E A S T L A N S I N G , M I C H 4 8 8 2 4 - 1 0 4 8 . . . _ - . _ . _ . _ . . . . _ I ‘ 8 1 2 m ; 5 1 ° ° é L I B R A R I E S \ l . l M I C H I G A N S T A T E U N I V E R S I T Y T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d I . P R O T E I N D E S I G N : R E E N G I N E E R I N G C E L L U L A R R E T I N O I C A C I D B I N D I N G P R O T E I N I I I N T O A R E T I N A L B I N D I N G P R O T E I N I I . P S E U D O - C A G E D C O M P O U N D S A S C H R O M O P H O R I C H O S T S F O R T H E A B S O L U T E S T E R E O C H E M I C A L D E T E R M I N A T I O N O F C H I R A L C O M P O U N D S p r e s e n t e d b y C h r y s o u l a V a s i l e i o u h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e P h . D . d e g r e e i n C h e m i s t r y / ” ' - - ‘ — — ‘ x " " w ” , . — — + 3 ¢ v é fl 4 , [ : 2 M a j o r P r o ‘ l ' e s s o r ’ s S i g n a t u r e F / l Z J / n g a . . . t . . C ‘ D a t e M S U i s a n A f f i r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 2 / 0 5 c J C T R C / D a t e D u e J n d d — p t I 5 I . H . P R O T E I N D E S I G N : R E E N G I N E E R I N G C E L L U L A R R E T I N O I C A C I D B I N D I N G P R O T E I N I I I N T O A R E T I N A L B I N D I N G P R O T E I N P S E U D O - C A G E D C O M P O U N D S A S C H R O M O P H O R I C H O S T S F O R _ T H E A B S O L U T E S T E R E O C H E M I C A L D E T E R M I N A T I O N O F C H I R A L C O M P O U N D S V o l u m e I B y C h r y s o u l a V a s i l e i o u A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y 2 0 0 5 I . 1 1 . A B S T R A C T P R O T E I N D E S I G N : R E E N G I N E E R I N G C E L L U L A R R E T I N O I C A C I D B I N D I N G P R O T E I N H I N T O A R E T I N A L B I N D I N G P R O T E I N P S E U D O - C A G E D C O M P O U N D S A S C H R O M O P H O R I C H O S T S F O R T H E A B S O L U T E S T E R E O C H E M I C A L D E T E R M I N A T I O N O F C H I R A L C O M P O U N D S B y C h r y s o u l a V a s i l e i o u T h e u n d e r l y i n g c h e m i c a l r e a s o n s t h a t e n a b l e c o l o r v i s i o n h a v e b e e n l o n g s t u d i e d , b u t s t i l l n o t f u l l y u n d e r s t o o d . H u m a n e y e c o n t a i n s f o u r d i f f e r e n t t r a n s m e m b r a n e p r o t e i n s c a l l e d O p s i n s t h a t u p o n b i n d i n g t o t h e s a m e s m a l l m o l e c u l e , l l - c i s - r e t i n a l , a s a p r o t o n a t e d i m i n e t h r o u g h a l y s i n e r e s i d u e , r e s u l t i n b o t h d i m a n d c o l o r v i s i o n . T h e d i f f i c u l t i e s i n s t u d y i n g t h e s e p r o t e i n s h a s p r o m p t e d u s t o d e v e l o p a m o d e l s y s t e m , b y u s i n g a s u r r o g a t e p r o t e i n , t h a t c o u l d a l l o w u S t o d e t e r m i n e t h e m e c h a n i s m b y w h i c h c o l o r v i s i o n i s m e d i a t e d . C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n 1 1 ( C R A B P I I ) , a s m a l l c y t o s o l i c p r o t e i n t h a t b i n d s a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d , w a s c h o s e n t o a c t a s t h e o p s i n m i m i c . B y u s i n g r a t i o n a l p r o t e i n d e s i g n a n d t h r o u g h s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s C R A B P H h a s b e e n c o n v e r t e d i n t o a r e t i n a l b i n d i n g p r o t e i n . A l l : t r a n s - r e t i n a l b i n d s t o t h e e n g i n e e r e d C R A B P I I p r o t e i n a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e t h r o u g h a n e n g i n e e r e d l y s i n e r e s i d u e . T h e m o d e O f b i n d i n g h a s b e e n f o u n d t o b e v e r y s i m i l a r t o w h a t i s O b s e r v e d i n t h e n a t i v e o p s i n s y s t e m s . E x c i t o n c o u p l e d c i r c u l a r d i c h r o i s m ( E C C D ) h a s e m e r g e d a s a p o w e r f u l t e c h n i q u e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f c h i r a l c o m p o u n d s i n a n n o n - e m p i r i c a l m a n n e r . T h e m e t h o d i s b a s e d o n t h e t h r o u g h S p a c e i n t e r a c t i o n o f n e i g h b o r i n g c h r o m o p h o r e s a n d h a s b e e n u s e d f o r t h e s t e r e o c h e m i c a l d e t e r m i n a t i o n O f a v a r i e t y O f s m a l l o r g a n i c m o l e c u l e s . A l o n g t h e s e l i n e s , w e w e r e e n g a g e d i n d e s i g n i n g c h r o m o p h o r i c r e c e p t o r s t h a t u p o n c o o r d i n a t i o n O f a m e t a l i o n c a n a s s u m e a p s e u d o - c a g e d c o n f o r m a t i o n . I n t h e a b s e n c e o f e x t e r n a l c h i r a l i t y , t h e f o r m e d c o m p l e x e x i s t s a s a r a c e m i c m i x t u r e O f t h e t w o p o s s i b l e e n a n t i o m e r i c f o r m s a n d i s E C C D s i l e n t . U p o n c o o r d i n a t i o n O f a c h i r a l m o l e c u l e , i n o u r c a s e c h i r a l m o n o a m i n e s , o n e o f t h e t w o d i a s t e r e o m e r i c f o r m s i s f a v o r e d , r e s u l t i n g i n t o a n E C C D a c t i v e S p e c i e s . T h e S i g n o f t h e E C C D c o u p l e t d i r e c t l y d e p e n d s o n t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f t h e b o u n d c h i r a l c o m p o u n d . D e d i c a t e d t O t h e l o v i n g m e m o r y O f m y f a t h e r , a v i v i d p h i l o s o p h e r b y n a t u r e , w h o s e s e a r c h f o r t h e u n k n o w n h a s b e e n a n i n s p i r a t i o n . i v A C K N O W L E D G M E N T S A l t h o u g h a t t i m e s o v e r w h e l m i n g , t h e l i f e i n g r a d u a t e s c h o o l h a s b e e n , f r o m a l l a s p e c t s , o n e O f t h e m o s t r e w a r d i n g e x p e r i e n c e s O f m y l i f e a n d t h e r e a r e m a n y p e o p l e t o t h a n k f o r t h a t . F o r e m o s t , I w o u l d l i k e t o t h a n k B a b a k f o r a l l t h e s u p p o r t a n d e n c o u r a g e m e n t h e h a s p r o v i d e d m e t h r o u g h o u t t h e y e a r s . N o t o n l y h e i s a n e x c e l l e n t s c i e n t i s t ( e v e n t h o u g h t h e g r o u p h a s b a n n e d h i m f r o m w o r k i n g i n t h e l a b ) a n d a n i n s p i r i n g m e n t o r a n d t e a c h e r , b u t h e i s a l s o a n e x c e p t i o n a l p e r s o n w h o t r u l y c a r e s a b o u t p e o p l e . I w a n t t o t h a n k h i m f o r a l w a y s b e l i e v i n g i n m e , e v e n w h e n I h a d a h a r d t i m e b e l i e v i n g i n m y s e l f . H i s s i n c e r e c o m m e n t s a n d e v a l u a t i o n s h a d a g r e a t i m p a c t o n m y g r o w i n g b o t h a s a s c i e n t i s t a n d a s a p e r s o n . H e i s a t r u e f r i e n d a n d , a s S O , i n v a r i o u s o c c a s i o n s h e h a d t o p u t u p w i t h m y e c c e n t r i c i t i e s a n d g r a d u a t e s c h o o l i n d u c e d o u t b u r s t s , f o r w h i c h I a m g r a t e f u l . S p e c i a l t h a n k s a r e d u e f o r c e r t a i n p e o p l e f o r t h e i r e f f o r t s a n d a s s i s t a n c e i n v a r i o u s a s p e c t s . D r . R a c h a e l C r i s t , f o r w e l c o m i n g m e t o a p r o j e c t t h a t s h e S i n g l e h a n d e d d e v e l o p e d , i n t r o d u c i n g m e t o a l l t h e t e c h n i q u e s a n d a l l o w i n g m e t o t a k e o v e r p a r t o f i t . M o n t s e r r a t R a b a g O - S m i t h f o r a l w a y s b e i n g t h e r e , b o t h a s a f r i e n d a n d a s a n e x c e l l e n t c o — w o r k e r . D r . B e n T r a v i s f o r p r o o f r e a d i n g t h i s t h e s i s a n d C o u r t n e y O l m s t e d f o r a l l h e r h e l p w i t h t h e v a r i o u s c o m p u t e r p r o b l e m s . D r . Q i f e i Y a n g , D r . R a d h a N a r a y a n a n d D r . M e e n a k s h i S i v a k u m a r f o r t h e u s e f u l d i s c u s s i o n s w e h a d c o v e r i n g a l l a s p e c t s o f l i f e a n d s c i e n c e . M y g r a t i t u d e i s e x t e n d e d t o a l l c u r r e n t a n d p a s t m e m b e r s o f t h e l a b ( R e d d y , D a n , J e n n i f e r , J u n , M a r i n a , S h a n g , S o m n a t h , S t e w a r t , T a o , X i a o f e i , X i a o y o n g , A l i , S a r a h , G o l a l a ) f o r t h e i r f r i e n d s h i p a n d s u p p o r t . A s p e c i a l m e n t i o n i s d u e f o r T a o w h o h a s b e e n a g o o d s p o r t , a c t i n g o c c a s i o n a l l y a s a p u n c h i n g s a c k w i t h o u t c o m p l a i n i n g . I r e a l i z e t h a t i n s u c h a c o m p e t i t i v e f i e l d i t i s r a r e t o f i n d s u c h a h e t e r o g e n e o u s g r o u p o f p e o p l e t h a t n o t o n l y c a n g e t a l o n g w i t h e a c h o t h e r , t h e y a c t u a l l y , g e n u i n e l y , l i k e a n d l o o k a f t e r e a c h o t h e r , f o r w h i c h I a m g r a t e f u l . S p e c i a l t h a n k s a l s o g o e s t o o u r c o l l a b o r a t o r s o n t h e p r o t e i n c r y s t a l l o g r a p h y e f f o r t s , P r o f e s s o r J i m G e i g e r , E r i k a M a t h e s a n d p a r t i c u l a r l y S o h e i l a V a e z e s l a m i . N o t o n l y s h e i s a v a l u a b l e c o - w o r k e r S h e i s a l s o a d e a r f r i e n d y o u c a n a l w a y s d e p e n d o n a n d h e r s u p p o r t h a s b e e n i n v a l u a b l e . F o r t h e c r y s t a l l o g r a p h i c e f f o r t s i n v o l v i n g s m a l l m o l e c u l e s D r . D o n a l d W a r d h a s p r o v i d e d t h e p r e l i m i n a r y r e s u l t s p r e s e n t e d i n t h i s m a n u s c r i p t . F o r t h e a c q u i s i t i o n o f 2 D - N M R d a t a t h e h e l p o f K e r m i t J o h n s o n h a s b e e n v e r y u s e f u l . I a l s o n e e d t o t h a n k t h e m a s s s p e c t r o m e t r y f a c i l i t y o f M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , a n d i n p a r t i c u l a r D r . R o n d a H u s s e i n a n d D r . S u s a n n e H o f f m a n n - B e n n i n g f o r t h e i r h e l p i n a c q u i r i n g t h e M A L D I - T O F s p e c t r a . A s p e c i a l m e n t i o n i s d u e f o r s o m e c l o s e f r i e n d s w h o , t h r o u g h o u t t h e y e a r s , p r o v i d e d m o s t l y e m o t i o n a l s u p p o r t , n e c e s s a r y f o r m a i n t a i n i n g a n a c c e p t a b l e l e v e l o f s a n i t y . M o n t s e r r a t , G l e n n , M a p i t s o a n d J a i n i s h a , w e s t a r t e d t h i s a d v e n t u r e t o g e t h e r , n o t r e a l l y k n o w i n g w h a t e x a c t l y w e w e r e g e t t i n g i n t o , b u t s o m e h o w w e m a d e i t t h r o u g h . A é o r t o w a , ( D m t s t v fi , O d l s r a a n d K t b o r a , t h a n k y o u f o r b e i n g t h e r e t o s h a r e c o m p l a i n t s a n d f r u s t r a t i o n s . R a c h a e l a n d C o n n i e , f o r o p e n i n g t h e i r h o m e t o m e a n d a l l o w i n g m e t o e x p e r i e n c e s o m e a s p e c t s o f t h e “ A m e r i c a n w a y o f l i f e ” . F i n a l l y , I w o u l d l i k e t o t h a n k m y f a m i l y ( ( D O M ' ] , ' E r p n , F t d w n g , T r a y t d ) f o r t h e i r c o n t i n u o u s s u p p o r t a n d e n c o u r a g e m e n t d u r i n g t h i s a d v e n t u r o u s j o u r n e y . C r o s s i n g h a l f t h e w o r l d f o l l o w i n g a d r e a m i s s o m e t h i n g t h a t s o u n d e d u n b e l i e v a b l e , e v e n c r a z y , a f e w y e a r s a g o b u t b e c a m e a r e a l i t y t h a n k s t o t h e i r u n c o n d i t i o n a l l o v e . v i T A B L E O F C O N T E N T S L i s t o f T a b l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i L i s t o f F i g u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i i i L i s t o f S c h e m e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x x v i i i K e y t o S y m b o l s a n d A b b r e v i a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x x i x C H A P T E R 1 I n t r o d u c t i o n 1 . 1 T h e P r i n c i p l e s O f V i s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 . 2 T h e P r i n c i p l e s O f C o l o r V i s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1 . 3 R h o d o p s i n : S c h i f f B a s e F o r m a t i o n a n d W a v e l e n g t h R e g u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 . 4 O t h e r O p s i n S y s t e m s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 1 . 5 D e s i g n i n g a R e t i n a l B i n d i n g P r o t e i n t o A c t a s a R h o d o p s i n S u r r o g a t e . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 1 . 6 I n t r o d u c t i o n t o R e t i n o i d B i n d i n g P r o t e i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 1 . 7 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 C H A P T E R 2 P r o t e i n D e s i g n : C o n v e r t i n g C R A B P I I i n t o a R e t i n a l B i n d i n g P r o t e i n 2 . 1 2 . 2 2 . 3 2 . 4 W i l d T y p e C R A B P I I B i n d i n g P r o p e r t i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1 I n t r o d u c t i o n o f a L y s R e s i d u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 4 H y d r o p h o b i c T u n i n g O f t h e B i n d i n g P o c k e t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1 A t t e m p t s t o R e s t o r e S c h i f f B a s e F o r m a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 9 v i i 2 - 5 I n t r o d u c t i o n o f a C o u n t e r A n i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 9 2 . 6 I m p o r t a n c e O f t h e C o u n t e r A n i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3 2 . 7 D e t e r m i n i n g t h e p K a o f t h e P S B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 6 2 . 8 D e t e r m i n a t i o n o f t h e R e t i n a l B i n d i n g S i t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 1 2 . 9 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 6 2 . 1 0 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 5 C H A P T E R 3 E n g i n e e r i n g a R h o d o p s i n P r o t e i n M i m i c 3 . 1 R e s t o r i n g T y r 1 3 4 : T h e I m p o r t a n c e o f a S i n g l e M u t a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 4 3 . 2 A P S B F o r m i n g P r o t e i n : T h e C r y s t a l S t r u c t u r e o f R 1 3 2 K 1 R 1 1 1 L 2 L 1 2 1 E w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 7 3 . 3 T h e I m p o r t a n c e o f t h e P S B C o u n t e r A n i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 4 3 . 4 M u t a t i n g A r g l 1 1 : I S i t N e c e s s a r y ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 2 3 . 5 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 3 3 . 6 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 1 C H A P T E R 4 T o w a r d s t h e D e t e r m i n a t i o n o f t h e p K a o f L y s l 3 2 , P S B 4 . 1 4 . 2 4 . 3 4 . 4 4 . 5 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 4 T h e N M R a p p r o a c h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 6 N a t i v e C h e m i c a l L i g a t i o n A p p r o a c h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 9 O v e r e x p r e s s i o n o f C R A B P H i n ‘ 5 N - E n r i c h e d M e d i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 6 v i i i 4 . 6 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 0 T A B L E S S u m m a r y o f p r o t e i n p r o p e r t i e s f o r C R A B P I I m u t a n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 5 S u m m a r y o f B i n d i n g A s s a y R e s u l t s f o r C R A B P H m u t a n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 8 C H A P T E R 5 I n t r o d u c t i o n t o C h i r o p t i c a l M e t h o d s : T h e o r y a n d A p p l i c a t i o n s 5 . 1 I n t r o d u c t i o n t o C h i r a l i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 1 5 . 2 O p t i c a l R o t a t o r y D i s p e r s i o n ( O R D ) a n d C i r c u l a r D i c h r o i s m ( C D ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 6 5 . 3 E x c i t o n C o u p l e d C i r c u l a r D i c h r o i s m ( E C C D ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 4 5 . 4 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 6 C H A P T E R 6 U s i n g H e l i c a t e s f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f t h e S t e r e o c h e m i s t r y o f C h i r a l C o m p o u n d s 6 . 1 I n t r o d u c t i o n t o H e l i c a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 6 6 . 2 T h e D i p y r r o m e t h e n e S y s t e m s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 9 6 . 3 T h e B i s p y r i d i n e S y s t e m s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 1 6 . 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 6 6 . 5 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 1 C H A P T E R 7 P s e u d o C a g e s a s H o s t s f o r C h i r a l D i s c r i m i n a t i o n 7 . 1 I n t r o d u c t i o n t o P s e u d o - C a g e d C o m p o u n d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 9 7 . 2 T h e T M Q A S y s t e m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 2 7 . 3 7 . 4 7 . 5 7 . 6 7 . 7 T h e D Q B A S y s t e m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 1 T h e T M Q M S y s t e m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 4 A t t e m p t s t o T r a n s f e r C h i r a l i t y T h r o u g h S c h i f f B a s e F o r m a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 5 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 7 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 7 T a b l e 1 - 1 T a b l e 2 - 1 T a b l e 2 - 2 T a b l e 2 - 3 T a b l e 2 - 4 T a b l e 2 - 5 T a b l e 2 - 6 T a b l e 3 - 1 T a b l e 3 - 2 T a b l e 4 - 1 T a b l e 4 - 2 T a b l e 4 - 3 T a b l e 5 - 1 L I S T O F T A B L E S S p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r i s t i c s o f r h o d o p s i n p r o t e i n s O f d i f f e r e n t S p e c i e s . . . . . . 2 1 S p e c t r o s c o p i c r e s u l t s o f v a r i o u s C R A B P I I m u t a n t s i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l , i n a n a t t e m p t t o p r o b e t h e i d e a l p o s i t i o n f o r t h e P S B c o u n t e r a n i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 0 C o m p a r i s o n o f t h e r e t i n a l b i n d i n g s p e c t r o s c o p i c a s s a y s o f v a r i o u s C R A B P H m u t a n t s i n t h e p r e s e n c e o r n o t O f v a r i o u s r e s i d u e s a t p o s i t i o n 1 2 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 5 C o m p a r i s o n O f t h e r e t i n a l b i n d i n g s p e c t r o s c o p i c a s s a y s o f t h e C R A B P I I m u t a n t s w i t h a n d w i t h o u t L y s l 3 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 3 B l a n k T i t r a t i o n o f N — a c e t y l t r y p t o p h a n a m i d e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 6 T i t r a t i o n O f C R A B P I I w i t h r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 7 C o r r e c t e d F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n O f C R A B P I I w i t h r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 9 S p e c t r o s c o p i c r e s u l t s O f v a r i o u s C R A B P I I m u t a n t s i n t h e p r e s e n c e O f a l l - t r a n s - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 5 S p e c t r o s c o p i c r e s u l t s O f v a r i o u s C R A B P I I m u t a n t s i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 7 E x p r e s s i o n O f C R A B P I I ( l - 1 2 9 ) - I n t e i n f u s i o n p r o t e i n u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 6 A t t e m p t s t o i s o l a t e t h e C R A B P I I ( 1 - 1 2 9 ) - I n t e i n f u s i o n p r o t e i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 6 E x p r e s s i o n o f C R A B P H m u t a n t s i n T u n e r c e l l s , i n M 9 m e d i u m . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 5 D e fi n i t i o n O f E x c i t o n C h i r a l i t y f o r a b i n a r y s y s t e m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 9 x i T a b l e 6 - 1 T a b l e 6 - 2 T a b l e 6 - 3 T a b l e 6 - 4 T a b l e 7 - 1 T a b l e 7 — 2 T a b l e 7 - 3 T a b l e 7 - 4 T a b l e 7 - 5 T a b l e 7 - 6 T a b l e 7 - 7 N M R s h i f t s o f t h e d i f f e r e n t f o r m s o f D T M P , r e c o r d e d o v e r t i m e . . . . . . . . . . . . . . 2 9 8 P r o t o n s h i f t s u p o n c o m p l e x a t i o n o f D E M P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 9 C D d a t a u p o n a d d i t i o n O f v a r i o u s c h i r a l a m i n e s i n t o a ( D E M P h — Z n s o l u t i o n i n b e n z e n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 6 C o m p a r i s o n O f t h e E C C D c r o s s p o i n t a n d t h e U V S p e c t r a o f D E M P - Z n i n t h e p r e s e n c e O f d i f f e r e n t c h i r a l a m i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 7 C o n d i t i o n s f o r t h e c o m p l e x a t i o n o f T M Q A w i t h m e t a l s a n d c h i r a l a m i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 4 F o r m a t i o n O f q u i n o l i n e r i n g s t h r o u g h t h e r m a l c y c l i z a t i o n w i t h v a r i o u s a l d e h y d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 1 C o m p l e x a t i o n a t t e m p t s u s i n g T M Q M u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 5 N M R a s s i g n m e n t o f t h e T M Q M p r o t o n s u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . 3 6 6 A t t e m p t s f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n u s i n g k e t o n e 3 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 6 A t t e m p t s f o r t h e o x i d a t i o n o f a l c o h o l 3 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 9 A t t e m p t s f o r t h e h y d r o l y s i s O f a c e t a l 4 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 1 x i i L I S T O F F I G U R E S F i g u r e 1 - 1 T h e H u m a n E y e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 F i g u r e 1 - 2 T h e R o d a n d C o n e C e l l s i n R e t i n a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 F i g u r e 1 - 3 S c h e m a t i c R e p r e s e n t a t i o n o f R h o d o p s i n i n a R o d C e l l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 F i g u r e 1 - 4 S t e r e o v i e w O f t h e t r a n s - m e m b r a n e 7 — O t — h e l i c a l G - p r o t e i n c o u p l e d r e c e p t o r r h o d o p s i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 F i g u r e 1 - 5 S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e i n t e r m e d i a t e s O b s e r v e d i n t h e i s o m e r i z a t i o n o f l l - c i s - r e t i n a l i n r h o d o p s i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 F i g u r e 1 - 6 T h e a c t i v a t i o n O f G - p r o t e i n t r a n s d u c i n u p o n b i n d i n g t o a c t i v a t e d r h o d o p s i n l e a d s t o c G M P h y d r o l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 F i g u r e 1 - 7 E a c h o f t h e f o u r r h o d o p s i n c o m p l e x e s a b s o r b a t a d i f f e r e n t w a v e l e n g t h c o m p r i s i n g t h e e n t i r e v i s i b l e s p e c t r u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 F i g u r e 1 - 8 U V a b s o r b a n c e s o f 1 1 - c i s - r e t i n a l a s f r e e a l d e h y d e ( 3 8 0 n m ) , a n - b u t y l a m i n e S c h i f f b a s e ( 3 6 5 n m ) a n d a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ( 4 4 0 n m ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 F i g u r e 1 - 9 D i s t a n c e O f t h e c o u n t e r a n i o n t o t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e a n d p o s i t i o n i n g O f c h a r g e s o r d i p o l e s a l o n g t h e b a c k b o n e O f t h e p o l y e n e m a y m o d u l a t e t h e m a x i m a l w a v e l e n g t h o f t h e c h r o m o p h o r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 F i g u r e 1 - 1 0 A b s o r p t i o n m a x i m a a n d a p p a r e n t p K a v a l u e s o f S c h i f f b a s e ( S B ) a n d p r o t o n a t e d S B ( P S B ) o f r e t i n a l w i t h v a r i o u s a m i n o a c i d s . T h e r e l a t i v e p o s i t i o n o f t h e c a r b o x y l i c a c i d d i c t a t e s t h e A m , “ a n d t h e p K a v a l u e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 x i i i F i g u r e 1 - 1 1 T w i s t i n g O f t h e s i n g l e b o n d s w i l l r e d u c e t h e d e g r e e O f I t o r b i t a l o v e r l a p , a n d t h u s w i l l l e a d t o d i f f e r e n t m a x i m a l w a v e l e n g t h s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 F i g u r e 1 - 1 2 S t e r e o v i e w o f t h e b i n d i n g p o c k e t o f t h e r o d r h o d o p s i n f r o m t h e c r y s t a l s t r u c t u r e . T h e c h r o m o p h o r e , l l - c i s - r e t i n a l i s S h o w n b o u n d a s a S c h i f f b a s e t O L y s 2 9 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 F i g u r e 1 - 1 3 M o d e l S t r u c t u r e s o f t h e b i n d i n g c a v i t y O f t h e t h r e e c o n e p i g m e n t s b a s e d o n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e O f t h e r o d r h o d o p s i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 F i g u r e 1 - 1 4 S t e r e o v i e w o f t h e r e t i n a l b i n d i n g s i t e o f i o n p u m p B a c t e r i o r h o d o p s i n ( t h ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 F i g u r e 1 - 1 5 C r y s t a l S t r u c t u r e s o f t h e r e t i n a l b i n d i n g S i t e s o f B a c t e r i o r h o d o p s i n , S e n s o r y R h o d o p s i n I I a n d A n a b a e n a S e n s o r y R h o d o p s i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 F i g u r e 1 - 1 6 C r y s t a l s t r u c t u r e s O f C e l l u l a r R e t i n o l B i n d i n g P r o t e i n 1 1 a n d A d i p o c y t e L i p i d B i n d i n g P r o t e i n i n t h e p r e s e n c e o f t h e i r n a t u r a l s u b s t r a t e s a l l - t r a n s - r e t i n o l a n d O l e i c a c i d , r e s p e c t i v e l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 F i g u r e 1 - 1 7 T h e b i n d i n g o f v a r i o u s s u b s t r a t e s w i t h i n t h e i L B P f a m i l y o c c u r s i n a s i m i l a r f a s h i o n . A . B i n d i n g c a v i t y o f C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n I I ( a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d b o u n d ) ; B . B i n d i n g c a v i t y o f H u m a n M u s c l e F a t t y A c i d B i n d i n g P r o t e i n ( O l e i c a c i d b o u n d ) . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 F i g u r e 1 — 1 8 S t e r e o v i e w o f t h e C R A B P I I c r y s t a l s t r u c t u r e b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 F i g u r e 2 - 1 S t r e r e o v i e w o f w i l d t y p e C R A B P H b o u n d t o a l l — t r a n s - r e t i n o i c a c i d . T h e l i g a n d c a r b o x y l a t e i s d i r e c t l y i n t e r a c t i n g w i t h A r g 1 3 2 a n d x i v T y r l 3 4 , w h i l e i s f o r m i n g a h y d r o g e n b o n d s w i t h A r g l l l a n d T h r 5 4 a r e d i r e c t e d t h r o u g h a w a t e r m o l e c u l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1 F i g u r e 2 - 2 F l u o r e s c e n c e a n d U V — v i s t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l K d d e t e r m i n a t i o n w i t h w i l d - t y p e C R A B P H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2 F i g u r e 2 - 3 S t e r e o v i e w o f t h e m i n i m i z e d m o d e l O f C R A B P I I - R 1 3 2 K m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 5 F i g u r e 2 - 4 F l u o r e s c e n c e , U V - v i s a n d M A L D I - T O F d a t a O f a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d t o C R A B P I I - R 1 3 2 K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 8 F i g u r e 2 - 5 T h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e b i n d i n g p o c k e t O f R h o d o p s i n b o u n d t o l l - c i s - r e t i n a l a n d t h e m o d e l s t r u c t u r e O f t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K m u t a n t i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2 F i g u r e 2 - 6 F l u o r e s c e n c e , U V - v i s a n d M A L D I - T O F d a t a o f a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d t o C R A B P I I - R 1 3 2 K 2 Y 1 3 4 F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 4 F i g u r e 2 - 7 S t e r e o v i e w O f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f C R A B P I I - R 1 3 2 K z Y 1 3 4 F w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l a n d a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 F i g u r e 2 - 8 S t e r e o v i e w o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e O f t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K z Y l 3 4 F m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . L y 8 1 3 2 c a n a t t a c k t h e 1 S t c o n f o r m a t i o n o f t h e c a r b o n y l f r o m a ~ 7 5 ° a n g l e . L y s l 3 2 c a n a t t a c k t h e 2 n d c o n f o r m a t i o n O f t h e c a r b o n y l f r o m a ~ 1 2 5 o a n g l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 0 F i g u r e 2 - 9 S t e r e o v i e w O f t h e W T - C R A B P I I a n d C R A B P I I - R 1 3 2 K z Y 1 3 4 F a p o p r o t e i n c r y s t a l s t r u c t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1 F i g u r e 2 - 1 0 S t e r e o v i e w O f t w o m i n i m i z e d m o d e l s O f t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2 X V F i g u r e 2 - 1 1 F i g u r e 2 - 1 2 F i g u r e 2 - 1 3 F i g u r e 2 - 1 4 F i g u r e 2 - 1 5 F i g u r e 2 - 1 6 F i g u r e 2 - 1 7 F i g u r e 2 - 1 8 F i g u r e 2 - 1 9 F i g u r e 2 - 2 0 F i g u r e 2 - 2 1 F l u o r e s c e n c e , U V - v i s a n d M A L D I - T O F d a t a O f a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d t o C R A B P I I - R 1 3 2 K z Y 1 3 4 F z R 1 1 1 L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4 F l u o r e s c e n c e , U V - v i S a n d M A L D I - T O F d a t a o f a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d t o C R A B P I I - R 1 3 2 K z Y l 3 4 F z T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 6 C r y s t a l s t r u c t u r e o f W T - C R A B P H b o u n d t o r e t i n o i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 7 M o d e l s t r u c t u r e s o f t h e C R A B P H b i n d i n g S i t e w i t h a l l - t r a n s — r e t i n a l b o u n d e i t h e r n o n - c o v a l e n t l y ( A ) o r c o v a l e n t l y ( B ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1 S t e r e o v i e w O f t h e m i n i m i z e d m o d e l o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : L 1 2 1 E b o u n d t o a l l - t r a n s — r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4 F l u o r e s c e n c e , U V - v i s a n d M A L D I - T O F d a t a o f a l l - t r a n s — r e t i n a l b o u n d t o C R A B P I I - R 1 3 2 K 2 Y 1 3 4 F z R 1 1 1 L : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 5 M o d e l s t r u c t u r e o f C R A B P H - R 1 3 2 K 2 Y l 3 4 F l e 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 6 F l u o r e s c e n c e , U V - v i s a n d M A L D I - T O F d a t a o f a l l — t r a n s - r e t i n a l b o u n d t o C R A B P I I - R 1 3 2 K 2 Y 1 3 4 F l e 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 8 C r y s t a l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K z Y l 3 4 F z R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 0 S t e r e o v i e w o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f a p o R 1 3 2 K 2 Y 1 3 4 F 2 R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1 M o d e l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K 2 Y l 3 4 F z R 1 1 1 L : L 1 2 1 D m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3 x v i F i g u r e 2 - 2 2 A c i d - b a s e t i t r a t i o n o f t h e R 1 3 2 K : Y l 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V / r e t i n a l c o m p l e x s h o w s i n t e r c o n v e r s i o n b e t w e e n t h e S B ( 3 6 6 n m ) a n d t h e P S B ( 4 5 0 n m ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 8 F i g u r e 2 - 2 3 T h e r e t i n a l i n c u b a t e d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V c o m p l e x w a s c o n v e r t e d c o m p l e t e l y t o t h e 4 6 4 n m a b s o r b i n g s p e c i e s . T h e m i x t u r e w a s t h e n t i t r a t e d w i t h b a s e a n d c o n v e r t e d c o m p l e t e l y t o t h e 3 6 6 n m a b s o r b i n g s p e c i e s . P l o t t i n g o f t h e a b s o r b a n c e a t 5 0 0 n m v e r s u s t h e p H o f t h e s a m p l e s r e v e a l s a p K a o f ~ 6 . 5 f o r t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 0 F i g u r e 2 - 2 4 C R A B P H - F 1 5 W a m i n o a c i d s e q u e n c e . T h e C N B r d i g e s t i o n s i t e s a r e h i g h l i g h t e d i n b l u e . C N B r d i g e s t i o n f r a g m e n t s o f C R A B P H . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 6 F i g u r e 2 - 2 5 1 5 % A c r y l / T r i s - t r i c i n e - g l y c e r o l g e l o f C R A B P I I - H i s t a g F 1 5 W a f t e r C N B r d i g e s t i o n ( n o i o d o a c e t a m i d e ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 7 F i g u r e 2 - 2 6 1 5 % A c r y l / T r i s - t r i c i n e - g l y c e r o l g e l o f C R A B P H - F 1 5 W a f t e r C N B r d i g e s t i o n ( a f t e r i o d o a c e t a m i d e ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 7 F i g u r e 2 - 2 7 A m i n o a c i d s e q u e n c e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : L 1 2 1 E : : R 1 1 1 L m u t a n t . R e s i d u e s i n b l u e r e p r e s e n t c u t S i d e s f o r t r y p s i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 9 F i g u r e 2 - 2 8 M A L D I - T O F S p e c t r u m o f t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t a f t e r t r y p s i n d i g e s t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 F i g u r e 2 - 2 9 A m i n o a c i d s e q u e n c e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : L 1 2 1 E : : R 1 1 1 L m u t a n t . R e s i d u e s i n b l u e m a r k p o t e n t i a l C h y m o t r y p s i n c u t S i t e s . . . . . . . . . . . 1 1 2 x v i i F i g u r e 2 - 3 0 M A L D I - T O F o f t h e d i g e s t i o n O f r e d u c t i v e l y a m i n a t e d R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R l l l e L 1 2 1 E ( W = 1 5 4 9 0 . 1 D a ) m u t a n t w i t h C h y m o t r y p s i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 3 F i g u r e 2 - 3 1 C r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e a p o f o r m o f W T - C R A B P I I ( t w o d i f f e r e n t v i e w s ) . T h e C - a n d N - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n a r e h i g h l i g h t e d i n r e d a n d g r e e n , r e s p e c t i v e l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 6 F i g u r e 2 - 3 2 D e p i c t i o n o f S t r a t a g e n e ’ s Q u i k C h a n g e ® S i t e - D i r e c t e d M u t a g e n e s i s P r o t o c o l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 7 F i g u r e 2 - 3 3 S t e r e o v i e w o f W T - C R A B P H w i t h r e t i n a l b o u n d ( m i n i m i z e d m o d e l ) . B i n d i n g a f f i n i t y o f c h r o m o p h o r e s t o t h e C R A B P I I m u t a n t p r o t e i n s i s m o n i t o r e d b y f l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g o f T r p r e s i d u e s . T r p r e s i d u e s a r e c o l o r e d i n g r e e n ( W 1 0 9 , W 8 7 , W 7 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 1 F i g u r e 2 - 3 4 F l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g u p o n a d d i t i o n o f r e t i n a l t o C R A B P H ( u n c o r r e c t e d d a t a ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 7 F i g u r e 2 - 3 5 F l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g u p o n a d d i t i o n o f r e t i n a l t o C R A B P I I ( c o r r e c t e d d a t a ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 9 F i g u r e 2 - 3 6 C o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n b e t w e e n r e t i n a l a n d t h e p r o t e i n c a n b e d e t e c t e d b y M A L D I — T O F . S c h i f f b a s e o r P S B f o r m a t i o n c a n b e s e e n a s a n [ M + 2 6 6 ] + o r [ M + 2 6 7 ] + p e a k , r e s p e c t i v e l y . B o t h S p e c i e s c a n b e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d a n d t r a p p e d a s a n [ M + 2 6 8 ] + s p e c i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 3 F i g u r e 2 - 3 7 S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n p r o c e s s u s i n g R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 5 x v i i i F i g u r e 2 - 3 8 U V t r a c e s O f W T - C R A B P I I a n d R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V m u t a n t a f t e r s u b m i t t e d t o r e d u c t i v e a m i n a t i o n c o n d i t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 9 F i g u r e 3 - 1 O v e r l a y o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f C R A B P H - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 l e L 1 2 1 E : T 5 4 V a n d C R A B P H - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 4 F i g u r e 3 - 2 F l u o r e s c e n c e , U V - v i s a n d M A L D I - T O F d a t a o f a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d t o C R A B P I I - R 1 3 2 K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 6 F i g u r e 3 - 3 T h e U V s p e c t r u m o f C R A B P I I - R 1 3 2 K l e 1 I L i n t h e p r e s e n c e o f a l l — t r a n s - r e t i n a l . P l o t t i n g o f t h e U V a b s o r b a n c e a t 4 7 3 n m v e r s u s t h e p H o f t h e s a m p l e s a f f o r d s a p K a o f 6 . 5 5 f o r t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . . . . . . . 1 5 8 F i g u r e 3 - 4 S t e r e o v i e w o f t h e m o d e l s t r u c t u r e s o f C R A B P H - R 1 3 2 K z R 1 1 1 L m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l , e i t h e r n o n - c o v a l e n t l y ( A ) o r a s a S c h i f f b a s e ( B ) . S t e r e o v i e w o f t h e m o d e l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l n o n - c o v a l e n t l y ( C ) . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 9 F i g u r e 3 - 5 F l u o r e s c e n c e , U V - v i s a n d M A L D I - T O F d a t a o f a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d t o C R A B P I I - R 1 3 2 K 2 R 1 1 1 L : L 1 2 1 E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 1 F i g u r e 3 - 6 U V S p e c t r a o f t h e t i t r a t i o n o f C R A B P I I - R 1 3 2 K z R 1 1 1 L z L 1 2 1 E m u t a n t w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 2 F i g u r e 3 - 7 p H t i t r a t i o n o f t h e R 1 3 2 K 2 R 1 1 1 L 2 L 1 2 1 E m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . U p o n a d d i t i o n O f N a O H , t h e p e a k a t 4 4 9 n m ( P S B ) i s d i s a p p e a r i n g w h i l e a n e w o n e a t 3 6 0 n m ( S B ) i s i n c r e a s i n g . G r a p h i c a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e c h a n g e i n t h e a b s o r b a n c e a t 3 6 0 n m x i x F i g u r e 3 - 8 F i g u r e 3 - 9 F i g u r e 3 - 1 0 F i g u r e 3 - 1 1 F i g u r e 3 - 1 2 F i g u r e 3 - 1 3 F i g u r e 3 - 1 4 F i g u r e 3 - 1 5 v e r s u s t h e p H c h a n g e . T h e p K a c a n b e c a l c u l a t e d b y s o l v i n g t h e 2 n d d e r i v a t i v e o f t h e fi t t e d c u r v e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C r y s t a l s t r u c t u r e o f C R A B P H - R 1 3 2 K 2 R 1 1 1 L z L 1 2 1 E i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d a s a S c h i f f b a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C r y s t a l s t r u c t u r e O f t h e b i n d i n g c a v i t y o f C R A B P H - R l 3 2 K l e l l e L l 2 1 E b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . T h e r e t i n a l i s c o n f i r m e d t o b e b o u n d a s a P S B v i a L y s l 3 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S t e r e o v i e w o f t h e c r y s t a l S t r u c t u r e O f t h e b i n d i n g p o c k e t o f t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 I E m u t a n t b o u n d t o r e t i n a l a s a P S B . . . . . . P r o p o s e d m e c h a n i s m f o r t h e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n b e t w e e n t r i p l e m u t a n t C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E a n d a l l - t r a n s - r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . C r y s t a l s t r u c t u r e o f b o v i n e r h o d o p s i n b o u n d t o l l - c i s - r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . C r y s t a l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e U V s p e c t r a o f a l l - t r a n s - r e t i n a l i n s i d e C R A B P I I - R 1 3 2 K z R 1 1 1 L : L 1 2 1 Q m u t a n t i n p h o s p h a t e b u f f e r i n t h e p r e s e n c e o f 1 5 0 m M N a C l 1 6 4 1 6 7 1 6 8 1 6 9 1 7 2 1 7 3 ( A m = 3 7 3 n m ) a n d a s a t u r a t e d s o l u t i o n o f N a C l ( A m = 3 6 8 n m ) . . . . . . . . 1 7 6 S t e r e o v i e w O f t h e m o d e l O f C R A B P I I - R 1 3 2 K 2 R 1 1 1 L 1 L l 2 1 D b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l a s a S c h i f f b a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S t e r e o v i e w o f t h e m o d e l s t r u c t u r e s o f C R A B P I I - R 1 3 2 K 1 R 1 1 1 L z C l 3 0 D b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l e i t h e r n o n - c o v a l e n t l y ( A ) o r a s a S c h i f f b a s e ( B ) ; S t e r e o v i e w o f t h e c r y s t a l X X 1 7 7 s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K 2 R 1 1 1 L z L 1 2 1 E b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l a s a S c h i f f b a s e ( C ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 9 F i g u r e 3 - 1 6 U V - v i s s p e c t r u m o f a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d t o C R A B P I I - R 1 3 2 K 2 L 1 2 1 E m u t a n t . U V - v i s s p e c t r a o f t h e t i t r a t i o n o f C R A B P H - R 1 3 2 K 2 L 1 2 1 E m u t a n t w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l . p H t i t r a t i o n o f t h e R 1 3 2 K : L 1 2 1 E m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s — r e t i n a l . G r a p h i c a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e c h a n g e i n t h e a b s o r b a n c e a t 4 5 5 n m v e r s u s t h e p H c h a n g e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 4 F i g u r e 3 - 1 7 S t e r e o v i e w o f t h e m o d e l S t r u c t u r e s o f C R A B P I I - R 1 3 2 K z L 1 2 1 E b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l e i t h e r n o n - c o v a l e n t l y o r a s a S c h i f f b a s e . . . . . . . 1 8 5 F i g u r e 3 - 1 8 S t e r e o v i e w O f t h e m o d e l S t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 H : L 1 2 1 E m u t a n t w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d a s a S c h i f f b a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 0 F i g u r e 3 - 1 9 S t e r e o v i e w O f t h e m o d e l s t r u c t u r e O f C R A B P H - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d n o n - c o v a l e n t l y . . . . . . . 1 9 1 F i g u r e 4 - 1 U V t i t r a t i o n o f R 1 3 2 K : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E i n c u b a t e d a t d i f f e r e n t p H S ( 4 - 7 . 5 ) u p o n a d d i t i o n o f a l l - t r a n s - r e t i n a l . G r a p h o f t h e a b s o r p t i o n c h a n g e a t 4 4 1 n m ( A 4 4 1 ) w i t h d i f f e r e n t p H s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 5 F i g u r e 4 - 2 S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e I n t e i n - m e d i a t e d n a t i v e c h e m i c a l l i g a t i o n p r o c e s s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 2 F i g u r e 4 - 3 S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e f o r m a t i o n o f 1 5 N - L y 3 1 3 2 C R A B P I I v i a I n t e i n M e d i a t e d C h e m i c a l L i g a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 4 F i g u r e 4 — 4 S D S e l e c t r o p h o r e s i s g e l o f t h e e x p r e s s e d f u s e d p r o t e i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 7 x x i F i g u r e 4 - 5 F i g u r e 4 - 6 F i g u r e 4 - 7 F i g u r e 5 - 1 F i g u r e 5 - 2 F i g u r e 5 - 3 F i g u r e 5 - 4 F i g u r e 5 - 5 F i g u r e 5 - 6 F i g u r e 5 — 7 F i g u r e 5 - 8 F i g u r e 5 - 9 F i g u r e 5 - 1 0 F i g u r e 5 - 1 1 F i g u r e 5 - 1 2 F i g u r e 5 - 1 3 F i g u r e 5 - 1 4 F i g u r e 5 - 1 5 S D S e l e c t r o p h o r e s i s g e l o f t h e e x p r e s s e d f u s e d p r o t e i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 8 S D S e l e c t r o p h o r e s i s g e l o f t h e e x p r e s s e d f u s e d p r o t e i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 9 U V s p e c t r a o f R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F a n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : V 1 2 9 A m u t a n t i n t h e p r e s e n c e o f r e t i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 2 D i f f e r e n t k i n d s o f c h i r a l m o l e c u l e s a n d t h e i r m i r r o r i m a g e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 1 E n a n t i o m e r i c f o r m s o f s e l e c t e d m o l e c u l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 4 L i g h t a s a n e l e c t r o m a g n e t i c r a d i a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 6 L i n e a r l y a n d c i r c u l a r l y p o l a r i z e d l i g h t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 7 P o s i t i v e ( A ) a n d n e g a t i v e ( B ) C o t t o n e f f e c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 9 T h e r i g h t h a n d r u l e t o d e t e r m i n e t h e d i r e c t i o n o f m a g n e t i c d i p o l e t r a n s i t i o n m o m e n t ( m ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 9 T h e d i p o l e t r a n s i t i o n m o m e n t s f o r h e x a h e l i c e n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 0 S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n O f a C D s p e c t r o p o l a r i m e t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 1 S p l i t t i n g o f t h e e x c i t e d S t a t e s o f i s o l a t e d c h r o m o p h o r e s i a n d j b y e x c i t o n i n t e r a c t i o n . T h e e n e r g y g a p 2 v i j i s c a l l e d D a v y d o v s p l i t t i n g . . . . . 2 5 4 T h e U V S p e c t r u m ( A ) a n d E C C D s p e c t r u m ( B ) u p o n t h r o u g h s p a c e i n t e r a c t i o n o f t w o d e g e n e r a t e c h r o m o p h o r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 5 T h e q u a l i t a t i v e e x p l a n a t i o n o f E C C D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 7 E C C D a c t i v e a s c i s i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 2 A p p l i c a t i o n o f t h e E C C D m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e a b s o l u t e c h i r a l i t y o f n a t u r a l p r o d u c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 3 T h e i n d u c e d c h i r a l i t y o f b i p h e n o l u p o n b i n d i n g t o c h i r a l a m i n e . . . . . . . . . . . . 2 6 6 D e t e r m i n a t i o n o f s t e r e s o c h e m i s t r y o f c h i r a l a l c o h o l s b y E C C D . . . . . . . . . . . . 2 6 6 x x i i F i g u r e 5 - 1 6 F i g u r e 5 - 1 7 F i g u r e 5 - 1 8 F i g u r e 5 — 1 9 F i g u r e 5 - 2 0 F i g u r e 5 - 2 1 F i g u r e 6 - 1 F i g u r e 6 - 2 F i g u r e 6 - 3 F i g u r e 6 - 4 F i g u r e 6 - 5 F i g u r e 6 - 6 F i g u r e 6 - 7 F i g u r e 6 - 8 D e t e r m i n a t i o n o f a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y O f o r g a n i c c o m p o u n d s u s i n g d i f f e r e n t c h r o m o p h o r i c h o s t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 8 D e r i v a t i z a t i o n m e t h o d f o r a n a l y s i s o f a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n s o f a m i n o a c i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 9 M e c h a n i s m o f c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s o c c u r r i n g u p o n r e d u c t i o n o r o x i d a t i o n o f t h e m e t a l c e n t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 0 S t r u c t u r e a n d s c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f a p o r p h y r i n t w e e z e r . . . . . . . . . . . . . 2 7 1 A s s i g n m e n t o f a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n o f a c y c l i c c h i r a l d i a m i n e s u s i n g E C C D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 2 U s e o f a c a r r i e r m o l e c u l e t o d e t e r m i n e t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f c h i r a l m o n o a m i n e b y E x c i t o n C o u p l i n g C i r c u l a r D i c h r o i s m . . . . . . . . . . . . . 2 7 4 M - a n d P — h e l i c a l c o n f o r m a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 6 D i p y r r o m e t h e n e a n d b i s - p y r i d i n e u n i t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 7 S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e d i a s t e r e o t o p i c d i f f e r e n t i a t i o n u p o n l i g a t i o n O f c h i r a l a m i n e s t o c o m p l e x e s o f Z n ( H ) w i t h d i p y r r o m e t h e n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 8 S t r u c t u r e s o f d i p y r r o m e t h e n e u n i t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 9 T h e Z - s p - c o n f o r m e r ( s y n , d i h e d r a l a n g l e i s 1 0 ° ) i s 1 2 k J / m o l e m o r e S t a b l e t h a n t h e E - S p - c o n f o r m e r ( a n t i , d i h e d r a l a n g l e i s 3 5 ° ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 9 R e p o r t e d c r y s t a l s t r u c t u r e s o f d i p y r r o m e t h e n e s w i t h v a r i o u s m e t a l s . . . . . 2 9 2 S t r u c t u r e o f D T M P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 3 U V s p e c t r a i n M e O H O f D T M P , D T M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 , D T M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v R - C I — I E A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 4 x x i i i F i g u r e 6 - 9 F i g u r e 6 - 1 0 F i g u r e 6 - 1 1 F i g u r e 6 - 1 2 F i g u r e 6 - 1 3 F i g u r e 6 - 1 4 F i g u r e 6 — 1 5 F i g u r e 6 - 1 6 F i g u r e 6 - 1 7 F i g u r e 6 - 1 8 F i g u r e 6 - 1 9 F i g u r e 6 - 2 0 U V s p e c t r a o f D T M P i n M e O H , D T M P i n C H C 1 3 , D T M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 i n C H C 1 3 a n d D T M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O ) 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v R — C H E A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 5 U V ( A ) a n d C D ( B , C ) S p e c t r a o f D T M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v R — C H E A , f o l l o w e d w i t h t i m e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 7 N M R s p e c t r a o f D T M P + Z n ( C l O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v R - C H E A , i n C D C 1 3 , f o l l o w e d w i t h t i m e . 1 . F u l l s p e c t r u m ; I ] . V i n y l i c r e g i o n . . . . . . . . . . . . 2 9 9 C D s p e c t r u m o f D T M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v S - M B A . . . . . . 3 0 1 S t r u c t u r e o f D E M P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 2 U V t r a c e s i n C H C 1 3 O f : D E M P ; D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 ; D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v R - C I - I E A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 3 C D s p e c t r a i n C H C 1 3 o f D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v R - C H E A o r S - S H E A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 4 U V S p e c t r u m o f D E M P ( 2 1 0 ’ 6 M ) i n C H C 1 3 w i t h t i m e . T h e p e a k a t 4 4 8 n m i s d e c r e a s i n g w h i l e a p e a k a t 4 8 8 n m i s g r o w i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 6 U V s p e c t r a O f D E M P i n C H C 1 3 , a f t e r 1 h a n d a f t e r t h e a d d i t i o n O f 1 e q u i v N 3 3 ( 4 3 7 n m ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 7 U V t r a c e s i n C H C 1 3 o f : 1 . D E M P H B r ; 2 . C r y s t a l s o f Z n ( D E M P ) 2 ; 3 . D E M P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 7 N M R S p e c t r a i n C D C I 3 o f : A . D E M P H B r ; B . D E M P ; C . C r y s t a l s o f D E M P - Z n ( C l O 4 ) 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 8 N M R s p e c t r a i n C D C l 3 o f : A . D E M P ; B . C r y s t a l s o f D E M P - Z n ( C l O 4 ) 2 ; C . D E M P + 0 . 5 e q Z n ( C l O 4 ) 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 0 x x i v F i g u r e 6 - 2 1 F i g u r e 6 - 2 2 F i g u r e 6 - 2 3 F i g u r e 6 - 2 4 F i g u r e 6 - 2 5 F i g u r e 6 - 2 6 F i g u r e 6 - 2 7 F i g u r e 6 - 2 8 F i g u r e 6 - 2 9 F i g u r e 7 — 1 F i g u r e 7 - 2 N M R s p e c t r a i n C D C 1 3 o f : A . D E M P ; B . D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 ; C . D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v R - C H E A ; D . D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + ( 1 - 4 ) e q u i v R - C H E A ; E . R - C H E A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 1 U V S p e c t r a i n b e n z e n e o f D E M P ( 4 5 5 n m , 4 8 9 n m ) , D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 ( 4 5 5 n m , 4 8 9 n m ) a n d D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v R - C H E A ( 3 6 5 n m , 4 9 1 n m ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 3 C D s p e c t r a o f D E M P - Z n i n t h e p r e s e n c e o f R o r S c y c l o h e x y l e t h y l a m i n e i n b e n z e n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 4 P r o p o s e d m e c h a n i s m f o r d i a s t e r e o m e r i c d i f f e r e n t i a t i o n u p o n l i g a t i o n o f a c h i r a l a m i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 5 P h o t o o x i d a t i o n p r o d u c t s o f d i p y r r o m e t h e n e s i n s o l u t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 8 S t r u c t u r e s o f B i s p y r i d i n e u n i t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 1 R e p r e s e n t a t i v e c r y s t a l s t r u c t u r e s O f b i s p y r i d i n e s w i t h v a r i o u s m e t a l s . . . 3 2 2 T h e E C C D s p e c t r u m o f b i p h e n y l d e p e n d s o n t h e d e g r e e o f c o n j u g a t i o n b e t w e e n t h e t w o r i n g s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 3 U V s p e c t r a o f : A . D D P i n M e C N ; D D P + 0 . 5 e q u i v Z n B r z ; D D P + 0 . 5 e q u i v Z n B r z + 0 . 5 e q u i v S - C H E A ; B . D M P B i n d i o x a n e ; D M P B + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 ; D M P B + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v S - C H E A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 5 S u g g e s t e d p s e u d o - c a g e t r i p o d a l s t r u c t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 9 P o s s i b l e c o n f o r m a t i o n s o f h o s t - m e t a l c o m p l e x e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 9 X X V F i g u r e 7 - 3 S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f d i a s t e r e o m e r i c d i f f e r e n t i a t i o n u p o n c o o r d i n a t i o n o f a c h i r a l a m i n e t o p r o c h i r a l h e l i c a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 1 F i g u r e 7 - 4 U V s p e c t r a o f T M Q A i n t h e p r e s e n c e o f m e t a l a t o m s a n d c h i r a l a m i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 7 F i g u r e 7 - 5 N M R s p e c t r a i n C D C 1 3 o f : A . T M Q A ; B . T M Q A + 1 e q u i v Z n B r z ; C . T M Q A + 1 e q u i v Z n B r z + 1 e q u i v R - C H E A ; D . Z n ( C l O 4 ) 2 + ( 1 - 4 ) e q u i v R - C H E A ; E . R - C H E A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 7 F i g u r e 7 - 6 C r y s t a l s t r u c t u r e o f ( T M Q A ) Z Z n 2 C 1 2 N a P F 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 0 F i g u r e 7 - 7 N M R s p e c t r a i n C D C 1 3 , i n t h e p r e s e n c e o f : A . D Q B A ; B . D Q B A + 1 e q u i v Z n B r z ; C . D Q B A + 1 e q u i v Z n B r z + 1 e q u i v R - C H E A ; D . Z n ( C l O 4 ) 2 + ( 1 - 4 ) e q u i v R - C H E A ; E . R - C H E A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 3 F i g u r e 7 — 8 S t r u c t u r e o f T M Q M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 4 F i g u r e 7 - 9 T r i o x o a d a m a n t a n e f o r m o f a l d e h y d e 1 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 1 F i g u r e 7 - 1 0 N M R S p e c t r a i n C D C l 3 o f : A . T M Q M ; B . T M Q M + 1 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 ; C . T M Q M + 1 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 1 e q u i v R - C H E A ; D . Z n ( C l O 4 ) 2 + ( 1 - 4 ) e q u i v R - C H E A ; E . R - C H E A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 4 F i g u r e 7 - 1 1 G r a p h i c a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e d e s h i e l d i n g e f f e c t ( A 5 ) o n e a c h o f t h e T M Q M p r o t o n s u p o n c o m p l e x a t i o n t o Z n + 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 7 F i g u r e 7 - 1 2 N M R s p e c t r a i n C D C l 3 o f : A . Q u i n o l i n e ; B . Z n ( C l O 4 ) 2 + 4 e q u i v q u i n o l i n e ; C . Z n ( C l O 4 ) 2 + 3 e q u i v q u i n o l i n e + 1 e q u i v R - C H E A ; D . Z n ( C l O 4 ) 2 + 2 e q u i v q u i n o l i n e + 2 e q u i v R - C H E A ; E . Z n ( C l O 4 ) 2 + 1 e q u i v q u i n o l i n e + 3 e q u i v R - C H E A ; F . Z n ( C I O 4 ) 2 + 4 e q u i v R - C H E A ; G . R - C H E A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 8 x x v i F i g u r e 7 - 1 3 N M R s p e c t r a i n C D C 1 3 o f : A . Q u i n o l i n e ; B . Z n ( C l O 4 ) 2 + 1 e q u i v q u i n o l i n e ; C . Z n ( C l O 4 ) 2 + 2 e q u i v q u i n o l i n e ; D . Z n ( C l O 4 ) 2 + 3 e q u i v q u i n o l i n e ; E . Z n ( C l O 4 ) 2 + 4 e q u i v Q u i n o l i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 0 F i g u r e 7 - 1 4 N M R S p e c t r a i n C D C 1 3 o f : A . R - C H E A ; B . Z n ( C l O 4 ) 2 + 1 e q u i v R - C H E A ; C . Z n ( C l O 4 ) 2 + 4 e q u i v R - C H E A ; D . Z n ( C l O 4 ) 2 + 8 e q u i v R - C H E A ; E . Z n ( C I O 4 ) 2 + 1 e q u i v R - C H E A + 1 e q u i v q u i n o l i n e ; F . Q u i n o l i n e + 1 e q u i v R - C H E A ; G . T M Q M + 1 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 1 e q u i v R - C H E A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 2 F i g u r e 7 - 1 5 N M R s p e c t r a i n C D C 1 3 o f : A . R - C I - I E A + 1 e q u i v b e n z e n e ; B . R - C H E A ; C . R - C H E A + 1 e q u i v q u i n o l i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 F i g u r e 7 - 1 6 C r y s t a l s t r u c t u r e o f [ T M Q M 1 1 2 ] + 2 ( C 1 0 4 ) 2 ' 2 H 2 0 C H C 1 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 5 F i g u r e 7 - 1 7 T r a n s f e r o f c h i r a l i t y t h r o u g h S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 6 F i g u r e 7 - 1 8 L e s s s t e r i c a l l y h i n d e r e d k e t o n e 3 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 7 F i g u r e 7 - 1 9 A l d e h y d i c s y n t h e t i c t a r g e t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 7 F i g u r e 7 - 2 0 A l d e h y d e 4 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 4 x x v i i S c h e m e 2 - 1 S c h e m e 2 - 2 S c h e m e 4 - 1 S c h e m e 6 - 1 S c h e m e 7 - 1 S c h e m e 7 - 2 S c h e m e 7 - 3 S c h e m e 7 - 4 S c h e m e 7 - 5 S c h e m e 7 - 6 S c h e m e 7 - 7 S c h e m e 7 — 8 S c h e m e 7 - 9 S c h e m e 7 - 1 0 S c h e m e 7 - 1 1 S c h e m e 7 - 1 2 S c h e m e 7 - 1 3 S c h e m e 7 - 1 4 S c h e m e 7 - 1 5 S c h e m e 7 - 1 6 L I S T O F S C H E M E S M e c h a n i s m o f a c t i o n o f c y a n o g e n b r o m i d e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 4 R e a c t i o n o f i o d o a c e t a m i d e w i t h C y s r e s i d u e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 5 V a r i o u s e q u i l i b r i u m s i n v o l v e d i n t h e f o r m a t i o n a n d p r o t o n a t i o n o f a r e t i n a l S c h i f f b a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 4 S y n t h e s i s o f D M P B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 4 S y n t h e s i s o f T M Q A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 2 S y n t h e s i s o f D Q B A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 2 F i r s t a t t e m p t e d s y n t h e s i s O f T M Q M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 5 R e t r o s y n t h e t i c a n a l y s i s o f T M Q M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 6 S u g g e s t e d m e c h a n i s m f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e q u i n o l i n e r i n g . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 6 S y n t h e s i s o f a r o m a t i c a m i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 7 F o r m a t i o n o f q u i n o l i n e r i n g s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 8 S y n t h e s i s a n d s u g g e s t e d m e c h a n i s m f o r q u i n o l i n e 2 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 9 F o r m a t i o n o f q u i n o l i n e r i n g s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 0 S y n t h e s i s o f T M Q M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 2 T o w a r d s t h e s y n t h e s i s o f a l d e h y d e 3 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 8 S y n t h e s i s O f a c e t a l 4 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 0 O n e c a r b o n h o m o l o g u e o f a l d e h y d e 3 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 2 S y n t h e s i s o f a l c o h o l 4 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 3 S y n t h e s i s o f a l c o h o l 5 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 4 S y n t h e s i s o f a l d e h y d e 4 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 6 x x v fi i A m i n o A c i d s A l a , A A r g , R A s n , N A s p , D C y s , C G l n , Q G l u , E H i s , H L e u , L L y s , K P h e , F P r o , P T h r , T T r p , W T y r , Y V a l , V K E Y T O S Y M B O L S O R A B B R E V I A T I O N S A n g s t r o m E x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t M a x i m a l w a v e l e n g t h A b s o r b a n c e A l a n i n e A r g i n i n e A s p a r a g i n e A s p a r t i c a c i d C y s t e i n e G l u t a m i n e G l u t a m i c a c i d H i s t i d i n e L e u c i n e L y s i n e P h e n y l a l a n i n e P r o l i n e T h r e o n i n e T r y p t o p h a n T y r o s i n e V a l i n e x x i x A I B N A m p A S R t h c a t C D C E c G M P C H E A C l m C R A B P C R A L B P C R B P D a D C C D D P D E M P D M F D M S O D M P B D N A D Q B A A z o b i s i s o b u t y r o n i t r i l e A m p i c i l i n A n a b a e n a S e n s o r y R h o d o p s i n B a c t e r i o r h o d o p s i n C a t a l y t i c a m o u n t C i r c u l a r D i c h r o i s m C o t t o n E f f e c t C y c l i c G u a n i d i n e M o n o p h o s p h a t e C y c l o h e x y l e t h y l a m i n e C h l o r a m p h e n i c o l C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n C e l l u l a r R e t i n a l B i n d i n g P r o t e i n C e l l u l a r R e t i n o l B i n d i n g P r o t e i n D a l t o n D i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e 2 , 9 - D i m e t h y 1 - 4 , 7 d i p h e n y l - 1 , 1 0 p h e n a n t h r o l i n e 4 , 4 ’ - D i e t h y l - 3 , 5 , 3 ’ , 5 ’ - t e t r a m e t h y l - 1 H , 2 ’ H , 2 , 2 ’ m e t h o n y l y l i d e n e - b i s p y r r o l e D i m e t h y l f o r r n a m i d e D i m e t h y l s u l f o x i d e 6 , 6 ’ D i m e t h y l - 4 , 4 ’ b i s ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) 2 , 2 ’ b i p y r i d i n e D e o x y r i b o n u c l e i c a c i d D i q u i n a l d y l - t b e n z y l a m i n e X X X D T M P D T T F A B P F P L C F Q G D P G T P G P C R H P L C i L B P M A L D I - T O F M B A m C P B A 4 , 4 ’ - D i - C 1 2 - 3 , 5 , 3 ’ , 5 ’ - t e t r a m e t h y l - 1 H , 2 ’ H , 2 , 2 ’ m e t h o n y l y l i d e n e - b i s p y r r o l e D i t h i o t h r e i t o l F a t t y A c i d B i n d i n g P r o t e i n F a s t P r o t e i n L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y F a s t - Q , q u a t e r n a r y a m m o n i u m r e s i n G u a n i d i n e D i p h o s p h a t e G u a n i d i n e T r i p h o s p h a t e G - P r o t e i n C o u p l e d R e c e p t o r H o u r H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y I n t r a c e l l u l a r L i p i d B i n d i n g P r o t e i n I s o p r o p y l t h i o g a l a c t o s i d e L u r i a b e r t a n i L i t e r M a t r i x A s s i s t e d L a s e r D e s o r p t i o n I o n i z a t i o n - T i m e O f F l i g h t M e t h y l b e n z y l a m i n e m - C h l o r o p e r b e n z o i c a c i d M i l l i l i t e r M i c r o l i t e r N - B r o m o s u c c i n i m i d e N a p h t h y l e t h y l a m i n e N a n o m e t e r x x x i n M N M O o / n P A G E P B S P C C P C R P D E P P m P S B s t O H P ) ’ , P Y T R A R B P R h R t r t , R T S B S B A S D S S R T C A N a n o m o l a r N - m e t h y l m o r p h o l i n e - N - o x i d e N u c l e i c M a g n e t i c R e s o n a n c e O v e r n i g h t P o l y A c r y l a m i d e G e l E l e c t I O p h o r e s i S P h o s p h a t e B u f f e r S a l i n e P y r i d i n i u m c h l o t o c h r o m a t e P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n P h o s p h o d i e s t e r a s e P a r t s p e r m i l l i o n P r o t o n a t e d S c h i f f b a s e p - t u l u e n e s u l f o n i c a c i d P y r i d i n e R e t i n o i c a c i d R e t i n o i d b i n d i n g p r o t e i n R h o d o p s i n R e t i n a l R o o m t e m p e r a t u r e S c h i f f b a s e S e c - b u t y l a m i n e S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e S e n s o r y R h o d o p s i n T r i c h l o r o a c e t i c a c i d x x x i i T F A T M Q A T M Q M T P A P v i s W T X S T r i f l u o r o a c e t i c a c i d T e t r a h y d r o f u r a n T r i s - 2 m e t h q u u i n o l i n e - a m i n e T r i s — 2 m e t h q u u i n o l i n e - m e t h a n e T e t r a - n - p r o p y l a m m o n i u m p e r r u t h e n a t e U l t r a v i o l e t l i g h t V i s i b l e l i g h t W i l d t y p e p r o t e i n E x c e s s x x x i i i C h a p t e r 1 I n t r o d u c t i o n 1 . 1 T h e P r i n c i p l e s o f V i s i o n “ T h e e y e i s t h e w i n d o w o f t h e h u m a n b o d y t h r o u g h w h i c h i t f e e l s i t s w a y a n d e n j o y s t h e b e a u t y o f t h e w o r l d . ” L e o n a r d o D a V i n c i V i s i o n , t h e a c t o r s e n s e O f s i g h t , i s o n e o f t h e m o s t f a s c i n a t i n g f u n c t i o n s o f t h e h u m a n m a c h i n e r y . T h i s c o m p l i c a t e d p r o c e s s r e q u i r e s n u m e r o u s c o m p o n e n t s o f t h e h u m a n e y e a n d b r a i n t o w o r k t o g e t h e r i n a n e x t r e m e l y e f f i c i e n t m a n n e r . F o r e a c h s i n g l e v i e w o n e e x p e r i e n c e s , t h e l i g h t w a v e s e m i t t e d f r o m t h e v a r i o u s o b j e c t s a r e c a p t u r e d b y t h e e y e a n d t r a n s m i t t e d a s e l e c t r i c a l i m p u l s e s t o t h e b r a i n l e a d i n g t o r e c o g n i t i o n o f b o t h i m a g e s a n d c o l o r s . 1 C o n s i d e r i n g t h e c o n t i n u o u s n a t u r e o f S i g h t , t h e a b o v e p r o c e s s h a s t o b e c o n s t a n t l y r e p e a t e d , w i t h e q u a l e f f i c a c y , f o r a s l o n g a s w e k e e p o u r e y e s o p e n . T h e q u e s t f o r u n d e r s t a n d i n g t h e p r i n c i p l e s O f v i s i o n t r a c e s b a c k t o a n c i e n t G r e e c e . F r o m E u c l i d ( c a . 3 0 0 B C ) t o D e m o c r i t u s ( c a . 3 5 0 B C ) a n d P l a t o ( c a . 4 5 0 B C ) b o t h m a t h e m a t i c a l a n d p h i l o s o p h i c a l e x p l a n a t i o n s o f t h e b a s i c o p t i c a l p h e n o m e n a w e r e p r o v i d e d . 2 H o w e v e r , t h e t h e o r y m o r e i n l i n e w i t h t h e m o d e m c o n c e p t i o n s o f l i g h t a n d v i s i o n o r i g i n a t e d f r o m A r i s t o t l e ( c a . 3 3 0 B C ) a n d w a s e x t e n d e d b y h i s s t u d e n t T h e o p h r a s t u s ( c a . 3 0 0 B C ) . L i g h t , g e n e r a t e d b y t h e s u n , w a s r e fl e c t e d b y t h e O b j e c t s b u t r e q u i r e d a m e d i u m , a i r , t h r o u g h w h i c h i t t r a v e l e d b e f o r e i t c o u l d b e r e c e i v e d b y t h e e y e . 3 T h i s t h e o r y , n o t v e r y p o p u l a r a t i t s t i m e , w a s i m p r o v e d t h r o u g h o u t t h e c e n t u r i e s a n d r e v i s i t e d b y t h e I s l a m i c s c h o l a r s A l - K i n d i ( c a 8 6 0 ) a n d I b n A l - H a y t h a m ( c a 9 6 5 ) . 2 D u r i n g t h e M i d d l e A g e s , i n s t e a d o f p o s t u l a t i n g t h a t t h e o b j e c t i t s e l f h a d i n n a t e p r o p e r t i e s t h a t a l l o w e d v i s i o n , t h e p o p u l a r t h e o r y o f t h e t i m e s u g g e s t e d t h a t t h e v i e w e r ' s e y e s s e n t o u t e m i s s i o n s t o t h e o b j e c t a n d t h a t t h o s e e m i s s i o n s e n a b l e d v i s i o n t o o c c u r . I t w a s n o t u n t i l 1 6 0 4 t h a t J o h a n n e s K e p l e r ( 1 5 7 1 - 1 6 3 0 ) r e v i s i t e d t h e o l d t h e o r i e s a n d e s t a b l i s h e d t h e fi r s t c o m p l e t e e x p l a n a t i o n o f t h e O p t i c s o f t h e e y e . 4 I n 1 7 0 4 I s a a c N e w t o n ( 1 6 4 2 - 1 7 2 7 ) p u b l i s h e d h i s a p p r o a c h i n O p t i c s , 5 a n d t h e i n t e r e s t o n t h e s u b j e c t r e m a i n e d i n t e n s e u n t i l t h e 1 8 3 0 ’ s w h e n i t w a s p r o v e d t h a t t h e p h o t o r e c e p t i o n i n t h e e y e o c c u r s i n t h e r o d a n d c o n e c e l l s o f t h e r e t i n a , t h e t i s s u e l i n i n g t h e i n n e r p a r t o f t h e e y e , r a t h e r t h a n t h e l e n s . I n 1 8 7 8 F . W . K u h n e ( 1 8 3 7 - 1 9 0 0 ) i s o l a t e d a p r o t e i n o u t O f t h e r e t i n a , n o w k n o w n a s 6 T h r o u g h o u t t h e y e a r s t h e r e s e a r c h o n t h e r h o d o p s i n , t h e r o d c e l l ’ s f u n c t i o n a l p r o t e i n . t o p i c o f v i s i o n r e m a i n e d a c t i v e b u t i t w a s n o t u n t i l t h e 1 9 5 0 ’ s w h e n G e o r g e W a l d ( 1 9 0 6 - 1 9 9 7 ) a n d h i s c o w o r k e r s a t H a r v a r d P u p i l C o r n e a U n i v e r s i t y p i o n e e r e d o u r . L e n s u n d e r s t a n d i n g o f t h e m o l e c u l e s r e s p o n s i b l e f o r t h e fi r s t s t e p s i n t h e v i s i o n p r o c e s s ( 1 9 6 7 N o b e l P r i z e i n M e d i c i n e a n d P h y s i o l o g y ) . 7 V i t r e o u s fl u i d D u r i n g t h e l a s t h a l f o f t h e 2 0 t h R e t i n a c e n t u r y , t h e b a s i c p r i n c i p l e s o f t h e p r o c e s s o f v i s i o n w e r e e x t e n s i v e l y F i g u r e 1 ' 1 . T h e H u m a n E y e s t u d i e d a n d u n d e r s t o o d a t t h e m o l e c u l a r l e v e l . N o w a d a y s , w e k n o w t h a t w i t h i n t h e e y e , t h e c o r n e a , l e n s a n d t h e v i t r e o u s fl u i d , F i g u r e 1 - 1 , a r e t h e p r i m a r y c o m p o n e n t s r e s p o n s i b l e f o r f o c u s i n g t h e l i g h t w a v e s o n t o t h e r e t i n a s T h e r e t i n a i s l a y e r e d w i t h t h e p h o t o r e c e p t o r s , t h e r o d a n d t h e c o n e c e l l s ( F i g u r e 1 — 2 ) , r e s p o n s i b l e f o r c a p t u r i n g a n y 9 T h e h u m a n e y e i m a g e a n d s e n d i n g t h e s i g n a l t o t h e b r a i n t h r o u g h t h e o p t i c n e r v e . c o n t a i n s a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 m i l l i o n r o d c e l l s a n d a b o u t 6 m i l l i o n c o n e c e l l s . 1 0 T h e c o n e c e l l s a r e r e s p o n s i b l e f o r c o l o r ( p h o t o p i c ) v i s i o n a n d a r e b o t h q u i c k e r t o a d a p t t o d a r k e n v i r o n m e n t s ( ~ 1 0 m i n ) a n d m o r e s e n s i t i v e t o a b r o a d e r r a n g e o f w a v e l e n g t h s . T h e r o d c e l l s a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e d i m ( s c o t o p i c ) v i s i o n a n d , w h i l e t h e y t a k e l o n g e r t o a d a p t t o d a r k e n v i r o n m e n t s ( ~ 2 0 - 3 0 m i n ) , o n c e a d a p t e d t h e y a r e 5 0 0 t i m e s m o r e s e n s i t i v e t h a n t h e c o n e c e l l s . r o d T h e s t r u c t u r e s a n d fi m c t i o n c o n e o f b o t h r o d a n d c o n e c e l l s a r e d i s k v e r y s i m i l a r . l l A s s h o w n i n c y t o p l a s m F i g u r e 1 - 2 , t h e y a r e t h e t y p i c a l n u c l e u s c o n t a i n i n g c e l l s , b e a r i n g , m i t o c h o n d r i a . h o w e v e r , t w o u n i q u e f e a t u r e s : a n u c l e u s s y n a p t i c e n d i n g , w h e r e t h e n e u r a l s i g n a l s p a s s t h r o u g h t o t h e b r a i n f o r p r o c e s s i n g , a n d a o u t e r s e g m e n t , fi l l e d w i t h d i s k s m a d e — s y n a p s e o f a p h o s p h o l i p i d b i l a y e r . F i g u r e 1 - 2 . T h e R o d a n d C o n e C e l l s i n R e t i n a S p a n n i n g t h e b i l a y e r s o f t h e s e d i s k s i s a m e m b r a n e b o u n d p r o t e i n c a l l e d o p s i n , r e s p o n s i b l e f o r t h e v i s u a l s i g n a l t r a n s d u c t i o n . O p s i n , a l a r g e ( ~ 3 9 , 0 0 0 D a ) , h y d r o p h o b i c t r a n s - m e m b r a n e 7 - O t - h e l i c a l p r o t e i n , b e l o n g s t o t h e f a m i l y o f G - p r o t e i n c o u p l e d r e c e p t o r s ( G P C R S ) . G P C R S a r e t h e p r e d o m i n a n t m e m b e r s i n t h e c l a s s o f m e m b r a n e - b o u n d p r o t e i n s a n d a r e r e s p o n s i b l e f o r a v a r i e t y o f i m p o r t a n t b i o l o g i c a l f u n c t i o n s i n c l u d i n g s i g n a l t r a n s d u c t i o n a n d g e n e r e g u l a t o r y c o n t r o l . O p s i n , a s s h o w n i n F i g u r e 1 - 3 , i s b o u n d t o a c h r o m o p h o r e , r e t i n a l , t h e a l d e h y d i c f o r m o f V i t a m i n A , a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ( P S B ) v i a a L y s r e s i d u e , 1 2 a s fi r s t s u g g e s t e d b y C o l l i n s a n d M o r t o n b a c k i n 1 9 5 3 a n d 1 9 5 5 r e s p e c t i v e l y w ’ ' 4 I n h u m a n s a n d m o s t a n i m a l s t h a t c h r o m o p h o r e i s t h e l l - c i s i s o m e r o f r e t i n a l , w h i l e o t h e r f o r m s , s u c h a s d e h y d r O - r e t i n a l ( fi s h , a m p h i b i a n s a n d r e p t i l e s ) ' a n d h y d r o x y - r e t i n a l ( i n s e c t s ) l s d e r i v a t i v e s , a r e p r e s e n t i n t h e v i s u a l c y c l e o f o t h e r s p e c i e s . W h i l e i n t h e h o l o 4 — P l a s m a M e m b r a n e R h o d o p s i n O u t e r S e g m e n t _ . I n n e r ‘ S e g m e n t C y t o p l a s m i c S u r f a c e S y n a p t i c B o d y F i g u r e 1 - 3 . S c h e m a t i c R e p r e s e n t a t i o n o f R h o d o p s i n i n a R o d C e l l f o r m ( b o u n d t o r e t i n a l ) , t h e O p s i n p r o t e i n i s r e f e r r e d t o a s r h o d o p s i n ( R h ) . A l t h o u g h i t v a r i e s i n d i fi e r e n t s p e c i e s , e a c h r o d c e l l c o n t a i n s u p t o 1 7 0 0 d i s k s a n d e a c h d i s k u p t o 1 . 5 m i l l i o n r h o d o p s i n m o l e c u l e s . l 6 A t o n e t i m e , t h o u g h , o n e u s e s o n l y a b o u t 1 0 % o f t h e a v a i l a b l e r h o d o p s i n c o m p l e x e s , a l l o w i n g f o r t h e c o n t i n u o u s n a t u r e o f v i s i o n . F i g u r e 1 - 4 . S t e r e o v i e w o f t h e t r a n s - m e m b r a n e 7 - a - h e l i c a l G - p r o t e i n c o u p l e d r e c e p t o r r h o d o p s i n . T h e v i s u a l p r o c e s s b e g i n s i n t h e d a r k s t a t e w h e r e t h e c h r o m o p h o r e , l l - c i s - r e t i n a l , i s b o u n d a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e w i t h L y s 2 9 6 . T h e a b s o r p t i o n o f a p h o t o n r e s u l t s i n t h e i s o m e r i z a t i o n o f l l - c i s - r e t i n a l t o a l l - t r a n s - r e t i n a l , s e t t i n g i n m o t i o n a b i o c h e m i c a l c a s c a d e i n v o l v i n g t r a n s d u c i n ( a G p r o t e i n ) , p h o s p h o d i e s t e r a s e ( P D E ) a n d g u a n i s i n e 3 ’ , 5 ’ - c y c l i c m o n o p h o s p h a t e ( c G M P ) . 1 7 T h i s i s o m e r i z a t i o n , o b s e r v e d b y U V — v i s a n d o t h e r 1 8 - 2 2 2 3 - 2 7 s p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u e s , p r o c e e d s t h r o u g h a s e r i e s o f d i s c r e t e i n t e r m e d i a t e s . T h e fi r s t S t e p s o f t h i s t r a n s f o r m a t i o n a r e c o n t r o l l e d b y s t e r i c s , a s p h o t o r h o d o p s i n , a a l l - t r a n s h i g h l y d i s t o r t e d 4 8 0 n m h i g h l y d i s t o r t e d a l l - t r a n s P S B m o i e t y i s f o r m e d w i t h i n f e m t o s e c o n d s a f t e r i r r a d i a t i o n , ( F i g u r e 1 - 5 ) . T h e p h o t o r h o d o p s i n p r o d u c t r e l a x e s t o t h e fi r s t i s o l a b l e i n t e r m e d i a t e k n o w n a s b a t h o - r h o d o p s i n . 2 8 ’ 2 9 I n a m a t t e r o f n a n o s e c o n d s , l u m i - r h o d o p s i n i s f o r m e d , f o l l o w e d b y m e t a I a n d m e t a I I s t a t e s . T h e m e t a 1 1 s t a t e i s a n a l l - t r a n s u n p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e a s e v i d e n t b y i t s l a r g e U V - v i s b l u e s h i f t . ” 3 ' T h e v i s u a l t r a n s d u c t i o n , i . e . i n i t i a t i o n o f t h e s i g n a l i n g p a t h w a y i s t r i g g e r e d a t t h e m e t a 1 1 s t a t e . F i n a l l y , t h e i m i n e b o n d i s p r o t o n a t e d ( m e t a 1 1 1 s t a t e ) a n d h y d r o l y z e d t o a f f o r d f r e e a l l - t r a n s - r e t i n a l . T o c o m p l e t e t h e v i s u a l c y c l e , t h i s c h r o m o p h o r e i s t r a n s p o r t e d e l s e w h e r e a n d r e - i s o m e r i z e d t o t h e l l - c i s - i s o m e r r b e f o r e r e - e n t e r i n g t h e v i s u a l p r o c e s s . V e r y r e c e n t l y , t h e s t r u c t u r e s o f s o m e o f t h e r h o d o p s i n ’ s i n t e r m e d i a t e p h o t o p r o d u c t s h a v e b e e n d e fi n e d u s i n g e l e c t r o n 3 2 , 3 3 c r y s t a l l o g r a p h y . o p s i n a l l - t r a n s , 3 8 5 n m 1 1 - c i s , 4 9 8 n m H \ ~ / . 1 N 9 ) > 0 ° l e n . m e t a - l l , O 0 C 3 8 0 n m h v < 2 o o f 5 U n p r o t o n a t e d — > ’ ’ I n i t i a t e s V i s u a l . T r a n s d u c t i o n S c h i f f B a s e 1 1 1 2 1 + H + i - H + P h o t o . 5 7 0 n m m e t a l - 1 5 ° C l 1 . . l ~ s R S 1 2 H 4 9 7 n m B a t h e . - 1 4 0 ° C 5 4 3 n m " d i s t o r t e d t r a n s " F i g u r e 1 - 5 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e i n t e r m e d i a t e s o b s e r v e d i n t h e i s o m e r i z a t i o n o f 1 1 - c i s - r e t i n a l t o a l l - t r a n S - r e t i n a l i n r h o d o p s i n . F i g u r e 1 - 6 . T h e a c t i v a t i o n o f G — p r o t e i n t r a n s d u c i n G T P u p o n b i n d i n g t o t h e a c t i v a t e d r h o d o p s i n ( R ' ) . O n c e G D P a c t i v a t e d , t h e o r s u b u n i t o f t r a n s d u c i n a c t i v a t e s t h e A c t i v e P D E e n z y m e p h o s p h o d i e s t e r a s e ( P D E ) b y b i n d i n g a n d c l e a v i n g t h e y s u b u n i t . A c t i v e P D E c a t a l y z e s t h e h y d r o l y s i s o f c G M P t o G M P , w h i c h c a u s e s c h a n g e s i n i o n c o n c e n t r a t i o n s i n t h e c e l l a n d r e s u l t s i n a n e l e c t r i c a l s i g n a l b e i n g s e n t t o t h e b r a i n . T h e i s o m e r i z a t i o n o f l l - c i s - r e t i n a l t o t h e a l l - t r a n s f o r m , a t t h e m e t a 1 1 s t a t e , r e s u l t s i n a m a j o r c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e o f t h e p r o t e i n s t r u c t u r e , 3 4 w h i c h a l l o w s f o r t h e b i n d i n g ' 8 A s s h o w n i n F i g u r e 1 - 6 , t r a n s d u c i n ( T ) i s a n d a c t i v a t i o n o f t h e G - p r o t e i n t r a n d u c i n . c o m p o s e d o f O I , B a n d y s u b u n i t s , a s w e l l a s a G D P m o l e c u l e a s s o c i a t e d w i t h t h e O L - c o m p o n e n t . U p o n a d d i t i o n t o a c t i v a t e d r h o d o p s i n ( R * ) t h e G D P i s e x c h a n g e d f o r a G T P r e s u l t i n g i n t h e d e s t a b i l i z a t i o n o f t h e c o m p l e x a n d d i s s o c i a t i o n o f t h e O t - s u b u n i t . T a - G T P t h e n b i n d s t o t h e y - s u b u n i t o f P D E w h i c h r e s u l t s i n t h e a c t i v a t i o n o f t h e e n z y m e s l e a d i n g t o t h e h y d r o l y s i s o f c G M P t o G M P . S i n c e c G M P i s r e s p o n s i b l e f o r t h e r e g u l a t i o n o f t h e i o n c h a r m e l s i n t h e c e l l , h y d r o l y s i s f o r c e s t h e C a 2 + i o n c h a n n e l s i n t h e r o d / c o n e c e l l s ’ ” ' 3 7 T h e e l e c t r i c p o t e n t i a l o u t e r s e g m e n t t o c l o s e , h a l t i n g t h e fl o w o f C a 2 + i n t o t h e c e l l . f o r m e d d u e t o t h e C a 2 + c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t i s t r a n s m i t t e d a s a S i g n a l t h r o u g h t h e s y n a p t i c e n d o f t h e c e l l t o t h e b r a i n , w h e r e t h e v i s u a l i m a g e i s f o r m e d . ” 3 8 T h e p r o c e s s i s s h u t o f f w h e n r h o d o p s i n i s i n a c t i v a t e d b y t h e j o i n t a c t i o n o f p h o s p h o r y l a t i o n a n d a p r o t e i n , a p p r o p r i a t e l y n a m e d a r r e s t i n . 3 9 ' 4 l O v e r a l l , a s a p h o t o n o f l i g h t a c t i v a t e s t h e p h o t o r e c e p t o r , a s i n g l e i s o m e r i z a t i o n o f a d o u b l e b o n d t r i g g e r s a c a s c a d e o f e v e n t s , l e a d i n g t o v i s i o n . ” 4 5 E a c h p h o t o n c a n a c t i v a t e ~ 1 0 0 P D E m o l e c u l e s , e a c h o f w h i c h c a n h y d r o l y z e r o u g h l y 1 , 0 0 0 c G M P s . 4 6 ’ 4 7 T h e v i s u a l t r a n s d u c t i o n i s o n e O f t h e m o s t e f fi c i e n t a n d s e n s i t i v e b i o — p r o c e s s e s k n o w n , w i t h a 4 8 — 5 2 c a l c u l a t e d q u a n t u m y i e l d o f ~ 0 . 6 7 , a n d e x p l a i n s t h e e x c e l l e n t s e n s i t i v i t y w h i c h a l l o w s u s t o s e e e v e n i n t h e d a r k e s t o f e n v i r o n m e n t s . 1 . 2 T h e P r i n c i p l e s o f C o l o r V i s i o n “ M e r e c o l o r , u n s p o i l e d b y m e a n i n g , a n d u n a l l i e d w i t h d e fi n i t e f o r m , c a n s p e a k t o t h e s o u l i n a t h o u s a n d d i fl e r e n t w a y s . ’ O s c a r W i l d e A l o n g w i t h t h e q u e s t f o r u n d e r s t a n d i n g t h e p r o c e s s O f v i s i o n a s a n a c t o f S i g h t , r e s e a r c h e r s o v e r t h e y e a r s b e c a m e i n t e r e s t e d i n e l u c i d a t i n g t h e m e c h a n i s m b y w h i c h w e a r e a b l e t o p e r c e i v e t h e w o r l d a s c o l o r f u l . C o l o r v i s i o n i s t h e a b i l i t y t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n l i g h t s e x c l u s i v e l y o n t h e b a s i s o f d i f f e r e n c e s i n s p e c t r a l d i s t r i b u t i o n s . E a r l y o n , i t w a s a p p a r e n t t h a t t h e r e s h o u l d b e a t l e a s t t w o o r m o r e d i f f e r e n t p h o t o r e c e p t o r s w i t h d i f f e r e n t a b s o r p t i o n S p e c t r a p r e s e n t i n t h e e y e . B a c k i n 1 8 0 2 T h o m a s Y o u n g ( 1 7 3 3 - 1 8 2 9 ) p o s t u l a t e d t h e e x i s t e n c e o f t h r e e d i f f e r e n t p h o t o r e c e p t o r s i n t h e h u m a n e y e s , t o a c c o u n t f o r c o l o r m i x t u r e e x p e r i m e n t s i n w h i c h a l m o s t a l l c o l o r s c a n b e a c h i e v e d b y m i x i n g t h e t h r e e p r i m a r i e s ( r e d , b l u e a n d y e l l o w ) . 5 3 T h e m i s c o n c e p t i o n t h a t t h e t h r e e p r i m a r y c o l o r s a r e e s s e n t i a l f o r c o l o r v i s i o n p e r s i s t e d t h r o u g h t h e b e g i n n i n g o f t h e 2 0 ‘ h c e n t u r y , w h e n t h e b a s i c p r i n c i p l e s o f c o l o r v i s i o n w e r e e l u c i d a t e d . W i t h i n v e r t e b r a t e s , t h e r e q u i r e m e n t s f o r c o l o r v i s i o n h a v e b e e n m e t i n d i f f e r e n t w a y s , s u g g e s t i n g t h a t c o l o r v i s i o n h a s d e v e l o p e d i n d e p e n d e n t l y s e v e r a l t i m e s d u r i n g e v o l u t i o n . 5 4 N o w a d a y s , w e k n o w t h a t p r i m a t e s u t i l i z e t h r e e d i s t i n c t c h r o m o p h o r i c p r o t e i n s , n a m e l y r e d , g r e e n , a n d b l u e r h o d o p s i n , l o c a t e d i n t h e c o n e c e l l s , i n o r d e r t o d e t e c t a n d r e g u l a t e t h e m u l t i t u d e o f t h e l i g h t w a v e l e n g t h s a n d a c h i e v e c o l o r d i f f e r e n t i a t i o n ( t r i c h r o m a c y ) . 5 5 E a c h o f t h e f o u r O p s i n s p r e s e n t i n t h e h u m a n e y e , r e d , g r e e n a n d b l u e c o n e O p s i n s 1 0 0 B l u e R h o d o p s i n 8 0 ' 4 2 0 n m R o d R h o d o p s i n 6 0 ' — 5 0 0 n m " / A o L G r e e n R h o d o p s i n 4 0 — 5 3 0 n m 4 2 ° _ _ R e d R h o d o p s i n — 5 6 0 n m 1 l l l l 1 I l l l l l 1 [ 4 | 3 6 0 4 0 0 4 4 0 4 8 0 5 2 0 5 6 0 6 0 0 n m F i g u r e 1 - 7 . E a c h o f t h e f o u r r h o d o p s i n c o m p l e x e s ( b l u e , g r e e n . r e d a n d r o d ) a b s o r b a t a d i f f e r e n t w a v e l e n g t h , c o m p r i s i n g t h e e n t i r e v i s i b l e s p e c t r u m . 9 S h i f t s t o ~ 3 6 5 n m i n s o l u t i o n . W h e n p r o t o n a t e d 3 0 ” “ b a s e a n d r o d O p s i n , b i n d t h e s a m e c h r o m o p h o r e , l l - c i s - r e t i n a l , i n a S i m i l a r f a s h i o n a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e v i a a L y s r e s i d u e . H o w e v e r , e a c h o f t h e m p r o d u c e s a d i s t i n c t l y d i f f e r e n t m a x i m a l a b s o r b a n c e i n t h e p r e s e n c e o f t h e s a m e r e t i n a l m o l e c u l e . I t i s t h e u n i q u e a b i l i t y o f t h e s e p r o t e i n s t o e l i c i t d i f f e r e n t p r o p e r t i e s f r o m t h e s a m e s u b s t r a t e t h a t a l l o w s u s t o s e e t h e w h o l e v i s i b l e s p e c t r u m . T h r o u g h o u t t h e y e a r s d i f f e r e n t a p p r o a c h e s a n d t e c h n i q u e s h a v e b e e n u s e d i n a n a t t e m p t t o e l u c i d a t e t h e m e c h a n i s m o f c o l o r v i s i o n , m o s t o f w h i c h i n v o l v e d v a r i o u s s p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u e s . ” 5 9 H u m a n r o d r h o d o p s i n a b s o r b s a t 5 0 0 n m w h i l e t h e c o n e O p s i n s , r e d , g r e e n a n d b l u e a b s o r b a t 5 6 0 n m , 5 3 0 n m a n d 4 2 0 n m , r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e l - 7 ) . 6 0 4 5 3 I n a n e t h a n o l i c s o l u t i o n , t h e s p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e \ \ \ 1 1 - c i s - r e t i n a l c h r o m o p h o r e , l l - c i s - r e t i n a l , v a r y a t / ‘ \ L i t s d i f f e r e n t f o r m s a n d s t a t e s O f p r o t o n a t i o n . T h e U V - v i s a b s o r b a n c e , , 1 1 - c r s - r e t l n a l . S c h i f f b a s e o f t h e f r e e a l d e h y d e I S a t ~ 3 8 0 n m w h i l e u p o n f o r m a t i o n o f a n n - b u t y l a r n i n e i m i n e t h e s p e c t r u m b l u e 1 1 - c i s - r e t i n a l ’ \ / \ : c - z e ) t h e S c h i f f b a s e i s p r o t o n a t e d , t h e r e i s ) ( m a x ~ 4 4 0 n m a S i g n i f i c a n t r e d s h i f t i n g t o ~ 4 4 0 n m F i g u r e 1 - 8 . U V - v i s a b s o r b a n c e s o f 1 1 - c i s - r e t i n a l a s - 6 4 . 6 5 . ( F i g u r e 1 ' 8 ) ’ W h I C h u n d e r a f r e e a l d e h y d e ( 3 8 0 n m ) , a n - b u t y l a m i n e S c h i f f c o n t r o l l e d c o n c e n t r a t i o n a n d s o l v e n t b a s e ( 3 6 5 n m ) a n d a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ( 4 4 0 c o n d i t i o n s m a y s h i f t u p t o ~ 5 0 0 n m ) . 1 0 n m . “ ‘ 6 7 H o w e v e r , i t i s O b v i o u s t h a t t h e p r o t o n a t i o n o f t h e S c h i f f b a s e a l o n e c a n n o t a c c o u n t f o r t h e s p e c t r a l r a n g e O b s e r v e d w i t h i n t h e f o u r r h o d o p s i n m o l e c u l e s . T h e d i f f e r e n c e i n t h e a b s o r b a n c e O b s e r v e d f o r t h e v i s u a l p i g m e n t s , a s c o m p a r e d t o t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e o f 1 1 - c i s - r e t i n a l i n s o l u t i o n i s d e f i n e d a s o p s i n s h i f t a n d i s b e l i e v e d t o b e d u e t o s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s o f e a c h i n d i v i d u a l p r o t e i n w i t h t h e r e t i n y l i d e n e c h r o m o p h o r e . 6 8 ' 6 9 O v e r t h e l a s t f i f t y y e a r s s e v e r a l h y p o t h e s e s h a v e b e e n s u g g e s t e d t o e x p l a i n t h e o p s i n s h i f t . H o w e v e r , t o d a t e , n o c o m p l e t e , s a t i s f a c t o r y e x p l a n a t i o n h a s b e e n p r o v i d e d t o a c c o u n t f o r a l l t h e e x p e r i m e n t a l l y O b s e r v e d r e s u l t s . W h a t f o l l o w s i s a S h o r t s u m m a r y o f t h e n u m e r o u s a c c o m p l i s h m e n t s a c h i e v e d i n t h i s f i e l d . 1 . 3 R h o d o p s i n : S c h i f f B a s e F o r m a t i o n a n d W a v e l e n g t h R e g u l a t i o n A s m e n t i o n e d b e f o r e , r h o d o p s i n i s a l a r g e , m e m b r a n e - b o u n d p r o t e i n c o n s i s t i n g o f 3 4 8 a m i n o a c i d s a n d t w o o l i g o s a c c h a r i d e c h a i n s . R e t i n a l , t h e f u n c t i o n a l c h r o m o p h o r e o f r h o d o p s i n w a s fi r s t i s o l a t e d i n 1 9 3 3 b y G e o r g e W a l d , 7 0 b u t i t w a s n o t u n t i l 1 9 4 4 t h a t M o r t o n a n d G o d d w i n s u g g e s t e d t h a t t h e i s o l a t e d c o m p o u n d w a s a c t u a l l y t h e a l d e h y d i c f o r m o f V i t a m i n A . 7 1 T h e c o n n e c t i o n b e t w e e n V i t a m i n A d e f i c i e n c y a n d n i g h t b l i n d n e s s w a s k n o w n s i n c e W o r l d W a r I b u t i t w a s n o t u n t i l t h e i s o l a t i o n o f r e t i n a l t h a t t h e r e a s o n b e c a m e c l e a r . D u r i n g t h e l a t e 1 9 6 0 ’ s B o w n d s a n d A k h t a r i n d e p e n d e n t l y p r o v i d e d e v i d e n c e f o r t h e f o r m a t i o n o f a n i m i n e b o n d b e t w e e n t h e a l d e h y d i c c h r o m o p h o r e a n d a n u c l e o p h i l i c L y s 7 2 . 7 3 r e s i d u e w i t h i n t h e p r o t e i n . T h e e x a c t S i t e o f a t t a c h m e n t w a s d e t e r m i n e d t h r o u g h a l l p r o t e o l y t i c f r a g m e n t a t i o n a n d f o u n d t o b e L y s 2 9 6 . B a c k i n 1 9 5 8 H u b b a r d w a s t h e fi r s t t o s u g g e s t t h a t t h e S c h i f f b a s e f o r m e d b e t w e e n t h e o p s i n a n d t h e r e t i n a l s u b s t r a t e h a d t o b e 7 4 S p e c i fi c e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s w i t h t h e p r o t e i n c a n i n d u c e a p r o t o n a t e d . d e l o c a l i z a t i o n o f t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ( P S B ) c h a r g e t h r o u g h o u t t h e p o l y e n e b a c k b o n e l e a d i n g t o a l t e r e d S p e c t r o s c o p i c b e h a v i o r . T h i s a p p r o a c h m a r k s t h e fi r s t a t t e m p t a t a l o g i c a l e x p l a n a t i o n o f t h e o p s i n s h i f t . T h e p r o t o n a t i o n o f t h e S c h i f f b a s e w a s u n a m b i g u o u s l y c o n fi r m e d s e v e r a l y e a r s l a t e r t h r o u g h r e s o n a n c e R a m a n s t u d i e s p e r f o r m e d b y C a l l e n d e r . ” I n 1 9 7 9 H o n i g s u g g e s t e d t h a t a n e g a t i v e l y c h a r g e d a m i n o a c i d , p r o b a b l y i n t h e f o r m o f a c a r b o x y l a t e , c o u l d s e r v e a s a c o u n t e r a n i o n , s u i t a b l y p l a c e d i n t h e v i c i n i t y o f t h e 6 i m i n e n i t r o g e n . 7 I n a d d i t i o n , i n a g r e e m e n t w i t h H u b b a r d ’ s e a r l i e r s u g g e s t i o n , h e b e l i e v e d t h a t a n o t h e r n e g a t i v e l y c h a r g e d r e s i d u e c o u l d b e p l a c e d a l o n g t h e p o l y e n e . N M R s t u d i e s , c a r r i e d o u t b y N a k a n i s h i a n d o t h e r s v a l i d a t e d o f t h i s s u g g e s t i o n . ” 7 9 A l t h o u g h t h e e x i s t e n c e O f a c a r b o x y l a t e a c t i n g a s P S B c o u n t e r a n i o n w a s w i d e l y a c c e p t e d , i t s e x a c t p o s i t i o n w a s n o t i d e n t i fi e d u n t i l 1 9 8 9 w h e n t h r e e i n d e p e n d e n t s t u d i e s i n d i c a t e d t h a t G l u 1 1 3 , 8 0 a h i g h l y c o n s e r v e d . ; : ; : : : ‘ . ' . - N r e s i d u e w i t h i n v e r t e b r a t e O p s i n s , w a s t h e c o u n t e r 8 1 - 8 3 F i g u r e 1 - 9 . D i s t a n c e o f t h e c o u n t e r a n i o n i n b o v i n e r h o d o p s i n . U s i n g s i t e , , a n i o n t o t h e r o t o n a t e d S c h i f f b a s e d r r e c t e d m u t a g e n e s r s S a k m a r e t a l . r e p o r t e d t h e p a n d p o s i t i o n i n g o f c h a r g e s o r d i p o l e s p r e s e n c e o f t w o S p e c i e s , a b s o r b i n g a t 4 9 0 n m a n d a l o n g t h e b a c k b o n e o f t h e p o l y e n e 3 8 0 n m , u p o n c h a n g i n g G l u 1 1 3 i n t o G l n . T h e m a y m o d u l a t e t h e m a x i m a l t w o s p e c i e s , i d e n t i fi e d a s t h e p r o t o n a t e d a n d w a v e l e n g t h o f t h e c h r o m o p h o r e . 1 2 u n p r o t o n a t e d f o r m o f t h e S c h i f f b a s e r e s p e c t i v e l y , w e r e f o u n d t o e x i s t i n a p H — d e p e n d e n t e q u i l i b r i u m ( s z = 6 . 5 ) . I t a p p e a r s t h a t r e m o v a l o f t h e c o u n t e r a n i o n p r e v e n t s t h e c o m p l e t e p r o t o n a t i o n O f t h e S c h i f f b a s e , p r e s u m a b l y d u e t o u n f a v o r a b l e e n e r g e t i c s O f p l a c i n g a n u n c o m p e n s a t e d p o s i t i v e l y c h a r g e d r e s i d u e w i t h i n a h y d r o p h o b i c c a v i t y . S i m i l a r r e s u l t s w e r e O b t a i n e d w h e n G l u 1 1 3 w a s r e p l a c e d b y a n A s n r e s i d u e , ( E 1 1 3 Q ) ; h o w e v e r t h e p r o t o n a t i o n w a s r e c o v e r e d i n t h e p r e s e n c e o f i n c r e a s e d h a l i d e i o n c o n c e n t r a t i o n , a n e x t e r n a l c o u n t e r a n i o n s o u r c e . I n 1 9 9 3 O p r i a n e t a l . s u g g e s t e d t h a t t h e r e i s a c h l o r i d e a n i o n b i n d i n g s i t e i n t h e h u m a n r e d a n d g r e e n p i g m e n t s t h a t i s r e s p o n s i b l e f o r t h e r e d s h i f t i n g i n t h e i r a b s o r p t i o n m a x i m a . 8 4 I n 1 9 7 2 , B l a t z w a s t h e f i r s t t o s u g g e s t t h a t t h e v a r i a t i o n i n c o u n t e r a n i o n d i s t a n c e s i n t h e d i f f e r e n t O p s i n s i s w h a t d e f i n e s t h e i r d i f f e r e n t a b s o r p t i o n m a x i m a ( F i g u r e 1 - 9 ) . 8 5 I f t h e c o u n t e r a n i o n i s f u r t h e r m o v e d f r o m t h e p o s i t i v e l y c h a r g e d i r n i n i u m i o n , a r e d S h i f t e d A m , w o u l d b e e x p e c t e d , a n d v i c e v e r s a . I n a n a g r e e m e n t w i t h t h e l a t t e r h y p o t h e s i s , A m m m ) R C o m p o u n d S B P S B p K a \ l R . “ I C O O H i t C O O H R T 1 3 4 0 4 5 0 1 2 . 3 s o . 1 G { < 7 N Z S C O O H 2 3 8 6 4 4 8 9 5 : 0 1 3 3 8 6 4 5 0 8 . 0 1 : 0 . 1 1 2 3 4 3 8 0 4 4 4 8 5 1 0 . 1 R R } C O O H R T 5 3 7 5 4 4 2 1 0 . 0 e o . 1 E V C O O H I n ) “ W 6 3 6 0 4 4 0 7 . 5 3 : 0 . 1 4 5 6 F i g u r e 1 - 1 0 . A b s o r p t i o n m a x i m a a n d a p p a r e n t p K a v a l u e s o f S c h i f f b a s e ( S B ) a n d p r o t o n a t e d S B ( P S B ) o f r e t i n a l w i t h v a r i o u s a m i n o a c i d s . T h e r e l a t i v e p o s i t i o n o f t h e c a r b o x y l i c a c i d d i c t a t e s t h e A m a x a n d t h e p K a v a l u e s . 1 3 r e p l a c e m e n t o f t h e b o v i n e r h o d o p s i n c o u n t e r a n i o n G l u 1 1 3 w i t h a s h o r t e r a n a l o g u e , A s p , r e s u l t s i n a 5 0 5 n m A m x , ~ 5 n m r e d s h i f t e d . 8 1 T h e e f f e c t o f v a r y i n g b o t h t h e d i s t a n c e a n d t h e a n g l e b e t w e e n t h e P S B a n d t h e c o u n t e r a n i o n h a s b e e n p r o b e d b y S h e v e s a n d c o w o r k e r s u s i n g a s e r i e s o f m o d e l c o u m p o u n d s . 8 6 A s s h o w n i n F i g u r e 1 - 1 0 , b o t h t h e a b s o r p t i o n m a x i m a a n d t h e p K a v a l u e s f o r S c h i f f b a s e s f o r m e d b e t w e e n a l l - t r a n s - r e t i n a l a n d s e v e r a l a m i n o a c i d s w e r e s t u d i e d a s t h e d i h e d r a l a n g l e b e t w e e n t h e P S B a n d t h e c o u n t e r a n i o n w a s v a r i e d , b y p l a c i n g t h e f u n c t i o n a l g r o u p s o n d i f f e r e n t s i z e r i n g s . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e p r e c i s e p o s i t i o n i n g o f t h e c o u n t e r a n i o n c a n s i g n i f i c a n t l y a f f e c t t h e p K a v a l u e f o r t h e p r o t o n a t i o n o f t h e S B , f a v o r i n g t h e c o n f o r m a t i o n s i n v o l v i n g a w a t e r m e d i a t e d c o o r d i n a t i o n ( t h e e s t i m a t e d v a l u e f o r t h e r h o d o p s i n P S B p K a i s ~ 1 6 ) . 8 7 ’ 9 0 H o w e v e r , c o n s i d e r i n g t h a t t h e m a x i m u m r e d s h i f t i n g a c h i e v e d w a s ~ 1 0 n m , t h e p o s i t i o n a n d o r i e n t a t i o n o f t h e c o u n t e r a n i o n , a l t h o u g h i m p o r t a n t , d o e s n o t s e e m t o a c c o u n t f o r t h e w h o l e S h i f t o b s e r v e d i n t h e f o u r d i f f e r e n t O p S l fl S . 9 l ' 9 2 A n a d d i t i o n a l s u g g e s t i o n b y H o n i g w a s t h a t t h e p o s i t i v e c h a r g e o f t h e P S B c o u l d b e s t a b i l i z e d b y p o l a r g r o u p s w i t h i n t h e b i n d i n g c a v i t y o f t h e p r o t e i n . 9 3 F o l l o w i n g t h i s a p p r o a c h , N a t h a n s p r o p o s e d t h a t t h e p l a c e m e n t o f d i f f e r e n t n e g a t i v e l y c h a r g e d a m i n o a c i d s a l o n g t h e p o l y e n e b a c k b o n e i n d i f f e r e n t p r o t e i n s w o u l d r e s u l t i n e x t e n d e d o r d i s r u p t e d c o n j u g a t i o n o f t h e p o s i t i v e c h a r g e , w h i c h c o u l d b e n a t u r e ’ s w a y o f t u n i n g t h e w a v e l e n g t h ( F i g u r e 1 - 9 ) . 8 0 A t t h e s a m e t i m e , s e v e r a l t h e o r i e s w e r e d e v e l o p e d r e g a r d i n g t h e p r e s e n c e o f o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e s i n t h e v i c i n i t y O f t h e S c h i f f b a s e ( S B ) . T h e i n v o l v e m e n t o f w a t e r m o l e c u l e s f o r t h e p K a i n c r e a s e O f t h e S B h a s b e e n s u g g e s t e d i n s e v e r a l m o d e l s t u d i e s . “ ’ 9 4 ‘ 9 5 S t r u c t u r a l c h a n g e s o f i n t r a m e m b r a n e w a t e r m o l e c u l e s u p o n f o r m a t i o n o f 1 4 t h e p h o t o i n t e r m e d i a t e s o f b o v i n e r h o d o p s i n h a v e b e e n d e t e c t e d b y F T I R s p e c t r o s c o p y , 9 6 w h i l e e x t e n s i v e d e p l e t i o n o f w a t e r f r o m b o v i n e r h o d o p s i n r e s u l t s i n t h e d e p r o t o n a t i o n o f t h e S c h i f f b a s e . T h e m o d e o f a c t i o n i s r e l a t e d t o t h e d e g r e e o f p r o t o n a t i o n o f t h e r e t i n a l S B s i n c e i s s u g g e s t e d t h a t t h e P S B i s f o r m i n g a h y d r o g e n b o n d w i t h t h e c o u n t e r i o n t h r o u g h a w a t e r b r i d g e . 9 7 I n a d d i t i o n t o t h e p o i n t c h a r g e t h e o r i e s , a s e r i e s o f o t h e r h y p o t h e s e s h a v e b e e n O f f e r e d t o e x p l a i n t h e f a c t o r s r e s p o n s i b l e f o r w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n , m o s t o f t h e m i n v o l v i n g a c h a n g e i n t h e d e g r e e o f c o n j u g a t i o n w i t h i n t h e c h r o m o p h o r e . ” 1 0 0 I n a n e a r l y s u g g e s t i o n , B l a t z p r o p o s e d t h a t t w i s t i n g t h e p l a n e s a b o u t t h e s i n g l e b o n d s o f t h e c h r o m o p h o r e w o u l d l e a d t o d i f f e r e n t l e v e l s o f c o n j u g a t i o n a n d , t h e r e f o r e , w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n ( F i g u r e 1 - 1 1 ) . ‘ m A l t h o u g h r e t i n a l w o u l d p r e f e r t o a d o p t a p l a n a r c o n f o r m a t i o n F i g u r e 1 4 1 ' T w i s t i n g o f t h e s i n g l e b o n d s t o m a x i m i z e t h e p - o r b i t a l o v e r l a p , i t i s w i l l r e d u c e t h e d e g r e e o f r t o r b i t a l o v e r l a p , k n o w n t h a t l l - c i s - r e t i n a l i s n o t a p l a n a r a n d t h u s w i l l l e a d t o d i f f e r e n t m a x i m a l m o l e c u l e . S t e r i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e w a v e l e n g t h s . C 5 - M e a n d C 8 - H a s w e l l a s C 1 3 - M e a n d C 1 0 - H f o r c e a t w i s t i n g o f t h e C 6 - C 7 a n d C 1 2 - C 1 3 S i n g l e b o n d s , r e s u l t i n g i n n o n - p l a n a r 6 - S — c i s a n d 1 2 - S - t r a n s c o n f o r m a t i o n s l o z ’ 1 0 3 I t i s b e l i e v e d t h a t t h e s p e c i f i c s t e r i c r e q u i r e m e n t s w i t h i n t h e v a r i o u s o p s i n s ’ b i n d i n g S i t e s c a n i n d u c e a u n i q u e t w i s t i n g , t h a t c o u l d a c c o u n t f o r t h e c h r o m o p h o r e ’ s c h a r a c t e r i s t i c m a x i m u m a b s o r b a n c e . A c c o r d i n g t o t h i s t h e o r y , r e d r h o d o p s i n w o u l d b e e x p e c t e d t o f o r c e r e t i n a l i n t o a m o r e p l a n a r c o n f o r m a t i o n , o p t i m i z i n g t h e o r b i t a l o v e r l a p a n d r e s u l t i n g 1 5 i n a r e d s h i f t e d a b s o r b a n c e . A c c o r d i n g l y , t h e b l u e p i g m e n t w o u l d b e e x p e c t e d t o m a i n t a i n a h i g h l y t w i s t e d c h r o m o p h o r e , a n d S O o n . S e v e r a l t h e o r e t i c a l c a l c u l a t i o n s s u p p o r t t h e s u g g e s t i o n t h a t a m u l t i t u d e o f t o r s i o n a l a n g l e s i s p o s s i b l e f o r t h e c h r o m o p h o r e ’ s s i n g l e b o n d s . H o w e v e r , t h e i n d u c e d d e g r e e o f c o n j u g a t i o n d o e s n o t a p p e a r t o b e s o l e l y r e s p o n s i b l e f o r t h e o p s i n S h i f t s o b s e r v e d m A l t h o u g h t h r o u g h o u t t h e y e a r s t h e v a l i d i t y o f s o m e o f t h e l a t t e r t h e o r i e s h a s b e e n s u p p o r t e d b y m o d e l c o m p o u n d s , t h e l a c k o f c r y s t a l l i z e d s t r u c t u r e s o f t h e d i f f e r e n t p i g m e n t s h a s h a m p e r e d t h e s t u d y o f t h e a c t u a l s y s t e m s . A s m e n t i o n e d b e f o r e , O p s i n s a r e m e m b r a n e b o u n d p r o t e i n s a n d a s s u c h h a v e p r o v e n p a r t i c u l a r l y h a r d t o c r y s t a l l i z e . F o r m o r e t h a n f o r t y y e a r s , t h e o n l y a v a i l a b l e s t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e f o u r O p s i n s p r e s e n t i n t h e h u m a n e y e w a s b a s e d o n a c o m b i n a t i o n o f t h e o r e t i c a l c a l c u l a t i o n s , N M R 1 0 5 - 1 1 2 s t r u c t u r e s , c r y o e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d p h o t o a f fi n i t y l a b e l i n g . I t w a s n o t u n t i l 2 0 0 0 t h a t P a l c z e w s k i e t a l . r e p o r t e d t h e fi r s t c r y s t a l s t r u c t u r e O f r o d r h o d o p s i n a t a 2 . 8 A Y 1 7 8 Y 1 7 8 E 1 8 1 M 2 0 7 E 1 8 1 M 2 0 7 E 1 1 3 ? v \ ' 4 . 9 £ 1 1 3 . ? W " P \ Y 2 6 8 " 2 1 1 \ Y 2 6 8 ” 4 % ‘ T “ Q ! K 2 9 6 K 2 9 6 W 2 6 5 W 2 6 5 F 2 6 1 F 2 6 1 H 2 1 1 F l g u r e 1 - 1 2 . S t e r e o v i e w o f t h e b i n d i n g p o c k e t o f t h e r o d r h o d o p s i n f r o m t h e c r y s t a l s t r u c t u r e . T h e c h r o m o p h o r e , 1 1 - c i s - r e t i n a l i s s h o w n b o u n d a s a S c h i f f b a s e t o L y 5 2 9 6 . S e l e c t e d i m p o r t a n t a m i n o a c i d s a r o u n d t h e p o l y e n e h a v e b e e n l a b e l e d . l 6 r e s o l u t i o n . 1 1 3 T h e b i n d i n g p o c k e t o f r o d r h o d o p s i n a n d t h e r e s i d u e s d i r e c t l y s u r r o u n d i n g t h e r e t i n a l m o l e c u l e a r e S h o w n i n F i g u r e 1 - 1 2 . l l - c i s - R e t i n a l i s b o u n d a s a S c h i f f b a s e v i a L y 5 2 9 6 , a s p r e v i o u s l y s u g g e s t e d , a n d G l u 1 1 3 a c t s a s t h e c o u n t e r a n i o n , p l a c e d 3 . 4 5 A a w a y f r o m t h e S B n i t r o g e n . A t t h e s a m e t i m e , t h e o v e r a l l s h a p e o f t h e c h r o m o p h o r e s u p p o r t s t h e s u g g e s t i o n t h a t t w i s t i n g a r o u n d t h e s i n g l e b o n d s , m o s t l y d u e t o s t e r i c s , c a n d i c t a t e t h e d i f f e r e n t l e v e l O f c o n j u g a t i o n a n d , t h e r e f o r e , r e g u l a t e t h e a b s o r p t i o n m a x i m a . F o r e x a m p l e , t h e i n d o l e r i n g o f T r p 2 6 5 p o i n t s d o w n t o t h e r e t i n y l i d e n e g r o u p n e a r t h e B - i o n o n e r i n g , w h i l e i t a l s o c o m e s c l o s e t o t h e C 1 3 - M e ( 3 . 8 A ) . B e c a u s e d e l e t i o n o f t h i s m e t h y l g r o u p i s k n o w n t o c a u s e p a r t i a l c o n s t i t u t i v e a c t i v i t y o f r h o d o p s i n i n t h e d a r k , ” 4 l o s s O f i t s i n t e r a c t i o n w i t h T r p 2 6 5 m a y b e a p o s s i b l e m e c h a n i s m o f t h i s a c t i v i t y . A t t h e s a m e t i m e , t h e p o s i t i o n o f T r p 2 6 5 c a n s u g g e s t p o s s i b l e e x c i t o n i c c o u p l i n g w i t h t h e p o l y e n e , a s o r i g i n a l l y p r o p o s e d b y R a f f e r t y i n 1 9 7 9 . 1 ' 5 T h e b r e a k t h r o u g h i n t h e c r y s t a l l i z a t i o n o f b o v i n e r h o d o p s i n p r e s e n t e d t h e O p p o r t u n i t y f o r a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f h o w t h e d i f f e r e n t p i g m e n t s p e r f o r m s p e c t r a l t u n i n g o v e r a w i d e r a n g e o f w a v e l e n g t h s . A l t h o u g h t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f t h e c o n e O p s i n s h a v e n o t b e e n s o l v e d y e t , t h e i r t h e o r e t i c a l m o d e l s h a v e b e e n u p d a t e d b a s e d u p o n t h e r h o d o p s i n s t r u c t u r e , n o w r e fi n e d d o w n t o 2 . 2 A . 1 1 6 F i g u r e 1 - 1 3 d e p i c t s t h e w o r k i n g ” 7 A s i n b o v i n e r h o d o p s i n , t h e m o d e l s f o r t h e t h r e e p i g m e n t s , r e d , g r e e n , a n d b l u e o p s i n . e n v i r o n m e n t a r o u n d t h e r e t i n a l i n a l l t h r e e c o n e p i g m e n t s i s s t r o n g l y h y d r o p h o b i c . R e d a n d g r e e n c o n e p i g m e n t s S h a r e n e a r l y t h e s a m e s e q u e n c e ( 9 6 % h o m o l o g o u s , d i f f e r b y o n l y 1 5 a m i n o a c i d s ) . H o w e v e r , t h e i r U V - v i s a b s o r b a n c e d i f f e r s b y 4 0 n m ( 5 7 0 n m a n d 5 3 0 n m , r e s p e c t i v e l y ) . 8 0 T h r o u g h s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s O p r i a n h a s p r o v e n b y 1 7 E 1 0 2 C 2 2 8 W 2 8 1 1 ‘ w 8 3 1 3 W 5 9 F i g u r e 1 - 1 3 . M o d e l s t r u c t u r e s o f t h e b i n d i n g c a v i t y o f t h e t h r e e c o n e p i g m e n t s b a s e d o n t h e E 1 1 0 T 1 1 5 2 6 5 F 2 9 0 K 2 9 3 F 2 0 9 Y 2 6 2 £ 2 9 4 8 S 1 3 4 E 1 2 9 ” C 2 2 7 F 3 0 9 C 2 2 8 5 3 1 3 I . w a s c S 1 3 4 E 1 2 9 I C 2 2 7 , . . & Y 3 0 9 Y 2 8 4 c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e r o d r h o d o p s i n ; A . B l u e o p s i n ; B . G r e e n o p s i n ; C . R e d o p s i n ; S e l e c t e d a m i n o a c i d s s u r r o u n d i n g t h e r e t i n a l c h r o m o p h o r e a r e h i g h l i g h t e d . 1 8 c h a n g i n g o n l y s e v e n a m i n o a c i d s o f t h e r e d c o n e p r o t e i n , n a m e l y S l l 6 Y : 8 1 8 0 A : 1 2 3 0 T : A 2 3 3 8 : Y 2 7 7 F : T 2 8 5 A : Y 3 0 9 F m u t a n t , a p i g m e n t r e s e m b l i n g t h e g r e e n o p s i n i s O b t a i n e d . 6 1 H o w e v e r , m u t a t i o n O f o n l y t h r e e o f t h e s e r e s i d u e s i n t h e g r e e n p i g m e n t i s e n o u g h t o a c c o u n t f o r t h e m a j o r i t y o f t h e r e d s h i f t . A l l s u b s t i t u t i o n s i n v o l v e t h e c o n v e r s i o n o f a h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d t o a p o l a r r e s i d u e a r o u n d t h e i o n o n e r i n g ( F 2 7 7 Y , A 2 8 5 T , A 1 8 0 8 ) . ‘ 1 8 I n t e r e s t i n g l y , h y d r o p h o b i c t o p o l a r m u t a t i o n s a t a n a l o g o u s p o s i t i o n s i n r o d r h o d o p s i n c a n a l s o p r o d u c e a r e d s h i f t e d p i g m e n t . R o d m u t a n t F 2 6 1 Y : : A 1 6 9 T : : A 1 6 4 S r e d s h i f t s t o ~ 7 0 0 n m , a n a m a z i n g 2 0 0 n m s h i f t . ” 9 A l t h o u g h t h e l a t t e r r e s i d u e s a r e i m p o r t a n t , a s c a n b e s e e n i n F i g u r e 1 - 1 3 B a n d C , t h e y a r e n o t t h e r e s i d u e s t h a t t h e m o d e l p l a c e s i n t h e v i c i n i t y o f t h e c h r o m o p h o r e . A c c o r d i n g t o t h e l a t t e r , t h e c e n t r a l r e s i d u e f o r m i n g t h e c a v i t y i s T r p 2 8 1 , a n a l o g o u s t o T r p 2 6 5 i n b o v i n e r h o d o p s i n . T h e c o u n t e r a n i o n t o t h e S B i s G l u 1 2 9 , w h i l e a s e c o n d c a r b o x y l a t e , G l u 1 0 2 , i s l o c a t e d c l o s e t o L y s 3 1 2 , t h e L y s c o v a l e n t l y l i n k e d t o r e t i n a l . . I n t h e c a s e o f t h e b l u e c o n e p i g m e n t , w h i c h o n l y b e a r s a 4 6 % h o m o l o g y w i t h t h e 8 0 ‘ ' 2 0 t h e c e n t r a l r e s i d u e f o r m i n g t h e c a v i t y i s T y r 2 6 2 ( F i g u r e 1 - o t h e r c o n e p i g m e n t s , 1 3 A ) . B e c a u s e o f t h e p r o x i m i t y o f t h e r e t i n a l B - i o n o n e r i n g , T y r 2 6 2 i s c o n s i d e r e d t o b e t h e m a j o r f a c t o r i n t h e b l u e S h i f t o f t h i s p i g m e n t . T h i s e x p l a n a t i o n a g r e e s w i t h t h e e x p e r i m e n t a l o b s e r v a t i o n t h a t s i n g l e m u t a n t Y 2 6 2 W g e n e r a t e s a 1 0 n m r e d s h i f t e d 1 2 1 I n a d d i t i o n , t h e s e c o n d g l u t a m i c a c i d p r e s e n t i n r e d a n d g r e e n a b s o r p t i o n S p e c t r u m . p i g m e n t s i s a b s e n t i n t h i s p r o t e i n , w h i c h i s b e l i e v e d t o c a u s e a n a d d i t i o n a l b l u e S h i f t . S i m i l a r m u t a g e n e s i s e x p e r i m e n t s , a s w e r e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d f o r t h e r e d a n d g r e e n c o n e c a s e , h a v e b e e n p e r f o r m e d , p r i o r t o t h e r h o d o p s i n c r y s t a l S t r u c t u r e . T h e s e i n d i c a t e d t h a t a s e r i e s o f r e s i d u e s , i n c l u d i n g p o s i t i o n s G l y 1 2 2 a n d T r p 2 6 5 , a r e i m p o r t a n t f o r 1 9 2 T h e l a t t e r m u t a t i o n s , a l t h o u g h t h e y d o n o t m a i n t a i n i n g t h e p i g m e n t ’ s p r o p e r t i e s . 1 2 e x a c t l y a g r e e w i t h t h e p r o p o s e d m o d e l , i n d i c a t e t h a t t h e a m i n o a c i d s b o t h a r o u n d t h e i o n o n e r i n g a n d c l o s e t o t h e S B f o r m a t i o n a r e i m p o r t a n t f o r t h e c o r r e c t p r o t e i n f u n c t i o n . 1 . 4 O t h e r O p s i n S y s t e m s R h o d o p s i n a n d t h e r e l a t e d c o n e p i g m e n t s a r e m e m b e r s o f a b r o a d e r f a m i l y O f m e m b r a n e b o u n d l i g h t t r a n s d u c i n g p r o t e i n s , f o u n d w i d e l y i n n a t u r e i n o r g a n i s m s a s 3 A l l t h e s e p r o t e i n s S h a r e a e v o l u t i o n a r y d i s t a n t a s a r c h a e a , a l g a e a n d m a m m a l s . 1 2 c o m m o n m o t i f o f s e v e n t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s e n c l o s i n g a n i n t e r i o r c h r o m o p h o r e b i n d i n g s i t e . I n a l l c a s e s , t h e p h o t o a c t i v e m o i e t y i s a r e t i n a l m o l e c u l e a t t a c h e d a s a S c h i f f b a s e t o a c o n s e r v e d L y s r e s i d u e , w h i c h u p o n a b s o r p t i o n o f l i g h t i s o m e r i z e s , m t r i g g e r i n g c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s t r a n s l a t i n g i n t o e i t h e r l i g h t - d r i v e n i o n t r a n s p o r t o r p h o t o s e n s o r y s i g n a l i n g . C e r t a i n l y f o r t h e v i s u a l p i g m e n t s , a n d p e r h a p s a l s o f o r t h e i o n s p u m p s , i t i s i m p o r t a n t t h a t e a c h p r o t e i n r e s p o n d s t o l i g h t i n a n a p p r o p r i a t e p a r t o f t h e S p e c t r u m . T h e r e f o r e , i t i s g e n e r a l l y c o n s i d e r e d t h a t t h e t u n i n g o f t h e c h r o m o p h o r e m u s t b e d u e t o t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e b i n d i n g p o c k e t i n t h e p r o t e i n . A l l v e r t e b r a t e s y s t e m s u t i l i z e p r o t e i n s s i m i l a r t o r h o d o p s i n a s v i s u a l p i g m e n t s , a n d i n a l l c a s e s G l u 1 1 3 , a n e x t r e m e l y c o n s e r v e d r e s i d u e , i s c o n s i d e r e d t h e c o u n t e r i o n r e s p o n s i b l e f o r s t a b i l i z i n g t h e P S B f o r m e d . F o r i n v e r t e b r a t e s , r e t i n a l r e m a i n s t h e c h r o m o p h o r e p r e s e n t i n a l l p i g m e n t s , a l t h o u g h f o r m o s t s y s t e m s i n t h e a l l - t r a n s f o r m m ’ ‘ 2 5 T a b l e 1 - 1 d e s c r i b e s t h e s p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r i s t i c s o f O c t o p u s a n d G e c k o r h o d o p s i n p r o t e i n s , a s c o m p a r e d t o t h e b o v i n e R h m ” 2 8 A s c a n b e s e e n f r o m t h e d a t a p r e s e n t e d , t h e 2 0 T a b l e 1 - 1 . S p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r i s t i c s o f r h o d o p s i n p r o t e i n s o f d i f f e r e n t s p e c i e s . P r o t e i n R e t i n a l R ’ d t / i r i g l i h e r g j U V Q n O ; ) S B U V ( : : n : S B P S B p K a R h 1 1 - c i s 3 8 0 3 6 0 5 0 0 > 1 6 O c t o p u s R h 1 1 - c i s 3 8 0 3 7 6 4 7 5 1 0 . 6 O c t o p u s R h ‘ 9 - c i s 3 8 0 3 6 2 4 6 8 1 0 . 4 G e c k o 1 1 - c i s 3 8 0 3 7 6 5 2 1 9 . 9 G e c k o 9 - c i s 3 8 0 3 5 0 4 8 7 9 . 3 d e g r e e o f t h e O p s i n s h i f t , a s w e l l a s t h e p K a v a l u e f o r t h e P S B c a n s i g n i f i c a n t l y d i f f e r w i t h i n d i f f e r e n t s y s t e m s , o r i n t h e p r e s e n c e O f a d i f f e r e n t r e t i n a l i s o m e r . I n t h e p r e s e n c e o f t h e l l - c i s - r e t i n a l c h r o m o p h o r e , t h e U V - v i s a b s o r b a n c e O f o c t o p u s r h o d o p s i n i s b l u e S h i f t e d w h i l e t h a t O f t h e g e c k o p i g m e n t r e d S h i f t s a r o u n d 2 0 n m , a s c o m p a r e d t o t h a t o f t h e b o v i n e r h o d o p s i n . A l t h o u g h t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f t h e i n v e r t e b r a t e p i g m e n t s h a v e n o t b e e n s o l v e d y e t , i t i s b e l i e v e d t h a t t h e d i f f e r e n t p l a c e m e n t o f t h e P S B c o u n t e r i o n i s w h a t d e t e r m i n e s t h e S p e c t r a l b e h a v i o r . I n a l m o s t a l l i n v e r t e b r a t e r h o d o p s i n s G l u 1 1 3 , t h e c o u n t e r a n i o n f o r t h e v e r t e b r a t e s y s t e m s , h a s b e e n r e p l a c e d b y a T y r r e s i d u e . A c c o r d i n g l y , O p r i a n a n d c o w o r k e r s h y p o t h e s i z e d t h a t t h i s t y r o s i n e c a n a c t a s t h e c o u n t e r i o n t o t h e P S B , p r e s u m a b l y b e i n g i n i t s a n i o n i c s t a t e . 8 2 H o w e v e r , d e t a i l e d S t u d i e s r e v e a l e d t h a t t h e r e i s n o t y r o s i n a t e p r e s e n t , s u g g e s t i n g t h a t t h e s t e p s r e q u i r e d t o a c h i e v e t h e a c t i v a t i n g s t a t e a r e d i f f e r e n t f o r 1 2 7 . 1 2 9 v e r t e b r a t e a n d i n v e r t e b r a t e v i s u a l p i g m e n t s . V e r y r e c e n t l y , i n a d e t a i l e d s t u d y O f t h e c o u n t e r i o n d i s p l a c e m e n t w i t h i n t h e r h o d o p s i n f a m i l y , S h i c h i d a a n d c o w o r k e r s s u g g e s t e d t h a t G l u l 8 1 , a l s o p r e s e n t i n v e r t e b r a t e r h o d o p s i n , a c t s a s t h e c o u n t e r i o n i n t h e 3 0 i n v e r t e b r a t e s y s t e m s . 1 T h e y b e l i e v e t h a t , d u r i n g e v o l u t i o n , a n a n c e s t r a l v e r t e b r a t e 2 1 r h o d o p s i n a c q u i r e d t h e G l u 1 1 3 c o u n t e r i o n , f o l l o w e d b y s t r u c t u r a l o p t i m i z a t i o n , f o r m o r e e f fi c i e n t G p r o t e i n a c t i v a t i o n . I n t h e c a s e o f b a c t e r i a l a n d a r c h a e a r h o d o p s i n s , m o s t o f w h i c h p e r f o r m a n i o n p u m p a c t i o n , a s i g n i fi c a n t b o d y o f w o r k h a s b e e n c a r r i e d o u t i n a n a t t e m p t t o e l u c i d a t e t h e i r m o d e o f a c t i o n . O n e o f t h e m o s t t h o r o u g h l y i n v e s t i g a t e d s y s t e m s i S b a c t e r i o r h o d o p s i n ( t h ) , t h e p u r p l e l i g h t - h a r v e s t i n g m e m b r a n e p r o t e i n o f H a l o b a c t e r i u m h a l o b i u m , w h i c h c o n v e r t s l i g h t e n e r g y i n t o a p r o t o n g r a d i e n t a c r o s s t h e b a c t e r i a l m e m b r a n e . l 3 ' B a c t e r i o r h o d o p s i n b i n d s a l l - t r a n s - r e t i n a l t h r o u g h L y s 2 1 6 a s a S B , w e l l e s t a b l i s h e d t o b e p r o t o n a t e d , a b s o r b i n g a t 5 7 0 n m . 1 3 2 S i m i l a r t o t h e r h o d o p s i n c a s e , s e v e r a l t h e o r i e s h a v e M 1 4 5 M 1 4 5 W 1 8 2 W 1 3 8 Y 1 “ 1 4 2 D 1 1 2 W 8 6 “ L i ” 1 W 1 8 9 D B 5 D 8 5 F i g u r e 1 - 1 4 . S t e r e o v i e w o f t h e r e t i n a l b i n d i n g s i t e o f i o n p u m p B a c t e r i o r h o d o p s i n ( t h ) W 1 8 9 b e e n p r o p o s e d t o a c c o u n t f o r t h e 7 0 n m o p s i n s h i f t o b s e r v e d , m o s t o f t h e m i n v o l v i n g t h e e l e c t r o n i c e n v i r o n m e n t a r o u n d t h e p o l y e n e c h a i n m ' ' 3 4 T h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l h a s b e e n s o l v e d a t 1 . 5 5 A r e s o l u t i o n , 1 3 5 r e v e a l i n g a r e t i n a l b i n d i n g p o c k e t q u i t e d i f f e r e n t f r o m t h a t o f b o v i n e r h o d o p s i n ( F i g u r e 1 - 1 4 ) . T h e r e i s a g r o u p o f a r o m a t i c a m i n o a c i d s s u r r o u n d i n g t h e S B b o u n d c h r o m o p h o r e , j o i n e d b y s e v e r a l M e t a n d T h r r e s i d u e s . T h e p K , o f t h e t h P S B h a s b e e n c a l c u l a t e d t o b e > 1 2 , ' 3 6 ’ ' 3 7 5 u n i t s h i g h e r t h a n w h a t i s t y p i c a l l y o b s e r v e d f o r 2 2 1 3 8 T h i s h a s b e e n a t t r i b u t e d t o a h y d r o g e n b o n d p r o t o n a t e d S B m o d e l c o m p o u n d s . b e t w e e n t h e r e t i n a l P S B a n d e i t h e r a c a r b o x y l a t e o r a t y r o s i n a t e r e s i d u e . A S c a n b e s e e n i n F i g u r e 1 - 1 4 , t h e p r o t o n a t e d f o r m o f t h e S B c o u l d b e s t a b i l i z e d b y e i t h e r o f t w o A s p r e s i d u e s ( D 1 1 2 , D 8 5 , 3 . 7 4 A a n d 3 . 7 9 A a w a y f r o m t h e S B n i t r o g e n , r e s p e c t i v e l y ) , w h i c h h a v e a l s o b e e n p r o p o s e d t o a c c o m m o d a t e t h e p r o t o n t r a n s f e r a c r o s s t h e m e m b r a n e , 1 3 1 o r b y t h e n e a r b y T y r 8 5 , a l t h o u g h t h e d i s t a n c e o f 4 . 7 7 A b e t w e e n t h e p h e n o l i c o x y g e n a n d t h e S B n i t r o g e n d o e s n o t s u p p o r t t h e l a t t e r . I n t e r e s t i n g l y , t h e r e i s a c l e a r i n t e r a c t i o n , i n t h e f o r m O f a h y d r o g e n b o n d , b e t w e e n t h e c a r b o x y l a t e o f A s p 8 5 a n d t h e t y r o s i n e o x y g e n , w h i c h s u g g e s t s t h a t o n e o f t h e m c a n e x i s t i n t h e u n p r o t o n a t e d f o r m , t o a c t a s a c o u n t e r i o n . P r e v i o u s S t u d i e s o n t h i s f i e l d h a v e f a i l e d t o d e t e c t t h e p r e s e n c e O f a t y r o s i n a t e i o n , s u g g e s t i n g t h a t i t i s a c a r b o x y l a t e m o i e t y t h a t i s r e s p o n s i b l e f o r t h e P S B S t a b i l i z a t i o n . 1 3 9 ’ 1 4 0 I n a d d i t i o n , A r g 8 2 ( F i g u r e 1 - 1 5 ) h a s b e e n i d e n t i f i e d a s a p r i n c i p a l c o u n t e r i o n , i m p o r t a n t f o r t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e t w o c a r b o x y l a t e s i n t h e v i c i n i t y o f t h e S B , w h i l e i t i s b e l i e v e d t h a t t h e i m i n e p r o t o n i s s t r o n g l y h y d r o g e n b o n d e d t o a s t r u c t u r e d w a t e r m o l e c u l e i n t h e b i n d i n g p o c k e t . 1 3 4 A n o t h e r i n t e r e s t i n g s y s t e m w i t h i n t h e g r o u p o f a r c h a e a ] r h o d o p s i n s i s S e n s o r y r h o d o p s i n H ( S R I I ) , a p i g m e n t f o u n d i n H a l o b a c t e r i u m s a l i n a r u m . M o s t h a l o p h i l i c a r c h a e a i n c l u d e a l l t y p e s O f l i g h t - t r a n s d u c i n g p r o t e i n s , p r o t o n p u m p b a c t e r i o r h o d o p s i n , c h l o r i d e p u m p h a l o r h o d o p s i n ( H R ) a s w e l l a s p h o t o t a x i s p i g m e n t s s e n s o r y r h o d o p s i n I ( S R 1 ) a n d H . T h e l a t t e r p r o v i d e a S i m p l e c o l o r s e n s i n g m e c h a n i s m f o r S p e c i fi c l i g h t a b s o r p t i o n , w h i c h t r i g g e r s t h e m o v e m e n t o f t h e c e l l s t o w a r d f a v o r a b l e , o r a w a y f r o m u n f a v o r a b l e e n v i r o n m e n t s . 2 3 S R I I i s s t r u c t u r a l l y v e r y S i m i l a r t o t h e o t h e r t h r e e a r c h a e a r h o d o p s i n s , w i t h t h e s e q u e n c e h o m o l o g y b e i n g e s p e c i a l l y s t r i k i n g i n t h e c h r o m o p h o r e e n v i r o n m e n t . m ' ” 2 H o w e v e r , w h i l e t h , H R a n d S R I h a v e a b s o r p t i o n m a x i m a t h a t f a l l i n a r e l a t i v e l y n a r r o w r a n g e ( 5 6 0 — 5 9 0 n m ) , S R H a b s o r b s a t ~ 5 0 0 n m , S i m i l a r t o v e r t e b r a t e r h o d o p s i n . T h i s u n u s u a l s p e c t r o s c o p i c b e h a v i o r w a s i n i t i a l l y a t t r i b u t e d t o t h e p r e s e n c e O f t h r e e d i f f e r e n t r e s i d u e s a s c o m p a r e d t o t h e o t h e r a r c h a e a r h o d o p s i n s , l o c a t e d i n t h e v i c i n i t y o f t h e p o l y e n e . H o w e v e r , m u t a t i o n O f t h e s e r e s i d u e s t o t h e i r s e q u e n t i a l c o u n t e r p a r t s i n t h d i d n o t a c c o u n t f o r a c o m p l e t e r e d S h i f t i n g ( A m , = 5 1 5 n m ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e m a j o r s o u r c e O f t h e S R I I b l u e S h i f t i n v o l v e d a c h a n g e i n t h e p r o t e i n g e o m e t r y . ' 4 3 I n a m o r e r e c e n t a p p r o a c h , a n a l t e r n a t i v e e x p l a n a t i o n w a s s u g g e s t e d b y S p u d i c h a n d c o w o r k e r s , o r i g i n a t i n g f r o m t h e S t u d y o f t h e h i g h r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e s a v a i l a b l e f o r b o t h t h a n d S R I I . 1 4 4 T h e b i n d i n g p o c k e t s o f t h e t w o p r o t e i n s ( F i g u r e 1 - 1 5 , A a n d B ) a r e s t r i k i n g l y s i m i l a r , w i t h m o s t O f t h e c r u c i a l r e s i d u e s c o n s e r v e d . A s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d , t h e c o u n t e r i o n S t r u c t u r e i n t h i s q u i t e u n u s u a l , i n v o l v i n g A s p 8 5 , A s p 2 1 2 a n d A r g 8 2 . A t t h e s a m e t i m e , t h e r e i s a n o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h e S B , w h i c h a c t s a s t h e b r i d g e f o r t h e i n t e r a c t i o n w i t h t h e t w o a s p a r t a t e s . T h e i m p o r t a n c e o f A r g 8 2 f o r t h e p r o t o n a t i o n o f t h e t h S B h a s b e e n p o i n t e d o u t , a l t h o u g h t h e r e s i d u e i s p l a c e d r e l a t i v e l y f a r a w a y f o r m t h e i m i n e m o i e t y . A s c a n b e s e e n i n F i g u r e 1 - 1 5 , i n t h e t h c a s e A r g 8 2 i s p o i n t i n g t o w a r d s A s p 2 1 2 , i n t e r a c t i n g w i t h i t , a s w e l l a s w i t h T y r 5 7 t h r o u g h b r i d g e d w a t e r m o l e c u l e s . H o w e v e r , t h a t i s n o t t h e c a s e i n t h e S R I I s t r u c t u r e . A S o n e c a n n o t i c e , a l t h o u g h m o s t o f t h e r e s i d u e s a r e a l m o s t i n i d e n t i c a l p o s i t i o n s a s i n t h e t h c a s e , A r g 7 2 , t h e r e s i d u e a n a l o g o u s t o A r g 8 2 o f t h , i s n o w p o i n t i n g a w a y f r o m t h e S B c o u n t e r i o n , A s p 2 0 1 , i n t e r a c t i n g w i t h A s p 1 9 3 i n s t e a d . T h i s 2 4 0 7 5 ? D 2 ? 0 1 c m A m a x = 5 0 0 n m K 2 1 6 A . B a c t e r i o r h o d o p s i n D 8 5 A . . . “ = 5 7 0 n m 1 * Y 1 8 5 0 2 1 2 ( 0 ) - W 1 : 2 . 9 A B u " 0 8 5 ( O ) - W 1 : 2 . 6 A 9 2 1 2 R 8 2 K 2 1 6 ( N ) - W 1 : 2 . 9 A Y 1 8 5 ( O ) - 0 2 1 2 ( O ) ; 2 . 6 A Y 5 7 ( O ) - W 3 : 3 . 0 A E 2 0 4 ( c ) - E 1 9 4 ( c ) ; 3 . 0 A 5 1 9 4 0 2 1 2 ( O ) - W 2 . 2 . 7 R 8 2 ( N ) - W 2 : 2 . 5 A j R 8 2 ( N ) - W 3 : 2 . 9 A 4 H K 2 0 5 B . S e n s o r y R h o d o p s i n I I Y 1 7 4 0 2 0 1 ( O ) - W 1 : 2 . 9 A 0 7 5 ( O ) . W 1 : 2 . 4 A K 2 0 5 ( N ) - W 1 : 2 . 6 A Y 1 7 4 ( O ) - 0 2 0 1 ( O ) ; 2 . 7 A 0 2 0 1 ( O ) - W 3 : 2 . 7 A Y 5 1 ( O ) - W 3 : 2 . 9 A Y 5 1 ( O ) - W 4 : 2 . 9 A R 7 2 ( N ) - W 4 : 2 . 8 2 R 7 2 ( N ) - W 5 : 3 . 0 D 1 9 3 5 2 0 4 ( 0 ) . W S : 2 . 4 A K 2 1 0 C . A n a b a e n a S e n s o r y ‘ 3 0 “ R h o d o p s i n \ 0 7 5 v 1 7 9 A . . . “ = 5 7 0 n m S 4 7 * 1 0 7 5 ( O ) - W 1 : 2 . 7 A K 2 1 0 ( N ) - W 1 : 2 . 6 A S 4 7 ( 0 ) - 0 7 5 ( O ) : 2 . 7 A R 7 2 8 4 7 ( O ) - Y 1 1 ( O ) : 2 . 6 A Y 5 1 ( O ) - W 1 : 2 . 9 A y 5 1 Y 5 1 ( O ) - W 2 : 3 . 9 A * R 7 2 ( N ) - W 2 : 3 . 1 A Y 1 1 2 fi n e R 7 2 ( N ) - W 3 : 3 . 0 A 3 * 0 1 9 8 ( 0 ) - W 3 : 2 . 6 A F i g u r e 1 - 1 5 . C r y s t a l s t r u c t u r e s o f t h e r e t i n a l b i n d i n g s i t e s o f B a c t e r i o r h o d o p s i n ( A ) , S e n s o r y R h o d o p s i n I I ( B ) a n d A n a b a e n a S e n s o r y R h o d o p s i n ( C ) . T h e i m p o r t a n t a m i n o a c i d s s u r r o u n d i n g t h e p o l y e n e a r e h i g h l i g h t e d . R e d c r o s s e s i n d i c a t e o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e s . S e l e c t e d d i s t a n c e s b e t w e e n r e s i d u e s a r e s h o w n o n t h e r i g h t . 2 5 c h a n g e i s p r o b a b l y d u e t o t h e f a c t t h a t A s p 1 9 3 i s a v a i l a b l e f o r i n t e r a c t i o n , w h i l e i n t h e t h c a s e , t h e a n a l o g o u s r e s i d u e , G l u 2 0 4 , i s i n v o l v e d i n a t i g h t i n t e r a c t i o n w i t h a n o t h e r c a r b o x y l i c a c i d , G l u 1 9 4 . S O , t h e f a c t t h a t A r g 7 2 i n S R I I i s n o t i n t e r a c t i n g w i t h A S p 2 0 l , t h e c o u n t e r i o n o f t h e P S B , c o u l d b e t h e r e a s o n f o r t h e b l u e s h i f t o b s e r v e d i n t h e e l e c t r o n i c S p e c t r u m o f t h e l a t t e r p i g m e n t . V e r y r e c e n t l y t h e c r y s t a l S t r u c t u r e O f a n o t h e r s e n s o r y r h o d o p s i n f r o m A n a b a e n a , a f r e s h w a t e r c y a n o b a c t e r i u m , h a s b e e n s o l v e d . I 4 5 A n a b a e n a s e n s o r y r h o d o p s i n ( A S R ) i s t h e o n l y b a c t e r i a l s e n s o r y r h o d o p s i n s o f a r e x p r e s s e d i n a p h o t o a c t i v e f o r m a n d , u n l i k e t h e h a l o a r c h a e a l a n a l o g u e s w h i c h t r a n s m i t S i g n a l s t o o t h e r i n t e g r a l m e m b r a n e p r o t e i n s , i t s f u n c t i o n a p p e a r s t o i n v o l v e m o d u l a t i o n o f a s o l u b l e c y t o p l a s m i c t r a n s d u c e r , a n a l o g o u s t o a n i m a l v i s u a l p i g m e n t s . ‘ 4 6 I t s e l e c t r o n i c s p e c t r u m i s v e r y c l o s e t o t h a t o f t h e r e d c o n e p i g m e n t ( A m a x = 5 7 0 n m ) , w h i l e t h e c r y s t a l s t r u c t u r e , a t t h e p r e s e n t r e s o l u t i o n O f 2 . 0 A , r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f t w o c o n f o r m a t i o n s f o r b o t h t h e r e t i n a l s u b s t r a t e a n d t h e L y s r e s i d u e b o u n d t o i t . B e s i d e s t h a t , t h e o v e r a l l b i n d i n g p o c k e t r e s e m b l e s t h o s e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d , l a c k i n g , h o w e v e r , a s e c o n d a s p a r t a t e r e s i d u e c l o s e t o t h e S B , s u p p o r t i n g t h e s u g g e s t i o n t h a t t h i s p r o t e i n d o e s n o t f u n c t i o n a s a n i o n p u m p ( F i g u r e 1 - 4 , C ) . I n s t e a d , a S e r a n d a T y r r e s i d u e a p p e a r t o h e l p S t a b i l i z e t h e p r o t o n a t e d S B , i n t e r a c t i n g w i t h t h e m a j o r c o u n t e r i o n , A s p 7 5 , a n d w i t h e a c h o t h e r . S i m i l a r t o t h e S R H c a s e , A r g 7 2 i s p o i n t i n g a w a y f r o m t h e c h r o m o p h o r e , i n t e r a c t i n g w i t h A s p 1 9 8 r a t h e r t h a n T y r 5 1 . A t t h e s a m e t i m e , o n e s h o u l d n o t i c e t h e p r e s e n c e o f a n o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h e S B n i t r o g e n , c o n s e r v e d i n a l l t h r e e s t r u c t u r e s d e s c r i b e d h e r e i n . E v e n t h o u g h b y c o m b i n i n g t h e k n o w l e d g e o b t a i n e d o v e r y e a r s o f r e s e a r c h w i t h t h e m o r e r e c e n t c r y s t a l l o g r a p h i c a d v a n c e s i n t h e r h o d o p s i n f i e l d o n e c a n d r a w s o m e 2 6 c o n c l u s i o n s a n d r a i s e n e w s u g g e s t i o n s , t h e p r e c i s e m e c h a n i s m o f s p e c t r a l t u n i n g t h a t l e a d s t o h u m a n c o l o r v i s i o n r e m a i n s u n c l e a r . T h e a b o v e o b s e r v a t i o n s v e r i f y t h e s u g g e s t i o n t h a t t h e m e c h a n i s m o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n i s m u c h m o r e c o m p l i c a t e d t h a n o r i g i n a l l y t h o u g h t , a n d i s p r o b a b l y d u e t o a c o m b i n a t i o n o f t h e f a c t o r s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d . I t i s t h e r e f o r e a p p a r e n t t h a t , s i n c e n o c r y s t a l s t r u c t u r e s o f t h e c o n e p i g m e n t s a r e a v a i l a b l e , a n a l t e r n a t i v e a p p r o a c h f o r t h e s t u d y o f t h e w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n , i n v o l v i n g s y s t e m s e a s i e r t o s t u d y a n d m a n i p u l a t e , c o u l d b e o f g r e a t u s e . 1 . 5 D e s i g n i n g a R e t i n a l B i n d i n g P r o t e i n t o a c t a s a R h o d o p s i n S u r r o g a t e A S p r e v i o u s l y d i s c u s s e d , s e v e r a l h y p o t h e s e s h a v e b e e n p r o p o s e d r e g a r d i n g t h e m e c h a n i s m O f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n , a l l O f w h i c h f o c u s o n a l t e r i n g t h e d e g r e e o f r e t i n a l ’ s c o n j u g a t i o n b y d i f f e r e n t m e a n s . H o w e v e r , t h e c h a l l e n g e s i n b i o p h y s i c a l s t u d i e s o f h y d r o p h o b i c m e m b r a n e b o u n d p r o t e i n s , t h e l a c k o f 3 - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e s f o r t h e c o l o r e d p i g m e n t s , a n d t h e d i f f i c u l t i e s i n m u t a g e n e s i s o f m e m b r a n e b o u n d p r o t e i n s h a s h a m p e r e d t h e e f f o r t s t o c l e a r l y t e s t t h e s e t h e o r i e s . G i v e n t h e r i s i n g i n t e r e s t i n u n d e r s t a n d i n g t h e n a t u r e o f t h i s p r o t e i n - s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n a n d c o n s i d e r i n g t h e d i f f i c u l t i e s e n c o u n t e r e d , w e h a v e o p t e d t o e n g i n e e r a p r o t e i n m i m i c o f r h o d o p s i n t h a t w i l l n o t s u f f e r f r o m t h e l i m i t a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h m e m b r a n e b o u n d p r o t e i n s . P r o t e i n d e s i g n a n d e n g i n e e r i n g i s e v o l v i n g a s a n a r e a o f r a p i d l y e x p a n d i n g i n t e r e s t s i n c e i t w a s fi r s t i n t r o d u c e d i n t h e e a r l y 1 9 8 0 ’ s . T h e a b i l i t y t o d e s i g n a p r o t e i n p o s s e s s i n g a s p e c i f i c , d e s i r e d f u n c t i o n b y a p p l y i n g t h e v a s t a r r a y o f k n o w l e d g e a n d t h e t h e o r i e s a s s o c i a t e d w i t h p r o t e i n c h e m i s t r y , i s a p a r t i c u l a r l y i n t r i g u i n g fi e l d . T h e 2 7 “ 5 0 4 6 2 A l o n g t h e s e l i n e s , d e s i r e d a d v a n c e m e n t o f c o m p u t a t i o n a l c h e m i s t r y o v e r t h e p a s t f e w y e a r s h a s a l l o w e d f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a s e r i e s o f m e t h o d s f o r t h e d e s i g n a n d t h e p r e d i c t i o n o f t h e s t r u c t u r e o f s e v e r a l c h e m i c a l l y a c t i v e o l i g o - a n d p o l y - p e p t i d e s . 1 4 7 " 5 0 H e l l i n g a a n d c o w o r k e r s h a v e p i o n e e r e d t h e fi e l d , h a v i n g p r o d u c e d a s e r i e s o f s u c c e s s f u l e x a m p l e s o f r a t i o n a l p r o t e i n d e s i g n m ' m O v e r t h e y e a r s , s e v e r a l s u c c e s s f u l a t t e m p t s a t p r o t e i n e n g i n e e r i n g h a v e b e e n r e c o r d e d , l e a d i n g t o a n i n c r e a s e i n t h e u n d e r s t a n d i n g o f p r o t e i n f o l d i n g a s w e l l a s s t r u c t u r e / f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s . 