4 ‘ 1 4 4 . . . . . a A : . 1 5 . 9 . p . . h a u ' ” fi . " u 0 . 5 fl . . . 9 r . i ‘ : W . 3 . % . . . z x l t fi . . . K L . . fi $ 5 . ; v a l A 2 q 3 7 . . . . I t . 1 : 0 3 . . . 1 . . a T H F S I S 5 \ L I . ‘ l ' - a I ‘ J I I C R ‘ I i : 2 3 d i e I a ‘ F m j J r z s a t y T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d S T R A T E G I C I M P R O V E M E N T S I N E F F I C A C Y O F D N A D A M A G I N G C H E M O T H E R A P E U T I C D R U G S T H R O U G H M O D U L A T I O N O F S U R V I V A L F A C T O R S . p r e s e n t e d b y V A S U D H A S H A R M A h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e P h . D . d e g r e e i n C H E M I S T R Y z / / T ’ T : : : : : : ; ; ; : : : : : : : : : l e ~ \ \ M a ' r o f e s s o fi ‘ S i g T a ‘ t U r e g a l o g l o é D a t e M S U i s a n A f fi r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 2 1 0 5 p : l C l R C / D a t e D u o . i n d d - p . 1 S T R A T E G I C I M P R O V E M E N T S I N E F F I C A C Y O F D N A D A M A G I N G C H E M O T H E R A P E U T I C D R U G S T H R O U G H M O D U L A T I O N O F S U R V I V A L F A C T O R S . V O L U M E I B y V a s u d h a S h a r m a A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y 2 0 0 6 T h i s i m p n s u m " c o l l : A B S T R A C T S T R A T E G I C I M P R O V E M E N T S I N E F F I C A C Y O F D N A D A M A G I N G C H E M O T H E R A P E U T I C D R U G S T H R O U G H M O D U L A T I O N O F S U R V I V A L F A C T O R S . B y V a s u d h a S h a r m a T h i s d i s s e r t a t i o n d e s c r i b e s t h e d e v e l o p m e n t o f v a r i o u s s t r a t e g i e s t h a t m a y b e u t i l i z e d t o i m p r o v e t h e e f fi c a c y o f D N A d a m a g i n g c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g s v i a m o d u l a t i o n o f s u r v i v a l p r o t e i n s . U n l i k e a n i d e a l s i t u a t i o n , w h e r e n o r m a l c e l l s s h o u l d u n d e r g o m i n i m a l " c o l l a t e r a l d a m a g e " , i n m o s t c l i n i c a l s c e n a r i o s , t h e e f f e c t i v e n e s s o f c h e m o t h e r a p y s u f f e r s a r a n g e o f c o m p l e x f a c t o r s i n c l u d i n g s y s t e m i c t o x i c i t y d u e t o a l a c k o f s p e c i fi c i t y , r a p i d d r u g m e t a b o l i s m , a n d b o t h i n t r i n s i c a n d a c q u i r e d d r u g r e s i s t a n c e r e s u l t i n g f r o m a c t i v a t i o n o f p r o - s u r v i v a l f a c t o r s s u c h a s N F - K B . A n t i t u m o r d r u g s e x e r t t h e i r a n t i t u m o r a c t i v i t y v i a t h e i n i t i a t i o n o f a p o p t o t i c s i g n a l i n g p a t h w a y s u l t i m a t e l y r e s u l t i n g i n c e l l d e a t h . A p o p t o s i s o r p r o g r a m m e d c e l l d e a t h i s a n o r d e r e d c e l l u l a r m e c h a n i s m u s e d t o r e g u l a t e a n d c o n t r o l c e l l n u m b e r a n d e l i m i n a t e d a m a g e d o r m u t a t e d c e l l s . M o d i fi c a t i o n o f t h i s n o r m a l p r o c e s s m i g h t r e s u l t i n t h e i n t e r f e r e n c e o f t h e d e l i c a t e b a l a n c e b e t w e e n c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d c e l l d e a t h a n d l e a d t o a v a r i e t y o f d i s e a s e s . C h a p t e r I d e s c r i b e s t h e v a r i o u s p r o b l e m s a n d p e r s p e c t i v e s l i n k e d t o c a n c e r a n d c u r r e n t d a y c h e m o t h e r a p y a n d a l s o s u g g e s t s p o s s i b l e w a y s t o m a k e t h e c a n c e r t r e a t m e n t m o r e e f f e c t i v e . C o n v e n t i o n a l c h e m o t h e r a p y s u f f e r s a c o m p r o m i s e d c l i n i c a l e f fi c a c y d u e t o t h e i n d u c t i o n o f a n t i - a p o p t o t i c f a c t o r s , s u c h a s N F - K B , a c t i v a t i o n o f D N A r e p a i r e t c . c o n c u r r e n t w i t h t h e d e s i r e d i n d u c t i o n o f p r o g r a m m e d c e l l d e a t h . I n h i b i t i o n o f s u c h a n t i - a p o p t o t i c s u r v i v a l f a c t o r s I ] d e s c s u r v i v e t r a n s - i 1 r e s u l t i r t h e a p p r e s e n t M e c h a i p o t e n t i I m i d a z i T h e g e ‘ a n o n g a d d s I t d i p O l u r d i a s t e r T h e s e m o s t 1 S I T l l h c i n h i b i ; C e l l s , I O w i n g f a c t o r s m i g h t r e t a r d s t h e c e l l u l a r r e s i s t a n c e i n d u c e d b y c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . C h a p t e r 1 1 d e s c r i b e s t h e u s e o f 8 - s u b s t i t u t e d t h e o p h y l l i n e s a n d c a f f e i n e s i n m o d u l a t i o n o f s u c h s u r v i v a l o r r e p a i r p a t h w a y s u p o n c a m p t o t h e c i n t r e a t m e n t . C h a p t e r 1 1 1 d e s c r i b e s t h e u s e o f t r a n s - i m i d a z o l i n e s i n m o d u l a t i o n o f N F - K B v i a i n h i b i t i o n o f d e g r a d a t i o n o f I i c B - a r e s u l t i n g i n e n h a n c e m e n t o f a p o p t o s i s i n C E M l e u k e m i a c e l l s . S t u d i e s r e v e a l e d t h a t o n l y t h e a p o p t o t i c r e s p o n s e i n d u c e d b y D N A d a m a g i n g a g e n t s c o u l d b e e n h a n c e d b y t h e p r e s e n c e o f i m i d a z o l i n e s . N o e f f e c t w a s s e e n f o r a n t i - t u b u l i n a g e n t s s u c h a s T a x o l . M e c h a n i s t i c s t u d i e s i n v o l v i n g v a r i o u s t i m e a n d c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t e f f e c t s a n d p o t e n t i a t i o n a s a f u n c t i o n o f a c t i v a t i o n o f N F - K B , e f f e c t o f e n a n t i o m e r s o f t r a n s - i m i d a z o l i n e s e t c . h a v e b e e n d e s c r i b e d u s i n g a v a r i e t y o f a s s a y s . T h e g e n e r a t i o n o f d i v e r s e s m a l l m o l e c u l a r s c a f f o l d s w i t h p o t e n t i a l b i o l o g i c a l a c t i v i t y i s a n o n g o i n g t h e m e i n o u r g r o u p . P r e v i o u s l y , o u r l a b d e s c r i b e d a m i l d m e t h o d u s i n g l e w i s a c i d s f o r h i g h l y s t e r e o s e l e c t i v e l l , 3 d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n s o n m t t n c h n o n e s , w i t h d i f f e r e n t d i p o l a r o p h i l e s . W e d e s c r i b e i n c h a p t e r I V , t h e s u b s t r a t e c o n t r o l l e d r e v e r s a l o f d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y t o p r o v i d e s t e r e o c h e m i c a l l y d i v e r s e s t r u c t u r e s - - c i s - i m i d a z o l i n e s . T h e s e m i g h t b e i m p o r t a n t i n i n h i b i t i o n o f p 5 3 - M D M 2 b i n d i n g , a n o t h e r s u r v i v a l e v e n t i n m o s t t u m o r c e l l s . F u r t h e r , c h a p t e r V d e s c r i b e s a s k e l e t a l l y d i v e r s e i n d o l e a z e p i n e , i t s s y n t h e s i s a n d i t s b i o l o g i c a l e f f e c t s i n i n h i b i t i o n o f c y t o k i n e p r o d u c t i o n a n d s p e c i fi c i n h i b i t i o n o f c h e c k p o i n t c h k 2 . T h e s e m i g h t fi n d u s e i n r e d u c i n g s i d e e f f e c t s i n n o r m a l c e l l s . F i n a l l y , c h a p t e r V I d e s c r i b e s a p r o d r u g m e t h o l o g y t o s e l e c t i v e l y t a r g e t t u m o r c e l l s o w i n g t o t h e i r r e d u c i n g e n v i r o n m e n t . T o I n ) y e a r s I ’ l l T o m y g r a n d m a , L a t e M r s . U r m i l a S h a r m a w h o d i e d o f c a n c e r o n 7 t h J u l y 2 0 0 5 . I n h e r 3 y e a r s l o n g b a t t l e w i t h c a n c e r , p a r a l l e l i n g m y t i m e i n g r a d u a t e s c h o o l , s h e s h o w e d u s a l l h o w t o l i v e w i t h p a i n a n d n o t m i s s o u t o n l i v i n g e a c h d a y , w i t h l o v e a n d g i v i n g . T o m y l o v i n g f a m i l y , f o r g i v i n g m e t h e m o d e l o f l i f e — i t i s a b e a u t i f u l o n e ! T o M a h e s h i v c o n t n l “ o v e r - a n d l p o w e r l o v e y y e a r s . t i m e . ‘ d i s c u s s m y C 0 ; C a r G e r b r i e f , A C K N O W L E D G E M E N T S T h i s d i s s e r t a t i o n w o u l d b e i n c o m p l e t e w i t h o u t t h e m e n t i o n o f a l l t h o s e w h o c o n t r i b u t e d t o m y s u c c e s s f u l g r a d u a t e c a r e e r . J e t z e h a s b e e n a n e n t h u s i a s t i c , s o m e t i m e s “ o v e r - e n t h u s i a s t i c ” a d v i s o r t o w o r k w i t h . S i n c e I a m h i s fi r s t g r a d u a t e s t u d e n t , b o t h J e t z e a n d I h a v e g o n e t h r o u g h t i m e s o f l e a r n i n g a n d t e a c h i n g . A f fi r m a t i o n s a r e a s i m p l e , p o w e r f u l , f r e e w a y t o m a i n t a i n / i m p r o v e m o r a l e . D u r i n g m y fi r s t s u m m e r , I q u o t e h i m , “ I l o v e y o u r l o v e f o r w o r ” l a i d t h e f o u n d a t i o n o f t h e c o n fi d e n c e h e h a d i n m e . I n m y i n i t i a l y e a r s , i t h e l p e d m e a c h i e v e g o a l s t h a t m i g h t h a v e s e e m e d o u t o f r e a c h a t t h a t p o i n t o f t i m e . W h e t h e r I w a s l u c k y f o r h i s c a r e e r o r h e f o r m i n e i s a t o p i c t h a t i s f e v e r i s h l y d i s c u s s e d f r o m t i m e t o t i m e . T i m e p r o b a b l y w i l l b e a b e t t e r j u d g e . I w o u l d l i k e t o t h a n k P r o f s . B o r h a n , W u l f f , W e l i k y a n d B l a n c h a r d f o r s e r v i n g o n m y c o m m i t t e e a n d t h e i r a d v i c e o n s e v e r a l o c c a s i o n s . I n f a c t , B a b a k ( D r . B o r h a n ) h a s b e e n a m e n t o r a n d a f r i e n d i n a t r u e s e n s e f o r h i s a b i l i t y t o l i s t e n . S o m e t i m e s , j u s t t h e f a c t t h a t y o u a r e b e i n g h e a r d h e l p s , a n d p e o p l e w h o h a v e b e e n t h r o u g h g r a d u a t e s c h o o l w o u l d a g r e e t h e r e i s n o c o u n t t o s u c h t i m e s . I a d m i r e h i s a b i l i t y t o b e a b l e t o a s k q u e s t i o n s r a n g i n g f r o m s p e c i fi c t o t h e m o r e p h i l o s o p h i c a l o n e s . I h a v e g r e a t r e s p e c t f o r P r o f . W u l f f , e s p e c i a l l y h i s c o m p o s u r e , w i s d o m , p e r s p e c t i v e a n d h o w h e d e a l s w i t h p e o p l e . B o t h B a b a k a n d P r o f . W u l f f g a v e m e a p e r s p e c t i v e w h e n I n e e d e d i t t h e m o s t . W h i l e P r o f . J o a n B r o d e r i c k c o u l d n o t b e a p a r t o f m y fi n a l d e f e n s e d u e t o h e r r e c e n t m o v e t o M o n t a n a S t a t e , s h e w a s e x t r e m e l y k i n d a n d u n d e r s t a n d i n g t h r o u g h o u t m y g r a d u a t e c a r e e r . M y a s s o c i a t i o n w i t h P r o f . W e l i k y a n d B l a n c h a r d a s c o m m i t t e e m e m b e r s w a s b r i e f , b u t I f o u n d b o t h o f t h e m v e r y a c c o m m o d a t i n g a n d u n d e r s t a n d i n g . I w a n t t o t h a n k t h e g r : M a l e c ; a n d l a ; i n t h e 1 c r y s t a l i s s u e s J o h n s A n i m s u p p o Y C a I ‘ S . b e e n c P u r s u e e x D r e : m i p e r t h e u ( h a V e f t h e g r a d u a t e s c h o o l f o r a d i s s e r t a t i o n c o m p l e t i o n f e l l o w s h i p . I a l s o w a n t t o t h a n k P r o f . M a l e c z k a f o r h e l p w i t h d i f f e r e n t t h i n g s a t d i f f e r e n t t i m e s a n d m a i n l y f o r C E M 8 5 2 . A l l t h e p a s t a n d p r e s e n t g r o u p m e m b e r s h a v e b e e n f r i e n d l y . K e v i n , J i n , M a n a s i a n d J a y a k u m a r w e r e g o o d w o r k c o l l e a g u e s . I e n j o y e d t h e i r c o m p a n y w o r k i n g l a t e h o u r s i n t h e l a b . T h e y k e p t m e i n g o o d h u m o r t h r o u g h g o o d a n d b a d t i m e s . I e s p e c i a l l y w a n t t o t h a n k D r . R u i H u a n g f o r h i s e x p e r t i s e o n X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y . T h e c o n fi d e n c e w i t h w h i c h w e c o u l d t a l k a b o u t t h e s t e r e o c h e m i c a l i s s u e s r e l i e d o n t h e X - r a y s t r u c t u r e s t h a t D r . H u a n g s o l v e d . D r . L o n g L e , D r . K e r m i t J o h n s o n a n d D r . D a n i e l H o l m e s h a v e b e e n h e l p f u l w i t h t h e N M R s p e c t r o s c o p y . I w o u l d l i k e t o t h a n k A r c h i t a , R a d h a , C h r y s s o u l a , S h i k h a , M u k t a , D a n , A n i r u d d h a , M a n i s h , J e n n i f e r , J i l l , J a s o n ; f r i e n d s w h o e n r i c h e d m y e x p e r i e n c e w i t h h e l p , s u p p o r t a n d e n c o u r a g e m e n t s t o d i f f e r e n t d e g r e e s a n d a t d i f f e r e n t t i m e s d u r i n g t h e l a s t f e w y e a r s . I a m g r a t e f u l f o r t h e s u p p o r t o f m y g r a n d p a r e n t s , p a r e n t s a n d s i s t e r s , w h o h a v e b e e n c r u c i a l t o m y s u c c e s s . T h e i r l o v e a n d f a i t h h a s h e l p e d m e o v e r c o m e a l l h u r d l e s a n d p u r s u e m y g o a l s t i r e l e s s l y . F i n a l l y , I a m g r a t e f u l t o G o d t h a t I h a v e M a h e s h i n m y l i f e . T h o s e l o n g h o u r s o f l a b w o r k w e r e m a d e e a s y i n h i s c o m p a n y . I a m r e a l l y f o r t u n a t e t h a t I c a n d i s c u s s a n d e x p e c t a l o t o f c r i t i c a l i n s i g h t i n c h e m i s t r y a n d b i o l o g y w i t h M a h e s h , w i t h t h e s a m e c a s e a s p e r s o n a l i s s u e s . H e i s a g r e a t c r i t i c a s w e l l a s s o m e o n e w h o e n c o u r a g e s a n d h e l p s a l l t h e w a y t o t h e e n d . H i s c o n s t a n t e n c o u r a g e m e n t b o t h i n p e r s o n a n d e v e n l o n g d i s t a n c e h a v e h e l p e d a g r e a t d e a l . I t r u l y a p p r e c i a t e h i s u n c o n d i t i o n a l l o v e a n d s u p p o r t . v i L i s t L i s t L i s t I K e y 1 C H A P r o b ] a I I S W t A . I n t B . p 5 . C . R e D . p 5 5 E . R e s T A B L E O F C O N T E N T S ( I m a g e s i n t h i s d i s s e r t a t i o n a r e p r e s e n t e d i n c o l o r ) L i s t o f T a b l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L i s t o f S c h e m e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L i s t o f F i g u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K e y t o S y m b o l s a n d A b b r e v i a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C H A P T E R 1 P r o b l e m s , p e r s p e c t i v e s a n d p r o m i s e s i n c u r r e n t c a n c e r c h e m o t h e r a p y : fi n d i n g a n s w e r s t o q u e s t i o n s p e r t a i n i n g l i f e o r c e l l d e a t h ? ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i ) D o u b l e J e o p a r d y : W h y a r e c a n c e r c e l l s i n h e r e n t l y r e s i s t a n t t o t h e c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g s ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i i ) S e n s i t i z i n g c a n c e r c e l l s t o a n t i - t u m o r t h e r a p y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B . p 5 3 : t h e g u a r d i a n o f t h e g e n o m e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . R e p a i r m e c h a n i s m s : c h e c k p o i n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i ) D N A d a m a g e t r a n s d u c t i o n a n d r e g u l a t i o n o f D N A r e p a i r . . . . . . . . . . . . . . . . . i i ) R e c o v e r y , a d a p t a t i o n o r a p o p t o s i s : a m a t t e r o f l i f e a n d d e a t h ? . . . . . . . . . . . . . . . . i i i ) W h e n c h e c k p o i n t s f a i l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i v ) C D K a n d c h e c k p o i n t k i n a s e i n h i b i t o r s - T a r g e t i n g c e l l d i v i s i o n c y c l e i n c a n c e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v ) C y c l i n d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D . p 5 3 a n d N F - c h c r o s s t a l k . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . R e s i s t a n c e p a t h w a y s : a c t i v a t i o n o f N F - K B a n d i t s r o l e i n c e l l s u r v i v a l . . . . . . . . . . . . i ) N F - K B : a m a j o r c u l p r i t o r a n i n n o c e n t b y s t a n d e r ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i i ) N F - K B a n d a p o p t o s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i i i ) K i n a s e i n h i b i t i o n a n d M o d u l a t i o n o f N F - K B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i v ) I c h - k i n a s e a n d N F - I c B : I K K c o m p l e x - a n i n t e g r a t o r o f a l l s i g n a l s t o a c t i v a t e N F c h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v ) U b i q u i t i n a t i o n a n d P r o t e o s o m e i n h i b i t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . B c l z p r o t e i n s : l i f e o r d e a t h s w i t c h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i ) O v e r e x p r e s s i o n o f b c h : t a r g e t s o r t o o l s ? ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i i ) A n t i s e n s e o l i g o n u c l e o t i d e t a r g e t i n g B c 1 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i i i ) S m a l l m o l e c u l e i n h i b i t o r s o f B c l - 2 f a m i l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . S u m m a r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H . R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C H A P T E R I I 8 - s u b s t i t u t e d x a n t h i n e d e r i v a t i v e s : p o t e n t i a t i o n o f c h e m o t h e r a p y b y N F - c h i n h i b i t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . B i o l o g i c a l i m p o r t a n c e o f x a n t h i n e s c a f f o l d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B . X a n t h i n e d e r i v a t i v e s a n d i n fl a m m a t i o n r e l a t e d d i s o r d e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v i i x i i x i v x v i x x i v 5 2 5 2 5 2 ( L C I ) . ) I E . 