u t a d i e n e c o m p o u n d s , ( E , E ) - 2 - e t h o x y c a r b o n y l - 1 , 4 - [ 1 3 C 1 2 - d i p h e n y l b u t a d i e n e , a n d 1 5 - 3 H - r e t i n a l . D r . M e e n a k s i R a m a r a t h n a m p r o v i d e d v a l u a b l e h e l p i n t h e fi n a l s t e p s o f t h e s y n t h e s i s o f 1 5 - 1 3 C - t r a n s - r e t i n a l . U n d e r g r a d u a t e s t u d e n t s K a t i e K a h l a n d S a r a h G o i n s o f f e r e d e x t r a o r d i n a r y e f f o r t s a n d e n t h u s i a s m b o t h i n l e a r n i n g a l l a s p e c t s o f t h e p r o j e c t h e l p i n g o u t w h e r e v e r p o s s i b l e . W i t h o u t t h e c o l l a b o r a t i v e e f f o r t s o f a l l t h e s e i n d i v i d u a l s , t h e p r o g r e s s o f t h i s r e s e a r c h w o u l d h a v e b e e n s e v e r e l y h a m p e r e d . S i n c e r e t h a n k s a l s o g o e s o u t t o o u r c o l l a b o r a t o r s o n t h e p r o t e i n c r y s t a l l o g r a p h y e f f o r t s , P r o f e s s o r J a m e s G e i g e r ( D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) a n d s t u d e n t s E r i k a M a t h e s a n d S o h e i l a V a e z e s l a m i . I a l s o w i s h t o t h a n k P r o f e s s o r H o n g g a o Y a n ( D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) f o r t h e g e n e r o u s g i f t o f t h e C R A B P I I c l o n e . A s p e c i a l g r a t i t u d e i s e x t e n d e d t o P r o f e s s o r J o h n F r o s t a n d D r . K a r e n F r o s t . T h e y i n v i t e d m e i n t o t h e i r l a b , t a u g h t m e t h e b a s i c m o l e c u l a r b i o l o g y s k i l l s n e c e s s a r y t o s t a r t t h i s p r o j e c t , a n d o f f e r e d m e f u l l a c c e s s t o b o t h t h e i r l a b o r a t o r y e q u i p m e n t a n d t h e i r v a s t b i o l o g y k n o w l e d g e b a s e . T h e m a s s s p e c t r o m e t r y f a c i l i t y ( D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) p r o v i d e d b o t h t h e i n s t r u m e n t a t i o n a n d a h e l p f u l s t a f f f o r a c q u i r i n g a n d a l l m a s s s p e c t r a l d a t a . T h e g e n o m i c s f a c i l i t y ( M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) p r o v i d e d a l l D N A s e q u e n c i n g a n a l y s i s a n d t h e M a c r o m o l e c u l a r S t r u c t u r e F a c i l i t y ( D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) p r o v i d e d a l l t h e p r i m e r s . I a l s o w i s h t o t h a n k v i t h e X ( G h l a b t i c n a ' l i l l l ) . “ W a y s P r o v I l T l U > t h e i r p o m e r t . - t h e i r l o v e a n ‘ s u p p o r t e d m e a n d w o u l d g , l m e l l . P a c o h O U r S o f f u n i m p o r t a n t i n m e m o r a b l c b 3 1 “ 3 . “ S a t c z r s h o w P T O U d t l 5 1 1 a n [ O m . O U I o f t h e i r ‘ k i l C h e n “ I t s I W Q U 1 1 ] } l i f e 2 T 0 “ t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h f o r f u n d i n g t h e r e s e a r c h p r e s e n t e d w i t h i n t h i s m a n u s c r i p t ( G M 6 7 3 1 1 ) . I m u s t a l s o t h a n k a l l o f t h e f r i e n d s a n d f a m i l y w h o h a v e p r o v i d e d a c o n s t a n t s t r e a m o f s u p p o r t t h r o u g h o u t m y a c a d e m i c c a r e e r , w i t h o u t w h i c h I m i g h t n o t h a v e m a d e i t a s f a r a s I h a v e . M y M o m a n d D a d h a v e a l w a y s b e e n t h e r e f o r m e , d o i n g e v e r y t h i n g i n t h e i r p o w e r t o b e s u r e I r e c e i v e d e v e r y t h i n g I e v e r w a n t e d o r n e e d e d . I o w e s o m u c h t o t h e i r l o v e a n d d e d i c a t i o n t o m e a n d m y d r e a m s . M y s i s t e r s R o b b i e a n d R a n d a h a v e a l s o s u p p o r t e d m e i n e v e r y t h i n g I s e t o u t t o d o . T h e y w o u l d n o t s t o p a t a n y t h i n g t o h e l p m e , a n d w o u l d g o s o f a r a s t o g i v e m e t h e s h i r t o f f t h e i r b a c k o r t h e s h o e s o f f t h e i r f e e t . J a n e l l , P a c o , a n d A n g i e h a v e g i v e n m e a l i g h t e n e d s p i r i t , a y o u t h f u l a t t i t u d e , c o u n t l e s s h o u r s o f f u n a n d e n t e r t a i n m e n t , a n d h a v e h e l p e d m e t o k e e p s i g h t o n w h a t i s r e a l l y i m p o r t a n t i n l i f e . M y G r a n d m a G . h a s g i v e n m e e v e r y t h i n g I e v e r a s k e d f o r , m o s t m e m o r a b l e b e i n g a b a r r e l o f l a u g h s f r o m h e r i n c r e d i b l y h i l a r i o u s , b r u t a l l y h o n e s t , a n d a l w a y s s a r c a s t i c s e n s e o f h u m o r . G r a n d m a a n d G r a n d p a C . h a v e n e v e r b e e n s h y a b o u t h o w p r o u d t h e y a r e o f m y h a r d w o r k a n d a c c o m p l i s h m e n t s , a n d h a v e a l w a y s o f f e r e d s u p p o r t t o m e i n a n y w a y I n e e d e d . M y A u n t B e c k y a n d U n c l e G r e g h a v e a l w a y s g o n e o u t o f t h e i r w a y t o s u p p o r t m e a s w e l l , a n d a m o n g o t h e r t h i n g s , a l w a y s m a d e s u r e m y k i t c h e n w a s w e l l - s t o c k e d . I w o u l d a l s o l i k e t o r e m e m b e r t h e g r a n d m o t h e r s I w a s f o r t u n a t e e n o u g h t o h a v e i n m y l i f e g r o w i n g u p , b u t h a v e s a d l y l o s t i n t h e p a s t f e w y e a r s . M y G r e a t - G r a n d m a B . a l w a y s p r o v i d e d a s u r p l u s o f l o v e a n d h o u r s o f a m u s e m e n t w i t h t h e o u t r a g e o u s s t o r i e s o f h e r y o u t h . M y G r e a t - G r a n d m a C . w a s s o f u l l o f l i f e a n d e n e r g y , a n d a l w a y s h a d t h e t i m e t o s h a r e c o n v e r s a t i o n o v e r a d r i n k o r t w o . M y G r e a t - G r a n d m a W . n e v e r h a d a s h o r t a g e v i i - J . . u ‘ ‘ , o f c o m p l i m i s s e d d e F i t e i e n t h i n g , w e h a t e c h a s k e p t r . m y d i f f i c i l o v e a n d : t h a n l ' d u l n l i f t p r e s e t C c o f c o m p l i m e n t s a n d a d m i r a t i o n f o r t h e d e s i r e I h a d t o p u r s u e m y g o a l s . Y o u a r e a l l m i s s e d d e a r l y a n d w i l l n e v e r b e f o r g o t t e n . F i n a l l y , I w o u l d l i k e t o e x p r e s s m y h e a r t f e l t t h a n k s a n d g r a t i t u d e t o C o n n i e f o r e v e r y t h i n g s h e h a s d o n e o v e r t h e c o u r s e o f t h e l a s t s i x y e a r s . W e h a v e l a u g h e d t o g e t h e r , w e h a v e c r i e d t o g e t h e r , a n d w e h a v e s h a r e d e v e r y e m o t i o n b e t w e e n . H e r s e n s e o f h u m o r h a s k e p t m y s p i r i t s h i g h , h e r p a t i e n c e a n d u n d e r s t a n d i n g h a v e h e l p e d m e o v e r c o m e a l l o f m y d i f fi c u l t i e s , h e r s e n s e o f a d v e n t u r e h a s k e p t m e y o u n g a n d l i v e l y , a n d h e r d e v o t e d l o v e a n d f r i e n d s h i p h a s m a d e m e c o m p l e t e . A l t h o u g h w o r d s c a n n o t b e g i n t o e x p r e s s t h e t h a n k f u l n e s s a n d a p p r e c i a t i o n I h a v e f o r h e r s e n s e o f h u m o r , h e r f r i e n d s h i p , h e r l o v e , a n d h e r p r e s e n c e , t h a n k y o u . I l o v e y o u a l l . v i i i T A B L E C C l l l l ’ f E 0 7 C , " r " " . o : r ; ~ r — ~ : = 7 ‘ - r . ' r fi A . Z ’ ‘ - s s ' Z f ‘ S ‘ m c r I i s t o f l a l ~ l i s t o i f i g L L i s r o i S c l ‘ l i e } t o 5 y , i C l l l l ’ l E l . T h e P r i A . l \ ‘ R T E " C . C C D . I i i 5 R E . : . I I . E n g i n t 7 ' A . H i B - S P ' P R O I ‘ E E W 1 ’ P u . 2 7 ‘ # 7 1 . 4 ” _ _ _ ' — ' T A B L E O F C O N T E N T S L i s t o f T a b l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i L i s t o f F i g u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i i L i s t o f S c h e m e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v i i K e y t o S y m b o l s a n d A b b r e v i a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v i i i C H A P T E R 1 I . T h e P r i n c i p l e s o f V i s i o n a n d t h e N e e d t o E n g i n e e r a R h o d o p s i n M i m i c A . I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 B . T H E V I S U A L P R O C E S S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 C . C O L O R V I S I O N : M O D E S O F W A V E L E N G T H R E G U L A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 D . T H E N E E D F O R A S U R R O G A T E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 E . R E F E R E N C E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 C H A P T E R 2 1 1 . E n g i n e e r i n g a R h o d o p s i n P r o t e i n S u r r o g a t e A . H U M A N C E L L U L A R R E T I N O I C A C I D B I N D I N G P R O T E I N I I ( C R A B P H ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 B . S P E C T R O S C O P I C T E C H N I Q U E S U T I L I Z E D F O R C H A R A C T E R I Z A T I O N O F P R O T E I N S A N D P R O T E I N / S U B S T R A T E C O M P L E X E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8 C . W I L D - T Y P E C R A B P H B I N D I N G P R O P E R T I E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 D . I N T R O D U C T I O N O F T H E P E R T I N E N T L Y S I N E R E S I D U E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 5 E . H Y D R O P H O B I C T U N I N G O F T H E B I N D I N G C A V I T Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1 F . P L A C E M E N T O F T H E C O U N T E R A N I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1 G . A S U C C E S S F U L R H O D O P S I N P R O T E I N M I M I C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 6 H . P R O B I N G A L T E R N A T E P O S I T I O N S F O R T H E L Y S I N E R E S I D U E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 1 I . I N V E S T I G A T I N G l l - C I S - R E T I N A L A S T H E S U B S T R A T E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 7 J . M O N I T O R I N G T H E S C H I F F B A S E V I A l 3 C - ‘ S N N M R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 2 K . S U M M A R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 6 L . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 8 M . R E F E R E N C E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 7 C H A P T E R 3 I I I . P r o b i n g a P o s s i b l e M o d e o f W a v e l e n g t h R e g u l a t i o n : T w i s t i n g o f t h e C h r o m o p h o r e ’ s S i n g l e B o n d s P O P ” ? S Y N T H E S I S O F M O D E L D E R I V A T I V E S F O R S O L I D S T A T E N M R O P T I M I Z A T I O N 1 9 7 P R O P O S E D S Y N T H E S I S O F 1 1 , 1 4 - [ 1 3 C ] 2 - 1 l - C I s - R E T I N A L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 4 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 6 R E F E R E N C E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 0 i x A P P m l I I N r ‘ L E a t - N ‘ u T ' D t h A 1 A 0 V n S S M S m D a t a C o l l t W I L D T Y R 1 3 : R l S Z K z : A P P E N D I X 2 1 3 S U M M A R Y T A B L E O F P R O T E I N P R O P E R T I E S F O R A L L C R A B P I I M U T A N T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 S U M M A R Y T A B L E O F R E T I N A L B I N D I N G A S S A Y R E S U L T S F O R A L L C R A B P I I M U T A N T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 7 S U M M A R Y T A B L E O F 1 1 - C I s - R E T I N A L B I N D I N G A S S A Y S F O R S E L E C T E D C R A B P I I M U T A N T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 9 D a t a C o l l e c t e d f o r : W I L D T Y P E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 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1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 3 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 0 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l 1 1 L : : T 5 4 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 7 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l l 1 L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 4 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 Q . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 1 Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 8 R 1 3 2 L : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 l L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 5 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F z l e 1 1 L : : L 1 2 1 E : : F 1 5 A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 3 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 0 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 Q : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 1 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l l 1 L : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 8 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 5 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l l 1 L : : L 1 2 1 N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 3 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 D : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 0 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 N : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 7 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V : : T 6 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 4 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V : : T 6 1 F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 2 Y 1 3 4 K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 0 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 9 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 6 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 4 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 K : : R 1 1 1 L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 1 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 K z l e 1 1 L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 8 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 K : : R l 1 1 L : : T 5 4 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 6 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L z z R 1 1 1 L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 2 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L z z L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 9 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 6 F 1 5 W . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 3 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : F 1 5 W . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7 0 L 1 9 W . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7 7 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : L 1 9 W . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8 5 L I S T o r T l T a b l e " - 1 . T a b l e 1 1 2 . T a b l e 1 1 - 3 . l T a b l e 1 1 4 . T a b l e 1 1 - 5 . L I S T O F T A B L E S T a b l e 1 1 - ] . S u m m a r y o f a t t e m p t s f o r r e m o v a l o f r e t i n a l f r o m p r o t e i n s o l u t i o n s . . . . . . . . . . 7 0 T a b l e 1 1 - 2 . R e s u l t s o f b i n d i n g a s s a y s w i t h v a r i o u s C R A B P I I m u t a n t s p r o b i n g t h e e f f e c t o f t h e c o u n t e r a n i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2 T a b l e 1 1 - 3 . B i n d i n g a s s a y r e s u l t s o f p r o t e i n s w i t h o u t a c o u n t e r a n i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 3 T a b l e 1 1 - 4 . R e s u l t s o f b i n d i n g a s s a y s p r o b i n g t h e e f fi c a c y o f l y s i n e a t p o s i t i o n l 3 4 . . . 1 2 3 T a b l e 1 1 - 5 . R e s u l t s o f b i n d i n g a s s a y s w i t h l l - c i s - R e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 8 x i I S T L O F T l N o t e : F i g u r e l - l . fi g u r e l - 2 . fi g u r e I - 3 . fi g u r e [ - 4 . F l g u n : l - S . F ' g u r e 1 . 6 . F l g u r e i - 7 . F l g u r e 1 . 3 , F l g u r e 1 . 9 . g 1 " ? [ . 1 0 P l g u m 1 1 . 1 L I S T O F F I G U R E S N o t e : F i g u r e [ - 1 . F i g u r e [ - 2 . F i g u r e [ - 3 . F i g u r e 1 - 4 . F i g u r e [ - 5 . F i g u r e [ - 6 . F i g u r e I - 7 . F i g u r e I - 8 . F i g u r e 1 - 9 . F i g u r e 1 . 1 0 . F i g u r e 1 1 - ] . S e l e c t fi g u r e s i n t h i s m a n u s c r i p t a r e p r e s e n t e d i n c o l o r . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f a v e r t e b r a t e r o d c e l l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 S t e r e o v i e w o f r h o d o p s i n w i t h l l - c i s - r e t i n a l b o u n d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 I n t e r m e d i a t e s i n t h e i s o m e r i z a t i o n o f 1 1 - c i s — r e t i n a l t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . . . . . . 7 R e p r e s e n t a t i o n O f t h e m o v e m e n t o f r e t i n a l a n d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n r h o d o p s i n w h e n h i t w i t h a p h o t o n o f l i g h t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 A c t i v a t i o n o f t h e G P C R r h o d o p s i n , t h e G - p r o t e i n t r a n s d u c i n , a n d t h e e n z y m e P D E a s t h e v i s u a l p r o c e s s i s i n i t i a t e d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l l S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e v i s u a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 M a x i m a l a b s o r b a n c e o f l l - c i s - r e t i n a l a n d t h e S c h i f f b a s e o f t h e a l d e h y d e d o n o t d i f f e r m u c h , b u t t h e P S B o f l l - c i s - r e t i n a l h a s a s i g i n i fi c a n t b a t h o c h r o m i c s h i f t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 R e p r e s e n t a t i o n o f t h e v i s i b l e r e g i o n o f t h e e l e c t r o m a g n e t i c s p e c t r u m a n d t h e r h o d o p s i n a b s o r b a n c e p a t t e r n s t h a t r e s u l t i n c o l o r v i s i o n . . . . . . . . . . . . . . . l 4 T w i s t i n g o f t h e p l a n e s a b o u t t h e d o u b l e b o n d s o f 1 1 - c i s - r e t i n a l m a y b e a p o s s i b l e m o d e o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 D i s t a n c e o f t h e c o u n t e r a n i o n a n d p l a c e m e n t o f o t h e r c h a r g e s o r d i p o l e s a l o n g t h e b a c k b o n e o f t h e p o l y e n e m a y b e a p o s s i b l e m o d e o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 S t e r e o v i e w o f C R A B P I I w i t h b o u n d r e t i n o i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 x i i F i g u r e “ - 2 . F i g u r e " - 3 . F i g u r e [ 1 4 . F i g u r e “ - 5 . F i g u r e 1 1 - 6 . F i g u r e 1 1 - 7 . F i g u r e " - 8 . F l g u n : 1 1 . 9 . I F i g u r e 1 1 . “ F i g u r e I I - l j fi g u r e I L L fi g u r e [ 1 . 1 F i g u r e " ‘ 1 F i g u r e 1 1 - 2 . F i g u r e 1 1 - 3 . F i g u r e 1 1 - 4 . F i g u r e 1 1 - 5 . F i g u r e 1 1 - 6 . F i g u r e I I - 7 . F i g u r e 1 1 - 8 . F i g u r e 1 1 . 9 . F i g u r e 1 1 - 1 0 . F i g u r e 1 1 - 1 1 . F i g u r e 1 1 - 1 2 . F i g u r e 1 1 . 1 3 . F i g u r e 1 1 - 1 4 . F i g u r e I I - l S . G e l d e p i c t i o n o f t h e p u r i fi c a t i o n o f H i s - t a g g e d C R A B P I I p r o t e i n s . . . . . . . . 4 2 P i c t u r e o f C R A B P H s h o w i n g t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e N - a n d C - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n t o t h e b i n d i n g c a v i t y e n t r a n c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 D e p i c t i o n o f p E T - B l u e 2 p l a s m i d w i t h C R A B P H g e n e s u b c l o n e d i n . . . . . . 4 4 C D S p e c t r a o f t h e w i l d t y p e H i s - t a g g e d C R A B P I I p r o t e i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2 C R A B P H s h o w i n g t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e s u b s t r a t e w i t h t h e t h r e e T r p r e s i d u e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 7 U V - v i s d i s t i n c t i o n b e t w e e n t h e d i f f e r e n t f o r m s o f r e t i n a l w i t h t h e p r o t e i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 4 U V - V i s t i t r a t i o n s h o w i n g t h e t r a n s i t i o n o f a 4 2 0 n m a b s o r b i n d s p e c i e s a t l o w r e t i n a l e q u i v a l e n t s t o a 3 8 0 n m a b s o r b i n g s p e c i e s a t h i g h e r r e t i n a l e q u i v a l e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 5 M A L D I - T O F d i s t i n c t i o n b e t w e e n t h e d i f f e r e n t f o r m s o f r e t i n a l w i t h t h e p r o t e i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 S t e r e o v i e w d e p i c t i n g t h e b i n d i n g c a v i t y f o r w i l d t y p e C R A B P I I . . . . . . . . . . 7 1 F l u o r e s c e n c e a n d U V - v i s d a t a f o r C R A B P H w i l d t y p e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2 C o n v e r s i o n o f C R A B P I I f r o m a r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n t o o n e t h a t w i l l b i n d r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 5 S t e r e o v i e w o f C R A B P I I R 1 3 2 K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 6 D e p i c t i o n o f S t r a t a g e n e ’ s Q u i k C h a n g e S i t e - D i r e c t e d M u t a g e n e s i s p r o c e d u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 7 F l u o r e s c e n c e a n d U V o f r e t i n a l a s b o u n d t o C R A B P H R 1 3 2 K . . . . . . . . . . . . . 7 9 x i i i F F i i g g u u r r e e l l l - l t i [ - 1 7 F i g u r e ' A ‘ F i g u r e 1 F i g u r e 1 F i g u r e . F i g u r e F I g u r e . F l g i l r e F l g u r e F i g u r e F l g u r e F l g u n . » F i g u P e . I - l b l - l i ' F i g u r e 1 1 - 1 6 . F i g u r e 1 1 - 1 7 . F i g u r e 1 1 - 1 8 . F i g u r e 1 1 - 1 9 . F i g u r e 1 1 - 2 0 . F i g u r e I I - 2 1 . F i g u r e I I - 2 2 . F i g u r e 1 1 - 2 3 . F i g u r e 1 1 - 2 4 . F i g u r e I I - 2 5 . F i g u r e I I - 2 6 . F i g u r e 1 1 - 2 7 . F i g u r e 1 1 - 2 8 . F i g u r e 1 1 . 2 9 . F i g u r e 1 1 - 3 0 . H y d r o p h o b i c c o m p a r i s o n o f t h e b i n d i n g c a v i t i e s o f r h o d o p s i n a n d C R A B P I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 0 F l u o r e s c e n c e , U V - v i s , a n d M A L D I - T O F d a t a f o r r e t i n a l b o u n d t o C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 3 U V - v i s s p e c t r a f o r R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F a t p H 7 a n d p H 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 5 O v e r l a y o f c r y s t a l s t r u c t u r e s f o r w i l d t y p e C R A B P I I a n d t h e d o u b l e m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 6 S t e r e o v i e w o f C R A B P H R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 8 F l u o r e s c e n c e , U V - v i s , a n d M A L D I - T O F d a t a f o r C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 0 S t e r e o v i e w o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1 S t e r e o v i e w O f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : T 5 4 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 5 U V - v i s a n d C D d a t a f o r C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 l L : : T 5 4 E . . . . . . . . . 9 6 S t e r e o v i e w o f C R A B P H R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F z z R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 8 G e l a n a l y s i s o f s e v e r a l C R A B P I I H i s - t a g g e d p r o t e i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 9 F l u o r e s c e n c e , U V - v i s , a n d M A L D I - T O F d a t a f o r C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l l 1 L : : L 1 2 1 D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 3 U V - v i s o v e r l a y o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 D a n d t h e p e n t a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F z l e l l L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 5 F l u o r e s c e n c e , U V - v i s , a n d M A L D I - T O F d a t a f o r C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F 2 2 R 1 1 l L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 7 C D s p e c t r a c o m p a r i n g C R A B P H i n P B S s o l u t i o n a n d P B S s o l u t i o n w i t h 1 0 m M C H A P S O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 8 x i v H a u l fi g m l fi w n l fi w m l fi w n l H a m ] H a m ] “ A m i “ a m t H E M ] . F l S u r e ] . “ a m t , F i g u l ‘ e ] S . M E M i y F i g u r e 1 1 . 3 1 . F i g u r e 1 1 - 3 2 . F i g u r e 1 1 - 3 3 . F i g u r e 1 1 - 3 4 . F i g u r e I I - 3 5 . F i g u r e I I - 3 6 . F i g u r e 1 1 - 3 7 . F i g u r e 1 1 - 3 8 . F i g u r e 1 1 - 3 9 . F i g u r e 1 1 1 - 1 . F i g u r e I I I - 2 . F i g u r e I I I - 3 . F i g u r e 1 1 1 - 4 . U V - v i s a n d M A L D I - T O F d a t a f o r Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 U V - v i s a n d M A L D I - T O F d a t a f o r R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 Q : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 4 A c i d / b a s e t i t r a t i o n o f t h e p e n t a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 6 p K a d e t e r m i n a t i o n O f t h e p e n t a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 7 V i e w o f t h e V a n d e r W a a l s c o n t a c t s o n t h e s u r f a c e o f C R A B P I I . . . . . . . . . 1 1 9 U V - v i s o v e r l a y s O f R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F 2 2 R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V : : T 6 1 E , a n d R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V : : T 6 1 F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 0 S t e r e o v i e w o f C R A B P I I Y 1 3 4 K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 1 U V - v i s f o r l l - c i s - r e t i n a l a s b o u n d t o Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F : l e 1 1 L : : T 5 4 E . . . 1 3 0 S t e r e o v i e w O f C R A B P I I Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 F 2 2 R 1 1 l L : : T 5 4 E w i t h l l - c i s - r e t i n a l b o u n d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 1 T w i s t i n g o f t h e p l a n e s a b o u t t h e d o u b l e b o n d s o f 1 1 - c i s - r e t i n a l m a y b e a p o s s i b l e m o d e o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 7 T h e c o m p o u n d p r o p o s e d t o p r o b e t h e d e g r e e o f t w i s t i n g i n l l - c i s - r e t i n a l , 1 1 , 1 4 - [ 1 3 C 2 ] - 1 l - c i s - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 8 S i m p l i fi e d p u l s e s e q u e n c e o f M a g i c A n g l e S p i n n i n g S p e c t r o s c o p y . . . . . . 1 9 8 M o d e l c o m p o u n d s ( E , E ) - 2 - e t h o x y c a r b o n y l - l , 4 - [ ” C h - d i p h e n y l b u t a d i e n e a n d ( E , E ) - 2 - e t h o x y c a r b o n y l - 1 , 4 - [ l 3 C ] z - d i p h e n y l b u t a d i e n e a n d X V M a c r O M O d e l m i n i m i z a t i o n s f o r e s t a b l i s h i n g t h e s o l i d s t a t e N M R c o n d i t i o n s n e c e s s a r y f o r d i h e d r a l a n g l e m e a s u r e m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 0 x v i L I S T 0 ? 5 1 f l S c h e m e l - l S c h e m e l l S c h e m e 1 1 . L I S T O F S C H E M E S S c h e m e I I - l . S c h e m e 1 1 1 - 1 . S c h e m e I I I - 2 . S c h e m e 1 1 1 - 3 . S y n t h e t i c r o u t e t o 1 5 - [ 1 3 C ] - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 5 S y n t h e t i c r o u t e t o ( Z , E ) - 2 - e t h o x y c a r b o n y l - l , 4 - [ 1 3 C ] 2 - d i p h e n y l b u t a d i e n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 1 S y n t h e t i c r o u t e t o ( E , E ) - 2 — e t h o x y c a r b o n y l - 1 , 4 - [ 1 3 C ] 2 - d i p h e n y l b u t a d i e n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 2 P r o p o s e d s y n t h e t i c r o u t e t o l 1 , 1 4 - [ I 3 C ] 2 - 1 l - c i s - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 5 x v i i K E Y I O 5 l e t A b s . A A m i n o A c i A l a . A A r g . R A s n . . \ ' A S p . D C y s . C G l n . Q G l u . E K E Y T O S Y M B O L S A N D A B B R E V I A T I O N S A 8 A r m a x A b s , A A m i n o A c i d s : A l a , A A r g , R A s n , N A s p , D C y s , C G l n , Q G l u , E H i s , H L e u , L L y s , K P h e , F P r o , P T h r , T T r p , W T y r , Y V a l , V A n g s t r o m E x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t M a x i m a l w a v e l e n g t h A b s o r b a n c e A l a n i n e A r g i n i n e A s p a r a g i n e A s p a r t i c a c i d C y s t e i n e G l u t a m i n e G l u t a m i c a c i d H i s t i d i n e L e u c i n e L y s i n e P h e n y l a l a n i n e P r o l i n e T h r e o n i n e T r y p t o p h a n T y r o s i n e V a l i n e x v i i i l L P A C A m p B C A B S A b e C D c f u c G h l P C l m C R A B P I I D A B C O D B L D C C D E A E d e n D N A G D P 0 M P G I ? G P C R H i t } ; [ P I G A m p B C A B S A b p C D c f u c G M P C l m C R A B P I I D A B C O D B U D C C D E A E d e n D N A G D P G M P G T P G P C R I U P A C A m p i c i l l i n B i c i n c h o n i n i c a c i d B o v i n e S e r u m A l b u m i n B a s e p a i r s C i r c u l a r D i c h r o i s m C o l o n y f o r m i n g u n i t s C y c l i c - G u a n i d i n e M o n o p h o s p h a t e C h l o r a m p h e n i c o l H u m a n C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n 1 1 l , 4 - D i a z a b i c y c l o [ 2 . 2 . 2 ] o c t a n e 1 , 8 - D i a z a b i c y c l o [ 5 . 4 . 0 ] u n d e c - 7 - e n e D i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e D i e t h y l a m i n o e t h y l - r e s i n D e n a t u r e d D e o x y r i b o n u c l e i c a c i d G u a n i d i n e D i p h o s p h a t e G u a n i d i n e M o n o p h o s p h a t e G u a n i d i n e T r i p h o s p h a t e G — P r o t e i n C o u p l e d R e c e p t o r H o m e r - W a d s w o r t h - E m m o n s I s o p r o p y l t h i o g a l a c t o s i d e I n t e r n a t i o n a l U n i o n o f P u r e a n d A p p l i e d C h e m i s t s x i x J h u ‘ i u _ q . , { . “ ‘ . l - \ _ : . m 3 u 1 . 3 i n m e H m K b L B b l A L D l - T C n a t n m n \ l N M R P B S P C R P D E P S B B i R t S B S D S ~ P A G } ; I B D P S T I P S M m m a m P I : 3 9 ¢ f o l i o ; K b K i l o - B a s e p a i r s L B L u r i a b e r t a n i M A L D I — T O F M a t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n — T i m e O f fl i g h t n a t N a t u r e d n m N a n o m e t e r n M N a n o m o l a r N M R N u c l e a r M a g n e t i c R e s o n a n c e P B S P h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e P C R P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n P D E P h o s p h o d i e s t e r a s e P S B P r o t o n a t e d S c h i f f b a s e R A R e t i n o i c a c i d R t R e t i n a l S B S c h i f f b a s e S D S - P A G E S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e — P o l y a c r y l a m i d e G e l E l e c t r o p h o r e s i s T B D P S t e r t - B u t y l d i p h e n y l s i l y l T H P T e t r a h y d r o p y r a n T I P S T r i i s o p r o p y l s i l y l M u t a n t p r o t e i n s a r e d e s i g n a t e d b y t h e o n e l e t t e r a b b r e v i a t i o n f o r t h e w i l d t y p e a m i n o a c i d , f o l l o w e d b y t h e a m i n o a c i d p o s i t i o n n u m b e r , f o l l o w e d b y t h e o n e l e t t e r a b b r e v i a t i o n f o r t h e n e w m u t a n t a m i n o a c i d . X X x ‘ — w _ _ . _ , . , . , _ i ( “ " 1 ‘ . ' m I n A . I n r o d u . \ l e a i ' a i i a l l l l ) 3 0 5 0 ‘ t o f h a s b e h \ \ c o m m a l i e s H o u s e e r . C I I I $ 0 1 1 fi g m e m b m e d i r e c t e l m “ p l o y t o 1 W m : l O n . m o d e } I O r C h a p t e r 1 I . T h e P r i n c i p l e s o f V i s i o n a n d t h e N e e d t o E n g i n e e r a R h o d o p s i n M i m i c A . I n t r o d u c t i o n M e m b r a n e b o u n d p r o t e i n s a r e t h e n e x t f r o n t i e r i n s t r u c t u r a l b i o l o g y . T h r o u g h t h e a v a i l a b i l i t y o f w h o l e g e n o m e s e q u e n c e s i t h a s b e c o m e c l e a r t h a t t h e y c o m p r i s e b e t w e e n 2 0 - 5 0 % o f k n o w n p r o t e i n s . T h e i r i m p o r t a n c e i n p h a r m a c e u t i c a l s c i e n c e a n d b i o m e d i c i n e h a s b e e n w e l l d o c u m e n t e d . T h i s i s e v i d e n t b y t h e s i m p l e f a c t t h a t m o s t p h a r m a c e u t i c a l c o m p a n i e s h a v e g e a r e d d r u g d e v e l o p m e n t t o t a r g e t d i f f e r e n t m e m b r a n e p r o t e i n s . " 2 H o w e v e r , d i f fi c u l t i e s i n c r y s t a l l i z i n g t h e m h a v e l i m i t e d t h e u s e o f X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y i n s o l v i n g t h e i r s t r u c t u r e s . A S a r e s u l t , m o s t o f t h e s t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n g a t h e r e d o n m e m b r a n e b o u n d p r o t e i n s a r e t h r o u g h t h e o r e t i c a l a n a l y s i s c o u p l e d w i t h r e s u l t s o f s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s , a n d l o w r e s o l u t i o n s t r u c t u r a l d a t a . W e a r e v e r y i n t e r e s t e d i n e x p l o r i n g t h e n a t u r e o f p r o t e i n / s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n s a t t h e m o l e c u l a r l e v e l S i n c e t h e s e i n t e r a c t i o n s a r e a t t h e h e a r t o f b i o c h e m i c a l e v e n t s t h a t r e g u l a t e b i o l o g i c a l s y s t e m s . A s a m o d e l f o r s u c h s t u d i e s w e h a v e c h o s e n t h e c a s e o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n i n r h o d o p s i n , i . e . , t h e m e c h a n i s m b y w h i c h w e c a n s e e c o l o r s a s a p o w e r f u l e x a m p l e o f t h e c o n s e q u e n c e s ' o f p r o t e i n / s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n s . W a v e l e n g t h r e g u l a t i o n e x h i b i t e d b y v a r i o u s r h o d o p s i n p i g m e n t s i n t h e e y e i s a r e m a r k a b l e e x a m p l e o f t h e p o w e r o f p r o t e i n - s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n s . H u m a n e y e s c o n t a i n f o u r d i f f e r e n t t y p e s o f r h o d o p s i n ; h o w e v e r , t h e c h r o m o p h o r e b o u n d t o d i f f e r e n t t y p e s o f r h o d o p s i n i s t h e s a m e . I n f a c t , a l l v e r t e b r a t e p i g m e n t s e m p l o y t h e s a m e l l - c i s - r e t i n a l ( 1 - a t c m “ 0 - : S c h i f f 1 3 5 5 t ‘ i S - I ‘ E i l i a l . f o r t h e p e r t . f o I E i t I T . e p x a m ; 6 9 " r o p e r i e s i n t e r a t ‘ i 0 n ~ m e c h a l l S I l ‘ . s t e r e d l e c t : i n v e s t ; g a t i t M i l l 5 u d j . r e t i n a l l a b e l e i c o r . r e t i c e h n h L I E S d e r n o r 31121”. I n . W S e r e 1 1 a t C I l l f T 3 3 5 5 3 3 4 7 1 2 1 3 1 3 f r o m I I e i r a ) c h r o m o p h o r e f o r v i s i o n , b o u n d t o t h e p r o t e i n a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ( P S B ) v i a a l y s i n e r e s i d u e . 3 ‘ 4 T h i s c h r o m o p h o r e , 1 1 - c i s - r e t i n a l , i s t u n e d t o a b s o r b a t v a r i o u s w a v e l e n g t h s a l l o w i n g f o r t h e p e r c e p t i o n o f c o l o r . A b s o r p t i o n m a x i m a a s s o c i a t e d w i t h 5 T h i s i s a r e m a r k a b l e d i f f e r e n t r h o d o p s i n p i g m e n t s r a n g e f r o m ~ 4 0 0 n m t o ~ 6 0 0 n m . e x a m p l e o f p r o t e i n / s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n i n w h i c h d i f f e r e n t p r o t e i n s e l i c i t d i f f e r e n t p r o p e r t i e s f r o m t h e s a m e s u b s t r a t e . A b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f p r o t e i n / s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n s i s c e n t r a l t O r a t i o n a l d r u g d e v e l o p m e n t a n d n e w i n s i g h t s i n t o e n z y m a t i c m e c h a n i s m s . T h i s s y s t e m , i . e . , h o w w e s e e c o l o r s , c a n p r o v i d e a s i m p l e a n d e l e g a n t p l a t f o r m t o s t u d y p r o t e i n / s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n s . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t c o n f o r m a t i o n a l a n d / o r s t e r e o e l e c t r o n i c e f f e c t s c o n t r o l w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n o f r h o d o p s i n , h o w e v e r i n v e s t i g a t i o n s i n t o t h e s e t h e o r i e s h a v e b e e n h a m p e r e d d u e t o t h e d i f fi c u l t i e s a s s o c i a t e d w i t h s t u d y i n g m e m b r a n e b o u n d r h o d o p s i n s . W e p r o p o s e t o s t u d y t h e p o s s i b i l i t y o f r e t i n a l c o n f o r m a t i o n a l d i f f e r e n c e s i n d i f f e r e n t p i g m e n t s b y t h e s y n t h e s i s o f b i s - 1 3 C - l a b e l e d r e t i n a l , w h i c h w i l l b e b o u n d t o v a r i o u s r h o d o p s i n s . T h e u s e o f s o l i d s t a t e N M R t e c h n i q u e s w i l l p r o b e t h e d e g r e e o f s i n g l e b o n d t w i s t i n g w i t h i n t h e p o l y e n e , a n d h e n c e d e m o n s t r a t e t h e p o s s i b i l i t y o f t h i s a s a m o d e o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e s t e r e o e l e c t r o n i c f a c t o r s , w e w i l l p r o b e t h e e f f e c t o f d i f f e r e n t a m i n o a c i d r e s i d u e s a t v a r y i n g l o c a t i o n s w i t h r e s p e c t t o t h e r e t i n a l p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . F o r t h i s , w e p l a n t o u s e p r o t e i n m i m i c s o f r h o d o p s i n t h a t b i n d r e t i n a l i n t h e s a m e P S B m a n n e r , b u t y e t a r e n o t m e m b r a n e b o u n d p r o t e i n s , a n d t h e r e f o r e , d o n o t s u f f e r f r o m t h e i r l i m i t a t i o n s i n s t r u c t u r a l a n a l y s i s . I n e s s e n c e , w e w i l l m o d i f y a w e l l - - : I H J ‘ k , " 1 . ‘ ' I “ ? - u c h a r d i l t ‘ d e n i ' a t i x f o r I n c a s : o p t i m a l c m O d e l C O : i s o l a t i o n ( M " R e t i n o i c , 1 I h I O U g h r h a v e d fi m t ‘ e l ‘ . g ‘ I - ' n e e r e i c j ” M U G f u n ] D H i s a r m a d d s w a r . c o m f n l l \ c h a r a c t e r i z e d p r o t e i n t o b i n d r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e , b u t w i t h t h e a d d e d a d v a n t a g e o f b e i n g s m a l l , s o l u b l e , a n d e a s i l y m a n i p u l a t e d . I n a d d i t i o n , h a v i n g a t h a n d t h e 3 - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n w i l l a l l o w u s t o p r o p o s e r a t i o n a l s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s t o p o s i t i o n d i f f e r e n t f u n c t i o n a l g r o u p s a t p r e c i s e l y t h e d e s i r e d l o c a t i o n s w i t h r e s p e c t t o t h e b o u n d c h r o m o p h o r e t o p r o b e t h e i r r o l e s i n w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n . M y e f f o r t s o n t h i s p r o j e c t i n c l u d e t h e s y n t h e s i s o f 1 , 4 - [ 1 3 C ] 2 - b u t a d i e n e m o d e l d e r i v a t i v e s w h i c h w i l l b e u s e d i n o p t i m i z i n g t h e s o l i d s t a t e N M R t e c h n i q u e s n e c e s s a r y f o r m e a s u r e m e n t o f b i s - l a b e l e d l l - c i s - r e t i n a l b o u n d t o d i f f e r e n t o p s i n p r o t e i n s . P r o v i d e d O p t i m a l c o n d i t i o n s a r e a t t a i n e d f o r d e t e r m i n i n g t h e d i h e d r a l a n g l e d i f f e r e n c e s w i t h t h e s e m o d e l c o m p o u n d s , s y n t h e s i s o f t h e l a b e l e d r e t i n a l w i l l n e e d t o b e c o m p l e t e d , a l o n g w i t h i s o l a t i o n o f t h e d e s i r e d r h o d o p s i n p r o t e i n s . M y p r i m a r y f o c u s h o w e v e r , h a s b e e n o n t h e e n g i n e e r i n g o f H u m a n C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n 1 1 ( C R A B P I I ) t o b i n d r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . T h r o u g h v a r i o u s s p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u e s , c o u p l e d w i t h s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s , w e h a v e d e m o n s t r a t e d t h e f o r m a t i o n o f a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e b e t w e e n r e t i n a l a n d t h e e n g i n e e r e d p r o t e i n . W h i l e t h e s e e f f o r t s h a v e b r o u g h t u s c l o s e t o t h e i d e a l r h o d o p s i n m i m i c f u r t h e r t u n i n g o f t h e P S B ’ S p K a i s s t i l l n e e d e d . O n c e a s t a b l e P S B a t p h y s i o l o g i c a l p H i s a t t a i n e d , t h i s e n g i n e e r e d C R A B P H m u t a n t c a n b e u s e d t o r a t i o n a l l y p l a c e a m i n o a c i d s w i t h d i f f e r e n t c h a r g e s , d i p o l e s , a n d s t e r i c s a t v a r i o u s l o c a t i o n s w i t h r e s p e c t t o t h e c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l , a n d t h e e f f e c t s o n w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n w i l l b e c h a r a c t e r i z e d . B . ' 1 " e \ " i s \ " i s [ m y t i t t a l W i t h i i t h e c o m p m e n : l i n i n g t h e e a p t u i n g 2 3 T h e t h e C l n e s , ‘ c o n e e l l s . 3 1 ? F E A p g n . m h l l i 1 1 i j C e l l s 1 t h e 3 B . T h e V i s u a l P r o c e s s V i s i o n , t h e a c t o r s e n s e o f s i g h t , i n v o l v e s t h e c a p t u r e o f l i g h t w a v e s b y t h e e y e , t r a n s m i t t a l o f e l e c t r i c a l i m p u l s e s t o t h e b r a i n , a n d t h e r e c o g n i t i o n o f i m a g e s a n d c o l o r s . 6 W i t h i n t h e e y e i t i s t h e c o r n e a , l e n s , a n d t h e v i t r e o u s fl u i d t h a t a r e t h e p r i m a r y c o m p o n e n t s r e s p o n s i b l e f o r f o c u s i n g l i g h t w a v e s o n t o t h e r e t i n a . 7 T h e r e t i n a , t h e t i s s u e l i n i n g t h e i n n e r p a r t o f t h e e y e , c o n t a i n s t h e p h o t o r e c e p t o r s a n d i s r e s p o n s i b l e f o r c a p t u r i n g t h e i m a g e a n d s e n d i n g t h e s i g n a l t o t h e b r a i n V i a t h e o p t i c n e r v e . T h e r e t i n a i s l a y e r e d w i t h t h e p h o t o r e c e p t o r s r e s p o n s i b l e f o r V i s i o n , t h e r o d s a n d t h e c o n e s . 8 A n e y e c o n t a i n s a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 m i l l i o n r o d c e l l s a n d a b o u t 6 m i l l i o n c o n e c e l l s . 9 T h e c o n e c e l l s a r e r e s p o n s i b l e f o r c o l o r ( p h o t o p i c ) v i s i o n a n d t h e r o d c e l l s a r e r e s p o n s i b l e f o r d i m ( s c o t o p i c ) v i s i o n . C o n e c e l l s a r e b o t h q u i c k e r t o a d a p t t o d a r k e n v i r o n m e n t s ( ~ 1 0 m i n ) a n d s e n s i t i v e t o a b r o a d e r r a n g e o f w a v e l e n g t h s . W h i l e r o d s c e l l s t a k e l o n g e r t o a d a p t t o d a r k e n v i r o n m e n t s ( 2 0 — 3 0 m i n ) , o n c e a d a p t e d t h e y a r e 5 0 0 t i m e s m o r e a s s e n s i t i v e t h a n c o n e c e l l s . T h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f r o d s a n d c o n e s a r e v e r y s i m i l a r . R o d c e l l s , b e i n g m o r e a b u n d a n t , h a v e b e e n m o r e t h o r o u g h l y i n v e s t i g a t e d . W h i l e t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f r o d c e l l s w i l l b e b r i e fl y i n t r o d u c e d h e r e , t h i s i n f o r m a t i o n m a y a l s o b e e x t r a p o l a t e d t o i n c l u d e c o n e c e l l s . T h e r o d c e l l i s a t y p i c a l n u c l e u s c o n t a i n i n g c e l l , b u t w i t h t w o u n i q u e p a r t s : t h e s y n a p t i c e n d i n g , w h e r e t h e n e u r a l s i g n a l s p a s s t h r o u g h t o t h e b r a i n f o r p r o c e s s i n g , a n d t h e o u t e r s e g m e n t ( F i g u r e I - l ) . T h e o u t e r s e g m e n t i s fi l l e d w i t h d i s k s m a d e o f a p h o s p h o l i p i d b i l a y e r a n d t h e p r o t e i n o p s i n , w h i c h s p a n s t h e b i l a y e r d i s k . T h e m a k e - u p o f r o d a n d c o n e c e l l s i s v e r y s i m i l a r , b u t w h e r e t h e d i s k s i n r o d c e l l s a r e ' l u h n - d I ‘ ‘ ~ ‘ W . 1 ‘ 4 ( I ' L I 1 1 1 2 : ? ” ‘ P P M - I . t d i s c o n n e c t m e m b r a n e 0 a c o u p l e d n p r o t o n a t e d t h a t e h r o m t o a s o p s x O u t e r S C S m e n t S l n a p n ‘ C 8 0 d ) , d i s c o n n e c t e d f r o m t h e i r p l a s m a m e m b r a n e , t h e d i s k s i n c o n e c e l l s f o r m t h e p l a s m a m e m b r a n e . 1 0 O p s i n i s a t r a n s - m e m b r a n e 7 - 0 t - h e l i c a l p r o t e i n f r o m t h e f a m i l y o f G - p r o t e i n c o u p l e d r e c e p t o r s ( G P C R ) . O p s i n b i n d s t h e a l d e h y d i c c h r o m o p h o r e r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e v i a a l y s i n e r e s i d u e ( F i g u r e I - 2 ) . l l I n h u m a n s a n d m o s t a n i m a l s , t h a t c h r o m o p h o r e i s t h e l l - c i s i s o m e r o f r e t i n a l . I n t h e a p o f o r m , t h e p r o t e i n i s r e f e r r e d t o a s o p s i n ; i n t h e h o l e ( r e t i n a l b o u n d ) f o r m , t h e p r o t e i n i s k n o w n a s r h o d o p s i n . = : 3 = = P l a s m a M e m b r a n e = = = O u t e r : I T ' 1 1 c i s S e g m e n t l 4 - _ - C : ' : R e t i n a l = = : 3 = : 3 S 5 1 C o n n e c t i n g 3 K . C i l i u m i . M i t o c h o n d r i a I n n e r U 0 S e e n t : 9 7 " . g m 3 ‘ . . - G o l g i N u c l e u s , I . . ' C y t o p l a s m i c S u r f a c e F i b e r [ I S y n a p t i c B o d y F i g u r e [ - 1 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f a v e r t e b r a t e r o d c e l l . A l t h o u g h e a c h d l ‘ k o n e 0 3 6 5 ; c o n t i n u u u G l ‘ u h i c ‘ h . t h e b i o l o g i c a l o t h e r s . m T 3 1 . i s b u t m i . . p r o t e i n } . P h i l l o n ( \ T A l t h o u g h v a r i a b l e i n d i f f e r e n t s p e c i e s , e a c h r o d c e l l c a n c o n t a i n u p t o 1 7 0 0 d i s k s a n d e a c h d i s k c a n c o n t a i n u p t o 1 . 5 m i l l i o n m o l e c u l e s o f r h o d o p s i n . ‘ 2 A t o n e t i m e , h o w e v e r , o n e u s e s a b o u t 1 0 % o f t h e r h o d o p s i n c o m p l e x e s , w h i c h i s w h a t a l l o w s f o r v i s i o n t o b e a c o n t i n u o u s p r o c e s s . G P C R S a r e t h e p r e d o m i n a n t p r o t e i n s i n t h e c l a s s o f m e m b r a n e - b o u n d p r o t e i n s , o f w h i c h , r h o d o p s i n c o n s t i t u t e s ~ 9 0 % . G P C R ’ S a r e r e s p o n s i b l e f o r a v a r i e t y o f i m p o r t a n t b i o l o g i c a l f u n c t i o n s i n c l u d i n g s i g n a l t r a n s d u c t i o n , g e n e r e g u l a t o r y c o n t r o l , a n d a m o n g O t h e r s , v i s i o n . 1 3 T h e v i s u a l p r o c e s s b e g i n s i n t h e d a r k S t a t e w h e r e t h e c h r o m o p h o r e , l l — c i s - r e t i n a l , i s b o u n d a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e V i a L y s 2 9 6 , a n d v i s u a l p a r t i c i p a n t s t r a n s d u c i n ( G - p r o t e i n ) a n d p h o s p h o d i e s t e r a s e ( P D E ) a r e i n a n i n a c t i v e s t a t e . T h e a b s o r p t i o n O f a p h o t o n o f l i g h t S t a r t s t h e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e o f l l — c i s - r e t i n a l t 0 a l l - t r a n s - r e t i n a l , F i g u r e I - 2 . S t e r e o v i e w O f t h e t r a n s - m a m b r a n e 7 - O t - h e l i c a l G - p r o t e i n c o u p l e d r e c e p t o r . r h o d o p s i n . R h o d o p s i n b i n d s t h e v i s u a l r e c e p t o r l l - e i s - r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e v i a L y s 2 9 6 . G l u 1 1 3 s e r v e s a s t h e c o u n t e r a n i o n f o r t h e P S B . i n t e r m e d w h i c h b e I c a n b e m t F i g u r e l i n c l u d i n g m e t a l . m T ? “ l i n e t h e E u p t o a n d , . S c h i f f b . » . L a , . r t T I H ~ f “ " l i { ( ~ - “ d w h i c h b e g i n s a s e r i e s O f e n z y m a t i c e v e n t s c u l m i n a t i n g i n v i s i o n . ‘ 4 T h e i s o m e r i z a t i o n o f t h e l l — c i s i s o m e r O f t h e c h r o m o p h o r e t o t h e a l l - t r a n s f o r m c a n b e m o n i t o r e d b y v a r i o u s l o w t e m p e r a t u r e s p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u e s i n c l u d i n g U V - v i s ( F i g u r e L 3 ) ” 2 1 T h e c h r o m o p h o r e g o e s t h r o u g h a s e r i e s O f d i s c r e t e i n t e r m e d i a t e s i n c l u d i n g p h o t o r h o d o p s i n , b a t h o r h o d o p s i n ( a “ d i s t o r t e d ” t r a n s P S B ) , l u m i r h o d o p s i n , m e t a I , m e t a I I ( a l l - t r a n s u n p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ) , a n d m e t a I I I s t a t e s i n ‘ 2 3 T h e i n i t i a l s t a g e s o f t h e t r a n s d u c t i o n p a t h w a y a r e c o n t r o l l e d b y s t e r i c f a c t o r s , “ 2 5 2 6 3 7 A l l i n t e r m e d i a t e s w h i l e t h e l a t t e r s t a g e s p r i m a r i l y i n v o l v e p r o t o n t r a n s f e r p r o c e s s e s . u p t o a n d i n c l u d i n g m e t a I m a i n t a i n a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . T h e d e p r o t o n a t i o n o f t h e S c h i f f b a s e a n d p r o t o n a t i o n o f t h e c o u n t e r a n i o n ( G l u 1 1 3 ) o c c u r i n t h e m e t a 1 1 i n t e r m e d i a t e , a n d t h e v i s u a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y i s i n i t i a t e d f r o m . F o l l o w i n g m e t a I I , o p s i n a l l - t r a n s , 3 8 5 n m 1 1 - c i s , 4 9 8 n m , H l \ ‘ N Q > 0 ° C m i n . m e t a - l l , 0 ° C 3 8 0 n m h v < 2 0 0 f 3 U n p r o t o n a t e d — > _ _ , I n i t i a t e s V i s u a l _ T r a n s d u c t i o n S c h i f f B a s e 1 1 1 2 + H + - H + . . P h o t o , 5 7 0 n m m e t a - l . - 1 5 ° C a l l - t r a n s ' h i g h l y d i s t o r t e d 4 8 0 n m l . . i t s n s . \ \ \ \ \ fi k fl w m i p w c 1 2 H 4 9 7 n m B a t h o , - 1 4 0 ° C 5 4 3 n m " d i s t o r t e d t r a n s " F i g u r e [ - 3 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e i n t e r m e d i a t e s i n v o l v e d i n t h e i s o m e r i z a t i o n o f l l - c i s - r e t i n a l t o a l l — t r a n s r e t i n a l a s i t i s e x c i t e d w i t h a p h o t o n o f l i g h t . ‘ a ~ . ~ . 1 . . m t h e S B ” L U I S - T C l ' é ' I l fl a l t r u l t i c h t i T I L L ' I M l G C U T I E “ . i l l ; t h e S B i s r e p r o t o n a t e d i n t h e m e t a I I I S t a g e , a n d fi n a l l y e l i m i n a t e d f r o m t h e p r o t e i n . A l l — t r a n s — r e t i n a l i s t r a n s p o r t e d t o a n o t h e r s i t e f o r r e - i s o m e r i z a t i o n t o t h e l l — c i s i s o m e r . V i s i o n i s i n i t i a t e d a s l i g h t i s a b s o r b e d b y r h o d o p s i n . T h e i s o m e r i z a t i o n o f l l - c i s - r e t i n a l t o t h e a l l - t r a n s f o r m l e a d s t o a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n t h e p r o t e i n ( F i g u r e I - 4 ) . w h i c h a l l o w s f o r b i n d i n g a n d a c t i v a t i o n o f t h e G — p r o t e i n t r a n s d u c i n ( F i g u r e I - 5 ) . 1 5 T r a n s d u c i n i s c o m p o s e d o f 0 t , [ 3 a n d 7 s u b u n i t s , a s w e l l a s a G D P s u b u n i t b o u n d t o t h e o r c o m p o n e n t . W h e n b o u n d t o a c t i v a t e d r h o d o p s i n , t h e G - p r o t e i n , t r a n s d u c i n , a l s o u n d e r g o e s a c o n f o r m a t i o n a l t r a n s i t i o n , w h i c h l e a d s t o d i s p l a c e m e n t o f t h e G D P u n i t i n G a — s u b u n i t b y a G T P . T h i s s u b s t i t u t i o n , i n t u r n , r e s u l t s i n t h e r e l e a s e o f t h e G u - G T P s u b g r o u p f r o m t h e r e m a i n d e r o f t h e t r a n s d u c i n c o m p l e x . I n t h e f r e e s t a t e , t h e G a l - G T P \ \ \ h v \ ( I s o m e n ‘ z a t i o n o f t h e N H C i t - 0 1 2 d o u b l e b o n d ) J . R h o d o p s i n M e t a l l F i g u r e L 4 . 3 ) D e p i c t i o n o f t h e m o v e m e n t o f t h e c h r o m o p h o r e a s i t u n d e r g o e s a n i s o m e r i z a t i o n o f t h e C l l — C 1 2 d o u b l e b o n d . b ) R e p r e s e n t a t i o n o f t h e r e s u l t a n t c h a n g e i n o r i e n t a t i o n o f t h e h e l i c e s o f r h o d o p s i n w h e n h i t w i t h a p h o t o n o f l i g h t . u n i t c a n c o n s i s t s i r e l e a s e d 1 u n i t s i n i t c G M P t o o x a l i c - G B h a l t s t h e f 1 0 1 t o 0 . l b e i n g s e n t T h . p h o t o n o f i s o m e r i z a t a n d t r a n s r : r e K i l n s 3 ? . I n i t i a t e s i h i d t o l y s j , T i . - h m e s s e s “ e n : 1 S i t . m O i E C U ] e \ ‘ l S u a i l i a r u n i t c a n n o w i n i t i a t e t h e a c t i v a t i o n o f t h e p h o s p h o d i e s t e r a s e e n z y m e ( P D E ) . P D E c o n s i s t s o f a n 0 t , B a n d t w o y s u b u n i t s i n t h e u n a c t i v a t e d s t a t e . A s t h e G a - G T P u n i t i s r e l e a s e d f r o m t r a n s d u c i n , i t t h e n b i n d s t h e 7 s u b u n i t o f P D E . C l e a v a g e O f b o t h P D E - y u n i t s i n i t i a t e s a c t i v a t i o n o f t h e P D E e n z y m e , w h i c h t h e n c a t a l y z e s t h e h y d r o l y s i s o f c G M P t o G I V I P ( F i g u r e 1 - 5 ) . c G M P i s r e s p o n s i b l e f o r t h e r e g u l a t i o n o f i o n c h a n n e l s i n t h e c e l l . H y d r o l y s i s o f c y c l i c - G M P t o G M P f o r c e s t h e C a 2 + i o n c h a n n e l i n t h e r o d o u t e r s e g m e n t t o c l o s e a n d h a l t s t h e fl o w o f C a 2 + i n t o t h e c e l l . T h i s f o r c e s a c o n c e n t r a t i o n c h a n g e i n C a 2 + f r o m 0 . 5 1 A M t o 0 . 1 u M . 2 8 ' 2 9 T h e s e i o n c o n c e n t r a t i o n c h a n g e s a r e w h a t i n i t i a t e t h e e l e c t r i c S i g n a l b e i n g s e n t t o t h e b r a i n a n d r e s u l t s i n a v i s u a l i m a g e . 3 ° ‘ 3 1 T h e o v e r a l l v i s u a l t r a n s d u c t i o n p r o c e s s i s s u m m a r i z e d i n F i g u r e 1 6 3 2 A s a p h o t o n o f l i g h t h i t s t h e p h o t o r e c e p t o r , t h e s i m p l e a c t i o n o f a s i n g l e d o u b l e b o n d i s o m e r i z a t i o n b e g i n s t h e c a s c a d e o f e v e n t s c u l m i n a t i n g i n t h e h y d r o l y s i s o f c y c l i c G M P a n d t r a n s m i s s i o n o f a n e u r a l s i g n a l t o t h e b r a i n , r e s u l t i n g i n v i s i o n . 3 3 ’ 3 4 T h e c h r o m o p h o r e r e t a i n s a p p r o x i m a t e l y 2 7 k c a l / m o l e o f t h e p h o t o n ’ s e n e r g y i n t h e m e t a 1 1 s t a t e , w h i c h i n i t i a t e s t h e r h o d o p s i n c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e , a c t i v a t i o n o f t r a n s d u c i n , P D E , a n d h y d r o l y s i s o f c G M P . 1 9 ' 3 5 ' 3 6 T h e m a g n i t u d e o f t h e v i s u a l p r o c e s s i s d e m o n s t r a t e d b y t h e m e a n s i n w h i c h i t h a r n e s s e s t h e e n e r g y o f a s i n g l e p h o t o n . R h o d o p s i n h a s t h e a b i l i t y t o b e a c t i v a t e d b y e v e n a s i n g l e p h o t o n . A n a c t i v a t e d r h o d o p s i n c a n c a t a l y z e c o n v e r s i o n o f 1 0 0 t r a n s d u c i n m o l e c u l e s t o t h e a c t i v a t e d G a - G T P s t a t e . T h e s e 1 0 0 m o l e c u l e s o f G a - G T P c a n c a t a l y z e c o n v e r s i o n O f 1 0 0 , 0 0 0 m o l e c u l e s o f P D E t o t h e a c t i v a t e d y - P D E c l e a v e d f o r m . ” 3 8 T h e v i s u a l t r a n s d u c t i o n c a s c a d e i s o n e o f t h e m o s t e f fi c i e n t a n d s e n s i t i v e p r o c e s s e s k n o w n , 7 , 3 9 4 2 a l l o w i n g d e t e c t i o n o f a s i n g l e p h o t o n . 4 3 I t i s t h i s w i t h a q u a n t u m e f fi c i e n c y o f ~ 0 . 6 s e n s i t i v i t y c o u p l e d w i t h t h e e n e r g e t i c e n h a n c e m e n t t h a t a l l o w s v i s i o n t o s t i l l o c c u r i n t h e d a r k e s t O f e n v i r o n m e n t s . 1 0 G T P G D P c G M P G M P A c t i v e P D E F i g u r e 1 - 5 . T h e v i s u a l p a t h w a y i n v o l v e s t h e a c t i v a t i o n o f t h e G - p r o t e i n c o u p l e d r e c e p t o r r h o d o p s i n . T h e c o m f o r m a t i o n a l c h a n g e i n r h o d o p s i n a l l o w s f o r b i n d i n g a n d a c i t i v a t i o n o f t h e G - p r o t e i n t r a n s d u c i n . O n c e a c t i v a t e d , t h e o r s u b u n i t o f t r a n s d u c i n a c t i v a t e s t h e e n z y m e p h o s p h o d i e s t e r a s e ( P D E ) b y b i n d i n g a n d c l e a v i n g t h e 7 s u b u n i t . A c t i v e P D E c a t a l y z e s t h e h y d r o l y s i s o f c G M P t o G M P , w h i c h c a u s e s c h a n g e s i n i o n c o n c e n t r a t i o n s i n t h e c e l l a n d r e s u l t s i n a n e l e c t r i c a l s i g n a l b e i n g s e n t t o t h e b r a i n . _ _ . . R h o d o p s i n \ h ; B a l t h o R L u m i 1 1 - c i s - r e t i n a l l M t I . 1 i e a G a ° G D P G B P D E G B c G M P a l l - t r a n s - r e t i n a i G T P . - = > . G D P A D P A T P G a ° G T P a n y + H , r h o d o p s i n k i n a s e 1 p h o t o n = 1 0 0 # 1 0 0 , 0 0 0 F i g u r e [ - 6 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e v i s u a l t r a n s d u c t i o n p r o c e s s . O p s i n b i n d s l l - c i s - r e t i n a l t o f o r m r h o d o p s i n . W h e n r h o d p s i n a b s o r b s a p h o t o n o f l i g h t . i t i n i t i a t e s t h e i s o m e r i z a t i o n o f r e t i n a l , o b s e r v a b l e t h r o u g h s e v e r a l d i s c r e t e i n t e r m e d i a t e s a n d c u l m i n a t i n g i n m e t a I I . T h e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n r e t i n a l p r o d u c e s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n t h e p r o t e i n , w h i c h i n t u r n a l l o w s f o r a c t i v a t i o n a n d b i n d i n g o f t h e G - p r o t e i n t r a n s d u c i n . A c t i v a t i o n o f t r a n s d u c i n i n t u r n a c t i v a t e s t h e e n z y m e p h o s p h o d i e s t e r a s e , w h i c h i s r e s p o n s i b l e f o r t h e h y d r o l y s i s o f c G M P t o G M P . c G M P r e g u l a t e s t h e i o n c h a n n e l s i n t h e c e l l , a n d c h a n g e s i n i o n c o n c e n t r a t i o n , a s a r e s u l t o f c o n v e r s i o n t o G M P . f o r c e s a n e l e c t r i c a l s i g n a l t o b e s e n t t o t h e b r a i n a n d r e s u l t s i n v i s i o n . 1 "P ( C . l C O n ; m a } 0 f [ 1 l 3 0 1 5 ( ’ 9 . e s t r s e p g e i o n 0 f c t r u m t h a t t h w e e l e e n c a t c r t o u m a c a a g n e l l y t s i e c e P b r a o t m o O n C a t i h m o m n i o f t h e S c C S h i f t t o 4 4 h 0 i f n f m . b a s e l e a d s t o a l a r g e C . C o l o r v i s i o n : M o d e s o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n V i s i o n n o t o n l y i n v o l v e s t h e a c t o f d e t e c t i n g o b j e c t s , b u t a l s o c o l o r s . D i f f e r e n t i a t i n g c o l o r s m e a n s t h a t w i t h i n t h e p r o c e s s o f v i s i o n t h e r e m u s t a l s o b e d e t e c t i o n a n d r e g u l a t i o n o f t h e m u l t i t u d e o f l i g h t w a v e l e n g t h s . T o a c c o m p l i s h t h i s , t h e e y e u t i l i z e s t h r e e c o l o r e d p r o t e i n s : r e d , g r e e n , a n d b l u e . E a c h o f t h e s e o p s i n s b i n d t h e s a m e c h r o m o p h o r e , l l — c i s - r e t i n a l . I t i s t h e u n i q u e a b i l i t y o f t h e s e p r o t e i n s t o e l i c i t d i f f e r e n t p r o p e r t i e s f r o m t h e s a m e s u b s t r a t e t h a t a l l o w u s t o s e e t h e w h o l e v i s i b l e s p e c t r u m . A s t h e f r e e a l d e h y d e , l l - c i s - r e t i n a l a b s o r b s a t 3 8 0 n m ( F i g u r e I - 7 ) . W h e n t h e S c h i f f b a s e i s f o r m e d w i t h n - b u t y l a m i n e , t h e r e i s a s l i g h t b l u e 1 1 - c i s - r e t i n a l s h i f t i n a b s o r b a n c e , 3 6 5 n m . H o w e v e r , w h e n t h e S c h i f f b a s e i s p r o t o n a t e d , t h e r e i s a s i g n i fi c a n t r e d 1 1 - c i s - r e t i n a l s h i f t o f t h e c h r o m o p h o r e ’ s a b s o r b a n c e S c h i f f b a s e \ N M t o 4 4 0 a m . “ 4 5 W i t h c o n t r o l l e d A m ~ 3 6 5 n m c o n c e n t r a t i o n a n d s o l v e n t , t h i s v a l u e \ \ \ 1 1 - c i s - r e t i n a l m a y s h i f t u p t o 5 0 0 n m . 4 6 P r o t o n a t i o n \ G P r o t o n a t e d 3 0 1 “ “ \ N M o f t h e S c h i f f b a s e a l o n e , h o w e v e r , i s A m . 4 4 0 n m ' 1 ‘ n o t s o l e l y r e s p o n s i b l e f o r c o l o r v i s i o n , F i g u r e 1 - 7 . l l - c i s - R e t i n a l a b s o r b s a t 3 8 0 n m . A s t h e a s 4 4 0 n m i s j u s t t h e b e g i n n i n g o f t h e S c h i f f b a s e w i t h n - b u t y l a m i n e , t h e r e i s n o t m u c h c h a n g e i n t h e m a x i m a l a b s o r b a n c e , 3 6 5 n m . 1 3 4 . 1 . - v a " i L 1 . . ' i l l ; 0 1 i p t e r r u s p e c c e i v e d w a v e | g n m t h o f l i g h t ( “ I “ ) g 7 ( ~ 4 0 0 — 7 0 0 n m ) . E a c h o f t h e f o u r o p s i n p r o t e i n s b i n d s l l — c i s — r e t i n a l i n t h e s a m e m a n n e r , a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e t h r o u g h a L y s r e s i d u e . I n t e r e s t i n g l y h o w e v e r , t h e y e a c h p r o d u c e a d r a m a t i c a l l y d i f f e r e n t m a x i m a l a b s o r b a n c e f o r t h e c h r o m o p h o r e . T h e a b s o r p t i o n v a l u e s o f e a c h o f t h e h u m a n p i g m e n t s h a s b e e n i n v e s t i g a t e d f o r m o r e t h a n a h u n d r e d y e a r s , 4 7 8 r e fl e c t i o n d e n s i t o m e t r y , 4 9 u t i l i z i n g t e c h n i q u e s s u c h a s p s y c h o p h y s i c a l c o l o r m a t c h i n g f ' e l e c t r o r e t i n o g r a p h y , 5 0 S i n g l e - c e l l a c t i o n s p e c t r a , “ a n d m i c r o s p e c t r o p h o t o m e t r y . 5 2 ' 5 3 H u m a n r o d r h o d o p s i n a b s o r b s a t 5 0 0 n m a n d t h e c o n e r h o d o p s i n s , r e d . g r e e n , a n d b l u e a b s o r b a t 5 7 0 n m , 5 3 0 n m , a n d 4 2 0 n m , r e s p e c t i v e l y } 4 T h e d i f f e r e n c e i n t h e a b s o r b a n c e v a l u e O b s e r v e d f o r t h e v i s u a l 1 2 5 p p i g m e n t s a s c o m p a r e d t o t h e P S B A 8 ' " . c o n e G r e e n c o n e R o d c o n e E o f l l - c i s — r e t i n a l i n s o l u t i o n i s 5 % E 3 k n o w n a s t h e o p s i n s h i f t a n d m u s t g ? » 2 8 r . . 1 : 2 b e d u e t o t h e I n t e r a c t i o n o f t h e : 9 5 p r o t e i n w i t h t h e r c t i n y l i d e n e i c h r o m o p h o r e . “ 5 5 I t i s t h e u n i q u e i t 5 0 0 I 6 0 0 I 7 0 0 C o l o r — v . I . 1 F i g u r e 1 - 8 . T h e v i s i b l e s p e c t r u m r a n g e s f r o m i n t e r a c t i o n s o f t h e i n d i v i d u a l p r o t e i n s w i t h t h e c h r o m o p h o r e , a n d t h e c o e x i s t e n c e o f t h e f o u r a p p r o x i m a t e l y 4 0 0 — 7 0 0 n m . A l t h o u g h e a c h o f t h e C O I n P I C X C S t h a t a l l O W U S t o $ 6 6 t h e r h o d o p s i n c o m p l e x e s a b s o r b o n l y a t a s p e c i fi c w a v e l e n g t h . i t i s t h e c o m b i n a t i o n o f t h e a b s o r b a n c e p a t t e r n s o f a l l e n t i r e v i s i b l e s p e c t r u m ( F i g u r e I - . ' . _ r h o d o p s r n s t h a t a l l o w u s s e e t h e e n t i r e V I S I D I C r a n g e . 8 ) . O \ D u e t o t h e f a c t t h a t r h o d o p s i n s a r e m e m b r a n e - b o u n d p r o t e i n s , t h e y a r e d i f fi c u l t t o w o r k w i t h a n d p a r t i c u l a r l y d i f fi c u l t t o c r y s t a l l i z e . I n 2 0 0 0 , P a l c z e w s k i , e t a 1 , p u b l i s h e d t h e fi r s t c r y s t a l s t r u c t u r e o f a r h o d O p s i n p r o t e i n , d i f f r a c t i n g t o 2 . 8 A r e s o l u t i o n . 5 6 U n t i l t h e n , t h e r e w e r e o n l y m o d e l s o f t h e t h r e e d i m e n s i o n a l p r o t e i n s t r u c t u r e a s a r e s u l t o f s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s , p h o t o a f fi n i t y l a b e l i n g , N M R , c r y o e l e c t r o n m i c r o s c o p y , a n d t h e o r e t i c a l c a l c u l a t i o n s . ” ' 5 7 ’ 6 3 A s o f y e t , t h e r e a r e s t i l l n o c r y s t a l s t r u c t u r e s o f a n y o f t h e c o n e r h o d o p s i n s , h a m p e r i n g e f f o r t s t o f u l l y u n d e r s t a n d t h e u n d e r l y i n g m e c h a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n . A l t h o u g h t h e r e a r e n o c r y s t a l s t r u c t u r e s a v a i l a b l e f o r t h e c o n e o p s i n s , t h e r e h a v e b e e n s e v e r a l h y p o t h e s e s p r e s e n t e d t o e x p l a i n t h e f a c t o r s r e s p o n s i b l e f o r w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n , m o s t i n f e r r i n g a c h a n g e i n t h e d e g r e e o f c o n j u g a t i o n w i t h i n t h e c h r o m o p h o r e . 6 4 “ A n e a r l y h y p o t h e s i s s u g g e s t e d t h e p o s s i b l e t w i s t i n g o f t h e p l a n e s a b o u t t h e s i n g l e b o n d s i n t h e m o l e c u l e t o a c h i e v e d i f f e r e n t l e v e l s o f c o n j u g a t i o n . A l t h o u g h r e t i n a l w o u l d p r e f e r t o a d o p t a p l a n a r c o n f o r m a t i o n t o m a x i m i z e p - o r b i t a l o v e r l a p , i t i s k n o w n t h a t l l - c i s - r e t i n a l i s n o t a p l a n a r m o l e c u l e . T h e c h r o m o p h o r e e x i s t s i n a n o n p l a n a r 6 - s - c i s - , l Z - s - t r a n s c o n f o r m a t i o n , w h e r e s t e r i c i n t e r a c t i o n s a t t h e C S - M e a n d C 8 - H a s w e l l a s t h e C l O - H a n d C 1 3 - M e f o r c e t w i s t i n g o f t h e C 6 — C 7 a n d C 1 2 — C 1 3 6 7 , 6 8 s i n g l e b o n d s , r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e I - 9 ) . D i f f e r i n g s t e r i c r e q u i r e m e n t s w i t h i n t h e v a r i o u s r h o d o p s i n p r o t e i n b i n d i n g c a v i t i e s m a y f o r c e m o r e o r l e s s t w i s t i n g i n e a c h c a s e . 