1 5 5 ' 1 5 7 B o t h r a t i o n a l a n d r a n d o m g e n e m a n i p u l a t i o n h a v e b e e n u s e d i n o r d e r t o o b t a i n a p o l y p e p t i d e s e q u e n c e o f d e s i r e d c o n f o r m a t i o n a n d 1 5 8 , 1 5 9 f u n c t i o n . A t t h e s a m e t i m e , s e v e r a l c h e m i c a l a p p r o a c h e s , i n c o n j u n c t i o n t o b i o c h e m i c a l p r o c e s s e s , h a v e b e e n f o l l o w e d f o r t h e i n t r o d u c t i o n O f n o v e l f u n c t i o n a l i t i e s a n d s t r u c t u r a l e l e m e n t s o n a l r e a d y e x i s t i n g p r o t e i n s . e l e m e n t s , s u c h a s m e t a l b i n d i n g S i t e s h a v e b e e n i n t r o d u c e d i n t o n a t u r a l l y o c c u r r i n g p r o t e i n s i n a n a t t e m p t t o f o r m c a t a l y t i c a l l y a c t i v e s t r u c t u r e s m ' 1 6 7 I n a d d i t i o n , t h r o u g h t h e d e n o v o p r o t e i n d e s i g n a p p r o a c h , s m a l l p e p t i d e s a n d p r o t e i n s t h a t c a n a d o p t p r e - d e fi n e d , e v e n n o v e l , s e c o n d a r y s t r u c t u r e s h a v e b e e n o b t a i n e d l s s ’ 1 6 8 4 7 0 R e c e n t l y , t h e r e h a s b e e n a n i n c r e a s i n g i n t e r e s t f o r t h e d e v e l o p m e n t o f e n g i n e e r e d p r o t e i n s f o r d i r e c t p h a r m a c e u t i c a l a p p l i c a t i o n s , w h i c h c a n r e v o l u t i o n a l i z e t h e f i e l d b y m i n i m i z i n g t h e s i d e e f f e c t s w h i l e o p t i m i z i n g t h e e f f i c a c y o f t h e d r u g m ‘ 1 7 2 O u r i n t e r e s t l i e s i n u s i n g t h e r a t i o n a l p r o t e i n e n g i n e e r i n g a p p r o a c h i n o r d e r t o c o n v e r t a s m a l l c y t o s o l i c p r o t e i n , C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n I I ( C R A B P I I ) , i n t o a r h o d o p s i n p r o t e i n s u r r o g a t e . B y d o i n g s o , w e w i l l b e a b l e t o r a t i o n a l l y d e s i g n t h e v a r i o u s i n t e r a c t i o n s t h a t c o u l d a f f e c t t h e w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n b y s y s t e m a t i c a l l y 2 8 i n t r o d u c i n g c h a r g e s , s t e r i c s a n d d i p o l e s a t v a r y i n g l o c a t i o n s w i t h r e s p e c t t o t h e b o u n d c h r o m o p h o r e . F r o m a p r a c t i c a l p o i n t o f v i e w , w e n e e d a s y s t e m t h a t i s s m a l l e r a n d e a s i e r t o m a n i p u l a t e t h a n r h o d o p s i n . S i n c e w e a r e t r y i n g t o o v e r c o m e t h e p r o b l e m s a s s o c i a t e d w i t h m e m b r a n e p r o t e i n s , w e n e e d a s o l u b l e p r o t e i n t h a t h a s a l r e a d y b e e n e x p r e s s e d i n b a c t e r i a l c u l t u r e s i n g o o d y i e l d s . I n o r d e r f o r a p r o t e i n t o a c t a s a r h o d o p s i n m i m i c , i t i s e s s e n t i a l t h a t i t b i n d s t h e s a m e c h r o m o p h o r e , r e t i n a l , a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . T h e r e f o r e , a p r o t e i n m i m i c c a n d i d a t e m u s t h a v e a r o b u s t o v e r a l l s t r u c t u r e , a m e n a b l e t o m u l t i p l e m u t a t i o n s , s o t h a t t h e d e s i r e d r e t i n a l b i n d i n g c a n b e O b t a i n e d . A t t h e s a m e t i m e , w e a r e i n t e r e s t e d i n r e d e s i g n i n g t h e b i n d i n g p o c k e t O f a p r o t e i n i n a r a t i o n a l m a n n e r . T h a t r e q u i r e s t h e e x i s t e n c e o f a s o l v e d 3 - D s t r u c t u r e , S O t h a t w o r k i n g m o d e l s o f t h e s u g g e s t e d m u t a n t s c a n b e v i e w e d i n a d v a n c e . 1 . 6 I n t r o d u c t i o n t o R e t i n o i d B i n d i n g P r o t e i n s C R A B P I I i s a m e m b e r o f t h e I n t r a c e l l u l a r L i p i d B i n d i n g P r o t e i n s ( i L B P ) f a m i l y , a g r o u p o f s m a l l , c y t o s o l i c p r o t e i n s t h a t h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m a n u m b e r o f d i f f e r e n t t i s s u e s O f v e r t e b r a t e s a n d i n v e r t e b r a t e s . 1 7 3 T h e e x a c t p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s o f i L B P s a r e s t i l l n o t k n o w n . I t h a s b e e n p r o p o s e d , h o w e v e r , t h a t t h e y p a r t i c i p a t e i n t h e t r a n s p o r t a n d m e t a b o l i s m o f h y d r o p h o b i c l i g a n d s i n s i d e t h e c e l l . m ' 1 7 7 A l l i L B P S S h a r e a s i m i l a r S i z e ( 1 3 0 - 1 4 0 a m i n o a c i d s ) a n d g e n e r a l s t r u c t u r e , c o m p r i s e d O f 1 0 a n t i p a r a l l e l B - s t r a n d s a n d 2 S h o r t h e l i c e s t h a t f o l d i n t o a h i g h l y c o n s e r v e d c l a m s h e l l - l i k e s t r u c t u r e ( B - b a r r e l ) , 2 9 s u r r o u n d i n g a l a r g e i n t e r n a l b i n d i n g c a v i t y , d e s p i t e a h i g h d e g r e e o f s e q u e n c e v a r i a b i l i t y ( F i g u r e 1 - 1 6 ) . 1 7 8 T h e t w o m a i n g r o u p s o f i L B P S a r e t h e F a t t y A c i d B i n d i n g P r o t e i n s ( F A B P ) a n d t h e R e t i n o i d B i n d i n g P r o t e i n s ( R B P ) . F i g u r e 1 4 6 . C r y s t a l s t r u c t u r e s o f C e l l u l a r R e t i n o l B i n d i n g P r o t e i n I I ( A ) a n d A d i p o c y t e L i p i d B i n d i n g P r o t e i n ( B ) i n t h e p r e s e n c e o f t h e i r n a t u r a l s u b s t r a t e s a l l - t r a n s — r e t i n o l a n d o l e i c a c i d . r e s p e c t i v e l y . T h e o v e r a l l s t r u c t u r e w i t h i n a l l t h e m e m b e r s o f t h e i L B P f a m i l y r e m a i n s a 6 - b a r r e l . I n a d d i t i o n t o t h e o v e r a l l s t r u c t u r e , t h e b i n d i n g c a v i t i e s o f t h e v a r i o u s i L B P s h a v e b e e n s t r i k i n g l y s i m i l a r , r a i s i n g q u e s t i o n s a b o u t t h e s o u r c e o f l i g a n d s e l e c t i v i t y w i t h i n t h e f a m i l y . F i g u r e 1 - 1 7 c o m p a r e s t h e a c i d b i n d i n g d o m a i n s o f t w o m e m b e r s o f t h e i L B P f a m i l y , H u m a n M u s c l e F a t t y A c i d B i n d i n g P r o t e i n ( H M - F A B P ) a n d C R A B P H . ” 9 ‘ “ ‘ 0 A s c a n b e s e e n , m o s t o f t h e r e s i d u e s a r o u n d t h e b o u n d s u b s t r a t e a r e c o n s e r v e d , m a i n t a i n i n g a v e r y S i m i l a r b i n d i n g n e t w o r k . I n e a c h c a s e , t h e a c i d i s d i r e c t l y i n t e r a c t i n g w i t h t w o A r g 3 0 . 3 m E 7 2 H 9 3 F i g u r e 1 - 1 7 . T h e b i n d i n g o f v a r i o u s s u b s t r a t e s w i t h i n t h e i L B P f a m i l y o c c u r s i n a s i m i l a r f a s h i o n . A . B i n d i n g c a v i t y o f C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n I I ( a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d b o u n d ) ; B . B i n d i n g c a v i t y o f H u m a n M u s c l e F a t t y A c i d B i n d i n g P r o t e i n ( o l e i c a c i d b o u n d ) . I m p o r t a n t a m i n o a c i d s a r e h i g h l i g h t e d . T h e c r o s s e s r e p r e s e n t t h e o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e s f o u n d i n t h e h y d r o p h o b i c c o r e o f e a c h p r o t e i n . a n d a T y r r e s i d u e , w h i l e a s t r u c t u r e d w a t e r n e t w o r k i s c o n n e c t i n g t h e p o l a r a m i n o a c i d s p r e s e n t i n t h e c a v i t y . A s u g g e s t i o n h a s b e e n t h a t t h e s e l e c t i v i t y o f v a r i o u s p r o t e i n s o r i g i n a t e s f o r m t h e p o s i t i o n o f d i f f e r e n t o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e s , p r e s e n t i n t h e 1 8 " ' 8 2 H o w e v e r , t o d a t e , t h i s i s s u e h a s n o t b e e n h y d r o p h o b i c c o r e O f e a c h p r o t e i n . c l a r i fi e d . A S m e n t i o n e d e a r l i e r , a n i m p o r t a n t s u b c a t e g o r y o f t h e i L B P s i s t h e r e t i n o i d b i n d i n g p r o t e i n s ( R B P S ) . R e t i n o i d s , t h e a l c o h o l i c , a l d e h y d i c a n d a c i d i c m e t a b o l i t e s o f v i t a m i n A , p l a y i m p o r t a n t r o l e s i n a m u l t i t u d e o f c e l l u l a r p r o c e s s e s , i n c l u d i n g e m b r y o n i c 1 8 3 4 8 5 R e t i n o i c a c i d , ( R A ) , a h o r m o n a l l y a c t i v e d e v e l o p m e n t a n d c e l l a p o p t o s i s . c o m p o u n d , h a s b e e n f o u n d t o e x h i b i t p r o f o u n d e f f e c t s o n c e l l g r o w t h , d i f f e r e n t i a t i o n a n d m o r p h o g e n e s i s . S i n c e a S h o r t a g e o r a n e x c e s s o f r e t i n o i d s c a n c a u s e m a l f u n c t i o n i n g o f s i g n a l i n g p a t h w a y s , m a i n t e n a n c e o f t h e i r h o m e o s t a s i s i n t h e c e l l i s v e r y i m p o r t a n t . T h e c o n c e n t r a t i o n o f r e t i n o i d s i s c o n t r o l l e d i n t h e c e l l c y t o p l a s m b y t h e r e t i n o i d b i n d i n g p r o t e i n s , n a m e l y C e l l u l a r R e t i n o l B i n d i n g P r o t e i n s ( C R B P ) a n d C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n s ( C R A B P ) . 1 8 6 A d d i t i o n a l l y , t h e p r e s e n c e o f a C e l l u l a r R e t i n a l B i n d i n g P r o t e i n ( C R A L B P ) h a s b e e n r e p o r t e d . C R A L B P i s a v i s u a l t i s s u e s p e c i f i c 3 6 k D a p r o t e i n ( 3 1 6 a m i n o a c i d s ) t h a t a p p e a r s t o s e r v e a s a s u b s t r a t e c a r r i e r , m o d u l a t i n g t h e i n t e r a c t i o n o f l l — c i s - r e t i n o l a n d 1 1 - c i s - r e t i n a l w i t h t h e v i s u a l c y c l e e n z y m e s . 1 8 7 A s p a r t o f o n g o i n g e f f o r t s t o b e t t e r u n d e r s t a n d t h e n o r m a l f u n c t i o n s o f C R A L B P , t h e C R A L B P - l i g a n d i n t e r a c t i o n s a n d t h e r e t i n o i d b i n d i n g p o c k e t h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d b y N M R a n d m u t a g e n e s i s e x p e r i m e n t s . 1 8 8 A l t h o u g h a l l t h e C R A L B P p r o t e i n s i s o l a t e d f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s s e e m t o s h a r e s t r u c t u r a l h o m o l o g y , n o s i g n i f i c a n t s e q u e n c e i d e n t i t y e x i s t s w i t h o t h e r r e t i n o i d b i n d i n g p r o t e i n s o r t h e v i s u a l p i g m e n t s . 1 8 9 C r a b b ’ s s t u d i e s i n t h i s a r e a h a v e 3 2 s h o w n t h a t a L y s r e s i d u e i s i m p o r t a n t f o r t h e b i n d i n g o f t h e l i g a n d . H o w e v e r , t h e e x p e r i m e n t a l d a t a i n d i c a t e t h a t t h e b i n d i n g i s n o n - c o v a l e n t u n l i k e t h e c a s e i n r h o d o p s i n . 1 9 0 U n f o r t u n a t e l y , n o c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h i s p r o t e i n h a s b e e n s o l v e d a s o f y e t . S i n c e w e w e r e i n t e r e s t e d i n e n g i n e e r i n g a r h o d o p s i n p r o t e i n m i m i c , w e b e l i e v e d t h a t t h e a b o v e - m e n t i o n e d r e t i n o i d b i n d i n g p r o t e i n s c o u l d a c t a s a s u i t a b l e t e m p l a t e . F r o m a fi r s t v i e w , o n e c o u l d a r g u e t h a t t h e b e s t c a n d i d a t e w o u l d b e t h e r e t i n a l b i n d i n g p r o t e i n s i n c e i t a l r e a d y e x h i b i t s h i g h a f fi n i t y f o r t h e d e s i r e d s u b s t r a t e . H o w e v e r , d u e t o t h e l a c k o f a c r y s t a l s t r u c t u r e , a r a t i o n a l r e - e n g i n e e r i n g o f t h e p r o t e i n ’ s c a v i t y i s n o t p o s s i b l e . F o r o u r p u r p o s e , o u r i n t e r e s t w a s d r a w n t o t h e r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n s , d u e t o t h e v a s t o f a v a i l a b l e i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e i r s t r u c t u r e . T h e r e a r e t w o f o r m s o f C R A B P p r o t e i n s p r e s e n t i n m o s t s p e c i e s , n a m e l y C R A B P I a n d C R A B P I I , h i g h l y c o n s e r v e d w i t h i n v e r t e b r a t e s , e x h i b i t i n g a 7 6 % h o m o l o g y i n h u m a n s m ' 1 9 2 T h e y a r e b o t h s m a l l , 1 3 7 a m i n o a c i d s , c y t o s o l i c p r o t e i n s t h a t b i n d a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d t h r o u g h a s e r i e s o f e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s . 1 9 3 B o t h p r o t e i n s h a v e b e e n c l o n e d a n d o v e r - e x p r e s s e d F i g u r e 1 - 1 8 S t e r e o v i e w o f t h e C R A B P I I c r y s t a l s t r u c t u r e b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d . 3 3 i n E - c o l i , a n d b o t h t h e i r N M R a n d X - r a y s t r u c t u r e s h a v e b e e n d e t e r m i n e d m ’ 1 8 6 ' ' 9 4 ‘ 1 9 7 F i g u r e 1 - 1 8 d e p i c t s t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f C R A B P I I b o u n d t o i t s n a t u r a l s u b s t r a t e , a s d e t e r m i n e d b y J o n e s e t a i m T h e p r o t e i n s h a v e b e e n a b l e t o t o l e r a t e a n u m b e r o f m u t a t i o n s , m a i n t a i n i n g t h e i r o v e r a l l s t r u c t u r e a n d e x p r e s s i o n l e v e l s . 1 9 8 P r o f e s s o r Y a n ( D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) g r a c i o u s l y d o n a t e d t o u s a p E T - 1 7 b v e c t o r c o n t a i n i n g t h e h u m a n C R A B P H g e n e . 3 4 1 . 7 R e f e r e n c e s 1 0 . l l . 1 2 . 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . H . S h i c h i , B i o c h e m i s t r y o f v i s i o n , A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N e w Y o r k , N Y , 1 9 8 3 . N . J . W a d e , A N a t u r a l H i s t o r y o f V i s i o n , B r a d f o r d B o o k s , 1 9 9 8 . F . J . E . W o o d b r i d g e , A r i s t o t l e ' s V i s i o n o f N a t u r e , G r e e n w o o d P r e s s R e p r i n t , 1 9 8 3 . J . K e p l e r , W . H . D o n a h u e , O p t i c s , G r e e n L i o n P r e s s , 2 0 0 0 . 1 . N e w t o n , B . J . C o h e n , A . E i n s t e i n , E . W h i t t a k e r , O p t i c k s : O r a T r e a t i s e o f t h e R e fl e c t i o n s , R e f r a c t i o n s , I n fl e c t i o n s & C o l o u r s o f L i g h t - B a s e d o n t h e F o u r t h E d i t i o n L o n d o n , 1 7 3 0 , D o v e r P u b l i c a t i o n s , 1 9 5 2 . F . C r e s c i t e l l i " F r i e d r i c h W i l h e l m K u h n e . T h e C e n t e n n i a l O f R h o d o p s i n " A r c h . O p t h a l m o l . 1 9 7 7 , 9 5 , 1 7 6 6 . G . W a l d , P . K . B r o w n " H u m a n R h o d o p s i n " S c i e n c e 1 9 5 8 , 1 2 7 , 2 2 2 - 2 2 6 . J . M . T i f f a n y , P . N o o r j a h a n , A . A . A b d e l - L a t i f , J . J . H a r d i n g , R . M a y n e , R . G . B r e w t o n , Z . X . R e n , B i o c h e m i s t r y o f t h e E y e , C h a p m a n a n d H a l l , L o n d o n , U K , 1 9 9 7 . F . C r e s c i t e l l i , i n H a n d b o o k o f S e n s o r y P h y s i o l o g y , V o l . V I I ( E d : I I . J . A . D a r t n e l l ) , S p r i n g e r - V e r l a g , N e w Y o r k , N Y , 1 9 7 2 , p p . 2 4 5 - 3 6 3 . B . W i s s i n g e r , L . T . S h a r p e " N e w a s p e c t s o f a n O l d t h e m e : T h e g e n e t i c b a s i s O f h u m a n c o l o r v i s i o n " A m . J . H u m . G e n e t . 1 9 9 8 , 6 3 , 1 2 5 7 - 1 2 6 2 . E . N . P u g h " R o d s a r e r o d s a n d c o n e s c o n e s , a n d ( n e v e r ) t h e t w a i n S h a l l m e e t " N e u r o n 2 0 0 1 , 3 2 , 3 7 5 - 3 7 6 . R . R . R a n d o " P o l y e n e s a n d v i s i o n " C h e m . B i o l . 1 9 9 6 , 3 , 2 5 5 - 2 6 2 . F . D . C o l l i n s " R h o d o p s i n a n d i n d i c a t o r y e l l o w " N a t u r e 1 9 5 3 , 1 7 1 , 4 6 9 - 4 7 2 . R . A . M o r t o n , G . A . J . P i t t " R h o d o p s i n . I X . p H a n d t h e h y d r o l y s i s o f i n d i c a t o r y e l l o w . " B i o c h e m . J . 1 9 5 5 , 5 9 , 1 2 8 - 1 3 4 . K . V o g t , F a c e t s o f v i s i o n , S p r i n g e r - V e r l a g , B e r l i n , 1 9 8 9 . R . H o f f m a n n , T h e S a m e a n d N o t t h e S a m e , C o l u m b i a U n i v e r s i t y P r e s s , N e w Y o r k , N Y , 1 9 9 5 . T . P . S a k m a r " R h o d o p s i n : A p r o t o t y p i c a l G p r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o r " P r o g . N u c l e i c A c i d R e s . 1 9 9 8 , 5 9 , 1 - 3 4 . 3 5 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . W . J . D e g r i p , D . G r a y , J . G i l l e s p i e , P . H . M . B o v e e , E . M . M . V a n d e n b e r g , J . L u g t e n b u r g , K . J . R o t h s c h i l d " P h o t o e x c i t a t i o n o f R h o d o p s i n - C o n f o r m a t i o n C h a n g e s i n t h e C h r o m o p h o r e , P r o t e i n a n d A s s o c i a t e d L i p i d s a s D e t e r m i n e d b y F t i r D i f f e r e n c e S p e c t r o s c o p y " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 8 8 , 4 8 , 4 9 7 - 5 0 4 . B . K o n i g , W . W e l t e , K . P . H o f m a n n " P h o t o a c t i v a t i o n o f R h o d o p s i n a n d I n t e r a c t i o n w i t h T r a n s d u c i n i n D e t e r g e n t M i c e l l e s - E f f e c t O f D o p i n g w i t h S t e r o i d M o l e c u l e s " F E B S L e t t . 1 9 8 9 , 2 5 7 , 1 6 3 - 1 6 6 . R . R . B i r g e " P h o t o p h y s i c s o f L i g h t T r a n s d u c t i o n i n R h o d o p s i n a n d B a c t e r i o r h o d o p s i n " A n n u . R e v . B i o p h y s . B i o . 1 9 8 1 , 1 0 , 3 1 5 - 3 5 4 . R . M a t h i e s " R e s o n a n c e R a m a n - S p e c t r o s c o p y o f R h o d o p s i n a n d B a c t e r i o r h o d o p s i n I s o t o p i c A n a l o g s " M e t h . E n z y m o l . 1 9 8 2 , 8 8 , 6 3 3 - 6 4 3 . A . C o o p e r " E n e r g y U p t a k e i n t h e 1 s t S t e p O f V i s u a l E x c i t a t i o n " N a t u r e 1 9 7 9 , 2 8 2 , 5 3 1 - 5 3 3 . M . L . S o u t o , B . B o r h a n , K . N a k a n i s h i " L o w - t e m p e r a t u r e p h o t o a f f i n i t y l a b e l i n g o f r h o d o p s i n a n d i n t e r m e d i a t e s a l o n g t r a n s d u c t i o n p a t h " V e r t e b r a t e P h o t o t r a n s d u c t i o n a n d t h e V i s u a l C y c l e , P t B 2 0 0 0 , 3 1 6 , 4 2 5 - 4 3 5 . D . S . K l i g e r , J . W . I e w i s " S p e c t r a l a n d k i n e t i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f v i s u a l p i g m e n t p h o t o i n t e r m e d i a t e s " I s r a e l J . C h e m . 1 9 9 5 , 3 5 , 2 8 9 - 3 0 7 . D . S . K l i g e r , J . W . L e w i s , I . S z u n d i " T i m e - r e s o l v e d s p e c t r o s c o p y o f v i s u a l p i g m e n t i n t e r m e d i a t e s . " A b s t r . P a p . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 9 , 2 1 7 , U 3 2 3 - U 3 2 3 . D . E m e i s , H . K u h n , J . R e i c h e r t , K . P . H o f m a n n " C o m p l e x - F o r m a t i o n b e t w e e n M e t a r h o d o p s i n - I i a n d t h - B i n d i n g P r o t e i n i n B o v i n e P h o t o r e c e p t o r - M e m b r a n e s L e a d s t o a S h i f t o f t h e P h o t o p r o d u c t E q u i l i b r i u m " F E B S L e t t . 1 9 8 2 , 1 4 3 , 2 9 - 3 4 . N . B e n n e t t , M . M i c h e l v i l l a z , H . K u h n " L i g h t - I n d u c e d I n t e r a c t i o n b e t w e e n R h o d o p s i n a n d t h e t h - B i n d i n g P r o t e i n M e t a r h o d o p s i n - I i I s t h e M a j o r P h o t o p r o d u c t I n v o l v e d " E u r . J . B i o c h e m . 1 9 8 2 , 1 2 7 , 9 7 - 1 0 3 . T . S h i e h , M . H a n , T . P . S a k m a r , S . O . S m i t h " T h e s t e r i c t r i g g e r i n r h o d o p s i n a c t i v a t i o n " J . M o l . B i o l . 1 9 9 7 , 2 6 9 , 3 7 3 - 3 8 4 . B . Y a n , K . N a k a n i s h i , J . L . S p u d i c h " M e c h a n i s m o f A c t i v a t i o n o f S e n s o r y R h o d o p s i n - I - E v i d e n c e f o r a S t e r i c T r i g g e r " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 1 , 8 8 , 9 4 1 2 - 9 4 1 6 . 3 6 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . 3 7 . 3 8 . 3 9 . 4 0 . 4 1 . 4 2 . S . A m i s , K . P . H o f m a n n " 2 D i f f e r e n t F o r m s o f M e t a r h o d o p s i n - I i - S c h i f f - B a s e D e p r o t o n a t i o n P r e c e d e s P r o t o n U p t a k e a n d S i g n a l i n g S t a t e " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 3 , 9 0 , 7 8 4 9 - 7 8 5 3 . I . S z u n d i , T . L . M a h , J . W . L e w i s , S . J a g e r , O . P . E r n s t , K . P . H o f m a n n , D . S . K l i g e r " P r o t o n t r a n s f e r r e a c t i o n s l i n k e d t o r h o d o p s i n a c t i v a t i o n " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 8 , 3 7 , 1 4 2 3 7 - 1 4 2 4 4 . J . J . R u p r e c h t , T . M i e l k e , R . V o g e l , C . V i l l a , G . F . X . S c h e r t l e r " E l e c t r o n c r y s t a l l o g r a p h y r e v e a l s t h e s t r u c t u r e o f m e t a r h o d o p s i n I " E m b o J . 2 0 0 4 , 2 3 , 3 6 0 9 - 3 6 2 0 . R . V o g e l , J . R u p r e c h t , C . V i l l a , T . M i e l k e , G . F . X . S c h e r t l e r , F . S i e b e r t " R h o d o p s i n p h o t o p r o d u c t s i n 2 D c r y s t a l s " J . M o l . B i o l . 2 0 0 4 , 3 3 8 , 5 9 7 - 6 0 9 . B . B o r h a n , M . L . S o u t o , H . I r n a i , Y . S h i c h i d a , K . N a k a n i s h i " M o v e m e n t o f r e t i n a l a l o n g t h e v i s u a l t r a n s d u c t i o n p a t h " S c i e n c e 2 0 0 0 , 2 8 8 , 2 2 0 9 - 2 2 1 2 . P . P . M . S c h n e t k a m p " H o w D o e s t h e R e t i n a l R o d N a - C a + K E x c h a n g e r R e g u l a t e C y t o s o l i c - F r e e C a 2 + " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 5 , 2 7 0 , 1 3 2 3 1 - 1 3 2 3 9 . P . D e t w i l e r " O p e n t h e l o o p : D i s s e c t i n g f e e d b a c k r e g u l a t i o n o f a s e c o n d m e s s e n g e r t r a n s d u c t i o n c a s c a d e " N e u r o n 2 0 0 2 , 3 6 , 3 - 4 . M . P . G r a y k e l l e r , P . B . D e t w i l e r " T h e C a l c i u m F e e d b a c k S i g n a l i n t h e P h o t o t r a n s d u c t i o n C a s c a d e O f V e r t e b r a t e R o d s " N e u r o n 1 9 9 4 , 1 3 , 8 4 9 - 8 6 1 . R . R . R a n d o " T h e C h e m i s t r y o f V i t a m i n - a a n d V i s i o n " A n g e w . C h e m . I n t . E d i t . 1 9 9 0 , 2 9 , 4 6 1 - 4 8 0 . R . B . P e n n , R . M . P a s c u a l , Y . M . K i m , S . J . M u n d e l l , V . P . K r y m s k a y a , R . A . P a n e t t i e r i , J . L . B e n o v i c " A r r e s t i n S p e c i f i c i t y f o r G p r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o r s i n h u m a n a i r w a y s m o o t h m u s c l e " J . B i o l . C h e m . 2 0 0 1 , 2 7 6 , 3 2 6 4 8 - 3 2 6 5 6 . S . J . M u n d e l l , M . E . O l a h , R . A . P a n e t t i e r i , J . L . B e n o v i c , R . B . P e n n " R e g u l a t i o n o f G p r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o r - a d e n y l y l c y c l a s e r e s p o n s i v e n e s s i n h u m a n a i r w a y s m o o t h m u s c l e b y e x o g e n o u s a n d a u t o c r i n e a d e n o s i n e " A m . J . R e s p . C e l l . M 0 1 . 2 0 0 1 , 2 4 , 1 5 5 - 1 6 3 . R . B . P e n n , A . N . P r o n i n , J . L . B e n o v i c " R e g u l a t i o n o f G p r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o r k i n a s e s " T r e n d s C a r d i o v a s . M e d . 2 0 0 0 , 1 0 , 8 1 - 8 9 . G . L . W h e e l e r , M . W . B i t e n s k y " L i g h t - A c t i v a t e d t h a s e i n V e r t e b r a t e P h o t o r e c e p t o r s - R e g u l a t i o n o f L i g h t - A c t i v a t e d C y c l i c - G m p P h o s p h o d i e s t e r a s e " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 7 7 , 7 4 , 4 2 3 8 - 4 2 4 2 . 3 7 4 3 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . 4 8 . 4 9 . 5 0 . 5 1 . 5 2 . 5 3 . 5 4 . 5 5 . A . C o o p e r , C . A . C o n v e r s e " E n e r g e t i c s o f P r i m a r y P r o c e s s e s i n V i s u a l E x c i t a t i o n - P h o t o c a l o r i m e t r y o f R h o d o p s i n i n R o d O u t e r S e g m e n t M e m b r a n e s " B i o c h e m i s t r y 1 9 7 6 , 1 5 , 2 9 7 0 - 2 9 7 8 . B . K . K . F u n g , J . B . H u r l e y , L . S t r y e r " F l o w o f I n f o r m a t i o n i n t h e L i g h t - T r i g g e r e d C y c l i c - N u c l e o t i d e C a s c a d e o f V i s i o n " P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U n i t e d S t a t e s o f A m e r i c a - B i o l o g i c a l S c i e n c e s 1 9 8 1 , 7 8 , 1 5 2 - 1 5 6 . G . A . S c h i c k , T . M . C o o p e r , R . A . H o l l o w a y , L . P . M u r r a y , R . R . B i r g e " E n e r g y - S t o r a g e i n t h e P r i m a r y P h o t o c h e m i c a l E v e n t s o f R h o d o p s i n a n d I s o r h o d o p s i n " B i o c h e m i s t r y 1 9 8 7 , 2 6 , 2 5 5 6 - 2 5 6 2 . N . M i k i , J . J . K e i m s , F . R . M a r c u s , J . F r e e m a n , M . W . B i t e n s k y " R e g u l a t i o n o f C y c l i c N u c l e o t i d e C o n c e n t r a t i o n s i n P h o t o r e c e p t o r s - A t p - D e p e n d e n t S t i m u l a t i o n o f C y c l i c N u c l e o t i d e P h o s p h o d i e s t e r a s e b y L i g h t " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 7 3 , 7 0 , 3 8 2 0 - 3 8 2 4 . T . D . L a m b " G a i n a n d k i n e t i c s o f a c t i v a t i o n i n t h e G - p r o t e i n c a s c a d e O f p h o t o t r a n s d u c t i o n " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 6 , 9 3 , 5 6 6 - 5 7 0 . H . J . A . D a r t n a l l , C . F . G o o d e v e , R . J . L y t h g o e " T h e q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e p h o t o c h e m i c a l b l e a c h i n g o f v i s u a l p u r p l e s o l u t i o n s i n m o n o c h r o m a t i c l i g h t . " P r o c . R o y . S o c . A 1 9 3 6 , 1 5 6 , 1 5 8 - 1 7 0 . H . J . A . D a r t n a l l " T h e p h o t o s e n s i t i v i t i e s o f v i s u a l p i g m e n t s i n t h e p r e s e n c e o f h y d r o x y l a m i n e . " V i s i o n R e s . 1 9 6 8 , 8 , 3 3 9 - 3 5 8 . J . E . K i m , M . J . T a u b e r , R . A . M a t h i e s " W a v e l e n g t h d e p e n d e n t c i s - t r a n s i s o m e r i z a t i o n i n v i s i o n " B i o c h e m i s t r y 2 0 0 1 , 4 0 , 1 3 7 7 4 - 1 3 7 7 8 . S . H e c h t , S . S h l a e r , M . H . P i r e n n e " E n e r g y , q u a n t a , a n d v i s i o n . " J . G e n . P h y s i o l . 1 9 4 2 , 2 5 , 8 1 9 - 8 4 0 . S c h n e i d e r " S p e c t r a l v a r i a t i o n i n t h e p h o t o s e n s i t i v i t y O f v i s u a l p u r p l e . " P r o c . R o y . S o c . A 1 9 3 9 , 1 7 0 , 1 0 2 - 1 1 2 . T . Y o u n g , T h e B a k e r i a n l e c t u r e : 0 n t h e t h e o r y o f l i g h t a n d c o l o r s , V o l . 9 2 , L o n d o n , 1 8 0 2 . J . K . B o w m a k e r , T h e e v o l u t i o n o f v e r t e b r a t e v i s u a l p i g m e n t s a n d p h o t o r e c e p t o r s , T h e M a c m i l l a n P r e s s , H o u n d s m i l l s , B a s i n g s t o k e , H a m p s h i r e , U K , 1 9 9 1 . M . P . R o w e , G . H . J a c o b s " C o n e p i g m e n t p o l y m o r p h i s m i n N e w W o r l d m o n k e y s : A r e a l l p i g m e n t s c r e a t e d e q u a l ? " V i s u a l N e u r o s c i . 2 0 0 4 , 2 1 , 2 1 7 - 2 2 2 . 3 8 5 6 . 5 7 . 5 8 . 5 9 . 6 0 . 6 1 . 6 2 . 6 3 . 6 4 . 6 5 . 6 6 . 6 7 . P . K . B r o w n , G . W a l d " V i s u a l p i g m e n t s i n s i n g l e r o d s a n d c o n e s o f t h e h u m a n r e t i n a . D i r e c t m e a s u r e m e n t s r e v e a l m e c h a n i s m s o f h u m a n n i g h t a n d c o l o r v i s i o n . " S c i e n c e 1 9 6 4 , 1 4 4 , 4 5 - 5 2 . M . N e i t z , J . N e i t z , G . H . J a c o b s " S p e c t r a l T u n i n g o f P i g m e n t s U n d e r l y i n g R e d - G r e e n C o l o r - V i s i o n " I n v e s t . O p h t h a l m o l . V i s . S c i . 1 9 9 1 , 3 2 , 1 0 9 2 - 1 0 9 2 . J . L . S c h n a p f , T . W . K r a f t , D . A . B a y l o r " S p e c t r a l S e n s i t i v i t y o f H u m a n C o n e P h o t o r e c e p t o r s " N a t u r e 1 9 8 7 , 3 2 5 , 4 3 9 - 4 4 1 . H . J . A . D a r t n a l l , J . K . B o w m a k e r , J . D . M o l l o n " H u m a n V i s u a l P i g m e n t s - M i c r o s p e c t r o p h o t o m e t r i c R e s u l t s f r o m t h e E y e s o f 7 P e r s o n s " P r o c . R o y . S o c . L o n d . B B i o . 1 9 8 3 , 2 2 0 , 1 1 5 - 1 3 0 . D . D . O p r i a n , A . B . A s e n j o , N . L e e , S . L . P e l l e t i e r " D e s i g n , C h e m i c a l S y n t h e s i s , a n d E x p r e s s i o n o f G e n e s f o r t h e 3 H u m a n C o l o r - V i s i o n P i g m e n t s " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 1 , 3 0 , 1 1 3 6 7 - 1 1 3 7 2 . A . B . A s e n j o , J . R i m , D . D . O p r i a n " M o l e c u l a r D e t e r m i n a n t s o f H u m a n R e d / G r e e n C o l o r D i s c r i m i n a t i o n " N e u r o n 1 9 9 4 , 1 2 , 1 1 3 1 - 1 1 3 8 . S . L . M e r b s , J . N a t h a n s " A b s o r p t i o n - S p e c t r a o f H u m a n C o n e P i g m e n t s " N a t u r e 1 9 9 2 , 3 5 6 , 4 3 3 - 4 3 5 . A . S t o c k m a n , L . T . S h a r p e , S . M e r b s , J . N a t h a n s " S p e c t r a l s e n s i t i v i t i e s o f h u m a n c o n e v i s u a l p i g m e n t s d e t e r m i n e d i n v i v o a n d i n v i t r o " V e r t e b r a t e P h o t o t r a n s d u c t i o n a n d t h e V i s u a l C y c l e , P t B 2 0 0 0 , 3 1 6 , 6 2 6 - 6 5 0 . G . A . J . P i t t , F . D . C o l l i n s , R . A . M o r t o n , P . S t o k " R h o d o p s i n . V I I I . N - R e t i n y l i d e n e m e t h y l a m i n e , a n i n d i c a t o r y e l l o w a n a l o g . " B i o c h e m . J . 1 9 5 5 , 5 9 , 1 2 2 - 1 2 8 . P . E . B l a t z , N . B a u m g a r t n e r , B . B a l a s u b r a m a n i y a n , P . B a l a s u b r a m a n i y a n , F . S t e d m a n " W a v e l e n g t h r e g u l a t i o n i n v i s u a l p i g m e n t c h r o m o p h o r e . L a r g e i n d u c e d b a t h o c h r o m i c S h i f t s i n r e t i n o l a n d r e l a t e d p o l y e n e s . " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 7 1 , 1 4 , 5 3 1 - 5 4 9 . J . O . E r i c k s o n , P . E . B l a t z " N - r e t i n y l i d e n e - l - a m i n O - 2 - p r o p a n o l : a S c h i f f b a s e a n a l o g f o r r h o d o p s i n . " V i s i o n R e s . 1 9 6 8 , 8 , 1 3 6 7 - 1 3 7 5 . P . E . B l a t z , J . H . M o h l e r , W . A h m e d " S p e c t r o s c o p i c O b s e r v a t i o n o f S o l v e n t I n t e r a c t i o n w i t h S e l e c t e d R e t i n a l S c h i f f - B a s e s " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 9 1 , 5 4 , 2 5 5 - 2 6 4 . 3 9 6 8 . 6 9 . 7 0 . 7 1 . 7 2 . 7 3 . 7 4 . 7 5 . 7 6 . 7 7 . 7 8 . 7 9 . 8 0 . 8 1 . M . G . M o t t o , M . S h e v e s , K . T s u j i m o t o , V . B a l o g h n a i r , K . N a k a n i s h i " O p s i n S h i f t s i n B o v i n e R h o d o p s i n a n d B a c t e r i o r h o d o p s i n - C o m p a r i s o n o f 2 E x t e r n a l P o i n t - C h a r g e M o d e l s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 8 0 , 1 0 2 , 7 9 4 7 - 7 9 4 9 . K . N a k a n i s h i , V . B a l o g h n a i r , M . A m a b o l d i , K . T s u j i m o t o , B . H o n i g " A n E x t e r n a l P o i n t - C h a r g e M o d e l f o r B a c t e r i o r h o d o p s i n t o A c c o u n t f o r I t s P u r p l e C o l o r " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 8 0 , 1 0 2 , 7 9 4 5 - 7 9 4 7 . C . W a l d " V i t a m i n A i n t h e r e t i n a . " N a t u r e 1 9 3 3 , 1 3 2 , 3 1 6 - 3 1 7 . R . A . M o r t o n , T . W . G o o d w i n " P r e p a r a t i o n o f r e t i n e n e i n v i t r o . " N a t u r e 1 9 4 4 , 1 5 3 , 4 0 5 - 4 0 6 . D . B o w n d s " S i t e o f a t t a c h m e n t o f r e t i n a l i n r h o d o p s i n . " N a t u r e 1 9 6 7 , 2 1 6 , 1 1 7 8 - 1 1 8 1 . M . A k h t a r , D . B l o s s e , P . D e w h u r s t " S t u d i e s o n v i s i o n . T h e n a t u r e o f t h e r e t i n a l - o p s i n l i n k a g e . " B i o c h e m . J . 1 9 6 8 , 1 1 0 , 6 9 3 - 7 0 2 . R . E . H u b b a r d , i n P r o c . N a t . P h y s . L a b . S y m p . N 0 . 8 , L o n d o n , 1 9 5 8 . A . R . O s e r o f f , C a l l e n d e . R h " R e s o n a n c e R a m a n - S p e c t r o s c o p y o f R h o d o p s i n i n R e t i n a l D i s k M e m b r a n e s " B i o c h e m i s t r y 1 9 7 4 , 1 3 , 4 2 4 3 - 4 2 4 8 . B . H o n i g , U . D i n u r , K . N a k a n i s h i , V . B a l o g h n a i r , M . A . G a w i n o w i c z , M . A m a b o l d i , M . G . M o t t o " E x t e r n a l P o i n t - C h a r g e M o d e l f o r W a v e l e n g t h R e g u l a t i o n i n V i s u a l P i g m e n t s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 9 , 1 0 1 , 7 0 8 4 - 7 0 8 6 . K . N a k a n i s h i " B i o o r g a n i c S t u d i e s w i t h R h o d o p s i n " P u r e A p p l . C h e m . 1 9 8 5 , 5 7 , 7 6 9 - 7 7 6 . M . A m a b o l d i , M . G . M o t t o , K . T s u j i m o t o , V . B a l o g h n a i r , K . N a k a n i s h i " H y d r o - R e t i n a l s a n d H y d r o - R h o d o p s i n s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 9 , 1 0 1 , 7 0 8 2 - 7 0 8 4 . L . C . P . J . M o l l e v a n g e r , A . P . M . K e n t g e n s , J . A . P a r d o e n , J . M . L . C o u r t i n , W . S . V e e m a n , J . L u g t e n b u r g , W . J . D e g l i p " H i g h - R e s o l u t i o n S o l i d - S t a t e C - l 3 - N m r S t u d y o f C a r b o n s C - 5 a n d 0 1 2 o f t h e C h r o m o p h o r e o f B o v i n e R h o d o p s i n - E v i d e n c e f o r a 6 - S - c i s C o n f o r m a t i o n w i t h N e g a t i v e - C h a r g e P e r t u r b a t i o n n e a r C - 1 2 " E u r . J . B i o c h e m . 1 9 8 7 , 1 6 3 , 9 - 1 4 . J . N a t h a n s , D . T h o m a s , D . S . H o g n e s s " M o l e c u l a r - G e n e t i c s o f H u m a n C o l o r - V i s i o n - t h e G e n e s E n c o d i n g B l u e , G r e e n , a n d R e d P i g m e n t s " S c i e n c e 1 9 8 6 , 2 3 2 , 1 9 3 - 2 0 2 . T . P . S a k m a r , R . R . F r a n k e , H . G . K h o r a n a " G l u t a m i c A c i d - 1 1 3 S e r v e s a s t h e R e t i n y l i d e n e S c h i f f - B a s e C o u n t e l i o n i n B o v i n e R h o d o p s i n " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 8 9 , 8 6 , 8 3 0 9 - 8 3 1 3 . 4 0 8 2 . 8 3 . 8 4 . 8 5 . 8 6 . 8 7 . 8 8 . 8 9 . 9 0 . 9 1 . 9 2 . 9 3 . 9 4 . 9 5 . E . A . Z h u k o v s k y , D . D . O p r i a n " E f f e c t o f C a r b o x y l i c - A c i d S i d e - C h a i n s o n t h e A b s o r p t i o n M a x i m u m o f V i s u a l P i g m e n t s " S c i e n c e 1 9 8 9 , 2 4 6 , 9 2 8 - 9 3 0 . J . N a t h a n s " D e t e r m i n a n t s o f V i s u a l P i g m e n t A b s o r b e n c y - I d e n t i fi c a t i o n o f t h e R e t i n y l i d e n e S c h i f f - B a s e C o u n t e r i o n i n B o v i n e R h o d o p s i n " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 0 , 2 9 , 9 7 4 6 - 9 7 5 2 . Z . Y . W a n g , A . B . A s e n j o , D . D . O p r i a n " I d e n t i fi c a t i o n o f t h e C l - - B i n d i n g S i t e i n t h e H u m a n R e d a n d G r e e n C o l o r - V i s i o n P i g m e n t s " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 3 , 3 2 , 2 1 2 5 - 2 1 3 0 . P . E . B l a t z , J . H . M o h l e r , H . V . N a v a n g u l " A n i o n - I n d u c e d W a v e l e n g t h R e g u l a t i o n o f A b s o r p t i o n M a x i m a o f S c h i f f - B a s e s o f R e t i n a l " B i o c h e m i s t r y 1 9 7 2 , 1 1 , 8 4 8 - 8 5 6 . Y . G a t , M . S h e v e s " A M e c h a n i s m f o r C o n t r o l l i n g t h e P k ( a ) o f t h e R e t i n a l P r o t o n a t e d S c h i f f - B a s e i n R e t i n a l P r o t e i n s - a S t u d y w i t h M o d e l C o m p o u n d s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 3 , 1 1 5 , 3 7 7 2 - 3 7 7 3 . G . W a l d " O n r h o d o p s i n i n s o l u t i o n . " J . G e n . P h y s i o l . 1 9 3 8 , 2 1 , 7 9 5 - 8 3 2 . G . S t e i n b e r g , M . O t t o l e n g h i , M . S h e v e s " P k ( a ) O f t h e P r o t o n a t e d S c h i f f - B a s e o f B o v i n e R h o d o p s i n - a S t u d y w i t h A r t i f i c i a l P i g m e n t s " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 3 , 6 4 , 1 4 9 9 - 1 5 0 2 . R . J . L y t h g o e " T h e a b s o r p t i o n s p e c t r a o f v i s u a l p u r p l e a n d O f i n d i c a t o r y e l l o w . " J . P h y s i o l . 1 9 3 7 , 8 9 , 3 3 1 - 3 5 8 . Y . K o u t a l o s " H i g h - P h F o r m o f B o v i n e R h o d o p s i n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 2 , 6 1 , 2 7 2 - 2 7 5 . N . L i v n a h , M . S h e v e s " T h e S c h i f f - B a s e B o n d C o n f i g u r a t i o n i n B a c t e r i o r h o d o p s i n a n d i n M o d e l C o m p o u n d s " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 3 , 3 2 , 7 2 2 3 - 7 2 2 8 . N . L i v n a h , M . S h e v e s " M o d e l C o m p o u n d s C a n M i m i c S p e c t r o s c o p i c P r o p e r t i e s O f B o v i n e R h o d o p s i n " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 3 , 1 1 5 , 3 5 1 - 3 5 3 . B . H o n i g , A . D . G r e e n b e r g , U . D i n u r , T . G . E b r e y " V i s u a l - P i g m e n t S p e c t r a - I m p l i c a t i o n s o f P r o t o n a t i o n o f R e t i n a l S c h i f f - B a s e " B i o c h e m i s t r y 1 9 7 6 , 1 5 , 4 5 9 3 - 4 5 9 9 . R . V . S a m p o g n a , A . S . Y a n g , B . H . H o n i g " C a l c u l a t i o n o f P k a s o f T i t r a t a b l e G r o u p s i n B a c t e r i o r h o d o p s i n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 4 , 6 6 , A 4 5 - A 4 5 . H . D e n g , L . W . H u a n g , R . C a l l e n d e r , T . E b r e y " E v i d e n c e f o r a B o u n d W a t e r M o l e c u l e N e x t t o t h e R e t i n a l S c h i f f - B a s e i n B a c t e r i o r h o d o p s i n a n d R h o d o p s i n - a 4 1 9 6 . 9 7 . 9 8 . 9 9 . 1 0 0 . 1 0 1 . 1 0 2 . 1 0 3 . 1 0 4 . 1 0 5 . 1 0 6 . R e s o n a n c e R a m a n - S t u d y o f t h e S c h i f f - B a s e H y d r o g e n / D e u t e r i u m E x c h a n g e " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 4 , 6 6 , 1 1 2 9 - 1 1 3 6 . H . K a n d o r i , Y . Y a m a z a k i , J . S a s a k i , R . N e e d l e m a n , J . K . L a n y i , A . M a e d a " W a t e r - M e d i a t e d P r o t o n - T r a n s f e r i n P r o t e i n s - a n F t i r S t u d y o f B a c t e r i o r h o d o p s i n " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 5 , 1 1 7 , 2 1 1 8 - 2 1 1 9 . C . N . R a f f e r t y , H . S h i c h i " P h o t o c h e m i c a l - R e a c t i o n s o f D r i e d P h o t o r e c e p t o r - M e m b r a n e s a t 7 7 - K " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 8 1 , 3 3 , A 2 9 3 - A 2 9 3 . S . W . L i n , G . G . K o c h e n d o e r f e r , H . S . C a r r o l l , D . W a n g , R . A . M a t h i e s , T . P . S a k m a r " M e c h a n i s m s O f s p e c t r a l t u n i n g i n b l u e c o n e v i s u a l p i g m e n t s - V i s i b l e a n d r a m a n S p e c t r o s c o p y o f b l u e - s h i f t e d r h o d o p s i n m u t a n t s " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 8 , 2 7 3 , 2 4 5 8 3 - 2 4 5 9 1 . H . K a k i t a n i , T . K a k i t a n i , H . R o d m a n , B . H o n i g " O n t h e M e c h a n i s m o f W a v e l e n g t h R e g u l a t i o n i n V i s u a l P i g m e n t s " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 8 5 , 4 1 , 4 7 1 - 4 7 9 . J . N a t h a n s " D e t e r m i n a n t s o f V i s u a l P i g m e n t A b s o r b a n c e - R o l e o f C h a r g e d A m i n o - A c i d s i n t h e P u t a t i v e T r a n s m e m b r a n e S e g m e n t s " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 0 , 2 9 , 9 3 7 - 9 4 2 . F . E . B l a t z , P . A . L i e b m a n " W a v e l e n g t h r e g u l a t i o n i n v i s u a l p i g m e n t s . " E x p . E y e R e s . 1 9 7 3 , 1 7 , 5 7 3 - 5 8 0 . Q . T a n , J . H . L o u , B . B o r h a n , E . K a m a u k h o v a , N . B e r o v a , K . N a k a n i s h i " A b s o l u t e s e n s e o f t w i s t o f t h e C 1 2 - C l 3 b o n d o f t h e r e t i n a l c h r o m o p h o r e i n b o v i n e r h o d o p s i n b a s e d o n e x c i t o n - c o u p l e d C D s p e c t r a o f 1 1 , 1 2 - d i h y d r o r e t i n a l a n a l o g u e s " A n g e w . C h e m . I n t . E d i t . 1 9 9 7 , 3 6 , 2 0 8 9 - 2 0 9 3 . P . I . E . V e r d e g e m , P . H . M . B o v e e - G e u r t s , W . J . d e G r i p , J . L u g t e n b u r g , H . J . M . d e G r o o t " R e t i n y l i d e n e l i g a n d s t r u c t u r e i n b o v i n e r h o d o p s i n , m e t a r h o d o p s i n - I , a n d I O - m e t h y l r h o d o p s i n f r o m i n t e r n u c l e a r d i s t a n c e m e a s u r e m e n t s u s i n g C - 1 3 - l a b e l i n g a n d l - D r o t a t i o n a l r e s o n a n c e M A S N M R " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 9 , 3 8 , 1 1 3 1 6 - 1 1 3 2 4 . B . H o n i g , B . H u d s o n , B . D . S y k e s , M . K a r p l u s " R i n g O r i e n t a t i o n i n B e t a - I o n o n e a n d R e t i n a l s ( T h e o r e t i c a l / N m r / S e m i - E m p i r i c a l A p p r o a c h / O v e r h a u s e r E f f e c t / S - c i s C o n f o r m a t i o n ) " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 7 1 , 6 8 , 1 2 8 9 - 1 2 9 3 . G . F . X . S c h e r t l e r , P . A . H a r g r a v e , P . C . E d w a r d s , V . M . U n g e r " T h e a r r a n g e m e n t o f a l p h a h e l i c e s i n r h o d o p s i n " I n v e s t . O p h t h a l m o l . V i s . S c i . 1 9 9 7 , 3 8 , 3 3 7 9 - 3 3 7 9 . V . M . U n g e r , P . A . H a r g r a v e , J . M . B a l d w i n , G . F . X . S c h e r t l e r " A r r a n g e m e n t o f r h o d o p s i n t r a n s m e m b r a n e a l p h a - h e l i c e s " N a t u r e 1 9 9 7 , 3 8 9 , 2 0 3 - 2 0 6 . 4 2 1 0 7 . 1 0 8 . 1 0 9 . 1 1 0 . 1 1 1 . 1 1 2 . 1 1 3 . 1 1 4 . 1 1 5 . 1 1 6 . 1 1 7 . 1 1 8 . G . F . X . S c h e r t l e r , P . A . H a r g r a v e , V . M . U n g e r " T h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f r h o d o p s i n o b t a i n e d b y e l e c t r o n c r y O - m i c r o s c o p y " I n v e s t . O p h t h a l m o l . V i s . S c i . 1 9 9 6 , 3 7 , 3 7 0 1 - 3 7 0 1 . V . M . U n g e r , G . F . X . S c h e r t l e r " L o w - R e s o l u t i o n S t r u c t u r e o f B o v i n e R h o d o p s i n D e t e r m i n e d b y E l e c t r o n C r y o m i c r o s c o p y " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 5 , 6 8 , 1 7 7 6 - 1 7 8 6 . J . M . B a l d w i n , G . F . X . S c h e r t l e r , V . M . U n g e r " A n a l p h a - c a r b o n t e m p l a t e f o r t h e t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s i n t h e r h o d o p s i n f a m i l y o f G - p r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o r s " J . M o l . B i o l . 1 9 9 7 , 2 7 2 , 1 4 4 - 1 6 4 . I . D . P o g o z h e v a , A . L . L o m i z e , H . I . M o s b e r g " T h e t r a n s m e m b r a n e 7 - a l p h a - b u n d l e o f r h o d o p s i n : D i s t a n c e g e o m e t r y c a l c u l a t i o n s w i t h h y d r o g e n b o n d i n g c o n s t r a i n t s " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 7 , 7 2 , 1 9 6 3 - 1 9 8 5 . P . H e r z y k , R . E . H u b b a r d " C o m b i n e d b i o p h y s i c a l a n d b i o c h e m i c a l i n f o r m a t i o n c o n fi r m s a r r a n g e m e n t o f t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s v i s i b l e f r o m t h e t h r e e - d i m e n s i o n a l m a p o f f r o g r h o d o p s i n " J . M o l . B i o l . 1 9 9 8 , 2 8 1 , 7 4 1 - 7 5 4 . G . F . X . S c h e r t l e r , C . V i l l a , R . H e n d e r s o n " P r o j e c t i o n S t r u c t u r e o f R h o d o p s i n " N a t u r e 1 9 9 3 , 3 6 2 , 7 7 0 - 7 7 2 . K . P a l c z e w s k i , T . K u m a s a k a , T . H o r i , C . A . B e h n k e , H . M o t o s h i m a , B . A . F o x , 1 . L e T r o n g , D . C . T e l l e r , T . O k a d a , R . E . S t e n k a m p , M . Y a m a m o t o , M . M i y a n o " C r y s t a l s t r u c t u r e o f r h o d o p s i n : A G p r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o r " S c i e n c e 2 0 0 0 , 2 8 9 , 7 3 9 - 7 4 5 . T . E b r e y , M . T s u d a , G . S a s s e n r a t h , J . L . W e s t , W . H . W a d d e l l " L i g h t A c t i v a t i o n o f B o v i n e R o d P h o s p h o d i e s t e r a s e b y N o n - P h y s i o l o g i c a l V i s u a l P i g m e n t s " F E B S L e t t . 1 9 8 0 , 1 1 6 , 2 1 7 - 2 1 9 . C . N . R a f f e r t y " L i g h t - I n d u c e d P e r t u r b a t i o n o f A r o m a t i c R e s i d u e s i n B o v i n e R h o d o p s i n a n d B a c t e r i o r h o d o p s i n " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 7 9 , 2 9 , 1 0 9 - 1 2 0 . T . O k a d a , M . S u g i h a r a , A . N . B o n d a r , M . E l s t n e r , P . E n t e l , V . B u s s " T h e r e t i n a l c o n f o r m a t i o n a n d i t s e n v i r o n m e n t i n r h o d o p s i n i n l i g h t o f a n e w 2 . 2 a n g s t r o m c r y s t a l s t r u c t u r e " J . M o l . B i o l . 2 0 0 4 , 3 4 2 , 5 7 1 - 5 8 3 . R . E . S t e n k a m p , S . F i l i p e k , C . A . G . G . D r i e s s e n , D . C . T e l l e r , K . P a l c z e w s k i " C r y s t a l s t r u c t u r e o f r h o d o p s i n : a t e m p l a t e f o r c o n e v i s u a l p i g m e n t s a n d o t h e r G p r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o r s " B b a - B i o m e m b r a n e s 2 0 0 2 , 1 5 6 5 , 1 6 8 - 1 8 2 . R . Y o k o y a m a , S . Y o k o y a m a " C o n v e r g e n t E v o l u t i o n o f t h e R e d — L i k e a n d G r e e n - L i k e V i s u a l P i g m e n t G e n e s i n F i s h , A s t y a n a x - F a s c i a t u s , a n d H u m a n " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 0 , 8 7 , 9 3 1 5 - 9 3 1 8 . 4 3 1 1 9 1 2 0 . 1 2 1 . 1 2 2 . 1 2 3 . 1 2 4 . 1 2 5 . 1 2 6 . 1 2 7 . 1 2 8 . 1 2 9 . 1 3 0 . T . C h a n , M . L e e , T . P . S a k m a r " I n t r o d u c t i o n o f H y d r o x y l - B e a r i n g A m i n o - A c i d s C a u s e s B a t h o c h r o m i c S p e c t r a l S h i f t s i n R h o d o p s i n - A m i n o - A c i d S u b s t i t u t i o n s R e s p o n s i b l e f o r R e d - G r e e n C o l o r P i g m e n t S p e c t r a l T u n i n g " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 2 , 2 6 7 , 9 4 7 8 - 9 4 8 0 . T . Y o s h i z a w a " T h e R o a d t o C o l o r - V i s i o n - S t r u c t u r e , E v o l u t i o n a n d F u n c t i o n o f C h i c k e n a n d G e c k o V i s u a l P i g m e n t s " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 9 2 , 5 6 , 8 5 9 - 8 6 7 . J . I . F a s i c k , N . L e e , D . D . O p r i a n " S p e c t r a l t u n i n g i n t h e h u m a n b l u e c o n e p i g m e n t " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 9 , 3 8 , 1 1 5 9 3 - 1 1 5 9 6 . J . M . J a n z , D . L . F a r r e n s " E n g i n e e r i n g a f u n c t i o n a l b l u e - w a v e l e n g t h - s h i f t e d r h o d o p s i n m u t a n t " B i o c h e m i s t r y 2 0 0 1 , 4 0 , 7 2 1 9 - 7 2 2 7 . J . L . S p u d i c h , C . S . Y a n g , K . H . J u n g , E . N . S p u d i c h " R e t i n y l i d e n e p r o t e i n s : S t r u c t u r e s a n d f u n c t i o n s f r o m a r c h a e a t o h u m a n s " A n n u . R e v . C e l l D e v . B i o l . 2 0 0 0 , 1 6 , 3 6 5 - 3 6 9 . T . K i t a g a w a , M . T s u d a " R e s o n a n c e R a m a n - S p e c t r a o f O c t o p u s A c i d a n d A l k a l i n e M e t a r h o d o p s i n s " B i o c h i m i c a E t B i o p h y s i c a A c t a 1 9 8 0 , 6 2 4 , 2 1 1 - 2 1 7 . C . P a n d e , A . P a n d e , K . T . Y u e , R . C a l l e n d e r , T . G . E b r e y , M . T s u d a " R e s o n a n c e R a m a n - S p e c t r o s c o p y o f O c t o p u s R h o d o p s i n a n d I t s P h o t o p r o d u c t s " B i o c h e m i s t r y 1 9 8 7 , 2 6 , 4 9 4 1 - 4 9 4 7 . C . Y u a n , O . K u w a t a , J . L i a n g , S . M i s r a , S . P . B a l a s h o v , T . G . E b r e y " C h l o r i d e b i n d i n g r e g u l a t e s t h e S c h i f f b a s e p K i n g e c k o P 5 2 1 c o n e - t y p e v i s u a l p i g m e n t " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 9 , 3 8 , 4 6 4 9 - 4 6 5 4 . M . N a k a g a w a , T . I w a s a , S . K i k k a w a , M . T s u d a , T . G . E b r e y " H o w v e r t e b r a t e a n d i n v e r t e b r a t e v i s u a l p i g m e n t s d i f f e r i n t h e i r m e c h a n i s m o f p h o t o a c t i v a t i o n " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 9 , 9 6 , 6 1 8 9 - 6 1 9 2 . S . N i s h i m u r a , H . K a n d o r i , M . N a k a g a w a , M . T s u d a , A . M a e d a " S t r u c t u r a l d y n a m i c s o f w a t e r a n d t h e p e p t i d e b a c k b o n e a r o u n d t h e S c h i f f b a s e a s s o c i a t e d w i t h t h e l i g h t - a c t i v a t e d p r o c e s s o f o c t o p u s r h o d o p s i n " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 7 , 3 6 , 8 6 4 - 8 7 0 . S . H a s h i m o t o , H . T a k e u c h i , M . N a k a g a w a , M . T s u d a " U l t r a v i o l e t r e s o n a n c e R a m a n e v i d e n c e f o r t h e a b s e n c e o f t y r o s i n a t e i n o c t o p u s r h o d o p s i n a n d t h e p a r t i c i p a t i o n o f T r p r e s i d u e s i n t h e t r a n s i t i o n t o a c i d m e t a r h o d o p s i n " F E B S L e t t . 1 9 9 6 , 3 9 8 , 2 3 9 - 2 4 2 . A . T e r a k i t a , M . K o y a n a g i , H . T s u k a m o t o , T . Y a m a s h i t a , T . M i y a t a , Y . S h i c h i d a " C o u n t e r i o n d i s p l a c e m e n t i n t h e m o l e c u l a r e v o l u t i o n o f t h e r h o d o p s i n f a m i l y " N a t S t r u c t M o l B i o l 2 0 0 4 , 1 1 , 2 8 4 - 2 8 9 . 1 3 1 1 3 2 . 1 3 3 . 1 3 4 . 1 3 5 . 1 3 6 . 1 3 7 . 1 3 8 . 1 3 9 . 1 4 0 . 1 4 1 . W . S t o e c k e n i u s , R . A . B o g o m o l n i " B a c t e r i o r h o d o p s i n a n d R e l a t e d P i g m e n t s o f H a l o b a c t e r i a " A n n u . R e v . B i o c h e m . 1 9 8 2 , 5 1 , 5 8 7 - 6 1 6 . H . J . M . D e g r o o t , G . S . H a r b i s o n , J . H e r z f e l d , R . G . G r i f fi n " N u c l e a r M a g n e t i c - R e s o n a n c e S t u d y o f t h e S c h i f f - B a s e i n B a c t e r i o r h o d o p s i n - C o u n t e r i o n E f f e c t s o n t h e N - 1 5 S h i f t A n i s o t r o p y " B i o c h e m i s t r y 1 9 8 9 , 2 8 , 3 3 4 6 - 3 3 5 3 . J . H u , R . G . G r i f fi n , J . H e r z f e l d " S y n e r g y i n t h e S p e c t r a l t u n i n g o f r e t i n a l p i g m e n t s : C o m p l e t e a c c o u n t i n g o f t h e O p s i n s h i f t i n b a c t e r i o r h o d o p s i n " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 4 , 9 1 , 8 8 8 0 - 8 8 8 4 . A . K u s n e t z o w , D . L . S i n g h , C . H . M a r t i n , I . J . B a r a n i , R . R . B i r g e " N a t u r e o f t h e c h r o m o p h o r e b i n d i n g S i t e o f b a c t e r i o r h o d o p s i n : T h e p o t e n t i a l r o l e o f A r g ( 8 2 ) a s a p r i n c i p a l c o u n t e r i o n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 9 , 7 6 , 2 3 7 0 - 2 3 8 9 . H . L u e c k e , B . S c h o b e r t , H . T . R i c h t e r , J . P . C a r t a i l l e r , J . K . L a n y i " S t r u c t u r e o f b a c t e r i o r h o d o p s i n a t 1 . 5 5 a n g s t r o m r e s o l u t i o n " J . M o l . B i o l . 1 9 9 9 , 2 9 1 , 8 9 9 - 9 1 1 . A . G . D o u k a s , A . P a n d e , T . S u z u k i , R . H . C a l l e n d e r , B . H o n i g , M . O t t o l e n g h i " O n t h e M e c h a n i s m o f H y d r o g e n - D e u t e r i u m E x c h a n g e i n B a c t e r i o r h o d o p s i n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 8 1 , 3 3 , 2 7 5 - 2 7 9 . B . E h r e n b e r g , A . L e w i s , T . K . P o r t a , J . F . N a g l e , W . S t o e c k e n i u s " E x c h a n g e K i n e t i c s o f t h e S c h i f f - B a s e P r o t o n i n B a c t e r i o r h o d o p s i n " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . - B i o l o g i c a l S c i e n c e s 1 9 8 0 , 7 7 , 6 5 7 1 - 6 5 7 3 . J . F a v r o t , C . S a n d o r f y , D . V o c e l l e " I n f r a r e d S t u d y o f B a s i c i t y o f N o n - A r o m a t i c I r n i n e s - R e l a t i o n t o V i s u a l P i g m e n t s " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 7 8 , 2 8 , 2 7 1 - 2 7 2 . G . S . H a r b i s o n , S . O . S m i t h , D . P . R a l e i g h , J . E . R o b e r t s , J . A . P a r d o e n , S . K . D . G u p t a , J . L u g t e n b u r g , R . A . M a t h i e s , J . H e r z f e l d , R . G . G r i f f i n " H i g h - R e s o l u t i o n S o l i d - S t a t e N m r - S t u d i e s o f B a c t e r i o r h o d o p s i n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 8 6 , 4 9 , A 1 8 0 - A 1 8 0 . J . H e r z f e l d , S . K . D a s g u p t a , M . R . F a r r a r , G . S . H a r b i s o n , A . E . M c d e r m o t t , S . L . P e l l e t i e r , D . P . R a l e i g h , S . O . S m i t h , C . W i n k e l , J . L u g t e n b u r g , R . G . G r i f fi n " S o l i d - S t a t e C - 1 3 N m r - S t u d y o f T y r o s i n e P r o t o n a t i o n i n D a r k - A d a p t e d B a c t e r i o r h o d o p s i n " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 0 , 2 9 , 5 5 6 7 - 5 5 7 4 . S . L . L i n , B . Y a n " T h r e e - d i m e n s i o n a l m o d e l o f s e n s o r y r h o d o p s i n I r e v e a l s i m p o r t a n t r e s t r a i n t s b e t w e e n t h e p r o t e i n a n d t h e c h r o m o p h o r e " P r o t e i n E n g 1 9 9 7 , 1 0 , 1 9 7 - 2 0 6 . 4 5 1 4 2 . 1 4 3 . 1 4 4 . 1 4 5 . 1 4 6 . 1 4 7 . 1 4 8 . 1 4 9 . 1 5 0 . 1 5 1 . 1 5 2 . 1 5 3 . A . B l a n c k , D . O e s t e r h e l t , E . F e r r a n d o , E . S . S c h e g k , F . L o t t s p e i c h " P r i m a r y S t r u c t u r e o f S e n s o r y R h o d o p s i n - I , a P r o k a r y o t i c P h o t o r e c e p t o r " E m b o . J . 1 9 8 9 , 8 , 3 9 6 3 - 3 9 7 1 . K . S h i m o n o , M . I w a m o t o , M . S u m i , N . K a m o " E f f e c t s o f t h r e e c h a r a c t e r i s t i c a m i n o a c i d r e s i d u e s o f P h a r a o n i s p h o b o r h o d o p s i n o n t h e a b s o r p t i o n m a x i m u m " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 2 0 0 0 , 7 2 , 1 4 1 - 1 4 5 : L . R e n , C . H . M a r t i n , K . J . W i s e , N . B . G i l l e s p i e , H . L u e c k e , J . K . L a n y i , J . L . S p u d i c h , R . R . B i r g e " M o l e c u l a r m e c h a n i s m o f S p e c t r a l t u n i n g i n s e n s o r y r h o d o p s i n I I " B i o c h e m i s t r y 2 0 0 1 , 4 0 , 1 3 9 0 6 - 1 3 9 1 4 . L . V o g e l e y , O . A . S i n e s h c h e k o v , V . D . T r i v e d i , J . S a s a k i , J . L . S p u d i c h , H . L u e c k e " A n a b a e n a s e n s o r y r h o d o p s i n : A p h o t o c h r o r r r i c c o l o r 0 s e n s o r a t 2 . 0 a n g s t r o m " S c i e n c e 2 0 0 4 , 3 0 6 , 1 3 9 0 - 1 3 9 3 . K . H . J u n g , V . D . T r i v e d i , J . L . S p u d i c h " D e m o n s t r a t i o n o f a s e n s o r y r h o d o p s i n i n e u b a c t e r i a " M o l . M i c r o b i o l . 2 0 0 3 , 4 7 , 1 5 1 3 - 1 5 2 2 . H . W . H e l l i n g a " C o m p u t a t i o n a l p r o t e i n e n g i n e e r i n g " N a t . S t r u c t . B i o l . 1 9 9 8 , 5 , 5 2 5 - 5 2 7 . M . A . D w y e r , L . L . L o o g e r , H . W . H e l l i n g a " C o m p u t a t i o n a l d e s i g n o f a b i o l o g i c a l l y a c t i v e e n z y m e " S c i e n c e 2 0 0 4 , 3 0 4 , 1 9 6 7 - 1 9 7 1 . L . L . L o o g e r , M . A . D w y e r , J . J . S m i t h , H . W . H e l l i n g a " C o m p u t a t i o n a l d e s i g n O f r e c e p t o r a n d s e n s o r p r o t e i n s w i t h n o v e l f u n c t i o n s " N a t u r e 2 0 0 3 , 4 2 3 , 1 8 5 - 1 9 0 . W . F . D e G r a d o " C o m p u t a t i o n a l b i o l o g y - B i o s e n s o r d e s i g n " N a t u r e 2 0 0 3 , 4 2 3 , 1 3 2 - 1 3 3 . M . A . D w y e r , L . L . L o o g e r , H . W . H e l l i n g a " C o m p u t a t i o n a l d e s i g n o f a Z n 2 + r e c e p t o r t h a t c o n t r o l s b a c t e r i a l g e n e e x p r e s s i o n " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 2 0 0 3 , 1 0 0 , 1 1 2 5 5 - 1 1 2 6 0 . J . S . M a r v i n , E . E . C o r c o r a n , N . A . H a t t a n g a d i , J . V . Z h a n g , S . A . G e r e , H . W . H e l l i n g a " T h e r a t i o n a l d e s i g n o f a l l o s t e r i c i n t e r a c t i o n s i n a m o n o m e r i c p r o t e i n a n d i t s a p p l i c a t i o n s t o t h e c o n s t r u c t i o n o f b i o s e n s o r s " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 7 , 9 4 , 4 3 6 6 - 4 3 7 1 . A . L . P i n t o , H . W . H e l l i n g a , J . P . C a r a d o n n a " C o n s t r u c t i o n o f a c a t a l y t i c a l l y a c t i v e i r o n s u p e r o x i d e d i s m u t a s e b y r a t i o n a l p r o t e i n d e s i g n " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 7 , 9 4 , 5 5 6 2 - 5 5 6 7 . 4 6 1 5 4 . 1 5 5 . 1 5 6 . 1 5 7 . 1 5 8 . 1 5 9 . 1 6 0 . 1 6 1 . 1 6 2 . 1 6 3 . 1 6 4 . 1 6 5 . M . S . W i s z , C . Z . G a r r e t t , H . W . H e l l i n g a " C o n s t r u c t i o n o f a f a m i l y o f C y s ( 2 ) H i s ( 2 ) z i n c b i n d i n g s i t e s i n t h e h y d r o p h o b i c c o r e o f t h i o r e d o x i n b y s t r u c t u r e - b a s e d d e s i g n " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 8 , 3 7 , 8 2 6 9 - 8 2 7 7 . R . B . H i l l , D . P . R a l e i g h , A . L o m b a r d i , N . F . D e g r a d o " D e n o v o d e s i g n O f h e l i c a l b u n d l e s a s m o d e l s f o r u n d e r s t a n d i n g p r o t e i n f o l d i n g a n d f u n c t i o n " A c c . C h e m . R e s . 2 0 0 0 , 3 3 , 7 4 5 - 7 5 4 . J . R . D e s j a r l a i s , T . M . H a n d e l " D e - N o v o D e s i g n O f t h e H y d r o p h o b i c C o r e s o f P r o t e i n s " P r o t e i n S c i e n c e 1 9 9 5 , 4 , 2 0 0 6 - 2 0 1 8 . C . G . B u n i c k , M . R . N e l s o n , S . M a n g a h a s , M . J . H u n t e r , J . H . S h e e h a n , L . S . M i z o u e , G . J . B u n i c k , W . J . C h a z i n " D e s i g n i n g s e q u e n c e t o c o n t r o l p r o t e i n f u n c t i o n i n a n E F - h a n d p r o t e i n " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 4 , 1 2 6 , 5 9 9 0 - 5 9 9 8 . J . A . B r a n n i g a n , A . J . W i l k i n s o n " P r o t e i n e n g i n e e r i n g 2 0 y e a r s o n " N a t . R e v . M o l . C e l l B i o . 2 0 0 2 , 3 , 9 6 4 - 9 7 0 . R . F a s a n , R . L . A . D i a s , K . M o e h l e , O . Z e r b e , J . W . V r i j b l o e d , D . O b r e c h t , J . A . R o b i n s o n " U s i n g a b e t a - h a i r p i n t o m i m i c a n a l p h a - h e l i x : C y c l i c p e p t i d o m i m e t i c i n h i b i t o r s o f t h e p 5 3 — H D M 2 p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n " A n g e w a n d t e C h e m i e - I n t e m a t i o n a l E d i t i o n 2 0 0 4 , 4 3 , 2 1 0 9 - 2 1 1 2 . Y . L u , 8 . M . B e r r y , M . D . G i e s e l m a n , M . R a l l e , D . W . L o w , W . A . v a n d e r D o n k , N . J . B l a c k b u r n " I n t r o d u c i n g u n n a t u r a l a m i n o a c i d s i n t o p r o t e i n m e t a l - b i n d i n g s i t e s a n d i t s r o l e i n m e t a l l o p r o t e i n d e s i g n a n d e n g i n e e r i n g " J . I n o r g . B i o c h e m . 2 0 0 3 , 9 6 , 1 8 1 - 1 8 1 . F . C e d r o n e , A . M e n e z , E . Q u e m e n e u r " T a i l o r i n g n e w e n z y m e f u n c t i o n s b y r a t i o n a l r e d e s i g n " C u r r . O p i n . S t r u c . B i o l 2 0 0 0 , 1 0 , 4 0 5 - 4 1 0 . D . F . Q i , C . M . T a n n , D . H a r i n g , M . D . D i s t e f a n o " G e n e r a t i o n o f n e w e n z y m e s v i a c o v a l e n t m o d i fi c a t i o n o f e x i s t i n g p r o t e i n s " C h e m . R e v . 2 0 0 1 , 1 0 1 , 3 0 8 1 - 3 1 1 1 . M . A l l e r t , L . B a l t z e r " S e t t i n g t h e s t a g e f o r n e w c a t a l y t i c f u n c t i o n s i n d e s i g n e d p r o t e i n s - E x p l o r i n g t h e i m i n e p a t h w a y i n t h e e f f i c i e n t d e c a r b o x y l a t i o n o f o x a l o a c e t a t e b y a n A r g - L y s s i t e i n a f o u r - h e l i x b u n d l e p r o t e i n s c a f f o l d " C h e m . - E u r . J . 2 0 0 2 , 8 , 2 5 4 9 - 2 5 6 0 . J . R . C a r e y , S . M . B e r r y , T . D . P f i s t e r , H . K i m , X . Z h a o , H . J . H w a n g , N . Y . W a n g , J . A . A b r a r n i t e , E . B r o w e r , J . Z . Z h u , Y . L u " E n g i n e e r i n g o f m e t a l l o p r o t e i n s a n d n o v e l b i o c a t a l y s t s u s i n g n a t i v e p r o t e i n s c a f f o l d s " A b s t r . P a p . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 3 , 2 2 5 , U 3 0 - U 3 0 . Y . L u , 8 . M . B e r r y , T . D . P f i s t e r " E n g i n e e r i n g n o v e l m e t a l l o p r o t e i n s : D e s i g n o f m e t a l - b i n d i n g s i t e s i n t o n a t i v e p r o t e i n s c a f f o l d s " C h e m . R e v . 2 0 0 1 , 1 0 1 , 3 0 4 7 - 3 0 8 0 . 4 7 1 6 6 . 1 6 7 1 6 8 . 1 6 9 . 1 7 0 . 1 7 1 . 1 7 2 . 1 7 3 . 1 7 4 . 1 7 5 . 1 7 6 . 1 7 7 . 1 7 8 . T . M . P e n n i n g , J . M . J e z " E n z y m e r e d e s i g n " C h e m . R e v . 2 0 0 1 , 1 0 1 , 3 0 2 7 - 3 0 4 6 . W . Y a n g , Y . M . Y e , H . W . L e e , L . J o n e s , A . L . W i l k i n s , H . W . H e l l i n g a , Z . R . L i u , J . J . Y a n g " E n g i n e e r i n g , s t r u c t u r a l a n a l y s i s & r a t i o n a l d e s i g n o f c a l c i u m b i n d i n g p r o t e i n s " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 2 0 0 3 , 8 4 , 3 1 1 a - 3 1 1 a . B . K u h l m a n , G . D a n t a s , G . C . I r e t o n , G . V a r a n i , B . L . S t o d d a r d , D . B a k e r " D e s i g n o f a n o v e l g l o b u l a r p r o t e i n f o l d w i t h a t o m i c - l e v e l a c c u r a c y " S c i e n c e 2 0 0 3 , 3 0 2 , 1 3 6 4 - 1 3 6 8 . L . B a l t z e r , H . N i l s s o n , J . N i l s s o n " D e n o v o d e s i g n o f p r o t e i n s - W h a t a r e t h e r u l e s ? " C h e m . R e v . 2 0 0 1 , 1 0 1 , 3 1 5 3 - 3 1 6 3 . Y . N . W e i , T . L i u , S . L . S a z i n s k y , D . A . M o f f e t , I . P e l c z e r , M . H . H e c h t " S t a b l y f o l d e d d e n o v o p r o t e i n s f r o m a d e s i g n e d c o m b i n a t o r i a l l i b r a r y " P r o t e i n S c i e n c e 2 0 0 3 , 1 2 , 9 2 - 1 0 2 . A . J . C h i r i n o , M . L . A r y , S . A . M a r s h a l l " M i n i m i z i n g t h e i m m u n o g e n i c i t y o f p r o t e i n t h e r a p e u t i c s " D r u g D i s c o v . T o d a y 2 0 0 4 , 9 , 8 2 - 9 0 . S . A . M a r s h a l l , G . A . L a z a r , A . J . C h i r i n o , J . R . D e s j a r l a i s " R a t i o n a l d e s i g n a n d e n g i n e e r i n g o f t h e r a p e u t i c p r o t e i n s " D r u g D i s c o v . T o d a y 2 0 0 3 , 8 , 2 1 2 - 2 2 1 . F . G . S c h a a p , G . J . v a n d e r V u s s e , J . F . C . G l a t z " E v o l u t i o n o f t h e f a m i l y o f i n t r a c e l l u l a r l i p i d b i n d i n g p r o t e i n s i n v e r t e b r a t e s " M o l . C e l l B i o c h e m 2 0 0 2 , 2 3 9 , 6 9 - 7 7 . M . B u e l t , L . B a n a s z a k , D . A . B e m l o h r " R e g u l a t i o n o f A d i p o c y t e L i p i d - B i n d i n g P r o t e i n - P h o s p h o r y l a t i o n b y F a t t y - A c i d s " F A S E B J . 1 9 9 1 , 5 , A 4 1 7 - A 4 l 7 . P . K r i e g , S . F e i l , G . F u r s t e n b e r g e r , G . T . B o w d e n " T u m o r - S p e c i f i c O v e r e x p r e s s i o n o f a N o v e l K e r a t i n o c y t e L i p i d - B i n d i n g P r o t e i n - I d e n t i f i c a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f a C l o n e d S e q u e n c e A c t i v a t e d D u r i n g M u l t i s t a g e C a r c i n o g e n e s i s i n M o u s e S k i n " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 3 , 2 6 8 , 1 7 3 6 2 - 1 7 3 6 9 . D . A . B e m l o h r " S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n o f t h e A d i p o c y t e L i p i d - B i n d i n g P r o t e i n " J C e l l B i o c h e m 1 9 9 4 , 1 5 2 - 1 5 2 . W . K r a m e r , D . C o r s i e r o , M . F r i e d r i c h , F . G i r b i g , S . S t e n g e l i n , C . W e y l a n d " I n t e s t i n a l a b s o r p t i o n o f b i l e a c i d s : p a r a d o x i c a l b e h a v i o u r o f t h e 1 4 k D a i l e a l l i p i d - b i n d i n g p r o t e i n i n d i f f e r e n t i a l p h o t o a f f i n i t y l a b e l l i n g " B i o c h e m J 1 9 9 8 , 3 3 3 , 3 3 5 - 3 4 1 . A . V . P a s t u k h o v , I . J . R o p s o n " F l u o r e s c e n t d y e s a s p r o b e s t o s t u d y l i p i d - b i n d i n g p r o t e i n s " P r o t e i n s 2 0 0 3 , 5 3 , 6 0 7 - 6 1 5 . 4 8 1 7 9 . 1 8 0 . 1 8 1 . 1 8 2 . 1 8 3 . 1 8 4 . 1 8 5 . 1 8 6 . 1 8 7 . 1 8 8 . 1 8 9 . G . J . K l e y w e g t , T . B e r g f o r s , H . S e n n , P . L e M o t t e , B . G s e l l , K . S h u d o , T . A . J o n e s " C r y s t a l s t r u c t u r e s o f c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n s I a n d I I i n c o m p l e x w i t h a l l - t r a n s r e t i n o i c a c i d a n d a s y n t h e t i c r e t i n o i d . " S t r u c t u r e 1 9 9 4 , 2 , 1 2 4 1 - 1 2 5 8 . A . C . M . Y o u n g , G . S c a p i n , A . K r o m m i n g a , S . B . P a t e l , J . H . V e e r k a m p , J . C . S a c c h e t t i n i " S t r u c t u r a l S t u d i e s o n H u m a n M u s c l e F a t t y - A c i d - B i n d i n g P r o t e i n a t 1 . 4 - A n g s t r o m R e s o l u t i o n - B i n d i n g I n t e r a c t i o n s w i t h 3 C 1 8 F a t t y - A c i d s " S t r u c t u r e 1 9 9 4 , 2 , 5 2 3 - 5 3 4 . J . M . L a l o n d e , D . A . B e m l o h r , L . J . B a n a s z a k " X - R a y C r y s t a l l o g r a p h i c S t r u c t u r e s o f A d i p o c y t e L i p i d - B i n d i n g P r o t e i n C o m p l e x e d w i t h P a l m i t a t e a n d H e x a d e c a n e s u l f o n i c A c i d - P r o p e r t i e s o f C a v i t y B i n d i n g - S i t e s " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 4 , 3 3 , 4 8 8 5 - 4 8 9 5 . C . L u c k e , S . H u a n g , M . R a d e m a c h e r , H . R u t e r j a n s " N e w i n s i g h t s i n t o i n t r a c e l l u l a r l i p i d b i n d i n g p r o t e i n s : T h e r o l e o f b u r i e d w a t e r " P r o t e i n S c i e n c e 2 0 0 2 , 1 1 , 2 3 8 2 - 2 3 9 2 . J . C . S a a r i , D . L . B r e d b e r g , N . N o y " C o n t r o l o f S u b s t r a t e F l o w a t a B r a n c h i n t h e V i s u a l C y c l e " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 4 , 3 3 , 3 1 0 6 - 3 1 1 2 . G . M . M o r r i s s K a y , N . S o k o l o v a " E m b r y o n i c d e v e l o p m e n t a n d p a t t e r n f o r m a t i o n " F A S E B J . 1 9 9 6 , 1 0 , 9 6 1 - 9 6 8 . V . H o r n , S . M i n u c c i , V . V . O g r y z k o , E . D . A d a m s o n , B . H . H o w a r d , A . A . L e v i n , K . O z a t o " R A R a n d R X R s e l e c t i v e l i g a n d s c o o p e r a t i v e l y i n d u c e a p o p t o s i s a n d n e u r o n a l d i f f e r e n t i a t i o n i n P 1 9 e m b r y o n a l c a r c i n o m a c e l l s " F A S E B J . 1 9 9 6 , 1 0 , 1 0 7 1 - 1 0 7 7 . B . N . C h a u d h u r i , G . J . K l e y w e g t , I . B r o u t i n - L ' H e m r i t e , T . B e r g f o r s , H . S e n n , P . L e M o t t e , O . P a r t o u c h e , T . A . J o n e s " S t r u c t u r e s o f c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n s I a n d H i n c o m p l e x w i t h s y n t h e t i c r e t i n o i d s " A c t a C r y s t a l l o g r . D 1 9 9 9 , 5 5 , 1 8 5 0 - 1 8 5 7 . Y . C h e n , K . W e s t , S . G o l d f l a m , J . W . C r a b b " D e l e t i o n M u t a n t s o f H u m a n R e c o m b i n a n t C r a l b p " I n v e s t . O p h t h a l m o l . V i s . S c i . 1 9 9 4 , 3 5 , 1 4 6 4 - 1 4 6 4 . J . W . C r a b b , Z . Q . N i e , Y . C h e n , J . D . H u l m e s , K . A . W e s t , J . T . K a p r o n , S . E . R u u s k a , N . N o y , J . C . S a a l i " C e l l u l a r r e t i n a l d e h y d e - b i n d i n g p r o t e i n l i g a n d i n t e r a c t i o n s - G L N - 2 1 0 a n d L Y S - 2 2 1 a r e i n t h e r e t i n o i d b i n d i n g p o c k e t " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 8 , 2 7 3 , 2 0 7 1 2 - 2 0 7 2 0 . J . W . C r a b b , A . C a r l s o n , Y . C h e n , S . G o l d f l a m , R . I n t r e s , K . A . W e s t , J . D . H u l m e s , J . T . K a p r o n , L . A . L u c k , J . H o r w i t z , D . B o k " S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f r e c o m b i n a n t h u m a n c e l l u l a r r e t i n a l d e h y d e - b i n d i n g p r o t e i n " P r o t e i n S c i e n c e 1 9 9 8 , 7 , 7 4 6 - 7 5 7 . 4 9 1 9 0 . 1 9 1 . 1 9 2 . 1 9 3 . 1 9 4 . 1 9 5 . 1 9 6 . 1 9 7 . 1 9 8 . Y . C h e n , S . G o l d fl a m , C . J o h n s o n , K . W e s t , J . W . C r a b b " T h e C r a l b p R e t i n o i d B i n d i n g D o m a i n " I n v e s t . O p h t h a l m o l . V i s . S c i . 1 9 9 3 , 3 4 , 1 1 9 8 - 1 1 9 8 . D . E . O n g , F . C h y t i l " C e l l u l a r R e t i n O l - B i n d i n g P r o t e i n f r o m R a t - L i v e r - P u r i fi c a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n " J . B i o l . C h e m . 1 9 7 8 , 2 5 3 , 8 2 8 - 8 3 2 . J . S . B a i l e y , C . H . S i u " P u r i f i c a t i o n a n d P a r t i a l C h a r a c t e r i z a t i o n o f a N o v e l B i n d i n g - P r o t e i n f o r R e t i n o i c A c i d f r o m N e o n a t a l R a t " J . B i o l . C h e m . 1 9 8 8 , 2 6 3 , 9 3 2 6 - 9 3 3 2 . L . C . W a n g , Y . L i , H . G . Y a n " S t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s o f c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d - b i n d i n g p r o t e i n s - Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e l i g a n d b i n d i n g p r o p e r t i e s o f t h e w i l d - t y p e p r o t e i n s a n d s i t e - d i r e c t e d m u t a n t s " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 7 , 2 7 2 , 1 5 4 1 - 1 5 4 7 . L . C . W a n g , Y . L i , F . A b i l d g a a r d , J . L . M a r k l e y , H . G . Y a n " N M R s o l u t i o n S t r u c t u r e o f t y p e H h u m a n c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n : I m p l i c a t i o n s f o r l i g a n d b i n d i n g " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 8 , 3 7 , 1 2 7 2 7 - 1 2 7 3 6 . X . C h e n , M . T o r d o v a , G . L . G i l l i l a n d , L . C . W a n g , Y . L i , H . G . Y a n , X . H . J i " C r y s t a l s t r u c t u r e o f a p o - c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d - b i n d i n g p r o t e i n t y p e H ( R l l l M ) s u g g e s t s a m e c h a n i s m o f l i g a n d e n t r y " J . M o l . B i o l . 1 9 9 8 , 2 7 8 , 6 4 1 - 6 5 3 . J . R i z o , Z . P . L i u , L . M . G i e r a s c h " H - 1 a n d N - 1 5 R e s o n a n c e A s s i g n m e n t s a n d S e c o n d a r y S t r u c t u r e o f C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d - B i n d i n g P r o t e i n w i t h a n d w i t h o u t B o u n d L i g a n d " J . B i o m o l . N M R 1 9 9 4 , 4 , 7 4 1 - 7 6 0 . J . R i z o , Z . P . L i u , L . M . G i e r a s c h " S t r u c t u r e a n d F o l d i n g o f C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d - B i n d i n g P r o t e i n , a P r e d o m i n a n t l y B e t a - S h e e t P r o t e i n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 4 , 6 6 , A 3 9 7 - A 3 9 7 . L . C . W a n g , H . G . Y a n " N M R s t u d y s u g g e s t s a m a j o r r o l e f o r A r g l l l i n m a i n t a i n i n g t h e s t r u c t u r e a n d d y n a m i c a l p r o p e r t i e s o f t y p e 1 1 h u m a n c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 8 , 3 7 , 1 3 0 2 1 - 1 3 0 3 2 . 5 0 C h a p t e r 2 P r o t e i n D e s i g n : C o n v e r t i n g C R A B P I I i n t o a R e t i n a l B i n d i n g P r o t e i n 2 . 1 W i l d T y p e C R A B P I I b i n d i n g p r o p e r t i e s C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d B i n d i n g P r o t e i n 1 1 ( C R A B P I I ) w a s c h o s e n t o a c t a s t h e t e m p l a t e f o r t h e e n g i n e e r i n g o f a r h o d o p s i n p r o t e i n m i m i c . T h i s s m a l l ( 1 3 7 a m i n o a c i d s ) , c y t o s o l i c m e m b e r o f t h e R e t i n o i d B i n d i n g P r o t e i n f a m i l y h a s a r a t h e r l a r g e ( ~ 6 0 0 A 3 ) b i n d i n g c a v i t y m a d e u p o f t w o fi v e - s t r a n d e d B - s h e e t s a n d a h e l i x - t u m - h e l i x m o t i f . A l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d , t h e n a t u r a l s u b s t r a t e , i s b o u n d t h r o u g h a s e r i e s o f e l e c t r o s t a t i c F i g u r e 2 - 1 . S t r e r e o v i e w o f w i l d t y p e C R A B P I I b o u n d t o a i l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d . T h e l i g a n d c a r b o x y l a t e i s d i r e c t l y i n t e r a c t i n g w i t h A r g 1 3 2 a n d T y r 1 3 4 . w h i l e i s f o r m i n g a h y d r o g e n b o n d s w i t h A r g 1 1 1 a n d T h r 5 4 a r e d i r e c t e d t h r o u g h a w a t e r m o l e c u l e ( t h e b l u e c r o s s r e p r e s e n t s o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e # 1 ) . i n t e r a c t i o n s , a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 1 . l O n e o x y g e n a t o m o f t h e c a r b o x y l i c a c i d m a k e s s t r o n g h y d r o g e n b o n d i n g c o n t a c t s d i r e c t l y w i t h A r g 1 3 2 a n d T y r l 3 4 ( 2 . 7 3 A a n d 2 . 5 7 A r e s p e c t i v e l y ) , w h i l e t h e o t h e r i s h y d r o g e n b o u n d t o a w a t e r m o l e c u l e ( 2 . 7 1 A ) , w h i c h 5 1 a p p e a r s o r d e r e d i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e d u e t o t i g h t b i n d i n g t o A r g 1 1 1 ( 3 . 0 2 A ) a n d T h r 5 4 ( 3 . 0 1 A ) . 1 T h e b i n d i n g o f a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d t o C R A B P I I i s s t o i c h i o m e t r i c , w i t h a d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f ~ 2 n M . 2 N o e v i d e n c e f o r s i g n i fi c a n t b i n d i n g o f o t h e r r e t i n o i d a n a l o g s i n t h e h y d r o p h o b i c c a v i t y h a s b e e n r e p o r t e d p r e s u m a b l y d u e t o l a c k o f a n i o n i c i n t e r a c t i o n s , S i m i l a r t o t h o s e d e s c r i b e d f o r t h e c a r b o x y l i c a c i d f u n c t i o n a l i t y . T h i s e f f e c t w a s e x p e r i m e n t a l l y v e r i fi e d , a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 2 , s i n c e t h e a l d e h y d i c a n a l o g o f r e t i n o i c a c i d , a l l - t r a n s - r e t i n a l , e x h i b i t s a p o o r d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r C R A B P I I , K ; = 6 6 0 0 i 3 6 0 n M , a s d e t e r m i n e d b y fl u o r e s c e n c e q u e n c h i n g . A B 1 ‘ W 0 . 5 l g 0 - 3 ‘ 0 . 4 . E 0 ' 6 1 A 0 . 3 l g 0 . 4 - 0 . 2 q 2 0 2 “ 0 . 1 - 0 I l l l 0 0 1 2 3 4 3 0 0 4 0 0 5 0 0 E q u i v a l e n t s R e t i n o i c A c i d I R e t i n a l n m F i g u r e 2 - 2 . A . F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l K . ) d e t e r m i n a t i o n w i t h w i l d - t y p e C R A B P I I . R e t i n o i c a c i d s h o w s a s t o i c h i o m e t r i c b i n d i n g r e l a t i o n s h i p ( K , = 2 . 0 : i : 1 . 2 n M ) . R e t i n a l s h o w s l o w e r b i n d i n g a f fi n i t y , K . ) = 6 6 0 0 1 : 3 6 0 n M . ; B . U V - v i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h w i l d - t y p e C R A B P I I p o r t r a y s a m a x i m a l a b s o r b a n c e a t 3 7 7 n m . D e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f a l l t h e s p e c t r o s c o p i c a s s a y s u s e d f o r t h e e v a l u a t i o n o f s u b s t r a t e b i n d i n g t o C R A B P I I i s p r o v i d e d i n t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s s e c t i o n . I n b r i e f , t h e b i n d i n g o f r e t i n a l t o t h e h y d r o p h o b i c p o c k e t c a n b e f o l l o w e d b y fl u o r e s c e n c e 3 q u e n c h i n g ? ’ T h e T r p r e s i d u e s o f t h e p r o t e i n a b s o r b a t 2 8 0 n m a n d e m i t a t ~ 3 4 0 n m . 5 2 T h e f r e e c h r o m o p h o r e , r e t i n a l , a b s o r b s ~ 3 8 0 n m i n a n e t h a n o l i c s o l u t i o n . W h e n t h e c h r o m o p h o r e i s w i t h i n t h e C R A B P I I c a v i t y , i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h e T r p r e s i d u e s , i t c a n a b s o r b t h e l i g h t e m i t t e d b y t h e p r o t e i n . B y p l o t t i n g t h e s u b s e q u e n t fl u o r e s c e n c e q u e n c h i n g v e r s u s t h e e q u i v a l e n t s o f a d d e d s u b s t r a t e , a d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( K d ) v a l u e f o r t h e c o m p l e x c a n b e d e t e r m i n e d . A t t h e s a m e t i m e , a U V a s s a y c a n d e t e r m i n e w h e t h e r t h e b o u n d s p e c i e s i s i n t h e f o r m O f a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ( P S B ) o r n o t . T h a t i s , a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 1 , u p o n f o r m a t i o n o f a P S B t h e A m , o f t h e b o u n d r e t i n a l i s e x p e c t e d t o s i g n i fi c a n t l y r e d s h i f t ( f r o m 3 8 0 n m t o ~ 4 4 0 n m , i n s o l u t i o n ) . H o w e v e r , t h i s a s s a y d o e s n o t p r o v i d e d e f i n i t e e v i d e n c e f o r t h e f o r m a t i o n o f S c h i f f b a s e , S i n c e t h e U V a b s o r b a n c e a s s o c i a t e d w i t h t h e l a t t e r s p e c i e s i s n o t a s w e l l d e f i n e d . F i n a l l y , a M A L D I - T O F a n a l y s i s O f t h e C R A B P I I - r e t i n a l c o m p l e x e s c a n p r o v i d e i n f o r m a t i o n o n w h e t h e r o r n o t a c o v a l e n t l y b o u n d s p e c i e s i s f o r m e d u n d e r b o t h i n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n c o n d i t i o n s . A t t h i s p o i n t , i t S h o u l d b e n o t e d t h a t a l t h o u g h r h o d o p s i n u t i l i z e s l l - c i s - r e t i n a l f o r v i s i o n , o u r a p p r o a c h t o e n g i n e e r i n g a r e t i n a l b i n d i n g p r o t e i n w a s f o c u s e d o n u s i n g t h e a l l - t r a n s - r e t i n a l i s o m e r i n s t e a d . T h i s w a s m o s t l y d u e t o t h e s e n s i t i v e n a t u r e o f l l - c i s - r e t i n a l , s i n c e i t r e a d i l y i s o m e r i z e s i n t h e p r e s e n c e o f a n y d i r e c t l i g h t . H o w e v e r , t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e c h r o m o p h o r e a n d t h e p r o t e i n s h o u l d r e m a i n S i m i l a r i n t h e p r e s e n c e o f b o t h i s o m e r s . T h e r e f o r e , t h e s t u d y o f w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n b a s e d o n t h e p e r t u r b a t i o n o f t h e e l e c t r o n i c e n v i r o n m e n t a r o u n d t h e c h r o m o p h o r e s h o u l d b e p o s s i b l e i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l . W h e n r e t i n a l w a s i n c u b a t e d w i t h W T C R A B P I I a A m a x o f 3 7 7 n m w a s O b s e r v e d , v e r y c l o s e t o t h e r e t i n a l a b s o r b a n c e i n p h o s p h a t e b u f f e r ( 3 8 0 n m , F i g u r e 2 - 2 ) . W T 5 3 C R A B P I I c o n t a i n s 1 3 L y s r e s i d u e s , a l l o f t h e m l o c a t e d o n t h e s u r f a c e o f t h e p r o t e i n . A t t h e p H o f t h e b u f f e r s o l u t i o n ( 7 . 3 ) a l l L y s r e s i d u e s a r e p r o t o n a t e d ( t h e p K a o f L y s s i d e c h a i n i n s o l u t i o n i s 1 0 . 7 ) a n d t h e y , t h e r e f o r e , c a n n o t a c t a s n u c l e o p h i l e s t o f o r m n o n - s p e c i fi c i m i n e s w i t h t h e a l d e h y d i c c h r o m o p h o r e . M A L D I - T O F a n a l y s i s v e r i f i e d t h e l a t t e r , s i n c e n o c o v a l e n t l y b o u n d S p e c i e s b e t w e e n r e t i n a l a n d W T - C R A B P I I c o u l d b e d e t e c t e d . D u e t o t h e s t r u c t u r a l h o m o l o g y b e t w e e n r e t i n o i d s w e e x p e c t e d t h a t r e t i n a l w o u l d o c c u p y r o u g h l y t h e s a m e p l a c e w i t h i n t h e C R A B P I I b i n d i n g p o c k e t . T h i s a s s u m p t i o n , v e r i fi e d b y m o d e l i n g s t u d i e s , w a s c r i t i c a l f o r t h e r a t i o n a l r e - d e s i g n i n g O f t h e b i n d i n g p o c k e t o f C R A B P H i n o r d e r t o a c h i e v e a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e f o r m i n g p r o t e i n . 2 . 2 I n t r o d u c t i o n o f a L y s r e s i d u e I n o r d e r t o r e - e n g i n e e r C R A B P I I i n t o a r h o d o p s i n p r o t e i n m i m i c , a n a c t i v e s i t e L y s r e s i d u e i s n e e d e d f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e n e c e s s a r y S c h i f f b a s e . I n s i l i c o m u t a g e n e s i s a n d r n i n i r n i z a t i o n s b a s e d o n t h e p u b l i s h e d c r y s t a l s t r u c t u r e o f C R A B P I I w i t h r e t i n o i c a c i d l e d u s t o b e l i e v e t h a t p o s i t i o n 1 3 2 w o u l d b e t h e i d e a l c h o i c e f o r t h e i n s t a l l a t i o n o f t h e L y s r e s i d u e . A S m e n t i o n e d b e f o r e , i t i s o n e O f t h e r e s i d u e s i n c l o s e c o n t a c t w i t h t h e r e t i n o i c a c i d s u b s t r a t e , a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 1 . A s s u m i n g t h a t r e t i n a l ’ s p l a c e m e n t i n t h e c a v i t y i s s i m i l a r t o t h a t o f r e t i n o i c a c i d , t h e L y s r e s i d u e a t p o s i t i o n 1 3 2 w o u l d b e w i t h i n V a n d e r W a a l s d i s t a n c e f r o m t h e a l d e h y d e t h u s a l l o w i n g f o r c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n . F i g u r e 2 - 3 d e p i c t s a m i n i m i z e d m o d e l o f t h e C R A B P H - R 1 3 2 K m u t a n t . A s c a n b e s e e n , t h e n i t r o g e n a t o m o f L y s l 3 2 r e s i d e s ~ 3 A a w a y f r o m t h e c a r b o n y l c a r b o n , a p p r o a c h i n g f r o m t h e s i d e 5 4 R 1 3 fi . R 1 3 2 K F i g u r e 2 - 3 . S t r e r e o v i e w o f t h e m i n i m i z e d m o d e l o f C R A B P I I - R 1 3 2 K m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . N e a r b y l i g a n d s T y r 1 3 4 a n d A r g t 1 1 a r e a l s o h i g h l i g h t e d . o f t h e r e t i n a l c h r o m o p h o r e ( d i h e d r a l a n g l e ~ 1 3 5 ° ) . T h i s o r i e n t a t i o n , i s c l o s e t o t h e o p t i m a l a n g l e f o r a t t a c k o n t o t h e c a r b o n y l , a s d e fi n e d b y B i i r g i a n d D u n i t z ( ~ 1 0 7 ° ) . 4 [ P o s i t i o n 1 3 4 w a s a l s o c o n s i d e r e d a s a p o s s i b l e s i t e f o r t h e i n t r o d u c t i o n o f a L y s r e s i d u e . H o w e v e r , a s e r i e s o f p r o t e i n s c o n t a i n i n g t h e Y 1 3 4 K m u t a t i o n d i d n o t y i e l d t h e d e s i r e d P S B f o r m a t i o n ( s e e R a c h a e l M . C r i s t ’ s t h e s i s ) . ] I n a d d i t i o n t o i t s g o o d p l a c e m e n t r e l a t i v e t o t h e c a r b o n y l , r e s i d u e 1 3 2 i s l o c a t e d i n t h e m i d d l e O f a h y d r o p h o b i c p o c k e t , w i t h i n t h e C R A B P I I c a v i t y . W i t h t h e e x c e p t i o n o f T y r l 3 4 , A r g 1 3 2 i s s u r r o u n d e d b y a l l n o n - p o l a r r e s i d u e s . W h e n a L y s r e s i d u e i s i n t r o d u c e d i n a n o n p o l a r e n v i r o n m e n t , t h e a p p a r e n t p K a o f t h e a m i n e s i d e c h a i n c a n b e s i g n i fi c a n t l y a l t e r e d , l e a d i n g i n i n c r e a s e d n u c l e o p h i l i c i t y . T h e p K , o f f r e e L y s i n s o l u t i o n h a s b e e n m e a s u r e d t o b e ~ 1 0 . 7 . L i t e r a t u r e e x a m p l e s o f L y s r e s i d u e s b u r i e d i n p r o t e i n c a v i t i e s r e p o r t m e a s u r e d p K a v a l u e s w i t h i n a w i d e r a n g e o f 5 . 5 — 8 . 5 , d e p e n d i n g o n t h e s p e c i fi c a m i n o a c i d e n v i r o n m e n t a r o u n d t h e p r i m a r y a m i n e . ” M u t a g e n e s i s o f C R A B P I I w a s p e r f o r m e d u s i n g s t a n d a r d m o l e c u l a r b i o l o g y p r o t o c o l s . W h e n t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K m u t a n t p l a s m i d w a s o b t a i n e d , t h e p r o t e i n w a s o v e r e x p r e s s e d i n E . c o l i a n d p u r i fi e d f o l l o w i n g e s t a b l i s h e d p r o t o c o l s ( f o r a l l p r o c e d u r e s 5 5 m e n t i o n e d a b o v e s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . I n a n a t t e m p t t o s i m p l i f y t h e p r o t e i n p u r i fi c a t i o n S t e p s , t h e p r o t e i n s w e r e e x p r e s s e d b e a r i n g a n a f f i n i t y t a g ( 6 x H i s t a g ) a t t h e i r C - t e r m i n u s ( p E T - B l u e 2 v e c t o r ) . T h i s t a g c o n s i s t s o f a c h a i n o f S i x h i s t i d i n e r e s i d u e s t h a t w i l l b i n d t o a N i 2 + b o u n d r e s i n ( N i - N T A , N o v a g e n ) a l l o w i n g c l e a n a n d r a p i d p u r i f i c a t i o n o f t h e d e s i r e d H i s - t a g g e d p r o t e i n s . 1 0 H o w e v e r , n o n e o f t h e r e p o r t e d c r y s t a l s t r u c t u r e s o f C R A B P I I c o n t a i n a n y p u r i f i c a t i o n t a g a t t a c h e d . 1 T h e r e h a v e b e e n c a s e s w h e r e t h e a d d i t i o n o f a H i s t a g h a s n o e f f e c t o n p r o d u c t i o n o f w e l l - d i f f r a c t i n g c r y s t a l s , ” a s w e l l a s c a s e s w h e r e a d d i t i o n O f t h e H i s t a g h a s h i n d e r e d t h e c r y s t a l l i z a t i o n p r o g r e s s . 1 2 I n o u r c a s e , o u r c o l l a b o r a t o r s r e s p o n s i b l e f o r t h e c r y s t a l l o g r a p h i c s t u d i e s o f C R A B P H ( c o l l a b o r a t i o n w i t h P r o f e s s o r J a m e s G e i g e r , D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) f o u n d e a r l y o n t h a t t h e a d d i t i o n o f t h e a f f i n i t y t a g h a m p e r s t h e c r y s t a l l i z a t i o n O f C R A B P I I p r o t e i n s . W h i l e t h e n a t i v e C R A B P H p r o t e i n t y p i c a l l y p r o d u c e s X - r a y q u a l i t y c r y s t a l s w i t h i n a w e e k , H i s - t a g g e d C R A B P H f a i l s t o p r o d u c e c r y s t a l s a t a l l . C o n s i d e r i n g t h a t t h e c r y s t a l l o g r a p h i c s t u d i e s a r e e s s e n t i a l f o r t h e r a t i o n a l r e d e s i g n i n g o f t h e C R A B P I I b i n d i n g c a v i t y , f o r e a c h p r o t e i n m u t a n t p r o d u c e d i n t h e H i s - t a g b e a r i n g v e c t o r , a s e c o n d C R A B P H m u t a n t , w i t h o u t t h e H i s - t a g w a s g e n e r a t e d a n d e v a l u a t e d . T h e p r o t o c o l s f o l l o w e d f o r t h e g e n e r a t i o n ( i n a p E T - 1 7 b v e c t o r ) , e x p r e s s i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f n o n - h i s t a g g e d p r o t e i n s a r e a l s o d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 ( M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . T h e p u r i fi c a t i o n o f t h e p E T - 1 7 b p r o t e i n s i s m o r e t i m e c o n s u m i n g , a n d t h e r e f o r e i n i t i a l l y o n l y s e l e c t e d m u t a n t s o f i n t e r e s t f o r c r y s t a l l o g r a p h i c a n a l y s i s w e r e o v e r e x p r e s s e d w i t h o u t t h e H i s - t a g . B y h a v i n g t h e s a m e p r o t e i n m u t a n t s f r o m b o t h p E T - l 7 b a n d t h e H i s - t a g c o n t a i n i n g p E T - B l u e 2 , w e c o u l d v e r i f y t h a t t h e e x i s t e n c e O f t h e e x t r a a m i n o a c i d s h a s n o e f f e c t o n t h e r e t i n a l b i n d i n g p r o p e r t i e s . A l l d u p l i c a t e p r o t e i n s ( H i s - t a g v s . n o H i s - t a g 5 6 w i t h t h e s a m e m u t a t i o n s ) d e m o n s t r a t e d t h e s a m e S p e c t r o s c o p i c r e s u l t s i n b i n d i n g a f fi n i t y , r e t i n a l a b s o r b a n c e , a n d c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n a s m o n i t o r e d b y M A L D I - T O F . T h e r e f o r e , f o r t h e r e s t o f t h i s d i s c u s s i o n , t h e r e w i l l b e n o d i s t i n c t i o n b e t w e e n H i s - t a g g e d a n d n o n - H i s - t a g g e d p r o t e i n s , u n l e s s t h e r e i s a p o i n t t o b e m a d e ( a l l H i s - t a g g e d C R A B P I I m u t a n t s ( p E T - B l u e 2 v e c t o r ) w e r e p r o d u c e d b y R a c h a e l M . C r i s t ( M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) a n d m o r e d e t a i l s o f t h e d a t a c a n b e f o u n d i n h e r t h e s i s ) . B y r e p l a c i n g A r g 1 3 2 w i t h a L y s r e s i d u e , a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n r e t i n o i c a c i d a f f i n i t y , f r o m 2 n M t o 6 5 n M , w a s O b s e r v e d , a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 4 . A t t h e s a m e t i m e , t h e r e t i n a l b i n d i n g , a s d e t e r m i n e d f r o m fl u o r e s c e n c e q u e n c h i n g , h a s i n c r e a s e d d r a m a t i c a l l y , w i t h t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t K d c h a n g i n g f r o m 6 6 0 0 n M t o 2 8 0 n M . T h i s i n c r e a s e d a f f i n i t y f o r r e t i n a l c a n b e d u e t o e i t h e r t h e c o v a l e n t b i n d i n g w i t h t h e i n t r o d u c e d L y s r e s i d u e t o a f f o r d t h e d e s i r e d S B , o r t h e h y d r o p h o b i c t u n i n g o f t h e b i n d i n g c a v i t y ( A r g r e s i d u e s a r e m o r e h y d r o p h i l i c t h a n L y s , h y d r o p a t h i c i n d e x o f — 4 . 5 v e r s u s — 3 . 9 , t h e m o r e p o s i t i v e t h e n u m b e r t h e m o r e h y d r o p h o b i c t h e r e s i d u e ) ” 1 4 T h e U V s p e c t r u m o f t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K m u t a n t r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f a d y n a m i c s y s t e m . T h e U V t r a c e c h a n g e s w i t h t i m e , s h i f t i n g f r o m ~ 3 9 2 n m , u p o n a d d i t i o n O f r e t i n a l , t o ~ 3 7 6 n m 1 5 m i n l a t e r ( F i g u r e 2 - 4 , B ) . S e c o n d d e r i v a t i v e a n a l y s i s o f t h e o b t a i n e d s p e c t r a r e v e a l s t h e p r e s e n c e a m i x t u r e o f p e a k s , w i t h m a x i m a a t ~ 4 1 7 n m a n d ~ 3 7 6 n m , a t a r e l a t i v e r a t i o o f 1 . 2 t o 1 r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e 2 - 4 C ) . I t a p p e a r s t h a t w h a t i s s h o w n a s a b r o a d ' p e a k i n t h e i n i t i a l U V t r a c e i s t h e p h y s i c a l s u m m a t i o n o f t h e s e t w o p e a k s . A s t i m e p a s s e s , t h e p e a k a t 4 1 7 n m d i m i n i s h e s w h i l e t h e 3 7 7 n m i n c r e a s e s r e s u l t i n g i n t h e s p e c t r a l t r a c e s h o w n i n f i g u r e 2 — 4 B ( m a g e n t a , 1 5 m i n ) . A t t h i s p o i n t , i t 5 7 E 1 0 . 1 5 - g 0 . 8 e 0 1 - g 0 . 6 - ' - A g 0 . 4 ~ 0 . 0 5 - 2 0 . 2 T E o l r i W l 0 fl 1 O 1 2 3 4 5 3 0 0 4 0 0 5 0 0 n m E q u I v a l e n t s R e t i n o i c A c i d / R e t i n a l 1 7 0 6 9 1 7 0 6 7 C D E 1 6 8 0 1 fl ; 1 6 8 0 1 3 2 0 3 9 0 / 4 6 0 n m 1 6 5 0 0 1 7 5 0 0 1 6 5 0 0 1 7 5 0 0 M a s s ( D a ) M a s s ( D a ) F i g u r e 2 - 4 . A . F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l K d d e t e r m i n a t i o n w i t h t h e s i n g l e m u t a n t C R A B P I I - R 1 3 2 K . T h e s i n g l e a m i n o a c i d m u t a t i o n d i s p l a y s a n e x p e c t e d d r o p i n r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y ( K n = 6 5 : l : 1 4 n M ) , w h i c h i s c o n c o m i t a n t w i t h a l a r g e i n c r e a s e i n r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y , K d = 2 8 0 1 : 1 7 n M ; B . U V - v i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K . T h e s p e c t r u m c h a n g e s w i t h t i m e , f r o m 3 9 2 n m ( r e d t r a c e , 1 m i n ) t o 3 7 6 n m ( m a g e n t a t r a c e , 1 5 m i n ) ; c . C a l c u l a t e d 2 n d d e r i v a t i v e s o f t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K u v t r a c e s s h o w n i n B . T h e p e a k m i n i m a r e p r e s e n t t h e c a l c u l a t e d U V A m ” . T h e r e d t r a c e ( 1 m i n ) s h o w s m i n i m a a t 4 1 7 n m a n d 3 7 7 n m , w i t h a r e l a t i v e r a t i o o f 1 . 2 / 1 r e s p e c t i v e l y . A f t e r 1 5 m i n ( m a g e n t a ) t h e A W r e m a i n v e r y s i m i l a r ( 4 1 5 n m a n d 3 7 6 n m ) b u t t h e r e l a t i v e r a t i o h a s c h a n g e d ( 1 / 2 . 2 r e s p e c t i v e l y ) . D . M A L D I - T O F o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d s i n g l e m u t a n t C R A B P I I - R 1 3 2 K ( M + = 1 6 8 0 1 D a ) . A s e c o n d p e a k , M ” = 1 7 0 6 7 D a , i s p r e s e n t ( m a j o r p e a k ) , a 2 6 8 m a s s u n i t a d d i t i o n i n d i c a t i n g . i m i n e f o r m a t i o n . E . M A L D l - T O F o f t h e r e t i n a l a d d e d t o s i n g l e m u t a n t C R A B P I I - R 1 3 2 K ( M + = 1 6 8 0 1 D a ) a f t e r r e d u c t i v e a m i n a t i o n . T h e s e c o n d p e a k , M + = 1 7 0 6 9 D a , i s i n d i c a t i v e f o r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n a d d u c t ( 2 6 8 m a s s u n i t s ) . 5 8 s h o u l d b e n o t e d t h a t a l l t h e U V d a t a p r e s e n t e d i n t h i s d i s c u s s i o n r e f e r t o s p e c t r a r e c o r d e d i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 1 — 0 . 2 e q u i v a l e n t s o f a l l - t r a n s - r e t i n a l , u n l e s s o t h e r w i s e m e n t i o n e d . A l t h o u g h g e n e r a l l y t h e t i t r a t i o n o f a p r o t e i n s o l u t i o n w i t h r e t i n a l w a s c a r r i e d o u t f o r u p t o a t l e a s t 1 e q u i v o f s u b s t r a t e , f o r m o s t c a s e s t h e s p e c t r a l b e h a v i o r w a s a l t e r e d i n t h e p r e s e n c e o f m o r e t h a n 0 . 3 e q u i v ( f o r e x t e n d e d d i s c u s s i o n s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . T h e r e f o r e , i n o r d e r f o r a d i r e c t c o m p a r i s o n t o b e p o s s i b l e , t h e l o w e q u i v a l e n t U V d a t a f o r t h e v a r i o u s C R A B P I I m u t a n t s a r e p r e s e n t e d a n d d i s c u s s e d . T h e U V A m , o b s e r v e d f o r a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d t o t h e R 1 3 2 K m u t a n t ( ~ 4 1 7 n m ) i s ~ 4 0 n m r e d s h i f t e d a s c o m p a r e d t o t h e A m , o f f r e e r e t i n a l i n s o l u t i o n ( ~ 3 8 0 n m ) . T h i s c o u l d b e a n i n d i c a t i o n o f P S B f o r m a t i o n b e t w e e n t h e e n g i n e e r e d L y s r e s i d u e a n d t h e r e t i n a l c h r o m o p h o r e . H o w e v e r , t h e r e d S h i f t e d s p e c i e s i s n o t s t a b l e w i t h t i m e a n d t h e s y s t e m e q u i l i b r a t e s i n t o a s t a t e w h e r e t h e p e a k a t 3 7 6 n m i s p r e d o m i n a n t . T h e n a t u r e o f t h e s p e c i e s r e s p o n s i b l e f o r t h e A M , a t 3 7 6 n m i s h a r d t o d e t e r m i n e . A s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d , f r e e r e t i n a l i n b u f f e r a b s o r b s a t ~ 3 8 0 n m , w h i l e a S B o f r e t i n a l i n s o l u t i o n e x h i b i t s a A m , o f ~ 3 6 5 n m . H o w e v e r , i t i s n o t c l e a r w h e t h e r o r n o t t h e a b s o r b a n c e o f a r e t i n a l S B w i t h i n t h e h y d r o p h o b i c c a v i t y o f a p r o t e i n w i l l r e m a i n t h e s a m e . T h e f a c t t h a t t h e U V - v i s s p e c t r u m c h a n g e s w i t h i n t h e c o u r s e o f s e v e r a l m i n u t e s s u g g e s t s t h a t w h a t w e O b s e r v e d c a n n o t b e d u e t o a n a c i d - b a s e e q u i l i b r i u m . A m o r e p l a u s i b l e e x p l a n a t i o n w o u l d b e t h a t t h e b i n d i n g o f t h e r e t i n a l i n d u c e s c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s w i t h i n t h e C R A B P I I c a v i t y . T h e o r i g i n a l r e d S h i f t e d S p e c t r u m c a n b e d u e t o P S B f o r m a t i o n t h a t c a n h y d r o l y z e w i t h t i m e i f t h e p r o t e i n ’ s i n t e r i o r b e c o m e s m o r e w a t e r a c c e s s i b l e . H o w e v e r , c o n s i d e r i n g t h a t b o t h t h e s i z e a n d t h e S h a p e O f a l l - t r a n s - r e t i n a l a r e v e r y c l o s e t o t h o s e o f t h e n a t i v e C R A B P H s u b s t r a t e , a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d , o n e w o u l d 5 9 n o t a n t i c i p a t e m a j o r c o n f o r m a t i o n a l C h a n g e s u p o n b i n d i n g o f r e t i n a l . A l t e r n a t i v e l y , t h e f a c t t h a t t h e r e t i n a l S p e c t r u m i n s i d e t h e R 1 3 2 K m u t a n t b l u e s h i f t s w i t h t i m e c o u l d b e a t t r i b u t e d t o c h a n g e s o n t h e c h r o m o p h o r e i t s e l f . I t i s p o s s i b l e t h a t o n e o r m o r e o f t h e c o n j u g a t e d d o u b l e b o n d s c a n r e a c t w i t h t h e s i d e c h a i n s o f n e i g h b o r i n g a m i n o a c i d s r e s u l t i n g i n a b l u e s h i f t e d s p e c i e s . I n a n y c a s e , f u r t h e r i n d i c a t i o n f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n b e t w e e n t h e R 1 3 2 K m u t a n t a n d t h e t i t r a t e d r e t i n a l w a s p r o v i d e d b y t h e M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s . I n p a r t i c u l a r , a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 4 D a n d 2 - 4 E , b o t h u n d e r i n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n c o n d i t i o n s a n a d d u c t , c o r r e s p o n d i n g t o t h e S B a n d r e d u c t i v e l y a m i n a t e d S B f o r m r e s p e c t i v e l y , i s d e t e c t e d . T h e a n a l o g o u s e x p e r i m e n t s w i t h t h e W T - C R A B P H h a d f a i l e d t o d e t e c t a n y m a s s a d d u c t . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t i t i s t h e e n g i n e e r e d L y s r e s i d u e t h a t , a s o r i g i n a l l y d e s i g n e d , r e a c t s w i t h t h e i n c o m i n g a l d e h y d e t o p r o d u c e a c o v a l e n t l y b o u n d s p e c i e s . A t t h i s p o i n t , i t S h o u l d b e n o t e d t h a t a l t h o u g h t h e M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s c a n p r o v i d e v a l u a b l e i n f o r m a t i o n o n w h e t h e r o r n o t a c o v a l e n t b o n d h a s b e e n f o r m e d b e t w e e n t h e p r o t e i n a n d t h e a l d e h y d i c s u b s t r a t e , t h e r e s u l t s c a n n o t b e u s e d t o e s t i m a t e t h e r e a c t i o n e f f i c a c y . I n p a r t i c u l a r , a s c a n b e s e e n i n F i g u r e 2 - 4 , t h e S p e c t r a o f b o t h t h e i n c u b a t i o n a n d t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n s c o n s i s t o f a m i x t u r e o f b o t h t h e f r e e p r o t e i n p e a k ( 1 6 8 0 1 D a ) a n d t h e c o v a l e n t l y l i n k e d r e t i n a l ( 1 7 0 6 7 D a a n d 1 7 0 6 9 D a , r e s p e c t i v e l y ) . H o w e v e r , a s w i l l b e d i s c u s s e d i n d e t a i l s i n M a t e r i a l a n d M e t h o d s , t h e r e l a t i v e h e i g h t s o f t h e t w o p e a k s a r e n o t i n d i c a t i v e o f t h e r e l a t i v e m o l a r r a t i o i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e , d u e t o t h e d i f f e r e n t e x t e n d o f i o n i z a t i o n o f d i f f e r e n t S p e c i e s . T h e r e f o r e , 6 0 t h e o n l y c o n c l u s i o n s t h a t c a n b e d e r i v e d f r o m t h e M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s i n v o l v e t h e e x i s t e n c e o r n o t o f t h e s e c o n d p e a k , c h a r a c t e r i s t i c f o r a r e t i n a l a d d u c t . 2 . 3 H y d r o p h o b i c T u n i n g o f t h e B i n d i n g P o c k e t T h e fi r s t a t t e m p t a t r a t i o n a l r e e n g i n e e r i n g o f C R A B P I I i n t o a r e t i n a l b i n d i n g p r o t e i n w a s v e r y p r o m i s i n g . T h e i n t r o d u c t i o n o f a S i n g l e L y s r e s i d u e i n t h e h y d r o p h o b i c c a v i t y o f C R A B P H r e s u l t e d i n a p r o t e i n w i t h a n i n c r e a s e d a f fi n i t y f o r r e t i n a l , w h i l e M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s s u g g e s t e d t h e f o r m a t i o n o f a S c h i f f b a s e . H o w e v e r , S i n c e t h e U V a s s a y d i d n o t s u p p o r t t h e f o r m a t i o n o f a S t a b l e P S B b e t w e e n t h e C R A B P I I m u t a n t a n d a l l - t r a n s - r e t i n a l , f u r t h e r m u t a t i o n s w e r e t o f o l l o w , i n o r d e r t o o p t i m i z e t h e s y s t e m . T h e f i r s t a p p r o a c h f o l l o w e d , i n a n a t t e m p t t o i m p r o v e t h e r e t i n a l b i n d i n g i n t h e C R A B P I I c a v i t y i n v o l v e d t h e i n c r e a s e o f t h e h y d r o p h o b i c i t y w i t h i n t h e c a v i t y . A s m e n t i o n e d b e f o r e , p o s i t i o n 1 3 2 r e s i d e s i n t h e m i d d l e o f a r a t h e r h y d r o p h o b i c c a v i t y . I n f a c t , a s s e e n i n F i g u r e 2 - S B , t h e o n l y p o l a r r e s i d u e s i n t h e v i c i n i t y o f t h e e n g i n e e r e d L y s l 3 2 r e s i d u e a r e T y r l 3 4 a n d S e r 1 2 ( t h e d i s t a n c e s o f t h e S i d e c h a i n L y s n i t r o g e n f r o m t h e h y d r o x y l g r o u p s o f T y r l 3 4 a n d S e r 1 2 a r e 3 . 3 9 A a n d 5 . 0 1 A , r e s p e c t i v e l y ) . B y c o m p a r i n g t h e C R A B P H - R 1 3 2 K m o d e l w i t h t h e r e p o r t e d R h o d o p s i n c r y s t a l s t r u c t u r e ( F i g u r e 2 - 5 ) , o n e c a n n o t i c e t h a t t h e a c t i v e s i t e L y s r e s i d u e i n R h o d o p s i n i s e m b e d d e d i n a r a t h e r h y d r o p h o b i c p o c k e t a n d i s n o t i n c l o s e c o n t a c t w i t h a n y p o l a r g r o u p . T h i s p o s i t i o n i n g , p r e s u m e d t o b e t h e m a i n r e a s o n f o r t h e e n h a n c e d n u c l e o p h i l i c i t y o f t h e L y s r e s i d u e ( e s t i m a t e d p K a ~ 6 ) , p r o m p t e d u s t o c o n s i d e r r e m o v i n g t h e h y d r o p h i l i c r e s i d u e s 6 1 Y 1 3 4 F i g u r e 2 - 5 . A . C r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e b i n d i n g p o c k e t o f R h o d o p s i n b o u n d t o 1 1 - c i s - r e t i n a l ( s h o w n i n r e d ) . T h e r e s i d u e s s u r r o u n d i n g L y s 2 9 6 ( s h o w n i n g r e e n ) h a v e b e e n s h o w n i n a s p a c e fi l l i n g m o d e l ( A t o m s a r e c o l o r c o d e d : C i n b l u e , 0 i n l i g h t r e d a n d S i n o r a n g e . T h e n u c l e o p h i l i c L y s r e s i d u e a p p e a r s t o b e b u r i e d i n a e x t r e m e l y h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t . B . M o d e l s t r u c t u r e o f t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K m u t a n t i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l . T h e r e s i d u e s s u r r o u n d i n g L y s t 3 2 ( s h o w n i n g r e e n ) h a v e b e e n s h o w n i n a s p a c e fi l l i n g m o d e l ( a t o m s a r e c o l o r c o d e d : C i n b l u e , 0 i n l i g h t r e d ) . T h e s i d e c h a i n n i t r o g e n o f L y s 1 3 2 i s s u r r o u n d e d b y t h e h y d r o x y l g r o u p s o f T y r 1 3 4 ( 3 . 3 9 A ) a n d S e r 1 2 ( 5 . 0 1 A ) . f r o m t h e C R A B P H - L y s l 3 2 e n v i r o n m e n t i n o r d e r t o i n c r e a s e t h e n u c l e o p h i l i c i t y o f t h e s i d e c h a i n n i t r o g e n . C o n s i d e r i n g t h a t S e r 1 2 i s f u r t h e r a w a y f o r m t h e L y s r e s i d u e o f i n t e r e s t ( 5 . 0 1 A ) , T y r l 3 4 ( 3 . 3 9 A a w a y ) w a s t h e i m m e d i a t e t a r g e t f o r m u t a g e n e s i s . D u e t o i t s c l o s e p r o x i m i t y t o t h e e n g i n e e r e d L y s r e s i d u e t h e h y d r o x y l o f T y r l 3 4 m a y b e i n v o l v e d i n a f a v o r a b l e h y d r o g e n b o n d i n g w i t h t h e 1 3 2 S i d e c h a i n n i t r o g e n . I f t h a t i s t h e c a s e , d e p e n d i n g o n t h e p K a v a l u e s o f b o t h T y r l 3 4 a n d L y s l 3 2 S i d e c h a i n s t h e p h e n o l i c o x y g e n c a n a c t e i t h e r a s a p r o t o n d o n o r , r e s u l t i n g i n r e d u c e d n u c l e o p h i l i c i t y O f L y s l 3 2 , o r a p r o t o n a c c e p t o r , i n w h i c h c a s e i t c a n e n h a n c e r e a c t i v i t y . C o n s i d e r i n g t h a t t h e p K a o f f r e e T y r i n s o l u t i o n i s ~ 1 0 . 4 , a n d t h e f a c t t h a t t h e i n t e r i o r o f t h e C R A B P I I c a v i t y w h e r e T y r l 3 4 i s l o c a t e d i s r a t h e r h y d r o p h o b i c , o n e w o u l d e x p e c t t h e p h e n o l i c o x y g e n t o b e p r o t o n a t e d a t p h y s i o l o g i c a l p H . K e e p i n g t h e s e o b s e r v a t i o n s u n d e r c o n s i d e r a t i o n , T y r l 3 4 w a s m u t a t e d i n t o a P h e r e s i d u e ( C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F ) . T h i s r a t h e r s t r u c t u r a l l y c o n s e r v a t i v e m u t a t i o n p l a c e s a h y d r o p h o b i c r e s i d u e n e x t t o t h e e n g i n e e r e d L y s l 3 2 , e x p e c t i n g t o r e s u l t i n t h e d e p r e s s i o n o f t h e a m i n e p K a . H o w e v e r , t h e s p e c t r o s c o p i c r e s u l t s O b t a i n e d u s i n g t h i s n e w m u t a n t r e v e a l t h e c o m p l e x i t y o f t h e p r o t e i n e n g i n e e r i n g t a s k . A S S h o w n i n F i g u r e 2 - 6 , t h e s e c o n d m u t a t i o n r e s u l t e d i n a S i g n i fi c a n t i n c r e a s e o f t h e r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y , w i t h t h e c a l c u l a t e d K d v a l u e a t 1 2 0 i 5 n M . I n a d d i t i o n , t h e r e t i n o i c a c i d a f fi n i t y h a s f u r t h e r d e c l i n e d ( K , = 1 0 0 i 7 n M ) , c o n s i s t e n t w i t h t h e r e m o v a l o f o n e o f t h e c r i t i c a l r e s i d u e s r e s p o n s i b l e f o r b i n d i n g . T h e U V t i t r a t i o n o f t h e n e w d o u b l e m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l r e v e a l e d t h e p r e s e n c e o f a p e a k a t 3 9 6 n m , r e p r e s e n t i n g a ~ 1 5 n m r e d S h i f t i n g a s 6 3 A B 1 E g 0 . 8 _ 0 . 0 5 7 3 0 6 q 0 . 0 4 - 5 ' 0 . 0 3 - ° 0 4 - { I ' 0 . 0 2 ~ ' 6 0 : 2 1 0 . 0 1 - 0 : 0 i i i i l 0 1 l o 2 4 5 3 1 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 E q u i v a l e n t s R e t i n o i c A c i d l R e t i n a l " m C D 1 6 7 9 8 . 1 1 6 7 8 8 . 1 1 7 0 6 7 . 4 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 M a s s ( D a ) M a s s ( D a ) F i g u r e 2 - 6 . A . F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l K d d e t e r m i n a t i o n w i t h t h e d o u b l e m u t a n t C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F . T h e r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y h a s d r o p p e d ( K , = 1 0 0 : I : 7 . 1 n M ) , w h i l e t h e r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y i n c r e a s e d ( K , = 1 2 0 : I : 4 . 9 n M ) . B . U V - v i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F p o r t r a y s a m a x i m a l a b s o r b a n c e a t 3 9 6 n m . C . M A L D l - T O F o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d d o u b l e m u t a n t s h o w s a n M ’ = 1 6 7 9 8 . 1 D a c o r r e s p o n d i n g t o t h e p r o t e i n m a s s , c a l c u l a t e d t o b e 1 6 7 8 5 . 2 D a . A s e c o n d p e a k , M ” = 1 7 0 6 7 . 4 0 8 , 2 6 9 . 3 m a s s u n i t s h i g h e r t h a n t h e p r o t e i n p e a k , r e p r e s e n t s a c o v a l e n t l y l i n k e d r e t i n a l m o l e c u l e ( c a l c u l a t e d m a s s d i f f e r e n c e 2 6 6 ) . D . R e d u c t i v e a m i n a t i o n o f r e t i n a l w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F r e s u l t s i n l o s s o f t h e c o v a l e n t c o m p l e x a n d o n l y t h e p r o t e i n m a s s M ’ = 1 6 7 8 8 . 1 D a c a n b e d e t e c t e d . T h e s m a l l p e a k t o t h e r i g h t o f t h e m a j o r p r o t e i n p e a k i s d u e t o m a t r i x a d d i t i o n t o t h e p r o t e i n , a n d d o e s n o t c o r r e s p o n d t o t h e c a l c u l a t e d r e t i n a l a d d i t i o n m o l e c u l a r w e i g h t . 6 4 c o m p a r e d t o t h e f r e e r e t i n a l s p e c t r u m ( A m a x ~ 3 8 0 n m ) . H o w e v e r , t h e M A L D I - T O F b a s e d b i n d i n g a s s a y s d i d n o t s u p p o r t t h e p r e s e n c e o f a s t a b l e b o n d b e t w e e n t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K 2 Y 1 3 4 F m u t a n t a n d a l l - t r a n s - r e t i n a l . I n p a r t i c u l a r , i n c u b a t i o n o f t h e d o u b l e m u t a n t w i t h r e t i n a l r e v e a l e d t h e p r e s e n c e o f a s m a l l a m o u n t o f c o v a l e n t l y b o u n d s p e c i e s , a s S h o w n i n F i g u r e 2 - 6 C . A l t h o u g h , a s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d , t h e M A L D I - T O F r e s u l t s d o n o t d i r e c t l y r e fl e c t t h e e f f i c i e n c y O f t h e r e t i n a l b i n d i n g t o t h e v a r i o u s C R A B P I I m u t a n t s , i t i s c l e a r i n t h i s c a s e t h a t t h e a m o u n t O f c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l f o r t h e R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F m u t a n t i s s i g n i f i c a n t l y s m a l l e r t h a n w h a t w a s O b s e r v e d f o r t h e R 1 3 2 K c a s e ( F i g u r e 2 - 4 D ) . I n a d d i t i o n , r e d u c t i v e a m i n a t i o n O f t h e d o u b l e m u t a n t i n t h e p r e s e n c e o f r e t i n a l f a i l e d t o p r o d u c e a p e a k c h a r a c t e r i s t i c f o r t h e c o v a l e n t l y b o u n d c o m p l e x , a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 6 D . T h e r e a c t i o n w a s r e p e a t e d s e v e r a l t i m e s w h i l e v a r y i n g t h e r e a c t i o n c o n d i t i o n s ( l e n g t h o f i n c u b a t i o n o f r e t i n a l , a m o u n t a n d r e a c t i o n t i m e o f r e d u c i n g a g e n t u s e d ( N a C N B H 3 ) ) . H o w e v e r , e a c h t i m e o n l y t h e p e a k c o r r e s p o n d i n g t o t h e p r o t e i n M + w a s p r e s e n t i n t h e s p e c t r u m ( t h e s m a l l e r p e a k o f [ M + 2 0 9 ] + p r e s e n t i n m o s t O f o u r M A L D I - T O F s p e c t r a i s d u e t o t h e m a t r i x u s e d , a s w i l l b e d i s c u s s e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . T h i s r e s u l t f u r t h e r i n d i c a t e s t h a t t h i s n e w l y f o r m e d d o u b l e m u t a n t ( R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F ) d o e s n o t p r o m o t e t h e f o r m a t i o n O f t h e d e s i r e d p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . T h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o b t a i n e d b y o u r c o l l a b o r a t o r s ( S o h e i l a V a e z e s l a m i , J a m e s G e i g e r , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y ) a l s o s u p p o r t t h e a b o v e c o n c l u s i o n . T h e S t r u c t u r e s o f C R A B P H - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F b o u n d t o b o t h a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d a n d a l l - t r a n s - r e t i n a l w e r e s o l v e d , a n d a p i c t o r i a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e b i n d i n g c a v i t i e s i s d e p i c t e d i n F i g u r e 2 - 7 . T h e b o u n d r e t i n o i c a c i d i s l o c a t e d a t e x a c t l y t h e s a m e p o s i t i o n a s i n W T - C R A B P I I ( F i g u r e 2 - 7 C ) . T w o O f t h e r e s i d u e s o r i g i n a l l y i m p l i c a t e d i n d i r e c t i n t e r a c t i o n s w i t h t h e 6 5 c a r b o x y l i c a c i d h a v e b e e n r e m o v e d ( A r g 1 3 2 , T y r l 3 4 ) , h o w e v e r t h e i n t e r a c t i o n w i t h t h e w a t e r b o u n d t o A r g 1 1 1 a n d T h r 5 4 i s m a i n t a i n e d ( w a t e r # 1 , 2 . 7 A ) . S i m i l a r l y , w h e n a r e t i n a l m o l e c u l e i s p r e s e n t i n t h e C R A B P H - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F c a v i t y , i t t o o o c c u p i e s a n a n a l o g o u s p o s i t i o n , a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 7 B . H o w e v e r , f o r t h e r e t i n a l b o u n d s t r u c t u r e , t w o c o n f o r m a t i o n s o f b o t h t h e a l d e h y d e a n d t h e L y s l 3 2 r e s i d u e h a v e b e e n i d e n t i f i e d ( F i g u r e 2 - 7 A ) . I n p a r t i c u l a r , t h e r e a r e t w o o r i e n t a t i o n s o f t h e b o u n d c h r o m o p h o r e , o n e w i t h t h e c a r b o n y l o x y g e n p o i n t i n g t o w a r d s L y s l 3 2 r e s u l t i n g i n a ~ 7 0 ° a n g l e t r a j e c t o r y , a n d t h e o t h e r w i t h t h e c a r b o n y l o x y g e n p o i n t i n g 1 4 6 ° t h e L y s r e s i d u e . I n b o t h c a s e s , h o w e v e r , t h e r e t i n a l r e m a i n s i n i t s f r e e f o r m a n d n o S c h i f f b a s e i s O b s e r v e d . T h e d i s t a n c e b e t w e e n t h e L y s l 3 2 s i d e c h a i n n i t r o g e n a n d t h e c a r b o n y l c a r b o n v a r i e s b e t w e e n 3 . 8 8 A a n d 6 . 7 0 A , d e p e n d i n g o n w h i c h c o n f o r m a t i o n i s c o n s i d e r e d . A t t h e s a m e t i m e t h e B - i o n o n e r i n g O f t h e c h r o m o p h o r e e x i s t s i n t w o c o n f o r m a t i o n s . T h e e l e c t r o n i c d e n s i t y f o r t h e g e m - d i m e t h y l g r o u p c a n b e f o u n d o n b o t h s i d e s O f t h e r i n g s u g g e s t i n g t h e p o s s i b i l i t y o f f r e e r o t a t i o n a l o n g t h e l o n g a x i s o f t h e p o l y e n e , e i t h e r w h i l e e n t e r i n g o r w h i l e b o u n d i n t h e c a v i t y ( F i g u r e 2 - 7 A ) . T h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f t h e C R A B P H - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F m u t a n t v e r i f i e d o u r M A L D I - T O F r e s u l t s t h a t f a i l e d t o d e t e c t a c o v a l e n t b o n d b e t w e e n t h e r e t i n a l a n d t h e e n g i n e e r e d L y s r e s i d u e . H o w e v e r , t h e o r i g i n o f t h e r e d s h i f t i n g O b s e r v e d b y t h e U V - v i s a s s a y u p o n a d d i t i o n o f r e t i n a l t o t h e C R A B P H d o u b l e m u t a n t r e m a i n e d u n c l e a r . I f t h e b o u n d r e t i n a l i s n o t i n v o l v e d i n a S c h i f f b a s e f o r m a t i o n , w h a t c a n a c c o u n t f o r t h e ~ 2 0 n m b a t h o c h r o m i c s h i f t o b s e r v e d ? T h e r e h a v e b e e n p r e v i o u s r e p o r t s o f p r o t e i n - r e t i n a l c o m p l e x e s t h a t e x h i b i t a r e d s h i f t e d U V s p e c t r u m , w i t h o u t t h e p r e s e n c e O f a S c h i f f b a s e . A n e x a m p l e o f t h a t i s 6 6 F i g u r e 2 - 7 . A . S t e r e o v i e w o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l . T w o i n d e p e n d e n t c o n f o r m a t i o n s o f b o t h r e t i n a l a n d L y 1 3 2 a r e f o u n d . T h e c h r o m o p h o r e e x i s t s i n t h e f r e e f o r m , n o S B f o r m a t i o n s i s o b s e r v e d . B . O v e r l a y o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l a n d a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d ( r e p r e s e n t e d b y g r e y c a r b o n s a n d g r e e n c a r b o n s , r e s p e c t i v e l y ) . C . O v e r l a y o f t h e W T - C R A B P I I a n d C R A B P I I - R 1 3 2 K 2 Y 1 3 4 F m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d ( r e p r e s e n t e d b y o r a n g e c a r b o n s a n d g r e e n c a r b o n s , r e s p e c t i v e l y ) . 6 7 C e l l u l a r R e t i n a l d e h y d e B i n d i n g P r o t e i n ( C R A L B P ) , a p r o t e i n t h a t m o d u l a t e s t h e 1 5 A s p a r t o f t h e a n o n g o i n g i n t e r a c t i o n o f 1 1 - c i s - r e t i n a l w i t h t h e v i s u a l c y c l e e n z y m e s . e f f o r t t o b e t t e r u n d e r s t a n d t h e n o r m a l f u n c t i o n o f C R A L B P , t h e r e t i n o i d b i n d i n g d o m a i n , l o c a t e d S i m i l a r t o t h e C R A B P H c a s e a t t h e C - t e r m i n u s , h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d . ' 6 U p o n b i n d i n g o f a l l - t r a n s - r e t i n a l t o C R A L B P , t h e U V a b s o r b a n c e m a x i m u m r e d S h i f t s f r o m ~ 3 8 0 n m t o 4 2 5 n m . ” ’ ' 8 T h i s b e h a v i o r , o r i g i n a l l y a t t r i b u t e d t o p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e f o r m a t i o n , h a s b e e n a s u b j e c t o f d i s c u s s i o n . C r a b b a n d c o w o r k e r s h a v e p r o v e n t h e e x i s t e n c e o f a L y s r e s i d u e ( L y 3 2 2 1 ) w i t h i n t h e C R A L B P c a v i t y . H o w e v e r , a s e r i e s o f r e d u c t i v e a m i n a t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f r e t i n a l h a v e f a i l e d t o p r o d u c e a c o v a l e n t l y b o u n d p r o t e i n - s u b s t r a t e s p e c i e s . ' 7 A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h i s r e s u l t c o u l d b e t h a t t h e r e t i n a l b i n d i n g s i t e i s n o t a c c e s s i b l e t o w a t e r s o l u b l e r e d u c i n g a g e n t s , s o m e t h i n g p r e v i o u s l y r e p o r t e d b y S a a r i a s w e l l . 1 6 H o w e v e r , i t i s m o s t c o m m o n l y b e l i e v e d t h a t t h e b i n d i n g o f t h e l i g a n d t o t h e p r o t e i n i s n o n c o v a l e n t , a n d t h e b a t h o c h r o m i c s h i f t m u s t b e a t t r i b u t e d t o u n s p e c i f i e d e l e c t r o n i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e a l d e h y d e m o l e c u l e a n d t h e p r o t e i n i n t e r i o r . ' 6 ‘ 1 9 ’ 2 0 T h e l a t t e r e x p l a n a t i o n , a l t h o u g h v e r y g e n e r a l i s c o n s i s t e n t w i t h w h a t i s O b s e r v e d i n t h e c a s e o f C e l l u l a r R e t i n o l B i n d i n g P r o t e i n s ( C R B P ) . T h i s f a m i l y o f p r o t e i n s , b r i e fl y d i s c u s s e d i n C h a p t e r 1 , a r e s t r u c t u r a l l y v e r y S i m i l a r t o C R A B P I I a n d b i n d a l l - t r a n s - ' T h e n a t u r e o f t h e s u b s t r a t e , n a m e l y a n a l c o h o l r e t i n o l i n a d e e p , h y d r o p h o b i c p o c k e t . 2 r a t h e r t h a n a n a l d e h y d e , p r e v e n t s t h e f o r m a t i o n o f a n y c o v a l e n t b o n d w i t h t h e p r o t e i n ’ s i n t e r i o r . H o w e v e r , t h e a b s o r p t i o n S p e c t r u m o f r e t i n o l b o u n d t o C R B P h a s a A m , a t ~ 3 5 0 n m , a ~ 2 5 n m S h i f t f r o m t h e f r e e r e t i n o l s p e c t r u m ( 3 2 5 n m ) . 2 2 ’ 2 3 T h i s b e h a v i o r h a s b e e n e x p l a i n e d a s t h e r e s u l t O f t w i s t i n g a r o u n d t h e c h r o m o p h o r e ’ s s i n g l e b o n d s . I n p a r t i c u l a r , 6 8 i t i s b e l i e v e d t h a t t h e p r o t e i n b i n d s r e t i n o l i n a c o n f o r m a t i o n t h a t a l l o w s f u r t h e r c o n j u g a t i o n o f t h e p o l y e n e , t h a t i s a s t r u c t u r e m o r e p l a n a r t h a n t h e a v e r a g e o r i e n t a t i o n o f r e t i n o l i n s o l u t i o n . 2 3 A t t h e s a m e t i m e , t h e p o s s i b i l i t y o f e l e c t r o n i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e a l c o h o l a n d t h e S i d e c h a i n s o f t h e n e i g h b o r i n g a m i n o a c i d s c a n n o t b e r u l e d o u t . T h e s e e x a m p l e s c a n n o t p r o v i d e s o l i d p r o o f o n t h e o r i g i n o f t h e U V r e d - S h i f t i n g O b s e r v e d u p o n a d d i t i o n o f a l l - t r a n s - r e t i n a l t o t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F m u t a n t . H o w e v e r , t h e y c a n s u g g e s t p o s s i b l e e x p l a n a t i o n s t h a t c a n a p p l y t o o u r s y s t e m a s w e l l . 2 . 4 A t t e m p t s t o r e s t o r e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n D o u b l e m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F f a i l e d t o p r o d u c e e v i d e n c e f o r S B f o r m a t i o n w i t h r e t i n a l . H o w e v e r , s i n c e i t r e s u l t e d i n 8 ~ 2 0 n m r e d S h i f t i n g o f t h e U V s p e c t r u m , t h e h y d r o p h o b i c m u t a t i o n ( Y 1 3 4 F ) w a s m a i n t a i n e d w h i l e a d d i t i o n a l c h a n g e s t o t h e C R A B P I I c a v i t y w e r e d e s i g n e d . B y l o o k i n g a t t h e s t r u c t u r e s h o w n i n F i g u r e 2 - 8 A , B o n e c a n n o t i c e t h a t t h e p l a n e o f t h e r e t i n a l c a r b o n y l h a s t o b e r o t a t e d a l o n g t h e l o n g a x i s o f t h e c h r o m o p h o r e i n o r d e r t o a c h i e v e a f a v o r a b l e t r a j e c t o r y f o r n u c l e o p h i l i c a t t a c k . C o n s i d e r i n g t h e c a r b o n y l p o i n t i n g t o w a r d s t h e L y s r e s i d u e , a r o t a t i o n O f ~ 3 2 ° i s r e q u i r e d i n o r d e r t o a c h i e v e t h e O p t i m a l B i i r g i - D u n i t z a n g l e o f 1 0 7 ° f o r t h e n u c l e o p h i l i c a t t a c k ( F i g u r e 2 . 8 C ) . I f t h e s e c o n d c o n f o r m a t i o n i s c o n s i d e r e d a ~ 1 8 ° a n g l e i s r e q u i r e d , a s s h o w n i n F i g u r e 2 . 8 D . W e b e l i e v e d t h a t b y r e m o v i n g t h e u n f a v o r a b l e i n t e r a c t i o n s l e a d i n g t o t h e u n d e s i r e d c a r b o n y l o r i e n t a t i o n a l o n g w i t h b u i l d i n g f a v o r a b l e a n d r e i n f o r c i n g i n t e r a c t i o n s t h a t w o u l d 6 9 R 1 3 2 K R 1 3 2 K N u 1 0 7 ° O p t i m a l O B t i r g i - D u n i t z a n g l e F i g u r e 2 - 8 . A . S t e r e o v i e w o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . T h e b l u e c r o s s , r e p r e s e n t i n g o r d e r e d w a t e r # 1 i s h y d r o g e n b o n d e d t o A r g 1 1 1 , T h r 5 4 a n d t h e c a r b o n y l o f t h e b o u n d r e t i n a l ; B . C l o s e r l o o k a t t h e d o u b l e c o n f o r m a t i o n o f b o u n d r e t i n a l t o t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F m u t a n t . T h e t w o c o n f o r m a t i o n s a r e r e p r e s e n t e d b y d i f f e r e n t c o l o r s ; C . L y 5 1 3 2 c a n a t t a c k t h e 1 “ c o n f o r m a t i o n o f t h e c a r b o n y l f r o m a ~ 7 5 ° a n g l e . F o r o p t i m a l a t t a c k a r o t a t i o n o f ~ 3 0 ° i s r e q u i r e d . D . L y 5 1 3 2 c a n a t t a c k t h e 2 " ‘ 1 c o n f o r m a t i o n o f t h e c a r b o n y l f r o m a ~ 1 2 5 ° a n g l e . F o r o p t i m a l a t t a c k a r o t a t i o n o f ~ 2 0 ° i s r e q u i r e d ; E . B I J r g i - D u n i t z a n g l e f o r o p t i m a l n u c l e o p h i l i c a t t a c k o n a c a r b o n y l . 7 0 p r o m o t e t h e c h r o m o p h o r e ’ s r o t a t i o n t o a s u i t a b l e d e g r e e , w e c a n a c h i e v e t h e f o r m a t i o n o f a S c h i f f b a s e . B y c o m p a r i n g t h e s t r u c t u r e s s h o w n i n F i g u r e 2 - 7 a n d 2 - 8 , o n e c a n n o t i c e t h a t t h e o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e ( # 1 ) r e s p o n s i b l e f o r b r i d g i n g t h e A r g 1 1 1 a n d T h r 5 4 r e s i d u e s w i t h F i g u r e 2 - 9 . S t e r e o v i e w o f t h e W T - C R A B P I I a n d C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F a p o p r o t e i n c r y s t a l s t r u c t u r e s ( t h e c a r b o n a t o m s a r e c o l o r e d y e l l o w f o r t h e W T c a s e a n d g r e e n f o r t h e d o u b l e m u t a n t c a s e ) . T h e o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e b o u n d t o b o t h A r g 1 1 1 a n d T h r 5 4 i s p r e s e n t i n b o t h s t r u c t u r e s ( r e p r e s e n t e d b y a y e l l o w o r a g r e e n s t a r f o r t h e W T a n d d o u b l e m u t a n t r e s p e c t i v e l y ) . t h e b o u n d r e t i n o i c a c i d i n t h e W T s t r u c t u r e i s m a i n t a i n e d i n b o t h R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F s t r u c t u r e s . T h i s w a t e r m o l e c u l e , t h a t a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 9 i s p r e s e n t e v e n i n t h e a b s e n c e o f l i g a n d i n t h e C R A B P I I c a v i t y , a p p e a r s t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e o r i e n t a t i o n o f t h e c a r b o n y l o f t h e c h r o m o p h o r e . I n t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l , o n e o f t h e t w o c o n f o r m a t i o n s o f t h e a l d e h y d e i s p o i n t i n g d i r e c t l y t o w a r d s t h e w a t e r m o l e c u l e ( 2 . 8 3 A ) , w h i l e t h e o t h e r i s f u r t h e r a w a y ( 3 . 2 1 A ) ( F i g u r e 2 - 8 ) . O n e w o u l d e x p e c t t h a t i f t h i s w a t e r i n t e r a c t i o n w a s r e m o v e d , t h e r e t i n a l c a r b o n y l c o u l d r o t a t e a w a y f r o m A r g 1 1 1 , f u r t h e r t o w a r d s L y s l 3 2 , a n d p o t e n t i a l l y a d o p t a c o n f o r m a t i o n t h a t c a n p r o m o t e n u c l e o p h i l i c a t t a c k . I n o r d e r t o e x p l o r e t h a t p o s s i b i l i t y , s p e c i fi c m u t a t i o n s w e r e d e s i g n e d i n v o l v i n g A r g ] 1 1 a n d T h r 5 4 r e s i d u e s . 7 1 A r g 1 1 1 a n d T h r 5 4 a r e t h e o n l y r e l a t i v e l y h y d r o p h i l i c r e s i d u e s e m b e d d e d i n t h e m i d d l e o f a h i g h l y h y d r o p h o b i c c a v i t y . O n e w o u l d e x p e c t t h a t b y r e m o v i n g o n e o r b o t h o f t h e s e r e s i d u e s t h e o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e t h e y a r e h y d r o g e n b o n d e d t o m i g h t b e r e m o v e d a s w e l l . I n o r d e r t o t e s t t h e l a t t e r h y p o t h e s i s , A r g 1 1 1 w a s c o n v e r t e d i n t o 8 L e u r e s i d u e . F i g u r e 2 - 1 0 . S t e r e o v i e w o f t w o m i n i m i z e d m o d e l s o f t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . I n t h e fi r s t s t r u c t u r e ( b l u e c a r b o n a t o m s ) t h e r e t i n a l m o l e c u l e i s b o u n d i n a v e r y s i m i l a r m a n n e r a s i n t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F c a s e . W h e n t h e r e t i n a l i s b o u n d t o R 1 3 2 K a s a S c h i f f b a s e ( g r e e n c a r b o n a t o m s ) , t h e m o d e l d i c t a t e s a r o t a t i o n o f t h e p o l y e n e a b o u t i t s l o n g a x i s . A l t h o u g h A r g t 1 1 i s r e m o v e d , a n o r d e r e d w a t e r # 1 i s m a i n t a i n e d i n t h e m o d e l , b o u n d t o T h r 5 4 ( b l u e c r o s s ) . P r i o r t o t h e a c t u a l e x p e r i m e n t , i n - s i l i c o m u t a g e n e s i s s u p p o r t e d o u r s u g g e s t i o n t h a t a t w i s t a b o u t t h e c h r o m o p h o r e s l o n g a x i s i s r e q u i r e d f o r t h e s u c c e s s f u l S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . I n p a r t i c u l a r , t h e m o l e c u l a r m o d e l s o f t r i p l e m u t a n t C R A B P H - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L b o t h c o v a l e n t l y a n d n o n - c o v a l e n t l y b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l w e r e b u i l d a n d m i n i m i z e d . A s s h o w n i n F i g u r e 2 - 1 0 , t h e o v e r l a y O f t h e t w o s t r u c t u r e s r e v e a l s a n ~ 6 0 ° r o t a t i o n o f t h e r e t i n a l a l o n g i t s l o n g a x i s o f t h e S B b o u n d c h r o m o p h o r e , a s c o m p a r e d t o t h e u n r e a c t e d r e t i n a l w i t h i n t h e s a m e m u t a n t . D u e t o t h e n a t u r e o f t h e m i n i m i z a t i o n , t h a t i s o n l y l o c a l m i n i m a c a n b e o b t a i n e d , t h e o v e r a l l s t r u c t u r e o f t h e 7 2 m o d e l d i r e c t l y d e p e n d s o n t h e i n i t i a l l y b u i l t c o n f o r m a t i o n s . T h e r e f o r e , a l t h o u g h t h e s e m o d e l s c a n b e u s e f u l t o h e l p v i s u a l i z e r a t i o n a l m u t a t i o n s , t h e y a l o n e c a n n o t v e r i f y t h e h y p o t h e s e s . T h e s p e c t r o s c o p i c a s s a y s f o r t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L t r i p l e m u t a n t a p p e a r c o n s i s t e n t w i t h a S B f o r m a t i o n . T h e a d d i t i o n a l h y d r o p h o b i c i t y i n t h e p o c k e t d o e s n o t i m p r o v e t h e r e t i n a l b i n d i n g ( K d = 1 6 0 i 6 . 7 n M ) , i t d o e s h o w e v e r a f f e c t t h e r e t i n o i c a c i d b i n d i n g ( K , = 1 0 0 0 i 2 8 n M , a t e n f o l d d e c r e a s e i n a f fi n i t y a s c o m p a r e d t o t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F m u t a n t , F i g u r e 2 - 1 1 ) . T h e U V a s s a y r e v e a l s a n a b s o r p t i o n p e a k v e r y s i m i l a r t o t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F p a r e n t m u t a n t ( A m , 2 3 9 8 n m ) . T h i s ~ 2 0 n m s h i f t c a n b e i n d i c a t i v e o f P S B f o r m a t i o n h o w e v e r , a s d i s c u s s e d i n d e t a i l s f o r t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F m u t a n t , i t d o e s n o t c o n s t i t u t e s o l i d p r o o f . T h e v e r i f i c a t i o n f o r t h e S B f o r m a t i o n b e t w e e n t h e l a t t e r t r i p l e m u t a n t a n d a l l — t r a n s - r e t i n a l c a n , h o w e v e r , b e p r o v i d e d b y t h e M A L D I - T O F a s s a y s . A s S h o w n i n F i g u r e 2 - 1 1 C a n d D , u n d e r b o t h i n c u b a t i o n w i t h r e t i n a l a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n c o n d i t i o n s a s e c o n d p e a k , i n d i c a t i v e O f a r e t i n a l b o u n d s p e c i e s i s p r e s e n t i n t h e s p e c t r u m . T h i s a d d i t i o n a l p e a k , m o r e p r o m i n e n t i n t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n c a s e , c a n c o n fi r m t h e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n b e t w e e n t r i p l e m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L a n d r e t i n a l , a n d p o i n t s o u t t h e i m p o r t a n c e O f t h e n e w l y i n t r o d u c e d m u t a t i o n . R e c a l l t h a t i n t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F m u t a n t , t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n e x p e r i m e n t r e p e a t e d l y f a i l e d t o p r o d u c e a r e t i n a l b o u n d s p e c i e s . T h e s p e c t r o s c o p i c r e s u l t s u s i n g t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L v e r i f y t h e v a l i d i t y o f o u r a p p r o a c h . T h e i n t r o d u c t i o n o f a d d i t i o n a l h y d r o p h o b i c i t y i n t h e C R A B P I I c a v i t y p r o d u c e d a S t a b l e S c h i f f b a s e a s e x p e c t e d f r o m o u r d e s i g n . T h i s c o u l d b e d u e t o e i t h e r 7 3 > W 1 0 . 0 4 — f 0 . 9 1 0 0 3 g o e - ' ‘ o 0 7 * A 0 . 0 2 4 > = 3 , 0 . 6 - g 0 5 . . 0 . 0 1 l 0 . 4 I T T I I I I 0 I T r l I 0 1 2 3 4 5 5 7 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 E q u i v a l e n t s R e t i n o i c A c i d I R e t i n a l " m c 0 1 6 7 5 7 . 6 1 6 7 4 1 . 7 1 7 0 2 6 . 8 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 M a s s ( 0 8 ) M a s s ( D a ) F i g u r e 2 - 1 1 . A . F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l K d d e t e r m i n a t i o n w i t h t h e t r i p l e m u t a n t C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L . R e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y d r o p p e d ( K , = 1 0 0 0 1 : 2 8 n M ) , w h i l e t h e r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y i s m a i n t a i n e d , K . ) = 1 6 0 : t 6 . 7 n M . B . U V - v i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L p o r t r a y s a m a x i m a l a b s o r b a n c e a t 3 9 9 n m . C . M A L D l - T O F o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d t r i p l e m u t a n t s h o w s a n M " = 1 6 7 4 1 . 7 D a c o r r e s p o n d i n g t o t h e p r o t e i n m a s s , c a l c u l a t e d t o b e 1 6 7 4 2 . 2 D a . T h e s e c o n d s m a l l e r p e a k , M + = 1 7 0 0 8 . 4 D a , 2 6 6 . 7 m a s s u n i t s h i g h e r t h a n t h e p r o t e i n p e a k , r e p r e s e n t s a c o v a l e n t l y l i n k e d r e t i n a l m o l e c u l e ( c a l c u l a t e d m a s s d i f f e r e n c e 2 6 6 ) . D . R e d u c t i v e a m i n a t i o n o f r e t i n a l w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L c o n fi r m s S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . P r o t e i n p e a k i s d e t e c t e d a t 1 6 7 5 7 . 6 D a , a n d t h e c o v a l e n t s p e c i e s i s d e t e c t e d a t 1 7 0 2 6 . 8 D a , r e v e a l i n g a d i f f e r e n c e o f 2 6 9 . 2 D a ( e x p e c t e d 2 6 8 D a ) . 7 4 t h e i n c r e a s e d n u c l e o p h i l i c i t y o f t h e e n g i n e e r e d L y s r e s i d u e o r , a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d , t h e r e m o v a l o f w a t e r # 1 , w h i c h c o u l d a l l o w f o r t h e r o t a t i o n o f t h e a l d e h y d i c c a r b o n y l t o f a c i l i t a t e t h e S B f o r m a t i o n . F u r t h e r s u p p o r t f o r o u r a p p r o a c h w a s p r o v i d e d b y t h e s p e c t r o s c o p i c e v a l u a t i o n o f t r i p l e m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F z T 5 4 V , w h i c h a l s o i n t r o d u c e s a n a d d i t i o n a l h y d r o p h o b i c r e s i d u e i n t h e v i c i n i t y o f t h e b o u n d c h r o m o p h o r e . A s p r e v i o u s l y s h o w n , t h e r e i s a h y d r o g e n b o n d b e t w e e n t h e s i d e c h a i n h y d r o x y l o f T h r 5 4 a n d w a t e r # 1 . ( F i g u r e 2 - 1 0 ) . I n t r o d u c i n g a n o n - p o l a r r e s i d u e a t t h i s p o s i t i o n w i t h a s t r u c t u r a l l y c o n s e r v a t i v e m u t a t i o n ( T h r t o V a l ) c o u l d r e s u l t i n t h e r e l e a s e o f t h e b o u n d w a t e r w h i c h i n t u r n , s i m i l a r t o t h e R 1 1 1 L c a s e , c a n f a c i l i t a t e t h e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . T h e r e s u l t s o f t h e v a r i o u s s p e c t r o s c o p i c a s s a y s u s i n g t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F z T 5 4 V m u t a n t a r e s u m m a r i z e d i n F i g u r e 2 - 1 2 . A s c o m p a r e d t o t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F d o u b l e m u t a n t t h e n e w t r i p l e m u t a n t a l s o e x h i b i t s i m p r o v e d b i n d i n g a f f i n i t y f o r r e t i n a l ( K ; = 8 1 i 1 4 n M ) , w h i l e t h e r e t i n o i c a c i d b i n d i n g h a s f u r t h e r d e c l i n e d ( K d = 5 6 5 t 7 9 n M ) . I n a d d i t i o n , t h e a b s o r b a n c e O f r e t i n a l w h e n b o u n d t o R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F t T 5 4 V h a s a A m , a t ~ 4 1 7 n m , a ~ 4 0 n m r e d S h i f t i n g a s c o m p a r e d t o t h e W T - C R A B P I I . F u r t h e r m o r e , a s i n t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L c a s e , t h e M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s v e r i f i e d t h e p r e s e n c e o f a S c h i f f b a s e b e t w e e n t h e p r o t e i n a n d t h e a d d e d r e t i n a l u n d e r b o t h i n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n c o n d i t i o n s ( F i g u r e 2 - 1 2 C a n d D ) . I t i s n o t c l e a r w h y t h e T 5 4 V m u t a t i o n i n d u c e s a l a r g e r r e d s h i f t i n g o f t h e U V a b s o r b a n c e t h a n R l l l L ( 4 1 7 n m v s 3 9 8 n m ) . H o w e v e r , t h e s t u d y o f t h e p u b l i s h e d c r y s t a l s t r u c t u r e s o f C R A B P H b o u n d t o r e t i n o i c a c i d r e v e a l s t h e p r e s e n c e O f a h y d r o g e n b o n d n e t w o r k b e t w e e n s e l e c t e d r e s i d u e s o f t h e C R A B P I I c a v i t y a n d e n c a p s u l a t e d w a t e r 7 5 y t i s n e t n I e v i t a l e R 1 1 0 . 