A : : 2 1 . n . n o ! I : . I 5 ) ‘ . 1 n ; 3 t 3 ’ ’ : 3 . l l . ‘ . 2 ‘ k 9 l \ l . . . 3 c A : . i t - : : 5 . v x . : I ; 4 : 8 . k v 4 . - a p " ; 1 ‘ : N ' ” I e u 3 . , . n ‘ . u : . ) 2 } I ‘ » . w : I J . 1 5 . ? r “ h a x e . n a , ‘ l \ fi % . . . w . 1 5 2 fi d r é . . . ” 5 3 u . . 5 f $ . » b n h i m « . . t . u fi b - o d . u v n n t . . . t a n u . h . - ‘ I 5 % ‘ 5 L . ‘ . ' I L L . { 3 / 7 2 2 / 0 L I B R A R I E S M I C H I G A N S T A T E U N I V E R S I T Y E A S T L A N S I N G , M I C H 4 8 8 2 4 - 1 0 4 8 T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d C H O L E C A L C I F E R O L ( V I T A M I N D 3 ) I N T H E P R E V E N T I O N A N D T R E A T M E N T O F P R O S T A T E C A N C E R : E F F E C T S A N D M E C H A N I S M S O F A C T I O N p r e s e n t e d b y E R I K J . T O K A R h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e P h . D . d e g r e e i n Z O O L O G Y ‘ ~ 4 3 A , C x e t i £ b u « t M a j o r P r o f e s s o r ’ s S i g n a t u r e 5 7 0 9 / 0 5 D a t e M S U i s a n A f fi n n a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n P L A C E I N R E T U R N B o x t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 2 1 0 5 c : / C | R C / D a t e D m . i n d d - p . 1 5 ‘ ( A H T O I L E I E X C T - l l f O F I I R E C H O L E C A L C I F E R O L ( V I T A M I N D 3 ) I N T H E P R E V E N T I O N A N D T R E A T M E N T O F P R O S T A T E C A N C E R : E F F E C T S A N D M E C H A N I S M S O F A C T I O N V O L U M E I B y E r i k J . T o k a r A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f Z o o l o g y 2 0 0 5 « h l I l . r J i f J d . o r o ‘ o ' . i J : 7 I . . . . 0 . $ 1 { | ' - I 0 " S L l 4 4 3 1 . I " I " . : v M I O F M H A I - I : o t o I v . ) . . . J I . l ( v . . l l . ' ~ . . , . . I , . v i r o t t w e i l l . . . g r - v a I I - ) 4 I f : I . 1 7 1 9 t r u l u l v a r r p p p u ( ” ( 0 . V 4 . t h o f l : . 1 v . . . V I I t i l l ; . w . 3 ; - i . . r . r . y / . . . l I , . ; ~ 4 J . . ) ~ I a 2 i t 3 3 a - p i r - . / m r . g m . v I I A ‘ l i m b - . 0 . L . o . L . c Q t . ‘ . o n . d b l ; . ( fl i n t . » 1 . . . } b ! ! ! I p W I I I H ‘ w . . . A x 1 r 5 f t . ‘ ' i v . . / _ . A B S T R A C T C H O L E C A L C I F E R O L ( V I T A M I N D 3 ) I N T H E P R E V E N T I O N A N D T R E A T M E N T O F P R O S T A T E C A N C E R : E F F E C T S A N D M E C H A N I S M S O F A C T I O N B y E r i k J . T o k a r P r o s t a t e c a r c i n o g e n e s i s , a m u l t i - s t e p p r o c e s s , w h i c h o c c u r s o v e r a p e r i o d o f 2 0 - 3 0 y e a r s , p r o v i d e s t h e o p p o r t u n i t y f o r c a n c e r p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t . E p i d e m i o l o g i c a l e v i d e n c e s u g g e s t s a n i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e a n d s e r u m V i t a m i n D l e v e l s . V i t a m i n D p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n . T h e o b j e c t i v e s o f t h i s s t u d y w e r e t o e x a m i n e : i ) t h e p o t e n t i a l o f c h o l e c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 3 ) a s a n a g e n t f o r t r e a t m e n t b y i n h i b i t i n g o r r e v e r s i n g m a l i g n a n t c h a r a c t e r i s t i c s o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s ; i i ) i t s a b i l i t y a s a c h e m o p r e v e n t i o n a g e n t b y r e v e r s i n g c e l l u l a r c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n , a n d i i i ) i t s m e c h a n i s m s o f a c t i o n . T h e m a l i g n a n t R W P E Z - W 9 9 , h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l l i n e , w h i c h f o r m s s l o w - g r o w i n g t u m o r s i n n u d e m i c e a n d m i m i c s b e h a v i o r o f p r i m a r y h u m a n p r o s t a t e c a n c e r s , w a s u s e d . R e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l , a t p h y s i o l o g i c a l l e v e l s : i ) i n h i b i t e d a n c h o r a g e - d e p e n d e n t a n d - i n d e p e n d e n t g r o w t h i n a g a r ; i i ) i n d u c e d d i f f e r e n t i a t i o n b y d e c r e a s i n g v i m e n t i n b u t i n c r e a s i n g P S A e x p r e s s i o n ; i i i ) d e c r e a s e d M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y w i t h c o n c o m i t a n t d e c r e a s e i n m o t i l i t y a n d i n v a s i o n ; a n d i v ) e x e r t e d i t s e f f e c t s , b y u p - r e g u l a t i n g v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) , r e t i n o i d - X r e c e p t o r s ( R X R S ) , a n d a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t e d c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h a m a l i g n a n t p h e n o t y p e . I a l s o r e p o r t , f o r t h e fi r s t t i m e , t h a t h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s 2 5 - h y d r o x y l a s e p r o t e i n a i - r 1 l 1 a . n d . ) . . . j . . . ~ ‘ . . u ( . r I . . . . . . . f I . , c , ~ o . v . . J ’ I U ‘ v l ‘ v \ M n 5 0 T - ( , A c t r / M w . r . u y u r r l w . I m e . a . - . 5 . . L . : . : . . . m . J . 0 2 : ? r . > I . . 4 . 7 . I V A . ‘ A w t v h T / r r . r I t W D I . ' ¥ r ' C I \ \ O . l . . - 4 . . . . . . . . _ . . . r . . . 2 1 . “ ? u r n I . . , i ‘ O I : 9 . ~ L . . { I . U « . . . : r L . . . r ( . . . . . . T i l l ? ! ( I . » ( ( » . . . f r 0 . . 1 . . . ; 3 1 . 1 4 . . I I . I . . . r ) . . t p . . . . . p i . . . . 0 4 . . ‘ 4 . I M O ! “ i t . . . . " . . ' I [ . . . p ’ a h ' J I r a j . . . U 1 ‘ . . . - . r x . . w u y r ; 3 ‘ 1 A ~ ( 7 ‘ 0 > . C u ~ ( r . i . . . r A n ( I . . . 3 . 1 . { J 4 . 7 . . . ( L f P u T . 7 r I . . . i s “ 0 . 1 , : 7 4 . ” t u m . 2 - h z g h v d . . q r . . s f . 7 . . . I ( A y . I . _ H . . p t . ( D a . . . . ' ( ‘ 4 9 . . . - p i n . o n . r . . C . m U ? n . I . . . « t h ' v v b a . 0 . 1 : I f . ( C Y P 2 7 A 1 ) , t h e e n z y m e t h a t c o n v e r t s c h o l e c a l c i f e r o l t o Z S O H D 3 a n d t h a t C Y P 2 7 A 1 i s u p - r e g u l a t e d b y c h o l e c a l c i f e r o l . C h o l e c a l c i f e r o l h a s e f f e c t s s i m i l a r t o t h o s e o f c a l c i t r i o l o n g r o w t h , M M P a c t i v i t y , a n d V D R . B e c a u s e c h o l e c a l c i f e r o l c a n i n h i b i t c e l l u l a r c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n a n d i n v a s i o n , I p r o p o s e t h a t c h o l e c a l c i f e r o l m a y b e a n e f f e c t i v e a g e n t f o r t r e a t m e n t , a n d f o r s e c o n d a r y a n d t e r t i a r y p r e v e n t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . C h e m o p r e v e n t i o n i s t h e u l t i m a t e a n s w e r t o r e d u c i n g t h e h i g h i n c i d e n c e o f p r o s t a t e c a n c e r . T h e a b i l i t y o f c h o l e c a l c i f e r o l , t o b l o c k o r r e v e r s e c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n , w a s e x a m i n e d . S i n c e i m m o r t a l i z a t i o n i s a n e a r l y s t e p i n c a r c i n o g e n e s i s , t h e i m m o r t a l i z e d b u t n o n - t u m o r i g e n i c R W P E - l h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l l i n e w a s u s e d . R W P E - l c e l l s d o n o t g r o w i n a g a r a n d a r e n o t i n v a s i v e . P h y s i o l o g i c a l l e v e l s o f c h o l e c a l c i f e r o l : i ) i n h i b i t e d a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h ; i i ) d e c r e a s e d M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y ; i i i ) i n d u c e d d i f f e r e n t i a t i o n b y d e c r e a s i n g v i m e n t i n b u t i n c r e a s i n g P S A e x p r e s s i o n , a n d i v ) u p - r e g u l a t e d V D R , R X R s , a n d A R , s u g g e s t i n g t h a t i t s e f f e c t s , i n p a r t , a r e r e c e p t o r - m e d i a t e d . B a s e d o n t h e s e i n v i t r o s t u d i e s , c h o l e c a l c i f e r o l a p p e a r s t o b e a n e f f e c t i v e c h e m o p r e v e n t i v e a g e n t . I f u r t h e r S h o w t h a t R W P E - l c e l l s a l s o e x p r e s s C P Y P 2 7 A 1 , a n d i t s e x p r e s s i o n i s u p - r e g u l a t e d b y c h o l e c a l c i f e r o l . S i n c e t h e p r e s e n c e o f l a - h y d r o x y l a s e h a s p r e v i o u s l y b e e n s h o w n , m y r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s , t a r g e t c e l l s f o r v i t a m i n D , h a v e t h e n e c e s s a r y e n z y m e s a n d t h e r a r e a b i l i t y t o l o c a l l y p r o d u c e t h e b i o l o g i c a l l y a c t i v e c a l c i t r i o l f r o m c h o l e c a l c i f e r o l . T h e m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f c h o l e c a l c i f e r o l a p p e a r t o i n v o l v e t h e u p - r e g u l a t i o n o f n u c l e a r r e c e p t o r s a n d C Y P 2 7 A 1 . T a k e n t o g e t h e r , m y r e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l m a y b e a n e f f e c t i v e a g e n t f o r c h e m o p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r . C o p y r i g h t b y E R I K J . T O K A R 2 0 0 5 T o m y f a m i l y a n d m y m e n t o r T h a n k y o u , f o r e v e r y t h i n g I 1 3 ! a n I d T l o ' 1 a m ’ . p I ' i s m " i t 5 3 1 3 1 : ; i n m e : I . . . I ‘ K t ‘ I : i ‘ L i h ‘ i : ; : b n i h i ‘ 1 ‘ 1 ? J r a h m n ' s c m i M u i n ‘ c u r s s t z t " t o t x I k . E i r h e l p . : . : z I x t y - 5 i " 5 3 . . . . . . u .: 5 5 1 5 . 3 \ m a f 5 . 3 3 3 , 1 : : : 3 1 » m c P I s t o r t h f n — I T h y } , a d d i t i o n . { m P . . l \ : m F..Jc.’f 1 ! " - “ " 1 " ‘ 3 1 D i m . , i n » : 4 ; 3 S a p t - t r . C . B “ 1 D " : 1 E \ \ . . , . . i . I I ‘ 1 : 5 } : t o { l i n k S I E e r I t ‘ j fi fl ' J ‘ ' I t h a t : h ' “ » - L l . \ ‘ 4 ‘ " t . ' v - i . r - | , I ” a . a n d C Y ‘ , . \ h . r ; _ . " ~ . ‘ J “ d b ; A C K N O W L E D G E M E N T S F i r s t a n d f o r e m o s t , I w o u l d l i k e t o t h a n k m y m e n t o r , D r . M u k t a M . W e b b e r , f o r h e r s u p p o r t , p a t i e n c e , w i s d o m a n d f r i e n d s h i p . B u t m o s t o f a l l I w o u l d l i k e t o t h a n k h e r f o r b e l i e v i n g i n m e a n d n e v e r l e t t i n g m e s e t t l e f o r “ g o o d e n o u g h . ” W i t h o u t h e r g u i d a n c e a n d i n s p i r a t i o n , n o n e o f t h i s w o u l d h a v e b e e n p o s s i b l e a n d , f o r t h a t , I a m t r u l y g r a t e f u l . I t h a n k D r . S t e p h e n C . B r o m l e y , D r . K e n n e t h A . S c h w a r t z , D r . D a v i d D . W a r t i n g e r , a n d D r . D a n i e l E . W i l l i a m s f o r s e r v i n g o n m y c o m m i t t e e a n d f o r t h e i r s u p p o r t a n d a d v i c e . I w i s h t o t h a n k S a l m a a n Q u a d e r a n d J a m e s ( J a s ) D a v i d s o n f o r s h a r i n g w i t h m e t h e i r k n o w l e d g e i n t h e l a b a n d , m o r e i m p o r t a n t l y , f o r t h e i r f r i e n d s h i p . I w o u l d l i k e t o e x t e n d m y a p p r e c i a t i o n t o w a r d s A d a m K . K e i t h a n d L e s l i e - A n n S . O v i t t f o r t h e i r i n v a l u a b l e a s s i s t a n c e w i t h f o r m a t t i n g fi g u r e s f o r t h i s d i s s e r t a t i o n . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k m y f e l l o w l a b m e m b e r s o v e r t h e y e a r s , A m a n d a R i v e t t e , B r o o k e A n c r i l e , A n t o n i a J e r k i n s , L e a n n e P a s t e r n a k , E l i z a b e t h G r o n d i n , K a t h e r i n e F a b i s , L a T o y i a J o h n s o n , a n d A i m e e S t e w a r t f o r t h e i r h e l p a n d f r i e n d s h i p . I n a d d i t i o n , f o r t h e i r a r d e n t s u p p o r t a n d e n c o u r a g e m e n t , a n d f o r t h e c o n s t a n t r e m i n d e r s t h a t t h e r e i s i n d e e d l i f e o u t s i d e t h e l a b , I t h a n k m y f r i e n d s B e n 0 . , R y a n ( P e l k y ) P . , K i m F . , J e f f T . , A s h l e y M . , K u r t R . , a n d E m i l y 0 . F i n a l l y , I e x t e n d m y m o s t s i n c e r e a p p r e c i a t i o n a n d g r a t i t u d e t o m y p a r e n t s , D r . A l a n R . T o k a r a n d S u s a n L . T o k a r , m y b r o t h e r , J a s o n , a n d s i s t e r , J e s s i c a , f o r t h e i r u n c o n d i t i o n a l a n d e v e r l a s t i n g l o v e , s u p p o r t , a n d e n c o u r a g e m e n t . T h a n k y o u f o r a l w a y s b e l i e v i n g i n m e a n d b e i n g t h e r e w h e n e v e r I n e e d y o u . v i ' v ; . _ ; ' . = f i : : ) T : k l ] e ‘ I : g ' ; r : s . . i ‘ ’ l € i S : r I : t L ‘ r " S a . I T m . L . . T a . . E h e . : . . . . . ~ » . . 2 » . A r o I s I t . . - . R P } p A 4 R H P C h a p t - 4 ‘ ' , . n 1 : " 3 \ \ , L i n L - A ; 1 * ~ " " ' . ‘ I ‘ t ‘ s t r I c t . . . . . . . A n t o n . ) . . . . . F I H C I I O U . . . _ . . . 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R a c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 D i e t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 S e a s o n a l a n d G e o g r a p h i c V a r i a t i o n s a n d E x p o s u r e t o S u n l i g h t . . . . . . . . . . . . 4 3 O t h e r F a c t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 C o n c l u s i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 7 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8 C h a p t e r 3 : T h e P h y s i o l o g i c a l R o l e a n d P r o p e r t i e s o f V i t a m i n D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 T h e P h y s i o l o g i c a l R o l e o f V i t a m i n D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 5 V i t a m i n D D e fi c i e n c y a n d E x c e s s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 8 D e fi c i e n c y o f V i t a m i n D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 8 V i t a m i n D T o x i c i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1 S y n t h e s i s a n d M e t a b o l i s m o f V i t a m i n D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 3 C o n v e r s i o n t o Z S O H D 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 6 C o n v e r s i o n t o 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 C o n v e r s i o n t o 2 4 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 8 C h e m i c a l a n d P h y s i c a l P r o p e r t i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 9 S t r u c t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 9 N o m e n c l a t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 0 S p e c t r a l P r o p e r t i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 S t a b i l i t y , L i g h t S e n s i t i v i t y , a n d S o l u b i l i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2 G e n e r a l P r o p e r t i e s o f V i t a m i n D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 3 v i i i C o n c l u s i o n . . . . . . . . 1 ‘ ‘ . . . . . . . . . 1 ; . J R , ' J fi : \ i d L ' u 3 1 : “ m u t t : t t t p t e r l : l n t c r m e d i a i A 5 5 2 1 c t . . . . . . . . . . . . h m fi u c t t o n . . . . . . . h i e r m c d u t c l e I t C y o k c r I t : \ ‘ t m c n t t n ( 0 6 ) . ; ‘ 1 ' 6 5 5 1 t ‘ l ‘ t o f T n : R c i t 0 1 . 1 2 2 9 ' ( r e c l a i m s . . . . . R a t ‘ s r e n c c s . . . . . . C h a p t e r S : M a t r i x M t A b s t r a c t . . . . . . . . . t r u n n i o n . . . . 7 - 1 5 5 C o n c l u s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 3 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4 C h a p t e r 4 : I n t e r m e d i a t e F i l a m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 6 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 7 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 8 I n t e r m e d i a t e F i l a m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 8 C y t o k e r a t i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1 V i m e n t i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4 C o e x p r e s s i o n o f C y t o k e r a t i n s a n d V i m e n t i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 T h e R o l e o f I n t e r m e d i a t e F i l a m e n t s i n A p o p t o s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 9 C o n c l u s i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 0 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2 C h a p t e r 5 : M a t r i x M e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P s ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 4 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 5 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 6 T h e M a t r i x M e t a l l o p r o t e i n a s e F a m i l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 8 G e l a t i n a s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 9 C o l l a g e n a s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 1 S t r o m e l y s i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 1 M T - M M P s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 2 O t h e r M M P s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 2 A s s o c i a t i o n o f M M P s a n d C a n c e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 3 M P r e g u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 7 i x i n t e r m e d - r e ( ” a y " 3 G e n A c t t x a t t u A C I I ' » 1 i } . E m e r g i n g R o i - b E t i e c t s o f V I I A I ‘ J C o n c l u s m n . . . . . R e f a r c n c e s . . . . . G u p t a 6 : C e l l P T U I I I I . X E : : r 3 c t . . . . . , . . . i n t r o d u c t i o n . . . D : f ‘ f e r c r t t : a t i o n l R e i a z x o r t s h x p B : M a k e r s o f D 1 3 3 " . h S I C K ‘ H I ; ” 0 6 : 1 . - 1 ' 9 d c h S G e n e e x p r e s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 7 A c t i v a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 7 A c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 8 E m e r g i n g R o l e s f o r M M P s i n T u m o r P r o g r e s s i o n a n d I n v a s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 E f f e c t s o f V i t a m i n D o n M M P s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l 1 2 C o n c l u s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 5 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l 1 6 C h a p t e r 6 : C e l l P r o l i f e r a t i o n a n d D i f f e r e n t i a t i o n a n d t h e E f f e c t s o f V i t a m i n D . . . . 1 2 1 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 2 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 3 D i f f e r e n t i a t i o n D u r i n g E a r l y D e v e l o p m e n t a n d G r o w t h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 5 R e l a t i o n s h i p B e t w e e n C e l l P r o l i f e r a t i o n a n d D i f f e r e n t i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 0 M a r k e r s o f D i f f e r e n t i a t i o n a n d D i f f e r e n t i a t e d F u n c t i o n i n E p i t h e l i a l C e l l s . . . . . . 1 3 2 I n t e r m e d i a t e F i l a m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 2 C y t o k e r a t i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l 3 2 V i m e n t i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 5 S e c r e t o r y P r o t e i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 7 M o d u l a t o r s o f C e l l D i f f e r e n t i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 8 M o d u l a t i o n o f C e l l D i f f e r e n t i a t i o n b y R e t i n o i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 8 M o d u l a t i o n o f C e l l D i f f e r e n t i a t i o n b y G r o w t h F a c t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 1 M o d u l a t i o n o f C e l l D i f f e r e n t i a t i o n b y E x t r a c e l l u l a r M a t r i x . . . . . . . . . . . 1 4 4 M o d u l a t i o n o f C e l l D i f f e r e n t i a t i o n b y H o r m o n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 5 A b n o r m a l i t i e s o f D i f f e r e n t i a t i o n i n C a n c e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 6 T G F - T h e R o l e o f a n c ‘ i t I i ‘ B \ l ‘ . T n : R o l e o f \ ‘ V M . K c r d t l n ‘ . 1 . I ‘ . \ n e ( L “ . B \ o l a m n ‘ H e m a . w I r r D i f f e r - e r . C o n g l u s m n s . R t t ‘ e r a C h a p t e r 7 : V i t a m i n D ‘ 1 ‘ . n i x E f f e c t s 1 ‘ 1 - P T U S I J I C i n t e s . “ C e l l c y c l e c h e c k p o i n t s a n d d i f f e r e n t i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 8 T h e p 5 3 T u m o r S u p p r e s s o r G e n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 8 T h e p r T u m o r S u p p r e s s o r G e n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 0 T G F - B a n d C e l l D i f f e r e n t i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 1 T h e R o l e o f V i t a m i n D i n C e l l P r o l i f e r a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 2 E f f e c t s o f V i t a m i n D o n t h e C e l l C y c l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 2 E f f e c t s o f V i t a m i n D o n G r o w t h F a c t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 7 E f f e c t s o f V i t a m i n D o n A n d r o g e n a n d E s t r o g e n A c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 9 T h e R o l e o f V i t a m i n D i n D i f f e r e n t i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 0 P r o s t a t e E p i t h e l i a l C e l l D i f f e r e n t i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 1 K e r a t i n o c y t e D i f f e r e n t i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 5 B o n e C e l l D i f f e r e n t i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 7 M a m m a r y G l a n d D i f f e r e n t i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 2 H e m a t o p o i e t i c D i f f e r e n t i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 2 D i fi ‘ e r e n t i a t i o n o f O t h e r C e l l T y p e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 4 C o n c l u s i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 4 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 6 C h a p t e r 7 : V i t a m i n D R e c e p t o r a n d L i g a n d I n t e r a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 6 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 7 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 8 V i t a m i n D R e c e p t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 1 D o m a i n o f t h e V D R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 1 L o c a l i z a t i o n o f V D R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 5 x i n g ' . i . i i l l . l f l o f P r h i 1 : n 3 1 1 ” . : a n 3 a c i a l l ) 1 1 : 3 1 1 t 1 R A n d r t . g .- .. C o n c i u s i o n s PART 11: O R I G I N . “ I m f l i c i a l f i é V D R H u m V i t a m i n D R c - c c r f l R u l e f o r t i : R c t x n m d X V D R - R A F V D R - R M V D R l . t a m - r u n ? » T h t ‘ A n d i V D R 1 r . R a fi ) ? \ - t u t u S P I L C S I ( t i m e T r a f fi c k i n g o f V D R B e t w e e n t h e C y t o p l a s m a n d N u c l e u s . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 7 V D R H o m o d i m e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 8 V i t a m i n D R e c e p t o r - R e t i n o i d X R e c e p t o r I n t e r a c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 9 R o l e f o r t h e 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 L i g a n d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 9 R e t i n o i d X R e c e p t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 2 V D R - R X R H e t e r o d i m e r i z a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 5 V D R — R X R H e t e r o d i m e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 7 V D R I n t e r a c t i o n s w i t h A n d r o g e n R e c e p t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 8 T h e A n d r o g e n R e c e p t o r G e n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 8 V D R C r o s s T a l k w i t h t h e A R i n P r o s t a t e C a n c e r C e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 8 R e g u l a t i o n o f P r o s t a t e S p e c i fi c A n t i g e n ( P S A ) b y V i t a m i n D i n P r o s t a t e C e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 0 M u t a t i o n s i n t h e V D R a n d A R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 2 V i t a m i n D R e c e p t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 2 R a c i a l D i f f e r e n c e s i n V i t a m i n D R e c e p t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 A n d r o g e n R e c e p t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 C o n c l u s i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 6 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 l 8 P A R T I I : O R I G I N A L R E S E A R C H 2 2 3 C h a p t e r 8 : C h o l e c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 3 ) M o d u l a t e s G r o w t h a n d I n v a s i o n , a n d U p - r e g u l a t e s N u c l e a r R e c e p t o r s a n d 2 5 — h y d r o x y l a s e ( C Y P 2 7 A 1 ) i n H u m a n P r o s t a t e C a n c e r C e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 4 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 5 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 7 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 5 x i i ( 8 1 1 : ) D C ' S C A R m C i ‘ ] A l l ! A » . l n u w n . l m m s n m t P r a t - c m . - \ \ V c s t c . , 1 S t I t z s t t h ' i R O L L S . . . , . . ‘ C h i ‘ i C L ‘ A L C h I - I ‘ i c k d i ‘ 6 . . “ “ ‘ 0 ‘ “ ‘ u . I I I \ . ~ “ \ ‘ ( ‘ 1 ' . : U ' " “ ( ' 4 ‘ C . ‘ = " 1 . ‘ n " " ' ~ \ d . C h . - , t , . u y i \ \ ‘ : C e l l s a n d C e l l C u l t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 5 D o s e R e s p o n s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 6 A g a r A s s a y f o r A n c h o r a g e - i n d e p e n d e n t g r o w t h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 7 I n v a s i o n a n d M o t i l i t y / C h e m o t a x i s A s s a y s U s i n g B o y d e n C h a m b e r s . . . . 2 3 8 S D S - P A G E Z y m o g r a p h y f o r M M P A c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 0 I m m u n o s t a i n i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 1 P r o t e i n A n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 3 W e s t e r n B l o t A n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 3 S t a t i s t i c a l A n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 4 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 5 C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s g r o w t h o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 5 C h o l e c a l c i f e r o l r e d u c e s a n c h o r a g e - i n d e p e n d e n t c o l o n y f o r m i n g e f fi c i e n c y ( C F E ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 5 C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s i n v a s i o n i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . . . . . . . . . . . . 2 4 8 C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s c e l l m o t i l i t y / c h e m o t a x i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 8 C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 9 C h o l e c a l c i f e r o l m o d u l a t e s v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 9 C h o l e c a l c i f e r o l m o d u l a t e s V D R , R X R s a n d A R n u c l e a r r e c e p t o r s . . . . . . 2 5 2 C h o l e c a l c i f e r o l i n d u c e s t h e e x p r e s s i o n o f t h e 2 5 - h y d r o x y 1 a s e e n z y m e , C Y P 2 7 A 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 2 E f f e c t s o f c a l c i t r i o l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 5 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 7 C o n c l u s i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 4 x i i i l c i n r ¥ a r . h ‘ r l fi t ’ > . R i l i l a p t e r 9 : h o l e c r o s t a C P a t l c c ' i ( ' A b s t r a c t . ' i ‘ v h n ‘ a d 3 b 1 u ‘ . l t ‘ n . , . l n : r ‘ l . 4 7 ‘ , l ' \ R e s c i n d . . . . . . . . \ l s t e r u l a n d \ l : D m c R 9 E D S - P M “ “ h i m “ . S i d : “ ‘ t i \ d ( ‘ h l l i \ I ' L L : ( “ N i a g - ( l l q t 1 { C ‘ C e m . C h ! “ l L ‘ k ( h t . . . ‘ ‘ l L ‘ k C R T - n . R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 6 C h a p t e r 9 : C h o l e c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 3 ) a n d C h e m o p r e v e n t i o n o f P r o s t a t e C a n c e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 4 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 5 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 7 M a t e r i a l a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 1 C e l l s a n d C e l l C u l t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 1 D o s e R e s p o n s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 2 S D S - P A G E Z y m o g r a p h y f o r M M P A c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 2 I m m u n o s t a i n i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 3 P r o t e i n A n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 5 W e s t e r n B l o t A n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 5 S t a t i s t i c a l A n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 6 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 6 C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s t h e g r o w t h o f R W P E - l a n d R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 6 C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 8 C h o l e c a l c i f e r o l d e c r e a s e s v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n R W P E - l c e l l s . . . . . . . . . 2 9 9 C h o l e c a l c i f e r o l u p - r e g u l a t e s V D R , R X R s , a n d A R n u c l e a r r e c e p t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 0 C h o l e c a l c i f e r o l i n d u c e s e x p r e s s i o n o f P S A i n R W P E - l c e l l s . . . . . . . . . . . . . 3 0 2 C h o l e c a l c i f e r o l i n d u c e s t h e e x p r e s s i o n o f 2 5 - h y d r o x l y a s e e n z y m e , C Y P 2 7 A 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 3 E f f e c t s o f c a l c i t r i o l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 4 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 6 x i v . , c t 1 ) ) . ) « ) . l I » . ; ” C a r o n . C o n c l u s i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 l 5 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 l 7 X V T a b l e l - l : l i b l c ‘ l - Z : M l : 9 - 1 : n d - c m : a c o t m o r s n l 11 [ E F N 0 1 : 5 : I i i ? L I S T O F T A B L E S T a b l e 1 - 1 : E v i d e n c e t h a t P I N i s p r e m a l i g n a n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 T a b l e 1 - 2 : F a c t o r s i m p l i c a t e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 T a b l e 9 - ] : N o r m a l p h y s i o l o g i c a l a n d p h a r m a c o l o g i c a l l e v e l s a n d h a l f l i v e s o f t h e t h r e e m a j o r v i t a m i n D 3 m e t a b o l i t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 4 x v i I m a g e s i n t h i s d i s s e r t : F g u r e l - l ; \ ‘ A i i , l " . \ . \ 1 u i . . ' , ‘ F i g u r e 3 _ ; _ ( J P . 3 } F i g u r e l - Z l l fl l l ’ t 1 - 3 : F i g u r e 1 4 ; F i l m l - S : F i g u r e H , “ g u l f 1 3 : F i g u r e 1 . 3 , F i g u r e 3 - l : F i g u r e 1 . 2 . E m ” 3 - 3 : 5 2 1 m “ h : l o t . 0 2 m : r ‘ : s I J u L t . D i a n a - ” t § $ L l n . \ . l Z k ' fi d l . 1 1 L 9 " . [ 1 1 C l l fl ' t I l T - V ” A d d “ ; W B l ‘ i - . , ' ‘ ‘ M “ “ n l d l i T 0 . ‘ l ‘ m x d z w u ~ i I “ m i c r o P r l l ‘ T ‘ - t u _ A i 1 ‘ 7 3 . K S . 1 ” . “ L . N W " : S u m . X ‘ J m L L I S T O F F I G U R E S I m a g e s i n t h i s d i s s e r t a t i o n a r e p r e s e n t e d i n c o l o r . F i g u r e 1 - 1 : F i g u r e 1 - 2 : F i g u r e 1 - 3 : F i g u r e 1 - 4 : F i g u r e 1 - 5 : F i g u r e 1 - 6 : F i g u r e 1 - 7 : F i g u r e 1 - 8 : F i g u r e 2 - 1 : F i g u r e 2 - 2 : F i g u r e 2 - 3 : F i g u r e 2 - 4 : F i g u r e 2 - 5 : T h e l o c a t i o n o f t h e p r o s t a t e g l a n d w i t h r e s p e c t t o t h e r e m a i n d e r o f t h e m a l e r e p r o d u c t i v e a n d u r i n a r y a n a t o m y . T h e p r o s t a t e g l a n d l i e s c a u d a l t o t h e u r i n a r y b l a d d e r a n d i s d i v i d e d i n t o t w o s e g m e n t s b y t h e p r o s t a t i c u r e t h r a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Z o n a l a n a t o m y o f t h e p r o s t a t e , s h o w i n g t h e t h r e e g l a n d u l a r z o n e s a n d t h e fi b r o m u s c u l a r s t r o m a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 P s e u d o s t r a t i fi e d e p i t h e l i a l c e l l l a y e r o f t h e n o r m a l p r o s t a t e . T h e b a s a l c e l l s ( g r a y ) a n d t h e l u m i n a l c e l l s ( w h i t e ) a r e s h o w n a t t a c h e d t o t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( E C M ) . F i b r o b l a s t s ( b l a c k ) a r e l o c a t e d i n t h e E C M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 H i s t o l o g i c a l s e c t i o n o f t h e b e n i g n p r o s t a t e , s h o w i n g t h e u n i f o r m c o l u m n a r c e l l s ( U ) , t h e b a s a l c e l l ( B ) , a n d fi b r o v a s c u l a r s t a l k ( F ) . . . . . . . . . . l l H i s t o l o g i c a l s e c t i o n o f t h e c a n c e r o u s p r o s t a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 ( A ) B P H h y p e r p l a s t i c n o d u l e o f t h e h i g h l y e p i t h e l i a l t y p e . ( B ) B P H s t r o m a l n o d u l e o f t h e fi b r o m u s c u l a r t y p e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 ( A ) L o w - g r a d e p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a . ( B ) H i g h - g r a d e p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a . B o t h p a n e l s s h o w 1 1 a n d E s t a i n i n g . . . 2 3 M o d e l f o r P I N — c a r c i n o g e n e s i s i n t h e p r o s t a t e s h o w i n g c h a r a c t e r i s t i c s a s s o c i a t e d w i t h p r o g r e s s i o n f r o m n o r m a l p r o s t a t i c c e l l s t o t h e c a n c e r o u s p h e n o t y p e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 E s t i m a t e d n e w c a n c e r c a s e s a n d d e a t h s b y g e n d e r , U S , 2 0 0 3 . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 P r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e b y r a c e a n d e t h n i c i t y , U S , 1 9 9 2 t o 1 9 9 9 . . . . . . . . 3 7 A v e r a g e c a n c e r m o r t a l i t y a n d i n c i d e n c e r a t e b y r a c e a n d e t h n i c i t y , U S , 1 9 9 2 t o 1 9 9 9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 N u m b e r o f p r o s t a t e c a n c e r c a s e s w o r l d - w i d e , p e r 1 0 0 , 0 0 0 m e n , a g e s t a n d a r d i z e d u s i n g t h e W o r l d s t a n d a r d p o p u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 S u m m a r y o f p u t a t i v e e f f e c t s o f s e r u m 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 l e v e l s o n a l l t h r e e s t a g e s o f p r o s t a t e c a r c i n o g e n e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 x v i i n e a r n r r c I U i r ? h : e - “ B h L m c i c o C 3 1 1 b 0 5 ' 3 ; fi g u r e 2 - 6 1 fi g u r e 3 ' 1 : l g u r e 3 — 2 : F i g u r e 3 - 3 : W e 3 4 : » l i m e 3 - 5 : fi g u r e 3 - 6 _ F t u n 3 . 7 ; E 3 1 1 8 4 . 1 ; F L g u r e 4 . 2 ; F i g u r e 4 - 3 : F i g u r e 5 . ] : I \ i k ‘ i ' s ‘ s u u n l m g h t r 4 : 2 ” p o s z t r u m x . . “ Y D a n n i . L i ' V ‘ . ’ 5 . 1 0 M . . - ' b r e w - K L : D u g m m { fl i t } 0 7 2 . 1 2 3 1 8 1 . 1 5 » 7 . : m c m r C : q 9 ~ , \ Q \ . u . \ ‘ R f i b h fl i r c c n p r n S t r u r n g ‘ r . S t C T t ‘ l d j ( \ W R l n j . “ r t h r 1 . “ O n - h g i d ‘ i ' m t r ‘ C u h u r ; ( U l t u r . T h e \ 1 ~ S i n g - 3 4 . b u r ( b y . P R 0 H t i t : F . \ ' : . N D : I F i g u r e 2 - 6 : F i g u r e 3 - 1 : F i g u r e 3 - 2 : F i g u r e 3 - 3 : F i g u r e 3 - 4 : F i g u r e 3 - 5 : F i g u r e 3 - 6 : F i g u r e 3 - 7 : F i g u r e 4 . 1 : F i g u r e 4 . 2 : F i g u r e 4 - 3 : F i g u r e 5 - 1 : L i n e a r t r e n d s u r f a c e m a p s . T o p : P r o s t a t e c a n c e r m o r t a l i t y a m o n g w h i t e m e n . B o t t o m : U V r a d i a t i o n u s i n g e p i d e m i o l o g i c a l i n d e x . A n i n v e r s e c o r r e l a t i o n b e t w e e n p r o s t a t e c a n c e r m o r t a l i t y r a t e s a n d U V r a d i a t i o n c a n b e s e e n w h e n c o m p a r i n g t h e t w o m a p s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 M o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f n u t r i t i o n a l f o r m s o f v i t a m i n D , c h o l e c a l c i f e r o l ( r i g h t ) a n d e r g o c a l c i f e r o l ( l e f t ) . N u m b e r s d e s i g n a t e c a r b o n a t o m p o s i t i o n s a n d l e t t e r s d e s i g n a t e t h e r i n g s o f t h e m o l e c u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 4 D i a g r a m m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e p h y s i o l o g i c a l a c t i o n s o f v i t a m i n D s h o w i n g d i f f e r e n t o r g a n s a n d h o r m o n e s i n v o l v e d i n c a l c i u m h o m e o s t a s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 6 D i a g r a m o f v i t a m i n D 3 m e t a b o l i s m s h o w i n g m e t a b o l i t e s i n v o l v e d a n d o r g a n s w h e r e t h e y s y n t h e s i z e d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 9 M e t a b o l i s m o f v i t a m i n D 3 s h o w i n g m o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f m e t a b o l i t e s a n d t h e e n z y m e s i n v o l v e d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 5 S t r u c t u r e s o f t a c h y s t e r o l ( t o p ) a n d l u m i s t e r o l ( b o t t o m ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 5 R e g u l a t i o n o f I a - h y d r o x y l a s e a n d 2 4 - h y d r o x y l a s e i n t h e k i d n e y . T h e r e c r i p r o c a l r e g u l a t i o n o f t h e l e t — a n d 2 4 — h y d r o x y l a s e e n z y m e s b y s e r u m c a l c i u m , s e r u m p h o s p h o r u s , P T H , a n d 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 9 S t e r o i d n u c l e u s s t r u c t u r e o f c y c l o p e n t a n o p e r h y d r o p h e n a n t h r e n e . . . . . . . . . . 7 1 C o m m o n s t r u c t u r e o f t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t w i t h a c e n t r a l d o m a i n w i t h f o u r a — h e l i c a l d o m a i n s ( 1 A , 1 B , 2 A , 2 8 ) d i s r u p t e d b y l i n k e r n o n - h e l i c a l d o m a i n s ( L 1 , L 1 2 , L 2 ) , a n d t w o n o n - h e l i c a l d i v e r g e n t d o m a i n s a t t h e a m i n o a n d c a r b o x y t e r m i n u s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 0 C u l t u r e P t K c e l l s s t a i n e d w i t h c y t o k e r a t i n a n t i b o d y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 2 C u l t u r e P t K c e l l s s t a i n e d w i t h v i m e n t i n a n t i b o d y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 5 T h e M a t r i x M e t a l l o p r o t e i n a s e F a m i l y . G r o u p s a r e a r r a n g e d b y d o m a i n s t r u c t u r e a n d s e p a r a t e d b y d a s h e d l i n e . F a m i l y m e m b e r s w i t h d i s t i n c t b u t s u b t l e s t r u c t u r a l f e a t u r e s a r e s e p a r a t e d b y d o t t e d l i n e . P R O = p r o d o m a i n ; P R E = l e a d e r s e q u e n c e ; C A T = c a t a l y t i c d o m a i n ; H = h i n g e d o m a i n ; H E M = h e m o p e x i n - l i k e d o m a i n ; F = f u r i n s i t e ; F N = fi b r o n e c t i n - l i k e d o m a i n ; T M = t r a n s m e m b r a n e d o m a i n ; a n d N D = n o t d e t e r m i n e d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 0 x v i i i G m \ M M e c \ l i e o M a l P t i t h c c i 7 i c é 1 n 1 u h l - ~ X ( O A Y ‘ T T ) T L h F , . ' 9 - 1 : 9 1 " " " - v - 1 ( E . s : ' 1 m ' I . 2 F i g u r e 6 - 1 : F a r e 6 - 2 : F u t u r e 6 - 3 ; F F l a r e 6 4 : F i g u r e 6 - 5 F 1 3 3 , , 6 - 6 - 0 o i R O W : U . - ~ i ' . ’ 1 } ] “ L ‘ g l b ‘ ‘ - ~ J . ‘ ‘ n 5 d b » . s u : : c \ f a n k v 1 \ v . a l - d ‘ _ ‘ ~ , ‘ a v ‘ y ' ; v b k s ‘ n a a / 4 t o m z a t r ( ( 0 8 5 x t h e c p z ? D 1 3 3 4 : “ h u h t c e l l s n ‘ . a c r m r t T h 3 ' 0 [ \ Q ~ r 1 I ‘ d u z t c : F i g u r e 5 - 2 : F i g u r e 5 - 3 : F i g u r e 6 - 1 : F i g u r e 6 — 2 : F i g u r e 6 - 3 : F i g u r e 6 — 4 : F i g u r e 6 - 5 : F i g u r e 6 - 6 : G e l a t i n z y m o g r a p h y o f t i s s u e e x t r a c t s o b t a i n e d f r o m p r i m a r y a n d m e t a s t a t i c s p i n a l t u m o r s a m p l e s . E q u a l a m o u n t s o f p r o t e i n ( 5 0 u g ) w e r e f r a c t i o n a t e d b y S D S - P A G E u s i n g g e l a t i n a s t h e s u b s t r a t e . M o l e c u l a r s i z e o f m a j o r M M P s i s d e n o t e d i n k i l o d a l t o n s ( k D a ) . M M P - 9 a t 9 2 k D a , M M P - 2 a t 7 2 k D a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 6 R o l e o f M M P s i n t h e m e t a s t a t i c p r o c e s s . M M P s h a v e b e e n c l a s s i c a l l y t h o u g h t t o c o n t r i b u t e t o t h e t i s s u e d e s t r u c t i o n r e q u i r e d f o r c e l l s t o i n v a d e , i n t r a v a s a t e , e x t r a v a s a t e , a n d m i g r a t e . M o r e r e c e n t e v i d e n c e s u g g e s t s t h e s e e n z y m e s c a n a l s o p l a y a r o l e i n t h e g r o w t h o f t u m o r s , a n g i o g e n e s i s , a n d t h e s u s t a i n e d g r o w t h o f m e t a s t a t i c n o d u l e s . . . . . . . . . . . . l 1 3 F e r t i l i z a t i o n a n d e a r l y s t a g e s o f e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t t h r o u g h t h e f o r m a t i o n o f t h e g e r m l a y e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 7 C r o s s s e c t i o n t h r o u g h t h e p r i m i t i v e s t r e a k s h o w i n g i n v a g i n a t i o n o f t h e e p i b l a s t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 8 D i a g r a m s h o w i n g c e l l m u l t i p l i c a t i o n a n d c e l l d i f f e r e n t i a t i o n , b o t h o f w h i c h c a n o c c u r s i m u l t a n e o u s l y i n t h e s a m e c u l t u r e w h e r e d i f f e r e n t c e l l s m a y h a v e d i f f e r e n t f a t e s . S i m i l a r p h e n o m e n a o c c u r i n t h e a c i n a r e p i t h e l i u m i n v i v o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 9 N o r m a l a n d d e r a n g e d c o n t r o l o f c e l l p r o d u c t i o n f r o m s t e m c e l l s . ( A ) T h e n o r m a l s t r a t e g y f o r p r o d u c i n g d i f f e r e n t i a t e d c e l l s . ( B a n d C ) T w o t y p e s o f d e r a n g e m e n t t h a t c a n g i v e r i s e t o t h e u n b r i d l e d p r o l i f e r a t i o n c h a r a c t e r i s t i c o f c a n c e r . E x c e s s i v e c e l l d i v i s i o n r a t e f o r t h e s t e m c e l l i n ( A ) w i l l n o t b y i t s e l f h a v e t h i s e f f e c t , a s l o n g a s e a c h s t e m c e l l d i v i s i o n p r o d u c e s o n l y o n e d a u g h t e r t h a t i s a s t e m c e l l . . . . . . . . . 1 3 1 C y t o k e r a t i n fi l a m e n t s i n e p i t h e l i a l c e l l s . I m m u n o fl u o r e s c e n c e m i c r o g r a p h o f t h e n e t w o r k o f c y t o k e r a t i n fi l a m e n t s ( g r e e n ) i n a s h e e t o f e p i t h e l i a l c e l l s i n c u l t u r e . T h e fi l a m e n t s i n e a c h c e l l a r e d i r e c t l y c o n n e c t e d t o t h o s e o f i t s n e i g h b o r s b y d e s m o s o m e s . A s e c o n d p r o t e i n ( b l u e ) h a s b e e n s t a i n e d t o r e v e a l t h e l o c a t i o n o f t h e c e l l b o u n d a r i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 2 H y p o t h e t i c a l d i f f e r e n t i a t i o n p a t h w a y f o r h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s b a s e d o n p a t t e r n s o f c y t o k e r a t i n s t a i n i n g . B a s a l s t e m c e l l s ( K 5 a n d K 1 4 o n l y ) g i v e r i s e t o a n i n t e r m e d i a t e t r a n s i t a m p l i f y i n g p o p u l a t i o n e x p r e s s i n g K 1 9 . T h e s e c e l l s d i f f e r e n t i a t e i n t o l u m i n a l c e l l s w i t h t r a n s i e n t c o - e x p r e s s i o n o f K 1 9 , 8 , a n d 1 8 b e f o r e c o m p l e t e d i f f e r e n t i a t i o n i n t o c e l l s e x p r e s s i n g K 8 a n d K 1 8 o n l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 5 x i x F g u r t M l : E u ! “ ( * 7 : fi g u r e 6 - 8 1 F i g u r e ( r 9 . F i g u r e 6 - 1 0 . c h d l l l l ' : e \ p l ' c . \ . \ l 1 1 1 \ 1 1 1 % , “ . M o d s 0 h i r ‘ c r r I a n d p a r . ‘ . , O Q J r ‘ A " n a e - 5 ‘ " D c r l u z . d c n l C d i E m n r u ? ‘ d r r r l r c r 1 : : i l l ( 0 : 7 3 . : c u r l ) > l . : . H O “ l ) ‘ ~ d a m ; M d m l : a n d d c ' b l fi d m : 3 1 m 5 1 1 ' . “ 1 3 I ‘ d . . . O f ‘ k fl F V h u m n F i g u r e 6 - 7 : F i g u r e 6 — 8 : F i g u r e 6 - 9 : F i g u r e 6 - 1 0 : F i g u r e 6 - 1 1 : F i g u r e 6 - 1 2 : F i g u r e 6 - 1 3 : T r e a t m e n t w i t h 4 - H P R c a u s e s a m a r k e d d e c r e a s e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n D U - l 4 5 c e l l s . W e s t e r n b l o t a n a l y s i s s h o w s a d e c r e a s e i n v i m e n t i n ( V ) e x p r e s s i o n b y 4 - H P R i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . . . 1 4 0 M o d e o f a c t i o n o f p o l y p e p t i d e g r o w t h f a c t o r s i n t h e n o r m a l , h y p e r p l a s t i c , a n d c a r c i n o m a t o u s p r o s t a t e s h o w i n g t h e a u t o c r i n e a n d p a r a c r i n e m a n n e r s o f s e c r e t i o n o f d i f f e r e n t g r o w t h f a c t o r a t d i f f e r e n t s t a g e s o f p r o s t a t e c a n c e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 2 D e f e c t i v e c e l l d i f f e r e n t i a t i o n i n e r y t h r o l e u k e m i a . E r y t h r o c y t e s a r e d e r i v e d f r o m a p l u r i p o t e n t s t e m c e l l i n t h e b o n e m a r r o w . E r y t h r o b l a s t s u n d e r g o s e v e r a l r o u n d s o f c e l l d i v i s i o n a s t h e y d i f f e r e n t i a t e , b u t c e l l d i v i s i o n s t o p s a t t e r m i n a l s t a g e s ( e r y t h r o c y t e s ) . I n c o n t r a s t , t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f l e u k e m i c c e l l s i s b l o c k e d a t a n e a r l y s t a g e a t w h i c h t h e y c o n t i n u e t o p r o l i f e r a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 7 H o w D N A d a m a g e a r r e s t s t h e c e l l c y c l e i n G 1 . W h e n D N A i s d a m a g e d , p r o t e i n k i n a s e s t h a t p h o s p h o r y l a t e p 5 3 a r e a c t i v a t e d . M d m 2 n o r m a l l y b i n d s t o p 5 3 a n d p r o m o t e s i t s u b i q u i t i n y l a t i o n a n d d e s t r u c t i o n i n p r o t e o s o m e s . P h o s p h o r y l a t i o n o f p 5 3 b l o c k s i t b i n d i n g t o M d m 2 ; a s a r e s u l t , p 5 3 a c c u m u l a t e s t o h i g h l e v e l s a n d s t i m u l a t e s t r a n s c r i p t i o n p 2 1 , t h e r e b y a r r e s t i n g t h e c e l l i n G 1 . . . . . . 1 4 9 T h e p a t h w a y t h a t c o n t o l s c e l l c y c l i n g v i a R b p r o t e i n . A l l c o m p o n e n t s o f t h i s p a t h w a y h a v e b e e n f o u n d t o b e a l t e r e d b y m u t a t i o n i n h u m a n c a n c e r s . I n m o s t c a s e s , o n l y o n e o f t h e c o m p o n e n t s i s a l t e r e d i n a n y i n d i v i d u a l t u m o r . T h e R b p r o t e i n i n h i b i t s e n t r y i n t o t h e c e l l - d i v i s i o n c y c l e w h e n i t i s u n p h o s p h o r y l a t e d . T h e c o m p l e x o f C d k 4 a n d c y c l i n D 1 p h o s p h o r y l a t e s R b , t h e r e b y e n c o u r a g i n g c e l l p r o l i f e r a t i o n . W h e n c e l l i s s t r e s s e d , p 1 6 i n h i b i t s t h e f o r m a t i o n o f a n a c t i v e C d k 4 / c y c l i n l D l c o m p l e x , p r e v e n t i n g p r o l i f e r a t i o n . I n a c t i v a t i o n o f R h o r p 1 6 b y m u t a t i o n e n c o u r a g e s c e l l d i v i s i o n , t h u s e a c h c a n b e r e g a r d e d a s a t u m o r s u p p r e s s o r . O v e r a c t i v i t y o f C d k 4 o r c y c l i n D 1 e n c o u r a g e s c e l l d i v i s i o n , t h u s e a c h c a n b e r e g a r d e d a s a p r o t o - o n c o g e n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 1 D i a g r a m o f t h e c e l l c y c l e s h o w i n g p o i n t s o f a n t i p r o l i f e r a t i v e a n d d i f f e r e n t i a t i n g a c t i o n s o f v i t a m i n D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 3 M e c h a n i s m s c o n t r o l l i n g S - p h a s e i n i t i a t i o n . G l - c d k a c t i v i t y i n t i a t e s R b p h o s p h o r y l a t i o n . T h i s i n a c t i v a t e s R b , f r e e i n g E 2 F t o a c t i v a t e t h e t r a n s c r i p t i o n o f S - p h a s e g e n e s , i n c l u d i n g t h e g e n e s f o r a G l / S - c y c l i n a n d S - c y c l i n . T h e r e s u l t i n g a p p e a r a n c e o f G l / S - c d k a n d S - c d k a c t i v i t i e s f u r t h e r e n h a n c e s R b p h o s p h o r y l a t i o n , f o r m i n g a p o s i t i v e f e e d b a c k l o o p . E 2 F a c t s b a c k t o s t i m u l a t e t h e t r a n s c r i p t i o n o f i t s o w n g e n e , f o r m i n g a n o t h e r p o s i t i v e f e e d b a c k l o o p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 5 F i g u r e 6 - 1 5 : 1 S A U : T P i i t h H a r r e l l - 1 8 : S t h c n : F r i a r ? 1 * ” : T h “ , ' C a l m : I n n . » l n \ ( £ ( P 1 0 : - B l u n t V ) l l \ ‘ \ \ l F i g u r e ( > 1 6 : S c h c r ‘ . F i g u r e 6 - 1 " : P h o t o : C o n i r d s ' p u z i m 3 “ s u r e 7 . ] . \ U t ‘ l e a a r e 1 1 : ; “ fi l m 7 . ) . — . . P U n C U t l a ) X L L A B _ ( - “ l l h m P V T “ - a : r e 4 . 3 . , _ T ] n \ F i g u r e 6 - 1 4 : T h e G l / S c h e c k p o i n t o f t h e c e l l c y c l e a n d t h e e f f e c t o f c a l c i t r i o l . C a l c i t r i o l r e g u l a t e s s e v e r a l p r o t e i n s s u c h a s c y c l i n s , c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e s ( c d k s ) , a n d c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r s ( c d k i ) , t h a t a r e i n v o l v e d i n t h e t h e G l / S t r a n s i t i o n , e s p e c i a l l y i n t h e p h o s p h o r y l a t i o n ( P ) o f r e t i n o b l a s t o m a ( R b ) . A r r o w s s h o w a c t i v a t i o n o r u p r e g u l a t i o n . B l u n t - e n d e d l i n e s r e p r e s e n t i n h i b i t i o n o r d o w n r e g u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 8 F i g u r e 6 - 1 5 : ( A ) P h o t o m i c r o g r a p h s h o w i n g o s t e o b l a s t s , t h e l a r g e r c e l l s o n t h e s u r f a c e o f t h e b o n e t i s s u e . ( B ) P h o t o m i c r o g r a p h o f b o n e t i s s u e s h o w i n g t w o o s t e o c l a s t s , t h e l a r g e c e l l s i n t h e c e n t e r o f t h e fi g u r e . . . . . . . 1 6 8 F i g u r e 6 - 1 6 : S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e r o l e o f v i t a m i n D i n d e v e l o p m e n t o f t h e b o n e c e l l t y p e s a n d r e g u l a t i o n o f b o n e r e m o d e l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 8 F i g u r e 6 - 1 7 : P h o t o m i c r o g r a p h o f y o u n g , g r o w i n g c a r t i l a g e . C e l l a r e c h o n d r o c y t e s . A r r o w r e p r e s e n t a r e a s o f G o l g i a p p a r a t u s . H & E s t a i n i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 1 F i g u r e 6 - 1 8 : S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f ( A ) c o n v e n t i o n a l a n d ( B ) s e q u e n t i a l m o d e l s o f h e m a t o p o i e s i s . T h e c o n v e n t i o n m o d e l h i g h l i g h t s t h e c o m m i t m e n t o f s t e m c e l l s t o e i t h e r l y m p h o i d o r m y e l o i d l i n e a g e f o l l o w e d b y f u r t h e r d i f f e r e n t i a t i o n t o a s p e c i fi c c e l l t y p e . T h e s e q u e n t i a l m o d e l p r o p o s e s t h a t t h e r e i s a p r e f e r r e d o r d e r t o t h e d e v e l o p m e n t o f i m m u n e c e l l s . S u c c e s s f u l m a t u r a t i o n t o w a r d a p a r t i c u l a r l i n e a g e i s d e p e n d e n t o n a v a r i e t y o f s i g n a l s . T h e i n fl u e n c e o f c a l c i t r i o l i n d i f f e r e n t i a t i o n o n m o n o c y t e s i s i n d i c a t e d a n d c o n t r a s t s w i t h t h e i n d u c t i o n o f n e u t r o p h i l s b y r e t i n o i d s . V i t a m i n D 3 p a t h w a y s i n r e d b o x e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 3 F i g u r e 7 - 1 : N u c l e a r r e c e p t o r s c a n b e g r o u p e d i n t o f o u r c l a s s e s . S h o w n h e r e a r e t h e r e p r e s e n t a t i v e r e c e p t o r s f o r e a c h g r o u p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 0 F i g u r e 7 - 2 : F u n c t i o n a l d o m a i n s t r u c t u r e o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r s u p e r f a m i l y . ( a ) N u c l e a r r e c e p t o r s ( N R ) a r e s e p a r a t e d i n t o f o u r r e g i o n s d e s i g n a t e d A / B , C , D , a n d E / F . ( b ) R e s i d u e b o u n d a r i e s o f c o r r e s p o n d i n g r e g i o n s w i t h i n t h e m a m m a l i a n V D R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 2 F i g u r e 7 - 3 : T h e N - t e r m i n a l , z i n c - fi n g e r b i n d i n g m o t i f o f t h e V D R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 4 F i g u r e 7 - 4 : P u t a t i v e m o l e c u l a r c o m m u n i c a t i o n s b e t w e e n V D R a n d t h e t r a n s c r i p t i o n a l c o m p l e x . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 0 F i g u r e 7 - 5 : S t r u c t u r e o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 1 x x i f i g u r e 7 - 6 3 F i z u r e 7 - 7 2 F ; u r e " - 8 F i g u r e 8 - 1 . F u t u r e 8 - 2 . F i g u r e 8 - 3 : F K i l n s 3 . 4 . R O l C I ‘ L ‘ l ’ h c r c r n d i t R X R m n u c l e u s i M o d - c l 0 V D R - R T T h r e e d : T r d d l i l t l M i l l ' s ; 1 1 ' . F i g u r e 7 - 6 : F i g u r e 7 - 7 : F i g u r e 7 - 8 : F i g u r e 8 - 1 : F i g u r e 8 — 2 : F i g u r e 8 - 3 : F i g u r e 8 - 4 : R o l e f o r 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i n t h e f o r m a t i o n o f f u n c t i o n a l V D R h e t e r o d i m e r . M o n o m e r o f V D R ( v ) a n d a p a r t n e r p r o t e i n s u c h a s R X R ( x ) a r e e i t h e r a s s o c i a t e d w i t h D N A ( 1 ) o r f r e e i n t h e n u c l e u s ( 1 1 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 3 M o d e l o f t w o d i f f e r e n t a l l o s t e r i c p a t h w a y s f o r V D R - R X R - l , 2 5 ( O H ) 2 D 3 b i n d i n g t o D N A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 4 T h r e e d i m e n s i o n a l m o d e l o f P S A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 1 T r a d i t i o n a l m o d e l o f t h e i n v i v o s y n t h e s i s o f v i t a m i n D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 2 M o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f v i t a m i n D m e t a b o l i t e s a n d e n z y m e s i n v o l v e d i n t h e s y n t h e s i s o f c a l c i t r i o l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 2 E f f e c t o f c h o l e c a l c i f e r o l o n a n c h o r a g e - d e p e n d e n t ( A ) a n d a n c h o r a g e - i n d e p e n d e n t ( B , C ) g r o w t h o f t h e R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . ( A ) 4 8 h a f t e r p l a t i n g 1 X 1 0 4 c e l l s / w e l l i n 9 6 — w e l l p l a t e s , c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . A f t e r 5 d a y s o f t r e a t m e n t , c e l l s w e r e s t a i n e d w i t h M T T . A b s o r b a n c e w a s r e a d a t 5 4 0 u m , i S D , ( n = 6 ) . T h e d a s h e d l i n e s h o w s I D s o o f ~ 6 . 4 1 1 M . ( B ) C o l o n y f o r m i n g e f fi c i e n c y ( C F E ) o f c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t e d R W P E 2 - W 9 9 c e l l s w a s d e t e r m i n e d u s i n g a s o f t a g a r a s s a y . C e l l s w e r e p l a t e d a t a d e n s i t y o f 1 2 , 5 0 0 c e l l s / 3 0 m m d i s h . C o l o n i e s w e r e s t a i n e d w i t h I N T a f t e r 2 1 d a y s o f g r o w t h , c o u n t e d , a n d r e s u l t s p l o t t e d , : 1 : S D , ( n = 3 ) . C F E o f e t h a n o l t r e a t e d c o n t r o l i s t a k e n a s 1 0 0 % . ( * * p = 0 . 0 1 ; * * * p < 0 . 0 0 1 ) . R e p r e s e n t a t i v e a g a r d i s h e s f o r e a c h c h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n a r e s h o w n i n ( C ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 7 T h e e f f e c t o f c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t o n t h e i n v a s i v e a b i l i t y ( A ) , m o t i l i t y ( B ) , a n d M M P a c t i v i t y ( C ) o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . ( A ) E f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n i n v a s i v e a b i l i t y w e r e e x a m i n e d u s i n g t h e i n v i t r o B o y d e n c h a m b e r a s s a y . 2 . 0 X 1 0 5 c e l l s w e r e p l a t e d / c h a m b e r i n t r i p l i c a t e a n d a l l o w e d t o i n v a d e t h r o u g h M a t r i g e l f o r 4 8 h . I n v a s i v e a b i l i t y o f e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l s w a s t a k e n a s 1 0 0 % ; 3 : S D ( n = 3 ) ( * * * = p < 0 . 0 0 1 ) . ( B ) T o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n c e l l m o t i i t y / c h e m o t a x i s , e x p e r i m e n t s w e r e r u n a s i n ( A ) , e x c e p t t h a t fi l t e r s w e r e n o t c o a t e d w i t h M a t r i g e l . M o t i l i t y o f e t h a n o l - t r e a t e d c e l l s w a s t a k e n a s 1 0 0 % ; : h S D , ( n = 4 ) ( * * * = p < 0 . 0 0 1 ) . ( C ) S D S - P A G E z y m o g r a p h y ( 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l c o n t a i n i n g 0 . 1 % g e l a t i n ) w a s u s e d t o a n a l y z e M M P - 2 a n d M M P - 9 a c t i v i t y i n c o n d i t i o n e d m e d i u m o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l f o r 4 8 h . 2 . 0 p g o f p r o t e i n w e r e l o a d e d / l a n e . D e n s i t o m e t r i c a n a l y s e s , w i t h e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l s t a k e n a s 1 0 0 % , a r e s h o w n b e l o w t h e z y r n o g r a m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 0 F a u r e 8 6 : ' f i h \ q f l o P u c a i F a c m c C r a r h e o r c m o k e i r c p n e e e a t E l c C s l \ C d c t t s . c e \ e m x n s n s ‘ . g t e e . d : d F l i n n 8 . 7 . b l U I . ' \ \ F i g u r e 8 - 6 : 1 m m . . . “ “ 2 1 1 ‘ . c R X R - c o n t : R X R . F E E U T E 8 ~ 8 ° F i g u r e 8 - 5 : F i g u r e 8 - 6 : F i g u r e 8 - 7 : F i g u r e 8 - 8 : E f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n t h e e x p r e s s i o n o f t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n v i m e n t i n . ( A ) I m m u n o s t a i n i n g r e s u l t s s u g g e s t t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n . T r e a t m e n t c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n a b o v e t h e i r r e s p e c t i v e s q u a r e . C = e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l . I n s e t i n ( a ) i s a n e g a t i v e c o n t r o l l a c k i n g p r i m a r y a n t i b o d y . B a r = 2 0 p m . ( B ) W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f v i m e n t i n e x p r e s s i o n c o n fi r m s i m m u n o s t a i n i n g r e s u l t s a n d s h o w s t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t d e c r e a s e s v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . V i m e n t i n M r = ~ 5 8 k D a . C h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n a b o v e t h e i r r e s p e c t i v e l a n e w h e r e C = e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l . D e n s i t o m e t r i c a n a l y s i s o f e a c h l a n e i s s h o w n b e l o w t h e b l o t , w h e r e e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l i s t a k e n a s 1 0 0 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 1 I m m u n o s t a i n i n g f o r n u c l e a r r e c e p t o r s i n R W P E 2 - W 9 9 c e l l s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . C e l l s w e r e t r e a t e d f o r 5 d a y s . V D R ( a - e ) a n d R X R - o r ( f - j ) b o t h d e m o n s t r a t e a m a r k e d i n c r e a s e i n e x p r e s s i o n w h e n c o m p a r e d t o t h e i r r e s p e c t i v e e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l c o v e r s l i p s ( b a n d g ) . R X R - y s h o w e d a v e r y s m a l l i n c r e a s e . T r e a t m e n t c o n c e n t r a t i o n s a r e 1 0 ' 9 M ( c , h , m ) , 1 0 ' 8 M ( d , i , n ) a n d 1 0 ' 7 M ( e , j , o ) c h o l e c a l c i f e r o l . ( a , f , k ) a r e c o n t r o l s l a c k i n g p r i m a r y a n t i b o d y . C e l l s w e r e p l a t e d o n s t e r i l e , g l a s s c o v e r s l i p s a t a d e n s i t y o f 7 , 5 0 0 c e l l s / c o v e r s l i p . B a r = 2 0 p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 3 W e s t e r n b l o t a n a l y s i s s h o w i n g t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n n u c l e a r r e c e p t o r s . R e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e d a d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n o f V D R , R X R - o r , a n d A R . R X R - y e x p r e s s i o n i s a l s o u p - r e g u l a t e d b u t a t a l o w e r l e v e l . R X R - y i s t h e n d o w n - r e g u l a t e d a t t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 ' 6 M c h o l e c a l c i f e r o l . F o r V D R 2 0 p g a n d f o r R X R s a n d A R 2 5 p g o f p r o t e i n w a s l o a d e d / l a n e . B - a c t i n w a s u s e d a s t h e l o a d i n g c o n t r o l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 4 W e s t e r n b l o t f o r 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e , C Y P 2 7 A 1 , i n R W P E 2 - W 9 9 c e l l s s h o w s t h a t w h i l e e n z y m e a c t i v i t y i s p r e s e n t i n u n t r e a t e d c e l l s i t i s a l s o u p - r e g u l a t e d u p o n t r e a t m e n t w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . C h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n f o r t h e r e s p e c t i v e l a n e s . 4 0 p g p r o t e i n w a s l o a d e d / l a n e . M o l e c u l a r w e i g h t o f C Y P 2 7 A 1 i s s h o w n t o b e ~ 5 4 k D a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 4 x x i i i 1 1 1 m g " F i g u r e 9 - 1 : F i g u r e 9 - 2 - E g u r e 9 - 3 ; 1 1 3 1 " , 9 4 . E r ‘ f e d r 3 3 : 1 1 “ ? \ x e r c r a f t e r x x i i i " . . \ 5 4 1 ' m . \ l . ‘ ~ l C O R G I : n u n - 2 : . 4 ‘ h . 1 : I f L ‘ d i g ‘ C . S I J I C C C T h 3 d d R u m - E e l “ “ \ \ l ( p n ‘ l c ' m t r v ‘ L ' ~ d s n r ; F i g u r e 8 — 9 : F i g u r e 9 - 1 : F i g u r e 9 - 2 : F i g u r e 9 - 3 : F i g u r e 9 - 4 : E f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n ( A ) a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h , ( B ) M M P a c t i v i t y , a n d ( C ) V D R e x p r e s s i o n i n R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . ( A ) C e l l s w e r e p l a t e d a t a d e n s i t y o f 1 . 0 X 1 0 4 c e l l s / w e l l i n 9 6 - w e l l p l a t e s . 4 8 h a f t e r p l a t i n g , c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h c a l c i t r i o l . P l a t e s w e r e s t a i n e d w i t h M T T a f t e r 5 d a y s o f t r e a t m e n t a n d a b s o r b a n c e w a s r e a d a t 5 4 0 n m . T h e d a s h e d l i n e s h o w s l D 5 o o f ~ 1 . 0 5 p M . ( B ) T h e a c t i v i t y o f M M P - 9 a n d M M P - 2 w a s a n a l y z e d b y S D S - P A G E z y m o g r a p h y o f c o n d i t i o n m e d i u m f r o m R W P E 2 - W 9 9 c e l l s t r e a t e d w i t h c a l c i t r i o l f o r 4 8 h . 2 . 0 p g o f p r o t e i n w a s l o a d e d / l a n e . ( C ) W e s t e r n b l o t f o r V D R i n c a l c i t r i o l - t r e a t e d R W P E 2 - W 9 9 c e l l s s h o w s a d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n o f V D R e x p r e s s i o n w i t h i n c r e a s i n g c a l c i t r i o l c o n c e n t r a t i o n s b u t i s t h e n d o w n - r e g u l a t e d a t t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 ' 6 M c h o l e c a l c i f e r o l . 2 0 p g p r o t e i n w a s l o a d e d / l a n e . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 6 T h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h o f t h e n o n - t u m o r i g e n i c R W P E - l a n d t h e m a l i g n a n t R W P E 2 - W 9 9 c e l l s l i n e s . 4 8 h a f t e r p l a t i n g l X 1 0 4 c e l l s / w e l l i n 9 6 - w e l l p l a t e s , c e l l w e r e t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . A f t e r 5 d a y s o f t r e a t m e n t , c e l l s w e r e s t a i n e d w i t h M T T . A b s o r b a n c e w a s r e a d a t 5 4 0 n m , d : S D , ( n = 6 ) . T h e d a s h e d l i n e s h o w s I D 5 0 o f ~ 3 . 8 p M f o r R W P E - l a n d ~ 6 . 4 p M f o r R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . * * p = 0 . 0 1 ; * * * p < 0 . 0 0 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 7 S D S - P A G E z y m o g r a p h y ( 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l c o n t a i n i n g 0 . 1 % g e l a t i n ) w a s u s e d t o a n a l y z e M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y i n c o n d i t i o n e d m e d i u m o f R W P E - l c e l l s t r e a t e d f o r 4 8 h w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . 2 . 0 p g o f p r o t e i n w e r e l o a d e d / l a n e . D e n s i t o m e t r i c a n a l y s e s , w i t h e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l s t a k e n a s 1 0 0 % , a r e s h o w n b e l o w t h e z y m o g r a m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 9 E f f e c t o f c h o l e c a l c i f e r o l o n t h e e x p r e s s i o n o f i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n v i m e n t i n . I m m u n s t a i n i n g r e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n . T r e a t m e n t c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n a b o v e t h e i r r e s p e c t i v e s q u a r e . C = e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l ; ( a ) i s a n e g a t i v e c o n t r o l ( C ) l a c k i n g p r i m a r y a n t i b o d y . B a r = 2 0 p m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 0 I m m u n o s t a i n i n g f o r n u c l e a r r e c e p t o r s i n R W P E - l c e l l s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . C e l l s w e r e t r e a t e d f o r 5 d a y s . V D R ( a - e ) , R X R - o r ( f - j ) , R X R - B ( k - o ) , a n d R X R - y ( p - t ) a l l d e m o n s t r a t e a m a r k e d i n c r e a s e i n e x p r e s s i o n w h e n c o m p a r e d t o t h e i r r e s p e c t i v e e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l c e l l s ( b , g , l , a n d q ) . T r e a t m e n t c o n c e n t r a t i o n s u s e d a r e 1 0 ' 9 M ( c , h , m , r ) , 1 0 ' 8 M ( d , i , n , s ) a n d 1 0 ' 7 M ( e , i , o , t ) . ( a , f , k , p ) a r e c o n t r o l s l a c k i n g p r i m a r y a n t i b o d y . C e l l s w e r e p l a t e d o n s t e r i l e , g l a s s c o v e r s l i p s a t d e n s i t y o f 7 , 5 0 0 c e l l s / c o v e r s l i p . B a r = 2 0 p m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 1 x x i v F i g u r e 9 - 5 3 1 } n g r e 9 - 6 : fi g u r e 9 - 7 : F i g u r e 9 - 8 ; “ L 5 1 3 n u c i c ; c a n c e r I i i . “ x i 0 { \ 1 J d e t e c t C O D C C v » c r c 1 \ V C \ I . C h k ‘ i c s C O U C C t h a t C l F i g u r e 9 - 5 : F i g u r e 9 - 6 : F i g u r e 9 - 7 : F i g u r e 9 - 8 : W e s t e r n b l o t a n a l y s i s s h o w i n g t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n n u c l e a r r e c e p t o r s . L a n e ‘ C ’ r e p r e s e n t s t h e c o n t r o l . C h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n a b o v e t h e i r r e s p e c t i v e l a n e s . R e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n o f V D R , R X R - o r , a n d R X R - y . V e r y l o w l e v e l s o f R X R - B w e r e d e t e c t e d u n t i l a m a r k e d u p - r e g u l a t i o n w a s s e e n a t t h e 1 0 6 M c o n c e n t r a t i o n . F o r V D R 2 0 p g a n d R X R s a n d A R 2 5 p g o f p r o t e i n w e r e l o a d e d / l a n e . B - a c t i n w a s u s e d a s t h e l o a d i n g c o n t r o l . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 2 W e s t e r n b l o t f o r P S A e x p r e s s i o n i n R W P E - l c e l l s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . L a n e ‘ C ’ r e p r e s e n t s t h e c o n t r o l . C h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n a b o v e t h e i r r e s p e c t i v e l a n e s . R e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l c a u s e s a n u p - r e g u l a t i o n i n t h e e x p r e s s i o n o f P S A . 4 0 p g o f p r o t e i n l o a d e d / l a n e . B - a c t i n w a s u s e d a s t h e l o a d i n g c o n t r o l . . . 3 0 3 W e s t e r n b l o t f o r 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e , C Y P 2 7 A 1 , i n R W P E - l c e l l s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . L a n e ‘ C ’ r e p r e s e n t s t h e c o n t r o l . C h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n a b o v e t h e i r r e s p e c t i v e l a n e s . R e s u l t s s h o w t h a t w h i l e e n z y m e a c t i v i t y i s p r e s e n t i n u n t r e a t e d c e l l s i t i s a l s o u p - r e g u l a t e d u p o n c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t . 4 0 m g p r o t e i n w e r e l o a d e d / l a n e . M o l e c u l a r w e i g h t o f C Y P 2 7 A 1 i s s h o w n t o b e ~ 5 4 k D a . B - a c t i n w a s u s e d a s t h e l o a d i n g c o n t r o l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 4 E f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n ( A ) a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h , ( B ) M M P a c t i v i t y , a n d ( C ) V D R e x p r e s s i o n i n R W P E - l c e l l s . ( A ) C e l l s w e r e p l a t e d a t a d e n s i t y o f 1 x 1 0 4 c e l l s / w e l l i n 9 6 - w e l l p l a t e s . 4 8 h a f t e r p l a t i n g c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . P l a t e s w e r e s t a i n e d w i t h M T T a f t e r 5 d a y s o f t r e a t m e n t . A b s o r b a n c e w a s r e a d a t 5 4 0 n m . T h e d a s h e d l i n e s h o w s I D s o o f ~ 1 . 2 5 p M . ( B ) T h e a c t i v i t y o f M M P - 9 a n d M M P - 2 w a s a n a l y z e d b y S D S - P A G E z y m o g r a p h y o f c o n d i t i o n e d m e d i u m f r o m R W P E - l c e l l s t r e a t e d f o r 4 8 h w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . 2 . 0 p g o f p r o t e i n w e r e l o a d e d / l a n e . ( C ) W e s t e r n b l o t f o r V D R i n c a l c i t r i o l - t r e a t e d R W P E - l c e l l s s h o w s a d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n o f V D R e x p r e s s i o n w i t h i n c r e a s i n g c a l c i t r i o l c o n c e n t r a t i o n s u p t o 1 0 ’ 7 M . 2 0 p g p r o t e i n w e r e l o a d e d / l a n e . . . . . . . . . . . . 3 0 5 X X V l \ a \ l \ ' . - \ 4 3 1 . 1 » a ; ] i t ' D Q p . . . - ‘ 0 1 ” T M , . D 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 2 5 0 H D 3 4 - H P R D H T 9 - c i s R A A D A M A D P A N O V A A R A T P A T R A B M B M P B P E B P H b p c d k c d k i C F E c K D - b o x D B D D B P D - P B S D R - 3 D N A E C M E D T A E L I S A E G F E R F B S F G F F L I P F N F R A P G D P G F A P H G P I N H P V I E N I G F I G F B P L I S T O F A B B R E V I A T I O N S 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 , c a l c i t r i o l 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 N - ( 4 - h y d r o x y p h e n y l ) r e t i n a m i d e 5 - a l p h a d i h y d r o t e s t o s t e r o n e 9 - c i s - r e t i n o i c a c i d A d i s i n t e g r i n a n d m e t a l l o p r o t e i n a s e A d e n o s i n e d i p h o s p h a t e A n a l y s i s o f v a r i a n c e A n d r o g e n r e c e p t o r A d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e a l l - t r a n s r e t i n o i c a c i d B a s e m e n t m e m b r a n e B o n e m o r p h o g e n e t i c p r o t e i n B o v i n e p i t u i t a r y e x t r a c t B e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a B a s e p a i r s c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r C o l o n y f o r m i n g e f fi c i e n c y c y t o k e r a t i n D i s t a l b o x D N A b i n d i n g d o m a i n V i t a m i n D b i n d i n g p r o t e i n D u l b e c c o ’ s p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e D i r e c t r e p e a t w i t h t h r e e n u c l e o t i d e s p a c e r D e o x y r i b o n u c l e i c a c i d E x t r a c e l l u l a r m a t r i x E t h y l e n e d i a m i n e t e t r a c e t i c a c i d E n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y E p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r E s t r o g e n r e c e p t o r F e t a l b o v i n e s e r u m F i b r o b l a s t g r t h f a c t o r F l u o r e s c e n c e l o s s i n p h o t o b l e a c h i n g F i b r o n e c t i n F l u o r e s c e n c e r e c o v e r y a fi e r p h o t o b l e a c h i n g G u a n i n e d i p h o s p h a t e G l i a l fi b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n H i g h - g r a d e p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a H u m a n p a p i l l o m a v i r u s I n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a I n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r I n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r b i n d i n g p r o t e i n x x v i 1 . « . 0 4 < a 3 . ) L / x 4 % . I N T I U P A C I V V M k D a K G F K S F M L B D M M P M r m R N A M T - M M P M T T N I H N L S N R P - b o x P A P A P P I C P I N P S A P T H R A R R b R X R S D S D S - P A G E T G F T I M P t P A T R u P A U V V D R V D R E p - i o d o n i t r o t e t r a z o l i u m I n t e r n a t i o n a l U n i o n o f P u r e a n d A p p l i e d C h e m i s t s I n t r a v i t a l v i d e o m i c r o s c o p y K i l o d a l t o n K e r a t i n o c y t e g r o w t h f a c t o r K e r a t i n o c y t e s e r u m f r e e m e d i u m L i g a n d b i n d i n g d o m a i n M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e M o l e c u l a r w e i g h t M e s s e n g e r r i b o n u c l e i c a c i d M e m b r a n e - t y p e m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e 3 - [ 4 , 5 - d i m e t h y l t h i a z o l - 2 - y l ] - 2 , 5 - d i p h e n y l t e t r a z o l i u m b r o m i d e N a t i o n a l i n s t i t u t e s o f h e a l t h N u c l e a r l o c a l i z a t i o n s i g n a l N u c l e a r r e c e p t o r P r o x i m a l b o x P l a s m i n o g e n a c t i v a t o r P r o s t a t e a c i d p h o s p h a t a s e P r e - i n i t i a t i o n c o m p l e x P r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a P r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n P a r a t h y r o i d h o r m o n e R e t i n o i c a c i d r e c e p t o r R e t i n o b l a s t o m a R e t i n o i d X r e c e p t o r S t a n d a r d d e v i a t i o n S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r T i s s u e i n h i b i t o r o f m e t a l l o p r o t e i n a s e T i s s u e - t y p e p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r T h y r o i d h o r m o n e r e c e p t o r U r o k i n a s e - t y p e p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r U l t r a v i o l e t V i t a m i n D r e c e p t o r V i t a m i n D r e s p o n s e e l e m e n t x x v i i H y p o t h e s e s T h e m a m ; : . ; ? : ; 3 l ; r f e r t . m u t e d x x 1 l : i n r 1 : n : 3 3 : t r e a t m e n t 1 4 1 . - I n _ t . _ ‘ . . - . . . e s e e l } d z : 4 \ \ ‘ L \ l _ “ 1 " ‘ “ A l l : r ‘ ‘ . . 1 L 3 1 n § d § : “ y 3 1 x ‘ m c r ' l i r r j . . m a l l - l ) . n - ‘ . " ” 5 1 3 3 , } , I ‘ . " 7 . 1 1 , 4 3 ! “ v ' 1 ‘ ” ‘ 4 " ‘ e . p 1 3 ) ” : t “ m “ 4 . “ “ J n ' e h H y p o t h e s e s T h e m a i n o b j e c t i v e s o f t h i s s t u d y a r e : i ) t o e x a m i n e t h e p o t e n t i a l o f c h o l e c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 3 ) a s a c h e m o p r e v e n t i o n a g e n t b y r e v e r s i n g c e l l u l a r c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n ; i i ) t o e x a m i n e i t s p o t e n t i a l a s a n a g e n t f o r c a n c e r t r e a t m e n t b y i n h i b i t i n g o r r e v e r s i n g m a l i g n a n t c h a r a c t e r i s t i c s o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s ; a n d i i i ) t o e x p l o r e i t s m e c h a n i s m s o f a c t i o n . T h e n o n - t u m o r i g e n i c R W P E - l c e l l l i n e w i l l b e u s e d t o t e s t t h e c h e m o p r e v e n t i v e a b i l i t y o f c h o l e c a l c i f e r o l a n d t h e m a l i g n a n t R W P E 2 - W 9 9 c e l l l i n e w i l l b e u s e d f o r p r o s t a t e c a n c e r t r e a t m e n t s t u d i e s . T h e p r o p o s e d h y p o t h e s e s a r e t h a t c h o l e c a l c i f e r o l : 1 ) i n h i b i t s t h e g r o w t h o f p r e - m a l i g n a n t a n d m a l i g n a n t h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s 2 ) i n d u c e s c e l l d i f f e r e n t i a t i o n , i n d i c a t e d b y c h a n g e s i n p r o t e i n e x p r e s s i o n , b y : a . d o w n - r e g u l a t i n g v i m e n t i n , a m a r k e r o f l o s s o f d i f f e r e n t i a t i o n b . i n d u c i n g p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) e x p r e s s i o n , a m a r k e r f o r c e l l d i f f e r e n t i a t i o n 3 ) i n h i b i t s i n v a s i o n b y d e c r e a s i n g : a . v i m e n t i n - a s s o c i a t e d m o t i l i t y b . m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e ( M M P - 9 a n d M M P - 2 ) a c t i v i t y 4 ) e x e r t s i t s b i o l o g i c a l e f f e c t s b y m o d u l a t i n g t h e e x p r e s s i o n o f v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) , r e t i n o i d X r e c e p t o r s ( R X R s ) , a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) , a n d 2 5 - h y d r o x y l a s e ( C Y P 2 7 A 1 ) 5 ) w i l l p r o v e t o b e a n e f f e c t i v e p o t e n t i a l a g e n t f o r p r o s t a t e c a n c e r p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t t h r o u g h i t s m u l t i p l e e f f e c t s P a r t I L i t e r a t u r e R e v i e w T h e l C h a p t e r 1 T h e P r o s t a t e : S t r u c t u r e , F u n c t i o n , a n d N e o p l a s t i c D i s e a s e s 6 t . 1 ; . I 0 . . ? - O 9 l : t r ~ . F 3 I : 7 . C W - . . r 7 . . . L L . m w . . . 4 ) . W z . _ . . / » t . w p : “ H u r t A . “ J 2 1 , c l ” : 2 3 2 T J C fl r m r u fi H . 9 9 4 0 O H : : 7 . ‘ . . . . . . . 4 . . r ; . , . ( r u . 3 r u t / m o . : 7 m 4 . . . . . . 1 . . v r 4 . . . # 3 2 3 1 1 4 \ 1 ( . 3 4 1 r . . ‘ . . ( h ( . . r . r . . v . ‘ . 1 ; ~ 1 1 I ‘ M : . ‘ 4 . . . . . . u r : { r a v e n / 2 . . . ! I I 4 ‘ 1 v . h . . . . 1 . . . v | . ' » ~ . F W r e r M J r I fi I e r . . . ’ 1 ; _ . . . ‘ I J I « t 1 ; A b s t r a c t I n o r d e r t o u n d e r s t a n d t h e o r g a n u n d e r i n v e s t i g a t i o n , o n e m u s t h a v e a b a s i c k n o w l e d g e o f i t s a n a t o m y , s t r u c t u r e , h i s t o l o g y , a n d f u n c t i o n . T h i s i s e s p e c i a l l y t r u e i n t h e c a s e o f t h e p r o s t a t e g l a n d b e c a u s e d i f f e r e n t d i s e a s e s o f t h e p r o s t a t e c a n b e a s s o c i a t e d w i t h i t s d i f f e r e n t a n a t o m i c a l r e g i o n s . T h e p r o s t a t e i s a s m a l l a c c e s s o r y m a l e s e x g l a n d w i t h a n i n c r e a s i n g t e n d e n c y t o d e v e l o p b o t h b e n i g n a n d m a l i g n a n t t u m o r s w i t h i n c r e a s i n g a g e . T h i s c h a p t e r p r o v i d e s i n f o r m a t i o n a b o u t t h e z o n a l a n a t o m y , s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f t h e p r o s t a t e g l a n d a n d t h e r o l e o f t h e c o m p o n e n t s o f t h e p r o s t a t i c s e c r e t i o n s , i n c l u d i n g g r o w t h f a c t o r s , p r o s t a s o m e s , p r o t e i n s , l i p i d s , a n d e n z y m e s . T h i s c h a p t e r a l s o d e s c r i b e s t h e m o r p h o l o g y a n d h i s t o l o g y o f t h e d i f f e r e n t c e l l t y p e s t h a t m a k e u p t h e p r o s t a t e g l a n d . P r o s t a t i c d i s e a s e s , i n c l u d i n g b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a , p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a , a n d p r o s t a t e c a n c e r w i l l a l s o b e d i s c u s s e d . A n a t o m y T 7 - r i n : p r o ) “ : ' - - . 1 v r ’ : f ‘ . . ' : ‘ : l ‘ . < . " i l O I a 1 . 3 . - ~ ‘ ~ - ‘ f i ? ’ : Y L C \ J - } C 0 . I t ) 1 1 1 . . 9 . 3 : . i t I S t h e l a r g ; . L i w ‘ , ‘ . . v u . : \ > - J A J : A n d I t \ \ i fi r m - l . “ ’ ‘ 1 v - ‘ I M 4 . . . E ‘ s d d \ t \ [ i ‘ ‘ - . r N 1 “ ‘ . . 1 3 3 ' V 9 t p i s t l n g t 5 . : N i l u . x “ w £ 1 ‘ e p r l l \ z a p c I l 7 1 . : ‘ 1 k p r | J \ L a s “ ' 3 1 : . A n a t o m y T h e p r o s t a t e i s a g l a n d f o u n d i n a l l o r d e r s o f m a l e m a m m a l s ( K r o n g r a d , 2 0 0 0 ) . T h e p r o s t a t e i s c o n s i d e r e d t o b e a g l a n d b e c a u s e i t m a k e s s e c r e t i o n s , t h u s , m e e t i n g t h e d e f i n i t i o n o f a g l a n d . T h e h u m a n p r o s t a t e i s c o n s i d e r e d a n e x o c r i n e a c c e s s o r y s e x g l a n d b e c a u s e o f i t s i n d i r e c t i n v o l v e m e n t i n p r o c r e a t i o n ( F i g u r e 1 - 1 ) . R e g a r d l e s s o f i t s s m a l l s i z e , i t i s t h e l a r g e s t o f t h e a c c e s s o r y s e x g l a n d s . I t s s h a p e a n d s i z e r e s e m b l e t h a t o f a c h e s t n u t a n d i t w e i g h s a p p r o x i m a t e l y 2 0 g r a m s , o r a l i t t l e l e s s t h a n a n o u n c e . T h e p r o s t a t e i s a b o u t t h e s i z e o f a p e a a t b i r t h a n d g r a d u a l l y i n c r e a s e s i n s i z e u n t i l p u b e r t y ( R o u s , 1 9 8 8 ) . A f t e r p u b e r t y t h e r e i s a r a p i d p e r i o d o f g r o w t h u n t i l t h e p r o s t a t e r e a c h e s i t s n o r m a l a d u l t s i z e s o m e t i m e b e t w e e n t h e t h i r d a n d f o u r t h d e c a d e o f l i f e . T h e n o r m a l p r o s t a t e g l a n d i n t h e a d u l t m a l e l i e s c a u d a l t o t h e u r i n a r y b l a d d e r a n d c r a n i a l t o t h e e x t e r n a l u r e t h r a l s p h i n c t e r ( F i g u r e 1 - 1 ) a n d c o n s i s t s o f a l a r g e s e r i e s o f b r a n c h i n g d u c t s t h a t e n t e r t h e p r o s t a t i c u r e t h r a ( I s a a c s , 1 9 8 3 ) . T h e p r o s t a t e i s d i v i d e d i n t o t w o d i s t i n c t s e g m e n t s , d i s t a l a n d p r o x i m a l , b y t h e 3 5 d e g r e e a n g l e o f d e v i a t i o n t h e u r e t h r a t a k e s a s i t p a s s e s t h r o u g h t h e p r o s t a t e ( M c N e a l , 1 9 8 9 ) . T h e u r e t h r a a l s o d i v i d e s t h e p r o s t a t e g l a n d i n t o a v e n t r a l fi b r o m u s c u l a r p o r t i o n a n d a d o r s a l g l a n d u l a r p o r t i o n , b o t h o f w h i c h a r e e n c a p s u l a t e d b y a t h i n l a y e r o f c o n n e c t i v e t i s s u e . T h e p r o s t a t i c u r e t h r a i s t h e p o r t i o n o f t h e u r e t h r a w h i c h i s w i t h i n t h e p r o s t a t e a n d h a s t h e s a m e a n a t o m i c a l r e l a t i o n s h i p t o t h e g l a n d a s t h e c o r e o f a n a p p l e h a s t o t h e a p p l e i t s e l f . I t i s a c h a n n e l t h r o u g h t h e p r o s t a t e g l a n d t h r o u g h w h i c h u r i n e fl o w s a s i t l e a v e s t h e b l a d d e r . T h e p r o s t a t e g l a n d c o n s i s t s o f a p p r o x i m a t e l y 3 0 - 5 0 t u b u l o a v e o l a r g l a n d s c o n t a i n e d i n t h e fi b r o e l a s t i c s t r o m a . T h e s t r o m a i s c o m p o s e d o f s m o o t h m u s c l e a n d c o m p l e t e l y s h i e l d s t h e t h r e e z o n e s f r o m v i e w . T h e fi b r o m u s c u l a r s t r o m a p o r t i o n v a s d e f e r e n s — l P t o s t a t i c u r e t h r a W I S E S c r o t u m \ \ _ , F i r - ” U r . 5 € 1 - 1 T h c l k l g ‘ . r r , [ 0 t h L P E R I , “ v a s d e f e r e n s s e m i n a l v e s i c l e u r l n a r y b l a d d e r p r o s t a t e g l a n d b u l b o u r e t h r a l 7 g l a n d t e s t i s e p l d l d y m l s F i g u r e 1 - 1 : T h e l o c a t i o n o f t h e p r o s t a t e g l a n d w i t h r e s p e c t t o t h e r e m a i n d e r o f t h e m a l e r e p r o d u c t i v e a n d u r i n a r y a n a t o m y . T h e p r o s t a t e g l a n d l i e s c a u d a l t o t h e u r i n a r y b l a d d e r a n d i s d i v i d e d i n t o t w o s e g m e n t s b y t h e p r o s t a t i c u r e t h r a ( m o d i fi e d f r o m S t a r r a n d M c M i l l i a n , 1 9 9 7 ) . o c c u p i e s t h e a n t e r ‘ 2 : 5 5 ; : o r t h e p r e s - t . . ‘ ‘ a t » o a c t o r i s l p - . . 3 1 3 _ 3 _ 1 ‘ 1 1 . ‘ 1 Y 1 o f t h e 1 ‘ l l 1 5 - L n k e a ] - 1 ‘ x , ’ t . ‘ _ ‘ ‘ l ' 7 2 - - x l " W I v ‘ . , ‘ e _ . 1 . l ‘ - . ’ _ n . i 3 1 m l t l " F e I , u r e 1 - 2 r . T I } . ' 4 ' ; 9 L " U r n u ? p T O n g . _ . . . W 1 Y ' - 9 . ” A I , . 1 1 ) “ _ » \ - , . . \ I U U ‘ - - » 3 - ) . 1 s - . 0 0 f t h e o c c u p i e s t h e a n t e r i o r s u r f a c e o f t h e p r o s t a t e a n d m a k e s u p r o u g h l y o n e t h i r d o f t h e t o t a l t i s s u e o f t h e p r o s t a t e c a p s u l e . T h e fi b r o e l a s t i c c a p s u l e s u r r o u n d s t h e p r o s t a t e g l a n d a n d a l s o c o n t a i n s s m a l l b u n d l e s o f s m o o t h m u s c l e . T h e c a p s u l e a n d fi b r o m u s c u l a r s t r o m a p o r t i o n s o f t h e p r o s t a t e a r e o f l e s s i m p o r t a n c e t h a n t h e g l a n d u l a r p o r t i o n f r o m a p a t h o l o g i c a l a n d h i s t o l o g i c a l s t a n d p o i n t . T h e g l a n d u l a r p o r t i o n o f t h e p r o s t a t e i s c o m p o s e d o f t h r e e z o n e s t h a t d i f f e r b i o l o g i c a l l y a n d h i s t o l o g i c a l l y : t h e p e r i p h e r a l , c e n t r a l , a n d t r a n s i t i o n a l z o n e s ( F i g u r e 1 - 2 ) . T h e s e c o n c e n t r i c z o n e s , fi r s t e s t a b l i s h e d b y M c N e a l ( M c N e a l , 1 9 8 1 ) , d i v i d e t h e p r o s t a t e b a s e d o n m o r p h o l o g i c a l , f u n c t i o n a l , a n d p a t h o l o g i c a l s i g n i fi c a n c e ( C o f f e y , 1 9 9 2 ) . T h e p e r i p h e r a l z o n e i n t h e n o r m a l p r o s t a t e c o m p r i s e s t h e m a j o r i t y ( a p p r o x i m a t e l y 7 0 % ) o f t h e p r o s t a t i c v o l u m e . A s i t s n a m e i m p l i e s , i t e x t e n d s a r o u n d t h e p o s t e r o l a t e r a l p e r i p h e r a l a s p e c t s o f t h e g l a n d f r o m i t s a p e x t o i t s b a s e ( K i r b y , e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e d u c t s o f t h e p e r i p h e r a l z o n e , w h i c h p r e d o m i n a n t l y c o n s i s t o f t h e m a i n p r o s t a t i c g l a n d s , o p e n i n t o t h e d i s t a l p r o s t a t i c u r e t h r a . T h e h i s t o l o g i c a l a p p e a r a n c e o f t h i s z o n e i s i d e n t i fi e d b y s m a l l , a c i n a r s p a c e s l i n e d b y t a l l c o l u m n a r s e c r e t o r y e p i t h e l i a l c e l l s . T h e m a j o r i t y ( a p p r o x i m a t e l y 7 0 % ) o f p r o s t a t i c a d e n o c a r c i n o m a s a r i s e i n t h i s z o n e ( A h m e d e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e c e n t r a l z o n e i s t h e s e c o n d l a r g e s t z o n e o f t h e n o r m a l p r o s t a t e a n d i t c o m p r i s e s a b o u t 2 5 % o f t h e g l a n d u l a r v o l u m e . T h e m a j o r i t y o f g l a n d s i n t h i s z o n e a r e m u c o s a ] g l a n d s . T h i s z o n e i s c o n e - s h a p e d a n d s u r r o u n d s t h e e j a c u l a t o r y d u e t s w i t h i t s a p e x a t t h e v e r u m o n t a n u m a n d i t s b a s e a g a i n s t t h e b l a d d e r n e c k ( D i x o n e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e c e n t r a l z o n e i s s u r r o u n d e d b y t h e p e r i p h e r a l z o n e a n d m a k e s u p t h e m a j o r i t y o f t h e p r o s t a t i c b a s e . T h e c e n t r a l z o n e i s c h a r a c t e r i z e d b y r e l a t i v e l y l a r g e a c i n i w i t h i r r e g u l a r c o n t o u r s , F i g u r e l - Z : Z o n a l l i b r o r r . .: C e n t r a l z o n e A n t e r i o r f i b r o m u s c u l a r s t r o m a P e r i p h e r a l z o n e F i g u r e 1 - 2 : Z o n a l a n a t o m y o f t h e p r o s t a t e , s h o w i n g t h e t h r e e g l a n d u l a r z o n e s a n d t h e fi b r o m u s c u l a r s t r o m a ( A h m e d e t a l . , 1 9 9 7 ) . 1 . 1 : ; H D } l o w ' e t W ‘ I I . . r r ‘ . 1 “ ; r i s 7 7 ; ; : 9 . i n e e T h e r s t t h i s r c n a o A s ! : m p : “ L 3 : e r u p t " i n t o I L h w ; o 3 ‘ . s 3 . 2 3 1 1 2 0 1 1 9 E l e ' l - _ ~ D e ? p t a s i a 1 C 0 I ‘ f ‘ c x 3 2 7 : 3 . T h e m a x : $ 2 7 1 3 3 ? V s n o s e n : - . . \ I . . ' r ‘ « 1 . 1 3 I : 1 1 4 0 ? . “ C H = " . . " \ ‘ 1 - 1 . : - ‘ “ r 5 - 3 o 0 1 l i n e d b y l o w c o l u m n a r c u b o i d a l e p i t h e l i u m . A l t h o u g h t h e c e n t r a l z o n e i s n o t u s u a l l y t h e s i t e o f e i t h e r b e n i g n o r m a l i g n a n t n e o p l a s m s , a p p r o x i m a t e l y 5 t o 1 0 % o f p r o s t a t i c c a n c e r s c a n a r i s e i n t h i s z o n e ( A h m e d e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e t r a n s i t i o n a l z o n e c o m p r i s e s t h e r e m a i n i n g 5 t o 1 0 % o f t h e p r o s t a t i c v o l u m e . T h i s z o n e i s c o m p o s e d o f t w o b i l a t e r a l l y s y m m e t r i c a l l o b u l e s t h a t s u r r o u n d t h e p r o s t a t i c u r e t h r a . T h e m a i n c o m p o n e n t o f t h e t r a n s i t i o n a l z o n e i s a c y l i n d r i c a l s m o o t h m u s c l e s p h i n c t e r w h o s e m a i n f u n c t i o n i s t o p r e v e n t t h e r e fl u x o f s e m i n a l fl u i d i n t o t h e b l a d d e r a t t h e t i m e o f e j a c u l a t i o n ( C o f f e y , 1 9 9 2 ) . T h e s u b m u c o s a l g l a n d s o f t h i s z o n e h a v e d u c t s t h a t e m p t y i n t o t h e u r e t h r a a t t h e b a s e o f t h e v e r u m o n t a n u m . H i s t o l o g i c a l l y , t h e t r a n s i t i o n z o n e a c i n i r e s e m b l e t h o s e o f t h e p e r i p h e r a l z o n e ; h o w e v e r , t h e s u r r o u n d i n g s t r o m a i s m o r e c o m p a c t a n d r e s e m b l e s t h a t o f t h e c e n t r a l z o n e . T h e t r a n s i t i o n z o n e d e v e l o p s 2 5 % o f p r o s t a t e c a n c e r s a n d i t i s t h e e x c l u s i v e s i t e o f b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a ( C o f f e y , 1 9 9 2 ) . T h e h i s t o l o g y o f t h e p r o s t a t e g l a n d w i l l b e d i s c u s s e d n e x t . H i s t o l o g y T h e n o r m a l p r o s t a t e i s a h i g h l y c o m p l e x t i s s u e . T h e g l a n d s i n t h e n o r m a l p r o s t a t e a r e l i n e d w i t h p s e u d o s t r a t i fi e d e p i t h e l i u m ( F i g u r e 1 - 3 ) a n d a r e s u r r o u n d e d b y s t r o m a t h a t c o n t a i n s n e r v e fi b e r s , s m o o t h m u s c l e , fi b r o b l a s t s , b l o o d v e s s e l s , a n d e x t r a c e l l u l a r m a t r i x . I n t h e n o r m a l p r o s t a t e , t h e p s e u d o s t r a t i fi e d e p i t h e l i u m i s a t t a c h e d t o t h e b a s e m e n t m e m b r a n e ( F i g u r e 1 — 4 ) . B u t w h e n t h e p r o s t a t e b e c o m e s c a n c e r o u s t h e e p i t h e l i a l c e l l s b e c o m e d i s o r g a n i z e d a n d f o r m a c l u s t e r o f c e l l s ( F i g u r e 1 - 5 ) . C o n s t a n t i n t e r a c t i o n b e t w e e n e p i t h e l i a l c e l l s a n d s t r o m a l c e l l s i s c r u c i a l f o r m a i n t a i n i n g t h e s t r u c t u r e a n d L u m i n a l c e l l B a s a l c e l l fl . . . . < — — B a s e m e n t m e m b r a n e / - ~ - ' J w l < — S t r o m a F i g u r e 1 - 3 : P s e u d o s t r a t i fi e d e p i t h e l i a l c e l l l a y e r o f t h e n o r m a l p r o s t a t e . T h e b a s a l c e l l s ( g r a y ) a n d t h e l u m i n a l c e l l s ( w h i t e ) a r e s h o w n a t t a c h e d t o t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( E C M ) . F i b r o b l a s t s ( b l a c k ) a r e l o c a t e d i n t h e E C M ( m o d i fi e d f r o m B e l l o , 1 9 9 6 ) . F § U f € l - 4 2 l i l s b fi i w . \ \ Y ' \ L . . \ l l . C I I . . | l f O . l ' v I I ~ J ~ q ‘ é U r e ] . § . . . H . ” : 1 F i g u r e 1 - 4 : H i s t o l o g i c a l s e c t i o n o f t h e b e n i g n p r o s t a t e , s h o w i n g t h e u n i f o r m c o l u m n a r c e l l s ( U ) , t h e b a s a l c e l l ( B ) , a n d fi b r o v a s c u l a r s t a l k ( F ) ( K i r b y e t a l . , 1 9 9 6 ) . F i g u r e 1 - 5 : H i s t o l o g i c a l s e c t i o n o f t h e c a n c e r o u s p r o s t a t e ( K i r b y e t a l . , 1 9 9 6 ) . : ; 3 1 3 0 0 1 - 1 ? 0 1 1 1 \ i " - ‘ ‘ t e g m n o r t h e N r . . , 1 , , t g . . ‘ i r . $ i l e m m a . t t m . ‘ r T h e l u m r . . . t . ‘ ‘ 9 i f t u m m y . t ‘ r r ‘ . . . 7 . 2 m m : m e m b r a r t w e e r m m c s 3 . " . r o s t e r : a c r d p l u m p , 3 7 . 7 3 1 1 3 3 a r e l o c a t e i s : o r t h e g e l } , p b o m e 0 1 1 1 1 - 3 0 9 : " . . ' . . . e a r i s e r \ fi r m . , f u n c t i o n o f t h e p r o s t a t e . T h e p r o s t a t i c a c i n i a r e k n o w n t o c o n t a i n t w o t y p e s o f e p i t h e l i a l c e l l s : l u m i n a l c e l l s a n d b a s a l c e l l s ( V e r h a g e n e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e l u m i n a l c e l l s a r e t h e m o s t c o m m o n c e l l t y p e i n t h e p r o s t a t e g l a n d . T h e y a r e t a l l c o l u m n a r , t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d s e c r e t o r y e p i t h e l i a l c e l l s . T h e y a r e a t t a c h e d t o t h e b a s e m e n t m e m b r a n e b y i n t e g r i n r e c e p t o r s . T h e s e c e l l s c a n b e d i s t i n g u i s h e d b y t h e i r s h a p e , e n z y m e s a n d s e c r e t o r y g r a n u l e s t h a t s t a i n f o r p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) , p r o s t a t e a c i d p h o s p h a t a s e ( P A P ) , a n d o t h e r p r o t e i n s . T h e s e s e c r e t o r y g r a n u l e s a n d e n z y m e s a r e l o c a t e d i n t h e l u m i n a l e n d o f t h e c e l l s . T h e n u c l e i a r e l o c a t e d t o w a r d s t h e b a s e o f t h e c e l l s b e l o w a z o n e o f a b u n d a n t G o l g i a p p a r a t u s . W i t h a n d r o g e n a b l a t i o n , t h e s e c e l l s d e c r e a s e i n n u m b e r b y u p t o 9 0 % , b e c o m e c u b o i d a l , a n d s h r i n k b y a s m u c h a s 8 0 % a n d 6 0 % i n v o l u m e a n d h e i g h t , r e s p e c t i v e l y . S o m e o f t h e b a s a l c e l l s a r e c o n s i d e r e d t o b e t h e s t e m c e l l s f r o m w h i c h t h e l u m i n a l c e l l s a r i s e ( V e r h a g e n e t a l . , 1 9 9 2 ; T o k a r e t a 1 , 2 0 0 5 ) . T h e s e c e l l s a r e l e s s a b u n d a n t t h a n t h e l u m i n a l c e l l s , c o m p r i s i n g o n l y 1 0 % o f t h e s e c r e t o r y e p i t h e l i a l c o m p o n e n t . T h e y a r e f a r s m a l l e r i n s i z e t h a n t h e l u m i n a l c e l l s a n d m a y a p p e a r a b s e n t f r o m s o m e o f t h e d u c t s a n d a c i n i . B a s a l c e l l s h a v e a r o u n d m o r p h o l o g y , p o s s e s s l a r g e n u c l e i , a n d a r e m o s t a b u n d a n t i n t h e c e n t r a l z o n e o f t h e p r o s t a t e g l a n d . B a s a l c e l l p r o l i f e r a t i o n h a s b e e n d i r e c t l y r e l a t e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a ( P a r t i n , 2 0 0 0 ) . S t e m c e l l s a r e e l o n g a t e d c e l l s t h a t c o n t a i n l i t t l e c y t o p l a s m . T h e y a r e l o c a t e d i n t h e b a s a l c e l l l a y e r ( F o s t e r a n d K e , 1 9 9 7 ) . S t e m c e l l s w i t h i n t h e b a s a l l a y e r g i v e r i s e t o t h e b a s a l c e l l s , l u m i n a l c e l l s , a n d n e u r o e n d o c r i n e c e l l s . T h e n e u r o e n d o c r i n e c e l l s r e s t o n t h e b a s a l c e l l l a y e r b e t w e e n t h e s e c r e t o r y c e l l s a n d o f t e n h a v e d e n d r i t i c p r o c e s s e s . T h e y a r e r a n d o m l y s c a t t e r e d t h r o u g h o u t t h e p r o s t a t e a n d e x i s t i n a l l t h r e e z o n e s . T h e 1 2 i f é i u i t f ' fl o f t h c h u m r : t I H( a g 1 7 0 7 1 1 m 2 a l c a n a l 1 2 1 1 1 . V a ~ ‘ 1 “ p r e c e d r z t m u o n s h * ‘ u . ‘ . F u n c t i o n T h e p n n c r p a e m a i l fl u i d . T h e S t e m w a r e c a n I n : 3 3 : 1 - 1 1 i s t o p r o m T h e p r S t l n L . . . ' V . " - “ ‘ 1 ‘ k k r e x . , l i p - I d s . ; { a 3 . ‘ . . J P ' C h ’ l “ ‘ 1 ‘ 3 ‘ E - L r l ” v i p r e c e d i n g s e c t i o n s h a v e p r o v i d e d b a c k g r o u n d i n f o r m a t i o n o n t h e a n a t o m y , s t r u c t u r e , a n d h i s t o l o g y o f t h e h u m a n p r o s t a t e n e c e s s a r y f o r a n u n d e r s t a n d i n g o f p r o s t a t e f u n c t i o n . F u n c t i o n T h e p r i n c i p a l f u n c t i o n o f t h e p r o s t a t e g l a n d i s t o c o n t r i b u t e i t s s e c r e t i o n t o t h e s e m i n a l fl u i d . T h e m a i n p u r p o s e o f t h i s fl u i d i s t o a c t a s a v e h i c l e i n w h i c h t h e s p e r m a t o z o a c a n t r a v e l t o t h e o u t s i d e a t t i m e o f e j a c u l a t i o n . T h e s e c o n d a r y p u r p o s e o f t h e fl u i d i s t o p r o v i d e n o u r i s h m e n t t o t h e s p e r m . T h e fl u i d i s s l i g h t l y a l k a l i n e , m a k i n g t h e v a g i n a l c a n a l l e s s a c i d i c , w h i c h a l l o w s t h e s p e r m t o s u r v i v e l o n g e r i n t h a t e n v i r o n m e n t . T h e p r o s t a t i c c o m p o n e n t m a k e s u p 1 8 - 2 0 % o f t h e t o t a l e j a c u l a t e v o l u m e ( D i x o n , 1 9 9 9 ) . I t s m a j o r s e c r e t o r y p r o d u c t s s u c h a s a c i d p h o s p h a t a s e , c i t r a t e , a n d z i n c i d e n t i f y t h e p r o s t a t i c c o m p o n e n t i n s e m e n . T h e s e c r e t i o n i s i n t h e f o r m o f s o l u b l e a n d p a r t i c u l a t e m a t t e r . T h e s o l u b l e f r a c t i o n o f t h e s e m e n i n c l u d e s p r o t e i n s , c a r b o h y d r a t e s , e l e c t r o l y t e s , h o r m o n e s , l i p i d s , a n d g r o w t h f a c t o r s . M o l e c u l e s s u c h a s I g A , t r a n s f e r r i n , a n d a l b u m i n a r e t a k e n u p f r o m t h e b l o o d . P r o s t a t i c a c i d p h o s p h a t a s e ( P A P ) , p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) , a n d p r o s t a t e b i n d i n g p r o t e i n , a l l m a j o r p r o t e i n s s p e c i fi c t o t h e p r o s t a t e , a r e e x p r e s s e d i n b o t h p u b e r t a l a n d a d u l t m a n . I n t h e s e m i n a l p l a s m a , p a r t i c u l a t e m a t t e r a p p e a r s a s p r o s t a s o m e s , w h i c h a r e m e m b r a n e - b o u n d o r g a n e l l e s r i c h i n C a 2 + , G D P , A D P , A T P , c h o l e s t e r o l , a n d m e m b r a n e - b o u n d e n z y m e s a n d p r o t e i n s . I n h u m a n s , d i f f e r e n t c o m p o n e n t s o f t h e p r o s t a t i c s e c r e t i o n s m a y i n t e r a c t a s w e l l a s a c t u p o n e j a c u l a t e d s p e r m a n d o t h e r s e m i n a l e l e m e n t s . 1 3 I t i s b c l r e x c t ‘ . r a b r l r t } . f r - 3 . 3 3 2 ; “ ) , " t a m \ p r l r i h u ‘ r r r t z e r m e p e a r . n t s a k e o e h n r . . 1 o u u p P r t - 9 ' 3 1 d e e r . i n c ' T \ 2 : : . s m \ a Z . s n e a fi s d s 5 r g e n s a i i o e p t e e a r c 9 m i n o s r r e } l p a z l s u c h L Z l i ‘ l C . s p e m ' n P r 0 5 2 3 5 ( q 1 1 3 \ 3 - P S A 1 3 m m 5 : 1 3 . , t O I [ r e - d i v z a p - : ‘ u I t i s b e l i e v e d t h a t s e m i n a l p l a s m a h a s a n e f f e c t o n s p e r m f u n c t i o n , s u c h a s , m o t i l i t y , v i a b i l i t y , f r u c t o s e a n d o x y g e n c o n s u m p t i o n , a l o n g w i t h i t s p r i m a r y p u r p o s e o f s p e r m t r a n s p o r t . P r o s t a t i c fl u i d c a n e n h a n c e t h e m o t i l i t y o f e p i d i d y m a l , e j a c u l a t e d s p e r m ( L i n d h o l m e r , 1 9 7 3 ) . I n c l i n i c a l s t u d i e s , i t w a s f o u n d t h a t m e n w i t h d i s t u r b e d p r o s t a t i c f u n c t i o n s h o w d e c r e a s e d m o t i l i t y a n d v i a b i l i t y ( E l i a s s o n , 1 9 7 0 ) . A t e j a c u l a t i o n , t h e s p e r m t a k e u p z i n c f r o m t h e p r o s t a t i c fl u i d , w h i c h t e m p o r a r i l y i n h i b i t s s p e r m c h r o m a t i n d e c o n d e n s a t i o n . T h i s i s i m p o r t a n t i n f e r t i l i t y s i n c e n u c l e a r z i n c c o n t e n t o f e j a c u l a t e d s p e r m c o r r e l a t e s w i t h f e r t i l i t y s t a t u s i n m e n ( D i x o n e t a l . , 1 9 9 9 ) . A n t i b a c t e r i a l a c t i v i t i e s o f s e m i n a l p l a s m a h a v e b e e n a t t r i b u t e d t o l o w m o l e c u l a r w e i g h t p r o d u c t s o f t h e p r o s t a t e s u c h a s z i n c , s p e r m i n e , a n d a h e a t - s t a b l e f r a c t i o n ( S t a m e y e t a l . , 1 9 6 8 ) . P r o s t a s o m e s , p a r t o f t h e p a r t i c u l a t e m a t t e r i n s e m i n a l p l a s m a , m a y p l a y a c o m p l e m e n t a r y r o l e i n p r o l o n g i n g t h e l i f e o f s p e r m b y p r e v e n t i n g h y p e r s e n s i t i z a t i o n o f t h e f e m a l e t o a n t i g e n i c p r o t e i n s p r e s e n t o n t h e s u r f a c e o f s p e r m . L i p i d s f r o m t h e p r o s t a t i c fl u i d i n t h e s e m i n a l p l a s m a p l a y a r o l e i n r e d u c i n g c e r t a i n m a c r o p h a g e a n d n e u t r o p h i l f u n c t i o n s t h a t a r e n o r m a l l y u n f a v o r a b l e t o s p e r m . A m a j o r a c t i v i t y o f p r o s t a t i c s e c r e t i o n i s p r o t e o l y s i s . T h e p r o s t a t e c o n t a i n s a v a s t a r r a y o f e n z y m e s t h a t a r e i n v o l v e d i n t i s s u e r e m o d e l i n g d u r i n g g r o w t h . T h e m o s t s t u d i e d o f t h e s e e n z y m e s i s p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) , a s e r i n e p r o t e a s e ( W e b b e r e t a l . , 1 9 9 5 ) . P S A i s u s e d a s a s e r u m m a r k e r f o r d i a g n o s i s o f p r o s t a t e c a n c e r a n d f o r m o n i t o r i n g e f fi c a c y o f t r e a t m e n t f o r p r o s t a t e c a n c e r . P S A h a s m a n y a c t i v i t i e s i n t h e p r o s t a t e i n c l u d i n g t h e b r e a k d o w n a n d m o d u l a t i o n o f i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r - b i n d i n g p r o t e i n ( I G F B P ) a n d d e g r a d a t i o n o f s e c r e t o r y l e u k o c y t e p r o t e a s e i n h i b i t o r ( S L P I ) , w h i c h p r o t e c t s t i s s u e s a g a i n s t d e g r a d a t i o n b y p r o t e a s e s r e l e a s e d d u r i n g i n fl a m m a t i o n ( D i x o n , 1 9 9 9 ) . r 4 a a r e . 3 0 2 5 $ 3 e ? ? ? E “ i w 3 8 . 3 , a : a n . : 3 5 5 3 3 . : . 5 a . 3 5 5 2 . 7 3 . . . . t ; E g g 5 a : “ H m 6 : 8 . 7 7 2 4 - ; o ; a b . a . “ 3 . 1 . 9 . 1 9 v . T o n g a n a , 0 . . c u e 1 . 9 V 4 . ( ( u f W r e p n m I ! w d B r a w n . ) w o w fl . . ' a fl V e r H n . M T t u t u ? . / . . . . I I r w r / t . n . 1 r / . J fl t l v 4 e ) r I . . . r n u . t 4 . w 1 P S A i s a l s o i n v o l v e d i n t h e d i s s o l u t i o n o f s e m e n c o a g u l u m . T h i s i n v o l v e s d e g r a d a t i o n o f fi b r o n e c t i n c o n t r i b u t e d t o t h e s e m i n a l p l a s m a b y t h e s e m i n a l v e s i c l e s ( W e b b e r e t a l . , 1 9 9 5 ) . P r o s t a s i n , a s e r i n e p r o t e a s e i s o l a t e d f r o m s e m i n a l p l a s m a , m a y h a v e a g e n e r a l p r o t e o l y t i c f u n c t i o n . P S P 9 4 , o n e o f t h e m o s t a b u n d a n t p r o t e i n s i n h u m a n p r o s t a t i c fl u i d , m a y f u n c t i o n i n m o d i f y i n g p r o p e r t i e s o f m u c u s i n t h e f e m a l e a n d m a l e r e p r o d u c t i v e t r a c t s ( D i x o n , 1 9 9 9 ) . K i n i n s , t i s s u e h o r m o n e s k n o w n t o p r o m o t e s p e r m m o t i l i t y , m a y a l s o b e r e g u l a t e d b y t h e e n z y m a t i c a c t i v i t i e s i n t h e p r o s t a t e . P r o s t a t i c a c i d p h o s p h a t a s e ( P A P ) , a g l y c o p r o t e i n , i s u s e d a s a s e r u m m a r k e r i n p r o s t a t e c a n c e r d i a g n o s i s a n d t h e r a p y . A l t h o u g h i t s e x a c t b i o l o g i c a l f u n c t i o n i s n o t k n o w n , P A P m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n p r o s t a t e f u n c t i o n . P A P m a y c o n t r i b u t e t o t h e f o r m a t i o n o f b o n e a r o u n d n e o p l a s t i c p r o s t a t i c m e t a s t a s i s s i t e s . P A P m a y a l s o c o n t r i b u t e t o c r e a t i n g a b a l a n c e b e t w e e n p h o s p h o r y l a t i o n a n d d e p h o s p h o r y l a t i o n o f p r o t e i n s n e c e s s a r y f o r p r o p e r g r t h o f c e l l s ( L e e e t a l . , 1 9 9 1 ) . O t h e r a c c e s s o r y s e x g l a n d p r o d u c t s a r e a f f e c t e d b y p r o s t a t i c p r o t e a s e s a n d m e t a l l o p r o t e i n a s e s , s u c h a s s e m i n a l p l a s m a m o t i l i t y i n h i b i t o r . O t h e r d e g r a d a t i o n p r o c e s s e s m a y p r o d u c e a m i n o a c i d s t h a t a i d i n e n e r g y m e t a b o l i s m o f s p e r m . P r o s t a t i c s e c r e t i o n m a y a s s i s t i n t h e c o n v e r s i o n o f f r u c t o s e t o g l u c o s e a s w e l l a s b e i n g a m a j o r c o n t r i b u t o r t o t h e i n o s i t o l c o n t e n t i n h u m a n s e m i n a l fl u i d . C a l c i u m i s r e q u i r e d f o r t h e m o t i l i t y a n d f e r t i l i z a t i o n o f s p e r m a n d t h e c i t r a t e f r o m t h e p r o s t a t i c fl u i d i s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t f a c t o r s i n r e g u l a t i n g t h e c a l c i u m l e v e l s i n t h e s e m e n . P r e s e n t l y , g r o w t h f a c t o r s a r e o n e o f t h e m o s t r e s e a r c h e d a r e a s i n t h e s t u d y o f t h e f u n c t i o n s o f t h e p r o s t a t e ( D i x o n , 1 9 9 9 ) . G r o w t h f a c t o r s a r e n e e d e d f o r n o r m a l c e l l u l a r g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t a n d t h e y w o r k b y b i n d i n g t o c e l l - s u r f a c e r e c e p t o r s i n o r d e r t o 1 5 r " ‘ 1 ' : a \ a n c l 3 ; 1 1 , 3 0 0 1 1 1 1 3 } P M “ . . . e ‘ t a m ‘ e r . 9 1 '- w 3 t h a n : “ ‘ 7 ‘ “ 1 1 1 * M U ' X J 1 5 5 ) u u l u l d t . , V ) ' I i n f l u fi m l h t [ l I l a , “ . i p r _ a r m m t ~ F . . . . \ I N N : T ( | . : 1 3 3 L 1 L n u . U 1 1 . 3 1 5 b u t n o t s t r o r ‘ . . . e x p r e s s M . 1 1 . 1 ' A r I . _ _ ‘ . t r B P p r o t e a s e : . 1 . " ' . " , f . 1 . 2 2 p m : 1 0 F 3 . , 3 7 1 7 1 3 6 o t h e r c o n : " “ ? “ " J ‘ ' h 1 ~ . . ’ ' I ‘ 3 5 4 ‘ 5 ‘ 3 ‘ H a d } . 1 1 : 5 : b u t t h e 1 m g P r o s t a t i c D i “ - h t h e a r t 1 . . t “ , , : ‘ ‘ 1 . y ‘ 3 ‘ 3 7 B t l l l g n P r u l s m T h i ‘ t ( 2 . 7 “ I x 9 9 2 ) . s t i m u l a t e a v a r i e t y o f c e l l u l a r r e s p o n s e s i n c l u d i n g p r o l i f e r a t i o n , s e c r e t i o n , a n d c o m m u n i c a t i o n . T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r ( T G F ) 4 3 1 a n d - B 2 a r e s e c r e t e d b y t h e s t r o m a a n d e p i t h e l i u m , r e s p e c t i v e l y . T G F - B i s k n o w n a s a s u p p r e s s o r o f e p i t h e l i a l c e l l p r o l i f e r a t i o n . I n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r s ( I G F ) a r e p o t e n t m i t o g e n s o f p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s b u t n o t s t r o m a l c e l l s . S t r o m a l c e l l s e x p r e s s t y p e I I G F r e c e p t o r s a n d e p i t h e l i a l c e l l s e x p r e s s I G F , I G F r e c e p t o r s a n d t h e i r b i n d i n g p r o t e i n s ( I G F B P ) . I G F s , I G F B P , a n d I G F B P p r o t e a s e s a r e i m p l i c a t e d i n t h e r e g u l a t i o n o f p r o s t a t i c g r o w t h , w i t h a n e m p h a s i s o n k e e p i n g I G F e f f e c t s t o a m i n i m u m i n t h e n o r m a l g l a n d . T h e s e g r o w t h f a c t o r s , a l o n g w i t h t h e o t h e r c o m p o n e n t s o f t h e p r o s t a t i c s e c r e t i o n s , a r e i m p o r t a n t f o r t h e m a i n t e n a n c e o f t i s s u e s t h a t m a k e u p t h e p r o s t a t e . T h e r e r e m a i n s a l o t t o b e l e a r n e d a b o u t p r o s t a t e c a n c e r b u t t h e b e t t e r o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e a n a t o m y , s t r u c t u r e , f u n c t i o n , a n d h i s t o l o g y o f t h e n o r m a l p r o s t a t e t h e m o r e w e w i l l b e p r e p a r e d t o d i a g n o s e , t r e a t , a n d p r e v e n t p r o s t a t e c a n c e r . P r o s t a t i c D i s e a s e s T h e h u m a n p r o s t a t e i s c o m p o s e d o f s e v e r a l g l a n d u l a r a n d n o n g l a n d u l a r e l e m e n t s e a c h w i t h a c h a r a c t e r i s t i c a n d u n i q u e p r e d i s p o s i t i o n t o d i s e a s e . T h e f o l l o w i n g s e c t i o n w i l l d i s c u s s t h e a n a t o m i c a l c o n s i d e r a t i o n s t h a t a r e i m p l i c a t e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h e s e d i s e a s e s . B e n i g n P r o t s t a t i c H y p e r p l a s i a T h e t r a n s i t i o n z o n e i s t h e e x c l u s i v e s i t e o f b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a ( B P H ) ( C o f f e y , 1 9 9 2 ) . T h i s e x c l u s i v i t y o f B P H o r i g i n m a y b e d u e t o d e l a y e d p r e p u b e r t a l l 6 n a l o p m e n o n t r r . t h a s c u h i p £ a s M 5 3 . c 7 b e b e i C r s a a ) e 0 r 5 c a n a ‘ l g r “ o l l : r. s : « J . e s e e n p n r x i r « . 1 9 9 " J . t c l n » a . M a n a p e - s a d - T h e fi r s : 1 : 3 E n l t ‘ o t ‘ t h t ‘ s c n : 1 1 i s n o t k r T h u — n o . . - . . a g o r ‘ s m ‘ . . . c p ‘ . K T T X ‘ L i ~ . 6 1 . ; m d u a u s " ‘ “ 0 4 ‘ . . . . . n l i m o . { A 6 5 . 1 5 1 1 : 5 4 : { \ ‘ fi h g \ r \ | n e r a x . fi t . " . K 1 2 2 1 ; : t : _ - T 1 . 5 % ‘ Q , \ d e v e l o p m e n t , c o n t i n u e d g r o w t h i n t o a d u l t l i f e , a n d i n t e r m i n g l i n g o f d i f f e r e n t s t r o m a t y p e s , w h i c h a r e a l l f e a t u r e s u n i q u e t o t h e t r a n s i t i o n z o n e ( M c N e a l , 1 9 9 0 ) . B P H c a n b e d e s c r i b e d a s b e i n g m i c r o s c o p i c , m a c r o s c o p i c , o r s y m p t o m a t i c . M i c r o s c o p i c e v i d e n c e c a n b e s e e n a s e a r l y a s t h e f o u r t h d e c a d e o f l i f e ( M c N e a l , 1 9 9 0 ) a n d c a n b e f o u n d i n a p p r o x i m a t e l y 5 0 % o f m e n b y t h e a g e o f 6 0 , a n d o v e r 9 0 % b y t h e a g e o f 8 0 ( A h m e d e t a l . , 1 9 9 7 ) . M a c r o s c o p i c d i s e a s e , w h i c h i s e v i d e n t o n p h y s i c a l e x a m i n a t i o n , i s s e e n i n o n l y h a l f o f t h e s e m e n a n d i s n o t n e c e s s a r i l y s y m p t o m a t i c . I t i s n o t k n o w n w h a t c a u s e s B P H t o d e v e l o p b u t t h r e e t h e o r i e s h a v e b e e n p r o p o s e d . T h e fi r s t h y p o t h e s i s i s t h a t t h e c h a n g e s i n t h e l e v e l s o r r a t i o s o f a n d r o g e n s a n d / o r e s t r o g e n s w i t h a g e s t i m u l a t e p r o s t a t e c e l l g r o w t h . T h e s e c o n d h y p o t h e s i s i s t h a t a l t e r a t i o n s i n e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l i n t e r a c t i o n s , t h r o u g h r e - a w a k e n i n g o f t h e e m b r y o n i c i n d u c t i v e p o t e n t i a l o f t h e s t r o m a , l e a d t o i n c r e a s e d p r o l i f e r a t i o n . A n d t h e t h i r d h y p o t h e s i s i s t h a t t h e r e i s a n e x p a n s i o n o f a n e p i t h e l i a l s t e m c e l l p o p u l a t i o n ( H u d s o n e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e t i s s u e s ( m u s c l e , g l a n d s , a n d fi b r o u s t i s s u e ) t h a t c o m p r i s e B P H w h e n i t a r i s e s a r e t h e s a m e t h a t c o m p o s e t h e n o r m a l p r o s t a t e . T h e o n l y d i f f e r e n c e i s t h a t B P H t i s s u e g e n e r a l l y h a s m o r e g l a n d s a n d l e s s m u s c l e a n d f i b r o u s t i s s u e t h a n t h e n o r m a l p r o s t a t e . H i s t o l o g i c a l l y , B P H i s e x t r e m e l y v a r i a b l e , r a n g i n g f r o m a h i g h l y e p i t h e l i a l t y p e t o a fi b r o m u s c u l a r t y p e t h a t i s l a r g e l y d e v o i d o f e p i t h e l i a l c o m p o n e n t s ( F i g u r e [ - 6 ) ( K i r b y e t a L , 2 0 0 1 ) T h e e a r l y s t a g e s o f B P H i n t h e t r a n s i t i o n z o n e p r o d u c e m i c r o s c o p i c n o d u l e s , b u t d o n o t l e a d t o c l i n i c a l s y m p t o m s . A s B P H c o n t i n u e s t o p r o g r e s s , t h e m i c r o s c o p i c n o d u l e s u n d e r g o f u r t h e r h y p e r p l a s t i c c h a n g e s w i t h a s u b s t a n t i a l i n c r e a s e i n s i z e . T h e 1 7 I ' f r , z . 1 . x i . 