6 9 R e d r h o d o p s i n w o u l d b e e x p e c t e d t o h a v e s t e r i c c o n s t r a i n t s f o r c i n g r e t i n a l i n t o a m o r e p l a n a r c o n f o r m a t i o n , r e s u l t i n g i n m o r e o r b i t a l o v e r l a p . M o r e t w i s t i n g o f t h e s i n g l e b o n d s a n d l e s s o r b i t a l o v e r l a p w o u l d b e e x p e c t e d i n t h e b l u e p i g m e n t . D i f f e r e n t d e g r e e s o f 1 5 t w i s t i n g c a n r e s u l t i n d i f f e r e n t d e g r e e s o f o v e r a l l c o n j u g a t i o n , w h i c h i n t u r n w o u l d l e a d t o d i f f e r e n t m a x i m a l a b s o r b a n c e s . O t h e r p o s t u l a t e d t h e o r i e s o n p o s s i b l e m o d e s o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n i n v o l v e t h e c h a r g e d e l o c a l i z a t i o n o n t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e o f t h e c h r o m o p h o r e i n r e s p o n s e t o t h e d i f f e r e n t c h a r g e d o r p o l a r s p e c i e s i n t h e b i n d i n g p o c k e t ( F i g u r e I - 1 0 ) . 7 0 M o r e s p e c i fi c a l l y , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e d i s t a n c e o f t h e c o u n t e r a n i o n t o t h e P S B m a y a i d i n m o d u l a t i n g t h e m a x i m a l w a v e l e n g t h o f r e t i n a l . A s h o r t e r c o u n t e r a n i o n d i s t a n c e w o u l d l e a d t o a m o r e b l u e s h i f t e d r e t i n a l , a n d c o n v e r s e l y , a l a r g e r c o u n t e r a n i o n d i s t a n c e , o r r e m o v a l o f t h e c o u n t e r a n i o n , w o u l d r e s u l t i n a m o r e r e d s h i f t e d r e t i n a l a b s o r b a n c e . “ I n a d d i t i o n , l o c a l i z a t i o n o f c h a r g e s o r d i p o l e s a t d i f f e r e n t p o s i t i o n s a l o n g t h e p o l y e n e b a c k b o n e m a y a l s o e f f e c t i v e l y s h o r t e n o r e l o n g a t e t h e p o l y e n e ’ s c o n j u g a t i o n r e s u l t i n g i n d i f f e r e n t m a x i m a l a b s o r b a n c e s a n d a p o s s i b l e m o d e o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n . 7 2 . ’ : ' . : Z : ' — " " 5 * \ N / \ ) § F i g u r e [ - 9 . T w i s t i n g o f t h e s i n g l e b o n d s w i l l F i g u r e [ . 1 0 D i s t a n c e o f t h e c o u n t e r r e d u c e t h e d e g r e e o f 1 : o r b i t a l o v e r l a p , a n d a n i o n t o t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e a n d t h u s w i l l l e a d t o d i f f e r e n t m a x i m a l p o s i t i o n i n g o f c h a r g e s o r d i p o l e s a l o n g w a v e l e n g t h s . I n d i v i d u a l r h o d o p s i n p r o t e i n s t h e b a c k b o n e o f t h e p o l y e n e m a y m a y m o d u l a t e t h i s b y a l t e r i n g t h e s t e r i c m o d u l a t e t h e m a x i m a l w a v e l e n g t h o f t h e r e s t r i c t i o n s p l a c e d o n t h e c h r o m o p h o r e . c h r o m o p h o r e . r e s u l t i n g i n d i f f e r e n t d e g r e e s o f c o n j u g a t i o n a n d u l t i m a t e l y d i f f e r e n t m a x i m a l w a v e l e n g t h s . l 6 « ( a I . . . I L . h i . I ‘ m a t h a i n d ! W i t h o u t c r y s t a l l o g r a p h i c i n f o r m a t i o n o n a l l f o u r r h o d o p s i n p r o t e i n s a n d a m e a n s t o c o r r e l a t e p r o t e i n s t r u c t u r e t o r e t i n a l m a x i m a l a b s o r b a n c e , d e t e r m i n a t i o n o r v a l i d a t i o n o f t h e m e c h a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n w i l l r e m a i n u n c o n fi r m e d . T h e s t u d i e s i n t o t h e c h e m i s t r y o f v i s i o n a n d t h e s p e c i fi c p r o t e i n / s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n s r e s p o n s i b l e f o r c o l o r v i s i o n h a s b e e n e n t h u s i a s t i c a l l y r e s e a r c h e d f o r m o r e t h a n 5 0 y e a r s . R e t i n a l w a s fi r s t i s o l a t e d i n 1 9 3 3 b y G e o r g e W a l d 7 3 ( t h e n c a l l e d ‘ r e t i n e n e ’ ) , b u t i t w a s n o t u n t i l 1 9 4 4 t h a t M o r t o n a n d G o o d w i n s u g g e s t e d t h a t t h i s c o m p o u n d w a s a c t u a l l y t h e a l d e h y d i c f o r m o f v i t a m i n A . 7 4 T h e t e r m s ‘ r e t i n a l d e h y d e ’ a n d ‘ r e t i n e n e ’ w e r e u s e d f o r t h e p h o t o r e c e p t o r s ’ s u b s t r a t e u n t i l 1 9 6 0 w h e n t h e I U P A C c o i n e d t h e t e r m r e t i n a l . R h o d o p s i n i s a l a r g e , h y d r o p h o b i c , m e m b r a n e - b o u n d p r o t e i n c o n s i s t i n g o f 3 4 8 a m i n o a c i d s a n d t w o o l i g o s a c c h a r i d e c h a i n s ( ~ 3 9 , 0 0 0 D a ) . A l t h o u g h c o u n t l e s s e f f o r t s 7 5 ’ 7 “ i t w a s n o t u n t i l 2 0 0 0 t h a t t h e fi r s t w e r e p u t i n t o s o l v i n g t h e s t r u c t u r e o f r h o d o p s i n , c r y s t a l s t r u c t u r e o f a r o d r h o d o p s i n w a s p u b l i s h e d . 5 6 T h e s t r u c t u r e s o f t h e c o n e o p s i n s h a v e y e t t o b e s o l v e d . C o l l i n s a n d M o r t o n fi r s t s u g g e s t e d t h a t r e t i n a l i s c o v a l e n t l y l i n k e d t o o p s i n v i a a S c h i f f b a s e i n 1 9 5 3 a n d 1 9 5 5 , r e s p e c t i v e l y . ” 7 8 F i r m e v i d e n c e o f t h i s S c h i f f b a s e l i n k a g e , v i a a l y s i n e r e s i d u e w i t h t h e p r o t e i n w a s n o t p r o v i d e d f o r a n o t h e r t e n y e a r s b y B o w n d s i n 1 9 6 5 7 9 a n d A k h t a r i n 1 9 6 8 . 8 0 I t t o o k a p p r o x i m a t e l y a n o t h e r t e n y e a r s o f r e s e a r c h b e f o r e t h e e x a c t a t t a c h m e n t s i t e f o r r e t i n a l i n r h o d o p s i n w a s k n o w n . M a n y p r o t e o l y t i c d i g e s t i o n s o f t h e p r o t e i n / s u b s t r a t e c o m p l e x h a d f a i l e d t o g e n e r a t e a r e t i n a l c o n t a i n i n g f r a g m e n t , p r e s u m a b l y d u e t o t h e h y d r o p h o b i c n a t u r e o f o p s i n , m a k i n g t h e b i n d i n g c a v i t y i n a c c e s s i b l e t o t h e e n z y m e . A n o n s p e c i f c e n z y m e m i x t u r e f r o m S t r e p t o m y c e s g r i s e u s , l 7 k n o n t c o n t a i § Q U fi i n t e n t p o l y e r 1 9 7 4 i 1 l - t ‘ l S a c i d , : h a r g e a n a n d t h k n o w n a s P r o n a s e , h o w e v e r w a s a b l e t o g e n e r a t e s m a l l a m o u n t s o f r c t i n y l i d e n e c o n t a i n i n g f r a g m e n t , w h i c h w e r e p u r i fi e d b y H P L C , s e q u e n c e d , a n d c o m p a r e d t o k n o w n s e q u e n c e d a t a . 7 9 I n 1 9 5 8 t h a t H u b b a r d s u g g e s t e d t h i s S c h i f f b a s e h a d t o b e p r o t o n a t e d , a n d i n t e r a c t i o n s w i t h t h e p r o t e i n f o r c e a d e l o c a l i z a t i o n o f t h e p o s i t i v e c h a r g e t h r o u g h o u t t h e p o l y e n e b a c k b o n e . 8 1 C o n fi r m a t i o n o f t h e p r o t o n a t i o n o f t h i s S c h i f f b a s e w a s u n v e i l e d i n 1 9 7 4 t h r o u g h R a m a n s t u d i e s . 8 2 W a l d w a s a l s o t h e fi r s t t o s h o w t h a t t h e i s o m e r i z a t i o n o f l l - c i s - r e t i n a l t o a l l — t r a n s — r e t i n a l w a s t h e p r i m a r y s t e p i n t h e t r a n s d u c t i o n p r o c e s s . 8 3 K r o p f a n d H u b b a r d h a d o r i g i n a l l y s u g g e s t e d i n 1 9 5 8 t h e t h e o r y t h a t w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n m a y r e s u l t f r o m e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e S B a n d c h a r g e d a m i n o a c i d s w i t h i n t h e b i n d i n g p o c k e t . 7 0 H o n i g s u g g e s t e d t h a t b o t h a n e g a t i v e l y c h a r g e d a m i n o a c i d , s u i t a b l y p l a c e d , c o u l d s e r v e a s a c o u n t e r a n i o n , a n d t h a t a s e c o n d n e g a t i v e l y c h a r g e d a m i n o a c i d c o u l d b e p l a c e d a t a n o t h e r p o s i t i o n a l o n g t h e p o l y e n e b a c k b o n e . 8 4 N M R s t u d i e s d i d i n f a c t c o n c l u d e t h a t t h e r e w a s a s e c o n d n e g a t i v e c h a r g e i n t h e c a v i t y , a n d t h a t i t r e s i d e s n e a r c a r b o n 1 2 o f r e t i n a l . ” 8 7 I d e n t i fi c a t i o n o f G l u 1 1 3 a s t h e c o u n t e r a n i o n i n b o v i n e r h o d o p s i n w a s n o t a c h i e v e d u n t i l 1 9 8 9 b y S a k m a r s s a n d o p r i a n 8 9 i n d e p e n d e n t l y , a n d 1 9 9 0 b y N a t h a n s . S a k m a r d i s c o v e r e d t h a t m u t a t i o n o f G l u 1 1 3 t o G l n p r o d u c e d a m i x t u r e o f t w o s p e c i e s , 4 9 0 n m a n d 3 8 0 n m , t h a t e x i s t e d a s a p H - d e p e n d e n t e q u i l i b r i u m . L o w e r i n g t h e p H f o r c e d t h e m i x t u r e t o 4 9 0 n m ( P S B ) , w h i l e i n c r e a s i n g t h e p H f o r c e d t h e m i x t u r e t o 3 8 0 n m ( S B ) . 8 8 R e m o v a l o f t h e c o u n t e r a n i o n d o e s n o t a l l o w f o r s i g n i fi c a n t p r o t o n a t i o n o f t h e S c h i f f b a s e t o o c c u r , p r e s u m a b l y d u e t o u n f a v o r a b l e e n e r g e t i c s o f h a v i n g a n u n c o m p e n s a t e d p o s i t i v e l y c h a r g e d r e s i d u e w i t h i n a h y d r o p h o b i c c a v i t y . S i m i l a r l y , 1 8 N a t h a n s g e n e r a t e d t h e E 1 1 3 Q m u t a t i o n t h a t p o r t r a y e d a 3 8 0 n m a b s o r b i n g p r o t e i n / r e t i n a l c o m p l e x . 6 5 I n c r e a s i n g t h e h a l i d e i o n c o n c e n t r a t i o n i n t h e s a m p l e , i . e . , a d d i t i o n o f a n o t h e r c o u n t e r a n i o n s o u r c e , f o r c e d a s h i f t b a c k t o 5 0 0 n m . A n i n c r e a s e i n h a l i d e i o n c o n c e n t r a t i o n i n t h e w i l d t y p e r h o d o p s i n p r o t e i n d i d n o t c h a n g e t h e c h r o m o p h o r e ’ s m a x i m a l a b s o r b a n c e . A d d i t i o n a l l y , m u t a t i o n o f a n y o f t h e o t h e r 1 9 A s p o r G l u r e s i d u e s i n t h e p r o t e i n d o e s n o t g e n e r a t e a s i g n i fi c a n t c h a n g e i n a b s o r b a n c e v a l u e , l e a d i n g t o t h e b e l i e f t h a t G l u 1 1 3 s e r v e s a s t h e P S B s c o u n t e r a n i o n . I n c i d e n t a l l y , G l u 1 1 3 h a s b e e n h i g h l y c o n s e r v e d a m o n g a l l v e r t e b r a t e o p s i n s . 9 0 T h e h y p o t h e s i s o f v a r y i n g c o u n t e r a n i o n d i s t a n c e s i n t h e d i f f e r e n t r h o d o p s i n p r o t e i n s w a s p r o p o s e d b y B l a t z i n 1 9 7 2 . 7 1 I f t h e c o u n t e r a n i o n w a s f u r t h e r r e m o v e d f r o m t h e p o s i t i v e l y c h a r g e d i m i n i u m i o n , a r e d s h i f t o f r e t i n a l ’ s a b s o r b a n c e w o u l d b e e x p e c t e d , a n d v i c e v e r s a . M u t a t i o n o f G l u 1 1 3 i n b o v i n e r h o d o p s i n t o A s p ( o n e m e t h y l e n e u n i t s h o r t e r ) d o e s p r o d u c e a s m a l l r e d s h i f t t o 5 0 5 n m . S h e v e s a n d c o - w o r k e r s h a v e p r o b e d t h e e f f e c t o f v a r y i n g t h e c o u n t e r a n i o n d i s t a n c e b y u t i l i z i n g d i f f e r i n g r i n g s i z e c o m p o u n d s 9 1 T h e y h a v e f o u n d t h a t b y a l t e r i n g c o n t a i n i n g b o t h a n a m i n o g r o u p a n d a c a r b o x y l a t e . t h e a n g l e b e t w e e n t h e P S B a n d t h e c o u n t e r a n i o n , t h e p K , , o f t h e r e t i n a l P S B c a n b e s i g n i fi c a n t l y p e r t u r b e d . A n o p t i m a l a n g l e i s d e s i r e d s u c h t h a t e f f e c t i v e b r i d g i n g w i t h o n e o r m o r e w a t e r m o l e c u l e s t a k e s p l a c e . I n 1 9 7 6 H o n i g s u g g e s t e d t h a t a s a n a l t e r n a t i v e o r s u p p l e m e n t t o t h e c o u n t e r a n i o n , t h e p o s i t i v e c h a r g e o n t h e n i t r o g e n c o u l d b e s o l v a t e d b y p o l a r g r o u p s w i t h i n t h e p r o t e i n s ’ b i n d i n g c a v i t y . 7 2 N a t h a n s a l s o s u g g e s t e d n e g a t i v e l y c h a r g e d a m i n o a c i d s c o u l d b e d i s t r i b u t e d a t v a r y i n g l o c a t i o n s t o a c c o u n t f o r t h e w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n o b s e r v e d i n c o n e p i g m e n t s . 9 0 l 9 T a i n t o a s h a m t h e f o r C h i t T h e t h e o r y o f p o s s i b l e e x c i t o n i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e b o u n d c h r o m o p h o r e a n d T r p r e s i d u e s p o s i t i o n e d i n c l o s e p r o x i m i t y w a s fi r s t s u g g e s t e d i n 1 9 7 9 b y R a f f e r t y . ” A l t h o u g h c a l c u l a t i o n s o f o p s i n s h i f t s u t i l i z i n g t h e s e i n t e r a c t i o n s s u g g e s t s t h e y m a y b e i n v o l v e d a n d p a r t i a l l y r e s p o n s i b l e , t h e d e g r e e o f s h i f t i n g c a l c u l a t e d d o e s n o t s u p p o r t t h i s a s b e i n g a p r i m a r y m o d e o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n . 6 6 B l a t z p r o p o s e d t h e p o s s i b i l i t y o f t h e c h r o m o p h o r e ’ s s i n g l e b o n d s b e i n g t w i s t e d a s a m o d e o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n . 6 9 S o l u t i o n a n a l y s i s o f t h e c o n f o r m a t i o n o f r e t i n a l i n t h e a b s e n c e o f p r o t e i n h a s n o t o f f e r e d m u c h i n s i g h t i n t o t h i s t h e o r y , a s t h e o r e t i c a l a n d e x p e r i m e n t a l s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t t h e r e a r e a m u l t i t u d e o f t o r s i o n a l a n g l e s p o s s i b l e f o r t h e C 6 - C 7 s i n g l e b o n d a l o n e . 9 2 T h e o r e t i c a l a n a l y s i s s u g g e s t s t h a t t w i s t i n g o f t h e c h r o m o p h o r e ’ s b o n d c a n n o t b e t h e s o l e m e c h a n i s m r e s p o n s i b l e f o r t h e l a r g e o b s e r v e d o p s i n s h i f t s . 6 6 H u m a n g r e e n a n d r e d c o n e p r o t e i n s a r e 9 6 % s e q u e n c e i d e n t i c a l a n d d i f f e r b y o n l y 1 5 a m i n o a c i d s . 9 0 G i v e n t h e h i g h s i m i l a r i t y o f t h e s e t w o p r o t e i n s , y e t t h e i r d i f f e r e n t m a x i m a l a b s o r b a n c e s w h e n b o u n d w i t h r e t i n a l , m o s t o f t h e w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n s s t u d i e s h a v e b e e n d o n e w i t h t h e s e t w o c o n e p r o t e i n s . G r e e n r h o d o p s i n a b s o r b s a t 5 3 0 n m w h i l e r e d r h o d o p s i n a b s o r b s a t 5 7 0 n m . M u t a t i o n o f o n l y 7 o f t h e 1 5 a m i n o a c i d s i n t h e r e d p i g m e n t i s r e q u i r e d t o s h i f t t h e a b s o r b a n c e f r o m 5 7 0 n m t o 5 3 0 n m ( S 1 1 6 Y : : S 1 8 0 A : 2 1 2 3 0 T : : A 2 3 3 S : : Y 2 7 7 F : : T 2 8 5 A : : Y 3 0 9 F ) . 9 3 H o w e v e r m u t a t i o n o f o n l y t h r e e o f t h e s e r e s i d u e s i n t h e g r e e n p i g m e n t w i l l a c c o u n t f o r t h e m a j o r i t y o f t h e r e d s h i f t . ” ’ 9 4 A l l s u b s t i t u t i o n s i n v o l v e t h e c o n v e r s i o n o f a h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d t o a p o l a r r e s i d u e n e a r t h e i o n o n e r e g i o n , F 2 7 7 Y , A 2 8 5 T , a n d A 1 8 0 8 . H y d r o p h o b i c t o p o l a r m u t a t i o n s a t a n a l o g o u s p o s i t i o n s i n r o d r h o d o p s i n a l s o w i l l p r o d u c e a r e d s h i f t i n t h e 2 0 r e t i n a l a b s o r b a n c e . T h e r o d m u t a n t F 2 6 1 Y : : A 2 6 9 T : : A 1 6 4 S r e d s h i f t s t o 7 0 0 n m f r o m 5 0 0 n m . 9 5 B l u e o p s i n i s b o t h l e s s a b u n d a n t a n d m o r e d i f fi c u l t t o e x p r e s s a n d o b t a i n a m p l e q u a n t i t i e s o f . I n a d d i t i o n , b l u e r h o d o p s i n i s o n l y ~ 4 6 % s e q u e n c e s i m i l a r t o t h e o t h e r ” ’ 9 6 r e s u l t i n g i n o n l y l i m i t e d w o r k b e i n g d o n e w i t h b l u e o p s i n . R a t h e r , t h e r o u t e o p s i n s , m o r e c o m m o n l y a p p r o a c h e d i s m u t a g e n e s i s o f a n o t h e r o p s i n t o p r o m o t e a b s o r p t i o n a t t h e b l u e w a v e l e n g t h s . S a k m a r h a s f o u n d t h a t b y m u t a t i n g n i n e p o s i t i o n s s i m u l t a n e o u s l y , a n h y p s o c h r o m i c s h i f t c a n b e o b s e r v e d t o 4 3 8 r r m . 6 4 T h e s e s u b s t i t u t i o n s i n c l u d e M 8 6 L : : G 9 O S : : A 1 1 7 G : : E 1 2 2 L : : A 1 2 4 T : : W 2 6 5 Y : : A 2 9 2 8 : : A 2 9 S S : : A 2 9 9 C . S i m i l a r w o r k w a s d o n e b y F a r r e n s , a n d f o u n d t h a t m u t a t i o n o f T 1 1 8 A : : E 1 2 2 D : : A 2 9 2 S i n r o d r h o d o p s i n , p r o d u c e d a p r o t e i n t h a t m a i n t a i n s s t r u c t u r e s t a b i l i t y a n d n o r m a l p h o t o a c t i v a t i o n a n d t r a n s d u c i n a c t i v i t y , a n d a b s o r b s a t 4 5 3 n m , 4 7 n m b l u e s h i f t e d . 9 7 W h i l e m u t a g e n e s i s o f t h i s n a t u r e m a y s e r v e t o h e l p p r e d i c t t h e a m i n o a c i d s n e c e s s a r y f o r b l u e s h i f t i n g t h e r e t i n a l a b s o r b a n c e a s c o m p a r e d t o r o d r h o d o p s i n , m u t a g e n e s i s o f t h e a c t u a l b l u e o p s i n i n d i c a t e s t h a t t h i s m a y o n l y b e t r u e f o r p r e d i c t i n g a m i n o a c i d s n e a r t h e B - i o n o n e r i n g a n d n o t n e a r t h e S c h i f f b a s e r e g i o n . 9 8 A s s h o w n p r e v i o u s l y , m u t a t i o n o f W 2 6 5 Y , G 9 0 8 a n d A 2 9 2 S i n t h e r o d o p s i n i n d i v i d u a l l y p r o d u c e 1 5 n m , 1 1 n m , a n d 1 0 n m b l u e s h i f t s , r e s p e c t i v e l y . M u t a t i o n o f c o r r e s p o n d i n g a m i n o a c i d s i n t h e b l u e p i g m e n t t h u s s h o u l d f o r c e r e d s h i f t i n g . B l u e o p s i n m u t a n t Y 2 6 2 W ( B - i o n o n e r i n g v i c i n i t y ) g e n e r a t e s a 1 0 n m r e d s h i f t , w h e r e a s S 2 8 9 A ( S B v i c i n i t y ) r e s u l t s i n n o c h a n g e , a n d S 8 7 G ( S B v i c i n i t y ) a c t u a l l y b l u e s h i f t s 1 0 n m . T h e e x t e n s i v e i n v e s t i g a t i o n s i n t o t h e s t r u c t u r e s o f o p s i n p r o t e i n s h a s l e a d t o a n i n c r e a s e d u n d e r s t a n d i n g o f t h e f a c t o r s r e s p o n s i b l e f o r c o l o r v i s i o n d e fi c i e n c i e s . T h e s e 2 1 d e fi c i e n c i e s a r e a r e s u l t o f m u t a g e n e s i s o f o n e o r m o r e o f t h e o p s i n p r o t e i n s , o r m o r e r a r e l y , l a c k o f o n e o f t h e o p s i n p r o t e i n s . C o l o r b l i n d n e s s h a s b e e n k n o w n s i n c e t h e 1 8 t h c e n t u r y , a n d i s o f t e n r e f e r r e d t o a s D a l t o n i s m i n h o n o r o f J o h n D a l t o n , o n e o f t h e fi r s t r e p o r t e d c o l o r d e fi c i e n t p e o p l e . 9 A l t h o u g h c o l o r v i s i o n d e f i c i e n c i e s a r e o f t e n t e r m e d ‘ c o l o r b l i n d n e s s ’ , m o r e g e n e r a l l y i t i s s i m p l y a r e d u c e d a b i l i t y t o d i f f e r e n t i a t e b e t w e e n c o l o r s . R e d a n d g r e e n c o n e s a r e h i g h l y c o n s e r v e d , a n d h a v e 9 6 % s e q u e n c e i d e n t i t y . B l u e c o n e s , w h i c h c o n s t i t u t e o n l y 1 0 % o f a l l c o n e s i n a h u m a n e y e , a r e o n l y 4 6 % i d e n t i c a l b a s e d o n s e q u e n c e s i m i l a r i t y . K n o w i n g t h i s , i t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t t h e m o s t c o m m o n c o l o r v i s i o n d e fi c i e n c i e s i n v o l v e t h e r e d a n d / o r g r e e n c o n e s . T h e r e d / g r e e n c o l o r v i s i o n d e fi c i e n c i e s a r e k n o w n a s p r o t a n o p e ( “ r e d b l i n d ” ) , d e u t e r a n o p e ( “ g r e e n b l i n d ” ) , p r o t a n o m a l o u s ( “ r e d w e a k ” ) , a n d d e u t e r a n o m a l o u s ( “ g r e e n w e a k ” ) . T h e l a t t e r o f t h e s e c o n d i t i o n s a c c o u n t s f o r a p p r o x i m a t e l y 5 0 % o f t h e r e d / g r e e n c o l o r b l i n d c a s e s ( ~ 1 / 2 5 m a l e s a n d 1 / 6 2 5 f e m a l e s ) , w h i l e t h e r e m a i n i n g c o n t r i b u t e i n a p p r o x i m a t e e q u a l p r o p o r t i o n s ( ~ l / 1 0 0 m a l e s a n d 1 / 1 0 , 0 0 0 f e m a l e s ) ” l o o T h e r e i s o n e m u t a t i o n i n t h e r e d c o n e p i g m e n t t h a t i s f a i r l y c o m m o n , b u t d o e s n o t r e s u l t i n c o l o r v i s i o n d e f e c t s . I n a r e c e n t s u r v e y , i t w a s f o u n d t h a t 6 2 % o f m a l e s h a v e a s e r i n e i n p o s i t i o n 1 8 0 , w h i l e 3 8 % h a v e a n a l a n i n e r e s i d u e . 1 0 1 B l u e c o n e d e f i c i e n c i e s a r e m o r e r a r e . T r i t a n o p i a i s a w e a k e n e d d i s c r i m i n a t i o n o f t h e b l u e , s h o r t w a v e l e n g t h s ( ~ 1 / 5 0 0 m a l e s a n d l / 6 5 , 0 0 0 f e m a l e s ) . T h e r a r e s t o f t h e c o l o r d e fi c i e n c i e s i s b l u e c o n e m o n o c h r o m a c y , w h i c h r e s u l t s f r o m l a c k o f b o t h t h e r e d a n d g r e e n c o n e o p s i n s , a n d e x i s t s i n o n l y l / 1 0 0 , 0 0 0 m a l e s . F i n a l l y , t h e s e v e r e s t f o r m o f c o l o r 2 2 C O M o f i t u n l i t t h e t ’ t ‘ J _ a t t e r . d e fi c i e n c y i s r o d m o n o c h r o m a c y ( ~ 1 / 2 0 , 0 0 0 m a l e s a n d 1 / 5 0 , 0 0 0 f e m a l e s ) . T h i s c o n d i t i o n p r o d u c e s t o t a l c o l o r b l i n d n e s s f r o m t h e l a c k o f a l l t h r e e c o n e p i g m e n t s . 1 0 2 W h i l e m u c h w o r k i n t h e p a s t s e v e r a l d e c a d e s h a s g e n e r a t e d a s i g n i fi c a n t d a t a b a s e o f i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e v i s u a l t r a n s d u c t i o n p r o c e s s , t h e s t r u c t u r e o f o p s i n p r o t e i n s , a n d e v e n t h e a m i n o a c i d s r e q u i r e d t o b e i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h e b o u n d c h r o m o p h o r e t o o b t a i n t h e o b s e r v e d o p s i n s h i f t s , t h e p r e c i s e m e c h a n i s m s f o r c o l o r v i s i o n r e m a i n u n k n o w n . I t i s n o t k n o w n w h i c h o f t h e p o s s i b l e t h e o r i e s i s m o s t p r e d o m i n a n t i n f o r c i n g t h e o p s i n s h i f t , n o r h o w m a n y d i f f e r e n t f a c t o r s a r e i n v o l v e d i n t h e s h i f t o f e a c h c o n e p i g m e n t . T h i s r e s e a r c h p r o j e c t , t h r o u g h u s e o f a n e n g i n e e r e d r h o d o p s i n m i m i c , w i l l a t t e m p t t o a n s w e r t h e s e q u e s t i o n s . 2 3 D . T h e n e e d f o r a s u r r o g a t e M e m b r a n e - b o u n d p r o t e i n s c o m p r i s e b e t w e e n 2 0 - 5 0 % o f a l l k n o w n p r o t e i n s a n d a r e o f t r e m e n d o u s i m p o r t a n c e i n p h a r m a c e u t i c a l s c i e n c e s a n d d r u g d e v e l o p m e n t . 1 0 3 A n i m p o r t a n t c l a s s o f m e m b r a n e - b o u n d p r o t e i n s i s t h e G - p r o t e i n c o u p l e d r e c e p t o r s ( G P C R S ) , o f w h i c h r h o d o p s i n i s a m e m b e r . G P C R S a r e i n v o l v e d i n n u m e r o u s b i o l o g i c a l f u n c t i o n s i n c l u d i n g g e n e r e g u l a t i o n , s i g n a l t r a n s d u c t i o n a n d c o l o r v i s i o n . A l s o o f s i g n i fi c a n c e a r e t h e s p e c i fi c p r o t e i n - s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n s t h a t a r e i n v o l v e d i n r e g u l a t i n g m a n y o f t h e s e b i o c h e m i c a l e v e n t s . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h w e s e e c o l o r s i s a r e m a r k a b l e e x a m p l e o f p r o t e i n / s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n i n w h i c h d i f f e r e n t p r o t e i n s e l i c i t d i f f e r e n t p r o p e r t i e s f r o m t h e s a m e s u b s t r a t e . O u r a p p r o a c h a t i n v e s t i g a t i n g t h e p r o t e i n / s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n s t h a t l e a d t o c o l o r v i s i o n m a y p r o v i d e u s e f u l i n s i g h t t h a t m a y b e e x t r a p o l a t e d t o o f f e r i n s i g h t s i n t o r a t i o n a l d r u g d e v e l o p m e n t a n d u n k n o w n e n z y m a t i c m e c h a n i s m s . O n l y l i m i t e d i n f o r m a t i o n i s k n o w n a b o u t m e m b r a n e - b o u n d p r o t e i n s , i n c l u d i n g r h o d o p s i n , d u e t o d i f fi c u l t i e s i n h a n d l i n g a n d m a n i p u l a t i n g t h e m . M o s t o f t h e c u r r e n t i n f o r m a t i o n k n o w n i s a r e s u l t o f t h e o r e t i c a l a n a l y s i s c o u p l e d w i t h s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s s t u d i e s a n d l o w r e s o l u t i o n s t r u c t u r a l d a t a . T h e m e m b r a n e b o u n d n a t u r e o f c o n e r h o d o p s i n s h a s m a d e p u r i fi c a t i o n , m a n i p u l a t i o n , a n d b i o p h y s i c a l s t u d i e s t e d i o u s . U n t i l r e c e n t l y , t h e r e w a s n o c o n c r e t e c r y s t a l l o g r a p h i c i n f o r m a t i o n a v a i l a b l e o n t h e r h o d o p s i n p i g m e n t s . I n 2 0 0 0 , P a l c z e w s k i , e t a 1 p u b l i s h e d t h e fi r s t h i g h r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e o f b o v i n e r h o d o p s i n . S 6 S t i l l h o w e v e r , t h e r e a r e n o c r y s t a l s t r u c t u r e s o f t h e c o n e o p s i n s f o r c o m p a r i s o n , a n d o n l y t h e o r e t i c a l m o d e l s e x i s t . B e c a u s e o f t h i s , t h e s t u d i e s n e c e s s a r y f o r a c o m p l e t e u n d e r s t a n d i n g o f t h e m e c h a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r w a v e l e n g t h 2 4 r e g u l a t i o n h a v e n o t b e e n c o m p l e t e d , a n d p r o m p t e d u s t o e n g i n e e r o f r h o d o p s i n p r o t e i n m i m i c . B y d e s i g n i n g a p r o t e i n t o m i r r r i c t h e P S B f o r m a t i o n w i t h r e t i n a l w e w i l l s y s t e m a t i c a l l y i n t r o d u c e c h a r g e s , s t e r i c s , a n d d i p o l e s a t v a r y i n g l o c a t i o n s w i t h r e s p e c t t o t h e b o u n d c h r o m o p h o r e w i t h h o p e s o f d e c i p h e r i n g t h e p o s s i b l e r e a s o n s f o r t h e a l t e r i n g o p s i n s h i f t s . A s u i t a b l e p r o t e i n m i m i c o f r h o d o p s i n m u s t f u l f i l l c e r t a i n c r i t e r i a . F o r e m o s t , i t s h o u l d b e t o l e r a n t a n d s t r u c t u r a l l y r o b u s t t o w i t h s t a n d m u l t i p l e m u t a t i o n s . N o t o n l y w i l l m a n y a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n s b e n e c e s s a r y f o r p r o b i n g w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n , b u t a l s o i n e n g i n e e r i n g t h e p r o t e i n t o b i n d r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . A l s o o f s i g n i fi c a n t i m p o r t a n c e , i t s h o u l d h a v e i t s t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e s o l v e d s o t h a t m u t a g e n e s i s o f t h e p r o t e i n c o u l d b e p l a n n e d r a t i o n a l l y . I n a d d i t i o n , t h e c h r o m o p h o r e i n t h e b i n d i n g p o c k e t s h o u l d o p t i m a l l y b e p r o t e c t e d f r o m t h e s o l v e n t t o e n s u r e t h e r e s u l t s w e s e e a r e o n l y a r e s u l t o f t h e d i r e c t i n t e r a c t i o n s o f t h e p r o t e i n w i t h t h e s u b s t r a t e . M o s t i m p o r t a n t l y , i t m u s t b i n d r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e , j u s t a s i n r h o d o p s i n . I n c h o o s i n g t h e p r o t e i n w e w o u l d t r a n s f o r m i n t o t h e r h o d o p s i n s u r r o g a t e , s e v e r a l o t h e r f a c t o r s w e r e c o n s i d e r e d a s w e l l . B e s i d e s h a v i n g a t h r e e - d i m e n s i o n a l c r y s t a l s t r u c t u r e a l r e a d y s o l v e d , t h e a b i l i t y o f t h e s u r r o g a t e p r o t e i n t o p r o d u c e h i g h r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e s i n a n e f fi c i e n t m a n n e r w o u l d b e a d v a n t a g e o u s f o r o u r p r o g r e s s . U l t i m a t e l y , w e w i l l w a n t t o d e t e r m i n e p r e c i s e o r i e n t a t i o n s a n d d i s t a n c e s o f a m i n o a c i d s w i t h r e s p e c t t o t h e s u b s t r a t e , r e t i n a l . A q u i c k t u m - a r o u n d t i m e i n c r y s t a l l o g r a p h y w i l l b e t h e m o s t e f f e c t i v e m e a n s o f d e t e r m i n i n g t h e c o n s e q u e n c e s o f t h e m u t a g e n e s i s p e r f o r m e d a n d i n h e l p i n g t o d e c i d e w h i c h m u t a t i o n s t o p u r s u e n e x t . 2 5 B l o c . C e l l ; W I A d d i t i o n a l l y , w e d e s i r e d a p r o t e i n c l o n e d i n t o a s y s t e m t h a t w a s m u c h e a s i e r t o w o r k w i t h t h a n m a m m a l i a n c u l t u r e s , i d e a l l y a n E . c o l i e x p r e s s i o n s y s t e m . T h e s u r r o g a t e p r o t e i n s h o u l d a l s o b e n o n - m e m b r a n e b o u n d , s m a l l , a n d c y t o s o l i c . P r e f e r e n c e f o r b i n d i n g r e t i n o i d s t r u c t u r e s w i l l a l s o b e a d v a n t a g e o u s t o t h e e n g i n e e r i n g p r o c e s s . S e v e r a l p r o t e i n s w e r e o f i n i t i a l i n t e r e s t i n c l u d i n g R X R ’ s a n d c e l l u l a r r e t i n o i d b i n d i n g p r o t e i n s . T h e c e l l u l a r r e t i n o i d b i n d i n g p r o t e i n s h a v e b e e n m o r e t h o r o u g h l y s t u d i e d , i n p a r t i c u l a r C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n 1 1 . P r o f e s s o r H o n g g a o Y a n ( D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) h a s d o n e e x t e n s i v e s t u d i e s w i t h H u m a n C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n I I ( C R A B P I I ) i n c l u d i n g m u t a g e n e s i s a n d s o l u t i o n N M R H M ’ 1 0 5 I t w a s c l o n e d i n t o a p E T - l 7 b p l a s m i d ( a n E . c o l i e x p r e s s i o n s y s t e m ) a n d h a d a p u b l i s h e d c r y s t a l s t r u c t u r e l o ‘ s ' 1 0 7 A d d i t i o n a l l y , C R A B P I I i s a s m a l l p r o t e i n ( 1 3 7 a m i n o a c i d s ) t h a t h a s h i g h e x p r e s s i o n l e v e l s . I t b e l o n g s t o t h e l i p o c a l i n f a m i l y o f p r o t e i n s i n w h i c h a l l m e m b e r s h a v e a v e r y r o b u s t s t r u c t u r e , a n d C R A B P H n a t i v e l y b i n d s a r e t i n o i d , r e t i n o i c a c i d . F o r t h e s e r e a s o n s , w e b e l i e v e d t h a t C R A B P I I w o u l d b e a s u i t a b l e t a r g e t f o r r e - e n g i n e e r i n g i n t o t h e r h o d o p s i n s u r r o g a t e , a n d P r o f e s s o r Y a n g r a c i o u s l y g i f t e d a p E T - 1 7 b C R A B P H c o n t a i n i n g c l o n e t o u s . 2 6 E . R e f e r e n c e s 1 . B e e l e y , N . R . A . ; S a g e , C . " G P C R S ; A n u p d a t e o n s t r u c t u r a l a p p r o a c h e s t o d r u g d i s c o v e r y . " T a r g e t s 2 0 0 3 , 2 , 1 9 - 2 5 . 2 . K l a b u n d e , T . ; G e r h a r d , H . " D r u g d e s i g n s t r a t e g i e s f o r t a r g e t i n g G - p r o t e i n c o u p l e d r e c e p t o r s . " C h e m b i o c h e m . 2 0 0 2 , 3 , 9 2 8 - 9 4 4 . 3 . O p r i a n , D . D . ; A s e n j o , A . B . ; L e e , N . ; P e l l e t i e r , S . L . " D e s i g n , c h e m i c a l s y n t h e s i s , a n d e x p r e s s i o n o f g e n e s f o r t h e 3 h u m a n c o l o r v i s i o n p i g m e n t s . " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 1 , 3 0 , 1 1 3 6 7 - 1 1 3 7 2 . 4 . M e r b s , S . L ; N a t h a n s , J . " A b s o r p t i o n s p e c t r a o f h u m a n c o n e p i g m e n t s . " N a t u r e 1 9 9 2 , 3 5 6 , 4 3 3 - 4 3 5 . 5 . L y t h g o e , J . N . , H a n d b o o k o f s e n s o r y p h y s i o l o g y . I n H a n d b o o k o f s e n s o r y p h y s i o l o g y , e d . ; D a r t n a l l , H . J . A . , S p r i n g e r : N e w Y o r k , 1 9 7 2 ; V o l . 7 / l , p p 6 0 4 - 6 2 4 . 6 . S h i c h i , H . , B i o c h e m i s t r y o f v i s i o n . e d . ; A c a d e m i c P r e s s , I n c . : N e w Y o r k , N Y , 1 9 8 3 ; V o l . p . 7 . T i f f a n y , J . M . ; N o o r j a h a n , P . ; A b d e l - L a t i f , A . A . ; H a r d i n g , J . J . ; M a y n e , R . ; B r e w t o n , R . G . ; R e n , Z . X . , B i o c h e m i s t r y o f t h e E y e . e d . ; C h a p m a n a n d H a l l : L o n d o n , U K , 1 9 9 7 ; V o l . p . 8 . C r e s c i t e l l i , F . , T h e v i s u a l c e l l s a n d v i s u a l p i g m e n t s o f t h e v e r t e b r a t e e y e . I n H a n d b o o k o f S e n s o r y P h y s i o l o g y , e d . ; D a r t n e l l , H . J . A . , S p r i n g e r - V e r l a g : N e w Y o r k , N Y , 1 9 7 2 ; V o l . V I I , p p 2 4 5 - 3 6 3 . 9 . W i s s i n g e r , B . ; S h a r p e , L . T . " N e w a s p e c t s o f a n o l d t h e m e : T h e g e n e t i c b a s i s o f h u m a n c o l o r v i s i o n . " A m . J . H u m . G e n e t . 1 9 9 8 , 6 3 , 1 2 5 7 - 1 2 6 2 . 2 7 1 0 . 1 1 . 1 2 . 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . P u g h , E . N . " R o d s a r e r o d s a n d c o n e s a r e c o n e s , a n d ( n e v e r ) t h e t w a i n s h a l l m e e t . " N e u r o n 2 0 0 1 , 3 2 , 3 7 5 - 3 8 0 . D i x o n , R . A . ; K o b i l k a , B . K . ; S t r a d e r , D . J . ; B e n o v i c , J . L . ; D o h l m a n , H . G . ; F r i e l l e , T . ; B o l a n o w s k i , M . A . ; B e n n e t t , C . D . ; R a n d s , E . ; D i e h l , R . E . ; M u m f o r d , R . A . ; S l a t e r , E . E . ; S i g a l , I . S . ; C a r o n , M . G . ; L e fl c o w i t z , R . J . ; S t r a d e r , C . D . " S t r u c t u r a l a n d t h e r m o d y n a m i c c o n s e q u e n c e s o f b u r y i n g a c h a r g e d r e s i d u e w i t h i n t h e h y d r o p h o b i c c o r e o f T 4 l y s o z y m e . " N a t u r e 1 9 8 6 , 3 2 1 , 7 5 - 7 9 . F e i n , A . ; S z u t s , E . Z . , P h o t o r e c e p t o r s : T h e i r r o l e i n v i s i o n . e d . ; C a m b r i d g e U n i v e r s i t y P r e s s : C a m b r i d g e , 1 9 8 2 ; V o l . p . H o f f m a n n , R . , T h e S a m e a n d N o t t h e S a m e . e d . ; C o l u m b i a U n i v e r s i t y P r e s s : N e w Y o r k , N Y , 1 9 9 5 ; V o l . p . S a k m a r , T . P . " R h o d o p s i n : a p r o t o t y p i c a l G - p r o t e i n c o u p l e d r e c e p t o r . " P r o g . N u c l e i c A c i d R e s . M o l . B i o l . 1 9 9 8 , 5 9 , 1 - 3 4 . D e G r i p , W . J . ; G r a y , D . ; G i l l e s p i e , J . ; B o v e e , P . H . ; V a n d e n B e r g , E . M . ; L u g t e n b u r g , J . ; R o t h s c h i l d , K . J . " P h o t o e x c i t a t i o n o f r h o d o p s i n : c o n f o r m a t i o n c h a n g e s i n t h e c h r o m o p h o r e , p r o t e i n a n d a s s o c i a t e d l i p i d s a s d e t e r m i n e d b y F T I R d i f f e r e n c e s p e c t r o s c o p y . " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 8 8 , 4 8 , 4 9 7 - 5 0 4 . K o n i g , B . ; W e l t e , W . ; H o f r n a n n , K . P . " P h o t o a c t i v a t i o n o f r h o d o p s i n a n d i n t e r a c t i o n w i t h t r a n s d u c i n i n d e t e r g e n t m i c e l l e s . E f f e c t o f ' d o p i n g ' w i t h s t e r o i d m o l e c u l e s . " F E B S L e t t . 1 9 8 9 , 2 5 7 , 1 6 3 - 1 6 6 . B i r g e , R . R . " P h o t o p h y s i c s o f l i g h t t r a n s d u c t i o n i n r h o d o p s i n a n d b a c t e r i o r h o d o p s i n . " A n n u . R e v . B i o p h y s . B i o e n g . 1 9 8 1 , 1 0 , 3 1 5 - 3 5 4 . 2 8 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 5 . 2 6 . M a t h i e s , R . , R e s o n a n c e R a m a n s p e c t r o s c o p y o f r h o d o p s i n a n d b a c t e r i o r h o d o p s i n i s o t o p i c a n a l o g s . I n M e t h o d s E n z y m o l . , e d . ; 1 9 8 2 ; V o l . 8 8 , p p 6 3 3 - 6 4 3 . C o o p e r , A . " E n e r g y u p t a k e i n t h e fi r s t s t e p o f v i s u a l e x c i t a t i o n . " N a t u r e 1 9 7 9 , 2 8 2 , 5 3 1 - 5 3 3 . E m e i s , D . ; K u h n , H . ; R e i c h e r t , J . ; H o f r n a n n , K . P . " C o m p l e x f o r m a t i o n b e t w e e n m e t a r h o d o p s i n I I a n d G T P - b i n d i n g p r o t e i n i n b o v i n e p h o t o r e c e p t o r m e m b r a n e s l e a d s t o a s h i f t o f t h e p h o t o p r o d u c t e q u i l i b r i u m . " F E B S L e t t . 1 9 8 2 , 1 4 3 , 2 9 - 3 4 . B e n n e t t , N . ; M i c h e l - V i l l a z , M . ; K u h n , H . " L i g h t - i n d u c e d i n t e r a c t i v a t i o n b e t w e e n r h o d o p s i n a n d t h e G T P - b i n d i n g p r o t e i n . M e t a r h o d o p s i n I I i s t h e m a j o r p h o t o p r o d u c t i n v o l v e d . " E u r . J . B i o c h e m . 1 9 8 2 , I 2 7 , 9 7 - 1 0 3 . K l i g e r , D . ; L e w i s , J . " S p e c t r a l a n d k i n e t i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f v i s u a l p i g m e n t p h o t o i n t e r m e d i a t e s . " I s r . . 1 . C h e m . 1 9 9 5 , 3 5 , 2 8 9 - 3 0 7 . S o u t o , M . L . ; B o r h a n , B . ; N a k a n i s h i , K . , L o w - t e m p e r a t u r e p h o t o a f fi n i t y l a b e l i n g o f r h o d o p s i n a n d i n t e r m e d i a t e s a l o n g t r a n s d u c t i o n p a t h . I n M e t h o d s E n z y m o l . , e d . ; 2 0 0 0 ; V o l . 3 1 6 , p p 4 2 5 - 3 4 5 . S h i e h , T . ; H a n , M . ; S a k m a r , T . P . ; S m i t h , S . O . " T h e s t e r i c t r i g g e r i n r h o d o p s i n a c t i v a t i o n . " J . M o l . B i o l . 1 9 9 7 , 2 6 9 , 3 7 3 - 3 8 4 . Y a n , B . ; N a k a n i s h i , K ; S p u d i c h , J . L . " M e c h a n i s m o f a c t i v a t i o n o f s e n s o r y r h o d o p s i n 1 : E v i d e n c e f o r a s t e r i c t r i g g e r . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 1 , 8 8 , 9 4 1 2 - 9 4 1 6 . A m i s , S . ; H o f r n a n n , K . P . " T w o d i f f e r e n t f o r m s o f m e t a r h o d o p s i n I I : S c h i f f b a s e d e p r o t o n a t i o n r e c e d e s p r o t o n u p t a k e a n d s i g n a l i n g s t a t e . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 3 , 9 0 , 7 8 4 9 - 7 8 5 3 . 2 9 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . S z u n d i , 1 . ; M a h , T . L . ; L e w i s , J . W . ; J a e g e r , S . ; E r n s t , O . P . ; H o f m a n n , K . P . ; K l i g e r , D . S . " P r o t o n t r a n s f e r r e a c t i o n s l i n k e d t o r h o d o p s i n a c t i v a t i o n . " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 8 , 3 7 , 1 4 2 3 7 - 1 4 2 4 4 . G r a y - K e l l e r , M . P . ; D e t w i l e r , P . B . " T h e c a l c i u m f e e d b a c k s i g n a l i n t h e p h o t o t r a n s d u c t i o n c a s c a d e o f v e r t e b r a t e r o d s . " N e u r o n 1 9 9 4 , 1 3 , 8 4 9 - 8 6 1 . S c h n e t k a m p , P . P . M . " H o w d o e s t h e r e t i n a l r o d N a - C a + K e x c h a n g e r r e g u l a t e c y t o s o l i c f r e e C a 2 + ? " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 5 , 2 7 0 , 1 3 2 3 1 - 1 3 2 3 9 . R a n d o , R . R . " T h e c h e m i s t r y o f v i t a m i n A a n d v i s i o n . " A n g e w . C h e m . I n t ] . E d . E n g l . 1 9 9 0 , 2 9 , 4 6 1 - 4 8 0 . R a n d o , R . R . " P o l y e n e s a n d v i s i o n . " C h e m . B i o l . 1 9 9 6 , 3 , 2 5 5 - 2 6 2 . P e p e , I . M . " R h o d o p s i n a n d p h o t o t r a n s d u c t i o n . " . 1 . P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . B - B i o l . 1 9 9 9 , 4 8 , 1 - 1 0 . W h e e l e r , G . L . ; B i t e n s k y , M . W . " A l i g h t - a c t i v a t e d G T P a s e i n v e r t e b r a t e p h o t o r e c e p t o r s : r e g u l a t i o n o f l i g h t - a c t i v a t e d c y c l i c G M P p h o s p h o d i e s t e r a s e . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i , U S A 1 9 7 7 , 7 4 , 4 2 3 8 - 4 2 4 2 . F u n g , B . K . ; H u r l e y , J . B . ; S t r y e r , L . " F l o w o f i n f o r m a t i o n i n t h e l i g h t - t r i g g e r e d c y c l i c n u c l e o t i d e c a s c a d e o f v i s i o n . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i , U S A 1 9 8 1 , 7 8 , 1 5 2 - 1 5 6 . C o o p e r , A . ; C o n v e r s e , C . A . " E n e r g e t i c s o f p r i m a r y p r o c e s s e s i n v i s u a l e x c i t a t i o n : P h o t o c a l o r i m e t r y o f r h o d o p s i n i n r o d o u t e r s e g m e n t m e m b r a n e s . " B i o c h e m i s t r y 1 9 7 6 , 1 5 , 2 9 7 0 - 2 9 7 8 . 3 0 3 6 . 3 7 . 3 8 . 3 9 . 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 4 . S c h n i c k , G . A . ; C o o p e r , T . M . ; H o l l o w a y , R . A . ; M u r r a y , L . P . ; B i r g e , R . R . " E n e r g y s t o r a g e i n t h e p r i m a r y p h o t o c h e m i c a l e v e n t s o f r h o d o p s i n a n d i s o r h o d o p s i n . " B i o c h e m i s t r y 1 9 8 7 , 2 6 , 2 5 5 6 - 2 5 6 2 . M i k i , N . ; K e i m s , J . J . ; M a r c u s , F . R . ; F r e e m a n , J . ; B i t e n s k y , M . W . " R e g u l a t i o n o f c y c l i c n u c l e o t i d e c o n c e n t r a t i o n s i n p h o t o r e c e p t o r s : A n A T P - d e p e n d e n t s t i m u l a t i o n o f c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e b y l i g h t . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 7 3 , 7 0 , 3 8 2 0 - 3 8 2 4 . L a m b , T . D . " G a i n a n d k i n e t i c s o f a c t i v a t i o n i n t h e G - p r o t e i n c a s c a d e o f p h o t o t r a n s d u c t i o n . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 6 , 9 3 , 5 6 6 - 5 7 0 . D a r t n a l l , H . J . A . " T h e p h o t o s e n s i t i v i t i e s o f v i s u a l p i g m e n t s i n t h e p r e s e n c e o f h y d r o x y l a m i n e . " V i s i o n R e s . 1 9 6 8 , 8 , 3 3 9 - 3 5 8 . D a r t n a l l , H . J . A . ; G o o d e v e , C . F . ; L y t h g o e , R . J . " T h e q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e p h o t o c h e m i c a l b l e a c h i n g o f v i s u a l p u r p l e s o l u t i o n s i n m o n o c h r o m a t i c l i g h t . " P r o c . R o y . S o c . A 1 9 3 6 , 1 5 6 , 1 5 8 - 1 7 0 . K i m , J . E . ; T a u b e r , M . J . ; M a t h i e s , R . A . " W a v e l e n g t h d e p e n d e n t c i s - t r a n s i s o m e r i z a t i o n i n v i s i o n . " B i o c h e m i s t r y 2 0 0 1 , 4 0 , 1 3 7 7 4 - 1 3 7 7 8 . S c h n e i d e r " S p e c t r a l v a r i a t i o n i n t h e p h o t o s e n s i t i v i t y o f v i s u a l p u r p l e . " P r o c . R o y . S o c . A 1 9 3 9 , 1 7 0 , 1 0 2 - 1 1 2 . H e c h t , S . ; S h l a e r , S . ; P i r e n n e , M . H . " E n e r g y , q u a n t a , a n d v i s i o n . " J . G e n . P h y s i o l . 1 9 4 2 , 2 5 , 8 1 9 - 8 4 0 . P i t t , G . A . J . ; C o l l i n s , F . D . ; M o r t o n , R . A . ; S t o k , P . " R h o d o p s i n . V I I I . N - R e t i n y l i d e n e m e t h y l a m i n e , a n i n d i c a t o r y e l l o w a n a l o g . " B i o c h e m . J . 1 9 5 5 , 5 9 , 1 2 2 - 1 2 8 . 3 1 4 5 . 4 6 . 4 7 . 4 8 . 4 9 . 5 0 . 5 1 . 5 2 . 5 3 . B l a t z , P . E . ; B a u m g a r t n e r , N . ; B a l a s u b r a m a n i y a n , B . ; B a l a s u b r a m a n i y a n , P . ; S t e d m a n , F . " W a v e l e n g t h r e g u l a t i o n i n v i s u a l p i g m e n t c h r o m o p h o r e . L a r g e i n d u c e d b a t h o c h r o m i c s h i fi s i n r e t i n o l a n d r e l a t e d p o l y e n e s . " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 7 1 , 1 4 , 5 3 1 - 5 4 9 . E r i c k s o n , J . 0 . ; B l a t z , P . E . " N - r e t i n y l i d e n e - l - a m i n o - 2 — p r o p a n o l : a S c h i f f b a s e a n a l o g f o r r h o d o p s i n . " V i s i o n R e s . 1 9 6 8 , 8 , 1 3 6 7 - 1 3 7 5 . M a x w e l l , J . C . P h i l . T r a n s . R o y . S o c . 1 8 6 0 , 1 5 0 , 5 7 - 8 4 . S m i t h , V . C . ; P o k o m y , J . " S p e c t r a l s e n s i t i v i t y o f c o l o r - b l i n d o b s e r v e r s a n d t h e h u m a n c o n e p h o t o p i g m e n t s . " V i s i o n R e s . 1 9 7 2 , 1 2 , 2 0 5 9 - 2 0 7 1 . R u s h t o n , W . A . H . , H a n d b o o k o f s e n s o r y p h y s i o l o g y . e d . ; S p r i n g e r : N e w Y o r k , N Y , 1 9 7 2 ; V o l . 7 , p 3 6 4 - 3 9 4 . N e i t z , M . ; N e i t z , J . ; J a c o b s , G . H . " S p e c t r a l t u n i n g o f p i g m e n t s u n d e r l y i n g r e d - g r e e n c o l o r v i s i o n . " S c i e n c e 1 9 9 1 , 2 5 2 , 9 7 1 - 9 7 4 . S c h n a p f , J . L . ; K r a fi , T . W . ; B a y l o r , D . A . " S p e c t r a l s e n s i t i v i t y o f h u m a n c o n e p h o t o r e c e p t o r s . " N a t u r e 1 9 8 7 , 3 2 5 , 4 3 9 - 4 4 1 . B r o w n , P . K . ; W a l d , G . " V i s u a l p i g m e n t s i n s i n g l e r o d s a n d c o n e s o f t h e h u m a n r e t i n a . D i r e c t m e a s u r e m e n t s r e v e a l m e c h a n i s m s o f h u m a n n i g h t a n d c o l o r v i s i o n . " S c i e n c e 1 9 6 4 , 1 4 4 , 4 5 - 5 2 . D a r t n a l l , H . J . A . ; B o w m a k e r , J . K . ; M o l l o n , J . D . " H u m a n v i s u a l p i g m e n t s : m i c r o s p e c t r o p h o t o m e t r i c r e s u l t s f r o m t h e e y e s o f s e v e n p e r s o n s . " P r o c . R . S o c . B 1 9 8 3 , 2 2 0 , 1 1 5 - 1 3 0 . 3 2 5 4 . 5 5 . 5 6 . 5 7 . 5 8 . 5 9 . 6 0 . 6 1 . N a k a n i s h i , K . ; B a l o g h - N a i r , V . ; A m a b o l d i , M . ; T s u j i m o t o , K . ; H o n i g , B . " A n e x t e r n a l p o i n t c h a r g e m o d e l f o r b a c t e r i o r h o d o p s i n t o a c c o u n t f o r i t s p u r p l e c o l o r . " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 8 0 , 1 0 2 , 7 9 4 5 - 7 9 4 7 . M o t t o , M . G . ; S h e v e s , M . ; T s u j i m o t o , K . ; B a l o g h - N a i r , V . ; N a k a n i s h i , K . " O p s i n s h i f t s i n b o v i n e r h o d o p s i n a n d b a c t e r i o r h o d o p s i n . C o m p a r i s o n o f t w o e x t e r n a l p o i n t - c h a r g e m o d e l s . " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 8 0 , 1 0 2 , 7 9 4 7 - 7 9 4 9 . P a l c z e w s k i , K . ; K u m a s a k a , T . ; H o r i , T . ; B e h n k e , C . A . ; M o t o s h i m a , H . ; F o x , B . A . ; L e T r o n g , 1 . ; T e l l e r , D . C . ; O k a d a , T . ; S t e n k a m p , R . E . ; Y a m a m o t o , M . ; M i y a n o , M . " C r y s t a l s t r u c t u r e o f r h o d o p s i n : A G p r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o r . " S c i e n c e 2 0 0 0 , 2 8 9 , 7 3 9 - 7 4 5 . S c h e r t l e r , G . F . X . ; H a r g r a v e , P . A . " P r o j e c t i o n s t r u c t u r e o f f r o g r h o d o p s i n i n t w o c r y s t a l f o r m s . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 5 , 9 2 , 1 1 5 7 8 - 1 1 5 8 2 . U n g e r , V . M . ; H a r g r a v e , P . A . ; B a l d w i n , J . M . ; S c h e r t l e r , G . F . X . " A r r a n g e m e n t o f r h o d o p s i n t r a n s m e m b r a n e a - h e l i c e s . " N a t u r e 1 9 9 7 , 3 8 9 , 2 0 3 - 2 0 6 . B a l d w i n , J . M . ; S c h e r t l e r , G . F . X . ; U n g e r , V . M . " A n o r - c a r b o n t e m p l a t e f o r t h e t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s i n t h e r h o d o p s i n f a m i l y o f G - p r o t e i n c o u p l e d r e c e p t o r s . " J . M o l . B i o l . 1 9 9 7 , 2 7 2 , 1 4 4 - 1 6 4 . P o g o z h e v a , I . D . ; L o m z i e , A . L . ; M o s b e r g , H . I . " T h e t r a n s m e m b r a n e 7 - a - b u n d l e o f r h o d o p s i n : D i s t a n c e g e o m e t r y c a l c u l a t i o n s w i t h h y d r o g e n b o n d i n g c o n s t r a i n t s . " B i o p h y s . J . 1 9 9 7 , 7 2 , 1 9 6 3 - 1 9 8 5 . H e r z y k , P . ; H u b b a r d , R . E . " C o m b i n e d b i o p h y s i c a l a n d b i o c h e m i c a l i n f o r m a t i o n c o n fi r m s a r r a n g e m e n t o f t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s v i s i b l e f r o m t h r e e - d i m e n s i o n a l m a p o f f r o g r h o d o p s i n . " J . M o l . B i o l . 1 9 9 8 , 2 8 1 , 7 4 1 - 7 5 4 . 3 3 69. 6 3 . 6 3 . 6 5 . 6 7 . 6 8 . 6 2 . 6 3 . 6 5 . 6 6 . 6 7 . 6 8 . 6 9 . S c h e r t l e r , G . F . X . ; V i l l a , C . ; H e n d e r s o n , R . " P r o j e c t i o n s t r u c t u r e o f r h o d o p s i n . " N a t u r e 1 9 9 3 , 3 6 2 , 7 7 0 - 7 7 2 . U n g e r , V . M . ; S c h e r t l e r , G . F . " L o w r e s o l u t i o n s t r u c t u r e o f b o v i n e r h o d o p s i n d e t e r m i n e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y . " B i o p h y s . J . 1 9 9 5 , 6 8 , 1 7 7 6 - 1 7 8 6 . L i n , S . W . ; K o c h e n d o e r f e r , G . G . ; C a r o o l , K . S . ; W a n g , D . ; M a t h i e s , R . A . ; S a k m a r , T . P . " M e c h a n i s m s o f s p e c t r a l t u n i n g i n b l u e c o n e v i s u a l p i g m e n t s . " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 8 , 2 7 3 , 2 4 5 8 3 - 2 4 5 9 1 . N a t h a n s , J . " D e t e r m i n a n t s o f v i s u a l p i g m e n t a b s o r b a n c e : R o l e o f c h a r g e d a m i n o a c i d s i n t h e p u t a t i v e t r a n s m e m b r a n e s e g m e n t s . " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 0 , 2 9 , 9 3 7 - 9 4 2 . K a k i t a n i , H . ; K a k i t a n i , T . ; R o d m a n , H . ; H o n i g , B . " O n t h e m e c h a n i s m o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n i n v i s u a l p i g m e n t s . " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 8 5 , 4 1 , 4 7 1 - 4 7 9 . T a n , Q . ; L o u , J . ; B o r h a n , B . ; K a m a u k h o v a , E . ; B e r o v a , N . ; N a k a n i s h i , K . " A b s o l u t e s e n s e o f t w i s t o f t h e C 1 2 - C 1 3 b o n d o f t h e r e t i n a l c h r o m o p h o r e i n b o v i n e r h o d o p s i n b a s e d o n e x c i t o n - c o u p l e d C D s p e c t r a o f 1 1 , 1 2 - d i h y d r o r e t i n a l a n a l o g u e s . " A n g e w . C h e m . I n t l . E d . E n g l . 1 9 9 7 , 3 6 , 2 0 8 9 - 2 0 9 3 . V e r d e g e m , P . J . E . ; B o v e e - G e u r t s , P . H . M . ; d e G r i p , W . J . ; L u g t e n b u r g , J . ; d e G r o o t , H . J . M . " R e t i n y l i d e n e l i g a n d s t r u c t u r e i n b o v i n e r h o d o p s i n , m e t a r h o d o p s i n - I , a n d l O - m e t h y l r h o d o p s i n f r o m i n t e r n u c l e a r d i s t a n c e m e a s u r e m e n t s u s i n g l 3 C - l a b e l i n g a n d 1 - D r o t a t i o n a l r e s o n a n c e M A S N M R . " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 9 , 3 8 , 1 1 3 1 6 - 1 1 3 2 4 . B l a t z , P . E . ; L i e b m a n , P . A . " W a v e l e n g t h r e g u l a t i o n i n v i s u a l p i g m e n t s . " E x p . E y e R e s . 1 9 7 3 , 1 7 , 5 7 3 - 5 8 0 . 3 4 p ‘ v SO. ' 7 . ' . 7 0 . 7 1 . 7 2 . 7 3 . 7 4 . 7 5 . 7 6 . 7 7 . 7 8 . 7 9 . 8 0 . K r o p f , A . ; H u b b a r d , R . " T h e m e c h a n i s m o f b l e a c h i n g r h o d o p s i n . " A n n . N . Y . A c a d . S c i . 1 9 5 8 , 7 4 , 2 6 6 - 2 8 0 . B l a t z , P . E . ; M o h l e r , J . ; N a v a n g u l , H . " A n i o n i n d u c e d w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n o f a b s o r p t i o n m a x i m a o f S c h i f f b a s e s o f r e t i n a l . " B i o c h e m i s t r y 1 9 7 2 , 1 1 , 8 4 8 - 8 5 5 . H o n i g , B . ; G r e e n b e r g , A . ; D i n u r , U . ; E b r e y , T . " V i s u a l p i g m e n t s p e c t r a : I m p l i c a t i o n s o f t h e p r o t o n a t i o n o f t h e r e t i n a l S c h i f f b a s e . " B i o c h e m i s t r y 1 9 7 6 , 1 5 , 4 5 9 3 - 4 4 9 9 . W a l d , G . " V i t a m i n A i n t h e r e t i n a . " N a t u r e 1 9 3 3 , 1 3 2 , 3 1 6 - 3 1 7 . M o r t o n , R . A . ; G o o d w i n , T . W . " P r e p a r a t i o n o f r e t i n e n e i n v i t r o . " N a t u r e 1 9 4 4 , 1 5 3 , 4 0 5 - 4 0 6 . H a r g r a v e , P . A . " T h e a m i n o - t e r m i n a l t r y p t i c p e p t i d e o f b o v i n e r h o d o p s i n . A g l y c o p e p t i d e c o n t a i n i n g t w o s i t e s o f o l i g o s a c c h a r i d e a t t a c h m e n t . " B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 9 7 7 , 4 9 2 , 8 3 - 9 4 . H a r g r a v e , P . A . ; M c D o w e l l , J . H . ; C u r t i s , D . R . ; W a n g , J . K . ; J u s z c z a k , E . ; F o n g , S . L . ; M o h a n n a R a o , J . K . ; A r g o s , P . " T h e s t r u c t u r e o f b o v i n e r h o d o p s i n . " B i o p h y s . S t r u c t . M e c h . 1 9 8 3 , 9 , 2 3 5 - 2 4 4 . C o l l i n s , F . D . " R h o d o p s i n a n d i n d i c a t o r y e l l o w . " N a t u r e 1 9 5 3 , 1 7 1 , 4 6 9 - 4 7 2 . M o r t o n , R . A . ; P i t t , G . A . J . " R h o d o p s i n . I X . p H a n d t h e h y d r o l y s i s o f i n d i c a t o r y e l l o w . " B i o c h e m . J . 1 9 5 5 , 5 9 , 1 2 8 - 1 3 4 . B o w n d s , D . " S i t e o f a t t a c h m e n t o f r e t i n a l i n r h o d o p s i n . " N a t u r e 1 9 6 7 , 2 1 6 , 1 1 7 8 - 1 1 8 1 . A k h t a r , M . ; B l o s s e , D . ; D e w h u r s t , P . " S t u d i e s o n v i s i o n . T h e n a t u r e o f t h e r e t i n a l - o p s i n l i n k a g e . " B i o c h e m . J . 1 9 6 8 , 1 1 0 , 6 9 3 - 7 0 2 . 3 5 b 4 8 5 . 8 8 . 8 9 . 8 1 . 8 2 . 8 3 . 8 4 . 8 5 . 8 6 . 8 7 . 8 8 . 8 9 . H u b b a r d , R . E . I n P a p e r 4 , P r o c . N a t . P h y s . L a b . S y m p . N o . 8 , L o n d o n , 1 9 5 8 ; ’ E d . " " E d s . ' L o n d o n , 1 9 5 8 ; p A p p . O s e r o f f , A . ; C a l l e n d e r , R . " R e s o n a n c e R a m a n s p e c t r o s c o p y o f r h o d o p s i n i n r e t i n a l d i s k m e m b r a n e s . " B i o c h e m i s t r y 1 9 7 4 , 1 3 , 4 2 4 3 - 4 2 4 8 . W a l d , G . " T h e m o l e c u l a r b a s i s o f v i s u a l e x c i t a t i o n . " S c i e n c e 1 9 6 8 , 1 6 2 , 2 3 0 - 2 3 9 . H o n i g , B . ; D i n u r , U . ; N a k a n i s h i , K . ; B a l o g h - N a i r , V . ; G a w i n o w i c z , M . A . ; A m a b o l d i , M . ; M o t t o , M . " A n e x t e r n a l p o i n t - c h a r g e m o d e l f o r w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n i n v i s u a l p i g m e n t s . " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 9 , 1 0 1 , 7 0 8 4 - 7 0 8 6 . N a k a n i s h i , K . P u r e A p p l . C h e m . 1 9 8 5 , 5 7 , 7 6 9 - 7 7 6 . M o l l e v a n g e r , L . C . P . J . ; K e n t g e n s , A . P . M . ; P a r d o e n , J . A . ; C o u r t i n , J . M . L . ; V e e m a n , W . S . ; L u g t e n b u r g , J . ; d e G r i p , W . J . " H i g h - r e s o l u t i o n s o l i d - s t a t e c a r b o n - 1 3 N M R s t u d y o f c a r b o n s C 5 a n d C 1 2 o f t h e c h r o m o p h o r e o f b o v i n e r h o d o p s i n . E v i d e n c e f o r a 6 - s - c i s c o n f o r m a t i o n w i t h n e g a t i v e c h a r g e p e r t u r b a t i o n n e a r C 1 2 . " E u r . J . B i o c h e m . 1 9 8 7 , 1 6 3 , 9 - 1 4 . A m a b o l d i , M . ; M o t t o , M . G . ; T s u j i m o t t o , K . ; B a l o g h - N a i r , V . ; N a k a n i s h i , K . " H y d r o r e t i n a l s a n d h y d r o r h o d o p s i n s . " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 9 , 1 0 1 , 7 0 8 2 - 7 0 8 4 . S a k m a r , T . P . ; F r a n k e , R . R . ; K h o r a n a , H . G . " G l u t a m i c a c i d - 1 1 3 s e r v e s a s t h e r c t i n y l i d e n e S c h i f f b a s e c o u n t e r i o n i n b o v i n e r h o d o p s i n . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i , U S A 1 9 8 9 , 8 6 , 8 3 0 9 - 8 3 1 3 . Z h u k o v s k y , E . A . ; O p r i a n , D . D . " E f f e c t o f c a r b o x y l i c s i d e c h a i n s o n t h e a b s o r p t i o n m a x i m u m o f v i s u a l p i g m e n t s . " S c i e n c e 1 9 8 9 , 2 4 6 , 9 2 8 - 9 3 0 . 3 6 9 1 . 9 4 . 9 5 . 9 6 . 9 1 s o 0 0 9 0 . 9 1 . 9 2 . 9 3 . 9 4 . 9 5 . 9 6 . 9 7 . 9 8 . N a t h a n s , J . ; T h o m a s , D . ; H o g n e s s , D . S . " M o l e c u l a r g e n e t i c s o f h u m a n c o l o r v i s i o n : T h e g e n e s e n c o d i n g b l u e , g r e e n , a n d r e d p i g m e n t s . " S c i e n c e 1 9 8 6 , 2 3 2 , 1 9 3 - 2 3 2 . G a t , Y . ; S h e v e s , M . " A m e c h a n i s m f o r c o n t r o l l i n g t h e p K a o f t h e r e t i n a l p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e i n r e t i n a l p r o t e i n s . A s t u d y w i t h m o d e l c o m p o u n d s . " . 1 . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 3 , 1 1 5 , 3 7 7 2 - 3 7 7 3 . R a f f e r t y , C . N . " L i g h t - i n d u c e d p e r t u r b a t i o n o f a r o m a t i c r e s i d u e s i n b o v i n e r h o d o p s i n a n d b a c t e r i o r h o d o p s i n . " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 7 9 , 2 9 , 1 0 9 - 1 2 0 . H o n i g , B . ; H u d s o n , 8 . ; S y k e s , B . D . ; K a r p l u s , M . " R i n g o r i e n t a t i o n i n B - i o n o n e a n d r e t i n a l s . " P r o c . N a t ] . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 7 1 , 6 8 , 1 2 8 9 - 1 2 9 3 . A s e n j o , A . B . ; R i m , J . ; O p r i a n , D . D . " M o l e c u l a r d e t e r m i n a n t s o f h u m a n r e d / g r e e n c o l o r d i s c r i m i n a t i o n . " N e u r o n 1 9 9 4 , 1 2 , 1 1 3 1 - 1 1 3 8 . Y o k o y a m a , R . ; Y o k o y a m a , S . " C o n v e r g e n t e v o l u t i o n o f t h e r e d - a n d g r e e n - l i k e v i s u a l p i g m e n t g e n e s i n fi s h , a s t y a n a x f a s c i a t u s , a n d h u m a n . " P r o c . N a t ] . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 0 , 8 7 , 9 3 1 5 - 9 3 1 8 . C h a n , T . ; L e e , M . L . ; S a k m a r , T . P . " I n t r o d u c t i o n o f h y d r o x y l - b e a r i n g a m i n o a c i d s c a u s e s b a t h o c h r o m i c s p e c t r a l s h i f t s i n r h o d o p s i n . A m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n s r e s p o n s i b l e f o r r e d - g r e e n c o l o r p i g m e n t s p e c t r a l t u n i n g . " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 2 , 2 6 7 , 9 4 7 8 - 9 4 8 0 . Y o s h i z a w a , T . " T h e r o a d t o c o l o r v i s i o n : s t r u c t u r e , e v o l u t i o n a n d f u n c t i o n o f c h i c k e n a n d g e c k o v i s u a l p i g m e n t s . " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 9 2 , 5 6 , 8 5 9 - 8 6 7 . J a n z , J . M . ; F a r r e n s , D . L . " E n g i n e e r i n g 3 f u n c t i o n a l b l u e - w a v e l e n g t h - s h i fi e d r h o d o p s i n m u t a n t . " B i o c h e m i s t r y 2 0 0 1 , 4 0 , 7 2 1 9 - 7 2 2 7 . 3 7 . d m ' 4 . 9 “ ] . . . . . , 9 9 . l 9 0 . 1 0 1 . 1 0 3 . 1 0 6 . 9 9 . 1 0 0 . 1 0 1 . 1 0 2 . 1 0 3 . 1 0 4 . 1 0 5 . 1 0 6 . 1 0 7 . F a s i c k , J . 1 . ; L e e , N . ; O p r i a n , D . D . " S p e c t r a l t u n i n g i n t h e h u m a n b l u e c o n e p i g m e n t . " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 9 , 3 8 , 1 1 5 9 3 - 1 1 5 9 6 . F r a n c o i s , J . , H e r e d i t y i n o p h t h a l m o l o g y . e d . ; M o s b y : S t . L o u i s , 1 9 6 1 ; V o l . p . l a g e r , W . , G e n e t i c s o f c o n g e n i t a l c o l o u r d e fi c i e n c i e s . I n H a n d b o o k o f s e n s o r y p h y s i o l o g y , e d . ; A u t r u m , V . H . ; J u n g , R . ; L o e w e n s t e i n , D . , S p r i n g e r : H e i d e l b e r g , 1 9 7 2 ; V o l . p p 6 2 5 - 6 6 9 . W i n d e r i c k x , J . " P o l y m o r p h i s m i n r e d p h o t o p i g m e n t u n d e r l i e s v a r i a t i o n i n c o l o u r m a t c h i n g . " N a t u r e 1 9 9 2 , 3 5 6 , 4 3 1 - 4 3 3 . H e s s , R . F . ; S h a r p e , L . T . ; N o r d b y , K . , N i g h t v i s i o n : B a s i c c l i n i c a l a n d a p p l i e d a s p e c t s . e d . ; C a m b r i d g e U n i v e r s i t y P r e s s : C a m b r i d g e , 1 9 9 0 ; V o l . p . A r k i n , I . T . ; B r u n g e r , A . T . ; E n g e l m a n , D . M . " A r e t h e r e d o m i n a n t m e m b r a n e p r o t e i n f a m i l i e s w i t h a g i v e n n u m b e r o f h e l i c e s ? " P r o t e i n s S t r u c t . F u n c . G e n e t . 1 9 9 7 , 2 8 , 4 6 5 - 4 6 6 . W a n g , L . ; Y a n , H . " N M R s t u d y s u g g e s t s a m a j o r r o l e f o r A r g l 1 1 i n m a i n t a i n i n g t h e s t r u c t u r e a n d d y n a m i c a l p r o p e r t i e s o f t y p e 1 1 H u m a n C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n . " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 8 , 3 7 , 1 3 0 2 1 - 1 3 0 3 2 . W a n g , L . ; L i , Y . ; A b i l d g a a r d , F . ; M a r k l e y , J . L . ; Y a n , H . " N M R s o l u t i o n s t r u c t u r e o f t y p e 1 1 H u m a n C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n : I m p l i c a t i o n s f o r l i g a n d b i n d i n g . " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 8 , 3 7 , 1 2 7 2 7 - 1 2 7 3 6 . K l e y w e g t , G . J . ; B e r g f o r s , T . ; S e n n , H . ; L e M o t t e , P . ; G s e l l , B . ; S h u d o , K . ; J o n e s , T . A . " C r y s t a l s t r u c t u r e s o f c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n s I a n d I I i n c o m p l e x w i t h a l l - t r a n s r e t i n o i c a c i d a n d a s y n t h e t i c r e t i n o i d . " S t r u c t u r e 1 9 9 4 , 2 , 1 2 4 1 - 1 2 5 8 . 3 8 1 0 8 . C h e n , X . ; T o r d o v a , M . ; G i l l i l a n d , G . L . ; W a n g , L . ; L i , Y . ; Y a n , H . ; J i , X . " C r y s t a l s t r u c t u r e o f a p o c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d p r o t e i n t y p e 1 1 ( R 1 1 1 M ) s u g g e s t s a m e c h a n i s m o f l i g a n d e n t r y . " J . M o l . B i o l . 1 9 9 8 , 2 7 8 , 6 4 1 - 6 5 3 . 3 9 C h a p t e r 2 1 1 . E n g i n e e r i n g a R h o d o p s i n P r o t e i n S u r r o g a t e A . H u m a n C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n 1 1 ( C R A B P I I ) H u m a n c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n I I ( C R A B P I I ) i s a m e m b e r o f t h e l i p o c a l i n f a m i l y o f p r o t e i n s , a l l o f w h i c h h a v e a w e l l c o n s e r v e d B - b a r r e l a s t h e c e n t r a l p a r t o f t h e i r s e c o n d a r y s t r u c t u r e . " 3 T h e v o l u m e o f w o r k d o n e w i t h t h i s f a m i l y o f p r o t e i n s h a s d e m o n s t r a t e d t h e s t a b i l i t y o f t h e s t r u c t u r a l s c a f f o l d w i t h r e g a r d s t o s e q u e n c e m o d i fi c a t i o n s ? 4 T h e h i g h t o l e r a n c e o f t h e p r o t e i n s t r u c t u r e t o c h a n g e s i n i t s s e q u e n c e i s o f u t m o s t i m p o r t a n c e f o r t h i s p r o j e c t s i n c e m a n y m u t a t i o n s a r e e n v i s i o n e d i n o r d e r t o a c c o m p l i s h o u r g o a l s . 5 L i p o c a l i n p r o t e i n s a r e t y p i c a l l y s m a l l , b u t h a v e a l a r g e b i n d i n g c a v i t y d e fi n e d b y t h e B - b a r r e l m o t i f , a n d p r i n c i p a l l y b i n d h y d r o p h o b i c m o l e c u l e s . T h i s w i l l b e i d e a l f o r i n t r o d u c t i o n o f t h e h y d r o p h o b i c v i s u a l r e c e p t o r , r e t i n a l . A d d i t i o n a l l y , t h e l a r g e b i n d i n g c a v i t y ( ~ 6 O O A 3 ) m a y a l l o w f o r s o m e fl e x i b i l i t y w i t h r e g a r d s t o t h e s t r u c t u r e o f t h e c h r o m o p h o r e , i . e . , 1 1 - c i s - r e t i n a l v e r s u s a l l - t r a n s - r e t i n a l . C R A B P I I i s a s m a l l , s o l u b l e p r o t e i n w i t h o n l y 1 3 7 a m i n o a c i d s , a n d i s e a s i l y p r o n e t o s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s . 6 I t n a t i v e l y b i n d s r e t i n o i c a c i d v i a a s a l t b r i d g e w i t h A r g 1 3 2 a n d t h r o u g h t h e i n t e r r n e d i a c y o f a w a t e r m o l e c u l e t o A r g 1 1 1 , a n d i s b e l i e v e d t o p r o t e c t c e l l s f r o m t h e d e t r i m e n t a l e f f e c t s o f f r e e r e t i n o i c a c i d . 5 T h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f C R A B P I I i s c o n s i s t e n t w i t h t h e l i p o c a l i n f a m i l y , a n d i s m a d e u p o f t w o fi v e - s t r a n d e d B - s h e e t s a n d a h e l i x - t u m - h e l i x m o t i f w i t h a l a r g e b i n d i n g c a v i t y ( F i g u r e H - l ) . 4 0 A l t h o u g h t h e n a t i v e h u m a n c h r o m o p h o r e f o r r h o d o p s i n i s t h e l l - c i s i s o m e r o f r e t i n a l , w e h a v e i n i t i a l l y p e r f o r m e d a l l o f t h e b i n d i n g a s s a y s u t i l i z i n g t h e a l l - t r a n s i s o m e r . A l l - t r a n s - r e t i n a l w i l l b e m u c h e a s i e r t o w o r k w i t h , s i n c e l l - c i s - r e t i n a l i s o m e r i z e s t o a l l - t r a n s v e r y r e a d i l y i n t h e p r e s e n c e o f m i n i m a l n a t u r a l l i g h t . O n c e t h e b i n d i n g a s s a y s h a v e b e e n p e r f e c t e d , s e l e c t p r o t e i n s w i l l b e u s e d w i t h l l - c i s - r e t i n a l , h o w e v e r s h o u l d t h i s n o t b i n d a s w e l l a s t h e a l l - t r a n s i t s h o u l d n o t h i n d e r t h e u l t i m a t e g o a l s o f t h i s p r o j e c t . A l l - t r a n s r e t i n a l e x h i b i t s t h e s a m e r e d s h i f t i n g a b i l i t y a s t h e l l - c i s i s o m e r w h e n t r a n s f o r m e d i n t o t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e m o i e t y . B a c t e r i o r h o d o p s i n , a l i g h t d r i v e n p r o t o n p u m p , b i n d s t h e a l l - t r a n s - a n d 1 3 - c i s i s o m e r s o f r e t i n a l a s P S B , a n d b o t h e x h i b i t a r e d s h i f t e d r e t i n a l M m ( a l l - t r a n s , 5 7 0 n m a n d l 3 - c i s , 4 1 2 n m ) . 7 A l t h o u g h t h e d e g r e e o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n s e e n i n a l l - t r a n s - r e t i n a l v e r s u s 1 1 - c i s — r e t i n a l m a y b e d i f f e r e n t , t h e m e c h a n i s m w h i c h g u i d e s t h e i r s p e c t r a l s h i f t s s h o u l d b e v e r y s i m i l a r . A l l d a t a p r e s e n t e d u t i l i z e a l l - t r a n s - r e t i n a l w i t h t h e e x c e p t i o n o f s e c t i o n I I - I t h a t s p e c i fi c a l l y a d d r e s s e s o u r a t t e m p t s a t u t i l i z i n g l l - c i s - r e t i n a l . F i g u r e I I - l . S t e r e o v i e w o f C R A B P I I w i t h b o u n d r e t i n o i c a c i d . T h e B - b a r r e l m o t i f p r o v i d e s a l a r g e i n t e r i o r c a v i t y u t i l i z i n g a s m a l l n u m b e r o f a m i n o a c i d r e s i d u e s . 4 1 h s o w a A s c l o n e d i n t o t h e p E T - l 7 b v e c t o r ( b e t w e e n t h e N d e I a n d E c o R I c l e a v a g e s i t e s ) , C R A B P I I ( 4 3 4 b a s e p a i r s ) w o u l d b e e x p r e s s e d a s t h e n a t i v e p r o t e i n w i t h o n l y 1 3 7 a m i n o a c i d s . S i n c e t h i s p r o j e c t w i l l r e q u i r e p r o d u c t i o n o f a s i g n i fi c a n t n u m b e r o f p r o t e i n m u t a n t s , w e o p t e d t o a d d a n a f fi n i t y p u r i fi c a t i o n t a g t o r e d u c e t h e a m o u n t o f t i m e s p e n t o n t h e p u r i fi c a t i o n p r o c e s s . B e c a u s e o f e a s e a n d a v a i l a b i l i t y , w e c h o s e t o u s e a 6 x - H i s t a g . T h i s t a g c o n s i s t s o f a c h a i n o f s i x h i s t i d i n e r e s i d u e s t h a t w i l l b i n d t o a N i b b o u n d r e s i n ( N i - N T A , N o v a g e n ) a l l o w i n g c l e a n a n d r a p i d p u r i fi c a t i o n o f t h e d e s i r e d H i s - t a g g e d p r o t e i n f r o m o t h e r p r o t e i n i m p u r i t i e s ( F i g u r e I I - 2 ) . 