1 3 i F . § § I ( 3 . 1 m I I . I n I . P 0 t I . h I e K . ( C c L . E x ; h l . R t C I I A I S e n s n c a m p t A . I n h B . ( : u 1 C . I ) N D . h i E T h < F . l < F C . C o n t r o l l i n g k i n a s e s : x a n t h i n e s i n c a n c e r t h e r a p y 5 6 i ) R e g u l a t i o n o f C D K s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 7 i i ) B e y o n d k i n a s e s : p u r i n e b i n d i n g t a r g e t s i n c a n c e r t h e r a p y . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 3 a ) A T P a s e s ( H s p 9 0 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 4 b ) S u l p h o t r a n s f e r a s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 5 D . X a n t h i n e s i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 6 E . B i o l o g i c a l a c t i v i t y - e v a l u a t i o n a n d d i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2 F . N F - c h i n d e f e n s e a n d d i s e a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 3 G . I n h i b i t i o n o f t r a n s l o c a t i o n o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e p 5 0 / p 6 5 h e t e r o d i m e r . 7 3 H . I n h i b i t i o n o f t r a n s l o c a t i o n o f N F - i c B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 7 I . P o t e n t i a t i o n o f e f f e c t o f c a m p t o t h e c i n i n C E M c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 8 J . M e t h y l x a n t h i n e s a n d s e p t i c s h o c k . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 2 i ) A n t i - b a c t e r i a l a c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4 i i ) N F - K B i s a c t i v a t e d b y L P S i n m a c r o p h a g e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 8 i i i ) N i t r o c a f f e i n e ( I I - 4 ) i n h i b i t s L P S i n d u c e d a c t i v a t i o n o f N F - I c B i n m a c r o p h a g e s . 8 9 K . C o n c l u s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 0 L . E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1 M . R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 3 C H A P T E R I I I . S e n s i t i z a t i o n o f t u m o r c e l l s t o w a r d s c h e m o t h e r a p y : e n h a n c i n g t h e a c t i v i t y o f c a m p t o t h e c i n b y n o v e l i m i d a z o l i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 A . I n t r o d u c t i o n - w h y i s a p o p t o s i s i m p o r t a n t ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 B . C u r r e n t l y u s e d c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 i ) C a m p t o t h e c i n a n d i t s m e c h a n i s m o f a c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 2 i i ) C i s - p l a t i n a n d D N A a l k y l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 4 C . D N A d a m a g e , m u t a t i o n s a n d s u r v i v a l p a t h w a y s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 6 i ) M D R a n d p r o t e a s o m a l i n h i b i t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 7 i i ) N F - K B : f r o m i n n o c e n t b y s t a n d e r t o a m a j o r c u l p r i t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 8 D . I n fl a m m a t i o n a n d c a n c e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 3 i ) R o l e o f N F - K B i n c a n c e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 E . T h e r a p e u t i c r e l e v a n c e o f N F - c h i n h i b i t i o n i n c a n c e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 5 i ) T e m p o r a l c o n t r o l o f N F - c h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 5 F . N F - c h m o d u l a t i o n a n d e n h a n c e m e n t o f e f fi c a c y o f D N A d a m a g i n g a g e n t s . . 1 2 6 i ) S y n t h e s i s o f i m i d a z o l i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 6 i i ) B i o l o g i c a l A c t i v i t y — s e n s i t i z a t i o n o f c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 8 a ) I m i d a z o l i n e s a n d i n fl a m m a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 8 b ) C y t o t o x i c i t y o f i m i d a z o l i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 9 c ) S e n s i t i z a t i o n o f c a n c e r c e l l s t o w a r d c a m p t o t h e c i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 0 ( 1 ) C e l l d e a t h d e t e r m i n e d b y T r y p a n B l u e E x c l u s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 6 e ) P a t h w a y o f a p o p t o t i c m o d u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 7 i . N F - K B a c t i v a t i o n b y c a m p t o t h e c i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 8 i i . N F - K B a c t i v a t i o n b y C P T i n C E M c e l l s i s t r a n s i e n t a n d a f u n c t i o n o f t i m e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 1 i i i . I n h i b i t i o n o f c a m p t o t h e c i n i n d u c e d N F - K B - D N A v i i i C H A A p p “ 0 . 1 H . S i I . E x ; 1 . R e l A . I n t 3 A 1 : C . A , E . 3 } F , C h b i n d i n g b y i m i d a z o l i n e I I I - 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i v . I n h i b i t i o n o f c a m p t o t h e c i n i n d u c e d n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f N F - K B b y i m i d a z o l i n e I I I - 4 . . . . . . . . . . . . . v . I n h i b i t i o n o f k i n a s e a c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v i . E f f e c t o f i m i d a z o l i n e I I I - 4 o n I - c h a p h o s p h o r y l a t i o n . . . v i i . I n h i b i t i o n o f C P T i n d u c e d N F - c h t r a n s c r i p t i o n b y i m i d a z o l i n e I I I - 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v i i i . L u c i f e r a s e e n z y m e a s s a y : i m i d a z o l i n e d o e s n o t a f f e c t t h e l u c i f e r a s e e n z y m e d i r e c t l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i x . P o s t t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e I I I - 4 d o e s n o t p o t e n t i a t e t h e C P T i n d u c e d a p o p t o s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x . P o t e n t i a t i o n b y I r n i d a z o l i n e s c a f f o l d r e q u i r e s D N A d a m a g e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i . S e l e c t i v e p o t e n t i a t i o n o f a p o p t o t i c e f f e c t o f D N A d a m a g i n g a g e n t s b y I m i d a z o l i n e s i n c a n c e r c e l l s . . . . . . x i i . C o r r e l a t i o n b e t w e e n p o t e n t i a t i o n a n d N F - I c B a c t i v a t i o n x i i i . C h e m i c a l r e s o l u t i o n o f 1 1 1 - 4 a n d b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f t h e e n a n t i o m e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i v . F A C S a n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v . N F - I c B - p 5 3 c r o s s t a l k . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v i . C P T - I I I - 4 s t a c k i n g i n t e r a c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . F u t u r e d i r e c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i ) S t r u c t u r e - a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p b a s e d o n I I I - 4 a s t h e p a r e n t s c a f f o l d . i i ) T a r g e t v a l i d a t i o n o f c o m b i n a t i o n t h e r a p y w i t h c a m p t o t h e c i n a n d t h e i m i d a z o l i n e I I I - 4 ( S P _ 4 _ 8 4 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . a ) M i c r o c h i p a n a l y s i s f o r c o m b i n a t i o n s t u d i e s w i t h c a m p t o t h e c i n a n d 1 1 1 - 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . b ) T h e p r o c e s s o f g e n e c h i p a r r a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . c ) G e n e c h i p a r r a y a n d c a n c e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ( 1 ) A n i m a l m o d e l s : i n v i v o S t u d i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H . S i g n i fi c a n c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I . E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J . R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C H A P T E R I V A p p l i c a t i o n o f t r a n s - i m i d a z o l i n e s i n c h e m i s t r y a n d b i o l o g y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B . A l t e r n a t i v e a p p r o a c h e s t o t h e s a m e p r o b l e m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i ) N a t u r e s e t s a n e x a m p l e - n a t u r a l - p r o d u c t g u i d e d s y n t h e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . i i ) D i v e r s i t y o r i e n t e d s y n t h e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i i i ) W h e r e d o s m a l l m o l e c u l e s fi t i n ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . A z l a c t o n e s : s i m i l a r i t y , d i v e r s i t y a n d c o m p l e x i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D . 1 , 3 d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n o n a z l a c t o n e t e m p l a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . S y n t h e s i s o f n o v e l d i h y d r o h e t e r o c y c l i c s c a f f o l d s : h a r n e s s i n g t h e p o t e n t i a l " o f L e w i s a c i d m e d i a t e d g e n e r a t i o n o f m t i n c h n o n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F . C h e m i c a l s i g n i fi c a n c e o f i m i d a z o l i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i x 1 4 3 1 4 5 1 4 8 1 5 0 1 5 4 1 5 5 1 5 7 1 6 0 1 6 3 1 6 5 1 6 9 1 7 1 1 7 4 1 7 6 1 7 7 1 7 7 1 7 8 1 7 8 1 7 9 1 8 1 1 8 2 1 8 3 1 8 5 2 0 0 2 1 1 2 1 1 2 1 2 2 1 2 2 1 4 2 1 5 2 1 6 2 1 9 2 2 0 2 2 1 G . B i o l o g i c a l i m p o r t a n c e o f i m i d a z o l i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 2 H . L e w i s a c i d m e d i a t e d s y n t h e s i s o f a n t i - i m i d a z o l i n e s v i a t h e g e n e r a t i o n o f m t l n c h n o n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 6 1 . V a r i a t i o n o f R z 2 3 3 J . V a r i a t i o n o f R 3 a n d R 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 4 K . C o n c l u s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 6 L . E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 7 M . R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 5 C H A P T E R V C h e c k p o i n t k i n a s e i n h i b i t o r s : a t c r o s s r o a d s t o l i f e a n d c e l l d e a t h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 9 A . I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 9 B . S y n t h e t i c e f f o r t s t o w a r d s n a t u r a l e n d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 1 C . H y m e n i a l d i s i n e a n d k i n a s e i n h i b i t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 4 D . B i o l o g i c a l r e l e v a n c e o f t h e a m i n o i m i d a z o l o n e r i n g a n d a m i n o i m i d a z o l e s . . . . . . . . . 2 8 6 E . T o t a l s y n t h e s e s o f h y m e n i a l d i s i n e f a m i l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 7 F . S y n t h e s i s o f i n d o l e a z e p i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 2 G . C o n d e n s a t i o n w i t h h y d a n t o i n a n d t h i o h y d a n t o i n t o t h e a l d i s i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 4 H . S t u d i e s t o w a r d s i m i d a z o l e b a s e d h y m e n i a l d i s i n e a n a l o g s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 4 I . K i n a s e i n h i b i t i o n w i t h i n d o l e a z e p i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 0 J . I n h i b i t i o n o f c y t o k i n e p r o d u c t i o n b y i n d o l e a z e p i n e d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 2 K . I n d o l e a z e p i n e s i n h i b i t P M A / P H A i n d u c e d c y t o k i n e p r o d u c t i o n i n j u r k a t c e l l s a n d L P S i n d u c e d T N F - a p r o d u c t i o n i n m a c r o p h a g e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 4 L . I n h i b i t i o n o f N F - K B - D N A b i n d i n g ' b y h y m e n i a l d i s i n e a n a l o g s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 6 M . C y t o t o x i c i t y p r o fi l e o f h y m e n i a l d i s i n e a n d i t s i n d o l e a z e p i n e a n a l o g s . . . . . . . . . . . . 3 1 8 N . C o n c l u s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 0 0 . E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 2 P . R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 1 C H A P T E R V I S t r a t e g i c b i o - r e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f t h e p r o d r u g s e l e c t i v e l y i n t u m o r c e l l s . . . . . . . . . . . . 3 4 6 A . I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 6 B . H y p o x i a a n d p r o d r u g s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 9 C . R e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f D N A c r o s s - l i n k e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 1 D . R e t r o - s y n t h e t i c a n a l y s i s f o r t h e p r o d r u g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 7 E . E l e c t r o c h e m i c a l d a t a f o r V l - l , V I - 4 a n d V 1 - 1 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 3 F . I n - v i t r o b i o - r e d u c t i v e a c t i v a t i o n s t u d i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 5 G . C r o s s - l i n k i n g s t u d i e s w i t h t h e p r o - d r u g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 6 H . B i o - r e d u c t i v e l y a c t i v a t e d N F - c h i n h i b i t o r s o f c a f f e i n e a n d t h e o p h y l l i n e . . . . . . . . . . . . 3 7 1 I . R e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f p r o d r u g g r o u p o n I I - 3 , a N F - c h i n h i b i t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 2 J . C o n c l u s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 5 K . E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 5 L . R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 2 A P P E N D I X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 6 ( I r I ‘ 1 1 ) O p t i n r i z a t i o n o f c y t o t o x i c i t y o f v a r i o u s c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s i n C E M c e l l s . M e a s u r i n g c e l l v i a b i l i t y a t 4 8 h w i t h M T S a s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 7 2 ) M e a s u r e o f i n d u c t i o n o f a p o p t o s i s t h r o u g h c a s p a s e a c t i v i t y u s i n g A p o - o n e a s s a y T M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 9 3 ) E f f e c t o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f A L L N , a n d l a c t a c y s t i n ( p r o t e a s o m a l 4 0 0 i n h i b i t o r s ) o n a p o p t o t i c i n d u c t i o n b y c a m p t o t h e c i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 1 4 ) C y t o t o x i c i t y o f p a r t h e n o l i d e : d o s e r e s p o n s e o f p a r t h e n o l i d e u p t o 2 4 h . . . . . . . . . . . . 4 0 1 5 ) I r n i d a z o l i n e i n h i b i t s t h e d e g r a d a t i o n o f I - K B O . i n d u c e d b y T N F - a i n C E M c e l l s . . 4 0 2 6 ) P o s t - t r e a t m e n t o f C E M c e l l s w i t h i m i d a z o l i n e I I I - 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 3 7 ) P o t e n t i a t i o n o f c i s p a t i n ( C D D P ) o r c a m p t o t h e c i n ( C P T ) w i t h i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n d i f f e r e n t c e l l t y p e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 9 x i 1 1 1 - 3 . 1 1 1 - 4 . 1 1 1 - 5 . 1 - 1 . 1 - 2 . 1 1 - 1 . [ 1 - 2 . 1 1 - 3 . 1 1 4 . 1 1 1 - 1 . 1 1 1 - 2 . l V - I . I V - 2 . I V - 3 . V - z . V . 3 . 1 - 1 . 1 - 2 . “ - 1 . I I - 2 . 1 1 - 3 . 1 1 - 4 . 1 1 1 - 1 . 1 1 1 - 2 . 1 1 1 - 3 . 1 1 1 - 4 . 1 1 1 - 5 . I V - 1 . I V - 2 . I V - 3 . L I S T O F T A B L E S S t r u c t u r e s a n d t h e i r i n v i t r o a c t i v i t y a g a i n s t C D K S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S t r u c t u r e a n d k i n a s e a c t i v i t i e s o f d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e a n d i n d o l e a z i p i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V a r i o u s a t t e m p t s t o r e d u c e [ L ] t o I I - 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A t t e m p t s t o w a r d s n u c l e o p h i l i c d i s p l a c e m e n t o n 1 1 - 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C h e m o p o t e n t i a t i o n i n d e x a f t e r 4 8 h a t 1 0 u M p r e t r e a t m e n t o f t h e o p h y l l i n e d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A c t i v i t y o f c a f f e i n e s a g a i n s t g r a m ( + ) a n d g r a m ( - ) b a c t e r i a . . . . . . . . . . . . . . . C h e m o p o t e n t i a t i o n i n d e x o f i m i d a z o l i n e s w i t h c a m p t o t h e c i n . . . . . . . . . . . . . . . C o m p a r i s o n o f c y t o t o x i c c o n c e n t r a t i o n c a u s i n g 9 5 % c e l l c y t o t o x i c i t y i n c o n t i n u o u s e x p o s u r e a n d w a s h e d c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K i n a s e i n h i b i t i o n d a t a f o r I I I - 4 a g a i n s t k i n a s e s f r o m N F — K B s i g n a l i n g a n d a p o p t o s i s m o d u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C a n c e r c e l l s p e c i fi c e n h a n c e m e n t o f e f fi c a c y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S t r u c t u r e - a c t i v i t y p r o fi l i n g o f 1 1 1 - 4 b a s e d o n c h e m o - p o t e n t i a t i o n i n d i c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I n fl u e n c e o f R . g r o u p o n d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I n fl u e n c e o f R 2 f a v o r i n g s y n - i m i d a z o l i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V a r i a t i o n o f R 3 a n d R 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N u c l e o p h i l i c s u b s t i t u t i o n w i t h g u a n i d i n e o n m o d e l c o m p o u n d V - l 3 . . . . . . N u c l e o p h i l i c r i n g o p e n i n g o f t h e a z l a c t o n e u n d e r a l k a l i n e c o n d i t i o n s . I C s o v a l u e s f o r k i n a s e i n h i b i t i o n b y c o m p o u n d V - l , V - 2 , h y m e n i a l d i s i n e a n d d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I n h i b i t i o n o f C y t o k i n e ( I L - 2 a n d T N F - a ) p r o d u c t i o n m e a s u r e d b y E I A f o r P D T C , h y m e n i a l d i s i n e a n d c o m p o u n d s V - l a n d V - 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i i l 6 1 8 6 9 7 O 8 1 8 5 1 3 2 1 3 4 1 4 9 1 6 4 1 8 0 2 2 8 2 3 3 2 3 5 3 0 0 3 0 2 3 1 1 3 1 5 V 1 V 1 V 1 V 1 V 1 - V 1 - V - 5 . V I - l . V I - 2 . V I - 3 . V I - 4 . V I - S . V I - 6 . I n h i b i t i o n o f c e l l g r o w t h w i t h h y m e n i a l d i s i n e a n d c o m p o u n d s V - l a n d V - 2 i n C E M l e u k e m i a T - c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 8 C o n v e r s i o n o f p r o t e c t e d a l c o h o l t o t h e a l k y l h a l i d e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 9 C o n v e r s i o n o f t h e c a r b a m a t e i n t o t h e p r o d r u g m o i e t y V I - l . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 0 S y n t h e s i s o f N - a l k y l a t e d h y d r o x y l a m i n e . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 2 R e d u c t i o n p o t e n t i a l o f p r o d r u g V I - l , V I - 4 , a n d V I - 1 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 3 O p t i m i z i n g t h e r e d u c i n g a g e n t f o r M M C r e d u c t i v e a c t i v a t i o n . . . . . . . . . . . . . . 3 6 7 T o w a r d s f u n c t i o n a l i z a t i o n o f N F - K B i n h i b i t o r , 1 1 - 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 x i i i I V - J I I I I I I I I I I 1 1 1 - I V - M I N . V - l . V . 2 . H . N . v . 5 , “ - 1 . 1 1 - 2 . I I - 3 . 1 1 - 4 . I I - S . I I I - 1 . 1 1 1 - 2 . 1 1 1 - 3 . 1 1 1 - 4 . I V - 1 . I V - 2 . I V - 3 . I V - 4 . V - 2 . V - 3 . V - 4 . V - 5 . L I S T O F S C H E M E S S y n t h e s i s o f t h e o p h y l l i n e d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S y n t h e s i s o f 8 - p h e n y l t h e o p h y l l i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S y n t h e s i s o f 1 1 4 f r o m I L ] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S y n t h e s i s o f 1 1 - 5 a n d 1 1 - 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N - b e n z y l a t i o n o f 1 1 - 1 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S y n t h e s i s o f i m i d a z o l i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P r o p o s e d r a t i o n a l e f o r d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y o f t r a n s - i m i d a z o l i n e 1 1 1 ( 1 - 8 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C h e m i c a l r e s o l u t i o n o f r a c e m i c I I I - 4 i n t o e n a n t i o m e r s I I I - 4 a a n d I I I - 4 b . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . _ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S t r u c t u r e - a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p b a s e d o n I I I - 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S y n t h e s i s o f d i h y d r o h e t e r o c y c l e s f r o m m i i n c h n o n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L e w i s a c i d m e d i a t e d g e n e r a t i o n o f m t i n c h n o n e a n d c y c l o a d d i t i o n . . . . . P r o p o s e d t r a n s i t i o n s t a t e s f o r d i a s t e r e o s e l e c t i v e s y n t h e s i s o f a n t i - i m i d a z o l i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P r o p o s e d m e c h a n i s t i c r a t i o n a l e f o r t h e f o r m a t i o n o f s y n - i m i d a z o l i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T o t a l s y n t h e s i s o f h y m e n i a l d i s i n e b y A n n o u r a e t a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T o t a l s y n t h e s i s o f h y m e n i a l d i s i n e a n d d e b r o m o h y m e n i a l d s i n e b y H o m e e t a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H o m e ’ s p r a c t i c a l s y n t h e s i s o f d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . S y n t h e s i s o f d e b r o m o h y m e n i l a d i s i n e a n d h y m e n i a l d i s i n e b y P a p e o e t a 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S y n t h e s i s o f N - H ( V - 7 ) a n d N - M e a l d i s i n e ( V - 8 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i v 6 9 7 1 7 1 7 2 7 2 1 2 7 1 2 8 1 6 9 1 7 9 2 2 0 2 2 6 2 2 7 2 3 6 2 8 8 2 9 0 2 9 1 2 9 2 2 9 4 V I - 6 V 1 . 1 V 1 . 3 V l - 9 , V 1 - V ] - V I - . V 1 . 4 V - 6 . C o n d e n s a t i o n b e t w e e n a l d i s i n e V - 7 a n d t h i o h y d a n t o i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 7 V - 7 . P r e p a r a t i o n o f C - 5 u n s a t u r a t e d h y d a n t o i n d e r i v a t i v e s u n d e r H o m e r - W a d s w o r t h E m m o n s c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 7 V - 8 . a — T e t r a l o n e c o n d e n s e d t o o x a z o l o n e u n d e r K n o e v e n a g e l c o n d i t i o n s . . . 2 9 9 V - 9 . K n o e v e n a g e l c o n d e n s a t i o n b e t w e e n a l d i s i n e ( V - 7 , V - 8 ) a n d a z l a c t o n e ( V - 1 0 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 1 V - 1 0 . S o l i d s u p p o r t s y n t h e s i s o f V - l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 4 V - l l . A t t e m p t e d c o n v e r s i o n o f h i p p u r i c a c i d t o 2 - p h e n y 1 i m i d a z o l e d i o i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 6 V - 1 2 . C o n v e r s i o n o f D A M N i n t o 2 - p h e n y l i m i d a z o l e - d i a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 7 V - 1 3 . S y n t h e s i s o f V - 2 0 f r o m t a r t a r i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 8 V - l 4 . C o n v e r s i o n o f V - 2 0 t o V - 2 2 v i a a d i m e r i z e d a c i d c h l o r i d e . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 8 V - l S . S E M p r o t e c t i o n o n t h e i m i d a z o l e r i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 9 V - 1 6 . R i n g o p e n i n g w i t h s e c o n d a r y a m i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 0 V I - l . S y n t h e s i s o f V I - l f r o m b e n z o i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 8 V I - Z . C o n v e r s i o n o f d i e t h a n o l a m i n e i n t o p r o t e c t e d a n d u n p r o t e c t e d N - m u s t a r d s ( n e g a t i v e a n d p o s i t i v e c o n t r o l s f o r i n v i t r o s t u d i e s ) . . . . . . . . . . . . 3 5 9 V l - 3 . C o n v e r s i o n o f V 1 - 1 4 i n t o t h e d i o x a z a l o n e V I - l S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 1 V I - 4 . F o r m a t i o n o f 2 - o x a z o l i d i n o n e r i n g V I - 1 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 1 V I - S . S y n t h e s i s o f V I - 1 8 a n d c o n v e r s i o n t o V I - 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 2 V H S . S y n t h e s i s o f V I - 2 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 5 V I - 7 . H y d r o l y s i s o f t h e p r o d r u g V I - l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 9 V I - 8 . R e t r o s y n t h e t i c a n a l y s i s o f V I - 2 l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 V I - 9 . S y n t h e s i s o f f u n c t i o n a l i z e d a m i n o t h e o p h y l l i n e V I - 2 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 4 V I - 1 0 . C o n v e r s i o n o f 1 1 - 3 a n d 1 1 - 6 i n t o t h e i r c h l o r o f o r r n a t e w h i c h w o u l d g i v e t h e i r f u n c t i o n a l i z e d f o r m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 5 X V [ - 1 1 1 . I L . 1 1 . ; L I S T O F F I G U R E S I - l . A c t i v a t i o n o f v a r i o u s p a t h w a y s i n v o l v e d i n c e l l c y c l e , s u r v i v a l a n d a p o p t o s i s u p o n e x p o s u r e t o c h e m o t h e r a p y o r r a d i a t i o n t h e r a p y . . . . . . . . . . . . . . 4 1 - 2 . I n h i b i t o r s o f p 5 3 - M D M 2 i n t e r a c t i o n . i n c h a l c o n e d e r i v a t i v e B - l , s y c - 7 , t e r p h e n y l d e r i v a t i v e , n u t l i n - 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 [ - 3 . D N A d a m a g e r e s p o n s e p a t h w a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 [ - 4 . C e l l c y c l e a n d c o n t r o l o f c h e c k p o i n t s a t G l / S , G 2 / M p h a s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 [ - 5 . N F - K B s i g n a l i n g c a s c a d e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 [ - 6 . S t r u c t u r e s o f a m i n o f o s t i n e a n d l e p t o m y c i n B , r e a c t i v a t o r s o f p 5 3 . . . . . . . . . . . . 2 3 1 - 7 . I r n a t i n i b , a s p e c i fi c i n h i b i t o r o f B c r - A b l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 [ - 8 . U p o n D N A d a m a g e a p o p t o s i s a n d a c t i v a t i o n o f N F — c h a r e t r i g g e r e d . . . . . . . 2 6 1 - 9 . S t r u c t u r e s o f g e m c i t a b i n e a n d h y m e n i a l d i s i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 1 - 1 0 . I K E - k i n a s e i n h i b i t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 1 - 1 1 . P r o t e a s o m e i n h i b i t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 I - 1 2 . S t r u c t u r e o f i m i d a z o l i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 I - 1 3 . C o n t r o l o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p e r r n e a b i l i z a t i o n b y B c 1 - 2 p r o t e i n s . . . 3 6 I - 1 4 . S t r u c t u r e s o f t o p o - l i n h i b i t o r , g i m a t e c a n a n d D N A a l k y l a t o r , D T I C ( d a c a r b a z i n e ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 1 - 1 5 . S t r u c t u r e s o f a n t i m y c i n A 3 , H A - l 4 - l a n d D e g e t e r e v ’ s B H 3 - B c l - X L b i n d i n g i n h i b i t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 1 1 - 1 . X a n t h i n e d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 5 I I - 2 . a & b . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f r e g u l a t i o n o f C D K i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f p 1 6 o r p 2 7 ( i n h i b i t o r s o f C D K a c t i v i t y ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 7 1 1 - 3 . S t r u c t u r e o f p u r i n e b a s e d k i n a s e i n h i b i t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 9 x v i " - 1 I I I I - I I - l l - " - 1 " - 1 . [ H I 1 1 . 1 } [ L I I ] “ - 4 . “ - 5 . I I - 6 . 1 1 - 7 . I I - 8 . 1 1 - 9 . " - 1 0 . I I - l l . “ - 1 2 . “ - 1 3 . I I - 1 4 . I I - l S . " - 1 6 . “ - 1 7 . “ - 1 8 . “ - 1 9 . I I - 1 9 S c h e m a t i c d i a g r a m s h o w i n g h o w c a f f e i n e o v e r r i d e s t h e a c t i v a t i o n o f C W c h e c k p o i n t b y i n h i b i t i n g A T M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S t r u c t u r a l l y i m p o r t a n t s i t e s f o r C h k l i n h i b i t i o n a c t i v i t y o f c a f f e i n e . . . . . . . . . . S t r u c t u r e s o f s o m e H s p 9 0 i n h i b i t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P u r i n e — b a s e d S T i n h i b i t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A n t i - i n fl a m m a t o r y a c t i v i t y o f t h e o p h y l l i n e c o r r e l a t e s t o i t s i m m u n o m o d u l a t o r y , a n t i - n e o p l a s i c a n d h y p e r c h o l e s t r i c e f f e c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S t r u c t u r e s o f s o m e I c h a i n h i b i t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S t r u c t u r e s o f t h e o p h y l l i n e s a n d c a f f e i n e s . . N u c l e o p h i l l i c d i s p l a c e m e n t r e a c t i o n o f b r o m o t h e o p h y l l i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I n h i b i t i o n o f N F - K B - D N A b i n d i n g w i t h I I - 1 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p 6 5 - D N A b i n d i n g o f t h e o p h y l l i n e d e r i v a t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p 6 5 t r a n s l o c a t i o n m e a s u r e d b y E L I S A w i t h u n a c t i v a t e d c o n t r o l , P M A / P H A , P D T C , t h e o p h y l l i n e a n d 8 - s u b s t i t u t e d d e r i v a t i v e s i n p r e s e n c e o f P M A / P H A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P o t e n t i a t i o n w i t h 1 1 - 1 a n d 1 1 - 2 P o t e n t i a t i o n w i t h “ - 1 1 a n d I I - 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I m i d a z o l e b a s e d a n t i - b a c t e r i a l c o m p o u n d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R e p r e s e n t a t i v e d i s c - d i f f u s i o n a s s a y . 1 1 - 4 a g a i n s t S . a u r e u s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A c t i v i t y o f 1 1 4 a g a i n s t A . B a c i l l u s c e r e u s , a n d B . B a c i l l u s s u b t i l i s . . . . . . . . . ( c o n t d ’ ) . A c t i v i t y o f " - 4 a g a i n s t C . S t a p h y l l o c o c c u s , a u r e u s , D . K l e b s i e l l a p n e u m o n e a e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v i i 6 0 6 3 6 5 6 6 6 7 6 8 7 0 7 4 7 6 7 7 7 9 8 0 8 4 8 5 8 6 8 7 l l 1 1 I I I I I I I I I I I I I I I - 1 1 1 - 1 1 1 - 2 1 1 1 . ] 1 1 1 - 1 i l l - 1 . 1 1 1 . 1 ‘ 1 1 1 . ] I I - 2 0 . I I - 2 1 . I I I - 1 . I I I - 2 . 1 1 1 - 3 . 1 1 1 - 4 . V a r i o u s s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s a r e t r i g g e r e d u p o n D N A d a m a g e . . . I I I - 5 . F u t u r e o f t h e c e l l a f t e r D N A d a m a g e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I I I - 6 . S t r u c t u r e s o f P - g l y c o p r o t e i n m o d u l a t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I I I - 7 . G e n e r a l N F - K B a c t i v a t i o n p a t h w a y b y c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . . . . . . . . . . . . I I I - 8 . S t r u c t u r e o f P S - 3 4 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I I I - 9 . S t r u c t u r e s o f i m i d a z o l e b a s e d a n t i - i n fl a m m a t o r y c o m p o u n d s . . . . . . . I I I - 1 0 . I m i d a z o l i n e s a r e n o t c y t o t o x i c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I I I - 1 1 . S e n s i t i z a t i o n o f C E M c e l l s t o c a m p t o t h e c i n b y i m i d a z o l i n e I I I - 4 , m e a s u r e d o v e r 4 8 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I I I - 1 2 . C C 9 5 c u r v e s f o r C P T a l o n e a n d c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t w i t h I I I - 4 . . . . . . . . . . . E M S A s h o w i n g N F - K B b i n d i n g i n T I - I P - l m o n o c y t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E M S A s h o w i n g N F - K B b i n d i n g i n T H P - l m o n o c y t e s u p o n L P S a c t i v a t i o n i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f n i t r o c a f f e i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S t r u c t u r e s o f c o m m o n l y u s e d d r u g s i n c h e m o t h e r a p y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ( T O P ) S t r u c t u r e s o f c l i n i c a l l y u s e d a n a l o g s o f c a m p t o t h e c i n . ( B O T T O M ) C P T s t a b i l i z e s t h e 3 ’ - p h o s p h o r y l e n d o f D N A c o m p l e x w i t h p r o t e i n . . . . . . ( T O P ) I n t r a a n d i n t e r - s t r a n d c r o s s l i n k i n g o f c i s - p l a t i n w i t h D N A . ( B O T T O M ) W a t e r s o l u b l e a n a l o g s o f c i s - p l a t i n - c a r b o p l a t i n a n d o x a l o p l a t i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I I I - 1 3 . M e a s u r e m e n t o f n u m b e r o f v i a b l e c e l l s u s i n g t h e t r y p a n b l u e m e t h o d . I I I - 1 4 a . E M S A a s s a y f o r N F - K B a c t i v a t i o n b y c a m p t o t h e c i n i n C E M c e l l s . . . . . . . . . . I I I - 1 4 b . E M S A a s s a y f o r N F - K B a c t i v a t i o n b y c a m p t o t h e c i n i n J u r k a t c e l l s . . . . I I I - 1 5 a . E M S A a s s a y f o r N F - c h a c t i v a t i o n b y c a m p t o t h e c i n ( C P T ) , T i m e c o u r s e . I I I - 1 5 b . T i m e d e p e n d e n t a c t i v a t i o n o f I c h - a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v i i i 8 8 8 9 1 1 2 1 1 3 1 1 4 1 1 5 1 1 6 1 1 7 1 2 1 1 2 6 1 2 8 1 2 9 1 3 3 1 3 5 1 3 7 1 3 9 1 4 0 1 4 1 1 4 2 I I I I I I I I I I . 1 1 1 . 1 1 1 - 2 1 1 1 . 2 1 1 1 . 2 1 1 1 . 2 I I I - l 6 . I I I - l 7 . I I I - 1 8 a . I I I - 1 8 b . I I I - 1 9 3 . I I I - 1 9 b . 1 1 1 - 2 0 . 1 1 1 - 2 1 . 