1 ; ’ I L 1 3 " J r ‘ « fi l a w " " l ” ’ 9 , u 1 F i g u r e 1 - 6 : ( A ) B P H h y p e r p l a s t i c n o d u l e o f t h e h i g h l y e p i t h e l i a l t y p e . ( B ) B P H s t r o m a l n o d u l e o f t h e fi b r o m u s c u l a r t y p e ( K i r b y e t a l , 2 0 0 1 ) . a m e n 0 f t h e : z r e r s c o u l d p o s s i ‘ R e v a ? t . - . m o a . B P H l p e a c t u h l o a z r e i 5 3 7 2 1 1 1 m l C T O $ C 0 P I C “ a i m s a n d « ) s z e n o m l ‘ i N 1 " ] p a t h O l - B P H 1 1 5 - “ B P H 1 5 h e d m ' c l t ‘ P T h e p r e c i s e : r , : = ; \ « ‘ « s e d . a n d t h e y s c i e n c e o f m i c r t v : r p r m n t r i s k { a n L ' T ‘ Q f ‘ fi i f l l p r e r e t h a n i m a t i n g ) a c t r x ‘ r ' a x e b e e n d e f r m t : C I “ . { f i s h ' 1 . . . « u fi d t t L A l e ( ’ \ L ; : \ \ . ‘ - . ~ - “ $ 5 1 0 “ ‘ . f — d S i t s , s t i m u l a t i o n o f t h e p r o s t a t i c d u c t s n e x t t o t h e s e n o d u l e s l e a d s t o t h e f o r m a t i o n o f m a c r o s c o p i c n o d u l e s . T h e m a c r o s c o p i c n o d u l e s d i s p l a c e p r o s t a t i c t i s s u e b o t h c a u d a l l y a n d p o s t e r i o r a l l y , l e a d i n g t o t h e f o r m a t i o n o f t h e s u r g i c a l c a p s u l e . T h e r e i s c o n s i d e r a b l e g r o w t h o f B P H t i s s u e d u r i n g t h i s s t a g e o f d e v e l o p m e n t . T h e fi n a l s t a g e o f h i s t o g e n e s i s o f B P H i s t h e d e v e l o p m e n t o f c l i n i c a l s y m p t o m s . T h e p r e c i s e c a u s e s o f B P H r e m a i n e n i g m a t i c b u t n u m e r o u s r i s k f a c t o r s h a v e b e e n p r o p o s e d , a n d t h e r e i s u n d o u b t e d l y i n t e r p l a y o f a n u m b e r o f f a c t o r s . T h e i n c r e a s i n g i n c i d e n c e o f m i c r o s c o p i c B P H w i t h a g e i s c l e a r e v i d e n c e t h a t a g e i s p o s s i b l y t h e m o s t i m p o r t a n t r i s k f a c t o r o f t h i s d i s e a s e . N o r m a l l y f u n c t i o n i n g t e s t e s a r e a l s o a n e x t r e m e l y i m p o r t a n t p r e r e q u i s i t e f o r d i s e a s e d e v e l o p m e n t a s t h i s p l a y s a r o l e i n t h e h o r m o n a l ( a n d r o g e n s ) a c t i v i t y l e v e l s i n t h e b o d y . W h i l e t h e s e a r e t h e o n l y t w o r i s k f a c t o r s t h a t h a v e b e e n d e fi n i t i v e l y l i n k e d t o B P H , t h e r e i s i n c r e a s i n g e v i d e n c e t o s u g g e s t s e v e r a l o t h e r s c o u l d p o s s i b l y p l a y a r o l e i n i t s d e v e l o p m e n t . T h e r e i s e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t h e r e d i t a r y p r e d i s p o s i t i o n o f B P H i s a r i s k f a c t o r . R e c e n t m o l e c u l a r o b s e r v a t i o n s h a v e s u g g e s t e d t h a t D N A a b n o r m a l i t i e s m a y c o n t r i b u t e t h e B P H p a t h o g e n e s i s . T h e s e s t u d i e s d e m o n s t r a t e d a b n o r m a l i t i e s s u c h a s : 1 ) a h i g h f r e q u e n c y o f g e n o m i c a l t e r a t i o n s i n B P H c o m p a r e d w i t h n o r m a l t i s s u e , 2 ) m o l e c u l a r a b n o r m a l i t i e s i n t h e D N A s e q u e n c e o f p 5 3 , a t u m o r s u p p r e s s o r g e n e , i n u p t o 4 0 % o f B P H t i s s u e s , a n d 3 ) i n c r e a s e s o r d e c r e a s e s i n t h e m e t h y l a t i o n p a t t e r n s o f n u c l e o t i d e s i n B P H t i s s u e w h e n c o m p a r e d t o n o r m a l t i s s u e ( P a r t i n , 2 0 0 0 ) . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s h a v e s h o w n t h a t t h e o b s e r v e d f a m i l i a l a g g r e g a t i o n o f B P H f o l l o w s a M e n d e l i a n p a t t e r n o f t r a n s m i s s i o n . F a c t o r s c o n t r o l l i n g p r o s t a t i c g r o w t h i n h e r e d i t a r y B P H m a y b e a n d r o g e n - i n d e p e n d e n t , a n d l a r g e r p r o s t a t e s i n y o u n g m e n w i t h h e r e d i t a r y B P H a r e c h a r a c t e r i z e d b y 1 9 i h z a h e r s t r o m a l - a p t e . : i ‘ - " J ‘ e 4 a c . e 1 o f B P H T h L . “ s a t h -' n a v ~ - — . y ) 3 . c ‘ A - U K V \ C Q C K F & « M - t n 1 ' 3 “ f ' 1 5 6 b , ' 3 1 C ; J 2 1 ( 4 ) , . R a c e a n d c : a g e s ! t h a t t h e r e t ~ a g e - m a t c h e d u h r t c E a t e r m a d a m ’ r a t ‘ . 1 ‘ \ ~ . b ~ Z . I . € T € fl e € . \ 1 T 1 . “ \ t a 1 0 ‘ s e s t i n c i d e n [ 5 : 2 3 a n d J a p a n \ \ ” ' 1 ‘ ? § . - I ‘ \ m i ‘ I L e [ ‘ k ‘ c Q . ' \ x ‘ \ ~ a " \ T ‘ _ ‘ 1 } . x i — \ ‘ “ a . “ \ ‘ k — ‘ t ‘ c T - - ~ ’ d D Q 2 % . “ ‘ 5 ‘ Q , “ ‘ 2 “ 1 1 * “ : , « I . \ t z ‘ : : — ‘ t x \ \ - 1 - y . . ‘ . a h i g h e r s t r o m a l - e p i t h e l i a l r a t i o t h a n s i m i l a r l y s i z e d p r o s t a t e s f o u n d i n o l d e r m e n ( P a r t i n , 2 0 0 0 ) R a c e a n d e t h n i c i t y h a v e a l s o b e e n s u g g e s t e d a s r i s k f a c t o r s f o r B P H . S t u d i e s s u g g e s t t h a t t h e r e i s a h i g h e r i n c i d e n c e r a t e i n A f r i c a n - A m e r i c a n m e n w h e n c o m p a r e d t o a g e - m a t c h e d w h i t e A m e r i c a n m e n . M e n o f O r i e n t a l r a c e s h a v e b e e n s h o w n t o h a v e l o w e r i n c i d e n c e r a t e s f o r B P H t h a n a n y o t h e r r a c e . I t i s a l s o s u g g e s t e d t h a t t h e s e r a c i a l d i f f e r e n c e s m a y b e a t t r i b u t e d t o d i e t a r y d i f f e r e n c e s . W h i l e m e n o f A s i a n d e s c e n t h a v e t h e l o w e s t i n c i d e n c e o f B P H , s t u d i e s s h o w t h a t d e s c e n d e n t s o f m e n b o r n a n d r a i s e d i n C h i n a a n d J a p a n w h o m i g r a t e d t o t h e U n i t e d S t a t e s d e m o n s t r a t e m i c r o s c o p i c a n d c l i n i c a l e v i d e n c e o f B P H s i m i l a r t o t h a t s e e n i n t h e i n d i g e n o u s A m e r i c a n p o p u l a t i o n ( P a r t i n , 2 0 0 0 ) . T h i s c h a n g e i n i n c i d e n c e m a y b e d u e t o t h e c h a n g e i n d i e t . T h e A s i a n d i e t i s r i c h i n y e l l o w v e g e t a b l e s a n d s o y p r o d u c t s , a l l o f w h i c h m a y i n h i b i t B P H d e v e l o p m e n t . C o n v e r s e l y , t h e W e s t e r n d i e t o f t h e U n i t e d S t a t e s i s h i g h i n f a t s , w h i c h c o u l d p o s s i b l y p r o m o t e t h e d e v e l o p m e n t o f B P H . T h e r e a r e o t h e r m i s c e l l a n e o u s r i s k f a c t o r s t h a t h a v e b e e n i m p l i c a t e d w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f B P H . T h e s e i n c l u d e s m o k i n g , a l c o h o l i n t a k e , o b e s i t y , c e r t a i n m e d i c a t i o n s , d i a b e t e s m e l l i t u s , c i r r h o s i s o f t h e l i v e r , a n d h y p e r t e n s i o n ( K i r b y a n d C h r i s t m a s , 1 9 9 3 ; ( P a r t i n , 2 0 0 0 ) . P r o s t a t i c I n t r a e p i t h e l i a l N e o p l a s i a ( P I N ) P r e c a n c e r o r i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a ( I E N ) i s a n o n i n v a s i v e l e s i o n t h a t h a s g e n e t i c a b n o r m a l i t i e s , l o s s o f c e l l u l a r g r o w t h c o n t r o l f u n c t i o n s , c e l l u l a r h e t e r o g e n e i t y , a n d s o m e p h e n o t y p i c c h a r a c t e r i s t i c s o f i n v a s i v e c a n c e r a n d t h a t p r e d i c t s a s u b s t a n t i a l l i k e l i h o o d o f d e v e l o p i n g i n v a s i v e c a n c e r ( O ’ S h a u g h n e s s y e t a l . , 2 0 0 2 ) . I E N o c c u r s i n m o s t e p i t h e l i a l t i s s u e a s a m o d e r a t e t o s e v e r e d y s p l a s i a , i s o n t h e c a u s a l p a t h w a y l e a d i n g 2 0 e m n o a u p i a s r r a a p p e n w f r h 1 l i t ( h 0 i 3 n 3 2 : ; e r i p o d o f m a l t i s s u e . 1 1 . m : i m e 3 m t e t a . : e t o i l l u s t r p g A i u n c a r c t h a r n - a s e d p r t r ‘ r u t l m c - n t a i r e : i a d g f ‘ m u n e d c m e r m s l e c t l a r a n d g e t : S ‘ J i ‘ j C C I S \ k ' i n ' 3 ‘ ‘ 4 ‘ “ . ‘ u g ‘ s l - » . ‘ ; L 1 . 4 g I n \ 3 5 1 - 5 t i t — s « - a t a : a t u f r o m n o r m a l t i s s u e t o c a n c e r , a n d i s c l o s e i n s t a g e o f p r o g r e s s i o n t o c a n c e r ( i n v a s i v e n e o p l a s i a ) ( O ’ S h a u g h n e s s y e t a l . , 2 0 0 2 ) . I n a g g r e s s i v e c a n c e r s t h i s p r o g r e s s i o n m a y h a p p e n w i t h i n m o n t h s t o a f e w y e a r s , b u t g e n e r a l l y t h e s e c h a n g e s a p p e a r t o o c c u r o v e r a l o n g p e r i o d o f t i m e . P r o g r e s s i o n i s m a p p e d i n t a r g e t t i s s u e s b y t h e a p p e a r a n c e o f s p e c i fi c m o l e c u l a r a n d g e n o t y p i c d a m a g e a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s i n g l y s e v e r e d y s p l a s i a a n d i s i n fl u e n c e d b y f a c t o r s s p e c i fi c t o t h e e n v i r o n m e n t o f t h e h o s t t i s s u e . S u b j e c t s w i t h I E N a r e a t s i g n i fi c a n t l y h i g h e r r i s k t h a n u n a f f e c t e d p o p u l a t i o n s f o r d e v e l o p i n g i n v a s i v e c a n c e r i n t h e s a m e t i s s u e ( O ’ S h a u g h n e s s y e t a l . , 2 0 0 2 ) . A n o t a b l e e x a m p l e t o i l l u s t r a t e t h e i n v a s i v e c a n c e r r i s k a s s o c i a t e d w i t h I E N i s t h e p r o s t a t e . P r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a ( P I N ) i s a r i s k m a r k e r f o r p r o s t a t e c a n c e r a n d s h a r e s m a n y c h a r a c t e r i s t i c s w i t h p r o s t a t e a d e n o c a r c i n o m a ( T a b l e 1 - 1 ) . A p a r t f r o m t h e c h a r a c t e r i s t i c s m e n t i o n e d i n T a b l e 1 , P I N l e s i o n s a l s o s h a r e t h e f o l l o w i n g c h a r a c t e r i s t i c s w i t h m a l i g n a n c y : l o s s o f b a s a l l a y e r c o n t i n u i t y , p r o d u c t i o n o f a c i d m u c i n , a l t e r e d l e c t i n b i n d i n g , e v i d e n c e o f l o s s o f d i f f e r e n t i a t i o n a s e v i d e n c e d b y d e c r e a s e d p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) i m m u n o s t a i n i n g , a n d a b n o r m a l i t i e s o f p l o i d y ( K i r b y e t a l , 2 0 0 1 ) . 2 1 / T a b l 0 0 0 e 1 - 1 l ‘ n r \ \ i F d \ ‘ a : t [ W I i r n u t i i c t g i i d h i h o n l U h - - 2 p e O r n c g n m ‘ i . ; ; r T - 3 . x g 9 a c ) Q ( L W I I n c i d e n c e r ' p r o s t a t i c e r T a b l e 1 - 1 : E v i d e n c e t h a t P I N i s p r e m a l i g n a n t ( m o d i fi e d f r o m K i r b y e t a l . , 2 0 0 1 ) 0 M o r p h o l o g i c a l s i m i l a r i t y t o i n v a s i v e c a n c e r — c e l l u l a r a t y p i a i n h i g h - g r a d e P I N i s v i r t u a l l y i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m i n v a s i v e c a n c e r , e x c e p t n o i n v a s i o n h a s o c c u r r e d i n h i g h - g r a d e P I N o P h e n o t y p i c s i m i l a r i t y t o c a n c e r — c y t o s k e l e t a l p r o t e i n s , s e c r e t e d p r o t e i n s , a n d d e g r e e o f g l y c o s y l a t i o n a r e s h a r e d b y P I N a n d c a n c e r b u t n o t B P H o r n o r m a l p r o s t a t i c e p i t h e l i u m 0 I n c i d e n c e i s g r e a t e r i n o r g a n s h a r b o r i n g i n v a s i v e c a n c e r 0 S e v e r i t y i s i n c r e a s e d w i t h c a n c e r 0 E x t e n t i s g r e a t e r w i t h c o n c o m i t a n t c a n c e r 0 S p a t i a l r e l a t i o n s h i p t o i n v a s i v e c a n c e r — b o t h b e i n g f o u n d p r i m a r i l y i n t h e p e r i p h e r i a l z o n e , f o u n d l e s s f r e q u e n t l y i n t h e t r a n s i t i o n z o n e 0 M i c r o i n v a s i o n p r e s e n t f r o m t h e p r e m a l i g n a n t c h a n g e P I N i s d i v i d e d i n t o t w o g r a d e s , l o w - g r a d e P I N a n d h i g h - g r a d e P I N . L o w - g r a d e P I N ( F i g u r e l - 7 A ) a r c h i t e c t u r e s h o w s t h e e p i t h e l i a l c r o w d i n g a n d s t r a t i fi c a t i o n , w i t h i r r e g u l a r s p a c i n g . T h e n u c l e i a r e e n l a r g e d w i t h a m a r k e d s i z e i n c r e a s e , t h e c h r o m a t i n a p p e a r s n o r m a l , a n d n u c l e o l i a r e r a r e l y p r o m i n e n t . I n l o w - g r a d e P I N t h e b a s a l c e l l l a y e r a n d t h e b a s e m e n t m e m b r a n e b o t h r e m a i n i n t a c t . S o m e p a t h o l o g i s t s p r e f e r n o t t o r e p o r t l o w - g r a d e P I N d u e t o t h e d i f fi c u l t y i n s e p a r a t i n g t h i s l e s i o n f r o m b e n i g n e p i t h e l i u m a n d r e a c t i v e a t y p i a ( B o s t w i c k a n d S a k r , 1 9 9 8 ) . T h e a r c h i t e c t u r e o f h i g h - g r a d e P I N ( F i g u r e l - 7 B ) i s s i m i l a r t o l o w - g r a d e P I N b u t w i t h m o r e e p i t h e l i a l c r o w d i n g a n d s t r a t i fi c a t i o n . H i g h - g r a d e P I N c a n b e d i v i d e d i n t o f o u r a r c h i t e c t u r a l p a t t e r n s : t u f t i n g , m i c r o c a p i l l a r y , c r i b i f o r m , a n d fl a t ( B o s t w i c k , 1 9 9 4 ) . A l t h o u g h m o s t c a s e s o f P I N h a v e m u l t i p l e p a t t e r n s , t u f t i n g i s t h e m o s t c o m m o n a n d i s 2 2 « 1 ‘ “ t 1 ; . r I ‘ . O u t ‘ A . ‘ - 0 . a v . \ i s x “ “ ~ ' \ ‘ ‘ I ‘ ' ‘ " \ a r ‘ b ‘ ‘1. - , I I § “ x . i F i g u r e 1 - 7 ; ( A : l 5 - 3 1 i n a t l C L ’ h ' . 3 : 2 0 6 P i . \ 3 : 5 0 a m t m i s o f l ‘ " h - r ' u " F - J i W l ] l 6 7 L \ \ h ‘ . \ 4 Q ; . . A a l i ‘ ‘ I ‘ M “ . " - 1 I i i . “ ' 1 s F i g u r e 1 - 7 : ( A ) L o w - g r a d e p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a . ( B ) H i g h - g r a d e p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a . B o t h p a n e l s s h o w H a n d E s t a i n i n g ( K i r b y e t a l . , 2 0 0 1 ) . f o u n d i n a t l e a s t 9 7 % o f r a d i c a l p r o s t a t e c t o m y s p e c i m e n s w i t h P I N a n d c a n c e r . H i g h - g r a d e P I N a l s o s h o w s e n l a r g e d n u c l e i w i t h s o m e s i z e a n d s h a p e d i f f e r e n t i a t i o n . T h e c h r o m a t i n i s o f i n c r e a s e d d e n s i t y w i t h c l u m p i n g a n d t h e n u c l e o l i a r e f r e q u e n t l y l a r g e a n d p r o m i n e n t , w h i c h i s s i m i l a r t o i n v a s i v e c a r c i n o m a . H i g h - g r a d e P I N i s a s s o c i a t e d w i t h d i s r u p t i o n o f t h e b a s a l c e l l l a y e r a n d b a s e m e n t m e m b r a n e , a s i d e n t i fi e d b y h i g h - m o l e c u l a r - w e i g h t c y t o k e r a t i n i m m u n o s t a i n i n g ( K i r b y e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h i s h a s l e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f a n i n c r e a s i n g l y a c c e p t e d m o d e l f o r p r o s t a t e c a r c i n o g e n e s i s ( F i g u r e 1 - 8 ) . T h e s i g n i fi c a n c e i n r e c o g n i z i n g P I N i s b a s e d o n i t s s t r o n g a s s o c i a t i o n w i t h p r o s t a t i c c a r c i n o m a . P I N h a s a h i g h p r e d i c t i v e r a t e o f p r o s t a t e a d e n o c a r c i n o m a , w h i c h m a k e s i t a n o v e l i n t e r m e d i a t e m a r k e r t o i n d i c a t e l i k e l i h o o d o f c a n c e r . 2 3 3 3 3 : . I I I - ‘ 0 1 o w . a n . . . H . m . . . . . . 3 : 2 . _ . 1 fi n d . . L J T L ) J t . r . C r . . r w ' 1 ) a . 1 . I r v ” . # 4 1 4 ) . v . p n p w w r . , . 5 : 2 a m 1 9 . . . . . v . . . / . . b . . . 1 1 . . . . . é E . I I I { i f : . . I 1 . . . . . I . . f . . . 1 . ¢ ? ! . ; . , . 1 1 . . . . 3 3 . . . C . I . . . . n I ( 1 . g i v e r s v ‘ ) { ( C , n . \ . . I z . ” . . ' ~ V r . < . : : \ . J — u J . Y ‘ 1 ' . | . I < * ; ‘ » - * - . , ' v ’ i i f " . - . ' . . . , ~ . 1 1 A m o d e l f o r c a r c l n o g e n e s l s i n t h e p r o s t a t e l D y s p l a s i a C a r c i n o m a l 3 N o r m a l l r I O J 1 I l . ' | i ‘ v e r y m i l d m i l d m e r a t e s e v e r e i n s r t u m i c r o i n v a s w e ‘ L u m i n a l ( s e c r e t o r y l 1 ‘ c e l l l a y e r ) : 3 6 . I . 1 1 . ) , ‘ B a s a l c e l l l a y e r - ' ‘ q u i m m C 9 , : y ( j g , o a “ i @ 3 3 5 - v t a Q G Z ‘ ' B a s e m e n t m e m b r a n e r : D C L . _ — - : : : r 1 7 : : 1 7 " “ G R A D E 1 I G R A D E 2 G R A D E 3 1 ‘ 9 3 * l P r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o l p l a S I a F i g u r e 1 - 8 : M o d e l f o r P I N — c a r c i n o g e n e s i s i n t h e p r o s t a t e s h o w i n g c h a r a c t e r i s t i c s a s s o c i a t e d w i t h p r o g r e s s i o n f r o m n o r m a l p r o s t a t i c c e l l s t o t h e c a n c e r o u s p h e n o t y p e ( K i r b y e t a l . , 2 0 0 1 ) . P r o s t a t e C a n c e r P r o s t a t e c a n c e r i s t h e m o s t c o m m o n n o n - s k i n c a n c e r i n A m e r i c a n m e n . I t s i n c i d e n c e i n c r e a s e s s h a r p l y w i t h a g e f r o m a b o u t t h e a g e o f 6 0 o n w a r d s a n d a p p r o x i m a t e l y 1 o u t o f e v e r y 7 m e n o v e r t h e a g e o f 6 0 w i l l d e v e l o p t h i s d i s e a s e . M o r e t h a n 8 0 % o f p r o s t a t e c a n c e r i s f o u n d i n m e n o v e r t h e a g e o f 6 5 . I t i s e s t i m a t e d t h a t p r o s t a t e c a n c e r w i l l h a v e a c c o u n t e d f o r 3 3 % o f a l l n e w c a n c e r c a s e s i n m e n i n 2 0 0 3 , w i t h 2 2 0 , 9 0 0 n e w c a s e s e x p e c t e d t o b e d i a g n o s e d ( J e m a l e t a l . 2 0 0 3 ) . S e c o n d o n l y t o l u n g a n d b r o n c h u s c a n c e r , p r o s t a t e c a n c e r w i l l b e r e s p o n s i b l e f o r a p p r o x i m a t e l y 1 0 % o f a l l c a n c e r d e a t h s a m o n g m e n i n 2 0 0 3 , a c c o u n t i n g f o r a n e s t i m a t e d 2 8 , 9 0 0 d e a t h s ( J e m a l e t a l . , 2 0 0 3 ) . W h i l e t h e e x a c t c a u s e o f p r o s t a t e c a n c e r r e m a i n s o b s c u r e , s e v e r a l f a c t o r s h a v e 2 4 . . . . T F m . E r . . . 4 . . . , 3 , . ” M i h r f r t s . . 5 : — n . T N : 7 : Z “ . . _ . . 1 3 . . D . 7 1 . 1 o ( r u . . . . ) . . I ‘ . U 4 4 . I ' m . ( t I I I f . W E - d . v J v d . v . 1 ! . - . E l ; 1 ( . . ” 4 : 1 “ 1 . I ’ . v r D . l - ' ( W I L ! z . . . r _ < i . . . ; . u . r . “ . . 1 P L ! . . r t . . . . ) . . r n u / . . l ; : , . . J T H . . . . V a “ . _ ‘ 4 l . . . 1 ‘ 4 . : A H H J J C a p . . . . 7 0 r : b e e n i m p l i c a t e d i n g i v i n g r i s e t o t h i s d i s e a s e . O l d a g e , r a c e , e n v i r o n m e n t , h o r m o n e s , a n d d i e t a r e t h e m o s t n o t i c e a b l e o f t h e s e f a c t o r s b u t g e n e t i c p r e d i s p o s i t i o n , s e x u a l h i s t o r y , a n d i n f e c t i o n a r e o t h e r f a c t o r s t h a t m a y b e a s s o c i a t e d w i t h r i s k f o r p r o s t a t e c a n c e r ( T a b l e 1 - 2 ) . T a b l e 1 - 2 : F a c t o r s i m p l i c a t e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r ( m o d i fi e d f r o m K i r b y e t a l . , 2 0 0 1 ) . G e n e t i c — F a m i l i a l a u t o s o m a l d o m i n a n t i n s o m e R a c i a l — M o r e c o m m o n i n b l a c k s , S c a n d i n a v i a n s , U S w h i t e s , a n d W e s t e r n E u r o p e a n s A g e — M o r e c o m m o n w i t h i n c r e a s i n g a g e D i e t — A n i m a l f a t s a n d l o w i n t a k e s o f y e l l o w / g r e e n v e g e t a b l e s U V l i g h t — H i g h e r i n c i d e n c e i n a r e a s w i t h l o w e r e x p o s u r e P o l l u t i o n — U r b a n d w e l l i n g , c a d m i u m e x p o s u r e , e x p o s u r e t o r a d i o a c t i v e a g e n t s S e x u a l H i s t o r y — M o r e c o m m o n i n m e n w i t h e a r l y e x p e r i e n c e a n d m u l t i p l e p a r t n e r s I n f e c t i o n “ — G o n o c c o l i n f e c t i o n , H e r p e s s i m p l e x t y p e 2 , h u m a n p a p i l l o m a v i r u s e s 1 6 a n d 1 8 * = p o s s i b l e r i s k f a c t o r s M o s t c a r c i n o m a s o f t h e p r o s t a t e a r e c l a s s i c a l a d e n o c a r c i n o m a s , b e i n g m a d e u p o f e p i t h e l i a l c e l l s w i t h v a r y i n g d e g r e e s o f g l a n d u l a r a r c h i t e c t u r e . T h e b a s a l c e l l l a y e r i s a b s e n t c a u s i n g a d e p a r t u r e f r o m t h e n o r m a l t w o l a y e r s o f c e l l s . T h e d e fi n i t i v e s i t e o f o r i g i n i s d i f fi c u l t t o i d e n t i f y d u e t o i n fi l t r a t i v e g r o w t h p a t t e r n r e s u l t i n g i n d i f fi c u l t y i n d e fi n i n g t h e a c t u a l e d g e o f t h e t u m o r . A p p r o x i m a t e l y 7 0 % o f p r o s t a t e c a r c i n o m a s o r i g i n a t e i n t h e p e r i p h e r a l z o n e , 2 0 % o r i g i n a t e i n t h e t r a n s i t i o n z o n e , a n d a b o u t 5 - 1 0 % o r i g i n a t e i n t h e c e n t r a l z o n e . T h e f r e q u e n c y o f c a r c i n o m a s i n t h e t r a n s i t i o n z o n e i s 2 5 4 v . 1 ‘ . . 3 Q I . . . . . 4 . . » 4 ) _ _ J ‘ . 4 _ ' 4 . r . . . ’ . p / . I ; ‘ 0 . 1 . 1 . f - n o . . . . . ' U a s a j l ‘ 1 1 : . - . r c c y . . a . . . 4 . 1 1 . 1 o l F . r t ; . . C ' 0 ’ . I . . c d i s p r o p o r t i o n a t e l y h i g h g i v e n t h a t t h i s z o n e c o m p r i s e s o n l y 5 - 1 0 % o f t h e v o l u m e o f t h e n o r m a l p r o s t a t e b u t a c c o u n t s f o r 2 5 % o f t h e c a r c i n o m a s . C o n v e r s e l y , t h e c e n t r a l z o n e a c c o u n t s f o r a b o u t 5 % o f c a r c i n o m a s , a d i s p r o p o r t i o n a t e l y l o w f r e q u e n c y c o n s i d e r i n g i t s l a r g e v o l u m e . T h e p r o b l e m w i t h p r o s t a t e c a n c e r i s v e r y c o m p l i c a t e d b e c a u s e o f w h a t i s c a l l e d a u t o p s y c a n c e r . E v e n t h o u g h o n l y a b o u t 1 0 % o f m e n o v e r t h e a g e o f 5 0 w i l l h a v e c l i n i c a l l y d i a g n o s e d p r o s t a t e c a n c e r , a p p r o x i m a t e l y 3 0 % o f t h e m w i l l h a v e h i s t o l o g i c e v i d e n c e o f a d e n o c a r c i n o m a a t a u t o p s y ( L i n a n d L a n g e , 2 0 0 0 ) . S i n c e i t i s o f t e n d i a g n o s e d a t a n a d v a n c e d s t a g e , t h e m a j o r i t y o f m e n d i e w i t h t h e i r d i s e a s e . I n r e c e n t y e a r s t h e r e h a s b e e n a r e d u c t i o n i n t h e i n c i d e n c e a n d m o r t a l i t y r a t e s o f p r o s t a t e c a n c e r . T h e r e d u c t i o n i n m o r t a l i t y i s d u e t o e i t h e r 1 ) r e d u c t i o n o f i n c i d e n c e , 2 ) i m p r o v e m e n t s i n t h e r a p y , a n d / o r 3 ) e a r l y d e t e c t i o n . R e d u c t i o n o f i n c i d e n c e i s d u e i n p a r t t o t h e e d u c a t i o n o f t h e p u b l i c a b o u t p r o s t a t e c a n c e r a n d t h e m e t h o d s f o r p o s s i b l y p r e v e n t i n g t h e d e v e l o p m e n t o f t h i s d i s e a s e . I m p r o v e m e n t s i n t h e r a p y a r e a r e s u l t o f t h e m a n y i n v e s t i g a t i o n s c o n d u c t e d o n m e n a n d a n i m a l m o d e l s w i t h p r o s t a t e c a n c e r . E a r l y d e t e c t i o n , o r fi n d i n g m e n w i t h p r o s t a t e c a n c e r a t a t i m e w h e n i t i s c u r a b l e , i s d u e m a i n l y i n p a r t t o t h e y e a r l y s c r e e n i n g o f p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n l e v e l s . B u t m u c h w o r k s t i l l r e m a i n s t o b e d o n e . N o t u n t i l a l l o f t h e s e t h r e e o p p o r t u n i t i e s a r e p e r f e c t e d w i l l w e h a v e t h e p o t e n t i a l t o f u l l y p r e v e n t a n d t r e a t t h i s d r e a d e d d i s e a s e . 2 6 ) . 1 4 . I D 1 . l J t o r l v L . x 4 . 4 . Q I I L I l o w I t - L ) ’ 1 ! J . v ( \ I . ‘ A ‘ v _ | . ' ) x l l . ; 1 . . . ! V I v " ; E B C o n c l u s i o n T h e p r o s t a t e i s a s m a l l a c c e s s o r y s e x g l a n d t h a t i s c o m p o s e d o f t h r e e z o n e s , p e r i p h e r a l , t r a n s i t i o n a l , a n d c e n t r a l . E a c h o f t h e s e z o n e s c a n b e a s s o c i a t e d w i t h d i f f e r e n t d i s e a s e s o f t h e p r o s t a t e . W i t h i n c r e a s i n g a g e , t h e p r o s t a t e g l a n d h a s a n i n c r e a s i n g t e n d e n c y t o d e v e l o p p r o s t a t i c d i s e a s e s , i n c l u d i n g b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a , p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a , a n d p r o s t a t e c a n c e r . T h u s , w i t h t h e c o n t i n u a l l y i n c r e a s i n g l i f e s p a n i n s o c i e t y t o d a y , p r o s t a t i c d i s e a s e s h a v e b e c o m e o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t h e a l t h c o n c e r n s i n m e n . W h i l e t h e e x a c t c a u s e s o f t h e s e d i s e a s e s h a v e y e t t o b e e l u c i d a t e d , a v a r i e t y o f r i s k f a c t o r s h a v e b e e n i d e n t i fi e d a n d a s s o c i a t e d w i t h t h e m , m o s t i m p o r t a n t l y , a g e , h o r m o n a l a c t i v i t y , r a c e , a n d d i e t . T h e s e f a c t o r s , c o u p l e d w i t h a t h o r o u g h k n o w l e d g e o f t h e p r o s t a t e g l a n d , c a n l e a d t o a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e c a u s e s a n d n a t u r a l h i s t o r y o f t h e d i s e a s e p r o c e s s e s . T h i s , i n t u r n , c o u l d r e s u l t i n b e t t e r t r e a t m e n t a n d p r e v e n t i o n m e t h o d s f o r p r o s t a t i c d i s e a s e s a n d p o s s i b l y i m p r o v e t h e q u a l i t y o f l i f e a m o n g t h e a g i n g m a l e p o p u l a t i o n . 2 7 . C l . D s R a l D s . ” . . . E l . a ; A . « l . . i . l s . . - H F : b 1 . 1 I x . . H . . . . . ‘ . 3 . r ‘ \ l . . . . 4 I a . . 4 . I I I . . . ‘ l . 4 “ H . t . . n o I . . . u . r . . . . . 1 S . . . . . 1 . . t t J \ l W . . . x . . w . . . « \ w R e f e r e n c e s A h m e d , M . M . , L e e , C . T . , a n d O e s t e r l i n g , J . E . : C u r r e n t t r e n d s i n t h e e p i d e m i o l o g y o f p r o s t a t i c d i s e a s e s : b e n i g n h y p e r p l a s i a a n d a d e n o c a r c i n o m a . I n N a z , R . K . ( e d ) : P r o s t a t e : B a s i c a n d C l i n i c a l A s p e c t s , N e w Y o r k , C R C P r e s s , p p . 3 - 2 5 , 3 7 7 p p . , 1 9 9 7 . B e l l o , D . : A n a t o m y , h i s t o l o g y , a n d e m b r y o l o g y o f t h e h u m a n p r o s t a t e . I n : B e l l o , D . : C h a r a c t e r i z a t i o n o f i m m o r t a l i z e d a n d m a l i g n a n t a d u l t h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l l i n e s : P W R - l E , R W P E - l a n d R W P E - 2 . M a s t e r ’ s T h e s i s D e p a r t m e n t o f Z o o l o g y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , p p . 6 - 4 1 , 1 2 0 p p . , 1 9 9 6 . B o s t w i c k , D . G . : H i g h g r a d e p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a : T h e m o s t l i k e l y p r e c u r s o r o f p r o s t a t e c a n c e r . C a n c e r , 7 5 : 1 8 2 3 - 1 8 3 6 , 1 9 9 4 . B o s t w i c k , D . G . a n d S a k r , W . : P r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a . I n : F o s t e r , C S . a n d B o s t w i c k , D . G . ( e d s ) : P a t h o l o g y o f t h e P r o s t a t e , P h i l a d e l p h i a , W . B . S a u n d e r s , p p . 9 5 - 1 1 3 , 4 4 3 p p . , 1 9 9 8 . D i x o n , J . S . , C h o w , P H , a n d G o s l i n g , J . A . : A n a t o m y a n d f u n c t i o n o f t h e p r o s t a t e g l a n d . I n : N i c k e l , J . C . ( e d ) : T e x t b o o k o f P r o s t a t i t i s , O x f o r d , U K , I s i s M e d i c a l M e d i a , p p . 3 3 - 4 6 , 3 7 8 p p . , 1 9 9 9 . E l i a s s o n , R . : C o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e s p e r m d e n s i t y , m o r p h o l o g y a n d m o t i l i t y a n d t h e s e c r e t o r y f u n c t i o n o f t h e a c c e s s o r y g e n i t a l g l a n d s . A n d r o l o g i a , 2 : 1 6 5 - 1 6 9 , 1 9 7 0 . F o s t e r , C S , a n d K e , Y . : S t e m c e l l s i n p r o s t a t i c e p i t h e l i a . I n t . J . E x p . P a t h o l . , 7 8 : 3 1 1 - 3 2 9 , 1 9 9 7 . H u d s o n , D . L . , G u y , A . T . , F r y , P . , O ’ H a r e , M . J . , W a t t , F . M . , a n d M a s t e r s , J . R . W . : E p i t h e l i a l c e l l d i f f e r e n t i a t i o n p a t h w a y s i n t h e h u m a n p r o s t a t e : I d e n t i fi c a t i o n o f i n t e r m e d i a t e p h e n o t y p e s b y k e r a t i n e x p r e s s i o n . J . H i s t o c h e m . C y t o c h e m . , 4 9 : 2 7 1 - 2 7 8 , 2 0 0 1 . I s a a c s , J . T . : P r o s t a t i c s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n i n r e l a t i o n t o t h e e t i o l o g y o f p r o s t a t i c c a n c e r . T h e P r o s t a t e , 4 : 3 5 1 - 3 6 6 , 1 9 8 3 . J e m a l , A . , M u r r a y , T . , S a m u e l s , A . , G h a f o o r , A . , W a r d , E . , a n d T h u n , M . J . : C a n c e r S t a t i s t i c s , 2 0 0 3 . C A C a n c e r J . C l i n . 5 3 : 5 - 2 6 . K i r b y , R S . a n d C h r i s t m a s , T . J . : E p i d e m i o l o g y a n d n a t u r a l h i s t o r y . I n : B e n i g n P r o s t a t i c H y p e r p l a s i a , N e w Y o r k , G o w e r M e d i c a l , p p . 3 - 1 7 , 1 1 1 p p . , 1 9 9 3 . K i r b y , R . S . , C h r i s t m a s , T . J . , a n d B r a w e r , M . K . : P r o s t a t e C a n c e r . L o n d o n , M o s b y , 1 7 0 p p . , 1 9 9 6 . 2 8 . t . i a y \ \ — . i 1 . . I b I _ , f I ) ‘ r . 5 4 . ) L ; - . K i r b y , R . S . , C h r i s t m a s , T . J . , a n d B r a w e r , M . K . : A n a t o m i c a l a n d p a t h o l o g i c a l c o n s i d e r a t i o n s . I n : P r o s t a t e C a n c e r , L o n d o n . M o s b y , p p . 5 - 2 4 , 2 3 0 p p . , 2 0 0 1 . K r o n g r a d , A . : P r o s t a t e A n a t o m y . I n : L e p o r , H . ( e d ) : P r o s t a t i c D i s e a s e s , P h i l a d e l p h i a , W . B . S a u n d e r s C o . , p p . 1 7 - 2 7 , 5 8 6 p p . , 2 0 0 0 . L e e , H . , C h u , T . M . , L e e , C . L . : E n d o g e n o u s p r o t e i n s u b s t r a t e s f o r p r o s t a t i c a c i d p h o s p h a t a s e i n h u m a n p r o s t a t e . T h e P r o s t a t e , 1 9 : 2 5 1 - 2 6 3 , 1 9 9 1 . L i n , D . W . a n d L a n g e , P . H . : T h e e p i d e m i o l o g y a n d n a t u r a l h i s t o r y o f p r o s t a t e c a n c e r . I n : L e p o r , H . ( e d ) : P r o s t a t i c D i s e a s e s , P h i l a d e l p h i a , W . B . S a u n d e r s C o . , p p . 3 4 5 - 3 5 6 , 5 8 6 p p . , 2 0 0 0 . L i n d h o l m e r , C . S u r v i v a l o f h u m a n s p e r m a t o z o a i n d i f f e r e n t f r a c t i o n s o f s p l i t e j a c u l a t e s . F e r t i l . S t e r i l . , 2 4 : 5 2 1 - 5 2 6 , 1 9 7 3 . M c N e a l , J . E . : T h e p a t h o b i o l o g y o f n o d u l a r h y p e r p l a s i a . I n B o s t w i c k , D . G . ( e d ) : P a t h o l o g y o f t h e p r o s t a t e , E d i n b u r g h , C h u r c h i l l L i v i n g s t o n e , p p . 3 1 - 3 6 , 2 5 0 p p . , 1 9 9 0 . M c N e a l , J . E . : T h e z o n a l a n a t o m y o f t h e p r o s t a t e . T h e P r o s t a t e , 2 : 3 5 - 4 9 , 1 9 8 1 . M c N e a l , J . E . : A n a t o m y a n d e m b r y o l o g y . I n F i t z p a t r i c k , J . M . a n d K r a n e , R . J . ( e d s ) : T h e P r o s t a t e , E d i n b u r g h , C h u r c h i l l L i v i n g s t o n e , p p . 3 - 7 , 1 9 8 9 . O ’ S h a u g h n e s s y , J . A . , K e l l o f , G . J . , G o r d o n , G . B . , D a n n e n b e r g , A . J . , H o n g , W . K . , F a b i a n , C . J . , S i g m a n , C . C . , B e r t a g n o l l i , M . M . , S t r a t t o n , S . P . , L a m , 3 . , N e l s o n , W . G . , M e y s k e n s , F . L . , A l b e r t s , D . S . , F o l l e n , M . , R u s t g i , A . K . , P a p a d i m i t r a k o p o u l o u , V . , S c a r d i n o , P . T . , G a z d a r , A . F . , W a t t e n b e r g , L . W . , S p o r n , D . G . , S a k r , W . A . , L i p p m a n , S . M . , a n d V o n H o f f , D . D . : T r e a t m e n t a n d p r e v e n t i o n o f i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a : A n i m p o r t a n t t a r g e t f o r a c c e l e r a t e d n e w a g a i n d e v e l o p m e n t . C l i n . C a n c e r R e s . , 8 : 3 1 4 - 3 4 6 , 2 0 0 2 . P a r t i n , A . W . a n d C o f f e y , D . S . : T h e m o l e c u l a r b i o l o g y , e n d o c r i n o l o g y , a n d p h y s i o l o g y o f t h e p r o s t a t e a n d s e m i n a l v e s i c l e s . I n : W a l s h , P . C . , R e t i k , A . B . , V a u g h n , E . D . J r . , a n d W e i n , A . J . ( e d s ) : C a m p b e l l ’ s U r o l o g y . P h i l a d e l p h i a , W . B . S a u n d e r s , p p . 1 3 8 1 - 1 4 1 5 , p p . 3 4 3 2 , 1 9 9 8 . P a r t i n , A . W . : B e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a : E t i o l o g y o f b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a . I n : L e p o r , H . ( e d ) : P r o s t a t i c D i s e a s e s , P h i l a d e l p h i a , W . B . S a u n d e r s C o . , p p . 9 5 - 1 0 5 , 5 8 6 p p . , 2 0 0 0 . R o u s , S . N . : T h e P r o s t a t e B o o k . N e w Y o r k , W . W . N o r t o n , p p . 1 9 - 2 5 , 2 5 3 p p . , 1 9 8 8 . S t a m e y , T . A . , F a i r , W . R . , T i m o t h y , M . M . , a n d C h u n g , H . K . : A n t i b a c t e r i a l n a t u r e o f p r o s t a t i c fl u i d . N a t u r e , 2 1 8 : 4 4 4 - 4 4 7 , 1 9 6 8 . 2 9 H p ‘ ' r H \ x v h 5 ' . § S t a r r , C . a n d M c M i l l i a n , B . , ( e d s ) : H u m a n B i o l o g y , B e l m o n t , C A , W a d s w o r t h , p p . 1 - 5 3 1 , 1 9 9 7 . V e r h a g e n , A . P . M . , R a m a e k e r s , F . C . S . , A a l d e r s , T . W . , S c h a a f s m a , H . E . , D e b r u y n e , M . J . , a n d S c h l k e n , J . A . : C o - l o c a l i z a t i o n o f b a s a l a n d l u m i n a l c e l l - t y p e c y t o k e r a t i n s i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r . C a n c e r R e s , 5 2 : 6 1 8 2 - 6 1 8 7 , 1 9 9 2 . W e b b e r , M . M . , W a g h r a y , A . , a n d B e l l o , D . : P r o s t a t e - s p e c i fi c a n t i g e n , a s e r i n e p r o t e a s e , f a c i l i t a t e s c a n c e r c e l l i n v a s i o n . C l i n . C a n c e r R e s . , 1 : 1 0 8 9 - 1 0 9 4 , 1 9 9 5 . 3 0 E p i d c r . C h a p t e r 2 E p i d e m i o l o g y o f P r o s t a t e C a n c e r a n d P o s s i b l e R e l a t i o n s h i p s w i t h V i t a m i n D 3 1 . 3 5 . : . L ‘ . . ‘ . . . I : . . { a l , / m 1 . 1 4 . I . . . « ( C . V p u . . ‘ . . . - 1 . . . ” . t / . . . 1 . . 4 . . . l . l P t . I l I . . ( . . . . ) ! _ I l l u f ( [ L i l - l l l . . . ’ I ‘ I f \ l ’ l 3 , . I ‘ 1 . 4 . s r . A ) ! A b s t r a c t P r o s t a t e c a n c e r i s t h e m o s t c o m m o n n o n - s k i n c a n c e r i n A m e r i c a n m e n . I t s i n c i d e n c e i n c r e a s e s s h a r p l y w i t h a g e f r o m a b o u t t h e a g e o f 6 0 o n w a r d s a n d a p p r o x i m a t e l y 1 o u t o f e v e r y 7 m e n o v e r t h e a g e o f 6 0 w i l l d e v e l o p t h i s d i s e a s e . M o r e t h a n 8 0 % o f p r o s t a t e c a n c e r i s f o u n d i n m e n o v e r t h e a g e o f 6 5 . I t i s e s t i m a t e d t h a t p r o s t a t e c a n c e r w i l l h a v e a c c o u n t e d f o r 3 3 % o f a l l n e w c a n c e r c a s e s i n m e n i n 2 0 0 3 , w i t h 2 2 0 , 9 0 0 n e w c a s e s e x p e c t e d t o b e d i a g n o s e d . S e c o n d o n l y t o l u n g a n d b r o n c h u s c a n c e r , p r o s t a t e c a n c e r w i l l b e r e s p o n s i b l e f o r a p p r o x i m a t e l y 1 0 % o f a l l c a n c e r d e a t h s a m o n g m e n i n 2 0 0 3 , a c c o u n t i n g f o r a n e s t i m a t e d 2 8 , 9 0 0 d e a t h s ( F i g u r e 2 - 1 ) . W h i l e t h e e x a c t c a u s e o f p r o s t a t e c a n c e r r e m a i n s o b s c u r e , s e v e r a l f a c t o r s h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n g i v i n g r i s e t o t h i s d i s e a s e . O l d a g e , r a c e , e n v i r o n m e n t , a n d d i e t a r e t h e m o s t n o t i c e a b l e o f t h e s e f a c t o r s b u t g e n e t i c p r e d i s p o s i t i o n a n d s o c i o e c o n o m i c s t a t u s a r e o t h e r f a c t o r s t h a t m a y b e a s s o c i a t e d w i t h r i s k f o r p r o s t a t e c a n c e r . I n r e c e n t y e a r s , o b s e r v a t i o n s h a v e b e e n m a d e t h a t s h o w a n i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p r o s t a t e c a n c e r m o r t a l i t y r a t e s a n d t h e g e o g r a p h i c a l l y i n c i d e n t u l t r a v i o l e t ( U V ) r a d i a t i o n e x p o s u r e f r o m t h e s u n . U l t r a v i o l e t l i g h t i s e s s e n t i a l f o r v i t a m i n D s y n t h e s i s i n t h e s k i n . T h e s e o b s e r v a t i o n s h a v e l e d t o t h e s u g g e s t i o n t h a t v i t a m i n D m a y p l a y a r o l e i n d e c r e a s i n g p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e . T h i s c h a p t e r w i l l e x a m i n e t h e e p i d e m i o l o g y o f p r o s t a t e c a n c e r a n d s h o w h o w i t r e l a t e s t o v i t a m i n D l e v e l s . 3 2 E s t i m a t e d N e w C a e e e P r o s t a t e ( 3 3 % ) L u n g a n d B r o n c h u s ( 1 4 % ) C o l o n a n d R e c t u m ( 1 1 % ) B r e a s t ( 3 2 % ) L u n g a i d B r o n c h u s ( 1 2 % ) C o l o n a n d R e c t u m ( 1 1 % ) U r i n a r y B l a d d e r ( 6 % ) f e U t e r i n e C o r p u s ( 6 % ) M e l a n o m a o t t h e S k i n ( 4 % ) ‘ O v a r y ( 4 % ) N o n - H o d g k i n L y m o h o m a ( 4 % ) N o n - H o d g k i n L y m p h o m a ( 4 % ) K i d n e y ( 3 % ) M e l a n o m a o i t h e S k i n ( 3 % ) O r a l C a v i t y ( 3 % ) T h y r o i d ( 3 % ) L e u k e m i a ( 3 % ) P a n c r e a s ( 2 % ) P a n c r e a s ( 2 % ) . U r i n a r y B l a d d e r ( 2 % ) A l l O t h e r S i t e s ( 1 7 % ) ' 3 A l l O t h e r S i t e s ( 2 0 % ) E s t i m a t e d D e a t h s L u n g a n d B r o n c h u s ( 3 1 % ) , _ i _ , L u n g a i d B r o n c h u s ( 2 5 % ) P r o s t a t e ( 1 0 % ) ‘ . B r e a s t ( 1 5 % ) C o l o n a n d R e c t u m ( 1 0 % ) , " C o l o n a n d R e c t u m ( 1 1 % ) P m c m a s ( 5 % ) ‘ " P a n c r e a s ( 6 % ) N o n - H o d g k i n L y m p h o m a ( 4 % ) ' O v a r y ( 5 % ) L e u k e m i a ( 4 % ) N o n - H o d g k i n L y m p h o m a ( 4 % ) B o p h a g u s ( 4 % ) L e u k e m i a ( 4 % ) l i v e r ( 3 % ) U t e r i n e C o r p u s ( 3 % ) U r i n a r y B l a d d e r ( 3 % ) B r a i n ( 2 % ) K i d n e y ( 3 % ) M u l t i p l e M y e l o m a ( 2 % ) A l l O t h e r S i t e s ( 2 2 % ) A l l O t h e r S i t e s ( 2 3 % ) F i g u r e 2 - 1 : E s t i m a t e d n e w c a n c e r c a s e s a n d d e a t h s b y g e n d e r , U S , 2 0 0 3 ( J e m a l e t a l . , 2 0 0 3 ) 3 3 5 “ . \ r . u - x I n t I n t r o d u c t i o n O v e r t h e p a s t t w o d e c a d e s t h e r e h a s b e e n a n i n c r e a s e i n p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e a n d m o r t a l i t y . C o u n t l e s s s t u d i e s e x a m i n i n g t h e e p i d e m i o l o g y o f p r o s t a t e c a n c e r a n d i t s p o s s i b l e r e l a t i o n s h i p s w i t h v i t a m i n D h a v e b e e n c o n d u c t e d s i n c e S c h w a r t z a n d H u l k a ( 1 9 9 0 ) fi r s t h y p o t h e s i z e d t h a t v i t a m i n D d e fi c i e n c y i n c r e a s e s t h e r i s k o f p r o s t a t e c a n c e r . D i e t a r y i n t a k e p r o v i d e s a s m a l l a m o u n t o f t h e d a i l y r e q u i r e m e n t o f v i t a m i n D , b u t t h e m a j o r s o u r c e o f v i t a m i n D f o r A m e r i c a n s i s U V l i g h t - i n d u c e d c o n v e r s i o n o f 7 - d e h y d r o c h o l e s t e r o l , a v i t a m i n D p r e c u r s o r , a s a r e s u l t o f s u n l i g h t e x p o s u r e . V i t a m i n D d e f i c i e n c y d u e t o a r e d u c t i o n i n e n d o g e n o u s s y n t h e s i s i s a c o m m o n l i n k a m o n g t h r e e o f t h e m a j o r r i s k f a c t o r s f o r p r o s t a t e c a n c e r ( B l u t t a n d W e i g e l , 1 9 9 9 ) . F i r s t , o l d e r m e n g e n e r a l l y h a v e l e s s s u n l i g h t e x p o s u r e t h a n y o u n g e r m e n a n d t h e i r a b i l i t y t o s y n t h e s i z e v i t a m i n D d e c r e a s e s w i t h a g e . S e c o n d , A f r i c a n - A m e r i c a n m e n h a v e a r e d u c e d e f fi c i e n c y o f v i t a m i n D s y n t h e s i s d u e t o t h e h i g h m e l a n i n c o n t e n t i n t h e i r s k i n . T h i r d , p r o s t a t e c a n c e r m o r t a l i t y r a t e s s h o w a n i n v e r s e c o r r e l a t i o n w i t h s u n l i g h t a v a i l a b i l i t y . T h i s p a p e r w i l l e x p l o r e s e v e r a l r i s k f a c t o r s t h a t c o u l d p o s s i b l y l e a d t o a n i n c r e a s e i n p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e a n d m o r t a l i t y . S u c h f a c t o r s i n c l u d e o l d a g e , r a c e , d i e t , e n v i r o n m e n t , o c c u p a t i o n a l h a z a r d s , s o c i o - e c o n o m i c s t a t u s , a n d v i t a m i n D l e v e l s . 3 4 v ‘ o l 4 . 1 1 1 0 ! ) L o . . . } n R i s k F a c t o r s A g e P r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e a n d m o r t a l i t y r a t e s i n c r e a s e w i t h a g e . C l i n i c a l p r o s t a t e c a n c e r h a s b e e n m a i n l y a d i s e a s e o f o l d e r m e n , w i t h t h e m e d i a n a g e o f d i a g n o s i s b e i n g 7 2 y e a r s ( L i n a n d L a n g e , 2 0 0 0 ) . U n l i k e m a n y o t h e r c a n c e r s , a s t e a d y r i s e o c c u r s a f t e r t h e a g e o f 5 0 b u t i s r a r e u n d e r t h e a g e o f 5 0 ( W e b b e r e t a l . , 1 9 8 8 ) . N i n e t y - fi v e p e r c e n t o f p r o s t a t e c a n c e r c a s e s a r e d i a g n o s e d i n m e n b e t w e e n t h e a g e s o f 4 5 a n d 8 9 ( L i n a n d L a n g e , 2 0 0 0 ) b u t l e s s t h a n o n e c a s e p e r 1 0 0 , 0 0 0 o c c u r s i n m e n u n d e r t h e a g e o f 4 0 ( Q u a d e r , 1 9 9 9 ) . B e c a u s e o f t h e i n c r e a s e i n t h e l i f e e x p e c t a n c y o f t h e m a l e p o p u l a t i o n , p r o s t a t e c a n c e r h a s b e c o m e a n i n c r e a s i n g c o n c e r n . A n i n c r e a s e i n l i f e e x p e c t a n c y a l s o c a u s e s a d e c r e a s e i n v i t a m i n D m e t a b o l i s m , w h i c h b e g i n s a r o u n d m i d l i f e a n d i s d u e t o s e v e r a l f a c t o r s . T h e r e i s a d e c r e a s e i n d i e t a r y c a l c i u m , c u t a n e o u s p r o d u c t i o n o f v i t a m i n D , a n d s e r u m c o n c e n t r a t i o n o f 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 ( Z S O H D 3 ) . C a l c i u m a b s o r p t i o n i n t h e i n t e s t i n e d i m i n i s h e s c a u s i n g a d e c r e a s e i n d i e t a r y c a l c i u m a n d V D R c o n c e n t r a t i o n , a n d c a l c i u m b i o a v a i l a b i l i t y t o m e e t s e r u m d e m a n d s d e c l i n e s ( H a l l o r a n a n d P o r t a l e , 1 9 9 7 ) . S e v e r a l s t u d i e s h a v e s h o w n v i t a m i n D t o i n h i b i t g r o w t h , p r o l i f e r a t i o n , a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f p r o s t a t e c e l l s ( Z h a o e t a l . , 2 0 0 0 ; B l u t t e t a l . , 1 9 9 7 ; a n d S k o w r o n s k i e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e s e d a t a s u g g e s t a p o s s i b l e l i n k b e t w e e n t h e d e c r e a s i n g v i t a m i n D l e v e l s i n e l d e r l y m e n a n d p r o s t a t e c a n c e r . A s l i f e e x p e c t a n c y i n c r e a s e s s o d o e s t h e i n c r e a s e d b u r d e n o f t h i s d i s e a s e o n s o c i e t y . T h i s i n c r e a s e i n r i s k i s e n h a n c e d e v e n m o r e i n c a s e s o f h i g h r i s k , s u c h a s i n A f r i c a n - A m e r i c a n m e n . 3 5 . ‘ u “ i t R a c e T h e i n c i d e n c e o f l a t e n t c a n c e r , o r c a n c e r d i s c o v e r e d a t t h e t i m e o f a u t o p s y , i s s i m i l a r t h r o u g h o u t a l l c o u n t r i e s a n d r a c e s . H o w e v e r , t h e r e a r e m a r k e d r a c i a l a n d e t h n i c d i f f e r e n c e s i n t h e m o r t a l i t y a n d i n c i d e n c e o f p r o s t a t e c a n c e r i n t h e U n i t e d S t a t e s ( F i g u r e 2 - 2 ) . A f r i c a n - A m e r i c a n m e n h a v e t h e h i g h e s t i n c i d e n c e r a t e o f p r o s t a t e c a n c e r . A n A fi i c a n — A m e r i c a n m a n h a s a n 8 5 % g r e a t e r c h a n c e o f b e i n g d i a g n o s e d w i t h , a n d 1 1 4 % g r e a t e r c h a n c e o f d y i n g f r o m p r o s t a t e c a n c e r t h a n a w h i t e m a n i n t h e U n i t e d S t a t e s ( B r a w n e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e c h a n c e s o f A f r i c a n - A m e r i c a n m e n d e v e l o p i n g c a n c e r a r e a b o u t 1 0 % h i g h e r t h a n i n W h i t e s , 5 0 - 6 0 % h i g h e r t h a n i n H i s p a n i c s a n d A s i a n / P a c i fi c I s l a n d e r s , a n d m o r e t h a n 2 0 0 % h i g h e r t h a n i n A m e r i c a n I n d i a n s ( J e m a l e t a l . , 2 0 0 3 ) . A f r i c a n - A m e r i c a m e n h a v e a p p r o x i m a t e l y 3 0 % h i g h e r m o r t a l i t y r a t e s f r o m c a n c e r t h a n w h i t e s a n d t h e i r d e a t h r a t e i s m o r e t h a n d o u b l e w h e n c o m p a r e d t o A s i a n / P a c i fi c I s l a n d e r s , A m e r i c a n I n d i a n s , a n d H i s p a n i c s ( J e m a l e t a l . , 2 0 0 3 ) ( F i g u r e 2 - 3 ) . I n a t t e m p t s t o d e c i p h e r t h e d i f f e r e n c e s i n p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e a m o n g r a c e s , r e c e n t s t u d i e s h a v e t e s t e d t h e l e v e l s o f p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) i n b l a c k a n d w h i t e m e n w i t h o u t p r o s t a t e c a n c e r . T h e s e s t u d i e s h a v e f o u n d t h a t b l a c k m e n t e n d t o h a v e h i g h e r l e v e l s a n d g r e a t e r d e n s i t i e s o f P S A t h a n d o a g e - m a t c h e d w h i t e m e n ( A b d a l l a e t a l . , 1 9 9 8 a n d E a s t h a m e t a l . , 1 9 9 8 ) . 3 6 > ~ . U . : £ ~ E \ e 0 = m H i s p a n i c 1 2 7 . 6 A m e r i c a n 1 8 . 8 l n d i a n l A l a s k a 6 0 7 I M o r t a l i t y N a t i v e ' l I I n c i d e n c e , E 2 l 5 A s i a n / P a c i fi c 1 5 - 1 m . 3 A m e n c a n 1 0 7 2 0 t o | a : ' 7 5 . 1 A f r i c a n - A m e r i c a n 2 7 5 . 3 3 2 . 9 W h i t e ] 1 7 2 . 9 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 R a t e p e r 1 0 0 , 0 0 0 m e n F i g u r e 2 - 2 : P r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e b y r a c e a n d e t h n i c i t y , U S , 1 9 9 2 t o 1 9 9 9 ( d a t a f r o m J e m a l e t a l . , 2 0 0 3 ) . > : 0 . . . . . . . . . . : c U : I n . , U 2 7 7 ; , I t . n y c e I I M I o n r c t i a d l l e 1 6 0 . 6 4 0 8 . 9 A n m l I n d l a e A A A f r i c r a i s c k a a i A a m n e n - A / r m s l a P i n e N a t a c c a v fi e c i n i r i c a n _ , E . 5 t % 2 r 8 1 6 3 . 7 H i s p a n i c 1 ' 3 9 3 . 1 7 0 3 . 6 2 5 8 . 1 W h i t e ' . . 5 6 8 . 2 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 R a t e p e r 1 0 0 , 0 0 0 m e n F i g u r e 2 - 3 : A v e r a g e c a n c e r m o r t a l i t y a n d i n c i d e n c e r a t e b y r a c e a n d e t h n i c i t y , U S , 1 9 9 2 t o 1 9 9 9 ( d a t a f r o m J e m a l e t a l . , 2 0 0 3 ) . . I L H . l s ~ ( a I . . ‘ w ! ” r i t f ' ‘ f w . . . . . . . » a . 4 . 1 . 1 T r y , H . . ” L . b . . ¢ . ( . 1 . . . . L . p I ! ) : - r . ( . I . . r ’ o f I . . H V L Y : V a i n . 1 : 1 . 1 - 3 O n e f a c t o r t h a t m a y r e l a t e t h e s e d i f f e r e n c e s i n p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e t o v i t a m i n D d e fi c i e n c y i s t h e f a c t t h a t h i g h m e l a n i n l e v e l s i n d a r k l y p i g m e n t e d s k i n i n h i b i t t h e f o r m a t i o n o f p r e v i t a m i n D 3 , a p r e c u r s o r t o 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . T h e m e l a n i n i n t h e s k i n a b s o r b s U V l i g h t a n d p r e v e n t s t h e p r e v i t a m i n D 3 f o r m a t i o n . S i m i l a r l y , a r e c e n t s t u d y ( C o r d e r e t a l . , 1 9 9 5 ) d e m o n s t r a t e d t h e p o s s i b i l i t y t h a t m e n a t e l e v a t e d r i s k o f p r o s t a t e c a n c e r h a v e , o n a v e r a g e , l o w e r s u m m e r l e v e l s o f s e r u m 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 c o m p a r e d t o o t h e r m e n , f o r w h o m a g g r e g a t e l e v e l s o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 r e m a i n e d c o n s t a n t t h r o u g h o u t t h e y e a r . T h i s i s s i g n i fi c a n t w h e n y o u c o n s i d e r t h e f a c t t h a t b l a c k m e n , b e c a u s e o f t h e m e l a n i n l e v e l s i n t h e i r s k i n , t e n d t o h a v e l o w e r l e v e l s o f p r e v i t a m i n D 3 . A n o t h e r f a c t o r t h a t c o u l d p l a y a r o l e i s t h e g e n e t i c p o l y m o r p h i s m t h a t o c c u r s i n t h e v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) b e t w e e n d i f f e r e n t r a c e s . T h e e f f e c t o f V D R p o l y m o r p h i s m o n p r o s t a t e c a n c e r r i s k m a y b e t h e r e s u l t o f d i f f e r e n t i a l a c t i v i t y o f t h e v a r i a n t V D R a l l e l e s i n t r a n s a c t i v a t i o n o f v i t a m i n D t a r g e t g e n e s . O n t h e o t h e r h a n d , w h i t e m e n t e n d t o h a v e a h i g h e r l e v e l o f p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e t h a n A s i a n - A m e r i c a n m e n i n t h e U n i t e d S t a t e s . E v e n w i t h t h e v a r i a t i o n i n i n c i d e n c e b e t w e e n s p e c i fi c A s i a n - A m e r i c a n e t h n i c i t i e s , t h e i n c i d e n c e i n e a c h o f t h e g r o u p s i s s i g n i fi c a n t l y l e s s t h a n i t i s i n w h i t e A m e r i c a n m e n ( A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y , 1 9 9 8 ) . O n e r e a s o n f o r t h e s e d i f f e r e n c e s c o u l d b e r e l a t e d t o t h e g e n e t i c p o l y m o r p h i s m i n t h e V D R g e n e . I t i s a l s o b e l i e v e d t h a t d i f f e r e n c e s i n d i e t m a y c o n t r i b u t e t o t h e s e d i f f e r e n c e s i n p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e b e t w e e n d i f f e r e n t e t h n i c g r o u p s , w h i c h c o u l d a l s o r e l a t e d i e t a r y h a b i t s o f d i f f e r e n t e t h n i c g r o u p s t o t h e v i t a m i n D l e v e l s i n c o r r e s p o n d i n g g r o u p s . 3 9 1 1 ‘ 1 . ) . . . 1 / J I . ) . . 1 l i l ‘ e i l 4 . I . . . . . D . ; J . I W C . . . ) 1 r f b n . r . . 4 . . . . . a D i e t T h e r e h a s b e e n c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t i n t h e r o l e o f d i e t a r y c o m p o n e n t s i n t h e e t i o l o g y a n d e p i d e m i o l o g y o f p r o s t a t e c a n c e r . M a n y e p i d e m i o l o g i c a l s t u d i e s d e m o n s t r a t e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n d i e t a n d p r o s t a t e c a n c e r . P r o s t a t e c a n c e r i s a h o r m o n e - a s s o c i a t e d m a l i g n a n c y a n d i n t e r n a t i o n a l d a t a s u g g e s t t h a t i t i s a c a n c e r t h a t m a y b e c a u s a l l y a s s o c i a t e d w i t h n u t r i t i o n ( W e b b e r e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e d i f f e r e n c e s i n i n c i d e n c e b e t w e e n d i f f e r e n t r a c i a l g r o u p s s t r o n g l y s u g g e s t a l i n k b e t w e e n d i e t a n d p r o s t a t e c a n c e r . T h e i n c i d e n c e o f p r o s t a t e c a n c e r i s h i g h i n t h e U n i t e d S t a t e s c o m p a r e d t o t h a t i n A s i a n c o u n t r i e s ( F i g u r e 2 - 4 ) . B u t , i t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t w i t h i n a f e w g e n e r a t i o n s , t h e i n c i d e n c e o f t h i s d i s e a s e i n A s i a n i m m i g r a n t s t o t h e U n i t e d S t a t e s b e g i n s t o a p p r o a c h t h e r i s k o f A m e r i c a n m e n ( H e m a d e z e t a l . , 1 9 9 9 ) . K r i s t a l e t a l ( 2 0 0 2 ) d e m o n s t r a t e d t h a t e n e r g y i n t a k e w a s a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d r i s k o f p r o s t a t e c a n c e r , w h e r e a s h i g h c o n s u m p t i o n o f f a t a n d c a l c i u m w a s a s s o c i a t e d w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f m o r e a g g r e s s i v e d i s e a s e o n l y . T h e p o s s i b l e m e c h a n i s m e x p l a i n i n g a d e l e t e r i o u s e f f e c t o f c a l c i u m o n p r o s t a t e c a n c e r r i s k i s t h a t h i g h c a l c i u m i n t a k e l e a d s t o l o w e r l e v e l s o f a c t i v e l , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . I n t h e W e s t e r n d i e t , f a t i n t a k e a c c o u n t s f o r a p p r o x i m a t e l y 4 0 % o f t h e c a l o r i e s w h i l e i n J a p a n i t a c c o u n t s f o r o n l y 1 0 t o 1 5 % ( W e b b e r e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e W e s t e r n d i e t i s h i g h i n a n i m a l f a t a n d p r o t e i n a n d r e fi n e d c a r b o h y d r a t e s a n d l o w i n fi b e r - r i c h f o o d s . C o n v e r s e l y , t h e l o w - f a t d i e t o f t h e A s i a n c o m m u n i t i e s i s r i c h i n s t a r c h e s , l e g u m e s , f r u i t a n d v e g e t a b l e s ( m a n y o f w h i c h h a v e h i g h fi b e r c o n t e n t ) , a n d s o y p r o d u c t s . O n e e x p l a n a t i o n o f h o w d i e t a r y f a t s i n c r e a s e t h e r i s k o f p r o s t a t e c a n c e r i s h o r m o n a l . H i g h - f a t d i e t s i n c r e a s e c i r c u l a t i n g a n d r o g e n l e v e l s , a n d h i g h t e s t o s t e r o n e l e v e l s m a y i n fl u e n c e p r o s t a t e c a n c e r r i s k . 4 0 < 5 . 9 < 1 4 . 1 ' 7 < 2 2 . 1 I < 3 1 . 0 I < 9 5 . 1 G L O B O C A N ( I A R C 1 9 9 8 ) F i g u r e 2 - 4 : N u m b e r o f p r o s t a t e c a n c e r c a s e s w o r l d - w i d e , p e r 1 0 0 , 0 0 0 m e n , a g e s t a n d a r d i z e d u s i n g t h e W o r l d s t a n d a r d p o p u l a t i o n . ( m o d i fi e d f r o m Q u i n n a n d B a b b , 2 0 0 2 ; W e b b e r e t a l . , 1 9 8 8 ) . 4 1 n r u . ' \ a h n a ' l l L ‘ H ‘ l A O 1 2 1 3 5 3 0 0 . l l 5 0 } ( 5 . 5 2 1 1 1 [ 0 l 1 4 0 4 ) I " . h a s t - e r r . - . 1 : ( 1 3 3 1 6 8 1 1 A : I I A J Q C U Q D L l . ‘ l F ‘ H E i ~ . : u . _ . ' p e , l i - H P R l . 3 1 0 : 2 3 : 1 5 n o I C O N ) " r » v \ ‘ ' ! \ \ l l 1 . A t " . F 3 . “ ‘ « r a i n s ; I n . 1 1 9 S o y i s r i c h i n t h e i s o fl a v o n e s g e n i s t e i n a n d d a i d z e i n , b o t h o f w h i c h h a v e b e e n s h o w n t o p l a y a r o l e i n t h e i n h i b i t i o n o f h u m a n c a n c e r c e l l g r o w t h ( H e m a d e z e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e t y p i c a l A s i a n d i e t a l s o c o n t a i n s l a r g e a m o u n t s o f fi s h o i l w h i c h i s h i g h i n v i t a m i n D 3 c o n t e n t . T h i s h i g h l e v e l o f v i t a m i n D 3 i n t h e A s i a n d i e t , c o m p a r e d t o t h e W e s t e r n d i e t , m a y p l a y a r o l e i n t h e o b s e r v e d r e d u c e d p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e r a t e s b e t w e e n A s i a n m e n a n d A m e r i c a n m e n . T h e t r a d i t i o n a l A s i a n d i e t a l s o c o n s i s t s o f l a r g e a m o u n t s o f y e l l o w a n d g r e e n v e g e t a b l e s t h a t c o n t a i n h i g h l e v e l s o f v i t a m i n A , w h i c h m a y h e l p p r o t e c t a g a i n s t t h e i n d u c t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . V i t a m i n A h a s r a i s e d c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t a s a c a n c e r p r e v e n t i o n a g e n t b e c a u s e o f i t s i m p o r t a n t r o l e i n c e l l u l a r d i f f e r e n t i a t i o n , i n h i b i t i o n o f i n v a s i o n , i n d u c t i o n o f a p o p t o s i s , a n d r e v e r s i o n o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s t o t h e n o r m a l p h e n o t y p e . W e b b e r e t a l . ( 1 9 9 9 ) e x a m i n e d t h e a b i l i t y o f N - ( 4 — h y d r o x y p h e n y l ) r e t i n a m i d e ( 4 — H P R ) , a s y n t h e t i c r e t i n o i d , t o r e v e r s e t h e m a l i g n a n t c h a r a c t e r i s t i c s o f D U - 1 4 5 c e l l s t o w a r d s n o r m a l p h e n o t y p e . T h e y f o u n d t h a t 4 - H P R i n h i b i t e d g r o w t h b y 3 1 % a n d 9 6 % a t c o n c e n t r a t i o n s o f 1 u M a n d l O u M , r e s p e c t i v e l y . T r e a t m e n t w i t h l t t M 4 - H P R a l s o c a u s e d a 5 3 % d e c r e a s e i n t h e e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n , a n i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n a s s o c i a t e d w i t h i n v a s i o n , a s w e l l a s a 3 2 % a n d 5 2 % d e c r e a s e i n c e l l m o t i l i t y a n d i n v a s i v e a b i l i t y , r e s p e c t i v e l y . I n 2 0 0 1 , Q u a d e r e t a 1 . e x a m i n e d t h e c h e m o p r e v e n t a t i v e p o t e n t i a l o f a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d ( A T R A ) a n d 4 - H P R o n W P E l — N B 1 4 a n d W P E l - N B l l c e l l l i n e s . B o t h R A a n d 4 - H P R i n h i b i t e d a n c h o r a g e i n d e p e n d e n t g r o w t h a n d i n v i t r o i n v a s i o n o f b o t h t h e W P E l - N B I 4 a n d W P E l - N B l l c e l l l i n e s . T h e e f f e c t s o f 4 - H P R w e r e t e s t e d o n t h e R W P E - l , W P E l - 7 , W P E l - l O , a n d D U - 1 4 5 c e l l l i n e s ( S h a r p e t a l . , 2 0 0 1 ) . I n t h i s 4 2 5 3 . 1 ) . H h a s 4 - p i r s u i e c 5 5 3 a n d r V ; I . , A m - L ‘ . ‘ J n ‘ t r a . . ‘ L : ; ‘ I I F 1 . ‘ h ' f ‘ i . ‘ s t u d y , 4 - H P R w a s s h o w n t o i n h i b i t g r o w t h a n d d e c r e a s e v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n a l l c e l l l i n e s . 4 - H P R i n d u c e d t h e e x p r e s s i o n o f c y t o k e r a t i n 1 8 , a d i f f e r e n t i a t i o n m a r k e r f o r p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s , a n d i t d e c r e a s e d t h e e x p r e s s i o n o f t h e t u m o r s u p p r e s s o r p r o t e i n s p 5 3 a n d p r . V i t a m i n E i s a l s o b e l i e v e d t o i n fl u e n c e t h e d e v e l o p m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r . A f o r m o f v i t a m i n E , o r - t o c o p h e r o l , w a s g i v e n t o m a l e s m o k e r s i n F i n l a n d , a g e s 5 0 - 6 9 . A f t e r r e c e i v i n g a - t o c o p h e r o l f o r 5 - 8 y e a r s , t h e m e n s h o w e d a d e c r e a s e i n i n c i d e n c e a n d m o r t a l i t y r a t e s o f p r o s t a t e c a n c e r b y 3 2 % a n d 4 1 % , r e s p e c t i v e l y ( H e i n o n e n e t a l . , 1 9 9 8 ) . V i t a m i n E i s a l s o b e l i e v e d t o e x e r t i t s e f f e c t s b y p r e v e n t i n g f r e e r a d i c a l d a m a g e t o D N A a n d p r o t e i n s , b y e n h a n c i n g i m m u n e f u n c t i o n s , a n d b y r e d u c i n g t h e a c t i v i t y o f p r o t e i n k i n a s e C , w h i c h r e g u l a t e s c e l l p r o l i f e r a t i o n ( H e i n o n e n e t a l . , 1 9 9 8 ) . S e a s o n a l a n d G e o g r a p h i c V a r i a t i o n s a n d E x p o s u r e t o S u n l i g h t I f e x p o s u r e t o s u n l i g h t i s a d e q u a t e , e n d o g e n o u s s y n t h e s i s o f v i t a m i n D i n t h e s k i n m a k e s a g r e a t e r c o n t r i b u t i o n t o v i t a m i n D a d e q u a c y t h a n a n y o t h e r f a c t o r . U l t r a v i o l e t ( U V ) l i g h t i s r e q u i r e d f o r t h e c o n v e r s i o n o f 7 - d e h y d r o c h o l e s t e r o l t o v i t a m i n D i n t h e s k i n . V i t a m i n D l e v e l s s h o w v a r i a t i o n s d e p e n d e n t o n s e a s o n s o f t h e y e a r a n d g e o g r a p h i c l o c a t i o n . I n a s t u d y d o n e o n p r e - s c h o o l c h i l d r e n i n G r e a t B r i t a i n , D a v i e s e t a l . ( 1 9 9 9 ) d e m o n s t r a t e d t h a t v i t a m i n D l e v e l s w e r e m u c h l o w e r i n w i n t e r m o n t h s , w h e n s u n l i g h t e x p o s u r e t e n d s t o b e m u c h l o w e r , t h a n i n s u m m e r m o n t h s . T h i s s u g g e s t s t h a t v i t a m i n D s t a t u s i s d e p e n d e n t o n s e a s o n . A s i m i l a r e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d o n m e n i n F i n l a n d ( T u o h i m a a e t a l . , 2 0 0 1 ) . F i n n i s h m e n r e c e i v e p r a c t i c a l l y n o e f f e c t i v e U V l i g h t d u r i n g t h e s e v e r a l w i n t e r m o n t h s o f 4 3 2 : » ) a l a w 3 8 . . 3 , . R U B , E a . 1 , 1 . . . _ _ . : . _ D : 4 . . 1 2 . . . . 1 0 3 5 3 . 3 3 . 1 4 7 ; } ( r . . . 1 L . p r . . . 3 2 f r . 1 . r . . . . . l ( . . u ’ v . a . . 1 . . . v . . . . ( r r f . . . . . J . . . _ 1 U r . . . t . . : . : — . . . 3 . . . . . . 1 b . r . l . v b . ( I n E C ; . . . . r r w . . . “ . . . . . f A ( L . r . 4 . . . . . - L 7 : 1 1 . 1 . r . t h e y e a r , t h e r e b y m a k i n g F i n l a n d a n o p t i m a l c o u n t r y f o r a n e p i d e m i o l o g i c a l s t u d y o f s e r u m v i t a m i n D l e v e l s . T u o h i m a a e t a l . ( 2 0 0 1 ) f o u n d t h a t t h e r e w a s a h i g h s e a s o n a l v a r i a t i o n i n t h e s e r u m 2 5 0 H 0 3 c o n c e n t r a t i o n , w i t h t h e h i g h e s t v a l u e s b e i n g f o u n d i n S e p t e m b e r . M e n w i t h h i g h e r l e v e l s o f s e r u m 2 5 0 H D 3 h a d a 1 ) l o w e r r e l a t i v e r i s k o f d e v e l o p i n g p r o s t a t e c a n c e r , 2 ) l e s s a g g r e s s i v e p r o s t a t e c a n c e r , a n d 3 ) d e l a y e d c l i n i c a l v e r i fi c a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r b y 1 . 8 y e a r s . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t v i t a m i n D h a s b e n e fi c i a l e f f e c t s a t a l l s t a g e s o f c a n c e r d e v e l o p m e n t ( F i g u r e 2 - 5 ) a n d i t s l e v e l s a r e s e a s o n - d e p e n d e n t . P r o s t a t e C a n c e r I N I T I A T I O N m 3 » P R O M O T I O N — ” i f : > P R O G R E S S I O N L O W S E R U M 2 5 - H Y D R O X Y V I T A M I N D 3 F i g u r e 2 - 5 : S u m m a r y o f p u t a t i v e e f f e c t s o f s e r u m 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 l e v e l s o n a l l t h r e e s t a g e s o f p r o s t a t e c a r c i n o g e n e s i s ( m o d i fi e d f r o m T u o h i m a a e t a l . , 2 0 0 1 ) U s i n g t h e d a t a f r o m t h e 3 0 7 3 c o n t i g u o u s U n i t e d S t a t e s c o u n t i e s , H a n c h e t t e a n d S c h w a r t z ( 1 9 9 2 ) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e i n c i d e n c e r a t e s o f p r o s t a t e c a n c e r f o l l o w a g r a d i e n t w i t h U V l i g h t i n t e n s i t y ( F i g u r e 2 - 6 ) . T h i s p a t t e r n s h o w s t h a t U V r a d i a t i o n a n d p r o s t a t e c a n c e r m o r t a l i t y a r e i n v e r s e l y c o r r e l a t e d . K a f a d a r ( 1 9 9 7 ) s h o w e d m o r t a l i t y r a t e s i n w h i t e m e n a r e a l s o h i g h e r i n n o r t h e r n t h a n i n s o u t h e r n c o u n t i e s . W h i t e m e n l i v i n g i n 4 4 M D E I I H i ! 5 1 ” ? 2 . 6 . P r e d l c t e d R a t e C ] 1 9 . 8 0 - 2 0 . 1 0 2 0 . 1 0 . 2 0 . 4 0 - 2 0 . 4 0 - 2 0 . 7 0 I 2 0 . 7 0 - 2 1 . 0 0 P u d l c t e d I n d e x E ] 1 0 . 0 - 1 0 . 0 E 1 8 . 0 - 2 6 . 0 . - ' - 2 6 . 0 - 3 4 . 0 - 3 4 . 0 - 4 2 . 0 F i g u r e 2 - 6 : L i n e a r t r e n d s u r f a c e m a p s . T o p : P r o s t a t e c a n c e r m o r t a l i t y a m o n g w h i t e m e n . B o t t o m : U V r a d i a t i o n u s i n g e p i d e m i o l o g i c a l i n d e x . A n i n v e r s e c o r r e l a t i o n b e t w e e n p r o s t a t e c a n c e r m o r t a l i t y r a t e s a n d U V r a d i a t i o n c a n b e s e e n w h e n c o m p a r i n g t h e t w o m a p s . ( H a n c h e t t e a n d S c h w a r t z , 1 9 9 2 ) . 4 5 m n h e m a r e a . l c . . - p . ; 1 ? . ) . l t l t ‘ l l L L _ , 1 : 1 2 2 3 1 1 : . 1 . » 2 5 5 5 C l i p t ‘ é ‘ d l : 1 0 1 7 3 1 1 1 1 0 1 1 1 1 ' i 1 . 1 2 . 3 1 1 1 1 . 1 0 . § O t h e r F a e Y ' t ' 9 - 9 ‘ P ‘ A l l : £ 3 3 . " 4 ‘ 1 ? “ . ‘ I ‘ e m e n . ‘ 1 1 ' - . . . l “ 1 ‘ 4 i l l 1 1 3 1 c 5 1 . 1 . 1 1 3 5 h d ‘ t fi 1 1 9 1 . , ” i \ 1 4 9 w . 1 ’ 1 « o h l t d ? “ 3 1 1 0 1 r p ‘ , w l " a - “ ‘ ( ‘ \ r ( m , J \ L L A I ) “ " a t e C a n I l . 3 1 , . . 9 H a g ; ( ' “ l . h n o r t h e r n a r e a s o f t h e U n i t e d S t a t e s h a d m o r t a l i t y r a t e s o f a p p r o x i m a t e l y 2 6 i n 1 0 0 , 0 0 0 p o p u l a t i o n c o m p a r e d t o 1 8 - 1 9 i n 1 0 0 , 0 0 0 p o p u l a t i o n i n t h e s o u t h e r n m o s t a r e a s . P r o s t a t e c a n c e r i s a l s o r a r e i n n a t i v e A f r i c a n s b u t i t i s c o m m o n i n A f r i c a n - A m e r i c a n s , w h o h a v e l e s s e x p o s u r e t o s u n l i g h t t h a n n a t i v e A f r i c a n s . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a d e m o n s t r a t e a c o r r e l a t i o n b e t w e e n l o w v i t a m i n D 3 l e v e l s ( c a u s e d b y l o w e x p o s u r e t o U V l i g h t ) a n d h i g h e r i n c i d e n c e r a t e s o f p r o s t a t e c a n c e r . O t h e r F a c t o r s T h e r e a r e s e v e r a l f a c t o r s o t h e r t h a n t h e o n e s d e s c r i b e d a b o v e t h a t a r e r e l a t e d t o p r o s t a t e c a n c e r d e v e l o p m e n t . M e n w i t h h i g h e r t h a n n o r m a l p l a s m a t e s t o s t e r o n e l e v e l s a r e b e l i e v e d t o h a v e a h i g h e r r i s k o f d e v e l o p i n g p r o s t a t e c a n c e r s i n c e t h e p r o s t a t e i s d e p e n d e n t u p o n a n d r o g e n t o g r o w ( A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y , 1 9 9 8 ) . W h e n c o m p a r e d t o w h i t e m e n , A f r i c a n - A m e r i c a n m e n , w h o a r e a t t h e h i g h e s t r i s k o f p r o s t a t e c a n c e r i n t h e w o r l d , h a v e 1 0 - 1 5 % h i g h e r c i r c u l a t i n g t e s t o s t e r o n e l e v e l s ( C o e t z e e a n d R o s s , 1 9 9 4 ) . T h e r e m a y a l s o b e a g e n e t i c p r e d i s p o s i t i o n t o t h e d e v e l o p m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r . R e c e n t s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t f a m i l i a l p r e d i s p o s i t i o n m a y b e r e s p o n s i b l e f o r 5 - 1 0 % o f p r o s t a t e c a n c e r c a s e s ( A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y , 2 0 0 2 ) . A n o t h e r f a c t o r t h a t h a s a n e f f e c t o n p r o s t a t e c a n c e r r i s k i s o c c u p a t i o n . O c c u p a t i o n a l e x p o s u r e m a y l e a d t o d i f f e r e n c e s i n i n c i d e n c e o f p r o s t a t e c a n c e r . F o r e x a m p l e , t h e o v e r a l l r i s k i n f a r m e r s f o r d e v e l o p i n g a n y t y p e o f c a n c e r i s l o w e r t h a n t h a t i n o t h e r o c c u p a t i o n a l g r o u p s . B u t , f a r m e r s h a v e a 2 0 t o 5 0 % h i g h e r c h a n c e o f d e v e l o p i n g p r o s t a t e c a n c e r t h a n o t h e r a g e - m a t c h e d n o n - f a r m e r s ( W i l l i a m s , 1 9 9 7 ) . C o m p a r e d t o o t h e r o c c u p a t i o n s , t h e l i f e t i m e r i s k o f a f a r m e r f o r d e v e l o p i n g p r o s t a t e c a n c e r i s 4 6 g i n 3 k C C ’ H n i a p p r o x i m a t e 1 W 1 1 1 3 1 1 1 1 1 : d i ‘ i t ' 1 . a ‘ ) ‘ 1 " 1 1 " . » 6 ) ; “ . ‘ L n - r “ . 1 1 . \ m a l l e t : 1 ‘ . . 1 4 . L ' L . m m . 0 1 u ; H - ' t o , I . ‘ . r . . u . . u n 5 t h : a C o n c l u s i [ 1 1 1 1 ‘ H M A I 3 1 ‘ " ' n ~ . i i i . “ J ‘ E V S T d l : 1 5 a g e 0 1 “ $ 3 5 1 , 1 1 3 ” a p p r o x i m a t e l y 7 % h i g h e r a n d a l m o s t 1 o u t o f 4 f a r m e r s w i l l d e v e l o p p r o s t a t e c a n c e r i n t h e i r l i f e t i m e ( W i l l i a m s , 1 9 9 7 ) . I t i s b e l i e v e d t h a t t h e i n c r e a s e d r i s k c a n b e a t t r i b u t e d t o t h e e x p o s u r e t o h e r b i c i d e s a n d i n s e c t i c i d e s . C a d m i u m i s a n o t h e r o c c u p a t i o n a l h a z a r d a s s o c i a t e d w i t h p r o s t a t e c a n c e r r i s k . C a d m i u m i s a t o x i c m e t a l k n o w n t o b e a c a r c i n o g e n a n d m o s t o f i t s e x p o s u r e c o m e s f r o m i n d u s t r i a l s e t t i n g s , s u c h a s n i c k e l - c a d m i u m b a t t e r y m a n u f a c t u r i n g o r w e l d i n g ( A c h a n z a r e t a l . , 2 0 0 1 ) . C o n c l u s i o n s I n r e c e n t y e a r s p r o s t a t e c a n c e r h a s b e c o m e t h e m o s t c o m m o n c a n c e r i n m e n . I t w i l l a c c o u n t f o r 3 3 % o f a l l n e w c a n c e r c a s e s i n m e n i n 2 0 0 3 , a n d a p p r o x i m a t e l y 1 0 % o f a l l c a n c e r d e a t h s w i l l b e a r e s u l t o f t h i s d i s e a s e . P r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e i n m e n u n d e r t h e a g e o f 6 5 i s 2 5 0 / 1 0 0 , 0 0 0 c o m p a r e d t o 1 , 0 0 0 / 1 0 0 , 0 0 0 i n m e n o v e r t h e a g o o f 6 5 ( K r i s t a l e t a l , 2 0 0 2 ) . W h i l e t h e e x a c t c a u s e o f p r o s t a t e c a n c e r r e m a i n s a n e n i g m a , s e v e r a l f a c t o r s h a v e b e e n a s s o c i a t e d w i t h t h e i n c i d e n c e o f t h i s d e a d l y d i s e a s e . T h e m o s t p r o m i n e n t o f t h e s e f a c t o r s a r e o l d a g e , r a c e , a n d d i e t . O t h e r p o t e n t i a l f a c t o r s t h a t d e m o n s t r a t e a n a s s o c i a t i o n w i t h p r o s t a t e c a n c e r a r e g e n e t i c p r e d i s p o s i t i o n , o c c u p a t i o n , a n d s o c i o e c o n o m i c s t a t u s . W i t h t h e r e c e n t d i s c o v e r i e s s h o w i n g a n i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p r o s t a t e c a n c e r c e l l g r o w t h , d i f f e r e n t i a t i o n , a n d p r o l i f e r a t i o n a n d v i t a m i n D l e v e l s , t h e f a c t t h a t v i t a m i n D i s s o m e h o w a s s o c i a t e d w i t h m o s t o f t h e s e f a c t o r s c a n n o t b e o v e r l o o k e d . T h u s , v i t a m i n D m a y h o l d g r e a t p r o m i s e a s a n i m p o r t a n t a d d i t i o n t o t h e a g e n t s c u r r e n t l y a v a i l a b l e f o r p r o s t a t e c a n c e r p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t . 4 7 R e l e r c n c A b fi l n l . l . I p I U S E l h s p 1 ; h i r z . r . \ l C 3 0 1 6 p x ? 3 1 1 1 ' . 1 w " n ~ . . ‘ i i e i f n k d l l ( 1 . 2 m m C c a n ; 1 4 9 ‘ 3 1 1 3 1 ; " ) . P ‘ \ P d n c 1 1 1 : 1 : ( t i t e r . G . ) J O Q Q C u i a . E } 1 \ u d r P I U 5 6 5 9 , 3 6 2 1 5 C h n ' s t a d ) » 4 1 : 1 1 , C o r d e r , E i r . t o H s a . t m , a i F n t e v p r i e D c , a d v m i a t n a n c e r , m i G n . b i n D D l . - a , c b e n V o g i k n a d n i d l g w m h a i p n t r , t o e J i e m . n e H , n , a . . a n n d d C a d n n d O c e r e h e r y t E r r p o e e i h a i p c i d e , n m N r : o . B s i d . S t o e e m a r a s o r o n k n e . a : l P R r v i e a s i r k v . , i a o 4 t f : o 6 n 5 i n 5 - R e f e r e n c e s A b d a l l a , 1 . , R a y , P . , R a y , V . , V a i d a , F . , a n d V i j a y a k u m a r , 8 . : C o m p a r i s o n o f s e r u m p r o s t a t e - s p e c i fi c a n t i g e n l e v e l s a n d P S A d e n s i t y i n A f r i c a n - A m e r i c a n , w h i t e , a n d H i s p a n i c m e n w i t h o u t p r o s t a t e c a n c e r . U r o l o g y , 5 1 : 3 0 0 - 3 0 5 , 1 9 9 8 . A c h a n z a r , W . B . , A c h a n z a r , K . B . , L e w i s , J . G . , W e b b e r , M . M . , a n d W a a l k e s , M . P . : C a d m i u m i n d u c e s c - m y c , p 5 3 , a n d c - j u n e x p r e s s i o n i n n o r m a l h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s a s a p r e l u d e t o a p o p t o s i s . T o x i c o l . A p p l . P h a r m a c o l , 1 6 4 : 2 9 1 - 3 0 0 , 2 0 0 0 . A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y . C a n c e r F a c t s a n d F i g u r e s , 1 9 9 8 . A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y . C a n c e r F a c t s a n d F i g u r e s , 2 0 0 2 . B l u t t , S . E . , A l l e g r e t t o , E . A . , P i k e , J . W . a n d W e i g e l , N . L . : 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 a n d 9 - c i s r e t i n o i c a c i d a c t s y n e r g i s t i c a l l y t o i n h i b i t t h e g r o w t h o f L N C a P p r o s t a t e c a n c e r c e l l s a n d c a u s e a c c u m u l a t i o n o f c e l l s i n G 1 . E n d o c r i n o l o g y , 1 3 8 : 1 4 9 1 - 1 4 9 7 , 1 9 9 7 . B r a w n , P . N . , J o h n s o n , E . H . , K u h l , D . L . , R i g g s , M . W . , S p e i g h t s , V . O . , J o h n s o n C . F . , P a n d y a , P . P . , L i n d , M . L . , a n d B e l l , N . F . : S t a g e a t p r e s e n t a t i o n a n d s u r v i v a l o f w h i t e a n d b l a c k p a t i e n t s w i t h p r o s t a t e c a r c i n o m a . C a n c e r , 7 1 : 2 5 6 9 - 2 5 7 3 , 1 9 9 3 . C o o p e r , G . M . : C o m m o n s o l i d t u m o r s o f a d u l t s . I n : E l e m e n t s o f H u m a n C a n c e r , B o s t o n , J o n e s a n d B a r t l e t t , 2 9 2 - 3 1 7 , 3 5 4 p p . , 1 9 9 2 . 6 5 9 , 1 9 9 5 . D a V i e s , P . S . W . , B a t e s , C . J . , C o l e , T . J . , P r e n t i c e , A . , a n d C l a r k e , P . C . : V i t a m i n D : s e a s o n a l a n d r e g i o n a l d i f f e r e n c e s i n p r e s c h o o l c h i l d r e n i n G r e a t B r i t a i n . E u r . J . C l i n . N u t . 5 3 : 1 9 5 - 1 9 8 , 1 9 9 9 . E a s fl l a m , J . A . , M a y , R . A . , W h a t l e y , T . , C r o w , A . , V e n a b l e , D D , a n d S a r t o r , 0 . : C l i n i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d b i o p s y s p e c i m e n f e a t u r e s i n A f r i c a n - A m e r i c a n a n d w h i t e m e n w i t h o u t p r o s t a t e c a n c e r . J . N a t l . C a n c e r I n s t . , 9 0 : 7 5 6 - 7 6 0 , 1 9 9 8 . H a l l O r a n , B R a n d P o r t a l e , A . A . : V i t a m i n D m e t a b o l i s m : T h e e f f e c t s o f a g i n g . I n : F e l d m a n , D . , G l o r i e u x , R H , a n d P i k e , J . W . ( e d s . ) , V i t a m i n D , S a n D i e g o , A c a d e m i c P r e s s , p p . 5 4 1 - 5 5 4 , 1 2 8 5 p p . , 1 9 9 7 . 4 8 1 1 1 1 0 1 3 1 1 B 5 . i ( 9 5 ( ' l 1 3 \ ‘ 3 " . \ X l t fi L ‘ I - h x ‘ u . H a h a . E ( 2 . , 1 ' V ’ Q ' L 1 . . . q 5 . 7 - V I , ‘ A H a H e n i c n h o e n t e t E 1 n H m L S . a U o , i 9 e v 9 , , a p r e . . C l a o L s P k e d 2 O p K p t a l . c n , e s , . o s m i t e y d b , , r t a n f o A l L t i i . a n k n a n a a J V i S c h p w r e , s M o n n r o i . c o , , a t i a r l r D e i o t i t . l z , a t e l c n l h , a o l w t G e i v V n a e i N , l d . r . p h M t S e , t r . f a R - , a . a i : f m l G c o o u a e a t . e t c J , t n h r l r l o o J . l p f , a E g N a t r h h a u e t T d p t y i , o a . l a w r l a d . o e r . a K i o a C M d c v i . s r a a p l d c o , , , n n a P e R t . t i b t R p e . r B e r a t , . s i H i n d t : t I a n - s c t f t i o S r o t t r , a a . u , P p n o r . u , s t 0 . o 9 n e M a e : o n s e a t n 4 C e t : , e 4 a a 0 n c e c . n J t i p a - c r e K a n n 4 . a c c 4 , e 6 i c 7 H a , , d n H e r , e 0 r : a a n . 1 r n c , 9 t d 9 e m 2 m 8 T 8 a o . e a l - i 2 t 8 y 6 : 9 A n . h M o . v , , i , 1 , a e 6 n r e t r d , v o a l l . 9 0 : n i t i Q u i n n , M P - r a e v a n l d e B c a b e n b a , n P . d : m o P r a t t a t l e i r t n y s . a P n a d r t t r 1 e : n i d n s t i r n n e p r o s t a t a t i o n a l e c c a n c e o m p a r r s i o n n c s i . d e n B c e r i t , . s J u . r v U r H e r n a n d e z , 0 . , W e b b e r , M . M . , a n d W i l l i a m s , D . E . : D i e t , s o y c o n s u m p t i o n a n d p r o s t a t e c a n c e r , P r o s t a t e H e a l t h W a t c h , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , 3 : 1 - 2 , 1 9 9 9 . J e m a l , A . , M u r r a y , T . , S a m u e l s , A . , G h a f o o r , A . , W a r d , E . , a n d T h u n , M . J . : C a n c e r S t a t i s t i c s , 2 0 0 3 . C A C a n c e r J . C l i n . 5 3 : 5 - 2 6 . K a f a d a r , K - : G e o g r a p h i c t r e n d s i n p r o s t a t e c a n c e r m o r t a l i t y : a n a p p l i c a t i o n o f s p a t i a l s m o o t h e r s a n d t h e n e e d f o r a d j u s t m e n t . A n n . E p i d e m i o l o g y , 7 : 3 5 - 4 5 , 1 9 9 7 . K i r b y , R . S - , C h r i s t m a s , T . J . , a n d B r a w e r , M . : E p i d e m i o l o g y a n d n a t u r a l h i s t o r y o f p r o s t a t e c a n c e r , I n : P r o s t a t e c a n c e r , L o n d o n , M o s b y , p p . 2 3 - 3 1 , 1 7 0 p p . , 1 9 9 6 . K r i s t a l , A . R . , C o h e n , J . H . , Q u , P . , a n d S t a n f o r d , J . L . : A s s o c i a t i o n s o f e n e r g y , f a t , c a l c i u m a n d v i t a m i n D w i t h p r o s t a t e c a n c e r r i s k . C a n c e r E p i d e m . B i o m a r k . P r e v . 1 1 : 7 1 9 - 7 2 5 , 2 0 0 2 . L i n , D . W . a n d L a n g e , P . H . : T h e e p i d e m i o l o g y a n d n a t u r a l h i s t o r y o f p r o s t a t e c a n c e r , I n : P r o s t a t i c D i s e a s e s , L e p o r , H . ( e d ) , P h i l a d e l p h i a , W . B . S a u n d e r s , 3 4 5 - 3 5 6 , 5 8 6 P P - , 2 0 0 0 . Q u a d e r , S - T . A . , B e l l o - D e O c a m p o , D . , W i l l i a m s , D . E . , K l e i n m a n , H . K . , a n d W e b b e r , M . M . : E v a l u a t i o n o f t h e c h e m o p r e v e n t a t i v e p o t e n t i a l o f r e t i n o i d s u s i n g a n o v e l i n V i t r o h u m a n p r o s t a t e c a r c i n o g e n e s i s m o d e l . M u t . R e s , 4 9 6 : 1 5 3 - 1 6 1 , 2 0 0 1 . Q u a d e r , S - T . A . : P r o s t a t e c a n c e r i n m a n : I n c i d e n c e a n d m o r t a l i t y . I n : Q u a d e r , S . T . A . : H u m a n p r o s t a t e c e l l c u l t u r e m o d e l s f o r s t u d i e s o n p r o s t a t e c a n c e r p r o g r e s s i o n a n d C h e m o p r e v e n t i o n . M a s t e r ’ s T h e s i s , D e p a r t m e n t o f Z o o l o g y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , p p . 4 0 - 5 7 , 1 9 2 p p . , 1 9 9 9 . 1 6 2 ~ 1 7 3 , 2 0 0 2 . S C h w a r t z ’ C G . a n d H u l k a , B . S . : I s v i t a m i n D d e fi c i e n c y a r i s k f a c t o r f o r p r o s t a t e c a n c e r ? ( h y p o t h e s i s ) . A n t i c a n c e r R e s . 1 0 : 1 3 0 7 - 1 3 1 2 , 1 9 9 0 . 4 9 S h i m . R : . 1 . 4 1 1 1 1 1 \ 1 l 1 3 1 1 1 8 1 1 1 1 1 0 1 1 5 1 1 1 . , . 1 . - 5 - 1 1 1 1 1 2 5 . T u o h i m a a . P A I N ‘ T \ 1 h d B l O l . ‘ l e b b s i . ) 1 ] S h o t b y . \ W e b b e r . . \ 1 p 1 0 5 R e s 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 5 . [ L 1 1 1 Z 2 1 0 , X . \ ’ 1 0 . c a r S h a r p , R . M . , B e l l o - D e O c a m p o , D . , Q u a d e r , S . T . A . , a n d W e b b e r , M . M . : N — ( 4 - h y d r o x y p h e n y l ) r e t i n a m i d e ( 4 - H P R ) d e c r e a s e s n e o p l a s t i c p r o p e r t i e s o f h u m a n p r o s t a t e c e l l s : a n a g e n t f o r p r e v e n t i o n . M u t . R e s , 4 9 6 : 1 6 3 - 1 7 0 , 2 0 0 1 . S k o w r o n s k i , R . J . , P e e h l , D . M . , a n d F e l d m a n , D . : V i t a m i n D a n d p r o s t a t e c a n c e r : 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 r e c e p t o r s a n d a c t i o n s i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s . E n d o c r i n o l o g y . , 1 3 2 : 1 9 5 2 - 1 9 6 0 , 1 9 9 3 . T u o h i m a a , P . , L y a k h o v i c h , A . , A k s e n o v , N . , P e n n a n e n , P . , S y v a l a , H . , L o u , Y . R . , A h o n e n , M . , H a s a n , T . , P a s a n e n , P . , B l a u e r , M . , M a n n i n e n , T . , M i e t t i n e n , S . , V i l j a , P . , a n d Y l i k o m i , T . : V i t a m i n D a n d p r o s t a t e c a n c e r . J . S t e r . B i o c h e m . M o l . B i o l . 7 6 : 1 2 5 - 1 3 4 , 2 0 0 1 . W e b b e r , M . M . , B e l l o - D e O c a m p o , D . , Q u a d e r , S , D e O c a m p o , N . D . , M e t c a l f e , W . S . , a n d S h a r p , R . M . : M o d u l a t i o n o f m a l i g n a n t p h e n o t y p e o f h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s b y N - ( 4 — h y d r o x y p h e n y l ) r e t i n a m i d e ( 4 - H P R ) . C l i n . E x p . M e t . , 1 7 : 2 5 5 - 2 6 3 , 1 9 9 9 . W e b b e r , M . M . , W e i n e r , S . M . , R e h m a n , S . M . M . , a n d W e t t l a u f e r , J . N . : C a r c i n o m a o f t h e p r o s t a t e : g e o g r a p h i c d i s t r i b u t i o n a n d r i s k f a c t o r s , I n : I n V i t r o M o d e l s f o r C a n c e r R e s e a r c h , W e b b e r , M . M . ( e d ) , B o c a R a t o n , C R C P r e s s , 5 : p p . 3 - 2 4 , 1 9 8 8 . W i l l i a m s , D . E . : P r o s t a t e c a n c e r i n f a r m e r s , P r o s t a t e H e a l t h W a t c h , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , 1 : 6 , 1 9 9 7 . Z h a O , X - Y . , L y , L . H . , P e e h l , D . M . , a n d F e l d m a n , D . : I n d u c t i o n o f a n d r o g e n r e c e p t o r b y 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 a n d 9 - c i s r e t i n o i c a c i d i n L N C a P h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . E n d o c r i n o l o g y . , 1 4 0 : 1 2 0 5 - 1 2 1 2 , 1 9 9 9 . 5 0 T h 1 C h a p t e r 3 T h e P h y s i o l o g i c a l R o l e a n d P r o p e r t i e s o f V i t a m i n D ( I 1 1 1 5 1 1 1 1 D j A b s t r a c . 5 1 \ H 1 1 . 1 } b e 0 1 " 1 1 6 3 1 1 1 1 1 1 1 ‘ 5 1 3 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 5 o n e 0 B I L L . 3 1 5 1 ‘ : c a m e r a s 1 : 1 ' 1 1 1 1 1 d e ' 1 \ ‘ 1 1 m o l e c u l a r b i o l o g y o f t h i s v i t a l m o l e c u l e . A b s t r a c t A v i t a m i n i s a n e s s e n t i a l s u b s t a n c e t h a t o u r b o d i e s c a n n o t m a n u f a c t u r e a n d c a n o n l y b e o b t a i n e d f r o m f o o d . B e c a u s e t h e b o d y c a n m a n u f a c t u r e v i t a m i n D b y e x p o s i n g t h e s k i n t o s u n l i g h t , b y d e fi n i t i o n i t i s n o t r e a l l y a v i t a m i n . V i t a m i n D i s a c t u a l l y a s t e r o i d h o r m o n e b e s t k n o w n f o r i t s a c t i v i t y i n r e g u l a t i n g c a l c i u m a n d b o n e m e t a b o l i s m . I t i s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t b i o l o g i c a l r e g u l a t o r s o f c a l c i u m m e t a b o l i s m a n d , a l o n g W i t h t h e p e p t i d e h o r m o n e s c a l c i t o n i n a n d p a r a t h y r o i d h o r m o n e , i t i s r e s p o n s i b l e f o r t h e m a i n t e n a n c e o f c a l c i u m a n d p h o s p h o r u s h o m e o s t a s i s . V i t a m i n D i s a l s o r e q u i r e d f o r t h e D o n n a ] d e v e l o p m e n t o f b o n e s a n d t e e t h . V i t a m i n D e x i s t s i n t w o f o r m s : v i t a m i n D 2 ( e r g o c a l c i f e r o l ) , f o u n d i n y e a s t , a n d v i t a m i n D 3 ( c h o l e c a l c i f e r o l ) , w h i c h i s f o u n d i n a n i m a l s k i n . P r e c u r s o r s o f v i t a m i n D a r e s y n t h e s i z e d i n t h e s k i n a n d a r e s u b s e q u e n t l y c o n v e r t e d i n t h e l i v e r a n d k i d n e y s , t o t h e b i o I o g i c a l l y a c t i v e f o r m , t h e h o r m o n e 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . F r o m t h e k i d n e y s t h i s h o r r n o n e i s t r a n s p o r t e d , v i a t h e b l o o d s t r e a m , t o i t s t a r g e t o r g a n s . A l a c k o f v i t a m i n D c o u l d p o t e n t i a l l y c a u s e a v a r i e t y o f p r o b l e m s . T h e s e i n c l u d e i n h i b i t i o n o f g r o w t h , r i c k e t s a n d o s t e o m a l a c i a , h y p o c a l c e m i a , a n d i n c r e a s e d p r o d u c t i o n o f t h e p a r a t h y r o i d h o r m o n e . T o o m u c h v i t a m i n D c o u l d a l s o c a u s e p r o b l e m s , i n c l u d i n g h 3 ’ 1 3 ' 3 1 ‘ \ I i t a m i n o s i s D , c a l c i f i c a t i o n o f s o f t t i s s u e s , l o s s o f a p p e t i t e a n d w e i g h t , a n d e l e v a t e d b l o o d C a l c i u m . W i t h t h e o b v i o u s d e p e n d e n c e o f n o r m a l l i f e o n v i t a m i n D , i t i s n o t S l l r I J I ‘ i S i n g t h a t m a j o r e f f o r t s a r e b e i n g m a d e t o u n d e r s t a n d t h e p h y s i o l o g i c a l r o l e a n d 5 2 l n t 1 - - 1 ‘ p m i a . I n t r o d u c t i o n V i t a m i n D i s o n e o f f o u r f a t - s o l u b l e v i t a m i n s t h a t h a v e b e e n r e c o g n i z e d a s h a v i n g i m p o r t a n t b i o l o g i c a l f u n c t i o n s . V i t a m i n D i s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t a n d e s s e n t i a l r e g u l a t o r s o f c a l c i u m a n d p h o s p h o r u s m e t a b o l i s m i n h i g h e r a n i m a l s . C a l c i u m a n d p h o s p h o r u s h o m e o s t a s i s a r e b o t h r e g u l a t e d b y t h e c o m b i n e d a c t i o n o f v i t a m i n D a n d t w o p e p t i d e h o r m o n e s , c a l c i t o n i n a n d p a r a t h y r o i d h o r m o n e ( C h e n , 1 9 9 9 ) . V i t a m i n D e x i s t s i n t w o m o l e c u l a r f o r m s : v i t a m i n D 2 a n d v i t a m i n D 3 , k n o w n a s e r g o c a l c i f e r o l a n d c h o l e c a l c i f e r o l , r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e 3 - 1 ) . T h e s e c l o s e l y r e l a t e d c o m p o u n d s b o t h p o s s e s s a n t i r a c h i t i c a c t i v i t y ( C o l l i n s a n d N o r m a n , 1 9 9 1 ) . E r g o c a l c i f e r o l i 5 d e r i v e d f r o m a c o m m o n p l a n t s t e r o i d , e r g o s t e r o l , a n d i s t h e f o r m u s u a l l y u s e d t o f o r t i f y f o o d s w i t h v i t a m i n D . C h o l e c a l c i f e r o l i s f o r m e d w h e n u l t r a v i o l e t l i g h t f r o m t h e s u n c o n v e r t s t h e b i o l o g i c a l p r e c u r s o r 7 - d e h y d r o c h o l e s t e r o l i n t o v i t a m i n D 3 . S i n c e c h o I e c a l c i f e r o l c a n b e p r o d u c e d i n t h e b o d y , v i t a m i n D i s n o t r e a l l y a v i t a m i n . A m o r e a c c : u r a t e d e s c r i p t i o n o f v i t a m i n D i s t h a t o f a s t e r o i d h o r m o n e . V i t a m i n D d e fi c i e n c y m a y c a u s e i n a d e q u a t e a b s o r p t i o n o f c a l c i u m f r o m t h e i n t e s t i n a l t r a c t a n d r e t e n t i o n o f p h o s p h o r u s i n t h e k i d n e y s , l e a d i n g t o a d e fi c i e n t d e p o s i t i o n o f h y d r o x y a p a t i t e i n t h e b o n e s . T h i s c a u s e s r i c k e t s i n c h i l d r e n a n d o s t e o m a l a c i a i n a d u l t s . V i t a m i n D d e fi c i e n c y c a n a l s o l e a d t o i n h i b i t i o n o f g r o w t h , h 3 " 1 : ’ ° < > a l c e m i a , a n d i n c r e a s e d p r o d u c t i o n o f t h e p a r a t h y r o i d h o r m o n e . A n e x c e s s o f V i t a m i n c a n l e a d t o h y p e r v i t a m i n o s i s D , c a l c i fi c a t i o n o f b o n e s a n d s o fi t i s s u e s , k i d n e y S t o n e S , w e a k n e s s , n a u s e a , p o l y d i p s i a , a n d p o l y u r i a . T h i s c h a p t e r w i l l d e s c r i b e t h e m a n y p t ‘ 0 ‘ ) e 1 ' t i e s o f v i t a m i n D , i n c l u d i n g i t s p h y s i o l o g i c a l r o l e , s y n t h e s i s a n d m e t a b o l i s m , a n d i t S I 1 1 0 l e c u l a r b i o l o g y . 5 3 1 1 0 “ “ H O “ F i g u r e 3 - 1 : M o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f n u t r i t i o n a l f o r m s o f v i t a m i n D , c h o l e c a l c i f e r o l ( l e f t ) a n d e r g o c a l c i f e r o l ( r i g h t ) . N u m b e r s d e s i g n a t e c a r b o n a t o m p o s i t i o n s a n d l e t t e r s d e s i g n a t e t h e r i n g s o f t h e m o l e c u l e s . 5 4 f " T h e P h y s i o l o g i c a l R o l e o f V i t a m i n D V i t a m i n D i s e s s e n t i a l i n m a i n t a i n i n g a p o s i t i v e c a l c i u m b a l a n c e a n d s k e l e t a l i n t e g r i t y . T h i s h o r m o n e fi r s t g a i n e d r e c o g n i t i o n b e c a u s e o f i t s a n t i r a c h i t i c p r o p e r t i e s b u t i s n o w r e c o g n i z e d a s a n i m p o r t a n t r e g u l a t o r o f c a l c i u m m e t a b o l i s m . T o g e t h e r w i t h c a l c i t o n i n a n d p a r a t h y r o i d h o r m o n e , v i t a m i n D m a i n t a i n s c a l c i u m a n d p h o s p h o r u s h o m e o s t a s i s i n t h e b o d y . V i t a m i n D i s a p r e c u r s o r o f t h e c a l c i u m - r e g u l a t i n g h o r m o n e , 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 , a l s o K n o w n a s c a l c i t r i o l . T h i s s t e r o i d h o r m o n e a c t s i n t h e n u c l e i , c y t o p l a s m , a n d p l a s m a m e m b r a n e o f t a r g e t c e l l s a n d i t s p r o d u c t i o n i s s u b j e c t t o f e e d b a c k r e g u l a t i o n . C a l c i t r i o l i s p r o d u c e d i n t h e k i d n e y s a n d i s r e l e a s e d i n t o t h e c i r c u l a t i o n e x e r t i n g i t s e f f e c t s o n m i n e r a l h o m e o s t a s i s b y a c t i n g o n t h e i n t e s t i n e , b o n e , k i d n e y , a n d t h e p a r a t h y r o i d g l a n d ( H e n d y , 1 9 9 7 ) ( F i g u r e 3 - 2 ) . I n t h e i n t e s t i n e , t h e c a l c i u m a n d p h o s p h o r u s i o n s e n t e r i n t o t l n e p h y s i o l o g i c a l e n v i r o n m e n t . I n t h e b o n e t h e i o n s a r e s t o r e d a n d a r e m a d e a v a i l a b l e f o r t h e m i n u t e - t o - m i n u t e r e g u l a t i o n o f t h e i r r e s p e c t i v e s e r u m l e v e l s , a n d t h e i r p r i n c i p a l r a t e o f e x c r e t i o n c a n b e r e g u l a t e d i n t h e k i d n e y . T h u s , t h e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e a b s o r p t i o n o f c a l c i u m a n d p h o s p h o r u s i o n s b y t h e i n t e s t i n e , t h e i r i n c r e a s e a n d r e - a b s o r p t i o n b y b o n e , a n d t h e i r u r i n a r y e x c r e t i o n b y t h e k i d n e y s a l l p l a y a r o l e i n c a l c i u m a n d p h O S p h o r u s h o m e o s t a s i s i n t h e b o d y . I n t h e s m a l l i n t e s t i n e , c a l c i t r i o l s t i m u l a t e s t h e a c t i v e t r a n s p o r t o f c a l c i u m a n d p h o s p h o r u s f r o m t h e l u m e n o f t h e i n t e s t i n e t o t h e b l o o d . A n i n d e p e n d e n t a c t i v e p h o s p h a t e t r a n s p o r t i s a l s o s t i m u l a t e d t h r o u g h o u t t h e s m a l l a n d l a r g e b o w e l s ( H e n d y , 1 9 9 7 ) - A d o s e o f c a l c i t r i o l c a u s e s a b i p h a s i c c a l c i u m t r a n s p o r t r e s p o n s e t h a t h a s t w o P h a s e s , t h e fi r s t p e a k i n g a t 6 h o u r s a n d t h e s e c o n d m a i n t a i n i n g e l e v a t e d c a l c i u m t r a n s p o r t 5 5 1 , 2 5 ( 0 H ) 2 D 3 P T H M i n e r a l i z a t i o n 9 M u s c u l a r F i g - . - r e 3 - 2 : D i a g r a m m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e p h y s i o l o g i c a l a c t i o n s o f v i t a m i n D s h o w i n g d i f f e r e n t o r g a n s a n d h o r m o n e s i n v o l v e d i n c a l c i u m h o m e o s t a s i s ( M c C r a r y a n d D e L u c a , 1 9 9 9 ) . 5 6 { ‘ 7 { 3 ‘ c a l c i u m a n d p h o s p h o r u s a r e m o b i l i z e d f r o m b o n e b y c a l c i t r i o l a n d p a r a t h y r o i d h o r m o n e f o r s e v e r a l d a y s ( H e n d y , 1 9 9 7 ) . T h e m e c h a n i s m r e s p o n s i b l e f o r t h e m o v e m e n t o f c a l c i u m i o n s i s n o t c l e a r , b u t i t i s k n o w n t h a t c a l c i t r i o l c a u s e s a b i - d i r e c t i o n a l fl u x o f c a l c i u m i o n s t h r o u g h o u t t h e s m a l l i n t e s t i n e , a p r o c e s s c o m p o s e d o f t h r e e c o m p o n e n t s : 1 ) u p t a k e o f c a l c i u m i o n s f r o m t h e i n t e s t i n a l l u m e n a t t h e m i c r o v i l l u s b o r d e r ; 2 ) t r a n s l o c a t i o n o f i o n s a c r o s s t h e c e l l t o t h e b a s o l a t e r a l m e m b r a n e ; a n d 3 ) a c t i v e e x t r u s i o n o f i o n s i n t o t h e c i r c u l a t i o n ( C o m b s , 1 9 9 8 ) . T h r o u g h t h e s e a c t i o n s o f c a l c i u m a n d p h o s p h o r u s t r a n s p o r t , c o m p l e t e s k e l e t a l m i n e r a l i z a t i o n o c c u r s d u e t o t h e i n d i r e c t a n a b o l i c e f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n b o n e ( M c C r a r y a n d D e L u c a , 1 9 9 9 ) . T h e r o l e o f v i t a m i n D o n b o n e i s c o m p l e x . A c c u m u l a t i n g m o r e t h a n o n e — q u a r t e r o f a s i n g l e d o s e o f v i t a m i n D w i t h i n a f e w h o u r s o f i t s a d m i n i s t r a t i o n , b o n e i s t h e l a r g e s t t a r g e t o r g a n f o r v i t a m i n D ( C o m b s , 1 9 9 8 ) . T h e m e t a b o l i t e s o f v i t a m i n D a r e e s s e n t i a l f o r b o n e f o r m a t i o n b e c a u s e h y p o v i t a m i n o s i s D c a n l e a d t o r i c k e t s o r o s t e o m a l a c i a , b o t h o f w h i c h c a n b e c o r r e c t e d b y e x o g e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f t h e v i t a m i n ( C i v i t e l l i a n d A v i o l i , 1 9 9 5 ) . H o w e v e r , a n e x c e s s o f c a l c i t r i o l c a n i n d u c e b o n e r e s o r p t i o n . A c c o r d i n g l y , b o n e m i n e r a l i z a t i o n a n d d e m i n e r a l i z a t i o n a r e b o t h a f f e c t e d b y v i t a m i n D . B e c a u s e o f t h e i r h i g h l e v e l s o f v i t a m i n D r e c e p t o r s ( V D R ) , o s t e o b l a s t s , c e l l s t h a t l a y d o w n b o n e m i n e r a l , a r e p r o b a b l y t h e m a i n t a r g e t s o f c a l c i t r i o l i n b o n e ( C i v i t e l l i a n d A V i o l i , 1 9 9 5 ) . T h e s y n t h e s i s o f s e v e r a l n o n c o l l a g e n i c p r o t e i n s t h a t a r e i n v o l v e d i n b o n e m a t r i x f o r m a t i o n , c a n b e s t i m u l a t e d b y c a l c i t r i o l . V i t a m i n D a l s o s t i m u l a t e s o s t e o c l a s t - I n e C I i a t e d b o n e r e s o r p t i o n , a p r o c e s s a l s o m e d i a t e d b y c a l c i t r i o l ( C o m b s , 1 9 9 8 ) . T h e h o r m o n e a p p e a r s t o p l a y a r o l e i n t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f m a c r o p h a g e s t o o s t e o c l a s t s , t h e I I I ‘ l l ‘ j t l u c l e a t e d b o n e - d e g r a d i n g c e l l s . W h e n c a l c i u m l e v e l s a r e e x t r e m e l y l o w , b o t h 5 7 V i t a m i n D t fi C l e n Q 1 P 1 H ‘ 1 1 1 M 1 1 1 1 s : m e t ; T h e 1 1 6 3 1 3 1 1 1 c s p h o s p h o r u s . 1 c ? D e l u c i 1 6 1 7 3 1 5 6 5 1 1 p i n p h o m s s e a m m c r s p r e s e m 1 1 1 1 } 1 1 1 . 1 5 1 l m p n 3 U ~ h 1 d m x § 5 ‘ 1 3 : s t e p 1 1 1 m e c h a n i s m w k , ' * d r a i n fl m m - y \ A 1 h ‘ 4 3 1 3 3 1 1 1 1 1 1 I , . - ; ‘ 1 P ) " l ' . ‘ L J 3 X . ‘ l i d } ; 1 3 ‘ 1 " , t h 1 “ ‘ 1 1 D l V D i e t f i a c m i i e n n c D d e fi c i e y o f V i t a m i n n c y a n d e x c e s s D ( P T H ) ( M c C r a r y a n d D e L u c a , 1 9 9 9 ) , a p r o c e s s t h a t h e l p s m a i n t a i n t h e h o m e o s t a s i s o f t h o s e m i n e r a l s i n t h e p l a s m a . T h e k i d n e y i s t h e m a j o r s i t e o f c a l c i t r i o l s y n t h e s i s a n d o f s e v e r a l o t h e r v i t a m i n D d e r i v a t i v e s ( F i g u r e 3 - 3 ) . I n t h e k i d n e y s , i n c r e a s e d r e a b s o r p t i o n o f c a l c i u m , b u t n o t p h o s p h o r u s , f r o m t h e u r i n e i n t o t h e s e r u m i s m e d i a t e d b y c a l c i t r i o l a n d P T H ( M c C r a r y a n d D e L u c a , 1 9 9 9 ) . P T H c a u s e s t h e k i d n e y s t o e x c r e t e p h o s p h o r u s . C a l c i t r i o l i n d i r e c t l y d e c r e a s e s t h e l e v e l s o f P T H i n t h e k i d n e y s t h e r e b y a c t i v a t i n g t h e r e a b s o r p t i o n o f p h o s p h o r u s f r o m t h e u r i n e t o t h e s e r u m ( M c C r a r y a n d D e L u c a , 1 9 9 9 ) . T h e r e i s n o n e t S e r u m i n c r e a s e o f p h o s p h o r u s t h r o u g h t h e a c t i o n o f c a l c i t r i o l a n d P T H w h e n b o t h a r e p r e s e n t i n t h e k i d n e y s , b u t t h e r e i s a n e t i n c r e a s e i n s e r u m c a l c i u m l e v e l s . P e r h a p s t h e m o s t i m p o r t a n t e f f e c t c a l c i t r i o l h a s o n t h e k i d n e y s i s i t s f e e d b a c k i n h i b i t i o n o f 1 a — h y d r o x y l a s e a c t i v i t y a n d t h e a s s o c i a t e d s t i m u l a t i o n o f 2 4 - h y d r o x y l a s e , w h i c h i s t h e F i r s t s t e p i n t h e i n a c t i v a t i o n o f v i t a m i n D m e t a b o l i t e s ( C i v i t e l l i a n d A v i o l i , 1 9 9 5 ) . T h i s m e c h a n i s m c o n t r o l s h o r m o n e s y n t h e s i s a n d i n a c t i v a t e s c i r c u l a t i n g m e t a b o l i t e s , m a i n t a i n i n g a d e q u a t e l e v e l s o f v i t a m i n D i n t h e b o d y . A n u m b e r o f f a c t o r s c o u l d r e s u l t i n v i t a m i n D d e fi c i e n c y : i n a d e q u a t e U V i t ' 1 " 5 ‘ < 1 i < ' = l t i o n o f t h e s k i n , i n s u f fi c i e n t d i e t a r y i n t a k e o f v i t a m i n D , f a i l u r e o f t h e l i v e r 2 5 - h E ’ C I 1 ‘ 5 3 ' E 3 ' l a s e , o r f a i l u r e o f t h e r e n a l h y d r o x y l a s e . A l t h o u g h s u n l i g h t i s t h e m a i n s o u r c e o f v i t a - . . . . . m l n D , i t 1 8 w e l l k n o w t h a t m a n y p e o p l e d o n o t r e c e i v e e n o u g h s o l a r r a d i a t i o n t o 5 8 R E L ’ W ‘ \ \ \ U V l i g h t 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 S k i n 7 - d e h y d r o c h o l e s t e r o l - > P r e - V i t a m i n D , " V i t 8 fl l i n D 3 D i e t 2 5 ( O H ) D , T a r g e t T i s s u e s F i g u r e 3 - 3 : D i a g r a m o f v i t a m i n D 3 m e t a b o l i s m s h o w i n g m e t a b o l i t e s i n v o l v e d a n d o r g a n s w h e r e t h e y a r e s y n t h e s i z e d ( m o d i fi e d f r o m O h m d a h l a n d M a y , 1 9 9 7 ) . 5 9 a l l f 7 . . s u p p o r t a d e q u a t e v i t a m i n D s t a t u s . I f a p e r s o n ' s l i f e s t y l e k e e p s t h e m i n d o o r s o r i f a i r p o l l u t i o n o r c l o t h i n g r e d u c e s t h e e x p o s u r e t o U V l i g h t , e v e n p e o p l e i n s u n n y c l i m a t e s m a y n o t p r o d u c e a d e q u a t e v i t a m i n D . A s a r e s u l t , m o s t p e o p l e s h o w s e a s o n a l v a r i a t i o n s i n 2 5 0 H D 3 l e v e l s , w h i c h , i f n o t c o r r e c t e d b y d i e t a r y m e a n s , c o u l d l e a d t o p e r i o d s o f s u b — o p t i m a l v i t a m i n D s t a t u s . S i n c e m o s t f o o d s c o n t a i n o n l y a s m a l l a m o u n t o f v i t a m i n D , i t i s d i f fi c u l t t o o b t a i n e n o u g h v i t a m i n D f r o m t h e d i e t w i t h o u t t h e c o n s u m p t i o n o f f o r t i fi e d f o o d s . V i t a m i n D d e fi c i e n c y l e a d s p r i m a r i l y t o s k e l e t a l d i s e a s e s , s u c h a s r i c k e t s i n c h i l d r e n a n d o s t e o m a l a c i a i n a d u l t s . T h e a p p e a r a n c e o f a t y p i c a l b o n e d i s e a s e , v i t a m i n D - r e s i s t a n t r i c k e t s , a l s o c a l l e d v i t a m i n D - d e p e n d e n t r i c k e t s , i s a r e s u l t o f a g e n e t i c d i s o r d e r r e l a t e d t o p o i n t m u t a t i o n s i n t h e g e n e f o r t h e V D R ( B o u i l l o n e t a l . , 1 9 9 5 ) . W h e n t h e s e d i s e a s e s a r e d u e t o i n a d e q u a t e v i t a m i n D s u p p l i e s , t h e y a r e d e s c r i b e d a s p r i v a t i o n a l r i c k e t s a n d p r i v a t i o n a l o s t e o m a l a c i a ( C o m b s , 1 9 9 8 ) . R i c k e t s fi r s t a p p e a r s b e t w e e n 6 a n d 2 4 m o n t h s o l d ( F r i e d r i c h , 1 9 8 8 ) . S y m p t o m s i n c l u d e i m p a i r e d b o n e m i n e r a l i z a t i o n , b o n e p a i n , m u s c u l a r t e n d e r n e s s , h y p o c a l c e m i c t e t a n y , d e l a y e d t o o t h e r u p t i o n , n e r v o u s n e s s , i n c r e a s e i n p l a s m a a l k a l i n e p h o s p h a t a s e , a n d a d e c r e a s e i n p l a s m a c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n . O s t e o m a l a c i a i s c h a r a c t e r i z e d b y l o s s o f c a l c i u m a n d p h o s p h a t e f r o m t h e a l r e a d y f o r m e d b o n e . S y m p t o m s a r e s i m i l a r t o r i c k e t s , i . e . m u s c l e w e a k n e s s a n d b o n e t e n d e r n e s s , p a r t i c u l a r l y i n t h e s p i n e , s h o u l d e r , r i b s , o r p e l v i s , b o n e p a i n a n d p o s s i b l e b r o k e n b o n e s . O s t e o m a l a c i a i s c h a r a c t e r i z e d b y a n i n c r e a s e i n t h e r a t i o o f n o n - m i n e r a l i z e d b o n e t o m i n e r a l i z e d b o n e ( C o m b s , 1 9 9 8 ) a n d i s c o m m o n i n w o m e n a f t e r t h e y h a v e g i v e n b i r t h t o s e v e r a l c h i l d r e n ( F r i e d r i c h , 1 9 8 8 ) . H y p o p a r a t h r y r o i d i s m ( l a c k o r 6 0 r e d u c e d p r o d u c t i o n o f P T H ) c a n b e c a u s e d b y r e m o v a l o f o r d i s e a s e o f t h e p a r a t h y r o i d g l a n d . P e o p l e w i t h h y p o p a r a t h y r o i d i s m l a c k t h e s i g n a l ( P T H ) t o r e s p o n d t o h y p o c a l c e m i a a n d a r e u n a b l e t o c o n v e r t 2 5 O H D 3 t o 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 r e s u l t i n g i n d e c r e a s e d l e v e l s o f s e r u m c a l c i u m a n d e l e v a t e d l e v e l s o f s e r u m p h o s p h a t e , o t h e r w i s e k n o w n a s h y p e r p h o s p h a t e m i a . T h e d e fi c i e n c y o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i n i n d i v i d u a l s w i t h h y p o p a r a t h y r o i d i s m i s t h e r e s u l t o f t h e a b s e n c e o f t w o i m p o r t a n t s t i m u l i f o r t h e l a - h y d r o x y l a s e : P T H a n d h y p o p h o s p h a t e m i a ( F r i e d r i c h , 1 9 8 8 ) . O s t e o p o r o s i s , c h a r a c t e r i z e d b y d e c r e a s e d b o n e m a s s w i t h r e t e n t i o n o f n o r m a l h i s t o l o g i c a l a p p e a r a n c e , h a s a l s o b e e n l i n k e d t o v i t a m i n D d e fi c i e n c y i n w o m e n ( C o m b s , I 9 9 8 ) . C e r t a i n d r u g s , s u c h a s a n t i c o n v u l s i v e s u s e d b y e p i l e p t i c p a t i e n t s , h a v e b e e n s h o w n t o c a u s e f u n c t i o n a l v i t a m i n D d e fi c i e n c y . T h e s e d r u g s c a t a b o l i z e 2 5 0 H D 3 a n d 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 r e s u l t i n g i n r e d u c e d c i r c u l a t i n g l e v e l s o f Z S O H D 3 . V i t a m i n D T o x i c i t y E x c e s s i v e a m o u n t s o f v i t a m i n D a r e n o t a v a i l a b l e f r o m n a t u r a l s o u r c e s a n d v i t a m i n D g e n e r a t e d b y t h e a c t i o n o f l i g h t o n t h e s k i n h a s n e v e r l e d t o v i t a m i n D t o x i c i t y ( F r i e d r i c h , 1 9 8 8 ) . V i t a m i n D t o x i c i t y i s n o t a c o m m o n c a u s e o f h y p e r v i t a m i n o s i s . H o w e v e r , v i t a m i n D i n t o x i c a t i o n i s a c o n c e r n i n p a t i e n t s t a k i n g v i t a m i n s u p p l e m e n t s a n d / o r t h o s e b e i n g t r e a t e d w i t h v i t a m i n D f o r h y p o p a r a t h y r o i d i s m , r e n a l o s t e o d y s t r o p h y , v i t a m i n D - r e s i s t a n t r i c k e t s , p s o r i a s i s , o s t e o p o r o s i s , a n d s o m e c a n c e r s . V i t a m i n D t a k e n i n e x c e s s c a n c a u s e p a t h o l o g i c a l c h a n g e s i n t h e b o d y a n d c a n r e s u l t i n i r r e v e r s i b l e c a l c i fi c a t i o n o f s o fi t i s s u e s i n c l u d i n g t h e h e a r t , l u n g s , a n d k i d n e y s . I f a l l o w e d t o g o u n c h e c k e d , d e a t h c o u l d e v e n t u a l l y o c c u r . T h e r e f o r e , i t i s v e r y i m p o r t a n t 6 1 t o d e t e c t f o r e a r l y s i g n s o f v i t a m i n D i n t o x i c a t i o n . S y m p t o m s o f v i t a m i n D t o x i c i t y i n c l u d e e x c e s s c a l c i fi c a t i o n o f b o n e , k i d n e y s t o n e s , h e a d a c h e s , w e a k n e s s , n a u s e a , v o m i t i n g , p o l y u r i a ( p a s s i n g o f l a r g e v o l u m e s o f u r i n e i n a g i v e n t i m e ) , p o l y d i p s i a ( e x c e s s i v e o r a b n o r m a l t h i r s t ) , h y p e r c a l c e m i a ( e l e v a t e d b l o o d c a l c i u m l e v e l s ) , h y p e r c a l c i u r i a ( e l e v a t e d c a l c i u m l e v e l s i n u r i n e ) , a n o r e x i a , j o i n t p a i n , a n d d i s o r i e n t a t i o n . T h e r e a r e s e v e r a l f o r m s o f e x o g e n o u s v i t a m i n D t o x i c i t y . H y p e r v i t a m i n o s i s w i t h h y p e r c a l c e m i a m a y b e s e c o n d a r y i ) t o e x c e s s i v e i n t a k e o f v i t a m i n D m e t a b o l i t e s Z S O H D 3 a n d 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 , o r v i t a m i n D a n a l o g s ; i i ) t o i n c r e a s e d p r o d u c t i o n o f Z S O H D 3 o r 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 f r o m e x o g e n o u s s u b s t r a t e s ; i i i ) a n d e v e n t o t o p i c a l a p p l i c a t i o n s o f p o t e n t v i t a m i n D a n a l o g s ( T h y s - J a c o b s e t a l . , 1 9 9 7 ) . A l t h o u g h r a r e , v i t a m i n D t o x i c i t y c a n a l s o b e c a u s e d b y e n d o g e n o u s f a c t o r s , a s s e e n i n W i l l i a m s s y n d r o m e , a n i d i o p a t h i c i n f a n t i l e f o r m o f h y p e r c a l c e m i a . P a t i e n t s w i t h g r a n u l o m a t o u s d i s e a s e s a r e s a i d t o b e h y p e r s e n s i t i v e t o v i t a m i n D a n d c a n d e v e l o p h y p e r c a l c e m i a w i t h o u t t h e i n t a k e o f e x o g e n o u s h o r m o n e . P o o r l y r e g u l a t e d e x t r a r e n a l s y n t h e s i s o f c a l c i t r i o l b y t h e g r a n u l o m a t o u s t i s s u e i s t h e m a i n c a u s e o f t h i s t y p e o f t o x i c i t y ( T h y s - J a c o b s e t a l . , 1 9 9 7 ) . D i s e a s e s a s s o c i a t e d w i t h t h i s f o r m o f v i t a m i n D t o x i c i t y i n c l u d e s a r c o i d o s i s a n d t u b e r c u l o s i s . E n d o g e n o u s e t i o l o g i e s m a y a l s o r e s u l t f r o m e c t o p i c p r o d u c t i o n o f c a l c i t r i o l i n l y m p h o m a . T h i s i s a s s o c i a t e d w i t h d i s e a s e s s u c h a s H o d g k i n ’ s d i s e a s e a n d n o n - H o d g k i n ’ s l y m p h o m a . T h e v i t a m i n D p a r e n t c o m p o u n d , v i t a m i n D 3 ( c h o l e c a l c i f e r o l ) , 2 5 0 H D 3 ( 2 5 - h y d r o x y c h o l e c a l c i f e r o l ) , o r 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ( c a l c i t r i o l ) a r e t h r e e f o r m s o f v i t a m i n D t h a t c o u l d c a u s e v i t a m i n D t o x i c i t y i n i n d i v i d u a l s . B e c a u s e o f t h e i r e x t e n s i v e l i p i d s o l u b i l i t y i n t h e l i v e r , m u s c l e , a n d f a t t i s s u e s , v i t a m i n D 2 a n d v i t a m i n D 3 t o x i c i t y i s m o r e d i f fi c u l t 6 2 t o m a n a g e t h a n t o x i c i t y o f t h e m e t a b o l i t e s Z S O H D 3 a n d 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . A s a r e s u l t , t h e h a l f - l i f e o f v i t a m i n D r a n g e s f r o m s e v e r a l d a y s t o m o n t h s , w h e r e a s t h e h a l f - l i v e s o f 2 5 0 H D 3 a n d 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 a r e 2 5 d a y s a n d 1 0 h o u r s , r e s p e c t i v e l y ( T h y s - J a c o b s e t a l . , 1 9 9 7 ) . S i n c e t h e d u r a t i o n o f t o x i c i t y i s r e l a t e d t o t h e h a l f - l i f e o f t h e c o m p o u n d , h y p e r c a l c e m i a c a n p e r s i s t f o r w e e k s d u e t o a n o v e r d o s e o f t h e p a r e n t v i t a m i n D c o m p o u n d f o r a s l o n g a s 1 8 m o n t h s d u e t o i t s s l o w r e l e a s e f r o m f a t d e p o t s a n d a n o v e r d o s a g e o f 2 5 0 H D 3 . I n c o n t r a s t , 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i s n o t s t o r e d i n a p p r e c i a b l e a m o u n t s i n t h e b o d y , t h e r e f o r e , e x c e s s i v e t o x i c i t y o f t h i s m e t a b o l i t e i s m o r e r a p i d l y r e v e r s e d ( T h y s - J a c o b s e t a l . , 1 9 9 7 ) . M u l t i p l e f a c t o r s , i n c l u d i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e v i t a m i n D m e t a b o l i t e s , v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) n u m b e r , a c t i v i t y o f l a - h y d r o x y l a s e , t h e m e t a b o l i c d e g r a d a t i o n p a t h w a y , a n d t h e c a p a c i t y o f t h e v i t a m i n D b i n d i n g p r o t e i n ( D B P ) , a l l i n fl u e n c e t h e s u s c e p t i b i l i t y o f a n i n d i v i d u a l t o v i t a m i n D t o x i c i t y . S y n t h e s i s a n d M e t a b o l i s m o f V i t a m i n D V i t a m i n D c a n b e a c q u i r e d b y i n g e s t i o n o f e i t h e r v i t a m i n D 3 f r o m f o o d s t h a t n a t u r a l l y c o n t a i n i t ( i . e . fi s h l i v e r o i l , s a r d i n e s , o r e g g s ) o r f r o m m i l k a n d d a i r y p r o d u c t s , w h i c h a r e o f t e n f o r t i fi e d w i t h v i t a m i n D 2 o r D 3 . B u t t h e m a i n s o u r c e o f v i t a m i n D 3 i n t h e b o d y c o m e s f r o m e x p o s u r e o f t h e s k i n t o n e a r - U V ( w a v e l e n g t h 2 9 0 - 3 1 5 n m ) l i g h t . H a l f o f t h e p r o - v i t a m i n D 3 c o n t e n t i n h u m a n s k i n i s f o u n d i n t h e d e r m i s a n d t h e o t h e r h a l f i s f o u n d t h e e p i d e r m i s . H o w e v e r , d u r i n g s u n l i g h t e x p o s u r e t h e h i g h - e n e r g y p h o t o n s a r e a b s o r b e d i n t h e e p i d e r m i s a n d g r e a t e r t h a n 9 0 % o f t h e p r e - v i t a m i n D 3 s y n t h e s i s o c c u r s i n t h e e p i d e r m i s ( H o l i c k , 1 9 8 8 ) . P r e - v i t a m i n D 3 i s t h e n c o n v e r t e d t o v i t a m i n D 3 , w h i c h i s t a n s l o c a t e d t o t h e d e r m a l c a p i l l a r y b e d v i a t h e v i t a m i n D - b i n d i n g p r o t e i n . 6 3 T h e r e a c t i o n b e g i n s u p o n e x p o s u r e t o s u n l i g h t c a u s i n g e n d o g e n o u s s y n t h e s i s i n t h e s k i n ( s e e F i g u r e 3 - 3 ) w h e r e 7 - d e h y d r o c h o l e s t e r o l ( p r o - v i t a m i n D 3 ) i s c o n v e r t e d t o p r e - v i t a m i n D 3 t h r o u g h a p h o t o s y n t h e t i c r e a c t i o n ( F i g u r e 3 - 4 ) . T h i s r e a c t i o n c a u s e s a c l e a v a g e o f t h e B r i n g o f t h e s t e r o i d s t r u c t u r e t o f o r m p r e - v i t a m i n D 3 , w h i c h i s a t h e r m a l l y u n s t a b l e c o m p o u n d . T h i s i s f o l l o w e d b y a h e a t - c a t a l y z e d p r o c e s s t h a t t a k e s a p p r o x i m a t e l y t h r e e d a y s t o c o m p l e t e . D u r i n g t h i s p r o c e s s , p r e - v i t a m i n D 3 u n d e r g o e s r e a r r a n g e m e n t o f i t s d o u b l e b o n d t o f o r m a m o r e s t a b l e i s o m e r , v i t a m i n D 3 . T h i s n e w s t r u c t u r e i s t e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t a n d f a v o r e d a t b o d y t e m p e r a t u r e . B e c a u s e t h i s c o n v e r s i o n t a k e s t h r e e d a y s , p r e - v i t a m i n D 3 i s s e n s i t i v e t o p h o t o d e g r a d a t i o n b y s u n l i g h t . T w o o t h e r b i o l o g i c a l l y i n e r t p r o d u c t s , l u m i s t e r o l a n d t a c h y s t e r o l ( F i g u r e 3 - 5 ) , a r e p r o d u c e d b y t h e p h o t o l y s i s o f p r e - v i t a m i n D 3 . V i t a m i n D 3 c a n a l s o b e p h o t o l y z e d t o 5 , 6 - t r a n s v i t a m i n D 3 , s u p r a s t e r o l 1 , a n d s u p r a s t e r o l 2 i f i t i s n o t a b l e t o e s c a p e i n t o t h e c i r c u l a t i o n ( H o l i c k , 1 9 8 8 ) . T h u s , b y c a u s i n g p h o t o d e g r a d a t i o n o f p r e - v i t a m i n D 3 a n d v i t a m i n D 3 , s u n l i g h t a p p e a r s t o b e t h e m a j o r f a c t o r t h a t r e g u l a t e s t h e o u t p u t o f v i t a m i n D 3 i n t h e s k i n . V i t a m i n D 3 m u s t b i n d w i t h t h e v i t a m i n D - b i n d i n g p r o t e i n ( D B P ) b e f o r e i t c a n b e t r a n s l o c a t e d i n t o t h e c i r c u l a t i o n . T h e D B P t h e n t r a n s p o r t s t h e v i t a m i n D 3 t o t h e l i v e r w h e r e i t i s h y d r o x y l a t e d a t t h e 2 5 - c a r b o n p o s i t i o n , f o r m i n g 2 5 0 H D 3 . F r o m t h e l i v e r , 2 5 0 H D 3 i s t r a n s p o r t e d , v i a t h e D B P , t o t h e k i d n e y s w h e r e i t g e t s h y d r o x y l a t e d a t t h e l - c a r b o n p o s i t i o n . T h i s fi n a l f o r m , 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 , i s t h e m o s t b i o l o g i c a l l y a c t i v e f o r m o f v i t a m i n D . 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i s t h e n t r a n s p o r t e d t o t h e i n t e s t i n a l m u c o s a l c e l l s , b o n e , a n d s k e l e t a l m u s c l e , o r b a c k t o t h e k i d n e y w h e r e i t i s e i t h e r s t o r e d , u s e d i n t h e r e g u l a t i o n o f c a l c i u m a b s o r p t i o n a n d m o b i l i z a t i o n , o r c a t a b o l i z e d i n t o 2 4 - h y d r o x y l a t e d m e t a b o l i t e s . 6 4 W C — — " ' . " _ ' . \ : U V l i g h t ’ H e a t 2 5 - h y d r o x y l a s e 1 a - h y d r o x y | a s e 7 - d e h y d r o c h o l e s t e r o l P r e - v i t a m i n 0 3 ( C Y P 2 7 A 1 ) V i t a m i n D 3 z s o H o 3 1 2 5 ( Q H } 2 0 3 C h o l e c a l c i f e r o l C a l e l t n o l F i g u r e 3 - 4 : M e t a b o l i s m o f v i t a m i n D 3 s h o w i n g m o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f m e t a b o l i t e s a n d t h e e n z y m e s i n v o l v e d . F i g u r e 3 - 5 : S t r u c t u r e s o f t a c h y s t e r o l ( l e f t ) a n d l u m i s t e r o l ( r i g h t ) . 