8 I n b r i e f , p r o t e i n s a r e e x p r e s s e d f r o m t h e T u n e r ( D E 3 ) p L a c I E . c o l i s t r a i n ( B L 2 1 ( D E 3 ) p L y s S i s u s e d t o e x p r e s s f r o m t h e p E T - 1 7 b H i s - t a g C R A B P I I e l u t e d w i t h 2 0 0 m M i m i d a z o l e F — L — N - , 4 . - . 9 . t o . 9 a ) ' o E F i g u r e I I - 2 . G e l o f i t H i s - t a g g e d C R A B P I I p r o t e i n . T h e fi r s t l a n e s h o w s o v e r - e x p r e s s i o n o f t h e d e s i r e d C R A B P I I b a n d . T h e s e c o n d l a n e s h o w s a s e p a r a t i o n o f a l l u n d e s i r e d p r o t e i n s a w a y f r o m t h e d e s i r e d C R A B P I I , s h o w n i n > 9 0 % p u r i t y i n t h e l a s t fi v e l a n e s . p l a s m i d ) , f o l l o w i n g t y p i c a l I P T G i n d u c e d p r o t o c o l s . 9 T h e c r u d e l y s a t e , w h i c h c o n t a i n s t h e s o l u b l e C R A B P I I p r o t e i n w a s p o u r e d t h r o u g h t h e N i - N T A c o l u m n , b i n d i n g t h e h i s t i d i n e t a g . U n d e s i r e d p r o t e i n s c a n b e w a s h e d a w a y f r o m t h e c o l u m n a n d t h e d e s i r e d p r o t e i n c a n b e e l u t e d w i t h a n i m i d a z o l e c o n t a i n i n g b u f f e r , a f f o r d i n g t h e C R A B P I I p r o t e i n i n v e r y h i g h p u r i t y . T y p i c a l e x p r e s s i o n s y i e l d 1 0 — 5 0 m g o f p r o t e i n p e r l i t e r o f c u l t u r e . E x c e s s i m i d a z o l e m u s t b e w a s h e d a w a y b e f o r e p r o c e e d i n g a n y f u r t h e r w i t h t h e p r o t e i n , a s i m i d a z o l e a b s o r b s i n t h e s a m e r e g i o n a s p r o t e i n s ( ~ 2 8 0 n m ) , w h i c h w i l l i n t e r f e r e w i t h d e t e r m i n a t i o n o f p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n . 4 2 I n c h o o s i n g t o i n c o r p o r a t e t h i s t a g t h e r e w e r e s e v e r a l f a c t o r s t o c o n s i d e r , t h e fi r s t b e i n g , w h e t h e r t o a d d t h e t a g t o t h e N - t e r m i n u s o r t h e C - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n . I n C R A B P I I , b o t h t e r m i n i a r e o n t h e o p p o s i t e s i d e o f t h e p r o t e i n a s t h e O p e n i n g t o t h e b i n d i n g c a v i t y ( F i g u r e I I - 3 ) , F i g u r e 1 1 - 3 . C R A B P I I w i t h r e t i n a l b o u n d . s h o w i n g t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e N — a n d C - a n d a d d i t i o n o f s e v e r a l n e w a m i n o a c i d s ‘ _ _ g _ t e r m l n u s b e i n g o n t h e o p p o s i t e o f t h e p r o t e i n s h o u l d n o t c a u s e a n y i n t e r f e r e n c e w i t h a s c o m p a r e d t o t h e e n t r a n c e o f t h e b i n d i n g p o c k e t . r e t i n a l b i n d i n g . F o r t h i s r e a s o n , w e c o n c l u d e d t h a t c h o i c e o f e i t h e r t e r m i n u s , i n o u r c a s e . w o u l d n o t m a k e a d i f f e r e n c e . S e c o n d l y , o n e m u s t d e c i d e w h e t h e r o r n o t t o i n s t a l l a c l e a v a g e s i t e f o r t h e t a g s o t h a t i t m a y b e r e m o v e d a f t e r p u r i fi c a t i o n . A l o n g t h e s a m e l i n e s , o n e m u s t a l s o d e c i d e w h i c h p l a s m i d t o u s e f o r i n c o r p o r a t i o n o f t h e g e n e a n d e x p r e s s i o n o f t h e p r o t e i n . W e h a d i n i t i a l l y l o o k e d i n t o , a n d a c t u a l l y c o m p l e t e d , t h e c l o n i n g o f C R A B P I I i n t o t h e p E T - 3 0 a p l a s m i d ( N o v a g e n ) . T h i s c l o n e i n c o r p o r a t e d t h e C R A B P I I g e n e t h r o u g h t h e B a m H I r e s t r i c t i o n s i t e a n d p l a c e d a c l e a v a b l e H i s t a g o n t h e N - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n . T h r o u g h t h i s c l o n i n g h o w e v e r , 4 7 e x t r a a m i n o a c i d s w e r e a d d e d o n t o t h e N - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n . A l t h o u g h a f t e r p u r i fi c a t i o n , t h e H i s t a g c o u l d b e c l e a v e d e n z y m a t i c a l l y w i t h t h r o m b i n , i t w o u l d s t i l l l e a v e 3 3 a d d i t i o n a l a m i n o a c i d s . S i n c e t h i s p r o j e c t r e q u i r e s e x t e n s i v e p r o t e i n / s u b s t r a t e a n a l y s i s , a n d c o n fi d e n c e i n t h e s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n t o a s s u r e t h e m u t a t i o n s w e m a k e a r e a t t h e l o c a t i o n s , r e l a t i v e t o t h e c h r o m o p h o r e , a s d e s i r e d , t h e l a r g e n u m b e r o f n e w a m i n o a c i d s w a s o f c o n c e r n . W i t h o u t b e i n g c e r t a i n o f 4 3 C X R h A o B P I l r e I s w t r i c a t s i o n c l s o i n e d t e s ( m F i m g t h e I N 4 I - u r e c o I ) , w h a i n c d h H O i p s e t r i a d t i e e n s o n t u a n g d e r e t h h e t n e g 3 1 e " . 0 T “ 1 ’ 6 h e p l a s m i ) " a n d T d 7 t h e p r o t e i n s ” t h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e ’ N I 0 ° C R A B P I I g e n e h i s - t a g a n d w h e t h e r o r n o t t h e s e a d d i t i o n a l a m i n o X h o l a c i d s w o u l d a f f e c t t h e o v e r a l l e s t a b l i s h e d p B Z / 4 . 1 K b s t r u c t u r e , w e o p t e d t o a b a n d o n t h i s c l o n e f o r T 7 o n e t h a t w o u l d a d d f e w e r e x t r a a m i n o a c i d s . T h e s e c o n d p l a s m i d u t i l i z e d w a s . , . F i g u r e I I - 4 . C R A B P I I l s c l o n e d i n t o t h e p E T - B l u e 2 ( 3 6 5 3 b p , N o v a g e n ) . m p E T - B l u e 2 p l a s m i d v i a N c o l a n d X h o l r e s t r i c t i o n s i t e s , i n c o r p o r a t i n g a s i x r e s i d u e p r o m o t e r a n d i s a m p i c i l l i n r e s i s t a n t . l e a d t o t w o a d d i t i o n a l r e s i d u e s b e i n g a d d e d t o t h e N - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n . T h e i n i t i a l m e t h i o n i n e r e s i d u e ( t h e s t a r t c o d o n ) i s n o t r e t a i n e d i n t h e n a t i v e s y s t e m , p E T - l 7 b . I n m a n y c a s e s t h e s t a r t i n g M e t r e s i d u e i s s u b j e c t t o p o s t - t r a n s l a t i o n a l e l i m i n a t i o n , a n d i s n o t r e t a i n e d . H o w e v e r , e x p r e s s i o n o f t h e C R A B P I I g e n e i n p E T - B l u e 2 a l l o w s f o r r e t e n t i o n o f t h e i n i t i a l M e t . A n a l a n i n e r e s i d u e w a s a l s o a d d e d i n t h e s e c o n d p o s i t i o n a s a r e s u l t o f u s i n g t h e N c o I r e s t r i c t i o n s i t e . T h i s i s b e c a u s e t h e N c o I s i t e i n c o r p o r a t i o n a d d s t h e M e t s t a r t c o d o n , b u t n o t i n f r a m e w i t h t h e r e m a i n d e r o f t h e p r o t e i n s ’ c o d o n s , t h e r e f o r e , t w o a d d i t i o n a l b a s e p a i r s h a d t o b e a d d e d i n o r d e r t o k e e p t h e e x p r e s s i o n i n f r a m e . W e c h o s e a n a l a n i n e r e s i d u e s o l e l y b e c a u s e o f t h e s m a l l s i z e , a n d f e l t t h a t t h i s s m a l l r e s i d u e w o u l d h a v e m i n i m a l , i f a n y , e f f e c t o n t h e p r o t e i n s t r u c t u r e a n d f o l d i n g . I n a d d i t i o n t o t h e t w o e x t r a r e s i d u e s a d d e d o n t o t h e N — t e r m i n u s , e i g h t a m i n o a c i d s h a d t o b e a d d e d t o t h e C - t e r m i n u s ; s i x o f t h o s e c o n s i s t o f t h e h i s t i d i n e p u r i fi c a t i o n t a g , a n d t w o r e s u l t f r o m t h e X h o l r e s t r i c t i o n s i t e i n c o r p o r a t i o n n e c e s s a r y f o r t h e c l o n i n g . W e a s s u m e d t h a t b y a d d i n g t h e s e e x t r a a m i n o a c i d s , w e w o u l d n o t a l t e r t h e o v e r a l l s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n , w h i c h w e c o u l d p r o b e t h r o u g h C D s p e c t r o s c o p i c a n a l y s i s o f t h e r e s u l t a n t p r o t e i n s a n d c r y s t a l l o g r a p h i c c o m p a r i s o n w i t h t h e w i l d t y p e p r o t e i n . A s a n a l t e r n a t i v e , t h e H i s t a g c o u l d b e i n c o r p o r a t e d i n t o o u r g e n e b y P C R i n g s i x H i s r e s i d u e s o n t o e i t h e r t e r m i n u s w i t h t h e o r i g i n a l p E T - 1 7 b p l a s m i d . W e i n f a c t d i d a t t e m p t t o d o t h i s w h i l e a t t h e s a m e t i m e p u r s u i n g t h e p E T - B l u e 2 c l o n e . W e l a t e r a b a n d o n e d t h i s i d e a f o r t w o r e a s o n s . F i r s t , t h e c l o n i n g i n t o p E T - B l u e 2 p r o c e e d e d w i t h g r e a t e r e a s e a n d p r o d u c e d t h e d e s i r e d p r o d u c t f a s t e r . S e c o n d l y , w e f o u n d t h a t p E T - 1 7 b i s a l o w c o p y p l a s m i d p r o v i d i n g o n l y m i n i m a l D N A , w h e r e a s p E T - B l u e 2 i s a h i g h c o p y p l a s m i d r e g u l a r l y p r o v i d i n g m o r e t h a n 4 0 0 1 1 g o f p u r e p l a s m i d D N A u p o n p u r i fi c a t i o n o f a 5 0 0 m L c u l t u r e . O u r c h o i c e b e t w e e n t h e 6 x - H i s i n c o r p o r a t e d p E T - l 7 b o r t h e c l o n e d p E T — B l u e 2 C R A B P I I , a s w e w o u l d l a t e r e s t a b l i s h , w o u l d n o t m a k e a d i f f e r e n c e . A s t h e P C R m u t a g e n e s i s p r o t o c o l w a s e s t a b l i s h e d a n d o p t i m i z e d , e v e n t h e l o w c o p y p E T - l 7 b p l a s m i d w o u l d h a v e p r o v i d e d u s w i t h a m p l e D N A f o r o u r p u r p o s e s . A d d i t i o n a l l y , c o m p a r i s o n o f fl u o r e s c e n c e , U V - v i s , a n d M A L D I - T O F d a t a o f t h e s l i g h t l y l o n g e r p E T - B l u e 2 p r o t e i n t o t h e i d e n t i c a l p r o t e i n d e r i v e d f r o m p E T - 1 7 b ( n o H i s t a g ) p r o v e d t h e a d d i t i o n a l 1 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s h a v e n o e f f e c t o n t h e r e t i n a l b i n d i n g p r o p e r t i e s . T h e p E T - B l u e 2 C R A B P I I c o n t a i n i n g c l o n e h a s a d d e d a m i n i m a l n u m b e r o f r e s i d u e s t o t h e p r o t e i n w h i l e s t i l l i n c o r p o r a t i n g a p u r i fi c a t i o n t a g f o r a m o r e r a p i d p r o d u c t i o n o f a p r o t e i n l i b r a r y . H o w e v e r , b y o n l y a d d i n g t h e m i n i m a l n u m b e r o f r e s i d u e s , w e h a v e r e m o v e d t h e c l e a v a g e s i t e f o r t h e H i s t a g m a k i n g i t a p e r m a n e n t a d d i t i o n t o t h e p r o t e i n . A s m e n t i o n e d a b o v e t h o u g h , t h e a d d i t i o n a l r e s i d u e s d o n o t i n t e r f e r e i n r e t i n a l b i n d i n g . 4 5 T h o u g h t h e l e n g t h y p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e o f t h e u n a l t e r e d C R A B P H p r o t e i n e x p r e s s e d f r o m t h e p E T - l 7 b c l o n e i n i t i a l l y f o r c e d u s i n t o t h e u s e o f p E T - B l u e 2 H i s - t a g g e d C R A B P I I c l o n e s , w e e v e n t u a l l y h a d t o g o b a c k t o t h e n a t i v e c l o n e . A s o u r c o l l a b o r a t o r s h a v e f o u n d , i n c o r p o r a t i o n o f t h e a d d i t i o n a l r e s i d u e s a s a c q u i r e d f r o m p E T - B l u e 2 ( 2 o n t h e N - t e r m i n u s a n d 8 o n t h e C - t e r r r r i n u s ) h a v e a d e t r i m e n t a l e f f e c t o n c r y s t a l l i z a t i o n . T h e r e a r e k n o w n c a s e s w h e r e t h e a d d i t i o n o f a H i s t a g h a s n o e f f e c t o n p r o d u c t i o n o f w e l l - d i f f r a c t i n g c r y s t a l s , H a s w e l l a s c a s e s w h e r e a d d i t i o n o f t h e H i s t a g h a s h i n d e r e d t h e c r y s t a l l i z a t i o n p r o g r e s s . 1 2 R e a s o n s w h y i t m a y o r m a y n o t e f f e c t c r y s t a l l o g r a p h y a r e n o t k n o w n t o a n y d e g r e e o f c e r t a i n t y . B e c a u s e o f t h e i n a b i l i t y t o c r y s t a l l i z e H i s - t a g g e d C R A B P H p r o t e i n s , w e h a d t o g o b a c k t o p r o d u c i n g t h e n a t i v e p E T - 1 7 b d e r i v e d C R A B P I I p r o t e i n s w i t h o u t t h e H i s t a g . C r y s t a l l o g r a p h i c e f f o r t s ( c o l l a b o r a t i o n w i t h P r o f e s s o r J a m e s G e i g e r , D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) w i l l b e a n i m p o r t a n t p a r t o f t h e s t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n g a t h e r i n g . T h r o u g h c r y s t a l l o g r a p h y o f t h e C R A B P H m u t a n t s , n o t o n l y w i l l w e b e a b l e t o t e l l i f t h e m u t a t i o n s a r e c a u s i n g a c h a n g e i n t h e o v e r a l l s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n , b u t w e w i l l b e a b l e t o d e t e r m i n e t h e o r i e n t a t i o n o f t h o s e a m i n o a c i d s w i t h i n t h e b i n d i n g p o c k e t . T h e m o s t c r u c i a l p i e c e o f i n f o r m a t i o n w e h o p e t o g a i n f r o m c r y s t a l l o g r a p h y i s t h e d i r e c t a m i n o a c i d r e l a t i o n s t o t h e b o u n d c h r o m o p h o r e r e t i n a l . S i n c e p r o d u c t i o n a n d p u r i fi c a t i o n o f t h e p E T - B l u e 2 p r o t e i n s o c c u r r e d a t a m o r e r a p i d p a c e , a s c o m p a r e d t o t h e p E T - 1 7 b c l o n e , w e fi r s t m a d e a l l p r o t e i n s w i t h t h e H i s t a g , p e r f o r m e d a l l b i n d i n g a s s a y s , a n d t h e n d e t e r m i n e d w h i c h p r o t e i n s w e r e m o s t i n t e r e s t i n g t o p u r s u e c r y s t a l l o g r a p h i c a n a l y s i s . T h e s e p r o t e i n s w e r e r e m a d e w i t h t h e p E T - l 7 b p l a s m i d ( n o H i s t a g ) . B y h a v i n g t h e s a m e p r o t e i n m u t a n t s f r o m b o t h p E T - l 7 b a n d t h e 4 6 H i s t a g c o n t a i n i n g p E T - B l u e 2 , w e c o u l d v e r i f y t h a t t h e e x i s t e n c e o f t h e e x t r a a m i n o a c i d s h a s n o e f f e c t o n t h e r e t i n a l b i n d i n g p r o p e r t i e s . A l l d u p l i c a t e p r o t e i n s ( H i s t a g v s . n o H i s t a g w i t h t h e s a m e m u t a t i o n s ) d e m o n s t r a t e d t h e s a m e r e s u l t s i n b i n d i n g a f fi n i t y , r e t i n a l a b s o r b a n c e , a n d c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n a s m o n i t o r e d b y M A L D I - T O F . P r o d u c t i o n o f t h e p E T - l 7 b p r o t e i n s w a s t a k e n o v e r b y C h r y s o u l a V a s i l e i o u ( M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) a n d m o r e d e t a i l s o f t h e d a t a c a n b e f o u n d i n h e r t h e s i s . A l l o f t h e d a t a I p r e s e n t h e r e a r e f r o m H i s - t a g g e d C R A B P H p r o t e i n s a r i s i n g f r o m t h e p E T - B l u e 2 p l a s m i d . 4 7 B . S p e c t r o s c o p i c T e c h n i q u e s U t i l i z e d f o r C h a r a c t e r i z a t i o n o f P r o t e i n s a n d P r o t e i n / S u b s t r a t e C o m p l e x e s O n c e p r o t e i n s h a v e b e e n e x p r e s s e d a n d p u r i fi e d , t h e y w i l l b e a n a l y z e d t h r o u g h C D f o r s t r u c t u r a l f e a t u r e s , a n d U V - v i s f o r d e t e r m i n a t i o n o f e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t s w h i c h w i l l b e u s e d f o r p r e p a r a t i o n o f p r o t e i n s o l u t i o n s w i t h h i g h c o n c e n t r a t i o n a c c u r a c y . I n a d d i t i o n t o m e t h o d s f o r p r o t e i n c h a r a c t e r i z a t i o n , s e v e r a l a s s a y s w i l l b e u s e d f o r d e t e r m i n a t i o n o f t h e r e t i n a l b i n d i n g p r o p e r t i e s o f e a c h p r o t e i n , i n c l u d i n g fl u o r e s c e n c e , U V - v i s , a n d M A L D I - T O F . E a c h b i n d i n g a s s a y i s e q u a l l y , y e t u n i q u e l y i m p o r t a n t i n t h e c o m p l e t e a n a l y s i s o f t h e r e t i n a l b i n d i n g p r o p e r t i e s w i t h t h e C R A B P I I p r o t e i n s a s t h e y e a c h p r o v i d e u s w i t h d i f f e r e n t i n f o r m a t i v e i n s i g h t i n t o t h e p r o t e i n / s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n s t a k i n g p l a c e . F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n s o f t h e p r o t e i n w i t h r e t i n a l ( o r r e t i n o i c a c i d ) w i l l g i v e u s a b i n d i n g a f f i n i t y b y p r o v i d i n g d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s . U V - v i s e x p e r i m e n t s w i l l d e m o n s t r a t e t h e e x i s t e n c e o f a r e t i n a l p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e a s v i s i b l e t h r o u g h t h e e x p e c t e d b a t h o c h r o m i c s h i f t f o r t h i s s p e c i e s . F i n a l l y , M A L D I - T O F w i l l b e u t i l i z e d t o i n v e s t i g a t e t h e e x i s t e n c e o f a n y c o v a l e n t c o m p l e x b e t w e e n r e t i n a ] a n d t h e p r o t e i n . T h e s e s p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u e s w i l l b e i n t r o d u c e d h e r e , e x p l a i n i n g w h y e a c h p r o c e d u r e i s n e c e s s a r y , w h a t i n f o r m a t i o n w e c a n a n d c a n n o t g a i n f r o m i t , a n d g i v i n g a b r i e f d e s c r i p t i o n o f t h e t e c h n i q u e i n v o l v e d a n d h o w i t w a s o p t i m i z e d . M o r e d e s c r i p t i v e d e t a i l s o f t h e p r o c e d u r e s i n v o l v e d i n e a c h m e t h o d c a n b e f o u n d i n t h e m a t e r i a l s a n d m e t h o d s s e c t i o n a t t h e e n d o f t h i s c h a p t e r . D e t a i l e d r e s u l t s o f t h e s e e x p e r i m e n t s w i l l b e 4 8 d i s c u s s e d w i t h t h e i n t r o d u c t i o n o f e a c h n e w p r o t e i n , o r c a n b e f o u n d i n t h e A p p e n d i x , b u t t h e g e n e r a l t r e n d s t o m a k e n o t e o f w i l l b e a d d r e s s e d h e r e a s w e l l . 4 9 B . 1 . E x t i n c t i o n C o e f fi c i e n t s T h e fi r s t m e a s u r e m e n t m a d e o n a p r o t e i n w a s t h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t d e t e r m i n a t i o n , u t i l i z i n g t h e m e t h o d a s d e s c r i b e d b y G i l l a n d v o n I - I i p p e l . l 3 B r i e fl y , p r o t e i n s o l u t i o n s o f i d e n t i c a l c o n c e n t r a t i o n w e r e p r e p a r e d i n b o t h a n a t i v e a n d a d e n a t u r i n g b u f f e r a n d t h e A 2 3 0 w a s m e a s u r e d b y U V - v i s . T h e t h e o r e t i c a l e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t f o r t h e d e n a t u r e d s a m p l e c a n b e c a l c u l a t e d a s a f u n c t i o n o f t h e n u m b e r o f T r p , T y r , a n d C y s r e s i d u e s i n t h e p r o t e i n . U t i l i z i n g t h i s c a l c u l a t e d v a l u e a n d t h e t w o a b s o r b a n c e m e a s u r e m e n t s f o r t h e n a t u r e d a n d d e n a t u r e d s a m p l e s , t h e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t f o r t h e p r o t e i n i n t h e n a t i v e s t a t e c a n b e c a l c u l a t e d b y B e e r ’ s L a w . C a r e m u s t b e t a k e n i n t h i s m e a s u r e m e n t , a n d r e p e t i t i o n m u s t b e d o n e t o e n s u r e a c c u r a c y , a s t h i s c a l c u l a t e d e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t w i l l b e u s e d f o r p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n a t i o n s . A c c u r a c y i n t h e c o n c e n t r a t i o n i s a v e r y i m p o r t a n t i s s u e i n m a n y o f t h e b i n d i n g a s s a y s u s e d , p a r t i c u l a r l y t h e fl u o r e s c e n c e a n d U V - v i s e x p e r i m e n t s w h e r e p r e c i s e c o n c e n t r a t i o n s o f p r o t e i n r e l a t i v e t o c h r o m o p h o r e m u s t b e k n o w n f o r a c c u r a t e c o n c l u s i o n s t o b e d r a w n . P r o t e i n s d e m o n s t r a t e a s i g n a t u r e 2 8 0 n m p e a k i n t h e U V - v i s p r i m a r i l y d u e t o T r p a b s o r b a n c e , a l t h o u g h P h e c o n t r i b u t e s a l i t t l e a s w e l l . 1 4 P r o v i d e d a n a c c u r a t e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t i s f o u n d , p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s c a n s i m p l y b e m e a s u r e d b y u s i n g t h e A 2 3 0 . T h e r e a r e a l t e r n a t i v e w a y s t o o b t a i n p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n v a l u e s b y u t i l i z i n g s t a n d a r d i z e d m e t h o d s s u c h B i o R a d o r t h e B C A r e a g e n t . 1 5 B o t h t e c h n i q u e s i n v o l v e p r e p a r i n g v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s a m p l e s o f a n o t h e r p r o t e i n , B S A , i n o r d e r t o c r e a t e a s t a n d a r d i z e d c u r v e t o w h i c h m e a s u r e m e n t o f o u r p r o t e i n s a m p l e s c a n b e c o m p a r e d t o . I n i t i a l l y I h a d e n s u r e d t h e a c c u r a c y o f t h e C R A B P H e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t s b y c o m p a r i n g 5 0 t h e c o n c e n t r a t i o n s o b t a i n e d f r o m U V - v i s ( u t i l i z i n g t h e e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t ) w i t h t h e c o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d f r o m t h e B i o R a d a s s a y . R e p r o d u c i b l e v a l u e s c o n fi r m e d a c c u r a t e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t s , h e n c e f u t u r e c o n c e n t r a t i o n m e a s u r e m e n t s w e r e s i m p l y m a d e w i t h t h e U V - v i s m e a s u r e m e n t a l o n e . T h e w i l d t y p e C R A B P H h a s a r e p o r t e d e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o f 1 9 , 4 8 0 M ' l c m ' l . 6 O u r e x p e r i m e n t a t i o n w i t h t h e H i s - t a g g e d C R A B P H p r o v i d e d a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o f 2 0 , 2 1 5 M ' l c m ' l , w h i c h c l o s e l y a g r e e s w i t h t h e p u b l i s h e d r e s u l t . A l l C R A B P I I m u t a n t s m a d e , w i t h t h e e x c e p t i o n o f f o u r p r o t e i n s t h a t i n c o r p o r a t e a n a d d i t i o n a l T r p r e s i d u e w h o s e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t s a r e i n t h e r a n g e o f 2 5 , 0 0 0 — 3 0 , 0 0 0 M ' l c m ' l , p r o d u c e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t s i n t h e r a n g e o f a p p r o x i m a t e l y 1 6 , 7 0 0 — 2 2 , 8 0 0 M ’ l c m ' l . A l l v a l u e s w e r e r e p r o d u c e d s e v e r a l t i m e s a n d f o u n d t o b e w i t h i n a n a c c e p t a b l e r a n g e a s c o m p a r e d t o t h e p u b l i s h e d d a t a . E x a c t v a l u e s f o r t h e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o f a l l p r o t e i n s c a n b e f o u n d i n t h e A p p e n d i x . 5 1 p e r x o t e ' r n s p r e s s 8 l . A e ' l d " 9 C d o R s A h B P o w H t h e m c u h t a a n t r a c t e r p r r o o s t r t . e c . i n B s - 2 0 0 0 - 4 ' 0 2 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 o 0 0 0 a — - J . = f 2 é . f ° , r _ _ 1 B . 2 . C i r c u l a r D i c h r o i s m T h e s e c o n d m o d e o f p r o t e i n c h a r a c t e r i z a t i o n w a s v i a C D s p e c t r o s c o p y . P r o t e i n s 1 6 T h e u s e o f C D s p e c t r o s c o p y f o r h a v e u n i q u e c h a r a c t e r i s t i c s i n t h e C D s p e c t r u m . p r o t e i n c h a r a c t e r i z a t i o n d e p e n d s m o s t l y o n e m p i r i c a l r u l e s . I n p a r t i c u l a r , p r o t e i n s w i t h a — h e l i c a l r e g i o n s s h o w t w o n e g a t i v e p e a k s a t 2 2 2 n m a n d 2 1 0 n m , a n d a p o s i t i v e p e a k n e a r 2 0 0 n m , w h i l e B - s h e e t s t r u c t u r e s s h o w a c h a r a c t e r i s t i c n e g a t i v e p e a k n e a r 2 2 0 n m a n d a p o s i t i v e p e a k n e a r 2 0 0 n m . A l s o p r e s e n t i n s o m e C D s p e c t r a i s a 2 3 0 n m p e a k t h a t a r i s e s f r o m t h e a b s o r b a n c e a n d i n t e r a c t i o n o f T r p a n d o t h e r a r o m a t i c r e s i d u e s i n t h e p r o t e i n . 1 7 T h i s p e a k m a y o r m a y n o t b e p r e s e n t i n a p r o t e i n ’ s s p e c t r u m d e p e n d i n g o n t h e n a t u r e a n d o r i e n t a t i o n o f t h e s e r e s i d u e s . T h e C D c u r v e f o r t h e w i l d t y p e C R A B P I I a s s h o w n i n F i g u r e I I - 5 , c l e a n l y d e p i c t s a l l t h r e e p e a k s , 2 0 0 n m a — h e l i c a l a n d B - s h e e t p e a k , 2 2 0 n m B - s h e e t p e a k , a n d t h e 2 3 0 n m p e a k d u e t o t h e a r o m a t i c a m i n o a c i d a b s o r b a n c e s , a n d c o m p a r e s v e r y w e l l t o C D s p e c t r a p u b l i s h e d f o r t h e s t r u c t u r a l l y r e l a t e d p r o t e i n s C R A B P I , C R B P I I , a n d C R A L B P 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 s h e e t p e a k a t a p p r o x i m a t e l y 2 2 0 n m . " I n T h e C D c u r v e s f o r a l l t h e s e p r o t e i n s c a n F i g u r e 1 1 - 5 . C D s p e c t r a o f t h e w i l d t y p e C R A B P I I p r o t e i n c l e a r l y s h o w s a B - s h e e t f o l d i n g p a t t e r n a s b e f o u n d i n t h e A n d i x . H o w e v e r , p p e e v i d e n t t h r o u g h t h e n e g a t i v e 2 2 1 n m n e g a t i v e p e a k w i t h s o m e p r o t e i n s , i t w a s d i f fi c u l t t o a n d t h e 2 0 0 1 1 1 1 1 1 9 0 9 9 " e P e a k - 5 2 p o s i t i v e l y i d e n t i f y t h e a - h e l i c a l r e g i o n . T h e a m o u n t o f h e l i c i t y i n C R A B P H i s m a s k e d b y t h e d o m i n a n t B - s h e e t f o r m a t i o n , t h u s t h e 2 1 0 n m p e a k e x p e c t e d i s n o t c l e a r l y d e p i c t e d . T h e 2 3 0 n m p e a k t h a t w a s c l e a r l y v i s i b l e i n t h e w i l d t y p e p r o t e i n w a s n o t a l w a y s v i s i b l e i n t h e s p e c t r a o f t h e m u t a n t p r o t e i n s . I n m o s t c a s e s , t h e t w o p e a k s ( 2 2 0 n m a n d 2 3 0 n m ) a r e h a r d l y d i s t i n g u i s h a b l e f r o m o n e a n o t h e r . T h e v a r i a t i o n i n t h e a p p e a r a n c e o f t h e 2 3 0 n m p e a k i s p r o b a b l y d u e t o s m a l l c h a n g e s i n s t r u c t u r e t h a t l e a d t o c h a n g e s i n e x t i n c t i o n . T h i s i s n o t c o m p l e t e l y u n e x p e c t e d a s v a r i a t i o n s i n t h e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t s , w h i c h a r e a l s o a m e a s u r e o f t h e a b s o r b a n c e s o f a r o m a t i c a m i n o a c i d s , c h a n g e s f r o m o n e p r o t e i n t o t h e n e x t a s w e l l . I n s t r u m e n t s e t t i n g s a n d s a m p l e c o n c e n t r a t i o n s w e r e v e r y i m p o r t a n t i n a c q u i r i n g r e p r o d u c i b l e C D s p e c t r a , a s t h e y a r e f o r m o s t a l l o f t h e a n a l y t i c a l t e c h n i q u e s u s e d i n t h i s p r o j e c t . T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s u s e d h a d t o b e i n t h e r a n g e o f 1 - 5 1 1 M . L o w e r c o n c e n t r a t i o n s g a v e v e r y n o i s y s p e c t r a , w h i l e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s p r o d u c e d s p e c t r a w h e r e t h e a m i n o a c i d a b s o r b a n c e o v e r s h a d o w e d t h e s t r u c t u r a l f e a t u r e s a n d t h e o n l y p e a k v i s i b l e w a s t h e 2 3 0 n m p e a k . T h e b a n d w i d t h o f t h e i n s t r u m e n t , w h i c h d e fi n e s h o w m u c h l i g h t i s a l l o w e d t o e n t e r t h e s a m p l e c h a m b e r , a l s o p l a y e d a r o l e i n t h i s a s w e l l . T h e r e p o r t e d d a t a w a s o b t a i n e d w h i l e u s i n g a b a n d w i d t h o f 1 n m , a b a n d w i d t h a n y h i g h e r t h a n t h i s p r o d u c e d s i m i l a r r e s u l t s w h e r e t h e 2 3 0 n m p e a k w a s d o m i n a n t a n d o v e r b e a r i n g . T h e C D d a t a g a t h e r e d t h u s f a r h a s o n l y b e e n u s e d a s a c r u d e a n a l y s i s o f t h e p r o t e i n s t r u c t u r e , p r i m a r i l y t o e n s u r e t h e p r e s e n c e o f t h e c h a r a c t e r i s t i c B - s h e e t p e a k . A n a l y s i s o f t h i s n a t u r e d o e s n o t t e l l u s e x a c t l y w h a t p e r c e n t o f t h e p r o t e i n i n t h e s a m p l e a c t u a l l y m a i n t a i n s a l l o f e i t h e r t h e B - s h e e t o r ( i t — h e l i c a l p r o p e r t i e s . A m o r e t h o r o u g h 5 3 a n a l y s i s o f t h e C D d a t a , a n d p o s s i b l e c a l c u l a t i o n o f t h e p e r c e n t o f s e c o n d a r y s t r u c t u r e r e l a t i v e t o p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n m a y p r o v e t o b e a b e n e fi c i a l t o o l i n f u t u r e p r o t e i n a n a l y s e s . R e t i n a l i t s e l f d o e s n o t p o r t r a y a C D c u r v e , h o w e v e r w h e n b o u n d t o r h o d o p s i n , i t c a n b e o b s e r v e d v i a C D . 2 0 R e t i n a l d e m o n s t r a t e s a n i n d u c e d c h i r a l i t y a s a r e s u l t o f c o v a l e n t l y b i n d i n g t o a c h i r a l m o l e c u l e i n a c h i r a l e n v i r o n m e n t . T h e r e a r e a l s o p u b l i s h e d s p e c t r a w h i c h e x h i b i t i n d u c e d C D i n r e t i n o i c a c i d w h e n b o u n d t o C R A B P I , a l t h o u g h t h e p e a k s a r e n o t v e r y p r o n o u n c e d . 1 9 T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e t w o i s t h a t r e t i n a l i s c o v a l e n t l y b o u n d t o r h o d o p s i n , w h i l e r e t i n o i c a c i d w i t h C R A B P I i s n o t . T h e C D c u r v e o b s e r v e d i s a r e s u l t o f i n d u c e d c h i r a l i t y a s a c o n s e q u e n c e o f t h e s t r o n g H - b o n d i n g w i t h t h e p r o t e i n a n d r i g i d s t r u c t u r e t h e c h r o m o p h o r e a d o p t s . W e w i l l a l s o u s e C D t o p r o b e r e t i n a l b i n d i n g w i t h t h e C R A B P I I m u t a n t s , w h e r e i t m a y b e p o s s i b l e t o s e e b o t h b o u n d a l d e h y d e a n d c o v a l e n t l y l i n k e d S B , a l b e i t t h e S B p e a k i s e x p e c t e d t o b e m o r e p r o m i n e n t . T h e s e a t t e m p t s w i l l b e a d d r e s s e d i n S e c t i o n I I — G . 5 4 B . 3 . C r y s t a l l o g r a p h y C r y s t a l l o g r a p h i c a n a l y s i s o f C R A B P I I w i l l b e a c r u c i a l p a r t o f o b t a i n i n g d i r e c t p r o t e i n / r e t i n a l i n t e r a c t i o n i n f o r m a t i o n , a n d i n f a c t , C R A B P I I w a s s e l e c t e d a s t h e p r o t e i n o f c h o i c e f o r c o n v e r s i o n i n t o t h e r h o d o p s i n m i m i c b e c a u s e i t i s h i g h l y a m e n a b l e t o c r y s t a l l o g r a p h y . T h e c r y s t a l l o g r a p h i c e f f o r t s o n t h i s p r o j e c t a r e b e i n g p e r f o r m e d i n c o l l a b o r a t i o n w i t h P r o f e s s o r J i m G e i g e r ( D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) , a n d p r e c i s e d e t a i l s o n c r y s t a l l i z a t i o n p r o c e d u r e s c a n b e f o u n d i n t h e t h e s i s o f S o h e i l a V a e z e s l a m i . W e h a v e b e e n a b l e t o r e p r o d u c e t h e p r e v i o u s l y p u b l i s h e d c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e r e t i n o i c a c i d b o u n d w i l d t y p e p r o t e i n , a s w e l l a s o b t a i n a c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e a p o w i l d t y p e p r o t e i n . 5 P r e v i o u s l y , a n a p o c r y s t a l s t r u c t u r e w a s o n l y o b t a i n a b l e f o r t h e R l l l M m u t a n t p r o t e i n . 2 1 W e h a v e a l s o o b t a i n e d c r y s t a l s t r u c t u r e s f o r a r e t i n o i c a c i d b o u n d F 1 5 W m u t a n t , i n a d d i t i o n t o b o t h a n a p o - a n d a r e t i n o i c a c i d b o u n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F d o u b l e m u t a n t C R A B P I I . O f c o u r s e , w e u l t i m a t e l y d e s i r e a h i g h r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e o f a r e t i n a l b o u n d p r o t e i n . U n f o r t u n a t e l y , t h i s h a s b e e n h a m p e r e d d u e t o t h e l o w s o l u b i l i t y o f r e t i n a l i n w a t e r a n d i n s t a b i l i t y o f r e t i n a l o v e r t h e e x t e n d e d p e r i o d s o f t i m e r e q u i r e d f o r p r o t e i n c r y s t a l l i z a t i o n . C r y s t a l l i z i n g c o n d i t i o n s r e q u i r e a h i g h c o n c e n t r a t i o n p r o t e i n s a m p l e i n a n a q u e o u s e n v i r o n m e n t , w h i c h i s n o t v e r y s u i t a b l e f o r t h e h y d r o p h o b i c c h r o m o p h o r e . I n o r d e r t o a d d r e s s t h i s , a c o u p l e o f t e c h n i q u e s a r e b e i n g a p p l i e d . O n e i n v o l v e s u s i n g p r e - f o r m e d c r y s t a l s o f t h e a p o - p r o t e i n , a n d s o a k i n g t h e m i n a h i g h c o n c e n t r a t i o n r e t i n a l s o l u t i o n . T h e o t h e r m e t h o d r e q u i r e s t h e u s e o f a c o - s o l v e n t i n t h e p r o t e i n b u f f e r s o l u t i o n 5 5 t h a t w i l l h e l p t o s o l u b i l i z e t h e r e t i n a l . T h e d i f fi c u l t y i n t h i s i s t h a t d i f f e r e n t s o l v e n t s a n d c o n c e n t r a t i o n s m u s t b e a p p l i e d s o a s t o m a x i m i z e r e t i n a l s o l u b i l i t y , y e t n o t h a r m t h e p r o t e i n f o l d i n g a n d c r y s t a l l i z a t i o n . I n a d d i t i o n t o c o - s o l v e n t s , s o m e d e t e r g e n t s m a y h a v e t h e s a m e e f f e c t , b u t a g a i n e x t r e m e c a u t i o n m u s t b e u s e d t o fi n d a c o n c e n t r a t i o n t h a t w i l l n o t d i s r u p t t h e p r o t e i n s t r u c t u r e o r c r y s t a l l i z a t i o n . A d d i t i o n a l l y , t o i n c r e a s e t h e l i f e o f t h e c h r o m o p h o r e a n d i t s b i n d i n g t o t h e p r o t e i n , c r y s t a l l i z a t i o n i s n o w b e i n g p e r f o r m e d a t 4 ° C a s o p p o s e d t o r o o m t e m p e r a t u r e . B e s i d e s t h e t r o u b l e i n a c q u i r i n g a r e t i n a l b o u n d c r y s t a l s t r u c t u r e , t h e o t h e r m a j o r s e t b a c k i n t h e c r y s t a l l o g r a p h y i s t h e a c q u i s i t i o n o f w e l l d i f f r a c t i n g c r y s t a l s o f t h e C R A B P I I p r o t e i n s t h a t h a v e m u l t i p l e m u t a t i o n s . E f f o r t s h a v e i n c l u d e d t h e t e t r a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E a n d t h e p e n t a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F z l e l l L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V . E x p e r i m e n t a t i o n w i t h t h e s e m u t a n t s i s s t i l l o n g o i n g , a n d v e r y h o p e f u l . W e b e l i e v e t o b e c l o s e t o a c q u i r i n g c r y s t a l l o g r a p h i c d a t a o n t h e p e n t a m u t a n t , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V . 5 6 B . 4 . F l u o r e s c e n c e F l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g i s u s e d f o r d e t e r m i n a t i o n o f t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s f o r 6 7 ' ) . . . - b i n d i n g o f b o t h r e t i n a ] a n d r e t i n o i c a c i d f o r e a c h C R A B P I I p r o t e i n . T h e fl u o r e s c e n c e o f T r p r e s i d u e s i n t h e p r o t e i n i s m o n i t o r e d a s a f u n c t i o n o f t h e a d d e d c h r o m o p h o r e ( F i g u r e I I — 6 ) . A s t h e c h r o m o p h o r e i s t i t r a t e d i n t o t h e p r o t e i n s o l u t i o n , s o m e a m o u n t o f t h e T r p fl u o r e s c e n c e w i l l b e q u e n c h e d . A d d i t i o n o f c h r o m o p h o r e c o n t i n u e s u n t i l t h e p o c k e t i s f u l l y s a t u r a t e d a n d t h e r e i s n o l o n g e r a c h a n g e d e t e c t e d i n t h e T r p fl u o r e s c e n c e . T h e s e m e a s u r e m e n t s w i l l b e p l o t t e d a g a i n s t c h r o m o p h o r e c o n c e n t r a t i o n a n d u s e d t o d e t e r m i n e t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s f o r a m o r e d e t a i l e d d e s c r i p t i o n ) . T h e fl u o r e s c e n c e t i t r a t i o n e x p e r i m e n t t o o k a l o t o f w o r k i n o p t i m i z i n g t h e p r o p e r F i g u r e I l - 6 . S t e r e o v i e w o f C R A B P I I w i t h r e t i n a l b o u n d . B i n d i n g a f f i n i t y o f c h r o m o p h o r e s t o t h e C R A B P I I m u t a n t p r o t e i n s i s m o n i t o r e d b y fl u o r e s c e n c e q u e n c h i n g o f T r p r e s i d u e s . C R A B P I I c o n t a i n s t h r e e T r p r e s i d u e s , 1 0 9 ( 9 . 4 A ) , 7 ( 1 0 . 7 A ) . a n d 8 7 ( 1 7 . 8 A ) . 5 7 c o n d i t i o n s f o r a d e q u a t e , r e p r o d u c i b l e d a t a . I n i t i a l l y w e m a d e s e v e r a l m u t a n t s i n c o r p o r a t i n g a n a d d i t i o n a l T r p r e s i d u e c l o s e r t o t h e b i n d i n g c a v i t y i n h o p e s o f s o l v i n g t h i s p r o b l e m . A n e x t r a T r p r e s i d u e w o u l d n o t o n l y i n c r e a s e t h e o v e r a l l f l u o r e s c e n c e o f t h e p r o t e i n , b u t b y m o v i n g i t c l o s e r t o t h e b i n d i n g p o c k e t , a n d c l o s e r t o r e t i n a l , t h e q u e n c h i n g e f f e c t w o u l d b e d r a m a t i c a l l y m o r e v i s i b l e . T r y p t o p h a n r e s i d u e s w e r e a d d e d a t p o s i t i o n s 1 9 ( 3 . 7 A f r o m t h e n e a r e s t p o i n t t o r e t i n a l ) a n d 1 5 ( 4 . 5 A f r o m t h e n e a r e s t p o i n t t o r e t i n a l ) i n t h e w i l d t y p e p r o t e i n a n d t h e d o u b l e m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F t o g i v e t h e f o u r p r o t e i n s F 1 5 W , L 1 9 W , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : F 1 5 W , a n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : L 1 9 W . T h e s e p r o t e i n s w e r e l a t e r f o u n d t o b e u n n e c e s s a r y f o r t h i s p u r p o s e , b u t n o n e t h e l e s s s t i l l p r o v i d e d u s w i t h s o m e v a l u a b l e i n s i g h t . T h e t w o s i n g l e m u t a n t s , F 1 5 W a n d L 1 9 W , d e m o n s t r a t e s i m i l a r r e t i n a l b i n d i n g p r o p e r t i e s a s c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e p r o t e i n . H o w e v e r , t h e m u t a t i o n s a t e i t h e r p o s i t i o n 1 5 o r 1 9 w e r e i n e f f e c t i v e i n p r o d u c i n g a p r o t e i n t h a t b o u n d r e t i n a l a s a P S B . T h i s d a t a w i l l b e i n t r o d u c e d a n d d i s c u s s e d i n m o r e d e t a i l l a t e r , b u t i n b r i e f , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F d o e s d e m o n s t r a t e a r e d s h i f t i n r e t i n a l ’ s a b s o r b a n c e , w h i c h i s l o s t w i t h e i t h e r R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : F 1 5 W o r R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : L 1 9 W . T h e F 1 5 W a n d L 1 9 W m u t a t i o n s m a y h a v e a l s o p r o v i d e d s o m e i n s i g h t i n t o t h e s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n . C r y s t a l l o g r a p h i c a n a l y s i s o f t h e F 1 5 W p r o t e i n b y P r o f e s s o r G e i g e r ’ s l a b o r a t o r y h a s r e v e a l e d t w o c r y s t a l f o r m s , o n e i n t a c t a n d r e s e m b l i n g t h e p r e v i o u s l y p u b l i s h e d c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e w i l d t y p e C R A B P H , a n d a n o t h e r w h e r e t h e t i t - h e l i c a l r e g i o n n e a r t h e o p e n i n g o f t h e b i n d i n g p o c k e t h a s b e e n d i s r u p t e d . P o s i t i o n 1 5 m a y b e o n e o f t h e k e y r e s i d u e s f o r m a i n t a i n i n g t h e s t r u c t u r a l i n t e g r i t y o f t h e p r o t e i n . I t i s b e l i e v e d t h a t t h e r e a r e o n l y a f e w s p e c i fi c a m i n o a c i d s i n t h e L i p o c a l i n f a m i l y o f p r o t e i n s 2 3 t h a t a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e o v e r a l l s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n . A n o t h e r p r o t e i n w a s m a d e 5 8 t o l o o k i n t o t h i s p o s s i b i l i t y o f s t r u c t u r a l c o l l a p s e n e a r t h e e n t r a n c e t o t h e b i n d i n g c a v i t y , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : F 1 5 A , h o w e v e r , w e h a v e y e t t o o b t a i n c r y s t a l l o g r a p h i c d a t a o n t h i s p r o t e i n . B i n d i n g a n a l y s i s o f t h i s m u t a n t , w h i c h w i l l b e i n t r o d u c e d l a t e r , w i l l b e u s e d t o h e l p i n d e t e r m i n i n g t h e p o s s i b i l i t y o f a n y s t r u c t u r a l d e v i a n c e s d u e t o m u t a t i o n o f r e s i d u e 1 5 . O p t i m i z a t i o n o f t h e fl u o r e s c e n c e t i t r a t i o n e x p e r i m e n t s w a s t h e m o s t t e d i o u s o f a l l t h e a s s a y s , a s t h e i n s t r u m e n t a n d t h e s p e c t r a a r e s e n s i t i v e t o m a n y c o m m o n , y e t p o t e n t i a l l y d e t r i m e n t a l p r o b l e m s . A i r b u b b l e s a n d s m a l l p a r t i c l e s w i l l c a u s e n o i s y s p e c t r a , t h e r e f o r e b u f f e r s s h o u l d b e d e - g a s s e d a n d s a m p l e s fi l t e r e d b e f o r e u s i n g t h e m . 2 4 F i n g e r p r i n t s a c t u a l l y d e m o n s t r a t e q u i t e a b i t o f fl u o r e s c e n c e , s o c a r e h a s t o b e t a k e n n o t t o t o u c h t h e q u a r t z c u v e t t e s . 2 5 W h e n h a n d l i n g t h e c u v e t t e s l i n t f r e e g l o v e s s h o u l d a l w a y s b e w o r n , a s l i n t o n t h e o u t s i d e o f a c u v e t t e w i l l i n t e r f e r e w i t h a r e a d i n g j u s t t h e s a m e . A l l 2 5 I n t h e c a s e o f p r o t e i n s a m p l e s , u s e s a m p l e s s h o u l d b e s t o r e d i n g l a s s c o n t a i n e r s . s i l a n i z e d g l a s s w a r e , a s m a n y p l a s t i c c o n t a i n e r s w i l l l e a c h fl u o r e s c e n t m a t e r i a l s i n t o t h e s a m p l e . S a m p l e c o n c e n t r a t i o n s a r e a l s o v e r y i m p o r t a n t . A l t h o u g h m o s t o f t h e p u b l i s h e d w o r k h a s u t i l i z e d c o n c e n t r a t i o n s i n t h e 1 0 ' 6 M r a n g e , I u s e d 1 0 ' 7 M p r o t e i n s o l u t i o n s . F o r t h e m o s t a c c u r a t e r e s u l t , y o u s h o u l d u s e a c o n c e n t r a t i o n i n t h e r a n g e o f t h e e x p e c t e d K d . B e s i d e s , a 1 0 4 5 M s o l u t i o n c o u l d n o t b e u s e d i n m o s t c a s e s s i n c e r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y w a s v e r y l o w a n d a l a r g e e x c e s s o f t h e s u b s t r a t e h a d t o b e a d d e d . T h e l o w s o l u b i l i t y o f r e t i n a l w o u l d p r o d u c e a c l o u d y s a m p l e a n d g i v e e r r o n e o u s r e s u l t s . T h e a m o u n t o f E t O H a d d e d t o t h e m e a s u r e m e n t s a m p l e w a s a l s o o f c o n c e r n . R e t i n a l i s t i t r a t e d i n t o t h e p r o t e i n f r o m a s t o c k i n E t O H ( s p e c t r a l g r a d e ) . T h e fi n a l E t O H c o n c e n t r a t i o n m u s t b e k e p t b e l o w 5 9 2 % . I t h a s b e e n s h o w n t h a t E t O H c o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n 2 - 8 % c a n r e d s h i f t t h e m a x i m u m w a v e l e n g t h u p t o 4 0 n m . 2 6 A d d i t i o n a l l y , a n o p t i m u m s a l t c o n c e n t r a t i o n m u s t b e u s e d f o r p r o t e i n a n a l y s i s i n b u f f e r . P o l a r s o l v e n t s , i n c l u d i n g w a t e r h a v e b e e n s h o w n t o q u e n c h s o m e a m o u n t o f T r p fl u o r e s c e n c e . 2 7 A h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n ( 1 5 0 m M ) p o t e n t i a l l y h e l p s t o s h i e l d t h e p r o t e i n a n d r e d u c e t h e a m o u n t o f u n w a n t e d q u e n c h i n g . A l l s a l t s u s e d i n t h e b u f f e r m u s t b e o f t h e h i g h e s t g r a d e a v a i l a b l e t o e n s u r e m i n i m a l b a c k g r o u n d fl u o r e s c e n c e . T e m p e r a t u r e a n d p H o f t h e m e a s u r e m e n t s a m p l e s a r e a l s o c r i t i c a l t o m a i n t a i n . I f t h e t e m p e r a t u r e i s r a i s e d a b o v e a m b i e n t , t h e w a v e l e n g t h o f t h e T r p e m i s s i o n w i l l r e d s h i f t a n d t h e i n t e n s i t y o f t h e p e a k w i l l d e c r e a s e . A t h i g h e r t e m p e r a t u r e s , t h e e x c i t e d s t a t e c a n r e t u r n t o t h e g r o u n d s t a t e v i a o t h e r m e a n s s u c h a s p h o s p h o r e s c e n c e . ” 2 8 L i k e w i s e , a n o p t i m a l p H i s r e q u i r e d f o r t h e p r o t e i n s a m p l e , i f i t i s e i t h e r t o o a c i d i c o r t o o b a s i c , t h e p r o t e i n s a m p l e m a y d e n a t u r e . 2 9 T y p i c a l p r o t e i n s a m p l e s h a v e a T r p e m i s s i o n i n t h e r a n g e o f 3 3 0 - 3 5 0 n m , b u t t h i s v a r i e s w i t h t h e p r o t e i n , t h e n u m b e r o f T r p r e s i d u e s , a n d w h e t h e r o r n o t t h e y a r e s o l v e n t e x p o s e d . ” 3 2 F r e e T r p e m i t s a t 3 6 5 n m . A d e n a t u r e d p r o t e i n w i l l r e d s h i f t t o w a r d s 3 6 5 n m a n d p r o v i d e a f a l s e s a t u r a t i o n p o i n t f o r t h e t i t r a t i o n . P r o t e i n s l i k e t o s t i c k t o t h e s u r f a c e o f g l a s s . W h e n s t o r i n g t h e s a m p l e s , s i l a n i z e d g l a s s w a r e s h o u l d b e u s e d t o a v o i d l o s s o f p r o t e i n a n d a c h a n g e i n p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n . W h e n p e r f o r m i n g t h e a c t u a l fl u o r e s c e n c e t i t r a t i o n w i t h l o w c o n c e n t r a t i o n p r o t e i n s a m p l e s a d u m m y p r o t e i n , s u c h a s g e l a t i n , s h o u l d b e u s e d t o s t a b i l i z e t h e p r o t e i n a n d a v o i d l o s s d u e t o b i n d i n g w i t h t h e s u r f a c e o f t h e c u v e t t e . T h e c u v e t t e s w e r e i n c u b a t e d f o r a p p r o x i m a t e l y t h i r t y m i n w i t h a 1 % g e l a t i n ( w / v ) b u f f e r s o l u t i o n . G e l a t i n i s a p r o t e i n t h a t 6 0 d o e s n o t c o n t a i n T r p r e s i d u e s , t h e r e f o r e i t w i l l n o t i n t e r f e r e w i t h t h e fl u o r e s c e n c e m e a s u r e m e n t s . A fi n a l n o t e t o m e n t i o n i s t h e f a c t t h a t r e t i n a l a l o n e a c t u a l l y i n t e r f e r e s s o m e w i t h t h e T r p fl u o r e s c e n c e d e t e c t i o n . T h e f r e e c h r o m o p h o r e w i l l q u e n c h s o m e o f t h e T r p e m i s s i o n . T o c o r r e c t f o r t h i s , o n e m u s t p e r f o r m a b l a n k t i t r a t i o n w i t h N - a c e t y l t r y p t o p h a n a m i d e , a n d a d d b a c k t h i s l o s t fl u o r e s c e n c e . 3 3 D e t a i l s o f t h i s p r o c e s s a r e g i v e n i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s s e c t i o n . I n t e r e s t i n g l y h o w e v e r , r e t i n o i c a c i d , w h i c h h a s a c l o s e r A m v a l u e t o t h e T r p e m i s s i o n w a v e l e n g t h , d o e s n o t h a v e t h e s a m e e f f e c t . I n c o m p a r i n g t h e fl u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g t o r e t i n a l b i n d i n g , t h e r e t i n o i c a c i d c u r v e s g e n e r a l l y g i v e a l o w e r r e l a t i v e i n t e n s i t y ( ~ 0 . 2 ) u p o n s a t u r a t i o n t h a n r e t i n a l ( ~ 0 . 5 ) . T h e d r o p i n i n t e n s i t y i s t h e a m o u n t o f T r p fl u o r e s c e n c e q u e n c h e d b y t h e c h r o m o p h o r e . T h e c l o s e r t h e c h r o m o p h o r e ’ s a b s o r b a n c e i s t o t h e T r p e m i s s i o n w a v e l e n g t h , t h e m o r e i t m a y q u e n c h . R e t i n o i c a c i d a b s o r b s a t a s i m i l a r w a v e l e n g t h t o w h e r e m o s t o f t h e C R A B P I I p r o t e i n s e m i t fl u o r e s c e n c e . R e t i n o i c a c i d ’ s a b s o r b a n c e i s c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t a n d v a r i e s f r o m 3 5 0 n m a t 1 0 " M t o 3 3 8 n m a t 1 0 ’ 6 M . T r p e m i s s i o n w a v e l e n g t h a l s o v a r i e s w i t h t h e p r o t e i n a n d c o n c e n t r a t i o n , b u t t y p i c a l l y i s a t 3 4 5 n m f o r C R A B P H p r o t e i n a t 1 0 ' 7 M . R e t i n a l , w h o s e m a x i m a l a b s o r b a n c e a l s o v a r i e s s l i g h t l y w i t h c o n c e n t r a t i o n , a b s o r b s n e a r 3 7 0 n m i n a p r o t e i n s o l u t i o n , t h a t i s i f i t e x i s t s a s t h e a l d e h y d e . T h e S c h i f f b a s e w i l l a b s o r b n e a r 3 6 5 n m a n d t h e P S B w i l l a b s o r b a n y w h e r e f r o m 4 2 0 n m — 4 6 5 n m . T h e l o w e r r e l a t i v e s a t u r a t i o n p o i n t o b s e r v e d i n t h e r e t i n a l t i t r a t i o n s m a y j u s t b e d u e t o t h e f a c t t h a t r e t i n a l c a n n o t q u e n c h t h e T r p a b s o r b a n c e a s e f f i c i e n t l y a s r e t i n o i c a c i d . 6 1 W e c a n n o t d i s p u t e t h e f a c t t h a t d i f f e r e n t f o r m s o f r e t i n a l m a y n o t q u e n c h a s e f fi c i e n t l y , b u t w e a l s o c a n n o t s a y w i t h c e r t a i n t y t h a t t h i s i s t h e o n l y r e a s o n f o r t h e o b s e r v e d l o w e r s a t u r a t i o n p o i n t . A n o t h e r t h e o r y f o r t h i s c o u l d b e t h a t t w o o r m o r e i s o f o r r n s o f t h e m u t a n t p r o t e i n s e x i s t s , a n d o n l y a p e r c e n t a g e o f t h e p r o t e i n b i n d s r e t i n a l . I f f o r e x a m p l e o n l y 5 0 % o f t h e p r o t e i n b i n d s r e t i n a l , t h a t w o u l d p r o d u c e a fl u o r e s c e n c e q u e n c h e d c u r v e w i t h s i m i l a r c h a r a c t e r i s t i c s a s i f 1 0 0 % o f t h e p r o t e i n w e r e t o b i n d r e t i n a l . T h e o n l y d i f f e r e n c e b e i n g t h a t t h e p r o t e i n t h a t e x h i b i t s 1 0 0 % b i n d i n g s h o u l d h a v e a l o w e r r e l a t i v e i n t e n s i t y . T h i s i s o n e i n s t a n c e w h e r e a m o r e t h o r o u g h a n a l y s i s o f t h e C D c u r v e s m a y h e l p i n p r o v i d i n g u s e f u l i n s i g h t i n t o d e g r e e s o f p r o t e i n s e c o n d a r y s t r u c t u r e . 6 2 B . 5 . U V - v i s U V - v i s w i l l b e t h e p r i m a r y m e a n s o f d i s t i n g u i s h i n g w h e t h e r o r n o t t h e f o r m a t i o n o f a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e h a s o c c u r r e d , ( d i a g n o s t i c t h r o u g h a l a r g e r e d s h i f t o f t h e r e t i n a l a b s o r b a n c e , F i g u r e I I - 7 ) . F r e e r e t i n a l a b s o r b s n e a r 3 8 0 n m i n p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e . A s t h e r e t i n a l m i g r a t e s t o t h e b i n d i n g c a v i t y o f t h e p r o t e i n w e d i d n o t e x p e c t a s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e i n a b s o r b a n c e . H o w e v e r , w e d o i n f a c t s e e a p p r o x i m a t e l y a 1 0 n m b l u e s h i f t f o r t h e s o l v e n t p r o t e c t e d f r e e a l d e h y d e a s e v i d e n t b y e x p e r i m e n t a t i o n w i t h s e v e r a l C R A B P H p r o t e i n s t h a t e i t h e r d o n o t c o n t a i n a L y s i n t h e b i n d i n g p o c k e t , o r w e r e p r o v e n t h r o u g h o t h e r m e a n s t o n o t f o r m a c o v a l e n t c o m p l e x d e s p i t e h a v i n g a n i n t e r n a l L y s . B y s o l v e n t p r o t e c t e d a l d e h y d e , I d o n o t m e a n t o i m p l y t h a t t h e r e t i n a l i n t h i s c a s e m u s t b e w i t h i n t h e b i n d i n g p o c k e t , a s e v e n p r o t e i n s w i t h a v e r y l o w a f fi n i t y f o r r e t i n a l s h o w a 1 0 n m b l u e s h i f t , i . e . , t h e w i l d t y p e p r o t e i n w h o s e c o m p l e t e d a t a w i l l b e p r e s e n t e d i n t h e n e x t s e c t i o n . P e r h a p s s i m p l y t h e e x i s t e n c e o f p r o t e i n i n t h e s a m p l e m i x t u r e , e v e n i f r e t i n a l i s o n t h e o u t s i d e o f t h e b i n d i n g c a v i t y , c a n p r o v i d e s o m e d e g r e e o f s h i e l d i n g . A s i g n i fi c a n t c h a n g e i n t h e r e t i n a l a b s o r b a n c e w a s n o t e x p e c t e d f o r t h e f o r m a t i o n o f a S c h i f f b a s e e i t h e r . T h e r e h a v e b e e n d a t a p u b l i s h e d t o s u g g e s t t h a t t h e S c h i f f b a s e w i l l a l s o b l u e s h i f t s l i g h t l y f r o m t h e f r e e a l d e h y d e a b s o r b a n c e . O u r e x p e r i m e n t a t i o n , a l t h o u g h s o m e w h a t l i m i t e d i n t h i s a r e a a l s o s e e m s t o s u g g e s t a k m o f ~ 3 6 5 n m f o r t h e u n p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . T h i s w i l l b e d i s c u s s e d i n m o r e d e t a i l l a t e r . A l t h o u g h t h e r e i s a p p r o x i m a t e l y a 5 n m d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e f r e e a l d e h y d e a n d t h e S c h i f f b a s e o f r e t i n a l , w e a r e n o t c o n fi d e n t e n o u g h i n b e i n g a b l e t o d i f f e r e n t i a t e t h e s e t w o s p e c i e s s o l e l y b y U V - v i s t o d r a w a n y d e c i s i v e c o n c l u s i o n s . 6 3 o r n o t t h e p r o t o n a t e d s t a t e o f t h e S B e x i s t s . [ A b s > 4 2 0 " m l W e c a n b e c o n fi d e n t h o w e v e r i n \ \ \ \ d e t e r r n i n i n i f t h e r e i s a r o t o n a t e d S c h i f f b a s e g P H ? _ N “ : i L y s 1 3 2 [ A b s ~ 3 7 0 n m l p r e s e n t . T h e P S B o f r e t i n a l s h o u l d p r o d u c e a d r a m a t i c a l l y r e d s h i f t e d a b s o r b a n c e a s s e e n w i t h t h e r h o d o p s i n p r o t e i n s , a n d e v e n t h e W N ‘ V ” 8 1 3 2 f o r m a t i o n o f a P S B w i t h n - b u t y l a r n i n e . 3 4 U V - A b s . ~ 3 6 5 n m v i s a n d t h e r e d s h i f t o f t h e r e t i n a l a b s o r b a n c e 1 1 w i l l b e o u r r i m m e a n s o f d e d u c i n w h e t h e r 9 p m y g \ \ \ \ ‘ fi ' W ‘ L y s 1 3 2 A l t h o u g h w e w i l l h a v e M A L D I — T O F a n a l y s i s F i g u r e 1 1 - 7 . E q u i l i b r i u m b e t w e e n r e t i n a l O f t h e c o m p l e x e s , g i v e n t h e u n c e r t a i n t y i n a n d t h e p r o t e i n . T h e f r e e a l d e h y d e a n d t h e S c h i f f b a s e b o t h p o r t r a y s i m i l a r A m v a l u e s . m a s s a n a l y s i s , w e c a n n o t d i s t i n g u i s h a n T h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e w i l l s h o w a l a r g e u n p r o t o n a t e d S B f r o m a p r o t o n a t e d o n e , i . e . , a r e d s h i f t . s i n g l e m a s s u n i t . I n b r i e f , w e h a v e e n g i n e e r e d p r o t e i n s t h a t r e d s h i f t t o ~ 4 2 0 n m a n d s o m e u p t o ~ 4 6 0 n m . T h e 4 6 0 n m a b s o r b i n g s p e c i e s , a t l o w e q u i v a l e n t s ( 0 . 2 5 e q . ) s h o w p r i m a r i l y a r e d s h i f t , b u t a t a h i g h e r r e t i n a l e q u i v a l e n t a d d i t i o n , o n l y t h e 3 8 0 n m p e a k g r o w s w h i l e t h e r e i s n o c h a n g e i n t h e 4 6 0 n m p e a k . F o r p r o t e i n s t h a t a b s o r b a t ~ 4 2 0 n m , a f t e r m o r e t h a n 0 . 2 5 e q . o f r e t i n a l w a s a d d e d , t h e r e d s h i f t e d p e a k b e g a n t o s h i f t b a c k t o ~ 3 8 0 n m ( F i g u r e 1 1 - 8 ) . T h i s s h i f t i n a b s o r b a n c e d o e s n o t s e e m t o b e d u e t o a s i m p l e m a s k i n g o f t h e r e d s h i f t e d p e a k f r o m a n o v e r b e a r i n g f r e e a l d e h y d e ( 3 8 0 n m ) , a s s e c o n d d e r i v a t i v e a n a l y s i s r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f o n l y a s i n g l e p e a k . 3 5 ' 3 6 T h e 4 2 0 n m p e a k i s s l o w l y b e i n g o g m g 0 0 0 0 0 0 ' . ‘ . 8 6 4 0 9 - J 0 3 0 i 5 0 3 . 0 0 4 . 5 0 4 5 0 0 5 5 0 — — — — — O — . 0 0 0 1 . . . 1 . 2 4 6 0 s s s s e e e e e q q q q q u u u u u i u i i i v v v v v a a a a a a l l l l l e e e e e n n n n n t t t t t s h i f t e d t o ~ 3 8 0 n m , a s o p p o s e d t o l o s s o f t h e 4 2 0 n m p e a k a n d a p p e a r a n c e o f t h e 3 8 0 n m p e a k s i m u l t a n e o u s l y , a s m a y b e e x p e c t e d i f t h e s e a r e t w o d i f f e r e n t s p e c i e s . S i n c e t h e r e i s a l a r g e a m o u n t o f a n o n - r e d s h i f t e d s p e c i e s a t h i g h e r e q u i v a l e n t s , t o b e t t e r s e e t h e r e d s h i f t e d p e a k , t h e f r e e r e t i n a l p e a k w a s s u b t r a c t e d f r o m t h e s p e c t r a ( s e e M a t e r i a l a n d M e t h o d s s e c t i o n f o r m o r e d i s c u s s i o n ) . T h i s s u b t r a c t i o n h a s n o e f f e c t o n t h e p e a k s a l r e a d y p r e s e n t , i t s o l e l y a l l o w s t h e r e d s h i f t e d p e a k t o b e m o r e v i s i b l e , a s t h e p e a k s a c q u i r e d f r o m t h e s u b t r a c t i o n v e r y c l o s e l y m a t c h t h o s e s e e n f r o m t h e s e c o n d d e r i v a t i v e o f t h e o r i g i n a l s p e c t r a . I n d o i n g t h i s i t c a n b e n o t i c e d t h a t , j u s t a s s e c o n d d e r i v a t i v e a n a l y s i s r e v e a l e d , t h e p e a k i s r e d s h i f t e d a t l o w e q u i v a l e n t s , a n d g r a d u a l l y r e t u r n s t o ~ 3 7 5 n m , s u g g e s t i n g l o s s o f t h e r e d s h i f t e d s p e c i e s a t h i g h e r r e t i n a l c o n c e n t r a t i o n s ( F i g u r e I I - 8 ) . T h e M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s ( d i s c u s s e d i n t h e n e x t s e c t i o n ) a r e d o n e a t r e t i n a l c o n c e n t r a t i o n s g r e a t e r t h a n o n e e q u i v a l e n t , a n d S c h i f f b a s e i s n m F i g u r e I l - 8 . C o r r e c t e d U V - v i s s p e c t r a o f a r e t i n a l t i t r a t i o n w i t h R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l l 1 E : : T 5 4 V . A s h i g h e r r e t i n a l e q u i v a l e n t s a r e a d d e d t h e r e d s h i f t s e e n a t l o w e q u i v a l e n t s i s s l o w l y l o s t . T h e r e t i n a l p e a k b e g i n s a t 4 3 0 n m , 0 . 1 e q u i v a l e n t s , a n d e n d s a t 3 8 5 n m 1 . 0 e q u i v a l e n t . T h e r e d s h i f t e d p e a k i s n o t s i m p l y m a s k e d b y a n o v e r w h e l m i n g f r e e a l d e h y d e a b s o r b a n c e . b u t i s n o l o n g e r p r e s e n t a s s e e n f r o m t h e s e c o n d d e r i v a t i v e a n a l y s i s . 6 5 s t i l l v i s i b l e , s o l o s s o f t h e r e d s h i f t h e r e m a y i m p l y l o s s o f p r o t o n a t i o n , b u t n o t l o s s o f c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n . A t t h i s p o i n t , f o r p u r p o s e s o f c l a r i t y , i t s h o u l d b e p o i n t e d o u t t h a t a l l o f t h e s p e c t r a s h o w n w i t h i n t h e t e x t a r e t a k e n w i t h a p p r o x i m a t e l y 0 . 2 5 e q u i v a l e n t s o f r e t i n a l p r e s e n t a n d h a v e h a d a n e q u i v a l e n t a m o u n t o f 3 8 0 n m a b s o r b i n g r e t i n a l s u b t r a c t e d f r o m t h e m . I n t h e A p p e n d i x b o t h o r i g i n a l a n d s u b t r a c t e d s p e c t r a a r e g i v e n , a s w e l l a s U V - v i s c u r v e s w i t h v a r y i n g a m o u n t s o f r e t i n a l . 6 6 B - S . 1 1 1 1 1 1 t h B - S . M A L D I - T O F T h e f i n a l b i n d i n g a s s a y p e r f o r m e d o n e a c h p r o t e i n m u t a n t i n v o l v e s t h e u s e o f t w o M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s . 3 7 T h e fi r s t o f t h e s e e x p e r i m e n t s i s t h e i n c u b a t i o n o f r e t i n a l w i t h t h e p r o t e i n . S u f fi c i e n t t i m e i s a l l o w e d f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n t o t a k e p l a c e , t h e s a m p l e i s t h e n w a s h e d w i t h e t h a n o l a n d c o n c e n t r a t e d . T h e c o v a l e n t b o n d b e t w e e n r e t i n a l a n d t h e p r o t e i n , i f f o r m e d , c a n b e d e t e c t e d a s a n [ M + 2 6 6 ] + p e a k i n t h e M A L D I - T O F s p e c t r u m . I n a d d i t i o n , r e d u c t i v e a m i n a t i o n o f t h i s i n c u b a t e d s a m p l e w i t h N a C N B H 3 w i l l b e p e r f o r m e d t o c o v a l e n t l y t r a p t h e r e t i n a l m o l e c u l e w i t h t h e p r o t e i n . 3 8 T h i s c o v a l e n t c o m p o u n d c a n b e s e e n a s a n [ M + 2 6 8 ] + p e a k ( F i g u r e I I - 9 ) . T h e n e c e s s i t y f o r b o t h M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s a r i s e s f r o m t h e f a c t t h a t s o m e S c h i f f b a s e s , p r o t o n a t e d o r n o t , m a y n o t b e s t a b l e e n o u g h t o b e t r a p p e d u n d e r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n c o n d i t i o n s , b u t w i l l s u r v i v e t h e w o r k - u p f r o m t h e i n c u b a t i o n l o n g e n o u g h t o b e d e t e c t e d . I n i t i a l l y , w e h a d a t t e m p t e d m a n y d i f f e r e n t p r o c e d u r e s t o s e p a r a t e u n r e a c t e d r e t i n a l o r r e d u c e d r e t i n a l f r o m t h e p r o t e i n b e f o r e 6 7 \ \ \ \ + H z N N L y s 1 3 2 l \ \ \ \ ‘ W L y 5 1 3 2 9 \ \ \ \ \ fi fi ‘ L y s 1 3 2 l \ \ \ \ ” N L y s 1 3 2 F i g u r e 1 1 - 9 . C o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n b e t w e e n r e t i n a l a n d t h e p r o t e i n c a n b e d e t e c t e d b y M A L D I - T O F . S c h i f f b a s e o r P S B f o r m a t i o n c a n b e s e e n a s a n [ M + 2 6 6 ] + o r [ M + 2 6 7 ] + p e a k , r e s p e c t i v e l y . B o t h s p e c i e s c a n b e r e d u c t i v e l y a r n i n a t e d a n d t r a p p e d a s a n [ M - t - 2 6 8 ] + s p e c i e s . 1 1 1 1 1 6 1 1 1 3 1 t h a t t h e 1 p r o p t O l l m a ; a s d o f i n d i n g a s u c c e s s f u l r o u t e . A s u m m a r y o f t h e s e m e t h o d s i s g i v e n i n T a b l e 1 1 - 1 . I n b r i e f , e x t r a c t i o n s , c e n t r i f u g a l fi l t e r s , i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , s i z e e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y , o r i o n a f fi n i t y w o u l d n o t c o m p l e t e l y s e p a r a t e r e t i n a l a n d / o r r e t i n o l f r o m t h e p r o t e i n r e a c t i o n m i x t u r e . A d e n a t u r i n g e x t r a c t i o n w i t h e t h y l a c e t a t e a n d u r e a d i d p r o v i d e s e p a r a t i o n o f a r e t i n a l / p r o t e i n s a m p l e , h o w e v e r , i t d i d n o t s e p a r a t e r e t i n a l f r o m a p r o t e i n s o l u t i o n ( w i l d t y p e ) t h a t a l s o c o n t a i n e d t h e b o r o h y d r i d e r e d u c i n g a g e n t . S e v e r a l o f t h e s e m e t h o d s w e r e a l s o a t t e m p t e d w i t h r a d i o a c t i v e r e t i n a l , 1 5 - 3 H - r e t i n a l , i n c l u d i n g S e p h a d e x a n d N i 2 + - N T A s e p a r a t i o n . S o m e a m o u n t o f r a d i o a c t i v i t y w a s f o u n d i n t h e p r o t e i n ( w i l d t y p e a n d R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F ) c o n t a i n i n g f r a c t i o n s , b u t s i m i l a r a m o u n t s o f r a d i o a c t i v i t y w e r e f o u n d i n a l m o s t a l l f r a c t i o n s , e v e n n o n - p r o t e i n c o n t a i n i n g f r a c t i o n s . G e n e r a l l y , t h e r a d i o a c t i v i t y w a s s p r e a d e q u a l l y i n a l l f r a c t i o n s , a n d t h e m a j o r i t y o f t h e r a d i o a c t i v i t y c o u l d n o t b e a c c o u n t e d f o r , p r e s u m a b l y s t u c k t o t h e c o l u m n r e s i n w h i c h c o u l d n o t b e s o l u b i l i z e d w e l l e n o u g h i n t h e s c i n t i l l a t i o n c o c k t a i l f o r a d e q u a t e d e t e c t i o n . W h i l e i t w a s e n c o u r a g i n g t h a t m o s t o f t h e r e t i n a l w a s b e i n g s e p a r a t e d , t h e f a c t t h a t w e c o u l d s t i l l d e t e c t r e t i n a l b y U V i n t h e p r o t e i n c o n t a i n i n g f r a c t i o n s ( w i l d t y p e , n o L y s i n t h e b i n d i n g c a v i t y ) , m e a n t t h a t i t m a y s t i l l i n t e r f e r e i n t h e M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s a n d t h e d e t e r m i n a t i o n o f r e t i n a l b i n d i n g t o b e s o l e l y w i t h i n t h e b i n d i n g c a v i t y . O u r a t t e m p t s a t s e p a r a t i n g n o n c o v a l e n t l y l i n k e d c h r o m o p h o r e f r o m t h e r e t i n a l / p r o t e i n i n c u b a t e d m i x t u r e , w i t h o u t d i s t u r b i n g t h e c o v a l e n t b o n d o f S B b o u n d r e t i n a l , i n c l u d e d c o n c e n t r a t i o n w i t h M i l l i p o r e c e n t r i f u g a l fi l t e r s , w a s h i n g o n c e w i t h E t O H a n d t w i c e w i t h w a t e r . M a s s a n a l y s i s w i l l s h o w a c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l m o l e c u l e t o s e l e c t p r o t e i n s a s a + 2 6 6 a d d u c t ( r e t i n a l M W = 2 8 4 g / m o l e ) . P r o t e i n s w i t h o u t t h e e n g i n e e r e d 6 8 “ N I I a n — I V . l q l . . . J . L y s s a p : t h e p i t p i t 1 1 0 L y s i n t h e b i n d i n g c a v i t y w i l l n o t s h o w t h i s a d d u c t , p r o v i n g t h a t e i t h e r a l l f r e e r e t i n a l i s s e p a r a t e d f r o m t h e m i x t u r e , o r a t l e a s t w i l l n o t i n t e r f e r e w i t h t h e r e s u l t s o b t a i n e d a s o n l y t h e f r e e p r o t e i n p e a k i s o b s e r v e d . S e p a r a t i o n o f r e t i n a l f r o m a r e d u c t i v e l y a m i n a t e d p r o t e i n m i x t u r e w a s a c h i e v e d t h r o u g h u s e o f a F a s t - Q i o n e x c h a n g e c o l u m n . A m o r e d e t a i l e d p r o c e d u r a l e x p l a n a t i o n c a n b e f o u n d i n t h e M a t e r i a l a n d M e t h o d s s e c t i o n . W h i l e c o n s i d e r i n g t h e s p e c t r a f r o m e i t h e r t h e i n c u b a t i o n o f r e t i n a l w i t h t h e p r o t e i n o r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n b e t w e e n t h e t w o , t h e p e a k r a t i o s b e t w e e n f r e e p r o t e i n v e r s u s p r o t e i n r e v e a l i n g a c o v a l e n t l y l i n k e d r e t i n a l m o l e c u l e c a n o n l y b e q u a l i t a t i v e l y a n d n o t q u a n t i t a t i v e l y . T h a t i s , b a s e d o n p e a k r a t i o s , w e c a n n o t d e t e r m i n e h o w m u c h o f t h e p r o t e i n s a m p l e i s b o u n d t o a r e t i n a l m o l e c u l e . R e t i n a l a b s o r b s n e a r t h e f r e q u e n c y o f t h e l a s e r a n d o f t e n d o e s n o t i o n i z e a s e f fi c i e n t l y a s t h e f r e e p r o t e i n w o u l d . A d d i t i o n a l l y , t h e p e a k r a t i o s w i l l v a r y b a s e d o n h o w w e l l t h e m i x t u r e c o - c r y s t a l l i z e s w i t h t h e m a t r i x a n d w h e r e t h e l a s e r i s a c t u a l l y s h o t . O f t e n , o n e s a m p l e w i l l p r o d u c e v e r y d i f f e r e n t p e a k r a t i o s d e p e n d i n g o n w h e r e t h e l a s e r i s a i m e d . A fi n a l n o t e o f m e n t i o n i n t h e M A L D I - T O F s p e c t r a i s t h a t , a s s p e c t r a a r e a c q u i r e d a s a r e s u l t o f c o - c r y s t a l l i z a t i o n w i t h t h e m a t r i x s i n a p i n i c a c i d . A n a d d u c t a s a r e s u l t o f t h e m a t r i x a d d i t i o n w i l l b e s e e n 2 2 0 m a s s u n i t s h i g h e r t h a n t h e p r o t e i n p e a k , a n d / o r a d e h y d r a t e d a d d u c t 2 0 2 m a s s u n i t s g r e a t e r t h a n t h e p r o t e i n m a s s m a y b e s e e n i n a l l M A L D I - T O F s p e c t r a . T h i s a d d u c t d o e s n o t i n t e r f e r e w i t h t h e a b i l i t y t o d e t e c t t h e + 2 6 6 - 2 6 8 p e a k a s a r e s u l t o f c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n w i t h a s i n g l e r e t i n a l m o l e c u l e . 