1 1 1 - 2 2 . I I I - 2 3 . I I I - 2 4 a . I I I - 2 4 b . I I I - 2 5 . I I I - 2 6 . I I I - 2 7 a . I I I - 2 7 b . S t r u c t u r e s o f C P T , P D T C a n d i m i d a z o l i n e I I I - 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I n h i b i t i o n o f C P T a c t i v a t e d N F - K B b i n d i n g b y i m i d a z o l i n e I I I - 4 u s i n g E M S A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L e v e l o f n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n m e a s u r e d b y p 6 5 E L I S A a s s a y o f c o m p o u n d I I I - 4 i n C E M c e l l s w i t h a c t i v a t i o n b y c a m p t o t h e c i n . . . . . . . . . . L e v e l o f n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n m e a s u r e d b y p 6 5 E L I S A a s s a y o f c o m p o u n d I I I - 4 i n H e L a c e l l s w i t h a c t i v a t i o n b y T N F - a . . . . . . . . . . . . . . . . . . P h o s p h o r y l a t e d I - c h ( a t s e r i n e 3 2 a n d s e r i n e 3 6 ) i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f A L L N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . P h o s p h o r y l a t e d I - c h ( a t s e r i n e 3 2 a n d s e r i n e 3 6 ) i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f p a r t h e n o l i d e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R e l a t i v e a m o u n t o f p h o s p h o r y l a t e d I - i c B ( a t s e r i n e 3 2 a n d s e r i n e 3 6 ) . M e a s u r i n g t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f N F - K B v i a L u c i f e r a s e r e p o r t e r a s s a y i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f i m i d a z o l i n e I I I - 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I m i d a z o l i n e s i n h i b i t N F - K B i n d u c e d t r a n s c r i p t i o n i n a c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t m a n n e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I m i d a z o l i n e s d o n o t d i r e c t l y b i n d t o t h e l u c i f e r a s e e n z y m e t o s h o w i n h i b i t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C a s p a s e 3 / 7 a c t i v i t y i n C E M c e l l s p o s t - t r e a t e d w i t h n o d r u g c o n t r o l , i m i d a z o l i n e I I I - 4 ( 1 0 n M ) , C P T ( 1 0 n M ) , a n d t h e c o m b i n a t i o n o f i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 ( 1 0 n M ) a n d C P T ( 1 0 n M ) o v e r 4 8 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . . C a s p a s e 3 / 7 a c t i v i t y i n C E M c e l l s p r e - t r e a t e d w i t h n o d r u g c o n t r o l , i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 ( 1 0 n M ) , C P T ( 1 0 n M ) , a n d t h e c o m b i n a t i o n o f i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 ( 1 0 n M ) a n d C P T ( 1 0 n M ) o v e r 4 8 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . I r n i d a z o l i n e I I I - 4 d o e s n o t s e n s i t i z e C E M c e l l s t o t u b u l i n i n h i b i t o r s . . . E M S A f o r a c t i v a t i o n o f N F - c h b y v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f T a x o l . . . . C C 9 5 c o m p a r i s o n o f C P T w i t h a n d w i t h o u t i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n C E M l e u k e m i a c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C C 9 5 o f C P T w i t h a n d w i t h o u t i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n n o n - c a n c e r o u s fi b r o b l a s t c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i x 1 4 3 1 4 4 1 4 7 1 4 7 1 5 1 1 5 2 1 5 3 1 5 4 1 5 5 1 5 6 1 5 9 1 5 9 1 6 1 1 6 2 1 6 5 1 6 5 l l 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ‘ I I I - 1 1 1 - 1 1 1 - . I V ' . ] I V . ) 1 V . 3 [ v . 4 I I I - 2 8 a . I I I - 2 8 b . 1 1 1 - 2 9 . 1 1 1 - 3 0 . 1 1 1 - 3 1 . 1 1 1 - 3 2 . I I I - 3 3 8 . I I I - 3 3 b . 1 1 1 - 3 4 . 1 1 1 - 3 5 . 1 1 1 - 3 6 . I I I - 3 7 . I V - 1 . I V - 2 . 1 V - 3 . I V - 4 . I V - 5 . E M S A f o r N F - K B i n C E M , H T 1 0 8 0 , H e L a c e l l s a c t i v a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f C P T ( 1 0 n M , 1 u M , 0 . 1 u M , 0 . 0 1 n M , 1 n M , 0 . 1 n M ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 7 E M S A f o r N F - K B i n C E M , H T 1 0 8 0 , H e L a c e l l s a c t i v a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f C D D P ( 1 0 n M , 3 p . M , l u M , 0 . 3 u M , 0 . 1 u M , 0 . 0 3 n M ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 7 E M S A f o r N F - K B a c t i v a t i o n i n S L 8 9 c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 8 S L 8 9 c e l l s d o n o t s h o w N F - K B m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y w i t h e i t h e r T N F - a o r C P T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 9 X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e s o f 1 1 1 - 4 b ( l e f t , R R ) a n d I I I - 4 3 ( r i g h t , S , S ) . . 1 7 0 C a s p a s e 3 / 7 a c t i v i t y m e a s u r e d i n C E M c e l l s . C C 9 5 c o m p a r i s o n f o r C P T i n C E M l e u k e m i a c e l l s i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f r a c e m i c I I I - 4 , t h e d i a s t e r e o m e r s 1 1 1 - 9 a n d 1 1 1 - 1 0 a n d t h e e n a n t i o m e r s 1 1 1 - 4 3 a n d 1 1 1 - 4 b . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 1 F A C S a n a l y s i s ( T O P ) c e l l s a l o n e , r a c e m i c I I I - 4 ( 0 . 1 u M ) ; ( B O T T O M ) I I I - 4 b ( 0 . 1 n M ) , I I I - 4 a ( 0 . 1 n M ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 2 F A C S a n a l y s i s ( T O P ) C P T ( 0 . 0 1 n M ) , I I I - 4 - ) C P T ( 0 . 0 1 u M ) ; ( B O T T O M ) I I I - 4 b - ) C P T ( 0 . 0 1 u M ) , 1 1 1 - 4 a - ) C P T ( 0 . 0 1 u M ) . . . . . . . . . . . . 1 7 3 E n h a n c e d p 5 3 t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y i n H T 1 0 8 0 d u e t o i n h i b i t i o n o f N F - K B b y I I I - 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 5 N M R s t u d i e s f o r s t a c k i n g i n t e r a c t i o n s b e t w e e n C P T a n d 1 1 1 - 4 . . . . . . . . . . . 1 7 8 G e n e r a l s c h e m e f o r a m i c r o c h i p a r r a y a s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 2 D e c r e a s e i n t h e t u m o r s i z e i n R I F — 1 t u m o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 5 N a t u r a l p r o d u c t l i k e s c a f f o l d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 A c c e s s i n g d i v e r s e s c a f f o l d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 C y c l o d e h y d r a t i o n o f N - a c y l - a - a m i n o a c i d s t o a z l a c t o n e s / m i t n c h n o n e s . . 2 1 7 N u c l e o p h i l i c a n d e l e c t r o p h i l i c s i t e s o n s a t u r a t e d a n d u n s a t u r a t e d a z l a c t o n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 7 G e n e r a t i o n o f d i v e r s e h e t e r o c y c l e s f r o m a z l a c t o n e t e m p l a t e . . . . . . . . . . . . . . 2 1 8 X X 1 V — 6 1 V - 7 I V - 8 I V - 9 l V - l 1 V - 1 I V - 1 I V - 1 1 V - 1 1 V - 1 1 V - 1 I V - l l V - 6 . l , 3 d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n r e a c t i o n o n m i l n c h n o n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 9 I V - 7 . S y n t h e s i s o f p y r ' r o l e s f r o m m t l n c h n o n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 0 I V - 8 . S t e r e o s e l e c t i v e s y n t h e s i s o f a n t i - i m i d a z o l i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 2 I V - 9 . B i o l o g i c a l a c t i v i t y o f 2 - i m i d a z o l i n e n u c l e u s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 3 I V - 1 0 . E x a m p l e s o f a n t i - h y p e r g l y c e m i c a n d a n t i - h y p e r t e n s i v e a g e n t s . . . . . . . . . . . . . 2 2 4 I V - l l . ( A ) O v e r l a y o f p 5 3 a n d n u t l i n . ( B ) N u t l i n i n t h e d e e p p o c k e t o f M D M 2 . . 2 2 5 I V - 1 2 . S t r u c t u r e o f n u t l i n . S P - 4 - 8 4 ( a n t i - i m i d a z o l i n e ) , I V - 4 o l ( s y n - i m i d a z o l i n e ) 2 2 5 I V - l 3 a . l H s p e c t r a f o r a r e p r e s e n t a t i v e B - l a c t a m ( I V - A ) , t r a n s - i m i d a z o l i n e ( I V - 1 - 1 ) a n d c i s - i m i d a z o l i n e ( I V - 4 - 1 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 9 1 V - l 3 b . l 3 C s p e c t r a f o r a r e p r e s e n t a t i v e B - l a c t a m ( I V - A ) , t r a n s - i m i d a z o l i n e ( I V - 1 - 1 ) a n d c i s - i m i d a z o l i n e ( I V - 4 - 1 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 0 1 V - l 3 b . ( c o n t d ’ ) l 3 C s p e c t r a f o r a r e p r e s e n t a t i v e B - I a c t a m ( I V - A ) , t r a n s - i m i d a z o l i n e ( I V - l - l ) a n d c i s - i m i d a z o l i n e ( I V - 4 - l ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 1 I V - l 4 . X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e o f c o m p o u n d I V - 4 - l ( t o p ) , 1 V - 4 - 6 ( m i d d l e ) , I V - S - 1 ( b o t t o m ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 2 I V - l 4 ( c o n t d ’ ) . X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e o f c o m p o u n d I V - 4 - 1 ( t o p ) , I V - 4 - 6 ( m i d d l e ) , 1 V - 5 - 1 ( b o t t o m ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 3 V - l . R e p r e s e n t a t i v e s t r u c t u r a l g r o u p s s y n t h e s i z e d b y p h y l u m P o r i f e r a . . . . . . . . . . 2 8 2 V - 2 . T h e o r o i d i n a n d h y m e n i a l d i s i n e f a m i l i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 3 V - 3 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n M A P K p a t h w a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 5 V - 4 . S t r u c t u r e b a s e d a c t i v i t y f o r i n d o l e a z e p i n e a n d h y m e n i a l d i s i n e a n a l o g s . . . 2 8 7 V - S . S t r u c t u r e o f V - l , V - 2 c o m p a r e d t o n a t u r a l p r o d u c t h y m e n i a l d i s i n e . . . . . . . . 2 9 3 V - 6 . R e t r o s y n t h e t i c a n a l y s i s f o r i n d o l e a z e p i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 3 V - 7 . C o n d e n s a t i o n w i t h t h i o h y d a n t o i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 5 V - 8 . H o m e ’ s s t r a t e g y f o r t h e s y n t h e s i s o f a x i n o h y d a n t o i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 5 V - 9 . C o n d e n s a t i o n o f i s a t i n w i t h h y d a n t o i n p h o s p h o n a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 7 x x i V 1 V 1 . V 1 - V 1 . V 1 . 5 V 1 . 6 V 1 . 7 V 1 . 3 I V - 1 0 . V - l l . V - 1 2 . V - 1 3 . V - 1 4 . V - l S . V - 1 6 . V - 1 7 . V - 1 8 . V - 1 9 . V - 2 0 . V - 2 1 . V I - l . V I - 2 . V I - 3 . V I - 4 . V I - S . V I - 6 . V 1 - 7 . V I - 8 . R e v i s e d r e t r o s y n t h e s i s f o r V - 2 a n d V - 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 8 P r a g e r ’ s K n o v e n e g e l ’ s a p p r o a c h t o s y n t h e s i z e d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e . 2 9 8 M u k e r j e e ’ s T E A m e d i a t e d c o n v e r s i o n o f o x a z o l o n e i n t o i m i d a z o l o n e . 3 0 1 S o l i d s u p p o r t s y n t h e s i s o f 2 - a m i n o i m i d a z o l o n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 2 X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e o f V . M e O H . . ‘ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 3 S t r u c t u r e s o f i m i d a z o l e b a s e d V - 1 6 a n d V - 1 7 c o m p a r e d t o h y m e n i a l d i s i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 5 R e a r r a n g e m e n t o f O - a c y l a t e d p r o d u c t t o C - a c y l a t e d i s o m e r . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 5 R e t r o s y n t h e t i c a n a l y s i s f o r V - 2 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 7 D o s e d e p e n d e n c e a c t i v i t y o f C h k 2 w i t h v a r y i n g V - l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 2 I L - 2 p r o d u c t i o n m e a s u r e d b y B I A w i t h P D T C , h y m e n i a l d i s i n e a n d c o m p o u n d s V - l a n d V - 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 5 E M S A a s s a y f o r N F - K B - D N A b i n d i n g i n h i b i t i o n b y c o m p o u n d V - l , V - 2 , a n d h y m e n i a l d i s i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 7 S u r v i v a l c u r v e s s h o w i n g c e l l g r o w t h i n p r e s e n c e o f 5 u M h y m e n i a l d i s i n e , V - l , V - 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 9 D N A a l k y l a t i o n r e a c t i o n w i t h D u o c a r m y c i n S A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 7 C o n v e r s i o n o f d r u g ( e n a l a p r i l a t ) f r o m p r o d u g ( e n a l a p r i l ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 8 C o m m o n l y k n o w n N - m u s t a r d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 8 P r o p o s e d m e c h a n i s m o f D N A - D N A c r o s s l i n k i n g w i t h N - m u s t a r d s . . . . . . 3 4 9 D e p l e t i o n o f o x y g e n , d r u g c o n c e n t r a t i o n i n s o l i d t u m o r c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 0 U s e o f n i t r o i m i d a z o l e s a n d m a s k e d N - m u s t a r d s f o r t a r g e t i n g D N A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 1 C o n v e r s i o n o f p r o d r u g T P Z i n t o a c t i v e B T Z * f o r t o p o i s o m e r a s e - 2 p o i s i o n i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 1 S e l f - i m m o l a t i o n p r o d r u g g e n e r a t e s D N A c r o s s l i n k e r u p o n C P G Z x x i i V I V 1 V 1 - W — V I - 9 . V I - l 0 . V I - l l . V I - 1 2 . V I - l 3 . V I - l 4 . V I - l S . V I - l 6 . V I - l 7 . V I - 1 8 . V I - 1 9 . a c t i v i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 2 A c t i v a t i o n o f m i t o m y c i n C ( M M C ) u n d e r r e d u c i n g c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 3 P r o p o s e d m o d e l f o r F e ( I H ) - m e d i a t e d r e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f F R 9 0 0 4 8 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 4 ( T o p ) . R a t i o n a l e f o r t h e d e s i g n o f t h e p r o d r u g . ( M i d d l e ) S t r u c t u r e o f t h e p r o d r u g m o d e l s y s t e m . ( B o t t o m ) m e c h a n i s m f o r p r o d r u g r e d u c t i v e a c t i v a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 5 R e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f N F - K B b y s a n g u a n a r i n e p r o d r u g s . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 6 R e t r o s y n t h e t i c a n a l y s i s o f V I - l 3 5 7 C y c l i c v o l t a m m e t r y f o r V I - l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 4 D e n n y ’ s n i t r o b e n z y l q u a r t e m a r y s a l t s a s a p r o d r u g f o r N - m u s t a r d . 3 6 5 N e u t r a l a g a r o s e g e l t o c h e c k t h e l i n e a r i t y , c o n c e n t r a t i o n a n d s i z e o f t h e p l a s m i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 6 R e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f V I - l . M i t o m y c i n C u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l f o r r e d u c t i v e a c t i v a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 8 R e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f V I - l i n p r e s e n c e o f F e 2 + l E D T A . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 8 V I - l u n d e r g o e s h y d r o l y s i s u n d e r a l k a l i n e c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 0 x x i i i A D M E T A L L N A n h y d . A S M A T P A T R A T M B R C A l C C 9 5 C D D P C D K C D C 2 6 C h k l C h k 2 C K l C M L C O X - 2 K E Y T O S Y M B O L S A N D A B B R E V I A T I O N S A d m i n i s t r a t i o n , d i s t r i b u t i o n , m e t a b o l i s m , e l i m i n a t i o n , t o x i c i t y A c e t y l - L - l e u c i n y l - L - l e u c i n y l - L — n o r l e u c i n a l A n h y d r o u s A i r w a y S m o o t h M u s c l e A d e n o s i n e T r i P h o s p h a t e A t a x i a - t e l a n g i e c t a s i a - m u t a t e d A T M - R a d 3 - r e 1 a t e d B r e a s t C a n c e r 1 C Y t o t o x i c C o n c e n t r a t i o n a t w h i c h 9 5 % c e l l p o p u l a t i o n d i e s c i s - D i a m m i n o d i c h l o r o P l a t i n u m ( H ) ( C i s - P l a t i n ) C y c l i n D e p e n d e n t K i n a s e C e l l d i v i s i o n c y c l e 2 6 C h e c k p o i n t k i n a s e 1 C h e c k p o i n t k i n a s e 2 C a s e i n K i n a s e 1 ( C S N A l K l ) C h r o n i c m y e l o g e n o u s l e u k e m i a C y c l o o x y g e n a s e - 2 C P T I C P T - l l C a m p t o t h e c i n / I r i n o t e c a n C S A ( 1 d e D N A - P K D C C D M A P D C M D M S O D N A D O S D T I C D T T 5 E D C I E D T A E G F R E M S A E L I S A E I A e q . E t O A c F A B F A C S 8 ( 3 1 5 0 G S K - 3 B c a m p h o r s u l f o n i c a c i d 2 ' , 2 ' - d i fl u o r o - 2 ' - d e o x y c y t i d i n e D N A d e p e n d e n t - P r o t e i n K i n a s e D i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e 4 - ( d i m e t h y l a m i n o ) p y r i d i n e D i c h l o r o m e t h a n e D i m e t h y l s u l p h o x i d e D e o x y r i b o n u c l e i c a c i d D i v e r s i t y o r i e n t e d s y n t h e s i s D i m e t h y l t r i a z e n o i m i d a z o l e c a r b o x a m i d e ( d a c a r b a z i n e ) D i t h i o t h r e i t o l c h e m i c a l s h i f t ( p a r t s p e r m i l l i o n ) E t h y l d i m e t h y l a m i n o p r o p y l c a r b o d i i m i d e E t h y l e n e D i a m i n e T e t r a a c e t i c a c i d e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r E l e c t r o M o b i l i t y S h i f t A s s a y ( g e l s h i f t a s s a y ) E n z y m e L i n k e d I m m u n o s o r b e n t A s s a y E n z y m e I r n m u n o A s s a y E q u i v a l e n t E t h y l A c e t a t e F a s t A t o m B o m b a r d m e n t F l u o r e s c e n c e a i d e d c e l l s o r t e r g r a m G r o w t h I n h i b i t i o n b y 5 0 % G l y c o g e n s y n t h a s e k i n a s e - 3 B x x i v G P C R H E P E S H T S H R M S H s p I C s o M A P K M D M 2 M D R M G M T M E K K - l M M P M S n M N B S N M R N F - K B N S A I D s P C R P D T C P D E P - g p P I - 3 K P M A P H A P P A G - P r o t e i n C o u p l e d R e c e p t o r 4 - ( 2 - H y d r o x y e t h y l ) - l - p i p e r a z i n e e t h a n e s u l f o n i c a c i d H y p o x i a I n d u c i b l e f a c t o r H i g h t h r o u g h p u t s c r e e n H i g h r e s o l u t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y H e a t S h o c k P r o t e i n h o u r I n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n f o r 5 0 % i n h i b i t i o n o f a c t i v i t y p r o b e d I n f r a R e d I n h i b i t o r o f K B I - c h k i n a s e I n t e r l e u k i n - 8 ( c y t o k i n e ) c o u p l i