6 5 C o n v e r s i o n t o 2 5 0 H D 3 O n c e v i t a m i n D 3 e n t e r s t h e c i r c u l a t i o n , i t i s i m m e d i a t e l y t a k e n u p b y a d i p o s e t i s s u e ( J o n e s e t a l . , 1 9 9 8 ) o r t r a n s p o r t e d t o t h e l i v e r w h e r e i t i s h y d r o x y l a t e d a t t h e 2 5 - c a r b o n p o s i t i o n . E a r l y d a t a s u g g e s t e d t h e l i v e r t o b e t h e o n l y l o c a t i o n f o r 2 5 - h y d r o x y l a t i o n , a l t h o u g h s o m e r e p o r t s i n d i c a t e t h i s a c t i v i t y a l s o t a k e s p l a c e i n i n t e s t i n a l a n d r e n a l e x t r a c t s ( J o n e s e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h e 2 5 - h y d r o x y l a t i o n o f v i t a m i n D i s t h e i n i t i a l s t e p i n v i t a m i n a c t i v a t i o n . T h e r e s u l t i s t h e f o r m a t i o n o f t h e m e t a b o l i t e 2 5 0 H D 3 . T h e p r o d u c t i o n o f 2 5 0 H D 3 o c c u r s i n t h e l i v e r a n d i s c a t a l y z e d b y t h e e n z y m e 2 5 - h y d r o x y l a s e . S i m i l a r l y , v i t a m i n D 2 i s m e t a b o l i z e d t o 2 5 0 H D 2 . T h e 2 5 - h y d r o x y l a s e , a c y t o c h r o m e P - 4 5 0 b a s e d e n z y m e , i s f o u n d i n l i v e r m i c r o s o m e s a n d m i t o c h o n d r i a . T h e r e i s s t i l l s o m e c o n t r o v e r s y a s t o w h e t h e r 2 5 - h y d r o x y l a t i o n i s c a r r i e d o u t b y o n e o r t w o e n z y m e s a n d w h e t h e r t h e s e e n z y m e s a r e f o u n d i n t h e m i t o c h o n d r i a l o r m i c r o s o m a l f r a c t i o n s o f t h e l i v e r ( J o n e s e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h e a c t i v i t y o f t h e 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e a p p e a r s t o b e p o o r l y r e g u l a t e d b y t h e h e p a t i c c o n c e n t r a t i o n o f v i t a m i n D a n d t h e r e i s l i t t l e o r n o i n h i b i t i o n o f 2 5 0 H D 3 f o r m a t i o n . T h e m a j o r c i r c u l a t i n g f o r m o f v i t a m i n D 3 , 2 5 0 H D 3 , i s t h e b e s t i n d i c a t o r o f v i t a m i n D s t a t u s . I t i s p r e s e n t i n p l a s m a a t c o n c e n t r a t i o n s t h a t r a n g e f r o m 1 0 - 4 0 n g / m l ( H o l l i s , 1 9 9 7 ) . T h e s t a b i l i t y o f t h e m e t a b o l i t e i s d e p e n d e n t u p o n i t s h i g h a f fi n i t y f o r D B P ( J o n e s e t a l . , 1 9 9 8 ) . A n u r g e n t n e e d f o r c a l c i u m o r a n a b u n d a n c e o f c a l c i u m r e s u l t s i n t h e l a - h y d r o x y l a t i o n o r t h e 2 4 - h y d r o x y l a t i o n o f t h i s m e t a b o l i t e , r e s p e c t i v e l y . T h e r e f o r e , t h e m e t a b o l i c f a t e o f 2 5 0 H D 3 i s d e p e n d e n t o n t h e c a l c i u m r e q u i r e m e n t s o f t h e a n i m a l . I t w a s r e c e n t l y d i s c o v e r e d t h a t m e g a l i n , a m e m b e r o f t h e L D L r e c e p t o r s u p e r f a m i l y w h i c h 6 6 i s p r e s e n t i n t h e a p i c a l s u r f a c e r e n a l p r o x i m a l t u b u l a r c e l l s a n d n e u r o e p i t h e l i u m , i s e s s e n t i a l t o d e l i v e r 2 5 0 H D 3 f o r t h e g e n e r a t i o n o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ( C h r i s t a k o s e t a l . , 2 0 0 3 ) . C o n v e r s i o n t o 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 T h e s e c o n d s t e p o f a c t i v a t i o n , l a - h y d r o x y l a t i o n , o c c u r s m a i n l y i n t h e k i d n e y ( J o n e s , 1 9 9 9 ) . 2 5 0 H D 3 g e t s h y d r o x y l a t e d a t t h e l - c a r b o n p o s i t i o n o f t h e A r i n g t o y i e l d 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . T h e r e a c t i o n i s c a t a l y z e d b y t h e l a - h y d r o x y l a s e e n z y m e , w h i c h i s l o c a t e d p r i m a r i l y i n t h e r e n a l c o r t i c a l m i t o c h o n d r i a ( C o m b s , 1 9 9 8 ) o f t h e p r o x i m a l a n d s t r a i g h t t u b u l e s i n t h e k i d n e y ( C h r i s t a k o s e t a l . , 2 0 0 3 ) . S e v e r a l s t u d i e s i n d i c a t e e x t r a r e n a l l a - h y d r o x y l a s e a c t i v i t y i n n o n c a n c e r o u s p r o s t a t i c c e l l s a n d s o m e p r o s t a t e c a r c i n o m a c e l l s ( S c h w a r t z e t a l . , 1 9 9 8 ) , l y m p h o c y t e s a n d a l v e o l a r m a c r o p h a g e s ( Y l i k o m i e t a l . , 2 0 0 2 ) , s k i n ( H o r s t a n d R e i n h a r d t , 1 9 9 7 ) , b o n e , l i v e r , p a n c r e a s , c o l o n , p a r a t h y r o i d s , a d r e n a l m e d u l l a , a n d c e r e b e l l u m ( H e w i s o n e t a l , 2 0 0 0 ) . T h e l a - h y d r o x y l a s e b e l o n g s t o a c l a s s o f e n z y m e s k n o w n a s t h e m i x e d - fi a n c t i o n o x i d a s e s , w h i c h u s e m o l e c u l a r o x y g e n a s t h e o x y g e n s o u r c e i n s t e a d o f w a t e r . I t h a s b e e n k n o w n f o r s o m e t i m e t h a t t h i s e n z y m e i s c o m p o s e d o f t h r e e p r o t e i n s : 1 ) a c y t o c h r o m e P - 4 5 0 , 2 ) f e r r e d o x i n , a n d 3 ) f e r r e d o x i n r e d u c t a s e f o r a c t i v i t y ( J o n e s , 1 9 9 9 ) . T h e s y n t h e s i s o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 f r o m 2 5 0 H D 3 b y l a - h y d r o x y l a s e i s a s t r i c t l y c o n t r o l l e d p r o c e s s . T h u s , a c t i v i t y o f t h e l a - h y d r o x y l a s e e n z y m e r e g u l a t e s t h e v i t a m i n D e n d o c r i n e s y s t e m . T h i s i s d o n e b y s e v e r a l f a c t o r s , i n c l u d i n g 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 , p a r a t h y r o i d h o r m o n e ( P T H ) , c a l c i t o n i n ( C T ) , a n d c i r c u l a t i n g l e v e l s o f c a l c i u m a n d p h o s p h a t e ( C o m b s , 1 9 9 8 ) . T h e l a - h y d r o x y l a s e e n z y m e i s f e e d b a c k - i n h i b i t e d b y 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 a n d i s s t i m u l a t e d b y p r o l a c t i n , h y p o c a l c e m i a , a n d h y p o p h o s p h a t e m i a ( C o m b s , 1 9 9 8 ) . T h i s 6 7 m e a n s t h a t w h e n c i r c u l a t i n g l e v e l s o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 a r e l o w , t h e p r o d u c t i o n o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i n t h e k i d n e y i s h i g h , a n d w h e n c i r c u l a t i n g l e v e l s o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 a r e h i g h , t h e s y n t h e s i s o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i s l o w ( C o m b s , 1 9 9 8 ; C o l l i n s a n d N o r m a n , 1 9 9 1 ) . P a r a t h y r o i d h o r m o n e ( P T H ) t r e a t m e n t h a s b e e n s h o w n t o s t i m u l a t e l a - h y d r o x y l a s e ( B r e n z a a n d D e L u c a , 2 0 0 0 ) , w h i c h i n c r e a s e s t h e p r o d u c t i o n o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i n r e s p o n s e t o h y p o c a l c e m i a ( F i g u r e 3 - 6 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t t h e m o d u l a t i o n o f t h e h o r m o n e 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i s b a s e d o n t h e c a l c i u m n e e d s o f t h e o r g a n i s m . S y n t h e s i s o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 c a n a l s o b e r e g u l a t e d b y p r o l a c t i n , c a l c i t o n i n , s e x s t e r o i d s , t h y r o i d h o r m o n e , a n d g l u c o c o r t i c o i d s ( H e n r y , 1 9 9 7 ) . C o n v e r s i o n t o 2 4 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 A l s o p r o d u c e d i n t h e k i d n e y , 2 4 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i s a s e c o n d d i h y d r o x y l a t e d m e t a b o l i t e o f v i t a m i n D 3 . T h i s m e t a b o l i t e i s t h e s e c o n d m o s t a b u n d a n t c i r c u l a t i n g m e t a b o l i t e o f v i t a m i n D ( F r i e d r i c h , 1 9 8 8 ) . T h e e n z y m e t h a t c a t a l y z e s t h e r e a c t i o n o f v i t a m i n D t o t h i s m e t a b o l i t e , k n o w n a s 2 4 - h y d r o x y l a s e , h a s b e e n f o u n d i n a l l t i s s u e s t h a t c o n t a i n V D R s . T h e 2 4 - h y d r o x y l a t i o n o f 2 5 0 H D 3 a n d 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i s t h e fi r s t s t e p i n a m e t a b o l i c p a t h w a y t o i n a c t i v a t e a n d d e g r a d e t h e s e v i t a m i n D m e t a b o l i t e s ( H o r s t a n d R e i n h a r d t , 1 9 9 7 ) . S i m i l a r t o t h e l a - h y d r o x y l a s e e n z y m e , 2 4 - h y d r o x y 1 a s e i s a P - 4 5 0 - d e p e n d e n t e n z y m e t h a t r e q u i r e s N A D P H . U n l i k e l o r - h y d r o x y l a s e , 2 4 - h y d r o x y l a s e i s i n c r e a s e d b y h y p e r c a l c e m i a a n d h y p e r p h o s p h a t e m i a a n d i s s t r o n g l y i n d u c e d b y 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ( C o m b s , 1 9 9 8 ) . I t i s p r o d u c e d u n d e r c o n d i t i o n s o f v i t a m i n D a d e q u a c y a n d n o r m a l c a l c i u m 6 8 L o w S e r u m P h o s p h o r u s I P a r a t h y r o i d H o r m o n e ( — L o w S e r u m C a l c l u m F i g u r e 3 - 6 : R e g u l a t i o n o f l a - h y d r o x y l a s e a n d 2 4 - h y d r o x y 1 a s e i n t h e k i d n e y . T h e r e c r i p r o c a l r e g u l a t i o n o f t h e 1 0 t - a n d 2 4 - h y d r o x y l a s e e n z y m e s b y s e r u m c a l c i u m , s e r u m p h o s p h o r u s , P T H , a n d 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ( m o d i fi e d f r o m M c C r a r y a n d D e L u c a , 1 9 9 7 ) . h o m e o s t a s i s a n d i t a l s o i n h i b i t s t h e s t i m u l a t o r y e f f e c t o f P T H o n b o n e r e s o r p t i o n ( C o m b s , 1 9 9 8 ) . I t h a s r e c e n t l y b e e n s h o w n t h a t P T H r e g u l a t e s 2 4 - h y d r o x y l a s e a c t i v i t y b y r e d u c i n g i t s h a l f - l i f e 4 . 2 - f o l d , t h e r e b y d e c r e a s i n g t h e s t a b i l i t y o f t h e e n z y m e ( Z i e r o l d e t a l . , 2 0 0 3 ) . C h e m i c a l a n d P h y s i c a l P r o p e r t i e s S t r u c t u r e V i t a m i n D i s t h e i n c l u s i v e t e r m t h a t r e f e r s t o s t e r o i d s t h a t p o s s e s s a n t i r a c h i t i c a c t i v i t y . T h e s t r u c t u r e s o f e r g o c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 2 ) a n d c h o l e c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 3 ) a r e p r e v i o u s l y s h o w n i n F i g u r e 3 — 1 . T h e c l e a v a g e o f t h e 9 , 1 0 b o n d ( r i n g B ) m u s t o c c u r i n o r d e r f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e p r e - v i t a m i n D f o r m s fi o m t h e p r o - v i t a m i n s , 6 9 7 — d e h y d r o c h o l e s t e r o l a n d e r g o s t e r o l . T h e s e v i t a m i n s t r u c t u r e s w i t h o p e n r i n g s a r e k n o w n a s s e c o s t e r o i d s . T h e o n l y s t r u c t u r a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n e r g o c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 2 ) a n d c h o l e c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 3 ) a r e a d o u b l e b o n d a n d a n a d d i t i o n a l m e t h y l g r o u p i n t h e s i d e c h a i n o f v i t a m i n D ( E i t e n m i l l e r a n d L a n d e n , 1 9 9 9 ) . T h e s i m i l a r i t y i n c h e m i c a l a n d p h y s i c a l p r o p e r t i e s i s d u e t o t h e i r s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y . T h r o u g h x - r a y c r y s t a l l o g r a p h i c w o r k i t w a s d i s c o v e r e d t h a t t h e d i e n e s y s t e m o f v i t a m i n D t h a t e x t e n d s f r o m O S t o O S i s t r a n s o i d a n d n e a r l y p l a n a r b u t t h e C - 6 t o C - 1 9 d i e n e s y s t e m i s c i s o i d a n d i s n o t p l a n a r ( C o l l i n s a n d N o r m a n , 1 9 9 1 ) . T h e C - 1 0 t o C - l 9 d o u b l e b o n d i s t w i s t e d o u t o f t h e p l a n e b y 6 0 ° r e s u l t i n g i n t h e A r i n g u n d e r g o i n g r a p i d i n t e r c o n v e r s i o n b e t w e e n t h e t w o p o s s i b l e c h a i r c o n f o r m a t i o n s , a c h a r a c t e r i s t i c u n i q u e t o t h e v i t a m i n D m o l e c u l e ( C o l l i n s a n d N o r m a l , 1 9 9 1 ) . I t i s a l s o k n o w n t h a t t h e C a n d D r i n g s a r e r i g i d a n d t h a t t h e s i d e c h a i n p r e f e r s a n e x t e n d e d c o n fi g u r a t i o n ( C o l l i n s a n d N o r m a n , 1 9 9 1 ) . N o m e n c l a t u r e T h e n o m e n c l a t u r e r u l e s o f t h e I n t e r n a t i o n a l U n i o n o f P u r e a n d A p p l i e d C h e m i s t s ( I U P A C ) f o r s t e r o i d s t r u c t u r e a r e u s e d t o c h a r a c t e r i z e t h e r i n g s y s t e m . C h o l e s t e r o l s e r v e s a s t h e p a r e n t c o m p o u n d a n d t h e A , B , C , a n d D r i n g s a r e d e r i v e d f r o m t h e c y c l o p e n t a n o p e r h y d r o p h e n a n t h r e n e s t e r o i d s t r u c t u r e ( F i g u r e 3 - 7 ) . B e c a u s e o f t h e fi s s i o n o f t h e B r i n g , v i t a m i n D i s d e s i g n a t e d a s a s e c o - s t e r o i d . T h e f o r m a l n a m e f o r v i t a m i n D 3 7 0 1 0 2 1 4 8 1 5 1 2 1 7 1 3 4 6 F i g u r e 3 - 7 : S t e r o i d n u c l e u s s t r u c t u r e o f c y c l o p e n t a n o p e r h y d r o p h e n a n t h r e n e ( E i t e n m i l l e r a n d L a n d e n , 1 9 9 9 ) . i s 9 , 1 0 - s e c o ( S Z , 7 E ) - 5 , 7 , 1 0 ( 1 9 ) — c h o l e s t a t r i e n e - 3 B - o l a n d t h e f o r m a l n a m e f o r v i t a m i n D 2 i s 9 , 1 0 - s e c o ( 5 Z , 7 E ) - 5 , 7 , l 0 ( 1 9 ) , 2 1 - e r g o s t a t e t r a e n e ~ 3 [ 3 - o l . S p e c t r a l P r o p e r t i e s V i t a m i n D d o e s n o t fl u o r e s c e . A l l f o r m s o f v i t a m i n D s h o w a c h a r a c t e r i s t i c b r o a d U V s p e c t r u m w i t h m a x i m u m a b s o r p t i o n n e a r 2 6 4 n m a n d a m i n i m u m n e a r 2 2 8 n m ( C o l l i n s a n d N o r m a n , 1 9 9 1 ; F r i e d r i c h , 1 9 8 8 ) . 7 1 S t a b i l i t y , L i g h t S e n s i t i v i t y , a n d S o l u b i l i t y V i t a m i n D i s s t a b l e i n t h e a b s e n c e o f w a t e r , l i g h t , a c i d i t y , a n d a t l o w t e m p e r a t u r e s . W h e n e x p o s e d t o l i g h t o r u n d e r a c i d i c c o n d i t i o n s , v i t a m i n D i s o m e r i z e s t o t h e 5 , 6 — t r a n s - i s o m e r a n d i s o t a c h y s t e r o l ( E i t e n m i l l e r a n d L a n d e n , 1 9 9 9 ) . V i t a m i n D i s s t a b l e i n a l k a l i n e c o n d i t i o n s . S a p o n i fi c a t i o n i s o f t e n u s e d a s t h e i n i t i a l t r e a t m e n t o f s a m p l e f o r e x t r a c t i o n o f c o m p l e x m a t r i c e s . V i t a m i n D i s l e s s s u s c e p t i b l e t o o x i d a t i v e l o s s e s t h a n v i t a m i n E , B - c a r o t e n e , a n d r e t i n o l b u t o x i d a t i o n c a n b e a p r e d o m i n a n t r o u t e f o r d e c o m p o s i t i o n a t t h e c o n j u g a t e d d o u b l e b o n d s a t t h e 5 , 6 a n d 7 , 8 p o s i t i o n s . V i t a m i n D w i l l u n d e r g o o x i d a t i o n i f e x p o s e d t o a i r f o r 2 4 - 7 2 h o u r s a n d i t i s b e s t s t o r e d i n e v a c u a t e d a m p u l e s a t 0 ° C . A n a l y t i c a l m e t h o d s a c c o u n t f o r a l l b i o l o g i c a l l y a c t i v e f o r m s t o a c c u r a t e l y a s s e s s v i t a m i n D a c t i v i t y s i n c e v a r i o u s e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s c a n c a u s e i s o m e r i z a t i o n o f v i t a m i n D 2 a n d v i t a m i n D 3 t o t h e p r e - v i t a m i n D f o r m s . V i t a m i n D i n f o r t i fi e d f o o d s i s q u i t e s t a b l e . S t u d i e s h a v e s h o w n t h a t w h e n v i t a m i n D 3 i n f o r t i fi e d f o o d s w a s e x p o s e d t o l i g h t , a i r , a n d e x t r e m e t e m p e r a t u r e s ( u p t o 1 4 9 ° C ) , t h e v i t a m i n s h o w e d o n l y s l i g h t l o s s , w a s n o t a f f e c t e d , a n d d i d n o t p r o d u c e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t l o s s e s , r e s p e c t i v e l y ( E i t e n m i l l e r a n d L a n d e n , 1 9 9 9 ) . V i t a m i n D i s s o l u b l e i n a v a r i e t y o f s o l v e n t s i n c l u d i n g a c e t o n e , e t h y l a l c o h o l , b e n z e n e , c h l o r o f o r m , a n d e t h e r a n d p e t r o l e u m e t h e r . I t i s m o d e r a t e l y s o l u b l e i n f a t s a n d o i l s . V i t a m i n D i s i n s o l u b l e i n w a t e r . 7 2 G e n e r a l P r o p e r t i e s o f V i t a m i n D V i t a m i n D 2 a n d D 3 a r e w h i t e ( C o l l i n s a n d N o r m a n , 1 9 9 1 ) t o y e l l o w i s h ( F r i e d r i c h , 1 9 8 8 ) p o w d e r s . V i t a m i n D 2 h a s a m e l t i n g p o i n t o f 1 2 1 ° C a n d c o n t a i n s f o u r d o u b l e b o n d s w h i l e v i t a m i n D 3 c o n t a i n s t h r e e d o u b l e b o n d s a n d h a s a m e l t i n g p o i n t o f 8 4 - 8 5 ° C . V i t a m i n D 3 h a s a m o l e c u l a r w e i g h t o f 3 8 4 . 6 5 a n d i s i n t h e f o r m o f fi n e n e e d l e s . C o n c l u s i o n T h r o u g h i t s b i o l o g i c a l l y a c t i v e m e t a b o l i t e 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 , v i t a m i n D i s k n o w n t o a c t o n b o n e a n d i n t e s t i n e t o m a i n t a i n c a l c i u m h o m e o s t a s i s . I t i s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t b i o l o g i c a l r e g u l a t o r s o f c a l c i u m m e t a b o l i s m a n d , a l o n g w i t h t h e p e p t i d e h o r m o n e s c a l c i t o n i n a n d p a r a t h y r o i d h o r m o n e , i t i s r e s p o n s i b l e f o r t h e m i n u t e - t o - m i n u t e m a i n t e n a n c e o f c a l c i u m a n d p h o s p h o r u s h o m e o s t a s i s i n t h e b o d y . V i t a m i n D e x i s t s i n t w o f o r m s , v i t a m i n D 2 a n d v i t a m i n D 3 , b o t h o f w h i c h p o s s e s a n t i r a c h i t i c a c t i v i t y . P r e c u r s o r s t o v i t a m i n D a r e s y n t h e s i z e d i n t h e s k i n a n d , s u b s e q u e n t l y , i n t h e l i v e r a n d k i d n e y s , t o t h e h o r m o n e 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . F r o m t h e k i d n e y s t h i s h o r m o n e i s t r a n s p o r t e d , v i a t h e b l o o d s t r e a m , t o i t s t a r g e t o r g a n s . S e v e r a l d i s e a s e s c a n a r i s e f r o m b o t h a v i t a m i n D d e fi c i e n c y a n d v i t a m i n D t o x i c i t y . N u m e r o u s s t u d i e s h a v e b e e n c o n d u c t e d i n a t t e m p t s t o f u l l y c h a r a c t e r i z e t h e v i t a m i n D s t e r o i d h o r m o n e . V i t a m i n D i s a r e m a r k a b l e m o l e c u l e b u t i t i s t a k e n f o r g r a n t e d b y m o s t i n d i v i d u a l s . H o p e f u l l y w i t h a l l t h e r e c e n t i n t e r e s t i n v i t a m i n D p e o p l e w i l l r e a l i z e h o w i m p o r t a n t i t i s a n d b e g i n t o a p p r e c i a t e t h i s g i f t f r o m t h e s u n . 7 3 R e f e r e n c e s B o u i l l o n , R . , O k a m u r a , W . H . , a n d N o r m a n , A . W . : S t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s i n t h e v i t a m i n D e n d o c r i n e s y s t e m . E n d o c r i n e R e v . 1 6 : 2 0 0 - 2 5 7 , 1 9 9 5 . C h e n , T . C . : P h o t o b i o l o g y o f v i t a m i n D . I n : H o l i c k , M . F . ( e d ) : “ V i t a m i n D : P h y s i o l o g y , m o l e c u l a r b i o l o g y , a n d c l i n i c a l a p p l i c a t i o n s ” T o t o w a , H u m a n a P r e s s , p p . 1 7 - 3 7 , 4 5 8 p p . , 1 9 9 9 . C h r i s t a k o s , S . , D h a w a n , P . , L i u , Y . , P e n g , X . , a n d P o r t a , A . : N e w i n s i g h t s i n t o t h e m e c h a n i s m s o f v i t a m i n D a c t i o n . J . C e l l . B i o c h e m . 8 8 : 6 9 5 - 7 0 5 , 2 0 0 3 . C i v i t e l l i , R . a n d A v i o l i , L . V . : T h e b i o c h e m i s t r y a n d fi i n c t i o n o f c a l c i o t r o p i c h o r m o n e s . I n : C r a s s , M . F . a n d A v i o l i , L . V . ( e d s ) : “ C a l c i u m - r e g u l a t i n g h o r m o n e s a n d c a r d i o v a s c u l a r f u n c t i o n ” B o c a R a t o n , C R C P r e s s , p p . 1 - 4 4 , 3 3 0 p p . , 1 9 9 5 . C o l l i n s , E D . a n d N o r m a n , A . W . : V i t a m i n D . I n : M a c h l i n , L . J . ( e d ) : “ H a n d b o o k o f v i t a m i n s ” N e w Y o r k , M a r c e l D e k k e r , I n c . , p p . 5 9 - 9 8 , 5 9 5 p p . , 1 9 9 1 . C o m b s , G . F . : V i t a m i n D . I n : T h e v i t a m i n s : F u n d a m e n t a l a s p e c t s i n n u t r i t i o n a n d h e a l t h . S a n D i e g o , A s s o c i a t e d P r e s s , p p . 1 5 5 - 1 8 7 , 6 1 8 p p . , 1 9 9 8 . D e L u c a , F . H . : H i s t o r i c a l o v e r v i e w . I n : F e l d m a n , D . , G l o r i e u x , R H , a n d P i k e , J . W . ( e d s ) : “ V i t a m i n D ” S a n D i e g o , A c a d e m i c P r e s s , p p . 3 - 1 1 , 1 2 8 5 p p . , 1 9 9 7 . E i t e n m i l l e r , R R . a n d L a n d e n , W . O . : V i t a m i n a n a l y s i s f o r t h e h e a l t h a n d f o o d s c i e n c e s . B o c a R a t o n , C R C P r e s s , p p . 7 7 - 1 0 7 , 5 1 8 p p . , 1 9 9 9 . F r i e d r i c h , W . : V i t a m i n s . N e w Y o r k , W a l t e r d e G r u y t e r , p p . 1 4 1 - 2 1 6 , 1 0 5 8 p p . , 1 9 8 8 . H e n d y , G . N . : C a l c i u m - r e g u l a t i n g h o r m o n e s : v i t a m i n D a n d p a r a t h y r o i d h o r m o n e . I n : C o n n , R M . a n d M e l m e d , S . ( e d s ) : “ E n d o c r i n o l o g y : B a s i c a n d c l i n i c a l p r i n c i p l e s ” T o t o w a , H u m a n a P r e s s , p p . 3 0 7 - 3 2 3 , 4 4 8 p p . , 1 9 9 7 . H e w i s o n , M . , Z e h n d e r , D . , B l a n d , R . , a n d S t e w a r t , P . M . : 1 a l p h a - h y d r o x y l a s e a n d t h e a c t i o n o f v i t a m i n D . J . M o l . E n d o c r i n o l . 2 5 : 1 4 1 - 1 4 8 , 2 0 0 0 . H o l i c k , M . F . : S k i n : S i t e o f s y n t h e s i s o f v i t a m i n D a n d a t a r g e t t i s s u e f o r t h e a c t i v e f o r m , 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . A n n . N e w Y o r k A c a d . S c i . 5 4 8 : 1 4 - 2 6 , 1 9 8 8 . H o l l i s , B . W . : D e t e c t i o n o f v i t a m i n D a n d i t s m a j o r m e t a b o l i t e s . I n : F e l d m a n , D . , G l o r i e u x , F . H . , a n d P i k e , J . W . ( e d s ) : “ V i t a m i n D ” S a n D i e g o , A c a d e m i c P r e s s , p p . 5 8 7 - 6 0 6 , 1 2 8 5 p p . , 1 9 9 7 . 7 4 H o r s t , R . L . a n d R e i n h a r d t , T . A . : V i t a m i n D m e t a b o l i s m . I n : F e l d m a n , D . , G l o r i e u x , F . H . , a n d P i k e , J . W . ( e d s ) : “ V i t a m i n D ” S a n D i e g o , A c a d e m i c P r e s s , p p . 1 3 - 3 1 , 1 2 8 5 p p . , 1 9 9 7 . J o n e s , G . : M e t a b o l i s m a n d c a t a b o l i s m o f v i t a m i n D , i t s m e t a b o l i t e s , a n d c l i n i c a l l y r e l e v a n t a n a l o g s . I n : H o l i c k , M . F . ( e d ) : “ V i t a m i n D : P h y s i o l o g y , m o l e c u l a r b i o l o g y , a n d c l i n i c a l a p p l i c a t i o n s ” T o t o w a , H u m a n a P r e s s , p p . 5 7 - 8 4 , 4 5 8 p p . , 1 9 9 9 . J o n e s , G . , S t r u g n e l l , S . A . , a n d D e L u c a , H . F . : C u r r e n t u n d e r s t a n d i n g o f t h e m o l e c u l a r a c t i o n s o f v i t a m i n D . P h y s i o l . R e v . 7 8 : 1 1 9 3 - 1 2 3 1 , 1 9 9 8 . M c C r a r y , L C . a n d D e L u c a , H . F . : F u n c t i o n a l m e t a b o l i s m a n d m o l e c u l a r b i o l o g y o f v i t a m i n D a c t i o n . I n : H o l i c k , M . F . ( e d ) : “ V i t a m i n D : P h y s i o l o g y , m o l e c u l a r b i o l o g y , a n d c l i n i c a l a p p l i c a t i o n s ” T o t o w a , H u m a n a P r e s s , p p . 3 9 - 5 6 , 4 5 8 p p . , 1 9 9 9 . O m d a h l , J . a n d M a y , B . : T h e 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 2 4 - h y d r o x y l a s e . I n : F e l d m a n , D . , G l o r i e u x , F . H . , a n d P i k e , J . W . ( e d s ) : “ V i t a m i n D ” S a n D i e g o , A c a d e m i c P r e s s , p p . 6 9 - 8 5 , 1 2 8 5 p p . , 1 9 9 7 . S c h w a r t z , G . G . , W h i t l a c h , L . W . , C h e n , T . C . , L o k e s h w a r , B L , a n d H o l i c k , M . F . : H u m a n p r o s t a t e c e l l s s y n t h e s i z e 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 f r o m 2 5 — h y d r o x y v i t a m i n D 3 . C a n c e r E p i d e m i o l . B i o m a r k e r s P r e v . 7 : 3 9 1 - 3 9 5 , 1 9 9 8 . T h y s - J a c o b s , 8 . , C h a n , F . K . W . , K o b e r l e , L . M . C . , a n d B i l e z i k i a n , J . P . : H y p e r c a l c e m i a d u e t o v i t a m i n D t o x i c i t y . I n : F e l d m a n , D . , G l o r i e u x , F . H . , a n d P i k e , J . W . ( e d s ) : “ V i t a m i n D ” S a n D i e g o , A c a d e m i c P r e s s , p p . 8 8 3 - 9 0 1 , 1 2 8 5 p p . , 1 9 9 7 . Y l i k o m i , T . L a a s k i , 1 . , L o u , Y - R . , M a r t k a i n e n , P . , M i e t t i n e n , S . , P e n n a n e n , P . , P u r r n o n e n , S . , S y v a l a , H . , V i e n o n e n , A . , a n d T u o h i m a a , P . : A n t i p r o l i f e r a t i v e a c t i o n o f v i t a m i n D . V i t a m . H o r m . 6 4 : 3 5 7 - 4 0 6 , 2 0 0 2 . Z i e r o l d , C . , M i n g s , J . A . , a n d D e L u c a , H . F . : R e g u l a t i o n o f 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 - 2 4 - h y d r o x y l a s e b y 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 a n d p a r a t h y r o i d h o r m o n e . J . C e l l . B i o c h e m . 8 8 : 2 3 4 - 2 3 7 , 2 0 0 3 . 7 5 C h a p t e r 4 I n t e r m e d i a t e F i l a m e n t s 7 6 A b s t r a c t T h e c y t o s k e l e t o n i s a d y n a m i c s t r u c t u r e t h a t fi l l s t h e c y t o p l a s m o f a l l e u k a r y o t i c c e l l s . I t i s c o m p o s e d o f t h r e e m a i n c l a s s e s , k n o w n a s t h e m i c r o fi l a m e n t s , m i c r o t u b u l e s , a n d t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s . I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t e x p r e s s i o n i s g e n e r a l l y c e l l - t y p e s p e c i fi c w h i c h m a k e s t h e s e fi l a m e n t s v e r y u s e f u l t o o l s i n c e l l t y p e d e t e r m i n a t i o n . T w o i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s t h a t a r e i m p o r t a n t c e l l t y p e m a r k e r s i n t h e p r o s t a t e a r e t h e c y t o k e r a t i n s a n d v i m e n t i n . V i m e n t i n i s n o r m a l l y a m e s e n c h y m a l c e l l i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t b u t i t s e x p r e s s i o n i s s o m e t i m e s o b s e r v e d i n n o r m a l , h y p e r p l a s t i c , a n d c a n c e r o u s p r o s t a t e t i s s u e . V i m e n t i n h a s b e e n s h o w n t o b e a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d c e l l p r o l i f e r a t i o n , a d e c r e a s e i n c e l l d i f f e r e n t i a t i o n , a s w e l l a s i n c r e a s e d m e t a s t a t i c a b i l i t y a n d i n v a s i v e n e s s o f c a n c e r c e l l s . C y t o k e r a t i n s a r e e x p r e s s e d i n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s . C y t o k e r a t i n s 5 , 1 4 a n d 1 5 a r e e x p r e s s e d i n t h e b a s a l c e l l s w h i l e c y t o k e r a t i n s 8 , 1 8 , a n d 1 9 a r e e x p r e s s e d i n t h e s e c r e t o r y c e l l s o f t h e n o r m a l p r o s t a t e . T h e e x p r e s s i o n o f t h e s e c y t o k e r a t i n s i s a g o o d p r o g n o s t i c i n d i c a t o r o f p r o s t a t e c a n c e r . I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s a r e a l s o i n v o l v e d i n c e l l u l a r a p o p t o s i s . I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s a r e u s e f u l t o o l s i n c e l l t y p e d e t e r m i n a t i o n a s w e l l a s t h e d e t e r m i n i n g t h e m e t a s t a t i c a b i l i t y a n d l e v e l o f i n v a s i v e n e s s o f c a n c e r c e l l s . 7 7 I n t r o d u c t i o n T h e c y t o s k e l e t o n fi l l s t h e c y t o p l a s m o f e u k a r y o t i c c e l l s . I t i s a d y n a m i c t h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e t h a t a c t s a s b o t h “ m u s c l e a n d s k e l e t o n , ” f o r m o v e m e n t a n d s t a b i l i t y . T h i s s t r u c t u r e i s c o m p r i s e d o f t h r e e m a i n c l a s s e s o f fi b e r s : l ) m i c r o fi 1 a m e n t s , 2 ) m i c r o t u b u l e s , a n d 3 ) i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s . E a c h c l a s s o f fi b e r i s d i s t i n c t l y d i f f e r e n t w i t h r e g a r d t o i t s s u b c e l l u l a r o r g a n i z a t i o n , c h a r a c t e r i s t i c m o r p h o l o g y , r e l a t i o n s h i p t o d i f f e r e n t c e l l fi i n c t i o n s , r e l a t i v e s t a b i l i t y , a d i s c r e t e p o l y p e p t i d e c o m p o s i t i o n , a n d s p e c i fi c p h y s i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s . I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s h a v e a d i a m e t e r o f a p p r o x i m a t e l y 1 0 n m a n d , a s i n d i c a t e d b y t h e i r n a m e , a r e t h i c k e r t h a n m i c r o fi l a m e n t s ( 7 n m ) b u t t h i n n e r t h a n m i c r o t u b u l e s ( 2 5 n m ) ( B e r s h a d s k y a n d V a s i l i e v , 1 9 8 8 ) . T h e m a j o r s t r u c t u r a l c o m p o n e n t s o f t h e m i c r o fi l a m e n t s a n d m i c r o t u b u l e s a r e h i g h l y c o n s e r v e d i n d i f f e r e n t c e l l t y p e s , w h e r e a s t h e p r o t e i n s o f t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s c a n v a r y g r e a t l y i n a m i n o a c i d s e q u e n c e a n d l e n g t h . T h i s c h a p t e r w i l l c o n c e n t r a t e o n o n l y o n e o f t h e s e c l a s s e s , t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s . I n t e r m e d i a t e F i l a m e n t s I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s a r e a n i m p o r t a n t p a r t o f t h e c y t o s k e l e t a l s y s t e m o f a c e l l . T h e y s t a b i l i z e o r g a n e l l e s , l i k e t h e n u c l e u s , a n d t h e y f o r m a n e t w o r k t h a t g i v e s s h a p e a n d m e c h a n i c a l i n t e g r i t y t o t h e c e l l ( P r a s a d e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h e y a r e a l s o i n v o l v e d i n c e l l l o c o m o t i o n a n d r e c e p t o r m e d i a t e d e n d o c y t o s i s . T h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t n e t w o r k s p r e a d s f r o m t h e c e l l p e r i p h e r y t o t h e n u c l e u s a n d f o r m s d y n a m i c l i n k a g e s b e t w e e n n u c l e a r m a t r i x a n d t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x . 7 8 T h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s a r e c o m p r i s e d o f a l a r g e f a m i l y o f g r e a t e r t h a n 5 0 g e n e p r o d u c t s ( G o l d m a n e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e p o l y m e r i z a t i o n o f t h e s e p r o t e i n s u b u n i t s t o f o r m t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t n e t w o r k i s c o m p l e x , w i t h s o m e b e i n g a b l e t o f o r m a s i n g l e t y p e o f p r o t e i n c h a i n ( h o m o p o l y m e r ) a n d o t h e r s f o r m i n g fi l a m e n t s o n l y w h e n t h e y a r e c o m b i n e d w i t h m o r e t h a n o n e t y p e o f p r o t e i n c h a i n ( h e t e r o p o l y m e r s ) ( G o l d m a n e t a l . , 1 9 9 9 ) . I f d e n a t u r e d , i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s c a n a l s o r a p i d l y a n d s p o n t a n e o u s l y r e f o l d a n d c o i l b a c k i n t o t h e i r o r i g i n a l s h a p e , i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h o s e f o r m e d i n l i v i n g c e l l s ( F r a n k e , 1 9 9 3 ) . T h e l a r g e s t f a m i l y o f t h e c y t o s k e l e t a l p r o t e i n s , t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s , s h a r e s a c o m m o n s t r u c t u r e ( F i g u r e 4 - 1 ) . T h e m o s t c o n s e r v e d r e g i o n o f t h i s s t r u c t u r e i s t h e l o n g , o r - h e l i c a l r o d d o m a i n t h a t c o n s i s t s o f a p p r o x i m a t e l y 3 1 0 a m i n o a c i d s ( G o l d m a n e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h i s d o m a i n , c o n s i d e r e d t o b e t h e b u i l d i n g b l o c k o f t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t , f o r m s c o i l e d - c o i l s i n a s s e m b l e d i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s a n d i s s u b d i v i d e d i n t o f o u r b l o c k s o f h e l i c a l s t r u c t u r e ( 1 A , 1 8 , 2 A , a n d 2 B ) b y s h o r t l i n k e r d o m a i n s ( L 1 , L 1 2 , L 2 ) ( P a r a m i o a n d J o r c a n o , 2 0 0 2 ) . T h i s r o d d o m a i n i s fl a n k e d b y n o n - h e l i c a l d o m a i n s a t t h e N t e r m i n u s ( h e a d ) a n d C t e r m i n u s ( t a i l ) . T h e s e d o m a i n s a r e n o t w e l l c o n s e r v e d a n d h a v e b e e n p o s t u l a t e d t o p r o t r u d e f r o m t h e c o r e o f t h e fi l a m e n t s a n d a r e a s s u m e d t o s p e c i f y t h e p o s s i b l e p o l y p e p t i d e - s p e c i fi c f u n c t i o n s ( P a r a m i o a n d J o r c a n o , 2 0 0 2 ) . B a s e d o n t h e p a t t e r n o f c e l l t y p e s p e c i fi c e x p r e s s i o n ( G o l d m a n e t a 1 , 1 9 9 9 ) , i m m u n o l o g i c a l a n d / o r a s s e m b l y p r o p e r t i e s ( P a r a m i o a n d J o r c a n o , 2 0 0 2 ) , g e n e s t r u c t u r e , a n d s e q u e n c e h o m o l o g y , i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s c a n b e s u b d i v i d e d i n t o 6 c a t e g o r i e s . T y p e s I a n d I I , t h e c y t o k e r a t i n s , c o n t a i n t h e l a r g e s t n u m b e r o f i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s a n d a r e e x p r e s s e d m a i n l y i n e p i t h e l i a l c e l l s . T y p e I I I c o n t a i n s v i m e n t i n , w h i c h i s 7 9 F i g u r e 4 - 1 : C o m m o n s t r u c t u r e o f t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t w i t h a c e n t r a l d o m a i n w i t h f o u r a — h e l i c a l d o m a i n s ( 1 A , 1 8 , 2 A , 2 B ) d i s r u p t e d b y l i n k e r n o n - h e l i c a l d o m a i n s ( L 1 , L 1 2 , L 2 ) , a n d t w o n o n - h e l i c a l d i v e r g e n t d o m a i n s a t t h e a m i n o a n d c a r b o x y t e r m i n u s ( m o d i fi e d f r o m P a r a m i o a n d J o r c a n o , 2 0 0 2 ) . 8 0 e x p r e s s e d i n m e s e n c h y m a l c e l l s , u n d i f f e r e n t i a t e d c e l l s a n d c e l l s i n c u l t u r e , ( C a p e t a n a k i , 1 9 8 4 ) , d e s m i n i s c h a r a c t e r i s t i c o f m u s c l e c e l l s , g l i a l fi b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n ( G F A P ) i s f o u n d i n g l i a l c e l l s , a n d p e r i p h e r i n i s e x p r e s s e d i n c e l l s o f t h e p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m . T y p e I V i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s , w h i c h a r e f o u n d i n t h e n e u r o n s , a r e t h e n e u r o fi l a m e n t s p r o t e i n s a n d a - i n t e r n e x i n . A l t h o u g h t h e m a j o r i t y o f t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s a r e e x p r e s s e d i n t h e c y t o p l a s m , t h e T y p e V p r o t e i n s , t h e l a m i n s , a r e l o c a l i z e d t o t h e n u c l e u s w h e r e t h e y p o l y m e r i z e t o f o r m t h e n u c l e a r l a m i n a ( G o l d m a n e t a l . , 1 9 9 9 ) . T y p e V 1 i s t h e l e a s t c h a r a c t e r i z e d i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n , n e s t i n . T h e c y t o k e r a t i n s a n d v i m e n t i n w i l l b e t h e o n l y t w o i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s d i s c u s s e d i n t h i s c h a p t e r . C y t o k e r a t i n s C y t o k e r a t i n s ( F i g u r e 4 - 2 ) a r e t h e fi r s t i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s t o a p p e a r d u r i n g e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t . T h e y a r e u s u a l l y a r r a n g e d i n t o b u n d l e s c a l l e d t o n o fi b r i l s , w h i c h f o r m a c a g e - l i k e s t r u c t u r e a r o u n d t h e n u c l e u s a n d e x t e n d t o t h e c e l l p e r i p h e r y . C y t o k e r a t i n s a r e t h e h a l l m a r k o f i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s o f e p i t h e l i a l a n d m e s o t h e l i a l c e l l s . I d e n t i fi c a t i o n o f c y t o k e r a t i n s i n c u l t u r e d c e l l s i s a s t a n d a r d m e t h o d t o v e r i f y t h e e p i t h e l i a l n a t u r e o f t h e i n v i t r o p o p u l a t i o n . T h e c y t o k e r a t i n s a r e a m u l t i g e n e f a m i l y o f a b o u t 2 0 b i o c h e m i c a l l y a n d i m m u n o l o g i c a l l y d i s t i n c t y e t c l o s e l y r e l a t e d p o l y p e p t i d e s , w h i c h r a n g e i n m o l e c u l a r w e i g h t f r o m 4 0 t o 7 8 k D a . T h e c y t o k e r a t i n fi l a m e n t s a r e a s s e m b l e d f r o m h e t e r o d i m e r i c s u b u n i t s o f a c i d i c t y p e I c y t o k e r a t i n s ( c y t o k e r a t i n s 9 t o 2 0 ) a n d b a s i c t y p e I I ( c y t o k e r a t i n s 8 1 . . - 2 3 ‘ ‘ L ‘ ‘ F i g u r e 4 - 2 : C u l t u r e P t K c e l l s s t a i n e d w i t h c y t o k e r a t i n a n t i b o d y ( S c h w i l a , 1 9 8 6 ) 8 2 l t o 8 ) i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s ( P a r a m i o a n d J o r c a n o , 2 0 0 2 ) . D i f f e r e n t t y p e s o f e p i t h e l i a l c e l l s c a n b e c h a r a c t e r i z e d b a s e d o n t h e s e a c i d i c a n d b a s i c c y t o k e r a t i n c o m b i n a t i o n s . S i m p l e e p i t h e l i a e x p r e s s c y t o k e r a t i n s 8 a n d 1 8 w i t h v a r i a b l e l e v e l s o f c y t o k e r a t i n 1 9 a n d 2 0 ( Y o o n e t a l . , 2 0 0 1 ) a n d i n s o m e i n s t a n c e s 1 7 a n d 7 ( P a r a m i o a n d J o r c a n o , 2 0 0 2 ) . S t r a t i fi e d e p i t h e l i a e x p r e s s c y t o k e r a t i n s 5 a n d 1 4 i n t h e b a s a l l a y e r , a n d w h e n t h e s e c e l l s b e g i n t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n t h e y m o v e u p w a r d s a n d b e g i n e x p r e s s i n g c y t o k e r a t i n s l a n d 1 0 i n t h e s k i n , c y t o k e r a t i n s 4 a n d 1 3 i n i n t e r n a l s t r a t i fi e d e p i t h e l i a a n d c y t o k e r a t i n s 3 a n d 1 2 i n c o r n e a l c e l l s ( P a r a m i o a n d J o r c a n o , 2 0 0 2 ) . T h e s e p a t t e r n s r e v e a l c l u e s t o t h e l i n e a g e o f a c e l l a n d i t s d i f f e r e n t i a t i o n s t a t u s a n d a l s o i m p l y t h a t c y t o k e r a t i n s m i g h t c a r r y o u t s p e c i fi c f u n c t i o n s i n e p i t h e l i a l c e l l s . T h e p r o s t a t i c l u m i n a l , s e c r e t o r y c e l l s e x p r e s s c y t o k e r a t i n s 8 , 1 8 a n d 1 9 , a n d c y t o k e r a t i n s 5 , 1 4 , 1 5 a n d 1 6 a r e e x p r e s s e d i n t h e p r o s t a t i c b a s a l c e l l s ( T r a u b , 1 9 8 5 ; P e e h l e t a l . , 1 9 9 4 ; S h e r w o o d e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e c y t o k e r a t i n p r o fi l e s i n t h e p r o s t a t e g l a n d a r e a n e x t r e m e l y u s e fi i l d i a g n o s t i c t o o l i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f p r o s t a t e c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a n d t h e l e v e l o f p r o s t a t e c a n c e r . A l b e r t i e t a l . ( 2 0 0 0 ) f o u n d t h a t s e v e r a l c o n s t i t u t i v e c y t o k e r a t i n s ( 8 , 1 8 , a n d 1 9 ) s h o w e d a s t r o n g d o w n r e g u l a t i o n i n p o o r l y d i f f e r e n t i a t e d p r o s t a t e c a n c e r c e l l s , a n d t h e i r e x p r e s s i o n s i g n i fi c a n t l y d e c r e a s e d w i t h r e s p e c t t o b o t h n o r m a l h u m a n p r o s t a t e c e l l s a n d b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a a n d a l s o w i t h r e s p e c t t o m o d e r a t e l y a n d w e l l d i f f e r e n t i a t e d t u m o r s . A d e c r e a s e i n t h e e x p r e s s i o n o f c y t o k e r a t i n s 8 a n d 1 8 i n p r o s t a t e c a r c i n o m a , w h e n c o m p a r e d t o n o r m a l p r o s t a t e , w a s a l s o o b s e r v e d i n a n i m a l m o d e l s ( R a m a e k e r s e t a l . , 1 9 9 4 ) . S h e r w o o d e t a l . ( 1 9 9 0 ) s h o w e d t h a t e s t a b l i s h e d p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s e x p r e s s e d c y t o k e r a t i n s 8 a n d 1 8 b u t n o t c y t o k e r a t i n s 5 , 7 , a n d 1 5 w h i c h w e r e o b s e r v e d i n t h e b e n i g n p r o s t a t e . T h e s e d a t a s u p p o r t t h e b e l i e f t h a t 8 3 p r o s t a t e c a n c e r a r i s e s f r o m t h e l u m i n a l c e l l s o f t h e p r o s t a t e , w h i c h e x p r e s s c y t o k e r a t i n s 8 , 1 8 , a n d 1 9 , a n d n o t f r o m t h e b a s a l c e l l s , w h i c h e x p r e s s c y t o k e r a t i n s 5 , 1 4 , 1 5 a n d I 6 . C o e x p r e s s i o n o f t w o d i f f e r e n t i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s i s k n o w n t o o c c u r . I t h a s b e e n s h o w n i n p r o s t a t e a n d b r e a s t c a n c e r t h a t t h e d o w n - r e g u l a t i o n o f c y t o k e r a t i n i s a s s o c i a t e d w i t h t h e e x p r e s s i o n o f t h e t y p e I I I i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t v i m e n t i n . V i m e n t i n w i l l b e d i s c u s s e d i n t h e n e x t s e c t i o n . V i m e n t i n V i m e n t i n ( F i g u r e 4 - 3 ) i s a 5 4 k D a i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n t h a t i s n o r m a l l y e x p r e s s e d i n c e l l s o f m e s e n c h y m a l o r i g i n , s u c h a s fi b r o b l a s t s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s ( P a r a m i o a n d J o r c a n o , 2 0 0 2 ) a n d c e l l s d e r i v e d f r o m m e s o d e r r n . V i m e n t i n i s t y p i c a l o f o s t e o c y t e s , c h o n d r o c y t e s , m e l a n o c y t e s , L a n g e r h a n c e l l s o f t h e s k i n , a n d m o s t b u t n o t a l l l y m p h a t i c c e l l s ( O s b o r n , 1 9 9 3 ) . I t i s e x p r e s s e d i n n o r m a l a d u l t e p i t h e l i a l c e l l s , n e u r o n a l o r m u s c l e c e l l s ( O s b o r n , 1 9 9 3 ) . I t s e x p r e s s i o n p r e c e d e s t h e e x p r e s s i o n o f o t h e r t y p e I I I p r o t e i n s d u r i n g t h e d i f f e r e n t i a t i o n a n d d e v e l o p m e n t o f n e u r a l c e l l s ( l a t e r r e p l a c e d b y G F A P ) a n d m u s c l e ( l a t e r r e p l a c e d b y d e s m i n ) ( P a r a m i o a n d J o r c a n o , 2 0 0 2 ) . U n l i k e c y t o k e r a t i n s , v i m e n t i n i s c o d e d f o r b y a s i n g l e g e n e . V i m e n t i n i s t h e fi r s t i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t e x p r e s s e d d u r i n g c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . I t c a n b e e x p r e s s e d i n e p i t h e l i a l c e l l s d u r i n g e a r l y d e v e l o p m e n t , w o u n d h e a l i n g , d u r i n g c e l l c u l t u r e , i n o v a r i a n a n d m e s o t h e l i a l e p i t h e l i u m , a n d i n c a r c i n o m a s ( F r a g a e t a l . , 1 9 9 8 ) . S e v e r a l e a r l y s t u d i e s s u g g e s t e d t h a t v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n e p i t h e l i a l c e l l s w a s i n d u c e d b y g r o w i n g t h e c e l l s i n v i t r o , b u t 8 4 F i g u r e 4 - 3 : C u l t u r e P t K c e l l s s t a i n e d w i t h v i m e n t i n a n t i b o d y ( S c h w i l a , 1 9 8 6 ) 8 5 ” ‘ 1 I f ‘ M C 8 1 ! M - e d " a t ! d a t a a r e n o w a c c u m u l a t i n g t o s u g g e s t i n s t e a d t h a t v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n e p i t h e l i a l c e l l s i n v i t r o c o r r e l a t e s w i t h a h i g h d e g r e e o f t r a n s f o r m a t i o n a n d m i g h t b e r e l a t e d t o t u m o r p r o g r e s s i o n ( G i l l e s e t a l . , 1 9 9 6 ) . I n c r e a s e s i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n a r e a s s o c i a t e d w i t h a d e c r e a s e i n c e l l u l a r d i f f e r e n t i a t i o n . T h e r e h a v e b e e n n u m e r o u s s t u d i e s t o s h o w t h e e f f e c t s o f v i m e n t i n e x p r e s s i o n o n t h e m o t i l i t y a n d i n v a s i v e n e s s o f c a n c e r c e l l s . L a n g e t a l . ( 2 0 0 2 ) d e m o n s t r a t e d t h a t v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g m o t i l i t y o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s a n d t h a t v i m e n t i n - p o s i t i v e c e l l s w e r e m o r e l i k e l y t o b e a s s o c i a t e d w i t h p o o r l y d i f f e r e n t i a t e d t u m o r s . F r a g a a n d c o l l e a g u e s ( 1 9 9 8 ) s h o w e d t h a t v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n c r e a s e d s i g n i fi c a n t l y i n e p i t h e l i a l c e l l s o f b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a ( B P H ) w h e n c o m p a r e d t o t h e c e l l s i n t h e a d j a c e n t n o r m a l e p i t h e l i u m . S i n c e s e v e r a l e p i t h e l i a , w h i c h d o n o t e x p r e s s v i m e n t i n i n t h e i r s l o w l y p r o l i f e r a t i n g e p i t h e l i u m , d o e x p r e s s t h i s fi l a m e n t w h e n g r o w n a s r a p i d l y d i v i d i n g c e l l s i n c u l t u r e , i t w a s s u g g e s t e d t h a t t h e d i f f e r e n c e i n p r o l i f e r a t i v e a c t i v i t y b e t w e e n B P H a n d n o r m a l t i s s u e s c a u s e s t h e d i f f e r e n c e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n , w i t h v i m e n t i n a c t i v i t y b e i n g p r o p o r t i o n a l t o p r o l i f e r a t i v e a c t i v i t y ( F r a g a e t a l . , 1 9 9 8 ) . A r e l a t i o n b e t w e e n v i m e n t i n e x p r e s s i o n a n d t h e i n v a s i v e n e s s o f o t h e r t y p e s o f c a n c e r h a s a l s o b e e n s h o w n . V i m e n t i n a p p e a r s t o b e a g o o d p r o g n o s t i c i n d i c a t o r i n b r e a s t c a n c e r ; i t i s a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d c e l l p r o l i f e r a t i o n r a t e s a n d i n c r e a s e d i n v a s i v e a b i l i t y i n b r e a s t c a n c e r i n v i t r o a n d i n v i v o . V i m e n t i n e x p r e s s i o n h a s a l s o b e e n s h o w n t o b e a s s o c i a t e d w i t h h o r m o n e - i n d e p e n d e n t b r e a s t c a n c e r c e l l s l i n e s , a l l o f w h i c h w e r e m o r e i n v a s i v e i n v i t r o t h a n c e l l l i n e s t h a t d i d n o t e x p r e s s v i m e n t i n ( S o m m e r s e t a l . , 1 9 9 4 ) . Z a j c h o w s k i a t e l ( 2 0 0 1 ) a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t b r e a s t c a n c e r c e l l s w i t h t h e g r e a t e s t m o t i l i t y a n d i n v a s i v e a c t i v i t y o v e r - e x p r e s s e d t h e m e s e n c h y m a l m a r k e r v i m e n t i n . A n 8 6 a s s o c i a t i o n b e t w e e n i n v a s i v e a n d m i g r a t o r y p o t e n t i a l a n d v i m e n t i n e x p r e s s i o n h a s a l s o b e e n s h o w n i n c e r v i c a l c a n c e r i n v i v a ( G i l l e s e t a l . , 1 9 9 6 ) . I n t h i s s t u d y , v i m e n t i n e x p r e s s i o n w a s d e t e c t e d i n a l l i n v a s i v e c a r c i n o m a s a n d l y m p h n o d e m e t a s t a s e s b u t n o t i n t h e C I N I I I ( p r e - i n v a s i v e ) l e s i o n s , w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h i t s a b s e n c e i n n o n - i n v a s i v e c e l l l i n e s i n v i t r o . G e n e r a l l y , f u l l y d i f f e r e n t i a t e d c e l l s e x p r e s s o n l y o n e c l a s s o f i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s u b u n i t s t y p i c a l f o r t h a t c e l l t y p e . H o w e v e r , v i m e n t i n i s u n i q u e f r o m o t h e r i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s i n t h a t i t s h o w s c o e x p r e s s i o n w i t h o t h e r t y p e s o f i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s . V i m e n t i n h a s b e e n f o u n d t o b e c o e x p r e s s e d w i t h d e s m i n i n m u s c l e c e l l s , G F A P i n c e r t a i n a d u l t g l i a l c e l l s , n e u r o fi l a m e n t p o l y p e p t i d e s d u r i n g n e u r o n a l d i f f e r e n t i a t i o n , a n d c y t o k e r a t i n s d u r i n g e p i t h e l i a l d i f f e r e n t i a t i o n ( C a p e t a n a k i e t a l . , 1 9 8 4 ) . C o e x p r e s s i o n o f V i m e n t i n a n d C y t o k e r a t i n s N o r m a l d i f f e r e n t i a t e d e p i t h e l i a l c e l l s e x p r e s s c y t o k e r a t i n s a n d n o t v i m e n t i n . H o w e v e r , c o e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n a n d c y t o k e r a t i n s h a s b e e n r e p o r t e d i n s e v e r a l t y p e s o f t u m o r s , i n c l u d i n g b r e a s t , r e n a l , t h y r o i d , o v a r i a n , a n d p r o s t a t e c a r c i n o m a s ( L e o n g e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h i s o b s e r v a t i o n h a s l e d t o s t u d i e s e x a m i n i n g t h e p o s s i b l e r e a s o n s b e h i n d t h i s c o e x p r e s s i o n p h e n o m e n o n a n d t o a n s w e r t h e q u e s t i o n o f w h e t h e r o r n o t t h i s c o e x p r e s s i o n i s a d v a n t a g e o u s t o t u m o r c e l l s . H e n d r i x e t a 1 ( 1 9 9 2 ) t e s t e d t h e c o e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n a n d c y t o k e r a t i n s 8 a n d 1 8 i n m e l a n o m a c e l l s . T h e y s h o w e d t h a t p o o r l y m e t a s t a t i c c e l l s ( A 3 7 5 P ) , m o d e r a t e l y m e t a s t a t i c c e l l s ( A 3 7 5 M ) , a n d h i g h l y m e t a s t a t i c c e l l s ( C 8 1 6 1 ) s h o w e d n o s t a i n i n g , l o w l e v e l s o f s t a i n i n g , a n d h i g h l e v e l s o f s t a i n i n g , r e s p e c t i v e l y , f o r c y t o k e r a t i n s 8 a n d 1 8 . 8 7 T h e s e d a t a s h o w a n o b v i o u s c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e c o e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n w i t h c y t o k e r a t i n s 8 a n d 1 8 a n d t h e i n v a s i v e a b i l i t y a n d m e t a s t a t i c b e h a v i o r o f t h e s e m e l a n o m a c e l l s . S i n c e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s c a n a c t a s s i g n a l t r a n s d u c e r s t h a t c a n r e g u l a t e g e n e e x p r e s s i o n , t h e c o e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n a n d c y t o k e r a t i n s m a y b e a d v a n t a g e o u s t o t u m o r c e l l s b y f a c i l i t a t i n g t h e t r a n s c r i p t i o n o f g e n e s t h a t w o u l d p r o m o t e t u m o r d e v e l o p m e n t . H e n d r i x e t a l . ( 1 9 9 2 ) a l s o s u g g e s t t h a t t h e p h e n o m e n o n o f “ s w i t c h i n g ” p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n a n d c o e x p r e s s i o n o f t w o p h e n o t y p i c m a r k e r s i n c e l l s c o n f e r s a s e l e c t i v e a d v a n t a g e t o w a r d t r a n s f o r m a t i o n . R e c e n t s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d d i f f e r e n c e s i n t h e m o t i l i t y a n d d y n a m i c a c t i v i t i e s o f v i m e n t i n a n d c y t o k e r a t i n s d u r i n g c o e x p r e s s i o n i n e p i t h e l i a l c e l l s . B y t a g g i n g v i m e n t i n a n d c y t o k e r a t i n s w i t h g r e e n fl u o r e s c e n t p r o t e i n , Y o o n e t a 1 . ( 2 0 0 1 ) s h o w e d t h a t t h e s e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s p o s s e s s u r p r i s i n g l y d i f f e r e n t p r o p e r t i e s w i t h i n t h e s a m e c y t o p l a s m i c r e g i o n s . V i m e n t i n fi b r i l s d e m o n s t r a t e c h a n g e s i n s h a p e , e x t e n d i n g a n d s h o r t e n i n g o v e r s h o r t p e r i o d s o f t i m e , a n d b i d i r e c t i o n a l t r a n s l o c a t i o n , w h e r e a s c y t o k e r a t i n t o n o fi b r i l s e x h i b i t s l o w o s c i l l a t i o n s o r u n d u l a t i o n s a n d u n i d i r e c t i o n a l fl u c t u a t i o n s o f d i f f u s e a n d p a r t i c u l a t e c y t o k e r a t i n f r o m t h e s u r f a c e o f t h e c e l l t o w a r d s t h e n u c l e u s . T h e s e d a t a s u g g e s t t h e d y n a m i c p r o p e r t i e s o f d i f f e r e n t t y p e s o f i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s w i t h i n t h e s a m e c y t o p l a s m i c r e g i o n a r e r e g u l a t e d b y d i f f e r e n t f a c t o r s . T h e f u r t h e r s t u d y o f t h e s e f a c t o r s m a y s h e d m o r e l i g h t o n t h e s p e c i fi c r o l e s o f t h e s e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s i n c a n c e r p r o g r e s s i o n , d i f f e r e n t i a t i o n , a n d l e v e l s o f m e t a s t a t i c a b i l i t y o f d i f f e r e n t c a n c e r s . 8 8 T h e R o l e o f C y t o k e r a t i n s a n d V i m e n t i n i n A p o p t o s i s A p o p t o s i s , o r p r o g r a m m e d c e l l d e a t h , a l l o w s f o r t h e l o s s o f c e l l s t h a t e i t h e r a r e n o t n e e d e d d u r i n g d e v e l o p m e n t o r m a y b e d a n g e r o u s t o t h e o r g a n i s m b e c a u s e o f m u t a t i o n s o r o t h e r d a m a g e . S e v e r a l c h a n g e s m u s t o c c u r i n t h e c y t o s k e l e t o n o f a c e l l t o a l l o w t h e s t r u c t u r a l a n d m e c h a n i c a l i n t e g r i t y o f t h e c e l l t o b e d e s t r o y e d d u r i n g a p o p t o s i s . D u r i n g e a r l y a p o p t o s i s t h e r e a r e m a n y c h a n g e s t h a t o c c u r t o t h e c y t o s k e l e t a l o r g a n i z a t i o n o f t h e c e l l , i n c l u d i n g t h e d i s a s s e m b l i n g a n d p r o t e o l y t i c c l e a v a g e o f i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s v i m e n t i n a n d t h e c y t o k e r a t i n s . V i m e n t i n fi l a m e n t s r e g u l a t e c e l l a t t a c h m e n t a n d s u b c e l l u l a r o r g a n i z a t i o n . D u r i n g e a r l y a p o p t o s i s , v i m e n t i n f u n c t i o n i s a l t e r e d w h e n t h e c e l l s b e c o m e d e t a c h e d f r o m t h e s u r r o u n d i n g t i s s u e . T h e fi l a m e n t s i n t h e d e t a c h e d c e l l s u n d e r g o p r o t e o l y t i c c l e a v a g e i n t o s e v e r a l d i f f e r e n t s i z e d f r a g m e n t s , w h i c h i s p a r t o f t h e e x e c u t i o n p h a s e o f a p o p t o s i s . ( P r a s a d e t a l . , 1 9 9 8 ) . D u r i n g a p o p t o s i s , c y t o k e r a t i n 8 a n d 1 8 fi l a m e n t s u n d e r g o r e o r g a n i z a t i o n a n d t h e p h o s p h o r y l a t i o n a n d f r a g m e n t a t i o n o f c y t o k e r a t i n a r e i n d e p e n d e n t l y r e s p o n s i b l e f o r i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t r e o r g a n i z a t i o n ( P r a s a d e t a l . , 1 9 9 8 ) . A c t i v a t i o n o f c a s p a s e s i s t h e fi n a l c o m m o n e v e n t t h a t o c c u r s d u r i n g a p o p t o s i s . C a s p a s e s c l e a v e a v a r i e t y o f s u b s t r a t e s , i n c l u d i n g s t r u c t u r a l p r o t e i n s , p r o t e i n s i n v o l v e d i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n , a n d c o m p o n e n t s o f t h e c e l l c y c l e m a c h i n e r y . C y t o k e r a t i n s e x h i b i t c a s p a s e - s e n s i t i v e m o t i f s a n d f r a g m e n t s d e r i v e d f r o m t h e m h a v e b e e n f o u n d i n a p o p t o t i c c e l l s ( P r a s a d e t a l . , 1 9 9 8 ) . C a s p a s e s a r e t h o u g h t t o b e t h e p r i m a r y m e t h o d o f p r o t e i n d e g r a d a t i o n u t i l i z e d i n a p o p t o s i s . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t t h e r e m a y b e i m p o r t a n t r o l e s f o r c y t o k e r a t i n s a n d v i m e n t i n i n t h e p r o c e s s o f a p o p t o s i s . 8 9 C o n c l u s i o n s I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s a r e a n i m p o r t a n t p a r t o f t h e c y t o s k e l e t a l s y s t e m o f a c e l l . T h e y s t a b i l i z e t h e o r g a n e l l e s , t h e y f o r m t h e n e t w o r k t h a t g i v e s s h a p e t o t h e c e l l a n d p r o v i d e s m e c h a n i c a l i n t e g r i t y , a n d t h e y a r e i n v o l v e d i n c e l l l o c o m o t i o n a n d r e c e p t o r m e d i a t e d e n d o c y t o s i s . T h e n e t w o r k e x t e n d s f r o m t h e n u c l e u s , t h r o u g h t h e c y t o p l a s m , a n d e n d s a t t h e p l a s m a m e m b r a n e . T h e r e a r e s i x c a t e g o r i e s o f i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s : T y p e s I a n d I I a r e t h e c y t o k e r a t i n s ( e p i t h e l i a l c e l l s ) , t y p e 1 1 1 i n c l u d e s v i m e n t i n ( m e s e n c h y m a l c e l l s ) , d e s m i n ( m u s c l e c e l l s ) , a n d G F A P ( g l i a l c e l l s ) , t y p e I V a r e t h e n e u r o fi l a m e n t s a n d a - i n t e r n e x i n ( n e u r o n s ) , t y p e V p r o t e i n s , l a m i n s , a r e l o c a l i z e d t o t h e n u c l e u s , a n d t y p e V I p r o t e i n s a r e n e s t i n . C y t o k e r a t i n s 8 a n d 1 8 a r e e x p r e s s e d i n t h e p r o s t a t i c l u m i n a l , s e c r e t o r y c e l l s o f t h e p r o s t a t e a n d c y t o k e r a t i n s 5 a n d 1 4 a r e e x p r e s s e d i n t h e l e s s d i f f e r e n t i a t e d b a s a l c e l l s o f t h e p r o s t a t e . T h i s m a k e s c y t o k e r a t i n s v e r y u s e fi i l p r o g n o s t i c i n d i c a t o r s o f p r o s t a t e c a n c e r a n d c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . S e v e r a l s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t p r o s t a t i c e x p r e s s i o n o f c y t o k e r a t i n s 8 a n d 1 8 d e c r e a s e s a s t h e c e l l s b e c o m e l e s s d i f f e r e n t i a t e d a n d m o r e c a n c e r o u s . T h e s a m e d e c r e a s e i n e x p r e s s i o n o f c y t o k e r a t i n 8 a n d 1 8 h a s b e e n s h o w n i n v i v o i n p r o s t a t e c a r c i n o m a w h e n c o m p a r e d t o n o r m a l p r o s t a t e . T h e s e d a t a s u p p o r t t h e o b s e r v a t i o n t h a t p r o s t a t e c a n c e r a r i s e s f r o m t h e l u m i n a l e p i t h e l i a l c e l l s o n t h e p a t h t o l u m i n a l c e l l d i f f e r e n t i a t i o n , w h e r e c y t o k e r a t i n s 8 a n d 1 8 . A b n o r m a l e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n m a y b e o b s e r v e d i n t h e n o r m a l , h y p e r p l a s t i c , a n d c a n c e r o u s p r o s t a t e . V i m e n t i n p l a y s s i g n i fi c a n t r o l e i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e i n v a s i v e l e v e l s o f c a n c e r c e l l s a n d i n c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a n d p r o l i f e r a t i o n . I t i s w e l l d o c u m e n t e d t h a t t h e i n c r e a s e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n i s a s s o c i a t e d w i t h a n i n c r e a s e i n t h e 9 0 i n v a s i v e a n d m e t a s t a t i c a b i l i t y o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . V i m e n t i n i s a v e r y u s e f u l p r o g n o s t i c i n d i c a t o r o f t h e p r o g r e s s i o n l e v e l o f p r o s t a t e c a n c e r . C o e x p r e s s i o n o f c y t o k e r a t i n s a n d v i m e n t i n i s a s s o c i a t e d w i t h a l e s s d i f f e r e n t i a t e d p h e n o t y p e a n d i t a p p e a r s t o g i v e t u m o r c e l l s , s h o w i n g s u c h c o e x p r e s s i o n , a n a d v a n t a g e o v e r n o r m a l c e l l s . T h e i n h i b i t i o n o f c o e x p r e s s i o n r e s u l t s i n a d e c r e a s e i n i n v a s i v e p o t e n t i a l o f m e l a n o m a c e l l s . S t u d i e s h a v e s h o w n t h a t c y t o k e r a t i n s a n d v i m e n t i n p o s s e s s d i f f e r e n t p r o p e r t i e s w i t h i n t h e s a m e c y t o p l a s m i c r e g i o n s s u g g e s t i n g t h a t t h e d y n a m i c p r o p e r t i e s o f t h e s e fi l a m e n t s a r e r e g u l a t e d b y d i f f e r e n t f a c t o r s . M o r e w o r k n e e d s t o b e d o n e t o e l u c i d a t e t h e m e c h a n i s m ( s ) o f a c t i o n o f t h e s e d i f f e r e n t f a c t o r s h a v e o n i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s . I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s a r e g o o d t a r g e t s f o r t h e s t u d y o f a p o p t o s i s d u e t o t h e i m p o r t a n t r o l e t h e fi l a m e n t s p l a y i n c e l l i n t e g r i t y a n d s t a b i l i t y . 9 1 R e f e r e n c e s A l b e r t i , I . , B a r b o r o , P . , B a r b e s i n o , M . , S a n n a , P . , P i s c i o t t a , L . , P a r o d i , S . , N i c o l o , G . , B o c c a r d o , F . , G a l l i , S . , P a t r o n e , E . , a n d B a l b i , C . : C h a n g e s i n t h e e x p r e s s i o n o f c y t o k e r a t i n s a n d n u c l e a r m a t r i x p r o t e i n s a r e c o r r e l a t e d w i t h t h e l e v e l o f d i f f e r e n t i a t i o n i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r . J C e l l B i o c h e m . , 7 9 : 4 7 1 - 4 8 5 , 2 0 0 0 . B e r s h a d s k y , A . D . , a n d V a s i l i e v , J . M . : C y t o s k e l e t o n , P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k , p p . 1 - 5 2 9 8 p p . , 1 9 8 8 . C a p e t a n a k i , Y . G . , N a g a i , J . , a n d L a z a r i d e s , E . : R e g u l a t i o n o f t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s c o d i n g f o r t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s u b u n i t s v i m e n t i n , d e s m i n , a n d g l i a l fi b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n . I n : M o l e c u l a r B i o l o g y o f t h e C y t o s k e l e t o n , B o r i s y , G . G . , C l e v e l a n d , D . W . , M u r p h y , D . B . ( e d s ) , C o l d S p r i n g H a r b o r , N e w Y o r k , p p . 4 1 5 - 4 3 3 , 1 9 8 4 . F r a g a , C . H . , T r u e , L . D . , a n d K i r k , D . : E n h a n c e d e x p r e s s i o n o f t h e m e s e n c h y m a l m a r k e r , v i m e n t i n , i n h y p e r p l a s t i c v e r s u s n o r m a l h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i u m . J U r o l . , 1 5 9 : 2 7 0 - 2 7 4 , 1 9 9 8 . F r a n k e , W . W . T h e I n t e r m e d i a t e F i l a m e n t s . I n : G u i d e b o o k t o t h e C y t o s k e l e t a l a n d M o t o r P r o t e i n s , K r e i s , T . a n d V a l e , R . ( e d s ) , O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s , O x f o r d , p p l 3 7 - 1 4 4 , 2 7 6 p p . , 1 9 9 3 . G i l l e s , C . , P o l e t t e , M . , P i e t t e , J . , D e l v i g n e , A - C . , T h o m p s o n , E . W . , F o i d a r t , J - M . , a n d B i r e m b a u t , P . : V i m e n t i n e x p r e s s i o n i n c e r v i c a l c a r c i n o m a s : a s s o c i a t i o n w i t h i n v a s i v e a n d m i g r a t o r y p o t e n t i a l . J P a t h , 1 8 0 : 1 7 5 - 1 8 0 , 1 9 9 6 . G o l d m a n , R . D . , C h o u , Y - H . , P r a h l a d , V . , a n d Y o o n , M . : I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s : d y n a m i c p r o c e s s e s r e g u l a t i n g t h e i r a s s e m b l y , m o t i l i t y , a n d i n t e r a c t i o n s w i t h o t h e r c y t o s k e l e t a l s y s t e m s . F A S E B , 1 3 : 8 2 6 1 - 8 2 6 5 , 1 9 9 9 . H e n d r i x , M . J . , S e f t o r , E . A . , C h u , Y . W . , S e f t o r , R . E . , N a g l e , R . B . , M c D a n i e l , K . M . , L e o n g , S . P . L . , Y o h e m , K . I - I . , L e i b o v i t z , A . M . , M e y s k e n s , F . L . , C o n a w a y , D . H . , W e l c h , D . R . , L i o t t a , L . A . , a n d S t e t l e r - S t e v e n s o n , W . : C o e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n a n d k e r a t i n s b y h u m a n m e l a n o m a t u m o r c e l l s : c o r r e l a t i o n w i t h i n v a s i v e a n d m e t a s t a t i c p o t e n t i a l . J . N a t l . C a n c e r I n s t . , 8 4 : 1 6 5 - 1 7 4 , 1 9 9 2 . L a n g , S . H . , H y d e , C . , R e i d , I . N . , H i t c h c o c k , I . S . , H a r t , C . A . , B r y d e n , A . A . , V i l l e t t e , J - M , S t o w e r , M . J . , a n d M a i t l a n d , N . J . : E n h a n c e d e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n i n m o t i l e p r o s t a t e c e l l l i n e s i n p o o r l y d i f f e r e n t i a t e d a n d m e t a s t a t i c p r o s t a t e c a r c i n o m a . T h e P r o s t a t e , 5 2 : 2 5 3 - 2 6 3 , 2 0 0 2 . L e o n g , A . S . Y . , G i l h a m , P . , a n d M i l i o s , J . : C y t o k e r a t i n a n d v i m e n t i n i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s i n b e n i g n a n d n e o p l a s t i c e p i t h e l i u m . H i s t o p a t h o l o g y , 1 3 : 4 3 5 - 4 4 2 , 1 9 8 8 . 9 2 O s b o r n , M . : V i m e n t i n . I n : G u i d e b o o k t o t h e C y t o s k e l e t a l a n M o t o r P r o t e i n s , K r e i s , T . a n d V a l e , R . ( e d s . ) , O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s , O x f o r d , p p . 1 6 9 - 1 7 1 , 2 7 6 p p . 1 9 9 3 . P a r a m i o , J . M . a n d J o r c a n o , J . L . : B e y o n d s t r u c t u r e : d o i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s m o d u l a t e c e l l s i g n a l i n g ? B i o e s s a y s , 2 4 : 8 3 6 - 8 4 4 , 2 0 0 2 . P e e h l , D . M . , L e u n g , G . K . , a n d W o n g , S . T . : K e r a t i n e x p r e s s i o n : a m e a s u r e o f p h e n o t y p i c m o d u l a t i o n o f h u m a n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s b y g r o w t h i n h i b i t o r y f a c t o r s . C e l l T i s s u e R e s . , 2 7 7 : 1 1 - 1 8 , 1 9 9 4 . P r a s a d , S . C . , T h r a v e s , P . J . , K u e t t e l , M . R . , S r i n i v a s a r a o , G . Y . , D r i t s c h i l o , A . , a n d S o l d a t e n k o v , V . A . : A p o p t o s i s - a s s o c i a t e d p r o t e o l y s i s o f v i m e n t i n i n h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l t u m o r c e l l s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . , 2 4 9 : 3 3 2 - 3 3 8 , 1 9 9 8 . R a m a e k e r s , F . C . S . , V e r h a g e n , A . P . M . , I s a a c s , J . T . , F e i t z , W . F . J . , M o e s k e r , O . , S c h a a r t , G . , S c h a l k e n , J . A . , a n d V o o i j s , G . P . : I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t e x p r e s s i o n a n d t h e p r o g r e s s i o n o f p r o s t a t i c c a n c e r a s s t u d i e d i n t h e d u n n i n g R - 3 3 2 7 r a t p r o s t a t i c c a r c i n o m a s y s t e m . T h e P r o s t a t e , 1 4 : 3 2 3 - 3 3 9 , 1 9 8 9 . . S c h w i l a , M . : I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s . I n : T h e C y t o s k e l e t o n : A n i n t r o d u c t o r y s u r v e y . S p r i n g e r - V e r l a g , N e w Y o r k , p p . 8 2 - 1 1 4 , 3 2 6 p p . , 1 9 8 6 . S h e r w o o d , E . R . , B e r g , L . A . , M i t c h e l l , N . J . , M c N e a l , J . E . , K o z l o w s k i , J . M . , a n d L e e , C . : D i f f e r e n t i a l c y t o k e r t a i n e x p r e s s i o n i n n o r m a l , h y p e r p l a s t i c a n d m a l i g n a n t e p i t h e l i a l c e l l s f r o m h u m a n p r o s t a t e . J U r o l . , 1 4 3 : 1 6 7 - 1 7 1 , 1 9 9 0 . S o m m e r s , C . L . , S k e r t e r , J . M . , C h r y s o g e l o s , S . A . , B o s s e l e r , M . , a n d G e l m a n , E . P . : R e g u l a t i o n o f v i m e n t i n g e n e t r a n s c r i p t i o n i n h u m a n b r e a s t c a n c e r c e l l l i n e s . C e l l G r o w t h D i f f . , 5 : 8 3 9 - 8 4 6 , 1 9 9 4 . T r a u b , P . : I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s : a r e v i e w , S p r i n g e r - V e r l a g , N e w Y o r k , p p . 2 - 1 4 4 , 2 6 6 p p . , 1 9 8 5 . Y o o n , K . H . , Y o o n , M . , M o i r , R . D . , K h u o n , S . , F l i t n e y , F . W . , a n d G o l d m a n , R . D . : I n s i g h t s i n t o t h e d y n a m i c p r o p e r t i e s o f k e r a t i n i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s i n l i v i n g e p i t h e l i a l c e l l s . J . C e l l B i o . 1 5 3 : 5 0 3 - 5 1 6 , 2 0 0 1 . Z a j c h o w s k i , D . A . , B a r t h o l d i , M . F . , G o n g , Y . , W e b s t e r , L . , L i u , H - L . , M u n i s h k i n , A . , B e a u h e i m , C . , H a r v e y , S . , E t h i e r , S P , a n d J o h n s o n , P . H . : I d e n t i fi c a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n p r o fi l e s t h a t p r e d i c t t h e a g g r e s s i v e b e h a v i o r o f b r e a s t c a n c e r c e l l s . C a n c e r R e s . , 6 1 : 5 1 6 8 - 5 1 7 8 , 2 0 0 1 . 9 3 C h a p t e r 5 M a t r i x M e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P s ) 9 4 A b s t r a c t C a n c e r i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s a r e t h e r e s u l t o f t i s s u e r e m o d e l i n g t h a t i n v o l v e s a p r o t e o l y t i c d e g r a d a t i o n o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x . M e t a s t a t i c s p r e a d c o n t i n u e s t o b e t h e g r e a t e s t b a r r i e r t o c a n c e r c u r e . M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P s ) a r e p r o t e a s e s i m p l i c a t e d i n t h e d e g r a d a t i o n o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x d u r i n g i n v a s i o n b y c a n c e r c e l l s . C l a r i f y i n g t h e m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f M M P s a n d M M P i n h i b i t o r s , a n d d i s c o v e r i n g n e w t r e a t m e n t s a n d / o r m e t h o d s t o c o n t r o l t h e i r a c t i v i t y , c o u l d p o t e n t i a l l y l e a d t o t h e d e v e l o p m e n t o f i m p o r t a n t t h e r a p e u t i c s t r a t e g i e s a g a i n s t c a n c e r i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s . T h i s c h a p t e r d e s c r i b e s t h e c l a s s i fi c a t i o n a n d r e g u l a t i o n o f M M P s a n d t h e i r a s s o c i a t i o n w i t h d i f f e r e n t c a n c e r s . A l s o d i s c u s s e d i n t h i s c h a p t e r a r e t h e e f f e c t s o f v i t a m i n D o n m e m b e r s o f t h e M M P f a m i l y . 9 5 I n t r o d u c t i o n T h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( E C M ) i s a c o m p l e x s t r u c t u r a l e n t i t y t h a t s u r r o u n d s a n d s u p p o r t s c e l l s i n m a m m a l i a n t i s s u e s . I t c o n t a i n s s i g n a l i n g m o l e c u l e s r e s p o n s i b l e f o r m a i n t a i n i n g t i s s u e f o r m a n d f u n c t i o n . T h e E C M i s c o m p o s e d o f t h r e e m a i n c l a s s e s o f b i o m o l e c u l e s : 1 ) s t r u c t u r a l p r o t e i n s ( c o l l a g e n , a n d e l a s t i n ) ; 2 ) s p e c i a l i z e d p r o t e i n s ( fi b r o n e c t i n , l a m i n i n , a n d fi b r i l l i n ) , a n d 3 ) p r o t e o g l y c a n s . T h e p r i m a r y f u n c t i o n o f t h e E C M i s s u p p o r t b u t i t a l s o p l a y s a r o l e i n d i r e c t i n g d e v e l o p m e n t a n d m o r p h o g e n e s i s b y i n fl u e n c i n g c e l l u l a r p r o c e s s e s s u c h a s p r o l i f e r a t i o n , d i f f e r e n t i a t i o n , m i g r a t i o n , a n d a d h e s i o n . I t i s a d y n a m i c m a t r i x o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s , g r o w t h f a c t o r s , a n d l a t e n t e n z y m e s t h a t i s c o n s t a n t l y b e i n g r e m o d e l e d . I n t h e 1 9 6 0 3 a n d 1 9 7 0 3 , i n v e s t i g a t o r s n o t i c e d a c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e i n v a s i v e b e h a v i o r o f t u m o r c e l l s a n d t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f d i f f e r e n t p r o t e a s e s ( L i o t t a e t a l . , 1 9 7 9 ; P o o l e e t a l . , 1 9 7 8 ) . I t i s n o w k n o w n t h a t a w i d e v a r i e t y o f p r o t e a s e s c a n c l e a v e E C M m o l e c u l e s . T h e s e p r o t e a s e s c a n b e g r o u p e d i n t o f o u r d i f f e r e n t c l a s s e s , t h e s e r i n e - , c y s t e i n e - , a s p a r t y l - , a n d m e t a l l o - p r o t e i n a s e s ( S t e t l e r — S t e v e n s o n a n d Y u , 2 0 0 1 ) . M e m b e r s f r o m a l l f o u r g r o u p s h a v e b e e n a s s o c i a t e d w i t h c a n c e r c e l l i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s , a n d i t i s l i k e l y t h a t t h e y h a v e o v e r l a p p i n g f u n c t i o n s i n t u m o r - m e d i a t e d E C M d e g r a d a t i o n ( F i n g l e t o n a n d M a t r i s i a n , 2 0 0 0 ) . T h e t h r e e s t e p t h e o r y o f c e l l i n v a s i o n p r o p o s e d b y L i o t t a a n d c o l l e a g u e s ( 1 9 8 2 ) i n v o l v e s t h e f o l l o w i n g b a s i c s t e p s : 1 ) f o r m a t i o n o f a p p r o p r i a t e c e l l z m a t r i x i n t e r a c t i o n s v i a c e l l - s u r f a c e r e c e p t o r s ( t h e i n t e g r i n s ) a n d s p e c i fi c g l y c o p r o t e i n s ( i . e . l a m i n i n , t y p e I V c o l l a g e n , a n d fi b r o n e c t i n ) a n d d i s r u p t i o n o f c o n t a c t s b e t w e e n c e l l z c e l l r e c e p t o r s ( t h e c a d h e r i n s ) ; 2 ) p r o t e o l y t i c d e s t r u c t i o n o f m a t r i x b a r r i e r s t o c l e a r a p a t h f o r t h e c e l l ; a n d 9 6 3 ) d i r e c t e d m o v e m e n t o f c e l l s i n t o t h e a r e a o f E C M r e m o d e l i n g , w h i c h p r o b a b l y d e p e n d s o n s p e c i fi c c h e m o t a c t i c f a c t o r s . C e l l s a r e t h e n a b l e t o e s c a p e f r o m p r i m a r y t u m o r s , i n t r a v a s a t e i n t o b l o o d v e s s e l s a n d l y m p h a t i c s , a n d g e t t r a n s p o r t e d t o a n d a r r e s t i n d i s t a n t o r g a n s . A f t e r w h i c h t i m e t h e c e l l s e x t r a v a s a t e a n d g r o w t o f o r m s e c o n d a r y t u m o r s i n t h e n e w o r g a n . E a r l y s t u d i e s o n i n v a s i o n f o c u s e d p r i m a r i l y o n i n t e r a c t i o n o f t u m o r c e l l s w i t h t h e E C M , i n p a r t i c u l a r t h e b a s e m e n t m e m b r a n e . T h e b a s e m e n t m e m b r a n e ( B M ) i s a s p e c i a l i z e d m a t r i x c o n s i s t i n g o f t y p e I V c o l l a g e n , l a m i n i n , e n t a c t i n , p r o t e o g l y c a n s , a n d g y l c o s a m i n o g l y c a n s ( N e l s o n e t a l . , 2 0 0 0 ) . L o s s o f B M c o n t i n u i t y a n d l a c k o f B M a r o u n d t h e i n v a s i v e t u m o r c e l l s w e r e f o u n d t o b e c h a r a c t e r i s t i c s o f i n v a s i v e c a r c i n o m a s ( L i o t t a e t a l , 1 9 9 1 ; S t e t l e r - S t e v e n s o n e t a l . , 1 9 9 3 ) . P r o t e o l y t i c d e g r a d a t i o n o f t h e E C M i s a c r u c i a l s t e p i n t h e p r o c e s s o f t u m o r i n v a s i o n ; i t p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e m e t a s t a t i c c a s c a d e . A s m e n t i o n e d a b o v e , s e v e r a l p r o t e a s e s a r e i n v o l v e d i n t h i s p r o c e s s , b u t m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s a n d m e m b e r s o f t h e s e r i n e p r o t e a s e f a m i l y a r e c o n s i d e r e d t o b e t h e m o s t i m p o r t a n t . S e r i n e p r o t e a s e s , s u c h a s p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) a n d u r o k i n a s e - t y p e p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r ( u P A ) , a r e i n v o l v e d i n E C M d e g r a d a t i o n a n d p r o s t a t e c a n c e r c e l l i n v a s i o n ( W e b b e r e t a l . , 1 9 9 5 ; W a g h r a y a n d W e b b e r , 1 9 9 5 ) . T h e r e a r e s e v e r a l r e a s o n s w h y M M P s a p p e a r t o b e t h e m o s t i m p o r t a n t a n d p h y s i o l o g i c a l l y r e l e v a n t o f a l l t h e p r o t e a s e s i n t e r m s o f m a t r i x t u r n o v e r . F i r s t , t h e y a r e s e c r e t e d p r o t e i n s , p l a c i n g t h e m i n t h e i d e a l l o c a t i o n f o r E C M d e g r a d a t i o n . S e c o n d , t h e y a r e m o s t p o t e n t a t p H l e v e l s c l o s e t o n e u t r a l . A n d , t h i r d , t h e y a r e r e g u l a t e d a t s e v e r a l l e v e l s , w h i c h s u g g e s t s t h a t a t i g h t c o n t r o l o v e r n o r m a l p r o c e s s e s i s r e q u i r e d . 9 7 M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P s ) h a v e b e e n r e p e a t e d l y i m p l i c a t e d i n c a n c e r c e l l i n v a s i o n a n d t h e m e t a s t a t i c p r o c e s s . T h e y a p p e a r t o b e i n v o l v e d i n t h e i n i t i a l s t e p o f E C M d e g r a d a t i o n a s w e l l a s i n f a c i l i t a t i n g t h e b r e a k d o w n o f o t h e r p h y s i c a l b a r r i e r s t o m e t a s t a s i s ( S t e t l e r - S t e v e n s o n a n d Y u , 2 0 0 1 ) . I n i t i a l l y , t h i s w a s b e l i e v e d t o b e t h e i r m o s t i m p o r t a n t r o l e i n t h e m e t a s t a t i c p r o c e s s . B u t r e c e n t d a t a s u g g e s t t h a t M M P s m a y p l a y a m o r e c o m p l e x r o l e t h a n w a s fi r s t t h o u g h t , a n d t h e y m a y a l s o m a k e i m p o r t a n t c o n t r i b u t i o n s a t o t h e r s t e p s i n t h e m e t a s t a t i c p r o c e s s . I t i s n o w b e l i e v e d t h a t M M P s a r e i m p o r t a n t i n c o n t r i b u t i n g t o t h e p r o c e s s o f a n g i o g e n e s i s a n d i n c r e a t i n g a n d m a i n t a i n i n g a n e n v i r o n m e n t t h a t s u p p o r t s t h e i n i t i a t i o n a n d m a i n t e n a n c e o f g r o w t h o f b o t h p r i m a r y a n d m e t a s t a t i c t u m o r s ( C h a m b e r s a n d M a t r i s i a n , 1 9 9 7 ; S t e t l e r - S t e v e n s o n a n d Y u , 2 0 0 1 ) . T h e M a t r i x M e t a l l o p r o t e i n a s e F a m i l y B a c t e r i a l c o l l a g e n a s e s w e r e d i s c o v e r e d l o n g b e f o r e G r o s s a n d L a p i e r e ( 1 9 6 2 ) d e s c r i b e d t h e fi r s t m a m m a l i a n c o l l a g e n a s e . T h e y d i s c o v e r e d t h i s e n z y m e w h i l e s t u d y i n g t h e d i s s o l u t i o n o f t h e t a d p o l e t a i l w h i c h o c c u r s d u r i n g t h e m o r p h o g e n e s i s i n t o a f r o g . T h i s c o l l a g e n a s e , n o w c a l l e d i n t e r s t i t i a l c o l l a g e n a s e o r M M P - l , w a s t h e fi r s t e v i d e n c e f o r t h e e x i s t e n c e o f a n a n i m a l c o l l a g e n a s e ( G r o s s a n d L a p i e r e , 1 9 6 2 ) . A f t e r t h i s d i s c o v e r y , t h e s t u d y o f a n i m a l c o l l a g e n a s e s , a n d o t h e r e n z y m e s i n v o l v e d i n E C M d e g r a d a t i o n , g r e w a t a n a l m o s t e x p o n e n t i a l r a t e . M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P s ) a r e t h e p r e d o m i n a n t g r o u p o f e n z y m e s t h a t d e g r a d e t h e E C M a n d c e l l s u r f a c e m o l e c u l e s . M M P s p l a y a c r i t i c a l r o l e i n a v a r i e t y o f p h y s i o l o g i c a l a n d p a t h o l o g i c a l p r o c e s s , i n c l u d i n g e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t , t i s s u e m o r p h o g e n e s i s , w o u n d h e a l i n g , a r t h r i t i s , a n d c a n c e r ( S t e m l i c h t e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h e y w e r e 9 8 i n i t i a l l y c l a s s i fi e d a s p r o t e i n a s e s c a p a b l e o f d e g r a d i n g t h e E C M b u t t h e i r t a r g e t s h a v e s i n c e e x p a n d e d t o i n c l u d e s e v e r a l o t h e r e x t r a c e l l u a r p r o t e i n s . T h e s e p r o t e i n s i n c l u d e o t h e r p r o t e i n a s e s , p r o t e i n a s e i n h i b i t o r s , c l o t t i n g f a c t o r s , c h e m o t a c t i c m o l e c u l e s , l a t e n t g r o w t h f a c t o r s , c e l l s u r f a c e r e c e p t o r s , a n d c e l l : c e l l a n d c e l l z m a t r i x a d h e s i o n m o l e c u l e s ( C o u s s e n s e t a l . , 2 0 0 2 ) . M M P s a r e a f a m i l y o f s e c r e t e d o r c e l l - s u r f a c e b o u n d z i n c e n d o p e p t i d a s e s . T h e r e a r e n o w m o r e t h a n 2 0 e n z y m e s c l a s s i fi e d a s M M P s , a n d t h e y a r e r e c o g n i z e d b y a d e s c r i p t i v e n a m e ( e . g . g e l a t i n a s e A , w h i c h d e g r a d e s n o n - fi b r i l l a r c o l l a g e n s ) a n d a n M M P n u m b e r . A l l M M P s s h a r e a c a t a l y t i c d o m a i n t h a t i s r e s p o n s i b l e f o r b i n d i n g z i n c , w h i c h i s e s s e n t i a l f o r c a t a l y t i c f u n c t i o n . T h e y a l s o s h a r e a “ p r o ” d o m a i n t h a t i s r e s p o n s i b l e f o r m a i n t a i n i n g t h e l a t e n c y a n d a “ p r e ” d o m a i n t o t a r g e t f o r s e c r e t i o n . T h e M M P f a m i l y m e m b e r s d i f f e r f r o m e a c h o t h e r s t r u c t u r a l l y b y t h e p r e s e n c e , o r a b s e n c e , o f a d d i t i o n a l d o m a i n s r e s p o n s i b l e f o r a c t i v i t i e s s u c h a s i n h i b i t o r b i n d i n g , m a t r i x b i n d i n g , c e l l - s u r f a c e l o c a l i z a t i o n , a n d s u b s t r a t e s p e c i fi c i t y ( C h a m b e r s a n d M a t r i s i a n , 1 9 9 7 ) . T h e M M P s a r e s u b d i v i d e d i n t o f o u r m a i n g r o u p s b a s e d o n t h e i r s u b s t r a t e s p e c i fi c i t y : g e l a t i n a s e s , c o l l a g e n a s e s , s t r o m e l y s i n s , a n d M T - M M P s . F u r t h e r c l a s s i fi c a t i o n o f t h e M M P s c a n b e m a d e a c c o r d i n g t o d o m a i n s t r u c t u r e s ( F i g u r e 5 - 1 ) . G e l a t i n a s e s T h e r e a r e t w o m e m b e r s i n t h i s g r o u p , g e l a t i n a s e A ( M M P - 2 ) a n d g e l a t i n a s e B ( M M P - 9 ) . B o t h o f t h e s e e n z y m e s r e a d i l y d e g r a d e h e a t - d e n a t u r e d c o l l a g e n s ( g e l a t i n s ) a n d s h a r e a n a l m o s t i d e n t i c a l s u b s t r a t e p r e f e r e n c e . S u b s t r a t e s f o r t h e s e M M P s i n c l u d e g e l a t i n , t y p e s I , I V , a n d V c o l l a g e n , a n d e l a s t i n . M M P - 2 i s a 7 2 k D a p r o t e i n t h a t i s 9 9 M M P D o m a i n S t r u c t u r e M a j o r S u b s t r a t e s M a t r i l y s l n P r o t e o g l y e a n s , g l y c o p r o t e i n s , ( M M P - 7 ) t y p e I V c o l l a g e n , g e l a t i n , e l a s t i n I n t e r s t i t i a l C o l l a g e n a s e F i b r i l l a r c o l l a g e n s ( M M P - 1 ) N e u t r o p h l l C o l l a g e n a s e 1 ' “ I ' m - m ; m - F i b r i l l a r c o l l a g e n s ( M M P - 8 ) ‘ C o l l a g e n a s e - 3 F i b r i l l a r c o l l a g e n s ( M M P - 1 3 ) S t r o m e l y s i n - l P r o t e o g l y c a n s . g l y c o p r o t e i n s ( M M P - 3 ) t y p e I V c o l l a g e n , g e l a t i n s S t r o m e l y s i n - Z P r o t e o g l y c a n s , g l y c o p r o t e i n s ( M M P - 1 0 ) t y p e I V c o l l a g e n , g e l a t i n s M e t a l l o e l a s t a s e E l a s t i n ( M M P - 1 2 ) M M P - 1 8 M M P - l 9 S t r o m e l y s i n - 3 ( M M P - 1 1 ) M T l - M M P ( M M P - l 4 ) M T Z - M M P ( M M P - 1 5 ) M T 3 - M M P ( M M P - 1 6 ) D I T 4 - D I B I P ( M M P - l 7 ) N . D . B I T S - M I “ ? ( M M P - 2 1 ) N J ) . G e l a t i n a s e A ” m m : I K E ! “ E - G e l a t i n s , t y p e s I a n d I V c o l l a g e n G I M P - 2 ) G e l a t i n a s e B l m r fi i m r I m p I - m G e l a t i n s , t y p e s I a n d I V c o l l a g e n ( M M P - 9 ) ' ‘ F i g u r e 5 - 1 : T h e M a t r i x M e t a l l o p r o t e i n a s e F a m i l y . G r o u p s a r e a r r a n g e d b y d o m a i n s t r u c t u r e a n d s e p a r a t e d b y d a s h e d l i n e . F a m i l y m e m b e r s w i t h d i s t i n c t b u t s u b t l e s t r u c t u r a l f e a t u r e s a r e s e p a r a t e d b y d o t t e d l i n e . P R O = p r o d o m a i n ; P R E = l e a d e r s e q u e n c e ; C A T = c a t a l y t i c d o m a i n ; H = h i n g e d o m a i n ; H E M = h e m o p e x i n - l i k e d o m a i n ; F = f u r i n s i t e ; F N = fi b r o n e c t i n - l i k e d o m a i n ; T M = t r a n s m e m b r a n e d o m a i n ; a n d N D = n o t d e t e r m i n e d ( m o d i fi e d f r o m C h a m b e r s a n d M a t r i s i a n , 1 9 9 7 ) . 1 0 0 e x p r e s s e d i n a v a r i e t y o f t i s s u e s a n d o f t e n e l e v a t e d i n m a l i g n a n t t u m o r s ( L i o t t a e t a l . , 1 9 7 9 ) . M M P - 9 i s a 9 2 k D a p r o t e i n e x p r e s s e d i n m a c r o p h a g e s , n e u t r o p h i l s , e p i t h e l i a l c e l l s , a n d k e r a t i n o c y t e s ( M a t r i s i a n , 1 9 9 2 ) . I t c o n t a i n s a n a d d i t i o n a l “ c o l l a g e n - l i k e ” d o m a i n i n i t s s t r u c t u r e . B o t h M M P - 2 a n d M M P - 9 c o n t a i n t h r e e fi b r o n e c t i n t y p e I I - l i k e r e p e a t s i n s e r t e d i n t o t h e c a t a l y t i c d o m a i n w h i c h a l l o w t h e m t o b i n d t o g e l a t i n , t h e m a i n s u b s t r a t e o f b o t h e n z y m e s . C o l l a g e n a s e s T h e c o l l a g e n a s e g r o u p i n c l u d e s i n t e r s t i t i a l c o l l a g e n a s e ( M M P - l ) , n e u t r o p h i l c o l l a g e n a s e ( M M P - 8 ) , a n d c o l l a g e n a s e s - 3 a n d - 4 ( M M P - 1 3 a n d M M P - 1 8 , r e s p e c t i v e l y ) ( N a g a s e , 2 0 0 0 ) . T h e s e e n z y m e s d e g r a d e fi b r i l l a r c o l l a g e n t y p e s I , I I , I I I , V I I I a n d X , p r o t e o g l y c a n s a n d g e l a t i n . T h e a b i l i t y t o c l e a v e fi b r i l l a r c o l l a g e n s i s l i m i t e d t o t h i s g r o u p o f M M P s ( M a t r i s i a n , 1 9 9 2 ) . A l l c o l l a g e n a s e s d e g r a d e i n t e r s t i t i a l c o l l a g e n s , b u t e a c h c o l l a g e n a s e e x h i b i t s a p r e f e r e n c e f o r d i f f e r e n t c o l l a g e n t y p e s . M M P - 1 p r e f e r s t y p e I I I , M M P - 8 t y p e I , a n d M M P - 1 3 h a s a p r e f e r e n c e f o r t y p e I I c o l l a g e n . S t r o m e l y s i n s S t r o m e l y s i n 1 ( M M P - 3 ) , s t r o m e l y s i n 2 ( M M P - 1 0 ) , a n d s t r o m e l y s i n 3 ( M M P - 1 1 ) a r e t h e t h r e e m e m b e r s o f t h e s t r o m e l y s i n g r o u p o f M M P s . B e c a u s e t h e e n z y m a t i c a c t i v i t y a n d a m i n o a c i d s e q u e n c e o f M M P - l l i s s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t f r o m M M P - 3 a n d M M P - 1 0 , i t i s o f t e n p l a c e d i n a s e p a r a t e s u b g r o u p . M M P - 3 a n d M M P - 1 0 b o t h d e g r a d e p r o t e o g l y c a n s a n d E C M g l y c o p r o t e i n s ( i . e . l a m i n i n a n d fi b r o n e c t i n ) , t y p e I V c o l l a g e n a n d g e l a t i n . M M P - 1 1 i s s e c r e t e d i n t h e a c t i v e f o r m a n d w e a k l y d e g r a d e s s t r o m e l y s i n - l i k e 1 0 1 s u b s t r a t e s . B o t h M M P - 3 a n d M M P - 1 0 p l a y a r o l e i n t h e a c t i v a t i o n o f s e v e r a l p r o M M P s ( N a g a s e , 2 0 0 0 ) . M T - M M P S C u r r e n t l y fi v e m e m b r a n e - t y p e M M P s ( M T - M M P s ) h a v e b e e n i d e n t i fi e d : M T l - M M P ( M M P - l 4 ) , M T Z - M M P ( M M P - 1 5 ) , M T 3 - M M P ( M M P - 1 6 ) , M T 4 - M M P ( M M P - 1 7 ) , a n d M T S - M M P ( M M P - 2 1 ) . E a c h h a s a s i n g l e c y t o p l a s m i c d o m a i n a n d a t r a n s m e m b r a n e ( T M ) d o m a i n . T h e T M d o m a i n r e s u l t s i n t h e M T - M M P s r e s i d i n g a t t h e c e l l m e m b r a n e . T h i s c h a r a c t e r i s t i c i s i n c o n t r a s t t o t h e o t h e r M M P f a m i l y m e m b e r s , w h i c h a r e a l l s e c r e t e d a s p r o - e n z y m e s i n t o t h e e x t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t . A l o n g w i t h M M P - 1 1 , t h e M T - M M P s a r e a c t i v a t e d i n t r a c e l l u l a r l y w i t h t h e h e l p o f a f u r i n s e q u e n c e l o c a t e d i n t h e i r s t r u c t u r a l d o m a i n s . L o c a l i z a t i o n o f M T - M M P s a t t h e c e l l m e m b r a n e r e s t r i c t s t h e i r a c t i o n s o n e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s n e a r t h e c e l l s u r f a c e . T h e m a j o r s u b s t r a t e s o f s o m e o f t h e M T - M M P s i n c l u d e g e l a t i n a s e A , fi b r i l l a r c o l l a g e n s , p r o t e o g l y c a n s a n d g l y c o p r o t e i n s ( C h a m b e r s a n d M a t r i s i a n , 1 9 9 7 ) . O t h e r M M P s S e v e r a l o t h e r M M P s h a v e b e e n i d e n t i fi e d b u t d o n o t f a l l i n t o o n e o f t h e f o u r m a i n s u b g r o u p s d u e t o d i f f e r e n c e s i n s u b s t r a t e s p e c i fi c i t y o r d o m a i n s t r u c t u r e s . S e v e r a l o f t h e s e “ o t h e r ” M M P s a r e d e s c r i b e d i n t h i s s e c t i o n . M a t r i l y s i n ( M M P - 7 ) i s t h e s m a l l e s t m e m b e r o f t h e M M P f a m i l y ( N a g a s e , 2 0 0 0 ) . T h i s M M P i s o c c a s i o n a l l y g r o u p e d i n t o t h e s t r o m e l y s i n f a m i l y . M M P - 7 d i g e s t s s e v e r a l E C M c o m p o n e n t s i n c l u d i n g p r o t e g l y c a n s , g l y c o p r o t e i n s , t y p e I V c o l l a g e n , g e l a t i n , a n d e l a s t i n . T h e e l a s t a s e g r o u p s o f a r h a s o n l y 1 0 2 o n e m e m b e r . M e t a l l o e l a s t a s e ( M M P - 1 2 ) d i g e s t s e l a s t i n a n d n o n fi b r i l l a r c o l l a g e n . T h i s M M P m a y r e p r e s e n t a n e w c l a s s o f e l a s t i n - d e g r a d i n g M M P s t h a t i n c l u d e s M M P - 1 8 a n d M M P - l 9 . M M P - 1 2 s h a r e s t h e s a m e d o m a i n s t r u c t u r e a s s t r o m e l y s i n s a n d c o l l a g e n a s e s . T h e l a s t o f t h e M M P s i n c l u d e M M P - 1 9 , M M P - 2 0 , M M P - 2 1 , M M P - 2 2 , a n d M M P - 2 3 . T h e s e M M P s h a v e b e e n m o r e r e c e n t l y d i s c o v e r e d a n d , a s a r e s u l t , t h e i r c h a r a c t e r i z a t i o n i s v e r y l i m i t e d . I t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t t h e r e i s a n o t h e r f a m i l y o f p r o t e i n s t h a t h a v e m e t a l l o p r o t e i n a s e a c t i v i t y . T h e A D A M ( A D i s i n t e g r i n A n d M e t a l l o p r o t e i n a s e ) p r o t e i n s c o n t a i n e n z y m e - l i k e r e g i o n s a n d a d i s i n t e g r i n r e g i o n t h a t c a n m e d i a t e c e l l a d h e s i o n a n d d e t a c h m e n t . O f t h e a p p r o x i m a t e l y 3 0 m e m b e r s o f t h e A D A M f a m i l y , o n l y 1 6 a r e k n o w n t o h a v e m e t a l l o p r o t e i n a s e a c t i v i t y ( N e l s o n e t a l . , 2 0 0 0 ) . A s s o c i a t i o n o f M M P s a n d C a n c e r I n o r d e r f o r a c e l l t o i n v a d e a n d m e t a s t a s i z e , t h e r e a r e a s e r i e s o f c o l l a g e n - c o n t a i n i n g s t r u c t u r a l b a r r i e r s t h a t i t m u s t b e a b l e t o c r o s s . E x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( E C M ) a n d b a s e m e n t m e m b r a n e ( B M ) b a r r i e r s m u s t b e p a s s e d d u r i n g i n t r a v a s a t i o n a n d e x t r a v a s a t i o n i n t o a n d o u t o f , r e s p e c t i v e l y , t h e l y m p h a t i c a n d b l o o d v a s c u l a r s y s t e m s . T h e c o l l a g e n - c o n t a i n i n g B M u n d e r l y i n g e n d o t h e l i a l c e l l s p r e s e n t s a fi n a l b a r r i e r t h a t m u s t b e b r e a c h e d d u r i n g t h e m e t a s t a t i c p r o c e s s . T i s s u e d e g r a d a t i o n i s r e q u i r e d t o p e r m i t t u m o r c e l l i n v a s i o n a t b o t h t h e p r i m a r y a n d s e c o n d a r y t u m o r s i t e s . W h i l e s o m e o f t h e p r o t e o l y t i c a c t i v i t y m a y b e d e r i v e d f r o m s t r o m a l c e l l s a n d t u m o r - i n fi l t r a t i n g i m m u n e c e l l s f r o m h o s t t i s s u e s ( C h a m b e r s a n d M a t r i s i a n , 1 9 9 7 ) , i t i s o b v i o u s t h a t c a n c e r c e l l s r e q u i r e a s u f f i c i e n t a m o u n t o f e n z y m a t i c a b i l i t y t o d e g r a d e t h e s e b a r r i e r s . M M P s w e r e 1 0 3 p r i m e c a n d i d a t e s f o r t h e s e d e g r a d a t i v e a c t i v i t i e s b e c a u s e t h e f a m i l y m e m b e r s c o l l e c t i v e l y d e g r a d e a l l c o m p o n e n t s o f t h e E C M . T h e fi r s t e v i d e n c e t o s u p p o r t t h e r e q u i r e m e n t f o r e l e v a t e d l e v e l s o f p r o t e o l y t i c a c t i v i t y i n c a n c e r c e l l s a n d t h e i m p o r t a n c e o f M M P s i n t h i s p r o c e s s c a m e f r o m e x p e r i m e n t s c a r r i e d o u t i n t h e e a r l y 1 9 8 0 5 ( B a r s k y e t a l . , 1 9 8 3 ; L i o t t a e t a l . , 1 9 7 9 ; L i o t t a , e t a l . , 1 9 8 0 ) . M M P s h a v e b e e n a s s o c i a t e d w i t h t h e m a l i g n a n t p h e n o t y p e f o r a n u m b e r o f y e a r s , a n d t h e r e i s n o w a n e x t e n s i v e a m o u n t o f e v i d e n c e t h a t s h o w s e l e v a t e d M M P l e v e l s i n c a n c e r t i s s u e s c o m p a r e d t o n o r m a l t i s s u e s . M o s t M M P s h a v e b e e n d e t e c t e d i n h u m a n t u m o r c e l l l i n e s . M M P s m a y b e e x p r e s s e d b y m a l i g n a n t c e l l s a s w e l l a s t h e a d j a c e n t s t r o m a l c e l l s . M a n y M M P s a r e e x p r e s s e d i n c o n n e c t i v e t i s s u e c e l l s ( e . g . fi b r o b l a s t s a n d i n fl a m m a t o r y c e l l s ) i n r e s p o n s e t o t h e t u m o r ( N e l s o n e t a l . , 1 9 9 7 ) . I n s e v e r a l t u m o r s s y s t e m s t h e r e i s a d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f M M P s i n t u m o r c e l l s a n d i n t h e s u r r o u n d i n g t u m o r s t r o m a . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e r e m o d e l i n g o f t h e t u m o r a n d s u r r o u n d i n g t i s s u e s m a y b e f a c i l i t a t e d b y t h e s t r o m a l r e s p o n s e t o t h e t u m o r ( S t e t l e r - S t e v e n s o n a n d Y u , 2 0 0 1 ) . T h e r e i s a l s o a p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t u m o r a g g r e s s i v e n e s s a n d t h e e x p r e s s i o n o f h i g h l e v e l s o f m u l t i p l e m e m b e r s o f t h e M M P f a m i l y . T h e o v e r e x p r e s s i o n o f M M P s u s u a l l y c o r r e l a t e s w i t h m o r e a g g r e s s i v e t u m o r b e h a v i o r a n d p o o r p r o g n o s i s ( S t e r n l i c h t e t a l . , 2 0 0 0 ) . G e l a t i n a s e A ( M M P - 2 ) h a s b e e n s h o w n t o h a v e i n c r e a s e d l e v e l s i n s e v e r a l d i f f e r e n t h u m a n t u m o r s ( M o n t i r o n i , e t a l . , 1 9 9 2 ; S t e t l e r - S t e v e n s o n e t a l . , 1 9 9 3 ; N e l s o n e t a l . , 2 0 0 0 ) . S t e a m s a n d W a n g ( 1 9 9 3 ) d e m o n s t r a t e d w i t h i m m u n o p e r o x i d a s e l a b e l i n g , N o r t h e r n b l o t a n a l y s i s , a n d e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y s ( E L I S A s ) t h a t M M P - 2 l e v e l s i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g G l e a s o n s c o r e s i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r . S t e a r n s a n d S t e a m s ( 1 9 9 6 ) h a d s i m i l a r r e s u l t s 1 0 4 w h e n t h e y s t u d i e d M M P - 2 l e v e l s i n p r o s t a t i c c a n c e r t i s s u e s e c t i o n s . T h e s e s t u d i e s s u g g e s t M M P e x p r e s s i o n l e v e l s m a y b e g o o d i n d i c a t o r s o f t h e g r a d e o r p r o g r e s s i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . U s i n g S D S - P A G E z y m o g r a p h y , i n c r e a s e d p r e s e n c e o f b o t h M M P - 2 a n d M M P - 9 , w a s d e m o n s t r a t e d i n t h e u r i n e o f p a t i e n t s w i t h p r o s t a t e , b r e a s t , c o l o n , r e n a l , a n d b l a d d e r c a n c e r s ( M o s e s e t a l . , 1 9 9 8 ) . G o k a s l a n a n d c o l l e a g u e s ( 1 9 9 8 ) t e s t e d M M P - 2 a n d M M P - 9 e x p r e s s i o n i n v a r i o u s p r i m a r y c a r c i n o m a s t h a t w e r e m e t a s t a t i c t o t h e s p i n e ( f r o m b r e a s t , l u n g , r e n a l c e l l , a n d t h y r o i d c a r c i n o m a s ) t o a s s e s s t h e r o l e o f t h e s e e n z y m e s i n s p i n a l i n v a s i o n . T h e y d i s c o v e r e d t h a t t h e m o r e a g g r e s s i v e l u n g c a r c i n o m a s a n d m e l a n o m a s , e x p r e s s e d t h e h i g h e s t l e v e l s o f M M P - 2 a n d M M P - 9 ( F i g u r e 5 - 2 ) , s u g g e s t i n g t h a t i n c r e a s e d l e v e l s o f M M P s a r e c o r r e l a t e d w i t h e n h a n c e d i n v a s i v e a b i l i t y . T h e s e r e s u l t s a l s o s u g g e s t t h a t i n c r e a s e d M M P a c t i v i t y i s i m p o r t a n t i n d e g r a d i n g t h e B M a t t h e p r i m a r y t u m o r s i t e a s w e l l a s a t d i s t a n t m e t a s t a t i c s i t e s . M M P - 2 a n d M M P - 9 a r e n o t t h e o n l y m e m b e r s o f t h e M M P f a m i l y t h a t s h o w e l e v a t e d e x p r e s s i o n l e v e l s i n c a n c e r . S t r o m e l y s i n - 3 ( M M P - 1 1 ) h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h m a l i g n a n t b r e a s t c a n c e r , b u t i s n o t e x p r e s s e d i n n o r m a l b r e a s t t i s s u e o r b e n i g n fi b r o a n d e n o m a s ( W o l f e t a l . , 1 9 9 3 ) . I n v e s t i g a t o r s h a v e a l s o d e m o n s t r a t e d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f M M P - 1 , M M P - 1 0 , M M P - 7 , a n d M T l - M M P i n a v a r i e t y o f h u m a n c a n c e r s ( S t e t l e r - S t e v e n s o n a n d Y u , 2 0 0 1 ) . S e v e r a l g e n e r a l i z a t i o n s a b o u t t h e a s s o c i a t i o n o f M M P s a n d c a n c e r c a n b e m a d e . F i r s t , t h e n u m b e r o f d i f f e r e n t M M P f a m i l y m e m b e r s t h a t c a n b e d e t e c t e d t e n d s t o i n c r e a s e w i t h t u m o r p r o g r e s s i o n . S e c o n d , t h e r e i s a p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e l e v e l s o f a n y M M P f a m i l y m e m b e r a n d t u m o r s t a g e ; M M P l e v e l s 1 0 5 x N C D N N S g I B r e a s t M e l a n o m a L u n g T h y r o i d R e n a l C h o r d o m a C h o n d r o s a r c o m a G i a n t C e l l t u m o r F i g u r e 5 - 2 : G e l a t i n z y m o g r a p h y o f t i s s u e e x t r a c t s o b t a i n e d f r o m p r i m a r y a n d m e t a s t a t i c s p i n a l t u m o r s a m p l e s . E q u a l a m o u n t s o f p r o t e i n ( 5 0 p g ) w e r e f r a c t i o n a t e d b y S D S - P A G E u s i n g g e l a t i n a s t h e s u b s t r a t e . M o l e c u l a r s i z e o f m a j o r M M P s i s d e n o t e d i n k i l o d a l t o n s ( k D a ) . M M P - 9 a t 9 2 k D a , M M P - 2 a t 7 2 k D a ( m o d i fi e d f r o m G o k a s l a n e t a l . , 1 9 9 8 ) . t e n d t o i n c r e a s e w i t h i n c r e a s i n g t u m o r s t a g e . T h i r d , s i n c e M M P s c a n b e p r o d u c e d b y t u m o r c e l l s a s w e l l a s b y h o s t o r g a n s t r o m a l c e l l s , a s a h o s t r e s p o n s e t o t h e t u m o r , t h e e x p r e s s i o n p a t t e r n o f M M P s s u p p o r t s a r o l e f o r t h e s e e n z y m e s i n l a t e r s t a g e s o f t u m o r p r o g r e s s i o n . W h i l e M M P s a n d t h e i r r o l e i n t u m o r p r o g r e s s i o n a r e t h e f o c u s o f t h i s c h a p t e r , i t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t t h e y a r e n o t t h e o n l y c o n t r i b u t o r s t o t h e p r o t e o l y t i c d e g r a d a t i o n t h a t o c c u r s d u r i n g t h i s p r o c e s s . I n t e r a c t i o n s b e t w e e n m e m b e r s o f t h e o t h e r p r o t e a s e f a m i l i e s p r o v i d e a d d i t i o n a l l e v e l s o f r e g u l a t i o n a n d c o m p l e x i t y t o t u m o r c e l l i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s ( W e b b e r e t a l . , 1 9 9 5 ; W a g h r a y a n d W e b b e r , 1 9 9 5 ; W e b b e r e t a l . , 1 9 9 6 ) . 1 0 6 M M P R e g u l a t i o n T h e r e g u l a t i o n o f M M P s c a n o c c u r a t s e v e r a l l e v e l s : g e n e e x p r e s s i o n ( t r a n s c r i p t i o n ) , a c t i v a t i o n , a n d a c t i v i t y . T h e s e m u l t i p l e l e v e l s o f r e g u l a t i o n a l l o w f o r a w i d e r a n g e o f a p p r o a c h e s t o c o n t r o l t h e f u n c t i o n s o f t h e M M P f a m i l y m e m b e r s . G e n e E x p r e s s i o n A s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d , M M P e x p r e s s i o n i s o f t e n e l e v a t e d d u r i n g t i s s u e r e m o d e l i n g o r c a n c e r i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s . S e v e r a l a g e n t s a r e k n o w n t o i n d u c e t h e e x p r e s s i o n o f M M P g e n e s , i n c l u d i n g c y t o k i n e s , g r o w t h f a c t o r s , o n c o g e n e s , t u m o r p r o m o t e r s , c h e m i c a l a g e n t s ( p h o r b o l e s t e r s , a c t i n s t r e s s fi b e r - d i s r u p t i n g d r u g s ) , u l t r a v i o l e t B i r r a d i a t i o n , a n d p h y s i c a l s t r e s s ( S t e a r n s a n d W a n g , 1 9 9 3 ; N a g a s e a n d W o e s s n e r , 1 9 9 9 ) . S e v e r a l s u p p r e s s i v e f a c t o r s ( t r a n s f o r m i n g g r t h f a c t o r - B , r e t i n o i c a c i d s , a n d g l u c o c o t i c o i d s ) c a n d o w n - r e g u l a t e M M P g e n e e x p r e s s i o n ( N a g a s e a n d W o e s s n e r , 1 9 9 9 ) . A c t i v a t i o n O n c e t h e M M P i s e x p r e s s e d a n d s e c r e t e d i n t o t h e e x t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t , t h e n e x t r e g u l a t o r y p o i n t i s a c t i v a t i o n . W i t h t h e e x c e p t i o n o f M M P - 1 1 a n d t h e M T - M M P s , a l l M M P s a r e i n i t i a l l y s y n t h e s i z e d a n d s e c r e t e d f r o m t h e c e l l a s i n a c t i v e p r o - e n z y m e s , o r z y m o g e n s . T h e l a t e n t e n z y m e s c a n b e a c t i v a t e d i n v i t r o a n d i n v i v o . I n a l l c a s e s , a c t i v a t i o n r e q u i r e s t h e r e m o v a l o f a p o r t i o n o f t h e P R O d o m a i n . R e m o v a l o f t h i s d o m a i n d e s t a b i l i z e s t h e a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e c y s t e i n e r e s i d u e w i t h z i n c a n d r e s u l t s i n a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e . T h e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e , r e f e r r e d t o a s t h e “ c y s t e i n e s w i t c h , ” 1 0 7 a l l o w s t h e n e w l y a c t i v a t e d c a t a l y t i c s i t e t o i n t e r a c t w i t h z i n c . T h e z i n c i o n i s t h e c a t a l y t i c e l e m e n t o f M M P s . M M P a c t i v a t i o n i n v i t r o c a n b e a c c o m p l i s h e d b y p r o t e i n a s e s a n d n o n - p r o t e o l y t i c a g e n t s s u c h a s m e r c u r i a l c o m p o u n d s , r e a c t i v e o x y g e n , a n d d e n a t u r a n t s ( N a g a s e a n d W o e s s n e r , 1 9 9 9 ) . F o u r m a i n m e c h a n i s m s f o r t h e i n v i v o a c t i v a t i o n o f M M P s h a v e b e e n p r o p o s e d : 1 ) t h e e x t r a c e l l u l a r a c t i v a t i o n o f M M P s b y n o n - M M P p r o t e i n s ( i . e . u P A / p l a s m i n s y s t e m , t h r o m b i n , a n d t r y p s i n ) ; 2 ) t h e e x t r a c e l l u l a r a c t i v a t i o n o f M M P s b y o t h e r M M P s ; 3 ) t h e i n t r a c e l l u l a r a c t i v a t i o n o f M M P - 1 1 a n d M T - M M P s b y f u r i n ; a n d 4 ) t h e M T - M M P m e m b r a n e - a s s o c i a t e d a c t i v a t i o n o f M M P - 2 . A c t i v i t y A f t e r M M P s h a v e b e e n a c t i v a t e d , t h e y a r e s u b j e c t t o i n h i b i t i o n b y a f a m i l y o f e n d o g e n o u s t i s s u e i n h i b i t o r s o f m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( T I M P S ) a s w e l l a s b y a 2 - m a c r o g l o b u l i n , a n i n h i b i t o r i n t h e p l a s m a . T I M P S a r e a f a m i l y o f s e c r e t e d p r o t e i n s w h o s e p r i m a r y f u n c t i o n i s t o i n h i b i t t h e p r o t e o l y t i c a c t i v i t y o f M M P s ( L i o t t a e t a l . , 1 9 8 2 ) . S t u d i e s d o n e o n T I M P S h e l p e d p r o v i d e e v i d e n c e t h a t i n c r e a s e d M M P a c t i v i t y w a s a d i r e c t c a u s e o f t h e e n h a n c e d i n v a s i v e a b i l i t y o f c a n c e r c e l l s . I n t h e s e s t u d i e s , T I M P S s p e c i fi c a l l y i n h i b i t e d d e g r a d a t i o n o f m a t r i c e s , i n v a s i o n , a n d t u m o r i g e n e s i s . H o w e v e r , t h e p r o t e a s e i n h i b i t o r s h a d n o e f f e c t o n c e l l p r o l i f e r a t i o n , a t t a c h m e n t t o a m n i o n i n t h e c h i c k a m n i o n i n v i v o i n v a s i o n a s s a y , a n d m i g r a t i o n t h r o u g h n o n - c o a t e d fi l t e r s i n t h e B o y d e n c h a m b e r i n v i t r o i n v a s i o n a s s a y . T o d a t e t h e r e a r e f o u r m e m b e r s o f t h e T I M P f a m i l y , n u m b e r e d T I M P - 1 t h r o u g h T I M P - 4 , b a s e d o n t h e i r o r d e r o f d i s c o v e r y . T I M P s s p e c i fi c a l l y a n d r e v e r s i b l y i n h i b i t M M P s , b u t t h e y a r e n o t k n o w n t o i n h i b i t a n y o t h e r m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M u r p h y a n d 1 0 8 W i l l e n b r o c k , 1 9 9 5 ) . T h e i n h i b i t o r y a b i l i t y o f t h e T I M P S i s c e n t r a l t o t h e i r e f f e c t i v e n e s s a s t u m o r a n d i n v a s i o n s u p p r e s s o r s . A l l f o u r T I M P S h a v e 1 2 a b s o l u t e l y c o n s e r v e d c y s t e i n e r e s i d u e s t h a t f o r m s i x i n t r a m o l e c u l a r d i s u l fi d e b o n d s . T h r e e o f t h e s e b o n d s a r e l o c a t e d i n t h e N - t e r m i n a l d o m a i n , w h i c h c o n t a i n s t h e M M P - i n h i b i t o r y a c t i v i t y ( S t e t l e r - S t e v e n s o n a n d Y u , 2 0 0 1 ) . T I M P S b i n d t o l a t e n t a n d a c t i v e M M P s i n a 1 : 1 s t o i c h i o m e t r y . T h i s b a l a n c e b e t w e e n a c t i v e p r o t e a s e s a n d i n h i b i t o r s w o u l d r e s u l t i n a n o p t i m a l n o n - i n v a s i v e p h e n o t y p e . C o m p l e t e d i s s o l u t i o n o f m a t r i x p r o t e i n s w o u l d p r e v e n t t u m o r c e l l s f r o m b e i n g a b l e t o f o r m a t t a c h m e n t s t o e a c h o t h e r o r t o t h e m a t r i x p r o t e i n s , b o t h o f w h i c h a r e n e c e s s a r y f o r i n v a s i o n t o o c c u r . B u t , p a t h o l o g i c a l t i s s u e d e s t r u c t i o n , s u c h a s i n c a n c e r , d o e s o c c u r i n t h e c a s e s o f r e d u c t i o n o r a b l a t i o n o f T I M P g e n e e x p r e s s i o n . C o n v e r s e l y , a n y i m b a l a n c e o f t h e r a t i o i n f a v o r o f T I M P S c a n l e a d t o a b n o r m a l E C M a c c u m u l a t i o n a n d a d e c r e a s e i n i n v a s i o n o f t u m o r c e l l s . T h e r o l e o f T I M P S h a s p r o v e n t o b e m o r e c o m p l e x a n d m u l t i f a c e t e d t h a n j u s t a s i n h i b i t o r s o f M M P a c t i v i t y . T h e r e a r e s e v e r a l r e p o r t s d e m o n s t r a t i n g t h a t T I M P s c a n b o t h s t i m u l a t e a n d i n h i b i t c e l l g r o w t h ( E d w a r d s , 2 0 0 0 ; S t e t l e r - S t e v e n s o n a n d Y u , 2 0 0 1 ) . T h e y h a v e a l s o b e e n s h o w n t o p r o m o t e a n d i n h i b i t a p o p t o s i s . M e m b e r s o f t h e T I M P f a m i l y h a v e a l s o b e e n a s s o c i a t e d w i t h c a n c e r . I n s e v e r a l c a s e s , m a l i g n a n t t u m o r s h a v e b e e n s h o w n t o e x p r e s s i n c r e a s e d r a t h e r t h a n d e c r e a s e d l e v e l s o f T I M P S ( G r i g n o n e t a l . , 1 9 9 6 ; J u n g e t a l . , 1 9 9 7 ) . W h e t h e r o r n o t t h e s e i n c r e a s e d l e v e l s o f T I M P s w e r e i n r e s p o n s e t o i n c r e a s e s i n M M P l e v e l s w a s n o t d e t e r m i n e d . T h e r e c a n a l s o b e v a r i a b l e e x p r e s s i o n p a t t e r n s o f M M P s a n d T I M P S w i t h i n t u m o r s v e r s u s s u r r o u n d i n g s t r o m a l c e l l s . I t i s o b v i o u s t h a t t h e i n t e r p l a y b e t w e e n M M P s a n d T I M P s i n v i v a i s c o m p l e x a n d p o o r l y u n d e r s t o o d a n d f u r t h e r s t u d i e s n e e d t o b e d o n e t o fi i l l y u n d e r s t a n d t h e i r r e l a t i o n s h i p . 1 0 9 E m e r g i n g R o l e s f o r M M P s i n T u m o r P r o g r e s s i o n a n d I n v a s i o n M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P s ) a n d t h e i r i n h i b i t o r s h a v e b e e n s t r o n g l y l i n k e d t o t h e p r o t e o l y t i c a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h m e t a s t a s i s a n d a s c o n t r i b u t o r s t o t h e p r o c e s s . H o w e v e r , r e c e n t s t u d i e s s u g g e s t t h a t M M P s a r e a l s o i m p o r t a n t i n c r e a t i n g a n d m a i n t a i n i n g a n e n v i r o n m e n t t h a t s u p p o r t s t h e i n i t i a t i o n a n d g r o w t h m a i n t e n a n c e o f b o t h p r i m a r y a n d m e t a s t a t i c t u m o r s . T h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( E C M ) c a n h a v e e f f e c t s o n c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n , d i f f e r e n t i a t i o n , a n d m i g r a t i o n . E v i d e n c e s u g g e s t s M M P s p l a y a r o l e i n t h e s e p r o c e s s e s , a t l e a s t i n p a r t , b y s p e c i fi c a l l y a l t e r i n g t h e i n t e g r i t y a n d c o m p o s i t i o n o f t h e E C M . O n e e m e r g i n g r o l e f o r M M P s i s i n t u m o r i n i t i a t i o n . T h e fi r s t e v i d e n c e s u p p o r t i n g t h i s r o l e c a m e f r o m S t e m l i c h t a n d c o l l e a g u e s ( 1 9 9 9 ) . T h e y s h o w e d t h a t M M P - 3 i n d u c e s t u m o r s i n a n i m a l s w i t h a n d w i t h o u t a n i n t a c t i m m u n e s y s t e m . U s i n g m a m m a r y e p i t h e l i a l c e l l s t h a t e x p r e s s e d M M P - 3 , t h e y d e m o n s t r a t e d t h a t M M P - 3 c o n v e r t s n o r m a l m a m m a r y e p i t h e l i a l c e l l s i n t o h i g h l y i n v a s i v e m e s e n c h y m a l - l i k e t u m o r s i n v i v a . T h e y a l s o s h o w e d t h a t t h i s t r a n s i t i o n c o u l d b e b l o c k e d b y o v e r - e x p r e s s i o n o f T I M P - 1 , w h i c h f u r t h e r s u p p o r t e d t h e r o l e o f M M P s i n t u m o r i n i t i a t i o n . T h e i n i t i a t i o n o f t u m o r g r o w t h m a y i n v o l v e t h e r e g u l a t i o n o f t h e g r o w t h e n v i r o n m e n t b y r e g u l a t i n g a c c e s s t o g r o w t h f a c t o r s f r o m t h e E C M s u r r o u n d i n g t h e g r o w i n g t u m o r . M M P s a l s o p l a y a r o l e i n t u m o r i n i t i a t i o n a n d g r o w t h a t s e c o n d a r y s i t e s . S t u d i e s h a v e s h o w n t h a t T I M P S c a n b l o c k M M P a c t i v i t y d u r i n g t h i s p r o c e s s . I n t r a v i t a l v i d e o m i c r o s c o p y ( I W M ) p e r m i t s d i r e c t o b s e r v a t i o n o f t h e m i c r o c i r c u l a t i o n i n v i v a . U s i n g t h i s t e c h n i q u e a n d q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f e x t r a v a s a t i o n , K o o p e t a 1 ( 1 9 9 4 ) c h a l l e n g e d t h e i d e a t h a t t u m o r c e l l e x t r a v a s a t i o n w a s t h e r a t e l i m i t i n g s t e p i n m e t a s t a s i s . T h e y 1 1 0 d e t e r m i n e d t h a t B l 6 F 1 0 m e l a n o m a c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h T I M P - l s h o w e d n o d i f f e r e n c e i n t h e r a t e o f e x t r a v a s a t i o n c o m p a r e d t o t h e p a r e n t c e l l l i n e . H o w e v e r , a f t e r s e v e n d a y s t h e r e w a s a s i g n i fi c a n t r e d u c t i o n i n b o t h s i z e a n d n u m b e r o f t u m o r n o d u l e s i n t h e T I M P - e x p r e s s i n g c e l l s c o m p a r e d t o t h e p a r e n t c e l l s . S i m i l a r r e s u l t s w e r e s h o w n u s i n g a t u m o r i g e n i c , m e t a s t a t i c r a t b l a d d e r c e l l l i n e ( K a w a m a t a e t a l . , 1 9 9 5 ) . K a w a m a t a a n d c o l l e a g u e s d e m o n s t r a t e d t h a t t r a n s f e c t i o n o f c e l l s w i t h T I M P - 1 o r T I M P - 2 c D N A o n l y s l i g h t l y a f f e c t e d p r i m a r y t u m o r g r o w t h a n d l o c a l i n v a s i o n , b u t s i g n i fi c a n t l y i n h i b i t e d e x t r a v a s c u l a r g r o w t h a t d i s t a n t m e t a s t a t i c s i t e s . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t M M P a c t i v i t y m a y b e m o r e i m p o r t a n t t o t h e e s t a b l i s h m e n t a n d g r o w t h o f t u m o r d e p o s i t s t h a n i n t h e i n v a s i v e s t e p s o f m e t a s t a s i s . T h e s e s t u d i e s a l s o s u g g e s t t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p o f m e t a s t a s i s m a y o c c u r a f t e r e x t r a v a s a t i o n . T h e m o d u l a t i o n o f E C M p r o t e i n s b y M M P s h a s b e e n s h o w n t o p l a y a r o l e i n c e l l u l a r m i g r a t i o n a n d i n v a s i o n . T h e i n t e g r i n s a r e a f a m i l y o f c e l l : m a t r i x a d h e s i o n m o l e c u l e s t h a t p r o v i d e a d h e s i v e t r a c t i o n a n d c o n t r a c t i o n o f a c t i n fi l a m e n t s d u r i n g c e l l m i g r a t i o n . R e c e n t d a t a s u g g e s t t h a t M M P - i n t e g r i n i n t e r a c t i o n s m a y m o d u l a t e i n t e g r i n f u n c t i o n o n t h e c e l l s u r f a c e . B r o o k s a n d c o l l e a g u e s ( 1 9 9 6 ) s h o w e d t h a t t h e ( 1 4 3 3 i n t e g r i n c a n b i n d M M P - 2 . T h i s s u g g e s t s t h a t M M P - i n t e g r i n i n t e r a c t i o n m a y l o c a l i z e M M P s a t s i t e s p r o x i m a l t o i m p o r t a n t E C M l i g a n d s t h a t w o u l d f a c i l i t a t e i n v a s i o n . M M P - 2 w a s a l s o s h o w n t o c l e a v e t h e 7 2 c h a i n o f l a m i n i n - 5 t o r e v e a l a c r y p t i c s i t e o n t h e 0 L 3 c h a i n t h a t h a s c h e m o t a c t i c p r o p e r t i e s a n d s t i m u l a t e d c e l l m i g r a t i o n ( G i a n n e l l i e t a l . , 1 9 9 7 ) . M M P s h a v e a l s o b e e n s h o w n t o p l a y a r o l e i n a n g i o g e n e s i s , t h e p r o c e s s b y w h i c h n e w b l o o d v e s s e l s a r e f o r m e d . S e v e r a l s t u d i e s h a v e s h o w n t h e n e e d f o r M M P - 2 a n d M M P - 9 i n t h e p r o c e s s o f a n g i o g e n e s i s i n m i c e ( F i n g l e t o n a n d M a t r i s i a n , 2 0 0 0 ) . 