0 2 - 0 . 9 - 0 . 0 1 5 4 0 . 8 ' l M A 0 . 0 1 - 1 0 . 7 - 0 . 0 0 5 - 0 . 6 I r T 1 I 0 I T I I l 0 1 2 3 4 5 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 E q u i v a l e n t s R e t i n o i c A c i d I R e t i n a l n m C 0 1 5 5 1 6 . 6 1 5 5 1 7 . 7 1 5 7 8 5 . 3 1 5 7 8 4 . 4 / I I I T I 1 I T I I I I 1 4 5 0 0 1 5 0 0 0 1 5 5 0 0 1 6 0 0 0 1 6 5 0 0 1 7 0 0 0 1 4 5 0 0 1 5 0 0 0 1 5 5 0 0 1 6 0 0 0 1 6 5 0 0 1 7 0 0 0 M a s s ( D a ) M 3 8 8 ( D a ) F i g u r e 2 - 1 2 . A . F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l K . ) d e t e r m i n a t i o n w i t h t h e t r i p l e m u t a n t C R A B P I I R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F 2 T 5 4 V . R e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f fi n i t y d r o p p e d ( K , = 5 6 5 1 7 9 n M ) , w h i l e t h e r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y s l i g h t l y i m p r o v e d , K , = 8 1 t 1 4 n M ; B . U V - v i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L p o r t r a y s a m a x i m a l a b s o r b a n c e a t 4 1 7 n m ; C . M A L D l - T O F o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d t r i p l e m u t a n t s h o w s a n M + = 1 5 5 1 7 . 7 0 8 c o r r e s p o n d i n g t o t h e p r o t e i n m a s s , c a l c u l a t e d t o b e 1 5 5 1 7 . 2 D a . T h e s e c o n d s m a l l e r p e a k , M + = 1 5 7 8 4 . 4 0 8 , ~ 2 6 7 m a s s u n i t s h i g h e r t h a n t h e p r o t e i n p e a k , r e p r e s e n t s a c o v a l e n t l y l i n k e d r e t i n a l m o l e c u l e ( c a l c u l a t e d m a s s d i f f e r e n c e 2 6 6 ) ; D . R e d u c t i v e a m i n a t i o n o f r e t i n a l w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L c o n fi r m s S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . P r o t e i n p e a k i s d e t e c t e d a t 1 5 5 1 6 . 6 D a , a n d t h e e n h a n c e d c o v a l e n t s p e c i e s i s d e t e c t e d a t 1 5 7 8 5 . 3 D a . r e v e a l i n g a d i f f e r e n c e o f 2 6 8 . 7 D a ( e x p e c t e d 2 6 8 D a ) . 7 6 m o l e c u l e s w i t h i n i t . 2 4 A S b r i e fl y d i s c u s s e d i n C h a p t e r 1 , t h i s n e t w o r k h a s b e e n i m p l i c a t e d i n t h e s u b s t r a t e s e l e c t i o n w i t h i n t h e i L B P f a m i l y s i n c e i t d i f f e r s i n a c c o r d a n c e t o t h e n a t u r e o f t h e m o l e c u l e b o u n d . I n a d d i t i o n , t h e p r e s e n c e o f o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e s i n t h e v i c i n i t y o f t h e P S B i n r h o d o p s i n h a s b e e n l i n k e d t o i t s e x c e p t i o n a l l y h i g h p K , , . 2 5 ' 2 7 I n f a c t , e x t e n s i v e d e p l e t i o n o f w a t e r f r o m b o v i n e r h o d o p s i n r e s u l t e d i n t h e d e p r o t o n a t i o n o f t h e $ 8 . 2 8 A s s h o w n i n F i g u r e 2 - 1 3 b o t h A r g 1 1 1 a n d T h r 5 4 i n C R A B P I I p a r t i c i p a t e i n t h i s n e t w o r k , w h i c h i s a l s o p r e s e n t i n t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F c r y s t a l s t r u c t u r e s . I n F i g u r e 2 - 1 3 , t h e w a t e r m o l e c u l e s i n r e d r e p r e s e n t t h o s e i n c l o s e p r o x i m i t y ( w i t h i n 3 . 5 A ) t h e a f o r e m e n t i o n e d r e s i d u e s 1 1 1 a n d 5 4 . A S c a n b e s e e n , t h i s h y d r o g e n b o n d n e t w o r k e x p a n d s a l o n g t h e p o l y e n e c h a i n , i n v o l v i n g s e v e r a l p o l a r r e s i d u e s , u p t o t h e “ m o u t h ” o f t h e C R A B P I I - c a v i t y , c l o s e t o t h e r e t i n a l B - i o n o n e - r i n g . B y r e m o v i n g A r g 1 1 1 a n d / o r T h r 5 4 , i t i s p o s s i b l e t h a t t h i s n e t w o r k i s d i s r u p t e d , p o t e n t i a l l y l e a d i n g t o f u r t h e r 4 4 v T « r ‘ 1 ' R 7 9 T 7 5 5 x 3 3 R 7 9 T 7 5 # E 7 3 0 9 0 9 7 F i g u r e 2 - 1 3 . C r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e b i n d i n g s i t e o f W T - C R A B P I I b o u n d t o r e t i n o i c a c i d . R e s i d u e s A r g 1 1 1 a n d T h r 5 4 p a r t i c i p a t e i n a h y d r o g e n b o n d n e t w o r k t h a t i n v o l v e s e n c a p s u l a t e d w a t e r m o l e c u l e s ( r e p r e s e n t e d b y c r o s s e s ) . S e l e c t e d a m i n o a c i d s t h a t a r e p a r t o f t h i s n e t w o r k a r e a l s o h i g h l i g h t e d . T h e n u m b e r e d w a t e r m o l e c u l e s ( r e d c r o s s e s ) a r e w i t h i n 3 . 5 A d i s t a n c e f r o m A r g t 1 1 a n d I o r T h r 5 4 . 7 7 c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s w i t h i n t h e c a v i t y . T h e s e c h a n g e s , i f p r e s e n t , d o n o t r e s u l t i n a n o v e r a l l c o l l a p s e o f t h e C R A B P H t e r t i a r y s t r u c t u r e , a s t h e C D s p e c t r a o f a l l t h e m u t a n t s a r e v i r t u a l l y i d e n t i c a l t o t h a t o f W T C R A B P I I . ” I f t h e m u t a t e d S i t e s a r e i n d u c i n g c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s , t h o s e a r e O f l o c a l i m p a c t a n d c o u l d p r o b a b l y o n l y b e o b s e r v e d b y c r y s t a l l o g r a p h i c s t u d i e s . I f t h e l a t t e r a r g u m e n t i s c o r r e c t , i t c o u l d p o t e n t i a l l y e x p l a i n t h e g r e a t e r i n fl u e n c e o f t h e T 5 4 V m u t a t i o n t o t h e U V s p e c t r u m . A S s h o w n i n F i g u r e 2 - 1 3 , T h r 5 4 i s l o c a t e d i n t h e m i d d l e o f t h e h y d r o g e n b o n d n e t w o r k a n d , i n a d d i t i o n t o w a t e r # 1 i t i s i n t e r a c t i n g w i t h a s e r i e s o f o t h e r w a t e r s . T h e r e f o r e , i t i s p o s s i b l e t h a t b y r e m o v i n g T h r 5 4 w e a r e d i s r u p t i n g t h e h y d r o g e n b o n d n e t w o r k m o r e t h a n i f t h e A r g 1 1 1 i s r e m o v e d , r e s u l t i n g i n a d d i t i o n a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e c h r o m o p h o r e a n d t h e a m i n o a c i d r e s i d u e s s u r r o u n d i n g i t . I n a n a t t e m p t t o f u r t h e r p r o b e t h e e f f e c t o f h y d r o p h o b i c i t y f o r S B f o r m a t i o n , t e t r a m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L z T 5 4 V w a s p r o d u c e d , c o n t a i n i n g b o t h o f t h e h y d r o p h o b i c m u t a t i o n s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d . T h i s n e w p r o t e i n m a i n t a i n e d t h e a b i l i t y t o b i n d r e t i n a l a s a S B a s e v i d e n t f r o m t h e M A L D I — T O F e x p e r i m e n t s . H o w e v e r , t h e o b s e r v e d U V A m , i s ~ 4 O O n m , ~ 1 7 n m b l u e S h i f t e d a s c o m p a r e d t o t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F 2 T 5 4 V t r i p l e m u t a n t . T h i s c o u l d b e t h e r e s u l t o f a f u r t h e r d i s r u p t i o n O f t h e h y d r o g e n b o n d n e t w o r k p r e v i o u s l y d i s c u s s e d . A t t h e s a m e t i m e , a l t h o u g h t h e a d d e d h y d r o p h o b i c i t y a p p e a r s t o h a v e h a d a p o s i t i v e e f f e c t i n t h e f o r m a t i o n o f a S c h i f f b a s e , w h e n t h e c a v i t y b e c o m e s t o o h y d r o p h o b i c t h e i m i n e s e e m s m o r e s t a b l e i n i t s n o n - p r o t o n a t e d f o r m . A s a c o n c l u s i o n , a l l o f t h e C R A B P I I m u t a n t s d i s c u s s e d a b o v e ( R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L , R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F 2 T 5 4 V a n d R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L z T 5 4 V ) h a v e s u c c e e d e d i n p r o v i d i n g a S c h i f f b a s e w i t h r e t i n a l s t a b l e u n d e r t h e w o r k i n g p H c o n d i t i o n s 7 8 ( p H = 7 . 3 ) t h a t c a n r e s u l t i n a b a t h o c h r o m i c s h i f t o f t h e r e t i n a l U V - v i s s p e c t r u m . H o w e v e r , t h i s U V S h i f t i s n o t a s e x t e n s i v e a s o n e w o u l d e x p e c t u p o n f o r m a t i o n o f a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . T h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l i n s o l u t i o n a b s o r b s a t ~ 4 4 0 n m . ” 3 2 I n o u r c a s e , t h e m o s t r e d s h i f t e d o f t h e t w o m u t a n t s , R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : T 5 4 V , a b s o r b s a t 4 1 7 n m , e v e n t h o u g h i t i s b o u n d w i t h i n t h e p r o t e i n c a v i t y . A l t h o u g h a s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d t h i s s h i f t i n g c o u l d a l s o b e d u e t o g e n e r a l p r o t e i n - c h r o m o p h o r e i n t e r a c t i o n s , i t i s a l s o p o s s i b l e t h a t t h e p r o t o n a t e d S B i s f o r m e d . H o w e v e r , t h e e x t r e m e l y h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t w e h a v e c r e a t e d c a n n o t e f fi c i e n t l y s t a b i l i z e a P S B . I f t h e p K a o f t h e P S B i s c l o s e t o 7 i t i s p o s s i b l e t h a t w h a t w e o b s e r v e a t p h y s i o l o g i c a l p H i s a m i x t u r e o f t h e p r o t o n a t e d a n d n o n - p r o t o n a t e d f o r m o f t h e S c h i f f b a s e . F o l l o w i n g t h e r h o d o p s i n e x a m p l e , t h e n e x t l o g i c a l s t e p w o u l d b e t h e i n t r o d u c t i o n o f a n e g a t i v e l y c h a r g e d g r o u p c l o s e t o t h e S B , s o t h a t t h e p r o t o n a t e d s p e c i e s w o u l d b e s t a b i l i z e d . 2 . 5 I n t r o d u c t i o n o f a c o u n t e r a n i o n A S d i s c u s s e d i n C h a p t e r 1 , t h e r e c e n t c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e b o v i n e r h o d o p s i n r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f a G l u r e s i d u e ( G l u 1 1 3 ) 4 . 2 A a w a y f r o m t h e S B n i t r o g e n . ” 3 4 E x t e n s i v e r e s e a r c h o n t h i s t o p i c h a s p r o v e d t h a t t h e p o s i t i o n i n g o f t h e c o u n t e r a n i o n a r o u n d t h e f o r m e d i m i n e i s c r i t i c a l f o r t h e P S B s t a b i l i z a t i o n . 2 5 A s a r e s u l t , i t i s p o s t u l a t e d t h a t t h e c o u n t e r a n i o n m a y r e s i d e a t v a r y i n g l o c a t i o n s i n o t h e r O p s i n s r e s u l t i n g i n t h e O b s e r v e d w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n . 3 5 7 9 I n o u r c a s e , t h e e n g i n e e r e d C R A B P H m u t a n t s h a v e p r o v i d e d e n o u g h e v i d e n c e t o s u p p o r t t h e f o r m a t i o n o f a S B b e t w e e n t h e i n t r o d u c e d r e t i n a l a n d t h e p r o t e i n . H o w e v e r , t h e U V a s s a y c a n n o t v e r i f y t h e p r e s e n c e o f a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . T h e i n t r o d u c t i o n o f a n e g a t i v e l y c h a r g e d r e s i d u e c l o s e t o t h e S c h i f f b a s e c a n l e a d i n t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e p r o t o n a t e d S t a t e , w h i c h S h o u l d b e c o n c o m i t a n t w i t h a U V b a t h o c h r o m i c S h i f t . A S p r e v i o u s l y m e n t i o n e d i n r h o d o p s i n t h e p o s i t i o n o f t h e c o u n t e r a n i o n a s w e l l a s i t s d i s t a n c e f r o m t h e S c h i f f b a s e n i t r o g e n c a n d i c t a t e t h e s p e c t r o s c o p i c b e h a v i o r O f t h e p r o t e i n . I n o r d e r t o p r o b e t h e i d e a l p o s i t i o n f o r t h e P S B c o u n t e r a n i o n , t h e C R A B P H m u t a t i o n s s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 - 1 w e r e c a r r i e d o u t . T a b l e 2 - 1 . S p e c t r o s c o p i c r e s u l t s o f v a r i o u s C R A B P I I m u t a n t s i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l , i n a n a t t e m p t t o p r o b e t h e i d e a l p o s i t i o n f o r t h e P S B c o u n t e r a n i o n . n d . P r o t e i n R t h F l t } . m , , U V 2 d e r . R e d u c t i v e . ( n M ) ° ( n m ) ( n m ) c A m i n a t i o n d 1 R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 E 2 6 0 : t 1 2 3 8 5 3 9 3 N O 2 R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 E 2 T 5 4 V 2 1 0 : 1 : 8 . 2 3 9 6 3 9 9 N O 3 R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L 2 T 5 4 E 8 0 : I : 3 . 4 3 8 1 3 7 9 N O 4 H 1 3 2 K 2 Y 1 3 4 F 2 L 1 2 1 E 1 6 0 : I : 9 . 8 3 8 1 3 8 1 Y e s . . . 3 7 8 3 7 2 ( 5 ) 5 H 1 3 2 K . Y 1 3 4 F . R ‘ I 1 1 L . L 1 2 1 E 2 0 0 : I : 8 . 3 4 3 8 4 4 9 ( 1 ) Y e s 3 8 2 3 7 0 ( 1 ) 6 R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V 2 . 7 : 1 : 7 . 0 Y e s 4 3 0 4 4 7 ( 1 . 4 ) a . D i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r a l l - t r a n s - r e t i n a l a s d e t e r m i n e d b y f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y b . U V a b s o r b a n c e o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n c . 2 " “ d e r i v a t i v e o f t h e U V s p e c t r u m d . R e d u c t i v e a m i n a t i o n a d d u c t a s d e t e r m i n e d b y M A L D l - T O F S e v e r a l p o s i t i o n s w e r e c o n s i d e r e d f o r t h e p l a c e m e n t o f t h e P S B c o u n t e r a n i o n . F i g u r e 2 - 1 4 d e p i c t s m o d e l s t r u c t u r e s o f t h e C R A B P I I b i n d i n g c a v i t y i n t h e p r e s e n c e O f a l l - t r a n s - r e t i n a l . T h e c h r o m o p h o r e i s p l a c e d w i t h i n t h e c a v i t y e i t h e r b o u n d a s a S c h i f f 8 0 b a s e o r w i t h o u t a n y c o v a l e n t a t t a c h m e n t s . I n b o t h c a s e s , G l u r e s i d u e s w e r e i n t r o d u c e d a t p o s i t i o n s 5 4 , 1 2 1 a n d 1 1 1 . A s c a n b e s e e n , t h e n a t u r e o f t h e r e t i n a l b i n d i n g d i c t a t e s t h e r e l a t i v e p o s i t i o n o f t h e r e t i n a l i n t h e c a v i t y , w h i c h i n t u r n d e t e r m i n e s t h e d i s t a n c e f r o m t h e e n g i n e e r e d G l u r e s i d u e s . I n p a r t i c u l a r , i f o u r m o d e l o f t h e r e t i n a l b o u n d a s a S c h i f f b a s e i s c o r r e c t ( F i g u r e 2 - 1 4 B ) , p o s i t i o n s 1 2 1 ( 2 . 5 9 A a w a y f r o m t h e S B n i t r o g e n ) w o u l d b e t h e i d e a l c h o i c e f o r p l a c i n g a c o u n t e r a n i o n . G l u a t p o s i t i o n s 5 4 a n d 1 1 1 a r e l o c a t e d t o o f a r a w a y f r o m t h e f o r m e d S B ( 5 . 7 1 A a n d 8 . 2 6 A r e s p e c t i v e l y ) . H o w e v e r , i f u p o n S c h i f f b a s e f o r m a t i o n t h e r e t i n a l m o l e c u l e d o e s n o t r o t a t e , a s o u r m o d e l p r e v i o u s l y s u g g e s t e d , G l u i n a l l t h e p o s i t i o n s d i s c u s s e d c a n p o t e n t i a l l y s e r v e a s a c o u n t e r a n i o n ( F i g u r e 2 - 1 4 A ) . A s a r e s u l t , a l l t h r e e p o s i t i o n s m e n t i o n e d w e r e i n i t i a l l y c o n s i d e r e d a s F i g u r e 2 - 1 4 . M o d e l s t r u c t u r e s o f t h e C R A B P I I b i n d i n g s i t e w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d e i t h e r n o n - c o v a l e n t l y ( A ) o r c o v a l e n t l y ( B ) . S e v e r a l p o s i t i o n s a r o u n d t h e c h r o m o p h o r e ( 5 4 , 1 1 1 , 1 2 1 ) h a v e b e e n m u t a t e d i n t o G l u r e s i d u e s . 8 1 p o s s i b l e c a n d i d a t e s . S t a r t i n g w i t h t h e d o u b l e m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F , w h i c h h a d d e m o n s t r a t e d a m o d e r a t e U V r e d s h i f t ( A m , = 3 9 6 n m ) , t r i p l e m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 E ( T a b l e 2 - 1 , e n t r y 1 ) w a s m a d e . T h e e x t r a m u t a t i o n r e s u l t e d i n a s i g n i fi c a n t r e g r e s s i o n O f t h e r e t i n a l a f fi n i t y ( K , = 2 6 0 i 1 2 n M a s c o m p a r e d t o 1 2 0 i 4 . 9 n M f o r t h e d o u b l e m u t a n t c a s e ) . I n 1 a d d i t i o n , a ~ 1 0 n m b l u e s h i f t o f t h e U V t r a c e w a s o b s e r v e d a n d t h e p r o t e i n f a i l e d t o b i n d r e t i n a l a s a S c h i f f b a s e a s e v i d e n t b y t h e M A L D I - T O F a s s a y s . A t t h e s a m e t i m e , n o s i g n i f i c a n t i m p r o v e m e n t w a s o b s e r v e d w i t h t h e t e t r a m u t a n t ( i n c o r p o r a t i n g t h e T 5 4 V m u t a t i o n , T a b l e 2 - 1 , e n t r y 2 ) . T h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : T 5 4 V m u t a n t h a d e x h i b i t e d a U V a b s o r b a n c e p e a k a t 4 1 7 n m . H o w e v e r , t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : T 5 4 V z R 1 1 1 E m u t a n t b l u e s h i f t e d b a c k t o 3 9 6 n m ( K d = 2 1 0 n M ) a n d f a i l e d t o p r o d u c e e v i d e n c e f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . A l t h o u g h e m b e d d e d i n t h e m i d d l e o f a v e r y h y d r o p h o b i c p o c k e t , p o s i t i o n 1 1 1 a p p e a r s t o t o l e r a t e a p o l a r r e s i d u e ( G l u ) , w i t h o u t a n y d e t r i m e n t a l e f f e c t s o n t h e p r o t e i n ’ s t e r t i a r y s t r u c t u r e , a s e v i d e n t f r o m t h e C D S p e c t r u m . T h e r e f o r e , i t s e e m s t h a t t h e u n f a v o r a b l e s p e c t r o s c o p i c r e s u l t s a r e d u e t o t h e n e w m u t a t i o n r a t h e r t h a n a n y o v e r a l l s t r u c t u r a l m o d i f i c a t i o n . . P o s i t i o n 1 1 1 i s f u r t h e r a w a y t h a n a n y o f t h e o t h e r p o s i t i o n s c o n s i d e r e d f o r i n t r o d u c t i o n o f t h e c o u n t e r i o n ( 5 . 5 — 8 . 3 A a w a y f r o m t h e S B n i t r o g e n , d e p e n d i n g o n t h e r e t i n a l c o n f o r m a t i o n ) . T h i s c o u l d e x p l a i n w h y t h e S p e c t r o s c o p i c a s s a y s h a v e n o t i m p r o v e d , a s c o m p a r e d t o t h e d o u b l e m u t a n t . H o w e v e r , i t d o e s n o t e x p l a i n w h y t h e r e t i n a l a f f i n i t y , a s w e l l a s t h e U V r e d S h i f t i n g h a v e d e c l i n e d . A t t h e s a m e t i m e , A r g 1 1 1 i s b e l i e v e d t o b e i n v o l v e d i n a h y d r o g e n b o n d n e t w o r k 2 4 w h i c h c a n a f f e c t t h e p r o t e i n ’ s a b i l i t y f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . I n f a c t , b y c h a n g i n g 8 2 A r g 1 1 1 i n t o a L e u r e s i d u e t h e p r o t e i n r e g a i n e d a b i l i t y f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . I t i s p o s s i b l e t h a t w h e n a G l u i s p l a c e d a t t h i s p o s i t i o n i n s t e a d , w a t e r # 1 b e l i e v e d t o h y d r o g e n b o n d t o t h e r e t i n a l c a r b o n y l i n a n u n f a v o r a b l e o r i e n t a t i o n f o r n u c l e o p h i l i c a t t a c k i s m a i n t a i n e d . T h e l a t t e r e x p l a n a t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t s o b t a i n e d f o r R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : T 5 4 E t e t r a m u t a n t . A s s h o w n b e f o r e , t h e p a r e n t t r i p l e m u t a n t , R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L , p r o v i d e d e n c o u r a g i n g r e s u l t s f o r P S B f o r m a t i o n a c c o r d i n g t o t h e U V a n d M A L D I - T O F a s s a y s . H o w e v e r , t h e i n t r o d u c t i o n o f a c o u n t e r a n i o n a t p o s i t i o n 5 4 d i d n o t t r a n s l a t e i n t o s t a b i l i z a t i o n O f t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . O n t h e c o n t r a r y , t h e U V d a t a r e v e a l a p e a k a t 3 8 1 n m , 8 ~ 1 7 n m b l u e S h i f t a s c o m p a r e d t o t h e o r i g i n a l t r i p l e m u t a n t . I n a d d i t i o n , e v e n t h o u g h t h e a f fi n i t y f o r a l l - t r a n s - r e t i n a l i n c r e a s e d ( K d = 8 0 i 3 . 4 n M ) , t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n f a i l e d t o p r o d u c e e v i d e n c e f o r a c o v a l e n t l y b o u n d S p e c i e s . T h e f a c t t h a t p o s i t i o n 5 4 d o e s n o t h e l p t o s t a b i l i z e t h e P S B f o r m e d w i t h t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L m u t a n t f u r t h e r s u p p o r t s t h e m o d e l s h o w n i n F i g u r e 2 - 1 4 B , w i t h t h e c h r o m o p h o r e r o t a t e d a r o u n d i t s l o n g a x i s , a s a r a t h e r a c c u r a t e r e p r e s e n t a t i o n o f t h e a c t u a l b i n d i n g . I f t r u e , p o s i t i o n 1 2 1 , l o c a t e d o n a h e a d o n t r a j e c t o r y r e l a t i v e t o t h e S c h i f f b a s e f o r m e d , w o u l d b e a n i d e a l l o c a t i o n f o r t h e G l u c o u n t e r a n i o n ( F i g u r e 2 - 1 4 B ) . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e l a t t e r s u g g e s t i o n , m u t a n t s 4 - 8 i n T a b l e 2 - 1 w e r e p r o d u c e d . S t a r t i n g w i t h d o u b l e m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F , a G l u w a s i n t r o d u c e d i n p o s i t i o n 1 2 1 . T h e r e s u l t i n g t r i p l e m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F z L 1 2 1 E m a i n t a i n e d r e s p e c t a b l e a f fi n i t y f o r r e t i n a l ( K d = 1 6 0 t 9 . 8 n M ) . H o w e v e r , i t f a i l e d t o p r o d u c e a r e d s h i f t e d U V S p e c t r u m i n d i c a t i v e o f a P S B . O n t h e o t h e r h a n d , a s O p p o s e d t o t h e p a r e n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F m u t a n t , t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n c o n f i r m e d t h e f o r m a t i o n o f a r e t i n a l S c h i f f b a s e . 8 3 T h e n e w l y i n t r o d u c e d m u t a t i o n ( L 1 2 1 E ) a p p e a r s t o a s s i s t t h e f o r m a t i o n o f a S c h i f f b a s e . T h e m o d e l o f t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F 1 L 1 2 1 E m u t a n t , a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 1 5 , p l a c e s 0 1 0 1 2 1 a t a h e a d o n t r a j e c t o r y w i t h t h e S B n i t r o g e n , ~ 2 . 6 A a w a y . T h i s c o u l d b e t h e i d e a l p l a c e m e n t f o r a P S B c o u n t e r i o n , b u t t h a t i s n o t s u p p o r t e d b y t h e U V - v i s r e s u l t s . H o w e v e r , t h e f a c t t h a t t h i s m u t a t i o n r e s t o r e d t h e p r o t e i n ’ s a b i l i t y t o b i n d r e t i n a l a s a F i g u r e 2 - 1 5 . S t e r e o v i e w o f t h e m i n i m i z e d m o d e l o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F z L 1 2 1 E b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . R e s i d u e s T h r 5 4 a n d A r g I 1 1 a r e a l s o h i g h l i g h t e d . S c h i f f b a s e l e d u s t o c o n s i d e r t h a t t h e g l u t a m a t e m i g h t b e i n v o l v e d i n a n i n t e r a c t i o n w i t h t h e r e t i n a l t h a t e n a b l e s b o n d f o r m a t i o n . A S S h o w n i n F i g u r e 2 - 1 5 , G l u 1 2 1 i s p o s i t i o n e d m i d w a y b e t w e e n L y s l 3 2 a n d A r g 1 1 1 . A h y d r o g e n b o n d i n t e r a c t i o n w i t h t h e c a r b o n y l o x y g e n c a n r o t a t e t h e p l a n e o f t h e c h r o m o p h o r e a n d f a c i l i t a t e t h e n u c l e o p h i l i c a t t a c k b y O p t i m i z i n g t h e B i i r g i - D u n i t z a n g l e . A t t h i s p o i n t , b o t h t h e i n c r e a s e o f t h e h y d r o p h o b i c i t y i n t h e c a v i t y ( i . e . t r i p l e m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L ) a n d t h e i n t r o d u c t i o n o f a c o u n t e r a n i o n ( R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : L 1 2 1 E ) s e e m t o h a v e r e s t o r e d t h e a b i l i t y f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . T h e n e x t l o g i c a l s t e p w o u l d b e t o c o m b i n e t h e l a t t e r t w o i n d i v i d u a l a l t e r a t i o n s , w h i c h l e d t o t h e d e s i g n o f t e t r a m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E ( T a b l e 2 - 1 , e n t r y 5 ) . T h e s p e c t r o s c o p i c r e s u l t s a s s o c i a t e d w i t h t h e l a t t e r t e t r a m u t a n t a r e s u m m a r i z e d i n F i g u r e 2 - 1 6 . T h e m u t a n t ’ s a f fi n i t i e s f o r b o t h r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l h a v e a c t u a l l y 8 4 > y t i s n e t n I e v i t a l e R 1 0 . 0 3 - . 0 . 0 2 0 . 8 \ A V 0 . 0 1 o 6 “ * F H ~ ‘ + ’ 0 . . . . . . o 2 4 6 3 1 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 E q u i v a l e n t s R e t i n o i c A c i d I R e t i n a l n m 1 5 5 0 6 . 2 D 1 5 5 0 3 . 6 1 5 7 7 1 . 2 1 5 7 7 3 . 4 A . “ A . 2 . . I “ i I 1 4 5 0 0 1 5 5 0 0 1 6 5 0 0 1 4 5 0 0 1 5 5 0 0 1 6 5 0 0 M a s s ( D a ) M a s s ( D a ) F i g u r e 2 - 1 6 . A . F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l l < d d e t e r m i n a t i o n w i t h t h e t e t r a m u t a n t C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E . T h e h y d r o p h o b i c t u n i n g a n d p r o p e r p o s i t i o n i n g o f t h e c o u n t e r a n i o n h a s r e s u l t e d i n a i n c r e a s e d r e t i n o i c a c i d d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( K , = 7 7 0 i 6 1 n M ) , w h i l e t h e b i n d i n g f o r r e t i n a l r e m a i n s s t a b l e ( K , = 2 2 4 : l : 1 8 n M ) . B . U V - v i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h t h e C R A B P I I p r o t e i n p o r t r a y s m a x i m a l a b s o r b a n c e s a t 3 7 8 n m a n d 4 3 8 n m , a n 6 1 n m r e d s h i f t a s c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e C R A B P I I ( 3 7 7 n m ) , p o s s i b l y s u g g e s t i n g p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . C . M A L D l - T O F o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d p e n t a m u t a n t s h o w s a n M ’ = 1 5 5 0 6 . 2 D a c o r r e s p o n d i n g t o t h e p r o t e i n m a s s , c a l c u l a t e d t o b e 1 5 4 9 0 . 7 . I n a d d i t i o n t h e r e i s a s m a l l s e c o n d p e a k , M " = 1 5 7 7 3 . 4 D a , w h i c h i s 2 6 6 . 7 m a s s u n i t s h i g h e r t h a n t h e p r o t e i n p e a k , r e p r e s e n t i n g a c o v a l e n t l y l i n k e d r e t i n a l m o l e c u l e ( c a l c u l a t e d m a s s d i f f e r e n c e 2 6 6 ) . D . R e d u c t i v e a m i n a t i o n o f r e t i n a l w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V r e s u l t s f u r t h e r t r a p p i n g o f t h e c o v a l e n t c o m p l e x , M ‘ = 1 5 5 0 3 . 6 D a a n d 1 5 7 7 1 . 2 D a ( e x p e c t e d 2 6 8 D a ) . 8 5 d e c r e a s e d a s c o m p a r e d t o t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F d o u b l e m u t a n t ( t h e c a l c u l a t e d K d v a l u e s a r e 7 7 0 i 6 1 n M a n d 2 2 4 i 1 8 n M , r e s p e c t i v e l y ) . H o w e v e r , t h e U V - v i s a s s a y r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f t w o o v e r l a p p i n g p e a k s w i t h a b s o r p t i o n m a x i m a a t 3 7 8 n m a n d 4 3 8 n m . B y a p p l y i n g t h e s e c o n d d e r i v a t i v e a p p r o x i m a t i o n m e t h o d ( a s d e s c r i b e d i n d e t a i l s i n M e t e r i a l s a n d M e t h o d s ) , w e c a n e s t i m a t e t h e a c t u a l a b s o r b a n c e m a x i m a a n d r e l a t i v e i n t e n s i t i e s o f t h e t w o o v e r l a p p i n g p e a k s . I n t h i s c a s e , t h e s e c o n d d e r i v a t i v e y i e l d e d m i n i m a a t 3 7 2 n m a n d 4 4 9 n m , w i t h a n i n t e n s i t y r a t i o o f a r o u n d 5 : 1 , r e s p e c t i v e l y . T h e a m o u n t o f r e d s h i f t o b s e r v e d u p o n i n c u b a t i o n w i t h r e t i n a l ( A m a x = 4 4 9 n m ) i s n o t a s d r a s t i c w h e n c o m p a r e d t o r h o d o p s i n ( f o r b o v i n e r h o d o p s i n , A m a x = 5 0 0 n m ) . H o w e v e r , t h i s m a r k s t h e fi r s t c a s e a m o n g t h e e n g i n e e r e d C R A B P I I m u t a n t s w h e r e t h e U V - v i s a s s a y r e v e a l s a b s o r b a n c e s c o n s i s t e n t w i t h t h e r e p o r t e d v a l u e s f o r r e t i n a l p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e s 1 . 3 0 " 3 2 I n a d d i t i o n , t h e M A L D I — T O F e x p e r i m e n t s v e r i fi e d t h e p r e s e n c e o f o f r e t i n a c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l , u n d e r b o t h i n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n c o n d i t i o n s ( F i g u r e 2 - 1 6 , C a n d D ) . A t t e m p t s t o c r y s t a l l i z e t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t i n t h e p r e s e n c e o f r e t i n a l h a v e n o t y e t b e e n s u c c e s s f u l . H o w e v e r , t h e m i n i m i z e d m o d e l o f t h e n e w l y f o r m e d t e t r a m u t a n t , a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 1 7 , p l a c e s G l u 1 2 1 ~ 2 . 6 A a w a y f r o m t h e S B n i t r o g e n , F i g u r e 2 - 1 7 . M o d e l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . T h e d i s t a n c e b e t w e e n G l u 1 2 1 a n d t h e S B n i t r o g e n i s 2 . 6 A . 8 6 a n a l m o s t i d e a l p o s i t i o n f o r a c o u n t e r a n i o n . T h i s p o s i t i o n i n g c a n e x p l a i n t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e P S B , a s o b s e r v e d i n t h e U V - v i s s p e c t r u m . H o w e v e r , t h e m o d e l c a n n o t p r o v i d e a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n o n w h y t h e R 1 1 1 L m u t a t i o n i s s o c r i t i c a l f o r t h e P S B f o r m a t i o n . T h e L e u l l l r e s i d u e i s p l a c e d f a r a w a y o f t h e f o r m e d S B , p o s s i b l y l e n d i n g s o m e c r e d e n c e t o t h e p r e v i o u s s u g g e s t i o n t h a t t h e R 1 1 1 L i s e s s e n t i a l f o r t h e r e d i s t r i b u t i o n o f w a t e r m o l e c u l e s i n t h e C R A B P I I c a v i t y . T h i s c o u l d r e s u l t i n r e p o s i t i o n i n g o f r e t i n a l s u c h t h a t i t a c h i e v e s a n o p t i m a l c o n f o r m a t i o n t o u n d e r g o n u c l e o p h i l i c a t t a c k . A l t h o u g h t h e s p e c t r o s c o p i c r e s u l t s o b t a i n e d w i t h R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t a r e e n c o u r a g i n g , t h e f a c t t h a t t h e U V - v i s s p e c t r u m i s a m i x t u r e o f t w o p e a k s p o i n t s t o e i t h e r a n e q u i l i b r i u m b e t w e e n t h e p r o t o n a t e d a n d n o n - p r o t o n a t e d f o r m o f t h e S B o r t h e p r e s e n c e o f u n b o u n d r e t i n a ] a n d a p o - p r o t e i n . A s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d , s i n c e w e d o n o t h a v e a d e f i n i t e w a y t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e U V - v i s t r a c e s o f n o n - p r o t o n a t e d S B a n d f r e e r e t i n a l , w e c a n n o t e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t w h a t w e o b s e r v e d i s a m i x t u r e o f u n r e a c t e d r e t i n a l a n d P S B . K e e p i n m i n d t h a t t h e r e p o r t e d U V - v i s d a t a a r e r e c o r d e d i n t h e p r e s e n c e o f o n l y 0 . 1 e q u i v a l e n t o f r e t i n a l . T h i s f a c t v i r t u a l l y r u l e s o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t d u e t o m i s c a l c u l a t i o n o f t h e p r o t e i n - r e t i n a l e q u i v a l e n t s a s e x c e s s o f r e t i n a l h a s b e e n a d d e d t o t h e p r o t e i n s o l u t i o n . I f t h e 3 7 8 n m p e a k w e o b s e r v e i s t h e a b s o r b a n c e o f n o n - c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l , t h i s c a n b e a t t r i b u t e d t o t h e r e d u c e d a b i l i t y o f L y s l 3 2 f o r n u c l e o p h i l i c a t t a c k ( i f t h e L y s p K a i s ~ 7 , t h e s i d e c h a i n a m i n e s h o u l d b e p a r t i a l l y p r o t o n a t e d a t p h y s i o l o g i c a l p H ) . I n a n a t t e m p t t o f u r t h e r i m p r o v e t h e s y s t e m , a n e x t r a h y d r o p h o b i c m u t a t i o n , T 5 4 V , t h a t p r e v i o u s l y r e s u l t e d i n e n h a n c e d r e t i n a l a f f i n i t y a n d b a t h o c h r o m i c s h i f t w a s 8 7 A B 1 - < g . 0 . 0 4 1 c 0 . 8 a . g 0 . 0 3 2 . 5 0 . 4 + 0 . 0 1 i a ? 0 . 2 . . . a 0 . . . . . 0 1 2 3 4 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 E q u i v a l e n t s o f R e t i n o i c A c i d I R e t i n a l n m C D 1 7 0 1 6 . 2 1 6 7 4 6 . 3 1 6 7 4 9 . 5 1 7 0 1 8 . 4 J 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 M a s s ( D a ) M a s s ( D a ) F i g u r e 2 - 1 8 . A . fl u o r e s c e n c e t i t r a t i o n c u r v e s f o r t h e r e t i n o i c a c i d a n d r e t i n a l K g d e t e r m i n a t i o n w i t h t h e p e n t a m u t a n t C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V . T h e h y d r o p h o b i c t u n i n g a n d p r o p e r p o s i t i o n i n g o f t h e c o u n t e r a n i o n h a s r e s u l t e d i n a r e t i n o i c a c i d d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f K , = 2 4 9 t 1 9 . 2 n M , a n d a s t o i c h i o m e t r i c r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y , K , = 2 . 7 1 7 . 0 n M . B . U V - v i s o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h t h e C R A B P I I p r o t e i n p o r t r a y s m a x i m a l a b s o r b a n c e s a t 3 8 2 n m a n d 4 3 0 n m , a n 5 3 n m r e d s h i f t a s c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e C R A B P I I ( 3 7 7 n m ) , p o s s i b l y s u g g e s t i n g p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . C . M A L D l - T O F o f t h e r e t i n a l i n c u b a t e d p e n t a m u t a n t s h o w s a n M ’ = 1 6 7 4 6 . 3 D a c o r r e s p o n d i n g t o t h e p r o t e i n m a s s , c a l c u l a t e d t o b e 1 6 7 5 6 . 2 D a . I n a d d i t i o n t h e r e i s s m a l l a m o u n t s o f a s e c o n d p e a k , M + = 1 7 0 1 8 . 4 D a , w h i c h i s 2 7 2 . 1 m a s s u n i t s h i g h e r t h a n t h e p r o t e i n p e a k , r e p r e s e n t i n g a c o v a l e n t l y l i n k e d r e t i n a l m o l e c u l e ( c a l c u l a t e d m a s s d i f f e r e n c e 2 6 6 ) . D . R e d u c t i v e a m i n a t i o n o f r e t i n a l w i t h C R A B P I I R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : 2 L 1 2 1 E 2 2 T 5 4 V r e s u l t s f u r t h e r t r a p p i n g o f t h e c o v a l e n t c o m p l e x , M " = 1 6 7 4 9 . 5 D a a n d 1 7 0 1 6 . 2 D a ( e x p e c t e d 2 6 8 B a ) . 8 8 i n t r o d u c e d . T h e r e s u l t i n g p e n t a m u t a n t , R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L 2 L 1 2 1 E : T 5 4 V ( T a b l e 2 - 1 , e n t r y 6 ) , r e v e a l e d s t o i c h i o m e t r i c b i n d i n g w i t h r e t i n a l ( K d = 2 . 7 t 7 n M , F i g u r e 2 - 1 8 A ) , w h i l e m a i n t a i n i n g a U V a b s o r b a n c e o f 4 3 0 n m . T h e r e d s h i f t e d p e a k i n t h i s c a s e i s t h e m a j o r c o m p o n e n t ( 1 . 4 : 1 r a t i o a s e s t i m a t e d b y t h e s e c o n d d e r i v a t i v e ) . I n a d d i t i o n , t h e c o v a l e n t b i n d i n g o f r e t i n a l t o t h i s m u t a n t w a s c o n f i r m e d b y b o t h i n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n s t u d i e s , a s o b s e r v e d i n t h e M A L D I - T O F s p e c t r a ( F i g u r e 2 - 1 8 C a n d D ) . A s c a n b e s e e n , t h e a d d u c t d e t e c t e d i n t h e i n c u b a t i o n r e a c t i o n i s m u c h s m a l l e r t h a n t h a t o b s e r v e d f o r t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t . H o w e v e r , a s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d , o n e c a n n o t d e p e n d o n t h e r e l a t i v e h e i g h t s o f t h e M A L D I - p e a k s t o e v a l u a t e t h e e f f i c a c y o f a r e a c t i o n ( f o r d e t a i l s s e e M a t e r i a l a n d M e t h o d s ) . T h e a d d i t i o n a l T 5 4 V m u t a t i o n r e s u l t e d i n a n i m p r o v e d r e t i n a l b i n d i n g , h o w e v e r i t d i d n o t i m p r o v e t h e r e d s h i f t o f t h e U V - v i s a b s o r b a n c e u p o n f o r m a t i o n o f a P S B . I t d i d , h o w e v e r , i n c r e a s e t h e a m o u n t o f P S B p r e s e n t a s s h o w n i n t h e U V - v i s t r a c e . I n i t i a l l y t h i s r e s u l t w a s u n e x p e c t e d O n e w o u l d a r g u e t h a t i n t r o d u c i n g e x t r a h y d r o p h o b i c i t y i n t h e v i c i n i t y o f t h e i m i n e s h o u l d p r o h i b i t t h e f o r m a t i o n o f a p r o t o n a t e d s p e c i e s . H o w e v e r , s i n c e t h e T 5 4 V m u t a t i o n c a n l e a d t o a r e a r r a n g e m e n t o f t h e w a t e r n e t w o r k w i t h i n t h e C R A B P I I c a v i t y , p o s s i b l e p o s i t i o n i n g o f w a t e r m o l e c u l e s c l o s e t o t h e i m i n e m o i e t y c o u l d c o m p e n s a t e f o r t h e a d d i t i o n a l h y d r o p h o b i c i t y . D e s p i t e n u m e r o u s a t t e m p t s p e r f o r m e d b y o u r c o l l a b o r a t o r s t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L l 2 1 E z ' I ‘ 5 4 V p e n t a m u t a n t b o u n d t o r e t i n a l h a s n o t b e e n o b t a i n e d . H o w e v e r , t h e s t r u c t u r e o f t h e p e n t a m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s — r e t i n o i c a c i d w a s s o l v e d , a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 1 9 . 8 9 F i g u r e 2 - 1 9 . A . C r y s t a l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d . T h e b l u e s t a r s r e p r e s e n t t h e o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e s w i t h i n t h e c a v i t y . B . O v e r l a y o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f W T - C R A B P I I ( y e l l o w c a r b o n a t o m s ) a n d C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V ( g r e e n c a r b o n a t o m s ) b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d . T h e y e l l o w a n d g r e e n s t a r s r e p r e s e n t o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e s w i t h i n t h e r e s p e c t i v e c a v i t i e s . C . O v e r l a y o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V w i t h a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d ( b l u e c a r b o n a t o m s ) a n d t h e m i n i m i z e d m o d e l o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V b o u n d t o a l l - t r a n s r e t i n a l a s a S c h i f f b a s e ( g r e e n c a r b o n a t o m s ) . 9 0 A l l o f t h e r e s i d u e s l i s t e d i n t h e l i t e r a t u r e a s i m p o r t a n t f o r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g h a v e b e e n r e m o v e d ( A r g 1 3 2 , T y r 1 3 4 , A r g 1 1 1 ) . 2 ’ 2 4 ’ 3 6 ’ 3 7 H o w e v e r , a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 1 9 A , a n a l t e r n a t e r e t i n o i c a c i d b i n d i n g m o t i f i s f o u n d . T h e c a r b o x y l i c a c i d o f t h e l i g a n d i s d i r e c t l y i n t e r a c t i n g w i t h t h e e n g i n e e r e d G l u 1 2 1 , w i t h t h e t w o c a r b o x y l i c a c i d f u n c t i o n a l i t i e s i n v o l v e d i n a p a i r o f s t r o n g h y d r o g e n b o n d s ( t h e d i s t a n c e s b e t w e e n t h e o x y g e n a t o m s o f t h e t w o c a r b o x y l i c a c i d s a r e 2 . 5 8 A a n d 2 . 5 9 A ) . T h e e n g i n e e r e d L y s l 3 2 i s a l s o i n c l o s e p r o x i m i t y , 2 . 6 0 A a w a y f r o m t h e c l o s e s t r e t i n o i c a c i d o x y g e n , w h i l e a w a t e r m o l e c u l e i s l o c a t e d 2 . 2 3 A a w a y f r o m t h e G l u 1 2 1 c a r b o x y l a t e o x y g e n . T h i s h e a d t o h e a d i n t e r a c t i o n b e t w e e n t w o c a r b o x y l i c g r o u p s c a n o n l y b e p o s s i b l e i f t h e y a r e p r o t o n a t e d . C o n s i d e r i n g t h a t t h e a v e r a g e p K a v a l u e f o r a c a r b o x y l a t e i n s o l u t i o n i s ~ 4 t h e h y d r o p h o b i c n a t u r e o f t h e C R A B P I I p e n t a m u t a n t c a v i t y s e e m s t o h a v e r a i s e d t h e p K a v a l u e o f t h e c a r b o x y l a t e s . P r e v i o u s r e p o r t s o n s i m i l a r c a s e s h a v e s h o w n t h a t w i t h i n a h y d r o p h o b i c c a v i t y t h e p K a o f a G l u r e s i d u e c a n b e i n c r e a s e d a s m u c h a s 5 u n i t s . 5 I n t h i s c a s e , i t i s p o s s i b l e t h a t L y s l 3 2 a n d t h e a f o r e m e n t i o n e d w a t e r m o l e c u l e c o n t r i b u t e t o t h e p r o t o n a t i o n o f t h e c a r b o x y l a t e s . F i g u r e 2 - 2 0 . S t e r e o v i e w o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f a p o R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V . O r d e r e d w a t e r m o l e c u l e s i n t h e c a v i t y a r e r e p r e s e n t e d b y t h e b l u e c r o s s e s . 9 1 F i g u r e 2 - 2 0 d e p i c t s t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e a p o f o r m o f t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V m u t a n t . A s c a n b e e n s e e n , t h e r e i s a c l u s t e r o f w a t e r m o l e c u l e s c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h G l u 1 2 1 a n d L y s l 3 2 ( a v e r a g e d i s t a n c e i s 2 . 5 t o 3 . 0 A ) . T h e s e i n t e r a c t i o n s c a n m a i n t a i n t h e G l u 1 2 1 r e s i d u e p r o t o n a t e d , e v e n i n t h e a b s e n c e o f b o u n d l i g a n d . T h e p o s i t i o n o f t h e b o u n d r e t i n o i c a c i d i n t h e p e n t a m u t a n t c a v i t y i s v e r y s i m i l a r t o t h a t i n t h e w i l d t y p e c a s e ( F i g u r e 2 - 1 9 B ) . T h e c a r b o x y l i c a c i d e n d s o f t h e c h r o m o p h o r e a r e a l m o s t s u p e r i m p o s a b l e , w h i l e t h e B - i o n o n e p a r t i s s l i g h t l y s h i f t e d . S p e c i a l a t t e n t i o n s h o u l d b e p a i d t o t h e o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e s p r e s e n t i n t h e p e n t a m u t a n t C R A B P I I c a v i t y . A s c a n b e s e e n i n F i g u r e 2 - 1 9 B , r e m o v a l o f t h e t w o r e l a t i v e l y p o l a r r e s i d u e s f r o m t h e C R A B P I I b i n d i n g p o c k e t ( m u t a t i o n s T 5 4 V a n d R 1 1 1 L ) r e s u l t e d i n t h e e x p e c t e d w a t e r r e m o v a l . I n p a r t i c u l a r , w a t e r # 1 t h a t w a s p r e s e n t i n t h e W T s t r u c t u r e a s a b r i d g e b e t w e e n t h e a f o r e m e n t i o n e d r e s i d u e s a n d t h e b o u n d r e t i n o i c a c i d i s n o l o n g e r t h e r e . U p t o n o w t h e r e t i n a l b o u n d c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V h a s n o t b e e n o b t a i n e d . H o w e v e r , t h e m i n i m i z e d m o d e l , s h o w n i n F i g u r e 2 - 1 9 C o v e r l a y e d w i t h t h e r e t i n o i c a c i d s t r u c t u r e , s u g g e s t s t h a t G l u 1 2 1 c a n h e l p i n o r i e n t i n g t h e r e t i n a l c a r b o n y l , i n o r d e r t o f a c i l i t a t e f o r t h e n u c l e o p h i l i c a t t a c k b y L y s . A d d i t i o n a l a t t e m p t s t o c r y s t a l l i z e t h i s m u t a n t i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l a r e u n d e r w a y 9 2 2 . 6 I m p o r t a n c e o f t h e c o u n t e r a n i o n A s p r e v i o u s l y s e e n , p o s i t i o n i n g a G l u r e s i d u e a s t h e c o u n t e r a n i o n o f t h e P S B a t p o s i t i o n 1 2 1 , a l o n g w i t h t h e R 1 1 1 L , T 5 4 V h y d r o p h o b i c m u t a t i o n s a f f o r d e d t h e p e n t a m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V , t h e b e s t P S B f o r m i n g C R A B P I I m u t a n t d e s i g n e d u p t o t h i s p o i n t . H o w e v e r , a s d i s c u s s e d i n C h a p t e r 1 , t h e e x a c t p o s i t i o n i n g o f a c o u n t e r i o n c a n b e p r o v e d c r i t i c a l f o r m a i n t a i n i n g t h e p r o t o n a t e d s t a t e o f t h e S c h i f f b a s e . B o t h t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s a n d t h e m i n i m i z e d m o d e l s s u g g e s t t h a t p o s i t i o n 1 2 1 i s i d e a l f o r t h e p l a c e m e n t o f a P S B c o u n t e r a n i o n i n o r d e r t o a c h i e v e a h e a d o n t r a j e c t o r y t o w a r d s t h e i m i n e n i t r o g e n . T h i s a p p r o a c h w a s e x p e r i m e n t a l l y v e r i fi e d s i n c e b o t h R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E a n d R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V m u t a n t s s u c c e e d e d i n f o r m i n g P S B w i t h r e t i n a l . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e w h e t h e r t h e e f f e c t o f t h e d i s t a n c e , r a t h e r t h a n t h e p o s i t i o n o f t h e c o u n t e r a n i o n f r o m t h e P S B i s a f a c t o r , a n A s p r e s i d u e i n s t e a d o f a G l u w a s i n t r o d u c e d a t p o s i t i o n 1 2 1 . A s p a r t i c a c i d r e s i d u e s a r e o n e c a r b o n s h o r t e r t h a n t h e i r g l u t a m i c a c i d a n a l o g s a n d , t h e r e f o r e , t h e c o u n t e r i o n i s e x p e c t e d t o b e f u r t h e r a w a y f r o m t h e i m i n e . A s e x p e c t e d , t h e m i n i m i z e d m o d e l s h o w n i n F i g u r e 2 - F i g u r e 2 - 2 1 . M o d e l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 D m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . T h e d i s t a n c e b e t w e e n t h e A s p 1 2 1 a n d t h e S B n i t r o g e n i s 3 . 5 A . 9 3 2 1 , p l a c e s t h e c o u n t e r i o n ~ 3 . 5 A a w a y f r o m t h e S B n i t r o g e n ( r e c a l l t h a t f o r G l u 1 2 1 t h e c o r r e s p o n d i n g d i s t a n c e w a s ~ 2 . 5 A ) . M u t a n t s R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 K 1 L 1 2 1 D a n d R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 D : T 5 4 V w e r e m a d e a n d t h e i r r e t i n a l b i n d i n g a f f i n i t i e s w e r e e v a l u a t e d . B o t h p r o t e i n s t e s t e d p o s i t i v e f o r S B f o r m a t i o n u n d e r b o t h i n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n c o n d i t i o n s . I n a d d i t i o n , i n t h e c a s e o f t e t r a m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 D t h e K d v a l u e e s t i m a t e d v i a fl u o r e s c e n c e q u e n c h i n g r e v e a l e d a s t o i c h i o m e t r i c b i n d i n g ( K , = 2 . 6 _ + _ 7 . 9 n M a s o p p o s e d t o 2 2 4 n M f o r t h e L 1 2 1 E m u t a t i o n ) . T h i s b e h a v i o r w a s n o t c o n s i s t e n t w i t h t h e p e n t a m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R l l 1 L : L 1 2 1 D : T 5 4 V , s i n c e i t s a f f i n i t y f o r r e t i n a l s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d a s c o m p a r e d t o i t s L 1 2 1 E a n a l o g u e ( K d v a l u e s o f 3 0 i 5 . 5 n M v e r s u s 2 . 7 i 7 . 0 n M , r e s p e c t i v e l y ) . A t t h e s a m e t i m e , t h e U V t r a c e s r e v e a l t h e p r e s e n c e o f a s m a l l a m o u n t o f P S B , a s d e t e r m i n e d b y t h e 2 n d d e r i v a t i v e m e t h o d ( T a b l e 2 - 1 , e n t r i e s 5 a n d 7 ) . A l o n g t h e s a m e l i n e s , t h e n e x t l o g i c a l s t e p w a s t h e r e m o v a l o f t h e c o u n t e r a n i o n b y p l a c i n g a s t r u c t u r a l l y c o n s e r v a t i v e n e u t r a l r e s i d u e i n t h e p l a c e o f t h e c a r b o x y l a t e . I n o r d e r t o a c h i e v e t h a t , G l u 1 2 1 w a s r e p l a c e d b y G l n , a n a m i d e a n a l o g u e , w h i l e A s p w a s r e p l a c e d b y A s n i n a s i m i l a r m a n n e r . S i m i l a r e x p e r i m e n t s h a v e b e e n r e p o r t e d f o r t h e 3 8 ' 3 9 T h i s s t r u c t u r a l l y c o n s e r v a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f t h e c o u n t e r a n i o n o f r h o d o p s i n . m u t a t i o n m i n i m i z e s t h e p o s s i b i l i t i e s f o r f u r t h e r r e a r r a n g e m e n t s w i t h i n t h e C R A B P I I c a v i t y , n o t a s s o c i a t e d w i t h t h e r e m o v a l o f t h e n e g a t i v e c h a r g e . T h e r e s u l t s o b t a i n e d f o r t h e f o u r n e w l y f o r m e d m u t a n t s ( R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R l l l L : L 1 2 1 Q , R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 Q : T 5 4 V , R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 N , R 1 3 2 K : 9 4 T a b l e 2 - 2 . C o m p a r i s o n o f t h e r e t i n a l b i n d i n g s p e c t r o s c o p i c a s s a y s o f v a r i o u s C R A B P I I m u t a n t s i n t h e p r e s e n c e o r n o t o f a n e g a t i v e l y c h a r g e d r e s i d u e a t p o s i t i o n 1 2 1 . U V . . a R t A m n d . R e d u c t i v e E n t r y P r o t e i n R t K d ( n M ) ( n m ) 5 2 ( n c r l r ‘ q r é v . A m i n a t i o n a . . . 3 7 8 3 7 2 ( 5 ) 1 R 1 3 2 K . Y 1 3 4 F . R 1 1 1 L . L 1 2 1 E 2 0 0 1 8 . 3 4 3 8 4 4 9 ( 1 ) Y e s 2 R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 O 5 3 0 a ; 4 4 3 8 6 3 9 0 Y e s . . . . 3 8 2 3 7 0 ( 1 ) 3 R 1 3 2 K . Y 1 3 4 F . R 1 1 1 L . L 1 2 1 E . T 5 4 V 2 . 7 x 7 . 0 4 3 0 4 4 7 ( 1 - 4 ) Y e s 4 R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 Q z T 5 4 V 6 0 0 : t 6 6 3 7 7 3 8 6 Y e s . . . 3 7 5 3 7 1 ( 9 ) 5 R 1 3 2 K . Y 1 3 4 F . R 1 1 1 L . L 1 2 1 D 2 . 6 1 7 . 9 4 4 0 4 5 0 ( 1 ) Y e s 6 R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 N 1 2 7 0 : 1 : 4 9 3 8 5 3 8 7 Y e s 7 R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 D : T 5 4 V 3 0 a : 5 . 5 3 7 9 Z 7 3 5 3 ) Y e s 8 R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 N z T 5 4 V 1 8 0 : l : 1 4 4 0 4 4 0 0 Y e s a . D i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r a l l - t r a n s - r e t i n a l a s d e t e r m i n e d b y f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y b . U V a b s o r b a n c e o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n c . 2 " d d e r i v a t i v e o f t h e U V s p e c t r u m d . R e d u c t i v e a m i n a t i o n a d d u c t a s d e t e r m i n e d b y M A L D I - T O F Y 1 3 4 F : R 1 l 1 L : L 1 2 1 N 2 T 5 4 V ) w i t h a n a m i d e r e p l a c i n g t h e c a r b o x y l a t e c o u n t e r a n i o n a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 — 2 . A l l p r o t e i n s m a i n t a i n t h e i r a b i l i t y t o b i n d r e t i n a l a s a S c h i f f b a s e , a s v e r i f i e d b y t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n e x p e r i m e n t s . H o w e v e r , a s c a n b e s e e n , t h e b a t h o c h r o m i c U V a b s o r b a n c e a s s o c i a t e d w i t h t h e p r e s e n c e o f a P S B h a s d i s a p p e a r e d i n t h r e e o u t o f f o u r c a s e s , w i t h t h e r e t i n a l A m , “ o b s e r v e d a t 3 7 7 - 3 8 6 n m , d e p e n d i n g o n t h e p r o t e i n i n v o l v e d . I n f a c t , e v e n w h e n t h e 2 n d d e r i v a t i v e m e t h o d i s u s e d , n o t a t r a c e o f a P S B a b s o r b a n c e m a x i m u m i s d e t e c t e d . T h e s e s p e c t r a a r e b l u e s h i f t e d a s c o m p a r e d t o s o m e o f t h e p r e v i o u s l y m e n t i o n e d p r o t e i n s ( R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L a n d R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L z T 5 4 V ) a l l o f w h i c h a b s o r b e d a t ~ 4 0 0 n m . O n t h e o t h e r h a n d , t h e 9 5 f o u r t h p r o t e i n , p e n t a m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 N : T 5 4 V r e t a i n s a U V a b s o r b a n c e ( 2 m m = 4 0 4 n m ) v e r y c l o s e t o t h a t o f t h e c o r r e s p o n d i n g p r o t e i n w i t h a L e u r e s i d u e a t p o s i t i o n 1 2 1 ( R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L z T 5 4 V , A m , “ = 3 9 5 n m ) . T h e f a c t t h a t i n m o s t c a s e s m a i n t a i n i n g L e u 1 2 1 , e v e n i n t h e a b s e n c e o f a c o u n t e r a n i o n , r e s u l t s i n m o r e b a t h o c h r o m i c s h i f t e d U V s p e c t r a i s c o n s i s t e n t w i t h w h a t w a s p r e v i o u s l y o b s e r v e d . R e p l a c i n g L e u 1 2 1 w i t h a c o u n t e r a n i o n ( A s p o r G l u ) h e l p s t o s t a b i l i z e t h e P S B . H o w e v e r , i n t r o d u c t i o n o f a m o r e p o l a r r e s i d u e a t t h e s a m e p o s i t i o n t h a t c a n n o t d i r e c t l y s t a b i l i z e t h e p r o t o n a t e d i m i n e ( A s n o r G l n ) , i n m o s t c a s e s r e s u l t s i n t h e l o s s o f p r o t o n a t i o n o f t h e S E . T h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d a b o v e u n a m b i g u o u s l y p r o v e t h a t t h e p r e s e n c e o f a c o u n t e r a n i o n i s e s s e n t i a l f o r m a i n t a i n i n g a s t a b l e r e t i n a l p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e w i t h t h e e n g i n e e r e d C R A B P I I m u t a n t s . 2 . 7 D e t e r m i n i n g t h e p K a o f t h e P S B A s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d , t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V p e n t a m u t a n t r e s u l t e d i n a 5 5 n m b a t h o c h r o m i c s h i f t o f t h e c h r o m p h o r e . T h i s s h i f t w a s a t t r i b u t e d t o t h e f o r m a t i o n o f a P S B , w h i c h a t p h y s i o l o g i c a l p H p a r t i c i p a t e d i n a n e q u i l i b r i u m w i t h i t s u n p r o t o n a t e d f o r m . A l t h o u g h o t h e r m u t a n t s d i d i n d u c e a s i m i l a r s h i f t a s w e l l , t h e a m o u n t o f P S B f o r m e d u s i n g t h e l a t t e r p e n t a m u t a n t w a s t h e l a r g e s t , p r o b a b l y , a s d i s c u s s e d b e f o r e , d u e t o t h e c o r r e c t p l a c e m e n t o f t h e s t a b i l i z i n g c o u n t e r a n i o n . I n o r d e r t o f u r t h e r p r o v e t h e n a t u r e o f t h e r e t i n a l b i n d i n g t o t h e p e n t a m u t a n t C R A B P I I , a t t e m p t s t o m e a s u r e t h e a p p a r e n t p K a o f t h e P S B w e r e c a r r i e d o u t . A s w i l l b e d i s c u s s e d i n g r e a t d e t a i l i n C h a p t e r 4 , t h e i d e a l m e t h o d t o m e a s u r e t h e p K a o f t h e P S B i s 9 6 b y u s i n g N M R s p e c t r o s c o p y . H o w e v e r , t h i s r e q u i r e s t h e u s e o f s p e c i f i c a l l y l a b e l e d r e a g e n t s a n d / o r p r o t e i n . A l t e r n a t i v e l y , a n e s t i m a t e o f t h e p K a v a l u e f o r t h e P S B c o u l d b e a s c e r t a i n e d b y u s i n g U V - v i s . S i n c e t h e P S B i s t h e o n l y f o r m o f t h e p r o t e i n - r e t i n a l c o m p l e x t h a t c a n b e u n a m b i g u o u s l y i d e n t i f i e d , a l t e r i n g t h e p H o f t h e s o l u t i o n s h o u l d r e s u l t i n e i t h e r e n h a n c e m e n t o r d e p l e t i o n o f t h e c h a r a c t e r i s t i c p e a k . T h a t i s , i f t h e b a t h o c h r o m i c s h i f t o b s e r v e d r e f l e c t s a n e q u i l i b r i u m b e t w e e n t h e p r o t o n a t e d a n d u n p r o t o n a t e d f o r m s o f t h e i m i n e , a d d i t i o n o f a c i d ( l o w e r i n g o f t h e p H ) s h o u l d s h i f t t h e h i g h e r e n e r g y a b s o r p t i o n t o t h e r e d . O n t h e o t h e r h a n d , u n d e r b a s i c c o n d i t i o n s t h e c h a r a c t e r i s t i c r e d s h i f t e d p e a k s h o u l d d i s a p p e a r , s i n c e t h e e q u i l i b r i u m w o u l d f a v o r t h e n o n - p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . A s s u m i n g t h a t t h e p H i s s u i t a b l y c o n t r o l l e d , s o t h a t t h e p r o t e i n ’ s t e r t i a r y s t r u c t u r e i s m a i n t a i n e d t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t , w e s h o u l d b e a b l e t o t i t r a t e t h e t w o a b s o r p t i o n s b a c k a n d f o r t h a n d o b s e r v e t h e c o n v e r s i o n b e t w e e n t h e t w o s p e c i e s r e p e a t e d l y . A d d i t i o n o f a c i d ( i n t h e f o r m o f c o n c e n t r a t e d H C l , f i n a l p H = 4 ) t o t h e p e n t a m u t a n t - r e t i n a l c o m p l e x d i d n o t r e s u l t i n o n e s i n g l e r e d s h i f t e d p e a k . I n f a c t , n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e w a s o b s e r v e d i n t h e s p e c t r u m , w h i l e f u r t h e r a d d i t i o n o f a c i d r e s u l t e d i n t h e d e n a t u r a t i o n o f t h e p r o t e i n . O n t h e o t h e r h a n d , t r e a t m e n t o f t h e C R A B P I I - r e t i n a l c o m p l e x w i t h b a s e r e s u l t e d i n t h e e x p e c t e d l o s s o f t h e r e d s h i f t e d p e a k ; u p o n a d d i t i o n o f N a O H t o a fi n a l p H o f 1 0 , o n l y o n e p e a k w a s p r e s e n t i n t h e U V s p e c t r u m w i t h a A m , ~ 3 6 6 n m . T h i s v a l u e i s v e r y c l o s e t o t h a t o f a n u n p r o t o n a t e d i m i n e i n s o l u t i o n , a s p r e v i o u s l y r e p o r t e d . ” 3 2 S u b s e q u e n t a d d i t i o n o f a c i d ( p H = 4 ) r e s u l t e d i n a s i n g l e p e a k a t 4 5 0 n m , i n d i c a t i n g f o r m a t i o n o f a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . A n a l o g o u s a c i d — 9 7 0 . 1 5 _ 1 . p H = 7 0 . 1 2 _ 2 . p H = 1 0 0 . 0 9 3 . p H = 8 0 . 0 6 — - 4 . p H = 4 0 . 0 3 — — 5 . R e t u r n t o p H = 1 0 k — 6 . R e t u r n t o p H = 4 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 1 0 0 5 5 0 n m F i g u r e 2 - 2 2 . A c i d - b a s e t i t r a t i o n ( u s i n g H C I / N a O H ) o f t h e R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V / r e t i n a l c o m p l e x s h o w s i n t e r c o n v e r s i o n b e t w e e n t h e S B ( 3 6 6 n m ) a n d t h e P S B ( 4 5 0 n m ) . b a s e t i t r a t i o n s o f t h i s s a m p l e c a n i n t e r c o n v e r t t h e 3 6 6 n m a n d 4 5 0 n m p e a k s r e p e a t e d l y a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 2 2 . T h e l a t t e r t i t r a t i o n c o n fi r m s t h e e q u i l i b r i u m b e t w e e n t h e p r o t o n a t e d a n d u n p r o t o n a t e d f o r m s o f t h e S c h i f f b a s e . H o w e v e r , t h e f a c t t h a t t h i s e q u i l i b r i u m w a s e s t a b l i s h e d a f t e r i n i t i a l t r e a t m e n t w i t h b a s e p r o m p t e d u s t o c o n s i d e r t h e o r i g i n f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e i m i n e . I n p a r t i c u l a r , t r e a t m e n t w i t h b a s e c a n p o t e n t i a l l y l e a d t o t h e d e p r o t o n a t i o n o f t h e s o l v e n t e x p o s e d L y s r e s i d u e s ( p K a = 1 0 . 7 ) , r e s u l t i n g i n f o r m a t i o n o f n o n - s p e c i fi c S B . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e l a t t e r , t h e s a m p l e p o s t t i t r a t i o n w a s a n a l y z e d b y r e d u c t i v e a m i n a t i o n , a n d t h e M A L D I - T O F w a s r e c o r d e d . T h e r e s u l t e d s p e c t r u m r e v e a l e d t h e p r e s e n c e o f o n l y o n e c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l m o l e c u l e ( r e c a l l t h a t C R A B P I I h a s 1 3 L y s r e s i d u e s , e x c l u d i n g t h e e n g i n e e r e d L y s l 3 2 ) . T h e r e f o r e , w e a r e f a i r l y c o n fi d e n t t h a t F i g u r e 2 - 2 2 d o e s i n d e e d r e p r e s e n t t h e p H e q u i l i b r i u m o f t h e S B o f r e t i n a l b o u n d t o L y s l 3 2 ( f u r t h e r e x p e r i m e n t s i n v e s t i g a t i n g t h e e x a c t b i n d i n g s i t e o f r e t i n a l w i t h i n t h e C R A B P I I m u t a n t s a r e d i s c u s s e d i n t h e n e x t s e c t i o n ) . 9 8 A l t h o u g h t h e b i n d i n g o f r e t i n a l t o t h e C R A B P I I m u t a n t a p p e a r s t o b e s p e c i f i c e v e n a f t e r a d d i t i o n o f b a s e , t h e f a c t t h a t t h e i n i t i a l t r e a t m e n t i s r e q u i r e d f o r t h e e x c l u s i v e f o r m a t i o n o f a P B S l e d u s t o q u e s t i o n t h e o r i g i n o f t h e s e c o n d p e a k a t ~ 3 7 0 n m i n t h e o r i g i n a l s p e c t r u m o f t h e p e n t a m u t a n t w i t h r e t i n a l ( F i g u r e 2 - 2 2 , p H = 7 ) . T h i s p e a k , i n i t i a l l y a s s i g n e d t o t h e n o n - p r o t o n a t e d f o r m o f t h e S B , i s p r o b a b l y d u e t o f r e e r e t i n a l , i n s i d e o r o u t s i d e t h e C R A B P I I c a v i t y . I t a p p e a r s t h a t t h e L y s l 3 2 i s n o t n u c l e o p h i l i c e n o u g h t o a t t a c k t h e r e t i n a l a t p h y s i o l o g i c a l p H . H o w e v e r , w h e n t r e a t e d w i t h b a s e , d u e t o i t s a l r e a d y p e r t u r b e d p K a t h i s r e s i d u e i s d e p r o t o n a t e d , a s o p p o s e d t o t h e r e s t o f t h e s o l v e n t e x p o s e d L y s r e s i d u e s . T h e n u c l e o p h i l i c L y s c a n n o w f o r m a n i m i n e w i t h t h e r e t i n a l i n t h e c a v i t y , w h i c h c a n b e p r o t o n a t e d u p o n a d d i t i o n o f a c i d , t o a f f o r d t h e e q u i l i b r i u m p r e s e n t i n F i g u r e 2 - 2 2 . A l t h o u g h t h e d a t a c a n s u p p o r t t h e l a t t e r s u g g e s t i o n , N M R e x p e r i m e n t s a r e r e q u i r e d f o r f u r t h e r p r o o f o f t h i s h y p o t h e s i s ( f o r f u r t h e r d i s c u s s i o n s e e C h a p t e r 4 ) . F i n a l l y , s i n c e t h e a c i d - b a s e t i t r a t i o n d e s c r i b e d i n F i g u r e 2 - 2 2 w a s p e r f o r m e d , b y p l o t t i n g t h e l o s s o f a b s o r b a n c e f o r t h e r e d s h i f t e d p e a k v e r s u s t h e p H o f t h e s o l u t i o n , w e w e r e a b l e t o c a l c u l a t e a n a p p a r e n t p K a v a l u e f o r t h e P S B f o r m e d b e t w e e n t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V m u t a n t a n d a l l - t r a n s - r e t i n a l ( F i g u r e 2 - 2 3 ) . A v a l u e o f ~ 6 . 5 w a s o b t a i n e d b y fi t t i n g t h e a b o v e d a t a t o a 3 r d p o w e r p o l y n o m i a l . T h i s p K a i s r a t h e r l o w a s c o m p a r e d t o t h e k n o w n p K a v a l u e s o f P S B s f r o m a n u m b e r o f r h o d o p s i n s . F o r b o v i n e r h o d o p s i n , t h e c o r r e s p o n d i n g v a l u e e s t i m a t e d b y a s i m i l a r m e t h o d , i s g r e a t e r t h a n 1 2 , a c t u a l l y s u g g e s t e d t o b e c l o s e r t o 1 6 4 0 ' 4 3 A t t h e s a m e t i m e , t h e v a l u e f o r t h e b a c t e r i o r h o d o p s i n h a s b e e n e s t i m a t e d a t ~ 1 3 . 3 . 4 4 ‘ 4 5 I n f a c t , a p K a o f 6 . 5 i s e v e n l o w e r t h a n t h a t o b s e r v e d f o r t h e r e t i n a l S B i n s o l u t i o n ( p K , l ~ 7 . 2 ) . 4 6 ’ 4 7 9 9 0 . 0 5 - 0 . 0 4 e A 5 0 0 0 . 0 3 ~ 0 . 0 2 1 0 . 0 1 e n m n m F i g u r e 2 - 2 3 . A . T h e r e t i n a l i n c u b a t e d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V c o m p l e x w a s c o n v e r t e d c o m p l e t e l y t o t h e 4 6 4 n m a b s o r b i n g s p e c i e s . T h e m i x t u r e w a s t h e n t i t r a t e d w i t h b a s e a n d c o n v e r t e d c o m p l e t e l y t o t h e 3 6 6 n m a b s o r b i n g s p e c i e s . B . P l o t t i n g o f t h e a b s o r b a n c e a t 5 0 0 n m v e r s u s t h e p H o f t h e s a m p l e s r e v e a l s a p K . o f ~ 6 . 5 f o r t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . T h e p K a v a l u e s f o r p r o t o n a t e d S B o f d i f f e r e n t o p s i n s v a r y s i g n i fi c a n t l y , w i t h t h o s e o f t h e i n v e r t e b r a t e s a t t h e l o w e r e n d ( o c t o p u s r h o d o p s i n 1 0 . 4 , 4 8 g e c k o c o n e o p s i n 9 . 9 ) . 4 9 I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h i s d r o p i n t h e p K a v a l u e i s d u e t o t h e l a c k o f a c a r b o x y l a t e c o u n t e r i o n i n t h e S B v i c i n i t y . I n s t e a d , a T y r r e s i d u e h a s b e e n f o u n d c l o s e t o t h e S c h i f f b a s e f o r t h e o c t o p u s r h o d o p s i n c a s e , w i t h s p e c t r o s c o p i c r e s u l t s i n d i c a t i n g t h a t i t d o e s n o t e x i s t i n i t s a n i o n i c f o r m . 5 0 T h e e f f e c t o f t h e p o s i t i o n o f t h e c o u n t e r a n i o n t o t h e p K a o f t h e P S B h a s b e e n f u r t h e r d e m o n s t r a t e d f o r b o v i n e r h o d o p s i n . 5 1 ’ 5 2 A s i n g l e a m i n o a c i d m u t a t i o n o f c o u n t e r a n i o n G l u 1 1 3 i n b o v i n e R h c a n r e s u l t i n a d r a m a t i c r e d u c t i o n o f t h e p K a ( E 1 1 3 Q , p K a = 6 . 0 ; E 1 1 3 N , p K a = 6 . 7 ; E 1 1 3 A , p K a = 5 . 7 ) . 3 9 I n a d d i t i o n t o t h e c o u n t e r a n i o n a s e r i e s o f o t h e r e x p l a n a t i o n s h a v e b e e n o f f e r e d f o r t h e e x c e p t i o n a l l y h i g h p K a v a l u e o f t h e r h o d o p s i n P S B . A s d i s c u s s e d i n d e t a i l s i n C h a p t e r 1 , t h e y i n v o l v e p o s i t i o n i n g o f p o l a r r e s i d u e s i n t h e P S B e n v i r o n m e n t , ” 5 3 a s w e l l a s s t a b i l i z a t i o n o f t h e P S B t h r o u g h 1 0 0 h y d r o g e n b o n d i n g w i t h n e a r b y r e s i d u e s . 5 4 F u r t h e r m o r e , a p r e c i s e a r r a n g e m e n t o f t h e w a t e r m o l e c u l e s i n t h e b i n d i n g p o c k e t c a n e f f e c t i v e l y d i r e c t a h y d r o g e n b o n d i n g n e t w o r k t h a t c o u l d a s s i s t t h e S B p r o t o n a t i o n . 5 5 I n t h e c a s e o f R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V p e n t a m u t a n t t h e l o w p K a v a l u e o f t h e P S B ( ~ 6 5 ) i n d i c a t e s t h a t o u r s y s t e m , a l t h o u g h p r o m i s i n g , s t i l l n e e d s t o b e o p t i m i z e d i n o r d e r t o b e u s e d a s a r h o d o p s i n p r o t e i n m i m i c . T h e a b o v e s u g g e s t i o n s f o r t h e r h o d o p s i n c a s e n e e d t o b e c o n s i d e r e d i n o r d e r f o r u s t o i n t r o d u c e t h e a p p r o p r i a t e c h a n g e s t o f u r t h e r s t a b i l i z e t h e P S B f o r m e d . A l t h o u g h t h e u l t i m a t e t a r g e t i s t o o b t a i n a p K a v a l u e a s c l o s e t o t h e r h o d o p s i n c a s e a s p o s s i b l e , c o n s i d e r i n g t h e r a d i c a l l y d i f f e r e n t s h a p e o f o u r s u r r o g a t e p r o t e i n , t h a t m a y b e h a r d t o a c h i e v e . A m o r e r e a l i s t i c t a r g e t m i g h t b e m a i n t a i n i n g a s t a b l e P S B a t p h y s i o l o g i c a l p H , w h i c h w o u l d r e q u i r e a p K a v a l u e a b o v e 9 . S u c h a p r o t e i n c o u l d s t i l l b e u s e d a s a m o d e l f o r t h e s t u d y o f t h e w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n m e c h a n i s m . 2 . 8 D e t e r m i n a t i o n o f t h e r e t i n a l b i n d i n g s i t e F r o m a l l t h e s p e c t r o s c o p i c r e s u l t s o b t a i n e d t o t h i s p o i n t i t i s c l e a r t h a t w e h a v e s u c c e s s f u l l y r e e n g i n e e r e d C R A B P H i n t o a r e t i n a l b i n d i n g p r o t e i n . T w o o f t h e a f o r e m e n t i o n e d p r o t e i n s , t e t r a m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E a n d p e n t a m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E 2 T 5 4 V b i n d r e t i n a l a s a P S B , a s e v i d e n t f r o m t h e i r r e d - s h i f t e d U V - v i s s p e c t r a . A l t h o u g h t h e b i n d i n g h a s n o t b e e n o p t i m i z e d y e t , s p e c t r o s c o p i c e v i d e n c e s u g g e s t t h a t t h e b i n d i n g o f t h e c h r o m o p h o r i c a l d e h y d e i s n o t n o n - s p e c i fi c b u t r a t h e r o c c u r s t h r o u g h t h e e n g i n e e r e d L y s r e s i d u e 1 3 2 . I n b r i e f , W T - C R A B P I I f a i l e d t o 1 0 1 b i n d r e t i n a l a s a S B , a s d e m o n s t r a t e d b y b o t h U V a n d M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s . I n a d d i t i o n , a s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d , r e d u c t i v e a m i n a t i o n o f t h e p e n t a m u t a n t u n d e r b a s i c c o n d i t i o n s a l s o f a i l e d t o d e t e c t m o r e t h a n o n e r e t i n a l m o l e c u l e c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o t h e p r o t e i n . H o w e v e r , i n o r d e r t o u n a m b i g u o u s l y p r o v e t h a t r e t i n a l b i n d s t o e n g i n e e r e d C R A B P I I t h r o u g h L y s l 3 2 , t w o d i f f e r e n t a p p r o a c h e s w e r e f o l l o w e d . T h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e r e t i n a l b i n d i n g s i t e c a n b e i n d i r e c t l y d e t e r m i n e d b y r e m o v i n g t h e e n g i n e e r e d L y s r e s i d u e , w h i l e m a i n t a i n i n g t h e r e s t o f t h e m u t a t i o n s . A t t h e s a m e t i m e , e n z y m a t i c d i g e s t i o n o f t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d p r o t e i n a n d a n a l y s i s o f t h e f r a g m e n t s c a n p r o v i d e t h e e x a c t a m i n o a c i d r e s p o n s i b l e f o r r e t i n a l b i n d i n g . O u r a t t e m p t s t o f o l l o w b o t h o f t h e s e a p p r o a c h e s a r e d e s c r i b e d b e l o w . A . M u t a t i n g L y s l 3 2 I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r o r n o t t h e e n g i n e e r e d L y s l 3 2 i s d i r e c t l y i n v o l v e d i n t h e f o r m a t i o n o f a r e t i n a l P S B , m u t a n t s Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L z L 1 2 1 E a n d R 1 3 2 L : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E w e r e m a d e . I n t h e f i r s t c a s e , t h e o r i g i n a l A r g r e s i d u e i s r e t a i n e d a t p o s i t i o n 1 3 2 ( s i n c e A r g i s t h e n a t i v e r e s i d u e n o m u t a t i o n i s n o t a t e d f o r t h a t s i t e ) . F o r t h e s e c o n d m u t a n t , L y s l 3 2 w a s r e p l a c e d b y a L e u r e s i d u e , i n a n a t t e m p t t o m a i n t a i n a s t r u c t u r a l l y c o n s e r v a t i v e m u t a t i o n . T h e s p e c t r o s c o p i c r e s u l t s o b t a i n e d f r o m t h e l a t t e r p r o t e i n s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 - 3 . T h e a n a l y s i s o f t h e b i n d i n g a s s a y r e s u l t s f o r t h e Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t ( T a b l e 2 - 3 , e n t r y 3 ) i s s t r a i g h t f o r w a r d . U p o n r e s t o r i n g t h e A r g 1 3 2 r e s i d u e t h e a f fi n i t y f o r r e t i n a l h a s s i g n i fi c a n t l y d e c l i n e d ( K d = 5 7 0 1 - 3 2 n M ) , a s c o m p a r e d t o b o t h 1 0 2 ) D U O L C T a b l e 2 - 3 . C o m p a r i s o n o f t h e r e t i n a l b i n d i n g s p e c t r o s c o p i c a s s a y s o f t h e C R A B P I I m u t a n t s w i t h a n d w i t h o u t L y s l 3 2 . . F i t K d R t A m U V 2 " d d e r i v . R e d u c t i v e E n t r y P r o t e i n ( n M ) a ( n m ) b ( n m ) C A m i n a t i o n d , , _ 3 7 8 3 7 2 ( 5 ) 1 R 1 3 2 K . Y 1 3 4 F . R 1 1 1 L . L 1 2 1 E 2 0 0 $ 8 . 3 4 3 8 4 4 9 ( 1 ) Y e s . . . . 3 8 2 3 7 0 ( 1 ) 2 R 1 3 2 K . Y 1 3 4 F . R 1 1 1 L . L 1 2 1 E . T 5 4 V 2 . 7 : t 7 . 0 4 3 0 4 4 7 “ . 4 ) Y e s 3 Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L 1 L 1 2 1 E 5 7 0 : 3 2 3 8 4 3 8 5 N O 4 R 1 3 2 L Z Y 1 3 4 F 2 R 1 1 1 L 2 L 1 2 1 E 1 8 0 : t 1 4 3 9 5 3 9 6 N 0 D i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r a l l - t r a n s - r e t i n a l a s d e t e r m i n e d b y f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y . U V a b s o r b a n c e o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n . 2 " d d e r i v a t i v e o f t h e U V s p e c t r u m . N u m b e r s i n p a r e n t h e s i s r e p r e s e n t t h e r e l a t i v e r a t i o . R e d u c t i v e a m i n a t i o n a d d u c t a s d e t e r m i n e d b y M A L D l - T O F . R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E ( K , = 2 0 0 i 8 . 3 n M ) a n d R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V ( K , = 2 . 7 i - 7 . 0 n M ) . A t t h e s a m e t i m e , b o t h t h e U V a n d t h e M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s f a i l e d t o d e t e c t a n y P S B f o r m a t i o n . T h e s e r e s u l t s d i r e c t l y s u g g e s t t h a t L y s l 3 2 i s n e c e s s a r y f o r S B f o r m a t i o n w i t h r e t i n a l . O n t h e o t h e r h a n d , w h e n a L e u r e s i d u e i s p r e s e n t i n p o s i t i o n 1 3 2 ( R 1 3 2 L : Y 1 3 4 F l e l l e L 1 2 1 E , T a b l e 2 - 3 , e n t r y 4 ) , t h e U V m a i n t a i n s a r e d s h i f t e d p e a k ( A m a x = 3 9 5 n m ) . T h i s c o u l d s e e m s u r p r i s i n g i n i t i a l l y b u t i s a c t u a l l y c o n s i s t e n t w i t h t h e U V r e s u l t s f o r r e t i n a l i n t h e p r e s e n c e o f W T - C R A B P H ( M m = 3 9 0 n m ) . T h e U V a b s o r b a n c e o b s e r v e d m u s t b e d u e t o n o n - s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s o f t h e c h r o m o p h o r e w i t h t h e p r o t e i n c a v i t y , e n h a n c e d b y t h e p r e s e n c e o f a e x t r a h y d r o p h o b i c r e s i d u e ( R 1 3 2 L ) . A t t h e s a m e t i m e , a l t h o u g h t h e a f f i n i t y f o r r e t i n a l i s v e r y c l o s e t o t h a t o f t h e R 1 3 2 K t e t r a m u t a n t ( t h e K , v a l u e s a r e 1 8 0 i 1 4 n M v e r s u s 2 0 0 i 3 2 n M , r e s p e c t i v e l y ) , n o c o v a l e n t l y b o n d e d r e t i n a l a d d u c t i s d e t e c t e d u n d e r b o t h i n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n c o n d i t i o n s . 1 0 3 I n c o n c l u s i o n , b o t h p r o t e i n s m a d e w i t h o u t t h e L y 3 1 3 2 r e s i d u e f u r t h e r v e r i f i e d t h e s u g g e s t i o n t h a t t h e e n g i n e e r e d L y s i s e s s e n t i a l f o r t h e f o r m a t i o n o f a r e t i n a l S B . B . E n z y m a t i c D i g e s t i o n s i . C N B r - D i g e s t i o n s S t r i c t l y s p e a k i n g , c y a n o g e n b r o m i d e d i g e s t i o n s h o u l d n o t b e c o n s i d e r e d a n e n z y m a t i c d i g e s t i o n s i n c e t h e r e i s n o e n z y m e i n v o l v e d . H o w e v e r , i t s u s e i n b i o l o g i c a l s y s t e m s i s s o c o m m o n t h a t t h e m e t h o d h a s b e e n u n o f f i c i a l l y l i s t e d a s a n e n z y m a t i c d i g e s t i o n . C y a n o g e n b r o m i d e ( C N B r ) i s u s e d t o d i g e s t p r o t e i n s f o r f u r t h e r p e p t i d e a n a l y s i s . U n d e r a l k a l i n e p H , C N B r r e a c t s w i t h a l l t h e b a s i c g r o u p s i n t h e p r o t e i n , l e a d i n g t o n o n - s p e c i fi c c l e a v a g e . H o w e v e r , u n d e r n e u t r a l o r a c i d i c p H i t c l e a v e s o n l y a f t e r M e t r e s i d u e s ( S c h e m e 2 - 1 ) , w h i l e a t t h e s a m e t i m e i t d o e s r e a c t w i t h C y s r e s i d u e s o x i d i z i n g t h e m t o c y s t e i c a c i d . ” 5 9 T h e r e f o r e , i f a s p e c i f i c c l e a v a g e a f t e r M e t i s d e s i r e d , t h e C y s r e s i d u e s h a v e t o b e p r o t e c t e d , u s u a l l y b y t h e u s e o f i o d o a c e t a t e o r i t s d e r i v a t i v e s . H " i ” H “ i ” ’ r N N ‘ H n g ( N ‘ H M 9 1 0 M e t 0 A 9 e ‘ v / S N S C - B r B r S ' C E N \ . ' - S - C E N m 9 H 2 N * H B r m 1 ” ( N 8 0 H 2 0 3 : 1 1 € N - H 0 M e t M e t 2 5 0 S c h e m e 2 - 1 . M e c h a n i s m o f a c t i o n o f c y a n o g e n b r o m i d e 1 0 4 S c h e m e 2 - 2 . R e a c t i o n o f i o d o a c e t a m i d e w i t h C y s r e s i d u e s I o d o a c e t a m i d e , l i k e t h e m o r e c o m m o n l y u s e d i o d o a c e t a t e , c a n m o d i f y a n u m b e r o f a m i n o a c i d s s i d e c h a i n s i n p r o t e i n s , y i e l d i n g a l k y l a t e d d e r i v a t i v e s ( S c h e m e 2 - 2 ) . I t i s t y p i c a l l y u s e d o n l y a s a b l o c k i n g a g e n t a n d c a n b e d i r e c t e d s p e c i fi c a l l y f o r — S H m o d i fi c a t i o n i f p r e s e n t i n l i m i t e d q u a n t i t i e s r e l a t i v e t o t h e — S H g r o u p s . I n s l i g h t l y a l k a l i n e p H t h e m o d i f i c a t i o n o f t h e C y s r e s i d u e s i s e x c l u s i v e w ‘ 6 1 C R A B P H c o n t a i n s o n l y 4 m e t h i o n i n e r e s i d u e s ( F i g u r e 2 — 2 4 ) . D i g e s t i o n w i t h C N B r w o u l d r e s u l t i n 4 m a j o r p e p t i d e s ( i n c o m p l e t e d i g e s t i o n s n o t i n c l u d e d ) t h e s i z e s o f w h i c h a r e s h o w n i n F i g u r e 2 - 2 4 B . R e s i d u e 1 3 2 , t h e e n g i n e e r e d L y s s u s p e c t e d t o b e t h e o n e b i n d i n g t o r e t i n a l , w i l l b e p a r t o f t h e l a s t a n d s h o r t e s t p e p t i d e w i t h a m a s s o f 2 6 8 9 D a . A f t e r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n o f t h e p r o t e i n w i t h r e t i n a l , t h e p r o d u c t c a n u n d e r g o C N B r c l e a v a g e a n d a f t e r p u r i f i c a t i o n o f t h e r e s u l t i n g p e p t i d e s b y H P L C , t h e i r m a s s c a n b e d e t e r m i n e d b y M A L D I - T O F . A n a d d i t i o n a l m a s s o f 2 6 8 u n i t s s h o u l d b e p r e s e n t f o r t h e p e p t i d e a t t a c h e d t o t h e r e t i n a l m o l e c u l e . A l t e r n a t i v e l y , r e a c t i o n w i t h r a d i o a c t i v e r e t i n a l c o u l d l e a d t o a r a d i o a c t i v e l y l a b e l e d p e p t i d e , w h i c h c o u l d t h e n b e s i n g l e d o u t . E i t h e r w a y , t h e p e p t i d e b o u n d t o r e t i n a l c a n b e i s o l a t e d a n d s e q u e n c e d a n d t h e m o d i fi e d a m i n o a c i d c a n b e i d e n t i f i e d . A s e r i e s o f C N B r d i g e s t i o n s w e r e p e r f o r m e d , p r i m a r i l y u s i n g a m o d e l p r o t e i n , C R A B P H - F 1 5 W , i n o r d e r t o s t a n d a r d i z e t h e m e t h o d b e f o r e m o v i n g t o a n a c t u a l t a r g e t . 6 0 . 6 1 A s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d , t h e p r o t e i n w a s f i r s t t r e a t e d w i t h i o d o a c e t a m i d e , t o p r e v e n t t h e C y s r e s i d u e s f r o m o x i d i z i n g , a n d t h e n w a s s u b m i t t e d t o C N B r d i g e s t i o n . H o w e v e r , 1 0 5 A M P N F S G N W K I I R S E N W E E L L K V L G V N V M L R K I A V A A A S K P A V E I 1 1 0 2 0 3 0 4 0 G D T F Y I K T S I I V R T T E I N F K V G E E F E E Q T V D G R P C K S L V K W E S E N 5 0 5 0 7 0 3 0 9 0 M V C E Q K L L K G E G P K T S W T R E L T N D G E L I L T M T A D D V V C T R V Y V R 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 3 7 P e p t i d e l e n g t h ( a a ) P e p t i d e M a s s ( D a ) I n c o m p l e t e D i g e s t i o n M a s s ( D a ) 1 1 4 9 . 0 5 1 3 3 9 1 . 7 4 2 2 8 3 2 4 2 . 6 9 1 6 6 7 4 5 9 . 8 4 3 1 0 7 0 2 5 3 4 3 0 3 3 8 8 . 7 3 7 1 0 3 4 3 - 5 8 2 2 2 6 8 9 . 2 6 8 6 0 7 8 . 0 0 5 F i g u r e 2 - 2 4 . A . C R A B P I I - F 1 5 W a m i n o a c i d s e q u e n c e . T h e C N B r d i g e s t i o n s i t e s ( M e t r e s i d u e s ) a r e h i g h l i g h t e d i n b l u e . B . C N B r d i g e s t i o n f r a g m e n t s o f C R A B P I I . b o t h t h e M A L D I - T O F a n d t h e S D S e l e c t r o p h o r e s i s r e s u l t s r e v e a l e d i n c o m p l e t e d i g e s t i o n s , a s d e p i c t e d i n F i g u r e s 2 - 2 6 . A t t h e s a m e t i m e , a t t e m p t s t o r e a c t t h e u n p r o t e c t e d p r o t e i n ( w i t h o u t i o d o a c e t a m i d e t r e a t m e n t ) w i t h C N B r r e s u l t e d i n s i m i l a r o b s e r v a t i o n s ( F i g u r e 2 - 2 5 ) . I n a d d i t i o n , t w o d i f f e r e n t a c i d i c c o n d i t i o n s ( 7 0 % T F A a n d 7 0 % f o r m i c a c i d ) w e r e t r i e d a n d , a l t h o u g h a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 2 6 t h e c l e a v a g e w i t h f o r m i c a c i d s e e m s t o b e m o r e e f fi c i e n t , i t s t i l l r e m a i n s i n c o m p l e t e . A n a d d i t i o n a l p r o b l e m w i t h t h e C N B r d i g e s t i o n w a s t h a t t h e p e p t i d e o f i n t e r e s t w i t h M W = 2 6 8 9 D a w a s t o o s m a l l t o s h o w o n t h e P A G E g e l s , e v e n t h o u g h t h e S D S T r i s / T r i c i n e - P A G E , s p e c i fi c f o r i d e n t i fi c a t i o n o f s m a l l s i z e p e p t i d e s , w a s u s e d ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . H o w e v e r , t h e d e s i r e d m a s s w a s p r e s e n t i n t h e M A L D I - T O F s p e c t r a , a l b e i t i n s m a l l a m o u n t . 1 0 6 1 2 3 4 5 6 7 6 6 . 0 0 0 4 5 , 0 0 0 3 6 , 0 0 0 2 7 , 0 0 0 2 4 , 0 0 0 1 4 , 2 0 0 6 , 5 0 0 F i g u r e 2 - 2 5 . 1 5 % A c r y l / T r i s - t r i c i n e - F i g u r e 2 - 2 6 . 1 5 % A c r y l / T r i s - t r i c i n e - g l y c e r o l g e l o f C R A B P I I - H i s t a g F 1 5 W g l y c e r o l g e l o f C R A B P I I - F 1 5 W a f t e r a f t e r C N B r d i g e s t i o n ( n o i o d o a c e t a m i d e ) C N B r d i g e s t i o n ( a f t e r i o d o a c e t a m i d e ) 1 . M a r k e r ; 2 . C r u d e C N B r r e a c t i o n ; 3 - 4 . 1 . M a r k e r ; 2 . I n s u l i n a ; 3 . I n s u l i n B ; 4 . W a s h f r a c t i o n s a f t e r N T A ; 5 - 7 . E l u t i o n i n s u l i n ( 0 H 3 ) : 5 , C r u d e C N B r w / T F A ; f r a c t i o n s f r o m N T A 6 . C r u d e C N B r w / F o r m i c A c i d S i n c e w e b e l i e v e d w e c o u l d i d e n t i f y t h e d e s i r e d p e p t i d e b y M A L D I - T O F , s e v e r a l a t t e m p t s w e r e m a d e i n o r d e r t o s e p a r a t e t h e p e p t i d e m i x t u r e b y H P L C . T h e c r u d e C N B r d i g e s t i o n a f t e r q u e n c h i n g w i t h H 2 0 w a s s u b m i t t e d t o H P L C a n a l y s i s . H o w e v e r , n o s e p a r a t i o n w a s a c h i e v e d s i n c e d u r i n g t h e fi r s t 2 0 m i n a l l p e p t i d e s w e r e e l u t e d . A l l p e a k s w e r e b r o a d a n d c o n t i n u o u s w i t h t h e r e t e n t i o n t i m e s b e i n g e x t r e m e l y c l o s e . A t t e m p t s t o a l t e r t h e H P L C c o n d i t i o n s d i d n o t y i e l d i m p r o v e d r e s u l t s . T h e r e f o r e , a n a l t e r n a t i v e s e p a r a t i o n m e t h o d w a s n e e d e d A n a t t e m p t w a s m a d e t o u t i l i z e t h e H i s - t a g l o c a t e d a t t h e C - t e r m i n u s o f o u r p r o t e i n s f o r s e p a r a t i n g o u t t h e d e s i r e d C - t e r m i n a l p e p t i d e t h a t s h o u l d h a v e c o n t a i n e d L y s l 3 2 . H o w e v e r , n o s e p a r a t i o n w a s a c h i e v e d w h e n t h e C N B r d i g e s t i o n m i x t u r e w a s p a s s e d t h r o u g h t h e N T A c o l u m n . S D S - P A G E a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h e r e w a s n o p e p t i d e b o u n d 1 0 7 o n t h e N i - c o l u m n , l e a d i n g u s t o b e l i e v e t h a t t h e 6 - H i s - t a g d o e s n o t s u r v i v e t h e C N B r d i g e s t i o n c o n d i t i o n s . O v e r a l l , t h e a t t e m p t s t o d i g e s t t h e m o d e l C R A B P I I p r o t e i n w i t h C N B r f a i l e d t o p r o v i d e p r o m i s i n g r e s u l t s . A s a r e s u l t , t h e l a t t e r p r o t o c o l s w e r e n o t t r i e d o n a c t u a l p r o t e i n t a r g e t s , a n d a n a l t e r n a t i v e m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e e x a c t r e t i n a l b i n d i n g s i t e i n C R A B P I I m u t a n t s w a s p u r s u e d . i i . T r y p s i n D i g e s t i o n s F o l l o w i n g t h e s a m e l o g i c a s i n t h e C N B r d i g e s t i o n c a s e , t r y p s i n w a s c h o s e n f o r t h e d i g e s t i o n o f t h e C R A B P H m u t a n t s , i n o r d e r t o o b t a i n i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e r e t i n a l b i n d i n g s i t e . T r y p s i n , a s e r i n e p r o t e a s e t h a t s p e c i f i c a l l y c l e a v e s a t t h e c a r b o x y l i c s i d e o f l y s i n e ( K ) a n d a r g i n i n e ( R ) , i s o n e o f t h e m o s t w i d e l y u s e d e n z y m e s f o r b i o c h e m i c a l m a n i p u l a t i o n s . T h e e n z y m e s h o w s m a x i m u m a c t i v i t y i n t h e p H r a n g e o f 7 - 9 a n d i s r e v e r s i b l y i n a c t i v a t e d a t p H = 4 . I t i s r e s i s t a n t t o m i l d d e n a t u r i n g c o n d i t i o n s ( 0 . 1 % S D S , 1 M U r e a , 1 0 % M e C N ) a n d r e t a i n s 4 8 % a c t i v i t y i n 2 M g u a n i d i n e H C I . A s o p p o s e d t o C N B r , n o m o d e l p r o t e i n w a s u s e d f o r t h e t r y p t i c d i g e s t i o n a t t e m p t s . I n s t e a d , t e t r a m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E , w h i c h i s k n o w n t o b i n d r e t i n a l a s a S c h i f f b a s e , w a s c h o s e n t o u n d e r g o t h e a n a l y s i s . A s c a n b e s e e n i n F i g u r e 2 - 2 7 , t h e r e a r e 1 8 p o s s i b l e t r y p s i n c u t s i t e s i n t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R l l 1 L : L 1 2 1 E s e q u e n c e . C o n s i d e r i n g t h a t t h e a m i n o a c i d o f i n t e r e s t i s a L y s a t p o s i t i o n 1 3 2 w e w o u l d e x p e c t t h a t a f t e r u n d e r g o i n g r e d u c t i v e a m i n a t i o n , t h e m o d i f i e d L y s s h o u l d n o t b e c l e a v e d 1 0 8 P N F S G N W K I I R S E N F E E L L K V L G V N V M L R K I A V A A A S K P A V E I K Q 1 1 0 2 0 3 0 4 0 G D T F Y I K T S T T V R T T E I N F K V G E E F E E Q T V D G R P C K S L V K W E S E N s o 6 0 7 0 8 0 9 0 M V C E Q K L L K G E G P K T S W T L E L T N D G E L I E T M T A D D V V C T K V F V R E 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 3 7 F i g u r e 2 - 2 7 . A m i n o a c i d s e q u e n c e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : L 1 2 1 E : : R 1 1 1 L m u t a n t . R e s i d u e s i n b l u e r e p r e s e n t c u t s i d e s f o r t r y p s i n . b y t r y p s i n . T h e r e f o r e , t h e T 1 0 7 - R 1 3 6 f r a g m e n t c o n t a i n i n g L y s l 3 2 a n d b e a r i n g t h e e x t r a m a s s o f 2 6 8 ( r e t i n a l b o u n d a fi e r r e d u c t i v e a m i n a t i o n ) s h o u l d b e o b s e r v e d . G e n e r a l l y m o s t p r o t e i n s r e q u i r e d e n a t u r a t i o n b e f o r e e n z y m a t i c d i g e s t i o n c a n g o t o c o m p l e t i o n . H o w e v e r , d e n a t u r a t i o n i n v o l v e s t h e u s e o f h i g h c o n c e n t r a t i o n o f u r e a o r g u a n i d i n e . I n t h i s c a s e , s i n c e w e i n t e n d e d t o r e c o r d t h e M A L D I s p e c t r u m o f t h e c r u d e r e a c t i o n i t w a s n e c e s s a r y t o m i n i m i z e t h e a m o u n t s o f s a l t s u s e d ( t h e p r e s e n c e o f h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n s w i l l i n t e r f e r e w i t h t h e i o n i z a t i o n p r o c e s s ) . T h e r e f o r e , n a t i v e c o n d i t i o n s w e r e u s e d f o r t h e t r y p s i n d i g e s t i o n s . D e t a i l s o f t h e d i f f e r e n t d i g e s t i o n r e a c t i o n s a r e p r o v i d e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . T h r e e d i f f e r e n t t r y p s i n t y p e s w e r e u s e d a n d t h e M A L D I s p e c t r a o f t h e c r u d e r e a c t i o n s r e v e a l p e a k s c h a r a c t e r i s t i c f o r t h e v a r i o u s C R A B P I I f r a g m e n t s . U s i n g t h e P r o t e i n P r o s p e c t o r p r o g r a m , t h e t h e o r e t i c a l v a l u e s f o r t h e t r y p t i c f r a g m e n t s o f C R A B P I I - R l 3 2 : : Y 1 3 4 F : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E w e r e c a l c u l a t e d . 6 2 A s s h o w n i n F i g u r e 2 - 2 8 , s e v e r a l f r a g m e n t s o f t h e C R A B P I I s e q u e n c e c a n b e i d e n t i fi e d . H o w e v e r , a c l o s e r l o o k a t t h e s p e c t r u m r e v e a l s t h a t t h e d e s i r e d f r a g m e n t s ( T h r 1 0 7 - A r g l 3 6 ( 3 4 5 7 . 6 9 D a ) , T h r 1 0 7 - L y 8 1 3 2 ( 3 4 2 4 . 6 1 D a ) ) t h a t c o n t a i n t h e L y s l 3 2 r e s i d u e a r e n o t p r e s e n t . I n f a c t , w h i l e w e w e r e a b l e t o i d e n t i f y a n d m a t c h v e r y w e l l w i t h t h e t h e o r e t i c a l v a l u e s m o s t o f t h e 1 0 9 3 4 0 2 . 0 ( 1 2 9 ) 1 8 2 2 . 2 ( 6 7 - 8 2 ) 3 0 9 4 . 0 3 5 3 0 . 7 ( 3 1 - 5 9 ) ( 1 - 3 0 ) 3 2 2 1 . 9 ( 3 0 - 5 9 ) \ \ 1 0 0 1 . 1 ( 2 1 2 9 ) 2 4 4 8 . 8 ( 3 1 - 5 3 ) I _ _ _ . _ . . _ _ . L . . . . _ _ _ _ - . m — _ I 1 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 3 5 0 0 4 0 0 0 m a s s ( D a ) F i g u r e 2 - 2 8 . M A L D l - T O F s p e c t r u m o f t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t a f t e r t r y p s i n d i g e s t i o n . T h e n u m b e r s i n p a r e n t h e s e s r e p r e s e n t t h e p e p t i d e s e q u e n c e t h a t t h e c o r r e s p o n d i n g m a s s r e f e r s t o . f r a g m e n t s f o r t h e N - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n , w e c o u l d n o t f i n d a n y f r a g m e n t t h a t c o r r e s p o n d s t o t h e C - t e r m i n u s . T h e f r a g m e n t s i n g o o d a g r e e m e n t t h a t c o u l d b e i d e n t i fi e d s t o p a r o u n d r e s i d u e 9 0 . I n a d d i t i o n , c h a n g i n g t h e s o u r c e o f t r y p s i n a n d a l l o w i n g f o r l o n g e r i n c u b a t i o n p e r i o d s d i d n o t a l t e r t h e r e s u l t s a t a l l ( s i m i l a r r e s u l t s w e r e o b s e r v e d f o r d i g e s t i o n s t h a t l a s t f o r 5 m i n o r 1 2 h o u r s ) . T h e C - t e r m i n u s o f C R A B P I I c o n s i s t s o f h y d r o p h o b i c r e s i d u e s , l e a d i n g t o h y d r o p h o b i c p e p t i d e s w h i c h a r e n o t a s a m e n a b l e t o e f f e c t i v e i o n i z a t i o n . S e v e r a l e x a m p l e s o f h y d r o p h o b i c f r a g m e n t s t h a t r e q u i r e s p e c i a l t r e a t m e n t h a v e b e e n p r e v i o u s l y r e p o r t e d s u c h a s t r y p t i c d i g e s t s o f r h o d o p s i n a n d b a c t e r i o r h o d o p s i n . “ ' 6 8 S i n c e t h e m a j o r p r o b l e m o f h y d r o p h o b i c p e p t i d e s i s s o l u b i l i t y , t h e w a y t o c i r c u m v e n t t h e p r o b l e m u s u a l l y i n v o l v e s t h e u s e o f v a r i o u s d e t e r g e n t s . “ 6 4 1 1 0 I n t h i s c a s e , t h e n a t u r e o f t h e r e t i n a l b o u n d p e p t i d e m i g h t p o s e a d d i t i o n a l p r o b l e m s . I n p a r t i c u l a r , t h e l a s e r b e a m u s e d i n t h e M A L D I - T O F s p e c t r o p h o t o m e t e r o p e r a t e s a t 3 3 7 n m ( n i t r o g e n ) . A t t h e s a m e t i m e , t h e r e d u c e d r e t i n a l i n t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d s a m p l e a b s o r b a t ~ 3 3 5 n m . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d p r o d u c t a b s o r b s t h e i n c i d e n t e n e r g y o f t h e l a s e r a n d s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t s t h e i o n i z a t i o n o f t h e m a t r i x ( s i n a p i n i c a c i d u s e d a s m a t r i x , A m “ : 3 1 4 n m , 2 3 3 n m i n w a t e r , 3 1 7 n m , 2 3 5 n m i n E t O H ) . T h e r e f o r e , t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d p r o d u c t i s g e n e r a l l y e x p e c t e d t o b e h a r d e r t o i o n i z e . S i n c e w e w e r e n o t a b l e t o i d e n t i f y t h e d e s i r e d t r y p t i c f r a g m e n t b y M A L D I , a d i f f e r e n t m e t h o d w a s f o l l o w e d . I n p a r t i c u l a r , t h e c r u d e r e a c t i o n w a s s u b m i t t e d t o H P L C a n a l y s i s i n a n a t t e m p t t o i d e n t i f y t h e r e t i n a l b o u n d f r a g m e n t . A l t h o u g h , a s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d t h e H P L C s e p a r a t i o n d i d n o t s u c c e e d w i t h t h e C N B r d i g e s t s , t h e g o a l w a s t o i d e n t i f y t h e p e p t i d e c o v a l e n t l y b o u n d t o r e t i n a l b y i t s U V - v i s t r a c e . T h e f r a g m e n t o f i n t e r e s t s h o u l d c o n t a i n a T r p r e s i d u e , t h u s i t s U V - v i s t r a c e s h o u l d e x h i b i t A m a t 2 8 0 n m ( p e p t i d e ) a n d 3 3 5 n m ( r e d u c e d r e t i n a l ) . H o w e v e r , n o n e o f t h e p e a k s e l u t e d f r o m t h e H P L C c o l u m n e x h i b i t e d a U V - v i s t r a c e t h a t s a t i s f i e d t h o s e c r i t e r i a . M o s t p e p t i d e s e l u t e d v e r y c l o s e t o e a c h o t h e r w i t h i n 8 - 2 5 m i n . H o w e v e r , t h e o n l y p e a k w i t h a c h r o m o p h o r e p r e s e n t ( 3 3 0 n m ) c o m e s o u t a t ~ 4 0 m i n , b u t n o 2 8 0 n m p e a k i s a s s o c i a t e d w i t h i t ( w h e n f r e e r e t i n o l w a s s u b m i t t e d u n d e r t h e l a t t e r c o n d i t i o n s i t e l u t e d a t 4 0 m i n e x h i b i t i n g a A m , a t 3 3 0 n m ) . I n a n a t t e m p t t o f u r t h e r i n v e s t i g a t e w h a t r e a l l y h a p p e n s d u r i n g t h e t r y p s i n d i g e s t i o n , t h e s a m p l e ( t e t r a m u t a n t r e d u c t i v e a m i n a t i o n p r o d u c t ) w a s s u b m i t t e d f o r H P L C s e p a r a t i o n a n d t h e i s o l a t e d f r a g m e n t s w e r e a n a l y z e d b y E I m a s s s p e c t r o m e t r y . 1 1 1 U n f o r t u n a t e l y , t h e r e s u l t s w e r e v e r y s i m i l a r t o d a t a o b t a i n e d t h r o u g h M A L D I - T O F a n a l y s i s . T h e r e i s e x c e l l e n t a g r e e m e n t f o r f r a g m e n t s f r o m t h e N - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n a n d t h i s t i m e w e c o u l d a c t u a l l y i d e n t i f y d e c e n t f r a g m e n t s f o r a l m o s t 3 / 5 o f t h e p r o t e i n . B u t , a s b e f o r e , n o t h i n g t h a t i n c l u d e s t h e C - t e r m i n u s w a s o b s e r v e d . i i i . C h y m o t r y p s i n d i g e s t i o n S i n c e d i g e s t i o n w i t h t r y p s i n d i d n o t y i e l d a n y o b s e r v a b l e f r a g m e n t s f o r t h e C - t e r r n i n u s t h e n e x t l o g i c a l s t e p w a s t o m o v e o n t o a n o t h e r e n z y m e , h o p i n g t h a t t h e d i f f e r e n t f r a g m e n t a t i o n w i l l e l i m i n a t e t h e p r e v i o u s l y m e n t i o n e d p r o b l e m s . C h y m o t r y p s i n , a n e n d o p r o t e i n a s e t h a t p r e f e r e n t i a l l y h y d r o l y z e s p e p t i d e b o n d s a t t h e c a r b o x y l g r o u p s o f a r o m a t i c a m i n o a c i d s w a s u t i l i z e d ( T y r , P h e , T r p ( F i g u r e 2 - 2 9 ) , L e u , M e t , A l a , A s n , G l n a r e a l s o c l e a v e d b u t a t a l o w e r r a t e ) . P N F S G N W K I I R S E N F E E I . . . L K V L G V N V M L R K I A V A A A S K P A V E I K Q 1 1 0 2 0 3 0 4 0 G D T F Y I K T S T T V R T T E I N F K V G E E F E E Q T V D G R P C K S L V K W E S E N 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 M V C E Q K L L K G E G P K T S W T L E L T N D G E L I E T M T A D D V V C T K V F V R E 1 0 0 l 1 0 1 2 0 1 3 0 1 3 7 F i g u r e 2 - 2 9 . A m i n o a c i d s e q u e n c e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : L 1 2 1 E : : R 1 1 1 L m u t a n t . R e s i d u e s i n b l u e m a r k p o t e n t i a l C h y m o t r y p s i n c u t s i t e s . T h e d i g e s t i o n s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s a n d i t a p p e a r s t h a t t h e y r e q u i r e m o r e t i m e t h a n t h e c o r r e s p o n d i n g t r y p s i n d i g e s t i o n s . T h e f r a g m e n t c o n t a i n i n g L y s l 3 2 ( T h r l 1 0 - P h e 1 3 4 ) w o u l d h a v e a n e x p e c t e d M + o f 2 7 5 9 . 1 D a . D u r i n g t h e fi r s t d i g e s t i o n a t t e m p t ( s u b s t r a t e / e n z y m e : 1 0 0 / 1 , r t , 1 5 m i n ) a s i g n i fi c a n t 1 1 2 1 1 6 3 0 . 6 1 5 7 6 5 . 8 1 5 4 9 6 . 0 A = 2 8 3 . 3 } A = 2 6 9 . 8 1 1 9 1 3 . 8 1 L I l I I I l 7 0 0 0 9 0 0 0 1 1 0 0 0 1 3 0 0 0 1 5 0 0 0 1 7 0 0 0 m a s s ( D a ) 1 1 9 0 0 . 0 1 5 7 6 3 . 8 1 1 6 3 4 . 0 1 5 4 9 8 . 7 l A = 2 6 4 . 9 A = 2 6 6 . 0 { “ U l L I I I I I I 7 0 0 0 9 0 0 0 1 1 0 0 0 1 3 0 0 0 1 5 0 0 0 1 7 0 0 0 m a s s ( D a ) F i g u r e 2 - 3 0 . M A L D l - T O F o f t h e d i g e s t i o n o f r e d u c t i v e l y a m i n a t e d R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E ( M + = 1 5 4 9 0 . 1 D a ) m u t a n t w i t h C h y m o t r y p s i n . T h e d i f f e r e n t s p e c t r a c o r r e s p o n d t o d i f f e r e n t e n z y m e / s u b s t r a t e r a t i o a n d d i f f e r e n t r e a c t i o n t i m e s . A . E n z y m e / s u b s t r a t e : 1 0 0 / 1 , 1 5 m i n ; B . E n z y m e / s u b s t r a t e : 2 0 0 / 1 , o v e r n i g h t d i g e s t i o n . I n b o t h c a s e s t h e d i g e s t i o n i s n o t e f f i c i e n t m a i n t a i n i n g n o n - d i g e s t e d p r o t e i n a s t h e m a j o r p e a k . T h e a d d u c t c h a r a c t e r i s t i c f o r a c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l m o l e c u l e i s p r e s e n t i n a s e c o n d s e t o f p e a k s ( ~ 1 1 6 3 0 D A , ~ 1 1 9 0 0 D a ) , i n a d d i t i o n t o t h e w h o l e p r o t e i n p e a k ( ~ 1 5 4 9 0 D a , 1 5 7 6 0 D a ) . a m o u n t o f n o n - d i g e s t e d p r o t e i n w a s p r e s e n t i n t h e s p e c t r a w h i l e t h e r e w a s s t i l l n o s i g n o f t h e d e s i r e d f r a g m e n t . H o w e v e r , t w o s e t s o f p e a k s c o r r e s p o n d i n g t o t h e M , ( M + r e t i n a l ) p a t t e r n ( F i g u r e 2 - 3 0 ) w e r e o b s e r v e d f o r b o t h t h e i n t a c t p r o t e i n ( 1 5 4 9 6 . 4 D a , 1 5 7 6 5 . 8 D a , 1 1 3 A = 2 6 9 . 4 , M W , e m = 1 5 4 9 0 . 7 D a ) a n d o n e o f t h e f r a g m e n t s ( 1 1 6 3 0 . 6 D a , 1 1 9 1 3 . 8 D a , A = 2 8 3 . 3 ) . A t t e m p t s t o a s s i g n t h e 1 1 6 3 0 D a p e a k w e r e n o t f r u i t f u l s i n c e n o o b v i o u s f r a g m e n t a t i o n f r o m e i t h e r e n d o f t h e p r o t e i n c o u l d b e m a t c h e d t o t h e o b s e r v e d m a s s . I d e n t i c a l r e s u l t s w e r e o b t a i n e d e v e n w h e n t h e e n z y m e r a t i o w a s i n c r e a s e d a n d t h e d i g e s t i o n w a s l e f t o v e r n i g h t ( F i g u r e 2 - 3 0 B ) . I t a p p e a r s t h a t t h e C h y m o t r y p s i n f r a g m e n t s f a c e t h e s a m e p r o b l e m s , r e l a t e d t o t h e i r h y d r o p h o b i c n a t u r e , a s t h e t h o s e p r o d u c e d b y t r y p s i n d i g e s t i o n . I n a d d i t i o n , s i n c e t h e C h y m o t r y p s i n d i g e s t i o n w a s m u c h s l o w e r t h a n t h e r e a c t i o n w i t h t r y p s i n , t h i s a p p r o a c h w a s n o t p u r s u e d f u r t h e r . i v . C a r b o x y p e p t i d a s e D i g e s t i o n s I n s p e c t i o n o f t h e C R A B P H a m i n o a c i d s e q u e n c e r e v e a l s t h a t L y s l 3 2 i s o n l y f i v e a m i n o a c i d s a w a y f r o m t h e C - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n ( C R A B P H h a s 1 3 7 a r r r i n o a c i d s ) . T h i s o b s e r v a t i o n p r o m p t e d t h e c o n s i d e r a t i o n o f C - t e r m i n u s s e q u e n c i n g o f t h e p r o t e i n b y e n z y m a t i c d i g e s t i o n u s i n g C a r b o x y p e p t i d a s e Y . C a r b o x y p e p t i d a s e Y i s a g l y c o p r o t e i n e x o p e p t i d a s e o f t h e “ a c i d ” a n d “ s e r i n e ” c l a s s . 6 9 ' 7 0 T h i s e n z y m e h a s a b r o a d a m i n o a c i d s p e c i f i c i t y a n d s u c c e s s i v e l y c l e a v e s a m i n o a c i d s , f r o m t h e c a r b o x y l i c e n d o f p e p t i d e s a n d p r o t e i n s ( t h e r e l e a s e o f g l y c i n e a n d a s p a r t i c a c i d r e s i d u e s i s c o n s i d e r a b l y r e t a r d e d ) . I t i s a c t i v e i n t h e p H r a n g e o f 5 . 5 - 7 . 5 a n d c a n t o l e r a t e u r e a a n d S D S s o l u t i o n s , a n d c a n t h u s a c t u n d e r d e n a t u r i n g c o n d i t i o n s i n t h e s e q u e n c i n g o f p o l y p e p t i d e s . 1 1 4 T h e e x p e r i m e n t a l p l a n e n t a i l e d r e m o v i n g o f a m i n o a c i d s f r o m t h e C - t e r m i n u s o f t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d p r o t e i n , o n e b y o n e , a n d m o n i t o r i n g t h e m a s s l o s s b y M A L D I t o i d e n t i f y t h e a m i n o a c i d w h i c h b e a r s t h e e x t r a m a s s o f 2 6 8 c o r r e s p o n d i n g t o t h e b o u n d r e t i n a l . F o r a t y p i c a l r e a c t i o n , 1 m g o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t ( o r r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n ) i n 5 0 1 . 1 L T r i s , p H = 8 . 0 b u f f e r w a s m i x e d w i t h 6 1 . 1 L o f 1 0 x 5 0 m M s o d i u m c i t r a t e , p H = 6 . 0 b u f f e r a n d 1 1 1 L o f c a r b o x y p e p t i d a s e Y ( 2 0 u g / 1 . 1 L ) s o l u t i o n ( 1 / 5 0 w / w r a t i o ) . A l t e r n a t i v e l y , t h e s a m e r e a c t i o n w a s s e t u p i n j u s t T r i s , p H = 8 . 0 b u f f e r . T h e r e a c t i o n w a s m o n i t o r e d a s a f u n c t i o n o f t i m e b y M A L D I - T O F a f t e r 1 , 2 , 5 , 1 0 , 1 5 , 2 0 , 3 0 a n d 6 0 m i n , a l t h o u g h a c c o r d i n g t o t h e l i t e r a t u r e a t y p i c a l d i g e s t i o n o c c u r s w i t h i n f e w m i n u t e s . ” 7 0 T h e e n z y m a t i c r e a c t i o n w a s q u e n c h e d u p o n m i x i n g w i t h t h e M A L D I m a t r i x s o l u t i o n ( s i n a p i n i c a c i d i n 3 0 % M e C N , 1 0 % T F A ) d u e t o t h e s i g n i fi c a n t d r o p i n t h e p H o f t h e s o l u t i o n . H o w e v e r , t h e r e a c t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f t h e s o d i u m c i t r a t e b u f f e r c o u l d n o t b e f o l l o w e d d i r e c t l y b y M A L D I b e c a u s e o f t h e g r e a t a m o u n t o f i n o r g a n i c s a l t p r e s e n t , w h i c h d r a m a t i c a l l y d e c r e a s e s t h e i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y . S p e c t r a r e c o r d e d a f t e r e x h a u s t i v e d e s a l t i n g o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e r e v e a l e d n o s i g n o f d i g e s t i o n . F o r t h e r e a c t i o n i n T r i s , p H = 8 . 0 b u f f e r t h e r e w a s n o p r o b l e m o b t a i n i n g M A L D I s p e c t r a . A s b e f o r e , t h o u g h , e v e n a f t e r 3 0 m i n o f r e a c t i o n n o f r a g m e n t a t i o n w a s p r e s e n t i n t h e s p e c t r u m . T h e r e p o r t e d e f f i c i e n c y f o r a n a v e r a g e c a r b o x y p e p t i d a s e r e a c t i o n i s g o o d f o r t h e r e m o v a l o f a t l e a s t t h e f i r s t f o u r a m i n o a c i d s . H o w e v e r , t h a t d i d n o t s e e m t o b e t h e c a s e f o r o u r s y s t e m . O n e e x p l a n a t i o n c o u l d b e t h a t t h e C - t e r m i n u s o f t h e C R A B P H p r o t e i n i s n o t a c c e s s i b l e f o r t h e e n z y m a t i c r e a c t i o n t o o c c u r . H o w e v e r , a s s h o w n i n F i g u r e 2 - 3 1 , 1 1 5 F i g u r e 2 - 3 1 . C r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e a p o f o r m o f W T - C R A B P I I ( t w o d i f f e r e n t v i e w s ) . T h e C - a n d N - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n a r e h i g h l i g h t e d i n r e d a n d g r e e n , r e s p e c t i v e l y . T h e C - t e r m i n u s a p p e a r s a c c e s s i b l e t o e n z y m a t i c d i g e s t i o n . t h a t i s n o t t r u e . I n s t e a d , i t c o u l d b e t h a t t h e q u a l i t y o f t h e p u r c h a s e d e n z y m e w a s n o t a s h i g h a s e x p e c t e d . 2 . 9 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s I m a g e s i n t h i s t h e s i s / d i s s e r t a t i o n a r e p r e s e n t e d i n c o l o r A . P r o t e i n M u t a t i o n , B a c t e r i a l E x p r e s s i o n a n d P u r i fi c a t i o n 1 . P r o t e i n M u t a t i o n M u t a g e n e s i s o f a l l C R A B P I I p r o t e i n s w a s a c c o m p l i s h e d b y u t i l i z i n g S t r a t a g e n e ’ s Q u i k C h a n g e ® p r o t o c o l . T h i s m e t h o d e n t a i l s t h e u s e o f c o m p l i m e n t a r y m u t a t i o n e n c o d i n g 1 1 6 l i n e a r u n m e t h y l a t e d d — _ _ - — - — * — - D p n / _ _ , 9 _ — ¥ — — — _ _ * — L o n e p r o d u c t — U n m u t a t e d M u t a t e d D N A t e m p l a t e D N A F i g u r e 2 - 3 2 . D e p i c t i o n o f S t r a t a g e n e ' s Q u i k C h a n g e ‘ I D S i t e - D i r e c t e d M u t a g e n e s i s P r o t o c o l . T h r o u g h u s e o f t h e r e s t r i c t i o n e n z y m e D p n l , t h e u n w a n t e d t e m p l a t e D N A c a n b e r e m o v e d f r o m t h e d e s i r e d m u t a e d D N A p r o d u c t . p r i m e r s . F o l l o w i n g a t y p i c a l P C R p r o c e s s t h e r e a c t i o n m i x t u r e w i l l c o n t a i n c i r c u l a r p a r e n t a l p l a s m i d D N A ( u n m u t a t e d ) a n d l i n e a r m u t a t e d D N A ( F i g u r e 2 - 3 2 ) . T h e o r i g i n a l t e m p l a t e D N A i s d i f f e r e n t f r o m t h e m u t a t e d D N A , n o t o n l y i n t h a t i t i s c i r c u l a r , b u t a l s o i t h a s m e t h y l a t e d a d e n i n e r e s i d u e s . A s t h e D N A i s c o p i e d i n a b a c t e r i a l h o s t , s o m e o f t h e a d e n i n e b a s e s b e c o m e m e t h y l a t e d . T h e r e s t r i c t i o n e n z y m e D p n I r e c o g n i z e s t h e s p e c i fi c s e q u e n c e G A T C ( b l u n t c u t b e t w e e n A a n d T ) , b u t w i l l o n l y c u t w h e r e m e t h y l a t e d a d e n i n e r e s i d u e s e x i s t . T h e p l a s m i d s u s e d i n o u r s t u d i e s c o n t a i n s e v e r a l c u t s i t e s ( b e t w e e n 1 0 - 2 0 , d e p e n d i n g o n t h e v e c t o r u s e d ) , t h u s i n c u b a t i o n o f t h e P C R p r o d u c t w i t h t h e D p n I r e s t r i c t i o n e n z y m e e f f e c t i v e l y d e s t r o y s t h e p a r e n t a l p l a s m i d a n d l e a v e s o n l y t h e l i n e a r , m u t a t e d D N A . T h e d e s i r e d p r o d u c t D N A c a n t h e n b e i n c o r p o r a t e d i n t o t h e h o s t s t r a i n o f c h o i c e ( J M 1 0 9 o r X L l - B l u e E . c o l i ) . i i . P C R c o n d i t i o n s 1 1 7 T h e P C R c o n d i t i o n s f o r a l l t h e h i s - t a g b e a r i n g C R A B P I I m u t a n t s ( p E T - B l u e 2 v e c t o r ) m e n t i o n e d i n t h i s c h a p t e r h a v e b e e n d e s c r i b e d i n d e t a i l i n R a c h a e l M . C r i s t ’ s t h e s i s . T h e d e t a i l e d c o n d i t i o n s f o r t h e f o r m a t i o n o f a l l t h e n o n - h i s t a g C R A B P I I p r o t e i n s ( p E T - l 7 b v e c t o r ) a r e d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 ( M a t e r i a l a n d M e t h o d s ) . i i i . P r o t e i n E x p r e s s i o n a n d P u r i f i c a t i o n T h e e x p r e s s i o n a n d p u r i f i c a t i o n c o n d i t i o n s f o r a l l t h e h i s - t a g b e a r i n g C R A B P H m u t a n t s ( p E T - B l u e 2 v e c t o r ) m e n t i o n e d i n t h i s c h a p t e r a r e d e s c r i b e d i n d e t a i l i n R a c h a e l M . C r i s t ’ s t h e s i s . T h e d e t a i l e d c o n d i t i o n s f o r t h e e x p r e s s i o n a n d p u r i fi c a t i o n o f a l l t h e n o n - h i s t a g C R A B P H p r o t e i n s ( p E T - 1 7 b v e c t o r ) a r e d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 ( M a t e r i a l a n d M e t h o d s ) . B . P r o t e i n C h a r a c t e r i z a t i o n a n d B i n d i n g A s s a y s i . C a l c u l a t i n g E x t i n c t i o n C o e f f i c i e n t s o f C R A B P I I m u t a n t s T h e a b s o r p t i o n e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s ( 8 ) f o r t h e v a r i o u s C R A B P H m u t a n t s w e r e d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d f i r s t d e s c r i b e d b y G i l l a n d v o n H i p p e l . 7 l T h e 8 a n ( 8 o f d e n a t u r e d p r o t e i n s i n 6 M G u a n i d i n e H C I ) i s d e p e n d a n t p r i m a r i l y o n t h e n u m b e r o f T y r , T r p a n d C y s r e s i d u e s p r e s e n t a n d c a n b e c a l c u l a t e d a c c o r d i n g t o e q u a t i o n : E d e n : a e t y r + b a n - p + c a c y s w h e r e a , b , a n d c r e p r e s e n t t h e n u m b e r o f r e s p e c t i v e a r r r i n o a c i d s p e r m o l e c u l e o f p r o t e i n , a n d t h e i r 6 v a l u e s h a v e b e e n d e t e r m i n e d e x p e r i m e n t a l l y ( s u p = 5 6 9 0 M ' 1 c m " , S t y , = 1 2 8 0 1 1 8 M ' 1 c m ] , 8 c h = 1 2 0 M ' 1 c m ' l , w i l d t y p e C R A B P I I p r o t e i n c o n t a i n s 3 T r p , 2 T y r , a n d 3 C y s r e s i d u e s ) . T w o p r o t e i n s o l u t i o n s a r e p r e p a r e d , a t i d e n t i c a l c o n c e n t r a t i o n s , o n e i n t h e n a t i v e b u f f e r ( 4 m M N a H z P O 4 , 1 6 m M N a z i - I P 0 4 , 1 5 0 m M N a C l , p H = 7 . 3 ) a n d t h e o t h e r i n a d e n a t u r i n g b u f f e r ( 6 M g u a n i d i n e H C I , 4 m M N a H z P O 4 , 1 6 m M N a z H P O 4 , 1 5 0 m M N a C l ) , a n d t h e A s z g o f o r e a c h s a m p l e i s m e a s u r e d . T h e 8 “ , " , t h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t f o r t h e n a t i v e p r o t e i n , c a n b e d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o B e e r ’ s l a w : A b s d e n + E d e n = C d e n A b s n a t + 8 m = c n a t w h e r e A b s i s t h e U V a b s o r b a n c e a t 2 8 0 r u n , u n d e r b o t h n a t i v e a n d d e n a t u r e d c o n d i t i o n s . : ( A b s n a t ) ( E d e n ) 7 1 I “ ( A b s d e n ) S i n c e t h e c o n c e n t r a t i o n o f b o t h s a m p l e s i s t h e s a m e , w e c a n e q u a t e t h e t w o e q u a t i o n s a n d s o l v e f o r t h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t b y : T h e m e a s u r e m e n t m u s t b e r e p e a t e d u n t i l a c o n s i s t e n t n u m b e r i s o b t a i n e d , s i n c e t h e c a l c u l a t e d n u m b e r e d i s w h a t i s u s e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f e a c h C R A B P H m u t a n t f o r a l l t h e f o l l o w i n g s p e c t r o s c o p i c a s s a y s . i i . S p e c t r o s c o p i c a s s a y s a . C i r c u l a r D i c h r o i s m 1 1 9 C i r c u l a r d i c h r o i s m ( C D ) s p e c t r a o f a l l C R A B P I I m u t a n t s w e r e o b t a i n e d i n o r d e r t o v e r i f y t h e c o r r e c t f o l d i n g o f e a c h p r o t e i n . T h e u s e o f C D s p e c t r o s c o p y f o r p r o t e i n c h a r a c t e r i z a t i o n d e p e n d s m o s t l y o n e m p i r i c a l r u l e s a p p l i e d b y c o m p a r i n g t h e o b t a i n e d s p e c t r u m w i t h c h a r a c t e r i s t i c s p e c t r a o f p e p t i d e s w i t h s p e c i fi c f o l d i n g p a t t e r n s . 7 2 T h e C D d a t a g a t h e r e d t h u s f a r h a s o n l y b e e n u s e d a s a c r u d e a n a l y s i s o f t h e p r o t e i n s t r u c t u r e , p r i m a r i l y t o e n s u r e t h e p r e s e n c e o f t h e c h a r a c t e r i s t i c B - s h e e t p e a k . I n s t r u m e n t s e t t i n g s a n d s a m p l e c o n c e n t r a t i o n s w e r e v e r y i m p o r t a n t i n a c q u i r i n g r e p r o d u c i b l e C D s p e c t r a . T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s u s e d h a d t o b e i n t h e r a n g e o f 1 — 5 u M . L o w e r c o n c e n t r a t i o n s g a v e n o i s y s p e c t r a , w h i l e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s p r o d u c e d s p e c t r a w h e r e t h e a m i n o a c i d a b s o r b a n c e o v e r s h a d o w e d t h e s t r u c t u r a l f e a t u r e s . A s i m i l a r p r o b l e m w a s a l s o o b s e r v e d w h e n t h e b a n d w i d t h o f t h e i n s t r u m e n t , w h i c h d e fi n e s h o w m u c h l i g h t i s a l l o w e d t o e n t e r t h e s a m p l e c h a m b e r , w a s s e t h i g h e r t h a n 1 u n i t . I n a t y p i c a l p r o t o c o l , a 5 1 . 1 M s o l u t i o n o f p r o t e i n i n P B S ( 4 m M N a H z P O 4 , 1 6 m M N a z i - I P 0 4 , 1 5 0 m M N a C l , p H = 7 . 3 ) w a s u s e d f o r C D m e a s u r e m e n t ( J A S C O 7 1 0 ) . T h e s p e c t r a w e r e s c a n n e d f r o m 5 0 0 n m t o 2 0 0 n m a t 1 0 0 n m / m i n , w i t h a b a n d w i d t h o f 1 n m . E x t e n d e d d e g a s s i n g o f t h e s a m p l e c h a m b e r w i t h n i t r o g e n m u s t b e p e r f o r m e d t o e n s u r e q u a l i t y s p e c t r a n e a r t h e 2 0 0 n m r e g i o n . b . F l u o r e s c e n c e F l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g i s u s e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s f o r 2 ’ 3 I t i s k n o w n t h a t b i n d i n g o f b o t h r e t i n a ] a n d r e t i n o i c a c i d t o C R A B P I I p r o t e i n s . p r o t e i n s c o n t a i n i n g T r p r e s i d u e s a b s o r b l i g h t a t 2 8 0 n m a n d f l u o r e s c e a t ~ 3 4 0 n m . T h i s f l u o r e s c e n c e c a n b e q u e n c h e d i n t h e p r e s e n c e o f a c h r o m o p h o r e t h a t i s c l o s e b y i n s p a c e , 1 2 0 i . e . b o u n d i n t h e c a v i t y o f t h e p r o t e i n , a n d a b s o r b s l i g h t w i t h i n t h e r e g i o n o f e m i s s i o n . A s t h e c h r o m o p h o r e i s t i t r a t e d i n t o t h e p r o t e i n s o l u t i o n , s o m e a m o u n t o f t h e T r p fl u o r e s c e n c e w i l l b e q u e n c h e d , u n t i l t h e p o c k e t i s fi r l l y s a t u r a t e d a n d n o l o n g e r a c h a n g e i s d e t e c t e d i n t h e T r p fl u o r e s c e n c e . T h e r e f o r e , b y m o n i t o r i n g t h e fl u o r e s c e n c e o f T r p r e s i d u e s i n t h e p r o t e i n a s a f u n c t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f a d d e d c h r o m o p h o r e a n a p p a r e n t d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r t h e l i g a n d - p r o t e i n c o m p l e x c a n b e c a l c u l a t e d ( d e t a i l e d d e s c r i p t i o n f o l l o w s ) . I n t h e c a s e o f C R A B P I I , t h e c r y s t a l s t r u c t u r e r e v e a l s t h r e e T r p F i g u r e 2 - 3 3 . S t e r e o v i e w o f W T - C R A B P I I w i t h r e t i n a l ( c o l o r e d i n b l u e ) b o u n d ( m i n i m i z e d m o d e l ) . B i n d i n g a f fi n i t y o f c h r o m o p h o r e s t o t h e C R A B P I I m u t a n t p r o t e i n s i s m o n i t o r e d b y fl u o r e s c e n c e q u e n c h i n g o f T r p r e s i d u e s . T r p r e s i d u e s a r e c o l o r e d i n g r e e n ( W 1 0 9 , W 8 7 , W 7 ) . r e s i d u e s w i t h i n t h e b i n d i n g s i t e t h a t c a n b e u s e d f o r t h e fl u o r e s c e n c e q u e n c h i n g a s s a y ( F i g u r e 2 - 3 3 ) . D u e t o t h e s e n s i t i v e n a t u r e o f t h e e x p e r i m e n t , t h e o p t i m i z a t i o n o f t h e fl u o r e s c e n c e t i t r a t i o n e x p e r i m e n t s h a s b e e n p a r t i c u l a r l y t e d i o u s . A i r b u b b l e s a n d s m a l l p a r t i c l e s c a u s e n o i s y s p e c t r a , t h e r e f o r e b u f f e r s s h o u l d b e d e g a s s e d a n d s a m p l e s fi l t e r e d b e f o r e u s e d . 7 3 I n a d d i t i o n , i t h a s b e e n f o u n d t h a t t h e o i l y r e s i d u e f r o m fi n g e r p r i n t s c a n d e m o n s t r a t e fl u o r e s c e n c e , s o c a r e h a s t o b e t a k e n n o t t o t o u c h t h e q u a r t z c u v e t t e s . 7 4 W h e n h a n d l i n g 1 2 1 t h e c u v e t t e s l i n t f r e e g l o v e s s h o u l d a l w a y s b e w o r n , a s l i n t o n t h e o u t s i d e o f a c u v e t t e i n t e r f e r e s w i t h t h e r e a d i n g a s w e l l . A l l s a m p l e s s h o u l d b e s t o r e d i n g l a s s c o n t a i n e r s . 7 4 I n t h e c a s e o f p r o t e i n s a m p l e s , s i l a n i z e d g l a s s w a r e s h o u l d b e u s e d , a s m a n y p l a s t i c c o n t a i n e r s w i l l l e a c h fl u o r e s c e n t m a t e r i a l s i n t o t h e s a m p l e . S a m p l e c o n c e n t r a t i o n s a r e a l s o v e r y i m p o r t a n t . L i t e r a t u r e r e p o r t s s u g g e s t t h e u s e o f a s a m p l e c o n c e n t r a t i o n a s c l o s e a s p o s s i b l e t o t h e e x p e c t e d K d , m a i n t a i n i n g a n a c c u r a t e m e a s u r e m e n t . C o n s i d e r i n g t h a t t h e K d v a l u e s w o u l d b e i n t h e n M r a n g e , p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f 5 0 0 n M w a s f o u n d t o b e t h e o p t i m a l f o r o u r e x p e r i m e n t s ; a n y t h i n g l o w e r w o u l d c o m p r o m i s e t h e a c c u r a c y o f o u r e x p e r i m e n t . A t t h e s a m e t i m e , t h e l o w s o l u b i l i t y o f r e t i n a l i n w a t e r c a n c a u s e p r o b l e m s , s i n c e p r e c i p i t a t i o n w h e n h i g h n u m b e r s o f e q u i v a l e n t s a r e a d d e d c a n p r o d u c e c l o u d y s a m p l e s , r e s u l t i n g i n e r r o n e o u s r e s u l t s . I n a d d i t i o n , s i n c e t h e r e t i n a l i s t i t r a t e d i n t o t h e p r o t e i n f r o m a s t o c k i n E t O H o n e m u s t m a k e s u r e t h a t t h e f i n a l E t O H c o n c e n t r a t i o n i s k e p t b e l o w 2 % , t o p r e v e n t p o s s i b l e p r o t e i n d e n a t u r a t i o n . I t h a s a l s o b e e n s h o w n t h a t E t O H c o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n 2 - 8 % c a n r e d s h i f t t h e m a x i m u m w a v e l e n g t h u p t o 4 0 n m . 7 5 A d d i t i o n a l l y , a n o p t i m u m s a l t c o n c e n t r a t i o n m u s t b e u s e d f o r p r o t e i n a n a l y s i s i n b u f f e r . P o l a r s o l v e n t s , i n c l u d i n g w a t e r h a v e b e e n s h o w n t o q u e n c h s o m e a m o u n t o f T r p fl u o r e s c e n c e . 7 6 A h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n ( 1 5 0 m M ) p o t e n t i a l l y h e l p s t o s h i e l d t h e p r o t e i n a n d r e d u c e t h e a m o u n t o f u n w a n t e d q u e n c h i n g . A l l s a l t s u s e d i n t h e b u f f e r m u s t b e o f t h e h i g h e s t g r a d e a v a i l a b l e t o e n s u r e m i n i m a l b a c k g r o u n d fl u o r e s c e n c e . M a i n t e n a n c e o f t e m p e r a t u r e a n d p H o f t h e m e a s u r e m e n t s a m p l e s i s a l s o c r i t i c a l . I f t h e t e m p e r a t u r e r i s e s a b o v e a m b i e n t , t h e w a v e l e n g t h o f t h e T r p e m i s s i o n r e d s h i f t s a n d t h e i n t e n s i t y o f t h e p e a k d e c r e a s e s . A t h i g h e r t e m p e r a t u r e s , t h e e x c i t e d s t a t e c a n r e t u r n t o 1 2 2 t h e g r o u n d s t a t e v i a o t h e r m e a n s s u c h a s p h o s p h o r e s c e n c e . ” 7 7 L i k e w i s e , a n o p t i m a l p H i s r e q u i r e d f o r t h e p r o t e i n s a m p l e , i f i t i s e i t h e r t o o a c i d i c o r t o o b a s i c , t h e p r o t e i n s a m p l e m a y d e n a t u r e . 7 8 T y p i c a l p r o t e i n s a m p l e s h a v e a T r p e m i s s i o n i n t h e r a n g e o f 3 3 0 — 3 5 0 n m , b u t t h i s v a r i e s w i t h t h e p r o t e i n , t h e n u m b e r o f T r p r e s i d u e s , a n d w h e t h e r o r n o t t h e y ( 1 . 7 9 ' 8 1 F r e e T r p e m i t s a t 3 6 5 n m . A d e n a t u r e d p r o t e i n w i l l r e d s h i f t a r e s o l v e n t e x p o s e t o w a r d s 3 6 5 n m a n d p r o v i d e a f a l s e s a t u r a t i o n p o i n t f o r t h e t i t r a t i o n . A n o t h e r p o i n t o f c o n c e r n i s t h e f a c t t h a t p r o t e i n s t e n d t o s t i c k t o t h e s u r f a c e o f g l a s s . W h e n s t o r i n g t h e s a m p l e s , s i l a n i z e d g l a s s w a r e s h o u l d b e u s e d t o a v o i d l o s s o f p r o t e i n a n d a c h a n g e i n p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n . W h e n p e r f o r m i n g t h e a c t u a l fl u o r e s c e n c e t i t r a t i o n w i t h l o w c o n c e n t r a t i o n o f p r o t e i n a d u m m y p r o t e i n , s u c h a s g e l a t i n , s h o u l d b e u s e d t o s t a b i l i z e t h e p r o t e i n a n d a v o i d l o s s d u e t o b i n d i n g w i t h t h e s u r f a c e o f t h e c u v e t t e . G e l a t i n d o e s n o t c o n t a i n T r p r e s i d u e s , t h e r e f o r e i t w i l l n o t i n t e r f e r e w i t h t h e fl u o r e s c e n c e m e a s u r e m e n t s . A f i n a l n o t e t o m e n t i o n i s t h e f a c t t h a t r e t i n a l a l o n e a c t u a l l y i n t e r f e r e s t o s o m e e x t e n d w i t h t h e T r p fl u o r e s c e n c e d e t e c t i o n . T h e f r e e c h r o m o p h o r e c a n q u e n c h s o m e o f t h e T r p e m i s s i o n . T o c o r r e c t f o r t h i s , o n e m u s t p e r f o r m a b l a n k t i t r a t i o n w i t h N - a c e t y l t r y p t o p h a n a m i d e , a n d a d d b a c k t h i s l o s t fl u o r e s c e n c e . 8 2 D e t a i l s o f t h i s p r o c e s s a r e d e s c r i b e d b e l o w . I n t e r e s t i n g l y h o w e v e r , r e t i n o i c a c i d , w h i c h h a s a c l o s e r A m ” v a l u e t o t h e T r p e m i s s i o n w a v e l e n g t h , d o e s n o t h a v e t h e s a m e e f f e c t . G e n e r a l p r o t o c o l f o l l o w e d f o r F l u o r e s c e n c e Q u e n c h i n g a n d K , d e t e r m i n a t i o n e x p e r i m e n t s . 1 2 3 T h e c u v e t t e i s a l l o w e d t o s i t w i t h 3 m L o f a 0 . 0 1 % g e l a t i n c o n t a i n i n g P B S ( 4 m M N a H z P O 4 , 1 6 m M N a z i - I P 0 4 , 1 5 0 m M N a C l , p H = 7 . 3 ) f o r 3 0 - 6 0 m i n . T h i s b u f f e r i s d i s c a r d e d a n d t h e c e l l i s r i n s e d o n c e w i t h d i s t i l l e d w a t e r . T h e c u v e t t e s a r e a l l h a n d l e d w h i l e w e a r i n g g l o v e s s o a s t o a v o i d b o t h f i n g e r p r i n t s a n d l i n t . T h e n 3 m L o f a r o o m t e m p e r a t u r e 5 0 0 n M p r o t e i n i s a d d e d t o t h e c e l l . T h e s a m p l e i s e x c i t e d a t 2 8 3 n m w i t h a s l i t w i d t h a b o u t 1 . 5 n m ( t h i s v a r i e s i n o r d e r t o e n s u r e t h a t t h e i n t e n s i t y o f e a c h s a m p l e r e m a i n s b e l o w o n e m i l l i o n c o u n t s ) . T h e fl u o r e s c e n c e i s m e a s u r e d a t t h e p e a k m a x i m u m , a b o u t 3 4 5 n m ( v a r i e s w i t h d i f f e r e n t p r o t e i n s ) . T h e c h r o m o p h o r e i s a d d e d a t v a r y i n g e q u i v a l e n t s f r o m a ~ 1 . 5 m M s t o c k ( i n 9 5 % s p e c t r o s c o p y g r a d e E t O H ) s a m p l e m a i n t a i n e d i n t h e d a r k . A m e a s u r e m e n t i s t a k e n a f t e r e a c h a d d i t i o n a t t h e s a m e w a v e l e n g t h . T h e r e s u l t s a r e p l o t t e d a s c o n c e n t r a t i o n o f c h r o m o p h o r e v e r s u s r e l a t i v e fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y . W h e n t h e c u r v e l e v e l s o f f , t h e t i t r a t i o n i s c o m p l e t e . I f t h e c h r o m o p h o r e i s a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d ( S i g m a , 8 = 4 5 , 0 0 0 M ' 1 c m ' l , 2 1 m , = 3 5 0 n m ) , t h e d a t a c a n b e p l o t t e d a s i s . T h e r e i s m i n i m a l e f f e c t o f r e t i n o i c a c i d o n t h e T r p e m i s s i o n a s s e e n i n a b l a n k t i t r a t i o n r u n w i t h N - a c e t y l t r y p t o p h a n a m i d e . I f t h e c h r o m o p h o r e i s a l l - t r a n s - r e t i n a l ( T o r o n t o R e s e a r c h C o m p a n y , 8 = 4 8 , 0 0 0 M ' 1 c m " , A m , = 3 8 0 n m ) , a b l a n k t i t r a t i o n m u s t b e r u n w i t h 3 m L o f 1 . 5 1 1 M N - a c e t y l t r y p t o p h a n a m i d e . T h e p e a k m a x i m u m f o r t h e b l a n k i s a t 3 6 5 n m . T h i s c u r v e i s p l o t t e d a s c o n c e n t r a t i o n o f r e t i n a l v e r s u s c h a n g e i n i n t e n s i t y . T h e r e t i n a l a b s o r b s s o m e o f t h e e m i s s i o n o b s e r v e d t h r o u g h t h e T r p r e s i d u e s . T h i s w i l l b e a d d e d b a c k i n t o e a c h o f t h e p r o t e i n / c h r o m o p h o r e t i t r a t i o n s . T h e c o r r e c t i o n f o r t h e r e t i n a l t i t r a t i o n s i n v o l v e s a f o u r s t e p c a l c u l a t i o n a f t e r c o m p l e t i o n o f b o t h t h e p r o t e i n t i t r a t i o n a n d t h e b l a n k t i t r a t i o n . 8 2 1 2 4 F m a x _ F F m a x — F o F m a x = fl u o r e s c e n c e u p o n s a t u r a t i o n F , , = i n i t i a l fl u o r e s c e n c e F = o b s e r v e d fl u o r e s c e n c e a : f r a c t i o n o f f r e e b i n d i n g s i t e s 1 . D e t e r m i n e t h e f r e e l i g a n d c o n c e n t r a t i o n , R . R = R 0 — n P , , ( l - a ) R 0 = l i g a n d c o n c e n t r a t i o n 1 1 = n u m b e r o f b i n d i n g s i t e s / p r o t e i n , a s s u m e n = 1 P 0 2 p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n 2 . F i n d fl u o r e s c e n c e c o n t r i b u t i o n o f f r e e l i g a n d , F R , t o b e d e d u c e d f r o m b l a n k ( s e e s o l v e d e x a m p l e b e l o w ) . 3 . S u b t r a c t fl u o r e s c e n c e c o n t r i b u t i o n o f f r e e l i g a n d f r o m a c t u a l r e a d i n g s , p l o t v s . l i g a n d c o n c e n t r a t i o n . ( F — F R ) v s . R 0 A n e x a m p l e o f t h e c o r r e c t i o n p r o c e d u r e i s g i v e n b e l o w . F i r s t , a t i t r a t i o n i s p e r f o r m e d w i t h r e t i n a l i n t o a 3 m L s o l u t i o n o f 1 . 5 M N - a c e t y l t r y p t o p h a n a m i d e i n P B S . R e s u l t s o f t h i s e x p e r i m e n t a r e s h o w n a b o v e ( T a b l e 2 - 4 , n o t a l l d a t a p o i n t s a r e s h o w n ) . T h e T r p fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y i s r e c o r d e d a t 3 6 5 n m f o r e a c h a d d i t i o n o f r e t i n a l , w h i c h i s 1 2 5 T a b l e 2 - 4 . B l a n k t i t r a t i o n o f N - a c e t y l t r y p t o p h a n a m i d e w i t h r e t i n a l . l n t e n s i a t R e l a t i v e [ R H M 3 6 5 t y 7 I n t e n s i t y . 0 ' . 9 6 4 2 7 8 1 A 5 5 - 0 8 9 5 9 0 7 8 0 . 9 9 4 6 0 7 3 6 4 1 5 4 0 7 9 5 5 2 9 4 , , 0 9 9 0 6 8 3 1 8 5 1 . 5 5 - 0 7 9 5 3 8 4 8 0 . 9 8 9 1 8 3 6 1 7 2 1 5 - 0 7 , 9 4 9 3 8 8 0 9 8 4 5 5 8 3 9 5 2 . 5 E - 0 7 ’ 9 4 5 5 0 8 1 0 9 8 0 5 3 4 6 5 9 ’ 3 1 5 - 0 7 9 4 0 9 4 5 0 9 7 5 8 0 2 6 2 1 3 . 5 5 - 0 7 ~ 9 3 7 6 9 9 0 9 7 2 4 3 6 3 7 2 , 4 1 5 - 0 7 9 3 4 7 3 4 0 . 9 6 9 3 6 1 5 3 3 4 . 5 E - 0 7 9 3 3 8 2 0 0 . 9 6 8 4 1 3 6 7 3 5 1 5 - 0 7 9 3 1 0 2 7 0 9 6 5 5 1 7 2 0 6 ’ 6 E - 0 7 9 2 5 2 2 8 . . 0 9 5 9 5 0 3 3 8 t h e n c o n v e r t e d t o a r e l a t i v e i n t e n s i t y b y d i v i d i n g a l l i n t e n s i t y v a l u e s b y t h e i n i t i a l i n t e n s i t y r e a d i n g ( 9 6 4 , 2 7 8 i n t h i s e x a m p l e ) . R e l a t i v e v a l u e s a r e u s e d s o t h a t a l l t i t r a t i o n c u r v e s c o u l d b e p l o t t e d o n t h e s a m e s c a l e . T h e s e ' d a t a p o i n t s a r e t h e n p l o t t e d a s r e l a t i v e l o s s i n i n t e n s i t y v e r s u s r e t i n a l c o n c e n t r a t i o n , a n d fi t t e d t o a c u r v e t o g e n e r a t e a n e q u a t i o n . F o r t h e a b o v e e x a m p l e : y = 5 1 3 - 0 5 1 1 2 — 0 . 0 1 2 x — 0 . 0 2 5 7 ( 1 ) T h e s a m e r e t i n a l s o l u t i o n i s u s e d t o t i t r a t e t h e d e s i r e d C R A B P I I p r o t e i n . F l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y i s m e a s u r e d a t a p p r o x i m a t e l y 3 4 7 n m ( p r o t e i n d e p e n d e n t ) , a n d t h e s e v a l u e s a r e a g a i n c o n v e r t e d t o r e l a t i v e i n t e n s i t y r e a d i n g s a s e a c h v a l u e i s d i v i d e d b y t h e i n i t i a l fl u o r e s c e n c e v a l u e ( f o r o u r e x a m p l e 7 2 0 , 9 6 1 , s e e T a b l e 2 - 5 ) . A s p l o t t e d , w i t h o u t t h e c o r r e c t i o n , t h e r e i s n o l e v e l i n g o f f o r s a t u r a t i o n p o i n t i n t h e c u r v e s i n c e t h e e x c e s s r e t i n a l c o n t i n u e s t o q u e n c h t h e fl u o r e s c e n c e ( F i g u r e 2 - 3 4 ) . [ I f t h e a s s a y i s p e r f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f r e t i n o i c a c i d , i n s t e a d o f r e t i n a l , t h i s s e t o f d a t a i s w h a t 1 2 6 T a b l e 2 - 5 . T i t r a t i o n o f C R A B P I I p r o t e i n w i t h r e t i n a l ( o n l y r e p r e s e n t a t i v e p o i n t s a r e s h o w n ) . [ R t ] M V . E q u i v a l e n t s I n t e n s i t y a t : R e l a t i v e , . . . . R t . 3 4 7 _ _ . . l n t e n s r t y . 0 0 7 2 0 9 6 1 ' 1 5 1 5 - 0 8 0 . 1 6 8 1 6 9 4 0 . 9 4 4 1 E - 0 7 0 . 2 6 5 8 2 2 6 ’ 0 . 9 1 0 5 1 . 5 5 - 0 7 0 . 3 6 3 7 3 5 6 f 0 . 8 8 0 7 H 2 . 5 - 0 . 7 . 0 - 4 , _ . 6 2 0 9 5 9 - ~ . 0 8 , 5 7 3 - 2 5 5 - 0 7 . 0 . 5 6 0 4 3 2 4 0 . 8 3 3 6 3 1 3 - 0 7 . 0 . 6 5 9 3 7 7 8 ; 0 . 8 1 8 6 3 . 5 E - 0 7 ” 0 . 7 . 5 7 9 1 5 6 0 . 7 9 7 7 4 E - 0 7 ' 0 . 8 5 6 8 2 5 7 ‘ 0 . 7 8 2 2 4 . 5 1 5 0 7 V 0 . 9 5 6 2 7 4 6 0 . 7 7 4 3 5 1 2 - 0 7 f 1 5 5 1 2 3 3 0 . 7 5 7 9 : 6 E - 0 7 1 . 2 5 3 9 6 8 7 0 . 7 4 1 4 7 1 5 - 0 7 1 . 4 5 2 0 8 0 1 . 0 . 7 1 4 4 _ . 1 8 E - 0 7 ; 1 . 6 5 1 6 5 6 9 0 . 7 0 8 4 " , 9 E - O 7 ; 1 . 8 5 0 5 5 8 0 0 . 6 9 2 7 1 E - 0 6 2 4 9 9 1 9 5 x 0 . 6 8 3 6 1 . 5 E - 0 6 3 4 7 5 9 1 0 0 . 6 5 0 4 ‘ 2 E - 0 6 ‘ 4 4 5 4 6 6 1 0 . 6 2 0 1 A 3 E - 0 6 6 4 2 8 8 9 2 0 . 5 8 3 3 4 E - 0 6 8 4 0 9 5 9 4 0 . 5 5 5 8 . 5 E - 0 6 1 0 3 9 2 2 1 8 0 . 5 3 1 i m p o r t e d t o S i g m a P l o t f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e K d , s i n c e , a s d i s c u s s e d b e f o r e , f r e e r e t i n o i c a c i d d o e s n o t q u e n c h t h e fl u o r e s c e n c e l C o r r e c t i o n p r o c e d u r e s b e g i n w i t h c a l c u l a t i o n o f t h e f r a c t i o n o f f r e e b i n d i n g s i t e s , A A V 0 0 5 0 0 . 9 - 8 3 O . 8 ~ 2 L L a , 0 . 7 — . 2 E 0 . 6 ~ 3 0 . 5 I T l i i 0 2 4 6 8 1 0 E q u i v a l e n t s R e t i n a l F i g u r e 2 - 3 4 . F l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g u p o n a d d i t i o n o f r e t i n a l t o C R A B P I I ( u n c o r r e c t e d d a t a ) . 1 2 7 ’ ( 1 , u s i n g t h e e q u a t i o n : F m - F F m a x — F 0 F m = fl u o r e s c e n c e u p o n s a t u r a t i o n = 0 . 5 3 F 0 = i n i t i a l fl u o r e s c e n c e = 1 F = o b s e r v e d fl u o r e s c e n c e T h i s v a l u e i s u s e d t o d e t e r m i n e t h e f r e e l i g a n d c o n c e n t r a t i o n , R , f o r e a c h m e a s u r e m e n t . R = R 0 - n P o ( l - a ) R 0 = l i g a n d c o n c e n t r a t i o n a t t h a t fl u o r e s c e n t m e a s u r e m e n t n = n u m b e r o f b i n d i n g s i t e s / p r o t e i n , a s s u m e n = 1 P 0 = p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n = S e ’ 7 M N e x t , t h e fl u o r e s c e n c e c o n t r i b u t i o n o f f r e e l i g a n d , F R , i s t o b e d e d u c e d f r o m t h e e q u a t i o n a c q u i r e d d u r i n g t h e b l a n k t i t r a t i o n a n d t h e f r e e l i g a n d c o n c e n t r a t i o n , R , a s j u s t d e t e r m i n e d . F R = 5 3 0 5 1 1 2 — 0 . 0 1 2 R — 0 . 0 2 5 7 F i n a l l y , t h e fl u o r e s c e n c e c o n t r i b u t i o n o f f r e e l i g a n d i s s u b t r a c t e d f r o m t h e a c t u a l i n t e n s i t y r e a d i n g s a n d p l o t t e d v e r s u s r e t i n a l c o n c e n t r a t i o n o r e q u i v a l e n t s . ( F - F R ) v s . [ R t ] 1 2 8 e c n e c s e r o u l F e v i t a l e R F i g u r e 2 - 3 5 d e p i c t s t h e g r a p h o f t h e c o r r e c t e d r e l a t i v e fl u o r e s c e n c e v a l u e s ( F — F R ) v e r s u s 7 l R t I M ' f . 5 5 : 0 3 f , , 1 E - 0 7 2 E - 0 7 2 . 5 2 0 7 3 1 3 - 0 7 ‘ 3 . 5 5 4 0 7 f 4 1 5 - 0 7 4 . 5 6 - 0 7 5 1 5 - 0 7 7 E - 0 7 , 8 E - 0 7 " 9 1 5 - 0 7 . 1 E - 0 6 ' _ 1 . 5 E - 0 6 ’ 2 E - 0 6 3 E - 0 6 ” ‘ ' 4 1 5 - 0 6 . 5 5 0 6 ] 8 ' A 9 ‘ . 1 f 0 . 9 2 1 5 6 1 ' . _ p 9 8 7 4 6 8 2 1 . 5 E - 0 7 _ 0 . 8 3 2 9 9 3 . 0 3 . 0 . 0 2 3 9 ' 0 . 7 6 7 0 0 9 , 0 . 7 4 5 9 4 3 _ 0 . 7 1 6 7 3 4 1 0 . 6 9 4 9 6 3 . 0 5 3 3 9 5 4 " - 0 5 5 0 9 5 6 f 0 . 6 3 7 8 9 2 0 . 6 0 0 1 6 6 0 . 5 9 1 7 1 2 , 0 . 5 6 9 7 6 1 . 0 . 5 5 7 0 0 7 0 . 5 2 7 7 0 . 4 5 5 2 6 0 . 4 2 5 3 1 7 . 0 . 3 7 8 0 2 2 0 . 3 4 3 3 1 3 _ . 0 . 1 . 0 8 E - 0 8 ' 3 7 3 5 - 0 8 : ‘ 6 . 6 5 1 3 4 0 8 w fi l l - 0 2 3 0 . 9 7 1 0 0 2 8 8 9 5 9 1 E - 0 7 ? 1 . 3 4 1 3 0 7 7 1 7 3 5 - 0 7 2 9 8 5 - 0 7 5 2 4 7 1 3 - 0 7 : 2 . 9 2 E - 0 7 : . - ; 3 9 5 - 0 . 7 L ) 4 . 1 9 E - 0 7 i 5 E - 0 7 5 . 9 6 E - 0 7 6 8 5 6 - 0 7 . + 7 7 9 2 - 0 7 ? . 1 . 0 6 E - 0 6 : 1 . 9 3 E - 0 6 i 2 5 1 1 5 - 0 6 3 5 9 5 - 0 6 ; 0 0 0 2 5 9 5 8 3 ‘ - 0 . 0 2 6 5 9 4 6 0 0 2 7 2 9 2 7 4 0 0 2 9 8 3 9 3 3 1 3 - 0 . 3 0 5 . 3 4 3 . - 0 . 0 3 1 6 1 8 6 9 9 3 2 5 8 0 2 0 0 3 3 5 9 8 1 i l l - ” 0 3 5 7 0 4 9 . " - f fi l l - 0 3 . 7 . 6 3 4 5 . 0 0 3 9 9 0 8 7 0 . 0 4 2 0 1 9 4 - 0 . 0 4 4 2 3 5 6 T a b l e 2 - 6 . C o r r e c t e d f l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n o f C R A B P I I w i t h r e t i n a l . ' ‘ F a f , " F - F e 1 w 0 . 9 6 9 9 4 0 . 