n g c o n s t a n t P o t a s s i u m H e x a m e t h l e i s i l a z a m i d e L i t h i u m a l u m i n i u m h y d r i d e L i p o p o l y s a c c h a r a i d e M o l a r ( c o n c e n t r a t i o n ) M e g a H e r t z m a s s t o c h a r g e r a t i o m i l l i A m p e r e s M i t o g e n - A c t i v a t e d P r o t e i n K i n a s e M u r i n e D o u b l e M i n u t e 2 M u l t i - D r u g R e s i s t a n c e 0 6 - m e t h y l g u a n i n e - D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e M A P K i n a s e K i n a s e M a t r i c m e t a l l o p r o t e i n a s e M a s s S p e c t r o m e t r y n a n o m o l a r N - b r o m o s u c c i n a m i d e n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e N u c l e a r f a c t o r - K B N o n - S t e r o i d a l A n t i - I n fl a m m a t o r y D r u g s P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n p y n ' o l i n e d i t h i o c a r b a m a t e P h o s p h o d i e s t e r a s e P - g l y c o p r o t e i n P h o s p h o l n o s i t o l 3 - k i n a s e P h o r b o l M y r i s t a l A c e t a t e P h y t o h e m a g g l u t i n i n . P y r o p h o s p h o r i c a c i d P r o t e a s o m e m u l t i - c a t a l y t i c p r o t e a s e u n i t i n c e l l s R b R N A R S S E M C I R e t i n o b l a s t o m a p r o t e i n R i b o n u c l e i c a c i d r e c t u s ( C a h n - I n g o l d - P r e l o g s y s t e m ) s i n i s t e r ( C a h n - I n g o l d - P r e l o g s y s t e m ) 2 - ( t r i m e t h y l s i l y l e t h o x y ) m e t h y l c h l o r i d e X X V S m a l l m o l e c u l e i n h i b i t o r s o f p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s S u l p h o t r a n s f e r a s e s T r i e t h y l a m i n e T r i m e t h y l s i l y l c h l o r i d e T u m o r N e c r o s i s F a c t o r - a m i c r o m o l a r V o l t s x x v i C H A P T E R I P R O B L E M S , P E R S P E C T I V E S A N D P R O M I S E S I N C U R R E N T C A N C E R C H E M O T H E R A P Y : F I N D I N G A N S W E R S T O Q U E S T I O N S P E R T A I N I N G L I F E O R C E L L D E A T H ? ? T h e c e l l , o v e r t h e b i l l i o n s o f y e a r s o f h e r l i f e , h a s c o v e r e d t h e e a r t h m a n y t i m e s w i t h h e r s u b s t a n c e , f o u n d w a y s t o c o n t r o l h e r s e l f a n d h e r e n v i r o n m e n t , a n d i n s u r e h e r s u r v i v a l . I t i s t h i s c e l l w h i c h p l a n s a n d c o m p o s e s a l l o r g a n i s m s , a n d w h i c h t r a n s m i t s t o t h e m i t s d e f e c t s a n d p o t e n t i a l i t i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A l b e r t C l a u d e A . I n t r o d u c t i o n A p o p t o s i s o r p r o g r a m m e d c e l l d e a t h i s a c e l l u l a r m e c h a n i s m u s e d t o r e g u l a t e c e l l n u m b e r a n d e l i m i n a t e d a m a g e d o r m u t a t e d c e l l s . S u c h a n o r d e r e d c o n t r o l m e c h a n i s m i s i m p o r t a n t f o r o r g a n f o r m a t i o n d u r i n g d e v e l o p m e n t a n d o v e r a l l h o m e o s t a s i s i n m u l t i - c e l l u l a r o r g a n i s m s . I t i s a n i m p o r t a n t b i o l o g i c a l p r o c e s s t o e l i m i n a t e u n w a n t e d c e l l s w i t h p o t e n t i a l l y h a r m f u l g e n o m i c m u t a t i o n s o r c e l l s t h a t d i d n o t d e v e l o p n o r m a l l y . M o d i fi c a t i o n o f t h i s n o r m a l p r o c e s s m i g h t r e s u l t i n t h e i n t e r f e r e n c e o f t h e d e l i c a t e b a l a n c e b e t w e e n c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d c e l l d e a t h a n d l e a d t o a v a r i e t y o f d i s e a s e s . " 2 J u s t r e c e n t l y u n d e r s t o o d , t h i s p r o c e s s h a s i n t r i n s i c w e a k n e s s e s , w h i c h w h e n c o m p r o m i s e d , o f t e n l e a d t o i n a p p r o p r i a t e c e l l d e a t h a n d d i s e a s e . M o s t c a n c e r s , t h r o u g h v a r i o u s m e c h a n i s t i c s t r a t e g i e s m a n i f e s t c a p a b i l i t i e s t o c a u s e a l t e r a t i o n s i n c e l l g r o w t h a n d p h y s i o l o g y l e a d i n g t o a m a l i g n a n t g r o w t h : s e l f - s u f fi c i e n c y i n g r o w t h s i g n a l s , i n s e n s i t i v i t y t o a n t i g r o w t h s i g n a l s , e v a s i o n o f a p o p t o s i s , u n l i m i t e d p o t e n t i a l t o r e p l i c a t e , s u s t a i n e d a n g i o g e n e s i s , a n d t i s s u e i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s . 3 I d e a l l y , c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g s s h o u l d s p e c i fi c a l l y t a r g e t o n l y t u m o r c e l l s a n d s h o u l d d e c r e a s e t u m o r b u r d e n b y i n d u c i n g c y ‘ . i n c i n t : C I ' l f d i r t m 0 : t h e t d r u g l e a d t e s i s R e s i I o n n p r u - t r a n s 0 1 ' 6 1 c e l l I a c l n M U I I E X P ; I i p O ; c y t o t o x i c a n d / o r c y t o s t a t i c e f f e c t s w i t h m i n i m a l " c o l l a t e r a l d a m a g e " t o n o r m a l c e l l s . H o w e v e r , i n r e a l i t y , t h e e f f e c t i v e n e s s o f c h e m o t h e r a p y s u f f e r s a r a n g e o f c o m p l e x f a c t o r s i n c l u d i n g s y s t e m i c t o x i c i t y d u e t o a l a c k o f s p e c i fi c i t y , r a p i d d r u g m e t a b o l i s m , a n d b o t h i n t r i n s i c a n d a c q u i r e d d r u g r e s i s t a n c e . 1 ) D O U B L E J E O P A R D Y : W h y a r e c a n c e r c e l l s i n h e r e n t l y r e s i s t a n t t o t h e c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g s ? M o s t c o n v e n t i o n a l a n t i - c a n c e r a g e n t s c a u s e c e l l d a m a g e d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y b y d a m a g i n g t h e D N A . C e l l d e a t h i n r e s p o n s e t o D N A d a m a g e h a s m o s t l y b e e n s h o w n t o o c c u r v i a a p o p t o t i c p a t h w a y s . W h e n t h e a n t i - c a n c e r a g e n t s h a v e a t h e r a p e u t i c r e s p o n s e , t h e y o f t e n S h o w s e l e c t i o n o f p r e - m a l i g n a n t c e l l s b y e l i m i n a t i n g t h e d r u g - s e n s i t i v e c e l l s . H e n c e , o n o n e h a n d , t h e r a p y - i n d u c e d k i l l i n g o f c a n c e r c e l l s m i g h t l e a d t o a t h e r a p e u t i c r e s p o n s e ; p r e f e r e n t i a l k i l l i n g o f d r u g - s e n s i t i v e c e l l s o f t e n s e l e c t s f o r r e s i s t a n c e a n d m i g h t l e a d t o t u m o r p r o g r e s s i o n . 4 R e s i s t a n c e t o c a n c e r t h e r a p e u t i c a g e n t s c o u l d b e n o n - o n c o g e n i c o r o n c o g e n i c . W h i l e t h e f o r m e r p e r t a i n s t o t h e d r u g - m e t a b o l i s m , t r a n s p o r t o r m u t a t i o n o f t a r g e t s c a u s i n g p r e v e n t i o n o r r e p a i r o f t h e t a r g e t . F o r e x a m p l e , t h e O 6 - m e t h y l g u a n i n e - D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e M G M T r e p a i r s t h e a l k y l a t i o n c a u s e d o n D N A b y D N A a l k y l a t i n g a g e n t s ? O v e r e x p r e s s i o n o f M G M T p r e v e n t s c a r c i n o g e n e s i s " . T h e l a t t e r r e f e r s t o t h e a l t e r a t i o n s i n c e l l c y c l e o r a p o p t o s i s c a u s i n g p a t h w a y ( e . g . o v e r e x p r e s s i o n o f o n c o p r o t e i n s E r b B a n d l a c k i n g t u m o r s u p p r e s s o r s s u c h a s p 5 3 a n d R b p r o t e i n m i g h t c a u s e t h e c a n c e r c e l l s t o ‘ i g n o r e ’ t h e d a m a g e ) . M u l t i - d r u g r e s i s t a n c e ( M D R ) h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h t h e i n v i v o a n d i n v i t r o o v e r e x p r e s s i o n o f M r ] g e n e p r o d u c t , P - g l y c o p r o t e i n , w h i c h c o n f e r s r e s i s t a n c e t o a v a r i e t y o f l i p o p h i l i c d r u g s i n c l u d i n g v i n c a a l k a l o i d s , d a u n a m y c i n e t c . T h i s s e t s u p a n e f fl u x p u m p d n 5 1 1 t h e b e t t o d e c r e a s e t h e i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n o f t h e d r u g t h u s l e a d i n g t o r e s i s t a n c e t o a p a r t i c u l a r d r u g . H o w e v e r , a c t i v a t i o n o f P - g l y c o p r o t e i n m e d i a t e d e f fl u x m a y b e j u s t o n e o f t h e p o s s i b l e m e c h a n i s m s t h a t i n d u c e r e s i s t a n c e i n t u m o r c e l l s . 7 C y t o t o x i c i t y o f c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g s i s d e p e n d e n t o n t h e i n v i v o a v a i l a b i l i t y o f d r u g s a n d t h e i r m e t a b o l i t e s . C h a n g e s i n c e l l u l a r p r o t e i n l e v e l s e m p l o y e d i n d e t o x i fi c a t i o n p r o c e s s e s a s w e l l a s t h o s e e m p l o y e d i n a c t i v a t i o n o f c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g s p r e d i c t a b l y m a y a l l o w a n e s c a p e f o r t u m o r c e l l s a n d s e l e c t f o r a n e w t y p e o f a d a p t i v e r e s i s t a n c e . F o r e . g . a n t i - t u m o r a g e n t , m i t o m y c i n C r e q u i r e s m e t a b o l i t e a c t i v a t i o n b y r e d u c t a s e s s u c h a s D T d i a p h o r a s e a n d c y t o c h r o m e p 4 5 0 r e d u c t a s e ; h o w e v e r , t h e c h e m o s e n s i t i v i t y t o t h e d r u g d e p e n d s o n t h e l e v e l s o f t h e e n z y m e i n t h e c e l l . 8 S i n c e o n c o g e n e s d r i v e i m p o r t a n t b i o l o g i c a l p r o c e s s e s s u c h , a s c e l l d i v i s i o n a n d g r o w t h , t h e i r o v e r e x p r e s s i o n m i g h t l e a d t o a l t e r a t i o n s i n t h e m a i n t e n a n c e o f t h e d e l i c a t e b a l a n c e b e t w e e n c e l l g r o w t h a n d c e l l d e a t h . B y v i r t u e o f t h e s e p r o p e r t i e s , o n c o g e n e s o r t h e i r p r o d u c t s b e c o m e p r i m e c a n d i d a t e s f o r i n h e r e n t o r a c q u i r e d r e s i s t a n c e t o a n t i - t u m o r t h e r a p y . 1 1 ) S e n s i t i z i n g c a n c e r c e l l s t o a n t i - t u m o r t h e r a p y O n e o f t h e m a j o r c h a n g e s i n c a n c e r c e l l s t h a t l i m i t t h e a c t i v i t y o f a d r u g i s t h e i n i t i a t i o n o f a n t i - a p o p t o t i c p a t h w a y s ( F i g u r e H ) i n t u m o r c e l l s e i t h e r t h r o u g h m u t a t i o n o r d o w n - r e g u l a t i o n o f a p r o - a p o p t o s i s p r o t e i n s u c h a s p 5 3 9 o r u p - r e g u l a t i o n o f a n t i - a p o p t o s i s p r o t e i n s s u c h a s N F - K B , ' 0 w h i c h r e g u l a t e s a p o p t o s i s o r M D M 2 ( m u r i n e d o u b l e m i n u t e ) , ” a n a t u r a l i n h i b i t o r o f p 5 3 . F i g u r e I - l . A c t i v a t i o n o f v a r i o u s p a t h w a y s i n v o l v e d i n c e l l c y c l e , s u r v i v a l a n d a p o p t o s i s u p o n e x p o s u r e t o c h e m o t h e r a p y o r r a d i a t i o n t h e r a p y . B . p 5 3 : t h e g u a r d i a n o f t h e g e n o m e . T h e p 5 3 t u m o r s u p p r e s s o r p r o t e i n p l a y s a k e y r o l e i n t h e c e l l ’ s r e s p o n s e t o s t r e s s . T h i s s t r e s s c a n l e a d t o l o s s o f t h e p 5 3 f u n c t i o n a s a ‘ g u a r d i a n o f t h e g e n o m e ’ . L o s s o f p 5 3 a c t i v i t y o c c u r s i n m o r e t h a n 5 0 % o f t h e c a n c e r t y p e s . 9 W h i l e i t i s o f u t m o s t i m p o r t a n c e t o u n d e r s t a n d t h e e t i o l o g y o f m a l i g n a n c y t o r e d u c e c a n c e r i n c i d e n c e , e l u c i d a t i o n t h r o u g h s t u d i e s i n v o l v i n g g e n e d a m a g e c a n b e p a r t i c u l a r l y c h a l l e n g i n g . M u t a t i o n s i n p 5 3 , w h i c h a r i s e b o t h d u e t o e x o g e n o u s c a r c i n o g e n s a n d e n d o g e n o u s b i o l o g i c a l p r o c e s s e s , h a v e p r o v i d e d s o m e c l u e s a b o u t t h e n a t u r e o f g e n e t i c a l t e r a t i o n s . T h e b a l a n c e b e t w e e n m u t a t i o n s c a u s e d b y t h e e x o g e n o u s a n d e n d o g e n o u s f a c t o r s m a y v a r y f o r d i f f e r e n t c a n c e r s o f t h e s a m e p o p u l a t i o n o r v i c e v e r s a . A d i s r u p t i o n i n t h e a c t i v i t y o f p 5 3 o c c u r s e i t h e r b y a l e s i o n t o p r e v e n t a c t i v a t i o n o f p 5 3 , a m u t a t i o n o f t h e p 5 3 g e n e o r v i a ( [ 5 $ 1 3 o f I e f f e - b i n d u s e d p 5 3 S e l e c I 0 1 3 1 ' I n t e r C T y s : I E V e g . P r i m i n h i b i t i o n o f t h e d o w n s t r e a m m e d i a t o r s o f i t s f u n c t i o n . p 5 3 a c t s a s a t u m o r s u p p r e s s o r b y i n d u c i n g g r o w t h a r r e s t , c e l l s e n e s c e n c e o r a p o p t o s i s i n r e s p o n s e t o a v a r i e t y o f c e l l u l a r s t r e s s s t i m u l i i n c l u d i n g D N A d a m a g i n g a g e n t s , h y p o x i a e t c . ( F i g u r e I - l ) , t h u s m a i n t a i n i n g t h e c o n t r o l o f c e l l p r o l i f e r a t i o n . S i n c e a c t i v a t e d p 5 3 h a s t h e a b i l i t y t o c a u s e a r r e s t o r a p o p t o s i s , t h e c e l l s h a v e e v o l v e d v a r i o u s m e c h a n i s m s t o k e e p t h e l e v e l s o f p 5 3 l o w u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s . T h e s t a b i l i t y o f p 5 3 p r i m a r i l y d e p e n d s o n i t s p h y s i c a l i n t e r a c t i o n w i t h M D M 2 , w h i c h i n h i b i t s t h e t r a n s a c t i v a t i o n a l a c t i v i t y o f p 5 3 . 1 2 T h i s c a u s e s d e g r a d a t i o n o f p 5 3 . ' 3 M D M 2 i s a m p l i fi e d i n ~ 4 0 % o f s a r c o m a s l e a d i n g t o i n a c t i v a t i o n o f p 5 3 . A c t i v a t e d p 5 3 l e a d s t o i n d u c t i o n o f m d m 2 e x p r e s s i o n w h i c h i n h i b i t s p 5 3 s t a b i l i z a t i o n t h u s s e t t i n g u p a n a u t o - r e g u l a t o r y l o o p t h a t p r e v e n t s e x c e s s i v e e x p r e s s i o n o f p 5 3 u n d e r u n s t r e s s e d c o n d i t i o n s . H e n c e , t a r g e t i n g r e a c t i v a t i o n o f p 5 3 t h r o u g h i n h i b i t i o n o f M D M 2 v i a d i s r u p t i o n o f p 5 3 - M D M 2 b i n d i n g m a y c a u s e s i g n i fi c a n t a n t i - c a n c e r e f f e c t s . I n t h e p a s t , s e v e r a l s t u d i e s i n c l u d i n g m i c r o i n j e c t i o n o f a n t i - b o d i e s t o t h e p 5 3 ' 5 ' e t c . h a v e b e e n b i n d i n g S i t e , ' 4 i n h i b i t i o n o f M D M 2 u s i n g a n t i - s e n s e o l i g o n u c l e o t i d e s , u s e d t o c l e a r l y i l l u s t r a t e t h a t d i s r u p t i o n o f t h e p 5 3 r e g u l a t o r y c i r c u i t , l e a d s t o a c t i v a t i o n o f p 5 3 p a t h w a y . I d e a l l y , f r o m a c l i n i c a l p e r s p e c t i v e , s m a l l d r u g — l i k e m o l e c u l e s t h a t s e l e c t i v e l y b i n d M D M 2 a t t h e p 5 3 p o c k e t w i t h o u t p h y s i c a l l y a f f e c t i n g p 5 3 o r i t s a c t i v i t y a r e m o s t d e s i r a b l e . F o r a l o n g t i m e , d i s r u p t i o n o f p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s w a s t h o u g h t t o b e a d i f fi c u l t t a s k f o r t h e r a p e u t i c i n t e r v e n t i o n . T h i s i s a r e s u l t o f t h e l a r g e a n d fl a t i n t e r a c t i n g f a c e s b e t w e e n t h e p a r t i c i p a t i n g p r o t e i n s . A s a n e x c e p t i o n t o t h i s i d e a , t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f M D M 2 b o u n d t o a p e p t i d e f r o m t h e t r a n s a c t i v a t i o n d o m a i n o f p 5 3 h a s r e v e a l e d t h a t M D M 2 p o s s e s s e s a r e l a t i v e l y d e e p h y d r o p h o b i c p o c k e t t h a t i s fi l l e d p r i m a r i l y b y t h r e e s i d e c h a i n s f r o m t h e h e l i c a l r e g i o n o f t h e p e p t i d e m ’ T h i s w e l l - d e fi n e d F i g u I n t e l T h e [ h e ‘ “ m g r O H N 5 0 . . p o c k e t o n t h e M D M 2 h i g h l i g h t s t h e f a c t t h a t s m a l l m o l e c u l e s m i g h t b l o c k t h e i n t e r a c t i o n o f M D M 2 w i t h p 5 3 . T h e r e h a v e b e e n a f e w s u c c e s s f u l a p p r o a c h e s t h a t h a v e t a r g e t e d t h e s u r f a c e s o f o n e o r b o t h t h e p a r t n e r s o f t h e c o m p l e x . 1 6 A o O C O y N / N O O O H O O O O / — C O O H a } O . . O c Q b F i g u r e I - 2 A ( T o p ) . p 5 3 - M D M 2 b i n d i n g p o c k e t . 2 B ( B o t t o m ) . I n h i b i t o r s o f p 5 3 - M D M 2 l i g t z e r a c t i o n . A : C h a l c o n e d e r i v a t i v e B — l B : S y c - 7 l 8 C : T e r p h e n y l d e r i v a t i v e 1 D : N u t l i n - 3 e 9 \ / / O \ ) _ N fl N x O H O T h e p o t e n c y o f t h e c h a l c o n e d e r i v a t i v e B — 1 a n d S y c - 7 ( F i g u r e [ - 2 , A a n d B ) i n i n h i b i t i n g t h e M D M 2 - p 5 3 b i n d i n g i s l o w i n t h e m i c r o m o l a r r a n g e . 1 7 R e c e n t l y , H a m i l t o n a n d C O “ i s a : s i t e W i l l s e l t ' s e l t ‘ p r o H i l l o f . t h e I n c c o w o r k e r s r e p o r t e d t h e s y n t h e s i s o f a t e r p h e n y l s c a f f o l d ( C , F i g u r e I - 2 ) , w h i c h p r o v e d t o b e a p o t e n t M D M 2 i n h i b i t o r . l 9 A n o t h e r n a t u r a l p r o d u c t , c h l o r o f u s i n a f u n g a l m e t a b o l i t e i s a n i n h i b i t o r o f p 5 3 - M D M 2 i n t e r a c t i o n w i t h a n d I C s o o f S u M , t h o u g h t h e e x a c t b i n d i n g s i t e f o r i t i s n o t k n o w n . 