1 1 1 A n g i o g e n e n s i s i s e s s e n t i a l f o r t u m o r g r o w t h a n d s u r v i v a l , a n d i t s r e g u l a t i o n b y M M P s m o s t l i k e l y p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e r e g u l a t i n g o f s u s t a i n e d t u m o r g r o w t h . I t c a n a l s o s e r v e a s a m e t h o d t o t r a n s f e r m e t a s t a t i c c e l l s t o s e c o n d a r y s i t e s . J o h n s o n e t a l . ( 1 9 9 4 ) d e m o n s t r a t e d t h a t a n u p - r e g u l a t i o n o f M M P s a n d a d o w n - r e g u l a t i o n o f t h e i r i n h i b i t o r s ( T I M P S ) a r e f e a t u r e s o f t h e a n g i o g e n i c p r o c e s s . C o n v e r s e l y , M M P - 9 a n d M M P - 7 h a v e b e e n s h o w n t o i n h i b i t a n g i o g e n e s i s b y c l e a v i n g p l a s m i n t o y i e l d a n g i o s t a t i n , a p o t e n t i n h i b i t o r o f a n g i o g e n e s i s . T h i s M M P a c t i v i t y i s n o w b e l i e v e d t o b e t h e p r i n c i p l e p r o t e a s e a c t i v i t y r e s p o n s i b l e f o r a n g i o s t a t i n g e n e r a t i o n ( P a t t e r s o n a n d S a n g , 1 9 9 7 ) T h e r e i s m u c h e v i d e n c e t o s u p p o r t t h e s e e m e r g i n g r o l e s f o r M M P s , b u t m u c h s t i l l r e m a i n s t o b e e l u c i d a t e d . A fi i r t h e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e s e n e w r o l e s f o r M M P s i s v i t a l t o t h e d e s i g n a n d d e v e l o p m e n t o f n e w a n d e f f e c t i v e c a n c e r t h e r a p e u t i c s . F i g u r e 5 - 3 i s a d i a g r a m s h o w i n g t h e c l a s s i c a s w e l l a s e m e r g i n g r o l e s o f M M P s i n t u m o r p r o g r e s s i o n a n d m e t a s t a s i s . E f f e c t s o f V i t a m i n D o n M M P s C o n s i d e r a b l e a t t e n t i o n h a s b e e n f o c u s e d o n t h e r o l e o f v i t a m i n D i n c a n c e r p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t . T h e r e i s s u b s t a n t i a l e v i d e n c e t o s h o w t h a t v i t a m i n D c a n i n d u c e a p o p t o s i s a n d d i f f e r e n t i a t i o n , a n d i n h i b i t p r o l i f e r a t i o n a n d i n v a s i o n i n s e v e r a l t y p e s o f c a n c e r . T h e m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f v i t a m i n D i n t h e s e p r o c e s s e s a r e b e i n g d i s c o v e r e d b u t s t i l l r e m a i n s o m e w h a t u n c l e a r . T h i s s e c t i o n w i l l f o c u s o n t h e e f f e c t s o f v i t a m i n D o n m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P s ) . T h e e f f e c t s o f v i t a m i n D o n s e v e r a l o t h e r p r o c e s s e s w i l l b e r e v i e w e d i n c h a p t e r s 6 , 8 a n d 9 . C u r r e n t l y t h e r e i s l i m i t e d d a t a 1 1 2 B e n i g n M a l i g n a n t C l i n i c a l l y t u m o r e v i d e n t m e t a s t a s i s n e w o r g a n I n i t i a t i o n P r i m a r y . t u m o r A n g i o g e n e s i s S u r v i v a l i n E X J N V E S W O " P r o m o t i o n 9 ’ ° “ ' “ ' i n v a s i o n c i r c u l a t i o n L o c a l S u s t a i n e d m l g n fl o n g r o w t h C o n v e r s i o n I n t r a v a s a t i o n I n i t i a t i o n T o f g r o w t h l S t l g e s a t w h l c h m m m m o u g m o p l a y a r o l e I ' E x p a n d e d r o l e t o r M M P : I n t u m o r p r o g r e s s i o n 1 F i g u r e 5 — 3 : R o l e o f M M P s i n t h e m e t a s t a t i c p r o c e s s . M M P s h a v e b e e n c l a s s i c a l l y t h o u g h t t o c o n t r i b u t e t o t h e t i s s u e d e s t r u c t i o n r e q u i r e d f o r c e l l s t o i n v a d e , i n t r a v a s a t e , e x t r a v a s a t e , a n d m i g r a t e . M o r e r e c e n t e v i d e n c e s u g g e s t s t h e s e e n z y m e s c a n a l s o p l a y a r o l e i n t h e g r o w t h o f t u m o r s , a n g i o g e n e s i s , a n d t h e s u s t a i n e d g r o w t h o f m e t a s t a t i c n o d u l e s ( N e l s o n e t a l , 2 0 0 0 ) . d e s c r i b i n g t h e e f f e c t s o f v i t a m i n D o n M M P s . T h i s i s a n i m p o r t a n t a r e a o f s t u d y g i v e n t h e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d r o l e s M M P s p l a y i n t u m o r p r o g r e s s i o n a n d m e t a s t a s i s . S c h w a r t z e t a l . ( 1 9 9 7 ) s t u d i e d t h e e f f e c t s o f 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 ( c a l c i t r i o l ) o n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s : D U 1 4 5 , a n d L N C a P . T h e y r e p o r t e d t h a t t h e p o o r l y i n v a s i v e L N C a P c e l l l i n e w a s h a r d l y a f f e c t e d b y t r e a t m e n t w i t h c a l c i t r i o l . H o w e v e r , t h e h i g h l y i n v a s i v e D U 1 4 5 c e l l s s h o w e d a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n i n v a s i v e a b i l i t y w h e n e x p o s e d t o c a l c i t r i o l t r e a t m e n t . I n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e p o s s i b l e m e c h a n i s m r e s p o n s i b l e f o r t h i s d e c r e a s e i n i n v a s i o n , S c h w a r t z a n d c o l l e a g u e s e x a m i n e d s e c r e t e d M M P - 2 a n d 1 1 3 M M P - 9 l e v e l s w i t h g e l a t i n - b a s e d z y m o g r a p h y i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i t r i o l . T h e y d e m o n s t r a t e d a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n a c t i v i t y l e v e l s o f b o t h e n z y m e s i n t h e D U 1 4 5 c e l l l i n e . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d u s i n g t h e h u m a n b r e a s t c a r c i n o m a c e l l l i n e M D A - M B - 2 3 l ( H a n s e n e t a l . , 1 9 9 4 ; K o l i a n d K e s k i - O j a , 2 0 0 0 ) . I n a n e x p e r i m e n t , u s i n g C o p e n h a g e n r a t s i n j e c t e d w i t h M A T L y L u p r o s t a t e c a n c e r c e l l s , a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n t h e s i z e a n d n u m b e r o f l u n g m e t a s t a s e s w a s o b s e r v e d i n r a t s t r e a t e d w i t h c a l c i t r i o l ( L o k e s h w a r e t a l . , 1 9 9 9 ) . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h i s s t u d y d i d n o t t e s t M M P l e v e l s i n t h e r a t s . H o w e v e r , t a k e n t o g e t h e r t h e s e d a t a d e m o n s t r a t e t h a t c a l c i t r i o l h a s a n i n h i b i t o r y e f f e c t o n M M P - 2 a n d M M P - 9 a c t i v i t y . T h i s d e c r e a s e i n a c t i v i t y c o u l d d e c r e a s e b a s e m e n t m e m b r a n e d e g r a d a t i o n , r e s u l t i n g i n a n i n h i b i t i o n o f i n v a s i v e a b i l i t y o f t h e c e l l s . T h e y a l s o s u g g e s t t h a t c a l c i t r i o l c o u l d i n h i b i t a n d / o r p r e v e n t t h e i n i t i a t i o n a n d g r o w t h m a i n t e n a n c e o f t u m o r s a t b o t h p r i m a r y a n d e c t o p i c s i t e s , s u c h a s , l u n g s . C a l c i t r i o l c a n a l s o h a v e a s t i m u l a t o r y e f f e c t o n M M P a c t i v i t y . I t h a s b e e n s h o w n t o i n c r e a s e t h e a c t i v i t y o f M M P - 9 i n t i b i a s o f m i c e ( L i n e t a l . , 2 0 0 2 ) , M M P - 1 a n d M M P - 3 i n c e l l s o f t h e r h e u m a t o i d l e s i o n ( T e t l o w a n d W o o l l e y , 1 9 9 9 ) , a n d M M P - l 3 i n m o u s e o s t e o b l a s t c e l l s ( U c h i d a e t a l . , 2 0 0 1 ) . M o s t o f t h e e f f e c t s o f M M P s i n t h e s e s t u d i e s a r e o n b o n e d u r i n g t h e s k e l e t a l f o r m a t i o n a t e a r l y a n d l a t e s t a g e s o f o s t e o g e n e s i s a n d / o r d u r i n g s k e l e t a l r e m o d e l i n g d u r i n g b o n e g r o w t h . T h e s e p r o c e s s e s r e q u i r e m u c h b o n e r e s o r p t i o n , w h i c h w o u l d h e l p e x p l a i n t h e o b s e r v e d s t i m u l a t o r y e f f e c t s o f c a l c i t r i o l . I n t e r e s t i n g l y , i n v e s t i g a t o r s i n a n o t h e r s t u d y d e m o n s t r a t e d t h a t v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) e x p r e s s i o n i n h u m a n o s t e o a r t h r i t i c c a r t i l a g e w a s o f t e n a s s o c i a t e d w i t h s i t e s o f p r e v a l e n t M M P e x p r e s s i o n , w h i c h i s i n c o n t r a s t t o t h e v i r t u a l a b s e n c e o f V D R i n n o r m a l a g e - m a t c h e d c a r t i l a g e ( T e t l o w a n d W o o l l e y , 2 0 0 1 ) . I n d e e d , i n a l l o f t h e s t u d i e s 1 1 4 m e n t i o n e d i n t h i s s e c t i o n , t h e e f f e c t s b y v i t a m i n D o n M M P s a p p e a r t o b e r e c e p t o r - m e d i a t e d b e c a u s e V D R s a r e e x p r e s s e d i n a l l t h e s e t i s s u e s . T h i s i n d i c a t e s t h a t v i t a m i n D m a y b e e f f e c t i v e i n M M P r e g u l a t i o n d u r i n g t u m o r p r o g r e s s i o n a n d m e t a s t a s i s . C o n c l u s i o n M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P s ) a r e t h e p r e d o m i n a n t f a m i l y o f e n z y m e s t h a t d e g r a d e s t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x . I t i s w e l l k n o w n t h a t t h e y a r e a c o n t r i b u t i n g f a c t o r i n s e v e r a l c o m p l e x p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s a n d t h e y g i v e m a l i g n a n t c a n c e r s t h e i r d e fi n i n g a b i l i t y t o i n v a d e a n d m e t a s t a s i z e . W i t h t h e s i g n i fi c a n t a m o u n t o f a t t e n t i o n M M P s h a v e r e c e i v e d i n t u m o r g r o w t h a n d m e t a s t a s i s , c l a s s i c a l r o l e s f o r t h e s e e n z y m e s a r e b e c o m i n g m o r e d e fi n e d a n d n e w r o l e s a r e b e i n g d i s c o v e r e d . M M P s h a v e r e c e n t l y b e e n i m p l i c a t e d i n t h e i n i t i a t i o n a n d s u s t a i n e d g r o w t h o f t u m o r s i n b o t h p r i m a r y a n d s e c o n d a r y s i t e s . H o w e v e r , m u c h s t i l l n e e d s t o b e l e a r n e d a b o u t M M P s b e f o r e w e c a n f u l l y c o m p r e h e n d t h e s e i n t r i g u i n g e n z y m e s . W i t h f u r t h e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e r o l e s a n d m e t h o d s o f r e g u l a t i n g M M P s , a n d w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f e f f e c t i v e t h e r a p e u t i c a g e n t s , s u c h a s v i t a m i n D , w e w i l l b e g i n t o r e a l i z e t h e t h e r a p e u t i c b e n e fi t t o c a n c e r t r e a t m e n t b y t h e i n h i b i t i o n o f M M P s . 1 1 5 R e f e r e n c e s B a r s k y , S . H . , S i e g a l , G . P . , J a n n o t t a , F . a n d L i o t t a , L . A . z L o s s o f b a s e m e n t m e m b r a n e c o m p o n e n t s b y i n v a s i v e t u m o r s b u t n o t b y t h e i r b e n i g n c o u n t e r p a r t s . L a b . I n v e s t , 4 9 : 1 4 0 - 1 4 7 , 1 9 8 3 . B r o o k s , P . C . , S t r o m b l a n d , S . , S a n d e r s , L . C . , v o n S c h a l s c h a , T . L . , A i m e s , R . T . , S t e t l e r - S t e v e n s o n , W . G . , Q u i g l e y , J . P . , a n d C h e r e s h , D . A . : L o c a l i z a t i o n o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e M M P - 2 t o t h e s u r f a c e o f i n v a s i v e c e l l s b y i n t e r a c t i o n w i t h i n t e g r i n a l p h a v b e t a 3 . C e l l , 8 5 : 6 8 3 - 6 9 3 , 1 9 9 6 . C h a m b e r s , A F . a n d M a t r i s i a n , L . M . : C h a n g i n g v i e w s o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s i n m e t a s t a s i s . J . N a t l . C a n c e r I n s t . , 8 9 : 1 2 6 0 - 1 2 7 0 , 1 9 9 7 . C o u s s e n s , L . M . , F i n g l e t o n , B . , a n d M a t r i s i a n , L . M . : M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e i n h i b i t o r s a n d c a n c e r : t r i a l s a n d t r i b u l a t i o n s . S c i e n c e , 2 9 5 : 2 3 8 7 - 2 3 9 2 , 2 0 0 2 . E d w a r d s , D . R . : T h e t i s s u e i n h i b i t o r s o f m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( T I M P S ) . I n : M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e i n h i b i t o r s i n c a n c e r t h e r a p y , C l e n d e n i n n , N J . a n d A p p e l t , K . ( e d s ) , T o t o w a , N J , H u m a n a P r e s s , p p . 6 7 - 8 4 , 2 0 0 0 . F i n g l e t o n , B . a n d M a t r i s i a n , L . M . : M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s i n c a n c e r . I n : M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e i n h i b i t o r s i n c a n c e r t h e r a p y , C l e n d e n i n n , N J . a n d A p p e l t , K . ( e d s ) , T o t o w a , N J , H u m a n a P r e s s , p p . 8 5 - 1 1 2 , 2 0 0 0 . G i a n n e l l i , G . , F a l k - M a r z i l l i e r , J . , S c h i r a l d i , O . , S t e t l e r - S t e v e n s o n , W . G . , a n d Q u a r a n t a , V . : I n d u c t i o n o f c e l l m i g r a t i o n b y m a t r i x m e t a l l o p r o t e a s e - 2 c l e a v a g e o f l a m i n i n - 5 . S c i e n c e , 2 7 7 : 2 2 5 - 2 2 8 , 1 9 9 7 . G o k a s l a n , Z . L . , C h i n t a l a , S . K . , Y o r k , J . E . , B o y a p a t i , V . , J a s t i , S . , S a w a y a , R . , F u l l e r , G . , W i l d r i c k , D . M . , N i c o l s o n , G . L . , a n d R a o , J . S . : E x p r e s s i o n a n d r o l e o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s M M P - 2 a n d M M P - 9 i n h u m a n s p i n a l c o l u m n t u m o r s . C l i n . E x p . M e t . , 1 6 : 7 2 1 - 7 2 8 , 1 9 9 8 . G r i g n o n , D . J . , S a k r , W . , T o t h , M . , R a v e r y , V . , A n g u l o , J . , S h a m s a , F . , P o n t e s , J . E . , C r i s s m a n , J . C . , a n d F r i d m a n , R . : H i g h l e v e l s o f t i s s u e i n h i b i t o r o f m e t a l l o p r o t e i n a s e - 2 ( T I M P - 2 ) e x p r e s s i o n a r e a s s o c i a t e d w i t h p o o r o u t c o m e i n i n v a s i v e b l a d d e r c a n c e r . C a n c e r R e s . , 5 6 : 1 6 5 4 - 1 6 5 9 , 1 9 9 6 . G r o s s , J . a n d L a p i e r e , C . M . : C o l l a g e n o l y t i c a c t i v i t y i n a m p h i b i a n t i s s u e s : a t i s s u e c u l t u r e a s s a y . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . , 5 4 : 1 1 9 7 - 1 2 0 4 , 1 9 6 2 . H a n s e n , C . M . , F r a n d s e n , T . L . , B r u n n e r , N . , a n d B i n d e r u p , L . : 1 a , 2 5 - d i h y r o x y v i t a m i n D 3 i n h i b i t s t h e i n v a s i v e p o t e n t i a l o f h u m a n b r e a s t c a n c e r c e l l s i n v i t r o . C l i n . , E x p . M e t a s t , 1 2 : 1 9 5 - 2 0 2 , 1 9 9 4 . 1 1 6 J o h n s o n , M . D . , K i m , H . R . C . , C h e s l e r , L . , T s a o - W u , G . , B o u c k , N . , a n d P o l v e r i n i , P . J . : I n h i b i t i o n o f a n g i o g e n e s i s b y t i s s u e i n h i b i t o r o f m e t a l l o p r o t e i n a s e . J . C e l l P h y s i o l . , 1 6 0 : 1 9 4 - 2 0 2 , 1 9 9 4 . J u n g , K . , N o w a k , L . , L e i n , M . , P r i e m , F . , S c h n o r r , D . , a n d L o e n i n g , S . A . : M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s 1 a n d 3 , t i s s u e i n h i b i t o r o f m e t a l l o p r o t e i n a s e - l a n d t h e c o m p l e x o f m e t a l l o p r o t e i n a s e - l / t i s s u e i n h i b i t o r i n p l a s m a o f p a t i e n t s w i t h p r o s t a t e c a n c e r . I n t . J . C a n c e r , 7 4 : 2 2 0 - 2 2 3 , 1 9 9 7 . K a w a m a t a , H . , K a w a i , K . , K a m e y a m a , S . , J o h n s o n , M . D . , S t e t l e r - S t e v e n s o n , W . G . , a n d O y a s u , R . : O v e r - e x p r e s s i o n o f t i s s u e i n h i b i t o r o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s T I M P - 1 a n d T I M P - 2 ) s u p p r e s s e s e x t r a v a s a t i o n o f p u l m o n a r y m e t a s t a s i s o f a r a t b l a d d e r c a r c i n o m a . I n t . J . C a n c e r , 6 3 : 6 8 0 - 6 8 7 , 1 9 9 5 . K o o p , S . , K h o k h a , R . , S c h m i d t , E . E . , M a c D o n a l d , I . C . , M o r r i s , V . L . , C h a m b e r s , A F , a n d G r o o m , A . C . : O v e r e x p r e s s i o n o f m e t a l l o p r o t e i n a s e i n h i b i t o r i n B 1 6 F 1 0 c e l l s d o e s n o t a f f e c t e x t r a v a s a t i o n b u t r e d u c e s t u m o r g r o w t h . C a n c e r R e s . , 5 4 : 4 7 9 1 - 4 7 9 7 , 1 9 9 4 . K o l i , K . , a n d K e s k i - O j a , J . : 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 a n d i t s a n a l o g u e s d o w n - r e g u l a t e c e l l i n v a s i o n - a s s o c i a t e d p r o t e a s e s i n c u l t u r e d m a l i g n a n t c e l l s . C e l l G r o w t h D i f f e r e n t i a t i o n , 1 1 : 2 2 1 - 2 2 9 , 2 0 0 0 . L i n , R , A m i z u k a , N . , S a s a k i , T . , A a r t s , M . M . , O z a w a , H . , G o l t z r n a n , D . , H e n d e r s o n , J . E . , a n d W h i t e , J . H . : 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 p r o m o t e s v a s c u l a r i z a t i o n o f t h e c h o n d r o - o s s e o u s j u n c t i o n b y s t i m u l a t i n g e x p r e s s i o n o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r a n d m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e 9 . J . B o n e M i n e r a l R e s . , 1 7 : 1 6 0 4 - 1 6 1 2 , 2 0 0 2 . L i o t t a , L . A . , A b e , S . , R o b e y , P G , a n d M a r t i n , G . R , R o s w i t , W . T . , M c C o u r t , D . W . , P a r t r i d g e , N C , a n d J e f f r e y , J . J . : P r e f e r e n t i a l d i g e s t i o n o f b a s e m e n t m e m b r a n e c o l l a g e n b y a n e n z y m e d e r i v e d f r o m a m e t a s t a t i c m u r i n e t u m o r . P u r i fi c a t i o n a n s e q u e n c e a n a l y s i s o f t w o r a t t i s s u e i n h i b i t o r s o f m e t a l l o p r o t e i n a s e s . P r o c . N a t l , A c a d . S c i . , 7 6 : 2 2 6 8 - 2 2 7 2 , 1 9 7 9 . L i o t t a , L . A . , T r y g g v a s o n , K . , G a r b i s a , S . , H a r t , 1 . , F o l t z , C . M . , a n d S h a fi e , S . : M e t a s t a t i c p o t e n t i a l c o r r e l a t e s w i t h e n z y m a t i c d e g r a d a t i o n o f b a s e m e n t m e m b r a n e c o l l a g e n . N a t u r e , 2 8 4 : 6 7 - 6 8 , 1 9 8 0 . L i o t t a , L . A . , T h o r g e i r s s o n , U . , a n d G a r b i s a , 8 . : R o l e o f c o l l a g e n a s e s i n t u m o r c e l l i n v a s i o n . C a n c e r M e t a s t . R e v . , 1 : 2 7 7 - 2 9 7 , 1 9 8 2 . L i o t t a , L . A . , S t e e g , P S , a n d S t e t l e r - S t e v e n s o n , W . G . : C a n c e r m e t a s t a s i s a n d a n g i o g e n e s i s : a n i m b a l a n c e o f p o s i t i v e a n d n e g a t i v e r e g u l a t i o n . C e l l , 6 4 : 3 2 7 - 3 3 6 , 1 9 9 1 . 1 1 7 L o k e s h w a r , B . L . , S c h w a r t z , G . G . , S e l z e r , M . G . , B u m s t e i n , K . L . , Z h u a n g , S - H . , B l o c k , N . L . , a n d B i n d e r u p , L . : I n h i b i t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r m e t a s t a s i s i n v i v a : A c o m p a r i s o n o f 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D ( c a l c i t r i o l ) a n d E B 1 0 8 9 . C a n c e r E p i d e m . B i o m a r k . P r e v . , 8 : 2 4 1 - 2 4 8 , 1 9 9 9 . M a t r i s i a n , L . M . : T h e m a t r i x - d e g r a d i n g m e t a l l o p r o t e i n a s e s . B i o E s s a y s , 1 4 : 4 5 5 - 4 6 3 , 1 9 9 2 . M o n t i r o n i , R . , L u c a r i n i , G . , C a s t a l d i n i , C . , G a l l u z z i , C . M . , B i a g i n i , G . , a n d F a b r i s , G . : I m m u n o h i s t o c h e m i c a l e v a l u a t i o n o f t y p e I V c o l l a g e n a s e ( 7 2 - k d m e t a l l o p r o t e i n a s e ) i n p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a . A n t i c a n c e r R e s . , 1 6 : 2 0 5 7 - 2 0 6 2 , 1 9 9 6 . M o s e s , M . A . , W i e d e r s c h a i n , D . , L o u g h l i n , K . R . , Z u r a k o w s k i , D . , L a m b , C C . a n d F r e e m a n , M . R . : I n c r e a s e d i n c i d e n c e o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s i n u r i n e o f c a n c e r p a t i e n t s . C a n c e r R e s . , 5 8 : 1 3 9 5 - 1 3 9 9 , 1 9 9 8 . M u r p h y , G . a n d W i l l e n b r o c k , F . : T i s s u e i n h i b i t o r s o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s . M e t h o d s E n z y m o l . , 2 4 8 : 4 9 6 - 5 1 0 , 1 9 9 5 . N a g a s e , H . a n d W o e s s n e r , J . F . : M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s . J . B i o l . C h e m , 2 7 4 : 2 1 4 9 1 - 2 1 4 9 4 , 1 9 9 9 . N a g a s e , H . : S u b s t r a t e s p e c i fi c i t y o f M M P s . I n : M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e i n h i b i t o r s i n c a n c e r t h e r a p y , C l e n d e n i n n , N J . a n d A p p e l t , K . ( e d s ) , T o t o w a , N J , H u m a n a P r e s s , p p . 3 9 - 6 6 , 2 0 0 0 . N e l s o n , A . R . , F i n g l e t o n , B . , R o t h e n b e r g , M . L . , a n d M a t r i s i a n , L . M . : M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s : b i o l o g i c a l a c t i v i t y a n d c l i n i c a l i m p l i c a t i o n s . J . C l i n . O n c o l . , 1 8 : 1 1 3 5 - 1 1 4 9 , 2 0 0 0 . P a t t e r s o n , B . a n d S a n g , Q . : A n g i o s t a t i n - c o n v e r t i n g e n z y m e a c t i v i t i e s o f h u m a n m a t r i l y s i n ( M M P - 7 ) a n d g e l a t i n a s e B / t y p e l V c o l l a g e n a s e ( M M P - 9 ) . J . B i o l . C h e m . , 2 7 2 : 2 8 8 2 3 - 2 8 8 2 5 , 1 9 9 7 . P o o l e , A . R . , T i l t m a n , K . J . , R e c k l i e s , A . D . , a n d S t o k e r , T . A . : D i f f e r e n c e s i n s e c r e t i o n o f t h e p r o t e i n a s e c a t h e p s i n B a t t h e e d g e s o f h u m a n b r e a s t c a r c i n o m a s a n d fi b r o s a r c o m a s . N a t u r e , 2 7 3 : 5 4 5 - 5 4 7 , 1 9 7 8 . S c h w a r t z , G . G . , W a n g , M - H . , Z h a n g , M . , S i n g h , R . K . , a n d S i e g a l , G . P . : 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D ( c a l c i t r i o l ) i n h i b i t s t h e i n v a s i v e n e s s o f h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . C a n c e r E p i d e m , B i o m a r k P r e v . , 6 : 7 2 7 - 7 3 2 , 1 9 9 7 . S t e a m s , M E . a n d S t e a m s , M . : I m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s o f a c t i v a t e d m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e - 2 ( M M P - 2 a ) e x p r e s s i o n i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r . O n c o l . R e s . , 8 : 6 3 - 6 7 , 1 9 9 6 . 1 1 8 S t e a m s , M E . a n d W a n g , M . : T y p e I V c o l l a g e n a s e ( M r 7 2 , 0 0 0 ) e x p r e s s i o n i n h u m a n p r o s t a t e : b e n i g n a n d m a l i g n a n t t i s s u e . C a n c e r R e s . , 5 3 : 8 7 8 - 8 8 3 , 1 9 9 3 . S t e m l i c h t , M . D . , L o c h t e r , A . , S y m p s o n , C . J . , H u e y , B . , R o u g i e r , J . P . , G r a y , J . W . , P i n k e l , D . , B i s s e l l , M . J . , a n d W e r b , Z . : T h e s t r o m a l p r o t e i n a s e M M P - 3 / s t r o m e l y s i n - l p r o m o t e s m a m m a r y g l a n d c a r c i n o g e n e s i s . C e l l , 9 8 : 1 3 7 - 1 4 6 , 1 9 9 9 . S t e m l i c h t , M . D . , C o u s s e n s , L . M . , V u , T . H . , a n d W e r b , 2 . : B i o l o g y a n d r e g u l a t i o n o f t h e M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s . I n : M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e i n h i b i t o r s i n c a n c e r t h e r a p y , C l e n d e n i n n , N J . a n d A p p e l t , K . ( e d s ) , T o t o w a , N J , H u m a n a P r e s s , p p . 1 - 3 7 , 2 0 0 0 . S t e t l e r — S t e v e n s o n , W . G . , A z n a v o o r i a n , S . , a n d L i o t t a , L . A . : T u m o r c e l l i n t e r a c t i o n s w i t h t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x d u r i n g i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s . A n n u . R e v . C e l l B i o l . , 9 : 5 4 1 - 5 7 3 , 1 9 9 3 . S t e t l e r - S t e v e n s o n , W C . a n d Y u , A . E . : P r o t e a s e s i n i n v a s i o n : m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s . S e m i n . C a n c e r B i o l . , 1 1 : 1 4 3 - 1 5 2 , 2 0 0 1 . T e t l o w , L C . a n d W o o l l e y , D E : T h e e f f e c t s o f 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 o n m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e a n d p r o s t a g l a n d i n E 2 p r o d u c t i o n b y c e l l s o f t h e r h e u m a t o i d l e s i o n . A r t h r i t i s R e s . , 1 : 6 3 - 7 0 , 1 9 9 9 . T e t l o w , L C . a n d W o o l l e y , D . E . : E x p r e s s i o n o f v i t a m i n D r e c e p t o r s a n d m a t r i x m e t a l l p r o t e i n a s e s i n o s t e o a r t h r i t i c c a r t i l a g e i n h u m a n a r t i c u l a r c h o n d r o c y t e s i n v i t r o . O s t e o a r t h r i t i s a n d C a r t i l a g e , 9 : 4 2 3 - 4 3 1 , 2 0 0 1 . U c h i d a , M . , S h i m a , M . , C h i k a z u , D . , F u j i e d a , A . , O b a r a , K . , S u z u k i , H . , N a g a l , Y . , Y a m a t o , H . , a n d K a w a g u c h i , H . : T r a n s c r i p t i o n a l i n d u c t i o n o f m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e - 1 3 ( c o l l a g e n a s e - 3 ) b y 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n m o u s e o s t e b l a s t i c M C 3 T 3 - E l c e l l s . J . B o n e M i n e r a l R e s . , 1 6 : 2 2 1 - 2 3 0 , 2 0 0 1 . W a g h r a y , A . a n d W e b b e r , M . M . : R e t i n o i c a c i d m o d u l a t e s e x t r a c e l l u l a r u r o k i n a s e - t y p e p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r a c t i v i t y i n D U - 1 4 5 h u m a n p r o s t a t i c c a r c i n o m a c e l l s . C l i n . C a n c e r R e s . , 1 : 7 4 7 - 7 5 3 , 1 9 9 5 . W e b b e r , M . M . , W a g h r a y , A . , a n d B e l l o , D . : P r o s t a t e - s p e c i fi c a n t i g e n , a s e r i n e p r o t e a s e , f a c i l i t a t e s h u m a n c a n c e r c e l l i n v a s i o n . C l i n . C a n c e r R e s . , 1 : 1 0 8 9 - 1 0 9 4 , 1 9 9 5 . W e b b e r , M . M . , W a g h r a y , A . , B e l l o , D . , a n d R h i m , J . S . : M i n i R e v i e w : P o r t e a s e s a n d i n v a s i o n i n h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l l i n e s : i m p l i c a t i o n s i n p r o s t a t e c a n c e r p r e v e n t i o n a n d i n t e r v e n t i o n . R a d . O n c o l . I n v e s t , 3 : 3 5 8 - 3 6 2 , 1 9 9 6 . 1 1 9 W o l f , C . , R o u y e r , N . , L u t z , Y . , A d i d a , C . , L o r i o t , M . , B e l l o c q , J . , C h a m b o n , P . , a n B a s s e t , P . : S t r o m e l y s i n 3 b e l o n g s t o a s u b g r o u p o f p r o t e i n a s e e x p r e s s e d i n b r e a s t c a r c i n o m a fi b r o b l a s t i c c e l l s a n d p o s s i b l y i m p l i c a t e d i n t u m o r p r o g r e s s i o n . P N A S , 9 0 : 1 8 4 3 - 1 8 4 7 , 1 9 9 3 . 1 2 0 C h a p t e r 6 C e l l P r o l i f e r a t i o n a n d D i f f e r e n t i a t i o n a n d t h e E f f e c t s o f V i t a m i n D A b s t r a c t T h e s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l m o d i fi c a t i o n o f a n u n s p e c i a l i z e d c e l l i n t o a s p e c i a l i z e d o n e i s k n o w n a s d i f f e r e n t i a t i o n . T h i s p r o c e s s m o s t o f t e n t a k e s p l a c e d u r i n g e m b r y o g e n e s i s w h e n a f e r t i l i z e d e g g d i f f e r e n t i a t e s i n t o o n e o f s e v e r a l d i f f e r e n t c e l l t y p e s , b u t i t a l s o o c c u r s c o n t i n u o u s l y d u r i n g a d u l t l i f e w i t h t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f s t e m c e l l s i n t o s p e c i a l i z e d c e l l t y p e s . S e v e r a l f a c t o r s r e g u l a t e c e l l d i f f e r e n t i a t i o n , i n c l u d i n g h o r m o n e s , v i t a m i n s , g r o w t h f a c t o r s , a n d t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x . T h e d i f f e r e n t i a t i n g a c t i o n s o f t h e s e f a c t o r s o n t h e t a r g e t t i s s u e s c a n b e c a r r i e d o u t i n d e p e n d e n t l y o r c o n c o m i t a n t l y w i t h o t h e r f a c t o r s . I n r e c e n t y e a r s , v i t a m i n D h a s g a i n e d a c o n s i d e r a b l e i n c r e a s e i n i n t e r e s t b e c a u s e o f i t s a b i l i t y t o m o d u l a t e a n d r e g u l a t e c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . I n t h i s c h a p t e r I w i l l d i s c u s s t h e p r o c e s s o f d i f f e r e n t i a t i o n a n d e x a m i n e h o w v i t a m i n D a n d i t s m e t a b o l i t e s , i n c l u d i n g i t s b i o l o g i c a l l y a c t i v e h o r m o n e , 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ( c a l c i t r i o l ) , w o r k i n d e p e n d e n t l y o r s y n e r g i s t i c a l l y , w i t h o t h e r a g e n t s , t o m o d u l a t e a n d r e g u l a t e t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f c e r t a i n c e l l t y p e s . 1 2 2 — f — — — ' , A w - ‘ - - ‘ a n v - N D u " I n t r o d u c t i o n D i f f e r e n t i a t i o n i s t h e g e n e r a t i o n o f c e l l u l a r d i v e r s i t y t h a t a l l o w s c e l l s t o b e c o m e s t r u c t u r a l l y o r f u n c t i o n a l l y s p e c i a l i z e d . I t p e r t a i n s t o s i n g l e o r g r o u p s o f c e l l s a n d i t i s m o s t o f t e n o b s e r v e d d u r i n g e m b r y o g e n e s i s . A f e r t i l i z e d e g g c a n g i v e r i s e t o m a n y d i f f e r e n t i a t e d c e l l t y p e s , i n c l u d i n g m u s c l e c e l l s , h e m a t o p o i e t i c c e l l s , n e r v e c e l l s , e p i d e r m a l c e l l s , b l o o d c e l l s , f a t c e l l s , a n d s o o n . B u t d i f f e r e n t i a t i o n i s n o t l i m i t e d t o e m b r y o g e n e s i s . D u r i n g a d u l t l i f e c e r t a i n c e l l s ( i . e . b l o o d c e l l s a n d e p i t h e l i a l c e l l s o f t h e s m a l l i n t e s t i n e ) c a n d i f f e r e n t i a t e f r o m s t e m c e l l s ( M u r a m a t s u , 1 9 9 0 ) , a l l o w i n g f o r a c o n t i n u o u s r e g e n e r a t i o n o f c e r t a i n c e l l s t h r o u g h o u t t h e l i f e t i m e o f a n o r g a n i s m . D i f f e r e n t i a t e d c e l l t y p e s a r e f o u n d i n a l l a n i m a l s , b u t b i l a t e r i a n s , a n i m a l s w i t h b i l a t e r a l s y m m e t r y ( d o r s a l - v e n t r a l a n d l e f t - r i g h t a x e s ) , a r e t h e o n l y o n e s t h a t p r o d u c e o r g a n s , o r t h r e e - d i m e n s i o n a l a r r a y s o f d i f f e r e n t i a t e d c e l l s ( D a v i d s o n , 2 0 0 1 ) . L a y e r s o f d i f f e r e n t i a t e d m e s o d e r m a l c e l l t y p e s c o m p r i s e m a j o r c o m p o n e n t s o f a l l b o d y p a r t s i n t h e a d u l t b o d y f o r m s o f b i l a t e r i a n s . O n c e d i f f e r e n t i a t e d , c e l l s e x h i b i t s p e c i a l i z e d f u n c t i o n s a n d t h e i r t r a n s c r i p t i o n p a t t e r n s a r e l o c k e d d o w n b y d i v e r s e s t a b i l i z a t i o n m e c h a n i s m s . T h e s e m e c h a n i s m s i n c l u d e : l o c a l D N A m e t h y l a t i o n a n d d e m e t h y l a t i o n r a t e s , f e e d b a c k c i r c u i t s t h a t r e g u l a t e d i f f e r e n t i a t i o n , a d e c r e a s e i n m R N A t u r n o v e r , a n d c h a n g e s i n c h r o m a t i n s t r u c t u r a l d o m a i n s t h a t i n c l u d e t h e r e g u l a t o r y s y s t e m s o f t h e r e l e v a n t g e n e s ( D a v i d s o n , 2 0 0 1 ) . T h e s e c e l l s a r e s a i d t o b e t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d a n d c a n b e m a r k e d b y a p r e c i s e s e t o f d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d p r o t e i n c o d i n g g e n e s . O n l y i n u n u s u a l c a s e s , l i k e t r a n s d i f f e r e n t i a t i o n , w i l l c e l l s d i f f e r e n t i a t e a n d t h e n r e - d i f f e r e n t i a t e i n a s e c o n d d i r e c t i o n ( D a v i d s o n , 2 0 0 1 ) . 1 2 3 S i n c e a l l c e l l s i n t h e b o d y c o n t a i n t h e s a m e g e n e t i c m a k e - u p , d i f f e r e n t i a t i o n m u s t b e t h e r e s u l t o f a l t e r a t i o n ( s ) a n d / o r s u p p r e s s i o n o f g e n e f u n c t i o n , n o t t h e l o s s o f g e n e s . I n o t h e r w o r d s , c e l l s b e c o m e d i f f e r e n t i a t e d d u e t o d i f f e r e n c e s i n t h e i r f u n c t i o n i n g g e n e s . S e v e r a l a g e n t s c o n t r i b u t e , e i t h e r i n d e p e n d e n t l y o r s y n e r g i s t i c a l l y w i t h o t h e r a g e n t s , t o t h e a l t e r a t i o n a n d s u p p r e s s i o n o f g e n e f u n c t i o n d u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n . T h e s e a g e n t s i n c l u d e h o r m o n e s , g r o w t h f a c t o r s , c o m p o n e n t s o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x , v i t a m i n s , s t e r o i d s , c y t o k i n e s , a n d p r o t e i n s k i n a s e s . O n e t y p e o f t h e s e a g e n t s t h a t h a s b e e n u n d e r i n t e n s e i n v e s t i g a t i o n i n r e c e n t y e a r s i s v i t a m i n D . V i t a m i n D i s e s s e n t i a l f o r c a l c i u m a n d p h o s p h o r o u s h o m e o s t a s i s a n d f o r p r o p e r b o n e d e v e l o p m e n t . T h e r o l e o f v i t a m i n D i n t h e p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f r i c k e t s h a s b e e n r e c o g n i z e d f o r s e v e r a l y e a r s . V i t a m i n D a n d i t s b i o l o g i c a l l y a c t i v e f o r m , 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ( c a l c i t r i o l ) , h a v e b e e n s h o w n , e x p e r i m e n t a l l y , t o p l a y s i g n i fi c a n t r o l e s i n t h e m o d u l a t i o n a n d r e g u l a t i o n o f c e l l g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n . I n d u c t i o n o f d i f f e r e n t i a t i o n b y v i t a m i n D h a s b e e n d e m o n s t r a t e d i n s e v e r a l n o r m a l c e l l t y p e s , i n c l u d i n g , b u t n o t l i m i t e d t o , p r o s t a t e , b r e a s t , c o l o n , b o n e , h e m a t o p o i e t i c , s k i n , B - c e l l p r o g e n i t o r s , k e r a t i n o c y t e s , a n d e p i t h e l i a l c e l l s . V i t a m i n D r e c e p t o r s ( V D R ) h a v e b e e n f o u n d i n t h e c l a s s i c a l t a r g e t o r g a n s ( k i d n e y , b o n e , i n t e s t i n e , p a r a t h y r o i d g l a n d s ) a s w e l l a s i n a n u m b e r o f n o n c l a s s i c a l o r g a n s , s u c h a s , b r e a s t a n d p r o s t a t e e p i t h e l i u m , s k i n , m u s c l e , p a n c r e a s , h e m a t o p o i e t i c a n d i m m u n e s y s t e m s , a n d r e p r o d u c t i v e o r g a n s ( D u s s o a n d B r o w n , 1 9 9 8 ) . T h e s e c l a s s i c a l a n d n o n c l a s s i c a l a c t i o n s h a v e e x p a n d e d t h e t h e r a p e u t i c a p p l i c a t i o n s o f v i t a m i n D a n d i t s b i o l o g i c a l l y a c t i v e m e t a b o l i t e , c a l c i t r i o l . T h i s c h a p t e r w i l l d i s c u s s c e l l d i f f e r e n t i a t i o n i n g e n e r a l a n d e x a m i n e t h e r o l e o f v i t a m i n D i n t h e p r o c e s s o f d i f f e r e n t i a t i o n i n s e v e r a l d i f f e r e n t c e l l t y p e s . 1 2 4 D i f f e r e n t i a t i o n D u r i n g E a r l y D e v e l o p m e n t a n d G r o w t h D u r i n g e a r l y d e v e l o p m e n t o f a n o r g a n i s m , c e l l d i f f e r e n t i a t i o n m u s t b e c a r e f u l l y r e g u l a t e d i n o r d e r f o r n o r m a l g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t t o t a k e p l a c e . D i f f e r e n t i a t i o n t a k e s p l a c e a s e a r l y a s i n t h e p r e p a r a t i o n f o r f e r t i l i z a t i o n , w h e n m a l e a n d f e m a l e g e r m c e l l s u n d e r g o m e i o s i s a n d c y t o d i f f e r e n t i a t i o n . T h e p u r p o s e o f t h e s e p r o c e s s e s i s t o r e d u c e c h r o m o s o m e n u m b e r s f r o m a d i p l o i d t o a h a p l o i d n u m b e r , a n d t o a l t e r g e r m c e l l s h a p e i n p r e p a r a t i o n f o r f e r t i l i z a t i o n . D u r i n g t h e p r o c e s s o f g o n a d f o r m a t i o n p r i m o r d i a l g e r m c e l l s a r r i v e a t t h e g o n a d o f t h e g e n e t i c f e m a l e a n d d i f f e r e n t i a t e i n t o o o g o n i a . T h e c e l l s t h e n u n d e r g o s e v e r a l m i t o t i c d i v i s i o n s a n d a r r a n g e i n a c l u s t e r t h a t i s s u r r o u n d e d b y a l a y e r o f e p i t h e l i a l c e l l s . T h e m a j o r i t y o f o o g o n i a c o n t i n u e t o d i v i d e a n d d i f f e r e n t i a t e i n t o p r i m a r y o o c y t e s , w h i c h r e p l i c a t e t h e i r D N A a n d e n t e r i n t o m e i o s i s . S i m i l a r p r o c e s s e s o c c u r i n t h e m a l e , w i t h t h e m a i n d i f f e r e n c e b e i n g t h a t d i f f e r e n t i a t i o n o f p r i m o r d i a l g e r m c e l l s b e g i n s a t p u b e r t y i n s t e a d o f d u r i n g t h e t h i r d m o n t h o f d e v e l o p m e n t a s i n t h e f e m a l e . T h e c e l l s c o n t i n u e t o d i f f e r e n t i a t e t h r o u g h t h e f o r m a t i o n o f g a m e t e s a n d u p t o f e r t i l i z a t i o n . T h i s e x a m p l e d e m o n s t r a t e s h o w e a r l y i n d e v e l o p m e n t d i f f e r e n t i a t i o n o c c u r s a n d h o w i m p o r t a n t i t i s t o s t r i c t l y r e g u l a t e t h i s p r o c e s s . B u t m o s t p e o p l e d o n o t t h i n k o f d i f f e r e n t i a t i o n o c c u r r i n g a t s u c h a n e a r l y s t a g e o f d e v e l o p m e n t . T h e y a r e m o r e f a m i l i a r w i t h t h e d i f f e r e n t i a t i o n t h a t b e g i n s t o t a k e s p l a c e a f t e r z y g o t e f o r m a t i o n . T h e fi r s t c e l l d i v i s i o n r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f t w o c e l l s f r o m t h e z y g o t e . T h e z y g o t e , w h i c h i s a g i a n t s t o r e h o u s e o f m a t e r i a l s , d i v i d e s o r c l e a v e s i n t o s e v e r a l s m a l l e r c e l l s t e r m e d b l a s t o m e r e s . T h e b l a s t o m e r e s r e m a i n l o o s e l y c l u m p e d u n t i l t h e 3 r d c l e a v a g e w h e n t h e y m a x i m i z e c o n t a c t w i t h e a c h o t h e r a n d f o r m a c o m p a c t b a l l 1 2 5 c a l l e d t h e m o r u l a ( F i g u r e 6 - 1 ) . T h e i n n e r c e l l s o f t h e m o r u l a m a k e u p t h e i n n e r c e l l m a s s a n d t h e s u r r o u n d i n g c e l l s c o n s t i t u t e t h e o u t e r c e l l m a s s . T h e i n n e r c e l l m a s s a n d o u t e r c e l l s m a s s g i v e r i s e t o t h e e m b r y o p r o p e r a n d t h e t r o p h o b l a s t , r e s p e c t i v e l y . T h e e m b r y o i s n o w a t t h e b l a s t o c y s t s t a g e . C e l l s o f t h e i n n e r c e l l m a s s , o r t h e e m b r y o b l a s t , a r e l o c a t e d a t o n e p o l e w h i l e t h e c e l l s o f t h e t r o p h o b l a s t fl a t t e n a n d f o r m t h e e p i t h e l i a l w a l l o f t h e b l a s t o c y s t . D u r i n g t h e n e x t s t a g e s o f d e v e l o p m e n t , p e r h a p s t h e m o s t c h a r a c t e r i s t i c p r o c e s s o f d i f f e r e n t i a t i o n t a k e s p l a c e . T h i s p r o c e s s , k n o w n a s g a s t r u l a t i o n , e s t a b l i s h e s a l l t h r e e g e r m l a y e r s i n t h e e m b r y o a n d b e g i n s w i t h t h e f o r m a t i o n o f t h e p r i m i t i v e s t r e a k o n t h e s u r f a c e o f t h e e p i b l a s t . C e l l s o f t h e e p i b l a s t m i g r a t e i n t h e d i r e c t i o n o f t h e p r i m i t i v e s t r e a k t o f o r m t h e m e s o d e r r n a n d i n t r a e m b r y o n i c e n d o d e r m . W h e n t h e c e l l s a r r i v e a t t h e e p i b l a s t , t h e y b e c o m e fl a s k — s h a p e d , d e t a c h f r o m t h e e p i b l a s t , a n d i n v a g i n a t e i n w a r d ( F i g u r e 6 - 2 ) . S o m e o f t h e s e i n v a g i n a t e d c e l l s f o r m t h e e m b r y o n i c e n d o d e r m , w h i l e o t h e r s f o r m t h e m e s o d e r r n b y l y i n g b e t w e e n t h e e p i b l a s t a n d n e w l y f o r m e d e n d o d e r m . T h e e c t o d e r m i s f o r m e d f r o m c e l l s r e m a i n i n g i n t h e e p i b l a s t . T h r o u g h t h e p r o c e s s o f g a s t r u l a t i o n , t h e e p i b l a s t i s a b l e t o f o r m a l l t h r e e g e r m l a y e r s i n t h e e m b r y o : t h e e c t o d e r m , m e s o d e r r n , a n d e n d o d e r m . T h e c e l l s o f t h e t h r e e g e r m l a y e r s a r e d e s t i n e d t o d i f f e r e n t i a t e i n t o m o r e t h a n 2 0 0 d i f f e r e n t c e l l t y p e s t h a t f o r m s p e c i fi c t i s s u e s a n d o r g a n s . T h e e c t o d e r m g i v e s r i s e t o t h e s k i n ; c e n t r a l a n d p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m s ; h a i r ; n a i l s ; e n a m e l o f t h e t e e t h ; a n d t h e p i t u i t a r y , m a m m a r y , a n d s w e a t g l a n d s . T h e m e s o d e r r n g i v e s r i s e t o t h e s p l e e n , m u s c l e , b o n e , c o n n e c t i v e t i s s u e , t h e a d r e n a l c o r t e x , c e l l s o f t h e b l o o d a n d l y m p h s y s t e m s a n d t h e 1 2 6 P o l a r b o d y C h r o m o s o m e s Z o n a p e l l u c i d a M a l e a n d f e m a l e p r o n u c l e i T w o c e l l T r o p h o b l a s t I n n e r c e l l m a s s B l l a m l n a r e m b r y o E n d o d e r m Y o l k s a c T r i l a m l n a r e m b r y o F i g u r e 6 - 1 : F e r t i l i z a t i o n a n d e a r l y s t a g e s o f e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t t h r o u g h t h e f o r m a t i o n o f t h e g e r m l a y e r s ( C o o p e r , 1 9 9 2 ) . 1 2 7 P r i m i t i v e n o d e P r i m i t i v e s t r e a k E p l b l a s t V . . " A m n i o b l a s t s I n v a g l n a t l n g H o b l a s t m e s o d e r r n c e l l s y p F i g u r e 6 - 2 : C r o s s s e c t i o n t h r o u g h t h e p r i m i t i v e s t r e a k s h o w i n g i n v a g i n a t i o n o f t h e e p i b l a s t ( m o d i fi e d f r o m S a d l e r , 1 9 9 5 ) . d e r m i s . T h e e n d o d e r m p r o v i d e s t h e e p i t h e l i a l l i n i n g o f t h e g a s t r o i n t e s t i n a l a n d r e s p i r a t o r y t r a c t s , a n d t h e u r i n a r y b l a d d e r . I t a l s o f o r m s t h e p a r e n c h y m a o f t h e t h y r o i d a n d t h e e p i t h e l i a l l i n i n g o f t h e t y m p a n i c a n d a u d i t o r y t u b e s , a n d p o r t i o n s o f t h e l i v e r , p a n c r e a s , t o n s i l s , a n d p a r a t h y r o i d g l a n d . D i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e c e l l s o f a n e m b r y o a r i s e i n v a r i o u s w a y s . S i s t e r c e l l s c a n b e b o r n d i f f e r e n t a s a r e s u l t o f a s y m m e t r i c c e l l d i v i s i o n ( F i g u r e 6 - 3 ) . I n a s y m m e t r i c d i v i s i o n , s o m e s i g n i fi c a n t s e t o f m o l e c u l e s i s d i v i d e d u n e q u a l l y b e t w e e n t w o d a u g h t e r c e l l s a t t h e t i m e o f d i v i s i o n . T h e u n e q u a l d i v i s i o n o f m o l e c u l e s a c t s a s a d e t e r m i n a n t f o r t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f o n e o f t h e c e l l s b y a l t e r i n g t h e g e n e e x p r e s s i o n i n t h e d a u g h t e r c e l l t h a t r e c e i v e s i t . 1 2 8 é ‘ _ . / B a s a l D i f f e r e n t i a t i o n c e l l C e / l l m u l t i p l i c a t i o n ‘ ‘ / . \ é a F i g u r e 6 - 3 : D i a g r a m s h o w i n g c e l l m u l t i p l i c a t i o n a n d c e l l d i f f e r e n t i a t i o n , b o t h o f w h i c h c a n o c c u r s i m u l t a n e o u s l y i n t h e s a m e c u l t u r e w h e r e d i f f e r e n t c e l l s m a y h a v e d i f f e r e n t f a t e s . S i m i l a r p h e n o m e n a o c c u r i n t h e a c i n a r e p i t h e l i u m i n v i v a ( W e b b e r , 1 9 8 1 ) . D u r i n g t h e p r o c e s s o f d i f f e r e n t i a t i o n s i m i l a r c e l l s c a n b e c o m e d i f f e r e n t t h r o u g h a c o m p e t i t i v e i n t e r a c t i o n w i t h o n e a n o t h e r ( c e l l : c e l l c o n t a c t ) o r t h e y m a y r e c e i v e d i f f e r e n t e x p o s u r e s t o i n d u c t i v e s i g n a l s f r o m c e l l s o u t s i d e t h e g r o u p . T h e s e i n d u c t i v e s i g n a l s m a y b e i n t h e f o r m o f h o r m o n e s o r g r o w t h f a c t o r s . C e l l m e m o r y a l l o w s t r a n s i e n t s i g n a l s t o h a v e a l a s t i n g e f f e c t o n t h e i n t e r n a l s t a t e o f a c e l l . T h e a b i l i t y o f a c e l l t o r e m e m b e r w h i c h g e n e s h a v e b e e n t u r n e d o n a n d w h i c h g e n e e x p r e s s i o n s t o m a i n t a i n a l l o w s t h e c e l l t o b e c o m e d e t e r m i n e d f o r a s p e c i fi c d i f f e r e n t i a t e d f a t e . W i t h t h e s e c e l l u l a r a b i l i t i e s , s e q u e n c e s o f d i f f e r e n t s i g n a l s a c t i n g a t d i f f e r e n t t i m e s a n d p l a c e s i n g r o w i n g c e l l a r r a y s c a n g i v e r i s e t o e l a b o r a t e a n d v a r i e d m u l t i c e l l u l a r o r g a n i s m s . 1 2 9 R e l a t i o n s h i p B e t w e e n C e l l P r o l i f e r a t i o n a n d D i f f e r e n t i a t i o n C e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n a r e t w o c l o s e l y l i n k e d p r o c e s s e s i n t h e d e v e l o p m e n t o f a n o r g a n i s m . I n n o r m a l d e v e l o p m e n t t h e r e i s h o m e o s t a s i s b e t w e e n t h e s e t w o p r o c e s s e s , m e a n i n g c e l l g a i n f r o m p r o l i f e r a t i o n e q u a l s c e l l l o s s f r o m d i f f e r e n t i a t i o n a n d a p o p t o s i s . T h i s b a l a n c e b e t w e e n p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f c e l l s i s r e g u l a t e d b y a n u m b e r o f f a c t o r s , s e v e r a l o f w h i c h w i l l b e d i s c u s s e d l a t e r . S o m e o f t h e s e f a c t o r s w i l l h a v e a n e g a t i v e e f f e c t ( g r o w t h i n h i b i t o r s ) o n p r o l i f e r a t i o n a n d o t h e r s w i l l h a v e a p o s i t i v e e f f e c t ( g r o w t h s t i m u l a t o r s ) . I n n o r m a l g r o w t h r e g u l a t i o n , g r t h s t i m u l a t o r s m u s t b e c o u n t e r e d b y t h e e f f e c t s o f g r o w t h i n h i b i t o r s , t h e r e b y g i v i n g a s t a b l e p o p u l a t i o n w h e r e c e l l l o s s w i l l e q u a l c e l l g a i n . N o r m a l t i s s u e s g e n e r a l l y h a v e a d e c r e a s e i n t h e i r a b i l i t y o f c e l l d i v i s i o n a s t h e y d i f f e r e n t i a t e . T h e m o r e d i f f e r e n t i a t e d t h e c e l l s b e c o m e , t h e g r e a t e r t h e l e v e l o f g r o w t h i n h i b i t o r s , w h i c h l e a d s t o a d e c r e a s e i n p r o l i f e r a t i o n . I n a b n o r m a l t i s s u e s , s u c h a s a t u m o r , t h e c e l l s r e t a i n t h e a b i l i t y t o p r o l i f e r a t e a n d t h e r e i s a d e c r e a s e i n c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . T h e d e c r e a s e i n d i f f e r e n t i a t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h a d e c r e a s e i n g r o w t h i n h i b i t o r s . O n a v e r a g e , a n o r m a l s t e m c e l l d i v i s i o n g e n e r a t e s o n e d a u g h t e r s t e m c e l l a n d o n e c e l l t h a t w i l l u n d e r g o t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n a n d s t o p d i v i d i n g . I f t h e s t e m c e l l d i v i d e s m o r e r a p i d l y , d i f f e r e n t i a t e d c e l l s w i l l b e p r o d u c e d a n d d i s c a r d e d ( i . e . t h r o u g h a p o p t o s i s ) m o r e r a p i d l y , b u t t h e b a l a n c e b e t w e e n t h e t w o i s m a i n t a i n e d . I n a b n o r m a l g r o w t h ( i . e . h y p e r p l a s i a o r a t u m o r ) , m o r e t h a n 5 0 % o f t h e d a u g h t e r c e l l s r e m a i n a s s t e m c e l l s . A s a r e s u l t , t h e p r o c e s s o f d i f f e r e n t i a t i o n i s a l t e r e d s o t h a t d a u g h t e r c e l l s t h a t f o l l o w t h i s r o u t e r e t a i n t h e a b i l i t y t o c a r r y o n d i v i d i n g i n d e fi n i t e l y a n d a v o i d a p o p t o s i s ( F i g u r e 6 - 4 ) . 1 3 0 K 9 s e l f - r e n e w i n g s t e r n e e l d a u d r t e r c e l w i t h l i m i t e d p r o l i f e r a t i o n . m / / \ @ 0 9 0 I l t e r m i n a l c i t t e r o j n t i a t i o n ; I I I ( ‘ i £ 0 @ [ ' 3 t 9 n o n d i v i d i n g c e l l s e v e n t u a t l l y d i s c a r d e d ( A ) N O R M A L P A T H W A Y / ' W \ { 3 } 4 / / \ \ ( 6 9 6 6 e ) / / I \ / I I \ / I I \ / I I \ I l l a - A u . A V ‘ N " " ' t a t o \ I O , “ / 1 \ ‘ k _ . ‘ \ x > / 1 " “ ' J fl v . \ i t » ; ‘ Q ‘ f t u m o r ( B ) S T E M C E L L F A I L S T O P R O D U C E O N E N O N - S T E M C E L L D A U G H T E R I N E A C H D I V I S I O N A N D T H E R E B Y P R O L I F E R A T E S T O F O R M A T U M O R , — Q - A _ ‘ - . - ~ 1 - ' " a ( C ) D A U G H T E R C E L L S F A I L T O D I F F E R E N T I A T E N O R M A L L Y A N D I N S T E A D P R O L I F E R A T E T O F O R M A T U M O R F i g u r e 6 - 4 : N o r m a l a n d d e r a n g e d c o n t r o l o f c e l l p r o d u c t i o n f r o m s t e m c e l l s . ( A ) T h e n o r m a l s t r a t e g y f o r p r o d u c i n g d i f f e r e n t i a t e d c e l l s . ( B a n d C ) T w o t y p e s o f d e r a n g e m e n t t h a t c a n g i v e r i s e t o t h e u n b r i d l e d p r o l i f e r a t i o n c h a r a c t e r i s t i c o f c a n c e r . E x c e s s i v e c e l l d i v i s i o n r a t e f o r t h e s t e m c e l l i n ( A ) w i l l n o t b y i t s e l f h a v e t h i s e f f e c t , a s l o n g a s e a c h s t e m c e l l d i v i s i o n p r o d u c e s o n l y o n e d a u g h t e r t h a t i s a s t e m c e l l ( m o d i fi e d f r o m A l b e r t s e t a l . , 2 0 0 2 ) . P r e s u m a b l y , s e v e r a l c a n c e r s a r i s e f r o m a n a l t e r a t i o n i n t h e n o r m a l d i f f e r e n t i a t i o n p r o g r a m , s u c h t h a t a c e l l c o m m i t t e d t o d i f f e r e n t i a t i o n d o e s n o t t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e a n d d i e , b u t r a t h e r c o n t i n u e s t o d i v i d e i n d e fi n i t e l y . I n o t h e r w o r d s , c h a n g e s t h a t b l o c k t h e n o r m a l d e v e l o p m e n t o f c e l l s t o w a r d a n o n d i v i d i n g , t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d p h e n o t y p e , o r t h o s e t h a t p r e v e n t a p o p t o s i s , p l a y a c r u c i a l r o l e i n m a n y c a n c e r s . 1 3 1 M a r k e r s o f D i f f e r e n t i a t i o n a n d D i f f e r e n t i a t e d F u n c t i o n i n E p i t h e l i a l C e l l s I n t e r m e d i a t e F i l a m e n t s I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s t h a t a r e i m p o r t a n t c e l l t y p e m a r k e r s i n e p i t h e l i a l c e l l s a r e t h e c y t o k e r a t i n s . V i m e n t i n i s a m e s e n c h y m a l c e l l i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t . C y t o k e r a t i n s : C y t o k e r a t i n s ( F i g u r e 6 - 5 ) a r e t h e fi r s t i n t e r m e d i a t e f i l a m e n t p r o t e i n s t o a p p e a r d u r i n g e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t . T h e y a r e u s u a l l y a r r a n g e d i n b u n d l e s c a l l e d t o n o fi b r i l s , w h i c h f o r m a c a g e - l i k e s t r u c t u r e a r o u n d t h e n u c l e u s a n d e x t e n d t o t h e c e l l p e r i p h e r y . C y t o k e r a t i n s a r e t h e h a l l m a r k i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s o f e p i t h e l i a l a n d m e s o t h e l i a l c e l l s . I d e n t i fi c a t i o n o f c y t o k e r a t i n s i n c u l t u r e d c e l l s i s a s t a n d a r d m e t h o d t o v e r i f y t h e e p i t h e l i a l n a t u r e o f t h e i n v i t r o p o p u l a t i o n . 1 0 u m F i g u r e 6 - 5 : C y t o k e r a t i n fi l a m e n t s i n e p i t h e l i a l c e l l s . I m m u n o fl u o r e s c e n c e m i c r o g r a p h o f t h e n e t w o r k o f c y t o k e r a t i n fi l a m e n t s ( g r e e n ) i n a s h e e t o f e p i t h e l i a l c e l l s i n c u l t u r e . T h e fi l a m e n t s i n e a c h c e l l a r e d i r e c t l y c o n n e c t e d t o t h o s e o f i t s n e i g h b o r s b y d e s m o s o m e s . A s e c o n d p r o t e i n ( b l u e ) h a s b e e n s t a i n e d t o r e v e a l t h e l o c a t i o n o f t h e c e l l b o u n d a r i e s ( A l b e r t s e t a l . , 2 0 0 2 ) . 1 3 2 T h e c y t o k e r a t i n s a r e a m u l t i g e n e f a m i l y o f a b o u t 2 0 b i o c h e m i c a l l y a n d i m m u n o l o g i c a l l y d i s t i n c t y e t c l o s e l y r e l a t e d p o l y p e p t i d e s , w h i c h r a n g e i n m o l e c u l a r w e i g h t f r o m 4 0 t o 7 8 k D a . T h e c y t o k e r a t i n fi l a m e n t s a r e a s s e m b l e d f r o m h e t e r o d i m e r i c s u b u n i t s o f a c i d i c t y p e I c y t o k e r a t i n s ( c y t o k e r a t i n s 9 t o 2 0 ) a n d b a s i c t y p e I I ( c y t o k e r a t i n s 1 t o 8 ) i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s ( P a r a m i o a n d J o r c a n o , 2 0 0 2 ) . T h e e x p r e s s i o n o f t h e s e c y t o k e r a t i n s i s a g o o d p r o g n o s t i c i n d i c a t o r o f c a n c e r p r o g r e s s i o n . I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s a r e u s e f u l t o o l s i n c e l l t y p e d e t e r m i n a t i o n a s w e l l a s i n d e t e r m i n i n g t h e l e v e l o f i n v a s i v e n e s s a n d m e t a s t a t i c a b i l i t y o f c a n c e r c e l l s . T h e p r o s t a t i c l u m i n a l , s e c r e t o r y c e l l s e x p r e s s c y t o k e r a t i n s 8 , 1 8 a n d 1 9 , a n d t h e p r o s t a t i c b a s a l c e l l s e x p r e s s c y t o k e r a t i n s 5 , 1 4 , 1 5 a n d 1 6 ( T r a u b , 1 9 8 5 ; P e e h l e t a l . , 1 9 9 4 a ; S h e r w o o d e t a l . , 1 9 9 0 ) . D i f f e r e n t t y p e s o f e p i t h e l i a l c e l l s c a n b e c h a r a c t e r i z e d b a s e d o n t h e s e a c i d i c a n d b a s i c c y t o k e r a t i n c o m b i n a t i o n s . S i m p l e e p i t h e l i a e x p r e s s c y t o k e r a t i n s 8 a n d 1 8 w i t h v a r i a b l e l e v e l s o f c y t o k e r a t i n 1 9 a n d 2 0 ( Y o o n e t a l . , 2 0 0 1 ) a n d i n s o m e i n s t a n c e s l 7 a n d 7 ( P a r a m i o a n d J o r c a n o , 2 0 0 2 ) . S t r a t i fi e d e p i t h e l i a e x p r e s s c y t o k e r a t i n s 5 a n d 1 4 i n t h e b a s a l l a y e r , a n d w h e n t h e s e c e l l s b e g i n t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n t h e y m o v e u p w a r d s a n d b e g i n t o e x p r e s s c y t o k e r a t i n s 1 a n d 1 0 i n t h e s k i n , c y t o k e r a t i n s 4 a n d 1 3 i n i n t e r n a l s t r a t i fi e d e p i t h e l i a a n d c y t o k e r a t i n s 3 a n d 1 2 i n c o r n e a l c e l l s ( P a r a m i o a n d J o r c a n o , 2 0 0 2 ) . T h e s e p a t t e r n s r e v e a l c l u e s t o t h e l i n e a g e o f a c e l l a n d i t s d i f f e r e n t i a t i o n s t a t u s a n d a l s o i m p l y t h a t c y t o k e r a t i n s m i g h t c a r r y o u t s p e c i fi c f u n c t i o n s i n e p i t h e l i a l c e l l s . T h e c y t o k e r a t i n p r o fi l e s i n t h e p r o s t a t e g l a n d a r e a n e x t r e m e l y u s e f u l d i a g n o s t i c t o o l i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f p r o s t a t e c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a n d t h e l e v e l o f p r o s t a t e c a n c e r g r a d e . A l b e r t i e t a 1 . ( 2 0 0 0 ) f o u n d t h a t s e v e r a l . c o n s t i t u t i v e c y t o k e r a t i n s ( 8 , 1 8 , a n d 1 9 ) 1 3 3 s h o w e d a s t r o n g d o w n r e g u l a t i o n i n p o o r l y d i f f e r e n t i a t e d p r o s t a t e c a n c e r c e l l s , a n d t h e i r e x p r e s s i o n s i g n i fi c a n t l y d e c r e a s e d a s c o m p a r e d t o n o r m a l h u m a n p r o s t a t e c e l l s , b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a , a n d t o m o d e r a t e l y a n d w e l l d i f f e r e n t i a t e d t u m o r s . A d e c r e a s e i n t h e e x p r e s s i o n o f c y t o k e r a t i n s 8 a n d 1 8 i n p r o s t a t e c a r c i n o m a , w h e n c o m p a r e d t o n o r m a l p r o s t a t e , w a s a l s o o b s e r v e d i n a n i m a l m o d e l s ( R a m a e k e r s e t a l . , 1 9 9 4 ) . S h e r w o o d e t a l . ( 1 9 9 0 ) s h o w e d t h a t e s t a b l i s h e d p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s s h o w e d e x p r e s s i o n o f c y t o k e r a t i n s 8 a n d 1 8 b u t n o t c y t o k e r a t i n s 5 , 7 , a n d 1 5 w h i c h w e r e o b s e r v e d i n t h e b e n i g n p r o s t a t e . A l l t h e s e d a t a s u p p o r t t h e b e l i e f t h a t p r o s t a t e c a n c e r a r i s e s f r o m t h e l u m i n a l c e l l s o f t h e p r o s t a t e , w h i c h e x p r e s s c y t o k e r a t i n s 8 , 1 8 , a n d 1 9 , a n d n o t f r o m t h e b a s a l c e l l s , w h i c h e x p r e s s c y t o k e r a t i n s 5 , 1 4 , 1 5 a n d 1 6 . I n a r e c e n t s t u d y , H u d s o n e t a l . ( 2 0 0 1 ) a t t e m p t e d t o i d e n t i f y s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s i n t h e b a s a l l a y e r o f t h e p r o s t a t e b y e x a m i n i n g t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n i n b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a ( B P H ) t i s s u e . B y s t a i n i n g b a s a l a n d l u m i n a l c e l l s w i t h fl u o r e s c e n c e - l a b e l e d c y t o k e r a t i n s , H u d s o n e t a l . ( 2 0 0 1 ) s h o w e d t h a t c y t o k e r a t i n 1 9 i s f o u n d b a s a l l y a n d i n a p o s i t i o n i n t e r m e d i a t e b e t w e e n t h e b a s a l a n d l u m i n a l c y t o k e r a t i n 8 - p o s i t i v e l a y e r . C y t o k e r a t i n 1 9 h a s b e e n i m p l i c a t e d i n t h e p r o c e s s o f d i f f e r e n t i a t i o n , f o r e x a m p l e , i n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s a s t h e y p r o g r e s s f r o m b a s a l t o d i f f e r e n t i a t e d s e c r e t o r y c e l l s ( F i g u r e 6 - 6 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t c y t o k e r a t i n 1 9 c o u l d b e a p o s s i b l e m a r k e r f o r a n a m p l i f y i n g , n o n - s t e m - c e l l , b a s a l p o p u l a t i o n i n t h e p r o s t a t e . F i g u r e 6 - 6 s h o w s a h y p o t h e t i c a l d i f f e r e n t i a t i o n p a t h w a y f o r h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s b a s e d o n c y t o k e r a t i n e x p r e s s i o n . 1 3 4 l © + ® + ° ° I n t e r m e d i a t e D i t t e r e n t i a t e d d i f f e r e n t i a t i n g ' > K B I K 1 8 N e u r o e n d o c r i n e K 8 ! K 1 8 _ 1 9 L u m i n a l B a s a K S J K 1 4 K S J K 1 4 " K 5 ! K 1 5 . 1 7 , o r 1 9 1 5 , 1 7 , o r 1 9 U n d i f e r e n t i a t e d I n t e r m e d i a t e b a s a l b a s a l F i g u r e 6 — 6 : H y p o t h e t i c a l d i f f e r e n t i a t i o n p a t h w a y f o r h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s b a s e o n p a t t e r n s o f c y t o k e r a t i n s t a i n i n g . B a s a l s t e m c e l l s ( K 5 a n d K 1 4 o n l y ) g i v e r i s e t o a n i n t e r m e d i a t e t r a n s i t a m p l i f y i n g p o p u l a t i o n e x p r e s s i n g K 1 9 . T h e s e c e l l s d i f f e r e n t i a t e i n t o l u m i n a l c e l l s w i t h t r a n s i e n t c o - e x p r e s s i o n o f K 1 9 , 8 , a n d 1 8 b e f o r e c o m p l e t e d i f f e r e n t i a t i o n i n t o c e l l s e x p r e s s i n g K 8 a n d K 1 8 o n l y ( m o d i fi e d f r o m H u d s o n e t a l . , 2 0 0 1 ) . V i m e n t i n : V i m e n t i n i s a 5 4 t o 5 8 k D a i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n t h a t i s n o r m a l l y e x p r e s s e d i n c e l l s o f m e s e n c h y m a l o r i g i n , s u c h a s fi b r o b l a s t s , m y o fi b r o b l a s t s , a n d e n d o t h e l i a l c e l l s ( P a r a m i o a n d J o r c a n o , 2 0 0 2 ; W e b b e r e t a l . , 1 9 9 9 a ) a n d c e l l s d e r i v e d f r o m m e s o d e r r n . I t i s t h e fi r s t i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t a s s o c i a t e d w i t h c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . A n i n c r e a s e s i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n o c c u r s d u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n i n t o t h r e e g e r m l a y e r s d u r i n g e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t . V i m e n t i n i s t y p i c a l o f o s t e o c y t e s , c h o n d r o c y t e s , m e l a n o c y t e s , L a n g e r h a n c e l l s o f t h e s k i n , m o s t b u t n o t a l l l y m p h a t i c c e l l s , a n d i t i s e x p r e s s e d i n n e u r o n a l o r m u s c l e c e l l s ( O s b o r n , 1 9 9 3 ) . T h e e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n h a s a l s o b e e n s h o w n t o b e a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d i n c r e a s e d m e t a s t a t i c a b i l i t y a n d i n v a s i v e n e s s o f c a n c e r c e l l s . I t s e x p r e s s i o n i s o b s e r v e d i n m a n y t u m o r s o f e p i t h e l i a l o r i g i n . V i m e n t i n i s o f t e n e x p r e s s e d 1 3 5 — — — _ = = = = — ' — — — “ — ' + . - s - . - - - ! ‘ - - - - . i n e p i t h e l i a l c e l l s i n c u l t u r e . S e v e r a l e a r l y s t u d i e s s u g g e s t e d t h a t t h i s e x p r e s s i o n w a s i n d u c e d b y i n v i t r o c u l t i v a t i o n o f t h e s e c e l l s . S o m e d a t a s u g g e s t t h a t v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n e p i t h e l i a l c e l l s i n v i t r o c o r r e l a t e s w i t h m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n . S e v e r a l i n v i v o s t u d i e s s u g g e s t t h a t v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n e p i t h e l i a l c e l l s m a y b e r e l a t e d t o t u m o r p r o g r e s s i o n ( G i l l e s e t a l . , 1 9 9 6 ) . L a n g e t a l . ( 2 0 0 2 ) d e m o n s t r a t e d t h a t v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g m o t i l i t y o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s a n d t h a t v i m e n t i n p o s i t i v e c e l l s w e r e m o r e l i k e l y t o b e a s s o c i a t e d w i t h p o o r l y d i f f e r e n t i a t e d t u m o r s . W h e n t e s t i n g v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n h y p e r p l a s t i c v e r s u s n o r m a l p r o s t a t e e p i t h e l i u m c e l l s , F r a g a e t a l . ( 1 9 9 8 ) s h o w e d t h a t v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n c r e a s e d s i g n i fi c a n t l y i n b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a ( B P H ) c e l l s w h e n c o m p a r e d t o t h e c e l l s i n t h e a d j a c e n t n o r m a l e p i t h e l i u m . S i n c e s e v e r a l e p i t h e l i a , w h i c h d o n o t e x p r e s s v i m e n t i n i n t h e i r s l o w l y p r o l i f e r a t i n g e p i t h e l i u m , d o e x p r e s s t h i s fi l a m e n t w h e n g r o w n a s r a p i d l y d i v i d i n g c e l l s i n c u l t u r e , F r a g a e t a l . ( 1 9 9 8 ) s u g g e s t t h e d i f f e r e n c e i n p r o l i f e r a t i v e a c t i v i t y b e t w e e n B P H a n d n o r m a l t i s s u e s c a u s e s t h e d i f f e r e n c e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n , w i t h v i m e n t i n a c t i v i t y b e i n g p r o p o r t i o n a l t o p r o l i f e r a t i v e a c t i v i t y . G e n e r a l l y , f u l l y d i f f e r e n t i a t e d c e l l s e x p r e s s o n l y o n e c l a s s o f i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s u b u n i t s t y p i c a l f o r t h a t c e l l t y p e . H o w e v e r , v i m e n t i n i s u n i q u e i n t h a t i t s h o w s c o - e x p r e s s i o n w i t h o t h e r t y p e s o f i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s . V i m e n t i n h a s b e e n f o u n d t o b e c o - e x p r e s s e d w i t h d e s m i n i n m u s c l e c e l l s , w i t h g l i a l fi b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n ( G F A P ) i n c e r t a i n a d u l t g l i a l c e l l s , w i t h n e u r o fi l a m e n t p o l y p e p t i d e s d u r i n g n e u r o n a l d i f f e r e n t i a t i o n , a n d w i t h c y t o k e r a t i n s d u r i n g e p i t h e l i a l d i f f e r e n t i a t i o n ( C a p e t a n a k i e t a l . , 1 9 8 4 ) . 1 3 6 L - m . ‘ . - - R e c e n t s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d d i f f e r e n c e s i n t h e m o t i l i t y a n d d y n a m i c a c t i v i t i e s o f v i m e n t i n a n d c y t o k e r a t i n s d u r i n g c o e x p r e s s i o n i n e p i t h e l i a l c e l l s . B y t a g g i n g v i m e n t i n a n d c y t o k e r a t i n s w i t h g r e e n fl u o r e s c e n t p r o t e i n , Y o o n e t a l . ( 2 0 0 1 ) s h o w e d t h a t t h e s e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s p o s s e s s u r p r i s i n g l y d i f f e r e n t p r o p e r t i e s w i t h i n t h e s a m e c y t o p l a s m i c r e g i o n s . V i m e n t i n fi b r i l s d e m o n s t r a t e c h a n g e s i n s h a p e , e x t e n d i n g a n d s h o r t e n i n g o v e r s h o r t p e r i o d s o f t i m e , a n d b i d i r e c t i o n a l t r a n s l o c a t i o n , w h e r e a s c y t o k e r a t i n t o n o fi b r i l s e x h i b i t s l o w o s c i l l a t i o n s o r u n d u l a t i o n s a n d u n i d i r e c t i o n a l fl u c t u a t i o n s o f d i f f u s e a n d p a r t i c u l a t e c y t o k e r a t i n f r o m t h e s u r f a c e o f t h e c e l l t o w a r d s t h e n u c l e u s . F u r t h e r s t u d y o f t h e s e f a c t o r s m a y s h e d m o r e l i g h t o n t h e s p e c i fi c r o l e s o f t h e s e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s i n d i f f e r e n t i a t i o n , c a n c e r p r o g r e s s i o n , a n d m e t a s t a t i c a b i l i t y o f d i f f e r e n t c a n c e r s . S e c r e t o r y P r o t e i n s : O n e v e r y g o o d m a r k e r o f d i f f e r e n t i a t i o n i n p r o s t a t e c e l l s i s p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) . T h e d i f f e r e n t i a t e d , s e c r e t o r y c e l l l i n i n g t h e p r o s t a t i c g l a n d s , s e c r e t e P S A i n t o t h e l u m e n o f t h e g l a n d s . T h e s y n t h e s i s o f P S A o c c u r s i n r e s p o n s e t o a n d r o g e n s t i m u l a t i o n . P S A r e p r e s e n t s t h e b e s t s e r u m m a r k e r f o r p r o s t a t i c c a r c i n o m a a n d i s a r g u a b l y t h e b e s t t u m o r m a r k e r a v a i l a b l e t o d a y . I t i s u s e f u l i n t h e d i a g n o s i s a n d s t a g i n g o f p r o s t a t e c a n c e r , a n d f o r m o n i t o r i n g t u m o r p r o g r e s s i o n i n m e n w i t h p r o s t a t e c a n c e r . R i s i n g s e r u m l e v e l s a r e a n i n d i c a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r a n d r e s u l t f r o m a n i n c r e a s e i n t o t a l n u m b e r o f s e c r e t o r y c e l l s . T h e r e a r e a l s o m a r k e r s o f d e - d i f f e r e n t i a t i o n o n c e n o r m a l c e l l s b e c o m e m a l i g n a n t . C a n c e r c e l l s m a y p r o d u c e a n a r r a y o f p r o d u c t s n o t n o r m a l l y e x p r e s s e d i n a d u l t t i s s u e s , o r a r e o n l y t r a n s i e n t l y e x p r e s s e d i n n o r m a l t i s s u e . D u r i n g d e v e l o p m e n t , e m b r y o n i c c e l l s 1 3 7 - P u b u . - . . r i . \ - e x p r e s s c e r t a i n h o r m o n e s a n d o t h e r p r o t e i n s k n o w n a s f e t a l a n t i g e n s , i n c l u d i n g o r - f e t o p r o t e i n , c a r c i n o - e m b r y o n i c a n t i g e n , a n d h u m a n c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n . O n c e t i s s u e i s f u l l y d e v e l o p e d a n d d i f f e r e n t i a t e d , t h e s e p r o t e i n s a r e n o l o n g e r e x p r e s s e d a n d a r e r e p l a c e d b y n e w g e n e p r o d u c t s . D e - d i f f e r e n t i a t i o n i n c a n c e r i s a s s o c i a t e d w i t h r e - e x p r e s s i o n o f t h e s e f e t a l a n t i g e n s w h e r e g e n e s t h a t a r e n o r m a l l y s i l e n t i n t h e a d u l t t i s s u e a r e t u r n e d o n . W h e n p r o d u c e d b y c a n c e r c e l l s t h e y a r e k n o w n a s f e t a l m a r k e r s o f m a l i g n a n c y . M o d u l a t o r s o f C e l l D i f f e r e n t i a t i o n T h e r e a r e s e v e r a l f a c t o r s t h a t c a n m o d u l a t e c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . T h e s e f a c t o r s i n c l u d e v i t a m i n s , h o r m o n e s , g r o w t h f a c t o r s , a n d t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x . S e v e r a l o f t h e s e f a c t o r s , a n d t h e i r m e c h a n i s m s o f a c t i o n a n d e f f e c t s o n c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a r e d i s c u s s e d i n t h e n e x t s e c t i o n . T h e e f f e c t s o f v i t a m i n D o n c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a r e d i s c u s s e d l a t e r i n t h i s c h a p t e r . M o d u l a t i o n o f C e l l D i f f e r e n t i a t i o n b y R e t i n o i d s V i t a m i n A i s r e q u i r e d f o r n o r m a l d e v e l o p m e n t a n d f o r m a i n t a i n i n g n o r m a l d i f f e r e n t i a t i o n o f e p i t h e l i a l c e l l s . R e t i n o i d s a r e d e r i v a t i v e s o f v i t a m i n A . M a n y n a t u r a l a n d s y n t h e t i c r e t i n o i d s h a v e b e e n s h o w n t o i n d u c e d i f f e r e n t i a t i o n a n d a p o p t o s i s i n a w i d e v a r i e t y o f c e l l c u l t u r e m o d e l s . B y m o d u l a t i n g c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a n d a p o p t o s i s , r e t i n o i d s h a v e t h e p o t e n t i a l t o r e v e r s e c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n a n d t u m o r p r o g r e s s i o n t o w a r d s a n o r m a l p h e n o t y p e . T h i s w o u l d m a k e r e t i n o i d s a n o v e l a g e n t f o r c a n c e r t r e a t m e n t a n d p r e v e n t i o n . 1 3 8 I h . . . — . - = = , : “ ; . . 3 ‘ “ I n a r e c e n t s t u d y , S h a r p e t a l . ( 2 0 0 1 ) e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f N - ( 4 - h y d r o x y p h e n y l ) r e t i n a m i d e ( 4 - H P R ) , a s y n t h e t i c r e t i n o i d , o n c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n d o n t h e e x p r e s s i o n o f i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n s , c y t o k e r a t i n 1 8 a n d v i m e n t i n , o n t h r e e i m m o r t a l i z e d , b u t n o n — t u m o r i g e n i c ( R W P E - l , W P E l - 7 a n d W P E l - I O ) , a n d o n e h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e ( D U - 1 4 5 ) . S h a r p e t a l . ( 2 0 0 1 ) d e m o n s t r a t e d t h a t 4 — H P R c a u s e d a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n t h e e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n a s w e l l a s a n i n c r e a s e i n c y t o k e r a t i n 1 8 e x p r e s s i o n i n a l l c e l l l i n e s . A d o s e - d e p e n d e n t i n h i b i t i o n o f g r o w t h w a s a l s o s e e n i n a l l c e l l l i n e s . T h i s s t u d y i s v e r y s i g n i fi c a n t i n t h a t i t s h o w s 4 - H P R , a s y n t h e t i c r e t i n o i d , i n d u c e s d i f f e r e n t i a t i o n b y i n c r e a s i n g c y t o k e r a t i n e x p r e s s i o n a n d d e c r e a s i n g v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n p r e - n e o p l a s t i c c e l l s ( R P W E - l , W P E l - 7 , W P E l - I O ) a s w e l l a s i n a m a l i g n a n t c e l l l i n e ( D U - 1 4 5 ) . I n a s i m i l a r e x p e r i m e n t ( W e b b e r e t a l . , 1 9 9 9 b ) , i t w a s s h o w n t h a t t r e a t m e n t w i t h 4 - H P R c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n D U - l 4 5 c e l l s ( F i g u r e 6 - 7 ) . W e b b e r e t a l . ( 1 9 9 9 b ) a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t a l l - t r a n s r e t i n o i c a c i d ( A T R A ) , a n o t h e r r e t i n o i d , c a u s e d g r t h i n h i b i t i o n o f D U - 1 4 5 c e l l s i n a d o s e d e p e n d e n t m a n n e r . R e t i n o i d s h a v e a l s o b e e n s h o w n t o p l a y a r o l e i n t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f s t e m c e l l s i n t o c a r d i o m y c y o c y t e s ( W o b u s e t a l . , 1 9 9 7 ) , a n d i n t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f n o r m a l b r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l s ( M o g h a l a n d N e e l , 1 9 9 8 ) , n e u r o b l a s t o m a c e l l s ( F e r r a r i e t a l . , 1 9 9 8 ) , s e v e r a l o v a r i a n c a n c e r c e l l l i n e s ( Z h a n g e t a l . , 2 0 0 0 ) , a n d l e u k e m i c b l a s t c e l l s ( M a n f r e d i n i e t a l . , 1 9 9 9 ) . I n t e r e s t i n g l y , A T R A h a s b e e n s h o w n t o b l o c k t h e p r o - d i f f e r e n t i a t i n g e f f e c t s o f c a l c i t r i o l i n n o r m a l h u m a n k e r a t i n o c y t e s ( G i b s o n e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h i s b l o c k i n g e f f e c t c o u l d p o s s i b l y b e d u e t o : 1 ) a c o m p e t i t i o n b e t w e e n t h e v i t a m i n D 1 3 9 R P H - 4 M u 0 . 1 : 4 6 k D a - F i g u r e 6 - 7 : T r e a t m e n t w i t h 4 - H P R c a u s e s a m a r k e d d e c r e a s e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n D U - l 4 5 c e l l s . W e s t e r n b l o t a n a l y s i s s h o w s a d e c r e a s e i n v i m e n t i n ( V ) e x p r e s s i o n b y 4 - H P R i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r ( m o d i fi e d f r o m W e b b e r e t a l . , 1 9 9 9 b ) . r e c e p t o r ( V D R ) a n d t h e r e t i n o i c a c i d r e c e p t o r ( R A R ) f o r h e t e r o d i m e r i z a t i o n w i t h r e t i n o i d X r e c e p t o r ( R X R ) ; 2 ) R A R b i n d i n g t o V D R t h e r e b y b l o c k i n g t h e a b i l i t y o f V D R t o h e t e r o d i m e r i z e w i t h R X R ; 3 ) t h e i n h i b i t i o n b y r e t i n o i c a c i d o f c a l c i t r i o l b i n d i n g t o t h e V D R ; o r 4 ) i n t e r a c t i o n s v i a o t h e r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s . R e t i n o i d s a r e a l s o a b l e t o i n d u c e t h e e x p r e s s i o n o f T G F - B . T G F - B i s a n i m p o r t a n t n e g a t i v e r e g u l a t o r o f e p i t h e l i a l c e l l p r o l i f e r a t i o n i n t h a t i s i n h i b i t s e p i t h e l i a l c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d i n d u c e s d i f f e r e n t i a t i o n . A b n o r m a l i t i e s i n r e s p o n s e t o t h i s g r o w t h f a c t o r a r e a m a j o r s t e p i n t h e p r o c e s s o f c a r c i n o g e n e n s i s . S e v e r a l o t h e r g r o w t h f a c t o r s a r e i n v o l v e d i n m o d u l a t i n g c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . 1 4 0 M o d u l a t i o n o f C e l l D i f f e r e n t i a t i o n b y G r o w t h F a c t o r s G r o w t h f a c t o r s a r e p o t e n t m e d i a t o r s o f c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n , d i f f e r e n t i a t i o n , a n d c e l l d e a t h . G r o w t h f a c t o r s h a v e b e e n s h o w n t o b e n e g a t i v e o r p o s i t i v e r e g u l a t o r s o f g r o w t h a n d f u n c t i o n o f s e v e r a l d i f f e r e n t t y p e s o f c e l l s . P o l y p e p t i d e g r o w t h f a c t o r s , i n c l u d i n g e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) , t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r ( T G F ) o r a n d [ 3 , fi b r o b l a s t ( F G E ) , a n d i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r s ( I G F ) , h a v e b e e n e x t e n s i v e l y s t u d i e d i n t h e p r o s t a t e g l a n d . P o l y p e p t i d e g r o w t h f a c t o r s a r e g e n e r a l l y l o c a l l y p r o d u c e d a n d e x e r t t h e i r e f f e c t s i n e i t h e r a n a u t o c r i n e o r p a r a c r i n e m a n n e r . T G F - B i n h i b i t s g r o w t h o f e p i t h e l i a l c e l l s i n t h e n o r m a l p r o s t a t e , B P H , a n d p r o b a b l y e a r l y p h a s e s o f p r o s t a t i c c a r c i n o m a . T h e a b i l i t y o f T G F - B t o a n t a g o n i z e t h e m i t o g e n i c e f f e c t s o f o t h e r , p o s i t i v e g r o w t h f a c t o r s ( S p o r n e t a l . , 1 9 8 6 ) c o u l d b e o n e m e c h a n i s m r e s p o n s i b l e f o r t h i s g r o w t h i n h i b i t i o n . T h e fi n d i n g t h a t t h e T G F - B r e c e p t o r i s u n d e r n e g a t i v e a n d r o g e n c o n t r o l i s a l s o c o n s i s t e n t w i t h t h e r o l e o f T G F - B a s a g r o w t h - i n h i b i t i n g f a c t o r i n n o r m a l p r o s t a t e s ( C u l i g e t a l . , 1 9 9 6 ) . C o n v e r s e l y , T G F - B s t i m u l a t e s t u m o r g r o w t h i n a d v a n c e d s t a g e s o f p r o s t a t e c a n c e r . P r o s t a t e c a n c e r c e l l s a r e a b l e t o a c t i v a t e l a t e n t T G F - B p r e c u r s o r s , s u g g e s t i n g a n a u t o c r i n e s t i m u l a t o r y T G F - B l o o p i n a d v a n c e d s t a g e s o f p r o s t a t e c a n c e r . T G F - [ 3 i n n o r m a l p r o s t a t e t i s s u e i s l o c a l i z e d i n t h e s t r o m a , w h i l e i t i s h o m o g e n e o u s l y d i s t r i b u t e d i n p o o r l y d i f f e r e n t i a t e d t u m o r s , i n d i c a t i n g a g g r e s s i v e t u m o r c e l l s m a y a c q u i r e t h e a b i l i t y t o p r o d u c e t h e i r o w n T G F - B ( C u l i g e t a l . , 1 9 9 6 ) . B o t h o f t h e s e f a c t o r s p r o b a b l y p l a y a r o l e i n t h e T G F - B - i n d u c e d g r o w t h s t i m u l a t i o n o f a d v a n c e d p r o s t a t e c a n c e r . S e v e r a l fi b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r s h a v e b e e n i d e n t i fi e d i n t h e p r o s t a t e . T h e y a r e m a i n l y e x p r e s s e d b y s t r o m a l c e l l s a n d s t i m u l a t e e p i t h e l i a l c e l l g r o w t h . B a s i c fi b r o b l a s t 1 4 1 k J g r o w t h f a c t o r ( b F G F ) , w h i c h i s o n e o f t h e m a i n g r o w t h f a c t o r s i n B P H , a l s o a c t s i n a n a u t o c r i n e m a n n e r i n h o r m o n e - i n d e p e n d e n t p r o s t a t e c a n c e r ( C u l i g e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h i s o b s e r v a t i o n s h o w s h o w t h e g r o w t h f a c t o r s m e n t i o n e d a b o v e a r e a b l e t o r e g u l a t e t h e g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e p r o s t a t e . F i g u r e 6 - 8 d e p i c t s t h e a c t i o n s o f t h e s e g r o w t h f a c t o r s o n t h e s t r o m a a n d e p i t h e l i u m o f n o r m a l , h y p e r p l a s t i c , a n d c a n c e r o u s p r o s t a t e . S t r o m a E p i t h e l i u m T G F o r E G F I G F - l , n T G F a b F G F b F G F I G F - I , I I ' 2 N o r m a l p r o s t a t e B P H E a r l y s t a g e s p r o s t a t i c c a n c e r L a t e s t a g e s p r o s t a t i c c a n c e r F i g u r e 6 - 8 : M o d e o f a c t i o n o f p o l y p e p t i d e g r o w t h f a c t o r s i n t h e n o r m a l , h y p e r p l a s t i c , a n d c a r c i n o m a t o u s p r o s t a t e s h o w i n g t h e a u t o c r i n e a n d p a r a c r i n e m a n n e r s o f s e c r e t i o n o f d i f f e r e n t g r o w t h f a c t o r a t d i f f e r e n t s t a g e s o f p r o s t a t e c a n c e r ( C u l i g e t a l . , 1 9 9 6 ) . 1 4 2 D e v e l o p m e n t o f t h e p r o s t a t e i s a n d r o g e n - d e p e n d e n t , a n d i s i n p a r t r e g u l a t e d b y t h e i n d u c t i v e i n fl u e n c e o f t h e m e s e n c h y m e . K e r a t i n o c y t e g r o w t h f a c t o r ( K G F ) i s p r o d u c e d b y fi b r o b l a s t s a n d m e s e n c h y m a l c e l l s , h a s a h i g h d e g r e e o f s p e c i fi c i t y f o r e p i t h e l i a l c e l l s , a n d p r o m o t e s e p i d e r m a l p r o l i f e r a t i o n . D u r i n g m a l e u r o g e n i t a l d e v e l o p m e n t , a n d r o g e n s a p p e a r t o a c t v i a m e s e n c h y m a l a n d r o g e n r e c e p t o r s ( A R ) t o e l i c i t s y n t h e s i s a n d s e c r e t i o n o f K G F w h i c h r e g u l a t e s p r o s t a t i c e p i t h e l i a l g r o w t h a n d m o r p h o g e n e s i s ( C u h n a , 1 9 9 6 ) . G r o w t h f a c t o r s h a v e a l s o b e e n s h o w n t o p l a y a r o l e i n t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f s e v e r a l c e l l t y p e s o t h e r t h a n p r o s t a t e c e l l s . W h i l e E G F i n d u c e d t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f m o u s e m a m m a r y e p i t h e l i a l c e l l s ( T a v e r n a e t a l . , 1 9 9 1 ) , i n b r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l s d i f f e r e n t i a t i o n b e g i n s o n l y u p o n t h e i n h i b i t i o n o f E G F ( M o g h a l a n d N e e l , 1 9 9 8 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e d i f f e r e n t i a t i n g e f f e c t s o f c e r t a i n g r o w t h f a c t o r s m a y b e c e l l - t y p e s p e c i fi c . I n t e r e s t i n g l y , i n t h e s t u d y b y M o g h a l a n d N e e l ( 1 9 9 8 ) , i t w a s a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t i n h i b i t i n g t h e p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s o f E G F w a s c r i t i c a l f o r r e t i n o i d s t o i n d u c e t a r g e t g e n e s n e e d e d t o i n d u c e d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e b r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l s . T h i s s u g g e s t s t h a t p a r t o f t h e m e c h a n i s m o f l u n g c a r c i n o g e n e s i s , i n w h i c h o v e r e x p r e s s i o n o f E G F r e c e p t o r s i s f r e q u e n t , m a y i n v o l v e a n t a g o n i s m o f t h e d i f f e r e n t i a t i o n - p r o m o t i n g a c t i v i t y o f r e t i n o i d s ( M o g h a l a n d N e e l , 1 9 9 8 ) . O t h e r g r o w t h f a c t o r s , s u c h a s , I G F - I a n d I G F - I I h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n t h e i n d u c t i o n o f d i f f e r e n t i a t i o n i n l u n g ( M a i t r e e t a l . , 1 9 9 5 ) a n d i n t e s t i n a l e p i t h e l i a l c e l l s ( J e h l e e t a l . , 1 9 9 8 ) . 1 4 3 ' ' b ‘ - » " ~ ~ \ ¢ - m a r ” M o d u l a t i o n o f C e l l D i f f e r e n t i a t i o n b y E x t r a c e l l u l a r M a t r i x C e r t a i n c o m p o n e n t s o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( E C M ) c a n a l s o m o d u l a t e t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f c e r t a i n c e l l t y p e s . T h e E C M i s e s s e n t i a l i n t h e s t r u c t u r a l a n d fi r n c t i o n a l ( s e c r e t i o n o f t i s s u e s p e c i fi c p r o t e i n s ) d i f f e r e n t i a t i o n o f e p i t h e l i a l a c i n i . A n a l t e r a t i o n o f t h e E C M o r a n y o f i t s i n d i v i d u a l c o m p o n e n t s c o u l d p l a y a c r i t i c a l r o l e i n e p i t h e l i a l c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . B r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l s u n d e r g o m u c o s e c r e t o r y d i f f e r e n t i a t i o n o n l y w h e n g r o w n o n c o l l a g e n g e l s ( M o g h a l a n d N e e l , 1 9 9 8 ) . M a t r i g e l , a r e - c o n s t i t u t e d b a s e m e n t m e m b r a n e , h a s b e e n e x t e n s i v e l y u s e d t o s t u d y t h e e p i t h e l i a l c e l l i n t e r a c t i o n s w i t h t h e b a s e m e n t m e m b r a n e . T h e p r o g r e s s i o n o f p r o s t a t e c a n c e r i s a c c o m p a n i e d b y t h e l o s s o f n o r m a l e p i t h e l i a l a r c h i t e c t u r e a n d t h e b r e a k d o w n o f t h e b a s e m e n t m e m b r a n e . W e b b e r e t a l . ( 1 9 9 7 ) d e m o n s t r a t e d t h a t n o n - t u m o r i g e n i c R W P E - l c e l l s u n d e r g o a c i n a r d i f f e r e n t i a t i o n a s a r e s u l t o f t h e i n t e r a c t i o n w i t h t h e E C M ( M a t r i g e l ) . C o n v e r s e l y , t h e m a l i g n a n t R W P E - 2 a n d D U - 1 4 5 p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s h a v e l o s t t h e a b i l i t y t o f o r m a c i n i w h e n g r o w n i n M a t r i g e l . P S A i s a n i m p o r t a n t , a n d r o g e n - d e p e n d e n t m a r k e r o f d i f f e r e n t i a t e d f u n c t i o n o f p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s . W h e n e x p o s e d t o t h e s y n t h e t i c a n d r o g e n m i b o l e r o n e t h e a c i n i , f o r m e d b y R W P E - l c e l l s c u l t u r e d i n M a t r i g e l , s y n t h e s i z e a n d s e c r e t e h i g h l e v e l s o f p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) ( W e b b e r e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e s e c r e t i o n o f P S A m i m i c s t h a t o f n o r m a l p r o s t a t i c a c i n i i n v i v a . S i m i l a r s t u d i e s w i t h b r e a s t a n d p r o s t a t e e p i t h e l i a h a v e a l s o s h o w n t h e f o r m a t i o n o f a c i n i t h a t s e c r e t e p r o t e i n s s p e c i fi c f o r f u n c t i o n a l d i f f e r e n t i a t i o n ( B a r c e l l o s - H o f f e t a l . , 1 9 8 9 ; L a n g e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e s e r e s u l t s s h o w t h e e f f e c t s o f t h e E C M ( M a t r i g e l ) o n t h e s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l d i f f e r e n t i a t i o n o f p r o s t a t e a n d b r e a s t e p i t h e l i a . T h e c r u c i a l r o l e o f E C M a n d i t s 1 4 4 c o m p o n e n t s i n n o r m a l c e l l d i f f e r e n t i a t i o n i m p l i e s t h a t i t s a l t e r a t i o n m a y h a v e s e r i o u s c o n s e q u e n c e s i n m a l i g n a n c i e s a n d o t h e r d i s e a s e s . M o d u l a t i o n o f C e l l D i f f e r e n t i a t i o n b y H o r m o n e s H o r m o n e s c a n a l s o p l a y a s i g n i fi c a n t r o l e i n t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f c e r t a i n t i s s u e s . A n o v e l e x a m p l e o f t h i s i s i n t h e p r o s t a t e . A n d r o g e n s p l a y a d u a l r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h i s g l a n d . T h e y fi r s t d i r e c t t h e p r o l i f e r a t i o n f o r g r t h o f t h e p r o s t a t e a n d t h e n m a i n t a i n t h e d i f f e r e n t i a t e d s t a t e o f t h e p r o s t a t e c e l l s i n t h e m a t u r e o r g a n . T h e y a r e e s s e n t i a l f o r t h e h o m e o s t a s i s i n n o r m a l p r o s t a t e d e v e l o p m e n t a n d m a i n t e n a n c e . E v i d e n c e o f t h i s i s s e e n u p o n c h e m i c a l o r s u r g i c a l c a s t r a t i o n , w h i c h r e s u l t s i n a r a p i d o n s e t o f e p i t h e l i a l a p o p t o s i s i n t h e p r o s t a t e g l a n d . T r e a t m e n t w i t h a n d r o g e n h a s b e e n s h o w n t o i n d u c e d i f f e r e n t i a t i o n i n s e v e r a l p r o s t a t e c e l l l i n e s ( W e b b e r e t a l . , 1 9 9 6 ; W e b b e r e t a l . , 1 9 9 7 ; L i n g e t a l . , 2 0 0 1 ; W h i t a c r e e t a l . , 2 0 0 2 ) . C o n v e r s e l y , a n d r o g e n s t i m u l a t e s p r o l i f e r a t i o n i n e a r l y - s t a g e p r o s t a t e c a n c e r . T h i s i s p r o v e n i n s t u d i e s u s i n g fi n a s t e r i d e , a 5 - a l p h a - r e d u c t a s e i n h i b i t o r . T h e e n z y m e 5 - a l p h a r e d u c t a s e c o n v e r t s t e s t o s t e r o n e t o d i h y d r o t e s t o s t e r o n e ( D H T ) , t h e m a j o r a n d r o g e n i n v o l v e d i n p r o s t a t e g r o w t h . T h e a d m i n i s t r a t i o n o f f m a s t e r i d e c a u s e s a r e d u c t i o n o r p r e v e n t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r g r o w t h . F i n a s t e r i d e a d m i n i s t r a t i o n i s , t h e r e f o r e , o n e e f f e c t i v e a n d r o g e n - d e p r i v a t i o n t h e r a p y u s e d t o t r e a t p r o s t a t e c a n c e r . H o w e v e r , a fi a c t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s e s c a p e s a n d r o g e n - d e p r i v a t i o n t h e r a p y . A s a r e s u l t , t h e s e c e l l s c a n c o n t i n u e t o g r o w a n d i n e v i t a b l y f o r m t u m o r s . T h e s e a n d r o g e n - r e s i s t a n t c e l l s h a v e a w a y o f a v o i d i n g o r i n h i b i t i n g t h e s i g n a l i n g m e c h a n i s m u s e d i n t h e a n d r o g e n - s u p p r e s s e d a p o p t o t i c p a t h w a y t h a t i s i n t r i n s i c t o n o r m a l p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s . T h e g r o w t h a n d n o r m a l f u n c t i o n o f t h e p r o s t a t e i s d e p e n d e n t o n D H T . T h e a c t i v i t y o f D H T i s m e d i a t e d 1 4 5 b y t h e a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) . S i n c e p r o s t a t e c a n c e r c e l l s e x p r e s s A R a n d a d v a n c e d t u m o r s a r e i n s e n s i t i v e t o a n d r o g e n t r e a t m e n t , i t i s b e l i e v e d t h a t a n a l t e r a t i o n ( i . e . m u t a t i o n ) i n A R s t r u c t u r e a n d / o r e x p r e s s i o n i s t h e m a i n c o n t r i b u t i n g f a c t o r t o a n d r o g e n - r e s i s t a n t p r o s t a t e c a n c e r . A b n o r m a l i t i e s o f D i f f e r e n t i a t i o n i n C a n c e r A n i m p o r t a n t c h a r a c t e r i s t i c i n c a n c e r c e l l s i s t h a t t h e y g e n e r a l l y f a i l , o r h a v e l o s t t h e a b i l i t y t o , d i f f e r e n t i a t e i n t o s p e c i a l i z e d c e l l t y p e s . W h e n n o r m a l c e l l s h a v e p r o g r e s s e d t h r o u g h a c e r t a i n n u m b e r o f p o p u l a t i o n d o u b l i n g s t h e y s i m p l y s t o p p r o l i f e r a t i n g , a p r o c e s s t e r m e d r e p l i c a t i v e c e l l s e n e s c e n c e . S i n c e m o s t d i f f e r e n t i a t e d c e l l s e i t h e r n o l o n g e r d i v i d e o r d i v i d e s l o w l y , t h e d e f e c t i v e d i f f e r e n t i a t i o n o f c a n c e r c e l l s i s c l o s e l y l i n k e d t o t h e i r u n c o n t r o l l e d p r o l i f e r a t i o n i n d i c a t i n g t h a t t h e y h a v e e s c a p e d t h e r e s t r a i n t s o f c e l l s e n e s c e n c e . I n s t e a d o f p r o g r e s s i n g t o a f u l l y d i f f e r e n t i a t e d s t a t e , c a n c e r c e l l s c o n t i n u e t o g r o w a n d d i v i d e d u e t o a r r e s t a t a n e a r l y s t a g e o f t h e d i f f e r e n t i a t i o n p r o c e s s . T h e o r i g i n s o f a c a n c e r c a n u s u a l l y b e t r a c e d t o c e l l d i v i s i o n o f a s i n g l e c e l l t h a t h a s u n d e r g o n e s o m e h e r i t a b l e c h a n g e w h i c h a l l o w s i t t o o u t g r o w i t s n e i g h b o r s . T h i s c e l l , a n d i t s p r o g e n y , n o l o n g e r d i f f e r e n t i a t e b u t c a n c o n t i n u e t o p r o l i f e r a t e a t a m o r e r a p i d p a c e t h a n n o r m a l c e l l s . T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c a n c e r a n d a b n o r m a l d i f f e r e n t i a t i o n c a n b e w e l l d e m o n s t r a t e d i n l e u k e m i a c e l l s ( F i g u r e 6 - 9 ) . A l l o f t h e d i f f e r e n t k i n d s o f b l o o d c e l l s a r e d e r i v e d f r o m a c o m m o n p l u r i p o t e n t s t e m c e l l i n t h e b o n e m a r r o w . S o m e o f t h e s e d e s c e n d e n t s b e c o m e r e d b l o o d c e l l s a n d o t h e r s b e c o m e d i f f e r e n t t y p e s o f w h i t e b l o o d 1 4 6 P l u n ' p o t e n t _ s t e m c e l l S e l f r e n e w a l * E r y t h r o i d . E C p r e c u r s o r c e l l . : 3 \ e - o \ / / @ \ g g / e u e m i a % % E r y t h r o b l a s t L k o / \ / \ / \ / \ Q / a \ J f f f f f f f f / 0 \ } K E E R e u w W e Q O O Q O Q O Q 5 t I l l l l l l / \ / \ ® / \ / \ g E r y t h r o c y t e e o c v c o o o o o c o c o c o . . @ ® I I I I I I I I I I I I I I a e e e e e s e e o e o a e I I I I I I I I I I I I I V I I I I I I U I I I I I L e u k e m i c c e l l s f a i l t o d i t t e r e n t i a t e a n d c o n t i n u e t o d i v i d e F i g u r e 6 - 9 : D e f e c t i v e c e l l d i f f e r e n t i a t i o n i n e r y t h r o l e u k e m i a . E r y t h r o c y t e s a r e d e r i v e d f r o m a p l u r i p o t e n t s t e m c e l l i n t h e b o n e m a r r o w . E r y t h r o b l a s t s u n d e r g o s e v e r a l r o u n d s o f c e l l d i v i s i o n a s t h e y d i f f e r e n t i a t e , b u t c e l l d i v i s i o n s t o p s a t t e r m i n a l s t a g e s ( e r y t h r o c y t e s ) . I n c o n t r a s t , t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f l e u k e m i c c e l l s i s b l o c k e d a t a n e a r l y s t a g e a t w h i c h t h e y c o n t i n u e t o p r o l i f e r a t e ( m o d i fi e d f r o m C o o p e r , 1 9 9 2 ) . c e l l s . C e l l d i v i s i o n s t o p s a f t e r t h e s e c e l l s g o t h r o u g h s e v e r a l r o u n d s o f d i f f e r e n t i a t i o n a n d b e c o m e t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d . I n c o n t r a s t , l e u k e m i c c e l l s b e c o m e b l o c k e d a t a n e a r l y s t a g e o f d i f f e r e n t i a t i o n , f a i l t o d i f f e r e n t i a t e n o r m a l l y , a n d u n d e r g o c o n t i n u e d p r o l i f e r a t i o n . A p o p t o s i s , o r p r o g r a m m e d c e l l d e a t h , i s a n i n t e g r a l p a r t o f t h e p r o c e s s o f c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . S i n c e m a n y k i n d s o f t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d c e l l s s u r v i v e f o r o n l y a s h o r t t i m e , s t e m c e l l s a r e c o n s t a n t l y d i v i d i n g a n d r e p l a c i n g t h e m i n o r d e r t o m a i n t a i n h o m e o s t a s i s . C a n c e r c e l l s g e n e r a l l y f a i l t o u n d e r g o a p o p t o s i s , a n d i n s t e a d c o n t i n u e t o p r o l i f e r a t e i n d e fi n i t e l y . W h e n c a n c e r c e l l s g a i n t h i s a b i l i t y , t h e y a r e s a i d t o h a v e b e c o m e i m m o r t a l i z e d . 1 4 7 C e l l C y c l e C h e c k p o i n t s a n d D i f f e r e n t i a t i o n C h a n g e s t h a t b l o c k t h e n o r m a l m a t u r a t i o n o f c e l l s t o w a r d a n o n - d i v i d i n g , t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d s t a t e o r b l o c k a p o p t o s i s p l a y a c r u c i a l r o l e i n m a n y c a n c e r s . T h e m o s t o b v i o u s w a y a c e l l g a i n s t h e a b i l i t y t o a v o i d n o r m a l d i f f e r e n t i a t i o n a n d / o r a p o p t o s i s i s t h r o u g h m u t a t i o n s i n k e y g e n e s r e s u l t i n g i n b l o c k i n g o n e o r b o t h o f t h e s e p r o c e s s e s . T h e t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s , p 5 3 a n d p r , a r e p e r h a p s t h e t w o g e n e s m o s t i n v o l v e d i n t h e s e p r o c e s s e s . T h e p 5 3 T u m o r S u p p r e s s o r G e n e T h e t u m o r s u p p r e s s o r g e n e , p 5 3 , h a s a f u n d a m e n t a l r o l e i n g r o w t h c o n t r o l a n d n e o p l a s i a a n d m a y b e t h e m o s t i m p o r t a n t g e n e i n h u m a n c a n c e r . I t i s n o t r e q u i r e d f o r n o r m a l d e v e l o p m e n t , b u t a l a c k , o r m u t a t i o n , o f p 5 3 u s u a l l y l e a d s t o c a n c e r ( A l b e r t s e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h i s g e n e i s m u t a t e d i n a p p r o x i m a t e l y 5 0 % o f a l l c a n c e r s a n d i s r e g a r d e d a s o n e o f t h e m o s t m u t a t e d g e n e s a s s o c i a t e d w i t h c a n c e r d e v e l o p m e n t ( A l m o g a n d R o t t e r , 1 9 9 7 ) ; i t i s t h e m o s t f r e q u e n t l y m u t a t e d g e n e i n h u m a n c a n c e r ( H o l l s t e i n e t a l . , 1 9 9 1 ) . p 5 3 s t a n d s a t a c r i t i c a l p o i n t i n t h e c e l l c y c l e a n d i n t h e p a t h w a y s g o v e r n i n g t h e r e s p o n s e s o f a c e l l s t o D N A d a m a g e . I t i s i n v o l v e d i n t h r e e v e r y i m p o r t a n t p r o c e s s e s : 1 ) c e l l c y c l e c o n t r o l , 2 ) a p o p t o s i s , a n d 3 ) g e n e t i c s t a b i l i t y . D N A d a m a g e a c t i v a t e s p 5 3 b y a n i n d i r e c t m e c h a n i s m . p 5 3 i s v e r y u n s t a b l e a n d p r e s e n t a t l o w c o n c e n t r a t i o n s i n u n d a m a g e d c e l l s . I t s t i m u l a t e s t h e t r a n s c r i p t i o n o f t h e p 2 1 c d k i ( c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r s ) , t h e r e b y h e l p i n g t o b l o c k c e l l e n t r y i n t o S p h a s e . T h i s i s b e c a u s e i t i n t e r a c t s w i t h a n o t h e r p r o t e i n , M d m 2 , t h a t t a r g e t s p 5 3 f o r d e s t r u c t i o n b y p r o t e o s o m e s . T h e b i n d i n g t o M d m 2 i s r e d u c e d b y t h e p r o t e i n k i n a s e m e d i a t e d p h o s p h o r y l a t i o n o f p 5 3 . T h e r e i s a m a r k e d i n c r e a s e i n p 5 3 i n t h e c e l l a s a r e s u l t 1 4 8 o f t h e d e c r e a s e i n p 5 3 d e g r a g a t i o n . T h e a b i l i t y o f p 5 3 t o s t i m u l a t e p 2 1 t r a n s c r i p t i o n i s e n h a n c e d b y t h e d e c r e a s e d b i n d i n g o f p 5 3 t o M d m 2 ( F i g u r e 6 — 1 0 ) . S V 4 0 l a r g e T a n t i g e n h a s b e e n s h o w n t o b i n d t o a n d s e q u e s t e r p 5 3 , t h e r e b y b l o c k i n g i t s a b i l i t y t o r e g u l a t e c e l l p r o l i f e r a t i o n . A s a r e s u l t , c e l l s t r a n s f o r m e d w i t h S V 4 0 l a r g e T a n t i g e n a r e a l l o w e d t o p r o g r e s s t h r o u g h t h e c e l l c y c l e , c o n t i n u i n g t o p r o l i f e r a t e e v e n w h e n t h e i r D N A h a s b e e n d a m a g e d . x — r a y s D N A _ _ C : 1 : : ‘ 1 2 : : P r o t e i n ‘ k l n a s e M d m 2 a c t i v a t i o n a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f p 5 3 s t a b l e . “ ’ 3 a c t i v e p 5 3 1 . 5 5 3 A c t i v e p 5 3 b i n d s t o r e g u l a t o r y r e g i o n o f p 6 3 D E G R A D A T I O N p 2 1 g e n e I N P R O T E A S O M E S . / h . . . \ : p 2 1 g e n e . - ~ . ~ . - 3 * T r a n s c r i p t i o n j m p 2 1 m R N A T r a n s l a t i o n 1 A m a y , a m . » ' . - . 1 . p 2 1 ( C d k i n h i b i t o r p r o t e i n ) : A C T I V E f ? I N A C T I V E G 1 / S — C d k G 1 / S — C d k a n d S - C d k a n d S — C d k c o m p l e x e d w i t h p 2 1 F i g u r e 6 - 1 0 : H o w D N A d a m a g e a r r e s t s t h e c e l l c y c l e i n G 1 . W h e n D N A i s d a m a g e d , p r o t e i n k i n a s e s t h a t p h o s p h o r y l a t e p 5 3 a r e a c t i v a t e d . M d m 2 n o r m a l l y b i n d s t o p 5 3 a n d p r o m o t e s i t s u b i q u i t i n y l a t i o n a n d d e s t r u c t i o n i n p r o t e o s o m e s . P h o s p h o r y l a t i o n o f p 5 3 b l o c k s i t b i n d i n g t o M d m 2 ; a s a r e s u l t , p 5 3 a c c u m u l a t e s t o h i g h l e v e l s a n d s t i m u l a t e s t r a n s c r i p t i o n p 2 1 , t h e r e b y a r r e s t i n g t h e c e l l i n G I ( m o d i fi e d f r o m A l b e r t s e t a l . , 2 0 0 2 ) . 1 4 9 W h e n n o r m a l c e l l s a r e e x p o s e d t o f a c t o r s t h a t c a u s e D N A d a m a g e ( r a d i a t i o n , o x y g e n d e p r i v a t i o n , e t c . ) , t h e y r a i s e t h e i r l e v e l o f p 5 3 b y r e d u c i n g t h e n o r m a l l y h i g h d e g r a d a t i o n r a t e o f t h e m o l e c u l e . T h i s e i t h e r c a u s e s t h e c e l l s t o u n d e r g o a p o p t o s i s b e c a u s e o f t h e D N A d a m a g e , o r a r r e s t s t h e c e l l s i n t h e c e l l c y c l e u n t i l t h e d a m a g e c a n b e r e p a i r e d . C e l l s d e f e c t i v e i n p 5 3 t e n d t o e s c a p e a p o p t o s i s a n d c o n t i n u e t o p r o l i f e r a t e , a l l o w i n g m u t a n t c e l l s t o c o n t i n u a l l y g o t h r o u g h t h e c e l l c y c l e w i t h o u t b e c o m i n g t e r m i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d . T h e p r T u m o r S u p p r e s s o r G e n e A n o t h e r t u m o r s u p p r e s s o r g e n e , R b , w o r k s i n a w a y s i m i l a r t o p 5 3 . M a n y c a n c e r c e l l s p r o l i f e r a t e i n a p p r o p r i a t e l y a s a r e s u l t o f l o s s o f R b f u n c t i o n d u e t o a l o s s o r m u t a t i o n s i n t h e R b g e n e , o r i n o t h e r g e n e s i n t h e r e g u l a t o r y p a t h w a y o f R b ( F i g u r e 6 - 1 1 ) . N o r m a l c e l l s p r o g r e s s t h r o u g h t h e c e l l c y c l e w h e n R b i s p h o s p h o r y l a t e d b y a n a c t i v e p r o t e i n k i n a s e c o m p l e x . T h e p 1 6 p r o t e i n i s p r o d u c e d w h e n c e l l s b e c o m e s t r e s s e d , a n d i n h i b i t s t h e p r o g r e s s i o n t h r o u g h t h e c e l l c y c l e b y p r e v e n t i n g t h e f o r m a t i o n o f t h e p r o t e i n k i n a s e c o m p l e x . M a n y c a n c e r s h a v e a d e l e t i o n o r i n a c t i v a t i o n o f t h e p 1 6 g e n e , o r i t c a n b e s i l e n c e d b y m e t h y l a t i o n o f i t s r e g u l a t o r y D N A . S o m e c a n c e r s h a v e a l s o b e e n f o u n d t o h a v e a m p l i fi e d t h e g e n e s e n c o d i n g t h e p r o t e i n k i n a s e c o m p l e x . T h e s e c h a n g e s f a v o r c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n d r e s u l t i n d e c r e a s e s i n a p o p t o s i s a n d d i f f e r e n t i a t i o n . I m p o r t a n t i n t h e d i s c u s s i o n o f c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a n d i t s a s s o c i a t i o n w i t h c a n c e r i s t h e “ C h a l o n e T h e o r y o f C a n c e r . ” T h i s t h e o r y s t a t e s t h a t “ M i t o t i c c o n t r o l i s l o s t w h e n t h e c h a l o n e c o n c e n t r a t i o n f a l l s s o l o w t h a t t h e d i s t a l c e l l s r e m a i n m i t o t i c , c e l l g a i n t h e n e x c e e d s c e l l l o s s a n d a t u m o r a p p e a r s ” ( W e b b e r , M . M . p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ; P a r k i n s o n a n d B a l m a i n , 1 9 9 0 ) . T h e m o r e d i f f e r e n t i a t e d t h e c e l l s , t h e m o r e c h a l o n e 1 5 0 N O N - P R O L I F E R A T I N G P R O L I F E R A T I N G C E L L p 1 6 i n a c fi v e C E L L a c t i v e p 1 6 o r a b s e n t \ i n a c t i v e @ ; 9 3 ’ 9 " " 0 1 ] p r o t e i n c y c l i n D 1 p r o t e i n ‘ C d k 4 j k i n a s e \ C d k 4 k i n a s e c o m p l e x c o m p l e x 9 1 e i n a c t i v e R b . . - . . E s i “ 3 _ e x p r e s s i o n o f S - p h a s e g e n e s i s i n h i b i t e d e x p i — e f s s i o n o f S - p h a s e g e n e s i s a c t i v a t e d F i g u r e 6 - 1 1 : T h e p a t h w a y t h a t c o n t r o l s c e l l c y c l i n g v i a R b p r o t e i n . A l l c o m p o n e n t s o f t h i s p a t h w a y h a v e b e e n f o u n d t o b e a l t e r e d b y m u t a t i o n i n h u m a n c a n c e r s . I n m o s t c a s e s , o n l y o n e o f t h e c o m p o n e n t s i s a l t e r e d i n a n y i n d i v i d u a l t u m o r . T h e R b p r o t e i n i n h i b i t s e n t r y i n t o t h e c e l l - d i v i s i o n c y c l e w h e n i t i s u n p h o s p h o r y l a t e d . T h e c o m p l e x o f C d k 4 a n d c y c l i n D 1 p h o s p h o r y l a t e s R b , t h e r e b y e n c o u r a g i n g c e l l p r o l i f e r a t i o n . W h e n c e l l i s s t r e s s e d , p 1 6 i n h i b i t s t h e f o r m a t i o n o f a n a c t i v e C d k 4 / c y c l i n D 1 c o m p l e x , p r e v e n t i n g p r o l i f e r a t i o n . I n a c t i v a t i o n o f R b o r p 1 6 b y m u t a t i o n e n c o u r a g e s c e l l d i v i s i o n , t h u s e a c h c a n b e r e g a r d e d a s a t u m o r s u p p r e s s o r . O v e r a c t i v i t y o f C d k 4 o r c y c l i n D 1 e n c o u r a g e s c e l l d i v i s i o n , t h u s e a c h c a n b e r e g a r d e d a s a p r o t o - o n c o g e n e ( m o d i fi e d f r o m A l b e r t s e t a l . , 2 0 0 2 ) . ( g r o w t h i n h i b i t o r ) t h e r e i s ; t h e l e s s d i f f e r e n t i a t e d t h e c e l l s , t h e l e s s t h e c h a l o n e . C h a l o n e l e v e l s a r e l o w i n s o m e t u m o r s w h e n c o m p a r e d t o n o r m a l t i s s u e s . T G F - B a n d C e l l D i f f e r e n t i a t i o n T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - B ( T G F - B ) i s a g o o d e x a m p l e o f a c h a l o n e , a n d i t p l a y s a c r i t i c a l r o l e i n c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . T G F - B i s a c e l l - t y p e s p e c i fi c g r o w t h f a c t o r a n d i t a c t s a s a n e g a t i v e a u t o c r i n e o r p a r a c r i n e r e g u l a t o r o f e p i t h e l i a l c e l l p r o l i f e r a t i o n . I t i n h i b i t s e p i t h e l i a l c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d i t s s y n t h e s i s i n c r e a s e s w i t h d i f f e r e n t i a t i o n i n e p i t h e l i a l c e l l s . L o s s o f g r o w t h i n h i b i t i o n t h r o u g h T G F - B - m e d i a t e d p a t h w a y s c o n t r i b u t e s t o t h e f o r m a t i o n o f s e v e r a l t y p e s o f c a n c e r . T h e n e g a t i v e f e e d b a c k c o n t r o l o f T G F - [ 3 t o 1 5 1 c a u s e c e l l s t o d i f f e r e n t i a t e i s s o m e h o w b l o c k e d i n c a n c e r c e l l s , p o s s i b l y b y m u t a t i o n s i n i t s r e c e p t o r o r b y t h e i n a c t i v a t i o n o f S m a d s , w h i c h a r e k e y i n t r a c e l l u l a r s i g n a l t r a n s d u c e r s i n t h e T G F - B p a t h w a y ( R o b e r t s a n d W a k e fi e l d , 2 0 0 3 ) . T G F - B i s a g o o d e x a m p l e o f h o w g r o w t h f a c t o r s c a n a l s o p l a y a c r i t i c a l r o l e i n c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a n d c a n c e r f o r m a t i o n . T h e R o l e o f V i t a m i n D i n C e l l P r o l i f e r a t i o n C e l l p r o l i f e r a t i o n , p r o d u c i n g m a n y c e l l s f r o m o n e , i s a p r o c e s s f u n d a m e n t a l t o g r o w t h , d e v e l o p m e n t , a n d n e o p l a s i a . T h e p r o c e s s e s b y w h i c h c a l c i t r i o l i n h i b i t s c e l l p r o l i f e r a t i o n i s a n a c t i v e a r e a o f s t u d y . E f f e c t s o f v i t a m i n D o n c h a n g e s i n c e l l c y c l e p r o g r e s s i o n a n d c e l l d e a t h h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d . T o d a t e , s t u d i e s s u g g e s t t h a t c a l c i t r i o l m o d u l a t e s t h e p r o l i f e r a t i o n o f s e v e r a l d i f f e r e n t c e l l t y p e s t h r o u g h a n u m b e r o f m e c h a n i s m s , i n c l u d i n g m o d u l a t i o n o f g e n e s i n v o l v e d i n c e l l c y c l e r e g u l a t i o n , a l t e r a t i o n s i n g r o w t h f a c t o r s , a n d r e g u l a t i o n o f h o r m o n e s a n d t h e i r r e c e p t o r s , f o r e x a m p l e , a n d r o g e n i n t h e p r o s t a t e g l a n d . E f f e c t s o f V i t a m i n D o n t h e C e l l C y c l e T h e c o n c e p t o f t h e c e l l c y c l e ( F i g u r e 6 - 1 2 ) i s c e n t r a l t o c e l l p r o l i f e r a t i o n . C a l c i t r i o l - i n d u c e d a n t i p r o l i f e r a t i v e a c t i o n i s m e d i a t e d p r e d o m i n a n t l y t h r o u g h a G l / S p h a s e b l o c k o f t h e c e l l c y c l e . T h e r e i s a d e c r e a s e i n t h e n u m b e r o f c e l l s i n t h e S p h a s e a n d a n a c c u m u l a t i o n o f c e l l s i n t h e G 1 p h a s e d u e t o c a l c i t r i o l m o d u l a t i o n o f s e v e r a l c e l l c y c l e r e g u l a t o r y g e n e s a n d r e d u c t i o n s o r i n c r e a s e s i n t h e k i n a s e a c t i v i t i e s o f c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e s ( c d k s ) ( Z h u a n g a n d B u m s t e i n , 1 9 9 8 ; Y l i k o m i e t a l . , 2 0 0 2 ; K r i s h n a n e t a l , 2 0 0 3 ) 1 5 2 V i t a m i n D L c , M / V i t a m i n D D i f f e r e n t i a t i o n F i g u r e 6 - 1 2 : D i a g r a m o f t h e c e l l c y c l e s h o w i n g p o i n t s o f a n t i p r o l i f e r a t i v e a n d d i f f e r e n t i a t i n g a c t i o n s o f v i t a m i n D . T r e a t m e n t w i t h c a l c i t r i o l c a u s e d c e l l s t o a c c u m u l a t e i n t h e G 1 p h a s e o f t h e c e l l c y c l e i n l e u k e m i a c e l l s ( Z h a n g e t a l . , 1 9 9 5 ) , s o m e b r e a s t c a n c e r c e l l s ( S i m b o l i - C a m p b e l l e t a l . , 1 9 9 7 ) , a n d L N C a P p r o s t a t e c a n c e r c e l l s ( Z h u a n g a n d B u m s t e i n , 1 9 9 8 ) . E v e n t h o u g h b o t h a r e g r o w t h i n h i b i t e d u p o n c a l c i t r i o l t r e a t m e n t , n e i t h e r t h e A L V A - 3 1 c e l l s n o r t h e P C 3 c e l l s a c c u m u l a t e i n t h e G 1 p h a s e o f t h e c e l l c y c l e ( Z h u a n g a n d B u m s t e i n , 1 9 9 8 ) , s u g g e s t i n g t h a t c a l c i t r i o l - m e d i a t e d g r o w t h i n h i b i t i o n o f t h e s e c e l l s a c t s t h r o u g h a l t e r n a t i v e p a t h w a y s . C a l c i t r i o l h a s a l s o b e e n s h o w n t o i n h i b i t t h e p r o l i f e r a t i o n o f s e v e r a l o t h e r c e l l t y p e s ( B e m a r d i e t a l . , 2 0 0 2 ; C o n s o l i n i e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n s o m e o f t h e s e c e l l t y p e s w i l l b e d i s c u s s e d i n f u r t h e r d e t a i l b e l o w . A l t h o u g h n o t k n o w n f o r c e r t a i n , s e v e r a l m e c h a n i s m s h a v e b e e n p r o p o s e d f o r v i t a m i n D t o i n d u c e c e l l s t o a c c u m u l a t e i n t h e G 1 p h a s e o f t h e c e l l c y c l e . M u c h o f t h e 1 5 3 d a t a s u g g e s t a r o l e f o r t h e R b p r o t e i n , w h i c h i n h i b i t s c e l l c y c l e p r o g r e s s i o n f r o m t h e G 1 t o S p h a s e . D u r i n g G 1 , R b b i n d s t o a n d s e q u e s t e r s E 2 F , a g e n e r e g u l a t o r y p r o t e i n c r i t i c a l i n c e l l p r o l i f e r a t i o n . T h i s b i n d i n g b l o c k s t h e t r a n s c r i p t i o n o f S p h a s e g e n e s . W h e n t h e c e l l s a r e s t i m u l a t e d t o d i v i d e , R b g e t s p h o s p h o r y l a t e d a n d t h e r e b y b e c o m e s i n a c t i v e . R b t h e n d i s s o c i a t e s f r o m E 2 F a n d t h e c e l l p r o g r e s s e s i n t o S p h a s e . T h e p h o s p h o r y a t i o n o f R h i s r e g u l a t e d b y c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e s ( c d k ) a n d b y t h e i r i n h i b i t o r s , c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r s ( c d k i ) . C y c l i n s a c t i v a t e t h e k i n a s e s a n d a r e , t h e r e f o r e , t h e p r i m a r y r e g u l a t o r s c d k a c t i v i t y . C y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r s a r e p r i m a r y i n h i b i t o r s o f k i n a s e a c t i v i t y . T h i s t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l s y s t e m i n c l u d e s t h e f o l l o w i n g f e e d b a c k l o o p s t h a t s h a r p e n t h e G 1 / S t r a n s i t i o n ( F i g u r e 6 - 1 3 ) : 1 ) t h e l i b e r a t e d E 2 F i n c r e a s e s t h e t r a n s c r i p t i o n o f i t s o w n g e n e , 2 ) R b p h o s p h o r y l a t i o n a n d p r o m o t i o n o f f u r t h e r E 2 F r e l e a s e i s t h e r e s u l t o f E 2 F - d e p e n d e n t t r a n s c r i p t i o n o f G l / S - c y c l i n a n d S - c y c l i n g e n e s t h a t l e a d t o i n c r e a s e d G l / S - c d k a n d S - c d k a c t i v i t i e s . T h e D U - l 4 5 c e l l l i n e , w h i c h d o e s n o t h a v e a f u n c t i o n a l R b , a n d s o m e p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s i m m o r t a l i z e d w i t h S V 4 0 l a r g e T a n t i g e n , w h i c h b l o c k s R b fi m c t i o n , a r e n o t g r o w t h i n h i b i t e d b y c a l c i t r i o l ( B l u t t a n d W e i g e l , 1 9 9 9 ; G r o s s e t a l . , 1 9 9 6 ) . H o w e v e r , t h e P W R - I E c e l l l i n e , w h i c h w a s i m m o r t a l i z e d w i t h S V 4 0 l a r g e T a n t i g e n , d o e s s h o w g r o w t h i n h i b i t i o n w h e n t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l , o t h e r w i s e k n o w n a s v i t a m i n D 3 ( T o k a r , 2 0 0 4 , u n p u b l i s h e d d a t a ) . O t h e r v i t a m i n D m e t a b o l i t e s , i n c l u d i n g 2 5 0 H D 3 , h a v e b e e n s h o w n t o d e c r e a s e p r o l i f e r a t i o n o f c o l o n i c e p i t h e l i a l c e l l s ( H o l t e t a l . , 2 0 0 2 ) a n d p r i m a r y p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s ( B a r r e t o e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t o t h e r f a c t o r s , w o r k i n g a l o n e o r s y n e r g i s t i c a l l y w i t h R b , m a y p l a y a r o l e i n r e g u l a t i n g t h e p r o l i f e r a t i o n o f i m m o r t a l i z e d , n o n - t u m o r i g e n i c p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s a n d p r o s t a t e 1 5 4 I : 1 K C i x ’ a c t i v e R b p o s i t i v e f e e d b a c k r i a l - v p r o t e i n G i I . : < \ a c t i v e E Z F p r Q o t e I n G 1 / S c y c l i n S p h a s e g e n e ( c y c l i n E ) a t t i c - . 