9 3 7 0 9 6 : 0 . 9 0 8 0 2 1 } ; . 0 e 8 3 5 4 3 3 . 0 . 8 6 2 5 ? 0 . 8 4 8 3 9 8 5 1 . 0 . . - 3 2 8 _ 3 _ 3 . 4 ; 0 . 8 1 3 7 6 9 V . 0 . 8 0 6 9 6 9 9 7 2 1 4 6 2 . : 0 . 7 7 7 0 9 7 f 0 . 7 5 2 0 8 4 ; 0 7 4 8 3 2 ; 0 . 7 3 4 7 5 4 ( 1 0 7 2 7 8 6 1 : 0 0 5 0 9 6 8 8 ' 0 - 0 7 1 1 5 2 5 “ 1 0 0 8 4 6 5 3 2 0 1 1 1 3 8 5 4 ' 9 4 . 1 3 . 3 2 9 . 1 4 H 0 . 7 1 3 6 6 5 2 0 . 6 8 2 1 1 4 0 . 6 7 4 2 2 9 1 0 . 6 6 7 1 8 5 ‘ 9 6 . 6 . 4 3 0 2 r e t i n a l c o n c e n t r a t i o n ( o r e q u i v a l e n t s ) , i n d i c a t i n g a c l e a r s a t u r a t i o n p o i n t . F i g u r e 2 - 3 5 . F l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g u p o n a d d i t i o n o f r e t i n a l t o 1 0 . 9 - 0 . 8 — 0 . 7 4 0 . 6 l V I O 2 4 6 E q u i v a l e n t s R e t i n a l C R A B P I I ( c o r r e c t e d d a t a ) . 1 2 9 1 0 T h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t i s c a l c u l a t e d w i t h t h e p r o g r a m S i g m a P l o t t h r o u g h n o n - 8 3 W i t h i n S i g m a P l o t , t h e c o r r e c t e d r e l a t i v e l i n e a r l e a s t s q u a r e r e g r e s s i o n a n a l y s i s . 3 ’ fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t i e s a r e p l o t t e d a g a i n s t t h e c o n c e n t r a t i o n o f r e t i n a l . T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n a n d t h e fi n a l fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y u p o n s a t u r a t i o n a r e t h e o t h e r t w o v a l u e s n e e d e d t o s o l v e t h e e q u a t i o n f o r t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t : 2 P t 2 { 2 4 ] , m . + K . - ( ( 2 + R , + K . > 2 - 4 2 R , ) F = o b s e r v e d fl u o r e s c e n c e F f : fl u o r e s c e n c e o f f r e e p r o t e i n F b = fl u o r e s c e n c e o f b o u n d p r o t e i n P , = t o t a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n , = t o t a l c h r o m o p h o r e c o n c e n t r a t i o n A s i n p u t i n t o S i g m a P l o t ( f o r o u r s p e c i f i c e x a m p l e ) : y = p 1 + p 1 * ( ( p 2 / p 1 - 1 ) * ( p 3 + x + k - ( ( p 3 + x + K d ) " 2 - 4 * p 3 * x ) " 0 . 5 ) ) / ( 2 * p 3 ) y = fl u o r e s c e n c e v a l u e x = c h r o m o p h o r e c o n c e n t r a t i o n p 1 = i n i t i a l fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y = 1 p 2 = fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y u p o n s a t u r a t i o n = 0 . 6 6 p 3 = p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n = 5 * 1 0 " ( - 7 ) 0 C l e a n i n g o f F l u o r e s c e n c e C u v e t t e s : 1 3 0 A s b o t h f i n g e r p r i n t s a n d p r o t e i n r e s i d u e o n t h e s u r f a c e o f t h e fl u o r e s c e n c e c e l l s m a y c a u s e i n t e r f e r e n c e i n t h e m e a s u r e m e n t s , t h e y s h o u l d b e t h o r o u g h l y c l e a n e d r e g u l a r l y , d e p e n d i n g o n v o l u m e o f u s e . A p r o p e r c l e a n i n g p r o c e d u r e e n t a i l s : 1 . S o a k 2 4 h i n c h r o m i c a c i d , t h e n r i n s e w i t h w a t e r . 2 . S o a k 8 h i n a K O H / M e O H s o l u t i o n ( 2 0 p e l l e t s / 1 0 0 m L ) , t h e n r i n s e w i t h w a t e r . 3 . S o a k 4 h i n H N O 3 , t h e n r i n s e w i t h w a t e r c . U V - v i s t i t r a t i o n s o f C R A B P I I w i t h r e t i n a l A s t o c k s o l u t i o n o f r e t i n a l ( T o r o n t o R e s e a r c h C o m p a n y , 8 = 4 8 , 0 0 0 M ’ l c m ' l , A m , = 3 8 0 n m ) w a s p r e p a r e d i n 9 5 % s p e c t r o s c o p y g r a d e E t O H . F o r a 5 “ M p r o t e i n s o l u t i o n i n P B S ( 4 m M N a H z P O 4 , 1 6 m M N a z H P O 4 , 1 5 0 m M N a C l , p H = 7 . 3 ) , t h e r e t i n a l s t o c k s o l u t i o n i s m a d e a t 2 . 5 m M . I n t h i s c a s e , 2 1 . 1 L o f t h e r e t i n a l s o l u t i o n w i l l b e 0 . 1 e q u i v a l e n t s . A d d i t i o n s f r o m 0 . 1 — 2 . 0 e q u i v a l e n t s a t 0 . 1 e q u i v a l e n t i n c r e m e n t s w e r e a d d e d a n d s p e c t r a r e c o r d e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f r o m 2 0 0 - 6 0 0 n m ( L a m b d a 4 0 , P e r k i n E l m e r a n d C a r y W i n U v , V a r i a n ) . T h e 2 n d d e r i v a t i v e o f t h e s p e c t r a w a s c a l c u l a t e d b y u s i n g t h e c o r r e s p o n d i n g s o f t w a r e p r o v i d e d w i t h t h e U V i n s t r u m e n t . T h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e A m , o f a U V p e a k u s i n g m a t h e m a t i c a l e q u a t i o n s h a s b e e n e s t a b l i s h e d a s a v a l i d m e t h o d , a n d h a s b e e n u s e d i n a v a r i e t y o f a p p l i c a t i o n s . 8 4 ' 8 9 1 3 1 A s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d , a l l t h e U V d a t a d i s c u s s e d a n d s h o w n i n t a b l e s r e f e r t o s p e c t r a r e c o r d e d i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 1 — 0 . 2 e q u i v a l e n t s o f a l l - t r a n s - r e t i n a l , u n l e s s o t h e r w i s e n o t e d . A l t h o u g h t h e t i t r a t i o n o f a p r o t e i n s o l u t i o n w i t h r e t i n a l w a s c a r r i e d o u t f o r u p t o a t l e a s t 1 e q u i v o f s u b s t r a t e , f o r m o s t c a s e s t h e s p e c t r a l b e h a v i o r w a s a l t e r e d i n t h e p r e s e n c e o f m o r e t h a n 0 . 3 e q u i v ( t h e U V s p e c t r a o f e a c h p r o t e i n a r e s h o w n i n t h e A p p e n d i x ) . I n p a r t i c u l a r , i f a p r o t e i n r e v e a l s a r e d - s h i f t e d p e a k i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 1 e q u i v o f r e t i n a l , u p o n a d d i t i o n o f a d d i t i o n a l c h r o m o p h o r e t h e A W s h i f t s b a c k , r e s e m b l i n g t h a t o f f r e e r e t i n a l , ~ 3 8 0 n m . T h e r e d s h i f t e d p e a k c a n s t i l l b e d e t e c t e d w h e n t h e 2 “ d d e r i v a t i v e i s c a l c u l a t e d , a t l e a s t i n t h e p r e s e n c e o f u p t o 1 e q u i v o f r e t i n a l . A l t h o u g h t h e o r i g i n o f t h i s b e h a v i o r i s n o t c l e a r , w e b e l i e v e t h a t i t m a y b e d u e t o r n i s f o l d i n g o f t h e p r o t e i n . T h a t i s , w e c a n b e c o n fi d e n t a b o u t t h e w o r k i n g c o n c e n t r a t i o n o f t h e p r o t e i n s o l u t i o n , s i n c e i t i s d e t e r m i n e d b y U V a c c o r d i n g t o a c a l c u l a t e d e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t . H o w e v e r , w e c a n n o t d e t e r m i n e i f p a r t o f t h i s p r o t e i n i s m i s f o l d e d , a n d i f s o h o w m u c h . T h e r e f o r e , i t w a s d e c i d e d t h a t a l l t h e d a t a s h o u l d b e p r e s e n t e d a t l o w e q u i v a l e n t s , a t w h i c h p o i n t a d i r e c t c o m p a r i s o n o f t h e U V b e h a v i o r i s p o s s i b l e . ( 1 . M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s i . D e s c r i p t i o n A n a d d i t i o n a l b i n d i n g a s s a y p e r f o r m e d o n e a c h C R A B P H m u t a n t i n v o l v e s t h e u s e o f t w o M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s . T h e f i r s t o f t h e s e e x p e r i m e n t s i s t h e i n c u b a t i o n o f r e t i n a l w i t h t h e p r o t e i n . S u f fi c i e n t t i m e ( 1 - 2 h ) i s a l l o w e d f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n t o 1 3 2 n r e e g a t i v e l y c h m a i n s a s a a y r e g e d p l l o w r r o e t s e i i d n u ( p H = 8 ) b i n d s t e o n t h e t o p o f t h o e W 1 : b d e e t t w e e e c t e n d t i r b e y n M a l A L a D r l d i - Y p / T t O h F e . r S o c t h e i i f n f L y b s 1 3 2 c a a n s e b o e r t a k e p l a c e , t h e s a m p l e i s t h e n w a s h e d w i t h e t h a n o l a n d c o n c e n t r a t e d . T h e c o v a l e n t b o n d b e t w e e n r e t i n a ] a n d t h e p r o t e i n , i f f o r m e d , c a n b e d e t e c t e d a s a n [ M + 2 6 6 ] ’ r p e a k i n t h e M A L D I - T O F s p e c t r u m . I n a d d i t i o n , r e d u c t i v e a m i n a t i o n o f t h i s i n c u b a t e d s a m p l e w i t h N a C N B H 3 w i l l b e p e r f o r m e d t o c o v a l e n t l y t r a p t h e r e t i n a l m o l e c u l e w i t h t h e p r o t e i n ( F i g u r e 2 - 3 6 ) . 9 0 T h e n e c e s s i t y f o r b o t h M A L D I — T O F e x p e r i m e n t s a r i s e s f r o m t h e f a c t t h a t s o m e S c h i f f b a s e s , p r o t o n a t e d o r n o t , m a y n o t b e s t a b l e e n o u g h t o b e t r a p p e d u n d e r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n c o n d i t i o n s , b u t W i l l s u r v r v e t h e w o r k - u p f r o m t h e H 2 " A 1 " L y s 1 3 2 i n c u b a t i o n l o n g e n o u g h t o b e d e t e c t e d . l l S i n c e a n e x c e s s o f r e t i n a l i s u s e d f o r . . . . \ \ \ \ \ N A a " L y s 1 3 2 t h e r e d u c t i v e a m r n a t r o n r e a c t i o n , t h e n o n - l [ M + 2 6 6 ] j c o v a l e n t l y b o u n d c h r o m o p h o r e m u s t b e I s e p a r a t e d b e f o r e t h e M A L D I s p e c t r a a r e e . / \ r e c o r d e d . I n o r d e r t o d o t h a t , t h e r e a c t i o n I \ \ \ \ \ l j ‘ , i t " L y s l 3 2 m i x t u r e i s l o a d e d o n t o a F a s t Q c o l u m n I E ( q u a t e r n a r y a m m o n i u m r e s i n ) . T h e i t h e r e s i n a n d c a n b e e l u t e d w i t h h i g h [ 1 1 . 1 2 6 3 1 3 ' 1 . T h f t ' 1 c o n c e n t r a t i o n 0 f N a C e r e e r e m a F i g u r e 2 - 3 6 . C o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n c o l u m n . T h e f r a c t i o n s c o n t a i n i n g p r o t e i n P S B f o r m a t i o n c a n b e s e e n a s a n [ M + 2 6 6 ] ” a r e c o m b i n e d , c o n c e n t r a t e d a n d t h e o r “ “ 2 6 7 1 p e a k , r e s p e c t i v e l y . 8 0 t h s p e c i e s c a n b e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d a n d M A L D I — T O F s p e c t r a a r e r e c o r d e d . t r a p p e d a s a n [ M + 2 6 8 ] * s p e c i e s . 1 3 3 T h e M A L D I _ T O F s p e c t r a f o r e i t h e r t h e i n c u b a t i o n o r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n s c a n o n l y b e e v a l u a t e d q u a l i t a t i v e l y a n d n o t q u a n t i t a t i v e l y . T h a t i s , b a s e d o n p e a k r a t i o s , w e c a n n o t d e t e r m i n e h o w m u c h o f t h e p r o t e i n s a m p l e i s b o u n d t o a r e t i n a l m o l e c u l e . R e t i n a l a b s o r b s n e a r t h e f r e q u e n c y o f t h e l a s e r a n d o f t e n d o e s n o t i o n i z e a s e f fi c i e n t l y a s t h e f r e e p r o t e i n . A d d i t i o n a l l y , t h e p e a k r a t i o s m a y v a r y b a s e d o n h o w w e l l t h e m i x t u r e c o - c r y s t a l l i z e s w i t h t h e m a t r i x a n d t h e p h y s i c a l l o c a t i o n o f t h e l a s e r s h o t o n t o t h e s a m p l e . O f t e n , o n e s a m p l e w i l l p r o d u c e v e r y d i f f e r e n t p e a k r a t i o s d e p e n d i n g o n w h e r e t h e l a s e r i s a i m e d . A f i n a l n o t e t o m e n t i o n a b o u t M A L D I - T O F s p e c t r a i s t h a t t h e y a r e a c q u i r e d a s a r e s u l t o f c o - c r y s t a l l i z a t i o n w i t h s i n a p i n i c a c i d a s t h e m a t r i x . G e n e r a l l y , i t i s v e r y c o m m o n f o r m a t r i x a d d u c t i o n s [ M + m a t r i x + H ] + t o b e o b s e r v e d i n M A L D I s p e c t r a . ( f o r s i n a p i n i c a c i d t h a t w o u l d b e M + 2 2 4 ) . 9 1 I n t h e c a s e o f s i n a p i n i c a c i d o t h e r s h a v e a l s o o b s e r v e d s a t e l l i t e p e a k s a t h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t t h a t c o r r e s p o n d t o t h e p h o t o d e h y d r a t i o n a d d u c t s [ M + n 2 0 6 ] . 9 2 I n o u r s p e c t r a w e c o u l d i d e n t i f y b o t h t y p e s o f a d d u c t s , d e p e n d i n g o n t h e d e s o r p t i o n c o n d i t i o n s . T h e s e a d d u c t s d o n o t i n t e r f e r e w i t h t h e a b i l i t y t o d e t e c t t h e + 2 6 6 - 2 6 8 p e a k a s a r e s u l t o f c o v a l e n t b o n d f o r m a t i o n w i t h a s i n g l e r e t i n a l m o l e c u l e . i i . M A L D I - T O F S t a n d a r d E x p e r i m e n t s I n o r d e r t o v e r i f y t h a t a f t e r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n t h e e x c e s s o f u n r e a c t e d r e t i n a l c a n b e s e p a r a t e d o u t b y a F a s t Q c o l u m n , t h e e x p e r i m e n t d e s c r i b e d i n F i g u r e 2 - 3 7 w a s c a r r i e d o u t . I n p a r t i c u l a r , t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E t e t r a m u t a n t 1 3 4 R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E M + = 1 5 , 4 9 0 . 7 e , 4 . T 1 . F a s t 0 c o l u m n M A L D l - T O F a 2 . N a C N B H 3 ( 9 1 5 0 0 0 1 5 5 0 0 1 6 0 0 0 1 5 5 0 0 \ \ \ \ ‘ N M ) ; M a s s ( D e ) 1 5 , 4 9 0 . 1 1 . N a C N B H 3 1 5 : 5 3 : 6 8 3 2 . F a s t 0 c o l u m n M A L D I - T O P _ ' \ \ \ \ ” W 1 5 0 0 0 1 5 5 0 0 1 6 0 0 0 1 6 5 0 0 M a s s ( D a ) F i g u r e 2 - 3 7 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n p r o c e s s u s i n g R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t . I f t h e F a s t Q c o l u m n i s r u n b e f o r e t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n n o r e t i n a l a d d u c t i s d e t e c t e d M A L D I - T O F ( t o p ) . O n t h e c o n t r a r y , w h e n t h e c o l u m n f o l l o w s t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n , t h e c h a r a c t e r i s t i c a d d u c t o f ( M + 2 6 8 ) * i s o b s e r v e d ( b o t t o m ) . F a s t 0 c o l u m n c a n s u c c e s s f u l l y s e p a r a t e t h e f r e e r e t i n a l f r o m t h e C R A B P I I m u t a n t s . w a s i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n t o f o r m a S B , i n e q u i l i b r i u m w i t h i t s p r o t o n a t e d f o r m . T h e s a m p l e w a s t h e n d i v i d e d a n d d i f f e r e n t c o n d i t i o n s w e r e a p p l i e d t o e a c h h a l f . U n d e r o u r n o r m a l r e d u c t i v e a m i n a t i o n p r o t o c o l , N a C N B H 3 w a s a d d e d t o o n e s a m p l e a n d a f t e r a d e q u a t e t i m e t h e r e a c t i o n w a s p a s s e d t h r o u g h a F a s t Q c o l u m n a n d t h e p r o t e i n c o n t a i n i n g f r a c t i o n s w e r e c o n c e n t r a t e d . T h e M A L D I - T O F s p e c t r u m r e c o r d e d ( F i g u r e 2 - 3 7 , b o t t o m s p e c t r u m ) r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f a c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l m o l e c u l e , i n a d d i t i o n t o t h e f r e e p r o t e i n p e a k . O n t h e o t h e r h a n d , t h e s e c o n d s a m p l e w a s fi r s t s e p a r a t e d b y F a s t Q f o l l o w e d b y N a C N B H ; t r e a t m e n t . T h e M A L D I - T O P s p e c t r u m o f 1 3 5 t h i s s a m p l e v e r i f i e s t h e a b s e n c e o f a n y b o u n d r e t i n a l . R e c a l l t h a t f o r t h i s p r o t e i n s i m p l e i n c u b a t i o n w i t h r e t i n a l r e s u l t s i n t h e a p p e a r a n c e o f t h e r e t i n a l p r o t e i n a d d u c t a s w e l l . T h i s e x p e r i m e n t v e r i fi e s t h e e f f i c i e n c y o f t h e F a s t Q s e p a r a t i o n . A t t h e s a m e t i m e , i n o r d e r t o i n v e s t i g a t e w h e t h e r o r n o t n o n - c o v a l e n t c o m p l e x e s c a n b e d e t e c t e d b y M A L D I - T O P , t h e s p e c t r u m o f t h e i n c u b a t i o n o f W T - C R A B P I I w i t h i t s n a t u r a l s u b s t r a t e , a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d , w a s r e c o r d e d . T h e s p e c t r u m ( d a t a n o t s h o w n ) r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f a s i n g l e p r o t e i n p e a k c o r r e s p o n d i n g t o t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e p r o t e i n . A s e x p e c t e d , t h e i o n i c i n t e r a c t i o n s r e s p o n s i b l e f o r t h e r e t i n o i c a c i d b i n d i n g c a n n o t s u r v i v e t h e i o n i z a t i o n c o n d i t i o n s . T h e r e f o r e , i n t h e c a s e o f r e t i n a l , w h a t e v e r b i n d i n g i s d e t e c t e d w i t h t h e v a r i o u s C R A B P I I m u t a n t s m u s t b e d u e t o f o r m a t i o n o f a c o v a l e n t b o n d . i i i . M A L D I - T O F M e a s u r e m e n t o f R e t i n a l i n c u b a t e d P r o t e i n S a m p l e s C R A B P H ( 0 . 5 m g ) i n P B S b u f f e r ( 1 m L ) w a s m i x e d w i t h r e t i n a l ( 1 . 0 e q ) f r o m a n e t h a n o l s t o c k ( fi n a l e t h a n o l v o l u m e l e s s t h a n 3 0 1 . 1 L ) . T h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d a t 2 5 ° C i n d a r k n e s s f o r 1 h . T h e r e a c t i o n s w e r e t r a n s f e r r e d i n t o m i c r o - c e n t r i f u g e fi l t e r s ( M i l l i p o r e U l t r a f r e e ® 0 . 5 C e n t r i f u g a l F i l t e r s , N M W L : 5 0 0 0 ) a n d c o n c e n t r a t e d . T h e y e l l o w s a m p l e s w e r e w a s h e d o n c e w i t h 9 5 % E t O H , t o w a s h o f f e x c e s s f r e e r e t i n a l a n d t h e n t w i c e w i t h H 2 0 ( 2 x 5 0 0 1 1 L ) , t o d e s a l t . F r o m a f i n a l v o l u m e o f 2 0 1 1 L , 0 . 5 1 1 L o f e a c h r e a c t i o n w a s m i x e d w i t h 0 . 5 1 1 L o f m a t r i x s o l u t i o n i n t h e M A L D I p l a t e , a n d u p o n c o - c r y s t a l l i z a t i o n , t h e M A L D I - T O F s p e c t r u m w a s o b t a i n e d . 1 3 6 i v . M A L D I - T O F R e d u c t i v e A m i n a t i o n P r o c e d u r e C R A B P I I ( 0 . 5 m g ) i n P B S b u f f e r ( 1 m L ) w a s m i x e d w i t h 1 . 0 e q u i v r e t i n a l f r o m a n e t h a n o l s t o c k ( f i n a l e t h a n o l v o l u m e l e s s t h a n 3 0 u L ) . T h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d a t 2 5 ° C i n d a r k n e s s f o r 1 h a f t e r w h i c h 1 0 u L o f 5 M N a C N B H 3 i n H 2 0 w e r e a d d e d . T h e r e a c t i o n w a s l e f t f o r a n a d d i t i o n a l h o u r b e f o r e b e i n g e x p o s e d t o l i g h t . T h e l i g h t y e l l o w c r u d e r e a c t i o n m i x t u r e w a s t h e n p u r i f i e d b y a Q S e p h a r o s e T M F a s t F l o w c o l u m n ( q u a t e r n a r y a m m o n i u m r e s i n , s t r o n g a n i o n e x c h a n g e r , C o l u m n : 3 x 1 . 5 c m ) l e a v i n g a y e l l o w r e s i d u e o n t h e t o p l a y e r o f t h e r e s i n ( P B S c o n t a i n s 1 5 0 m M N a C l , h e n c e t h e c r u d e r e a c t i o n h a d t o b e d i l u t e d t o a f i n a l v o l u m e o f ~ 8 m L t o r e d u c e s a l t c o n c e n t r a t i o n a n d e n h a n c e F Q ( F a s t - Q ) b i n d i n g b e f o r e l o a d i n g o n t o t h e c o l u m n ) . T h e c o l u m n w a s w a s h e d w i t h 1 0 m M T r i s H C I , p H = 8 ( 1 0 m L ) a n d t h e p r o t e i n w a s e l u t e d u s i n g 1 0 m M T r i s H C I , 1 0 0 m M N a C l , p H = 8 b u f f e r ( 1 5 m L ) . T h e p r o t e i n c o n t a i n i n g f r a c t i o n s w e r e i d e n t i fi e d u s i n g U V - v i s ( A 2 3 0 ) a n d c o n c e n t r a t e d t o a 5 0 1 . 1 L fi n a l v o l u m e u s i n g m i c r o - c e n t r i f u g e f i l t e r s ( M i l l i p o r e U l t r a f r e e ® 0 . 5 C e n t r i f u g a l F i l t e r s , N M W L : 5 0 0 0 ) . 0 . 5 1 . 1 L o f e a c h r e a c t i o n w e r e m i x e d w i t h 0 . 5 1 . 1 L o f m a t r i x s o l u t i o n i n t h e M A L D I p l a t e , a n d u p o n c o - c r y s t a l l i z a t i o n , t h e M A L D I - T O F s p e c t r u m w a s o b t a i n e d . v . M A L D I - T O F E x p e r i m e n t a l P a r a m e t e r s S y s t e m : A p p l i e d B i o s y s t e m s V o y a g e r S T R M A L D I - T O F m a s s s p e c t r o m e t e r M o d e o f o p e r a t i o n : L i n e a r A c q u i s i t i o n m a s s r a n g e : 5 0 0 0 — 2 0 0 0 0 D a 1 3 7 N u m b e r o f l a s e r s h o t s : 2 5 0 / s p e c t r u m N i t r o g e n L a s e r : 3 3 7 n m L a s e r i n t e n s i t y : 3 0 1 3 — 3 0 2 4 L a s e r R e p R a t e : 5 . 2 H z C a l i b r a t i o n t y p e : E x t e r n a l ( a p o m y o g l o b i n , M W = 1 6 9 5 2 . 6 D a ) M a t r i x : S i n a p i n i c a c i d ( F l u k a ) , S a t u r a t e d s o l u t i o n ( 1 0 m g s i n a p i n i c a c i d , 6 7 0 1 1 L d d e O , 0 . 3 % T F A ( 3 0 L I L , 1 0 % s o l u t i o n ) , 3 0 % M e C N ( 3 0 0 M L ) v i . U V - v i s e v a l u a t i o n o f t h e R e d u c t i v e A m i n a t i o n R e a c t i o n s I n a d d i t i o n t o t h e M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s , t h e c o v a l e n t b i n d i n g o f r e t i n a l t o t h e C R A B P H m u t a n t s a f t e r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n c a n a l s o b e e v a l u a t e d b y U V s p e c t r o s c o p y . A s s h o w n i n F i g u r e 2 - 3 8 t h e U V - v i s t r a c e o f a p r o t e i n t h a t s u c c e s s f u l l y b i n d s r e t i n a l a s a S c h i f f b a s e ( i n t h i s c a s e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R l 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V p e n t a m u t a n t ) a n d t h a t o f a n o n b i n d i n g p r o t e i n ( W T - C R A B P H ) a r e v e r y d i f f e r e n t . I n p a r t i c u l a r , a f t e r t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d p r o t e i n h a v e b e e n p a s s e d t h r o u g h a F a s t Q c o l u m n ( q u a t e r n a r y a m m o n i u m r e s i n ) t h a t s e p a r a t e s t h e p r o t e i n f r o m t h e n o n c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l , o n l y t h e p r o t e i n p e a k ( A m , = 2 8 0 n m ) w a s p r e s e n t f o r t h e W T - C R A B P I I . H o w e v e r , f o r t h e p e n t a m u t a n t c a s e i n a d d i t i o n t o t h e p r o t e i n p e a k a c h r o m o p h o r e p e a k a t 3 3 5 n m i s p r e s e n t a s w e l l . T h i s p e a k c l e a r l y c o r r e s p o n d s t o t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d f o r m o f r e t i n a l ( f r e e r e t i n a l a b s o r b s a t 3 8 3 n m ) a n d c a n b e u s e d , i n a d d i t i o n t o t h e M A L D I - T O P d a t a , f o r t h e e v a l u a t i o n o f a p r o t e i n ’ s a b i l i t y t o b i n d r e t i n a l . A t t h e s a m e t i m e , t h i s m e t h o d c a n f u r t h e r v e r i f y t h e a b i l i t y o f t h e F a s t Q r e s i n t o s e p a r a t e a m i x t u r e o f 1 3 8 0 . 1 4 . 0 . 1 2 - 0 . 1 ~ . 2 0 . 0 8 « 0 . 0 6 - 0 . 0 4 « 0 . 0 2 4 0 . . 4 2 3 0 2 8 0 3 3 0 3 8 0 F i g u r e 2 - 3 8 . U V t r a c e s o f W T - C R A B P I I ( b l u e ) a n d R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V m u t a n t ( m a g e n t a ) a f t e r s u b m i t t e d t o r e d u c t i v e a m i n a t i o n c o n d i t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l . T h e r e a c t i o n s w e r e p u r i fi e d t h r o u g h a f a s t Q c o l u m n a n d t h e p r o t e i n c o n t a i n i n g f r a c t i o n s ( A m , = 2 8 0 n m ) w e r e c o m b i n e d a n d c o n c e n t r a t e d f o r M A L D I - T O F . T h e r e i s n o s i g n o f c h r o m o p h o r e a s s o c i a t e d w i t h t h e W T p r o t e i n , w h i l e a p e a k a t 3 3 5 n m i s a s s o c i a t e d w i t h t h e p e n t a m u t a n t f r a c t i o n s . N o t i c e t h a t a f t e r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n , t h e A " . . . o f t h e p r o t e i n h a s s h i f t e d f r o m ~ 4 4 0 n m ( P S B ) t o 3 3 5 n m ( r e d u c t i v e l y a m i n a t e d r e t i n a l ) . n o n - c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l a n d C R A B P I I m u t a n t s ( n o f r e e c h r o m o p h o r e i s e l u t e d a l o n g w i t h t h e W T p r o t e i n a s e v i d e n t f r o m t h e U V s p e c t r u m ) B . E n z y m a t i c D i g e s t i o n s i . C N B r D i g e s t i o n s a . I o d o a c e t a m i d e R e a c t i o n : P r o c e d u r e C R A B P I I m u t a n t ( 1 0 m g , ~ 6 0 0 n m o l ) p r o t e i n w a s c o n c e n t r a t e d a n d d e s a l t e d b y m i c r o c e n t r i f u g e fi l t r a t i o n a n d d i s s o l v e d i n r e a c t i o n b u f f e r B ( 2 0 0 1 . 1 L ) . I o d o a c e t a r n i d e w a s t h e n a d d e d ( s o l u t i o n A , 0 . 2 M , 9 0 ( L L , 1 8 u m o l ) u n d e r N 2 a n d t h e r e a c t i o n w a s 1 3 9 m i x e d a n d i n c u b a t e d a t R T , i n t h e d a r k n e s s f o r 2 h . 2 - M e r c a p t o e t h a n o l ( 1 0 0 ( L , e x c e s s ) w a s a d d e d t o q u e n c h t h e r e a c t i o n w h i c h w a s t h e n d e s a l t e d b y m i c r o c e n t r i f u g e fi l t r a t i o n a n d w a s h e d w i t h w a t e r . U p o n w a s h i n g w i t h w a t e r , w h i t e p r e c i p i t a t e w a s f o r m e d o n t h e f i l t e r w h i c h w a s r e a l l y h a r d t o t r a n s f e r . T h e r e a c t i o n w a s r e p e a t e d s e v e r a l t i m e s , a n d t h i s r e s u l t w a s c o n s i s t e n t . S D S - P A G E a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e p r o t e i n i s w h a t p r e c i p i t a t e s . T h e r e f o r e t h i s p r e c i p i t a t e d p r o t e i n w a s u s e d f o r t h e C N B r d i g e s t i o n ] . B u f f e r s o B u f f e r A ( f o r a l k y l a t i n g a g e n t ) : B u f f e r A w a s p r e p a r e d b y a d d i n g G u a n i d i n e H C I ( 1 g ) t o 0 . 9 5 M T r i s C l , p H = 8 . 0 ( 1 m L , f i n a l c o n c e n t r a t i o n s 0 . 5 M T r i s C l a n d 6 M G u a n i d i n e H C I ) . T o t h i s b u f f e r I o d o a c e t a m i d e ( F W = 1 8 5 ) w a s a d d e d t o a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 2 M . o B u f f e r B : 1 g G u a n i d i n e H C l ( 6 M fi n a l ) ; 1 m L 0 . 1 9 M T r i s C l , p H = 8 . 0 ( 0 . 1 M f i n a l ) S t o r e a t R T b . C N B r R e a c t i o n P r o c e d u r e C R A B P I I p r o t e i n ( 5 0 m g , 3 n m o l ) w e r e d i s s o l v e d i n a s o l u t i o n o f 7 0 % T F A ( o r 7 0 % f o r m i c a c i d , 5 m L ) a n d C N B r ( 0 . 3 g / m L , 1 . 5 g ) . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s c a r e f u l l y m i x e d u n d e r N 2 i n d a r k n e s s a n d i n c u b a t e d a t R T f o r 2 4 h . T h e r e a c t i o n w a s q u e n c h e d w i t h w a t e r a n d s u b s e q u e n t l y d r i e d . T h e s o l i d r e s i d u e s w a s d i s s o l v e d i n w a t e r a n d 1 4 0 s u b m i t t e d t o p e p t i d e a n a l y s i s u s i n g H P L C o r S D S - T r i s / T r i c i n e P A G E . T h e p r o d u c t o f t h e i o d o a c e t a m i d e r e a c t i o n w a s u s e d w i t h o u t a n y f u r t h e r p u r i f i c a t i o n . c . S D S - T R I S / T R I C I N E P A G E R u n n i n g G e l ( 9 . 8 % ) S t a c k i n g G e l A c r y l a m i d e / B i s A c r y l ( S O / 0 . 8 ) 9 . 8 m L 1 . 6 m L T r i s / S D S b u f f e r , p H = 8 . 4 5 1 0 . 0 m L 3 . 1 m L H 2 0 7 . 0 m L 7 . 8 m L G l y c e r o l 4 , 0 g 1 0 % A P S 1 5 0 1 1 L 1 0 0 u L T E M E D 2 0 0 L 1 0 1 1 L A . T r i s / S D S , p H = 8 . 4 5 : 1 8 2 g T r i s ( b a s e ) , 3 0 0 m L H 2 O , a d j u s t p H = 8 . 4 5 , w a t e r t o 5 0 0 m L . A d d i t i o n o f 0 . 4 g S D S . B . S a m p l e B u f f e r : I n 1 M T r i s , p H = 6 . 8 b u f f e r ( 1 m L ) g l y c e r o l ( 2 . 4 m L , 3 g ) , S D S ( 0 . 8 g ) , C o o m a s s i e B l u e ( 2 m g ) a n d D T T ( 0 . 3 1 g ) w e r e a d d e d . T h e m i x t u r e w a s d i l u t e d w i t h H 2 0 ( 1 0 m L ) . T h e s a m p l e b u f f e r w a s m i x e d w i t h t h e p r o t e i n s a m p l e a n d t h e m i x t u r e w a s e i t h e r b o i l e d 5 0 ° C f o r 5 m i n o r i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 1 h . S e v e r a l t r i a l s t o o k p l a c e t o o p t i m i z e t h e S D S A c r y l / T r i s - T r i c i n e - P A G E c o n d i t i o n s , i n o r d e r t o s e e p e p t i d e s s m a l l e r t h a n 3 0 0 0 D a . I n o r d e r t o b e u s e d a s a l o w m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n m a r k e r t h e s e p a r a t e c h a i n s o f i n s u l i n o r ( M W a = 2 5 3 l D a ) a n d B , ( M W B = 3 4 9 5 D a ) f r o m b o v i n e p a n c r e a s w a s p u r c h a s e d . 1 4 1 T h e g e l w a s f i x e d , s t a i n e d a n d d e s t a i n e d u s i n g s t a n d a r d r a p i d s t a i n p r o t o c o l s . H o w e v e r , a t t h e e n d , o n l y t h e B - c h a i n b a n d w a s p r e s e n t . L i t e r a t u r e r e p o r t s s u g g e s t t h a t i f t h e g e l s a r e fi x e d f i r s t i n 5 0 % M e O H / 1 0 % a c e t i c a c i d , m o s t o f t h e s m a l l p e p t i d e s a r e s h o w n ( d o w n t o a b o u t 3 k D a ) . 5 7 B u t , e v e n w h e n t h e s e c o n d i t i o n s w e r e t r i e d , o n l y t h e b a n d o f i n s u l i n [ 3 w a s p r e s e n t . ( 1 . H P L C c o n d i t i o n s R e v e r s e P h a s e , C o l u m n : V Y D A C P r o t e i n a n d P e p t i d e C 1 8 B u f f e r A : 0 . 0 5 2 % T F A i n 8 0 % M e C N i n H 2 O B u f f e r B : 0 . 0 6 % T F A i n H 2 O P r o g r a m : 0 - 2 m i n , 7 5 % B 2 - 3 2 m i n , 3 0 % B 3 2 - 4 2 m i n , 0 % B F l o w : 1 m L / m i n T e m p e r a t u r e : 6 0 ° C i i . T r y p s i n D i g e s t i o n T h r e e d i f f e r e n t t y p e s o f t h e T r y p s i n w e r e p u r c h a s e d d u r i n g o u r a t t e m p t s t o d i g e s t t h e C R A B P H m u t a n t s a l o n g w i t h t h e i r r e d u c t i v e a m i n a t i o n p r o d u c t s : a . S e q u e n c i n g G r a d e M o d i f i e d T r y p s i n , F r o z e n s o l u t i o n i n 5 0 m M a c e t i c a c i d ( P r o m e g a ) , s t a b l e f o r s i x m o n t h s a t — 7 0 ° C . ; b . S e q u e n c i n g G r a d e M o d i f i e d T r y p s i n , L y o p h i l i z e d p o w d e r 1 4 2 ( P r o m e g a ) ; c . I m m o b i l i z e d T P C K T r y p s i n ( P i e r c e ) , 5 0 % s l u r r y c o n t a i n i n g g l y c e r o l a n d 0 . 0 5 % s o d i u m a z i d e , c r o s s - l i n k e d 4 % b e a d e d a g a r o s e . G e n e r a l l y m o s t p r o t e i n s r e q u i r e d e n a t u r a t i o n b e f o r e e n z y m a t i c d i g e s t i o n c a n g o t o c o m p l e t i o n . I n o u r c a s e , s i n c e w e n e e d e d t o t a k e M A L D I s p e c t r a o f o u r d i g e s t i o n s w e c h o s e n o t t o u s e d e n a t u r a n t s , t o a v o i d t h e p r e s e n c e o f a d d i t i o n a l s a l t s . T h e o p t i m u m c o n d i t i o n s f o r a t r y p s i n d i g e s t i o n i s a t p H o f 7 - 9 ( s u g g e s t e d b u f f e r 5 0 m M N H 4 H C O 3 , p H = 7 . 6 ) . D e p e n d i n g o n t h e t y p e o f t r y p s i n u s e d , 3 d i f f e r e n t p r o t o c o l s w e r e f o l l o w e d . a . U s e o f S e q u e n c i n g G r a d e M o d i f i e d T r y p s i n , f r o z e n s o l u t i o n i n a c e t i c a c i d ( 5 0 m M ) : B e f o r e u s i n g t h e s o l u t i o n , a t e s t t i t r a t i o n w a s c a r r i e d o u t t o m a k e s u r e t h a t t h a t a d d i t i o n o f t h e a c e t i c a c i d s o l u t i o n w i l l n o t l o w e r t h e p H o f t h e N H 4 H C O 3 b u f f e r . U p o n a d d i t i o n o f a c e t i c a c i d ( 4 0 1 1 1 , 5 0 m M ) i n N H 4 H C O 3 b u f f e r ( l m L ) t h e p H s h i f t s f r o m 7 . 6 t o 7 . 4 , s t i l l g o o d f o r t h e d i g e s t i o n . I n a t y p i c a l r e a c t i o n C R A B P H m u t a n t ( o r r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n m i x t u r e , 1 m g ) i n N H 4 H C 0 3 ( 0 . 5 - 1 m L , 5 0 m M , p H = 7 . 6 ) w a s m i x e d w i t h a t r y p s i n s o l u t i o n ( 4 0 1 1 L , 0 . 5 u g / u L ) ( s u b s t r a t e / e n z y m e r a t i o i s 5 0 / 1 ) a n d t h e r e a c t i o n w a s i n c u b a t e d a t 3 7 ° C o v e r n i g h t . T h e m i x t u r e w a s c o n c e n t r a t e d i n a s p e e d v a c a t 7 5 ° C t o a m i n i m u m v o l u m e ( ~ 5 0 1 1 L ) a n d w a s u s e d a s i t i s f o r M A L D I - T O P e x p e r i m e n t s . b . U s e o f s e q u e n c i n g G r a d e M o d i f i e d T r y p s i n , l y o p h i l i z e d p o w d e r : A f r e s h s o l u t i o n o f t r y p s i n ( 2 . 5 p i g / 1 1 L ) w a s p r e p a r e d i n t h e p r o v i d e d b u f f e r ( 5 0 m M a c e t i c a c i d ) . F o r a t y p i c a l r e a c t i o n C R A B P H ( o r r e d u c t i v e a m i n a t i o n p r o d u c t , 0 . 5 - l m g ) i n 1 0 m M T r i s , p H = 8 . 0 ( 3 0 1 1 . 1 ) w e r e m i x e d w i t h t h e a b o v e t r y p s i n s o l u t i o n ( 2 u L , s u b s t r a t e / e n z y m e r a t i o i s 5 0 / 1 ) . A p a r t o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e ( ~ 3 1 1 1 ) w a s r e m o v e d a f t e r 5 a n d 1 0 m i n a n d q u e n c h e d b y t h e a d d i t i o n o f t h e M A L D I m a t r i x s o l u t i o n c o n t a i n i n g T F A . 1 4 3 c . U s e o f i m m o b i l i z e d T P C K T r y p s i n ( P i e r c e ) , 5 0 % s l u r r y c o n t a i n i n g g l y c e r o l a n d 0 . 0 5 % s o d i u m a z i d e , c r o s s - l i n k e d 4 % b e a d e d a g a r o s e : F o r a t y p i c a l r e a c t i o n t h e i m m o b i l i z e d t r y p s i n s l u r r y ( 1 0 0 u L ) w a s w a s h e d w i t h 0 . 1 M N H 4 H C O 3 , p H = 8 . 0 b u f f e r ( 3 x 5 0 0 1 1 . 1 ) . T h e b e a d s w e r e s e p a r a t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d w e r e a d d e d t o a s o l u t i o n o f C R A B P H ( o r r e d u c t i v e a m i n a t i o n p r o d u c t , 1 m g ) i n 0 . 1 M N H 4 H C O 3 , p H = 8 . 0 b u f f e r ( 0 . 5 m L ) . T h e r e a c t i o n w a s m i x e d a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C w h i l e s h a k i n g , f o r 2 h . T h e b e a d s w e r e o n c e m o r e s e p a r a t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s c o l l e c t e d . T h e v o l u m e w a s r e d u c e d u s i n g s p e e d v a c ( t o ~ 5 0 ( L L ) a n d w a s u s e d a s i t i s f o r M A L D I - T O P a n a l y s i s . i i i . C h y m o t r y p s i n D i g e s t i o n C h y m o t r y p s i n ( B o v i n e P a n c r e a s , H i g h P u r i t y , E n d o t o x i n — F r e e ) w a s p u r c h a s e d f r o m C a l b i o c h e m ® a s a s o l u t i o n ( 5 m g / m L ) i n 0 . 9 % N a C l ( s t a b l e f o r a t l e a s t 3 y e a r s i n — 2 0 ° C ) . T h e s u g g e s t e d w o r k i n g r a n g e f o r t h e e n z y m e i s a t p H = 7 - 9 . F o r a t y p i c a l d i g e s t i o n , 1 m g o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : R l l 1 L : : L 1 2 1 E m u t a n t ( o r t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n p r o d u c t ) i n 1 0 m M T r i s , p H = 8 . 0 ( ~ 3 0 1 1 . 1 . ) w a s m i x e d w i t h a C h y m o t r y p s i n s o l u t i o n ( 2 - 4 ( L , s u b s t r a t e / e n z y m e r a t i o i s 1 0 0 / 1 t o 5 0 / 1 ) . T h e r e a c t i o n s w e r e i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 5 m i n t o o v e r n i g h t a n d e v e n t u a l l y w e r e q u e n c h e d b y a d d i t i o n o f a c i d i c M A L D I m a t r i x s o l u t i o n ( M A L D I - T O F e x p e r i m e n t s ) o r S D S - P A G E s a m p l e b u f f e r ( f o r e l e c t r o p h o r e s i s ) . 1 4 4 C o m m e n t : o r - C y a n o - 4 - h y d r o x y C i n n a m i c A c i d ( A C H A ) w a s u s e d a s t h e M A L D I - T O P m a t r i x f o r a l l t r y p s i n a n d C h y m o t r y p s i n d i g e s t s ( o p t i m u m m a t r i x f o r 5 0 0 - 1 0 0 0 0 D a ) . T o c a l i b r a t e t h e i n s t r u m e n t , A d r e n o C o r t i c o t r o p i c H o r m o n e ( A C T H , M W 1 - 3 9 = 4 5 4 1 . 1 , M W 7 - 3 3 : 3 6 5 9 2 , M W 1 3 - 3 9 = 2 4 6 5 . 7 ) a n d B r a d y k i n i n ( M W : 1 0 6 1 . 2 ) w e r e u s e d a s e x t e r n a l s t a n d a r d s . i v . C a r b o x y p e p t i d a s e Y C a r b o x y p e p t i d a s e Y ( 1 m g ) w a s p u r c h a s e d a s a l y o p h i l i z e d p o w d e r f r o m W o r t h i n g t o n B i o c h e m i c a l C o r p . S o l u t i o n s o f 2 0 ( l g / 1 1 1 i n H 2 O w e r e f r e s h l y m a d e a n d u s e d f o r d i g e s t i o n s ( s t a b i l i t y o f e n z y m e : w a t e r s o l u t i o n , 2 - 8 ° C , 1 w e e k ; l y o p h i l i z e d p o w d e r , - 1 5 t o — 2 5 ° C f o r 6 - 1 2 m o n t h s ) . L i t e r a t u r e r e p o r t s s u g g e s t e d t h a t C a r b o x y p e p t i d a s e Y w o r k s b e t t e r i n s o d i u m c i t r a t e ( 5 0 m M ) b u f f e r , a t p H = 6 . 0 . T h e r e f o r e , a 1 0 x 5 0 m M S o d i u m C i t r a t e , p H = 6 . 0 b u f f e r w a s p r e p a r e d a n d w a s u s e d t o c o n t r o l t h e p H o f t h e r e a c t i o n ( a d d i t i o n o f l m L 1 0 x 5 0 m M S o d i u m C i t r a t e , p H = 6 i n 9 m L 1 0 m M T r i s , p H = 8 . 0 r e s u l t e d i n t o a p H = 6 . 5 s o l u t i o n ) . T h e e n z y m e w a s u s e d i n a 1 / 5 0 t o 1 / 1 0 0 w / w a c c o r d i n g t o p r o t e i n r a t i o . I n a t y p i c a l r e a c t i o n , C R A B P H m u t a n t ( o r r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n , 1 m g ) i n 5 0 0 1 1 L T r i s , p H = 8 . 0 b u f f e r w a s m i x e d w i t h 1 0 x 5 0 m M S o d i u m C i t r a t e , p H = 6 . 0 b u f f e r ( 6 ( L L ) a n d C a r b o x y p e p t i d a s e Y ( 2 0 u g / u L ) s o l u t i o n ( 1 1 . 1 L , 1 / 5 0 w / w r a t i o ) . A l t e r n a t i v e l y , t h e s a m e r e a c t i o n w a s s e t u p i n T r i s p H = 8 . 0 b u f f e r ( n o 1 0 x 5 0 m M s o d i u m c i t r a t e , p H = 6 . 0 b u f f e r a d d e d ) . T h e r e a c t i o n w a s m o n i t o r e d w i t h t i m e b y M A L D I - T O F a f t e r 1 , 2 , 5 , 1 0 , 1 5 , 2 0 , 3 0 a n d 6 0 m i n ( a l t h o u g h a c c o r d i n g t o t h e l i t e r a t u r e t h e r e a c t i o n i s s u p p o s e d t o b e v e r y f a s t ) . U p o n m i x i n g o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e 1 4 5 w i t h t h e M A L D I m a t r i x s o l u t i o n ( S i n a p i n i c a c i d i n 3 0 % M e C N , 1 0 % T F A ) b e c a u s e o f t h e s i g n i fi c a n t l o w e r i n g o f t h e m i x t u r e p H ( T F A ) t h e e n z y m a t i c d i g e s t i o n w a s q u e n c h e d . ( I n f a c t , t h e r e a c t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f t h e s o d i u m c i t r a t e b u f f e r c o u l d n o t b e f o l l o w e d b y M A L D I - T O P a n a l y s i s b e c a u s e o f t h e g r e a t a m o u n t o f i n o r g a n i c s a l t p r e s e n t w h i c h d r a m a t i c a l l y d e c r e a s e s t h e i o n i z a t i o n e f f i c i e n c y . T h e r e f o r e , a l l s u b s e q u e n t r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n t h e T r i s , p H = 8 . 0 b u f f e r ) . 2 . 1 0 R e f e r e n c e s l . G . J . K l e y w e g t , T . B e r g f o r s , H . S e n n , P . L e M o t t e , B . G s e l l , K . S h u d o , T . A . J o n e s " C r y s t a l s t r u c t u r e s o f c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n s I a n d I I i n c o m p l e x w i t h a l l - t r a n s r e t i n o i c a c i d a n d a s y n t h e t i c r e t i n o i d . " S t r u c t u r e 1 9 9 4 , 2 , 1 2 4 1 - 1 2 5 8 . 2 . L . C . W a n g , Y . L i , H . G . Y a n " S t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s o f c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d - b i n d i n g p r o t e i n s - Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e l i g a n d b i n d i n g p r o p e r t i e s o f t h e w i l d - t y p e p r o t e i n s a n d s i t e - d i r e c t e d m u t a n t s " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 7 , 2 7 2 , 1 5 4 1 - 1 5 4 7 . 3 . A . W . N o r r i s , L . C h e n g , V . G i g u e r e , M . R o s e n b e r g e r , E . L i " M e a s u r e m e n t o f S u b n a n o m o l a r R e t i n o i c A c i d - B i n d i n g A f f i n i t i e s f o r C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d - B i n d i n g P r o t e i n s b y F l u o r o m e t r i c T i t r a t i o n . " B i o c h i m . B i o p h . A c t . - P r o t e i n S t r u c t u r e a n d M o l e c u l a r E n z y m o l o g y 1 9 9 4 , 1 2 0 9 , 1 0 - 1 8 . 4 . M . M . M i d l a n d , Y . C . K w o n " S t e r e o c h e m i s t r y o f h y d r o b o r a t i o n o f o r — c h i r a l o l e fi n s a n d r e d u c t i o n o f a - c h i r a l k e t o n e s . A n u n u s u a l a n t i - C r a m s e l e c t i v i t y w i t h d i a l k y l b o r a n e s . " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 8 3 , 1 0 5 , 3 7 2 5 - 3 7 2 7 . 5 . C . A . F i t c h , D . A . K a r p , K . K . L e e , W . E . S t i t e s , E . E . L a t t m a n , B . G a r c i a — M o r e n o " E x p e r i m e n t a l p K ( a ) v a l u e s o f b u r i e d r e s i d u e s : A n a l y s i s w i t h c o n t i n u u m m e t h o d s a n d r o l e o f w a t e r p e n e t r a t i o n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 2 0 0 2 , 8 2 , 3 2 8 9 - 3 3 0 4 . 6 . C . F . B a r b a s I I I , A . H e i n e , G . Z h o n g , T . H o f f m a n n , S . G r a m a t i k o v a , R . B j o m e s t e d t , B . L i s t , J . A n d e r s o n , E . A . S t u r a , I . A . W i l s o n , R . A . L e r n e r " I m m u n e v e r s u s n a t u r a l s e l e c t i o n : A n t i b o d y A l d o l a s e w i t h e n z y m a t i c r a t e s b u t b r o a d e r s c o p e . " S c i e n c e 1 9 9 7 , 2 7 8 , 2 0 8 5 - 2 0 9 2 . 7 . D . E . S c h m i d t , W e s t h e i m . F h " P k o f L y s i n e A m i n o G r o u p a t A c t i v e S i t e o f A c e t o a c e t a t e D e c a r b o x y l a s e " B i o c h e m i s t r y 1 9 7 1 , 1 0 , 1 2 4 9 - 1 2 5 3 . 1 4 6 8 . 1 0 . 1 1 . 1 2 . l 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . S . D a o p i n , D . E . A n d e r s o n , W . A . B a a s e , F . W . D a h l q u i s t , B . W . M a t t h e w s " S t r u c t u r a l a n d T h e r m o d y n a m i c C o n s e q u e n c e s o f B u r y i n g a C h a r g e d R e s i d u e w i t h i n t h e H y d r o p h o b i c C o r e o f T 4 L y s o z y m e " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 1 , 3 0 , 1 1 5 2 1 - 1 1 5 2 9 . J . K . L e e , K . N . H o u k " A p r o fi c i e n t e n z y m e r e v i s i t e d : T h e p r e d i c t e d m e c h a n i s m f o r o r o t i d i n e m o n o p h o s p h a t e d e c a r b o x y l a s e " S c i e n c e 1 9 9 7 , 2 7 6 , 9 4 2 - 9 4 5 . J . A . B o m h o r s t , J . J . F a l k e " P u r i f i c a t i o n o f p r o t e i n s u s i n g p o l y h i s t i d i n e a f fi n i t y t a g s " A p p l i c a t i o n s o f C h i m e r i c G e n e s a n d H y b r i d P r o t e i n s , P t A 2 0 0 0 , 3 2 6 , 2 4 5 - 2 5 4 . U . M u e l l e r , K . B u e s s o w , A . D i e h l , F . J . B a r t ] , F . H . N i e s e n , L . N y a r s i k , U . H e i n e m a n n " R a p i d p u r i f i c a t i o n a n d c r y s t a l s t r u c t u r e a n a l y s i s o f a s m a l l p r o t e i n c a r r y i n g t w o t e r m i n a l a f fi n i t y t a g s . " J . S t r u c t . F u n c r . G e n o m i c s 2 0 0 3 , 4 , 2 1 7 - 2 2 5 . K . M . K i m , B . C . Y i , D . B a k e r , K . Y . J . Z h a n g " P o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n o f t h e N - t e r m i n a l H i s t a g i n t e r f e r e s w i t h t h e c r y s t a l l i z a t i o n o f t h e w i l d - t y p e a n d m u t a n t S H 3 d o m a i n s f o r m c h i c k e n s r c t y r o s i n e k i n a s e . " A c t a C r y s t a l l o g r . D 2 0 0 1 , D 5 7 , 7 5 9 - 7 6 2 . J . K y t e , R . F . D o o l i t t l e " A S i m p l e M e t h o d f o r D i s p l a y i n g t h e H y d r o p a t h i c C h a r a c t e r o f a P r o t e i n " J . M o l . B i o l . 1 9 8 2 , 1 5 7 , 1 0 5 - 1 3 2 . T . P . H o p p , K . R . W o o d s " P r e d i c t i o n o f P r o t e i n A n t i g e n i c D e t e r m i n a n t s f r o m A m i n o - A c i d - S e q u e n c e s " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . - B i o l o g i c a l S c i e n c e s 1 9 8 1 , 7 8 , 3 8 2 4 - 3 8 2 8 . Y . J . C h e n , C . ; W e s t , K . , G o l d fl a m ; 8 . , B e a n , M . F . ; H u d d l e s t o n , M . J . ; C a r r , S . A . ; G a b r i e l , J . L . ; C r a b b , J . W . , T e c h n i q u e s i n P r o t e i n C h e m i s t r y V , A c a d e m i e s P r e s s , S a n D i e g o , 1 9 9 4 . J . C . S a a r i , L . B r e d b e r g " E n z y m a t i c R e d u c t i o n o f l l - c i s - R e t i n a l B o u n d t o C e l l u l a r R e t i n a l - B i n d i n g P r o t e i n " B i o c h i m . B i o p h . A c t a 1 9 8 2 , 7 1 6 , 2 6 6 - 2 7 2 . J . W . C r a b b , Z . Q . N i e , Y . C h e n , J . D . H u l m e s , K . A . W e s t , J . T . K a p r o n , S . E . R u u s k a , N . N o y , J . C . S a a r i " C e l l u l a r r e t i n a l d e h y d e - b i n d i n g p r o t e i n l i g a n d i n t e r a c t i o n s - G L N - 2 1 0 a n d L Y S - 2 2 1 a r e i n t h e r e t i n o i d b i n d i n g p o c k e t " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 8 , 2 7 3 , 2 0 7 1 2 — 2 0 7 2 0 . J . W . C r a b b , A . C a r l s o n , Y . C h e n , S . G o l d fl a m , R . I n t r e s , K . A . W e s t , J . D . H u l m e s , J . T . K a p r o n , L . A . L u c k , J . H o r w i t z , D . B o k " S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f r e c o m b i n a n t h u m a n c e l l u l a r r e t i n a l d e h y d e - b i n d i n g p r o t e i n " P r o t e i n S c i e n c e 1 9 9 8 , 7 , 7 4 6 - 7 5 7 . 1 4 7 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . J . W . C r a b b , R . I n t r e s , S . G o l d fl a m , Y . C h e n , C . J o h n s o n , K . W e s t " R e c o m b i n a n t P r o d u c t i o n o f V i s u a l C y c l e C e l l u l a r R e t i n a l d e h y d e - B i n d i n g P r o t e i n " F A S E B J . 1 9 9 2 , 6 , A 5 2 8 - A 5 2 8 . J . W . C r a b b , Y . C h e n , J . T . K a p r o n , K . A . W e s t , D . L . B r e d b e r g , J . C . S a a n " A n a l y s i s o f t h e r e t i n o i d - b i n d i n g s i t e o f C R A L B P " I n v e s t . O p h t h a l m o l . V i s . S c i . 1 9 9 6 , 3 7 , 3 6 9 1 - 3 6 9 1 . M . E . N e w c o m e r " R e t i n o i d - B i n d i n g P r o t e i n s - S t r u c t u r a l D e t e r m i n a n t s I m p o r t a n t f o r F u n c t i o n " F A S E B J . 1 9 9 5 , 9 , 2 2 9 - 2 3 9 . C . F o l l i , V . C a l d e r o n e , S . O t t o n e l l o , A . B o l c h i , G . Z a n o t t i , M . S t o p p i n i , R . B e r n i " I d e n t i f i c a t i o n , r e t i n o i d b i n d i n g , a n d x - r a y a n a l y s i s o f a h u m a n r e t i n o l - b i n d i n g p r o t e i n " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 2 0 0 1 , 9 8 , 3 7 1 0 - 3 7 1 5 . D . E . O n g , F . C h y t i l " C e l l u l a r R e t i n o l - B i n d i n g P r o t e i n f r o m R a t - L i v e r - P u r i f i c a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n " J . B i o l . C h e m . 1 9 7 8 , 2 5 3 , 8 2 8 - 8 3 2 . X . C h e n , M . T o r d o v a , G . L . G i l l i l a n d , L . C . W a n g , Y . L i , H . G . Y a n , X . H . J i " C r y s t a l s t r u c t u r e o f a p o - c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d - b i n d i n g p r o t e i n t y p e H ( R l l l M ) s u g g e s t s a m e c h a n i s m o f l i g a n d e n t r y " J . M o l . B i o l . 1 9 9 8 , 2 7 8 , 6 4 1 - 6 5 3 . Y . G a t , M . S h e v e s " A M e c h a n i s m f o r C o n t r o l l i n g t h e P k ( a ) o f t h e R e t i n a l P r o t o n a t e d S c h i f f - B a s e i n R e t i n a l P r o t e i n s - a S t u d y w i t h M o d e l C o m p o u n d s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 3 , 1 1 5 , 3 7 7 2 - 3 7 7 3 . H . D e n g , L . W . H u a n g , R . C a l l e n d e r , T . E b r e y " E v i d e n c e f o r a B o u n d W a t e r M o l e c u l e N e x t t o t h e R e t i n a l S c h i f f - B a s e i n B a c t e r i o r h o d o p s i n a n d R h o d o p s i n - a R e s o n a n c e R a m a n - S t u d y o f t h e S c h i f f - B a s e H y d r o g e n / D e u t e r i u m E x c h a n g e " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 4 , 6 6 , 1 1 2 9 - 1 1 3 6 . R . V . S a m p o g n a , A . S . Y a n g , B . H . H o n i g " C a l c u l a t i o n o f P k a s o f T i t r a t a b l e G r o u p s i n B a c t e r i o r h o d o p s i n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 4 , 6 6 , A 4 5 - A 4 5 . C . N . R a f f e r t y , H . S h i c h i " P h o t o c h e m i c a l - R e a c t i o n s o f D r i e d P h o t o r e c e p t o r - M e m b r a n e s a t 7 7 - K " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 8 1 , 3 3 , A 2 9 3 - A 2 9 3 . J . H . Z h a n g , Z . P . L i u , T . A . J o n e s , L . M . G i e r a s c h , J . F . S a m b r o o k " M u t a t i n g t h e C h a r g e d R e s i d u e s i n t h e B i n d i n g P o c k e t o f C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d - B i n d i n g P r o t e i n S i m u l t a n e o u s l y R e d u c e s I t s B i n d i n g - A f f i n i t y t o R e t i n o i c A c i d a n d I n c r e a s e s I t s T h e r m o s t a b i l i t y " P r o t e i n s 1 9 9 2 , 1 3 , 8 7 - 9 9 . G . A . J . P i t t , F . D . C o l l i n s , R . A . M o r t o n , P . S t o k " R h o d o p s i n . V I I I . N - R e t i n y l i d e n e m e t h y l a m i n e , a n i n d i c a t o r y e l l o w a n a l o g . " B i o c h e m . J . 1 9 5 5 , 5 9 , 1 2 2 - 1 2 8 . 1 4 8 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . 3 7 . 3 8 . 3 9 . 4 0 . 4 1 . P . E . B l a t z , N . B a u m g a r t n e r , B . B a l a s u b r a m a n i y a n , P . B a l a s u b r a m a n i y a n , F . S t e d m a n " W a v e l e n g t h r e g u l a t i o n i n v i s u a l p i g m e n t c h r o m o p h o r e . L a r g e i n d u c e d b a t h o c h r o m i c s h i f t s i n r e t i n o l a n d r e l a t e d p o l y e n e s . " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 7 1 , 1 4 , 5 3 1 - 5 4 9 . P . E . B l a t z , R . H . J o h n s o n , J . H . M o h l e r , A l d i l a i m . S k , S . D e w h u r s t , J . O . E r i c k s o n " E f f e c t o f S o l u t i o n E n v i r o n m e n t o n A b s o r p t i o n M a x i m a o f S c h i f f B a s e s o f R e t i n a l " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 7 1 , 1 3 , 2 3 7 - 2 4 3 . K . P a l c z e w s k i , T . K u m a s a k a , T . H o r i , C . A . B e h n k e , H . M o t o s h i m a , B . A . F o x , I . L . T r o n g , D . C . T e l l e r , T . O k a d a , R . E . S t e n k a m p , M . Y a m a m o t o , M . M i y a n o " C r y s t a l s t r u c t u r e o f r h o d o p s i n : A G - p r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o r " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 2 0 0 1 , 8 0 , 3 4 9 a - 3 4 9 a . K . P a l c z e w s k i , T . K u m a s a k a , T . H o r i , C . A . B e h n k e , H . M o t o s h i m a , B . A . F o x , 1 . L e T r o n g , D . C . T e l l e r , T . O k a d a , R . E . S t e n k a m p , M . Y a m a m o t o , M . M i y a n o " C r y s t a l s t r u c t u r e o f r h o d o p s i n : A G p r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o r " S c i e n c e 2 0 0 0 , 2 8 9 , 7 3 9 - 7 4 5 . P . E . B l a t z , J . H . M o h l e r " E f f e c t o f S e l e c t e d H y d r o g e n - B o n d i n g S o l v e n t s o n A b s o r p t i o n M a x i m a o f N - R e t i n y l i d e n e B u t y l a m m o n i u m S a l t s " B i o c h e m i s t r y 1 9 7 2 , I I , 3 2 4 0 - 3 2 4 5 . L . C . W a n g , Y . L i , F . A b i l d g a a r d , J . L . M a r k l e y , H . G . Y a n " N M R s o l u t i o n s t r u c t u r e o f t y p e H h u m a n c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n : I m p l i c a t i o n s f o r l i g a n d b i n d i n g " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 8 , 3 7 , 1 2 7 2 7 - 1 2 7 3 6 . L . C . W a n g , H . G . Y a n " N M R s t u d y s u g g e s t s a m a j o r r o l e f o r A r g l l l i n m a i n t a i n i n g t h e s t r u c t u r e a n d d y n a m i c a l p r o p e r t i e s o f t y p e H h u m a n c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 8 , 3 7 , 1 3 0 2 1 - 1 3 0 3 2 . T . P . S a k m a r , R . R . F r a n k e , H . G . K h o r a n a " G l u t a m i c A c i d - 1 1 3 S e r v e s a s t h e R e t i n y l i d e n e S c h i f f - B a s e C o u n t e r i o n i n B o v i n e R h o d o p s i n " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 8 9 , 8 6 , 8 3 0 9 - 8 3 1 3 . T . P . S a k m a r , R . R . F r a n k e , H . G . K h o r a n a " T h e R o l e o f t h e R e t i n y l i d e n e S c h i f f - B a s e C o u n t e r i o n i n R h o d o p s i n i n D e t e r m i n i n g W a v e l e n g t h A b s o r b e n c y a n d S c h i f f - B a s e P k a " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 1 , 8 8 , 3 0 7 9 - 3 0 8 3 . G . W a l d " O n r h o d o p s i n i n s o l u t i o n . " J . G e n . P h y s i o l . 1 9 3 8 , 2 1 , 7 9 5 - 8 3 2 . G . S t e i n b e r g , M . O t t o l e n g h i , M . S h e v e s " P k ( a ) o f t h e P r o t o n a t e d S c h i f f - B a s e o f B o v i n e R h o d o p s i n - a S t u d y w i t h A r t i f i c i a l P i g m e n t s " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 3 , 6 4 , 1 4 9 9 - 1 5 0 2 . 1 4 9 4 2 . 4 3 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . 4 8 . 4 9 . 5 0 . 5 1 . 5 2 . 5 3 . 5 4 . R . J . L y t h g o e " T h e a b s o r p t i o n s p e c t r a o f v i s u a l p u r p l e a n d o f i n d i c a t o r y e l l o w . " J . P h y s i o l . 1 9 3 7 , 8 9 , 3 3 1 - 3 5 8 . Y . K o u t a l o s " H i g h - P h F o r m o f B o v i n e R h o d o p s i n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 2 , 6 1 , 2 7 2 - 2 7 5 . S . D r u c k m a n n , M . O t t o l e n g h i , A . P a n d e , J . P a n d e , R . H . C a l l e n d e r " A c i d - B a s e - E q u i l i b r i u m o f t h e S c h i f f - B a s e i n B a c t e r i o r h o d o p s i n " B i o c h e m i s t r y 1 9 8 2 , 2 1 , 4 9 5 3 - 4 9 5 9 . S . D r u c k m a n n , M . O t t o l e n g h i , A . P a n d e , J . P a n d e , R . H . C a l l e n d e r " A c i d - B a s e - E q u i l i b r i u m o f t h e S c h i f f - B a s e i n B a c t e r i o r h o d o p s i n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 8 2 , 3 7 , A 2 2 7 - A 2 2 7 . I . R o u s s o , N . F r i e d m a n , M . S h e v e s , M . O t t o l e n g h i " P k ( a ) o f t h e P r o t o n a t e d S c h i f f - B a s e a n d A s p a r t i c - 8 5 i n t h e B a c t e r i o r h o d o p s i n B i n d i n g - S i t e I s C o n t r o l l e d b y a S p e c i fi c G e o m e t r y b e t w e e n t h e 2 R e s i d u e s " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 5 , 3 4 , 1 2 0 5 9 - 1 2 0 6 5 . T . B a a s o v , M . S h e v e s " A l t e r a t i o n o f P k a o f t h e B a c t e r i o r h o d o p s i n P r o t o n a t e d S c h i f f - B a s e - a S t u d y w i t h M o d e l C o m p o u n d s " B i o c h e m i s t r y 1 9 8 6 , 2 5 , 5 2 4 9 - 5 2 5 8 . Y . K o u t a l o s , T . G . E b r e y , H . R . G i l s o n , B . H o n i g " O c t o p u s P h o t o r e c e p t o r - M e m b r a n e s - S u r f a c e - C h a r g e D e n s i t y a n d P k o f t h e S c h i f f - B a s e o f t h e P i g m e n t s " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 0 , 5 8 , 4 9 3 - 5 0 1 . J . L i a n g , G . S t e i n b e r g , N . L i v n a h , M . S h e v e s , T . G . E b r e y , M . T s u d a " T h e P k ( a ) o f t h e P r o t o n a t e d S c h i f f - B a s e s o f G e c k o C o n e a n d O c t o p u s V i s u a l P i g m e n t s " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 4 , 6 7 , 8 4 8 - 8 5 4 . M . N a k a g a w a , T . I w a s a , S . K i k k a w a , M . T s u d a , T . G . E b r e y " H o w v e r t e b r a t e a n d i n v e r t e b r a t e v i s u a l p i g m e n t s d i f f e r i n t h e i r m e c h a n i s m o f p h o t o a c t i v a t i o n " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 9 , 9 6 , 6 1 8 9 - 6 1 9 2 . S . S c h e i n e r , X . F . D u a n " E f f e c t o f I n t e r m o l e c u l a r O r i e n t a t i o n U p o n P r o t o n - T r a n s f e r w i t h i n a P o l a r i z a b l e M e d i u m " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 1 , 6 0 , 8 7 4 - 8 8 3 . S . S c h e i n e r , E . A . H i l l e n b r a n d " M o d i f i c a t i o n o f P k V a l u e s C a u s e d b y C h a n g e i n H - B o n d G e o m e t r y " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 8 5 , 8 2 , 2 7 4 1 - 2 7 4 5 . A . W a r s h e l , S . T . R u s s e l l , A . K . C h u r g " M a c r o s c o p i c M o d e l s f o r S t u d i e s o f E l e c t r o s t a t i c I n t e r a c t i o n s i n P r o t e i n s - L i m i t a t i o n s a n d A p p l i c a b i l i t y " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . B i o l o g i c a l S c i e n c e s 1 9 8 4 , 8 1 , 4 7 8 5 - 4 7 8 9 . B . H o n i g , U . D i n u r , K . N a k a n i s h i , V . B a l o g h n a i r , M . A . G a w i n o w i c z , M . A m a b o l d i , M . G . M o t t o " E x t e r n a l P o i n t - C h a r g e M o d e l f o r W a v e l e n g t h R e g u l a t i o n i n V i s u a l P i g m e n t s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 9 , 1 0 1 , 7 0 8 4 - 7 0 8 6 . 1 5 0 5 5 . 5 6 . 5 7 . 5 8 . 5 9 . 6 0 . 6 1 . 6 2 . 6 3 . 6 4 . 6 5 . 6 6 . 6 7 . 6 8 . P . D u p u i s , F . I . H a r o s i , C . S a n d o r f y , J . M . L e c l e r c q , D . V o c e l l e " 1 s t S t e p i n V i s i o n - P r o t o n - T r a n s f e r o r I s o m e r i z a t i o n " R e v . C a n . B i o l . E x p t l . 1 9 8 0 , 3 9 , 2 4 7 - 2 5 8 . C u r r e n t p r o t o c o l s i n P r o t e i n S c i e n c e , V o l . C h . 1 1 . 4 . , W i l e y & S o n s I n c . , 1 9 9 5 . h t t p : / / b m b s g i 1 0 . l e e d s . a c . u k / l a b m a n / S D S . h t m l A . C o m p a g n i n i , V . C u n s o l o , S . F o t i , R . S a l e t t i " I m p r o v e d a c c u r a c y i n t h e m a t r i x — a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i s a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y d e t e r m i n a t i o n o f t h e m o l e c u l a r m a s s o f c y a n o g e n b r o m i d e f r a g m e n t s o f p r o t e i n s b y p o s t - c l e a v a g e r e a c t i o n w i t h t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e " E u r . J . M a s s S p e c t r o m . 2 0 0 1 , 7 , 1 2 3 - 1 3 0 . J . R . M o r r i s o n , N . H . F i d g e , B . G r e g o " S t u d i e s o n t h e F o r m a t i o n , S e p a r a t i o n , a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f C y a n o g e n - B r o m i d e F r a g m e n t s o f H u m a n A i A p o l i p o p r o t e i n " A n a l . B i o c h e m . 1 9 9 0 , 1 8 6 , 1 4 5 - 1 5 2 . G . T . H e r m a n s o n , B i o c o n j u g a t e T e c h n i q u e s , A c a d e m i c P r e s s , 1 9 9 6 . C u r r e n t p r o t o c o l s i n P r o t e i n S c i e n c e , V o l . C h . 1 5 . 1 . 3 , W i l e y & S o n s I n c . , 1 9 9 5 . w w w . p r o s p e c t o r . u c s f . e d u / G . A . B r e a u x , K . B . G r e e n - C h u r c h , A . F r a n c e , P . A . L i m b a c h " S u r f a c t a n t - a i d e d , m a t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y o f h y d r o p h o b i c a n d h y d r o p h i l i c p e p t i d e s " A n a l . C h e m . 2 0 0 0 , 7 2 , 1 1 6 9 - 1 1 7 4 . G . B r e a u x , K . B . G r e e n - C h u r c h , P . A . L i m b a c h " M A L D I - M S o f h y d r o p h o b i c a n d h y d r o p h i l i c p e p t i d e s . " A b s t r . P a p . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 9 , 2 1 8 , U 2 6 6 - U 2 6 6 . R . K . C h i t t a , M . L . G r o s s " E l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n - m a s s s p e c t r o m e t r y a n d t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y r e v e a l s e l f - a s s o c i a t i o n a n d m e t a l - i o n b i n d i n g o f h y d r o p h o b i c p e p t i d e s : A s t u d y o f t h e g r a m i c i d i n d i m e r " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 2 0 0 4 , 8 6 , 4 7 3 - 4 7 9 . D . R . B a m i d g e , E . A . D r a t z , J . S u n n e r , A . J . J e s a i t i s " I d e n t i fi c a t i o n o f t r a n s m e m b r a n e t r y p t i c p e p t i d e s o f r h o d o p s i n u s i n g m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n t i m e - o f - fl i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y " P r o t e i n S c i e n c e 1 9 9 7 , 6 , 8 1 6 - 8 2 4 . D . R . B a m i d g e , E . A . D r a t z , A . J . J e s a i t i s , J . S u n n e r " E x t r a c t i o n m e t h o d f o r a n a l y s i s o f d e t e r g e n t - s o l u b i l i z e d b a c t e r i o r h o d o p s i n a n d h y d r o p h o b i c p e p t i d e s b y e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y " A n a l . B i o c h e m . 1 9 9 9 , 2 6 9 , 1 - 9 . D . R . B a m i d g e , E . A . D r a t z , T . M a r t i n , L . E . B o n i l l a , L . B . M o r a n , A . L i n d a l l " A b s o l u t e q u a n t i fi c a t i o n o f t h e G p r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o r r h o d o p s i n b y 1 5 1 6 9 . 7 0 . 7 1 . 7 2 . 7 3 . 7 4 . 7 5 . 7 6 . 7 7 . 7 8 . 7 9 . 8 0 . 8 1 . L C / M S / M S u s i n g p r o t e o l y s i s p r o d u c t p e p t i d e s a n d s y n t h e t i c p e p t i d e s t a n d a r d s " A n a l . C h e m . 2 0 0 3 , 7 5 , 4 4 5 - 4 5 1 . B . T h i e d e , B . W i t t m a n n l i e b o l d , M . B i e n e r t , E . K r a u s e " M a l d i - M s f o r C - T e r m i n a l S e q u e n c e D e t e r m i n a t i o n o f P e p t i d e s a n d P r o t e i n s D e g r a d e d b y C a r b o x y p e p t i d a s e - Y a n d C a r b o x y p e p t i d a s e - P " F E B S L e t t . 1 9 9 5 , 3 5 7 , 6 5 - 6 9 . D . H . P a t t e r s o n , G . E . T a r r , F . E . R e g n i e r , S . A . M a r t i n " C - T e r m i n a l L a d d e r S e q u e n c i n g V i a M a t r i x - A s s i s t e d L a s e r - D e s o r p t i o n M a s s - S p e c t r o m e t r y C o u p l e d w i t h C a r b o x y p e p t i d a s e - Y T i m e - D e p e n d e n t a n d C o n c e n t r a t i o n - D e p e n d e n t D i g e s t i o n s " A n a l . C h e m . 1 9 9 5 , 6 7 , 3 9 7 1 - 3 9 7 8 . S . C . G i l l , P . H . V o n h i p p e l " C a l c u l a t i o n o f P r o t e i n E x t i n c t i o n C o e f fi c i e n t s f r o m A m i n o - A c i d S e q u e n c e D a t a " A n a l . B i o c h e m . 1 9 8 9 , 1 8 2 , 3 1 9 - 3 2 6 . S . Y . V e n y a m i n o v , J . T . Y a n g , i n C i r c u l a r d i c h r o i s m a n d t h e c o n f o r m a t i o n a l a n a l y s i s o f b i o m o l e c u l e s . ( E d . : G . D . F a s m a n ) , P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k , N Y , 1 9 9 6 , p p . 6 9 — 1 0 7 . J . A . G a l l y , G . M . E d e l m a n " T h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o f t h e fl u o r e s c e n c e o f s o m e a r o m a t i c a m i n o a c i d s a n d p r o t e i n s . " B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 9 6 2 , 6 0 , 4 9 9 - 5 0 9 . J . N . M i l l e r , i n T e c h n i q u e s i n v i s i b l e a n d u l t r a - v i o l e t s p e c t r o s c o p y , V o l . 2 ( E d . : J . N . M i l l e r ) , C h a p m a n a n d H a l l , N e w Y o r k , 1 9 8 1 , p p . 1 - 7 . M . J . K r o n m a n " F l u o r e s c e n c e s t u d i e s o f t e h m o l e c u l a r c o n f o r m a t i o n o f o n - l a c t a l b u m i n . " B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 9 6 7 , 1 3 3 , 1 9 - 3 2 . R . F . S t e i n e r , H . E d e l h o c h " E f f e c t o f t h e r m a l l y i n d u c e d s t r u c t u r a l t r a n s i t i o n s o n t h e u l t r a - v i o l e t fl u o r e s c e n c e o f p r o t e i n s . " N a t u r e 1 9 6 2 , 1 9 3 , 3 7 5 - 3 7 6 . B . V a l e u r , i n M o l e c u l a r F l u o r e s c e n c e , W i l e y — V C H , W e i n h a m , G e r m a n y , 2 0 0 2 , p p . 3 4 - 7 1 . A . W h i t e " E f f e c t o f p H o n f l u o r e s c e n c e o f t y r o s i n e , t r y p t o p h a n a n d r e l a t e d c o m p o u n d s . " B i o c h e m . J . 1 9 5 9 , 7 1 , 2 1 7 - 2 2 0 . R . F . C h e n , i n F l u o r e s c e n c e : T h e o r y , I n s t r u m e n t a t i o n , a n d P r a c t i c e ( E d . : G . G . G u i l b a u l t ) , M a r c e l D e k k e r , I n c . , N e w Y o r k , 1 9 6 7 , p p . 4 4 3 - 5 0 9 . M . R . E f t i n k , i n T o p i c s i n F l u o r e s c e n c e S p e c t r o s c o p y , V o l . 6 ( E d . : J . R . L a k o w i c z ) , K u l w e r A c a d e m i c / P l e n u m P u b l i s h e r s , N e w Y o r k , 2 0 0 0 , p p . 1 - 1 5 . S . V . K o n e v , F l u o r e s c e n c e a n d p h o s p h o r e s c e n c e o f p r o t e i n s a n d n u c l e i c a c i d s , P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k , 1 9 6 7 . 1 5 2 8 2 . 8 3 . 8 4 . 8 5 . 8 6 . 8 7 . 8 8 . 8 9 . 9 0 . 9 1 . 9 2 . U . C o g a n , M . K o p e l m a n , S . M o k a d y , M . S h i n i t z k y " B i n d i n g a f f i n i t i e s o f r e t i n o l a n d r e l a t e d c o m p o u n d s t o r e t i n a l b i n d i n g p r o t e i n s . " E u r . J . B i o c h e m . 1 9 7 6 , 6 5 , 7 1 - 7 8 . L . W a n g , Y . L i , H . Y a n " S t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s o f C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d - b i n d i n g p r o t e i n s . " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 7 , 2 7 2 , 1 5 4 1 - 1 5 4 7 . D . C . L e e , J . A . H a y w a r d , C . J . R e s t a l l , D . C h a p m a n " 2 n d - D e r i v a t i v e I n f r a r e d S p e c t r o s c o p i c S t u d i e s o f t h e S e c o n d a r y S t r u c t u r e s o f B a c t e r i o r h o d o p s i n a n d C a - 2 + - A t p a s e " B i o c h e m i s t r y 1 9 8 5 , 2 4 , 4 3 6 4 - 4 3 7 3 . M . P . H o r v a t h , R . A . C o p e l a n d , M . W . M a k i n e n " T h e s e c o n d d e r i v a t i v e e l e c t r o n i c a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n t h e S o r e t r e g i o n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 9 , 7 7 , 1 6 9 4 - 1 7 1 1 . J . E . C a h i l l " D e r i v a t i v e S p e c t r o s c o p y - U n d e r s t a n d i n g I t s A p p l i c a t i o n " I n t L a b 1 9 8 0 , 1 0 , 6 4 - 6 8 . J . E . C a h i l l , F . G . P a d e r a " D e r i v a t i v e A n a l y s i s o f U v - V i s i b l e S p e c t r a " A m L a b 1 9 8 0 , 1 2 , 1 0 1 - 1 0 4 . J . E . C a h i l l " D e r i v a t i v e S p e c t r o s c o p y - U n d e r s t a n d i n g I t s A p p l i c a t i o n " A m L a b 1 9 7 9 , 1 1 , 7 9 - 8 3 . A . C . S e h g a l , R . T o m p s o n , J . C a v a n a g h , R . M . K e l l y " S t r u c t u r a l a n d c a t a l y t i c r e s p o n s e t o t e m p e r a t u r e a n d c o s o l v e n t s o f c a r b o x y l e s t e r a s e E S T l f r o m t h e e x t r e m e l y t h e r m o a c i d o p h i l i c a r c h a e o n S u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s P 1 " B i o t e c h n o l . B i o e n g . 2 0 0 2 , 8 0 , 7 8 4 - 7 9 3 . G . T . H e r m a n s o n , i n B i o c o n j u g a t e T e c h n i q u e s , A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o , C A , 1 9 9 6 , p p . 1 6 9 - 1 8 6 . w w w . s r s m a l d i . c o m / M a l d i / S t e p / M a t S e l . h t m l L . E . F i s h e r , D . M . E n g e l m a n " H i g h - y i e l d s y n t h e s i s a n d p u r i f i c a t i o n o f a n a l p h a - h e l i c a l t r a n s m e m b r a n e d o m a i n " A n a l . B i o c h e m . 2 0 0 1 , 2 9 3 , 1 0 2 — 1 0 8 . 1 5 3 W W R 1 3 2 K C h a p t e r 3 E n g i n e e r i n g a R h o d o p s i n P r o t e i n M i m i c 3 . 1 R e s t o r i n g T y r l 3 4 : T h e i m p o r t a n c e o f a s i n g l e m u t a t i o n A s d i s c u s s e d i n t h e p r e v i o u s c h a p t e r t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L 2 L 1 2 1 E 2 T 5 4 V p e n t a m u t a n t w i t h r e t i n o i c a c i d r e v e a l s a b i s c a r b o x y l i c a c i d d i m e r f o r m e d b e t w e e n G l u 1 2 1 a n d t h e b o u n d r e t i n o i c a c i d ( F i g u r e 3 - 1 ) . I n o r d e r f o r t h i s b i n d i n g t o o c c u r b o t h c a r b o x y l i c a c i d s n e e d t o b e p r o t o n a t e d . A c l o s e r l o o k a t t h e F i g u r e 3 - 1 . O v e r l a y o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V ( g r e e n c a r b o n a t o m s ) a n d C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F ( b l u e c a r b o n a t o m s ) b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d . b i n d i n g m o t i f s u g g e s t s t h a t L y s l 3 2 , 2 . 6 A a w a y f r o m t h e c l o s e s t r e t i n o i c a c i d o x y g e n , c a n a s s i s t i t s p r o t o n a t i o n . A s s h o w n i n F i g u r e 3 - 1 , t h e L y s r e s i d u e h a s s i g n i fi c a n t l y m o v e d t o w a r d s t h e l i g a n d , a s c o m p a r e d t o i t s p o s i t i o n i n t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F s t r u c t u r e . T h e p K a o f c a r b o x y l i c a c i d s i n s o l u t i o n i s b e t w e e n 4 - 5 . I n o u r s t r u c t u r e , t h i s v a l u e f o r b o t h G l u 1 2 1 a n d t h e b o u n d r e t i n o i c a c i d h a s t o b e a l t e r e d , s i n c e t h e y a p p e a r t o r e m a i n p r o t o n a t e d a t p h y s i o l o g i c a l p H . C a s e s o f p e r t u r b e d c a r b o x y l i c a c i d p K , 1 v a l u e s , i n c r e a s e d 1 5 4 a s m u c h a s 5 u n i t s , h a v e b e e n p r e v i o u s l y r e p o r t e d . 1 T h e y a r e u s u a l l y d u e t o t h e p l a c e m e n t o f t h e c a r b o x y l i c a c i d r e s i d u e s w i t h i n a h y d r o p h o b i c c a v i t y , c o n s i s t e n t w i t h w h a t w e o b s e r v e f o r C R A B P I I p e n t a m u t a n t . A s b r i e f l y d i s c u s s e d i n t h e p r e v i o u s c h a p t e r , t h e p r o t o n a t e d G l u 1 2 1 r e s i d u e i s u s e f u l f o r r e s t o r i n g t h e r e t i n o i c a c i d b i n d i n g a f f i n i t y i n a m u t a n t ( R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V ) w h e r e a l l t h e r e s i d u e s p r e v i o u s l y r e p o r t e d a s r e s p o n s i b l e f o r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g h a v e b e e n r e m o v e d . H o w e v e r , o u r m a i n g o a l f o r i n t r o d u c i n g a G l u r e s i d u e a t p o s i t i o n 1 2 1 w a s t o m a i n t a i n a c o u n t e r a n i o n t h a t c a n s t a b i l i z e t h e P S B f o r m e d w i t h r e t i n a l . R e c a l l t h e U V - v i s d a t a o f t h e C R A B P H - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 2 R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V t i t r a t i o n w i t h r e t i n a l ( k m , 2 3 8 2 n m , 4 3 0 n m ) . W h a t w e o b s e r v e d c a n b e a t t r i b u t e d t o a m i x t u r e o f p r o t o n a t e d a n d n o n - p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e a n d c a n b e d u e t o t h e a b s e n c e o f a s t r o n g c o u n t e r a n i o n i n t h e v i c i n i t y o f t h e P S B . O n e w a y t o a d d r e s s t h i s i s s u e i s b y p l a c i n g a p o l a r r e s i d u e , t h a t c a n a c t a s a g e n e r a l b a s e , c l o s e t o G l u 1 2 1 . W e b e l i e v e d t h a t r e s t o r i n g T y r 1 3 4 , a r e s i d u e i n c l o s e p r o x i m i t y t o p o s i t i o n 1 2 1 a s e v i d e n t f r o m t h e W T - C R A B P I I s t r u c t u r e , c o u l d l e a d t o a d r o p i n t h e p K a v a l u e o f G l u 1 2 1 , a c t i v a t i n g i t a s a c o u n t e r a n i o n . T h e i d e a o f r e s t o r i n g T y r l 3 4 w a s a l s o p u r s u e d f o r a n a d d i t i o n a l r e a s o n . A s w e s a w b e f o r e u p o n m u t a t i o n o f T y r l 3 4 t o P h e , t h e d o u b l e m u t a n t R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F , a l t h o u g h p r o d u c i n g a r e d s h i f t e d U V - v i s t r a c e , c o n s i s t e n t l y f a i l e d t o p r o d u c e p o s i t i v e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e s u l t s , a s e v i d e n t f o r m t h e M A L D I - T O F s p e c t r a a c q u i r e d ( F i g u r e 2 - 6 ) . O n t h e c o n t r a r y , t h e M A L D I - T O P s p e c t r a o f t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n p e r f o r m e d w i t h s i n g l e m u t a n t R 1 3 2 K c l e a r l y s h o w e d t h e p r e s e n c e o f a r e t i n a l a d d u c t ( [ M + 2 6 8 ] + p e a k , F i g u r e 2 - 4 ) . A l t h o u g h t h e a b i l i t y f o r S B f o r m a t i o n w a s r e s t o r e d t h r o u g h a d d i t i o n a l m u t a t i o n s a s 1 5 5 0 . 1 2 w 0 . 1 - 0 . 0 8 1 0 . 0 6 ~ 0 . 0 4 - 0 . 0 2 « 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 1 6 0 0 0 M a s s ( D a ) 0 r r r r 1 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 5 0 0 5 5 0 1 4 7 0 0 n m 1 6 8 0 1 . 1 1 7 0 6 9 . 4 r l 1 5 7 0 0 M a s s ( D a ) 1 R 1 3 2 K K d ( R t ) = 2 8 0 : 1 : 1 7 n M K d ( R A ) = 6 5 : I : 1 4 n M R 1 3 2 K : R 1 1 1 L K d ( R t ) = 5 6 7 : l : 3 6 n M K d ( R A ) = 7 3 6 : 1 1 4 n M 1 6 7 0 0 F i g u r e 3 - 2 . A . U V a n d M A L D I - T O F s p e c t r a o f C R A B P I I - R 1 3 2 K i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l . T h e U V t r a c e c h a n g e s w i t h t i m e f r o m 3 9 2 n m ( r e d t r a c e , 1 m i n ) t o 3 7 6 n m ( b l u e t r a c e . 1 5 m i n ) . T h e M A L D I - T O F s p e c t r u m o f t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d p r o t e i n ( 1 6 8 0 1 . 1 D a ) r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f a s e c o n d p e a k ( 1 7 0 6 9 . 4 D a ) i n d i c a t i v e o f a r e t i n a l a d d u c t ; B . U V a n d M A L D I - T O F s p e c t r a o f C R A B P I I - R 1 3 2 K 2 R 1 1 1 L i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l . T h e U V t r a c e c h a n g e s w i t h t i m e f r o m 4 0 1 n m ( r e d t r a c e , 1 m i n ) t o 3 7 7 n m ( m a g e n t a t r a c e , 5 0 m i n ) . T h e U V - v i s r e m a i n s s t a b l e a f t e r 4 5 m i n . T h e M A L D I - T O F s p e c t r u m o f t h e r e d u c t i v e a m i n a t e d p r o t e i n ( 1 5 4 9 6 . 1 D a ) r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f a s e c o n d p e a k ( 1 5 7 6 6 . 4 D a ) i n d i c a t i v e o f a r e t i n a l a d d u c t . 1 5 6 d i s c u s s e d i n C h a p t e r 2 , i t a p p e a r s t h a t T y r l 3 4 c a n f a c i l i t a t e t h e f o r m a t i o n o f a r e t i n a l S c h i f f b a s e . T h e r e f o r e , u t i l i z i n g t h e k n o w l e d g e a c q u i r e d f r o m o u r p r e v i o u s m u t a t i o n s i n v o l v i n g t h e t e c h n i q u e s f o r p r o t e i n e n g i n e e r i n g a n d t h e p r i n c i p l e s o f r a t i o n a l p r o t e i n d e s i g n , a n e w s e r i e s o f m u t a n t s , t h a t m a i n t a i n t h e T y r 1 3 4 r e s i d u e i n t a c t , w a s p r o d u c e d . W e o f t e n r e f e r t o t h e s e p r o t e i n s a s t h e T y r l 3 4 s e r i e s i n o r d e r t o d i s t i n g u i s h t h e m f r o m t h o s e d e s c r i b e d i n C h a p t e r 2 ( Y 1 3 4 F s e r i e s ) . S i n c e T y r l 3 4 i s n a t i v e f o r C R A B P I I n o a d d i t i o n a l n o t a t i o n i s s h o w n f o r t h i s r e s i d u e w h e n t h e v a r i o u s m u t a n t s a r e p r e s e n t e d . F i g u r e 3 - 2 A s u m m a r i z e s t h e r e t i n a l b i n d i n g p r o p e r t i e s o f t h e R 1 3 2 K s i n g l e m u t a n t . A s d i s c u s s e d i n C h a p t e r 2 , t h e i n i t i a l r e d s h i f t e d U V - v i s t r a c e ( 3 9 2 n m ) b l u e s h i f t s w i t h t i m e u n t i l i t f i n a l l y e q u i l i b r a t e s a t 3 7 6 n m . A t t h e s a m e t i m e , t h e M A L D I - T O F s p e c t r u m o f t h e r e d u c t i v e l y a m i n a t e d p r o t e i n d e t e c t s t h e a d d i t i o n a l p e a k c h a r a c t e r i s t i c o f a r e t i n a l a d d u c t F r o m a f i r s t v i e w , t h e s p e c t r a f o r t h e R 1 3 2 K 2 R 1 1 1 L d o u b l e m u t a n t ( F i g u r e 3 - 2 B ) a r e v e r y s i m i l a r t o w h a t i s d e s c r i b e d a b o v e . T h e U V - v i s t r a c e s h o w s a n i n i t i a l p e a k a t 4 0 1 n m w h i c h c h a n g e s w i t h t i m e . I n t h e c o u r s e o f s e v e r a l m i n u t e s t h e t r a c e b l u e s h i f t s u n t i l a t 4 5 m i n i t e q u i l i b r a t e s a t 3 7 5 n m . T h e fi n a l U V - v i s t r a c e , a s s h o w n i n F i g u r e 3 - 2 , i s v e r y s i m i l a r t o t h a t o f R 1 3 2 K ( A m , = 3 7 7 n m ) . H o w e v e r , i n t h e c a s e o f R 1 3 2 K : R 1 1 1 L , t h e t i m e r e q u i r e d f o r t h e s y s t e m t o r e a c h a n e q u i l i b r i u m i s c o n s i d e r a b l y h i g h e r t h a n w h a t p r e v i o u s l y w a s o b s e r v e d f o r R 1 3 2 K ( 4 5 m i n v e r s u s 1 5 m i n ) . I n a d d i t i o n , u p o n a c i d i f i c a t i o n o f t h e R 1 3 2 K 2 R 1 1 1 L - r e t i n a l m i x t u r e , t h e p e a k a t 3 7 5 n m s l o w l y r e d s h i f t s t o ~ 4 3 3 n m ( F i g u r e 3 - 3 ) . H o w e v e r , a l t h o u g h t h e r e d s h i f t i s s i g n i f i c a n t , t h e fi n a l p e a k a p p e a r s t o b e t h e s u m m a t i o n o f t w o d i f f e r e n t p e a k s . T h i s r e s u l t i n d i c a t e s t h a t t h e o r i g i n a l p e a k a t 3 7 5 n m m a y b e d u e t o t w o d i f f e r e n t s p e c i e s a b s o r b i n g a t v e r y 1 5 7 0 1 5 4 0 . 4 — O J 3 ~ 0 2 3 1 O J — a c i d i fi c a t i o n o l I I fi r 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 n m F i g u r e 3 - 3 . A . T h e U V s p e c t r u m o f C R A B P I I - R 1 3 2 K 2 R 1 1 1 L i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 1 e q u i v o f a l l - t r a n s - r e t i n a l a f t e r ~ 5 0 m i n h a s a 1 . . . . . . a t ~ 3 7 5 n m . U p o n a c i d i fi c a t i o n t h e s p e c t r u m r e d s h i f t s , u n t i l i t e q u i l i b r a t e s a t 4 3 3 n m ( p H r a n g e f r o m 7 . 3 t o 5 . 2 3 ) ; B . P l o t t i n g o f t h e U V a b s o r b a n c e a t 4 7 3 n m v e r s u s t h e p H o f t h e s a m p l e s a f f o r d s a p K . o f 6 . 5 5 f o r t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . s i m i l a r w a v e l e n g t h s : f r e e r e t i n a l a n d n o n - p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . U p o n a d d i t i o n o f a c i d t h e S B i s p r o t o n a t e d ( 4 3 3 u m s p e c i e s ) b u t t h e f r e e r e t i n a l r e m a i n s a s i s , y i e l d i n g a b r o a d o v e r a l l p e a k . A s w a s b r i e fl y d i s c u s s e d i n C h a p t e r 2 , a c i d i fi c a t i o n o f t h e s i n g l e m u t a n t R 1 3 2 K - r e t i n a l s o l u t i o n d i d n o t r e s u l t i n a n y r e d s h i f t i n g . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e o b s e r v e d s i m i l a r U V - v i s b e h a v i o r f o r t h e t w o a f o r e m e n t i o n e d p r o t e i n s a c t u a l l y o r i g i n a t e s f r o m d i f f e r e n t s p e c i e s . F i g u r e 3 - 4 d e p i c t s t h e m o d e l s t r u c t u r e s o f t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L m u t a n t w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d e i t h e r n o n - c o v a l e n t l y ( A ) o r a s a S c h i f f b a s e ( B ) . A s c a n b e s e e n , L y 3 1 3 2 c a n b e i n c l o s e p r o x i m i t y t o T y r l 3 4 ( 2 . 8 A ) , s u g g e s t i n g t h a t T y r l 3 4 c a n a c t i v a t e t h e p r i m a r y a m i n e a n d f a c i l i t a t e t h e n u c l e o p h i l i c a t t a c k . A t t h e s a m e t i m e , t h e m o d e l o f t h e c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l s u g g e s t s t h a t t h e c h r o m O p h o r e n e e d s t o r o t a t e a n d s l i d e 1 5 8 F i g u r e 3 - 4 . S t e r e o v i e w o f t h e m o d e l s t r u c t u r e s o f C R A B P I I - R 1 3 2 K z R 1 1 1 L m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . e i t h e r n o n - c o v a l e n t l y ( A ) o r a s a S c h i f f b a s e ( B ) ; C . S t e r e o v i e w o f t h e m o d e l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l n o n - c o v a l e n t l y . T h e b l u e c r o s s r e p r e s e n t s a n o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e a s s o c i a t e d w i t h A r g 1 1 1 . 1 5 9 t o w a r d s L y s l 3 2 f o r t h e S B t o f o r m . T h e n e c e s s a r y r o t a t i o n c a n n o w b e a c h i e v e d s i n c e t h e w a t e r m o l e c u l e a s s o c i a t e d w i t h A r g l l l ( F i g u r e 3 - 4 C ) , t h a t a p p e a r e d t o “ l o c k ” t h e r e t i n a l i n a p o s i t i o n a w a y f r o m L y s l 3 2 , h a s b e e n r e m o v e d . T h i s c o u l d e x p l a i n w h y t h e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n a p p e a r s t o b e m o r e s u c c e s s f u l w h e n t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L m u t a n t i s u s e d . A f t e r t h e S B i s f o r m e d , t h e p h e n o l i c C H o f T y r l 3 4 c a n b e c l o s e t o t h e i m i n e n i t r o g e n ( F i g u r e 3 - 4 A ) o n a t r a j e c t o r y t h a t c a n f a v o r s t a b i l i z a t i o n o f a P S B . H o w e v e r , s i n c e t h e s y s t e m i s n o t s t a b l e , p o s i t i o n i n g o f a c o u n t e r a n i o n t o f u r t h e r s t a b i l i z e t h e p r o t o n a t e d i m i n e i s e s s e n t i a l . T h e m o d e l o f t h e c o v a l e n t l y b o u n d r e t i n a l i n F i g u r e 3 - 4 B s u g g e s t s t h a t t h e b e s t p o s i t i o n f o r i n t r o d u c i n g a c o u n t e r a n i o n i s r e s i d u e 1 2 1 . C o n s i d e r i n g t h a t m u t a t i o n L 1 2 1 E a f f o r d e d t h e m o s t p r o m i s i n g r e s u l t s i n t h e Y 1 3 4 F s e r i e s a s w e l l ( m u t a n t s R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E a n d R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V , C h a p t e r 2 ) , t r i p l e m u t a n t R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E w a s f o r m e d . T h e s p e c t r o s c o p i c r e s u l t s f o r t h e n e w l y f o r m e d C R A B P I I t r i p l e m u t a n t R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 3 - 5 . T h e p r o t e i n h a s a r e m a r k a b l e a f f i n i t y f o r r e t i n a l a s e v i d e n t f r o m t h e e x t r e m e l y l o w d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( K , = 1 . 3 6 i 4 . 9 n M ) o b t a i n e d b y fl u o r e s c e n c e q u e n c h i n g . A t t h e s a m e t i m e , t h e U V - v i s t r a c e i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f a s i n g l e p e a k a t 4 4 9 n m , a 7 2 n m r e d s h i f t a s c o m p a r e d t o t h e t r a c e o f r e t i n a l i n t h e p r e s e n c e o f W T - C R A B P I I ( F i g u r e 3 - 5 B ) . T h e d i r e c t e f f e c t o f t h e r e s t o r e d T y r 1 3 4 f o r r e t i n a l b i n d i n g a n d p r o t o n a t e d S B f o r m a t i o n i s e v i d e n t w h e n o n e c o m p a r e s t h e U V - v i s t r a c e s o f t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t a n d t h a t o f t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E t e t r a m u t a n t ( F i g u r e 3 - 5 B ) . T h e s p e c t r u m o f K F L E t e t r a m u t a n t i s a c o m b i n a t i o n o f t w o o v e r l a p p i n g p e a k s a b s o r b i n g 1 6 0 e c n e c s e r o u l F e v i t a l e R > m 0 . 1 — 1 1 0 . 0 8 4 0 . 9 “ A 0 . 0 6 " 0 . 0 4 — 0 . 8 . 0 . 0 2 - 0 . 7 I i l I j 0 1 l ] 0 0 . 5 1 1 . 5 2 2 . 5 2 5 0 3 5 0 4 5 0 5 5 0 E q u i v a l e n t s R e t i n o i c A c i d l R e t i n a l n m C D 1 5 5 0 3 . 5 1 5 5 1 1 . 4 1 5 7 7 6 . 3 1 5 7 8 0 . 0 1 5 0 0 0 1 5 5 0 0 1 6 0 0 0 1 6 5 0 0 1 5 0 0 0 1 5 5 0 0 1 6 0 0 0 1 6 5 0 0 M a s s ( D a ) M 3 8 8 ( D a ) F i g u r e 3 - 5 . A . F l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n s o f r e t i n o i c a c i d ( K d = 4 2 6 t 4 7 n M ) a n d r e t i n a l ( K , = 1 . 4 : i : 4 . 9 n M ) w i t h t h e C R A B P I I m u t a n t R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E ; B . U V N i s s p e c t r u m o f r e t i n a l b o u n d t o W T C R A B P I I ( b l u e t r a c e ) a n d t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E ( m a g e n t a t r a c e , K F L E ) , R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E ( r e d t r a c e , K L E ) m u t a n t . R e t i n a l b o u n d w i t h w i l d - t y p e a b s o r b s a t 3 7 7 n m . T h e U V o f r e t i n a l w i t h t h e K L E m u t a n t r e v e a l s a 4 4 9 n m p e a k , i n d i c a t i n g f o r m a t i o n o f P S B . T h e U V f o r t h e K F L E m u t a n t i s a m i x t u r e o f t w o p e a k s a t 3 7 8 n m a n d 4 3 8 n m ; C . M A L D I - T O F o f t h e i n c u b a t i o n o f r e t i n a l w i t h R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E . I n a d d i t i o n t o t h e a p o p r o t e i n p e a k ( 1 5 5 1 1 . 4 D a , c a l c u l a t e d v a l u e 1 5 5 0 8 . 2 D a ) a s e c o n d p e a k a t 1 5 7 8 0 . 0 D a i s f o u n d , t h a t c o r r e s p o n d s t o t h e c o v a l e n t c o m p l e x o f t h e m u t a n t w i t h r e t i n a l ; D . R e d u c t i v e a m i n a t i o n o f r e t i n a l w i t h t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t r e v e a l s a m i x t u r e o f t h e a p o - p r o t e i n ( 1 5 5 0 8 . 5 D a ) a s w e l l a s t h e c o v a l e n t c o m p l e x o f t h e p r o t e i n w i t h r e t i n a l ( 1 5 7 7 6 . 3 D a ) . 1 6 1 a t 3 7 8 n m a n d 4 3 8 n m . T h e s e p e a k s w e r e a t t r i b u t e d t o t h e l o w p K a v a l u e o f t h e f o r m e d P S B , c o r r e s p o n d i n g t o t h e n o n - p r o t o n a t e d a n d t h e p r o t o n a t e d f o r m r e s p e c t i v e l y . W h e n T y r l 3 4 i s r e s t o r e d ( R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t ) , a d d i t i o n o f r e t i n a l r e s u l t s i n a s i n g l e U V - v i s p e a k , w i t h a 1 m m a t 4 4 9 n m . S e e m i n g l y , T y r l 3 4 i s a s s i s t i n g t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e P S B t h a t r e s u l t s i n a s p e c i e s s t a b l e a t p h y s i o l o g i c a l p H ( e l e v a t i o n o f P S B p K . ) . T h e s u g g e s t i o n t h a t T y r l 3 4 c a n a c t i v a t e t h e c o u n t e r a n i o n G l u 1 2 1 , a s i n t r o d u c e d a t t h e b e g i n n i n g o f t h i s C h a p t e r , a p p e a r s t o s u p p o r t e d . I n a d d i t i o n t o t h e U V - v i s s p e c t r a , t h e M A L D I - T O F s p e c t r a f o r b o t h t h e i n c u b a t i o n a n d t h e r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n s f u r t h e r s u p p o r t t h e S B f o r m a t i o n ( F i g u r e 3 - 5 , C a n d D ) . " ’ 7 r i f , r ' * T T 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 n m F i g u r e 3 - 6 . U V s p e c t r a o f t h e t i t r a t i o n o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l . T h e a m o u n t o f r e t i n a l p r e s e n t i n c r e a s e s i n 0 . 2 i n c r e m e n t s , f r o m 0 . 2 e q u i v t o 2 . 0 e q u i v . T h e s t o i c h i o m e t r y o f t h e b i n d i n g i s c l o s e t o o n e . E v e n i n t h e p r e s e n c e o f 2 e q u i v o f r e t i n a l t h e r e d s h i f t e d p e a k a t 4 4 9 n m i s s t i l l p r e s e n t a s a s h o u l d e r . I n a d d i t i o n t o t h e f o r m a t i o n o f a m o r e s t a b l e P S B , t h e s t o i c h i o m e t r y o f t h e r e t i n a l b i n d i n g i s v e r y c l o s e t o o n e , a s c a n b e s e e n f r o m t h e t i t r a t i o n i n F i g u r e 3 - 6 . A s 1 6 2 m e n t i o n e d i n C h a p t e r 2 , f o r a l l t h e p r e v i o u s l y d i s c u s s e d m u t a n t s t h e p r e s e n t e d U V - v i s s p e c t r a w e r e r e c o r d e d i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 1 - 0 . 2 e q u i v o f l i g a n d . T h a t w a s b e c a u s e , f o r a l l t h e a f o r e m e n t i o n e d c a s e s , a d d i t i o n o f m o r e t h a n 0 . 3 e q u i v o f r e t i n a l r e s u l t e d i n a m i x t u r e o f p e a k s t h a t c o u l d b e a t t r i b u t e d t o b o t h f r e e a n d P S B b o u n d r e t i n a l . H o w e v e r , i n t h e c a s e o f t h i s l a t t e r m u t a n t , R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E , t h e P S B p e a k i s t h e o n l y p e a k p r e s e n t f o r u p t o ~ 0 8 e q u i v o f r e t i n a l , w h i l e r e m a i n s t h e m a j o r p e a k e v e n i n t h e p r e s e n c e o f 1 . 2 e q o f r e t i n a l . A s m o r e r e t i n a l i s t i t r a t e d i n t o t h e s y s t e m , t h e p e a k a t 4 4 9 r e m a i n s s t a b l e w h i l e a n e w p e a k , a t ~ 3 7 7 n m d u e t o f r e e r e t i n a l i s o b s e r v e d . I n a d d i t i o n , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e 4 4 9 n m p e a k i s p r e s e n t i m m e d i a t e l y a f t e r m i x i n g t h e p r o t e i n w i t h r e t i n a l a n d t h e s p e c t r u m r e m a i n s i n t a c t f o r s e v e r a l h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e ; a t 4 ° C , t h e c o m p l e x w a s m a i n t a i n e d f o r a t l e a s t 5 d a y s . S i n c e t h e P S B f o r m e d w i t h t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t i s s t a b l e a t p h y s i o l o g i c a l p H a n a t t e m p t w a s c a r r i e d o u t f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f i t s a p p a r e n t p K a u s i n g a p H t i t r a t i o n . T h e t r i p l e m u t a n t w a s i n c u b a t e d w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l a t p h y s i o l o g i c a l p H a n d t h e U V - v i s c h a n g e s w e r e r e c o r d e d u p o n a d d i t i o n o f c o n c e n t r a t e d N a O H . T h e r e s u l t , a s s h o w n i n F i g u r e 3 - 7 A , r e v e a l s a v e r y s m o o t h c o n v e r s i o n o f t h e 4 4 9 n m p e a k t o a 3 6 0 n m p e a k w i t h a s i n g l e i s o s b e s t i c p o i n t ( 3 9 6 n m ) . B y p l o t t i n g t h e i n c r e a s e o f t h e a b s o r b a n c e a t 3 6 0 n m a g a i n s t t h e p H c h a n g e , a s i g m o i d a l c u r v e i s o b t a i n e d . T h e s e c o n d d e r i v a t i v e o f a 3 r d o r d e r p o l y n o m i a l c u r v e t h a t fi t s t h r o u g h t h e o b t a i n e d p o i n t s c a n a f f o r d a v a l u e f o r t h e p K a o f t h e P S B . I n t h i s c a s e , t h e c a l c u l a t e d v a l u e w a s 8 . 7 , m o r e t h a n t w o u n i t s h i g h e r t h a n t h e v a l u e w e c a l c u l a t e d f o r t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V m u t a n t ( C h a p t e r 2 , p K a l = 6 . 5 ) , v e r i f y i n g t h e p o s i t i v e e f f e c t o f T y r l 3 4 o n t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . 1 6 3 F i g u r e 3 - 7 . A . p H t i t r a t i o n o f t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t b o u n d t o 0 . 5 e q u i v a l l - t r a n s - r e t i n a l . U p o n a d d i t i o n o f N a O H , t h e p e a k a t 4 4 9 n m ( P S B ) i s d i s a p p e a r i n g w h i l e a n e w o n e a t 3 6 0 n m ( S B ) i s i n c r e a s i n g . T h e p H w a s c h a n g e d f r o m 7 . 0 8 t o 9 . 8 8 ; B . G r a p h i c a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e c h a n g e i n t h e a b s o r b a n c e a t 3 6 0 n m v e r s u s t h e p H c h a n g e . T h e p K . c a n b e c a l c u l a t e d b y s o l v i n g t h e 2 " ‘ 1 d e r i v a t i v e o f t h e fi t t e d c u r v e ; C . U p o n a d d i t i o n o f a c i d ( H C l ) t o t h e 3 6 0 n m p e a k , t h e S B i s p r o t o n a t e d r e s t o r i n g t h e r e d s h i f t e d p e a k ( 4 4 9 n m ) . 1 6 4 I f a d d i t i o n o f b a s e i n t h e t r i p l e m u t a n t - r e t i n a l c o m p l e x r e s u l t e d i n d e p r o t o n a t i o n o f t h e P S B , s u b s e q u e n t a d d i t i o n o f a c i d s h o u l d p r o t o n a t e t h e S c h i f f b a s e a n d y i e l d a r e d s h i f t e d U V - v i s s p e c i e s . A s c a n b e s e e n i n F i g u r e 3 - 7 C t h a t i s t h e c a s e . I n p a r t i c u l a r , u p o n a d d i t i o n o f c o n c e n t r a t e d H C I t o t h e 3 6 0 n m R 1 3 2 L : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E - r e t i n a l s p e c i e s t h e U V - v i s t r a c e s l o w l y s h i f t s b a c k t o a 4 4 9 n m a b s o r b i n g s p e c i e s . T h e t r a n s i t i o n i s e q u a l l y s m o o t h , g o i n g t h r o u g h t h e s a m e i s o s b e s t i c p o i n t ( 3 9 6 n m ) . T h i s f u r t h e r s u p p o r t s t h e v a l i d i t y o f o u r p K a c a l c u l a t i o n , t h e o b s e r v e d e q u i l i b r i u m i s i n d e e d b e t w e e n t h e d e p r o t o n a t e d a n d t h e p r o t o n a t e d f o r m o f t h e S c h i f f b a s e . ( T h e a b o v e e x p e r i m e n t c a n o n l y w o r k w h e n a c o n c e n t r a t e d s o l u t i o n o f p r o t e i n ( m M c o n c e n t r a t i o n ) i s u s e d . A t l o w e r c o n c e n t r a t i o n s ( M M ) t h e p r o t e i n d e n a t u r e s u p o n a d d i t i o n o f s m a l l a m o u n t s o f c o n c e n t r a t e d H C I ) . A c c o r d i n g t o p u b l i c r e p o r t s , o n e w o u l d e x p e c t t h a t u p o n f o r m a t i o n o f a S c h i f f b a s e t h e U V — v i s o f t h e r e t i n a l i n s o l u t i o n w o u l d b l u e s h i f t f r o m ~ 3 8 0 n m ( f r e e r e t i n a l ) t o ~ 3 6 5 n m . 2 ’ 3 H o w e v e r , w h e n t h e r e a c t i o n o c c u r s w i t h i n a p r o t e i n c a v i t y t h e s p e c t r o s c o p i c t r e n d s c a n n o t b e p r e d i c t e d . T h e r e f o r e , t h r o u g h o u t o u r p r e v i o u s d i s c u s s i o n w e c o u l d n o t d e f i n e w h e t h e r w h a t w a s o b s e r v e d i n t h e U V - v i s s p e c t r a w a s d u e t o f r e e r e t i n a l o r n o n - p r o t o n a t e d S B . H o w e v e r , s i n c e b y u s i n g t h e C R A B P H - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t o n e c a n o b t a i n s i n g l e U V - v i s p e a k s a t b o t h h i g h ( 3 6 0 n m ) a n d l o w ( 4 4 9 n m ) p H v a l u e s , w e c a n a r g u e t h a t t h e s e a b s o r p t i o n m a x i m a c o r r e s p o n d t o t h e S B a n d P S B s p e c i e s , r e s p e c t i v e l y . T h e c a l c u l a t e d p K a v a l u e f o r t h e P S B f o r m e d b e t w e e n t h e C R A B P H - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t a n d a l l - t r a n s - r e t i n a l ( 8 . 7 ) i s r a t h e r l o w a s c o m p a r e d t o t h e p K a v a l u e s o f t h e v a r i o u s r h o d o p s i n s . F o r b o v i n e r h o d o p s i n , t h e c o r r e s p o n d i n g v a l u e 1 6 5 c a l c u l a t e d b y a s i m i l a r m e t h o d , i s g r e a t e r t h a n 1 2 , e s t i m a t e d t o b e c l o s e r t o 1 6 . 4 ' 7 A t t h e s a m e t i m e , t h e v a l u e f o r b a c t e r i o r h o d o p s i n h a s b e e n e s t i m a t e d a t ~ 1 3 . 3 . 8 ’ 9 T h e p K a o f t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t ( 8 . 7 ) c o m p a r e s b e t t e r w i t h w h a t i s o b s e r v e d f o r i n v e r t e b r a t e s ( P S B p K a : o c t o p u s r h o d o p s i n 1 0 . 4 , g e c k o c o n e o p s i n 9 . 9 ) . 1 0 ' 1 1 I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h i s d r o p i n t h e p K a v a l u e i s d u e t o t h e l a c k o f a c a r b o x y l a t e c o u n t e r a n i o n i n t h e S B v i c i n i t y . I n s t e a d , a T y r r e s i d u e h a s b e e n f o u n d c l o s e t o t h e S c h i f f b a s e f o r t h e o c t o p u s r h o d o p s i n , w i t h s p e c t r o s c o p i c r e s u l t s i n d i c a t i n g t h a t i t d o e s n o t e x i s t i n i t s ' 2 W i t h C R A B P H m u t a n t s , r e s t o r i n g T y r l 3 4 r e s u l t e d i n a n i n c r e a s e o f t h e a n i o n i c f o r m . P S B p K a o f ~ 2 . 2 u n i t s ( c o m p a r e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V ( 6 . 5 ) w i t h R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E ( 8 . 7 ) ) . T h i s r e s u l t f u r t h e r s u p p o r t s t h e s u g g e s t i o n t h a t T y r l 3 4 a c t i v a t e s G l u 1 2 1 t o a c t a s a m o r e e f f i c i e n t c o u n t e r a n i o n r e s u l t i n g i n P S B s t a b i l i t y . A s m e n t i o n e d b e f o r e , t h e c a l c u l a t e d P S B p K a o f 8 . 7 i s s i g n i fi c a n t l y l o w e r t h a n w h a t h a s b e e n e s t i m a t e d f o r r h o d o p s i n . H o w e v e r , t h e f a c t t h a t t h e P S B f o r m e d b e t w e e n t h e C R A B P H - t r i p l e m u t a n t a n d a l l - t r a n s - r e t i n a l i s s t a b l e a t p h y s i o l o g i c a l p H c a n a l l o w u s t o u s e t h e C R A B P H - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t a s a r h o d o p s i n m i m i c i n o r d e r t o t e s t t h e p r o p o s e d w a v e l e n g t h r e g u l a t i o n m e c h a n i s m s . F i n a l l y , i n o r d e r t o v e r i f y t h a t L y s l 3 2 i s t h e r e s i d u e r e s p o n s i b l e f o r t h e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n t h e R 1 3 2 L : R l l l L : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t w a s f o r m e d . T h e p r e s e n c e o f a L e u r e s i d u e a t p o s i t i o n 1 3 2 r e s u l t s i n l o s s o f t h e r e d s h i f t e d U V - v i s p e a k ( K m , = 3 7 9 r u n ) w h i l e n o r e t i n a l a d d u c t i s d e t e c t e d i n t h e M A L D I - T O P s p e c t r u m a f t e r r e d u c t i v e a m i n a t i o n . 1 6 6 3 . 2 A P S B F o r m i n g P r o t e i n : T h e C r y s t a l S t r u c t u r e o f R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E w i t h a l l - t r a n s - R e t i n a l G r a t i f y i n g l y , t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l w a s s o l v e d b y o u r c o l l a b o r a t o r s a t 1 . 2 A r e s o l u t i o n . T h e o v e r a l l p r o t e i n s t r u c t u r e , a s s h o w n i n F i g u r e 3 - 8 , h a s n o t s i g n i fi c a n t l y c h a n g e d f r o m t h e F i g u r e 3 - 8 . C r y s t a l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d a s a S c h i f f b a s e . p r e v i o u s l y r e p o r t e d s t r u c t u r e s , m a i n t a i n i n g t h e B - b a r r e l f o l d . A l l - t r a n s - r e t i n a l i s b o u n d a s a S c h i f f b a s e t h r o u g h L y s l 3 2 i n a c c o r d a n c e t o w h a t o u r s p e c t r o s c o p i c r e s u l t s h a d s u g g e s t e d . A c l o s e r l o o k a t t h e C R A B P I I c a v i t y ( F i g u r e 3 - 9 ) v e r i fi e s t h e p r e s e n c e o f a P S B w i t h t h e e n g i n e e r e d G l u 1 2 1 c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h t h e n i t r o g e n o f t h e i m i n e ( t h e d i s t a n c e s f r o m t h e t w o o x y g e n a t o m s t o t h e c a r b o n y l a r e 2 . 5 9 A a n d 3 . 5 4 A ) . T y r 1 3 4 , a r e s i d u e p r o v e n c r i t i c a l f o r t h e s u c c e s s f u l f o r m a t i o n o f a p r o t o n a t e d S B , i s 3 . 7 6 A a w a y f r o m t h e S B n i t r o g e n , t o o f a r w a y t o b e d i r e c t l y i n v o l v e d i n t h e s t a b i l i z a t i o n o f 1 6 7 F i g u r e 3 - 9 . C r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e b i n d i n g c a v i t y o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l . T h e r e t i n a l i s c o n fi r m e d t o b e b o u n d a s a P S B v i a L y s 1 3 2 . T h e i m p o r t a n t d i s t a n c e s a r o u n d t h e i m i n e a r e h i g h l i g h t e d . t h e P S B . H o w e v e r , a s c o n s i s t e n t w i t h o u r d e s i g n , T y r l 3 4 i s s t r o n g l y h y d r o g e n b o n d e d t o G l u 1 2 1 ( 2 . 7 2 A ) . T h i s i n t e r a c t i o n c a n m a i n t a i n G l u 1 2 1 a s a c a r b o x y l a t e i n c r e a s i n g i t s e f f i c i e n c y a s a c o u n t e r a n i o n . R e c a l l t h e c a s e o f t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V p e n t a m u t a n t . I n t h e a b s e n c e o f T y r l 3 4 t h e U V - v i s s p e c t r u m r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f a m i x t u r e o f n o n - p r o t o n a t e d a n d p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e a t p h y s i o l o g i c a l p H . T h i s b e h a v i o r w a s e x p l a i n e d a s a r e s u l t o f t h e p a r t i a l p r o t o n a t i o n o f G l u 1 2 1 i n t h e p o c k e t ( p e r t u r b e d p K a , p r o b a b l y c l o s e t o 7 , d u e t o t h e h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t ) , T h e a b o v e c r y s t a l s t r u c t u r e d o e s s u g g e s t t h a t T y r l 3 4 c a n a c t i v a t e G l u 1 2 1 b y r e d u c i n g i t s p K a v a l u e . A c l o s e r l o o k a t t h e p o s i t i o n i n g o f t h e c h r o m o p h o r e i n t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E — r e t i n a l s t r u c t u r e s u p p o r t s o u r i n i t i a l m o d e l s : i n o r d e r f o r t h e S B t o f o r m t h e r e t i n a l m o l e c u l e n e e d s t o r o t a t e a l o n g i t s l o n g a x i s . A s c l e a r l y d e p i c t e d i n F i g u r e s 3 - 1 0 B a n d C 1 6 8 F i g u r e 3 - 1 0 . A . S t e r e o v i e w o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e b i n d i n g p o c k e t o f t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t b o u n d t o r e t i n a l a s a P S B ; B . O v e r l a y o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f W T - C R A B P I I b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n o i c a c i d a n d C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l a s a P S B ; C . O v e r l a y o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l a s a P S B a n d C R A B P I I - R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l n o n - c o v a l e n t l y . 1 6 9 t h e r o t a t i o n o f t h e m o l e c u l e i s m o r e p r o m i n e n t a t t h e a l d e h y d i c e n d w h i l e t h e m o v e m e n t o f t h e i o n o n e r i n g i s l i m i t e d a s c o m p a r e d t o b o t h W T - r e t i n o i c a c i d a n d R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F — r e t i n a l s t r u c t u r e s . I t a p p e a r s t h a t t h e r e a r e t h r e e m o t i o n s l e a d i n g t o t h e d i f f e r e n c e o f t h e c h r o m o p h o r e ’ s t r a j e c t o r y a s c o m p a r e d t o t h e W T - r e t i n o i c a c i d s t r u c t u r e . T h e i o n o n e r i n g i s t r a n s l a t e d b y a b o u t 1 A w h i l e t h e C 5 - C 6 - C 7 - C 8 d i h e d r a l a n g l e i s r o t a t e d b y ~ 3 0 ° . A t t h e s a m e t i m e t h e e n t i r e m o l e c u l e i s r o t a t e d a b o u t t h e i o n o n e r i n g C 1 - C 6 b o n d b y ~ 2 0 ° w h i l e a l l o t h e r d i h e d r a l a n g l e s , i n c l u d i n g t h o s e t h a t d e fi n e t h e c o n f o r m a t i o n o f t h e i o n o n e r i n g , a r e i d e n t i c a l i n t h e t w o m o l e c u l e s . T h i s o b s e r v e d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e d i r e c t l y s u p p o r t s t h e s u g g e s t i o n t h a t t h e r o t a t i o n o f t h e a l d e h y d i c c a r b o n y l i s r e q u i r e d t o a c c o m m o d a t e t h e L y s n u c l e o p h i l i c a t t a c k t h r o u g h t h e o p t i m a l B i i r g i - D u n i t z a n g l e o f ~ 1 0 7 ° . A t t h e s a m e t i m e t h e r o t a m e r a d o p t e d b y L y s l 3 2 h a s r e s u l t e d i n t h e f o r m a t i o n o f a c i s - i m i n e . F i g u r e 3 - 1 0 C c l e a r l y i n d i c a t e s t h e m o v e m e n t o f t h e L y s l 3 2 r e s i d u e , a s c o m p a r e d t o t h e R 1 3 2 2 Y 1 3 4 F d o u b l e m u t a n t , n e c e s s a r y f o r S B f o r m a t i o n . T h e c r y s t a l . s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E w i t h r e t i n a l a l s o r e v e a l s t h e f a t e o f t h e w a t e r m o l e c u l e a s s o c i a t e d w i t h A r g 1 1 1 i n t h e R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F — r e t i n a l s t r u c t u r e . A s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d i t i s b e l i e v e d t h i s o r d e r e d w a t e r c a n c o o r d i n a t e t o t h e c a r b o n y l o f r e t i n a ] a n d p r e v e n t t h e r o t a t i o n o f t h e c h r o m o p h o r e , a n d t h e r e f o r e h i n d e r t h e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n . A s s h o w n i n F i g u r e 3 - 1 0 A , u p o n r e m o v a l o f A r g l 1 1 t h e o r d e r e d w a t e r h a s m o v e d t o w a r d s T h r 5 4 ( 3 . 0 7 A ) . A s d i s c u s s e d i n C h a p t e r 2 , T h r 5 4 w a s c r i t i c a l f o r t h e P S B f o r m a t i o n i n t h e Y 1 3 4 F s e r i e s o f p r o t e i n s . I n f a c t , t h e b e s t P S B f o r m i n g p r o t e i n , R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E z T 5 4 V p e n t a m u t a n t , w a s s i g n i f i c a n t l y m o r e e f f i c i e n t t h a n i t s t e t r a m u t a n t 1 7 0 a n a l o g u e l a c k i n g t h e T 5 4 V m u t a t i o n . A t t h e m o m e n t , w e b e l i e v e d t h a t t h e m u t a t i o n o f T h r 5 4 w a s e s s e n t i a l f o r t h e r e m o v a l o f t h e o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e ( # 1 , F i g u r e 3 - 1 0 A ) . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e w h e t h e r o r n o t t h a t s t a t e m e n t i s t r u e w i t h T y r 1 3 4 p r e s e n t i n t h e b i n d i n g p o c k e t t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E z T 5 4 V t e t r a m u t a n t w a s f o r m e d . T h e s p e c t r o s c o p i c r e s u l t s u s i n g t h e n e w l y f o r m e d m u t a n t w e r e v i r t u a l l y i d e n t i c a l t o t h o s e o b t a i n e d w i t h t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t . T h e a d d i t i o n a l m u t a t i o n ( T 5 4 V ) d o e s n o t r e s u l t i n t h e b a t h o c h r o m i c s h i f t o f t h e U V - v i s a b s o r p t i o n m a x i m u m ( h m , r e m a i n s a t 4 4 9 n m ) , w h i l e t h e p r o t e i n ’ s a f f i n i t y f o r r e t i n a l r e m a i n s e x t r e m e l y h i g h ( K 1 2 1 . 9 9 i 4 . 1 n M ) . A s e x p e c t e d , t h e p r o t e i n p r o v i d e s p o s i t i v e M A L D I - T O P d a t a u n d e r b o t h i n c u b a t i o n a n d r e d u c t i v e a m i n a t i o n c o n d i t i o n s . I t a p p e a r s t h a t m u t a t i n g T h r 5 4 i n t o a V a l r e s i d u e i s i m p o r t a n t i n t h e a b s e n c e o f T y r 1 3 4 . H o w e v e r , w h e n T y r 1 3 4 i s p r e s e n t i t s i n t e r a c t i o n w i t h t h e r e t i n a l c a r b o n y l d i c t a t e s t h e r o t a t i o n o f t h e c h r o m o p h o r e , e v e n i n t h e p r e s e n c e o f t h e w a t e r m o l e c u l e a s s o c i a t e d w i t h T h r 5 4 . B y c o m b i n i n g t h e o b t a i n e d s p e c t r o s c o p i c a n d c r y s t a l l o g r a p h i c d a t a w e a r e a b l e t o p r o p o s e a m e c h a n i s m f o r t h e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n b e t w e e n a l l - t r a n s - r e t i n a l a n d t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t . A s s h o w n i n F i g u r e 3 - 1 1 , t h e s u g g e s t e d m e c h a n i s m i n v o l v e s t h e a c t i v a t i o n o f t h e b o u n d a l d e h y d e b y T y r l 3 4 f o r n u c l e o p h i l i c a t t a c k b y L y s l 3 2 . A f t e r w a t e r e l i m i n a t i o n a n d S c h i f f b a s e f o r m a t i o n t h e i m i n e r e m a i n s p r o t o n a t e d d u e t o t h e c l o s e p r o x i m i t y o f G l u 1 2 1 r e s u l t i n g i n a G l u 1 2 1 — S c h i f f b a s e s a l t b r i d g e . A s d e s c r i b e d b e f o r e , t h e a t t a c k o f L y s l 3 2 r e q u i r e s t h e r o t a t i o n o f t h e r e t i n a l c h r o m o p h o r e i n t h e b i n d i n g s i t e . H o w e v e r , w h e t h e r t h i s r o t a t i o n o c c u r s u p o n b i n d i n g o r i s s u b s e q u e n t t o t h e c a r b o n y l p r o t o n a t i o n b y T y r 1 3 4 r e m a i n s a n o p e n q u e s t i o n . 1 7 1 R 1 3 2 K Y 1 3 4 H 2 1 E 1 . [ / 1 R 1 3 2 K [ / l “ a . R 1 3 2 K H 2 N H C N Q V W ” 0 Y 1 3 4 O J H O W M 1 5 ‘ \ \ H W 1 " . > O H o n 0 1 . 1 2 1 5 1 . 1 2 1 5 “ ' 5 ‘ , 0 k ? “ R 1 3 2 K i i a . “ “ a . 3 ' " { / l g v a " R 1 3 2 K K / 7 ‘ “ 6 4 " ” H O Y 1 3 4 / ” 2 % ) 0 6 — — ‘ ~ — 0 ” 2 1 5 A L 1 2 1 E a . “ a . ’ 3 ‘ / / / g H H Y 1 3 4 0 9 0 \ \ \ \ L 1 2 1 E F i g u r e 3 - 1 1 . P r o p o s e d m e c h a n i s m f o r t h e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n b e t w e e n t r i p l e m u t a n t C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E a n d a l l - t r a n s - r e t i n a l . 1 7 2 F i g u r e 3 - 1 2 . A . C r y s t a l s t r u c t u r e o f b o v i n e r h o d o p s i n b o u n d t o 1 1 - c i s - r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ; 8 . C r y s t a l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . A l t h o u g h t h e t w o p r o t e i n s a r e c o m p l e t e l y d i f f e r e n t t h e y b o t h c a n b i n d r e t i n a l i n a s i m i l a r m a n n e r . I n c o n c l u s i o n , u s i n g b a s i c p r i n c i p l e s o f o r g a n i c c h e m i s t r y a n d t h e t o o l s o f p r o t e i n d e s i g n w e h a v e s u c c e e d e d i n c o n v e r t i n g C R A B P I I , a s m a l l s o l u b l e p r o t e i n i n t o a r e t i n a l b i n d i n g s y s t e m t h a t c a n m i m i c t h e r h o d o p s i n b i n d i n g m o t i f . T h e o v e r a l l s t r u c t u r e s o f t h e t w o p r o t e i n s a r e v e r y d i f f e r e n t , a s s h o w n i n F i g u r e 3 - 1 2 . H o w e v e r , t h e y c a n b o t h b i n d r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e t h r o u g h a L y s r e s i d u e e m b e d d e d i n a h y d r o p h o b i c c a v i t y . 1 7 3 3 . 3 T h e I m p o r t a n c e o f t h e P S B C o u n t e r A n i o n T h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e R 1 3 2 K : R 1 ] 1 L : L 1 2 1 E — r e t i n a l c o m p l e x p r o v e s t h e p r e s e n c e o f a S c h i f f b a s e a n d j u s t i fi e s t h e c r i t i c a l r o l e o f G l u 1 2 1 a s t h e c o u n t e r a n i o n . I n o r d e r t o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e c o u n t e r a n i o n s e v e r a l a d d i t i o n a l m u t a t i o n s w e r e f o r m e d a n d a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 3 - 1 . A s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d , i n t h e a b s e n c e o f G l u 1 2 1 t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L d o u b l e m u t a n t i s n o t a v e r y g o o d r e t i n a l b i n d e r . A l t h o u g h t h e M A L D I - T O P s p e c t r u m s u g g e s t s S B f o r m a t i o n , t h e U V — v i s s p e c t r u m d o e s n o t s u p p o r t t h e p r e s e n c e o f a P S B . H o w e v e r , d u e t o t h e s i g n i f i c a n t c o n f o r m a t i o n a l a n d e l e c t r o n i c d i f f e r e n c e s b e t w e e n G l u 1 2 1 a n d t h e n a t i v e r e s i d u e L e u 1 2 1 , o n e c o u l d a r g u e t h a t t h e o b s e r v e d d i f f e r e n c e s i n t h e r e t i n a l b i n d i n g a f f i n i t y i n t h e a b s e n c e o f G l u 1 2 1 m i g h t b e d u e t o o t h e r r e a s o n s b e s i d e s t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e P S B . I n o r d e r t o d i s m i s s t h a t p o s s i b i l i t y G l u 1 2 1 w a s r e p l a c e d b y i t s a m i d e a n a l o g u e , G l n , a f f o r d i n g a s t r u c t u r a l l y c o n s e r v a t i v e m u t a t i o n . A s c a n b e s e e n i n T a b l e 3 - 1 , e n t r i e s 3 a n d 4 , r e m o v a l o f t h e n e g a t i v e c h a r g e r e s u l t s i n b l u e s h i f t i n g o f t h e U V - v i s a b s o r p t i o n m a x i m u m f o r b o t h R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 Q ( 3 7 6 n m ) a n d R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 Q : T 5 4 V ( 3 7 5 n m ) m u t a n t s . H o w e v e r , b o t h p r o t e i n s m a i n t a i n t h e i r a b i l i t y t o f o r m i m i n e s w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l a s e v i d e n t f r o m t h e M A L D I - T O E s p e c t r a o f t h e c o r r e s p o n d i n g r e d u c t i v e a m i n a t i o n r e a c t i o n s . S i m i l a r t o t h e d i s c u s s i o n i n C h a p t e r 2 , G l u 1 2 1 i s e s s e n t i a l f o r t h e f o r m a t i o n o f a s t a b l e P S B . S t u d i e s w i t h r h o d o p s i n h a v e s h o w n t h a t m u t a t i o n o f G l u 1 1 3 , t h e r e s i d u e t h a t a c t s a s t h e P S B c o u n t e r a n i o n , i n t o a G l n r e s u l t s i n t h e b l u e s h i f t i n g o f t h e U V - v i s a b s o r p t i o n m a x i m u m b y ~ 1 2 0 n m ( f r o m 5 0 0 n m t o 3 8 0 n m ) . 1 3 H o w e v e r , t h e b a t h o c h r o m i c s h i f t , 1 7 4 E n t r y P r o t e . i n R t K d ( n M ) a R t A m , ( n m ) b 2 n d d e r . ( " W e A m i n a t i o n a T a b l e 3 - 1 . S p e c t r o s c o p i c r e s u l t s o f v a r i o u s C R A B P I I m u t a n t s i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l . U V R e d u c t i v e 4 0 1 ( 2 m i n ) 4 0 8 ( 2 m i n ) 1 R 1 3 2 K : R 1 1 1 L 5 6 7 a : 3 6 3 7 7 ( 5 0 m i n ) 3 7 6 ( 5 0 m i n ) Y e s 2 R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E 1 . 3 6 : 1 ; 4 . 9 4 4 9 4 4 9 Y e s 3 R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 Q 1 5 2 6 : 1 : 8 3 3 7 6 3 7 0 Y e s R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 Q 4 : T 5 4 V 6 3 7 : t 6 7 3 7 5 3 6 9 Y e s 5 R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 D 1 3 3 1 1 1 4 4 1 ( 1 5 m i n ) 4 3 4 ‘ : ( ( 1 3 ) Y e s 6 R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : C 1 3 0 D 1 0 3 : 1 : 1 0 3 7 7 3 8 0 R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E 7 : C 1 3 0 0 5 2 : 1 ; 1 0 4 4 0 4 4 6 N o 8 R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : Y 1 3 4 D 5 9 3 7 : 1 : 3 9 7 3 7 9 3 8 7 R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E 9 : Y 1 3 4 D 5 4 0 3 : 1 : 3 3 9 3 7 8 3 8 1 R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E 1 0 : Y 1 3 4 E 4 7 5 5 a : 2 5 3 3 8 1 3 8 5 R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E 1 1 : Y 1 3 4 E : T 5 4 V 4 8 0 2 a : 2 7 3 3 8 0 3 8 5 1 2 R 1 3 2 K i m 1 1 L : L 1 2 1 E 8 7 e 2 0 4 4 8 ( 1 5 m i n ) 4 5 1 ( 1 5 m i n ) . V 4 1 E a . D i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r a l l - t r a n s - r e t i n a l a s d e t e r m i n e d b y f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y b . U V - v i s a b s o r b a n c e o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n c . 2 " “ d e r i v a t i v e o f t h e U V - v i s s p e c t r u m ( n u m b e r s i n p a r e n t h e s i s r e p r e s e n t r e l a t i v e r a t i o ) ( 1 . R e d u c t i v e a m i n a t i o n a d d u c t a s d e t e r m i n e d b y M A L D I - T O F w a s r e c o v e r e d i n t h e p r e s e n c e o f i n c r e a s e d h a l i d e c o n c e n t r a t i o n . 1 4 I n t h i s c a s e t h e e x c e s s o f h a l i d e a c t s a s a c o u n t e r a n i o n . S i m i l a r e x p e r i m e n t s f o r t h e b a c t e r i o r h o d o p s i n s u g g e s t s l . l s H o w e v e r f o r o u r t h e i m p o r t a n c e o f h a l i d e c o n c e n t r a t i o n f o r t h a t s y s t e m , a s w e l s y s t e m , a s s h o w n i n F i g u r e 3 - 1 3 , t h e p r e s e n c e o f e x c e s s h a l i d e d o e s n o t r e s u l t i n t h e r e c o v e r y o f t h e P S B w i t h e i t h e r o f t h e t w o p r o t e i n s b e a r i n g m u t a t i o n L 1 2 1 Q ( R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 Q , R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 Q 2 T 5 4 V ) . B o t h N a C l a n d K C ] w e r e t r i e d a s 1 7 5 0 . 1 — 0 . 0 8 ~ 0 . 0 6 - A 0 . 0 4 . 0 . 0 2 - O I I r l I 2 8 0 3 3 0 3 8 0 4 3 0 4 8 0 5 3 0 n m F i g u r e 3 - 1 3 . U V s p e c t r a o f a l l - t r a n s - r e t i n a l i n s i d e C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 Q m u t a n t i n p h o s p h a t e b u f f e r i n t h e p r e s e n c e o f 1 5 0 m M N a C l ( r e d t r a c e , k m , = 3 7 3 n m ) a n d a s a t u r a t e d s o l u t i o n o f N a C l ( b l u e t r a c e , A m e , = 3 6 8 n m ) . h a l i d e s o u r c e s h o w e v e r a s l i g h t b l u e s h i f t o f t h e U V - v i s a b s o r p t i o n m a x i m u m w a s o b s e r v e d ( f r o m 3 7 3 n m t o 3 6 8 n m ) i n s t e a d . I t i s b e l i e v e d t h a t r h o d o p s i n h a s a c h l o r i d e b i n d i n g s i t e t h a t c o n t r i b u t e s t o t h e b a t h o c h r o m i c s h i f t . “ S T h e r e i s n o i n d i c a t i o n t h a t a h a l i d e a n i o n c a n e n t e r a n d b i n d i n s i d e t h e C R A B P I I c a v i t y . B u t e v e n i f i t c o u l d , i t i s p o s s i b l e t h a t a n i o n o f t h a t s i z e c a n n o t b e p l a c e d c l o s e t o t h e i m i n e . I n o r d e r t o f u r t h e r p r o b e t h e e x a c t e f f e c t o f t h e c o u n t e r a n i o n G l u 1 2 1 w a s r e p l a c e d b y t h e o n e c a r b o n s h o r t e r h o m o l o g u e A s p . U p o n f o r m a t i o n o f t h e C R A B P I I - R 1 3 2 K 1 R 1 1 1 L : L 1 2 1 D m u t a n t ( T a b l e 3 - 1 , e n t r y 5 ) t h e U V - v i s s p e c t r u m s l i g h t l y b l u e s h i f t s t o ~ 4 4 1 n m w h i l e t h e p r o t e i n c l e a r l y m a i n t a i n s i t s a b i l i t y f o r S B f o r m a t i o n . I n a d d i t i o n t o t h e s l i g h t U V - v i s b l u e s h i t t i n g , i n t r o d u c t i o n o f a n A s p r e s i d u e a t p o s i t i o n 1 2 1 r e s u l t s i n a m o r e d y n a m i c s y s t e m . I n o r d e r f o r t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 D — r e t i n a l c o m p l e x t o r e a c h e q u i l i b r i u m a n d r e v e a l t h e 4 4 1 n m a b s o r p t i o n m a x i m u m 1 5 m i n a r e r e q u i r e d ( f o r t h e c o r r e s p o n d i n g L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t t h e c o n v e r s i o n i s i n s t a n t a n e o u s ) . 1 7 6 R e p l a c e m e n t o f t h e c o u n t e r a n i o n ( G l u 1 1 3 ) i n b o v i n e r h o d o p s i n w i t h A s p r e s u l t s i n a 5 0 5 n m U V - v i s m a x i m u m , a ~ 5 n m r e d s h i f t . [ 3 A s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e v a r y i n g c o u n t e r a n i o n d i s t a n c e s i n t h e d i f f e r e n t o p s i n s c o u l d y i e l d d i f f e r e n t a b s o r p t i o n m a x i m a . 1 7 I f t h e c o u n t e r a n i o n i s f u r t h e r m o v e d f r o m t h e p o s i t i v e l y c h a r g e d i m i n i u m i o n , a r e d s h i fl e d A m “ w o u l d b e e x p e c t e d , a n d v i c e v e r s a . T h i s a g r e e s w i t h w h a t i s o b s e r v e d w i t h r h o d o p s i n b u t d o e s n o t e x p l a i n t h e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h o u r s y s t e m . A c c o r d i n g t o t h e l a t t e r e x p l a n a t i o n w e s h o u l d o b s e r v e a r e d s h i fi e d p e a k u p o n c o n v e r s i o n o f G l u 1 2 1 i n t o A s p . H o w e v e r t h e d i s t a n c e o f t h e c o u n t e r a n i o n i s n o t t h e o n l y f a c t o r t h a t a f f e c t s t h e U V - v i s a b s o r p t i o n m a x i m u m . S h e v e s a n d c o w o r k e r s h a v e u t i l i z e d a s e r i e s o f m o d e l c o m p o u n d s t o p r o v e t h a t b o t h t h e d i s t a n c e a n d t h e a n g l e b e t w e e n t h e P S B a n d t h e c o u n t e r a n i o n c a n e f f e c t t h e U V - v i s s p e c t r u m . 1 8 A s d i s c u s s e d i n C h a p t e r 1 , t h e i r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e p r e c i s e p o s i t i o n i n g o f t h e c o u n t e r a n i o n c a n s i g n i fi c a n t l y a f f e c t t h e p K a v a l u e f o r t h e P S B , f a v o r i n g t h e c o n f o r m a t i o n s i n v o l v i n g a w a t e r m e d i a t e d c o o r d i n a t i o n . 1 9 ’ 2 0 T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h F i g u r e 3 - 1 4 . S t e r e o v i e w o f t h e m o d e l o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 D b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l a s a S c h i f f b a s e . r h o d o p s i n s i n c e t h e P S B s t a b i l i z a t i o n d o e s o c c u r t h r o u g h a w a t e r m o l e c u l e i n t e r a c t i n g w i t h G l u 1 1 3 . H o w e v e r , a s t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E — r e t i n a l c r y s t a l s t r u c t u r e r e v e a l s , t h e i n t e r a c t i o n o f t h e c o u n t e r a n i o n G l u 1 2 1 a n d t h e P S B i s d i r e c t . 1 7 7 L o o k i n g a t t h e m o d e l s t r u c t u r e o f t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 D b o u n d t o r e t i n a l a s a S c h i f f b a s e ( F i g u r e 3 — 1 4 ) o n e c a n n o t i c e t h a t A s p 1 2 1 i s l o c a t e d f a r a w a y f o r m t h e S B ( 4 . 3 8 A ) a t a u n f a v o r a b l e t r a j e c t o r y f o r i n t e r a c t i n g w i t h t h e i m i n e . S i n c e t h e r e i s n o w a t e r m o l e c u l e p r e s e n t t o a c c o m m o d a t e t h e i n t e r a c t i o n , t h e P S B s t a b i l i z a t i o n i s w e a k . I n a d d i t i o n , w e h a v e p r o v e n t h a t t h e i n t e r a c t i o n o f G l u 1 2 1 w i t h T y r 1 3 4 i s i m p o r t a n t f o r t h e e f f i c i e n c y o f t h e c o u n t e r a n i o n . H o w e v e r , w h e n A s p i s p r e s e n t , t h e t w o r e s i d u e s a r e t o o f a r a w a y t o d i r e c t l y i n t e r a c t . A c c o r d i n g t o t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t , p o s i t i o n 1 2 1 a p p e a r s t o b e i d e a l f o r t h e p l a c e m e n t o f a c o u n t e r a n i o n . H o w e v e r , s i n c e w h a t w e o b s e r v e i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e i s a s t a t i c p i c t u r e o b t a i n e d a f t e r t h e i m i n e i s f o r m e d w e w e r e i n t e r e s t e d t o i n v e s t i g a t e w h e t h e r o r n o t p l a c e m e n t o f t h e c o u n t e r a n i o n o n t h e o t h e r s i d e o f t h e c h r o m o p h o r e c o u l d r e s u l t i n a P S B w i t h a d i f f e r e n t o r i e n t a t i o n . T h e r e s i d u e o f c h o i c e w a s C y s 1 3 0 w h i c h , a s s h o w n i n F i g u r e s 3 - 1 5 A a n d B , i s i n c l o s e p r o x i m i t y t o L y s l 3 2 . T h e m o d e l p l a c e s t h e i n t r o d u c e d A s p r e s i d u e i n a g o o d t r a j e c t o r y t o w a r d s L y s l 3 2 . H o w e v e r , i f t h e o r i e n t a t i o n o f t h e i r r r i n e i s s i m i l a r t o w h a t i s o b s e r v e d i n t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E c r y s t a l s t r u c t u r e , t h i s t r a j e c t o r y c a n n o t p r o v i d e a n y s t a b i l i z a t i o n o f t h e P S B ( F i g u r e 3 - 1 5 B ) . T w o m u t a n t s b e a r i n g t h e C 1 3 0 D m u t a t i o n w e r e f o r m e d , o n e h a v i n g A s p l 3 0 a s t h e s o l e p o s s i b l e c o u n t e r a n i o n ( R 1 3 2 K : R 1 1 1 L z C 1 3 0 D ) a n d a n o t h e r m a i n t a i n i n g t h e L 1 2 1 E m u t a t i o n ( R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : C 1 3 0 D ) . I n t h e a b s e n c e o f G l u 1 2 1 t h e U V - v i s a s s a y f a i l s t o d e t e c t a n y s i g n o f P S B f o r m a t i o n ( h u m = 3 7 7 n m ) . A t t h e s a m e t i m e , t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 : L 1 2 1 E : C 1 3 0 D t e t r a m u t a n t m a i n t a i n s m o s t o f t h e b a t h o c h r o m i c s h i f t ( M W 1 7 8 0 B V ‘ 7 . ‘ O 1 1 1 1 3 4 , v 1 3 \ \ R 1 \ ‘ ~ ‘ . ‘ ( I " 1 2 1 ' ‘ I 1 R 1 1 1 L c 1 1 5 1 3 1 1 1 C 1 3 0 R 1 1 L R 1 1 1 F i g u r e 3 - 1 5 . S t e r e o v i e w o f t h e m o d e l s t r u c t u r e s o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : C 1 3 0 D b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l e i t h e r n o n - c o v a l e n t l y ( A ) o r a s a S c h i f f b a s e ( B ) ; S t e r e o v i e w o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l a s a S c h i f f b a s e . V a | 4 1 i s p o s i t i o n e d v e r y c l o s e t o T y r 1 3 4 o n t h e o p p o s i t e s i d e o f G l u 1 2 1 . P l a c i n g a G l u r e s i d u e a t p o s i t i o n 1 2 1 m i g h t r e o r i e n t T y r 1 3 4 a w a y f r o m G l u 1 2 1 . 1 7 9 = 4 4 0 n m ) o f t h e c o r r e s p o n d i n g R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t . H o w e v e r , t h e a f f i n i t y f o r r e t i n a l i s s i g n i fi c a n t l y r e d u c e d ( 5 2 i 1 0 n M ) . A s d i s c u s s e d i n C h a p t e r 1 , b o t h t h e d i s t a n c e a n d t h e a n g l e b e t w e e n t h e P S B a n d t h e c o u n t e r a n i o n a r e r e s p o n s i b l e f o r d e fi n i n g t h e a b s o r p t i o n m a x i m a o f t h e v a r i o u s S c h i f f b a s e s . A s S h e v e s a n d c o w o r k e r s h a v e p r o v e n , t h e p r e c i s e p o s i t i o n i n g o f t h e c o u n t e r a n i o n c a n s i g n i f i c a n t l y a f f e c t t h e p K a v a l u e o f t h e P S B . 1 8 I n o u r c a s e , i t i s c l e a r t h a t A s p 1 3 0 c a n n o t p r o v i d e t h e n e c e s s a r y P S B s t a b i l i z a t i o n p r o b a b l y d u e t o i t s u n f a v o r a b l e t r a j e c t o r y . A n o t h e r p o s i t i o n t h a t , a c c o r d i n g t o t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E — r e t i n a l c r y s t a l s t r u c t u r e c a n a c c o m m o d a t e t h e P S B c o u n t e r a n i o n i s r e s i d u e 1 3 4 . T h e e x p e r i m e n t a l d a t a o b t a i n e d s o f a r s t r o n g l y s u g g e s t t h a t T y r 1 3 4 i s e s s e n t i a l f o r a s u c c e s s f u l P S B f o r m a t i o n . H o w e v e r , t h e c r y s t a l s t r u c t u r e r e v e a l s t h a t a c a r b o x y l i c a c i d a t p o s i t i o n 1 3 4 c a n a c t a s a c o u n t e r a n i o n s t a b i l i z i n g t h e f o r m e d P S B . A t t h e s a m e t i m e , s i n c e w e b e l i e v e t h a t T y r l 3 4 c a n a c t i v a t e G l u 1 2 1 , p o s i t i o n i n g a c a r b o x y l i c a c i d a t p o s i t i o n 1 3 4 c o u l d p r o v i d e t h e s a m e e f f e c t . T y r l 3 4 w a s r e p l a c e d w i t h e i t h e r G l u o r A s p a n d f o u r d i f f e r e n t m u t a n t s , l i s t e d i n T a b l e 3 — 1 w e r e f o r m e d ( R 1 3 2 K : R 1 1 1 L z Y l 3 4 D ; R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : Y 1 3 4 D ; R 1 3 2 K : R 1 1 1 L 1 2 1 E : Y 1 3 4 E ; R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E 2 Y 1 3 4 E : T 5 4 V , e n t r i e s 8 — l l ) . R e p l a c i n g T y r 1 3 4 w i t h a c a r b o x y l i c a c i d h a d d e t r i m e n t a l r e s u l t s f o r t h e p r o t e i n s t a b i l i t y . A l l p r o t e i n s w e r e i s o l a t e d i n l o w y i e l d s ( 3 - 4 m g / L a s o p p o s e d t o 1 5 - 3 0 m g / L f o r t h e p r e v i o u s l y m e n t i o n e d C R A B P H m u t a n t s ) . I t a p p e a r s t h a t p l a c i n g a c a r b o x y l i c a c i d a t p o s i t i o n 1 3 4 p r e v e n t s t h e p r o t e i n f r o m f o l d i n g c o r r e c t l y l e a d i n g t o f o r m a t i o n o f i n c l u s i o n b o d i e s . O n l y a v e r y s m a l l a m o u n t o f p r o t e i n f o l d s c o r r e c t l y a n d r e m a i n s s o l u b l e r e s u l t i n g i n l o w i s o l a t e d y i e l d s . A l t h o u g h t h i s f a m i l y o f p r o t e i n s h a s b e e n 1 8 0 d , ” 2 8 r e s i d u e 1 3 4 h a s n o t b e e n i d e n t i f i e d a s c r i t i c a l f o r p r o t e i n f o l d i n g e x t e n s i v e l y s t u d i e a n d s t a b i l i z a t i o n . H o w e v e r , i t i s a r a t h e r c o n s e r v e d r e s i d u e , r e p l a c e d o n l y b y P h e i n t h e c a s e o f t h e r e t i n o l b i n d i n g p r o t e i n s . A l t h o u g h o n l y a s m a l l a m o u n t o f t h e l a t t e r p r o t e i n s w e r e i s o l a t e d , i t w a s e n o u g h t o p e r f o r m t h e U V - v i s a n d fl u o r e s c e n c e a s s a y s . A l l f o u r p r o t e i n s e x h i b i t e d a n e x t r e m e l y l o w a f f i n i t y f o r r e t i n a l ( t h e K d v a l u e s a r e i n t h e l o w M i n s t e a d o f n M r e g i o n ) , w h i l e n o n e e x h i b i t e d t h e p r e s e n c e o f a P S B i n t h e U V - v i s a s s a y s ( l t m a x b e t w e e n ~ 3 7 8 - 3 8 1 n m , s e e T a b l e 3 - 1 , e n t r i e s 8 — 1 1 ) . I t i s a p p a r e n t t h a t A s p 1 3 4 c a n n o t a c t a s a c o u n t e r a n i o n s i n c e t h e 1 m m o f t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L z Y l 3 4 D m u t a n t i s a t 3 7 9 n m . A t t h e s a m e t i m e r e p l a c i n g T y r l 3 4 w i t h e i t h e r a G l u o r a n A s p r e s i d u e r e s u l t s i n l o s s o f t h e P S B b a t h o c h r o m i c s h i f t c h a r a c t e r i s t i c o f t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t . ( R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : Y 1 3 4 E , 7 1 m m , = 3 8 1 n m ; R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E z Y 1 3 4 D , h m , = 3 7 8 n m ) . I n a d d i t i o n t h e T 5 4 V m u t a t i o n d o e s n o t c o n t r i b u t e t o t h e P S B f o r m a t i o n a s e v i d e n t f r o m t h e U V - v i s a b s o r p t i o n m a x i m u m o f t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V 2 Y l 3 4 E m u t a n t ( h m , = 3 8 0 n m ) . D u e t o l a c k o f s u f f i c i e n t a m o u n t o f a v a i l a b l e p r o t e i n n o i n c u b a t i o n o r r e d u c t i v e a m i n a t i o n e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t w i t h e i t h e r o f t h e a b o v e p r o t e i n s . T h e r e f o r e i t i s n o t c l e a r w h e t h e r t h e o b s e r v e d l o s s o f b a t h o c h r o m i c s h i f t i n t h e p r e s e n c e o f t h e Y 1 3 4 D o r Y 1 3 4 F m u t a t i o n i s d u e t o f r e e r e t i n a l o r l o s s o f P S B s t a b i l i z a t i o n . A c c o r d i n g t o o u r p r o p o s e d m e c h a n i s m f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n , T y r 1 3 4 a c t i v a t e s t h e c a r b o n y l t o u n d e r g o t h e n u c l e o p h i l i c a t t a c k . N e i t h e r G l u o r A s p c a n p r o v i d e t h a t a c t i v a t i o n s o o n e w o u l d e x p e c t t h a t t h e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n w o u l d n o t b e a s e f fi c i e n t a s t h e m u t a n t b e a r i n g T y r l 3 4 . 1 8 1 F i n a l l y , i n o r d e r t o p r o b e t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n T y r l 3 4 a n d G l u 1 2 1 b e l i e v e d t o b e r e s p o n s i b l e f o r t h e a c t i v a t i o n o f b o t h t h e r e t i n a l a n d t h e c o u n t e r a n i o n , a G l u r e s i d u e w a s p l a c e d a t p o s i t i o n 4 1 ( V 4 1 E m u t a t i o n ) . A s c a n b e s e e n i n F i g u r e 3 - 1 5 C , V a 1 4 1 i s l o c a t e d r i g h t a b o v e T y r l 3 4 . P l a c e m e n t o f G l u 4 l c l o s e t o T y r l 3 4 c o u l d d i s r u p t i t s i n t e r a c t i o n w i t h G l u 1 2 1 , r e s u l t i n g i n a l t e r e d s p e c t r o s c o p i c b e h a v i o r . P r o t e i n R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E z V 4 1 E s u f f e r e d f r o m t h e s a m e p r o b l e m s a s t h e Y 1 3 4 E , Y 1 3 4 D s e r i e s o f m u t a n t s , l e a d i n g t o v e r y s m a l l a m o u n t o f i s o l a t e d y i e l d ( ~ 3 m g / L ) . A d d i t i o n o f t h e s e c o n d G l u c l o s e t o T y r l 3 4 r e s u l t e d i n a d r o p o f r e t i n a l b i n d i n g a f fi n i t y ( 8 7 i 2 0 n M ) . H o w e v e r , t h e U V - v i s s p e c t r u m m a i n t a i n s t h e b a t h o c h r o m i c s h i f t ( h m x = 4 4 8 n m ) , a l t h o u g h t h e s y s t e m r e q u i r e s a d d i t i o n a l t i m e ( ~ 1 5 m i n ) t o e q u i l i b r a t e . I t a p p e a r s t h a t G l u 4 1 d o e s n o t d i s r u p t t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n T y r 1 3 4 a n d G l u 1 2 1 , m a i n t a i n i n g a s t a b l e P S B . 3 . 4 A r g 1 1 1 : I s M u t a t i n g i t N e c e s s a r y ? A s d i s c u s s e d i n C h a p t e r 2 r e p l a c i n g A r g 1 1 1 w i t h a h y d r o p h o b i c r e s i d u e w a s o n e o f t h e m o s t c r i t i c a l m u t a t i o n s f o r P S B f o r m a t i o n i n t h e Y 1 3 4 F s e r i e s o f p r o t e i n s . W e b e l i e v e t h a t t h e r e m o v a l o f t h e g u a n i d i n e m o i e t y l e a d s t o t h e r e m o v a l o f t h e w a t e r m o l e c u l e t h a t s e e m s t o h a v e f o r m e d a h y d r o g e n b o n d w i t h t h e r e t i n a l m o l e c u l e , t h u s i n h i b i t i n g i t s r o t a t i o n t o a s s u m e a n o p t i m a l o r i e n t a t i o n f o r n u c l e o p h i l i c a t t a c k . F o l l o w i n g t h i s l o g i c , t h e m u t a t i o n w a s a l s o m a i n t a i n e d t h r o u g h o u t t h e Y 1 3 4 s e r i e s o f p r o t e i n s r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f t r i p l e m u t a n t R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E , a p r o t e i n t h a t c a n s u c c e s s f u l l y b i n d r e t i n a l a s a P S B . A s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d , r e s t o r i n g T y r 1 3 4 l e d t o 1 8 2 d r a m a t i c i m p r o v e m e n t o f t h e p r o t e i n s ’ s p e c t r o s c o p i c p r o f i l e s . T y r 1 3 4 i s b e l i e v e d t o p a r t i c i p a t e i n t h e a c t i v a t i o n o f b o t h r e t i n a l a n d t h e P S B c o u n t e r a n i o n ( G l u 1 2 1 ) . A t t h e s a m e t i m e , w e k n o w t h a t i n t h e a b s e n c e o f G l u 1 2 1 n o P S B f o r m a t i o n c a n b e d e t e c t e d b y t h e U V - v i s a s s a y . H o w e v e r , t h e n e c e s s i t y o f t h e R 1 1 1 L m u t a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f b o t h T y r 1 3 4 a n d G l u 1 2 1 h a s n o t b e e n e v a l u a t e d . I n o r d e r t o p r o b e t h i s R 1 3 2 K : L 1 2 1 E d o u b l e m u t a n t w a s f o r m e d . T h e c a l c u l a t e d a f f i n i t y o f C R A B P I I - R 1 3 2 K z L 1 2 1 E f o r r e t i n a l ( 1 0 4 : 1 1 n M ) i s m u c h l o w e r t h a n t h a t o f t h e c o r r e s p o n d i n g t r i p l e m u t a n t R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E ( 1 . 3 6 i 4 . 9 n M ) b u t f i v e t i m e s b e t t e r t h a n t h a t o f t h e R 1 3 2 2 R 1 1 1 L m u t a n t ( 5 6 7 i 3 6 n M ) . A t t h e s a m e t i m e t h e U V - v i s a s s a y o f t h e n e w l y f o r m e d p r o t e i n , a s s h o w n i n F i g u r e 3 - 1 6 A a n d B , r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f a d y n a m i c s y s t e m . U p o n a d d i t i o n o f r e t i n a l a m i x t u r e o f p e a k s a t 3 7 0 n m a n d 4 5 0 n m a r e p r e s e n t . H o w e v e r , a f t e r ~ 2 0 m i n t h e s y s t e m e q u i l i b r a t e s a t a n a b s o r p t i o n m a x i m u m o f ~ 4 5 5 n m . A l t h o u g h t h i s i s a 6 n m r e d s h i f t a s c o m p a r e d t o t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E U V - v i s t r a c e ( h m x = 4 4 9 n m ) , t h e s t o i c h i o m e t r y o f t h e b i n d i n g i s n o t a s g o o d a s t h a t o f t h e t r i p l e m u t a n t . I f m o r e t h a n 0 . 