2 0 A p p e l l a a n d c o - w o r k e r s s h o w e d a s e r i e s o f a - a m i n o k e t o n e s w h i c h r e a c t i v a t e d p 5 3 i n S a O S - 2 c e l l s ( a m u t a n t c e l l l i n e R 1 7 5 H , R 2 8 1 0 ) a n d i n d u c e d s e l e c t i v e c e l l u l a r c y t o t o x i c i t y . ” W h i l e A p p e l l a e t a l s u g g e s t a f o r m a l p o s s i b i l i t y o f s e l e c t i v e l y t a r g e t i n g c e l l s e x p r e s s i n g m u t a n t p 5 3 , t h e y d i d n o t s e e r e s t o r a t i o n o f w i l d t y p e p r o p e r t i e s o f p 5 3 , s u c h a s t h e e x p r e s s i o n o f i t s e n d o g e n o u s t a r g e t H D M 2 ( h u m a n d o u b l e m i n u t e ) . D e v e l o p e d b y H o f f m a n L a R o c h e , n u t l i n s , a r e c i s - i m i d a z o l i n e s t h a t a r e p o t e n t i n h i b i t o r s o f M D M 2 i n t h e n a n o m o l a r r a n g e } 2 2 T h e s e m o l e c u l e s i n t e r a c t w i t h M D M 2 , m i m i c k i n g t h e i n t e r a c t i o n o f t h r e e p 5 3 a m i n o a c i d r e s i d u e s w i t h i n t h e h y d r o p h o b i c c a v i t y o f M D M 2 . I n c e l l c u l t u r e , t h e s e i r r r i d a z o l i n e s a c t i v a t e d t h e p 5 3 p a t h w a y a n d t r a n s c r i p t i o n o f i t s g e n e s ( p 2 1 , M D M 2 ) . F u r t h e r , t h e n u t l i n s d i d n o t e f f e c t t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f S e r l S o f p 5 3 , w h i c h i s n o r m a l l y s e e n i n g e n o t o x i c s t r e s s , i n d i c a t i n g t h a t t h e a c t i v i t y o f t h e s e m o l e c u l e s i s v e r y s p e c i fi c . T h e a c t i v i t y o f p 5 3 d o e s n ’ t j u s t i n v o l v e i t s a c t i v a t i o n a n d a c c u m u l a t i o n b u t a l s o p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n 2 3 i n r e s p o n s e t o v a r i o u s s t i m u l i , w h i c h c a n d i r e c t i t s f u n c t i o n a l r o l e i n c e l l s . “ I t h a s b e e n a c c e p t e d w i d e l y t h a t t u m o r t y p e s t h a t h a v e a w i l d t y p e p 5 3 u s u a l l y s u f f e r a b e r r a t i o n s i n t h e p 5 3 p a t h w a y ( s u c h a s h i g h l e v e l s o f M D M 2 ) , w h i c h c a n p a r t i a l l y o r c o m p l e t e l y a b r o g a t e t h e t u m o r s u p p r e s s o r a c t i v i t y o f p 5 3 . ” T u m o r s w i t h w i l d t y p e p 5 3 a n d h i g h l e v e l s o f M D M 2 a r e e x p e c t e d t o b e n e fi t t h e m o s t f r o m t h e r a p y t a r g e t i n g t h e p 5 3 - M D M 2 i n t e r a c t i o n s , s i n c e i n h i b i t i o n o f t h i s i n t e r a c t i o n w o u l d i m p l y a t V I 0 1 O n t h e C h i S l l ‘ r e s t o r a t i o n o f w i l d t y p e c h a r a c t e r i s t i c s o f p 5 3 . C o n s i s t e n t w i t h t h e s e p r e d i c t i o n s , n u t l i n s w e r e f o u n d t o c a u s e c y t o t o x i c i t y i n S J S A - l o s t e o s a r c o m a c e l l s w h i c h h a v e a n a m p l i fi e d m d m 2 g e n e . 9 H o w e v e r , t h e q u e s t i o n p e r t a i n i n g t h e n u m b e r o f h u m a n t u m o r s u n d e r t h i s c a t e g o r y ( w i l d t y p e p 5 3 a n d h i g h l e v e l s o f M D M 2 ) i n a c l i n i c a l s e t t i n g r e m a i n s u n a n s w e r e d . S i n c e n u t l i n s d o n o t d i r e c t l y a f f e c t t h e p 5 3 , t h e b i o l o g i c a l p a t h w a y f o r a c t i v a t i o n a n d t r a n s c r i p t i o n o f p 5 3 c a n b e d i s s e c t e d b o t h u p s t r e a m a n d d o w n s t r e a m i n a v a r i e t y o f c e l l l i n e s a n d c o n c l u s i o n s f o r t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f n u t l i n s c a n b e d r a w n b a s e d o n t h e i r p 5 3 s t a t u s . A l t h o u g h M D M 2 a n t a g o n i s t s s u c h a s n u t l i n s d o n o t c a u s e D N A d a m a g e , y e t t h e y a c t i v a t e t h e p 5 3 p a t h w a y . T h i s i s p a r t i c u l a r l y c o n s i d e r e d a d v a n t a g e o u s o v e r t r a d i t i o n a l c h e m o t h e r a p y s i n c e i t w o u l d r e l i e v e t h e p a t i e n t s o f g e n o t o x i c s t r e s s . C . R e p a i r m e c h a n i s m s : C h e c k p o i n t s . O n e o f t h e i m p o r t a n t f u n c t i o n s o f p 5 3 a f t e r i t g e t s a c t i v a t e d i s t o i m p o s e G l / S a n d G Z / M c h e c k p o i n t s i n t h e c e l l c y c l e . 2 6 E u k a r y o t i c c e l l s u n d e r g o c o n t i n u o u s a s s a u l t b y e n v i r o n m e n t a l a g e n t s ( s u c h a s U V l i g h t a n d r e a c t i v e c h e m i c a l s ) a n d n o r m a l m e t a b o l i c b y p r o d u c t s ( s u c h a s r e a c t i v e o x y g e n i n t e r m e d i a t e s ) . I r r e s p e c t i v e o f t h e s o u r c e , g e n e t i c d a m a g e t h r e a t e n s c e l l s u r v i v a l . T h e i n a b i l i t y t o c a r r y o u t r e p a i r s a n d / o r f a i l u r e i n m a i n t a i n i n g t h i s b a l a n c e o f t e n l e a d s t o t h e t r a n s f o r m a t i o n o f n o r m a l c e l l s i n t o m a l i g n a n c i e s a n d o t h e r p a t h o l o g i c a l c o m p l i c a t i o n s . 2 7 C e l l s r e s p o n d t o D N A d a m a g e b y a c t i v a t i o n o f s i g n a l i n g p a t h w a y s t h a t c o n t r o l D N A r e p a i r a n d c e l l c y c l e d e l a y s ? “ T o e n s u r e t h a t c e l l s p a s s a c c u r a t e c o p i e s o f t h e i r g e n o m e s o n t o t h e i r p r o g e n y , c e l l - c y c l e m a c h i n e r y i s m o n i t o r e d b y c e r t a i n p h y l l o g e n e t i c a l l y c o n s e r v e d s u r v e i l l a n c e p a t h w a y s t e r m e d ‘ c e l l - c y c l e c h e c k p o i n t s ’ . O v e r a l l , c h e c k p o i n t s d e t e c t d a m a g e d o r a b n o r m a l l y s t r u c t u r e d D N A , a n d c o o r d i n a t e c e l l - c y c l e p r o g r e s s i o n w i t h D N A r e p a i r . T h u s , t h e c f 3 F n e n o 3 C 1 m o t h y : v i a s u b ( F i c m a i n t e n a n c e o f i n t e g r i t y o f D N A a f t e r c h r o m o s o m a l i n s u l t s d e p e n d s o n t h e c o o r d i n a t i o n b e t w e e n D N A r e p a i r a s s e m b l y a n d c e l l c y c l e c h e c k p o i n t c o n t r o l s . 2 8 N o r m a l l y , c e l l — c y c l e c h e c k p o i n t a c t i v a t i o n r e t a r d s o r a r r e s t s c e l l - c y c l e p r o g r e s s i o n , a l l o w i n g t i m e f o r a p p r o p r i a t e r e p a i r m e c h a n i s m s t o c o r r e c t g e n e t i c l e s i o n s b e f o r e t h e y a r e p a s s e d o n t o t h e n e x t g e n e r a t i o n o f d a u g h t e r c e l l s . D N A d a m a g e c h e c k p o i n t s w e r e i n i t i a l l y d e fi n e d a s n o n — e s s e n t i a l r e g u l a t o r y p a t h w a y s t h a t c o n t r o l t h e c e l l s t o a r r e s t t h e c e l l c y c l e i n r e s p o n s e t o D N A d a m a g e , a l l o w i n g t i m e f o r r e p a i r . H o w e v e r , i n a d d i t i o n t o c o n t r o l l i n g c e l l - c y c l e a r r e s t , r e c e n t s t u d i e s h a v e i l l u s t r a t e d t h e r o l e o f t h e s e p a t h w a y s i n c o n t r o l l i n g t h e 2 9 a c t i v a t i o n o f r e p a i r p a t h w a y s , t h e c o m p o s i t i o n o f t e l o m e r i c c h r o m a t i n a n d t h e 3 0 a c t i v a t i o n o f m o v e m e n t o f D N A r e p a i r p r o t e i n s t o d a m a g e d g e n o m i c s i t e s , t r a n s c r i p t i o n a l m a c h i n e r y , ” t e l o m e r e l e n g t h “ a n d , i n c e r t a i n c e l l t y p e s ( s u c h a s t h y m o c y t e s ) f o r r e a s o n s n o t c o m p l e t e l y u n d e r s t o o d , i n d u c t i o n o f c e l l d e a t h b y a p o p t o s i s v i a i n d u c t i o n o f p 5 3 . 3 2 T h u s , i t i s n o w c l e a r t h a t a m u l t i f a c e t e d r e s p o n s e i s g e n e r a t e d b y a s u b - r o u t i n e o f t h e c h e c k p o i n t o n c e t h e D N A d a m a g e r e s p o n s e p a t h w a y i s t r i g g e r e d ( F i g u r e I - 3 ) . l i b p n ‘ ” P i E l l i I E S I i u S h ; t h e D N A d a m a g e C d k . A o t o s i s C e l l c y c l e a r r e s t D N A R 9 9 3 " p p F i g u r e [ - 3 . D N A d a m a g e r e s p o n s e p a t h w a y . A r r o w h e a d s i n d i c a t e p o s i t i v e r e g u l a t i o n , T i n d i c a t e s n e g a t i v e r e g u l a t i o n . T h e p a t h w a y h a s n o t b e e n c o m p l e t e l y e l u c i d a t e d h e r e . T h e i n i t i a l D N A d a m a g e s e n s o r s a r e c u r r e n t l y u n k n o w n . F o r a l o n g t i m e , p o l y ( A D P - r i b o s e ) p o l y m e r a s e ( P A R P ) a n d D N A - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e ( D N A - P K ) w e r e p r o p o s e d a s D N A d a m a g e s e n s o r s s i n c e t h e y c o u l d b i n d t o D N A d i r e c t l y a n d b e a c t i v a t e d u p o n D N A s t r a n d b r e a k s . 3 2 ¢ H o w e v e r , J i m e n e z a n d c o - w o r k e r s - p r o v i d e d g e n e t i c e v i d e n c e a c c o r d i n g t o w h i c h t h e s e p r o t e i n s a r e n o t a c t i v a t o r s o f t h e g l o b a l D N A d a m a g e r e s p o n s e . 3 3 S t u d i e s s u g g e s t a g r o u p o f f o u r c o n s e r v e d p r o t e i n s ( R a d l , R a d 9 , R a d 1 7 a n d H u s l w h i c h f o r m a D N A r e s p o n s i v e c o m p l e x “ ) a s c a n d i d a t e s f o r s e n s o r s b e c a u s e t h e y s h a r e s o m e o f t h e p r o p e r t i e s e x p e c t e d f o r s e n s o r s , i n c l u d i n g a n e s s e n t i a l g e n e t i c r o l e i n t h e a c t i v a t i o n o f t h e D N A d a m a g e r e s p o n s e p a t h w a y a n d t h e p o t e n t i a l t o i n t e r a c t w i t h n u c l e i c a c i d s . I n t h e D N A d a m a g e r e s p o n s e , R a d 1 7 h o m o l o g u e s , c a n m e d i a t e i n t e r a c t i o n s w i t h t h e R a d l - R a d 9 — H u s l c o m p l e x , 3 5 a n d a r e p o s s i b l y i n v o l v e d i n m a i n t a i n i n g t h e d a m a g e s i g n a l u n t i l r e p a i r i s c o m p l e t e d . S i m p l i s t i c a l l y , i n S . p o m b e , R a d l 7 c o m p l e x e s 1 0 d i s p l a t r e s ; b i n d t o d a m a g e d D N A d i r e c t l y , a n d t h e n l o a d t h e R a d l c o m p l e x e s o n t o D N A , w h i c h l e a d s t o a c t i v a t i o n o f t h e m a i n d a m a g e r e s p o n s e k i n a s e R a d 3 . 3 6 I n r e s p o n s e t o D N A d a m a g e , R a d - 3 d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n o f c h e c k p o i n t a r e d e p e n d e n t o n R a d l a n d R a d 1 7 , h o w e v e r , t h e r e i s e v i d e n c e t h a t t h e s e p r o t e i n s t h a t a r e r e p u t e d a s s e n s o r s m a y n o t a l w a y s b e r e q u i r e d f o r o t h e r p h o s p h o r y l a t i o n e v e n t s s u c h a s R a d 3 - d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n o f R a d 2 6 i n r e s p o n s e t o i o n i z i n g r a d i a t i o n ( I R ) . 3 6 T h i s l a t t e r o b s e r v a t i o n d o e s n o t p r e c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e R a d l a n d R a d 1 7 c o m p l e x e s c a n a c t a s s e n s o r s . T h e p h o s p h o r y l a t i o n o f R a d 2 6 - R a d 3 m i g h t b e a n i n i t i a l r e s p o n s e t o d o u b l e s t r a n d e d b r e a k s w h i c h r e q u i r e s t h e p r e s e n c e o f R a d l a n d R a d l 7 a t a l a t e r t i m e f o r t h e d a m a g e s i g n a l t o a m p l i f y a n d t r a n s l a t e . T h i s s u g g e s t s a p o s s i b i l i t y o f d i f f e r e n t s e n s o r y p a t h w a y s t o f u n c t i o n i n o r d e r t o c o m p l e t e l y a c t i v a t e t h e d a m a g e r e s p o n s e . T h i s s i t u a t i o n i s f u r t h e r c o m p l i c a t e d b y t h e f a c t t h a t a g i v e n D N A d a m a g i n g a g e n t g e n e r a t e s s e v e r a l t y p e s o f D N A d a m a g e , p o s s i b l y a c t i v a t i n g s e v e r a l s e n s o r s . A t p r e s e n t , i t i s i m p o s s i b l e t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n a s e n s o r y r o l e a n d a n e f f e c t o r r o l e f o r a n y o f t h e s e p r o t e i n s , a n d i t i s p l a u s i b l e t h a t t h e a c t i v i t y o f a n e n t i r e c o m p l e x m u s t b e i n t a c t t o p r o p e r l y s e n s e a n d r e s p o n d t o d a m a g e . 1 ) D N A d a m a g e t r a n s d u c t i o n a n d r e g u l a t i o n o f D N A r e p a i r . S e v e r a l c h e c k p o i n t g e n e s p a r t i c i p a t e i n t h e c e l l c y c l e s u r v e i l l a n c e p r o g r a m , a n d a r e a l s o e s s e n t i a l f o r c e l l a n d 7 o r g a n i s m s u r v i v a l , ” 3 s u g g e s t i n g t h a t t h e s e p a t h w a y s a r e n o t o n l y s u r v e y o r s o f o c c a s i o n a l d a m a g e , b u t a r e fi r m l y i n t e g r a t e d c o m p o n e n t s o f c e l l u l a r p h y s i o l o g y . l l [ I I 1 1 1 ' [ h r a t a l l b O L / / ’ \ C h k 1 c y c l l n D 1 , D 2 , D 3 i I \ ~ . L C d k 4 , 6 G 1 M “ : 2 5 c y c l i n E l C d k 2 c y c l i n B / C d k 1 C h k 2 \ c y c l m A / C d k 1 C d c 2 5 p 6 3 ’ B R C A 1 \ G z \ c y c l i n A l C d e / \ \ \ \ \ S / \ \ V / F i g u r e [ - 4 . C e l l c y c l e a n d c o n t r o l o f c h e c k p o i n t s a t G l / S , G 2 / M p h a s e s A r r o w h e a d s i n d i c a t e p o s i t i v e r e g u l a t i o n , T i n d i c a t e s n e g a t i v e r e g u l a t i o n . T h e p a t h w a y h a s n o t b e e n c o m p l e t e l y e l u c i d a t e d h e r e . T h e D N A d a m a g e c h e c k p o i n t s a c t a t m a i n l y t h r e e s t a g e s o f t h e c e l l c y c l e , G l / S t r a n s i t i o n , p r o g r e s s i o n t h r o u g h S , G Z / M b o u n d a r y . 3 8 I A c c o r d i n g t o t h e c u r r e n t u n d e r s t a n d i n g ; t h e G 2 c h e c k p o i n t D N A d a m a g e a c t i v a t e s A T M a n d A T R . 2 7 A s i g n a l i s t h e n t r a n s m i t t e d t o t h e d o w n s t r e a m k i n a s e s C h k l a n d C h k 2 w h i c h p h o s p h o r y l a t e C d c 2 5 a t S e r — 2 1 6 . 3 9 T h i s p h o s p h o r y l a t i o n i n a c t i v a t e s t h e C d c 2 5 a n d f a c i l i t a t e s i t s a s s o c i a t i o n w i t h 1 4 — 3 - 3 p r o t e i n s ” 4 1 b y c r e a t i n g a b i n d i n g S i t e f o r 1 4 - 3 - 3 p r o t e i n s . I n t h e 1 4 - 3 - 3 - b o u n d f o r m , C d c 2 5 C i s e i t h e r c a t a l y t i c a l l y i n h i b i t e d o r s e q u e s t e r e d i n t h e c y t o p l a s m ( o r b o t h ) . I n a n y c a s e , t h e p h o s p h o r y l a t e d , l 4 - 3 - 3 - b o u n d f o r m o f C d c 2 5 C i s p r o h i b i t e d f r o m d e p h o s p h o r y l a t i n g a n d a c t i v a t i n g t h e m i t o t i c c y c l i n B . H e n c e , C d c 2 k i n a s e , a n d t h e d a m a g e d c e l l s a r e e f f e c t i v e l y b l o c k e d f r o m e n t e r i n g m i t o s i s . i i ) R e c o v e r y , a d a p t a t i o n o r a p o p t o s i s : a m a t t e r o f l i f e a n d d e a t h ? O n c e D N A r e p a i r i s c o m p l e t e , a c e l l a r r e s t e d a t a c h e c k p o i n t m u s t t h e n r e s u m e c e l l - c y c l e p r o g r e s s i o n . T h i s p r o c e s s , t e r m e d ‘ r e c o v e r y ’ , i s u n d e r g e n e t i c c o n t r o l . E s a s h i e t a l h a v e 1 2 D I H e t h e l i n t A P ‘ m C I m e t 2 1 P C t h e a p t I I I 1 s u g g e s t e d a r o l e f o r C d c 2 k i n a s e i n t h i s p r o c e s s . 4 2 T h e y p r o v i d e e v i d e n c e f o r p h o s p h o r y l a t i o n o f T 2 1 5 a s a r e q u i r e m e n t f o r r e c o v e r y f r o m c h e c k p o i n t a r r e s t . C d c 2 h a s b e e n s h o w n p r e v i o u s l y t o b e a t a r g e t f o r r e p r e s s i o n d u r i n g c h e c k p o i n t a r r e s t . ” T h e r e f o r e , t h e r o l e s o f C d c 2 i n c h e c k p o i n t r e g u l a t i o n a r e o b v i o u s l y c o m p l e x a n d f u t u r e s t u d i e s w i l l b e r e q u i r e d t o u n r a v e l t h i s c o m p l e x i t y f u l l y . U n i c e l l u l a r c e l l s a r r e s t e d i n G l e b y t h e D N A - d a m a g e c h e c k p o i n t w i l l e v e n t u a l l y p r o l i f e r a t e , e v e n i f t h e d a m a g e i s n o t r e p a i r e d . " 3 T h i s o p t i o n , t e r m e d ‘ a d a p t a t i o n ’ , c o m e s f r o m e v o l u t i o n t o m a k e a n a t t e m p t f o r s u r v i v a l . H o w e v e r , f o r m u l t i - c e l l u l a r o r g a n i s m s t h i s i s n o t t h e b e s t a l t e r n a t i v e a s c e l l s t h a t a d a p t t o t h e p r e s e n c e o f i r r e p a r a b l e D N A d a m a g e w i l l d o s o b y fi x i n g m u t a t i o n s i n t h a t c e l l ’ s l i n e a g e . A p o p t o s i s i s a t h i r d a l t e r n a t i v e o u t c o m e o f a c t i v a t i o n o f c h e c k p o i n t p a t h w a y s i n m e t a z o a n c e l l s . T h e l i n k b e t w e e n a p o p t o s i s a n d c h e c k p o i n t s h a s b e e n w e l l c h a r a c t e r i z e d i n m a m m a l i a n c e l l s . “ ' 4 I n c e r t a i n c e l l t y p e s , D N A d a m a g e d e p e n d e n t a p o p t o s i s i s m e d i a t e d b y t h e t u m o r s u p p r e s s o r p r o t e i n p 5 3 . A T M i s a l s o a c t i v e l y i n v o l v e d i n s o m e a p o p t o t i c r e s p o n s e s . “ A c o m m o n c o n n e c t i o n b e t w e e n v a r i o u s d e a t h s t i m u l i s e e m s t o b e t h e a c c u m u l a t i o n o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s w h i c h a r e n e c e s s a r y a n d s u f fi c i e n t f o r t h e a p o p t o t i c p h e n o t y p e . i i i ) W h e n c h e c k p o i n t s f a i l : S i m i l a r t o o t h e r s i g n a l t r a n s d u c t i o n p r o c e s s e s , c h e c k p o i n t s c o u l d e x h i b i t a d a p t a t i o n , 4 6 o r h a v e a n i n t e r n a l e r r o r r a t e . U s u a l l y , i f t h e D N A d a m a g e c h e c k p o i n t f a i l s , t h e D N A r e p a i r w i l l b e c o m p r o m i s e d . U n d e r t h i s s i t u a t i o n , t h e c e l l s w o u l d e x p e r i e n c e t h e c o n s e q u e n c e s o f a r e p l i c a t i o n o f a d a m a g e d t e m p l a t e . F o r i n s t a n c e , a c o v a l e n t m o d i fi c a t i o n o f a N - b a s e o n t h e D N A t e m p l a t e m i g h t a f f