9 D N A i i i i i i t r a n s c r i p t i o n ' S - - c y c l i n ' S - C r l l t I S Y N T H E S I S ( c y c l i n A ) i n a c t i v a t e d E Z F p r o t e i n e p o s i t i v e f e e d b a c k i n a c t i v a t e d R b p r o t e i n G 1 I , - , $ 1 ” , F i g u r e 6 - 1 3 : M e c h a n i s m s c o n t r o l l i n g S - p h a s e i n i t i a t i o n . G l - c d k a c t i v i t y i n t i a t e s R b p h o s p h o r y l a t i o n . T h i s i n a c t i v a t e s R b , f r e e i n g E 2 F t o a c t i v a t e t h e t r a n s c r i p t i o n o f S - p h a s e g e n e s , i n c l u d i n g t h e g e n e s f o r a G l / S - c y c l i n a n d S - c y c l i n . T h e r e s u l t i n g a p p e a r a n c e o f G l / S - c d k a n d S - c d k a c t i v i t i e s f u r t h e r e n h a n c e s R b p h o s p h o r y l a t i o n , f o r m i n g a p o s i t i v e f e e d b a c k l o o p . E 2 F a c t s b a c k t o s t i m u l a t e t h e t r a n s c r i p t i o n o f i t s o w n g e n e , f o r m i n g a n o t h e r p o s i t i v e f e e d b a c k l o o p ( A l b e r t s e t a l . , 2 0 0 2 ) . c a n c e r c e l l s . T h e y a l s o s u g g e s t t h a t t h e e f f e c t s o f d i f f e r e n t m e t a b o l i t e s o f v i t a m i n D m a y b e c e l l t y p e s p e c i fi c , w h i c h m a y b e d u e t o t h e l e v e l s a n d / o r a c t i v i t y o f c e r t a i n v i t a m i n D c o n v e r s i o n e n z y m e s i n t h e d i f f e r e n t c e l l t y p e s . B l o c k i n c e l l c y c l e p r o g r e s s i o n a t t h e G 2 / M c h e c k p o i n t i n H L 6 0 h u m a n l e u k e m i a c e l l s , c a u s e d b y c a l c i t r i o l , h a s a l s o b e e n d e m o n s t r a t e d ( G o d y n e t a l . , 1 9 9 4 ) b u t t h e r e a r e f e w o t h e r e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f v i t a m i n D a t t h i s c h e c k p o i n t i n t h e c e l l c y c l e . T h e b l o c k i n g o f c e l l c y c l e p r o g r e s s i o n a t t h e G l / S c h e c k p o i n t i s k n o w n t o b e a s s o c i a t e d w i t h t h e a l t e r a t i o n o f p r o t e i n l e v e l s o r k i n a s e a c t i v i t y o f d i f f e r e n t c d k s . A d e c r e a s e i n c d k 2 a c t i v i t y i n L N C a P c e l l s a n d a d e c r e a s e c d k 2 a n d c d k 6 a c t i v i t i e s h a s b e e n s h o w n i n H L 6 0 c e l l s ( W a n g , e t a l . , 1 9 9 7 ; Z h u a n g a n d B u m s t e i n , 1 9 9 8 ) . T r e a t m e n t 1 5 5 o f M C F - 7 b r e a s t c a n c e r c e l l s w i t h c a l c i t r i o l c a u s e d a d e r e g u l a t i o n o f c d k 2 a n d c d k 4 w i t h i n 2 4 h o u r s o f i n i t i a l t r e a t m e n t . A f t e r 7 d a y s o f t r e a t m e n t , g r o w t h i n h i b i t i o n o f t h e M C F - 7 c e l l s w a s a p p r o x i m a t e l y 1 0 % o f c o n t r o l ( J e n s e n e t a l . . 2 0 0 1 ) . I t w a s p r o p o s e d t h a t t h i s g r o w t h i n h i b i t i o n o f t h e M C F - 7 c e l l s m a y b e d u e , i n p a r t , t o a n i n c r e a s e i n t h e e x p r e s s i o n o f p 2 1 , a c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r ( c d k i ) . S i n c e a v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) r e s p o n s e e l e m e n t h a s b e e n i d e n t i fi e d i n t h e p 2 1 p r o m o t e r , t h i s i n c r e a s e o f t h e p 2 1 t r a n s c r i p t i s p r o b a b l y a V D R - d e p e n d e n t m e c h a n i s m ( J e n s e n e t a l . , 2 0 0 1 ) . C d k i n h i b i t o r s ( c d k i ) a c t a s n e g a t i v e r e g u l a t o r s o f c e l l g r o w t h b y c a u s i n g c e l l s t o b e a r r e s t e d i n G 1 a n d w i t h d r a w f r o m t h e c e l l c y c l e . S e v e r a l o f t h e s e g e n e s h a v e b e e n f o u n d t o b e c a l c i t r i o l - r e g u l a t e d ( F r e e d m a n , 1 9 9 9 ) . O n e o f t h e k e y r e g u l a t o r y p r o t e i n s i n t h e c e l l c y c l e , p 2 7 , h a s b e e n s h o w n t o i n h i b i t R b p h o s p h o r y l a t i o n a n d a r r e s t c e l l s i n G 1 b y s u p p r e s s i n g t h e a c t i v i t y o f s e v e r a l c y c l i n / c d k c o m p l e x e s ( L i u e t a l . , 2 0 0 2 ; W a n g e t a l . , 1 9 9 6 ) . C a l c i t r i o l h a s b e e n s h o w n t o u p - r e g u l a t e p 2 7 i n s e v e r a l h u m a n c a n c e r c e l l l i n e s . A n o t h e r c d k i , p 2 1 , i s a l s o u p - r e g u l a t e d b y c a l c i t r i o l i n m a n y h u m a n c a n c e r c e l l s ( W u e t a l . , 1 9 9 7 ; S e o l e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h e i n c r e a s e d a c t i v i t y o f t h i s c d k i a l s o l e a d s t o a c c u m u l a t i o n o f c e l l s i n t h e G 1 p h a s e o f t h e c e l l c y c l e . T h e c - m y c p r o t o - o n c o g e n e i s a c e l l - c y c l e - r e l a t e d p r o t e i n t h a t i s r e g u l a t e d b y c a l c i t r i o l . I t h a s b e e n s h o w n t o e n h a n c e c d k a c t i v i t y v i a i n a c t i v a t i o n o f p 2 1 a n d p 2 7 ( Y l i k o m i e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h e r e i s a l s o e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t t h e e f f e c t o f c a l c i t r i o l o n p 2 1 m a y b e s e c o n d a r y t o a n e f f e c t o n t r a n s f o r m i n g g r t h f a c t o r 1 3 1 ( T G F - B l ) ( O s b o r n e a n d H u t c h i n s o n , 2 0 0 2 ) . P o l e k e t a l . ( 2 0 0 3 ) e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f p 5 3 o n t h e c a l c i t r i o l - i n d u c e d c e l l c y c l e a r r e s t o f t h r e e d i f f e r e n t p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s , P C - 3 , L N C a P , a n d L N - 5 6 , w h i c h w a s d e r i v e d f r o m L N C a P c e l l s . P C - 3 a n d L N - 5 6 c e l l l i n e s l a c k a fi i n c t i o n a l p 5 3 g e n e . U p o n 1 5 6 t r e a t m e n t w i t h c a l c i t r i o l , p 5 3 i s r e q u i r e d f o r a r r e s t o f L N C a P c e l l s i n t h e G 0 , a n d n o t i n t h e G 1 p h a s e o f t h e c e l l c y c l e . I t w a s a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t , e v e n t h o u g h c a l c i t r i o l t r e a t m e n t r e s u l t e d i n g r o w t h i n h i b i t i o n o f P C - 3 a n d L N - 5 6 c e l l s , t h e c e l l c y c l e a r r e s t w a s m u c h s h o r t e r t h a n t h a t s e e n i n L N C a P c e l l s a n d i t w a s n o t d u e t o t h e p 5 3 t u m o r s u p p r e s s o r g e n e . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e l o n g - l a s t i n g e f f e c t o f c a l c i t r i o l i n t h e L N C a P c e l l s m a y r e s u l t f r o m c e l l s e x i t i n g t h e c e l l c y c l e r a t h e r t h a n s i m p l y b e i n g h a l t e d , o r a r r e s t e d , i n t h e G 1 p h a s e . T h i s i s p r o b a b l y d u e t o t h e l a c k o f a f u n c t i o n a l p 5 3 i n t h e P C - 3 a n d L N - 5 6 c e l l l i n e s . T o m y k n o w l e d g e , a s u b s t a n t i a l a m o u n t o f w o r k h a s n o t b e e n d o n e t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f v i t a m i n D t r e a t m e n t o n t h e p 5 3 t u m o r s u p p r e s s o r g e n e o r i t s a b i l i t y t o r e g u l a t e c e l l p r o l i f e r a t i o n . A d d i t i o n a l w o r k w i l l u n d o u b t e d l y e l u c i d a t e t h e m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f v i t a m i n D o n t h e p 5 3 g e n e a n d i t s c o n t r o l o f t h e c e l l c y c l e . A s u m m a r y o f t h e f a c t o r s , i n t h e c e l l c y c l e , r e g u l a t e d b y v i t a m i n D i s s h o w n i n F i g u r e 6 - 1 4 . E f f e c t s o f V i t a m i n D o n G r o w t h F a c t o r s G r o w t h f a c t o r s a n d h o r m o n e s a r e i m p o r t a n t f a c t o r s i n r e g u l a t i n g g r o w t h i n n o r m a l c e l l s . T h e e x p r e s s i o n a n d a c t i v i t y o f t h e s e p r o t e i n s a r e o f t e n d i s t u r b e d i n c a n c e r c e l l s , w h i c h l e a d t o t h e f u r t h e r p r o m o t i o n o f t h e m a l i g n a n t p r o c e s s . N o r m a l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r s a r e a c t i v a t e d b y g r t h f a c t o r b i n d i n g , u p o n w h i c h t h e y s i g n a l t h e c e l l t o d i v i d e . H o w e v e r , g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r s o f s o m e c a n c e r c e l l s a r e a c t i v e e v e n i n t h e a b s e n c e o f g r o w t h f a c t o r b i n d i n g . T h i s a l l o w s c a n c e r c e l l s t o c o n t i n u o u s l y s i g n a l c e l l s t o p r o l i f e r a t e . 1 5 7 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 P 1 6 P 1 5 P 2 7 P 2 c y c l i n D - C D K 4 / 6 C y c l i n E - C D K 2 R b — > P I E Z F 1 G 1 > S F i g u r e 6 - 1 4 : T h e G l / S c h e c k p o i n t o f t h e c e l l c y c l e a n d t h e e f f e c t o f c a l c i t r i o l . C a l c i t r i o l r e g u l a t e s s e v e r a l p r o t e i n s s u c h a s c y c l i n s , c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e s ( c d k s ) , a n d c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r s ( c d k i ) , t h a t a r e i n v o l v e d i n t h e t h e G l / S t r a n s i t i o n , e s p e c i a l l y i n t h e p h o s p h o r y l a t i o n ( P ) o f r e t i n o b l a s t o m a ( R b ) . A r r o w s s h o w a c t i v a t i o n o r u p r e g u l a t i o n . B l u n t - e n d e d l i n e s r e p r e s e n t i n h i b i t i o n o r d o w n r e g u l a t i o n ( O s b o r n e a n d H u t c h i n s o n , 2 0 0 2 ) G r o w t h f a c t o r s , a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e s i n c e l l p r o l i f e r a t i o n i n c l u d e e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) , i n s u l i n - l i k e g r t h f a c t o r ( I G F ) , fi b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) , i n t e r l e u k i n s ( Y l i k o m i e t a l . , 2 0 0 2 ) , a n d k e r a t i n o c y t e g r o w t h f a c t o r ( K G F ) , h a v e b e e n s h o w n t o b e i n h i b i t e d b y c a l c i t r i o l ( F e l d m a n e t a l . , 2 0 0 0 ) . O n t h e o t h e r h a n d , c a l c i t r i o l h a s b e e n s h o w n t o i n d u c e T G F - [ 3 i n s o m e c e l l s . T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - B S ( T G F - B ) a r e a h i g h l y c o n s e r v e d 2 5 k D a d i m e r s w h o s e a c t i v i t i e s i n c l u d e r e g u l a t i o n o f e x t r a c e l l u l a r m a t r i x s y n t h e s i s a n d c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n , e n h a n c i n g p r o l i f e r a t i o n a t t i m e s a n d i n h i b i t i n g 1 5 8 i t a t o t h e r s , a s w e l l a s m o d u l a t i n g n u m e r o u s a c t i v i t i e s o f c e l l s t h a t r e l a t e t o c e l l d i f f e r e n t i a t i o n ( S p o r n a n d R o b e r t s , 1 9 9 0 ) . T h e g r o w t h o f p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s i s i n h i b i t e d b y T G F - B S b o t h i n v i t r o a n d i n v i v a ( D a n i e l p o u r , I 9 9 6 ) . T G F - B e x i s t s i n a t l e a s t fi v e d i f f e r e n t i s o f o r m s , T G F - B S 1 , 2 , 3 ( f o u n d i n m a m m a l s ) a n d 4 a n d 5 ( f o u n d i n b i r d s a n d a m p h i b i a n s , r e s p e c t i v e l y ) ( D a n i e l p o u r , 1 9 9 6 ) . E a c h o f t h e T G F - [ 3 i s o f o r m s e i t h e r u p r e g u l a t e s o r d o w n r e g u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f t h e o t h e r i s o f o r m s ( S p o r n a n d R o b e r t s , 1 9 9 0 ) . T G F - 1 3 i s a p o t e n t i n h i b i t o r o f e p i t h e l i a l c e l l p r o l i f e r a t i o n . A n i n c r e a s e i n T G F - 1 3 1 e x p r e s s i o n w a s a c c o m p a n i e d b y g r o w t h i n h i b i t i o n o f b r e a s t c a n c e r c e l l s t r e a t e d w i t h c a l c i t r i o l ( Y l i k o m i e t a l . , 2 0 0 2 ) . I t i s b e l i e v e d t h a t c a l c i t r i o l e x e r t s i t s e f f e c t s o n t h e s e g r o w t h f a c t o r s b y r e g u l a t i n g m R N A l e v e l s o f t h e i r r e s p e c t i v e b i n d i n g p r o t e i n s ( A g a r w a l e t a l . , 1 9 9 9 ; S p r e n g e r e t a l . , 2 0 0 1 ) . E f f e c t s o f V i t a m i n I D o n A n d r o g e n a n d E s t r o g e n A c t i o n T h e r e i s a s u b s t a n t i a l e v i d e n c e t o s u g g e s t a p o t e n t i a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n a n d r o g e n s a n d r e s p o n s e t o c a l c i t r i o l . A n d r o g e n s , s u c h a s t e s t o s t e r o n e a n d S c i - d i h y d r o t e s t o s t e r o n e ( D H T ) , a c t b y b i n d i n g t o t h e a n d r o g e n r e c e p t o r . T h e a n d r o g e n r e c e p t o r m e d i a t e s t h e a c t i o n o f t h e s e h o r m o n e s . B e c a u s e o f t h e i m p o r t a n c e o f a n d r o g e n s i n p r o s t a t e c a n c e r , i t i s i m p o r t a n t t o e l u c i d a t e a n y i n t e r a c t i o n s b e t w e e n a n d r o g e n s a n d c a l c i t r i o l i n n o r m a l a n d m a l i g n a n t p r o s t a t e c e l l s . C a l c i t r i o l h a s b e e n s h o w n t o i n h i b i t p r o s t a t e c a n c e r c e l l g r o w t h b y b o t h a n d r o g e n - d e p e n d e n t a n d a n d r o g e n - i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s . Z h a o e t a l . ( 2 0 0 0 ) e x a m i n e d t h e i n t e r a c t i o n s o f c a l c i t r i o l a n d D H T o n t h r e e h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s l i n e s , L N C a P a n d M D A P C a 2 a a n d M D A P C a 2 b . T h e g r o w t h i n h i b i t o r y e f f e c t o f c a l c i t r i o l w a s b l o c k e d b y C a s o d e x , a p u r e a n t i - a n d r o g e n , i n 1 5 9 _ J 1 t h e L N C a P c e l l s . H o w e v e r , C a s o d e x d i d n o t b l o c k t h e a n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l i n e i t h e r o f t h e M D A c e l l l i n e s . T h e d i f f e r e n c e s c o u l d b e d u e t o t h e f a c t t h a t t h e M D A c e l l l i n e s h a v e l o w a f fi n i t y a n d r o g e n r e c e p t o r s ( A R s ) d u e t o m u t a t i o n s , i n c o n t r a s t t o t h e L N C a P c e l l l i n e . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t c a l c i t r i o l a c t s t o i n h i b i t p r o s t a t e c a n c e r c e l l g r o w t h b y a n d r o g e n - d e p e n d e n t m e c h a n i s m s a n d a n d r o g e n - i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s i n t h e L N C a P a n d M D A c e l l l i n e s , r e s p e c t i v e l y . C a l c i t r i o l h a s a l s o b e e n s h o w n t o i n h i b i t t h e g r o w t h o f b r e a s t c a n c e r c e l l s t h r o u g h a m o d u l a t i o n o f t h e e s t r o g e n r e c e p t o r ( E R ) . I n b r e a s t c a n c e r c e l l s , e s t r o g e n s t i m u l a t e s p r o l i f e r a t i o n t h r o u g h a r e c e p t o r m e d i a t e d p a t h w a y . T r e a t m e n t o f M C F - 7 c e l l s , a e s t r o g e n p o s i t i v e b r e a s t c a n c e r c e l l l i n e , w i t h c a l c i t r i o l c a u s e d a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n E R i n b o t h p r o t e i n a n d m R N A l e v e l s . T h e m e t h o d b y w h i c h c a l c i t r i o l d o w n - r e g u l a t e s t h e g r o w t h o f M C F - 7 b r e a s t c a n c e r c e l l s m a y b e m e d i a t e d t h r o u g h a d o w n - r e g u l a t i o n o f t h e E R . T h i s E R d o w n - r e g u l a t i o n w o u l d , i n t u r n , d e c r e a s e t h e r e s p o n s i v e n e s s o f t h e b r e a s t c a n c e r c e l l s t o t h e g r o w t h s t i m u l a t o r y e f f e c t s o f e s t r o g e n . T h e R o l e o f V i t a m i n D i n D i f f e r e n t i a t i o n A f t e r t h e d i s c o v e r y o f t h e v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) i n t i s s u e s o t h e r t h a n t h e i n t e s t i n e , m a j o r f o c u s o n t h e s t u d y o f v i t a m i n D c e n t e r e d o n i t s e f f e c t s o n c e l l g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n ( H a l l o r a n , 1 9 9 2 ) . I t i s u n c l e a r i f v i t a m i n D - i n d u c e d c e l l d i f f e r e n t i a t i o n i s a c o n s e q u e n c e o f a b l o c k o f c e l l c y c l e p r o g r e s s i o n o r v i c e v e r s a , a n d w h e t h e r o r n o t i t i s e v e n p o s s i b l e t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e t w o p r o c e s s e s . S t u d i e s o n m o s t c e l l l i n e s s u p p o r t t h e i d e a t h a t t h e t w o p r o c e s s e s w o r k t o g e t h e r , w i t h i n h i b i t i o n o f c e l l g r o w t h b e i n g a c c o m p a n i e d b y s t i m u l a t i o n o f c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . H o w e v e r , t h e r e h a v e b e e n a 1 6 0 f e w s t u d i e s t o s u g g e s t t h a t t h e t w o p r o c e s s e s a r e u n c o u p l e d ( R a n s e n e t a l . , 2 0 0 1 ) . I t i s d i f fi c u l t t o m e a s u r e d i f f e r e n t i a t i o n i n i n v i t r o e x p e r i m e n t s , b u t a l t e r a t i o n s i n t h e e x p r e s s i o n o f s p e c i fi c m o l e c u l a r , b i o c h e m i c a l , a n d m o r p h o l o g i c a l m a r k e r s a r e a n i n d i c a t i o n t h a t c e l l s h a v e r e a c h e d a m a t u r e p h e n o t y p e . G o o d e x a m p l e s o f s u c h m a r k e r s a r e p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) i n p r o s t a t e c e l l s a n d C D 1 1 b , C D 1 4 , a n d C D 1 8 s u r f a c e a n t i g e n s i n l e u k e m i a c e l l s . P r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) i s o f t e n u s e d a s a d i f f e r e n t i a t i o n m a r k e r b e c a u s e i t s s e c r e t i o n i s c h a r a c t e r i s t i c o f m a t u r e p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . T r e a t m e n t o f L N C a P p r o s t a t e c a n c e r c e l l s w i t h c a l c i t r i o l r e s u l t e d i n a n i n c r e a s e i n t h e s y n t h e s i s o f P S A , w h i c h s u g g e s t s t h a t c a l c i t r i o l m a y c a u s e d i f f e r e n t i a t i o n i n p r o s t a t e c e l l s ( B l u t t a n d W e i g e l , 1 9 9 9 ) . T r e a t m e n t o f h u m a n l e u k e m i a c e l l s w i t h c a l c i t r i o l c a u s e d a s i g n i fi c a n t u p r e g u l a t i o n o f s e v e r a l m a r k e r s t h a t i n d i c a t e d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e s e c e l l s ( R a n s e n e t a l . , 2 0 0 1 ) . V i t a m i n D t r e a t m e n t h a s a l s o b e e n s h o w n t o c a u s e d i f f e r e n t i a t i o n i n s e v e r a l o t h e r t y p e s o f c a n c e r c e l l s , i n c l u d i n g b r e a s t , c o l o n , a n d h u m a n s q u a m o u s c a r c i n o m a c e l l s ( R a n s e n e t a l . , 2 0 0 1 ) T h e s e d a t a d e m o n s t r a t e t h a t v i t a m i n D p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n i n d u c i n g c e l l d i f f e r e n t i a t i o n i n s e v e r a l c a n c e r c e l l t y p e s . T h i s h a s l e d t o t h e e x a m i n a t i o n o f t h e r o l e o f v i t a m i n D o n t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f n o r m a l c e l l t y p e s . T h e r e s t o f t h i s p a p e r w i l l d i s c u s s t h e e f f e c t s o f v i t a m i n D o n t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f n o r m a l c e l l t y p e s . P r o s t a t e E p i t h e l i a l C e l l D i f f e r e n t i a t i o n M u c h a t t e n t i o n i s g i v e n t o t h e p r o s t a t e d u e t o g r t h d i s o r d e r s t h a t o c c u r i n t h i s g l a n d i n m e n . D u e t o i t s d e p e n d e n c e o n a c o n t i n u o u s s u p p l y o f a n d r o g e n s , t h e n o r m a l p r o s t a t e h a s b e e n a f r e q u e n t l y s t u d i e d m o d e l f o r a n d r o g e n - r e l a t e d g e n e e x p r e s s i o n a n d g r o w t h . T h e p r o s t a t e r e q u i r e s a n d r o g e n s f o r d e v e l o p m e n t , g r o w t h , d i f f e r e n t i a t i o n , a n d 1 6 1 m a i n t e n a n c e o f s e c r e t o r y f u n c t i o n ( D a v i e s a n d E a t o n , 1 9 9 1 ) . T h e r e m a y b e s e v e r a l c e l l t y p e s i n t h e n o r m a l p r o s t a t e s h o w i n g d i f f e r e n t r e s p o n s e s t o a n d r o g e n , i n c l u d i n g c e l l s t h a t r e q u i r e a n d r o g e n s f o r s u r v i v a l ; c e l l s t h a t c a n s u r v i v e w i t h o u t a n d r o g e n b u t g r o w m o r e r a p i d l y i n i t s p r e s e n c e ; c e l l s i n d i r e c t l y d e p e n d e n t o n a n d r o g e n ; a n d c e l l s t o t a l l y i n d e p e n d e n t o f a n d r o g e n ( D a v i e s a n d E a t o n , 1 9 9 1 ) . S e v e r a l g r o w t h f a c t o r s s u c h a s E G F , F G F , a n d T G F - B a r e a l s o i n v o l v e d i n t h e n o r m a l a n d a b n o r m a l g r o w t h o f t h e p r o s t a t e . V i t a m i n D h a s b e e n s h o w n t o h a v e a r e g u l a t o r y e f f e c t o n t h e p r o s t a t e . S c h w a r t z a n d H u l k a ( 1 9 9 0 ) fi r s t i d e n t i fi e d a p o t e n t i a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p r o s t a t e c a n c e r a n d c a l c i t r i o l , a fi n d i n g t h a t w a s f u r t h e r d e v e l o p e d w h e n a c o n n e c t i o n w a s f o u n d b e t w e e n u l t r a v i o l e t l i g h t a n d p r o s t a t e c a n c e r m o r t a l i t y i n t h e U n i t e d S t a t e s ( H a n c h e t t e a n d S c h w a r t z , 1 9 9 2 ) . N o r m a l p r o s t a t e e p i t h e l i a l a n d s t r o m a l c e l l s i n c u l t u r e a s w e l l a s p r o s t a t e c e l l l i n e s h a v e b e e n f o u n d t o e x p r e s s v i t a m i n D r e c e p t o r s ( V D R ) ( M i l l e r e t a l . , 1 9 9 2 ; S k o w r o n s k i e t a l . , 1 9 9 3 ; P e e h l e t a l . , 1 9 9 4 a ) . T h e s e fi n d i n g s a r e i m p o r t a n t f o r t h e f o l l o w i n g r e a s o n s : 1 ) V D R m u s t b e e x p r e s s e d i n t a r g e t t i s s u e s i n o r d e r f o r v i t a m i n D t o e x e r t i t s e f f e c t s , a n d 2 ) v i t a m i n D c a n i n d u c e d i f f e r e n t i a t i o n o f p r o s t a t e c e l l s , w h i c h c o u l d p o s s i b l y i n h i b i t t h e f o r m a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . I n c r e a s i n g d a t a s u g g e s t a r o l e f o r v i t a m i n D i n p r o s t a t e c a n c e r p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t , b u t l i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e r o l e o f t h e h o r m o n e i n n o r m a l c e l l s . B e c a u s e v i t a m i n D m a y p l a y a r o l e i n t h e e t i o l o g y o f p r o s t a t e c a n c e r , K r i l l e t a 1 . ( 1 9 9 9 ) d e s i g n e d a s t u d y t o t e s t t h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n n o r m a l p r i m a r y p r o s t a t e e p i t h e l i a l a n d s t r o m a l c e l l s i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f d i h y d r o t e s t o s t e r o n e ( D H T ) , t h e a c t i v e f o r m o f a n d r o g e n i n t h e p r o s t a t e , i n a c h e m i c a l l y d e fi n e d m e d i u m . T r e a t m e n t o f e p i t h e l i a l c e l l s i n c u l t u r e w i t h D H T a l o n e d i d n o t a f f e c t c e l l p r o l i f e r a t i o n . T r e a t m e n t o f e p i t h e l i a l c e l l s 1 6 2 i n c u l t u r e w i t h c a l c i t r i o l a l o n e r e d u c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n t o 6 0 % o f c o n t r o l s ; t h i s i n h i b i t i o n w a s m a i n t a i n e d i n t h e p r e s e n c e o f D H T . T h e s e r e s u l t s d i f f e r f r o m t h o s e o f Z h a o e t a l . ( 1 9 9 7 ) w h o s a w a s y n e r g i s t i c r e d u c t i o n i n p r o l i f e r a t i o n o f L N C a P c e l l s u p o n t h e c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t w i t h c a l c i t r i o l a n d D H T . T h e d i f f e r e n c e i n r e s u l t s c o u l d b e d u e t o t h e p r e s e n c e o f s e r u m f a c t o r s i n t h e Z h a o e t a l . ( 1 9 9 7 ) s t u d y . T r e a t m e n t o f s t r o m a l c e l l s w i t h c a l c i t r i o l h a d t h e o p p o s i t e e f f e c t , t h e s e c e l l s s h o w e d i n c r e a s e d p r o l i f e r a t i o n ( K r i l l e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h i s e f f e c t m a y b e d u e t o t h e u s e o f c h e m i c a l l y d e fi n e d m e d i u m . T h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f g r o w t h f a c t o r s i n t h e b a s e m e d i a h a v e b e e n s h o w n t o a f f e c t t h e c o m p o s i t i o n o f t h e s t r o m a l c e l l p o p u l a t i o n . G r o w t h f a c t o r s h a v e a l s o b e e n c o r r e l a t e d w i t h V D R a b u n d a n c e a n d c e l l p r o l i f e r a t i o n ( K r i s h n a n a n d F e l d m a n , 1 9 9 1 ) . V D R e x p r e s s i o n a n d c e l l p r o l i f e r a t i o n w e r e s t i m u l a t e d i n t h e p r e s e n c e o f g r o w t h f a c t o r s a n d s e r u m w a s r e p o r t e d t o e x e r t a m a x i m a l e f f e c t s i n c e i n c o n t a i n s a m i x t u r e o f g r o w t h f a c t o r s . C a s t r a t e d S p r a g u e - D a w l e y r a t s w e r e t r e a t e d w i t h c a l c i t r i o l i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f fl u t a m i d e , a n a n d r o g e n r e c e p t o r b l o c k e r , t o t e s t t h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n p r o s t a t e g r o w t h i n v i v o . T h e p r o s t a t i c w e i g h t o f t h e s e r a t s i n c r e a s e d w i t h t h e a d m i n i s t r a t i o n o f c a l c i t r i o l a n d i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i t r i o l p l u s fl u t a m i d e . T h i s i n c r e a s e i n w e i g h t w a s d u e t o a n i n c r e a s e i n s t r o m a l c e l l n u m b e r s i n t h e p r o s t a t e . T h i s r e p o r t b y K r i l l e t a l . ( 1 9 9 9 ) s h o w s t h a t c a l c i t r i o l h a s d i f f e r e n t i a l e f f e c t s o n p r o s t a t e s t r o m a l a n d e p i t h e l i a l c e l l s t h a t d o n o t a p p e a r t o b e a n d r o g e n r e c e p t o r - m e d i a t e d . A s i m i l a r s t u d y w a s c o n d u c t e d b y K o n e t y e t a 1 . ( 1 9 9 6 ) w h e r e b o t h c a s t r a t e d a n d u n c a s t r a t e d S p r a g u e - D a w l e y r a t s w e r e t r e a t e d w i t h c a l c i t r i o l , t e s t o s t e r o n e , o r a c o m b i n a t i o n o f b o t h h o r m o n e s . A g r e a t e r d e g r e e o f c e l l u l a r d i f f e r e n t i a t i o n w a s o b s e r v e d 1 6 3 i n r a t s t h a t r e c e i v e d t r e a t m e n t w i t h b o t h h o r m o n e s c o m p a r e d t o r a t s t h a t r e c e i v e d t e s t o s t e r o n e t r e a t m e n t a l o n e . T h e s e r e s u l t s s h o w t h a t c o n c o m i t a n t t r e a t m e n t w i t h c a l c i t r i o l a n d t e s t o s t e r o n e m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e n o r m a l r a t p r o s t a t e . B e c a u s e s i m i l a r e f f e c t s a r e n o t s e e n i n t h e s e m i n a l v e s i c l e , a n o t h e r s e x a c c e s s o r y t i s s u e , K o n e t y e t a l . , ( 1 9 9 6 ) b e l i e v e t h a t t h e p r o d i f f e r e n t i a t i n g e f f e c t s o f v i t a m i n D m a y b e r e s t r i c t e d t o t h e p r o s t a t e . F u t u r e s t u d i e s n e e d t o b e p e r f o r m e d t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l t r e a t m e n t o n a n d r o g e n r e c e p t o r s . W h i l e t h e r e i s a l a r g e a m o u n t o f i n f o r m a t i o n o f t h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n n o r m a l a n d m a l i g n a n t p r o s t a t e c e l l s , f e w s t u d i e s h a v e b e e n p e r f o r m e d t o t e s t t h e e f f e c t s o f t h e h o r m o n e o n t h e d e v e l o p i n g p r o s t a t e . A d m i n i s t r a t i o n o f c a l c i t r i o l i n u t e r a c a n i n fl u e n c e p r o s t a t e d i f f e r e n t i a t i o n t h r o u g h o u t t h e l i f e o f t h e a n i m a l ( K o n e t y e t a l . , 1 9 9 9 ) . B y f o c u s i n g o n t h e e a r l y s t a g e s , n e o n a t a l a n d p r e p u b e r t a l , o f p r o s t a t e d e v e l o p m e n t , K o n e t y e t a l . ( 2 0 0 0 ) e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n t h e n o r m a l p r o s t a t e i n v i t r o a n d i n v i v a . T h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n g r o w t h o f 2 6 7 B - l , a n o r m a l h u m a n n e o n a t a l p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l l i n e , w e r e t e s t e d i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f D H T . T h e i r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e a d m i n i s t r a t i o n o f c a l c i t r i o l j u s t b e f o r e p u b e r t y d o e s n o t h a v e a s i g n i fi c a n t e f f e c t o n p r o s t a t i c g r o w t h i n t h e p r e s e n c e o f D H T , a n d h a s a n i n h i b i t o r y e f f e c t o n n e o n a t a l e p i t h e l i a l c e l l g r o w t h i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f D H T . S e v e r a l g r o w t h f a c t o r s p l a y a r o l e i n t h e e f f e c t s o f v i t a m i n D o n c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . D a n i e l p o u r ( 1 9 9 6 ) s t u d i e d t h e r o l e o f T G F - B o n t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s o f a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d ( A T R A ) o r c a l c i t r i o l i n N R P — 1 5 2 c e l l l i n e d e r i v e d f r o m a r a t p r o s t a t e . T h i s s t u d y s h o w s t h a t A T R A o r c a l c i t r i o l b o t h i n d u c e d T G F - B S 2 a n d 3 . T h e s e r e s u l t s s h o w t h a t t h e T G F - B S p l a y a m a j o r r o l e a s l o c a l m e d i a t o r s o f t h e e f f e c t s o f A T R A 1 6 4 a n d c a l c i t r i o l o n d i f f e r e n t i a t i o n o f p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s . T h e s e s t u d i e s w e r e c a r r i e d o u t o n r a t p r o s t a t e c e l l m o d e l s , t h e r e f o r e , i t i s i m p o r t a n t t o e x p l o r e s i m i l a r e f f e c t s o n h u m a n p r o s t a t e c e l l s i n o r d e r t o h a v e a r e l i a b l e c e l l s y s t e m t h a t w o u l d m i m i c i n v i v a s t u d i e s i n h u m a n s . K e r a t i n o c y t e D i f f e r e n t i a t i o n T h e o b s e r v a t i o n m a d e b y H o s o m i e t a l . ( 1 9 8 3 ) , p r o v i n g t h a t k e r a t i n o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n i s i n d u c e d b y c a l c i t r i o l , p r o v i d e d a n e x p l a n a t i o n f o r t h e p r e s e n c e o f V D R r e c e p t o r s i n t h e s k i n . C a l c i t r i o l i s p r o d u c e d f r o m 2 5 0 H D 3 i n c u l t u r e d h u m a n k e r a t i n o c y t e s , w h i c h c o r r e l a t e s w i t h e a r l y e v e n t s i n d i f f e r e n t i a t i o n , s u c h a s t r a n s g l u t a m i n a s e a c t i v i t y . T h e t r a n s g l u t a m i n a s e e n z y m e i s r e s p o n s i b l e f o r t h e c r o s s - l i n k i n g o f p r o t e i n s i n t h e c o r n i fi e d e n v e l o p e a n d t h e p r e c u r s o r p r o t e i n s , i n v o l u c r i n a n d l o r i c r i n . . C a l c i t r i o l - i n d u c e d t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n o f c u l t u r e d h u m a n k e r a t i n o c y t e s i s a l s o r e d u c e d b y i n s u l i n a n d e n h a n c e d b y e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) ( C h e n e t a l . , 1 9 9 5 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t E G F - s p e c i fi c p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e c a t a l y z e s t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f V D R , r e s u l t i n g i n a m o r e s t a b l e a n d / o r m o r e a c t i v e V D R . T h i s w o u l d e x p l a i n t h e e n h a n c e d a n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t o f c a l c i t r i o l i n t h e p r e s e n c e o f E G F . P h o s p h o r y l a t i o n o f V D R h a s b e e n s u g g e s t e d a s a p r i m a r y e v e n t i n c a l c i t r i o l a c t i o n s ( B r o w n a n d D e L u c a , 1 9 9 0 ) . T h e p r o - d i f f e r e n t i a t i n g a c t i o n s o f c a l c i t r i o l a r e a n t a g o n i s t i c a l l y a l t e r e d b y A T R A i n h u m a n k e r a t i n o c y t e s ( G i b s o n e t a l . , 1 9 9 8 ) . C a l c i t r i o l a n d A T R A b o t h h a d a n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s o n n o r m a l h u m a n k e r a t i n o c y t e s . H o w e v e r , w h e n A T R A a n d c a l c i t r i o l w e r e a d d e d t o g e t h e r , t h e i r a n t i p r o l i f e r a t i v e a c t i o n s w e r e p a r t i a l l y r e v e r s e d ( G i b s o n e t a l . , 1 9 9 8 ) . P o t e n t i a l e x p l a n a t i o n s f o r t h i s e f f e c t a r e : l ) t h e c o m p e t i t i o n 1 6 5 b e t w e e n V D R a n d R A R f o r R X R h e t e r o d i m e r i z a t i o n o r 2 ) i n h i b i t i o n b y A T R A o f c a l c i t r i o l b i n d i n g t o V D R . C o n v e r s e l y , d i f f e r e n t i a t i o n o f k e r a t i n o c y t e s c a n r e g u l a t e c a l c i t r i o l p r o d u c t i o n ( B i k l e a n d P i l l a i , 1 9 9 3 ) . W i t h a d e q u a t e a m o u n t s o f c a l c i u m , k e r a t i n o c y t e s c a n g o f r o m a c e l l t h a t i s r a p i d l y p r o l i f e r a t i n g t o o n e t h a t i s c a p a b l e o f m a k i n g c o r n i fi e d e n v e l o p e s . T h e c o r n i fi e d e n v e l o p e s , o n e o f t h e m o s t d i s t i n c t i v e f e a t u r e s o f e p i d e r m a l t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n , a r e f o r m e d f r o m t h e c r o s s - l i n k i n g o f i n v o l u c r i n a n d l o r i c r i n b y t r a n s g l u t a m i n a s e . S u c c e s s i v e i n c r e a s e s i n c o r n i fi e d e n v e l o p e s , i n v o l u c r i n , a n d t r a n s g l u t a m i n a s e c o r r e s p o n d t o a n i n c r e a s e i n d i f f e r e n t i a t i o n . T w o m a i n e n z y m e s t h a t r e g u l a t e c a l c i t r i o l p r o d u c t i o n , 2 5 0 H D 3 - 1 - h y d r o x y l a s e a n d 2 5 0 H D 3 - 2 4 - h y d r o x y l a s e , b o t h f o u n d m a i n l y i n t h e k i d n e y , a l s o c h a n g e w i t h d i f f e r e n t i a t i o n ( B i k l e a n d P i l l a i , 1 9 9 3 ) . T h i s p r o c e s s c o n s i s t s o f t h e f o l l o w i n g c a s c a d e o f e v e n t s : 1 ) a r i s e i n t h e 2 5 0 H D 3 - 1 - h y d r o x y l a s e a c t i v i t y i s f o l l o w e d b y a r i s e i n t r a n s g l u t a m i n a s e a c t i v i t y , 2 ) c o r n i fi e d e n v e l o p e s a p p e a r a s t h e l - h y d r o x y l a s e a n d t r a n s g l u t a m i n a s e a c t i v i t i e s f a l l , a n d 3 ) t h e a p p e a r a n c e o f c o r n i fi e d e n v e l o p e s a n d f a l l i n l - h y d r o x y l a s e a c t i v i t y c o r r e s p o n d s w i t h a r i s e i n 2 4 - h y d r o x y l a s e a c t i v i t y . T h i s 2 4 - h y d r o x y l a s e a c t i v i t y b l o c k s t h e f o r m a t i o n o f t h e c a l c i t r i o l m e t a b o l i t e . ‘ S e v e r a l s t u d i e s h a v e b e e n p e r f o r m e d t o t e s t t h e e f f e c t s o f v i t a m i n D a n d i t s m e t a b o l i t e s o n k e r a t i n o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n . I t i n e t a l . ( 1 9 9 4 ) e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f h u m a n k e r a t i n o c y t e s g r o w n i n s e r u m - f r e e o r d e fi n e d c u l t u r e m e d i u m . T h e i r r e s u l t s s h o w e d a n e n h a n c e m e n t o f d i f f e r e n t i a t i o n w h e n c e l l s w e r e g r o w n i n t h e p r e s e n c e o f h i g h c a l c i u m a n d t r e a t e d w i t h c a l c i t r i o l a t d o s e s h i g h e r t h a n 1 6 6 p h y s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s ( 1 0 ’ 9 M ) . D o s e s l o w e r t h a n 1 0 ' 9 M e n h a n c e d t h e p r o l i f e r a t i o n r a t e o f t h e k e r a t i n o c y t e s . T h e p r o d u c t i o n o f c a l c i t r i o l a n d i t s r e c e p t o r - b i n d i n g a f fi n i t y i n h u m a n k e r a t i n o c y t e s v a r i e s b a s e d o n t h e i r l e v e l i n d i f f e r e n t i a t i o n . P i l l a i e t a l . ( 1 9 8 8 ) d e m o n s t r a t e d t h a t p r e - c o n fl u e n t a n d c o n fl u e n t c e l l s c o n t a i n e d h i g h e r n u m b e r s o f V D R s t h a n p o s t - c o n fl u e n t c e l l s a n d t h a t t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f t h e s e r e c e p t o r s w a s n o t c o n s i s t e n t l y a l t e r e d b y d i f f e r e n t i a t i o n . T h e n u m b e r o f r e c e p t o r s a p p e a r s t o f a l l a s t h e c e l l s d i f f e r e n t i a t e . S i n c e c a l c i t r i o l i s a p o t e n t s t i m u l a t o r o f d i f f e r e n t i a t i o n i n t h e e p i d e r m i s , t h e s e d a t a s u g g e s t t h e p o s s i b i l i t y t h a t e n d o g e n o u s c a l c i t r i o l p r o d u c t i o n m a y p a r t i c i p a t e a t e a r l y s t a g e s o f k e r a t i n o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n i n c u l t u r e a n d i n v i v a . T h e s e p r o d i f f e r e n t i a t i n g a c t i o n s o f c a l c i t r i o l h a v e l e d t o t h e t r e a t m e n t o f t h e h y p e r p r o l i f e r a t i v e s k i n d i s e a s e , p s o r i a s i s , a s w e l l a s i t s u s e i n t h e p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f s e v e r a l c a n c e r t y p e s . B o n e C e l l D i f f e r e n t i a t i o n T h e s k e l e t a l s y s t e m i n t h e b o d y p r o v i d e s s t r u c t u r a l a n d m e c h a n i c a l s u p p o r t , p r o t e c t i o n o f v i t a l o r g a n s , a n d s e r v e s a s a r e s e r v o i r f o r c a l c i u m a n d p h o s p h a t e i o n s ( L i a n e t a l . , 1 9 9 9 ) . V i t a m i n D p l a y s a k e y r o l e i n t h e h o m e o s t a s i s o f c a l c i u m a n d p h o s p h o r u s i n t h e b l o o d . D u r i n g p e r i o d s o f r e d u c e d s e r m n c a l c i u m l e v e l s , c a l c i u m t r a n s p o r t i s s t i m u l a t e d a c r o s s t h e g u t a n d i n t o t h e b l o o d s t r e a m a n d c a l c i u m i s m o b i l i z e d f r o m t h e b o n e b y v i t a m i n D a c t i n g o n s e v e r a l c e l l t y p e s f o u n d i n t h e b o n e . O s t e o b l a s t s ( F i g u r e 6 - 1 5 A ) , b o n e - f o r m i n g c e l l s , a n d o s t e o c l a s t s ( F i g u r e 6 - I S B ) , o r c e l l s t h a t r e s o r b b o n e , a r e b o t h i n d u c e d b y v i t a m i n D t o u n d e r g o d i f f e r e n t i a t i o n ( F i g u r e 6 - 1 6 ) b y 1 6 7 F i g u r e 6 - 1 5 : ( A ) P h o t o m i c r o g r a p h s h o w i n g o s t e o b l a s t s , t h e l a r g e r c e l l s o n t h e s u r f a c e o f t h e b o n e t i s s u e . ( B ) P h o t o m i c r o g r a p h o f b o n e t i s s u e s h o w i n g t w o o s t e o c l a s t s , t h e l a r g e c e l l s i n t h e c e n t e r o f t h e fi g u r e ( R o s s e t a l . , 1 9 9 5 a ) . M o u n c l r y m a l H e m o p o l e t l c s t e m c e l l s t e m c e l l 7 o n l t o r p 0 ' _ I t e m i n D o e t e o c l a s t p r o g e n l t o r l ‘ ‘ r ‘ > N 1 P r e o a t e o b l a e t \ \ ’ 7 ’ G ) \ i o e t e o c l e e t L o c a l f a c t o r s @ P r o c u n o r Z c o u p l i n g \ 1 F l e l e a e e r l w f a c t o r s M l n o r a l l z e d m a I r I x F i g u r e 6 - 1 6 : S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e r o l e o f v i t a m i n D i n d e v e l o p m e n t o f t h e b o n e c e l l t y p e s a n d r e g u l a t i o n o f b o n e r e m o d e l i n g ( L i a n e t a l . , 1 9 9 9 ) . 1 6 8 m o d u l a t i o n o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t i e s o f s e v e r a l g e n e s r e l a t e d t o b o n e c e l l p h e n o t y p e . S e v e r a l s t u d i e s h a v e s h o w n a n i n t e r a c t i o n b e t w e e n v i t a m i n D - i n d u c e d b o n e c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a n d T G F - B . S i n c e T G F - B s i g n a l s t h r o u g h t h e S m a d f a m i l y o f i n t r a c e l l u l a r t r a n s d u c i n g p r o t e i n s , S m a d s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h i s i n t e r a c t i o n . S m a d s a r e a f a m i l y o f t r a n s c r i p t i o n a l c o - m o d u l a t o r s t h a t i n t e r a c t w i t h s e v e r a l d i f f e r e n t D N A - b i n d i n g p r o t e i n s t o r e g u l a t e t h e i r a c t i v i t y i n r e s p o n s e t o T G F - 1 3 ( W r a n a , 2 0 0 0 ) . S m a d s a r e d i v i d e d i n t o t h r e e c l a s s e s : 1 ) t h e r e c e p t o r - r e g u l a t e d S m a d s ( w h i c h i n t e r a c t w i t h T G F - B ) , 2 ) t h e c o m m o n S m a d s , a n d 3 ) i n h i b i t o r y S m a d s , e a c h o f w h i c h h a s a d i s t i n c t f u n c t i o n ( W r a n a , 2 0 0 0 ) . A r e c e n t s t u d y s h o w e d t h a t i n o r d e r f o r V D R a n d S m a d 3 t o m e d i a t e c r o s s - t a l k b e t w e e n c a l c i t r i o l a n d T G F - B b o t h p r o t e i n s h a d t o b i n d t h e i r r e s p e c t i v e D N A r e c o g n i t i o n e l e m e n t s . A l o n g w i t h T G F - B , b o n e m o r p h o g e n e t i c p r o t e i n s ( B M P s ) , a r e p o t e n t r e g u l a t o r s o f o s t e o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n , a c r u c i a l p r o c e s s i n b o n e r e m o d e l i n g ( E i c h n e r e t ‘ a l . , 2 0 0 2 ) . B o t h T G F - B l a n d B M P 7 h a v e b e e n s h o w n t o m o d u l a t e , i n o p p o s i t e w a y s , t h e d i f f e r e n t i a t i o n c a p a b i l i t i e s o f c a l c i t r i o l o n o s t e o b l a s t s . T G F - B l h a d a s t i m u l a t i n g a n d B M P 7 h a d a i n h i b i t o r y e f f e c t o n c a l c i t r i o l - i n d u c e d o s t e o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n . T h i s s t u d y i s a g o o d e x a m p l e o f c r o s s - t a l k b e t w e e n d i f f e r e n t s i g n a l i n g p a t h w a y s a n d e m p h a s i z e s t h e n e e d f o r e v a l u a t i o n o f t h e c o m p a t i b i l i t y o f T G F - B L , B M P 7 - , a n d c a l c i t r i o l - b a s e d t h e r a p i e s ( E i c h n e r e t a l . , 2 0 0 2 ) . V e r y l i t t l e i s k n o w n a b o u t h o w d i f f e r e n t i a t i o n o f b o n e m a r r o w s t r o m a l c e l l s i s r e g u l a t e d b y h o r m o n e s a n d g r o w t h f a c t o r s . I t i s b e l i e v e d t h a t t h e s e c e l l s p l a y a m a j o r r o l e i n b o n e f o r m a t i o n a s a s o u r c e o f o s t e o p r o g e n i t o r c e l l s ( L i u e t a l . , 1 9 9 9 ) . L i u e t a l . 1 6 9 ( 1 9 9 9 ) e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f c o n c o m i t a n t t r e a t m e n t o f s e c o n d a r y c u l t u r e s o f h u m a n b o n e m a r r o w s t r o m a l c e l l s w i t h T G F - B a n d c a l c i t r i o l . T h e y o b s e r v e d a s y n e r g i s t i c a l l y e n h a n c e d e x p r e s s i o n o f a l k a l i n e p h o s p h a t a s e , a u s e f u l m a r k e r o f a c t i v e b o n e f o r m a t i o n . N o s y n e r g i s t i c e f f e c t w a s s e e n w i t h c o m b i n a t i o n s o f c a l c i t r i o l a n d o t h e r g r o w t h f a c t o r s , s u c h a s , B M P - 2 , i n s u l i n l i k e g r o w t h f a c t o r - I ( I G F - I ) , o r b a s i c fi b r o b l a s t g r t h f a c t o r . T h i s s u g g e s t s t h a t t h i s a c t i o n i s s p e c i fi c f o r T G F - B . T h e t r e a t m e n t o f b o n e m a r r o w s t r o m a l c e l l s w i t h c a l c i t r i o l a n d T G F - [ 3 h a d a n i n h i b i t o r y e f f e c t o n c e l l p r o l i f e r a t i o n . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t t h e c o n c o m i t a n t t r e a t m e n t o f h u m a n b o n e m a r r o w s t r o m a l c e l l s w i t h T G F - B a n d c a l c i t r i o l e n h a n c e s t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e s e c e l l s t o t h e o s t e o b l a s t l i n e a g e . T h e r e i s a l s o e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t h o r m o n e s h a v e d i f f e r e n t e f f e c t s o n o s t e o b l a s t s b a s e d o n t h e i r s t a g e o f p h e n o t y p e d e v e l o p m e n t ( P o c k w i n s e e t a l . , 1 9 9 5 ) . F e t a l r a t c a l v a r i a - d e r i v e d o s t e o b l a s t s i n i n s i t u h y b r i d i z a t i o n e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e d t h e s e l e c t i v e i n fl u e n c e s o f c a l c i t r i o l a n d g l u c o c o r t i c o i d s o n s u b s e t s o f c e l l s t h a t r e s u l t f r o m o s t e o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n . B a s e d o n t h e u p r e g u l a t i o n o f o s t e o p o n t i n a n d o s t e o c a l c i n , t w o g e n e s t h a t a r e h i g h l y u p r e g u l a t e d d u r i n g b o n e m i n e r a l i z a t i o n ( P o c k w i n s e e t a l . , 1 9 9 5 ) , t h e s e h o r m o n a l e f f e c t s a r e c l e a r l y o s t e o b l a s t d e v e l o p m e n t s t a g e - s p e c i fi c . C a r t i l a g e i s a f o r m o f c o n n e c t i v e t i s s u e t h a t i s m a d e u p o f c h o n d r o c y t e s a n d a s p e c i a l i z e d e x t r a c e l l u l a r m a t r i x , w h i c h i s p r o d u c e d a n d m a i n t a i n e d b y t h e c h o n d r o c y t e s ( F i g u r e 6 - 1 7 ) . C h o n d r o c y t e s t h a t a r e a c t i v e i n m a t r i x p r o d u c t i o n s e c r e t e c o l l a g e n , g l y c o s a m i n o g l y c a n s , a n d p r o t e o g l y c a n s ( R o s s e t a l . , 1 9 9 5 b ) . T h e t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n 1 7 0 L . . l ’ . . . 2 . . . . F i g u r e 6 - 1 7 : P h o t o m i c r o g r a p h o f y o u n g , g r o w i n g c a r t i l a g e . C e l l s a r e c h o n d r o c y t e s . A r r o w s r e p r e s e n t a r e a s o f G o l g i a p p a r a t u s . H & E s t a i n i n g . ( R o s s e t a l . , 1 9 9 5 b ) . o f c h o n d r o c y t e s t h a t w e r e t r e a t e d w i t h a s c o r b i c a c i d w a s r e c e n t l y e x a m i n e d . A s c o r b i c a c i d w a s s h o w n t o p r o m o t e c h o n d r o c y t e m a t r i x p r o d u c t i o n a n d u p r e g u l a t e V D R n u m b e r s i n p r o l i f e r a t i n g a n d h y p e r t r o p h i c c h o n d r o c y t e s i n v i t r o . A n e l e v a t i o n i n p l a s m a c a l c i t r i o l l e v e l s i n c h i c k s f e d a n a s c o r b i c a c i d - s u p p l e m e n t e d d i e t w a s a l s o o b s e r v e d ( F a r q u h a r s o n e t a l . , 1 9 9 8 ) . S i m i l a r l y , C a n t o r e a n d c o l l e a g u e s ( 1 9 9 1 ) d e m o n s t r a t e d t h a t d i e t a r y s u p p l e m e n t a t i o n w i t h a s c o r b i c a c i d r e s u l t e d i n e l e v a t e d p l a s m a c a l c i t r i o l l e v e l s i n h u m a n s . A s c o r b i c a c i d i s c e n t r a l t o h y d r o x y l a t i o n r e a c t i o n s i n s e v e r a l b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s , i n c l u d i n g c a r n i t i n e a n d n o r e p i n e p h r i n e b i o s y n t h e s i s ( L e v i n e , 1 9 8 6 ) a n d m a y a l s o e n h a n c e h y d r o x y l a t i o n r e a c t i o n s i n v i t a m i n D s y n t h e s i s ( S e r g e e v e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h i s 1 7 1 c o u l d b e a n e x p l a n a t i o n f o r t h e o b s e r v e d e l e v a t i o n s i n p l a s m a c a l c i t r i o l . T h e s e r e s u l t s s h o w t h a t a s c o r b i c a c i d p l a y s a r o l e i n c h o n d r o c y t e m a t r i x p r o d u c t i o n a n d i n t h e m e t a b o l i s m o f v i t a m i n D a n d t h e u p r e g u l a t i o n o f i t s r e c e p t o r . B o t h o f t h e s e o b s e r v a t i o n s a r e i m p o r t a n t b e c a u s e t h e y b o t h c a n l e a d t o c h o n d r o c y t e t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n . M a m m a r y G l a n d D i f f e r e n t i a t i o n M a m m a r y g l a n d d e v e l o p m e n t u n d e r g o e s c o n s i d e r a b l e d u c t a l e l o n g a t i o n a n d b r a n c h i n g d u r i n g t h e p r e p u b e r t a l p e r i o d . S t i m u l a t i o n o f d u c t a l e l o n g a t i o n a n d b r a n c h i n g a r e d i r e c t e d b y e s t r o g e n a n d p r o g e s t e r o n e , r e s p e c t i v e l y , w h i c h a r e t h e m a j o r p r o l i f e r a t i v e h o r m o n e s d r i v i n g m a m m a r y g l a n d d e v e l o p m e n t . C a l c i t r i o l a n d i t s r e c e p t o r , V D R , h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n c e l l c y c l e r e g u l a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f c u l t u r e d m a m m a r y c e l l s , b u t l i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e i r r o l e i n t h e d e v e l o p i n g m a m m a r y g l a n d ( Z i n s e r e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t t h e v i t a m i n D 3 s i g n a l i n g p a t h w a y p l a y s a r o l e i n i n h i b i t i n g t h e g r o w t h b y c o n t r o l l i n g d i f f e r e n t i a t i o n a n d p r o l i f e r a t i o n o f e p i t h e l i a l c e l l s o f t h e m a m m a r y g l a n d ( N a r v a e z e t a l . , 2 0 0 1 ; Z i n s e r e t a l . , 2 0 0 2 ) . H e m a t o p o i e t i c D i f f e r e n t i a t i o n T h e d i f f e r e n t i a t i o n o f m a c r o p h a g e p r e c u r s o r c e l l s , o r m o n o c y t e s , b y v i t a m i n D i s o n e o f t h e e a r l i e s t f u n c t i o n a l r e s p o n s e s l i n k i n g t h e v i t a m i n D t o t h e i m m u n e s y s t e m ( H e w i s o n a n d O ’ R i o r d a n , 1 9 9 7 ) . S e v e r a l s t u d i e s o n b o t h m o u s e a n d h u m a n l e u k e m i c a n d m o n o c y t i c c e l l l i n e s h a v e s h o w n t h a t c a l c i t r i o l t r e a t m e n t s t i m u l a t e d m o n o c y t i c d i f f e r e n t i a t i o n t o w a r d s a m o r e m a t u r e , m a c r o p h a g e - l i k e p h e n o t y p e ( H e w i s o n a n d O ’ R i o r d a n , 1 9 9 7 ) . T h e s e i n v e s t i g a t i o n s r e v e a l e d i m p o r t a n t a s p e c t s o f h o r m o n a l c o n t r o l o f h e m a t o p o i e s i s ( F i g u r e 6 - 1 8 ) . V i t a m i n D h a s a l s o b e e n s h o w n t o i n d u c e t h e 1 7 2 / O P l u r i p o t e n t s t e m c e l l L y m p h o i d M y e l o i d s t e m c e l l s t e m c e l l ® ' ° 0 , e C T - c e l l B - c e l l P l a t e l e t E r y t h r o c y t e G r a n u l o c y t ® M o n o c y t c N e u t r o p h i l P l u r i p o t e n t s t e m c e l l — — > . . . P l a t e l e t O O . _ _ ' > . E “ H E r y t h m c y t e — _ é : % G r a n u l o c y t c O O G é l v i o n o c y t e O N e u t r o p h i l O — > C T - c e l l O — _ _ > Q B - c e l l F i g u r e 6 - 1 8 : S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f ( A ) c o n v e n t i o n a l a n d ( B ) s e q u e n t i a l m o d e l s o f h e m a t o p o i e s i s . T h e c o n v e n t i o n m o d e l h i g h l i g h t s t h e c o m m i t m e n t o f s t e m c e l l s t o e i t h e r l y m p h o i d o r m y e l o i d l i n e a g e f o l l o w e d b y f u r t h e r d i f f e r e n t i a t i o n t o a s p e c i fi c c e l l t y p e . T h e s e q u e n t i a l m o d e l p r o p o s e s t h a t t h e r e i s a p r e f e r r e d o r d e r t o t h e d e v e l o p m e n t o f i m m u n e c e l l s . S u c c e s s fi i l m a t u r a t i o n t o w a r d a p a r t i c u l a r l i n e a g e i s d e p e n d e n t o n a v a r i e t y o f s i g n a l s . T h e i n fl u e n c e o f c a l c i t r i o l i n d i f f e r e n t i a t i o n o n m o n o c y t e s i s i n d i c a t e d a n d c o n t r a s t s w i t h t h e i n d u c t i o n o f n e u t r o p h i l s b y r e t i n o i d s . V i t a m i n D 3 p a t h w a y s i n r e d b o x e s ( m o d i fi e d f r o m H e w i s o n a n d O ’ R i o r d a n , 1 9 9 7 ) . 1 7 3 d i f f e r e n t i a t i o n o f n o r m a l b o n e m a r r o w c e l l s i n t o m o n o c y t e s a n d m a c r o p h a g e s ( O ’ K e l l y e t a l . , 2 0 0 2 a n d P 0 1 5 e t a l . , 1 9 9 0 ) . D i f f e r e n t i a t i o n o f O t h e r C e l l T y p e s D e n t a l m o r p h o g e n e s i s a n d f o r m a t i o n i n v o l v e s a s e q u e n c e o f c e l l - c e l l a n d c e l l - m a t r i x i n t e r a c t i o n s t h a t i s v e r y s i m i l a r t o t h a t o f e p i t h e l i o - m e s e n c h y m a l o r g a n d e v e l o p m e n t . T h e s e i n t e r a c t i o n s l e a d t o : l ) m o r p h o g e n e s i s o f t e e t h ; 2 ) d i f f e r e n t i a t i o n o f a m e l o b l a s t , o d o n t o b l a s t , a n d c e m e n t o b l a s t l i n e a g e s ; a n d 3 ) m a t r i x s e c r e t i o n a n d m i n e r a l i z a t i o n ( B e r d a l , 1 9 9 7 ) . P r o g r e s s i o n o f d e n t a l m o r p h o g e n e s i s a n d d i f f e r e n t i a t i o n r e s u l t f r o m s e q u e n t i a l a n d r e c i p r o c a l c o m m u n i c a t i o n b e t w e e n c e l l s o f t h e e p i t h e l i u m a n d m e s e n c h y m e . T h e s e c e l l s a l s o f o l l o w p r o g r a m m e d c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n . V i t a m i n D h a s a l s o b e e n s h o w n t o p l a y a r o l e i n t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e i n t e r f o l l i c u l a r e p i d e r m i s a n d h a i r f o l l i c l e s w h i c h a p p e a r t o r e q u i r e t h e v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) f o r n o r m a l d i f f e r e n t i a t i o n . A l a c k o f t h e V D R r e s u l t s i n a r e d u c t i o n o f e p i d e r m a l d i f f e r e n t i a t i o n ( X i e e t a l . , 2 0 0 2 ) . C o n c l u s i o n s D i f f e r e n t i a t i o n i s t h e m o d i fi c a t i o n o f c e l l s t h a t l e a d s t o t h e i r s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l s p e c i a l i z a t i o n . D i f f e r e n t i a t i o n o c c u r s t h r o u g h o u t t h e l i f e o f a n o r g a n i s m , f r o m e m b r y o g e n e s i s t o a d u l t h o o d . D i f f e r e n t i a t e d c e l l t y p e s a r e f o u n d i n a l l a n i m a l s . E x c e p t i n v e r y r a r e c a s e s , o n c e a c e l l h a s d i f f e r e n t i a t e d i t w i l l n o l o n g e r e x p r e s s a d d i t i o n a l f u n c t i o n s a n d i t s t r a n s c r i p t i o n p a t t e r n s a r e l o c k e d d o w n . S i n c e d a u g h t e r c e l l s c o n t a i n t h e s a m e g e n e t i c m a k e - u p a s t h e p a r e n t c e l l , d i f f e r e n t i a t i o n i s n o t a r e s u l t o f t h e l o s s o f g e n e s , b u t r a t h e r f r o m t h e d i f f e r e n t i a l a c t i v a t i o n a n d / o r s u p p r e s s i o n o f g e n e s . 1 7 4 T h e r e a r e s e v e r a l a g e n t s t h a t c o n t r i b u t e t o t h e f u n c t i o n a l m o d i fi c a t i o n o f t h e g e n e s i n a c e l l . O n e t h a t h a s g a i n e d a g r e a t d e a l o f i n t e r e s t i n r e c e n t y e a r s i s v i t a m i n D . V i t a m i n D i s b e s t k n o w n f o r i t s r o l e i n m a i n t a i n i n g c a l c i u m a n d p h o s p h o r u s h o m e o s t a s i s i n t h e b o d y . B u t i t c a n a l s o w o r k a l o n e o r i n c o n c e r t w i t h o t h e r a g e n t s , s u c h a s , g r o w t h f a c t o r s , c y t o k i n e s , a n d c o m p o n e n t s o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x t o i n d u c e t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f c e l l t y p e s s u c h a s p r o s t a t e c e l l s , k e r a t i n o c y t e s , e p i t h e l i a l a n d e p i d e r m a l c e l l s , h e m a t o p o i e t i c a n d b o n e m a r r o w c e l l s , a n d c e l l s o f t h e m a m m a r y g l a n d s . C o n s i d e r a b l e a m o u n t o f w o r k i s c r u r e n t l y i n p r o g r e s s t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f v i t a m i n D o n c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . T h e s e a n d p a s t s t u d i e s s h o w m u c h p r o m i s e f o r t h e p r o d i f f e r e n t i a t i n g a c t i o n o f v i t a m i n D a n d i t s m e t a b o l i t e s i n t h e t r e a t m e n t o f h y p e r p r o l i f e r a t i v e d i s e a s e s a n d i n t h e p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f c a n c e r . M u c h m o r e w o r k n e e d s t o b e d o n e w i t h v i t a m i n D b e f o r e w e c a n f u l l y u n d e r s t a n d i t s m e c h a n i s m s o f a c t i o n i n t h e p r o c e s s o f c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . 1 7 5 F R e f e r e n c e s A g a r w a l , C . , L a m b e r t , A , C h a n d r a r a t n a , R . A . S . , R o r k e , E . A . , a n d E c k e r t , R . L . : V i t a m i n D r e g u l a t e s h u m a n e c t o c e r v i c a l e p i t h e l i a l c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r - b i n d i n g p r o t e i n - 3 l e v e l s . B i o l . R e p r o d . , 6 0 : 5 6 7 - 5 7 2 , 1 9 9 9 . A l b e r t i , 1 . , B a r b o r o , P . , B a r b e s i n o , M . , S a n n a , P . , P i s c i o t t a , L . , P a r o d i , S . , N i c o l o , G . , B o c c a r d o , F . , G a l l i , S . , P a t r o n e , E . , a n d B a l b i , C . : C h a n g e s i n t h e e x p r e s s i o n o f c y t o k e r a t i n s a n d n u c l e a r m a t r i x p r o t e i n s a r e c o r r e l a t e d w i t h t h e l e v e l o f d i f f e r e n t i a t i o n i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r . J . C e l l B i o c h e m . , 7 9 : 4 7 1 - 4 8 5 , 2 0 0 0 . A l b e r t s , B . , J o h n s o n , A . , L e w i s , J . , R a f f , M . , R o b e r t s , K . , a n d W a l t e r , P . : M o l e c u l a r B i o l o g y o f t h e C e l l . N e w Y o r k , G a r l a n d S c i e n c e , 1 4 6 3 p p . , 2 0 0 2 . A l m o g , N . a n d R o t t e r , V . : I n v o l v e m e n t o f p 5 3 i n c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a n d d e v e l o p m e n t . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 1 3 3 3 : F 1 - F 2 7 , 1 9 9 7 . B a r c e l l o s - H o f f , M . H . , A g g e l e r , J . , R a m , T . G . , a n d B i s s e l , M . J . : F u n c t i o n a l d i f f e r e n t i a t i o n a n d a l v e o l a r m o r p h o g e n e s i s o f p r i m a r y m a m m a r y c u l t u r e s i n r e c o n s t i t u t e d b a s e m e n t m e m b r a n e . D e v e l o p m e n t , 1 0 5 : 2 2 3 - 2 3 5 , 1 9 8 9 . B a r r e t o , A . M . , S c h w a r t z , G . G . , W o o d r u f f , R . , a n d C r a m e r , S . D . : 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 , t h e p r o h o r m o n e o f 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 , i n h i b i t s t h e p r o l i f e r a t i o n o f p r i m a r y p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s . C a n c e r E p i d e m i o l . B i o m a r k . P r e v . , 9 : 2 6 5 - 2 7 0 , 2 0 0 0 . B e r d a l , A . : V i t a m i n D a c t i o n o n t o o t h d e v e l o p m e n t a n d b i o m i n e r a l i z a t i o n . I n : V i t a m i n D . F e l d m a n , D . , G l o r i e u x , F . H . , a n d P i k e , J . W . ( e d s ) , S a n D i e g o , A c a d e m i c P r e s s , p g . 4 2 3 - 4 3 5 , 1 2 8 5 p p . , 1 9 9 7 . B e m a r d i , R . J . , J o h n s o n , C . S . , M o d z e l e w s k i , R . A . , a n d T r u m p , D . L . : A n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s o f 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 a n d v i t a m i n D a n a l o g s o n t u m o r - d e r i v e d e n d o t h e l i a l c e l l s . E n d o c r i n o l o g y , 1 4 3 : 2 5 0 8 - 2 5 1 4 , 2 0 0 2 . B i k l e , D D . a n d P i l l a i , S . : V i t a m i n D , c a l c i u m , a n d e p i d e r m a l d i f f e r e n t i a t i o n . E n d o c r i n e R e v . , 1 4 : 3 - 1 9 , 1 9 9 3 . B l u t t , S E . a n d W e i g e l , N . L . : V i t a m i n D a n d p r o s t a t e c a n c e r . P r o . S o c . E x p . B i o l . M e d . 2 2 1 : 8 9 - 9 8 , 1 9 9 9 . B r o w n , T A . a n d D e L u c a , H . F . : P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 r e c e p t o r , a p r i m a r y e v e n t 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 a c t i o n . J . B i o l . C h e m . , 2 6 5 : 1 0 0 2 5 - 1 0 0 2 9 , 1 9 9 0 . 1 7 6 C a n t o r e , F . P . , L o p e r fi d o , M . C . , M a g l i , D . M . , M a n c i n i , L . , a n d C a r r o z z o , M . : T h e i m p o r t a n c e o f v i t a m i n C i n t h e h y d r o x y l a t i o n o f v i t a m i n D 3 t o 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i n m a n . C l i n . , R h e u m , 1 0 : 1 6 2 - 1 6 7 , 1 9 9 1 . C a p e t a n a k i , Y . G . , N a g a i , J . , a n d L a z a r i d e s , E . : R e g u l a t i o n o f t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s c o d i n g f o r t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s u b u n i t s v i m e n t i n , d e s m i n , a n d g l i a l fi b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n . I n : M o l e c u l a r B i o l o g y o f t h e C y t o s k e l e t o n , B o r i s y , G . G . , C l e v e l a n d , D . W . , M u r p h y , D . B . ( e d s . ) , C o l d S p r i n g H a r b o r , N e w Y o r k , p p . 4 1 5 - 4 3 3 , 1 9 8 4 . C h e n , T . C . , P e r s o n s , K . , L i u , W - W , C h e n , M . L . , a n d H o l i c k , M . F . : T h e a n t i p r o l i f e r a t i v e a n d d i f f e r e n t i a t i v e a c t i v i t i e s o f 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 a r e p o t e n t i a t e d b y e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r a n d a t t e n u a t e d b y i n s u l i n i n c u l t u r e d h u m a n k e r a t i n o c y t e s . J . I n v e s t . D e r m a t o l . , 1 0 4 : 1 1 3 - 1 1 7 , 1 9 9 5 . C o n s o l i n i , R . , P a l a , S . , L e g i t o m o , A . , C r i m a l d i , G . , F e r r a r i , S . , a n d F e r r a r i , S . : E f f e c t s o f v i t a m i n D o n t h e g r o w t h o f n o r m a l a n d m a l i g n a n t B - c e l l p r o g e n i t o r s . C l i n . E x p . I m m u n o l . , 1 2 6 : 2 1 4 - 2 1 9 , 2 0 0 1 . C o o p e r , G . M . : E l e m e n t s o f H u m a n C a n c e r . S u d b u r y , J o n e s a n d B a r t l e t t P u b l i s h e r s , 3 5 4 p p . , 1 9 9 2 . C u h n a , G . R . : G r o w t h f a c t o r s a s m e d i a t o r s o f a n d r o g e n a c t i o n d u r i n g m a l e u r o g e n i t a l d e v e l o p m e n t . T h e P r o s t a t e , 6 : 2 2 - 2 5 , 1 9 9 6 . C u l i g , Z . , H o b i s c h , A . , C r o n a u e r , M . V . , R a d m a y r , C . , H i t t m a i r , A . , Z h a n d , J . , T h u m h e r , M . , B a r t s c h , G . , a n d K l o c k e r , H . : R e g u l a t i o n o f p r o s t a t i c g r o w t h a n d f u n c t i o n b y p e p t i d e g r o w t h f a c t o r s . T h e P r o s t a t e , 2 8 : 3 9 2 - 4 0 5 , 1 9 9 6 . D a n i e l p o u r , D . : I n d u c t i o n o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - [ 3 a u t o c r i n e a c t i v i t y b y a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d a n d 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n N R P - 1 5 2 r a t p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s . J . C e l l . P h y s . , 1 6 6 : 2 3 1 - 2 3 9 , 1 9 9 6 . D a v i d s o n , E . H . : R e g u l a t o r y h a r d w r i t i n g : A b r i e f o v e r v i e w o f t h e g e n o m i c c o n t r o l a p p a r a t u s a n d i t s c a u s a l r o l e i n d e v e l o p m e n t a n d e v o l u t i o n . I n : G e n o m i c r e g u l a t o r y s y s t e m s : d e v e l o p m e n t a n d e v o l u t i o n , S a n D i e g o , A c a d e m i c P r e s s , p g . 2 - 2 3 , 2 6 1 p p . , 2 0 0 1 . D a v i e s , P . a n d E a t o n , C . L . : R e g u l a t i o n o f p r o s t a t e g r o w t h . J . E n d o c r i n o l . 1 3 1 : 5 - 1 7 , 1 9 9 1 . D u s s o , A S . a n d B r o w n , A . J . : M e c h a n i s m o f v i t a m i n D a c t i o n a n d i t s r e g u l a t i o n . A m . J . K i d n e y D i s . , 3 2 : $ 1 3 - $ 2 4 , 1 9 9 8 . 1 7 7 E i c h n e r , A . , B r o c k , J . , H e l d i n , C - H . , a n d S o u c h e l n y t s k y i , 8 . : B o n e m o r p h o g e n e t i c p r o t e i n - 7 ( O P l ) a n d t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r 1 3 1 m o d u l a t e 1 , 2 5 ( O H ) 2 - v i t a m i n D 3 - i n d u c e d d i f f e r e n t i a t i o n o f h u m a n o s t e o b l a s t s . E x p . C e l l R e s . , 2 7 5 : 1 3 2 - 1 4 2 , 2 0 0 2 . F a r q u h a r s o n , C . , B e r r y , J . L . , M a w e r , B . , S e a w r i g h t , E . , a n d W h i t e h e a d , C . C . : A s c o r b i c a c i d - i n d u c e d c h o n d r o c y t e t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n : t h e r o l e o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x a n d 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D . E u r . J . C e l l B i o l . , 7 6 : 1 1 0 - 1 1 8 , 1 9 9 8 . F e l d m a n , D . , Z h a o , X - Y . , K r i s h n a n , A . V . : E d i t o r i a l / M i n i - r e v i e w : V i t a m i n D a n d p r o s t a t e c a n c e r . E n d o c r i n o l o g y , 1 4 1 : 5 - 9 , 2 0 0 0 . F e r r a r i , N . , P f a h l , M . , a n d L e v i , G . : R e t i n o i c a c i d r e c e p t o r y l ( R A R y l ) l e v e l s c o n t r o l R A R B Z e x p r e s s i o n i n S K - N - B E 2 ( c ) n e r u b l a s t o m a c e l l s a n d r e g u l a t e a d i f f e r e n t i a t i o n - a p o p t o s i s s w i t c h . M o l . C e l l . B i o l . , 1 8 : 6 4 8 2 - 6 4 9 2 , 1 9 9 8 . F r a g a , C . H . , T r u e , L . D . , a n d K i r k , D . : E n h a n c e d e x p r e s s i o n o f t h e m e s e n c h y m a l m a r k e r , v i m e n t i n , i n h y p e r p l a s t i c v e r s u s n o r m a l h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i u m . J U r o l . , 1 5 9 : 2 7 0 - 2 7 4 , 1 9 9 8 . F r e e d m a n , L . P . : T r a n s c r i p t i o n a l t a r g e t s o f t h e v i t a m i n D 3 r e c e p t o r - m e d i a t i n g c e l l c y c l e a r r e s t a n d d i f f e r e n t i a t i o n . J . N u t r . , 1 2 9 : 5 8 1 S - 5 8 6 S , 1 9 9 9 . G i b s o n , D . F . , B i k l e , D D , a n d H a r r i s , J . : A l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d b l o c k s t h e a n t i p r o l i f e r a t i v e p r o d i f f e r e n t i a t i n g a c t i o n s o f 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n n o r m a l h u m a n k e r a t i n o c y t e s . J . C e l l . P h y s . , 1 7 4 : 1 - 8 , 1 9 9 8 . G i l l e s , C . , P o l e t t e , M . , P i e t t e , J . , D e l v i g n e , A - C . , T h o m p s o n , E . W . , F o i d a r t , J - M . , a n d B i r e m b a u t , P . : V i m e n t i n e x p r e s s i o n i n c e r v i c a l c a r c i n o m a s : a s s o c i a t i o n w i t h i n v a s i v e a n d m i g r a t o r y p o t e n t i a l . J . P a t h . , 1 8 0 : 1 7 5 - 1 8 0 , 1 9 9 6 . G o d y n , J . J . , X u , H . , Z h a n g , F . , K o l l a , S . , a n d S t u d z i n s k i , G . P . : A d u a l b l o c k t o c e l l c y c l e p r o g r e s s i o n i n H L 6 0 c e l l s e x p o s e d t o a n a l o g u e s o f v i t a m i n D 3 . C e l l P r o l i f . , 2 7 : 3 7 - 4 6 , 1 9 9 4 . G r o s s , C . , S k o w r o n s k i , R . J . , P l y m a t e , S . R . , R h i m , J . S . , P e e h l , D . M . , a n d F e l d m a n , M . : S i m i a n v i r u s 4 0 - , b u t n o t h u m a n p a p i l l o m a v i r u s - , t r a n s f o r m a t i o n o f p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s r e s u l t s i n l o s s o f g r o w t h - i n h i b i t i o n b y 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . I n t . J . O n c o l . , 8 : 4 1 - 4 7 , 1 9 9 6 . H a l l o r a n , B . P . : C e l l u l a r g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n d u r i n g e m b r y o g e n e s i s a n d f e t a l d e v e l o p m e n t . I n : N u t r i e n t r e g u l a t i o n d u r i n g p r e g n a n c y , l a c t a t i o n , a n d i n f a n t g r o w t h . A d v . E x p . M e d . B i o l . , 3 5 2 : 2 2 7 - 2 3 6 , 1 9 9 2 . H a n c h e t t e , M . A . a n d S c h w a r t z , G . G . : G e o g r a p h i c p a t t e r n s o f p r o s t a t e c a n c e r m o r t a l i t y . C a n c e r , 7 0 : 2 8 6 1 - 2 8 6 9 , 1 9 9 2 . 1 7 8 H e w i s o n , M . a n d O ’ R i o r d a n , J . L . H . : I m m u n o m o d u l a t o r y a n d c e l l d i f f e r e n t i a t i o n e f f e c t s o f v i t a m i n D . I n : V i t a m i n D . F e l d m a n , D . , G l o r i e u x , F . H . , a n d P i k e , J . W . ( e d s ) , S a n D i e g o , A c a d e m i c P r e s s , p g . 4 4 7 - 4 6 2 , 1 2 8 5 p p . , 1 9 9 7 . H o l l s t e i n , M . , S i d r a n s k y , D . , V o g e l s t e i n , B . , a n d H a r r i s , C . C . : p 5 3 m u t a t i o n s i n h u m a n c a n c e r s . S c i e n c e , 2 5 3 : 4 9 - 5 3 , 1 9 9 1 . H u d s o n , D . L . , G u y , A . T . , F r y , P . , O ’ H a r e , M . J . , W a t t , F . M . , a n d M a s t e r s , J . R . W . : E p i t h e l i a l c e l l d i f f e r e n t i a t i o n p a t h w a y s i n t h e h u m a n p r o s t a t e : I d e n t i fi c a t i o n o f i n t e r m e d i a t e p h e n o t y p e s b y c y t o k e r a t i n e x p r e s s i o n . J . H i s t o c h e m . C y t o c h e m . , 4 9 : 2 7 1 - 2 7 8 , 2 0 0 1 . I t i n , P . H . , P i t t e l k o w , M . R . , a n d K u m a r , R . : E f f e c t s o f v i t a m i n D m e t a b o l i t e s o n p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f c u l t u r e d h u m a n e p i d e r m a l k e r a t i n o c y t e s g r o w n i n s e r u m - f r e e o r d e fi n e d c u l t u r e m e d i u m . E n d o c r i n o l o g y , 1 3 5 : 1 7 9 3 - 1 7 9 8 , 1 9 9 4 . J e h l e , F . M . , F u s s g a e n g e r , R . D . , B l u m , W . F . , A n g e l u s , N . K . O . , H o e fl i c h , A , W o l f , E . , a n d J u n g w i r t h , R . J . : D i f f e r e n t i a l a u t o c r i n e r e g u l a t i o n o f i n t e s t i n a l e p i t h e l i a l c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d i f f e r e n t i a t i o n b y i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r ( I G F ) s y s t e m c o m p o n e n t s . H o r m . M e t a b . R e s . , 3 1 : 9 7 - 1 0 2 , 1 9 9 9 . J e n s e n , S . S . , M a d s e n , M . W . , L u k a s , J . , B i n d e r u p , L . , a n d B a r t e k , J . : I n h i b i t o r y e f f e c t s o f 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 o n t h e G l - S p h a s e - c o n t r o l l i n g m a c h i n e r y . M o l . E n d o c r i n o l . , 1 5 : 1 3 7 0 - 1 3 8 0 , 2 0 0 1 . K o n e t y , B . R . , L e m a n , E . , V i e t r n e i e r , B . , A r l o t t i , J . , D h i r , R . , a n d G e t z e n b e r g , R . H . : I n v i t r o a n d i n v i v o e f f e c t s o f v i t a m i n D ( c a l c i t r i o l ) a d m i n i s t r a t i o n o n t h e n e o n a t a l a n d p r e p u b e r t a l p r o s t a t e . J . U r o l . , 1 6 4 : 1 8 1 2 - 1 8 1 8 , 2 0 0 0 . K o n e t y , B . R . , N a n g i a , A . K . , N g u y e n , T . S . , T h o m a s , A . , a n d G e t z e n b e r g , R . H . : E f f e c t o f p r e n a t a l v i t a m i n D ( c a l c i t r i o l ) e x p o s u r e o n t h e g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o f t h e p r o s t a t e . T h e P r o s t a t e , 4 1 : 1 8 1 - 1 8 9 , 1 9 9 9 . K o n e t y , B . R . , S c h w a r t z , G . G . , A c i e m o , J . S . , B e c i c h , M . J . , a n d G e t z e n b e r g , R . H . : T h e r o l e o f v i t a m i n D i n n o r m a l a n d p r o s t a t e g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n . C e l l G r o w t h D i f f . , 7 : 1 5 6 3 - 1 5 7 0 , 1 9 9 6 . K r i l l , D . , S t o n e r , J . , K o n e t y , B . R . , B e c i c h , M . J . , a n d G e t z e n b e r g , R . H . : D i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f v i t a m i n D o n n o r m a l h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l a n d s t r o m a l c e l l s i n p r i m a r y c u l t u r e . U r o l o g y , 5 4 : 1 7 1 - 1 7 7 , 1 9 9 9 . K r i s h n a n , A . V . a n d F e l d m a n , D . : S t i m u l a t i o n o f 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 r e c e p t o r g e n e e x p r e s s i o n i n c u l t u r e d c e l l b y s e r u m a n d g r o w t h f a c t o r s . J . B o n e M i n e r . R e s . , 1 0 : 1 0 9 9 - 1 1 0 7 , 1 9 9 1 . 1 7 9 K r i s h n a n , A . V . , P e e h l , D . M . , a n d F e l d m a n , D . : I n h i b i t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r g r o w t h b y v i t a m i n D : r e g u l a t i o n o f t a r g e t g e n e e x p r e s s i o n . J . C e l l . B i o c h e m . , 8 8 : 3 6 3 - 3 7 1 , 2 0 0 3 . L a n g , S . H . , S h a r r a r d , R . M . , V i l l e t t e , J . M . , a n d M a i t l a n d , N . J . : P r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l l i n e s f o r m s p h e r o i d s w i t h e v i d e n c e o f g l a n d u l a r d i f f e r e n t i a t i o n i n t h r e e - d i m e n s i o n a l M a t r i g e l c u l t u r e s . B r . J . C a n c e r , 8 5 : 5 9 0 - 5 9 9 , 2 0 0 1 . L a n g , S . H . , H y d e , C . , R e i d , l . N . , H i t c h c o c k , I . S . , H a r t , C . A . , B r y d e n , A . A . , V i l l e t t e , J - M , S t o w e r , M . J . , a n d M a i t l a n d , N . J . : E n h a n c e d e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n i n m o t i l e p r o s t a t e c e l l l i n e s i n p o o r l y d i f f e r e n t i a t e d a n d m e t a s t a t i c p r o s t a t e c a r c i n o m a . T h e P r o s t a t e , 5 2 : 2 5 3 - 2 6 3 , 2 0 0 2 . L e v i n e , M . : N e w c o n c e p t s i n t h e b i o l o g y a n d b i o c h e m i s t r y o f a s c o r b i c a c i d . N e w E n g . J . M e d . , 3 1 4 : 8 9 2 - 9 0 2 , 1 9 8 6 . L i a n , J . B . , S t a a l , A . , v a n W i j n e n , A . , S t e i n , J . L . , a n d S t e i n , G . S . : B i o l o g i c a l a n d m o l e c u l a r e f f e c t o f v i t a m i n D o n b o n e . I n : V i t a m i n D : P h y s i o l o g y , m o l e c u l a r b i o l o g y , a n d c l i n i c a l a p p l i c a t i o n s . H o l i c k , M . F . ( e d . ) , p g . 1 7 5 - 1 9 3 , 4 5 8 p p . , 1 9 9 9 . L i n g , M . T . , C h a n , K . W . , a n d C h o o , C . K . : A n d r o g e n i n d u c e s d i f f e r e n t i a t i o n o f a h u m a n p a p i l l o m a v i r u s 1 6 E 6 / E 7 i m m o r t a l i z e d p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l l i n e . J . E n d o c r i n o l . , 1 7 0 : 2 8 7 - 2 9 6 , 2 0 0 1 . L i u , P . , O y a j o b i , 8 0 . , R u s s e l l , R . G . G . , a n d S c u t t , A . : R e g u l a t i o n o f o s t e o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n o f h u m a n b o n e m a r r o w s t r o m a l c e l l s : I n t e r a c t i o n b e t w e e n t r a n s f o r m i n g g r t h f a c t o r - B a n d 1 , 2 5 ( O H ) 2 v i t a m i n D 3 i n v i t r o . C a l c i f . T i s s u e I n t . , 6 5 : 1 7 3 - 1 8 0 , 1 9 9 9 . L i u , W . , A s a , S . L . , F a n t u s , I . G . , W a l fi s h , P . G . , a n d E z z a t , 8 . : V i t a m i n D a r r e s t s t h y r o i d c a r c i n o m a c e l l g r o w t h a n d i n d u c e s p 2 7 d e p h o s p h o r y l a t i o n a n d a c c u m u l a t i o n t h r o u g h P T E N / A k t - d e p e n d e n t a n d — i n d e p e n d e n t p a t h w a y s . A m . J . P a t h . , 1 6 0 : 5 1 1 - 5 1 9 , 2 0 0 2 . M a i t r e , B . , C l e m e n t , A . , W i l l i a m s , M . C . , a n d B r o d y , J . S . : E x p r e s s i o n o f i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r s 1 a n d 2 i n t h e d e v e l o p i n g l u n g a n d t h e i r r e l a t i o n t o e p i t h e l i a l c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . A m . J . R e s p i r . C e l l M o l . B i o l . , 1 3 : 2 6 2 - 2 7 0 , 1 9 9 5 . M a n f r e d i n i , R . T r e v i s a n , F . , G r a n d e , A . , T a g l i a fi c o , E . , M o n t a n a r i , M . , L e m o l i , R . , V i s a n i , G . , T u r a , 8 . , F e r r a r i , S . , a n d F e r r a r i , 8 . : I n d u c t i o n o f a f u n c t i o n a l v i t a m i n D r e c e p t o r i n a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d - i n d u c e d m o n o c y t i c d i f f e r e n t i a t i o n o f M 2 - t y p e l e u k e m i c b l a s t c e l l s . C a n c e r R e s . , 5 9 : 3 8 0 3 - 3 8 1 1 , 1 9 9 9 . 1 8 0 M i l l e r , G . J . , S t a p l e t o n , G . E . , F e r r a r a , J . A . , L u c i a , M . S . , P fi s t e r , S . , H e d l u n d , T E , a n d U p a d h y a , P . : T h e h u m a n p r o s t a t i c c a r c i n o m a c e l l l i n e L N C a P e x p r e s s e s b i o l o g i c a l l y a c t i v e , s p e c i fi c r e c e p t o r s f o r l a , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . C a n c e r R e s . , 5 2 : 5 1 5 - 5 2 0 , 1 9 9 2 . M o g h a l , N . a n d N e e l , 8 . : I n t e g r a t i o n o f g r o w t h f a c t o r , e x t r a c e l l u l a r m a t r i x , a n d r e t i n o i d s i g n a l s d u r i n g b r o n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . M o l . , C e l l . , B i o l . , 1 8 : 6 6 6 6 - 6 6 7 8 , 1 9 9 8 . M u r a m a t s u , T . : B i o l o g i c a l s y s t e m s . I n : C e l l S u r f a c e a n d D i f f e r e n t i a t i o n , L o n d o n , C h a p m a n a n d H a l l , p g . 1 - 2 0 , 1 5 9 p p . , 1 9 9 0 . N a r v a e z , C . J . , Z i n s e r , G . , a n d W e l s h , J . : F u n c t i o n s o f 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n m a m m a r y g l a n d : f r o m n o r m a l d e v e l o p m e n t t o b r e a s t c a n c e r . S t e r o i d s , 6 6 : 3 0 1 - 3 0 8 , 2 0 0 1 . O ’ K e l l y , J . , H i s a t a k e , J . , H i s a t a k e , Y . , B i s h o p , J . , N o r m a l , A . , a n d K o e f fl e r , H . P . : N o r m a l m y e l o p o i e s i s b u t a b n o r m a l T l y m p h o c y t e r e s p o n s e s i n v i t a m i n D r e c e p t o r k n o c k o u t m i c e . J . C l i n . I n v e s t , 1 0 9 : 1 0 9 1 - 1 0 9 9 , 2 0 0 2 . O s b o r n , M . : V i m e n t i n . I n : G u i d e b o o k t o t h e C y t o s k e l e t a l a n d M o t o r P r o t e i n s , K r e i s , T . a n d V a l e , R . ( e d s ) , O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s , O x f o r d , p p . 1 6 9 - 1 7 1 , 2 7 6 p p . 1 9 9 3 . O s b o r n e , J . E . a n d H u t c h i n s o n , P . E . : V i t a m i n D a n d s y s t e m i c c a n c e r : i s t h i s r e l e v a n t t o m a l i g n a n t m e l a n o m a ? B r . J . D e r m a t o l . , 1 4 7 : 1 9 7 - 2 1 3 , 2 0 0 2 . P a r a m i o , J . M . a n d J o r c a n o , J . L . : B e y o n d s t r u c t u r e : d o i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s m o d u l a t e c e l l s i g n a l i n g ? B i o e s s a y s , 2 4 : 8 3 6 - 8 4 4 , 2 0 0 2 . P a r k s i n s o n K . a n d B a l m a i n , A . : C h a l o n e s r e v i s i t e d — a p o s s i b l e r o l e f o r t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r B i n t u m o u r p r o m o t i o n . C a r c i n o g e n e s i s , 1 1 : 1 9 5 - 1 9 8 , 1 9 9 0 . P e e h l , D . M . , L e u n g , G K , a n d W o n g , S . T . : C y t o k e r a t i n e x p r e s s i o n : a m e a s u r e o f p h e n o t y p i c m o d u l a t i o n o f h u m a n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s b y g r o w t h i n h i b i t o r y f a c t o r s . C e l l T i s s u e R e s . , 2 7 7 : 1 1 - 1 8 , 1 9 9 4 a . P e e h l , D . M . , S k o w r o n s k i , R . J . , L e u n g , G . K . , W o n g , S . T . , S t a m e y , T . A . , a n d F e l d m a n , D . : A n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s o f 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 o n p r i m a r y c u l t u r e s o f h u m a n p r o s t a t i c c e l l s . C a n c e r R e s . , 5 4 : 8 0 5 - 8 1 0 , 1 9 9 4 b . P i l l a i , S . , B i k l e , D D , a n d E l i a s , P . M . : 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D p r o d u c t i o n a n d r e c e p t o r b i n d i n g i n h u m a n k e r a t i n o c y t e s v a r i e s w i t h d i f f e r e n t i a t i o n . J . B i o l . C h e m , 2 6 3 : 5 3 9 0 - 5 3 9 5 . 1 8 1 P o c k w i n s e , S . M . , S t e i n , J . L . , L i a n , J . B . , a n d S t e i n , G . S . : D e v e l o p m e n t a l s t a g e - s p e c i fi c c e l l u l a r r e s p o n s e s t o v i t a m i n D a n d g l u c o c o r t i c o i d s d u r i n g d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e o s t e o b l a s t p h e n o t y p e : I n t e r r e l a t i o n s h i p o f m o r p h o l o g y a n d g e n e e x p r e s s i o n b y i n s i t u h y b r i d i z a t i o n . E x p . C e l l R e s . , 2 1 6 : 2 4 4 - 2 6 0 , 1 9 9 5 . P o l e k , T . C . , S t e w a r t , L . V . , R y u , E . J . , C o h e n , M . B . , A l l e g r e t t o , E . A . , a n d W e i g e l , N . L . : p 5 3 i s r e q u i r e d f o r 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i a m i n D 3 - i n d u c e d G O a r r e s t b u t i s n o t r e q u i r e d f o r G 1 a c c u m u l a t i o n o r a p o p t o s i s o f L N C a P p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . E n d o c r i n o l o g y , 1 4 4 : 5 0 - 6 0 , 2 0 0 3 . P o l s , H . A . P . , B i r k e n h a g e r , J . C . , F o e k e n s , J . A . , a n d v a n L e e u w e n , J . P . T . M . : V i t a m i n D : A m o d u l a t o r o f c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n . J . S t e r o i d B i o c h e m . M o l e c . B i o l . , 3 7 : 8 7 3 - 8 7 6 , 1 9 9 0 . P r a s a d , S . C . , T h r a v e s , P . J . , K u e t t e l , M . R . , S r i n i v a s a r a o , G . Y . , D r i t s c h i l o , A . , a n d S o l d a t e n k o v , V . A . : A p o p t o s i s - a s s o c i a t e d p r o t e o l y s i s o f v i m e n t i n i n h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l t u m o r c e l l s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . , 2 4 9 : 3 3 2 - 3 3 8 , 1 9 9 8 . R a m a e k e r s , F . C . S . , V e r h a g e n , A . P . M . , I s a a c s , J . T . , F e i t z , W . F . J . , M o e s k e r , 0 . , S c h a a r t , G . , S c h a l k e n , J . A . , a n d V o o i j s , G . P . : I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t e x p r e s s i o n a n d t h e p r o g r e s s i o n o f p r o s t a t i c c a n c e r a s s t u d i e d i n t h e d u n n i n g R - 3 3 2 7 r a t p r o s t a t i c c a r c i n o m a s y s t e m . T h e P r o s t a t e , 1 4 : 3 2 3 - 3 3 9 , 1 9 8 9 . R a n s e n , C . M . , B i n d e r u p , L . , H a m b e r g , K . J . , a n d C a r l b e r g , C . : V i t a m i n D a n d c a n c e r : E f f e c t s o f c a l c i t r i o l a n d i t s a n a l o g s o n g r o w t h c o n t r o l a n d t u m o r i g e n e s i s . F r o n t . B i o s c i e n c e , 6 : d 8 2 0 - 8 4 8 , 2 0 0 1 . R o b e r t s , A B . a n d W a k e fi e l d , L . M . : T h e t w o f a c e s o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r 1 3 i n c a r c i n o g e n e s i s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i e n c e , 1 0 0 : 8 6 2 1 - 8 6 2 3 , 2 0 0 3 . R o s s , M . H . , R o m r e l l , L . J . , a n d K a y e , G . I . : B o n e . I n : H i s t o l o g y : a t e x t a n d a t l a s , 3 r d e d . , B a l t i m o r e , W i l l i a m s a n d W i l k i n s , p g . 1 5 0 - 1 8 7 , 8 2 3 p p . , 1 9 9 5 a . R o s s , M . H . , R o m r e l l , L . J . , a n d K a y e , G . I . : C a r t i l a g e . I n : H i s t o l o g y : a t e x t a n d a t l a s , 3 r d e d . , B a l t i m o r e , W i l l i a m s a n d W i l k i n s , p g . 1 3 2 - 1 4 9 , 8 2 3 p p . , 1 9 9 5 b . S a d l e r , T . W . : M e d i c a l e m b r y o l o g y . L i p p i n c o t t , W i l l i a m s , a n d W i l k i n s , P h i l a d e l p h i a , p p . 5 3 - 6 6 , 4 6 0 p p . , 1 9 9 5 . S c h w a r t z , G . G . a n d H u l k a , 8 . 8 . : I s v i t a m i n D d e fi c i e n c y a r i s k f a c t o r f o r p r o s t a t e c a n c e r ( h y p o t h e s i s ) ? A n t i c a n c e r R e s . , 1 0 : 1 3 0 7 - 1 3 1 1 , 1 9 9 0 . S e o l , J . G . , P a r k , W . H . , K i m , E . S . , J u n g , C . W . , B i n d e r u p , L . , K o e f fl e r , H . P . , H i m , B . K . , a n d L e e , Y . Y . : E f f e c t o f a n o v e l v i t a m i n D 3 a n a l o g , E B 1 0 8 9 , o n G 1 c e l l c y c l e r e g u l a t o r y p r o t e i n s i n H L - 6 0 c e l l s . I n t . J . O n c o l . , 1 6 : 3 1 5 - 3 2 0 , 2 0 0 0 . 1 8 2 S e r g e e v , I . N . , A r k h a p c h e v , Y . P . , a n d S p i r i c h e v , V . B . : A s c o r b i c a c i d e f f e c t s o n v i t a m i n D h o r m o n e m e t a b o l i s m a n d b i n d i n g i n g u i n e a p i g s . J . N u t r . , 1 2 0 : 1 1 8 5 - 1 1 9 0 , 1 9 9 0 . S h a r p , R . M . , B e l l o - D e O c a m p o , D . , Q u a d e r , S . T . A . , a n d W e b b e r , M . M . : N - ( 4 h y d r o x y p h e n y l ) r e t i n a m i d e ( 4 - H P R ) d e c r e a s e s n e o p l a s t i c p r o p e r t i e s o f h u m a n p r o s t a t e c e l l s : a n a g e n t f o r p r e v e n t i o n . M u t . R e s . , 4 9 6 : 1 6 3 - 1 7 0 , 2 0 0 1 . S h e r w o o d , E . R . , B e r g , L . A . , M i t c h e l l , N . J . , M c N e a l , J . E . , K o z l o w s k i , J . M . , a n d L e e , C . : D i f f e r e n t i a l c y t o k e r t a i n e x p r e s s i o n i n n o r m a l , h y p e r p l a s t i c a n d m a l i g n a n t e p i t h e l i a l c e l l s f r o m h u m a n p r o s t a t e . J . U r o l . , 1 4 3 : 1 6 7 - 1 7 1 , 1 9 9 0 . S i m b o l i - C a m p b e l l , M . , N a r v a e z , C . J . , V a n W e e l d e n , K . , T e n n i s w o o d , M . , W e l s h , J . : C o m p a r a t i v e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l a n d E B 1 0 8 9 o n c e l l c y c l e k i n e t i c s a n d a p o p t o s i s i n M C F - 7 b r e a s t c a n c e r c e l l s . B r e a s t C a n c e r R e s . T r e a t , 4 2 : 3 1 - 4 1 , 1 9 9 7 . S k o w r o n s k i , R . J . , P e e h l , D . M . , a n d F e l d m a n , D . : V i t a m i n D a n d p r o s t a t e c a n c e r : c a l c i t r i o l r e c e p t o r s a n d a c t i o n i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s . E n d o c r i n o l o g y , 1 3 2 : 1 9 5 2 - 1 9 6 0 , 1 9 9 3 . S p o r n , M . B . , R o b e r t s , A . B . , W a k e fi e l d , L . M . , a n d A s s o i a n , R K . : T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - b : b i o l o g i c a l f u n c t i o n a n d c h e m i c a l s t r u c t u r e . S c i e n c e , 2 3 3 : 5 3 2 - 5 3 4 , 1 9 8 6 . S p o m , M B . a n d R o b e r t s , A . B . : T h e t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - b e t a s : P a s t , p r e s e n t , a n d F u t u r e . A n n . N e w Y o r k A c a d . S c i . , 5 9 3 : 1 - 6 , 1 9 9 0 . S p r e n g e r , C . C . , P e t e r s o n , A , L a n c e , R . , W a r e , J . L . , D r i v d a h l , R H , a n d P l y m a t e , S . R . : R e g u l a t i o n o f p r o l i f e r a t i o n o f p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s b y 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i s a c c o m p a n i e d b y a n i n c r e a s e i n i n s u l i n - l i k e g r t h f a c t o r b i n d i n g p r o t e i n - 3 . J . E n d o c r i n o l . , 1 7 0 : 6 0 9 - 6 1 8 , 2 0 0 1 . T a v e r n a , D . , G r o n e r , B , a n d H y n e s , N . E . : E p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r , p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r , a n d c - e r b B - 2 r e c e p t o r a c t i v a t i o n a l l p r o m o t e g r o w t h b u t h a v e d i s t i n c t i v e e f f e c t s u p o n m o u s e m a m m a r y e p i t h e l i a l c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . C e l l G r o w t h D i f f . , 2 : 1 4 5 - 1 5 4 , 1 9 9 1 . T r a u b , P . : I n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s : a r e v i e w , S p r i n g e r - V e r l a g , N e w Y o r k , p p . 2 - 1 4 4 , 2 6 6 p p . , 1 9 8 5 . W a n g , Q . M . , J o n e s , J . B . , a n d S t u d z i n s k i , G . P . : C y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r p 2 7 a s a m e d i a t o r o f t h e G l - S p h a s e t r a v e r s e i n d u c e d b y c a l c i t r i o l i n H L 6 0 c e l l s . C a n c e r R e s . , 5 7 : 2 8 5 1 - 2 8 5 5 , 1 9 9 7 . W e b b e r , M . M . : P o l y p e p t i d e h o r m o n e s a n d t h e p r o s t a t e . I n : T h e p r o s t a t i c c e l l : S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n . A l a n R L i s s , I n c . , N e w Y o r k , p p . 6 3 - 8 8 , 1 9 8 1 . 1 8 3 W e b b e r , M . M . , B e l l o , D , a n d Q u a d e r , S . : I m m o r t a l i z e d a n d t u m o r i g e n i c a d u l t h u m a n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l l i n e s : c h a r a c t e r i s t i c s a n d a p p l i c a t i o n s P a r t 1 . C e l l m a r k e r s a n d i m m o r t a l i z e d n o n t u m o r i g e n i c c e l l l i n e s . T h e P r o s t a t e , 2 9 : 3 8 6 — 3 9 4 , 1 9 9 6 . W e b b e r , M . M . , B e l l o , D . , K l e i n m a n , H . K . , a n d H o f f m a n , M . P . : A c i n a r d i f f e r e n t i a t i o n b y n o n - m a l i g n a n t i m m o r t a l i z e d h u m a n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s a n d i t s l o s s b y m a l i g n a n t c e l l s . C a r c i n o g e n e s i s , 1 8 : 1 2 2 5 - 1 2 3 1 , 1 9 9 7 . W e b b e r , M . M . , T r a k u l , N . , T h r a v e s , P . S . , B e l l o - D e O c a m p o , D . , C h u , W . W . , S t o r t o , P . D . , H u a r d , T . K . , R h i m , J . S . , a n d W i l l i a m s , D E : A h u m a n p r o s t a t i c s t r o m a l m y o fi b r o b l a s t c e l l l i n e W P M Y - l : a m o d e l f o r s t r o m a l - e p i t h e l i a l i n t e r a c t i o n s i n p r o s t a t i c n e o p l a s i a . C a r c i n o g e n e s i s , 2 0 : 1 1 8 5 - 1 1 9 2 , 1 9 9 9 a . W e b b e r , M . M . , B e l l o — D e O c a m p o , D . , Q u a d e r , S . , D e O c a m p o , N . D . , M e t c a l f e , W . S . , a n d S h a r p , R . M . : M o d u l a t i o n o f m a l i g n a n t p h e n o t y p e o f h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s b y N — ( 4 - h y d r o x y p h e n y l ) r e t i n a m i d e ( 4 - H P R ) . C l i n . E x p . M e t . , 1 7 : 2 5 5 - 2 6 3 , 1 9 9 9 b . W h i t a c r e , D . C . , C h a u h a n , S . , D a v i s , T . , G o r d o n , T . , C r e s s , A . E . , a n d M i e s f e l d , R . L . : A n d r o g e n i n d u c t i o n o f i n v i t r o p r o s t a t e c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . C e l l G r o w t h D i f f , 1 3 2 1 - 1 1 , 2 0 0 2 . W o b u s , A . M . , K a o m e i , G . , S h a n , J . , W e l l n e r , M - C . , R o h w e d e l , J . , G u a n j u , J . , F l e i s c h m a n n , B . , K a t u s , H . A . , H e s c h e l e r , J . , a n d F r a n z , W - M . : R e t i n o i c a c i d a c c e l e r a t e s e m b r y o n i c s t e m c e l l - d e r i v e d c a r d i a c d i f f e r e n t i a t i o n a n d e n h a n c e s d e v e l o p m e n t o f v e n t r i c u l a r c a r d i o m y o c y t e s . J . M o l . C e l l C a r d i o l . , 2 9 : 1 5 2 5 - 1 5 3 9 , 1 9 9 7 . W r a n a , J . L . : R e g u l a t i o n o f S m a d a c t i v i t y . C e l l , 1 0 0 : 1 8 9 - 1 9 2 , 2 0 0 0 . W u , G . , F a n , R . S . , L i , W . , K o , T C . a n d B r a t t a i n , M . G . : M o d u l a t i o n o f c e l l c y c l e c o n t r o l b y v i t a m i n D 3 a n d i t s a n a l o g u e , E 8 1 0 8 9 , i n h u m a n b r e a s t c a n c e r c e l l s . O n c o g e n e , 1 5 : 1 5 5 5 - 1 5 6 3 , 1 9 9 7 . Y l i k o m i , T . , L a a k s i , 1 . , L o u , Y - R , M a r t i k a i n e n , P . , M i e t t i n e n , S . , P e n n a n e n , P . , P u r m o n e n , S . , S y v a l a , H . , V i e n o n e n , A . , a n d T u o h i m a a , P . : A n t i p r o l i f e r a t i v e a c t i o n o f v i t a m i n D . V i t . H o r m . , 6 4 : 3 5 7 - 4 0 6 , 2 0 0 2 . Y o o n , K . H . , Y o o n , M . , M o i r , R . D . , K h u o n , S . , F l i t n e y , F . W . , a n d G o l d m a n , R D . : I n s i g h t s i n t o t h e d y n a m i c p r o p e r t i e s o f c y t o k e r a t i n i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s i n l i v i n g e p i t h e l i a l c e l l s . J C e l l B i o . 1 5 3 : 5 0 3 - 5 1 6 , 2 0 0 1 . Z a n g , F . , G o d y n , J . J . , U s k o k o v i c , M . , B i n d e r u p , L . , S t u d z i n s k i , G . P . : M o n o c y t i c d i f f e r e n t i a t i o n o f H L 6 0 c e l l i n d u c e d b y p o t e n t a n a l o g s o f v i t a m i n D 3 p r e c e d e s t h e G 1 / G 0 p h a s e c e l l c y c l e b l o c k . C e l l P r o l i f . , 2 7 : 6 4 3 - 6 5 4 , 1 9 9 5 . 1 8 4 Z h a n g , D . , H o l m e s , W . F . , W u , 8 . , S o p r a n o , D R , a n d S o p r a n o , K . J . : R e t i n o i d s a n d o v a r i a n c a n c e r . J . C e l l . P h y s i o l . , 1 8 5 : 1 - 2 0 , 2 0 0 0 . Z h a o , X - Y . , L y , L . H . , P e e h l , D . M . , a n d F e l d m a n , D . : 1 a , 2 5 - D i h y d r o x y v i t a m i n D a c t i o n s i n L N C a P h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s a r e a n d r o g e n - d e p e n d e n t . E n d o c r i n o l o g y , 1 3 8 : 3 2 9 0 - 3 2 9 8 , 1 9 9 7 . Z h a o , X - Y , P e e h l , D . M . , N a v o n e , N . M . , a n d F e l d m a n , D . : 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n h i b i t s p r o s t a t e c a n c e r c e l l g r o w t h b y a n d r o g e n - d e p e n d e n t a n d a n d r o g e n - i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s . E n d o c r i n o l o g y , 1 4 1 : 2 5 4 8 - 2 5 5 6 , 2 0 0 0 . Z h u a n g , S - H a n d B u m s t e i n , K . L . : A n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t o f 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e L N C a P i n v o l v e s r e d u c t i o n o f c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e 2 a c t i v i t y a n d p e r s i t e n t G 1 a c c u m u l a t i o n . E n d o c r i n o l o g y , 1 3 9 : 1 1 9 7 - 1 2 0 7 , 1 9 9 8 . Z i n s e r , G . , P a c k m a n , K . , a n d W e l s h , J . : V i t a m i n D 3 r e c e p t o r a b l a t i o n a l t e r s m a m m a r y g l a n d m o r p h o g e n e s i s . D e v e l o p m e n t , 1 2 9 : 3 0 6 7 - 3 0 7 6 , 2 0 0 2 . 1 8 5 i t i t t i t i i j i i j i i m i t t — : : r : » 3 . l : 1 l : E 0 « . i x . e ! . . . l d 3 - I 1 7 1 £ h r 4 . 3 4 . . . g fi a ‘ s z m w , ‘ . a n . . . H . A : . H é m ‘ . . . fi m m fi s m fi fi m r L . i . 7 l I 9 3 2 3 a . . . : | . t x . 1 . . ‘ 3 U n L - . . F ‘ . . w k “ ) N " " " ' L I B R A R Y M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E ~ v — — — . — — — - 2 / 0 5 c : / C l R C I D a t e D u e . i n d d - p . 1 5 u — u — g . T R E A T C H O L E C A L C I F E R O L ( V I T A M I N D 3 ) I N T H E P R E V E N T I O N A N D T R E A T M E N T O F P R O S T A T E C A N C E R : E F F E C T S A N D M E C H A N I S M S O F A C T I O N V O L U M E I I B y E r i k J . T o k a r A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f Z o o l o g y 2 0 0 5 V i i C h a p t e r 7 V i t a m i n D R e c e p t o r a n d L i g a n d I n t e r a c t i o n s 1 8 6 i n h l b i t m g ' P S A . S i n U n d e r : o u r A b s t r a c t T h e r e c e p t o r s u ; b i n d i n g . h e : V D R t o b e l i g a n d . t h e h e t e r o d i m c : i n V i t a m i n . r t i l n o i c a n . V D e u d e n c c { ( 3 l 5 e n h a n c e . g r o w t h . A ] c e l l s a n d a t [ h e m o s t U : i s i n d i c a t e r t h e t o t a l I T l i g a n d b i n A b s t r a c t T h e v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) i s a m e m b e r o f t h e s t e r o i d h o r m o n e n u c l e a r r e c e p t o r s u p e r f a m i l y . I t s s t r u c t u r e c o n s i s t s o f 5 s e p a r a t e r e g i o n s t h a t p l a y a r o l e i n l i g a n d b i n d i n g , h e t e r o d i m e r i z a t i o n , D N A b i n d i n g , o r t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n . I n o r d e r f o r t h e V D R t o b e c o m e a c t i v e i t m u s t b i n d t o i t s l i g a n d , 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . A f t e r i t b i n d s t o i t s l i g a n d , t h e V D R i s t h e n a b l e t o h e t e r o d i m e r i z e w i t h t h e r e t i n o i d X r e c e p t o r ( R X R ) . T h e h e t e r o d i m e r t h e n b i n d s t o D N A a n d i n t e r a c t s w i t h v i t a m i n D r e s p o n s e e l e m e n t s ( V D R E S ) i n v i t a m i n D - r e s p o n s i v e g e n e s . T h e h e t e r o d i m e r i z a t i o n p r o c e s s c a n b e b l o c k e d b y 9 - c i s r e t i n o i c a c i d ( 9 - c i s R A ) , a s p e c i fi c r e t i n o i d l i g a n d o f R X R . V D R i n t e r a c t s w i t h o t h e r m e m b e r s o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r s u p e r f a m i l y . T h e r e i s e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t V D R c a n c r o s s - t a l k w i t h a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) , a p r o c e s s t h a t i s e n h a n c e d b y 9 - c i s R A . A n d r o g e n s p l a y a m a j o r r o l e i n p r o s t a t e d e v e l o p m e n t a n d g r o w t h . A n d r o g e n r e c e p t o r c a n p l a y a r o l e i n g r o w t h i n h i b i t i o n o f c e r t a i n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s a n d a l s o i n i n c r e a s i n g t h e l e v e l s o f p r o s t a t e S p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) i n c e l l s . P S A i s t h e m o s t u s e f u l t u m o r m a r k e r f o r s c r e e n i n g a n d e a r l y d e t e c t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r , w h i c h i s i n d i c a t e d b y r i s i n g s e r u m P S A l e v e l s . R i s i n g P S A l e v e l s a r e a r e s u l t o f a n i n c r e a s e i n t h e t o t a l n u m b e r o f c e l l s . 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 t r e a t m e n t c a u s e s a n i n c r e a s e i n c e l l u l a r P S A l e v e l s , s u g g e s t i n g t h e l i g a n d m a y c a u s e c e r t a i n p r o s t a t e c e l l s t o d i f f e r e n t i a t e t h e r e b y i n h i b i t i n g c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n a n d r e d u c i n g c e l l n u m b e r s , r e s u l t i n g i n a d e c r e a s e i n t o t a l P S A . S i n c e i t s d i s c o v e r y m u c h h a s b e e n l e a r n e d a b o u t V D R t h a t h a s h e l p e d i n c r e a s e o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h i s g e n e , i n c l u d i n g d i s c o v e r i e s c o n c e r n i n g v i t a m i n D a n a l o g s , l i g a n d b i n d i n g , c h a n g e s c a u s e d b y l i g a n d b i n d i n g , a n d i t s p a r t i n t h e m e c h a n i s m o f 1 8 7 V i t a m i n t o h e l e d l n t r o c s u p c r t ‘ a n t h e r c t i n t h e m u d 3 C I l \ a l i g h i g h s c l S m a l l , 1 1 ‘ n u c l c u g V i t a m i n O f n u t n 1 . 3 5 1 0 } l i g h t , m m e n i a l v i t a m i n D a c t i o n . B u t a l l t h e s e n e w d i s c o v e r i e s a r e j u s t t h e b e g i n n i n g . M u c h s t i l l n e e d s t o b e l e a r n e d b e f o r e w e c a n f u l l y u n d e r s t a n d t h i s g e n e a n d r e a l i z e i t s f u l l p o t e n t i a l . I n t r o d u c t i o n T h e v i t a m i n D r e c e p t o r i s a m e m b e r o f t h e s t e r o i d h o r m o n e n u c l e a r r e c e p t o r s u p e r f a m i l y o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s t h a t a l s o i n c l u d e s t h e t h y r o i d h o r m o n e r e c e p t o r s a n d t h e r e t i n o i c a c i d r e c e p t o r s ( B l u t t a n d W e i g e l , 1 9 9 9 ) . S i m i l a r t o m o s t o t h e r m e m b e r s o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r f a m i l y , V D R i s b e l i e v e d t o r e s i d e m a i n l y i n t h e n u c l e u s p r i o r t o a c t i v a t i o n b y 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 , a f t e r w h i c h V D R b i n d s 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 w i t h h i g h a f fi n i t y a n d h i g h s e l e c t i v i t y . A c o m m o n f e a t u r e o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r s i s t h a t t h e y a r e o c c u p i e d b y s m a l l , l i p o p h i l i c l i g a n d s t h a t e a s i l y p e n e t r a t e t h e p l a s m a m e m b r a n e a n d d i f f u s e i n t o t h e n u c l e u s ( H a u s s l e r e t a l . , 1 9 9 7 ) . A l t h o u g h 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i s d e r i v e d f r o m c h o l e s t e r o l , v i t a m i n D c a n a l s o b e o b t a i n e d f r o m t h e d i e t , w h i c h w o u l d b e t t e r c l a s s i f y i t w i t h l i g a n d s o f n u t r i t i o n a l o r i g i n l i k e t h e r e t i n o i d s . T h e f a c t t h a t v i t a m i n D 3 , t h e p r e c u r s o r t o 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 , i s a l s o s y n t h e s i z e d i n t h e s k i n b y a p h o t o s y n t h e t i c r e a c t i o n w i t h u l t r a v i o l e t l i g h t , m a k e s 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 u n i q u e i n t h a t i t c a n b e o b t a i n e d t h r o u g h t w o i n d e p e n d e n t e x t e r n a l p r o c e s s e s , f r o m t h e d i e t a n d s y n t h e s i s b y t h e s u n . A s e c o n d p r o p e r t y o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r s i s t h e i r a b i l i t y t o f o r m m u l t i m e r s t h a t f a c i l i t a t e h i g h a fl i n i t y a n d s p e c i fi c D N A b i n d i n g . B y b i n d i n g a s d i m e r s t o s p e c i fi c h o r m o n e r e s p o n s e e l e m e n t s , t h e r e c e p t o r s u p e r f a m i l y i s a b l e t o c o n t r o l t a r g e t g e n e s . B a s e d o n t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e n u c l e a r r e c e p t o r s a n d t h e i r r e s p o n s e e l e m e n t s , t h e s u p e r f a m i l y c a n b e o r g a n i z e d i n t o t w o s u b f a m i l i e s ( H a u s s l e r e t a l . , 1 9 9 7 a ) . T h e fi r s t s u b f a m i l y , t h e g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r s u b f a m i l y , o f s t e r o i d h o r m o n e r e c e p t o r s , w h i c h 1 8 8 s u h i ‘ a m i l i o c c u p i d e o t f i n [ I o \ r i d t e a r m r e p e a t \ k ’ i t T a l n c O n s i m r m e ' ll i c k e E S S n . W e d C e h e 9 7 4 ) fi s t . m ” a 1 n d . H 5 a n 1 s o 3 0 5 0 : - n } 2 C t h e i n c l u d e s t o l i g a n d s e c o n d 5 L a n d b i n d s u b f a m i l ) ( F i g u r e ? P f e ~ i n c l u d e s a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) a n d e s t r o g e n r e c e p t o r ( E S ) , h o m o d i m e r i z e i n r e s p o n s e t o l i g a n d a n d b i n d t o i n v e r t e d r e p e a t e l e m e n t s s p a c e d b y 3 b a s e p a i r s ( b p ) i n D N A . T h e s e c o n d s u b f a m i l y , t h e V D R s u b f a m i l y , h e t e r o d i m e r i z e s w i t h r e t i n o i d X r e c e p t o r ( R X R ) a n d b i n d s t o d i r e c t r e p e a t e l e m e n t s s p a c e d b y 1 - 5 b p ( H a u s s l e r , 1 9 9 5 ) . T h e V D R s u b f a m i l y i n c l u d e s t h e t h y r o i d h o r m o n e r e c e p t o r ( T R ) a n d r e t i n o i c a c i d r e c e p t o r ( R A R ) ( F i g u r e 7 - 1 ) . I t i s c l e a r t h a t t h e V D R , b a s e d o n t h e g r o u p i n g o f n u c l e a r r e c e p t o r s i n t o s u b f a m i l i e s , i s a m e m b e r o f t h e h e t e r o d i m e r i z i n g g r o u p o f n u c l e a r r e c e p t o r s t h a t i s o c c u p i e d b y a l i g a n d [ 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ] o f n u t r i t i o n a l o r i g i n . I t h e t e r o d i m e r i z e s w i t h R X R i n o r d e r t o b i n d D N A w i t h h i g h a f fi n i t y a n d i n t e r a c t s w i t h a h o r m o n e r e s p o n s e e l e m e n t , i n v i t a m i n D r e s p o n s i v e g e n e s , t h a t i s a d i r e c t r e p e a t s p a c e d b y 3 b p ( t e r m e d D R - 3 f o r d i r e c t r e p e a t w i t h t h r e e — n u c l e o t i d e s p a c e r ) . T h e fi r s t s u c c e s s f u l s t u d i e s t o s u g g e s t t h e e x i s t e n c e o f a r e c e p t o r t o v i t a m i n D w e r e c a r r i e d o u t i n 1 9 6 9 b y H a u s s l e r a n d N o r m a n ( P i k e , 1 9 9 7 ) . T h e s e s t u d i e s d e m o n s t r a t e d t h e p r e f e r e n t i a l u p t a k e o f a c t i v e v i t a m i n i n t o t h e c h r o m a t i n f r a c t i o n O f c h i c k e n i n t e s t i n e s a n d p r o v i d e d e v i d e n c e t h a t a S p e c i fi c p r o t e i n l i k e l y m e d i a t e d t h e p r o c e s s . F u r t h e r s t u d i e s b y B r u m b a u g h a n d H a u s s l e r ( 1 9 7 4 ) a n d L a w s o n a n d W i l s o n ( 1 9 7 4 ) e s t a b l i s h e d t h e p r o t e i n n a t u r e o f t h e r e c e p t o r ( P i k e , 1 9 9 7 ) . I n 1 9 7 5 B r u m b a u g h a n d H a u s s l e r fi r s t r e p o r t e d t h e a c t u a l e x i s t e n c e o f a r e c e p t o r o n t h e c h r o m a t i n f o r 1 , 2 5 ( O I - I ) 2 D 3 ( D e L u c a e t a l . , 1 9 9 0 ) . I n t h e i r i n v i t r o e x p e r i m e n t s i t w a s d i s c o v e r e d t h a t t h e c y t o s o l - d e r i v e d v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) c o u l d b i n d t o c h r o m a t i n f r a c t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f t h e h o r m o n a l l i g a n d ( P i k e , 1 9 9 7 ) . 1 8 9 D i r F l g u S t e r o l d R e c e p t o r s R X R H e t e r o d l m e r s G R g l u c o c o r t i c o i d T R “ ; t h y r o l d h o r m o n e ( & & M R M i n e r a l c o r t l c o l d * 1 1 3 1 1 . 1 5 ” a l l z - t s r a S R R A V D P R P r s t e r o n e ’ V R . - ( 2 - 3 A R g o w n R ' X ‘ R R ‘ A R P P Q R q u q e l c o s l n o l d s E : I E R E s t r o g e n I I e c d y s o n e D l m o r l c O r p h a n R e c e p t o r s M o n o m e r i c O r p h a n R e c e p t o r s R X R ( u s p ) 9 - c l s R A C O U P / A R P ? H N F - 4 ? N G F I - B ( C E B — 1 ' ) ? E L P / S F - 1 ( t h - F 1 ) ? F i g u r e 7 - ] : N u c l e a r r e c e p t o r s c a n b e g r o u p e d i n t o f o u r c l a s s e s . S h o w n h e r e a r e t h e r e p r e s e n t a t i v e r e c e p t o r s f o r e a c h g r o u p ( M a n g e l s d o r f e t a l . , 1 9 9 5 ) . I 9 0 a c c e s s i h l - Z X h c t h y p e c e p i e s t o f V D P l e i e l s c I é s p t i n s } V D R a c c a p a c u } C O H C C D t 5 3 ! ] : . i ‘ 4 0 . r h d ‘ n l 1 T h e v i t a m i n D r e c e p t o r h a s a n e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f a p p r o x i m a t e l y 1 - 2 X 1 0 " 0 M a n d a m o l e c u l a r w e i g h t a r o u n d 5 0 k D a ( P i k e , 1 9 9 7 ) . D e p e n d i n g o n t h e c e l l t y p e e x a m i n e d , e s t i m a t e s o f r e c e p t o r a b u n d a n c e r a n g e f r o m u n d e r 5 0 0 t o o v e r 2 5 , 0 0 0 c o p i e s O f V D R p e r c e l l ( P i k e , 1 9 9 7 ) . A l t h o u g h t h i s s u g g e s t s t h a t c e l l s w i t h h i g h e r l e v e l s o f V D R m a y b e m o r e r e s p o n s i v e t o t h e 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 h o r m o n e t h a n t h o s e w i t h l o w e r l e v e l s o f V D R , i t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t s e v e r a l o t h e r f a c t o r s p l a y a r o l e i n t h e r e s p o n s i v e n e s s o f a c e l l t o t h e h o r m o n e . S o m e o f t h e s e f a c t o r s i n c l u d e m o d u l a t i o n o f V D R a c t i v i t y i n a c e l l - o r t i s s u e - s p e c i fi c m a n n e r b y d i f f e r e n t i a l a c t i v a t i o n e v e n t s , c e l l u l a r c a p a c i t y t o i n t e r n a l i z e a n d m e t a b o l i z e 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 , t h e n a t u r e , a v a i l a b i l i t y , a n d c o n c e n t r a t i o n o f n u m e r o u s p a r t n e r p r o t e i n s r e q u i r e d f o r g e n e a c t i v a t i o n , a n d t h e a c c e s s i b i l i t y a n d i n d u c i b i l i t y o f s p e c i fi c g e n e s ( P i k e , 1 9 9 7 ) . V i t a m i n D R e c e p t o r D o m a i n s o f t h e V D R T h e m a j o r f u n c t i o n a l d o m a i n s o f t h e V D R p a r t i c i p a t e i n n u c l e a r l o c a l i z a t i o n , l i g a n d b i n d i n g , h e t e r o d i m e r i z a t i o n , D N A b i n d i n g , a n d t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n ( H a u s s l e r e t a l , 1 9 9 7 a ) . T h e f u n c t i o n a l d o m a i n s t r u c t u r e o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r s u p e r f a m i l y i s s e p a r a t e d i n t o s i x p a r t s d e s i g n a t e d A , B , C , D , a n d E , F . S e g m e n t A / B ( F i g u r e 7 - 2 a ) i n c l u d e s r e s i d u e s o n t h e a m i n o t e r m i n a l s i d e o f t h e D N A b i n d i n g d o m a i n ( D B D ) . T h e h i g h l y c o n s e r v e d D B D i s c o m p r i s e d o f s e g m e n t C . B e t w e e n s e g m e n t C a n d t h e l i g a n d b i n d i n g d o m a i n l i e s t h e h i n g e r e g i o n , d e s i g n a t e d b y t h e l e t t e r D . T h e E / F d o m a i n l i e s o n t h e c a r b o x y - t e r m i n a l e n d o f t h e s t r u c t u r e a n d c o n t a i n s t h e l i g a n d b i n d i n g d o m a i n ( L B D ) i n a c t i v a t e d r e c e p t o r s . F i g u r e 7 - 2 b s h o w s t h e m a m m a l i a n V D R d o m a i n 1 9 1 a h a ” R U N 1 / / — — A / B c D E / F 1 8 9 2 3 2 4 2 7 I I f _ F i g u r e 7 - 2 : F u n c t i o n a l d o m a i n S t r u c t u r e o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r s u p e r f a m i l y . ( a ) N u c l e a r r e c e p t o r s ( N R ) a r e s e p a r a t e d i n t o f o u r r e g i o n s d e s i g n a t e d A / B , C , D , a n d E / F . ( b ) R e s i d u e b o u n d a r i e s o f c o r r e s p o n d i n g r e g i o n s w i t h i n t h e m a m m a l i a n V D R ( P i k e , 1 9 9 7 ) . 1 9 2 s t r u t ‘ I U i a c r o s s 2 n u c l e a r d o m a i n n u c l e o n I S a n a . a n d e m l m P O I T u i R e s i d i n - z a n d m m T h e D B s t r u c t u r e . C o m p a r e d t o t h e o t h e r m e m b e r s o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r f a m i l y t h e N B d o m a i n o f t h e V D R i s m u c h s h o r t e r . T h e C r e g i o n c o m p r i s e s t h e D B D o f t h e V D R . T h i s i s t h e m o s t c o n s e r v e d d o m a i n a c r o s s a l l n u c l e a r r e c e p t o r s ( M c D o n n e l l e t a 1 , 1 9 8 9 ) a n d i s c o n s i d e r e d t h e h a l l m a r k o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r f a m i l y . T h e r e a r e t h r e e i m p o r t a n t s u b d o m a i n s w i t h i n t h e D N A b i n d i n g d o m a i n s ( D B D S ) o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r s t h a t a r e r e q u i r e d t o r e c o g n i z e a n d b i n d s p e c i fi c n u c l e o t i d e s e q u e n c e s o f D N A . T h e fi r s t r e g i o n i s r e f e r r e d t o a s t h e p r o x i m a l ( P ) - b o x . I t i s a n o t - h e l i c a l r e g i o n t h a t c o n f e r s t a r g e t s e q u e n c e s e l e c t i v i t y f o r t h e g l u c o c o r t i c o i d ( G R ) a n d e s t r o g e n r e c e p t o r ( E R ) ( M a c D o n a l d , 1 9 9 9 ) . T h e s e c o n d r e g i o n , t h e d i s t a l ( D ) - b o x , i s i m p o r t a n t i n h o m o d i m e r i z a t i o n o f t h e G R s u b f a m i l y o f r e c e p t o r s ( M a c D o n a l d , 1 9 9 9 ) . R e s i d i n g j u s t C - t e r m i n a l t o t h e s e c o n d z i n c fi n g e r i s t h e r e g i o n t h a t m e d i a t e s h o m o d i m e r a n d m o n o m e r i n t e r a c t i o n s w i t h D N A . T h i s o t - h e l i c a l r e g i o n i s r e f e r r e d t o a s t h e T - b o x . T h e D B D c o n s i s t s o f t w o s i m i l a r m o d u l e s , e a c h c o m p r i s i n g a z i n c - c o o r d i n a t e d fi n g e r s t r u c t u r e ( F i g u r e 7 - 3 ) . T h e fi r s t e i g h t c y s t e i n e r e s i d u e s i n t h e D B D c o o r d i n a t e t e t r a h e d r a l l y t o f o r m t h e t w o z i n c fi n g e r s , e a c h c o m p r i s e d o f f o u r o f t h e c y s t e i n e r e s i d u e s . A l t h o u g h t h e s e z i n c fi n g e r s a p p e a r t o b e s t r u c t u r a l l y S i m i l a r , t h e r e a r e s u b s t a n t i a l d i f f e r e n c e s i n t h e f u n c t i o n s o f e a c h o f t h e s e m o d u l e s . T h e f u n c t i o n o f t h e a m i n o - t e r m i n a l m o d u l e i s t o d i r e c t s p e c i fi c D N A b i n d i n g i n t h e m a j o r g r o v e o f t h e D N A b i n d i n g s i t e . T h e c a r b o x y - t e r m i n a l m o d u l e s e r v e s a s a d i m e r i z a t i o n i n t e r f a c e f o r i n t e r a c t i o n w i t h a p a r t n e r p r o t e i n , s u c h a s R X R ( P i k e , 1 9 9 7 ) . 1 9 3 , p D - ' : 1 - 0 , V ' F - l g u r e 7 / \ r P D | | l x ’ \ u ‘ i T i i i i I r [ K I — b o 1 | ! 3 i r e d I T e c a t \ s a \ v . H l a m } - l . " ‘ a k 1 . . . . “ \ © . . n ' h I " P t . 0 ' : . z . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ‘ 9 g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , r D - n - I - v - r - n - x ’ . - " @ r - r - R - n - s - I - x - e t f i e - L - H . 5 . . . . . . § : E : 5 : * © . . . . . . . 1 ' 7 3 ? ! : 2 ? “ " ‘ t f : t : ¥ : ¥ t t i t ? i ” ‘ " D | - T - b - a P b o x " X ‘ p ‘ n — p - L - s - r - s - A - A - l - A - I - l - n , F i g u r e 7 - 3 : T h e N - t e r m i n a l , z i n c - fi n g e r b i n d i n g m o t i f o f t h e V D R ( M a c D o n a l d , 1 9 9 9 ) . 