3 e q u i v o f r e t i n a l a r e a d d e d t h e c o n v e r s i o n t o t h e P S B p e a k i s n o t c o m p l e t e w i t h a p e a k a t 3 7 0 n m c l e a r l y r e m a i n i n g . A d d i t i o n o f a c i d t o t h i s s p e c i e s , a s s h o w n i n F i g u r e 3 - 1 7 , d o e s n o t r e s u l t i n c o m p l e t e r e d s h i f t i n g o f t h e r e t i n a l p e a k t o t h e 4 5 5 n m a b s o r b i n g s p e c i e s . T h i s p r o m p t s u s t o b e l i e v e t h a t w h a t i s o b s e r v e d i n t h e o r i g i n a l s p e c t r u m i s a m i x t u r e o f f r e e r e t i n a l a n d r e t i n a l b o u n d a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e . R e c a l l t h a t i n a s i m i l a r e x p e r i m e n t u s i n g t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L m u t a n t a d d i t i o n o f a c i d t o t h e 3 7 7 n m a b s o r b i n g s p e c i e s r e s u l t e d i n t h e c o m p l e t e r e d s h i f t i n g o f t h e p e a k t o 4 3 8 n m ( F i g u r e 3 - 3 ) . T h e a b o v e a c i d i fi c a t i o n e x p e r i m e n t s i n d i c a t e t h a t m u t a t i o n R 1 1 1 L i s i m p o r t a n t f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e 1 8 3 0 . 2 — 0 . 1 5 . A 0 . 1 — 0 . 0 5 — o I 1 ‘ . . . _ 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 n m n m C < — l n c r e a s e d p H D R 2 = 0 . 9 9 7 3 p H F i g u r e 3 - 1 6 . A . U V N i s s p e c t r u m o f a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d t o C R A B P I I - R 1 3 2 K 2 L 1 2 1 E m u t a n t . T h e a b s o r p t i o n m a x i m u m i s a t ~ 4 5 5 n m , i n d i c a t i n g f o r m a t i o n o f P S B ; B . U V - v i s s p e c t r a o f t h e t i t r a t i o n o f C R A B P I I - R 1 3 2 K 1 L 1 2 1 E m u t a n t w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l . T h e a m o u n t o f r e t i n a l p r e s e n t i n c r e a s e s i n 0 . 1 i n c r e m e n t s , f r o m 0 . 1 e q u i v t o 0 . 5 e q u i v . F o r e a c h e q u i v a l e n t , t h e s p e c t r u m i s r e c o r d e d 2 m i n a f t e r m i x i n g r e v e a l i n g a m i x t u r e o f p e a k s a t ~ 3 7 0 n m a n d 4 5 0 n m . T h e U V t r a c e c h a n g e s w i t h t i m e , u n t i l i t e q u i l i b r a t e s a f t e r ~ 2 0 m i n , a t w h i c h t i m e t h e ~ 4 5 0 n m p e a k i s p r e d o m i n a n t ; C . p H t i t r a t i o n o f t h e R 1 3 2 K : L 1 2 1 E m u t a n t b o u n d t o 0 . 2 e q u i v a l l - t r a n s - r e t i n a l . U p o n a d d i t i o n o f N a O H , t h e p e a k a t 4 5 5 n m ( P S B ) d i m i n i s h e s w h i l e a n e w o n e a t 3 6 0 n m ( S B ) i n c r e a s e s . T h e p H r a n g e f r o m 6 . 9 t o 9 . 2 ; D . G r a p h i c a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e c h a n g e i n t h e a b s o r b a n c e a t 4 5 5 n m v e r s u s t h e p H c h a n g e . T h e p K . c a l c u l a t e d b y s o l v i n g t h e 2 " d d e r i v a t i v e o f t h e fi t t e d c u r v e i s 7 . 9 6 . 1 8 4 S B . O n t h e o t h e r h a n d , t h e L 1 2 1 E m u t a t i o n i s c r i t i c a l f o r m a i n t a i n i n g t h e P S B , h o w e v e r t h e s y s t e m ’ s e f fi c i e n c y f o r n u c l e o p h i l i c a t t a c k a n d S B f o r m a t i o n i s s i g n i fi c a n t l y r e d u c e d w h e n A r g 1 1 1 i s p r e s e n t . T h e i m p o r t a n c e o f t h e L 1 2 1 E m u t a t i o n f o r t h e P S B s t a b i l i z a t i o n i s f u r t h e r s u p p o r t e d b y t h e c a l c u l a t e d p K a v a l u e s o f t h e P S B f o r m e d f o r e a c h o f t h e a b o v e c a s e s . A s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d t h e p K a v a l u e f o r t h e P S B f o r m e d w i t h t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L d o u b l e m u t a n t i s 6 . 5 5 ( t h i s n u m b e r i s c o n s i s t e n t w i t h t h e f a c t t h a t a t p h y s i o l o g i c a l p H o f 7 . 3 t h e U V - v i s f a i l s t o d e t e c t t h e e x i s t e n c e o f a s t a b l e P S B ) . H o w e v e r , t h e p K a o f t h e R 1 3 2 K 2 L 1 2 1 E m u t a n t i s 7 . 9 6 ( F i g u r e 3 - 1 6 C a n d D ) . R e c a l l t h a t t h e c o r r e s p o n d i n g v a l u e A F i g u r e 3 - 1 7 . S t e r e o v i e w o f t h e m o d e l s t r u c t u r e s o f C R A B P I I - R 1 3 2 K z L 1 2 1 E b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l e i t h e r n o n - c o v a l e n t l y ( A ) o r a s a S c h i f f b a s e ( B ) . f o r t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t i s 8 . 7 . I t a p p e a r s t h a t a l t h o u g h G l u 1 2 1 i s t h e m o s t c r i t i c a l m u t a t i o n f o r t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e P S B , t h e r e m o v a l o f A r g 1 1 1 i s a l s o 1 8 5 i m p o r t a n t . A n e x t r a s t a b i l i z a t i o n o f ~ 0 . 7 p K a u n i t s i s a c h i e v e d w h e n t h e p o l a r A r g 1 1 1 i s r e p l a c e d b y t h e n e u t r a l L e u r e s i d u e , a s i g n i f i c a n t c o n t r i b u t i o n f o r a r e s i d u e t h a t i s l o c a t e d s e v e r a l A a w a y f r o m t h e a c t u a l r e a c t i o n s i t e . T h e m o d e l s t r u c t u r e s o f t h e R 1 3 2 K : L 1 2 1 E m u t a n t , b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l b o t h n o n - c o v a l e n t l y a n d a s a P S B , a r e s h o w n i n F i g u r e 3 - 1 8 . G l u 1 2 1 c a n b e i n c l o s e p r o x i m i t y t o b o t h t h e f r e e ( 2 . 3 9 A ) a n d t h e S B b o u n d l i g a n d ( 2 . 5 9 A ) . A t t h e s a m e t i m e i t i n t e r a c t s w i t h t h e o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e c o o r d i n a t e d t o A r g 1 1 1 ( 3 . 1 9 A ) . T h i s i n t e r a c t i o n c a n b e t h e c a u s e o f t h e a d d i t i o n a l U V - v i s r e d s h i f t ( ~ 6 n m ) o b s e r v e d b e t w e e n t h e l a t t e r d o u b l e m u t a n t , ( R 1 3 2 K : L 1 2 1 E , K m , = 4 5 5 n m ) a n d t h e c o r r e s p o n d i n g R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t ( A m i , x = 4 4 9 n m ) . A s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d , b o t h t h e d i s t a n c e a n d t h e d i h e d r a l a n g l e b e t w e e n t h e P S B a n d t h e c o u n t e r a n i o n c a n d i c t a t e t h e e x a c t a b s o r p t i o n m a x i m u m o f t h e P S B . 1 8 I n t h i s c a s e , t h e i n t e r a c t i o n o f G l u 1 2 1 w i t h t h e o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e c a n c a u s e a c h a n g e o f b o t h i t s t r a j e c t o r y a n d d i s t a n c e f r o m t h e P S B . I f t h e c o u n t e r a n i o n i s p u l l e d a w a y f r o m t h e c h a r g e d s p e c i e s , a r e d s h i f t o f i t s U V — v i s s p e c t r u m i s e x p e c t e d , 1 3 ‘ ‘ 7 w h i c h i s o b s e r v e d . C l e a r l y t h e r e m o v a l o f A r g 1 1 1 c a n a s s i s t t h e S B f o r m a t i o n b e t w e e n a l l - t r a n s - r e t i n a l a n d t h e m u t a t e d C R A B P I I p r o t e i n . H o w e v e r , t h e q u e s t i o n r a i s e d i s w h e t h e r o u r t h e o r y i n v o l v i n g t h e d i s p l a c e m e n t o f t h e w a t e r m o l e c u l e a s s o c i a t e d w i t h A r g 1 1 1 i s v a l i d o r n o t . I n o r d e r t o a d d r e s s t h a t i s s u e a s e r i e s o f a d d i t i o n a l m u t a n t s w e r e m a d e a n d e v a l u a t e d i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s - r e t i n a l ( T a b l e 3 - 2 ) . F o r m o s t c a s e s t w o a n a l o g o u s p r o t e i n s , w i t h a n d w i t h o u t t h e p r e s e n c e o f G l u 1 2 1 w e r e m a d e . F r o m t h e m u t a n t s l i s t e d i n T a b l e 3 - 2 , t h e f i r s t 1 1 e n t r i e s r e p r e s e n t a t t e m p t s t o i n t r o d u c e d i f f e r e n t a m i n o a c i d r e s i d u e s a t p o s i t i o n 1 1 1 . T h i s g r o u p o f p r o t e i n s c a n 1 8 6 W n n n ) ) ) ) ) ) e P S B p K a 8 8 8 7 8 _ . . . . _ . 7 8 9 6 _ 9 E n t 1 3 2 4 5 6 7 8 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 2 3 4 5 6 7 r y P r o t e i R 2 R 1 1 K K 1 K K K K 1 1 R 1 3 R 1 3 R R R R R 1 1 1 1 1 R 3 3 3 3 3 1 R 1 3 2 2 2 2 2 R 2 R R R 3 1 K R 2 R 2 1 K 1 K . 1 : 1 1 . 1 . 1 : 1 : 0 , z : , , 2 3 R 1 R 1 R W 1 1 R 1 R 1 9 l E 0 A 3 : 3 : 3 3 3 : : . . 3 . , . , . 2 3 2 R 2 2 R 2 R 2 R R R 2 W K K 1 1 1 K 1 K K 1 K 1 1 3 2 | 2 , E K K 5 7 ( “ i m n i . 1 1 1 1 . L M V K 1 1 H E L 2 n R t 1 1 1 2 1 1 : 2 . z . 0 . 5 7 2 L , L 1 1 1 L 1 1 L L L L L 9 D _ 1 L 1 2 A _ . 3 M K L 1 H E L 1 1 1 1 1 1 2 2 1 E 2 1 E 2 2 2 2 2 1 E E E E E 1 1 1 1 1 E 1 E 3 1 1 1 1 9 5 1 1 1 2 4 9 6 5 5 0 1 6 4 . . 8 K 3 6 6 1 4 . 1 3 1 6 9 6 9 6 2 2 d 7 4 2 6 9 2 9 5 3 5 2 8 6 1 ( 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 n 1 1 1 1 M 6 3 4 3 2 3 4 . 1 1 1 9 6 4 7 1 1 a ) R . 6 2 5 4 7 7 3 0 9 7 5 7 4 6 0 8 2 2 3 n m m m i i i m m m m i i i n n n ) n n n ) ) ) ) ) ) 1 3 2 n 4 3 3 3 3 3 m 1 8 5 t 4 3 3 3 3 3 0 7 8 8 7 7 A 7 2 6 , ( ( ( 2 2 2 5 1 2 4 7 4 4 6 5 4 8 8 8 7 5 8 8 7 7 5 ( 0 5 0 1 9 8 8 6 5 5 6 6 2 0 5 6 2 8 4 2 3 ( 4 4 4 ( 3 4 ( 4 3 3 3 3 4 3 3 3 3 4 d 7 7 7 0 9 8 d e r 8 2 3 6 6 2 6 4 3 4 3 4 ( 4 3 4 4 ( ( 4 3 3 3 3 3 5 6 7 1 6 6 1 3 6 4 7 1 ( ( 0 ( 7 8 0 7 4 2 2 2 0 5 0 ( ( 5 1 2 . 4 7 5 4 5 8 8 1 8 8 7 ( ( 9 5 0 8 5 0 0 3 9 m m m 1 2 ( ( ( 2 i i ) ) m m i i 1 1 1 ) ) ) ) n n ) ( 1 1 . ) 3 T a b l e 3 - 2 . S p e c t r o s c o p i c r e s u l t s o f v a r i o u s C R A B P I I m u t a n t s i n t h e p r e s e n c e o f a l l - t r a n s — r e t i n a l . U V a . D i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r a l l - t r a n s - r e t i n a l a s d e t e r m i n e d b y f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y b . U V a b s o r b a n c e o f r e t i n a l i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n c . 2 " " d e r i v a t i v e o f t h e U V s p e c t r u m ( n u m b e r s i n p a r e n t h e s i s r e p r e s e n t r e l a t i v e r a t i o ) 1 8 7 p r o v i d e f u r t h e r i n f o r m a t i o n o n t h e i m p o r t a n c e o f p o s i t i o n 1 1 1 , i s t h e r e m o v a l o f A r g 1 1 1 o r t h e p l a c e m e n t o f L e u l 1 1 t h a t m a t t e r s ? A s a g e n e r a l t r e n d t h r o u g h o u t t h e p r o t e i n s p r e s e n t e d i n T a b l e 3 - 2 o n e c a n n o t i c e t h a t r e g a r d l e s s o f t h e r e s i d u e a t p o s i t i o n 1 1 1 , w h e n G l u 1 2 1 i s a b s e n t t h e r e i s n o i n d i c a t i o n f o r P S B f o r m a t i o n a c c o r d i n g t o t h e U V - v i s d a t a ( e n t r i e s 1 , 3 , 6 , 8 , 1 0 , 1 2 , 1 4 , 1 6 ) . I n f a c t , t w o o f t h e m u t a n t s , R 1 3 2 K : R 1 1 1 K a n d R 1 3 2 K : R 1 1 1 H h a v e a v e r y s i m i l a r b e h a v i o r , a d y n a m i c s y s t e m t h a t r e q u i r e s s e v e r a l m i n u t e s t o e q u i l i b r a t e , a s w a s o b s e r v e d f o r t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L d o u b l e m u t a n t . H o w e v e r , i n t h e p r e s e n c e o f G l u 1 2 1 t h e c a p a c i t y f o r P S B f o r m a t i o n i s r e t a i n e d w h e n h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s a r e p l a c e d i n p o s i t i o n 1 1 1 . I n a d d i t i o n t o L e u l 1 1 a s t a b l e P S B i s f o r m e d i n t h e p r e s e n c e V a l ( e n t r y 5 ) a n d M e t ( e n t r y 4 ) . H o w e v e r , a s e v i d e n t f r o m t h e i r K d v a l u e s t h e a f fi n i t y f o r b i n d i n g r e t i n a l i s r e d u c e d i n b o t h c a s e s ( 3 0 . 9 1 6 3 n M , 1 6 4 1 3 2 n M , r e s p e c t i v e l y ) . T h e f a c t t h a t L e u i s a m o r e s t r u c t u r a l l y c o n s e r v a t i v e m u t a t i o n t h a t c a n m i n i m i z e t h e c h a n c e s f o r a d d i t i o n a l c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n t h e p r o t e i n c a v i t y c a n e x p l a i n t h e e n h a n c e d r e t i n a l a f fi n i t y a s c o m p a r e d t o m u t a n t s b e a r i n g e i t h e r o f t h e R l l l V , R l l l M m u t a t i o n s . I n b o t h c a s e s , t h o u g h , t h e f o r m e d P S B i s s t a b l e w i t h c a l c u l a t e d p K a v a l u e s o f 8 . 9 a n d 8 . 8 , r e s p e c t i v e l y . I n o r d e r t o m a i n t a i n a n e l e c t r o n i c a l l y c o n s e r v a t i v e m u t a t i o n a t p o s i t i o n 1 1 1 R 1 3 2 K : R 1 1 1 K : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t w a s e n g i n e e r e d . I n t h e o r y , t h e L y s r e s i d u e a t p o s i t i o n 1 1 1 c o u l d m a i n t a i n t h e o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e ( # 1 ) b e l i e v e d t o “ l o c k ” t h e r e t i n a l i n a n u n f a v o r a b l e p o s i t i o n t o u n d e r g o n u c l e o p h i l i c a t t a c k . T h e U V - v i s s p e c t r u m o f t h e l a t t e r m u t a n t m a i n t a i n s t h e a b i l i t y t o b i n d r e t i n a l a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ( 4 5 5 n m ) . H o w e v e r , t h e s p e c t r u m i s a m i x t u r e o f t w o d i f f e r e n t p e a k s a t 3 6 5 n m a n d 4 5 5 n m , 1 8 8 w h i c h i n d i c a t e s t h a t t h e f o r m e d P S B i s n o t v e r y s t a b l e a t p h y s i o l o g i c a l p H ( t h e a p p a r e n t p K a v a l u e w a s c a l c u l a t e d t o b e ~ 7 . 6 . T h e a b s o r p t i o n m a x i m u m o f 4 5 5 n m o b s e r v e d f o r t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 K z L 1 2 1 E m u t a n t i s a c t u a l l y ~ 6 n m r e d s h i f t e d a s c o m p a r e d t o t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t ( 4 4 9 n m ) . A s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d s i m i l a r A M w a s o b s e r v e d w i t h d o u b l e m u t a n t R 1 3 2 K : L 1 2 1 E , w h e r e A r g 1 1 1 w a s r e t a i n e d . T h a t r e d s h i f t w a s a t t r i b u t t e d t o t h e c o o r d i n a t i o n o f t h e G l u 1 2 1 t o t h e o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e a s s o c i a t e d w i t h A r g 1 1 1 , a n d a s i m i l a r e x p l a n a t i o n m a y a p p l y t o t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 K 2 L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t , s i n c e L y s l l l c a n a l s o m a i n t a i n a n o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e . T h e f a c t t h a t t h e c o u n t e r a n i o n i s p l a c e d f u r t h e r a w a y f r o m t h e P S B d u e t o c o o r d i n a t i o n w i t h w a t e r c a n a l s o e x p l a i n t h e r e d u c e d p K a o f t h e P S B . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e i f a n y r e s i d u e t h a t c a n c o o r d i n a t e t o a w a t e r m o l e c u l e c a n h a v e t h e s a m e e f f e c t w h e n p l a c e d a t p o s i t i o n 1 1 1 , t r i p l e m u t a n t R 1 3 2 K : R 1 1 1 H 2 L l 2 l E w a s f o r m e d . T h e U V - v i s s p e c t r u m o f t h e l a t t e r m u t a n t r e v e a l e d t h e p r e s e n c e o f a P S B , s t a b l e a t p h y s i o l o g i c a l p H ( A m x = 4 4 6 n m , P S B p K a = 8 . 9 ) . H o w e v e r , t h e s y s t e m r e q u i r e s s e v e r a l m i n u t e s t o e q u i l i b r a t e w h i l e t h e s t o i c h i o m e t r y i s l e s s t h a n 1 : 1 ( a f t e r ~ O . 5 e q u i v o f r e t i n a l w e r e a d d e d a s e c o n d p e a k a t ~ 3 7 O n m w a s p r e s e n t i n t h e s p e c t r u m ) . F u r t h e r m o r e , t h e o b s e r v e d a b s o r p t i o n m a x i m u m i s n o t r e d s h i f t e d ( A m = 4 4 6 n m ) a s c o m p a r e d t o t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E m u t a n t w h i c h i n d i c a t e s t h a t e v e n i f a w a t e r m o l e c u l e i s c o o r d i n a t e d t o H i s l l l i t d o e s n o t h a v e t h e s a m e e f f e c t o b s e r v e d w i t h R 1 3 2 K : L 1 2 1 E , a n d R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E . F i g u r e 3 - 1 8 d e p i c t s t h e m o d e l s t r u c t u r e o f t h e R 1 3 2 K : R 1 1 1 H : L 1 2 1 E m u t a n t b o u n d t o a l l - t r a n s - r e t i n a l a s a P S B . D u e t o t h e 1 8 9 F i g u r e 3 - 1 8 . S t e r e o v i e w o f t h e m o d e l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 H z L 1 2 1 E m u t a n t w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d a s a S c h i f f b a s e . D u e t o t h e d i s p o s i t i o n o f t h e H i s r i n g t h e c o o r d i n a t e d w a t e r m o l e c u l e s w o u l d b e f a r a w a y f r o m G l u 1 2 1 . d i s p o s i t i o n o f t h e H i s r i n g a n y c o o r d i n a t e d w a t e r m o l e c u l e s w o u l d b e f a r a w a y f r o m G l u 1 2 1 , i n a n u n f a v o r a b l e f o r i n t e r a c t i o n t r a j e c t o r y . T o f u r t h e r p r o b e t h e e f f e c t o f t h e A r g 1 1 1 a n i n d i r e c t r o u t e w a s c h o s e n . A s c a n b e s e e n i n F i g u r e 3 - 1 9 , t h e o r i e n t a t i o n o f A r g l l l i n t h e C R A B P I I b i n d i n g p o c k e t i s r e s t r i c t e d d u e t o i n t e r a c t i o n s w i t h t h e n e i g h b o r i n g r e s i d u e s . I n p a r t i c u l a r , A r g l l l i s i n v o l v e d i n a c l o s e n - c a t i o n i n t e r a c t i o n w i t h T r p 1 0 9 ( 2 . 9 A a v e r a g e d i s t a n c e ) . A c l o s e r l o o k r e v e a l s t h a t t h e p o s i t i o n o f T r p 1 0 9 i s a l s o “ l o c k e d ” d u e t o t h e c o o r d i n a t i o n o f t h e i m i d a z o l e n i t r o g e n w i t h G l u 7 3 . W e b e l i e v e d t h a t b y d i s r u p t i n g t h e a b o v e i n t e r a c t i o n s A r g 1 1 1 c o u l d f r e e l y r o t a t e a n d a s s u m e a d i f f e r e n t o r i e n t a t i o n t h a t w o u l d n o t i n t e r f e r e w i t h t h e P S B f o r m a t i o n . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e a b o v e , t r i p l e m u t a n t s R 1 3 2 K : W 1 0 9 L : L 1 2 1 E a n d R 1 3 2 K : E 7 3 A : L 1 2 1 E w e r e f o r m e d . U p o n i n t r o d u c t i o n o f e i t h e r W 1 0 9 L o r E 7 3 A m u t a t i o n t h e r e t i n a l b i n d i n g a f f i n i t y d e c l i n e d s i g n i fi c a n t l y r e s u l t i n g i n K d v a l u e s o f 1 9 1 i 1 8 n M a n d 5 2 6 : t 7 3 , r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , t h e U V — v i s b e h a v i o r o f b o t h p r o t e i n s i s s i m i l a r t o t h a t o f t h e p a r e n t R 1 3 2 K : L 1 2 1 E m u t a n t . D i s r u p t i n g t h e i n t e r a c t i o n s t h a t d i r e c t l y ( T r p 1 0 9 ) o r i n d i r e c t l y 1 9 0 ( G l u 7 3 ) d e fi n e t h e o r i e n t a t i o n o f A r g 1 1 1 d o e s n o t a f f e c t p r o t e i n ’ s a b i l i t y f o r P S B f o r m a t i o n . F i g u r e 3 — 1 9 . S t e r e o v i e w o f t h e m o d e l s t r u c t u r e o f C R A B P I I - R 1 3 2 K : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l b o u n d n o n - c o v a l e n t l y . T h e p o s i t i o n o f A r g 1 1 1 a s s o c i a t e d w i t h a n o r d e r e d w a t e r m o l e c u l e ( b l u e c r o s s ) i s d e t e r m i n e d b y a n — c a t i o n i n t e r a c t i o n w i t h T r p 1 0 9 ( 2 . 9 0 A ) . T h e o r i e n t a t i o n o f t h e i n d o l e r i n g i s f u r t h e r f i x e d b y i t s i n t e r a c t i o n w i t h G l u 7 3 . " 9 5 2 i s l o c a t e d c l o s e t o A r g 1 1 1 . T h e t w o p i c t u r e s d e p i c t a d i f f e r e n t a n g l e o f t h e b i n d i n g p o c k e t . F i n a l l y , i n a n a t t e m p t t o o r i e n t A r g l l l a n d t h e w a t e r m o l e c u l e a s s o c i a t e d w i t h i t a w a y f r o m t h e r e t i n a l b i n d i n g s i t e , I l e 5 2 w a s c o n v e r t e d i n t o a n A s p . A s c a n b e s e e n i n F i g u r e 3 - 1 9 B I l e 5 2 i s l o c a t e d o n t h e o p p o s i t e s i t e o f t h e r e t i n a l m o l e c u l e . W e b e l i e v e d t h a t i f a n A s p r e s i d u e i s p l a c e d a t t h a t p o s i t i o n i t c o u l d f o r m a s a l t b r i d g e w i t h A r g 1 1 1 , a n d t h u s r e p o s i t i o n i t a w a y f r o m t h e b i n d i n g p o c k e t a n d i n p a r t i c u l a r a w a y f r o m t h e 1 9 1 a l d e h y d i c o x y g e n o f r e t i n a l . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h a t t r i p l e m u t a n t R 1 3 2 K : L 1 2 1 E : 1 5 2 D w a s f o r m e d ( T a b l e 3 - 2 , e n t r y 1 5 ) . A l t h o u g h I l e 5 2 h a s n o t b e e n i d e n t i f i e d a s o n e o f t h e c r i t i c a l r e s i d u e s f o r t h e C R A B P H s t a b i l i t y , t h e i s o l a t e d y i e l d f o r t h e o b t a i n e d p r o t e i n w a s e x t r e m e l y l o w ( 3 m g / L ) . I t a p p e a r s t h a t p l a c i n g a p o l a r a m i n o a c i d i n a h i g h l y h y d r o p h o b i c c a v i t y d i s r u p t s t h e p r o p e r p r o t e i n f o l d i n g m e c h a n i s m , r e s u l t i n g i n f o r m a t i o n o f i n s o l u b l e i n c l u s i o n b o d i e s . I n a n y c a s e , t h e i s o l a t e d a m o u n t o f p r o t e i n w a s s u f fi c i e n t t o p e r f o r m a U V - v i s t i t r a t i o n w i t h a l l - t r a n s - r e t i n a l . P l a c i n g a n A s p r e s i d u e a t p o s i t i o n 5 2 h a s l e d t o l o s s o f t h e U V - v i s r e d s h i f t c h a r a c t e r i s t i c o f P S B f o r m a t i o n . R e c a l l t h a t t h e k m o f d o u b l e m u t a n t R 1 3 2 K : L 1 2 1 E w a s ~ 4 5 5 n m . A t t h i s p o i n t w e d o n o t h a v e e n o u g h e v i d e n c e t o a r g u e w h e t h e r o r n o t t h e p r o t e i n ’ s i n a b i l i t y f o r P S B f o r m a t i o n i s a d i r e c t r e s u l t o f t h e i n t e r a c t i o n s a s s o c i a t e d w i t h t h e 1 5 2 D m u t a t i o n . H o w e v e r , w e b e l i e v e t h a t t h e l o s s o f P S B f o r m a t i o n i s d u e t o p r o t e i n i n s t a b i l i t y c a u s e d b y t h e i n t r o d u c t i o n o f a c a r b o x y l i c r e s i d u e i n a h y d r o p h o b i c c a v i t y . U n f o r t u n a t e l y , d u e t o a n i n s u f f i c i e n t a m o u n t o f i s o l a t e d p r o t e i n n o M A L D I - T O F o r C D s p e c t r a w e r e o b t a i n e d . 1 9 2 3 . 5 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s A . P r o t e i n M u t a t i o n , B a c t e r i a l E x p r e s s i o n a n d P u r i f i c a t i o n i . M u t a t i o n s o f p E T - 1 7 b v e c t o r P C R r e c i p e T e m p l a t e D N A ( 1 0 n g / u l ) 5 u L P r i m e r 1 1 5 p m o l P r i m e r 2 1 5 p m o l D N T P 1 1 . 1 L P f u T u r b o 1 u L 1 0 x p i u b u f f e r 1 0 u L H 2 0 5 0 - R x a n P C R g r o g r a m 1 X 9 5 ° C 3 : 3 0 m i n 9 5 ° C 1 m i n 3 0 X { 5 5 ° C 1 m i n 7 2 ° C 8 m i n 1 X 7 2 ° C 1 0 m i n 1 X 2 3 ° C 1 0 m i n i i . P C R P r i m e r s C R A B P I I m u t a n t P 3 3 3 ? P r i m e r s S e q u e n c e P C R T e m p l a t e b b b 2 7 5 ' C T C T C G G A C G T A G A C C T T G G T G C A C A C A A C G T C 2 ' R 1 3 2 K 5 5 5 2 3 5 ' G A C G T T G T G T G C A C C A A G G W T ' C R A B P " T C T A C G T C C G A G A G _ T 1 ' A ' I A 3 ' R 1 3 2 K - Y 1 3 4 F 5 5 5 3 1 5 ' C T C G A G C T C T C G G A C G A A G R 1 3 2 K A C C T T G G T G C A C A C A A C b b b 3 7 5 ' G A T G G G G A A C é T G A T C G - A G A , , C C A T G A C G G G G A T G A C , 4 . R 1 3 2 K . Y 1 3 4 F . L 1 2 1 E b b b 3 8 5 . 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E x p r e s s i o n T h e t a r g e t g e n e ( C R A B P I I / p E T - l 7 b ) w a s t r a n s f o r m e d i n t o B L 2 1 ( D E 3 ) p L y s S c e l l s a c c o r d i n g t o s t a n d a r d p r o t o c o l s a n d p l a t e d o n A m p / C l m r e s i s t a n t L B p l a t e s . T y p i c a l l y , h u n d r e d s o f c o l o n i e s g r o w . A s i n g l e c o l o n y f r o m t h e p l a t e w a s i n o c u l a t e d i n 2 0 0 m L L B / A m p - C l m b r o t h ( A m p 1 0 0 u g / m L ; C l m 1 7 0 ( L g / m L ) a n d g r o w n a t 3 7 ° C , w h i l e s h a k i n g , o v e r n i g h t . 5 0 m L o f t h e o v e r n i g h t c u l t u r e w e r e i n o c u l a t e d i n t o 1 L o f L B / A m p - C l m m e d i u m . T h e c u l t u r e w a s i n c u b a t e a t 3 7 ° C u n t i l O D w o z 0 . 6 ( ~ 3 h o n a v e r a g e ) . T h e e x p r e s s i o n w a s i n d u c e d b y a d d i t i o n o f 1 m M I P T G . T h e c u l t u r e w a s i n c u b a t e d a t 3 0 1 9 7 ° C f o r 6 h . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 6 0 0 0 r p m , 3 0 m i n ) a n d f r o z e n a t — 2 0 ° C o v e r n i g h t . T h e c e l l m a s s w a s t h a w e d a n d r e s u s p e n d e d i n 1 0 0 m L o f B u f f e r A ( f o r 4 L e x p r e s s i o n ) . T h e c e l l s w e r e s o n i c a t e d ( p r o b e s o n i c a t o r , 6 0 % p o w e r , 3 x 1 m i n ) , t h e m i x t u r e w a s s p u n d o w n ( 3 0 m i n , 4 ° C , 5 0 0 0 r p m ) a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s c o l l e c t e d . A t t h i s p o i n t 3 0 0 m L M g S O 4 l m M a n d 3 0 u L b e n z o n a s e ( t o r e d u c e v i s c o s i t y ) w e r e a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d o n i c e f o r 3 0 m i n . T h e m i x t u r e w a s s p u n d o w n o n c e m o r e ( 6 0 0 0 r p m , 3 0 m i n ) a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s c o l l e c t e d t o b e l o a d e d o n t h e F a s t - Q c o l u m n . i i . P u r i fi c a t i o n a . F a s t - Q T h e c r u d e C R A B P I I e x p r e s s i o n w a s p u r i f i e d b y a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y u s i n g Q S e p h a r o s e , F a s t F l o w r e s i n . T h i s q u a t e r n a r y a m m o n i u m b a s e d r e s i n i s a s t r o n g a n i o n e x c h a n g e r . ( C o l u m n h e i g h t : ~ 1 0 c m ; D i a m e t e r : ~ 4 c m ; B i n d i n g c a p a c i t y : ~ 2 0 m g ) . T h e c o l u m n w a s q q u i l i b r a t e d w i t h 2 0 0 m L B u f f e r A ( i f p r e v i o u s l y u s e d , t h e c o l u m n h a s t o b e w a s h e d w i t h ~ 3 0 0 m L 2 M N a C l a n d t h e n e q u i l i b r a t e d w i t h b u f f e r A ) . ~ 1 / 3 o f a 4 L c u l t u r e s u p e r n a t a n t e x t r a c t w a s l o a d e d o n t o t h e c o l u m n ( u s u a l l y ~ 3 0 m L ) a n d f r a c t i o n s o f 3 m L w e r e c o l l e c t e d ( i f t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f t h e c o l u m n i s e x c e e d e d , t h e e x c e s s d e s i r e d p r o t e i n w a s h e s o f f w i t h t h e fl o w t h r o u g h ) . T h e c o l u m n w a s i n i t i a l l y w a s h e d w i t h 1 5 0 m L B u f f e r A f o l l o w e d b y ~ 5 0 m L o f a g r a d i e n t o f B u f f e r s A & B . C R A B P I I - m u t a n t s w e r e e l u t e d b y r u n n i n g 1 0 0 m L B u f f e r B ( a l t e r n a t i v e l y , a f t e r t h e fi r s t 5 0 m L o f 1 9 8 B u f f e r B , t h e p r o t e i n c a n b e e l u t e d f a s t e r w i t h B u f f e r C , b u t u s u a l l y t h i s l e a d s t o m o r e c o n t a m i n a t e d p r o t e i n f r a c t i o n s ) . T h e c o l l e c t e d f r a c t i o n s w e r e c h e c k e d u s i n g S D S - P A G E a n d t h e o n e s c o n t a i n i n g t h e d e s i r e d p r o t e i n w e r e c o m b i n e d a n d c o n c e n t r a t e d a n d d e s a l t e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( M i l l i p o r e , C e n t r i p l u s Y M - l O , c e n t r i f u g a l f i l t e r d e v i c e s , 4 0 0 0 r p m , 5 h . [ A l t e m a t i v e l y , a s t i r r e d U l t r a fi l t r a t i o n C e l l ( M i l l i p o r e ) c a n b e u s e d a n d t h e c o n c e n t r a t i o n i s p e r f o r m e d u n d e r n i t r o g e n p r e s s u r e ( ~ 2 0 p s i ) t h r o u g h a n Y M l O ( N M W L = 1 0 0 0 0 ) m e m b r a n e ( U l t r a f i l t r a t i o n M e m b r a n e s , M a t e r i a l R e g e n e r a t i o n C e l l u l o s e ) . U s i n g t h i s c e l l , w h i c h h a s a c a p a c i t y o f 2 5 0 m L , t h e c o n c e n t r a t i o n o f l a r g e v o l u m e s o f p r o t e i n s o l u t i o n s c a n b e c o m p l e t e d i n ~ 1 h . I n t h i s m a n n e r t h e p u r i fi c a t i o n o f e a c h p r o t e i n c a n b e a c c o m p l i s h e d i n l e s s t h a n 2 d a y s . H o w e v e r , o n e m u s t b e c a r e f u l n o t t o l e t t h e c o n c e n t r a t i o n c e l l t o d r y . T h e r e m a i n i n g v o l u m e s h o u l d n e v e r b e l e s s t h a n 5 m L w h i l e o n e m u s t m a k e s u r e t h a t t h e m e m b r a n e i s p l a c e d p r o p e r l y i n t h e c e l l , o r e l s e t h e p r o t e i n w i l l l e a k i n t o t h e w a s t e ] T h e c o n c e n t r a t e d s a m p l e w a s d i s s o l v e d i n B u f f e r A t o a fi n a l v o l u m e o f 5 0 m L i n o r d e r t o b e f u r t h e r p u r i f i e d b y F P L C . B u f f e r s : A . 1 0 m M T r i s H C I , p H = 8 . 0 ; B . 1 0 m M T r i s H C l + 5 0 m M N a C l , p H = 8 . 0 ; C . 1 0 m M T r i s H C 1 + 1 0 0 m M N a C l , p H = 8 . 0 b . F P L C ( B i o L o g i c s D u o F l o w , B i o R a d ) - C o l u m n : S o u r c e 1 5 Q ( q u a t e r n a r y a m m o n i u m s t r o n g a n i o n e x c h a n g e r ) 0 B i n d i n g C a p a c i t y : ~ 2 0 m g 0 B u f f e r s : A 1 : 5 0 m M T r i s H C l 1 9 9 A 2 : 5 0 m M t r i s 8 1 : w a t e r 8 2 : 2 M N a C l 0 P r o t o c o l : S t e p V o l u m e ( m L ) D e s c r i p t i o n 1 0 C o l l e c t 3 . 0 m L f r a c t i o n s 2 0 l s o c r a t i c F l o w p H = 8 . 1 , 0 % B , 2 0 m L , 5 m L / m i n 3 2 0 Q u a d t e c a u t o z e r o 4 2 0 L o a d / I n j e c t 5 0 m L , 5 m L / m i n 5 7 0 l s o c r a t i c F l o w p H = 8 . 1 , 0 % B , 2 0 m L , 5 m L / m i n 6 9 0 L i n e a r G r a d i e n t p H = 8 . 1 , 0 - 4 % B , 2 0 m L , 5 m L / m i n 7 1 1 0 l s o c r a t i c F l o w p H = 8 . 1 , 4 % B , 2 0 m L , 5 m L / m i n 8 1 3 0 L i n e a r G r a d i e n t p H = 8 . 1 , 4 - 8 % B , 2 0 m L , 5 m L / m i n 9 1 5 0 L i n e a r G r a d i e n t p H = 8 . 1 , 8 - 2 0 % B , 2 0 m L , 5 m L / m i n ' 1 0 1 7 0 L i n e a r G r a d i e n t p H = 8 . 1 , 2 0 - 7 5 % B , 2 0 m L , 5 m L / m i n B 1 1 1 9 0 l s o c r a t i c F l o w p H = 8 . 1 , 1 0 0 % B , 2 0 m L , 5 m L / m i n 1 2 2 1 0 l s o c r a t i c F l o w p H = 8 . 1 , 0 % B , 2 0 m L , 5 m L / m i n 1 3 2 3 0 E n d o f P r o t o c o l r e f e r s t o b u f f e r 8 2 , 2 M N a C l s o l u t i o n - T h e a b o v e p r o t o c o l h a s b e e n o p t i m i z e d f o r C R A B P I I p u r i f i c a t i o n . C R A B P I I p r o t e i n s e l u t e a t ~ 4 % B . - T h e p u r i t y o f t h e p r o t e i n a n a l y z e d b y S D S - P A G E e l e c t r o p h o r e s i s , i s g r e a t e r t h a n 9 0 % . 2 0 0 C . P r o t e i n C h a r a c t e r i z a t i o n a n d B i n d i n g A s s a y s A d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f a l l t h e p r o t e i n c h a r a c t e r i z a t i o n t e c h n i q u e s a n d t h e b i n d i n g a s s a y s u t i l i z e d i n t h i s c h a p t e r i s p r o v i d e d i n C h a p t e r 2 , M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . D . M o l e c u l a r M o d e l i n g : C o m p u t a t i o n a l r e s u l t s w e r e o b t a i n e d u s i n g s o f t w a r e p r o g r a m s f r o m A c c e l r y s . D y n a m i c s a n d r n i n i m i z a t i o n s w e r e d o n e u s i n g t h e D i s c o v e r 3 ® p r o g r a m , u s i n g t h e C V F F f o r c e fi e l d f r o m w i t h i n t h e I n s i g h t I I 2 0 0 0 m o l e c u l a r m o d e l i n g s y s t e m . P r o t e i n fi g u r e s w e r e g e n e r a t e d u s i n g P y M o l M o l e c u l a r G r a p h i c s S y s t e m , v e r s i o n 0 . 9 3 , c o p y r i g h t b y D e L a n o S c i e n t i fi c L L C . 3 . 6 R e f e r e n c e s l . C . A . F i t c h , D . A . K a r p , K . K . L e e , W . E . S t i t e s , E . E . L a t t m a n , B . G a r c i a - M o r e n o " E x p e r i m e n t a l p K ( a ) v a l u e s o f b u r i e d r e s i d u e s : A n a l y s i s w i t h c o n t i n u u m m e t h o d s a n d r o l e o f w a t e r p e n e t r a t i o n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 2 0 0 2 , 8 2 , 3 2 8 9 - 3 3 0 4 . 2 . P . E . B l a t z , N . B a u m g a r t n e r , B . B a l a s u b r a m a n i y a n , P . B a l a s u b r a m a n i y a n , F . S t e d m a n " W a v e l e n g t h r e g u l a t i o n i n v i s u a l p i g m e n t c h r o m o p h o r e . L a r g e i n d u c e d b a t h o c h r o m i c s h i f t s i n r e t i n o l a n d r e l a t e d p o l y e n e s . " P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . 1 9 7 1 , 1 4 , 5 3 1 — 5 4 9 . 3 . G . A . J . P i t t , F . D . C o l l i n s , R . A . M o r t o n , P . S t o k " R h o d o p s i n . V I I I . N - R e t i n y l i d e n e m e t h y l a m i n e , a n i n d i c a t o r y e l l o w a n a l o g . " B i o c h e m . J . 1 9 5 5 , 5 9 , 1 2 2 - 1 2 8 . 4 . G . W a l d " O n r h o d o p s i n i n s o l u t i o n . " J . G e n . P h y s i o l . 1 9 3 8 , 2 1 , 7 9 5 - 8 3 2 . 5 . G . S t e i n b e r g , M . O t t o l e n g h i , M . S h e v e s " P k ( a ) o f t h e P r o t o n a t e d S c h i f f - B a s e o f B o v i n e R h o d o p s i n - a S t u d y w i t h A r t i f i c i a l P i g m e n t s " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 3 , 6 4 , 1 4 9 9 - 1 5 0 2 . 6 . R . J . L y t h g o e " T h e a b s o r p t i o n s p e c t r a o f v i s u a l p u r p l e a n d o f i n d i c a t o r y e l l o w . " J . P h y s i o l . 1 9 3 7 , 8 9 , 3 3 1 - 3 5 8 . 2 0 1 7 . 1 0 . 1 1 . 1 2 . 1 3 . 1 4 . 1 5 . l 6 . 1 7 . 1 8 . Y . K o u t a l o s " H i g h - P h F o r m o f B o v i n e R h o d o p s i n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 2 , 6 1 , 2 7 2 - 2 7 5 . S . D r u c k m a n n , M . O t t o l e n g h i , A . P a n d e , J . P a n d e , R . H . C a l l e n d e r " A c i d - B a s e - E q u i l i b r i u m o f t h e S c h i f f - B a s e i n B a c t e r i o r h o d o p s i n " B i o c h e m i s t r y 1 9 8 2 , 2 1 , 4 9 5 3 - 4 9 5 9 . S . D r u c k m a n n , M . O t t o l e n g h i , A . P a n d e , J . P a n d e , R . H . C a l l e n d e r " A c i d - B a s e - E q u i l i b r i u m o f t h e S c h i f f - B a s e i n B a c t e r i o r h o d o p s i n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 8 2 , 3 7 , A 2 2 7 - A 2 2 7 . Y . K o u t a l o s , T . G . E b r e y , H . R . G i l s o n , B . H o n i g " O c t o p u s P h o t o r e c e p t o r - M e m b r a n e s - S u r f a c e - C h a r g e D e n s i t y a n d p K o f t h e S c h i f f - B a s e o f t h e P i g m e n t s " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 0 , 5 8 , 4 9 3 - 5 0 1 . J . L i a n g , G . S t e i n b e r g , N . L i v n a h , M . S h e v e s , T . G . E b r e y , M . T s u d a " T h e P k ( a ) o f t h e P r o t o n a t e d S c h i f f - B a s e s o f G e c k o C o n e a n d O c t o p u s V i s u a l P i g m e n t s " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 4 , 6 7 , 8 4 8 - 8 5 4 . M . N a k a g a w a , T . I w a s a , S . K i k k a w a , M . T s u d a , T . G . E b r e y " H o w v e r t e b r a t e a n d i n v e r t e b r a t e v i s u a l p i g m e n t s d i f f e r i n t h e i r m e c h a n i s m o f p h o t o a c t i v a t i o n " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 9 , 9 6 , 6 1 8 9 - 6 1 9 2 . T . P . S a k m a r , R . R . F r a n k e , H . G . K h o r a n a " G l u t a m i c A c i d - 1 1 3 S e r v e s a s t h e R e t i n y l i d e n e S c h i f f - B a s e C o u n t e r i o n i n B o v i n e R h o d o p s i n " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 8 9 , 8 6 , 8 3 0 9 - 8 3 1 3 . J . N a t h a n s " D e t e r m i n a n t s o f V i s u a l P i g m e n t A b s o r b e n c y - I d e n t i fi c a t i o n o f t h e R e t i n y l i d e n e S c h i f f — B a s e C o u n t e r i o n i n B o v i n e R h o d o p s i n " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 0 , 2 9 , 9 7 4 6 - 9 7 5 2 . H . J . M . D e g r o o t , G . S . H a r b i s o n , J . H e r z f e l d , R . G . G r i f fi n " N u c l e a r M a g n e t i c - R e s o n a n c e S t u d y o f t h e S c h i f f - B a s e i n B a c t e r i o r h o d o p s i n - C o u n t e r i o n E f f e c t s o n t h e N - 1 5 S h i f t A n i s o t r o p y " B i o c h e m i s t r y 1 9 8 9 , 2 8 , 3 3 4 6 - 3 3 5 3 . Z . Y . W a n g , A . B . A s e n j o , D . D . O p r i a n " I d e n t i f i c a t i o n o f t h e C l - - B i n d i n g S i t e i n t h e H u m a n R e d a n d G r e e n C o l o r - V i s i o n P i g m e n t s " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 3 , 3 2 , 2 1 2 5 - 2 1 3 0 . P . E . B l a t z , J . H . M o h l e r , H . V . N a v a n g u l " A n i o n - I n d u c e d W a v e l e n g t h R e g u l a t i o n o f A b s o r p t i o n M a x i m a o f S c h i f f - B a s e s o f R e t i n a l " B i o c h e m i s t r y 1 9 7 2 , 1 1 , 8 4 8 - 8 5 6 . Y . G a t , M . S h e v e s " A M e c h a n i s m f o r C o n t r o l l i n g t h e P k ( a ) o f t h e R e t i n a l P r o t o n a t e d S c h i f f - B a s e i n R e t i n a l P r o t e i n s - a S t u d y w i t h M o d e l C o m p o u n d s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 3 , 1 1 5 , 3 7 7 2 - 3 7 7 3 . 2 0 2 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . N . L i v n a h , M . S h e v e s " T h e S c h i f f - B a s e B o n d C o n fi g u r a t i o n i n B a c t e r i o r h o d o p s i n a n d i n M o d e l C o m p o u n d s " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 3 , 3 2 , 7 2 2 3 - 7 2 2 8 . N . L i v n a h , M . S h e v e s " M o d e l C o m p o u n d s C a n M i m i c S p e c t r o s c o p i c P r o p e r t i e s o f B o v i n e R h o d o p s i n " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 3 , 1 1 5 , 3 5 1 - 3 5 3 . S . J . E y l e s , L . M . G i e r a s c h " M u l t i p l e r o l e s o f p r o l y l r e s i d u e s i n s t r u c t u r e a n d f o l d i n g " J . M o l . B i o l . 2 0 0 0 , 3 0 1 , 7 3 7 - 7 4 7 . K . G u n a s e k a r a n , A . T . H a g l e r , L . M . G i e r a s c h " S e q u e n c e a n d s t r u c t u r a l a n a l y s i s o f c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d - b i n d i n g p r o t e i n s r e v e a l s a n e t w o r k o f c o n s e r v e d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s " P r o t e i n s 2 0 0 4 , 5 4 , 1 7 9 - 1 9 4 . K . S . R o t o n d i , L . M . G i e r a s c h " R o l e o f l o c a l s e q u e n c e i n t h e f o l d i n g o f c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n 1 : S t r u c t u r a l p r o p e n s i t i e s o f r e v e r s e t u r n s " B i o c h e m i s t r y 2 0 0 3 , 4 2 , 7 9 7 6 - 7 9 8 5 . K . S . R o t o n d i , L . F . R o t o n d i , L . M . G i e r a s c h " N a t i v e s t r u c t u r a l p r o p e n s i t y i n c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d - b i n d i n g p r o t e i n , 1 6 4 - 8 8 : t h e r o l e o f l o c a l l y e n c o d e d s t r u c t u r e i n t h e f o l d i n g o f a b e t a - b a r r e l p r o t e i n " B i o p h y s . C h e m . 2 0 0 3 , 1 0 0 , 4 2 1 - 4 3 6 . J . H . Z h a n g , Z . P . L i u , T . A . J o n e s , L . M . G i e r a s c h , J . F . S a m b r o o k " M u t a t i n g t h e C h a r g e d R e s i d u e s i n t h e B i n d i n g P o c k e t o f C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d - B i n d i n g P r o t e i n S i m u l t a n e o u s l y R e d u c e s I t s B i n d i n g - A f f i n i t y t o R e t i n o i c A c i d a n d I n c r e a s e s I t s T h e r m o s t a b i l i t y " P r o t e i n s 1 9 9 2 , 1 3 , 8 7 - 9 9 . J . R i z o , Z . P . L i u , L . M . G i e r a s c h " S t r u c t u r e a n d F o l d i n g o f C e l l u l a r R e t i n o i c A c i d - B i n d i n g P r o t e i n , a P r e d o m i n a n t l y B e t a - S h e e t P r o t e i n " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 4 , 6 6 , A 3 9 7 - A 3 9 7 . P . L . C l a r k , Z . P . L i u , J . R i z o , L . M . G i e r a s c h " C a v i t y f o r m a t i o n b e f o r e s t a b l e h y d r o g e n b o n d i n g i n t h e f o l d i n g o f a b e t a - c l a m p r o t e i n " N a t . S t r u c t . B i o l . 1 9 9 7 , 4 , 8 8 3 - 8 8 6 . P . L . C l a r k , M . S u k u m a r , Z . P . L i u , J . R i z o , K . S . R o t o n d i , L . M . G i e r a s c h " F o l d i n g o f a p r e d o m i n a n t l y b e t a s h e e t p r o t e i n w i t h a c e n t r a l c a v i t y " F A S E B J . 1 9 9 7 , 1 1 , A 8 7 2 - A 8 7 2 . 2 0 3 C h a p t e r 4 T o w a r d s t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e p K , o f L y s l 3 2 , P S B 4 . 1 I n t r o d u c t i o n A s d i s c u s s e d i n t h e p r e v i o u s c h a p t e r s , i n t h e c o u r s e o f r e d e s i g n i n g C R A B P I I i n t o a r e t i n a l b i n d i n g p r o t e i n , t w o m a i n g o a l s w e r e s e t a s t h e e s s e n t i a l p r e r e q u i s i t e s f o r s u c c e s s . A n u c l e o p h i l i c L y s r e s i d u e , c a p a b l e o f f o r m i n g a n i m i n e w i t h t h e i n c o m i n g a l d e h y d e w a s n e e d e d , w h i l e t h e e l e c t r o n i c e n v i r o n m e n t o f t h e b i n d i n g s i t e h a d t o b e t u n e d s o t h a t t h e f o r m e d i m i n e r e m a i n s p r o t o n a t e d . F o r t h a t , i t w a s c e n t r a l f o r t h e a d v a n c e m e n t o f t h e p r o j e c t t o d e t e r m i n e p K a v a l u e s i n a n a c c u r a t e a n d q u a n t i t a t i v e m a n n e r f o r b o t h t h e L y s r e s i d u e a n d t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e f o r m e d . A s s h o w n i n C h a p t e r 3 , w e h a v e b e e n a b l e t o f o l l o w t h e p r o t o n a t i o n o f t h e S c h i f f L y s p K . H H 1 3 1 5 H e 1 6 ' ) H M O H Q N M L y s R N / k o H 3 N l / \ / \ L Y S 2 1 m , = 3 7 7 n m A m = 3 7 7 n m I / l U V - v l s o b s e r v e d H H W M H £ 9 e R \ \ N M L y s = — ‘ — - R \ \ ” M u s A m = 3 6 0 n m ( ? ) A m = 4 4 5 n m S c h e m e 4 - 1 . V a r i o u s e q u i l i b r i a i n v o l v e d i n t h e f o r m a t i o n a n d p r o t o n a t i o n o f a r e t i n a l S c h i f f b a s e 2 0 4 b a s e b y U V - v i s s p e c t r o s c o p y , a n d h a v e m a n a g e d t o c a l c u l a t e p K a v a l u e s f o r t h e P S 8 o f v a r i o u s p r o t e i n s . T h e r e s u l t s h a v e b e e n c o n s i s t e n t a n d w e a r e c o n fi d e n t t h a t t h e y r e p r e s e n t a g o o d a p p r o x i m a t i o n o f t h e a c t u a l v a l u e . H o w e v e r , t h e m e a s u r e m e n t o f t h e p K , o f L y s l 3 2 u s i n g U V - v i s a s s a y s i s m o r e c o m p l i c a t e d . S c h e m e 4 - 1 d e p i c t s a s e r i e s o f p H d e p e n d e n t e q u i l i b r i a b e t w e e n t h e n o n - b o n d e d a n d r e t i n a l - b o n d e d f o r m s o f L y 5 1 3 2 . W h a t w e a r e i n t e r e s t e d i n f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e p K , o f L y s l 3 2 i s t h e e q u i l i b r i u m b e t w e e n i t s p r o t o n a t e d a n d n o n - p r o t o n a t e d f o r m . H o w e v e r , a s c a n b e s e e n , t h e U V - v i s a s s a y c a n n o t d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e t w o f o r m s ( h m a x = 3 7 7 n m i n b o t h c a s e s ) . T h e o n l y U V - v i s a c t i v e s p e c i e s t h a t w e a r e c o n fi d e n t i n a s s i g n i n g i s t h e p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ( A m , = 4 4 5 n m ) . W e b e l i e v e d w e c o u l d c a l c u l a t e a n a p p a r e n t p K a v a l u e f o r L y s ] 3 2 b y i n c u b a t i n g t h e p r o t e i n a t d i f f e r e n t p H s , p r i o r t o t h e F i g u r e 4 - 1 . A . U V t i t r a t i o n o f R 1 3 2 K : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E i n c u b a t e d a t d i f f e r e n t p H s ( 4 - 7 . 5 ) u p o n a d d i t i o n o f a l l - t r a n s - r e t i n a l . B . G r a p h o f t h e a b s o r p t i o n c h a n g e a t 4 4 1 n m ( A m ) w i t h d i f f e r e n t p H s . 2 0 5 a d d i t i o n o f r e t i n a ] a n d p l o t t i n g t h e a m o u n t o f r e d s h i f t i n g p r e s e n t a t 4 4 1 n m ( A 4 4 1 ) v e r s u s t h e d i f f e r e n t p H v a l u e s . A c c o r d i n g t o t h i s m e t h o d , t h e c a l c u l a t e d v a l u e f o r t h e R 1 3 2 K : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t w a s 5 . 4 ( F i g u r e 4 - 1 ) . I n a s i m i l a r m a n n e r , t h e v a l u e c a l c u l a t e d f o r t h e R 1 3 2 K : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E : : T 5 4 V m u t a n t w a s e v e n l o w e r ( ~ 4 . 9 ) . T h e s e v a l u e s c o m p a r e w e l l w i t h t h e r e p o r t e d p K a f o r t h e a c t i v e s i t e L y s r e s i d u e f o r r h o d o p s i n ( ~ 6 ) . H o w e v e r , t h e f a c t t h a t w e a r e f o l l o w i n g a n o v e r a l l c h a n g e o f t h e U V - v i s a b s o r b a n c e t h a t i s i n d i r e c t l y c o n n e c t e d t o t h e c a l c u l a t e d p K a , h a s m a d e u s q u e s t i o n t h e v a l i d i t y o f t h e s e d a t a . I n p a r t i c u l a r , w e c a n n o t b e c o n f i d e n t t h a t t h e c h a n g e w e o b s e r v e u p o n a l t e r i n g t h e p H i s d u e t o t h e p K a o f t h e n u c l e o p h i l i c L y s a n d n o t d u e t o o t h e r a m i n o a c i d r e s i d u e s t h a t w e h a v e i d e n t i f i e d a s e s s e n t i a l f o r a s u c c e s s f u l P S B . F o r e x a m p l e , p r o t o n a t i o n o f e i t h e r G l u 1 2 1 o r T y r 1 3 4 w o u l d p r o b a b l y r e s u l t i n l o s s o f t h e U V - v i s r e d s h i f t i n g ( P S B ) b u t w o u l d n o t n e c e s s a r i l y p r e v e n t t h e S B f o r m a t i o n . H o w e v e r , s i n c e w e c a n n o t d e c i s i v e l y d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e U V - v i s a b s o r b a n c e o f f r e e r e t i n a l a n d t h a t o f a S B o u r c o n c l u s i o n c a n n o t b e d e f i n i t e . A d i r e c t m e a s u r e o f t h e p r o t o n a t i o n s t a t e o f t h e e n g i n e e r e d L y s i s n e e d e d . T h e m e t h o d o f c h o i c e i s N M R s p e c t r o s c o p y . 4 . 2 T h e N M R a p p r o a c h N M R s p e c t r o s c o p y h a s b e e n e s t a b l i s h e d a s o n e o f t h e m o s t d e p e n d a b l e m e t h o d s f o r t h e s t u d y o f b i o m o l e c u l e s i n s o l u t i o n . F o r o u r p u r p o s e , i t c a n p r o v i d e d i r e c t i n f o r m a t i o n o f t h e e l e c t r o n i c e n v i r o n m e n t o f t h e r e t i n a l - p r o t e i n i m i n e f o r m e d , w h i c h c o u l d t r a n s l a t e i n t o e s t i m a t i n g a c c u r a t e p K a v a l u e s f o r b o t h t h e f r e e L y s a n d t h e P S B n i t r o g e n . 2 0 6 C R A B P H h a s b e e n e x t e n s i v e l y s t u d i e d b y N M R , a n d t h e s o l u t i o n s t r u c t u r e s o f b o t h a p o a n d h o l o p r o t e i n h a v e b e e n s o l v e d . ” 2 I n o u r c a s e , t h e d e s i g n e d e x p e r i m e n t s i n v o l v e d t h e u s e o f e i t h e r l 3 C - l a b e l e d r e t i n a l a n d / o r 1 3 C a n d 1 5 N l a b e l e d p r o t e i n . A c c o r d i n g t o p r e v i o u s l y d e v e l o p e d m e t h o d s , 3 i f t h e s i d e c h a i n o f o u r e n g i n e e r e d L y 5 1 3 2 r e s i d u e i s l a b e l e d w i t h 1 5 N , a c h a n g e i n t h e p H o f t h e s o l u t i o n c a n d i r e c t l y t r a n s l a t e i n t o a c h a n g e o f t h e 1 5 N N M R c h e m i c a l s h i f t . T h e o b s e r v e d t r a n s i t i o n f r o m t h e u n p r o t o n a t e d t o t h e p r o t o n a t e d s t a t e a n d v i c e v e r s a c a n d i r e c t l y a f f o r d a p K a v a l u e f o r t h e L y s . I n o r d e r t o u s e t h e 1 5 N c h e m i c a l s h i f t c h a n g e s t o f o l l o w t h e p r o t o n a t i o n o f t h e a m i n e , t h e e - a m i n o g r o u p o f L y s l 3 2 h a d t o b e s p e c i fi c a l l y l a b e l e d . T o a c c o m p l i s h t h i s N a t i v e C h e m i c a l L i g a t i o n p r o t o c o l s f o r s p e c i f i c i n t r o d u c t i o n o f l a b e l e d r e s i d u e s w e r e f o l l o w e d . A t t h e s a m e t i m e , w e p r o p o s e t w o a d d i t i o n a l e x p e r i m e n t s f o r i n v e s t i g a t i n g t h e b o n d i n g , p K a a n d e n v i r o n m e n t a l c h a r a c t e r i s t i c s o f L y 5 1 3 2 , t h a t d o n o t r e q u i r e t h e s y n t h e s i s o f s p e c i fi c a l l y l a b e l e d L y s . T h e f i r s t a p p r o a c h , i n v o l v e s t h e u s e o f 1 3 C - l a b e l e d r e t i n a l , w h i c h u p o n b i n d i n g t o t h e p r o t e i n a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e c a n r e s u l t i n a s i g n i f i c a n t c h a n g e o f t h e c h e m i c a l s h i f t o f t h e a l d e h y d i c c a r b o n ( u s u a l l y ~ 2 0 0 p p m ) . T h e c h a n g e i n c h e m i c a l s h i f t t o a n i m i n e ( ~ 1 6 O p p m ) o r a n i m i n i u m ( ~ 1 8 0 p p m ) c a n b e i n d i c a t i v e o f t h e t y p e o f b o n d i n g b e t w e e n t h e a c t i v e s i t e L y s a n d r e t i n a l . ( F o r s y n t h e s i s o f l 3 C - r e t i n a l r e f e r t o R a c h a e l C r i s t ’ s t h e s i s ) . L i t e r a t u r e r e p o r t s d e t a i l s e v e r a l N M R s t u d i e s c a r r i e d o u t i n a n a t t e m p t t o i n v e s t i g a t e t h e r e t i n a l b i n d i n g t o b a c t e r i o r h o d o p s i n . M o s t o f t h e s e a p p r o a c h e s i n v o l v e d m e a s u r i n g t h e ’ 3 C N M R c h e m i c a l s h i f t s f o r s e v e r a l r e t i n a l i m i n i u m s a l t s i n a n a t t e m p t t o e s t a b l i s h t h e c h r o m o p h o r e ’ s b i n d i n g a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e i n t h e a c t u a l s y s t e m . T h e r e s u l t s r e v e a l e d a n u p f i e l d s h i f t i n g o f t h e r e t i n a l C - 1 5 ( t h e c a r b o n y l c a r b o n ) o f ~ 3 0 p p m u p o n 2 0 7 a d d i t i o n t o b a c t e r i o r h o d o p s i n . A t t h e s a m e t i m e , t h e s i g n a l f o r t h e C - 1 3 w a s m o v e d d o w n fi e l d ~ 1 1 p p m a n d t h e s a m e t r e n d w a s f o u n d f o r a l l t h e o d d n u m b e r e d c a r b o n s d u e t o t h e r e s o n a n c e o f t h e i r n i n i u m . " ' 8 T h e s e e x p e r i m e n t s p r o v i d e u s w i t h a g o o d e s t i m a t e o f t h e C - 1 5 s h i f t e x p e c t e d f o r o u r N M R e x p e r i m e n t s . I n a d d i t i o n , s i m i l a r d a t a w e r e o b t a i n e d i n a s e r i e s o f s o l i d s t a t e N M R e x p e r i m e n t s . T h e r e p o r t e d s h i f t o f t h e a l d e h y d i c p r o t o n i n t h e H - N M R i s q u i t e s i g n i fi c a n t t o o , c h a n g i n g f r o m 9 . 7 p p m ( f r e e a l d e h y d e ) t o 8 . 9 p p m ( p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ) . 9 ’ ’ 0 I n a d i f f e r e n t a p p r o a c h , m o r e a c c u r a t e d a t a r e g a r d i n g t h e e x t e n t o f p r o t o n a t i o n , p K a a n d a n i o n i n t e r a c t i o n c a n b e o b t a i n e d f r o m m e a s u r i n g t h e c h e m i c a l s h i f t o f t h e S c h i f f b a s e n i t r o g e n a t o m . W e p r o p o s e t o d o s o b y o v e r - e x p r e s s i o n o f t h e t a r g e t m u t a n t w i t h 1 5 N - l a b e l e d N H 4 C l t o y i e l d a u n i f o r m l y l a b e l e d p r o t e i n . T h e c h e m i c a l s h i f t o f t h e c r u c i a l n i t r o g e n a t o m , n a m e l y t h e o n e i n v o l v e d i n t h e S c h i f f b a s e f o r m a t i o n , c a n b e e x t r a c t e d ” " 5 u p o n b i n d i n g o f t h e f r o m t h e m a z e o f t h e 1 5 N s i g n a l s b y ’ 3 C - 1 5 N I - I M Q C e x p e r i m e n t s , l 3 C - l a b e l e d r e t i n a l . T h e u n i q u e c r o s s p e a k f r o m t h e h e t e r o n u c l e a r c o u p l i n g e x p e r i m e n t c a n y i e l d c h e m i c a l s h i f t i n f o r m a t i o n n e c e s s a r y f o r t h e e v a l u a t i o n o f t h e P S B , i t s p K a a n d i t s e n v i r o n m e n t . T h e d i f f e r e n t a p p r o a c h e s f o l l o w e d i n o r d e r t o o b t a i n e i t h e r s e l e c t i v e l y o r f u l l y l a b e l e d p r o t e i n s f o r o u r N M R e x p e r i m e n t s a r e d e s c r i b e d b e l o w . 2 0 8 4 . 3 N a t i v e C h e m i c a l L i g a t i o n A p p r o a c h “ M y e n t i r e y e a r n i n g i s d i r e c t e d t o w a r d t h e fi r s t s y n t h e t i c e n z y m e . I f i t s p r e p a r a t i o n f a l l s i n t o m y l a p w i t h t h e s y n t h e s i s o f a n a t u r a l p r o t e i n m a t e r i a l , I w i l l c o n s i d e r m y m i s s i o n f u l f i l l e d . ” ‘ 6 E m i l F i s c h e r , 1 9 0 5 O v e r t h e l a s t y e a r s , d u e t o t h e e x p l o s i v e s u c c e s s o f t h e g e n o m e - s e q u e n c i n g p r o j e c t s , u n d e r s t a n d i n g t h e m o l e c u l a r b a s i s o f t h e n u m e r o u s a n d i n t r i c a t e b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s o f p r o t e i n s h a s e m e r g e d a s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t o b j e c t i v e s o f b i o c h e m i c a l r e s e a r c h . H u n d r e d s o f t h o u s a n d s o f n e w p r o t e i n s h a v e b e e n r e v e a l e d , a l b e i t o n l y a s p r e d i c t e d s e q u e n c e d a t a , a n d t h e c h a l l e n g e n o w i s t o b e a b l e t o p r e d i c t a n d c o n t r o l t h e i r a c t i v i t i e s . M o s t s t u d i e s o f t h e m o l e c u l a r b a s i s o f p r o t e i n a c t i o n h a v e b e e n c a r r i e d o u t b y r e c o m b i n a n t D N A - b a s e d e x p r e s s i o n o f p r o t e i n s i n g e n e t i c a l l y e n g i n e e r e d c e l l s . 1 7 T h i s p o w e r f u l t e c h n i q u e h a s r e v o l u t i o n i z e d t h e s t u d y o f p r o t e i n s b y e n a b l i n g t h e p r o d u c t i o n o f l a r g e a m o u n t s o f p r o t e i n s o f d e f i n e d m o l e c u l a r c o m p o s i t i o n a n d b y a l l o w i n g t h e s y s t e m a t i c v a r i a t i o n o f t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e . 1 8 H o w e v e r , t h e r e a r e c e r t a i n l i m i t a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h t h i s m e t h o d i n v o l v i n g t h e s i z e a n d t h e f u n c t i o n o f t h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n s . 1 9 I n a d d i t i o n , s i n c e t h e c e l l i s u s e d a s a p r o t e i n f a c t o r y , s u c h s t u d i e s h a v e b e e n l i m i t e d t o t h e 2 0 g e n e t i c a l l y e n c o d e d a m i n o a c i d s . T h e l a t t e r o b s t a c l e h a s b e e n r e c e n t l y a d d r e s s e d i n p i o n e e r i n g w o r k l e d b y S c h u l t z a n d o t h e r s , ” 2 7 b u t i n c o r p o r a t i n g u n n a t u r a l a m i n o a c i d s i n t o p r o t e i n s i s s t i l l n o t a t r i v i a l t a s k . 2 0 9 C h e m i c a l s y n t h e s i s h a s a l w a y s b e e n c o n s i d e r e d a n a t t r a c t i v e a l t e r n a t i v e t o b i o l o g i c a l m e t h o d s f o r p r o t e i n p r o d u c t i o n . T h e u s e o f s y n t h e t i c c h e m i s t r y p r o m i s e s t h e u n l i m i t e d v a r i a t i o n o f t h e c o v a l e n t s t r u c t u r e o f a p o l y p e p t i d e c h a i n w i t h t h e o b j e c t i v e o f u n d e r s t a n d i n g t h e m o l e c u l a r b a s i s o f p r o t e i n f u n c t i o n . T o t a l c h e m i c a l s y n t h e s i s o f n a t i v e p r o t e i n s h a s m a d e a n u m b e r o f i m p o r t a n t c o n t r i b u t i o n s t o b i o m e d i c a l r e s e a r c h , a s n o t e d i n t h e w o r k o f K e n t a n d o t h e r s . ” 3 1 H o w e v e r , d u e t o t h e s i z e a n d t h e c o m p l e x i t y o f t h e t a r g e t m o l e c u l e s , a p p l y i n g c h e m i c a l p r o t o c o l s f o r p o l y p e p t i d e s y n t h e s i s i s a v e r y c h a l l e n g i n g t a s k . I n r e c e n t y e a r s , t h e a p p r o a c h f o l l o w e d i n v o l v e s t h e s y n t h e s i s o f a c t i v e p r o t e i n s b y s t i t c h i n g v a r i o u s s y n t h e t i c p e p t i d e s t o g e t h e r , a m e t h o d r e f e r r e d t o a s c h e m i c a l l i g a t i o n . A c c o r d i n g t o t h e e s t a b l i s h e d p r o t o c o l s , p r o t e i n s c a n b e m a d e i n h i g h y i e l d a n d g o o d p u r i t y f r o m u n p r o t e c t e d p e p t i d e b u i l d i n g b l o c k s , a l l o w i n g f o r t h e i n c o r p o r a t i o n o f u n n a t u r a l s e g m e n t s , e s s e n t i a l f o r t h e s t u d y o f p r o t e i n s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n . 3 2 T h e 3 3 ' ” r e s u l t e d i n a o r i g i n a l l i g a t i o n c h e m i s t r i e s , a s d e v e l o p e d b y K e n t a n d c o w o r k e r s , n o n p e p t i d e b o n d ( o x i m e , t h i a z o l i n e ) a t t h e s i t e o f l i g a t i o n , a n d a l t h o u g h t h e s e u n n a t u r a l s t r u c t u r e s w e r e o f t e n w e l l t o l e r a t e d , t r i a l s f o r t h e f o r m a t i o n o f a n a t i v e p e p t i d e b o n d w e r e p e r s i s t i n g . T h e fi r s t c a s e o f n a t i v e c h e m i c a l l i g a t i o n w a s r e p o r t e d b y M u i r a n d K e n t i n 1 9 9 4 , 3 6 a n d s i n c e t h e n a s e r i e s o f c h e m i c a l l y a n d e n z y m a t i c a l l y a c t i v e p r o t e i n s h a v e b e e n m a d e f o l l o w i n g d i f f e r e n t v a r i a t i o n s o f t h e s a m e c e n t r a l i d e a . 3 2 A c c o r d i n g t o t h e n a t i v e c h e m i c a l l i g a t i o n m e t h o d , l i g a t i o n o c c u r s a t a u n i q u e N - t e r m i n a l C y s r e s i d u e , n o m a t t e r h o w m a n y a d d i t i o n a l i n t e r n a l C y s r e s i d u e s a r e p r e s e n t i n e i t h e r s e g m e n t . T h e s i d e c h a i n o f t h e N - t e r m i n u s C y s r e s i d u e i s r e s p o n s i b l e f o r t h e f o r m a t i o n o f a t h i o e s t e r - l i n k e d p r o d u c t t h a t u n d e r g o e s s p o n t a n e o u s r e a r r a n g e m e n t , v i a a n 2 1 0 i r r e v e r s i b l e i n t r a m o l e c u l a r n u c l e o p h i l i c a t t a c k o f t h e C y s a m i n e n i t r o g e n , t o g i v e t h e d e s i r e d a m i d e - l i n k e d p r o d u c t . T h e r e s u l t i s a c o m p l e t e l y n a t i v e p o l y p e p t i d e c h a i n t h a t i s o b t a i n e d d i r e c t l y i n f i n a l f o r m . M o r e r e c e n t l y , t h i s l a t t e r a p p r o a c h h a s b e e n e x t e n d e d b y u s i n g s e l f s p l i c i n g p r o t e i n s a s a m e d i a t o r f o r t h e f o r m a t i o n o f a n a t i v e a m i d e b o n d f o r t h e s y n t h e s i s o f p r o t e i n s . P r o t e i n s p l i c i n g i s a p o s t - t r a n s l a t i o n a l p r o c e s s i n v o l v i n g t h e p r e c i s e e x c i s i o n o f a n i n t e r n a l p r o t e i n s e g m e n t , c a l l e d i n t e i n , f r o m t h e p r i m a r y t r a n s l a t i o n a l p r o d u c t w i t h c o n c o m i t a n t l i g a t i o n o f t h e fl a n k i n g s e q u e n c e s , t h e e x t e i n s . 3 7 ' 3 9 I n t e i n - m e d i a t e d p r o t e i n s p l i c i n g h a s b e e n s h o w n t o p r o c e e d v i a i n t e i n - m e d i a t e d f o r m a t i o n o f t h i o e s t e r - l i n k e d i n t e r m e d i a t e s , f o l l o w e d b y n u c l e o p h i l i c a t t a c k t o f o r m t h e fi n a l a r r r i d e - l i n k e d s p l i c e d p o l y p e p t i d e , v e r y s i m i l a r t o t h e n a t i v e c h e m i c a l l i g a t i o n . H o w e v e r , i n t h e i n t e i n c a s e , t h e s p e c i f i c c o n f o r m a t i o n o f t h e p r o t e i n d i c t a t e s t h e p r e c i s e s i t e o f l i g a t i o n o f t h e N - a n d C - e x t e i n s . B y c o n t r a s t , i n n a t i v e c h e m i c a l l i g a t i o n , i n i t i a l r e a c t i o n p r o d u c t s m a y i n v o l v e e v e r y t h i o l f u n c t i o n a l i t y i n t h e r e a c t i n g p e p t i d e s e g m e n t s . U t i l i z i n g s i m i l a r f e a t u r e s , i n t e i n - m e d i a t e d s p l i c i n g h a s b e e n u s e d f o r a p p l y i n g t h e n a t i v e c h e m i c a l l i g a t i o n m e t h o d o l o g y , 4 0 a s p r e s e n t e d i n F i g u r e 4 - 2 . A c c o r d i n g t o w h a t i s c a l l e d a s e r n i - e x p r e s s e d i n t e i n m e d i a t e d c h e m i c a l l i g a t i o n , t h e g e n e o f a t a r g e t p e p t i d e i s c l o n e d i n a n i n t e i n - c o n t a i n i n g v e c t o r a n d e x p r e s s e d a s a r e c o m b i n a n t p r o t e i n . T h e e x p r e s s e d p r o t e i n c o n t a i n s , i n a d d i t i o n , a n a f fi n i t y t a g , i . e . a c h i t i n b i n d i n g d o m a i n ( C B D ) , t h a t s i m p l i f i e s t h e p u r i f i c a t i o n , m a i n t a i n i n g t h e d e s i r e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n b o u n d t o a n a p p r o p r i a t e r e s i n ( i . e . c h i t i n b e a d s ) . W h i l e s t i l l o n c o l u m n , i n t r o d u c t i o n o f a s e c o n d , s y n t h e t i c p e p t i d e , b e a r i n g a C y s r e s i d u e a t t h e N - t e r m i n u s , l e a d s t o t r a n s - t h i o e s t e r i f i c a t i o n , f a c i l i t a t e d b y t h e i n t e i n c o n f o r m a t i o n , t h a t 2 1 1 C l o n e t a r g e t g e n e i n t o I n t e i n - v e c t o r e x p r e s s i n E . c o l i c o n t a m i n a n t s a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y ' 1 N _ \ , . C h i t i n - ‘ B e a d s t r a n s e s t e r i fi c a t i o n k s y n t h e t i c p e p t i d e 0 N — r R e c o m b i n a n t P r o t e i n E m i r a t e - 2 1 “ n u s - 8 * . s i n — i < S . : H S C h i t i n B e a d s N — l : r L E I ' W W m a fl q l ‘ a ‘ r l a ' m w ’ m S e m i - S y n t h e t i c P r o t e i n F i g u r e 4 - 2 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e I n t e i n - m e d i a t e d n a t i v e c h e m i c a l l i g a t i o n p r o c e s s . 2 1 2 e v e n t u a l l y r e s u l t s i n e l u t i o n o f t h e s e m i - s y n t h e t i c p r o t e i n , w h i l e t h e i n t e i n p a r t r e m a i n s b o u n d o n t h e a f fi n i t y c o l u m n ( F i g u r e 4 - 2 ) . T h i s m e t h o d w o u l d a l l o w f o r t h e i n c o r p o r a t i o n o f a n y u n n a t u r a l o r l a b e l e d a m i n o a c i d i n t h e p a r t o f t h e p r o t e i n o r i g i n a t i n g f r o m t h e s y n t h e t i c p e p t i d e , a n d t h u s c o u l d b e u s e d f o r a v a r i e t y o f a p p l i c a t i o n s . C R A B P I I c o n t a i n s a C y s r e s i d u e a t p o s i t i o n 1 3 0 t h a t i s p e r f e c t l y s u i t e d f o r N - t e r r n i n u s l i g a t i o n s i n c e t h e l a b e l e d L y s l 3 2 c a n b e a c c o m m o d a t e d i n a c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d p e p t i d e . T h e r e f o r e , t h e s e m i — e x p r e s s e d i n t e i n m e d i a t e d c h e m i c a l l i g a t i o n c a n a l l o w u s t o c o m b i n e t h e e x p r e s s e d f u s i o n p r o t e i n o f i n t e i n - C R A B P I I ( 1 - 1 2 9 ) w i t h a n s y n t h e t i c p e p t i d e c o n s i s t i n g o f t h e r e m a i n i n g 1 6 a m i n o a c i d s ( H i s - t a g p r o t e i n ) t o c o m p l e t e t h e C R A B P H s e q u e n c e , w h i c h , a f t e r i n t e i n s p l i c i n g s h o u l d a f f o r d t h e w h o l e C R A B P H p r o t e i n ( F i g u r e 4 - 3 ) . T h e a c t u a l s y s t e m u s e d w a s t h e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e I M P A C T T M - C N S y s t e m ( I n t e i n M e d i a t e d P u r i f i c a t i o n w i t h a n A f fi n i t y C h i t i n - b i n d i n g T a g , N e w E n g l a n d 4 1 - 4 3 B i o l a b s ) . I M P A C T s y s t e m s h a v e b e e n r e p e a t e d l y u s e d i n t h e l i t e r a t u r e , g i v i n g g o o d r e s u l t s f o r p r o t e i n s u p t o ~ 8 0 k D a . T h e v e c t o r u s e d ( p T X B 3 ) c o n t a i n s a n e n g i n e e r e d m i n i - i n t e i n ( 1 9 8 r e s i d u e s ) f r o m t h e g y r A g e n e o f M y c o b a c t e r i u m x e n o p i , a n d i s d e s i g n e d f o r f u s i n g t h e C - t e r m i n u s o f a t a r g e t p r o t e i n ( i n o u r c a s e C R A B P H - V 1 2 9 ) t o t h e M x e i n t e i n - C h i t i n B i n d i n g D o m a i n t a g f o r p r o t e i n p u r i fi c a t i o n a n d g e n e r a t i o n o f C - t e r m i n a l t h i o e s t e r t a g g e d p r o t e i n s f o r p r o t e i n l i g a t i o n . A s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d , t h e d e s i r e d p r o t e i n c a n b e e x p r e s s e d a s a n i n t e i n f u s e d p r o t e i n , h a v i n g a c h i t i n b i n d i n g d o m a i n a t t h e C - t e r m i n u s ( F i g u r e 4 - 3 ) . T h i s o v e r e x p r e s s e d f u s i o n p r o t e i n w h e n l o a d e d o n a c h i t i n c o l u m n s e l e c t i v e l y b i n d s , a n d i s t h e r e f o r e s e p a r a t e d f r o m t h e r e s t o f t h e b a c t e r i a l p r o t e i n s . T h e c o l u m n c a n t h e n b e t r e a t e d w i t h t h i o p h e n o l ( o r 2 - m e r c a p t o e t h a n e s u l f o n i c a c i d ( M E S N A ) 2 1 3 é C R A B P I I ( 1 - 1 2 8 ) " " " “ " " V E I I ( 1 2 9 ) ” W E W C Y S U 3 0 ) " ~ W 1 5 N - L y s ( 1 3 2 ) W G l u ( 1 3 7 ) < — E . c o l i e x p r e s s e d p r o t e i n — > < — C h e m i c a l l y S y n t h e s i z e d P e p t i d e — > S H a l fi g N \ < c y s C R A B P I I - i n t e i n f u s i o n p r o t e i n N S a c y \ i C R A B : : 1 - 1 2 8 ) I o p s r e a r r a n g e m e n t o n j . 1 % C R A B P I I ( 1 - 1 2 8 ) H u m m e r : i i 1 1 m m 0 H O C R A B P I I ( 1 - 1 2 8 ) ” é 0 ” H 8 1 D T T i n d u c e d o n - O H c o l u m n c l e a v a g e s 1 5 n g H Z N J W A T L B m a m - g 1 5 N - 1 3 2 K l a b e l e d \ 0 o s y n t h e t i c p e p t i d e f ‘ C R A B P I I ( 1 - 1 2 8 ) ‘ 3 fl o n t a n e o u s r e a q r r a n g e m e n t C R A B P I I E C R A B P I I ( 1 - 1 2 8 ) { 4 1 1 0 3 1 - 1 3 1 1 g S e m i - s y n t h e t i c C R A B P I I - ‘ 5 N - L y s 1 3 2 F i g u r e 4 - 3 . F o r m a t i o n o f 1 5 N - L y s 1 3 2 C R A B P I I v i a I n t e i n M e d i a t e d C h e m i c a l L i g a t i o n 2 1 4 o r N - m e t h y l m e r c a p t o a c e t a m i d e ( N M A ) ) t o i n d u c e t h e p r o t e i n s p l i c i n g a n d t h e n t h e s y n t h e t i c p e p t i d e c a n b e a d d e d a n d t h e n e w l y f o r m e d p r o t e i n c a n e l u t e f r o m t h e c o l u m n . A s d i s c u s s e d i n t h e p r e v i o u s c h a p t e r s i n o r d e r t o o p t i m i z e t h e r e t i n a l b i n d i n g a s a p r o t o n a t e d S c h i f f b a s e ( P S B ) , s e v e r a l m u t a t i o n s o f C R A B P H w e r e c a r r i e d o u t w i t h i n t h e f i r s t 1 2 9 a m i n o a c i d s o f C R A B P H . I n f a c t , t h e b e s t p r o t e i n t o d a t e , t h e R 1 3 2 K : : R 1 1 1 L : : L 1 2 1 E t r i p l e m u t a n t , c o n t a i n s t w o m u t a t i o n s w i t h i n t h e f i r s t 1 3 0 a m i n o a c i d s t h a t a r e p r o v e n e s s e n t i a l f o r t h e P S B f o r m a t i o n . T h e r e f o r e , o n e w o u l d e x p e c t t h a t t h e g e n e o f C R A B P H ( 1 - 2 9 , R 1 1 1 L : L 1 2 1 E ) w o u l d b e t h e o b v i o u s C h o i c e f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n . H o w e v e r , w h e n o u r e f f o r t s t o u t i l i z e t h e n a t i v e c h e m i c a l l i g a t i o n m e t h o d b e g a n , d o u b l e m u t a n t R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F w a s t h e m o s t p r o m i s i n g p r o t e i n i n h a n d . T h e r e f o r e , t h e n a t i v e C R A B P I I ( 1 - 1 2 9 ) g e n e w a s u s e d f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n , k e e p i n g i n m i n d t h a t i f t h e p r o c e s s w a s s u c c e s s f u l , i t c o u l d t h e n b e r e p e a t e d f o r a n y d e s i r e d m u t a n t , w i t h o u t a n t i c i p a t i n g s i g n i fi c a n t a d d i t i o n a l p r o b l e m s . T h e C l o n i n g o f t h e C R A B P H ( l - 1 2 9 ) g e n e i n t o t h e p T X B 3 v e c t o r r e q u i r e d t h e p r e s e n c e o f N c o I a n d S a p ] r e s t r i c t i o n e n z y m e c u t s i t e s . p E T - B l u e 2 , a l r e a d y i n c l u d e d t h e N c o I r e c o g n i t i o n s e q u e n c e , w h i l e t h e S a p I c u t s i t e w a s i n t r o d u c e d t o t h e C - t e r m i n u s o f C R A B P I I ( 1 - 1 2 9 ) g e n e b y P C R . T h e p r o d u c t , a l o n g w i t h t h e p T X B 3 v e c t o r , w e r e d i g e s t e d w i t h b o t h N c o I a n d S a p I a n d t h e l i n e a r D N A w a s p u r i fi e d f r o m a g a r o s e g e l u s i n g t h e G e n e C l e a n p r o t o c o l . T h e t w o p a r t s , C R A B P I I ( 1 - l 2 9 ) a n d p T X B 3 w e r e c o m b i n e d i n a m o l a r r a t i o o f g e n e / v e c t o r : 1 5 / 1 , i n t h e p r e s e n c e o f T 4 l i g a s e , a t 1 6 ° C f o r 2 4 h , t r a n s f o r m e d i n t o b a c t e r i a a n d a m p l i f i e d t o a f f o r d t h e l i g a t i o n p r o d u c t . 2 1 5 T h e r e c o m b i n a n t D N A ( p T X B 3 - C R A B P I I ( 1 - 1 2 9 ) ) w a s c o n f i r m e d b y s e q u e n c i n g a n d t h e g e n e w a s o r i g i n a l l y t r a n s f o r m e d i n t o E R 2 5 6 6 c e l l s , a s t r a i n p r o v i d e d w i t h t h e v e c t o r a n d s u g g e s t e d f o r u s e . T h e p r o t e i n e x p r e s s i o n w a s p e r f o r m e d a t t w o d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s , 1 5 ° C a n d 3 2 ° C . T h e b a n d e x p e c t e d f o r t h e C R A B P I I ( 1 - 1 2 9 ) - I n t e i n f u s i o n p r o t e i n s h o u l d s h o w a t ~ 4 3 k D a ( 3 2 7 a m i n o a c i d s t o t a l ) a n d , i n d e e d , a s s h o w n o n g e l i n F i g u r e 4 - 4 a n d s u m m a r i z e d i n T a b l e 4 - 1 , u n d e r a l l c o n d i t i o n s t h e d e s i r e d p r o t e i n b a n d w a s p r e s e n t . H o w e v e r , e x t r a c t i n g t h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n o u t o f t h e c e l l m a s s w a s p r o b l e m a t i c . T a b l e 4 - 1 . E x p r e s s i o n o f C R A B P I I ( 1 - 1 2 9 ) - I n t e i n f u s i o n p r o t e i n u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s . C e l l S t r a i n I n d u c t i o n C o n d i t i o n s E x p r e s s i o n E R 2 5 6 6 3 2 ° C , 6 h B a n d ~ 4 3 , 0 0 0 D a E R 2 5 6 6 1 5 ° C , o v e r n i g h t B a n d ~ 4 3 , 0 0 0 D a T u n e r 1 5 ° C , o v e r n i g h t B a n d ~ 4 3 , 0 0 0 D a D u e t o t h e n a t u r e o f t h e s y s t e m , l y s o z y m e i s n o t r e c o m m e n d e d f o r t h e c e l l l y s i s , s i n c e i t d i g e s t s t h e c h i t i n b e a d s u s e d i n t h e n e x t p u r i fi c a t i o n s t e p . A l t e r n a t i v e l y , w h e n s o n i c a t i o n w a s u s e d f o r t h e c e l l l y s i s , t h e r e s u l t s w e r e n o t v e r y e n c o u r a g i n g e i t h e r ( F i g u r e 4 - 4 ) . M o s t o f t h e p r o t e i n w a s s t i l l l e f t i n t h e p e l l e t w h i l e a v e r y s m a l l a m o u n t w a s T a b l e 4 - 2 . A t t e m p t s t o i s o l a t e t h e C R A B P I I ( 1 - 1 2 9 ) - l n t e i n f u s i o n p r o t e i n . B u f f e r E x t r a c t P e l l e t L y s i s B u f f e r 3 w a s h e s , l i t t l e f u s i o n p r o t e i n m o s t f u s i o n p r o t e i n B u g B u s t e r S o m e f u s i o n p r o t e i n m o s t f u s i o n p r o t e i n L y s i s B u f f e r + 0 . 1 % T r i t o n X 1 0 0 l i t t l e f u s i o n p r o t e i n m o s t f u s i o n p r o t e i n L y s i s B u f f e r + 6 M U r e a l i t t l e f u s i o n p r o t e i n m o s t f u s i o n p r o t e i n L y s i s B u f f e r : ( 2 0 m M N a H z P O 4 , 5 0 0 m M N a C l , p H = 8 . 0 ) 2 1 6 e x t r a c t e d i n t o t h e L y s i s B u fi ' e r s o l u t i o n . T h e s e v e r a l s o l u t i o n s s u g g e s t e d a n d f o l l o w e d a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 4 - 2 a n d i n c l u d e t h e u s e o f t h e B u g B u s t e r s o l u t i o n ( N o v a g e n ) a s w e l l a s u s e o f d e t e r g e n t s ( T r i t o n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 6 6 , 0 0 0 — D 4 5 , 0 0 0 3 6 , 0 0 0 2 9 , 0 0 0 2 0 , 0 0 0 1 4 , 2 0 0 6 . 5 0 0 F i g u r e 4 - 4 . 1 . M a r k e r ; 2 . C r u d e 3 2 ° C , i n d u c e d ; 3 . 3 2 ° C , 1 s t e x t r a c t w i t h l y s i s b u f f e r ; 4 . 3 2 ° C , p e l l e t a f t e r 2 n d e x t r a c t i o n ; 5 . 3 2 ° C , 2 n d e x t r a c t i o n ; 6 . 3 2 ° C , p e l l e t a f t e r B u g B u s t e r e x t r a c t i o n ; 7 . 3 2 ° C , B u g B u s t e r E x t r a c t ; 8 . M a r k e r ; 9 . C r u d e , 1 5 ° C , i n d u c e d ; 1 0 . 1 5 ° C , p e l l e t a f t e r e x t r a c t i o n w i t h l y s i s b u f f e r ; 1 1 . 1 5 ° C , e x t r a c t w i t h l y s i s b u f f e r ; 1 2 . 1 5 ° C , p e l l e t a f t e r B u g B u s t e r e x t r a c t i o n ; 1 3 . 1 5 ° C . B u g B u s t e r e x t r a c t ; 1 4 . M a r k e r X 1 0 0 ) a n d c h a o t r o p i c a g e n t s ( u r e a ) , w h i c h a r e k n o w n t o i m p r o v e p r o t e i n s o l u b i l i t y . F r o m a l l t h e a b o v e , t h e B u g B u s t e r r e a g e n t s e e m e d t o w o r k t h e b e s t e s p e c i a l l y w h e n t h e 1 5 ° C e x p r e s s i o n w a s u s e d ( F i g u r e 4 - 4 , l a n e 1 3 ) . E v e n w h e n a n o t h e r k i n d o f c o m p e t e n t c e l l s w a s u s e d ( T u n e r c e l l s ) f o r t h e e x p r e s s i o n , n o c h a n g e i n t h e p r o t e i n b e h a v i o r w a s o b s e r v e d . T h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n a p p e a r s t o f o l d i n t o i n c l u s i o n b o d i e s , a r e o c c u r r i n g p r o b l e m w i t h t h e i n t e i n - m e d i a t e d c h e m i c a l l i g a t i o n s y s t e m s . T h e r e f o r e , a d i f f e r e n t a p p r o a c h h a d t o b e f o l l o w e d . 2 1 7 A c c o r d i n g t o t h e l i t e r a t u r e , o n e w a y t o p r e v e n t t h e m i s f o l d i n g o f p r o t e i n s i n t o i n c l u s i o n b o d i e s i s b y r e d u c i n g t h e e x p r e s s i o n t e m p e r a t u r e a f t e r i n d u c t i o n . H o w e v e r , i n o u r c a s e , e x p r e s s i o n a t 1 5 ° C d i d n o t s e e m t o m a k e a d i f f e r e n c e . A t t h e s a m e t i m e , i t h a s b e e n o b s e r v e d t h a t r e d u c i n g t h e a m o u n t o f l P T G u s e d f o r i n d u c t i o n , f r o m t h e u s u a l 1 m M t o 0 . 2 m M o r l e s s , c a n r e s u l t i n b e t t e r p r o t e i n f o l d i n g . I n a d d i t i o n , a r e c e n t r e f e r e n c e s u g g e s t e d t h a t c o o l i n g d o w n t h e e x p r e s s i o n fl a s k s o n i c e b e f o r e i n d u c t i o n a c t u a l l y 4 4 H o w e v e r , n o n e o f t h e s e m o d i fi c a t i o n w a s p r e v e n t s t h e f o r m a t i o n o f i n c l u s i o n b o d i e s . e f f e c t i v e f o r o u r s y s t e m . A t t h e s a m e t i m e , t h r o u g h p e r s o n a l c o r r e s p o n d e n c e ( D e b o r a h S t o n e r - M a , S U N Y S t o n y B r o o k S t a t e U n i v e r s i t y o f N e w Y o r k ; I z a b e l a G i r i a t , R o c k e f e l l e r U n i v e r s i t y ) w e c a m e a c r o s s a p r o t o c o l u s e d i n M u i r ’ s g r o u p o n h o w t o d e a l w i t h t h e i n c l u s i o n b o d i e s p r o b l e m . T h e p r o t o c o l , a s d e s c r i b e d i n d e t a i l i n t h e e x p e r i m e n t a l p a r t , u t i l i z e s b u f f e r 1 2 3 4 5 6 7 8 9 6 6 , 0 0 0 4 5 , 0 0 0 3 6 , 0 0 0 2 9 , 0 0 0 2 0 , 0 0 0 1 4 , 2 0 0 F i g u r e 4 - 5 . P r o t e i n G e l . 1 . M a r k e r ; 2 . D i a l y s i s s u p e r n a t a n t l o a d e d o n C h i t i n B e a d s ; 3 , 4 . C h i t i n b e a d s a f t e r l o a d i n g ; 5 , 6 . C h i t i n b e a d s d i g e s t e d w i t h 1 0 m M D T T ; 7 . 1 s t fl o w t h r o u g h ; 8 . 2 n d fl o w t h r o u g h ; 9 . W a s h . 2 1 8 w i t h 1 % T r i t o n X - 1 0 0 t o w a s h t h e i n c l u s i o n b o d i e s f r o m c o n t a m i n a t i o n f r o m o t h e r s o l u b l e p r o t e i n s . I n t h e n e x t s t e p , t h e p e l l e t c o n t a i n i n g t h e i n c l u s i o n b o d i e s o f t h e d e s i r e d p r o t e i n i s r e s u s p e n d e d i n t h e p r e s e n c e o f 6 M u r e a . U n d e r t h e u s e o f t h i s c h a o t r o p i c a g e n t t h e f u s i o n p r o t e i n d e n a t u r e s a n d t h e r e f o r e , d i s s o l v e s i n t o t h e w o r k i n g b u f f e r . T h i s u r e a c o n t a i n i n g p r o t e i n s o l u t i o n w a s t h e n d i a l y z e d a g a i n s t b u f f e r w i t h 1 % T r i t o n X - 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 6 6 , 0 0 0 4 5 , 0 0 0 3 6 , 0 0 0 2 9 , 0 0 0 2 0 , 0 0 0 1 4 , 2 0 0 F i g u r e 4 - 6 . P r o t e i n G e l . 1 . M a r k e r ; 2 . D i a l y s i s c r u d e ; 3 . D i a l y s i s s u p e r n a t a n t ; 4 . C h i t i n b e a d s a f t e r l o a d i n g ; 5 , 1 0 . C h i t i n b e a d s d i g e s t e d w i t h 1 0 m M D T T ; 6 . C h i t i n b e a d s + M E S N A , s o l u t i o n ; 7 . 1 1 . C h i t i n b e a d s + M E S N A ; 8 . I n t e i n e x p r e s s e d . c r u d e ; 9 . M a r k e r . C R A B P I I . o v e r a t l e a s t 2 4 h , c h a n g i n g t h e d i a l y s i s b u f f e r f r e q u e n t l y . A fi e r d i a l y s i s , t h e m i x t u r e w a s s p u n d o w n a n d t h e p r e c i p i t a t e w a s r e m o v e d . A c c o r d i n g t o t h e e l e c t r o p h o r e s i s g e l s ( F i g u r e 4 - 5 , 4 - 6 ) , t h e r e i s a g o o d a m o u n t o f t h e d e s i r e d p r o t e i n p r e s e n t i n t h e d i a l y s i s s u p e r n a t a n t t h a t c a n b e d i r e c t l y l o a d e d o n t o t h e c h i t i n b e a d s t o c h e c k f o r b i n d i n g ( e v e n i f a s m a l l a m o u n t o f u r e a i s l e f t a t t h i s s t a g e i t s h o u l d n o t b e a p r o b l e m , s i n c e w e k n o w t h a t t h e C h i t i n b e a d s c a n t o l e r a t e u p t o 4 M u r e a ) . G r a t i f y i n g l y , a s c a n b e s e e n i n F i g u r e s 4 - 5 , 4 - 6 t h e r e i s a n e x c e l l e n t e x c l u s i v e b i n d i n g o f 2 1 9 1 ' { . t h e d e s i r e d p r o t e i n t o t h e c h i t i n b e a d s . A s a m a t t e r o f f a c t , t h e a m o u n t o f s o l u b l e d e s i r e d p r o t e i n p r e s e n t s e e m s t o e x c e e d t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f t h e c h i t i n c o l u m n s i n c e t o o m u c h o f i t i s w a s h e d o f f w i t h t h e fl o w t h r o u g h ( F i g u r e 4 - 5 , l a n e s 7 , 8 ) . I t a p p e a r s t h a t t h e l a t t e r p r o t o c o l c a n g u a r a n t e e t h e p r e s e n c e o f a s o l u b l e f o r m o f t h e d e s i r e d f u s i o n p r o t e i n . H o w e v e r , i n o r d e r t o a c h i e v e t h i s , t h e p r o t e i n h a d t o b e d e n a t u r e d a n d r e f o l d e d t h r o u g h d i a l y s i s . T h e r e f o r e , w e h a d t o m a k e s u r e t h a t t h e r e f o l d i n g p r o c e s s w a s s u c c e s s f u l . I f t h e t e r t i a r y s t r u c t u r e o f t h e i n t e i n i s n o t c o r r e c t , t h e e s s e n t i a l t h i o l i n d u c e d s e l f c l e a v a g e w o u l d n o t t a k e p l a c e . I n o r d e r t o c h e c k t h e a b o v e , a s m a l l p a r t o f t h e c h i t i n b e a d s w a s r e m o v e d f r o m t h e c o l u m n a n d w a s i n c u b a t e d o v e r n i g h t i n t h e p r e s e n c e o f 1 m M D T T . T h e r e s u l t i n g m i x t u r e w a s c h e c k e d w i t h S D S - P A G E g e l ( F i g u r e s 4 - 5 , 4 - 6 ) r e v e a l i n g t h e p r e s e n c e o f a n e w p r o t e i n b a n d , a t a r o u n d 1 5 K D a , t h a t c a n b e a t t r i b u t e d t o t h e C R A B P I I ( 1 - 1 2 9 ) p r o t e i n . A t t h e s a m e t i m e , t h e r e i s a n o t h e r n e w p r o t e i n b a n d , o f a l m o s t e q u a l i n t e n s i t y , p r e s e n t o n t h e g e l , a t ~ 2 9 K D a , w h i c h w e b e l i e v e i s t h e i n t e i n m o i e t y a f t e r t h e C l e a v a g e o f t h e f u s i o n p r o t e i n . T o v e r i f y t h i s s u g g e s t i o n , t h e M x e G y r A p r o t e i n ( I n t e i n w i t h o u t C R A B P I I ) w a s e x p r e s s e d a n d t h e c r u d e l y s a t e w a s c o m p a r e d w i t h t h e c l e a v a g e r e s u l t s . T h e m a i n b a n d e x h i b i t s a m o l e c u l a r w e i g h t o f ~ 2 9 K D a , i s i n e x c e l l e n t a g r e e m e n t w i t h t h e b a n d w e a s s i g n e d a s t h e i n t e i n a f t e r t h e D T T c l e a v a g e ( s e e F i g u r e 4 - 5 , l a n e s 5 , 6 ) . A l t h o u g h s o m e o f t h e i n t e i n m o i e t y i s a c t i v e a c c o r d i n g t o t h e l a t t e r r e s u l t s , i t c o n s t i t u t e s o n l y a s m a l l a m o u n t o f t h e p r o t e i n b o u n d o n t h e C h i t i n b e a d s . A s c a n b e s e e n f r o m t h e g e l s , m o s t o f t h e f u s i o n p r o t e i n r e m a i n s a s i t w a s , a m o l e c u l a r w e i g h t o f ~ 4 3 K D a , i n d i c a t i n g t h a t n o t a l l t h e i n t e i n r e f o l d e d c o r r e c t l y d u r i n g t h e d i a l y s i s . A t t h i s p o i n t , t h e r e a r e s e v e r a l c o n d i t i o n s t h a t c a n b e t r i e d i n o r d e r t o o p t i m i z e t h e a m o u n t o f a c t i v e 2 2 0 ' u h u L ‘ . - . ‘ l “ w a v e g u g . - 1 . . . . i n t e i n p r e s e n t . F o r e x a m p l e , a l o n g e r d i a l y s i s p e r i o d a s w e l l a s t h e u s e o f l e s s t h a n 6 M u r e a f o r t h e i n c l u s i o n b o d i e s d i s r u p t i o n w o u l d p r o b a b l y h e l p t h e a c t i v i t y o f t h e i n t e i n . A l s o , u s e o f a n o t h e r m e t h o d o f r e f o l d i n g t h e p r o t e i n b e s i d e s d i a l y s i s , f o r e x a m p l e g r e a t d i l u t i o n i n t o b u f f e r w i t h o u t c h a o t r o p i c a g e n t c o u l d p r o d u c e m o r e a c t i v e f u s i o n p r o t e i n . E v e n t h o u g h t h e c o n d i t i o n s w e r e n o t o p t i m i z e d , s i n c e t h e i n t e i n b o u n d t o t h e C h i t i n c o l u m n w a s a c t i v e t o s o m e e x t e n t , a n a t t e m p t w a s c a r r i e d o u t t o u s e t h e a c t u a l c h e m i c a l l i g a t i o n c l e a v a g e c o n d i t i o n s , t h a t i s t h e u s e o f M E S N A ( 2 - m e r c a p t o e t h a n e s u l f o n i c a c i d ) i n s t e a d o f D T T t o i n d u c e t h e p r o t e i n s p l i c i n g ( t h e u s e o f t h i o l r e a g e n t s s u c h a s M E S N A p r o v i d e s a r e a c t i v e t h i o e s t e r a t t h e C - t e r m i n u s o f t h e t a r g e t p r o t e i n f o r u s e i n i n t e i n m e d i a t e d P r o t e i n L i g a t i o n , w h i l e D T T d o e s n o t ) . T h e l o a d e d C h i t i n c o l u m n w a s i n c u b a t e d w i t h a f r e s h M E S N A s o l u t i o n a n d a f t e r a d a y t h e s p l i c i n g w a s c h e c k e d b y e l e c t r o p h o r e s i s . A s c a n b e s e e n i n F i g u r e 4 - 6 , t h e r e i s s t i l l a t r a c e o f p r o t e i n a t ~ 1 5 K D a p r e s e n t , a l t h o u g h m u c h l e s s a m o u n t t h a n t h a t p r e s e n t u n d e r t h e D ' I T c l e a v a g e . O n e p a r a m e t e r t h a t c o u l d b e c h a n g e d i s t h e u s e o f N M A ( N - m e t h y l m e r c a p t o a c e t a m i d e ) i n s t e a d o f M E S N A w h i c h , a c c o r d i n g t o R a i n e s ’ s t u d y h a s p r o v e n m u c h m o r e e f fi c i e n t . 4 4 T h e a b o v e c o n d i t i o n s h a v e n o t b e e n o p t i m i z e d y e t a n d , t h e r e f o r e , n o fi n a l c o n c l u s i o n s c a n b e m a d e . H o w e v e r , i t s e e m s t h a t t h e a c t u a l c l e a v a g e f o r C h e m i c a l l i g a t i o n c a n b e m o r e c h a l l e n g i n g . T h i s c a n b e d u e t o e i t h e r m i s f o l d e d i n t e i n a f t e r d i a l y s i s o r a n a d d i t i o n a l p a r a m e t e r t h a t w e h a d n o t c o n s i d e r e d s o f a r . A c c o r d i n g t o t h e l i t e r a t u r e , t h e l a s t a m i n o a c i d f u s e d w i t h t h e i n t e i n i s v e r y i m p o r t a n t f o r t h e e f f i c i e n c y o f t h e t h i o l i n d u c e d c l e a v a g e . 4 S I n f a c t , i n a c o m p r e h e n s i v e s t u d y t o e v a l u a t e t h e e f f i c a c y o f t h e t w e n t y a r r r i n o a c i d s a s t h e C - t e r m i n u s r e s i d u e , V a l , r e s i d u e 1 2 9 i n t h e C R A B P H s e q u e n c e , i s o n e o f t h e w o r s t p o s s i b l e c h o i c e s . I n p a r t i c u l a r , 2 2 1 i n m o d e l c a s e s s u c h a s t h a t o f t h e e x p r e s s i o n a n d p u r i fi c a t i o n o f m a l t o s e - b i n d i n g p r o t e i n , i f t h e C - t e r r n i n a l r e s i d u e i s a n A l a , t h e o n c o l u m n c l e a v a g e w i t h D T T o c c u r s a t 7 5 - 1 0 0 % b o t h a t 4 ° C a n d a t 1 6 ° C . B u t , i n t h e c a s e o f a C - t e r r n i n a l V a l , t h e m a x i m u m c l e a v a g e i s 5 0 - 7 4 % , a t 1 6 ° C a n d d r o p s t o 3 0 - 4 9 % a t 4 ° C . I n f a c t , a c c o r d i n g t o t h i s s t u d y , t h e o n l y a m i n o a c i d t h a t c a n b e h a v e w o r s e t h a n V a l a t t h e C - t e r r n i n a l p o s i t i o n i s I l e , i n w h i c h c a s e t h e c l e a v a g e i s n e v e r b e t t e r t h a n 5 0 % . C o n s i d e r i n g t h e e f f e c t o f a d j a c e n t a m i n o a c i d s i t 0 . 3 . 0 . 2 5 — 0 . 2 — A 0 _ 1 5 . 3 9 8 n m 0 . 1 4 4 0 5 n m 0 . 0 5 - 0 l I 2 5 0 3 5 0 4 5 0 n m F i g u r e 4 - 7 . A . U V s p e c t r a o f R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F ( r e d ) a n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : V 1 2 9 A ( b l u e ) m u t a n t i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 2 e q u i v . r e t i n a l ; B . P o s i t i o n o f t h e V 1 2 9 r e s i d u e ( b l u e ) r e l a t i v e t o t h e r e t i n a l b i n d i n g s i t e . a p p e a r e d t h a t c h a n g i n g V a 1 1 2 9 t o A l a 1 2 9 w o u l d b e n e c e s s a r y t o o b t a i n a p r o t e i n c a p a b l e o f e f fi c i e n t s e l f s p l i c i n g . A s c a n b e s e e n i n F i g u r e 4 - 7 8 , V a 1 1 2 9 i s p o s i t i o n e d f a r f r o m t h e r e t i n a l b i n d i n g p o c k e t a n d , a c c o r d i n g t o m o l e c u l a r m o d e l i n g , i t s m u t a t i o n s h o u l d n o t s i g n i fi c a n t l y c h a n g e t h e o v e r a l l s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n . B e f o r e t r y i n g t h e c h e m i c a l l i g a t i o n , t h e n e w m u t a n t , R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F : : V 1 2 9 A w a s f o r m e d , e x p r e s s e d a n d s p e c t r o s c o p i c a l l y e v a l u a t e d a s c o m p a r e d t o t h e c o r r e s p o n d i n g R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F d o u b l e m u t a n t . A s c a n b e s e e n i n F i g u r e 4 - 7 A , t h e U V - v i s s p e c t r a f o r 2 2 2 t h e t w o p r o t e i n s a r e v e r y s i m i l a r , w i t h t h e n e w m u t a n t s l i g h t l y r e d s h i f t e d ( 4 0 5 n m ) . T h i s r e s u l t v e r i fi e s t h a t t h e a d d i t i o n a l V 1 2 9 A m u t a t i o n d o e s n o t c a u s e a n y p r o b l e m w i t h S B f o r m a t i o n a n d i n f a c t i t s e e m s t o i m p r o v e i t s o m e w h a t . T h e c o n d i t i o n s f o r t h e l i g a t i o n o f t h e C R A B P I I ( 1 - V 1 2 9 A ) g e n e i n t o t h e p T X B 3 v e c t o r w e r e v e r y s i m i l a r t o t h o s e d e s c r i b e d b e f o r e . T h e l i g a t e d g e n e w a s c o n fi r m e d b y s e q u e n c i n g a n d w a s t r a n s f o r m e d i n t o b o t h E R 2 5 6 6 a n d T u n e r c e l l s f o r p r o t e i n e x p r e s s i o n . F r o m t h e S D S - P A G E o f t h e c r u d e c e l l e x t r a c t i t i s o b v i o u s t h a t t h e d e s i r e d p r o t e i n ( ~ 4 3 K D a ) i s e x p r e s s e d a s w e l l a s t h e C R A B P H ( 1 - 1 2 9 ) / p T X B 3 o n e . H o w e v e r , e v e n w i t h t h e n e w m u t a t i o n , t h e r e s u l t s w e r e v e r y s i m i l a r t o w h a t p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . T h e s o l u b i l i t y o f t h e n e w r e c o m b i n a n t p r o t e i n w a s n o t i m p r o v e d , a n d n e i t h e r w a s i t s c a p a b i l i t y f o r t h i o l - i n d u c e d c l e a v a g e . A l t h o u g h m o r e t i m e n e e d s t o b e s p e n t o n t h e s e s y s t e m s , a t t h i s p o i n t i t w a s c l e a r t h a t a l t e r n a t i v e s o l u t i o n s s h o u l d b e e x p l o r e d a s w e l l . A s m e n t i o n e d b e f o r e , l i t e r a t u r e r e p o r t s t h a t i n t h e c a s e s o f t h e i n t e i n - m e d i a t e d c h e m i c a l l i g a t i o n t h e r u l e o f t r i a l a n d e r r o r a p p l i e s w h e n i t c o m e s t o c h o o s i n g t h e a p p r o p r i a t e i n t e i n s y s t e m . S o f a r , n o c o m p r e h e n s i v e r u l e s h a v e b e e n e s t a b l i s h e d o n w h i c h i n t e i n w o r k s b e t t e r f o r w h i c h s y s t e m , a n d t h e r e f o r e , t h e s u g g e s t i o n i s t h a t i f a s y s t e m i s p r o b l e m a t i c a d i f f e r e n t i n t e i n - m e d i a t o r s h o u l d b e t r i e d . A s s t a t e d b e f o r e , t h e i n t e i n u s e d s o f a r , p a r t o f v e c t o r p T X B 3 , i s a s m a l l p r o t e i n ( 1 9 8 r e s i d u e s ) a n d , a s e x p l a i n e d a b o v e , i t d o e s n o t a p p e a r t o f o l d c o r r e c t l y w h e n f u s e d w i t h t h e s i m i l a r l y s i z e d C R A B P H p o l y p e p t i d e . W e b e l i e v e d t h a t i f a l a r g e r i n t e i n w a s u s e d , t h e p r o p e r i n t e i n f o l d i n g w o u l d n o t b e a f f e c t e d r e s u l t i n g i n b o t h m o r e s o l u b l e , a n d m o r e a c t i v e r e c o m b i n a n t p r o t e i n . T h e r e f o r e , t h e C R A B P I I ( 1 - V 1 2 9 A ) g e n e w a s c l o n e d i n t o t h e 2 2 3 p T Y B 3 v e c t o r , b e a r i n g a l a r g e r i n t e i n ( 4 5 4 a m i n o a c i d r e s i d u e s ) f r o m t h e S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e V M A l g e n e ( S c e V M A ) . T h e l i g a t i o n c o n d i t i o n s w e r e v e r y s i m i l a r t o w h a t w a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . C R A B P I I ( 1 - V 1 2 9 A ) w a s s u c c e s s f u l l y l i g a t e d i n t o t h e p T Y B 3 v e c t o r , a s c o n f i r m e d b y s e q u e n c i n g ( a c t u a l l i g a t i o n m o l e r a t i o g e n e / v e c t o r : 1 0 / 1 ) a n d t h e g e n e w a s t r a n s f o r m e d a n d e x p r e s s e d i n b o t h E R 2 5 6 6 a n d T u n e r c e l l s , y i e l d i n g t h e c o r r e s p o n d i n g f u s i o n p r o t e i n , a l b e i t n o t i n a v e r y s o l u b l e f o r m . O n l y p r e l i m i n a r y r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d u s i n g t h i s s y s t e m , a n d t h e r e f o r e , n o c o n c l u s i o n s c a n b e d e r i v e d . S i n c e m o r e w o r k n e e d s t o b e d o n e o n t h i s s u b j e c t , a n a d d i t i o n a l s u g g e s t i o n i s t h e u s e o f O r i g a m i c e l l s f o r t h e e x p r e s s i o n o f a l l t h e f u s i o n p r o t e i n s m e n t i o n e d a b o v e . A c c o r d i n g t o t h e l i t e r a t u r e “ t h e s e c e l l s p r o m o t e t h e d i s u l fi d e b o n d f o r m a t i o n ( p r o v i d i n g m u t a t i o n s i n b o t h t h e t h i o r e d o x i n r e d u c t a s e ( t p r ) a n d g l u t a t h i o n e r e d u c t a s e ( g o r ) g e n e s ) w h i l e i n c r e a s i n g p r o t e i n s o l u b i l i t y a n d p e r m i t p r o t e i n f o l d i n g i n b a c t e r i a l c y t o p l a s m . A t t h i s p o i n t , a l t h o u g h s i g n i f i c a n t p r o g r e s s h a s b e e n m a d e t o w a r d s a p p l y i n g t h e i n t e i n - m e d i a t e d n a t i v e C h e m i c a l l i g a t i o n f o r o u r s y s t e m , w e w e r e n o t a b l e t o i s o l a t e e n o u g h t h i o l - a c t i v a t e d C R A B P I I f r a g m e n t t o c o n t i n u e w i t h t h e fi n a l l i g a t i o n s t e p . 4 . 4 O v e r e x p e s s i o n o f C R A B P I I i n l s N - E n r i c h e d M e d i a W h i l e t h e p r o t e i n l i g a t i o n t e c h n i q u e c a n a f f o r d s p e c i f i c a l l y l a b e l e d p r o t e i n s , t h e m e t h o d h a s n o t b e e n y e t o p t i m i z e d f o r o u r e x p r e s s i o n s y s t e m . H o w e v e r , a s p r e v i o u s l y 2 2 4 d e s c r i b e d , a u n i f o r m l y l a b e l e d p r o t e i n c a n b e m o r e e a s i l y o b t a i n e d a n d c a n b e u s e d f o r a s e r i e s o f N M R e x p e r i m e n t s . S p e c i fi c l a b e l i n g o f a l l t h e L y s r e s i d u e s o f C R A B P I I h a s b e e n p r e v i o u s l y r e p o r t e d a s p a r t o f t h e d e t a i l e d N M R s t u d i e s o f t h e C R A B P H s y s t e m . ” 2 T h e e x p r e s s i o n o f t h e p r o t e i n t a k e s p l a c e i n M 9 ( m i n i m u m ) i n s t e a d o f L B m e d i u m , a n d t h e l a b e l e d e - ’ 5 N - L y s i s a d d e d t o t h e m e d i u m 1 0 m i n b e f o r e I P T G i n d u c t i o n . A d d i t i o n o f t h i a m i n e d i d n o t m a k e a d i f f e r e n c e i n t h e e x p r e s s i o n l e v e l s , b u t s e e m e d t o h e l p t h e c e l l g r o w t h ( a d d i t i o n o f t h i a r r r i n e w a s a l l o w e d s i n c e i t d o e s n o t p a r t i c i p a t e i n t h e b i o s y n t h e s i s o f L y s ) . A s w a s e x p l a i n e d i n t h e n a t i v e c h e m i c a l l i g a t i o n c a s e , w h e n t h e l a b e l i n g e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t , t h e R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F d o u b l e m u t a n t w a s c o n s i d e r e d t h e m o s t p r o m i s i n g p r o t e i n f o r r e t i n a l b i n d i n g . T h e r e f o r e , t h a t w a s t h e m u t a n t o f C h o i c e f o r t h e i n i t i a l e x p r e s s i o n o f u n i f o r m l y 1 5 N - L y s l a b e l i n g . T a b l e 4 - 3 . E x p r e s s i o n o f C R A B P I I m u t a n t s i n T u n e r c e l l s , i n M 9 m e d i u m P r o t e i n M e d i u m C o n d i t i o n s Y i e l d ( m g / l ) C R A B P I I - W T M 9 , s t a n d a r d 3 7 ° C , 6 h 3 3 C R A B P I I - R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F M 9 , 0 3 0 ; , t h i a m i n e 3 7 ° C , o v e r n i g h t 1 1 C R A B P I I - R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F ( ’ 5 N ) M 9 , s t a n d a r d 3 7 ° C , o v e r n i g h t 1 2 C R A B P I I - R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F ( ’ S N ) M 9 , C a C l z , t h i a m i n e 3 7 ° C , o v e r n i g h t 3 2 C R A B P I I - R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F ( " ’ N ) M 9 , C a C l z , t h i a m i n e 3 7 ° C , o v e r n i g h t 9 C R A B P I I - R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F ( ’ S N ) M 9 , C a C l z , t h i a m i n e 3 7 ° C , o v e r n i g h t 1 9 B e f o r e e x p r e s s i o n w i t h t h e l a b e l e d c o m p o u n d w a s a t t e m p t e d , s e v e r a l t r i a l s t o e x p r e s s W T - C R A B P I I a n d R 1 3 2 K : : Y 1 3 4 F C R A B P I I i n M 9 w e r e c a r r i e d o u t . A f t e r t h e c o n d i t i o n s w e r e s t a n d a r d i z e d f o r n o n - l a b e l e d e x p r e s s i o n ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) , w i t h v e r y g o o d y i e l d s o f ~ 3 0 m g / L , s e v e r a l a t t e m p t s w e r e c a r r i e d o u t f o r t h e 1 5 N 2 2 5 e x p r e s s i o n , m o s t l y c h a n g i n g o n l y t h e t o t a l v o l u m e o f t h e c u l t u r e . T h e r e s u l t s , a s s u m m a r i z e d i n T a b l e 4 - 3 s h o w t h a t t h e l a b e l e d e x p r e s s i o n w a s u s u a l l y n o t a s s u c c e s s f u l a s e x p r e s s i o n i n L B m e d i u m . A l s o , i n t e r e s t i n g l y l a r g e r c u l t u r e v o l u m e s y i e l d e d l e s s p r o t e i n e x p r e s s e d . E s p e c i a l l y i n t h e c a s e o f t h e 1 L c u l t u r e , t h e y i e l d w a s p a r t i c u l a r l y b a d ( ~ 9 m g / L ) w i t h a n a d d i t i o n a l p r o t e i n a t ~ 2 4 k D a b e i n g o v e r e x p r e s s e d . T h i s p r o t e i n ( o r p r o t e i n c o m p l e x ) b i n d s t o t h e N T A c o l u m n ( a f f i n i t y C h r o m a t o g r a p h y f o r p u r i f y i n g p r o t e i n s b e a r i n g a 6 - H i s t a g ) m o r e e f f i c i e n t l y t h a n C R A B P H , i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f t h e a f fi n i t y t a g . M A L D I - T O F a n d e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n s p e c t r a o f t h e l a b e l e d d o u b l e m u t a n t v e r i fi e d t h e i n c o r p o r a t i o n o f t h e l a b e l e d L y s . I n a d d i t i o n t o t h e 1 5 N - L y s i n c o r p o r a t i o n , a u n i f o r m l y 1 5 N l a b e l e d p r o t e i n w a s e x p r e s s e d a s w e l l u s i n g 1 5 N H 4 C l a s t h e o n l y s o u r c e o f n i t r o g e n . T h e e x p r e s s i o n w a s u n e v e n t f u l , y i e l d i n g ~ 5 m g / L o f p r o t e i n , a n d t h e l a b e l i n g w a s v e r i f i e d b y M A L D I - T O F a s w e l l . A t t h i s p o i n t , t a l t h o u g h a c t u a l N M R e x p e r i m e n t s h a v e n o t t a k e n p l a c e , w e a r e c o n f i d e n t t h a t w e c a n e a s i l y a c h i e v e a u n i f o r m l a b e l i n g o f e i t h e r a s p e c i f i c a m i n o a c i d o r t h e f u l l C R A B P H m u t a n t w i t h 1 5 N . 4 . 5 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s A . I n t e i n M e d i a t e d N a t i v e C h e m i c a l L i g a t i o n 2 2 6 i . S a p l c u t s i t e P C R c o n d i t i o n s C R A B P I I - W T ( 1 O n g / u l ) 5 u L 5 5 5 2 4 ( N c o l ) 4 u L 1 P c i g fl l ’ a m s . b b b 5 8 ( S a p l ) 7 u L x g : , C 1 m d N T P 2 1 1 L 3 0 x 5 5 O C - 1 m i n M g S O . , ( 1 m M ) 1 u L 7 2 ° C 1 m i n 4 5 s e c D e e p V e n t 1 ( 1 L 1 x 7 2 ° C 1 0 m i n B u f f e r 1 o 1 1 L 1 X 2 3 ° C 1 0 m i n H 2 0 7 0 1 1 L i i . B u f f e r s a C e l l L y s i s / C o l u m n E q u i l i b r a t i o n B u f f e r : 2 0 m M N a H 2 P 0 4 ; 5 0 0 m M N a C l , p H = 8 . 0 b . C l e a v a g e B u f f e r : 2 0 m M N a H z P O 4 ; 5 0 0 m M N a C l ; 2 % t h i o p h e n o l ( o r 5 0 m M M E S N A ) , p H = 8 . 0 ( o r h i g h e r , t h e h i g h e r t h e p H t h e m o r e e f f i c i e n t t h e c l e a v a g e ) c . S t r i p p i n g s o l u t i o n ( f o r c h i t i n b e a d s ) : 0 . 3 M N a O H C o m m e n t s 0 U s e o f n o n - i o n i c d e t e r g e n t s ( 0 . 1 - 0 . 2 % T w e e n - 2 0 , 1 % T r i t o n X 1 0 0 ) f o r t h e l y s i s b u f f e r i s a l l o w e d . 0 C h i t i n b e a d s c o l u m n c a n t o l e r a t e u p t o 4 M u r e a . i i i . P r o t o c o l f o r R e f o l d i n g p r o t e i n a t t a c h e d t o t h e M x e G y r A i n t e i n ( M u i r ’ s G r o u p ) T h e f u s i o n p r o t e i n w a s e x p r e s s e d i n E R 2 5 6 6 o r T u n e r c e l l s . 5 0 m L o f L B c u l t u r e w a s g r o w n o v e r n i g h t a n d w a s i n o c u l a t e d i n 1 L L B m e d i u m . T h e c u l t u r e w a s i n c u b a t e d a t 3 7 ° C w i t h s h a k i n g u n t i l O D o o o = 0 . 8 ( 3 - 4 h ) . T h e o v e r e x p r e s s i o n w a s i n d u c e d b y a d d i t i o n o f l m M I P T G a n d t h e c u l t u r e w a s k e p t a t f o r 5 h a t 3 7 ° C o r o v e r n i g h t a t 1 5 ° C . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 5 0 0 0 r p m , 4 ° C , 3 0 m i n ) a n d w e r e 2 2 7 r e s u s p e n d e d i n l y s i s b u f f e r ( 2 5 m L / L c u l t u r e ) . T h e c e l l s w e r e l y s e d b y s o n i c a t i o n ( p r o b e s o n i c a t o r , 3 x 1 m i n , 6 0 % p o w e r , 0 ° C ) . A f t e r l y s i s T r i t o n X - 1 0 0 w a s a d d e d t o 1 % a n d t h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 0 m i n . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n ( 5 0 0 0 r p m , 4 ° C , 3 0 m i n ) b o t h t h e s u p e r n a t a n t a n d t h e p e l l e t w e r e k e p t . A t t h i s p o i n t , i f a n y o f t h e f u s i o n p r o t e i n i s i n t h e s o l u b l e f r a c t i o n , i t s h o u l d b e a c t i v e . T h e c o l l e c t e d p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d w i t h l y s i s b u f f e r ( 5 0 m L ) c o n t a i n i n g 2 M u r e a a n d 1 % T r i t o n X - 1 0 0 ( w a s h s t e p , c a n b e s k i p p e d ) . T h e m i x t u r e w a s s p u n d o w n ( 5 0 0 0 1 p m , 4 ° C , 3 0 m i n ) a n d t h e c o l l e c t e d p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d w i t h l y s i s b u f f e r c o n t a i n i n g 6 M u r e a a n d 1 % T r i t o n X - 1 0 0 . U p o n c e n t r i g u g a t i o n ( 5 0 0 0 r p m , 4 ° C , 3 0 m i n ) t h e i n s o l u b l e f r a c t i o n w a s r e m o v e d a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s d i a l y z e d ( S p e c t r a / P o r ® , M o l e c u l a r p o r o u s C e l l u l o s e D i a l y s i s M e m b r a n e ) a g a i n s t l y s i s b u f f e r c o n t a i n i n g 1 % T r i t o n X - 1 0 0 , o v e r a 2 4 h r s p e r i o d a t 4 ° C , c h a n g i n g t h e d i a l y s i s b u f f e r e v e r y ~ 8 h . A f t e r d i a l y s i s , t h e s a m p l e w a s s p u n d o w n ( 5 0 0 0 r p m , 4 ° C , 3 0 m i n ) t o r e m o v e a n y p r e c i p i t a t i o n . A t t h i s p o i n t , t h e r e f o l d e d i n t e i n s h o u l d b e i n t h e s u p e r n a t a n t , w h i c h t h e n c a n b e a d d e d t o t h e c h i t i n b e a d s t o c o n t i n u e t h e p u r i f i c a t i o n . 1 0 m L o f c h i t i n r e s i n w e r e u s e d f o r ~ 2 0 m L o f t h e d i a l y s i s s u p e r n a t a n t ( f r o m 2 L e x p r e s s i o n ) T h e d i a l y s i s s o l u t i o n w a s s o a k e d w i t h t h e r e s i n f o r ~ 2 h a f t e r w h i c h i t w a s r u n t h r o u g h a t a r a t e o f ~ 0 . 5 m U m i n . T h e f l o w t h r o u g h w a s c o l l e c t e d a n d r e s u b m i t t e d t o t h e c o l u m n k e e p i n g t h e s a m e fl o w r a t e . T h e c o l u m n w a s w a s h e d 1 0 0 m L 2 5 m M T r i s , 2 0 0 m M N a C l , p H = 7 . 5 . A t t h e e n d , t h e i n t e i n c a n b e c h e c k e d b y i n c u b a t i n g t h e f u s i o n p r o t e i n w i t h l m M D T T ( f r e s h s o l u t i o n ) a t R T , o v e r n i g h t . I f t h e i n t e i n i s a c t i v e , p r o t e i n s p l i c i n g f o r c h e m i c a l l i g a t i o n c a n b e a c h i e v e d b y i n c u b a t i n g t h e c o l u m n w i t h 5 m L 1 0 0 m M M E S N A , p H = 8 . 7 . I n c u b a t e a t 4 ° C f o r ~ 4 h a n d t h e n a t R T f o r a d a y . 2 2 8 i v . R a i n e s ’ P r o t o c o l T h e p T X B 3 - C R A B P I I ( 1 - 1 2 9 ) p l a s m i d w a s t r a n s f o r m e d i n t o T u n e r ( o r E R 2 5 6 6 ) E . c o l i c e l l s a n d a s i n g l e c o l o n y w a s i n o c u l a t e d i n t o L B / A m p ( 1 0 0 p g / m L ) ( C l m ( 1 7 0 u g / m L ) f o r T u n e r ) . T h e c u l t u r e w a s i n c u b a t e d a t 3 7 ° C o v e r n i g h t a n d 1 0 m L o f i t w e r e i n o c u l a t e d i n t o a n 1 L L B m e d i u m . T h e c u l t u r e w a s g r o w n a t 3 7 ° u n t i l O D 6 0 0 = O . 6 . T h e fl a s k w a s t h e n c o o l e d o n i c e f o r 1 0 m i n , a n d e x p r e s s i o n w a s i n d u c e d b y t h e a d d i t i o n o f 0 . 5 m M I P T G . T h e f l a s k s w e r e s h a k e n a t R T f o r 5 h . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 5 0 0 0 r p m , 4 0 C , 3 0 m i n ) a n d t h e w e t c e l l p e l l e t w a s f r o z e n f o r s t o r a g e . F r o z e n c e l l s w e r e t h a w e d a n d h o m o g e n i z e d i n 5 0 m M T r i s - H C l b u f f e r ( p H = 8 . 5 ) c o n t a i n i n g N a C l ( 0 . 5 0 M ) , a n d t h e n l y s e d b y s o n i c a t i o n ( p r o b e s o n i c a t o r , 3 x 1 m i n , 6 0 % p o w e r , 0 ° C ) . T h e l y s e d c e l l s w e r e s u b m i t t e d t o t h e p u r i f i c a t i o n p r o t o c o l d e s c r i b e d a b o v e . B . E x p r e s s i o n o f C R A B P I I a n d e - l s N - K - C R A B P I I i n M 9 i . C o n d i t i o n s N 3 2 H P O 4 6 . 0 g K H 2 P 0 4 3 - 0 9 M 9 m e d i u m N a C l 0 . 5 g N H 4 C I 1 . 0 9 C o n d i t i o n s A C o n d i t i o n s B C o n d i t i o n s C M 9 1 L 1 L 1 L 2 0 % G l u c o s e 2 0 m L 5 0 m L 5 0 m L 1 M M 9 8 0 . 2 m L 1 m L 2 m L 1 M C a C I z 0 . 1 m L 1 0 u L T h i a m i n e m 1 m L 1 m L 2 2 9 i i . P r o c e d u r e C o m p e t e n t E . c o l i c e l l s f o r e x p r e s s i o n ( e . g . B L 2 1 , T u n e r ) w e r e t r a n s f o r m e d w i t h t h e d e s i r e d p l a s m i d ( C R A B P I I i n p E T - B l u e 2 ) a n d p l a t e d o n t o L B a g a r p l a t e s . A f t e r o v e r n i g h t i n c u b a t i o n a t 3 7 0 C a s i n g l e c o l o n y w a s i n o c u l a t e i n t o 5 m L o f L B m e d i u m a n d w a s i n c u b a t e d a t 3 7 0 C w i t h s h a k i n g o v e r n i g h t . 5 0 m L o f m i n i m a l m e d i a ( M 9 ) w e r e i n o c u l a t e d w i t h 0 . 5 m L o f t h e L B c u l t u r e a n d t h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e o v e r n i g h t a t 3 0 - 3 7 ° C w i t h s h a k i n g . T h e c e l l s w e r e s p u n d o w n t h e c e l l s ( 2 0 0 0 r p m , 4 ° C , 3 0 m i n ) a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s r e m o v e d . T h e c e l l p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d 1 0 m L M 9 a n d i n o c u l a t e d i n t o 5 0 0 m L o f M 9 . T h e c u l t u r e w a s i n c u b a t e d a t 3 7 ° C w i t h v i g o r o u s s h a k i n g f o r ~ 3 h . B e f o r e t h e I P T G i n d u c t i o n ( 1 m M ) 1 1 0 m g / L o f e - U N - L y s w e r e a d d e d a n d t h e c u l t u r e w a s i n c u b a t e d a t R T f o r 1 0 m i n . A f e r I P T G i n d u c t i o n t h e c u l t u r e w a s i n c u b a t e d a t 3 0 — 3 7 ° C , 5 h t o o v e r n i g h t . A f t e r t h e c e l l s a r e h a r v e s t e d , s t a n d a r d p r o t e i n p u r i f i c a t i o n p r o t o c o l s ( H i s - t a g p r o t e i n s ) w e r e f o l l o w e d . 4 . 6 R e f e r e n c e s 1 . L . C . W a n g , H . G . Y a n " N M R s t u d y s u g g e s t s a m a j o r r o l e f o r A r g 1 1 1 i n m a i n t a i n i n g t h e s t r u c t u r e a n d d y n a m i c a l p r o p e r t i e s o f t y p e 1 1 h u m a n c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 8 , 3 7 , 1 3 0 2 1 - 1 3 0 3 2 . 2 . L . C . W a n g , Y . L i , F . A b i l d g a a r d , J . L . M a r k l e y , H . G . Y a n " N M R s o l u t i o n s t r u c t u r e o f t y p e H h u m a n c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n : I m p l i c a t i o n s f o r l i g a n d b i n d i n g " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 8 , 3 7 , 1 2 7 2 7 - 1 2 7 3 6 . 3 . R . M . C z e r w i n s k i , T . K . H a m ' s , W . H . J o h n s o n , P . M . L e g l e r , J . T . S t i v e r s , A . S . M i l d v a n , C . P . W h i t m a n " E f f e c t s o f m u t a t i o n s o f t h e a c t i v e s i t e a r g i n i n e r e s i d u e s i n 4 - o x a l o c r o t o n a t e t a u t o m e r a s e o n t h e p K ( a ) v a l u e s o f a c t i v e s i t e r e s i d u e s a n d o n t h e p H d e p e n d e n c e o f c a t a l y s i s " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 9 , 3 8 , 1 2 3 5 8 - 1 2 3 6 6 . 2 3 0 4 . 1 0 . l l . 1 2 . 1 3 . 1 4 . A . A l b e c k , N . L i v n a h , H . G o t t l i e b , M . S h e v e s " C - 1 3 N M R - S t u d i e s o f M o d e l C o m p o u n d s f o r B a c t e r i o r h o d o p s i n - F a c t o r s A f f e c t i n g t h e R e t i n a l C h r o m o p h o r e C h e m i c a l - S h i f t s a n d A b s o r p t i o n M a x i m u m " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 2 , 1 1 4 , 2 4 0 0 - 2 4 1 1 . R . R . B i r g e , L . P . M u r r a y , R . Z i d o v e t z k i , H . M . K n a p p " 2 - P h o t o n , C - 1 3 a n d T w o - D i m e n s i o n a l H - l — N m r S p e c t r o s c o p i c S t u d i e s o f R e t i n y ] S c h i f f - B a s e s , P r o t o n a t e d S c h i f f - B a s e s , a n d S c h i f f - B a s e S a l t s - E v i d e n c e f o r a P r o t o n a t i o n I n d u c e d P i - P i - S t a r E x c i t e d - S t a t e L e v e l O r d e r i n g R e v e r s a l " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 8 7 , 1 0 9 , 2 0 9 0 - 2 1 0 1 . Y . I n o u e , Y . T o k i t o , R . C h u j o , Y . M i y o s h i " S t u d y o f P i - E l e c t r o n D e l o c a l i z a t i o n i n M o d e l C o m p o u n d s o f V i s u a l P i g m e n t b y U v a n d C - 1 3 N m r - S p e c t r a " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 7 , 9 9 , 5 5 9 2 - 5 5 9 6 . Y . I n o u e , Y . T o k i t o , S . T o m o n o h , R . C h u j o " C - l 3 C h e m i c a l - S h i f t s o f R e t i n a l I s o m e r s a n d T h e i r S c h i f f - B a s e s a s M o d e l s o f V i s u a l C h r o m o p h o r e s " B u l l . C h e m . S o c . J p n . 1 9 7 9 , 5 2 , 2 6 5 - 2 6 6 . Y . I n o u e , T a k a h a s h . A , Y . T o k i t o , R . C h u j o , Y . M i y o s h i " C - 1 3 N m r - S p e c t r a o f R e t i n a l - l a n d I t s R e l a t e d C o m p o u n d s " O r g . M a g n . R e s . 1 9 7 4 , 6 , 4 8 7 - 4 9 1 . G . S . H a r b i s o n , S . O . S m i t h , J . A . P a r d o e n , J . M . L . C o u r t i n , J . L u g t e n b u r g , J . H e r z f e l d , R . A . M a t h i e s , R . G . G r i f f i n " S o l i d - S t a t e C - l 3 N m r D e t e c t i o n o f a P e r t u r b e d 6 - S - T r a n s C h r o m o p h o r e i n B a c t e r i o r h o d o p s i n " B i o c h e m i s t r y 1 9 8 5 , 2 4 , 6 9 5 5 - 6 9 6 2 . S . O . S m i t h , H . J . M . D e g r o o t , R . G e b h a r d , J . M . L . C o u r t i n , J . L u g t e n b u r g , J . H e r z f e l d , R . G . G r i f f i n " S t r u c t u r e a n d P r o t e i n E n v i r o n m e n t o f t h e R e t i n a ] C h r o m o p h o r e i n L i g h t - A d a p t e d a n d D a r k - A d a p t e d B a c t e r i o r h o d o p s i n S t u d i e d b y S o l i d - S t a t e N m r " B i o c h e m i s t r y 1 9 8 9 , 2 8 , 8 8 9 7 - 8 9 0 4 . R . K o n r a t , D . R . M u h a n d i r a m , N . A . F a r r o w , L . E . K a y " P u l s e s c h e m e s f o r t h e m e a s u r e m e n t o f ( 3 ) J ( C ' C g a m m a ) a n d ( 3 ) J ( N C g a m m a ) s c a l a r c o u p l i n g s i n N - l 5 , C - 1 3 u n i f o r m l y l a b e l e d p r o t e i n s " J . B i o m o l . N M R 1 9 9 7 , 9 , 4 0 9 - 4 2 2 . K . V . L a k s h m i , M . R . F a r r a r , J . R a a p , J . A . P a r d o e n , J . L u g t e n b u r g , R . G . G r i f fi n , J . H e r z f e l d " S o l i d - S t a t e N - l S - N m r a n d C - l 3 - N m r S t u d y o f B a c t e r i o r h o d o p s i n P h o t o i n t e r m e d i a t e s " B i o p h y s i c a l J o u r n a l 1 9 9 4 , 6 6 , A 4 3 - A 4 3 . H . J . M . D e g r o o t , S . O . S m i t h , J . C o u r t i n , E . V a n d e n b e r g , C . W i n k e l , J . L u g t e n b u r g , R . G . G r i f f i n , J . H e r z f e l d " S o l i d - S t a t e C - 1 3 a n d N - l S N m r - S t u d y o f t h e L o w P h F o r m s o f B a c t e r i o r h o d o p s i n " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 0 , 2 9 , 6 8 7 3 - 6 8 8 3 . K . V . R a m a n a t h a n , S . J . O p e l l a " H i g h - R e s o l u t i o n S o l i d — S t a t e C - 1 3 - N - 1 4 a n d C - 1 3 - N - 1 5 H e t e r o n u c l e a r C o r r e l a t i o n S p e c t r o s c o p y " J . M a g n . R e s o n . 1 9 9 0 , 8 6 , 2 2 7 - 2 3 5 . 2 3 1 1 5 . l 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 5 . 2 6 . D . M . S c h n e i d e r , R . T y c k o , S . J . O p e l l a " H i g h - R e s o l u t i o n S o l i d - S t a t e T r i p l e N u c l e a r - M a g n e t i c - R e s o n a n c e M e a s u r e m e n t o f C - l 3 - N - 1 5 D i p o l e D i p o l e C o u p l i n g s " J . M a g n . R e s o n . 1 9 8 7 , 7 3 , 5 6 8 - 5 7 3 . J . S . F r u t o n , A S k e p t i c a l B i o c h e m i s t , H a r v a r d U n i v . P r e s s , C a m b r i d g e , M A , 1 9 9 2 . B . W . M a t t h e w s " S t r u c t u r a l a n d G e n e t i c - A n a l y s i s o f P r o t e i n S t a b i l i t y " A n n u . R e v . B i o c h e m . 1 9 9 3 , 6 2 , 1 3 9 - 1 6 0 . 4 M . S m i t h " S y n t h e t i c D N A a n d B i o l o g y ( N o b e l L e c t u r e ) " A n g e w . C h e m . I n t . E d i t . 1 9 9 4 , 3 3 , 1 2 1 4 - 1 2 2 1 . J . L . C l e l a n d , C . S . C r a i k , P r o t e i n E n g i n e e r i n g : P r i n c i p l e s a n d P r a c t i c e , W i l e y & S o n s , N e w Y o r k , 1 9 9 6 . D . K i g a , K . S a k a m o t o , K . K o d a m a , T . K i g a w a , T . M a t s u d a , T . Y a b u k i , M . S h i r o u z u , Y . H a r a d a , H . N a k a y a m a , K . T a k i o , Y . H a s e g a w a , Y . E n d o , I . H i r a o , S . Y o k o y a m a " A n e n g i n e e r e d E s c h e r i c h i a c o l i t y r o s y l - t R N A s y n t h e t a s e f o r s i t e - s p e c i fi c i n c o r p o r a t i o n o f a n u n n a t u r a l a m i n o a c i d i n t o p r o t e i n s i n e u k a r y o t i c t r a n s l a t i o n a n d i t s a p p l i c a t i o n i n a w h e a t g e r m c e l l - f r e e s y s t e m " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 2 0 0 2 , 9 9 , 9 7 1 5 - 9 7 2 0 . N . Z i m m e r m a n n , E . M e g g e r s , P . G . S c h u l t z " A n o v e l s i l v e r ( I ) - m e d i a t e d D N A b a s e p a i r " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 2 , 1 2 4 , 1 3 6 8 4 - 1 3 6 8 5 . K . S a k a m o t o , A . H a y a s h i , A . S a k a m o t o , D . K i g a , H . N a k a y a m a , A . S o m a , T . K o b a y a s h i , M . K i t a b a t a k e , K . T a k i o , K . S a i t o , M . S h i r o u z u , I . H i r a o , S . Y o k o y a m a " S i t e - s p e c i f i c i n c o r p o r a t i o n o f a n u n n a t u r a l a m i n o a c i d i n t o p r o t e i n s i n m a m m a l i a n c e l l s " N u c l e i c A c i d s R e s . 2 0 0 2 , 3 0 , 4 6 9 2 - 4 6 9 9 . R . A . M e h l , J . C . A n d e r s o n , S . W . S a n t o r o , L . W a n g , A . B . M a r t i n , D . S . K i n g , D . M . H o r n , P . G . S c h u l t z " G e n e r a t i o n o f a b a c t e r i u m w i t h a 2 1 a m i n o a c i d g e n e t i c c o d e " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 3 , 1 2 5 , 9 3 5 — 9 3 9 . A . D e i t e r s , T . A . C r o p p , M . M u k h e r j i , J . W . C h i n , J . C . A n d e r s o n , P . G . S c h u l t z " A d d i n g a m i n o a c i d s w i t h n o v e l r e a c t i v i t y t o t h e g e n e t i c c o d e o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 3 , 1 2 5 , 1 1 7 8 2 - 1 1 7 8 3 . I . C . A n d e r s o n , P . G . S c h u l t z " A d a p t a t i o n o f a n o r t h o g o n a l a r c h a e a l l e u c y l - t R N A a n d s y n t h e t a s e p a i r f o r f o u r - b a s e , a m b e r , a n d o p a l s u p p r e s s i o n " B i o c h e m i s t r y 2 0 0 3 , 4 2 , 9 5 9 8 - 9 6 0 8 . A . B . M a r t i n , P . G . S c h u l t z " O p p o r t u n i t i e s a t t h e i n t e r f a c e o f c h e m i s t r y a n d b i o l o g y " T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 9 9 9 , 2 4 , M 2 4 - M 2 8 . 2 3 2 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . 3 7 . J . A . P i c c i r i l l i , T . K r a u c h , S . E . M o r o n e y , S . A . B e n n e r " E n z y m a t i c I n c o r p o r a t i o n o f a N e w B a s e P a i r i n t o D N A a n d R n a E x t e n d s t h e G e n e t i c A l p h a b e t " N a t u r e 1 9 9 0 , 3 4 3 , 3 3 - 3 7 . M . J a s k o l s k i , A . G . T o m a s s e l l i , T . K . S a w y e r , D . G . S t a p l e s , R . L . H e i n r i k s o n , J . S c h n e i d e r , S . B . H . K e n t , A . W l o d a w e r " S t r u c t u r e a t 2 . 5 - a R e s o l u t i o n o f C h e m i c a l l y S y n t h e s i z e d H u m a n - I r n m u n o d e f i c i e n c y - V i r u s T y p e - l P r o t e a s e C o m p l e x e d w i t h a H y d r o x y e t h y l e n e - B a s e d I n h i b i t o r " B i o c h e m i s t r y 1 9 9 1 , 3 0 , 1 6 0 0 - 1 6 0 9 . J . S c h n e i d e r , S . B . H . K e n t " E n z y m a t i c - A c t i v i t y o f a S y n t h e t i c - 9 9 R e s i d u e P r o t e i n C o r r e s p o n d i n g t o t h e P u t a t i v e H i v - l P r o t e a s e " C e l l 1 9 8 8 , 5 4 , 3 6 3 - 3 6 8 . M . M i l l e r , J . S c h n e i d e r , B . K . S a t h y a n a r a y a n a , M . V . T o t h , G . R . M a r s h a l l , L . C l a w s o n , L . S e l k , S . B . H . K e n t , A . W l o d a w e r " S t r u c t u r e o f C o m p l e x o f S y n t h e t i c H i v - l P r o t e a s e w i t h a S u b s t r a t e - B a s e d I n h i b i t o r a t 2 . 3 - a R e s o l u t i o n " S c i e n c e 1 9 8 9 , 2 4 6 , 1 1 4 9 - 1 1 5 2 . A . W l o d a w e r , M . M i l l e r , M . J a s k o l s k i , B . K . S a t h y a n a r a y a n a , E . B a l d w i n , 1 . T . W e b e r , L . M . S e l k , L . C l a w s o n , J . S c h n e i d e r , S . B . H . K e n t " C o n s e r v e d F o l d i n g i n R e t r o v i r a l P r o t e a s e s - C r y s t a l - S t r u c t u r e o f a S y n t h e t i c H i v - l P r o t e a s e " S c i e n c e 1 9 8 9 , 2 4 5 , 6 1 6 - 6 2 1 . P . E . D a w s o n , S . B . H . K e n t " S y n t h e s i s o f n a t i v e p r o t e i n s b y c h e m i c a l l i g a t i o n " A n n u . R e v . B i o c h e m . 2 0 0 0 , 6 9 , 9 2 3 - 9 6 0 . P . E . D a w s o n , M . J . C h u r c h i l l , M . R . G h a d i r i , S . B . H . K e n t " M o d u l a t i o n o f r e a c t i v i t y i n n a t i v e c h e m i c a l l i g a t i o n t h r o u g h t h e u s e o f t h i o l a d d i t i v e s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 7 , 1 1 9 , 4 3 2 5 - 4 3 2 9 . T . M . H a c k e n g , C . M . M o u n i e r , C . B o n , P . E . D a w s o n , J . H . G r i f fi n , S . B . H . K e n t " T o t a l c h e m i c a l s y n t h e s i s o f e n z y m a t i c a l l y a c t i v e h u m a n t y p e I I s e c r e t o r y p h o s p h o l i p a s e A ( 2 ) " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 7 , 9 4 , 7 8 4 5 - 7 8 5 0 . T . M . H a c k e n g , J . H . G r i f fi n , P . E . D a w s o n " P r o t e i n s y n t h e s i s b y n a t i v e c h e m i c a l l i g a t i o n : E x p a n d e d s c o p e b y u s i n g s t r a i g h t f o r w a r d m e t h o d o l o g y " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 9 , 9 6 , 1 0 0 6 8 - 1 0 0 7 3 . P . E . D a w s o n , T . W . M u i r , I . C l a r k l e w i s , S . B . H . K e n t " S y n t h e s i s o f P r o t e i n s b y N a t i v e C h e m i c a l L i g a t i o n " S c i e n c e 1 9 9 4 , 2 6 6 , 7 7 6 - 7 7 9 . S . R . C h o n g , F . B . M e r s h a , D . G . C o m b , M . E . S c o t t , D . L a n d r y , L . M . V e n c e , F . B . P e r l e r , J . B e n n e r , R . B . K u c e r a , C . A . H i r v o n e n , J . J . P e l l e t i e r , H . P a u l u s , M . Q . X u " S i n g l e - c o l u m n p u r i f i c a t i o n o f f r e e r e c o m b i n a n t p r o t e i n s u s i n g a s e l f - c l e a v a b l e a f fi n i t y t a g d e r i v e d f r o m a p r o t e i n s p l i c i n g e l e m e n t " G e n e 1 9 9 7 , 1 9 2 , 2 7 1 - 2 8 1 . 2 3 3 3 8 . 3 9 . 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 5 . 4 6 . T . T . H o a n g , Y . F . M a , R . J . S t e r n , M . R . M c N e i l , H . P . S c h w e i z e r " C o n s t r u c t i o n a n d u s e o f l o w - c o p y n u m b e r T 7 e x p r e s s i o n v e c t o r s f o r p u r i f i c a t i o n o f p r o b l e m p r o t e i n s : p u r i fi c a t i o n o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s l e D a n d P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a L a s I a n d R h l I p r o t e i n s , a n d f u n c t i o n a l a n a l y s i s o f p u r i fi e d R h l I " G e n e 1 9 9 9 , 2 3 7 , 3 6 1 - 3 7 1 . S . M a t h y s , T . C . E v a n s , 1 . C . C h u t e , H . W u , S . R . C h o n g , J . B e n n e r , X . Q . L i u , M . Q . X u " C h a r a c t e r i z a t i o n o f a s e l f - s p l i c i n g m i n i - i n t e i n a n d i t s c o n v e r s i o n i n t o a u t o c a t a l y t i c N - a n d C - t e r m i n a l c l e a v a g e e l e m e n t s : f a c i l e p r o d u c t i o n o f p r o t e i n b u i l d i n g b l o c k s f o r p r o t e i n l i g a t i o n " G e n e 1 9 9 9 , 2 3 1 , 1 - 1 3 . G . J . C o t t o n , T . W . M u i r " P e p t i d e l i g a t i o n a n d i t s a p p l i c a t i o n t o p r o t e i n e n g i n e e r i n g " C h e m . B i o l . 1 9 9 9 , 6 , R 2 4 7 - R 2 5 6 . S . H . H o n g , M . T o y a m a , W . M a r e t , Y . M u r o o k a " H i g h y i e l d e x p r e s s i o n a n d s i n g l e s t e p p u r i f i c a t i o n o f h u m a n t h i o n e i n / m e t a l l o t h i o n e n " P r o t e i n E x p r . P u r i f . 2 0 0 1 , 2 1 , 2 4 3 - 2 5 0 . P . S z w e d a , R . P l a d z y k , R . K o t l o w s k i , J . K u r " C l o n i n g , e x p r e s s i o n , a n d p u r i fi c a t i o n o f t h e S t a p h y l o c o c c u s s i m u l a n s l y s o s t a p h i n u s i n g t h e i n t e i n - c h i t i n - b i n d i n g d o m a i n ( C B D ) s y s t e m " P r o t e i n E x p r . P u r i f . 2 0 0 1 , 2 2 , 4 6 7 - 4 7 1 . A . W i e s e , B . W i l m s , C . S y l d a t k , R . M a t t e s , J . A l t e n b u c h n e r " C l o n i n g , n u c l e o t i d e s e q u e n c e a n d e x p r e s s i o n o f a h y d a n t o i n a s e a n d c a r b a m o y l a s e g e n e f r o m A r t h r o b a c t e r a u r e s c e n s D S M 3 7 4 5 i n E s c h e r i c h i a c o l i a n d c o m p a r i s o n w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g g e n e s f r o m A r t h r o b a c t e r a u r e s c e n s D S M 3 7 4 7 " A p p l . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . 2 0 0 1 , 5 5 , 7 5 0 - 7 5 7 . R . J . H o n d a ] , B . L . N i l s s o n , R . T . R a i n e s " S e l e n o c y s t e i n e i n n a t i v e c h e m i c a l l i g a t i o n a n d e x p r e s s e d p r o t e i n l i g a t i o n " B i o c h e m i s t r y 2 0 0 1 , 4 0 , 8 6 0 8 - 8 6 0 9 . N e w E n g l a n d B i o l a b s , I M P A C T T M - C N s y s t e m , I n s t r u c t i o n M a n u a l W . A . P r i n z , F . A s l u n d , A . H o l m g r e n , J . B e c k w i t h " T h e r o l e o f t h e t h i o r e d o x i n a n d g l u t a r e d o x i n p a t h w a y s i n r e d u c i n g p r o t e i n d i s u l fi d e b o n d s i n t h e E s c h e r i c h i a c o l i c y t o p l a s m " J . B i o l . C h e m . 1 9 9 7 , 2 7 2 , 1 5 6 6 1 - 1 5 6 6 7 . 2 3 4 1 1 5 4 0 8 8 8 2 4 6 8 8 0 9 4 2 2 2 2 2 2 1 1 2 1 2 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 d l e i Y ) s t n a " t M 5 2 2 4 0 7 8 0 8 2 6 8 4 7 6 4 1 9 6 1 0 3 5 9 3 9 0 2 5 3 1 1 2 6 u 2 3 4 6 4 1 2 6 5 1 3 7 3 2 0 9 8 2 M ’ , , , , , , , , , , , , , , , , , m 0 1 2 0 2 0 9 8 6 8 8 6 9 7 9 7 7 c 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 I I P B A R C ( s s s r a 9 2 0 6 6 8 8 8 6 6 4 5 5 3 3 3 o m . . . . . . . . . . . . . . . . f 1 8 3 0 9 0 3 0 2 2 0 0 9 4 5 9 s D 8 8 7 7 7 4 7 7 7 7 5 7 7 7 7 7 e 6 6 6 6 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 5 6 I 2 0 8 4 5 9 5 4 5 4 7 6 4 1 5 5 i L 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 t A r e p o r P n i e M d e t a s l s u a t c M o l r a P C f o y r a m m u S 2 3 5 P r o t e i n C D r - ‘ N M V W O F O O G O _ N M V V W \ D I \ v — t v — ‘ v — i v - d v — t v — l v — i v — t * W T * R l 3 2 K * R 1 3 2 K 2 Y 1 3 4 F * R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : L 1 2 1 E * R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L * R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 E R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 E * R l 3 2 K z Y 1 3 4 F z R 1 1 1 L z T 5 4 E * R 1 3 2 K z Y 1 3 4 F z R 1 1 1 L z L 1 2 1 D * R 1 3 2 K 2 Y 1 3 4 F z R 1 1 1 L : L 1 2 1 E : T 5 4 V * R 1 3 2 K z Y 1 3 4 F z R 1 1 1 L : L 1 2 1 D : T 5 4 V * R 1 3 2 K z Y 1 3 4 F z R 1 1 1 L : T 5 4 V R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : T 5 4 V * R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 E : T 5 4 V * R 1 3 2 K z Y 1 3 4 F l e 1 1 L : L 1 2 1 Q * R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 Q 2 T 5 4 V * R 1 3 2 K : Y 1 3 4 F : R 1 1 1 L : L 1 2 1 N 1 6 8 2 9 . 2 1 6 8 0 1 . 2 1 6 7 8 5 . 2 1 6 8 0 1 . 2 1 6 7 4 2 . 2 1 6 7 5 8 . 1 1 5 4 9 0 . 7 1 6 6 7 0 . 2 1 6 7 4 4 . 1 1 6 7 5 6 . 2 1 6 7 4 2 . 1 1 6 7 4 0 . 2 1 5 5 1 5 . 8 1 6 7 5 6 . 2 1 6 7 5 7 . 1 1 6 7 5 5 . 2 1 6 7 4 3 . 1 1 6 7 9 4 3 . 8 ( * ) I n d i c a t e s H i s - t a g g e d p r o t e i n s D 5 8 8 8 8 5 8 8 8 0 8 8 8 8 8 8 2 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 C 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 d l e i Y ) " s M t 1 6 2 6 5 2 6 6 1 3 7 6 8 8 8 7 9 8 6 1 0 4 5 2 3 8 3 3 3 0 7 2 6 8 6 7 4 4 8 9 1 6 7 9 6 1 1 3 7 6 0 0 n , , ' , , , , , , , , , , , , , , , a m 1 0 3 0 9 9 7 9 6 9 0 3 0 0 8 9 5 c 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 ( 8 t u M I I P B A R I D s 6 0 7 2 9 9 9 9 6 8 7 5 5 1 1 . . . . . . . . . . . . . . . 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P S E U D O - C A G E D C O M P O U N D S A S C I - { R O M O P H O R I C H O S T S F O R T H E A B S O L U T E S T E R E O C H E M I C A L D E T E R M I N A T I O N O F C H I R A L C O M P O U N D S V o l u m e I I B y C h r y s o u l a V a s i l e i o u A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y 2 0 0 5 C h a p t e r 5 I n t r o d u c t i o n t o C h i r o p t i c a l M e t h o d s : T h e o r y a n d A p p l i c a t i o n s 5 . 1 I n t r o d u c t i o n t o C h i r a l i t y “ I c a l l a n y g e o m e t r i c a l fi g u r e , o r g r o u p o f p o i n t s , c h i r a l , a n d s a y i t h a s C h i r a l i t y , i f i t s i m a g e i n a p l a n e m i r r o r , i d e a l l y r e a l i z e d , c a n n o t b e b r o u g h t t o c o i n c i d e w i t h i t s e l fi ” L o r d K e l v i n W h i l e s t i l l i n g r a d u a t e s c h o o l i n 1 8 4 7 , L o u i s P a s t e u r ( 1 8 2 2 - 1 8 9 5 ) w a s i n v o l v e d i n s t u d y i n g t h e t w o a c i d s f o u n d i n t h e d r e g s o f w i n e . T h e i r c h e m i c a l c o m p o s i t i o n w a s i d e n t i c a l . Y e t , c r y s t a l s o f t a r t r a t e r o t a t e d t h e p l a n e o f t h e p o l a r i z e d l i g h t , w h i l e t h o s e o f p a r a t a r t r a t e d i d n o t . U n d e r t h e m i c r o s c o p e , e v e r y t a r t r a t e c r y s t a l l o o k e d a l i k e . B u t p a r a t a r t r a t e , P a s t e u r n o t i c e d , h a d t w o f o r m s . O n e w a s l i k e t a r t r a t e , t h e o t h e r w a s i t s m i r r o r i m a g e . " 2 I t w a s n o t u n t i l a l m o s t f o r t y y e a r s l a t e r , i n 1 8 8 4 , t h a t t h e w o r d “ c h i r a l ” w a s fi r s t i n t r o d u c e d i n t o s c i e n c e b y L o r d K e l v i n ( W i l l i a m T h o m s o n , 1 8 2 4 - 1 9 0 7 ) , 3 O r i g i n a t i n g f r o m t h e P r o f e s s o r o f N a t u r a l P h i l o s o p h y i n t h e U n i v e r s i t y o f G l a s g o w . G r e e k w o r d f o r h a n d ( x e i p , c h e i r ) , C h i r a l i t y i n t r o d u c e s t h e c o n c e p t o f “ h a n d n e s s ” , i n r e f e r e n c e t o t h e p a i r o f n o n - s u p e r i m p o s a b l e m i r r o r i m a g e s c o n s t a n t l y p r e s e n t e d b e f o r e u s : o u r t w o h a n d s . I n c h e m i s t r y , C h i r a l i t y h a s e v o l v e d a s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t p r o p e r t i e s o f a m o l e c u l e , a r i s i n g f r o m a s y m m e t r i c d i s p o s i t i o n o f a t o m s . I f a m o l e c u l e i s n o t 2 4 1 o o o o G O 0 . c . c . 0 . s u p e r i m p o s a b l e w i t h i t s m i r r o r i m a g e , i t i s c o n s i d e r e d t o b e “ c h i r a l ” . I n o r g a n i c c h e m i s t r y , t h e t y p i c a l e x a m p l e o f a c h i r a l c o m p o u n d i s o n e i n w h i c h a t e t r a h e d r a l c a r b o n i s b o n d e d t o f o u r d i f f e r e n t s u b s t i t u e n t s ( F i g u r e 5 - 1 , A ) . L e t t e r s R a n d S a r e u s e d t o i n d i c a t e t h e c o n fi g u r a t i o n ( a r r a n g e m e n t o f g r o u p s ) o f t h e c h i r a l c e n t e r , b a s e d o n d e fi n e d p r i o r i t i e s . 4 H o w e v e r , n o n - s u p e r i m p o s a b i l i t y o n t h e m i r r o r i m a g e i s t h e n e c e s s a r y a n d s u f fi c i e n t c o n d i t i o n f o r C h i r a l i t y , n o e x c e p t i o n h a s e v e r b e e n f o u n d . T h i s c o n d i t i o n c a n b e f u l fi l l e d i n a n u m b e r o f w a y s a n d n e e d n o t n e c e s s a r i l y i n v o l v e a c h i r a l c e n t e r , o r e v e n o r g a n i c m o l e c u l e s a t a l l . A n y m o l e c u l e t h a t , f o r a n y r e a s o n , l a c k s a n e l e m e n t o f s y m m e t r y i s c o n s i d e r e d c h i r a l . S o m e e x a m p l e s o f c h i r a l m o l e c u l e s l a c k i n g a c h i r a l c e n t e r a r e s h o w n i n F i g u r e 5 - 1 . I n t h e c a s e o f a l l e n e s ( F i g u r e 5 - 1 B ) , c o m p o u n d s w i t h c u m u l a t e d d o u b l e b o n d s , t h e o v e r a l l m o l e c u l e i s n o t p l a n a r . T h e t w o 1 t b o n d s a r e p e r p e n d i c u l a r t o e a c h o t h e r a n d t h e A : B 1 M e H ' H M e i ¢ ' \ M e n M e ' I > ‘ \ M e : ; _ . . \ M e E t c o z H E H O Z C E t H F C = < H i H > = C H 2 - m e t h y l b u t y r i c a c i d a l l e n e C D C 0 2 H O . 0 H 0 2 0 1 2 N i N 2 i O a e o O W ~ H 0 2 0 i C O Z H " ' H E H H n o 2 : o z u : E a t r o p i s o m e r s F s p i r a n e C I 0 ' C l C l C l C C I C I 0 ' C l C ' C I . . C I C I c : C . C l C l h e x a h e l i c e n e p e r c h l o r o t r i p h e n y l a m i n e F i g u r e 5 - 1 . D i f f e r e n t k i n d s o f c h i r a l m o l e c u l e s a n d t h e i r m i r r o r i m a g e s . 2 4 2 m o l e c u l e l a c k s a n y p l a n e o f s y m m e t r y w h e n b o t h s i d e s a r e u n s y m m e t r i c a l l y s u b s t i t u t e d . 5 A n o t h e r s o u r c e o f C h i r a l i t y i n a m o l e c u l e i s r e s t r i c t e d r o t a t i o n a b o u t a s i n g l e b o n d , w e l l k n o w n a s a p o t e n t i a l s o u r c e o f g e o m e t r i c i s o m e r i s m ( a t r o p i s o m e r i s m ) . B i p h e n y l s b e a r i n g l a r g e g r o u p s o n e a c h s i d e o f t h e C - C s i n g l e b o n d , s u c h a s t h e o n e s h o w n i n F i g u r e 5 - 1 C , a r e “ l o c k e d ” i n t o a c h i r a l c o n f o r m a t i o n s i n c e s t e r i c h i n d r a n c e b e t w e e n t h e o r t h o - s u b s t i t u e n t s p r e v e n t s f u r t h e r r o t a t i o n . R e s t r i c t e d r o t a t i o n c a n a l s o b e f o u n d i n s p i r a n e s , c o m p o u n d s h a v i n g t w o r i n g s w i t h o n e c a r b o n a t o m i n c o m m o n ( F i g u r e 5 - 1 D ) . T h i s f e a t u r e p o s i t i o n s t h e r i n g s p e r p e n d i c u l a r t o e a c h o t h e r a n d a s u i t a b l e s u b s t i t u t i o n p a t t e r n c a n g i v e r i s e t o C h i r a l i t y . 6 H e l i c i t y i s a n o t h e r c o m m o n s o u r c e o f C h i r a l i t y i n m o l e c u l e s l a c k i n g a s y m m e t r i c c a r b o n s . H e l i c a l m o l e c u l e s , l i k e h e x a h e l i c e n e s h o w n i n F i g u r e S - I E , a r e n o t p l a n a r , b u t t r a c e a h e l i x w h e n o n e s i d e o f t h e m o l e c u l e l i e s a b o v e t h e o t h e r o w i n g t o c r o w d i n g o f t h e r i n g s . T h e d e f i n e d h e l i x c a n b e e i t h e r r i g h t - o r l e f t - h a n d e d a n d , t h e r e f o r e , n o n - s u p e r i m p o s a b l e w i t h i t s m i r r o r i m a g e . 7 ' 8 I n a s i m i l a r m a n n e r , p e r c h l o r o t r i p h e n y l a m i n e ( F i g u r e 5 - 1 F ) , w h i c h a d o p t s a p r o p e l l e r s h a p e d u e t o t h e s t e r i c a l l y h i n d e r e d p h e n y l r i n g s , i s a l s o c h i r a l ( a t l o w e n o u g h t e m p e r a t u r e ) . T h e o r i g i n o f C h i r a l i t y o n E a r t h h a s b e e n t h e t o p i c o f a n o n g o i n g d e b a t e a n d s e v e r a l t h e o r i e s h a v e b e e n i n t r o d u c e d t h r o u g h o u t t h e y e a r s . L i v i n g o r g a n i s m s u s e e x c l u s i v e l y o n e c h i r a l m o l e c u l a r f o r m ( h o m o c h i r a l i t y ) : a l l a m i n o a c i d s a r e l e f t h a n d e d ( L ) w h i l e a l l s u g a r s a r e r i g h t h a n d e d ( D ) . M u c h s p e c u l a t i o n h a s f o c u s e d o n e x t r a t e r r e s t r i a l i n fl u e n c e s b e h i n d e a r l y l i f e . S o m e s c i e n t i s t s s u g g e s t t h a t a n e x c e s s o f l e f t h a n d e d a m i n o a c i d s a r r i v e d o n m e t e o r i t e s a s l i f e w a s e m e r g i n g o n E a r t h . 9 ’ ' 0 I n a n o t h e r t h e o r y , E a r t h f o r m e d f r o m d u s t h a r b o r i n g a p r i m o r d i a l e x c e s s o f L - a m i n o a c i d s . l l A t t h e s a m e t i m e , p r o p o n e n t s o f a t e r r e s t r i a l m o d e l a r g u e t h a t i t w a s e v o l u t i o n a r y p r e s s u r e s t h a t s e l e c t e d 2 4 3 ( 3 8 F i g u ) r — e 3 - m e r c a p t o h e x a n a l ( 3 R ) - 3 - m e r c a p t o h e x a n a l 5 - 2 . E n a n t l o m e r l c f o r m s o f s e l e c t e d e t n a n t i o m e r h a s a S U l f U F O U S , h a t h a v e a s p e c i f i c p h y s i c a l s h a p e . C h i r a l i t y o u t o f a r a c e m a t e m a t r i x . ” l s H o w e v e r , w h a t e v e r t h e o r i g i n , C h i r a l i t y h a s b e e n a n d s t i l l r e m a i n s o n e o f t h e m o s t f u n d a m e n t a l a s p e c t s o f l i f e o n E a r t h . T h e s t e r e o c h e m i s t r y o f n a t u r a l c o m p o u n d s i s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t f a c t o r s d e fi n i n g t h e i r c h e m i c a l a n d b i o l o g i c a l p r o p e r t i e s . F o r e x a m p l e , t h e ( S ) e n a n t i o m e r o f 3 - m e r c a p t o h e x a n a l h a s a f r u i t y , A B E A O / \ / § \ H / § O p l e a s a n t o d o r , w h i l e t h e ( R ) ( f r u i t y ) ( s u l f u r o u s , r u b b e r l i k e ) r u b b e r l i k e , n o n - p l e a s a n t s m e l l . H S C O O ” H S . 