6 9 T a b l e 1 1 - 1 . S u m m a r y o f p r o c e d u r e s a t t e m p t e d f o r r e t i n a l r e m o v a l f r o m p r o t e i n s o l u t i o n s A c t i o n f o r R e m o v i n g R e t i n a l R e s u l t S p i n t h r o u g h M i l l i p o r e 5 0 0 u L - c e n t r i f u g a l fi l t e r s 1 . W a t e r w a s h , r e t i n a l d i d n o t w a s h t h r o u g h fi l t e r . 2 . A c e t o n i t r i l e w a s h d i s s o l v e d fi l t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . E t O H w a s h d i d n o t p a s s t h r o u g h fi l t e r . S p i n t h r o u g h M i l l i p o r e Y M - 3 c e n t r i f u g a l fi l t e r s 2 . U r e a w a s h , r e t i n a l d i d n o t p a s s t h r o u g h fi l t e r . 3 . S D S w a s h , r e t i n a l d i d n o t p a s s t h r o u g h fi l t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . E t O A c , r e t i n a l r e m a i n e d i n a q u e o u s l a y e r . 2 . E t O A c a n d u r e a : W o u l d s e p a r a t e r e t i n a l f r o m a n i n c u b a t e d p r o t e i n r e a c t i o n , b u t w o u l d n o t E x t r a c t i o n s s e p a r a t e r e t i n a l f r o m a r e a c t i o n w h e r e b o r o h y d r i d e h a s b e e n a d d e d . 3 . S p i n t o d r y n e s s i n s p e e d v a c , e x t r a c t E t O A c , d i d r e m o v e s o m e a m o u n t s o f r e t i n a l , b u t l e f t p r o t e i n u n r e c o v e r a b l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . R e t i n a l c o e l u t e d w i t h p r o t e i n . N i 2 + - N T A C o l u m n 2 . U n d e r d e n a t u r i n g c o n d i t i o n s , r e t i n a l w a s s t i l l v i s i b l e i n p r o t e i n f r a c t i o n s b y H P L C . . - - - - - - - - — - - - — - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - — - - - - - - - — — - - — - - - - - - - o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . 6 M u r e a b u f f e r , r e t i n a l c o e l u t e d . S e p h a d e x C o l u m n 2 . 5 0 % a c e t o n i t r i l e i n P B S , r e t i n a l c o n t a i n i n g f r a c t i o n s ( f o u n d b y U V ) a l s o c o n t a i n e d p r o t e i n ( f o u n d b y S D S - P A G E ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P r e c i p i t a t e p r o t e i n w i t h t r i c h l o r o a c e t i c a c i d R e t i n a l d e t e c t e d i n p r e c i p i t a t e . P r o t e i n u n r e c o v e r a b l e . 7 0 C . W i l d - T y p e C R A B P I I B i n d i n g P r o p e r t i e s A d e p i c t i o n o f t h e w i l d t y p e C R A B P I I p r o t e i n c a n b e s e e n i n F i g u r e I I - l O w i t h s e l e c t a m i n o a c i d s i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h e c h r o m o p h o r e s h o w n . A r g 1 3 2 a n d A r g 1 1 1 a r e 3 . 8 A a n d 5 . 4 A f r o m t h e r e t i n o i c a c i d c a r b o n y l c a r b o n , r e s p e c t i v e l y . T h e p h e n o l i c o x y g e n o f T y r 1 3 4 i s 3 . 2 A a w a y , a n d t h e h y d r o x y l o x y g e n o f T h r 5 4 i s 3 . 8 A a w a y . L e u 1 2 1 . w h i c h i s t h e o n l y h y d r o p h o b i c r e s i d u e i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h e c h r o m o p h o r e , r e s i d e s 3 . 7 A f r o m t h e c h r o m o p h o r e . P r e v i o u s l y p u b l i s h e d d a t a s h o w s t h a t C R A B P I I h a s a s t o i c h i o m e t r i c b i n d i n g r e l a t i o n s h i p w i t h i t s n a t i v e s u b s t r a t e r e t i n o i c a c i d , w i t h a n a p p r o x i m a t e 2 n M d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t . 6 O u r e x p e r i m e n t a t i o n h a s a l s o r e p r o d u c e d t h i s r e s u l t ( F i g u r e I I — l 1 a ) . D e s p i t e r e t i n a l h a v i n g a v e r y s i m i l a r s t r u c t u r e , l a c k o f t h e a n i o n i c f u n c t i o n a l i t y p r o h i b i t s t h i s s u b s t r a t e f r o m h a v i n g a t i g h t b i n d i n g t o t h e p r o t e i n . R e c a l l t h a t t h e a n i o n i c r e t i n o i c a c i d i s h e l d i n p l a c e t h r o u g h h y d r o g e n b o n d i n g w i t h t h e t w o p o s i t i v e l y c h a r g e d A r g r e s i d u e s . N e u t r a l r e t i n a l h o w e v e r , h a s a v e r y w e a k a f fi n i t y f o r t h e w i l d — t y p e p r o t e i n , e x h i b i t i n g a F i g u r e I I - 1 0 . S t e r e o v i e w o f w i l d - t y p e C R A B P I I . R e t i n a l i s s h o w n b o u n d t o t h e p r o t e i n . a s w e l l a s r e s i d u e s w h o s e m u t a t i o n s w i l l b e a d d r e s s e d i n t h e f o r m a t i o n o f a s u c c e s s f u l p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e f o r m i n g p r o t e i n ; A r g 1 3 2 . T y r 1 3 4 . L e u 1 2 1 . A r g l l l . T h r 5 4 . 7 1 p o o r d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t , K ; = 6 6 0 0 1 - 3 6 0 n M ( F i g u r e I I - l l a ) . T h i s l o w b i n d i n g a f fi n i t y m a y b e d u e t o t h e h y d r o p h i l i c n a t u r e o f t h e c a v i t y , a n d t h e l a c k o f a s t a b i l i z i n g f e a t u r e s u c h a s t h e h y d r o g e n b o n d i n g n e t w o r k s e e n i n t h e n a t i v e s y s t e m . T h e U V m a x i m a l a b s o r b a n c e o f r e t i n a l w h e n i n c u b a t e d w i t h t h e w i l d - t y p e C R A B P I I p r o t e i n , e x h i b i t s a h m , o f 3 7 0 n m ( F i g u r e I I - l l b ) . T h e r e t i n a l a b s o r b a n c e v a l u e a s o b s e r v e d i n t h e p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) b l a n k s o l u t i o n i s 3 8 0 n m . T h e 1 0 n m d i f f e r e n c e , a s d i s c u s s e d b e f o r e , c o u l d b e d u e t o t h e n o n - s p e c i fi c i n t e r a c t i o n o f t h e p r o t e i n w i t h r e t i n a l , p e r h a p s s o m e a m o u n t o f s h i e l d i n g o f t h e h y d r o p h o b i c m o l e c u l e f r o m t h e w a t e r e n v i r o n m e n t . I n a d d i t i o n , s i n c e t h e r e a r e n o L y s r e s i d u e s w i t h i n t h e b i n d i n g s i t e , t h e b l u e s h i f t i n g c a n n o t b e d u e t o S c h i f f b a s e f o r m a t i o n , e s p e c i a l l y s i n c e a l l t h e s u r f a c e L y s r e s i d u e s a r e u n d o u b t e d l y p r o t o n a t e d a t o u r w o r k i n g p H o f 7 . 3 . M A L D I - T O F a n a l y s i s o f t h e w i l d - t y p e p r o t e i n a l s o p r o d u c e d t h e e x p e c t e d r e s u l t s . N e i t h e r t h e i n c u b a t i o n n o r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n p r o d u c e d a p e a k g r e a t e r i n m a s s t h a n t h e p r o t e i n p e a k . A s a v e r i fi c a t i o n o f o u r p r o c e d u r e , r e t i n o i c a c i d , w h i c h n o n - c o v a l e n t l y b i n d s t h e w i l d t y p e p r o t e i n w i t h a 2 n M d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t , w a s a d d e d t o t h e p r o t e i n a b a . 1 ‘ W 0 . 4 - 2 0 ' 8 ‘ 8 0 . 3 — 2 O 6 _ C 5 ’ § 0 . 2 - g 0 . 4 “ o = m 0 1 _ a 0 . 2 ~ 9 - 3 < I 0 f r T l 0 T I l l l O 1 2 3 4 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 E q u i v a l e n t s R e t i n o i c A c i d / R e t i n a l n m F i g u r e I I - l l . a ) F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l K d d e t e r m i n a t i o n w i t h w i l d - t y p e C R A B P I I . R e t i n o i c a c i d s h o w s a s t o i c h i o m e t r i c b i n d i n g r e l a t i o n s h i p a n d K , = 2 . 0 i 1 . 2 n M . R e t i n a l s h o w s l i t t l e b i n d i n g a f fi n i t y , K , = 6 6 0 0 i 3 6 0 n M . b ) U V - v i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h w i l d - t y p e C R A B P I I p o r t r a y s a m a x i m a l a b s o r b a n c e a t 3 7 0 n m . 7 2 u n d e r i d e n t i c a l r e a c t i o n c o n d i t i o n s . I t a l s o f a i l e d t o p r o d u c e a n y t h i n g o t h e r t h a n t h e p r o t e i n W p e a k i n t h e s p e c t r u m , l e a d i n g u s t o b e l i e v e t h a t i f a n y a d d i t i o n p r o d u c t s a r e o b s e r v e d i n t h e M A L D I - T O F i t m u s t c o m e f r o m c o v a l e n t c o m p l e x e s . T h e s e r e s u l t s f o r t h e w i l d t y p e p r o t e i n v a l i d a t e t h e a c c u r a c y o f o u r m e t h o d s , a s a l l r e s u l t s o b t a i n e d w e r e t h o s e e x p e c t e d , a n d w e w e r e a b l e t o r e p r o d u c e t h e p u b l i s h e d v a l u e s f o r t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f r e t i n o i c a c i d w i t h t h e w i l d - t y p e C R A B P I I . T h e d a t a g a t h e r e d f o r t h i s p r o t e i n s e t s t h e s t a g e f o r c o m p a r i s o n o f a l l n e w p r o t e i n m u t a n t s m a d e f r o m t h e w i l d - t y p e C R A B P I I . B e f o r e p r o c e e d i n g w i t h t h e e n g i n e e r i n g o f C R A B P H , w e c a n n o w u s e t h e d a t a a c q u i r e d f o r t h e w i l d t y p e p r o t e i n a n d c o m p a r e t o t h e t w o s i n g l e m u t a n t p r o t e i n s m a d e f o r fl u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n t , F 1 5 W a n d L 1 9 W . T h e F 1 5 W s i n g l e m u t a n t , w h o s e c r y s t a l s t r u c t u r e m a y h a v e s u g g e s t e d s o m e l o s s o f s t r u c t u r a l i n t e g r i t y , a c t u a l l y d e m o n s t r a t e s s i m i l a r r e s u l t s a s c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e . F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n s p r o d u c e a K , = 4 0 t 4 n M f o r r e t i n o i c a c i d a n d K d = 5 9 5 0 i 3 6 0 n M f o r r e t i n a l . T h e r e t i n a l a b s o r b a n c e f o r t h e F 1 5 W p r o t e i n i s 3 7 5 n m . T h i s d a t a p r e s e n t s n o i n d i c a t i o n o f s i g n i fi c a n t s t r u c t u r a l d e f e c t s . A l t h o u g h t h e r e i s a 5 n m r e d s h i f t i n t h e U V - v i s , a n d t h i s v a l u e i s c l o s e r t o t h e v a l u e e x p e c t e d f o r a s o l v e n t e x p o s e d r e t i n a l , g i v e n t h e h i g h K d , r e t i n a l i s p r o b a b l y n o t i n t h e b i n d i n g p o c k e t . T h u s , t h e s e r e s u l t s o f f e r n o i n s i g h t i n t o t h e p o s s i b l e d i s r u p t i o n o f h e l i c a l s t r u c t u r e n e a r t h e m o u t h o f t h e c a v i t y . T h e L 1 9 W s i n g l e m u t a n t d e v i a t e s a b i t m o r e f r o m t h e w i l d - t y p e p r o t e i n , b u t n o t s i g n i fi c a n t l y . R e t i n o i c a c i d a f fi n i t y h a s b e e n d e c r e a s e d t o 1 7 0 i 2 2 n M a n d r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y h a s i n c r e a s e d t o 9 0 0 i 3 8 n M . T h e r e t i n a l A M a s b o u n d t o L 1 9 W i s 3 7 8 n m , 8 n m r e d s h i f t e d f r o m t h e w i l d t y p e . W h i l e t h i s v a l u e i s c l o s e r t o a s o l v e n t e x p o s e d 7 3 r e t i n a l , i t c a n n o t b e r u l e d o u t t h a t i n t e r a c t i o n s w i t h t h e s l i g h t l y d i f f e r e n t b i n d i n g p o c k e t m a y f o r c e t h i s s m a l l s h i f t . A s e x p e c t e d , b o t h s i n g l e m u t a n t p r o t e i n s d o n o t d e v i a t e s i g n i fi c a n t l y f r o m t h e w i l d t y p e p r o t e i n b i n d i n g a b i l i t i e s . 7 4 b m o o n d f o r m a t l e c u l e t h i a o n m t i s i t m i c s t h e p l a n h e e s a m e \ \ \ \ \ E W o f t h e r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . D . I n t r o d u c t i o n o f t h e L y s i n e R e s i d u e T o c r e a t e a r h o d o p s i n m i m i c , w e n e e d e d t o c o n v e r t C R A B P H f r o m a r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n t o o n e t h a t w i l l b i n d r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e v i a a l y s i n e r e s i d u e ( F i g u r e 1 1 - 1 2 ) . T h e r e a r e 1 3 L y s r e s i d u e s p r e s e n t i n C R A B P I I , h o w e v e r t h e y a r e a l l o n t h e s u r f a c e o f t h e p r o t e i n . T h e s u r f a c e L y s r e s i d u e s , b e i n g s o l v e n t e x p o s e d , w i l l e x i s t i n t h e p r o t o n a t e d s t a t e a t p h y s i o l o g i c a l p H , a n d t h u s w i l l n o t i n t e r f e r e w i t h o u r a t t e m p t s a t e n g i n e e r i n g a s p e c i fi c L y s — r e t i n a l b o n d . U t i l i z i n g t h e p u b l i s h e d c r y s t a l s t r u c t u r e a n d p e r f o r m i n g i n s i l i c o m u t a g e n e s i s a n d m i n i m i z a t i o n s , 3 9 a r g i n i n e 1 3 2 w a s c h o s e n a s t h e p o s i t i o n f o r p l a c e m e n t o f t h e p e r t i n e n t l y s i n e r e s i d u e . I n s i g h t I I m i n i m i z a t i o n s p l a c e t h e m u t a t e d O o l y s i n e 2 . 5 A f r o m t h e c a r b o n y l \ \ \ \ 0 0 H 2 H 2 N a ” 9 1 3 2 c a r b o n o f r e t i n a l , w i t h i n V a n d e r a 1 1 _ , m n s - r e t i n o i c a c i d W a a l s d i s t a n c e f o r c o v a l e n t b o n d 3 f o r m a t i o n , a n d s h o u l d i t e x i s t , C H O \ \ \ \ H . 2 N ’ \ / \ s t R 1 3 2 K a l l - t r a n s - r e t i n a l w o u l d n o t f o r c e t h e r e t i n a l f a r f r o m i t s d e s i r e d p o s i t i o n ( F i g u r e I I - 1 3 ) . T h e a n g l e o f t r a j e c t o r y f o r c o v a l e n t s e e n i n r h o d o p s i n a s w e l l . T h e L y s r e s i d u e a p p r o a c h e s t h e c a r b o n y l F i g u r e 1 1 - 1 2 . T o c r e a t e a s u c c e s s f u l r h o d o p s i n p r o t e i n m i m i c , C R A B P I I w i l l n e e d t o b e c o n v e r t e d f r o m a f r o m t h e S i d e O f t h e r e t i n a l r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n t o a p r o t e i n t h a t b i n d s 7 5 L y s r e s i d u e a n d t h a t o f t h e r e t i n a l m o l e c u l e a r e a p p r o x i m a t e l y 9 0 ° t o e a c h o t h e r . I n c i d e n t a l l y , t h e L y s a t p o s i t i o n 1 3 2 h a p p e n s t o h a v e g i v e n u s t h e m o s t e f f e c t i v e r e s u l t s t h u s f a r . T h e p o s i t i v e r e s u l t s ( a n d c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n , w h i c h w i l l b e s e e n w i t h f u r t h e r m u t a t i o n s ) m a y b e a r e s u l t o f t h e c o r r e c t o r i e n t a t i o n o f t h e e n g i n e e r e d L y s , i n w h i c h a n o p t i m a l a n g l e f o r a t t a c k o n t o t h e c a r b o n y l , r e f e r r e d t o a s t h e B i i r g i — D i i n i t z a n g l e o f 1 0 7 0 h a s b e e n a c h i e v e d . 4 0 O t h e r p o s i t i o n s f o r L y s i n c o r p o r a t i o n h a v e , a n d a r e i n t h e p r o c e s s o f b e i n g i n v e s t i g a t e d a n d a n a l y z e d f o r e f f e c t i v e P S B f o r m a t i o n . D i s c u s s i o n o f t h e s e m u t a n t s w i l l b e a d d r e s s e d i n a l a t e r s e c t i o n , a s I w i l l f i r s t d i s c u s s t h e l i b r a r y o f m u t a n t s c o n t a i n i n g t h e R 1 3 2 K m u t a t i o n . M u t a g e n e s i s o f a l l C R A B P I I p r o t e i n s , w a s a c c o m p l i s h e d b y u t i l i z i n g S t r a t a g e n e ’ s Q u i k C h a n g e ® p r o t o c o l . T h i s m e t h o d e n t a i l s t h e u s e o f c o m p l i m e n t a r y , m u t a t i o n e n c o d i n g p r i m e r s . F o l l o w i n g a t y p i c a l P C R p r o c e s s t h e r e a c t i o n m i x t u r e w i l l c o n t a i n c i r c u l a r p a r e n t a l p l a s m i d D N A ( u n m u t a t e d ) a n d l i n e a r m u t a t e d D N A ( F i g u r e I I - 1 4 ) . T h e o r i g i n a l t e m p l a t e D N A i s u n i q u e f r o m t h e m u t a t e d D N A , n o t o n l y i n t h a t i t i s c i r c u l a r , b u t a l s o i t h a s m e t h y l a t e d a d e n i n e r e s i d u e s . A s t h e D N A i s c o p i e d i n a b a c t e r i a l h o s t , F i g u r e I I - 1 3 . S t e r e o v i e w o l e 3 2 K C R A B P I I m u t a n t . w i t h T y r 1 3 4 s h o w n . L y s 1 3 2 i s 2 . 5 A a w a y f r o m r e t i n a ] . T h e h y d r o x y l g r o u p o f T y r 1 3 4 i s ~ 2 . 8 A a w a y f r o m t h e L y s a m i n o g r o u p . 7 6 s o m e o f t h e a d e n i n e b a s e s b e c o m e s m e t h y l a t e d . T h e r e s t r i c t i o n e n z y m e D p n I r e c o g n i z e s t h e s p e c i fi c s e q u e n c e G A T C ( b l u n t c u t b e t w e e n A a n d T ) , b u t w i l l o n l y c u t w h e r e m e t h y l a t e d a d e n i n e r e s i d u e s e x i s t . O u r p l a s m i d , p E T - B l u e Z c o n t a i n s 1 8 D p n I c u t s i t e s , t h u s i n c u b a t i o n o f t h e P C R p r o d u c t w i t h t h e D p n l r e s t r i c t i o n e n z y m e e f f e c t i v e l y d e s t r o y s t h e p a r e n t a l p l a s m i d a n d l e a v e s o n l y t h e l i n e a r , m u t a t e d D N A . T h e d e s i r e d p r o d u c t D N A c a n t h e n b e i n c o r p o r a t e d i n t o t h e h o s t s t r a i n o f c h o i c e ( J M 1 0 9 o r X L l — B l u e E . c o l i ) . A l t h o u g h S t r a t a g e n e ’ s Q u i k C h a n g e ® m e t h o d i s v e r y r e l i a b l e i n t h e p r o d u c t i o n o f m u t a t i o n s , t h e r e i s o n e m a j o r d o w n f a l l . I n s o m e i n s t a n c e s , d e s p i t e d i g e s t i o n w i t h D p n I , t h e r e r e m a i n s s o m e a m o u n t o f u n m u t a t e d D N A , a r i s i n g f r o m a n i n c o m p l e t e d i g e s t i o n r e a c t i o n . A l s o , b e c a u s e w e a r e o n l y m u t a t i n g a s i n g l e a m i n o a c i d a t a t i m e ( t h r e e b a s e p a i r s ) w i t h o u t c a u s i n g a n y o t h e r c h a n g e s i n t h e p r o t e i n , t h e s e m u t a t i o n s d o n o t t y p i c a l l y a l l o w f o r a n e w a n d u n i q u e r e s t r i c t i o n s i t e t o b e e n g i n e e r e d . T h e i n c o r p o r a t i o n o f a n e w r e s t r i c t i o n s i t e w o u l d o f f e r a q u i c k m e a n s o f d e d u c i n g w h e t h e r o r n o t t h e d e s i r e d m u t a t i o n h a d b e e n i n c o r p o r a t e d ; a 5 m L c u l t u r e c o u l d b e c r u d e l y c h a r a c t e r i z e d b y a 2 h d i g e s t i o n f o l l o w e d b y a 2 0 m i n g e l . W i t h o u t t h i s , t h e p l a s m i d m u s t b e e x p r e s s e d o n a l i n e a r u n m e t h y l a t e d A _ P C R D p n I — _ _ _ ‘ _ _ — — — > _ M e t h y l a t e d — p l a s m i d L o n e p r o d u c t — U n m u t a t e d M u t a t e d D N A t e m p l a t e D N A F i g u r e I I - 1 4 . D e p i c t i o n o f S t r a t a g e n e ‘ s Q u i k C h a n g e ® S i t e - D i r e c t e d M u t a g e n e s i s P r o t o c o l . T h r o u g h u s e o f t h e r e s t r i c t i o n e n z y m e D p n l , t h e u n w a n t e d t e m p l a t e D N A c a n b e r e m o v e d f r o m t h e d e s i r e d m u t a e d D N A p r o d u c t . 7 7 l a r g e r s c a l e , p u r i f i e d t o a h i g h d e g r e e , a n d s e n t f o r s e q u e n c e a n a l y s i s ( 2 d a y t u r n a r o u n d t i m e ) . O n c e t h e m u t a t i o n h a d b e e n v e r i f i e d b y i t s s e q u e n c e , t h e p r o t e i n w a s e x p r e s s e d , f o l l o w i n g I P T G i n d u c e d p r o c e d u r e s , p u r i fi e d b y N i - N T A c o l u m n , a n d c h a r a c t e r i z e d u s i n g a l l t h e p r o c e d u r e s m e n t i o n e d p r e v i o u s l y . B y r e p l a c i n g t h e A r g r e s i d u e t h a t w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e s t r o n g r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y w i t h a L y s r e s i d u e , t h e e x p e c t e d d e c r e a s e i n r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y ( f r o m 2 n M t o 6 5 n M ) w a s c o n c o m i t a n t w i t h a n i n c r e a s e i n r e t i n a l a f fi n i t y ( f r o m 6 6 0 0 n M t o 2 8 0 n M ) ( F i g u r e I I - l S a ) . C h a n g e o f h y d r o p h o b i c i t y w i t h i n t h e p o c k e t m a y d e s e r v e s o m e a c k n o w l e d g e m e n t f o r t h e d r a m a t i c i m p r o v e m e n t i n r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y . A r g h a s a h y d r o p a t h i c i n d e x o f — 4 . 5 v e r s u s - 3 . 9 f o r L y s ( t h e m o r e p o s i t i v e t h e n u m b e r , t h e m o r e h y d r o p h o b i c t h e r e s i d u e ) “ 4 2 F l u o r e s c e n c e a n a l y s i s i s f o l l o w e d u p b y a U V - v i s a n a l y s i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d p r o t e i n c o m p l e x . R e c a l l t h a t t h e U V a b s o r b a n c e o f r e t i n a l w i t h t h e w i l d t y p e p r o t e i n h a d a m a x i m a l a b s o r b a n c e a t 3 7 0 n m , a n d t h e S c h i f f b a s e o f r e t i n a l i s e x p e c t e d t o a b s o r b n e a r 3 6 5 n m . B y U V - v i s a l o n e , w e c a n n o t b e c e r t a i n o f t h e f o r m a t i o n o f a S c h i f f b a s e b e c a u s e t h e e x p e c t e d d i f f e r e n c e i s o n l y 5 n m , a n d c o u l d p o t e n t i a l l y a l s o b e d u e t o u n i q u e p r o t e i n / s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n s . H o w e v e r , i f t h e S c h i f f b a s e i s p r o t o n a t e d t h e c h r o m o p h o r e w i l l r e d - s h i f t s i g n i fi c a n t l y . A s i s t h e c a s e i n h u m a n s , t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e o f l l - c i s - r e t i n a l w i t h r o d r h o d o p s i n r e d - s h i f t s f r o m a b o u t 3 8 0 n m t o 5 0 0 n m , a 1 2 0 n m r e d s h i f t . T h e i n c o r p o r a t i o n o f a L y s r e s i d u e , t h e s i n g l e m u t a n t R 1 3 2 K , d i d n o t l e a d t o a c h a n g e i n t h e r e t i n a l a b s o r b a n c e a s c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e , a s a 3 7 0 n m p e a k i s s t i l l o b s e r v e d ( F i g u r e I I - 1 5 b ) . W e e x p e c t e d t h a t t h i s s i n g l e m u t a t i o n w o u l d n o t p r o v i d e P S B f o r m a t i o n a s t h e L y s p r o b a b l y s t i l l p r i m a r i l y e x i s t s i n t h e p r o t o n a t e d s t a t e d u e t o t h e 7 8 c o n t i n u e d h y d r o p h i l i c n a t u r e o f t h e b i n d i n g c a v i t y . T h e r e i s h o w e v e r s o m e a m o u n t o f c o v a l e n t s p e c i e s d e t e c t e d b y b o t h M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s . A s e v i d e n t f r o m t h e l a c k o f a b a t h o c h r o m i c s h i f t i n t h e U V — v i s , t h i s c o v a l e n t c o m p l e x i s S B , b u t n o t P S B . F u r t h e r t u n i n g o f t h e p o c k e t i s n e c e s s a r y t o p r o m o t e n o t o n l y s u b s t a n t i a l P S B f o r m a t i o n , b u t a l s o i n c r e a s e d b i n d i n g a f f i n i t y . T h e l y s i n e r e s p o n s i b l e f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n i n r h o d o p s i n p r o b a b l y e x i s t s i n t h e u n p r o t o n a t e d s t a t e . 4 3 T h e b i n d i n g c a v i t y o f r h o d o p s i n c o n t a i n s t h r e e a c i d i c a n d t h r e e b a s i c r e s i d u e s t h a t e x i s t i n t h e m i d d l e o f l o n g s t r e t c h e s o f h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s ( F i g u r e I I - 1 6 a ) . 4 4 T h i s m a y a l l o w f o r e f f e c t i v e s c r e e n i n g o f t h e l y s i n e r e s i d u e f r o m w a t e r m o l e c u l e s t h a t c o u l d p r o t o n a t e i t a n d d i s r u p t t h e P S B f o r m a t i o n . 4 5 C o m p a r i s o n t o t h e C R A B P I I b i n d i n g c a v i t y s h o w s b o t h h y d r o p h o b i c a n d h y d r o p h i l i c a m i n o a c i d s ( F i g u r e I I - 1 6 b ) . T h e h y d r o p h i l i c r e s i d u e s i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h e c h r o m o p h o r e m a y n e e d t o b e m u t a t e d t o m o r e h y d r o p h o b i c r e s i d u e s , m i m i c k i n g t h e h y d r o p h o b i c n a t u r e o f t h e a b E ‘ 1 t 0 . 3 n g 0 . 8 - 3 g 0 . 6 ~ : 0 . 2 - - 3 g 0 - 4 g 0 . 1 . ‘ 5 0 . 2 ‘ a 7 ; < m 0 " — _ — T — — _ ‘ _ T _ — T _ Y T _ — " l 0 0 1 2 3 4 5 3 0 0 E q u i v a l e n t s R e t i n o i c A c i d / R e t i n a l n m F i g u r e I I - 1 5 . 3 ) F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l K d d e t e r m i n a t i o n w i t h t h e s i n g l e m u t a n t C R A B P I I R 1 3 2 K . T h e s i n g l e a m i n o a c i d m u t a t i o n d i s p l a y s a n e x p e c t e d d r o p i n r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f f i n i t y ( K , = 6 5 i 1 4 n M ) , w h i c h i s c o n c o m i t a n t w i t h a l a r g e i n c r e a s e i n r e t i n a l b i n d i n g a f f i n i t y , K d = 2 8 0 i 1 7 n M . b ) U V - v i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K p o r t r a y s a m a x i m a l a b s o r b a n c e a t 3 7 0 n m , u n c h a n g e d f r o m t h e w i l d t y p e p r o t e i n a n d m o s t p r o b a b l y d u e t o t h e h y d r o p h i l i c n a t u r e o f t h e b i n d i n g c a v i t y a n d t h e L y s r e m a i n i n g p r o t o n a t e d . 7 9 r h o d o p s i n , i n o r d e r t o l o w e r t h e p K a o f l y s i n e a n d p r o m o t e s i g n i fi c a n t d e g r e e s o f c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n . F i g u r e I I - l 6 . a ) V i e w o f t h e b i n d i n g c a v i t y o f r h o d o p s i n ( h y d r o p h o b i c r e s i d u e s a r e i n r e d , h y d r o p h i l i c r e s i d u e s a r e i n b l u e ) . T h e L y s i n r h o d o p s i n i s s u g g e s t e d t o e x i s t i n t h e n o n - p r o t o n a t e d s t a t e b u r i e d d u e t o t h e e x t e n d e d h y d r o p h o b i c n a t u r e o f t h e b i n d i n g c a v i t y . b ) T h e s a m e v i e w o f t h e C R A B P I I c a v i t y r e v e a l s b o t h h y d r o p h o b i c a n d h y d r o p h i l i c a m i n o a c i d s . T h e h y d r o p h i l i c r e s i d u e s i n t h e c a v i t y m a y n e e d t o b e a l t e r e d i n o r d e r t o r e d u c e t h e p K a o f L y s s o t h a t i t m a y e x i s t i n t h e n o n - p r o t o n a t e d s t a t e a n d i s a v a i l a b l e f o r a t t a c k a n d c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n w i t h r e t i n a l . 8 0 E . H y d r o p h o b i c T u n i n g o f t h e B i n d i n g P o c k e t T h e n e x t s t e p i n t r y i n g t o a c h i e v e t h e i d e a l P S B f o r m i n g m u t a n t w a s t o i n c r e a s e t h e h y d r o p h o b i c i t y o f t h e b i n d i n g p o c k e t . A m o r e h y d r o p h o b i c b i n d i n g p o c k e t w i l l p o s s i b l y i n c r e a s e t h e a f fi n i t y o f r e t i n a l f o r t h e c a v i t y , a n d a l l o w f o r t h e i n c o r p o r a t e d L y s r e s i d u e t o r e m a i n d e p r o t o n a t e d . W h i l e w e a r e i n c r e a s i n g t h e p o c k e t ’ s h y d r o p h o b i c i t y t o p r o m o t e t h e e x i s t e n c e o f a n o n - p r o t o n a t e d L y s , k e e p i n m i n d t h a t w e e v e n t u a l l y w a n t t h i s s a m e h y d r o p h o b i c c a v i t y t o a l l o w f o r a p o s i t i v e l y c h a r g e d S c h i f f b a s e t o e x i s t . T h e r e w e r e t w o r e s i d u e s t h a t w e r e o f i n i t i a l i n t e r e s t f o r p o s s i b l e h y d r o p h i l i c t o h y d r o p h o b i c m u t a t i o n s , T y r 1 3 4 a n d A r g 1 1 1 . T y r 1 3 4 i s c l o s e t o t h e c a r b o n y l r e g i o n o f t h e r e t i n a l ( 3 . 2 A ) a n d m a y b e i n v o l v e d i n f a v o r a b l e h y d r o g e n b o n d i n g w i t h L y s 1 3 2 t h a t p r o h i b i t s t h e L y s f r o m i n t e r a c t i n g w i t h r e t i n a l . A r g 1 1 1 i s f u r t h e r a w a y f r o m t h e c h r o m o p h o r e ( 5 . 4 A ) t h a n T y r 1 3 4 b u t i s a h y d r o p h i l i c r e s i d u e a n d i t s r e p l a c e m e n t c o u l d s e r v e t o m a k e t h e p o c k e t m o r e h y d r o p h o b i c . T h e fi r s t o f t h e s e a m i n o a c i d s t o b e m u t a t e d w a s T y r 1 3 4 , w h i c h w a s c o n v e r t e d t o a P h e . T h i s w a s d o n e f o r s e v e r a l r e a s o n s . F i r s t t h i s i s a r a t h e r c o n s e r v a t i v e m u t a t i o n t h a t w i l l i n c r e a s e t h e h y d r o p h o b i c i t y o f t h e b i n d i n g p o c k e t , w h i c h w e b e l i e v e i s n e c e s s a r y f o r d e p r e s s i n g t h e p K a o f L y s . S e c o n d , t h r o u g h s t r u c t u r a l c o m p a r i s o n w i t h i n t h i s f a m i l y o f p r o t e i n s , i t i s b e l i e v e d t h a t t h e p r e s e n c e o f T y r a i d s i n t h e b i n d i n g o f i o n i c s u b s t r a t e s ( r e t i n o i c a c i d ) w h i l e t h e p r e s e n c e o f a P h e g r o u p i s m o r e s u i t a b l e f o r t h e b i n d i n g o f n o n - i o n i c s u b s t r a t e s ( r e t i n o l a n d r e t i n a l ) . A n d fi n a l l y , t h i s w i l l a t t e m p t t o m i m i c a P h e r e s i d u e t h a t e x i s t s i n t h e r h o d o p s i n p r o t e i n s . T h e r e i s a c o n s e r v e d P h e r e s i d u e i n t h e b i n d i n g p o c k e t o f t h e o p s i n p r o t e i n s . R o d r h o d o p s i n h a s F 9 1 , w h i c h r e s i d e s 5 . 9 A f r o m t h e c l o s e s t p o i n t t o t h e p o l y e n e b a c k b o n e a n d n e a r t h e c a r b o n y l r e g i o n , b l u e r h o d o p s i n h a s 8 1 F 2 9 0 , w h i c h i s p o s t u l a t e d t o b e 5 . 4 A a w a y , a n d g r e e n r h o d o p s i n h a s F 3 0 9 , w h i c h i s p o s t u l a t e d t o b e 5 . 8 A a w a y ( i n r e d r h o d o p s i n , t h i s r e s i d u e i s a T y r . ) . T h i s m a y o r m a y n o t h a v e a n y t h i n g t o d o w i t h t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e P S B , b u t i f w e c a n c o n s e r v a t i v e l y m o d e l C R A B P I I w i t h t h e s a m e r e s i d u e s f o u n d i n t h e r h o d o p s i n b i n d i n g c a v i t y , w e m a y i n c r e a s e e i t h e r t h e r e t i n a l a f f i n i t y f o r C R A B P I I o r t h e p o s s i b l e P S B f o r m a t i o n . B y i n t r o d u c i n g t h i s P h e m u t a t i o n a n d i n c r e a s i n g t h e h y d r o p h o b i c i t y w i t h i n t h e c a v i t y , w e s e e d r a m a t i c d i f f e r e n c e s i n a l l o f o u r b i n d i n g a s s a y s . T h e fl u o r e s c e n c e i n d i c a t e s t h a t w e d o i n d e e d i n c r e a s e t h e b i n d i n g a f fi n i t y f o r r e t i n a l e v e n f u r t h e r ( 1 0 0 n M ) , a n d l o s e m o r e a f fi n i t y f o r r e t i n o i c a c i d ( 1 2 0 n M ) ( F i g u r e I I - 1 7 a ) . M o s t n o t a b l y , t h e U V - v i s n o w s h o w s a r e d - s h i f t i n g o f t h e c h r o m o p h o r e t o 4 2 9 n m a s c a n b e s e e n i n F i g u r e I I - l 7 b . A 5 9 n m r e d - s h i f t i s a g o o d i n d i c a t i o n t h a t t h e r e m a y b e P S B f o r m a t i o n . T h i s 4 2 9 n m a b s o r b i n g s p e c i e s c a n n o t , h o w e v e r , b e t r a p p e d w i t h a r e d u c i n g a g e n t d e s p i t e u s e o f v a r i o u s r e a c t i o n c o n d i t i o n s i n c l u d i n g v a r y i n g t h e l e n g t h o f i n c u b a t i o n o f r e t i n a l w i t h t h e p r o t e i n , i n c r e a s i n g t h e r e d u c t i o n t i m e w i t h N a C N B H 3 , a n d c h a n g i n g t h e p H o f t h e r e a c t i o n ( F i g u r e I I - l 7 d ) . D e s p i t e b e i n g u n s u c c e s s f u l i n t r a p p i n g a c o v a l e n t c o m p l e x b y r e d u c t i v e a m i n a t i o n , w e d o s e e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n w i t h t h e i n c u b a t i o n o f t h e t w o s p e c i e s , b e f o r e N a C N B H 3 a d d i t i o n . A [ M + 2 6 6 ] + p e a k c a n b e s e e n i n t h e i n c u b a t i o n o f t h e p r o t e i n w i t h r e t i n a l a s m o n i t o r e d b y M A L D I - T O F ( F i g u r e l I - l 7 c ) . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e S c h i f f b a s e o r p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e i s t o o u n s t a b l e i n t h e r e a c t i o n c o n d i t i o n s f o r r e d u c t i v e a m i n a t i o n a n d h y d r o l y z e s b e f o r e i t c a n b e r e d u c e d . W h i l e t h e M A L D I - T O F r e s u l t s f r o m t h e i n c u b a t i o n w i t h r e t i n a l d o e s c o n f i r m S c h i f f b a s e f o r m a t i o n , i t c a n n o t c o n fi r m o r 8 2 d i s m i s s t h e e x i s t e n c e o f t h i s s p e c i e s a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e a s t h e o b s e r v e d s h i f t i n t h e U V - v i s m a y s u g g e s t . A t t e m p t s a t p r o v i n g w h e t h e r o r n o t t h e S c h i f f b a s e w a s p r o t o n a t e d i n c l u d e a d d i t i o n o f a c i d a n d b a s e t o t h e p r o t e i n / s u b s t r a t e m i x t u r e w h i l e m o n i t o r i n g b y U V - v i s . a b g 1 0 . 2 5 9 g 0 . 8 ~ 3 0 . 2 - E 0 - 5 “ E 0 . 1 5 - ‘ e g 0 . 4 1 3 0 . 1 1 g 0 . 2 . g 0 . 0 5 ~ m 0 r r T " ’ t _ ‘ 1 o l t T I t o 2 4 6 8 1 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 E q u l v a l e n t s R e t i n o i c A c i d / R e t i n a l n m e ( 1 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 D a l t o n s D a l t o n s F i g u r e I I - l 7 . 3 ) F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l K d d e t e r m i n a t i o n w i t h t h e d o u b l e m u t a n t C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F . T h e a d d i t i o n a l a m i n o a c i d m u t a t i o n d i s p l a y s a n o t h e r e x p e c t e d d r o p i n r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f f i n i t y ( K : = 1 2 0 . t 4 . 9 n M ) , a n d a n o t h e r e x p e c t e d i n c r e a s e i n r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y . K , = 1 0 0 i 7 . 1 n M . b ) U c h i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F p o r t r a y s a m a x i m a l a b s o r b a n c e a t 4 2 9 n m . a 5 9 n m r e d s h i f t a s c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e C R A B P I I ( 3 7 0 n m ) , p o s s i b l y s u g g e s t i n g p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . c ) M A L D I - T O F o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d d o u b l e m u t a n t s h o w s a n M + = 1 6 7 9 8 . 1 D a c o r r e s p o n d i n g t o t h e p r o t e i n m a s s . c a l c u l a t e d t o b e 1 6 7 8 5 . 2 D a . I n a d d i t i o n t h e r e i s s m a l l a m o u n t s o f a s e c o n d p e a k ( i n d i c a t e d b y a r r o w ) , M ” = 1 7 0 6 7 . 4 D a , w h i c h i s 2 6 9 . 3 m a s s u n i t s h i g h e r t h a n t h e p r o t e i n p e a k , r e p r e s e n t i n g a c o v a l e n t l y l i n k e d r e t i n a l m o l e c u l e ( c a l c u l a t e d m a s s d i f f e r e n c e 2 6 6 ) . d ) R e d u c t i v e a m i n a t i o n o f r e t i n a l w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F r e s u l t s i n l o s s o f t h e c o v a l e n t c o m p l e x a n d o n l y t h e p r o t e i n m a s s M + = 1 6 7 8 8 . 1 D a c a n b e d e t e c t e d . T h e s m a l l p e a k t o t h e r i g h t o f t h e m a j o r p r o t e i n p e a k i s d u e t o m a t r i x a d d i t i o n t o t h e p r o t e i n , a n d d o e s n o t c o r r e s p o n d t o t h e c a l c u l a t e d r e t i n a l a d d i t i o n m o l e c u l a r w e i g h t . 8 3 I f t h e 4 2 9 n m a b s o r b i n g s p e c i e s i s a n o n p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e , l o w e r i n g t h e p H o f t h e m i x t u r e s h o u l d p r o t o n a t e t h e S B a n d f o r c e t h e r e t i n a l a b s o r b a n c e t o r e d s h i f t e v e n m o r e . I f t h e 4 2 9 n m s p e c i e s i s P S B , a d d i t i o n o f a c i d s h o u l d h a v e n o e f f e c t o n t h e a b s o r p t i o n , p r o v i d e d c a u t i o n i s t a k e n t o e n s u r e t h a t t h e p r o t e i n d o e s n o t d e n a t u r e . U p o n a d d i t i o n o f a s m a l l a m o u n t o f a c i d t o t h e s a m p l e , t h e r e d s h i f t i s l o s t , a n d t h e p e a k b l u e s h i f t s t o 3 8 4 n m ( F i g u r e I I - 1 8 ) . T h i s c o u l d b e d u e t o t h e h y d r o l y s i s o f t h e c o v a l e n t b o n d , w h e t h e r S B o r P S B , a n d s t i l l d o e s n o t c o n c l u s i v e l y d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e t w o . T h i s c o u l d a l s o m e a n t h a t t h e r e d s h i f t i s n o t d u e t o a P S B a t a l l , b u t i s o b s e r v e d s o l e l y b e c a u s e o f t h e h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t o f t h e c a v i t y . T r e a t m e n t w i t h a c i d c h a n g e s t h e h y d r o p h o b i c i t y o f t h e r e t i n a l e n v i r o n m e n t a n d n o w f o r c e s t h e a b s o r p t i o n b a c k t o 3 8 4 n m . T h e r e h a v e b e e n r e p o r t s o f a 4 2 0 n m a b s o r b i n g r e t i n a l t h a t i s b e l i e v e d t o b e a n o n - p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . I n i t i a l s t u d i e s b y O p r i a n a n d c o - w o r k e r s w i t h b l u e r h o d o p s i n , w h i c h a b s o r b s a t 4 2 0 n m , s u g g e s t e d t h e n a t u r e o f t h e b o n d i n b l u e r h o d o p s i n i s a n o n - p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . 4 6 M u t a t i o n s o f t h e b l u e p i g m e n t , 8 2 8 9 A a n d 8 8 7 6 , n e a r t h e S B r e g i o n f a i l e d t o s h o w s i g n i fi c a n t c h a n g e s i n t h e a b s o r b a n c e v a l u e s f o r r e t i n a l . I f r e t i n a l w a s b o u n d a s a P S B , i t m a y n o t b e u n r e a s o n a b l e t o t h i n k t h a t r e m o v a l o f t w o p o l a r r e s i d u e s n e a r t h e P S B r e g i o n w o u l d a f f e c t t h e a b s o r b a n c e . T h e 8 2 8 9 A m u t a t i o n f a i l e d t o p r o d u c e a n y c h a n g e , w h i l e t h e 8 8 7 6 m u t a t i o n h a d a 1 0 n m b l u e s h i f t . T h e p r o t e i n c o n t a i n i n g t h e E 1 1 3 Q m u t a t i o n f a i l e d t o r e g e n e r a t e w i t h r e t i n a l . O p r i a n , w h o p r o p o s e d t h e n o n p r o t o n a t e d S B f o r t h e b l u e v i s u a l p i g m e n t , l a t e r r e t r a c t e d t h i s t h e o r y . 4 7 ’ 4 8 M u t a t i o n o f t h e h u m a n b l u e p i g m e n t , a s w e l l a s m u t a t i o n w i t h t h e b o v i n e b l u e p i g m e n t , t o g e n e r a t e t h e E 1 1 3 Q m u t a n t b o t h f a i l e d t o r e g e n e r a t e w i t h r e t i n a l . C o n s e q u e n t l y , m o u s e U V o p s i n w a s m u t a t e d t o p r o d u c e t w o m u t a n t c l o n e s 8 4 c c r o y s n t fi a r l l o m g p r l a a p c h e i c m e n t r e O s u l t s f t h e L d y o s F R U i 1 p g u r e 3 o 2 n K : l : o I Y w e I - 1 r l 3 i 8 4 n . F g U o n p w c o r r s H a o f e d n e r c e t t t h i e a s l a U m m p V a l - x e v . i s i m a h t l e o f a b s r e d t h e o s r h b i f a t d n u e o c i s b l l o o e t f s s t h h e m u t a n n m t . 4 , 0 a 0 n d t h e w h o s e a b s o r b a n c e c l o s e l y m a t c h e d t h o s e o f h u m a n ( 4 1 4 n m ) a n d b o v i n e b l u e ( 4 3 8 n m ) r h o d o p s i n . O n e m u t a t i o n w a s r e q u i r e d t o m i m i c b o v i n e b l u e a n d g e n e r a t e a 4 2 4 n m a b s o r b i n g p r o t e i n c o m p l e x , w h i l e 7 m u t a t i o n s g e n e r a t e d a 4 1 1 n m a b s o r b i n g p i g m e n t . U t i l i z i n g t h e s e t w o n e w ‘ m o u s e b l u e ’ p r o t e i n s , t h e E 1 1 3 Q m u t a t i o n w a s p e r f o r m e d . T h e s i n g l e m u t a n t e x h i b i t e d a p H d e p e n d e n t e q u i l i b r i u m b e t w e e n 4 2 4 a n d 3 5 1 n m , w h i l e t h e 7 a m i n o a c i d m u t a n t d i s p l a y e d t h e e x p e c t e d b l u e s h i f t t o 3 6 9 n m . B a s e d o n t h e s e o b s e r v a t i o n s , O p r i a n c o n c l u d e d t h a t t h e 4 2 0 n m b l u e p i g m e n t c o u l d i n f a c t b e a P S B . A d d i t i o n a l l y , l l — c i s - r e t i n a l b o u n d t o H u m a n C e l l u l a r R e t i n a l B i n d i n g P r o t e i n ( C R A L B P ) a l s o a b s o r b s a t ~ 4 2 0 n m . ' 9 ‘ 4 9 W h i l e t h e e x a c t b i n d i n g n a t u r e o f r e t i n a l w i t h C R A L B P h a s n o t b e e n d e t e r m i n e d , e x t e n s i v e r e d u c t i v e a m i n a t i o n t e c h n i q u e s h a v e c o n s i s t e n t l y f a i l e d t o p r o d u c e a c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l . O f c o u r s e , t h i s m a y b e a r e s u l t o f e i t h e r a s o l v e n t i n a c c e s s i b l e c a v i t y , o r a n u n s t a b l e P S B t h a t h y d r o l y z e s b e f o r e i t c a n b e t r a p p e d . H o w e v e r , i t i s b e l i e v e d t h a t r e t i n a l e x i s t s i n a n o n - c o v a l e n t f o r m , b u t d u e t o t h e h y d r o p h o b i c n a t u r e o f t h e b i n d i n g c a v i t y , a r e d s h i f t i s s t i l l o b s e r v e d f o r t h e a l d e h y d i c s u b s t r a t e . ' 9 ' 4 9 A l t h o u g h w e a r e s t i l l 0 0 ' 0 3 1 l e f t w i t h o u t c o n c l u s i v e p r o o f E 0 ' 0 2 " t h a t r e t i n a l e x i s t s a s a g 0 . 0 1 — - p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e w h e n 0 + _ , _ _ I f 1 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 b o u n d t o R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F , n m r e S I d u e a s b e i n g W l t h m a r e t i n a l m a x i m a l a b s o r b a n c e b l u e s h i f t s t o 3 8 4 n m . 8 5 s u i t a b l e d i s t a n c e a n d t r a j e c t o r y f o r a t t a c k o n t h e c a r b o n y l . F i g u r e I I — 1 9 s h o w s a n o v e r l a y o f t h e r e t i n o i c a c i d b o u n d w i l d t y p e C R A B P I I a n d r e t i n o i c a c i d b o u n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F d o u b l e m u t a n t c r y s t a l s t r u c t u r e s a s o b t a i n e d b y o u r c o l l a b o r a t o r s . T h e r e d o e s n o t s e e m t o b e a n y g r o s s s t r u c t u r a l c h a n g e i n t h e o v e r a l l t h r e e d i m e n s i o n a l s h a p e o f t h e p r o t e i n . A c l o s e r l o o k a t t h e b i n d i n g c a v i t y s h o w s t h a t t h e L y s r e s i d u e i s p o i n t e d d i r e c t l y a t t h e c a r b o n y l o f r e t i n o i c a c i d ( 3 . 5 A a w a y ) , a n d s h o u l d b e c l o s e e n o u g h f o r c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n w i t h l i t t l e m o v e m e n t o f r e t i n a l n e e d e d ( p r o v i d e d r e t i n a l s i t s i n t h e s a m e l o c a l m i n i m a a s r e t i n o i c a c i d ) . I m p o r t a n t t o n o t e i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e ( F i g u r e I I - 1 9 b ) i s t h a t t h e m u t a t i o n s w i t h i n t h e b i n d i n g c a v i t y d o n o t s e e m t o p e r t u r b t h e d e s i r e d l o c a t i o n o f t h e r e t i n o i c a c i d F i g u r e I I - l 9 . a ) O v e r l a y o f t h e r e t i n o i c a c i d b o u n d C R A B P I I w i l d t y p e c r y s t a l s t r u c t u r e ( 1 . 6 A ) w i t h t h e r e t i n o i c a c i d b o u n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F d o u b l e m u t a n t ( 1 . 8 A ) . a ) T h e r e i s n o g r o s s s t r u c t u r a l c h a n g e i n t h e o v e r a l l t h r e e d i m e n s i o n a l s h a p e o f t h e p r o t e i n a s a r e s u l t o f t h e t w o a m i n o a c i d m u t a t i o n s . b ) A c l o s e r l o o k i n t h e b i n d i n g p o c k e t s h o w s m i n i m a l m o v e m e n t o f t h e c h r o m o p h o r e , a n d t h e L y s r e s i d u e p o i n t i n g d i r e c t l y t o w a r d s t h e c a r b o n y l , s u i t a b l y l i n e d u p f o r a t t a c k a n d c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n w i t h r e t i n a l s h o u l d i t e x i s t r e s i d e i n t h e s a m e p o s i t i o n a s r e t i n o i c a c i d . 8 6 s u b s t r a t e . A l s o , r e m o v a l o f t h e p h e n o l i c h y d r o x y l g r o u p a n d t h e p o t e n t i a l h y d r o g e n b o n d p a r t i c i p a n t a l l o w s f o r t h e n e w l y i n t r o d u c e d L y s t o e x t e n d d i r e c t l y t o w a r d s t h e s u b s t r a t e , a s o p p o s e d t o t h e w i l d t y p e s t r u c t u r e w h e r e A r g 1 3 2 i s p o i n t e d m o r e t o w a r d s T y r 1 3 4 . U n f o r t u n a t e l y , d u e t o d i f fi c u l t i e s a d d r e s s e d p r e v i o u s l y , a r e t i n a l b o u n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F c r y s t a l s t r u c t u r e h a s y e t t o b e o b t a i n e d . T h e t r i p l e m u t a n t s m a d e f o r fl u o r e s c e n c e s t u d i e s , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : F 1 5 W a n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : L 1 9 W b o t h s h o w d i m i n i s h e d r e t i n a l b i n d i n g a b i l i t i e s . W h e r e a s t h e d o u b l e m u t a n t h a s a r e l a t i v e l y d e c e n t b i n d i n g a f fi n i t y ( K : = 1 2 0 n M ) , b o t h T r p t r i p l e m u t a n t s s h o w a K , = 6 8 0 n m . A d d i t i o n a l l y , t h e r e d s h i f t i n t h e U V - v i s o f t h e d o u b l e m u t a n t i s n o w l o s t w i t h t h e T r p t r i p l e m u t a n t s t h a t n o w a b s o r b a t 3 7 4 n m ( R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : F 1 5 W ) a n d 3 6 7 n m ( R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : L 1 9 W ) . A l t h o u g h t h e r e d s h i f t i s l o s t , j u s t a s i n t h e d o u b l e m u t a n t , a c o v a l e n t c o m p l e x c a n b e s e e n b y M A L D I - T O F b y i n c u b a t i o n o f r e t i n a l w i t h t h e p r o t e i n , b u t i s n o t t r a p p e d b y t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n . T h e m u t a g e n e s i s o f t h e s e t w o r e s i d u e s ( P h e 1 5 a n d L e u 1 9 ) d o e s n o t i m p e d e S B f o r m a t i o n , b u t d o e s r e d u c e t h e o v e r a l l b i n d i n g a f fi n i t y o f r e t i n a l f o r t h e p r o t e i n s . T h e p o s s i b i l i t y o f a d i s r u p t e d ( J r - h e l i c a l s t r u c t u r e n e a r t h e m o u t h o f t h e c a v i t y ( a s w a s s e e n i n t h e c r y s t a l l o g r a p h i c a n a l y s i s o f t h e F 1 5 W s i n g l e m u t a n t ) m a y b e t h e c a u s e o f t h i s , b u t a g a i n , t h i s c a n n o t c o n c l u s i v e l y b e d e d u c e d . I n a d d i t i o n t o T y r 1 3 4 , A r g 1 1 1 w a s a l s o e x p l o r e d a s a p o s s i b l e s i t e f o r i n c o r p o r a t i o n o f a h y d r o p h o b i c r e s i d u e , a n d a s w e w i l l d i s c o v e r , i s c r u c i a l f o r m a i n t a i n i n g o p t i m a l P S B f o r m a t i o n , b o t h i n t e r m s o f t h e r e t i n a l m a x i m a l a b s o r b a n c e o b s e r v e d a n d t h e r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y t o w a r d s v a r i o u s p r o t e i n s . F i g u r e 1 1 - 2 0 s h o w s t h e 8 7 m i n i m i z e d s t r u c t u r e o f t h e b i n d i n g c a v i t y o f t h e t r i p l e m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L , w h e r e r e t i n a l h a s b e e n b o u n d t o L y s 1 3 2 a s a S c h i f f b a s e . T h e m u t a n t R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L m a i n t a i n s a r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y s i m i l a r t o t h e d o u b l e m u t a n t ( 1 6 0 n M v e r s u s 1 2 0 n M f o r R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F ) . A l s o , a s e x p e c t e d , t h e r e t i n o i c a c i d a f fi n i t y w a s g r e a t l y r e d u c e d b y r e m o v a l o f t h e fi n a l s t a b i l i z i n g A r g r e s i d u e ( 1 0 0 0 n M v e r s u s 1 0 0 n M f o r R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F ) ( F i g u r e I I — 2 1 a ) . R e t i n a l a b s o r b a n c e s t i l l r e m a i n s r e d s h i f t e d , s i m i l a r t o t h e d o u b l e m u t a n t , a l t h o u g h n o t q u i t e a s s t r o n g ( 4 1 0 n m v e r s u s 4 2 9 n m f o r R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F ) . I f t h e s e s p e c i e s a r e P S B , i t s e e m s t h e p o s i t i v e l y c h a r g e d A r g 1 1 1 ( 5 . 4 A ) a l l o w s f o r a l a r g e r r e d s h i f t t h a n t h e e s s e n t i a l l y n e u t r a l b i n d i n g c a v i t y o f t h e t r i p l e m u t a n t . D e s p i t e n o t h a v i n g a s l a r g e o f a r e d s h i f t a s t h e p r e v i o u s m u t a n t , t h e S c h i f f b a s e f o r m e d w i t h t h i s m u t a n t s e e m s t o b e m o r e s t a b l e . T h e e f f e c t i v e n e s s o f t h i s a m i n o a c i d m u t a t i o n i s h i g h l i g h t e d i n t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n , w h e r e a s p r e v i o u s l y t h e P S B w a s n o t a b l e t o b e t r a p p e d , n o w t h e c o v a l e n t c o m p l e x c a n b e d e t e c t e d b y M A L D I - T O F u n d e r b o t h t h e i n c u b a t i o n o n l y ( p r o t e i n p l u s r e t i n a l , n o b o r o h y d r i d e ) a n d t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n c o n d i t i o n s ( F i g u r e I I - 2 1 c - d ) . F i g u r e I I - 2 0 . S t e r e o v i e w o f t h e b i n d i n g p o c k e t o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l l l L . R e t i n a l h a s b e e n b o u n d t o L y s 1 3 2 a s a S c h i f f b a s c a n d m i n i m i z e d b y I n s i g h t l l . W e n o w h a v e a C R A B P I I p r o t e i n t h a t w e c a n u n e q u i v o c a l l y s a y i s f o r m i n g a S c h i f f b a s e w i t h r e t i n a l . D u e t o t h e 4 0 n m ( R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L ) — 5 9 n m ( R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F ) r e d - s h i f t w e h a v e r e a s o n t o b e l i e v e t h a t t h e S c h i f f b a s e i s p r o t o n a t e d , a l t h o u g h c u r r e n t l y t h e r e i s n o o t h e r m e a n s b y w h i c h w e c a n p r o v e t h i s , e v e n i f w e d o o b t a i n a c r y s t a l s t r u c t u r e d e p i c t i n g t h e c o v a l e n t S c h i f f b a s e b e t w e e n r e t i n a l a n d t h e p r o t e i n , t h e r e s o l u t i o n m o s t l i k e l y w i l l n o t b e h i g h e n o u g h t o d e t e c t t h e e x i s t e n c e o f a p r o t o n o n t h e S B n i t r o g e n . A l l s u c c e s s f u l l y r e d s h i f t e d r e t i n a l c o m p l e x e s > 4 4 0 n m p r o d u c e d t h u s f a r h a v e h a d t h e R 1 1 1 L m u t a t i o n . E x p e r i m e n t a t i o n h a s s h o w n t h a t n e i t h e r a h y d r o p h i l i c r e s i d u e ( A r g ) o r a c o u n t e r a n i o n ( G l u ) i n t h i s p o s i t i o n w i l l p r o d u c e a s u c c e s s f u l P S B f o r m i n g r h o d o p s i n m i m i c . W e h a v e n o t h o w e v e r , p r o b e d t h e e f f e c t o f o t h e r h y d r o p h o b i c r e s i d u e s p l a c e d a t t h i s p o s i t i o n , w h i c h s h o u l d b e d o n e . W h i l e t h e i n t r o d u c t i o n o f t h e R 1 1 1 L m u t a t i o n h a s l e a d t o t h e i n c r e a s e o f s t a b i l i t y o f t h e S B s o t h a t i t c a n b e s e e n b y r e d u c t i v e a m i n a t i o n , i t s t i l l i s n o t a s s t a b l e a s w e r e q u i r e f o r a n i d e a l r h o d o p s i n s u r r o g a t e . M A L D I - T O F a n a l y s i s s h o w s s m a l l a m o u n t s o f t h e c o v a l e n t c o m p l e x , w h i l e t h e m a j o r s p e c i e s s t i l l r e m a i n s t h e f r e e p r o t e i n . R e c a l l t h a t w h i l e r e t i n a l a b s o r b s n e a r t h e l a s e r ’ s f r e q u e n c y i n t h e M A L D I - T O F a n d m a y n o t a l w a y s i o n i z e v e r y e f fi c i e n t l y , w e c a n n o t u s e p e a k r a t i o s f o r c o m p a r i s o n o f r e a c t i o n o r P S B f o r m a t i o n e f fi c i e n c y . H o w e v e r , t h e e x i s t e n c e o f a l a r g e a m o u n t o f t h e f r e e p r o t e i n p e a k d o e s s u g g e s t a l e s s t h a n p e r f e c t c o m p l e x a t i o n o r r e a c t i o n . F o r f u r t h e r P S B s t a b i l i z a t i o n w e b e g a n t o p r o b e t h e p r o p e r p o s i t i o n i n g o f a s u i t a b l e c o u n t e r a n i o n . 8 9 y t i s n e t n I e v i t a l e R 1 0 . 0 4 . 0 . 9 - 8 0 . 0 3 4 0 . 8 — E g ; - § 0 . 0 2 i . F . 0 4 0 . 5 A < 0 . 0 1 0 4 r r r T T r 1 0 ‘ r 1 f 7 1 0 1 2 3 4 5 5 7 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 E q u i v a l e n t s R e t i n o i c A c i d / R e t i n a l n m e ( 1 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 D a l t o n s D a l t o n s F i g u r e I I - 2 1 . a ) F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l K d d e t e r m i n a t i o n w i t h t h e t r i p l e m u t a n t C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L . R e m o v a l o f t h e s e c o n d A r g r e s i d u e i n t h e b i n d i n g p o c k e t d i s p l a y s a n e x p e c t e d d r o p i n r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y ( K d = 1 0 0 0 1 - 2 8 n M ) , w h i l e t h e h y d r o p h o b i c L e u r e s i d u e m a i n t a i n s r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y , K , = 1 6 0 i - 6 . 7 n M . b ) U V - v i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L p o r t r a y s a m a x i m a l a b s o r b a n c e a t 4 1 0 n m , a d e c r e a s e f r o m t h e 4 2 9 n m o b s e r v e d f o r t h e p r e v i o u s d o u b l e m u t a n t , b u t s t i l l a 4 0 n m r e d s h i f t a s c o m p a r e d t o r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h t h e w i l d t y p e C R A B P I I . c ) M A L D l - T O F o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d t r i p l e m u t a n t s h o w s a n M + = 1 6 7 4 1 . 7 D a c o r r e s p o n d i n g t o t h e p r o t e i n m a s s , c a l c u l a t e d t o b e 1 6 7 4 2 . 2 D a . l n a d d i t i o n t h e r e i s s m a l l a m o u n t s o f a s e c o n d p e a k ( i n d i c a t e d b y a r r o w ) , M " = 1 7 0 0 8 . 4 D a , w h i c h i s 2 6 6 . 7 m a s s u n i t s h i g h e r t h a n t h e p r o t e i n p e a k , r e p r e s e n t i n g a c o v a l e n t l y l i n k e d r e t i n a l m o l e c u l e ( c a l c u l a t e d m a s s d i f f e r e n c e 2 6 6 ) . d ) R e d u c t i v e a m i n a t i o n o f r e t i n a l w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L c o n fi r m s S c h i f f b a s e f o r m a t i o n b y t r a p p i n g a s i n g l e r e t i n a l m o l e c u l e . P r o t e i n p e a k i s d e t e c t e d a t 1 6 7 5 7 . 6 D a , a n d t h e e n h a n c e d c o v a l e n t s p e c i e s i s d e t e c t e d a t 1 7 0 2 6 . 8 D a , r e v e a l i n g a d i f f e r e n c e o f 2 6 9 . 2 D a . C a l c u l a t e d a d d i t i o n o f a s i n g l e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d r e t i n a l m o l e c u l e i s 2 6 8 D a . 9 0 F . P o s i t i o n i n g o f t h e C o u n t e r a n i o n I n c o r p o r a t i o n o f t h e c o u n t e r a n i o n i s g o i n g t o b e c r i t i c a l i n m a i n t a i n i n g a s t a b i l i z e d p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . I n b o v i n e r h o d o p s i n , G l u 1 1 3 s e r v e s a s t h e c o u n t e r a n i o n t o t h e P S B a n d r e s i d e s 4 . 2 A f r o m t h e S B n i t r o g e n . 4 8 ' 5 ° ‘ 5 ' I t i s p o s t u l a t e d t h a t t h e c o u n t e r a n i o n m a y r e s i d e a t v a r y i n g l o c a t i o n s i n o t h e r o p s i n s w h i c h s t i l l m a i n t a i n P S B f o r m a t i o n , s o a l t h o u g h d i s t a n c e w i l l b e i m p o r t a n t , w e m a y h a v e s o m e l e n i e n c y i n fi n d i n g a n o p t i m u m l o c a t i o n . I n i t i a l l y , w e w e n t b a c k t o t h e d o u b l e m u t a n t ( R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F ) t h a t h a d d e m o n s t r a t e d t h e l a r g e s t r e d s h i f t t h u s f a r ( 4 2 9 n m ) , a n d m u t a t e d A r g 1 1 1 t o a g l u t a m i c a c i d r e s i d u e , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 E . T h e c o u n t e r a n i o n i n t h i s p o s i t i o n i s 7 . 4 A f r o m t h e P S B ( m i n i m i z e d s t r u c t u r e , F i g u r e I I - 2 2 ) . A s t h e d a t a w i l l s h o w , t h i s c o u n t e r a n i o n d o e s n o t h e l p t o s t a b i l i z e P S B f o r m a t i o n , b u t a c t u a l l y e l i m i n a t e d S B f o r m a t i o n a l l t o g e t h e r . T h e r e d - s h i f t i n t h e U V - v i s i s l o s t ( 3 7 0 n m ) , a n d s o h a s s o m e o f t h e b i n d i n g a f fi n i t y f o r r e t i n a l ( K , = 2 6 0 i 1 2 n M ) a s c a n b e s e e n i n E n t r y 1 o f T a b l e I I - 2 . A d d i t i o n a l l y , t h e e v i d e n c e f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n t h a t h a d b e e n s e e n i n t h e M A L D I - F i g u r e I I - 2 2 . S t e r e o v i e w o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 E . A r g 1 1 1 w a s m u t a t e d t o i n c o r p o r a t e a c o u n t e r a n i o n f o r t h e p o s t u l a t e d P S B . ~ 7 . 4 A a w a y . 9 1 T a b l e I I - 2 . R e s u l t s o f b i n d i n g a s s a y s w i t h v a r i o u s C R A B P H m u t a n t s p r o b i n g t h e e f f e c t o f t h e c o u n t e r a n i o n E n t r y P r o t e i n R t K d ( n M ) ' R t A . . . " ( n m ) " R e d u c t i v e l y c A m i n a t e s l R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 E 2 6 0 a ; 1 2 3 7 0 N o 2 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 E : : T 5 4 V 2 1 0 i 8 . 2 4 1 4 N o 3 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : L 1 2 1 E 1 6 0 i 9 . 8 3 7 0 Y e s 4 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 l l L : : T 5 4 E 8 0 : t 3 . 4 3 7 9 , 4 5 4 N o 5 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 l 1 L : : L 1 2 1 E 2 0 0 i 8 . 3 3 7 2 , 4 6 4 Y e s 6 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 D 2 . 6 1 7 . 9 3 6 5 , 4 6 4 Y e s 7 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 l l L : : L 1 2 1 D : : T 5 4 V 3 0 : t 5 . 5 3 7 0 , 4 6 6 Y e s 8 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l 1 l L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V 2 . 7 i 7 . 0 3 7 8 , 4 5 6 Y e s a . D i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r a l l - t r a n s - r e t i n a l a s d e t e r m i n e d b y fl u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y . b . R e t i n a l m a x i m a l a b s o r b a n c e w h e n i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n . c . M A L D I - T O F o f r e d u c t i v e a m i n a t i o n . Y e s i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f a c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l m o l e c u l e . T O P o f R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F , n o l o n g e r e x i s t s f o r t h e t r i p l e m u t a n t . T h e e x p e c t e d d r o p i n r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f f i n i t y i s a l s o s e e n a s t h e s e c o n d s t a b i l i z i n g A r g r e s i d u e i s r e m o v e d f r o m t h e p o c k e t , j u s t a s w e s a w w i t h R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L d i s c u s s e d i n t h e l a s t s e c t i o n . N e i t h e r t h e i n c u b a t i o n o r r e d u c t i v e a m i n a t i o n o f r e t i n a l w i t h t h i s n e w t r i p l e m u t a n t s h o w e v i d e n c e f o r a c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n . A d i s t a n c e o f 7 . 4 A m i g h t b e t o o f a r t o s t a b i l i z e a n y P S B t h a t m a y h a v e f o r m e d , a n d p e r h a p s t h e b i n d i n g p o c k e t i s n o t y e t h y d r o p h o b i c e n o u g h , a s w e c a n s e e t h a t r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y h a s a l s o b e e n a f f e c t e d . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t t h e c o u n t e r a n i o n i n t h i s m u t a n t w i l l n o t p r o d u c e a r e d s h i f t a n d p o s s i b l e P S B , y e t t h e p o s i t i v e c h a r g e i n t h i s p o s i t i o n ( R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 ) , w h i c h r e s i d e s c l o s e r t o t h e S B m o i e t y w i l l . T h i s a t t e s t s f o r t h e f a c t t h a t t h e r e m a y b e o n l y a v e r y s m a l l w i n d o w o f e f f e c t i v e h y d r o p h o b i c i t y f o r 9 2 e x i s t e n c e o f a d e p r o t o n a t e d L y s r e s i d u e , y e t a t t h e s a m e t i m e , s t a b i l i z e t h e e x i s t e n c e o f a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . B y i n t r o d u c t i o n o f a n o t h e r h y d r o p h o b i c r e s i d u e i n t h e c a v i t y , p e r h a p s w e c a n r e c o v e r t h e r e d s h i f t a n d c o v a l e n t c o m p l e x t h a t w a s o b s e r v e d w i t h t h e R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F d o u b l e m u t a n t . W e o p t e d t o c o n v e r t T h r 5 4 t o a V a l b e c a u s e o f t h e c o n s e r v a t i v e c h a n g e a s w e l l a s t h e l a r g e i n c r e a s e i n h y d r o p h o b i c i t y . T h e q u a d r u p l e m u t a n t , R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 E : : T 5 4 V , d o e s i n d e e d r e g a i n t h e r e d s h i f t , a l t h o u g h 1 5 n m b l u e s h i f t e d c o m p a r e d t o t h e d o u b l e m u t a n t ( 4 1 4 n m , E n t r y 2 , T a b l e 1 1 - 2 ) . T h e i n c r e a s e i n h y d r o p h o b i c i t y , a s w e e x p e c t , d o e s e x h i b i t s o m e i m p r o v e m e n t o n r e t i n a l b i n d i n g a f f i n i t y ( 2 1 0 n M ) a s c o m p a r e d t o t h e p r e v i o u s t r i p l e m u t a n t ( 2 6 0 n M , E n t r y 1 ) , a l t h o u g h n o t a s s i g n i fi c a n t a s w e h a d i m a g i n e d i t w o u l d b e . T h e r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y h a s b e e n r e d u c e d e v e n f u r t h e r ( 8 6 0 n M ) a s c o m p a r e d t o t h e t r i p l e m u t a n t ( R l B Z K : : Y 1 3 4 F : : R l l l E , 5 3 0 n M ) , m o s t p r o b a b l y b e c a u s e o f t h e r e m o v a l o f a h y d r o x y l f u n c t i o n a l i t y t h a t m a y h a v e h e l p e d s t a b i l i z e r e t i n o i c a c i d b i n d i n g b y a c t i n g a s a h y d r o g e n b o n d d o n o r . T h e a d d i t i o n o f b o t h a c o u n t e r a n i o n a n d a n o t h e r h y d r o p h o b i c r e s i d u e h a s n o t h a d a n y e f f e c t o n t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e P S B . T h e r e t i n a l i s n o t q u i t e a s r e d s h i f t e d a s i n t h e R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F d o u b l e m u t a n t c a s e ( 4 1 4 n m v s . 4 2 9 n m ) , a n d t h e s a m e r e s u l t s w e r e s e e n i n t h e M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s a s w a s s e e n w i t h t h e d o u b l e m u t a n t . A c o v a l e n t c o m p l e x , c o n s i s t i n g o f a s i n g l e r e t i n a l m o l e c u l e b o u n d a s a S c h i f f b a s e i s d e t e c t e d i n t h e i n c u b a t i o n w i t h t h e q u a d r u p l e m u t a n t , b u t c a n n o t b e t r a p p e d a n d d e t e c t e d b y r e d u c t i v e a m i n a t i o n . S i n c e t h e c o u n t e r a n i o n i n p o s i t i o n 1 1 1 d i d n o t p r o d u c e a p r o t e i n w i t h i m p r o v e d c h a r a c t e r i s t i c s w e t r i e d t o r e p o s i t i o n i t i n p l a c e o f L e u 1 2 1 . T h i s r e s i d u e , a l t h o u g h c l o s e r 9 3 t o t h e S B r e g i o n ( 5 . 7 A ) , r e m o v e s a h y d r o p h o b i c r e s i d u e f r o m t h e b i n d i n g p o c k e t , r e p l a c i n g i t w i t h a h y d r o p h i l i c o n e . T h e l o s s o f h y d r o p h o b i c i t y h o w e v e r d o e s n o t e f f e c t t h e b i n d i n g a f fi n i t y o f r e t i n a l w i t h t h e t r i p l e m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : L 1 2 1 E ( 1 6 0 n M , E n t r y 3 , T a b l e I I - 2 ) . T h e a d d i t i o n o f t h e n e g a t i v e c h a r g e d G l u r e s i d u e i n c l o s e r p r o x i m i t y t o t h e c h r o m o p h o r e i s d e m o n s t r a t e d b y t h e 1 0 f o l d d e c r e a s e i n b i n d i n g a f fi n i t y o f r e t i n o i c a c i d ( K d = 1 4 0 0 i 6 3 n M ) a s c o m p a r e d t o t h e d o u b l e m u t a n t w i t h o u t t h e c o u n t e r a n i o n ( R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F , 1 2 0 n M ) . T h i s t r i p l e m u t a n t h a s a 3 7 0 n m A m u p o n i n c u b a t i o n w i t h r e t i n a l . R e g a r d l e s s o f t h e l a c k o f a n e x p e c t e d b l u e s h i f t i n g ( ~ 5 r u n ) , t h i s c o m p l e x i s s t i l l a S c h i f f b a s e , j u s t a s w e s a w w i t h t h e s i n g l e m u t a n t , R 1 3 2 K ( 3 7 0 n m ) . T h e c h r o m o p h o r e i s i n a u n i q u e e n v i r o n m e n t w i t h i n e a c h p r o t e i n s ’ b i n d i n g p o c k e t , a l l o w i n g f o r e a c h p r o t e i n t o p r o v i d e s m a l l v a r i a t i o n s i n t h e w a v e l e n g t h s f o r t h e b o u n d c h r o m o p h o r e . I t i s f o r t h i s r e a s o n U V - v i s a l o n e c a n n o t d i f f e r e n t i a t e t h e f o r m a t i o n o f a S c h i f f b a s e , e x p e c t e d 5 n m b l u e s h i f t , f r o m t h e f r e e a l d e h y d e . T h e c o m p l e x c a n b e t r a p p e d b y r e d u c t i v e a m i n a t i o n a n d v i s u a l i z e d i n t h e M A L D I - T O F , w h i c h d o e s v e r i f y S B f o r m a t i o n . A s M A L D I - T O F i l l u s t r a t e s , r e t i n a l b o u n d t o R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : L 1 2 1 E d o e s e x i s t a s a S c h i f f b a s e , h o w e v e r t h i s i s p r o b a b l y t h e n o n p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e a s w e d o n o t d e t e c t a r e d s h i f t o f r e t i n a l ’ s m a x i m a l a b s o r b a n c e i n t h e U V - v i s e x p e r i m e n t . T h u s f a r , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L h a s b e e n t h e o n l y p r o t e i n t h a t b o t h s h o w s a r e d s h i f t i n t h e U V - v i s a n d s h o w s t h e c o v a l e n t c o m b i n a t i o n o f r e t i n a l a n d p r o t e i n i n t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n . G i v e n t h i s , w e c h o s e t o r e i n t r o d u c e t h e h y d r o p h o b i c R 1 1 1 L m u t a t i o n t o t h e p r o t e i n a n d p r o b e f o r t h e o p t i m u m c o u n t e r a n i o n p o s i t i o n . 