1 9 4 l i g a n d h i i n t h e E e x h i b i t n ‘ d o m a i n i : b i n d i n g 0 V D R i n t t I U d U L ‘ e s c . L o c a l i z ; T h e c ' . b e c o m e 5 , S t e r o i d q m ” O n g e n o n T h e D d o m a i n O f t h e V D R l i n k s t h e D B D a n d t h e E / F d o m a i n , a l s o k n o w n a s t h e l i g a n d b i n d i n g d o m a i n ( L B D ) . T h e 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 b i n d i n g f u n c t i o n o f t h e V D R i s l o c a t e d i n t h e E / F d o m a i n ( M c D o n n e l l , 1 9 8 9 ) . T h i s d o m a i n c o n t a i n s s e v e r a l s u b d o m a i n s t h a t e x h i b i t m o d e r a t e c o n s e r v a t i o n a c r o s s t h e e n t i r e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r g e n e f a m i l y . T h e E / F d o m a i n i s r e s p o n s i b l e f o r t h e h i g h - a f fi n i t y b i n d i n g o f t h e l i g a n d , 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . T h e b i n d i n g o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i s t h e “ s w i t c h ” t h a t c o n v e r t s t h e l a t e n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r o f t h e V D R i n t o t h e a c t i v e g e n e r e g u l a t o r . I t i s h y p o t h e s i z e d t h a t t h e b i n d i n g o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i n d u c e s c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n t h e L B D o f t h e V D R ( P i k e , 1 9 9 7 ) . L o c a l i z a t i o n o f V D R T h e c l a s s i c m o d e l f o r s t e r o i d h o r m o n e a c t i o n a c t i n g o n l y v i a a n u c l e a r r e c e p t o r h a s b e c o m e s o m e w h a t c o n t r o v e r s i a l . R e c e n t r e s e a r c h h a s s u g g e s t e d t h a t s e v e r a l i m p o r t a n t s t e r o i d - i n d u c e d s i g n a l i n g e v e n t s a c t i n d e p e n d e n t l y o f g e n e t r a n s c r i p t i o n . T h e s e n o n g e n o m i c b i o l o g i c a l r e s p o n s e s i n c l u d e : 1 ) e s t r o g e n - m e d i a t e d d i l a t i o n o f b l o o d v e s s e l s , 2 ) e s t r o g e n - i n d u c e d p r o l i f e r a t i o n o f b r e a s t c e l l l i n e s , 3 ) p r o g e s t e r o n e - i n d u c e d a c t i v a t i o n o f t h e a c r o s o m a l r e a c t i o n i n s p e r m ( H a m m e s , 2 0 0 3 ) . E x p e r i m e n t s h a v e b e e n c o n d u c t e d t o t r y t o i d e n t i f y t h e s t e r o i d r e c e p t o r s r e s p o n s i b l e f o r t h e s e n o n g e n o m i c m o d u l a t i o n s . S e v e r a l s u g g e s t i o n s h a v e b e e n m a d e , i n c l u d i n g c l a s s i c a l s t e r o i d r e c e p t o r s l o c a t e d i n t h e m e m b r a n e , G - p r o t e i n c o u p l e d r e c e p t o r s , a n d n o v e l m e m b r a n e - a s s o c i a t e d s t e r o i d b i n d i n g p r o t e i n s ( H a m m e s , 2 0 0 3 ) . T h e n u c l e a r l o c a l i z a t i o n o f V D R a n d i t s r o l e i n r e g u l a t i n g t r a n s c r i p t i o n h a s b e e n w e l l d o c u m e n t e d f o r y e a r s . H o w e v e r , i n c r e a s i n g e v i d e n c e h a s s h o w n c a l c i t r i o l c a n e x e r t a c t i o n o n a w i d e v a r i e t y o f c e l l s v i a r a p i d e f f e c t s o n t h e c e l l m e m b r a n e . T h e s e e f f e c t s 1 9 5 d i s t i n c t i n c a n c S C I ! o f m : 3 1 . i l ‘ . a t ‘ fi n i t ; e a l e i t r i i n m a t r : i n c l u d e a c t i v a t i o n o f p h o s p o l i p a s e C a n d p h o s p h o l i p a s e D , p r o d u c t i o n o f d i a c y l g l y c e r o l a n d i n o s i t o l t r i p h o s p h a t e , a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C a n d m a p k i n a s e s ( F l e e t , 1 9 9 9 ) , a c t i v a t i o n o f v o l t a g e - g a t e d i o n c h a n n e l s , c h a n g e s i n C a + i o n fl u x , a n d a l t e r a t i o n s i n m e m b r a n e fl u i d i t y ( N e m e r e e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h e s e e f f e c t s a r e s p e c i fi c , w h i c h s u g g e s t s t h a t t h e y a r e m e d i a t e d b y m e m b r a n e r e c e p t o r s . T h r e e l i n e s o f e v i d e n c e s u p p o r t t h e e x i s t e n c e o f m e m b r a n e V D R . U t i l i z i n g r a t c a r t i l a g e c e l l s a n d v e s i c l e s f r o m t h e s e c e l l s N e m e r e e t a l . ( 1 9 9 8 ) d e m o n s t r a t e d t h a t 1 ) c a l c i t r i o l a n a l o g s a n d m e t a b o l i t e s t h a t h a v e a v e r y h i g h a f fi n i t y f o r t h e n u c l e a r V D R s t i l l s t i m u l a t e n o n g e n o m i c a c t i o n s ; 2 ) r a p i d e f f e c t s o f c a l c i t r i o l c a n b e o b s e r v e d i n i s o l a t e d m e m b r a n e s , a n d 3 ) r a p i d e f f e c t s o f c a l c i t r i o l o c c u r i n m a t r i x v e s i c l e s . C o l l e c t i v e l y , t h e s e d a t a p r o v i d e e v i d e n c e f o r a m e m b r a n e V D R t h a t i s d i s t i n c t f r o m t h e n u c l e a r V D R . D i s c o v e r y o f t h e m e m b r a n e V D R i s j u s t t h e b e g i n n i n g . T h e g e n e o r g e n e s t h a t e n c o d e t h e m e m b r a n e V D R S n e e d t o b e i d e n t i fi e d i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e h o r m o n a l , d i e t a r y , a n d c e l l u l a r m e c h a n i s m s r e g u l a t i n g t h i s p r o t e i n a n d i t s a c t i v i t y . D e t e r m i n i n g w h e t h e r o r n o t t h e f u n c t i o n ( s ) o f t h e m e m b r a n e V D R i s c r i t i c a l t o t h e f u n c t i o n o f t h e n u c l e a r V D R , a n d d e t e r m i n i n g h o w i t s s i g n a l i s g e n e r a t e d a r e j u s t t w o m o r e c h a l l e n g e s t h a t i n v e s t i g a t o r s f a c e . A l t h o u g h i t s e x i s t e n c e i s n o t f u l l y a c c e p t e d , t h e r e i s i n c r e a s i n g e v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f V D R i n t h e c y t o p l a s m . M i c r o s c o p y i n l i v i n g c e l l s h a s d e m o n s t r a t e d t h a t V D R i s d i s t r i b u t e d b e t w e e n t h e c y t o p l a s m a n d t h e n u c l e u s ( R a c z a n d B a r s o n y , 1 9 9 9 ; S u n n e t a l . , 2 0 0 1 ) . P r u f e r a n d B a r s o n y ( 2 0 0 2 ) c o m p a r e d V D R p a r t i t i o n i n g i n l i v i n g a n d fi x e d c e l l s a n d f o u n d t h a t t h e a p p a r e n t e x c l u s i v e l y n u c l e a r l o c a l i z a t i o n o f V D R i s a fi x a t i o n a r t i f a c t . I n a d d i t i o n , s e v e r a l s t u d i e s u s i n g l i v i n g c e l l s h a v e s h o w n a c a l c i t r i o l - 1 9 6 i n d u c e d 3 1 . 7 1 0 3 i . c y t o p l a s m i e r o t u l T r a f fi c e a t e g n n ' t h e c y t o c l e a r 1 h ; S h U t i l e s h f t e r o d j t h i s C h a r l o s s i n P S h U I I l e m a c h i n e “ ” 1 5 5 w t ( m e e r a i n d u c e d r e d i s t r i b u t i o n o f V D R f r o m t h e c y t o p l a s m i n t o t h e n u c l e u s ( B a r s o n y a n d P r u f e r , 2 0 0 2 ) . I n a 1 9 9 7 s t u d y , B a r s o n y e t a l . f o u n d a s u b s t a n t i a l p r o p o r t i o n o f V D R i n t h e c y t o p l a s m , c o l o c a l i z e d i n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , t h e G o l g i c o m p l e x , a n d m i c r o t u b u l e s . T r a f fi c k i n g o f V D R B e t w e e n t h e C y t o p l a s m a n d N u c l e u s F o r y e a r s , t h e g e n e r a l l y a c c e p t e d m o d e l d i v i d e d n u c l e a r r e c e p t o r s i n t o t w o c a t e g o r i e s : 1 ) r e c e p t o r s t h a t a l w a y s r e s i d e i n t h e n u c l e u s , a n d 2 ) r e c e p t o r s t h a t r e s i d e i n t h e c y t o p l a s m a n d t r a n s l o c a t e i n t o t h e n u c l e u s o n l y a f t e r h o r m o n e b i n d i n g . I t i s n o w c l e a r t h a t n u c l e a r r e c e p t o r s a r e h i g h l y m o b i l e . V i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) c o n s t a n t l y S h u t t l e s b e t w e e n t h e c y t o p l a s m a n d t h e n u c l e u s . T h i s s h u t t l i n g i s r e g u l a t e d b y V D R h e t e r o d i m e r i z a t i o n w i t h R X R ; h e t e r o d i m e r i z a t i o n w i l l b e d i s c u s s e d i n a l a t e r s e c t i o n o f t h i s c h a p t e r . U s i n g fl u o r e s c e n c e r e c o v e r y a f t e r p h o t o b l e a c h i n g ( F R A P ) a n d fl u o r e s c e n c e l o s s i n p h o t o b l e a c h i n g ( F L I P ) e x p e r i m e n t s , i t w a s d e m o n s t r a t e d t h a t V D R a n d R X R b o t h s h u t t l e a c r o s s t h e n u c l e a r m e m b r a n e w i t h t h e h e l p o f n u c l e a r i m p o r t a n d e x p o r t m a c h i n e r y ( B a r s o n y a n d P r u f e r , 2 0 0 2 ; P r u f e r a n d B a m s o n y , 2 0 0 2 ) . T h e r e c o v e r y h a l f - t i m e s w e r e 1 5 - 3 0 m i n u t e s f o r t h e u n l i g a n d e d a n d 5 - 1 5 m i n u t e s f o r t h e l i g a n d e d V D R ( P r u f e r a n d B a r s o n y , 2 0 0 2 ) . N u c l e o c y t o p l a s m i c s h u t t l i n g o f n u c l e a r r e c e p t o r s i s r e g u l a t e d b y s e v e r a l m e c h a n i s m s , i n c l u d i n g d o c k i n g / r e t e n t i o n , p h o s p h o r y l a t i o n , a n d d i m e r i z a t i o n . N u c l e a r r e t e n t i o n / d o c k i n g p l a y s a n i n s i g n i fi c a n t r o l e a n d p h o s p h o r y l a t i o n h a s y e t t o b e e x p l o r e d i n t h e n u c l e a r l o c a l i z a t i o n o f V D R ( B a r s o n y a n d P r u f e r , 2 0 0 2 ; P r u f e r a n d B a r s o n y , 2 0 0 2 ) 1 9 7 o f u n l h g a n d a n d r o ‘ : p e n n e ; u n d e r : t h a t \ ' l a g o n fi : a n d B a ; D i m e r i z a t i o n w i t h R X R h a s b e e n s h o w n r e g u l a t e b o t h n u c l e a r i m p o r t a n d e x p o r t o f u n l i g a n d e d V D R ( P r u f e r e t a l . , 2 0 0 0 ; P r u f e r a n d B a r s o n y , 2 0 0 2 ) . I t i s w e l l k n o w n t h a t l i g a n d b i n d i n g i n d u c e s a r a p i d r e d i s t r i b u t i o n o f s e v e r a l n u c l e a r r e c e p t o r s , i n c l u d i n g a n d r o g e n r e c e p t o r , f r o m t h e c y t o p l a s m t o t h e n u c l e u s . P h o t o b l e a c h i n g a n d p e r m e a b i l i z a t i o n e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t l i g a n d e d V D R a c c u m u l a t e d i n t h e n u c l e u s u n d e r s t e a d y - s t a t e c o n d i t i o n s ( B a r s o n y a n d P r u f e r , 2 0 0 2 ) . S e v e r a l s t u d i e s h a v e r e v e a l e d t h a t V D R a n d R X R a l s o m o v e r a p i d l y w i t h i n t h e n u c l e u s a n d a c c u m u l a t e i n f o c i u p o n a g o n i s t t r e a t m e n t a n d t h a t t h e y b i n d t o f o c i a s h e t e r o d i m e r s ( P r u f e r e t a l . , 2 0 0 0 ; P r u f e r a n d B a r s o n y , 2 0 0 2 ; a n d R a c z a n d B a r s o n y , 1 9 9 9 ) . V D R H o m o d i m e r s T o d a t e , t h e f u n c t i o n a l s i g n i fi c a n c e o f a V D R h o m o d i m e r i s u n c l e a r . S t u d i e s S h o w t h a t l i g a n d d e c r e a s e s t h e a m o u n t o f D N A — b o u n d h o m o d i m e r a n d c a u s e s d i s s o c i a t i o n o f t h e h o m o d i m e r b y d e c r e a s i n g t h e r a t e o f m o n o m e r t o h o m o d i m e r f o r m a t i o n u p t o fi v e - f o l d ( C h e s k i s a n d F r e e d m a n , 1 9 9 4 ) . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t c a l c i t r i o l f a v o r s t h e V D R - R X R h e t e r o d i m e r f o r m a t i o n . O t h e r s t u d i e s d e m o n s t r a t e c o n fl i c t i n g r e s u l t s a s t o t h e D N A - b i n d i n g a f fi n i t y o f V D R h o m o d i m e r s . I n v i t r o e x p e r i m e n t s s u g g e s t t h e l i g a n d - b o u n d V D R h o m o d i m e r s d i s p l a y l o w e r a f fi n i t y f o r D N A r e s p o n s e e l e m e n t s t h a n c o r r e s p o n d i n g l i g a n d - i n d u c e d V D R - R X R h e t e r o d i m e r s ( I s s a e t a l . , 1 9 9 8 ) . C o n v e r s e l y , u s i n g g e l m o b i l i t y s h i fi a s s a y s , K i m e t a l . ( 1 9 9 6 ) d e m o n s t r a t e d a V D R h o m o d i m e r t h a t s h o w e d g r e a t e r a f f i n i t y f o r D N A r e s p o n s e e l e m e n t s t h a n V D R - R X R h e t e r o d i m e r . T o f u l l y u n d e r s t a n d t h e f u n c t i o n a l 1 9 8 s i g n i f i c a n t V i t a m i n D V i t a m i l n r a t e s o f g T h i s h i n t r e c r u i t m c C o m p l e x l F i g u r e ' [ l m e d i a t R O I Q f 0 T f o l - ” T a n g S o l u n ‘ O n 1 9 9 1 ) . S 9 ‘ f 0 l d I I ‘ . N a m i n g i n t e r a c t i t w i t h i t s ; h e ‘ e r fi d i r s i g n i fi c a n c e o f t h e V D R h o m o d i m e r , f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s i n t o h o m o d i m e r i c s p e c i fi c v i t a m i n D r e s p o n s i v e g e n e s a r e r e q u i r e d . V i t a m i n D R e c e p t o r - R e t i n o i d X R e c e p t o r I n t e r a c t i o n I n t h e t a r g e t c e l l , a c a s c a d e O f e v e n t s t h a t c l i m a x e s i n a l t e r a t i o n s i n t r a n s c r i p t i o n r a t e s o f g e n e s i s i n i t i a t e d w i t h t h e b i n d i n g o f t h e 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 h o r m o n e w i t h t h e V D R . T h i s b i n d i n g h y p e r p h o s p h o r y l a t e s t h e V D R ( H a u s s l e r e t a l . , 1 9 9 7 b ) , f a c i l i t a t i n g t h e r e c r u i t m e n t o f t h e R X R i n t o t h e r e q u i s i t e h e t e r o d i m e r i c c o m p l e x . T h i s h e t e r o d i m e r i c c o m p l e x b i n d s t o s p e c i fi c D N A s e q u e n c e s c a l l e d v i t a m i n D r e s p o n s e e l e m e n t s ( V D R E S ) ( F i g u r e 7 - 4 ) i n v i t a m i n D - r e s p o n s i v e g e n e s a n d i n fl u e n c e s t h e r a t e o f R N A p o l y m e r a s e I I m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n ( M a c D o n a l d , 1 9 9 9 ) . R o l e f o r t h e 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 L i g a n d T h e 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 l i g a n d ( F i g u r e 7 - 5 ) d r a m a t i c a l l y e n h a n c e s t h e h e t e r o d i m e r f o r m a t i o n o f t h e V D R - R X R c o m p l e x b y b o t h t h e d i r e c t i n t e r a c t i o n o f V D R w i t h R X R i n s o l u t i o n a n d t h e i n t e r a c t i o n o f t h e V D R - R X R h e t e r o d i m e r w i t h t h e V D R E ( S o n e e t a 1 , 1 9 9 1 ) . S o n e e t a l . ( 1 9 9 1 ) d e m o n s t r a t e d t h a t i n t h e p r e s e n c e o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 t h e r e w a s a 9 - f o l d i n c r e a s e i n t h e a f fi n i t y o f t h e V D R f o r R X R i n t h e a b s e n c e o f D N A . S u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e t e c h n i q u e s c o n fi r m e d t h e b i n d i n g c o n s t a n t s f o r V D R - R X R i n t e r a c t i o n s a n d s h o w e d a c l e a r 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n V D R i n t e r a c t i o n w i t h i t s e l f ( h o m o d i m e r f o r m a t i o n ) a n d a c o n c o m i t a n t i n c r e a s e i n V D R - R X R h e t e r o d i m e r i z a t i o n ( C h e s k i s e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h i s i n c r e a s e i n a fi i n i t y o f V D R f o r R X R 1 9 9 C t r fi \ < C a l c m C a l c i t r i o l [ i , 2 5 ( 0 H ) 2 0 3 1 O H N U C L E U S F i g u r e 7 - 4 : P u t a t i v e m o l e c u l a r c o m m u n i c a t i o n s b e t w e e n V D R a n d t h e t r a n s c r i p t i o n a l c o m p l e x ( M a c D o n a l d , 1 9 9 9 ) . 2 0 0 0 S u r e ¢ \ \ H m ‘ O H F i g u r e 7 - 5 : S t r u c t u r e o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ( D e L u c a , 1 9 9 7 ) . 2 0 1 O H a h e m i o n R e t i n r e S l ‘ O n s h C I C e r a l m o s t c e r t a i n l y r e fl e c t s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n t h e V D R i n d u c e d b y t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f t h e l , 2 5 ( O I - I ) 2 D 3 l i g a n d . T h e r e f o r e , o n e s u c h r o l e f o r t h e 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 l i g a n d i n t h e V D R - m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n m a y b e t o i n d u c e a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n V D R t h a t p r o m o t e s l i g a n d - b o u n d V D R h e t e r o d i m e r i z a t i o n w i t h R X R a n d d i s r u p t s w e a k h o m o d i m e r s o f u n l i g a n d e d V D R ( F i g u r e 7 - 6 ) . R e t i n o i d X R e c e p t o r s R e t i n o i d X r e c e p t o r s ( R X R S ) a r e n u c l e a r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s t h a t a r e a c t i v a t e d b y t h e i r r e t i n o i d l i g a n d , 9 - c i s - r e t i n o i c a c i d ( 9 - c i s R A ) ( Z o u e t a l . , 1 9 9 7 ) . R X R S a r e t h o u g h t t o f o r m h o m o d i m e r s u p o n i n t e r a c t i o n w i t h l i g a n d t o a c t i v a t e r e p u t e d R X R - s e l e c t i v e g e n e s , s u c h a s a p o l i p o p r o t e i n A 1 a n d c e l l u l a r r e t i n a l - b i n d i n g p r o t e i n 1 1 t h r o u g h R X R - r e s p o n s i v e e l e m e n t s i n t h o s e g e n e s ( A l l e g r e t t o e t a l . , 1 9 9 5 ) . R X R i s a l s o k n o w n t o f o r m h e t e r o d i m e r s w i t h s e v e r a l o t h e r i n t r a c e l l u l a r r e c e p t o r s , i n c l u d i n g t h e v i t a m i n D r e c e p t o r , t h y r o i d h o r m o n e r e c e p t o r ( T R ) , a n d r e t i n o i c a c i d r e c e p t o r ( R A R ) . I n t h e s e i n t e r a c t i o n s , R X R i s t h o u g h t t o a c t a s a S i l e n t ( n o n - l i g a n d e d ) p a r t n e r . R X R h a s a l s o b e e n s h o w n t o f o r m h o m o d i m e r s i n a c o m p l e x w i t h D N A u p o n b i n d i n g t o 9 - c i s R A . 9 - c i s R A a c t s a s a p o t e n t i a l i n h i b i t o r o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 - e n h a n c e d V D R - R X R b i n d i n g t o V D R E s . D r a m a t i c a t t e n u a t i o n o f t h i s i n t e r a c t i o n c a n o c c u r a t c o n c e n t r a t i o n s a s l o w a s 1 0 ’ 7 M ( H a u s s l e r e t a l . , 1 9 9 7 a ) . T w o p o s s i b l e p a t h w a y s h a v e b e e n h y p o t h e s i z e d t o e x p l a i n t h e V D R - R X R i n t e r a c t i o n w i t h V D R E ( F i g u r e 7 - 7 ) . I n p a t h w a y A o f F i g u r e 7 - 7 , l , 2 5 ( O I - I ) 2 D 3 o c c u p i e s t h e m o n o m e r i c V D R , c a u s i n g a c o n f o r m a t i o n a l a l t e r a t i o n o f t h e l i g a n d - b i n d i n g d o m a i n . T h i s c h a n g e i n t h e c o n f o r m a t i o n f a c i l i t a t e s t h e 2 0 2 ’ r i ’ T / T . ‘ l L i ( l l V v u F l g l l r e 7 ‘ 6 : 1 , 2 5 ( O H ) ; D 3 F i g u r e 7 - 6 : R o l e f o r 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i n t h e f o r m a t i o n o f f u n c t i o n a l V D R h e t e r o d i m e r . M o n o m e r o f V D R ( v ) a n d a p a r t n e r p r o t e i n s u c h a s R X R ( x ) a r e e i t h e r a s s o c i a t e d w i t h D N A ( 1 ) o r f r e e i n t h e n u c l e u s ( I I ) ( P i k e , 1 9 9 7 ) . 2 0 3 H g g a g F i g u r e 7 - 7 : M o d e l o f t w o d i f f e r e n t a l l o s t e r i c p a t h w a y s f o r V D R - R X R - 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 b i n d i n g t o D N A ( H a u s s l e r e t a l . , 1 9 9 7 b ) . 2 0 4 C l c h ‘ T I i n i V D R - R l i t C h a r a c t e r ] ; i m p o r ‘ t a n t . P r o t t e r e o i n p m d i m e r h L e B D o f ( M a c D O n y a D 1 d . b e t w e e n 3 8 2 d i e V D R ‘ R X L O b s e fi ' e d t o n . s u p p o r t ; R X R l 0 l i s p j a d s 9 a r r e e r u e t a l . h e t e r c 9 1 1 5 ‘ l s i g n a i R X R r 9 - ( ‘ 1 5 R l . 2 5 t O l r e c r u i t m e n t o f R X R f o r h e t e r o d i m e r i z a t i o n a n d s u b s e q u e n t V D R E r e c o g n i t i o n . H a u s s l e r e t a l . ( 1 9 9 7 a ) p o s t u l a t e t h a t V D R c o n f o r m a t i o n a l l y i n fl u e n c e s R X R i n t h e r e s u l t i n g h e t e r o d i m e r i n a w a y t h a t i t i s r e s i s t a n t t o l i g a n d b i n d i n g b y 9 - c i s R A , t h u s , p r e v e n t i n g 9 - c i s R A f r o m d i s s o c i a t i n g t h e R X R - V D R c o m p l e x i n o r d e r t o d i v e r t R X R f o r r e t i n o i d S i g n a l t r a n s d u c t i o n . I n p a t h w a y B o f F i g u r e 7 - 7 t h e 9 - c i s R A b i n d i n g f u n c t i o n o f t h e R X R p a r t n e r h a s n o t b e e n s u p p r e s s e d , m a k i n g t h i s f o r m s u s c e p t i b l e t o d i s s o c i a t i o n b y 9 - c i s R A , t h u s f a v o r i n g t h e f o r m a t i o n o f r e t i n o i d - o c c u p i e d R X R h o m o d i m e r s . T h e r e f o r e , 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 m u s t fi r s t o c c u p y t h e V D R m o n o m e r s i n o r d e r t o p r e v e n t 9 - c i s R A f r o m d i v e r t i n g o r d i s s o c i a t i n g R X R b l o c k i n g t h e f o r m a t i o n o f V D R - R X R h e t e r o d i m e r . V D R - R X R H e t e r o d i m e r i z t i o n H e t e r o d i m e r i z a t i o n w i t h R X R i s e s s e n t i a l f o r V D R a c t i o n . B e c a u s e o f t h i s , c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e r e g i o n s o f t h e V D R t h a t a c t u a l l y c o n t a c t t h e R X R i s v e r y i m p o r t a n t . T h e l i g a n d b i n d i n g d o m a i n ( L B D ) o f t h e r e c e p t o r s p l a y s a m a j o r r o l e i n p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s , s u c h a s t h e p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s d u r i n g t h e h e t e r o d i m e r i z a t i o n o f V D R w i t h R X R . T h e r e a r e a t l e a s t f o u r p u t a t i v e r e g i o n s i n t h e L B D o f V D R t h a t a r e i n v o l v e d i n t h e m e d i a t i o n o f p r o t e i n - p r o t e i n c o n t a c t s w i t h R X R ( M a c D o n a l d , 1 9 9 9 ) . T h e fi r s t , a C - t e r m i n a l h e t e r o d i m e r i z a t i o n d o m a i n , i s l o c a t e d b e t w e e n 3 8 2 a n d 4 0 2 i n t h e V D R s e q u e n c e ( H a u s s l e r , 1 9 9 7 a ) . C o m p l e t e d i s r u p t i o n o f t h e V D R - R X R i n t e r a c t i o n a n d e l i m i n a t i o n o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f t h e V D R w e r e o b s e r v e d f o l l o w i n g m u t a g e n e s i s i n t h e s e r e s i d u e s . A s e c o n d d o m a i n t h a t p o s s i b l y s u p p o r t s R X R h e t e r o d i m e r i z a t i o n r e s i d e s b e t w e e n r e s i d u e s 3 1 8 a n d 3 3 9 , c o r r e s p o n d i n g t o h e p t a d s 9 a n d 4 , r e s p e c t i v e l y ( M a c D o n a l d , 1 9 9 9 ) . 2 0 5 d i m e r . r e g i o n t ( f O m t F r m a t i o , a m o i c m a j o r i n i c C ‘ c o I m S t h I } t e n n i n a a U “ “ i r a j h . t h e i m c d o m . A t h i r d r e g i o n i s f o u n d i n t h e a m i n o - t e r m i n a l s e g m e n t o f t h e L B D a n d i s l o c a t e d b e t w e e n r e s i d u e s 2 4 4 a n d 2 6 3 , k n o w n a s E 1 ( H a u s s l e r , 1 9 9 7 a ) . P o i n t m u t a t i o n s i n t h i s r e g i o n d o n o t a l t e r l i g a n d b i n d i n g b u t t h e y d o a f f e c t t h e a b i l i t y o f t h e V D R t o h e t e r o d i m e r i z e w i t h R X R . L o c a t e d o n r e s i d u e s 9 1 a n d 9 2 , t h e f o u r t h r e g i o n i s l o c a t e d i n t h e T - b o x ( s e e F i g u r e 3 ) o f t h e V D R ( H a u s s l e r , 1 9 9 7 a ) . T h i s r e g i o n i s a p p a r e n t l y i n v o l v e d i n t h e m e d i a t i o n o f t h e h e t e r o d i m e r i z a t i o n o f t h e V D R a n d R X R D N A b i n d i n g d o m a i n s ( D B D S ) o n t h e V D R E s c a f f o l d . S o m e i n s i g h t i n t o t h e s t r u c t u r e o f t h e V D R - R X R h e t e r o d i m e r c o m p l e x c a n b e g a i n e d b y l o o k i n g a t t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e R X R - R X R h o m o d i m e r i c c o m p l e x . T h e L B D o f t h e R X R c r y s t a l s t r u c t u r e c o n s i s t e d o f 1 1 o t - h e l i c e s o r g a n i z e d i n t o w h a t w a s t e r m e d a t h r e e - l a y e r a n t i p a r a l l e l s a n d w i c h ( M a c D o n a l d , 1 9 9 9 ) . H e l i x 1 0 o f t h e R X R d i m e r , w h i c h f o r m s t h e m a j o r i t y o f i t s i n t e r a c t i o n s u r f a c e , c o r r e s p o n d s t o t h e C - t e r m i n a l r e g i o n o f t h e V D R ( N a k a j i m a e t a 1 , 1 9 9 4 ) . T h i s r e g i o n i s c r u c i a l f o r h e t e r o d i m e r f o r m a t i o n . T h e o v e r a l l s t r u c t u r a l i n t e g r i t y o f t h e r e c e p t o r i s m a i n t a i n e d b y t h e i n t r a m o l e c u l a r c o n t a c t s w i t h w h i c h t h e o t h e r h e p t a d r e p e a t s a r e i n v o l v e d . T h e r e f o r e , t h e m a j o r i n t e r a c t i o n s u r f a c e o f t h e V D R - R X R h e t e r o d i m e r m a y b e c o m p r i s e d o f t h e C - t e r m i n a l r e g i o n o f t h e V D R , w h i c h i n c l u d e s r e s i d u e s 3 8 2 - 4 0 3 ( h e l i x 1 0 ) , m a k i n g d i r e c t c o n t a c t w i t h h e l i x 1 0 o f t h e R X R ( M a c D o n a l d , 1 9 9 9 ) . T h i s i n t e r a c t i o n w o u l d g e n e r a t e a s t r u c t u r a l l y s y m m e t r i c a l V D R - R X R h e t e r o d i m e r . 2 0 6 \ ' [ ) l o f t h e m e m t 1 9 9 9 ) b i n d l n l ' l i ‘ l c ‘ l ‘ r x o c c u p i . b i n d i n g h e a d - t o V D R - R X R H e t e r o d i m e r s T h e m e c h a n i s m O f V D R b i n d i n g t o V D R E S i s r e fl e c t e d i n t h e d i r e c t r e p e a t n a t u r e o f t h e e l e m e n t . C l a s s 1 1 r e c e p t o r s o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r s u p e r f a m i l y ( o f w h i c h V D R i s a m e m b e r ) b i n d t o d i r e c t r e p e a t e l e m e n t s a s a s y m m e t r i c a l h e t e r o d i m e r s ( M a c D o n a l d , 1 9 9 9 ) . T h i s a s y m m e t r i c a l h e t e r o d i m e r ( R X R i n t h i s c a s e ) i s r e q u i r e d f o r h i g h - a f fi n i t y b i n d i n g o f V D R s t o V D R E S . T h e a s y m m e t r i c a l d i r e c t r e p e a t m o t i f ( D R - 3 ) o f t h e V D R E a l l o w s t h e V D R - R X R h e t e r o d i m e r t o b i n d w i t h d e fi n e d p o l a r i t y . T h e 3 ' h a l f s i t e o f t h e D R - 3 e l e m e n t i s o c c u p i e d b y V D R a n d t h e R X R o c c u p i e s t h e 5 ' h a l f s i t e ( M a c D o n a l d , 1 9 9 9 ) . T h e D N A b i n d i n g d o m a i n s ( D B D S ) o f a V D R - R X R h e t e r o d i m e r a r e a r r a n g e d i n a n a s y m m e t r i c a l , h e a d - t o - t a i l a s s e m b l y w i t h t h e V D R T - b o x f o r m i n g a d i r e c t c o n t a c t w i t h t h e R X R D - b o x ( M a c D o n a l d , 1 9 9 9 ) . T h e p r e d o m i n a n t i n t e r a c t i o n i n t e r f a c e o f t h e C - t e r m i n i w o u l d p l a c e t h e l i g a n d b i n d i n g d o m a i n s ( L B D S ) o f V D R a n d R X R i n a s y m m e t r i c a l a r r a n g e m e n t w h e n t h e y f o r m t h e h e t e r o d i m e r ( M a c D o n a l d , 1 9 9 9 ) . T o e x p l a i n t h i s d i f f e r e n c e , M a n g e l s d o r f a n d E v a n s ( 1 9 9 5 ) p r o p o s e t h a t t h e D B D S o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r s h a v e a n i n h e r e n t fl e x i b i l i t y . T h i s fl e x i b i l i t y , a f u n c t i o n o f t h e h i n g e r e g i o n o f t h e r e c e p t o r s , p e r m i t s a h i g h d e g r e e o f r o t a t i o n a l f r e e d o m i n t h e D B D t h a t w o u l d a c c o m m o d a t e s u c h a b i n d i n g s c h e m e . T h e n e x t s e c t i o n w i l l d i s c u s s h o w V D R i n t e r a c t s w i t h t h e a n d r o g e n r e c e p t o r , a m e m b e r o f t h e g l u c o c o r t i c o i d s u b f a m i l y o f s t e r o i d h o r m o n e r e c e p t o r s . 2 0 7 V D F T h e ; g l u e o c c ‘ C c ‘ p i t b y 3 b a p p r o x a l . 1 9 9 V i t a m i t l e m n n ; r 6 9 0 1 ] ; d O m a j n 3 C I i V a t i S l m l l a r t h e D B ] L h a t i s t A R P r o r e s p ‘ i ’ n s i V D R I n t e r a c t i o n s w i t h A n d r o g e n R e c e p t o r T h e A n d r o g e n R e c e p t o r G e n e A s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d , t h e a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) b e l o n g s t o t h e g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r s u b f a m i l y o f s t e r o i d h o r m o n e r e c e p t o r s . T h e s e h o r m o n e r e c e p t o r s h o m o d i m e r i z e i n r e s p o n s e t o l i g a n d a n d b i n d t o i n v e r t e d r e p e a t e l e m e n t s s p a c e d b y 3 b a s e p a i r s ( b p ) i n D N A . T h e g e n e e n c o d i n g t h e A R c o n t a i n s 8 e x o n s a n d s p a n s a p p r o x i m a t e l y 9 0 k b o f g e n o m i c D N A o n t h e l o n g a r m o f t h e X - c h r o m o s o m e ( B e n t e l e t a 1 , 1 9 9 7 ) . T h e h u m a n A R h a s a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r m a s s o f 1 1 0 k D a . S i m i l a r t o t h e v i t a m i n D r e c e p t o r , A R c a n b e d i v i d e d i n t o f o u r f u n c t i o n a l d o m a i n s : 1 ) a n a m i n o t e r m i n a l t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n d o m a i n ; 2 ) a D N A b i n d i n g d o m a i n ( D B D ) ; 3 ) a h i n g e r e g i o n ; a n d 4 ) a l i g a n d b i n d i n g d o m a i n ( L B D ) ( E v a n s , 1 9 8 8 ) . T h e l a r g e a m i n o t e r m i n a l d o m a i n m a k e s u p m o r e t h a n h a l f o f t h e A R p r o t e i n a n d i s r e q u i r e d f o r w i l d - t y p e a c t i v a t i o n o f t h e r e c e p t o r . T h e D B D c o n t a i n s t w o z i n c b i n d i n g m o t i f s ( z i n c fi n g e r s ) w i t h s i m i l a r s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n a s t h o s e o f t h e v i t a m i n D r e c e p t o r D B D . L o c a t e d b e t w e e n t h e D B D a n d L B D , t h e h i n g e r e g i o n c o n t a i n s a s p e c i fi c n u c l e a r l o c a l i z a t i o n s i g n a l ( N L S ) t h a t i s h i g h l y c o n s e r v e d a m o n g s t e r o i d r e c e p t o r s . T h i s N L S d i r e c t s t r a n s l o c a t i o n o f t h e A R p r o t e i n f o r m t h e c y t o p l a s m t o t h e n u c l e u s ( B e n t e l e t a 1 , 1 9 9 7 ) . T h e L B D i s r e s p o n s i b l e f o r t h e h i g h - a f fi n i t y b i n d i n g o f a n d r o g e n s t o t h e A R . V D R C r o s s T a l k w i t h t h e A R i n P r o s t a t e C a n c e r C e l l s A f u n c t i o n a l A R i s n e c e s s a r y f o r t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f t a r g e t g e n e s b y a n d r o g e n s . T e s t o s t e r o n e i s m e t a b o l i z e d w i t h i n t h e p r o s t a t e t o S o t - d i h y d r o t e s t o s t e r o n e ( D H T ) b y t h e e n z y m e S - o t r e d u c t a s e . I t i s n o w k n o w n t h a t i t i s D H T a n d n o t t e s t o s t e r o n e 2 0 8 t h a t i s ' a l . 1 9 9 l a m a j o r e x p r e S S c r o s s t a a c t i o n s r 9 - ( ‘ i . \ ' R ; l 9 9 7 ) . 2 b o t h t h e A R e x p r a l . , 1 9 9 9 C O m b i n a t a “ I i i - “ f r o l i f b l o c k e d b o f L N C a . m e c h a n i s r I t 1 ‘ c e l l s i s n o t t e l l “ ” 6 , a l t h a t i s t h e m a j o r i n t r a c e l l u l a r a n d r o g e n t h a t p r o m o t e s g r o w t h w i t h i n t h e p r o s t a t e ( K i r b y e t a l , 1 9 9 6 ) . A R i s t h e k e y e l e m e n t i n t h e a n d r o g e n s i g n a l t r a n s d u c t i o n c a s c a d e a n d i t p l a y s a m a j o r r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n O f t h e p r o s t a t e . L N C a P c e l l s a r e a n a n d r o g e n - r e s p o n s i v e h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e t h a t e x p r e s s A R a n d V D R . U s i n g L N C a P c e l l s , Z h a o e t a l . , ( 1 9 9 9 ) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e c r o s s t a l k b e t w e e n 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 a n d a n d r o g e n s e x i s t s a n d t h a t t h e a n t i p r o l i f e r a t i v e a c t i o n s o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i n t h e s e c e l l s a r e a n d r o g e n - d e p e n d e n t . I t h a s b e e n s h o w n t h a t 9 - c i s R A a c t s s y n e r g i s t i c a l l y w i t h 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 t o i n h i b i t L N C a P c e l l g r o w t h ( B l u t t e t a 1 , 1 9 9 7 ) . Z h a o e t a l . ( 1 9 9 9 ) f o u n d t h a t 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 u p - r e g u l a t e s A R g e n e e x p r e s s i o n a t b o t h t h e m R N A a n d p r o t e i n l e v e l s i n t h e L N C a P c e l l s . 9 - c i s R A , w h i c h a l s o u p - r e g u l a t e s A R e x p r e s s i o n i n L N C a P c e l l s , e n h a n c e d t h e i n d u c t i v e a c t i o n o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ( Z h a o e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e s e d a t a S h o w t h a t g r o w t h i n h i b i t i o n i n d u c e d b y 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h 9 - c i s R A w a s a c c o m p a n i e d b y a n i n c r e a s e i n A R e x p r e s s i o n . A l s o , t h e a n t i p r o l i f e r a t i v e a c t i o n s o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 a n d 9 - c i s R A w e r e A R - d e p e n d e n t a n d c o u l d b e b l o c k e d b y t h e A R a n t a g o n i s t , C a s o d e x . T h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t g r o w t h i n h i b i t i o n o f L N C a P c e l l s b y 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 a n d 9 - c i s R A i s m e d i a t e d b y a n A R - d e p e n d e n t m e c h a n i s m a n d p r e c e d e d b y t h e i n d u c t i o n o f A R g e n e e x p r e s s i o n ( Z h a o e t a 1 , 1 9 9 9 ) . I t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t t h e a n t i p r o l i f e r a t i v e a c t i v i t y o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i n L N C a P c e l l s i s n o t t h e s i t u a t i o n i n a l l p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . P C - 3 , a n A R - n e g a t i v e p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e , a l s o d e m o n s t r a t e s g r o w t h i n h i b i t i o n w h e n e x p o s e d t o 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . Z h a o e t a l . , ( 2 0 0 0 ) a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t t w o n e w A R - p o s i t i v e p r o s t a t e c a n c e r c e l l s l i n e s , M D A P C a 2 a a n d M D A P C a 2 b , s h o w g r t h i n h i b i t i o n w h e n e x p o s e d t o 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e g r o w t h i n h i b i t o r y e f f e c t o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i n P C - 3 a n d M D A p r o s t a t e 2 0 9 f a C l O r s ‘ : 5 C S D C C F s i e n n l i : e x p r e s s o f L N C A R a n d w o u l d z e l e m e n t i n c r e a s e R e g u l : P r o s t a T l b i n d i n g I t c a n c e r c e l l l i n e s i s A R - i n d e p e n d e n t a n d m e d i a t e d b y m e c h a n i s m s o t h e r t h a n a n d r o g e n s i g n a l i n g ( Z h a o e t a l . , 2 0 0 0 ) . H s i e h a n d W u ( 1 9 9 7 ) h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i n c r e a s e s t h e e x p r e s s i o n o f A R b y f a c i l i t a t i n g t h e t r a n s l o c a t i o n o f A R f r o m t h e c y t o s o l t o t h e n u c l e u s o f L N C a P c e l l s . T h e y s u g g e s t t h a t t h i s m o d e l w o u l d a c c o u n t f o r t h e c o u p l e d i n d u c t i o n o f A R a n d P S A b y 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . I n c r e a s i n g t h e a m o u n t o f A R i n t h e n u c l e a r f r a c t i o n w o u l d a l l o w f o r a n e f fi c i e n t a n d p r o d u c t i v e i n t e r a c t i o n w i t h t h e a n d r o g e n - r e s p o n s e e l e m e n t o f P S A g e n e , t h e r e b y i n c r e a s i n g t r a n s c r i p t i o n o f t h e P S A m R N A l e a d i n g t o a n i n c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r a n d s e c r e t e d P S A ( H s i e h a n d W u , 1 9 9 7 ) . R e g u l a t i o n o f P r o s t a t e S p e c i f i c A n t i g e n ( P S A ) b y V i t a m i n D i n P r o s t a t e C e l l s T h e a n d r o g e n r e c e p t o r r e g u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f a n d r o g e n - r e s p o n s i v e g e n e s b y b i n d i n g t o t h e i r a n d r o g e n - r e s p o n s e e l e m e n t s a n d b y i n t e r a c t i n g w i t h o t h e r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s . A n o t a b l e g e n e r e g u l a t e d b y a n d r o g e n i n t h e p r o s t a t e i s p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( C r a w f o r d e t a l , 1 9 9 6 ) . P r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) ( F i g u r e 7 - 8 ) h a s e m e r g e d a s t h e m o s t u s e f u l t u m o r m a r k e r f o r t h e s c r e e n i n g a n d e a r l y d e t e c t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r a s w e l l a s a f o l l o w - u p t o o l a f t e r t h e r a p y . P S A i s a 3 3 k D a g l y c o p r o t e i n t h a t i s s p e c i fi c t o t h e p r o s t a t i c e p i t h e l i u m . I t i s a n i m p o r t a n t c o m p o n e n t a n d o n e o f t h e m o s t a b u n d a n t s e r i n e p r o t e a s e s i n t h e s e m i n a l p l a s m a ( W e b b e r e t a l , 1 9 9 5 ) . D i f f e r e n t i a t e d p r o s t a t e c e l l s s e c r e t e P S A . A s t h e t o t a l n u m b e r o f c e l l s i n c r e a s e s , s e r u m P S A l e v e l s i n c r e a s e i n d i c a t i n g p r o s t a t e c a n c e r ( B l u t t a n d W e i g e l , 1 9 9 9 ) . C e l l u l a r 2 1 0 F i g u r e 7 - 8 : T h r e e d i m e n s i o n a l m o d e l o f P S A ( K i r b y e t a l . , 1 9 9 6 ) . 2 1 1 s t ' n t l i r o b s e n » i n e r e a s t ‘ r a n s 1 0 i G t l O C a t c d i n ( P i k e , l 9 c s y n t h e s i s o f P S A i n c r e a s e s w h e n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s a r e t r e a t e d w i t h 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 , s u g g e s t i n g t h a t 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 m a y b e c a p a b l e o f c a u s i n g d i f f e r e n t i a t i o n o f p r o s t a t e c e l l s ( M i l l e r e t a l , 1 9 9 2 ; S k o w r o n s k i e t a l , 1 9 9 3 ) . A l t h o u g h t h i s i s s e e m i n g l y i n c o n s i s t e n t w i t h t h e f a c t t h a t r i s i n g s e r u m P S A l e v e l s a r e a n i n d i c a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r , l o w e r l e v e l s o f P S A w i l l r e s u l t d u e t o t h e a b i l i t y o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 t o r e d u c e c e l l n u m b e r . U p o n t r e a t i n g L N C a P c e l l s w i t h 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 f o r 4 8 h o u r s , H s i e h e t a l . ( 1 9 9 6 ) o b s e r v e d a t w o - f o l d i n c r e a s e i n t h e i n t r a c e l l u l a r a n d s e c r e t e d f o r m s o f P S A . T h i s i n c r e a s e i n P S A l e v e l s i s m o s t l i k e l y d u e t o 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 , w h i c h m a y f a c i l i t a t e t h e t r a n s l o c a t i o n o f A R f r o m t h e c y t o s o l t o t h e n u c l e u s o f t h e c e l l . S y n t h e t i c v i t a m i n D a n a l o g u e s h a v e a l s o b e e n s h o w n t o i n d u c e P S A i n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . H e d l u n d e t a l . ( 1 9 9 7 ) t e s t e d t h e e f f e c t s o f t h r e e v i t a m i n D a n a l o g u e s ( R o 2 3 - 7 5 5 3 , R o 2 4 - 5 5 3 1 , a n d R o 2 5 - 6 7 6 0 ) o n t h e s e c r e t i o n o f P S A i n L N C a P c e l l s . T h e y d e m o n s t r a t e d t h a t a l l t h r e e a n a l o g u e s , a s w e l l a s 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 , i n d u c e d P S A e x p r e s s i o n i n t h e L N C a P c e l l s . S i n c e t h e s e a n a l o g u e s a r e l e s s c a l c e m i c t h a n t h e n a t u r a l h o r m o n e 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 , t h e y c o u l d p o s s i b l y b e u s e d i n p l a c e o f t h e h o r m o n e t o h e l p r e d u c e i t s h y p e r c a l c e m i c p r o p e r t i e s . M u t a t i o n s i n t h e V D R a n d A R V i t a m i n D R e c e p t o r G e n e t i c p o l y m o r p h i s m s h a v e b e e n i d e n t i fi e d w i t h i n t h e V D R g e n e . T h e fi r s t i s l o c a t e d i n e x o n 2 a n d i s r e p r e s e n t e d b y a C t o T s w i t c h i n t h e t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n s i t e ( P i k e , 1 9 9 7 ) . T h e p r e s e n c e o f a C i n t h i s p o s i t i o n r e s u l t s i n a p r o t e i n w i t h t h r e e a d d i t i o n a l a m i n o a c i d s a t t h e C - t e r m i n u s a n d c o u l d w e l l h a v e f u n c t i o n a l s i g n i fi c a n c e . 2 1 2 3 1 1 0 “ . f o r ” g e n o t y p e e m , t o w h i t e s { T a $ 1 1 a n d p 9 r 9 6 ) 2 T 0 o s t a t e C “ l D C b e i O S I C I R a c i a 1 1 3 R . n i a l l e l e s { 3 h o m o z y g , S t u d } - d o n g . 9 6 W h i t e n ‘ W h o W e r e h r i s k o f d e w ] 1 & G e n e t i c p o l y m o r p h i s m s h a v e a l s o b e e n d e l i n e a t e d i n t h e i n t r o n s b e t w e e n e x o n s 7 a n d 8 a s w e l l a s t h e 3 ’ n o n c o d i n g r e g i o n o f e x o n 9 ( P i k e , 1 9 9 7 ) . T h e s e p o l y m o r p h i s m s a r e n o t l o c a t e d i n r e g i o n s o f t h e g e n e t h a t m i g h t a f f e c t s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n , b u t t h e y a p p e a r t o b e c o r r e l a t e d w i t h b o n e m i n e r a l d e n s i t y a n d i t i s h y p o t h e s i z e d t h e y a r e p r e d i c t i v e f o r o s t e o p o r o s i s . T o d a t e , n o n e o f t h e p o l y m o r p h i s m s f o u n d a r e a s s o c i a t e d w i t h c h a n g e s i n g e n e f u n c t i o n o r s t r u c t u r e , s u g g e s t i n g i t m a y b e a n a l t e r a t i o n l i n k e d t o t h e s e p o l y m o r p h i s m s t h a t a l t e r s p r o s t a t e c a n c e r r i s k ( B l u t t a n d W e i g e l , 1 9 9 9 ) . R a c i a l D i f f e r e n c e s i n V i t a m i n D R e c e p t o r I n 1 9 9 7 , I n g l e s e t a l . e x a m i n e d a p o l y m o r p h i s m 3 ' - u n t r a n s l a t e d r e g i o n o f t h e V D R i n w h i t e n o n - H i s p a n i c m e n . T h e y d e s i g n a t e d S h o r t a l l e l e s ( S 7 p o l y - A ’ s ) a n d l o n g a l l e l e s ( 2 8 p o l y A ’ s ) . T h e p r e s e n c e o f t h e l o n g a l l e l e , w h e t h e r i n t h e h e t e r o z y g o u s o r h o m o z y g o u s s t a t e , w a s a s s o c i a t e d w i t h a 4 - t o 5 - f o l d i n c r e a s e i n p r o s t a t e c a n c e r r i s k . I n a s t u d y d o n e b y T a y l o r e t a l . ( 1 9 9 6 ) , T a q I p o l y m o r p h i s m s o f t h e V D R w e r e e x a m i n e d i n 9 6 w h i t e m a l e s a n d 1 2 b l a c k m a l e s , a l l i n t h e U n i t e d S t a t e s . T h e y f o u n d t h a t t h e m e n w h o w e r e h o m o z y g o u s o r h e t e r o z y g o u s f o r t h e T a l l e l e h a d a t h r e e - f o l d i n c r e a s e i n t h e r i s k o f d e v e l o p i n g p r o s t a t e c a n c e r . A l t h o u g h t h e l o w n u m b e r o f b l a c k p a t i e n t s d o e s n o t a l l o w f o r m e a n i n g f u l a n a l y s i s o f r i s k , t h e b l a c k p a t i e n t s S h o w e d a l o w e r f r e q u e n c y o f t h e t t g e n o t y p e , w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h h i g h e r p r o s t a t e c a n c e r r a t e s a m o n g b l a c k s c o m p a r e d t o w h i t e s ( T a y l o r e t a 1 , 1 9 9 6 ) . T h e s e p a r a l l e l r e s u l t s o f I n g l e s e t a l . ( 1 9 9 7 ) a n d T a y l o r e t a 1 . ( 1 9 9 6 ) g r e a t l y s t r e n g t h e n t h e fi n d i n g s o f a n a s s o c i a t i o n b e t w e e n V D R p o l y m o r p h i s m s a n d p r o s t a t e c a n c e r r i s k . 2 1 3 r e s t r i c t p o l y m t a l l e l e s i n c o n t r 1 9 9 . “ ) . l o n g ( L a n d d e e ; a l l e l e m b l t h e y \ m e n s e a A t h e 8 5 m ] P r o s t a t e ( A P O ] P 0 1 B P H . H t a S i g n i fi c ; I n g l e s e t a 1 . ( 1 9 9 8 ) e x a m i n e d t h e B s m l , a r e s t r i c t i o n l e n g t h p o l y m o r p h i s m , r e s t r i c t i o n s i t e ( B a n d b a l l e l e s ) a n d p o l y - A m i c r o s a t e l l i t e ( L a n d S a l l e l e s ) p o l y m o r p h i s m s i n t h e V D R g e n e o f A f r i c a n - A m e r i c a n m e n i n t h e U n i t e d S t a t e s . T h e b a l l e l e s w e r e a s s o c i a t e d w i t h a 2 - f o l d d e c r e a s e i n a d v a n c e d p r o s t a t e c a n c e r r i s k , w h i c h i s i n c o n t r a s t t o t h e 4 - f o l d i n c r e a s e i n r i s k p r e v i o u s l y o b s e r v e d i n C a u c a s i a n s ( I n g l e s e t a 1 , 1 9 9 7 ) . I n A f r i c a n - A m e r i c a n s t h e a s s o c i a t i o n w a s c o n fi n e d t o t h e h a p l o t y p e s c a r r y i n g t h e l o n g ( L ) a l l e l e o f t h e p o l y - A m i c r o s a t e l l i t e . B L a n d b L h a p l o t y p e s s h o w e d a n i n c r e a s e d a n d d e c r e a s e d r i s k , r e s p e c t i v e l y , f o r p r o s t a t e c a n c e r . H a p l o t y p e s c a r r y i n g t h e s h o r t ( S ) a l l e l e w e r e n o t a s s o c i a t e d w i t h p r o s t a t e c a n c e r r i s k , r e g a r d l e s s o f w h i c h B s m I a l l e l e ( B o r b ) t h e y w e r e c a r r y i n g . T h e r e f o r e , i n c r e a s e d r i s k o f p r o s t a t e c a n c e r i n A f r i c a n - A m e r i c a n m e n s e e m s t o b e a s s o c i a t e d w i t h t h e B s m I / p o l y - A B L h a p l o t y p e ( I n g l e s e t a 1 , 1 9 9 8 ) . A s t u d y d o n e o n J a p a n e s e m e n ( H a b u c h i e t a l . , 2 0 0 0 ) e x a m i n e d t h e a s s o c i a t i o n o f t h e B s m I , A p a l , a n d T a n p o l y m o r p h i s m s o f t h e V D R g e n e a n d p r o t e c t i o n a g a i n s t p r o s t a t e c a n c e r a n d b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a ( B P H ) . I t w a s f o u n d t h a t t h e T a n a n d A p a I p o l y m o r p h i s m s s h o w e d n o s i g n i fi c a n t a s s o c i a t i o n w i t h e i t h e r p r o s t a t e c a n c e r o r B P H . H o w e v e r , t h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e B s m I p o l y m o r p h i s m i n t h e V D R g e n e p l a y s a s i g n i fi c a n t r o l e i n p r o t e c t i o n a g a i n s t p r o s t a t e c a n c e r a n d B P H . V D R g e n e p o l y m o r p h i s m s m a y a s s o c i a t e w i t h o t h e r f a c t o r s i n m o d u l a t i n g p r o s t a t e c a n c e r r i s k . I n a s t u d y d o n e o n C h i n e s e m e n , C h o k k a l i n g a m e t a l . ( 2 0 0 1 ) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e B s m l g e n e p o l y m o r p h i s m i s n o t r e l a t e d t o p r o s t a t e c a n c e r , a n d t h a t t h e f f g e n o t y p e o f t h e F o k I V D R p o l y m o r p h i s m m a y c o m b i n e w i t h s y s t e m i c l e v e l s o f i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r b i n d i n g p r o t e i n ( I G F B P ) - 3 a n d — 1 t o m o d u l a t e d i s e a s e r i s k . T h e s e fi n d i n g s s u g g e s t t h a t t h e i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r ( I G F ) a n d t h e v i t a m i n D 2 1 4 t m n S i i C t i t T h e r e f o r e . r e g u l p o l y n A n d i l e a d m , C l l S C S S t o f C A g l u t a m h i g h l y ~ b e t u e e l S l g I I l I T C ; C a u c a s j 1 9 9 4 ) . A m e fi c a 0 f P T O S I ; a n d m g e n : h i g h E r i r a l e a d ‘ 0 i n p n g t a I e C a r r e g u l a t o r y s y s t e m s m a y i n t e r a c t t o a f f e c t p r o s t a t e c a n c e r r i s k . T h e s e fi n d i n g s a l s o b r i n g u p t h e p o s s i b i l i t y o f t h e r e b e i n g s e v e r a l f a c t o r s a s s o c i a t e d w i t h V D R g e n e p o l y m o r p h i s m s t h a t c o n t r i b u t e t o r a c i a l d i f f e r e n c e s i n p r o s t a t e c a n c e r r i s k . A n d r o g e n R e c e p t o r I t i s w e l l k n o w n t h a t e a r l y f o r m s o f p r o s t a t e c a n c e r a r e a n d r o g e n - d e p e n d e n t , l e a d i n g t o t h e b e l i e f t h a t t h e h o r m o n e p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h i s d i s e a s e . T h e a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) g e n e h a s h i g h l y v a r i a b l e t r i n u c l e o t i d e m i c r o s a t e l l i t e o f C A G r e p e a t s i n e x o n 1 , w h i c h r e s u l t s i n t h e i n c o r p o r a t i o n o f d i f f e r e n t n u m b e r s O f g l u t a m i n e r e s i d u e s i n t h e N - t e r m i n a l r e g i o n o f t h e A R p r o t e i n . T h i s m a k e s t h e g e n e h i g h l y p o l y m o r p h i c i n h u m a n p o p u l a t i o n s . N o r m a l n u m b e r s o f C A G r e p e a t s r a n g e b e t w e e n n i n e a n d t h i r t y r e s i d u e s a n d t h e y v a r y f r o m p o p u l a t i o n t o p o p u l a t i o n . T h e r e a r e s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e s i n t h e C A G - r e p e a t p o l y m o r p h i s m s b e t w e e n A f r i c a n - A m e r i c a n , C a u c a s i a n - A m e r i c a n , a n d A s i a n - A m e r i c a n m e n i n t h e U n i t e d S t a t e s ( C o e t z e e a n d R o s s , 1 9 9 4 ) . A f r i c a n - A m e r i c a n m e n , w h o h a v e t h e l o w e s t n u m b e r o f r e p e a t s , a n d A s i a n - A m e r i c a n m e n , w h o h a v e t h e h i g h e s t n u m b e r o f r e p e a t s , h a v e t h e h i g h e s t a n d l o w e s t r i s k o f p r o s t a t e c a n c e r , r e p s e c t i v e l y . T h e l o n g e r v a r i a n t s o f t h e A R g e n e h a v e d e c r e a s e d t r a n s a c t i v a t i o n a c t i v i t y a n d h a v e b e e n s h o w n t o h a v e d e c r e a s e d b i n d i n g a f fi n i t y f o r a n d r o g e n s , w h e r e a s t h e s h o r t e r v a r i a n t s s h o w i n c r e a s e r e s p o n s i v e n e s s t o a n d r o g e n a n d h i g h e r t r a n s a c t i v a t i o n a c t i v i t y ( F e l d m a n , 1 9 9 7 ) . T h i s h i g h e r t r a n s a c t i v a t i o n a c t i v i t y m a y l e a d t o i n c r e a s e d p r o l i f e r a t i v e a c t i v i t y i n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s ( I n g l e s e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e r e f o r e , t h i s f u n c t i o n a l d i f f e r e n c e m i g h t b e a f a c t o r a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d r i s k o f p r o s t a t e c a n c e r . 2 1 5 , 1 . , . C o n d e a l 0 i \ ' D R f u n c t i t ‘ T h e s e D N A t i n i t i a t e 1 . 2 5 1 0 t h a t i n , b i n d i n g I O C a l i z a b i n d i n t h e 3 ' h T h e h e r . R X R ‘ 3 “ M e n S u p e r - f a n C 1 0 5 3 L 1 1 } t h e e x p . - p T O C E S S C o n c l u s i o n s S i n c e i t s d i s c o v e r y i n 1 9 7 5 b y B r u m b a u g h a n d H a u s s l e r ( s e e P i k e , 1 9 9 7 ) , a g r e a t d e a l o f i n s i g h t h a s b e e n g a i n e d i n t o t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f t h e v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) . V D R i s a m e m b e r o f t h e s t e r o i d h o r m o n e n u c l e a r r e c e p t o r s u p e r f a m i l y . I t s f u n c t i o n a l d o m a i n s t r u c t u r e i s s e p a r a t e d i n t o f o u r r e g i o n s d e s i g n a t e d A / B , C , D a n d E / F . T h e s e r e g i o n s p a r t i c i p a t e i n n u c l e a r l o c a l i z a t i o n , l i g a n d b i n d i n g , h e t e r o d i m e r i z a t i o n , D N A b i n d i n g , a n d t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n . A c a s c a d e o f e v e n t s t h a t c l i m a x e s i n a l t e r a t i o n s i n t r a n s c r i p t i o n r a t e s o f g e n e s i s i n i t i a t e d w i t h t h e h i g h - a f fi n i t y , h i g h - s e l e c t i v i t y b i n d i n g o f V D R t o i t s l i g a n d , 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 . O n c e V D R b i n d s t o 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i t u n d e r g o e s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e t h a t i n c r e a s e s i t s a f fi n i t y t o h e t e r o d i m e r i z e w i t h r e t i n o i d X r e c e p t o r ( R X R ) . L i g a n d b i n d i n g a n d s u b s e q u e n t h e t e r o d i m e r i z a t i o n p l a y a m a j o r r o l e i n t h e s u b c e l l u a r l o c a l i z a t i o n o f V D R . H e t e r o d i m e r i z a t i o n i s a l s o n e c e s s a r y f o r t h e V D R - R X R c o m p l e x t o b i n d t o D N A a n d i n t e r a c t w i t h a D R - 3 h o r m o n e r e s p o n s e e l e m e n t . O n c e b i n d i n g o c c u r s , t h e 3 ' h a l f s i t e o f t h e V D R E i s o c c u p i e d b y V D R a n d t h e R X R o c c u p i e s t h e 5 ' h a l f s i t e . T h e h e t e r o d m e r i z a t i o n p r o c e s s c a n b e b l o c k e d b y 9 - c i s R A , t h e s p e c i fi c r e t i n o i d l i g a n d o f R X R . 9 - c i s R A i n h i b i t s t h e V D R - R X R b y d i s s o c i a t i n g R X R f r o m V D R t o f o r m a n R X R h o m o d i m e r , w h i c h p r e v e n t s t h e f o r m a t i o n o f t h e V D R - R X R h e t e r o d i m e r . V D R c a n a l s o i n t e r a c t w i t h o t h e r m e m b e r s o f t h e s t e r o i d h o r m o n e r e c e p t o r s u p e r f a m i l y . T h e r e i s e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t t h e a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) i s a b l e t o c r o s s t a l k w i t h V D R i n c e r t a i n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s . T h i s c r o s s t a l k c a n u p - r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f A R g e n e a t b o t h t h e m R N A a n d p r o t e i n l e v e l o f t h e s e c e l l s . T h i s p r o c e s s i s e n h a n c e d b y 9 - c i s R A , w h i c h i s a l s o a b l e t o u p - r e g u l a t e A R . T h i s 2 1 6 d i fi e r e n t a c i h t a i n e r e a s p r o s t a t e P S \ , v d e m o n s t r a t e s t h a t g r o w t h i n h i b i t i o n o f c e r t a i n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s b y 1 , 2 5 ( O I - I ) 2 D 3 a n d 9 - c i s R A i s m e d i a t e d b y a n A R - d e p e n d e n t m e c h a n i s m a n d p r e c e d e d b y t h e i n d u c t i o n o f A R g e n e e x p r e s s i o n . T h e 1 , 2 5 ( O I - 1 ) 2 D 3 c a n a l s o u p - r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f A R b y f a c i l i t a t i n g t h e t r a n s l o c a t i o n o f A R f r o m t h e c y t o s o l t o t h e n u c l e u s , w h i c h a l s o l e a d s t o i n c r e a s e i n p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) l e v e l s i n t h e c e l l s . P S A i s t h e m o s t u s e f u l t u m o r m a r k e r f o r t h e s c r e e n i n g a n d e a r l y d e t e c t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . T r e a t m e n t o f c e l l s w i t h 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 i n c r e a s e s t h e c e l l u l a r s y n t h e s i s o f P S A , w h i c h s u g g e s t s t h a t 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 m a y c a u s e c e r t a i n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s t o d i f f e r e n t i a t e . S e v e r a l s t u d i e s u s i n g 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 a n d i t s a n a l o g u e s h a v e s h o w n t h i s t o b e t r u e . O t h e r s t u d i e s h a v e a l s o s h o w n t h a t t h e r e a r e r a c i a l d i f f e r e n c e s i n t h e V D R g e n e w h i c h c o u l d c a u s e a n i n c r e a s e i n t h e r i s k f o r p r o s t a t e c a n c e r . M u c h h a s b e e n l e a r n e d a b o u t t h e v i t a m i n D r e c e p t o r i n r e c e n t y e a r s a n d i t i s l i k e l y t h a t n e w d i s c o v e r i e s w i l l b e m a d e t h a t w i l l f u r t h e r i n c r e a s e o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h i s g e n e . D i s c o v e r i e s c o n c e r n i n g v i t a m i n D a n a l o g s a n d t h e i r a c t i o n s , t h e n a t u r e o f t h e l i g a n d b i n d i n g s i t e , c h a n g e s t h a t o c c u r u p o n l i g a n d b i n d i n g , t h e r e g u l a t i o n o f t h e V D R a t b o t h t h e t r a n s c r i p t i o n a l a n d p o s t - t r a n s l a t i o n a l l e v e l s , a n d i t s c o n t r i b u t i o n t o t h e m e c h a n i s m o f v i t a m i n D a c t i o n w i l l a l l c o n t r i b u t e t o b e t t e r o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e v i t a m i n D h o r m o n e a n d i t s r e c e p t o r . M u c h h a s b e e n l e a r n e d , b u t m u c h m o r e n e e d s t o b e u n d e r s t o o d b e f o r e w e c a n f u l l y r e a l i z e t h e p r o m i s e t h a t v i t a m i n D a n d i t s r e c e p t o r h o l d i n t h e t r e a t m e n t a n d p r e v e n t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . 2 1 7 C I E W f O I - m D a n i c a . d ’ E c e H 1 n .F. B a r s o r B a r s o n B e n t e l . B l u n . S , 9 c 1 f u n . S . r C h C S k j g ‘ I k i r 1 0 . C h O k k a h n é M O : P 0 1 } P o p t C O E l Z e e ‘ G J “ k m ; 3 9 5 1 ' , R e f e r e n c e s A l l e g r e t t o , E . A . , S h e v d e , N . , Z o u , A . , H o w e l l , S . R . , B o e h m , M . F . , H o l l i s , B . W . , a n d P i k e , J . W . : R e t i n o i d X r e c e p t o r a c t s a s a h o r m o n e r e c e p t o r i n v i v o t o i n d u c e a k e y m e t a b o l i c e n z y m e f o r 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t m a m i n D 3 . . 1 . B i o l . C h e m . , 2 7 0 : 2 3 9 0 6 - 2 3 9 0 9 , 1 9 9 5 . B a r s o n y , . l . a n d P r u f e r , K . : V D R a n d R X R i n t e r a c t i o n s i n m o t i o n . V i t a m . H o r m . 6 5 : 3 4 5 - 3 7 6 , 2 0 0 2 . B a r s o n y , J . , R e n y i , I . , a n d M c K o y , W . : S u b c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f n o r m a l a n d m u t a n t v i t a m i n D r e c e p t o r s i n l i v i n g c e l l s . J B i o l . C h e m . 2 7 2 : 5 7 7 4 - 5 7 8 2 , 1 9 9 7 . B e n t e l , J . M . , B u c h a n a n , G . , a n d T i l l e y , W . D . : A n d r o g e n r e c e p t o r g e n e m u t a t i o n s i n p r o s t a t e c a n c e r , I n : P r o s t a t e : b a s i c a n d c l i n i c a l a s p e c t s , N a z , R . K . ( e d ) , B o c a R a t o n , F L , C R C P r e s s , p p . 2 1 9 - 2 4 4 , 3 7 7 p p . , 1 9 9 7 . B l u t t , S . E . , A l l e g r e t t o , E . A . , P i k e , J . W . a n d W e i g e l , N . L . : 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 a n d 9 - c i s r e t i n o i c a c i d a c t s y n e r g i s t i c a l l y t o i n h i b i t t h e g r t h o f L N C a P p r o s t a t e c a n c e r c e l l s a n d c a u s e a c c u m u l a t i o n o f c e l l s i n G 1 . E n d o c r i n o l o g y , 1 3 8 : 1 4 9 1 - 1 4 9 7 , 1 9 9 7 . B l u t t , S E . a n d W e i g e l , N . L . : V i t a m i n D a n d P r o s t a t e C a n c e r . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . , 2 2 1 : 8 9 - 9 8 , 1 9 9 9 . C h e s k i s , B . a n d F r e e d m a n , L . P . : M o d u l a t i o n o f n u c l e a r r e c e p t o r i n t e r a c t i o n s b y l i g a n d s k i n e t i c s a n a l y s i s u s i n g s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e . B i o c h e m i s t r y , 2 7 0 : 1 0 , 5 5 1 - 1 0 , 5 5 8 , 1 9 9 6 . C h o k k a l i n g a m , A . P . , M c G l y n n , K . A . , G a o , Y - T . , P o l l a k , M . , D e n g , J . , S e s t e r h e n n , I . A . , M o s t o fi , F . K . , F r a u m e n i , I F , a n d H s i n g , A . W . : V i t a m i n D r e c e p t o r g e n e p o l y m o r p h i s m s , i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r s , a n d p r o s t a t e c a n c e r r i s k : a p o p u l a t i o n - b a s e d c a s e - c o n t r o l s t u d y i n C h i n a . C a n c e r R e s . , 6 1 : 4 3 3 3 - 4 3 3 6 , 2 0 0 1 . C o e t z e e , G A . a n d R o s s , R . K . : R e : P r o s t a t e c a n c e r a n d t h e a n d r o g e n r e c e p t o r . J . N a t l . C a n c e r I n s t , 8 6 : 8 7 2 - 8 7 3 , 1 9 9 4 . C r a w f o r d , E . D . , D e A n t o n i , E R , a n d R o s s , C A : T h e r o l e o f p r o s t a t e - s p e c i fi c a n t i g e n i n t h e c h e m o p r e v e n t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . J . C e l l . B i o c h e m . , 2 5 3 : 1 4 9 - 1 5 5 , 1 9 9 6 . D e L u c a , H . F . , K r i s i n g e r , J . , a n d D a r w i s h , H . : T h e v i t a m i n D s y s t e m , I n : K i d n e y I n t e r n a t i o n a l , V o l . 3 8 , ( S u p p l . 2 9 ) p p . S - 2 - S - 8 , 1 9 9 0 . E v a n s , R . M . : T h e s t e r o i d a n d t h y r o i d h o r m o n e r e c e p t o r s u p e r f a m i l y . S c i e n c e , 2 4 0 : 8 8 9 - 8 9 5 , 1 9 8 8 . 2 1 8 F e l d m a n 0 F l e e t . l . ( 6 H a h u e h i . S A b 1 2 | H a m m e s S H a u s s l e r b ” H a u s s l e r S f ‘ C l H 3 U ‘ \ l 8 1 l I H e d l u n ‘ H s i e h F e l d m a n , D . : A n d r o g e n a n d v i t a m i n D r e c e p t o r g e n e p o l y m o r p h i s m s : t h e l o n g a n d S h o r t o f p r o s t a t e c a n c e r r i s k . J . N a t l . C a n c e r I n s t , 8 9 ( 2 ) : 1 0 9 - 1 1 1 , 1 9 9 7 . F l e e t , J . C . : V i t a m i n D r e c e p t o r s : N o t j u s t i n t h e n u c l e u s a n y m o r e . N u t r i t . R e v . 5 7 : 6 0 - 6 4 , 1 9 9 9 . H a b u c h i , T . , S u z u k i , T . , S a s a k i , R . , W a n g , L . , S a t o , K . , S a t o h , S . , A k a o , T . , T s u c h i y a , N . , S h i m o d a , N . , W a d a , Y . , K o i z u m i , A . , C h i l h a r a , J . , O g a w a , O . , a n d K a t o , T . : A s s o c i a t i o n o f v i t a m i n D r e c e p t o r g e n e p o l y m o r p h i s m w i t h p r o s t a t e c a n c e r a n d b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a i n a J a p a n e s e p o p u l a t i o n . C a n c e r R e s . , 6 0 : 3 0 5 - 3 0 8 , 2 0 0 0 . H a m m e s , S . R . : T h e f u r t h e r r e d e fi n i n g o f s t e r o i d - m e d i a t e d S i g n a l i n g . P r o c . N a t l . A c a d . S c i e n c e , 1 0 0 : 2 1 6 8 - 2 1 7 0 , 2 0 0 3 . H a u s s l e r , M . R . , a n d E v a n s , R . M . : T h e R X R h e t e r o d i m e r s a n d o r p h a n r e c e p t o r s . C e l l , 8 3 : 8 4 1 1 - 8 5 0 , 1 9 9 5 . H a u s s l e r , M . R . , J u r u t k a , P . W . , H s i e h , J - C . , T h o m p s o n , P . D . , H a u s s l e r , C . A . , S e l z n i c k , S . H . , R e m u s , L S , a n d W h i t fi e l d , G . K . : N u c l e a r v i t a m i n D r e c e p t o r : S t r u c t u r e - f u n c t i o n , p h o s p h o r y l a t i o n , a n d c o n t r o l o f g e n e t r a n s c r i p t i o n . I n : F e l d m a n , D . , G l o r i e u x , R H , a n d P i k e , J . W . ( e d s ) , V i t a m i n D , S a n D i e g o , A c a d e m i c P r e s s , p p . 1 0 5 - 1 2 5 , 1 2 4 1 p p . , 1 9 9 7 a . H a u s s l e r , M . R . , H a u s s l e r , C . A . , J u r u k t a , P . W . , T h o m p s o n , P . D . , H s i e h , J - C . , R e m u s , L . S . , S e l z n i c k , S H , a n d W h i t fi e l d , G . K . : T h e v i t a m i n D h o r m o n e a n d i t s n u c l e a r r e c e p t o r : m o l e c u l a r a c t i o n s a n d d i s e a s e s t a t e s . J . E n d o c r i n o l . , 1 5 4 : 8 5 7 - 8 7 3 , 1 9 9 7 b . H e d l u n d , T . E . , M o f f a t t , K . A . , U s k o k o v i c , M . R . , a n d M i l l e r , G . J . : T h r e e s y n t h e t i c v i t a m i n D a n a l o g u e s i n d u c e p r o s t a t e - s p e c i fi c a c i d p h o s p h a t a s e a n d p r o s t a t e - s p e c i fi c a n t i g e n w h i l e i n h i b i t i n g t h e g r o w t h o f h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s i n a v i t a m i n D r e c e p t o r - d e p e n d e n t f a s h i o n . C l i n . C a n c e r R e s . , 3 : 1 3 3 1 - 1 3 3 8 , 1 9 9 7 . H s i e h , T - C . , N g , C - Y . , M a l l o u h , C . , T a z a k i , H . , a n d W u , J . M . : R e g u l a t i o n o f g r o w t h , P S A / P A P a n d a n d r o g e n r e c e p t o r e x p r e s s i o n b y l o t , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n t h e a n d r o g e n - d e p e n d e n t L N C a P c e l l s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n , 2 2 3 : 1 4 1 - 1 4 6 , 1 9 9 6 . H s i e h , T - C . , a n d W u , J . M . : I n d u c t i o n o f a p o p t o s i s a n d a l t e r e d n u c l e a r / c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f t h e a n d r o g e n r e c e p t o r a n d p r o s t a t e - s p e c i fi c a n t i g e n b y l o t , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n a n d r o g e n - r e s p o n s i v e L N C a P c e l l s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n , 2 3 5 : 5 3 9 - 5 4 4 , 1 9 9 7 . 2 1 9 I n g l e s : I n g l e s , S . A . , R o s s , R . K . , Y u , M . C . , I r v i n e , R . A . , L a P e r a , G . , H a i l e , R . W . , a n d C o e t z e e , G . A . : A s s o c i a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r r i s k w i t h g e n e t i c p o l y m o r p h i s m s i n v i t a m i n D r e c e p t o r a n d a n d r o g e n r e c e p t o r . J . N a t l . C a n c e r I n s t , 8 9 ( 2 ) : 1 6 6 - 1 7 0 , 1 9 9 7 . I n g l e s , S . A . , C o e t z e e , G . A . , R o s s , R . K . , H e n d e r s o n , B . E . , K o l o n e l , L . N . , C r o c i t t o , L . , W a n g , W . , a n d H a i l e , R . W . : A s s o c i a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r w i t h v i t a m i n D r e c e p t o r h a p l o t y p e s i n A f r i c a n - A m e r i c a n s . C a n c e r R e s . , 5 8 : 1 6 2 0 - 1 6 2 3 , 1 9 9 8 . I s s a , L . L . , L e o n g , G . M . , a n d E i s m a n , J . A . : M o l e c u l a r m e c h a n i s m o f v i t a m i n D r e c e p t o r a c t i o n . I n fl a m m . R e s . 4 7 : 4 5 1 - 4 7 5 , 1 9 9 8 . K i m , R . H . , L i , J . J . , O g a t a , Y . , Y a m a u c h i , M . , F r e e d m a n , L P , a n d S o d e k , J . : I d e n t i fi c a t i o n o f a v i t a m i n D 3 - r e s p o n s e e l e m e n t t h a t o v e r l a p s a u n i q u e i n v e r t e d T A T A b o x i n t h e r a t b o n e S i a l o p r o t e i n g e n e . B i o c h e m . J . 3 1 8 : 2 1 9 - 2 2 6 , 1 9 9 6 . K i r b y , R . S . , C h r i s t m a s , T . J . , a n d B r a w e r , M . : E p i d e m i o l o g y a n d n a t u r a l h i s t o r y o f p r o s t a t e c a n c e r , I n : P r o s t a t e c a n c e r , L o n d o n , M o s b y , p p . 2 3 - 3 1 , 1 7 0 p p . , 1 9 9 6 . M a c D o n a l d , P . N . : M o l e c u l a r b i o l o g y o f t h e v i t a m i n D r e c e p t o r . I n : H o l i c k , M . F . ( e d ) V i t a m i n D : p h y s i o l o g y , m o l e c u l a r b i o l o g y , a n d c l i n i c a l a p p l i c a t i o n s , N e w J e r s e y , H u m a n a P r e s s , p p . 1 0 9 - 1 2 8 , 4 5 8 p p . , 1 9 9 9 . M a n g e l s d o r f , D J . a n d E v a n s , R . M . : T h e R X R h e t e r o d i m e r s a n d o r p h a n r e c e p t o r s . C e l l , 8 3 : 8 4 1 - 8 5 0 , 1 9 9 5 . M a n g e l s d o r f , D . J . , T h u m m e l , C . , B e a t o , M . , H e r r l i c h , P . , S c h u t z , G . , U m e s o n o , K . , B l u m b e r g , B . , K a s t n e r , R , M a r k , M . , C h a m b o n , P . , a n d E v a n s , R . M . : T h e n u c l e a r r e c e p t o r s u p e r f a m i l y : T h e s e c o n d d e c a d e . C e l l , 8 3 : 8 3 5 - 8 3 9 , 1 9 9 5 . M c D o n n e l l , D . P . , S c o t t , R . A . , K e m e r , R . A . , O ’ M a l l e y , B . W . , a n d P i k e , J . W . : F u n c t i o n a l d o m a i n s o f t h e h u m a n v i t a m i n D r e c e p t o r r e g u l a t e o s t e o c a l c i n g e n e e x p r e s s i o n . M o l . E n d o c r i n o l . , 3 : 6 3 5 - 6 4 4 , 1 9 8 9 . M i l l e r , G . J . , S t a p l e t o n , G . E . , F e r r a r a , J . A . , L u c i a , M . S . , P fi s t e r , S . , H e d l u n d , T . E . , a n d U p a d h y a , P . : T h e h u m a n p r o s t a t i c c a r c i n o m a c e l l l i n e L N C a P e x p r e s s e s b i o l o g i c a l l y a c t i v e , s p e c i fi c r e c e p t o r s f o r l o t , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . C a n c e r R e s . , 5 2 : 5 1 5 - 5 2 0 , 1 9 9 2 . N a k a j i m a , S . , H s i e h , J - C . , M a c D o n a l d , P . N . , G a l l i g a n , M . A . , H a u s s l e r , C . A . , W h i t fi e l d , G K , a n d H a u s s l e r , M . R . : T h e C - t e r m i n a l r e g i o n o f t h e v i t a m i n D r e c e p t o r i s e s s e n t i a l t o f o r m a c o m p l e x w i t h a r e c e p t o r a u x i l i a r y f a c t o r r e q u i r e d f o r h i g h a f fi n i t y b i n d i n g t o t h e v i t a m i n D - r e s p o n s i v e e l e m e n t . M o l . E n d o c r i n o l . , 8 : 1 5 9 - 1 7 2 , 1 9 9 4 . 2 2 0 N e m e - P i k e . . P r u f e r . P r u t ‘ e r . R a c z , , : S h O V x T Q l S O n e _ T _ N e m e r e , 1 . , S c h w a r t z , Z . , P e d r o z o , H . , S y l v i a , V . L . , D e a n , D D , a n d B o y a n , B . D . : I d e n t i fi c a t i o n o f a m e m b r a n e r e c e p t o r f o r 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 w h i c h m e d i a t e s r a p i d a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C . J . B o n e M i n . R e s . 1 3 : 1 3 5 3 - 1 3 5 9 , 1 9 9 8 . P i k e , J . W . : T h e v i t a m i n D r e c e p t o r a n d i t s g e n e . I n : F e l d m a n , D . , G l o r i e u x , F . H . , a n d P i k e , J . W . ( e d s ) , V i t a m i n D , S a n D i e g o , A c a d e m i c P r e s s , p p . 1 0 5 - 1 2 5 , 1 2 4 1 p p . , 1 9 9 7 . P r u f e r , K . a n d B a r s o n y , J . : R e t i n o i d X r e c e p t o r d o m i n a t e s t h e n u c l e a r i m p o r t a n d e x p o r t o f t h e u n l i g a n d e d v i t a m i n D r e c e p t o r . M o l . E n d o c r i n o l . 1 6 : 1 7 3 8 - 1 7 5 1 , 2 0 0 2 . P r u f e r , K . , R a c z , A . , L i n , G O , a n d B a r s o n y , B . : D i m e r i z a t i o n w i t h r e t i n o i d X r e c e p t o r s p r o m o t e s n u c l e a r l o c a l i z a t i o n a n d s u b n u c l e a r t a r g e t i n g o f v i t a m i n D r e c e p t o r s . J . B i o l . C h e m . 2 7 5 : 4 1 1 1 4 - 4 1 1 2 3 , 2 0 0 0 . R a c z , A . a n d B a r s o n y , J . : H o r m o n e - d e p e n d e n t t r a n s l o c a t i o n o f v i t a m i n D r e c e p t o r s i s l i n k e d t o t r a n s a c t i v a t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 7 4 : 1 9 3 5 2 - 1 9 3 6 0 , 1 9 9 9 . S k o w r o n s k i , R . J . , P e e h l , D . M . , a n d F e l d m a n , D . : V i t a m i n D a n d p r o s t a t e c a n c e r : 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 r e c e p t o r s a n d a c t i o n s i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s . E n d o c r i n o l o g y , 1 3 2 : 1 9 5 2 - 1 9 6 0 , 1 9 9 3 . S o n e , T . , K e m e r , S . , a n d P i k e , J . W . : V i t a m i n D r e c e p t o r i n t e r a c t i o n w i t h s p e c i fi c D N A : a s s o c i a t i o n a s a 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 - m o d u l a t e d h e t e r o d i m e r . J . B i o l . C h e m . , 2 6 6 : 2 3 2 9 6 - 2 3 3 0 5 , 1 9 9 1 . S u n n , K . L . , C o c k , T . A . , C r o f t s , L . A . , E i s m a n , J . A . , a n d G a r d i n e r , E . M . : N o v e l N - t e r m i n a l v a r i a n t o f h u m a n V D R . M o l . E n d o c r i n o l . 1 5 : 1 5 9 9 - 1 6 0 9 , 2 0 0 1 . T a y l o r , J . A . , H i r v o n e n , A . , W a t s o n , M . , P i t t m a n , G . , M o h l e r , J . L . , a n d B e l l , D . A . : A s s o c i a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r r i s k w i t h v i t a m i n D r e c e p t o r g e n e p o l y m o r p h i s m . C a n c e r R e s . , 5 6 : 4 1 0 8 - 4 1 1 0 , 1 9 9 6 . W e b b e r , M . M . , W a g h r a y , A . , a n d B e l l o , D . : P r o s t a t e - s p e c i fi c a n t i g e n , a s e r i n e p r o t e a s e , f a c i l i t a t e s h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l i n v a s i o n . C l i n . C a n c e r R e s . , 1 : 1 0 8 9 - 1 0 9 4 , 1 9 9 5 . Z h a o , X — Y . , L y , L . H . , P e e h l , D . M . , a n d F e l d m a n , D . : I n d u c t i o n o f a n d r o g e n r e c e p t o r b y l o t , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 a n d 9 - c i s r e t i n o i c a c i d i n L N C a P h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . E n d o c r i n o l o g y , 1 4 0 : 1 2 0 5 - 1 2 1 2 , 1 9 9 9 . Z h a o , X - Y . , P e e h l , D . M . , N a v o n e , N M . a n d F e l d m a n , D . : l o t , 2 5 d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n h i b i t s p r o s t a t e c a n c e r c e l l g r o w t h b y a n d r o g e n - d e p e n d e n t a n d a n d r o g e n - i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s . E n d o c r i n o l o g y , 1 4 1 : 2 5 4 8 - 2 5 5 6 , 2 0 0 0 . 2 2 1 Z o u , A . , E l g o r t , M . G . , a n d A l l e g r e t t o , E . A . : R e i n o i d X r e c e p t o r ( R X R ) l i g a n d s a c t i v a t e t h e h u m a n 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 - 2 4 - h y d r o x y l a s e p r o m o t e r v i a R X R h e t e r o d i m e r b i n d i n g t o t w o v i t a m i n D - r e s p o n s i v e e l e m e n t s a n d e l i c i t a d d i t i v e e f f e c t s w i t h 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . J . B i o l . C h e m . , 2 7 2 : 1 9 0 2 7 - 1 9 0 3 4 , 1 9 9 7 . 2 2 2 P a r t 1 1 O r i g i n a l R e s e a r c h 2 2 3 C h a n d C h a p t e r 8 C h o l e c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 3 ) M o d u l a t e s G r o w t h a n d I n v a s i o n , a n d U p - r e g u l a t e s N u c l e a r R e c e p t o r s a n d 2 5 - h y d r o x y l a s e ( C Y P 2 7 A 1 ) i n H u m a n P r o s t a t e C a n c e r C e l l s 2 2 4 e p l i l i i f l l a l C C ] , I ’ m u p c a n d C h O / f m a l i g t R \ \ ' P E n u d e m ; W a s u s e t 1 ' ) i n h i b i t d e c r e a s i n g a n d M W ) . e t T e c t s . b y m fi r m e r . T h a s s m j a t e d W A b s t r a c t P r o s t a t e c a n c e r i s t h e m o s t c o m m o n , n o n - S k i n , c a n c e r i n A m e r i c a n m e n . E p i d e m i o l o g i c a l e v i d e n c e s u g g e s t s a n i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e a n d m o r t a l i t y a n d s e r u m v i t a m i n D l e v e l s . V i t a m i n D i s s y n t h e s i z e d i n t h e s k i n u p o n e x p o s u r e t o u l t r a v i o l e t l i g h t ( U V ) a n d i t p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n . T h e O b j e c t i v e o f t h i s s t u d y w a s t o e x a m i n e t h e a b i l i t y o f C h o l e c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 3 ) t o i n h i b i t o r r e v e r s e c e l l u l a r c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n a n d i n v a s i o n a n d t o e x p l o r e i t s m e c h a n i s m o f a c t i o n . T h e R W P E 2 - W 9 9 , h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l l i n e , w h i c h f o r m s S l o w - g r o w i n g t u m o r s i n n u d e m i c e a n d m i m i c s t h e m a j o r i t y o f t h e p r i m a r y h u m a n p r o s t a t e c a n c e r s i n i t s b e h a v i o r , w a s u s e d f o r t h i s s t u d y . R e s u l t s S h o w t h a t C h o l e c a l c i f e r o l , a t p h y s i o l o g i c a l l e v e l s , c a n : i ) i n h i b i t a n c h o r a g e - d e p e n d e n t a n d - i n d e p e n d e n t g r o w t h ; i i ) i n d u c e d i f f e r e n t i a t i o n b y d e c r e a s i n g v i m e n t i n e x p r e s s i o n a n d i n c r e a s i n g P S A e x p r e s s i o n ; i i i ) d e c r e a s e M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y w i t h c o n c o m i t a n t d e c r e a s e i n m o t i l i t y a n d i n v a s i o n ; a n d i v ) e x e r t i t s e f f e c t s , b y u p - r e g u l a t i n g n u c l e a r r e c e p t o r s V D R , R X R S , a n d A R , i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . T h e s e r e s u l t s s h o w t h a t C h o l e c a l c i f e r o l h a s t h e a b i l i t y t o i n h i b i t c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h a m a l i g n a n t p h e n o t y p e . F u r t h e r m o r e , I d e m o n s t r a t e t h a t h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s 2 5 - h y d r o x y l a s e p r o t e i n ( C Y P 2 7 A 1 ) , t h e e n z y m e k n o w n t o c o n v e r t C h o l e c a l c i f e r o l t o 2 5 0 H D 3 a n d t h a t C Y P 2 7 A 1 i s u p - r e g u l a t e d b y C h o l e c a l c i f e r o l . T h e p r e s e n c e o f 2 5 - h y d r o x y l a s e i n h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s h a s n o t p r e v i o u s l y b e e n s h o w n . T h i s i s t h e fi r s t r e p o r t o f t h e p r e s e n c e o f t h i s e n z y m e i n h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s . T h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s , a t a r g e t c e l l t y p e f o r v i t a m i n D , h a v e t h e n e c e s s a r y e n z y m e s a n d r a r e a b i l i W t o 2 2 5 l o c a H } ' e fi e c t s c a l c i t r i r e e H u l a r c h c d e e a . p r e x e n t i l o c a l l y c o n v e r t C h o l e c a l c i f e r o l t o t h e a c t i v e h o r m o n e c a l c i t r i o l . A c o m p a r i s o n o f t h e e f f e c t s o f t h e t w o a g e n t s S h o w s t h a t C h o l e c a l c i f e r o l h a s e f f e c t s s i m i l a r t o t h o s e o f c a l c i t r i o l o n g r o w t h , M M P a c t i v i t y , a n d V D R . B e c a u s e C h o l e c a l c i f e r o l c a n i n h i b i t c e l l u l a r c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n a n d i n v a s i o n , I p r o p o s e t h a t C h o l e c a l c i f e r o l m a y b e a n e f f e c t i v e a g e n t f o r t r e a t m e n t , a n d f o r s e c o n d a r y a n d t e r t i a r y p r e v e n t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . 2 2 6 p o s s i b l e I n P r o : t T o n i ( ‘ 3 3 0 n - 3 0 0 - 1 a d y a n r n e e d f t O b \ i o u : I n t r o d u c t i o n P r o s t a t e c a n c e r i s t h e m o s t c o m m o n n o n - s k i n c a n c e r a n d s e c o n d l e a d i n g c a u s e o f d e a t h f r o m c a n c e r i n A m e r i c a n m e n . I t i s e x p e c t e d t h a t a p p r o x i m a t e l y 2 3 0 , 0 0 0 n e w c a s e s ( 3 3 % o f a l l n e w c a n c e r c a s e s ) a n d 2 9 , 5 0 0 d e a t h s ( 1 0 % o f a l l c a n c e r d e a t h s ) w i l l o c c u r i n 2 0 0 4 ( C a n c e r F a c t s a n d F i g u r e s , A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y , 2 0 0 4 ) . D e s p i t e r e c e n t a d v a n c e s i n t h e d e t e c t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r , i t s e x a c t c a u s e s t i l l r e m a i n s a m y s t e r y . T h e n e e d f o r n e w , e f f e c t i v e t h e r a p i e s f o r t h e p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r i s o b v i o u s . B e c a u s e o f t h e 2 0 - 3 0 y e a r l a t e n c y p e r i o d b e f o r e i t s m a n i f e s t a t i o n , i t m a y b e p o s s i b l e t o p r e v e n t t h e d e v e l o p m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r . P r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e r a t e s r i s e w i t h i n c r e a s i n g a g e , m a k i n g t h i s d i s e a s e a n e v e n g r e a t e r p r o b l e m w i t h t h e i n c r e a s i n g l i f e e x p e c t a n c y . S e v e r a l f a c t o r s h a v e b e e n s u g g e s t e d a s c o n t r i b u t i n g t o p r o s t a t e c a n c e r r i s k i n c l u d i n g a g e , r a c e , d i e t , a n d g e o g r a p h y . I n t e r e s t i n g l y , a l l o f t h e s e f a c t o r s a r e a s s o c i a t e d w i t h v i t a m i n D s y n t h e s i s . F u r t h e r m o r e , t h e r e i s e v i d e n c e t o s u g g e s t a c o r r e l a t i o n b e t w e e n p r o s t a t e c a n c e r a n d v i t a m i n D l e v e l s . F i r s t c o n s i d e r t h e f a c t o r o f a g e . E l d e r l y m e n m a y r e c e i v e l e s s e x p o s u r e t o s u n l i g h t c o m p a r e d t o y o u n g e r m e n ( L a w s o n e t a l . , 1 9 7 9 ) a n d t h e i r a b i l i t y t o s y n t h e s i z e v i t a m i n D 3 a l s o d e c l i n e s w i t h a g e ( H a l l o r a n a n d P o r t a l e , 1 9 9 7 ; H o l i c k e t a l . , 1 9 8 7 ) . P r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e i n c r e a s e s w i t h a g e . A s t e a d y r i s e o c c u r s a f t e r t h e a g e o f 5 0 b u t i t i s r a r e u n d e r t h e a g e o f 5 0 ( W e b b e r e t a l . , 1 9 8 8 ) a n d 8 0 % o f a l l p r o s t a t e c a n c e r s a r e f o u n d i n m e n o v e r t h e a g e o f 6 5 ( S c h w a r t z a n d H u l k a , 1 9 9 0 ) . T h e s e c o n d f a c t o r i s r a c e . A f r i c a n A m e r i c a n m e n h a v e h i g h e r i n c i d e n c e o f m o r e a d v a n c e d p r o s t a t e c a n c e r t h a n t h e i r C a u c a s i a n A m e r i c a n c o u n t e r p a r t s ( S c h w a r t z a n d H u l k a , 1 9 9 0 ) . A b s o r p t i o n o f u l t r a v i o l e t ( U V ) l i g h t b y t h e s k i n i s e s s e n t i a l f o r v i t a m i n D s y n t h e s i s . C o m p a r e d t o C a u c a s i a n 2 2 7 A m e r i \ K ' t h l ‘ i h a \ e h 3 1 . . 1 9 P S A s c t h a t b l a t h e \ ‘ a r i n c i d e n T h e i m K u n h a r { A C C O U n t m 3 } b e V i t a m i n l n d ‘ L - ‘ C n c { 1 5 1 1 a n d t h e L ' s A m e r i c a n m e n , A f r i c a n A m e r i c a n m e n h a v e m u c h h i g h e r m e l a n i n c o n t e n t i n t h e i r s k i n , w h i c h r e d u c e s t h e i r e f fi c i e n c y f o r v i t a m i n D 3 s y n t h e s i s . A f r i c a n A m e r i c a n m e n t e n d t o h a v e h i g h e r l e v e l s a n d g r e a t e r P S A d e n s i t y t h a n d o a g e - m a t c h e d w h i t e m e n ( A b d a l l a e t a l . , 1 9 9 8 ; E a s t h a m e t a l . , 1 9 9 8 ) . C o n s i d e r i n g t h e s t r o n g c o r r e l a t i o n b e t w e e n e l e v a t e d P S A s e r u m l e v e l s a n d p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e , t h i s i s a g o o d i n d i c a t o r o f t h e p o s s i b i l i t y t h a t b l a c k m e n m a y b e p r e d i s p o s e d t o p r o s t a t e c a n c e r d e v e l o p m e n t . S i m i l a r l y , e v e n w i t h t h e v a r i a t i o n i n i n c i d e n c e b e t w e e n s p e c i fi c A s i a n - A m e r i c a n e t h n i c i t i e s , p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e i n e a c h O f t h e s e g r o u p s i s s i g n i fi c a n t l y l e s s t h a n i t i s i n w h i t e A m e r i c a n m e n . T h e i n c i d e n c e r a t e f o r J a p a n e s e m e n i s 1 / 2 0 t h a t o f A m e r i c a n m e n ( H a e n s z e l a n d K u r i h a r a , 1 9 6 8 ) . G e n e t i c p o l y m o r p h i s m i n t h e v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) g e n e c o u l d a c c o u n t f o r t h e s e d i f f e r e n c e s . T h e e f f e c t o f V D R p o l y m o r p h i s m o n p r o s t a t e c a n c e r r i s k m a y b e t h e r e s u l t o f d i f f e r e n t i a l a c t i v i t y o f t h e v a r i a n t V D R a l l e l e s i n t r a n s a c t i v a t i o n o f v i t a m i n D t a r g e t g e n e s . D i f f e r e n c e s i n d i e t c o u l d a l s o c o n t r i b u t e t o t h e s e d i f f e r e n c e s . I n d i g e n o u s J a p a n e s e m e n , w h o h a v e l o w c l i n i c a l p r o s t a t e c a n c e r r a t e , h a v e a d i e t r i c h i n fi s h a n d fi s h O i l s , w h i c h c o n t a i n h i g h l e v e l s o f v i t a m i n D . H o w e v e r , J a p a n e s e m i g r a n t s t o t h e U S , w h o a d o p t a W e s t e r n d i e t , S h o w a s i g n i fi c a n t i n c r e a s e i n p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e ( H a e n z e l a n d K u r i h a r a , 1 9 6 8 ) . N e x t , c o n s i d e r t h e f a c t o r o f g e o g r a p h y . E p i d e m i o l o g i c a l s t u d i e s s h o w a g e o g r a p h i c r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e a n d m o r t a l i t y r a t e s a n d U V r a d i a t i o n l e v e l s . U l t r a v i o l e t r a d i a t i o n i s e s s e n t i a l f o r t h e s y n t h e s i s o f v i t a m i n D i n t h e s k i n . N i n e t y t o 1 0 0 % o f a h u m a n ’ s v i t a m i n D r e q u i r e m e n t c o m e s f r o m e x p o s u r e t o s u n l i g h t ( H o l i c k , 2 0 0 2 ) . W h i t e m e n w h o l i v e i n s o u t h e r n l a t i t u d e s , w h e r e U V r a d i a t i o n l e v e l s a r e h i g h e r , h a v e a l e s s e r r i s k o f p r o s t a t e c a n c e r t h a n t h o s e w h o l i v e i n n o r t h e r n 2 2 8 l a t i t u d p r o s t a t n o r t h e r r a t e s a , C e n t r a l A f r i c a n H e s h m a s o u t h e r r l l i C S C g : P e o p l e \ \ l a t i t u d e s . I n w h i t e m e n i n t h e U n i t e d S t a t e s , t h e r e i s a s t r o n g i n v e r s e a s s o c i a t i o n b e t w e e n p r o s t a t e c a n c e r m o r t a l i t y r a t e s a n d U V r a d i a t i o n l e v e l s . M o r t a l i t y r a t e s a r e h i g h e r i n n o r t h e r n t i e r e d s t a t e s c o m p a r e d t o t h e s t a t e s i n t h e s o u t h e r n p a r t o f t h e c o u n t r y . M o r t a l i t y r a t e s a r e h i g h i n N o r t h A m e r i c a a n d n o r t h w e s t E u r o p e b u t a r e l o w i n A f r i c a a n d i n C e n t r a l a n d S o u t h A m e r i c a ( H a n c h e t t e a n d S c h w a r t z , 1 9 9 2 ; W e b b e r e t a l . , 1 9 8 8 ) . N a t i v e A fi i c a n m e n h a v e l o w e r p r o s t a t e c a n c e r r a t e s t h a n A f r i c a n A m e r i c a n m e n ( K o v i a n d H e s h m a t , 1 9 7 3 ) . I n a l l t h e s e c a s e s , t h e c o u n t r i e s , o r p a r t s o f c o u n t r i e s , l o c a t e d i n t h e s o u t h e r n l a t i t u d e s s h o w l o w e r p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e a n d / o r m o r t a l i t y r a t e s . A l l o f t h e s e g e o g r a p h i c l o c a t i o n s r e c e i v e h i g h e r l e v e l s o f U V r a d i a t i o n a n d , t h e r e f o r e , t h e p e o p l e w h o l i v e i n t h e s e r e g i o n s a r e a b l e t o s y n t h e s i z e h i g h e r l e v e l s o f v i t a m i n D 3 . S c a n d i n a v i a n c o u n t r i e s ( i . e . F i n l a n d a n d N o r w a y ) h a v e h o m o g e n o u s p o p u l a t i o n s a n d a r e s p r e a d o v e r l a r g e l a t i t u d i n a l r a n g e s . T h i s m a k e s t h e m g o o d c a n d i d a t e s f o r e p i d e m i o l o g i c a l s t u d i e s i n v o l v i n g U V r a d i a t i o n l e v e l s . 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 ( 2 5 0 H D 3 ) i s c o n s i d e r e d t o b e t h e b e s t i n d i c a t o r o f v i t a m i n D s t a t u s i n h u m a n s . A c a s e - c o n t r o l s t u d y o f a p p r o x i m a t e l y 1 9 , 0 0 0 m i d d l e - a g e d F i n n i s h m e n d e m o n s t r a t e d t h a t s e r u m l e v e l s o f 2 5 0 H D 3 w e r e i n v e r s e l y r e l a t e d t o p r o s t a t e c a n c e r r i s k a n d d i r e c t l y r e l a t e d t o a g e a t d i a g n o s i s o f c l i n i c a l p r o s t a t e c a n c e r ( A h o n e n e t a l . , 2 0 0 0 a ) . A t h i g h e s t r i s k w e r e m e n y o u n g e r t h a n 5 2 y e a r s w h o h a d l o w 2 5 0 H D 3 s e r u m c o n c e n t r a t i o n u p o n e n t r y i n t o t h e s t u d y . I t w a s s u g g e s t e d t h a t t h e a l m o s t d i s a p p e a r a n c e o f r i s k d u e t o l o w 2 5 0 H D 3 l e v e l s i n o l d e r m e n a t e n t r y m i g h t b e i n d e p e n d e n t l y d u e t o t h e d e c r e a s e i n a n d r o g e n l e v e l s d u r i n g a n d r o p a u s e . T h e a p p e a r a n c e o f c l i n i c a l p r o s t a t e c a n c e r w a s d e l a y e d b y a l m o s t t w o y e a r s i n m e n w i t h h i g h e r l e v e l s o f 2 5 0 H D 3 . T h e m e n w i t h l o w 2 5 0 H D 3 l e v e l s a n d y o u n g e r a t e n t r y S h o w e d a n i n c r e a s e d r i s k o f n o n - l o c a l i z e d p r o s t a t e c a n c e r , s u g g e s t i n g 2 2 9 t h a t V I I I i n v a s i o n s t a g e s 1 i S l U L l } ' t h ‘ s e a s o n C ( s u m m e r c o l o n c a r a t t h e l i t v i t a m i n C A t c a n c e r 3 3 h i g h e r i n l D m e t a b o l C O l ' T C l a l i O n t h a t v i t a m i n D 3 m a y b e i n v o l v e d i n t h e p r e v e n t i o n o r i n h i b i t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t v i t a m i n D h a s b e n e fi c i a l e f f e c t s a t a l l s t a g e s ( i n i t i a t i o n , p r o m o t i o n , a n d p r o g r e s s i o n ) o f p r o s t a t e c a n c e r d e v e l o p m e n t . A S i m i l a r s t u d y d o n e i n N o r w a y s h o w e d a s i g n i fi c a n t v a r i a t i o n i n c a s e f a t a l i t y d e p e n d i n g o n t h e s e a s o n o f d i a g n o s i s . D i a g n o s e s d u r i n g t h e s e a s o n s w i t h h i g h e s t l e v e l s o f v i t a m i n D ( s u m m e r a n d f a l l ) w e r e f o l l o w e d b y t h e h i g h e s t s u r v i v a l r a t e s i n p r o s t a t e , b r e a s t , a n d c o l o n c a n c e r s ( R o b s a h m e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t h i g h l e v e l s o f v i t a m i n D a t t h e t i m e o f d i a g n o s i s o f t h e s e c a n c e r s m a y h e l p i m p r o v e t h e p r o g n o s e s a n d t h a t v i t a m i n D m a y b e i m p o r t a n t i n p r e v e n t i n g t h e d e a t h f r o m t h e s e c a n c e r s . A f r i c a n A m e r i c a n m e n h a v e t h e s a m e i n c i d e n c e o f l a t e n t , n o n — i n v a s i v e p r o s t a t e c a n c e r a s w h i t e m e n . H o w e v e r , t h e i n c i d e n c e o f a g g r e s s i v e , m e t a s t a s i z i n g c a n c e r i s h i g h e r i n b l a c k m e n t h a n i n w h i t e m e n ( B r e s l o w e t a l . , 1 9 7 7 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t v i t a m i n D m e t a b o l i t e l e v e l s m a y b e r e d u c e d i n m e n w i t h m o r e a g g r e s s i v e p r o s t a t e c a n c e r . T h i s c o r r e l a t i o n w a s s u b s t a n t i a t e d w h e n s e r u m l e v e l s o f c a l c i t r i o l w e r e s h o w n t o b e g o o d p r e d i c t o r s o f p r o s t a t e c a n c e r r i s k ( C o r d e r e t a l . , 1 9 9 3 ) . I n m e n w i t h h i g h e r l e v e l s o f s e r u m c a l c i t r i o l t h e r e w a s a d e c r e a s e i n p r o s t a t e c a n c e r r i s k , a l a r g e r e d u c t i o n i n t h e r i s k f o r p a l p a b l e , d i s s e m i n a t e d , a n d a n a p l a s t i c t u m o r s , a n d f e w e r a n a p l a s t i c t u m o r s . T h e s e e f f e c t s w e r e d i s t i n c t f r o m c a l c i u m a n d p h o s p h a t e l e v e l s a n d p o o r k i d n e y f u n c t i o n , a l l o f w h i c h r e g u l a t e t h e l e v e l s o f c a l c i t r i o l i n t h e b o d y ( C o r d e r e t a l . , 1 9 9 3 ) . C h i l d h o o d s u n b u r n , s u n b a t h i n g s c o r e , e x t e n t o f e x p o s u r e t o U V r a d i a t i o n , a n d a b i l i t y o f t h e s k i n t o b e c o m e p i g m e n t e d u p o n U V e x p o s u r e a r e a l l a s s o c i a t e d w i t h r i s k f o r d e v e l o p i n g p r o s t a t e c a n c e r . W h e n c o m p a r e d t o c a s e s w i t h h i g h U V r a d i a t i o n e x p o s u r e , l o w U V e x p o s u r e r e s u l t e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r a t a y o u n g e r m e d i a n a g e ( B o d i w a l a e t a l . , 2 3 0 \ " l l d l ‘ . 2 0 0 3 ; L u s c o m b e e t a l . , 2 0 0 1 ) . A l t h o u g h m u l t i p l e f a c t o r s f o r p r o s t a t e c a n c e r i n c i d e n c e a n d m o r t a l i t y a r e l i k e l y , e a c h o f t h e f a c t o r s l i s t e d a b o v e c a n b e c o r r e l a t e d w i t h c h a n g e s i n v i t a m i n D s y n t h e s i s a n d v i t a m i n D l e v e l s . V i t a m i n D 3 i s i m p o r t a n t f o r n o r m a l d e v e l o p m e n t , g r o w t h , d i f f e r e n t i a t i o n a n d m a i n t e n a n c e o f a h e a l t h y s k e l e t o n . V i t a m i n D 3 i s b e s t k n o w n f o r i t s r o l e s i n c a l c i u m a n d p h o s p h o r u s h o m e o s t a s i s a n d i n m a i n t a i n i n g s k e l e t a l i n t e g r i t y . S y n t h e s i s i n t h e s k i n i s t h e m a i n s o u r c e o f v i t a m i n D i n t h e b o d y b u t i t c a n a l s o b e o b t a i n e d f r o m t h e d i e t ( H o l i c k , 1 9 9 0 ) . U l t r a v i o l e t r a d i a t i o n i s e s s e n t i a l f o r t h e i n v i v o s y n t h e s i s o f v i t a m i n D 3 . S y n t h e s i s b e g i n s i n t h e s k i n w i t h 7 - d e h y d r o c h o l e s t e r o l . A c c o r d i n g t o t h e t r a d i t i o n a l m o d e l f o r v i t a m i n D 3 s y n t h e s i s ( F i g u r e 8 - 1 ) , u p o n e x p o s u r e t o u l t r a v i o l e t ( U V ) l i g h t f r o m t h e s u n , 7 - d e h y d r o c h o l e s t e r o l i s c o n v e r t e d t o p r e - v i t a m i n D 3 . P r e - v i t a m i n D 3 g e t s c o n v e r t e d , t h r o u g h a h e a t c a t a l y z e d r e a c t i o n , t o C h o l e c a l c i f e r o l [ v i t a m i n D 3 ] . C h o l e c a l c i f e r o l i s t r a n s p o r t e d t o t h e l i v e r , v i a t h e v i t a m i n D b i n d i n g p r o t e i n , w h e r e i t i s c o n v e r t e d t o 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 [ 2 5 0 H D 3 ] b y t h e 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e . 2 5 0 H D 3 t h e n g e t s t r a n s p o r t e d t o t h e k i d n e y w h e r e t h e e n z y m e l o t - h y d r o x y l a s e c o n v e r t s i t t o c a l c i t r i o l [ 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ] . F i g u r e 8 - 2 s h o w s t h e m o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f t h e v i t a m i n D m e t a b o l i t e s a n d t h e e n z y m e s i n v o l v e d i n t h e s y n t h e s i s o f c a l c i t r i o l . C a l c i t r i o l i s t h e m o s t b i o l o g i c a l l y a c t i v e f o r m o f v i t a m i n D a n d i t b i n d s t o t h e v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) i n t a r g e t t i s s u e s . V D R t h e n f o r m s h e t e r o d i m e r s w i t h r e t i n o i d X r e c e p t o r s ( R X R S ) t o e x e r t m o s t o f t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s o f v i t a m i n D . T h e V D R i s e x p r e s s e d i n n o r m a l p r o s t a t i c t i s s u e , s u g g e s t i n g a r o l e f o r v i t a m i n D i n t h e p r o s t a t e ( G r o s s e t a l . , 1 9 9 7 ; K i v i n e v a e t a l . , 1 9 9 8 ; P e e h l e t a l . , 1 9 9 4 ) . 2 3 1 F i g u r e 8 V C h o l i e t c a a m l i c n i D f e 3 r o l 2 5 0 H 0 3 1 2 C 5 a ( l c 0 i H t ) r i ’ o D l 3 ’ l n f ‘ \ \ \ U V l i g h t S k i l l L i v e r 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 - d e h y d r o c h o l e s t e r o l - > P r e - V i t a m i n D 3 - ) V i t a m i n D D i e t 2 5 ( o m n , T a r g e t T i s s u e s 1 3 5 ( 0 H ) , D , K i d n e y F i g u r e 8 - 1 : T r a d i t i o n a l m o d e l o f t h e i n v i v o s y n t h e s i s o f v i t a m i n D . M U V 1 1 9 M ” H e a l Z S - h y d r o x y l a s e 1 a 4 1 “ , , ” t h 7 - d e h y d r o c h o l e s t e r o l p g w t a m o , ( C Y P 2 7 A 1 ) F i g u r e 8 - 2 : M o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f v i t a m i n D m e t a b o l i t e s a n d e n z y m e s i n v o l v e d i n t h e s y n t h e s i s o f c a l c i t r i o l . 2 3 2 T h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n n o r m a l p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s a n d p r o s t a t e c a n c e r c e l l s a r e w e l l d o c u m e n t e d . C a l c i t r i o l h a s a n t i p r o l i f e r a t i v e a n d p r o - d i f f e r e n i a t i n g e f f e c t s o n n o r m a l p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s a n d p r o s t a t e c a n c e r c e l l s ( G r o s s e t a l . , 1 9 9 8 ; K o n e t y e t a l . , 1 9 9 6 ; K r i l l e t a l . , 1 9 9 9 ; M i l l e r e t a l . , 1 9 9 2 ; M i l l e r e t a l . , 1 9 9 5 ; P e e h l e t a l . , 1 9 9 4 ; Z h a o e t a l . , 2 0 0 0 ) . C a l c i t r i o l a l s o i n h i b i t s i n v a s i o n b y p r o s t a t e c a n c e r c e l l s i n v i t r o a n d i n v i v o ( L o k e s h w a r e t a l . , 1 9 9 9 ; S c h w a r t z e t a l , 1 9 9 7 ) . S i m i l a r e f f e c t s w e r e s e e n i n s e v e r a l o t h e r n o r m a l a n d m a l i g n a n t c e l l t y p e s i n c l u d i n g b r e a s t , e n d o t h e l i a l a n d c o l o n c e l l s , t r e a t e d w i t h c a l c i t r i o l ( B e m a r d i e t a l . , 2 0 0 2 ; H a n s e n e t a l . , 1 9 9 4 ; J e n s e n e t a l . , 2 0 0 1 ; S h a b a h a n g e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e s e d a t a s u p p o r t t h e u s e o f c a l c i t r i o l i n p r o s t a t e c a n c e r t h e r a p y . H o w e v e r , d e s p i t e t h e e f f e c t i v e n e s s o f c a l c i t r i o l , i t s c l i n i c a l u s e i s g e n e r a l l y a c c o m p a n i e d b y e l e v a t e d s e r u m c a l c i u m ( h y p e r c a l c e m i a ) . T h e r e f o r e , l e s s c a l c e m i c a l t e r n a t i v e s t o c a l c i t r i o l , i n c l u d i n g n a t u r a l p r e c u r s o r s t o c a l c i t r i o l a n d v i t a m i n D a n a l o g s , a r e b e i n g s o u g h t . I t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s p o s s e s s l o t - h y d r o x y l a s e a c t i v i t y n e e d e d t o s y n t h e s i z e c a l c i t r i o l f r o m 2 5 0 H D 3 ( S c h w a r t z e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h e r e f o r e , i n v e s t i g a t o r s h a v e u s e d 2 5 0 H D 3 , w h i c h h a s a l o w e r c a l c e m i c e f f e c t , a s a n a l t e r n a t i v e t o c a l c i t r i o l ( B a r r e t o e t a l . , 2 0 0 0 ; S k o w r o n s k i e t a l . , 1 9 9 5 ) . 2 5 0 H D 3 i n h i b i t s t h e p r o l i f e r a t i o n o f p r i m a r y p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s i n a m a n n e r S i m i l a r t o c a l c i t r i o l ( B a r e t t o e t a l . , 2 0 0 0 ) . I r e c e n t l y d i s c o v e r e d 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e e x p r e s s i o n i n t w o h u m a n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l l i n e s , R W P E - l a n d R W P E 2 - W 9 9 . T h i s i s t h e fi r s t r e p o r t e d e v i d e n c e o f t h e p r e s e n c e o f t h i s e n z y m e i n a n y t i s s u e t y p e o t h e r t h a n l i v e r , k i d n e y a n d k e r a t i n o c y t e s . T h e c a p a c i t y o f p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s t o e x p r e s s 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e s u g g e s t s t h a t l o c a l p r o d u c t i o n o f c a l c i t r i o l c a n o c c u r i n t h e s e c e l l s . L o c a l p r o d u c t i o n o f c a l c i t r i o l i s 2 3 3 b e l i e v e d t o h a v e b i o l o g i c a l i m p o r t a n c e s o t h a t i t m a y r e g u l a t e c e l l g r o w t h i n a t i s s u e - s p e c i fi c m a n n e r . T h i s c o u l d p o t e n t i a l l y d e c r e a s e t h e r i s k o f c a n c e r d e v e l o p m e n t a n d p r o g r e s s i o n i n t i s s u e s p o s s e s s i n g 2 5 - h y d r o x y l a s e a n d l o r - h y d r o x y l a s e , t w o e n z y m e s n e c e s s a r y f o r t h e s y n t h e s i s o f c a l c i t r i o l . T h i s l e d m e t o e x p l o r e t h e e f fi c a c y o f C h o l e c a l c i f e r o l i n p r o s t a t e c a n c e r p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t , w h i c h m a y b e s i m i l a r t o t h a t o f 2 5 0 H D 3 a n d c a l c i t r i o l . T h e R W P E 2 - W 9 9 h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e , u s e d i n t h i s s t u d y , w a s d e r i v e d i n t h e l a b o r a t o r y o f D r . M u k t a M . W e b b e r ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ; W e b b e r e t a l . , 1 9 9 7 ) . I t b e l o n g s t o a u n i q u e f a m i l y o f c e l l l i n e s i n w h i c h e a c h m e m b e r m i m i c s a d i f f e r e n t s t a g e i n v o l v e d i n t h e p r o c e s s o f p r o s t a t e c a r c i n o g e n e s i s . A l l m e m b e r s w e r e d e r i v e d f r o m t h e p a r e n t a l R W P E - l h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s . T h e R W P E - l c e l l s , a l t h o u g h i m m o r t a l i z e d , a r e n o t t u m o r i g e n i c a n d S h o w m a n y c h a r a c t e r i s t i c s o f n o r m a l p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s . H o w e v e r , b e c a u s e t h e y a r e i m m o r t a l i z e d , t h e y m a y a l s o b e u s e d a s a p r e - n e o p l a s t i c c e l l m o d e l a n d a r e i d e a l f o r t h e s t u d i e s o n e a r l y s t a g e s o f p r o s t a t e c a r c i n o g e n e s i s a n d f o r i n v e s t i g a t i n g n e w a g e n t s f o r c h e m o p r e v e n t i o n ( s e e c h a p t e r 9 ) . O n t h e o t h e r h a n d , t h e R W P E 2 - W 9 9 c e l l l i n e i s t u m o r i g e n i c , f o r m s s l o w - g r o w i n g t u m o r s , i s i n v a s i v e a n d , t h e r e f o r e , m i m i c s t h e b e h a v i o r o f t h e m a j o r i t y o f p r o s t a t e c a n c e r s i n m e n . T h u s , i t i s a u s e f u l m o d e l f o r s t u d y i n g a g e n t s t h a t c o u l d b e u s e d f o r t h e t r e a t m e n t o f l e s s a g g r e s s i v e p r o s t a t e c a n c e r . T h e p r e s e n t s t u d y w a s c o n d u c t e d t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f C h o l e c a l c i f e r o l o n t h e R W P E 2 - W 9 9 h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . T o t h e b e s t o f m y k n o w l e d g e , t h e o n l y o t h e r s t u d y t h a t h a s e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f C h o l e c a l c i f e r o l o n a n y n o r m a l o r c a n c e r c e l l l i n e s t o d a t e e x a m i n e d t h e e f f e c t s o n g r o w t h a n d b i n d i n g a f fi n i t y t o V D R i n n o r m a l h u m a n 2 3 4 k e r a t i n o c y t e s ( C h e n e t a l . , 2 0 0 0 ) . I s o u g h t t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f C h o l e c a l c i f e r o l o n g r o w t h , i n v a s i o n , m o t i l i t y , m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e a c t i v i t y , a n d v i m e n t i n e x p r e s s i o n , u s i n g s e p a r a t e i n v i t r o a s s a y s . I n o r d e r t o e x p l o r e t h e m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f c h o l e c a l c i f e r o l , I a l s o e x a m i n e d t h e e x p r e s s i o n o f v i t a m i n D r e c e p t o r a n d R X R S , w i t h w h i c h V D R f o r m s h e t e r o d i m e r s . T h e r e i s e v i d e n c e t o s u g g e s t c r o s s - t a l k b e t w e e n V D R a n d a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) . T h e r e f o r e , t h e e f f e c t s o f C h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t o n t h e e x p r e s s i o n o f A R a n d P S A w e r e a l s o e x a m i n e d . I n a d d i t i o n , t h e e f f e c t s o f C h o l e c a l c i f e r o l w e r e c o m p a r e d t o t h o s e o f c a l c i t r i o l . M y r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t r e a t m e n t o f t h e R W P E 2 - W 9 9 h u m a n p r o s t a t e c a r c i n o m a c e l l s w i t h C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s s e v e r a l c h a r a c t e r i s t i c s a s s o c i a t e d w i t h m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n . T h e o b s e r v e d e f f e c t s w e r e s i m i l a r t o t h o s e o b t a i n e d u s i n g c a l c i t r i o l t r e a t e d c e l l s . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s C e l l s a n d C e l l C u l t u r e T h e R W P E 2 - W 9 9 c e l l l i n e , d e v e l o p e d i n o u r l a b o r a t o r y , i s a t u m o r i g e n i c a n d i n v a s i v e h u m a n p r o s t a t e c a r c i n o m a c e l l l i n e . T h e R W P E - 2 c e l l l i n e w a s d e r i v e d f r o m R W P E - l c e l l s a f t e r t r a n s f e c t i o n w i t h t h e K i - r a s o n c o g e n e ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ; W e b b e r e t a l . , 1 9 9 7 ) . R W P E - 2 c e l l s w e r e g r o w n i n a g a r c u l t u r e a n d s e v e r a l c l o n e s w e r e i s o l a t e d , e x p a n d e d a n d s c r e e n e d f o r K i - r a s e x p r e s s i o n . O n e o f t h e s e c l o n e s w a s s e l e c t e d f o r h i g h K i - r a s e x p r e s s i o n , e x p a n d e d a n d w a s d e s i g n a t e d a s R W P E 2 - W 9 9 c e l l s ( W e b b e r , u n p u b l i s h e d d a t a ) . C e l l s w e r e m a i n t a i n e d i n c o m p l e t e k e r a t i n o c y t e s e r u m - f r e e m e d i u m ( K S F M ; C a t . # : 1 0 7 2 4 - 0 1 1 ) c o n t a i n i n g 5 0 j i g / m l b o v i n e p i t u i t a r y e x t r a c t ( B P E ) a n d 5 n g / m l e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) s u p p l e m e n t s ( C a t . # : 3 7 0 0 0 - 0 1 5 ) , a n d 1 X a n t i b i o t i c / a n t i m y c o t i c m i x t u r e ( P e n i c i l l i n l O O U / m l , S t r e p t o m y c i n 1 0 0 u g / m l , a n d 2 3 5 F u n g i z o n e 0 . 2 5 r i g / m l ) ( G i b c o / l n v i t r o g e n , R o c k v i l l e , M D ) . M e d i u m w a s c h a n g e d e v e r y 4 8 h . C u l t u r e s w e r e m a i n t a i n e d a t 3 7 ° C i n a h u m i d i fi e d a t m o s p h e r e c o n t a i n i n g 5 % C 0 2 . W h e n c o n fl u e n t , c e l l s w e r e l i f t e d u s i n g t r y p s i n / E D T A ( T / E ; S i g m a , S t . L o u i s , M O ) d i l u t e d 1 : 1 w i t h D - P B S ( D u l b e c c o ’ s p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e , C a 2 + / M g 2 + f r e e ; S i g m a , S t . L o u i s , M O ) a n d p a s s a g e d a n d s e e d e d a t 1 x 1 0 6 c e l l s / T - 2 5 fl a s k , o r 2 x 1 0 6 c e l l s / T - 7 5 fl a s k ( B D F a l c o n , V W R , B a t a v i a , I L ) . D o s e R e s p o n s e T h e e f f e c t s o f C h o l e c a l c i f e r o l ( C a t . # : C - 1 3 5 7 , S i g m a ) a n d c a l c i t r i o l ( C a t . # : D - 1 5 3 0 , S i g m a ) o n a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s i n m o n o l a y e r c u l t u r e w e r e e x a m i n e d u s i n g a 9 6 - w e l l m i c r o p l a t e a s s a y . T h e d r u g s w e r e d i s s o l v e d i n 1 0 0 % e t h a n o l , p r o t e c t e d f r o m l i g h t a n d s t o r e d a t - 7 0 ° C . T h e fi n a l l e v e l o f v e h i c l e i n t h e m e d i u m w a s 0 . 1 % . C e l l s w e r e p l a t e d i n 1 0 0 p l o f c o m p l e t e K S F M m e d i u m a t a d e n s i t y o f 1 0 , 0 0 0 c e l l s / w e l l , s i x w e l l s p e r t r e a t m e n t , i n 9 6 - w e l l p l a t e s ( B D F a l c o n ) . C o n c e n t r a t i o n s o f t e s t a g e n t s f r o m 1 n M ( 1 0 ‘ 9 M ) t o 1 0 u M ( 1 0 ' 5 M ) w e r e t e s t e d . A f t e r 4 8 h , 1 0 0 p l o f t e s t m e d i a c o n t a i n i n g t w i c e t h e c o n c e n t r a t i o n o f C h o l e c a l c i f e r o l o r c a l c i t r i o l w e r e a d d e d t o t h e w e l l s . I n s u b s e q u e n t m e d i u m c h a n g e s , e v e r y 4 8 h , a l l 2 0 0 p l o f t e s t m e d i a w e r e r e m o v e d a n d r e p l a c e d w i t h 2 0 0 p l o f fl e s h t e s t m e d i a . E f f e c t s o n g r o w t h w e r e m e a s u r e d u s i n g t h e M T T a s s a y ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ) . A f t e r 5 d a y s o f t r e a t m e n t , 5 0 u l o f M T T ( S i g m a ) w e r e a d d e d t o e a c h w e l l a n d i n c u b a t e d ( 3 7 ° C ) f o r 3 . 5 h . T h e m e d i u m / M T T m i x t u r e w a s s l o w l y a s p i r a t e d f r o m e a c h w e l l a n d 1 5 0 p l o f D M S O w e r e a d d e d t o e a c h w e l l a n d t r i t u r a t e d s e v e r a l t i m e s t o e x t r a c t t h e s t a i n . A b s o r b a n c e w a s r e a d a t 5 4 0 n m u s i n g a T i t e r t e k m i c r o p l a t e r e a d e r w h e r e a b s o r b a n c e s h o w s a d i r e c t r e l a t i o n s h i p w i t h c e l l g r o w t h . 2 3 6 A b s o r b a n c e o f e t h a n o l t r e a t e d c e l l s w a s s e t a t 1 0 0 % g r o w t h a n d s e r v e d a s t h e c o n t r o l s t o w h i c h a l l o t h e r t r e a t m e n t s w e r e c o m p a r e d . T h e d o s e t h a t i n h i b i t s g r o w t h a n d r e d u c e s i t t o 5 0 % o f c o n t r o l ( I D 5 0 ) w a s d e t e r m i n e d . I n i t i a l e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d u s i n g a w i d e r a n g e o f C h o l e c a l c i f e r o l a t l o g d i l u t i o n s f r o m 1 0 " 2 M t o 1 0 ‘ 5 M t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t i v e r a n g e . S u b s e q u e n t e x p e r i m e n t s w e r e t h e n c o n d u c t e d u s i n g a n a r r o w r a n g e f r o m 1 0 ' 9 M t o 1 0 ' 5 M b u t u s i n g s m a l l d o s e i n c r e m e n t s . S i x i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d . A g a r a s s a y f o r a n c h o r a g e - i n d e p e n d e n t g r o w t h T o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f C h o l e c a l c i f e r o l o n a n c h o r a g e - i n d e p e n d e n t g r o w t h o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s , c o l o n y f o r m a t i o n i n s o f t a g a r w a s p e r f o r m e d , i n 3 5 m m p l a t e s i n t r i p l i c a t e . A 1 . 2 5 % ( w / v ) a g a r s o l u t i o n w a s p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 1 . 2 5 g r a m s o f a g a r i n d H Z O o v e r l o w h e a t , a u t o c l a v e d f o r 2 5 m i n , a n d s t o r e d i n t h e r e f r i g e r a t o r f o r u p t o o n e m o n t h . D i s s o l v i n g t h e a g a r w a s f a c i l i t a t e d b y h e a t i n g i t i n a m i c r o w a v e o v e n f o r ~ 1 m i n u t e , r e m o v i n g i t b e f o r e i t b e g a n t o b o i l . I t w a s a l l o w e d t o c o o l f o r 3 - 4 m i n , a n d t h e n k e p t i n a 4 4 ° C w a t e r b a t h . A f r e s h s o l u t i o n o f 0 . 5 % a g a r - c o n t a i n i n g m e d i u m w a s p r e p a r e d [ 4 0 % o f 1 . 2 5 % a g a r , 4 0 % K S F M c o m p l e t e m e d i u m , 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m ( F B S ) ( I n t e r g e n , P u r c h a s e , N Y ) , a n d 1 0 % D u l b e c c o ’ s p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e C a 2 + / M g 2 + - f r e e ( D P B S ) ( G i b c o - B R L , G r a n d I s l a n d , N Y ) ] a n d k e p t i n a 4 4 ° C w a t e r b a t h . T w o m l o f 0 . 5 % a g a r - c o n t a i n i n g m e d i u m w e r e e v e n l y l a y e r e d i n e a c h 3 5 m m p l a t e ( B D F a l c o n ) a n d a l l o w e d t o s o l i d i f y f o r 3 0 m i n . C e l l s w e r e s u b c u l t u r e d a n d fi l t e r e d t h r o u g h a 4 0 - u m p o r e s i z e c e l l s t r a i n e r t o g e t a s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n . 3 7 , 5 0 0 c e l l s w e r e a d d e d t o 1 m l o f 1 0 % P B S i n c o m p l e t e K S F M c o n t a i n i n g a p p r o p r i a t e C h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t . T o t h i s c e l l s u s p e n s i o n 2 m l o f 0 . 5 % a g a r m e d i u m w a s a d d e d , g i v i n g 0 . 3 3 % a g a r i n t h e 2 3 7 t h e c h a m b e r 2 2 0 p l o f N I H 3 T 3 - c o n d i t i o n e d m e d i u m , w h i c h s e r v e d a s a c h e m o a t t r a c t a n t , m e d i u m . T h e s u s p e n s i o n w a s g e n t l y t r i t u r a t e d t h r e e t i m e s t o m i x a n d 1 m l w a s l a y e r e d o n t o p o f t h e h a r d e n e d a g a r i n 3 p l a t e s / d r u g t r e a t m e n t , g i v i n g 1 2 , 5 0 0 c e l l s / p l a t e . T h e p l a t e s r e m a i n e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 0 m i n b e f o r e b e i n g t r a n s f e r r e d t o a n i n c u b a t o r . T h e c e l l s w e r e n o t f e d d u r i n g t h e i n c u b a t i o n p e r i o d . A f t e r 2 1 d a y s o f i n c u b a t i o n a t 3 7 ° C , t h e c o l o n i e s w e r e s t a i n e d w i t h 1 m l o f s t e r i l e 1 m g / m l p - i o d o n i t r o t e t r a z o l i u m ( I N T ) ( S i g m a ) s o l u t i o n f o r 1 2 h a t 3 7 ° C . T h e c o l o n i e s w e r e fi x e d w i t h 0 . 5 m l o f 1 0 % f o r m a l i n a n d i m m e d i a t e l y c o u n t e d u s i n g a B i o T r a n I I a u t o m a t e d c o l o n y c o u n t e r . P e r c e n t c o l o n y f o r m i n g e f fi c i e n c y ( C F E ) w a s t h e n c a l c u l a t e d . E t h a n o l t r e a t e d d i s h e s w e r e u s e d a s c o n t r o l s . T h e C F E o f a l l t r e a t m e n t s w a s c o m p a r e d t o t h e e t h a n o l c o n t r o l C F E . R e s u l t s r e p r e s e n t t h e a v e r a g e s o f t h r e e e x p e r i m e n t s . I n v a s i o n a n d m o t i l i t y / c h e m o t a x i s a s s a y s u s i n g B o y d e n c h a m b e r s T h e e f f e c t s o f t e s t a g e n t s o n t h e i n v a s i v e a b i l i t y a n d m o t i l i t y o f t h e t u m o r i g e n i c R W P E 2 - W 9 9 c e l l l i n e w e r e e x a m i n e d b y m o d i f y i n g a p r e v i o u s l y d e s c r i b e d B o y d e n c h a m b e r i n v a s i o n a s s a y ( B e l l o e t a l , 1 9 9 7 ) . T h e d a y p r i o r t o r u n n i n g t h e a s s a y , c e l l s w e r e p l a t e d a t a d e n s i t y o f 3 m i l l i o n c e l l s / T - 7 5 fl a s k . N u c l e o p o r e fi l t e r s ( 8 . 0 p m p o r e s i z e , 1 3 m m d i a m e t e r ) ( C a t . # : 3 5 2 3 4 0 , F i s h e r S c i e n t i fi c , C h i c a g o , I L ) w e r e c o a t e d w i t h M a t r i g e l ( T r e v i g e n I n c . , G a i t h e r s b u r g , M D ) d i l u t e d 1 : 2 0 i n c o l d ( 4 ° C ) , s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r a n d a l l o w e d t o d r y o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e u n d e r s t e r i l e c o n d i t i o n s . C e l l s w e r e l i f t e d 2 4 h a f t e r p l a t i n g b y i n c u b a t i o n i n 1 . 0 m M E D T A ( G i b c o - B R L ) f o r ~ 9 m i n a t 3 7 ° C , d i s l o d g e d b y t a p p i n g , a n d r e c o v e r e d b y c e n t r i fi a g a t i o n . C e l l s w e r e r e s u s p e n d e d a t a d e n s i t y o f 1 x 1 0 6 c e l l s / m l i n b a s a l K S F M m e d i u m ( n o B P E o r E F G ) c o n t a i n i n g 0 . 1 % b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) ( P i e r c e B i o t e c h n o l o g y , R o c k f o r d , I L ) . T o t h e b o t t o m o f 2 3 8 w a s a d d e d . T h e M a t r i g e l - c o a t e d fi l t e r s w e r e p l a c e d o n t o p o f t h e c h e m o a t t r a c t a n t w i t h t h e M a t r i g e l - c o a t e d S i d e f a c i n g u p . A S i n g l e c e l l s u s p e n s i o n c o n t a i n i n g 2 0 0 , 0 0 0 c e l l s i n 2 0 0 p l w a s p l a t e d i n t r i p l i c a t e o n t o p o f t h e fi l t e r a n d a l l o w e d t o r e m a i n f o r 2 0 m i n . T h e c e l l s u s p e n s i o n w a s t h e n o v e r l a i d w i t h 6 5 0 p l o f b a s a l K S F M m e d i u m / 0 . 1 % B S A s o l u t i o n c o n t a i n i n g e i t h e r e t h a n o l ( c o n t r o l ) o r v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f C h o l e c a l c i f e r o l . T h e a s s a y w a s r u n f o r 4 8 h a t 3 7 ° C t o a l l o w t h e c e l l s t o i n v a d e . T h e fi l t e r s w e r e t h e n fi x e d a n d s t a i n e d w i t h a H E M A - 3 k i t ( F i s h e r ) . T h e n o n - i n v a d e d c e l l s , r e m a i n i n g o n t h e M a t r i g e l - c o a t e d s i d e o f t h e fi l t e r , w e r e r e m o v e d a n d e a c h fi l t e r w a s t r a n s f e r r e d t o t h e w e l l s o f a 2 4 - w e l l p l a t e ( B D F a l c o n ) . T h e s t a i n w a s e x t r a c t e d f r o m t h e fi l t e r s w i t h 3 0 0 p l o f 0 . 1 N H C l f o r 1 5 m i n . 2 0 0 p l f r o m e a c h w e l l w a s t h e n t r a n s f e r r e d t o a 9 6 - w e l l p l a t e . T h e a b s o r b a n c e w a s r e a d a t 6 2 0 n m u s i n g a T i t e r t e k m i c r o p l a t e r e a d e r . I n a d d i t i o n , a n y c e l l s t h a t i n v a d e d i n t o t h e b o t t o m c h a m b e r w e r e c o u n t e d u s i n g a C o u l t e r C o u n t e r . T h e p e r c e n t a g e s f r o m t h e fi l t e r s a n d c h a m b e r c o u n t s w e r e a v e r a g e d t o o b t a i n t o t a l i n v a s i o n . E t h a n o l t r e a t e d c h a m b e r s w e r e u s e d a s c o n t r o l s a n d s e t a t 1 0 0 % f o r i n v a s i v e a b i l i t y . T h e e f f e c t o f C h o l e c a l c i f e r o l o n t h e m o t i l i t y / c h e m o t a x i s o f t h e R W P E 2 - W 9 9 c e l l s w a s i n v e s t i g a t e d b y a l l o w i n g t h e c e l l s t o m i g r a t e f r o m t h e u p p e r t o l o w e r c h a m b e r f o r 4 8 h . T h e p r o t o c o l u s e d w a s t h e s a m e a s d e s c r i b e d a b o v e , e x c e p t t h a t t h e fi l t e r s w e r e n o t c o a t e d w i t h M a t r i g e l f o r t h e m o t i l i t y / c h e m o t a x i s a s s a y . T h e r e s u l t s r e p r e s e n t t h e a v e r a g e o f a t l e a s t 3 i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t s f o r e a c h a s s a y , a n d a r e e x p r e s s e d a s : t S D . 