0 0 0 ” ( F i g u r e 5 - 2 A ) . T h e e f f e c t o f N H 2 N H 2 ( S ) - p e n i c i l l a m i n e ( R ) - p e n i c i l l a m i n e s t e r e o c h e m i s t r y o n t h e c h e m i s t r y o f o o t h e v a r i o u s c o m p o u n d s i s 1 1 " “ ; m l “ ; p r o n o u n c e d b y t h e i r p h a r m a c o l o g i c a l o N o O o N o 0 H H p r o p e r t i e s . M o s t d r u g s w o r k b y ( S ) - t h a l i d o m i d e ( F D - t h a l i d o m i d e i n t e r a c t i n g w i t h r e c e p t o r s i n t h e b o d y m o l e c u l e s A s a r e s u l t , u s u a l l y o n e i s o m e r b i n d s p r e f e r e n t i a l l y w h i l e t h e o t h e r h a s l i t t l e o r n o a c t i v i t y . U n t i l t h e l a t e 1 9 7 0 3 , m o s t p h a r m a c e u t i c a l s m a r k e t e d w e r e i n t h e f o r m s o f r a c e m a t e s , a l t h o u g h t h e i r t h e r a p e u t i c e f f e c t w a s m a i n l y d u e t o o n l y o n e i s o m e r . I n m o s t c a s e s , t h e i n a c t i v e e n a n t i o m e r h a d l i t t l e o r n o a c t i v i t y a n d d i d n o t c a u s e a n y s e r i o u s s i d e e f f e c t s . H o w e v e r , t h a t w a s n o t a l w a y s t h e c a s e . F o r e x a m p l e , t h e a n t i - a r t h r i t i c a c t i v i t y o f p e n i c i l l a r n i n e , a d r u g u s e d t o t r e a t p a t i e n t s w i t h a c t i v e r h e u m a t o i d a r t h r i t i s ( F i g u r e 5 - 2 B ) , r e s i d e s w i t h t h e ( S ) - e n a n t i o m e r w h i l e t h e ( R ) - f o r m i s e x t r e m e l y t o x i c . T h e m o s t d e v a s t a t i n g e x a m p l e o f o n e 2 4 4 e n a n t i o m e r c a u s i n g s e r i o u s s i d e - e f f e c t s w a s t h a l i d o m i d e i n t h e 1 9 6 0 3 . T h e d r u g w a s p r e s c r i b e d t o p r e g n a n t w o m e n t o c o u n t e r m o r n i n g s i c k n e s s . T r a g i c a l l y , w h i l e t h e ( S ) - i s o m e r h a d t h e d e s i r e d a n t i n a u s e a e f f e c t s , t h e ( R ) - f o r m w a s t e r a t o g e n i c a n d c a u s e d f e t a l a b n o r m a l i t i e s , s u c h a s s e v e r e l y u n d e r d e v e l o p e d l i m b s . C u r r e n t l y , C h i r a l i t y p l a y s a m a j o r r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f n e w p h a r m a c e u t i c a l s . O n e - t h i r d o f a l l m a r k e t e d d r u g s a r e s o l d a s a s i n g l e i s o m e r i c f o r m a n d t h i s t r e n d i s i n c r e a s i n g a s c o m p a n i e s t a k e t h e t i m e t o s y n t h e s i z e a n d / o r i s o l a t e t h e m o r e e f f e c t i v e a n d s a f e r i s o m e r . ” ' 7 C o n s i d e r i n g t h e i m p a c t a n d t h e a p p l i c a t i o n s o f c h i r a l o r g a n i c m o l e c u l e s o n c h e m i s t r y , p h a r m a c e u t i c s a n d b i o c h e m i s t r y , t h e n e e d f o r s i m p l e , s e l e c t i v e a n d e f f e c t i v e w a y s f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e i r a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n i s m o r e p r o m i n e n t t h a n e v e r . H o w e v e r , d e s p i t e t h e e x t e n s i v e r e s e a r c h c u r r e n t l y u n d e r w a y , d e t e r m i n i n g a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y i s s t i l l n o t a t r i v i a l t a s k . S e v e r a l a p p r o a c h e s h a v e b e e n p r o p o s e d , i n c l u d i n g c h e m i c a l c o r r e l a t i o n w i t h k n o w n c h i r a l c o m p o u n d s , 2 N M R s p e c t r o s c o p y u s i n g M o s h e r e s t e r d e r i v a t i v e s a n d c l o s e l y r e l a t e d a n a l o g u e s , 1 8 a s w e l l a s X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y . F r o m a l l t h e a b o v e , X - r a y d i f f r a c t i o n h a s s o f a r b e e n t h e m o s t d i r e c t a n d d e p e n d a b l e m e t h o d . H o w e v e r , c o n s i d e r i n g t h e d i f f i c u l t i e s i n c r y s t a l l i z i n g c e r t a i n m o l e c u l e s a s w e l l a s t h e n e e d f o r m u l t i m i l l i g r a m a m o u n t s o f c o m p o u n d , X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y i s n o t a l w a y s t h e m e t h o d o f c h o i c e . O v e r t h e l a s t f e w y e a r s , i n t e r e s t i n t h i s f i e l d o f r e s e a r c h h a s f o c u s e d o n d e v e l o p i n g c h i r o p t i c a l m e t h o d s , b a s e d o n o p t i c a l r o t a t o r y d i s p e r s i o n ( O R D ) a n d c i r c u l a r d i c h r o i s m ( C D ) s p e c t r o s c o p y . T h e a d v a n t a g e o f t h e l a t t e r a p p r o a c h e s i s t h e i r s i m p l i c i t y a n d g r e a t s e n s i t i v i t y ; t h e y g e n e r a l l y r e q u i r e o n l y u M c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c o m p o u n d o f i n t e r e s t , a n d p e r f o r m w e l l i n s u i t a b l y c a l i b r a t e d c a s e s . H o w e v e r , s o f a r t h e i r u s e h a s b e e n l i m i t e d . 2 4 5 W e h a v e b e e n i n t e r e s t e d i n e x p a n d i n g t h e u s e o f C D - b a s e d s p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u e s b y d e s i g n i n g n e w g e n e r a l s y s t e m s f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f C h i r a l i t y . O u r a p p r o a c h h a s b e e n f o c u s e d o n d e v e l o p i n g n o v e l , e a s y t o u s e a n d a c c e s s i b l e c h r o m o p h o r e h o s t s y s t e m s t h a t a c t a s r e p o r t e r s o f C h i r a l i t y w h e n b o u n d t o c h i r a l g u e s t m o l e c u l e s a n d w o u l d r e s u l t i n t h e u n a m b i g u o u s a s s i g n m e n t o f t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y w i t h o u t t h e n e e d f o r e m p i r i c a l c o r r e l a t i o n s . 5 . 2 O p t i c a l R o t a t o r y D i s p e r s i o n ( O R D ) a n d C i r c u l a r D i c h r o i s m ( C D ) B a s i c p r i n c i p l e s o f P h y s i c s t e a c h u s t h a t l i g h t i s a t r a n s v e r s e w a v e , c o n s i s t i n g o f b o t h a n e l e c t r i c a n d a m a g n e t i c fi e l d ( F i g u r e 5 - 3 ) . T h e e l e c t r i c fi e l d , E , t h e m a g n e t i c fi e l d , H , a n d t h e d i r e c t i o n i n w h i c h t h e w a v e p r o p a g a t e s f o r m a r i g h t h a n d e d c o o r d i n a t e s y s t e m . ' 9 ' 2 ° D i r e c t i o n o f P r o p a g a t l o n F i g u r e 5 - 3 . L i g h t a s a n e l e c t r o m a g n e t i c r a d i a t i o n 2 4 6 " t h p o l a r i z e d p o l a r i z e d l i g h t N a t u r a l l i g h t f r o m o r d i n a r y s o u r c e s s h o w s n o p r e f e r e n c e f o r a p a r t i c u l a r p l a n e o f p o l a r i z a t i o n a n d i s a x i a l l y s y m m e t r i c ( u n p o l a r i z e d ) . T h i s i s b e c a u s e t h e e x t r e m e l y l a r g e n u m b e r o f o s c i l l a t o r s i n a l i g h t s o u r c e i s s t a t i s t i c a l l y d i s t r i b u t e d u n i f o r m l y o v e r a l l P o l a r i z i n g : . f i l t e r L i n e a r l y L e f t a n d r i g h t c i r c u l a r l y x I L i g h t p r o p a g a t i o n ' m w a s — ; R i g h t c i r c u l a r l y p o l a r i z e d l i g h t F i g u r e 5 - 4 . L i n e a r l y a n d c i r c u l a r l y p o l a r i z e d L i g h t d i r e c t i o n s ( F i g u r e 5 4 ) . H o w e v e r , w h e n l i g h t p a s s e s t h r o u g h a p o l a r i z i n g f i l t e r o n l y t h e s u b s e t w i t h p a r a l l e l o s c i l l a t i o n i n t h e d i r e c t i o n o f t h e fi l t e r s u r v i v e s a n d i s r e f e r r e d t o a s l i n e a r l y ( o r p l a n e - ) p o l a r i z e d l i g h t . L i n e a r l y p o l a r i z e d l i g h t c o n s i s t s o f a p a i r o f c i r c u l a r l y p o l a r i z e d b e a m s , l e f t a n d r i g h t , a s s c h e m a t i c a l l y s h o w n i n F i g u r e 5 - 4 . I n t h i s c a s e , t h e e l e c t r i c fi e l d r e m a i n s c o n s t a n t i n m a g n i t u d e , b u t t r a c e s o u t a h e l i x a s a f u n c t i o n o f t i m e . ” R i g h t c i r c u l a r l y p o l a r i z e d l i g h t t r a c e s o u t a p o s i t i v e ( P ) h e l i x , a l s o c a l l e d r i g h t h a n d e d , w h i l e t h a t o f t h e l e f t c i r c u l a r l y p o l a r i z e d l i g h t i s t h e m i r r o r i m a g e ( M h e l i x ) . W h e n c i r c u l a r l y p o l a r i z e d l i g h t i n t e r a c t s w i t h a n a c h i r a l , o r r a c e m i c m i x t u r e , b o t h i t s c o m p o n e n t s , l e f t a n d r i g h t , a r e e q u a l l y a f f e c t e d . H o w e v e r , i n t h e p r e s e n c e o f a c h i r a l m o l e c u l e , t h e i n t e r a c t i o n o f o n e o f t h e h e l i c a l f o r m s o f l i g h t i s m o r e f a v o r a b l e . T h i s 2 4 7 i n t e r a c t i o n t r a n s l a t e s i n t o d i f f e r e n c e o f t h e a b s o r p t i o n o f t h e t w o c o m p o n e n t s o f t h e p o l a r i z e d l i g h t . 2 2 T h i s p h e n o m e n o n , f i r s t o b s e r v e d b y A i m é C o t t o n ( 1 8 6 9 - 1 9 5 1 ) , i s r e f e r r e d t o a s t h e C o t t o n E f f e c t ( C E ) . A p h y s i c a l e x p l a n a t i o n f o r t h e a b o v e o b s e r v a t i o n i n v o l v e s t h e d i f f e r e n t r e f r a c t i v e i n d i c e s a s s o c i a t e d w i t h r i g h t a n d l e f t c i r c u l a r l y p o l a r i z e d l i g h t ( n L a n d m e r e s p e c t i v e l y ) . T h i s d i f f e r e n c e , w h i c h c o r r e s p o n d s t o d i f f e r e n t v e l o c i t i e s o f l i g h t , r e s u l t s i n O p t i c a l R o t a t o r y D i s p e r s i o n ( O R D ) . S i n c e t h e t w o c o m p o n e n t s o f t h e c i r c u l a r l y p o l a r i z e d l i g h t t r a v e l t h r o u g h a n o p t i c a l l y a c t i v e m e d i u m w i t h d i f f e r e n t s p e e d , t h e i r v e l o c i t i e s a r e n o a [ G I - 2 7 E q u a t i o n 5 - 1 . a : a n g l e o f r o t a t i o n ( d e g ) ; a . c o n c e n t r a t i o n ( m L “ ) ; r . s a m p l e p a t h l e n g t h ( c m ) l o n g e r i n p h a s e . T h e r e s u l t a n t v e c t o r h a s b e e n r o t a t e d b y a n a n g l e ( a ) r e l a t i v e t o t h e o r i g i n a l p l a n e o f p o l a r i z a t i o n . T h e s p e c i fi c r o t a t i o n , [ 0 1 , c a n b e c a l c u l a t e d f r o m t h e o b s e r v e d a n g l e o f r o t a t i o n , o r , a c c o r d i n g t o E q u a t i o n 5 - 1 . I t i s [ a ] t h a t , a s a f u n c t i o n o f w a v e l e n g t h , i s m e a s u r e d b y O R D . I n t h e o r y , O R D c a n b e d e t e c t e d a t a l l w a v e l e n g t h s s i n c e i t i s s o l e l y b a s e d o n t h e d i f f e r e n c e o f t h e r e f r a c t i v e i n d i c e s . A l l c h i r a l c o m p o u n d s e x h i b i t a m o l e c u l a r r e f r a c t i o n a t a l m o s t a n y w a v e l e n g t h o f i n c i d e n t r a d i a t i o n . C o m m o n l y , o p t i c a l r o t a t i o n a t t h e s o d i u m D - l i n e ( 5 8 9 n m ) h a s b e e n u s e d t o d e t e c t a n d q u a n t i t a t e o p t i c a l a c t i v i t y . W h e n a n o p t i c a l l y a c t i v e m a t e r i a l i n t e r a c t s w i t h c i r c u l a r l y p o l a r i z e d l i g h t , i n A 8 = 8 L — 8 , , E q u a t l o n 5 - 2 . a , 5 , ; a r e t h e m o l a r a b s o r p t i o n c o e f f i c i e n t s f o r l e f t a n d r i g h t c i r c u l a r l y p o l a r i z e d l i g h t 2 4 8 a d d i t i o n t o t h e v e l o c i t y , t h e a b s o r b a n c e o f t h e t w o l i g h t c o m p o n e n t s i s d i f f e r e n t , a s w e l l . T h e d i f f e r e n c e i n m o l a r a b s o r p t i v i t y , A 8 , i s d e fi n e d a s C i r c u l a r D i c h r o i s m ( C D ) , a n d i s c a l c u l a t e d a s s h o w n i n E q u a t i o n 5 - 2 . n m n m A . P o s i t i v e C D 3 . N e g a t i v e C D F i g u r e 5 - 5 . P o s i t i v e ( A ) a n d n e g a t i v e ( B ) C o t t o n e f f e c t s S i n c e C D i s a n a b s o r p t i v e p r o c e s s , i t i s o n l y p r e s e n t i n t h e v i c i n i t y o f t h e m o l e c u l e s F i g u r e 5 - 6 . T h e r i g h t h a n d r u l e t o d e t e r m i n e t h e d i r e c t i o n o f m a g n e t i c d i p o l e t r a n s i t i o n m o m e n t ( m ) a b s o r p t i o n b a n d . T h e r e f o r e , i n o r d e r f o r a C D s p e c t r u m t o b e o b s e r v e d , t h e c h i r a l m o l e c u l e s t u d i e d n e e d s t o c o n t a i n a c h r o m o p h o r e . T h e s h a p e a n d a p p e a r a n c e o f a C D c u r v e c l o s e l y r e s e m b l e s t h a t o f t h e U V - v i s s p e c t r u m o f t h e e l e c t r o n i c t r a n s i t i o n t o w h i c h i t c o r r e s p o n d s . H o w e v e r , u n l i k e a U V - v i s a b s o r p t i o n b a n d , C D s p e c t r a m a y b e b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e , a s s h o w n i n F i g u r e 5 - 5 . T h e s e p e a k s a r e o fi e n r e f e r r e d t o a s C o t t o n e f f e c t s . A s b r i e fl y m e n t i o n e d b e f o r e , w h e n a 2 4 9 m o l e c u l e i s i r r a d i a t e d , t h e a b s o r p t i o n o f l i g h t p r o m o t e s a n e l e c t r o n f r o m i t s g r o u n d t o a n e x c i t e d s t a t e . T h i s c h a r g e p o l a r i z a t i o n c r e a t e s a m o m e n t a r y d i p o l e , c o m m o n l y r e f e r r e d t o a s E l e c t r i c D i p o l e T r a n s i t i o n M o m e n t ( a ) . F o r a n a c h i r a l m o l e c u l e , t h e n e t e l e c t r o n r e d i s t r i b u t i o n d u r i n g t h i s p r o c e s s i s a l w a y s p l a n a r . H o w e v e r , i n t h e c a s e o f a n o p t i c a l l y a c t i v e m a t e r i a l , t h e e l e c t r o n r e a r r a n g e m e n t d u r i n g t h e a b o v e t r a n s i t i o n o c c u r s i n a h e l i c a l m a n n e r . T h i s h e l i c a l m o v e m e n t i n t e r a c t s d i f f e r e n t l y w i t h t h e l e f t a n d r i g h t c i r c u l a r l y p o l a r i z e d l i g h t g i v i n g r i s e t o t h e o b s e r v e d C o t t o n e f f e c t . R = p o m = l a | m | | c o s fl E q u a t i o n 5 - 3 . , u : e l e c t r i c t r a n s i t i o n d i p o l e m o m e n t ; m m a g n e t i c t r a n s i t i o n d i p o l e m o m e n t ; [ 3 : a n g l e b e t w e e n t h e t w o d i p o l e m o m e n t s T h e r o t a t i o n o f t h e e l e c t r i c c h a r g e , d e s c r i b e d a b o v e , i s r e s p o n s i b l e f o r c r e a t i n g a m a g n e t i c f i e l d , t h e s t r e n g t h a n d d i r e c t i o n o f w h i c h c a n b e d e s c r i b e d b y t h e t e r m M a g n e t i c D i p o l e T r a n s i t i o n M o m e n t ( m ) . 2 T h e d i r e c t i o n o f m c a n b e d e t e r m i n e d b y a p p l y i n g t h e “ r i g h t h a n d r u l e ” t o t h e r o t a t i o n o f t h e c i r c u l a r e l e c t r i c c u r r e n t , a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 5 - 6 . I n p a r t i c u l a r , w h e n t h e r i g h t h a n d fi n g e r s a r e c u r v e d a c c o r d i n g t o t h e e l e c t r o n f l o w , t h e o u t s t r e t c h e d t h u m b p o i n t s t h e d i r e c t i o n o f m . T h e s i g n a n d s t r e n g t h o f a C D C o t t o n e f f e c t i s r e p r e s e n t e d b y r o t a t i o n a l s t r e n g t h , R , C W ? d i r e c t i o n o f . . d i r e c t i o n o f e l e c t r o n f l o w ( M ) H e l i x ( P ) H e l i x e l e c t r o n f l o w . / , / m M / m F i g u r e 5 - 7 . T h e d i p o l e t r a n s i t i o n m o m e n t s f o r h e x a h e l i c e n e 2 5 0 6 i t s o u r c e l i n e L h l i g m a o n o c « r l y p h l < o r 2 a o m a . r . i z e t d o r l i g 7 h t e d u l a t , o r a m o s a m p a c i r c u l a r l y p o l a r i z e d l i g h t e l ‘ a s s h o w n i n E q u a t i o n 5 - 3 . T h e s i g n o f t h e C D c u r v e i s p o s i t i v e w h e n t h e a n g l e ( fl ) b e t w e e n t h e v e c t o r s o f t h e t w o d i p o l e m o m e n t s i s a c u t e ( 0 ° 5 , 6 < 9 0 ° ) , a n d n e g a t i v e w h e n t h e a n g l e i s o b t u s e ( 9 0 ° < , 8 5 1 8 0 ° ) . T h e r e i s n o C D p r e s e n t w h e n t h e t w o d i p o l e m o m e n t s a r e p e r p e n d i c u l a r t o e a c h o t h e r . T h e h e l i c a l m o t i o n o f t h e e l e c t r o n s o f c h i r a l c o m p o u n d s d u r i n g e x c i t a t i o n c a n b e e a s i l y d e m o n s t r a t e d i n t h e c a s e o f h e x a h e l i c e n e , t h e h e l i c a l m o l e c u l e p r e v i o u s l y i n t r o d u c e d ( F i g u r e 5 - 7 ) . W h e n t h i s m o l e c u l e i s i r r a d i a t e d , t h e d i r e c t i o n o f t h e e l e c t r o n fl o w f o l l o w s t h e p h y s i c a l s h a p e o f t h e s t r u c t u r e , t r a c i n g o u t a h e l i x . F o r a l l i s o m e r i c f o r m s o f h e x a h e l i c e n e t h e e l e c t r i c t r a n s i t i o n d i p o l e m o m e n t i s i d e n t i c a l , s i n c e i t o n l y d e p e n d s o n t h e c h a r g e s e p a r a t i o n d u r i n g e x c i t a t i o n . H o w e v e r , t h e d i r e c t i o n o f t h e m a g n e t i c d i p o l e t r a n s i t i o n m o m e n t i s o p p o s i t e f o r t h e t w o h e l i c a l e n a n t i o m e r s , d u e t o t h e C D s p e c t r u m A s 0 L I . _ n m L o c k - i n a m p l i f i e r p h o t o m u l t i p l i e r t u b e F i g u r e 5 - 8 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f a C D s p e c t r o p o l a r i m e t e r o p p o s i t e d i r e c t i o n s o f t h e e l e c t r o n fl o w . T h e r e f o r e , a c c o r d i n g t o E q u a t i o n 5 - 3 , i n t h e c a s e o f t h e M - h e l i x , t h e a n t i p a r a l l e l a l i g n m e n t o f t h e t r a n s i t i o n m o m e n t s w i l l l e a d t o a n e g a t i v e C D s i g n a l , w h i l e a p o s i t i v e C o t t o n e f f e c t i s o b s e r v e d w h e n t h e P - h e l i c a l c o n f o r m a t i o n i s a d o p t e d . 2 5 1 B o t h O R D a n d C D s p e c t r o s c o p y c a n b e r e c o r d e d u s i n g S p e c t r o p o l a r i m e t e r s ( a l s o c a l l e d C i r c u l a r D i c h r o m e t e r s ) . F i g u r e 5 - 8 d e p i c t s t h e e s s e n t i a l f e a t u r e s p r e s e n t i n a C D s p e c t r o p o l a r i m e t e r i n s t r u m e n t . T h e l i g h t s o u r c e , t y p i c a l l y f r o m a X e n o n l a m p , p a s s e s t h r o u g h a m o n o c h r o m a t o r , c o n s i s t i n g o f a s e r i e s o f c r y s t a l p r i s m s , t o a f f o r d l i n e a r l y p o l a r i z e d l i g h t . T h i s l i g h t i s t h e n s e p a r a t e d i n t o r i g h t a n d l e f t c i r c u l a r l y p o l a r i z e d b y t h e m o d u l a t o r b e f o r e a p p l i e d t o t h e s a m p l e . T h e t r a n s m i t t e d l i g h t i s c o l l e c t e d i n t h e p h o t o m u l t i p l i e r t u b e a n d t r a n s f o r m e d i n t o a c u r r e n t , t h e m a g n i t u d e o f w h i c h s o l e l y d e p e n d s o n t h e n u m b e r o f i n c i d e n t p h o t o n s . T h i s c u r r e n t i s s u b s e q u e n t l y d e t e c t e d b y a l o c k - i n a m p l i f i e r a n d r e c o r d e d . M o s t C D S p e c t r o p o l a r i m e t e r s m e a s u r e d i f f e r e n t i a l a b s o r b a n c e , A A , b e t w e e n t h e l e f t a n d r i g h t c i r c u l a r l y p o l a r i z e d l i g h t . B a s e d o n L a m b e r t - B e e r ’ s L a w , t h i s a b s o r b a n c e c a n b e c o n v e r t e d i n t o t h e d i f f e r e n c e o f t h e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t s , A 8 , a c c o r d i n g t o E q u a t i o n 5 - 4 . A A = A 8 c l E q u a t i o n 5 4 . A A : d i f f e r e n c e i n a b s o r b a n c e ; A s . d i f f e r e n c e i n m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s ( M ' 1 L ' 1 ) ; 5 . 2 . a A p p l i c a t i o n s o f O R D a n d C D S p e c t r o s c o p y A s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d , b o t h O R D a n d C D a r e o b s e r v e d o n l y i n t h e p r e s e n c e o f c h i r a l m o l e c u l e s a n d , t h e r e f o r e , c a n b e u s e d t o d e t e c t a n d q u a n t i t a t e o p t i c a l a c t i v i t y . H o w e v e r , i t s h o u l d b e e m p h a s i z e d t h a t n e i t h e r o f t h e l a t t e r s p e c t r o s c 0 p i e s c a n a l l o w f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n o f a c h i r a l c o m p o u n d . 2 5 2 2 4 S e v e r a l a t t e m p t s h a v e b e e n r e p o r t e d f o r e s t a b l i s h i n g e m p i r i c a l ” a n d 1 2 5 ’ 2 6 r u l e s t h a t w o u l d p e r m i t t h e a p r i o r i c a l c u l a t i o n o f t h e e x p e c t e d O R D s e m i e m p i r i c a a n d C D s p e c t r u m o f a g i v e n s t r u c t u r e . 2 7 T h e c a l c u l a t e d s p e c t r a c a n t h e n b e c o m p a r e d w i t h t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s a n d t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f a c h i r a l c o m p o u n d i s e m p i r i c a l l y a s s i g n e d . H o w e v e r , g i v e n t h e c o m p l e x i t y o f m o s t s y s t e m s , e s t i m a t i n g a t h e o r e t i c a l s p e c t r u m c a n b e a n e x t r e m e l y d i f fi c u l t t a s k . T h e r e f o r e , t h e s e r u l e s a r e t o b e a p p l i e d w i t h g r e a t c a u t i o n , a n d s i m p l e a p p l i c a t i o n d o e s n o t n e c e s s a r i l y a l l o w f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n . A s e c o n d a p p r o a c h i n t h e a t t e m p t t o u t i l i z e t h e c h i r o p t i c a l t e c h n i q u e s f o r t h e a s s i g n m e n t o f C h i r a l i t y , i n v o l v e s t h e t h e o r e t i c a l c a l c u l a t i o n o f t h e s p e c i fi c r o t a t i o n a n g l e 2 8 ‘ 2 9 A d v a n c e s i n c o m p u t a t i o n a l c h e m i s t r y a l l o w f o r t h e o f o p t i c a l l y a c t i v e m o l e c u l e s . q u a n t u m m e c h a n i c a l c a l c u l a t i o n o f t h e e l e c t r i c - d i p o l e , m a g n e t i c - d i p o l e p o l a r i z a t i o n ( G ) , 3 0 a m e a s u r e o f t h e o v e r l a p o f t h e o v e r l a p o f t h e e l e c t r o n i c p o l a r i z a t i o n i n d u c e d b y t h e e l e c t r i c a n d t h e m a g n e t i c f i e l d o f t h e i n c i d e n t l i g h t . T h i s c a l c u l a t i o n , r o u t i n e l y p e r f o r m e d u s i n g t h e c o u p l e d - p e r t u r b e d H a r t r e e - F o c k m e t h o d , l e a d s t o t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e s p e c i f i c a n g l e o f r o t a t i o n o f a c h i r a l c o m p o u n d . A c c o r d i n g t o t h i s m e t h o d , d e v e l o p e d b y B e r a t a n a n d c o w o r k e r s , t h e i n d i v i d u a l c o n t r i b u t i o n s o f a l l a t o m s a n d f u n c t i o n a l g r o u p s a r e c a l c u l a t e d a n d s u m m e d u p t o y i e l d a s p e c i fi c r o t a t i o n a n g l e . 3 1 ’ 3 2 T h e v a l u e o b t a i n e d , c o n t a i n i n g i n f o r m a t i o n o n t h e s i g n a n d m a g n i t u d e o f t h e o p t i c a l r o t a t i o n a n g l e , i s t h e n c o m p a r e d w i t h t h e e x p e r i m e n t a l v a l u e s a n d t h e s t e r e o c h e m i s t r y i s a s s i g n e d . 3 3 T h i s m e t h o d o l o g y , p r o v e n u s e f u l f o r l a r g e , fl e x i b l e m o l e c u l e s w i t h m u l t i p l e c h i r a l c e n t e r s , h a s b e e n s u c c e s s f u l l y a p p l i e d f o r t h e s t e r e o c h e m i c a l a s s i g n m e n t o f s e v e r a l n a t u r a l p r o d u c t s . 3 4 ' 3 6 H o w e v e r , s o f a r , i t h a s n o t b e e n a c c e p t e d a s a g e n e r a l m e t h o d s i n c e 2 5 3 a d d i t i o n a l w o r k n e e d s t o b e d o n e t o d e t e r m i n e t h e p o s s i b l e l i m i t a t i o n s o f t h i s f u n d a m e n t a l a p p r o a c h t o s t r u c t u r a l a n a l y s i s . 5 . 3 E x c i t o n C o u p l e d C i r c u l a r D i c h r o i s m ( E C C D ) 5 . 3 . a T h e t h e o r e t i c a l b a c k g r o u n d o f E C C D A s p r e v i o u s l y e x p l a i n e d , t h e i n t e r a c t i o n o f l i g h t w i t h c h i r a l c o m p o u n d s g i v e s r i s e t o b o t h a n e l e c t r i c ( , u ) a n d a m a g n e t i c ( m ) d i p o l e t r a n s i t i o n m o m e n t d u e t o a h e l i c a l m o v e m e n t o f e l e c t r o n s . T h e s i m p l e c a s e o f o n e i n t e r a c t i n g c h r o m o p h o r e w a s d e s c r i b e d a b o v e . H o w e v e r , w h e n t h e m o l e c u l e c o n t a i n s t w o o r m o r e c h r o m o p h o r e s , t h r o u g h s p a c e E x c i t e d s t a t e e n e r g y G r o u n d s t a t e c h r o m o p h o r e i E x c i t o n s y s t e m c h r o m o p h o r e j l o c a l e x c i t a t i o n d e l o c a l i z e d l o c a l e x c i t a t i o n e x c fi a fi o n F i g u r e 5 - 9 . S p l i t t i n g o f t h e e x c i t e d s t a t e s o f i s o l a t e d c h r o m o p h o r e s i a n d j b y e x c i t o n i n t e r a c t i o n . T h e e n e r g y g a p 2 v i j i s c a l l e d D a v y d o v s p l i t t i n g i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e m c o m p l i c a t e s t h e o b s e r v e d s p e c t r u m . T o s i m p l i f y t h e s y s t e m , t h e c a s e o f t w o d e g e n e r a t e c h r o m o p h o r e s i n t e r a c t i n g w i t h e a c h o t h e r w i l l b e d i s c u s s e d b e l o w . W h e n t w o i d e n t i c a l , n o n c o n j u g a t e d c h r o m o p h o r e s a r e n e a r b y i n s p a c e , t h e r e i s a s i g n i fi c a n t c o u p l i n g t h a t o c c u r s b e t w e e n t h e t r a n s i t i o n s o f t h e s a m e e n e r g y . U p o n 2 5 4 — > | ' 1 — M D a v y d o v s p l i t t i n g _ . “ 4 — A A e x c i t a t i o n , d u e t o t h i s t h r o u g h s p a c e i n t e r a c t i o n , t h e e x c i t e d s t a t e ( e x c i t o n ) 3 7 i s s p l i t i n t o t w o s t a t e s , a a n d , 6 , b y r e s o n a n c e i n t e r a c t i o n o f t h e l o c a l e x c i t a t i o n s ( F i g u r e 5 - 9 ) . T h e t r a n s i t i o n s f r o m t h e g r o u n d s t a t e t o e i t h e r a o r , 6 s t a t e a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e t w o d i f f e r e n t U V - v i s a b s o r b a n c e s , a s s h o w n i n F i g u r e 5 - 1 0 A . T h e d i f f e r e n c e i n t h e h u m o f t h e t w o U V - v i s p e a k s i s d u e t o t h e e n e r g y g a p , 2 v i j , s h o w n i n F i g u r e s 5 - 9 a n d 5 - 1 0 , a n d i s c a l l e d t h e D a v y d o v s p l i t t i n g . I f t h i s e n e r g y g a p i s s m a l l , t h e t w o s e p a r a t e p e a k s o v e r l a p a n d a p p e a r a s o n e i n t h e s p e c t r a l t r a c e . I n a c h i r a l m o l e c u l e , t h e a f o r e m e n t i o n e d t h r o u g h s p a c e c o u p l i n g o f t r a n s i t i o n s r e s u l t s i n i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e e l e c t r i c d i p o l e t r a n s i t i o n m o m e n t s ( e d t m ) o f e a c h c h r o m o p h o r e i n a c h i r a l , h e l i c a l f a s h i o n . D e p e n d i n g o n w h e t h e r t h e d i p o l e t r a n s i t i o n ’ I \ I \ B I \ F i g u r e 5 - 1 0 . T h e U V s p e c t r u m ( A ) a n d E C C D s p e c t r u m ( B ) u p o n t h r o u g h s p a c e i n t e r a c t i o n o f t w o d e g e n e r a t e c h r o m o p h o r e s . T h e t w o o b s e r v e d C o t t o n e f f e c t s a r e s h o w n u s i n g d a s h e d l i n e s , w h i l e t h e o b s e r v e d , s u m m a t i o n c u r v e s a r e i n s o l i d l i n e s . m o m e n t s a r e i n p h a s e ( s y m m e t r i c ) o r o u t o f p h a s e ( a n t i s y m m e t r i c ) , a C o t t o n e f f e c t o f d i f f e r e n t s i g n i s p r o d u c e d . A s c a n b e s e e n i n F i g u r e 5 - 1 O B , t h e D a v y d o v g a p i s a l s o 2 5 5 p r e s e n t i n t h e C D s p e c t r a , s i n c e t h e t w o C o t t o n e f f e c t s , o n e p o s i t i v e a n d o n e n e g a t i v e , a r e n o t i n p h a s e . T h e p h y s i c a l s u m m a t i o n o f t h e s e t w o o u t o f p h a s e C o t t o n e f f e c t s w i t h o p p o s i t e s i g n i s r e s p o n s i b l e f o r t h e c h a r a c t e r i s t i c b i s i g n a t e s p e c t r u m . T h i s p h e n o m e n o n , b a s e d o n t h e t h r o u g h s p a c e e x c i t o n c o u p l i n g b e t w e e n t w o o r m o r e n o n - c o n j u g a t e d c h r o m o p h o r e s i s c a l l e d E x c i t o n C o u p l e d C i r c u l a r D i c h r o i s m ( E C C D ) . T h e a b o v e d e s c r i p t i o n c l a r i fi e s t h e r e a s o n w h y t h e E C C D s p e c t r u m c o n s i s t s o f t w o d i f f e r e n t C o t t o n e f f e c t s . H o w e v e r , i n o r d e r t o f u r t h e r u n d e r s t a n d t h i s p h e n o m e n o n , i t s a p p l i c a t i o n o n a s p e c i fi c m o l e c u l e , b e a r i n g t w o i d e n t i c a l b e n z o a t e g r o u p s , w i l l b e e x a m i n e d . 3 8 ' 3 9 T h e l a r g e B e n z o a t e e s t e r s e x h i b i t a s t r o n g U V - v i s a b s o r p t i o n a t ~ 2 3 0 n m . e l e c t r i c d i p o l e t r a n s i t i o n m o m e n t , u o f e a c h b e n z o a t e g r o u p i s o r i e n t e d c o l i n e a r l y w i t h t h e l o n g a x i s o f t h e m o l e c u l e , a l m o s t p a r a l l e l t o t h e d i r e c t i o n o f t h e C - 0 e s t e r b o n d ( F i g u r e 5 - 1 1 A ) a n d o s c i l l a t e s i n b o t h d i r e c t i o n s . I t h a s b e e n k n o w n t h a t t h e f a v o r e d c o n f o r m a t i o n o f d i b e n z o a t e m o l e c u l e s a s t h e o n e s h o w n i n F i g u r e 5 - 1 1 p l a c e s t h e a x i a l h y d r o g e n o n t h e r i n g s y n t o t h e c a r b o n y l o f t h e e s t e r . L o o k i n g d o w n t h e C - C b o n d c o n n e c t i n g t h e t w o e s t e r g r o u p s , f r o m f r o n t t o b a c k , t h e o r i e n t a t i o n o f t h e t w o b e n z o a t e g r o u p s i s s e t i n a c l o c k w i s e m a n n e r . T h e i n d i v i d u a l e d t m , u o f a n e l e c t r i c t r a n s i t i o n , f o r e a c h c h r o m o p h o r e , c o u p l e s i n p h a s e ( s y m m e t r i c ) o r o u t o f p h a s e ( a s y m m e t r i c ) ( F i g u r e 5 - 1 1 B , ( i ) a n d ( i i ) r e s p e c t i v e l y ) . I n t h e c a s e o f i n p h a s e c o u p l i n g , t h e “ t o t a l ” e d t m i s o r i e n t e d a l o n g t h e c h r o m o p h o r i c C 2 a x i s , w h i l e d u r i n g t h e o u t o f p h a s e i n t e r a c t i o n t h e e d t m i s p e r p e n d i c u l a r t o i t . T h e c h a r g e r o t a t i o n a s s o c i a t e d w i t h t h e t r a n s i t i o n c a n b e v i s u a l i z e d b y p l a c i n g t h e p a r t i a l e d t m i n a c y l i n d e r , a l i g n e d a l o n g t h e a x i s o f t h e t o t a l e d t m , , u . A s s h o w n i n F i g u r e 2 5 6 A C A s p ( 7 ‘ ( m | o o 1 " C o t t o n e f f e c t n e r m f u f e c t m i C 2 H n i t g e h r o u E c n l e o r c g w k y i N C e o g t a t t o i n v e e f f e c n d e s t 2 ” C “ C D o s t t o n p e c t P o s r - t - i v e E C § > \ \ 9 6 P ‘ ( i i ) ) n K E E C > 0 C ‘ I ” O o t s t i o t i n v e . W e e r I f f S e g y G c t L — P o 1 , , C F i g u r e 5 - 1 1 . T h e q u a l i t a t i v e e x p l a n a t i o n o f E C C D . A . S t r u c t u r e s o f b e n z o a t e a n d d i b e n z o a t e e s t e r s . E l e c t r i c t r a n s i t i o n d i p o l e m o m e n t s a r e s h o w n i n r e d ; B . P o s s i b l e i n p h a s e ( i ) a n d o u t o f p h a s e ( i i ) i n t e r a c t i o n s o f t h e e l e c t r i c t r a n s i t i o n d i p o l e m o m e n t s o f t h e d e g e n e r a t e c h r o m o p h o r e s ( s h o w n i n b l u e ) ; C . E x p e c t e d E C C D s p e c t r u m o f d i b e n z o a t e , a n d i t s r a t i o n a l i z a t i o n . 5 - 1 1 C ( i ) , t h e s y m m e t r i c c o u p l i n g r e s u l t s i n a c o u n t e r c l o c k w i s e h e l i c a l m o v e m e n t a n d , t h e r e f o r e , a c c o r d i n g t o t h e r i g h t h a n d r u l e , t h e m a g n e t i c t r a n s i t i o n d i p o l e m o m e n t , m , i s a n t i - p a r a l l e l t o a . A s e x p e c t e d , t h e o u t o f p h a s e i n t e r a c t i o n c a u s e s t h e o p p o s i t e e f f e c t , l e a d i n g t o p a r a l l e l m a n d , u v e c t o r s ( F i g u r e 5 - 1 1 C ( i i ) ) . A c c o r d i n g t o E q u a t i o n 5 - 3 , t h e 2 5 7 s i g n o f a C o t t o n e f f e c t d e p e n d s e x c l u s i v e l y o n t h e a n g l e b e t w e e n t h e e l e c t r i c a n d t h e m a g n e t i c t r a n s i t i o n d i p o l e m o m e n t . T h e r e f o r e , t h e s y m m e t r i c c o u p l i n g o f t h e e t d m w i l l p r o d u c e a n e g a t i v e p e a k ( , 6 = 1 8 0 ° , c o s fl = - 1 ) , w h i l e t h e a n t i - s y m m e t r i c a p o s i t i v e o n e ( , 6 = 0 ° , c o s fl = 1 ) , b o t h o f e q u a l m a g n i t u d e . T h e r e l a t i v e p o s i t i o n o f t h e t w o C o t t o n e f f e c t s , w h i c h d e f i n e s t h e o v e r a l l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e E C C D s p e c t r u m , d e p e n d s o n t h e r e l a t i v e e n e r g i e s o f t h e t w o o c c u r r i n g t r a n s i t i o n s . C o n s i d e r i n g t h e r e p u l s i o n b e t w e e n s a m e c h a r g e s , t h e i n p h a s e c o u p l i n g i s o f h i g h e r e n e r g y , a n d t h e r e f o r e , t h e n e g a t i v e C o t t o n e f f e c t w i l l a p p e a r a t a l o w e r w a v e l e n g t h . N o m e n c l a t u r e d i c t a t e s t h a t t h e b i s i g n a t e E C C D c u r v e i s n a m e d a f t e r t h e l o w e n e r g y , 1 S t C o t t o n e f f e c t . T h e r e f o r e , t h e s p e c t r u m o f t h e d i b e n z o a t e c a s e , s h o w n i n F i g u r e 5 - 1 1 C , i s r e f e r r e d t o a s a p o s i t i v e E C C D c u r v e . A d i f f e r e n t a p p r o a c h o f t h e E C C D t h e o r y i n v o l v e s t h e u s e o f Q u a n t u m M e c h a n i c a l p r i n c i p l e s . B a s e d o n t h e o r e t i c a l c a l c u l a t i o n s , t h e r o t a t i o n a l s t r e n g t h , R , w h i c h w e 1 ~ _ . . . R a u fl = i _ 2 _ 7 Z - 0 - 0 1 ? i j . ( l u i o a X l l ’ l j o a ) E q u a t i o n 5 - 4 . F i i fi d i s t a n c e v e c t o r b e t w e e n t w o c h r o m o p h o r e s ; u m , u m : e t d m o f e x c i t a t i o n s ; o o z e x c i t a t i o n n u m b e r o f t r a n s i t i o n f r o m 0 t o a s t a t e p r e v i o u s l y d e f i n e d i n E q u a t i o n 5 - 3 a s t h e t h e o r e t i c a l p a r a m e t e r r e p r e s e n t i n g t h e s i g n a n d s t r e n g t h o f a C o t t o n e f f e c t , c a n a l s o b e a p p r o x i m a t e d a c c o r d i n g t o E q u a t i o n 5 - 4 . T h e a b o v e e q u a t i o n i n d i c a t e s , o n c e m o r e , t h a t t h e C o t t o n e f f e c t s o f a a n d fl s t a t e s h a v e i d e n t i c a l r o t a t i o n a l s t r e n g t h o f o p p o s i t e s i g n . I n a d d i t i o n , t h e s i g n o f e a c h p e a k i n t h i s c a s e i s d e fi n e d e x c l u s i v e l y o n t h e r e l a t i v e s p a t i a l o r i e n t a t i o n o f t h e t w o c h r o m o p h o r e s . 4 0 A s s h o w n i n T a b l e 5 - 1 , 4 1 a c l o c k w i s e o r i e n t a t i o n l e a d s t o a p o s i t i v e C h i r a l i t y , w h i c h r e f e r s t o a p o s i t i v e 1 S t a n d n e g a t i v e 2 n d C o t t o n e f f e c t s , a n d v i c e v e r s a . 2 5 8 D e f i n i t i o n Q u a n t i t a t i v e D e f i n i t i o n C o t t o n e f f e c t s T a b l e 5 - 1 . D e f i n i t i o n o f E x c i t o n C h i r a l i t y f o r a b i n a r y s y s t e m Q u a l i t a t i v e P o s i t i v e C h i r a l i t y N e g a t i v e C h i r a l i t y 6 / R t } 0 ( [ 2 m x [ g o a l / 3 ' ; > 0 p o s i t i v e f i r s t a n d n e g a t i v e s e c o n d C o t t o n e f f e c t s 6 K — ‘ . . a n e a t i v e f i r s t a n d o s i t i v e \ é R i j . ( # 0 0 X M o a ) ‘ / i j < 0 9 s e c o n d p C o t t o n e f f e c t s I n c o n c l u s i o n , t h e t h r o u g h s p a c e c o u p l i n g o f t h e e d t m o f t w o , o r m o r e , n o n - c o n j u g a t e d c h r o m o p h o r e s g i v e s r i s e t o a b i s i g n a t e p e a k , d e fi n e d a s a n E C C D s p e c t r u m . T h e s i g n o f t h e p e a k i s d i c t a t e d b y t h e o r i e n t a t i o n o f t h e i n t e r a c t i n g c h r o m o p h o r e s . I f t h e e t d m f r o m f r o n t t o b a c k c o n s t i t u t e a c l o c k w i s e o r i e n t a t i o n , a p o s i t i v e b i s i g n a t e s p e c t r u m i s p r o d u c e d , w h i l e a n o p p o s i t e b u t o t h e r w i s e i d e n t i c a l s p e c t r u m i s p r o d u c e d b y t h e c o u n t e r c l o c k w i s e o r i e n t a t i o n . c h r o m o p h o r e s i n s p a c e i s k n o w n , t h e s i g n o f t h e i r E C C D s p e c t r u m c a n b e p r e d i c t e d . A t t h e s a m e t i m e , t h e s i g n o f a b i s i g n a t e E C C D p e a k e n a b l e s o n e t o d e t e r m i n e t h e r e l a t i v e 4 2 , 4 3 o r i e n t a t i o n o f t h e t w o c h r o m o p h o r e s i n s p a c e , i n a n o n - e m p i r i c a l m a n n e r . T h e a m p l i t u d e , A , o f t h e E C C D c o u p l e t , d e fi n e d a s t h e d i f f e r e n c e i n A 8 b e t w e e n t h e l S t a n d 2 n d C o t t o n e f f e c t , i s a f f e c t e d b y t h e f o l l o w i n g f a c t o r s : 4 4 a . M o l a r a b s o r p t i o n c o e fi i c i e n t ( 8 ) o f t h e i n t e r a c t i n g c h r o m o p h o r e s . T h e a m p l i t u d e i s p r o p o r t i o n a l t o 8 2 a n d , t h e r e f o r e , c h r o m o p h o r e s w i t h s t r o n g a b s o r p t i o n s a r e p r e f e r r e d f o r h i g h e r s e n s i t i v i t i e s o f t h e E C C D m e t h o d s . I n t h e p r e s e n c e o f h i g h l y a c t i v e c h r o m o p h o r e s C D m e a s u r e m e n t s c a n b e p e r f o r m e d a t m i c r o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s , a n e x t r e m e l y u s e f u l p r o p e r t y w h e n o n l y l i m i t e d a m o u n t o f a n a l y t e i s a v a i l a b l e . 2 5 9 T h e r e f o r e , a s l o n g a s t h e o r i e n t a t i o n o f t w o b . I n t e r c h r o m o p h o r i c d i s t a n c e ( R ) . T h e a m p l i t u d e i s i n v e r s e l y p r o p o r t i o n a l t o R 2 , C . t h e d i s t a n c e b e t w e e n t h e i n t e r a c t i n g c h r o m o p h o r e s . ” 4 6 T o a c h i e v e e n h a n c e d i n t e r a c t i o n , t h e c o u p l i n g c h r o m o p h o r e s s h o u l d b e c l o s e t o e a c h o t h e r i n s p a c e . I t h a s b e e n o b s e r v e d , h o w e v e r , t h a t s t r o n g c h r o m o p h o r e s , s u c h a s p o r p h y r i n s ( S o r e t b a n d h m “ a t 4 1 5 n m , e = 3 5 0 , 0 0 0 M " l c m " ) c o u p l e a t d i s t a n c e s o f > 5 0 A 4 7 4 9 P r o j e c t i o n a n g l e b e t w e e n t h e i n t e r a c t i n g c h r o m o p h o r e s . I n v i c i n a l s y s t e m s t h e A v a l u e i s m a x i m a l a t a c h r o m o p h o r i c p r o j e c t i o n a n g l e o f a r o u n d 7 0 ° . T h e r e i s n o e x c i t o n c o u p l i n g w h e n t h e c h r o m o p h o r e s a r e e i t h e r p a r a l l e l o r p e r p e n d i c u l a r t o e a c h o t h e r . N u m b e r o f i n t e r a c t i n g c h r o m o p h o r e s . T h e p r i n c i p l e o f p a i r - w i s e a d d i t i v i t y h o l d s i n s y s t e m s c o m p r i s i n g o f t h r e e o r m o r e c h r o m o p h o r e s . F o r e x a m p l e , i n 1 3 0 h e x a p y r a n o s e s s u b s t i t u t e d w i t h p - b r o m o b e n z o a t e a n d p - m e t h o x y c i n n a m a t e c h r o m o p h o r e s ( A m , 3 0 6 n m , e = 2 3 , 4 0 0 M ' 1 c m ' l ) , t h e c h a r a c t e r i s t i c 2 2 0 - 3 6 0 n m r a n g e C D s a r e i n e x c e l l e n t a g r e e m e n t w i t h t h e p a i r w i s e s u m m a t i o n c u r v e s . ” 5 0 T h i s o b s e r v a t i o n i s a l s o s u p p o r t e d b y t h e o r e t i c a l c a l c u l a t i o n s . 5 1 ' 5 3 F i n a l l y , e x c i t o n c o u p l i n g c a n o c c u r b e t w e e n i n t e r c h r o m o p h o r i c s y s t e m s . T h e U V - v i s a b s o r p t i o n A W v a l u e s f o r t h e i n t e r a c t i n g c h r o m o p h o r e s n e e d t o b e c l o s e , h o w e v e r f o r b i c h r o m o p h o r i c s y s t e m s , e x c i t o n c o u p l i n g h a s b e e n o b s e r v e d e v e n w h e n t h e a b s o r p t i o n m a x i m a d i f f e r b y ~ 6 0 n m , a s f o r t h e c a s e o f t h e p - b r o m o b e n z o a t e ( A m , 2 4 4 n m , 8 = 1 9 , 5 0 0 ) ; p - d i m e t h y l a m i n o b e n z o a t e ( A m , 3 0 7 n m , e = 2 8 , 5 0 0 M ‘ 1 c m " ) s y s t e m . I n s y s t e m s c o n t a i n i n g t w o d i f f e r e n t c h r o m o p h o r e s , t w o o p p o s i t e C o t t o n e f f e c t s a p p e a r , s l i g h t l y r e d - a n d b l u e - s h i f t e d f r o m t h e r e s p e c t i v e m a x i m a o f t h e i n t e r a c t i n g 2 6 0 5 4 T h e i n t e r a c t i n g c h r o m o p h o r e s d o n o t h a v e t o b e w i t h i n t h e s a m e c h r o m o p h o r e s . m o l e c u l e , a s l o n g a s t h e y a r e i n c l o s e p r o x i m i t y i n s p a c e . I n p a r t i c u l a r , s u p r a m o l e c u l a r c o m p o u n d s , l i k e s t a c k i n g o f a n t h o c y a n i n s 5 5 a n d p o r p h y r i n c o n t a i n i n g b r e v e t o x i n s 4 9 h a v e b e e n r e p o r t e d t o g i v e r i s e t o e x c i t o n c o u p l e d C D b a n d s . 5 . 3 b A p p l i c a t i o n s o f t h e E C C D m e t h o d 5 . 3 b . i D i r e c t A p p l i c a t i o n S i n c e , a s p r e v i o u s l y p r o v e n , t h e E C C D s p e c t r u m i s a d i r e c t r e s u l t o f t h e r e l a t i v e o r i e n t a t i o n o f t w o i n t e r a c t i n g c h r o m o p h o r e s , s e v e r a l d i r e c t a p p l i c a t i o n s h a v e b e e n d e v e l o p e d , b o t h o f c h e m i c a l a n d b i o c h e m i c a l i n t e r e s t . I n t h e o r y , a l l t h e p r e v i o u s l y m e n t i o n e d c h i r a l f o r m s ( P a r t 5 . 1 ) c a n b e s t u d i e d b y E C C D , a s l o n g a s t h e y b e a r c h r o m o p h o r e s w i t h i n t h e m . R e c e n t e x a m p l e s i n c l u d e t h e s t u d y o f t h e l i n e a r t e t r a p y r r o l e a t r o p i s o m e r s , 5 6 a s w e l l a s h e l i c a l c o n f o r m a t i o n s o f 1 , 2 - d i a r n i n o c y c l o h e x e n e d e r i v a t i v e s , 5 7 a n d p o l y i s o c y a n i d e p o s s e s s i n g p o r p h y r i n p e n d a n t s . 5 8 T h e E C C D m e t h o d h a s a l s o b e e n e x t e n s i v e l y u s e d f o r s u p r a m o l e c u l a r s t r u c t u r e s , a s i n t h e f o r m a t i o n o f m u l t i c h r o m o p h o r i c a s s e m b l i e s , u s i n g m e r o c y a n i n e d y e s , 5 9 p o l y m e r i c p o r p h y r i n c o m p a r t m e n t s w i t h a c h i r a l t w i s t , 6 0 a s w e l l a s c a r o t e n o i d a g g r e g a t e s . 6 1 R e c e n t l y , t h e E C C D m e t h o d h a s a l s o b e e n a p p l i e d f o r t h e s t u d y o f D N A c o n j u g a t e s , 6 2 w h i l e a t t e m p t s a r e u n d e r w a y f o r t h e u s e o f t h e e x c i t o n i c c o u p l i n g m o d e l f o r t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e a n a l y s i s o f p o l y p e p t i d e s . 6 3 H o w e v e r , t h e m o s t s i g n i f i c a n t a p p l i c a t i o n o f t h e E C C D m e t h o d s i n v o l v e s t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f c h i r a l c o m p o u n d s . A s p r e v i o u s l y 2 6 1 d i s c u s s e d , t h e p r i n c i p l e s o f E C C D h a v e b e e n a p p l i e d a s a s e n s i t i v e a n d g e n e r a l m e t h o d t h a t r e q u i r e s o n l y m i c r o g r a m s c a l e o f a n a l y t e . S i n c e t h e o r i g i n o f t h e o b s e r v e d C o t t o n e f f e c t s a r e w e l l u n d e r s t o o d , b a s e d o n s o u n d t h e o r e t i c a l c a l c u l a t i o n s , t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f o r g a n i c c o m p o u n d s e x h i b i t i n g t y p i c a l b i s i g n a t e s p e c t r a c a n b e a s s i g n e d i n a n o n - e m p i r i c a l m a n n e r . T h e E C C D m e t h o d , a s d e s c r i b e d b y t h e s o - c a l l e d e x c i t o n C h i r a l i t y r u l e s i n t r o d u c e d b y H a r a d a a n d N a k a n i s h i , 4 0 w a s a m a j o r b r e a k t h r o u g h , a s c o m p a r e d t o t h e O R D a n d C D a p p l i c a t i o n s , s i n c e i t a l l o w s f o r t h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e C D s p e c t r u m a n d t h e m o l e c u l a r a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n a v o i d i n g a n y k i n d o f c a l c u l a t i o n s . S i n c e i t s d e v e l o p m e n t , i t h a s b e e n e s t a b l i s h e d a s a n e x t r e m e l y v e r s a t i l e m e t h o d t h a t h a s b e e n s u c c e s s f u l l y a p p l i e d i n d e t e r m i n i n g t h e s t e r e o c h e m i s t r y o f a w i d e v a r i e t y o f c o m p o u n d s . W h a t f o l l o w s i s a s h o r t s u m m a r y o f s o m e o f t h e p i o n e e r i n g w o r k , a s w e l l a s m o r e r e c e n t a p p l i c a t i o n s . T h e o r i g i n s o f t h e e x c i t o n C h i r a l i t y m e t h o d g o e s b a c k t o t h e s e m i n a l a r t i c l e s O H ‘ \ \ E o f K u h n 6 4 a n d K i r k w o o d , 6 5 a n d i t s fi r s t 0 C O O H p r a c t i c a l a p p l i c a t i o n s c o n c e r n F i g u r e 5 - 1 2 . E C C D a c t i v e a b s c i s i c a c i d b i o p o l y m e r s . “ 6 8 T h e fi r s t d e t e r m i n a t i o n o f t h e a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n o f a s m a l l m o l e c u l e , t h e n a t u r a l p r o d u c t c a l y c a n t h i n e , w a s p e r f o r m e d b y M a s o n , b a c k i n 1 9 6 2 . 6 9 ' 7 0 T h e fi r s t r e p o r t e d e x a m p l e , a f t e r t h e i n t r o d u c t i o n o f t h e a f o r e m e n t i o n e d e x c i t o n C h i r a l i t y r u l e s i n v o l v e d t h e s t u d y o f 7 ] , 7 2 ( + ) - a b s c i s i c a c i d . A b s c i s i c a c i d , a p l a n t h o r m o n e , c o n t a i n s t w o n o n - c o n j u g a t e d c h r o m o p h o r e s , a n e n o n e a n d a d i e n o i c a c i d , s e p a r a t e d b y t h e o n l y c h i r a l c e n t e r , a t e r t i a r y 2 6 2 a l c o h o l ( F i g u r e 5 - 1 2 ) . T h e e n o n e a n d t h e d i e n o i c a c i d m o i e t i e s a r e i n t e r a c t i n g t h r o u g h s p a c e , r e s u l t i n g i n a p o s i t i v e E C C D c o u p l e t . B a s e d o n t h e s i g n o f t h e s p e c t r u m , t h e t w o c h r o m o p h o r e s m u s t b e o r i e n t e d i n a c l o c k w i s e m a n n e r , w h i c h d i r e c t l y i n d i c a t e s t h e , 6 - c o n fi g u r a t i o n f o r t h e t e r t i a r y h y d r o x y l g r o u p . A O A c l | R a _ _ > V 0 3 2 O - I N A H Q C C v P a v o n i n i n - 4 B 0 9 > o . / F ) i - P r e P e r i p l a n o n e B k / I C D i h y d r o f u r o a n g e l i c i n F i g u r e 5 - 1 3 . A p p l i c a t i o n o f t h e E C C D m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e a b s o l u t e c h i r a l i t y o f n a t u r a l p r o d u c t s T h r o u g h o u t t h e y e a r s , t h e s t e r e o c h e m i s t r y o f s e v e r a l o t h e r n a t u r a l p r o d u c t s h a s b e e n d e t e r m i n e d b a s e d o n t h e E C C D m e t h o d ( f o r a r e c e n t r e v i e w s e e A l l e n m a r k , 2 0 0 0 ) . 7 3 T h e c o n fi g u r a t i o n o f t h e 1 5 - g l c N A c g r o u p i n P a v o n i n i n - 4 , a s h a r k r e p e l l e n t ( F i g u r e 5 - 1 3 A ) , h a s b e e n d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o t h e E C C D c o u p l e t b e t w e e n t h e e n o n e a n d t h e b r o m o b e n z o a t e m o i e t y . 7 4 O n t h e o t h e r h a n d P e r i p l a n o n e B , b e a r i n g o n l y o n e 2 6 3 c h r o m o p h o r e ( d i e n e ) , r e q u i r e d d e r i v a t i z a t i o n i n o r d e r t o p l a c e a s e c o n d c h r o m o p h o r e n e c e s s a r y f o r E C C D . A f t e r s t e r e o s e l e c t i v e r e d u c t i o n o f t h e c a r b o n y l a n d t h e b e n z o y l a t i o n o f t h e r e s u l t i n g a l c o h o l t h e o b s e r v e d E C C D d e fi n e s t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y , a s s h o w n i n F i g u r e 5 - 1 3 B . 7 5 F i n a l l y , i n a m o r e r e c e n t e x a m p l e , t h e a s s i g n m e n t o f t h e a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n o f a c h i r a l p h e n y l - s u b s t i t u t e d d i h y d r o f u r o a n g e l i n c i n h a s b e e n a c h i e v e d , a s s h o w n i n F i g u r e 5 - 1 3 C . 7 6 5 . 3 b . i i U s e o f C h r o m o p h o r i c h o s t s A l t h o u g h t h e s e n s i t i v i t y o f t h e E C C D a s s a y h a s b e e n l o n g e s t a b l i s h e d , t h e n e e d f o r t w o i n d e p e n d e n t c h r o m o p h o r e s f o r t h e m e t h o d t o b e a p p l i e d c a n s i g n i fi c a n t l y l i m i t i t s u s e . A l t h o u g h , a s c a n b e s e e n f r o m t h e c a s e s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d , s o m e n a t u r a l p r o d u c t s d o b e a r t w o n o n - c o n j u g a t e d c h r o m o p h o r e s , m o s t l y i n t h e f o r m a c o n j u g a t e d c a r b o n y l o r o l e fi n , t h a t i s o b v i o u s l y n o t a g e n e r a l p r o p e r t y . O n e w a y t o o v e r c o m e t h i s p r o b l e m i s b y i n t r o d u c i n g a s e c o n d c h r o m o p h o r e , u s u a l l y i n t h e f o r m o f a b e n z o y l g r o u p , a s i n t h e P e r i p l a n o n e B c a s e d i s c u s s e d a b o v e . H o w e v e r , t h a t i s n o t a l w a y s f e a s i b l e e i t h e r , s i n c e a g r e a t n u m b e r o f c h e m i c a l l y a n d b i o l o g i c a l l y i m p o r t a n t c o m p o u n d s d o n o t i n c l u d e a n y c h r o m o p h o r i c m o i e t y w i t h i n t h e i r s t r u c t u r e s a n d t h e o p p o r t u n i t y f o r d e r i v a t i z a t i o n i s n o t a l w a y s p r e s e n t . I n a n a t t e m p t t o a d d r e s s t h i s i s s u e i n a m o r e g e n e r a l m a n n e r , c h r o m o p h o r i c r e c e p t o r s h a v e b e e n d e s i g n e d t o a c t a s h o s t s f o r n o n - c h r o m o p h o r i c , c h i r a l m o l e c u l e s . U p o n b i n d i n g o f t h e c h i r a l s u b s t r a t e , e i t h e r c o v a l e n t l y o r n o n — c o v a l e n t l y , t h e h o s t w i l l a d o p t a p r e f e r r e d c h i r a l c o n f o r m a t i o n , i n d u c e d b y t h e c h i r a l g u e s t , w h i c h c a n t h e n b e o b s e r v e d a s a n E C C D c o u p l e t . 2 6 4 C h i r a l p r o d u c t s o b t a i n e d f r o m m e t a b o l i c p r o c e s s e s a r e o f t e n u s e d a s r e a c t a n t s f o r s u b s e q u e n t a s y m m e t r i c r e a c t i o n s i n d i f f e r e n t c h i r a l e n v i r o n m e n t s . A t t h e s a m e t i m e p h y s i c a l e v e n t s , s u c h a s t h e s e l e c t i v e t r a n s p o r t o f c h i r a l s u b s t r a t e s , r e q u i r e c h i r a l c o m m u n i c a t i o n b e t w e e n t h e m o l e c u l e s e n g a g e d i n t h e c h i r a l p r o c e s s . T h e r e f o r e , t r a n s f e r , t r a n s d u c t i o n , m o d u l a t i o n a n d a m p l i fi c a t i o n o f c h i r a l i n f o r m a t i o n a r e e s s e n t i a l i s s u e s f o r a l l c h i r a l p h e n o m e n a . 7 7 T h e fi r s t r e p o r t e d c a s e o f c h i r a l i n d u c t i o n w a s d e m o n s t r a t e d o n d y e s b o u n d t o h e l i c a l p o l y p e p t i d e s . T h i s b i n d i n g i n d u c e d a h e l i c a l o r i e n t a t i o n w i t h i n t h e c h r o m o p h o r i c m o l e c u l e , p r o d u c i n g a n E C C D a c t i v e s p e c i e s . 7 8 I n a n y c a s e , t h e p r o c e s s f o r t r a n s m i s s i o n o f c o n fi g u r a t i o n a l i n f o r m a t i o n i n c l u d i n g c h i r a l i t y c o m p r i s e o f a t l e a s t t w o e l e m e n t a r y p r o c e s s e s . A t fi r s t , a c o m p l e x h a s t o b e f o r m e d b e t w e e n t h e r e c e p t o r a n d t h e c h i r a l m o l e c u l e , f o l l o w e d b y s o m e d y n a m i c p r o c e s s , u s u a l l y a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e , t h a t c a n i n d u c e a n d i d e a l l y a m p l i f y t h e s i g n a l , l e a d i n g t o e f fi c i e n t t r a n s m i s s i o n o f i n f o r m a t i o n . T h e c h r o m o p h o r i c h o s t s u s e d f o r E C C D s t u d i e s a r e e i t h e r a c h i r a l o r i n t h e f o r m o f r a c e m a t e s . W h e n a n a c h i r a l h o s t i s u s e d , u p o n b i n d i n g t o a c h i r a l s u b s t r a t e , t h e c h r o m o p h o r i c h o s t c a n a d o p t t h e d i c t a t e d i n d u c e d c h i r a l i t y . T h i s i n d u c t i o n l e a d s t o t h e f o r m a t i o n o f a p r e f e r r e d h e l i c a l c o n f o r m e r , t h e o r i e n t a t i o n o f w h i c h c a n b e d e t e r m i n e d b y E C C D . I f t h e h o s t i s p r o c h i r a l ( r a c e m i c m i x t u r e ) o n l y o n e o f t h e t w o p o s s i b l e d i a s t e r e o m e r s w i t h t h e c h i r a l m o l e c u l e i s f a v o r e d r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f a c h i r a l m i x t u r e . I n b o t h c a s e s t h e f a v o r e d c h i r a l c o n f o r m a t i o n c a n b e t r a n s l a t e d b a c k i n t o t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f t h e c h i r a l c o m p o u n d i n a n o n - e m p i r i c a l m a n n e r . A n e x a m p l e o f i n d u c e d c h i r a l i t y o n a p r o c h i r a l h o s t , u p o n i n t e r a c t i o n w i t h a c h i r a l g u e s t , i s s h o w n i n F i g u r e 5 - 1 4 . A t fi r s t l o o k , o n e w o u l d a r g u e t h a t t h e b i p h e n o l s h o w n 2 6 5 B r i H O : H B r Q O O H R ‘ N S H H N ‘ R c ) 2 N N 0 2 N \ / \ + 0 g “ : 2 B r H ‘ o o ’ H B B r H O O H B r " ' N / v U ' Q Q H O O 0 2 N N 0 2 0 2 N N 0 2 F i g u r e 5 - 1 4 . T h e i n d u c e d c h i r a l i t y o f b i p h e n o l u p o n b i n d i n g t o c h i r a l a m i n e c a n n o t b e a n E C C D a c t i v e m o l e c u l e s i n c e t h e t w o a r o m a t i c r i n g s a r e c o n j u g a t e d . H o w e v e r , a s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d , t h i s i s a c a s e o f a n a t r o p i s o m e r i c m o l e c u l e , s i n c e b e c a u s e o f s t e r i c a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e t w o h y d r o x y l g r o u p s t h e m o l e c u l e i s n o t p l a n a r b u t e x i s t s a s a m i x t u r e o f t h e t w o e n a n t i o m e r i c f o r m s . U p o n a d d i t i o n o f t h e c h i r a l t r a n s - 1 , 2 - c y c l o h e x a n e d i a m i n e s h o w n , a p r e f e r r e d c o m p l e x i s f o r m e d , d u e t o t h e h y d r o g e n b o n d i n g b e t w e e n t h e p h e n o l s a n d t h e a m i n e g r o u p s ( t h e h y d r o g e n b o n d i n g b e t w e e n p h e n o l s a n d a l i p h a t i c a m i n e s h a s b e e n w e l l s t u d i e d ) . 7 9 ' 8 ' T h e o b s e r v e d E C C D s p e c t r u m i s d e t e r m i n e d b y t h e i n d u c e d c o m p l e x a n d i s d i c t a t e d b y t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f t h e c h i r a l d i a m i n e . 8 2 R * O H C O O M e D M A P , C H a c N : [ C C 0 0 R . F i g u r e 5 - 1 5 . D e t e r m i n a t i o n o f s t e r e s o c h e m i s t r y o f c h i r a l a l c o h o l s b y E C C D . 2 6 6 " J e n - 1 . ! I n a s i m i l a r m a n n e r , t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f c h i r a l s e c o n d a r y a l c o h o l s h a s b e e n d e t e r m i n e d . 8 3 A s s h o w n i n F i g u r e 5 - 1 5 , t h e c h r o m o p h o r i c r e a g e n t , 3 - c y a n o c a r b o n y l - 3 ’ - m e t h o x y c a r b o n y l - 2 , 2 ’ - b i n a p h t h a l e n e c a n b e e s t e r i f i e d u s i n g c h i r a l s e c o n d a r y a l c o h o l s . T h e r e s u l t a n t c o m p l e x e x h i b i t s a n i n d u c e d E C C D , a s a r e s u l t o f f a v o r i n g o n e a t r o p i s o m e r , a s i n t h e b i p h e n o l c a s e a b o v e . F o l l o w i n g t h e l o g i c a b o v e , a s e r i e s o f d i f f e r e n t s y s t e m s , u t i l i z i n g d i f f e r e n t c h r o m o p h o r e s h a v e b e e n d e v e l o p e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f m o l e c u l e s b e a r i n g d i f f e r e n t f u n c t i o n a l g r o u p s . F o r o r - a n d B - h y d r o x y c a r b o x y l i c a c i d s , t h e c h r o m o p h o r e s o f c h o i c e f o r d e r i v a t i z a t i o n i s a c o m b i n a t i o n o f n a p h t h a l e n e a n d m e t h y l a n t h r y l d e r i v a t i v e s ( F i g u r e 5 - 1 6 A ) . 8 ‘ 4 F o r c h i r a l a m i n e a n d a m i n o a l c o h o l s , t h e c h i r a l i t y a s s i g n m e n t h a s b e e n a c h i e v e d b y f o r m i n g a h e l i c a l p o l y ( ( 4 - c a r b o x y p h e n y l ) a c e t y l e n e ) t h r o u g h a c i d - b a s e c o m p l e x a t i o n ( F i g u r e 5 - 1 6 B ) . 8 5 F i n a l l y , a S a l e n - C o ( I I ) p r o c h i r a l h o s t b e a r i n g t w o b o r o n i c g r o u p s h a s b e e n u s e d a s a r e p o r t e r o f t h e s t e r e o c h e m i s t r y o f c a r b o h y d r a t e s ( F i g u r e 5 - 1 6 C ) . 8 6 O n e o f t h e m o s t e l e g a n t a n d s u c c e s s f u l s y s t e m s d e s i g n e d s o f a r i n v o l v e s t h e u s e o f q u i n o l i n e c h r o m o p h o r e s f o r t h e f o r m a t i o n o f c h i r a l p r o p e l l e r s a n d w a s d e v e l o p e d b y C a n a r y a n d c o w o r k e r s . A s s h o w n i n F i g u r e 5 - 1 7 , a t r i p o d a l s y s t e m , b e a r i n g a c h i r a l g r o u p , i n t h i s c a s e a m i n o a c i d , a s o n e o f t h e a r m s i s p r e p a r e d . U p o n c o m p l e x a t i o n o f C u ( H ) d e p e n d i n g o n t h e c h i r a l i t y o f t h e o r i g i n a l m o l e c u l e o n e o f t h e p o s s i b l e p r o p e l l e r c o n f o r m a t i o n s i f f o r m e d , g i v i n g r i s e t o t h e c o r r e s p o n d i n g c h a r a c t e r i s t i c E C C D c o u p l e t . I n t h i s c a s e , S - a m i n o a c i d s r e s u l t i n n e g a t i v e E C C D a n d v i c e v e r s a . “ 8 9 S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w h e n Z n ( I I ) i n s t e a d o f C u ( I I ) w a s c o o r d i n a t e d . ” 9 ‘ W i t h t h e a p p r o p r i a t e 2 6 7 0 ‘ 0 2 ) \ r l c i 1 . 2 e q u i v O 3 % 0 “ 0 “ 2 5 % ? O H 2 . 0 R - 0 5 S - a c i d N L O “ N : - 1 . 2 e q u i v D B U B o 9 o o 9 0 2 “ . 0 0 e r c o z n 0 0 2 H C O Z H C 0 2 H C 0 2 H O D ‘ — ' W — ’ O 0 0 0 C O Z H C O Z H C O z H C O Z H 0 0 e r 0 0 2 + } E f . S - A m i n e E E . . O R - A m i n e O O C P r o c h i r a l F i g u r e 5 - 1 6 . D e t e r m i n a t i o n o f a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f o r g a n i c c o m p o u n d s u s i n g d i f f e r e n t c h r o m o p h o r i c h o s t s . A . o r - a n d B - h y d r o x y c a r b o x y l i c a c i d s u s i n g n a p h t h a l e n e a n d m e t h y l a n t h r y l d e r i v a t i c e s ; B . C h i r a l a m i n e s a n d a m i n o a l c o h o l s u s i n g h e l i c a l p o l y ( ( 4 - c a r b o x y p h e n y l ) a c e t y l e n e ) ; C . S u g a r s u s i n g s a l e n - C o ( l l ) — b o r o n c o m p o u n d s . 2 6 8 N e g a t i v e E C C D c o u p l e t P o s i t i v e E C C D c o u p l e t R - C o n f i g u r a t i o n F i g u r e 5 - 1 7 . D e r i v a t i z a t i o n m e t h o d f o r a n a l y s i s o f a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n s o f a m i n o a c i d s d e r i v a t i z a t i o n a d j u s t m e n t s t h e m e t h o d c a n w o r k f o r c h i r a l p r i m a r y a m i n e s , 9 2 B - a m i n o a l c o h o l s a n d N , N , d i a l k y l 0 L a m i n o a c i d s . 9 3 I n t e r e s t i n g l y , i n t h e c a s e o f N , N - d i a l k y l m e t h i o n i n e s , a n e l e c t r o n - i n d u c e d i n v e r s i o n o f t h e h e l i c a l c h i r a l i t y o f t h e c o r r e s p o n d i n g c o p p e r c o m p l e x e s w a s o b s e r v e d . I n p a r t i c u l a r , w h e n t h e c o o r d i n a t e d s p e c i e s w a s C u ( I I ) , t h e s y s t e m w o r k s i n a n a n a l o g o u s w a y a s w h a t d e s c r i b e d i n F i g u r e 5 - 1 7 . H o w e v e r , w h e n t h e m e t a l w a s r e d u c e d t o C u ( I ) , t h e s i g n e d o f t h e o b s e r v e d E C C D s p e c t r u m w a s r e v e r s e d . T h i s b e h a v i o r w a s a t t r i b u t e d t o t h e d i f f e r e n t c o o r d i n a t i o n p a t t e r n , i n t h e p r e s e n c e o f t h e d i f f e r e n t o x i d a t i o n s t a t e o f t h e m e t a l . I n p a r t i c u l a r , C u ( I I ) h a s a h i g h e r a f f i n i t y f o r t h e c a r b o x y l a t e o x y g e n w h i l e i t s r e d u c e d f o r m , C u ( I ) p r e f e r s t o c o o r d i n a t e w i t h t h e s u l f o r a t o m o f t h e M e t s i d e c h a i n . T h e r e f o r e , a s s h o w n i n F i g u r e 5 - 1 8 , i n t h e p r e s e n c e o f C u ( I I ) t h e c a r b o x y l a t e o f t h e m e t h i o n i n e a r m i s c o o r d i n a t e d t o t h e m e t a l a n d t h e t h r e e C - H b o n d s f o r m a c l o c k w i s e p r o p e l l e r , r e s u l t i n g i n n e g a t i v e c h i r a l i t y . U p o n r e d u c t i o n o f t h e m e t a l ( C u ( I ) ) , t h e c a r b o x y l a t e a n d s u l f i d e l i g a n d s a r e e x c h a n g e d c a u s i n g t h e i n v e r s i o n o f t h e C - H t w i s t a n d , t h e r e f o r e , t h e o r i e n t a t i o n a l c h i r a l i t y . 2 6 9 h e n t x . d f E t y H s i s s V s c d r i 1 u z a s s e r h e g m s e 8 o e r e U e l t e 3 e C r r n l s o e u h o r e w i v t y u y n a n c t r o c e i s h w M o t t c e b p f p d - t r b u u a i i 5 - a r d 9 l D l e 4 e t o n h o o h o y u i p r m o o t m d e s u m s e e m m T C u I s o t y r e t t t c t n u o o v t r ( e h t u . C h h i a h S i p i p F t i h g e h e E h e n t a t c h s h o r a h e e d e r n r e c e r e p r e p v e r e e n h n r o m d o e n t s T t b i s m c a a t p b c p S h a n i s h i u t , a e h h , u i h l n b y e l s v t s s d p i m r t t c l a h y s o y r s s e l a i a g t n i t e l d y n t b , s ) t d a a n l t i e k d s o e t e c e n a n r e f e a r m i E e t e n e i d o e t t i s v i i t a o c l o f e r c e r n C r i u v t s y a a h a C l g r h t a t c i t r e e p t t e p n n a r c t o D h p o i r t a d o u l n p e , i g a a o e s e e r a m v n a s e e m t p l n t i c x r c i n o a h t o r m l y m i s i f s m t e l a o i o C n g r i p n h a o n O r c s t i n r o r i , e r t b e h O u p H o i e t e t e o c e c 4 t l t e s e 1 r l i n c h o 8 p e w u y o t o n u m c o r o , p o h l f c n c a s a f p n p C s a i i d fi d c n D c e d e i o c d a u c i c r o l c e i u s n e r i h e i a c h e a e n m s u h t r g o f e r d o ) r n c t u b ( c u i h s A e m o e p o i s g o i n r i s y n e o e a a . t n f s f g d s p p t t t p t i a t e s o c c u p e r u o e r d c o r h r o n m h h t e o e v e e h a h e j r d i e s r i c r I e n E p ( n c i d o o t o o t t o c m m e f e C e r e s u y i n t s r a t i o n a t x g n h e o u s u v a i y e i l t e r n n t a e a e o n t f n o t e t t r d n h i r b d m i s h e f e r a e v u d q e a . n g t t i h c c o a n t s y s o t o i m o y e s i r p s o c e n c h p h f l o d a s t r t h f n s g e f o l r i l f a e m f h r a r b r n o o e d u t e r o y o e f s r m p r s y f o o r t i r m u r o o c y i h n p c i e l t i o n e c y g r t f h t o n d n p p s o y h n e d h r r j e d a a r o h c a o r l 4 p i e s t i s u h h n r o h n d g r e s a e 0 o f n a i t a b r m i b t , t p e m e b i d e 0 fi i n a h a t i t o g o l d i r l a t n o d a a n e x i s p c r t e d n d a 0 o o r 0 n p i e n d l e i m o a n s 0 o r i d e e h t g o o n . e e n i a n e x r ' t s a ) M b s h o e p l c c c l . r 8 p c 2 h m n k l m , T e n t h h f i T o o n s v a v t s o a c a m i e e " h o h s i f f . e l e , t o n ; e t s i r a l w e e n t h c e d n d t h s u b s t r a t e t h a t c a n p o t e n t i a l l y c o m p l i c a t e t h e s p e c t r a l a n a l y s i s . F u r t h e r m o r e , m e t a l 2 7 0 i n c o r p o r a t i o n i n t o t h e p o r p h y r i n r i n g c a n b e e a s i l y a c h i e v e d , p r o v i d i n g a c o o r d i n a t i o n c e n t e r f o r t h e b i n d i n g o f t h e c h i r a l m o l e c u l e . T h e r e f o r e , p o r p h y r i n s h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d a s t h e i d e a l c h r o m o p h o r e s f o r d e t e c t i n g s u b t l e c h a n g e s i n t h e i r c l o s e e n v i r o n m e n t , i n c l u d i n g c h i r a l i t y i n d u c t i o n . P o r p h y r i n r i n g s h a v e b e e n w i d e l y u t i l i z e d a s a d e r i v a t i z e d c h r o m o p h o r e i n c h i r o p t i c a l s t e r e o c h e m i c a l s t u d i e s . T h e s e i n c l u d e c o n fi g u r a t i o n a l a s s i g n m e n t s o f F i g u r e 5 - 1 9 . S t r u c t u r e a n d s c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f a p o r p h y r i n t w e e z e r 4 9 , 9 5 9 6 , 9 7 9 8 . 9 9 s t e r e o c h e m i c a l d i f f e r e n t i a t i o n o f s u g a r s a n d a r r r i n o a c i d s , a n d s t e r o i d s , i n t e r a c t i o n s w i t h b i o m o l e c u l e s . ' 0 ° ’ 1 0 2 I n a r e c e n t w o r k , t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f l , n - G l y c o l s h a s b e e n d e t e r m i n e d b y u s i n g l i p o s o m a l p o r p h y r i n e s t e r s a s r e p o r t e r s o f c h i r a l i t y m ' 1 0 5 I n m o s t c a s e s , h o w e v e r , b i s - p o r p h y r i n s y s t e m s , a l s o r e f e r r e d t o a s z i n c - p o r p h y r i n t w e e z e r s , l i k e t h e o n e s h o w n i n F i g u r e 5 - 1 9 h a v e b e e n u s e d a s t h e h o s t s f o r t h e s t e r e o c h e m i c a l d e t e r m i n a t i o n o f c h i r a l c o m p o u n d s . 2 7 1 z i n c p o r p h y r i n \ Z v N H L H z N - i é 2 M e O Z C t w e e z e r H z N fi / ‘ N H Z I : H z N / z / N l e z O 0 W 0 ( a ) e 1 0 0 ( b ) 9 / — \ 5 0 _ ( 3 ( 6 ) ) ( B e n z e n e ) @ 4 y . . . . - - I t s r m e i _ _ 4 3 4 . ’ 1 0 0 ( - 1 1 7 ) \ 4 5 0 1 1 n e g a t i v e e c c o 3 5 0 3 , 2 3 % " t h 3 1 5 " ? ) 5 0 0 p o s i t i v e e c c o c o u p l e t 9 c o u p l e t F i g u r e 5 - 2 0 . A s s i g n m e n t o f a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n o f a c y c l i c c h i r a l d i a m i n e s u s i n g E C C D B i n d i n g o f c h i r a l d i a m i n e s t o l e a d s t o t h e c o m p l e x a d o p t i n g a h e l i c a l c o n f o r m a t i o n t h a t r e s u l t s i n a n o b s e r v a b l e E C C D s p e c t r u m . I n t u r n , t h e h e l i c i t y o f t h e r e c e p t o r r e fl e c t s t h e c h i r a l i t y o f t h e b o u n d c o m p o u n d . 9 4 ’ 1 0 6 ’ ' 0 7 A s s h o w n i n F i g u r e 5 - 2 0 , w h e n z i n c p o r p h y r i n t w e e z e r i s a d d e d t o t h e s o l u t i o n o f c h i r a l d i a m i n e ( S ) - m e t h y l - 2 , 4 - d i a r n i n o b u t y r a t e , t h e p o r p h y r i n t w e e z e r b i n d s t o t h e c h i r a l d i a m i n e v i a Z n - N c o o r d i n a t i o n t o f o r m a “ s a n d w i c h ” s t r u c t u r e . ' 0 7 T h e p o r p h y r i n , w h i c h i s f a r a w a y f r o m t h e c h i r a l c e n t e r , d o e s n o t i n t e r a c t w i t h i t . H o w e v e r , t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e p o r p h y r i n c o o r d i n a t e d t o t h e e n d c l o s e r t o t h e c h i r a l c e n t e r a n d t h e c h i r a l g r o u p i s s u c h t h a t t h e s t e r i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e m a r e k e p t a t m i n i m u m . I n o r d e r t o a c h i e v e t h a t , t h e p o r p h y r i n r i n g ‘ s l i d e s a w a y ’ f r o m t h e l a r g e g r o u p o n t h e c h i r a l c e n t e r a n d c o v e r s t h e s m a l l g r o u p ( F i g u r e 5 - 2 0 a ) . T h i s c o n f o r m a t i o n i s m o r e s t a b l e t h a n t h e a l t e r n a t i v e ( F i g u r e 5 - 2 0 b ) , i n w h i c h t h e p o r p h y r i n r i n g ‘ s l i d e s a w a y ’ f r o m t h e s m a l l g r o u p a n d i n t e r a c t s w i t h 2 7 2 t h e l a r g e g r o u p i n s t e a d . T h e m o r e s t a b l e c o n f o r m a t i o n ( a ) , l e a d s t o t h e t w o p o r p h y r i n s p l a n e s a d o p t i n g a c o u n t e r c l o c k w i s e o r i e n t a t i o n a n d a n e g a t i v e E C C D c o u p l e t i s p r e d i c t e d . T h i s p r e d i c t i o n m a t c h e s t h e C D o b s e r v a t i o n . T h e l a t t e r a p p r o a c h h a s b e e n e x t e n d e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f c h i r a l a m i n o a c i d s a n d a m i n o a l c o h o l s w h i c h h a v e a p r i m a r y a m i n o g r o u p d i r e c t l y a t t a c h e d t o t h e s t e r e o g e n i c c e n t e r . A f t e r s i m p l e c h e m i c a l m o d i f i c a t i o n s a m i n o a c i d s o r a m i n o a l c o h o l s c a n b e c o n v e r t e d t o d i a m i n e s ( d e r i v a t i z a t i o n o f a m i n o a c i d s w i t h e t h y l e n e d i a m i n e , d e r i v a t i z a t i o n o f a m i n o a l c o h o l s w i t h G l y ) a n d t h e a b o v e r a t i o n a l i z a t i o n i s f o l l o w e d . ‘ 0 7 Z i n c p o r p h y r i n t w e e z e r s c a n n o t b e u s e d d i r e c t l y t o d e t e r m i n e t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f c h i r a l c o m p o u n d s t h a t h a v e o n l y o n e s i t e o f a t t a c h m e n t , s i n c e t w o c h r o m o p h o r e s n e e d t o b e b o u n d a n d i n t e r a c t t h r o u g h s p a c e i n o r d e r t o o b s e r v e E C C D . I n o r d e r t o o v e r c o m e t h i s p r o b l e m , c a r r i e r m o l e c u l e s h a v e b e e n d e s i g n e d t o c o n v e r t c o m p o u n d s w i t h o n l y o n e s i t e o f a t t a c h m e n t t o m o l e c u l e s p o s s e s s i n g t w o s i t e s o f a t t a c h m e n t . C a r r i e r s a r e a c h i r a l m o l e c u l e s , w h i c h c a n b e d e r i v a t i z e d w i t h t h e c h i r a l s u b s t r a t e s t o p r o v i d e t h e r e q u i s i t e t w o s i t e s o f a t t a c h m e n t f o r b i n d i n g t o z i n c p o r p h y r i n t w e e z e r . T h e s u c c e s s o f t h e c a r r i e r - m e d i a t e d m e t h o d r e l i e s o n i d e n t i f y i n g t h e m o s t e n e r g e t i c a l l y f a v o r e d c o n f o r m a t i o n o f t h e d e r i v a t i z e d c a r r i e r . T h i s i s i m p e r a t i v e b e c a u s e t h e c o n f o r m a t i o n o f t h e d e r i v a t i z e d c a r r i e r d i c t a t e s t h e p o s i t i o n o f t h e s u b s t i t u e n t s a t t h e c h i r a l c e n t e r i n s p a c e r e l a t i v e t o t h e p o r p h y r i n s , a n d t h e r e f o r e , w i l l d i c t a t e t h e s p a t i a l o r i e n t a t i o n a d o p t e d b y t h e t w o p o r p h y r i n p l a n e s . T h e i d e a l c a r r i e r , u p o n d e r i v a t i z a t i o n 2 7 3 s m a l l s t e r i c l a r g e s t e r i c i n f l u e n c e i n fl u e n c e 6 M a i N \ N I t ] s y n \ a o r g i i t n e a t i o n K N K C O Z H H 2 N C H L g ' / H C H 3 : > ( I f ) N H B o c t N H z c o o r d i n a t i o n & s i t e i n I D , H n Z n I / H C H 3 \ H \ / 2 m — [ ( 1 a n o 0 W 0 o = o 0 Y 0 o 2 0 0 4 3 2 K ‘ V 4 3 4 I ( - 1 0 8 ) - 2 0 0 . . - . \ 4 1 0 4 2 0 4 3 0 4 4 0 w a v e l e n g t h ( n m ) p r e f e r r e d c o n f o r m a t i o n o f t h e c o m p l e x F i g u r e 5 — 2 1 . U s e o f a c a r r i e r m o l e c u l e t o d e t e r m i n e t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f c h i r a l m o n o a m i n e b y E x c i t o n C o u p l i n g C i r c u l a r D i c h r o i s m . w i t h c h i r a l c o m p o u n d s , e x h i b i t s a r i g i d a n d p r e d i c t a b l e c o n f o r m a t i o n a b o u t t h e f r e e r o t a t i n g s i n g l e b o n d s . a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f c h i r a l m o n o a m i n e s u s i n g z i n c p o r p h y r i n t w e e z e r s . F i g u r e 5 - 2 1 d e s c r i b e s a c a r r i e r s y s t e m d e s i g n e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e c a r r i e r u s e d , a p y r i d i n e d e r i v a t i v e , c a n b e d e r i v a t i z e d w i t h c h i r a l m o n o a m i n e s t h r o u g h a n a m i d e b o n d . T h i s c o n j u g a t e c a n b i n d t o t h e z i n c p o r p h y r i n t w e e z e r t h r o u g h t w o n i t r o g e n a t o m s , t h e p y r i d i n e n i t r o g e n a n d t h e f r e e a m i n o n i t r o g e n . T h e c o m p l e x a t i o n l e a d s t o a 2 7 4 1 0 8 T h e u n i q u e h e l i c a l a r r a n g e m e n t o f t h e t w o p o r p h y r i n p l a n e s w i t h r e s p e c t t o e a c h o t h e r , a n d c a n b e o b s e r v e d b y E C C D s p e c t r u m . M o l e c u l a r m o d e l i n g o f t h e c a r r i e r c o n j u g a t e s u g g e s t s t h a t i t i s a r i g i d m o l e c u l e a n d i t h a s a p r e d i c t a b l e e n e r g e t i c a l l y f a v o r e d c o n f o r m a t i o n . 1 0 8 I n t h i s m o s t f a v o r a b l e c o n f o r m a t i o n , t h e f r e e r o t a t i o n s a r o u n d t h e s i n g l e b o n d s : C N - C c z o , C c = o - N H , a n d N H - C c h i m ] a r e r e s t r i c t e d . M o l e c u l a r m o d e l i n g o f t h e c o n j u g a t e h a s s h o w n t h a t t h e c o n j u g a t e 6 f a v o r s a c o p l a n a r o r i e n t a t i o n o f t h e c a r b o n y l g r o u p t o t h e p y r i d i n e r i n g . M o r e o v e r , d u e t o e l e c t r o s t a t i c r e p u l s i o n , t h e a n t i c a r b o n y l o x y g e n / p y r i d i n e n i t r o g e n d i s p o s i t i o n i s p r e f e r r e d b y ~ 3 0 k J / m o l . F i n a l l y , i t h a s b e e n w e l l u n d e r s t o o d t h a t i n a n a r r r i d e , d u e t o t h e p s e u d o A 1 3 i n t e r a c t i o n , t h e s m a l l g r o u p o n t h e c h i r a l c e n t e r ( h y d r o g e n ) i s s y n t o t h e c a r b o n y l o x y g e n . S i n c e t h e s p a t i a l a r r a n g e m e n t o f t h e s u b s t i t u e n t s o f t h e c h i r a l c e n t e r c a n b e d e d u c e d f r o m t h i s f a v o r e d c o n f o r m a t i o n , t h e o r i e n t a t i o n o f t h e p o r p h y r i n p l a n e s c a n b e p r e d i c t e d b a s e d o n t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e c h i r a l c o m p o u n d a n d t h e p o r p h y r i n p l a n e s . F o l l o w i n g t h e s e g u i d e l i n e s , a s e r i e s o f s y s t e m s h a s b e e n d e s i g n e d a n d s u c c e s s f u l l y a p p l i e d f o r t h e s t e r e o c h e m i c a l a s s i g n m e n t o f s e c o n d a r y a m i n e s , 1 0 9 a n d c r - c h i r a l c a r b o x y l i c a c i d s m ' 1 1 2 A s m e n t i o n e d a b o v e , t h e u s e o f p o r p h y r i n t w e e z e r s r e q u i r e s t h e u s e o f a c h i r a l m o l e c u l e b e a r i n g t w o s i t e s o f a t t a c h m e n t . A n e x c e p t i o n t o t h i s r u l e i s t h e w o r k b y I n o u e ” 3 " ” T h e y h a v e d e v e l o p e d a m e t h o d o l o g y f o r t h e a s s i g n m e n t o f t h e a n d c o w o r k e r s . s t e r e o c h e m i s t r y o f m o n o a m i n e s a n d m o n o a l c o h o l s , w i t h o u t t h e n e e d f o r d e r i v a t i z a t i o n , u s i n g a p o r p h y r i n t w e e z e r w i t h a v e r y s h o r t l i n k a g e . T h e m a j o r d r a w b a c k o f t h i s m e t h o d , 2 7 5 b e l i e v e d t o b e b a s e d o n i n d u c e d s u p r a m o l e c u l a r c h i r a l i t y , i n v o l v e s t h e n e e d f o r a g r e a t e x c e s s o f c h i r a l m o l e c u l e ( m M c o n c e n t r a t i o n ) . O u r r e s e a r c h h a s f o c u s e d o n e x p l o r i n g a n d e x p a n d i n g t h i s l a t t e r a p p r o a c h . I n p a r t i c u l a r , w e a r e i n t e r e s t e d i n d e s i g n i n g n o n - p o r p h y r i n c h r o m o p h o r i c h o s t s t h a t c a n a c t a s r e p o r t e r s o f c h i r a l i t y , u p o n a d d i t i o n o f a c h i r a l m o l e c u l e . O u r m a i n i n t e r e s t h a s b e e n t o d e v e l o p a s y s t e m t h a t c a n b e u s e d f o r t h e a s s i g n m e n t o f t h e s t e r e o c h e m i s t r y o f c o m p o u n d s w i t h o n l y o n e s i t e o f a t t a c h m e n t , w i t h o u t t h e n e e d f o r d e r i v a t i z a t i o n , i n u M s c a l e . 5 . 4 R e f e r e n c e s 1 . L . P a s t e u r , T h e A s s y m e t r y o f N a t u r a l O c c u r i n g C o m p o u n d s , A m e r i c a n B o o k C o m p a n y , N e w Y o r k , 1 9 0 1 . 2 . E . L . E l i e l , S . W . W i l e n , L . N . M a n d e r , S t e r e o c h e m i s t r y o f O r g a n i c C o m p o u n d s , W i l e y , N e w Y o r k , 1 9 9 4 . 3 . W . T h o m s o n , K e l v i n s ' s B a l t i m o r e L e c t u r e s a n d M o d e r n T h e o r i t i c a l P h y s i c s . H i s t o r i c a l a n d P h i l o s o p h i c a l P e r s p e c t i v e s , M I T P r e s s , 1 9 8 7 . 4 . P . Y . B r u i c e , O r g a n i c C h e m i s t r y , 3 r d e d i t i o n e d . , P r e n t i c e - H a l l , I n c . , U p p e r S a d d l e R i v e r , N e w J e r s e y , 2 0 0 1 . 5 . R . R o s s i , P . D i v e r s i " S y n t h e s i s , A b s o l u t e C o n fi g u r a t i o n , a n d O p t i c a l P u r i t y o f C h i r a l A l l e n e s " S y n t h e s i s 1 9 7 3 , 2 5 - 3 6 . 6 . M . O k i , i n T o p i c s i n S t e r e o c h e m i s t r y ( E d s . : N . L . A l l i n g e r , E . L . E l i e l , S . W . W i l e n ) , I n t e r s c i e n c e P u b l i c a t i o n , N e w Y o r k , 1 9 8 3 . 7 . W . H . L a a r h o v e n , W . J . C . P r i n s e n " C a r b o h e l i c e n e s a n d H e t e r o h e l i c e n e s " T o p . C u r r . C h e m . 1 9 8 4 , 1 2 5 , 6 3 - 1 3 0 . 8 . W . J . C . P r i n s e n , W . H . L a a r h o v e n " D e t e r m i n a t i o n o f t h e E n a n t i o m e r i c E x c e s s o f H e x a h e l i c e n e a n d I t s M e t h y l - S u b s t i t u t e d D e r i v a t i v e s b y H i g h - P e r f o r m a n c e L i q u i d - C h r o m a t o g r a p h y " J . C h r o m a t o g r . 1 9 8 7 , 3 9 3 , 3 7 7 - 3 9 0 . 2 7 6 1 0 . l l . 1 2 . 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . J . L . B a d a " M e t e o r i t i c s - E x t r a t e r r e s t r i a l h a n d e d n e s s ? " S c i e n c e 1 9 9 7 , 2 7 5 , 9 4 2 - 9 4 3 . J . R . C r o n i n , S . P i z z a r e l l o " E n a n t i o m e r i c e x c e s s e s i n m e t e o r i t i c a m i n o a c i d s " S c i e n c e 1 9 9 7 , 2 7 5 , 9 5 1 - 9 5 5 . R . M . H a z e n , T . R . F i l l e y , G . A . G o o d f r i e n d " S e l e c t i v e a d s o r p t i o n o f L - a n d D - a m i n o a c i d s o n c a l c i t e : I m p l i c a t i o n s f o r b i o c h e m i c a l h o m o c h i r a l i t y " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 2 0 0 1 , 9 8 , 5 4 8 7 - 5 4 9 0 . B . L . F e r i n g a , R . A . v a n D e l d e n " A b s o l u t e a s y m m e t r i c s y n t h e s i s : T h e o r i g i n , c o n t r o l , a n d a m p l i f i c a t i o n o f c h i r a l i t y " A n g e w . C h e m - I n t . E d i t . 1 9 9 9 , 3 8 , 3 4 1 9 - 3 4 3 8 . P . R . K a v a s m a n e c k , W . A . B o n n e r " A d s o r p t i o n o f A m i n o - A c i d D e r i v a t i v e s b y D - Q u a r t z a n d L — Q u a r t z " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 7 , 9 9 , 4 4 - 5 0 . W . A . B o n n e r , P . R . K a v a s m a n e c k " A s y m m e t r i c A d s o r p t i o n o f D l - A l a n i n e H y d r o c h l o r i d e b y Q u a r t z " J . O r g . C h e m . 1 9 7 6 , 4 1 , 2 2 2 5 - 2 2 2 6 . W . A . B o n n e r , P . R . K a v a s m a n e c k , F . S . M a r t i n , J . J . F l o r e s " A s y m m e t r i c A d s o r p t i o n b y Q u a r t z - M o d e l f o r P r e b i o t i c O r i g i n o f O p t i c a l - A c t i v i t y " O r i g i n s L i f e E v o l . B 1 9 7 5 , 6 , 3 6 7 - 3 7 6 . S . S t i n s o n " C h i r a l C h e m i s t r y " C h e m . E n g . N e w s 2 0 0 1 , 7 9 , 4 5 - 5 7 . S . S t i n s o n " C h i r a l D r u g s " C h e m . E n g . N e w s 2 0 0 0 , 7 8 , 5 5 - 7 8 . J . A . D a l e , H . S . M o s h e r " N u c l e a r M a g n e t i c - R e s o n a n c e E n a n t i o m e r R e a g e n t s - C o n fi g u r a t i o n a l C o r r e l a t i o n s V i a N u c l e a r M a g n e t i c - R e s o n a n c e C h e m i c a l - S h i f t s o f D i a s t e r e o m e r i c M a n d e l a t e , O - M e t h y l m a n d e l a t e , a n d A l p h a - M e t h o x y - A l p h a - T r i fl u o r o m e t h y l p h e n y l a c e t a t e ( M t p a ) E s t e r s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 3 , 9 5 , 5 1 2 - 5 1 9 . J . B . L a m b e r t , J . F . S h u r v e l l , D . A . L i g h t n e r , R . G . C o o k s , O r g a n i c S r u c t u r a l S p e c t r o s c o p y , P r e n t i c e H a l l , U p p e r S a d d l e R i v e r , 1 9 9 8 . H . H . P e r k a m p u s , E n c y c l o p e d i a o f S p e c t r o s c o p y , V C H , N e w Y o r k , 1 9 9 5 . T . W . S o m o l o n s , O r g a n i c C h e m i s t r y , J o h n W i l e y & S o n s I n c . , N e w Y o r k , 1 9 7 8 . L . V e l l u z , M . L e G r a n d , M . G r o s j e a n , O p t i c a l C i r c u l a r D i c h r o i s m , A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , 1 9 6 5 . W . K l y n e " O p t i c a l r o t a t o r y d i s p e r s i o n . A p p l i c a t i o n s a n d s t e r e o c h e m i c a l p r o b l e m s i n o r g a n i c c h e m i s t r y " T e t r a h e d r o n 1 9 6 1 , 1 3 , 2 8 - 4 7 . 2 7 7 2 4 . 2 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . W . M o f fi t t , R . B . W o o d w a r d , A . M o s c o w i t z , W . K l y n e , C . D j e r a s s i " S t r u c t u r e a n d t h e o p t i c a l r o t a t o r y d i s p e r s i o n o f s a t u r a t e d k e t o n e s " J . A m . C h e m . S o c 1 9 6 1 , 8 3 , 4 0 1 3 - 4 0 1 8 . G . S n a t z k e " C i r c u l a r - D i c h r o i s m a n d A b s o l u t e C o n f o r m a t i o n - A p p l i c a t i o n o f Q u a l i t a t i v e M o T h e o r y t o C h i r o p t i c a l P h e n o m e n a " A n g e w . C h e m . - I n t . E d i t . E n g l . 1 9 7 9 , 1 8 , 3 6 3 - 3 7 7 . G . S n a t z k e " S e m i - E m p i r i c a l R u l e s i n C i r c u l a r - D i c h r o i s m o f N a t u r a l - P r o d u c t s " P u r e A p p l . C h e m . 1 9 7 9 , 5 1 , 7 6 9 - 7 8 5 . S . S u p e r c h i , E . G i o r g i o , C . R o s i n i " S t r u c t u r a l d e t e r m i n a t i o n s b y c i r c u l a r d i c h r o i s m s p e c t r a a n a l y s i s u s i n g c o u p l e d o s c i l l a t o r m e t h o d s : A n u p d a t e o f t h e a p p l i c a t i o n s o f t h e D e V o e p o l a r i z a b i l i t y m o d e l " C h i r a l i t y 2 0 0 4 , 1 6 , 4 2 2 - 4 5 1 . P . L . P o l a v a r a p u " A b i n i t i o m o l e c u l a r o p t i c a l r o t a t i o n s a n d a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n s " M o l . P h y s . 1 9 9 7 , 9 1 , 5 5 1 - 5 5 4 . P . L . P o l a v a r a p u , D . K . C h a k r a b o r t y " A b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f c h i r a l m o l e c u l e s f r o m a b i n i t i o t h e o r e t i c a l a n d e x p e r i m e n t a l m o l e c u l a r o p t i c a l r o t a t i o n s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 8 , 1 2 0 , 6 1 6 0 - 6 1 6 4 . R . K . K o n d r u , P . W i p f , D . N . B e r a t a n " T h e o r y - a s s i s t e d d e t e r m i n a t i o n o f a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y f o r c o m p l e x n a t u r a l p r o d u c t s v i a c o m p u t a t i o n o f m o l a r r o t a t i o n a n g l e s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 8 , 1 2 0 , 2 2 0 4 - 2 2 0 5 . R . K . K o n d r u , S . L i m , P . W i p f , D . N . B e r a t a n " S y n t h e t i c a n d m o d e l c o m p u t a t i o n a l s t u d i e s o f m o l a r r o t a t i o n a d d i t i v i t y f o r i n t e r a c t i n g c h i r a l c e n t e r s : A r e i n v e s t i g a t i o n o f v a n ' t H o f f s p r i n c i p l e " C h i r a l i t y 1 9 9 7 , 9 , 4 6 9 - 4 7 7 . R . K . K o n d r u , P . W i p f , D . N . B e r a t a n " A t o m i c c o n t r i b u t i o n s t o t h e o p t i c a l r o t a t i o n a n g l e a s a q u a n t i t a t i v e p r o b e o f m o l e c u l a r c h i r a l i t y " S c i e n c e 1 9 9 8 , 2 8 2 , 2 2 4 7 - 2 2 5 0 . R . K . K o n d r u , P . W i p f , D . N . B e r a t a n " S t r u c t u r a l a n d c o n f o r m a t i o n a l d e p e n d e n c e o f o p t i c a l r o t a t i o n a n g l e s " J . P h y s . C h e m . A 1 9 9 9 , 1 0 3 , 6 6 0 3 - 6 6 1 1 . R . K . K o n d r u , C . H . T . C h e n , D . P . C u r r a n , D . N . B e r a t a n , P . W i p f " D e t e r m i n a t i o n o f t h e a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n o f l , 3 , 5 , 7 - t e t r a m e t h y l - l , 3 - d i h y d r o i n d o l - 2 - o n e b y o p t i c a l r o t a t i o n c o m p u t a t i o n " T e t r a h e d r o n - A s y m m e t r 1 9 9 9 , 1 0 , 4 1 4 3 - 4 1 5 0 . R . K . K o n d r u , D . N . B e r a t a n , G . K . F r i e s t a d , A . B . S m i t h , P . W i p f " C h i r a l a c t i o n a t a d i s t a n c e : R e m o t e s u b s t i t u e n t e f f e c t s o n t h e o p t i c a l a c t i v i t y o f c a l y c u l i n s A a n d B " O r g . L e t t . 2 0 0 0 , 2 , 1 5 0 9 - 1 5 1 2 . 2 7 8 3 6 . 3 7 . 3 8 . 3 9 . 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . S . R i b e , R . K . K o n d r u , D . N . B e r a t a n , P . W i p f " O p t i c a l r o t a t i o n c o m p u t a t i o n , t o t a l s y n t h e s i s , a n d s t e r e o c h e m i s t r y a s s i g n m e n t o f t h e m a r i n e n a t u r a l p r o d u c t p i t i a r n i d e A " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 0 , 1 2 2 , 4 6 0 8 - 4 6 1 7 . S . M . L . C h e n , N . H a r a d a , N a k a n i s h . K " L o n g - R a n g e E f f e c t i n E x c i t o n C h i r a l i t y M e t h o d " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 4 , 9 6 , 7 3 5 2 - 7 3 5 4 . W . T . W i e s l e r , J . T . V a z q u e z , K . N a k a n i s h i " P a i r w i s e A d d i t i v i t y i n E x c i t o n - C o u p l e d C d C u r v e s o f M u l t i c h r o m o p h o r i c S y s t e m s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 8 7 , 1 0 9 , 5 5 8 6 - 5 5 9 2 . J . T . V a z q u e z , W . T . W i e s l e r , K . N a k a n i s h i " C i r c u l a r — D i c h r o i s m S p e c t r a o f B i c h r o m o p h o r i c a l l y D e r i v a t i z e d M e t h y l - D - G a l a c t o p y r a n o s i d e s , C a l c u l a b l e b y P a i r w i s e A d d i t i v i t y , P r o v i d e a B a s i s f o r N o v e l M i c r o a n a l y s i s o f O l i g o s a c c h a r i d e s " C a r b o h y d . R e s . 1 9 8 8 , 1 7 6 , 1 7 5 - 1 9 4 . N . H a r a d a , N a k a n i s h . K " E x c i t o n C h i r a l i t y M e t h o d a n d I t s A p p l i c a t i o n t o C o n f i g u r a t i o n a l a n d C o n f o r m a t i o n a l S t u d i e s o f N a t u r a l - P r o d u c t s " A c c o u n t s C h e m . R e s . 1 9 7 2 , 5 , 2 5 7 - 2 6 1 . N . H a r a d a , S . L . C h e n , K . N a k a n i s h i " Q u a n t i t a t i v e D e f i n i t i o n o f E x c i t o n C h i r a l i t y a n d D i s t a n t E f f e c t i n E x c i t o n C h i r a l i t y M e t h o d " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 5 , 9 7 , 5 3 4 5 - 5 3 5 2 . W . H u g , G . W a g n i e r e " O p t i c a l - A c t i v i t y o f C h r o m o p h o r e s o f S y m m e t r y C 2 " T e t r a h e d r o n 1 9 7 2 , 2 8 , 1 2 4 1 - 1 2 4 5 . G . W a g n i e r e , W . H u g " P o l a r i z a t i o n a n d S i g n o f L o n g - W a v e l e n g t h C o t t o n - E f f e c t s i n C h r o m o p h o r e s o f S y m m e t r y C 2 " T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 7 0 , 4 7 6 5 - 4 7 6 7 . B . W e c k e r l e , P . S c h r e i e r , H . U . H u m p f " A n e w o n e - s t e p s t r a t e g y f o r t h e s t e r e o c h e m i c a l a s s i g n m e n t o f a c y c l i c 2 - a n d 3 - s u l f a n y l - 1 - a l k a n o l s u s i n g t h e C D e x c i t o n c h i r a l i t y m e t h o d " J . O r g . C h e m . 2 0 0 1 , 6 6 , 8 1 6 0 - 8 1 6 4 . S . O a n c e a , F . F o r r n a g g i o , S . C a m p e s t r i n i , Q . B . B r o x t e r m a n , B . K a p t e i n , C . T o n i o l o " D i s t a n c e d e p e n d e n c y o f e x c i t o n c o u p l e d c i r c u l a r d i c h r o i s m u s i n g t u r n a n d h e l i c a l p e p t i d e s p a c e r s " B i o p o l y m e r s 2 0 0 3 , 7 2 , 1 0 5 - 1 1 5 . G . P e s c i t e l l i , S . G a b r i e l , Y . K . W a n g , J . F l e i s c h h a u e r , R . W . W o o d y , N . B e r o v a " T h e o r e t i c a l a n a l y s i s o f t h e p o r p h y r i n - p o r p h y r i n e x c i t o n i n t e r a c t i o n i n c i r c u l a r d i c h r o i s m s p e c t r a o f d i m e r i c t e t r a a r y l p o r p h y r i n s " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 3 , 1 2 5 , 7 6 1 3 - 7 6 2 8 . S . M a t i l e , N . B e r o v a , K . N a k a n i s h i " E x c i t o n c o u p l e d c i r c u l a r d i c h r o i c s t u d i e s o f s e l f - a s s e m b l e d b r e v e t o x i n - p o r p h y r i n c o n j u g a t e s i n l i p i d b i l a y e r s a n d p o l a r s o l v e n t s " C h e m . B i o l . 1 9 9 6 , 3 , 3 7 9 - 3 9 2 . 2 7 9 4 8 . 4 9 . 5 0 . 5 1 . 5 2 . 5 3 . 5 4 . 5 5 . 5 6 . 5 7 . 5 8 . 5 9 . S . M a t i l e , N . B e r o v a , K . N a k a n i s h i " I n t r a m o l e c u l a r p o r p h y r i n p i , p i - s t a c k i n g : A b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n a l a s s i g n m e n t o f a c y c l i c c o m p o u n d s w i t h s i n g l e c h i r a l c e n t e r s b y e x c i t o n c o u p l e d c i r c u l a r d i c h r o i s m " E n a n t i o m e r 1 9 9 6 , I , 1 - 1 2 . S . M a t i l e , N . B e r o v a , K . N a k a n i s h i , J . F l e i s c h h a u e r , R . W . W o o d y " S t r u c t u r a l s t u d i e s b y e x c i t o n c o u p l e d c i r c u l a r d i c h r o i s m o v e r a l a r g e d i s t a n c e : P o r p h y r i n d e r i v a t i v e s o f s t e r o i d s , d i m e r i c s t e r o i d s , a n d b r e v e t o x i n B " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 6 , 1 1 8 , 5 1 9 8 - 5 2 0 6 . W . T . W i e s l e r , K . N a k a n i s h i " R e l a t i v e a n d A b s o l u t e C o n fi g u r a t i o n a l A s s i g n m e n t s o f A c y c l i c P o l y o l s b y C i r c u l a r - D i c h r o i s m . 1 . R a t i o n a l e f o r a S i m p l e P r o c e d u r e B a s e d o n t h e E x c i t o n C h i r a l i t y M e t h o d " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 8 9 , 1 1 1 , 9 2 0 5 - 9 2 1 3 . F . W . L i c h t e n t h a l e r , T . S a k a k i b a r a , E . O e s e r " S u g a r E n o l o n e s . 6 . " T e t r a - O - B e n z o y l — 2 - H a l o h e x o p y r a n o s y l H a l i d e s - P r e p a r a t i o n , A s s i g n m e n t o f C o n fi g u r a t i o n , a n d H y d r o l y s i s t o E n o l o n e s " C a r b o h y d . R e s . 1 9 7 7 , 5 9 , 4 7 - 6 1 . H . W . L i u , K . N a k a n i s h i " A M i c r o m e t h o d f o r D e t e r m i n i n g t h e B r a n c h i n g P o i n t s i n O l i g o s a c c h a r i d e s B a s e d o n C i r c u l a r - D i c h r o i s m " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 8 1 , 1 0 3 , 7 0 0 5 - 7 0 0 6 . J . G . D o n g , I . A k r i t o p o u l o u - Z a n z e , J . S . G u o , N . B e r o v a , K . N a k a n i s h i , N . H a r a d a " T h e o r e t i c a l c a l c u l a t i o n o f c i r c u l a r d i c h r o i c e x c i t o n - s p l i t s p e c t r a i n p r e s e n c e o f t h r e e i n t e r a c t i n g 2 - n a p h t h o a t e c h r o m o p h o r e s " E n a n t i o m e r 1 9 9 7 , 2 , 3 9 7 - 4 0 9 . N . H a r a d a , N a k a n i s h i . K . , C i r c u l a r D i c h r o i c S p e c t r o s c o p y : E x c i t o n C o u p l i n g i n O r g a n i c S t e r e o c h e m i s t r y , U n i v e r s i t y S c i e n c e B o o k s , M i l l V a l l e y , 1 9 8 3 . T . G o t o , T . K o n d o " S t r u c t u r e a n d M o l e c u l a r S t a c k i n g o f A n t h o c y a n i n s - F l o w e r C o l o r V a r i a t i o n " A n g e w . C h e m . - I n t . E d i t . E n g l . 1 9 9 1 , 3 0 , 1 7 - 3 3 . S . E . B o i a d j i e v , D . A . L i g h t n e r " A t r o p i s o m e r i s m i n l i n e a r t e t r a p y r r o l e s " T e t r a h e d r o n 2 0 0 2 , 5 8 , 7 4 1 1 - 7 4 2 1 . M . K w i t , J . G a w r o n s k i " H e l i c i t y o f N , N ' - d i a r y l - t r a n s - 1 , 2 - d i a m i n o c y c l o h e x a n e d e r i v a t i v e s . I m p l i c a t i o n s f o r m o l e c u l a r h e l i c i t y m a n i p u l a t i o n s " T e t r a h e d r o n 2 0 0 3 , 5 9 , 9 3 2 3 - 9 3 3 1 . F . T a k e i , H . H a y a s h i , K . O n i t s u k a , N . K o b a y a s h i , S . T a k a h a s h i " H e l i c a l c h i r a l p o l y i s o c y a n i d e s p o s s e s s i n g p o r p h y r i n p e n d a n t s : D e t e r m i n a t i o n o f h e l i c i t y b y e x c i t o n - c o u p l e d c i r c u l a r d i c h r o i s m " A n g e w . C h e m . - I n t . E d i t . 2 0 0 1 , 4 0 , 4 0 9 2 - 4 0 9 5 . L . J . P r i n s , C . T h a l a c k e r , F . W u r t h n e r , P . T i m m e r m a n , D . N . R e i n h o u d t " C h i r a l e x c i t o n c o u p l i n g o f m e r o c y a n i n e d y e s w i t h i n a w e l l d e f i n e d h y d r o g e n - b o n d e d a s s e m b l y " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 2 0 0 1 , 9 8 , 1 0 0 4 2 - 1 0 0 4 5 . 2 8 0 6 0 . 6 1 . 6 2 . 6 3 . 6 4 . 6 5 . 6 6 . 6 7 . 6 8 . 6 9 . 7 0 . 7 1 . M . A y a b e , K . Y a m a s h i t a , K . S a d a , S . S h i n k a i , A . I k e d a , S . S a k a m o t o , K . Y a m a g u c h i " C o n s t r u c t i o n o f m o n o m e r i c a n d p o l y m e r i c p o r p h y r i n c o m p a r t m e n t s b y a P d ( I I ) - p y r i d i n e i n t e r a c t i o n a n d t h e i r c h i r a l t w i s t i n g b y a B I N A P l i g a n d " J . O r g . C h e m . 2 0 0 3 , 6 8 , 1 0 5 9 - 1 0 6 6 . M . S i m o n y i , Z . B i k a d i , F . Z s i l a , J . D e l i " S u p r a m o l e c u l a r e x c i t o n c h i r a l i t y o f c a r o t e n o i d a g g r e g a t e s " C h i r a l i t y 2 0 0 3 , 1 5 , 6 8 0 - 6 9 8 . F . D . L e w i s , Y . S . W u , L . G . Z h a n g , X . B . Z u o , R . T . H a y e s , M . R . W a s i e l e w s k i " D N A - M e d i a t e d e x c i t o n c o u p l i n g a n d e l e c t r o n t r a n s f e r b e t w e e n d o n o r a n d a c c e p t o r s t i l b e n e s s e p a r a t e d b y a v a r i a b l e n u m b e r o f b a s e p a i r s " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 4 , 1 2 6 , 8 2 0 6 - 8 2 1 5 . R . S c h w e i t z e r - S t e n n e r " S e c o n d a r y s t r u c t u r e a n a l y s i s o f p o l y p e p t i d e s b a s e d o n a n e x c i t o n i c c o u p l i n g m o d e l t o d e s c r i b e t h e b a n d p r o fi l e o f a m i d e I ' o f I R , R a m a n , a n d v i b r a t i o n a l c i r c u l a r d i c h r o i s m s p e c t r a " J . P h y s . C h e m . B 2 0 0 4 , 1 0 8 , 1 6 9 6 5 - 1 6 9 7 5 . W . K u h n " T h e p h y s i c a l s i g n i f i c a n c e o f t h e o p t i c a l r o t a t o r y p o w e r " T r a n s . F a r a d a y S o c . 1 9 3 0 , 4 6 , 2 9 3 - 3 0 8 . J . G . K i r k w o o d " T h e t h e o r y o f o p t i c a l r o t a t o r y p o w e r " J . C h e m . P h y s . 1 9 3 7 , 5 , 4 7 9 - 4 9 1 . W . M o f fi t t " O p t i c a l r o t a t o r y d i s p e r s i o n o f h e l i c a l p o l y m e r " J . C h e m . P h y s . 1 9 5 6 , 2 5 . I . T i n o c o " T h e o r e t i c a l a s p e c t s o f o p t i c a l a c t i v i t y " A d v . C h e m . P h y s . 1 9 6 2 , 4 , 1 1 3 - 1 6 0 . P . M . B a y l e y , E . B . N i e l s e n , J . A . S c h e l l m a n " R o t a t o r y p r o p e r t i e s o f m o l e c u l e s c o n t a i n i n g t w o p e p t i d e g r o u p s z t h e o r y " J . C h e m . P h y s . 1 9 6 9 , 7 3 , 2 2 8 - 2 4 3 . S . F . M a s o n " T h e a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n o f c a l y c a n t h i n e " P r o c . C h e m . S o c . 1 9 6 2 , 3 6 2 - 3 6 3 . S . F . M a s o n , G . W . V a n e " T h e c i r c u l a r d i c h r o i s m a n d a b s o r p t i o n s p e c t r a o f a l k a l o i d s c o n t a i n i n g t h e a n i l i n e c h r o m o p h o r e . T h e a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n o f c a l y c a n t h i n e " J . C h e m S o c . ( B ) 1 9 6 6 . N . H a r a d a " A b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n o f ( + ) - t r a n s - a b s c i s i c a c i d a s d e t e r m i n e d b y a q u a n t i t a t i v e a p p l i c a t i o n o f t h e e x c i t o n c h i r a l i t y m e t h o d " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 3 , 9 5 , 2 4 0 - 2 4 2 . 2 8 1 7 2 . 7 3 . 7 4 . 7 5 . 7 6 . 7 7 . 7 8 . 7 9 . 8 0 . 8 1 . 8 2 . 8 3 . 8 4 . M . K o r e e d a , G . W e i s s , N a k a n i s h . K " A b s o l u t e C o n fi g u r a t i o n o f N a t u r a l ( + ) - A b s c i s i c A c i d " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 3 , 9 5 , 2 3 9 - 2 4 0 . S . G . A l l e n m a r k " C h i r o p t i c a l m e t h o d s i n t h e s t e r e o c h e m i c a l a n a l y s i s o f n a t u r a l p r o d u c t s " N a t . P r o d . R e p . 2 0 0 0 , 1 7 , 1 4 5 - 1 5 5 . K . T a c h i b a n a , M . S a k a i t a n i , K . N a k a n i s h i " P a v o n i n i n s , S h a r k - R e p e l l i n g a n d I c h t h y o t o x i c S t e r o i d N - A c e t y l g l u c o s a m i n i d e s f r o m t h e D e f e n s e S e c r e t i o n o f t h e S o l e P a r a d a c h i r u s - P a v o n i n u s ( S o l e i d a e ) " T e t r a h e d r o n 1 9 8 5 , 4 1 , 1 0 2 7 - 1 0 3 7 . M . A . A d a m s , K . N a k a n i s h i , W . C . S t i l l , E . V . A r n o l d , J . C l a r d y , C . J . P e r s o o n s " S e x - P h e r o m o n e o f t h e A m e r i c a n C o c k r o a c h - A b s o l u t e - C o n fi g u r a t i o n o f P e r i p l a n o n e - B " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 9 , 1 0 1 , 2 4 9 5 - 2 4 9 8 . G . P e s c i t e l l i , N . B e r o v a , T . L . X i a o , R . V . R o z h k o v , R . C . L a r o c k , D . W . A r m s t r o n g " A s s i g n m e n t o f a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n o f a c h i r a l p h e n y l - s u b s t i t u t e d d i h y d r o f u r o a n g e l i c i n " O r g . B i o m o l . C h e m . 2 0 0 3 , I , 1 8 6 - 1 9 0 . T . N a b e s h i m a , A . H a s h i g u c h i , T . S a i k i , S . A k i n e " T r a n s f e r o f c h i r a l i n f o r m a t i o n t h r o u g h a c h i r a l i o n r e c o g n i t i o n b y a n o v e l p s e u d o c r o w n o t h e r w i t h a b i n a p h t h y l m o i e t y " A n g e w . C h e m - I n t . E d i t . 2 0 0 2 , 4 1 , 4 8 1 - 4 8 4 . E . R . B l o u t , L . S t r y e r " A n o m a l o u s o p t i c a l r o t a t o r y d i s p e r s i o n o f d y e : p o l y p e p t i d e c o m p l e x e s " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 5 9 , 4 5 , 1 5 9 1 - 1 5 9 3 . R . K r a m e r , R . L a n g , B . B r z e z i n s k i , G . Z u n d e l " P r o t o n - T r a n s f e r i n I n t r a m o l e c u l a r H y d r o g e n - B o n d s w i t h L a r g e P r o t o n P o l a r i z a b i l i t y i n l - P i p e r i d i n e c a r b o x y l i c A c i d s - T e m p e r a t u r e , S o l v e n t a n d C o n c e n t r a t i o n - D e p e n d e n c e " J . C h e m . S o c . F a r a d a y T r . 1 9 9 0 , 8 6 , 6 2 7 - 6 3 0 . S . H a n e s s i a n , M . S i m a r d , S . R o e l e n s " M o l e c u l a r R e c o g n i t i o n a n d S e l f - A s s e m b l y b y N o n - A r r r i d i c H y d r o g e n - B o n d i n g - a n E x c e p t i o n a l A s s e m b l e r o f N e u t r a l a n d C h a r g e d S u p r a m o l e c u l a r S t r u c t u r e s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 5 , 1 1 7 , 7 6 3 0 - 7 6 4 5 . C . L . B e l l , G . M . B a r r o w J . C h e m . P h y s . 1 9 5 9 , 3 6 , 5 . T . M i z u t a n i , H . T a k a g i , O . H a r a , T . H o r i g u c h i , H . O g o s h i " A x i a l c h i r a l i t y i n d u c t i o n i n fl e x i b l e b i p h e n o l s b y h y d r o g e n b o n d i n g a n d s t e r i c i n t e r a c t i o n s " T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 9 7 , 3 8 , 1 9 9 1 - 1 9 9 4 . S . H o s o i , M . K a r r r i y a , T . O h t a " N o v e l d e v e l o p m e n t o f e x c i t o n - c o u p l e d c i r c u l a r d i c h r o i s m b a s e d o n i n d u c e d a x i a l c h i r a l i t y " O r g . L e t t . 2 0 0 1 , 3 , 3 6 5 9 - 3 6 6 2 . 0 . G i m p l e , P . S c h r e i e r , H . U . H u m p f " A n e w e x c i t o n - c o u p l e d c i r c u l a r d i c h r o i s m m e t h o d f o r a s s i g n i n g t h e a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n i n a c y c l i c a l p h a - a n d b e t a - h y d r o x y c a r b o x y l i c a c i d s " T e t r a h e d r o n - A s y m m e t r y 1 9 9 7 , 8 , 1 1 - 1 4 . 2 8 2 8 5 . 8 6 . 8 7 . 8 8 . 8 9 . 9 0 . 9 1 . 9 2 . 9 3 . 9 4 . 9 5 . E . Y a s h i m a , T . M a t s u s h i m a , Y . O k a m o t o " C h i r a l i t y a s s i g n m e n t o f a m i n e s a n d a m i n o a l c o h o l s b a s e d o n c i r c u l a r d i c h r o i s m i n d u c e d b y h e l i x f o r m a t i o n o f a s t e r e o r e g u l a r p o l y ( ( 4 - c a r b o x y p h e n y l ) a c e t y l e n e ) t h r o u g h a c i d - b a s e c o m p l e x a t i o n " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 7 , 1 1 9 , 6 3 4 5 - 6 3 5 9 . T . M i z u n o , M . Y a m a m o t o , M . T a k e u c h i , S . S h i n k a i " S u g a r ' c h i r a l i t y ' s e n s i n g u s i n g a ' p r o c h i r a l ' s a l e n - C o ( I I ) c o m p l e x " T e t r a h e d r o n 2 0 0 0 , 5 6 , 6 1 9 3 - 6 1 9 8 . A . E . H o l m e s , S . Z a h n , J . W . C a n a r y " S y n t h e s i s a n d c i r c u l a r d i c h r o i s m s t u d i e s o f N , N - b i s ( 2 - q u i n o l y l m e t h y l ) a m i n o a c i d C u ( H ) c o m p l e x e s : D e t e r m i n a t i o n o f a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n a n d e n a n t i o m e r i c e x c e s s b y t h e e x c i t o n c o u p l i n g m e t h o d " C h i r a l i t y 2 0 0 2 , 1 4 , 4 7 1 - 4 7 7 . J . W . C a n a r y , C . S . A l l e n , J . M . C a s t a g n e t t o , Y . H . W a n g " C o n f o r r n a t i o n a l l y D r i v e n , P r o p e l l e r - L i k e C h i r a l i t y i n L a b i l e C o o r d i n a t i o n - C o m p l e x e s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 5 , 1 1 7 , 8 4 8 4 - 8 4 8 5 . J . W . C a n a r y , C . S . A l l e n , J . M . C a s t a g n e t t o , Y . H . C h i u , P . J . T o s c a n o , Y . H . W a n g " S o l i d s t a t e a n d s o l u t i o n c h a r a c t e r i z a t i o n o f c h i r a l , c o n f o r m a t i o n a l l y m o b i l e t r i p o d a l l i g a n d s " I n o r g . C h e m . 1 9 9 8 , 3 7 , 6 2 5 5 - 6 2 6 2 . Y . H . C h i u , O . d o s S a n t o s , J . W . C a n a r y " C o n f o r m a t i o n a l c o n t r o l o f p r o p e l l e r - l i k e c h i r a l i t y i n Z n ( I I ) c o m p l e x e s : T i g h t l y b a l a n c e d s t e r i c b i a s " T e t r a h e d r o n 1 9 9 9 , 5 5 , 1 2 0 6 9 - 1 2 0 7 8 . S . Z a h n , J . W . C a n a r y " E l e c t r o n - i n d u c e d i n v e r s i o n o f h e l i c a l c h i r a l i t y i n c o p p e r c o m p l e x e s o f N , N - d i a l k y l m e t h i o n i n e s " S c i e n c e 2 0 0 0 , 2 8 8 , 1 4 0 4 - 1 4 0 7 . J . Z h a n g , A . E . H o l m e s , A . S h a r m a , N . R . B r o o k s , R . S . R a r i g , J . Z u b i e t a , J . W . C a n a r y " D e r i v a t i z a t i o n , c o m p l e x a t i o n , a n d a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n a l a s s i g n m e n t o f c h i r a l p r i m a r y a m i n e s : A p p l i c a t i o n o f e x c i t o n - c o u p l e d c i r c u l a r d i c h r o i s m " C h i r a l i t y 2 0 0 3 , 1 5 , 1 8 0 - 1 8 9 . S . Z a h n , J . W . C a n a r y " A b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n s o f N , N - d i a l k y l a l p h a - a m i n o a c i d s a n d b e t a - a r r r i n o a l c o h o l s f r o m e x c i t o n - c o u p l e d c i r c u l a r d i c h r o i s m s p e c t r a o f C u ( I I ) c o m p l e x e s " O r g . L e t t . 1 9 9 9 , 1 , 8 6 1 - 8 6 4 . X . F . H u a n g , K . N a k a n i s h i , N . B e r o v a " P o r p h y r i n s a n d m e t a l l o p o r p h y r i n s : V e r s a t i l e c i r c u l a r d i c h r o i c r e p o r t e r g r o u p s f o r s t r u c t u r a l s t u d i e s " C h i r a l i t y 2 0 0 0 , 1 2 , 2 3 7 - 2 5 5 . S . M a t i l e , N . B e r o v a , K . N a k a n i s h i , S . N o v k o v a , I . P h i l i p o v a , B . B l a g o e v " P o r p h y r i n s - P o w e r f u l C h r o m o p h o r e s f o r S t r u c t u r a l S t u d i e s b y E x c i t o n - C o u p l e d C i r c u l a r - D i c h r o i s m " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 5 , 1 1 7 , 7 0 2 1 - 7 0 2 2 . 2 8 3 9 6 . 9 7 . 9 8 . 9 9 . 1 0 0 . 1 0 1 . 1 0 2 . 1 0 3 . 1 0 4 . 1 0 5 . 1 0 6 . S . A r i m o r i , M . T a k e u c h i , S . S h i n k a i " S u g a r - s e n s i n g b y c h i r a l o r i e n t a t i o n o f d i m e r i c b o r o n i c - a c i d - a p p e n d e d p o r p h y r i n s w h i c h s h o w s e l e c t i v i t y f o r g l u c o s e a n d x y l o s e " C h e m . L e t t . 1 9 9 6 , 7 7 - 7 8 . S . A r i m o r i , M . T a k e u c h i , S . S h i n k a i " S u g a r - c o n t r o l l e d a g g r e g a t e f o r m a t i o n i n b o r o n i c a c i d - a p p e n d e d p o r p h y r i n a m p h i p h i l e s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 6 , 1 1 8 , 2 4 5 - 2 4 6 . M . J . C r o s s l e y , L . G . M a c k a y , A . C . T r y " E n a n t i o s e l e c t i v e R e c o g n i t i o n o f H i s t i d i n e a n d L y s i n e E s t e r s b y P o r p h y r i n C h i r a l C l e f t s a n d D e t e c t i o n o f A m i n o - A c i d C o n f o r m a t i o n s i n t h e B o u n d - S t a t e " J . C h e m . S o c - C h e m . C o m m u n . 1 9 9 5 , 1 9 2 5 - 1 9 2 7 . M . J . C r o s s l e y , T . W . H a m b l e y , L . G . M a c k a y , A . C . T r y , R . W a l t o n " P o r p h y r i n A n a l o g s o f T r o g e r s B a s e - L a r g e C h i r a l C a v i t i e s w i t h a B i m e t a l l i c B i n d i n g - S i t e " J . C h e m . S o c - C h e m . C o m m u n . 1 9 9 5 , 1 0 7 7 - 1 0 7 9 . N . F o s t e r , A . K . S i n g h a l , M . W . S m i t h , N . G . M a r c o s , W . J . B i r d s a l l " I n t e r a c t i o n s o f P o r p h y r i n s a n d M e t a l l o p o r p h y r i n s w i t h T r a n s f e r - R N A " A b s t r . P a p . A m . C h e m . S o c . 1 9 8 8 , 1 9 5 , 4 0 5 - 4 0 9 . N . F o s t e r , A . K . S i n g h a l , M . W . S m i t h , N . G . M a r c o s , K . J . S c h r a y " I n t e r a c t i o n s o f P o r p h y r i n s a n d T r a n s f e r - R N A " B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 9 8 8 , 9 5 0 , 1 1 8 - 1 3 1 . H . S u e n a g a , S . A r i m o r i , S . S h i n k a i " S u g a r - c o n t r o l l e d a s s o c i a t i o n d i s s o c i a t i o n e q u i l i b r i a b e t w e e n D N A a n d b o r o n i c a c i d - a p p e n d e d p o r p h y r i n " J . C h e m . S o c . P e r k . T r . 2 1 9 9 6 , 6 0 7 - 6 1 2 . J . B . M a c M i l l a n , T . F . M o l i n s k i " E x c i t o n c o u p l i n g c i r c u l a r d i c h r o i s m a p p r o a c h t o s o l v i n g a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n o f l , n - d i o l s ( n = 5 , 7 , 9 ) . " A b s t r . P a p . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 3 , 2 2 6 , U 2 1 4 - U 2 1 4 . J . B . M a c M i l l a n , T . F . M o l i n s k i " L o n g - r a n g e s t e r e o - r e l a y : R e l a t i v e a n d a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n o f l , n - g l y c o l s f r o m c i r c u l a r d i c h r o i s m o f l i p o s o m a l p o r p h y r i n e s t e r s " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 4 , 1 2 6 , 9 9 4 4 - 9 9 4 5 . J . B . M a c M i l l a n , R . G . L i n i n g t o n , R . J . A n d e r s e n , T . F . M o l i n s k i " S t e r e o c h e r r r i c a l a s s i g n m e n t i n a c y c l i c l i p i d s a c r o s s l o n g d i s t a n c e b y c i r c u l a r d i c h r o i s m : A b s o l u t e s t e r e o c h e r r r i s t r y o f t h e a g l y c o n e o f c a r r r i n o s i d e A " A n g e w . C h e m - I n t . E d i t . 2 0 0 4 , 4 3 , 5 9 4 6 - 5 9 5 1 . X . F . H u a n g , B . B o r h a n , N . B e r o v a , K . N a k a n i s h i " U V - v i s s p e c t r a l c h a n g e s i n t h e b i n d i n g o f a c y c l i c d i a m i n e s w i t h a z i n c p o r p h y r i n t w e e z e r " J . I n d i a n C h e m . S o c . 1 9 9 8 , 7 5 , 7 2 5 - 7 2 8 . 2 8 4 1 0 7 1 0 8 . 1 0 9 . 1 1 0 . 1 1 1 . 1 1 2 . 1 1 3 . 1 1 4 . 1 1 5 . X . F . H u a n g , B . H . R i c k m a n , B . B o r h a n , N . B e r o v a , K . N a k a n i s h i " Z i n c p o r p h y r i n t w e e z e r i n h o s t - g u e s t c o m p l e x a t i o n : D e t e r m i n a t i o n o f a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n s o f d i a m i n e s , a r r r i n o a c i d s , a n d a r r r i n o a l c o h o l s b y c i r c u l a r d i c h r o i s m " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 8 , 1 2 0 , 6 1 8 5 - 6 1 8 6 . X . H u a n g , B . B o r h a n , B . H . R i c k m a n , K . N a k a n i s h i , N . B e r o v a " Z i n c P o r p h y r i n T w e e z e r i n H o s t - G u e s t C o m p l e x a t i o n : D e t e r m i n a t i o n o f A b s o l u t e C o n fi g u r a t i o n s o f P r i m a r y M o n o a m i n e s b y C i r c u l a r D i c h r o i s m " C h e m . E u r . J . 2 0 0 0 , 6 , 2 1 6 - 2 2 4 . X . F . H u a n g , N . F u j i o k a , G . P e s c i t e l l i , F . E . K o e h n , R . T . W i l l i a m s o n , K . N a k a n i s h i , N . B e r o v a " A b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n a l a s s i g n m e n t s o f s e c o n d a r y a m i n e s b y C D - s e n s i t i v e d i m e r i c z i n c p o r p h y r i n h o s t " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 2 , 1 2 4 , 1 0 3 2 0 - 1 0 3 3 5 . Q . Y a n g , C . O l m s t e d , B . B o r h a m " A b s o l u t e s t e r e o c h e m i c a l d e t e r m i n a t i o n o f c h i r a l c a r b o x y l i c a c i d s " O r g . L e t t . 2 0 0 2 , 4 , 3 4 2 3 - 3 4 2 6 . G . P r o n i , G . P e s c i t e l l i , X . F . H u a n g , N . Q . Q u r a i s h i , K . N a k a n i s h i , N . B e r o v a " C o n fi g u r a t i o n a l a s s i g n m e n t o f a l p h a - c h i r a l c a r b o x y l i c a c i d s b y c o m p l e x a t i o n t o d i m e r i c Z n - p o r p h y r i n : h o s t - g u e s t s t r u c t u r e , c h i r a l r e c o g n i t i o n a n d c i r c u l a r d i c h r o i s m " C h e m . C o m m u n . 2 0 0 2 , 1 5 9 0 - 1 5 9 1 . G . P r o n i , G . P e s c i t e l l i , X . F . H u a n g , K . N a k a n i s h i , N . B e r o v a " M a g n e s i u m t e t r a a r y l p o r p h y r i n t w e e z e r : A C D - s e n s i t i v e h o s t f o r a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n a l a s s i g n m e n t s o f a l p h a - c h i r a l c a r b o x y l i c a c i d s " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 3 , 1 2 5 , 1 2 9 1 4 - 1 2 9 2 7 . V . V . B o r o v k o v , N . Y a m a m o t o , J . M . L i n t u l u o t o , T . T a n a k a , Y . I n o u e " S u p r a m o l e c u l a r c h i r a l i t y i n d u c t i o n i n b i s ( z i n c p o r p h y r i n ) b y a m i n o a c i d d e r i v a t i v e s : R a t i o n a l i z a t i o n a n d a p p l i c a t i o n s o f t h e l i g a n d b u l k i n e s s e f f e c t " C h i r a l i t y 2 0 0 1 , 1 3 , 3 2 9 - 3 3 5 . V . V . B o r o v k o v , J . M . L i n t u l u o t o , Y . I n o u e " S u p r a m o l e c u l a r c h i r o g e n e s i s i n z i n c p o r p h y r i n s : M e c h a n i s m , r o l e o f g u e s t s t r u c t u r e , a n d a p p l i c a t i o n f o r t h e a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n d e t e r m i n a t i o n " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 1 , 1 2 3 , 2 9 7 9 - 2 9 8 9 . J . M . L i n t u l u o t o , V . V . B o r o v k o v , Y . I n o u e " D i r e c t d e t e r m i n a t i o n o f a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n o f m o n o a l c o h o l s b y b i s ( m a g n e s i u m p o r p h y r i n ) " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 2 , 1 2 4 , 1 3 6 7 6 - 1 3 6 7 7 . 2 8 5 h w o a i p n d e d o n e t p h o o p p s i t e C . o s D ( F i g u i t e s p e r c e h t 6 - 1 ) c i t e r l a i , . a i s e s S t r t h e t h u i u e c x y r b a e i r s t e . r M e . - 6 l H - 1 e . i M a x - F i g u P a n d P - h e l i c a l c - o H e l i n f o r x m a t i o n s C h a p t e r 6 U s i n g H e l i c a t e s f o r t h e D e t e r m i n a t i o n o f t h e S t e r e o c h e m i s t r y o f C h i r a l C o m p o u n d s 6 . 1 I n t r o d u c t i o n t o H e l i c a t e s O v e r t h e p a s t f e w y e a r s , t h e r e h a s b e e n a g r e a t i n t e r e s t i n t h e s t u d y o f h e l i c a l s u p r a m o l e c u l a r s t r u c t u r e s a s a n a p p r o a c h t o n e w s t r u c t u r e s w i t h n o v e l a n d i n t e r e s t i n g p r o p e r t i e s i n t h e a r e a s o f m o l e c u l a r r e c o g n i t i o n , s e l f o r g a n i z a t i o n a n d s e l f a s s e m b l y , " 3 T h e fi r s t r e p o r t e d e x a m p l e s i n c l u d e l i n e a r p o l y l i g a n d s , w h i c h u p o n c o o r d i n a t i o n t o a t r a n s i t i o n m e t a l c a n f o r m h e l i c a l s t r u c t u r e s . 4 S i n c e t h e n , a s e r i e s o f h e l i c a l s t r u c t u r e s 8 - 1 3 h a v e b e e n r e p o r t e d , 5 ' 7 i n c l u d i n g d o u b l e o r t r i p l e h e l i c e s u s i n g t r a n s i t i o n m e t a l s a s w e l l 1 4 , 1 5 1 6 , 1 7 a s l a n t h a n i d e s a s t h e c o o r d i n a t i o n c e n t e r . I n m o s t c a s e s , p o l y - b i s - p y r i d i n e c o n t a i n i n g l i g a n d s w e r e u s e d , b u t d i p y r r o m e t h e n e u n i t s h a v e p r o v e n a m e n a b l e t o h e l i c a l f o r m a t i o n a s w e l l . ' 8 ' 1 9 O u r p l a n s i n v o l v e d t h e u s e o f s i m i l a r l i g a n d s a s r e p o r t e r s o f c h i r a l i t y f o r b o u n d / c o o r d i n a t e d s t r u c t u r e s . A s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d , h e l i c a l c o m p l e x e s c a n a d o p t t w o d i f f e r e n t c o n f o r m a t i o n a l t w i s t s , w h i c h a r e r e f e r r e d a s P a n d M h e l i c i t y . P ( p l u s ) r e p r e s e n t s a c l o c k w i s e o r r i g h t - h a n d e d t u r n o f t h e h e l i x w h i l e M ( m i n u s ) a c o u n t e r c l o c k w i s e , l e f t - 2 8 6 e n a n t i o m e r s . I n a n a c h i r a l s y s t e m , t h e r a t i o o f M a n d P h e l i c e s i s o n e a n d , t h e r e f o r e , t h e o v e r a l l C D s p e c t r u m i s z e r o . H o w e v e r , i f a c h i r a l s t r u c t u r e i s p r e s e n t i n t h e s y s t e m , i t c a n a c t a s a m o l e c u l a r t e m p l a t e a n d f a v o r o n e h e l i c a l p o p u l a t i o n o v e r t h e o t h e r , l e a d i n g t o a n o b s e r v a b l e C D s p e c t r u m . T h r o u g h o u t t h e l i t e r a t u r e s t r u c t u r e s s u c h a s b i l i v e r d i n , a l i n e a r t e t r a p y r r o l e , w h i c h c a n a d o p t b o t h P a n d M h e l i c i t i e s u p o n c o o r d i n a t i o n o f t h e p y r r o l e n i t r o g e n a t o m s w i t h m e t a l i o n s h a v e b e e n r e p o r t e d . 4 T h i s f e a t u r e h a s b e e n f u r t h e r e x a m i n e d b y O g o s h i a n d c o w o r k e r s w h o d e m o n s t r a t e d t h a t t h e b i n d i n g o f L - a m i n o a c i d e s t e r s t o z i n c - b i l i v e r d i n i n d u c e d a l e f t - h a n d e d ( M ) h e l i c i t y . 2 0 I n o u r c a s e , w e w e r e i n t e r e s t e d i n d e v e l o p i n g r e p o r t e r s y s t e m s u s i n g d i p y r r o m e t h e n e a n d b i s - p y r i d i n e u n i t s , l i k e t h o s e s h o w n i n F i g u r e 6 - 2 . U p o n c o o r d i n a t i o n t o a m e t a l c e n t e r , t h e c o m p l e x c o u l d R 1 F “ 1 R R e x i s t i n b o t h P a n d M h e l i c a l c o n fi g u r a t i o n s a s a \ \ \ R / \ \ 2 \ N H N ‘ 2 — N N / r a c e m i c m i x t u r e . W h e n a c h i r a l m o l e c u l e , i . e . c h i r a l a m i n e , b i n d s t o t h e c o m p l e x , t w o d i f f e r e n t ” 9 W 9 5 ' 2 - D i p y r r o m e t h e n e a n d . . . . b i s - p y r i d i n e u n i t s d i a s t e r e o m e r s c a n f o r m . D u e t o s t e m r e s t r i c t i o n s o n e c o n f o r m a t i o n w o u l d b e f a v o r e d r e s u l t i n g i n e i t h e r P o r M h e l i c i t y ( F i g u r e 6 - 3 ) . T h i s d i a s t e r e o m e r i c d i f f e r e n t i a t i o n w o u l d l e a d t o a ” c h i r a l e x c e s s “ w h i c h c a n t r a n s l a t e i n t o a u n i q u e E C C D s p e c t r u m d u e t o t h e t h r o u g h s p a c e i n t e r a c t i o n o f t h e t w o i n d e p e n d e n t l y c o n j u g a t e d c h r o m o p h o r e s . O u r a p p r o a c h i n v o l v e s t h e n o n - e m p i r i c a l c o r r e l a t i o n o f t h e o b s e r v e d C D w i t h t h e c h i r a l i t y o f t h e b o u n d m o l e c u l e , s i n c e t h e s i g n o f t h e C D c o u p l e t i s g o v e r n e d o n l y b y t h e o r i e n t a t i o n o f t h e i n t e r a c t i n g e l e c t r i c d i p o l e t r a n s i t i o n m o m e n t s . 2 8 7 \ \ N H N \ 1 . Z n + 2 M ” 9 " " P H e l i x ” # 6 2 . c h i r a l - a m i n e f a v o r e d d l a s t e r e o m e r F i g u r e 6 - 3 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e d i a s t e r e o t o p i c d i f f e r e n t i a t i o n u p o n l i g a t i o n o f c h i r a l a m i n e s t o c o m p l e x e s o f Z n ( | l ) w i t h d i p y r r o m e t h e n e s . D e p e n d i n g o n t h e s t e r e o c h e m i s t r y o f t h e c h i r a l a m i n e o n e h e l i c a l c o n f o r m a t i o n w i l l b e f a v o r e d y i e l d i n g a c h a r a c t e r i s t i c E C C D s p e c t r u m . A s s h o w n i n F i g u r e 6 - 2 , o u r s u g g e s t e d h o s t s y s t e m s a r e n i t r o g e n - c o n t a i n i n g , b i - d e n t a t e s u b s t r a t e s . T h e m e t a l o f c h o i c e t o c o o r d i n a t e w i t h t h e s e s y s t e m s i s Z n ” . I t h a s b e e n s h o w n t h a t z i n c i o n s h a v e a g r e a t a f fi n i t y f o r b i n d i n g w i t h n i t r o g e n , 2 1 w h i c h c a n f a v o r t h e f o r m a t i o n o f t h e d e s i r e d c o m p l e x e s . I t i s a l s o k n o w n t h a t z i n c c a n e a s i l y c h a n g e i t s c o o r d i n a t i o n s p h e r e i n o r d e r t o a c c o m m o d a t e 4 , 5 o r 6 d i f f e r e n t l i g a n d s , ” 2 4 a 2 8 8 p r e f e r e n c e h a s a l s o b e e n s t u d i e d b y I R , ” 3 0 f e a t u r e t h a t w e i n t e n d t o e x p l o i t . A d d i t i o n a l l y , z i n c - n i t r o g e n b i n d i n g i s n o t g r e a t l y a f f e c t e d b y m o i s t u r e , a n d h a n d l i n g t h e s e c o m p o u n d s i s s i m p l e . 6 . 2 T h e D i p y r r o m e t h e n e s y s t e m s H R T h e f i r s t s y s t e m s c h o s e n f o r t h e f o r m a t i o n o f \ E t O O C \ \ N H N ~ \ C O O E t c h i r a l h e l i c a t e s w e r e d i p y r r o m e t h e n e u n i t s , l i k e t h o s e s h o w n i n F i g u r e 6 - 4 . D i p y r r o m e t h e n e s a r e f u l l y R R R \ \ N H \ : \ 3 : F l c o n j u g a t e d , fl a t b i p y r r o l i c m o i e t i e s . T h e y c a n b e e a s i l y 5 2 5 - 2 7 s y n t h e s i z e d b y e s t a b l i s h e d p r o c e d u r e s a n d a c t a s F l 9 “ " 9 5 ‘ 4 - S t r u c t u r e s 0 f i n t e r m e d i a t e s f o r t h e s y n t h e s i s o f v a r i o u s p o r p h y r i n d i p y r r o m e t h e n e u n i t s . s y s t e m s . T h e y a l s o a c t a s m o d e l s y s t e m s f o r t h e s t u d y o f t h e p r o p e r t i e s o f p o r p h y r i n s i n s o l u t i o n a n d a r e a v e r y i m p o r t a n t p a r t i a l s t r u c t u r e o f v e r d i n o i d b i l e p i g m e n t s . F o r c e f i e l d c a l c u l a t i o n s o n l i n e a r d i p y r r o m e t h e n e s , 2 0 i . e . h e x a r n e t h y l d i p y r r o m e t h e n e i n F i g u r e 6 - 5 , h a v e s h o w n t h e Z - s p - s y s t e m t o b e t h e l o w e s t e n e r g y c o n f o r m a t i o n ( f o r c o n f o r m a t i o n a l n o m e n c l a t u r e s e e L i n d s e y e t a l . ) . 2 5 T h e m o l e c u l e i s a l m o s t fl a t ( t h e d i h e d r a l a n g l e i s 1 0 ° ) a n d t h e s t a b i l i z a t i o n i s a l m o s t c o m p l e t e l y d u e t o t h e i n t r a r n o l e c u l a r h y d r o g e n b o n d . T h i s c o n f o r m a t i o n a l 2 8 9 _ N \ \ \ \ 3 5 ° Z - s p - c o n f o r m e r E - s p - c o n f o r m e r F i g u r e 6 - 5 . T h e Z - s p - c o n f o r m e r ( s y n , d i h e d r a l a n g l e i s 1 0 ° ) i s 1 2 k J / m o l e m o r e s t a b l e t h a n t h e E - s p - c o n f o r m e r ( a n t i , d i h e d r a l a n g l e i s 3 5 ° ) f o l l o w i n g t h e N - H s t r e t c h c h a n g e s u s i n g d i f f e r e n t s u b s t i t u e n t s o n t h e d i p y r r o l e r i n g s . I n a d d i t i o n , i t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t d i p y r r o m e t h e n e s i n t h e f r e e b a s e f o r m ( a s s h o w n i n F i g u r e s 6 - 3 , 6 - 4 ) e x h i b i t s t r o n g a b s o r p t i o n i n t h e v i s i b l e r e g i o n b u t o n l y a f a i n t 3 0 ’ “ A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n i s t h a t q u e n c h i n g o f t h e fl u o r e s c e n c e i s fl u o r e s c e n c e . p r o m o t e d b y t h e m o t i o n o f t h e i r r r i n o p r o t o n b e t w e e n t h e t w o p y r r o l e r i n g s . I n t h e Z - s y n s t r u c t u r e , t h i s m o t i o n t a k e s p l a c e i n s i d e t h e d o u b l e w e l l p o t e n t i a l o f t h e i n t r a m o l e c u l a r h y d r o g e n b o n d . T h i s e x p l a n a t i o n i s c o r r o b o r a t e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t d i p y r r o m e t h e n e d e r i v a t i v e s w h i c h l a c k a n i n t r a m o l e c u l a r H — b o n d h a v e d i f f e r e n t e m i s s i o n p r o p e r t i e s . F o r e x a m p l e , t h e h y d r o b r o m i d e f o r m o f t h e a b o v e s t r u c t u r e s s h o w s t r o n g a b s o r p t i o n i n t h e v i s i b l e r e g i o n a s w e l l a s a c l e a r fl u o r e s c e n c e a t l o w t e m p e r a t u r e . H o w e v e r , t h e p r e f e r e n c e o f t h e s e m o l e c u l e s f o r t h e Z - s y n c o n f o r m a t i o n h a s a l s o b e e n e s t a b l i s h e d b y t h e r e p o r t e d c r y s t a l s t r u c t u r e s o f b o t h t h e f r e e b a s e 3 5 a n d t h e h y d r o b r o r r r i d e f o r m s . 3 6 I n a d d i t i o n , n O e N M R r e s u l t s s u p p o r t e d t h e Z - s y n c o n f o r m a t i o n s i n c e , u p o n i r r a d i a t i o n o f t h e b r i d g e - m e t h i n e , c l e a r e n h a n c e m e n t i n t h e i n t e n s i t i t y o f t h e r e s o n a n c e o f t h e n e a r b y m e t h y l g r o u p p e a k w a s o b s e r v e d . 3 7 T h i s o b s e r v a t i o n w a s i m p o r t a n t f o r o u r p u r p o s e s i n c e t h e E - s p - c o n f o r m e r c o u l d n o t f o r m t h e h e l i c a l c o m p l e x e s d e p i c t e d i n F i g u r e 6 - 3 . T h e c o m p l e x e s o f d i p y r r o m e t h e n e u n i t s w i t h t r a n s i t i o n m e t a l s h a v e b e e n r e p e a t e d l y r e p o r t e d f o r o v e r 4 0 y e a r s . “ 3 8 “ “ T h e t r a n s i t i o n m e t a l s u s e d h a v e c o v e r e d a l m o s t t h e w h o l e fi r s t r o w o f t h e p e r i o d i c t a b l e , w i t h m o s t r e s e a r c h e r s f o c u s i n g o n C u ( I I ) , Z n ( I I ) , C o ( I I ) a n d N i ( I I ) c o m p l e x e s d u e t o t h e i r n a t u r a l a b u n d a n c e i n b i o l o g i c a l s y s t e m s . I n t h e p r e s e n c e o f 5 , 5 ’ s u b s t i t u t i o n t h e s e c o m p l e x e s a r e e x p e c t e d t o b e f a r f r o m p l a n a r i n o r d e r t o p r e v e n t o v e r c r o w d i n g . 2 9 0 B a c k i n 1 9 6 5 F e r g u s s o n a n d R a m s a y 4 0 p r e s e n t e d s p e c t r a l e v i d e n c e ( e l e c t r o n i c s p e c t r a , m a g n e t i c m e a s u r e m e n t s a n d X - r a y p o w d e r p h o t o g r a p h s ) t h a t t h e c o m p l e x e s o f d i p y r r o m e t h e n e s w i t h C o ( I I ) , N i ( I I ) a n d Z n ( I I ) a r e t e t r a h e d r a l a n d t h a t t h e C u ( I I ) c o m p l e x e s a r e p r o b a b l y d i s t o r t e d t e t r a h e d r a l . T h e r a r i t y o f a t e t r a h e d r a l e n v i r o n m e n t f o r C u ( H ) m a d e a s t r u c t u r e a n a l y s i s d e s i r a b l e , a n d t h e r e f o r e t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e c o m p l e x w a s e l u c i d a t e d . 3 8 T h e s t r u c t u r e ( F i g u r e 6 - 6 A ) r e v e a l e d t h a t e a c h o f t h e b i d e n t a t e l i g a n d s i s p l a n a r w i t h i n l i m i t s o f e r r o r , w i t h a n a n g l e o f 6 6 ° b e t w e e n t h e t w o m e a n p l a n e s . T h e f o u r n i t r o g e n a t o m s b o n d e d t o t h e C u ( I I ) c o m p r i s e a d i s t o r t e d t e t r a h e d r a l g r o u p , t h e a n g l e b e t w e e n t h e N - C u ( I I ) - N f r a g m e n t s o f t h e c h e l a t e r i n g s b e i n g 6 8 ° . T h e m o s t i m p o r t a n t f e a t u r e o f t h e s t r u c t u r e c o n c e r n s t h e d i s t o r t i o n o f t h e b o n d c o n fi g u r a t i o n a r o u n d t h e c o p p e r a t o m c a u s e d b y t h e s t e r i c d e m a n d o f t h e t w o l a r g e l i g a n d s . T h e c o p p e r e n v i r o n m e n t i s b e s t d e s c r i b e d a s p s e u d o t e t r a h e d r a l . T h r o u g h t h e y e a r s a f e w m o r e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f d i p y r r o m e t h e n e s w i t h C u ( I I ) h a v e b e e n s o l v e d ( F i g u r e 6 — 6 B , D ) r e v e a l i n g t h a t , a s e x p e c t e d , i n t h e a b s e n c e o f s u b s t i t u t i o n a t t h e 5 , 5 ’ p o s i t i o n t h e g e o m e t r y a r o u n d t h e m e t a l i s c l o s e r t o s q u a r e p l a n a r t h a n t e t r a h e d r a l . ” 4 " A s m e n t i o n e d b e f o r e , o u r i n t e r e s t l i e s i n t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n d i p y r r o m e t h e n e - Z n c o m p l e x e s a n d c h i r a l a m i n e s . T h e fi r s t c r y s t a l s t r u c t u r e o f a d i p y r r o m e t h e n e m o l e c u l e w i t h Z n ( I I ) i s t h a t o f z i n c o c t a e t h y l f o r r n y l b i l i v e r d i n a t e , 3 1 w h i c h a l s o r e v e a l e d a d i s t o r t e d t e t r a h e d r a l g e o m e t r y a r o u n d t h e z i n c ( 3 D c o o r d i n a t e s n o t a v a i l a b l e i n t h e C a m b r i d g e D a t a B a s e ) . I n t h i s c a s e , a m o l e c u l e o f w a t e r w a s f o u n d t o b e c o o r d i n a t e d t o t h e m e t a l a t o m . H o w e v e r , i n t h e o n l y a v a i l a b l e c r y s t a l s t r u c t u r e o f d i p y r r o m e t h e n e s w i t h 2 9 1 E M P Y C U A T E V E A C D C u D A N R A L A T E V A W E F J E S X O U J E S X U A . C u ( I l ) . N I ( I I ) E c I N . Z n ( l l ) I o I C I F i g u r e 6 - 6 . R e p o r t e d c r y s t a l s t r u c t u r e s o f d i p y r r o m e t h e n e s w i t h v a r i o u s m e t a l s . T h e n a m e s u n d e r t h e s t r u c t u r e s r e f e r t o t h e n a m e o f t h e c o r r e s p o n d i n g C S D f i l e . 2 9 2 Z n ( I I ) , n o a d d i t i o n a l s o l v e n t c o o r d i n a t i o n i s o b s e r v e d ( F i g u r e 6 - 6 C ) . 4 7 T h e g e o m e t r y a r o u n d t h e m e t a l , t h o u g h , r e m a i n s a s d i s t o r t e d t e t r a h e d r a l . T h e o n l y r e p o r t e d c a s e s i n v o l v i n g s i m i l a r m o l e c u l e s w h e r e a fi f t h l i g a n d , a p a r t f r o m t h e f o u r l i g a t e d n i t r o g e n s f r o m t h e d i p y r r o m e t h e n e m o l e c u l e , i s p r e s e n t h a s b e e n r e p o r t e d b y C l e a r f i e l d a n d c o w o r k e r s . 4 8 A s s h o w n i n F i g u r e 6 - 6 ( B , F , G ) , a d y p y r r o m e t h e n e b e a r i n g e s t e r g r o u p s a t p o s i t i o n s 5 , 5 ’ w a s c o m p l e x e d w i t h t r a n s i t i o n m e t a l s C u ( H ) a n d N i ( I I ) . T h e r e s u l t i n g s t r u c t u r e s r e v e a l t h a t , i n a d d i t i o n t o t h e d i p y r r o m e t h e n e ’ s n i t r o g e n s t h e s u b s t i t u t e d e s t e r g r o u p s a r e a l s o c o o r d i n a t i n g t o t h e m e t a l . D u e t o s a t u r a t i o n o f t h e m e t a l ’ s c o o r d i n a t i o n s p h e r e o n l y o n e o f t h e e s t e r g r o u p s f r o m e a c h d i p y r r o m e t h e n e i s b i n d i n g r e v e a l i n g t h e h i g h e r a f f i n i t y o f t h e m e t a l f o r n i t r o g e n c o n t a i n i n g l i g a n d s . W i t h s i x l i g a n d s c o o r d i n a t e d b o t h C u ( H ) a n d N i ( H ) a d o p t a n o c t a h e d r a l g e o m e t r y . A l t h o u g h t h e Z n ( I I ) s t r u c t u r e o f t h e a b o v e l i g a n d w a s n o t s o l v e d w e b e l i e v e t h a t i n a s i m i l a r m a n n e r t h e c o o r d i n a t i o n o f a f i f t h l i g a n d ( i n o u r c a s e a c h i r a l a m i n e ) t o a Z n ( I I ) — d i p y r r o m e t h e n e c o m p l e x i s p l a u s i b l e . 6 . 2 3 T h e D T M P s y s t e m T h e f i r s t d i p y r r o m e t h e n e s y s t e m o b t a i n e d \ \ \ a n d t e s t e d f o r t h e f o r m a t i o n o f c h i r a l h e l i c a t e s C 1 2 * " 2 5 \ N H N ~ ( 3 1 2 s t w a s D i - d o d e c a n e - T e t r a m e t h y l - M e t h y l y l i d e n e b i s 1 P y r r o l e ( 1 , D T M P ) , t h e s t r u c t u r e o f w h i c h i s F i g u r e 6 - 7 . S t r u c t u r e o f D T M P s h o w n i n F i g u r e 6 - 7 . T h i s m o l e c u l e , a g e n e r o u s g i f t f r o m P r o f . C . C h a n g ’ s l a b o r a t o r y ( M S U ) , p o s s e s s e s a C 1 2 a l i p h a t i c c h a i n o n e a c h C - 4 2 9 3 c a r b o n i n a d d i t i o n t o t h e 5 , 5 ’ - m e t h y l g r o u p s n e c e s s a r y f o r t h e f o r m a t i o n o f n o n - p l a n a r c o m p l e x e s . D T M P w a s o b t a i n e d a s t h e h y d r o b r o m i d e s a l t a n d f o r m a t i o n o f t h e f r e e b a s e , t h r o u g h t r e a t m e n t w i t h N a O H , w a s p e r f o r m e d b e f o r e t h e i n s i t u c o m p l e x a t i o n w i t h t h e m e t a l . F i g u r e 6 - 8 p r e s e n t s t h e U V - v i s t r a c e o f D T M P f r e e b a s e i n M e O H ( A m , 4 8 6 n m , a 5 2 , 4 0 0 M " e m " ) . A d d i t i o n o f 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 ( s o l u b l e i n M e O H ) l e a d s t o a r e d 0 . 3 t ( b ) 0 . 2 5 - ( a ) 0 . 2 - 0 . 1 5 - 0 . 1 ~ 0 . 0 5 ~ 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 n m F i g u r e 6 - 8 . U V s p e c t r a i n M e O H o f D T M P ( ( a ) , b l u e ) ; ( b ) D T M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l 0 4 ) 2 ( m a g e n t a ) ; ( c ) D T M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O . ) 2 + 0 . 5 e q u i v R - C H E A ( r e d ) s h i f t e d s p e c t r u m ( 5 0 5 n m ) , - a l t h o u g h t h e c o n v e r s i o n i s n o t 1 0 0 % , s i n c e a s h o u l d e r a t 4 7 7 n m r e m a i n s . U p o n a d d i t i o n o f c h i r a l a m i n e ( R - C y c l o h e x y l E t h y l A m i n e , R - C H E A ) , a s i g n i fi c a n t d r o p i n t h e a b s o r b a n c e i n t e n s i t y w a s o b s e r v e d , s u g g e s t i n g t h a t t h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t o f t h e f o r m e d s p e c i e s i s l o w e r . W h e n t h e C D s p e c t r u m o f t h e a b o v e s a m p l e w a s r e c o r d e d , n o c h i r a l s p e c i e s w a s d e t e c t e d . A l t h o u g h t h e U V - v i s c h a n g e s s u g g e s t a t r a n s f o r m a t i o n h a d o c c u r r e d , t h e l a c k o f E C C D c o u l d b e a t t r i b u t e d t o s e v e r a l f a c t o r s . F i r s t o f a l l , a l t h o u g h s u g g e s t e d b y U V - v i s , w e o n l y h a v e e m p i r i c a l e v i d e n c e t o s u p p o r t t h e f o r m a t i o n o f t h e D T M P - Z n c o m p l e x . 2 9 4 B u t e v e n i f t h i s c o m p l e x w a s f o r m e d , t h e c o o r d i n a t i o n o f t h e c h i r a l m o l e c u l e c o u l d b e a n i s s u e . O n e c a s e w o u l d b e t h a t e v e n a f t e r t h e c h i r a l a m i n e c o o r d i n a t i o n t o t h e m e t a l , t h e c h i r a l i t y w a s n o t i n d u c e d w i t h i n t h e h o s t s y s t e m a n d , t h e r e f o r e , n o E C C D a c t i v e h e l i c a t e w a s f o r m e d . I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t u p o n c o o r d i n a t i o n o f t h e c h i r a l a m i n e t o t h e m e t a l , t h e p r e f o r m e d D T M P - Z n c o m p l e x b r e a k s T h e a b o v e e x p e r i m e n t w a s c a r r i e d o u t i n M e O H , a s o l v e n t w h i c h c o u l d i t s e l f c o o r d i n a t e t o t h e m e t a l a n d t h u s r e t a r d t h e c o o r d i n a t i o n o f t h e c h i r a l a m i n e . T h e r e f o r e , i t w a s d e c i d e d t o p r o c e e d b y u s i n g c h l o r i n a t e d s o l v e n t s . S i n c e w e p l a n n e d t o f o l l o w t h e c o m p l e x a t i o n b y N M R a s w e l l , C H C l 3 ( r e a g e n t g r a d e ) w a s t h e s o l v e n t o f c h o i c e . T h e s p e c t r u m o f D T M P i n C H C 1 3 i s s h o w n i n F i g u r e 6 - 9 . A s c o m p a r e d t o t h e s p e c t r u m i n M e O H , D T M P i n C H C 1 3 i s r e d s h i f t e d t o 4 9 1 n m , a l t h o u g h a s h o u l d e r p e a k 2 . 5 ( C ) 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 n m F i g u r e 6 - 9 . U V s p e c t r a o f D T M P i n M e O H ( ( a ) , r e d ) , D T M P i n C H C I 3 ( ( b ) , b l u e ) , D T M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C | 0 4 ) 2 i n C H C I 3 ( ( c ) , m a g e n t a ) a n d D T M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O ) 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v R - C H E A ( ( d ) , y e l l o w ) r e m a i n s a t 4 6 0 n m . S i n c e Z n ( C l O 4 ) 2 i s n o t s o l u b l e i n C H C 1 3 , 0 . 5 e q u i v o f s o l i d Z n s a l t w a s a d d e d t o t h e s o l u t i o n a n d t h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r ~ 1 h u n t i l 2 9 5 a l l t h e s o l i d Z n h a d d i s s o l v e d . T h e U V - v i s o f t h e r e s u l t i n g c o m p l e x i s s h o w n i n F i g u r e 6 - 9 B ( m a g e n t a ) . I n a g r e e m e n t w i t h t h e m e t h a n o l c a s e , t h e K m , d o e s n o t s h i f t ( 4 9 1 n m ) b u t t h e i n t e n s i t y o f t h e a b s o r b a n c e h a s a g a i n r e d u c e d . U p o n a d d i t i o n o f a c h i r a l a m i n e , t h e h a m r e m a i n s a t 4 9 1 n m , o n c e m o r e i n a g r e e m e n t w i t h t h e M e O H c a s e . I n t e r e s t i n g l y , i n t h i s c a s e , t h e c o m p l e x f o r m e d w a s C D a c t i v e . T h e C D s p e c t r a o f t h e D T M P - Z n - R - C H E A m i x t u r e w e r e r e c o r d e d o v e r a p e r i o d o f s e v e r a l h o u r s , s i n c e t h e s h a p e o f t h e t r a c e k e p t c h a n g i n g ( F i g u r e 6 - 1 0 , B a n d C ) . T h e o r i g i n a l s p e c t r u m c o n s i s t e d o f a p o s i t i v e p e a k , a t ~ 4 9 0 n m . F o r a t l e a s t 1 5 h , t h i s p e a k r e m a i n e d u n c h a n g e d , w h i l e a n e g a t i v e p e a k a t 5 3 0 n m w a s s t e a d i l y i n c r e a s i n g . A f t e r t h a t , t h e 4 9 0 n m p e a k s t a r t e d d e c r e a s i n g w h i l e t h e 5 3 0 n m p e a k k e p t i n c r e a s i n g f o r a n a d d i t i o n a l 1 0 h p e r i o d . H o w e v e r , ~ 3 0 h a f t e r t h e o r i g i n a l m i x i n g , t h e C D o f t h e s a m p l e e x h i b i t e d a b i s i g n a t e s h a p e , a s s h o w n i n F i g u r e 6 - 1 0 C . T h i s E C C D l o o k i n g p e a k , h a s a fi r s t C o t t o n e f f e c t a t 5 2 3 n m ( n e g a t i v e p e a k ) , a s e c o n d C o t t o n e f f e c t a t 4 8 7 n m ( p o s i t i v e p e a k ) a n d a c r o s s p o i n t a t 5 0 0 n m . A c c o r d i n g t o t h e E C C D t h e o r y , t h i s c r o s s p o i n t h a s t o c o i n c i d e w i t h t h e A m a x U V - v i s a b s o r b a n c e , f o r t h e c a S e o f i d e n t i c a l c h r o m o p h o r e s i n t e r a c t i n g . I n t h i s c a s e , t h e n u m b e r s a r e c l o s e , 4 9 1 n m v e r s u s 5 0 0 n m , w h i c h s u p p o r t s t h e s u g g e s t i o n o f a n E C C D i n t e r a c t i o n . T h i s p e a k r e m a i n e d s t a b l e f o r a n a d d i t i o n a l 3 0 h , a t w h i c h p o i n t w e s t o p p e d r e c o r d i n g s p e c t r a . T h r o u g h o u t t h e 3 0 h , t h e U V - v i s o f t h i s m i x t u r e , a t t h e s a m e c o n c e n t r a t i o n ( ~ 5 1 0 ' 5 M ) , r e m a i n e d r e m a r k a b l y s t a b l e ( F i g u r e 6 - 1 0 A ) . T h e h m , d i d n o t c h a n g e ( 4 9 1 n m ) , b u t t h e i n t e n s i t y s l i g h t l y i n c r e a s e d d u r i n g t h e fi r s t 3 0 h . A f t e r t h a t , t h e r e c o r d e d s p e c t r a w e r e i d e n t i c a l , a t l e a s t f o r u p t o 6 0 h . 