e c t t h e s t a l l i n g o f t h e 1 3 I r e p r o C O I ‘ . C h e a c e t h e t h e t s p l a c S I L f o r k d u r i n g r e p l i c a t i o n , w h i c h w o u l d t h e n r e s u m e d o w n s t r e a m o f t h e d a m a g e l e a d i n g t o t h e f o r m a t i o n o f a l e s i o n 3 8 i v ) C D K a n d c h e c k p o i n t k i n a s e i n h i b i t o r s - T a r g e t i n g c e l l d i v i s i o n c y c l e i n c a n c e r : S i n c e p r o g r e s s i o n t h r o u g h t h e c e l l c y c l e i s r e g u l a t e d b y C D K / c y c l i n c o m p l e x e s w h i c h a r e m o n i t o r e d b y C h k l a n d C h k 2 c h e c k p o i n t s , t h e s e c a n e l i m i n a t e h a z a r d o u s , d a m a g e d c e l l s t h r o u g h i n d u c t i o n o f c e l l d e a t h a n d p r e v e n t t h e o r g a n i s m a g a i n s t c a n c e r . A c o m m o n g o a l i n c a n c e r c h e m o t h e r a p y i s t o k i l l c a n c e r c e l l s w h i l e s p a r i n g t h e n o r m a l t i s s u e . T a k i n g a d v a n t a g e o f p h y s i o l o g i c a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n n o r m a l c e l l s a n d c a n c e r c e l l s c o u l d f a c i l i t a t e l o c a l i z e d d e l i v e r y o f c y t o t o x i c a g e n t s a n d a p p l i c a t i o n o f a g e n t s t h a t e f f e c t f r e q u e n t l y d i v i d i n g c e l l s m o r e t h a n t h e s l o w l y o r n o n - d i v i d i n g c e l l s . T h e c o m m o n o c c u r r e n c e o f c h e c k p o i n t d e f e c t s d i s t i n g u i s h e s c a n c e r c e l l s f r o m n o r m a l c e l l s , t h e r e b y p r o v i d i n g a p o t e n t i a l t a r g e t f o r t h e r a p e u t i c i n t e r v e n t i o n . U n l i k e n o r m a l c e l l s , w h i c h a r e c o m p l e t e l y a r m o r e d w i t h c h e c k p o i n t r e s p o n s e s , t u m o r c e l l s a r e d e f e c t i v e i n s o m e c h e c k p o i n t p a t h w a y s a n d t h i s i n e f f e c t i v e n e s s e v e n t u a l l y i s d r i v e n t o c e l l d e a t h d u e t o a c c u m u l a t i o n o f D N A d a m a g e . O n e s t r a t e g y f o r a n t i - c a n c e r t h e r a p y h a s b e e n t o i n h i b i t t h e G 2 c h e c k p o i n t s i g n a l i n g i n p 5 3 - d e fi c i e n t c a n c e r s t h a t l a c k G 1 c h e c k p o i n t t o e n h a n c e t h e i m p a c t o f c o n c o m i t a n t t r e a t m e n t w i t h D N A - d a m a g i n g d r u g s o r r a d i a t i o n . “ S e v e r a l r e p o r t s h a v e i d e n t i fi e d n o v e l c o m p o u n d s c a p a b l e o f i n h i b i t i n g G 2 / M a r r e s t i n c e l l s l a c k i n g p 5 3 ‘ 8 ( e . g . S t a u r o s p o r i n e a n d i t s 7 - h y d r o x y d e r i v a t i v e U C N - O l , c a f f e i n e ) . T h e s e s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d a l o w e r d o s e o f r a d i a t i o n o r c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t t o e f f e c t i v e l y k i l l t h e c a n c e r c e l l s . N o r m a l c e l l s w i t h f u n c t i o n a l p 5 3 w o u l d n o t b e a f f e c t e d s i n c e t h e y r e t a i n t h e i r a b i l i t y t o u n d e r g o G l a r r e s t . 1 4 v ) C y c l i n d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r s M e i j e r a n d c o w o r k e r s r e p o r t e d t h e u t i l i t y o f a d e n i n e - b a s e d h e t e r o c y c l e s a s C D K i n h i b i t o r s , w h i c h b i n d i n t h e A T P - b i n d i n g p o c k e t w i t h H - b o n d s . 4 9 M a r k w a l d e r e t a l s y n t h e s i z e d a s e r i e s o f p y r a z o l o p y r i m i d i n o n e s 5 0 t h a t h a v e s h o w n a c t i v i t y a g a i n s t C D K l , C D K 2 , C D K 4 . T h i s i n h i b i t i o n p r o fi l e w a s f o u n d t o b e f a i r l y n o n - s e l e c t i v e o v e r a p a n e l o f c e l l l i n e s i n d e p e n d e n t o f t h e i r p 5 3 o r R b s t a t u s . H M S - 3 8 7 0 3 2 ( 1 , T a b l e I - l ) s h o w e d s o m e s e l e c t i v i t y f o r C D K 2 v s . C D K 1 a n d C D K 4 . 5 1 A n i m a l m o d e l s i n d i c a t e d r a p i d a n d s i g n i fi c a n t t u m o r r e g r e s s i o n i n > 5 0 % t e s t c a s e s w h e n d o s e d u p t o t h e m a x i m a l t o l e r a t e d d o s e . “ T h e p y r a l a z o p y r i d i n e s S Q - 6 7 5 6 3 a n d E M S - 2 6 5 2 4 6 5 2 h a v e b e e n r e p o r t e d t o b e s e l e c t i v e i n h i b i t o r s o f C D K 1 a n d C D K 2 ( 2 , T a b l e I - l ) . B o t h o f t h e s e c l a s s e s o f c o m p o u n d s s h o w e d s i m i l a r p o t e n c y t o w a r d s C D K 1 a n d C D K 2 . S Q - 6 7 5 6 3 i n d u c e d a G Z / M a r r e s t i n d i c a t i n g a C D K l i n h i b i t i o n , w h i c h c o r r e l a t e d w i t h i n h i b i t i o n o f p h o s p h o r y l a t i o n o f R b p r o t e i n , H 1 e t c . i n A 2 7 8 0 c e l l s . T h e o x i n d o l e c o m p o u n d s ( 3 a n d 4 , T a b l e I - l ) , t h e s e c o m p o u n d s s h o w e d v e r y s p e c i fi c a c t i v i t y t o w a r d s C D K 2 . A d d i t i o n a l c e l l u l a r p r o fi l i n g w a s s u g g e s t i v e o f b o t h G 1 a n d G 2 a r r e s t s i n a t i m e a n d c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t m a n n e r . ” 5 " A l o i s i n e s ( 5 , T a b l e 1 - 1 ) a r e s y n t h e t i c p y r r o l o p y r a z i n e s t h a t i n h i b i t e d C D K S a l o n g w i t h G S K 3 . T h e a n t i - p r o l i f e r a t i v e e f f e c t o f a l o i s i n e s w a s r e v e r s i b l e i n d i c a t i n g t h a t t h e y s h o w e d m o r e o f a c y t o s t a t i c e f f e c t t h a n a c y t o t o x i c p r o fi l e . W h a t w a s i n t r i g u i n g w a s t h e f a c t t h a t t h e b i o c h e m i c a l e f f e c t o n k i n a s e i n h i b i t i o n w a s 1 0 0 - 4 0 0 n M r a n g e w h i l e c y t o t o x i c e f f e c t s w e r e s e e n a t ~ 1 0 n M . ” B M I - 1 0 2 6 ( 6 , T a b l e I - 6 ) , a b i s - a m i n o p y r i m i d i n e e x h i b i t s e q u a l a c t i v i t y a g a i n s t C D K S 1 , 2 , a n d 5 b u t i s h i g h l y s e l e c t i v e o v e r o t h e r m i t o t i c r e g u l a t o r s . 1 5 C o m p o u n d S t r u c t u r e I d e n t i f i e d i n v i t r o t a r g e t 9 9 1 9 1 9 0 0 9 ( l e 1 , i n n M ) O 1 J i g — N ” C D K 2 / c y c l i n E ( 4 8 ) 5 1 E M S - 3 8 7 0 3 2 S C D K 1 / c y c l i n B ( 4 8 0 ) K ? ” C D K 4 / c y c l i n D ( 9 2 5 ) 0 ‘ ; 2 x 0 C M - _ _ C D K 1 / c y c l l n B ( 1 5 0 ) 5 2 a X ' Y - H ' $ 0 6 7 5 6 3 \ \ C D K 2 / c y c l i n E ( 1 1 0 ) X F Y M I I N . N = ' = 9 Y X N C D K 1 / c y c l i n B ( 6 ) 5 2 b B M 3 2 6 5 2 4 6 H C D K 2 / c y c l i n E ( 9 ) C D K 4 / c y c l i n D ( 2 3 0 ) M O O / C D K 2 / c y c l i n A ( 3 1 ) 3 M ” C D K 2 / c y c l i n E ( 8 2 ) 5 3 S U 9 5 1 6 N o C D K 1 / c y c l i n B ( 2 3 0 ) H 4 C D K 2 / c y c l i n E ( 6 ) 5 4 N C D K 2 / c y c l i n A ( 1 2 0 ) \ C D K 2 / c y c l i n E ( 4 0 0 ) 5 E , \ O H C D K 2 / c y c l i n B ( 1 5 0 ) 5 5 N N C D K S / p 2 5 ( 2 0 0 ) H C D L 5 / p 3 5 ( 1 6 0 ) G S K 3 € 1 ( 5 0 0 ) 5 6 O H 5 C D K 1 / c y c l i n B ( 8 ) B M l - 1 0 2 6 H z N Y I ‘ L N Y N H z C D K 2 / c y c l i n A ( 2 ) N ' / l , N C D K 5 / p 2 5 ( 1 ) T a b l e [ - 1 . S t r u c t u r e s a n d t h e i r i n v i t r o a c t i v i t y a g a i n s t C D K S . P h a r m a c o l o g i c a l l y , i t d i s t i n g u i s h e s b e t w e e n C D K 1 a n d 2 i n a w a y t h a t s y n c h r o n o u s c e l l s r e l e a s e d f r o m G 1 u p o n t r e a t m e n t l e d t o G Z / M a r r e s t a t l o w c o n c e n t r a t i o n a n d u p o n 1 6 i n c r e a s e o f c o n c e n t r a t i o n , a n i n c r e a s e i n s u b - G 1 p o p u l a t i o n w a s s e e n . T h i s s u g g e s t s t h a t C D K I i n h i b i t i o n o c c u r s m o r e p o t e n t l y t h a n C D K 2 f o r t h i s s m a l l m o l e c u l e a n d f u r t h e r , C D K l i n h i b i t i o n c a n l e a d t o m i t o t i c a r r e s t a n d l e a d t o a n i n c r e a s e i n t h e a p o p t o t i c p o p u l a t i o n . 5 6 G i v e n t h e w i d e r a n g e o f m u t a t i o n s t h a t o c c u r i n t u m o r s a t a n i n d i v i d u a l l e v e l , i n v e s t i g a t i o n o f a l t e r n a t i v e s t r a t e g i e s t o m o d u l a t e c h e c k p o i n t r e s p o n s e s i n c a n c e r t h e r a p y i s c l e a r l y w a r r a n t e d . E v e n t u a l l y , t h e r e i s a p o s s i b i l i t y f o r t h e r e q u i r e m e n t o f t a i l o r - m a d e o u t c o m e s b a s e d o n t h e t u m o r — p r o fi l e a n d d e f e c t s i n t h e p e r t i n e n t p a t h w a y s . A c t i v a t e d c h e c k p o i n t t h e r a p y ( A C T ) i s a t h e o r e t i c a l l y d i f f e r e n t a p p r o a c h t o s e l e c t i v e l y e n h a n c e c e l l d e a t h i n c a n c e r c e l l s . F o r e x a m p l e , B - l a p a c h o n e s t a b i l i z e s a p r o - a p o p t o t i c f a c t o r E 2 F 1 t h a t i s u s u a l l y e x p r e s s e d i n h i g h e r l e v e l s i n c a n c e r c e l l s . 5 7 B e t w e e n C h k l a n d C h k 2 , t h e r e i s s o m e o v e r l a p p i n g s p e c i fi c i t y f o r t h e s u b s t r a t e . 5 8 a H o w e v e r , t h e r e a r e d i f f e r e n t i a l r o l e s p e r t a i n i n g o n c o g e n e s i s a n d e m b r y o g e n e s i s . W h i l e t h e r e i s s u c c e s s i n t a r g e t i n g C h k l u s i n g U C N - O l u p t o c l i n i c a l t r i a l s , t h e C h k 2 k i n a s e h a s b e e n f o u n d t o b e n o n e s s e n t i a l i n e m b r y o d e v e l o p m e n t a n d m a i n t a i n s t h e g e n o m i c i n t e g r i t y o n l y c o n d i t i o n a l l y — u n d e r c i r c u m s t a n c e s t h a t c a u s e d o u b l e s t r a n d b r e a k s . I n t h e C h k 2 — d e fi c i e n t m i c e m o d e l , t h e t u m o r s u p p r e s s o r r o l e o f C h k 2 i s e v i d e n t m a i n l y w h e n e x t e r n a l c a r c i n o g e n s w e r e u t i l i z e d t o i n c r e a s e t h e g e n o t o x i c b u r d e n o n t h e c e l l s . 5 8 b S i n c e , m u l t i p l e c e l l t y p e s l a c k i n g C h k 2 o f t e n s h o w r e s i s t a n c e t o r a d i a t i o n i n d u c e d a p o p t o s i s , u s a g e o f s m a l l m o l e c u l e i n h i b i t o r s t a r g e t i n g C h k 2 m i g h t p r o t e c t s e n s i t i v e t i s s u e s a s l y m p h o c y t e s f r o m t h e s i d e e f f e c t s o f t h e t h e r a p y . T h e m o s t i m p o r t a n t i s s u e w o u l d b e t o i d e n t i f y i n h i b i t o r s s p e c i fi c t o C h k 2 a n d t e s t i f t h i s t y p e o f c o m b i n a t i o n a l s t r a t e g y w o u l d 1 7 b e a b l e t o r e d u c e t h e i n c i d e n c e o f t u m o r s . W e h a v e s h o w n t h e s y n t h e s i s a n d e f fi c a c y o f a n i n d o l e a z e p i n e ( 2 , T a b l e I - 2 ) w h i c h s h o w s s u c h s p e c i fi c i t y f o r C h k 2 k i n a s e . 5 9 D e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e ( D B H , 1 T a b l e I - 2 ) o n t h e o t h e r h a n d d i d n o t s h o w s p e c i fi c i t y f o r e i t h e r C h k l o r C h k 2 . C o m p o u n d S t r u c t u r e I d e n t i f i e d i n v i t r o t a r g e t ( l e 0 i n n M ) R e f e r e n c e C h k l ( 3 0 0 0 ) 4 8 b D B H C h k 2 ( 3 5 0 0 ) H r “ 2 \ C D K 1 ( ( 8 ) O O ) 5 9 \ S g t fi é ‘ o ’ Z l g N “ M E K K I ( 8 9 ) T a b l e [ - 2 . S t r u c t u r e a n d k i n a s e a c t i v i t i e s o f d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e a n d i n d o l e a z i p i n e . B a r t e k a n d c o w o r k e r s 6 0 h a v e s h o w n t h e c o o r d i n a t i o n i n v o l v e m e n t o f C h k l a n d C h k 2 i n r e g u l a t i o n o f t h e p r o t o - o n c o g e n i c h u m a n C d c 2 5 A p h o s p h a t a s e i n r e s p o n s e t o i o n i z i n g r a d i a t i o n . I n a b s e n c e o f g e n o t o x i c b u r d e n t o t h e c e l l s , C h k l t a r g e t s t h e s a m e f o u r r e s i d u e s o f C d c 2 5 A a s i n p r e s e n c e o f g e n o t o x i c b u r d e n . T h i s f u n c t i o n i s v i t a l f o r t h e r e g u l a t i o n o f p h y s i o l o g i c a l t u r n o v e r o f C d c 2 5 A , a n d t h e r e b y n o r m a l c e l l c y c l e t r a n s i t i o n s . T h i s p h o s p h o r y l a t i o n e v e n t i s a l s o r e q u i r e d f o r t h e D N A d a m a g e - i n d u c e d d e g r a d a t i o n o f C d c 2 5 A 6 0 v i a t h e u b i q u i t i n / p r o t e o s o m e a s s e m b l y , w h i c h s i l e n c e s C d c 2 5 A . A s a r e s u l t o f i n h i b i t i o n o f t h e C D K S , t h i s e v e n t t r a n s l a t e s i n a p r o m p t l y d e p l o y e d c e l l c y c l e d e l a y s i n G I , 6 ' i n S , 6 2 a s w e l l a s i n G 2 " 3 p h a s e s o f t h e c e l l c y c l e . C o n c e p t u a l l y , t h e r e q u i r e m e n t o f 1 8 t n I n ; C a l S U C h k l f o r t h e m a i n t e n a n c e t h e S p h a s e e v e n t s e x p l a i n s w h y C h k l i s a n e s s e n t i a l g e n e a n d c a n n o t b e s u b s t i t u t e d e v e n b y a f u n c t i o n a l l y o v e r l a p p i n g k i n a s e s u c h a s C h k 2 . T y p i c a l l y , t h e r e i s s c a r c i t y o f c a n c e r - r e l a t e d m u t a t i o n s o f C h k l , d u e t o t h e l e t h a l c o n s e q u e n c e s o f C h k l d e fi c i e n c y i n a n i m a l m o d e l s . T h e c u r r e n t k n o w l e d g e a b o u t C h k l a n d C h k 2 i s s t i l l i n s u f fi c i e n t t o b e a p p l i e d f o r t h e b e n e fi t o f c a n c e r c h e m o t h e r a p y o r r a d i a t i o n t h e r a p y . R e s e a r c h e r s a l l o v e r t h e w o r l d a r e s e a r c h i n g f o r a d d i t i o n a l s u b s t r a t e s o f t h e s e k i n a s e s , a n d i n t e g r a t e t h e s e w i t h t h e c h e c k p o i n t s i g n a l i n g . A c o m p l e t e a s s e s s m e n t o f t h e s c o p e a n d i m p o r t a n c e o f c a n c e r - r e l a t e d a b n o r m a l i t i e s ( i n p a r t i c u l a r C h k 2 ) w o u l d h e l p i n i m p r o v i n g t h e c u r r e n t t r e a t m e n t s f o r c a n c e r . F i n a l l y , s y n t h e s i s a n d i s o l a t i o n o f n e w s m a l l m o l e c u l e i n h i b i t o r s o f C h k l a n d C h k 2 a n d d e s i g n a n d r a t i o n a l i z i n g n o v e l s t r a t e g i e s o f c h e c k p o i n t m o d u l a t i o n , c o m b i n e d w i t h t h e t r a d i t i o n a l r a d i a t i o n a n d c h e m o t h e r a p y m o d e l s , h o l d p r o m i s e f o r i m p r o v e d t r e a t m e n t o f c a n c e r . D . p 5 3 a n d N F - K B c r o s s t a l k I n a c t i v a t i o n o f t h e a p o p t o t i c p a t h w a y i s a s i g n i fi c a n t c o n t r i b u t o r i n t h e d e v e l o p m e n t o f c a n c e r . T w o i m p o r t a n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s t h a t r e g u l a t e t h i s e v e n t a r e p 5 3 ( t h e ‘ g u a r d i a n ’ o f t h e c e l l ) a n d N F - K B ( t h e ‘ m a s t e r m i n d ’ f o r c e l l s u r v i v a l ) . A s a g e n e r a l c o n s e n s u s , i t i s b e l i e v e d t h a t N F - K B i s a c e l l - d e a t h s u p p r e s s o r . T h e m a m m a l i a n n u c l e a r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r K B ( N F - K B ) i s a p i v o t a l r e g u l a t o r o f t h e i n d u c i b l e a c t i v a t i o n o f a n t i - a p o p t o t i c s i g n a l i n g p a t h w a y s . “ N F - c h , i s a m u l t i s u b u n i t c o m p l e x i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f g e n e t r a n s c r i p t i o n , i n c l u d i n g t h e r e g u l a t i o n o f a p o p t o s i s . “ 6 5 F i v e d i s t i n c t s u b u n i t s o f N F - c h a r e f o u n d i n m a m m a l i a n c e l l s , w h i c h i n c l u d e N F - c h l ( p 1 0 5 / p 5 0 ) , l 9 N F - K B Z ( p l O O / p 5 2 ) , R e l A ( p 6 5 ) , R e l B a n d c - R e l . 6 5 T h e s e s u b u n i t s c a n c o m p o s e a v a r i e t y o f h o m o - o r h e t e r o d i m e r s , w h i c h a r e u s e d t o c o n t r o l t h e s p e c i fi c i t y a n d s e l e c t i v i t y o f S p e c i fi c D N A c o n t r o l e l e m e n t s . ° ° ‘ 6 7 I n m o s t u n s t i m u l a t e d m a m m a l i a n c e l l s N F - K B e x i s t s m a i n l y a s a h o m o d i m e r ( p 5 0 / p 5 0 ) o r h e t e r o d i m e r ( p 5 0 / p 6 5 ) i n t h e c y t o p l a s m i n t h e f o r m o f a n i n a c t i v e c o m p l e x w i t h t h e i n h i b i t o r y p r o t e i n I - K B ( F i g u r e 1 - 5 ) . M a n y c e l l u l a r s t i m u l i i n c l u d i n g : a n t i n e o p l a s t i c a g e n t s , 6 8 v i r u s e s ( e . g . H I V ) , c y t o k i n e s , p h o r b o l e s t e r s a n d o x i d a t i v e s t r e s s , r e s u l t i n t h e I K K m e d i a t e d p h o s p h o r y l a t i o n o f I - K B o n s e r i n e s 3 2 a n d 3 6 , f o l l o w e d b y u b i q u i t i n y l a t i o n a n d s u b s e q u e n t d e g r a d a t i o n b y t h e 2 6 S p r o t e o s o m e . 6 4 2 0 D t i n l g 6 e t 5 1 1 . . ; ‘ . 7 l i ’ fi l l fi i f l l - ' ‘ [ a l i g n - : 7 F i g u r e 1 - 5 . N F - c h s i g n a l i n g c a s c a d e D e g r a d a t i o n o f I c h e n s u r e s t h e r e l e a s e o f N F - K B . 6 9 U p o n r e l e a s e , N F - K B t r a n s l o c a t e s i n t o t h e n u c l e u s w h e r e t h e s u b u n i t s b i n d w i t h s p e c i fi c D N A c o n t r o l e l e m e n t s a n d i n i t i a t e g e n e t r a n s c r i p t i o n ( F i g u r e [ - 5 ) P r i o r t o D N A b i n d i n g , a d d i t i o n a l p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n e v e n t s a r e r e q u i r e d f o r o p t i m a l a n d s p e c i fi c g e n e t r a n s c r i p t i o n . 