2 3 9 S D S - P A G E Z y m o g r a p h y f o r M M P a c t i v i t y I n o r d e r t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f t h e t e s t a g e n t s o n s e c r e t e d M M P a c t i v i t y , c o n d i t i o n e d m e d i u m s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d . C e l l s w e r e p l a t e d i n c o m p l e t e K S F M a t a d e n s i t y o f o n e m i l l i o n c e l l s / 6 0 m m d i s h ( B D F a l c o n ) , i n d u p l i c a t e d i s h e s f o r e a c h t r e a t m e n t . A f t e r 4 8 h , t h e m e d i u m w a s S l o w l y a s p i r a t e d a n d e a c h d i s h w a s w a s h e d t w i c e w i t h 3 m l o f D P B S . N e x t , 2 . 2 m l b a s a l K S F M ( w i t h o u t B P E a n d E G F ) c o n t a i n i n g t h e d e s i r e d c o n c e n t r a t i o n o f C h o l e c a l c i f e r o l o r c a l c i t r i o l w e r e a d d e d t o t h e d i s h e s . T h e c e l l s w e r e e x p o s e d t o t h e t r e a t m e n t s f o r 4 8 h a t 3 7 ° C . C o n d i t i o n e d m e d i u m s a m p l e s f r o m d u p l i c a t e d i s h e s w e r e p o o l e d , a d d e d t o s t e r i l e 1 5 m l c e n t r i f u g e t u b e s , c e n t r i fi r g e d a t 2 5 0 0 r p m f o r 5 m i n t o r e m o v e c e l l u l a r d e b r i s , a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s c o l l e c t e d . T o e a c h s a m p l e 2 % T r i t o n - X 1 0 0 w a s a d d e d a t a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 % , t h e m e d i a w e r e g e n t l y v o r t e x e d t o m i x , a n d a l i q u o t e d i n t o s t e r i l e 2 0 0 p l E p p e n d o r f t u b e s . T h e p r o t e i n c o n t e n t o f e a c h s a m p l e w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e L o w r y H i g h p r o t e i n a s s a y ( B i o - R a d , H e r c u l e s , C A ) . S a m p l e s o f c o n d i t i o n e d m e d i a w e r e s t o r e d a t - 7 0 ° C u n t i l n e e d e d . T o d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f t h e t e s t a g e n t s o n M M P - 2 a n d M M P - 9 a c t i v i t y , s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) z y m o g r a p h y w a s c o n d u c t e d . T h e s e p a r a t i n g a n d s t a c k i n g g e l s w e r e m a d e u s i n g t h e f o l l o w i n g p r o t o c o l s a n d p o u r e d i n t o 0 . 7 5 m m c a s t i n g p l a t e s . T h e fi n a l g e l a t i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e g e l s w a s 0 . 1 % . T h e g e l s w e r e a l l o w e d t o p o l y m e r i z e o v e r n i g h t a t 4 ° C b e f o r e u s e . C o n d i t i o n e d m e d i u m s a m p l e s c o n t a i n i n g 2 u g / u l o f p r o t e i n a n d 5 u l o f L a e m m l i S a m p l e B u f f e r w e r e l o a d e d i n t o e a c h w e l l . U s i n g a B i o - R a d M i n i P r o t e a n I I a p p a r a t u s , t h e g e l s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d ( 4 ° C ) a t 1 5 7 v o l t s f o r 1 . 5 h i n a p p r o x i m a t e l y 8 0 0 m l o f I X r u n n i n g b u f f e r [ 2 4 g T r i s b a s e , 1 1 5 . 2 g G l y c i n e ( B i o - R a d ) , p H 8 . 3 ] . T h e g e l s w e r e t h e n t r e a t e d 2 4 0 S e p a r a t i n g G e l S t a c k i n g G e l D i s t i l l e d w a t e r 3 . 9 1 m l D i s t i l l e d w a t e r 5 . 7 3 m l 1 . 5 T r i s - H C I , p H 8 . 8 2 . 5 m l 0 . 5 M T r i s - H C I , p H 6 . 8 2 . 5 m l A c y l a m i d e / B i s ( 3 0 % s t o c k ) 3 . 3 3 m l 1 0 % ( w / v ) S D S 1 0 0 p l G e l a t i n ( 1 0 % ) 1 0 0 p l A c r y l a m i d e / B i s ( 3 0 % s t o c k ) 1 . 6 7 m l E l e c t r o p h o r e t i c g r a d e 1 0 % ( w / v ) S D S 1 0 0 p l D e - g a s f o r 1 5 m i n u t e s D e - g a s f o r 1 5 m i n u t e s , 1 0 % a m m o n i u m p e r s u l f a t e 1 0 0 p l T E M E D 2 0 p l 1 0 % A m m o n i u m p e r s u l f a t e 5 0 p l T E M E D 1 0 p l w i t h t w o s e p a r a t e 3 0 m i n w a s h e s o f 2 . 5 % T r i t o n - X 1 0 0 o n t h e p l a t e r o c k e r a t r o o m t e m p e r a t u r e t o r e m o v e t h e S D S . A f t e r t h e T r i t o n - X t r e a t m e n t s , t h e g e l s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 1 8 h i n T r i s - H C I s o a k i n g b u f f e r [ 5 0 m M T r i s - H C I , 2 0 0 m M N a C l , 5 m M C a C l z , 0 . 0 2 % B r i j - 3 5 , ( B i o - R a d ) ] , p H 7 . 5 . T h e s o a k i n g b u f f e r r e - n a t u r e s t h e p r o t e a s e s , w h i c h a l l o w s t h e m t o l y s e t h e g e l a t i n i n t h e g e l s . T h e g e l s w e r e s t a i n e d w i t h 0 . 2 5 % C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e R - 2 5 0 f o r 2 0 m i n f o l l o w e d b y a p p r o x i m a t e l y 2 0 m i n o f d e s t a i n i n g i n m e t h a n o l z a c e t i c a c i d d e Z O ( 4 : 1 2 5 ) s o l u t i o n . B a n d s o f l y s i s i n d i c a t i n g p r o t e a s e a c t i v i t y a p p e a r a s l i g h t b a n d s a g a i n s t a d a r k p u r p l e b a c k g r o u n d . T h e a r e a o f e a c h b a n d w a s m e a s u r e d d e n s i t o m e t r i c a l l y a n d c o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f t h e t e s t a g e n t s o n M M P - 2 a n d M M P - 9 a c t i v i t y . I m m u n o s t a i n i n g I m m u n o c y t o c h e m i s t r y w a s c o n d u c t e d t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f C h o l e c a l c i f e r o l o n t h e e x p r e s s i o n o f t h e f o l l o w i n g : i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n v i m e n t i n ( S i g m a , C a t . # : V - 6 6 3 0 ) ; t h e n u c l e a r r e c e p t o r s V D R ( O n c o g e n e , S a n D i e g o , C A , C a t . # : G R 3 7 ) , 2 4 1 i / r R X R - o r ( S a n t a C r u z B i o t e c h n o l o g y , S a n t a C r u z , C a l i f o r n i a , C a t . # : s c - 5 5 3 ) , R X R - B ( S a n t a C r u z , C a t . # : s c - 8 3 l ) , a n d R X R - y ( S a n t a C r u z , C a t . # 2 s c - 5 5 5 ) ; a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) ( S a n t a C r u z , C a t . # : s c - 7 3 0 5 ) ; p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) ( D a k o C y t o m a t i o n , C a r p i n t e r i a , C A , C a t . # : M - 0 7 5 0 ) w e r e e x a m i n e d . M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s f o r v i m e n t i n , P S A , a n d V D R , a n d p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s f o r R X R S a n d a m o d i fi e d a v i d i n — b i o t i n i m m u n o p e r o x i d a s e p r o t o c o l w e r e u s e d ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ) . C e l l s w e r e p l a t e d i n 1 m l o f c o m p l e t e K S F M o n s t e r i l e , a c i d w a s h e d g l a s s c o v e r s l i p s i n 2 4 - w e l l p l a t e s a t a d e n s i t y O f 7 , 5 0 0 c e l l s / w e l l . T h e m e d i u m w a s r e p l a c e d 4 8 h a f t e r p l a t i n g w i t h 2 m l o f m e d i u m c o n t a i n i n g t h e d e s i r e d C h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n . T h e f o l l o w i n g c o n c e n t r a t i o n s o f C h o l e c a l c i f e r o l w e r e u s e d : 1 n M , 1 0 n M , 1 0 0 n M , a n d 1 p M . E t h a n o l t r e a t e d c e l l s s e r v e d a s t h e c o n t r o l s . T e s t m e d i a w e r e c h a n g e d e v e r y 4 8 h . A f t e r 5 d a y s o f t r e a t m e n t , t h e t e s t m e d i a w e r e s l o w l y a s p i r a t e d , c e l l s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h D - P B S , a n d fi x e d a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h a w a r m ( 2 5 ° C ) s o l u t i o n o f 1 : 1 m e t h a n o l ( 1 0 0 % ) / a c e t o n e f o r 2 m i n . T h e c o v e r s l i p s w e r e s t o r e d a t - 2 0 ° C u n t i l n e e d e d . A l l o f t h e f o l l o w i n g s t e p s w e r e c a r r i e d o u t a t r o o m t e m p e r a t u r e : c e l l s w e r e b l o c k e d f o r l h w i t h n o r m a l h o r s e s e r u m ( V e c t o r L a b s , B u r l i n g a m e , C A ) , i n c u b a t e d w i t h p r i m a r y A b d i l u t e d i n b l o c k i n g s o l u t i o n , i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n w i t h a b i o t i n y l a t e d s e c o n d a r y a n t i b o d y d i l u t e d 1 : 2 0 0 i n b l o c k i n g s o l u t i o n , t r e a t e d w i t h 3 % H 2 0 2 t o q u e n c h e n d o g e n o u s p e r o x i d a s e a c t i v i t y , i n c u b a t e d w i t h A B C ( V e c t o r ) f o r 3 0 m i n , a n d d e v e l o p e d w i t h D A B s u b s t r a t e k i t f o r p e r o x i d a s e ( V e c t o r ) f o r 1 - 3 m i n . C e l l s w e r e r i n s e d 2 X 8 m i n e a c h b e t w e e n a l l s u c c e s s i v e s t e p s a f t e r i n c u b a t i o n w i t h t h e p r i m a r y A b . C e l l s n o t i n c u b a t e d i n p r i m a r y A b b u t i n c u b a t e d o n l y i n s e c o n d a r y A b s e r v e d a s c o n t r o l s . C o v e r s l i p s w e r e d e h y d r a t e d a n d m o u n t e d o n a l c o h o l - w a s h e d 2 4 2 m i c r o s c o p e s l i d e s u s i n g P e r m o u n t . A n t i b o d y d i l u t i o n s a n d i n c u b a t i o n t i m e s w e r e : v i m e n t i n 1 : 4 0 ( 1 h ) , V D R 1 : 1 0 0 ( 2 h ) , R X R - 0 t , R X R - B , a n d R X R - y 1 : 1 0 0 ( 2 h ) . P r o t e i n A n a l y s i s T o q u a n t i f y p r o t e i n s , a B e c k m a n D U S e r i e s 5 3 0 S p e c t r o p h o t o m e t e r w a s u s e d f o r p r o t e i n a s s a y s . S a m p l e s w e r e c o m p a r e d t o s t a n d a r d c o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 0 , 0 . 1 , 0 . 5 , 1 . 0 , 1 . 5 , a n d 2 . 0 p g / m l p r e p a r e d f r o m t h e A l b u m i n S t a n d a r d ( b o v i n e s e r u m a l b u m i n , 2 . 0 m g / m l , P i e r c e ) . T h e a s s a y s w e r e r u n u s i n g t h e L o w r y H i g h p r o t e i n a s s a y m e t h o d . W e s t e r n b l o t a n a l y s i s W e s t e r n b l o t a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d i n o r d e r t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f C h o l e c a l c i f e r o l o n C Y P 2 7 A 1 ( S a n t a C r u z , C a t . # : s c - 1 4 8 3 5 ) , V D R , R X R - o r , B , a n d 7 , A R a n d v i m e n t i n , a n d t h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n V D R p r o t e i n e x p r e s s i o n . R W P E 2 - W 9 9 c e l l s w e r e p l a t e d a t a d e n s i t y o f 5 0 0 , 0 0 0 c e l l s / T - 2 5 fl a s k ; t w o fl a s k s w e r e u s e d f o r e a c h t r e a t m e n t . 4 8 h a f t e r p l a t i n g , t h e m e d i u m w a s r e m o v e d a n d r e p l a c e d w i t h t h e t e s t m e d i a . T h e c e l l s w e r e t r e a t e d f o r 4 d a y s , i n c u b a t e d w i t h 2 . 0 m l t r y p s i n / E D T A f o r 7 m i n , a n d d i s l o d g e d b y t a p p i n g . C e l l s f r o m d u p l i c a t e fl a s k s w e r e p o o l e d a n d c e n t r i f u g e d a t 2 5 0 0 r p m f o r 5 m i n a n d t h e p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n 1 . 5 m l o f D - P B S a n d i n c u b a t e d o n i c e . N u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d u s i n g t h e N E - P E R k i t a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r p r o t o c o l ( P i e r c e ) . E x t r a c t s w e r e a l i q u o t e d a n d f r o z e n a t - 7 0 ° C . T h e L o w r y H i g h p r o t e i n a s s a y m e t h o d w a s u s e d t o d e t e r m i n e p r o t e i n c o n t e n t o f e a c h s a m p l e . S a m p l e s o f c y t o p l a s m i c e x t r a c t c o n t a i n i n g 1 0 p g ( v i m e n t i n ) a n d 4 0 p g ( C Y P 2 7 A 1 ) , a n d n u c l e a r e x t r a c t c o n t a i n i n g 2 0 p g ( V D R ) a n d 2 5 p g ( R X R S a n d A R ) o f p r o t e i n w e r e r u n i n 2 4 3 N u P A G E 1 0 % B i s - T r i s p r e - c a s t g e l s ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A ) a t 1 7 5 V f o r 1 . 5 - 1 . 7 h a t 4 ° C . P r o t e i n s w e r e t r a n s f e r r e d t o l m m o b o l i n - P t r a n s f e r m e m b r a n e s ( 0 . 4 5 p m p o r e s i z e ) ( M i l l i p o r e C o r p . , B e d f o r d , M a r y l a n d ) a t 3 0 V f o r l - l . 5 h a t 4 ° C . F o r i m m u n o b l o t t i n g , m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s w e r e u s e d f o r v i m e n t i n , A R , a n d V D R , a n d p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s w e r e u s e d f o r R X R S a n d C Y P 2 7 A 1 ( S a n t a C r u z ) . A l l b l o t s w e r e s t a i n e d u s i n g a v i d i n - b i o t i n i m m u n o p e r o x i d a s e V e c t o r A B C k i t ( V e c t o r ) f o r 1 h . B - a c t i n ( S i g m a , C a t . # 2 A - 5 4 4 1 ) w a s u s e d a s t h e l o a d i n g c o n t r o l . B a n d s w e r e d e v e l o p e d w i t h D A B k i t ( V e c t o r ) . B l o t s w e r e a n a l y z e d w i t h t h e I m a g e ] a n a l y s i s p r o g r a m f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h ( N I H ) . I n d i v i d u a l l a n e s w e r e c o m p a r e d t o c o n t r o l s l a n e s f o r c h a n g e s i n p r o t e i n e x p r e s s i o n . A n t i b o d y d i l u t i o n s a n d i n c u b a t i o n t i m e s w e r e a s f o l l o w s : v i m e n t i n 1 : 5 0 0 ( 1 . 5 h ) , V D R 1 : 1 0 0 0 ( 2 h ) , R X R - o r ( 1 : 1 0 0 ) , R X R - B ( 1 : 2 5 0 ) , a n d R X R - y ( 1 2 2 0 0 ) ( e a c h 2 h ) , A R 1 : 5 0 0 ( 2 h ) , C Y P 2 7 A 1 1 : 1 0 0 ( 1 h ) . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s A l l o f t h e r e s u l t s i n t h i s s t u d y w e r e o b t a i n e d f r o m t h r e e t o S i x i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n s w i t h s t a n d a r d d e v i a t i o n s ( S D ) . D i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e m e a n s w e r e c o n s i d e r e d s i g n i fi c a n t i f p < 0 . 0 5 . R e s p o n s e t o i n d i v i d u a l c o n c e n t r a t i o n s w a s c o m p a r e d t o c o n t r o l s u s i n g u n p a i r e d t - t e s t w i t h W e l c h c o r r e c t i o n . G r a p h P a d I n S t a t # 3 w a s u s e d f o r t h e s e a n a l y s e s . 2 4 4 R e s u l t s C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s g r o w t h o f R W P E Z - W 9 9 c e l l s : D o s e r e s p o n s e e x p e r i m e n t s w e r e fi r s t r u n t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h o f t h e R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . C e l l s w e r e p l a t e d i n 9 6 - w e l l p l a t e s a n d t r e a t e d w i t h i n c r e a s i n g c h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s f o r 5 d a y s a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . T h e s e r e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l c a u s e s a d o s e — d e p e n d e n t g r o w t h i n h i b i t i o n i n t h e R W P E 2 — W 9 9 c e l l s ( F i g u r e 8 - 3 A ) . T h e m m w a s a p p r o x i m a t e l y 6 . 4 p M . T h e r e s u l t s f r o m t h e s e e x p e r i m e n t s w e r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e c h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s t h a t w o u l d b e u s e d i n a l l s u b s e q u e n t a s s a y s . C h o l e c a l c i f e r o l r e d u c e s a n c h o r a g e - i n d e p e n d e n t c o l o n y f o r m i n g e fl i c i e n c y ( C F E ) : A s o fi a g a r a s s a y w a s u s e d t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n t h e a n c h o r a g e - i n d e p e n d e n t g r o w t h o f t h e t u m o r i g e n i c R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . T h i s a s s a y i s o n e d e t e r m i n a n t o f t h e a b i l i t y o f t h e c e l l s t o f o r m t u m o r s i n v i v o . T h e R W P E 2 - W 9 9 c e l l s h a v e p r e v i o u s l y b e e n s h o w n t o f o r m c o l o n i e s i n a g a r a n d t u m o r s i n n u d e m i c e ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ) . A S s e e n i n F i g u r e 8 - 3 B , t h e t r e a t m e n t o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f c h o l e c a l c i f e r o l c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n t h e i r c o l o n y f o r m i n g e f fi c i e n c y ( C F E ) . S i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n w a s s e e n b e g i n n i n g a t 1 n M ( 1 0 ' 9 M ) ( p < 0 . 0 1 ) . C o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 1 p M ( 1 0 ' 7 M ) ( p < 0 . 0 1 ) , 1 p M ( 1 0 * 6 M ) ( p < 0 . 0 1 ) , a n d 1 0 p M ( 1 0 - 5 M ) ( p < 0 . 0 0 1 ) i n h i b i t e d C F E b y 2 5 % , 3 2 % a n d 5 1 % , r e s p e c t i v e l y , w h e n c o m p a r e d t o e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l s . R e p r e s e n t a t i v e a g a r d i s h e s f o r e a c h c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t a r e s h o w n i n F i g u r e 8 - 3 C . 2 4 5 F i g u r e 8 - 3 : E f f e c t o f c h o l e c a l c i f e r o l o n a n c h o r a g e - d e p e n d e n t ( A ) a n d a n c h o r a g e - i n d e p e n d e n t ( B , C ) g r o w t h o f t h e R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . ( A ) 4 8 h a f t e r p l a t i n g l X 1 0 4 c e l l s / w e l l i n 9 6 - w e l l p l a t e s , c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . A f t e r 5 d a y s o f t r e a t m e n t , c e l l s w e r e s t a i n e d w i t h M T T . A b s o r b a n c e w a s r e a d a t 5 4 0 u m , i S D , ( n = 6 ) . T h e d a s h e d l i n e S h o w s I D s o o f ~ 6 . 4 p M . ( B ) C o l o n y f o r m i n g e f fi c i e n c y ( C F E ) O f c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t e d R W P E 2 - W 9 9 c e l l s w a s d e t e r m i n e d u s i n g a s o f t a g a r a s s a y . C e l l s w e r e p l a t e d a t a d e n s i t y o f 1 2 , 5 0 0 c e l l s / 3 0 m m d i s h . C o l o n i e s w e r e s t a i n e d w i t h I N T a f t e r 2 1 d a y s o f g r o w t h , c o u n t e d , a n d r e s u l t s p l o t t e d , : t S D , ( n = 3 ) . C F E o f e t h a n o l t r e a t e d c o n t r o l i s t a k e n a s 1 0 0 % . ( * * p = 0 . 0 1 ; * * * p < 0 . 0 0 1 ) . R e p r e s e n t a t i v e a g a r d i s h e s f o r e a c h c h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n a r e s h o w n i n ( C ) . 2 4 6 _ _ _ _ . _ _ _ _ _ . fi 1 fi € € 4 . o 0 0 0 0 0 0 “ r 1 1 1 x x x 1 1 1 x x x x 1 r 1 5 5 5 5 2 1 > . ) l o r t h 8 3 n g o C : f E O % ; 2 ( h " c t w o r G 8 l S l e C H 8 F ) l o r t n o C f g I o o / A " ( y c l 8 n e i c fi f E g n l I S i L m r o F 3 y n o l o l A C l o 2 4 7 1 1 0 ‘ . — 0 O n 2 0 ' O R W P E 2 - 9 9 1 x 1 0 1 r _ _ . = : O E : — 8 1 x 1 0 € - 7 6 I l | | l | | l | | l | | l l | | l | | l - 6 C h o l e c a l c i f e r o l C o n c e n t r a t i o n ( M ) C h o l e c a l c i f e r o l C o n c e n t r a t i o n ( 1 0 x M ) - 5 c o n c e n t r a t i o n s i n c l u d i n g a s l o w a s 1 n M . C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s i n v a s i o n i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r : T h e e f f e c t o f c h o l e c a l c i f e r o l o n t h e i n v a s i v e a b i l i t y o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s w a s t e s t e d u s i n g a n i n v i t r o B o y d e n c h a m b e r a s s a y . T h e u s e o f M a t r i g e l i n t h i s a s s a y m i m i c s t h e b a s e m e n t m e m b r a n e d e g r a d e d b y i n v a s i v e c a n c e r c e l l s d u r i n g t h e m e t a s t a t i c p r o c e s s i n v i v o . T h e d a t a i n F i g u r e 8 - 4 A s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t i n h i b i t s t h e i n v a s i v e a b i l i t y o f t h e R W P E 2 - W 9 9 c e l l s i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . S i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n ( p < 0 . 0 0 1 ) w a s o b s e r v e d a t a l l c o n c e n t r a t i o n s i n c l u d i n g a s l o w a s 1 n M . C o n c e n t r a t i o n s O f 1 p M ( 1 0 4 ’ M ) a n d 1 0 p M ( 1 0 ' 5 M ) r e d u c e d i n v a s i o n t o 5 6 % a n d 3 9 % o f t h e e t h a n o l t r e a t e d c o n t r o l s , r e s p e c t i v e l y . C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s c e l l m o t i l i t y / c h e m o t a x i s : T o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n t h e m o t i l i t y / c h e m o t a x i s o f t h e R W P E 2 - W 9 9 c e l l s , t h e s a m e p r o t o c o l t h a t w a s u s e d i n t h e i n v a s i o n a s s a y w a s e m p l o y e d , e x c e p t t h a t t h e fi l t e r s w e r e n o t c o a t e d w i t h M a t r i g e l . S i m i l a r t o t h e i n v a s i o n a s s a y , c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e d a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n t h e m o t i l i t y o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . H o w e v e r , h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s w e r e n e e d e d i n t h e m o t i l i t y a s s a y i n o r d e r t o s e e t h e s a m e i n h i b i t o r y e f f e c t s a s s e e n i n t h e i n v a s i o n a s s a y . T r e a t m e n t w i t h 1 0 p M ( 1 0 ' 5 M ) c h o l e c a l c i f e r o l c a u s e d a d e c r e a s e t o 5 5 % o f e t h a n o l t r e a t e d c o n t r o l i n t h e m o t i l i t y a s s a y , W h e r e a s a n a l m o s t i d e n t i c a l d e c r e a s e ( 5 6 % o f c o n t r o l ) w a s s e e n a t 1 p M ( 1 0 4 5 M ) i n t h e i n v a s i o n a s s a y . F i g u r e 8 - 4 B S h o w s t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t o n t h e m o t i l i t y o f t h e R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . S i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n ( p < 0 . 0 0 1 ) w a s o b s e r v e d a t a l l 2 4 8 2 4 9 I : C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y : T O d e t e r m i n e p o t e n t i a l m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n t h e m o d u l a t i o n o f i n v a s i v e a b i l i t y b y c h o l e c a l c i f e r o l , I e x a m i n e d t h e s e c r e t e d l e v e l s o f t y p e I V c o l l a g e n a s e s . I u s e d 0 . 1 % g e l a t i n - b a s e d S D S - P A G E z y m o g r a p h y t o d e t e r m i n e t h e g e l a t i n o l y t i c a c t i v i t y o f M M P - 9 a n d M M P - 2 i n c o n d i t i o n e d m e d i a o f c h o l e c a l c i f e r o l - t r e a t e d R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . A s s e e n i n F i g u r e 8 - 4 C , c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t r e s u l t e d i n a m a r k e d d e c r e a s e i n t h e g e l a t i n o l y t i c a c t i v i t y o f b o t h M M P - 9 a n d M M P - 2 . T h e d e n s i t o m e t r i c a n a l y s i s O f t h e z y m o g r a m s h o w s a m a r k e d d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n M M P a c t i v i t y w i t h m a x i m u m i n h i b i t i o n o f 8 1 % a n d 9 3 % f o r M M P - 9 a n d M M P - 2 , r e s p e c t i v e l y , a t 1 0 ' 5 M c h o l e c a l c i f e r o l w h e n c o m p a r e d t o t h e e t h a n o l t r e a t e d c o n t r o l s . C h o l e c a l c i f e r o l m o d u l a t e s v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n R W P E Z - W 9 9 c e l l s : V i m e n t i n e x p r e s s i o n i n e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l c e l l s w a s c o m p a r e d w i t h t h a t i n c e l l s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l f o r 5 d a y s . I m m u n o s t a i n i n g r e s u l t s i n F i g u r e 8 - 5 A s u g g e s t t h a t c h o l e c a l c i f e r o l c a u s e s a d e c r e a s e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n . T h e c o n t r o l c e l l s S h o w s t r o n g v i m e n t i n s t a i n i n g w h i l e t h e c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t e d c e l l s S h o w a d e c r e a s e i n v i m e n t i n s t a i n i n g . T h e s e i m m u n o s t a i n i n g r e s u l t s w e r e c o n fi r m e d b y W e s t e r n b l o t a n a l y s i s ( F i g u r e 8 - S B ) . D e n s i t o m e t r i c a n a l y s i s S h o w s a m a r k e d d e c r e a s e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n o f a p p r o x i m a t e l y 7 3 % a t t h e 1 p M ( 1 0 6 M ) c o n c e n t r a t i o n w h e n c o m p a r e d t o e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l . T h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t c h o l e c a l c i f e r o l c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n . E E E a , 0 1 0 0 : 3 5 . g " “ g : - 9 8 0 “ . E E g _ g - s l 4 t ¢ o E E O O U ' 0 - 7 7 1 : 0 0 . E 8 g _ é - G 6 9 0 m m - . 2 3 I a E - § - 5 # 5 5 o n O G . g g l I v I fi fi * I v fi U U 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 M o t i l i t y ( ' / o o f C o n t r o l ) é ‘ 5 a t e s “ e 4 ‘ \ g 9 ~ 9 4 } . 3 4 5 « 9 4 > $ 9 . 0 0 ’ 4 . ’ 0 9 a } ( 0 ‘ D e n s i t o m e t r i c A n a l y s i s : M M P - 9 1 0 0 % 7 1 % 6 5 % 6 4 % 6 5 % 4 1 % 2 6 % 2 8 % 1 9 % N I P - 2 1 0 0 % 7 3 % 4 9 % 3 7 % 3 6 % 1 9 % 1 2 % 1 1 % 7 % F i g u r e 8 — 4 : T h e e f f e c t o f c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t o n t h e i n v a s i v e a b i l i t y ( A ) , m o t i l i t y ( B ) , a n d M M P a c t i v i t y ( C ) o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . ( A ) E f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n i n v a s i v e a b i l i t y w e r e e x a m i n e d u s i n g t h e i n v i t r o B o y d e n c h a m b e r a s s a y . 2 . 0 X 1 0 5 c e l l s w e r e p l a t e d / c h a m b e r i n t r i p l i c a t e a n d a l l o w e d t o i n v a d e t h r o u g h M a t r i g e l f o r 4 8 h . I n v a s i v e a b i l i t y o f e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l s w a s t a k e n a s 1 0 0 % ; 3 : S D ( n = 3 ) ( “ ‘ " ‘ = p < 0 . 0 0 1 ) . ( B ) T o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n c e l l m o t i i t y / c h e m o t a x i s , e x p e r i m e n t s w e r e r u n a s i n ( A ) , e x c e p t t h a t f i l t e r s w e r e n o t c o a t e d w i t h M a t r i g e l . M o t i l i t y o f e t h a n o l - t r e a t e d c e l l s w a s t a k e n a s 1 0 0 % ; i S D , ( n = 4 ) ( * * * = p < 0 . 0 0 1 ) . ( C ) S D S - P A G E z y m o g r a p h y ( 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l c o n t a i n i n g 0 . 1 % g e l a t i n ) w a s u s e d t o a n a l y z e M M P - 2 a n d M M P - 9 a c t i v i t y i n c o n d i t i o n e d m e d i u m o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l f o r 4 8 h . 2 . 0 u g o f p r o t e i n w e r e l o a d e d / l a n e . D e n s i t o m e t r i c a n a l y s e s , w i t h e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l s t a k e n a s 1 0 0 % , a r e s h o w n b e l o w t h e z y m o g r a m . 2 5 0 t i n — > V ~ i 5 8 m e D k n a _ _ i g . , . 1 F i g u r e 8 — 5 : 6 ‘ 1 : . 9 D e n s i t o m e t r i c 1 0 0 % 5 8 . 3 % 3 9 . 0 % 2 7 . 9 % 2 7 . 1 % A n a l y s i s : E f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n t h e e x p r e s s i o n o f t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n v i m e n t i n . ( A ) I m m u n o s t a i n i n g r e s u l t s s u g g e s t t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n . T r e a t m e n t c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n a b o v e t h e i r r e s p e c t i v e s q u a r e . C = e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l . I n s e t i n ( a ) i s a n e g a t i v e c o n t r o l l a c k i n g p r i m a r y a n t i b o d y . B a r = 2 0 u m . ( B ) W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f v i m e n t i n e x p r e s s i o n c o n f i r m s i m m u n o s t a i n i n g r e s u l t s a n d s h o w s t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t d e c r e a s e s v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . V i m e n t i n M r = ~ 5 8 k D a . C h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n a b o v e t h e i r r e s p e c t i v e l a n e w h e r e C = e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l . D e n s i t o m e t r i c a n a l y s i s o f e a c h l a n e i s s h o w n b e l o w t h e b l o t , w h e r e e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l i s t a k e n a s 1 0 0 % . 2 5 1 C h o l e c a l c i f e r o l m o d u l a t e s V D R , R X R S a n d A R n u c l e a r r e c e p t o r s : F i g u r e 8 - 6 s h o w s t h e i m m u n o s t a i n i n g r e s u l t s f o r V D R a n d R X R S a f t e r t r e a t m e n t w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f c h o l e c a l c i f e r o l . C h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t a p p e a r s t o u p — r e g u l a t e , i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r , t h e V D R a n d R X R - ( X . a n d R X R - B . R X R - y d i d n o t a p p e a r t o b e s i g n i fi c a n t l y u p - r e g u l a t e d . T h e W e s t e r n b l o t a n a l y s e s i n F i g u r e 8 - 7 c o n fi r m t h e i m m u n o s t a i n i n g r e s u l t s s h o w i n g t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n o f V D R a n d R X R - a a n d , t o a l e s s e r e x t e n t , t h a t o f R X R - y . D e n s i t o m e t r i c a n a l y s i s s h o w e d t h a t V D R h a d t h e g r e a t e s t u p - r e g u l a t i o n ( a p p r o x i m a t e l y 1 6 0 % o f e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l ) f o l l o w e d b y R X R - ( 1 . R X R - y s h o w e d a s m a l l d o s e - d e p e n d e n t i n c r e a s e b u t a p p e a r s t o b e d o w n - r e g u l a t e d a t t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 4 6 M c h o l e c a l c i f e r o l . T h e W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f t h e a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) u p o n t r e a t m e n t w i t h c h o l e c a l c i f e r o l ( F i g u r e 8 - 7 ) d e m o n s t r a t e s a d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n i n A R e x p r e s s i o n . C h o l e c a l c i f e r o l i n d u c e s t h e e x p r e s s i o n o f t h e 2 5 - h y d r o x fl a s e e n z y m e , C Y P 2 7 A 1 : W e s t e r n B l o t a n a l y s i s w a s c o n d u c t e d t o e x a m i n e t h e a b i l i t y o f c h o l e c a l c i f e r o l t o i n d u c e 2 5 - h y d r o x y l a s e , C Y P 2 7 A 1 , w h i c h c o n v e r t s c h o l e c a l c i f e r o l t o 2 5 0 H D 3 . U s i n g a p o l y c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t C Y P 2 7 A 1 , a s i n g l e b a n d a t M r ~ 5 4 k D a w a s d e t e c t e d . T h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e h u m a n C Y P 2 7 e n z y m e h a s b e e n s h o w n t o b e 5 4 k D a ( A x e n e t a l . , 1 9 9 4 ) . A s s e e n i n F i g u r e 8 - 8 , u n t r e a t e d R W P E 2 - W 9 9 c e l l s ( l a n e c ) c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s C Y P 2 7 A 1 e n z y m e . F u r t h e r m o r e , r e s u l t s s h o w t h a t t h i s e n z y m e i s u p - r e g u l a t e d , i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r , u p o n t r e a t m e n t w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . C o m p a r e d t o e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l s , C Y P 2 7 A 1 w a s u p - r e g u l a t e d t o a p p r o x i m a t e l y 5 - 7 f o l d a t 1 0 u M ( 1 0 ' 5 M ) c o n c e n t r a t i o n i n d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s . 2 5 2 c 0 - R X R y - R X R C E T O H 1 0 ‘ 9 M ‘ " B M ( 1 0 ‘ 7 M V D R F i g u r e 8 - 6 : I m m u n o s t a i n i n g f o r n u c l e a r r e c e p t o r s i n R W P E 2 - W 9 9 c e l l s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . C e l l s w e r e t r e a t e d f o r 5 d a y s . V D R ( a - e ) a n d R X R - a ( f - j ) b o t h d e m o n s t r a t e a m a r k e d i n c r e a s e i n e x p r e s s i o n w h e n c o m p a r e d t o t h e i r r e s p e c t i v e e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l c o v e r s l i p s ( b a n d g ) . R X R - y s h o w e d a v e r y s m a l l i n c r e a s e . T r e a t m e n t c o n c e n t r a t i o n s a r e 1 0 ‘ 9 M ( c , h , m ) , 1 1 0 * M ( d , i , n ) a n d 1 0 ' 7 M ( e , i , o ) c h o l e c a l c i f e r o l . ( a , f , k ) a r e c o n t r o l s l a c k i n g p r i m a r y a n t i b o d y . C e l l s w e r e p l a t e d o n s t e r i l e , g l a s s c o v e r s l i p s a t a d e n s i t y o f 7 , 5 0 0 c e l l s / c o v e r s l i p . B a r = 2 0 u . 2 5 3 C Y P 2 ~ 5 7 4 A k 1 D a I _ . $ 9 2 * 5 0 $ 0 ' 9 v 9 ' 9 V D R a l l - I . fi n . “ t o I " R X R - a W m . _ _ _ . . , . _ _ B - A c t i n l M | F i g u r e 8 - 7 : W e s t e r n b l o t a n a l y s i s s h o w i n g t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n n u c l e a r r e c e p t o r s . R e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e d a d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n o f V D R , R X R - a , a n d A R . R X R - y e x p r e s s i o n i s a l s o u p - r e g u l a t e d b u t a t a l o w e r l e v e l . R X R - y i s t h e n d o w n - r e g u l a t e d a t t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 4 5 M c h o l e c a l c i f e r o l . F o r V D R 2 0 u g a n d f o r R X R S a n d A R 2 5 u g o f p r o t e i n w a s l o a d e d / l a n e . B - a c t i n w a s u s e d a s t h e l o a d i n g c o n t r o l . M “ ( e 0 N 3 9 s o d s N ‘ 6 . 9 ( Q F i g u r e 8 - 8 : W e s t e r n b l o t f o r 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e , C Y P 2 7 A 1 , i n R W P E 2 - W 9 9 c e l l s s h o w s t h a t w h i l e t h e e n z y m e i s p r e s e n t i n u n t r e a t e d c e l l s i t i s a l s o u p - r e g u l a t e d u p o n t r e a t m e n t w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . C h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n f o r t h e r e s p e c t i v e l a n e s . 4 0 p g p r o t e i n w a s l o a d e d / l a n e . M o l e c u l a r w e i g h t o f C Y P 2 7 A 1 i s s h o w n t o b e ~ 5 4 k D a . E f f e c t s o f c a l c i t r i o l : 2 5 4 I n o r d e r t o c o m p a r e t h e e f fi c a c y o f c h o l e c a l c i f e r o l , s e v e r a l o f t h e a s s a y s , m e n t i o n e d a b o v e , w e r e a l s o c o n d u c t e d u s i n g c a l c i t r i o l - t r e a t e d c e l l s . F i g u r e 8 - 9 A s h o w s t h e r e s u l t s o f t h e c a l c i t r i o l d o s e r e s p o n s e a s s a y . T h e c e l l s w e r e m o r e s e n s i t i v e t o c a l c i t r i o l t r e a t m e n t , w i t h a n a p p r o x i m a t e I D s o o f 1 . 0 5 n M , c o m p a r e d t o ~ 6 . 4 u M f o r t h e c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t e d c e l l s . R e s u l t s f r o m c a l c i t r i o l z y m o g r a m s a r e s h o w n i n F i g u r e 8 - 9 B . S i m i l a r t o t h e c h o l e c a l c i f e r o l z y m o g r a m s , c a l c i t r i o l t r e a t m e n t c a u s e d a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y . W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f V D R e x p r e s s i o n ( F i g u r e 8 - 9 C ) i n c a l c i t r i o l - t r e a t e d c e l l s s h o w s t h a t t h e d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n p a t t e r n i s s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d f o r c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t e d c e l l s , h o w e v e r , c a l c i t r i o l i s a p p r o x i m a t e l y 6 t o 1 0 f o l d m o r e e f f e c t i v e i n t h e d i f f e r e n t a s s a y s c o n d u c t e d , w h e n c o m p a r e d t o c h o l e c a l c i f e r o l . 2 5 5 O ) l o r t n o C f o % ( h t w o r G l l e C ' 3 ' — — — — — — - _ F i g u r e 8 . 9 : 9 ’ ~ 4 8 k D a 1 1 0 1 0 0 \ O 8 0 7 0 - 6 0 - + R W P E 2 - W 9 9 5 0 - — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 4 0 - 3 0 J 2 0 - I D 5 0 ~ 1 . 0 5 u M 1 0 - 0 0 1 x 1 0 " - I ' 7 c F ‘ N " 2 l ‘ M ) E f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n ( A ) a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h , ( B ) M M P a c t i v i t y , a n d ( C ) V D R e x p r e s s i o n i n R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . ( A ) C e l l s w e r e p l a t e d a t a d e n s i t y o f 1 . 0 X 1 0 4 c e l l s / w e l l i n 9 6 - w e l l p l a t e s . 4 8 h a f t e r p l a t i n g , c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h c a l c i t r i o l . P l a t e s w e r e s t a i n e d w i t h M T T a f t e r 5 d a y s o f t r e a t m e n t a n d a b s o r b a n c e w a s r e a d a t 5 4 0 n m . T h e d a s h e d l i n e s h o w s I D 5 0 o f ~ 1 . 0 5 n M . ( B ) T h e a c t i v i t y o f M M P - 9 a n d M M P — 2 w a s a n a l y z e d b y S D S - P A G E z y m o g r a p h y o f c o n d i t i o n m e d i u m f r o m R W P E 2 - W 9 9 c e l l s t r e a t e d w i t h c a l c i t r i o l f o r 4 8 h . 2 . 0 u g o f p r o t e i n w a s l o a d e d / l a n e . ( C ) W e s t e r n b l o t f o r V D R i n c a l c i t r i o l - t r e a t e d R W P E 2 - W 9 9 c e l l s s h o w s a d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n o f V D R e x p r e s s i o n w i t h i n c r e a s i n g c a l c i t r i o l c o n c e n t r a t i o n s b u t i s t h e n d o w n - r e g u l a t e d a t t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 ' 6 M c h o l e c a l c i f e r o l . 2 0 u g p r o t e i n w a s l o a d e d / l a n e . 2 5 6 D i s c u s s i o n I n a d d i t i o n t o i t s c r u c i a l r o l e i n m i n e r a l h o m e o s t a s i s a n d b o n e r e g u l a t i o n , v i t a m i n D i s a l s o i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f s e v e r a l n o r m a l a n d c a n c e r c e l l t y p e s ( B e m a r d i e t a l . , 2 0 0 2 ; G r o s s e t a l . , 1 9 9 8 ; J e n s e n e t a l . , 2 0 0 1 ; K o n e t y e t a l . , 1 9 9 6 ; K r i l l e t a l . , 1 9 9 9 ; M i l l e r e t a l . , 1 9 9 2 ; M i l l e r e t a l . , 1 9 9 5 ; P e e h l e t a l . , 1 9 9 4 ; S h a b a h a n g e t a l . , 1 9 9 3 ; Y o u n g e t a l . , 1 9 9 5 ; Z h a o e t a l . , 2 0 0 0 ) . C a l c i t r i o l [ 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ] h a s a l s o b e e n s h o w n t o i n h i b i t i n v a s i v e a b i l i t y a n d t u m o r i g e n i c i t y o f c a n c e r c e l l s ( H a n s e n e t a l . , 1 9 9 4 ; L o k e s h w a r e t a l . , 1 9 9 9 ; S c h w a r t z e t a l , 1 9 9 7 ) . T h e v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) h a s b e e n f o u n d i n m a n y n o r m a l a n d m a l i g n a n t c e l l s . S e v e r a l e p i d e m i o l o g i c a l s t u d i e s s u g g e s t a n i n v e r s e r e l a t i o n b e t w e e n v i t a m i n D l e v e l s a n d c a n c e r r i s k ( A h o n e n e t a l . , 2 0 0 0 a ; B o d i w a l a e t a l . , 2 0 0 3 ; C o r d e r e t a l . , 1 9 9 3 ; L u s c o m b e e t a l . , 2 0 0 1 ; H a n c h e t t e a n d S c h w a r t z , 1 9 9 2 ) . B a s e d o n t h e s e f a c t s , m u c h w o r k h a s b e e n d o n e t o t e s t t h e e f fi c a c y o f c a l c i t r i o l a s a c h e m o p r e v e n t a t i v e a n d c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t . H o w e v e r , d u e t o t h e a d v e r s e c a l c e m i c e f f e c t s c a u s e d b y c a l c i t r i o l t r e a t m e n t , a l t e r n a t i v e f o r m s o f v i t a m i n D , i n c l u d i n g c a l c i t r i o l p r e c u r s o r s a n d v i t a m i n D a n a l o g s , a r e b e i n g s t u d i e d . U V l i g h t c o n v e r t s 7 - d e h y d r o c h o l e s t e r o l t o p r e - v i t a m i n D 3 , w h i c h i s t h e n c o n v e r t e d t o v i t a m i n D 3 ( c h o l e c a l c i f e r o l ) . C h o l e c a l c i f e r o l i s c o n v e r t e d t o 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 ( 2 5 0 H D 3 ) a n d s u b s e q u e n t l y t o 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 ( c a l c i t r i o l ) , t h e m o s t b i o l o g i c a l l y a c t i v e f o r m o f t h e h o r m o n e ( s e e F i g u r e 8 - 1 ) . G i v e n t h e s i g n i fi c a n t b i o l o g i c a l e f f e c t s o f v i t a m i n D , t h e c o n v e r s i o n o f v i t a m i n D 3 t o c a l c i t r i o l i s o b v i o u s l y v e r y i m p o r t a n t i n t h e h u m a n b o d y . T w o e n z y m e s a r e n e c e s s a r y f o r t h e c o n v e r s i o n o f c h o l e c a l c i f e r o l t o c a l c i t r i o l . T h e l a - h y d r o x y l a s e e n z y m e c o n v e r t s 2 5 7 2 5 0 H D 3 t o c a l c i t r i o l . S e v e r a l t i s s u e t y p e s i n t h e b o d y h a v e t h e c a p a c i t y t o e x p r e s s l a - h y d r o x y l a s e , i n c l u d i n g c o l o n , k e r a t i n o c y t e s , p a n c r e a s , b r a i n , l y m p h n o d e s , a n d o s t e o b l a s t s ( H o l i c k 2 0 0 3 ; O s b o r n e a n d H u t c h i n s o n , 2 0 0 2 ) a n d , t h e r e f o r e , h a v e t h e a b i l i t y t o s y n t h e s i z e c a l c i t r i o l f r o m 2 5 0 H D 3 . R e c e n t l y , i t w a s s h o w n t h a t p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s a l s o p o s s e s s t h e l a - h y d r o x y l a s e e n z y m e ( S c h w a r t z e t a l . , 1 9 9 8 ) . I n t e r e s t i n g l y , a l l o f t h e s e t i s s u e s e x p r e s s v i t a m i n D r e c e p t o r , s u g g e s t i n g a r o l e f o r v i t a m i n D i n t h e s e t a r g e t t i s s u e s . T h e c o n v e r s i o n o f c h o l e c a l c i f e r o l t o 2 5 0 H D 3 r e q u i r e s t h e 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e , C Y P 2 7 A 1 . L i v e r e x p r e s s e s 2 5 - h y d r o x y l a s e a n d i s g e n e r a l l y c o n s i d e r e d t o b e t h e m a j o r s i t e o f s y n t h e s i s o f 2 5 0 H D 3 . H o w e v e r , t h e k i d n e y a n d k e r a t i n o c y t e s a r e o t h e r c e l l t y p e s t h a t h a v e b e e n s h o w n t o e x p r e s s t h e 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e i n h u m a n s ( B i k l e e t a l . , 1 9 8 6 ; L e h m a n n e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e r e f o r e , i t s t a n d s t o r e a s o n t h a t i n o r d e r t o r e g u l a t e c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n i n a t i s s u e — s p e c i fi c m a n n e r , v i t a m i n D t a r g e t c e l l s t h a t e x p r e s s V D R , m a y h a v e t h e c a p a c i t y t o l o c a l l y m e t a b o l i z e s o m e v i t a m i n D p r e c u r s o r s t o i t s a c t i v e f o r m s . T o t h e b e s t o f m y k n o w l e d g e , I d e m o n s t r a t e , f o r t h e fi r s t t i m e , t h e p r e s e n c e o f 2 5 - h y d r o x y l a s e i n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s a s d e t e c t e d b y a p o l y c l o n a l a n t i b o d y t o C Y P 2 7 A 1 . l h a v e s h o w n t h a t u n t r e a t e d R W P E 2 - W 9 9 c e l l s c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s t h e e n z y m e , a n d c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t r e s u l t s i n a d o s e - d e p e n d e n t i n c r e a s e i n i t s e x p r e s s i o n ( F i g u r e 8 - 8 ) . T h e s e d a t a , c o u p l e d w i t h t h e p r e s e n c e o f l a — h y d r o x y l a s e a c t i v i t y ( S c h w a r t z e t a l . , 1 9 9 8 ) , d e m o n s t r a t e t h a t p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s a p p e a r t o p o s s e s s t h e u n i q u e a b i l i t y t o l o c a l l y p r o d u c e c a l c i t r i o l f r o m c h o l e c a l c i f e r o l . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t c h o l e c a l c i f e r o l c o u l d h a v e e f f e c t s s i m i l a r t o t h o s e o f c a l c i t r i o l a n d 2 5 0 H D 3 , o n p r o s t a t e c e l l s , b u t a t h i g h e r d o s e l e v e l s . 2 5 8 L o c a l p r o d u c t i o n o f c a l c i t r i o l i n t h e p r o s t a t e i s p r e s u m e d t o b e o f b i o l o g i c a l i m p o r t a n c e , p e r h a p s f o r t h e p u r p o s e o f r e g u l a t i n g c e l l g r o w t h i n a t i s s u e - s p e c i fi c m a n n e r . T h i s w o u l d d e c r e a s e t h e r i s k o f c a n c e r d e v e l o p m e n t a n d p r o g r e s s i o n i n t i s s u e s p o s s e s s i n g e i t h e r o n e o r b o t h o f t h e e n z y m e s n e c e s s a r y f o r t h e s y n t h e s i s o f c a l c i t r i o l . 2 5 0 H D 3 i s c o n s i d e r e d t o b e t h e b e s t i n d i c a t o r o f v i t a m i n D s t a t u s . L o w s e r u m l e v e l s o f 2 5 0 H D 3 c o r r e l a t e w i t h i n c r e a s e d r i s k o f p r o s t a t e c a n c e r ( A h o n e n e t a l . , 2 0 0 0 a ) , a n d , c o m p a r e d t o c a l c i t r i o l , 2 5 0 H D 3 e x e r t s s i m i l a r a n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s , w i t h s i m i l a r p o t e n c y , o n n o r m a l p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s ( B a r r e t o e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h e r e f o r e , c i r c u l a t i n g l e v e l s o f 2 5 0 H D 3 m a y b e m o r e r e l e v a n t t o t h e c o n t r o l o f p r o s t a t e c a n c e r t h a n c i r c u l a t i n g l e v e l s o f c a l c i t r i o l . I f l o c a l p r o d u c t i o n o f c a l c i t r i o l i s m o r e i m p o r t a n t t h a n s y s t e m i c l e v e l s , t h e n t h e a v a i l a b i l i t y o f c i r c u l a t i n g l e v e l s o f c a l c i t r i o l p r e c u r s o r s ( e . g . 2 5 0 H D 3 a n d c h o l e c a l c i f e r o l ) m a y b e m o r e s i g n i fi c a n t t h a n c i r c u l a t i n g l e v e l s o f c a l c i t r i o l . F o r t h e s e r e a s o n s , I b e l i e v e t h a t c h o l e c a l c i f e r o l , a n a t u r a l p r e c u r s o r t o c a l c i t r i o l a n d i m m e d i a t e p r e c u r s o r t o 2 5 0 H D 3 , m a y h a v e c h e m o p r e v e n t i v e a n d c h e m o t h e r a p e u t i c p o t e n t i a l . I r e p o r t , f o r t h e fi r s t t i m e , t h e e f f e c t s a n d m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f c h o l e c a l c i f e r o l o n h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s . I a l s o p r o v i d e , f o r t h e fi r s t t i m e , e v i d e n c e i n d i c a t i n g t h a t p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l l i n e s , R W P E - l a n d R W P E 2 - W 9 9 , p o s s e s s t h e 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e n e e d e d t o c o n v e r t c h o l e c a l c i f e r o l t o 2 5 0 H D 3 . T h e R W P E - Z c e l l l i n e w a s d e r i v e d f r o m R W P E - l c e l l s b y t r a n s f o r m a t i o n w i t h t h e K i - r a s o n c o g e n e ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ; W e b b e r e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e m a l i g n a n t R W P E 2 - W 9 9 c e l l l i n e w a s c l o n e d f r o m R W P E - 2 , a n d c h o s e n f o r i t s h i g h K i - r a s e x p r e s s i o n . T h e m a j o r i t y o f s t u d i e s h a v e u s e d c e l l l i n e s ( i . e . D U - 1 4 5 , P C - 3 , a n d L N C a P ) i s o l a t e d f r o m m e t a s t a t i c t u m o r s w h i c h r e p r e s e n t l a t e s t a g e , a d v a n c e d d i s e a s e . H o w e v e r , t h e m a j o r i t y o f 2 5 9 p r o s t a t e c a n c e r s a r e s l o w - g r o w i n g p r i m a r y t u m o r s . R W P E 2 — W 9 9 f o r m s s l o w g r o w i n g t u m o r s , t h u s , m i m i c k i n g t h e m a j o r i t y o f p r o s t a t e c a n c e r s . T h e r e f o r e , R W P E 2 - W 9 9 i s a m o r e a p p r o p r i a t e m o d e l f o r s t u d y i n g t h e e f f e c t s a n d m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f a g e n t s f o r r e v e r s i n g t h e d i s e a s e o n c e i t h a s b e e n i n i t i a t e d ( s e c o n d a r y p r e v e n t i o n ) a n d p r e v e n t i n g i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s o f d i s e a s e ( t e r t i a r y p r e v e n t i o n ) . T h e R W P E 2 - W 9 9 c e l l s f o r m t u m o r s i n n u d e m i c e , f o r m c o l o n i e s i n a g a r , a n d a r e i n v a s i v e . I e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n s e v e r a l m a l i g n a n t c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . T o t h e b e s t o f m y k n o w l e d g e , t h e s e a r e t h e fi r s t i n v e s t i g a t i o n s t o t e s t t h e e f f e c t s o f t h e c h o l e c a l c i f e r o l f o r m o f v i t a m i n D o n p r o s t a t e , o r a n y o t h e r , c e l l t y p e s . I n t h e p r e s e n t s t u d y , c h o l e c a l c i f e r o l w a s s h o w n t o i n h i b i t t h e a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h o f R W P E 2 - W 9 9 h u m a n p r o s t a t e c a r c i n o m a c e l l s ( F i g u r e 8 - 3 A ) i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . R W P E 2 - W 9 9 c e l l s t r e a t e d w i t h c a l c i t r i o l a l s o s h o w e d a d o s e - d e p e n d e n t i n h i b i t i o n o f a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h ( F i g u r e 8 - 9 ) . T h e s e c e l l s w e r e ~ 6 - f o l d m o r e s e n s i t i v e t o c a l c i t r i o l w i t h a n I D 5 0 o f ~ 1 . 0 5 u M a s c o m p a r e d t o ~ 6 . 4 u M f o r c h o l e c a l c i f e r o l . S i m i l a r r e s u l t s w e r e s e e n w i t h k e r a t i n o c y t e s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l a n d c a l c i t r i o l ( C h e n e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h i s i s n o t s u r p r i s i n g g i v e n t h a t b o t h p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s a n d k e r a t i n o c y t e s e x p r e s s t h e 2 5 - h y d r o x y l a s e a n d l a - h y d r o x y l a s e e n z y m e s n e e d e d t o c o n v e r t c h o l e c a l c i f e r o l t o c a l c i t r i o l ( B i k l e e t a l . , 1 9 8 6 ; L e h m a n n e t a l . , 1 9 9 9 ; S c h w a r t z e t a l . , 1 9 9 8 ) . K e r a t i n o c y t e s u s e t h e s e t w o e n z y m e s t o l o c a l l y p r o d u c e c a l c i t r i o l . C a l c i t r i o l r e g u l a t e s t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f k e r a t i n o c y t e s a n d i s a l s o u s e d t o t r e a t p s o r i a s i s , a h y p e r p r o l i f e r a t i v e s k i n d i s e a s e . T h e s e f a c t s , a n d t h e s e s i m i l a r i t i e s s h a r e d b e t w e e n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s a n d k e r a t i n o c y t e s , s u g g e s t t h a t c h o l e c a l c i f e r o l h a s t h e p o t e n t i a l t o b e a n e f f e c t i v e a g e n t f o r p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t n o t o n l y o f p r o s t a t e c a n c e r b u t a l s o 2 6 0 o t h e r c a n c e r s . T h i s a l s o r a i s e s t h e p o s s i b i l i t y t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c o u l d h a v e s i m i l a r g r o w t h i n h i b i t o r y e f f e c t s i n o t h e r t i s s u e s t h a t e x p r e s s V D R a n d t h e l a - h y d r o x l a s e e n z y m e , s u c h a s t h e c o l o n a n d p a n c r e a s . I t i s i n t e r e s t i n g t o p o i n t o u t t h a t t h e s e t i s s u e s , l i k e t h e p r o s t a t e , a r e s i t e s o f c o m m o n e p i t h e l i a l m a l i g n a n c i e s . T o d a t e , s t u d i e s s h o w t h a t c a l c i t r i o l m o d u l a t e s t h e p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f s e v e r a l c e l l t y p e s t h a t e x p r e s s V D R t h r o u g h a n u m b e r o f m e c h a n i s m s , i n c l u d i n g m o d u l a t i o n o f g e n e s i n v o l v e d i n c e l l c y c l e r e g u l a t i o n , a l t e r a t i o n s i n g r o w t h f a c t o r s , a n d r e g u l a t i o n o f h o r m o n e s a n d t h e i r r e c e p t o r s , f o r e x a m p l e , a n d r o g e n i n t h e p r o s t a t e g l a n d . A b e r r a t i o n s i n t h e G l / S c h e c k p o i n t o f t h e c e l l c y c l e h a v e b e e n o b s e r v e d i n m a n y c a n c e r s . C a l c i t r i o l e x e r t s m o s t o f i t s a n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s , a n d m a y p r o d u c e c o m p l e t e g r o w t h a r r e s t , a t t h i s c h e c k p o i n t . E x p o s u r e o f c a n c e r c e l l s t o c a l c i t r i o l r e s u l t s i n f e w e r c e l l s e n t e r i n g t h e S p h a s e o f t h e c e l l c y c l e . C a l c i t r i o l t r e a t m e n t c a u s e s a d o w n - r e g u l a t i o n o f s e v e r a l c y c l i n s a n d c d k s a n d u p - r e g u l a t i o n o f p 2 1 a n d p 2 7 ( J e n s e n e t a l . , 2 0 0 1 ; V e r l i n d e n e t a l . , 1 9 9 8 ; Z h u a n g e t a l . , 1 9 9 8 ) . C y c l i n s a r e p r o t e i n s t h a t g o v e r n t r a n s i t i o n t h r o u g h d i s t i n c t p h a s e s o f t h e c e l l c y c l e b y f o r m i n g c o m p l e x e s w i t h a n d r e g u l a t i n g t h e a c t i v i t y o f t h e c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e s ( c d k ) . O n c e f o r m e d , t h e s e c o m p l e x e s h e l p c e l l s o v e r c o m e i n h e r e n t b l o c k s i n t h e c e l l c y c l e . C d k s a r e i n h i b i t e d b y c d k i n h i b i t o r s ( c d k i ) , i n c l u d i n g p 2 1 a n d p 2 7 . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e e f f e c t o f c a l c i t r i o l o n p 2 1 i s s e c o n d a r y t o t h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n T G F - B . C a l c i t r i o l i n h i b i t s c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d p r o m o t e s d i f f e r e n t i a t i o n o f p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s b y e l e v a t i n g T G F - B p r o d u c t i o n a n d s i g n a l i n g ( D a n i e l p o u r , 1 9 9 6 ; M u r t h y a n d W e i g e l , 2 0 0 4 ) . W e h a v e p r e v i o u s l y s h o w n t h a t T G F - B i n h i b i t s t h e g r o w t h o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ) . H o w e v e r , c a l c i t r i o l c o u l d a l s o a c t d i r e c t l y o n p 2 1 2 6 1 b e c a u s e t h e p r o m o t e r r e g i o n o f p 2 1 c o n t a i n s a v i t a m i n D r e s p o n s e e l e m e n t ( V D R E ) ( V e r l i n d e n e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h u s , v i t a m i n D c o u l d i n h i b i t c e l l p r o l i f e r a t i o n b y t w o i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s . M a l i g n a n t c e l l s , s u c h a s R W P E 2 - W 9 9 , s h o w a n c h o r a g e i n d e p e n d e n c e w h i c h i s r e l a t e d t o t u m o r i g e n i c i t y . I n a d d i t i o n t o i n h i b i t i n g a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h , c h o l e c a l c i f e r o l w a s a l s o s h o w n t o i n h i b i t , i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r , t h e a n c h o r a g e - i n d e p e n d e n t g r o w t h , i . e c o l o n y f o r m i n g e f fi c i e n c y , o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s ( F i g u r e 8 - 3 B ) . I n a s i m i l a r a g a r a s s a y , c a l c i t r i o l a n d s e v e r a l v i t a m i n D a n a l o g s i n h i b i t e d t h e c l o n a l p r o l i f e r a t i o n o f s e v e r a l p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s ( d e V o s e t a l . , 1 9 9 7 ) . C a l c i t r i o l r e d u c e s t h e s i z e a n d n u m b e r o f m e t a s t a s e s d e r i v e d f r o m D u n n i n g r a t p r o s t a t e t u m o r s i n v i v o ( G e t z e n b e r g e t a l . , 1 9 9 7 ) . A l s o , C o p e n h a g e n r a t s i n j e c t e d w i t h M A T L y L u p r o s t a t e c a n c e r c e l l s s h o w e d a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n t h e s i z e a n d n u m b e r o f l u n g m e t a s t a s e s i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i t r i o l ( L o k e s h w a r e t a l . , 1 9 9 9 ) . R e s u l t s f r o m t h e p r e s e n t s t u d y s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l i s e f f e c t i v e i n i n h i b i t i n g a n c h o r a g e - i n d e p e n d e n t g r o w t h o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . T h e r e f o r e , i t s e f fi c a c y i n i n h i b i t i n g t u m o r g r o w t h s h o u l d b e i n v e s t i g a t e d . T h e a b i l i t y o f c a n c e r c e l l s t o i n v a d e d e p e n d s o n m u l t i p l e f a c t o r s i n c l u d i n g l o s s o f c e l l z c e l l a n d c e l l z m a t r i x a d h e s i o n , l o s s o f c e l l p o l a r i z a t i o n , e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n a n d s e c r e t i o n o f p r o t e a s e s , a n d c e l l m o t i l i t y . I n o r d e r f o r c a n c e r c e l l s t o i n v a d e , t h e b a s e m e n t m e m b r a n e i s d e g r a d e d b y s e v e r a l p r o t e a s e s r e s u l t i n g i n a l o s s o f c e l l a d h e s i o n t o t h e b a s e m e n t m e m b r a n e a n d n e i g h b o r i n g c e l l s . C a l c i t r i o l i n h i b i t s i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s i n s e v e r a l m a l i g n a n t c e l l t y p e s , b o t h i n v i t r o a n d i n v i v o ( G e t z e n b e r g e t a l . , 1 9 9 7 ; H a n s e n e t a l . , 1 9 9 4 ; K o l i a n d K e s k i - O j a , 2 0 0 0 ; K o n e t y e t a l . , 2 0 0 1 ; S c h w a r t z e t a l . , 1 9 9 7 ) . I n 2 6 2 r e l a t i o n t o m e c h a n i s m s f o r t h e s e e f f e c t s , c a l c i t r i o l w a s s h o w n t o i n h i b i t t h e a c t i v i t y o f s e r i n e p r o t e a s e s a n d m e t a l l o p r o t e i n a s e s t h a t a r e i m p o r t a n t d e t e r m i n a n t s o f i n v a s i o n . C a l c i t r i o l d e c r e a s e d a c t i v i t y o f c o m p o n e n t s o f t h e p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r ( P A ) s y s t e m , i n c l u d i n g u r o k i n a s e P A ( u P A ) , t i s s u e - t y p e P A ( t P A ) a n d i n c r e a s e d t h e e x p r e s s i o n o f P A i n h i b i t o r . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t t h e u P A p r o m o t e r r e g i o n c o n t a i n s a V D R E ( K o l i a n d K e s k i - O j a , 2 0 0 0 ) . P r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s h a v e b e e n s h o w n t o i n t r i n s i c a l l y s e c r e t e t P A a n d u P A , w h i c h w a s p r o p o s e d t o p l a y a k e y r o l e i n t u m o r p r o g r e s s i o n ( W a g h r a y a n d W e b b e r , 1 9 9 5 ) . T h e ( 1 6 a n d [ 3 4 i n t e g r i n s a r e a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d m i g r a t i o n a n d i n v a s i o n o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . C a l c i t r i o l r e d u c e s m i g r a t i o n a n d i n v a s i o n b y d o w n - r e g u l a t i n g b o t h o f t h e s e i n t e g r i n s ( S u n g a n d F e l d m a n , 2 0 0 0 ) . T h e B 3 i n t e g r i n g e n e c o n t a i n s a f u n c t i o n a l V D R E ( O s b o r n e a n d H u t c h i n s o n , 2 0 0 2 ) , s u g g e s t i n g t h a t c a l c i t r i o l c o u l d i n h i b i t m i g r a t i o n a n d i n v a s i o n b y m o d u l a t i n g o t h e r m e m b e r s o f t h e i n t e g r i n f a m i l y . L o s s o f fi b r o n e c t i n ( F N ) , a n e x t r a c e l l u l a r m a t r i x p r o t e i n , r e s u l t s i n t h e l o s s o f c e l l u l a r a d h e s i v e n e s s a n d t h e a c q u i s i t i o n o f m e t a s t a t i c p h e n o t y p e i n m a l i g n a n t c e l l s . T h e F N g e n e a l s o c o n t a i n s a V D R E a n d c a l c i t r i o l t r e a t m e n t i n d u c e s F N t r a n s c r i p t i o n ( P o l l y e t a l . , 1 9 9 6 ) . I h a v e s h o w n t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t a l s o r e s u l t s i n t h e i n h i b i t i o n o f i n v a s i o n ( F i g u r e 8 - 4 A ) a n d m o t i l i t y ( F i g u r e 8 - 4 B ) o f t h e R W P E 2 - W 9 9 p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . M e t a s t a t i c s p r e a d c o n t i n u e s t o b e t h e g r e a t e s t b a r r i e r t o c a n c e r c u r e . C e l l s m u s t e x h i b i t a n i n v a s i v e a n d m o t i l e p h e n o t y p e i n o r d e r t o p r o d u c e m e t a s t a s e s . T h e r e f o r e , t h e a b i l i t y o f c h o l e c a l c i f e r o l a n d c a l c i t r i o l t o i n h i b i t i n v a s i o n a n d m o t i l i t y , a n d , t h u s , r e d u c e t h e f o r m a t i o n o f m e t a s t a t i c t u m o r s w o u l d b e e x t r e m e l y b e n e fi c i a l i n t h e t r e a t m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r . 2 6 3 T o i n v e s t i g a t e t h e m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f c h o l e c a l c i f e r o l t h a t a r e i n v o l v e d i n i n h i b i t i o n o f i n v a s i o n , I t e s t e d i t s e f f e c t s o n t h e a c t i v i t y o f M M P - 9 a n d M M P - 2 . C a n c e r i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s a r e t h e r e s u l t o f p r o t e o l y t i c d e g r a d a t i o n o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x . M a t r i x m e t a l l p r o t e i n a s e s ( M M P s ) , p a r t i c u l a r l y M M P - 9 a n d M M P - 2 , h a v e b e e n s u g g e s t e d t o p l a y a m a j o r r o l e i n t h i s d e g r a d a t i o n ( L i o t t a a n d S t e t l e r - S t e v e n s o n , 1 9 9 1 ) . M M P - 9 a n d M M P - 2 a r e e x p r e s s e d i n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s a n d t h e i r i n c r e a s e d e x p r e s s i o n i s a s s o c i a t e d w i t h p r o s t a t e c a n c e r p r o g r e s s i o n ( S t e a m s a n d S t e a r n s , 1 9 9 6 a ; S t e a m s a n d S t e a m s , 1 9 9 6 b ) . C a l c i t r i o l h a s b e e n s h o w n t o d e c r e a s e t h e a c t i v i t y o f b o t h M M P - 9 a n d M M P - 2 ( K o l i a n d K e s k a - O j a , 2 0 0 0 ; S c h w a r t z e t a l . , 1 9 9 7 ) . I o b s e r v e d a s i m i l a r , d o s e - d e p e n d e n t , d e c r e a s e i n t h e a c t i v i t y o f b o t h M M P - 9 a n d M M P - 2 i n R W P E 2 - W 9 9 p r o s t a t e c a n c e r c e l l s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . T h i s i n h i b i t i o n o f M M P a c t i v i t y w o u l d c a u s e a m a r k e d r e d u c t i o n o f p r o t e o l y t i c d e g r a d a t i o n o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x , r e s u l t i n g i n a d e c r e a s e i n i n v a s i v e a b i l i t y o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . C h o l e c a l c i f e r o l m a y i n h i b i t i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s n o t o n l y b y m o d u l a t i n g M M P a c t i v i t y b u t a l s o b y m o d u l a t i n g t h e a c t i v i t y o f m e m b e r s o f t h e p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r s y s t e m d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y t h r o u g h t h e i r i n h i b i t o r s . T h e s e m e c h a n i s m s r e m a i n t o b e e l u c i d a t e d . T h e p r i m a r y fi m c t i o n o f M M P i n h i b i t o r s , t h e t i s s u e i n h i b i t o r s o f m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( T I M P s ) , i s t o i n h i b i t t h e d e g r a d a t i v e a c t i o n s o f M M P s d u r i n g t i s s u e r e m o d e l i n g ( N a g a s e a n d W o e s s n e r , 1 9 9 9 ) . A s u b s e t o f M M P s , k n o w n a s m e m b r a n e - t y p e M M P s ( M T - M M P s ) , a r e a b l e t o a c t i v a t e s e c r e t e d M M P s , p a r t i c u l a r l y M M P - 2 ( C o r c o r a n e t a l . , 1 9 9 6 ; S t r o n g i n e t a l . , 1 9 9 5 ) . M T - M M P s c a n a l s o c l e a v e p r o t e i n s i n t h e b a s e m e n t m e m b r a n e , w h i c h e n h a n c e s t h e m i g r a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s ( U d a y a k u m a r e t a l , 2 0 0 3 ) . T h e o b s e r v e d d e c r e a s e i n M M P a c t i v i t y i n m y e x p e r i m e n t s m a y , i n p a r t , b e t h e 2 6 4 r e s u l t o f a c h o l e c a l c i f e r o l - r e l a t e d i n c r e a s e i n T I M P l e v e l s , a d e c r e a s e i n M M P a n d / o r M T - M M P l e v e l s . I n c r e a s e d l e v e l s o f a c t i v a t e d M M P - 2 a h a v e b e e n o b s e r v e d w i t h i n c r e a s i n g G l e a s o n s c o r e s o f p r o s t a t e c a n c e r ( S t e a m s a n d S t e a m s , I 9 9 6 b ) , s u g g e s t i n g a n i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n d i f f e r e n t i a t i o n a n d M M P - 2 a l e v e l s . L e v e l s o f M M P - 2 i n c r e a s e p r o g r e s s i v e l y f r o m t h e n o r m a l p r o s t a t e , t h r o u g h p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a , t o i n v a s i v e c a n c e r ( M o n t i r o n i e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e e f f e c t s o f v i t a m i n D o n T I M P s a n d M T - M M P s o n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s h a v e n o t b e e n s t u d i e d a n d t h e s u g g e s t i o n t h a t c h o l e c a l c i f e r o l w o r k s t o d e c r e a s e M M P a c t i v i t y t h r o u g h o n e o f t h e s e m e c h a n i s m s n e e d s f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n . T o f u r t h e r e x a m i n e f a c t o r s t h a t c o n t r i b u t e t o i n h i b i t i o n o f i n v a s i o n b y c h o l e c a l c i f e r o l , I e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n t h e e x p r e s s i o n o f t h e i n t e r m e d i a t e d fi l a m e n t p r o t e i n v i m e n t i n . V i m e n t i n i s n o r m a l l y e x p r e s s e d i n m e s e n c h y m a l c e l l s . V i m e n t i n i s n o t n o r m a l l y e x p r e s s e d i n d i f f e r e n t i a t e d , s e c r e t o r y e p i t h e l i a l c e l l s , b u t m a y b e e x p r e s s e d b y r a p i d l y p r o l i f e r a t i n g e p i t h e l i a l c e l l s i n c u l t u r e , a n d u n d i f f e r e n t i a t e d e p i t h e l i a l c e l l s , s u c h a s p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . V i m e n t i n e x p r e s s i o n i n c r e a s e s w i t h i n c r e a s i n g m o t i l i t y o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s ( F r a g a e t a l . , 2 0 0 2 ; L a n g e t a l . , 2 0 0 2 ) . S e v e r a l i n v i v o s t u d i e s s u g g e s t t h a t v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n e p i t h e l i a l c e l l s m a y b e r e l a t e d t o t u m o r p r o g r e s s i o n ( G i l l e s e t a l . , 1 9 9 6 ) . M y r e s u l t s s h o w ( F i g u r e 8 - 5 ) t h a t c h o l e c a l c i f e r o l c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n t h e e x p r e s s i o n o f t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n v i m e n t i n . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t c h o l e c a l c i f e r o l m a y i n d u c e d i f f e r e n t i a t i o n b y d e c r e a s i n g v i m e n t i n e x p r e s s i o n a n d , t h u s , i n h i b i t m o t i l i t y a n d i n v a s i o n o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . 2 6 5 I n a d d i t i o n t o g r o w t h a n d t u m o r i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s , c h o l e c a l c i f e r o l m a y m o d u l a t e o t h e r c h a r a c t e r i s t i c s a s s o c i a t e d w i t h a m a l i g n a n t p h e n o t y p e . L o s s o f d i f f e r e n t i a t i o n i s a n i m p o r t a n t c h a r a c t e r i s t i c a s s o c i a t e d w i t h m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n i n e p i t h e l i a l c e l l s . E p i t h e l i a l c e l l s n o r m a l l y e x p r e s s t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t s , c y t o k e r a t i n s . T h e e p i t h e l i a l o r i g i n o f t h e R W P E 2 - W 9 9 c e l l s h a s b e e n e s t a b l i s h e d p r e v i o u s l y ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ) a n d s u b s t a n t i a t e d b y m y W e s t e r n b l o t a n a l y s e s ( d a t a n o t s h o w n ) . C h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t h a d n o e f f e c t o n t h e e x p r e s s i o n o f c y t o k e r a t i n 1 8 ( d a t a n o t s h o w n ) , w h i c h i s i n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s u s i n g c a l c i t r i o l ( P e e h l e t a l . , 1 9 9 4 ) . S o f a r I h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t i n h i b i t s b o t h a n c h o r a g e - d e p e n d e n t a n d — i n d e p e n d e n t g r o w t h , i n d u c e s d i f f e r e n t i a t i o n , a n d i n h i b i t s M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y a n d e x p r e s s i o n o f i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n v i m e n t i n , w i t h c o n c o m i t a n t d e c r e a s e i n m o t i l i t y a n d i n v a s i o n . T h e b i o l o g i c a l e f f e c t s o f v i t a m i n D a r e m e d i a t e d v i a i t s n u c l e a r r e c e p t o r , V D R . T o e x p l o r e p o s s i b l e m e c h a n i s m s o f a c t i o n , I e x a m i n e d t h e e x p r e s s i o n o f s e v e r a l n u c l e a r r e c e p t o r s a n d t h e i r m o d u l a t i o n b y c h o l e c a l c i f e r o l . T h e s e r e c e p t o r s i n c l u d e t h e v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) , r e t i n o i d X r e c e p t o r s ( R X R - a , - B , a n d — y ) , a n d t h e a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) . T h e d i s c o v e r y t h a t V D R s a r e a c o m m o n f e a t u r e o f n o r m a l , b e n i g n a n d m a l i g n a n t p r o s t a t i c e p i t h e l i u m ( M i l l e r e t a l . , 1 9 9 5 ) s u g g e s t s t h a t t h e s e r e c e p t o r s c o u l d m o d u l a t e t h e m a l i g n a n t p h e n o t y p e o f p r o s t a t e c a n c e r i n v i v o . P r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s a p p e a r t o b e t h e p r i m a r y t a r g e t o f v i t a m i n D ( M i l l e r e t a l . , 1 9 9 5 ) . V D R e x p r e s s i o n i s a l s o t h e h i g h e s t i n t h e p e r i p h e r a l z o n e o f t h e p r o s t a t e ( K r i l l e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h i s i s p a r t i c u l a r l y i m p o r t a n t g i v e n t h a t m o s t p r o s t a t e c a n c e r s d e v e l o p i n t h e p e r i p h e r a l z o n e a n d a r e o f e p i t h e l i a l o r i g i n . U p o n b i n d i n g t o i t s l i g a n d , t h e V D R f o r m s h e t e r o d i m e r s w i t h r e t i n o i d X 2 6 6 g r o w t h . W e h a v e f o u n d t h a t c o m b i n e d t r e a t m e n t w i t h c h o l e c a l c i f e r o l a n d r e c e p t o r s ( ( 1 , - B , a n d y ) t o c a r r y o u t i t s t r a n s c r i p t i o n a l e f f e c t s . C a l c i t r i o l e n h a n c e s t h e f o r m a t i o n o f V D R z R X R h e t e r o d i m e r s a n d p r o m o t e s t h e i r b i n d i n g t o v i t a m i n D r e s p o n s e e l e m e n t s ( V D R E ) . T h e b i n d i n g o f c a l c i t r i o l a n d R X R t o V D R i s r e q u i r e d t o i n d u c e a V D R c o n f o r m a t i o n t h a t i s c o m p e t e n t t o a c t i v a t e t r a n s c r i p t i o n . T h e d i m e r i z a t i o n w i t h R X R S p r o m o t e s n u c l e a r l o c a l i z a t i o n o f u n l i g a n d e d V D R s . R X R S p r o m o t e n u c l e a r a c c u m u l a t i o n o f V D R a n d i n h i b i t e x p o r t o f V D R f r o m t h e n u c l e u s . D e g r a d a t i o n o f R X R S r e d u c e s t h e s e n s i t i v i t y o f c e l l s t o a n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l . E l e v a t e d l e v e l s o f R X R - a i n c r e a s e t h e a n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l b y i n c r e a s i n g c a l c i t r i o l - i n d u c e d e x p r e s s i o n o f p 2 1 , a c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r ( P r u f e r e t a l . , 2 0 0 0 ; P r u f e r a n d B a r s o n y , 2 0 0 2 ) , w h i l e d i s r u p t i o n o f R X R - a r e s u l t s i n t h e d e v e l o p m e n t o f d y s p l a s i a i n p r o s t a t e s o f m i c e ( H u a n g e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h i s i l l u s t r a t e s t h e i m p o r t a n c e o f R X R s i n t r e a t m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r w i t h v i t a m i n D . M y r e s u l t s s h o w t h a t t r e a t m e n t w i t h c h o l e c a l c i f e r o l c a u s e d a m a r k e d i n c r e a s e i n t h e e x p r e s s i o n o f V D R . F u r t h e r m o r e , a m o n g s t t h e R X R S , t h e e x p r e s s i o n o f R X R - a w a s a l s o m a r k e d l y i n c r e a s e d . T h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v e d g r o w t h i n h i b i t i o n i n d u c e d b y c h o l e c a l c i f e r o l i n R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . I n a d d i t i o n , t h e s e r e s u l t s a r e a l s o c o n s i s t e n t w i t h r e p o r t s i n d i c a t i n g t h a t i n c r e a s e d R X R - 0 L l e v e l s i n c r e a s e t h e a n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l ( P r u f e r a n d B a r s o n y , 2 0 0 2 ; P r u f e r e t a l . , 2 0 0 0 ) . I n c r e a s i n g V D R a n d R X R e x p r e s s i o n c o u l d i n c r e a s e t h e s e n s i t i v i t y o f c e l l s t o b o t h c h o l e c a l c i f e r o l a n d r e t i n o i d s , s u g g e s t i n g a r o l e f o r c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t s w i t h t h e s e t w o a g e n t s . S e v e r a l s t u d i e s h a v e e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f c o m b i n a t i o n t h e r a p i e s u s i n g c a l c i t r i o l a n d r e t i n o i d s a n d f o u n d t h e s e t r e a t m e n t s t o h a v e a s y n e r g i s t i c e f f e c t o n c e l l 2 6 7 N - ( 4 - h y d r o x y p h e n y l ) r e t i n a m i d e ( 4 - H P R ) , a s y n t h e t i c r e t i n o i d , r e s u l t e d i n a s y n e r g i s t i c i n h i b i t i o n o f g r o w t h o f R W P E - l c e l l s ( m a n u s c r i p t i n p r e p a r a t i o n ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t c o m b i n e d t r e a t m e n t w i t h c h o l e c a l c i f e r o l a n d 4 - H P R m a y h a v e e n h a n c e d c h e m o p r e v e n t i v e a n d c h e m o t h e r a p e u t i c a b i l i t y . I t w i l l b e i n t e r e s t i n g t o e x a m i n e c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t s w i t h c h o l e c a l c i f e r o l a n d o t h e r r e t i n o i d s t o d e t e r m i n e i f t h e y w i l l h a v e s i m i l a r e f f e c t s . I h a v e n o t y e t e x p l o r e d t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n r e t i n o i c a c i d r e c e p t o r s ( R A R s ) , b u t t h i s w i l l b e a n i m p o r t a n t a r e a o f fi x t u r e s t u d y u s i n g c h o l e c a l c i f e r o l . I t i s w e l l k n o w n t h a t e a r l y f o r m s o f p r o s t a t e c a n c e r a r e a n d r o g e n - d e p e n d e n t , l e a d i n g t o t h e b e l i e f t h a t t h e a n d r o g e n p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h i s d i s e a s e . T h e a n d r o g e n r e c e p t o r r e g u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f a n d r o g e n - r e s p o n s i v e g e n e s b y b i n d i n g t o t h e i r a n d r o g e n - r e s p o n s e e l e m e n t s a n d b y i n t e r a c t i n g w i t h o t h e r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s . A n o t a b l e g e n e r e g u l a t e d b y a n d r o g e n i n t h e p r o s t a t e i s p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) ( C r a w f o r d e t a l , 1 9 9 6 ) . P r o s t a t e c a r c i n o g e n e s i s i s d r i v e n b y a n d r o g e n , t h e r e f o r e , t h e a n d r o g e n r e c e p t o r i s a p r i m e t a r g e t f o r c a n c e r t r e a t m e n t a n d p r e v e n t i o n . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t n o t o n l y d o e s c a l c i t r i o l u p - r e g u l a t e A R e x p r e s s i o n b u t t h a t t h e a n d r o g e n S a - d i h y d r o t e s t o s t e r o n e ( S o n - D H T ) u p - r e g u l a t e s V D R , i n d i c a t i n g a p o s s i b l e c r o s s - t a l k b e t w e e n V D R a n d A R ( A h o n e n e t a l . , 2 0 0 0 b ) . M y r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e d a n u p - r e g u l a t i o n o f a n d r o g e n r e c e p t o r e x p r e s s i o n i n R W P E 2 - W 9 9 c e l l s ( F i g u r e 8 - 8 ) . T h e i n d u c t i o n o f A R b y c h o l e c a l c i f e r o l c o u l d D O t e n t i a l l y r e s t o r e a n d r o g e n r e s p o n s i v e n e s s t o p r o s t a t e c a n c e r p a t i e n t s w h o a r e n o t r e s 1 3 > < ) n s i v e t o c u r r e n t t h e r a p i e s . I f c h o l e c a l c i f e r o l f u n c t i o n s a s a d i f f e r e n t i a t i n g a g e n t , p e r h a p s t h e i n c r e a s e d l e v e l s o f A R r e p r e s e n t a m o r e d i f f e r e n t i a t e d p h e n o t y p e . I n d u c t i o n Q ? V D R a n d A R b y c h o l e c a l c i f e r o l m a y e x p l a i n t h e g r o w t h i n h i b i t o r y e f f e c t s o f 2 6 8 c h o l e c a l c i f e r o l . T h i s i n d u c t i o n o f d i f f e r e n t i a t i o n i s a p o s i t i v e s t e p i n u s i n g c h o l e c a l c i f e r o l i n c h e m o p r e v e n t i o n . D i f f e r e n t i a t i o n o f p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s t o l u m i n a l , s e c r e t o r y c e l l s , i s a s s o c i a t e d w i t h s y n t h e s i s a n d s e c r e t i o n o f p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) . P S A h a s e m e r g e d a s t h e m o s t u s e f u l t u m o r m a r k e r f o r t h e s c r e e n i n g a n d e a r l y d e t e c t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r a s w e l l a s a f o l l o w - u p t o o l a f t e r t h e r a p y . P S A i s a 3 3 k D a g l y c o p r o t e i n t h a t i s s p e c i fi c t o t h e p r o s t a t i c e p i t h e l i u m . I t i s a n i m p o r t a n t c o m p o n e n t a n d o n e o f t h e m o s t a b u n d a n t s e r i n e p r o t e a s e s i n t h e s e m i n a l p l a s m a ( W e b b e r e t a 1 , 1 9 9 5 ) . D i f f e r e n t i a t e d p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s s e c r e t e P S A . A s t h e t o t a l n u m b e r o f c e l l s i n c r e a s e s , s e r u m P S A l e v e l s i n c r e a s e , i n d i c a t i n g t h e p o s s i b i l i t y o f p r o s t a t e c a n c e r ( B l u t t a n d W e i g e l , 1 9 9 9 ) . C e l l u l a r s y n t h e s i s o f P S A i n c r e a s e s w h e n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s a r e t r e a t e d w i t h 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 , s u g g e s t i n g 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 m a y b e c a p a b l e o f c a u s i n g d i f f e r e n t i a t i o n o f p r o s t a t e c e l l s ( M i l l e r e t a l , 1 9 9 2 ) . A l t h o u g h t h i s i s s e e m i n g l y i n c o n s i s t e n t w i t h t h e f a c t t h a t r i s i n g s 6 1 1 1 1 1 ) P S A l e v e l s m a y b e a n i n d i c a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r , l o w e r l e v e l s o f P S A w i l l r e s u l t d u e t o t h e a b i l i t y o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 t o r e d u c e c e l l n u m b e r b y i n h i b i t i n g g r o w t h . C h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e d a n u p - r e g u l a t i o n o f P S A i n t h e R W P E 2 - W 9 9 a n d R W P E - l c e l l s ( s e e C h a p t e r 9 ) , p r o v i d i n g f u r t h e r p r o o f t h a t c h o l e c a l c i f e r o l i n d u c e s d i f f e r e n t i a t i o n i n t h i s c e l l l i n e . T o c o m p a r e t h e e f fi c a c y o f c h o l e c a l c i f e r o l w i t h t h a t o f c a l c i t r i o l , I p e r f o r m e d s e v e r a l o f t h e s a m e a s s a y s d e s c r i b e d a b o v e u s i n g c a l c i t r i o l a s t h e t e s t a g e n t . I n t e r e s t i n g l y , b u t n o t s u r p r i s i n g l y , c o m p a r e d t o c a l c i t r i o l , c h o l e c a l c i f e r o l s h o w e d v e r y S i t r l i l a r r e s u l t s ( F i g u r e s 8 - 3 a n d 8 - 9 ) . T h e r e s u l t s f o r e a c h a g e n t w e r e w i t h i n n o r m a l Q ‘ t x ‘ j s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s . I n a l l a s s a y s s t u d i e d , t h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l a p p e a r t o 2 6 9 o c c u r a t a p p r o x i m a t e l y a 6 - t o l O - f o l d l o w e r c o n c e n t r a t i o n t h a n c h o l e c a l c i f e r o l . N o r m a l p h y s i o l o g i c a l l e v e l s o f c a l c i t r i o l a r e 0 . 1 n M ( 1 0 " 0 M ) t o 1 n M ( 1 0 ' 9 M ) a n d p h a r m a c o l o g i c a l l e v e l s a r e a p p r o x i m a t e l y 0 . 1 u M ( 1 0 ' 7 M ) ( F r i e d r i c h 1 9 8 8 ; S c h w a r t z e t a l . , 1 9 9 7 ) . I n c o m p a r i s o n , p h y s i o l o g i c a l l e v e l s o f c h o l e c a l c i f e r o l f a l l b e t w e e n 0 . 0 1 u M ( 1 0 " 3 M ) a n d 0 . 1 u M ( 1 0 " 7 M ) ( F r i e d r i c h 1 9 8 8 ) . I a m n o t a w a r e o f a n y o t h e r e x p e r i m e n t a l o r c l i n i c a l s t u d i e s u s i n g c h o l e c a l c i f e r o l , t h e r e f o r e , p h a r m a c o l o g i c a l d o s e s m a y n o t y e t h a v e b e e n d e t e r m i n e d . H o w e v e r , t h e r e h a s n e v e r b e e n a r e p o r t o f h y p e r c a l c e m i a d u e t o o v e r e x p o s u r e t o s u n l i g h t , w h i c h i s t h e m a i n s o u r c e o f c h o l e c a l c i f e r o l i n t h e b o d y . B a s e d o n k n o w n n o r m a l p h y s i o l o g i c a l l e v e l s f o r c a l c i t r i o l a n d c h o l e c a l c i f e r o l , a n d p h a r m a c o l o g i c a l d o s e s f o r c a l c i t r i o l , t h e c o n c e n t r a t i o n s u s e d i n m y e x p e r i m e n t s a p p e a r t o f a l l w i t h i n t h e n o r m a l p h y s i o l o g i c a l a n d p o s s i b l y p h a r m a c o l o g i c a l r a n g e s f o r c h o l e c a l c i f e r o l . T h e r a t i o o f s e r u m l e v e l s o f c h o l e c a l c i f e r o l t o 2 5 0 H D 3 t o c a l c i t r i o l i s e s t i m a t e d t o b e : 8 0 3 8 0 0 2 1 ( B e r g i n e r e t a l . , 1 9 9 3 ) , m e a n i n g 8 0 t i m e s t h e a m o u n t o f c h o l e c a l c i f e r o l i s n e e d e d t o r e a c h e q u i v a l e n t c a l c i t r i o l l e v e l s . T h e n e e d f o r h i g h e r c h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s t o s e e t h e s a m e r e s u l t s a s c a l c i t r i o l i n m y s t u d i e s c o u l d b e e x p l a i n e d s i m p l y b y t h e c o n v e r s i o n o f c h o l e c a l c i f e r o l t o c a l c i t r i o l . O n l y a p o r t i o n o f 2 5 0 H D 3 g e t s c o n v e r t e d t o c a l c i t r i o l b y t h e l a - h y d r o x y l a s e e n z y m e . T h e s a m e c o u l d b e p o s s i b l e f o r t h e c o n v e r s i o n o f c h o l e c a l c i f e r o l t o 2 5 0 H D 3 b y t h e 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e C Y P 2 7 A 1 . I n t h i s s t u d y , I h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s C Y P 2 7 A 1 . P r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s a l s o p o s s e s s t h e 2 4 - h y d r o x y l a s e e n z y m e , t h e a C t i V i t y a n d p r o d u c t i o n o f w h i c h i s i n c r e a s e d i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i t r i o l ( M i l l e r e t a l . , \ 9 9 5 ) . T h e 2 4 - h y d r o x y l a s e e n z y m e c o n v e r t s 2 5 0 H D 3 t o 2 4 , 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 a n d 2 7 0 a l s o c a t a l y z e s t h e c o n v e r s i o n o f c a l c i t r i o l t o 1 , 2 4 , 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 , a l e s s a c t i v e m e t a b o l i t e t h a n c a l c i t r i o l . T h e r e f o r e , s o m e o f t h e c h o l e c a l c i f e r o l t h a t w a s c o n v e r t e d t o 2 5 0 H D 3 c o u l d b e s u b s e q u e n t l y c o n v e r t e d t o 2 4 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 o r 1 , 2 4 , 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 , i n s t e a d o f c a l c i t r i o l . C h o l e c a l c i f e r o l c a n b i n d d i r e c t l y t o t h e ‘ V D R . H o w e v e r , i t s a f fi n i t y f o r V D R i s m u c h l o w e r t h a n t h a t o f c a l c i t r i o l ( C h e n e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h u s , t o r e a c h t h e s a m e c a l c i t r i o l l e v e l s , a n d t h e r e f o r e , t h e s a m e p o t e n c y , o n e v v o u l d r e q u i r e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f c h o l e c a l c i f e r o l . I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t c h o l e c a l c i f e r o l w o r k s t h r o u g h c o m p l e t e l y d i f f e r e n t m e c h a n i s m s t h a n c a l c i t r i o l . M y r e s u l t s w o u l d s u g g e s t t h a t s i n c e t r e a t m e n t w i t h c h o l e c a l c i f e r o l r e s u l t e d i n u p - r e g u l a t i o n o f V D R , c h o l e c a l c i f e r o l w o r k s v i a t h e V D R . T h i s fi n d i n g i s s u p p o r t e d b y t h e f a c t t h a t c h o l e c a l c i f e r o l c a n i n d e e d b i n d t o t h e V D R ( C h e n e t a l , 2 0 0 0 ) . H o w e v e r , c h o l e c a l c i f e r o l c o u l d e x e r t s o m e o f i t s e f f e c t s a l s o b y V D R - i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s . B a s e d o n e p i d e m i o l o g i c a l s t u d i e s a n d e x p e r i m e n t a l d a t a f r o m i n v i t r o s t u d i e s a n d i n v i v o s t u d i e s w i t h m i c e , c l i n i c a l t r i a l s , u s i n g c a l c i t r i o l , a r e b e i n g c o n d u c t e d t o t e s t i t s e f fi c a c y i n t h e t r e a t m e n t o f d i f f e r e n t c a n c e r s . C o m p a r e d t o o t h e r a v a i l a b l e a l t e r n a t i v e s c a l c i t n ' o l i s a r e l a t i v e l y s a f e f o r m o f c a n c e r t r e a t m e n t , w i t h t h e m a i n i m p e d i m e n t i n t h e c l i n i c a l s e t t i n g b e i n g h y p e r c a l c e m i a a n d h y p e r c a l c i u r i a . A s m a l l p i l o t s t u d y w a s c a r r i e d o u t o n p a t i e n t s w i t h e a r l y r e c u r r e n t p r o s t a t e c a n c e r ( G r o s s e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h e s u b j e c t s i n t h i s s t u d y e x h i b i t e d n o e v i d e n c e o f m e t a s t a s i s a n d h a d p r e v i o u s l y r e c e i v e d p r i m a r y t t l e l ‘ a p y w i t h r a d i a t i o n o r s u r g e r y . T h e r a t e o f P S A r i s e d u r i n g c a l c i t r i o l t r e a t m e n t v e r s u s b e f o r e t r e a t m e n t w a s s i g n i fi c a n t l y d e c r e a s e d i n 6 / 7 p a t i e n t s a n d o n e s h o w e d a d e c r e a s e i n s e r u m P S A . A l l p a t i e n t s s h o w e d a t l e a s t a 2 - f o l d d e c r e a s e i n t h e i r P S A d o u b l i n g t i m e , W h i l e i n s o m e i t w a s p r o l o n g e d 5 t o 6 f o l d . S o m e p a t i e n t s h a d s t a b i l i z a t i o n o f P S A l e v e l s 2 7 1 f o r g r e a t e r t h a n o n e y e a r . N o s u b j e c t b e c a m e h y p e r c a l c e m i c , h o w e v e r a l l s u b j e c t s b e c a m e h y p e r c a l c i u r i c w i t h t w o d e v e l o p i n g a s y m p t o t i c r e n a l s t o n e s ( G r o s s e t a l . , 1 9 9 8 ) . A n e a r l y p h a s e I I t r i a l i n v o l v i n g p a t i e n t s w i t h a d v a n c e d m e t a s t a t i c , h o r m o n e - r e f r a c t o r y p r o s t a t e c a n c e r f a i l e d t o s e e s i g n i fi c a n t i m p r o v e m e n t s i n p a t i e n t s ( O s b o r n e t a l . , 1 9 9 5 ) . O n l y 2 / 1 3 o f t h e m e n s h o w e d d e c r e a s e s i n P S A l e v e l s o f 2 5 % a n d 4 5 % f o r 3 0 a n d 4 5 d a y s , r e s p e c t i v e l y . T h e l a r g e t u m o r b u r d e n p r e s e n t b e f o r e t h e i n i t i a t i o n o f t r e a t m e n t m a y h a v e m i t i g a t e d t h e e f f e c t o f c a l c i t r i o l . M o r e r e c e n t l y , t w o p h a s e I t r i a l s s t u d i e d c a l c i t r i o l e f f e c t s o n a d v a n c e d , h o r m o n e r e f r a c t o r y m a l i g n a n c i e s . W h i l e n e i t h e r s t u d y s a w s i g n i fi c a n t a n t i - t u m o r e f f e c t s , b o t h h e l p e d d e t e r m i n e m a x i m u m t o l e r a b l e d o s e s o f c a l c i t r i o l w i t h o u t s h o w i n g h y p e r c a l c e m i c s i d e e f f e c t s . S u b c u t a n e o u s ( s . c . ) i n j e c t i o n o f c a l c i t r i o l e v e r y o t h e r d a y a l l o w e d f o r a m a x i m u m t o l e r a t e d d o s e o f 8 p g ; n o n e o f t h e p a t i e n t s a t t h i s d o s e l e v e l d e v e l o p e d h y p e r c a l c e m i a ( S m i t h e t a l . , 1 9 9 9 ) . W e e k l y p u l s e d o s i n g o f c a l c i t r i o l a l l o w s s u b s t a n t i a l d o s e e s c a l a t i o n , a p p r o x i m a t e l y 2 5 - f o l d a b o v e t h e u p p e r l i m i t o f p h y s i o l o g i c a l r a n g e , w i t h m i n i m a l t o x i c i t y . T h e s e l e v e l s w e r e w e l l w i t h i n t h e t h e r a p e u t i c r a n g e o f c a l c i t r i o l s u g g e s t e d b y i n v i t r o e x p e r i m e n t s ( B e e r e t a l . , 2 0 0 1 a ) . F u r ’ t h e r s t u d i e s u s i n g c a l c i t r i o l n e e d t o b e c a r r i e d o u t t o d e t e r m i n e i f s . c . i n j e c t i o n o r p u l s e d o s i n g c o u l d h a v e p o s i t i v e e f f e c t s o n t h e t r e a t m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r . T o a m e l i o r a t e t h e h y p e r c a l c e m i c e f f e c t s o f t e n c a u s e d b y c a l c i t r i o l , i n v e s t i g a t o r s h a v e b e g u n u s i n g v i t a m i n D a n a l o g s a n d c a l c i t r i o l i n c o m b i n a t i o n w i t h o t h e r a g e n t s i n c l i n i c a l s t u d i e s . O n e P h a s e I a n d o n e P h a s e I I t r i a l w e r e c a r r i e d o u t i n p r o s t a t e c a n c e r p a t i e n t s u s i n g l a - h y d r o x y v i t a m i n D 2 ( L u i e t a l . , 2 0 0 2 ; L u i e t a l . , 2 0 0 3 ) . I n t h e P h a s e I I t I ‘ i a l , 3 0 % o f t h e p a t i e n t s s h o w e d d i s e a s e s t a b i l i t y o f g r e a t e r t h a n 6 m o n t h s a n d t h e O b s e r v e d m e d i a n s u r v i v a l w a s 6 3 0 d a y s ( 2 1 m o n t h s ) , w h i c h w a s h i g h e r t h a n p r e d i c t e d b y 2 7 2 t h e s u r v i v a l n o m o g r a m . I n c r e a s e s i n T G F - B a n d P S A l e v e l s w e r e a l s o o b s e r v e d i n s e v e r a l o f t h e p a t i e n t s . T G F - B i n h i b i t s t h e g r o w t h p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s a n d P S A i s s e c r e t e d b y d i f f e r e n t i a t e d p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s . I n c r e a s e s i n b o t h s u g g e s t a n t i - p r o l i f e r a t i v e a n d p r o - d i f f e r e n t i a t i n g e f f e c t s . C l i n i c a l t r i a l s h a v e b e e n e x e c u t e d u s i n g c a l c i t r i o l i n c o m b i n a t i o n w i t h c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s , s u c h a s d o c e t a x e l a n d p a c l i t a x e l , t h a t a t t e n u a t e t h e h y p e r c a l c e m i c e f f e c t ( B e e r e t a l . , 2 0 0 1 b ; M u i n d i e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h e c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t s a l l o w e d f o r t h e u s e o f h i g h e r d o s e s o f c a l c i t r i o l , a n d t r e a t m e n t s w e r e w e l l t o l e r a t e d w i t h n o p r o b l e m s w i t h h y p e r c a l c e m i a . I n a d d i t i o n , P S A l e v e l s w e r e d e c r e a s e d b y a t l e a s t 5 0 % i n a l l p a t i e n t s r e c e i v i n g c a l c i t r i o l / d o c e t a x e l t r e a t m e n t s ( B e e r e t a l . , 2 0 0 1 b ) . C l i n i c a l s t u d i e s u s i n g c a l c i t r i o l o r v i t a m i n D a n a l o g s a r e i n t h e e a r l y s t a g e s o f d e v e l o p m e n t , a n d , t h e r e f o r e , o n l y a s m a l l n u m b e r o f s t u d i e s h a v e b e e n r e p o r t e d . A d d i t i o n a l s t u d i e s i n v o l v i n g v i t a m i n D a n d v i t a m i n D a n a l o g s , a l o n e a n d i n c o m b i n a t i o n , a r e n e e d e d . T o t h e b e s t o f m y k n o w l e d g e , t o d a t e t h e r e a r e n o c l i n i c a l t r i a l s u s i n g 2 5 O H D 3 o r c h o l e c a l c i f e r o l , a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n . E p i d e m i o l o g i c a l e v i d e n c e s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t p r o s t a t e c a n c e r r i s k , d e v e l o p m e n t , a n d p r o g r e s s i o n a r e l i n k e d w i t h l o w s e r u m v i t a m i n D l e v e l s . N u m e r o u s s t u d i e s h a v e s h o w n c a l c i t r i o l [ 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ] a n d 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 ( 2 5 0 H D 3 ) w o r k t h r o u g h m u l t i p l e m e c h a n i s m s a n d p a t h w a y s t o r e v e r s e o r i n h i b i t t h e m a l i g n a n t C h a r a c t e r i s t i c s o f s e v e r a l c a n c e r t y p e s . H o w e v e r , t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l , t h e I l a t l l l ‘ a l p r e c u r s o r t o 2 5 0 H D 3 a n d c a l c i t r i o l , h a v e n o t p r e v i o u s l y b e e n e x a m i n e d . 1 p r e s e n t , f o r t h e fi r s t t i m e , t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n a t u m o r i g e n i c , i n v a s i v e h u m a n V t o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e , R W P E 2 - W 9 9 . F u r t h e r m o r e , I a l s o p r o v i d e d e v i d e n c e , f o r t h e 2 7 3 fi r s t t i m e , d e m o n s t r a t i n g t h a t p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s p o s s e s s t h e 2 5 - h y d r o x l a s e e n z y m e ( C Y P 2 7 A 1 ) n e c e s s a r y f o r t h e c o n v e r s i o n o f c h o l e c a l c i f e r o l t o 2 5 0 H D 3 . T h i s i n d i c a t e s t h a t p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s c a n l o c a l l y p r o d u c e c a l c i t r i o l a n d t h a t t h e t r a d i t i o n a l m o d e l o f c a l c i t r i o l m e t a b o l i s m m a y n o t n e c e s s a r i l y a p p l y t o s p e c i a l t a r g e t c e l l s , s u c h a s , p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s . C o n c l u s i o n s I n c o n c l u s i o n , I h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s 2 5 - h y d r o x y l a s e p r o t e i n ( C Y P 2 7 A 1 ) , t h e e n z y m e k n o w n t o c o n v e r t C h o l e c a l c i f e r o l t o 2 5 0 H D 3 . T h i s i s t h e fi r s t t i m e t h a t t h e p r e s e n c e o f C Y P 2 7 A 1 h a s b e e n r e p o r t e d i n h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s . F u r t h e r w o r k w i l l n e e d t o b e d o n e t o s h o w e n z y m e a c t i v i t y . T h e p r e s e n c e o f l a - h y d r o x y l a s e , w h i c h c o n v e r t s 2 5 0 H D 3 t o c a l c i t r i o l , h a s b e e n p r e v i o u s l y s h o w n . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s s h o w t h a t h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s , a t a r g e t c e l l t y p e f o r v i t a m i n D , h a v e t h e n e c e s s a r y e n z y m e s a n d t h e r a r e a b i l i t y t o l o c a l l y c o n v e r t c h o l e c a l c i f e r o l t o c a l c i t r i o l . M y r e s u l t s a l s o s h o w t h a t p h y s i o l o g i c a l l e v e l s o f c h o l e c a l c i f e r o l : i ) i n h i b i t b o t h a n c h o r a g e - d e p e n d e n t a n d — i n d e p e n d e n t g r o w t h ; i i ) i n d u c e d i f f e r e n t i a t i o n b y i n c r e a s i n g P S A e x p r e s s i o n a n d d e c r e a s i n g v i m e n t i n e x p r e s s i o n ; i i i ) d e c r e a s e M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y a n d v i m e n t i n e x p r e s s i o n w i t h c o n c o m i t a n t d e c r e a s e i n i n v a s i o n a n d m o t i l i t y ; a n d i v ) c a u s e a c 1 < ' > S e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n o f V D R a n d R X R - 0 L , s u g g e s t i n g t h a t t h e o b s e r v e d e f f e c t s a r e r e c e p t o r - m e d i a t e d . B a s e d o n s i m i l a r i t i e s b e t w e e n r e s u l t s o b t a i n e d f r o m c h o l e c a l c i f e r o l a n d c a l c i t r i o l , m y r e s u l t s s h o w t h a t s e v e r a l o f t h e m e c h a n i s m s a r e p o t e n t i a l l y t h e s a m e . W h e t h e r 2 7 4 c h o l e c a l c i f e r o l a n d c a l c i t r i o l s h a r e a n y o t h e r e f f e c t s o r m e c h a n i s m s o f a c t i o n i n t h e t r e a t m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r c e l l s r e m a i n s t o b e d i s c o v e r e d . F u r t h e r m o r e , t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l a p p e a r t o b e r e c e p t o r - m e d i a t e d , w h i c h h a s b e e n p r o v e n t o b e t h e c a s e w i t h s e v e r a l o f t h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l . B a s e d o n t h e fi n d i n g s i n t h i s s t u d y , c h o l e c a l c i f e r o l a p p e a r s t o r e v e r s e o r i n h i b i t s e v e r a l c h a r a c t e r i s t i c s i n v o l v e d i n t h e m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n o f h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . T h e r e f o r e , c h o l e c a l c i f e r o l c o u l d h o l d m u c h p o t e n t i a l i n t h e f u t u r e f o r p r o s t a t e c a n c e r p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t . F u r t h e r i n v i t r o a n d i n v i v o s t u d i e s w i l l h e l p t o f u l l y e l u c i d a t e a l l t h e m e c h a n i s m s o f a c t i o n a n d d e t e r m i n e t h e f u l l p o t e n t i a l o f c h o l e c a l c i f e r o l , a s w e l l a s d e t e r m i n e s i m i l a r i t i e s b e t w e e n c h o l e c a l c i f e r o l a n d c a l c i t r i o l i n t h e t r e a t m e n t a n d p r e v e n t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . T h i s p r o m i s e s t o b e a n e x t r e m e l y f e r t i l e a r e a i n t h e fi e l d o f c a n c e r r e s e a r c h . 2 7 5 B i k l e , D . D . , N e m a n i c , M . L . , W h i t n e y , J . O . , a n d E l i a s , P . W . : N e o n a t a l h u m a n f o r e s k i n R e f e r e n c e s A b d a l l a , 1 . , R a y , P . , R a y , V . , V a i d a , F . , a n d V i j a y a k u m a r , 8 . : C o m p a r i s o n o f s e r u m p r o s t a t e - s p e c i fi c a n t i g e n l e v e l s a n d P S A d e n s i t y i n A f r i c a n - A m e r i c a n , w h i t e , a n d H i s p a n i c m e n w i t h o u t p r o s t a t e c a n c e r . U r o l o g y , 5 1 : 3 0 0 - 3 0 5 , 1 9 9 8 . A h o n e n , M . H . , T e n k a n e n , L . , T e p p o , L . , H a k a m a , M . , a n d T u o h i m a a , P . : P r o s t a t e c a n c e r r i s k a n d p r e d i a g n o s t i c s e r u m o f 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D l e v e l s ( F i n l a n d ) . C a n c e r C a u s e s C o n t r o l , 1 1 : 8 4 7 - 8 5 2 , 2 0 0 0 a . A h o n e n , M . H . , Z h u a n g , Y . H . , A i n e , R . , Y l i k o m i , T . , a n d T u o h i m a a , P . : A n d r o g e n r e c e p t o r a n d v i t a m i n D r e c e p t o r i n h u m a n o v a r i a n c a n c e r : g r o w t h s t i m u l a t i o n a n d i n h i b i t i o n b y l i g a n d s . I n t . J . C a n c e r , 8 6 : 4 0 - 4 6 , 2 0 0 0 b . A x e n , E . , P o s t l i n d , H . , S j o b e r g , H . , a n d W i k v a l l , K . : L i v e r m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e P 4 5 0 C Y P 2 7 a n d r e c o m b i n a n t - e x p r e s s e d h u m a n C Y P 2 7 c a t a l y z e l a - h y d r o x y l a t i o n o f 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 . P r o c . N a t l . A c a d . S c i e n c e , 9 1 : 1 0 0 1 4 - 1 0 0 1 8 , 1 9 9 4 . B a r r e t o , A . M . , S c h w a r t z , G . G . , W o o d r u f f , R . , a n d C r a m e r , S . D . : 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 , t h e p r o h o r r n o n e o f 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 , i n h i b i t s t h e p r o l i f e r a t i o n o f p r i m a r y p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s . C a n c e r E p i d e m i o l . B i o m a r k e r s P r e v . , 9 : 2 6 5 - 2 7 0 , 2 0 0 0 . B e e r , T . M . , M u n a r , M . , a n d H e n n e r , W . D . : A p h a s e I t r i a l o f p u l s e c a l c i t r i o l i n p a t i e n t s w i t h r e fi a c t o r y m a l i g n a n c i e s : p u l s e d o s i n g p e r m i t s s u b s t a n t i a l d o s e e s c a l a t i o n . C a n c e r , 9 1 : 2 4 3 1 - 2 4 3 9 , 2 0 0 1 a . B e e r , T . M . , H o u g h , K . M . , G a r z o t t o , M . , L o w e , B . A . , a n d H e n n e r , W . D . : W e e k l y h i g h d o s e c a l c i t r i o l a n d d o c e t a x e l i n a d v a n c e d p r o s t a t e c a n c e r . S e m . O n c o l . , 2 8 : 4 9 - 5 5 , 2 0 0 1 b . B e l l o , D . , W e b b e r , M . M . , K l e i n m a n , H . K . , W a r t i n g e r , D D , a n d R h i m , J . S . : A n d r o g e n r e s p o n s i v e a d u l t h u m a n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l l i n e s i m m o r t a l i z e d b y h u m a n p a p i l l o m a v i r u s 1 8 . C a r c i n o g e n e s i s , 1 8 : 1 2 1 5 - 1 2 2 3 , 1 9 9 7 . B e r n a r d i , R . J . , J o h n s o n , C . S . , M o d z e l e w s k i , R . A . , T r u m p , D . L . : A n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s o f l a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 a n d v i t a m i n D a n a l o g s o n t u m o r - d e r i v e d e n d o t h e l i a l c e l l s . E n d o c r i n o l o g y , 1 4 3 : 2 5 0 8 - 2 5 1 4 , 2 0 0 2 . k e r a t i n o c y t e s p r o d u c e 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . B i o c h e m i s t r y , 2 5 : 1 5 4 5 - 1 5 4 8 , 1 9 8 6 . 2 7 6 B o d i w a l a , D . , L u s c o m b e , C . J . , F r e n c h , M . E . , L i u , S . , S a x b y , M . F . , J o n e s , P . W . , R a m a c h a n d r a n , S . , F r y e r , A . A . , a n d S t r a n g e , R . C . : S u s c e p t i b i l i t y t o p r o s t a t e c a n c e r : s t u d i e s o n i n t e r a c t i o n s b e t w e e n U V R e x p o s u r e a n d s k i n t y p e . C a r c i n o g e n e s i s , 2 4 : 7 1 1 - 7 , 2 0 0 3 . B r e s l o w , N . , C h a n , C . W . , D h o m , G . , D r u r y , R . A . B . , F r a n k s , L . M . , G e l l e r i , B . , L e e , Y . S . , L u n d e r b e r g , S . , S p a r k e , B . , S t e m b y , N H , a n d T u l i n i u s , H . : L a t e n t c a r c i n o m a o f p r o s t a t e a t a u t o p s y i n s e v e n a r e a s . I n t . J . C a n c e r , 2 0 : 6 8 0 - 6 8 8 , 1 9 7 7 . C a n c e r F a c t s a n d F i g u r e s , A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y , 2 0 0 4 . C h e n , T . C . , P e r s o n s , K . S . , L u . 2 . , M a t h i e u , J . S . , a n d H o l i c k , M . F . : A n e v a l u a t i o n o f t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f v i t a m i n D r e c e p t o r b i n d i n g a f fi n i t y o f t h e p h o t o i s o m e r s o f v i t a m i n D 3 a n d p r e v i t a m i n D 3 . J . N u t r . B i o c h e m . , 1 1 : 2 7 6 — 2 7 2 , 2 0 0 0 . C o r c o r a n , M . L . , H e w i t t , R . E . , K l e i n e r , D E , a n d S t e t l e r - S t e v e n s o n , W . J . : M M P - 2 : e x p r e s s i o n , a c t i v a t i o n a n d i n h i b i t i o n . E n z y m e P r o t . , 4 9 : 7 - 1 9 , 1 9 9 6 . C o r d e r , E . H . , G u e s s , H . A . , H u l k a , B . S . , F r i e d m a n , G . D . , S a d l e r , M . , V o l l m e r , R . T . , L o b a u g h , B . , D r e z n e r , M . K . , V o g e l m a n , J . H . , a n d O r e n t r e i c h , N . : V i t a m i n D a n d p r o s t a t e c a n c e r : a p r e d i a g n o s t i c s t u d y w i t h s t o r e d s e r a . C a n c e r E p i d e m i o l . B i o m a r k e r s P r e v . , 2 : 4 6 7 - 4 7 2 , 1 9 9 3 . C r a w f o r d , E . D . , D e A n t o n i , E R , a n d R o s s , C . A . : T h e r o l e o f p r o s t a t e - s p e c i fi c a n t i g e n i n t h e c h e m o p r e v e n t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . J . C e l l . B i o c h e m . , 2 5 5 : 1 4 9 - 1 5 5 , 1 9 9 6 . D a n i e l p o u r , 1 ) . : I n d u c t i o n o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - B a u t o c r i n e a c t i v i t y b y a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d a n d l a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n N R P - 1 5 2 r a t p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s . J . C e l l . P h y s i o l . , 1 6 6 : 2 3 1 - 2 3 9 , 1 9 9 6 . d e V 0 3 , 8 . , H o l d e n , S . , H e b e r , D . , E l s t n e r , E . , B i n d e r u p , L . , U s k o k o v i c , M . , R u d e , 8 . , C h e n , D . L . , L e , J . , C h o , S . K . , a n d K o e f fl e r , H . P . : E f f e c t s o f p o t e n t v i t a m i n D 3 a n a l o g s o n c l o n a l p r o l i f e r a t i o n o f h u m a n p r o s t a t e c e l l l i n e s . T h e P r o s t a t e , 3 1 : 7 7 - 8 3 , 1 9 9 7 . E a s t h a m , J . A . , M a y , R . A . , W h a t l e y , T . , C r o w , A . , V e n a b l e , D D , a n d S a r t o r , 0 . : C l i n i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d b i o p s y s p e c i m e n f e a t u r e s i n A f r i c a n - A m e r i c a n a n d w h i t e m e n w i t h o u t p r o s t a t e c a n c e r . J . N a t . C a n c e r I n s t . , 9 0 : 7 5 6 - 7 6 0 , 1 9 9 8 . F r a g a , C . H . , T r u e , L . D . , a n d K i r k , D . : E n h a n c e d e x p r e s s i o n o f t h e m e s e n c h y m a l m a r k e r , v i m e n t i n , i n h y p e r p l a s t i c v e r s u s n o r m a l h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i u m . J U r o l . , 1 5 9 : 2 7 0 - 2 7 4 , 1 9 9 8 . F r i e d r i c h , W . : V i t a m i n D . I n : F r i e d r i c h , W . : “ V i t a m i n s ” N e w Y o r k , d e G r u y t e r , p p . 1 4 3 - 2 1 8 , 1 0 5 8 p p . , 1 9 8 8 . 2 7 7 G e t z e n b e r g , R . H . , L i g h t , B . W . , L a p c o , P . E . , K o n e t y , B . R . , N a n g i a , A . K . , A c i e m o , J . S . , D h i r , R . , S h u r i n , 2 . , D a y , R . S . , T r u m p , D . L . , a n d J o h n s o n , C . S . : V i t a m i n D i n h i b i t i o n o f p r o s t a t e a d e n o c a r c i n o m a g r o w t h a n d m e t a s t a s i s i n t h e D u n n i n g r a t p r o s t a t e m o d e l s y s t e m . U r o l o g y , 5 0 : 9 9 9 - 1 0 0 6 , 1 9 9 7 . G i l l e s , C . , P o l e t t e , M . , P i e t t e , J . , D e l v i g n e , A - C . , T h o m p s o n , B . W . , F o i d a r t , J - M . , a n d B i r e m b a u t , P . : V i m e n t i n e x p r e s s i o n i n c e r v i c a l c a r c i n o m a s : a s s o c i a t i o n w i t h i n v a s i v e a n d m i g r a t o r y p o t e n t i a l . J . P a t h . , 1 8 0 : 1 7 5 - 1 8 0 , 1 9 9 6 . G r o s s , C . , P e e h l , D . M . , a n d F e l d m a n , D . : V i t a m i n D a n d p r o s t a t e c a n c e r . I n : V i t a m i n D . F e l d m a n , D . , G l o r i e u x , F . H . , a n d P i k e , J . W . ( e d s ) : “ V i t a m i n D ” S a n D i e g o , A c a d e m i c P r e s s , p p . 1 1 2 5 - 1 1 3 9 , 1 2 8 5 p p . , 1 9 9 7 . G r o s s , C . , S t a m e y , T . , H a n c o c k , 8 . , a n d F e l d m a n , D . : T r e a t m e n t o f e a r l y r e c u r r e n t p r o s t a t e c a n c e r w i t h 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 ( c a l c i t r i o l ) . J . U r o l . , 1 5 9 : 2 0 3 5 - 2 0 4 0 , 1 9 9 8 . H a e n s z e l , W . a n d K u r i h a r a , M . : S t u d i e s o f J a p a n e s e m i g r a n t s . 1 . M o r t a l i t y f r o m c a n c e r a n d o t h e r d i s e a s e s a m o n g J a p a n e s e i n t h e U n i t e d S t a t e s . J . N a t . C a n c e r I n s t , 4 0 : 4 3 - 6 8 , 1 9 6 8 . H a l l o r a n , B R a n d P o r t a l e , A . A . : V i t a m i n D m e t a b o l i s m : T h e e f f e c t s o f a g i n g . I n : F e l d m a n , D . , G l o r i e u x , F . H . , a n d P i k e , J . W . ( e d s ) , V i t a m i n D , S a n D i e g o , A c a d e m i c P r e s s , p p . 5 4 1 - 5 5 4 , 1 2 8 5 p p . , 1 9 9 7 . H a n c h e t t e , C L . a n d S c h w a r t z , G . G . : G e o g r a p h i c p a t t e r n s o f p r o s t a t e c a n c e r m o r t a l i t y . C a n c e r , 7 0 : 2 8 6 1 - 2 8 6 9 , 1 9 9 2 . H a n s e n , C . M . , F r a n d s e n , T . L . , B r u n n e r , N . , a n d B i n d e r u p , L . : 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n h i b i t s t h e i n v a s i v e p o t e n t i a l o f h u m a n b r e a s t c a n c e r c e l l s i n v i t r o . C l i n . , E x p . M e t a s t , 1 2 : 1 9 5 - 2 0 2 , 1 9 9 4 . H o l i c k , M . F . , S m i t h , E . , a n d P i n c u s , 8 . : S k i n a s t h e s i t e o f v i t a m i n D s y n t h e s i s a n d t a r g e t t i s s u e f o r 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . U s e o f c a l c i t r i o l f o r t r e a t m e n t o f p s o r i a s i s . A r c h . D e r m a t o l . , 1 2 3 : 1 6 7 7 - 1 6 8 3 , 1 9 8 7 . H o l i c k , M . F . : T h e u s e a n d i n t e r p r e t a t i o n o f a s s a y s f o r v i t a m i n D a n d i t s m e t a b o l i t e s . J . N u t r . , 1 2 0 : 1 4 6 4 - 1 4 6 9 , 1 9 9 0 . H o l i c k , M . F . : V i t a m i n D : T h e u n d e r a p p r e c i a t e d D - l i g h t f u l h o r m o n e t h a t i s i m p o r t a n t f o r s k e l e t a l a n d c e l l u l a r h e a l t h . C u r r . O p i n . E n d o c r i n o l . D i a b e t e s , 9 : 8 7 - 9 8 , 2 0 0 2 . H u a n g , J . , P o w e l l , W . C . , K h o d a v i r d i , A . C . , W u , J . , M a k i t a , T . , C a r d i f f , R . D . , C o h e n , M . B . , S u c o v , H . M . , a n d R o y - B u r m a n , P . : P r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a i n m i c e w i t h c o n d i t i o n a l d i s r u p t i o n o f t h e r e t i n o i d X r e c e p t o r 3 a l l e l e i n t h e p r o s t a t e e p i t h e l i u m . C a n c e r R e s . , 6 2 : 4 8 1 2 - 4 8 1 9 , 2 0 0 2 . 2 7 8 J e n s e n , S . S . , M a d s e n , M . W . , L u k a s , J . , B i n d e r u p , L . , a n d B a r t e k , J . : I n h i b i t o r y e f f e c t s o f 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 o n t h e G S p h a s e - c o n t r o l l i n g m a c h i n e r y . M o l . E n d o c r i n o l . , 1 5 : 1 3 7 0 - 1 3 8 0 , 2 0 0 1 . K i v i n e v a , M . , B l a u e r , M . , S y v a l a , H . , T a m m e l a , T . , a n d T u o h i m m a , P . : L o c a l i z a t i o n o f 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 r e c e p t o r ( V D R ) e x p r e s s i o n i n h u m a n p r o s t a t e . J . S t e r o i d B i o c h e m . M o l . B i o . , 6 6 : 1 2 1 - 1 2 7 , 1 9 9 8 . K o l i , K . a n d K e s k i - O j a , J . : 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 a n d i t a n a l o g u e s d o w n - r e g u l a t e c e l l i n v a s i o n - a s s o c i a t e d p r o t e a s e s i n c u l t u r e d m a l i g n a n t c e l l s . C e l l G r o w t h D i f f e r e n t , 1 1 : 2 2 1 - 2 2 9 , 2 0 0 0 . K o n e t y , B . R . , S c h w a r t z , G . G . , A c i e m o , J . S . , B e c i c h , M . J . , a n d G e t z e n b e r g , R . H . : T h e r o l e o f v i t a m i n D i n n o r m a l p r o s t a t e g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n . C e l l G r o w t h D i f f e r e n t i a t i o n , 7 : 1 5 6 3 - 1 5 7 0 , 1 9 9 6 . K o n e t y , B . R . , L a v e l l e , J . P . , P i r t s k a l a i s h v i l i , G . , R a j i v , D . , M e y e r s , S . , N g u y e n , T . T . , H e r s h b e r g e r , P . , S h u r i n , M . R . , J o h n s o n , C . S . , T r u m p , D . L . , Z e i d e l , M . L . , a n d G e t z e n b e r g , R . H . : E f f e c t s o f v i t a m i n D ( c a l c i t r i o l ) o n t r a n s i t i o n a l c e l l c a r c i n o m a o f t h e b l a d d e r i n v i t r o a n d i n v i v o . J . U r o l . , 1 6 5 : 2 5 3 - 2 5 8 , 2 0 0 1 . K o v i , H . a n d H e s h m a t , M . Y . : I n c i d e n c e o f c a n c e r i n n e g r o e s i n W a s h i n g t o n D C . a n d s e l e c t e d A f r i c a n c i t i e s . A m . J . E p i d e m i o l . , 9 6 : 4 0 1 - 4 0 3 , 1 9 7 3 . K r i l l , D . , S t o n e r , J . , K o n e t y , B . R . , B e c i s h , M . J . , a n d G e t z e n b e r g , R . H . : D i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f v i t a m i n D o n n o r m a l h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l a n d s t r o m a l c e l l s i n p r i m a r y c u l t u r e . U r o l o g y , 5 4 : 1 7 1 - 1 7 7 , 1 9 9 9 . K r i l l , D . , D e F l a v i a , P . , D h i r , R . , L u o , J . , B e c i c h , M . J . , L e h m a n , E . , a n d G e t z e n b e r g , R . H . : E x p r e s s i o n p a t t e r n s o f v i t a m i n D r e c e p t o r i n h u m a n p r o s t a t e . J . C e l l . B i o c h e m . , 8 2 : 5 6 6 - 5 7 2 , 2 0 0 1 . L a n g , S . H . , H y d e , C . , R e i d , I . N . , H i t c h c o c k , I . S . , H a r t , C . A . , B r y d e n , A . A . , V i l l e t t e , J - M , S t o w e r , M . J . , a n d M a i t l a n d , N . J . : E n h a n c e d e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n i n m o t i l e p r o s t a t e c e l l l i n e s i n p o o r l y d i f f e r e n t i a t e d a n d m e t a s t a t i c p r o s t a t e c a r c i n o m a . T h e P r o s t a t e , 5 2 : 2 5 3 - 2 6 3 , 2 0 0 2 . L a w s o n , D . E . , P a u l , A . A . , B l a c k , A . E . , C o l e , T . J . , M a n d a ] , A . R . , a n d D a v i e , M . : R e l a t i v e c o n t r i b u t i o n s o f d i e t a n d s u n l i g h t t o v i t a m i n D s t a t e i n t h e e l d e r l y . B r . M e d . J . , 2 : 3 0 3 - 3 0 5 , 1 9 7 9 . L e h m a n n , B . , T i e b e l , O . , M e u r e r , M . : E x p r e s s i o n o f v i t a m i n D 3 2 5 - h y d r x y l a s e ( C Y P 2 7 ) m R N A a f t e r i n d u c t i o n b y v i t a m i n D 3 o r U V B r a d i a t i o n i n k e r a t i n o c y t e s o f h u m a n s k i n e q u i v a l e n t s — a p r e l i m i n a r y s t u d y . A r c h . D e r m a t o l . , R e s . , 2 9 1 : 5 0 7 - 5 1 0 , 1 9 9 9 . 2 7 9 L i o t t a , L A . a n d S t e t l e r - S t e v e n s o n , W . G . : T u m o r i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s : a n i m b a l a n c e o f p o s i t i v e a n d n e g a t i v e r e g u l a t i o n . C a n c e r R e s . , 5 1 : 5 0 5 4 - 5 0 5 9 , 1 9 9 1 . L o k e s h w a r , B . L . , S c h w a r t z , G . G . , S e l z e r , M . G . , B u m s t e i n , K . L . , Z h u a n g , S - H . , B l o c k , N . L . , a n d B i n d e r u p , L . : I n h i b i t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r m e t a s t a s i s i n v i v o : a c o m p a r i s o n o f 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D ( c a l c i t r i o l ) a n d E B I O 8 9 . C a n c e r E p i d e m i o l . B i o m a r k e r s P r e v . , 8 : 2 4 1 - 2 4 8 , 1 9 9 9 . L u i , G . , O e t t e l , K . , R i p p l e , G . , S t a a b , M . J . , H o r v a t h , D . , A l b e r t i , D . , A r z o o m a n i a n , R . , M a m o c h a , R . , B r u s k e w i t z , R . , M a z e s s , R . , B i s h o p , C . , B h a t t a c h a r y a , A . , B a i l y , H . , a n d W i l d i n g , G . : P h a s e I t r i a l o f l a - h y d r o x y v i t a m i n D 2 i n p a t i e n t s w i t h h o r m o n e r e f r a c t o r y p r o s t a t e c a n c e r . C l i n . C a n c e r R e s . , 8 : 2 8 2 0 - 2 8 2 7 , 2 0 0 2 . L u i , G . , W i l d i n g , G . , S t a a b , M . J . , H o r v a t h , D . , M i l l e r , K . , D r e s e n , A . , A l b e r t i , D . , A r z o o m a n i a n , R . , C h a p p e l l , R . , a n d B a i l e y , H . H . : P h a s e I I t r i a l o f l o r - h y d r o x y v i t a m i n D 2 i n t h e t r e a t m e n t o f a d v a n c e d a n d r o g e n - i n d e p e n d e n t p r o s t a t e c a n c e r . C l i n , C a n c e r R e s . , 9 : 4 0 7 7 - 4 0 8 3 , 2 0 0 3 . L u s c o m b e , C . J . , F r y e r , A . A . , F r e n c h , M . E . , L i u , S . , S a x b y , M . F . , J o n e s , P . W . , a n d S t r a n g e , R . C . : E x p o s u r e t o u l t r a v i o l e t r a d i a t i o n : a s s o c i a t i o n w i t h s u s c e p t i b i l i t y a n d a g e a t p r e s e n t a t i o n w i t h p r o s t a t e c a n c e r . L a n c e t , 3 5 8 : 6 4 1 - 6 4 2 , 2 0 0 1 . M i l l e r , G . J . , S t a p l e t o n , G . E . , F e r r a r a , J . A . , L u c i a , M . S . , P fi s t e r , S . , H e d l u n d , T . E . , a n d U p a n d h y a , P . : T h e h u m a n p r o s t a t e c a r c i n o m a c e l l l i n e L N C a P e x p r e s s e s b i o l o g i c a l l y a c t i v e , s p e c i fi c r e c e p t o r s f o r 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . C a n c e r R e s . , 5 2 : 5 1 5 - 5 2 0 , 1 9 9 2 . M i l l e r , G . J . , S t a p l e t o n , G . E . , H e d l u n d , T . E . , a n d M o f f a t t , K . A . : V i t a m i n D r e c e p t o r e x p r e s s i o n , 2 4 - h y d r o x y l a s e a c t i v i t y , a n d i n h i b i t i o n o f g r o w t h b y l a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n s e v e n h u m a n p r o s t a t i c c a r c i n o m a c e l l l i n e s . C l i n . C a n c e r R e s . , 1 : 9 9 7 - 1 0 0 3 , 1 9 9 5 . M o n t i r o n i , R . , L u c a r i n i , G . , C a s t a l d i n i , C . , G a l l u z z i , C . M . , B i a g i n i , G . , a n d F a b r i s , G . : I m m u n o h i s t o c h e m i c a l e v a l u a t i o n o f t y p e I V c o l l a g e n a s e ( 7 2 - k D a m e t a l l o p r o t e i n a s e ) i n p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a . A n t i c a n c e r R e s . , 1 6 : 2 0 5 7 - 2 0 6 2 , 1 9 9 6 . M u i n d i , J . R . , P e n g , Y . , P o t t e r , D . M . , H e r s h b e r g e r , P . A . , T a u c h , J . S . , C a p o z z o l i , M . J . , E g o r i n , M . J . , J o h n s o n , C S , a n d T r u m p , D . L . : P h a r r n a c o k i n e t i c s o f h i g h - d o s e o r a l c a l c i t r i o l : r e s u l t s f r o m a p h a s e I t r i a l o f c a l c i t r i o l a n d p a c l i t a x e l . C l i n . P h a r m a c o l . T h e r a p . , 7 2 : 6 4 8 - 6 5 9 , 2 0 0 2 . M u r t h y , S . a n d W e i g e l , N . L . : 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n d u c e d g r t h i n h i b i t i o n o f P C - 3 p r o s t a t e c a n c e r c e l l s r e q u i r e s a n a c t i v e t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a s i g n a l i n g p a t h w a y . P r o s t a t e , 5 9 : 2 8 2 - 2 9 1 , 2 0 0 4 . 