2 9 6 1 . 4 1 . 2 - A 0 ; : F i g u r e 6 - 1 0 . u v ( A ) a n d C D ( 8 . 0 ) s p e c t r a A W o f D T M P + 0 . 5 e q u i v 2 n ( 0 i o . . ) 2 + 0 . 5 e q u i v z : F i - C H E A , f o l l o w e d o v e r t i m e . A . U V s p e c t r a 0 4 0 0 4 : 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 a t t i m e 5 m i n t o 6 0 h . A f t e r 3 5 h t h e s p e c t r a n m r e m a i n u n c h a n g e d . B . C D s p e c t r a o f t h e m i x t u r e a t t i m e 5 m i n t o 3 0 h . T h e p o s i t i v e p e a k a t 4 8 9 n m r e m a i n s s t a b l e w h i l e a 2 n e g a t i v e p e a k a t 5 3 2 n m i s i n c r e a s i n g f o r d o " V i a t l e a s t 1 5 h . A f t e r 3 0 h a b i s i g n a t e p e a k ~ 1 2 n m ( 1 “ C o t t o n e f f e c t H 5 2 0 n m , 2 " d C o t t o n 3 e f f e c t ( + ) 4 8 7 n m , c r o s s p o i n t 5 0 0 n m ) i s . C 3 f o r m e d . 0 . T h e b i s i g n a t e p e a k i s s t a b l e 0 ' 4 5 0 5 0 0 1 . a n d d o e s n o t s i g n i f i c a n t l y c h a n g e b e t w e e n a . - 1 ‘ V _ 2 . 3 6 - 5 0 h . - 3 . - 4 n m A l t h o u g h t h e a b o v e r e s u l t s w e r e e x t r e m e l y e n c o u r a g i n g , t h e f a c t t h a t t h e s y s t e m i s s o d y n a m i c , c h a n g i n g s t e a d i l y w i t h t i m e f o r a t l e a s t 3 0 h u n t i l i t r e a c h e s a n e q u i l i b r i u m p o i n t , w a s a m a j o r c o n c e r n . I n a n a t t e m p t t o g a i n m o r e i n s i g h t i n t o t h i s s y s t e m a s e r i e s o f N M R e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t . T h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n T a b l e 6 - 1 s u m m a r i z e t h e N M R s h i f t s o f d i f f e r e n t D T M P f o r m s , f o l l o w e d w i t h t i m e . D u r i n g t h e 6 0 h p e r i o d o f t h e e x p e r i m e n t , t h e s p e c t r a o f f r e e b a s e D T M P , a s w e l l a s t h a t o f D T M P H B r , w e r e u n c h a n g e d , u n l i k e D T M P i n t h e p r e s e n c e o f Z n a n d c h i r a l a m i n e . I n p a r t i c u l a r , t h e s p e c t r u m o f D T M P m i x e d w i t h Z n ( C l O 4 ) 2 c h a n g e d w i t h i n t h e fi r s t 5 h , r e s u l t i n g i s d o w n fi e l d s h i f t i n g o f a l l t h e p e a k s p r e s e n t . T h e l a t t e r s p e c t r u m w a s c o n s i s t e n t w i t h a 2 9 7 T a b l e 6 - 1 . N M R s h i f t s o f t h e d i f f e r e n t f o r m s o f D T M P , r e c o r d e d o v e r t i m e . 1 3 \ \ C 1 2 " 1 2 5 \ N H N ~ \ C 1 2 H 2 5 D T M P P r o t o n D T M P D T M P D T M P + 0 . 5 e q 2 n ( C I o . . ) 2 D T M P + 0 . 5 e q 2 n ( C I o . , ) 2 + 0 . 5 ( p p m ) H B r ( p p m ) ( p p m ) 6 9 R - C H E A ( p p m ) 5 h 5 h 5 m i n 5 h 5 m i n 6 0 h 1 6 . 6 0 6 . 9 9 6 . 8 5 7 . 0 3 6 . 9 3 . 6 . 7 7 6 . 8 9 , 6 . 9 3 , 7 . 3 7 2 2 . 2 6 2 . 6 3 2 . 4 4 2 . 5 7 2 . 1 5 2 . 1 9 3 2 . 0 9 2 . 2 2 2 . 1 8 2 . 2 4 2 . 3 8 2 . 4 6 m e t a l c o m p l e x f o r m a t i o n , s i n c e u p o n c o m p l e x a t i o n t h e p r e s e n c e o f t h e e l e c t r o n r i c h m e t a l s h o u l d r e s u l t i n a d e s h i e l d i n g e f f e c t . F u r t h e r m o r e , i f t h e c o m p l e x f o r m a t i o n i s a s w e p r e d i c t e d i n F i g u r e 6 - 3 , t h e 5 , 5 ’ m e t h y l g r o u p s w o u l d f a l l i n t h e d e s h i e l d i n g c o n e o f t h e n e i g h b o r i n g a r o m a t i c r i n g . O n t h e o t h e r h a n d , i n t e r e s t i n g l y , t h e l a t t e r s p e c t r u m ( a t 5 h ) r e s e m b l e s v e r y m u c h t h a t o f t h e D T M P H B r , s u g g e s t i n g t h a t p e r h a p s p r o t o n a t i o n o f t h e D T M P i s w h a t o c c u r s . I n t h e p r e s e n c e o f t h e c h i r a l a m i n e , t h e i n d u c e d c h a n g e s o f t h e N M R s p e c t r a a r e m o r e p r o m i n e n t ( F i g u r e 6 - 1 1 ) . T h e s p e c t r u m r e c o r d e d i m m e d i a t e l y a f t e r t h e a d d i t i o n o f a m i n e r e v e a l s t w o d i f f e r e n t p e a k s t h a t c o r r e s p o n d t o t h e v i n y l i c m e t h i n e p r o t o n , a t 6 . 7 7 p p m a n d 6 . 9 3 p p m a n d i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f t w o d i f f e r e n t c o m p l e x e s . F i g u r e 6 - 1 1 i l l u s t r a t e s s o m e r e p r e s e n t a t i v e N M R s p e c t r a o f t h e D T M P - Z n - R - C H E A m i x t u r e i n a c o u r s e o f 6 0 h . A s c a n b e s e e n , f r o m t h e t w o d i f f e r e n t m e t h i n e p r o t o n s , t h e p e a k a t 6 . 9 3 p p m a p p e a r s t o b e s t a b l e . T h e s h i f t o f t h i s p e a k , a l t h o u g h n o t i d e n t i c a l , i s v e r y c l o s e t o 2 9 8 L L I m i n 2 5 h l a t W M 1 0 h J L i M M 1 1 W M U l _ L 3 6 1 1 W u ; u _ M E L L L J L 3 6 h r r v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v p p m F i g u r e 6 - 1 1 . N M R s p e c t r a o f D T M P + Z n ( C l O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v . R - C H E A , i n C D C I 3 , f o l l o w e d o v e r t i m e . l . F u l l s p e c t r u m ; l l . V i n y l i c r e g i o n . t h a t o f t h e D T M P - Z n m i x t u r e a n d c o u l d b e d u e t o u n r e a c t e d c o m p l e x . B u t t h e p e a k a t 6 . 7 7 p p m c h a n g e s c o n s t a n t l y w i t h t i m e . I n p a r t i c u l a r , i t a p p e a r s t h a t a s t i m e g o e s b y t h e p e a k i s b e c o m i n g m o r e s h i e l d e d , h a v i n g c o v e r e d 0 . 0 4 p p m i n t h e fi r s t 1 0 h ( f r o m 6 . 7 7 2 9 9 p p m t o 6 . 8 1 p p m ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e s p e c t r u m a f t e r 3 6 h , w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e E C C D a c t i v e s p e c i e s , r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f a t h i r d p e a k , a t 7 . 3 7 p p m . I n a d d i t i o n t o t h e s t a b l e 6 . 9 3 p p m p e a k , t h e s e c o n d p e a k i s a t 6 . 9 5 p p m , c o r r e s p o n d i n g t o a s h i f t o f 0 . 1 4 p p m . A t t h e s a m e t i m e , o n e c a n o b s e r v e t h a t t h e r e l a t i v e i n t e n s i t i e s o f t h e p e a k s h a v e c h a n g e d a s w e l l . W h a t s t a r t e d a s a 1 : 8 r a t i o o f t h e 6 . 9 3 p p m a n d 6 . 7 7 p p m p e a k s , r e s p e c t i v e l y , a n d r e m a i n e d s t a b l e f o r t h e fi r s t 1 0 h , b e c a m e a 1 : 1 : 1 . 2 r a t i o o f t h e 7 . 3 7 p p m , 6 . 9 5 p p m a n d 6 . 9 3 p p m p e a k s , r e s p e c t i v e l y i n t h e 3 6 h s p e c t r u m ( r a t i o d e t e r m i n e d f r o m i n t e g r a t i o n ) . T h i s i n d i c a t e s t h a t w h a t e v e r t h e a r o m a t i c p e a k a t 7 . 3 7 p p m i s d u e t o , i t s e e m s l i k e l y t o h a v e o r i g i n a t e d f r o m t h e o r i g i n a l 6 . 7 7 p p m p e a k . A t t h e s a m e t i m e , t h e r e s t o f t h e s p e c t r u m , i n t h e a l i p h a t i c r e g i o n , d o e s n o t u n d e r g o s i g n i fi c a n t c h a n g e s . T h e o n l y p a r t o f t h e s p e c t r u m t h a t a p p e a r s t o c h a n g e a l o n g w i t h t h e m e t h i n e p r o t o n i s t h e b r o a d p e a k a t ~ 3 . 4 p p m . T h i s p e a k c o u l d b e l o n g t o t h e f r e e a m i n e p r o t o n o f D T M P b u t c o u l d a l s o b e d u e t o t h e p r e s e n c e o f w a t e r i n t h e s y s t e m ( t h e Z n ( C l O a ) 2 u s e d i s t h e h e x a h y d r a t e f o r m ) . A c l o s e r l o o k a t t h e s p e c t r a r e v e a l s t h a t t h e a p p e a r a n c e o f t h e t h i r d p e a k i n t h e a r o m a t i c r e g i o n t h a t c o i n c i d e s w i t h t h e d i s a p p e a r a n c e o f t h e 3 . 4 p e a k . C o n s i d e r i n g t h a t w h e n t h e s e e x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e d t h i s b r o a d p e a k w a s n o t o b s e r v e d c o n s i s t e n t l y a t t h e s a m e p l a c e , r a n g i n g f r o m 2 . 9 p p m t o 4 . 3 p p m , i t i s s a f e t o a s s u m e t h a t i t i s d u e t o a n e x c h a n g a b l e p r o t o n . T h i s r e s u l t c a n s u g g e s t t h a t a c h e m i c a l t r a n s f o r m a t i o n o f t h e d i p y r r o m e t h e n e r i n g t o o k p l a c e . A t t e m p t s t o c r y s t a l l i z e t h e c o m p l e x i n o r d e r t o c o m p l e t e l y u n d e r s t a n d t h e s y s t e m h a v e f a i l e d t o p r o d u c e X - r a y q u a l i t y c r y s t a l s . A l t h o u g h t h e N M R s p e c t r a d o n o t a l l o w u s t o d r a w d e fi n i t e c o n c l u s i o n s a b o u t t h e n a t u r e o f t h e E C C D a c t i v e c h i r a l s p e c i e s , t h e y h a v e b e e n v e r y u s e f u l i n v e r i f y i n g t h e d y n a m i c n a t u r e o f o u r s y s t e m . H o w e v e r , w e h a v e t o k e e p i n m i n d t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n 3 0 0 - 1 ~ 4 7 5 5 2 5 o f t h e N M R s a m p l e s ( 5 1 0 ‘ 3 M ) i s c o n s i d e r a b l y h i g h e r t h a n t h a t o f t h e U V - v i s a n d C D m e a s u r e m e n t s ( 5 1 0 ’ 5 M ) . F o r a s y s t e m a s s e n s i t i v e a s t h i s , a 1 0 0 f o l d d i f f e r e n c e c a n b e a n i m p o r t a n t f a c t o r . T h i s i s i n d e e d v e r i fi e d b y t h e f a c t t h a t d i l u t i o n o f t h e 3 6 h N M R s a m p l e t o C D c o n c e n t r a t i o n s d o e s n o t l e a d t o a n E C C D a c t i v e s p e c i e s . H o w e v e r , a f e w h o u r s ( 2 - 3 h ) a f t e r t h e d i l u t i o n t a k e s p l a c e , t h e E C C D p e a k i s p r e s e n t , a s w a s u n d e r t h e o r i g i n a l C D c o n d i t i o n s . S i n c e t h i s s y s t e m p r o v i d e d p r o m i s i n g r e s u l t s f o r t h e c o o r d i n a t i o n o f R - C I - I E A , a s e r i e s o f o t h e r c h i r a l a m i n e s , w e r e s u b m i t t e d t o t h e s a m e c o n d i t i o n s , a n d t h e s p e c t r a w e r e n m F i g u r e 6 - 1 2 . C D s p e c t r u m o f D T M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v S - M B A r e c o r d e d . H o w e v e r , t h e r e s u l t s w e r e n o t c o n s i s t e n t , a n d n o E C C D s p e c t r u m w a s o b s e r v e d , e v e n i n t h e p r e s e n c e o f S - C H E A . T h e o n l y o t h e r a m i n e t h a t y i e l d e d a C D a c t i v e s p e c i e s w a s S - M e t h y ] B e n z y l A m i n e ( S - M B A ) , t h e s p e c t r u m o f w h i c h i s s h o w n i n F i g u r e 6 - 1 2 . I n a d d i t i o n t o Z n , a n a t t e m p t w a s c a r r i e d o u t t o u s e C u 2 + ( i n t h e f o r m o f C u ( C l O 4 ) 2 ) a s t h e m e t a l c o r e . S p e c t r a r e c o r d e d u n d e r s i m i l a r c o n d i t i o n s a s t h o s e u s e d w i t h Z n ” , i n t h e p r e s e n c e o f R - C H E A a s w e l l a s o t h e r c h i r a l a m i n e s f a i l e d t o p r o d u c e a n E C C D a c t i v e s p e c i e s . 3 0 1 c o m p l e x e s . B u t , a s c o m p a r e d t o D T M P , t h e l o n g F i g u r e 6 ' 1 3 ‘ S t r u c t u r e O f D E M P A t t h i s p o i n t , w e c o u l d s e e t h a t a l t h o u g h i n p r i n c i p l e w h a t w e w e r e a f t e r c o u l d b e f e a s i b l e , t h e D T M P m i g h t n o t b e t h e i d e a l h o s t - m o l e c u l e f o r h e l i c a t e f o r m a t i o n . O u r i n i t i a l c o n c e r n s a b o u t t h e l o n g c a r b o n c h a i n , a t 0 4 c a r b o n , h a m p e r i n g t h e f o r m a t i o n o f a c h i r a l s p e c i e s w e r e r a i s e d a g a i n . W e b e l i e v e t h a t t h e p r e s e n c e o f t h e l o n g c a r b o n c h a i n c a n p r o m o t e a g g r e g a t i o n , p o t e n t i a l l y i n a c h i r a l f o r m , t h a t c o u l d b e r e s p o n s i b l e f o r t h e E C C D a c t i v e s p e c i e s d e t e c t e d . I n o r d e r t o a l l a y o u r c o n c e r n s , a s i m p l e r d i p y r r o m e t h e n e m o l e c u l e w a s r e q u i r e d . 6 . 2 b T h e D E N H ’ s y s t e m T h e m o l e c u l e o f c h o i c e , t o a d d r e s s t h e c o n c e r n s d e s c r i b e d a b o v e , w a s D i - E t h y l - t e t r a m e t h y l - M e t h o n y l y l i d e n e b i s P y r r o l e ( 2 , D E M P , F i g u r e 6 - 1 3 ) . T h i s d i p y r r o m e t h e n e , w h i c h w a s a l s o k i n d l y g i v e n t o u s b y P r o f . C . C h a n g , m a i n t a i n s t h e 5 , 5 ’ m e t h y l g r o u p s , e s s e n t i a l \ \ N H \ N - \ f o r p r e v e n t i n g t h e f o r m a t i o n o f fl a t m e t a l 2 C t z - c h a i n h a s b e e n r e p l a c e d b y a m u c h s m a l l e r e t h y l g r o u p , m i n i m i z i n g t h e p o t e n t i a l i s s u e s t h a t l e d t o t h e p r o b l e m s o b s e r v e d w i t h D T M P . A s i n t h e D T M P c a s e , D E M P w a s o b t a i n e d a s a h y d r o b r o m i d e s a l t a n d , t h e r e f o r e , i n i t i a l e x t r a c t i o n w i t h N a O H a n d s a t u r a t e d s o l u t i o n o f N a z C O 3 w a s n e c e s s a r y f o r t h e f r e e b a s e f o r m a t i o n . H a v i n g D E M P i n h a n d , s i m i l a r e x p e r i m e n t s , a s w a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d f o r D T M P , w e r e c a r r i e d o u t . T h e U V - v i s t r a c e s o f D E M P i n i t s d i f f e r e n t f o r m s i n C H C l 3 a r e s h o w n i n F i g u r e 6 - 1 4 . I n a g r e e m e n t w i t h w h a t p r e v i o u s l y o b s e r v e d f o r D T M P , t h e 4 4 8 n m p e a k o f t h e 3 0 2 ( b ) F i g u r e 6 - 1 4 . U V t r a c e s i n C H C I 3 o f : D E M P ( ( a ) , m a g e n t a , A m , 4 4 8 n m ) ; D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C I O 4 ) 2 ( ( b ) , g r e e n , A m . 4 8 8 n m ) ; D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v R - C H E A ( ( 0 ) , b l u e , A m 4 8 8 n m ) . D E M P f r e e b a s e r e d s h i f t s t o 4 8 8 n m u p o n a d d i t i o n o f s o l i d Z n ( C l O 4 ) 2 ( a s d e s c r i b e d b e f o r e , t h e s p e c t r u m w a s r e c o r d e d a f t e r m i x i n g t h e D E M P s o l u t i o n a n d t h e s o l i d Z n s a l t a t r o o m t e m p e r a t u r e , u n t i l t h e s o l i d r e s i d u e d i s a p p e a r s ) . A d d i t i o n o f c h i r a l a m i n e ( R - o r S — C H E A ) d o e s n o t a l t e r t h e A m “ . I t d o e s , h o w e v e r , l o w e r t h e i n t e n s i t y o f t h e U V - v i s a b s o r b a n c e , i n a g r e e m e n t w i t h w h a t w a s p r e v i o u s l y o b s e r v e d f o r t h e D T M P c a s e . G r a t i f y i n g l y , t h e r e c o r d e d C D s p e c t r u m d e t e c t e d t h e p r e s e n c e o f a n E C C D a c t i v e s p e c i e s , b u t t h e s y s t e m a p p e a r s a g a i n t o b e d y n a m i c , s i m i l a r l y t o t h e D T M P c a s e . T h e E C C D s i g n a l s , a s d e p i c t e d i n F i g u r e 6 - 1 5 , a p p e a r ~ 1 8 h a f t e r t h e a d d i t i o n o f t h e c h i r a l a m i n e a n d r e m a i n s t a b l e f o r 5 - 6 h . T h e s p e c t r u m g e n e r a t e d u p o n a d d i t i o n o f a c h i r a l a m i n e ( R - C H E A ) t o a D E M P - Z n ( C l O 4 ) 2 s o l u t i o n c o n s i s t s o f a n E C C D - l o o k i n g s e t o f p e a k s , w i t h a s m o o t h t r a n s i t i o n ( ~ 5 1 5 n m ) f r o m t h e 1 S t n e g a t i v e C o t t o n e f f e c t ( 5 4 0 n m ) t o a 2 ' “ l p o s i t i v e o n e ( 5 0 8 n m ) . I n a d d i t i o n , a t h i r d , n e g a t i v e p e a k i s p r e s e n t ( 4 5 5 n m ) . A s e x p e c t e d , u p o n a d d i t i o n o f t h e e n a n t i o m e r i c a m i n e ( S - C H E A ) t h e e x a c t o p p o s i t e 3 0 3 ( a ) F i g u r e 6 - 1 5 . C D s p e c t r a i n C H C I 3 o f D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v R - C H E A ( ( a ) , m a g e n t a ) o r S - S H E A ( ( b ) , b l u e ) s p e c t r u m i s g e n e r a t e d . H o w e v e r , s i n c e t h e s p e c t r a a r e m o r e c o m p l i c a t e d t h a n w h a t o n e w o u l d e x p e c t f r o m a s i n g l e e x c i t o n c o u p l i n g i n t e r a c t i o n , s t r u c t u r a l v a r i a t i o n o f t h e c o m p l e x m i g h t b e p r e s e n t ( t h e e x p e r i m e n t s h a v e b e e n r e p e a t e d s e v e r a l t i m e s y i e l d i n g t h e s a m e r e s u l t s u n d e r e x a c t l y t h e s a m e c o n d i t i o n s ) . A c c o r d i n g t o t h e E C C D t h e o r y , t h e c r o s s p o i n t o f t h e b i s i g n a t e d E C C D p e a k s h o u l d b e a p p r o x i m a t e l y a t t h e h m . B u t , f o r t h e s e s y s t e m s , t h a t i s n o t w h a t w e o b s e r v e . A c c o r d i n g t o t h e U V - v i s , t h e k m o f t h e D E M P - Z n - c h i r a l a m i n e c o m p l e x i s a t ~ 4 9 O n m a n d , i n a g r e e m e n t t o t h e D T M P c a s e , d o e s n o t s i g n i fi c a n t l y c h a n g e w i t h t i m e . I t i s p o s s i b l e , h o w e v e r , t h a t a m i x t u r e o f m o r e t h a n o n e c h i r a l s p e c i e s i s p r e s e n t i n t h e s o l u t i o n l e a d i n g t o a c o m b i n a t i o n o f C o t t o n e f f e c t s t h a t a r e n o t t h e r e s u l t o f e x c i t o n c o u p l i n g . A s i t u a t i o n l i k e t h a t c o u l d e x p l a i n w h y t h e t r a n s i t i o n f r o m t h e 5 0 8 n m p e a k t o t h e 4 5 5 n m p e a k i s n o t s m o o t h , t h e y a r e t h e r e s u l t o f i n t e r a c t i o n s b e t w e e n n o n - d e g e n e r a t e c h r o m o p h o r e s . H o w e v e r , f o r t h e a b o v e s c e n a r i o t o b e p o s s i b l e , t h e d i p y r r o m e t h e n e u n i t s m u s t h a v e u n d e r g o n e s o m e k i n d o f c h e m i c a l t r a n s f o r m a t i o n . 3 0 4 I n a d d i t i o n t o a l l t h e a b o v e d a t a , w e o b s e r v e d t h a t t h e o v e r a l l b e h a v i o r s o f t h e t w o s t u d i e d s y s t e m s , D T M P a n d D E M P a r e q u i t e d i f f e r e n t , m o s t l y w i t h r e s p e c t t o t h e t i m e s c a l e o v e r w h i c h t h e C D a c t i v e s p e c i e s a p p e a r s . I n t h e c a s e o f D T M P , i t t o o k m o r e t h a n 3 0 h f o r a b i s i g n a t e s i g n t o a p p e a r u p o n a d d i t i o n o f R - C H E A . F u r t h e r m o r e , w h e n t h a t p e a k w a s f o r m e d , i t w a s s t a b l e f o r a t l e a s t 3 0 a d d i t i o n a l h o u r s . T h a t i s n o t t h e c a s e f o r t h e D E M P c o m p l e x e s . A s m e n t i o n e d b e f o r e , t h e s p e c t r a p r e s e n t e d i n F i g u r e 6 - 1 5 r e m a i n s t a b l e f o r ~ 6 h a f t e r t h e y i n i t i a l l y a p p e a r . A f t e r t h a t , t h o u g h , t h e s y s t e m s e e m s t o e q u i l i b r a t e t o a s t a t e w h e r e e i t h e r o n l y o n e p e a k , a t ~ 5 3 0 n m , i s p r e s e n t ( p o s i t i v e i n t h e c a s e o f S - a m i n e s , n e g a t i v e i n t h e p r e s e n c e o f R - a m i n e s ) . O n e c a n a r g u e t h a t t h e p r e s e n c e o f t h e l o n g c a r b o n c h a i n o f t h e D T M P m o l e c u l e d e l a y s t h e t r a n s f o r m a t i o n r e s p o n s i b l e f o r t h e d i a s t e r e o t o p i c d i f f e r e n t i a t i o n . O n t h e o t h e r h a n d , i n t h e p r e s e n c e o f t h e s m a l l e r D E M P u n i t , t h e f o r m a t i o n o f a n E C C D a c t i v e s p e c i e s i s a c c e l e r a t e d , a n d s o i s i t s d i s a p p e a r a n c e . R e v i s i t i n g o u r U V - v i s d a t a , a s r e c o r d e d f o r t h e d i f f e r e n t s a m p l e s , w e n o t i c e d t h a t t h e r e i s a s h o u l d e r a t ~ 4 8 8 n m g r o w i n g i n t h e f r e e b a s e D E M P s p e c t r u m . T h i s p e a k i s s u s p i c i o u s l y c l o s e t o w h e r e D E M P i n t h e p r e s e n c e o f Z n 2 + a n d c h i r a l a m i n e a b s o r b s . T h e r e f o r e , w e s t a r t e d w o r r y i n g a b o u t t h e s t a b i l i t y o f t h e f r e e b a s e D E M P s p e c i e s i n s o l u t i o n . I n a v e r y d e t a i l e d s e r i e s o f p h y s i c o c h e m i c a l s t u d i e s o f s e v e r a l d i p y r r o l y l m e t h e n e s y s t e m s ( i n c l u d i n g D E M P ) i n s e v e r a l s o l v e n t s y s t e m s , a R u s s i a n g r o u p h a s r e p o r t e d t h a t C H C 1 3 a s t h e s o l v e n t i s a v e r y s p e c i a l c a s e . 4 9 A c c o r d i n g t o t h e i r d a t a , o n l y i n C H C 1 3 d i p y r r o l y l u n i t s l i k e D E M P e x h i b i t t w o a b s o r p t i o n b a n d s ( a t 4 5 5 n m a n d 4 8 1 n m ) a n d t h i s i s a t t r i b u t e d t o t h e h i g h b a s i c i t y o f t h e s e c o m p o u n d s , w h i c h a r e r e a d i l y p r o t o n a t e d w i t h t h e a c i d a l w a y s p r e s e n t a s a t r a c e i m p u r i t y i n c h l o r o f o r m A n 3 0 5 e x p l a n a t i o n l i k e t h a t w o u l d a c t u a l l y fi t o u r d a t a b e t t e r , s i n c e i t w a s o b s e r v e d t h a t o u r e x p e r i m e n t s w e r e m o r e r e p r o d u c i b l e w h e n r e a g e n t C H C 1 3 w a s u s e d a s a s o l v e n t i n s t e a d o f s p e c t r o s c o p i c g r a d e c h l o r o f o r m ( p r e s u m a b l y m o r e a c i d i s p r e s e n t i n t h e r e a g e n t g r a d e s o l v e n t ) . 3 5 0 4 5 0 5 5 0 F i g u r e 6 - 1 6 . U V s p e c t r u m o f D E M P ( 2 1 0 4 5 M ) i n C H C I 3 w i t h t i m e . T h e p e a k a t 4 4 8 n m i s d e c r e a s i n g w h i l e a p e a k a t 4 8 8 n m i s g r o w i n g . A f t e r ~ 4 0 m i n t h e c o n v e r s i o n i s o v e r . T h i s l e d u s t o s t u d y t h e s o l u t i o n s o f D E M P m o r e c a r e f u l l y . W h a t w a s f o u n d w a s t h a t i n U V - v i s a n d C D c o n c e n t r a t i o n ( 1 0 ' 5 - 1 0 ' 6 M ) , D E M P i n C H C l 3 i s n o t s t a b l e a t a l l . I n f a c t , t h e U V - v i s s p e c t r u m c h a n g e s r a p i d l y w i t h t i m e ( F i g u r e 6 - 1 6 ) , f r o m a s p e c i e s a b s o r b i n g a t 4 4 8 n m t o a s e c o n d o n e a b s o r b i n g a t 4 8 8 n m . I n t e r e s t i n g l y , a f u l l c o n v e r s i o n f r o m o n e s p e c i e s t o a n o t h e r t o o k ~ 4 0 m i n f o r C = 1 0 ' 6 M a n d ~ 3 h f o r C = 1 0 ' 5 M , d e m o n s t r a t i n g t h e c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c e o f t h e s y s t e m . A t t e m p t s t o f o l l o w t h e c h a n g e b y N M R s h o w e d t h a t t h e s y s t e m i s v e r y s t a b l e u n d e r N M R c o n c e n t r a t i o n ( ~ 1 0 ' 3 ' M ) f o r a t l e a s t 2 w e e k s . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e i f t h e p r o t o n a t i o n w a s o c c u r r i n g , t h e s y s t e m w a s a l l o w e d t o c o n v e r t c o m p l e t e l y t o t h e 4 8 8 n m p e a k a n d t h e n b a s e w a s a d d e d t o t h e s o l u t i o n . I n a 3 0 6 0 . 7 0 . 6 ‘ 0 . 5 ‘ A 0 . 4 . 0 . 3 * 0 . 2 1 0 . 1 . ( a ) ( b ) 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 n m F i g u r e 6 4 7 . U V s p e c t r a o f D E M P i n C H C l a , a f t e r 1 h ( ( a ) , b l u e t r a c e , m o s t l y 4 8 8 n m ) a n d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 e q u i v N E t ; ( ( b ) , m a g e n t a , 4 3 7 n m ) . s i m i l a r e x p e r i m e n t , t r y i n g t o s t u d y t h e b e h a v i o r o f d i p y r r o l e s y s t e m s i n s o l u t i o n s i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f b a s e , a n I n d i a n g r o u p s o ’ 5 1 h a s r e p o r t e d t h a t d e p r o t o n a t i o n c a n o c c u r i n t h e p r e s e n c e o f N E t 3 . A s s h o w n i n F i g u r e 6 - 1 7 , t h a t w a s c o r r e c t s i n c e u p o n a d d i t i o n o f o n l y 1 e q u i v o f N E t 3 t h e U V - v i s b l u e s h i f t s f r o m ~ 4 8 8 n m t o ~ 4 3 7 n m . A t t h i s p o i n t , s i n c e w e s u s p e c t e d t h a t t h e p r o t o n a t e d f o r m o f D E M P w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e r e d s h i f t e d U V - v i s s p e c t r a o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f b o t h z i n c a n d c h i r a l a m i n e , a m o r e d e t a i l e d s t u d y o f t h e d i f f e r e n t D E M P f o r m s t o o k p l a c e , 1 . 8 1 . 6 ‘ 1 . 4 1 1 . 2 + A 1 * 0 8 0 . 6 0 . 4 1 0 . 2 + 0 . 3 5 0 4 5 0 n m 4 0 0 M n m ) L i t e r a t u r e A “ ! ( n m ) E x p e r i m e n t 1 3 6 3 , 4 7 3 3 6 5 . 4 8 9 2 3 6 8 , 5 0 0 3 6 8 , 5 0 5 3 4 5 5 , 4 8 1 4 4 8 , 4 8 8 F i g u r e 6 - 1 8 . U V t r a c e s i n C H C I 3 o f : 1 . D E M P H B r ( ( a ) , b l u e ) ; 2 . C r y s t a l s o f Z n ( D E M P ) 2 ( ( b ) , m a g e n t a ) ; 3 . D E M P ( ( 0 ) . y e l l o w ) . 3 0 7 m a i n l y s o t h a t w e c o u l d e s t a b l i s h t h e s t a n d a r d c o n d i t i o n s t o w h i c h w e c o u l d c o m p a r e o u r c o m p l e x a t i o n s . F o r t h a t , f o l l o w i n g p r e v i o u s l y r e p o r t e d c o n d i t i o n s , 4 9 a c r y s t a l l i n e c o m p l e x o f D E M P - Z n w a s f o r m e d ( a t t e m p t s t o f o r m X — r a y q u a l i t y c r y s t a l s h a v e y e t t o s u c c e e d ) . T h e U V - v i s d a t a o f D E M P , D E M P - H B r a n d t h e p r e f o r m e d c r y s t a l s o f Z n ( D E M P ) 2 a r e s h o w n i n F i g u r e 6 - 1 8 a n d a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e r e p o r t e d l i t e r a t u r e . I n t h e c a s e o f D E M P H B r , t h e s p e c t r u m i s v i r t u a l l y i d e n t i c a l t o t h a t o f D E M P i n s o l u t i o n a f t e r ~ l h , a s A . 1 6 ) B @ ® ® ‘ 1 C ® ® @ L L ® - @ M U L J L [ I I I I I I T T I I I I T T I T T T T T T Y T I I T T I V I I I ] I I I T , 8 . 0 7 . 0 6 . 0 5 . 0 4 . 0 3 . 0 2 . 0 1 . 0 p p m I V I I T T I ’ F T F T I I I r I T Y T T I Y T I T I I T T T F i g u r e 6 - 1 9 . N M R s p e c t r a i n C D C I 3 o f : A . D E M P H B r ; B . D E M P ; C . C r y s t a l s o f D E M P - Z n ( C I O 4 ) 2 3 0 8 s h o w n i n F i g u r e 6 - 1 6 . H o w e v e r , t h e s p e c t r u m o f t h e p r e f o r m e d ( D E M P ) Z Z n c r y s t a l s ( 5 0 5 n m ) i s q u i t e d i f f e r e n t f r o m t h a t o f t h e i n S i t u Z n b o u n d c o m p l e x , a s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 6 — 1 4 . T h e s e r e s u l t s s u p p o r t t h e s u g g e s t i o n t h a t t h e D E M P - Z n c o m p l e x i n s o l u t i o n w a s n e v e r f o r m e d . I n s t e a d , w h a t c a u s e s t h e r e d s h i f t i n g o f t h e U V - v i s a b s o r p t i o n i s t h e p r o t o n a t i o n o f t h e f r e e b a s e D E M P . A n e x p l a n a t i o n f o r t h e d i f f e r e n t U V - v i s b e h a v i o r s b e t w e e n t h e d i f f e r e n t D E M P f o r m s i s b a s e d o n t h e s o l v a t o c h r o m i c e f f e c t . F o r m a t i o n o f t h e f r e e b a s e d e c r e a s e s t h e p o l a r i t y o f t h e d i p y r r o l y l m e t h e n e , w e a k e n s i t s i n t e r a c t i o n w i t h t h e s o l v e n t a n d , t h e r e f o r e , c a u s e s a b l u e s h i f t i n g o f t h e a b s o r p t i o n b a n d . M e t a l i o n s o r p r o t o n s c a n p o l a r i z e t h e c h r o m o p h o r e , w h i c h e n h a n c e s i t s i n t e r a c t i o n w i t h t h e s o l v e n t , c a u s i n g a b a t h o c h r o m i c s h i f t . E x t e n d e d 1 D a n d 2 D N M R e x p e r i m e n t s o f D E M P , D E M P H B r a n d ( D E M P ) 2 Z n c r y s t a l s w e r e c a r r i e d o u t l e a d i n g t o t h e f i n a l a s s i g n m e n t o f e a c h p r o t o n . F i g u r e 6 - 1 9 d i s p l a y s t h e 1 H N M R o f t h e t h r e e d i f f e r e n t f o r m s o f D E M P , a s w e l l a s t h e a s s i g n m e n t T a b l e 6 - 2 . P r o t o n s h i f t s u p o n c o m p l e x a t i o n o f D E M P 4 5 / / / N / H N / 3 2 1 1 H N M R D E M P ( p p m ) D E M P H B r ( p p m ) ( D E M P ) 2 2 n ( p p m ) 1 2 . 3 0 2 . 6 4 1 . 8 9 2 1 . 0 3 1 . 0 5 1 . 0 0 3 2 . 3 5 2 . 3 9 2 . 3 3 4 2 . 1 3 2 . 2 4 2 . 2 1 5 6 . 6 7 7 . 0 0 6 . 9 5 b a s e d o n t h e H M B C s p e c t r a , w h i l e T a b l e 6 - 2 c o m p a r e s t h e c h e m i c a l s h i f t o f e a c h p r o t o n . A s c a n b e s e e n , t h e p r o t o n s t h a t c a n m o s t l y “ f e e l ” t h e d i f f e r e n t e n v i r o n m e n t s , i n t h e 3 0 9 d i f f e r e n t f o r m s o f D E M P a r e m e t h y l g r o u p s 1 a n d 4 . C o m p a r i n g t h e f i r s t t w o s p e c t r a , w e c a n s e e t h a t i n t h e p r e s e n c e o f t h e H B r , a l l p e a k s a r e s h i f t e d d o w n fi e l d d u e t o t h e s a l t f o r m a t i o n . T h e g r o u p t h a t s e e m s t o b e m o r e i n fl u e n c e d i s m e t h y l g r o u p 1 , r i g h t n e x t t o t h e p o s i t i v e l y c h a r g e d n i t r o g e n , t h a t s h i f t s f r o m ~ 2 . 3 p p m t o ~ 2 . 6 4 p p m . I n f a c t i n t h e c a s e o f t h e D E M P - H C l , m e t h y l g r o u p 1 i s e v e n m o r e d o w n f i e l d s h i f t e d t h a n m e t h y l e n e 3 . U p o n c o m p l e x a t i o n t o t h e m e t a l , t h e N M R p r o fi l e o f t h e m o l e c u l e c h a n g e s s i g n i f i c a n t l y . T h i s t i m e , m e t h y l g r o u p 1 h a s s h i f t e d u p fi e l d ( f r o m ~ 2 . 3 p p m f o r D E M P t o ~ 1 9 p p m ) , w h i l e t h e r e s t o f t h e p r o t o n s r e m a i n m o s t l y t h e s a m e . T h i s u p fi e l d s h i f t c a n © / / H N / / Q ) ’ N A Q ) ® @ @ C 9 @ 1 - L L Q ) G ) 3 ® 6 ) 6 ) L L . l u m i c ® @ 8 . 0 7 . 0 6 . 0 5 . 0 4 . 0 3 . 0 2 . 0 1 . 0 p p m F i g u r e 6 - 2 0 . N M R s p e c t r a i n C D C I 3 o f : A . D E M P ; B . C r y s t a l s o f D E M P - Z n ( C l O 4 ) 2 ; C . D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C I O 4 ) 2 3 1 0 L + 0 . 5 e q u i v 2 n < C I o . ) 2 + ( 1 - 4 ) - « v l L i C D . o a t 1 ) L L F i g u r e 6 - 2 1 . N M R s p e c t r a i n ” E D ‘ 6 ) 0 0 0 1 3 o f : A . D E M P ; B . D E M P c J W h C D ( D G ) D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C | O 4 ) 2 + L ® , i i A , 0 . 5 e q u i v F i - C H E A ; D . D E M P C D A o + 0 . 5 e q u i v Z n ( C l 0 4 ) 2 ; C . @ C D M i e q u i v F i - C H E A ; E . F i - C H E A . 1 . 0 b e e x p l a i n e d a s t h e r e s u l t o f c o m p l e x f o r m a t i o n . I f ( D E M P ) 2 Z n i s f o r m e d m e t h y l g r o u p A G c a 8 . 0 7 . 0 6 . 0 5 . 0 4 . 0 3 . 0 2 0 p p m 1 w i l l b e n e a r t h e s h i e l d i n g c o n e o f t h e p y r r o l e s . ( T h e s p e c t r u m o f ( D E M P ) Z Z n i s v e r y s y m m e t r i c , s u p p o r t i n g t h e s u g g e s t i o n o f D z d g e o m e t r y a r o u n d t h e m e t a l . ) N M R e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t w i t h t h e s o l u t i o n o f t h e c o m p l e x e s t h a t p r o v i d e d t h e E C C D a c t i v e s p e c i e s . A s s h o w n i n F i g u r e 6 - 2 0 C , w h e n 0 . 5 e q u i v o f Z n ( C l O 4 ) 2 6 H 2 0 w e r e a d d e d i n a s o l u t i o n o f D E M P i n C D C 1 3 , t h e s p e c t r u m r e s e m b l e s t h a t o f D E M P - H B r a n d n o t t h a t o f ( D E M P ) 2 Z n ( F i g u r e 6 - 2 0 B ) . W h a t s e e m s t o h a p p e n i s t h a t t h e w a t e r f r o m t h e Z n ( C l O 4 ) 2 6 H 2 0 m o l e c u l e p r o t o n a t e s t h e p y r r o l i c n i t r o g e n s , a c o n c l u s i o n a l s o c o n s i s t e n t w i t h t h e U V - v i s o b s e r v a t i o n s . B u t , a l t h o u g h t h e U V - v i s d i d n o t r e a l l y c h a n g e i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 5 e q u i v o f c h i r a l a m i n e , t h e N M R s p e c t r u m d i d 3 1 1 ( F i g u r e 6 - 2 1 C ) . I t a p p e a r s t h a t t h e p r i m a r y a m i n e , a c t i n g a s a b e t t e r b a s e , i s p i c k i n g u p t h e p r o t o n s p r e v i o u s l y c o o r d i n a t e d t o t h e n i t r o g e n s , l e a d i n g t o a s p e c t r u m r e s e m b l i n g t h a t o f t h e f r e e b a s e D E M P . T h i s w a s a n i n t e r e s t i n g r e s u l t s i n c e t h e N M R d a t a d o n o t s e e m t o a g r e e w i t h t h e U V - v i s d a t a . B u t , w h a t m a d e t h i s r e s u l t e v e n m o r e i n t e r e s t i n g w a s t h e f a c t t h a t u p o n d i l u t i o n o f t h e N M R s o l u t i o n o f [ D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C 1 0 4 ) 2 6 H Z O + 0 . 5 e q u i v R - C H E A ] i n t o C D c o n c e n t r a t i o n , t h e s y s t e m d i d n o t s h o w a n y C D p e a k s a t a l l . H o w e v e r , w i t h i n ~ 5 h , v e r y s i m i l a r C D r e s u l t s a s t h o s e o b s e r v e d b e f o r e w e r e o b t a i n e d . O n c e m o r e , t h e N M R e x p e r i m e n t s , a l t h o u g h i n t e r e s t i n g , d i d n o t l e a d u s t o a n y d e fi n i t e c o n c l u s i o n s . A t t h e s a m e t i m e a t t e m p t s w e r e c a r r i e d o u t i n o r d e r t o c o o r d i n a t e a c h i r a l a m i n e t o t h e p r e f o r m e d ( D E M P ) 2 Z n c o m p l e x . B o t h U V - v i s a n d C D s p e c t r a w e r e r e c o r d e d , o v e r a l o n g p e r i o d o f t i m e , i n t h e p r e s e n c e o f l t o 1 0 3 e q u i v a l e n t s o f c h i r a l a m i n e ( w i t h r e s p e c t t o t h e c o m p l e x ) . H o w e v e r , n o e v i d e n c e o f c o o r d i n a t i o n w a s o b s e r v e d . T h e s y s t e m s e e m e d t o b e “ l o c k e d ” i n t h e t e t r a h e d r a l g e o m e t r y a n d n o f u r t h e r c o o r d i n a t i o n w a s a l l o w e d . S u c h a r e s u l t , a l t h o u g h u p s e t t i n g , w a s n o t v e r y s u r p r i s i n g . A s m e n t i o n e d b e f o r e , a l l r e l a t e d s y s t e m s t h a t h a v e b e e n c r y s t a l l i z e d a n d r e s o l v e d s h o w e d a t e t r a h e d r a l g e o m e t r y a b o u t t h e m e t a l , w i t h o n l y t h e f o u r p y r r o l i c n i t r o g e n s b o u n d . I n a d d i t i o n , i t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t c o m p l e x e s o f d i p y r r o m e t h e n e s d o n o t e x h i b i t p r o n o u n c e d c o o r d i n a t i v e u n s a t u r a t i o n , i . e . t h e y d o n o t s h o w p r o n o u n c e d t e n d e n c y t o c o o r d i n a t e a d d i t i o n a l m o l e c u l a r l i g a n d s a s o p p o s e d t o t h e m e t a l a t e d p o r p h y r i n s . 4 9 T h e r e f o r e o u r p r e v i o u s a t t e m p t s a t t h e f o r m a t i o n o f a c h i r a l c o m p l e x i n s i t u , b y a d d i n g Z n 2 + a n d c h i r a l a m i n e t o a s o l u t i o n o f D E M P s h o u l d b e p r e f e r r e d . A s b r i e fl y m e n t i o n e d b e f o r e , C H C l 3 a p p e a r s t o b e a s p e c i a l s o l v e n t f o r t h e s t u d y o f d i p y r r o m e t h e n e u n i t s , s i n c e i t p r o m o t e s t h e p r o t o n a t i o n o f t h e f r e e b a s e . H o w e v e r , i t h a s 3 1 2 b e e n s u g g e s t e d t h a t s u c h a r e a c t i o n c o u l d b e p r e v e n t e d , i f a n i n e r t a p r o t i c s o l v e n t , s u c h a s d . 2 6 ’ 4 9 ' 5 2 ' ” C o n s i d e r i n g t h a t s u c h a c h a n g e m i g h t l e a d t o a l e s s b e n z e n e , w a s u s e d y n a m i c , a n d e a s i e r t o f o l l o w s y s t e m , s i m i l a r e x p e r i m e n t s , a s w h a t p r e v i o u s l y d e s c r i b e d i n C H C l 3 w a s u n d e r t a k e n . B e f o r e m o v i n g o n , t h e s t a b i l i t y o f f r e e b a s e D E M P i n b e n z e n e w a s s t u d i e d b y f o l l o w i n g t h e U V - v i s s p e c t r u m a s a f u n c t i o n o f t i m e . H o w e v e r , t h e o b t a i n e d s p e c t r a i n b e n z e n e d i d n o t a g r e e w i t h w h a t h a s b e e n p r e v i o u s l y r e p o r t e d . 5 3 ' 5 5 A l t h o u g h t h e s y s t e m i n b e n z e n e i s c o n s i d e r a b l y m o r e s t a b l e , t h e s e c o n d U V - v i s p e a k a t t r i b u t e d t o p r o t o n a t i o n o f t h e f r e e b a s e i s s t i l l o b s e r v e d . Y e t , e v e n a f t e r s e v e r a l h o u r s , a s o l u t i o n o f 5 x 1 0 " 5 M D E M P i n b e n z e n e m a i n t a i n s t h e 4 4 8 n m p r o m i n e n t p e a k . I f w h a t o c c u r s i s p r o t o n a t i o n , a s w a s p r o v e n f o r t h e C H C 1 3 s y s t e m , u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s i t i s s i g n i fi c a n t l y s l o w e r , a n d t h e r e f o r e c o u l d h e l p i n s t a b i l i z i n g t h e s y s t e m . F o l l o w i n g t h e o p t i m i z e d c o n d i t i o n s t h a t p r o v i d e d o b s e r v a b l e E C C D s p e c t r a i n C H C 1 3 , s o l i d Z n ( C l O 4 ) 2 w a s a d d e d t o a D E M P s o l u t i o n i n b e n z e n e ( 5 0 u M ) , a n d a fi e r s t i r r i n g f o r 3 h , d i f f e r e n t c h i r a l a m i n e s w e r e i n t r o d u c e d . T h e U V - v i s s p e c t r a o f d i f f e r e n t F i g u r e 6 - 2 2 . U V s p e c t r a i n b e n z e n e o f D E M P ( ( a ) , b l u e , 4 5 5 n m . 4 8 9 n m ) , D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C | O 4 ) 2 ( ( b ) , m a g e n t a , 4 5 5 n m , 4 8 9 n m ) a n d D E M P + 0 . 5 e q u i v Z n ( C | O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v R - C H E A ( ( c ) , g r e e n , 3 6 5 n m , 4 9 1 n m ) . 3 1 3 f o r m s o f D E M P i n b e n z e n e a r e s h o w n i n F i g u r e 6 - 2 2 . U p o n a d d i t i o n o f Z n ( C l O 4 ) 2 , t h e 7 1 , . . . “ r e m a i n s t h e s a m e ( 4 5 5 n m , 4 8 9 n m ) a s i n t h e f r e e D E M P s p e c t r u m , b u t t h e e o f t h e z i n c a t e d s p e c i e s s i g n i fi c a n t l y d e c r e a s e d . U p o n c o o r d i n a t i o n o f a c h i r a l a m i n e ( R - C H E A ) t h e U V - v i s r e d s h i f t e d c o m p l e t e l y t o 4 9 1 n m , r e s e m b l i n g t h e c o r r e s p o n d i n g t r a c e i n C H C l 3 . n m F i g u r e 6 - 2 3 . C D s p e c t r a o f D E M P - Z n i n t h e p r e s e n c e o f R ( ( a ) , b l u e ) o r S ( ( b ) , m a g e n t a ) c y c l o h e x y l e t h y l a m i n e i n b e n z e n e G r a t i f y i n g l y , a f t e r ~ 1 h o f s t i r r i n g , a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h e C D s p e c t r a r e c o r d e d r e v e a l e d t h e f o r m a t i o n o f a n E C C D a c t i v e c o m p l e x a s a p p a r e n t f r o m t h e b i s i g n a t e p e a k p r e s e n t . T h e s i g n o f t h e i n d u c e d C o t t o n e f f e c t i s e x c l u s i v e l y d e t e r m i n e d b y t h e a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n o f t h e a m i n e . I n p a r t i c u l a r , w e b e l i e v e t h a t c o m p l e x a t i o n o f R - a m i n e s p r o m o t e s t h e f o r m a t i o n o f a l e f t - h a n d e d ( M ) h e l i x l e a d i n g t o a n e g a t i v e 1 S t C o t t o n e f f e c t ( F i g u r e 6 - 2 3 ) . A s e x p e c t e d , S - a m i n e s r e v e a l t h e o p p o s i t e E C C D ( p o s i t i v e 1 S t C o t t o n e f f e c t ) , o r i g i n a t i n g f r o m t h e f o r m a t i o n o f a P - h e l i x . F i g u r e 6 - 2 4 d e p i c t s a p r o p o s e d m e c h a n i s m f o r t h e d i a s t e r e o m e r i c d i f f e r e n t i a t i o n i n d u c e d u p o n l i g a t i o n o f a c h i r a l m o n o a m i n e t o t h e D E M P — Z n c o m p l e x . D e p e n d i n g o n t h e c h i r a l i t y o f t h e a m i n e o n e o f t h e t w o p o s s i b l e h e l i c a l c o n fi g u r a t i o n s i s p r e f e r r e d i n 3 1 4 \ \ \ \ N H N \ 1 . Z n + 2 2 . c h i r a l a m i n e R - a m i n e s S ' a m i n e s M H e l i x P H e l l x ( - ) E C C D ( + ) E C C D F i g u r e 6 - 2 4 . P r o p o s e d m e c h a n i s m f o r d i a s t e r e o m e r i c d i f f e r e n t i a t i o n u p o n l i g a t i o n o f a c h i r a l a m i n e . D u e t o s t e r i c s , R - a m i n e s w i l l r e s u l t i n t h e f o r m a t i o n o f a M - h e l i x w h i c h c a n b e o b s e r v e d a s a ( - ) E C C D . U p o n c o o r d i n a t i o n o f S - a m i n e s t h e P - h e l i c i t y i s p r e f e r r e d a n d a ( + ) E C C D p e a k i s o b s e r v e d . 3 1 5 “ M Q o r d e r t o m i n i m i z e t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e l a r g e g r o u p o n t h e c h i r a l c e n t e r ( L ) a n d t h e p y r r o l e r i n g . F o l l o w i n g t h i s l o g i c , R - a m i n e s w o u l d i n d u c e a p r e f e r r e d M - h e l i c i t y w h i l e S - a m i n e s w o u l d l e a d t o P - h e l i c e s , c o n s i s t e n t w i t h w h a t i s o b s e r v e d . A s e r i e s o f c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e c h i r a l m o n o a m i n e s w e r e t r i e d w i t h t h i s s y s t e m a n d t h e r e s u l t s , a s s h o w n i s T a b l e 6 - 3 , a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e l a t t e r r a t i o n a l i z a t i o n . A l l R - a m i n e s u s e d y i e l d e d a n e g a t i v e E C C D c o u p l e t w h i l e a l l S - a m i n e s , a s e x p e c t e d , h a d t h e T a b l e 6 - 3 . C D d a t a u p o n a d d i t i o n o f v a r i o u s c h i r a l a m i n e s i n t o a ( D E M P ) 2 - Z n s o l u t i o n i n b e n z e n e L i g a n d 1 g 1 C o ( t t ‘ q r ‘ r f f f e c t 2 m C o ( t r t o r r ‘ i ) E f f e c t A m p l l ‘ i t u d e ( R ) - c y c l o h e x y l e t h y l a m i n e - 5 3 0 + 5 1 1 - 5 ( S ) - c y c l o h e x y l e t h y l a m i n e + 5 3 0 - 5 1 1 + 9 ( R ) - m e t h y l b e n z y l a m i n e - 5 3 0 + 5 1 1 - 1 8 ( S ) - m e t h y l b e n z y l a m i n e + 5 2 8 - 5 1 1 + 7 ( R ) - n a p h t h y l e t h y l a m i n e - 5 3 0 + 5 0 7 - 2 ( S ) - n a p h t h y l e t h y l a m i n e + 5 3 0 - 5 0 7 + 2 ( S ) - s e c b u t y l a m i n e + 5 3 1 - 5 0 7 + 4 o p p o s i t e e f f e c t . F o r a l l t h e s e c a s e s , w e h a v e t o k e e p i n m i n d t h a t t h e p r i o r i t y r u l e s f o r t h e a s s i g n m e n t o f t h e a b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n o f t h e a m i n e s c o i n c i d e w i t h t h e r e l a t i v e s i z e o f t h e s u b s t i t u e n t s o n t h e c h i r a l c e n t e r . I n c a s e s w h e r e t h e a b o v e s t a t e m e n t d o e s n o t a p p l y , t h e E C C D s i g n a l s w o u l d b e e x p e c t e d t o i n v e r t , t o c o m p l y w i t h t h e a b o v e r a t i o n a l i z a t i o n ; i . e . s t e r i c s a n d n o t p r i o r i t i e s o f a s s i g n i n g c h i r a l i t y d i c t a t e t h e m o r e p o p u l a t e d ( l o w e r e n e r g y ) d i a s t e r e o m e r . T h e E C C D p e a k s a n d t h e c r o s s p o i n t s f o r t h e b i s i g n a t e p e a k s w e r e i n a l l c a s e s c o n s i s t e n t , a t a r o u n d 5 1 5 n m , r a n g i n g w i t h i n o n l y 1 - 4 n m . H o w e v e r , t h a t n u m b e r i s n o t c o n s i s t e n t w i t h t h e U V - v i s s p e c t r u m o f t h e s o l u t i o n . I n p a r t i c u l a r , a s s h o w n i n F i g u r e 6 - 3 1 6 2 4 , t h e s p e c t r u m o f t h e D E M P - Z n - c h i r a l a m i n e c o m p l e x s h o w s a p r o m i n e n t p e a k a t ~ 4 9 1 n m . H o w e v e r , c a l c u l a t i n g t h e 2 n d d e r i v a t i v e o f t h e U V - v i s s p e c t r u m ( T a b l e 6 - 4 ) l e a d s t o t h e d e t e c t i o n o f a n a c t u a l p e a k , a l t h o u g h w e a k , b e t w e e n 5 0 7 - 5 1 0 n m . . F u r t h e r m o r e , t h e r e d - s h i f t e d a b s o r p t i o n i s s i m i l a r t o t h e U V - v i s d a t a o b t a i n e d f o r t h e c r y s t a l l i n e T a b l e 6 4 . C o m p a r i s o n o f t h e E C C D c r o s s p o i n t a n d t h e U V s p e c t r a o f D E M P - Z n i n t h e p r e s e n c e o f d i f f e r e n t c h i r a l a m i n e s . L i g a n d C D c r o s s p o i n t ( n m ) U V ( n m ) U V 2 " " d e r ( n m ) ( R ) - c y c l o h e x y l e t h y l a m i n e 5 2 0 5 0 5 , 4 9 3 5 0 7 . 4 9 0 . 4 7 6 ( S ) - c y c l 0 h e x y l e t h y l a m i n e 5 2 0 4 9 0 » 3 5 9 4 9 4 . 4 6 0 ( R ) - m e t h y l b e n z y l a m i n e 5 1 6 5 0 6 , 4 9 1 , 4 8 0 5 1 1 , 4 9 0 , 4 7 6 ( S ) - m e t h y l b e n z y l a m i n e 5 2 1 4 9 1 5 1 1 . 4 9 2 . 4 6 1 ( R ) - n a p h t h y l e t h y l a m i n e 5 1 2 4 9 1 5 1 0 . 4 9 3 . 4 6 1 ( S ) - n a p h t h y l e t h y l a m i n e 5 1 8 4 9 2 5 1 1 . 4 9 6 . 4 6 0 5 1 8 4 9 1 5 0 9 . 4 9 1 , 4 7 5 ( S ) - s e c b u t y l a m i n e ( D E M P ) Z Z n c o m p l e x ( 5 0 5 n m ) , w h i c h r a i s e s t h e q u e s t i o n o f w h e t h e r o r n o t t h e c o m p l e x i s f o r m e d i n s o l u t i o n , e v e n i n a v e r y s m a l l a m o u n t , a n d i n f a c t i t i s o n l y t h e s m a l l a m o u n t o f t h e c o m p l e x t h a t i s r e s p o n s i b l e f o r t h e C D a c t i v e s p e c i e s . S u c h a p o s s i b i l i t y w o u l d a l s o e x p l a i n t h e f a c t t h a t t h e a m p l i t u d e o f t h e C D p e a k s i s s m a l l , d u e t o t h e s m a l l p o p u l a t i o n o f C D a c t i v e c o m p l e x . S i n c e t h i s s y s t e m p r o v i d e s c o n s i s t e n t r e s u l t s , a c o m p a r i s o n w i t h s i m i l a r s y s t e m s , d e v e l o p e d f o r t h e d i r e c t d e t e r m i n a t i o n o f a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y i s i n o r d e r . A s m e n t i o n e d i n C h a p t e r 5 , c h i r a l m o n o a m i n e s h a v e b e e n a v e r y a t t r a c t i v e t a r g e t f o r a p p l y i n g t h e E C C D m e t h o d m o s t l y d u e t o t h e i r h i g h a f f i n i t y f o r Z n c o m p l e x e s . A s e r i e s 6 - 5 8 d 5 o f p o r p h y r i n t w e e z e r s y s t e m s h a v e b e e n d e v e l o p e t h a t h a v e p r o v e n s u c c e s s f u l i n d e t e r m i n i n g t h e c o n f i g u r a t i o n o f c a r r i e r - d e r i v a t i z e d c h i r a l m o n o a m i n e s . B u t t o d a t e , t h e 3 1 7 o n l y a p p r o a c h d e v e l o p e d f o r t h e d i r e c t d e t e r m i n a t i o n o f t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f c h i r a l m o n o a m i n e s , w i t h o u t t h e n e e d o f c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s , i s b a s e d o n t h e u s e o f B i s ( Z n - p o r p h y r i n ) a n d r e q u i r e s a g r e a t e x c e s s o f c h i r a l s u b s t r a t e ( > m M c o n c e n t r a t i o n ) ” 6 0 O u r r e s u l t s c o m p a r e w e l l w i t h t h e l a t t e r m e t h o d h a v i n g t h e a d v a n t a g e t h a t o n l y u M c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c h i r a l c o m p o u n d a r e r e q u i r e d . H o w e v e r , a s o p p o s e d t o w h a t h a s b e e n p r e v i o u s l y o b s e r v e d w i t h o t h e r c h i r a l a m i n e r e c e p t o r s , t h e s i z e o f t h e s u b s t i t u e n t s o n t h e c h i r a l c e n t e r d o e s n o t s e e m t o h a v e a s y s t e m a t i c e f f e c t o n t h e t o t a l a m p l i t u d e o f t h e E C C D . F o r e x a m p l e , i n t h e c a s e o f S - s e c b u t y l a m i n e t h e t o t a l a m p l i t u d e w a s 4 , d o u b l e o f t h a t o f S - n a p h t h y l e t h y l a m i n e . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n c o u l d b e t h a t w h e n a p a r t i c u l a r l y b u l k y g r o u p , l i k e n a p h t h a l e n e , i s o n t h e c h i r a l c e n t e r t h e o v e r a l l b i n d i n g o f t h e a m i n e t o t h e m e t a l i s w e a k e r a n d l e s s o f t h e C D a c t i v e c o m p l e x i s f o r m e d . I n g e n e r a l f o r a l l t h e c a s e s a b o v e , t h e o b s e r v e d a m p l i t u d e s o f t h e E C C D p e a k s a r e r e l a t i v e l y l o w e r a s c o m p a r e d t o t h o s e r e p o r t e d w i t h t h e p o r p h y r i n - b a s e d r e c e p t o r s . 5 9 ' 6 0 T h i s c a n b e d u e t o e i t h e r t h e c h r o m o p h o r i c r e c e p t o r ( p o r p h y r i n s a r e b e t t e r c h r o m o p h o r e s t h a n t h e d i p y r r y l m e t h e n e s s o t h e i r i n t e r a c t i o n l e a d s t o e n h a n c e d E C C D ) o r t o t h e b i n d i n g o f t h e c h i r a l m o l e c u l e t o o u r r e c e p t o r . I t i s p o s s i b l e t h a t w e f o r m o n l y a v e r y s m a l l a m o u n t o f c h i r a l s p e c i e s , e n o u g h t o b e d e t e c t e d b y t h e e x t r e m e l y s e n s i t i v e E C C D m e t h o d b u t n o t e n o u g h t o p r o d u c e s t r o n g s i g n a l s . A t t e m p t s t o i n c r e a s e t h e a m p l i t u d e b y r e c o r d i n g s p e c t r a a t l o w e r e d t e m p e r a t u r e ( 4 ° C ) d i d n o t y i e l d a n y i m p r o v e d r e s u l t s , a n d i n f a c t t h e o b t a i n e d s p e c t r a w e r e F i g u r e 5 ' 2 5 - P h o t o o x i d a t i o n P T O d U C t S 0 ‘ v i r t u a l l y i d e n t i c a l w i t h t h o s e o b t a i n e d a t d i p y r r o m e t h e n e s i n s o l u t i o n r o o m t e m p e r a t u r e . 3 1 8 F i n a l l y , s i n c e w e a r e s t i l l n o t s u r e a b o u t t h e n a t u r e o f t h e c h i r a l c o m p l e x f o r m e d t h a t g i v e s r i s e t o t h e C D s p e c t r a , o t h e r p o s s i b i l i t i e s w e r e e x p l o r e d . A c c o r d i n g t o l i t e r a t u r e , 2 6 ’ 4 9 ‘ 5 5 ’ 6 1 ' 6 2 d i p y r r o l e u n i t s , a f t e r h a v i n g b e e n d e p r o t o n a t e d , a r e n o t v e r y s t a b l e i n s o l u t i o n s . I n p a r t i c u l a r , i t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t d i p y r r o m e t h e n e s u n d e r g o p h o t o o x i d a t i o n i n s o l u t i o n . “ 6 2 P h o t o o x i d a t i o n o f t h e h y d r o c h l o r i d e s a l t s i n M e O H w a s s l o w e r ( 5 0 % b l e a c h e d i n 1 2 h ) t h a n t h a t o f t h e f r e e b a s e ( 5 0 % b l e a c h e d i n 1 . 5 h ) . A s e r i e s o f p h o t o o x i d a t i o n p r o d u c t s a r e r e p o r t e d , a m o n g t h e m t h e s t r u c t u r e s s h o w n i n F i g u r e 6 - 2 5 , a s w e l l a s s e v e r a l m e t h o x y - a n d h y d r o x y l a c t a m s . W h i l e p h o t o o x i d a t i o n u s u a l l y r e q u i r e s t h e p r e s e n c e o f l i g h t a n d s e n s i t i z e r , t h e s e m o l e c u l e s c a n a l s o u n d e r g o a u t o o x i d a t i o n s i n s o l u t i o n , w h i c h a r e f o u n d t o b e m u c h s l o w e r . A t t h e s a m e t i m e , i t w a s o b s e r v e d t h a t w h e n a u t o o x i d a t i o n o f D E M P o c c u r s , t h e U V - v i s s h i f t s f r o m 4 4 3 n m t o 4 8 0 n m ( i n M e O H ) . T h e U V - v i s a b s o r b a n c e o b s e r v e d d u e t o a u t o o x i d a t i o n i s v e r y s i m i l a r t o t h e s p e c t r a o b t a i n e d f o r o u r s y s t e m , w h i c h w e p r e v i o u s l y a t t r i b u t e d t o t h e p r o t o n a t i o n o f D E M P . T h e c o n c l u s i o n i s t h a t a u t o o x i d a t i o n s h o u l d d e f i n i t e l y b e c o n s i d e r e d a s a n o t h e r p o s s i b l e m e c h a n i s m t h a t c o u l d e x p l a i n s o m e o f o u r o b s e r v a t i o n s , a n d c a n a l s o l e a d t o s o m e f u r t h e r t h o u g h t s . F o r e x a m p l e , o n e c o u l d i m a g i n e t h a t t h e c o m p l e x o f t h e D E M P w i t h t h e m e t a l a n d t h e c h i r a l a m i n e w a s n e v e r f o r m e d , b u t w h a t w e r e a l l y o b s e r v e d w a s t h e a m i n e r e a c t i n g w i t h a n o x i d i z e d f o r m o f D E M P , w i t h t h e m e t a l a c t i n g a s a c a t a l y s t . I n a n a t t e m p t t o i n v e s t i g a t e t h e r o l e o f t h e m e t a l , c h i r a l a m i n e w a s a d d e d t o a s o l u t i o n o f D E M P i n b e n z e n e a n d t h e s y s t e m w a s f o l l o w e d b y U V - v i s a n d C D . T h e U V - v i s t r a c e r e m a i n e d s t a b l e a t ~ 4 4 3 n m w h i l e n o C D p e a k s w e r e o b s e r v e d o v e r a p e r i o d o f 3 d a y s . T h e s e o b s e r v a t i o n s v e r i f y t h a t t h e m e t a l i s e s s e n t i a l f o r t h e f o r m a t i o n - o f t h e C D 3 1 9 a c t i v e c h i r a l c o m p o u n d . I n a d d i t i o n , D E M P w a s o x i d i z e d u s i n g m C P B A a n d t h e r e a C t i o n w a s f o l l o w e d b y U V - v i s . U p o n a d d i t i o n o f m C P B A t h e A W i m m e d i a t e l y s h i f t e d f r o m 4 4 3 n m t o 4 8 9 n m , c o n s i s t e n t w i t h o u r p r e v i o u s o b s e r v a t i o n s . H o w e v e r n o C D s p e c t r u m w a s o b t a i n e d w h e n m e t a l a n d c h i r a l a m i n e w e r e a d d e d t o t h e D E M P — m C P B A s o l u t i o n . F i n a l l y , i n o r d e r t o e n t e r t a i n t h e c o n c e r n s t h a t l i g h t a n d o x y g e n m i g h t t r i g g e r t h e d e c o m p o s i t i o n o f D E M P , e x p e r i m e n t s w e r e d e s i g n e d t o e l i m i n a t e t h o s e f a c t o r s . I n p a r t i c u l a r , i n o r d e r t o i n v e s t i g a t e h o w l a c k o r e x c e s s o f o x y g e n p r e s e n t i n t h e s o l u t i o n w o u l d a f f e c t t h e c o n v e r s i o n r a t e o f D E M P , f r o m t h e 4 4 8 n m t o t h e 4 8 8 n m a b s o r b i n g s p e c i e s , a r g o n w a s b u b b l e d i n t o a c h l o r o f o r m s o l u t i o n o f D E M P a n d t h e U V - v i s s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o v e r a p e r i o d o f t i m e . I n t e r e s t i n g l y , n o d e v i a t i o n i n t h e c o n v e r s i o n r a t e o f t h e t w o U V - v i s p e a k s w a s o b s e r v e d . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w h e n t h e s o l u t i o n w a s b u b b l e d w i t h a i r . T h e e x c e s s o f o x y g e n p r e s e n t d i d n o t s e e m t o a c c e l e r a t e t h e c o n v e r s i o n . I n a d d i t i o n , l i g h t w a s e l i m i n a t e d a s a c o n t r i b u t i n g f a c t o r , a s w e l l . T h e s p e c t r a e x p o s e d t o d a y l i g h t h a d e x a c t l y t h e s a m e b e h a v i o r a s t h o s e p r e p a r e d a n d s t o r e d i n d a r k n e s s , s u g g e s t i n g t h a t t h e a c i d p r o m o t e d t r a n s f o r m a t i o n o f D E M P w o u l d , m o s t p r o b a b l y b e t h e r e a s o n f o r i t s a u t o o x i d a t i o n i n s o l u t i o n . I n c o n c l u s i o n , a n e w e f f i c i e n t w a y t o d e t e r m i n e t h e s t e r e o c h e m i s t r y o f c h i r a l a m i n e s w i t h o u t t h e n e e d f o r d e r i v a t i z a t i o n u s i n g t h e E C C D m e t h o d h a s b e e n d e v e l o p e d . S o f a r , t w o p o s s i b l e e x p l a n a t i o n s h a v e b e e n o f f e r e d , e a c h o f w h i c h s a t i s f i e s a p a r t o f o u r e x p e r i m e n t a l d a t a . U p t o t h i s p o i n t , n o d e fi n i t e c o n c l u s i o n s c a n b e d e r i v e d o n h o w t h e C D a c t i v e c h i r a l c o m p o u n d s a r e f o r m e d w i t h t h i s s y s t e m , s o m o r e i n v e s t i g a t i o n i s i n o r d e r . 3 2 0 6 . 3 T h e B i s p y r i d i n e s y s t e m s I n a d d i t i o n t o t h e d i p y r r o m e t h e n e s , b i s - p y r i d i n e u n i t s , l i k e t h o s e s h o w n i n F i g u r e 6 - 2 6 w e r e c o n s i d e r e d a s p o t e n t i a l h o s t s f o r t h e f o r m a t i o n o f c h i r a l h e l i c a t e s . I n a s i m i l a r f a s h i o n t o t h e c a r t o o n i n F i g u r e 6 - 2 4 , w e b e l i e v e t h a t u p o n b i n d i n g o f a m e t a l c a t i o n w i t h t h e n i t r o g e n a t o m s , a r a c e m i c m i x t u r e o f t h e t w o M e O O M e O O e n a n t i o m e r i c h e l i c a t e s w o u l d f o r m . W h e n a c h i r a l \ — / \ — / m o l e c u l e i s a d d e d , u p o n c o o r d i n a t i o n , o n e o f t h e t w o N N 3 f o r m s w i l l b e f a v o r e d r e s u l t i n g i n a n E C C D a c t i v e c o m p l e x . T h r o u g h o u t t h e y e a r s , p o l y p y r i d i n e u n i t s h a v e b e e n p r i m a r i l y u s e d f o r t h e f o r m a t i o n o f s e v e r a l F i g u r e 6 - 2 6 . S t r u c t u r e s o f s u p r a m o l e c u l a r f o r m s , a m o n g t h e m h e l i c a l B i p y r i d i n e u n i t s 6 3 - 6 5 m a c r o m o l e c u l a r s t r u c t u r e s . R e p o r t e d c r y s t a l l i z e d f o r m s o f p o l y p y r i d i n e m e t a l c o m p l e x e s , i n t h e p r e s e n c e o f C u ” , Z n “ a n d C o “ , r e v e a l t h e p o s s i b i l i t y o f b o t h t e t r a h e d r a l a n d o c t a h e d r a l c o o r d i n a t i o n . T h e k i n d o f s t r u c t u r e o b t a i n e d c a n b e c o n t r o l l e d b y u s i n g l i g a n d s b e a r i n g t h e a p p r o p r i a t e n u m b e r o f b i n d i n g 6 6 , 6 7 s i t e s , b i d e n t a t e v s t r i d e n t a t e c o r r e s p o n d i n g l y . I n a d d i t i o n , d e p e n d i n g o n t h e n a t u r e o f t h e c o o r d i n a t e d m e t a l i o n , d o u b l e o r t r i p l e h e l i c a l c o m p l e x e s h a v e b e e n p r o d u c e d . 6 8 6 , 6 ’ - D i m e t h y l - 2 , 2 ’ - B i s p y r i d i n e l i g a n d s , l i k e t h e o n e s s h o w n i n F i g u r e 6 — 2 6 , h a v e b e e n u s e d f o r t h e f o r m a t i o n o f h e l i c a l s t r u c t u r e s , a s w e l l , i n a n o l i g o m e r i c f o r m . ” 7 4 I n a d d i t i o n , m o n o m e r i c b i s p y r i d i n e s w i t h a c h i r a l g r o u p a t t a c h e d t o o n e r i n g , h a v e b e e n 7 5 u s e d a s c h i r a l l i g a n d s f o r R u a n d R h b a s e d c a t a l y s t s . N u m e r o u s c r y s t a l s t r u c t u r e s o f 3 2 1 B A K R O V R I D P I D O 1 Z U W O B . C u ( I i ) N i ( l l ) — c — N . Z n ( " ) 3 C o ( l l ) — 0 — s — F F i g u r e 6 - 2 7 . R e p r e s e n t a t i v e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f b i s p y r i d o n e s w i t h v a r i o u s m e t a l s . T h e n a m e s u n d e r t h e s t r u c t u r e s r e f e r t o t h e n a m e o f t h e c o r r e s p o n d i n g P D B f i l e . b i s p y r i d i n e s w i t h v a r i o u s m e t a l s h a v e b e e n r e p o r t e d . ” 8 0 S o m e r e p r e s e n t a t i v e m o l e c u l e s a r e s h o w n i n F i g u r e 6 - 2 7 . F o r o u r p u r p o s e , t h e m o s t i m p o r t a n t s t r u c t u r e i s t h a t o f h e x a - c o o r d i n a t e d Z n ( I I ) ( F i g u r e 6 - 2 7 C ) 8 ° . T h e p r e s e n c e o f s i x l i g a n d s a r o u n d t h e c e n t r a l m e t a l a l l o w s u s t o e n v i s i o n t h e c o o r d i n a t i o n o f t h e c h i r a l m o l e c u l e o n t o a b i s p y r i d i n e — Z n ( I I ) c o m p l e x . 3 2 2 a c i s a n o w s . h 8 2 n A s e i n s i t u F a i g u t i o n t e r a c t i o n s c a n o c r c e u 6 - l i k e 2 t 8 h f o i s c r o r . T h e t t h l d o e b u w b t i e p n p o h e n y l t i a l l y i s p y r i d i n e F 1 i 9 9 < < 9 0 2 ° 7 0 0 ° < 0 8 / < \ g u r e 6 ’ 2 8 ' T h e E C 2 7 C 9 0 ° < 0 < 6 9 < < / 8 3 6 1 - ° 0 \ 0 t h O f D 1 9 9 9 0 C o m p o u n d 4 ( 2 , 9 - D i m e t h y l - 4 , 7 - D i p h e n y l - 1 , 1 0 - P h e n a n t h r o l i n e , D D P , F i g u r e 6 - 2 6 ) i s c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e . A s a l i g a n d , i t h a s b e e n e x t e n s i v e l y u s e d f o r t h e d e v e l o p m e n t o f o r g a n i c l i g h t e m i t t i n g d e v i c e s , f o r d i s p l a y a p p l i c a t i o n s . “ S t r u c t u r e 3 ( 6 , 6 ’ - D i m e t h y l - 4 , 4 ’ ~ b i s - [ 4 - M e t h o x y P h e n y l ] - 2 , 2 ’ B i p y r i d i n e , D M P B , F i g u r e 6 - 2 6 ) w a s c h o s e n b e c a u s e o f t h e p r e s e n c e o f t h e p - O M e g r o u p s . T h e p a r a e l e c t r o n d o n a t i n g g r o u p s c a n r e d s h i f t t h e k m ” o f t h e c h r o m o p h o r e , a w a y f r o m t h e 2 0 0 - 2 5 0 n m r e g i o n w h e r e m o s t o f t h e s o l v e n t s s t r o n g l y a b s o r b . T h e m a i n d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o s t r u c t u r e s 3 a n d 4 i s t h e e x t r a r i n g o f t h e D D P m o l e c u l e , w h i c h p r o h i b i t s t h e r o t a t i o n b e t w e e n t h e t w o p y r i d i n e r i n g s . U p o n a d d i t i o n o f a m e t a l , i t i s e x p e c t e d t h a t D M P B w o u l d f o r m a h e l i c a t e s t r u c t u r e . I n f a c t , a s i t h a s b e e n o b s e r v e d w i t h s i m i l a r b i p h e n y l s y s t e m s , t h e r o t a t i o n a r o u n d t h e s i n g l e b o n d c a n d i s r u p t t h e c o n j u g a t i o n b e t w e e n t h e t w o r i n g s , r e s u l t i n g i n t w o d i f f e r e n t d i p o l e s . S i n c e t h e e x t e n t o f c o n j u g a t i o n i n c r e a s e s w i t h p l a n a r i t y , a t a n a n g l e o f ~ 4 5 ° , w e w o u l d e x p e c t t h a t t h e r e i s l i t t l e c o n j u g a t i o n . W e w o u l d a n t i c i p a t e E C C D s p e c t r a a r i s i n g f r o m “ 8 % f 1 b “ b A 1 1 3 t h e c o u p l i n g o f t h e t w o r i n g s o f t h e A B a b i s p y r i d i n e u n i t , i n t e r a c t i n g w i t h e a c h o t h e r , c o m p l i c a t e o u r s y s t e m , s i n c e u p o n f o r m a t i o n o f a m e t a l c o m p l e x t w o d i f f e r e n t E C C D . _ , , b i p h e n y l d e p e n d s o n t h e d e g r e e o f u n i t s c o u l d i n t e r a c t b o t h i n t r a - a n d i n t e r - c o n j u g a t i o n b e t w e e n t h e t w o r i n g s m o l e c u l a r l y p o t e n t i a l l y r e s u l t i n g i n a 3 2 3 s u m m a t i o n o f E C C D p e a k s . T h e r e f o r e , a r e l a t e d s t u d y o f a c o n s t r a i n e d s y s t e m , l i k e D D P , i s e s s e n t i a l . T h e s y n t h e s i s o f b i p y r i d i n e 3 , a s p r e s e n t e d i n S c h e m e 6 - 1 , w a s u n e v e n t f u l f o l l o w i n g k n o w n p r o c e d u r e s . 8 3 R e a c t i o n o f b u t a n e - 2 , 3 - d i o n e w i t h a n i s a l d e h y d e y i e l d s d i k e t o n e 7 , w h i c h u p o n r e a c t i o n w i t h a c e t o n y l - p y r i d i n i u m c h l o r i d e 9 , i n t h e p r e s e n c e o f a m m o n i u m a c e t a t e , a f f o r d s D M P B i n a 2 5 % y i e l d . ” 1 7 H a v i n g b o t h c o m p o u n d s , 3 a n d 4 , i n h a n d , w e w e r e r e a d y t o a t t e m p t c o m p l e x a t i o n w i t h m e t a l s t o f o r m c h i r a l h e l i c a t e s . H J U + > { E t O H I O M e O O p i p e r i d i n e 4 h e a t , 2 0 % 3 O — H e x a n e s I O I \ A ’ C ' + C I N 7 0 c , 7 9 % M O — 6 C P 7 M e O O M e M e O O O _ _ + 2 1 9 W ) A m m o n i u m a c e t a t e 0 1 9 E t O H , r e f l u x 2 5 % 5 7 S c h e m e 6 - 1 . S y n t h e s i s o f D M P B T h e U V - v i s s p e c t r a o f b o t h c o m p o u n d s , i n t h e p r e s e n c e o f Z n 2 + a n d c h i r a l a m i n e i n d i f f e r e n t s o l v e n t s a r e d e p i c t e d i n F i g u r e 6 - 2 9 . I n t h e c a s e o f D D P , t h e s p e c t r u m i n M e C N c o n s i s t s o f a m a j o r p e a k a t ~ 2 7 9 n m ( 8 3 7 , 8 1 6 M ' 1 c m - l ) , w i t h a n o t i c e a b l e s h o u l d e r a t 2 8 7 n m . U p o n a d d i t i o n o f Z n B r z , t h e m a i n p e a k r e d s h i f t s t o 2 8 7 n m , m a i n t a i n i n g a s h o u l d e r p e a k a t 2 7 9 n m , m a k i n g t h e t r a c e s u s p i c i o u s l y s i m i l a r t o t h a t o f t h e f r e e D D P . T h e s h a p e o f t h e s p e c t r u m i s f u r t h e r c h a n g e d w h e n S - C H E A i s a d d e d , 3 2 4 F ( i m g a u g r e e n 6 - 2 9 . U V t a ) a n d B s . p e c t r a o f : A . D D D M P B i n d i o x P a i e n n M e C N ( b l u e ) ; a . I s n s h o w n i n d u c e d d r a a F m i a g t u i r e c e f 6 f - 2 9 B , e c t o n a t d h d e i t i o U V n - o 1 ' f 3 v 0 . 2 c o n s i s t i n g o f a b r o a d p e a k ( ~ 2 8 4 n m ) , A 0 ‘ 1 6 ‘ c o v e r i n g b o t h p r e v i o u s l y n o t i c e d p e a k s 0 . 1 2 - A 0 0 8 a n d h a v i n g a n e n h a n c e d a b s o r b a n c e . T h e 0 . 0 4 . o b s e r v e d c h a n g e s o f t h e U V - v i s s p e c t r a 0 1 1 . c o u l d b e i n d i c a t i v e o f s o m e c o m p l e x a t i o n , 2 2 0 2 5 0 2 8 0 3 1 0 0 6 n m h o w e v e r t h e r e c o r d e d C D s p e c t r u m f a i l s B 0 ' 5 ‘ t o d e t e c t t h e p r e s e n c e o f a n y c h i r a l 0 . 4 4 A 0 . 3 1 s p e c i e s . 0 ' 2 i T h e s p e c t r o s c o p i c b e h a v i o r o f 0 . 1 - 0 . . 1 . s t r u c t u r e 3 , D M P B ( k m , 2 8 9 n m , 8 4 8 , 8 6 4 2 2 0 2 5 0 2 8 0 3 1 0 3 4 0 n m i n M e O H ) , w a s v e r y s i m i l a r . I n t h i s c a s e , ( b l u e ) ; D D P + 0 . 5 e q u i v Z n B r z ( r e d ) ; D D P + 2 + . . Z n i n a d i o x a n e s o l u t i o n o f D M P B 0 . 5 e q u i v Z n B r z + 0 . 5 e q u i v S - C H E A D M P B + 0 . 5 e q u i v Z n ( C I O 4 ) 2 ( r e d ) ; D M P B + s p e c t r u m . A r e d s h i f t i n g o f 1 6 n m a n d 4 4 0 - 5 e q u i v Z n ( C I O 4 ) 2 + 0 . 5 e q u i v S - C H E A n m f r o m t h e i r o r i g i n a l a b s o r p t i o n s ( 2 6 4 ( m a g e n t a ) n m a n d 2 8 6 n m , r e s p e c t i v e l y ) i s o b s e r v e d f o r b o t h D M P B p e a k s . T h i s s p e c t r u m , m a i n t a i n e d e v e n a f t e r t h e a d d i t i o n o f t h e c h i r a l a m i n e , i s i n d i c a t i v e o f m e t a l c o m p l e x a t i o n . H o w e v e r , s i m i l a r t o D D P , n o C D p e a k w a s d e t e c t e d , s u g g e s t i n g t h a t n o c h i r a l h e l i c a t e w a s f o r m e d . I n b o t h c a s e s , t h e s p e c t r a w e r e f o l l o w e d o v e r t i m e b u t n o s i g n i fi c a n t c h a n g e o c c u r r e d . P r e l i m i n a r y N M R s t u d i e s s u p p o r t e d t h e l i g a n d - m e t a l c o m p l e x f o r m a t i o n , b u t t h e s t u d y w a s n o t c o m p l e t e d . T h e f a c t t h a t n o c h i r a l s p e c i e s i s o b s e r v e d i n t h e C D 3 2 5 s p e c t r u m c o u l d b e d u e t o d i f f e r e n t f a c t o r s . I t i s p o s s i b l e t h a t a f t e r t h e p y r i d i n e - m e t a l c o m p l e x i s f o r m e d t h e c o o r d i n a t i o n o f t h e a m i n e n e v e r o c c u r s . A l s o , t h e p r e s e n c e o f t h e a m i n e c o u l d c a u s e t h e d i s s o c i a t i o n o f t h e p y r i d i n e - m e t a l c o m p l e x , s i m i l a r t o w h a t w a s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d f o r t h e d i p y r r o m e t h e n e s . H o w e v e r , e v e n i f t h e a m i n e i s c o o r d i n a t i n g t h e w a y i t w a s a n t i c i p a t e d , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e g e o m e t r y a r o u n d t h e m e t a l d o e s n o t a l l o w f o r t h e f o r m a t i o n o f a c h i r a l h e l i c a t e . A l t h o u g h a s o f y e t n o p o s i t i v e r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d f o r t h e b i s p y r i d i n e s y s t e m s , c o n s i d e r i n g t h e l i m i t e d t i m e a n d e f f o r t s p e n t o n t h e m m o r e w o r k i s i n o r d e r . I n s p e c i f i c , a d e t a i l e d s t u d y o f t h e c o m p l e x a t i o n f o r e a c h s y s t e m , i n d i f f e r e n t s o l v e n t s , i n t h e p r e s e n c e o f d i f f e r e n t Z n s o u r c e s s h o u l d b e p e r f o r m e d . I n a d d i t i o n , a l t e r n a t e m e t a l s , l i k e C u 2 + , w h i c h i s p r e s e n t i n t h e m a j o r i t y o f t h e b i p y r i d i n e c o m p l e x e s , s h o u l d b e t r i e d o u t . 6 . 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s A . S y n t h e s i s o f C o m p o u n d s 1 . S y n t h e s i s o f ( 7 ) O “ O H O M e 0 0 5 6 A m i x t u r e o f f r e s h l y d i s t i l l e d a n i s a l d e h y d e 5 ( 9 . 9 g , 7 3 m o l , 2 e q u i v ) , b u t a n e - 2 , 3 - d i o n e 6 ( 3 . 1 g , 3 6 m m o l , 1 e q u i v ) a n d p i p e r i d i n e ( 0 . 3 4 g , 4 m m o l , 0 . 0 5 e q u i v ) i n a b s o l u t e 3 2 6 e t h a n o l ( 1 5 m L ) w a s h e a t e d o v e r s t e m b a t h f o r 2 h , u n d e r n i t r o g e n . A f t e r t h e f i r s t 5 m i n t h e l i g h t y e l l o w c o l o r t u r n e d d a r k b r o w n a n d r e m a i n e d s o . A f t e r 2 h , t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o s t a n d a t 4 ° C o v e r n i g h t d u r i n g w h i c h y e l l o w / o r a n g e c r y s t a l s o f d i k e t o n e 7 w e r e f o r m e d . T h e p r o d u c t w a s w a s h e d t w i c e w i t h e t h a n o l a n d c o l d m e t h a n o l a n d p l a c e d u n d e r v a c u u m f o r 4 h t o y i e l d p u r e 7 ( 1 0 % ) . I H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l ; ) 5 3 . 8 9 ( s , 3 H ) , 6 . 7 5 ( d , 1 H ) , 7 . 3 5 ( d , 1 H ) , 7 . 6 5 ( d , 1 H ) , 7 . 8 3 ( d , 1 H ) . 2 . S y n t h e s i s o f ( 9 ) O O / / U \ / C ' M N _ \ 8 9 C 1 9 C h l o r o a c e t o n e 8 ( 9 . 3 g , 1 0 0 m o l , 1 e q u i v ) a n d p y r i d i n e ( 7 . 9 g , 1 0 0 m m o l , 1 e q u i v ) w e r e d i s s o l v e d i n h e x a n e s ( 1 5 m L ) a n d s t i r r e d a t r t . A f t e r o n l y f e w m i n u t e s w h i t e c r y s t a l s a p p e a r e d . A f t e r o v e r n i g h t h e a t i n g a t 6 0 ° C t h e p r e c i p i t a t e w a s fi l t e r e d o f f a n d w a s h e d w i t h h e x a n e . A y e l l o w i s h p o w d e r o f p y r i d i n i u m s a l t 9 w a s i s o l a t e d ( 7 9 % ) . l H N M R ( 3 0 0 M H z , C D 3 O D ) 6 2 . 4 ( 5 , 3 H ) , 5 . 7 8 ( s , 2 H ) , 8 . 1 9 ( t , 2 H ) , 8 . 7 1 ( t , 1 H ) , 8 . 8 1 ( d , 2 H ) . 3 . S y n t h e s i s o f ( 3 ) 8 3 M e O O M e A c e t o n y l p y r i d i n i u m c h l o r i d e 5 ( 0 . 3 g , 1 m m o l , 1 e q u i v ) , d i o n e 7 ( 0 . 3 4 g , 2 m o ] , 2 e q u i v ) a n d a m m o n i u m a c e t a t e ( 1 g , 1 3 m m o l , 1 3 e q u i v ) a r e r e f l u x e d i n m e t h a n o l ( 6 m L ) , u n d e r N 2 . A f t e r t h e f i r s t 3 0 m i n t h e o r i g i n a l y e l l o w / o r a n g e m i x t u r e t u r n e d 3 2 7 r e d d i s h / b r o w n . F i n e , c r e a m c o l o r e d c r y s t a l s w e r e f o r m e d a n d a f t e r 4 h t h e y w e r e fi l t e r e d a n d w a s h e d t w i c e w i t h m e t h a n o l . B i p y r i d i n e l i g a n d 3 w a s c o l l e c t e d ( 2 5 % ) . 1 H N M R ( 3 0 0 M I - I z , C D C 1 3 ) 5 2 . 6 7 ( s , 3 H ) , 3 . 8 6 ( s , 3 H ) , 7 . 0 0 ( d , 4 H ) , 7 . 3 4 ( d , 2 H ) , 7 . 7 ( d , 4 H ) , 8 . 4 ( d , 2 H ) ] B C o m p l e x a t i o n A t t e m p t s 1 . G e n e r a l R e m a r k s C D s p e c t r a w e r e r e c o r d e d w i t h a J A S C O 8 1 0 i n s t r u m e n t . U V - v i s s p e c t r a w e r e r e c o r d e d w i t h a L a m b d a 4 0 , P e r k i n E l m e r i n s t r u m e n t , C h i r a l a m i n e s w e r e p u r c h a s e d f r o m A l d r i c h C h e m i c a l C o . a n d u s e d a s r e c e i v e d . 2 . D e p r o t o n a t i o n o f D E M P / D T M P D E M P H B r o r D T M P H B r ( d a r k b r o w n s o l i d s ) w e r e d i s s o l v e d i n M e O H a n d e x c e s s o f s o l i d N a z C O 3 w a s a d d e d . T h e s o l u t i o n w a s m i x e d f o r 3 0 m i n a f t e r w h e n t h e b a s e w a s fi l t e r e d o f f a n d t h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d . F r e e b a s e D E M P w a s i s o l a t e d a s a d a r k o r a n g e p o w d e r a n d s t o r e d u n d e r n i t r o g e n a t m o s p h e r e . 3 . D E M P C o m p l e x a t i o n a t t e m p t s U n l e s s o t h e r w i s e n o t e d , a l l c o m p l e x a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t b y a d d i t i o n o f s o l i d Z n - s a l t ( m o s t l y Z n ( C l O 4 ) 2 6 H z O ) t o a c o n c e n t r a t e d s o l u t i o n o f D E M P ( o r D T M P ) i n C H C l 3 3 2 8 o r b e n z e n e . T h e h e t e r o g e n e o u s m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r l - 2 h , u n t i l a l l t h e c r y s t a l l i n e Z n - s a l t h a d d i s o l v e d T h e c h i r a l a m i n e w a s t h e n a d d e d d i r e c t l y i n t o t h i s s o l u t i o n , w i t h o u t h a v i n g b e e n d i s s o l v e d i n t o a n y s o l v e n t , r e s u l t i n g i n a n i n s i g n i fi c a n t c h a n g e o f t h e o v e r a l l c o n c e n t r a t i o n . 4 . C r y s t a l l i z a t i o n a t t e m p t s o f D E M P H B r - Z a n A w a r m s o l u t i o n o f Z n C l z ( F W = 1 3 6 . 2 8 , 1 5 . 7 m g ) i n w a t e r ( 1 m L ) a n d a w a r m s o l u t i o n o f C H 3 C O O N a ( e x c e s s ) i n w a t e r ( l m L ) w e r e a d d e d t o a b o i l i n g s o l u t i o n o f D E M P H B r ( F W = 3 3 8 , 8 9 m g , 2 e q u i v ) i n E t O H ( 2 m L ) . T h e o r a n g e / r e d s o l u t i o n o f D E M P H B r b e c a m e g r e e n u p o n a d d i t i o n o f Z a n a n d c r y s t a l s s t a r t e d f o r m i n g . T h e m i x t u r e w a s k e p t o v e r s t e a m f o r 2 m i n . C o l l e c t i o n a n d r e c r y s t a l l i z a t i o n f r o m E t O H a f f o r d e d g r e e n c r y s t a l s , n o t o f X - r a y q u a l i t y . A s i m i l a r p r o c e d u r e w i t h Z n ( C l O 4 ) 2 a s t h e z i n c s o u r c e a l s o a f f o r d e d g r e e n c r y s t a l s . 5 . E x p e r i m e n t s i n B e n z e n e D E M P ( 1 5 m g ) w a s d i s s o l v e d i n s p e c t r o p h o t o m e t r i c g r a d e b e n z e n e ( 1 0 m L ) . S o l i d Z n ( C l O 4 ) 2 6 H z O ( 1 1 m g , 0 . 5 e q u i v ) w a s a d d e d a n d t h e h e t e r o g e n o u s s o l u t i o n w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r a t l e a s t 3 h . [ Z n ( C l O 4 ) 4 d i d n o t d i s s o l v e i n b e n z e n e . T h e s o l u t i o n w a s s t i r r e d u n t i l t h e c o m p l e x a t i o n w i t h D E M P i s c o m p l e t e a n d n o s o l i d Z n s a l t i s p r e s e n t ] . T h i s s o l u t i o n w a s u s e d a s a s t o c k a n d r e m a i n s g o o d f o r a t l e a s t a w e e k . 3 2 9 P a r t o f t h e a b o v e s o l u t i o n ( 5 0 ( L L ) w a s d i l u t e d w i t h b e n z e n e ( 5 m L , f i n a l c o n c e n t r a t i o n ~ 6 1 0 ' 5 M o f t h e p r e f o r m e d c o m p l e x ) . I n t h i s s o l u t i o n c h i r a l a m i n e w a s a d d e d ( 0 . 5 e q u i v a s r e f e r r e d t o t h e i n i t i a l D E M P a m o u n t . A l l a m i n e s , a s p u r c h a s e d , w e r e l i q u i d s s o a f e w u L o f e a c h w e r e r e q u i r e d t o a c h i e v e a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f ~ 3 0 1 1 M ) . T h e s e s o l u t i o n s w e r e u s e d t o r e c o r d t h e C D s p e c t r a . 6 . C D C o n d i t i o n s B a n d w i d t h : 5 n m R e s p o n s e : l s e c S e n s i t i v i t y : S t a n d a r d M e a s u r e m e n t r a n g e : 6 0 0 - 4 5 0 n m D a t a p i t c h : 0 . 1 n m S c a n n i n g s p e e d : 1 0 0 n m / m i n A c c u m u l a t i o n : 4 T e m p e r a t u r e : R o o m T e m p e r a t u r e A l l C D s p e c t r a o f t h e ( D E M P ) 2 Z n — c h i r a l a m i n e c o m p l e x e s w e r e r e c o r d e d u s i n g a 1 c m c e l l . 3 3 0 6 . 5 R e f e r e n c e s 1 0 . 1 1 . D . P h i l p , J . F . S t o d d a r t " S e l f - a s s e m b l y i n n a t u r a l a n d u n n a t u r a l s y s t e m s " A n g e w . C h e m - I n t . E d i t . E n g l . 1 9 9 6 , 3 5 , 1 1 5 5 - 1 1 9 6 . J . M . L e h n , S u p r a m o l e c u l a r C h e m i s t r y C o n c e p t s a n d P e r s p e c t i v e s , V C H , W e i n h e i m , 1 9 9 5 . B . D i e t r i c h , P . V i o u t , J . M . L e h n , M a c r o c y c l i c C h e m i s t r y : A s p e c t s o f O r g a n i c a n d I n o r g a n i c S u p r a m o l e c u l a r C h e m i s t r y , V C H , W e i h e i m , 1 9 9 3 . A . L . B a l c h , M . M a z z a n t i , B . C . N o l l , M . M . O l m s t e a d " C o o r d i n a t i o n P a t t e r n s f o r B i l i v e r d i n - T y p e L i g a n d s - H e l i c a l a n d L i n k e d H e l i c a l U n i t s i n 4 - C o o r d i n a t e C o b a l t a n d S - C o o r d i n a t e M a n g a n e s e ( I i i ) C o m p l e x e s o f O c t a e t h y l b i l i n d i o n e " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 4 , 1 1 6 , 9 1 1 4 - 9 1 2 2 . R . D . S o m m e r , A . L . R h e i n g o l d , A . J . G o s h e , B . B o s n i c h " S u p r a m o l e c u l a r c h e m i s t r y : M o l e c u l a r r e c o g n i t i o n a n d s e l f - a s s e m b l y u s i n g r i g i d s p a c e r - c h e l a t o r s b e a r i n g c o f a c i a l t e r p y r i d y l P a l l a d i u m ( I I ) c o m p l e x e s s e p a r a t e d b y 7 A " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 1 , 1 2 3 , 3 9 4 0 - 3 9 5 2 . S . G . T e l f e r , N . T a j i m a , R . K u r o d a , M . C a n t u e l , C . P i g u e t " C D s p e c t r a o f d - f h e t e r o b i m e t a l l i c h e l i c a t e s w i t h s e g m e n t a l d i - i m i n e l i g a n d s " I n o r g . C h e m . 2 0 0 4 , 4 3 , 5 3 0 2 - 5 3 1 0 . S . G . T e l f e r , N . T a j i m a , R . K u r o d a " C D s p e c t r a o f p o l y n u c l e a r c o m p l e x e s o f d i i m i n e l i g a n d s : T h e o r e t i c a l a n d e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e f o r t h e i m p o r t a n c e o f i n t e r n u c l e a r e x c i t o n c o u p l i n g " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 4 , 1 2 6 , 1 4 0 8 - 1 4 1 8 . B . H a s e n k n o p f , J . M . L e h n " T r i n u c l e a r d o u b l e h e l i c a t e s o f i r o n ( I I ) a n d n i c k e l ( H ) : S e l f - a s s e m b l y a n d r e s o l u t i o n i n t o h e l i c a l e n a n t i o m e r s " H e l v . C h i m . A c t a 1 9 9 6 , 7 9 , 1 6 4 3 - 1 6 5 0 . B . H a s e n k n o p f , J . H a l l , J . M . L e h n , V . B a l z a n i , A . C r e d i , S . C a m p a g n a " L i n e a r t r i s - t e r p y r i d i n e s a n d t h e i r t r i n u c l e a r R u ( I I ) c o m p l e x e s : S y n t h e s i s , a b s o r p t i o n s p e c t r a , a n d e x c i t e d s t a t e p r o p e r t i e s " N e w J . C h e m . 1 9 9 6 , 2 0 , 7 2 5 - 7 3 0 . B . H a s e n k n o p f , J . M . L e h n , B . O . K n e i s e l , G . B a u m , D . F e n s k e " S e l f - a s s e m b l y o f a c i r c u l a r d o u b l e h e l i c a t e " A n g e w . C h e m . - I n t . E d i t . E n g ] . 1 9 9 6 , 3 5 , 1 8 3 8 - 1 8 4 0 . B . H a s e n k n o p f , J . M . L e h n , G . B a u m , D . F e n s k e " S e l f - a s s e m b l y o f a h e t e r o d u p l e x h e l i c a t e f r o m t w o d i f f e r e n t l i g a n d s t r a n d s a n d C u ( H ) c a t i o n s " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 6 , 9 3 , 1 3 9 7 - 1 4 0 0 . 3 3 1 1 2 . l 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . B . H a s e n k n o p f , J . M . L e h n , N . B o u m e d i e n e , A . D u p o n t G e r v a i s , A . V a n D o r s s e l a e r , B . K n e i s e l , D . F e n s k e " S e l f - a s s e m b l y o f t e t r a - a n d h e x a n u c l e a r c i r c u l a r h e l i c a t e s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 7 , 1 1 9 , 1 0 9 5 6 - 1 0 9 6 2 . B . H a s e n k n o p f , J . M . L e h n , N . B o u m e d i e n e , E . L e i z e , A . V a n D o r s s e l a e r " K i n e t i c a n d t h e r m o d y n a m i c c o n t r o l i n s e l f - a s s e m b l y : S e q u e n t i a l f o r m a t i o n o f l i n e a r a n d c i r c u l a r h e l i c a t e s " A n g e w . C h e m . - I n t . E d i t . 1 9 9 8 , 3 7 , 3 2 6 5 - 3 2 6 8 . C . P i g u e t , G . B e m a r d i n e l l i , G . H o p f g a r t n e r " H e l i c a t e s a s v e r s a t i l e s u p r a m o l e c u l a r c o m p l e x e s " C h e m . R e v . 1 9 9 7 , 9 7 , 2 0 0 5 - 2 0 6 2 . B . B o c q u e t , G . B e m a r d i n e l l i , N . O u a l i , S . F l o q u e t , F . R e n a u d , G . H o p f g a r t n e r , C . P i g u e t " T h e f i r s t s e l f - a s s e m b l e d t r i m e t a l l i c l a n t h a n i d e h e l i c a t e : d i f f e r e n t c o o r d i n a t i o n s i t e s i n s y m m e t r i c a l m o l e c u l a r a r c h i t e c t u r e s " C h e m . C o m m u n . 2 0 0 2 , 9 3 0 - 9 3 1 . P . N . W . B a x t e r , J . M . L e h n , J . F i s c h e r , M . T . Y o u i n o u " S e l f - A s s e m b l y a n d S t r u c t u r e o f a 3 x 3 I n o r g a n i c G r i d f r o m 9 S i l v e r I o n s a n d 6 L i g a n d C o m p o n e n t s " A n g e w . C h e m . - I n t . E d i t . E n g l . 1 9 9 4 , 3 3 , 2 2 8 4 - 2 2 8 7 . M . F u j i t a , S . Y . Y u , T . K u s u k a w a , H . F u n a k i , K . O g u r a , K . Y a m a g u c h i " S e l f - a s s e m b l y o f n a n o m e t e r - s i z e d m a c r o t r i c y c l i c c o m p l e x e s f r o m t e n s m a l l c o m p o n e n t m o l e c u l e s " A n g e w . C h e m . - I n t . E d i t . 1 9 9 8 , 3 7 , 2 0 8 2 - 2 0 8 5 . Y . J . Z h a n g , A . T h o m p s o n , S . J . R e t t i g , D . D o l p h i n " T h e u s e o f d i p y r r o m e t h e n e l i g a n d s i n s u p r a m o l e c u l a r c h e m i s t r y " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 8 , 1 2 0 , 1 3 5 3 7 - 1 3 5 3 8 . A . T h o m p s o n , S . J . R e t t i g , D . D o l p h i n " S e l f - a s s e m b l y o f n o v e l t r i m e r s u s i n g d i p y r r o m e t h e n e l i g a n d s " C h e m . C o m m u n . 1 9 9 9 , 6 3 1 - 6 3 2 . T . M i z u t a n i , S . Y a g i , A . H o n m a r u , H . O g o s h i " I n t e r c o n v e r s i o n b e t w e e n p o i n t c h i r a l i t y a n d h e l i c a l c h i r a l i t y d r i v e n b y s h a p e - s e n s i t i v e i n t e r a c t i o n s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 6 , 1 1 8 , 5 3 1 8 - 5 3 1 9 . X . F . H u a n g , B . B o r h a n , N . B e r o v a , K . N a k a n i s h i " U V - v i s s p e c t r a l c h a n g e s i n t h e b i n d i n g o f a c y c l i c d i a m i n e s w i t h a z i n c p o r p h y r i n t w e e z e r " J . I n d i a n C h e m . S o c . 1 9 9 8 , 7 5 , 7 2 5 - 7 2 8 . T . H e y d e , L . R . N a s s i m b e n i " R e a c t i o n P a t h w a y s f r o m S t r u c t u r a l D a t a - D y n a m i c S t e r e o c h e m i s t r y o f Z i n c ( I i ) C o m p o u n d s " A c t a C r y s t a l l o g r . S e c t . B - S t r u c t . C o m m u n . 1 9 8 4 , 4 0 , 5 8 2 - 5 9 0 . H . V a h r e n k a m p " T r a n s i t i o n s , t r a n s i t i o n s t a t e s , t r a n s i t i o n s t a t e a n a l o g u e s : Z i n c p y r a z o l y l b o r a t e c h e m i s t r y r e l a t e d t o z i n c e n z y m e s " A c c o u n t s C h e m . R e s . 1 9 9 9 , 3 2 , 5 8 9 - 5 9 6 . E . M . L a r s e n , T r a n s i t i o n E l e m e n t s , W . A . B e n a m i n , I n c . , 1 9 6 5 . 3 3 2 2 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . T . B a l a s u b r a m a n i a n , J . S . L i n d s e y " S y n t h e s i s o f b e t a - s u b s t i t u t e d p o r p h y r i n b u i l d i n g b l o c k s a n d c o n v e r s i o n t o d i p h e n y l e t h y n e - l i n k e d p o r p h y r i n d i m e r s " T e t r a h e d r o n 1 9 9 9 , 5 5 , 6 7 7 1 - 6 7 8 4 . M . B . B e r e z i n , A . S . S e m e i k i n , E . V . A n t i n a , N . A . P a s h a n o v a , N . S . L e b e d e v a , G . B . B u k u s h i n a " S y n t h e s i s a n d p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f h y d r o b r o m i d e s o f a l k y l - s u b s t i t u t e d d i p y r r o l y l m e t h e n e s " R u s s . J . G e n . C h e m . 1 9 9 9 , 6 9 , 1 9 4 9 - 1 9 5 5 . A . W . J o h n s o n , I . T . K a y , E . M a r k h a m , R . P r i c e , K . B . S h a w " C o l o r i n g m a t t e r s d e r i v e d f r o m p y r r o l e s . H . I m p r o v e d s y n t h e s e s o f s o m e d i p y r r o m e t h e n e s a n d p o r p h y r i n s " J . C h e m . S o c , A b s 1 9 5 9 , 3 4 1 6 - 3 4 2 4 . G . M . B a d g e r , R . L . H a r r i s , R . A . J o n e s , J . M . S a s s e " P o r p h y r i n s . I . I n t r a m o l e c u l a r h y d r o g e n b o n d i n g i n p y r r o m e t h e n e s a n d p o r p h y r i n s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 6 2 , 4 3 2 9 - 4 3 3 7 . R . W . G u y , R . A . J o n e " P y r r o l e s t u d i e s . I V . E l e c t r o n i c s p e c t r a o f a l k y l - a n d e t h o x y c a r b o n y l d i p y r r o m e t h e n e s " A u s . J . C h e m . 1 9 6 5 , 1 8 , 3 6 3 - 3 7 1 . A . J . C a s t r o , J . P . M a r s h , B . T . N a k a t a " H y d r o g e n b o n d i n g i n p u ] y r r y l m e t h e n e s " J . O r g . C h e m . 1 9 6 3 , 2 8 , 1 9 4 3 - 1 9 4 5 . G . S t r u c k m e i e r , U . T h e w a l t , J . H . F u h r h o p " S t r u c t u r e s o f Z i n c O c t a e t h y l F o r r n y l b i l i v e r d i n a t e H y d r a t e a n d I t s D e h y d r a t e d B i s - H e l i c a l D i m e r " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 6 , 9 8 , 2 7 8 - 2 7 9 . H . F a l k , N . M u l l e r " F o r c e - F i e l d C a l c u l a t i o n s o n L i n e a r P o l y p y r r o l e S y s t e m s " T e t r a h e d r o n 1 9 8 3 , 3 9 , 1 8 7 5 - 1 8 8 5 . J . A . P a r d o e n , J . L u g t e n b u r g , G . W . C a n t e r s " O p t i c a l - P r o p e r t i e s o f P y r r o m e t h e n e D e r i v a t i v e s - P o s s i b l e E x c i t e d - S t a t e D e a c t i v a t i o n t h r o u g h P r o t o n T u n n e l i n g " J . P h y s . C h e m . 1 9 8 5 , 8 9 , 4 2 7 2 - 4 2 7 7 . S . E . B r a s l a v s k y , A . R . H o l z w a r t h , K . S c h a f f n e r " S o l u t i o n C o n f o r m a t i o n s , P h o t o p h y s i c s , a n d P h o t o c h e m i s t r y o f B i l e - P i g m e n t s - B i l i r u b i n a n d B i l i v e r d i n D i m e t h y l E s t e r s a n d R e l a t e d L i n e a r T e t r a p y r r o l e s " A n g e w . C h e m - I n t . E d i t . E n g l . 1 9 8 3 , 2 2 , 6 5 6 - 6 7 4 . W . S . S h e l d r i c k , A . B o r k e n s t e i n , G . S t r u c k m e i e r , J . E n g e l " 5 , 5 ' - D i e t h o x y c a r b o n y l - 3 , 3 ' - D i e t h y l - 4 , 4 ' - D i m e t h y l - 2 , 2 ' - P y r r o m e t h e n e " A c t a C r y s t a l l o g r . S e c t . B - S t r u c t . C o m m u n . 1 9 7 8 , 3 4 , 3 2 9 - 3 3 2 . W . B e c k e r , W . S . S h e l d r i c k , J . E n g e l " 5 , 5 ' - D i b r o m o - 3 , 3 ' - D i e t h y l - 4 , 4 ' — D i m e t h y l - 2 , 2 ' - P y r r o m e t h e n e H y d r o b r o m i d e " A c t a C r y s t a l l o g r . S e c t . B - S t r u c t . C o m m u n . 1 9 7 8 , 3 4 , 1 0 2 1 - 1 0 2 4 . 3 3 3 3 7 . 3 8 . 3 9 . 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . 4 8 . n O E e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d w i t h b o t h s y s t e m s ( D E M P a n d D T M P ) i n C D C l 3 M . E l d e r , B . R . P e n f o l d " C r y s t a l s t r u c t u r e o f b i s ( d i p y r r o m e t h e n e ) c o p p e r ( 1 1 ) " J . C h e m . S o c . ( A ) 1 9 6 9 , 2 5 5 6 - 2 5 5 9 . J . F e r g u s o n , B . 0 . W e s t " T h e p r o p e r t i e s o f T r a n s i t i o n - m e t a l C o m p l e x e s o f D i p y r r o m e t h e n e s . P a r t I . T h e S p e c t r a a n d M a g n e t i c M o m e n t s o f S o m e N i c k e l ( I I ) C o m p l e x e s " J . C h e m . S o c . ( A ) 1 9 6 6 , 1 5 6 5 - 1 5 6 8 . J . E . F e r g u s s o n , C . A . R a m s a y " D i p y r r o m e t h e n e c o m p l e x e s o f t r a n s i t i o n m e t a l s . 1 . T e t r a h e d r a l c o m p l e x e s o f c o b a l t ( I I ) , n i c k e 1 ( I I ) , c o p p e r ( I I ) , a n d Z i n c ( H ) " J . C h e m . S o c . 1 9 6 5 , 5 2 2 2 - 5 2 2 5 . Y . M u r a k a m i , K . S a k a t a " T r a n s i t i o n - m e t a l C o m p l e x e s o f P y r r o l e P i g m e n t s . 1 . E l e c t r o n i c a n d V i b r a t i o n a l S p e c t r a o f C o b a l t ( 1 1 ) , N i c k e l ( I I ) a n d C o p p e r ( I I ) C o m p l e x e s o f S o m e D i p y r r o m e t h e n e s " I n . C h i m . A c t a 1 9 6 8 , 2 , 2 7 3 - 2 7 9 . Y . M u r a k a m i , Y . M a t s u d a , K . S a k a t a " T r a n s i t i o n M e t a l C o m p l e x e s o f P y r r o l e P i g m e n t s . 4 . E l e c t r o n i c a n d V i b r a t i o n a l S p e c t r a o f C o b a 1 t ( I i ) , N i c k e l ( I i ) , a n d C o p p e r ( I i ) C o m p l e x e s o f S o m e S u b s t i t u t e d D i p y r r o m e t h e n e s " I n o r g . C h e m . 1 9 7 1 , 1 0 , 1 7 2 8 - 1 7 3 6 . Y . M u r a k a m i , K . S a k a t a , K . H a r a d a , Y . M a t s u d a " T r a n s i t i o n - M e t a l C o m p l e x e s o f P y r r o l e P i g m e n t s . 1 0 . D i v a l e n t a n d T r i v a l e n t M a n g a n e s e C h e l a t e s o f D i p y r r o m e t h e n e s " B u l l . C h e m . S o c . J p n . 1 9 7 4 , 4 7 , 3 0 2 1 - 3 0 2 4 . Y . M u r a k a m i , K . S a k a t a " T r a n s i t i o n - M e t a l C o m p l e x e s o f P y r r o l e P i g m e n t s . 1 1 . Z i n c ( I I ) C h e l a t e s o f S o m e D i p y r r o m e t h e n e s " B u l l . C h e m . S o c . J p n . 1 9 7 4 , 4 7 , 3 0 2 5 - 3 0 2 8 . S . R . H a l p e r , S . M . C o h e n " S y n t h e s i s , s t r u c t u r e , a n d s p e c t r o s c o p y o f p h e n y l a c e t y l e n y l e n e r o d s i n c o r p o r a t i n g m e s o - s u b s t i t u t e d d i p y r r i n l i g a n d s " C h e m . - E u r . J . 2 0 0 3 , 9 , 4 6 6 1 - 4 6 6 9 . S . R . H a l p e r , M . R . M a l a c h o w s k i , H . M . D e l a n e y , S . M . C o h e n " H e t e r o l e p t i c c o p p e r d i p y r r o m e t h e n e c o m p l e x e s : S y n t h e s i s , s t r u c t u r e , a n d c o o r d i n a t i o n p o l y m e r s " I n o r g . C h e m . 2 0 0 4 , 4 3 , 1 2 4 2 - 1 2 4 9 . C . 1 . . H i l l , M . M . W i l l i a m s o n " I s o l a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e P r i n c i p a l K i n e t i c P r o d u c t i n t h e P r e p a r a t i o n o f a S t e r i c a l l y H i n d e r e d T e t r a - A r y l p o r p h y r i n - X - R a y S t r u c t u r e o f a B i s ( D i p y r r o m e t h e n e ) C o m p l e x o f Z i n c , Z n ( I I ) ( C 2 2 h 1 3 c l 4 n 2 ) 2 . T o l u e n e " J . C h e m . S o c - C h e m . C o m m u n . 1 9 8 5 , 1 2 2 8 - 1 2 2 9 . E . T . C l a r k e , P . J . S q u a t t r i t o , P . R . R u d o l f , R . J . M o t e k a i t i s , A . E . M a r t e l ] , A . C l e a r fi e l d " S t r u c t u r a l I n v e s t i g a t i o n s o f t h e D i p y r r o m e t h e n e C o m p l e x e s o f C a l c i u m ( I i ) , N i c k e l ( I i ) a n d C o p p e r ( I i ) " I n o r g . C h i m . A c t a 1 9 8 9 , 1 6 6 , 2 2 1 - 2 3 1 . 3 3 4 4 9 . 5 0 . 5 1 . 5 2 . 5 3 . 5 4 . 5 5 . 5 6 . 5 7 . 5 8 . N . A . P a s h a n o v a , A . S . S e m e i k i n , M . B . B e r e z i n " T h e r r n o c h e r n i s t r y o f s o l u t i o n o f s o m e p y r r o l y l i d e n e m e t h y l p y r r o l e s a n d t h e i r c o m p l e x e s w i t h c o p p e r ( I I ) a n d Z i n c ( I I ) i n o r g a n i c s o l v e n t s " R u s s . J . G e n . C h e m . 1 9 9 9 , 6 9 , 1 4 7 7 - 1 4 8 0 . R . K . K a r , S . C . B e r a " F l a s h - P h o t o l y s i s o f M e s o p h e n y l - 3 , 4 , 5 , 3 ' , 4 ' , 5 ' - H e x a m e t h y l d i p y r r y l m e t h e n e " J . P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . A - C h e m . 1 9 8 9 , 4 9 , 1 2 1 - 1 3 0 . R . K . K a r , S . C . B e r a " S a l t B a s e E q u i l i b r i u m a n d F l u o r e s c e n c e o f 3 , 4 , 5 , 3 ' , 4 ' , 5 ’ - H e x a r n e t h y l a n d 4 , 4 ' - D i c a r b e t h o x y - 3 , 5 , 3 ' , 5 ' - T e t r a m e t h y l D i p y r r y l m e t h e n e H y d r o c h l o r i d e s i n t h e P r e s e n c e o f T r i e t h y l a m i n e " J . P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . A - C h e m . 1 9 9 1 , 5 6 , 1 9 5 - 2 0 6 . N . A . P a s h a n o v a , M . B . B e r e z i n , E . V . A n t i n a , A . S . S e m e i k i n " T h e r m o d y n a m i c s o f c o m p l e x a t i o n o f c o p p e r ( I I ) a n d z i n c ( I I ) s a l t s w i t h d i p y r r o l y l m e t h e n e s i n n - p r o p a n o l " R u s s . J . C o o r d . C h e m . 1 9 9 9 , 2 5 , 6 5 8 - 6 6 0 . M . B . B e r e z i n , O . M . C h e m o v a , P . A . S h a t u n o v , N . A . P a s h a n o v a , D . B . B e r e z i n , A . S . S e m e i k i n " S p e c t r a l a n d s o l v a t i o n p r o p e r t i e s o f s o m e d i p y r r o m e t h e n e h y d r o b r o m i d e s a n d t h e i r o x a - a n d t h i a - a n a l o g e s " M o l e c u l e s 2 0 0 0 , 5 , 8 0 9 - 8 1 5 . M . B . B e r e z i n , O . M . C h e m o v a , N . A . P a s h a n o v a , D . B . B e r e z i n , A . S . S e m e i k i n " T h e i n fl u e n c e o f f u n c t i o n a l s u b s t i t u t i o n o n t h e e n t h a l p y c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s o l u t i o n o f d i p y r r o l y l m e t h e n e s " R u s s . J . P h y s . C h e m . 2 0 0 1 , 7 5 , 1 2 4 2 - 1 2 4 5 . B . D . B e r e z i n , S . V . R u m y a n t s e v a , M . B . B e r e z i n " K i n e t i c s o f m e t a l e x c h a n g e b e t w e e n c a d m i u m m e s o p o r p h y r i n a n d z i n c a n d c o b a l t s a l t s i n o r g a n i c s o l v e n t s " R u s s . J . C o o r d . C h e m . 2 0 0 4 , 3 0 , 2 9 1 - 2 9 5 . J . G a w r o n s k i , M . B r z o s t o w s k a , K . K a c p r z a k , H . K o l b o n , P . S k o w r o n e k " C h i r a l i t y o f a r o m a t i c b i s - i m i d e s f r o m t h e i r c i r c u l a r d i c h r o i s m s p e c t r a " C h i r a l i t y 2 0 0 0 , 1 2 , 2 6 3 - 2 6 8 . X . F . H u a n g , B . H . R i c k m a n , B . B o r h a n , N . B e r o v a , K . N a k a n i s h i " Z i n c p o r p h y r i n t w e e z e r i n h o s t - g u e s t c o m p l e x a t i o n : D e t e r m i n a t i o n o f a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n s o f d i a m i n e s , a m i n o a c i d s , a n d a m i n o a l c o h o l s b y c i r c u l a r d i c h r o i s m " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 8 , 1 2 0 , 6 1 8 5 - 6 1 8 6 . T . K u r t a n , N . N e s n a s , Y . Q . L i , X . F . H u a n g , K . N a k a n i s h i , N . B e r o v a " C h i r a l r e c o g n i t i o n b y C D - s e n s i t i v e d i m e r i c z i n c p o r p h y r i n h o s t . 1 . C h i r o p t i c a l p r o t o c o l f o r a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n a l a s s i g n m e n t s o f m o n o a l c o h o l s a n d p r i m a r y m o n o a m i n e s " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 1 , 1 2 3 , 5 9 6 2 - 5 9 7 3 . 3 3 5 5 9 . 6 0 . 6 1 . 6 2 . 6 3 . 6 5 . 6 6 . 6 7 . 6 8 . 6 9 . 7 0 . V . V . B o r o v k o v , J . M . L i n t u l u o t o , Y . I n o u e " S u p r a m o l e c u l a r c h i r o g e n e s i s i n b i s ( z i n c p o r p h y r i n ) : A n a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n p r o b e h i g h l y s e n s i t i v e t o g u e s t s t r u c t u r e " O r g . L e t t . 2 0 0 0 , 2 , 1 5 6 5 - 1 5 6 8 . V . V . B o r o v k o v , J . M . L i n t u l u o t o , Y . I n o u e " S u p r a m o l e c u l a r c h i r o g e n e s i s i n z i n c p o r p h y r i n s : M e c h a n i s m , r o l e o f g u e s t s t r u c t u r e , a n d a p p l i c a t i o n f o r t h e a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n d e t e r m i n a t i o n " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 1 , 1 2 3 , 2 9 7 9 - 2 9 8 9 . D . A . L i g h t n e r , D . C . C r a n d a l l " P h o t o o x y g e n a t i o n o f B i l i v e r d i n " T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 7 3 , 9 5 3 - 9 5 6 . R . D . N o n i s , D . A . L i g h t n e r " P h o t o - O x y g e n a t i o n a n d A u t o x i d a t i o n o f D i p y r r y l m e t h e n e s a n d D i p y r r y l m e t h a n e s " J . H e t e r o c y c l . C h e m . 1 9 7 9 , 1 6 , 2 6 3 - 2 7 2 . V . B e r l , I . H u c , R . G . K h o u r y , M . J . K r i s c h e , J . M . L e h n " I n t e r c o n v e r s i o n o f s i n g l e a n d d o u b l e h e l i c e s f o r m e d f r o m s y n t h e t i c m o l e c u l a r s t r a n d s " N a t u r e 2 0 0 0 , 4 0 7 , 7 2 0 - 7 2 3 . V . B e r l , I . H u c , R . G . K h o u r y , J . M . L e h n " H e l i c a l m o l e c u l a r p r o g r a m m i n g : F o l d i n g o f o l i g o p y r i d i n e - d i c a r b o x a m i d e s i n t o m o l e c u l a r s i n g l e h e l i c e s " C h e m . - E u r . J . 2 0 0 1 , 7 , 2 7 9 8 - 2 8 0 9 . V . B e r l , I . H u e , R . G . K h o u r y , J . M . L e h n " H e l i c a l m o l e c u l a r p r o g r a m m i n g : S u p r a m o l e c u l a r d o u b l e h e l i c e s b y d i m e r i z a t i o n o f h e l i c a l o l i g o p y r i d i n e - d i c a r b o x a m i d e s t r a n d s " C h e m - E u r . J . 2 0 0 1 , 7 , 2 8 1 0 - 2 8 2 0 . V . P a t r o n i a k , P . N . W . B a x t e r , J . M . L e h n , M . K u b i c k i , M . N i s s i n e n , K . R i s s a n e n " S e l f - a s s e m b l y a n d c h a r a c t e r i s a t i o n o f g r i d - t y p e i r o n ( I I ) , c o b a l t ( I I ) a n d Z i n c ( I D c o m p l e x e s " E u r . J . I n o r g . C h e m . 2 0 0 3 , 4 0 0 1 - 4 0 0 9 . U . Z i e n e r , E . B r e u n i n g , J . M . L e h n , E . W e g e l i u s , K . R i s s a n e n , G . B a u m , D . F e n s k e , G . V a u g h a n " R e c o g n i t i o n - d i r e c t e d s u p r a m o l e c u l a r a s s e m b l i e s o f m e t a l c o m p l e x e s o f t e r p y r i d i n e d e r i v e d l i g a n d s w i t h s e l f - c o m p l e m e n t a r y h y d r o g e n b o n d i n g s i t e s " C h e m — E u r . J . 2 0 0 0 , 6 , 4 1 3 2 - 4 1 3 9 . N . F a t i n - R o u g e , S . B l a n c , A . P f e i l , A . R i g a u l t , A . M . A l b r e c h t - G a r y , J . M . L e h n " S e l f - a s s e m b l y o f t r i c u p r o u s d o u b l e h e l i c a t e s : T h e r m o d y n a m i c s , k i n e t i c s , a n d m e c h a n i s m " H e l v . C h i m . A c t a 2 0 0 1 , 8 4 , 1 6 9 4 - 1 7 1 1 . M . S h a u l , Y . C o h e n " N o v e l p h e n a n t h r o l i n e - c o n t a i n i n g t r i n u c l e a r d o u b l e - s t r a n d e d h e l i c a t e s : S e l f - r e c o g n i t i o n b e t w e e n h e l i c a t e s w i t h p h e n a n t h r o l i n e a n d b i p y r i d i n e b i n d i n g s i t e s " J . O r g . C h e m . 1 9 9 9 , 6 4 , 9 3 5 8 - 9 3 6 4 . P . D . B e e r , J . W . W h e e l e r , C . P . M o o r e " C o p p e r ( I ) a n d S i l v e r ( I ) H o m o m e t a l l i c C o m p l e x e s o f N e w B i s ( 2 , 2 ' - B i p y r i d i n e ) L i g a n d s " J . C h e m . S o c . D a l t o n 1 9 9 2 , 2 6 6 7 - 2 6 7 3 . 3 3 6 7 1 . 7 2 . 7 3 . 7 4 . 7 5 . 7 6 . 7 7 . 7 8 . 7 9 . 8 0 . 8 1 . J . M . L e h n , A . R i g a u l t " H e l i c a t e s - T e t r a n u c l e a r a n d P e n t a n u c l e a r D o u b l e H e l i x C o m p l e x e s o f C u - I a n d P o l y ( B i p y r i d i n e ) S t r a n d s " A n g e w . C h e m - I n t . E d i t . E n g l . 1 9 8 8 , 2 7 , 1 0 9 5 - 1 0 9 7 . J . M . L e h n , A . R i g a u l t , J . S i e g e l , J . H a r r o w fi e l d , B . C h e v r i e r , D . M o r a s " S p o n t a n e o u s A s s e m b l y o f D o u b l e - S t r a n d e d H e l i c a t e s f r o m O l i g o b i p y r i d i n e L i g a n d s a n d C o p p e r ( I ) C a t i o n s - S t r u c t u r e o f a n I n o r g a n i c D o u b l e H e l i x " P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 8 7 , 8 4 , 2 5 6 5 - 2 5 6 9 . R . S t i l l e r , J . M . L e h n " S y n t h e s i s a n d p r o p e r t i e s o f S i l v e r ( I ) a n d c o p p e r ( I ) h e l i c a t e s w i t h i m i n e - b r i d g e d o l i g o b i p y i d i n e l i g a n d s " E u r . J . I n o r g . C h e m . 1 9 9 8 , 9 7 7 - 9 8 2 . E . C . C o n s t a b l e , C . E . H o u s e c r o f t , M . N e u b u r g e r , I . P o l e s c h a k , M . Z e h n d e r " F u n c t i o n a l i s e d 2 , 2 ' - b i p y r i d i n e l i g a n d s f o r t h e p r e p a r a t i o n o f m e t a l l o s t a r s ; X - r a y s t r u c t u r e s o f f r e e l i g a n d s a n d p r e p a r a t i o n o f c o p p e r ( I ) a n d S i l v e r ( I ) c o m p l e x e s " P o l y h e d r o n 2 0 0 3 , 2 2 , 9 3 - 1 0 8 . B . Z . C h e n , H . F . S l e i m a n " R u t h e n i u m b i p y r i d i n e - c o n t a i n i n g p o l y m e r s a n d b l o c k c o p o l y m e r s v i a r i n g - o p e n i n g m e t a t h e s i s p o l y m e r i z a t i o n " M a c r o m o l e c u l e s 2 0 0 4 , 3 7 , 5 8 6 6 - 5 8 7 2 . P . A . M a g g a r d , A . L . K o p f , C . L . S t e r n , K . R . P o e p p e l m e i e r " P r o b i n g h e l i x f o r m a t i o n i n c h a i n s o f v e r t e x - l i n k e d o c t a h e d r a " C r y s t e n g c o m m 2 0 0 4 , 6 , 4 5 1 - 4 5 7 . P . A . M a g g a r d , A . L . K o p f , C . L . S t e r n , K . R . P o e p p e l m e i e r , K . M . O k , P . S . H a l a s y a m a n i " F r o m l i n e a r i n o r g a n i c c h a i n s t o h e l i c e s : C h i r a l i t y i n t h e M ( p y z ) ( ( H O ) - O - 2 ) ( 2 ) M 0 0 2 F 4 ( M = Z n , C d ) c o m p o u n d s " I n o r g . C h e m . 2 0 0 2 , 4 1 , 4 8 5 2 - 4 8 5 8 . P . A . M a g g a r d , A . L . K o p f , C . L . S t e r n , K . R . P o e p p e l m e i e r " ( 2 , 2 ' - B i p y r i d i n e - k a p p a N - 2 , N ' ) ( d i c h r o m a t o - k a p p a O ) c o p p e r ( I I ) " A c t a C r y s t a l l o g r . C 2 0 0 2 , 5 8 , M 2 0 7 - M 2 0 9 . C . R i c h a r d s o n , S . G . T e l f e r , R . M . H a r t s h o m " 2 - c y c l o p r o p y l g l y c i n a t o b i s ( 2 , 2 ' - b i p y r i d y l ) c o b a l t ( I I I ) d i p e r c h l o r a t e a n d i t s d i h y d r a t e " A u s t . J . C h e m . 2 0 0 2 , 5 5 , 5 3 9 - 5 4 2 . D . A . B a r d w e l l , J . C . J e f f e r y , M . D . W a r d " C o o r d i n a t i o n c h e m i s t r y o f m i x e d p y r i d i n e - p h e n o l l i g a n d s . T h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f [ Z n ( L ( l ) ) ( 2 ) ( B P h ( 2 ) ) ] [ B P h ( 4 ) ] ( H L ( 1 ) = 6 - ( 2 - h y d r o x y p h e n y l ) 2 , 2 ' - b i p y r i d i n e ) , t h e fi r s t e x a m p l e o f a p h e n o l a t e b r i d g e b e t w e e n a t r a n s i t i o n m e t a l a n d b o r o n " I n o r g . C h i m . A c t a 1 9 9 6 , 2 4 1 , 1 2 5 - 1 2 9 . D . G . M a , F . S . L i a n g , L . X . W a n g , S . T . L e e , L . S . H u n g " B l u e o r g a n i c l i g h t - e m i t i n g d e v i c e s w i t h a n o x i d i a z o l e - c o n t a i n i n g e m i t t i n g l a y e r e x h i b i t i n g e x c i t e d 3 3 7 8 2 . 8 3 . s t a t e i n t r a m o l e c u l a r p r o t o n t r a n s f e r ( v o l 3 5 8 , p g 2 4 , 2 0 0 2 ) " C h e m . P h y s . L e t t . 2 0 0 2 , 3 6 4 , 6 4 3 - 6 4 3 . A . R o d g e r , B . N o r d e n , C i r c u l a r D I c h r o i s m & L i n e a r D i c h r o i s m , O x f o r d C h e m i s t r y M a s t e r s , 1 9 9 7 . V . M . M u k k a l a , J . J . K a n k a r e " N e w 2 , 2 ' - B i p y r i d i n e D e r i v a t i v e s a n d T h e i r L u m i n e s c e n c e P r o p e r t i e s w i t h E u r o p i u m ( I i i ) a n d T e r b i u m ( 1 i i ) I o n s " H e l v . C h i m . A c t a 1 9 9 2 , 7 5 , 1 5 7 8 - 1 5 9 2 . 3 3 8 o n t h e n a t u r e o f t h e m e t a l q u y ( C o ) \ I o n ( C o ) \ C h a p t e r 7 P s e u d o c a g e s a s h o s t s f o r c h i r a l d i s c r i m i n a t i o n 7 . 1 I n t r o d u c t i o n t o P s e u d o - c a g e d c o m p o u n d s O u r a p p r o a c h t o p s e u d o - c a g e d s y s t e m s a s h o s t s f o r a b s o l u t e s t e r e o c h e m i c a l d e t e r m i n a t i o n o f c h i r a l c o m p o u n d s w i t h o n e s i t e o f a t t a c h m e n t i s m a i n l y f o c u s e d o n C 3 - N H 2 0 0 H 2 N X : C o r N F i g u r e 7 - 1 : S u g g e s t e d p s e u d o - c a g e t r i p o d a l s t r u c t u r e s N ‘ { w E x fi x ” s y m m e t r i c m o l e c u l e s l i k e t h o s e s h o w n i n F i g u r e 7 - 1 . T h e c o m m o n f e a t u r e o f t h e s e s t r u c t u r e s i s t h e p r e s e n c e o f t h r e e c h r o m o p h o r i c a r m s b e a r i n g a h e t e r o a t o m t h a t c a n c o o r d i n a t e t o a m e t a l c e n t e r . U p o n c o m p l e x a t i o n , t h e s e t r i p o d a l s t r u c t u r e s a r e e x p e c t e d t o f o r m o n e o f t h e c o n f o r m a t i o n s d e p i c t e d i n F i g u r e 7 - 2 . D e p e n d i n g a s w e l l a s t h e n u m b e r o f F i g u r e 7 - 2 : P o s s i b l e c o n f o r m a t i o n s o f h o s t - m e t a l c o m p l e x e s c o o r d i n a t i o n s i t e s o n t h e c h r o m o p h o r e w e c a n h a v e a t r i g o n a l b i p y r a m i d a l ( C 3 ) , s q u a r e p y r a m i d a l ( C o ) o r a n o c t a h e d r a l ( C o ) g e o m e t r y . 3 3 9 T h e t r i g o n a l b i p y r a m i d a l c o m p l e x ( C 3 ) c o u l d b e c o n s i d e r e d a p r o - c h i r a l m o l e c u l e . I f X i s a n a c h i r a l l i g a n d , t h i s c o m p l e x e x i s t s i n e q u i l i b r i u m b e t w e e n t w o d i f f e r e n t e n a n t i o m e r i c p r o p e l l e r - l i k e c o n f o r m a t i o n s a s a r a c e m i c m i x t u r e . O n t h e o t h e r h a n d , i f X i s a c h i r a l m o l e c u l e , t h e c o m p l e x c a n p r e f e r e n t i a l l y a d o p t o n e o f t h e t w o p o s s i b l e p r o p e l l e r - t y p e a r r a n g e m e n t s d e p e n d i n g o n t h e a b s o l u t e s t e r e o c h e m i s t r y o f X . F i g u r e 7 - 3 i l l u s t r a t e s t h e c h i r a l h e l i c a l c o n f o r m a t i o n s e x p e c t e d u p o n c o o r d i n a t i o n o f a c h i r a l a m i n e t o t h e t r i p o d a l — m e t a l c o m p l e x . D e p e n d i n g o n t h e p r e s e n c e o f a n R o r S - c h i r a l a m i n e t h e a r o m a t i c r i n g s c a n o r i e n t i n a c h i r a l f a s h i o n y i e l d i n g e i t h e r a A ( c o u n t e r c l o c k w i s e ) o r a A ( c l o c k w i s e ) p r o p e l l e r . T h e t h r o u g h s p a c e i n t e r a c t i o n o f t h e c h r o m o p h o r e s c o u l d t h e n l e a d t o a n o b s e r v a b l e E C C D s p e c t r u m . T h u s , t h e a s y m m e t r y o f t h e b o u n d c h i r a l c o m p o u n d l e a d s t o a d i a s t e r e o m e r i c d i f f e r e n t i a t i o n w h i c h s h o u l d b e o b s e r v a b l e v i a s p e c t r o s c o p y . S i m i l a r t r i p o d a l s t r u c t u r e s h a v e b e e n p r e v i o u s l y r e p o r t e d a n d t h e i r X - r a y s t r u c t u r e s c o m p l e x e d w i t h C u 2 + h a v e b e e n s o l v e d . " 2 A l s o , C a n a r y a n d c o w o r k e r s h a v e s h o w n t h a t a n a n a l o g o u s s t r u c t u r e w h i c h h a s c h i r a l i t y i n c o r p o r a t e d i n o n e o f t h e t h r e e a r m s , d o e s i n f a c t i n d u c e c h i r a l i t y w i t h i n t h e p r o p e l l e r s y s t e m . 3 ' 8 C o m p l e x e s o f s e v e r a l o t h e r C 3 s y m m e t r i c m o l e c u l e s w i t h a v a r i e t y o f t r a n s i t i o n m e t a l s h a v e b e e n r e p e a t e d l y r e p o r t e d . “ " 1 5 S o m e o f t h e m , b e a r a c h i r a l c e n t e r a s p a r t o f t h e t r i d e n t a t e l i g a n d , a n d t h e s e o p t i c a l l y a c t i v e f o r m s h a v e b e e n u s e d a s a u x i l i a r i e s f o r m e t a l - p r o m o t e d e n a n t i o s e l e c t i v e r e a c t i o n s . ” 1 9 I n a r e c e n t r e v i e w , t h e r o l e o f C 3 s y m m e t r y i n a s y m m e t r i c c a t a l y s i s a n d c h i r a l r e c o g n i t i o n 2 0 a s w e l l a s c r y s t a l e n g i n e e r i n g 2 1 h a s b e e n h i g h l i g h t e d . H o w e v e r , s o f a r , n o o n e h a s r e p o r t e d t h e “ t r a n s f e r o f c h i r a l i t y ” b y c o o r d i n a t i o n o f t h e c h i r a l m o l e c u l e t o a p r e f o r m e d , n o n - c h i r a l , p s e u d o - c a g e d c o m p l e x . 3 4 0 u - n u u r N a fi u . “ Z n 3 ’ I ’ I ' r I ‘ H ' 9 l : 5 " I n , ‘ ’ I ’ l 1 ’ : ‘ 3 ~ ‘ ‘ I N s 2 ’ \ - N ’ r / / Z ' c N / \ ¢ fl u , O E C C D 6 9 E C C D F i g u r e 7 - 3 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f d i a s t e r e o m e r i c d i f f e r e n t i a t i o n u p o n c o o r d i n a t i o n o f a c h i r a l a m i n e t o p r o c h i r a l h e l i c a t e . D e p e n d i n g o n t h e c h i r a l i t y o f t h e a m i n e e x c e s s o f o n e o f t h e t w o p o s s i b l e h e l i c a l c o n f o r m a t i o n s c a n f o r m . T h e c h i r a l o r i e n t a t i o n o f t h e c h r o m o p h o r i c a r m s w i l l t r a n s l a t e i n t o a E C C D s p e c t r u m . 3 4 1 7 . 2 T h e T M Q A s y s t e m T h e fi r s t h o s t s y s t e m c h o s e n t o i n v e s t i g a t e t h e p s e u d o - c a g e d c o m p o u n d a p p r o a c h w a s t e r t i a r y a m i n e 4 ( T r i s - M e t h y l - 2 Q u i n o l y l - A m i n e , T M Q A ) . T h e s y n t h e s i s o f t h i s c o m p o u n d h a d b e e n p r e v i o u s l y r e p o r t e d l ’ 2 ( S c h e m e 7 - 1 ) a n d b e g i n s w i t h a n a l l y l i c b r o m i n a t i o n o f c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e 2 - m e t h y l q u i n o l i n e ( q u i n a l d i n e ) 1 . S u b s e q u e n t r e a c t i o n o f t h e m o n o b r o m i n a t e d m e t h y l q u i n o l i n e 2 w i t h e x c e s s o f a q u e o u s a m m o n i a u n d e r r e fl u x i n g c o n d i t i o n s r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f c r y s t a l l i n e T M Q A i n 8 0 % y i e l d ( t h e o r i g i n a l r e f e r e n c e c a l l e d f o r a a m b i e n t t e m p e r a t u r e r e a c t i o n t h a t a f f o r d e d ~ 2 0 % T M Q A i n 3 d a y s ) . m N B S , C H C I 3 > m + \ N / r e f l u x , 1 . 5 h N / B r N ’ B r 1 2 3 B r 2 7 % 4 % N “ L \ \ T H F \ N \ l + N H O H m / / N ’ B r 4 r e f l u x , 3 h / N 8 0 % / ‘ 2 4 / S c h e m e 7 - 1 : S y n t h e s i s o f T M Q A T M Q A w a s f o u n d t o b e s o l u b l e i n C H 2 C 1 2 , C H C l 3 a n d T H F b u t d o e s n o t d i s s o l v e i n m o r e p o l a r s o l v e n t s s u c h a s M e O H a n d M e C N . T h e U V - v i s s p e c t r u m o f t h i s t e r t i a r y a m i n e c o n s i s t s o f a m a j o r p e a k a t 2 3 0 n m ( e = 1 2 4 , 0 0 0 M ' l c m ' 1 i n M e O H ) a n d a b a n d o f p o o r l y r e s o l v e d p e a k s a t 2 5 0 — 3 2 5 n m ( 3 0 4 n m , e = 1 8 , 0 0 0 M ' l c m ‘ l ; 3 1 7 n m , e = 1 6 , 0 0 0 M ‘ l c m ' l i n M e O H ) . T h e e x c t i n c t i o n c o e f fi c i e n t s f o r t h e a b o v e p e a k s w e r e c a l c u l a t e d f o r t h e m e t h a n o l i c s o l u t i o n a l t h o u g h , a s m e n t i o n e d b e f o r e , T M Q A i s n o t v e r y s o l u b l e i n t h a t 3 4 2 s o l v e n t . T h a t i s d u e t o t h e f a c t t h a t t h e c h l o r i n a t e d s o l v e n t s h a v e a s t r o n g a b s o r p t i o n a t ~ 2 5 0 n m , o v e r l a p p i n g w i t h t h e m a i n p e a k . A s s h o w n i n F i g u r e 7 - 1 , a l l o u r s u g g e s t e d h o s t - g u e s t s y s t e m s a r e n i t r o g e n c o n t a i n i n g s u b s t r a t e s . T h e m e t a l o f c h o i c e t o c o o r d i n a t e w i t h t h e s e s y s t e m s w o u l d b e Z n “ . I t h a s b e e n s h o w n t h a t z i n c i o n s h a v e a g r e a t a f f i n i t y f o r b i n d i n g w i t h n i t r o g e n , 2 2 w h i c h c a n f a v o r t h e f o r m a t i o n o f t h e d e s i r e d c o m p l e x e s . I t i s a l s o k n o w n t h a t z i n c c a n e a s i l y c h a n g e i t s c o o r d i n a t i o n s p h e r e i n o r d e r t o a c c o m m o d a t e 4 , 5 o r 6 d i f f e r e n t ” ' 2 5 a f e a t u r e t h a t w e i n t e n d t o e x p l o i t . A d d i t i o n a l l y , z i n c - n i t r o g e n b i n d i n g i s n o t l i g a n d s , g r e a t l y a f f e c t e d b y m o i s t u r e , a n d h a n d l i n g t h e s e c o m p o u n d s i s s i m p l e . T h e c o m p l e x a t i o n o f T M Q A w i t h Z n 2 + w a s t r i e d u s i n g v a r i o u s Z n 2 + s o u r c e s u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s ( T a b l e 7 - 1 ) . A t t h e s a m e t i m e , c h i r a l a m i n e s w e r e i n t r o d u c e d t o t h e s y s t e m a n d t h e t r a n s f e r o f c h i r a l i t y w a s c h e c k e d b y C D s p e c t r o s c o p y . U n f o r t u n a t e l y , n o E C C D p e a k w a s p r e s e n t d e s p i t e o u r a t t e m p t s t o o p t i m i z e t h e s y s t e m b y a l t e r i n g t h e c o m p l e x a t i o n c o n d i t i o n s ( s o l v e n t , t e m p e r a t u r e ) . A c c o r d i n g t o w o r k d o n e w i t h s i m i l a r s y s t e m s ? " 8 i f a c h i r a l c o m p l e x i s f o r m e d t h e E C C D b i s i g n a t e p e a k w o u l d b e c e n t e r e d a r o u n d 2 3 0 n m . I n a l l t h e s e c a s e s , t h e s o l v e n t o f c h o i c e w a s M e O H s i n c e , a s d i s c u s s e d a b o v e , w h e n t h e s p e c t r a w e r e r e c o r d e d i n a c h l o r i n a t e d s o l v e n t t h e p e a k s a t ~ 2 3 0 n m c o u l d n o t b e r e s o l v e d . I n o u r c a s e t h o u g h M e O H w a s n o t t h e o p t i m u m s o l v e n t i n p a r t d u e t o T M Q A ’ s p o o r s o l u b i l i t y . B u t e v e n i f w e c o u l d c i r c u m v e n t t h i s p r o b l e m w e w e r e r e l u c t a n t t o u s e M e O H s i n c e i t c o u l d c o o r d i n a t e t o Z n 2 + a n d p r e v e n t t h e c h i r a l a m i n e c o o r d i n a t i o n ( s i m i l a r a r g u m e n t s a p p l y f o r t h e M e C N c a s e ) . A t t h i s p o i n t , t h o u g h s i n c e w e f a i l e d t o d e t e c t a n y c h i r a l s p e c i e s f o r m a t i o n w h e n c h l o r i n a t e d s o l v e n t s w e r e u s e d , s e v e r a l a t t e m p t s w e r e c a r r i e d o u t u s i n g 3 4 3 T a b l e 7 - 1 . C o n d i t i o n s f o r t h e c o m p l e x a t i o n o f T M Q A w i t h m e t a l s a n d c h i r a l a m i n e s E n t r y T M Q A i n S o l v e n t M e t a l S o u r c e C h i r a l C o m p o u n d 1 C H Z C l z Z n C l 2 / M e O H R - C H E A 2 M e C N Z n B r 2 / M e C N V a l - M e — e s t e r 3 M e C N Z n B r Z / M e C N R - C H E A 4 C H C I 3 Z n B r 2 / M e C N S - C H E A 5 M C H Z n B r Z / M e C N S - M B A 6 C H Z C I Z Z n B r z , s o l i d S - M B A 7 C H Z C I Z Z n ( O A c ) 2 / M e C N V a l - M e - e s t e r 8 C H Z C I Z Z n ( O A c ) 2 , s o l i d V a l - M e - e s t e r 9 M e O H Z n ( C l O 4 ) 2 / M e O H S - M B A 1 0 M e O H Z n ( C I O 4 ) 2 / M e O H R - C H E A 1 1 C H C I a Z n ( C l O 4 ) 2 / M e C N R - C H E A 1 2 C H C I 3 C d C l z , s o l i d R - C H E A 1 3 C H Z C I Z C u B r z , s o l i d S - M B A m o r e p o l a r s o l v e n t s ( M e O H , M e C N ) . H o w e v e r , a s s e e n i n T a b l e 7 - 1 c h a n g i n g t h e s o l v e n t a n d / o r t h e c o o r d i n a t e d c h i r a l a m i n e d i d n o t r e s u l t i n E C C D o b s e r v a b l e r e s u l t s . A l t h o u g h i n t h e o r y t h e c o o r d i n a t i o n o f a n a m i n e t o a Z n - b e a r i n g h o s t m o l e c u l e i s t h e i d e a l c a s e , w e t h o u g h t w e s h o u l d e x p e r i m e n t w i t h s o m e o t h e r m e t a l s t h a t c o u l d p o t e n t i a l l y w o r k f o r t h i s s y s t e m . A s s h o w n i n e n t r i e s 1 2 a n d 1 3 i n T a b l e 7 - 1 , t h e m e t a l s o f c h o i c e w e r e C d 2 + a n d C u “ . B o t h t h e s e m e t a l s e x h i b i t g o o d a f fi n i t y f o r n i t r o g e n - b e a r i n g l i g a n d s a n d t h e i r c o o r d i n a t i o n p a t t e r n s c o u l d a c c o m m o d a t e t h e f o r m a t i o n o f a c h i r a l s p e c i e s . I n f a c t , i n a s i m i l a r C 3 - s y m m e t r i c s y s t e m b e a r i n g p y r i d i n e r i n g s , t h e 3 4 4 b i n d i n g o f a c y a n i d e g r o u p a s t h e f i f t h l i g a n d h a s b e e n r e p o r t e d . 2 6 H o w e v e r , e v e n u n d e r t h e n e w c o n d i t i o n s , n o E C C D s i g n a l w a s d e t e c t e d . F i n a l l y , t h e l a s t p a r a m e t e r a l t e r e d t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f e x p e r i m e n t s w a s t e m p e r a t u r e . I f t h e c o o r d i n a t i o n o f t h e c h i r a l a m i n e o c c u r s , w h a t w e e x p e c t t o o b s e r v e i s a n e v e n s l i g h t e x c e s s o f o n e o f t h e t w o d i a s t e r e o t o p i c c h i r a l c o m p l e x e s f o r m e d t h a t w o u l d l e a d t o a n E C C D s p e c t r u m . I t i s p o s s i b l e , h o w e v e r , t h a t a t r o o m t e m p e r a t u r e t h e e q u i l i b r i u m b e t w e e n t h e t w o s p e c i e s i s t o o f a s t r e s u l t i n g i n a r a c e m i c m i x t u r e . T h e r e f o r e , C D s p e c t r a w e r e r e c o r d e d a t l o w e r t e m p e r a t u r e s ( d o w n t o 0 ° C ) . H o w e v e r , n o s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e w a s o b s e r v e d . A t t h i s p o i n t , i t w a s c l e a r t h a t w e w e r e e i t h e r n o t f o r m i n g t h e l i g a n d - m e t a l - a m i n e c o m p l e x t h a t w e e x p e c t e d o r , e v e n i f w e w e r e , t h e c h i r a l i t y o f t h e a m i n e i s n o t t r a n s f e r r e d i n t o t h e f i n a l c o m p l e x . I n o r d e r t o o b t a i n f u r t h e r i n s i g h t i n t o t h i s s y s t e m o t h e r s p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u e s b e s i d e s C D , i n p a r t i c u l a r U V - v i s a n d N M R , w e r e i n v o l v e d . F r o m t h e l i t e r a t u r e w e k n o w t h a t f o r s o m e c h r o m o p h o r i c s y s t e m s , i . e . p o r p h y r i n s , 2 2 ‘ 2 7 b i n d i n g o f a m e t a l i o n i n d u c e s a r e d s h i f t i n g o f t h e U V - v i s a b s o r b a n c e o f ~ 5 n m . H o w e v e r , s t u d y i n g t h e c o o r d i n a t i o n o f l i g a n d s l i k e T M Q A t o a m e t a l t h r o u g h U V - v i s s p e c t r o s c o p y i s n o t a s s t r a i g h t f o r w a r d . ( O n e s h o u l d k e e p i n m i n d t h o u g h t h a t i n t h e p o r p h y r i n c a s e s t h e m e t a l f o r m s t w o c o v a l e n t b o n d s w i t h t h e c h r o m o p h o r e a s o p p o s e d t o t h e t r i p o d a l s y s t e m s w h e r e a p o s s i b l e c o m p l e x w o u l d b e b a s e d s o l e l y o n c o o r d i n a t i o n o f t h e h e t e r o a t o m s t h r o u g h t h e i r f r e e p a i r o f e l e c t r o n s ) . I n p a r t i c u l a r , f o r r e l a t e d s y s t e m s s i m i l a r t o T M Q A , 4 n o s i g n i f i c a n t s h i f t o f t h e m a j o r U V - v i s a b s o r b a n c e o f t h e c h r o m o p h o r e s ( ~ 2 3 0 n m ) w a s o b s e r v e d u p o n a d d i t i o n o f Z n “ , e v e n i n c a s e s w h e r e t h e c o o r d i n a t i o n o f t h e m e t a l w a s v e r i f i e d b y o t h e r m e a n s . T h e l a r g e s t c h a n g e i n d u c e d 3 4 5 b y c o o r d i n a t i o n s e e m s t o o c c u r a t t h e l o w e n e r g y t r a n s i t i o n p e a k s ( 2 5 0 - 3 4 0 n m ) w h e r e t h e s h a p e o f t h e o v e r a l l s p e c t r u m i s a l t e r e d , w i t h t h e b r o a d p e a k a t ~ 2 6 0 d i s a p p e a r i n g a n d t h a t a t ~ 3 2 0 n m s l i g h t l y r e d s h i f t i n g ( ~ 2 n m ) . O u r U V - v i s d a t a , a s s h o w n i n F i g u r e 7 - 4 , s e e m t o b e c o n s i s t e n t w i t h t h e l a t t e r o b s e r v a t i o n s . I n p a r t i c u l a r , u p o n a d d i t i o n o f Z n B r z ( A ) o r C d C l z ( C ) t h e p e a k a t ~ 2 6 5 n m s i g n i fi c a n t l y d e c r e a s e d w h i l e t h o s e a t 3 0 4 n m a n d 3 1 7 n m r e d s h i f t e d ~ 2 n m b u t r e t a i n e d t h e i r o v e r a l l s h a p e . H o w e v e r , a d d i t i o n o f C u B r z h a d a m o r e d r a m a t i c e f f e c t o n t h e o v e r a l l s p e c t r u m . I n s p e c i fi c , a l t h o u g h t h e l o s s o f t h e 2 6 5 n m p e a k i s c o n s i s t e n t w i t h t h e 0 . 0 2 2 5 0 2 7 0 2 9 0 n m F i g u r e 7 4 . U V s p e c t r a o f T M Q A i n t h e p r e s e n c e o f m e t a l a t o m s a n d c h i r a l a m i n e s 3 1 0 3 3 0 3 5 0 3 4 6 p r e v i o u s s p e c t r a a n d t h e l i t e r a t u r e r e p o r t s , t h e l o s s o f t h e fi n e f e a t u r e s a t t h e 3 0 0 - 3 4 0 n m p e a k s i s u n i q u e , l e a d i n g t o a s i g n i fi c a n t l i n e b r o a d e n i n g . C o n s i d e r i n g t h e f a c t t h a t t h e b a s e l i n e r o s e i n t h e p r e s e n c e o f c o p p e r , o n e m i g h t c o n c l u d e t h a t t h e c o m p l e x , i f f o r m e d , i s l e s s s o l u b l e t h a n t h e f r e e l i g a n d , l e a d i n g t o t h e l o s s o f s p e c t r a l d e t a i l s . I n a d d i t i o n t o t h e a b o v e o b s e r v a t i o n s , i n a l l t h r e e c a s e s t h e r e s e e m t o b e a n e n h a n c e m e n t o f t h e a b s o r p t i o n i n t h e p r e s e n c e o f t h e m e t a l . / ‘ H ‘ N H Z ’ 2 1 A 1 . . _ B C H ; C I 2 1 A l 1 1 1 1 L 1 1 . 1 - 1 1 0 . 0 9 . 0 8 . 0 7 . 0 6 . 0 5 . 0 4 . 0 3 . 0 2 . 0 1 . 0 P M “ F i g u r e 7 - 5 . N M R s p e c t r a i n C D C I a o f : A . T M Q A ; B . T M Q A + 1 e q u i v Z n B r z ; C . T M Q A + 1 e q u i v Z n B r 2 + 1 e q u i v R - C H E A ; D . Z n ( C I O 4 ) 2 + ( 1 - 4 ) e q u i v R - C H E A ; E . F i - C H E A A l t h o u g h n o c e r t a i n c o n c l u s i o n c a n b e d r a w n o n w h e t h e r o r n o t t h e l i g a n d - m e t a l c o m p l e x i s f o r m e d , t h e U V - v i s r e s u l t s s e e m t o s u p p o r t t h i s s u g g e s t i o n . F u r t h e r e v i d e n c e f o r t h e l i g a n d - m e t a l c o m p l e x f o r m a t i o n i s p r o v i d e d b y t h e g r e a t e r s o l u b i l i t y o f t h e m e t a l s a l t s i n c h l o r i n a t e d s o l v e n t s . 3 4 7 A d d i t i o n a l v a l i d a t i o n f o r t h e l i g a n d - m e t a l c o m p l e x f o r m a t i o n w a s p r o v i d e d b y a s e r i e s o f N M R e x p e r i m e n t s . A s s h o w n i n F i g u r e 7 - 5 , t h e p r o t o n N M R s p e c t r a o f t h e f r e e a n d m e t a l b e a r i n g f o r m o n l y c o n f i r m t h e b i n d i n g o f t h e m e t a l , i n t h i s c a s e Z n “ , t o T M Q A i n a C 3 — s y m m e t r i c f a s h i o n . C o m p a r i n g s p e c t r a ( A ) a n d ( B ) w e c a n s e e t h a t a f t e r t h e a d d i t i o n o f Z n 2 + ( i n t h i s c a s e a s Z n B r z ) t h e s p e c t r u m c h a n g e s s i g n i fi c a n t l y . T h e p a t t e r n o f t h e a r o m a t i c p e a k s i s a l t e r e d a n d m o s t o f t h e m h a v e s h i f t e d d o w n f i e l d . T h e s a m e b e h a v i o r c a n b e o b s e r v e d f o r t h e m e t h y l e n e p r o t o n s o f T M Q A w h i c h h a v e m o v e d f r o m 4 . 1 t o 4 . 7 5 p p m , y i e l d i n g o n l y o n e p e a k . T h e l a t t e r s u g g e s t s t h a t t h e m e t a l c a t i o n h a s f o r m e d a C 3 - s y m m e t r i c c o m p l e x w i t h T M Q A s i n c e l a c k o f s y m m e t r y w o u l d h a v e l e d t o d i a s t e r e o t o p i c p e a k s . I n t r i g u e d b y t h e U V - v i s r e s u l t s i n t h e p r e s e n c e o f C u “ w e c o n s i d e r e d s t u d y i n g t h a t s y s t e m u s i n g N M R a s w e l l . H o w e v e r , t h e p a r a m a g n e t i c n a t u r e o f t h e C u 2 + n u c l e u s e x c l u d e s t h i s o p t i o n . S o , f a r b o t h U V - v i s a n d N M R e x p e r i m e n t s s u g g e s t t h e f o r m a t i o n o f a l i g a n d — m e t a l c o m p l e x . B u t , s i n c e t h e C D e x p e r i m e n t s d i d n o t d e t e c t a n y E C C D a c t i v e s p e c i e s t h e q u e s t i o n r e m a i n s w h e t h e r t h e c h i r a l a m i n e i s n o t c o o r d i n a t i n g t o t h e p r e f o r m e d c o m p l e x a t a l l , o r i t d o e s b u t t h e c h i r a l i t y i s n o t t r a n s f e r r i n g t o t h e c h r o m o p h o r i c h o s t m o l e c u l e . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h i s q u e s t i o n t h e f o l l o w i n g U V - v i s a n d N M R e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t . I n t h e c a s e o f t h e C u 2 + - l i g a n d c o m p l e x , t h e U V - v i s s p e c t r u m a f t e r t h e a d d i t i o n o f a c h i r a l a m i n e ( i n t h i s c a s e S - M e t h y l B e n z y l A m i n e , S - M B A ) c l o s e l y r e s e m b l e s t h a t o f t h e o r i g i n a l c o m p l e x . ( F i g u r e 7 - 4 B ) . F o r t h e Z n 2 + a n d C d 2 + c a s e s , t h e a d d i t i o n o f t h e c h i r a l a m i n e d o e s i n d u c e c h a n g e s i n t h e c o r r e s p o n d i n g U V - v i s s p e c t r a . I n p a r t i c u l a r , f o r t h e Z n 2 + - l i g a n d c a s e , u p o n a d d i t i o n o f S - M B A t h e s p e c t r u m r e m a i n s r e d s h i f t e d w h i l e a t t h e 3 4 8 s a m e t i m e t h e p e a k a t ~ 2 7 0 n m i n c r e a s e s , r e s e m b l i n g m o r e c l o s e l y t h e t r a c e f o r t h e f r e e T M Q A . I n t e r e s t i n g l y , i n t h e c a s e o f t h e C d 2 + - l i g a n d c o m p l e x , a d d i t i o n o f R - C H E A ( R - C y c l o h e x y l E t h y l A m i n e ) y i e l d s a s p e c t r u m a l m o s t i d e n t i c a l t o t h a t o f t h e f r e e T M Q A . A l t h o u g h t h e a b o v e o b s e r v a t i o n s c a n l e a d t o a n u m b e r o f s p e c u l a t i o n s o n w h e t h e r t h e a m i n e s a r e b o u n d t o t h e c o m p l e x e s o r n o t , t h e t r u t h i s t h a t n o s a f e c o n c l u s i o n s c a n b e d r a w n . T o s h e d s o m e f u r t h e r l i g h t o n t h i s s u b j e c t , N M R e x p e r i m e n t s o f t h e Z n 2 + - T M Q A c o m p l e x u p o n a d d i t i o n o f R - C H E A w e r e c a r r i e d o u t . A s c a n b e s e e n i n F i g u r e 7 - 5 ( C ) , t h e a d d i t i o n o f t h e c h i r a l a m i n e ( 1 e q u i v ) r e s u l t s i n t w o s e p a r a t e s e t s o f p e a k s i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f t w o d i f f e r e n t s p e c i e s . A c l o s e r l o o k a t t h e s p e c t r u m r e v e a l s t h a t t h e r e a r e t w o d i f f e r e n t s e t s o f a r o m a t i c p e a k s a s w e l l a s t w o d i f f e r e n t k i n d s o f m e t h y l e n e p r o t o n s w h i c h v e r y w e l l m a t c h t h e p e a k s o f t h e u n b o u n d a n d t h e c o m p l e x e d h o s t - m o l e c u l e , a t a r a t i o o f a b o u t 1 : 3 . I n a d d i t i o n , t h e p e a k s c o r r e s p o n d i n g t o t h e c h i r a l a m i n e h a v e s h i f t e d d o w n fi e l d c o n s i d e r a b l y , r e s e m b l i n g t h e o n e s o f R - C H E A i n t h e p r e s e n c e o f Z n “ , w i t h o u t a n y l i g a n d p r e s e n t ( D ) r a t h e r t h a n t h e p e a k s o f t h e u n b o u n d R - C H E A i n C D C l 3 . S o , a c c o r d i n g t o o u r N M R d a t a , t h e a d d i t i o n o f t h e c h i r a l a m i n e r e s u l t s i n p a r t i a l d i s s o c i a t i o n o f t h e h o s t - m e t a l c o m p l e x a n d f o r m a t i o n o f a c h i r a l a r n i n e - m e t a l c o m p l e x , w i t h t h e t w o s p e c i e s b e i n g i n e q u i l i b r i u m . T h u s , t h e N M R r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e d e s i r e d c o m p l e x i n v o l v i n g a h o s t - m e t a l - c h i r a l g u e s t s p e c i e s w a s n e v e r f o r m e d , w h i c h e x p l a i n s t h e l a c k o f C D s p e c t r a . A t t h i s p o i n t , c o n c e r n s w e r e r a i s e d i n v o l v i n g t h e d e s i g n o f t h e b i n d i n g c a v i t y i n o u r s y s t e m . A c c o r d i n g t o t h e m o d e l o f t h e s y s t e m t h e b i n d i n g c a v i t y f o r m e d u p o n c o m p l e x a t i o n o f t h e m e t a l t o T M Q A i s l a r g e e n o u g h t o a c c o m m o d a t e a c h i r a l a m i n e . 3 4 9 H o w e v e r , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e c a v i t y d e fi n e d b y t h e c h r o m o p h o r i c a r m s o f T M Q A i s t o o o p e n s o t h a t e v e n i f t h e a m i n e c o o r d i n a t e s t h e w a y i t w a s p r e d i c t e d , t h e c o m p l e x d o e s n o t a d o p t t h e e x p e c t e d c h i r a l , p r o p e l l e r - l i k e c o n f o r m a t i o n a n d , t h e r e f o r e , n o E C C D i n t e r a c t i o n o c c u r s . I n o r d e r t o g e t s o m e i n s i g h t i n t o t h e p s e u d o - c a g e d c a v i t y f o r m e d , a f t e r t h e c o o r d i n a t i o n o f t h e m e t a l t o T M Q A , c r y s t a l l i z a t i o n a t t e m p t s w e r e u n d e r t a k e n . 2 8 T h e p r e l i m i n a r y r e s u l t s o f t h e c r y s t a l l i z e d s p e c i e s r e v e a l t h e p r e s e n c e o f a d i m e r i c f o r m o f t h e Z n 2 + — T M Q A c o m p l e x ( F i g u r e 7 - 6 ) . T h e t w o m o n o m e r s a r e h e l d t o g e t h e r b y t w o C l - b r i d g e s c o o r d i n a t e d t o t h e m e t a l ( t h e z i n c s o u r c e ( Z n C l z ) u s e d d u r i n g c r y s t a l l i z a t i o n i s t h e s o u r c e o f C l a s w e l l ) . E a c h Z n 2 + h a s a d i s t o r t e d o c t a h e d r a l g e o m e t r y , b e i n g b o u n d t o F i g u r e 7 - 6 C r y s t a l s t r u c t u r e o f ( T M Q A ) ; Z n Z C I 2 N a P F s a l l f o u r n i t r o g e n s o f t h e t r i p o d a l s t r u c t u r e a n d t h e t w o c h l o r i n e s . T h i s r e s u l t a d d r e s s e d t h e u n e x p e c t e d p o s s i b i l i t y o f d i m e r i z a t i o n a n d r a i s e d c o n c e r n s a b o u t t h e a b i l i t y o f o u r h o s t - m e t a l c o m p l e x t o a c c o m m o d a t e t h e c o o r d i n a t i o n o f a c h i r a l g u e s t . A s m e n t i o n e d b e f o r e Z n 2 + c a n f o r m c o m p l e x e s w i t h 4 , 5 o r 6 l i g a n d s . 2 3 ' 2 4 T h e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d a t t e m p t s a t f o r m i n g a T M Q A - Z n 2 + c o m p l e x i n v o l v e d t h e u s e o f 3 5 0 Z n 2 + s a l t s ( i . e . Z n C l z ) a s t h e m e t a l s o u r c e . C o n s i d e r i n g t h a t T M Q A c a n o c c u p y f o u r c o o r d i n a t i o n s i t e s o f t h e m e t a l a n d a s s u m i n g t h a t t h e a n i o n s ( i . e . C l ' ) r e m a i n b o u n d o n t h e m e t a l ( n o r e d o x c h e m i s t r y i s p u r s u e d ) t h e c o o r d i n a t i o n s p h e r e o f Z n 2 + w i l l b e s a t u r a t e d ( s i x o v e r a l l l i g a n d s ) . T h e r e f o r e , f o r t h e c h i r a l a m i n e t o c o o r d i n a t e , i t h a s t o d i s p l a c e o n e o f t h e c o o r d i n a t e d l i g a n d s f r o m T M Q A , e i t h e r t h e c e n t r a l o r o n e o f t h e s p 2 n i t r o g e n s ( a s s u m i n g t h e m e t a l i s n o t r e d u c e d ) . C o n s i d e r i n g t h e s y n e r g i s t e f f e c t i n v o l v e d i n t h e T M Q A c o o r d i n a t i o n a n d t h e f a c t t h a t t h e f o r m e d c o m p l e x , a s m o d e l s t r u c t u r e s s u g g e s t , i t n o t s t r a i n e d , o n e w o u l d a r g u e t h a t s u c h a d i s p l a c e m e n t i s n o t f a v o r e d . I n a d d i t i o n t h e t r a n s - a x i a l e l e c t r o n d o n a t i o n f r o m t h e c e n t r a l , t e r t i a r y n i t r o g e n c a n w e a k e n t h e a x i a l a p p r o a c h o f t h e c h i r a l a m i n e . H o w e v e r , t h e o b s e r v e d c h a n g e o f t h e N M R s p e c t r u m u p o n a d d i t i o n o f t h e c h i r a l p r i m a r y a m i n e d o e s s u g g e s t t h e p r e s e n c e o f f r e e l i g a n d ( F i g u r e 7 - 5 C ) . C o n s i d e r i n g a l l t h e a b o v e , s o m e n e w h o s t m o l e c u l e s t h a t b e a r l e s s c o o r d i n a t i o n s i t e s a n d a r e n o t e x p e c t e d t o s a t u r a t e t h e c o o r d i n a t i o n s p h e r e o f Z n 2 + w e r e d e s i g n e d a n d s y n t h e s i z e d . 7 . 3 T h e D Q B A s y s t e m T h e f i r s t s y s t e m s y n t h e s i z e d t o e n t e r t a i n o u r c o n c e r n s r e g a r d i n g t h e s a t u r a t e d c o o r d i n a t i o n s p h e r e o f Z n “ w a s l i g a n d D i Q u i n o l y l - t - B u t y l A m i n e ( D Q B A , 6 ) . T h i s s y s t e m c o n s i s t s o f o n l y t w o c h r o m o p h o r i c a r m s a n d a f t e r b i n d i n g , t h e m e t a l c e n t e r s h o u l d s t i l l b e a b l e t o a c c o m m o d a t e t h e c o o r d i n a t i o n o f t h e c h i r a l g u e s t . T h e e x p e c t e d m o d e o f b i n d i n g i s v e r y s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e d f o r T M Q A a n d u p o n f o r m a t i o n o f a c h i r a l 3 5 1 s p e c i e s t h e r e l a t i v e o r i e n t a t i o n o f t h e t w o q u i n o l i n e r i n g s c o u l d g i v e r i s e t o E C C D s p e c t r a . N N N w + H 2 N r e f l u x / k I / 6 h 2 5 6 S c h e m e 7 - 2 : S y n t h e s i s o f D Q B A D Q B A w a s s y n t h e s i z e d a s s h o w n i n S c h e m e 7 - 2 , b y r e a c t i n g t - b u t y l a m i n e w i t h m e t h y l q u i n o l i n e b r o m i d e 2 . W h e n i n h a n d , s i m i l a r a t t e m p t s t o b i n d Z n 2 + a n d c h i r a l a m i n e a s t h e o n e s d e s c r i b e d f o r T M Q A w e r e p e r f o r m e d . F o r m a t i o n o f a c h i r a l c o m p l e x w a s m o n i t o r e d u s i n g C D s p e c t r o s c o p y . H o w e v e r , a s i n t h e T M Q A c a s e , n o E C C D p e a k w a s o b s e r v e d . A l t h o u g h u p o n c o o r d i n a t i o n t o D Q B A t h e m e t a l s h o u l d r e t a i n a s i t e o f a t t a c h m e n t f o r t h e c h i r a l a m i n e t o c o o r d i n a t e , u n d e r o u r r e a c t i o n c o n d i t i o n s n o E C C D a c t i v e c o m p l e x w a s f o r m e d . I n o r d e r t o g e t s o m e i n s i g h t i n t o t h e s y s t e m , s e v e r a l N M R e x p e r i m e n t s , s i m i l a r t o t h o s e d e s c r i b e d e a r l i e r f o r T M Q A w e r e p e r f o r m e d . T h e N M R d a t a o b t a i n e d a r e s h o w n i n F i g u r e 7 - 7 . I n a m a n n e r s i m i l a r t o T M Q A , a d d i t i o n o f t h e m e t a l c a t i o n t o a D Q B A s o l u t i o n s u g g e s t s t h e f o r m a t i o n o f a s y m m e t r i c s p e c i e s . T h e a r o m a t i c p a t t e r n o f t h e q u i n o l i n e r i n g s h a s b e e n s i g n i fi c a n t l y a l t e r e d i n d i c a t i n g s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e t w o c h r o m o p h o r i c a r m s , w h i l e t h e p r e s e n c e o f o n l y o n e m e t h y l e n e p e a k , d o w n fi e l d s h i f t e d b y ~ 0 . 7 p p m , s u g g e s t s t h e f o r m a t i o n o f a s y m m e t r i c c o m p l e x . O n l y t h i s t i m e , a l t h o u g h 1 e q u i v o f t h e m e t a l w a s u s e d , t h e r e i s s o m e u n b o u n d D Q B A s p e c i e s p r e s e n t i n t h e N M R . I n t e r e s t i n g l y , u p o n a d d i t i o n o f R - C H E A t h e a r o m a t i c p e a k s o f t h e b o u n d - h o s t s h i f t u p fi e l d w h i l e t h e m e t h y l e n e p r o t o n s s e e m t o b e d e s h i e l d e d . A l s o t h e R - C H E A p e a k s a r e d e s h i e l d e d s u g g e s t i n g t h a t t h e c h i r a l 3 5 2 2 H V N H 2 1 A I l u i - i e 1 _ _ A _ A . J l l _ fi . ~ l 1 J r 1 a L U Q W J ‘ . c 1 E M L [ I I I I I I I I I [ I 1 1 1 ] I I T T T T H I Y T I I T T I I I I I I I I I I T I I Y T I I I T T T Y I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Y I I I I I T T I I I I T 1 0 9 . 0 8 . 0 7 . 0 6 . 0 5 . 0 4 . 0 3 . 0 2 . 0 1 . 