9 4 T h r 5 4 w a s c o n v e r t e d t o a G l u t o g i v e t h e t e t r a m u t a n t , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : T 5 4 E . F r o m t h e I n s i g h t I I m i n i m i z e d s t r u c t u r e ( F i g u r e I I - 2 3 ) , t h e c o u n t e r a n i o n i s 3 . 4 A f r o m t h e c a r b o n y l c a r b o n o f r e t i n a l . A s w e s a w i n t h e p r e v i o u s c a s e , i n t r o d u c t i o n o f t h e c o u n t e r a n i o n r e d u c e s t h e r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y d r a m a t i c a l l y , K d = 2 1 8 0 i 4 3 n M ( E n t r y 4 , T a b l e I I - 2 ) . A s t h e c o u n t e r a n i o n h a s m o v e d c l o s e r t o t h e c a r b o x y l a t e e n d o f t h e s u b s t r a t e w e e x p e c t t h i s e r o s i o n i n b i n d i n g . H a v i n g b o t h t h e R 1 1 1 L h y d r o p h o b i c m u t a t i o n c o u p l e d w i t h t h e c o u n t e r a n i o n i n p o s i t i o n 5 4 h a s i n c r e a s e d t h e r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y , K , = 8 0 . 4 : 3 . 4 n M . T h i s p r o t e i n m u t a n t n o t o n l y h a s i n c r e a s e d t h e r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y b e l o w 1 0 0 n M f o r t h e fi r s t t i m e , b u t i t a l s o h a s i n c r e a s e d t h e a m o u n t o f r e d s h i f t i n g s e e n i n t h e U V - v i s . T h e p r o t e i n / r e t i n a l c o m p l e x s h o w s a m i x t u r e o f t w o s p e c i e s , o n e a b s o r b i n g a t 3 7 9 n m , t h e o t h e r a t 4 5 4 n m ( F i g u r e I I - 2 4 ) . T h e c o v a l e n t c o m p l e x , p r e s u m a b l y t h e 4 5 4 n m a b s o r b i n g p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e , c a n b e d e t e c t e d b y M A L D I - T O F . H o w e v e r , a s w e h a v e s e e n w i t h R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F a n d R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 E : : T 5 4 V , t h e c o v a l e n t c o m p l e x c a n o n l y b e s e e n i n t h e i n c u b a t i o n e x p e r i m e n t , a n d c a n n o t b e d e t e c t e d b y M A L D I - T O F o f t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n . F i g u r e I I - 2 3 . S t e r e o v i e w o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 l L : : T 5 4 E . T h e c o u n t e r a n i o n a t p o s i t i o n 5 4 i s 3 . 4 A f r o m t h e p o s t u l a t e d P S B . 9 5 T h i s C R A B P I I m u t a n t s e e m s t o b e a s t e p i n t h e r i g h t d i r e c t i o n , a s w e n o w h a v e a n e v e n m o r e r e d s h i f t e d r e t i n a l p e a k a n d t h e r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y h a s b e e n i n c r e a s e d s i g n i fi c a n t l y . T h i s s t i l l i s n o t a n i d e a l r h o d o p s i n m i m i c n o t o n l y b e c a u s e t h e S c h i f f b a s e i s n o t s t a b l e e n o u g h t o b e t r a p p e d u n d e r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n c o n d i t i o n s , b u t a l s o b e c a u s e t h e r e e x i s t s a m i x t u r e o f t w o p e a k s . S o m e a m o u n t o f w h a t i s b e l i e v e d t o b e P S B e x i s t s , b u t t h e r e i s a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f a n o t h e r s p e c i e s . T h e r e t i n a l b i n d i n g a f f i n i t y i s r e s p e c t a b l e a t 8 0 n M , b u t w h e n t h e r e t i n a l i n c u b a t e d M A L D I - T O F s p e c t r a w a s r e c o r d e d , a l t h o u g h t h e p r o t e i n / r e t i n a l S c h i f f b a s e w a s p r e s e n t , t h e r e w a s a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f u n c o m p l e x e d p r o t e i n o b s e r v e d . T h e e x i s t e n c e o f f r e e p r o t e i n i n t h e M A L D I - T O F m a y s u g g e s t t h a t t h e 3 7 9 n m p e a k i n t h e U V - v i s i s d u e t o t h e f r e e a l d e h y d e a n d n o t t h e n o n - p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . I n f a c t , a n i n t e r e s t i n g t r e n d t o n o t e i s t h a t a l l o f t h e p r o t e i n s t h a t h a v e a ~ 4 6 0 n m p e a k i n t h e U V - v i s a l s o h a v e a ~ 3 7 5 n m p e a k a s w e l l . H o w e v e r , a l l o f t h e p r o t e i n s t h a t a b s o r b a t ~ 4 2 0 n m h a v e o n l y t h i s o n e p e a k . T h i s c o u l d a g a i n g o b a c k t o t h e t h e o r y o f a n o n - c o v a l e n t r e d s h i f t e d r e t i n a l a s a r e s u l t o f r e s i d i n g i n a a b 0 - 0 3 ‘ 2 0 0 0 0 0 - r o o o o o 1 L “ 0 0 2 o _ f ' A “ : ' g - 1 o o o o o ~ ' " - 2 o o o o o « 0 . 0 1 " g . m - 4 4 0 0 0 0 0 . o l ' I I I I . m d 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 2 0 ° 2 5 ° 3 0 ° 3 5 ° 4 0 0 n m n m F i g u r e I I - 2 4 . a ) U V - v i s s p e c t r u m f o r r e t i n a l a s b o u n d t o t h e t e t r a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l 1 1 L : : T 5 4 E . I t s h o w s t h e e x i s t e n c e o f t w o p e a k s , 3 7 9 r u n a n d 4 5 4 n m . b ) C D s p e c t r u m f o r t h e a p o - R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l l l L : : T 5 4 E s h o w s s m a l l c h a n g e s a s c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e C R A B P I I C D s p e c t r u m . T h e m i n i m a i s 2 2 4 n m a n d t h e d i s t i n c t i o n b e t w e e n t h e 2 2 0 n m a n d 2 3 0 n m p e a k h a s b e e n l o s t . 9 6 h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t , a n d m a y e x p l a i n w h y o n l y o n e s p e c i e s i s d e t e c t e d i n t h e U V - v i s , a n d o n l y a v e r y l i t t l e a m o u n t o f S B c a n u s u a l l y b e d e t e c t e d b y M A L D I - T O F . T h e p r o t e i n s t h a t a b s o r b ~ 4 6 0 n m g e n e r a l l y s h o w a s t r o n g e r r e d u c t i v e l y a m i n a t e d p e a k i n t h e M A L D I - T O F . T h e q u e s t i o n r e m a i n s t h e n , i f w e a r e c o n s t a n t l y g e t t i n g a ~ 3 7 5 n m / ~ 4 6 0 n m m i x t u r e , a r e t h e r e t w o p r o t e i n i s o f o r r n s t h a t a r e r e s p o n s i b l e f o r e a c h p e a k ? R e c a l l e a r l i e r e v i d e n c e t h a t s e e m e d t o s u g g e s t t h i s p o s s i b i l i t y a s w e l l . P r o t e i n fl u o r e s c e n c e t i t r a t i o n s w i t h r e t i n a l d o n o t s h o w a s l a r g e o f a d r o p i n t h e o v e r a l l r e l a t i v e i n t e n s i t y a s c o m p a r e d t o t h e n a t i v e s u b s t r a t e r e t i n o i c a c i d , w h i c h m a y b e a r e s u l t o f i n e f fi c i e n t q u e n c h i n g w i t h a h i g h e r a b s o r b i n g r e t i n a l - P S B c o m p l e x . I n a d d i t i o n , C D a n a l y s i s o f t h e p r o t e i n s r e v e a l a c h a n g e i n t h e s h a p e o f t h e c u r v e , w h e r e t h e c h a r a c t e r i s t i c 2 2 0 n m B - s h e e t p e a k i s p r e s e n t , b u t t h e 2 0 0 n m a n d 2 3 0 n m r e g i o n v a r y f r o m p r o t e i n t o p r o t e i n w h i c h m a y b e a r e s u l t o f s m a l l s t r u c t u r a l d e v i a t i o n s . H o w e v e r , t h e s e s p e c t r a l d e v i a n c e s c o u l d b e d u e t o a n o t h e r p r o t e i n i s o f o r m t h a t d o e s n o t b i n d r e t i n a l a s e f fi c i e n t l y . E i t h e r a m o r e i n d e p t h s t r u c t u r a l a n a l y s i s o f t h e C D d a t a o r f u r t h e r c r y s t a l l o g r a p h i c s t u d i e s m u s t b e p e r f o r m e d t o a n s w e r t h i s q u e s t i o n . R e t u r n i n g n o w t o t h e a t t e m p t s a t fi n d i n g t h e o p t i m u m c o u n t e r a n i o n p o s i t i o n , u t i l i z i n g t h e R 1 1 1 L h y d r o p h o b i c m u t a t i o n , t h e c o u n t e r a n i o n h a s n o w b e e n r e p o s i t i o n e d t o r e s i d u e 1 2 1 ( f o r m e r l y a l e u c i n e ) t o g e n e r a t e t h e t e t r a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 E ( E n t r y 5 , T a b l e I I - 2 ) . T h e c o u n t e r a n i o n i s 2 . 6 A f r o m t h e m i n i m i z e d S c h i f f b a s e n i t r o g e n ( m i n i m i z e d b y I n s i g h t I I , F i g u r e I I - 2 5 ) . W i t h t h e c o u n t e r a n i o n b e i n g c l o s e r t o t h e S B n i t r o g e n f r o m L y s 1 3 2 t h a n f r o m G l u 5 4 ( 7 . 1 A ) f r o m t h e I n s i g h t H S B m i n i m i z e d s t r u c t u r e ) , t h e r e i s e v i d e n c e f o r a n e v e n s t r o n g e r r e d 9 7 s h i f t , a s n o w t h e r e i s a m i x t u r e o f a 3 7 2 n m a n d a 4 6 4 n m a b s o r b i n g s p e c i e s ( E n t r y 5 , T a b l e I I - 2 ) . R e m o v a l o f t h e h y d r o p h o b i c L e u 1 2 1 r e s i d u e i s e v i d e n t i n t h e fl u o r e s c e n c e t i t r a t i o n s . T h e r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y h a s b e e n r e d u c e d a s c o m p a r e d t o t h e t e t r a m u t a n t c o n t a i n i n g t h e G l u 5 4 c o u n t e r a n i o n ( 8 0 n M , E n t r y 4 ) . R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E e x h i b i t s a K , = 2 0 0 t 8 . 3 n M . A l t h o u g h t h e b i n d i n g a f fi n i t y i s n o t a s s t r o n g a s p r e v i o u s , M A L D I - T O F r e a c t i o n s d o p r o v i d e b e t t e r r e s u l t s . T h i s i s t h e fi r s t c o u n t e r a n i o n c o n t a i n i n g m u t a n t w h e r e b o t h t h e i n c u b a t i o n a n d t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n s d e m o n s t r a t e d e v i d e n c e f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . I n t h e n o n c o v a l e n t f o r m , t h e c o u n t e r a n i o n i s a c t u a l l y f u r t h e r a w a y f r o m t h e c h r o m o p h o r e ’ s c a r b o n y l f r o m p o s i t i o n 1 2 1 ( 5 . 7 A ) a s c o m p a r e d t o t h e c o u n t e r a n i o n b e i n g i n p o s i t i o n 5 4 ( 3 . 4 A b a s e d o n I n s i g h t I I m i n i m i z a t i o n s ) . T h i s d e m o n s t r a t e s i t s e l f t h r o u g h t h e r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y . R e c a l l t h e p r e v i o u s t e t r a m u t a n t ( R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l 1 1 L : : T 5 4 E , E n t r y 4 ) h a d a r e t i n o i c a c i d d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f 2 1 8 0 n M w h e r e a s w i t h t h e n e g a t i v e c h a r g e f u r t h e r a w a y f r o m t h e c h r o m o p h o r e ( E n t r y 5 , F i g u r e I I - 2 5 . S t e r e o v i e w o f C R A B P H R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E w i t h T h r 5 4 a l s o s h o w n . A s t h e c o v a l e n t S c h i f f b a s e c o m p l e x a t i o n i s f o r m e d . I n s i g h t l l m i n i m i z a t i o n s p l a c e t h e c o u n t e r a n i o n a t p o s i t i o n 1 2 1 c l o s e r t o t h e p o s t u l a t e d p o s i t i v e c h a r g e t h a n i f p o s i t i o n 5 4 ( T h r ) w a s u t i l i z e d f o r t h e c o u n t e r a n i o n . 9 8 G l u 1 2 1 ) t h e r e t i n o i c a c i d b i n d i n g i s n o t i n h i b i t e d a s m u c h , K d = 7 7 0 i - 6 1 n M . T h e r e i s s o m e t h i n g s t r u c t u r a l l y w r o n g w i t h t h e R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l 1 1 L 1 1 L 1 2 1 E p r o t e i n h o w e v e r w h a t s t i l l r e m a i n s u n k n o w n t o u s . M A L D I - T O F a n a l y s i s o f t h e p r o t e i n r e v e a l s t w o p e a k s , o n e h i g h e r i n m a s s ( 1 7 4 4 4 D a ) a n d o n e l o w e r i n m a s s ( 1 6 6 6 0 D a ) t h a n t h e e x p e c t e d m o l e c u l a r w e i g h t f o r t h e p r o t e i n ( 1 6 7 5 8 D a ) . A l t h o u g h m a s s a n a l y s i s s h o w s w h a t s e e m s t o b e t w o p r o t e i n p e a k s , S D S - P A G E a n a l y s i s s h o w s o n l y o n e b a n d , a n d i t a p p e a r s a t a h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t t h a n o t h e r C R A B P I I p r o t e i n s ( F i g u r e I I - 2 6 ) . I t i s n o t c o m p l e t e l y o b v i o u s w h a t t r a n s f o r m a t i o n i s t a k i n g p l a c e t o m o d i f y t h i s p r o t e i n f r o m i t s o r i g i n a l s t r u c t u r e a n d s e q u e n c e . D N A s e q u e n c i n g v e r i fi e s t h e p r e s e n c e o f t h e s t o p c o d o n , a n d s h o u l d t h i s s t o p c o d o n b e s k i p p e d f o r s o m e r e a s o n , t h e r e a r e s e v e r a l s t o p c o d o n s f o l l o w i n g t h e i n i t i a l o n e . T h e m a s s i s n o t l a r g e e n o u g h t o b e a d i m e r o f t h e p r o t e i n . R e t r a n s f e c t i o n o f t h e v e r i fi e d D N A s e q u e n c e s t i l l p r o v i d e d t h e s a m e r e s u l t s . A d d i t i o n a l l y , t h i s c l o n e w a s m o r e d i f fi c u l t t o o b t a i n t h a n u s u a l , a n d , t h i s p r o t e i n e x p r e s s e s i n l o w y i e l d s a s c o m p a r e d t o o t h e r p r o t e i n s , y i e l d i n g o n l y a b o u t 1 0 m g o f p r o t e i n p e r l i t e r o f 9 9 A B C D E - ~ . F i g u r e I I - 2 6 . L a n e s A - C s h o w S D S - P A G E a n a l y s i s o f W T , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F , a n d R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l l l L a t a p p r o x . 1 7 , 0 0 0 D a , r e s p e c t i v e l y . L a n e R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : L 1 2 1 E s l i g h t e r h i g h e r t h a n D d e p i c t s t h e o t h e r s , b u t t h i s p r o t e i n s t i l l s h o w s c o r r e c t m o l e c u l a r w e i g h t b y M A L D l - T O F . L a n e E s h o w s t h e t e t r a m u t a n t , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 : : R l l l L : : L 1 2 1 E e v e n h i g h e r t h a n l a n e D . T h e t e t r a m u t a n t c o n s i s t e n t l y r u n s h i g h e r t h a n 1 7 , 0 0 0 D a o n g e l . M A L D I - T O F o f t h i s t e t r a m u t a n t s h o w s t w o p e a k s . o n e h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t a n d o n e l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t p e a k . T h e h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t p e a k , w h i c h i s t h i s o n l y p e a k s e e n h e r e . i s a l s o t h e o n l y p e a k t h a t d e m o n s t r a t e s S c h i f f b a s e f o r m a t i o n w i t h r e t i n a l . c u l t u r e . D e s p i t e t h e u n c e r t a i n t y i n p r o t e i n s e q u e n c e a n d s t r u c t u r e , t h i s m u t a n t s t i l l d e m o n s t r a t e s g o o d r e t i n a l b i n d i n g p r o p e r t i e s , i n f a c t t h e b e s t w e h a v e s e e n t h u s f a r . I n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n e x p e r i m e n t s w i t h t h i s p r o t e i n d o s h o w S c h i f f b a s e f o r m a t i o n , h o w e v e r , o n l y w i t h t h e h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n . T h i s a g r e e s w i t h t h e S D S - P A G E t h a t o n l y s h o w s o n e p r o t e i n p e a k . T h e s e c o n d l o w e r m a s s p e a k m a y b e a c l e a v a g e p r o d u c t o f t h e h i g h e r m a s s s p e c i e s . A l s o , t h i s p r o t e i n p o r t r a y s a l m o s t i d e n t i c a l r e t i n a l b i n d i n g p r o p e r t i e s a s c o m p a r e d t o t h e p E T - l 7 b , n o n - H i s - t a g g e d p r o t e i n . T h e R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E t e t r a m u t a n t w a s p r e p a r e d i n t h e p E T - l 7 b p l a s m i d f o r c r y s t a l l o g r a p h i c s t u d i e s , a n d i n t e r e s t i n g l y d o e s n o t s u f f e r f r o m t h e s a m e s t r u c t u r a l i n c o n s i s t e n c i e s a s t h e H i s - t a g g e d p r o t e i n . T h e n o n - H i s - t a g g e d R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E p r o t e i n h a s t h e c o r r e c t m o l e c u l a r w e i g h t . I n a d d i t i o n , fl u o r e s c e n c e , U V , a n d M A L D I - T O F d a t a b e t w e e n t h e t w o p r o t e i n s a r e i n v e r y g o o d a g r e e m e n t . T h e r e i s o n e a s p e c t a b o u t t h e p E T - l 7 b n o n - H i s - t a g g e d p r o t e i n t h a t i s d i f f e r e n t f r o m t h e p E T - B l u e 2 H i s - t a g g e d p r o t e i n . T h e c o d o n u s e d f o r t h e R 1 1 1 L a m i n o a c i d i s d i f f e r e n t b y a s i n g l e b a s e p a i r ( C T G u s e d w i t h p E T - B l u e 2 a n d C T A u s e d w i t h p E T - 1 7 b ) . S e v e r a l a t t e m p t s w e r e m a d e a t c o n v e r t i n g t h e p E T - B l u e 2 c o d o n t o m a t c h t h a t o f t h e p E T - l 7 b p l a s m i d . H o w e v e r , t h e c l o n i n g a t t e m p t s h a v e y e t t o p r o v e s u c c e s s f u l . A t t e m p t s a t p r o d u c i n g t h i s c l o n e f o r M A L D I - T O F a n a l y s i s o f t h e m o l e c u l a r w e i g h t a r e s t i l l o n g o i n g . T h e p e n t a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : F 1 5 A ( R t A m = 3 6 8 n m , R t K , = 1 1 0 i 6 3 n M ) w a s p r o d u c e d t o p r o b e t h e p o s s i b i l i t y o f l o s s o f s t r u c t u r a l i n t e g r i t y i n t h e a — h e l i c a l r e g i o n a s w a s s e e n i n t h e F 1 5 W c r y s t a l s t r u c t u r e . C o m p a r i n g t h i s p r o t e i n t o 1 0 0 t h e t e t r a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 E ( R t k m = 3 7 2 , 4 6 4 n m , R t K , = 2 0 0 i 8 . 3 n M ) s h o w s t h a t t h e r e i s n o t m u c h d i f f e r e n c e i n b i n d i n g a f fi n i t y , h o w e v e r , t h e r e d s h i f t t o 4 6 4 r u n t h a t w a s s e e n i n t h e t e t r a m u t a n t i s l o s t i n t h e p e n t a m u t a n t p r o t e i n t h r o u g h t h e a d d i t i o n o f t h e F I S A m u t a t i o n . L o s s o f s t r u c t u r a l i n t e g r i t y a s a r e s u l t o f t h i s m u t a t i o n c o u l d r e s u l t i n a l e s s r i g i d a n d m o r e o p e n b i n d i n g c a v i t y , m a k i n g t h e P S B m o r e s o l v e n t e x p o s e d . O n l y p r o t o n a t i o n , a n d n o t S c h i f f b a s e f o r m a t i o n i s l o s t h e r e , a s b o t h M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s s t i l l v e r i f y c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n w i t h a s i n g l e r e t i n a l m o l e c u l e . C r y s t a l l o g r a p h i c a n a l y s i s i s o n g o i n g . T h e f u r t h e r d e g r e e o f r e d s h i f t i n g o b s e r v e d w i t h t h e c o u n t e r a n i o n i n p o s i t i o n 1 2 1 a s c o m p a r e d t o 5 4 , a n d t h e f a c t t h a t t h e c o v a l e n t c o m p l e x , w h i l e b i n d i n g a f fi n i t y w a s n o t a s g o o d a s p r e v i o u s , c o u l d b e t r a p p e d i n r e d u c t i v e a m i n a t i o n ( R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : T 5 4 E c o u l d n o t ) p r o m p t e d u s t o p u r s u e t h e 1 2 1 c o u n t e r a n i o n p o s i t i o n . W e w e r e a l s o c u r i o u s t o s e e i f t h i s u n k n o w n p r o t e i n t r a n s f o r m a t i o n ( m o l e c u l a r w e i g h t i n c o n s i s t e n c y o b s e r v e d w i t h R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E ) w i l l b e c a r r i e d t h r o u g h t o f u t u r e c l o n e s . T h e G l u 1 2 1 c o u n t e r a n i o n i n t h e t e t r a m u t a n t w a s r e p l a c e d w i t h A s p t o p r o d u c e R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 D . T h e A s p r e s i d u e ( b a s e d o n I n s i g h t I I m i n i m i z a t i o n s ) m i n i m i z e s t o a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e d i s t a n c e f r o m t h e S c h i f f b a s e n i t r o g e n ( 2 . 9 A ) a s c o m p a r e d t o G l u ( 3 . 1 A ) d e s p i t e A s p h a v i n g o n e l e s s m e t h y l e n e u n i t i n i t s s i d e c h a i n . T h i s s m a l l d i f f e r e n c e i n d i s t a n c e e x h i b i t s a l a r g e e f f e c t o n t h e r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y , b u t l i t t l e e f f e c t o n t h e a b s o r b a n c e o f r e t i n a l ( E n t r y 6 , T a b l e I I - 2 ) . W h i l e r e t i n a l b o u n d t o R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 D p o r t r a y s m a x i m a l a b s o r b a n c e v a l u e s o f 3 6 5 n m a n d 4 6 4 n m , t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t h a s n o w d r o p p e d t o a c h i e v e a s t o i c h i o m e t r i c b i n d i n g 1 0 1 r e l a t i o n s h i p w i t h t h e c h r o m o p h o r e , K , = 2 . 6 : 1 : 7 . 9 n M . A l s o , j u s t a s t h e c o r r e s p o n d i n g p r o t e i n m u t a n t c o n t a i n i n g G l u a s t h e c o u n t e r a n i o n , b o t h t h e i n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n e x p e r i m e n t s r e v e a l S c h i f f b a s e c o m p l e x e s w i t h a s i n g l e m o l e c u l e o f r e t i n a l ( F i g u r e I I - 2 7 ) . A l t h o u g h t h e 3 6 5 n m a b s o r b i n g s p e c i e s m a y l e a d u s t o t h i n k t h a t w e n o w h a v e a m i x t u r e o f S B a n d P S B , t h e M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s s t i l l s h o w a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f f r e e p r o t e i n . A l t h o u g h t h i s r e s u l t m a y b e d u e t o u n o p t i m i z e d r e a c t i o n c o n d i t i o n s , t h e 3 6 5 n m a b s o r b i n g s p e c i e s c o u l d n o t b e f o r c e d t o t h e r e d s h i f t e d 4 6 4 n m p e a k u p o n a d d i t i o n o f a c i d . P r e s u m a b l y , t h i s t o o i s a m i x t u r e o f a l d e h y d e a n d P S B . W e h a v e y e t t o c o n c l u s i v e l y d e t e r m i n e w h y , a l t h o u g h w e a r e g e t t i n g s o m e a m o u n t o f P S B , t h e m a j o r s p e c i e s i s s t i l l t h e f r e e a l d e h y d e . I n a s i t u a t i o n s u c h a s w i t h t h i s p r o t e i n , t h e b i n d i n g a f fi n i t y i s s o h i g h t h a t w e c a n b e l i e v e t h a t t h e c h r o m o p h o r e i s w i t h i n t h e b i n d i n g c a v i t y w i t h a s t o i c h i o m e t r i c b i n d i n g r e l a t i o n s h i p , y e t w e s t i l l c a n n o t r u l e o u t a s e c o n d i s o f o r m o f t h e p r o t e i n , t h a t e i t h e r a l l o w s f o r b i n d i n g , b u t n o t P S B f o r m a t i o n , o r d o e s n o t b i n d r e t i n a l . W i t h e v e r y h y d r o p h o b i c a d d i t i o n t o t h e p o c k e t w e h a v e h a d i n c r e a s e d s u c c e s s i n a t l e a s t o n e o f t h e r e t i n a l b i n d i n g a s s a y s . H o p i n g t o f o l l o w t h i s t r e n d w e d e c i d e d t o c h a n g e T h r 5 4 t o a V a l a g a i n t o p r o d u c e t h e p e n t a m u t a n t s R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 D : : T 5 4 V a n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V ( E n t r i e s 7 a n d 8 , r e s p e c t i v e l y , T a b l e I I - 2 ) . T h i s i s o n e o f t h e l a s t r e s i d u e s t h a t r e s i d e s < 7 A f r o m t h e S c h i f f b a s e r e g i o n b e t w e e n r e t i n a ] a n d L y s 1 3 2 . O t h e r r e s i d u e s t h a t m a y b e a l t e r e d i n f u t u r e s t u d i e s a r e f u r t h e r a w a y f r o m t h e c h r o m o p h o r e , e i t h e r d e e p e r i n t o t h e p r o t e i n s t r u c t u r e t h a n t h e r e s i d u e s c u r r e n t l y s t u d i e d , o r a l o n g t h e i n t e r i o r s u r f a c e o f t h e 1 0 2 c a v i t y , b u t f u r t h e r a l o n g t h e c h a i n o f t h e p o l y e n e t o w a r d s t h e r i n g a n d t h e o p e n i n g o f t h e c a v n y . T h i s h y d r o p h o b i c a d d i t i o n h a s m i n i m a l e f f e c t o n t h e r e t i n a l b i n d i n g a n d P S B a b g 0 . 0 5 — g 8 0 . 0 4 4 E 5 0 . 0 3 J I , e 3 g 0 . 0 2 l 5 5 0 0 1 ~ 3 . m 0 6 — — fl F — — r _ ' — fi — — - — 1 O R I * F r 1 0 1 2 3 4 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 E q u i v a l e n t s R e t i n o i c a c i d I R e t i n a l n m e ( 1 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 M a s s ( D a ) M a s s ( D a ) F i g u r e I I - 2 7 . 3 ) F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l K d d e t e r m i n a t i o n w i t h t h e t e t r a m u t a n t C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l l 1 L : : L 1 2 1 D . T h e r e t i n o i c a c i d d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t i s K d = 2 0 0 i 2 5 . 3 n M , a n d a s t o i c h i o m e t r i c r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y , K , = 2 . 6 r 7 . 9 n M . b ) U V - v i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h t h e C R A B P I I p r o t e i n p o r t r a y s m a x i m a l a b s o r b a n c e s a t 3 6 5 n m a n d 4 6 4 n m , a 9 4 n m r e d s h i f t a s c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e C R A B P I I ( 3 7 0 n m ) , p o s s i b l y s u g g e s t i n g p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . c ) M A L D l - T O F o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d p e n t a m u t a n t s h o w s a n M + = 1 6 7 5 4 . 2 D a c o r r e s p o n d i n g t o t h e p r o t e i n m a s s , c a l c u l a t e d t o b e 1 6 7 4 4 . 1 D a . I n a d d i t i o n t h e r e i s s m a l l a m o u n t s o f a s e c o n d p e a k ( i n d i c a t e d b y a r r o w ) . M l = 1 7 0 2 5 . ] D a , w h i c h i s 2 7 0 . 9 m a s s u n i t s h i g h e r t h a n t h e p r o t e i n p e a k . r e p r e s e n t i n g a c o v a l e n t l y l i n k e d r e t i n a l m o l e c u l e ( c a l c u l a t e d m a s s d i f f e r e n c e 2 6 6 ) . d ) R e d u c t i v e a m i n a t i o n o f r e t i n a l w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L 1 1 L 1 2 1 E : : T 5 4 V r e s u l t s f u r t h e r t r a p p i n g o f t h e c o v a l e n t c o m p l e x , M ’ = 1 6 7 3 4 . 6 D a a n d 1 7 0 1 0 . 6 D a ( d i f f e r e n c e o f 2 7 6 D a . c a l c u l a t e d d i f f e r e n c e s h o u l d b e 2 6 8 D a ) . 1 0 3 f o r m a t i o n w h e n A s p i s u s e d a s t h e c o u n t e r a n i o n ( E n t r y 7 , K d = 3 0 n M , k m = 3 7 0 a n d 4 6 6 n m , p o s i t i v e d e t e c t i o n o f S B v i a M A L D I - T O F ) . T h e o n l y v i s i b l e s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e i s s e e n i n t h e r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y w h e r e t h e h y d r o p h o b i c a d d i t i o n h a s h a m p e r e d r e t i n o i c a c i d b i n d i n g ( 7 6 0 n M ) s i m i l a r t o t r e n d s p r e v i o u s l y r e p o r t e d f o r R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 E : : T 5 4 V . T h e t e t r a m u t a n t ( R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 D ) , h a d a l r e a d y a c h i e v e d a s t o i c h i o m e t r i c b i n d i n g r e l a t i o n s h i p w i t h r e t i n a l ( p r o v i d e d t h e r e i s o n l y o n e p r o t e i n f o r m ) , t h e r e f o r e w e d i d n o t e x p e c t t o s e e a n i n c r e a s e i n r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y b y t h i s h y d r o p h o b i c a d d i t i o n . O n t h e o t h e r h a n d , t h i s s i n g l e h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d m u t a t i o n h a s h a d a s i g n i fi c a n t p o s i t i v e e f f e c t o n t h e p r o t e i n c o n t a i n i n g G l u a s t h e c o u n t e r a n i o n . T h e p r o t e i n r e t i n a l c o m p l e x m a i n t a i n s a r e d s h i f t e d / n o n - r e d s h i f t e d m i x t u r e o f t w o s p e c i e s ( 3 7 8 n m , 4 5 6 n m ) a n d S c h i f f b a s e i s d e t e c t e d i n b o t h M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s . T h e m o s t s i g n i fi c a n t i m p r o v e m e n t i s s e e n i n t h e b i n d i n g a f fi n i t y f o r r e t i n a l . T h e t e t r a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E h a s a K d o f 2 0 0 n M , w h i l e i n t r o d u c t i o n o f V a l i n p o s i t i o n 5 4 e n h a n c e d t h e b i n d i n g s i g n i fi c a n t l y w i t h a n a p p a r e n t K d o f 2 n M . W e h a v e a g a i n a c h i e v e d a s t o i c h i o m e t r i c b i n d i n g r e l a t i o n s h i p b e t w e e n r e t i n a l a n d t h e p r o t e i n . T h i s p r o t e i n i s t h e b e s t r e t i n a l P S B f o r m i n g p r o t e i n c r e a t e d t h u s f a r . I t f o r m s P S B w i t h a s i n g l e m o l e c u l e o f r e t i n a l a s d e t e c t e d b y M A L D I - T O F a n d U V - v i s . T h e t e t r a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 D a l s o h a s a s t o i c h i o m e t r i c b i n d i n g a f fi n i t y w i t h r e t i n a l a n d f o r m s a r e d s h i f t e d P S B , b u t a s s e e n i n F i g u r e 1 1 - 2 8 , t h e e q u i l i b r i u m i n t h e p e n t a m u t a n t f a v o r s t h e P S B m o r e s o t h a n t h e t e t r a m u t a n t . F o r t h i s r e a s o n , i t i s t h i s p r o t e i n t h a t w a s p r o b e d f u r t h e r f o r c o n f i r m a t i o n o f t h e P S B f o r m a t i o n w i t h L y s 1 3 2 , a n d w i l l b e d i s c u s s e d i n m u c h m o r e d e t a i l i n t h e n e x t s e c t i o n . 1 0 4 e c n a b r o s b A 0 . 0 6 r 0 . 0 5 1 0 . 0 4 ' * 0 . 0 3 i 0 . 0 2 r 0 . 0 1 * O _ T I f f I f 7 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 n m F i g u r e I I - 2 8 . C o r r e c t e d U V - v i s o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l l l L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V ( 3 7 8 n m , 4 5 6 n m ) a n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 D ( 3 6 5 n m , 4 6 4 n m ) C R A B P I I m u t a n t s . T h e p e n t a m u t a n t h a s a l a r g e r a m o u n t o f t h e r e d s h i f t e d p e a k a s c o m p a r e d t o t h e t e t r a m u t a n t . F o r t h i s r e a s o n , R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l l l L : : L l 2 l E : : T 5 4 V w a s p r o b e d m o r e e x t e n s i v e l y f o r t h e e x i s t e n c e o f a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e w i t h L y s 1 3 2 . 1 0 5 G . A S u c c e s s f u l P r o t o n a t e d S c h i f f B a s e F o r m i n g P r o t e i n T h e p e n t a C R A B P I I m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l l 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V i s m y m o s t s u c c e s s f u l p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e f o r m i n g p r o t e i n . I t h a s a c h i e v e d a l a r g e r e d s h i f t p r e s u m a b l y d u e t o p r o t o n a t i o n o f t h e S c h i f f b a s e a n d a s t o i c h i o m e t r i c b i n d i n g r e l a t i o n s h i p w i t h r e t i n a l . T h e s u c c e s s i n r e t i n a l b i n d i n g w i t h R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V i s a r e s u l t o f b o t h p r o p e r h y d r o p h o b i c t u n i n g a n d p r e c i s e p l a c e m e n t o f t h e c o u n t e r a n i o n . T h r e e r e s i d u e s h a d t o b e m u t a t e d i n o r d e r t o i n c r e a s e t h e h y d r o p h o b i c n a t u r e o f t h e b i n d i n g p o c k e t , T y r 1 3 4 ( 3 . 2 A f r o m r e t i n a l ) , A r g 1 1 1 ( 5 . 5 A f r o m r e t i n a l ) , a n d T h r 5 4 ( 3 . 8 A f r o m r e t i n a l ) . A s p r e v i o u s p r o t e i n c l o n e s s u g g e s t , a n y t h i n g l e s s t h a n t h e s e t h r e e h y d r o p h o b i c m u t a t i o n s m a y s t i l l a c h i e v e t h e s a m e a m o u n t o f r e d s h i f t i n g a s o b s e r v e d i n t h i s p e n t a m u t a n t , h o w e v e r , t h e b i n d i n g a f f i n i t y o f r e t i n a l t o t h e p r o t e i n i s d r a m a t i c a l l y r e d u c e d a n d u n a c c e p t a b l e . I n a d d i t i o n , c o u n t e r a n i o n p l a c e m e n t o n l y a t p o s i t i o n 1 2 1 h a s b e e n f r u i t f u l i n a c h i e v i n g b o t h t h e o p t i m a l U V - v i s a n d fl u o r e s c e n c e r e s u l t s . F i g u r e I I — 2 9 d i s p l a y s t h e r e s u l t s o b t a i n e d f r o m t h e r e t i n a l b i n d i n g a s s a y s p e r f o r m e d w i t h C R A B P H R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V . F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n s h o w s a s t o i c h i o m e t r i c b i n d i n g r e l a t i o n s h i p w i t h r e t i n a l ( 2 . 7 n M ) , s i m i l a r t o t h a t b e t w e e n w i l d t y p e C R A B P I I a n d i t s n a t i v e s u b s t r a t e r e t i n o i c a c i d ( 2 . 0 n M , s e e F i g u r e H - 1 1 ) . U V - v i s r e v e a l s a p r o t e i n t h a t n o w a b s o r b s a t 4 5 5 n m i n a d d i t i o n t o t h e s e c o n d 3 7 8 n m p e a k . T h i s i s a n 8 5 n m r e d s h i f t a s c o m p a r e d t o r e t i n a l w i t h t h e w i l d t y p e C R A B P I I ( 3 7 0 n m ) . F i n a l l y , M A L D I - T O F r e v e a l s v e r y c l e a r l y a p o s i t i v e p e a k f o r t h e c o v a l e n t c o m p l e x a t i o n 1 0 6 b e t w e e n r e t i n a l a n d t h e p r o t e i n , w h i c h c a n n o w b e t r a p p e d u n d e r b o t h i n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n c o n d i t i o n s . C D s p e c t r a o f t h e p e n t a m u t a n t i n c u b a t e d w i t h r e t i n a l w e r e t a k e n i n h o p e s o f a b 1 1 > - ' 2 0 . 8 q 0 . 0 6 2 8 . E = 0 . 0 4 - . . 0 - 6 1 a . 2 3 i i i a n . a 0 . 4 l 2 0 . 0 2 a : 0 . 2 Y T " l — — 1 O * 1 f 1 1 1 0 1 2 3 4 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 E q u i v a l e n t s R e t i n o i c A c i d / R e t i n a l " " 1 c ( 1 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 M a s s ( D a ) M a s s ( D a ) F i g u r e I I - 2 9 . 3 ) F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l K d d e t e r m i n a t i o n w i t h t h e p e n t a m u t a n t C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 l l L : : L 1 2 l E : : T 5 4 V . T h e h y d r o p h o b i c t u n i n g a n d p r o p e r p o s i t i o n i n g o f t h e c o u n t e r a n i o n h a s r e s u l t e d i n a r e t i n o i c a c i d d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f K , = 2 4 9 i 1 9 . 2 n M . a n d a s t o i c h i o m e t r i c r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y , K , = 2 . 7 i 7 . 0 n M . b ) U V - v i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h t h e C R A B P I I p r o t e i n p o r t r a y s m a x i m a l a b s o r b a n c e s a t 3 7 8 n m a n d 4 5 5 r u n , a n 8 6 n m r e d s h i f t a s c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e C R A B P I I ( 3 7 0 n m ) . p o s s i b l y s u g g e s t i n g p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . c ) M A L D I - T O F o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d p e n t a m u t a n t s h o w s a n M ’ = 1 6 7 4 6 . 3 D a c o r r e s p o n d i n g t o t h e p r o t e i n m a s s , c a l c u l a t e d t o b e 1 6 7 5 6 . 2 D a . I n a d d i t i o n t h e r e i s s m a l l a m o u n t s o f a s e c o n d p e a k ( i n d i c a t e d b y a r r o w ) , M + = 1 7 0 1 8 . 4 D a , w h i c h i s 2 7 2 . 1 m a s s u n i t s h i g h e r t h a n t h e p r o t e i n p e a k , r e p r e s e n t i n g a c o v a l e n t l y l i n k e d r e t i n a l m o l e c u l e ( c a l c u l a t e d m a s s d i f f e r e n c e 2 6 6 ) . d ) R e d u c t i v e a m i n a t i o n o f r e t i n a l w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V r e s u l t s f u r t h e r t r a p p i n g o f t h e c o v a l e n t c o m p l e x , M + = 1 6 7 4 9 . 5 D a a n d 1 7 0 1 6 . 2 D a ( d i f f e r e n c e o f 2 6 6 . 7 D a , c a l c u l a t e d d i f f e r e n c e s h o u l d b e 2 6 8 D a ) . 1 0 7 o b s e n c h r o m l r e i a n l x “ b a n o f t h e s o l u b l l : s o l u t i n a s S D S W i l l h e c o n c e n 1 1 3 0 . C D c u o b s e r v i n g a b o u n d c h r o m o p h o r e , b u t h a s y e t t o b e d e t e c t e d . E v e n a c o v a l e n t l y b o u n d c h r o m o p h o r e m a y n o t s h o w C D . I n i t i a l l y , n o m o r e t h a n o n e e q u i v a l e n t o f r e t i n a l / r e t i n o i c a c i d w a s a d d e d , a s t h e b e s t U V — v i s r e s u l t s w e r e o b t a i n e d a t t h e s e c o n c e n t r a t i o n s . W h e n t h i s f a i l e d t o g i v e a C D c u r v e , p r e s u m a b l y b e c a u s e o f t h e v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n o f t h e a c t u a l b o u n d c h r o m o p h o r e , e x c e s s c h r o m o p h o r e w a s a d d e d . H o w e v e r , t h e l i m i t e d s o l u b i l i t y i n w a t e r w a s p r o b l e m a t i c i n a c h i e v i n g h i g h c o n c e n t r a t i o n s . A s o l u t i o n t o t h e s o l u b i l i t y p r o b l e m i s t h e a d d i t i o n o f a d e t e r g e n t t o t h e p r o t e i n s o l u t i o n . W e h a d e x p e r i m e n t e d w i t h C H A P S O , b u t a d d i t i o n a l l y o n e m a y t r y o t h e r s s u c h a s S D S o r T r i t o n - X 1 0 0 . A n o p t i m a l d e t e r g e n t c o n c e n t r a t i o n h a s t o b e f o u n d s o t h a t i t w i l l h e l p t o s o l u b i l i z e t h e c h r o m o p h o r e w h i l e n o t d e n a t u r e t h e p r o t e i n . A t d e t e r g e n t c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 m M t h e r e w a s s i g n i fi c a n t p r o t e i n d e n a t u r a t i o n a s e v i d e n t i n F i g u r e I I - 3 0 . E x p e r i m e n t a t i o n w i t h r e t i n a l C D s p e c t r a w a s n o t p u r s u e d f u r t h e r t h a n t h i s , a n d a C D c u r v e t h a t u n e q u i v o c a l l y d e m o n s t r a t e d t h e e x i s t e n c e o f a b o u n d r e t i n a l m o l e c u l e w a s n e v e r o b t a i n e d . T h e 2 0 0 0 0 0 - c o n d i t i o n s f o r t h e 1 0 0 0 0 0 ~ 0 - - 3 e x p e r i m e n t m a y o r m a y , 2 “ . 4 0 0 0 0 0 4 3 2 0 0 0 0 0 - n o t h a v e h a d a n y t h i n g t o 2 _ 3 0 0 0 0 0 . . . . . « 1 0 0 0 0 0 - d o W i t h t h i s , b u t i t l s o u r - 5 0 0 0 0 0 1 . - 6 0 0 0 0 0 , b € l l e f t h a t a l t h o u g h t h e 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 n m R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : F i g u r e I I - 3 0 . T h e r e d C D s p e c t r u m i s t h e Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F I L 1 2 1 E 1 3 T 5 4 V 1 8 t h e C R A B P I I p r o t e i n . T h e b l u e s p e c t r u m i s t h e C D o f Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F i n p r e s e n c e o f 1 0 m M C H A P S O . T h e r e i s n o t o n l y a d e g r a d a t i o n i n b e s t r e t i n a l b i n d i n g . . . . t h e 2 2 0 n m a b s o r b i n g p e a k , b u t a l s o t h e r e l s p e r t u r b a t i o n i n t h e 2 0 0 p r o t e i n w e h a v e n m o r - h e l i c a l r e g i o n . 1 0 8 e n g i n e t p e r f o m i n f o r m ; S C I o u t w h a t i f t h e L N e n g i n e e w a s r e l W i t h t h h y d r O p t h e 1 3 1 — ; S e c o n d S i r - J i g } P E t i n O i 6 1 , a f i l n i C o m p r e d R 1 3 : a n y “ e n g i n e e r e d t h u s f a r , w e m u s t p r o d u c e a b e t t e r P S B f o r m i n g p r o t e i n t o b e a b l e t o p r o p e r l y p e r f o r m t h i s e x p e r i m e n t a n d b e a b l e t o a c t u a l l y d e t e c t a b o u n d r e t i n a l m o l e c u l e . T h e fl u o r e s c e n c e , U V - v i s a n d M A L D I - T O F a s s a y s h a v e p r o v i d e d p o s i t i v e i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e n a t u r e o f t h e r e t i n a l b i n d i n g . U s i n g a l l o f t h i s i n f o r m a t i o n , w e s e t o u t t o p r o d u c e a f e w m o r e C R A B P H p r o t e i n m u t a n t s t h a t w i l l h e l p i n c o n fi r m i n g w h a t t h e b i n d i n g a s s a y s h a v e a l r e a d y l e d u s t o b e l i e v e , t h e r e d s h i f t e d p e a k o b s e r v e d i n t h e U V - v i s i s a r e s u l t o f r e t i n a l P S B f o r m a t i o n . F o r e m o s t , u n e q u i v o c a l p r o o f t h a t t h e L y s i n v o l v e d i n P S B f o r m a t i o n i s t h e e n g i n e e r e d L y s 1 3 2 i n t h e b i n d i n g p o c k e t c o m e s f r o m t w o p r o t e i n m u t a n t s w h e r e t h i s L y s w a s r e m o v e d f r o m t h e b i n d i n g p o c k e t . I n o n e c a s e t h e L y s w a s r e m o v e d a n d r e p l a c e d w i t h t h e o r i g i n a l A r g r e s i d u e ( Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E ) , a n d i n t h e o t h e r , r e p l a c e d w i t h t h e h y d r o p h o b i c r e s i d u e L e u ( R 1 3 2 L : : Y 1 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 E ) . B o t h o f t h e s e p r o t e i n s l o s e t h e l a r g e r e d s h i f t t h a t i s v i s i b l e i n R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : T 5 4 V : : L 1 2 1 E a s w e l l a s t h e s e c o n d p e a k i n t h e M A L D I - T O F r e p r e s e n t a t i v e o f t h e c o v a l e n t c o m p l e x . A n a l y s i s o f t h e r e s u l t s o f t h e b i n d i n g a s s a y s f o r Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E i s f a i r l y s t r a i g h t f o r w a r d . W i t h r e p l a c e m e n t o f t h e A r g r e s i d u e w e e x p e c t t o s e e a n i n c r e a s e i n r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y , w h i c h w e d o , K , = 2 2 0 i 2 8 n M , a s c o m p a r e d t o K ; = 7 7 0 1 6 1 n M f o r R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E . W e h a v e a l s o l o s t s o m e a m o u n t o f r e t i n a l a f fi n i t y d u e t o i n c o r p o r a t i o n o f t h e m o r e h y d r o p h i l i c A r g r e s i d u e , K ; = 5 7 0 i 3 2 n M , a s c o m p a r e d t o K . = 2 0 0 i 8 . 3 n M f o r R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E . A s e x p e c t e d , a l l r e d s h i f t i n g h a s b e e n l o s t a l s o , 3 6 9 n m a s c o m p a r e d t o 4 6 4 n m f o r R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E ( F i g u r e I I - 3 1 a ) . M o s t i m p o r t a n t l y , n e i t h e r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n n o r t h e i n c u b a t i o n e x p e r i m e n t s s h o w a c o v a l e n t l y l i n k e d r e t i n a l m o l e c u l e b y 1 0 9 0 . o A e 0 c . o n o n a b O ) r O n o s b ) O ‘ A S M A L I w i t h I E r e s i d u . e x p e c t e i t h e r l l l L l i d f l ' R e t i n a 4 6 4 m 1 1 a s s e W e e x ; a b s e n c ( h i t ? t o s h i f t . n “ g u n m a x i n C " fi n i a l 1 ' 1 3 4 1 P a u l i i M A L D I - T O F a n a l y s i s ( F i g u r e I I - 3 1 b ) , s u g g e s t i n g t h a t S c h i f f b a s e f o r m a t i o n m u s t b e w i t h t h e e n g i n e e r e d L y s i n t h e b i n d i n g p o c k e t , a n d n o t n o n - s p e c i fi c a l l y t o a n y o t h e r L y s r e s i d u e . T h e s e c o n d o f t h e s e m u t a n t s , R 1 3 2 L : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E , a l s o s h o w s t h e e x p e c t e d l o s s o f S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . N o S c h i f f b a s e i s v i s i b l e b y M A L D I - T O F f r o m e i t h e r r e a c t i o n . R e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y i s s l i g h t l y b e t t e r t h a n t h e c o r r e s p o n d i n g L y s m u t a n t p r o t e i n , K d = 1 8 0 i - 1 4 n M a s e x p e c t e d d u e t o t h e f u r t h e r h y d r o p h o b i c t u n i n g . R e t i n a l a b s o r b a n c e a s i n c u b a t e d w i t h t h i s p r o t e i n l o s e s t h e l a r g e r e d s h i f t a s w a s s e e n a t 4 6 4 n m , b u t i s s t i l l s l i g h t l y r e d s h i f t e d a t 4 0 2 n m . T h e r e i s o n l y t h i s o n e p e a k p r e s e n t ( a s w a s s e e n i n a l l t h e ~ 4 2 0 n m a b s o r b i n g p r o t e i n c o m p l e x e s ) , b u t i t i s m o r e r e d s h i f t e d t h a n w e e x p e c t e d t o s e e f o r a n o n c o v a l e n t c o m p l e x . F r o m t h e M A L D I - T O F a n a l y s i s a n d t h e a b s e n c e o f t h e r e t i n a l b o u n d p r o t e i n p e a k , w e a r e c o n fi d e n t t h a t t h i s 3 0 n m r e d s h i f t i s n o t d u e t o S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . D i s c u s s e d p r e v i o u s l y w a s t h e i d e a t h a t r e t i n a l m a y r e d s h i f t , a s t h e a l d e h y d e , w h e n p l a c e d i n a h y d r o p h o b i c p r o t e i n a c i o u s e n v i r o n m e n t . a b 0 . 0 4 — 8 0 . O 3 « E 0 . 0 2 . - ° 0 0 1 « 0 3 0 0 5 5 0 1 4 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 n m M a s s ( D a ) F i g u r e I I - 3 1 . a ) U V - v i s o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E p r o t e i n c o m p l e x r e v e a l s a m a x i m a l a b s o r b a n c e o f 3 6 9 n m , a n d l o s s o f t h e r e d s h i f t e d p e a k s e e n i n t h e c o r r e s p o n d i n g t e t r a m u t a n t c o n t a i n i n g t h e L y s a t p o s i t i o n 1 3 2 . 3 7 2 n m a n d 4 6 4 n m . b ) R e d u c t i v e a m i n a t i o n o f Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E s h o w s t h e d i s a p p e a r a n c e o f t h e c o v a l e n t c o m p l e x h e r e a s w e l l . T h e o n l y v i s i b l e p e a k i s t h e p r o t e i n p e a k . 1 6 7 8 5 . 4 D a ( c a l c u l a t e d p r o t e i n m a s s = 1 6 7 8 6 . 1 D a ) . 1 1 0 A l t h o u g h i n o t h e r m u t a n t s w e h a v e M A L D I - T O F d a t a i n a t l e a s t o n e o f t h e t w o e x p e r i m e n t s t o c o n fi r m S B f o r m a t i o n , h e r e w e d o n o t , a n d c a n n o t d i s r e g a r d t h e p o s s i b i l i t y o f a r e d s h i f t e d r e t i n a l w i t h o u t c o v a l e n t b i n d i n g . A s i d e f r o m a r e t i n a l b o u n d c r y s t a l s t r u c t u r e , t h e r e i s o n e a d d i t i o n a l p i e c e o f e v i d e n c e w e w o u l d l i k e t o o b t a i n f o r c o m p l e t e c o n fi r m a t i o n t h a t r e t i n a l i s b o u n d t o L y s 1 3 2 . A l t h o u g h w e a r e f a i r l y c o n fi d e n t f r o m t h e p r e v i o u s t w o m u t a t i o n s , p r o t e o l y t i c c l e a v a g e o f t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d s p e c i e s , c o u p l e d w i t h m a s s a n a l y s i s c o u l d f u r t h e r c o n fi r m t h e e x i s t e n c e o f a r e t i n a l m o l e c u l e o n t h e L y s 1 3 2 c o n t a i n i n g p e p t i d e f r a g m e n t . C N B r , w h i c h c l e a v e s a f t e r M e t r e s i d u e s , c o u l d g i v e a m a x i m u m o f fi v e f r a g m e n t s , o n e o f w h i c h w o u l d b e t h e s i n g l e M e t r e s i d u e a t t h e N - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n s e q u e n c e . T r y p s i n , w h i c h c l e a v e s a f t e r A r g a n d L y s r e s i d u e s , c o u l d g i v e a m a x i m u m o f 2 0 f r a g m e n t s , a n d c h y m o t r y p s i n , w h i c h c l e a v e s a f t e r P h e , T y r , a n d T r p r e s i d u e s , c o u l d g e n e r a t e a m a x i m u m o f 1 1 r e s i d u e s . A l l t h r e e p r o t e o l y t i c r e a c t i o n s w e r e u s e d i n a t t e m p t t o c l e a v e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d C R A B P I I a n d i s o l a t e o r d e t e c t a r e t i n a l m o l e c u l e c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o t h e L y s 1 3 2 c o n t a i n i n g f r a g m e n t . C l e a v a g e w i t h C N B r w a s e x t e n s i v e l y s t u d i e d b a s e d o n t h e s m a l l n u m b e r o f e x p e c t e d f r a g m e n t s . S i n c e t h i s w o r k w a s p r i m a r i l y t h e e f f o r t s o f C h r y s o u l a V a s i l e i o u ( M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) , t h e d e t a i l s o f t h e e x p e r i m e n t a l o p t i m i z a t i o n s w i l l n o t b e d i s c u s s e d h e r e . H o w e v e r , i t w i l l b e m e n t i o n e d t h a t m a n y o f t h e e x p e c t e d f r a g m e n t s c o u l d b e f o u n d i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e a s d e t e c t e d b y m a s s a n a l y s i s h o w e v e r , t h e p e p t i d e f r a g m e n t c o n t a i n i n g L y s 1 3 2 w a s n o t d e t e c t a b l e i n a n y o f t h e c l e a v a g e r e a c t i o n s , p r o b a b l y d u e t o i t s h y d r o p h o b i c n a t u r e . F o r c o m p l e t e c o n fi r m a t i o n o f t h e r e t i n a l b i n d i n g , t h e r e a c t i o n a n d d e t e c t i o n c o n d i t i o n s o f t h e c l e a v a g e r e a c t i o n s m u s t b e o p t i m i z e d , a s t h i s m e t h o d m a y b e t h e b e s t 1 1 1 h o p e i C 0 1 ' l l l l ’ 1 1 - r e d u c t i w i t h o u b e i n g L a b l e t r e x p e n s s e q u e n t h a n f 1 1 4 r e s l C n l c l a l 0 f p r o c V e r i fi c ; m a d e 1 C o n t a i n p r o t e i n P r o t o n ; P S B R 1 3 2 } , - R 1 3 2 } f r o m h o p e a t a c h i e v i n g t h i s c o n fi r m a t i o n i n a t i m e l y m a n n e r . O t h e r m e a n s i n c l u d e t h e c o n t i n u i n g q u e s t f o r a r e t i n a l b o u n d c r y s t a l s t r u c t u r e , a n d p o s s i b l e s e q u e n c i n g o f t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d c o m p l e x . S e q u e n c i n g w i l l p r o b a b l y n o t b e a t t e m p t e d , a t l e a s t n o t w i t h o u t e x h a u s t i v e a t t e m p t s a t o t h e r m e t h o d s , d u e t o t h e h i g h c o s t a n d u n c e r t a i n t y o f b e i n g a b l e t o a c t u a l l y d e t e c t t h i s r e s i d u e . N - t e r m i n a l s e q u e n c i n g , w h i l e i s k n o w n t o b e a b l e t o s e q u e n c e m o r e t h a n 1 0 0 r e s i d u e s , i s c h a r g e d p e r a m i n o a c i d a n d w i l l v e r y e x p e n s i v e . F r o m t h e N - t e r m i n u s o f C R A B P I I , t h e L y s i s 1 3 4 a m i n o a c i d s i n . C - t e r r n i n a l s e q u e n c i n g i s s t i l l q u i t e e x p e n s i v e , a n d i s n o t r o u t i n e l y p e r f o r m e d . A c q u i s i t i o n o f m o r e t h a n fi v e a m i n o a c i d s c a n n o t b e g u a r a n t e e d . a n d f r o m t h e C - t e r m i n u s , t h e d e s i r e d L y s i s 1 4 r e s i d u e s i n . A s p r e v i o u s w o r k s e e m s t o s u g g e s t , p r e c i s e p o s i t i o n i n g o f a c o u n t e r a n i o n i s c r u c i a l f o r m a i n t a i n i n g t h e p r o t o n a t e d s t a t e o f t h e S c h i f f b a s e . A l t h o u g h t h e o n l y m e a n s o f p r o o f f o r t h e P S B s p e c i e s i s t h r o u g h t h e a b s o r b a n c e a s s e e n i n t h e U V - v i s , f o r f u r t h e r v e r i fi c a t i o n t h a t G l u 1 2 1 i s e s s e n t i a l f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e P S B , s e v e r a l m u t a n t s w e r e m a d e t h a t r e m o v e t h e c o u n t e r a n i o n a n d r e p l a c e i t w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g a m i d e c o n t a i n i n g a m i n o a c i d . T h i s w a s d o n e t o m i m i c p r e v i o u s w o r k d o n e w i t h r h o d o p s i n p r o t e i n s , d e s c r i b e d i n C h a p t e r 1 , t h a t s h o w t h i s t y p e o f m u t a t i o n r e s u l t s i n l o s s o f t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e , b u t s t i l l m a i n t a i n s S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . F o u r p r o t e i n s w e r e m a d e t o t e s t t h e n a t u r e o f t h e c o u n t e r a n i o n r e l a t i o n s h i p t o P S B m a i n t e n a n c e , t w o w i t h G l n , R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 Q a n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 Q : : T 5 4 V a n d t w o w i t h A s n , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 N a n d R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 N : : T 5 4 V . T h e r e s u l t s f r o m b i n d i n g a s s a y s f o r t h e s e f o u r p r o t e i n s a r e l i s t e d i n T a b l e I I - 3 . T h e s p a t i a l 1 1 2 ) T a b l E M I r ) U 9 3 o r _ n I Q a O n e n t fi fl n o l P F 0 1 0 : r e s u h I n a h n r e S t i l l ~ 4 6 0 C O u n t C O V a h r e 3 1 1 1 1 : ” ! ‘ 9 ” . ' 9 T a b l e I I - 3 . B i n d i n g A s s a y R e s u l t s P r o b i n g t h e I m p o r t a n c e o f t h e C o u n t e r A n i o n E n t r y P r o t e i n R A K d ( n M ) ‘ R t K d ( n M ) " R t A m , ( n m ) ° M A L D I - T O P “ l n c u b . R e d . A m . 1 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : 2 4 0 e 2 2 5 3 0 e 4 4 3 6 8 Y e s Y e s R 1 1 1 L : : L 1 2 1 Q 2 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : 3 0 5 0 i 2 4 0 1 2 7 0 1 4 9 3 5 7 , 4 6 7 Y e s Y e s R 1 1 1 L : : L 1 2 1 N 3 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : 1 7 2 0 . t 9 4 6 0 1 i 6 6 4 0 8 Y e s Y e s R 1 1 1 L : : L 1 2 1 e r T 5 4 V 4 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : 4 2 0 i 3 4 1 2 8 t 1 5 3 7 0 , 4 6 2 Y e s Y e s R 1 1 1 L : : L 1 2 1 N : : T 5 4 V D i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r r e t i n o i c a c i d a s d e t e r m i n e d b y fl u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y . D i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r a l l - t r a n s - r e t i n a l a s d e t e r m i n e d b y fl u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y . R e t i n a l m a x i m a l a b s o r b a n c e w h e n i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n . M A L D I - T O F i n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n e x p e r i m e n t s . Y e s i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f a c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l m o l e c u l e . o r i e n t a t i o n o f G l u v s . G l n a n d A s p v s . A s n r e m a i n s t h e s a m e , b u t i n t h e s e m u t a n t s w e a r e r e m o v i n g t h e n e g a t i v e c h a r g e w h i c h c o u l d b e t h e s o u r c e o f s t a b i l i z a t i o n f o r t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . T h e G l u t o G l n m u t a t i o n s ( E n t r i e s 1 a n d 3 , T a b l e l I - 3 ) s h o w t h e m o s t i n t r i g u i n g r e s u l t s . T h i s s i n g l e a m i n o a c i d m u t a t i o n h a s r e s u l t e d i n l o s s o f t h e r e d s h i f t , y e t m a i n t e n a n c e o f t h e S c h i f f b a s e a s v i s i b l e v i a b o t h M A L D I - T O F r e a c t i o n s , m i m i c k i n g t h e r e s u l t s s e e n w i t h r h o d 0 p s i n E 1 1 3 Q m u t a t i o n s ( F i g u r e I I - 3 2 ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h e ~ 4 6 0 n m s p e c i e s i s a P S B w h o s e e x i s t e n c e d e p e n d s h e a v i l y o n t h e p r e s e n c e o f t h e c o u n t e r a n i o n , a n d b y r e m o v i n g t h i s c o u n t e r a n i o n , w e l o s e t h e p r o t o n a t e d s t a t e o f t h e c o v a l e n t c o m p l e x . T h e c o r r e s p o n d i n g m u t a t i o n s w i t h A s p t o A s n m u t a t i o n s d o n o t e x h i b i t a s c l e a r r e s u l t s a s t h o s e o b s e r v e d a b o v e ( E n t r i e s 2 a n d 4 , T a b l e I I - 3 ) . B o t h o f t h e s e p r o t e i n s s t i l l 1 1 3 m a i n t a i n t h e e x i s t e n c e o f s o m e a m o u n t o f P S B a s i n d i c a t e d t h r o u g h U V - v i s . S o m e E 1 1 3 Q r h o d o p s i n m u t a n t s a l s o d i d n o t c o m p l e t e l y l o s e t h e p r o t o n a t e d f o r m o f t h e S c h i f f b a s e c o m p l e x ( s e e C h a p t e r I f o r d i s c u s s i o n ) . 5 1 O n e p l a u s i b l e r e a s o n f o r t h e c o n t i n u e d e x i s t e n c e o f s o m e P S B c o u l d b e t h a t n o t a l l o f t h e p r o t e i n c o n t a i n s t h e a m i d e a m i n o a c i d . T h e d i f f e r e n c e i n m a s s i s t o o s m a l l t o t e l l t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e c a r b o x y l i c a c i d m o i e t y v e r s u s t h e a m i d e f u n c t i o n a l i t y . G r a n t e d , w e h a v e D N A s e q u e n c e v e r i fi c a t i o n f o r t h e a m i d e m u t a t i o n , b u t w e c a n n o t r u l e o u t a u t o h y d r o l y s i s o f t h e a m i d e b a c k t o t h e c a r b o x y l i c a c i d . F i n a l l y , a p r o t e i n m u t a n t w a s p r o d u c e d w i t h o u t t h e c o u n t e r a n i o n a t a l l , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : T 5 4 V . W e a l s o e x p e c t e d t o s e e a l o s s o f r e d s h i f t i n g i n t h i s p r o t e i n a s w e l l . T h i s p r o t e i n d o e s d i s p l a y a r e l a t i v e l y g o o d b i n d i n g a f fi n i t y w i t h r e t i n a l ( K ; = 8 4 i 1 2 n M ) a s e x p e c t e d w i t h t h e h y d r o p h o b i c n a t u r e o f t h e b i n d i n g c a v i t y . H o w e v e r , a s s e e n i n t h e l a s t t w o m u t a t i o n s , r e m o v a l o f t h e c o u n t e r a n i o n d o e s n o t a b 0 . 0 6 ~ 8 0 . 0 5 ‘ g 0 . 0 4 . e 0 . 0 3 ~ 8 a 0 . 0 2 - < 0 . 0 1 ~ 0 I I T fl 1 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 1 5 0 0 0 1 7 0 0 0 1 9 0 0 0 n m D a l t o n s F i g u r e 1 1 - 3 2 . a ) C o r r e c t e d U V - v i s s p e c t r a o f t h e p e n t a m u t a n t / r e t i n a l c o m p l e x , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V . s h o w s e x i s t e n c e o f t w o p e a k s , 3 7 8 n m a n d 4 5 5 n m . R e p l a c e m e n t o f t h e c o u n t e r a n i o n w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g a m i d e f u n c t i o n a l i t y , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 Q : : T 5 4 V . c a u s e s e l i m i n a t i o n o f t h e r e d s h i f t e d p e a k , a n d o n l y o n e p e a k i s n o w p r e s e n t a t 4 0 8 n m . b ) R e d u c t i v e a m i n a t i o n o f t h e p r o t e i n s t i l l s h o w s e v i d e n c e f o r t h e S c h i f f b a s e e x i s t e n c e d e s p i t e d e p r o t o n a t i o n . P r o t e i n M + = 1 6 7 5 4 . 1 D a ( c a l c u l a t e d 1 6 7 5 5 . 2 D a ) a n d S B M + = 1 7 0 2 8 . 1 D a ( d i f f e r e n c e o f 2 7 4 m a s s u n i t s , c a l c u l a t e d d i f f e r e n c e i s 2 6 8 D a ) . 1 1 4 c o m p l f o n n a t r e a c t l t a n i o n p r e s e n C O U I l l i a n d e \ t h a t 1 1 h y d r o ; p r o b e b e a F d e t e n i , P F O I e l a b S O r i a c i d / b c o m p l e t e l y e l i m i n a t e t h e r e d s h i f t e d s p e c i e s ( 3 9 1 n m a n d 4 5 5 n m ) a n d t h e c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n b e t w e e n t h e p r o t e i n a n d c h r o m o p h o r e i s v i s i b l e i n b o t h M A L D I - T O F r e a c t i o n s . A g a i n , t h e f a c t t h a t t h e r e d s h i f t i s n o t c o m p l e t e l y l o s t b y r e m o v i n g t h e c o u n t e r a n i o n d o e s n o t d i s c o u n t t h e p r o b a b i l i t y o f t h i s b e i n g a P S B . H a v i n g t h e c o u n t e r a n i o n p r e s e n t d o e s h e l p t o i n c r e a s e t h e p K a o f t h e P S B . I n a d d i t i o n , o n l y t h e p r o t e i n w i t h t h e c o u n t e r a n i o n e x h i b i t s s t o i c h i o m e t r i c b i n d i n g w i t h r e t i n a l . R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : T 5 4 V i s t h e m o s t h y d r o p h o b i c p r o t e i n w e h a v e m a d e , a n d e v e n w i t h o u t a c o u n t e r a n i o n i t e x h i b i t s a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f r e d s h i f t i n g . G i v e n t h a t p o s i t i o n 1 2 1 i s p r e s u m a b l y t h e b e s t p l a c e f o r t h e c o u n t e r a n i o n , a d d i t i o n a l h y d r o p h o b i c m u t a t i o n s s h o u l d b e a d d e d t o R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V t o p r o b e a p o s s i b l e i n c r e a s e i n s t a b i l i t y . A l t h o u g h t h e a b o v e m e n t i o n e d d a t a a l l s u g g e s t t h a t t h e r e d s h i f t e d c o m p l e x m a y b e a P S B w i t h L y s 1 3 2 , t h e s e n e x t f e w e x p e r i m e n t s w e r e d o n e t o h e l p i n u n e q u i v o c a l l y d e t e r m i n i n g t h a t w e a r e i n d e e d f o r m i n g a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e b e t w e e n r e t i n a l a n d t h e p r o t e i n c l o n e a t t h e e n g i n e e r e d L y s p o s i t i o n 1 3 2 . F i r s t , t o p r o v e t h a t t h e 4 5 5 n m a b s o r b i n g s p e c i e s d e t e c t e d b y U V - v i s i s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e w e p e r f o r m e d a s i m p l e a c i d / b a s e t i t r a t i o n . A t p H = 7 , t h e r e e x i s t s a m i x t u r e o f t w o s p e c i e s , o n e a b s o r b i n g a t 4 5 5 n m ( p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ) , t h e o t h e r a t 3 7 0 n m ( f r e e a l d e h y d e o r u n p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ) . A d d i t i o n o f a c i d t o t h e m i x t u r e d i d n o t f o r c e t h e 3 7 0 n m s p e c i e s t o r e d s h i f t , h o w e v e r , i f t h e m i x t u r e w a s t r e a t e d w i t h b a s e fi r s t , b o t h s p e c i e s s h i f t e d t o 3 6 6 n m ( S B ) a n d c o u l d t h e n a l l b e f o r c e d t o a r e d s h i f t e d a b s o r b a n c e o f 4 5 0 ( P S B ) n m . A c i d / b a s e t i t r a t i o n s o f t h i s s a m p l e c a n i n t e r c o n v e r t t h e 3 6 6 n m a n d 4 5 0 n m p e a k s r e p e a t e d l y ( F i g u r e I I - 3 3 ) . W e k n o w t h a t t h i s 4 5 0 n m p e a k i s d u e t o s p e c i fi c S c h i f f b a s e f o r m a t i o n w i t h t h e 1 1 5 L y s i n t h e b i n d i n g p o c k e t , a s a s o l v e n t e x p o s e d P S B h a s b e e n f o u n d t o a b s o r b a t 4 4 5 n m b y d e n a t u r a t i o n o f t h e m i x t u r e w i t h S D S . F r o m t h e a b o v e e x p e r i m e n t , a t p H = 7 t h e r e i s a p p r o x i m a t e l y a 1 : 1 m i x t u r e o f S B z P S B , t h u s w e w o u l d e x p e c t t h e p K , , o f t h e P S B t o b e a r o u n d 7 . O u r a t t e m p t s a t m e a s u r i n g t h i s p K a p r o d u c e s i m i l a r r e s u l t s . F o l l o w i n g s i m i l a r p r o c e d u r e s t o d e t e r m i n e t h e p K a o f t h e P S B f o r r h o d o p s i n , t i t r a t i o n o f t h e p r o t e i n s o l u t i o n w a s p e r f o r m e d a n d t h e a b s o r b a n c e ( A 5 0 0 ) v e r s u s t h e p H w a s p l o t t e d ( F i g u r e I I - 3 4 ) . F i t t i n g t h e d a t a t o a p o l y n o m i a l ( 3 r d p o w e r ) y i e l d e d a p K a = 6 . 5 f o r t h e P S B . T h i s i s a r a t h e r l o w v a l u e f o r t h e p K a i n c o m p a r i s o n w i t h t h e p K a o f P S B s i n v a r i o u s r h o d o p s i n p r o t e i n s . M o s t r h o d o p s i n s h a v e a P S B p K a e s t i m a t e d t o b e g r e a t e r t h a n 1 0 . F o r b o v i n e r h o d o p s i n , i t i s s u g g e s t e d t o b e g r e a t e r t h a n 1 6 , a n d i s k n o w n t o b e a t l e a s t g r e a t e r t h a n 1 2 5 2 ' 5 4 M e a s u r e m e n t o f t h e p K a o f b o v i n e r h o d o p s i n w a s a t t e m p t e d b y s i m i l a r e x p e r i m e n t s a s j u s t d e s c r i b e d f o r t h e C R A B P I I p K a d e t e r m i n a t i o n . T h e P S B w a s f o u n d t o b e u n p e r t u r b e d a t p H r a n g e s u p t o 1 1 , b u t s i g n i fi c a n t p r o t e i n d e n a t u r a t i o n l i m i t e d t i t r a t i o n t o h i h e r H v a l u e s . 5 5 A l t e r n a t i v e l , K “ v a l u e s w e r e e s t i m a t e d u s i n 8 P y P g : 3 4 ? ? — 8 — 2 . p H = 1 0 c - 3 . H = 8 g P g - — 4 . p H = 4 4 . - - ~ — 5 . R e t u r n t o p H = 1 0 - — - 6 . R e t u r n t o p H = 4 n m F i g u r e I I - 3 3 . A c i d - b a s e t i t r a t i o n o f t h e R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V / r e t i n a l c o m p l e x s h o w s i n t e r c o n v e r s i o n b e t w e e n t h e S B ( 3 6 6 n m ) a n d t h e P S B ( 4 5 0 n m ) . 1 1 6 fl u o r i n a t e d r e t i n a l a n a l o g s . 5 6 T h e s e fl u o r i n a t e d d e r i v a t i v e s t y p i c a l l y p r o d u c e p K a v a l u e s a p p r o x i m a t e l y 5 . 5 u n i t s l o w e r t h a n t h e n o n - fl u o r i n a t e d a n a l o g . T r e a t m e n t o f b o v i n e r h o d o p s i n w i t h l l - c i s - 1 3 - t r i fl u o r o m e t h y l - r e t i n a l s t i l l p r o d u c e d a r e d s h i f t e d a n a l o g t h a t w a s s t a b l e t o p H 1 1 . I f t h i s c h r o m o p h o r e i s 5 . 5 u n i t s l o w e r t h a n t h e c o r r e s p o n d i n g n o n - fl u o r i n a t e d d e r i v a t i v e ( 1 l - c i s — r e t i n a l ) , t h e p K a o f b o v i n e r h o d o p s i n i s a g a i n e s t i m a t e d t o b e ~ 1 6 . 5 . 5 5 I n t e r e s t i n g l y h o w e v e r . a s i n g l e a m i n o a c i d m u t a t i o n i n b o v i n e r h o d o p s i n r e d u c e s t h e p K a o f t h e P S B f r o m a b o v e 1 6 t o a p p r o x i m a t e l y 6 ( E 1 1 3 Q ( p K , l = 6 . 0 ) , E 1 1 3 N ( p K , = 6 . 7 ) , a n d E 1 1 3 A ( p K a = 5 . 7 ) ) , 5 7 w h i c h a t t e s t s f o r t h e f a c t t h a t p r e c i s e c o u n t e r a n i o n p l a c e m e n t i s c r i t i c a l f o r P S B e x i s t e n c e . O t h e r o p s i n P S B p K , v a l u e s t h a t h a v e b e e n m e a s u r e d i n c l u d e , o c t o p u s r h o d o p s i n ( 1 0 . 4 ) , ” ‘ 5 ” g e c k o c o n e o p s i n ( 9 . 9 ) , 5 9 a n d a p a r t i a l l y t i t r a t a b l e b a c t e r i o r h o d o p s i n ( ~ 1 3 . 3 ) . ( ’ n T h e r e l a t i v e l y l o w v a l u e f o r t h e o c t o p u s p K a i s t h o u g h t t o b e b e c a u s e o f t h e c h a n g e a t p o s i t i o n 1 1 3 . I n v e r t e b r a t e p i g m e n t s , t h i s i s t h e p o s i t i o n f o r t h e c o u n t e r a n i o n , G l u , h o w e v e r . i n i n v e r t e b r a t e p i g m e n t s t h i s r e s i d u e i s r e p l a c e d b y t h e n e u t r a l T y r f ’ l I n c i d e n t a l l y , t h i s d o e s n o t e x p l a i n t h e l o w v a l u e o b s e r v e d f o r g e c k o o p s i n a s i t h a s G l u a b 0 . 0 5 ‘ 0 . 0 4 1 A b s o r b a n c e a t 5 0 0 n m O O N p H F i g u r e I I - 3 4 . a ) T h e r e t i n a l i n c u b a t e d R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V c o m p l e x w a s f o r c e d c o m p l e t e l y t o t h e 4 6 4 n m . T h e m i x t u r e w a s t h e n t i t r a t e d w i t h b a s e a n d f o r c e d c o m p l e t e l y t o t h e 3 6 6 n m a b s o r b i n g s p e c i e s . b ) P l o t t i n g o f t h e a b s o r b a n c e a t 5 0 0 n m v e r s u s t h e p H o f t h e s a m p l e s r e v e l s a p K a o f ~ 6 5 f o r t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . 1 1 7 p o s i t i o n 1 1 3 . I n v e r t e b r a t e p i g m e n t s , t h i s i s t h e p o s i t i o n f o r t h e c o u n t e r a n i o n , G l u , h o w e v e r , i n i n v e r t e b r a t e p i g m e n t s t h i s r e s i d u e i s r e p l a c e d b y t h e n e u t r a l T y r . 6 | I n c i d e n t a l l y , t h i s d o e s n o t e x p l a i n t h e l o w v a l u e o b s e r v e d f o r g e c k o o p s i n a s i t h a s G l u 1 1 3 . T h e r e h a v e b e e n m a n y p l a u s i b l e r e a s o n s s u g g e s t e d f o r t h e v e r y h i g h P S B p K a v a l u e s , m o s t i n v o l v i n g t h e p o s s i b l e p o l a r n a t u r e o f t h e P S B e n v i r o n m e n t m ‘ 6 3 S t a b i l i z a t i o n c o u l d a l s o b e a t t r i b u t e d t o h y d r o g e n b o n d i n g w i t h n e a r b y p r o t e i n r e s i d u e s a n d t h e c o u n t e r a n i o n . " 4 A p r e c i s e a r r a n g e m e n t o f w a t e r m o l e c u l e s i n t h e b i n d i n g p o c k e t t h a t e f f e c t i v e l y d i r e c t s a h y d r o g e n b o n d i n g n e t w o r k c a n a l s o n o t b e r u l e d o u t . “ O t h e r t h e o r i e s i n c l u d e s t a b i l i z a t i o n d u e t o p r e c i s e o r i e n t a t i o n o f t h e S B w i t h t h e c o u n t e r a n i o n 6 6 , 6 7 t o p r o m o t e e f fi c i e n t p r o t o n t r a n s f e r , a n d d i f f e r i n g d e g r e e s o f t w i s t i n g a r o u n d t h e C 1 4 - C 1 5 s i n g l e b o n d t h a t m a y p r o m o t e s t a b i l i z i n g H - b o n d i n t e r a c t i o n s . 6 8 T h e r e a r e d i f f e r e n t p o s s i b l e r o u t e s t o f i n e t u n e t h e p K a o f t h e P S B . F i r s t , f u r t h e r t u n i n g o f t h e a m i n o a c i d s i n t h e b i n d i n g p o c k e t , i n c l u d i n g h y d r o p h o b i c i t y c h a n g e s a n d r e p o s i t i o n i n g o f t h e c o u n t e r a n i o n c o u l d p o t e n t i a l l y i n c r e a s e t h e s t a b i l i t y a n d p K a o f t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . T h i s r o u t e t o a c h i e v i n g t h e u l t i m a t e r h o d o p s i n m i m i c i s c u r r e n t l y o n g o i n g i n t h e l a b o r a t o r y . O p t i o n a l l y , m u t a t i o n s o n t h e s u r f a c e o f t h e p r o t e i n m a y l e a d t o a n i n c r e a s e d P S B p K a v a l u e . F i g u r e 1 1 - 3 5 s h o w s a V a n d e r W a a l s s t r u c t u r e o f t h e s u r f a c e o f t h e C R A B P I I p r o t e i n . T h e r e i s a h o l e i n t h e s u r f a c e o f t h e p r o t e i n t h a t l i e s a b o v e t h e b i n d i n g c a v i t y a n d d i r e c t l y o v e r t h e t o p o f t h e r e g i o n w h e r e t h e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n o c c u r s . T h e h o l e i s a p p r o x i m a t e l y 6 A i n d i a m e t e r , a n d c o u l d p o t e n t i a l l y a l l o w f o r w a t e r a n d / o r o t h e r i o n s a c c e s s t o t h e c a v i t y , r e d u c i n g t h e i s o l a t i o n o f t h e S B f r o m t h e b u l k s o l v e n t , a n d t h u s n o t e f f e c t i v e l y s h i e l d i n g t h e S B . 1 1 8 A t t e m p t s t o c l o s e t h e g a p s e e n h e r e i n v o l v e d m u t a t i o n a t r e s i d u e 6 1 w i t h b u l k i e r a m i n o a c i d s t o p r o d u c e t h e h e x a - m u t a n t s R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V : : T 6 1 E a n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E F i g u r e I I - 3 5 . A v i e w o f t h e V a n d e r W a a l s c o n t a c t s o n ” T 5 4 V “ T 6 1 F N e i t h e r o f t h e s e t h e s u r f a c e o f C R A B P I I r e v e a l s a h o l e t h a t o v e r l o o k s t h e b i n d i n g c a v i t y a n d s i t s d i r e c t l y o v e r t h e w h e r e S c h i f f m u t a t i o n s h a v e m u c h e f f e c t o n b a s e f o r m a t i o n w i l l o c c u r . a n y o f t h e r e t i n a l b i n d i n g a s s a y s , fl u o r e s c e n c e , U V - v i s o r M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s ( s e e A p p e n d i x f o r d a t a c u r v e s ) . A l l t h r e e p r o t e i n s h a v e a r e t i n a l K ; < 1 0 0 n M , e x h i b i t 2 p e a k s i n t h e U V - v i s ( ~ 3 7 0 n m a n d ~ 4 6 0 n m ) , a n d d i s p l a y p o s i t i v e c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n i n b o t h M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s . F i g u r e I I - 3 6 s h o w s t h e U V — v i s c u r v e s f o r t h e s e t w o m u t a n t s a s w e l l a s t h e R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V C R A B P I I m u t a n t a t p H = 7 . T h e r e i s a p p r o x i m a t e l y a 1 : 1 m i x t u r e o f t w o s p e c i e s i n t h e p e n t a m u t a n t s p e c t r a , g i v i n g a n a p p r o x i m a t e p K a ~ 6 . 5 f o r t h e P S B i n t h i s p r o t e i n . F o r a n i m p r o v e m e n t a n d i n c r e a s e i n t h e p K a o f t h e P S B w e e x p e c t t o s e e a n i n c r e a s e i n t h e a m o u n t o f r e d s h i f t e d p e a k p r e s e n t a t p H = 7 . A s c a n b e n o t i c e d i n F i g u r e I I - 3 6 , t h e r e i s n o s i g n i fi c a n t c h a n g e i n t h e d i s t r i b u t i o n b e t w e e n t h e t w o s p e c i e s w i t h t h e t w o n e w h e x a m u t a n t s . M u t a t i o n a t t h e s u r f a c e r e s i d u e 6 1 h a s n o e f f e c t o n r e t i n a l b i n d i n g a b i l i t i e s . F u r t h e r e f f o r t s a r e n e e d e d , e i t h e r b y f u r t h e r m u t a t i o n s o n t h e s u r f a c e o f t h e p r o t e i n i n a t t e m p t s t o c l o s e t h e h o l e , o r 1 1 9 e c n a b r o s b A f u r t h e r m u t a t i o n s i n t h e b i n d i n g c a v i t y , t o i n c r e a s e t h e P S B ’ s p K a v a l u e o p t i m a l l y t o a b o v e 1 0 f o r u s e a s a r h o d o p s i n m i m i c a n d f o r p r o b i n g t h e f a c t o r s r e s p o n s i b l e f o r w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n . 0 . 0 5 0 . 0 4 0 . 0 3 0 . 0 2 0 . 0 1 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 n m F i g u r e I I - 3 6 . U V - v i s c u r v e s o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d p r o t e i n c o m p l e x e s R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l l 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V , R 1 3 2 K : : 1 " 1 3 4 1 3 ' : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 - 1 V : : ' l " 6 1 E . a n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l l 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V : : T 6 1 F a t p H = 7 . A t t e m p t s a t c l o s i n g t h e h o l e o n t h e s u r f a c e o f t h e p r o t e i n d i d n o t p r o d u c e a s t a b i l i z a t i o n o f P S B a n d i n c r e a s e i n t h e a m o u n t o f t h e r e d s h i f t e d s p e c i e s . 1 2 0 H . P r o b i n g a n A l t e r n a t e P o s i t i o n f o r L y s i n e I n a d d i t i o n t o i n c o r p o r a t i n g t h e L y s a t p o s i t i o n 1 3 2 , w e a l s o p r o b e d t h e p o s s i b i l i t y o f h a v i n g t h e L y s a t p o s i t i o n 1 3 4 g i v e n t h a t t h i s r e s i d u e i s t h e c l o s e s t t o t h e r e t i n a l c a r b o n y l c a r b o n . L y s a t p o s i t i o n 1 3 4 w i l l a p p r o a c h t h e c a r b o n y l i n a d i f f e r e n t t r a j e c t o r y t h a n L y s a t p o s i t i o n 1 3 2 . L y s 1 3 4 a p p r o a c h e s i n a m o r e h e a d - o n t r a j e c t o r y , w h i l e L y s 1 3 2 a p p r o a c h e s f r o m t h e p l a n e p e r p e n d i c u l a r t o t h e c h r o m o p h o r e . U t i l i z i n g k n o w l e d g e g a i n e d t h r o u g h p r e v i o u s m u t a g e n e s i s a n d b i n d i n g s t u d i e s , o u r a t t e m p t s a t d e s i g n i n g a n e f fi c i e n t r h o d o p s i n m i m i c w i t h L y s 1 3 4 i n c l u d e d h y d r o p h o b i c t u n i n g a n d p r o b i n g f o r a n e f f e c t i v e p o s i t i o n f o r t h e c o u n t e r a n i o n . T h e s i n g l e C R A B P I I m u t a n t Y 1 3 4 K r e m o v e s t h e h y d r o g e n b o n d i n g p h e n o l i c a m i n o a c i d a n d a d d s a n a d d i t i o n a l p o s i t i v e c h a r g e t o t h e b i n d i n g p o c k e t t h r o u g h t h e i n t r o d u c t i o n o f a L y s r e s i d u e ( F i g u r e 1 1 - 3 7 ) . A s c o m p a r e d t o t h e R 1 3 2 K s i n g l e m u t a n t , r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y i s a n o r d e r o f m a g n i t u d e w o r s e ( 6 3 0 n M v e r s u s 6 5 n M f o r R 1 3 2 K , E n t r y 1 . T a b l e I I — 4 ) . T h i s r e s u l t i s a l i t t l e s u r p r i s i n g g i v e n t h a t t h e p o s i t i v e l y c h a r g e d A r g r e s i d u e s , w h i c h a r e b e l i e v e d t o b e t h e r e a s o n f o r m a i n t a i n i n g b i n d i n g o f t h e F i g u r e I I - 3 7 . S t e r e o v i e w o f C R A B P I I Y 1 3 4 K w i t h A r g 1 3 2 , A r g 1 1 1 , L e u 1 2 1 a n d T h r 5 4 a l s o s h o w n . F r o m p o s i t i o n 1 3 4 , L y s i s 4 . 1 A f r o m t h e c a r b o n y l o f r e t i n a l . 1 2 1 n e g a t i v e l y c h a r g e d r e t i n o i c a c i d , a r e s t i l l i n t a c t . T h e c h a r g e r e p u l s i o n d u e t o i n c o r p o r a t i o n o f t h e p r e s u m a b l y p o s i t i v e l y c h a r g e d L y s , c o u p l e d w i t h t h e t w o i n t a c t p o s i t i v e l y c h a r g e d A r g r e s i d u e s , m a y f o r c e a d e p r e s s i o n o f t h e p K a o f t h e l e s s a c i d i c a m i n o a c i d . H a v i n g b o t h a n A r g a n d a L y s i n c l o s e p r o x i m i t y t o e a c h o t h e r i n t h e b i n d i n g p o c k e t m a y r e d u c e t h e p K a o f t h e L y s a n d f o r c e i t t o r e m a i n n o n - p r o t o n a t e d . W i t h t h e s i n g l e m u t a n t Y 1 3 4 K h o w e v e r , r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y r e m a i n s u n a c c e p t a b l y l o w ( 5 7 0 n M ) , a n d n o S c h i f f b a s e w a s d e t e c t a b l e b y M A L D I - T O F . S t i l l u t i l i z i n g t h e t h e o r y t h a t t w o p o s i t i v e l y c h a r g e d r e s i d u e s i n c l o s e p r o x i m i t y t o e a c h o t h e r m a y f o r c e o n e t o r e m a i n n o n - p r o t o n a t e d , t h e d o u b l e l y s i n e m u t a n t Y 1 3 4 K : : R l 3 2 K w a s p r e p a r e d ( E n t r y 2 , T a b l e I I - 4 ) . T h i s A r g t o L y s m u t a t i o n ( R t l a m = 3 7 4 n m , R t K , = 2 7 0 : t 1 0 n M , R A K d = 6 6 0 i 2 5 n M ) r e s u l t s i n l o s s o f r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y c o m p a r e d t o t h e p r e v i o u s s i n g l e m u t a n t R 1 3 2 K ( R t k w = 3 7 0 n m , R t K d = 2 8 0 : 1 : 1 7 n M , R A K d = 6 5 i 1 4 n M ) , h o w e v e r , n o c h a n g e i n r e t i n a l b i n d i n g a b i l i t y w a s o b s e r v e d . A l t h o u g h t h e r e i s s t i l l n o r e d s h i f t i n t h e U V - v i s o f t h e r e t i n a l / p r o t e i n c o m p l e x , S c h i f f b a s e f o r m a t i o n w a s d e t e c t e d i n b o t h t h e i n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s . T h e s e r e s u l t s a l s o m i m i c w h a t w a s s e e n w i t h R 1 3 2 K . T h e b i n d i n g p o c k e t o f t h e Y 1 3 4 F : : R 1 3 2 K C R A B P I I p r o t e i n i s v e r y h y d r o p h i l i c n e a r t h e S B r e g i o n , w i t h t w o L y s r e s i d u e s a n d a n A r g r e s i d u e . I t i s s o m e w h a t s u r p r i s i n g t h a t t h e r e t i n a l b i n d i n g a f f i n i t y i s d o w n t o 2 7 0 n M a n d t h a t S B f o r m a t i o n d o e s o c c u r . H o w e v e r , t h e l a c k o f a r e d s h i f t i n t h e U V - v i s i m p l i e s f u r t h e r m a n i p u l a t i o n o f t h e b i n d i n g p o c k e t i s r e q u i r e d t o o b t a i n p r o t o n a t i o n o f t h e S c h i f f b a s e . T o a c h i e v e t h i s , w e b e g a n t o i n c o r p o r a t e s o m e o f t h e a m i n o a c i d s t h a t h a d p r e v i o u s l y s h o w n i m p r o v e m e n t s . 1 2 2 » ! ' 9 9 - 0 . T a b l e I I - 4 . B i n d i n g A s s a y s P r o b i n g t h e E f fi c a c y o f L y s i n e a t P o s i t i o n 1 3 4 . E n t r y P r o t e i n R A K , ( n M ) a R t K , m M ) " R t k m , ( n m ) ° M A L D I - T O F “ I n c u b . R e d . A m . 1 Y 1 3 4 K 6 3 0 e 2 0 5 7 0 1 - 2 9 3 7 0 N o N o 2 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 K 6 6 0 e 2 5 2 7 0 s 1 0 3 7 4 Y e s Y e s 3 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F 1 8 0 : 7 . 3 7 8 : 1 1 4 1 5 N o N o 4 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L 8 0 0 z 1 9 3 4 0 2 1 6 4 3 2 Y e s N o 5 Y l 3 4 K : : R l 3 2 F : : 5 7 0 e 2 6 7 . 9 r . 7 . 2 4 1 5 Y e s N o R 1 1 1 L 6 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 F 2 : 1 0 0 0 x 5 1 2 2 0 i 1 6 3 6 4 Y e s Y e s R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E 7 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 F z z 1 2 0 x 1 0 4 1 i 6 . 6 4 3 4 Y e s Y e s R 1 1 1 L : : T S 4 E 8 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L z z 3 3 0 0 i 2 6 4 2 1 0 t 7 . 8 4 2 3 Y e s Y e s R 1 1 1 L 9 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L : : 4 5 0 i 1 9 1 1 0 i 6 . 7 4 2 3 N o N o L 1 2 1 E 1 0 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 L : : 1 0 6 9 : t 3 8 5 7 0 t 3 0 3 6 7 Y e s Y e s R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E D i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r r e t i n o i c a c i d a s d e t e r m i n e d b y fl u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y . D i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r a l l - t r a n s - r e t i n a l a s d e t e r m i n e d b y fl u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y . R e t i n a l m a x i m a l a b s o r b a n c e w h e n i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n . M A L D I - T O F i n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n e x p e r i m e n t s . Y e s i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f a c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l m o l e c u l e . G i v e n t h e i n i t i a l s u c c e s s o f t h e R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F d o u b l e m u t a n t , w e o p t e d t o a d d t h e h y d r o p h o b i c P h e r e s i d u e a t p o s i t i o n 1 3 2 t o p r o d u c e t h e d o u b l e m u t a n t , Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F . A s a n a l t e r n a t i v e , A r g 1 3 2 w a s a l s o m u t a t e d t o L e u . T h i s m u t a t i o n a l s o i n c r e a s e s t h e h y d r o p h o b i c i t y o f t h e b i n d i n g p o c k e t , y e t i s a m o r e s p a t i a l l y c o n s e r v a t i v e m u t a t i o n t h a n A r g t o P h e . B o t h o f t h e s e p r o t e i n m u t a n t s e x h i b i t s i m i l a r r e s u l t s c o m p a r e d t o t h e p r e v i o u s R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F d o u b l e m u t a n t ( 4 2 9 n m ) , p r o d u c i n g a r e t i n a l k m o f 4 1 5 1 2 3 n m ( Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 F , E n t r y 3 , T a b l e I I - 4 ) a n d 4 3 2 n m ( Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 L , E n t r y 4 , T a b l e I I - 4 ) . T h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F ( 7 8 n M ) i s c o m p a r a b l e t o t h e d o u b l e m u t a n t R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F ( 1 0 0 n M ) w h e r e b o t h p r o t e i n s h a v e i d e n t i c a l h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t s . C R A B P I I Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L h a s a s l i g h t l y h i g h e r K , ( 3 4 0 n M ) , b u t s t i l l fi t s w e l l w i t h t h e p r e v i o u s l y s e e n r e s u l t s . A l s o m i m i c k i n g t h e r e s u l t s s e e n w i t h R 1 3 2 K : : Y l 3 4 , n e i t h e r o f t h e s e d o u b l e m u t a n t s c o u l d t r a p a c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l b y r e d u c t i v e a m i n a t i o n . Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L d o e s d e m o n s t r a t e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n t h r o u g h t h e i n c u b a t i o n w i t h r e t i n a l b u t Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F d o e s n o t . A s w e c a n n o t s a y w i t h a n y d e g r e e o f c e r t a i n t y w h e t h e r o r n o t t h i s ~ 4 2 0 n m s p e c i e s i s a P S B , f u r t h e r t u n i n g o f t h e p o c k e t i s s t i l l n e c e s s a r y . T h e b i n d i n g a f fi n i t y o f r e t i n a l f o r t h e p r o t e i n n e e d s t o b e i n c r e a s e d , a s w e l l a s t h e s t a b i l i t y o f t h e S c h i f f b a s e . I n k e e p i n g w i t h t h e s a m e s t r a t e g y a s t h e p r e v i o u s s e r i e s o f C R A B P H m u t a n t s , a n a d d i t i o n a l h y d r o p h o b i c m u t a t i o n w a s i n c o r p o r a t e d a t t h e A r g 1 1 1 s i t e ( c h a n g e d t o L e u ) t o g e n e r a t e t h e t r i p l e m u t a n t s Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F z z R 1 1 1 L ( E n t r y 5 , T a b l e H 4 ) a n d Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L z l e l l L ( E n t r y 8 , T a b l e I I - 4 ) . I n c o r p o r a t i o n o f t h e a d d i t i o n a l h y d r o p h o b i c r e s i d u e i n R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L d i d n o t h a v e m u c h e f f e c t o n e i t h e r t h e b i n d i n g a f fi n i t y o f r e t i n a l ( 1 6 0 n M ) w i t h t h e p r o t e i n , o r r e t i n a l ’ s A m ( 4 1 0 n m ) w h e n i n c u b a t e d w i t h t h e p r o t e i n , b u t i t d i d a l l o w f o r t r a p p i n g o f t h e c o v a l e n t c o m p l e x b y r e d u c t i v e a m i n a t i o n , a s R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F d i d n o t . T h a t t r e n d i s a g a i n r e p e a t e d i n t h e Y 1 3 4 K s e r i e s o f m u t a n t s a s w e l l . T h e R 1 1 1 L m u t a t i o n i n Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 L : : R 1 1 1 L d o e s n o t g e n e r a t e m u c h c h a n g e i n r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y ( 2 1 0 n M ) o r U V - v i s a b s o r b a n c e ( 4 2 3 n m ) . M A L D I - T O F a n a l y s i s o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d c o m p l e x a n d t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d c o m p l e x b o t h d e m o n s t r a t e S B f o r m a t i o n . S i m i l a r l y , t h e t r i p l e m u t a n t 1 2 4 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F z l e l l L h a s a n a b s o r b a n c e o f 4 1 5 n m , a n d a l t h o u g h t h e S B i n o b s e r v e d w i t h t h e i n c u b a t i o n o f r e t i n a l , i t c a n n o t b e t r a p p e d b y r e d u c t i v e a m i n a t i o n . I n t e r e s t i n g l y , t h i s t r i p l e m u t a n t , w h o s e h y d r o p h o b i c i t y c l o s e l y m a t c h e s Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L z z R 1 1 1 L , h a s a d r a m a t i c a l l y l o w e r d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( 8 n M ) . D e s p i t e t h i s v e r y g o o d b i n d i n g a f fi n i t y , t h i s p r o t e i n s t i l l n e e d s f u r t h e r t u n i n g t o s t a b i l i z e S B f o r m a t i o n . W e n e x t b e g a n t o p r o b e o p t i m a l p l a c e m e n t o f t h e c o u n t e r a n i o n . I n i t i a l l y , t h e c o u n t e r a n i o n w a s p l a c e d a t p o s i t i o n 1 2 1 , a s t h i s h a d b e e n t h e b e s t i n p r e v i o u s s t u d i e s w i t h t h e L y s 1 3 2 s e r i e s o f m u t a n t s . I n t h e t w o t e t r a m u t a n t s Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E ( E n t r y 6 , T a b l e H - 4 ) a n d Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L z z R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E ( E n t r y 1 0 , T a b l e I I - 4 ) t h e r e d s h i f t t h a t w a s v i s i b l e i n e a c h o f t h e i r r e s p e c t i v e p r e v i o u s t r i p l e m u t a n t s h a s n o w b e e n l o s t , 4 1 5 n m ( Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F z l e l l L ) s h i f t e d t o 3 6 4 n m , a n d 4 2 3 n m ( Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 L : : R 1 1 1 L ) t o 3 6 7 n m u p o n a d d i t i o n o f G l u 1 2 1 . A l t h o u g h t h e s e a b s o r b a n c e v a l u e s d o n o t i n d i c a t e P S B f o r m a t i o n f r o m t h e l a c k o f r e d s h i f t i n t h e U V - v i s , r e d u c t i v e a m i n a t i o n a n d M A L D I - T O F r e v e a l t h e f o r m a t i o n o f S c h i f f b a s e . A l s o i n b o t h t h e t e t r a m u t a n t p r o t e i n s , a d d i t i o n o f G l u 1 2 1 r e s u l t s i n s o m e l o s s o f r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y . Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L : l e l l L : : L 1 2 1 E h a s d r o p p e d t o a K , o f 5 7 0 n m a n d Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F z l e 1 1 L : : L 1 2 1 E h a s d r o p p e d s i g n i fi c a n t l y t o 2 2 0 n M . A 2 2 0 n M K , f o r t h i s p r o t e i n , a l t h o u g h d r a m a t i c a l l y w o r s e t h a n t h e 8 n M o b s e r v e d f o r t h e t r i p l e m u t a n t Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 F : : R 1 1 I L , i s t h e e x p e c t e d K d w h e n c o m p a r e d t o t h e a n a l o g o u s p r o t e i n i n t h e L y s 1 3 2 s e r i e s , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E ( 2 0 0 n M ) . T w o a d d i t i o n a l m u t a n t s w e r e m a d e i n t h i s s e r i e s i n e f f o r t s t o w a r d s e s t a b l i s h i n g t h e p r o p e r c o u n t e r a n i o n p l a c e m e n t a n d e n v i r o n m e n t . Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L z z L 1 2 1 E ( E n t r y 9 , 1 2 5 T a b l e I I - 4 ) , w h i c h s t i l l h a s t h e h y d r o p h i l i c , p o s i t i v e l y c h a r g e d A r g 1 1 1 r e s i d u e , d i d m a n a g e t o m a i n t a i n a r e d s h i f t ( 4 2 3 n m ) a n d l o w e r t h e b i n d i n g a f fi n i t y f o r r e t i n a l ( 1 1 0 n M ) , h o w e v e r n o t l o w e n o u g h t o b e o f s i g n i fi c a n t u s e a s t h e o p t i m a l r h o d o p s i n p r o t e i n m i m i c . T h i s p r o t e i n s e r v e s a s a n o t h e r p i e c e o f e v i d e n c e f o r t h e t h e o r y t h a t t h e ~ 4 2 0 n m a b s o r b i n g s p e c i e s m a y n o t b e P S B . A l l o f t h e o t h e r ~ 4 2 0 n m a b s o r b i n g c o m p l e x e s d e m o n s t r a t e S B f o r m a t i o n i n o n e o f t h e t w o e x p e r i m e n t s , h o w e v e r t h i s p r o t e i n s h o w s n o i n d i c a t i o n o f S B f o r m a t i o n w i t h e i t h e r M A L D I - T O F e x p e r i m e n t . B e s i d e s p o s i t i o n 1 2 1 f o r t h e p u t a t i v e c o u n t e r a n i o n , p o s i t i o n 5 4 ( o r i g i n a l l y a T h r ) w a s a l s o p r o b e d . Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 F : : R 1 1 1 L : : T 5 4 E ( E n t r y 7 , T a b l e I I - 3 ) , w a s e f f e c t i v e i n t h a t i t h a d a r e l a t i v e l y l o w d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( K , = 4 1 n M , b e s t i n t h e L y s 1 3 4 s e r i e s ) , a n d e x h i b i t e d a 6 4 n m r e d s h i f t ( 7 1 m , = 4 3 4 n m , t h e b e s t i n t h i s s e r i e s o f p r o t e i n s ) . A d d i t i o n a l l y , t h e r e t i n a l c o m p l e x w a s s t a b l e e n o u g h t o b e t r a p p e d u n d e r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n c o n d i t i o n s a n d d e t e c t e d b y M A L D I - T O F . A l t h o u g h G l u a t p o s i t i o n 1 2 1 m a y h a v e s e r v e d L y s 1 3 2 t h e b e s t , G l u a t p o s i t i o n 5 4 m a y b e b e s t s u i t e d f o r L y s 1 3 4 . U n l i k e t h e p r e v i o u s s e r i e s o f p r o t e i n s t h o u g h , t h e L y s 1 3 4 s e r i e s w a s n e v e r a b l e t o d e m o n s t r a t e a r e d s h i f t u p ~ 4 6 0 n m . T h e l a r g e s t r e d s h i f t s e e n w a s o n l y u p t o 4 3 4 n m . T h e L y s 1 3 4 p o s i t i o n h a s y e t t o p r o d u c e a d e q u a t e P S B f o r m i n g p r o t e i n t h a t w o u l d b e s u i t a b l e t o s e r v e a s a r h o d o p s i n m i m i c , a n d f u r t h e r t u n i n g o f t h e Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F z l e 1 1 L : : T 5 4 E p r o t e i n i s n e c e s s a r y . 1 2 6 I . I n v e s t i g a t i n g l l - c i s - R e t i n a l a s t h e S u b s t r a t e I n h u m a n s , t h e n a t i v e s u b s t r a t e o f r h o d o p s i n i s l l - c i s - r e t i n a l , a l t h o u g h o t h e r i s o m e r i c f o r m s ( 9 - c i s - a n d a l l - t r a n s - r e t i n a l ) a r e a l s o k n o w n t o b o t h e f fi c i e n t l y b i n d s o m e o p s i n s a s a P S B , a n d e f fi c i e n t l y p r o m o t e a c t i v a t i o n o f t h e G - p r o t e i n , t r a n s d u c i n , i n v i t r o . A d d i t i o n a l l y , t a d p o l e s h a v e a n e x t r a c o n j u g a t e d d o u b l e b o n d i n t h e B - i o n o n e r i n g w h i c h a l l o w s t h e m t o s e e i n t o t h e I R w a v e l e n g t h s . 6 9 S o m e i n s e c t s h a v e l o s t t h e d o u b l e b o n d i n t h e B - i o n o n e r i n g o f r e t i n a l , a n d c a n s e e i n t o t h e U V w a v e l e n g t h s . 7 0 T h e s e v a r i o u s r e t i n a l a n a l o g s s e e m t o s u g g e s t t h a t w e d o h a v e s o m e fl e x i b i l i t y i n t h e s t r u c t u r e o f t h e r c t i n y l i d e n e c h r o m o p h o r e w h i l e s t i l l m a i n t a i n i n g t h e s a m e P S B f o r m i n g , r e d - s h i f t e d p r o p e r t i e s . A d d i t i o n a l l y , e v e n i f o u r p r o t e i n w o u l d n o t b i n d t h e l l - c i s i s o m e r , i t s h o u l d n o t h i n d e r o u r s t u d i e s t o u t i l i z e t h e a l l - t r a n s i s o m e r . I n i t i a l l y , a l l o f t h e b i n d i n g a s s a y s p e r f o r m e d o n t h e C R A B P P H m u t a n t s w e r e p e r f o r m e d w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l . T h i s w a s d o n e i n p a r t b e c a u s e o f t h e v e r y s e n s i t i v e n a t u r e o f l l - c i s - r e t i n a l ( e v e n s m a l l a m o u n t s o f n a t u r a l l i g h t w i l l i s o m e r i z e t h e 1 1 - c i s b o n d t o t r a n s ) a n d t h e l e n g t h y m e a n s o f o b t a i n i n g p u r e s a m p l e s ( e i t h e r v i a i s o m e r i z a t i o n “ ' 7 2 o r s y n t h e s i s a n d p u r i fi c a t i o n o f t h e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l a n d H P L C p u r i fi c a t i o n , c o m p o u n d i n t h e a b s e n c e o f n a t u r a l l i g h t ) . A t t e m p t s w e r e m a d e a t s e p a r a t i o n o f a n i s o m e r i z e d r e t i n a l m i x t u r e , h o w e v e r , t h i s d i d n o t l e a d t o i s o l a t i o n o f p u r e c o m p o u n d s i n a c c e p t a b l e y i e l d s . I n s t e a d , t h e m o l e c u l e w a s s y n t h e s i z e d f o l l o w i n g a p u b l i s h e d p r o c e d u r e . 7 3 S e v e r a l o f t h e C R A B P I I m u t a n t s c a p a b l e o f b i n d i n g a l l — t r a n s - r e t i n a l w e r e c h o s e n f o r b i n d i n g a n a l y s i s w i t h t h e l l - c i s - r e t i n a l i s o m e r . R e s u l t s o f t h e fl u o r e s c e n c e t i t r a t i o n s , 1 2 7 T a b l e I I - 5 . R e s u l t s o f b i n d i n g a s s a y s w i t h l l - c i s - R e t i n a l E n t r y P r o t e i n R t K , ( n M ) ' R t A . . . ” ( n m ) " R e d u c t i v e l y c A m i n a t e s 1 W i l d - T y p e > 1 0 0 0 3 7 3 N o 2 R 1 3 2 K 5 0 i 1 6 3 5 6 Y e s 3 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F 6 3 0 : 1 : 5 3 3 7 3 N o 4 R 1 3 2 L : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E - 3 8 5 - d 5 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 l l L : : L l 2 1 E : : T 5 4 V 2 1 0 i : 1 8 3 6 0 Y e s 6 R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R l l 1 L : : L 1 2 1 D 3 2 0 x 1 9 3 6 0 - 7 Y 1 3 4 K 1 6 8 0 : l : 1 4 0 3 8 4 N o 8 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F - 3 9 4 - 9 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F z l e l 1 L : : L 1 2 1 E - 3 7 1 - 1 0 Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F : : R 1 1 1 L : : T 5 4 E 1 0 0 0 : 1 : 1 0 0 3 8 1 , 4 1 8 - l l L 1 9 W 2 1 2 0 : 3 0 0 3 8 0 - a . F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n w i t h l l - c i s - r e t i n a l t o d e t e r m i n e K , v a l u e s . b . l l - c i s - r e t i n a l U V - v i s a b s o r b a n c e w h e n i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n . c . R e d u c t i v e a m i n a t i o n m e a s u r e d b y M A L D I - T O F . Y e s i n d i c a t e s t h e c o v a l e n t c o m p l e x b e t w e e n l l - c i s - r e t i n a l a n d p r o t e i n w a s d e t e c t e d . d . R e s u l t s i n d i c a t e d w i t h a — w e r e n o t c o m p l e t e d . U V - v i s i n c u b a t i o n a n d M A L D I - T O F r e d u c t i v e a m i n a t i o n s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e I I - 5 ( g r a p h s a r e p r e s e n t e d i n t h e A p p e n d i x ) . p o s i t i v e r e s u l t s i n a l l t h r e e e x p e r i m e n t s , i . e . , b i n d i n g e f fi c i e n c y , r e d s h i f t e d A m , a n d p o s i t i v e r e d u c t i v e a m i n a t i o n . T h e w i l d t y p e p r o t e i n ( E n t r y 1 ) , L 1 9 W ( E n t r y 1 1 ) , a n d t h e t e t r a m u t a n t R 1 3 2 L : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E ( E n t r y 4 ) w e r e a l l a n a l y z e d a s c o n t r o l s , a s t h e y a l l l a c k t h e a c t i v e s i t e l y s i n e . N o n e o f t h e s e t h r e e p r o t e i n s s h o w e d a r e d s h i f t i n t h e U V - v i s , a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n w i t h t h e w i l d t y p e p r o t e i n c o n fi r m s t h e a b s e n c e o f t h e S B . T h e r e w a s n o s i n g l e p r o t e i n t h a t e x h i b i t e d 1 2 8 T h e s i n g l e m u t a n t R 1 3 2 K ( E n t r y 2 , T a b l e I I - 5 ) w a s t h e o n l y p r o t e i n a m o n g t h o s e t e s t e d t h a t h a d a b i n d i n g a f fi n i t y l e s s t h a n 1 0 0 n M ( K , = 5 0 n M ) . I t w a s a l s o o n e o f o n l y t w o p r o t e i n s t h a t d i s p l a y e d a p o s i t i v e c o v a l e n t c o m p l e x a t i o n a s d e t e c t e d b y M A L D I - T O F . R 1 3 2 K i n c u b a t e d w i t h 1 1 - c i s - r e t i n a l d o e s n o t h o w e v e r g e n e r a t e a r e d s h i f t e d a b s o r b a n c e ( 3 6 5 n m ) . T h e p e n t a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V ( E n t r y 5 ) a n d t h e t e t r a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 D ( E n t r y 6 ) , w h i c h w e r e t h e b e s t a l l - t r a n s - r e t i n a l b i n d i n g p r o t e i n s ( 2 n M d e ) , w e r e t h e n e x t b e s t l l - c i s - r e t i n a l b i n d i n g p r o t e i n s w i t h 2 0 0 n M a n d 3 2 0 n M d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s , r e s p e c t i v e l y . O n l y R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V w a s t e s t e d f o r r e d u c t i v e a m i n a t i o n ( d u e t o i n s u f fi c i e n t s u p p l y o f t h e c h r o m o p h o r e ) , a n d d o e s i n d e e d s h o w S B f o r m a t i o n . B o t h o f t h e s e m u t a n t s a b s o r b a t 3 6 0 n m , w h i c h m a y o n l y s u g g e s t S B f o r m a t i o n a s o p p o s e d t o P S B f o r m a t i o n . T h e d o u b l e m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F ( E n t r y 3 , T a b l e I I - 5 ) h a s a l s o l o s t t h e r e d s h i f t ( 3 7 3 n m ) t h a t w a s s e e n a s a r e s u l t o f c o m p l e x a t i o n o f t h e a l l - t r a n s - r e t i n a l ( 4 2 9 n m ) . B i n d i n g a f fi n i t y i s a l s o w o r s e w i t h l l - c i s - r e t i n a l ( 6 3 0 n M ) a s c o m p a r e d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l ( 1 0 0 n M ) . S B f o r m a t i o n i s n o t d e t e c t e d i n t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n e i t h e r . U V - v i s a n a l y s i s o f l l - c i s - r e t i n a l w i t h t h e s e C R A B P I I m u t a n t p r o t e i n s d i d n o t p r o d u c e m a n y r e d s h i f t e d s p e c i e s . I n f a c t , n o n e o f t h e p r o t e i n s w i t h t h e L y s i n p o s i t i o n 1 3 2 r e d s h i f t e d a t a l l . T h e t w o p r o t e i n s t h a t r e v e a l e d S c h i f f b a s e f o r m a t i o n v i a M A L D I - T O F ( R 1 3 2 K a n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V ) , a s w e l l a s R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 D w h o s e r e d u c t i v e a m i n a t i o n w a s n o t a t t e m p t e d , e x h i b i t r e t i n a l k m v a l u e s t h a t a r e a c t u a l l y b l u e s h i f t e d a s c o m p a r e d t o t h e n o n c o v a l e n t w i l d t y p e 1 2 9 e c n a b r o s b A / r e t i n a l m i x t u r e . A g a i n , t h i s b l u e s h i f t e d a b s o r b a n c e m a y b e i n d i c a t i v e o f S c h i f f b a s e f o r m a t i o n , h o w e v e r i n t h e u n p r o t o n a t e d s t a t e . M o s t o f t h e L y s 1 3 4 p r o t e i n s t e s t e d d o r e d s h i f t f r o m t h e w i l d t y p e a b s o r b a n c e , u n f o r t u n a t e l y , a c u r r e n t l a c k o f a m p l e q u a n t i t i e s o f t h e l l - c i s - r e t i n a l s u b s t r a t e h a s n o t a l l o w e d f o r a c o m p l e t e a n a l y s i s o f t h i s s e r i e s o f p r o t e i n s a s i s n e c e s s a r y . T h e r e w e r e t w o p r o t e i n s w i t h t h e L y s i n p o s i t i o n 1 3 4 t h a t e x h i b i t e d a s m a l l d e g r e e o f r e d s h i f t i n g . T h e d o u b l e m u t a n t Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F ( E n t r y 8 ) s h o w e d a r e t i n a l p e a k a t 3 9 4 n m , a r e d s h i f t o f 2 1 n m a s c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e . T h i s i s a 1 0 n m i m p r o v e m e n t o v e r t h e Y 1 3 4 K s i n g l e m u t a n t w h i c h a b s o r b s a t 3 8 4 n m ( E n t r y 7 ) . H y d r o p h o b i c t u n i n g a n d p l a c e m e n t o f t h e c o u n t e r a n i o n a t p o s i t i o n 1 2 1 ( E n t r y 9 ) a l s o d i d n o t r e d s h i f t , b u t t h e t e t r a m u t a n t Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F z l e 1 1 L : : T 5 4 E ( E n t r y 1 0 ) d o e s s h o w a 4 5 n m r e d s h i f t , w i t h p e a k s a t 3 8 1 n m a n d 4 1 8 n m . T h i s i s a p a r t i c u l a r l y i n t e r e s t i n g r e s u l t , s i n c e a s o p p o s e d t o t h e p r e v i o u s ~ 4 2 0 n m a b s o r b i n g a l l - t r a n s c o m p l e x e s t h a t o n l y s h o w e d t h e o n e p e a k , t h i s p r o t e i n d o e s s h o w t w o p e a k s a s w a s s e e n w i t h t h e ~ 4 6 0 n m a b s o r b i n g s p e c i e s ( F i g u r e I I - 3 8 ) . T h i s r e d s h i f t e d p e a k c o u l d b e d u e t o a s m a l l 0 . 0 2 1 a m o u n t o f P S B , o r a l t e r n a t i v e l y , i t 0 . 0 1 5 . c o u l d b e b o u n d a l d e h y d e , w h i c h a b s o r b s a t a d i f f e r e n t w a v e l e n g t h t h a n r e t i n a l i n s o l u t i o n , a s t h e K , i s f a i r l y h i g h , e q u i l i b r i u m m a y n o t F i g u r e 1 1 ‘ ” . U V - V I S O f l l ' C i S ' I ' C t i n a l a s b o u n d t o Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F : : R 1 1 l L : : T 5 4 E . T h i s i s t h e l a r g e s t f a v o r S U b S t r a t e b r n d r n g . b a t h o c h r o m i c s h i f t o b s e r v e d t h u s f a r f o r t h e l l - c i s i s o m e r , 3 8 1 n m a n d 4 1 8 n m . F i g u r e I I - 3 9 s h o w s l l - c i s - 1 3 0 r e t i n a l i n t h e b i n d i n g c a v i t y o f Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F : : R 1 1 1 L : : T 5 4 E . L y s 1 3 4 i s p o s i t i o n e d 6 . 6 A f r o m t h e c a r b o n y l o f t h e c h r o m o p h o r e a n d G l u 5 4 i s 2 . 7 A . T h e h y d r o p h o b i c L e u r e s i d u e s 1 2 1 a n d 1 1 1 a r e 3 . 5 A a n d 7 . 2 A f r o m r e t i n a l , r e s p e c t i v e l y . C o m p a r e d t o t h e a l l - t r a n s - r e t i n a l b i n d i n g p o s i t i o n , t h e i o n o n e r i n g h a s n o t m o v e d , b u t a s a r e s u l t o f t h e d o u b l e b o n d i s o m e r i z a t i o n , t h e c a r b o n y l r e g i o n h a s s h i f t e d ~ 3 A . T h e b i n d i n g a f fi n i t y f o r t h i s p r o t e i n , a s w e l l a s a l l L y s 1 3 4 p r o t e i n s a n a l y z e d , i s v e r y p o o r ( K , > 1 0 0 0 n M ) . T h i s s e r i e s h a s y e t t o b e t e s t e d f o r S B f o r m a t i o n w i t h l l - c i s - r e t i n a l b y r e d u c t i v e a m i n a t i o n a n d M A L D I - T O F . P r e l i m i n a r y b i n d i n g a n a l y s e s w i t h l l — c i s - r e t i n a l i n d i c a t e t h a t L y s i n p o s i t i o n 1 3 4 c o u p l e d w i t h G l u i n p o s i t i o n 5 4 m a y b e t h e m o s t b e n e fi c i a l f o r P S B f o r m a t i o n . H o w e v e r , s t e r i c s m a y p r o h i b i t 1 1 - c i s - r e t i n a l f r o m a c h i e v i n g a s u i t a b l e b i n d i n g a f fi n i t y w i t h L y s 1 3 4 . T h e L y s 1 3 2 s e r i e s m a y b e m o r e s u i t e d f o r b i n d i n g , a n d w i t h p r o p e r c o u n t e r a n i o n p l a c e m e n t m a y p r o m o t e P S B f o r m a t i o n . F i g u r e I I - 3 9 . S t e r e o v i e w o f Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F 2 2 R 1 1 1 L : : T 5 4 E w i t h l l - r ' i s — r e t i n a l b o u n d . L y s 1 3 4 i s 6 . 6 A f r o m t h e s u b s t r a t e , a n d t h e c o u n t e r a n i o n G l u 5 4 i s 2 . 7 A f r o m t h e s u b s t r a t e ( I n s i g h t l l m i n i m i z a t i o n s ) . 1 3 1 . 1 . M o n i t o r i n g t h e S c h i f f B a s e v i a l 3 C - “ N N M R A n o t h e r m e a n s b y w h i c h w e h o p e t o m o n i t o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n i s v i a N M R , m o r e s p e c i fi c a l l y , 1 5 N a n d 1 3 C N M R . T h e c a r b o n y l c a r b o n o f r e t i n a l s h o u l d e x h i b i t d i f f e r e n t c h e m i c a l s h i f t s f o r f r e e a l d e h y d e , S B , a n d P S B . W e h o p e t o b e a b l e t o c o u p l e t h e r e s u l t s a l r e a d y u n c o v e r e d t h r o u g h fl u o r e s c e n c e , U V - v i s a n d M A L D I - T O F w i t h N M R e x p e r i m e n t s t o f u r t h e r p r o b e t h e n a t u r e a n d e x t e n t o f r e t i n a l b i n d i n g . A l t h o u g h o n e m a y c o n c e i v a b l y b e a b l e t o f o l l o w t h e 1 3 C p e a k o f r e t i n a l ’ s a l d e h y d i c c a r b o n i n t h e N M R , r e l a t i n g t h e c h e m i c a l s h i f t s s e e n t o d i f f e r e n t s p e c i e s , i . e . , u n b o u n d , S c h i f f b a s e , a n d p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e , w e w i l l a l s o c o u p l e t h i s w i t h a 1 5 N — L y s l 3 2 p r o t e i n f o r m o r e c o n c l u s i v e r e s u l t s . F o l l o w i n g t h e 1 3 C s i g n a l o n l y m a y n o t b e c o n c l u s i v e d u e t o t h e e x i s t e n c e o f m u l t i p l e s p e c i e s p r e s e n t . B y c o u p l i n g t h e 1 3 C l a b e l e d r e t i n a l w i t h t h e 1 5 N l a b e l e d p r o t e i n , w e w i l l a t t e m p t t o a c q u i r e l 3 C — l s N H M Q C d a t a t o d e m o n s t r a t e w i t h m o r e c e r t a i n t y i f i n d e e d t h e r e t i n a l i s c o v a l e n t l y a t t a c h e d , a n d s p e c i fi c a l l y t o t h e L y s w e d e s i r e . I f r e t i n a l i s c o v a l e n t l y a t t a c h e d , t h e 1 3 C p e a k s h o u l d s h o w c o r r e l a t i o n t o t h e 1 5 N p e a k . A d d i t i o n a l l y , d e t e r m i n a t i o n o f t h e p K , o f t h e a c t i v e s i t e P S B w i l l b e a t t e m p t e d t h r o u g h u s e o f b o t h t h e l a b e l e d r e t i n a l a n d l a b e l e d p r o t e i n . R e t i n a l w i l l b e i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n s a m p l e s a t d i f f e r e n t p H v a l u e s a n d p r o b e d f o r S B f o r m a t i o n . F o l l o w i n g s i m i l a r p r o c e d u r e s u s e d i n t h e U V - v i s d e t e r m i n a t i o n o f t h e P S B p K , , c h e m i c a l s h i f t s o f e i t h e r t h e c a r b o n o r n i t r o g e n w i l l b e p l o t t e d a g a i n s t p H a n d t h e p K , c a n b e d e d u c e d . W e a l r e a d y h a v e a f u l l y e - l s N - L y s l a b e l e d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F p r o t e i n , a n d a r e w o r k i n g o n a c q u i r i n g a 1 3 2 - 8 - 1 5 N - L y s o n l y . 1 3 2 T h e s y n t h e s i s o f 1 5 - [ 1 3 C ] - r e t i n a l ( I I - a ) t o b e u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s h a s b e e n c o m p l e t e d a n d i s o u t l i n e d i n S c h e m e I I - l . E t h y l d i p h e n y l p h o s p h i n i t e ( I I - b ) w a s h e a t e d w i t h c h l o r o a c e t o n i t r i l e , n e a t , t o p r o d u c e y l i d e I I - c w h i c h w a s d e p r o t o n a t e d w i t h t - B u O K a n d r e a c t e d w i t h B - i o n o n e t o g i v e p r i m a r i l y t h e E i s o m e r o f I I - d . D i b a l r e d u c t i o n o f t h e c y a n o d e r i v a t i v e g a v e a l d e h y d e I I - e i n 7 0 % y i e l d . 7 4 T h i s a l d e h y d e w a s u s e d i n a n o t h e r H o m e r - W a d s w o r t h - E m m o n s ( H W E ) r e a c t i o n w i t h y l i d e I I - f t o p r o d u c e t h e e s t e r I I - g . T r e a t m e n t o f e s t e r I I - g w i t h T M S C l a n d M e L i y i e l d e d m e t h y l k e t o n e I I - h i n 4 6 % y i e l d . 7 5 ’ 7 6 A l t h o u g h t h e l o w y i e l d i n g s t e p f r o m I I - g t o I I - h o n l y r e s u l t s i n a 4 6 % y i e l d o f t h e p r o d u c t , 2 9 % o f t h e s t a r t i n g m a t e r i a l i s r e c o v e r e d a n d c a n b e r e c y c l e d . P u s h i n g t h e r e a c t i o n w i t h l o n g e r t i m e s o n l y r e s u l t e d i n d e g r a d a t i o n o f t h e o l e fi n a n d l o w e r y i e l d s i n t h e r a n g e o f 2 0 % . T h e fi n a l t w o r e a c t i o n s i n c o r p o r a t e t h e l a b e l e d c a r b o n v i a a n o t h e r H W E r e a c t i o n . l - ‘ 3 C - A c e t o n i t r i l e i s t r e a t e d w i t h t w o e q u i v a l e n t s o f n - B u L i a n d s t i r r e d f o r 1 0 m i n a t — - 6 0 O C . C h l o r o d i e t h y l p h o s p h i t e w a s a d d e d i n t o t h e r e a c t i o n a n d s t i r r e d f o r a n a d d i t i o n a l 3 0 m i n a t l o w t e m p e r a t u r e s , fi r s t g e n e r a t i n g t h e y l i d e , t h e n d e p r o t o n a t i n g i t . K e t o n e I I - h w a s a d d e d , a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r 1 h a t — 6 0 ° C a n d t h e n a l l o w e d t o s l o w l y w a r m t o r o o m t e m p e r a t u r e . I n t e r m e d i a t e I I - i w a s q u e n c h e d a n d e x t r a c t e d , b u t n o t p u r i fi e d . I t w a s t a k e n d i r e c t l y i n t o E t 2 0 f o r D i b a l r e d u c t i o n , a n d a f t e r c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y y i e l d e d 3 0 % o f 1 5 - 1 3 C - r e t i n a l , I I - a . 7 7 T h e r e c o v e r y i s a b i t l o w , b u t i t i s o v e r t w o s t e p s . T h e r e a c t i o n s e e m s f a i r l y c l e a n b y T L C a n d t h e r e i s n o r e c o v e r y o f o t h e r m a t e r i a l s . T h e l o w y i e l d i n g s t e p i s t h e r e c o v e r y o f [ L a f r o m t h e s i l i c a g e l w o r k - u p . E v e n a f t e r s e v e r a l e x t r a c t i o n s t h e s i l i c a g e l s t i l l m a i n t a i n s a y e l l o w / o r a n g e c o l o r p r e s u m a b l y f r o m t h e r e t i n a l . 1 3 3 A t t e m p t s a r e c u r r e n t l y o n g o i n g t o a c q u i r e s u i t a b l e N M R s p e c t r a w i t h t h e 1 3 C l a b e l e d r e t i n a l a n d f u l l y e - l s N - L y s l a b e l e d p r o t e i n t o d e t e c t d i f f e r e n t r e t i n a l / p r o t e i n c o m p l e x e s . 1 3 4 S c h e m e I I - l C I A C N 1 . t B u O K T H F 3 0 m i n > P t h O E t * P h 2 P ( O ) C H 2 0 N n e a t 1 2 5 ° C 2 . T H F , 3 6 1 1 1 ' M 3 1 1 1 . 3 6 9 . ' " ' ° 3 E \ ' 0 8 5 % D i b a l - H \ \ C ” > \ \ ” 0 E l g 0 , 0 ° C , 2 h r , 7 0 % I I - e B r E t 1 . t B u O K , T H F , 3 0 m i n t h P O E I > P h 2 P ( O ) C H 2 0 0 2 E t n e a t , 1 2 5 ° C . 2 . T H F , 3 6 h r 1 1 ' ” 3 h r , 7 5 % [ 1 4 W H O % [ L e 6 8 1 . T M S C I , T H F , - 6 0 ° C \ \ \ 2 . M e L i , 2 h r \ \ \ O 4 6 % + 2 9 % S M > I I - h r - 1 . n B u L i 2 , - 6 0 ° C , T H F 0 1 1 3 1 3 0 1 4 ( e q ) p \ \ \ \ ‘ 3 N 2 . ( E t O ) 2 P ( O ) C I 3 . 1 1 . 1 \ \ \ 0 — _ I l - h D i b a l - H £ 1 2 0 . - 6 0 ° c , 2 h r , 3 0 % 1 3 W H O < _ _ . n - 1 3 5 K . S u m m a r y M u t a g e n e s i s o f H u m a n C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n 1 1 h a s a f f o r d e d a p r o t e i n t h a t w i l l n o w b i n d r e t i n a l w i t h b i n d i n g a f fi n i t y c o m p a r a b l e t o t h a t o f t h e n a t i v e p r o t e i n w i t h i t s n a t i v e s u b s t r a t e ( K , = 2 n M ) . A d d i t i o n a l l y , r e t i n a l w i l l b i n d a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e w i t h a n e n g i n e e r e d L y s i n a n a p p r o p r i a t e l y t u n e d b i n d i n g c a v i t y . T h e b e s t P S B f o r m i n g p r o t e i n i s t h e p e n t a m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V , t h a t i n c l u d e s m u t a t i o n s t o n o t o n l y i n t r o d u c e t h e p e r t i n e n t L y s r e s i d u e , b u t a l s o t o i n c r e a s e t h e h y d r o p h o b i c i t y o f t h e b i n d i n g c a v i t y a n d c o r r e c t l y p o s i t i o n a c o u n t e r a n i o n f o r t h e p o s i t i v e l y c h a r g e d i m i n i u m i o n . T h r o u g h o u r m u t a g e n e s i s s t u d i e s , w e h a v e f o u n d t h a t p o s i t i o n 1 3 2 s e e m s t o b e b e s t s u i t e d f o r t h e L y s l o c a t i o n , c o u p l e d w i t h a c o u n t e r a n i o n a t p o s i t i o n 1 2 1 , f o r b i n d i n g w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l . P r e l i m i n a r y b i n d i n g s t u d i e s w i t h l l — c i s - r e t i n a l i n d i c a t e t h a t p e r h a p s p o s i t i o n 1 3 4 , c o u p l e d w i t h a c o u n t e r a n i o n a t p o s i t i o n 5 4 , w o u l d b e b e s t s u i t e d . T h e o p t i m a l a l l - t r a n s - r e t i n a l P S B f o r m i n g p r o t e i n a n d l l - c i s - r e t i n a l P S B f o r m i n g p r o t e i n d o n o t n e c e s s a r i l y h a v e t o b e t h e s a m e p r o t e i n , a n d i n d e e d t h e y p r o b a b l y w i l l n o t b e . E f f o r t s a t p r o b i n g t h e m e c h a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n c a n , a n d w i l l , b e a p p l i e d t o b o t h c h r o m o p h o r e s a n d t h e i r r e s p e c t i v e p r o t e i n s . H y d r o p h o b i c t u n i n g i s e s s e n t i a l , n o t n e c e s s a r i l y t o f o r m P S B , b u t t o i n c r e a s e t h e b i n d i n g a f fi n i t y t o a c c e p t a b l e l e v e l s ( K , < 1 0 0 n M ) . P a r t i c u l a r l y , t h e A r g r e s i d u e a t p o s i t i o n 1 1 1 s e e m s t o b e c r i t i c a l f o r h y d r o p h o b i c i n c o r p o r a t i o n . N o r e d - s h i f t e d r e t i n a l s p e c i e s > 4 4 0 n m w a s e v e r o b t a i n e d i n a p r o t e i n t h a t d i d n o t h a v e t h e R 1 1 1 L m u t a t i o n . S t u d i e s a r e c u r r e n t l y o n g o i n g t o p r o b e t h e e f f e c t o f o t h e r h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s a t t h i s p o s i t i o n . P r e c i s e p o s i t i o n i n g o f t h e c o u n t e r a n i o n i s a l s o c r i t i c a l i n f o r c i n g t h e P S B 1 3 6 s p e c i e s t o b e c o m e f a v o r e d a t e q u i l i b r i u m , a s s h o r t e n i n g t h e d i s t a n c e o f t h e c o u n t e r a n i o n ( G l u m u t a t e d t o A s p ) i n o u r b e s t P S B f o r m i n g p r o t e i n s h o w s n o t o n l y a s l i g h t d e c r e a s e i n t h e b i n d i n g a f fi n i t y , b u t a l s o t h a t t h e e q u i l i b r i u m h a s s h i f t e d t o f a v o r t h e 3 8 0 n m s p e c i e s m o r e t h a n t h e 4 6 0 n m P S B . T h e p K a o f R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V h a s b e e n m e a s u r e d t o b e 6 . 5 , w h i c h i s c o n s i d e r a b l y l o w e r t h a n p K , I v a l u e s m e a s u r e d f o r v a r i o u s r h o d o p s i n p r o t e i n s ( g e n e r a l l y > 1 0 ) . O u r e f f o r t s a t i n c r e a s i n g t h i s v a l u e h a v e j u s t b e g u n , a n d i s s t i l l b e i n g h e a v i l y p u r s u e d . O n c e c o m p l e t e h o w e v e r , t h e u l t i m a t e t a s k a t h a n d w i l l b e g i n , p r o b i n g t h e u n d e r l y i n g p r i n c i p l e s o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n . S i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s o n t h e p r o t e i n w i l l i n c l u d e a d d i n g v a r y i n g c h a r g e s , d i p o l e s , a n d s t e r i c s a t p o s i t i o n s a l l a l o n g t h e p o l y e n e b a c k b o n e a n d m e a s u r i n g t h e e f f e c t o n r e t i n a l ’ s m a x i m a l a b s o r b a n c e . 1 3 7 L . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s T y p i c a l P C R C o n d i t i o n s f o r S t r a t a g e n e ’ s Q u i k C h a n g e S i t e - D i r e c t e d M u t a g e n e s i s P r o t o c o l : F o r t h e P C R r e a c t i o n , t h e f o l l o w i n g m a t e r i a l s a r e m i x e d t o g e t h e r i n a 5 0 0 m L e p p e n d o r f t u b e : 5 0 — 1 0 0 1 1 g t e m p l a t e p l a s m i d D N A ; 1 5 p m o l e a c h o f c o m p l i m e n t a r y , m u t a t i o n c o n t a i n i n g p r i m e r s ; 1 0 L o f 1 0 m M p r e - m i x e d d N T P ; 5 1 . 1 L o f a 1 0 x r e a c t i o n b u f f e r ; s t e r i l e w a t e r , d i l u t e d u p t o a r e a c t i o n v o l u m e o f 4 9 M L ; 1 M L o f p f u t u r b o p o l y m e r a s e ( T h i s s h o u l d b e a d d e d 1 a s t . ) . T e m p e r a t u r e c y c l e s f o r t h e P C R : ~ 9 5 ° C ( 0 . 5 m i n ) , o n e t i m e ~ 9 5 ° C ( 0 . 5 m i n ) , ~ 5 5 ° C ( 1 m i n ) , 7 0 ° C ( 8 m i n ) , r e p e a t 1 6 - 2 0 t i m e s d e p e n d i n g o n t h e n u m b e r o f b a s e p a i r s b e i n g m u t a t e d ~ 7 0 ° C ( 1 0 m i n ) , o n e t i m e F o l l o w i n g t h e P C R r e a c t i o n a n d a g a r o s e g e l v e r i fi c a t i o n , 1 1 1 L o f D p n I i s a d d e d t o t h e r e a c t i o n t u b e a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e a t 3 7 ° C f o r l h , a f t e r w h i c h t i m e 1 — 5 0 L o f r e a c t i o n i s t r a n s f o r m e d i n t o 1 0 0 1 1 L o f e i t h e r J M 1 0 9 o r X L l - B l u e c o m p e t e n t c e l l s . A t y p i c a l t r a n s f o r m a t i o n p r o c e d u r e : A 1 0 0 p t L a l i q u o t o f c o m p e t e n t c e l l s w a s a l l o w e d t o t h a w o n i c e a b o u t fi v e n r i n . O n e m i c r o l i t e r ( u s u a l l y 1 a n d n e v e r m o r e t h a n 1 0 1 1 1 . ) w a s a d d e d t o t h e c e l l s , g e n t l y m i x e d , a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e o n i c e 3 0 m i n . T h e c e l l s w e r e t h e n h e a t s h o c k e d i n a 4 2 ° C w a t e r b a t h f o r 2 m i n a n d i n c u b a t e d o n i c e 2 m i n . A 5 0 0 u L a l i q u o t o f L B w a s a d d e d , m i x e d g e n t l y , a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 1 h . A f t e r w h i c h t i m e t h e c e l l s w e r e s p u n d o w n , 1 3 8 5 0 0 p t L o f s u p e r n a t a n t r e m o v e d , r e s u s p e n d e d i n r e m a i n i n g l i q u i d , a n d p l a t e d o n a p p r o p r i a t e a n t i b i o t i c c o n t a i n i n g p l a t e s . P l a s m i d P u r i f i c a t i o n : F o l l o w i n g s u c c e s s f u l t r a n s f o r m a t i o n i n t o e i t h e r J M 1 0 9 o r X L l - B l u e c o m p e t e n t c e l l s ( T e t r e s i s t a n t ) , a c o l o n y w a s g r o w n u p i n 5 0 0 m L L B ( c o n t a i n i n g a p p r o p r i a t e a n t i b i o t i c s ) a n d p u r i fi e d w i t h v i a Q i a g e n ® c o l u m n p u r i fi c a t i o n . U p o n c o m p l e t i o n o f t h e Q i a g e n ® p u r i fi c a t i o n , t h e r e c o v e r e d D N A w a s r e s u s p e n d e d i n a p p r o x i m a t e l y 4 0 0 1 1 L s t e r i l e w a t e r , a n d a n a l y z e d b y U V - v i s f o r c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n a t i o n a n d p u r i t y . C o n c e n t r a t i o n o f D N A s a m p l e ( p g / u L ) = A b 3 2 6 0 x ( 5 0 u g / 1 0 0 0 1 1 L ) x ( v o l u m e o f D N A u s e d / t o t a l v o l u m e U V s a m p l e ) P u r i t y o f D N A s a m p l e = A b 8 2 6 0 / A s z g o = 1 . 8 , p u r e > 1 . 8 , R N A c o n t a m i n a t i o n < 1 . 8 , p r o t e i n c o n t a m i n a t i o n S a m p l e p r e p a r a t i o n f o r s e q u e n c i n g D N A : I n a s t e r i l i z e d 0 . 5 m L e p p e n d o r f t u b e , c o m b i n e 1 p g D N A a n d 3 0 p m o l p r i m e r ( 5 ’ C G T T G T A A A A C G A C G G C C A G C G , f o r p E T - B l u e 2 p l a s m i d , a p p r o x i m a t e l y 7 5 b a s e p a i r s u p s t r e a m f r o m t h e d e s i r e d s e q u e n c e s t a r t i n g p o s i t i o n ) i n a c o m b i n e d t o t a l v o l u m e o f 1 2 M L w i t h s t e r i l e w a t e r . T h e D N A s h o u l d h a v e b e e n p u r i fi e d b y a Q i a g e n c o l u m n a n d 1 3 9 r e s u s p e n d e d i n s t e r i l e w a t e r . F a i l u r e t o d o t h i s w i l l r e s u l t i n p o o r s e q u e n c e d a t a . I n a d d i t i o n , t h e s e q u e n c e s a m p l e s h o u l d b e d i l u t e d w i t h s t e r i l e w a t e r , n o t b u f f e r . P r o t e i n E x p r e s s i o n o f a C l o n e w i t h a H i s t i d i n e P u r i f i c a t i o n T a g : A 1 0 0 m L L B c u l t u r e w a s i n o c u l a t e d w i t h t h e a p p r o p r i a t e p l a s m i d ( p E T - B l u e 2 + C R A B P I I , A m p r e s i s t a n t ) c o n t a i n i n g c e l l ( T u n e r ( D E 3 ) p L a c I , C l m r e s i s t a n t ) , a n t i b i o t i c s w e r e a d d e d ( a m p i c i l l i n , 1 0 0 m g / m L a n d C h l o r a m p h e n i c o l , 2 5 m g / m L ) a n d g r o w n o v e r n i g h t a t 3 7 ° C w i t h s h a k i n g . T h i s c u l t u r e w a s t h e n u s e d t o i n o c u l a t e o n e l i t e r o f L B ( c o n t a i n i n g a p p r o p r i a t e a n t i b i o t i c s ) a n d g r o w n a t 3 7 ° C w i t h s h a k i n g u n t i l t h e a b s o r b a n c e a t 6 0 0 n m r e a c h e d 0 . 6 - 0 . 8 . A t t h i s t i m e , i s o - p r o p y l t h i o g a l a c t o s i d e ( I P T G ) w a s a d d e d t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 0 m M a n d a l l o w e d t o g r o w a t 3 2 ° C w i t h s h a k i n g f o r a n a d d i t i o n a l 5 h . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d ( 6 , 0 0 0 r p m , 2 0 m i n , 4 ° C ) , r e s u s p e n d e d i n m i n i m a l ( 2 0 - 5 0 m L ) b i n d i n g b u f f e r ( 5 0 m M N a H 2 P 0 4 , 3 0 0 m M N a C l , 1 0 m M i m i d a z o l e , p H = 8 ) , a n d f r o z e n o v e r n i g h t a t — 2 0 ° C . E x p r e s s i o n t e m p e r a t u r e s m a y n e e d t o b e o p t i m i z e d t o fi n d t h e h i g h e s t l e v e l o f p r o t e i n p r o d u c t i o n . F o r t h i s c l o n e , 3 2 ° C w a s f o u n d t o b e t h e b e s t f r o m 2 8 ° C — 3 7 ° C e x p r e s s i o n s . L y s i s o f a C e l l P e l l e t : T h e f o l l o w i n g m o r n i n g t h e f r o z e n c e l l p e l l e t w a s a l l o w e d t o t h a w o n i c e , a f t e r w h i c h t i m e l y s o z y m e ( 0 . 5 - 1 . 0 m g / m L ) w a s a d d e d a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e o n i c e f o r 3 0 m i n . O p t i o n a l l y , t h e l y s a t e w a s e i t h e r s u b j e c t e d t o 2 - 3 m o r e c y c l e s o f f r e e z i n g a n d t h a w i n g , o r w a s s o n i c a t e d f o r t h r e e o n e n r i n u t e c y c l e s . F i n a l l y , b e n z o n a s e ( 2 5 U / m L , 1 4 0 N o v a g e n ) a n d m a g n e s i u m ( 1 m M ) w e r e a d d e d a n d a l l o t t e d 3 0 m i n o n i c e . F o l l o w i n g t h i s , t h e c e l l m i x t u r e w a s s p u n d o w n ( 6 , 0 0 0 r p m , 3 0 m i n , 4 ° C ) a n d t h e l y s a t e c o n t a i n i n g s o l u b l e p r o t e i n s e p a r a t e d f r o m t h e c e l l p e l l e t . P u r i f i c a t i o n o f a C l o n e w i t h a H i s t i d i n e P u r i f i c a t i o n T a g : T h e l y s a t e , c o n t a i n i n g t h e H i s t a g e n c o d e d p r o t e i n , i s a p p l i e d t o a n i c k e l r e s i n f o r p u r i fi c a t i o n ( N o v a g e n ) . T h e l y s a t e w a s a l l o w e d t o fl o w t h r o u g h t h e c o l u m n , a f t e r w h i c h t i m e i t w a s w a s h e d ( 2 x 1 0 m L ) w i t h t h e w a s h b u f f e r ( 5 0 m M N a H 2 P 0 4 , 3 0 0 m M N a C l , 2 0 m M i m i d a z o l e , p H = 8 ) . T h e p r o t e i n w a s e l u t e d w i t h t h e e l u t i o n b u f f e r ( 5 0 m M N a H z P O 4 , 3 0 0 m M N a C l , 2 5 0 m M i m i d a z o l e , p H = 8 ) , a n d t h e f r a c t i o n s w e r e t h e n a n a l y z e d b y S D S - P A G E . T h e f r a c t i o n s c o n t a i n i n g p r o t e i n w e r e t h e n c o n c e n t r a t e d w i t h A m i c o n C e n t r i p l u s Y M - l O fi l t e r s , a n d b u f f e r e x c h a n g e d t o 4 m M N a H z P O 4 , 1 6 m M N a z i — I P 0 4 , a n d 1 5 0 m M N a C l a t p H = 7 . 3 . P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n c a n b e r e s o l v e d v i a e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o r B i o R a d s t a n d a r d p r o t o c o l . I r n i d a z o l e f r o m t h e e l u t i o n b u f f e r m a y b e r e m o v e d b y a v a r i e t y o f m e t h o d s , b u t c a r e m u s t b e t a k e n t o e n s u r e t h a t i t i s i n d e e d a l l r e m o v e d f r o m t h e p r o t e i n s a m p l e . I r n i d a z o l e a b s o r b s a t 2 8 0 n m , t h e s a m e w a v e l e n g t h a s t h e p r o t e i n s i g n a t u r e p e a k o c c u r s . A n y i m i d a z o l e l e f t i n t h e s a m p l e w i l l i n t e r f e r e i n p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n a t i o n , w h i c h m a y c a u s e i n c o r r e c t i n t e r p r e t a t i o n s o f s p e c t r o s c o p i c d a t a . 1 4 1 P u r i f i c a t i o n o f 6 x - I - I i s P r o t e i n U n d e r D e n a t u r i n g C o n d i t i o n s : A f t e r t h e c e l l c u l t u r e h a s b e e n s p u n d o w n , i t i s r e s u s p e n d e d i n o n e o f t w o b i n d i n g b u f f e r s ( B u f f e r l : 6 M G n d H C l , 0 . 1 M N a H z P O 4 , 0 . 0 1 M T r i s H C l , p H = 8 , l y s o z y m e = 1 m g / m L o r B u f f e r 2 : 8 M U r e a , 0 . 1 M N a H z P O 4 , 0 . 0 1 M T r i s H C l , p H = 8 , l y s o z y m e = 1 m g / m L . F o l l o w i n g a 3 0 m i n u t e i n c u b a t i o n t i m e o n i c e t o a l l o w f o r c o m p l e t e c e l l l y s i s , i t i s a p p l i e d t o t h e c o l u m n a n d w a s h e d o u t w i t h t h e w a s h b u f f e r ( 8 M U r e a , 0 . 1 M N a H z P O 4 , 0 . 0 1 M T r i s H C l , p H = 6 . 3 ) , t h e n e l u t e d w i t h t h e fi r s t e l u t i o n b u f f e r ( 8 M U r e a , 0 . 1 M N a H z P O 4 , 0 . 0 1 M T r i s H C l , p H = 5 . 9 ) , f o l l o w e d b y c o m p l e t e e l u t i o n w i t h 8 M U r e a , 0 . 1 M N a H 2 P 0 4 , 0 . 0 1 M T r i s H C l , p H = 4 . 5 . T h e f r a c t i o n s c o l l e c t e d a r e t h e n a n a l y z e d b y S D S - P A G E . N i 2 + R e s i n R e g e n e r a t i o n : R e s i n i s r e g e n e r a t e d a n d r e c y c l e d a f t e r e a c h u s e b y fi r s t s t r i p p i n g t h e c o l u m n o f a l l N i 2 + i o n s a n d a n y t h i n g b o u n d t o t h e m . T h e c o l u m n i s w a s h e d w i t h t h r e e c o l u m n l e n g t h s o f t h e s t r i p b u f f e r ( 1 0 0 m M E D T A , 0 . 5 M N a C l , 2 0 m M T r i s H C l , p H = 7 . 9 ) , f o l l o w e d b y t h r e e c o l u m n l e n g t h s o f s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r . T h e c o l u m n i s t h e n r e c h a r g e d w i t h f i v e c o l u m n l e n g t h s o f a f r e s h , c l e a n N i 2 + s o u r c e u t i l i z i n g t h e c h a r g e b u f f e r ( 5 0 m M N i S O 4 ) . F i n a l l y , t h e c o l u m n i s e q u i l i b r a t e d w i t h t h r e e c o l u m n l e n g t h s o f b i n d i n g b u f f e r ( 5 0 m M N a H z P O 4 , 3 0 0 m M N a C l , 1 0 m M i m i d a z o l e , p H = 8 ) t o w a s h a w a y a n y u n b o u n d N i “ i o n s . T h e c o l u m n c a n b e r e c y c l e d a s l o n g a s i t r e t a i n s a b l u e / g r e e n c o l o r a f t e r t h e c l e a n i n g . 1 4 2 E x t e n d e d N i 2 + R e s i n R e g e n e r a t i o n : W h e n t h e fl o w r a t e o f t h e c o l u m n s l o w s d r a m a t i c a l l y , o r d o e s n o t t u r n a s t r o n g b l u e / g r e e n a f t e r b e i n g w a s h e d w i t h c h a r g e b u f f e r , t h e f o l l o w i n g w a s h s h o u l d b e d o n e ( f o r a 2 . 5 m L c o l u m n b e d ) : 1 . 5 m L o f 6 M g u a n i d i n e H C l , 0 . 2 M A c e t i c A c i d 2 . 5 m L s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r 3 . 2 . 5 m L 2 % S D S 4 . 2 . 5 m L 2 5 % E t O H 5 . 2 . 5 m L 5 0 % E t O H 6 . 2 . 5 m L 7 5 % E t O H 7 . 1 2 . 5 m L 1 0 0 % E t O H 8 . 2 . 5 m L 7 5 % E t O H 9 . 2 . 5 m L 5 0 % E t O H 1 0 . 2 . 5 m L 2 5 % E t O H 1 1 . 2 . 5 m L s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r 1 2 . 1 2 . 5 1 0 0 m M E D T A , p H = 8 . 0 1 3 . 7 . 5 m L s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r 1 4 . 7 . 5 2 0 % E t O H ( f o r p r o l o n g e d s t o r a g e ) N o t e t h a t t h e S D S s o l u t i o n s a n d t h e S D S w a s h s t e p s c a n n o t b e d o n e i n t h e c o l d r o o m a s t h e d e t e r g e n t p r e c i p i t a t e s o u t o f s o l u t i o n . A l s o , t h e c o l u m n s h o u l d b e s t o r e d i n 2 0 % E t O H w h e n n o t i n u s e f o r l o n g p e r i o d s o f t i m e b e c a u s e b a c t e r i a c a n g r o w i n t h e a g a r o s e r e s i n . 1 4 3 E x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t d e t e r m i n a t i o n : U s i n g t h e m e t h o d o f G i l l a n d v o n H i p p e l , 1 3 f i r s t t h e n u m b e r o f t r y p t o p h a n , t y r o s i n e , a n d c y s t e i n e r e s i d u e s i n t h e p r o t e i n m u s t b e d e t e r m i n e d , a n d u s e d t o c a l c u l a t e t h e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o f t h e d e n a t u r e d p r o t e i n ( E d e n ) b y : E d e n = a E t y r + b e t r p + C E C y s w h e r e a , b , a n d 0 r e p r e s e n t t h e n u m b e r o f r e s p e c t i v e a m i n o a c i d s p e r m o l e c u l e o f p r o t e i n , a n d t h e i r 8 v a l u e s h a v e b e e n d e t e r m i n e d e x p e r i m e n t a l l y ( e , y r = 5 6 9 0 M ’ 1 c m ' l , e m , = 1 2 8 0 M ' 1 c m ] , 8 c h = 1 2 0 M ’ 1 c m ' l , w i l d t y p e C R A B P H p r o t e i n c o n t a i n s 3 T r p , 2 T y r , a n d 3 C y s r e s i d u e s ) . T w o p r o t e i n s o l u t i o n s a r e m a d e , a t i d e n t i c a l c o n c e n t r a t i o n s , o n e i n t h e n a t i v e b u f f e r ( 4 m M N a H z P O 4 , 1 6 m M N a z l - I P O 4 , 1 5 0 m M N a C l , p H = 7 . 3 ) a n d t h e o t h e r i n a d e n a t u r i n g b u f f e r ( 6 M g u a n i d i n e - H C I , 4 m M N a H z P O 4 , 1 6 m M N a Z I - I P O 4 , 1 5 0 m M N a C l ) , a n d t h e A s z g o f o r e a c h s a m p l e i s m e a s u r e d . T o d e t e r m i n e t h e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t f o r t h e n a t u r e d p r o t e i n ( e m ) , w e u t i l i z e B e e r ' s L a w : A b s d e n + 8 d e n = C d e n A b s n a t + S e a t = c n a t S i n c e t h e c o n c e n t r a t i o n o f b o t h s a m p l e s i s t h e s a m e , w e c a n e q u a t e t h e t w o e q u a t i o n s a n d s o l v e f o r t h e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t b y : E n a t = ( A b s n a t ) ( 8 d e n ) + ( A b s d e n ) 1 4 4 U V - V i s t i t r a t i o n s o f C R A B P I I w i t h r e t i n a l : A s t o c k s o l u t i o n o f r e t i n a l ( T o r o n t o R e s e a r c h C o m p a n y , 6 = 4 8 , 0 0 0 M " , c m " , k m , “ = 3 8 0 n m ) i s m a d e i n 9 5 % s p e c t r o s c o p y g r a d e E t O H , k e e p i n g i n m i n d t h a t w e w a n t t o k e e p < 2 % v o l u m e o f E t O H a f t e r a d d i n g t w o e q u i v a l e n t s o f c h r o m o p h o r e t o o u r 1 m L p r o t e i n s a m p l e . F o r a 5 x 1 0 6 M p r o t e i n s o l u t i o n i n P B S ( 4 m M N a H 2 P 0 4 , 1 6 m M N a z H P O 4 , 1 5 0 m M N a C l , p H = 7 . 3 ) , t h e r e t i n a l s t o c k s o l u t i o n i s m a d e a t 2 . 5 m M . I n t h i s c a s e , 2 1 1 L o f t h e r e t i n a l s o l u t i o n w i l l b e 0 . 1 e q u i v a l e n t s . A d d i t i o n s f r o m 0 . 1 — 2 . 0 e q u i v a l e n t s a t 0 . 1 e q u i v a l e n t i n c r e m e n t s w e r e a d d e d a n d s p e c t r a r e c o r d e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f r o m 2 0 0 - 6 0 0 n m ( L a m b d a 4 0 , P e r k i n E l m e r ) . T h i s r e t i n a l t i t r a t i o n w a s d o n e f o r b o t h t h e p r o t e i n s a m p l e s , a n d P B S o n l y t o s e r v e a s o u r b l a n k . D u e t o t h e l o w b i n d i n g a f fi n i t y o f r e t i n a l w i t h m o s t p r o t e i n m u t a n t s , a n d t h e o v e r w h e l m i n g p r e s e n c e o f t h e 3 8 0 n m f r e e a l d e h y d e p e a k , t h e r e t i n a l t i t r a t i o n p e r f o r m e d i n b u f f e r o n l y w a s s u b t r a c t e d f r o m t h e r e t i n a l p r o t e i n t i t r a t i o n c u r v e , i . e . , 0 . 2 e q u i v a l e n t s o f r e t i n a l m e a s u r e d i n b u f f e r o n l y w a s s u b t r a c t e d f r o m t h e 0 . 2 r e t i n a l e q u i v a l e n t p r o t e i n s p e c t r u m . T h i s w a s d o n e f o r e v e r y p o i n t t a k e n s o l e l y t o h e l p d e c o n v o l u t e t h e r e d s h i f t e d p e a k f r o m t h e r e s t o f t h e s p e c t r a . S p e c t r a w e r e c o n s i d e r e d i n b o t h t h e u n c o r r e c t e d f o r m ( r a w d a t a ) , a n d t h i s c o r r e c t e d f o r m . T h e p e a k s a p p e a r i n g i n t h e c o r r e c t e d U V - v i s s p e c t r a v e r y c l o s e l y c o r r e l a t e t o p e a k s p r e s e n t i n t h e u n c o r r e c t e d s p e c t r a , a s d e c o n v o l u t e d b y t a k i n g t h e s e c o n d d e r i v a t i v e . 1 4 S F l u o r e s c e n c e T i t r a t i o n s T h e c u v e t t e i s a l l o w e d t o s i t w i t h 3 m L o f a 0 . 0 1 % g e l a t i n c o n t a i n i n g P B S ( 4 m M N a H z P O 4 , 1 6 m M N a z l - I P O 4 , 1 5 0 m M N a C l , p H = 7 . 