2 8 0 N a g a s e , H . a n d W o e s s n e r , J . F . : M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s . J . B i o l . C h e m . , 2 7 4 : 2 1 4 9 1 - 2 1 4 9 4 , 1 9 9 9 . O s b o r n , J . L . , S c h w a r t z , G . G . , S m i t h , D . C . , B a h n s o n , R . , D a y , R . , a n d T r u m p , D . L . : P h a s e I I t r i a l o f o r a l 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D ( c a l c i t r i o l ) i n h o r m o n e r e f r a c t o r y p r o s t a t e c a n c e r . U r o l . O n c o l . , 1 2 1 9 5 - 1 9 8 , 1 9 9 5 . O s b o r n e , J . E . a n d H u t c h i n s o n , P . E . : V i t a m i n D a n d s y s t e m i c c a n c e r : i s t h i s r e l e v a n t t o m a l i g n a n t m e l a n o m a ? B r . J . D e r m a t o l . , 1 4 7 : 1 9 7 - 2 1 3 , 2 0 0 2 . P e e h l , D . M . , S k o w r o n s k i , R . J . , L e u n g , G . K . , W o n g , S . T . , S t a m e y , T . A . , a n d F e l d m a n , D . : A n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s o f 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 o n p r i m a r y c u l t u r e s o f h u m a n p r o s t a t e c e l l s . C a n c e r R e s . , 5 4 : 8 0 5 - 8 1 0 , 1 9 9 4 . P o l l y , P . , C a r l b e r g , C . , E i s m a n , J . A . , a n d M o r r i s o n , N . A . : I d e n t i fi c a t i o n o f a v i t a m i n D 3 r e s p o n s e e l e m e n t i n t h e fi b r o n e c t i n g e n e t h a t i s b o u n d b y a v i t a m i n D 3 r e c e p t o r h o m o d i m e r . J . C e l l . B i o c h e m . , 6 0 : 3 2 2 - 3 3 3 , 1 9 9 6 . P r u f e r , K . , R a c z , A . , L i n , G O , a n d B a r s o n y , J . : D i m e r i z a t i o n w i t h r e t i n o i d X r e c e p t o r s p r o m o t e s n u c l e a r l o c a l i z a t i o n a n d s u b n u c l e a r t a r g e t i n g o f v i t a m i n D r e c e p t o r s . J . B i o l . , C h e m , 2 7 5 : 4 1 1 1 4 - 4 1 1 2 3 , 2 0 0 0 . P r u f e r , K . a n d B a r s o n y , J . : R e t i n o i d X r e c e p t o r d o m i n a t e s t h e n u c l e a r i m p o r t a n d e x p o r t o f t h e u n l i g a n d e d v i t a m i n D r e c e p t o r . M o l . E n d o c r i n o l . , 1 6 : 1 7 3 8 - 1 7 5 1 , 2 0 0 2 . R o b s a h m , T . E . , T r e t l i , S . , D a h l b a c k , A . , a n d M o a n , J . : V i t a m i n D 3 f r o m s u n l i g h t m a y i m p r o v e t h e p r o g n o s i s o f b r e a s t - , c o l o n - , a n d p r o s t a t e c a n c e r ( N o r w a y ) . C a n c e r C a u s e s & C o n t r o l , 1 5 : 1 4 9 - 1 5 8 , 2 0 0 4 . S c h w a r t z , G O . a n d H u l k a , 8 . 8 . : I s v i t a m i n D d e fi c i e n c y a r i s k f a c t o r f o r p r o s t a t e c a n c e r ? ( H y p o t h e s i s ) . A n t i c a n c e r R e s . , 1 0 : 1 3 0 7 - 1 3 1 2 , 1 9 9 0 . S c h w a r t z , G . G . , W a n g , M - H . , Z h a n g , M . , S i n g h , R . K . , a n d S i e g a l , G . P . : l a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 ( c a l c i t r i o l ) i n h i b i t s t h e i n v a s i v e n e s s o f h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . C a n c e r E p i d e m i o l . B i o m a r k e r s P r e v . , 6 : 7 2 7 - 7 3 2 , 1 9 9 7 . S c h w a r t z , G . G . , W h i t l a c h , L . W . , C h e n , T . C . , L o k e s h w a r , B L , a n d H o l i c k , M . F . : H u m a n p r o s t a t e c e l l s s y n t h e s i z e 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 f r o m 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 . C a n c e r E p i d e m i o l . B i o m a r k e r s P r e v . , 7 : 3 9 1 - 3 9 5 , 1 9 9 8 . S h a b a h a n g , M . , B u r a s , R . R . , D a v o o d i , F . , S c h u m a k e r , L . M . , N a u t a , R . J . , a n d E v a n s , S . R . T . : 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 r e c e p t o r a s a m a r k e r o f h u m a n c o l o n c a r c i n o m a c e l l l i n e d i f f e r e n t i a t i o n a n d g r o w t h i n h i b i t i o n . C a n c e r R e s . , 5 3 : 3 7 1 2 - 3 7 1 8 , 1 9 9 3 . 2 8 1 S k o w r o n s k i , R . J . , P e e h l , D . M . , a n d F e l d m a n , D . : A c t i o n s o f v i t a m i n D 3 a n a l o g s o n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s : c o m p a r i s o n w i t h 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . E n d o c r i n o l o g y , 1 3 6 : 2 0 - 2 6 , 1 9 9 5 . S m i t h , D . C . , J o h n s o n , C . S . , F r e e m a n , C . C . , M u i n d i , J . , W i l s o n , J . W . , a n d T r u m p , D . L . : A p h a s e I t r i a l o f c a l c i t r i o l ( 1 , 2 5 - d i h y d r x o y c h o l e c a l c i f e r o l ) i n p a t i e n t s w i t h a d v a n c e d m a l i g n a n c y . C l i n . E x p . , M e t a s t , 5 : 1 3 3 9 - 1 3 4 5 , 1 9 9 9 . S t e a m s , M E . a n d S t e a m s , M . : I m m u n h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s o f a c t i v a t e d m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e - 2 ( M M P - 2 a ) e x p r e s s i o n i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r . O n c o l . R e s . , 6 3 - 6 7 , 1 9 9 6 a . S t e a m s , M E . a n d S t e a m s , M . : E v i d e n c e f o r i n c r e a s e d a c t i v a t e d m e t a l l o p r o t e i n a s e - 2 ( M M P - 2 a ) e x p r e s s i o n a s s o c i a t e d w i t h h u m a n p r o s t a t e c a n c e r p r o g r e s s i o n . O n c o l . R e s . , 8 : 6 9 - 7 5 , 1 9 9 6 b . S t r o n g i n , A . Y . , C o l l i e r , I . , B a n n i k o v , G . , M a r m e r , B . L . , G r a n t , G . A . , a n d G o l d b e r g , G . I . : M e c h a n i s m o f c e l l s u r f a c e a c t i v a t i o n o f 7 2 - k D a t y p e I V c o l l a g e n a s e . I s o l a t i o n o f t h e a c t i v a t e d f o r m o f t h e m e m b r a n e m e t a l l o p r o t e a s e . J . B i o l . C h e m . , 2 7 0 : 5 3 3 1 - 5 3 3 8 , 1 9 9 5 . S u n g , V . a n d F e l d m a n , D . : 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 d e c r e a s e s h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l a d h e s i o n a n d m i g r a t i o n . M o l . C e l l . E n d o c r i n o l . , 1 6 4 : 1 3 3 - 1 4 3 , 2 0 0 0 . U d a y a k u m a r , T . S . , C h e n , M . L . , B a i r , E . L . , v o n B r e d o w , D . C . , C r e s s , A . E . , N a g l e , R . B . , a n d B o w d e n , G . T . : M e m b r a n e t y p e - l - m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e e x p r e s s e d b y p r o s t a t e c a r c i n o m a c e l l c l e a v e s h u m a n l a m i n i n - S B 3 c h a i n a n d i n d u c e s c e l l m i g r a t i o n . C a n c e r R e s . , 6 3 : 2 2 9 2 - 2 2 9 9 , 2 0 0 3 . V e r l i n d e n , L . , V e r s t u y f , A . , C o n v e n t s , R . , M a r c e l i s , S . , V a n C a m p , M . , a n d B o u i l l o n , R . : A c t i o n o f 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 o n t h e c e l l c y c l e g e n e s , c y c l i n D 1 , p 2 1 a n d p 2 7 i n M C F - 7 c e l l s . M o l . C e l l . E n d o c r i n o l . , 1 4 2 : 5 7 - 6 5 , 1 9 9 8 . W a g h r a y , A . a n d W e b b e r , M . M . : R e t i n o i c a c i d m o d u l a t e s e x t r a c e l l u l a r u r o k i n a s e - t y p e p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r a c t i v i t y i n D U - 1 4 5 h u m a n p r o s t a t i c c a r c i n o m a c e l l s . C l i n . E x p . M e t a s t , 1 : 7 4 7 - 7 5 3 , 1 9 9 5 . W e b b e r , M . M . , W e i n e r , S . M . , R e h m a n , S . M . M . , a n d W e t t l a u f e r , J . N . : C a r c i n o m a o f t h e p r o s t a t e : g e o g r a p h i c d i s t r i b u t i o n a n d r i s k f a c t o r s , I n : I n V i t r o M o d e l s f o r C a n c e r R e s e a r c h , W e b b e r , M . M . ( e d ) , B o c a R a t o n , C R C P r e s s , 5 : p p . 3 - 2 4 , 1 9 8 8 . W e b b e r , M . M . , W a g h r a y , A . , a n d B e l l o , D . : P r o s t a t e - s p e c i fi c a n t i g e n , a s e r i n e p r o t e a s e , f a c i l i t a t e s h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l i n v a s i o n . C l i n . C a n c e r R e s . , 1 : 1 0 8 9 - 1 0 9 4 , 1 9 9 5 . 2 8 2 W e b b e r , M . M . , B e l l o , D . , K l e i n m a n , H . K . , a n d H o f f m a n , M . : A c i n a r d i f f e r e n t i a t i o n b y n o n - m a l i g n a n t i m m o r t a l i z e d h u m a n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s a n d i t s l o s s b y m a l i g n a n t c e l l s , C a r c i n o g e n e s i s , 1 8 : 1 2 2 5 - 1 2 3 1 , 1 9 9 7 . Z h a o , X - Y . , P e e h l , D . M . , N a v o n e , N . M . , a n d F e l d m a n , D . : l o r , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n h i b i t s p r o s t a t e c a n c e r c e l l g r o w t h b y a n d r o g e n - d e p e n d e n t a n d a n d r o g e n - i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s . E n d o c r i n o l o g y , 1 4 1 : 2 5 4 8 — 2 5 5 6 , 2 0 0 0 . Z h u a n g , S . H . , B u m s t e i n , K . L . : A n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t o f 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e L N C a P i n v o l v e s r e d u c t i o n o f c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e 2 a c t i v i t y a n d p e r s i s t e n t G 1 a c c u m u l a t i o n . E n d o c r i n o l o g y , 1 3 9 : 1 1 9 7 - 1 2 0 7 , 1 9 9 8 . 2 8 3 C h a p t e r 9 C h o l e c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 3 ) a n d C h e m o p r e v e n t i o n o f P r o s t a t e C a n c e r 2 8 4 A b s t r a c t M o r t a l i t y f r o m p r o s t a t e c a n c e r r e m a i n s u n a c c e p t a b l y h i g h . C h e m o p r e v e n t i o n m a y b e t h e u l t i m a t e a n s w e r t o t h i s p r o b l e m . P r o s t a t e c a r c i n o g e n e s i s i s a m u l t i - s t e p p r o c e s s w h i c h a p p e a r s t o o c c u r o v e r a p e r i o d o f 2 0 - 3 0 y e a r s . T h i s l o n g l a t e n c y p e r i o d , b e f o r e i t s m a n i f e s t a t i o n , a l l o w s f o r s e v e r a l p o i n t s o f i n t e r v e n t i o n t o p r e v e n t d i s e a s e d e v e l o p m e n t . T h e o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y w a s t o e x a m i n e t h e c h e m o p r e v e n t i v e a b i l i t y o f c h o l e c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 3 ) t o b l o c k o r r e v e r s e c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n i n h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s . I m m o r t a l i z a t i o n i s a n e a r l y s t e p i n c a r c i n o g e n e s i s . T h e r e f o r e , I u s e d t h e R W P E - l h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l l i n e , w h i c h i s a n i m m o r t a l i z e d b u t a n o n - t u m o r i g e n i c c e l l l i n e . T h i s m a k e s i t a u s e f u l m o d e l f o r s t u d i e s o n c h e m o p r e v e n t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . U n l i k e t h e t u m o r i g e n i c R W P E 2 - W 9 9 c e l l s , R W P E - l c e l l s d o n o t g r o w i n a n a n c h o r a g e - i n d e p e n d e n t m a n n e r a n d a r e n o t i n v a s i v e . R e s u l t s s h o w t h a t p h y s i o l o g i c a l l e v e l s o f c h o l e c a l c i f e r o l : i ) i n h i b i t a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h ; i i ) d e c r e a s e M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y ; i i i ) i n d u c e d i f f e r e n t i a t i o n b y d e c r e a s i n g v i m e n t i n e x p r e s s i o n a n d i n c r e a s i n g P S A e x p r e s s i o n ; i v ) u p - r e g u l a t e V D R , R X R S , a n d A R , s u g g e s t i n g t h a t i t s e f f e c t s a r e r e c e p t o r - m e d i a t e d . T h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t , b a s e d o n i n v i t r o s t u d i e s , c h o l e c a l c i f e r o l i s a n e f f e c t i v e c h e m o p r e v e n t i v e a g e n t . F u r t h e r m o r e , I h a v e s h o w n t h a t R W P E - l c e l l s c o n s t i t u t i v e l y e X P r e s s 2 5 - h y d r o x y l a s e ( C P Y P 2 7 A 1 ) p r o t e i n , a n d t h a t t h i s e x p r e s s i o n i s u p - r e g u l a t e d i n r e s p o n s e t o t r e a t m e n t w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . T h e p r e s e n c e o f 2 5 - h y d r o x y l a s e i n h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s h a s n o t p r e v i o u s l y b e e n s h o w n . T h i s s u g g e s t s t h a t p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s p o s s e s s t h e a b i l i t y t o l o c a l l y p r o d u c e t h e b i o l o g i c a l l y a c t i v e c a l c i t r i o l f r o m 2 8 5 c h o l e c a l c i f e r o l . B a s e d o n t h e s e d a t a , I p r o p o s e t h a t c h o l e c a l c i f e r o l c o u l d b e a n e f f e c t i v e a g e n t f o r t h e c h e m o p r e v e n t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . 2 8 6 I n t r o d u c t i o n P r o s t a t e c a n c e r i s t h e m o s t c o m m o n n o n - s k i n c a n c e r i n A m e r i c a n m e n . I t s i n c i d e n c e i n c r e a s e s s h a r p l y w i t h a g e f r o m a b o u t t h e a g e o f 6 0 o n w a r d s a n d m o r e t h a n 8 0 % o f p r o s t a t e c a n c e r i s f o u n d i n m e n o v e r t h e a g e o f 6 5 ( S c h w a r t z a n d H u l k a , 1 9 9 0 ) . A p p r o x i m a t e l y 8 % o f A m e r i c a n m e n a r e d i a g n o s e d w i t h p r o s t a t e c a n c e r d u r i n g t h e i r l i f e t i m e a n d a b o u t 2 - 3 % o f a l l d e a t h s i n m e n a r e t h e r e s u l t s o f t h i s d i s e a s e ( O ’ S h a u g h n e s s y e t a l . , 2 0 0 2 ) . A l t h o u g h p r o s t a t e c a n c e r g r o w s m o r e s l o w l y t h a n m o s t o t h e r c a n c e r s , a n d e v e n w i t h e a r l y d e t e c t i o n b y P S A s c r e e n i n g , m o r t a l i t y r a t e s d u e t o t h i s d i s e a s e r e m a i n h i g h . A s a r e s u l t , p r o s t a t e c a n c e r h a s b e c o m e a m a j o r h e a l t h c o n c e r n a m o n g m e n i n r e c e n t y e a r s . C a r c i n o g e n e s i s i n t h e p r o s t a t e i s a m u l t i - s t e p p r o c e s s w h i c h t a k e s s e v e r a l y e a r s b e f o r e i t s c u l m i n a t i o n t o i n v a s i v e c a r c i n o m a . T h i s m u l t i - y e a r , m u l t i - s t e p p r o c e s s p r o v i d e s a l a r g e w i n d o w o f o p p o r t u n i t y f o r c h e m o p r e v e n t i o n b e c a u s e i t p e r m i t s i n t e r v e n t i o n a t s e v e r a l s t e p s t o b l o c k o r r e v e r s e t h e d e v e l o p m e n t o f t h e d i s e a s e . P r e - c a n c e r o u s l e s i o n s , k n o w a s p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a ( P I N ) , m a y d e v e l o p o v e r a p e r i o d o f 2 0 y e a r s a n d m a y p r e c e d e c a n c e r b y a t l e a s t 1 0 y e a r s ( O ’ S h a u g h n e s s y e t a l . , 2 0 0 2 ; S a k r e t a l . , 1 9 9 3 ) . T h e p r e s e n c e o f P I N i s a n i n d i c a t o r f o r i n c r e a s e d r i s k o f p r o s t a t e c a n c e r a n d P I N l e s i o n s a r e c o n s i d e r e d t o b e p r e c u r s o r s o f p r o s t a t e c a n c e r s . S t u d i e s h a v e s h o w n t h a t p a t i e n t s w i t h h i g h - g r a d e P I N ( H G P I N ) , b u t n o d e t e c t a b l e c a n c e r , p r o g r e s s e d t o a 4 0 % i n c i d e n c e o f c a n c e r i n t h r e e y e a r s a n d t o a p p r o x i m a t e l y 8 0 % i n c i d e n c e i n 1 0 y e a r s ( S a k r e t a l . , 2 0 0 0 ) . P r e v e n t i n g o r r e v e r s i n g t h e s e p r e - c a n c e r o u s l e s i o n s r e d u c e s t h e r i s k o f i n v a s i v e a n d m e t a s t a t i c p r o s t a t e c a n c e r , t h e p r i m a r y c a u s e o f 2 8 7 d e a t h f r o m t h i s d i s e a s e . B e c a u s e o f t h e 2 0 - 3 0 y e a r l a t e n c y p e r i o d b e f o r e i t s m a n i f e s t a t i o n , i t m a y b e p o s s i b l e t o p r e v e n t t h e d e v e l o p m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r . C h e m o p r e v e n t i o n i s t h e u s e o f d r u g s o r n a t u r a l a g e n t s t o i n h i b i t , d e l a y , o r r e v e r s e t h e p r o c e s s o f c a r c i n o g e n e s i s b e f o r e i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s ( H o n g a n d S p o m , 1 9 9 7 ; O ’ S h a u g h n e s s y e t a l . , 2 0 0 2 ) . C h e m o p r e v e n t i o n i s r e c o g n i z e d a s a p r o m i s i n g a n d i m p o r t a n t a r e a i n c a n c e r r e s e a r c h a n d m a y b e t h e u l t i m a t e a n s w e r t o s o l v i n g t h e p r o s t a t e c a n c e r p r o b l e m ( H o n g a n d S p o r n , 1 9 9 7 ; L i p p m a n e t a l . , 1 9 9 8 ; Q u a d e r e t a l . , 2 0 0 1 ; W e b b e r e t a l . , 1 9 9 9 ) . R e c e n t a d v a n c e s i n u n d e r s t a n d i n g t h e m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s h a v e l e d t o t h e d i s c o v e r y a n d d e v e l o p m e n t o f n e w c h e m o p r e v e n t i v e a g e n t s . D i e t a r y c o m p o u n d s a r e o f p a r t i c u l a r i n t e r e s t b e c a u s e o f t h e i r l o w c o s t a n d e x p e c t e d s a f e t y f o r l o n g - t e r m a d m i n i s t r a t i o n t o h e a l t h y p e o p l e f o r c h e m o p r e v e n t i o n . T h e s e a g e n t s , i n c l u d i n g v i t a m i n D a n d r e t i n o i d s , a r e e f f e c t i v e d u e t o t h e i r e f f e c t s o n s e v e r a l c a n c e r c e l l c h a r a c t e r i s t i c s , w h i c h i n c l u d e i n h i b i t i o n o f c e l l p r o l i f e r a t i o n , i n d u c t i o n o f d i f f e r e n t i a t i o n a n d a p o p t o s i s , m o d u l a t i o n o f t u m o r s u p p r e s s o r a n d i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n e x p r e s s i o n , i n h i b i t i o n o f a n c h o r a g e - d e p e n d e n t a n d — i n d e p e n d e n t g r o w t h , d e c r e a s e i n p r o t e a s e a c t i v i t y , a n d i n h i b i t i o n o f m o t i l i t y a n d i n v a s i o n . C a l c i t r i o l [ 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 ] , t h e m o s t b i o l o g i c a l l y a c t i v e f o r m o f v i t a m i n D 3 , h a s b e e n s h o w n t o h a v e c h e m o p r e v e n t i v e a c t i v i t y o n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s t h r o u g h a v a r i e t y o f e f f e c t s o n d i f f e r e n t c a n c e r c e l l c h a r a c t e r i s t i c s . S o m e o f t h e s e e f f e c t s i n c l u d e t h e i n h i b i t i o n o f c e l l p r o l i f e r a t i o n , i n d u c t i o n o f d i f f e r e n t i a t i o n a n d a p o p t o s i s , a n d i n h i b i t i o n o f p r o t e a s e a c t i v i t y a n d i n v a s i o n ( G u z e y e t a l . , 2 0 0 2 ; M i l l e r e t a l . , 1 9 9 2 ; S c h w a r t z e t a l . , 1 9 9 7 ; S k o w r o n s k i e t a l , 1 9 9 3 ; Z h u a n g a n d B u m s t e i n , 1 9 9 8 ) . H o w e v e r , c a l c i t r i o l t r e a t m e n t i s g e n e r a l l y a c c o m p a n i e d b y h y p e r c a l c e m i a . C h e m o p r e v e n t i v e a g e n t s 2 8 8 s h o u l d h a v e l o w t o x i c i t y i n o r d e r t o b e c l i n i c a l l y u s e f u l . T h e r e f o r e , a l t e r n a t i v e v i t a m i n D t r e a t m e n t s a r e b e i n g t e s t e d , i n c l u d i n g c a l c i t r i o l p r e c u r s o r s a n d v i t a m i n D a n a l o g s . T h e s e l e s s c a l c e m i c a l t e r n a t i v e s h a v e p r o v e n t o b e j u s t a s , a n d s o m e t i m e m o r e , e f f e c t i v e a s c a l c i t r i o l . V i t a m i n D e x e r t s i t s e f f e c t s t h r o u g h g e n o m i c a n d n o n - g e n o m i c m e c h a n i s m s . T h e a c t i v i t y o f v i t a m i n D i s t h o u g h t t o b e m e d i a t e d p r i m a r i l y t h r o u g h i t s b i n d i n g t o t h e v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) . V D R i s a l i g a n d - a c t i v a t e d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r a n d a m e m b e r o f t h e s t e r o i d h o r m o n e - r e c e p t o r s u p e r f a m i l y ( M a n g e l s d o r f e t a l . , 1 9 9 5 ) . V D R i s e x p r e s s e d i n a p p r o x i m a t e l y 3 0 t i s s u e s , i n c l u d i n g p r o s t a t e , b r e a s t , c o l o n , a n d s k i n ( M i n g h e t t i a n d N o r m a l , 1 9 8 8 ) . T h i s w i d e d i s t r i b u t i o n o f V D R i s t h e u n d e r l y i n g r e a s o n b e h i n d t h e a b i l i t y o f v i t a m i n D t o e x e r t i t s p l e i o t r o p i c e f f e c t s t h r o u g h o u t t h e b o d y . T h e g e n o m i c e f f e c t s a r e m e d i a t e d v i a t h e n u c l e a r v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) . T h e l i g a n d - V D R c o m p l e x f o r m s h e t e r o d i m e r s w i t h r e t i n o i d X r e c e p t o r s ( R X R S ) . T h e f o r m a t i o n o f V D R z R X R h e t e r o d i m e r s a n d t h e i r b i n d i n g t o V D R E S a r e e n h a n c e d b y t h e p r e s e n c e o f c a l c i t r i o l . T h e h e t e r o d i m e r s b i n d t o t h e v i t a m i n D r e s p o n s e e l e m e n t s ( V D R E S ) i n t h e t a r g e t g e n e s t o c a r r y o u t t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y . F u n c t i o n a l V D R E S a r e f o u n d i n t h e p r o m o t e r r e g i o n o f s e v e r a l g e n e s . T h e s e i n c l u d e s e v e r a l b o n e - r e l a t e d g e n e s ( e . g . o s t e o c a l c i n , o s t e o p o n t i n , c a l b i n d i n — D 2 8 k a n d D 9 k ) , c e l l c y c l e r e g u l a t o r p 2 1 , 2 5 0 H D 3 2 4 - h y d r o x y l a s e , u r o k i n a s e p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r , t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r [ 3 2 a n d fi b r o n e c t i n , j u s t t o n a m e a f e w ( B e e r a n d M y r t h u e , 2 0 0 4 ) . I n a d d i t i o n t o t h e c l a s s i c g e n o m i c e f f e c t s o f V D R , t h e p r e s e n c e o f a n o n - g e n o m i c p a t h w a y h a s b e e n d e m o n s t r a t e d i n a n u m b e r o f d i f f e r e n t t i s s u e s . M o d u l a t i o n o f s e v e r a l c y t o p l a s m i c p a t h w a y s b y v i t a m i n D r e s u l t s i n r a p i d b i o l o g i c a l r e s p o n s e s , i n c l u d i n g 2 8 9 i n h i b i t i o n o f c e l l p r o l i f e r a t i o n , s t i m u l a t i o n o f d i f f e r e n t i a t i o n , a n d a p o p t o s i s ( B e e r a n d M y r t h u e , 2 0 0 4 ) . T h e s e p a t h w a y s m a y i n t e r a c t w i t h t h e c l a s s i c g e n o m i c p a t h w a y s t h r o u g h t h e n u c l e a r V D R . T h e r e i s e v i d e n c e o f a m e m b r a n e - b o u n d V D R , w h i c h m a y m e d i a t e t h e g e n e r a t i o n o f n o n - g e n o m i c e f f e c t s ( N e m e r e e t a l . , 1 9 9 3 ) . H o w e v e r , t h e e x i s t e n c e o f a m e m b r a n e - b o u n d V D R i s s t i l l c o n t r o v e r s i a l . P o s s i b l e a l t e r n a t i v e s t o a s p e c i fi c m e m b r a n e - b o u n d V D R i n c l u d e m e m b r a n e - a s s o c i a t e d a n n e x i n I I t h a t w o u l d s e r v e a s a r e c e p t o r f o r v i t a m i n D o r e x t r a c e l l u l a r b i n d i n g s i t e s f o r t h e V D R - l i g a n d c o m p l e x ( B a r a n e t a l . , 2 0 0 0 ; K i m e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e m a j o r i t y o f e s t a b l i s h e d h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s c u r r e n t l y b e i n g u s e d ( i . e . L N C a P , P C - 3 , D U - l 4 5 ) a r e f r o m b i o p s i e s o f m e t a s t a t i c p r o s t a t e c a n c e r . T h e s e c e l l l i n e s a r e m o r e a p p r o p r i a t e f o r e x a m i n i n g a g e n t s t h a t c o u l d b e u s e d f o r t h e t r e a t m e n t o f a d v a n c e d p r o s t a t e c a n c e r . T h e n o n - t u m o r i g e n i c h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l l i n e , R W P E - l , w a s d e r i v e d b y i m m o r t a l i z a t i o n o f p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s i s o l a t e d f r o m t h e p e r i p h e r a l z o n e o f a n o r m a l h u m a n p r o s t a t e ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ; W e b b e r e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h i s c e l l l i n e s h a r e s m a n y c h a r a c t e r i s t i c s w i t h n o r m a l p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s , b u t a l s o m i m i c s a n e a r l y p r e - n e o p l a s t i c s t e p i n p r o s t a t e c a r c i n o g e n e s i s b e c a u s e i t i s a n i m m o r t a l i z e d c e l l l i n e . R W P E - l i s , t h e r e f o r e , a n a p p r o p r i a t e c e l l m o d e l f o r t h e s t u d y o f p r o s t a t e c a n c e r p r e v e n t i o n . I n t h e p r e s e n t s t u d y , I h a v e e l e c t e d t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 3 ) , a n a t u r a l c a l c i t r i o l p r e c u r s o r , o n t h e R W P E - l h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l l i n e . M y l o n g t e r m o b j e c t i v e i s t o d e t e r m i n e t h e e f fi c a c y o f c h o l e c a l c i f e r o l a s a p o t e n t i a l a g e n t i n t h e c h e m o p r e v e n t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . I n t h i s s t u d y , I h a v e e x a m i n e d t h e a b i l i t y o f c h o l e c a l c i f e r o l t o b l o c k o r r e v e r s e c h a n g e s t h a t o c c u r i n p r e - n e o p l a s t i c p r o s t a t e 2 9 0 e p i t h e l i a l c e l l s . T h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h , v i m e n t i n e x p r e s s i o n , m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e ( M M P ) a c t i v i t y , e x p r e s s i o n o f v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) , r e t i n o i d X r e c e p t o r s ( R X R S ) , a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) , a n d p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) , a n d t h e p r e s e n c e a n d i n c r e a s e i n t h e 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e ( C Y P 2 7 A 1 ) a c t i v i t y w e r e e x a m i n e d t o d e t e r m i n e p o t e n t i a l m e c h a n i s m s o f a c t i o n . I a l s o p r o v i d e t h e fi r s t r e p o r t e d e v i d e n c e f o r t h e a b i l i t y o f p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s ( R W P E - l ) t o e x p r e s s t h e 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e , C Y P 2 7 A 1 , n e c e s s a r y t o c o n v e r t c h o l e c a l c i f e r o l t o c a l c i t r i o l . A c o m p a r i s o n b e t w e e n t h e e f fi c a c y o f c h o l e c a l c i f e r o l a n d c a l c i t r i o l w a s a l s o m a d e i n s e v e r a l o f t h e a s s a y s . T h e s e e x p e r i m e n t s w i l l h e l p t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t i v e n e s s a n d m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f c h o l e c a l c i f e r o l i n p r o s t a t e c a n c e r c h e m o p r e v e n t i o n . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s A l l t h e m a t e r i a l a n d m e t h o d s u s e d i n t h i s c h a p t e r a r e i d e n t i c a l t o t h o s e u s e d i n C h a p t e r 8 . T h e r e f o r e , o n l y a b r i e f s u m m a r y o f m a t e r i a l s a n d m e t h o d s i s g i v e n i n t h i s c h a p t e r . F o r m o r e d e t a i l o n b u f f e r s , r e a g e n t s , p r o t o c o l s , c a t a l o g n u m b e r s a n d s u p p l i e r s , p l e a s e r e f e r t o C h a p t e r 8 . C e l l s a n d C e l l C u l t u r e T h e R W P E - l c e l l l i n e i s a n o n - t u m o r i g e n i c , n o n - i n v a s i v e h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l l i n e . I t w a s d e r i v e d f r o m t h e p e r i p h e r a l z o n e o f a n o r m a l h u m a n p r o s t a t e a n d i m m o r t a l i z e d w i t h a s i n g l e c o p y o f t h e h u m a n p a p i l l o m a v i r u s - 1 8 D N A ( H P V - 1 8 ) ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ; W e b b e r e t a l . , 1 9 9 7 ) . C e l l s w e r e m a i n t a i n e d i n c o m p l e t e k e r a t i n o c y t e s e r u m f r e e m e d i u m ( K S F M ; C a t . # : 1 0 7 2 4 - 0 1 1 ) c o n t a i n i n g 5 0 u g / m l B P E a n d 5 n g / m l 2 9 1 E G F ( C a t . # : 3 7 0 0 0 - 0 1 5 ) , a n d 1 X a n t i b i o t i c / a n t i m y c o t i c m i x t u r e ( P e n i c i l l i n I O O U / m l , S t r e p t o m y c i n 1 0 0 u g / m l , a n d F u n g i z o n e 0 . 2 5 u g / m l ) ( G i b c o / l n v i t r o g e n , R o c k v i l l e , M D ) . M e d i u m w a s c h a n g e d e v e r y 4 8 h . C u l t u r e s w e r e m a i n t a i n e d a t 3 7 ° C i n a h u m i d i fi e d a t m o s p h e r e c o n t a i n i n g 5 % C O 2 . W h e n c o n fl u e n t , c e l l s w e r e p a s s a g e d a n d s e e d e d a t 1 x 1 0 6 c e l l s / T - 2 5 fl a s k , o r 2 x 1 0 6 c e l l s / T - 7 5 f l a s k . D o s e R e s p o n s e T h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l ( S i g m a , S t L o u i s , M O , C a t . # : 0 1 3 5 7 ) o r c a l c i t r i o l ( S i g m a , C a t . # : D - 1 5 3 0 ) o n t h e g r o w t h o f R W P E - l a n d R W P E 2 - W 9 9 c e l l s w e r e e x a m i n e d u s i n g a 9 6 - w e l l m i c r o p l a t e a s s a y . C e l l s w e r e p l a t e d a t a d e n s i t y o f 1 0 , 0 0 0 c e l l s / w e l l , 6 w e l l s / t r e a t m e n t , i n a 9 6 - w e l l p l a t e ( B D F a l c o n ) . 4 8 h a f t e r p l a t i n g , c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l o r c a l c i t r i o l . T e s t m e d i a w e r e c h a n g e d e v e r y 4 8 h . A f t e r 5 d a y s o f t r e a t m e n t , c e l l s w e r e s t a i n e d w i t h M T T f o r 3 . 5 h a t 3 7 ° C . A b s o r b a n c e w a s r e a d a t 5 4 0 n m . E t h a n o l - t r e a t e d w e l l s w e r e s e t t o 1 0 0 % g r o w t h a n d s e r v e d a s t h e c o n t r o l s t o w h i c h a l l o t h e r t r e a t m e n t s w e r e c o m p a r e d . S i x i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s w e r e r u n f o r e a c h c e l l l i n e . S D S - P A G E Z y m o g r a p h y f o r M W a c t i v i t y T o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y i n R W P E - l c e l l s , c o n d i t i o n e d m e d i u m w a s c o l l e c t e d a n d a n a l y z e d . C e l l s w e r e p l a t e d i n c o m p l e t e K S F M m e d i u m a t a d e n s i t y o f l X 1 0 6 c e l l s / 6 0 m m d i s h ( B D F a l c o n ) , i n d u p l i c a t e d i s h e s f o r e a c h t r e a t m e n t . 4 8 h a f t e r p l a t i n g , c e l l s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h D - P B S . N e x t 2 . 2 m l o f b a s a l K S F M ( n o E G F o r B P E ) , c o n t a i n i n g d e s i r e d c h o l e c a l c i f e r o l 2 9 2 o r c a l c i t r i o l t r e a t m e n t s w e r e a d d e d t o t h e d i s h e s . C e l l s w e r e t r e a t e d f o r 4 8 h a t 3 7 ° C . C o n d i t i o n e d m e d i u m f r o m d u p l i c a t e d i s h e s w a s p o o l e d a n d c o l l e c t e d a n d a l i q u o t e d . T h e p r o t e i n c o n t e n t o f e a c h s a m p l e w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e L o w r y H i g h p r o t e i n a s s a y . S a m p l e s o f c o n d i t i o n e d m e d i a w e r e s t o r e d a t - 7 0 ° C u n t i l n e e d e d . T o d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f t h e t e s t a g e n t s o n M M P - 2 a n d M M P - 9 a c t i v i t y , g e l a t i n - b a s e d S D S - P A G E z y m o g r a p h y w a s p e r f o r m e d . T h e s e p a r a t i n g a n d s t a c k i n g g e l s w e r e m a d e u s i n g t h e e s t a b l i s h e d p r o t o c o l ( s e e C h a p t e r 8 , p g . 2 4 1 ) a n d p o u r e d i n t o 0 . 7 5 m m c a s t i n g p l a t e s . T h e fi n a l g e l a t i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e g e l s w a s 0 . 1 % . T h e g e l s w e r e a l l o w e d t o p o l y m e r i z e o v e r n i g h t a t 4 ° C b e f o r e u s e . 2 . 0 p g o f p r o t e i n w e r e l o a d e d / l a n e . G e l s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d ( 4 ° C ) a t 1 5 7 v o l t s f o r 1 . 5 h . T h e g e l s w e r e t h e n t r e a t e d w i t h 2 . 5 % T r i t o n - X 1 0 0 f o r 1 h t o r e m o v e t h e S D S . T h e g e l s w e r e t h e n i n c u b a t e d ( 3 7 ° C ) f o r 1 8 h i n s o a k i n g b u f f e r i n o r d e r t o r e - n a t u r e t h e e n z y m e s a n d a l l o w t h e m t o l y s e t h e g e l e t i n . T h e g e l s w e r e s t a i n e d w i t h 0 . 2 5 % C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e R - 2 5 0 a n d d e - s t a i n e d i n m e t h a n o l z a c e t i c a c i d d e 2 O ( 4 : 1 : 5 ) s o l u t i o n . B a n d s o f l y s i s , i n d i c a t i n g p r o t e a s e a c t i v i t y , a p p e a r a s l i g h t b a n d s a g a i n s t a d a r k p u r p l e b a c k g r o u n d . T h e a r e a o f e a c h b a n d w a s m e a s u r e d d e n s i t o m e t r i c a l l y a n d c o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f t h e t e s t a g e n t s o n M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y . I m m u n o s t a i n i n g I m m u n o c y t o c h e m i s t r y w a s c o n d u c t e d t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n t h e e x p r e s s i o n o f t h e f o l l o w i n g : i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n v i m e n t i n ( S i g m a , C a t . # : V - 6 6 3 0 ) ; t h e n u c l e a r r e c e p t o r s V D R ( O n c o g e n e , S a n D i e g o , C A , C a t . # : G R 3 7 ) , R X R - a ( S a n t a C r u z B i o t e c h n o l o g y , S a n t a C r u z , C a l i f o r n i a , C a t . # : s c - 5 5 3 ) , R X R - B 2 9 3 ( S a n t a C r u z , C a t . # : s c - 8 3 l ) , a n d R X R - y ( S a n t a C r u z , C a t . # : s c - 5 5 5 ) . M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s f o r v i m e n t i n a n d V D R a n d p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s f o r t h e R X R S a n d a m o d i fi e d a v i d i n - b i o t i n i m m u n o p e r o x i d a s e p r o t o c o l w e r e u s e d ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ) . C e l l s w e r e p l a t e d i n 1 m l o f c o m p l e t e K S F M o n s t e r i l e , a c i d w a s h e d g l a s s c o v e r s l i p s i n 2 4 - w e l l p l a t e s a t a d e n s i t y o f 7 , 5 0 0 c e l l s / w e l l . 4 8 h a f t e r p l a t i n g , t h e m e d i u m w a s r e p l a c e d w i t h m e d i u m c o n t a i n i n g t h e d e s i r e d c h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n . T h e f o l l o w i n g c o n c e n t r a t i o n s o f c h o l e c a l c i f e r o l w e r e u s e d : 1 n M ( 1 0 ' 9 M ) , 1 0 n M ( 1 0 ' 8 M ) , 1 0 0 n M ( 1 0 ' 7 M ) , a n d 1 p M ( 1 0 ' 6 M ) . E t h a n o l t r e a t e d c e l l s w e r e u s e d a s c o n t r o l s . T e s t m e d i a w e r e c h a n g e d e v e r y 4 8 h . A f t e r 5 d a y s o f t r e a t m e n t t h e c e l l s w e r e w a s h e d w i t h D - P B S a n d fi x e d w i t h a s o l u t i o n o f 1 : 1 m e t h a n o l ( 1 0 0 % ) / a c e t o n e f o r 2 m i n . T h e c o v e r s l i p s w e r e s t o r e d a t - 2 0 ° C u n t i l n e e d e d . A l l o f t h e f o l l o w i n g s t e p s w e r e c a r r i e d o u t a t r o o m t e m p e r a t u r e : c e l l s w e r e b l o c k e d f o r l h w i t h n o r m a l h o r s e s e r u m ( V e c t o r L a b s , B u r l i n g a m e , C A ) , i n c u b a t e d w i t h p r i m a r y A b d i l u t e d i n b l o c k i n g s o l u t i o n , i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n w i t h a b i o t i n y l a t e d s e c o n d a r y a n t i b o d y d i l u t e d 1 : 2 0 0 i n b l o c k i n g s o l u t i o n , t r e a t e d w i t h 3 % H 2 0 2 t o q u e n c h e n d o g e n o u s p e r o x i d a s e a c t i v i t y , i n c u b a t e d w i t h A B C ( V e c t o r ) f o r 3 0 m i n , a n d d e v e l o p e d w i t h D A B s u b s t r a t e k i t f o r p e r o x i d a s e ( V e c t o r ) f o r 1 - 3 m i n . C e l l s w e r e w a s h e d 2 X , 8 m i n e a c h , b e t w e e n a l l s u c c e s s i v e s t e p s a f t e r i n c u b a t i o n w i t h t h e p r i m a r y A b . C e l l s n o t i n c u b a t e d i n p r i m a r y A b b u t i n c u b a t e d i n s e c o n d a r y A b s e r v e d a s c o n t r o l s . C o v e r s l i p s w e r e d e h y d r a t e d a n d m o u n t e d o n a l c o h o l - w a s h e d m i c r o s c o p e s l i d e s u s i n g P e r m o u n t . A n t i b o d y d i l u t i o n s a n d i n c u b a t i o n t i m e s w e r e a s f o l l o w s : v i m e n t i n 1 : 4 0 ( 1 h ) , V D R 1 : 1 0 0 ( 2 h ) , R X R - a , i s , a n d - y 1 : 1 0 0 ( 2 h ) . 2 9 4 P r o t e i n A n a l y s i s T o q u a n t i f y p r o t e i n s , a B e c k m a n D U S e r i e s 5 3 0 S p e c t r o p h o t o m e t e r w a s u s e d f o r p r o t e i n a s s a y s . S a m p l e s w e r e c o m p a r e d t o s t a n d a r d c o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 0 , 0 . 1 , 0 . 5 , 1 . 0 , 1 . 5 , a n d 2 . 0 p g / m l p r e p a r e d f r o m t h e A l b u m i n S t a n d a r d ( b o v i n e s e r u m a l b u m i n , 2 . 0 m g / m l , P i e r c e ) . T h e a s s a y s w e r e r u n u s i n g t h e L o w r y H i g h p r o t e i n a s s a y m e t h o d . W e s t e r n b l o t a n a l y s i s W e s t e r n b l o t a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d i n o r d e r t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n V D R , R X R - o r , B , a n d 7 , A R a n d P S A , a n d C Y P 2 7 A 1 a n d t h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n V D R p r o t e i n e x p r e s s i o n i n R W P E - l c e l l s . C e l l s w e r e p l a t e d a t a d e n s i t y o f 5 0 0 , 0 0 0 c e l l s / T - 2 5 fl a s k i n d u p l i c a t e fl a s k s . 4 8 h a f t e r p l a t i n g , t h e m e d i u m w a s r e m o v e d a n d r e p l a c e d w i t h t h e t e s t m e d i a . T h e c e l l s w e r e t r e a t e d f o r 4 d a y s , i n c u b a t e d w i t h 2 . 0 m 1 t r y p s i n / E D T A ( d i l u t e d 1 : 1 w i t h D - P B S ) f o r 7 m i n , a n d d i s l o d g e d b y t a p p i n g . C e l l s f r o m d u p l i c a t e fl a s k s w e r e p o o l e d a n d c o l l e c t e d . N u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d u s i n g t h e N E - P E R k i t a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l ( P i e r c e ) . E x t r a c t s w e r e a l i q u o t e d a n d f r o z e n a t - 7 0 ° C . T h e L o w r y H i g h p r o t e i n a s s a y m e t h o d w a s u s e d t o d e t e r m i n e p r o t e i n c o n t e n t o f e a c h s a m p l e . S a m p l e s c o n t a i n i n g 1 0 p g ( v i m e n t i n ) , 2 0 p g ( V D R ) , 2 5 p g ( R X R S a n d A R ) , a n d 4 0 p g ( C Y P 2 7 A 1 a n d P S A ) o f p r o t e i n w e r e r u n i n N u P A G E 1 0 % B i s - T r i s p r e - c a s t g e l s ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A ) a t 1 7 5 V f o r 1 . 5 - 1 . 7 h a t 4 ° C . P r o t e i n s w e r e t r a n s f e r r e d t o I m m o b o l i n - P t r a n s f e r m e m b r a n e s ( 0 . 4 5 p m p o r e s i z e ) ( M i l l i p o r e C o r p . , B e d f o r d , M a r y l a n d ) a t 3 0 V f o r 1 - 1 . 5 h a t 4 ° C . F o r i m m u n o b l o t t i n g , m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s w e r e u s e d f o r v i m e n t i n , V D R , A R ( S a n t a C r u z , C a t . # : s c - 7 3 0 5 ) , a n d p r o s t a t e s p e c i fi c a n t i g e n ( P S A ) ( D a k o C y t o m a t i o n , C a r p i n t e r i a , C A , 2 9 5 C a t . # : M - 0 7 5 0 ) , a n d p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s w e r e u s e d f o r R X R S a n d C Y P 2 7 A 1 ( S a n t a C r u z , C a t . # : s c - 1 4 8 3 5 ) . A l l b l o t s w e r e s t a i n e d u s i n g a v i d i n - b i o t i n i m m u n o p e r o x i d a s e A B C k i t ( V e c t o r ) a n d d e v e l o p e d u s i n g D A B k i t ( V e c t o r ) a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 8 . B l o t s w e r e a n a l y z e d w i t h t h e I m a g e J a n a l y s i s p r o g r a m f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h ( N I H ) . I n d i v i d u a l l a n e s w e r e c o m p a r e d t o c o n t r o l l a n e f o r c h a n g e s i n p r o t e i n e x p r e s s i o n . A n t i b o d y d i l u t i o n s a n d i n c u b a t i o n t i m e s w e r e a s f o l l o w s : V D R 1 2 1 0 0 0 ( 2 h ) , R X R - a ( 1 : 1 0 0 ) , R X R - B ( 1 : 2 5 0 ) , a n d R X R - y ( 1 : 2 0 0 ) ( e a c h 2 h ) , A R 1 : 5 0 0 ( 2 h ) , C Y P 2 7 A 1 1 : 1 0 0 ( 1 h ) , P S A 1 : 1 0 0 ( 2 4 h ) . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s R e s u l t s i n t h i s s t u d y w e r e o b t a i n e d f r o m t h r e e t o s i x i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n s w i t h s t a n d a r d d e v i a t i o n s ( S D ) . D i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e m e a n s w e r e c o n s i d e r e d s i g n i fi c a n t i f p < 0 . 0 5 . O n e - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) w a s u s e d t o c o m p a r e c h o l e c a l c i f e r o l e f f e c t s o n t h e g r o w t h o f R W P E - l a n d R W P E 2 - W 9 9 c e l l l i n e s . R e s p o n s e t o i n d i v i d u a l c o n c e n t r a t i o n s w a s c o m p a r e d t o c o n t r o l s u s i n g u n p a i r e d t - t e s t w i t h W e l c h c o r r e c t i o n . G r a p h P a d I n S t a t # 3 w a s u s e d f o r t h e s e a n a l y s e s . R e s u l t s C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s t h e g r o w t h o f R W P E - I a n d R W P E Z - W 9 9 c e l l s : D o s e r e s p o n s e e x p e r i m e n t s w e r e fi r s t r u n t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h o f R W P E - l a n d R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . C e l l s w e r e p l a t e d i n 9 6 - w e l l p l a t e s a n d t r e a t e d f o r 5 d a y s w i t h c h o l e c a l c i f e r o l a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . R e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t g r o w t h i n h i b i t i o n o f b o t h R W P E - l a n d R W P E 2 - W 9 9 c e l l s ( F i g u r e 9 - 1 ) . T h e 2 9 6 ) l o r t n o C f o % ( h t w o r G l l e C 1 1 0 1 0 0 F i g u r e 9 - 1 : 9 0 - 8 0 4 7 0 ‘ 6 0 - 5 0 - - 4 0 - 3 o - 2 0 - 1 0 - i i - - . . . . . . R W P E - l + R W P E 2 - W 9 9 R W P E - L I D 5 0 ~ 3 . 8 " M R W P E 2 - W 9 9 , I D 5 0 ~ 6 . 4 p M ‘ x O s U I t \ — ' / / l ‘ U I ” l I U 1 - 0 ' e ” 3 : i : e " E a ” a ‘ 1 ’ : ' 3 : H H H H H H H H H N N N K M N N N N 1 - 1 H t - l I n H I O m I n 1 - 1 o i b “ C h o l e c a l c i f e r o l C o n c e n t r a t i o n ( M ) T h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h o f t h e n o n - t u m o r i g e n i c R W P E - l a n d t h e m a l i g n a n t R W P E 2 - W 9 9 c e l l s l i n e s . 4 8 h a f t e r p l a t i n g l X 1 0 4 c e l l s / w e l l i n 9 6 - w e l l p l a t e s , c e l l w e r e t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . A f t e r 5 d a y s o f t r e a t m e n t , c e l l s w e r e s t a i n e d w i t h M T T . A b s o r b a n c e w a s r e a d a t 5 4 0 n m , : t S D , ( n = 6 ) . T h e d a s h e d l i n e s h o w s I D 5 0 o f ~ 3 . 8 p M f o r R W P E - l a n d ~ 6 . 4 p M f o r R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . * * p = 0 . 0 1 ; * * * p < 0 . 0 0 1 2 9 7 n o n - t u m o r i g e n i c R W P E - l c e l l s a r e m o r e s e n s i t i v e t o c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t t h a n R W P E 2 - W 9 9 . A s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e ( * * p = 0 . 0 1 ; * * * p < 0 . 0 0 1 ) i n r e s p o n s e b e t w e e n t h e t w o c e l l l i n e s c a n b e s e e n s t a r t i n g a t c o n c e n t r a t i o n s a s l o w a s 0 . 5 p M ( 5 X 1 0 ' 7 M ) . T h e I D 5 0 c o n c e n t r a t i o n s w e r e ~ 3 . 8 p M f o r R W P E — l a n d ~ 6 . 4 p M f o r R W P E 2 - W 9 9 . T h e s e r e s u l t s s h o w t h a t t h e n o n - t u m o r i g e n i c R W P E - l c e l l s a r e m o r e r e s p o n s i v e , a n d s h o w g r e a t e r g r o w t h i n h i b i t i o n u p o n e x p o s u r e t o c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t , t h a n t h e m a l i g n a n t R W P E 2 - W 9 9 c e l l s w h e n g r o w n i n a n a n c h o r a g e - d e p e n d e n t m a n n e r . T h e s e r e s u l t s w e r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e c h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s u s e d i n a l l s u b s e q u e n t a s s a y s . C h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y : G e l a t i n - b a s e d ( 0 . 1 % ) S D S - P A G E z y m o g r a p h y w a s p e r f o r m e d t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n t h e g e l a t i n o l y t i c a c t i v i t y o f M M P - 9 a n d M M P - 2 . R e s u l t s i n F i g u r e 9 - 2 s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l m a r k e d l y d e c r e a s e s t h e a c t i v i t y o f b o t h M M P - 9 a n d M M P - 2 i n c o n d i t i o n e d m e d i u m o f R W P E - l c e l l s . T h e d e n s i t o m e t r i c a n a l y s i s o f t h e z y m o g r a m s h o w s a m a r k e d d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n M M P a c t i v i t y w i t h m a x i m u m i n h i b i t i o n o f 7 0 % a n d 4 4 % f o r M M P - 9 a n d M M P - 2 , r e s p e c t i v e l y , a t 1 0 ' 5 M c o n c e n t r a t i o n , w h e n c o m p a r e d t o e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l s . 2 9 8 D e n s i t o m e t r i c A n a l y s i s : M M P - 9 1 0 0 % 1 0 6 % 9 4 % 7 2 % 4 0 % 3 0 % M M P - 2 1 0 0 % 9 5 % 9 8 % 9 8 % 8 0 % 5 6 % F i g u r e 9 - 2 : S D S - P A G E z y m o g r a p h y ( 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l c o n t a i n i n g 0 . 1 % g e l a t i n ) w a s u s e d t o a n a l y z e M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y i n c o n d i t i o n e d m e d i u m o f R W P E - l c e l l s t r e a t e d f o r 4 8 h w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . 2 . 0 p g o f p r o t e i n w e r e l o a d e d / l a n e . D e n s i t o m e t r i c a n a l y s e s , w i t h e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l s t a k e n a s 1 0 0 % , a r e s h o w n b e l o w t h e z y m o g r a m . C h o l e c a l c i f e r o l d e c r e a s e s v i m e n t i n e x p r e s s i o n i n R W P E — I c e l l s : T h e e f f e c t o f c h o l e c a l c i f e r o l o n t h e e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n w a s e x a m i n e d b y i m m u n o s t a i n i n g . C e l l s w e r e t r e a t e d f o r 5 d a y s . T h e r e s u l t s i n F i g u r e 9 - 3 s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n . E t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l c e l l s s h o w s t r o n g s t a i n i n g f o r v i m e n t i n w h i l e t h e c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t e d c e l l s s h o w a d e c r e a s e i n s t a i n i n g f o r v i m e n t i n . 2 9 9 F i g u r e 9 - 3 : E f f e c t o f c h o l e c a l c i f e r o l o n t h e e x p r e s s i o n o f i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n v i m e n t i n . l m m u n s t a i n i n g r e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n . T r e a t m e n t c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n a b o v e t h e i r r e s p e c t i v e s q u a r e . C = e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l ; ( a ) i s a n e g a t i v e c o n t r o l l a c k i n g p r i m a r y a n t i b o d y , E T O H = e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l . B a r = 2 0 p m . C h o l e c a l c i f e r o l u p - r e g u l a t e s V D R , R X R S , a n d A R n u c l e a r r e c e p t o r s : I m m u n o s t a i n i n g r e s u l t s f o r V D R a n d R X R S a f t e r c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a n b e s e e n i n F i g u r e 9 - 4 . C h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t a p p e a r s t o u p - r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f V D R , R X R - o r , R X R - B , a n d R X R - y , i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . W e s t e r n b l o t a n a l y s e s i n F i g u r e 9 - 5 c o n fi r m t h e i m m u n o s t a i n i n g r e s u l t s . C h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e s a m a r k e d d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n o f V D R a n d R X R - a a n d R X R - y . R X R - B s h o w e d b a r e l y d e t e c t a b l e l e v e l s o f e x p r e s s i o n i n t h e c o n t r o l a n d a t l o w e r c h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s b u t w a s m a r k e d l y u p - r e g u l a t e d a t 1 0 4 5 M c h o l e c a l c i f e r o l . A n u p - r e g u l a t i o n i n t h e e x p r e s s i o n o f a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) c a n a l s o b e s e e n i n F i g u r e 9 - 5 a t 1 0 ‘ 8 M a n d 1 0 ' 7 M l e v e l . 3 0 0 C E T O H 1 0 ' 9 M C ! D . > a b c ~ ? 2 n . a : X ‘ , m . . . _ 5 ; . f 9 . h * 3 2 2 * § 3 Q . - : - . ~ \ I l , s 1 ‘ . ‘ . k I 1 ' 1 1 . . . a a ‘ 1 i ‘ a : > < “ - ‘ 5 . - D : p q r ' . . F i g u r e 9 - 4 : I m m u n o s t a i n i n g f o r n u c l e a r r e c e p t o r s i n R W P E - l c e l l s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . C e l l s w e r e t r e a t e d f o r 5 d a y s . V D R ( a - e ) , R X R - o r ( f - j ) , R X R - B ( k - o ) , a n d R X R - y ( p - t ) a l l d e m o n s t r a t e a m a r k e d i n c r e a s e i n e x p r e s s i o n w h e n c o m p a r e d t o t h e i r r e s p e c t i v e e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l c e l l s ( b , g , l , a n d q ) . T r e a t m e n t c o n c e n t r a t i o n s u s e d a r e 1 0 ‘ 9 M ( c , h , m , r ) , 1 0 ' 8 M ( d , i , n , s ) a n d 1 0 ‘ 7 M ( e , j , o , t ) . ( a , f , k , p ) a r e c o n t r o l s l a c k i n g p r i m a r y a n t i b o d y . C e l l s w e r e p l a t e d o n s t e r i l e , g l a s s c o v e r s l i p s a t d e n s i t y o f 7 , 5 0 0 c e l l s / c o v e r s l i p . B a r = 2 0 p m . 3 0 1 A - R ( X M l d i R X R l — I I " - U W “ l l a w — . - W " m n , 3 “ 0 ' 9 i s “ t o “ N o , 9 " R X R - [ 3 ‘ 7 M B - A c t i n l — M F i g u r e 9 - 5 : W e s t e r n b l o t a n a l y s i s s h o w i n g t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n n u c l e a r r e c e p t o r s . L a n e ‘ C ’ r e p r e s e n t s t h e c o n t r o l . C h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n a b o v e t h e i r r e s p e c t i v e l a n e s . R e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n o f V D R , R X R - o r , a n d R X R - y . V e r y l o w l e v e l s o f R X R - B w e r e d e t e c t e d u n t i l a m a r k e d u p - r e g u l a t i o n w a s s e e n a t t h e 1 0 ' 6 M c o n c e n t r a t i o n . F o r V D R 2 0 p g a n d R X R S a n d A R 2 5 p g o f p r o t e i n w e r e l o a d e d / l a n e . B - a c t i n w a s u s e d a s t h e l o a d i n g c o n t r o l . C h o l e c a l c i f e r o l i n d u c e s e x p r e s s i o n o f P S A i n R W P E - 1 c e l l s : W e s t e r n b l o t a n a l y s i s w a s c o n d u c t e d t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n t h e e x p r e s s i o n o f P S A . R e s u l t s i n F i g u r e 9 - 6 s h o w t h a t P S A e x p r e s s i o n i s u p - r e g u l a t e d i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r i n c e l l s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . 3 0 2 u ' - P 3 3 ~ S k A D a . . . r t - " - ? - ' = ’ 9 ‘ s , ’ ‘ . B - a c t i n F i g u r e 9 - 6 2 W e s t e r n b l o t f o r P S A e x p r e s s i o n i n R W P E - l c e l l s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . L a n e ‘ C ’ r e p r e s e n t s t h e c o n t r o l . C h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n a b o v e t h e i r r e s p e c t i v e l a n e s . R e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l c a u s e s a n u p - r e g u l a t i o n i n t h e e x p r e s s i o n o f P S A . 4 0 p g o f p r o t e i n w a s l o a d e d / l a n e . B - a c t i n w a s u s e d a s t h e l o a d i n g c o n t r o l . C h o l e c a l c i f e r o l i n d u c e s t h e e x p r e s s i o n o f 2 5 - h y d r o x l y a s e e n z y m e , C Y P 2 7 A 1 : W e s t e r n b l o t a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d t o e x a m i n e t h e a b i l i t y o f c h o l e c a l c i f e r o l t o i n d u c e 2 5 - h y d r o x y l a s e , C Y P 2 7 A 1 , w h i c h c o n v e r t s c h o l e c a l c i f e r o l t o 2 5 0 H D 3 . U s i n g a p o l y c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t C Y P 2 7 A 1 , a s i n g l e b a n d a t M R ~ 5 4 k D a w a s d e t e c t e d . T h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e h u m a n C Y P 2 7 e n z y m e h a s b e e n s h o w n t o b e ~ 5 4 k D a . A s s e e n i n F i g u r e 9 - 7 , C Y P 2 7 A 1 i s c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e d i n t h e c o n t r o l R W P E - l c e l l s ( l a n e C ) . I n a d d i t i o n , C Y P 2 7 A 1 e n z y m e e x p r e s s i o n i s u p - r e g u l a t e d , i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r , t o o v e r 2 0 0 % o f e t h a n o l - t r e a t e d c o n t r o l a t t h e 1 0 ’ 5 M c o n c e n t r a t i o n . 3 0 3 C Y P 2 7 A 1 ~ 5 4 k D a B - a c t i n M F i g u r e 9 - 7 : W e s t e r n b l o t f o r 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e , C Y P 2 7 A 1 , i n R W P E - l c e l l s t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . L a n e ‘ C ’ r e p r e s e n t s t h e c o n t r o l . C h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s a r e s h o w n a b o v e t h e i r r e s p e c t i v e l a n e s . R e s u l t s s h o w t h a t w h i l e t h e e n z y m e i s p r e s e n t i n u n t r e a t e d c e l l s i t i s a l s o u p - r e g u l a t e d u p o n c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t . 4 0 p g p r o t e i n w e r e l o a d e d / l a n e . M o l e c u l a r w e i g h t o f C Y P 2 7 A 1 i s s h o w n t o b e ~ 5 4 k D a . B - a c t i n w a s u s e d a s t h e l o a d i n g c o n t r o l . E f f e c t s o f c a l c i t r i o l : I n o r d e r t o c o m p a r e t h e e f fi c a c y o f c h o l e c a l c i f e r o l , s e v e r a l o f t h e a s s a y s w e r e a l s o c o n d u c t e d u s i n g c a l c i t r i o l - t r e a t e d c e l l s . F i g u r e 9 - 8 A s h o w s t h e r e s u l t s o f t h e c a l c i t r i o l d o s e r e s p o n s e a s s a y . T h e R W P E - l c e l l s w e r e m o r e s e n s i t i v e t o c a l c i t r i o l t r e a t m e n t w i t h a n I D 5 0 o f ~ 1 . 2 5 p M . T h i s i s c o m p a r e d t o t h e I D 5 0 o f ~ 3 . 8 p M f o r c h o l e c a l c i f e r o l - t r e a t e d c e l l s ( s e e F i g u r e 9 - 1 ) . R e s u l t s f r o m c a l c i t r i o l z y m o g r a m s a r e s h o w n i n F i g u r e 9 - 8 B . C a l c i t r i o l t r e a t m e n t c a u s e d a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n M M P - 9 a n d M M P - 2 a c t i v i t y , s i m i l a r t o c h o l e c a l c i f e r o l z y m o g r a m s . W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f V D R e x p r e s s i o n i s s e e n i n F i g u r e 9 - 8 C . T h e r e s u l t s s h o w t h a t c a l c i t r i o l c a u s e d a d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n o f V D R , s i m i l a r t o t h a t s e e n i n c h o l e c a l c i f e r o l - t r e a t e d c e l l s . H o w e v e r , w h e n c o m p a r e d t o c h o l e c a l c i f e r o l , c a l c i t r i o l i s a p p r o x i m a t e l y 3 - 1 0 f o l d m o r e e f f e c t i v e i n t h e d i f f e r e n t a s s a y s p e r f o r m e d . V D R w a s u p - r e g u l a t e d a t c h o l e c a l c i f e r o l c o n c e n t r a t i o n s u p t o 1 0 ’ 7 M , 3 0 4 > . ) l o r t n o C f o o / ° ( h t w o r G l l e C V h o w e v e r , w i t h f u r t h e r i n c r e a s e i n c o n c e n t r a t i o n t o 1 0 ' 6 M , V D R w a s t h e n d o w n - r e g u l a t e d . O v e r - s t i m u l a t i o n o f r e c e p t o r s o f t e n l e a d s t o a d o w n - r e g u l a t i o n . 1 1 0 ~ 1 0 0 1 » . . 9 0 - . ‘ 1 r - 1 5 - . A s o « 7 o - ‘ 2 - a . , ~ 6 0 - - - ~ - R W P E - l s o - - - - - — - — - — — - — - - — - — — — — - — — — - - - - — - " - 4 . - _ 4 o - E 3 0 ~ 1 2 0 - : 1 0 1 R W ' P E - I I D 5 . ~ 1 . 2 5 p M i 1 , : 2 3 : ' i ' v ' l ' : " 2 " " : I " N F i g u r e 9 - 8 : E f f e c t s o f c a l c i t r i o l o n ( A ) a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h , ( B ) M M P a c t i v i t y , a n d ( C ) V D R e x p r e s s i o n i n R W P E - l c e l l s . ( A ) C e l l s w e r e p l a t e d a t a d e n s i t y o f 1 X 1 0 4 c e l l s / w e l l i n 9 6 - w e l l p l a t e s . 4 8 h a f t e r p l a t i n g c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . P l a t e s w e r e s t a i n e d w i t h M T T a f t e r 5 d a y s o f t r e a t m e n t . A b s o r b a n c e w a s r e a d a t 5 4 0 n m . T h e d a s h e d l i n e s h o w s I D 5 0 o f ~ 1 . 2 5 p M . ( B ) T h e a c t i v i t y o f M M P - 9 a n d M M P - 2 w a s a n a l y z e d b y S D S - P A G E z y m o g r a p h y o f c o n d i t i o n e d m e d i u m f r o m R W P E - l c e l l s t r e a t e d f o r 4 8 h w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . 2 . 0 p g o f p r o t e i n w e r e l o a d e d / l a n e . ( C ) W e s t e r n b l o t f o r V D R i n c a l c i t r i o l - t r e a t e d R W P E - l c e l l s s h o w s a d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n o f V D R e x p r e s s i o n w i t h i n c r e a s i n g c a l c i t r i o l c o n c e n t r a t i o n s u p t o 1 0 ' 7 M . 2 0 p g p r o t e i n w e r e l o a d e d / l a n e . 3 0 5 D i s c u s s i o n C h e m o p r e v e n t i o n i s t h e p r e v e n t i o n o f c a n c e r b y e i t h e r p r e v e n t i n g o r t r e a t i n g p r e - m a l i g n a n t l e s i o n s . B e c a u s e o f t h e 2 0 o r m o r e y e a r s b e t w e e n i n i t i a t i o n a n d t h e m a n i f e s t a t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r , c h e m o p r e v e n t i o n i s , p e r h a p s , t h e m o s t p r a c t i c a l a p p r o a c h t o t h e p r o s t a t e c a n c e r p r o b l e m . A g r e a t d e a l o f i n t e r e s t i n e x a m i n i n g t h e e f fi c a c y o f v i t a m i n D a s a c h e m o p r e v e n t i v e a n d c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t h a s b e e n s h o w n s i n c e i t w a s fi r s t h y p o t h e s i z e d t h a t v i t a m i n D l e v e l s a r e a s s o c i a t e d w i t h p r o s t a t e c a n c e r ( S c h w a r t z a n d H u l k a , 1 9 9 0 ) . A w e a l t h o f d a t a h a s b e e n a c c u m u l a t e d a n d t h r o u g h t h e s e n u m e r o u s s t u d i e s i t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t t h e r e a r e s e v e r a l m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g t h e c h e m o p r e v e n t i v e a c t i v i t y o f c a l c i t r i o l [ 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ] ( f o r r e v i e w s s e e K r i s h n a n e t a l . , 2 0 0 3 ; O s b o r n e a n d H u t c h i n s o n , 2 0 0 2 ; P o l e k a n d W e i g e l , 2 0 0 2 ) . D e s p i t e t h e e f f e c t i v e n e s s o f c a l c i t r i o l , i t s c l i n i c a l u s e i s l i m i t e d b e c a u s e i t c a u s e s e l e v a t i o n i n s e r u m c a l c i u m l e v e l s ( h y p e r c a l c e m i a ) . A s a r e s u l t , t h e e f f e c t s o f v i t a m i n D a n a l o g s a n d 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 ( 2 5 0 H D 3 ) , t h e i m m e d i a t e p r e c u r s o r t o c a l c i t r i o l , h a v e b e e n e x a m i n e d . T h e s e l e s s c a l c e m i c , a l t e r n a t i v e a g e n t s e x e r t t h e i r e f f e c t s t h r o u g h m a n y o f t h e s a m e m e c h a n i s m s a n d h a v e s i m i l a r , s o m e t i m e s b e t t e r , p o t e n c y t h a n c a l c i t r i o l ( B a r r e t o e t a l . , 2 0 0 0 ; P o l e k a n d W e i g e l , 2 0 0 2 ) . T h e m a j o r i t y o f e s t a b l i s h e d h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s c u r r e n t l y b e i n g u s e d ( i . e . L N C a P , P C - 3 , D U - 1 4 5 ) w e r e d e v e l o p e d f r o m b i o p s i e s o f m e t a s t a t i c p r o s t a t e c a n c e r . T h e r e f o r e , t h e y a r e n o t a p p r o p r i a t e m o d e l s t o s t u d y t h e e f f e c t s o f c h e m o p r e v e n t i v e a g e n t s o n p r o s t a t e c a n c e r . T h e s e c e l l l i n e s a r e m o r e a p p r o p r i a t e f o r e x a m i n i n g a g e n t s t h a t m a y b e u s e d f o r t h e t r e a t m e n t o f a d v a n c e d p r o s t a t e c a n c e r . T h e h u m a n p a p i l l o m a s v i r u s - 1 8 ( H P V - l 8 ) i m m o r t a l i z e d c e l l l i n e , R W P E - l , w a s d e r i v e d f r o m p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s 3 0 6 i s o l a t e d f r o m t h e p e r i p h e r a l z o n e o f a n o r m a l h u m a n p r o s t a t e ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ; W e b b e r e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h i s c e l l l i n e s h a r e s m a n y c h a r a c t e r i s t i c s w i t h n o r m a l p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s , b u t a l s o m i m i c s e a r l y s t a g e s o f p r o s t a t e c a r c i n o g e n e s i s . T h e r e f o r e , R W P E - l i s a n a p p r o p r i a t e c e l l m o d e l f o r t h e s t u d y i n g t h e e f f e c t s o f a g e n t s w i t h c h e m o p r e v e n t i v e p o t e n t i a l . N i n e t y t o 1 0 0 % o f t h e v i t a m i n D i n t h e h u m a n b o d y c o m e s f r o m t h e i n v i v o s y n t h e s i s i n t h e s k i n ( H o l i c k 2 0 0 2 ) . A c c o r d i n g t o t h e t r a d i t i o n a l m o d e l o f v i t a m i n D s y n t h e s i s , v i t a m i n D 3 i n t h e s k i n i s t r a n s p o r t e d t o t h e l i v e r a n d c o n v e r t e d t o 2 5 0 H D 3 b y t h e 2 5 - h y d r o x y l a s e e n z y m e , C Y P 2 7 . T h e l i v e r i s t h e m a j o r s i t e o f 2 5 0 H D 3 s y n t h e s i s . F r o m t h e l i v e r , 2 5 0 H D 3 i s t r a n s p o r t e d t o t h e k i d n e y w h e r e i t i s c o n v e r t e d t o 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 b y t h e l a - h y d r o x l a s e e n z y m e . M y r e s u l t s s h o w ( F i g u r e 9 - 7 ) t h a t t h e R W P E - l h u m a n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s 2 5 - h y d r o x y l a s e . T o t h e b e s t o f m y k n o w l e d g e , t h i s i s t h e fi r s t r e p o r t e d e v i d e n c e o f 2 5 - h y d r o x l y a s e i n c e l l s o t h e r t h a n k i d n e y , l i v e r , a n d k e r a t i n o c y t e s ( B i k l e e t a l . , 1 9 8 6 ; L e h m a n n e t a l . , 1 9 9 9 ) . P r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s p o s s e s s l o r - h y d r o x y l a s e a c t i v i t y ( S c h w a r t z e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h e r e f o r e , p o s s e s s i n g t w o e n z y m e s , t h e 2 5 - h y d r o x y l a s e a n d l a - h y d r o x y l a s e , i n v o l v e d i n t h e s y n t h e s i s o f c a l c i t r i o l , w o u l d a l l o w p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s t o l o c a l l y p r o d u c e c a l c i t r i o l f r o m c h o l e c a l c i f e r o l . G i v e n t h e a n t i p r o l i f e r a t i v e a n d d i f f e r e n t i a t i n g e f f e c t s o f c a l c i t r i o l , l o c a l p r o d u c t i o n o f c a l c i t r i o l i n p r e - n e o p l a s t i c p r o s t a t e c e l l s c o u l d p r e v e n t c a r c i n o g e n e s i s a t a n e a r l y s t a g e , t h u s , i n d i c a t i n g t h a t c h o l e c a l c i f e r o l h a s c h e m o p r e v e n t i v e p o t e n t i a l . I n t h e p r e s e n t s t u d y , I h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t c h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s , i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r , t h e g r o w t h o f t h e n o n - t u m o r i g e n i c R W P E - l a n d t h e m a l i g n a n t R W P E 2 - W 9 9 h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s ( F i g u r e 9 - 1 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e n o n - 3 0 7 t u m o r i g e n i c R W P E — l c e l l s a r e m o r e s e n s i t i v e t o c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t . T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - B ( T G F - B ) r e g u l a t e s s e v e r a l c e l l u l a r p r o c e s s e s , i n c l u d i n g c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s ( C u l i g e t a l . , 1 9 9 6 ) . W e h a v e p r e v i o u s l y s h o w n t h a t T G F - B i n h i b i t s t h e g r o w t h o f R W P E - l c e l l s , a n d t o a l e s s e r d e g r e e , t h e g r o w t h o f R W P E 2 - W 9 9 c e l l s ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ) . I t h a s b e e n s h o w n t h a t c a l c i t r i o l i n d u c e s T G F - B ( D a n i e l p o u r , 1 9 9 6 ; M u r t h y a n d W e i g e l , 2 0 0 4 ) . E l e v a t i o n o f T G F - B p r o d u c t i o n a n d s i g n a l i n g b y c a l c i t r i o l i s t h o u g h t t o b e i n v o l v e d i n t h e i n h i b i t i o n o f p r o l i f e r a t i o n a n d i n d u c t i o n d i f f e r e n t i a t i o n i n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s ( D a n i e l p o u r , 1 9 9 6 ; M u r t h y a n d W e i g e l , 2 0 0 4 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t i n d u c t i o n o f T G F - B i s a l s o i n v o l v e d i n t h e i n h i b i t i o n o f g r o w t h o f R W P E - l a n d R W P E 2 - W 9 9 c e l l s b y c h o l e c a l c i f e r o l . T h e l a - h y d r o x y l a s e e n z y m e i s i n v o l v e d i n t h e s y n t h e s i s o f c a l c i t r i o l a n d i t s e x p r e s s i o n i n h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s h a s b e e n s h o w n ( S c h w a r t z e t a l . , 1 9 9 8 ) . C o m p a r e d t o n o r m a l p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s , B P H a n d p r o s t a t e c a n c e r c e l l s a n d c a n c e r c e l l l i n e s d e m o n s t r a t e a m a r k e d d e c l i n e i n t h e a c t i v i t y o f t h i s e n z y m e ( H s u e t a l . , 2 0 0 1 ; W h i t l a c h e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t , c o m p a r e d t o t h e m a l i g n a n t R W P E 2 - W 9 9 c e l l s , t h e n o n - t u m o r i g e n i c R W P E - l c e l l s m a y h a v e a h i g h e r c a p a c i t y t o c o n v e r t c h o l e c a l c i f e r o l t o c a l c i t r i o l a n d , t h u s , w o u l d b e m o r e g r o w t h i n h i b i t e d b y c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t . T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o c e l l l i n e s i n s e n s i t i v i t y t o c h o l e c a l c i f e r o l m a y a l s o b e e x p l a i n e d b y t h e e x p r e s s i o n a n d u p - r e g u l a t i o n o f c e r t a i n n u c l e a r r e c e p t o r s , w h i c h w i l l b e d i s c u s s e d i n m o r e d e t a i l . M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P s ) h a v e r e p e a t e d l y b e e n i m p l i c a t e d i n t h e d e g r a d a t i o n o f e x t r a c e l l u l a r m a t r i x d u r i n g c a n c e r c e l l i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s . B u t r e c e n t d a t a s u g g e s t t h a t M M P s m a y p l a y a m o r e c o m p l e x r o l e t h a n w a s o r i g i n a l l y t h o u g h t , a n d 3 0 8 t h e y m a y a l s o m a k e i m p o r t a n t c o n t r i b u t i o n s a t o t h e r s t e p s i n t u m o r d e v e l o p m e n t . M M P s c a n i n fl u e n c e t u m o r d e v e l o p m e n t a n d m a i n t a i n a n e n v i r o n m e n t t h a t s u p p o r t s t h e m a i n t e n a n c e o f g r o w t h o f b e n i g n a n d m a l i g n a n t t u m o r s . B l o c k i n g o r i n h i b i t i n g M M P s ( M M P - 3 , M M P - 7 a n d M M P - 1 1 ) l e d t o s i g n i fi c a n t r e d u c t i o n s i n t h e o n s e t a n d n u m b e r s o f t u m o r s ( N o e l e t a l . , 1 9 9 6 ; S t e m l i c h t e t a l . , 1 9 9 9 ; W i l s o n e t a l . , 1 9 9 7 ; W i t t y e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e m e c h a n i s m s b y w h i c h M M P s a r e a b l e t o p r o m o t e t u m o r d e v e l o p m e n t a r e n o t f u l l y u n d e r s t o o d . M M P s m a y s t i m u l a t e c e l l p r o l i f e r a t i o n b y r e l e a s i n g g r o w t h f a c t o r s d u r i n g e x t r a c e l l u l a r m a t r i x d e g r a d a t i o n o r b y a l t e r i n g c e l l z m a t r i x i n t e r a c t i o n s . I t w a s s u g g e s t e d t h a t M M P s m a y c o n t r i b u t e t o t u m o r m e t a s t a s i s s u b s e q u e n t t o t h e g r o w t h o f t h e p r i m a r y t u m o r ( W i t t y e t a l . , 1 9 9 4 ) a n d t h a t M M P s m a y p r o m o t e t h e e f f e c t s o f c a r c i n o g e n s a n d p r e - e x i s t i n g g e n e d e f e c t s ( S t e m l i c h t e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t a g e n t s t h a t c a n b l o c k o r i n h i b i t t h e a c t i o n o f M M P s m a y b e e f f e c t i v e i n i n h i b i t i n g e a r l y s t a g e s o f c a r c i n o g e n e s i s a n d c o u l d h a v e p o t e n t i a l c h e m o p r e v e n t i v e a b i l i t y . R W P E - l c e l l s a r e n o n - i n v a s i v e ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ) , h o w e v e r , t h e y e x p r e s s l a t e n t M M P - 9 a n d M M P - 2 . M y r e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t d e c r e a s e s t h e a c t i v i t y o f b o t h o f t h e s e p r o t e a s e s ( F i g u r e 9 - 2 ) a n d , t h e r e f o r e , m a y h a v e t h e a b i l i t y t o i n h i b i t o r b l o c k t h e d e v e l o p m e n t o f p r i m a r y t u m o r s . T h u s , t h e d e c r e a s e i n a c t i v i t y o f M M P - 9 a n d M M P - 2 u p o n c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t ( F i g u r e 9 — 2 ) w a r r a n t s fi i r t h e r i n v e s t i g a t i o n i n t o t h i s a g e n t i n a c h e m o p r e v e n t i v e s e t t i n g . W h e t h e r c h o l e c a l c i f e r o l i n h i b i t s M M P a c t i v i t y b y i n c r e a s i n g T I M P l e v e l s , w h i c h i n h i b i t M M P a c t i v i t y , o r b y d e c r e a s i n g l e v e l s o f M T - M M P s , w h i c h c a n a c t i v a t e M M P s ( C o r c o r a n e t a l . , 1 9 9 6 ; S t r o n g i n e t a l . , 1 9 9 5 ) w o u l d n e e d f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n . 3 0 9 T h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o fi l e o f a p r o s t a t e c e l l i s a g o o d i n d i c a t o r o f i t s d i f f e r e n t i a t i o n s t a t u s . C y t o k e r a t i n s a r e t h e s t a n d a r d m a r k e r s f o r e p i t h e l i a l c e l l o r i g i n . T h e e p i t h e l i a l o r i g i n o f t h e R W P E - l c e l l s w a s c o n fi r m e d p r e v i o u s l y b y e x p r e s s i o n o f c y t o k e r a t i n s 8 a n d 1 8 , u s i n g i m m u n o s t a i n i n g ( B e l l o e t a l . , 1 9 9 7 ) , w h i c h I s u b s t a n t i a t e d w i t h W e s t e r n b l o t a n a l y s i s ( d a t a n o t s h o w n ) . C a l c i t r i o l t r e a t m e n t d o e s n o t a f f e c t t h e e x p r e s s i o n o f c y t o k e r a t i n 1 8 i n p r i m a r y c u l t u r e s o f n o r m a l , B P H , a n d p r o s t a t e c a n c e r t i s s u e s ( P e e h l e t a l . , 1 9 9 4 ) . I o b s e r v e d s i m i l a r r e s u l t s w h e n R W P E - l c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h c h o l e c a l c i f e r o l ( d a t a n o t s h o w n ) . V i m e n t i n i s n o r m a l l y e x p r e s s e d i n c e l l s o f m e s e n c h y m a l o r i g i n b u t e p i t h e l i a l c e l l s i n c u l t u r e a n d r a p i d l y p r o l i f e r a t i n g e p i t h e l i a l c e l l s i n v i v o m a y a l s o e x p r e s s v i m e n t i n . I n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s , e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n s h o w s a n i n v e r s e r e l a t i o n s h i p w i t h d i f f e r e n t i a t i o n s t a t u s . P r o s t a t e c e l l s e x p r e s s i n g v i m e n t i n a r e m o r e l i k e l y t o b e a s s o c i a t e d w i t h p o o r l y d i f f e r e n t i a t e d t u m o r s ( L a n g e t a l . , 2 0 0 2 ) . W h e n c o m p a r e d t o c e l l s i n t h e a d j a c e n t n o r m a l e p i t h e l i u m , c e l l s i n b e n i g n p r o s t a t i c h y p e r p l a s i a ( B P H ) e x p r e s s s i g n i fi c a n t l y h i g h e r l e v e l s o f v i m e n t i n . I n n o r m a l p r o s t a t i c e p i t h e l i u m , ~ 2 % o f c e l l s e x p r e s s e d v i m e n t i n c o m p a r e d t o ~ 7 1 % o f c e l l s i n B P H ( F r a g a e t a l . , 2 0 0 2 ) . I t w a s s u g g e s t e d t h a t t h e d i f f e r e n c e i n p r o l i f e r a t i o n b e t w e e n B P H a n d n o r m a l t i s s u e s c a u s e s t h e d i f f e r e n c e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n , w i t h v i m e n t i n e x p r e s s i o n b e i n g d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o p r o l i f e r a t i v e a c t i v i t y . P I N , w h i c h a r e p r e c u r s o r s t o m a l i g n a n t p r o s t a t e c a n c e r , s h o w i n c r e a s e d c e l l p r o l i f e r a t i o n ( O ’ S h a u g h n e s s y e t a l . , 2 0 0 2 ) . V i m e n t i n e x p r e s s i o n i n n e o p l a s t i c e p i t h e l i a l c e l l s m a y b e r e l a t e d t o t u m o r p r o g r e s s i o n ( G i l l e s e t a l . , 1 9 9 6 ) . F r o m t h i s , i t i s r e a s o n a b l e t o s u g g e s t t h a t a g e n t s t h a t c a u s e a d e c r e a s e i n v i m e n t i n e x p r e s s i o n m a y h a v e c h e m o p r e v e n t i v e p o t e n t i a l b e c a u s e o f t h e i r a n t i - p r o l i f e r a t i v e a n d 3 1 0 p r o - d i f f e r e n t i a t i n g e f f e c t s ( Q u a d e r e t a l . , 2 0 0 1 ; W e b b e r e t a l . , 1 9 9 9 ) . M y r e s u l t s s h o w ( F i g u r e 9 - 3 ) t h a t c h o l e c a l c i f e r o l c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n t h e e x p r e s s i o n o f t h e i n t e r m e d i a t e fi l a m e n t p r o t e i n v i m e n t i n i n R W P E - I c e l l s . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t c h o l e c a l c i f e r o l h a s t h e a b i l i t y t o i n h i b i t p r o l i f e r a t i o n a n d i n d u c e d i f f e r e n t i a t i o n o f p r e - n e o p l a s t i c p r o s t a t e c e l l s b y d e c r e a s i n g v i m e n t i n e x p r e s s i o n , w h i c h m a y , i n p a r t , a c c o u n t f o r t h e o b s e r v e d g r o w t h i n h i b i t i o n o f t h e R W P E - l c e l l s . M o s t o f t h e b i o l o g i c a l e f f e c t s o f v i t a m i n D a r e m e d i a t e d v i a t h e v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) . T h e l e v e l o f V D R e x p r e s s i o n m a y b e a s s o c i a t e d w i t h t h e d e g r e e o f d i f f e r e n t i a t i o n o f h u m a n c a n c e r . T h e l o s s o f V D R e x p r e s s i o n c o r r e l a t e s w i t h l o s s o f d i f f e r e n t i a t i o n a n d p r o g r e s s i o n o f p r o s t a t e c a n c e r ( S h a b a h a n g e t a l . , 1 9 9 3 ) . M o s t p r o s t a t e c a n c e r s d e v e l o p i n t h e p e r i p h e r a l z o n e a n d a r e o f e p i t h e l i a l o r i g i n . T h e e x p r e s s i o n o f V D R , w h i c h i s t h e h i g h e s t i n t h e p e r i p h e r a l z o n e , s u g g e s t s t h a t p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s a r e t a r g e t c e l l s f o r v i t a m i n D ( K r i l l e t a l . , 2 0 0 1 ; M i l l e r e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t v i t a m i n D a n d i t s r e c e p t o r m i g h t b e i m p o r t a n t i n t h e c h e m o p r e v e n t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r . I n a d d i t i o n , R X R S a r e a l s o l i k e l y t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e c h e m o p r e v e n t i v e e f f e c t s v i t a m i n D f o r s e v e r a l r e a s o n s . F i r s t , R X R S f o r m h e t e r o d i m e r s w i t h V D R t o c a r r y o u t t h e t r a n s c r i p t i o n a l e f f e c t s o f v i t a m i n D . C a l c i t r i o l e n h a n c e s h e t e r o d i m e r f o r m a t i o n a n d t h e i r b i n d i n g t o V D R E S . S e c o n d , R X R S p r o m o t e n u c l e a r a c c u m u l a t i o n , l o c a l i z a t i o n a n d r e t e n t i o n o f u n b o u n d V D R ( P r u f e r a n d B a r s o n y , 2 0 0 2 ) . T h i r d , d e g r a d a t i o n o f R X R s r e d u c e s t h e s e n s i t i v i t y o f c e l l s t o a n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l ( P r u f e r e t a l . , 2 0 0 0 ) . S o f a r I h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t i n h i b i t s a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h , i n d u c e s d i f f e r e n t i a t i o n a n d i n h i b i t s p r o l i f e r a t i o n b y d o w n - r e g u l a t i n g 3 1 1 v i m e n t i n e x p r e s s i o n , a n d d e c r e a s e s t h e a c t i v i t y o f M M P - 9 a n d M M P - 2 , a l l i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . T o e x p l o r e p o s s i b l e m e c h a n i s m s o f a c t i o n , I e x a m i n e d t h e e x p r e s s i o n o f s e v e r a l n u c l e a r r e c e p t o r s a n d t h e i r m o d u l a t i o n i n r e s p o n s e t o t r e a t m e n t w i t h c h o l e c a l c i f e r o l . I m m u n o s t a i n i n g r e s u l t s ( F i g u r e 9 - 4 ) , c o n fi r m e d b y W e s t e r n b l o t a n a l y s i s ( F i g u r e 9 - 5 ) , d e m o n s t r a t e t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e s a d o s e - d e p e n d e n t u p - r e g u l a t i o n o f v i t a m i n D r e c e p t o r ( V D R ) , a n d a l l t h r e e i s o f o r m s o f r e t i n o i d X r e c e p t o r ( R X R - o r , - B , a n d 7 ) . A l t h o u g h V D R f o r m s h e t e r o d i m e r s w i t h a l l t h r e e R X R S , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t i t p r e f e r e n t i a l l y a s s o c i a t e s w i t h R X R - o r a n d R X R - y t o s t i m u l a t e t r a n s c r i p t i o n ( J i n e t a l . , 1 9 9 6 ; K e p h a r t e t a l . , 1 9 9 6 ) . T r e a t m e n t w i t h c h o l e c a l c i f e r o l c a u s e d a m a r k e d i n c r e a s e i n t h e e x p r e s s i o n o f R X R - a a n d R X R - y i n t h e n o n - t u m o r i g e n i c R W P E - l c e l l s , w h i l e t h e m a l i g n a n t R W P E 2 - W 9 9 c e l l s a p p e a r t o s h o w l o w e r e x p r e s s i o n o f b o t h R X R - o r a n d R X R - y , a n d n o o b v i o u s u p - r e g u l a t i o n R X R - y ( s e e F i g u r e s 8 - 6 & 8 - 7 , p g . 2 5 4 , 2 5 5 ) . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h s t u d i e s w h i c h s h o w t h a t e l e v a t e d l e v e l s o f R X R - a i n c r e a s e t h e s e n s i t i v i t y t o g r o w t h i n h i b i t i o n b y c a l c i t r i o l ( P r u f e r e t a l . , 2 0 0 2 ) , a n d d i s r u p t i o n o f R X R - o r r e s u l t s i n t h e d e v e l o p m e n t o f p r e - n e o p l a s t i c l e s i o n s i n t h e p r o s t a t e s o f m i c e ( H u a n g e t a l . , 2 0 0 2 ) . F u r t h e r m o r e , t h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h a n o b s e r v e d 2 t o 9 f o l d d e c r e a s e a n d l o s s o f n u c l e a r e x p r e s s i o n o f R X R - a i n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s c o m p a r e d t o n o r m a l p r o s t a t e c e l l s ( Z h o n g e t 1 a . , 2 0 0 3 ) . R X R - [ 3 w a s a l s o u p - r e g u l a t e d i n t h e R W P E - l c e l l s . H o w e v e r , t h e r e w a s n o d e t e c t a b l e e x p r e s s i o n o r u p - r e g u l a t i o n o f R X R - B i n t h e m a l i g n a n t R W P E 2 - W 9 9 c e l l s . T h e s e r e s u l t s m a y , i n p a r t , h e l p t o e x p l a i n w h y t h e g r o w t h o f R W P E - l c e l l s i s m o r e i n h i b i t e d b y c h o l e c a l c i f e r o l t h a n t h a t o f R W P E 2 - W 9 9 ( F i g u r e 9 - 1 ) . T h e s e r e s u l t s a l s o s u g g e s t t h a t a l o s s o f e x p r e s s i o n o f c e r t a i n R X R S , o r a d e c r e a s e 3 1 2 i n t h e i r e x p r e s s i o n l e v e l s , m a y b e a m a r k e r o f p r o s t a t e c a n c e r p r o g r e s s i o n a n d r e s t o r a t i o n o f t h e i r e x p r e s s i o n c o u l d p r o v e t o b e a n e f f e c t i v e c h e m o p r e v e n t i v e s t r a t e g y . I n c r e a s i n g V D R a n d R X R e x p r e s s i o n c o u l d i n c r e a s e t h e s e n s i t i v i t y o f c e l l s t o b o t h c h o l e c a l c i f e r o l a n d r e t i n o i d s , s u g g e s t i n g a r o l e f o r c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t s w i t h t h e s e t w o a g e n t s . N u m e r o u s s t u d i e s h a v e e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f c o m b i n a t i o n t h e r a p i e s u s i n g c a l c i t r i o l a n d r e t i n o i d s . W e h a v e f o u n d t h a t c o m b i n e d t r e a t m e n t w i t h c h o l e c a l c i f e r o l a n d N - ( 4 - h y d r o x y p h e n y l ) r e t i n a m i d e ( 4 - H P R ) , a s y n t h e t i c r e t i n o i d , r e s u l t e d i n a s y n e r g i s t i c i n h i b i t i o n o f g r o w t h o f R W P E - l c e l l s ( m a n u s c r i p t i n p r e p a r a t i o n ) , s u g g e s t i n g t h a t s u c h a c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t m a y h a v e c h e m o p r e v e n t i v e a b i l i t y . I t w i l l b e i n t e r e s t i n g t o s t u d y a n d c o m p a r e t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l o n t h e e x p r e s s i o n o f r e t i n o i c a c i d r e c e p t o r s ( R A R s ) , i n b o t h t h e R W P E - l a n d R W P E 2 - W 9 9 c e l l l i n e s . P r o s t a t e c a r c i n o g e n e s i s i s d r i v e n b y a n d r o g e n , t h e r e f o r e t h e a n d r o g e n r e c e p t o r i s a p r i m e t a r g e t f o r c h e m o p r e v e n t i o n . S t u d i e s h a v e s h o w n a p o s s i b l e c r o s s - t a l k b e t w e e n V D R a n d A R ( A h o n e n e t a l . , 2 0 0 0 b ) . M y r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e d a n u p - r e g u l a t i o n i n a n d r o g e n r e c e p t o r e x p r e s s i o n i n R W P E - l c e l l s ( F i g u r e 9 - 5 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e i n c r e a s e d l e v e l s o f A R t h a t r e s u l t f r o m c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t r e p r e s e n t a m o r e d i f f e r e n t i a t e d p h e n o t y p e . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t c h o l e c a l c i f e r o l m a y e x e r t s o m e o f i t s c h e m o p r e v e n t i v e e f f e c t s i n d i r e c t l y b y t h e i n d u c t i o n o f d i f f e r e n t i a t i o n , a s i n d i c a t e d b y u p - r e g u l a t i o n o f A R . P S A i s a u s e f u l t o o l f o r p r o s t a t e c a n c e r d e t e c t i o n . I t i s s e c r e t e d b y d i f f e r e n t i a t e d l u m i n a l , s e c r e t o r y c e l l s o f t h e p r o s t a t i c e p i t h e l i u m . M y r e s u l t s s h o w ( F i g u r e 9 - 6 ) t h a t c h o l e c a l c i f e r o l t r e a t m e n t c a u s e s 3 1 3 a d o s e - d e p e n d e n t i n c r e a s e i n P S A e x p r e s s i o n i n R W P E - l c e l l s . T h e s e d a t a f u r t h e r d e m o n s t r a t e t h a t c h o l e c a l c i f e r o l i n d u c e s d i f f e r e n t i a t i o n i n t h e R W P E - l c e l l l i n e . I n o r d e r t o c o m p a r e t h e e f fi c a c i e s o f c h o l e c a l c i f e r o l w i t h t h a t o f c a l c i t r i o l , s e v e r a l a s s a y s w e r e a l s o c o n d u c t e d u s i n g c a l c i t r i o l . C h o l e c a l c i f e r o l s h o w e d v e r y s i m i l a r r e s u l t s t o t h o s e o b t a i n e d u s i n g c a l c i t r i o l t r e a t e d c e l l s ( F i g u r e s 9 - 1 , 9 - 2 , 9 - 5 a n d 9 - 8 ) . I n a l l a s s a y s s t u d i e d , t h e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l a p p e a r t o o c c u r a t a p p r o x i m a t e l y a 3 t o 1 0 f o l d l o w e r c o n c e n t r a t i o n t h a n c h o l e c a l c i f e r o l . B a s e d o n t h e r e s u l t s o n V D R , w h i c h i s s i m i l a r l y u p - r e g u l a t e d b y b o t h a g e n t s , t h e e f f e c t s o f c h o l e c a l c i f e r o l a n d c a l c i t r i o l a p p e a r t o b e r e c e p t o r - m e d i a t e d . T h e c o n c e n t r a t i o n s u s e d f o r b o t h a g e n t s w e r e w i t h i n t h e i r r e s p e c t i v e n o r m a l p h y s i o l o g i c a l l e v e l s . T h e n o r m a l p h y s i o l o g i c a l r a n g e o f c a l c i t r i o l i s 0 . 1 n M ( 1 0 ' ' 0 M ) t o 1 n M ( 1 0 ' 9 M ) c o m p a r e d t o 0 . 0 1 p M ( 1 0 ' 8 M ) t o 0 . 1 p M ( 1 0 2 7 M ) f o r c h o l e c a l c i f e r o l ( F r i e d r i c h 1 9 8 8 ; S c h w a r t z e t a l . , 1 9 9 7 ) ( T a b l e 9 - 1 ) . T a b l e 9 - 1 : N o r m a l p h y s i o l o g i c a l a n d p h a r m a c o l o g i c a l l e v e l s a n d h a l f l i v e s o f t h e t h r e e m a j o r v i t a m i n D m e t a b o l i t e s . P h y s i o l o g i c a l P h a r m a c o l o g i c a l H a l f L i f e L e v e l s L e v e l s C h o l e c a l c i f e r o l 1 0 ' 8 M — 1 0 ' 7 M ( 1 0 ' 5 M ) ? 4 - 7 d a y s 2 5 0 H D 3 1 0 ' 8 M — 1 0 ' 7 M ( 1 0 ‘ 5 M ) ? 3 - 4 w e e k s C a l c i t r i o l 1 0 ' ' 0 M — - 1 0 ' 9 M 1 0 ' 7 M 1 - 8 h o u r s T h e “ ? ” i n d i c a t e s e s t i m a t e d l e v e l b a s e d o n k n o w n p h y s i o l o g i c a l a n d p h a r m a c o l o g i c a l l e v e l s f o r c a l c i t r i o l . 3 1 4 S e v e r a l r e a s o n s c o u l d e x p l a i n w h y 3 t o 1 0 f o l d h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s w e r e n e e d e d f o r c h o l e c a l c i f e r o l t o o b t a i n s i m i l a r r e s u l t s a s c a l c i t r i o l . F i r s t , i f t h e o b s e r v e d c h o l e c a l c i f e r o l e f f e c t s a r e d u e t o i t s c o n v e r s i o n t o c a l c i t r i o l , t h e n i t m u s t b e fi r s t m e t a b o l i z e d t o 2 5 0 H D 3 a n d t h e n t o c a l c i t r i o l . S e c o n d , t h e 2 4 - h y d r o x y l a s e e n z y m e c o u l d c o n v e r t 2 5 0 H D 3 t o 2 4 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 o r c a l c i t r i o l [ 1 , 2 5 ( O H ) 2 D 3 ] t o 1 , 2 4 , 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 . T h i r d , s o m e o f t h e c h o l e c a l c i f e r o l i s c o n v e r t e d t o 2 5 0 H D 3 , w h i c h b i n d s t o V D R t o c a r r y o u t i t s e f f e c t s , w h i l e t h e r e m a i n i n g c h o l e c a l c i f e r o l g o e s t h r o u g h t h e s u b s e q u e n t h y d r o x y l a t i o n t o f o r m c a l c i t r i o l . 2 5 0 H D 3 , l i k e c h o l e c a l c i f e r o l , h a s a m u c h l o w e r b i n d i n g a f fi n i t y f o r V D R c o m p a r e d t o t h a t o f c a l c i t r i o l ( B a r r e t o e t a l . , 2 0 0 0 ) . A n d fi n a l l y , c o m p a r e d t o c a l c i t r i o l , c h o l e c a l c i f e r o l h a s a m u c h l o w e r b i n d i n g a f fi n i t y f o r V D R , t h e r e f o r e , h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f c h o l e c a l c i f e r o l w o u l d b e n e e d e d t o s e e e f f e c t s s i m i l a r t o t h o s e o f c a l c i t r i o l . O t h e r p o s s i b l e e x p l a n a t i o n s , t h a t w o u l d n e e d f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n , a r e h o w R X R S a n d / o r R A R s a f f e c t t h e m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f c h o l e c a l c i f e r o l , a n d t h a t c h o l e c a l c i f e r o l m a y w o r k t h r o u g h m e c h a n i s m s o t h e r t h a n V D R ( n o n - g e n o m i c p a t h w a y s ) . C o n c l u s i o n s I n c o n c l u s i o n , I h a v e s h o w n t h a t t h e n o n - t u m o r i g e n i c R W P E - l h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s e x p r e s s t h e 2 5 - h y d r o x y l a s e ( C Y P 2 7 A 1 ) p r o t e i n n e c e s s a r y f o r t h e c o n v e r s i o n o f c h o l e c a l c i f e r o l t o 2 5 0 H D 3 . T h i s i s t h e fi r s t r e p o r t e d e v i d e n c e o f t h e p r e s e n c e o f t h i s e n z y m e i n h u m a n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s . C o u p l e d w i t h p r e v i o u s e v i d e n c e t h a t p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s a l s o e x p r e s s l a - h y d r o x y l a s e e n z y m e , t h i s s h o w s t h a t p r o s t a t e e p i t h e l i a l c e l l s h a v e t h e a b i l i t y t o l o c a l l y p r o d u c e t h e b i o l o g i c a l l y a c t i v e 3 1 5 c a l c i t r i o l f r o m c h o l e c a l c i f e r o l . T h e r e f o r e , c h o l e c a l c i f e r o l c o u l d b e a n e f f e c t i v e c h e m o p r e v e n t i v e a g e n t f o r p r o s t a t e c a n c e r . I n s u p p o r t o f t h i s , m y r e s u l t s s h o w t h a t c h o l e c a l c i f e r o l , i n t h e p h y s i o l o g i c a l r a n g e , c a n : i ) i n h i b i t a n c h o r a g e - d e p e n d e n t g r o w t h ; i i ) i n d u c e d i f f e r e n t i a t i o n b y d e c r e a s i n g v i m e n t i n e x p r e s s i o n a n d i n c r e a s i n g P S A s y n t h e s i s ; a n d i i i ) u p - r e g u l a t e V D R , R X R - 0 L , R X R - B , R X R - y , a n d A R , i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . W h e t h e r c h o l e c a l c i f e r o l e x e r t s t h e s e e f f e c t s b y a c t i n g d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y w i t h t h e V D R , a n d t h r o u g h t h e s a m e m e c h a n i s m s a s c a l c i t r i o l , r e m a i n s t o b e e l u c i d a t e d . H o w e v e r , t h e s i m i l a r i t i e s b e t w e e n t h e e f f e c t s o f t h e s e t w o f o r m s o f v i t a m i n D , i n t h i s a n d t h e p r e v i o u s c h a p t e r , s u g g e s t t h a t c h o l e c a l c i f e r o l a n d c a l c i t r i o l e x e r t t h e i r e f f e c t s t h r o u g h t h e s a m e , o r s i m i l a r , m e c h a n i s m s . B a s e d o n t h e s e r e s u l t s , c h o l e c a l c i f e r o l a p p e a r s t o h a v e m u c h p o t e n t i a l a s a c h e m o p r e v e n t i v e a n d c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t . D i e t a r y c o m p o u n d s , s u c h a s c h o l e c a l c i f e r o l ( v i t a m i n D 3 ) , a r e o f p a r t i c u l a r i n t e r e s t b e c a u s e t h e y a r e r e a d i l y a v a i l a b l e t o t h e p u b l i c a t l o w c o s t a n d t h e y a r e e x p e c t e d t o b e s a f e f o r l o n g - t e r m a d m i n i s t r a t i o n t o h e a l t h y p e o p l e f o r c h e m o p r e v e n t i o n . O n e g r a m o f c h o l e c a l c i f e r o l c o s t s $ 3 6 , c o m p a r e d t o a p p r o x i m a t e l y $ 5 6 , 0 0 0 a n d $ 4 , 0 0 0 , 0 0 0 , r e s p e c t i v e l y , f o r 1 g r a m o f 2 5 0 H D 3 a n d c a l c i t r i o l ( S i g m a C a t a l o g , S t . L o u i s , M O ) . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s a r e n e e d e d i n t o t h e p a t h w a y s a n d m e c h a n i s m s s h a r e d b y c a l c i t r i o l a n d c h o l e c a l c i f e r o l i n t h e p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r . 3 1 6 R e f e r e n c e s A h o n e n , M . H . , T e n k a n e n , L . , T e p p o , L . , H a k a m a , M . , a n d T u o h i m a a , P . : P r o s t a t e c a n c e r r i s k a n d p r e d i a g n o s t i c s e r u m o f 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D l e v e l s ( F i n l a n d ) . C a n c e r C a u s e s & C o n t r o l , 1 I : 8 4 7 - 8 5 2 , 2 0 0 0 a . A h o n e n , M . H . , Z h u a n g , Y . H . , A i n e , R . , Y l i k o m i , T . , a n d T u o h i m a a , P . : A n d r o g e n r e c e p t o r a n d v i t a m i n D r e c e p t o r i n h u m a n o v a r i a n c a n c e r : g r o w t h s t i m u l a t i o n a n d i n h i b i t i o n b y l i g a n d s . I n t . J . C a n c e r , 8 6 : 4 0 - 4 6 , 2 0 0 0 b . B a r a n , D . T . , Q u a i l , J . M . , R a y , R . , L e s z y k , J . , a n d H o n e y m a n , T . : A n n e x i n I I i s t h e m e m b r a n e r e c e p t o r t h a t m e d i a t e s r a p i d a c t i o n s o f 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . J . C e l l B i o c h e m . , 7 8 2 3 4 - 4 6 , 2 0 0 0 . B a r r e t o , A . M . , S c h w a r t z , G . G . , W o o d r u f f , R . , a n d C r a m e r , S . D . : 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 , t h e p r o h o r m o n e o f 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 , i n h i b i t s t h e p r o l i f e r a t i o n o f p r i m a r y p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s . C a n c e r E p i d e m i o l . B i o m a r k e r s P r e v . , 9 : 2 6 5 - 2 7 0 , 2 0 0 0 . B e e r , T M . a n d M y r t h u e , A . : C a l c i t r i o l i n c a n c e r t r e a t m e n t : f r o m t h e l a b t o t h e c l i n i c . M o l . C a n c e r T h e r . , 3 : 3 7 3 - 3 8 1 , 2 0 0 4 . B e l l o , D . , W e b b e r , M . M . , K l e i n m a n , H . K . , W a r t i n g e r , D D , a n d R h i m , J . S . : A n d r o g e n r e s p o n s i v e a d u l t h u m a n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l l i n e s i m m o r t a l i z e d b y h u m a n p a p i l l o m a s v i r u s 1 8 . C a r c i n o g e n e s i s , 1 8 : 1 2 1 5 - 1 2 2 3 , 1 9 9 7 . B i k l e , D . D . , N e m a n i c , M . L . , W h i t n e y , J . O . , a n d E l i a s , P . W . : N e o n a t a l h u m a n f o r e s k i n k e r a t i n o c y t e s p r o d u c e 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . B i o c h e m i s t r y , 2 5 : 1 5 4 5 - 1 5 4 8 , 1 9 8 6 . B l u t t , S E . a n d W e i g e l , N . L . : V i t a m i n D a n d p r o s t a t e c a n c e r . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . , 1 2 2 : 8 9 - 9 8 , 1 9 9 9 . C h e n , T . C . , P e r s o n s , K . S . , L u . Z . , M a t h i e u , J . S . , a n d H o l i c k , M . F . : A n e v a l u a t i o n o f t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f v i t a m i n D r e c e p t o r b i n d i n g a f fi n i t y o f t h e p h o t o i s o m e r s o f v i t a m i n D 3 a n d p r e v i t a m i n D 3 . J . N u t r . B i o c h e m . , 1 1 : 2 7 6 - 2 7 2 , 2 0 0 0 . C o r c o r a n , M . L . , H e w i t t , R . B . , K l e i n e r , D E , a n d S t e t l e r - S t e v e n s o n , W . J . : M M P - 2 : e x p r e s s i o n , a c t i v a t i o n a n d i n h i b i t i o n . E n z y m e P r o t . , 4 9 : 7 - 1 9 , 1 9 9 6 . C u l i g , Z . , H o b i s c h , A . , C r o n a u e r , M . V . , R a d m a y r , C . , H i t t m a i r , A . , Z h a n d , J . , T h u m h e r , M . , B a r t s c h , G . , a n d K l o c k e r , H . 2 R e g u l a t i o n o f p r o s t a t i c g r t h a n d fi m c t i o n b y p e p t i d e g r o w t h f a c t o r s . T h e P r o s t a t e , 2 8 : 3 9 2 - 4 0 5 , 1 9 9 6 . D a n i e l p o u r , D . : I n d u c t i o n o f t r a n s f o r m i n g g r t h f a c t o r - B a u t o c r i n e a c t i v i t y b y a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d a n d l a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n N R P - 1 5 2 r a t p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s . J . C e l l . B i o l . , 1 6 6 : 2 3 1 - 2 3 9 , 1 9 9 6 . 3 1 7 F r a g a , C . H . , T r u e , L . D . , a n d K i r k , D . : E n h a n c e d e x p r e s s i o n o f t h e m e s e n c h y m a l m a r k e r , v i m e n t i n , i n h y p e r p l a s t i c v e r s u s n o r m a l h u m a n p r o s t a t e e p i t h e l i u m . J . U r o l . , 1 5 9 : 2 7 0 - 2 7 4 , 1 9 9 8 . F r i e d r i c h , W . : V i t a m i n D . I n : F r i e d r i c h , W . : “ V i t a m i n s ” N e w Y o r k , d e G r u y t e r , p p . 1 4 3 - 2 1 8 , 1 0 5 8 p p . , 1 9 8 8 . G i l l e s , C . , P o l e t t e , M . , P i e t t e , J . , D e l v i g n e , A - C . , T h o m p s o n , E . W . , F o i d a r t , J - M . , a n d B i r e m b a u t , P . : V i m e n t i n e x p r e s s i o n i n c e r v i c a l c a r c i n o m a s : a s s o c i a t i o n w i t h i n v a s i v e a n d m i g r a t o r y p o t e n t i a l . J . P a t h , 1 8 0 2 1 7 5 - 1 8 0 , 1 9 9 6 . G r o s s , C . , S k o w r o n s k i , R . J . , P l y m a t e , S . R . , R h i m , J . S . , P e e h l , D . M . a n d F e l d m a n , D . : S i m i a n v i r u s 4 0 - , b u t n o t h u m a n p a p i l l o m a s v i r u s - , t r a n s f o r m a t i o n o f p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s r e s u l t s i n l o s s o f g r o w t h - i n h i b i t i o n b y 1 , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . I n t . J . O n c o l . , 8 2 4 1 - 4 7 , 1 9 9 6 . G u z e y , M . , K i t a d a , S . , a n d R e e d , J . C . : A p o p t o s i s i n d u c t i o n b y l a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n p r o s t a t e c a n c e r . M o l . C a n c e r T h e r a p . , 1 : 6 6 7 - 6 7 7 , 2 0 0 2 . H o l i c k , M . F . : V i t a m i n D : T h e u n d e r a p p r e c i a t e d D - l i g h t f u l h o r m o n e t h a t i s i m p o r t a n t f o r s k e l e t a l a n d c e l l u l a r h e a l t h . C u r r . O p i n . E n d o c r i n o l . D i a b e t e s , 9 : 8 7 - 9 8 , 2 0 0 2 . H o l i c k , M . F . : V i t a m i n D : a m i l l e n n i u m p e r s p e c t i v e . J . C e l l . B i o c h e m . , 8 8 2 2 9 6 - 3 0 7 , 2 0 0 3 . H o n g , W . K . a n d S p o m , M . B . 2 R e c e n t a d v a n c e s i n c h e m o p r e v e n t i o n o f c a n c e r . S c i e n c e , 2 7 8 : 1 0 7 3 - 1 0 7 7 , 1 9 9 7 . H s u , J . Y . , F e l d m a n , D . , M c N e a l , J . E . , a n d P e e h l , D . M . : R e d u c e d l a - h y d r o x y l a s e a c t i v i t y i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s c o r r e l a t e s w i t h d e c r e a s e s u s c e p t i b i l i t y t o 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 - i n d u c e d g r o w t h i n h i b i t i o n . C a n c e r R e s . , 6 1 : 2 8 5 2 - 2 8 5 6 , 2 0 0 1 . H u a n g , J . , P o w e l l , W . C . , K h o d a v i r d i , A . C . , W u , J . , M a k i t a , T . , C a r d i f f , R . D . , C o h e n , M . B . , S u c o v , H . M . , a n d R o y - B u m a m , P . : P r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a i n m i c e w i t h c o n d i t i o n a l d i s r u p t i o n o f t h e r e t i n o i d C r e c e p t o r a l p h a a l l e l e i n t h e p r o s t a t e e p i t h e l i u m . C a n c e r R e s . , 6 2 : 4 8 1 2 - 4 8 1 9 , 2 0 0 2 . J i n , C . H . , K e m e r , S . A . , H o n g , M . H . , a n d P i k e , J . W . : T r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n a n d d i m e r i z a t i o n f u n c t i o n s i n t h e h u m a n v i t a m i n D r e c e p t o r . M o l . E n d o c r i n o l . , 1 0 : 9 4 5 - 9 5 7 , 1 9 9 6 . K e p h a r t , D . D . , W a l fi s h , P . G . , D e L u c a , H . a n d B u t t , T . R . : R e t i n o i d X r e c e p t o r i s t o y p e i d e n t i t y d i r e c t s h u m a n v i t a m i n D r e c e p t o r h e t e r o d i m e r t r a n s a c t i v a t i o n f r o m t h e 2 4 - h y d r o x y l a s e v i t a m i n D r e s p o n s e e l e m e n t i n y e a s t . M o l . E n d o c r i n o l . , 1 0 : 4 0 8 - 4 1 9 , 1 9 9 6 . 3 1 8 K i m , Y . S . , M a c D o n a l d , P . N . , D e d h a r , S . , a n d H r u s k a , K . A . : A s s o c i a t i o n o f l a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 - o c c u p i d e d v i t a m i n D r e c e p t o r s w i t h c e l l u l a r m e m b r a n e a c c e p t a n c e s i t e s . E n d o c r i n o l o g y , 1 3 7 : 3 6 4 9 - 3 6 5 8 , 1 9 9 6 . K r i l l , D . , D e F l a v i a , P . , D h i r , R . , L u o , J . , B e c i c h , M . J . , L e h m a n , E . , a n d G e t z e n b e r g , R . H . : E x p r e s s i o n p a t t e r n s o f v i t a m i n D r e c e p t o r i n h u m a n p r o s t a t e . J . C e l l . B i o c h e m . , 8 2 : 5 6 6 - 5 7 2 , 2 0 0 1 . K r i s h n a n , A . V . , P e e h l , D . M . , a n d F e l d m a n , D . : I n h i b i t i o n o f p r o s t a t e c a n c e r g r o w t h b y v i t a m i n D : r e g u l a t i o n o f t a r g e t g e n e e x p r e s s i o n . J . C e l l . B i o c h e m . , 8 8 : 3 6 3 - 3 7 1 , 2 0 0 3 . L a n g , S . H . , H y d e , 0 , R e i d , I . N . , H i t c h c o c k , I . S . , H a r t , C . A . , B r y d e n , A . A . , V i l l e t t e , J - M , S t o w e r , M . J . , a n d M a i t l a n d , N . J . : E n h a n c e d e x p r e s s i o n o f v i m e n t i n i n m o t i l e p r o s t a t e c e l l l i n e s i n p o o r l y d i f f e r e n t i a t e d a n d m e t a s t a t i c p r o s t a t e c a r c i n o m a . T h e P r o s t a t e , 5 2 : 2 5 3 - 2 6 3 , 2 0 0 2 . L e h m a n , B . , T i e b e l , 0 . , M e u r e r , M . : E x p r e s s i o n o f v i t a m i n D 3 2 5 - h y d r x y l a s e ( C Y P 2 7 ) m R N A a f t e r i n d u c t i o n b y v i t a m i n D 3 o r U V B r a d i a t i o n i n k e r a t i n o c y t e s o f h u m a n s k i n e q u i v a l e n t s — a p r e l i m i n a r y s t u d y . A r c h . D e r m a t o l . , R e s . , 2 9 1 : 5 0 7 - 5 1 0 , 1 9 9 9 . L i p p m a n , S . M . , L e e , 1 . 1 . , a n d S a b i c h i , A . L . : C a n c e r c h e m o p r e v e n t i o n : p r o g r e s s a n d p r o m i s e . J . N a t . C a n c e r I n s t , 9 0 : 1 5 1 4 - 1 5 2 8 , 1 9 9 8 . M a n g e l s d o r f , D . J . , T h u m m e l , C . , B e a t o , M . , H e r r l i c h , P . , S c h u t z , G . , U m e s o n o , K . , B l u m b e r g , B . , K a s t n e r , R , M a r k , M . , C h a m b o n , P . , a n d E v a n s , R . M . : T h e n u c l e a r r e c e p t o r s u p e r f a m i l y : t h e s e c o n d d e c a d e . C e l l , 8 3 : 8 3 5 - 8 3 9 , 1 9 9 5 . M i l l e r , G . J . , S t a p l e t o n , G . E . , F e r r a r a , J . A . , L u c i a , M . S . , P fi s t e r , S . , H e d l u n d , T . E . , a n d U p a d h y a , P . : T h e h u m a n p r o s t a t e c a r c i n o m a c e l l l i n e L N C a P e x p r e s s e s b i o l o g i c a l l y a c t i v e , s p e c i fi c r e c e p t o r s f o r l a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 . C a n c e r R e s . , 5 2 : 5 1 5 - 5 2 0 , 1 9 9 2 . M i l l e r , G . J . , S t a p l e t o n , G . E . , H e d l u n d , T . E . , a n d M o f f a t , K . A . : V i t a m i n D r e c e p t o r e x p r e s s i o n , 2 4 - h y d r o x y l a s e a c t i v i t y , a n d i n h i b i t i o n o f g r o w t h b y l a l p h a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n s e v e n h u m a n p r o s t a t i c c a r c i n o m a c e l l l i n e s . C l i n . C a n c e r R e s . , 1 : 9 9 7 - 1 0 0 3 , 1 9 9 5 . M i n g h e t t i , R P . a n d N o r m a n , A . W . : l , 2 5 ( O H ) 2 - v i t a m i n D 3 r e c e p t o r s : g e n e r e g u l a t i o n a n d g e n e t i c c i r c u i t r y . F A S E B J , 2 : 3 0 4 3 - 3 0 5 3 , 1 9 8 8 . M u r t h y , S . a n d W e i g e l , N . L . : 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n d u c e d g r o w t h i n h i b i t i o n o f P C — 3 p r o s t a t e c a n c e r c e l l s r e q u i r e s a n a c t i v e t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a s i g n a l i n g p a t h w a y . T h e P r o s t a t e , 5 9 : 2 8 2 - 2 9 1 , 2 0 0 4 . 3 1 9 N e m e r e , 1 . , Z h o u , L . X . , a n d N o r m a l , A . W . : N o n t r a n s c r i p t i o n a l e f f e c t s o f s t e r o i d h o r m o n e s . R e c e p t o r s , 3 : 2 7 7 - 2 9 1 , 1 9 9 3 . N o e l , A . C . , L e f e b v r e , O . , M a q u o i , E . , V a n H o o r d e , L . , C h e n a r d , M . P . , M a r e e l , M . , F o i d a r t , J . M . , B a s s e t , P . , a n d R i o , M . C . 2 S t r o m e l y s i n - 3 e x p r e s s i o n p r o m o t e s t u m o r t a k e i n n u d e m i c e . J . C l i n . , I n v e s t , 9 7 2 1 9 2 4 - 1 9 3 0 , 1 9 9 6 . O s b o r n e , J . E . a n d H u t c h i n s o n , P . E . : V i t a m i n D a n d s y s t e m i c c a n c e r : i s t h i s r e l e v a n t t o m a l i g n a n t m e l a n o m a ? B r . J . D e r m a t o l . , 1 4 7 : 1 9 7 — 2 1 3 , 2 0 0 2 . O ’ S h a u g h n e s s y , J . A . , K e l l o f , G . J . , G o r d o n , G . B . , D a n n e n b e r g , A . J . , H o n g , W . K . , F a b i a n , C . J . , S i g m a n , C . C . , B e r t a g n o l l i , M . M . , S t r a t t o n , S . P . , L a m , 8 . , N e l s o n , W . G . , M e y s k e n s , F . L . , A l b e r t s , D . S . , F o l l e n , M . , R u s t g i , A . K . , P a p a d i m i t r a k o p o u l o u , V . , S c a r d i n o , P . T . , G a z d a r , A . F . , W a t t e n b e r g , L . W . , S p o r n , D . G . , S a k r , W . A . , L i p p m a n , S . M . , a n d V o n H o f f , D . D . : T r e a t m e n t a n d p r e v e n t i o n o f i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a : A n i m p o r t a n t t a r g e t f o r a c c e l e r a t e d n e w a g e n t d e v e l o p m e n t . C l i n . C a n c e r R e s . , 8 : 3 1 4 - 3 4 6 , 2 0 0 2 . P e e h l , D . M . , S k o w r o n s k i , R . J . , L e u n g , G . K . , W o n g , S . T . , S t a m e y , T . A . , a n d F e l d m a n , D . : A n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s o f l , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 o n p r i m a r y c u l t u r e s o f h u m a n p r o s t a t i c c e l l s . C a n c e r R e s . , 5 4 : 8 0 5 - 8 1 0 , 1 9 9 4 . P o l e k , T C . a n d W e i g e l , N . L . : V i t a m i n D a n d p r o s t a t e c a n c e r . J . A n d r o l . , 2 3 : 9 - 1 7 , 2 0 0 2 . P r u f e r , K . , R a c z , A . , L i n , G . C . , B a r s o n y , J . : D i m e r i z a t i o n w i t h r e t i n o i d X r e c e p t o r s p r o m o t e s n u c l e a r l o c a l i z a t i o n a n d s u b n u c l e a r t a r g e t i n g o f v i t a m i n D r e c e p t o r s . J . B i o l . C h e m . , 2 7 5 : 4 1 1 1 4 - 4 1 1 2 3 , 2 0 0 0 . P r u f e r , K . a n d B a r s o n y , J . : R e t i n o i d X r e c e p t o r d o m i n a t e s t h e n u c l e a r i m p o r t a n d e x p o r t o f t h e u n l i g a n d e d v i t a m i n D r e c e p t o r . M o l . E n d o c r i n o l . , 1 6 : 1 7 3 8 - 1 7 5 1 , 2 0 0 2 . P r u f e r , K . , S c h r o d e r , C . , H e g y i , K . , a n d B a r s o n y , J . : D e g r a d a t i o n o f R X R S i n fl u e n c e s s e n s i t i v i t y o f r a t o s t e o s a r c o m a c e l l s t o t h e a n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s o f c a l c i t r i o l . M o l . E n d o c r i n o l . , 1 6 : 9 6 1 - 9 7 6 , 2 0 0 2 . Q u a d e r , S . T . A . , B e l l o - D e O c a m p o , D . , W i l l i a m s , D . E . , K l e i n m a n , H . K . , a n d W e b b e r , W . W . : E v a l u a t i o n o f t h e c h e m o p r e v e n t i v e p o t e n t i a l o f r e t i n o i d s u s i n g a n o v e l i n v i t r o h u m a n p r o s t a t e c a r c i n o g e n e s i s m o d e l . M u t . R e s . , 4 9 6 : 1 5 3 - 1 6 1 , 2 0 0 1 . S a k r , W . A . , H a a s , G . P . , C a s s i n , B . F . , P o n t e s , J . E . , a n d C r i s s m a n , J . D . 2 T h e f r e q u e n c y o f c a r c i n o m a a n d i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a o f t h e p r o s t a t e i n y o u n g m a l e p a t i e n t s . J . U r o l . , 1 5 0 : 3 7 9 - 3 8 5 , 1 9 9 3 . S a k r , W . A . , B i l l i s , A . , E k m a n , P . , W i l t , T . , a n d B o s t w i c k , D . G . : E p i d e m i o l o g y o f h i g h - g r a d e p r o s t a t i c i n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s i a . S c a n d . J . U r o l . N e p h r o l . , 2 0 5 ( S u p p l ) : 1 1 - 1 8 , 2 0 0 0 . 3 2 0 S c h w a r t z , G . G . a n d H u l k a , 8 . 8 . : I s v i t a m i n D d e fi c i e n c y a r i s k f a c t o r f o r p r o s t a t e c a n c e r ? ( H y p o t h e s i s ) . A n t i c a n c e r R e s . , 1 0 : 1 3 0 7 - 1 3 1 2 , 1 9 9 0 . S c h w a r t z , G . G . , W a n g , M - H . , Z h a n g , M . , S i n g h , R . K . , a n d S i e g a l , G . P . : l o r , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 ( c a l c i t r i o l ) i n h i b i t s t h e i n v a s i v e n e s s o f h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s . C a n c e r E p i d e m i o l . B i o m a r k e r s P r e v . , 6 : 7 2 7 - 7 3 2 , 1 9 9 7 . S c h w a r t z , G . G . , W h i t l a c h , L . W . , C h e n , T . C . , L o k e s h w a r , B L , a n d H o l i c k , M . F . 2 H u m a n p r o s t a t e c e l l s s y n t h e s i z e l , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 f r o m 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D 3 . C a n c e r E p i d e m i o l . B i o m a r k e r s P r e v . , 7 : 3 9 1 - 3 9 5 , 1 9 9 8 . S h a b a h a n g , M . , B u r a s , R . R . , D a v o o d i , F . , S c h u m a k e r , L . M . , N a u t a , R . J . , a n d E v a n s , S . R . T . : l , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 r e c e p t o r a s a m a r k e r o f h u m a n c o l o n c a r c i n o m a c e l l l i n e d i f f e r e n t i a t i o n a n d g r o w t h i n h i b i t i o n . C a n c e r R e s . , 5 3 : 3 7 1 2 - 3 7 1 8 , 1 9 9 3 . S k o w r o n s k i , R . J . , P e e h l , D . M . , a n d F e l d m a n , D : V i t a m i n D a n d p r o s t a t e c a n c e r : l , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 r e c e p t o r s a n d a c t i o n s i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e s . E n d o c r i n o l o g y , 1 3 2 : 1 9 5 2 - 1 9 6 0 , 1 9 9 3 . S t e m l i c h t , M . D . , L o c h t e r , A . , S y m p s o n , C . J . , H u e y , B . , R o u g i e r , J . P . , G r a y , J . W . , P i n k e l , D . , B i s s e l l , M . J . , a n d W e r b , Z . : T h e s t r o m a l p r o t e i n a s e M M P - 3 / s t r o m e 1 y s i n - l p r o m o t e s m a m m a r y g l a n d c a r c i n o g e n e s i s . C e l l , 9 8 : 1 3 7 - 1 4 6 , 1 9 9 9 . S t r o n g i n , A . Y . , C o l l i e r , I . , B a n n i k o v , G . , M a n n e r , B . L . , G r a n t , G . A . , a n d G o l d b e r g , G . I . : M e c h a n i s m o f c e l l s u r f a c e a c t i v a t i o n o f 7 2 - k D a t y p e I V c o l l a g e n a s e . I s o l a t i o n o f t h e a c t i v a t e d f o r m o f t h e m e m b r a n e m e t a l l o p r o t e a s e . J . B i o l . C h e m , 2 7 0 2 5 3 3 1 - 5 3 3 8 , 1 9 9 5 . W e b b e r , M . M . , B e l l o , D . , K l e i n m a n , H . K . , a n d H o f f m a n , M . : A c i n a r d i f f e r e n t i a t i o n b y n o n - m a l i g n a n t i m m o r t a l i z e d h u m a n p r o s t a t i c e p i t h e l i a l c e l l s a n d i t s l o s s b y m a l i g n a n t c e l l s , C a r c i n o g e n e s i s , 1 8 : 1 2 2 5 - 1 2 3 1 , 1 9 9 7 . W e b b e r , M . M . , B e l l o - D e O c a m p o , D . , Q u a d e r , S . , D e O c a m p o , N . D . , M e t c a l f e , W . S . , a n d S h a r p , R . M . : M o d u l a t i o n o f t h e m a l i g n a n t p h e n o t y p e o f h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s b y N - ( 4 - h y d r o x y p h e n y l ) r e t i n a m i d e ( 4 - H P R ) . C l i n . E x p . M e t , 1 7 : 2 5 5 - 2 6 3 , 1 9 9 9 . W h i t l a c h , L . W . , Y o u n g , M . V . , S c h w a r t z , G . G . , F l a n a g a n , J . N . , B u m s t e i n , K . L . , L o k e s h w a r , B . L . , R i c h , E . S . , H o l i c k , M . F . , a n d C h e n , T . C . 2 2 5 - h y d r o x y v i t a m i n D - l a — h y d r o x y l a s e a c t i v i t y i s d i m i n i s h e d i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l s a n d i s e n h a n c e d b y g e n e t r a n s f e r . J . S t e r o i d B i o c h e m . M o l . , B i o l . , 8 1 : 1 3 5 - 1 4 0 , 2 0 0 2 . W i l s o n , C . L . , H e p p n e r , K . J . , L a b o s k y , P . A . , ; H o g a n , B L , a n d M a t r i s i a n , L . M . : I n t e s t i n a l t u m o r i g e n e s i s i s s u p p r e s s e d i n m i c e l a c k i n g t h e m e t a l l o p r o t e i n a s e m a t r i l y s i n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i e n c e , 9 4 : 1 4 0 2 - 1 4 0 7 , 1 9 9 7 . 3 2 1 W i t t y , J . P . , M c D o n n e l l , S . , N e w e l l , K . J . , C a n n o n , P . , N a v r e , M . , T r e s s l e r , R . J . , a n d M a t r i s i a n , - L . M . 2 M o d u l a t i o n o f m a t r i l y s i n l e v e l s i n c o l o n c a r c i n o m a c e l l l i n e s a f f e c t s t u m o r i g e n i c i t y i n v i v o . C a n c e r R e s . , 5 4 : 4 8 0 5 - 4 8 1 2 , 1 9 9 4 . Z h o n g , C . , Y a n g , S . , H u a n g , J . , C o h e n , M . B . , a n d R o y - B u r m a n , P . : A b e r r a t i o n i n t h e e x p r e s s i o n o f t h e r e t i n o i d r e c e p t o r , R X R o r , i n p r o s t a t e c a n c e r . C a n c e r B i o l . & T h e r . , 2 : 1 7 9 - 1 8 4 , 2 0 0 3 . Z h u a n g , S . H . , B u m s t e i n , K . L . : A n t i p r o l i f e r a t i v e e f f e c t o f 1 a , 2 5 - d i h y d r o x y v i t a m i n D 3 i n h u m a n p r o s t a t e c a n c e r c e l l l i n e L N C a P i n v o l v e s r e d u c t i o n o f c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e 2 a c t i v i t y a n d p e r s i s t e n t G 1 a c c u m u l a t i o n . E n d o c r i n o l o g y , 1 3 9 : 1 1 9 7 - 1 2 0 7 , 1 9 9 8 . 3 2 2 1 1 l l l l l l l j l l l l l l l l l l l 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l l I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3 3 0 2 7 3 6 0 8 5 2