0 p p m F i g u r e 7 - 7 : N M R s p e c t r a i n C D C l a , i n t h e p r e s e n c e o f : A . D Q B A ; B . D Q B A + 1 e q u i v Z n B r z ; C . D Q B A + 1 e q u i v Z n B r 2 + 1 e q u i v R - C H E A ; D . Z n ( C l O 4 ) 2 + ( 1 - 4 ) e q u i v F i - C H E A ; E . R - C H E A a m i n e i s b o u n d t o t h e m e t a l . B u t , a s e x p e c t e d , t h e s p e c t r u m s h o w s t w o d i f f e r e n t s p e c i e s , a n d t h e o n e t h a t s e e m s t o b e a p o s s i b l e h o s t - m e t a l - g u e s t c o m p l e x i s t h e m i n o r o n e . T h e b i n d i n g o f t h e m e t a l t o D Q B A d o e s n o t s e e m t o b e a s e f fi c i e n t a s i n T M Q A ( s i n c e t h e m i n o r s p e c i e s i s s h o w n i n t h e N M R a t l e a s t 5 % o f i t i s p r e s e n t i n s o l u t i o n ) . H o w e v e r , w h e n t h e c h i r a l m o l e c u l e i s a d d e d , f o r m a t i o n o f a n e w s p e c i e s , t h a t d o e s n o t m a t c h e i t h e r t h e u n b o u n d o r t h e z i n c - c o m p l e x e d D Q B A i s o b s e r v e d . T h e s p e c t r u m o f t h i s s p e c i e s s e e m s t o b e c o n s i s t e n t w i t h t h e d e s i r e d D Q B A - Z n - R - C H E A c o m p l e x , 3 5 3 a l t h o u g h p r e s e n t a s t h e m i n o r p r o d u c t i n t h e m i x t u r e . H o w e v e r , e v e n i n t h i s c a s e , t h e p r e s e n c e o f o n l y o n e s e t o f m e t h y l e n e p r o t o n s i n s t e a d o f t h e e x p e c t e d d i a s t e r e o t o p i c m o t i f d o e s n o t s u p p o r t t h e f o r m a t i o n o f a h e l i c a l s t r u c t u r e . T h i s o b s e r v a t i o n i s f u r t h e r v e r i f i e d b y C D s i n c e n o E C C D p e a k , i n d i c a t i v e o f h e l i c a l d i a s t e r e o m e r i c e x c e s s w a s o b s e r v e d . W i t h t h e h o s t b e a r i n g o n l y t w o a r o m a t i c a r m s t h e r e i s n o c l o s e d c a v i t y f o r m e d u p o n c o o r d i n a t i o n o f t h e m e t a l . T h e r e f o r e , t h e c o o r d i n a t i o n o f t h e c h i r a l a m i n e c o u l d o c c u r f r o m t h e o p p o s i t e s i t e o f t h e m e t a l , a s f a r a w a y f r o m t h e q u i n o l i n e r i n g s a s p o s s i b l e , l e a d i n g t o t h e f o r m a t i o n o f a c h i r a l , a l b e i t E C C D s i l e n t c o m p l e x , s i n c e t h e q u i n o l i n e r i n g s a r e n o t c h i r a l l y o r i e n t e d . 7 . 4 T h e T M Q M s y s t e m I n a n a t t e m p t t o m a i n t a i n a h o s t m o l e c u l e w i t h l e s s t h a n f o u r c o o r d i n a t i o n s i t e s t h a t c a n f o r m a m o r e d e fi n e d c a v i t y u p o n m e t a l c o o r d i n a t i o n F i g u r e 7 - 3 . S t r u c t u r e o f T M Q M m o l e c u l e 7 ( F i g u r e 7 - 8 ) w a s f o r m e d . T M Q M ( T r i s ( 2 - M e t h y l - Q u i n o l i n e ) M e t h a n e , i s t h e c a r b o n a n a l o g u e o f T M Q A . I n a d d i t i o n t o f r e e i n g a c o o r d i n a t i o n s i t e t h e r e m o v a l o f t h e c e n t r a l n i t r o g e n i s e x p e c t e d t o b e t t e r f a c i l i t a t e t h e b i n d i n g o f t h e c h i r a l a m i n e t o t h e T M Q M - Z n c o m p l e x . I n p a r t i c u l a r , r e m o v a l o f t h e p o s s i b l e t r a n s - a x i a l e l e c t r o n d o n a t i o n c a n e a s e t h e a p p r o a c h o f t h e a m i n e t o f o r m a p s e u d o - c a g e d c o m p l e x . 7 . 4 a S y n t h e s i s o f T M Q M 3 5 4 C 0 1 ] N C H W D i o x a n “ e / R e f l u x ( m N ’ B r x T h e s y n t h e s i s o f h o s t T M Q M h a s n o t b e e n p r e v i o u s l y r e p o r t e d a n d s e v e r a l a p p r o a c h e s t o w a r d s i t w e r e c a r r i e d o u t . T h e f i r s t a t t e m p t f o r t h e s y n t h e s i s o f T M Q M i s p r e s e n t e d i n S c h e m e 7 - 3 . W e b e l i e v e d t h a t T M Q M c o u l d b e f o r m e d b y t h e 8 N 2 a t t a c k o f t h e l i t h i a t e d b r o m o q u i n o l i n e 1 2 w i t h t h e t r i - i o d o b u t a n e 1 0 . T h e i o d i d e w a s e a s i l y p r e p a r e d , a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d , 2 9 f r o m 2 - h y d r o x y l m e t h y l - 2 - n i t r o - 1 , 3 p r o p a n e d i o l . I n i t i a l s u l f o n y l a t i o n o f t h e t r i o ] w a s f o l l o w e d b y r e d u c t i o n o f t h e n i t r o g r o u p t o y i e l d 2 - m e t h y l s u l f o n y l o x y m e t h y l - 1 , 3 , p r o p a n e d i o l d i m e t h a n e s u l f o n a t e 9 . T r e a t m e n t o f t h e l a t t e r w i t h s o d i u m i o d i d e y i e l d e d t h e d e s i r e d t r i - i o d i d e 1 0 i n 8 0 % y i e l d . A t t h e s a m e t i m e , 2 - b r o m o - q u i n o l i n e w a s p r e p a r e d b y a l l y l i c b r o m i n a t i o n o f 2 - h y d r o x y q u i n o l i n e i n 3 0 % y i e l d . C H 3 8 0 2 C | H 8 2 , “ O H p y r ’ 0 0 C ‘ H 3 C O Z S O O 2 E I > < O S O Z C H 3 ( C 4 H 9 ) 3 S l ’ l H / A l B N > O H 3 3 ° / o O S O Z C H 3 C G H B é g s / fl u x 8 O H C O S O 3 2 K O S O Z C H a N a l / a c e t o n e > I m l O S O Z C H a r e f l u x , 8 0 % ' 9 1 0 1 ) n - B u L i , e t h e r - 7 8 ° C 3 0 ° / 2 ) ' K ' 1 1 ° 1 2 I S c h e m e 7 - 3 . F i r s t a t t e m p t e d s y n t h e s i s o f T M Q M . T h e f i n a l c o u p l i n g o f t r i i o d i d e 1 0 a n d l i t h i a t e d 1 2 f o r t h e f o r m a t i o n o f T M Q M w a s n o t s u c c e s s f u l . I n t h e c o u r s e o f t h e r e a c t i o n w e o b s e r v e d t h e d i s a p p e a r a n c e o f t h e t r i - i o d i d e s p e c i e s , b u t n o d e s i r e d p r o d u c t w a s i s o l a t e d . I n s t e a d , t o a n e x t e n t , t h e 3 5 5 d i m e r i z a t i o n o f t h e q u i n o l i n e r i n g o c c u r r e d w h i l e t h e i o d i d e d e c o m p o s e d u n d e r t h e b a s i c c o n d i t i o n s . O v e r a l l , t h e r e a c t i o n w a s n o t c l e a n a n d e v e n a f t e r n u m e r o u s a t t e m p t s n e v e r y i e l d e d t h e d e s i r e d p r o d u c t . T o v e r i f y t h a t t h e t r a n s m e t a l l a t i o n s t e p w a s t a k i n g p l a c e , t h e r e a c t i o n w a s q u e n c h e d s o o n a f t e r t h e a d d i t i o n o f n - B u L i t o 2 - B r — q u i n o l i n e . T h e c r u d e N M R r e v e a l e d t h e p r e s e n c e o f a c o m p l e x m i x t u r e o f a r o m a t i c p e a k s , w h i c h i n c l u d e d t h e d i m e r i z a t i o n p r o d u c t . A l t h o u g h t h i s t y p e o f r e a c t i o n i s c o n s i d e r e d s t a n d a r d f o r v a r i o u s a r o m a t i c s y s t e m s , 3 0 t h e r e h a s b e e n n o r e p o r t i n v o l v i n g q u i n o l i n e s y s t e m s . S i n c e t h e r e a c t i o n o f f u n c t i o n a l i z e d q u i n o l i n e r i n g s w i t h a C 3 s y m m e t r i c c a r b o n c o r e d i d n o t w o r k a s a n t i c i p a t e d , o u r s e c o n d a p p r o a c h i n v o l v e d t h e f o r m a t i o n o f t h e r i n g s a r o u n d t h e c e n t r a l c a r b o n a t o m . I n p a r t i c u l a r , w e e n v i s i o n e d t h e f o r m a t i o n o f T M Q M b y i n i t i a l S c h i f f b a s e f o r m a t i o n b e t w e e n a n i l i n e d e r i v a t i v e 1 3 a n d t r i a l d e h y d e 1 4 . T h e s u g g e s t e d m e c h a n i s m f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e q u i n o l i n e r i n g i s d e s c r i b e d i n S c h e m e 7 - 4 . S c h e m e 7 - 4 . R e t r o s y n t h e t i c a n a l y s i s o f T M Q M A f t e r t h e i n i t i a l S c h i f f b a s e f o r m a t i o n , o f a S c h i f f b a s e , a n a c i d - p r o m o t e d c y c l i z a t i o n f o l l o w e d b y a r o m a t i z a t i o n c o u l d y i e l d q u i n o l i n e r i n g s . I n t h e p r e s e n c e o f t r i a l d e h y d e l 4 , 9 H H H 2 R ' C H O E ° N : > F i ' N R ' — — » > — - o r e “ / 8 S c h e m e 7 - 5 . S u g g e s t e d m e c h a n i s m f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e q u i n o l i n e r i n g 3 5 6 3 3 ' 3 4 H o w e v e r , t h e i r m e t h o d o l o g y o n l y w o r k e d t h i s r e a c t i o n w o u l d d i r e c t l y y i e l d t h e d e s i r e d T M Q M m o l e c u l e . S i m i l a r c y c l i z a t i o n s h a v e b e e n d e s c r i b e d b e f o r e 3 1 i n r e fl u x i n g 6 M H C l a s w e l l a s u n d e r m i l d e r , L e w i s a c i d i c c o n d i t i o n s . 3 2 Q i a n g e t a l . r e p o r t e d t h e s y n t h e s i s o f 2 , 3 - a n d 2 , 4 - d i s u b s t i t u t e d q u i n o l i n e s i n a s i n g l e s t e p b y t h e r m a l e l e c t r o c y c l i c r e a r r a n g e m e n t o f o - v i n y l i c a n i l s u n d e r n o n - a c i d i c c o n d i t i o n s . w h e n a r o m a t i c a l d e h y d e s w e r e u s e d , s i n c e p r i m a r y a l i p h a t i c a l d e h y d e s w o u l d f a v o r t h e i s o m e r i z a t i o n o f t h e r e s p e c t i v e a n i l s t o O n - B u L i . . H P h 3 P M e B r : \ e n a m r n e s . T o t h i s d a y , t h e o n l y T H F . . . N 0 2 4 4 % N 0 2 s u c c e s s f u l c y c l i z a t i o n r e p o r t e d u s r n g 1 5 1 6 _ n - B u L i a l i p h a t i c a l d e h y d e s i n v o l v e s a R h - P h 3 P C H 2 0 H 3 8 r . 3 3 3 5 T H F , 7 3 % c o m p l e x i n t e r r n e d r a t e . ' C ( Z " _ _ , S n C l z , H C l F o r o u r s y s t e m , t h e s y n t h e s r s o f 8 8 % : 8 6 ; a m i n e 1 3 b e g a n w i t h t h e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e o - n i t r o - b e n z a l d e h y d e 1 5 . S c h e m e 7 - 6 : S y n t h e s i s o f a r o m a t i c a m i n e s W i t t i g o l e fi n a t i o n u s i n g m e t h y l - t r i p h e n y l p h o s p h o n i u m b r o m i d e , i n t h e p r e s e n c e o f n - B u L i i n T H F , y i e l d s 4 4 % o f o - n i t r o s t y r e n e 1 6 ( S c h e m e 7 - 6 ) , w h i c h s h o u l d u n d e r g o r e d u c t i o n o f t h e n i t r o g r o u p t o p r o v i d e t h e c o r r e s p o n d i n g p r i m a r y a m i n e . H o w e v e r , 1 6 w a s n o t s t a b l e a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e a n d r e a d i l y d e c o m p o s e d . S i n c e o u r c y c l i z a t i o n s c h e m e i n v o l v e s i n t e n s e h e a t i n g o f t h e s t a r t i n g m a t e r i a l , a n u n s t a b l e c o m p o u n d w o u l d b e o f n o u s e f o r f u r t h e r s t u d i e s . I n o r d e r t o i n c r e a s e t h e s t a b i l i t y o f t h e a n i l s y s t e m u s e d , t h e o l e fi n a t i o n w a s r e p e a t e d t h i s t i m e u s i n g e t h y l - t r i p h e n y l p h o s p h o n i u m b r o m i d e t o y i e l d 1 7 ( 7 3 % ) , w h i c h w a s t h e n r e d u c e d w i t h S n C l z / H C l t o g i v e 2 - p r o p e n y l a n i l i n e 1 8 i n 8 8 % y i e l d ( S c h e m e 7 - 3 5 7 6 ) . A l t h o u g h t h e u s e o f t h e l a t t e r a n i l G E L P h C H O , T H F _ N H 2 s t O H , r t 7 N " w o u l d l e a d t o t h e f o r m a t i o n o f a 3 - 1 9 s o b m e t h y l q u i n o l i n e s y s t e m , t h a t s h o u l d n o t P h C H O , N 8 2 5 0 4 B F 3 E t h , C G H G , r e f l u x C G H G v r e f l u x i n t e r f e r e w i t h t h e d e s i r e d p r o p e r t i e s o f 4 7 % f r o m 1 9 0 C 6 H 4 C l 2 o u r h o s t s y s t e m . F o l l o w i n g t h i s t h o u g h t , r e f l u x _ \ a n d i n a n a t t e m t t o r e d u c e o u r 3 t h e t i c 5 6 % f r o m 1 9 O N Q p y n 2 1 s t e p s , c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e 2 - S c h e m e 7 - 7 . F o r m a t i o n O f q u i n o l i n e r i n g s I s o p r o p e n y ] a n i ] i n e 1 9 w a s u s e d f o r o u r f u r t h e r e x p e r i m e n t s , t o y i e l d , u p o n c y c l i z a t i o n , a 2 - m e t h y l q u i n o l i n e r i n g . I n o r d e r t o o p t i m i z e t h e r e a c t i o n c o n d i t i o n s f o r o u r s y s t e m , a s e r i e s o f a t t e m p t s t o c y c l i z e 2 - I s o p r o p e n y l a n i l i n e i n t h e p r e s e n c e o f v a r i o u s a l d e h y d e s t o o k p l a c e . I n t h e c a s e 3 6 ‘ 3 7 w e w e r e a b l e t o w h e r e a r o m a t i c a l d e h y d e s w e r e u s e d , f o l l o w i n g r e p o r t e d p r o t o c o l s i s o l a t e t h e i n t e r m e d i a t e S c h i f f b a s e f o r m e d a n d f u r t h e r c y c l i z e i t . A s c a n b e s e e n ( S c h e m e 7 - 7 ) , t h e c y c l i z a t i o n c a n o c c u r e i t h e r u n d e r L e w i s a c i d i c c o n d i t i o n s ( B F 3 E t Z O ) o r u n d e r r e fl u x i n g a t m u c h h i g h e r t e m p e r a t u r e ( b . p . : B e n z e n e 8 0 ° C , 0 - d i c h l o r o b e n z e n e z l 8 0 ° C ) . H o w e v e r , i f t h e L e w i s a c i d i s n o t p r e s e n t , a g r e a t e x c e s s o f s o l i d N a 2 S O 4 i s e s s e n t i a l f o r t h e s u c c e s s f u l f o r m a t i o n o f t h e S c h i f f b a s e , a s a d e h y d r a t i n g a g e n t , t o p r e v e n t h y d r o l y s i s . I n t h e p r e s e n c e o f a l i p h a t i c a l d e h y d e s , t h e fi r s t c y c l i z a t i o n c o n d i t i o n s t r i e d i n v o l v e d t h e u s e o f L e w i s a c i d i c c o n d i t i o n s . H o w e v e r , w h e n f o l l o w i n g a p r e v i o u s l y r e p o r t e d p r o c e d u r e , 3 8 1 9 w a s m i x e d w i t h a c e t a l d e h y d e , i n a 1 : 7 r a t i o i n T H F , i n t h e p r e s e n c e o f s t O H ( 1 e q u i v ) , a f t e r fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y , o n l y o n e c l e a n f r a c t i o n w a s c o l l e c t e d , w h i c h w a s i d e n t i fi e d a s s t r u c t u r e 2 2 ( 3 8 % ) . T h e m e c h a n i s m o f t h i s r e a c t i o n , 3 5 8 f i r s t r e p o r t e d b y W a t a n a b e e t a l . , i s p r e s e n t e d i n S c h e m e 7 - 8 . I n t h e p r e s e n c e o f s t O H , a c e t a l d e h y d e c o n d e n s e s i n t o 0 1 , 6 u n s a t u r a t e d b u t a n a l , w h i c h t h e n u n d e r g o e s a 1 , 4 1 . C H 3 0 H O T H F N H 2 2 . s t O H \ l ‘ 1 1 9 2 2 Z C H 3 C H O o L , 0 i H H A W - 5 N H Z N T L H \ I N , ‘ _ \ \ - H 2 0 1 1 6 3 m e S c h e m e 7 - 8 . S y n t h e s i s a n d s u g g e s t e d m e c h a n i s m f o r t h e f o r m a t i o n o f q u i n o l i n e 2 2 . l l a d d i t i o n o f t h e a r o m a t i c a m i n e t o f i n a l l y y i e l d s t r u c t u r e 2 2 . ( A n i n i t i a l f o r m a t i o n o f t h e S c h i f f b a s e w o u l d e x p l a i n t h e r e l a t i v e l y l o w y i e l d f o r t h e f o r m a t i o n o f 2 2 ( 3 4 % ) , b u t a s e x p e c t e d , i t w o u l d n o t s u r v i v e t h e s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y c o n d i t i o n s i n o r d e r t o b e i s o l a t e d . ) A s i m i l a r r e a c t i o n i s e x p e c t e d i n t h e p r e s e n c e o f a n y a l i p h a t i c a l d e h y d e , b e s i d e s f o r m a l d e h y d e . H o w e v e r , w h e n t h e l a t t e r w a s s u b m i t t e d t o t h e s a m e r e a c t i o n c o n d i t i o n s n o q u i n o l i n e r i n g w a s i s o l a t e d w h i l e t h e s t a r t i n g a n i l d e c o m p o s e d . S i n c e s o f a r t h e o n l y c o n d i t i o n s y i e l d i n g t h e d e s i r e d p r o d u c t w e r e t h e o n e s u s e d f o r t h e a r o m a t i c a l d e h y d e c a s e ( S c h e m e 7 - 7 ) , 2 - i s o p r o p e n y l a n i l i n e w a s m i x e d w i t h e i t h e r C H 3 C H O o r H C H O i n o - C 6 H 4 C 1 2 , i n t h e p r e s e n c e o f e x c e s s o f N a 2 S O 4 , a n d t h e r e a c t i o n s w e r e r e fl u x e d ( S c h e m e 7 - 9 ) . I n b o t h c a s e s , t h e c o l o r l e s s r e a c t i o n m i x t u r e b e c a m e d a r k a n d a f t e r ~ 1 2 h r e fl u x i n g t h e r e s p e c t i v e q u i n o l i n e d e r i v a t i v e s ( 4 - M e - q u i n o l i n e ( L e p i d i n e , 3 5 9 2 4 ) , > 9 0 % a n d 2 , 4 d i m e t h q u u i n o l i n e H C H O / H 2 0 ( 2 3 ) , 2 3 % ) . w e r e f o r m e d . A s c a n b e N a Z S O 4 ‘ \ . _ / 0 ' 0 5 H 4 C l 2 a l l s e e n , t h e r e a c t i o n w r t h H C H O w a s m u c h d r e fl u x , > 9 0 % 2 3 " . c l e a n e r t h a n t h e C H 3 C H O o n e w h i c h N H ? C H 3 C H O 1 9 \ N a s t 4 ‘ w c o u l d b e d u e t o t h e d i f f e r e n c e i n 0 . 0 6 1 1 4 0 2 N ’ r e f l u x , 2 3 % 2 4 r e a c t i v i t y . H o w e v e r , a n o t h e r p o s s i b l e S c h e m e 7 - 9 . F o r m a t i o n o f q u i n o l i n e r i n g s e x p l a n a t i o n c o u l d b e t h a t a s a n a q u e o u s s o l u t i o n H C H O w a s l e s s v o l a t i l e a n d h e n c e m o r e a v a i l a b l e t o r e a c t . T h i s o b s e r v a t i o n i s s u p p o r t e d b y t h e f a c t t h a t w h e n a c e t a l d e h y d e w a s r e a c t e d a s a 5 0 % a q u e o u s s o l u t i o n t h e y i e l d i s s l i g h t l y i m p r o v e d ( 3 0 % ) . N o r m a l l y , o n e w o u l d e x p e c t t h a t t h e p r e s e n c e o f w a t e r i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e w o u l d i n h i b i t t h e p r o d u c t f o r m a t i o n , s i n c e t h e i n t e r m e d i a t e S c h i f f b a s e w o u l d h y d r o l y z e . H o w e v e r , i n t h e p r e s e n c e o f e x c e s s N a Z S O 4 t h a t d o e s n o t s e e m t o b e t h e c a s e . I n f a c t , w h e n p r o p i o n a l d e h y d e w a s u s e d f o r t h e c y c l i z a t i o n , t h e a n h y d r o u s f o r m y i e l d e d o n l y 1 0 % o f t h e d e s i r e d q u i n o l i n e , w h i l e i n t h e p r e s e n c e o f 5 0 % a q u e o u s s o l u t i o n a 4 0 % y i e l d w a s o b t a i n e d . F o r t h e l e s s v o l a t i l e , h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t a l d e h y d e s , t h e n a t u r e o f t h e s o l u t i o n , a q u e o u s o r n o t , d i d n o t r e fl e c t i n t h e y i e l d o f t h e c o r r e s p o n d i n g r i n g , f u r t h e r v e r i f y i n g t h e o b s e r v a t i o n . T h e a b o v e r e a c t i o n c o n d i t i o n s , s l i g h t l y m o d i fi e d b y u s i n g t o l u e n e i n s t e a d o f o - d i c h l o r o b e n z e n e i n a s e a l e d t u b e , w e r e a p p l i e d f o r a l i s t o f a l d e h y d e s a n d t h e r e s u l t s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 7 - 2 . A l t h o u g h t h e y i e l d s o f t h e c y c l i z e d p r o d u c t s a r e i n m o s t c a s e s l o w t o m o d e r a t e , t h e y s t i l l c o m p a r e w e l l w i t h t h e r e p o r t e d o n e s i n t h e p r e s e n c e o f R h c a t a l y s t . 3 5 I n t h e c a s e o f t h e h i g h e r a l i p h a t i c a l d e h y d e s n o n a n a l a n d d e c e n a l ( e n t r i e s 8 3 6 0 ( : ( K N H + H C H O t o l u s e e n a e l , e N d a t u Z b S e , O 4 _ C f ? ! ’ N F 1 a n d 9 ) t h e o b s e r v e d l o w y i e l d s a r e a t t r i b u t e d t o s t e r i c f a c t o r s , s i n c e t h e l o n g f a t t y c h a i n b l o c k s t h e a t t a c k o f t h e a r o m a t i c a m i n e . T a b l e 7 - 2 . F o r m a t i o n o f q u i n o l i n e r i n g s t h r o u g h t h e r m a l c y c l i z a t i o n w i t h v a r i o u s a l d e h y d e s 2 2 0 0 ° C , 2 4 h E n t r y R : 2 2 ? 1 H 9 0 2 C H 3 3 0 3 C H 3 C H 2 4 0 4 C H Z Z C H 3 0 5 C H 3 0 H Z C H 2 5 6 C H 3 ' ( C H 2 ) 2 4 0 7 C H 3 ' ( C H 2 ) 4 4 5 8 C H 3 ' ( C H 2 ) 7 1 0 9 C H 3 - ( C H 2 ) 4 - C H = C H — ( C H 2 ) 2 1 0 1 0 0 6 1 1 1 1 4 5 W e b e l i e v e t h a t t h e a f o r e m e n t i o n e d r e a c t i o n c o n d i t i o n s w o u l d a l l o w f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e q u i n o l i n e r i n g s a r o u n d t h e t r i a l d e h y d e c o r e . H o w e v e r , t h e r e s t o f t h e s y n t h e s i s w a s n o t f u r t h e r p u r s u e d d u e t o s e v e r a l p r o b l e m s f o r e s e e n f o r t h e p r e p a r a t i o n o f t r i a l d e h y d e 1 4 . I n p a r t i c u l a r , a c c o r d i n g t o t h e . 4 l r t e r a t u r e , 3 9 ’ 0 O H C . f - C H O Z 3 C H 0 0 0 0 1 4 2 5 F i g u r e 7 - 9 . T r i o x o a d a m a n t a n e f o r m o f a l d e h y d e 1 4 a s y s t e m l i k e t h a t w o u l d s p o n t a n e o u s l y c y c l i z e i n t o a t r i o x o a d a m a n t a n e s t r u c t u r e 2 5 , a s d e s c r i b e d i n F i g u r e 7 - 9 . A t t h i s p o i n t o u r s y n t h e t i c p l a n h a d t o b e m o d i f i e d s o t h a t t h e q u i n o l i n e r i n g s w o u l d b e c o n s t r u c t e d i n a s t e p w i s e m a n n e r w i t h o u t 3 6 1 u s i n g a C 3 - t r i a l d e h y d e . H o w e v e r a p a r a l l e l s y n t h e s i s , d e s c r i b e d b e l o w , s u c c e e d e d i n y i e l d i n g t h e d e s i r e d m o l e c u l e 7 a n d , t h e r e f o r e , t h i s a p p r o a c h w a s n o t f u r t h e r f o l l o w e d . T h e fi n a l s y n t h e s i s o f T M Q M i s i l l u s t r a t e d i n S c h e m e 7 - 1 0 . S t a r t i n g w i t h c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e q u i n a l d y l - c h l o r i d e 2 6 , t h e fi r s t s t e p i n v o l v e d t h e f o r m a t i o n o f t h e W e i n r e b a m i d e 2 7 . 4 1 M e t h y l a t i o n o f 2 7 w i t h M e L i i n T H F , a t 0 ° C y i e l d e d q u i n a l d y l m e t h y l k e t o n e 2 8 i n 7 5 % ( a t t e m p t s t o d i r e c t l y m e t h y l a t e 2 6 w i t h M e L i l e d t o v e r y l o w y i e l d s o f t h e d e s i r e d k e t o n e ) . E n o l a t e f o r m a t i o n u s i n g K H M D S o r N a I - I M D S a n d r e a c t i o n w i t h 2 - i o d o - m e t h y l q u i n o l i n e 2 9 y i e l d s t r i q u i n o l y d i n e k e t o n e 3 0 , w h i c h t h e n M e O . / O E O M L ' 0 e l N \ C l 6 N \ N ‘ O M e — > N \ / p y r i d i n e / | T H F , 0 ° C / 0 ° C , > 9 5 % 7 5 % 2 6 2 7 2 8 N N m B r N a I / A c e t o n e _ \ I K H M D S , E t Z O / r e f l u x , 8 5 % ’ / 0 ° C , 4 3 % 2 2 9 N H Z N H Z , K O H D i e t h y l e n e g l y c o l 2 0 0 ° C 8 2 % S c h e m e 7 - 1 0 . S y n t h e s i s o f T M Q M u n d e r g o e s a W o l f f - K i s h n e r r e d u c t i o n t o y i e l d T M Q M . T h e c o n v e r s i o n o f b r o m o - m e t h y l q u i n o l i n e 2 i n t o i t s i o d o - a n a l o g u e 2 9 w a s n e c e s s a r y , s i n c e 2 i s n o t s t a b l e u n d e r b a s i c c o n d i t i o n s , y i e l d i n g v e r y s m a l l a m o u n t s o f 3 0 . I n a d d i t i o n , a t t e m p t s t o u s e a n o t h e r b a s e ( L D A o r N a H ) , b e s i d e s K H M D S o r N a H M D S f o r t h e f o r m a t i o n o f 3 0 , a f f o r d e d v e r y l o w y i e l d s . F i n a l l y , a t t e m p t s t o r e d u c e k e t o n e 3 0 t o t h e d e s i r e d p r o d u c t u n d e r C l e m m e n s o n r e d u c t i o n c o n d i t i o n s l e d t o d e c o m p o s i t i o n o f t h e s t a r t i n g m a t e r i a l . 3 6 2 T M Q M w a s i s o l a t e d a s a l i g h t y e l l o w p o w d e r a n d w a s p u r e e n o u g h t o b e u s e d f o r s p e c t r o s c o p i c a s s a y s . 7 . 4 b C o m p l e x a t i o n a t t e m p t s u s i n g T M Q M H a v i n g T M Q M i n h a n d , s i m i l a r e x p e r i m e n t s a s t h o s e d e s c r i b e d f o r c o o r d i n a t i o n o f m e t a l i o n a n d c h i r a l a m i n e w i t h T M Q A a n d D Q B A w e r e c a r r i e d o u t . T h i s t i m e Z n ( C l O 4 ) 2 w a s u s e d a s t h e z i n c s o u r c e a n d , a s a l w a y s , r e a c t i o n s w e r e m o n i t o r e d b y U V - v i s , C D a n d N M R s p e c t r o s c o p y . T h e N M R r e s u l t s a s s h o w n i n F i g u r e 7 - 1 0 , w e r e v e r y s i m i l a r t o t h o s e o f t h e p r e v i o u s s y s t e m s , a s f a r a s t h e h o s t - m e t a l c o m p l e x f o r m a t i o n i s c o n c e r n e d . A f t e r t h e a d d i t i o n o f Z n “ , t h e w h o l e s p e c t r u m s h i f t e d d o w n f i e l d w i t h t h e a r o m a t i c p r o t o n s c l o s e t o t h e n i t r o g e n a f f e c t e d t h e m o s t . O n l y t h i s t i m e , u p o n a d d i t i o n o f R - C H E A t h e N M R w a s v e r y c l e a n , w i t h o n l y o n e s p e c i e s p r e s e n t ( C ) . T h e h o s t p e a k s s e e m t o m o v e s o m e h o w u p f i e l d b u t w i t h o u t g o i n g b a c k t o t h e o r i g i n a l , u n b o u n d h o s t s p e c t r u m . F u r t h e r m o r e , t h e c h i r a l a m i n e p e a k s h a v e m o v e d d o w n fi e l d , s i g n i fi c a n t l y . F o r e x a m p l e , t h e R - C H E A m e t h i n e p e a k h a s m o v e d f r o m 2 . 4 5 p p m ( E ) t o 3 . 4 5 p p m ( C ) u p o n a d d i t i o n t o t h e h o s t - m e t a l c o m p l e x . C o m p a r i n g s p e c t r a ( C ) a n d ( D ) i n F i g u r e 7 - 1 0 , w e c a n n o t i c e a ~ 1 p p m d o w n f i e l d s h i f t b e t w e e n t h e m e t h i n e o f t h e c h i r a l a m i n e p r e s e n t i n t h e h o s t - m e t a l c o m p l e x ( C ) a n d t h a t o f R - C H E A c o m p l e x e d w i t h Z n ( C l O 4 ) 4 ( D ) . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h i s c o u l d b e t h a t t h e c h i r a l a m i n e i n s p e c t r u m ( C ) i s i n fl u e n c e d b y t h e d e s h i e l d i n g c o n e o f t h e a r o m a t i c r i n g s , w h i c h s u p p o r t s t h e c a s e t h a t w e h a v e f o r m e d t h e h o s t - m e t a l - c h i r a l g u e s t c o m p l e x . H o w e v e r , t h e p r e s e n c e o f o n l y o n e m e t h y l e n e g r o u p o f 3 6 3 ° O Y 7 H \ ‘ C H 3 3 N H 2 5 2 4 9 6 8 7 A 1 4 6 8 5 2 9 , J J J ‘ l L i J U L 8 2 7 5 J o d i 3 ° L A 4 1 I l l I I I I I I I I I I T T I I I I T I I I I I I I I I I I T I T I I I I I I I I I I I I I I I I I I I T I I I I I I I T T I T I T T T I I I I I I I I I I I I I W I I T T I ' 9 . 0 8 . 0 7 . 0 6 . 0 5 . 0 4 . 0 3 . 0 2 . 0 1 . 0 P P m F i g u r e 7 - 1 0 . N M R s p e c t r a i n C D C I 3 o f : A . T M Q M ; B . T M Q M + 1 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 ; C . T M Q M + 1 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 1 e q u i v R - C H E A ; D . Z n ( C I O 4 ) 2 + ( 1 - 4 ) e q u i v R - C H E A ; E . F i - C H E A T M Q M a t ( C ) a g a i n s u g g e s t s t h e f o r m a t i o n o f a h i g h l y s y m m e t r i c , C 3 s y s t e m w i t h o u t a p r o p e l l e r c o n f o r m a t i o n . T h e o b t a i n e d d a t a s u g g e s t t h a t t h e T M Q M c a v i t y i s t o o o p e n a n d t h e r e f o r e , c o o r d i n a t i o n o f t h e c h i r a l m o l e c u l e d o e s n o t d i s r u p t t h e p r e f o r m e d C 3 s y m m e t r i c s y s t e m . A s w i t h a l l t h e p r e v i o u s s y s t e m s , t h e U V - v i s s p e c t r a c o u l d n e i t h e r c o n fi r m n o r r e f u t e t h e f o r m a t i o n o f a n a m i n e c o m p l e x . I n a d d i t i o n , i n a g r e e m e n t w i t h t h e N M R r e s u l t s t h a t i n d i c a t e a f o r m a t i o n o f a n o n - c h i r a l c o m p l e x , n o C D p e a k w a s p r e s e n t w h e n t h e s p e c t r u m w a s r e c o r d e d . T a b l e 7 - 3 d e s c r i b e s t h e v a r i o u s c o n d i t i o n s t r i e d t o y i e l d a 3 6 4 c h i r a l s p e c i e s . H o w e v e r , n o n e o f t h e a b o v e t r i a l s r e v e a l e d a n E C C D a c t i v e s p e c i e s . I n a n a t t e m p t t o i n v e s t i g a t e o t h e r p o s s i b l e c o n f o r m a t i o n s t h a t c o u l d l e a d t o i n d u c e d c h i r a l i t y t h e t e m p e r a t u r e o f t h e s y s t e m w a s v a r i e d f r o m — 4 0 ° C t o 5 0 ° C , h o w e v e r n o n e l e d t o a n y p o s i t i v e r e s u l t s . T a b l e 7 - 3 . C o m p l e x a t i o n a t t e m p t s u s i n g T M Q M u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s T M Q M i n S o l v e n t M e t a l S o u r c e C h i r a l C o m p o u n d 1 C H Z C I Z Z n ( C | 0 4 ) 2 R - C H E A 2 C H 2 C | 2 a n z R - C H E A 3 H e x a n e s a n z R - C H E A 4 H e x a n e s a n z S - C H E A 5 C H z C l z Z n B r 2 F i - C H E A A l t h o u g h T M Q M d i d n o t y i e l d a s u c c e s s f u l c h i r a l i t y r e p o r t e r , w e d e c i d e d t o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e c o m p l e x a t i o n o b s e r v e d i n o r d e r t o o b t a i n i n f o r m a t i o n t h a t w i l l p o t e n t i a l l y a l l o w u s t o o p t i m i z e o u r s y s t e m s . O n c e m o r e , t h e m e t h o d o f c h o i c e w a s N I V I R s p e c t r o s c o p y . I n o r d e r t o f u r t h e r i n v e s t i g a t e h o w e a c h p r o t o n o f t h e h o s t m o l e c u l e b e h a v e s i n t h e p r e s e n c e o f a c o o r d i n a t e d m e t a l , a s e r i e s o f D Q F - C O S Y e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t . I n p a r t i c u l a r , D Q F - C O S Y s p e c t r a o f b o t h f r e e T M Q M a n d T M Q M i n t h e p r e s e n c e o f Z n 2 + w e r e r e c o r d e d a n d c o m p a r e d w i t h t h o s e o f t h e T M Q M - Z n - c h i r a l a m i n e s o l u t i o n . T h e a n a l y s i s o f t h e s e s p e c t r a r e s u l t e d i n t h e a s s i g n m e n t o f e a c h N M R p r o t o n p e a k t o t h e c o r r e s p o n d i n g T M Q M p r o t o n , a n d t h e c u m u l a t i v e r e s u l t s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 7 - 4 . A f t e r t h e a d d i t i o n o f t h e c h i r a l a m i n e a l l t h e p r o t o n s a r e s h i f t e d b a c k u p fi e l d , b u t n o t t o t h e i r o r i g i n a l c h e m i c a l s h i f t s . H o w e v e r , i f w e c a l c u l a t e t h e a v e r a g e p p m f o r t h e f i r s t t w o f o r m s , t h a t i s t h e f r e e l i g a n d a n d t h e l i g a n d b o u n d j u s t t o Z n 2 + w e c a n e a s i l y 3 6 5 T a b l e 7 - 4 . N M R a s s i g n m e n t o f t h e T M Q M p r o t o n s u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s A . B . T M Q M + A v e r a g e A 8 1 B i b s - [ g a g s ) P r o t o n s T M Q M 1 e q u n v Z n ( C I O 4 ) 2 [ ( A + B ) / 2 ] [ B - A ] + 1 e q u i v R - C H E A 6 ( p p m ) 8 ( p p m ) 6 ( p p m ) 6 ( p p m ) 5 ( p p m ) H 1 7 . 8 8 8 . 4 2 8 . 1 5 0 . 5 4 8 . 2 1 H 2 7 . 2 9 7 . 7 8 7 . 5 3 0 . 4 9 7 . 5 5 H 3 7 . 6 1 7 . 8 8 7 . 7 5 0 . 2 7 7 . 8 2 H 4 7 . 4 2 7 . 6 3 7 . 5 3 0 . 2 7 7 . 8 2 H 5 7 . 6 5 7 . 8 3 7 . 7 4 0 . 1 8 7 . 7 5 H 6 8 . 0 0 8 . 1 3 8 . 0 7 0 . 1 3 8 . 0 8 H 7 3 . 1 3 3 . 2 5 3 . 1 9 0 . 1 2 3 . 2 0 H 8 3 . 4 7 3 . 6 0 3 . 5 4 0 . 1 3 3 . 4 9 n o t i c e t h a t t h e c o r r e s p o n d i n g n u m b e r s a r e s i m i l a r , i f n o t i d e n t i c a l , t o t h o s e o f t h e l a s t c o l u m n ( l i g a n d - m e t a l - c h i r a l a m i n e m i x t u r e ) . T h i s o b s e r v a t i o n s u g g e s t s t h a t p e r h a p s w h a t w e s o f a r t h o u g h t t o b e a l i g a n d - m e t a l - c h i r a l a m i n e c o m p l e x w a s n e v e r f o r m e d . T h e o b s e r v e d s p e c t r a c o u l d b e d u e t o a n e q u i l i b r i u m o f t w o , n o t d i s t i n g u i s h a b l e a c c o r d i n g t o N M R t i m e s c a l e , f o r m s o f t h e l i g a n d , f r e e a n d b o u n d t o t h e m e t a l . A t t h e s a m e t i m e , t h e p r o t o n s b e l o n g i n g t o t h e c h i r a l a m i n e a r e c o n s i d e r a b l y d e s h i e l d e d t o o , s u g g e s t i n g t h a t t h e a m i n e i s b o u n d t o t h e m e t a l . A n o t h e r e l e m e n t i n T a b l e 7 - 4 i s A 8 , w h i c h r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f d e s h i e l d i n g t h a t e a c h o f t h e T M Q M p r o t o n s “ e x p e r i e n c e s ” u p o n t h e c o o r d i n a t i o n t o t h e m e t a l . S h o w n m o r e c l e a r l y i n F i g u r e 7 - 1 1 , o n e c a n n o t i c e t h a t t h e p r o t o n s m e t a a n d p a r a t o t h e 3 6 6 0 . 6 0 . 5 ‘ 0 . 4 ‘ 0 . 3 ‘ 0 . 2 ‘ 0 . 1 * A 5 0 i r r 1 2 3 4 5 6 7 8 H . F i g u r e 7 - 1 1 . G r a p h i c a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e d e s h i e l d i n g e f f e c t ( A 5 ) o n e a c h o f t h e T M Q M p r o t o n s u p o n c o m p l e x a t i o n t o Z n + 2 q u i n o l i n e n i t r o g e n a r e t h e o n e s m o s t d e s h i e l d e d a n d t h e e f f e c t k e e p s d e c r e a s i n g a s w e g o a r o u n d t h e r i n g . F o r t h e m e t h y l e n e a n d t h e m e t h i n e p r o t o n s , n o s i g n i fi c a n t A 5 d i f f e r e n c e c a n b e d e t e c t e d . T h i s r e s u l t w a s n o t a n t i c i p a t e d s i n c e , a c c o r d i n g t o t h e e x p e c t e d c o m p l e x f o r m a t i o n ( F i g u r e 7 - 3 ) , p r o t o n s 6 a n d 7 s h o u l d b e t h e m o s t d e s h i e l d e d o n e s , b e i n g c l o s e r t o t h e m e t a l c a t i o n . O n t h e c o n t r a r y , w h a t t h e d a t a s u g g e s t i s t h a t a f t e r t h e l i g a n d - m e t a l c o m p l e x i s f o r m e d , p r o t o n s 1 , 2 a n d 3 f a l l i n t o t h e d e s h i e l d i n g c o n e o f t h e n e i g h b o r i n g q u i n o l i n e r i n g s , w h i l e t h e r e s t o f t h e m d o n o t “ f e e l ” s u c h a s t r o n g e f f e c t . A n o t h e r s u g g e s t i o n w o u l d b e t h a t , s i m i l a r t o t h e T M Q A c a s e , t h e r e i s a d i m e r f o r m e d , h o w e v e r a t t h i s p o i n t t h e r e i s n o t e n o u g h e v i d e n c e t o s u p p o r t t h a t . A s m e n t i o n e d b e f o r e , t h e D Q F - C O S Y r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e c h i r a l c o m p l e x o f l i g a n d - m e t a l - c h i r a l a m i n e w a s n e v e r f o r m e d ( e v e n i n a v e r y s m a l l p e r c e n t a g e ( ~ 5 % ) , s i n c e t h a t w o u l d b e e n o u g h t o p r o d u c e a C D s p e c t r u m ) . H o w e v e r , w h a t w e b e l i e v e h a p p e n s i n t h e s o l u t i o n i s t h e c o m p l e t e o r p a r t i a l d i s s o c i a t i o n o f t h e l i g a n d - m e t a l c o m p l e x u p o n a d d i t i o n o f t h e c h i r a l p r i m a r y a m i n e . T h e N M R d a t a s u g g e s t t h a t t h e 3 6 7 : r l h £ 3 3 0 1 1 1 M n o . 1 - 2 2 1 E F i g u r e 7 - 1 2 . N M R s p e c t r a i n C D C 1 3 o f : A . Q u i n o l i n e ; B . Z n ( C l O 4 ) 2 + 4 e q u i v q u i n o l i n e ; C . Z n ( C I O 4 ) 2 + 3 e q u i v q u i n o l i n e + 1 e q u i v F i - C H E A ; D . Z n ( C l O 4 ) 2 + 2 e q u i v q u i n o l i n e + 2 e q u i v R - C H E A ; E . Z n ( C I O 4 ) 2 + 1 e q u i v q u i n o l i n e + 3 e q u i v R - C H E A ; F . Z n ( C l O 4 ) 2 + 4 e q u i v F i - C H E A ; G . F i - C H E A m e t a l c a t i o n h a s a g r e a t e r a f f i n i t y f o r t h e i n c o m i n g p r i m a r y a m i n e t h a n f o r t h e s p 2 n i t r o g e n s o f t h e l i g a n d , i n o t h e r w o r d s t h e c h i r a l a m i n e , i n s t e a d o f c o o r d i n a t i n g t o t h e l i g a n d - m e t a l c o m p l e x i s a c t u a l l y b r e a k i n g i t u p , “ fi s h i n g “ t h e Z n 2 + o u t . S o , i t a p p e a r s t h a t w h a t w e o b s e r v e i s t h e a m i n e r e p l a c i n g o n e o r m o r e o f t h e q u i n o l i n e a r m s i n t h e c o o r d i n a t i o n s p h e r e o f z i n c . T h e c o o r d i n a t e d q u i n o l i n e a r m s c a n a l t e r n a t e w i t h t h e n o n - 3 6 8 c o o r d i n a t e d o n e s i n a n e q u i l i b r i u m t h a t i s t o o f a s t t o b e o b s e r v e d b y N M R . T h e r e f o r e , w h a t w e s e e c a n b e a n a v e r a g e o f t h e t w o q u i n o l i n e f o r m s , f r e e a n d b o u n d t o t h e m e t a l . . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e l a t t e r s u g g e s t i o n a n d d e t e r m i n e w h e t h e r s p 2 o r s p 3 n i t r o g e n s h a v e a g r e a t e r a f fi n i t y f o r Z n “ , t h e t i t r a t i o n d e s c r i b e d i n F i g u r e 7 - 1 2 w a s p e r f o r m e d . T h e i d e a w a s t o a l w a y s k e e p f o u r a v a i l a b l e l i g a n d s f o r e v e r y e q u i v a l e n t o f Z n ( C l O 4 ) 2 , c h a n g i n g o n l y t h e r a t i o o f q u i n o l i n e a n d R - C H E A m o l e c u l e s a v a i l a b l e a n d t h e r e s u l t s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 7 - 1 2 . M o v i n g d o w n f r o m ( B ) t o ( F ) , t h e e q u i v a l e n t s o f t h e q u i n o l i n e p r e s e n t a r e d e c r e a s i n g w h i l e t h o s e o f t h e c h i r a l a m i n e a r e i n c r e a s i n g . A f t e r t h e a d d i t i o n o f f o u r q u i n o l i n e r i n g s t o t h e m e t a l s o u r c e , t h e s p e c t r u m ( B ) h a s s h i f t e d d o w n fi e l d , c o m p a r e d t o t h e f r e e q u i n o l i n e ( A ) , a n d t h e a r o m a t i c p a t t e r n h a s c h a n g e d . A s o n e e q u i v a l e n t o f q u i n o l i n e w a s r e p l a c e d w i t h R - C H E A ( C ) , t h e a r o m a t i c p e a k s a l m o s t r e t u r n t o t h e i r o r i g i n a l c h e m i c a l s h i f t s ( A ) . A t t h e s a m e t i m e , t h e R - C I - I E A p e a k s , w i t h m o s t c h a r a c t e r i s t i c t h e m e t h i n e p r o t o n , a r e s h i f t e d c o n s i d e r a b l y d o w n f i e l d ( t h e m e t h i n e p r o t o n i s a l m o s t a t t h e s a m e p l a c e ~ 3 . 2 p p m a s i n s p e c t r u m ( C ) i n F i g u r e 7 - 1 2 ) . I n s p e c t r a ( D ) a n d ( E ) , a s t h e r a t i o o f t h e p r i m a r y a m i n e i n c r e a s e s , t h e q u i n o l i n e s p e c t r u m r e m a i n s t h e s a m e w h i l e t h e a m i n e p r o t o n s s h i f t u p fi e l d . W h e n n o q u i n o l i n e i s p r e s e n t , ( F ) , t h e p e a k s a r e e v e n m o r e u p fi e l d s h i f t e d b u t w i t h o u t g o i n g b a c k t o t h e f r e e a m i n e s p e c t r u m ( G ) . I n o r d e r t o s t u d y t h e b i n d i n g o f t h e m e t a l t o t h e q u i n o l i n e r i n g s o f T M Q M , w i t h o u t t h e p r e s e n c e o f t h e p r i m a r y a m i n e , t h e t i t r a t i o n d e s c r i b e d i n F i g u r e 7 - 1 3 w a s c a r r i e d o u t . I n t h i s c a s e a s p r e v i o u s l y , f o r r e a s o n s o f c o n v e n i e n c e , t h e m o d e l s y s t e m o f Z n ( C l O 4 ) 2 a n d q u i n o l i n e ( i n s t e a d o f T M Q M ) w a s s t u d i e d . I n a 1 : 1 m i x t u r e o f q u i n o l i n e a n d z i n c , ( B ) , t h e a r o m a t i c p a t t e r n c h a n g e s a n d a l l t h e p e a k s s h i f t d o w n fi e l d . U p o n a d d i t i o n o f o n e 3 6 9 L — C 3 4 6 1 7 5 2 D 3 4 6 1 7 5 2 3 E 7 4 5 5 2 1 . T T T I I T I V T I T I I I I I 1 i T H i I I I T fl I H fl I I T ‘ l — T ] l i l i l e l i l l T i T I i l i T 9 . 2 9 . 0 8 . 8 8 . 6 8 . 4 8 . 2 8 . 0 7 . 8 7 . 6 7 . 4 7 . 2 9 1 3 ' “ I F i g u r e 7 - 1 3 . N M R s p e c t r a i n C D C I 3 o f : A . Q u i n o l i n e ; B . Z n ( C I O 4 ) 2 + 1 e q u i v q u i n o l i n e ; C . Z n ( C I O 4 ) 2 + 2 e q u i v q u i n o l i n e ; D . Z n ( C I O 4 ) 2 + 3 e q u i v q u i n o l i n e ; E . Z n ( C l O 4 ) 2 + 4 e q u i v q u i n o l i n e m o r e e q u i v a l e n t o f q u i n o l i n e , ( C ) , t h e s p e c t r u m m o v e s b a c k u p fi e l d , a n d k e e p s m o v i n g a s a n e x t r a q u i n o l i n e e q u i v a l e n t i s a d d e d , ( D ) , w i t h o u t s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e i n t h e a r o m a t i c p a t t e r n . A f t e r t h e a d d i t i o n o f a f o u r t h e q u i v a l e n t , ( E ) , t h e r e i s a l m o s t n o d i f f e r e n c e i n t h e s p e c t r u m . I t a p p e a r s t h a t t h e m o r e q u i n o l i n e y o u p u t i n t h e s o l u t i o n t h e l e s s d e s h i e l d i n g e f f e c t t h e p r o t o n s “ e x p e r i e n c e ” f r o m t h e c o o r d i n a t i o n o f t h e m e t a l c a t i o n . B u t , f r o m 3 7 0 t h e s e r e s u l t s , w e c a n n o t r e a l l y c o n c l u d e w h e t h e r t h e f o u r t h q u i n o l i n e e q u i v a l e n t i s b o u n d , r e s u l t i n g i n o n l y s m a l l d i f f e r e n c e s b e t w e e n s p e c t r a ( D ) a n d ( E ) , o r t h e r e i s a r a p i d , a c c o r d i n g t o t h e N M R t i m e s c a l e , l i g a n d e x c h a n g e a n d w h a t w e c a n a c t u a l l y o b s e r v e i s a n a v e r a g e o f t h e b o u n d a n d u n b o u n d q u i n o l i n e m o i e t i e s . F i n a l l y , i n a n a t t e m p t t o d e t e r m i n e t h e o r i g i n o f t h e d o w n f i e l d s h i f t i n g o f t h e R - C H E A p r o t o n s u p o n a d d i t i o n t o t h e T M Q M a n d / o r m e t a l s o l u t i o n , t h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d i n F i g u r e 7 - 1 4 w e r e c a r r i e d o u t . I n p a r t i c u l a r , w h a t t h e s e e x p e r i m e n t s t r y t o c l a r i f y i s w h e t h e r t h e d e s h i e l d i n g n o t i c e d w i t h t h e c h i r a l a m i n e ’ s p r o t o n s i s d u e t o t h e f o r m a t i o n o f a m e t a l c o m p l e x o r i s t h e r e s u l t o f t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e a m i n e m o i e t y a n d t h e r t s y s t e m o f t h e q u i n o l i n e r i n g . C o m p a r i n g s p e c t r a ( A ) a n d ( B ) w e n o t i c e t h a t t h e m e t h i n e p r o t o n o f R - C H E A s h i f t s ~ 0 . 3 p p m d o w n f i e l d u p o n a d d i t i o n o f 1 e q u i v o f z i n c . I f t h e m o l e c u l a r r a t i o o f a m i n e t o z i n c i s f o u r ( C ) , t h e d o w n fi e l d s h i f t i s g r e a t e r ( ~ 0 . 4 p p m ) w h i l e , i f t h e R - C I - I E A i s i n g r e a t e x c e s s ( 8 e q u i v , ( D ) ) t h e s p e c t r u m d o e s n o t c h a n g e . S o , j u s t i n t h e p r e s e n c e o f t h e m e t a l c a t i o n t h e m e t h i n e p r o t o n n e v e r r e a c h e s a n y w h e r e c l o s e t o 3 . 2 p p m , w h e r e i t a p p e a r s i n t h e o r i g i n a l T M Q M s p e c t r u m ( G ) . B u t , u p o n a d d i t i o n o f 1 e q u i v o f q u i n o l i n e , t h e m e t h i n e p r o t o n s h i f t s a l l t h e w a y d o w n t o 3 . 2 p p m , v e r y c l o s e t o s p e c t r u m ( G ) . S o , a l t h o u g h i t i s c l e a r t h a t o n l y 1 e q u i v o f q u i n o l i n e c a n m a k e t h e d i f f e r e n c e a s f a r a s t h e d e s h i e l d i n g i s c o n c e r n e d , t h e r e i s s t i l l t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e q u i n o l i n e i s c o o r d i n a t e d t o t h e m e t a l a n d , t h e r e f o r e , c l o s e e n o u g h t o t h e R - C H E A - m e t a l c o m p l e x t o c a u s e t h e d o w n f i e l d s h i f t . T h e r e f o r e , s p e c t r u m ( F ) w a s t a k e n s h o w i n g R - C H E A i n t h e p r e s e n c e o f 1 e q u i v o f q u i n o l i n e , w i t h o u t a n y m e t a l b r i n g i n g t h e t w o m o i e t i e s c l o s e t o g e t h e r . W h a t i t s h o w s i s a d o w n fi e l d s h i f t o f t h e m e t h i n e p r o t o n o f ~ 0 . 3 p p m c o m p a r e d w i t h ( A ) , t h e f r e e a m i n e . A l t h o u g h b y i t s e l f i t d o e s n o t l o o k l i k e a n 3 7 1 1 N H 2 ‘ L E L M B M U N — c 1 2 . J - . 1 M L . D M L E M 7 L ” . 7 2 “ ; w F 1 i r 1 . 1 1 M ; c . - - ‘ A U L 1 0 . 0 9 . 0 8 . 0 7 . 0 6 . 0 5 . 0 4 . 0 3 . 0 2 . 0 1 . 0 m m F i g u r e 7 - 1 4 . N M R s p e c t r a i n C D C I 3 o f : A . R - C H E A ; B . Z n ( C l O 4 ) 2 + 1 e q u i v F i - C H E A ; C . Z n ( C l O 4 ) 2 + 4 e q u i v F i - C H E A ; D . Z n ( C I O 4 ) 2 + 8 e q u i v R - C H E A ; E . Z n ( C I O 4 ) 2 + 1 e q u i v R - C H E A + 1 e q u i v q u i n o l i n e ; F . Q u i n o l i n e + 1 e q u i v F i - C H E A ; G . T M Q M + 1 e q u i v Z n ( C l O 4 ) 2 + 1 e q u i v R - C H E A . 3 7 2 i m p o r t a n t s h i f t , i f y o u c o m b i n e t h e d e s h i e l d i n g e f f e c t t h e m e t h i n e f e e l s f r o m b o t h t h e m e t a l ( ( B ) , ~ 0 . 3 p p m ) a n d t h e q u i n o l i n e ( ( F ) , ~ 0 . 3 p p m ) y o u g e t a n o v e r a l l s h i f t o f ~ 0 . 6 p p m , w h i c h w o u l d r e s u l t i n a s p e c t r u m v e r y s i m i l a r t o ( G ) . T h e f a c t t h a t t h e p r e s e n c e o f a n e q u i v a l e n t o f q u i n o l i n e e q u i v a l e n t c a n s h i f t t h e R - C H E A 1 H N M R d o w n f i e l d s u g g e s t s a c a s e o f n - c a t i o n i n t e r a c t i o n s . I t a p p e a r s t h a t t h e c h i r a l a m i n e , m o s t p r o b a b l y i n a p r o t o n a t e d s t a t e i n s o l u t i o n h a s a n a f fi n i t y f o r t h e r t - 1 1 1 1 8 0 1 L W W L P P M F i g u r e 7 - 1 5 . N M R s p e c t r a i n C D C I 3 o f : A . H - C H E A + 1 e q u i v b e n z e n e ; B . R - C H E A ; C . R - C H E A + 1 e q u i v q u i n o l i n e . a r o m a t i c s y s t e m o f q u i n o l i n e . T o v e r i f y t h a t t h i s , t h e N M R o f R - C H E A i n t h e p r e s e n c e o f o n l y 1 e q u i v o f a n i n e r t a r o m a t i c r i n g l i k e b e n z e n e w a s t a k e n ( F i g u r e 7 - 1 5 ) . T h e 3 7 3 s p e c t r u m ( A ) w a s v e r y s i m i l a r t o t h a t o f R - C H E A i n t h e p r e s e n c e o f q u i n o l i n e ( C ) s h o w i n g t h a t i n t h e p r e s e n c e o f a n y a r o m a t i c c o m p o u n d t h e p e a k s o f R - C H E A s h i f t d o w n fi e l d , e v e n i n t h e a b s e n c e o f a m e t a l c a t i o n . S i n c e t h e i n t e r a c t i o n i s p r e s e n t r e g a r d l e s s o f t h e n a t u r e o f t h e a r o m a t i c r i n g t h e r t - c a t i o n c o o r d i n a t i o n e x p l a n a t i o n s e e m s 4 2 a n d a r e p l a u s i b l e . I n t e r a c t i o n s l i k e t h i s a r e v e r y c o m m o n i n b i o l o g i c a l s y s t e m s , b e l i e v e d t o c o n t r i b u t e t o t h e s t a b i l i t y o f p r o t e i n s . A l l t h e a b o v e N I V H R e x p e r i m e n t s , a l t h o u g h v e r y i n t e r e s t i n g , d o n o t a l l o w u s t o c o n fi d e n t l y c l a i m t h a t a t a n y t i m e t h e T M Q M - m e t a l - c h i r a l a m i n e c o m p l e x w a s f o r m e d . H o w e v e r , t h e e x p l a n a t i o n t h a t t h e i n c o m i n g c h i r a l a m i n e e x t r a c t s t h e m e t a l f r o m t h e a l r e a d y f o r m e d l i g a n d - m e t a l c o m p l e x i s s t i l l v a l i d . I n a n a t t e m p t t o i n v e s t i g a t e t h e g e o m e t r y o f t h e T M Q M - Z n 2 + c o m p l e x f o r m e d b e f o r e t h e a d d i t i o n o f a n y c h i r a l a m i n e , c r y s t a l l i z a t i o n a t t e m p t s w e r e p u r s u e d . T h e s y s t e m i s n o t h a r d t o c r y s t a l l i z e ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) g i v i n g r e l a t i v e l y g o o d q u a l i t y c r y s t a l s . H o w e v e r , t h e c r y s t a l s w e r e n o t s t a b l e d u r i n g t h e d a t a c o l l e c t i o n . A f t e r s e v e r a l a t t e m p t s i t w a s f o u n d t h a t f r e e z i n g t h e c r y s t a l s a t — 4 0 0 C w a s e s s e n t i a l a n d t h e s t r u c t u r e s h o w n i n F i g u r e 7 - 1 6 w a s d e t e r m i n e d . U n f o r t u n a t e l y , t h e c r y s t a l t h a t w a s p i c k e d w a s n o t t h e l i g a n d - m e t a l c o m p l e x ( a s s u m i n g t h a t t h e c o m p l e x i s a c t u a l l y f o r m e d , a s o u r N M R d a t a s u g g e s t ) . W h a t t h e X - r a y s r e v e a l e d w a s a f r e e f o r m o f T M Q M i n t h e p r e s e n c e o f o n e w a t e r a n d o n e c h l o r o f o r m m o l e c u l e a s w e l l a s t w o p e r c h l o r a t e a n i o n s . A s s h o w n i n F i g u r e 7 1 6 , t w o o f t h e T M Q M q u i n o l i n e a r m s h y d r o g e n b o n d w i t h e a c h o t h e r , w h i l e t h e t h i r d q u i n o l i n e n i t r o g e n i s i n t e r a c t i n g w i t h t h e w a t e r m o l e c u l e . I n t u r n t h e w a t e r h y d r o g e n b o n d s w i t h o n e o f t h e 3 7 4 o x y g e n s o f t h e p e r c h l o r a t e , w h i c h i s i n c l o s e t o t h e b o u n d c h l o r o f o r m m o l e c u l e . A c t i n g a s a c o u n t e r a n i o n a n o t h e r p e r c h l o r a t e a n i o n h a s b e e n c r y s t a l l i z e d i n t h e v i c i n i t y . R e d : O x y g e n B l u e : N i t r o g e n : C h l o r i n e F i g u r e 7 - 1 6 . C r y s t a l s t r u c t u r e o f [ T M Q M H J 2 ( 0 1 0 , ) ; 2 H 2 0 C H C I ; A l t h o u g h t h e f a c t t h a t n o m e t a l w a s p r e s e n t i n t h i s c r y s t a l w a s d i s a p p o i n t i n g , s o m e i n t e r e s t i n g i n f o r m a t i o n c o u l d s t i l l b e d e r i v e d f r o m t h i s c r y s t a l s t r u c t u r e . D u r i n g t h e s t u d i e s w i t h l i g a n d T M Q M , t h e p o s s i b i l i t y o f h a v i n g t h e q u i n o l i n e n i t r o g e n s p r o t o n a t e d w a s c o n s i d e r e d a n d e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d w i t h t h e a d d i t i o n o f a b a s e ( N 3 2 C O 3 ) , h o w e v e r N M R d i d n o t e x h i b i t a n y e v i d e n c e o f a l i g a n d - m e t a l c o m p l e x . S i n c e t h e s y s t e m a p p e a r s t o b e a m e n a b l e t o c r y s t a l l o g r a p h y , m o r e a t t e m p t s s h o u l d b e c a r r i e d o u t i n t h e f u t u r e i n o r d e r t o o b t a i n m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t t h e T M Q M s y s t e m . 7 . 5 A t t e m p t s t o t r a n s f e r c h i r a l i t y t h r o u g h S c h i f f b a s e f o r m a t i o n 3 7 5 F i g u r e 7 - 1 7 . T r a n s f e r o f c h i r a l i t y t h r o u g h S c h i f f b a s e f o r m a t i o n A s m e n t i o n e d i n t h e i n t r o d u c t i o n , t h e g o a l o f t h i s p r o j e c t i s t o i n d u c e t h e c h i r a l i t y o f a g u e s t m o l e c u l e t o a n a c h i r a l h o s t w i t h o u t t h e n e e d o f d e r i v a t i z a t i o n , m e a n i n g w i t h o u t p e r f o r m i n g a n y c h e m i c a l m a n i p u l a t i o n s o n t h e c h i r a l m o l e c u l e , d e p e n d i n g o n l y o n c o o r d i n a t i o n c h e m i s t r y . H o w e v e r , s i n c e d u r i n g t h e s y n t h e s i s o f T M Q M w e c a m e a c r o s s k e t o n e 3 0 w e t h o u g h t t h a t w e c o u l d c o m b i n e i t w i t h a c h i r a l a m i n e , l e a d i n g t o a c h i r a l i m i n e f o r m a t i o n 3 1 . S u c h a m o l e c u l e , u p o n c o o r d i n a t i o n w i t h a m e t a l c e n t e r w o u l d l e a d t o a d i a s t e r e o m e r i c p a i r . I f o n e d i a s t e r e o m e r i s e n e r g e t i c a l l y f a v o r e d i t w o u l d y i e l d a d i s t i n c t E C C D s p e c t r u m . 3 ' 8 ’ 4 3 ' ” H o w e v e r , a p o t e n t i a l p r o b l e m w i t h t h i s a p p r o a c h i s t h a t n o t a l l k i n d s o f i m i n e s a r e i s o l a b l e . I n f a c t , m o s t l y s y s t e m s i n v o l v i n g a r o m a t i c a m i n e s T a b l e 7 - 5 . A t t e m p t s f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n u s i n g k e t o n e 3 0 R e a c t i o n C o n d i t i o n s R e s u l t 1 1 e q u i v . R - C H E A , H e x a n e s , N a S O 4 ( x s ) , 5 0 ° C , 1 h N o R e a c t i o n 1 e q u i v . R - C H E A , C H Z C I Z , N a S O 4 ( x s ) , R T , 2 h N o R e a c t i o n 1 e q u i v . R - C H E A , B e n z e n e , N a S O 4 ( x s ) , r e f l u x , 2 h N o R e a c t i o n 2 e q u i v . R - C H E A , B e n z e n e , D e a n - S t a r k t r a p , r e f l u x o / n N o R e a c t i o n 1 e q u i v . R - C H E A , o - C l z - C 5 H 4 , r e f l u x , 2 d a y s N o R e a c t i o n 3 e q u i v . R - C H E A , 0 ° C , 0 . 6 e q u i v . T i C I 4 / p e n t , r e f l u x 1 2 h N o R e a c t i o n 4 0 e q u i v . R - C H E A , D E G , K O H ( x s ) , 1 8 0 ° C , 2 h N o R e a c t i o n 4 0 e q u i v . A l a - M e - e s t e r H C I , D E G , K O H ( x s ) , 1 8 0 ° C , 5 h N o R e a c t i o n ( D Q V O D U ‘ I b O D N 4 0 e q u i v . R - C H E A , o - C l z - C S H M e q u i v . p - T s O H , r e f l u x 5 h N o R e a c t i o n 3 7 6 r e a c t e d W i t h 5 e q u i v o f R C H E A i n t e p r e s e n c e 0 a F i g u r e 7 4 8 : L e s s s t e r i c a l l y a n d / o r a r o m a t i c a l d e h y d e s o r k e t o n e s h a v e b e e n i s o l a t e d . M o s t i m i n e s , f o r m f r o m a l i p h a t i c m o l e c u l e s , h y d r o l i z e r e a d i l y a n d d o n o t s u r v i v e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y . ” 3 7 T h e f o r m a t i o n o f a n i m i n e w i t h a k e t o n e i s m u c h m o r e c h a l l e n g i n g t h a n w e a n t i c i p a t e d . U s i n g k e t o n e 3 0 a n d R - C I - I E A , s e v e r a l n e u t r a l a n d a c i d i c c o n d i t i o n s w e r e t r i e d , a s s u m m a r i z e d i n T a b l e 7 - 5 . D u r i n g t h e f i r s t a t t e m p t s , a 1 : 1 r a t i o o f t h e k e t o n e a n d t h e a m i n e w a s u s e d , b u t a c c o r d i n g t o l i t e r a t u r e 4 6 i n o r d e r t o f o r m a n i m i n e f r o m a k e t o n e " u - V I — - . w a t l e a s t 3 e q u i v o f t h e a m i n e a r e n e e d e d . H o w e v e r , e v e n u n d e r r e p o r t e d c o n d i t i o n s ( e n t r y 6 , T a b l e 7 - 5 ) , n o i m i n e w a s i s o l a t e d . S u r p r i s i n g l y , e v e n c o n d i t i o n s v e r y s i m i l a r t o t h o s e o f t h e W o l f f - K i s c h n e r r e d u c t i o n ( e n t r i e s 7 a n d 8 , T a b l e 7 - 5 ) , w h i c h w o r k e d f o r t h e r e d u c t i o n o f 3 0 , d i d n o t y i e l d a n i m i n e m o i e t y , e i t h e r w i t h R - C H E A o r a l a n i n e m e t h y l e s t e r . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n i s t h a t k e t o n e 3 0 i s t o o s t e r i c a l l y h i n d e r e d . I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e i f s t e r i c s i s w h a t p r e v e n t s O N N t h e i m i n e f o r m a t i o n , k e t o n e 3 2 ( F i g u r e 7 - 1 8 ) w a s 0 / I / Q 3 2 L e w i s a c i d c a t a l y s t , T i C l 4 . 4 6 T h e r e a c t i o n w a s s t i r r e d h i n d e r e d k e t o n e 3 2 a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 h a n d t h e n r e fl u x e d o v e r n i g h t , b u t s t i l l o n l y s t a r t i n g m a t e r i a l w a s p r e s e n t . T h e r e f o r e , i t a p p e a r s t h a t s t e r i c s i s n o t w h a t p r e v e n t s t h e f o r m a t i o n o f t h e k e t o - i m i n e . I t i s m o r e p r o b a b l e t h a t , e v e n i f t h e i m i n e i s f o r m e d i t h y d r o l y z e s d u r i n g t h e r e a c t i o n w o r k u p . F i g u r e 7 - 1 9 . A l d e h y d i c s y n t h e t i c t a r g e t s 3 7 7 C \ Q W C I S m , + H O ’ \ T H F , r e f l u x o v e r n i g h t w N \ “ ’ Y N ‘ | \ / 3 6 3 6 ’ 3 7 t h e f o r m a t i o n o f a n i m i n e f r o m a n a l d e h y d e i s A c c o r d i n g t o r e p o r t e d l i t e r a t u r e m u c h e a s i e r t h a n f r o m a k e t o n e . T h e r e f o r e , i t w a s d e c i d e d t o p u r s u e t h e s y n t h e s i s o f c h r o m o p h o r i c a l d e h y d e s , l i k e t h o s e p r e s e n t e d i n F i g u r e 7 - 1 9 . I n a s i m i l a r f a s h i o n a s b e f o r e , u p o n i m i n e f o r m a t i o n w i t h a c h i r a l a m i n e a n d m e t a l c o o r d i n a t i o n t h e c o m p l e x c a n a d o p t a c h i r a l c o n f o r m a t i o n w h i c h w o u l d g i v e r i s e t o a n E C C D s p e c t r u m . X S N 8 2 C 0 3 , 9 2 ° / o 2 3 0 5 O N \ N N \ E t O H , N a B H 4 _ a ) ? m r e f l u x 2 h O H 3 7 S c h e m e 7 - 1 1 . T o w a r d s t h e s y n t h e s i s o f a l d e h y d e 3 3 T h e f i r s t a t t e m p t e d s y n t h e s i s o f a l d e h y d e 3 3 g o e s t h r o u g h a l c o h o l 3 7 , t h e s y n t h e s i s o f w h i c h i s p r e s e n t e d i n S c h e m e 7 - 1 1 . T h e c o m b i n a t i o n o f 2 - b r o m o q u i n o l i n e 2 w i t h 0 . 5 e q u i v o f g l y c i n e h y d r o c h l o r i d e e t h y l e s t e r 3 5 , u n d e r b a s i c c o n d i t i o n s g a v e d i m e t h y l q u i n o l i n e e t h y l e s t e r a m i n e 3 6 i n a n e x c e l l e n t y i e l d . A f t e r s e v e r a l u n s u c c e s s f u l a t t e m p t s t o r e d u c e 3 6 w i t h D I B A L o r L A H , t h e r e d u c t i o n w a s fi n a l l y c a r r i e d o u t w i t h N a B H . ; , g i v i n g a l c o h o l 3 7 i n q u a n t i t a t i v e y i e l d . ( T h e o r i g i n a l p l a n w a s t o o x i d i z e t h e a l c o h o l d i r e c t l y t o t h e d e s i r e d a l d e h y d e 3 3 , b u t t h e a t t e m p t w i t h D I B A L a t l o w t e m p e r a t u r e ( - 7 8 ° C ) f a i l e d . ) H a v i n g a l c o h o l 3 7 i n h a n d , a l d e h y d e 3 3 w a s j u s t a n o x i d a t i o n a w a y b u t , o n c e a g a i n , t h i n g s w e r e m u c h m o r e c h a l l e n g i n g t h a n i t w a s a n t i c i p a t e d . T a b l e 7 - 6 p r e s e n t s a l l t h e a t t e m p t s t h a t w e r e c a r r i e d o u t f o r t h e o x i d a t i o n o f 3 7 t o a l d e h y d e 3 3 . T h e f i r s t t w o t r i a l s i n c l u d e d a D e s s - M a r t i n o x i d a t i o n , b u t , s u r p r i s i n g l y , w h a t w a s m o s t l y o b t a i n e d , b o t h 3 7 8 t i m e s , w a s q u i n o l i n e c a r b o x a l d e h y d e 3 8 w i t h o u t e v e n a t r a c e o f 3 3 . V e r y s i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d d u r i n g a P C C o x i d a t i o n 4 7 . S i m i l a r l y , b o t h T P A P 4 8 ' 5 0 a n d D o c s " 5 2 o x i d a t i o n s r e s u l t e d i n v e r y m e s s y r e a c t i o n s , w i t h o u t a n y d e s i r e d p r o d u c t p r e s e n t b u t , a l s o , w i t h o u t y i e l d i n g 3 8 . ( N o t i c e t h a t t h e D C C r e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t u n d e r s p e c i a l , n e u t r a l c o n d i t i o n s , i n t h e p r e s e n c e o f b o t h p y r i d i n e a n d T F A . ) W h a t f o l l o w e d w a s a D o e r i n g - P a r i k h o x i d a t i o n , w h i c h a g a i n l e d t o 3 8 , w h i l e a S w e m o x i d a t i o n a t - 7 8 ° C r e s u l t e d i n r e c o v e r e d s t a r t i n g m a t e r i a l . W h e n t h e t e m p e r a t u r e w a s r a i s e d t o - 3 0 ° C , t h e s t a r t i n g m a t e r i a l w a s c o n s u m e d b u t t h e o n l y p r o d u c t p r e s e n t w a s t h e q u i n o l i n e c a r b o x a l d e h y d e 3 8 , a s i n m o s t o f t h e p r e v i o u s o x i d a t i o n a t t e m p t s . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w h e n a v a r i a t i o n o f t h e S w e m o x i d a t i o n a s r e p o r t e d b y G i a c o m e l l i a n d c o w o r k e r s 4 3 w a s t r i e d ( T a b l e 7 - 6 , e n t r y 9 ) . T a b l e 7 - 6 . A t t e m p t s t o r t h e o x i d a t i o n o f a l c o h o l 3 7 O / / / / / K ‘ C Y . 0 “ H 3 3 3 8 3 7 R e a c t i o n C o n d i t i o n s R e s u l t s 1 D M P , C H Z C I Z , 0 ° C , p y , R T , 1 h > 7 0 % ( 3 8 ) 2 D M P , C H Z C I Z , 0 ° C , p y , R T , 3 0 m i n M o s t l y ( 3 8 ) 3 F C C , c e l i t e , C H Z C I Z , R T , 2 0 m i n ( 3 8 ) , c l e a n 4 C H Z C I 2 , N M O , T P A P ( c a t ) , R T , 1 0 m i n N o p d t / S M / ( 3 8 ) 5 D M S O / B e n z , D C C , p y , T F A , R T , 1 h N o p d t / S M / ( 3 8 ) 6 D M S O , i - P e r E t , S O a P y r M o s t l y ( 3 8 ) 7 ( C O C I ) 2 , D M S O , - 7 8 ° C , E t a N , - 3 0 ° C , 3 0 m i n N o r e a c t i o n 8 ( C O C I ) 2 , D M S O , - 3 0 ° C , E t a N , R T , 3 0 m i n ( 3 8 ) , c l e a n 9 D M S O , T C T , - 3 0 ° C , E t 3 N , R T , 3 0 m i n N o r e a c t i o n 3 7 9 A t t h e s a m e t i m e , s i n c e t h e o x i d a t i o n a t t e m p t s w e r e n o t s u c c e s s f u l , a n o t h e r a p p r o a c h f o r t h e s y n t h e s i s o f a l d e h y d e 3 3 w a s f o l l o w e d . A s s h o w n i n S c h e m e 7 - 1 2 , t h e c o m b i n a t i o n o f 2 - b r o m o - q u i n o l i n e 2 w i t h a m i n o a c e t a l d e h y d e d i m e t h y l a c e t a l 3 9 i n t h e p r e s e n c e o f s o d i u m c a r b o n a t e y i e l d e d t h e d e s i r e d a c e t a l 4 0 ( 4 6 % ) a s w e l l a s a c e t a l 4 1 ( 4 3 % ) . O n c e a g a i n o n e s t e p b e f o r e \ O a l d e h y d e 3 3 , s e v e r a l a t t e m p t s a t t h e m a r + H Z N / z \ \ 2 3 9 h y d r o l y s i s o f d i m e t h y l a c e t a l 4 0 w e r e H F f l c a r r i e d o u t , a s d e s c r i b e d i n T a b l e 7 - 7 . T ' r e u x o / n A q u i c k s e a r c h t h r o u g h t h e l i t e r a t u r e N — N r e v e a l s t h a t m o s t a c e t a l s c a n b e N * 9 ‘ N H c m + / w / K r “ o h y d r o l y z e d b a c k t o t h e c o r r e s p o n d i n g \ 4 0 , 4 6 ° / . 0 \ 4 1 , 4 3 ° / . a l d e h y d e s e v e n u n d e r m i l d a c i d i c S c h e m e 7 - 1 2 . S y n t h e s i s o f a c e t a l 4 0 c o n d i t i o n s . 5 3 ' 5 4 t h e f i r s t h y d r o l y s i s a t t e m p t s i n v o l v e d t h e u s e o f F o l l o w i n g s e v e r a l r e f e r e n c e s , T F A , e i t h e r a t r o o m t e m p e r a t u r e o r a t 0 ° C . I n t h e fi r s t c a s e , w h a t w a s r e c o v e r e d w a s t h e s t a r t i n g m a t e r i a l 4 0 , w h i l e t h e c o l d r e a c t i o n r e s u l t e d i n a v e r y m e s s y N M R w i t h o u t a n y a l d e h y d e p e a k s p r e s e n t , w h i c h s u g g e s t e d t h a t e v e n i f t h e a l d e h y d e w a s f o r m e d , i t m o s t p r o b a b l y p o l y m e r i z e d u n d e r t h e s t r o n g a c i d i c c o n d i t i o n s . A n a d d i t i o n a l a t t e m p t w a s p e r f o r m e d , t h i s t i m e b y u s i n g T C A ( t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ) , a m i l d e r a c i d , i n a m i x t u r e o f T H F a n d w a t e r , f o r 1 . 5 h a t r o o m t e m p e r a t u r e . O n c e m o r e , t h i s r e a c t i o n l e d t o a d e c o m p o s i t i o n , w i t h n o a l d e h y d e p e a k p r e s e n t i n t h e N M R s p e c t r u m . A s e c o n d a p p r o a c h i n v o l v e d t h e u s e o f a n a c i d i c r e s i n , A m b e r l y s t - 1 5 5 5 ’ 5 6 B u t , a s s h o w n i n T a b l e 7 - 7 , a l l t h e i n i t i a l A m b e r l y s t a t t e m p t s a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e r e s u l t e d i n 3 8 0 T a b l e 7 - 7 . A t t e m p t s f o r t h e h y d r o l y s i s q t a c e t a l 4 0 r d ? N - N \ N \ / N \ W y e — ’ C L ) ” N — N \ / H r H 0 r d ? 0 \ 4 o 3 3 R e a c t i o n C o n d i t i o n s R e s u l t 1 5 0 % T F A / H Z O , C H C I a , O ° C - R T , 1 . 5 h N o R e a c t i o n 2 5 0 % T F A / H Z O , C H C I a , 0 ° C - R T , 2 4 h N o R e a c t i o n 3 T F A , C H C I 3 , R T , 2 h M e s s y N M R , p o l y m e r 4 8 0 % T F A / H Z O , C H C I 3 , R T N o R e a c t i o n 5 A c e t o n e / H 2 0 , A m b e r l y s t 1 5 , R T , 2 0 m i n N o R e a c t i o n 6 1 N A c O H / M e C N , R T , 2 d a y s N o R e a c t i o n 7 1 0 % H C l / H Z O , M e C N A l d e h y d e p e a k , n o C H 2 8 A c e t o n e / H 2 0 , A m b e r l y s t 1 5 , 1 0 e q R - M B A , R T , 2 h N o R e a c t i o n 9 1 N A c O H / M e C N , 5 e q R - M B A , R T , 2 d a y s N o R e a c t i o n 1 0 A c e t o n e / H 2 0 , A m b e r l y s t 1 5 , s e a l e d t u b e , 7 5 ° C , 3 h M e s s y N M R , p o l y m e r 1 1 S i l i c a g e l / H 2 0 , C H Z C I Z , R T , o / n N o R e a c t i o n 1 2 N H 4 C I , / H 2 0 , D M F , R T , o / n M e s s y , n o a l d e h y d e 1 3 T C A , T H F / H Z O , R T , 1 . 5 h M e s s y , n o a l d e h y d e 1 4 m C P B A , C H Z C I Z , R T , 3 h , t h e n H C l / H Z O M e s s y , n o a l d e h y d e 1 5 R - M B A , T H F , R T , o / n N o R e a c t i o n r e c o v e r e d s t a r t i n g m a t e r i a l . W h e n t h e t e m p e r a t u r e w a s r a i s e d t o 7 5 ° C , h o w e v e r , a f t e r o n l y 3 h t h e r e a c t i o n r e s u l t e d i n d e c o m p o s i t i o n w i t h o u t a n y a l d e h y d e p e a k s p r e s e n t i n t h e N M R . A n a n a l o g o u s r e a c t i o n , b y u s i n g N H 4 C l / H 2 0 i n D M F , a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t l e d t o t h e s a m e r e s u l t s . O n t h e o t h e r h a n d , w h e n m u c h m i l d e r c o n d i t i o n s w e r e t r i e d , i n p a r t i c u l a r w e t s i l i c a g e l a t r o o m t e m p e r a t u r e , n o r e a c t i o n o c c u r r e d e v e n a f t e r 3 8 1 t I a i s a l s o l d e h y d e w p e o s s t i b l r y e t o t h f a o t r t h e s i m m . “ N — N d p W M > N \ j / K L O H 4 2 4 3 ‘ ) “ s t i r r i n g o v e r n i g h t . A c e t a l 4 0 w a s s t a b l e e v e n i n t h e p r e s e n c e o f 1 N A c O H i n M e C N ” , w h i l e t h e m o s t i n t e r e s t i n g r e s u l t s w e r e o b t a i n e d b y u s i n g 1 0 % H C l i n M e C N . 5 8 I n t h i s l a s t c a s e , w h a t t h e N M R r e v e a l e d w a s t h e p r e s e n c e o f a n a l d e h y d e p e a k , b u t n o s i g n o f a n y m e t h y l e n e p e a k s , w h i c h m e a n s t h a t t h e d e s i r e d p r o d u c t i s n o t p r e s e n t . I n f a c t , f r o m t h e N M R s p e c t r u m , a l d e h y d e 2 5 ( q u i n o l i n e c a r b o x a l d e h y d e ) a p p e a r s t o b e t h e m a j o r p r o d u c t . F i n a l l y , r e a c t i o n o f d i m e t h y l a c e t a l 4 0 w i t h m C P B A i n C H 2 C 1 2 a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 h f o l l o w e d b y q u e n c h i n g w i t h H C I / H Z O d i d n o t y i e l d t h e d e s i r e d a l d e h y d e , b u t r a t h e r d e c o m p o s e d t h e c o m p o u n d . S i n c e m a k i n g a l d e h y d e 3 3 i s m u c h m o r e c h a l l e n g i n g t h a t w e e v e r a n t i c i p a t e d , a t t e m p t s w e r e m a d e f o r t h e f o r m a t i o n o f a n i m i n e , b y d i r e c t l y r e a c t i n g d i m e t h y l a c e t a l 4 0 w i t h c h i r a l a m i n e R - M B A ( R - m e t h y l b e n z y l a m i n e ) , f o l l o w i n g a p r o c e d u r e f o u n d i n t h e l i t e r a t u r e ( T a b l e 7 - 7 , e n t r y 9 . T h e c h o i c e o f t h e s p e c i f i c c h i r a l a m i n e w a s b a s e d o n t h e f a c t t h a t i r r r i n e s f o r m e d f r o m a r o m a t i c a m i n e s a r e i s o l a b l e ) . 5 8 T h e r e s u l t s w e r e , o n c e m o r e , d i s a p p o i n t i n g g i v i n g t h e d i m e t h y l a c e t a l b a c k . A s e c o n d t r i a l , u t i l i z i n g A m b e r l y s t r e s i n a n d l R - M B A f o l l o w e d t h e s a m e f a t e ( E n t r y 8 , T a b l e 7 - 7 ) . I t a p p e a r s t h a t t h i s p a r t i c u l a r s y s t e m w i t h t h e c e n t r a l t e r t i a r y a m i n e a n d t h e m e t h y l q u i n o l i n e r i n g s , d o e s n o t r e s p o n d w e l l a n d a f f o r d s u n a n t i c i p a t e d r e s u l t s w h e n r e l a t i v e l y c l a s s i c c h e m i s z i s a p p l i e d . t o o c l o s e t o t h e c e n t r a l S c h e m e 7 - 1 3 . O n e c a r b o n h o m o l o g u e o f a l d e h y d e 3 3 . n i t r o g e n , w h i c h m i g h t b e t h e r e a s o n w h y n e i t h e r t h e d e p r o t e c t i o n o f t h e d i m e t h y l a c e t a l o r t h e o x i d a t i o n o f t h e p r i m a r y 3 8 2 a l c o h o l c a n w o r k . I n o r d e r t o a d d r e s s t h e l a t t e r , a n a t t e m p t w a s m a d e t o f o r m a l d e h y d e 4 3 , a o n e c a r b o n h o m o l o g u e o f o u r p r e v i o u s t a r g e t , a l d e h y d e 3 3 . T h e s y n t h e s i s o f p r i m a r y a l c o h o l 4 2 , w h i c h u p o n o x i d a t i o n c a n l e a d t o a l d e h y d e 4 3 , \ - N N m a r T H F , r e f l u x o v e r n i g h t W N W N = / I / 2 + X S N 8 2 C O 3 , 9 2 0 / 0 j 4 6 O O K H 2 N \ / \ n , O / \ O ‘ 5 E t O H , N a B H 4 E t O H r e f l u x H ” , r e f l u x N N \ N | \ H Q N W O H / K L / O 4 4 4 2 O H S c h e m e 7 - 1 4 . S y n t h e s i s o f a l c o h o l 4 2 i s s h o w n i n S c h e m e 7 - 1 4 . C o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e B - a l a n i n e 4 4 w a s f i r s t c o n v e r t e d t o t h e c o r r e s p o n d i n g e t h y l e s t e r 4 5 , w h i c h w a s t h e n c o m b i n e d w i t h b r o m o m e t h y l q u i n o l i n e 2 , i n T H F , i n t h e p r e s e n c e o f e x c e s s o f N a Z C O 3 . A f t e r r e f l u x i n g o v e r n i g h t t h e r e a c t i o n y i e l d e d q u i n o l i n e e t h y l e s t e r 4 6 , w h i c h w a s t h e n r e d u c e d w i t h N a B H 4 t o y i e l d p r i m a r y a l c o h o l 4 2 . ( T h e a t t e m p t t o r e d u c e t h e q u i n o l i n e e s t e r 4 8 d i r e c t l y t o a l d e h y d e 4 2 b y u s i n g D I B A L - H a t l o w t e m p e r a t u r e ( - 7 8 ° C ) a n d q u e n c h i n g t h e r e a c t i o n w i t h g l a c i a l a c e t i c a c i d , r e s u l t e d i n r e c o v e r i n g t h e s t a r i n g m a t e r i a l . T h e e x t r a c a r b o n o f s t r u c t u r e 4 2 d i d n o t s e e m t o h e l p t h e o x i d a t i o n a t t e m p t s . I n p a r t i c u l a r , s u b m i t t i n g a l c o h o l 4 2 u n d e r D e s s - M a r t i n o x i d a t i o n c o n d i t i o n s r e s u l t e d , a s p r e v i o u s l y i n t h e c a s e o f a l c o h o l 3 7 , i n t h e f o r m a t i o n o f q u i n o l i n e c a r b o x a l d e h y d e 3 8 . T h e r e a c t i o n w a s r e p e a t e d t w i c e u n d e r 3 8 3 2 e q W E / L i H M D S ( Z e q ) s l i g h t l y d i f f e r e n t c o n d i t i o n s ( t e m p e r a t u r e , t i m e ) a n d b o t h t i m e s 3 8 w a s e i t h e r t h e o n l y o r t h e m a j o r p r o d u c t , w h i l e n o t r a c e o f t h e d e s i r e d a l d e h y d e 4 2 w a s f o u n d . A t t h e s a m e t i m e , a t t e m p t s w e r e c a r r i e d o u t t o f o r m 0 N ; “ E C t h e c a r b o n a n a l o g u e o f 3 3 , a l d e h y d e 4 7 ( F i g u r e 7 - 2 0 ) . 4 7 O u r a p p r o a c h f o r t h e s y n t h e s i s o f 4 7 i n v o l v e s t h e F i g u r e 7 - 2 0 . A l d e h y d e 4 7 f o r m a t i o n o f d i q u i n o l i n e s u b s t i t u t e d m a l o n a t e e s t e r 4 9 f r o m b r o m o m e t h y l q u i n o l i n e 2 a n d m a l o n y l e t h y l e s t e r 4 8 i n t h e p r e s e n c e o f L i H M D S ( S c h e m e 7 - 1 5 ) . A f t e r h a v i n g d i e s t e r 4 9 i n h a n d , t w o d i f f e r e n t d e c a r b o x y l a t i o n r e a c t i o n s c a n p r o c e e d y i e l d i n g t o e i t h e r m o n o e s t e r 5 1 o r m o n o a c i d 4 9 . I n p a r t i c u l a r , w h e n 5 1 i s r e f l u x e d o v e r n i g h t i n D M S O i n t h e p r e s e n c e o f N a C n g ‘ 6 0 t h e r e a c t i o n a f f o r d s m o n o e s t e r + 2 > O O T H F , r t o v e r n i g h t q u a n t . E t O / u \ / U \ 0 E t 4 8 S N K O H / T H F r e f l u x , 6 7 % N a C N , D M S O r e f l u x , 3 8 % N N \ E t O H , H ” N N \ o ‘ l G - o ‘ . O / / / O O H r e f l u x , q u a n t . / 0 Q B 5 0 5 1 r N a B H 4 , E t O H r e f l u x , 3 3 % o ” ‘ / / O H 5 2 S c h e m e 7 - 1 5 . S y n t h e s i s o f a l c o h o l 5 2 3 8 4 5 7 i n 3 8 % y i e l d . T h e r e a c t i o n i s r e a l l y c l e a n , s h o w i n g o n l y o n e s p o t o n t h e T L C w h i l e t h e s t a r t i n g m a t e r i a l i s c o m p l e t e l y c o n s u m e d . H o w e v e r , t h e e x t r a c t i o n o f t h e p r o d u c t f r o m D M S O a n d t h e p o t e n t i a l l y d a n g e r o u s c y a n i d e w a s t e l o w e r s t h e y i e l d s i g n i fi c a n t l y . A n a t t e m p t t o r e p l a c e N a C N w i t h N a C l a c c o r d i n g t o p u b l i s h e d p r o c e d u r e s d i d n o t y i e l d t h e d e s i r e d p r o d u c t , e v e n a f t e r 2 d a y s , l e a d i n g e v e n t u a l l y t o t h e d e c o m p o s i t i o n o f 4 9 . A t t h e s a m e t i m e , i f 4 9 i s t r e a t e d w i t h a 6 N s o l u t i o n o f K O H i n T H F a n d a f t e r r e f l u x i n g o v e r n i g h t , 6 7 % o f c a r b o x y l i c a c i d 5 0 i s i s o l a t e d . I n t h i s c a s e a g a i n t h e r e s t o f t h e p r o d u c t w a s l o s t d u r i n g t h e e x t r a c t i o n . N o t i c e t h a t a v e r y s i m i l a r r e a c t i o n u n d e r a c i d i c i n s t e a d o f b a s i c c o n d i t i o n s ( 6 N H C l / T H F ) d i d n o t y i e l d a c i d 5 0 , r e s u l t i n g i n r e c o v e r e d s t a r t i n g m a t e r i a l . C a r b o x y l i c a c i d 5 0 w a s e a s i l y c o n v e r t e d t o e s t e r 5 1 i n q u a n t i t a t i v e y i e l d , i n a n a t t e m p t t o a v o i d t h e u s e o f t h e c y a n i d e r e a g e n t . A t t h i s p o i n t , a g a i n , t w o d i f f e r e n t a p p r o a c h e s w e r e f o l l o w e d . A s a l w a y s , t h e fi r s t a t t e m p t i s t h e d i r e c t r e d u c t i o n o f e s t e r 5 1 t o t h e c o r r e s p o n d i n g a l d e h y d e 4 7 , i n t h e p r e s e n c e o f D I B A L - H , a t l o w t e m p e r a t u r e . O n c e a g a i n t h e r e a c t i o n d i d n o t w o r k a n d , t h e r e f o r e , t h e e s t e r w a s r e d u c e d t o t h e c o r r e s p o n d i n g p r i m a r y a l c o h o l 5 2 b y t h e u s e o f N a B I - I 4 . O x i d a t i o n o f a l c o h o l 5 2 w i t h D e s s M a r t i n p e r i o d i n a n e l e d t o m o r e e n c o u r a g i n g r e s u l t s . I n p a r t i c u l a r , t h e r e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t t w i c e a n d b o t h t i m e s t h e r e w a s a n a l d e h y d e p e a k p r e s e n t i n t h e c r u d e N M R , w h i c h d i d n o t m a t c h t h a t o f a l d e h y d e 4 7 . T h e p r o b l e m w a s t h a t b o t h t i m e s d u r i n g t h e p u r i f i c a t i o n p r o c e s s n o a l d e h y d i c c o m p o u n d w a s e l u t e d f r o m t h e c o l u m n . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n c a n b e t h a t t h e f o r m e d a l d e h y d e d e c o m p o s e s , o r j u s t p o l y m e r i z e s , w h i l e g o i n g t h r o u g h t h e a c i d i c s i l i c a g e l , a n d i f t h a t i s t h e c a s e t h e s o l u t i o n c a n b e t h e u s e o f a n o t h e r p u r i fi c a t i o n p r o c e s s . A t t h i s p o i n t n o c o n c l u s i o n s c a n b e 3 8 5 d e r i v e d , b u t s i n c e t h i s r e a c t i o n w a s t h e m o s t p r o m i s i n g i n a v e r y l o n g s e r i e s o f o x i d a t i o n s , i t h a s t o b e s c a l e d u p a n d o p t i m i z e d . F i n a l l y , t h e r o u t e t h a t a f f o r d e d a l d e h y d e 4 7 w a s t h r o u g h t h e W e i n r e b a m i d e a s d e s c r i b e d i n S c h e m e 7 - 1 6 . A m o d e s t 2 0 % o f t h e d e s i r e d a l d e h y d e 4 7 w a s i s o l a t e d , w h i c h w a s e n o u g h f o r u s t o e v a l u a t e i t . _ N H ( O M e ) M e H C I ( 1 . 5 e q ) s p e c t r o s c o p i c a l l y a n d d e t e r m i n e w h e t h e r o r n - B u L i ( 3 e q ) , T H F , 0 ° C 5 0 % n o t i t c a n a c t a s a c h i r a l i t y t r a n s f e r r e c e p t o r . H a v i n g a l d e h y d e 4 7 i n h a n d , s e v e r a l a t t e m p t s t o o k p l a c e i n o r d e r t o f o r m a c h i r a l S c h i f f b a s e , o b s e r v a b l e b y E C C D . l 2 0 0 / H o w e v e r , a s i n t h e c a s e o f k e t o n e 3 0 , w e w e r e n o t a b l e t o i s o l a t e a n i m i n e , e v e n w h e n a r o m a t i c a m i n e s , l i k e R - o r S - M B A , w e r e u s e d . I n a d d i t i o n , C D s p e c t r a r e c o r d e d i n S c h e m e 7 4 5 - S W t h G S i S 0 f a l d e h y d e 4 7 t h e p r e s e n c e o f a l d e h y d e , c h i r a l a m i n e a n d m e t a l ( Z n C l z , C u C l z ) d i d n o t y i e l d a n E C C D a c t i v e c h i r a l s p e c i e s . A t t h i s p o i n t , t h e e f f o r t s t o i n d u c e t h e c h i r a l i t y o f a n a m i n e t o a n a c h i r a l h o s t , t h r o u g h S c h i f f b a s e f o r m a t i o n , w e r e h a l t e d , m o s t l y d u e t o l a c k o f t i m e . C o n s i d e r i n g t h e r e p o r t e d i n t e r e s t f o r S c h i f f b a s e f o r m a t i o n , p e r h a p s m o r e t i m e s p e n t o n t h i s i d e a i s w o r t h w h i l e . 3 8 6 7 . 6 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s A . S y n t h e s i s o f C o m p o u n d s 1 . S y n t h e s i s o f ( 2 ) Q u i n a l d i n e 1 ( 0 . 3 g , 2 . 3 m o l , 1 e q u i v ) a n d N B S ( 0 . 4 g , 2 . 5 m m o l , 1 . 1 e q u i v ) w e r e d i s s o l v e d i n f r e s h l y d i s t i l l e d C H C 1 3 ( 5 0 m L ) . T h e r e a c t i o n w a s r e fl u x e d f o r 1 h a f t e r w h e n t h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d . A f t e r fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 7 % E t O A c / H e x a n e s ) m o n o b r o m i n a t e d p r o d u c t 2 w a s i s o l a t e d a s a r e d d i s h s o l i d ( 1 4 % ) . [ R f ( C H C l 3 ) = 0 . 5 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 4 . 7 ( s , 2 H ) , 7 . 5 7 ( m , 2 H ) , 7 . 7 3 ( t , 1 H ) , 7 . 8 2 ( d , 1 H ) , 8 . 0 7 ( d , 1 H ) , 8 . 1 8 ( d , 1 H ) . ] 2 . S y n t h e s i s o f ( 4 ) m w N / N ’ B r I \ B r o m o q u i n o l i n e 2 ( 0 . 5 g , 2 . 3 m o l , 1 e q u i v ) w a s d i s s o l v e d i n f r e s h l y d i s t i l l e d T H F ( 1 0 m L ) . N H 4 0 H ( 0 . 6 m L , 8 e q u i v ) w a s a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d . A f t e r ~ 2 0 m i n w h i t e c r y s t a l s s t a r t i n g a p p e a r i n g a n d a f t e r 2 h t h e p r e c i p i t a t e w a s f i l t e r e d o f f a n d c o l l e c t e d . A f t e r v e r i f y i n g t h a t t h e s a l t f o r m o f p r o d u c t 4 w a s w h a t p r e c i p i t a t e d o u t t h e 3 8 7 s o l u t i o n o f 2 - h y d r o x y m e t h y l - 2 - n i t r o - l , 3 - p r o p a n e d i o l ( 5 . 1 g , 3 3 m m o l ) i n p y r i d i n e ( 9 fi l t r a t e w a s m i x e d w i t h e x t r a N H 4 0 H ( 1 m L ) a n d t h e m i x t u r e w a s s u b m i t t e d t o r e fl u x i n g ‘ o n c e m o r e . T h e p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d u n t i l n o m o r e c r y s t a l s w e r e f o r m e d a f t e r a d d i t i o n o f N H 4 0 H . T h e c o l l e c t e d c r y s t a l l i n e p r o d u c t w a s c o m b i n e d , e x t r a c t e d o n c e w i t h N a O H t o d e p r o t o n a t e t h e t e r t i a r y a m i n e a n d d r i e d u n d e r v a c u u m t o a f f o r d t h e d e s i r e d p r o d u c t 4 ( 8 0 % ) . [ R f ( E t O A c ) = 0 . 2 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 4 . 1 ( s , 2 H ) , 7 . 4 7 ( t , 1 H ) , 7 . 6 6 ( t , 1 H ) , 7 . 7 4 ( t , 2 H ) , 8 . 0 4 ( d , 1 H ) , 8 . 1 0 ( d , 1 H ) . ] 3 . S y n t h e s i s o f ( 6 ) N — N / X 2 6 I n a s o l u t i o n o f 2 ( 0 . 2 5 g , 1 . 1 m m o l , 1 e q u i v ) i n T I - I F ( 6 m L ) , t - b u t y l a m i n e ( 0 . 6 m L , 5 . 5 m o ] , 5 e q u i v ) w e r e a d d e d , a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x i n g f o r 6 h . W h i t e p r e c i p i t a t e w a s f o r m e d ( t - B u N H g B r ) , w h i c h w a s fi l t e r e d o u t a n d t h e f i l t r a t e w a s c o n c e n t r a t e d a n d s e p a r a t e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 2 0 % E t O A c / H e x ) . 4 7 m g o f 6 w e r e i s o l a t e d ( 1 2 % ) . [ R f ( 4 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 1 5 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 1 . 1 9 ( s , 9 H ) , 4 . 1 3 ( s , 4 H ) , 7 . 3 9 ( t , 2 H ) , 7 . 5 8 ( t , 2 H ) , 7 . 6 6 ( t , 4 H ) , 7 . 9 0 ( d , 2 H ) , 7 . 9 6 ( d , 2 H ) ] . 4 . S y n t h e s i s o f ( 8 ) O H o s o z c u 3 N O H O N 0 2 H 3 C O Z S O 2 a M e t h a n e s u l f o n y l c h l o r i d e ( 8 m L ) w a s a d d e d d r o p w i s e a t 0 ° C u n d e r N 2 t o a s t i r r e d 3 8 8 m L ) . T h e y e l l o w i s h s o l u t i o n t u r n e d d a r k r e d a n d t h e n f r o z e . T h e v i s c o u s m i x t u r e w a s k e p t i n t h e r e f r i g e r a t o r f o r 2 4 h a n d t h e n w a s p o u r e d i n t o w a t e r ( 5 0 0 m L ) . T h e p r e c i p i t a t e w a s r e c r y s t a l l i z e d f r o m 9 5 % E t O H y i e l d i n g 8 a s a y e l l o w p o w d e r ( 3 3 % ) . [ ' H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 3 . 2 7 ( s , 9 H ) , 4 . 8 5 ( s , 6 H ) ] 5 . S y n t h e s i s o f ( 9 ) o s o z c u 3 H a c o z s o H a c o z s o y H 3 C O Q S O Y N 0 2 H H 3 0 0 2 S O H 3 C O Z S O a 9 A m i x t u r e o f 2 - m e t h y l s u l f o n y l o x y m e t h y l - 1 , 3 - p r o p a n e d i o l d i m e t h y l s u l f o n a t e 8 ( 0 . 3 6 g , 0 . 9 m m o l , 5 e q u i v ) , A I B N ( 3 1 m g , 0 . 1 9 m m o l , 1 e q u i v ) a n d t r i b u t y l s t a n n a n e ( 0 . 4 g , 1 . 4 m m o l , 7 . 5 e q u i v ) i n b e n z e n e ( 5 0 m L ) , u n d e r N 2 w a s r e fl u x e d f o r 2 0 h . E v a p o r a t i o n o f s o l v e n t u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e l e a v e s a n o i l y r e s i d u e . A d d i t i o n o f E t z O ( 5 0 m L ) i n d u c e s t h e f o r m a t i o n o f c r e a m c o l o r e d c r y s t a l s . A f t e r r e c r y s t a l l i z a t i o n f r o m 9 5 % E t O H , 9 w a s i s o l a t e d a s a w h i t e p o w d e r ( 6 3 % ) . [ R f ( 3 0 % E t O A c / H e x a n e s ) = 0 . 9 2 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 3 . 0 6 ( s , 9 H ) , 4 . 3 3 ( d , 6 H ) , 2 . 6 7 ( m , 1 H ) ] 6 . S y n t h e s i s o f ( 1 0 ) H a c o z s o H a C O Z S O y I I H D ? H 3 0 0 2 $ O l 9 1 0 A s t i r r e d s o l u t i o n o f 2 - m e t h y l s u l f o n y l o x y m e t h y l - 1 , 3 - p r o p a n e d i o l d i m e t h a n e s u l f o n a t e 9 ( 0 . 2 g , 0 . 6 m m o l , 1 e q u i v ) i n a c e t o n e ( 1 5 m L ) w a s t r e a t e d w i t h s o d i u m i o d i d e ( 0 . 8 8 g , 6 m m o l , 1 0 e q u i v ) a n d r e fl u x e d f o r 1 3 h . A f t e r t h e m i x t u r e w a s fi l t e r e d , t h e 3 8 9 s o l v e n t o f t h e s u p e r n a t a n t w a s e v a p o r a t e d a n d t h e r e s i d u e w a s p a r t i t i o n e d b e t w e e n w a t e r a n d C H z C l z . T h e o r g a n i c p h a s e w a s d r i e d a n d t h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d . A f t e r fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( h e x a n e ) t r i i o d i d e 1 0 w a s c o l l e c t e d a s a p a l e r o s e l i q u i d ( 8 0 % ) . [ R f ( H e x a n e s ) = 0 . 6 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 3 . 3 6 ( d , 6 H ) , 1 . 6 2 ( m , 1 H ) ] 7 . S y n t h e s i s o f ( 1 2 ) m m N ’ C H N ’ B r 1 1 1 2 N B S ( 3 g , 1 8 m o l , 5 e q u i v ) w a s a d d e d t o a s o l u t i o n o f P P h 3 ( 4 . 5 g , 1 8 m o l , 5 e q u i v ) i n 1 , 4 d i o x a n e ( 1 0 0 m L ) a n d t h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t r . t . A f t e r 3 0 m i n a s o l u t i o n o f 2 - h y d r o x y q u i n o l i n e 1 1 ( 0 . 5 3 g , 3 . 6 m m o l , 1 e q u i v ) i n d i o x a n e ( 5 0 m L ) w a s a d d e d t o t h e s u s p e n s i o n a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s r e fl u x e d f o r 4 h . D i o x a n e w a s t h e n r e m o v e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a n d t h e r e s i d u e w a s d i s s o l v e d i n C H z C l z a n d b a s i f i e d w i t h N E t 3 . A f t e r fl a s h s i l i c a c h r o m a t o g r a p h y ( 5 0 % C H 2 C 1 2 / H e x a n e s ) b r o m o q u i n o l i n e 1 2 w a s i s o l a t e d ( 3 0 % ) . [ R r ( 1 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 6 5 ; l H i N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 8 . 0 2 ( d , 1 H ) , 5 7 . 9 8 ( d , 1 H ) , 5 7 . 7 9 ( d , 1 H ) , 5 7 . 7 2 ( d t , 1 H ) , 5 7 . 5 6 ( t , 1 H ) , 5 7 . 5 0 ( ( 1 , 1 H ) ; G C / M S : 2 0 8 a n d 2 0 9 - 1 : 1 r a t i o ] 8 . S y n t h e s i s o f ( 1 6 ) 0 C t “ C 6 N 0 2 n o 2 1 1 1 2 3 9 0 A s o l u t i o n o f n - B u L i ( 4 . 2 7 m L ( 2 . 5 M ) , 1 0 . 7 m m o l , 1 . 1 e q u i v ) w a s a d d e d t o a n i c e - c o o l e d s o l u t i o n o f m e t h y l - t r i p h e n y l p h o s p h o n i u m b r o m i d e ( 3 . 8 1 g , 1 0 . 7 m m o l , 1 . 1 e q u i v ) i n a n h y d r o u s T H F ( 3 0 m L ) , u n d e r N 2 s t r e a m . A f t e r c o m p l e t i o n o f y l i d e f o r m a t i o n ( 3 0 m i n ) a s o l u t i o n o f o - n i t r o b e n z a l d e h y d e 1 5 ( 1 . 5 3 7 3 g , 9 . 7 m o l , 1 e q u i v , ) i n a n h y d r o u s T H F ( 2 0 m L ) w a s a d d e d t o t h e y l i d e a n d t h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t . F l a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 1 0 % E t O A c / P e t . E t h ) y i e l d e d 1 6 a s a y e l l o w o i l ( 4 4 % ) . [ R f ( 2 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 8 6 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 5 . 4 2 ( d , 1 H ) , 5 . 6 8 ( d , 1 H ) , 7 . 1 5 ( q , 1 H ) , 7 . 3 5 ( t , l H ) , 7 . 5 5 ( t , l H ) , 7 . 6 0 ( d , 1 H ) , 7 . 9 0 ( d , 1 H ) . ] 9 . S y n t h e s i s o f ( 1 8 ) 2 1 7 1 8 A m i x t u r e o f 1 7 ( 0 . 5 g , 3 m m o l , 1 e q u i v ) , S n C l 2 ( 2 . 1 g , 9 m o l , 3 e q u i v ) a n d H C l ( 1 0 m L ) w a s h e a t e d a t 7 0 ° C f o r 3 0 m i n , u n t i l a r e d d i s h , c l e a r s o l u t i o n w a s f o r m e d . A d d i t i o n o f s a t u r a t e d s o l u t i o n o f N a H C O 3 , f o l l o w i n g b y a n e x t r a c t i o n w i t h C H 2 C 1 2 a n d s e p a r a t i o n o f t h e m i x t u r e b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 1 0 % E t O A c / H e x ) y i e l d e d 1 8 , a s a n y e l l o w o i l ( 8 8 % , c i s a n d t r a n s i s o m e r s ) . [ R f ( 2 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 6 5 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 l . 7 1 ( d , 3 H ) , 1 . 9 2 ( d , 3 H ) , 3 . 7 0 ( s , 2 H ) , 5 . 9 2 ( m , 1 H ) , 6 . 2 4 ( m , 1 H ) , 6 . 7 0 ( d , 1 H ) , 6 . 8 3 ( d , 1 H ) , 7 . 3 7 ( m , 2 H ) , 7 . 5 5 ( m , 2 H ) , 7 . 8 4 ( d , l H ) , 7 . 9 8 ( d , 1 H ) ] . 1 0 . S y n t h e s i s o f ( 2 2 ) 3 9 1 N I : N H \ 1 9 2 2 2 I n a s o l u t i o n o f 1 9 ( 1 0 0 u L , 0 . 7 4 m o l , 1 e q u i v ) i n d r y T H F ( 4 m L ) , a c e t a l d e h y d e ( 5 0 m g , 1 . 4 m o l , 2 e q u i v ) w a s a d d e d , a n d t h e s o l u t i o n w a s s t i r r e d a t R T . T h e r e a c t i o n w a s m o n i t o r e d b y T L C , a n d a f t e r 1 h o n l y s t a r t i n g m a t e r i a l w a s p r e s e n t . M o r e a c e t a l d e h y d e w a s a d d e d ( 1 2 5 m g , 3 . 7 m o l , 5 e q u i v ) a n d t h e r e a c t i o n w a s s t i r r e d o v e r n i g h t . S t i l l o n l y s t a r t i n g m a t e r i a l w a s p r e s e n t o n t h e T L C . A d d i t i o n o f p - t o l u e n e s u l f o n i c a c i d ( p - T s O H , 0 . 1 2 2 1 g , 0 . 7 4 m o l , 1 e q u i v ) . I m m e d i a t e l y , t h e c o l o r l e s s s o l u t i o n b e c a m e y e l l o w a n d k e p t g e t t i n g d a r k e r ( l i g h t r e d , b r o w n ) . A f t e r 2 4 h , T H F w a s e v a p o r a t e d a n d C H 2 C l 2 w a s a d d e d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s e x t r a c t e d w i t h s a t u r a t e d s o l u t i o n o f N a H C O 3 a n d b r i n e a n d w a s s e p a r a t e d w i t h fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( E t O A c / H e x a n e s : 1 / 1 0 ) t o a f f o r d 8 - i s o p r o p e n y l - 2 - m e t h y l - q u i n o l i n e 2 2 ( 3 4 % ) . [ R f ( 2 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 6 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 2 . 4 2 6 ( s , 3 H ) , 2 . 7 4 2 ( s , 3 H ) , 5 . 2 2 5 ( s , 1 H ) , 5 . 3 1 9 ( s , 1 H ) , 7 . 2 2 5 ( d , 1 H ) , 7 . 4 1 8 ( t , 1 H ) , 7 . 5 5 7 ( d , 1 H ) , 7 . 6 7 9 ( d , 1 H ) , 8 . 0 0 5 ( d , l H ) ; C O S Y ( 5 0 0 M H z ) : 5 2 . 7 4 2 - 5 5 2 2 5 , 2 . 7 4 2 - 5 . 3 1 9 , 7 . 2 2 5 - 8 . 0 0 5 , 5 8 . 0 0 5 - 7 . 4 1 8 , 7 . 4 1 8 - 7 . 6 7 9 , 7 . 4 1 8 - 7 . 5 5 7 , 7 . 6 7 9 - 7 . 5 5 7 ; G C - M S : M + : 1 8 3 . ] 1 1 . S y n t h e s i s o f ( 2 0 ) | \ d / “ W e 1 9 2 0 3 9 2 A . I n a s o l u t i o n o f 1 9 ( 1 0 0 1 1 . 1 , 0 . 7 4 m m o l e s , 1 e q u i v ) i n d r y T H F ( 4 m L ) , u n d e r N 2 , P h C H O ( 7 5 p l , 0 . 7 m m o l , 1 e q u i v ) w e r e a d d e d . A l s o , a d d i t i o n o f s t O H ( 1 3 . 5 m g , 0 . 0 7 m m o l , 0 . 1 e q u i v ) . A f t e r s t i r r i n g a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h e c o l o r l e s s s o l u t o n b e c a m e l i g h t y e l l o w . A f t e r 1 8 h , o n e m o r e e q u i v a l e n t o f P h C H O w a s a d d e d a n d t h e r e a c t i o n w a s s t i r r e d f o r 3 m o r e h o u r s . T H F w a s e v a p o r a t e d a n d t h e r e s i d u e w a s d i s s o l v e d i n C H 2 C l 2 a n d e x t r a c t e d w i t h s a t u r a t e d N a H C O 3 a n d b r i n e . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d o l e fi n 2 0 w a s i s o l a t e d ( 5 6 % ) . B . I n a s o l u t i o n o f 1 9 ( 7 5 u L , 0 . 7 m m o l , 1 e q u i v ) i n C 6 H 6 ( 5 m L ) , P h C H O ( 7 5 u l , 0 . 7 m m o l , 1 e q u i v ) a n d N a 2 S O 4 ( 0 . 3 g , e x c e s s ) w e r e a d d e d , a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x i n g f o r 3 d a y s . T h e N a 2 S O 4 w a s fi l t e r e d o u t a n d t h e s o l v e n t w a s e v a p o t a r e d . T h e c r u d e N M R s h o w e d t h a t 2 0 w a s f o r m e d e x c l u s i v e l y . [ 2 0 : R f ( 2 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 6 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 2 . 2 1 ( s , 3 H ) , 5 . 1 5 ( d , 2 H ) , 6 . 9 9 ( d , 1 H ) , 7 . 2 2 ( t , 1 H ) , 7 . 3 4 ( q , 2 H ) , 7 . 5 0 ( t , 3 H ) , 7 . 9 3 ( m , 2 H ) , 8 . 4 0 ( s , 1 H ) . ] 1 2 . S y n t h e s i s o f ( 2 1 ) 2 . 8 ; 2 0 2 0 2 1 A . T h e s o l i d r e s i d u e o f 2 0 w a s d i s s o l v e d i n C 6 H . 5 ( 5 m L ) i n t h e p r e s e n c e o f B F 3 E t 2 O ( I O u L ) . T h e m i x t u r e w a s l e f t t o r e fl u x f o r 3 d a y s a n d t h e n e x t r a c t e d w i t h s a t u r a t e d N a H C O 3 . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a S O 4 , c o n c e n t r a t e d a n d s e p a r a t e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( H e x a n e ) . S o m e s t a r t i n g m a t e r i a l 2 0 w e r e r e c o v e r e d ( 5 1 . 5 m g , 3 1 . 5 % ) a l o n g w i t h p r o d u c t 2 1 ( 7 0 . 2 m g , 4 6 . 7 % o v e r a l l y i e l d f r o m 1 9 ) . 3 9 3 B . C r u d e 2 0 ( 1 0 4 . 6 m g ) w a s d i s s o l v e d i n o - d i c h l o r o b e n z e n e ( 4 m L ) a n d w a s r e fl u x e d f o r 2 4 h . T h e m i x t u r e w a s c o n c e n t r a t e d a n d s e p a r a t e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( H e x a n e s ) t o a f f o r d 2 1 ( 5 4 . 6 m g 5 6 . 3 % o v e r a l l y i e l d f r o m 9 ) . [ 2 1 : R f ( 1 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 5 7 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 2 . 7 4 5 ( s , 3 H ) , 7 . 5 0 ( m , 4 H ) , 7 . 7 0 ( m , 2 H ) , 7 . 9 8 ( d , 1 H ) , 8 . 1 5 ( m , 3 H ) ] . 1 3 . S y n t h e s i s o f ( 2 3 ) G E L 6 6 5 N H 2 N ’ 1 9 2 3 I n a s o l u t i o n o f 1 9 ( 1 0 0 M L , 0 . 7 3 4 m o l , 1 e q u i v ) i n o - C 4 H 4 C l 2 ( 4 m L ) , H C H O / H 2 O ( 3 7 . 3 % H C H O / H 2 0 , 6 0 u L , 0 . 7 3 m o l , 1 e q u i v ) a n d N a 2 S O 4 ( 0 . 9 4 g , e x c e s s ) w e r e a d d e d . T h e m i x t u r e w a s h e a t e d t o r e fl u x i n a n o i l b a t h f o r 1 7 h , t h e s o l i d N a 2 S O 4 w a s fi l t e r e d o u t a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s c o n c e n t r a t e d . T h e c r u d e N M R w a s t h e s a m e a s t h e o n e f o r L e p i d i n e , 2 3 , r e v e a l i n g a v e r y c l e a n r e a c t i o n ( y i e l d > 9 0 % ) . [ R f ( 2 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 2 2 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 2 . 6 8 ( s , 1 H ) , 7 . 2 0 ( d , 1 H ) , 7 . 5 5 ( t , 1 H ) , 7 . 6 9 ( t , 1 H ) , 7 . 9 9 ( d , 1 H ) , 8 . 0 9 ( d , 1 H ) , 8 . 7 6 ( d , 1 H ) ] . 1 4 . S y n t h e s i s o f ( 2 4 ) ( : 6 k C O L N H 2 N ’ 1 9 2 4 3 9 4 I n a s o l u t i o n o f 1 9 ( 1 0 0 1 1 1 , 0 . 7 3 4 m o l , 1 e q u i v ) i n o - C 4 H 4 C 1 2 ( 4 m L ) , C H 3 C H O ( 1 3 4 . 6 m g , 3 m o l , 4 e q u i v ) a n d N a 2 S O 4 ( 0 . 2 6 g , e x c e s s ) w e r e a d d e d . T h e m i x t u r e w a s h e a t e d t o r e fl u x i n a s a n d b a t h f o r 2 4 h , t h e s o l i d N a 2 S O 4 w a s fi l t e r e d o u t a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s c o n c e n t r a t e d a n d s e p a r a t e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 1 0 % E t O A c / H e x ) t o a f f o r d 2 4 ( 2 6 . 1 m g 2 2 . 4 % ) . [ R f ( 2 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 2 1 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 2 . 6 3 ( s , 3 H ) , 2 . 6 8 ( s , 3 H ) , 7 . 1 0 ( s , 1 H ) , 7 . 4 7 ( t , 1 H ) , 7 . 6 4 ( t , 1 H ) , 7 . 9 3 ( d , 1 H ) , 8 . 0 1 ( d , 1 H ) ] . 1 5 . S y n t h e s i s o f ( 2 7 ) 0 O N ‘ C I N \ / / 2 6 2 7 C o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e q u i n a l d y l c h l o r i d e 2 6 ( 0 . 3 g , 1 . 6 m m o l , 1 e q u i v ) a n d N , O - d i m e t h y l h y d r o x y l a m i n e h y d r o c h l o r i d e ( C H 3 N H O C H 3 , 0 . 1 7 g , 1 . 8 m m o l , 1 . 1 e q u i v ) w e r e d i s s o l v e d i n e t h a n o l - f r e e c h l o r o f o r m , a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e s o l u t i o n w a s c o o l e d a t 0 o C a n d 2 . 2 e q u i v o f p y r i d i n e w e r e a d d e d . T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r 3 0 m i n a n d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 h , a n d w a s c o n c e n t r a t e d i n v a c u o . T h e r e s i d u e w a s p a r t i t i o n e d b e t w e e n b r i n e a n d 1 : 1 m i x t u r e o f B 2 0 / C H 2 C l 2 . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d c o n c e n t r a t e d t o a f f o r d t h e a m i d e ( > 9 5 % y i e l d , d e e p r e d o i l ) . T o a s o l u t i o n o f c r u d e a m i d e ( 0 . 2 g , 0 . 9 m o l , 1 e q u i v ) i n f r e s h l y d i s t i l l e d T H F ( 5 m L ) a t 0 ° C , . M e L i ( 1 . 4 M i n 3 2 0 , 1 . 6 m L , 2 . 3 m m o l , 2 . 5 e q u i v ) w e r e a d d e d a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r 1 . 5 h ( d a r k b r o w n m i x t u r e ) . T h e r e a c t i o n w a s q u e n c h e d w i t h 1 0 % H C l , w a s h e d w i t h b r i n e a n d e x t r a c t e d w i t h a s o l v e n t s y s t e m o f E t h e r / C H 2 C l 2 1 : 1 . T h e o r g a n i c 3 9 5 l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 , a n d m e t h y l k e t o n e 2 7 w a s p u r i fi e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 2 0 % E t O A c / H e x a n e s ) a n d i s o l a t e d a s a l i g h t y e l l o w s o l i d ( 7 5 % y i e l d ) . [ R f ( 2 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 7 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 2 . 8 6 ( s , 3 H ) , 7 . 6 5 ( t , 1 H ) , 7 . 7 7 ( t , 1 H ) , 7 . 8 2 ( d , 1 H ) , 8 . 1 7 ( d , 1 H ) , 8 . 1 9 ( d , 1 H ) , 8 . 2 3 ( d , 1 H ) . ] 1 6 . S y n t h e s i s o f ( 2 9 ) N \ B r N \ | / / 2 2 9 M o n o b r o m i n a t e d 2 - m e t h y l q u i n o l i n e 2 ( 1 . 2 3 g , 5 . 5 m m o l , 1 e q u i v ) w a s c o m b i n e d w i t h N a I ( 4 . 2 g , 2 8 m o l , 5 e q u i v ) i n a c e t o n e ( 5 0 m L ) , a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d o v e r n i g h t . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a n d t h e r e s i d u e w a s e x t r a c t e d w i t h C H 2 C l 2 T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d p u r i fi e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 2 5 % E t O A c / P e n t a n e ) t o a f f o r d l i g h t b r o w n s o l i d o f i o d o 2 - m e t h y l q u i n o l i n e 2 9 ( 9 1 % ) . [ R f ( 2 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 6 ; ‘ H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 4 . 5 9 ( s , 2 H ) , 7 . 4 0 ( d , 1 H ) , 7 . 4 5 ( t , 1 H ) , 7 . 6 2 ( t , 1 H ) , 7 . 6 8 ( d , 1 H ) , 7 . 9 8 ( d , 2 H ) ; G C / M S : M + = 2 6 9 ] 1 7 . S y n t h e s i s o f ( 3 0 ) 3 9 6 M e t h y l k e t o n e 2 8 ( 2 4 3 m g , 1 . 4 2 m o l , 1 e q u i v ) w a s d i s s o l v e d i n f r e s h l y d i s t i l l e d E t 2 O ( S m L ) a n d c o o l e d a t 0 ° C . N a I - I M D S ( 1 M i n T H F , 4 . 5 4 m L , 4 . 5 4 m m o l , 3 . 2 e q u i v ) w e r e a d d e d a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r 2 0 m i n . A s o l u t i o n o f q u i n a l d i n e i o d i d e 2 9 ( 1 . 1 6 g , 4 . 3 m m o l , 3 . 3 e q u i v ) i n 3 2 0 ( 8 m L ) w a s a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r 3 h . T h e r e a c t i o n w a s q u e n c h e d w i t h b r i n e a n d e x t r a c t e d w i t h C H 2 C l 2 . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d p u r i fi e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 2 0 % E t O A c / H e x a n e s ) . L i g h t y e l l o w s o l i d o f k e t o n e 3 0 w a s i s o l a t e d ( 4 5 % ) . [ R f ( 5 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 5 2 ; I H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 3 . 4 - 3 . 8 ( d o u b l e t o f a n A B q u a r t e t , 4 H ) , 5 . 6 ( q , 1 H ) , 7 . 3 6 ( t , 2 H ) , 7 . 4 3 ( d , 2 H ) , 7 . 5 1 ( t , 2 H ) , 7 . 6 6 ( m , 6 H ) , 7 . 8 4 ( d , 1 H ) , 7 . 9 4 ( d , 2 H ) , 8 . 1 4 ( t , 2 H ) , 8 . 2 5 ( d , 1 H ) ; l 3 C N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 4 0 . 5 ( C H 2 ) , 4 4 . 1 ( C H ) , 1 1 8 . 9 , 1 2 1 . 9 , 1 2 5 . 6 , 1 2 6 . 6 , 1 2 7 . 3 , 1 2 7 . 5 , 1 2 8 . 1 , 1 2 8 . 6 , 1 2 9 . 0 , 1 2 9 . 3 , 1 2 9 . 6 , 1 3 0 . 6 , 1 3 5 . 9 , 1 3 6 . 6 , 1 4 7 . 0 , 1 4 7 . 4 , 1 5 3 . 5 , 1 6 0 . 1 , 2 0 3 . 4 ( C O ) ; G C / M S : W : 4 3 5 ] 1 8 . S y n t h e s i s o f ( 7 ) A m i x t u r e o f t r i q u i n o l i n e k e t o n e 3 0 ( 5 6 m g , 0 . 1 2 m m o l , 1 e q u i v ) , d i e t h y l e n e g l y c o l ( 1 0 m L ) , h y d r a z i n e m o n o h y d r a t e ( 1 2 m g , 0 . 2 4 m o ] , 2 e q u i v ) a n d e x c e s s o f K O H w e r e h e a t e d a t 1 8 0 ° C f o r 5 h . T h e d e e p r e d r e a c t i o n m i x t u r e w a s c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e a n d p o u r e d i n t o e x c e s s o f w a t e r . T h e p r o d u c t w a s e x t r a c t e d w i t h C H 2 C l 2 a n d w a s h e d s e v e r a l t i m e s w i t h w a t e r . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d p u r i fi e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 1 0 0 % E t O A c ) y i e l d i n g T M Q M 7 a s a p a l e p i n k o i l ( 8 2 % ) . 3 9 7 [ R f ( 4 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 6 ; 1 H N l \ / I R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 3 . 1 3 ( d , 6 H ) , 3 . 4 7 ( q , 1 H ) , 7 . 2 8 ( d , 3 H ) , 7 . 4 1 ( t , 3 H ) , 7 . 6 2 ( t , 3 H ) , 7 . 6 6 ( d , 3 H ) , 7 . 8 8 ( d , 3 H ) , 8 . 0 0 ( d , 3 H ) ; 1 3 C N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 2 9 . 6 3 , 3 9 . 8 0 , 4 3 . 3 3 , 1 2 2 . 2 5 , 1 2 5 . 5 8 , 1 2 6 . 6 0 , 1 2 7 . 3 4 , 1 2 8 . 7 9 , 1 2 9 . 0 8 , 1 3 5 . 7 4 , 1 4 7 . 7 0 , 1 6 1 . 3 2 ; G C / M S : W : 4 3 9 ] 1 9 . S y n t h e s i s o f ( 3 6 ) I n a s o l u t i o n o f B r - 2 - m e t h y l q u i n o l i n e 2 ( 0 . 3 g , 1 . 4 m o l , 1 e q u i v ) i n f r e s h l y d i s t i l l e d T H F ( 1 0 m L ) w a s a d d e d G l y c i n e h y d r o c h l o r i d e e t h y l e s t e r ( 0 . 9 g , 0 . 7 m m o l , 0 . 5 e q u i v ) a n d e x c e s s o f s o d i u m c a r b o n a t e a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d o v e r n i g h t . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a n d t h e r e s i d u e w a s e x t r a c t e d w i t h C H 2 C l 2 , T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d p u r i f i e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 3 0 % E t O A c / P e t r o l e u m E t h e r ) t o a f f o r d l i g h t y e l l o w p o w d e r o f d i - m e t h q u u i n o l i n e m e t h y l e t h y l e s t e r - a m i n e 3 6 ( 9 2 % ) . [ R f ( 3 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 2 3 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 1 . 1 9 ( t , 3 H ) , 3 . 5 0 ( s , 2 H ) , 4 . 1 0 ( t , 2 H ) , 4 . 1 4 ( s , 4 H ) , 7 . 4 3 ( t , 2 H ) , 7 . 6 2 ( t , 2 H ) , 7 . 7 l ( d , 2 H ) , 7 . 7 5 ( d , 2 H ) , 8 . 0 1 ( d , 2 H ) , 8 . 0 7 ( d , 2 H ) ] 2 0 . S y n t h e s i s o f ( 3 7 ) 3 9 8 N \ A l f — { Q : 1 7 3 6 W 3 7 O ” A m i x t u r e o f e t h y l e s t e r 3 6 ( 1 6 9 m g , 0 . 4 3 m o l , 1 e q u i v ) i n a b s o l u t e e t h a n o l ( 1 5 m L ) a n d N a B H 4 ( 1 6 9 m g , F W = 3 7 . 8 5 , ~ 1 0 e q u i v ) w a s r e fl u x e d f o r 2 h . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a n d t h e r e s i d u e w a s e x t r a c t e d w i t h b r i n e a n d C H C 1 3 . I T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d c o n c e n t r a t e d i n v a c u o t o a f f o r d l i g h t r y e l l o w p o w d e r o f p r i m a r y a l c o h o l 3 7 i n q u a n t i t a t i v e y i e l d . [ R f ( E t O A c ) : 0 . 2 7 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 2 . 9 8 ( t , 2 H ) , 5 3 . 7 4 ( t , 2 H ) , 5 4 . 1 5 ( s , 4 H ) , 5 7 . 4 0 ( m , 4 H ) , 5 7 . 6 8 ( t , 2 H ) , 5 7 . 7 4 ( d , 2 H ) , 5 8 . 0 1 ( d , 2 H ) , 5 8 . 0 7 ( d , 2 H ) . ] 2 1 . S y n t h e s i s o f ( 3 8 ) I n a n a t t e m p t t o o x i d i z e t h e p r i m a r y a l c o h o l 3 7 t o t h e c o r r e s p o n d i n g a l d e h y d e d i f f e r e n t o x i d a t i o n c o n d i t i o n s w e r e t r i e d . S u r p r i s i n g l y , s o m e o f t h e m l e d t o q u i n o l i n e c a r b o x a l d e h y d e 3 8 i n v e r y g o o d y i e l d s . A . D e s s - M a r t i n O x i d a t i o n : I n a s o l u t i o n o f D e s s - M a r t i n p e r i o d i n a n e ( 7 7 m g , 0 . 1 8 m m o l , 2 e q u i v ) i n C H 2 C l 2 ( 2 m L ) a t 0 ° C , u n d e r N 2 , p y r i d i n e ( 2 2 M L , 0 . 5 4 m m o l , 3 3 9 9 e q u i v ) w a s a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r 1 0 r r r i n . A s o l u t i o n o f a l c o h o l 3 7 ( 3 0 m g , 0 . 0 9 m o l , 1 e q u i v ) i n C H 2 C l 2 ( 5 m L ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e r e a c t i o n w a s s t i r r e d f o r 3 0 m i n a t 0 ° C a n d t h e n a n a d d i t i o n a l h o u r a t r o o m t e m p e r a t u r e . A f t e r t h a t , s a t u r a t e d s o l u t i o n o f N a 2 S 0 3 w a s a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s e x t r a c t e d w i t h C H 2 C 1 3 . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d p u r i fi e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 8 0 % E t O A c / H e x ) y i e l d i n g q u i n o l i n e c a r b o x a l d e h y d e 3 8 a s a y e l l o w i s h p o w d e r ( 7 0 % ) . B . P C C O x i d a t i o n : T o a s t i r r e d s u s p e n s i o n o f p y r i d i n i u m c h l o r o c h r o m a t e ( P C C , 2 6 m g , 0 . 1 2 m m o l , 1 . 5 e q u i v ) a n d c e l i t e ( 2 6 m g ) i n f r e s h l y d i s t i l l e d C H 2 C l 2 ( 2 m L ) a t r o o m t e m p e r a t u r e w a s a d d e d a s o l u t i o n o f a l c o h o l 3 7 ( 2 7 . 5 m g , 0 . 0 8 m o l , 1 e q u i v ) i n C H 2 C l 2 ( 2 m L ) . T h e r e s u l t i n g s u s p e n s i o n w a s s t i r r e d f o r 2 0 m i n a n d t h e n d i l u t e d w i t h E t 2 O ( 1 0 0 m L ) . T h e s u s p e n s i o n w a s f i l t e r e d t h r o u g h a p a d o f s i l i c a a n d w a s r i n s e d w i t h a d d i t i o n a l E t 2 O ( 5 0 m L ) . T h e s o l v e n t w a s r e m o v e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e t o a f f o r d p u r e c a r b o x a l d e h y d e 3 8 i n q u a n t i t a t i v e y i e l d . [ R f ( E t O A c ) = 0 . 8 3 ; l H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 7 . 6 8 ( t , 1 H ) , 7 . 8 2 ( t , 1 H ) , 7 . 9 0 ( d , 1 H ) , 8 . 0 2 ( d , 1 H ) , 8 . 2 4 ( d , 1 H ) , 8 . 3 0 ( d , 1 H ) , 1 0 . 2 2 ( s , 1 H ) ; l 3 C N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 1 1 7 . 3 , 1 2 7 . 8 , 1 2 9 . 2 , 1 3 0 . 4 , 1 3 7 . 4 , 1 9 3 . 7 ; M S / D i r e c t P r o b e : M : 1 5 7 ; I R 1 2 2 . S y n t h e s i s o f ( 4 0 ) , ( 4 1 ) 4 0 0 t m . n a ( I — I n a s o l u t i o n o f B r - 2 - m e t h y l q u i n o l i n e 2 ( 0 . 4 g , 1 . 8 m o l , 1 e q u i v ) i n f r e s h l y d i s t i l l e d T H F ( 1 0 m L ) w a s a d d e d a m i n o a c e t a l d e h y d e d i m e t h y l a c e t a l ( 0 . 1 9 g , 1 . 8 m m o l , 1 . 0 e q u i v ) a n d e x c e s s o f s o d i u m c a r b o n a t e a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d o v e r n i g h t . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a n d t h e r e s i d u e w a s e x t r a c t e d w i t h C H 2 C l 2 T h e o r g a n i c l a y e r w a s w a s h e d s e v e r a l t i m e s w i t h w a t e r , d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d p u r i fi e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 1 0 % M e O H / E t O A c ) t o a f f o r d l i g h t y e l l o w p o w d e r o f a c e t a l 4 0 ( 4 6 % ) . [ R f ( E t O A c ) = 0 . 5 0 ; l H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 2 . 8 4 ( d , 2 H ) , 3 . 2 3 ( s , 6 H ) , 4 . 0 9 ( s , 4 H ) , 4 . 5 7 ( t , 1 H ) , 7 . 4 4 ( t , 2 H ) , 7 . 6 2 ( t , 2 H ) , 7 . 7 3 ( t , 4 H ) , 8 . 0 1 ( d , 2 H ) , 8 . 0 7 ( d , 2 H ) ] . A l s o , 4 3 % o f a c e t a l 4 1 w a s i s o l a t e d . [ R f ( E t O A c ) = 0 . 1 7 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 2 . 2 6 ( s , 1 H ) , 2 . 7 4 ( d , 2 H ) , 3 . 2 6 ( s , 6 H ) , 4 . 0 1 ( s , 2 H ) , 4 . 4 5 ( d , 1 H ) , 7 . 3 2 ( d , 1 H ) , 7 . 3 7 ( d , 1 H ) , 7 . 5 5 ( t , 1 H ) , 7 . 6 4 ( d , 1 H ) , 7 . 9 5 ( d , 2 H ) ] . 2 3 . S y n t h e s i s o f ( 4 9 ) \ / N \ B r / O 2 4 9 I n a s o l u t i o n o f E t h y l A c e t a t e ( 1 2 u L , 0 . 1 2 m o l , 1 e q u i v ) i n f r e s h l y d i s t i l l e d B 2 0 ( 1 m L ) , u n d e r N 2 a t m o s p h e r e , a t 0 ° C w a s a d d e d K H M D S ( 0 . 5 M i n t o l u e n e , 1 . 2 5 m L , 0 . 6 m m o l , 5 e q u i v ) a n d t h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r 3 0 m i n . A s o l u t i o n o f B r - 2 m e t h y l q u i n o l i n e 2 ( 1 0 3 m g , 0 . 4 6 m o l , 3 e q u i v ) i n B 2 0 ( 2 m L ) w a s t h e n a d d e d . U p o n a d d i t i o n t h e y e l l o w i s h s o l u t i o n b e c a m e d a r k g r e e n a n d fi n a l l y b r o w n . T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C a n d w a s f o l l o w e d b y T L C . A f t e r 1 5 m i n i t w a s q u e n c h e d w i t h b r i n e a n d 4 0 1 - j e x t r a c t e d w i t h e t h e r . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d p u r i f i e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 2 0 % E t O A c / P e n t a n e ) . L i g h t y e l l o w s o l i d o f a l k e n e 4 9 w a s i s o l a t e d ( 2 5 % ) , w h i l e n o o t h e r s i g n i fi c a n t p r o d u c t w a s i s o l a t e d . [ R f ( E t O A c ) = 0 . 5 6 ; l H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 7 . 5 1 ( t , 1 H ) , 7 . 7 1 ( t , 1 H ) , 7 . 7 9 ( d , 2 H ) , 7 . 8 2 ( d , 1 H ) , 7 . 9 3 ( s , 1 H ) , 8 . 0 9 ( d , 1 H ) , 8 . 1 7 ( d , 1 H ) ; 1 3 C N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 1 1 9 . 4 4 , 1 2 6 . 5 8 , 1 2 7 . 5 0 , 1 2 7 . 5 6 , 1 2 9 . 3 6 , 1 2 9 . 8 1 , 1 3 4 . 5 8 , 1 3 6 . 5 2 , 1 4 8 . 2 0 , 1 5 5 . 3 2 ; M S / D i r e c t P r o b e : M H + = 2 8 3 ; I R . ] 2 4 . S y n t h e s i s o f ( 4 5 ) o o H 2 N / \ / U \ O H H Z N A / I L O A 4 4 4 5 C o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e fi - a l a n i n e 4 4 ( 3 . 6 9 g , 4 1 . 4 m m o l , 1 e q u i v ) w e r e s u s p e n d e d i n a b s o l u t e e t h a n o l ( 1 0 0 m L ) . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s a c i d i f i e d w i t h c o n c e n t r a t e d H 2 S O 4 ( ~ 0 . 5 m L ) a n d r e fl u x e d o v e r n i g h t . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d u n d e r v a c u o a n d t h e m i x t u r e w a s q u e n c h e d w i t h s a t u r a t e d N a 2 C 0 3 a n d e x t r a c t e d w i t h C H C 1 3 t o y i e l d v e r y s m a l l a m o u n t o f e t h y l e s t e r 4 5 ( 8 % ) . ( T h e e s t e r i f c a t i o n r e a c t i o n w a s c l e a n b u t t h e p r o d u c t c o u l d n ’ t b e e x t r a c t e d e f f i c i e n t l y . [ 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 l . 1 4 ( t , 3 H ) , 1 . 4 5 ( s , 2 H ) , 2 . 3 3 ( t , 2 H ) , 2 . 8 5 ( t , 2 H ) , 4 . 0 3 ( q , 2 H ) ] 2 5 . S y n t h e s i s o f ( 4 6 ) 4 0 2 N . - ~ \ / B r H Z N N E O A W E 2 4 5 4 5 0 O K A m i x t u r e o f B - a l a n i n e e t h y l e s t e r h y d r o c h l o r i d e 4 5 ( 1 5 3 m g , 1 . 3 m o l , 1 e q u i v ) , b r o m o m e t h q u u i n o l i n e 2 ( 5 8 4 m g , 2 . 6 2 m o l , 2 e q u i v ) a n d e x c e s s o f N a 2 C O 3 i n f r e s h l y d i s t i l l e d T H F ( 1 2 m L ) w a s s t i r r e d a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d a n d t h e r e s i d u e w a s p a r t i t i o n e d b e t w e e n C H C l 3 / H 2 O . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d p u r i fi e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y t o a f f o r d a l i g h t y e l l o w p o w d e r o f N - D i - m e t h y l q u i n o l i n e B - a l a n i n e e t h y l e s t e r 4 6 ( 6 3 % ) . [ R f ( 3 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 3 7 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) : 5 0 . 9 9 ( t , 3 H ) , 2 . 4 8 ( t , 2 H ) , 2 . 9 4 ( t , 2 H ) , 3 . 9 3 ( q , 2 H ) , 3 . 9 6 ( s , 4 H ) , 7 . 3 5 ( d , 2 H ) , 7 . 5 5 ( m , 4 H ) , 7 . 6 2 ( d , 2 H ) , 7 . 9 6 ( t , 4 H ) . ] 2 6 . S y n t h e s i s o f ( 4 2 ) 4 6 O A m i x t u r e o f 1 1 8 m g e t h y l e s t e r 4 6 ( F W = 3 9 9 , 1 e q u i v ) i n a b s o l u t e e t h a n o l ( 1 5 m L ) a n d N a B H 4 ( 1 1 0 m g , 2 . 9 m m o l , 1 0 e q u i v ) w a s r e fl u x e d f o r 2 h . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a n d t h e r e s i d u e w a s e x t r a c t e d w i t h b r i n e a n d C H C l 3 . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 , c o n c e n t r a t e d i n v a c u o a n d p u r i f i e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y t o a f f o r d l i g h t y e l l o w p o w d e r o f p r i m a r y a l c o h o l 4 2 ( 3 1 % ) . [ R f 4 0 3 ( E t O A c ) = 0 . 1 8 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 1 . 8 2 ( m , 2 H ) , 2 . 8 2 ( t , 2 H ) , 3 . 8 l ( t , 2 H ) , 4 . 0 0 ( s , 4 H ) , 7 . 3 5 ( t , 2 H ) , 7 . 6 5 ( d , 2 H ) , 7 . 6 7 ( t , 2 H ) , 7 . 7 3 ( d , 2 H ) , 8 . 0 4 ( d , 2 H ) , 8 . 1 2 ( d , 2 H ) . ] 2 7 . S y n t h e s i s o f ( 4 9 ) C ( I ° ° N ’ 3 ' E t O M O E t 2 4 8 T o a s o l u t i o n o f c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e e t h y l m a l o n a t e 4 8 ( 6 8 m L , 0 . 4 4 m m o l , 1 . 0 e q u i v ) i n f r e s h l y d i s t i l l e d T H F ( 2 m L ) w a s a d d e d t r i e t h y l a m i n e ( 6 6 m g , 0 . 6 6 m m o l , 1 . 5 e q u i v ) . T h e s o l u t i o n w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d l i t h i u m b i s ( t r i m e t h y l s i l y l ) a m i d e ( L i H M D S , 1 . 0 M i n T H F , 0 . 4 5 m L , 0 . 4 8 m m o l , 1 . 1 e q u i v ) w a s a d d e d . A f t e r s t i r r i n g t h e m i x t u r e f o r ~ 1 0 m i n , a s o l u t i o n o f b r o m o m e t h y l q u i n o l i n e 2 ( 1 0 4 . 5 m g , 0 . 4 7 m m o l , 1 . 1 e q u i v ) i n T H F ( 2 m L ) w a s a d d e d a n d t h e r e a c t i o n w a s s t i r r e d f o r ~ 1 h ( o r u n t i l n o m o r e s t a r t i n g m a t e r i a l 2 w a s p r e s e n t o n t h e T L C ) . A t t h i s p o i n t , t h e m o n o - s u b s t i t u t e d c o m p o u n d w a s f o r m e d a n d t h e r e f o r e , s u b s e q u e n t a d d i t i o n o f L i H M D S ( 1 . 0 M i n T H F , 0 . 4 5 m L , 0 . 4 8 m m o l , 1 . 1 e q u i v ) a n d b r o m o m e t h y l q u i n o l i n e ( 1 0 4 . 5 m g , 0 . 4 7 m m o l , 1 . 1 e q u i v ) a n d s t i r r i n g a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t r e s u l t s i n t h e fi n a l p r o d u c t 4 9 . T h e r e a c t i o n w a s q u e n c h e d w i t h w a t e r a n d T H F w a s e v a p o r a t e d i n v a c u o . T h e r e s i d u e w a s p a r t i t i o n e d b e t w e e n b r i n e a n d B 2 0 a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d c o n c e n t r a t e d i n v a c u o . C r u d e N M R s h o w e d f u l l c o n v e r s i o n t o t h e d e s i r e d p r o d u c t 4 9 [ R f ( 3 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 4 9 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 1 . 2 7 2 ( t , 6 H ) , 3 . 7 9 5 ( s , 4 H ) , 4 . 3 2 5 ( q , 4 H ) , 7 . 2 8 ( d , 2 H ) , 7 . 4 8 9 ( t , 2 H ) , 7 . 6 8 4 ( t , 2 H ) , 7 . 7 7 ( d , 2 H ) , 8 . 0 2 ( d , 4 0 4 : — m r A ? ‘ 5 4 H ) ; l 3 C N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 1 3 . 9 , 3 9 . 9 , 5 7 . 9 , 6 1 . 3 , 1 2 2 . 7 , 1 2 5 . 8 , 1 2 6 . 6 , 1 2 7 . 3 , 1 2 8 . 9 , 1 2 9 , 1 3 5 . 7 , 1 4 7 . 5 , 1 5 8 , 1 7 0 . 8 ] 3 0 . S y n t h e s i s o f ( 5 1 ) A s o l u t i o n o f t h e m a l o n y l d i e s t e r 4 9 ( 1 5 5 . 7 m g , 0 . 3 5 m o l , 1 e q u i v ) a n d s o d i u m c y a n i d e ( N a C N , 3 6 . 2 m g , 0 . 7 m m o l , 2 . 1 e q u i v ) i n D M S O ( 5 m L ) w a s h e a t e d t o 1 6 0 ° C f o r 1 8 h , u n d e r N 2 , u n t i l n o t r a c e o f s t a r t i n g m a t e r i a l w a s p r e s e n t o n t h e T L C p l a t e . T h e d a r k r e d s o l u t i o n w a s c o o l e d a n d d i l u t e d w i t h w a t e r a n d t h e m i x t u r e w a s e x t r a c t e d w i t h E t 2 O s e v e r a l t i m e s . T h e o r g a n i c l a y e r w a s w a s h e d w i t h w a t e r , d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d p u r i fi e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y ( 1 0 % E t O A c / H e x ) t o a f f o r d 5 1 a s a r e d o i l ( 3 8 % ) . ( A c c o r d i n g t o T L C t h e r e s h o u l d b e f u l l c o n v e r s i o n o f t h e d i e s t e r t o p r o d u c t 5 1 . T h e l o w y i e l d i s , m o s t p r o b a b l y , d u e t o t h e l o s s o f p r o d u c t d u r i n g t h e t e d i o u s e x t r a c t i o n ) . [ R f ( 3 0 % E t O A c / H e x ) = 0 . 2 9 ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 1 . 0 1 ( t , 3 H ) , 3 . 2 2 - 3 . 4 8 ( A B d d , 4 H ) , 3 . 8 1 ( p , 1 H ) , 4 . 0 3 ( q , 2 H ) , 7 . 2 7 ( d , 2 H ) , 7 . 4 4 ( t , 2 H ) , 7 . 6 4 ( t , 2 H ) , 7 . 7 1 ( d , 2 H ) , 7 . 9 7 ( d , 2 H ) , 8 . 0 0 ( d , 2 H ) . ] 3 1 . S y n t h e s i s o f ( 5 2 ) 4 0 5 T o a s o l u t i o n o f e s t e r 5 1 ( 4 2 m g , 0 . 1 1 m o l , 1 e q u i v ) i n a b s o l u t e e t h a n o l ( 1 0 m L ) , N a B H 4 ( 9 2 m g , 2 . 4 m m o l , 2 0 e q u i v ) w a s a d d e d . T h e r e d s o l u t i o n b e c a m e o r a n g e / y e l l o w u p o n a d d i t i o n a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d o v e r n i g h t . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a n d t h e r e s i d u e w a s q u e n c h e d w i t h s a t u r a t e d s o l u t i o n o f s o d i u m c a r b o n a t e a n d e x t r a c t e d w i t h C H C 1 3 / H 2 O . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d p u r i f i e d b y fl a s h s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y t o a f f o r d a l c o h o l 5 2 ( 3 3 % ) . [ 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 2 . 8 1 ( m , 1 H ) , 3 . 1 3 ( d , 4 H ) , 3 . 6 1 ( d , 2 H ) , 7 . 3 0 ( d , 2 H ) , 7 . 4 9 ( t , 2 H ) , 7 . 6 8 ( t , 2 H ) , 7 . 7 7 ( d , 2 H ) , 8 . 0 5 ( t , 4 H ) ] 3 2 . S y n t h e s i s o f ( 5 0 ) T o a s o l u t i o n o f d i e s t e r 4 9 ( 2 1 0 m g , 0 . 4 7 m o l , 1 e q u i v ) , i n T H F ( 5 m L ) , 6 N K O H ( 5 m L , 3 0 m m o l , e x c e s s ) w a s a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d o v e r n i g h t . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d a n d t h e s o l i d r e s i d u e w a s d i s s o l v e d i n C H 2 C l 2 a n d e x t r a c t e d w i t h b r i n e . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d t h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e t o a f f o r d c a r b o x y l i c a c i d 5 0 ( 7 8 % ) . ( A l t h o u g h t h e r e a c t i o n w a s v e r y c l e a n y i e l d i n g e x c l u s i v e l y p r o d u c t 5 0 , a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f i t w a s l o s t d u r i n g t h e e x t r a c t i o n ) [ ' H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) : 5 3 . 2 4 - 3 . 5 6 ( A B d d , 4 H ) , 3 . 7 8 ( m , 1 H ) , 7 . 2 7 ( d , 2 H ) , 7 . 4 5 ( t , 2 H ) , 7 . 6 5 ( t , 2 H ) , 7 . 7 5 ( d , 2 H ) , 7 . 9 4 ( d , 2 H ) , 8 . 0 5 ( d , 2 H ) ] 4 0 6 7 . 7 R e f e r e n c e s 1 . N . W e i , N . N . M u r t h y , K . D . K a r l i n " C h e m i s t r y o f P e n t a c o o r d i n a t e L - C u ( I I ) - C l ( + ) C o m p l e x e s w i t h Q u i n o l y l C o n t a i n i n g T r i p o d a l T e t r a d e n t a t e L i g a n d s L " I n o r g . C h e m . 1 9 9 4 , 3 3 , 6 0 9 3 - 6 1 0 0 . 2 . N . W e i , N . N . M u r t h y , Q . C h e n , J . Z u b i e t a , K . D . K a r l i n " C o p p e r ( I ) D i o x y g e n R e a c t i v i t y o f M o n o n u c l e a r C o m p l e x e s w i t h P y r i d y l a n d Q u i n o l y l T r i p o d a l T e t r a d e n t a t e L i g a n d s - R e v e r s i b l e F o r m a t i o n o f C u - I I 1 / 1 a n d 2 / 1 A d d u c t s " I n o r g . C h e m . 1 9 9 4 , 3 3 , 1 9 5 3 - 1 9 6 5 . 3 . S . Z a h n , J . W . C a n a r y " E l e c t r o n - i n d u c e d i n v e r s i o n o f h e l i c a l c h i r a l i t y i n c o p p e r c o m p l e x e s o f N , N - d i a l k y l m e t h i o n i n e s " S c i e n c e 2 0 0 0 , 2 8 8 , 1 4 0 4 - 1 4 0 7 . 4 . S . Z a h n , J . W . C a n a r y " A b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n s o f N , N - d i a l k y l a l p h a - a m i n o a c i d s a n d b e t a - a m i n o a l c o h o l s f r o m e x c i t o n - c o u p l e d c i r c u l a r d i c h r o i s m s p e c t r a o f C u ( H ) c o m p l e x e s " O r g . L e t t . 1 9 9 9 , I , 8 6 1 - 8 6 4 . 5 . S . Z a h n , J . W . C a n a r y " R e d o x - s w i t c h e d e x c i t o n - c o u p l e d c i r c u l a r d i c h r o i s m : A n o v e l s t r a t e g y f o r b i n a r y m o l e c u l a r s w i t c h i n g " A n g e w . C h e m - I n t . E d i t . 1 9 9 8 , 3 7 , 3 0 5 - 3 0 7 . 6 . J . W . C a n a r y , C . S . A l l e n , J . M . C a s t a g n e t t o , Y . H . C h i u , P . J . T o s c a n o , Y . H . W a n g " S o l i d s t a t e a n d s o l u t i o n c h a r a c t e r i z a t i o n o f c h i r a l , c o n f o r m a t i o n a l l y m o b i l e t r i p o d a l l i g a n d s " I n o r g . C h e m . 1 9 9 8 , 3 7 , 6 2 5 5 - 6 2 6 2 . 7 . J . M . C a s t a g n e t t o , X . D . X u , N . D . B e r o v a , J . W . C a n a r y " A b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n a l a s s i g n m e n t o f s e l f - o r g a n i z i n g a s y m m e t r i c t r i p o d a l l i g a n d - m e t a l c o m p l e x e s " C h i r a l i t y 1 9 9 7 , 9 , 6 1 6 - 6 2 2 . 8 . J . M . C a s t a g n e t t o , J . W . C a n a r y " A c h i r o p t i c a l l y e n h a n c e d fl u o r e s c e n t c h e m o s e n s o r " C h e m . C o m m u n . 1 9 9 8 , 2 0 3 - 2 0 4 . 9 . C . J a n i a k , S . T e m i z d e m i r , S . D e c h e r t , W . D e c k , F . G i r g s d i e s , J . H e i n z e , M . J . K o l m , T . G . S c h a r r n a n n , O . M . Z i p f f e l " B i n a r y [ h y d r o t r i s ( i n d a z o l - 1 - y l ) b o r a t o ] m e t a l c o m p l e x e s , M ( T p ( 4 B o ) ) ( 2 ) w i t h M = F e , C o , N i , C u , a n d Z n : E l e c t r o n i c p r o p e r t i e s a n d s o l v e n t - d e p e n d e n t f r a m e w o r k s t r u c t u r e s t h r o u g h C - H c e n t e r d o t c e n t e r d o t c e n t e r d o t p i i n t e r a c t i o n s " E u r . J . I n o r g . C h e m . 2 0 0 0 , 2 4 2 1 - 2 4 2 1 . 4 0 7 1 0 . 1 1 . 1 2 . 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . C . J a n i a k , S . T e r r r i z d e m i r , S . D e c h e r t , W . D e c k , F . G i r g s d i e s , J . H e i n z e , M . J . K o l m , T . G . S c h a r r n a n n , O . M . Z i p f f e l " B i n a r y [ h y d r o t r i s ( i n d a z o l - 1 - y l ) b o r a t o ] m e t a l c o m p l e x e s , M ( T p ( 4 B o ) ) ( 2 ) ( [ l ] ) w i t h M = F e , C o , N i , C u , a n d Z n : E l e c t r o n i c p r o p e r t i e s a n d s o l v e n t - d e p e n d e n t f r a m e w o r k s t r u c t u r e s t h r o u g h C - H c e n t e r d o t c e n t e r d o t c e n t e r d o t p i i n t e r a c t i o n s " E u r . J . I n o r g . C h e m . 2 0 0 0 , 1 2 2 9 - 1 2 4 1 . A . N a i i n i , J . P i n k a s , W . P l a s s , J . G . V e r k a d e , Y . W a n " A t r a n e s a n d A z a t r a n e s - N o v e l R e a c t i v i t y a n d S t r u c t u r a l P a t t e r n s " A b s t r . P a p . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 3 , 2 0 5 , 2 6 . J . P i n k a s , B . G a u l , J . G . V e r k a d e " G r o u p - 1 3 A z a t r a n e s - S y n t h e t i c , C o n f o r m a t i o n a l , a n d C o n f i g u r a t i o n a l F e a t u r e s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 3 , 1 1 5 , 3 9 2 5 - 3 9 3 1 . J . P i n k a s , J . G . V e r k a d e " N e w G r o u p - 1 3 A z a t r a n e s - S t r u c t u r e a n d R e a c t i v i t y " A b s t r . P a p . A m . C h e m . S . 1 9 9 3 , 2 0 5 , 1 5 4 . J . P i n k a s , A . A . N a i i n i , W . P l a s s , V . Y o u n g , J . V e r k a d e " N o v e l T r i p o d a l L i g a n d C o m p l e x e s o f G r o u p - l a n d G r o u p - 2 C a t i o n s I n c l u d i n g H + " A b s t r . P a p . A m C h e m . S . 1 9 9 3 , 2 0 5 , 1 5 6 . J . P i n k a s , T . L . W a n g , R . A . J a c o b s o n , J . G . V e r k a d e " G r o u p - l 3 A z a t r a n e s - S t r u c t u r e a n d R e a c t i v i t y " I n o r g . C h e m . 1 9 9 4 , 3 3 , 5 2 4 4 - 5 2 5 3 . D . D . L e c l o u x , D . C h r i s t e n s o n , V . R e y n o l d s , C . T o k a r , W . B . T o l m a n " C o m p l e x e s o f a n E n a n t i o m e r i c a l l y P u r e T r i s ( P y r a z o l y l ) - H y d r o b o r a t e L i g a n d - S y n t h e s i s , S t r u c t u r e s , a n d A s y m m e t r i c R e a c t i v i t y " A b s t r . P a p . A m . C h e m . S . 1 9 9 3 , 2 0 5 , 5 5 5 . D . D . L e c l o u x , C . J . T o k a r , M . O s a w a , R . P . H o u s e r , M . C . K e y e s , W . B . T o l m a n " O p t i c a l l y - A c t i v e a n d C 3 - S y m m e t r i c a l T r i s ( P y r a z o l y l ) H y d r o b o r a t e a n d T r i s ( P y r a z o l y l ) P h o s p h i n e O x i d e L i g a n d s - S y n t h e s i s a n d S t r u c t u r a l C h a r a c t e r i z a t i o n " O r g a n o m e t a l l i c s 1 9 9 4 , 1 3 , 2 8 5 5 - 2 8 6 6 . P . B . K e t t l e r , D . L e c l o u x , C . T o k a r , W . B . T o l m a n " E n a n t i o m e r i c a l l y P u r e C - 3 S y m m e t r i c a l P o l y p y r a z o l e L i g a n d s - T r a n s i t i o n - M e t a l C o m p l e x a t i o n a n d A s y m m e t r i c I n d u c t i o n " A b s t r . P a p . A m . C h e m . S . 1 9 9 2 , 2 0 3 , 6 7 4 . C . J . T o k a r , P . B . K e t t l e r , W . B . T o l m a n " E n a n t i o m e r i c a l l y P u r e C o p p e r ( I ) a n d Z i n c ( I i ) C o m p l e x e s o f a N o v e l C 3 - S y r m n e t r i c a l P o l y p y r a z o l e L i g a n d " O r g a n o m e t a l l i c s 1 9 9 2 , I I , 2 7 3 7 - 2 7 3 9 . C . M o b e r g " C - 3 s y m m e t r y i n a s y m m e t r i c c a t a l y s i s a n d c h i r a l r e c o g n i t i o n " A n g e w . C h e m . - I n t . E d i t . 1 9 9 8 , 3 7 , 2 4 8 - 2 6 8 . B . S . H a m m e s , D . R a m o s - M a l d o n a d o , G . P . A . Y a p , A . L . R h e i n g o l d , V . G . Y o u n g , A . S . B o r o v i k " T h e u s e o f C - 3 - s y m m e t r i c t r i p o d a l l i g a n d s i n c r y s t a l e n g i n e e r i n g " C o o r d i n . C h e m . R e v . 1 9 9 8 , 1 7 4 , 2 4 1 - 2 5 3 . 4 0 8 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . X . F . H u a n g , B . B o r h a n , N . B e r o v a , K . N a k a n i s h i " U V - v i s s p e c t r a l c h a n g e s i n t h e b i n d i n g o f a c y c l i c d i a m i n e s w i t h a z i n c p o r p h y r i n t w e e z e r " J . I n d i a n C h e m . S o c . 1 9 9 8 , 7 5 , 7 2 5 - 7 2 8 . H . V a h r e n k a m p " T r a n s i t i o n s , t r a n s i t i o n s t a t e s , t r a n s i t i o n s t a t e a n a l o g u e s : Z i n c p y r a z o l y l b o r a t e c h e m i s t r y r e l a t e d t o z i n c e n z y m e s " A c c o u n t s C h e m . R e s . 1 9 9 9 , 3 2 , 5 8 9 - 5 9 6 . T . H e y d e , L . R . N a s s i m b e n i " R e a c t i o n P a t h w a y s f r o m S t r u c t u r a l D a t a - D y n a m i c S t e r e o c h e m i s t r y o f Z i n c ( I i ) C o m p o u n d s " A c t a C r y s t a l l o g r . S e c t . B - S t r u c t . C o m m u n . 1 9 8 4 , 4 0 , 5 8 2 - 5 9 0 . E . M . L a r s e n , T r a n s i t i o n E l e m e n t s , W . A . B e n a m i n , I n c . , 1 9 6 5 . B . S . L i m , R . H . H o l m " M o l e c u l a r h e m e - c y a n i d e - c o p p e r b r i d g e d a s s e m b l i e s : L i n k a g e i s o m e r i s m , t r e n d s i n n u ( C N ) v a l u e s , a n d r e l a t i o n t o t h e h e m e - a ( 3 ) / C u - B s i t e i n c y a n i d e - i n h i b i t e d h e m e - c o p p e r o x i d a s e s " I n o r g . C h e m . 1 9 9 8 , 3 7 , 4 8 9 8 - 4 9 0 8 . X . F . H u a n g , B . H . R i c k m a n , B . B o r h a n , N . B e r o v a , K . N a k a n i s h i " Z i n c p o r p h y r i n t w e e z e r i n h o s t - g u e s t c o m p l e x a t i o n : D e t e r m i n a t i o n o f a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n s o f d i a m i n e s , a m i n o a c i d s , a n d a m i n o a l c o h o l s b y c i r c u l a r d i c h r o i s m " J . A m . C h e m . S o c . ' 1 9 9 8 , 1 2 0 , 6 1 8 5 - 6 1 8 6 . V . V . B o r o v k o v , J . M . L i n t u l u o t o , Y . I n o u e " S y n - a n t i c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n z i n c p o r p h y r i n d i m e r s i n d u c e d b y t e m p e r a t u r e - c o n t r o l l e d a l c o h o l l i g a t i o n " J . P h y s . C h e m . B 1 9 9 9 , 1 0 3 , 5 1 5 1 - 5 1 5 6 . S . L a t o u r , J . D . W u e s t " S i m p l e S y n t h e s e s o f 2 - H y d r o x y m e t h y l - l , 3 - P r o p a n e d i o l a n d R e l a t e d - C o m p o u n d s " S y n t h e s i s 1 9 8 7 , 7 4 2 - 7 4 5 . B . J . W a k e f i e l d C o m p . O r g a n o m e t a l . C h e m . 1 9 8 2 , 7 , 4 5 . C . M . L e i r " I m p r o v e m e n t i n D o e b n e r - M i l l e r S y n t h e s i s o f Q u i n a l d i n e s " J . O r g . C h e m . 1 9 7 7 , 4 2 , 9 1 1 - 9 1 3 . R . P . F o u l d s , R . R o b i n s o n " S o m e d e r i v a t i v e s o f s a f r o l e " J . C h e m . S o c . A b s . 1 9 1 4 , 1 0 5 , 1 9 6 3 - 1 9 7 2 . L . G . Q i a n g , N . H . B a i n e " A C o n v e n i e n t S y n t h e s i s o f S u b s t i t u t e d Q u i n o l i n e s b y T h e r m a l E l e c t r o c y c l i c R e a r r a n g e m e n t o f O r t h o - V i n y l A n i l s u n d e r N o n a c i d i c C o n d i t i o n s " J . O r g . C h e m . 1 9 8 8 , 5 3 , 4 2 1 8 - 4 2 2 2 . L . G . Q i a n g , N . H . B a i n e " A C o n v e n i e n t S y n t h e s i s o f S u b s t i t u t e d Q u i n o l i n e s b y T h e r m a l o r P h o t o c h e m i c a l E l e c t r o c y c l i c R e a r r a n g e m e n t o f O r t h o - V i n y l I m i d a t e s u n d e r N o n - A c i d i c C o n d i t i o n s " T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 8 8 , 2 9 , 3 5 1 7 - 3 5 2 0 . 4 0 9 3 5 . 3 6 . 3 7 . 3 8 . 3 9 . 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 4 . 4 5 . Y . W a t a n a b e , S . C . S h i m , T . M i t s u d o " T h e R h o d i u m C o m p l e x - C a t a l y z e d S y n t h e s i s o f Q u i n o l i n e s f r o m A r n i n o a r e n e s a n d A l i p h a t i c - A l d e h y d e s " B u l l . C h e m . S o c . J p n . 1 9 8 1 , 5 4 , 3 4 6 0 - 3 4 6 5 . T . K a m e t a n i , H . T a k e d a , Y . S u z u k i , H . K a s a i , T . H o n d a " A p p l i c a t i o n o f t h e L e w i s A c i d - C a t a l y z e d 4 + 2 C y c l o a d d i t i o n R e a c t i o n t o S y n t h e s i s o f N a t u r a l Q u i n o l i n e A l k a l o i d s " H e t e r o c y c l e s 1 9 8 6 , 2 4 , 3 3 8 5 - 3 3 9 5 . T . K a m e t a n i , Y . S u z u k i , H . T a k e d a , H . K a s a i , K . Y a m a z a k i , N . T a k a d a , T . H o n d a " N o v e l C o n s t r u c t i o n o f Q u i n o l i n e R i n g - S y s t e m b y E l e c t r o c y c l i c R e a c t i o n o f A z a h e x a t r i e n e D e r i v a t i v e s " Y a k u g a k u Z a s s h i - J . P h a r m . S o c . J p n . 1 9 8 7 , 1 0 7 , 1 0 7 - 1 1 0 . L . O l l e r o , L . C a s t e d o , D . D o m i n g u e z " E n a n t i o s p e c i f i c s y n t h e s i s o f ( + ) - r i b a s i n e " T e t r a h e d r o n 1 9 9 9 , 5 5 , 4 4 4 5 - 4 4 5 6 . B . H e r r a n z , S e r r a t o s . F " C o n t r o l l e d P r o t o n a t i o n o f T r i s - A l p h a - D i a z o k e t o n e s " T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 7 4 , 4 4 4 5 - 4 4 4 6 . E . H e r r a n z , F . S e r r a t o s a " P r o t o n a t i o n o f M e t h a n e ( T r i - A l p h a - D i a z o a c e t o n e ) i n A c i d S o f t e n i n g S o l v e n t s - A c i d a n d B a s e - I n d u c e d I n t r a m o l e c u l a r C y c l i z a t i o n s O m M e t h a n e ( T r i - C h l o r o a c e t o n e ) t o T r i o x a a d a m a n t a n e a n d T r i a s t e r a n e D e r i v a t i v e s " T e t r a h e d r o n 1 9 7 7 , 3 3 , 9 9 5 - 9 9 8 . S . N a h m , S . M . W e i n r e b " N - M e t h o x y - N - M e t h y l a m i d e s a s E f f e c t i v e A c y l a t i n g A g e n t s " T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 8 1 , 2 2 , 3 8 1 5 - 3 8 1 8 . L . K . T s o u , C . D . T a t k o , M . L . W a t e r s " S i m p l e c a t i o n - p i i n t e r a c t i o n b e t w e e n a p h e n y l r i n g a n d a p r o t o n a t e d a m i n e s t a b i l i z e s a n a l p h a - h e l i x i n w a t e r " J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 2 , 1 2 4 , 1 4 9 1 7 - 1 4 9 2 1 . Y . H . C h i u , O . d o s S a n t o s , J . W . C a n a r y " C o n f o r m a t i o n a l c o n t r o l o f p r o p e l l e r - l i k e c h i r a l i t y i n Z n ( H ) c o m p l e x e s : T i g h t l y b a l a n c e d s t e r i c b i a s " T e t r a h e d r o n 1 9 9 9 , 5 5 , 1 2 0 6 9 - 1 2 0 7 8 . J . W . C a n a r y , C . S . A l l e n , J . M . C a s t a g n e t t o , Y . H . W a n g " C o n f o r r n a t i o n a l l y D r i v e n , P r o p e l l e r - L i k e C h i r a l i t y i n L a b i l e C o o r d i n a t i o n - C o m p l e x e s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 5 , 1 1 7 , 8 4 8 4 - 8 4 8 5 . B . S z l y k , A . S u r d y k o w s k i , M . B a r w i o l e k , E . L a r s e n " S p e c t r o s c o p y a n d s t e r e o c h e m i s t r y o f t h e o p t i c a l l y a c t i v e c o p p e r ( I I ) , c o b a l t ( 1 1 ) a n d n i c k e l ( I I ) c o m p l e x e s w i t h S c h i f f b a s e s N , N ' - ( 1 R , 2 R ) - ( - ) - 1 , 2 - c y c l o h e x y l e n e b i s ( 3 - m e t h y l b e n z y l i d e n e i m i n a t o ) a n d N , N ' - ( 1 R , 2 R ) - ( - ) - l , 2 - c y c l o h e x y l e n e b i s ( 5 - m e t h y l b e n z y l i d e n e i m i n a t o ) " P o l y h e d r o n 2 0 0 2 , 2 1 , 2 7 1 1 - 2 7 1 7 . 4 1 0 4 6 . 4 7 . 4 8 . 4 9 . 5 0 . 5 1 . 5 2 . 5 3 . 5 4 . 5 5 . 5 6 . 5 7 . H . W e i n g a r t e n , J . P . C h u p p , W . A . W h i t e " K e t i r n i n e s y n t h e s i s . U s e o f t i t a n i u m t e t r a c h l o r i d e i n a n e w p r o c e d u r e f o r t h e i r p r e p a r a t i o n " J . O r g . C h e m . 1 9 6 7 , 3 2 , 3 2 4 6 - 3 2 4 9 . R . D . L i t t l e , G . W . M u l l e r " I n t r a m o l e c u l a r D i y l T r a p p i n g - T o t a l S y n t h e s i s o f D 1 - H i r s u t e n e " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 8 1 , 1 0 3 , 2 7 4 4 - 2 7 4 9 . S . V . L e y , J . N o r m a n , W . P . G r i f fi t h , S . P . M a r s d e n " T e t r a p r o p y l a m m o n i u m P e r r u t h e n a t e , P r 4 n + R u o 4 - , T p a p - a C a t a l y t i c O x i d a n t f o r O r g a n i c - S y n t h e s i s " S y n t h e s i s 1 9 9 4 , 6 3 9 - 6 6 6 . W . P . G r i f fi t h , S . V . L e y , G . P . W h i t c o m b e , A . D . W h i t e " P r e p a r a t i o n a n d U s e o f T e t r a - N o r m a l - B u t y l a m m o n i u m P e r - R u t h e n a t e ( T b a p R e a g e n t ) a n d T e t r a - N o r m a l - P r o p y l a m m o n i u m P e r - R u t h e n a t e ( T p a p R e a g e n t ) a s N e w C a t a l y t i c O x i d a n t s f o r A l c o h o l s " J . C h e m . S o c . - C h e m . C o m m u n . 1 9 8 7 , 1 6 2 5 - 1 6 2 7 . W . P . G r i f f i t h , J . M . J o l l i f f e , S . V . L e y , K . F . S p r i n g h o m , P . D . T i f f i n " O x i d a t i o n o f A c t i v a t e d H a l i d e s t o A l d e h y d e s a n d K e t o n e s b y N - M e t h y l m o r p h o l i n e - N - O x i d e " S y n t h . C o m m u n . 1 9 9 2 , 2 2 , 1 9 6 7 - 1 9 7 1 . K . E . P fi t z n e r , J . G . M o f f a t t " S u l f o x i d e - c a r b o d i i m i d e r e a c t i o n s . 1 . A f a c i l e o x i d a t i o n o f a l c o h o l s " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 6 5 , 8 7 , 5 6 6 1 - 5 6 7 0 . K . E . P f i t z n e r , J . G . M o f f a t t " S u l f o x i d e - c a r b o d i i r r r i d e r e a c t i o n s . H . S c o p e o f t h e o x i d a t i o n r e a c t i o n " J . A m . C h e m . S o c . 1 9 6 5 , 8 7 , 5 6 7 0 - 5 6 7 8 . R . A . E l l i s o n , E . R . L u k e n b a c h , C . W . C h i u " C y c l o p e n t e n o n e S y n t h e s i s V i a A l d o l C o n d e n s a t i o n - S y n t h e s i s o f a K e y P r o s t a g l a n d i n I n t e r m e d i a t e " T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 7 5 , 4 9 9 - 5 0 2 . J . J . T u f a r i e l l o , K . W i n z e n b e r g " A N i t r o n e - B a s e d S y n t h e s i s o f t h e P y r r o l i z i d i n e A l k a l o i d C r o a l b i n e c i n e " T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 8 6 , 2 7 , 1 6 4 5 - 1 6 4 8 . G . M . C o p p o l a " A m b e r l y s t - 1 5 , a S u p e r i o r A c i d C a t a l y s t f o r t h e C l e a v a g e o f A c e t a l s " S y n t h e s i s 1 9 8 4 , 1 0 2 1 - 1 0 2 3 . M . J . S m i t h " T o t a l S y n t h e s i s a n d A b s o l u t e - C o n fi g u r a t i o n o f R h i z o b a c t i n , a S t r u c t u r a l l y N o v e l S i d e r o p h o r e " T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 8 9 , 3 0 , 3 1 3 - 3 1 6 . S . T a k a m u r a , T . Y o s h i m i y a , S . K a m e y a m a , A . N i s h i d a , H . Y a m a m o t o , M . N o g u c h i " A n e f f i c i e n t p r e p a r a t i o n o f m a c r o c y c l e s b e a r i n g v i n a m i d i n e m o i e t i e s b y t h e c y c l o c o n d e n s a t i o n o f m a l o n a l d e h y d e d e r i v a t i v e s a n d 1 , o m e g a - d i a m i n o a l k a n e s " S y n t h e s i s 2 0 0 0 , 6 3 7 - 6 3 9 . 4 1 1 5 8 . 5 9 . 6 0 . M . B o i s b r u n , L . J e a n n i n , L . T o u p e t , J . Y . L a r o n z e " A c o n v e n i e n t s y n t h e s i s o f i n d o l e - s u b s t i t u t e d 2 - p y r r o l i d o n e s a n d t h e i r c y c l i z e d d e r i v a t i v e s " E u r . J . O r g . C h e m . 2 0 0 0 , 3 0 5 1 - 3 0 5 7 . A . P . K r a p c h o " S y n t h e t i c A p p l i c a t i o n s o f D e a l k o x y c a r b o n y l a t i o n s o f M a l o n a t e E s t e r s , B e t a - K e t o - E s t e r s , A l p h a - C y a n o E s t e r s a n d R e l a t e d - C o m p o u n d s i n D i p o l a r A p r o t i c M e d i a . 2 " S y n t h e s i s 1 9 8 2 , 8 9 3 - 9 1 4 . A . P . K r a p c h o " S y n t h e t i c A p p l i c a t i o n s o f D e a l k o x y c a r b o n y l a t i o n s o f M a l o n a t e E s t e r s , B e t a - K e t o - E s t e r s , A l p h a - C y a n o E s t e r s a n d R e l a t e d - C o m p o u n d s i n D i p o l a r A p r o t i c M e d i a . 1 " S y n t h e s i s 1 9 8 2 , 8 0 5 - 8 2 3 . 4 1 2 l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l