3 ) f o r 3 0 - 6 0 m i n . T h i s b u f f e r i s d u m p e d a n d t h e c e l l r i n s e d o n c e w i t h d i s t i l l e d w a t e r . T h e c u v e t t e s a r e a l l h a n d l e d w h i l e w e a r i n g g l o v e s s o a s t o a v o i d b o t h fi n g e r p r i n t s a n d l i n t . T h e n 3 m L o f a r o o m t e m p e r a t u r e 5 e “ 7 M p r o t e i n i s a d d e d t o t h e c e l l . T h e s a m p l e i s e x c i t e d a t 2 8 3 n m w i t h a s l i t w i d t h a b o u t 1 . 5 n m ; t h i s v a r i e s a l i t t l e t o e n s u r e t h e i n t e n s i t y o f e a c h s a m p l e r e m a i n s b e l o w o n e m i l l i o n c o u n t s . T h e fl u o r e s c e n c e i s m e a s u r e d a t t h e p e a k m a x i m u m , a b o u t 3 4 5 n m , b u t a g a i n v a r i e s s o m e w h a t f o r e a c h p r o t e i n . T h e c h r o m o p h o r e i s a d d e d i n a t v a r y i n g e q u i v a l e n t s f r o m a 1 . 5 e ' 3 M s t o c k ( i n 9 5 % s p e c t r o s c o p y g r a d e E t O H ) s a m p l e m a i n t a i n e d i n t h e d a r k . A m e a s u r e m e n t i s t a k e n f o r e a c h c h r o m o p h o r e a d d i t i o n a t t h e s a m e w a v e l e n g t h . T h i s i s p l o t t e d a s c o n c e n t r a t i o n o f c h r o m o p h o r e v e r s u s r e l a t i v e fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y . W h e n t h e c u r v e l e v e l s o f f , t h e t i t r a t i o n i s c o m p l e t e . I f t h e c h r o m o p h o r e i s r e t i n o i c a c i d ( S i g m a , 8 = 4 5 , 0 0 0 M ' l , c m ' l , A m , “ = 3 5 0 n m ) , t h e d a t a c a n b e p l o t t e d a s i s . T h e r e i s m i n i m a l e f f e c t o f R A o n T r p e m i s s i o n a s s e e n i n a b l a n k t i t r a t i o n r u n w i t h N - a c e t y l t r y p t o p h a n a m i d e . I f t h e c h r o m o p h o r e i s r e t i n a l ( T o r o n t o R e s e a r c h C o m p a n y , 8 = 4 8 , 0 0 0 M ' l , c m ' l , A m , = 3 8 0 n m ) , a b l a n k t i t r a t i o n m u s t b e r u n w i t h 3 m L o f 1 . 5 e 4 5 M N - a c e t y l t r y p t o p h a n a m i d e . T h e p e a k m a x i m u m f o r t h e b l a n k i s a t 3 6 5 n m . T h i s c u r v e i s p l o t t e d a s c o n c e n t r a t i o n o f r e t i n a l v e r s u s c h a n g e i n i n t e n s i t y . T h e r e t i n a l s e e m s t o a b s o r b s o m e o f t h e e m i s s i o n o b s e r v e d t h r o u g h t h e T r p r e s i d u e s . T h i s w i l l b e a d d e d b a c k i n t o e a c h o f t h e p r o t e i n / c h r o m o p h o r e t i t r a t i o n s . 1 4 6 T h e c o r r e c t i o n f o r t h e r e t i n a l t i t r a t i o n s i n v o l v e s a f o u r s t e p c a l c u l a t i o n a f t e r t h e c o m p l e t i o n o f b o t h t h e p r o t e i n t i t r a t i o n a n d t h e b l a n k t i t r a t i o n . 3 3 1 . D e t e r m i n e a v a l u e o f o r f o r e v e r y p o i n t o n t h e c u r v e . F m a x — F a : — F m — F 0 F m = F l u o r e s c e n c e u p o n s a t u r a t i o n F 0 = i n i t i a l fl u o r e s c e n c e F = o b s e r v e d fl u o r e s c e n c e a = f r a c t i o n o f f r e e b i n d i n g s i t e s 2 . D e t e r m i n e t h e f r e e l i g a n d c o n c e n t r a t i o n , R . R = R 0 — n P o ( l - o c ) R 0 = l i g a n d c o n c e n t r a t i o n 1 1 = # b i n d i n g s i t e s / p r o t e i n , a s s u m e n = 1 P 0 = p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n 3 . F i n d fl u o r e s c e n c e c o n t r i b u t i o n o f f r e e l i g a n d , F 3 , t o b e d e d u c e d f r o m b l a n k . 4 . S u b t r a c t fl u o r e s c e n c e c o n t r i b u t i o n o f f r e e l i g a n d f r o m a c t u a l r e a d i n g s , p l o t v s . l i g a n d c o n c e n t r a t i o n . ( F - F R ) V S . R 0 1 4 7 5 . U s i n g t h e v a l u e s i n 4 , t h e c o r r e c t i o n c a n b e r e p e a t e d a s e c o n d t i m e , c a l c u l a t i n g n e w o r v a l u e s . I h a v e f o u n d t h i s t o m o s t l y b e u n n e c e s s a r y . A n e x a m p l e o f t h e c o r r e c t i o n p r o c e d u r e i s g i v e n b e l o w . F i r s t , a t i t r a t i o n i s p e r f o r m e d w i t h r e t i n a l i n t o a 3 m L s o l u t i o n o f 1 . 5 e ' 6 M N - a c e t y l t r y p t o p h a n a m i d e i n P B S . R e s u l t s o f t h i s e x p e r i m e n t a r e s h o w n b e l o w ( n o t a l l d a t a p o i n t s a r e s h o w n ) . T h e T r p fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y i s r e c o r d e d a t 3 6 5 n m f o r e a c h a d d i t i o n o f r e t i n a l , w h i c h i s t h e n c o n v e r t e d t o a r e l a t i v e i n t e n s i t y b y d i v i d i n g a l l i n t e n s i t y v a l u e s b y t h e i n i t i a l i n t e n s i t y r e a d i n g , 9 6 4 , 2 7 8 . R e l a t i v e v a l u e s a r e u s e d s o t h a t a l l t i t r a t i o n c u r v e s w i l l b e p l o t t e d o n t h e s a m e s c a l e . T h i s i s t h e n c o n v e r t e d t o a r e l a t i v e d r o p i n i n t e n s i t y b y s u b t r a c t i n g 1 f r o m a l l r e l a t i v e i n t e n s i t y v a l u e s . T h i s i s t h e a m o u n t o f T r p fl u o r e s c e n c e t h a t i s q u e n c h e d b y a d d i t i o n o f r e t i n a l t h r o u g h n o n s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s . T h i s i s t h e a m o u n t t h a t w i l l h a v e t o b e a d d e d b a c k i n t o t h e p r o t e i n t i t r a t i o n s . T h e s e d a t a p o i n t s a r e t h e n p l o t t e d a s r e l a t i v e l o s s i n i n t e n s i t y v e r s u s r e t i n a l c o n c e n t r a t i o n , a n d fi t t e d t o a c u r v e t o g e n e r a t e t h e e q u a t i o n : y = 5 E - 0 5 x 2 - 0 . 0 1 2 x - 0 . 0 2 5 7 1 4 8 B l a n k T i t r a t i o n : ’ [ R t ] 0 5 E - 0 8 T ” l E - 0 7 1 . 5 1 3 0 7 2 6 0 7 2 . 5 1 5 0 7 2 3 1 3 - 0 7 ’ 3 . 5 E - 0 7 4 E - 0 7 ’ 4 . 5 6 - 0 7 ‘ ' 5 1 3 - 0 7 6 E - 0 7 ’ ’ ” 7 E - 0 7 ' 8 E - 0 7 ‘ ’ 9 E - O 7 0 0 0 0 0 0 1 L I E - 0 6 1 . 2 E - 0 6 1 . 3 E - 0 6 1 . 4 E - 0 6 ‘ 1 . 5 E - O 6 1 . 6 E - 0 6 1 . 7 E - 0 6 1 . 8 E - O 6 * 1 . 9 6 0 6 0 . 0 0 0 0 0 2 ' 2 . 2 E - 0 6 2 . 4 E - 0 6 2 . 6 E - 0 6 " 2 . 8 E - 0 6 T 0 . 0 0 0 0 0 3 ; 2 : 2 3 . 2 E - 0 6 3 . 4 E - 0 6 3 . 6 1 3 0 6 3 . 8 E - 0 6 0 . 0 0 0 0 0 4 4 . 2 1 3 0 6 4 . 4 1 3 0 6 ‘ ' 4 . 6 E - 0 6 _ 4 . 8 6 0 6 0 . 0 0 0 0 0 5 1 0 . 0 0 0 0 0 6 ’ 0 . 0 0 0 0 0 7 . ‘ 0 . 0 0 0 0 0 8 j 0 . 0 0 0 0 0 9 1 0 . 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 2 ‘ ' . I n t . @ 3 6 5 9 6 4 2 7 8 9 5 9 0 7 8 ' 9 5 5 2 9 4 ' 9 5 3 8 4 8 9 4 9 3 8 8 ‘ 9 4 5 5 0 8 9 4 0 9 4 5 9 3 7 6 9 9 9 3 4 7 3 4 9 3 3 8 2 0 ’ 9 3 1 0 2 7 9 2 5 2 2 8 9 2 0 9 4 0 9 2 0 3 1 3 9 1 3 9 3 7 9 1 2 9 8 9 ‘ 9 0 9 6 6 1 9 0 6 6 7 3 9 0 2 6 6 0 _ 8 9 8 6 5 1 - . . 8 9 8 4 4 0 8 9 4 2 9 7 8 9 3 5 8 5 . 8 9 1 8 9 9 8 8 9 8 0 4 8 8 7 8 4 7 8 8 4 4 3 9 8 7 5 5 2 5 ' 8 7 0 2 8 7 ‘ 8 6 4 6 2 5 8 6 3 1 8 5 8 5 8 7 5 3 8 5 5 0 4 0 8 5 6 5 1 5 ' 8 4 9 3 6 7 8 4 6 1 3 7 8 4 1 3 1 8 8 4 0 1 7 0 8 3 7 7 2 1 8 3 2 8 5 1 8 3 0 4 3 4 N 8 0 9 2 8 4 ' , 7 8 8 8 5 7 7 6 3 7 9 5 7 4 7 9 8 3 7 3 2 3 2 1 7 0 1 8 3 4 R e l . I n t . , 1 ' 0 9 9 4 6 0 7 3 6 4 f 0 9 9 0 6 8 3 1 8 5 ; 0 . 9 8 9 1 8 3 6 1 7 0 9 8 4 5 5 8 3 9 5 1 0 9 8 0 5 3 4 6 5 9 " 0 . 9 7 5 8 0 2 6 2 1 ; ' 0 . 9 7 2 4 3 6 3 7 2 ” f 0 9 6 9 3 6 1 5 3 3 { ' 0 9 6 8 4 1 3 6 7 3 ‘ T _ 0 9 6 5 5 1 7 2 0 6 } 0 9 5 9 5 0 3 3 8 ? 0 9 5 5 0 5 6 5 2 9 : ' 0 9 5 4 4 0 6 3 0 2 7 ’ 0 9 4 7 7 9 4 1 0 1 ’ 3 f ' 0 0 5 3 1 8 9 0 1 8 0 9 4 6 8 1 0 9 8 2 ’ 0 9 4 3 3 5 9 6 9 5 . 0 9 4 0 2 6 1 0 0 4 ' ‘ 0 9 3 6 0 9 9 3 4 1 0 9 3 1 9 4 1 8 2 6 0 9 3 1 7 2 3 0 0 9 1 0 9 2 7 4 2 6 5 3 1 E 0 9 2 6 6 8 8 1 5 4 : 0 9 2 4 9 3 9 6 9 6 3 ’ 0 9 2 2 7 6 7 0 8 6 ; 0 9 2 0 7 3 7 5 8 8 ‘ 0 9 1 7 2 0 3 3 3 8 j 0 9 0 7 9 5 9 1 1 6 3 0 9 0 2 5 2 7 0 7 2 . 0 8 9 6 6 5 5 3 2 1 0 8 9 5 1 6 1 9 7 6 ; ' 0 . 8 9 0 5 6 5 7 9 1 ; - 0 8 8 6 7 1 5 2 4 2 3 0 8 8 8 2 4 4 8 8 4 ' 0 8 8 0 8 3 2 0 8 4 j ' 0 8 7 7 4 8 2 4 2 7 5 " ‘ 0 8 7 2 4 8 4 9 0 6 3 ' 0 8 7 1 2 9 4 3 7 8 a 0 8 6 8 7 5 4 6 5 4 0 8 6 3 7 0 4 2 4 3 : 0 8 6 1 1 9 7 7 0 4 9 0 8 3 9 2 6 4 1 9 6 2 ‘ ’ 0 8 1 8 0 8 0 4 7 1 ' f 0 7 9 2 0 9 0 0 4 7 0 7 7 5 6 9 2 2 8 . 9 7 5 9 4 5 9 9 7 5 . . - . 0 7 2 7 8 3 3 6 7 5 1 4 9 l - R e l . 1 n t . D r o p s 0 . 0 . 0 0 5 3 9 2 6 3 6 0 . 0 0 9 3 1 6 8 1 5 0 . 0 1 0 8 1 6 3 8 3 0 0 1 5 4 4 1 6 0 5 0 0 1 9 4 6 5 3 4 1 0 . 0 2 4 1 9 7 3 7 9 0 . 0 2 7 5 6 3 6 2 8 0 0 3 0 6 3 8 4 6 7 ’ 0 0 3 1 5 8 6 3 2 7 0 0 3 4 4 8 2 7 9 4 0 0 4 0 4 9 6 6 2 0 0 4 4 9 4 3 4 7 1 0 0 4 5 5 9 3 6 9 8 - 0 . 0 5 2 2 0 5 8 9 9 0 0 5 6 6 4 0 3 0 5 ‘ 0 0 5 9 7 3 8 9 9 6 0 0 6 3 9 0 0 6 5 9 0 0 6 8 0 5 8 1 7 4 0 0 6 8 2 7 6 9 9 1 0 0 7 2 5 7 3 4 6 9 . 8 . 5 9 0 7 3 3 1 1 . 8 . 4 . 6 . 0 0 7 5 0 6 0 3 0 4 0 0 7 7 2 3 2 9 1 4 0 0 7 9 2 6 2 4 1 2 0 0 8 2 7 9 6 6 6 2 0 0 9 2 0 4 0 8 8 4 0 0 9 7 4 7 2 9 2 8 ‘ 0 1 0 3 3 4 4 6 7 9 0 1 0 4 8 3 8 0 2 4 0 1 0 9 4 3 4 2 0 9 0 1 1 3 2 8 4 7 5 8 0 1 1 1 7 5 5 1 1 6 0 1 1 9 1 6 7 9 1 6 0 1 2 2 5 1 7 5 7 3 ‘ 0 1 2 7 5 1 5 0 9 4 0 . 1 2 8 7 0 5 6 2 2 0 1 3 1 2 4 5 3 4 6 0 1 3 6 2 9 5 7 5 7 2 0 1 3 8 8 0 2 2 9 6 0 1 6 0 7 3 5 8 0 4 - 0 . 1 8 1 9 1 9 5 2 9 - 0 . 2 0 7 9 0 9 9 6 - 0 . 2 2 4 3 0 7 7 2 ‘ 0 2 4 0 5 4 9 9 2 4 0 2 7 2 1 6 6 3 2 5 " T h e s a m e r e t i n a l s o l u t i o n i s u s e d t o t i t r a t e t h e d e s i r e d C R A B P H p r o t e i n . F l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y i s m e a s u r e d a t a p p r o x i m a t e l y 3 4 7 n m ( p r o t e i n d e p e n d e n t ) , t h e b u f f e r fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y ( 2 0 , 0 0 0 ) i s s u b t r a c t e d f r o m e a c h r e a d i n g , a n d t h e s e v a l u e s a r e a g a i n c o n v e r t e d t o r e l a t i v e i n t e n s i t y r e a d i n g s a s e a c h v a l u e i s d i v i d e d b y t h e i n i t i a l f l u o r e s c e n c e v a l u e , 7 0 0 , 9 6 1 . 1 5 0 P r o t e i n T i t r a t i o n : 0 2 0 0 ‘ 5 E 3 0 8 1 1 3 0 7 . L S E L O 7 ' ' 2 E 3 0 7 : 1 5 1 3 0 7 ' ” 3 E - 0 7 1 2 1 5 1 3 0 7 . 4 E - 0 7 4 . 5 E - 0 7 5 E - 0 7 6 E - 0 7 7 5 3 0 7 ’ 8 6 3 0 7 9 5 3 0 7 1 1 3 0 6 : 1 1 1 3 0 6 ' 1 2 E > 0 6 i 1 3 5 3 0 6 ’ 1 4 1 3 0 6 ' 1 5 E 3 0 6 - 1 4 6 E 3 0 6 f " 1 . 7 E 3 0 6 { ' ‘ : 1 8 E 3 0 6 . L 9 E 3 0 6 ’ 2 E - 0 6 2 1 2 1 3 0 6 7 2 . 4 E - 0 6 ‘ 2 . 6 E - 0 6 i 2 . 8 E - 0 6 ; 3 1 3 - 0 6 _ 3 . 2 E - O 6 : ; 3 ' 4 E ' 0 6 : 3 £ fi 3 0 6 . 3 . 8 E - 0 6 4 & 9 0 6 , . 1 _ 4 1 2 E 3 0 6 1 4 . 4 E - 0 6 ‘ 4 . 6 E - 0 6 4 . 8 E - 0 6 1 * 5 1 3 0 6 . E q . R t 1 0 0 1 ‘ ( 1 2 ' ( 1 3 ( 1 4 ( 1 5 ( 1 6 ( 1 7 ( 1 8 ( 1 9 1 1 2 1 4 1 6 1 8 N ' 2 : 1 2 2 3 4 2 ( 3 : 1 8 3 : 1 2 : 3 4 3 ( 3 " : 1 8 ' 4 ‘ 4 4 4 1 8 5 : 2 5 1 3 6 6 3 4 ’ ( 1 8 " 1 2 ' 1 6 8 8 x 4 ( 1 8 £ 1 2 9 1 5 1 0 7 2 0 9 6 1 6 8 1 6 9 4 6 5 8 2 2 6 6 3 7 3 5 6 6 2 0 9 5 9 ' 6 0 4 3 2 4 5 9 3 7 7 8 5 7 9 1 5 6 5 6 8 2 5 7 5 6 2 7 4 6 5 5 1 2 3 3 5 3 9 6 8 7 5 2 0 8 0 1 5 1 6 5 6 9 5 0 5 5 8 0 4 9 9 1 9 5 4 9 4 3 6 7 4 8 9 1 8 0 4 8 4 5 2 4 4 7 8 8 7 1 4 7 5 9 1 0 4 7 0 6 8 0 4 6 5 5 7 1 " 4 6 0 3 8 7 4 5 6 9 2 4 4 5 4 6 6 1 ' 4 4 8 2 6 0 4 4 1 7 6 1 " ' 4 3 8 8 0 3 4 3 3 2 7 0 4 2 8 8 9 2 4 2 4 4 7 5 4 2 1 5 5 4 " 4 1 8 1 2 6 1 1 4 1 2 6 2 6 4 0 9 5 9 4 “ ' 4 0 8 3 5 3 ’ 4 0 3 9 2 3 3 9 8 8 3 8 3 9 6 1 3 9 3 9 2 2 1 8 7 0 0 9 6 1 6 6 1 6 9 4 6 3 8 2 2 6 ‘ 6 1 7 3 5 6 6 0 0 9 5 9 5 8 4 3 2 4 1 ' 5 7 3 7 7 8 5 5 9 1 5 6 ” 5 4 8 2 5 7 5 4 2 7 4 6 5 3 1 2 3 3 5 1 9 6 8 7 5 0 0 8 0 1 4 9 6 5 6 9 4 8 5 5 8 0 ' 4 7 9 1 9 5 ‘ 4 7 4 3 6 7 4 6 9 1 8 0 4 6 4 5 2 4 4 5 8 8 7 1 4 5 5 9 1 0 ‘ 1 . . . 0 - 6 4 2 9 . 5 ' ~ 0 . 6 3 5 7 . 4 5 0 6 8 0 4 4 5 5 7 1 4 4 0 3 8 7 4 3 6 9 2 4 " 4 3 4 6 6 1 ‘ 4 2 8 2 6 0 1 H 4 2 1 7 6 l 4 1 8 8 0 3 7 4 1 3 2 7 0 4 0 8 8 9 2 4 0 4 4 7 5 " 4 0 1 5 5 4 ‘ 3 9 8 1 2 6 ’ . 3 9 2 6 2 6 ‘ . “ 3 8 9 5 9 4 g ” 3 8 8 3 5 3 ‘ " 3 8 3 9 2 3 ” 3 7 8 8 3 8 3 7 6 1 3 9 ' 3 7 2 2 . 1 8 . 1 5 1 ‘ H ( 1 9 4 4 I n t . @ 3 4 7 1 1 1 1 - 3 1 1 1 1 6 6 R e l . 1 m . . 1 ( 1 9 1 0 5 " 0 . 8 8 0 7 0 . 8 5 7 3 ‘ ' 0 . 8 3 3 6 ( 1 8 1 8 6 A ’ 0 . 7 9 7 7 0 . 7 8 2 2 , " 0 . 7 7 4 3 ' ' 0 . 7 5 7 9 : - ( 1 7 4 1 4 . " ( 1 7 1 4 4 i . 0 . 7 0 8 4 3 T ‘ 0 . 6 9 2 7 g 7 ' 0 . 6 8 3 6 ; 0 . 6 7 6 7 ‘ 0 . 6 6 9 3 ; 1 0 . 6 6 2 7 3 0 . 6 5 4 6 J ( 1 6 5 0 4 E 0 6 2 8 3 ; 0 - 6 2 3 3 * ; ’ ( 1 6 2 0 1 i ( 1 6 1 1 ( 1 6 0 1 7 i . 7 0 . 5 9 7 5 g v 0 . 5 8 9 6 p f 1 0 . 5 8 3 3 f 0 . 5 7 7 0 . 5 7 2 9 4 . . 3 0 . 5 6 8 . . ( 1 5 6 0 1 ; 1 0 . 5 5 5 8 : ' ( 1 5 5 4 [ 0 . 5 4 7 7 ‘ 2 0 . 5 4 0 5 * ; 0 . 5 3 6 6 ' “ 0 . 5 3 1 ' A s p l o t t e d , w i t h o u t t h e c o r r e c t i o n , t h e r e i s n o l e v e l i n g o f f o r s a t u r a t i o n p o i n t i n t h e c u r v e . 0 1 0 O 5 o 0 . 9 ~ ‘ 2 ” o 0 . 8 ‘ . 2 I L a 0 . 7 — . 2 E 0 . 6 ~ 1 % 0 . 5 7 1 l l l 0 2 4 6 8 1 0 E q u i v a l e n t s R e t i n a l C o r r e c t i o n p r o c e d u r e s b e g i n w i t h c a l c u l a t i o n o f t h e f r a c t i o n o f f r e e b i n d i n g s i t e s , 0 1 , u s i n g t h e e q u a t i o n : F m — F ( X : — P a m - F 0 F m = F l u o r e s c e n c e u p o n s a t u r a t i o n = 0 . 5 3 F 0 = i n i t i a l fl u o r e s c e n c e = 1 F = o b s e r v e d fl u o r e s c e n c e T h i s v a l u e i s u s e d t o d e t e r m i n e t h e f r e e l i g a n d c o n c e n t r a t i o n , R , f o r e a c h m e a s u r e m e n t . R = R 0 — n P o ( 1 - O L ) R 0 = l i g a n d c o n c e n t r a t i o n a t t h a t fl u o r e s c e n t m e a s u r e m e n t 1 5 2 n = # b i n d i n g s i t e s / p r o t e i n , a s s u m e n = 1 P 0 = p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n = 5 e ' 7 M N e x t , t h e fl u o r e s c e n c e c o n t r i b u t i o n o f f r e e l i g a n d , P R , i s t o b e d e d u c e d f r o m t h e e q u a t i o n a c q u i r e d d u r i n g t h e b l a n k t i t r a t i o n a n d t h e f r e e l i g a n d c o n c e n t r a t i o n , R , a s j u s t d e t e r m i n e d . F R = 5 1 3 0 5 1 1 2 - 0 . 0 1 2 R - 0 . 0 2 5 7 F i n a l l y , t h e fl u o r e s c e n c e c o n t r i b u t i o n o f f r e e l i g a n d i s s u b t r a c t e d f r o m t h e a c t u a l i n t e n s i t y r e a d i n g s a n d p l o t t e d v e r s u s r e t i n a l c o n c e n t r a t i o n o r e q u i v a l e n t s . ( F - F R ) v s . R 0 1 5 3 C o r r e c t e d P r o t e i n T i t r a t i o n : 0 1 1 0 . 9 2 1 5 6 1 0 . 8 7 4 6 8 2 ’ 0 . 8 3 2 9 9 3 0 . 8 0 0 2 3 9 0 . 7 6 7 0 0 9 ‘ 0 . 7 4 5 9 4 3 0 . 7 1 6 7 3 4 ' 0 . 6 9 4 9 6 3 0 . 6 8 3 9 5 4 ’ 0 . 6 6 0 9 5 6 0 . 6 3 7 8 9 2 0 . 6 0 0 1 6 6 0 . 5 9 1 7 1 2 0 . 5 6 9 7 6 1 0 . 5 4 7 3 6 2 0 . 5 3 7 0 0 1 0 . 5 2 7 7 0 5 1 6 4 0 8 i f 0 . 5 1 0 4 9 3 0 . 5 0 0 0 4 6 ‘ ‘ 0 . 4 8 9 8 4 0 . 4 7 9 4 8 5 0 . 4 7 2 5 6 7 0 . 4 6 8 0 4 7 0 . 4 5 5 2 6 0 . 4 4 2 2 7 8 0 . 4 3 6 3 6 9 0 4 2 5 3 1 7 0 . 4 1 6 5 7 1 0 . 4 0 7 7 4 8 0 . 4 0 1 9 1 3 0 . 3 9 5 0 6 6 0 . 3 8 4 0 7 9 0 . 3 7 8 0 2 2 0 . 3 7 5 5 4 3 7 0 . 3 6 6 6 9 4 0 . 3 5 6 5 3 6 0 . 3 5 1 1 4 5 R 0 . 1 . 0 8 E - 0 8 , 3 . 7 3 E - 0 8 . 6 . 6 5 E - 0 8 l E - 0 7 g 1 . 3 4 1 3 0 7 ' 1 . 7 3 1 3 0 7 2 . 0 8 E - 0 7 2 . 4 7 1 3 0 7 ‘ ' 2 . 9 2 1 3 0 7 ‘ 3 . 3 1 3 0 7 4 . 1 9 1 3 0 7 ' 5 E - 0 7 7 . 7 9 E - 0 7 f 8 . 7 4 E - O 7 ~ 9 . 6 9 E - 0 7 1 . 0 6 E - 0 6 ‘ 1 . 1 6 E - 0 6 1 . 2 6 1 3 0 6 ’ ‘ 1 . 3 5 E — O 6 ' 7 1 . 4 4 E - O 6 ‘ ‘ 1 . 5 4 E - 0 6 ; 1 . 6 4 E - 0 6 1 7 3 1 3 0 6 ‘ 1 . 9 3 1 3 0 6 2 . 1 2 1 3 0 6 ’ 2 . 3 2 1 3 0 6 2 . 5 1 1 3 0 6 E 2 . 7 1 1 3 0 6 ; ' 2 9 1 3 - 0 6 7 ' 3 . 1 E - 0 6 ‘ 2 3 . 3 1 3 0 6 4 3 . 4 9 E - O 6 3 . 6 9 1 3 0 6 3 . 8 9 1 3 0 6 4 . 0 8 1 3 0 6 4 . 2 8 6 0 6 4 . 4 8 1 3 0 6 0 . 3 4 3 3 1 3 i 4 9 7 5 - 0 6 F R 0 0 0 2 5 9 5 8 3 ’ 0 0 2 6 5 9 4 6 0 0 2 7 2 9 2 7 0 0 2 8 0 9 7 4 0 0 2 8 8 9 5 9 " 0 8 4 8 3 9 8 1 0 . 8 2 8 3 8 4 : i 0 . 8 1 3 7 6 9 - 0 . 0 2 9 8 3 9 3 - 0 . 0 3 0 6 8 4 8 - 0 . 0 3 1 6 1 8 6 0 . 0 3 2 6 8 0 2 ' _ ' . ‘ 0 . 7 9 1 4 6 2 w - 0 . 0 3 3 5 9 8 1 ’ 0 0 3 5 7 0 4 9 . 0 0 3 7 6 3 4 5 5 . 9 6 E - 0 7 ' ' 6 . 8 5 E - 0 7 ; 0 . 5 5 7 0 0 7 - 0 . 0 3 9 9 0 8 7 - 0 . 0 4 2 0 1 9 4 ‘ 0 0 4 4 2 3 5 6 0 0 4 6 4 8 5 1 0 0 4 8 7 2 2 5 0 0 5 0 9 6 8 8 0 0 5 3 1 8 8 1 0 0 5 5 4 6 6 9 0 0 5 7 6 8 8 8 0 0 5 9 9 1 0 . 0 6 2 1 2 5 8 - 0 . 0 6 4 3 7 8 1 — 0 . 0 6 6 6 5 4 5 - 0 . 0 7 1 1 5 2 5 - 0 . 0 7 5 6 3 3 3 0 0 8 0 1 8 0 5 1 ' 0 0 8 4 6 5 3 2 0 0 8 9 1 3 7 1 ' 0 0 9 3 6 0 4 8 f 0 0 9 8 0 9 1 2 0 1 0 2 5 5 0 6 0 1 0 6 9 4 7 9 0 1 1 1 3 8 5 4 " 0 1 1 5 8 4 7 5 0 1 2 0 2 2 2 7 0 1 2 4 5 6 8 ‘ 0 1 2 8 9 5 0 9 0 1 3 3 2 9 1 4 1 5 4 F - F R 1 0 . 9 6 9 9 4 0 . 9 3 7 0 9 6 0 . 9 0 8 0 2 1 ~ 0 . 8 8 5 4 3 3 1 0 . 8 6 2 5 0 . 8 0 6 9 6 9 ' 0 . 7 7 7 0 9 7 0 . 7 5 2 0 8 4 Y ~ 0 . 7 4 8 3 2 : 0 7 3 4 7 5 4 ' : ’ 0 7 2 7 8 6 1 ” ' 0 . 7 2 3 2 2 3 " 0 . 7 1 8 0 6 1 ‘ T 0 . 7 1 3 6 6 5 ' 0 . 7 0 7 8 1 9 ‘ , 0 . 7 0 5 8 7 4 } 0 . 7 0 0 6 3 5 1 0 . 6 9 5 5 6 7 } . 1 0 . 6 9 0 3 8 8 7 1 0 . 6 8 7 6 9 9 . 7 0 . 6 8 6 7 4 7 ' 7 0 . 6 8 2 1 1 4 0 . 6 7 7 3 2 3 ; ; 0 . 6 7 7 6 5 ; g 0 . 6 7 4 2 2 9 0 . 6 7 2 4 6 8 i T 0 . 6 7 0 6 3 4 ” I 0 . 6 7 0 9 5 3 ' 7 0 . 6 7 0 5 2 2 ‘ i ’ 0 . 6 6 7 0 7 3 , 0 . 6 6 7 1 8 5 i i 0 . 6 6 9 8 7 7 1 0 . 6 6 7 9 3 2 q a _ 0 . 6 6 5 0 2 3 ‘ 0 . 6 6 5 5 5 6 1 9 6 6 4 3 0 2 f P l o t t i n g t h e c o r r e c t e d r e l a t i v e fl u o r e s c e n c e v a l u e s ( F - F R ) v e r s u s r e t i n a l c o n c e n t r a t i o n ( o r e q u i v a l e n t s ) s h o w s h o w t h e c u r v e n o w l e v e l s o f f t o c l e a r l y i n d i c a t e t h e s a t u r a t i o n p o i n t . 1 0 0 C 3 0 . 9 — ( n 2 g 0 . 8 — E 0 . 5 . 0 . 7 4 fl 7 : I 0 . 6 . . . . . 0 2 4 6 8 1 0 E q u i v a l e n t s R e t i n a l T h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t i s c a l c u l a t e d w i t h t h e p r o g r a m S i g m a P l o t t h r o u g h n o n - ” W i t h i n S i g m a P l o t , t h e c o r r e c t e d r e l a t i v e l i n e a r l e a s t s q u a r e r e g r e s s i o n a n a l y s i s . “ fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t i e s a r e p l o t t e d a g a i n s t t h e c o n c e n t r a t i o n o f r e t i n a l . T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n a n d t h e fi n a l fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y u p o n s a t u r a t i o n a r e t h e o t h e r t w o v a l u e s n e e d e d f o r s o l v i n g t h e e q u a t i o n f o r t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t : 1 : b 1 3 + R , + K , - \ / a > . + R , + 1 0 9 2 — 4 1 4 1 : . t : 1 + _ _ - l x F f F f 2 P t F = o b s e r v e d fl u o r e s c e n c e F f = fl u o r e s c e n c e o f f r e e p r o t e i n F b = fl u o r e s c e n c e o f b o u n d p r o t e i n P t = t o t a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n 1 5 5 p 3 = p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n = 5 * 1 0 " ( - 7 ) R = t o t a l c h r o m o p h o r e c o n c e n t r a t i o n A s i n p u t i n t o S i g m a P l o t : y = p l + p 1 * ( ( p 2 / p l - l ) * ( p 3 + x + k - ( ( p 3 + x + K d ) " 2 - 4 * p 3 * x ) " 0 . 5 ) ) / ( 2 * p 3 ) y = fl u o r e s c e n c e v a l u e x = c h r o m o p h o r e c o n c e n t r a t i o n p l = i n i t i a l fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y = 1 p 2 = f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y u p o n s a t u r a t i o n = 0 . 5 3 C l e a n i n g o f F l u o r e s c e n c e C u v e t t e s : A s b o t h fi n g e r p r i n t s a n d p r o t e i n r e s i d u e o n t h e s u r f a c e o f t h e fl u o r e s c e n c e c e l l s m a y c a u s e i n t e r f e r e n c e i n t h e m e a s u r e m e n t s , t h e y s h o u l d b e t h o r o u g h l y c l e a n e d r e g u l a r l y , d e p e n d i n g o n v o l u m e o f u s e . A p r o p e r c l e a n i n g p r o c e d u r e e n t a i l s : l . S o a k 2 4 h i n c h r o m i c a c i d , t h e n r i n s e w i t h w a t e r . 2 . S o a k 8 h i n a K O H / M e O H s o l u t i o n ( 2 0 p e l l e t s / 1 0 0 m L ) , t h e n r i n s e w i t h w a t e r . 3 . S o a k 4 h i n I ' I N O 3 , t h e n r i n s e w i t h w a t e r . 1 5 6 C D M e a s u r e m e n t s : A 5 M s o l u t i o n o f p r o t e i n i n P B S ( 4 m M N a H z P O 4 , 1 6 m M N a z H P O 4 , 1 5 0 m M N a C l , p H = 7 . 3 ) w a s u s e d f o r C D m e a s u r e m e n t ( J A S C O ) . C D w a s s c a n n e d f r o m 5 0 0 n m t o 2 0 0 n m a t 1 0 0 n m / m i n w i t h a b a n d w i d t h o f 1 n m . E x t e n d e d d e g a s s i n g o f t h e s a m p l e c h a m b e r w i t h n i t r o g e n m u s t b e d o n e t o e n s u r e q u a l i t y s p e c t r a n e a r t h e 2 0 0 n m r e g i o n . M A L D I - T O F E x p e r i m e n t a l P a r a m e t e r s : S y s t e m : A p p l i e d B i o s y s t e m s V o y a g e r S T R M A L D I - T O F m a s s s p e c t r o m e t e r M o d e o f o p e r a t i o n : L i n e a r A c q u i s i t i o n m a s s r a n g e : 5 0 0 0 — 2 0 0 0 0 D a N u m b e r o f l a s e r s h o t s : 2 5 0 / s p e c t r u m N i t r o g e n L a s e r : 3 3 7 n m L a s e r i n t e n s i t y : 3 0 1 3 - 3 0 2 4 * L a s e r R e p R a t e : 5 . 2 H z C a l i b r a t i o n t y p e : E x t e r n a l ( a p o m y o g l o b i n , M W = 1 6 9 5 2 . 6 D a ) C a l i b r a t i o n m a t r i x : S i n a p i c a c i d ( F l u k a ) M A L D I - T O F M e a s u r e m e n t o f R e t i n a l i n c u b a t e d P r o t e i n S a m p l e s : A p p r o x i m a t e l y 0 . 5 m g o f C R A B P I I p r o t e i n i n 1 m L P B S w a s m i x e d w i t h 1 . 0 e q r e t i n a l f r o m a n e t h a n o l s t o c k ( fi n a l e t h a n o l v o l u m e l e s s t h a n 3 0 ( L ) . T h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d a t 2 5 ° C , d a r k f o r 1 h . T h e r e a c t i o n s w e r e e x p o s e d t o l i g h t , t r a n s f e r r e d i n t o m i c r o - c e n t r i f u g e fi l t e r s ( M i l l i p o r e U l t r a f r e e ® 0 . 5 C e n t r i f u g a l F i l t e r s , N M W L : 5 0 0 0 ) a n d c o n c e n t r a t e d . T h e y e l l o w s a m p l e s w e r e w a s h e d o n c e w i t h 9 5 % E t O H , t o w a s h o f f e x c e s s 1 5 7 f r e e r e t i n a ] a n d t h e n t w i c e w i t h d d e O ( 2 x 5 0 0 1 1 L ) , t o d e s a l t . F r o m a fi n a l v o l u m e o f 2 0 1 1 L , 0 . 5 ( L L o f e a c h r e a c t i o n w a s m i x e d w i t h 0 . 5 1 1 L o f m a t r i x s o l u t i o n i n t h e M A L D I p l a t e , a n d u p o n c o - c r y s t a l l i z a t i o n , t h e M A L D I — T O F s p e c t r u m w a s o b t a i n e d . M A L D I - T O F R e d u c t i v e A m i n a t i o n P r o c e d u r e : A p p r o x i m a t e l y 0 . 5 m g o f C R A B P H p r o t e i n i n 1 m L P B S w a s m i x e d w i t h 1 . 0 e q r e t i n a l f r o m a n e t h a n o l s t o c k ( fi n a l e t h a n o l v o l u m e l e s s t h a n 3 0 1 1 L ) . T h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d a t 2 5 ° C , d a r k f o r 1 h a f t e r w h i c h 1 0 1 . 1 L o f 5 M N a C N B H 3 i n I N N a O H w e r e a d d e d . T h e r e a c t i o n w a s l e f t f o r a n a d d i t i o n a l h o u r b e f o r e b e i n g e x p o s e d t o l i g h t . T h e l i g h t y e l l o w c r u d e r e a c t i o n m i x t u r e w a s t h e n r u n t h r o u g h a Q S e p h a r o s e T M F a s t F l o w c o l u m n ( q u a t e r n a r y a m m o n i u m r e s i n , s t r o n g a n i o n e x c h a n g e r , C o l u m n : 3 x 1 . 5 c m ) l e a v i n g a y e l l o w r e s i d u e o n t h e t o p l a y e r o f t h e r e s i n ( P B S c o n t a i n s 1 5 0 m M N a C l , h e n c e t h e c r u d e r e a c t i o n h a d t o b e d i l u t e d t o a fi n a l v o l u m e o f ~ 8 m L t o r e d u c e s a l t c o n c e n t r a t i o n a n d e n h a n c e F Q b i n d i n g b e f o r e l o a d i n g o n t o t h e c o l u m n ) . T h e c o l u m n w a s w a s h e d w i t h 1 0 m M T r i s H C l , p H = 8 a n d t h e p r o t e i n w a s e l u t e d u s i n g 1 0 m M T r i s H C l , 1 0 0 m M N a C l , p H = 8 b u f f e r . T h e p r o t e i n c o n t a i n i n g f r a c t i o n s w e r e i d e n t i fi e d u s i n g U V - v i s ( A 2 3 0 ) a n d c o n c e n t r a t e d t o a 5 0 1 1 L fi n a l v o l u m e u s i n g m i c r o - c e n t r i f u g e fi l t e r s ( M i l l i p o r e U l t r a f r e e ® 0 . 5 C e n t r i f u g a l F i l t e r s , N M W L : 5 0 0 0 ) . 0 . 5 ( L o f e a c h r e a c t i o n w e r e m i x e d w i t h 0 . 5 1 1 L o f m a t r i x s o l u t i o n i n t h e M A L D I p l a t e , a n d u p o n c o - c r y s t a l l i z a t i o n , t h e M A L D I - T O F s p e c t r u m w a s o b t a i n e d . 1 5 8 G e n e C l a n P r o t o c o l f o r p u r i f y i n g D N A f r a g m e n t s : D i g e s t e d D N A s h o u l d b e r u n o n a 0 . 5 % a g a r o s e g e l , a n d t h e d e s i r e d b a n d c u t o u t . C h o p u p t h i s f r a g m e n t , p l a c e i n a 1 . 5 m L e p p e n d o r f t u b e , a n d a d d G e n e C l e a n T u r b o S a l t S o l u t i o n ( 1 0 0 1 1 L / 0 . 1 g a g a r o s e ) . H e a t t h i s a t 5 5 ° C f o r 5 m i n a n d m i x w e l l . T r a n s f e r 5 0 0 M L o f t h i s s o l u t i o n a t a t i m e t o a T u r b o C o l u m n , s p i n f o r 5 s e c o n d s , e m p t y c a t c h t u b e , a n d r e p e a t u n t i l a l l s o l u t i o n h a s b e e n w a s h e d t h r o u g h t h e c o l u m n . N e x t , a d d 5 0 0 1 . 1 L o f T u r b o W a s h S o l u t i o n , s p i n 5 s e c o n d s , e m p t y c a t c h t u b e , a n d r e p e a t . T h e c o l u m n s h o u l d t h e n b e s p u n f o r 4 m i n t o d r y . F i n a l l y , p l a c e c o l u m n i n a f r e s h c a t c h t u b e , a d d 3 0 1 . 1 L T u r b o E l u t i o n S o l u t i o n , a l l o w t o s i t f o r 5 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e , s p i n 1 m i n u t e , a n d q u a n t i f y e l u t e d D N A b y a g a r o s e g e l . M e l t i n g t e m p e r a t u r e c a l c u l a t i o n f o r p r i m e r s : P r i m e r s s h o u l d i d e a l l y h a v e m e l t i n g p o i n t s 2 7 8 ° C , a n d e n d i n a t l e a s t o n e , i f n o t m o r e , G C b a s e p a i r T m = 8 1 . 5 ° C + ( 0 . 4 1 ) ( % G C ) — 6 7 5 / N - % M i s m a t c h w h e r e N 2 p r i m e r l e n g t h M o l e c u l a r M o d e l i n g : C o m p u t a t i o n a l r e s u l t s w e r e o b t a i n e d u s i n g s o f t w a r e p r o g r a m s f r o m A c c e l r y s . D y n a m i c s a n d m i n i m i z a t i o n s w e r e d o n e u s i n g t h e D i s c o v e r 3 0 3 ) p r o g r a m , u s i n g t h e C V F F f o r c e fi e l d f r o m w i t h i n t h e I n s i g h t I I 2 0 0 0 m o l e c u l a r m o d e l i n g s y s t e m . P r o t e i n fi g u r e s w e r e g e n e r a t e d u s i n g P y M o l M o l e c u l a r G r a p h i c s S y s t e m , v e r s i o n 0 . 9 3 , c o p y r i g h t b y D e L a n o S c i e n t i fi c L L C . 1 5 9 P C R c o n d i t i o n s f o r i n t r o d u c i n g B a m H I c u t s i t e s o n b o t h C R A B P I I t e r m i n i f r o m p E T - 1 7 b : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 L ) P C R C y c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 4 7 n g / u L ) 1 1 x 9 4 ° C f o r 5 m i n b b b 0 0 1 3 ( 9 . 9 1 1 M ) 5 9 4 ° C f o r 2 m i n b b b 0 0 1 4 ( 1 0 . 8 1 . 1 M ) 4 . 6 3 0 x 5 5 ° C f o r 2 m i n T h e r m o p o l r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 1 0 7 2 ° C f o r 2 m i n d N T P ( l O m M ) 2 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n M g S O 4 ( 1 0 0 m M ) 0 . 6 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 7 6 D e e p V e n t p o l y m e r a s e 1 b b b 0 0 1 3 5 ’ C G C G G A T C C T C A C T C T C G G A C G T A b b b 0 0 1 4 5 ’ C G C G G A T C C C A T A T G C C A A A C T T C C R A B P I I a n d p E T - 3 0 a l i g a t i o n : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 L ) p E T - 3 0 a + B a m H I ( 2 0 0 n g / 1 1 L ) 1 C R A B P I I P C R - : - B a m H I ( 1 0 0 n g / u L ) 1 . 6 L i g a s e B u f f e r ( 1 0 x ) 1 T 4 D N A l i g a s e 2 T E 4 . 4 T h e a b o v e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o s i t a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t ( ~ 1 2 h ) a n d t r a n s f o r m e d i n t o b o t h J M 1 0 9 a n d B L 2 1 ( D E 3 ) p L y s S . 1 6 0 T o t r o u b l e s h o o t a l i g a t i o n r e a c t i o n , s e v e r a l d i f f e r e n t c o n d i t i o n s c a n b e v a r i e d . P l a s m i d v e c t o r t o g e n e i n s e r t r a t i o s s h o u l d b e v a r i e d f r o m 1 : 3 t o 1 : 1 0 , a l w a y s u s i n g e x c e s s o f t h e s m a l l e r g e n e i n s e r t . T o t a l D N A c o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n 1 0 n g — 5 0 0 n g c a n b e t r i e d . A l s o , v a r y c l e a v a g e t i m e s f r o m 2 - 2 4 h , l i g a t i o n t i m e s f r o m 2 - 2 4 h , l i g a t i o n t e m p e r a t u r e s a t 1 6 ° C a n d 2 3 ° C , r e a c t i o n v o l u m e s a t 1 0 M L a n d 2 0 1 1 L , a n d T 4 D N A l i g a s e v o l u m e f r o m 1 - 2 1 . 1 L . P C R c o n d i t i o n s f o r i n c o r p o r a t i n g N e a l a n d X h o l c u t s i t e s o n C R A B P I I f o r p E T - B l u e 2 l i g a t i o n : R E A C T A N T A M O U N T A L L - L l P C R C y c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / M L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n 6 6 6 0 0 2 4 ( 1 2 . 5 p m o l / 1 , 1 1 . ) 4 ' 9 5 ° c f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 2 6 ( 1 2 . 2 p m o l / 1 1 L ) 4 1 6 x 4 5 5 ° C f o r l m i n T h e r m o p o l b u f f e r ( 1 0 x ) 1 0 s 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( l O m M ) 2 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 7 3 . 5 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n D e e p V e n t p o l y m e r a s e I b b b 0 0 2 4 5 ’ G G G C C A T G G C G C C A A A C ’ I T C T C T G G C A A C b b b 0 0 2 6 5 ’ G G G C T C G A G C T C T C G G A C G T A G A C 1 6 1 C R A B P I I a n d p E T - B l u e 2 l i g a t i o n : R E A C T A N T A M O U N T ( L I L ) P E T - 3 0 a + N c o I , X h o I ( 2 0 0 n g / 1 1 L ) 1 C R A B P I I P C R + N c o I , X h o l ( 1 7 5 n g / u L ) 1 . 6 L i g a s e B u f f e r ( 1 0 x ) 1 T 4 D N A l i g a s e 2 T B 4 . 4 T h e a b o v e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o s i t a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t ( ~ 1 2 h ) a n d t r a n s f o r m e d i n t o J M 1 0 9 . O n c e t h e p l a s m i d w a s v e r i fi e d , i t w a s t h e n t r a n s f o r m e d i n t o B L 2 1 ( D E 3 ) p L y s S . P C R c o n d i t i o n s f o r R 1 3 2 K M u t a t i o n o f C R A B P I I i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( L L L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / H L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n 6 6 6 0 0 2 7 ( 4 . 3 p m o l / u L ) 2 . 6 ' 9 5 ° c f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 2 8 ( 9 . 5 p m o l / 1 1 L ) 1 . 2 1 6 x 4 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 e 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( l O m M ) 1 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 4 . 2 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I 1 6 2 b b b 0 0 2 7 5 ’ C T C T C G G A C G T A G A C C T I ‘ G G T G C A C A C A A C G T C b b b 0 0 2 8 5 ’ G A C G T T G T G T G C A C C A A G G T C T A C G T C C G A G A G A f t e r t h e P C R w a s c o m p l e t e , 1 0 1 1 L w a s t a k e n o u t f o r g e l a n a l y s i s , a n d 1 1 1 L D p n I w a s a d d e d t o t h e r e m a i n i n g s o l u t i o n . T h e r e a c t i o n w a s i n c u b a t e d f o r 1 h a t 3 7 0 C , t h e n t r a n s f o r m e d i n t o e i t h e r J M 1 0 9 o r X L l - B l u e E . c o l i c o m p e t e n t c e l l s . F o r b e s t r e s u l t s , s u p e r c o m p e t e n t c e l l s w e r e u s e d ( S t r a t a g e n e , 1 0 6 — 1 0 8 c f u / 1 1 g ) a s s e l f p r e p a r e d c o m p e t e n t c e l l s w e r e u s u a l l y n o t e f fi c i e n t e n o u g h ( 1 0 3 c f u / 1 1 g ) . T h e s e s t e p s a r e s t a n d a r d p r a c t i c e , a n d w e r e p e r f o r m e d a f t e r e v e r y m u t a g e n e s i s P C R . P C R c o n d i t i o n s f o r Y 1 3 4 F M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K i n p E T - B l u e Z : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 . 1 . ) P C R C y c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / H L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n 6 6 6 0 0 3 0 ( 8 . 7 p m o l / 1 1 L ) 1 . 2 r 9 5 ° c f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 3 1 ( 7 . 2 p m o l / 1 . 1 L ) 1 . 5 1 6 x 4 5 5 ° C f o r l m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( l O m M ) 1 1 x h 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 5 . 3 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 3 0 5 ’ G T T G T G T G C A C C A A G G T C T T C G T C C G A G A G C T C G A G b b b 0 0 3 1 5 ’ C T C G A G C T C T C G G A C G A A G A C C T T G G T G C A C A C A A C 1 6 3 P C R c o n d i t i o n s f o r R l l l E M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F i n p E T - B l u e Z : R E A C T A N T T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u L ) b b b 0 0 3 3 ( 1 0 . 9 p m o l / 1 . 1 L ) b b b 0 0 3 4 ( 1 3 . 7 p m o l / 1 . 1 L ) p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) d N T P ( l O m M ) W a t e r P f u t u r b o p o l y m e r a s e A M O U N T ( L L ) P C R C v c l e s 1 x 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n 1 6 x 5 5 ° C f o r 1 m i n 7 0 ° C f o r 8 m i n 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n b b b 0 0 3 3 5 ’ T C G T G G A C C G A G G A A C T G A C C b b b 0 0 3 4 5 ’ G G T G A C ' I T C C T C G G T C C A C G A P C R c o n d i t i o n s f o r T 5 4 V M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 E i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u L ) b b b 0 0 6 7 ( 7 . 5 p m o l / 1 1 L ) b b b 0 0 6 8 ( 6 . 7 p m o l / 1 1 L ) p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) d N T P ( 1 0 m M ) W a t e r P f u t u r b o p o l y m e r a s e A M O U N T ( 1 4 L ) P C R C v c l e s 1 x 9 5 ° C f o r 3 . 5 m i n 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n 2 0 x 5 5 ° C f o r l m i n 7 0 ° C f o r 8 m i n 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n b b b 0 0 6 7 5 ’ C T A C A T C A A A G T C T C C A C C A C C G T G C G b b b 0 0 6 8 5 ’ C G C A C G G T G G T G G A G A C I ' I ' I G A T G T A G 1 6 4 P C R c o n d i t i o n s f o r L 1 2 1 E M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F i n p E T - B l u e z : R E A C T A N T A M O U N T ( u L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u L ) 5 1 x 9 5 0 C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 3 7 ( 6 . 1 p m o l / u L ) 1 . 4 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 3 8 ( 8 . 3 p m o l / U L ) 1 . 2 1 6 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 0 C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 5 . 4 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 3 7 5 ’ G A T G G G G A A C T G A T C G A G A C C A T G A C G G C G G A T G A C b b b 0 0 3 8 5 ’ G T C A T C C G C C G T C A T G G T C T C G A T C A G ' I ' I ’ C C C C A T C P C R c o n d i t i o n s f o r R l l l L M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F i n p E T - B l u e z : R E A C T A N T A M O U N T ( u L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 3 9 ( 7 . 7 p m o l / u L ) 1 . 6 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 4 0 ( 8 . 8 p m o l / u L ) 1 . 2 1 6 x 5 5 ° C f o r l m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 5 . 2 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 3 9 5 ’ C C C A A G A C C T C G T G G A C C C T G G A A C T G A C C A A C G A T G G G b b b 0 0 4 0 5 ’ C C C A T C G T T G G T C A G T T C C A G G G T C C A C G A G G T C T T G G G 1 6 5 P C R c o n d i t i o n s f o r T 5 4 E M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u L ) b b b 0 0 6 5 ( 1 1 p m o l / 1 . 1 L ) b b b 0 0 6 6 ( 8 . 7 p m o l / 1 1 L ) p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) d N T P ( 1 0 m M ) W a t e r P f u t u r b o p o l y m e r a s e A M O U N T ( 1 1 1 : ) 5 1 . 3 6 1 . 7 2 3 2 . 9 2 P C R C y c l e s 1 x 9 5 ° C f o r 3 . 5 m i n 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n 7 0 ° C f o r 8 m i n 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n b b b 0 0 6 5 5 ’ C T A C A T C A A A G A G T C C A C C A C C G T G C G b b b 0 0 6 6 5 ’ C G C A C G G T G G T G G A C T C T T I ‘ G A T G T A G P C R c o n d i t i o n s f o r L 1 2 1 E M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u L ) b b b 0 0 3 7 ( 6 . 1 p m o l / U L ) b b b 0 0 3 8 ( 8 . 3 p m o l / U L ) p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) d N T P ( 1 0 m M ) W a t e r P f u t u r b o p o l y m e r a s e A M O U N T ( u L ) 5 1 . 4 1 . 2 3 5 . 4 P C R C v c l e s 1 x 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n 1 6 x 5 5 ° C f o r 1 m i n 7 0 ° C f o r 8 m i n 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n b b b 0 0 3 7 5 ’ G A T G G G G A A C T G A T C G A G A C C A T G A C G G C G G A T G A C b b b 0 0 3 8 5 ’ G T C A T C C G C C G T C A T G G T C T C G A T C A G T T C C C C A T C 1 6 6 P C R c o n d i t i o n s f o r R l l l L M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : L 1 2 1 E i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 r i g / P L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 8 2 ( 4 . 4 p m o l / u L ) 3 . 4 1 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 8 3 ( 7 . 2 p m o l / 1 1 L ) 2 . 0 8 1 6 x 5 5 ° C f o r l m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 2 . 5 1 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 8 2 5 ’ C C C A A G A C C T C G T G G A C C C T A G A A C T G A C C A A C G A T G G G b b b 0 0 8 3 5 ’ C C C A T C G ' I T G G T C A G T I ‘ C T A G G G T C C A C G A G G T C ’ I T G G G P C R c o n d i t i o n s f o r L I Z I Q M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T @ P C R C y c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / H L ) 7 1 x 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 9 6 ( 7 . 2 0 p m o l / 1 1 L ) 2 . 1 0 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 9 7 ( 1 1 . 0 p m o l / 1 1 L ) 1 . 4 0 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 2 . 5 0 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 9 6 5 ’ G G G G A A C T G A T C C A G A C C A T G A C G G C G b b b 0 0 9 7 5 ’ C G C C G T C A T G G T C T G G A T C A G T T C C C C 1 6 7 P C R c o n d i t i o n s f o r R 1 3 2 R M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E i n p E T - B l u e z : R E A C T A N T A M O U N T 0 . 1 1 . . ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / H L ) 7 1 x 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 8 8 ( 1 3 . 5 p m o l / 1 1 L ) 1 . 1 1 9 5 ° C f o r l m i n b b b 0 0 8 9 ( 9 . 6 p m o l / 1 1 L ) 1 . 5 6 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n . d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 3 . 3 3 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I 1 b b b 0 0 8 8 5 ’ C G T T G T G T G C A C C A G G G T C ’ I T C G T C C G b b b 0 0 8 9 5 ’ C G G A C G A A G A C C C T G G T G C A C A C A A C G P C R c o n d i t i o n s f o r R 1 3 2 L M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E i n p E T - B l u e z : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 . 1 1 : ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u L ) 7 1 x 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 8 6 ( 1 6 . 1 p m o l / M L ) 0 . 9 3 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 8 7 ( 4 . 8 p m o l / 1 1 L ) 3 . 1 2 2 0 x 5 5 ° C f o r l m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 1 . 9 5 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 8 6 5 ’ C G ' I T G T G T G C A C C C T G G T C ’ I T C G T C C G b b b 0 0 8 7 5 ’ C G G A C G A A G A C C A G G G T G C A C A C A A C G 1 6 8 P C R c o n d i t i o n s f o r F I S A M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l l l L : : L 1 2 1 E i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 . 1 L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u L ) 7 1 x 9 5 ° C f o r l m i n b b b 0 0 9 2 ( 9 . 2 p m o l / 1 1 L ) 1 . 6 0 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 9 3 ( 5 . 8 p m o l / 1 1 L ) 2 . 6 0 2 0 x 5 5 ° C f o r l m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( l O m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 1 . 8 0 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 9 2 5 ’ C G A T C G G A A A A C G C C G A G G A A T T G C T C b b b 0 0 9 3 5 ’ G A G C A A T I ’ C C T C G G C G T T I T C C G A T C G P C R c o n d i t i o n s f o r T 5 4 V M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E i n p E T - B l u e Z : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 . 1 L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 r i g / 1 1 L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r l m i n b b b 0 0 6 7 ( 7 . 5 p m o l / 1 1 L ) 2 . 0 0 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 6 8 ( 6 . 7 p m o l / 1 1 L ) 2 . 2 4 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 2 9 . 7 6 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 6 7 5 ’ C T A C A T C A A A G T C T C C A C C A C C G T G C G b b b 0 0 6 8 5 ’ C G C A C G G T G G T G G A G A C I ' I ' I G A T G T A G 1 6 9 P C R c o n d i t i o n s f o r L 1 2 1 Q M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V i n p E T - B l u e Z : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 ; ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r l m i n 6 6 6 0 0 9 6 ( 7 . 2 0 p m o l / 1 . 1 L ) 2 . 1 0 ’ 9 5 ° c f o r 1 m i n b b b 0 0 9 7 ( 1 1 . 0 p m o l / 1 1 L ) 1 . 4 0 2 0 x 4 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 L 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 2 . 5 0 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 9 6 5 ’ G G G G A A C T G A T C C A G A C C A T G A C G G C G b b b 0 0 9 7 5 ’ C G C C G T C A T G G T C T G G A T C A G T T C C C C P C R c o n d i t i o n s f o r T 5 4 V M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( fl ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 6 7 ( 7 . 5 p m o l / 1 1 L ) 2 . 0 0 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 6 8 ( 6 . 7 p m o l / 1 . 1 L ) 2 . 2 4 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 2 9 . 7 6 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 6 7 5 ’ C T A C A T C A A A G T C T C C A C C A C C G T G C G b b b 0 0 6 8 5 ’ C G C A C G G T G G T G G A G A C ’ I ' I T G A T G T A G 1 7 0 P C R c o n d i t i o n s f o r L 1 2 1 D M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / H L ) 7 1 x 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 9 0 ( 7 . 6 p m o l / 1 1 L ) 2 . 0 0 ' 9 5 ° C f o r l m i n b b b 0 0 9 l ( 1 1 . 4 p m o l / 1 1 L ) 1 . 3 0 2 0 x 4 5 5 ° C f o r l m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x L 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 2 . 7 0 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 9 0 5 ’ G G G G A A C T G A T C G A C A C C A T G A C G G C G b b b 0 0 9 l 5 ’ C G C C G T C A T G G T G T C G A T C A G T T C C C C P C R c o n d i t i o n s f o r L 1 2 1 N M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E i n p E T - B l u e Z : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / H L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r l m i n b b b 0 1 0 2 ( 1 0 . 4 p m o l / 1 1 L ) 1 . 4 5 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 1 0 3 ( 1 2 . 1 p m o l / 1 1 L ) 1 . 2 4 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 5 . 3 1 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 1 0 2 5 ’ G G G G A A C T G A T C A A C A C C A T G A C G G C G b b b 0 1 0 3 5 ’ C G C C G T C A T G G T G T T G A T C A G T T C C C C 1 7 1 A . . . a » l v l - ' . . . 1 . . . . . . . 4 3 . 3 1 . . P C R c o n d i t i o n s f o r T 5 4 V M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 D i n p E T - B l u e Z : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n y l l L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 9 6 ( 7 . 2 0 p m o l / 1 1 L ) 2 . 1 0 9 5 ° C f o r l m i n b b b 0 0 9 7 ( 1 1 . 0 p m o l / 1 1 L ) 1 . 4 0 2 0 x 5 5 ° C f o r l m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 2 . 5 0 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 9 6 5 ’ G G G G A A C T G A T C C A G A C C A T G A C G G C G b b b 0 0 8 7 5 ’ C G C C G T C A T G G T C T G G A T C A G T I ’ C C C C P C R c o n d i t i o n s f o r T 5 4 V M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 N i n p E T - B l u e z : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 1 : ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / l L L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 6 7 ( 7 . 5 p m o l / 1 4 . 1 . . ) 2 . 0 0 9 5 ° C f o r l m i n b b b 0 0 6 8 ( 6 . 7 p m o l / u L ) 2 . 2 4 2 0 x 5 5 ° C f o r l m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 2 9 . 7 6 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 6 7 5 ’ C T A C A T C A A A G T C T C C A C C A C C G T G C G b b b 0 0 6 8 5 ’ C G C A C G G T G G T G G A G A C T I T G A T G T A G 1 7 2 P C R c o n d i t i o n s f o r T 6 1 E M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 4 L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / H L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 1 0 7 ( 9 . 0 p m o l / 1 . 1 L ) 1 . 6 7 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 1 0 8 ( 5 . 8 p m o l / u L ) 2 . 5 9 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 3 . 7 4 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 1 0 7 5 ’ C C G T G C G C A C C G A G G A G A T T A A C T T C b b b 0 1 0 8 5 ’ G A A G T T A A T C T C C T C G G T G C G C A C G G P C R c o n d i t i o n s f o r T 6 1 F M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V i n p E T - B l u e Z : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 0 : ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / H L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 1 0 5 ( 8 . 7 p m o l / 1 . 1 L ) 1 . 7 2 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 1 0 6 ( 6 . 4 p m o l / 1 . 1 L ) 2 . 3 4 2 0 x 5 5 ° C f o r l m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 3 . 9 4 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 1 0 5 5 ’ C C G T G C G C A C C T T C G A G A T I ‘ A A C ' I T C b b b 0 1 0 6 5 ’ G A A G T T A A T C T C G A A G G T G C G C A C G G 1 7 3 P C R c o n d i t i o n s f o r Y 1 3 4 K M u t a t i o n o f C R A B P I I W i l d - T y p e i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 L ) P C R C y c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u L ) 5 1 x 9 5 ° c f o r 3 . 5 m i n b b b 0 0 6 1 ( 9 p m o l / 1 1 L ) 1 . 6 7 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 6 2 ( 1 3 . 4 p m o l / 1 . 1 L ) 1 . 1 2 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 2 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 3 . 2 1 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e 2 b b b 0 0 6 l 5 ’ G C A C C A G G G T C A A G G T C C G A G A G C b b b 0 0 6 2 5 ’ G C T C T C G G A C C T I ‘ G A C C C T G G T G C P C R c o n d i t i o n s f o r Y 1 3 4 K M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / H L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 3 . 5 m i n b b b 0 0 6 3 ( 7 . 4 p m o l / 1 . 1 L ) 2 . 0 3 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 6 4 ( 1 4 . 1 p m o l / 1 1 L ) 1 . 0 6 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 2 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 2 . 9 1 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e 2 b b b 0 0 6 3 5 ’ G C A C C A A G G T C A A G G T C C G A G A G C b b b 0 0 6 4 5 ’ G C T C T C G G A C C T T G A C C T T G G T G C 1 7 4 P C R c o n d i t i o n s f o r R 1 3 2 F M u t a t i o n o f C R A B P I I Y 1 3 4 K i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( u L ) P C R C y c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / H L ) 1 0 1 x 9 5 ° C f o r 3 . 5 m i n b b b 0 0 7 1 ( 1 3 . 4 p m o l / 1 . 1 L ) 1 . 1 2 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 7 5 ( 1 1 . 2 p m o l / u L ) 1 . 3 4 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 2 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 2 8 . 5 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 7 l 5 ’ C G T T G T G T G C A C C T T C G T C A A G G T C C G b b b 0 0 7 5 5 ’ C G G A C C ' I T G A C G A A G G T G C A C A C A A C G P C R c o n d i t i o n s f o r R 1 3 2 L M u t a t i o n o f C R A B P I I Y 1 3 4 K i n p E T - B l u e z : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 L ) P C R C y c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 r i g / 1 1 L ) 1 0 1 x 9 5 ° C f o r 3 . 5 m i n b b b 0 0 6 9 ( 1 2 . 1 p m o l / 1 1 L ) 1 . 6 5 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 7 0 ( 8 . 5 p m o l / 1 1 L ) 2 . 3 5 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 2 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 2 8 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 6 9 5 ’ C G T T G T G T G C A C C C T G G T C A A G G T C C G b b b 0 0 7 0 5 ’ C G G A C C T T G A C C A G G G T G C A C A C A A C G 1 7 5 P C R c o n d i t i o n s f o r R l l l L M u t a t i o n o f C R A B P I I Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 . 1 L ) P C R C y c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / l J - L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 3 . 5 m i n b b b 0 0 8 2 ( 4 . 4 p m o l / 1 1 L ) 3 . 4 1 9 5 0 C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 8 3 ( 7 . 2 p m o l / 1 1 L ) 2 . 0 8 2 0 x 5 5 ° C f o r l m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 2 . 5 1 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 8 2 5 ’ C C C A A G A C C T C G T G G A C C C T A G A A C T G A C C A A C G A T G G G b b b 0 0 8 3 5 ’ C C C A T C G T T G G T C A G T ' I ’ C T A G G G T C C A C G A G G T C T T G G G P C R c o n d i t i o n s f o r L 1 2 1 E M u t a t i o n o f C R A B P I I Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F : : R 1 1 1 L i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( u L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 r i g / M L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 3 . 5 m i n b b b 0 0 3 7 ( 6 . 1 p m o l / 1 1 L ) 2 . 5 0 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 3 8 ( 8 . 3 p m o l / 1 1 L ) 1 . 8 0 2 0 x 5 5 ° C f o r l m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 3 . 7 0 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 3 7 5 ’ G A T G G G G A A C T G A T C G A G A C C A T G A C G G C G G A T G A C b b b 0 0 3 8 5 ’ G T C A T C C G C C G T C A T G G T C T C G A T C A G T T C C C C A T C 1 7 6 P C R c o n d i t i o n s f o r T 5 4 E M u t a t i o n o f C R A B P I I Y 1 3 4 K : : R l 3 2 F : : R 1 1 1 L i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 L ) P C R C y c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 r i g / M L ) 7 1 x 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 6 5 ( 1 1 . 0 p m o l / 1 1 L ) 1 . 4 0 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 6 6 ( 8 . 7 p m o l / M L ) 1 . 7 0 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 2 . 9 0 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I 1 b b b 0 0 6 5 5 ’ C T A C A T C A A A G A G T C C A C C A C C G T G C G b b b 0 0 6 6 5 ’ C G C A C G G T G G T G G A C T C ’ I ' I T G A T G T A G P C R c o n d i t i o n s f o r R l l l L M u t a t i o n o f C R A B P I I Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 ; ) P C R C y c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u - L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 3 . 5 m i n b b b 0 0 8 2 ( 4 . 4 p m o l / 1 1 L ) 3 . 4 1 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 8 3 ( 7 . 2 p m o l / 1 1 L ) 2 . 0 8 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 2 . 5 1 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 8 2 5 ’ C C C A A G A C C T C G T G G A C C C T A G A A C T G A C C A A C G A T G G G b b b 0 0 8 3 5 ’ C C C A T C G T T G G T C A G T T C T A G G G T C C A C G A G G T C ’ I T G G G 1 7 7 P C R c o n d i t i o n s f o r L 1 2 1 E M u t a t i o n o f C R A B P I I Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( 0 . 1 . ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / l L L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 6 7 ( 6 . 1 p m o l / 1 . 1 L ) 1 . 4 9 5 ° C f o r 1 m i n b b b 0 0 6 8 ( 8 . 3 p m o l / 1 1 L ) 1 . 2 2 0 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 2 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 2 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 5 . 4 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n _ P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 3 7 5 ’ G A T G G G G A A C T G A T C G A G A C C A T G A C G G C G G A T G A C b b b 0 0 3 8 5 ’ G T C A T C C G C C G T C A T G G T C T C G A T C A G T T C C C C A T C P C R c o n d i t i o n s f o r L 1 2 1 E M u t a t i o n o f C R A B P I I Y 1 3 4 K : : R l 3 2 L : : R l l l L i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( 0 . 1 : ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / H L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 3 . 5 m i n 6 6 6 0 0 3 7 ( 6 . 1 p m o l / p l . ) 2 . 5 0 F 9 5 ° c f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 3 8 ( 8 . 3 p m o l / 1 1 L ) 1 . 8 0 2 0 x 4 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x ‘ 7 0 ° c f o r 1 0 m i n W a t e r 3 3 . 7 0 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 3 7 5 ’ G A T G G G G A A C T G A T C G A G A C C A T G A C G G C G G A T G A C b b b 0 0 3 8 5 ’ G T C A T C C G C C G T C A T G G T C T C G A T C A G ' I T C C C C A T C 1 7 8 P C R c o n d i t i o n s f o r F 1 5 W M u t a t i o n o f W i l d T y p e C R A B P I I i n p E T - B l u e z : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 1 ; ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 r i g / 1 1 L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 4 9 ( 6 . 1 p m o l / u L ) 1 . 4 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 5 0 ( 8 . 3 p m o l / 1 1 L ) 1 . 2 1 6 x 5 5 ° C f o r l m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 5 . 4 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 4 9 5 ’ C G A T C G G A A A A C T G G G A G G A A T T G C T C b b b 0 0 5 1 5 ’ G A G C A A ' I T C C T C C C A G I ' I ' I ' I C C G A T C G P C R c o n d i t i o n s f o r F 1 5 W M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y l 3 4 F i n p E T - B l u e 2 : R E A C T A N T A M O U N T ( 1 . 1 . 1 : ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 4 9 ( 6 . 1 p m o l / 1 . 1 L ) 1 . 4 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 5 0 ( 8 . 3 p m o l / 1 1 L ) 1 . 2 1 6 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 0 0 C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 5 . 4 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 4 9 5 ’ C G A T C G G A A A A C T G G G A G G A A T I ’ G C T C b b b 0 0 5 1 5 ’ G A G C A A T T C C T C C C A G I I I I C C G A T C G 1 7 9 r ‘ F L " ‘ . ; “ y [ ' 4 1 - " v - P C R c o n d i t i o n s f o r L 1 9 W M u t a t i o n o f W i l d T y p e C R A B P I I i n p E T - B l u e z : R E A C T A N T A M O U N T ( u L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / l l L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 4 7 ( 6 . 1 p m o l / 1 1 L ) 1 . 4 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 4 8 ( 8 . 3 p m o l / 1 . 1 L ) 1 . 2 1 6 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 5 . 4 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 4 7 5 ’ C G A G G A A ' I T G T G G A A A G T G C T G G G G b b b 0 0 4 8 5 ’ C C C C A G C A C ‘ I ' I ' I C C A C A A ’ I ' I ’ C C T C G P C R c o n d i t i o n s f o r L 1 9 W M u t a t i o n o f C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F i n p E T - B l u e z : R E A C T A N T A M O U N T ( u L ) P C R C v c l e s T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u L ) 5 1 x 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 4 7 ( 6 . 1 p m o l / 1 1 L ) 1 . 4 9 5 ° C f o r 0 . 5 m i n b b b 0 0 4 8 ( 8 . 3 p m o l / 1 1 L ) 1 . 2 1 6 x 5 5 ° C f o r 1 m i n p f u t u r b o r x n b u f f e r ( 1 0 x ) 5 7 0 ° C f o r 8 m i n d N T P ( 1 0 m M ) 1 1 x 7 0 ° C f o r 1 0 m i n W a t e r 3 5 . 4 1 x 2 3 ° C f o r 1 0 m i n P f u t u r b o p o l y m e r a s e I b b b 0 0 4 7 5 ’ C G A G G A A T T G T G G A A A G T G C T G G G G b b b 0 0 4 8 5 ’ C C C C A G C A C I ' I ' I C C A C A A ' I T C C T C G 1 8 0 [ P h 2 P ( O ) C H 2 C N ] S y n t h e s i s o f ( D i p h e n y l - p h o s p h i n o y l ) - a c e t o n i t r i l e ( I I - c ) : E t h y l d i p h e n y l p h o s p h i n i t e ( 2 1 . 7 1 m m o l ) w a s p l a c e d i n t o a s e a l e d t u b e . T o t h e s e a l e d t u b e w a s a d d e d c h l o r o a c e t o n i t r i l e ( 2 3 . 9 m m o l ) . T h e m i x t u r e w a s h e a t e d a t 1 2 5 ° C f o r 3 h . A f t e r a l l o w i n g t h e r e a c t i o n t o c o o l , t h e m i x t u r e s o l i d i fi e d a n d w a s t a k e n u p i n C H C l 3 . T h i s w a s t h e n t r a n s f e r r e d t o a n R B a n d s o l v e n t w a s r e m o v e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . D i c h l o r o m e t h a n e ( 1 5 m L ) w a s a d d e d t o t h e s o l i d a n d , u n d e r g e n t l e h e a t i n g , t h e c o m p o u n d d i s s o l v e d . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d b y a d d i t i o n o f E t z O , f i l t e r e d a n d p l a c e d u n d e r h i g h v a c u u m t o y i e l d 8 6 % o f a fi n e w h i t e p o w d e r . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 3 . 3 2 ( 2 H , d , J = 1 5 . 1 H z ) ; 7 . 5 1 - 7 . 6 7 ( 5 H , m ) ; 7 . 7 8 - 7 . 8 8 ( 5 H , m ) . M a t c h e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d s p e c t r a l d a t a . 7 7 S y n t h e s i s o f 3 - M e t h y l - 5 - ( 2 , 6 , 6 - t r i m e t h y l - c y c l o h e x - 1 - e n y l ) - p e n t a - 2 , 4 - d i e n e n i t r i l e ( I I - d ) : Y l i d e I I - c ( 1 8 . 7 m m o l ) w a s d i s s o l v e d i n 7 5 m L o f d r y T H F . P o t a s s i u m t - b u t o x i d e ( 1 8 . 7 m m o l ) w a s a d d e d a n d a l l o w e d t o s t i r a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 0 m i n A f t e r t h i s t i m e , B - i o n o n e ( 9 . 3 5 m m o l ) w a s a d d e d , a n d a l l o w e d t o s t i r a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 6 h . E t z O w a s a d d e d t o p r e c i p i t a t e t h e p h o s p h a t e , w h i c h w a s t h e n c e l i t e fi l t e r e d . T h e fi l t r a t e w a s c o n c e n t r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a n d a p p l i e d d i r e c t l y t o a s i l i c a c o l u m n . T h e c o m p o u n d w a s e l u t e d w i t h 1 0 % E t O A c / H e x t o y i e l d 8 5 % o f a y e l l o w o i l . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 1 . 0 0 ( 6 H , s ) ; 1 . 4 6 ( 2 H , m ) ; 1 . 5 8 ( 2 H , m ) ; 1 . 6 8 ( 3 H , s ) ; 1 8 1 2 . 0 2 ( 2 H , m ) ; 2 . 1 8 ( 3 H , s ) ; 5 . 1 3 ( 1 H , s ) ; 6 . 1 1 ( 1 H , d , J = 1 5 . 9 H z ) ; 6 . 5 3 ( 1 H , d , J = 1 5 . 9 H z ) . M a t c h e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d s p e c t r a l d a t a . 7 7 W H O S y n t h e s i s o f 3 - M e t h y l - 5 - ( 2 , 6 , 6 - t r i m e t h y l - c y c l o h e x - 1 - e n y l ) - p e n t a - 2 , 4 - d i e n a l ( I I - e ) : C o m p o u n d I I - d ( 9 . 3 5 m m o l ) w a s d i s s o l v e d i n 8 5 m L o f d r y E t z O a n d c o o l e d t o 0 ° C . F o u r e q u i v a l e n t s o f D i b a l - H w e r e a d d e d a n d a l l o w e d t o s t i r a t 0 ° C f o r 2 h . T h e r e a c t i o n w a s q u e n c h e d b y a d d i n g w e t s i l i c a a n d N H a C l , a n d s t i r r e d v i g o r o u s l y f o r 1 h . T h e m i x t u r e w a s c e l i t e fi l t e r e d , a n d t h e o r g a n i c p h a s e w a s h e d w i t h b r i n e , d r i e d o v e r N a Z S O a , a n d c o n c e n t r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . T h e c r u d e r e a c t i o n m i x t u r e w a s a p p l i e d d i r e c t l y t o a s i l i c a c o l u m n a n d e l u t e d w i t h 1 0 % E t O A c / H e x t o y i e l d 7 0 % o f a y e l l o w 0 1 1 . ] H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l ; ; ) : 5 1 . 0 2 ( 6 H , s ) ; 1 . 4 7 ( 2 H , m ) ; 1 . 6 0 ( 2 H , m ) ; 1 . 7 0 ( 3 H , s ) ; 2 . 0 1 ( 2 H , m ) ; 2 . 2 9 ( 3 H , s ) ; 5 . 9 1 ( 1 H , d , J = 8 . 5 H z ) ; 6 . 1 9 ( 1 H , d , J = 1 6 . 2 H z ) ; 6 . 7 2 ( 1 H , d , J = 1 5 . 7 H z ) ; 1 0 . 1 0 ( 1 H , d , J = 8 . 0 H z ) . 1 3 C N M R ( 7 5 M H z , C D C 1 3 ) : 8 1 9 1 . 3 7 , 1 5 5 . 0 5 , 1 3 7 . 0 1 , 1 3 5 . 6 6 , 1 3 5 . 5 5 , 1 3 2 . 7 3 , 1 2 8 . 7 4 , 3 9 . 4 5 , 3 4 . 2 3 , 3 3 . 1 8 , 2 8 . 8 9 , 2 1 . 7 2 , 1 8 . 9 9 , 1 2 . 9 1 . M a t c h e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d s p e c t r a l d a t a . 7 7 E n z m o l c n z c o z a ] S y n t h e s i s o f ( D i p h e n y l - p h o s p h i n o y I ) - a c e t i c a c i d e t h y l e s t e r ( I I - f ) : E t h y l d i p h e n y l p h o s p h i n i t e ( 2 1 . 7 1 m m o l ) w a s p l a c e d i n t o a s e a l e d t u b e . T o t h e r e a c t i o n v e s s e l w a s a d d e d b r o m o e t h y l a c e t a t e ( 2 3 . 9 m m o l ) . T h e m i x t u r e w a s h e a t e d a t 1 2 5 ° C f o r 3 h . A f t e r a l l o w i n g t h e r e a c t i o n t o c o o l , t h e m i x t u r e s o l i d i fi e d a n d w a s t a k e n 1 8 2 u p i n C H C l 3 . T h i s w a s t h e n t r a n s f e r r e d t o a n R B a n d s o l v e n t r e m o v e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . D i c h l o r o m e t h a n e ( 1 5 m L ) w a s a d d e d t o t h e s o l i d a n d u n d e r g e n t l e h e a t i n g , t h e c o m p o u n d w a s d i s s o l v e d . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d b y a d d i t i o n o f 3 2 0 , fi l t e r e d a n d p l a c e d u n d e r h i g h v a c u u m t o y i e l d 7 5 % o f a fi n e w h i t e p o w d e r . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C ] ; , ) : 5 1 . 0 1 ( 3 H , t , J = 7 . 1 4 H z ) ; 3 . 4 7 ( 2 H , d , J = 1 5 . 1 1 H z ) ; 3 . 9 8 ( 2 H , q , J = 7 . 1 4 H z ) ; 7 . 5 6 - 7 . 4 3 ( 6 H , m ) ; 7 . 8 2 - 7 . 4 5 ( 4 H , m ) . M a t c h e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d s p e c t r a l d a t a . 7 7 E 1 S y n t h e s i s o f 5 - M e t h y l - 7 - ( 2 , 6 , 6 - t r i m e t h y l - c y c l o h e x - l - e n y l ) - h e p t a - 2 , 4 , 6 - t r i e n o i c a c i d e t h y l e s t e r ( I I - g ) : Y l i d e I I - f ( 1 8 . 7 m m o l ) w a s t a k e n u p i n 1 0 0 m L T H F . K O t B u ( 1 8 . 7 m m o l ) w a s a d d e d a n d a l l o w e d t o s t i r f o r 3 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e . A l d e h y d e I I - e ( 9 . 3 5 m m o l ) w a s a d d e d a n d a l l o w e d t o s t i r f o r 2 4 h a t r o o m t e m p e r a t u r e . A f t e r t h e r e a c t i o n w a s c o m p l e t e E t z O w a s a d d e d t o p r e c i p i t a t e t h e p h o s p h a t e , w h i c h w a s c e l i t e fi l t e r e d a n d c o n c e n t r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . F l a s h c h r o m a t o g r a p h y ( 1 0 % E t O A c / H e x ) y i e l d e d 6 8 % o f a y e l l o w o i l . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 6 1 . 0 0 ( 6 H , s ) ; 1 . 2 8 ( 3 H , t , J = 7 . 1 4 H z ) ; 1 . 4 6 - 1 . 4 2 ( 3 H , m ) ; 1 . 6 1 - 1 . 5 5 ( 3 H , m ) ; 1 . 6 9 ( 3 H , s ) ; 2 . 0 2 ( 3 H , s ) ; 4 . 1 9 ( 2 H , q , J = 7 . 1 4 H z ) ; 5 . 8 4 ( 1 H , d , J = 1 5 . 1 1 H z ) ; 6 . 1 2 ( 2 H , d , J = 1 5 . 6 6 H z ) ; 6 . 3 6 ( 1 H , d , J = 1 5 . 9 3 H z ) ; 7 . 6 6 ( 1 H , d d , J = 1 5 . 1 1 H z , 3 . 3 0 H z ) . 1 3 C N M R ( 7 5 M H z , C D C 1 3 ) : 5 1 9 7 . 2 9 , 1 6 7 . 5 6 , 1 4 4 . 3 5 , 1 4 0 . 6 5 , 1 3 6 . 7 2 , 1 3 0 . 8 2 , 1 3 0 . 6 8 , 1 2 7 . 2 5 , 1 2 0 . 0 1 , 6 0 . 1 8 , 3 9 . 5 4 , 3 4 . 2 3 , 3 3 . 0 9 , 2 8 . 9 2 , 2 1 . 7 4 , 1 9 . 1 4 , 1 4 . 3 3 , 1 3 . 0 0 . M a t c h e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d s p e c t r a l d a t a . 7 7 1 8 3 W 0 S y n t h e s i s o f 6 - M e t h y l - 8 - ( 2 , 6 , 6 - t r i m e t h y l - c y c l o h e x - 1 - e n y l ) - o c t a - 3 , 5 , 7 - t r i e n - 2 - o n e ( I I - h ) : E s t e r I I - g ( 5 . 9 0 m m o l ) w a s s u s p e n d e d i n 3 0 m L T H F , c o o l e d t o — 1 0 0 ° C , a n d a n e x c e s s o f f r e s h l y d i s t i l l e d T M S C l ( 2 9 . 5 m m o l ) w a s a d d e d . T h i s m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r 3 0 m i n t o a l l o w f o r f o r m a t i o n o f t h e s i l y l e n o l e t h e r . M e L i ( 1 e q . ) w a s a d d e d d r o p w i s e i n 0 . 2 5 e q . a l i q u o t s o v e r 3 0 m i n a n d a l l o w e d t o s t i r f o r a n a d d i t i o n a l 2 h . A f t e r t h i s t i m e , t h e m i x t u r e w a s w a r m e d t o r o o m t e m p e r a t u r e , q u e n c h e d w i t h s a t . N H a C l , a n d e x t r a c t e d . T h e a q u e o u s l a y e r w a s w a s h e d w i t h 3 2 0 t h r e e t i m e s . T h e c o m b i n e d o r g a n i c l a y e r s w e r e w a s h e d w i t h b r i n e , d r i e d o v e r N a 2 8 0 4 , a n d c o n c e n t r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . T h e r e a c t i o n w a s p u r i fi e d v i a fl a s h c h r o m a t o g r a p h y ( 1 0 % E t O A c / H e x ) t o r e c o v e r 4 6 % o f t h e d e s i r e d c o m p o u n d ( y e l l o w 0 1 1 ) p l u s 2 9 % u n r e a c t e d s t a r t i n g m a t e r i a l . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 8 l . 0 0 ( 6 H , s ) ; 1 . 4 6 - 1 . 4 2 ( 3 H , m ) ; 1 . 6 3 - 1 . 5 5 ( 3 H , m ) ; 1 . 6 9 ( 3 H , s ) ; 2 . 0 2 ( 3 H , s ) ; 2 . 7 3 ( 3 H , s ) ; 6 . 1 7 - 6 . 1 2 ( 3 H , m ) ; 6 . 3 9 ( 1 H , d , J = 1 5 . 9 3 H z ) ; 7 . 5 5 ( 1 H , d d , J = 1 5 . 1 1 H z , 3 . 5 7 H z ) . 1 3 C N M R ( 7 5 M H z , C D C 1 3 ) : 5 1 9 8 . 5 2 , 1 3 9 . 3 0 , 1 3 7 . 4 4 , 1 3 6 . 6 7 , 1 3 1 . 2 6 , 1 3 1 . 0 1 , 1 2 9 . 2 5 , 1 2 7 . 6 7 , 1 0 0 . 3 0 , 3 9 . 5 3 , 3 4 . 2 2 , 3 3 . 1 2 , 2 8 . 9 2 , 2 7 . 6 6 , 2 1 . 7 4 , 1 9 . 1 1 , 1 3 . 0 9 . M a t c h e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d s p e c t r a l d a t a . 7 7 1 8 4 1 3 W “ S y n t h e s i s o f 3 , 7 - D i m e t h y l - 9 - ( 2 , 6 , 6 - t r i m e t h y l - c y c l o h e x - 1 - e n y l ) - n o n a - 2 , 4 , 6 , 8 - t e t r a e n e - l 3 C - n i t r i l e fl I - i ) : T H F ( 5 m L ) w a s c o o l e d t o — 6 0 ° C . 1 - 1 3 C - a c e t o n i t r i l e ( 0 . 5 8 1 m m o l ) w a s a d d e d , f o l l o w e d b y n - B u L i ( 1 . 1 6 m m o l ) , a n d w a s s t i r r e d f o r 1 0 m i n a t — 6 0 ° C . C h l o r o d i e t h y l p h o s p h i t e ( 0 . 5 8 1 m m o l ) w a s a d d e d t o t h e n o w b r o w n r e a c t i o n m i x t u r e a n d a l l o w e d t o s t i r f o r 3 0 m i n a t — 6 0 ° C , g e n e r a t i n g a n d d e p r o t o n a t i n g t h e y l i d e . M e t h y l k e t o n e I I - h ( 0 . 2 3 2 m m o l ) t a k e n u p i n 2 m L T H F w a s a d d e d t o t h e r e a c t i o n . I t w a s s t i r r e d f o r 1 h a t — 6 0 ° C a f t e r w h i c h t i m e t h e c r y o - c o o l e r w a s t u r n e d o f f a n d t h e r e a c t i o n a l l o w e d t o w a r m t o r o o m t e m p e r a t u r e v e r y s l o w l y ( 4 h ) . T h e r e a c t i o n w a s q u e n c h e d w i t h s a t . N H 4 C l a n d e x t r a c t e d w i t h E t z O t h r e e t i m e s . T h e c o m b i n e d o r g a n i c l a y e r s w e r e w a s h e d w i t h b r i n e , d r i e d o v e r N a Z S O a , a n d c o n c e n t r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . T h e c r u d e r e a c t i o n m i x t u r e w a s u s e d i n t h e s y n t h e s i s o f I I - a . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 8 1 . 0 0 ( 6 H , s ) ; 1 . 4 6 - 1 . 4 2 ( 3 H , m ) ; 1 . 6 3 - 1 . 5 5 ( 3 H , m ) ; 1 . 6 8 ( 3 H , s ) ; 2 . 1 8 ( 3 H , s ) ; 5 . 1 3 ( 1 H , s ) ; 6 . 1 1 ( 1 H , d , J = 1 6 . 2 1 H z ) ; 6 . 5 4 ( 1 H , d , J = 1 5 . 6 6 H z ) . M a t c h e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d s p e c t r a l d a t a . 7 6 1 8 5 1 3 W H O S y n t h e s i s o f 1 5 - [ 1 3 C ] - r e t i n a l ( I I - a ) : T h e c r u d e m i x t u r e o f I I - i ( 0 . 2 3 2 m m o l ) w a s t a k e n u p i n 5 m L E t z O a n d c o o l e d t o — 6 0 ° C . D i b a l ( 0 . 9 2 8 m m o l ) w a s a d d e d a n d s t i r r e d f o r 2 h a t — 6 0 ° C . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r a n a d d i t i o n a l 2 h o v e r a N H a C l / s i l i c a g e l s l u r r y a f t e r w h i c h t i m e t h e m i x t u r e fi l t e r e d o v e r c e l i t e , a n d t h e s i l i c a g e l w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h E t Z O . T h e c o m b i n e d o r g a n i c l a y e r s w e r e d r i e d o v e r N a 2 8 0 4 a n d c o n c e n t r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . T h e m i x t u r e w a s p u r i fi e d b y fl a s h c h r o m a t o g r a p h y ( 1 0 % E t O A c / H e x ) t o y i e l d 3 0 % o f t h e d e s i r e d c o m p o u n d ( y e l l o w 0 1 ] ) . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 1 . 0 1 ( 6 H , s ) ; 1 . 4 7 - 1 . 4 3 ( 3 H , m ) ; 1 . 6 2 - 1 . 5 7 ( 3 H , m ) ; 1 . 7 0 ( 3 H , s ) ; 2 . 0 1 ( 3 H , s ) ; 2 . 3 1 ( 3 H , s ) ; 5 . 9 5 ( 1 H , d , J = 8 . 2 4 H z ) ; 6 . 1 8 - 6 . 1 1 ( 2 H , m ) ; 6 . 3 7 - 6 . 2 9 ( 2 H , m ) ; 7 . 1 2 ( 1 H , d d , J H H = 1 5 . 1 1 H z , 3 . 5 7 H z ) ; 1 0 . 0 8 ( 1 H , d d , J H H = 8 . 2 4 H z , J H C = 1 6 1 . 5 2 H z ) . 1 3 C N M R ( 7 5 M H z , C D C 1 3 ) : 5 1 9 1 . 1 4 , 1 5 5 . 6 3 , 1 4 1 . 2 9 , 1 3 7 . 6 0 , 1 3 7 . 0 5 , 1 3 4 . 4 3 , 1 3 2 . 5 3 , 1 3 0 . 5 3 , 1 2 9 . 7 3 , 1 2 9 . 3 6 , 1 2 8 . 6 1 , 3 9 . 5 7 , 3 4 . 2 4 , 3 3 . 1 4 , 2 8 . 9 5 , 2 3 . 7 1 , 1 9 . 1 6 , 1 3 . 0 0 . M a t c h e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d 7 6 . 7 7 s p e c t r a l d a t a . 1 8 6 M . R e f e r e n c e s 1 . F l o w e r , D . R . " E x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d l i p o c a l i n s t r u c t u r e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a - P r o t e i n S t r u c t . M o l e c . E n z y m . 2 0 0 0 , 1 4 8 2 , 4 6 - 5 6 . 2 . F l o w e r , D . R . ; N o r t h , A . C . T . ; S a n s o m , C . E . " T h e l i p o c a l i n p r o t e i n f a m i l y : s t r u c t u r a l a n d s e q u e n c e o v e r v i e w . " B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a - P r o t e i n S t r u c t . M o l e c . E n z y m . 2 0 0 0 , 1 4 8 2 , 9 - 2 4 . 3 . S k e r r a , A . " L i p o c a l i n s a s a s c a f f o l d . " B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a - P r o t e i n S t r u c t . M o l e c . E n z y m . 2 0 0 0 , 1 4 8 2 , 3 3 7 - 3 5 0 . 4 . A k e r s t r o m , B . ; F l o w e r , D . R . ; S a l i e r , J . P . " L i p o c a l i n s : u n i t y i n d i v e r s i t y . " B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a - P r o t e i n S t r u c t . M o l e c . E n z y m . 2 0 0 0 , 1 4 8 2 , 1 - 8 . 5 . K l e y w e g t , G . J . ; B e r g f o r s , T . ; S e n n , H . ; L e M o t t e , P . ; G s e l l , B . ; S h u d o , K . ; J o n e s , T . A . " C r y s t a l s t r u c t u r e s o f c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n s I a n d H i n c o m p l e x w i t h a l l - t r a n s r e t i n o i c a c i d a n d a s y n t h e t i c r e t i n o i d . " S t r u c t u r e 1 9 9 4 , 2 , 1 2 4 1 - 1 2 5 8 . 6 . W a n g , L . ; L i , Y . ; Y a n , H . " S t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s o f C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d - b i n d i n g p r o t e i n s . " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 7 , 2 7 2 , 1 5 4 1 - 1 5 4 7 . 7 . S t o e c k e n i u s , W . ; L o z i e r , R . H . ; B o g o m o l n i , R . A . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 9 7 9 , 5 0 5 , 2 1 5 - 2 7 8 . 8 . B o m h o r s t , J . A . ; F a l k e , J . J . , P u r i fi c a t i o n o f p r o t e i n s u s i n g p o l y h i s t i d i n e a f fi n i t y t a g s . I n M e t h o d s i n E n z y m o l o g y , e d . ; T h o m e r , J . ; E m r , S . D . ; A b e l s o n , J . N . , A c a d e m i c P r e s s : L o n d o n , 2 0 0 0 ; V o l . 3 2 6 , p p 2 4 5 - 2 5 4 . 1 8 7 1 0 . l l . 1 2 . l 3 . 1 4 . 1 5 . S a m b r o o k , J . ; R u s s e l l , D . W . , E x p r e s s i o n o f c l o n e d g e n e s i n E s c h e r i c h i a c o l i . I n M o l e c u l a r c l o n i n g . A l a b o r a t o r y m a n u a l , e d . ; S a m b r o o k , J . ; R u s s e l l , D . W . , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s : C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y , 2 0 0 1 ; V o l . 3 , p p 1 5 . 1 - 1 5 . 6 5 . S a m b r o o k , J . ; R u s s e l l , D . W . , P l a s m i d s a n d t h e i r u s e f u l n e s s i n m o l e c u l a r c l o n i n g . I n M o l e c u l a r c l o n i n g . A l a b o r a t o r y m a n u a l , e d . ; S a m b r o o k , J . ; R u s s e l l , D . W . , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s : C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y , 2 0 0 1 ; V o l . 1 , p p l . 1 - 1 . 7 0 . M u e l l e r , U . ; B u e s s o w , K . ; D i e h l , A . ; B a r t l , F . J . ; N i e s e n , F . H . ; N y a r s i k , L . ; H e i n e m a n n , U . " R a p i d p u r i fi c a t i o n a n d c r y s t a l s t r u c t u r e a n a l y s i s o f a s m a l l p r o t e i n c a r r y i n g t w o t e r m i n a l a f fi n i t y t a g s . " J . S t r u c t . F u n c t . G e n o m i c s 2 0 0 3 , 4 , 2 1 7 - 2 2 5 . K i m , K . M . ; Y i , E . C . ; B a k e r , D . ; Z h a n g , K . Y . J . " P o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n o f t h e N - t e r m i n a l H i s t a g i n t e r f e r e s w i t h t h e c r y s t a l l i z a t i o n o f t h e w i l d - t y p e a n d m u t a n t 8 H 3 d o m a i n s f o r m c h i c k e n s r c t y r o s i n e k i n a s e . " A c t a C r y s t a l l o g r . D 2 0 0 1 , D 5 7 , 7 5 9 - 7 6 2 . G i l ] , S . C . ; v o n H i p p e l , P . H . " C a l c u l a t i o n o f p r o t e i n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t s f r o m a m i n o a c i d s e q u e n c e d a t a . " A n a l . B i o c h e m . 1 9 8 9 , 1 8 2 , 3 1 9 - 3 2 6 . E d e l h o c h , H . " S p e c t r o s c o p i c d e t e r m i n a t i o n o f t r y p t o p h a n a n d t r y o s i n e i n p r o t e i n s . " B i o c h e m i s t r y 1 9 6 7 , 1 9 4 8 - 1 9 5 4 . W a l k e r , J . M . , P r o t e i n P r o t o c o l s H a n d b o o k . 2 n d e d . ; H u m a n a P r e s s , I n c . : T o t o w a , N J , 2 0 0 2 ; p 1 1 - 1 4 . 1 8 8 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . V e n y a m i n o v , S . Y . ; Y a n g , J . T . , D e t e r m i n a t i o n o f p r o t e i n s e c o n d a r y s t r u c t u r e . I n C i r c u l a r d i c h r o i s m a n d t h e c o n f o r m a t i o n a l a n a l y s i s o f b i o m o l e c u l e s . , e d . ; F a s m a n , G . D . , P l e n u m P r e s s : N e w Y o r k , N Y , 1 9 9 6 ; p p 6 9 - 1 0 7 . W o o d y , R . W . ; D u n k e r , A . K . , A r o m a t i c a n d c y s t i n e s i d e - c h a i n c i r c u l a r d i c h r o i s m i n p r o t e i n s . I n C i r c u l a r d i c h r o i s m a n d t h e c o n f o r m a t i o n a l a n a l y s i s o f b i o m o l e c u l e s . , e d . ; F a s m a n , G . D . , P l e n u m P r e s s : N e w Y o r k , N Y , 1 9 9 6 ; p p 1 0 9 - 1 5 7 . Z h a n g , J . ; L i u , Z . P . ; J o n e s , T . A . ; G i e r a s c h , L . ; S a m b r o o k , J . F . " M u t a t i n g t h e c h a r g e d r e s i d u e s i n t h e b i n d i n g p o s k e t o f C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n s i m u l t a n e o u s l y r e d u c e s i t s b i n d i n g a f fi n i t y t o r e t i n o i c a c i d a n d i n c r e a s e s i t s t h e r m o s t a b i l i t y . " P r o t e i n s : S t r u c . F u n c . G e n . 1 9 9 2 , 1 3 , 8 7 - 9 9 . C r a b b , J . W . ; C a r l s o n , A . ; C h e n , Y . ; G o l d fl a m , S . ; I n t r e s , R . ; W e s t , K . A . ; H u l m e s , J . D . ; K a p r o n , J . T . ; L u c k , L . A . ; H o r w i t z , J . ; B o k , D . " S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f r e c o m b i n a n t c e l l u l a r r e t i n a l d e h y d e - b i n d i n g p r o t e i n . " P r o t e i n S c i e n c e 1 9 9 8 , 7 , 7 4 6 - 7 5 7 . T a n , Q . ; L o u , J . ; B o r h a n , B . ; K a m a u k h o v a , E . ; B e r o v a , N . ; N a k a n i s h i , K . " A b s o l u t e s e n s e o f t w i s t o f t h e C 1 2 - C 1 3 b o n d o f t h e r e t i n a l c h r o m o p h o r e i n b o v i n e r h o d o p s i n b a s e d o n e x c i t o n - c o u p l e d C D s p e c t r a o f 1 1 , 1 2 - d i h y d r o r e t i n a l a n a l o g u e s . " A n g e w . C h e m i e I n t l . E d . 1 9 9 7 , 3 6 , 2 0 8 9 - 2 0 9 3 . C h e n , X . ; T o r d o v a , M . ; G i l l i l a n d , G . L . ; W a n g , L . ; L i , Y . ; Y a n , H . ; J i , X . " C r y s t a l s t r u c t u r e o f a p o c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d p r o t e i n t y p e I I ( R l l l M ) s u g g e s t s a m e c h a n i s m o f l i g a n d e n t r y . " J . M o l . B i o l . 1 9 9 8 , 2 7 8 , 6 4 1 - 6 5 3 . 1 8 9 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . N o r r i s , A . W . ; C h e n g , L . ; G i g u e r e , V . ; R o s e n b e r g e r , M . ; L i , E . " M e a s u r e m e n t o f S u b n a n o m o l a r R e t i n o i c A c i d - B i n d i n g A f fi n i t i e s f o r C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d - B i n d i n g P r o t e i n s b y F l u o r o m e t r i c T i t r a t i o n . " B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a - P r o t e i n S t r u c t . M o l e c . E n z y m . 1 9 9 4 , 1 2 0 9 , 1 0 - 1 8 . R o s t , B . " P r o t e i n s t r u c t u r e s s u s t a i n e v o l u t i o n a r y d r i f t . " F o l d . D e s . 1 9 9 7 , 2 , 8 1 9 - 8 2 4 . G a l l y , J . A . ; E d e l m a n , G . M . " T h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o f t h e fl u o r e s c e n c e o f s o m e a r o m a t i c a m i n o a c i d s a n d p r o t e i n s . " B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 9 6 2 , 6 0 , 4 9 9 - 5 0 9 . M i l l e r , J . N . , S t a n d a r d s i n fl u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t r y . I n T e c h n i q u e s i n v i s i b l e a n d u l t r a - v i o l e t s p e c t r o s c o p y , e d . ; M i l l e r , J . N . , C h a p m a n a n d H a l l : N e w Y o r k , 1 9 8 1 ; V o l . 2 , p p 1 - 7 . K r o n m a n , M . J . " F l u o r e s c e n c e s t u d i e s o f t e h m o l e c u l a r c o n f o r m a t i o n o f 0 1 - l a c t a l b u r n i n . " B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 9 6 7 , 1 3 3 , 1 9 - 3 2 . S t e i n e r , R . F . ; E d e l h o c h , H . " E f f e c t o f t h e r m a l l y i n d u c e d s t r u c t u r a l t r a n s i t i o n s o n t h e u l t r a - v i o l e t fl u o r e s c e n c e o f p r o t e i n s . " N a t u r e 1 9 6 2 , 1 9 3 , 3 7 5 - 3 7 6 . V a l e u r , B . , C h a r a c t e r i s t i c s o f fl u o r e s c e n c e e m i s s i o n . I n M o l e c u l a r F l u o r e s c e n c e , e d . ; W i l e y - V C H : W e i n h a m , G e r m a n y , 2 0 0 2 ; p p 3 4 - 7 1 . W h i t e , A . " E f f e c t o f p H o n fl u o r e s c e n c e o f t y r o s i n e , t r y p t o p h a n a n d r e l a t e d c o m p o u n d s . " B i o c h e m . J . 1 9 5 9 , 7 1 , 2 1 7 - 2 2 0 . C h e n , R . F . , E x t r i n s i c a n d i n t r i n s i c fl u o r e s c e n c e i n t h e s t u d y o f p r o t e i n s t r u c t u r e . I n F l u o r e s c e n c e : T h e o r y , I n s t r u m e n t a t i o n , a n d P r a c t i c e , e d . ; G u i l b a u l t , G . G . , M a r c e l D e k k e r , I n c . : N e w Y o r k , 1 9 6 7 ; p p 4 4 3 - 5 0 9 . 1 9 0 t l ‘ . . . l U l i b h t x l ' E E ‘ ’ 6 1 A ‘ 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . 3 7 . 3 8 . E f t i n k , M . R . , I n t r i n s i c fl u o r e s c e n c e o f p r o t e i n s . I n T o p i c s i n F l u o r e s c e n c e S p e c t r o s c o p y , e d . ; L a k o w i c z , J . R . , K u l w e r A c a d e m i c / P l e n u m P u b l i s h e r s : N e w Y o r k , 2 0 0 0 ; V o l . 6 , p p 1 - 1 5 . K o n e v , S . V . , F l u o r e s c e n c e a n d p h o s p h o r e s c e n c e o f p r o t e i n s a n d n u c l e i c a c i d s . e d . ; P l e n u m P r e s s : N e w Y o r k , 1 9 6 7 ; p 6 9 - 7 9 . C o g a n , U . ; K o p e l m a n , M . ; M o k a d y , S . ; S h i n i t z k y , M . " B i n d i n g a f fi n i t i e s o f r e t i n o l a n d r e l a t e d c o m p o u n d s t o r e t i n a l b i n d i n g p r o t e i n s . " E u r . J . B i o c h e m . 1 9 7 6 , 6 5 , 7 1 - 7 8 . B l a t z , P . E . ; B a u m g a r t n e r , N . ; B a l a s u b r a m a n i y a n , B . ; B a l a s u b r a m a n i y a n , P . ; S t e d m a n , F . " W a v e l e n g t h r e g u l a t i o n i n v i s u a l p i g m e n t c h r o m o p h o r e . L a r g e i n d u c e d b a t h o c h r o m i c s h i f t s i n r e t i n o l a n d r e l a t e d p o l y e n e s . " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 7 1 , 1 4 , 5 3 1 - 5 4 9 . A b a s o l o , M . I . ; B e k e r m a n , D . G . ; R o d r i g o , G . A . ; F e r n a n d e z , B . M . " S e c o n d d e r i v a t i v e U V - V I S a b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p y : A s u c c e s s f u l m e t h o d t o f o l l o w k i n e t i c s o f o r g a n i c r e a c t i o n s , w h e n t w o b a n d s a r e s t r o n g l y o v e r l a p p e d i n t h e f u n d a m e n t a l s p e c t r a . " A n . A s o c . Q u i m . A r g e n t . 1 9 9 7 , 8 5 , 9 - 1 5 . K u s , S . ; M a r c z e n k o , Z . ; O b a r s k i , N . " D e r i v a t i v e U V - V I S s p e c t r o p h o t o m e t r y i n a n a l y t i c a l c h e m i s t r y . " C h e m . A n a l . 1 9 9 6 , 4 1 , 8 9 9 - 9 2 9 . A l l M A L D I - T O F m e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d b y C h r y s o u l a V a s i l e i o u , a n d a m o r e d e t a i l e d d i s c u s s i o n o f t h e s e c a n b e f o u n d i n h e r t h e s i s . H e r m a n s o n , G . T . , Z e r o — L e n g t h C r o s s - l i n k e r s . I n B i o c o n j u g a t e T e c h n i q u e s , e d . ; A c a d e m i c P r e s s : S a n D i e g o , C A , 1 9 9 6 ; p p 1 6 9 - 1 8 6 . 1 9 1 3 9 . 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . C o m p u t a t i o n a l r e s u l t s o b t a i n e d u s i n g s o f t w a r e p r o g r a m s f r o m A c c e l r y s , I n c . M i n i m i z a t i o n c a l c u l a t i o n s p e r f o r m e d w i t h t h e D i s c o v e r p r o g r a m u s i n g C V F F f o r c e f i e l d . G r a p h i c a l d i s p l a y s w e r e g e n e r a t e d w i t h t h e I n s i g h t I I m o l e c u l a r m o d e l i n g s y s t e m . M i d l a n d , M . M . ; K w o n , Y . C . " S t e r e o c h e r n i s t r y o f h y d r o b o r a t i o n o f ( a t - c h i r a l o l e fi n s a n d r e d u c t i o n o f a - c h i r a l k e t o n e s . A n u n u s u a l a n t i - C r a m s e l e c t i v i t y w i t h d i a l k y l b o r a n e s . " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 8 3 , 1 0 5 , 3 7 2 5 - 3 7 2 7 . K y t e , J . ; D o o l i t t l e , R . F . " A s i m p l e m e t h o d f o r d i s p l a y i n g t h e h y d r o p a t h i c c h a r a c t e r o f a p r o t e i n . " J . M o l . B i o l . 1 9 8 2 , 1 5 7 , 1 0 5 - 1 3 2 . H o o p , T . P . ; W o o d s , K . R . " P r e d i c t i o n o f p r o t e i n a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s f r o m a m i n o a c i d s e q u e n c e s . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 8 1 , 7 8 , 3 8 2 4 - 3 8 2 8 . P a j a r e s , M . A . ; R a n d o , R . R . " T h e a c t i v e - s i t e e n v i r o n m e n t o f r h o d o p s i n . " J . B i o l . C h e m . 1 9 8 9 , 2 6 4 , 6 8 0 4 - 6 8 0 9 . H a r g r a v e , P . A . ; M c D o w e l l , J . H . ; C u r t i s , D . R . ; W a n g , J . K . ; J u s z c z a k , E . ; F o n g , S . L . ; M o h a n n a R a o , J . K ; A r g o s , P . " T h e s t r u c t u r e o f b o v i n e r h o d o p s i n . " B i o p h y s . S t r u c t . M e c h . 1 9 8 3 , 9 , 2 3 5 - 2 4 4 . H o n i g , B . ; H u b b e l l " S t a b l i l i t y o f " s a l t b r i d g e s " i n m e m b r a n e p r o t e i n s . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 8 4 , 8 1 , 5 4 1 2 - 5 4 1 6 . J a g e r , S . ; P a l c z e w s k i , K . ; H o f f m a n n , K . P . " O p s i n / a l l - t r a n s - r e t i n a l c o m p l e x a c t i v a t e s t r a n s d u c i n b y d i f f e r e n t m e c h a n i s m t h a n p h o t o l y z e d r h o d o p s i n . " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 6 , 3 5 , 2 9 0 1 - 2 9 0 8 . F a s i c k , J . I . ; A p p l e b u r y , M . L . ; O p r i a n , D . D . " S p e c t r a l t u n i n g i n t h e m a m m a l i a n s h o r t - w a v e l e n g t h s e n s i t i v e c o n e p i g m e n t s . " B i o c h e m i s t r y 2 0 0 2 , 4 1 , 6 8 6 0 - 6 8 6 5 . 1 9 2 4 8 . 4 9 . 5 0 . 5 1 . 5 2 . 5 3 . 5 4 . 5 5 . 5 6 . 5 7 . Z h u k o v s k y , E . A . ; O p r i a n , D . D . " E f f e c t o f c a r b o x y l i c s i d e c h a i n s o n t h e a b s o r p t i o n m a x i m u m o f v i s u a l p i g m e n t s . " S c i e n c e 1 9 8 9 , 2 4 6 , 9 2 8 - 9 3 0 . C r a b b , J . W . ; N i e , Z . ; C h e n , Y . ; H u l m e s , J . D . ; W e s t , K . A . ; K a p r o n , J . T . ; R u u s k a , S . E . ; N o y , N . ; S a a r i , J . C . " C e l l u l a r r e t i n a l d e h y d e - b i n d i n g p r o t e i n l i g a n d i n t e r a c t i o n s . " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 8 , 2 7 3 , 2 0 7 1 2 - 2 0 7 2 0 . N a t h a n s , J . " D e t e r m i n a n t s o f v i s u a l p i g m e n t a b s o r b a n c e : R o l e o f c h a r g e d a m i n o a c i d s i n t h e p u t a t i v e t r a n s m e m b r a n e s e g m e n t s . " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 0 , 2 9 , 9 3 7 - 9 4 2 . S a k m a r , T . P . ; F r a n k e , R . R . ; K h o r a n a , H . G . " G l u t a m i c a c i d - 1 1 3 s e r v e s a s t h e r e t i n y l i d e n e S c h i f f b a s e c o u n t e r i o n i n b o v i n e r h o d o p s i n . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . , U S A 1 9 8 9 , 8 6 , 8 3 0 9 - 8 3 1 3 . L y t h g o e , R . J . " T h e a b s o r p t i o n s p e c t r a o f v i s u a l p u r p l e a n d o f i n d i c a t o r y e l l o w . " J . P h y s i o l . 1 9 3 7 , 8 9 , 3 3 1 - 3 5 8 . W a l d , G . " O n r h o d o p s i n i n s o l u t i o n . " J . G e n . P h y s i o l . 1 9 3 8 , 2 1 , 7 9 5 - 8 3 2 . K o u t a l o s , Y . " H i g h p H f o r m o f b o v i n e r h o d o p s i n . " B i o p h y s . J . 1 9 9 2 , 6 1 , 2 7 2 - 2 7 5 . S t e i n b e r g , G . ; O t t o l e n g h i , M . ; S h e v e s , M . " p K a o f t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e o f b o v i n e r h o d o p s i n . " B i o p h y s . J . 1 9 9 3 , 6 4 , 1 4 9 9 - 1 5 0 2 . S h e v e s , M . ; A l b e c k , A . ; F r i e d m a n , N . ; O t t o l e n g h i , M . " C o n t r o l l i n g t h e p K a o f t h e b a c t e r i o r h o d o p s i n S c h i f f b a s e b y u s e o f a r t i fi c i a l r e t i n a l a n a l o g u e s . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 8 6 , 8 3 , 3 2 6 2 - 3 2 6 6 . S a k m a r , T . P . ; F r a n k e , R . R . ; K h o r a n a , G . " T h e r o l e o f r c t i n y l i d e n e S c h i f f b a s e c o u n t e r i o n i n r h o d o p s i n i n d e t e r m i n i n g w a v e l e n g t h a b s o r b a n c e a n d S c h i f f b a s e p K a . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i , U S A 1 9 9 1 , 8 8 , 3 0 7 9 - 3 0 8 3 . 1 9 3 5 8 . 5 9 . 6 0 . 6 1 . 6 2 . 6 3 . 6 4 . 6 5 . K o u t a l o s , Y . ; E b r e y , T . G . ; G i l s o n , H . R . ; H o n i g , B . " O c t o p u s p h o t o r e c e p t o r m e m b r a n e s . S u r f a c e c h a r g e d e n s i t y a n d p K o f t h e S c h i f f b a s e o f t h e p i g m e n t s . " B i o p h y s . J . 1 9 9 0 , 5 8 , 4 9 3 - 5 0 1 . L i a n g , J . ; S t e i n b e r g , G . ; L i v n a h , N . ; S h e v e s , M . ; E b r e y , T . G . ; T s u d a , M . " T h e p K a o f t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e s o f g e c k o c o n e a n d o c t o p u s v i s u a l p i g m e n t s . " B i o p h y s . J . 1 9 9 4 , 6 7 , 8 4 8 - 8 5 4 . D r u k m a n , S . ; O t t o l e n g h i , M . ; P a n d e , A . ; C a l l e n d e r , R . " A c i d - b a s e e q u i l i b r i u m o f t h e S c h i f f b a s e i n b a c t e r i o r h o d o p s i n . " B i o c h e m i s t r y 1 9 8 2 , 2 1 , 4 9 5 3 — 4 9 5 9 . N a k a g a w a , M . ; I w a s a , T . ; K i k k a w a , M . ; T s u d a , M . ; E b r e y , T . G . " H o w v e r t e b r a t e a n d i n v e r t e b r a t e v i s u a l p i g m e n t s d i f f e r i n t h e i r m e c h a n i s m o f p h o t o a c t i v a t i o n . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 9 , 9 6 , 6 1 8 9 - 6 1 9 2 . G a t , Y . ; S h e v e s , M . " A m e c h a n i s m f o r c o n t r o l l i n g t h e p K a o f t h e r e t i n a l p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e i n r e t i n a l p r o t e i n s . A s t u d y w i t h m o d e l c o m p o u n d s . " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 3 , 1 1 5 , 3 7 7 2 - 3 7 7 3 . W a r s h e l , A . ; R u s s e l , S . ; C h u r g , A . " M a c r o s c o p i c m o d e l s f o r s t u d i e s o f e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s i n p r o t e i n s : L i m i t a t i o n s a n d a p p l i c a b i l i t y . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 8 4 , 8 1 , 4 7 8 5 - . H o n i g , B . ; E b r e y , T . G . ; C a l l e n d e r , R . ; D i n u r , U . ; O t t o l e n g h i , M . " P h o t o i s o m e r i z a t i o n , e n e r g y s t o r a g e , a n d c h a r g e s e p a r a t i o n : A m o d e l f o r l i g h t e n e r g y t r a n s d u c t i o n i n v i s u a l p i g m e n t s a n d b a c t e r i o r h o d o p s i n . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 7 9 , 7 6 , 2 5 0 3 - 2 5 0 7 . D u P u i s , P . ; H a r o s i , I . ; S a n d o r f y , C . ; L e c l e r q , J . ; V o c e l l e , D . " F i r s t s t e p i n v i s i o n : p r o t o n t r a n s f e r o r i s o m e r i z a t i o n ? " R e v . C a n . B i o l . 1 9 8 0 , 3 9 , 2 4 7 - 2 5 8 . 1 9 4 6 6 . 6 7 . 6 8 . 6 9 . 7 0 . 7 1 . 7 2 . 7 3 . 7 4 . 7 5 . 7 6 . S c h e i n e r , S . ; D u a n , X . " E f f e c t o f i n t e r m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n u p o n p r o t o n t r a n s f e r w i t h i n a p o l a r i z a t i o n m e d i u m . " B i o p h y s . J . 1 9 9 1 , 6 0 , 8 7 4 - 8 8 3 . S c h e i n e r , S . ; H i l l e n b r a n d , E . " M o d i fi c a t i o n o f p K v a l u e s c a u s e d b y c h a n g e i n H - b o n d g e o m e t r y . " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 8 5 , 8 2 , 2 7 4 1 - 2 7 4 5 . S c h u l t e n , K . ; T a v a n , P . N a t u r e 1 9 7 9 , 2 7 2 , 8 5 . B r i d g e s , C . D . B . " R v e r s i b l e v i s u a l p i g m e n t c h a n g e s i n t a d p o l e s e x p o s e d t o l i g h t a n d d a r k n e s s . " N a t u r e 1 9 7 0 , 2 2 7 , 9 5 6 - 9 5 7 . P a n d e , C . ; D e n g , H . ; R a t h , P . ; C a l l e n d e r , R . H . ; S c h w e m e r , J . " R e s o n a n c e R a m a n s p e c t r o s c o p y o f a n u l t r a v i o l e t s e n s i t i v e i n s e c t r h o d o p s i n . " B i o c h e m i s t r y 1 9 8 7 , 2 6 , 7 4 2 6 - 7 4 3 0 . T s u k i d a , K . ; K o d a m a , A . ; I t o , M . " A r a p i d a n d c o n v e n i e n t a c q u i s i t i o n o f t h e p u r e l l - c i s - r e t i n a l s p e c i m e n b y p r e p a r a t i v e h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . " J . N u t r . S c i . V i t a m i n o l . 1 9 7 8 , 2 4 , 5 9 3 - 5 9 6 . L i u , R . S . H . ; A s a t o , A . E . " S y n t h e s i s a n d p h o t o c h e m i s t r y o f s t e r e o i s o m e r s o f r e t i n a l . " M e t h o d s i n E n z y m o l o g y 1 9 8 2 , 8 8 , 5 0 6 - 5 1 6 . B o r h a n , B . ; S o u t o , M . L . ; U r n , J . M . ; Z h o u , B . ; N a k a n i s h i , K . " E f fi c i e n t s y n t h e s i s o f l l - c i s - r e t i n o i d s . " C h e m . E u r . J . 1 9 9 9 , 5 , 1 1 7 2 - 1 1 7 5 . D u g g e r , R . W . ; H e a t h c o c k , C . H . " A n e f fi c i e n t p r e p a r a t i o n o f t r a n s , t r a n s - B - i o n y l i d e n e a c e t a l d e h y d e . " S y n . C o m m . 1 9 8 0 , 1 0 , 5 0 9 - 5 1 5 . C o o k e , M . P . J . " A c y l a t i o n o f o r g a n o l i t h i u m r e a g e n t s b y e s t e r s i n t h e p r e s e n c e o f c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e . " J . O r g . C h e m . 1 9 8 6 , 5 1 , 9 5 1 - 9 5 3 . V e r d e g e m , P . J . E . ; M o n n e e , M . C . F . ; L u g t e n b u r g , J . " S i m p l e a n d e f f i c i e n t p r e p a r a t i o n o f [ 1 0 , 2 0 - 1 3 C 2 ] - a n d [ 1 0 - C H 3 , 1 3 - 1 3 C 2 ] - l O - m e t h y l r e t i n a l : I n t r o d u c t i o n 1 9 5 7 7 . o f s u b s t i t u e n t s a t t h e p o s i t i o n o f 2 , 3 - u n s a t u r a t e d n i t r i l e s . " J . O r g . C h e m . 2 0 0 1 , 6 6 , 1 2 6 9 - 1 2 8 2 . G r o e s b e e k , M . ; L u g t e n b u r g , J . " S y n t h e s i s o f d o u b l y a n d m u l t i p l y i s o t o p i c a l l y l a b e l e d r e t i n a l s . " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 9 2 , 5 6 , 9 0 3 - 9 0 8 . 1 9 6 m e e s s o r D 3 V i d W e l i k y , D e p a r t m e n t O f a n d u l t i m a t e l y d i f f e r e n t m a x i m a l w a v e l e n g t h s . C h a p t e r 3 P r o b i n g a P o s s i b l e M o d e o f W a v e l e n g t h R e g u l a t i o n : T w i s t i n g o f t h e C h r o m o p h o r e ’ s S i n g l e B o n d s A . S y n t h e s i s o f M o d e l D e r i v a t i v e s f o r S o l i d S t a t e N M R O p t i m i z a t i o n R e c a l l o n e o f t h e p o s s i b l e m o d e s o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n e n t a i l s t h e d e g r e e o f t w i s t i n g a b o u t t h e s i n g l e b o n d s w i t h i n r e t i n a l ( F i g u r e I I I - l ) . I t i s p r o p o s e d t h a t d i f f e r e n t s t e r i c c o n s t r a i n t s i n t h e v a r i o u s r h o d o p s i n p r o t e i n s m a y f o r c e d i f f e r e n t d e g r e e s o f t w i s t i n g , r e s u l t i n g i n d i f f e r e n t a m o u n t s o f o r b i t a l o v e r l a p o r c o n j u g a t i o n , a n d u l t i m a t e l y , d i f f e r e n t r e t i n a l m a x i m a l a b s o r b a n c e s . W e p r o p o s e t o i n v e s t i g a t e t h i s t h e o r y t h r o u g h t h e u s e o f a n i s o t o p i c a l l y l a b e l e d r e t i n a l c o u p l e d w i t h s o l i d s t a t e N M R e x p e r i m e n t s t h a t m a y p r o b e t h e d e g r e e o f s i n g l e b o n d t w i s t i n g . U s e o f 1 1 , 1 4 - [ l 3 C ] 2 - 1 l - c i s - r e t i n a l ( F i g u r e I I I - 2 ) w i l l p r o v i d e t h e m e a n s t o m e a s u r e t h e d i h e d r a l a n g l e b e t w e e n t h e t w o i s o t o p i c l a b e l s , a n d t h u s g i v e u s t h e d e g r e e o f t w i s t i n g a b o u t t h e C 1 2 / C 1 3 s i n g l e b o n d . T h e l a b e l e d r e t i n a l w i l l b e b o u n d t o e a c h o f t h e f o u r . . F i u r e I I I - 1 . T w i s t i n o f t h e s i n l e b o n d s r h o d o p s r n p r o t e i n s ( r o d , r e d , g r e e n , a n d b l u e ) g g 8 w i l l r e d u c e t h e d e g r e e o f r t o r b i t a l o v e r l a p , a n d t h e d i h e d r a l a n g l e w i l l b e m e a s u r e d a s a a n d t h u s w i l l l e a d t o d i f f e r e n t m a x i m a l w a v e l e n g t h s . I n d i v i d u a l r h o d o p s i n p r o t e i n s f u n i n f h l i n ’ 3 n C t 0 0 t e c o u p g 0 f t h e C t e s o r s b y m a y m o d u l a t e t h i s b y a l t e r i n g t h e s t e r i c s o l i d s t a t e N M R ( c o l l a b o r a t i o n w i t h ’ e s m m i o n s P l a c e d o n t h e C h r o m O P h o r e . r e s u l t i n g i n d i f f e r e n t d e g r e e s o f c o n j u g a t i o n 1 9 7 C h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) " 3 W e w o u l d e x p e c t t h e a m o u n t o f t w i s t i n g t o b e m i n i m a l w h e n b o u n d t o r e d r h o d o p s i n , a s t h i s h a s t h e l a r g e s t m a x i m a l w a v e l e n g t h ( 5 7 0 n m ) a n d w o u l d r e q u i r e t h e l a r g e s t d e g r e e o f o r b i t a l o v e r l a p . B y t h e s a m e a r g u m e n t s , w e w o u l d t h e n e x p e c t t h e b l u e r h o d o p s i n t o d i s p l a y t h e l a r g e s t d e g r e e o f t w i s t i n g r e s u l t i n g i n t h e l a r g e s t d i s r u p t i o n i n c o n j u g a t i o n a n d s m a l l e s t A m ( 4 2 0 n m ) . T h e t e c h n i q u e i n v o l v e d i n t h i s s t u d y w i l l m e a s u r e t h e r e l a t i v e o r i e n t a t i o n o f c h e m i c a l s h i fi a n i s o t r o p y ( C S A ) t e n s o r s o f l a b e l e d o l e fi n i c c a r b o n s . T h e C S A d e p e n d s o n h o w t h e fi i n c t i o n a l g r o u p s f r o m t h e n u c l e i a r e p o s i t i o n e d r e l a t i v e t o t h e e x t e r n a l m a g n e t i c fi e l d . S o l i d s t a t e N M R , r a t h e r t h a n s o l u t i o n N M R i s t h e m o s t v i a b l e F i g u r e 1 1 1 - 2 . l 3 c l a b e l s w i l l b e i n c o r p o r a t e d a t p o s i t i o n s 1 1 a n d 1 4 a s i n d i c a t e d b y t h e a r r o w s . T h i s c o m p o u n d w i l l b e b o u n d t o e a c h o f t h e f o u r o p s i n p r o t e i n s a n d t h e d i h e d r a l a n g l e , i . e . , t h e t w i s t o f t h e C 1 2 / C 1 3 s i n g l e b o n d , w i l l b e m e a s u r e d . 9 0 ° 9 0 ° 9 0 ° ( 1 n n . f l . F i g u r e I I I - 3 . S i m p l i fi e d p u l s e s e q u e n c e o f M a g i c A n g l e S p i n n i n g s p e c t r o s c o p y . t . a n d t 2 r e p r e s e n t w h e r e N M R s p e c t r u m i s r e c o r d e d . 1 r e p r e s e n t s t h e e x c h a n g e t i m e w h e r e m a g n e t i z a t i o n t r a n s f e r t a k e s p l a c e . a p p r o a c h f o r t h i s e x p e r i m e n t n o t o n l y b e c a u s e o f t h e s i z e o f t h e p r o t e i n , b u t a l s o b e c a u s e i t i s a m e m b r a n e b o u n d p r o t e i n w h i c h w i l l b e i n a m o r e s t r u c t u r a l l y r o b u s t e n v i r o n m e n t u n d e r s o l i d s t a t e N M R c o n d i t i o n s . T w o - d i m e n s i o n a l s p e c t r a i n t h e s o l i d s t a t e a r e a c q u i r e d t h r o u g h r o t o r - s y n c h r o n i z e d M a g i c A n g l e S p i n n i n g s p e c t r o s c o p y , w h o s e s i m p l i fi e d p u l s e s e q u e n c e i s s h o w n i n F i g u r e I I I - 3 . M a g n e t i z a t i o n t r a n s f e r b e t w e e n t h e 1 3 C d u r i n g 1 ( e x c h a n g e t i m e ) g i v e s r i s e t o c r o s s p e a k s i n t h e t w o - d i m e n s i o n a l s p e c t r a . T h e i n t e n s i t i e s o f t h e s e 1 9 8 c r o s s p e a k s c a n t h e n b e c o m p a r e d t o s i m u l a t e d d a t a a n d c o n s t r a i n t s p l a c e d o n t h e d i h e d r a l a n g l e s b e t w e e n t h e l a b e l e d c a r b o n s . T h e t w o i s o m e r s o f 1 , 4 - d i p h e n y l - 2 - e t h o x y c a r b o n y l b u t a d i e n e ( Z , E i s o m e r I I I - a , a n d E , E i s o m e r I I I - b , F i g u r e I I I - 6 ) a r e m e a n t t o s e r v e a s m o d e l c o m p o u n d s t o m i m i c t h e d i e n e n a t u r e o f t h e fi n a l d e s i r e d b i s - l a b e l e d l l - c i s - r e t i n a l c o m p o u n d ( F i g u r e I I I - 2 ) . 4 S i m i l a r c o m p o u n d s h a v e b e e n s y n t h e s i z e d b e f o r e , 5 b u t w e r e q u i r e d a r o u t e t o a c q u i r e 1 , 4 - b i s - l a b e l e d b u t a d i e n e s f r o m r e a d i l y a v a i l a b l e a n d i n e x p e n s i v e l 3 C l a b e l e d p r e c u r s o r s . T h e s e t w o m o l e c u l e s c o n t a i n t h e s a m e o l e fi n i c l a b e l i n g p a t t e r n a s t h e p r o p o s e d l l - c i s - r e t i n a l , i . e . ; 1 , 4 - [ 1 3 C ] 2 - l a b e l s . T h e i s o m e r i c p h e n y l g r o u p a t C 1 o f I I I - a a n d I I I - b l e a d s t o d i f f e r e n t t o r s i o n a l t w i s t s w i t h i n t h e C 2 / C 3 s i n g l e b o n d . W e h a v e p e r f o r m e d c o n f o r m a t i o n a l a n a l y s e s o f t h e s e m o l e c u l e s ( M o n t e C a r l o ) a n d h a v e d e t e r m i n e d t h e t h e o r e t i c a l d i h e d r a l a n g l e s b e t w e e n t h e o l e fi n i c p l a n e s ( d i h e d r a l a n g l e s b e t w e e n C 1 - C 2 - C 3 - C 4 ) f o r e a c h c o m p o u n d . A s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e I I I - 4 , t h e p l a n e s d e fi n e d b y t h e t w o o l e fi n s i n t h e Z , E i s o m e r I I I - a a r e t w i s t e d b y a b o u t 2 0 ° . H o w e v e r , t h e s a m e t w o p l a n e s i n t h e E , E i s o m e r I I I - b a r e t w i s t e d b y 4 1 ° . F o r b o t h c o m p o u n d s I I I - a a n d I I I - b , t h e s - c i s c o n f o r m a t i o n s w e r e m o r e s t a b l e a s c o m p a r e d t o t h e i r c o r r e s p o n d i n g s - t r a n s c o n f o r m a t i o n s b y 1 . 2 a n d 1 . 4 K c a l / m o l , r e s p e c t i v e l y ( P M 3 , S p a r t a n V . 5 . 1 . 3 ) . T h e s - c i s c o n f o r m a t i o n f o r b o t h c o m p o u n d s w a s o b t a i n e d b y s t a r t i n g t h e m i n i m i z a t i o n f r o m v a r i o u s s t a r t i n g g e o m e t r i e s i n c l u d i n g s - t r a n s . T h e s y n t h e t i c r o u t e f o r s y n t h e s i s o f ( Z , E ) - 2 - e t h o x y c a r b o n y l - l , 4 - [ 1 3 C ] 2 - d i p h e n y l b u t a d i e n e ( I I I - a ) i s o u t l i n e d i n S c h e m e 1 1 1 - 1 . T h e Z , E i s o m e r I I I - a w a s s y n t h e s i z e d b y e m p l o y i n g a d o u b l e H o m e r - W a d s w o r t h - E m m o n s ( H W E ) s t r a t e g y i n a s i m i l a r f a s h i o n w h i c h w a s r e p o r t e d b y M i n a m i e t a l . 6 S e l e n a t i o n o f t r i e t h y l - Z - 1 9 9 p p h r o o s c p e h e o d n e o d e p r s o m p o r o o t n h a l t y t o ( f I u I r I n - i b s ) h 1 3 \ O E t O Z C O \ 1 3 O 1 3 \ 1 3 \ O 0 0 2 E t I I I - c , w h i c h w a s o x i d i z e d ( Z , E ) i s o m e r I I I - a ( E , E ) i s o m e r I I I - b p r o m p t l y w i t h m C P B A t o 4 1 ° d i h e d r a l a n g l e y i e l d t h e s y n - e l i m i n a t e d p r o d u c t I I I - d i n h i g h y i e l d . \ / \ / 4 \ “ 1 ’ \ / \ D u e t o t h e l o w e r c o s t — a n d t o x i c i t y o f s u l f u r a s 2 0 0 d i h e d r a l a n g l e c o m p a r e d t o s e l e n i u m F i g u r e I I I - 4 . C o n f o r m a t i o n a l a n a l y s i s a n d m i n i m i z a t i o n s ( M a c r o M o d e l , v e r s i o n 7 . 0 ) r e v e a l a 2 0 0 d i h e d r a l t w i s t o f t h e c o m o u n d s , w e i n i t i a l l t r i e d p y s i n g l e b o n d b e t w e e n t h e t w o i s o t o p i c l a b e l s f o r t h e Z , E i s o m e r s e v e r a l a r o m a t i c s u l f u r ( I I I - a ) . T h e E , E i s o m e r ( I I I - b ) e x h i b i t s a 4 1 ° d i h e d r a l t w i s t o f . . t h e s a m e b o n d . c o m p o u n d s 1 n p r o g r e s s r o n t o w a r d s I I I - d . P h e n y l d i s u l fi d e , 4 - n i t r o b e n z e n e s u l f e n y 1 c h l o r i d e , a n d 1 , 4 - d i n i t r o b e n z e n e s u l f e n y l c h l o r i d e a l l p r o v i d e d > 9 0 % y i e l d s o f t h e s u l f u r a n a l o g o f I I I - c . O x i d a t i o n o f t h e s e c o m p o u n d s w i t h e i t h e r m C P B A o r N a I O a p r o v i d e d t h e s u l f o x i d e i n t e r m e d i a t e s a g a i n i n > 9 0 % y i e l d s . T h e s y n - e l i m i n a t e d p r o d u c t ( I I I - d ) w a s o n l y o b t a i n e d u p o n h i g h t e m p e r a t u r e K u g e l r o h r d i s t i l l a t i o n a n d i n y i e l d s < 5 0 % . U s e o f p h e n y l s e l e n y l c h l o r i d e p r o v i d e d t h e e l i m i n a t e d p r o d u c t i n 9 5 % y i e l d d i r e c t l y f r o m I I I - c u p o n t r e a t m e n t w i t h m C P B A . N o f u r t h e r r e a c t i o n o r h e a t i n g w a s r e q u i r e d t o a f f o r d I I I - d i n h i g h y i e l d a n d p u r i t y . T h e o l e fi n i c c a r b o n s i n I I I - d a r e t h e u n l a b e l e d c a r b o n s C 2 a n d C 3 i n t h e fi n a l p r o d u c t . T h e d o u b l e H W E r e a c t i o n a t t h e s e t w o c a r b o n c e n t e r s w i t h l 3 C - c a r b o n y l l a b e l e d b e n z a l d e h y d e w o u l d d e l i v e r t h e 1 , 4 - b i s - ’ 3 C - l a b e l e d c o m p o u n d s . T h e d o u b l e H W E w a s 2 0 0 i n i t i a t e d b y t h e 1 , 4 - a d d i t i o n o f d i e t h y l p h o s p h i t e t o o b t a i n t h e b i s - p h o s p h a t e I I I - e . D e p r o t o n a t i o n o f I I I - e w i t h s - B u L i a n d a d d i t i o n o f l a b e l e d b e n z a l d e h y d e d e l i v e r e d i n t e r m e d i a t e I I I - f , w h i c h w a s t r e a t e d w i t h a n o t h e r e q u i v a l e n t o f s - B u L i a n d l a b e l e d b e n z a l d e h y d e t o d e l i v e r a 6 : 1 i s o m e r i c m i x t u r e o f I I I - a z l l l - b i n 3 9 % y i e l d o v e r t h e l a t t e r s t e p s . T h e Z , E i s o m e r I I I - a w a s p u r i fi e d b y H P L C . O u r a t t e m p t s a t a o n e p o t s y n t h e s i s f r o m I I I - d — > I I I - a , b y u t i l i z i n g t h e e n o l a t e g e n e r a t e d a f t e r t h e M i c h a e l a d d i t i o n o f d i e t h y l p h o s p h i t e t o I I I - d f o r t h e s u b s e q u e n t H W E r e a c t i o n s p r o d u c e d l o w y i e l d s o f t h e d e s i r e d fi n a l c o m p o u n d a n d w a s n o t r e p r o d u c i b l e . I t w a s t h e r e f o r e n e c e s s a r y t o i s o l a t e I I I - e a n d p r o c e e d f o r w a r d . T h e b i s - o l e fi n a t i o n o f I I I - e a l l o w s f o r t h e i n t r o d u c t i o n o f c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e l 3 C — l a b e l e d c a r b o n y l c o m p o u n d s s u c h a s b e n z a l d e h y d e o r o t h e r k e t o n e s o r a l d e h y d e s a s t h e l a s t s t e p o f t h e s y n t h e s i s . I n S c h e m e I I I - l 0 9 E t c / K r I I I - b o o B \ > 8 0 % ( O E t ) 2 H P ( O ) ( O E t ) 2 . T H F I I I - d 1 . n - B u L i / T H F _ P \ ( O E t ) 2 2 . P h S e C I 9 4 % s — B u L i I H M P A 0 S ? p \ m C P B A - E t O ( O E t ) 2 — — > C H C | S e P h 2 2 6 7 % 3 . s - B u L i / H M P A _ 0 I I I - c 9 5 / ° 1 . s - B u L i / H M P A ‘ o o B E t O \ ( o a ) 2 0 ‘ 2 . C 3 H 5 1 3 0 H O ‘ 8 T H F ( 0 5 1 1 2 I I I - e C O z E t 4 . C 6 H 5 ‘ 3 C H O 3 9 % t h i s m a n n e r , w e c a n i n t r o d u c e b o t h l a b e l s a t o n c e a t t h e e n d o f t h e s c h e m e . T h i s c o u l d e n a b l e u s t o q u i c k l y c r e a t e a s m a l l l i b r a r y o f 1 , 4 - [ 1 3 C ] 2 - b u t a d i n e c o m p o u n d s i f n e e d e d . S y n t h e s i s o f t h e E , E i s o m e r I I I - b i s i l l u s t r a t e d i n S c h e m e 1 1 1 - 2 . 7 T h e B a y l i s - H i l l m a n r e a c t i o n b e t w e e n l a b e l e d b e n z a l d e h y d e a n d e t h y l a c r y l a t e p r o c e e d e d s m o o t h l y t o f u r n i s h t h e a l l y l a l c o h o l I I I - h , 8 w h i c h u p o n t r e a t m e n t w i t h H B r i n c o n c e n t r a t e d s u l f u r i c a c i d r e a r r a n g e d t o y i e l d t h e a l l y l b r o m i d e I I I - i i n e x c e l l e n t y i e l d . 9 A s r e p o r t e d b y A g g a r w a l a n d c o w o r k e r s , w e a l s o n o t i c e d a s u b s t a n t i a l d e c r e a s e i n r e a c t i o n t i m e r e q u i r e d f o r t h e B a y l i s - H i l l m a n r e a c t i o n c a t a l y z e d b y 1 , 8 - d i a z a b i c y c l o [ 5 . 4 . 0 ] u n d e c - 7 - e n e ( D B U ) ( 1 d a y ) a s c o m p a r e d t o D A B C O ( 7 d a y s ) . 1 0 Y l i d e I I I - j w a s o b t a i n e d i n q u a n t i t a t i v e y i e l d f r o m t h e r e a c t i o n o f I I I - i w i t h t 1 i p h e n y l p h o s p h i n e , w h i c h w a s s u b s e q u e n t l y d e p r o t o n a t e d a n d r e a c t e d w i t h l a b e l e d b e n z a l d e h y d e t o a f f o r d t h e d e s i r e d E , E d i e n e I I I - b i n g o o d y i e l d a n d h i g h i s o m e r i c p u r i t y ( 2 0 : 1 r a t i o o f I I I - b z l l l - a ) . A l t h o u g h w e h a d t o u s e t h e l a b e l e d b e n z a l d e h y d e i n t h e fi r s t s t e p o f t h e s y n t h e s i s , b e c a u s e t h e y i e l d s o f t h e s u b s e q u e n t r e a c t i o n s w e r e h i g h , w e d i d n o t d e e m t h i s a s a m a j o r p r o b l e m . S c h e m e I I I - 2 C O z E t O H 1 3 i / 4 8 % H B r C H 0 I > 1 3 C O Z E t C 0 0 0 . H 2 3 0 4 D B U / R . T . R O T H / 2 3 3 6 2 4 h . . " " 8 8 0 % “ 1 ' “ 9 5 % 1 3 1 3 \ C 0 2 E t P P h 3 / A C N ‘ \ C 0 2 5 1 1 0 h / R . T . ' B r q u a n t . P P h a B r I I I - i I I I - j C O z E t 1 3 1 . n - B u L i / T H F _ O \ \ 1 3 7 2 % I I I - b O 2 0 2 T h e s t e r e o i s o m e r s I I I - a a n d I H - b w e r e c h a r a c t e r i z e d b y o n e a n d t w o - d i m e n s i o n a l N M R s p e c t r o s c o p y . T h e s t e r e o c h e m i s t r y o f t h e o l e fi n i c b o n d s w e r e c o n fi r m e d b y N O E S Y . I n p a r t i c u l a r , s t r o n g c o u p l i n g o f H 1 a n d H 3 p r o t o n s w a s o b s e r v e d i n I I I - a , w h i c h w a s a b s e n t i n I I I - b . 1 3 C N M R a n a l y s i s o f t h e r e s u l t i n g I I I - a r e v e a l e d d o u b l y e n h a n c e d s i g n a l s a t 1 3 2 . 5 a n d 1 3 1 p p m , w h i l e I I I - b d i s p l a y e d e n h a n c e d s i g n a l s a t 1 3 9 a n d 1 3 5 p p m , c o r r e s p o n d i n g t o e n r i c h e d C 1 a n d C 4 o f t h e 1 , 4 - b i s - l 3 C - b u t a d i e n e s y s t e m . T h e s e c o m p o u n d s a r e r e a d y f o r a n a l y s i s b y s o l i d s t a t e N M R e x p e r i m e n t s . I f s u c c e s s f u l m e a s u r e m e n t s a r e m a d e , a n d i t i s f o u n d t h a t t h e d i f f e r e n c e i n d i h e d r a l a n g l e o f t h e t w o i s o m e r s c a n b e d i s t i n g u i s h e d t h r o u g h t h e s e m e a n s , s y n t h e s i s o f 1 1 , 1 4 - [ 1 3 C ] 2 - 1 1 - c i s - r e t i n a l a n d i s o l a t i o n o f t h e r h o d o p s i n p i g m e n t s w i l l c o m m e n c e . 2 0 3 B . P r o p o s e d S y n t h e s i s o f l 1 , 1 4 - [ ' 3 C ] 2 - 1 l - c i s - r e t i n a l T h e p r o p o s e d r o u t e t o s y n t h e s i z e t h e b i s - l a b e l e d r e t i n a l a n a l o g i s d e p i c t e d i n S c h e m e 1 1 1 - 3 . T h e s o u r c e s o f ‘ 3 C w i l l b e i n c o r p o r a t e d t h r o u g h e t h y l b r o m o a c e t a t e ( I H - k ) a n d c a r b o n t e t r a b r o m i d e . D e p r o t e c t i o n a n d o x i d a t i o n o f t h e a l l y l i c a l c o h o l w i l l p r o v i d e c o m p o u n d [ I I I - n , w h i c h i s s e t u p f o r a C o r e y - F u c h s t y p e r e a c t i o n a n d i n c o r p o r a t i o n o f t h e s e c o n d i s o t o p i c l a b e l . T h e s y n t h e s i s o f v i n y l i o d i d e I I I - q w i l l f o l l o w p u b l i s h e d ” ' ' 2 a n d w i l l u n d e r g o a S o n o g a s h i r a c o u p l i n g w i t h t h e b i s - l 3 C - l a b e l e d p r o c e d u r e s , f r a g m e n t I I I - o t o p r o d u c e t h e l l - y n e r e t i n a l p r e c u r s o r ( I I I - r ) . 1 3 F o r fi n a l c o n v e r s i o n t o t h e d e s i r e d c o m p o u n d , D I B A L r e d u c t i o n o f t h e e s t e r w i l l a f f o r d t h e a l c o h o l , t h e t r i p l e b o n d w i l l b e s e l e c t i v e l y r e d u c e d t o f u r n i s h l l - c i s - r e t i n o l a s p r e v i o u s l y r e p o r t e d , a n d o x i d a t i o n w i t h a c t i v a t e d M n O z s h o u l d a f f o r d t h e d e s i r e d a d d u c t , 1 1 , 1 4 — [ 1 3 C ] z - l l - c i s - r e t i n a l ( I I I - s ) . ' 4 A l t h o u g h t h e i s o t o p i c l a b e l s a p p e a r e a r l y i n t h e s y n t h e t i c p l a n , w e d o n o t d e e m t h i s a m a j o r p r o b l e m g i v e n t h a t m a n y o f t h e f u r t h e r s t e p s a r e w e l l e s t a b l i s h e d . T h e e f f o r t s o n t h i s p o r t i o n o f t h e w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n p r o j e c t h a v e s t o p p e d h e r e , w i t h t h e s y n t h e s i s o f t h e l a b e l e d a d i p i c a n d s u c c i n i c m o d e l d e r i v a t i v e s I I I - a a n d I I I - b , a n d p r e l i m i n a r y i n v e s t i g a t i o n s i n t o t h e s y n t h e s i s o f t h e b i s - l a b e l e d r e t i n a l , I I I - s . P r o v i d e d s u c c e s s fi r l s o l i d s t a t e N M R m e a s u r e m e n t s a n d c o n d i t i o n s a r e o b t a i n e d f r o m t h e m o d e l b u t a d i e n e s , t h i s p r o j e c t w i l l b e c o n t i n u e d w i t h t h e c o m p l e t i o n o f t h e s y n t h e s i s o f I I I - s a s d e s c r i b e d a b o v e , a n d i s o l a t i o n o f t h e r h o d o p s i n p i g m e n t s . R e g e n e r a t i o n o f r o d r h o d 0 p s i n a n d t h e c o n e r h o d o p s i n s f r o m t h e i r o p s i n s w i l l b e p e r f o r m e d f o l l o w i n g l 5 - l 7 p r e v i o u s l y p u b l i s h e d p r o t o c o l s . S i n c e n e i t h e r t h e p r o t e i n n o r t h e c h r o m o p h o r e i s 2 0 4 a l t e r e d s t r u c t u r a l l y o r c h e m i c a l l y , t h e r e s u l t o f t h e r e g e n e r a t i o n w i l l b e t h e w i l d t y p e p i g m e n t s w i t h l 3 C - l a b e l s i n c o r p o r a t e d w i t h i n t h e p o l y e n e . S o l i d s t a t e N M R e x p e r i m e n t s s h o u l d r e v e a l t h e d e g r e e o f t w i s t w i t h i n t h e C 1 2 / C 1 3 s i n g l e b o n d o f r e t i n a l a s b o u n d t o d i f f e r e n t r h o d o p s i n s . I f t h i s p r o v e s t o b e a s u c c e s s f u l m e t h o d f o r a n a l y s i s o f d i h e d r a l a n g l e s o f b o u n d c h r o m o p h o r e s , o n e c o u l d e m p l o y t h i s s a m e p r o c e d u r e t o i n v e s t i g a t e t h e t w i s t o f o t h e r s i n g l e b o n d s i n l l - c i s - r e t i n a l a s i t i s b o u n d t o d i f f e r e n t r h o d o p s i n s , u s i n g a l t e r n a t i v e b i s - 1 3 C - l a b e l e d l l - c z ' s - r e t i n a l s w i t h p l a c e m e n t o f t h e l a b e l s b e f o r e a n d a f t e r t h e s i n g l e b o n d t o b e a n a l y z e d . S c h e m e I I I - 3 ‘ 3 P P h 3 B r A C O Z E t — + 1 3 0 E t L O T I P S B r P h a P A 0 0 2 E t H 0 2 8 1 ' T B A F ’ T H F > H 2 > T I P S 1 3 2 . S w e r n O x . O H 3 L D A / T H F 1 3 0 3 a n B u L i P d ( P P h 3 ) 4 0 2 3 C u C l / i P r N H z ) j o z a ‘ ¢ 1 3 1 . D i b a l - H / E t z o 1 3 2 . Z n ( C u / A g ) / M e O H / H 2 0 > \ \ \ 3 . M n 0 2 ( a c t i v a t e d ) \ 1 3 ‘ o 2 0 5 C . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s O i ? P E t O / U > < \ ( O E 1 ) 2 S e P h P r e p a r a t i o n o f 2 - ( D i e t h o x y p h o s p h o r y l ) - 2 - p h e n y l s e l a n y l - p r o p i o n i c a c i d e t h y l e s t e r ( I I I — c ) : A 0 . 7 5 M s o l u t i o n o f t r i e t h y l - 2 - p h o s p h o n o p r o p i o n a t e i n T H F w a s c o o l e d t o — 7 8 ° C . O n e e q u i v a l e n t ( 2 . 1 m m o l ) o f n - B u L i ( 1 . 2 M i n h e x a n e ) w a s a d d e d t o t h e m i x t u r e a n d a l l o w e d t o w a r m t o r o o m t e m p e r a t u r e . U p o n r e a c h i n g r o o m t e m p e r a t u r e a 0 . 8 5 M ( 2 . 1 m m o l / 2 . 5 m L T H F ) s o l u t i o n o f p h e n y l s e l e n y l c h l o r i d e w a s a d d e d a n d s t i r r e d f o r 4 h o u r s . T h e r e a c t i o n w a s q u e n c h e d w i t h 1 0 % H C l , e x t r a c t e d w i t h E t Z O , d r i e d o v e r a n h y d r o u s N a 2 S 0 4 , a n d c o n c e n t r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . T h e p r o d u c t w a s i s o l a t e d i n 9 4 % y i e l d , a n d u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r i fi c a t i o n . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 6 1 . 2 2 ( 3 H , t , J = 8 . 1 H z ) ; 1 . 3 4 ( 6 H , m ) ; 1 . 5 5 ( 3 H , d , J = 1 5 . 8 H z ) ; 4 . 0 - 4 . 2 ( 4 H , m ) ; 4 . 2 5 ( 2 H , q , J = 8 . 1 H z ) ; 7 . 2 6 - 7 . 4 3 ( 4 H , m ) ; 7 . 6 8 ( 1 H , d d , J = 1 . 4 , 7 . 5 H z ) . M a t c h e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d s p e c t r a l d a t a . ‘ 8 O 8 p 5 0 k a \ ( O E t ) 2 P r e p a r a t i o n o f 2 - ( D i e t h o x y p h o s p h o r y l ) - a c r y l i e a c i d e t h y l e s t e r ( I I I - d ) : A 0 . 1 7 M ( 2 . 1 m m o l / 1 2 . 4 m L ) s o l u t i o n o f m C P B A i n C H Z C I Z w a s a d d e d d r o p w i s e t o a 0 . 1 M s o l u t i o n ( 2 . 1 m m o l / 2 1 m L ) o f I I I - c i n C H z C l z a t — 7 8 ° C . A fi e r c o m p l e t e a d d i t i o n , t h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o w a r m t o r o o m t e m p e r a t u r e a n d s t i r f o r 2 0 h o u r s . T h e m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h s a t u r a t e d N a H C O 3 , b r i n e , d r i e d o v e r a n h y d r o u s 2 0 6 N a Z S O 4 a n d c o n c e n t r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . T h e p r o d u c t w a s p u r i fi e d b y K u g e l r o h r d i s t i l l a t i o n t o y i e l d 9 5 % o f a c o l o r l e s s o i l . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 8 1 . 3 3 ( 3 H , t ) ; 1 . 3 5 ( 3 H , t ) ; 4 . 1 8 ( 2 H , m ) ; 4 . 2 8 ( 2 H , q , J = 7 . 1 4 H z ) ; 6 . 7 4 ( 1 H , d d , J H H = 1 . 9 H z , J H p = 2 0 . 3 H z ) ; 6 . 9 8 ( 1 H , d d , J H H = 1 . 9 , J H P = 4 2 . 0 H z ) . M a t c h e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d s p e c t r a l d a t a . ' 8 l o o . L I t a r o / “ j \ ( O E t ) 2 o \ \ 7 ( 0 3 ) ; ; P r e p a r a t i o n o f 2 , 3 - B i s - ( d i e t h o x y p h o s p h o r y l ) - p r o p i o n i c a c i d e t h y l e s t e r ( I I I — e ) : A 0 . 1 5 M ( 5 9 . 1 m m o l ) s o l u t i o n o f d i e t h y l p h o s p h i t e i n T H F w a s c o o l e d t o — 7 8 ° C , N a H M D S ( 6 9 m m o l ) w a s a d d e d a n d s t i r r e d f o r o n e h o u r . T h e n 1 9 . 7 m m o l o f I I I - d , d i l u t e d i n T H F ( 5 m L ) , w a s a d d e d v i a c a n u l a a n d a l l o w e d t o s t i r o v e r n i g h t . T h e r e a c t i o n w a s q u e n c h e d w i t h 2 % H C l , e x t r a c t e d w i t h E t Z O , d r i e d o v e r N a 2 S 0 4 a n d c o n c e n t r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . T h e c r u d e r e a c t i o n m i x t u r e w a s p u r i fi e d w i t h fl a s h c h r o m a t o g r a p h y , w a s h e d w i t h 7 0 % E t O A c / h e x a n e , t h e n e l u t e d w i t h 1 0 % M e O H / C H C 1 3 t o y i e l d 6 7 % p r o d u c t . l H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 8 1 . 3 ( 1 5 H , m ) ; 2 . 2 ( 1 H , d d , J = 1 6 . 4 , 1 9 H z ) ; 2 . 5 ( 1 H , d q , J = 2 . 1 , 1 6 . 4 H z ) ; 3 . 2 3 ( 1 H , d t , J = 1 3 . 6 , 2 4 . 5 H z ) ; 4 . 1 5 ( 8 H , m ) ; 4 . 3 ( 2 H , m ) . M a t c h e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d s p e c t r a l d a t a . 5 2 0 7 P r e p a r a t i o n o f ( Z , E ) - 2 - e t h o x y c a r b o n y l - 1 , 4 - [ 1 3 C l z - d i p h e n y l b u t a d i e n e ( I I I — a ) : A 0 . 1 M ( 0 . 2 4 m m o l / 2 . 4 m L ) s o l u t i o n o f I I I - e i n T H F w a s c o o l e d t o 0 ° C , 0 . 2 4 m m o l o f s - B u L i ( 1 . 2 M i n h e x a n e ) w a s a d d e d , 0 . 2 4 m m o l o f H M P A w a s a d d e d , a n d s t i r r e d f o r 1 0 m i n u t e s . T h e r e a c t i o n w a s t h e n c o o l e d t o — 7 8 ° C a n d 0 . 2 4 m m o l o f P h ' 3 C H O , d i l u t e d i n T H F w a s a d d e d . T h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o s t i r f o r 3 - 4 h o u r s , u n t i l c o m p l e t e b y T L C . T h e m i x t u r e w a s t h e n c o o l e d t o 0 ° C a g a i n , 0 . 2 4 m m o l s B u L i a d d e d , 0 . 2 4 m m o l H M P A a d d e d , a n d a l l o w e d t o s t i r f o r 2 0 m i n u t e s . I t w a s t h e n c o o l e d t o — 7 8 ° C a n d a n o t h e r 0 . 2 4 m m o l o f P h ' 3 C H O , d i l u t e d i n T H F w a s a d d e d a n d m o n i t o r e d b y T L C . U p o n c o m p l e t i o n , t h e c r u d e r e a c t i o n m i x t u r e w a s p u r i fi e d b y fl a s h c h r o m a t o g r a p h y u s i n g 1 % E t O A c / h e x a n e t o y i e l d a 6 : 1 i s o m e r i c m i x t u r e o f I I I - a z l l l - b i n 3 9 % y i e l d . T h e i s o m e r s w e r e t h e n s e p a r a t e d b y H P L C ( P e r k i n E l m e r L C - 7 5 s y s t e m , n o r m a l p h a s e c o l u m n A l t e x U l t r a S h e r e - S i , u n d e r i s o c r a t i c c o n d i t i o n s , 3 % E t O A c / H e x , 5 m L / m i n , d e t e c t i o n a t 3 2 5 n m ) t o r e c o v e r 3 0 % o f t h e d e s i r e d i s o m e r I I I - a . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) Z 5 1 . 2 ( 3 H , t , J = 7 . 1 4 H z ) ; 4 . 3 4 ( 2 H , q , J = 7 . 1 4 H z ) ; 6 . 6 5 ( 1 H , d d , J H H = 1 6 . 5 H z , l J H C = 1 5 6 H z ) ; 6 . 7 5 ( 1 H , d , ' J H C = 1 5 5 . 2 H z ) ; 6 . 8 9 ( 1 H , m ) ; 7 . 2 — 7 . 5 ( 1 0 H , m ) . 1 3 C N M R ( 7 5 M H z , C D C 1 3 ) : 8 1 3 . 9 ; 6 1 . 4 ; 1 2 6 . 6 ( ( 1 , 3 1 c c = 2 . 3 H z ) ; 1 2 7 . 4 ( d , ' J c c = 4 3 . 8 H z ) ; 1 2 8 . 0 ; 1 2 8 . 2 ; 1 2 8 . 3 ; 1 2 8 . 5 ( d , 2 1 c c = 4 . 6 H z ) ; 1 2 8 . 7 ( d , 2 1 c c = 4 . 6 H z ) ; 1 3 1 . 0 ( d , 3 J c c = 8 . 0 H z ) ; 1 3 2 . 7 ( d , 3 1 c c = 9 . 2 H z ) ; 1 3 4 . 2 ( d , ' J c c = 5 8 . 5 H z ) ; 8 1 3 5 . 4 ( d , ‘ J c c = 5 5 . 5 H z ) ; 1 3 6 . 7 ( d , l J c c = 5 5 . 5 H z ) ; 1 6 8 . 9 . M a t c h e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d s p e c t r a l d a t a . 5 2 0 8 1 3 ‘ H N M R : ( 5 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 8 1 . 3 8 ( 3 H , t , J = 7 H z ) ; 4 . 3 5 ( 2 H , q , J = 7 H z ) ; 7 . 0 3 ( 1 H , d d , J = 3 . 3 H z , 1 7 H z ) ; 7 . 2 0 — 7 . 4 8 ( 1 1 H , m ) ; 7 . 5 7 ( 1 H , d , l J H C = 1 3 4 H z ) . 1 3 ’ c N M R ( 7 5 M H z , c o c 1 3 ) : 8 1 4 . 5 ; 6 1 . 0 ; 1 2 1 . 6 ( d , ' J C C = 7 3 . 3 H z ) ; 1 2 6 . 7 ; 1 2 7 . 8 ; 1 2 8 . 4 ( d , 2 1 c c = 4 . 6 H z ) ; 1 2 8 . 6 ; 1 2 8 . 7 ; 1 3 0 . 0 ( d , 1 J C C = 7 0 . 9 H z ) ; 1 3 0 . 1 ; 1 3 4 . 7 ( d , 3 J C C = 5 . 7 H z ) ; 1 3 5 . 5 ( d , l J c c = 5 5 . 5 H z ) ; 1 3 8 . 8 ( d , 3 J c c = 5 . 7 H z ) ; 1 6 7 . 5 . M a t c h e s p r e v i o u s l y p u b l i s h e d s p e c t r a l d a t a . 5 0 0 2 5 1 \ \ 1 3 J N M R d a t a o f ( E , E ) — 2 - e t h o x y c a r b o n y l - 1 , 4 - [ ” C h - d i p h e n y l b u t a d i e n e ( I I I — b ) : 2 0 9 D . R e f e r e n c e s 1 . W e l i k y , D . P . ; T y c k o , R . " D e t e r m i n a t i o n o f p e p t i d e c o n f o r m a t i o n s b y t w o - d i m e n s i o n a l m a g i c a n g l e s p i n n i n g N M R e x c h a n g e s p e c t r o s c o p y w i t h r o t o r s y n c h r o n i z a t i o n . " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 6 , 1 1 8 , 8 4 8 7 - 8 4 8 8 . 2 . T y c k o , R . ; W e l i k y , D . P . ; B e r g e r , A . E . " I n v e s t i g a t i o n o f m o l e c u l a r s t r u c t u r e i n s o l i d s b y t w o - d i m e n s i o n a l e x c h a n g e s p e c t r o s c o p y w i t h m a g i c a n g l e s p i n n i n g . " J . C h e m . P h y s . 1 9 9 6 , 1 0 5 , 7 9 1 5 - 7 9 2 6 . 3 . W e l i k y , D . P . ; B e n n e t t , A . E . ; Z v i , A . ; A n g l i s t e r , J . ; S t e i n b a c h , P . J . ; T y c k o , R . " S o l i d s t a t e N M R e v i d e n c e f o r a n a n t i b o d y - d e p e n d e n t c o n f o r m a t i o n o f V 3 l o o p o f H I V g p l Z O . " N a t u r e S t r u c . B i o l . 1 9 9 9 , 6 , 1 4 1 - 1 4 5 . 4 . C r i s t , R . M . ; R e d d y , P . V . ; B o r h a n , B . " S y n t h e s i s o f i s o m e r i c 1 , 4 - [ 1 3 C ] 2 - l a b e l e d 2 - e t h o x y c a r b o n y l - l , 4 - d i p h e n y l b u t a d i e n e s . " T e t r a h e d r o n L e t t . 2 0 0 1 , 4 2 , 6 1 9 - 6 2 1 . 5 . J a n e c k i , T . ; B o d a l s k i , R . " A c o n v e n i e n t H o m e r - E m m o n s a p p r o a c h t o t h e s y n t h e s i s o f s u b s t i t u t e d e t h y l 1 , 3 - b u t a d i e n e - 2 - c a r b o x y l a t e s a n d r e l a t e d c o m p o u n d s . " S y n t h e s i s 1 9 8 9 , 7 , 5 0 6 - 5 1 0 . 6 . M i n a m i , T . ; T o k u m a s u , S . ; H i r a o , 1 . " R e a c t i o n s o f v i n y l p h o s p h o n a t e s . 3 . O n e — p o t s y n t h e s i s o f d i e n e s a n d t h e i r a n a l o g s f r o m v i n y l p h o s p h o n a t e s , a l d e h y d e s a n d d i e t h y l p h o s p h o n a t e . " B u l l . C h e m . S o c . J p n . 1 9 8 5 , 5 8 , 2 1 3 9 - 2 1 4 0 . 7 . T h i s w o r k w a s p e r f o r m e d i n c o l l a b o r a t i o n w i t h p o s t - d o c t o r a l f e l l o w , D r . P u l g a m V e e r a R e d d y . 8 . F o r t , Y . ; B e r t h e , M . C . ; C a u b e r e , P . " T h e ' B a y l i s - H i l l m a n R e a c t i o n ' m e c h a n i s m a n d a p p l i c a t i o n s r e v i s i t e d . " T e t r a h e d r o n 1 9 9 2 , 4 8 , 6 3 7 1 - 6 3 8 4 . 2 1 0 1 0 . l l . 1 2 . l 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . B u c h h o l z , R . ; H o f f m a n n , H . M . R . " c t - M e t h y l i d e n e - a n d a - a l k y l i d e n e - B - l a c t a m s f r o m n o n p r o t e i n o g e n i c a m i n o a c i d s . " H e l v . C h i m . A c t a 1 9 9 1 , 7 4 , 1 2 1 3 - 1 2 2 0 . A g g a r w a l , V . K . ; M e r e u , A . " S u p e r i o r a m i n e c a t a l y s t s f o r t h e B a y l i s - H i l l m a n r e a c t i o n : t h e u s e o f D B U a n d i t s i m p l i c a t i o n s . " C h e m . C o m m u n . 1 9 9 9 , 2 2 , 2 3 1 1 - 2 3 1 2 . N e g i s h i , E . ; V a l e n t e , L . F . ; K o b a y a s h i , M . " P a l l a d i u m - c a t a l y z e d c r o s s - c o u p l i n g r e a c t i o n o f h o m o a l l y l i c o r h o m o p r o p a r g y l i c o r g a n o z i n c s w i t h a l k e n y l h a l i d e s a s a n e w s e l e c t i v e r o u t e t o 1 , 5 - d i e n e s a n d 1 , 5 - e n y n e s . " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 8 0 , 1 0 2 , 3 2 9 8 - 3 2 9 9 . N e g i s h i , E . ; K i n g , A . 0 . ; T o u r , J . M . , C o n v e r s i o n o f m e t h y l k e t o n e s i n t o t e r m i n a l a l k y n e s . I n O r g a n i c S y n t h e s e s , e d . ; K e n d e , A . 8 . , A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y : B l o o m i n g t o n , 1 9 8 5 ; V o l . 6 4 , p p 4 4 - 4 9 . S o n o g a s h i r a , K . ; T o h d a , Y . ; H a g i h a r a , N . " A c o n v e n i e n t s y n t h e s i s o f a c e t y l e n e s : C a t a l y t i c s u b s t i t u t i o n s o f a c e t y l e n i c h y d r o g e n w i t h b r o m o a l k e n e s , i o d o a r e n e s , a n d b r o m o p y r i d i n e s . " T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 7 5 , 1 6 , 4 4 6 7 - 4 4 7 0 . B o r h a n , B . ; S o u t o , M . L . ; U m , J . M . ; Z h o u , B . ; N a k a n i s h i , K . " E f fi c i e n t s y n t h e s i s o f 1 l - c i s - r e t i n o i d s . " C h e m . E u r . J . 1 9 9 9 , 5 , 1 1 7 2 - 1 1 7 5 . O p r i a n , D . D . ; A s e n j o , A . B . ; L e e , N . ; P e l l e t i e r , S . L . " D e s i g n , c h e m i c a l s y n t h e s i s , a n d e x p r e s s i o n o f g e n e s f o r t h e 3 h u m a n c o l o r v i s i o n p i g m e n t s . " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 1 , 3 0 , 1 1 3 6 7 - 1 1 3 7 2 . P a p e r m a s t e r , D . S . " P r e p a r a t i o n o f r e t i n a l r o d o u t e r s e g m e n t s . " M e t h o d s i n E n z y m o l o g y ; A c a d e m i c P r e s s : N e w Y o r k 1 9 8 2 , 8 1 , 4 8 - 5 2 . 2 1 1 1 7 . 1 8 . K o c h e n d o e r f e r , G . G . ; W a n g , Z . ; O p r i a n , D . D . ; M a t h i e s , R . A . " R e s o n a n c e R a m a n e x a m i n a t i o n o f t h e w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n m e c h a n i s m i n h u m a n v i s u a l p i g m e n t s . " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 7 , 3 6 , 6 5 7 7 - 6 5 8 7 . K l e s c h i c k , W . A . ; H e a t h c o c k , C . H . " S y n t h e s i s a n d c h e m i s t r y o f e t h y l 2 - d i e t h y l p h o s p h o n o a c r y l a t e . " J . O r g . C h e m . 1 9 7 8 , 4 3 , 1 2 5 6 - 1 2 5 9 . 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 t g . fl ) “ . w i . ' 1 . m n n \ o . “ I . r 1 h " ‘ . % 3 . k 1 . 4 0 : x a t . . v . 3 u x { S u v J n . u ¢ . u a 2 n . . u 9 3 u . fi \ x A r . 5 3 ( : w . . 2 1 n . A h . $ . \ 7 . . d 5 E r : . 3 . l 2 L 1 l 3 y t 5 . r 1 a . n e w k 5 4 . 0 % : « r : E . 3 1 4 2 , . 9 5 2 ; c a n ? F 1 1 5 A . 3 ! . . x j u r i fl t u y r h U i t i . . 2 1 . : . 3 i F a n s 9 3 0 1 ' . " ( o i / l . L h I i B g R a A n R S Y t M i c a t e U n i v e r s i t y P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T o A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 6 / 0 1 c : / C | R C / D a t e D u e . p 6 5 - p . 1 5 { \ T ’ L O R I N G E X P L O R I N G T H E U N D E R L Y I N G C H E M I C A L B A S I S F O R C O L O R V I S I O N : D E S I G N I N G A P R O T E I N M I M I C O F R H O D O P S I N V o l u m e I I B y R a c h a e l M . C r i s t A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H [ L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y 2 0 0 4 A p p e n d i x . . . . . . . . . S U I I ‘ J M Q ’ t a b . S u m m a r y t a b . S u m m a r y t a b ) D a t a C o l l e c t s W i l d t y p e R 1 3 1 K . . . R l 3 l e z l R 1 3 3 3 ) R l 3 2 K z z l R l 3 2 K : : l R l 3 Z K : : \ R l 3 2 K : : l R l B Z K : : I A p p e n d i x . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 S u m m a r y t a b l e o f p r o t e i n p r o p e r t i e s f o r a l l C R A B P I I m u t a n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 S u m m a r y t a b l e o f r e t i n a l b i n d i n g a s s a y r e s u l t s f o r a l l C R A B P I I m u t a n t s . . . . . . . . . . . . 2 1 7 S u m m a r y t a b l e o f l l - c i s - r e t i n a l b i n d i n g a s s a y s f o r s e l e c t e d C R A B P I I m u t a n t s . . . . 2 1 9 D a t a C o l l e c t e d f o r : W i l d t y p e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 0 R 1 3 2 K . . 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. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 0 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : T 5 4 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 7 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 4 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 Q . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 1 Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 8 R 1 3 2 L : : Y 1 3 4 F : : R 1 l l L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 5 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l 1 1 L : : L 1 2 1 E : : F 1 5 A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 3 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l l 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 0 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l l 1 L : : L 1 2 1 s z T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 1 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l 1 1 L : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 8 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 5 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l l 1 L : : L 1 2 1 N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 3 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 D : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 0 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 N : : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 7 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l l 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V : : T 6 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 4 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V : : T 6 1 F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 2 Y 1 3 4 K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 0 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 9 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 6 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 4 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 P z l e 1 1 L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 1 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 8 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 F : : R 1 1 1 L : : T 5 4 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 6 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 L : : R 1 1 1 L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 2 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 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N D I X 2 1 3 : “ : 9 5 a ; “ m 5 m 3 ; g a z : m z m m s 5 . i c 2 r E Z ~ 5 2 . . . . . . . ; z ; z . m 9 5 m 3 ; . : ; 2 ; ; ; ; 9 m m 2 . m 1 g m 1 g 5 g E x . : r W r : r r 2 ., L 3 y : : ; u ; m g V3,; W xv“: _m 2 _H. 5 .,_ v f I m I ; “If ; f m , 5 . ._._..§ ; . . : ; _ : 5 m E g 2 1 E 3 . ; 3 . 3 a s fi é v fi 3 “ , ? “ $ 4 4 b y . . 3 2 . a ; $ 2 ; A P P E N D I X 2 1 3 S U M M A R Y T A B L E O F P R O T E I N P R O P E R T I E S F O R A L L C R A B P I I M U T A N T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 S U M M A R Y T A B L E O F R E T I N A L B I N D I N G A S S A Y R E S U L T S F O R A L L C R A B P I I M U T A N T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 7 S U M M A R Y T A B L E O P 1 1 - C I s - R E T I N A L B I N D I N G A S S A Y S F O R S E L E C T E D C R A B P I I M U T A N T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 9 D a t a C o l l e c t e d f o r : W I L D T Y P E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 0 R 1 3 2 K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 1 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 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1 l 1 L : : T 5 4 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 7 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 4 R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 Q . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 1 Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 8 R 1 3 2 L : : Y l 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 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K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V : : T 6 1 F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 2 Y 1 3 4 K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 0 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 9 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 6 Y 1 3 4 K : : R 1 3 2 L . . . . . . . . . . . . . . . . . . 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