7 0 A n t i a p o p t o t i c g e n e s s u c h a s , T R A F I , T R A F Z , c - I A P I , c - I A P Z , I X A P , a n d [ E X — 1 L , a r e d i r e c t l y r e g u l a t e d b y 2 1 N F - c h , a n d a b r o g a t e t h e a p o p t o t i c s i g n a l s i n r e s p o n s e t o t h e c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s ' o ' 7 1 T h e f u n c t i o n a l c o n s e q u e n c e s o f p 5 3 a n d N F - c h i n d u c t i o n a r e g e n e r a l l y d i v e r g e n t . A c t i v a t i o n o f p 5 3 l e a d s t o c e l l d e a t h o r c e l l c y c l e a r r e s t , 2 6 w h i l e N F - c h p r o m o t e s c e l l g r o w t h o r r e s i s t a n c e t o c e l l d e a t h . “ 6 5 R e l - A m e d i a t e d t r a n s a c t i v a t i o n c a n b e r e g u l a t e d b y I W A F ' K H P ' . 7 2 p 2 1 , o n t h e o t h e r h a n d i s o n e o f t h e m o s t p r o m i n e n t t a r g e t g e n e s o f p 5 3 p 2 a n d i t s a c t i v a t i o n a s s o c i a t e d s t r o n g l y w i t h c e l l a r r e s t u p o n D N A d a m a g e . 7 3 W e b s t e r e t a l s u g g e s t e d a n d f u r t h e r p r o v e d a p r e v i o u s l y u n r e a l i z e d c r o s s t a l k b e t w e e n p 5 3 a n d N F - K B . ” U p o n e x t e r n a l e x p o s u r e t o T N F o r r a d i a t i o n , b o t h p 5 3 a n d N F - K B a r e a c t i v a t e d b u t t h e n e t e f f e c t i n fl u e n c i n g t h e c e l l f a t e w a s s h o w n t o b e t h e a b i l i t y o f N F - c h t o s u p p r e s s p 5 3 t r a n s a c t i v a t i o n . T h u s , N F - c h i s b e i n g v i e w e d a s h a v i n g a d i r e c t c o n t r o l o v e r t h e a n t i - a p o p t o t i c g e n e s s u c h a s T R A F I , T R A F Z , I A P 2 e t c . ' ° ‘ 7 ' a n d a l s o s u p p r e s s t h e f u n c t i o n o f p r o - a p o p t o t i c t r a n s c r i p t i o n a l f a c t o r s l i k e p 5 3 ( a d i r e c t a c t i v a t o r o f B a x ) , i n a n i n d i r e c t m a n n e r . 7 4 T h e r e i s a m p l e e v i d e n c e t h a t p 5 3 c a n r e g u l a t e c e l l d e a t h i n a n o n - t r a n s c r i p t i o n a l m a n n e r . S u c h a m e c h a n i s m w o u l d b e p r o b a b l y n o t b e d i r e c t l y r e l a t e d t o N F - K B a n d t h i s m i g h t o v e r r i d e t h e r e s i s t a n c e m e c h a n i s m s d u e t o N F - K B a c t i v a t i o n . H e n c e , t h e o u t c o m e o f t h e c r o s s t a l k b e t w e e n N F - c h a n d p 5 3 w o u l d d e p e n d o n t h e n a t u r e o f s t i m u l i a n d a l s o t h e c e l l t y p e . M u t a n t p 5 3 d o e s n o t i n h i b i t N F - K B r e g u l a t i o n , i n f a c t , a l o t o f r e s e a r c h o n N F - c h r e g u l a t i o n h a s b e e n p e r f o r m e d o n c e l l s w i t h m u t a n t p 5 3 o r i n a c t i v a t e d p 5 3 . 6 7 A c t i v a t i o n o f N F - c h i s u s u a l l y t r a n s i e n t i n m o s t c e l l t y p e s ? ” T h i s o b s e r v a t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h a m o d u l a t o r y e f f e c t o f N F - K B o n p 5 3 a n d d u e t o a fl u c t u a t i o n i n t h e l e v e l s o f p 5 3 a n d N F - c h , t h e v a r i o u s g e n e s t h a t a r e i n d u c e d b y t h e s e t w o t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s m i g h t b e e x p e c t e d t o a l t e r . I n s o m e d i s e a s e s , h o w e v e r , s u c h a s 2 2 C C d e a d H o d g k i n s o n ’ s d i s e a s e a n d b r e a s t c a n c e r , t h e a c t i v a t i o n o f N F - K B i s c o n s t i t u t i v e , a n d i t s i n h i b i t i o n c a n r e v e r s e t h e p h e n o t y p e e v e n i n c l i n i c a l s a m p l e s . ” b I t i s l o g i c a l t o s p e c u l a t e , t h a t i n h i b i t i o n o f p 5 3 f u n c t i o n m i g h t c o n t r i b u t e t o N F - K B ’ S r o l e i n t u m o r i g e n e s i s a n d o t h e r d i s e a s e s . F u r t h e r , i t i s p o s s i b l e t h a t n o v e l c a n c e r t h e r a p i e s i n v o l v i n g r e - a c t i v a t i o n o f w t p 5 3 f u n c t i o n m i g h t b e n e fi t f r o m c o o r d i n a t e s u p p r e s s i o n o f N F - K B t o p r o m o t e a f a v o r a b l e o u t c o m e . H i e t a n e n e t a l s h o w e d a c t i v a t i o n o f p 5 3 i n c e r v i c a l c a r c i n o m a c e l l s u s i n g s m a l l m o l e c u l e l e p t o m y c i n C a n d a c t i n o m y c i n G 7 6 M a u r i c i a n d c o w o r k e r s u s e d a m i f o s t i n e t o r e s t o r e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f p 5 3 o f m u t a n t p r o t e i n s i n y e a s t s y s t e m s . " I ' I \ \ , O H H 2 N \ / \ / N \ / \ S I P \ O H A m i f o s t i n e L e p t o m W i n 8 F i g u r e [ - 6 . S t r u c t u r e s o f A m i n o f o s t i n e a n d L e p t o m y c i n B , r e a c t i v a t o r s o f p 5 3 B c r — A b l , a c h i m e r i c o n c o p r o t e i n i m p o r t a n t i n c e l l u l a r t r a n s f o r m a t i o n a s w e l l a s p r o t e c t i o n o f c e l l s f r o m c e l l d e a t h i n r e s p o n s e t o c y t o k i n e s a n d D N A d a m a g i n g a g e n t s , a c t i v a t e s N F - K B v i a m u l t i p l e p a t h w a y s . B c r - A b l f a c i l i t a t e s t h e t r a n s l o c a t i o n o f N F - K B a c r o s s t h e n u c l e a r m e m b r a n e i n a R a s d e p e n d e n t m a n n e r . 7 8 R e s e a r c h e r s a t N o v a r t i s d e v e l o p e d a s m a l l m o l e c u l e i m a t i n i b ( G l e e v e c ® ) w h i c h s p e c i fi c a l l y i n h i b i t s t h e a c t i v i t y o f B c r - A b l i n c e l l s p r o d u c i n g t h i s p r o t e i n . N o w a p p r o v e d b y F D A , t h i s m o l e c u l e s h o w e d d o s e - d e p e n d e n t i n h i b i t i o n a n d e v e n e r a d i c a t i o n o f B c r - A b l c o n t a i n i n g t u m o r s w h e n a d m i n i s t e r e d o r a l l y i n a n i m a l m o d e l s . 7 9 a 2 3 p a 0 1 ' o f i " \ F i g u r e [ - 7 . I m a t i n i b , a s p e c i fi c i n h i b i t o r o f B c r - A b l A l t h o u g h i m a t i n i b m e s y l a t e p r o d u c e s h i g h r a t e s o f r e s p o n s e s i n a c l i n i c a l s e t t i n g t h e r e i s s o m e u n i v e r s a l r e s i s t a n c e a n d c l i n i c a l r e l a p s e t h a t s e e n i n a d v a n c e d p h a s e s o f c h r o n i c m y e l o g e n o u s l e u k e m i a ( C M L ) . 7 9 b U s u a l l y , t h i s r e s i s t a n c e i s c a u s e d b y s p e c i fi c A T P b i n d i n g S i t e m u t a t i o n s o r a m p l i fi c a t i o n o f B c r — A b l g e n e , r e s u l t i n g i n a B c r — A b l t y r o s i n e k i n a s e t h a t i s r e s i s t a n t t o f u r t h e r i n h i b i t i o n b y i m a t i n i b . 8 0 A l t e r n a t i v e m e c h a n i s m s t h a t a r e B c r - A b l - i n d e p e n d e n t b u t d r i v e t h e g r o w t h a n d s u r v i v a l m a y a l s o b e r e s p o n s i b l e f o r i m a t i n i b r e s i s t a n c e . N o v e l t y r o s i n e k i n a s e i n h i b i t o r s t h a t t a r g e t B c r - A b l t y r o s i n e k i n a s e , o r s m a l l m o l e c u l e s t h a t d o w n r e g u l a t e B c r — A b l l e v e l s r e g a r d l e s s o f i t s w t o r m u t a n t s t a t u s a r e r e q u i r e d f o r f u t u r e t h e r a p y o f i m a t i n i b - r e s i s t a n t c h r o n i c m y e l o g e n o u s l e u k e m i a . E . R e s i s t a n c e p a t h w a y s : a c t i v a t i o n o f N F - K B a n d i t s r o l e i n c e l l s u r v i v a l A s m e n t i o n e d i n S e c t i o n C , N F - K B p l a y s a c e n t r a l r o l e i n r e g u l a t i n g t h e c e l l s u r v i v a l p a t h w a y s a n d i n h i b i t i o n o f a p o p t o t i s . I t c a n b e a c t i v a t e d u n d e r t h e i n fl u e n c e o f c y t o k i n e s o r D N A d a m a g i n g a g e n t s . T h e N F - K B s i g n a l i n g c a s c a d e i s u n i q u e i n t e r m s o f t h e r a p i d i t y o f t h e a c t i v a t i o n , i t s m e c h a n i s m a n d a n d r e g u l a t i o n . T h e p r o t e o l y t i c d e g r a d a t i o n o f t h e p h o s p h o r y l a t e d I - K B a i s a n i r r e v e r s i b l e s t e p r e q u i r e d f o r t h e N F - K B t r a n s l o c a t i o n a n d i n e s s e n c e i s a c o m m i t m e n t t o t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n . O n l y t h e R e l p r o t e i n s o f a l l t h e v a r i o u s k i n d s o f s u b u n i t s a r e t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e . W h i l e p 5 0 / p 6 5 c a u s e s t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n , a h o m o d i m e r , p 5 0 / p 5 0 i s t r a n s c r i p t i o n a l l y r e p r e s s i v e . “ B u t t e r fl y — l i k e c r y s t a l s t r u c t u r e o f N F - K B o f v a r i o u s f o r m s b i n d t o D N A t h r o u g h t h e N - 2 4 t e r C X I i n f S U I n n c i n d : i l fi t [ h u t u n d e c y t o l a c n v C X p r c a P O p l P a fi n l e n h a n C a n o e a l s o a b i d ) e “ h a l l t e r m i n a l r e g i o n . 8 2 U p o n , D N A b i n d i n g , N F - K B r e g u l a t e s t h e t r a n s c r i p t i o n o f a n e x c e p t i o n a l l y l a r g e n u m b e r o f g e n e s e s p e c i a l l y t h o s e i n v o l v e d i n i m m u n e a n d i n fl a m m a t o r y r e s p o n s e s . 8 3 I n m o s t c e l l s , N F - K B c i r c u m v e n t s a p o p t o s i s v i a i n d u c t i o n o f s u r v i v a l g e n e s . H o w e v e r , u n d e r s o m e s p e c i a l c o n d i t i o n s i t c a n i n d u c e a p o p t o s i s . “ A s i g n i fi c a n t i n d i c a t i o n t h a t N F - K B c o n t r i b u t e s i n c e l l s u r v i v a l c o m e s f r o m t h e f a c t t h a t m i c e w i t h R e l - l - d o n o t s u r v i v e a n d d i e b e f o r e b i r t h w i t h e x t e n s i v e d e g e n e r a t i o n o f l i v e r i n d i c a t i n g t h a t t h e r o l e o f N F - K B i n e a r l y l i v e r d e v e l o p m e n t . 8 5 i ) N F - K B : a m a j o r c u l p r i t o r a n i n n o c e n t b y s t a n d e r ? B a l d w i n e t a l 8 6 h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t c e l l s w i t h i n a c t i v a t e d N F - x B a r e m o r e p r o n e t o u n d e r g o a p o p t o s i s i n r e s p o n s e t o p r o - a p o p t o t i c s t i m u l i o t h e r t h a n t h e i n fl a m m a t o r y c y t o k i n e T N F - a . D N A - d a m a g i n g a g e n t s , s u c h a s i o n i z i n g r a d i a t i o n a n d d a u n o r u b i c i n , a c t i v a t e N F - K B , a n d . a r e m o r e t o x i c t o c e l l s w h e n N F - K B a c t i v a t i o n i s b l o c k e d b y e x p r e s s i o n o f a d o m i n a n t - n e g a t i v e I K B - a m u t a n t . W e h a v e s h o w n e n h a n c e m e n t o f t h e a p o p t o t i c s i g n a l o f c a m p t o t h e c i n u s i n g t r a n s - i m i d a z o l i n e s v i a m o d u l a t i o n o f N F - K B p a t h w a y . “ A t h e r a p e u t i c s e n s e o f t h e s e o b s e r v a t i o n s i s t h a t i t m a y b e p o s s i b l e t o e n h a n c e t h e e f fi c a c y o f a n t i - c a n c e r d r u g s b y i n h i b i t i n g N F - K B a c t i v a t i o n . S e v e r a l a n t i - c a n c e r c o m p o u n d s a r e c y t o t o x i c a n d k i l l t u m o r c e l l s b y i n d u c i n g a p o p t o s i s . M o s t o f t h e s e a l s o a c t i v a t e N F - K B i n a v a r i e t y o f c e l l l i n e s . 8 7 B y c o m b i n i n g c a n c e r c h e m o t h e r a p e u t i c s w i t h a c o m p o u n d t h a t s u p p r e s s e s N F - K B a c t i v a t i o n , t h e i r a n t i - t u m o r a c t i v i t y m a y b e e n h a n c e d . ( F i g u r e I - 8 ) 2 5 F i g T h e e x o § S l u h p r o t e . D N A d a m a - l n g a g e n t s N F - c h A p o p t o s i s A n t i - a p o p t o t i c . e n e p r o d u c t s " - 6 F i g u r e [ - 8 . U p o n D N A d a m a g e a p o p t o s i s a n d a c t i v a t i o n o f N F - K B a r e t r i g g e r e d . T h e a n t i - a p o p t o t i c g e n e s a c t i v a t e d b y N F - K B i n r e s p o n s e t o e n d o g e n o u s T N F - o . o r e x o g e n o u s g e n o t o x i c s t r e s s r e m a i n t o b e i d e n t i fi e d . M u l t i - c e l l u l a r o r g a n i s m s s e e m t o h a v e e v o l v e d a l i n k b e t w e e n N F — K B a c t i v a t i o n w i t h p r o t e c t i o n f r o m a p o p t o s i s m a i n l y t o a v o i d u n n e c e s s a r y c e l l s u i c i d e i n r e s p o n s e t o c e r t a i n p r o - a p o p t o t i c s i g n a l s , s u c h a s T N F - o r . H e n c e , a c e l l w o u l d c o m m i t t o d e a t h o n l y i f t h e d a m a g e o r g e n o t o x i c b u r d e n i s s o h i g h t h a t i t h i n d e r s t h e r e p l i c a t i o n , t r a n s c r i p t i o n o r p r o t e i n s y n t h e s i s . I n s u c h c a s e s , t h e c e l l m a y n o t b e a b l e t o m o u n t a n d a l l e v i a t e t h e N F — K B - d e p e n d e n t g e n e t i c r e s p o n s e a n d a n t i - a p o p t o t i c s i g n a l s w o u l d n o t b e a c t i v a t e d . H e n c e , t h e o r g a n i s m c a n m o n i t o r i t s e l f f o r d a m a g e d o r i n f e c t e d c e l l s a n d e l i m i n a t e t h e m w h i l e t h e t r a n s c r i p t i o n a l l y a n d t r a n s l a t i o n a l l y f u n c t i o n a l c e l l s w o u l d m a k e i t t o t h e n e x t 2 6 p i i i [ 0 ( n p h t h e N F m e W h q u e : a m y i n v o j p r o g e n y . N F - K B i s t h u s a k e y r e g u l a t o r c o n n e c t i n g t h e e x e c u t i o n o f a p o p t o s i s w i t h a n a n a l y s i s o f f u n c t i o n a l c e l l u l a r m a c h i n e r y . i i ) N F - K B a n d a p o p t o s i s T h e r e i s s o m e e v i d e n c e t h a t i n d u c t i o n o f N F - K B m i g h t i n d u c e a p o p t o s i s . S u c h a n o p p o s i t e e f f e c t w a s o b s e r v e d b y G r i l l e t a l . W h i l e s t u d y i n g t h e g l u t a m a t e - i n d u c e d t o x i c i t y i n n e u r o n a l c e l l s t h e y a l s o o b s e r v e d s i g n i fi c a n t i n d u c t i o n o f N F — K B . 8 8 A s p i r i n ( m e t h y l s a l i c y l a t e ) , w h i c h b l o c k s N F - K B a c t i v a t i o n v i a i n h i b i t i o n o f I K B p h o s p h o r y l a t i o n 8 9 p r o t e c t e d c e l l s f r o m n e u r o t o x i c e f f e c t s o f g l u t a m a t e , t h u s i n d i c a t i n g t h a t N F - K B a c t i v a t i o n a p p e a r s t o c a u s e c e l l d e a t h . N e r v e g r o w t h f a c t o r ( N G F ) a c t i v a t e s N F - K B i n S c h w a n n c e l l s t h r o u g h t h e n e u r o t r o p h i n r e c e p t o r p 7 5 . 9 0 T h e r e c e p t o r , p 7 5 m e d i a t e s c e l l d e a t h a s w e l l a s s u r v i v a l d e p e n d i n g o n t h e d e v e l o p m e n t a l s t a t e o f n e u r o n s . W h e t h e r N F - K B p e r f o r m s a p r o - a p o p t o t i c o r a n t i - a p o p t o t i c r o l e i n t h i s g l i a l c e l l t y p e i s a q u e s t i o n u n a n s w e r e d y e t . S t u d i e s o f t h i s t y p e w i t h N F - K B - a c t i v a t i n g n e u r o t o x i n s ( e v e n , 6 a m y l o i d p e p t i d e ) , i n d i c a t e , t h a t i n n e u r o n s , u n l i k e s e v e r a l o t h e r c e l l t y p e s , N F - K B m a y b e i n v o l v e d i n t r i g g e r i n g c e l l d e a t h . A p o p t o t i c c e l l d e a t h w a s a l s o s e e n i n h u m a n e m b r y o n i c k i d n e y c e l l l i n e ( 2 9 3 c e l l s ) b y s e r u m w i t h d r a w a l w i t h N F - K B a c t i v a t i o n . ” I n a n o t h e r s t u d y , S i n d b i s - V i r u s - i n d u c e d a p o p t o s i s i n a c a r c i n o m a c e l l l i n e w a s s h o w n t o r e q u i r e N F - K B a c t i v a t i o n . 9 2 T h u s , t h e r e a r e c l e a r s i t u a t i o n s i n w h i c h N F - K B a c t i v a t i o n s e e m s t o b e r e q u i r e d f o r a p o p t o s i s t o o c c u r . I n t e r e s t i n g l y , t h e l i s t o f t a r g e t g e n e s f o r N F - K B i n c l u d e b o t h a n t i - a p o p t o t i c ( s e e a b o v e ) a s w e l l a s p r o - a p o p t o t i c g e n e s , s u c h a s c - m y c a n d p 5 3 . 6 " U l t i m a t e l y , t h e a n s w e r t o t h e q u e s t i o n w h e t h e r N F - K B a c t s a s a p r o m o t e r o r a t t e n u a t o r o f c e l l d e a t h m a y d e p e n d s 2 7 f u t m p a l s e r f o r i n h ; c y t o I l ‘ E i i I . o n b o t h t h e c e l l t y p e a n d t h e n a t u r e o f t h e a p o p t o s i s - i n d u c i n g s t i m u l u s . I n d i f f e r e n t c e l l t y p e s , N F - K B c o u l d p e r f o r m o p p o s i n g f u n c t i o n s b y a c t i v a t i n g d i s t i n c t p a t t e r n s o f g e n e s i n c o n j u n c t i o n w i t h c e l l - t y p e - s p e c i fi c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s . T h e e f f e c t o f v a r i o u s a p o p t o s i s - i n d u c i n g s t i m u l i m a y v a r y w i t h r e s p e c t t o t h e k i n d o f p a t h w a y s t h e y c a n a c t i v a t e , i n a d d i t i o n t o t h o s e r e l a t e d t o a p o p t o s i s a n d N F - K B . A d d i t i o n a l a c t i v a t e d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s , s u c h a s A P - l , m a y b e i n fl u e n t i a l i n d e t e r m i n i n g w h e t h e r N F - K B c a n o p p o s e o r p r o m o t e a p o p t o s i s v i a t h e i n d u c t i o n o f a w i d e s p e c t r u m o f g e n e s . H e n c e , N F - K B a p p e a r s t o b e a g e n e t i c s w i t c h w h o s e b i o l o g i c a l e f f e c t w o u l d d e p e n d o n t h e s e t o f g e n e s t h a t c a n b e a c c e s s e d i n a g i v e n c e l l t y p e . R e c e n t l y , i t h a s b e e n u n l e a s h e d t h a t b l o c k i n g N F - K B p a t h w a y s a l s o i n c r e a s e s t h e c e l l ’ s v u l n e r a b i l i t y t o c y t o t o x i c s t i m u l i i n a p h a r m a c o l o g i c a l s e n s e . 6 8 ° ' 8 7 " W h i l e t h i s m a y b e a d e s i r a b l e o u t c o m e w h e n u s i n g c a n c e r c h e m o t h e r a p e u t i c s f o r t u m o r s , i t m a y n o t b e a d v a n t a g e o u s w h e n t r e a t i n g i n fl a m m a t o r y d i s e a s e s w i t h N F - K B i n h i b i t o r s . M o s t a n t i - i n fl a m m a t o r y d r u g s w o u l d h a v e t o r e l y o n p a r t i a l i n h i b i t i o n o f N F - K B w h i c h p r o t e c t s f r o m a p o p t o s i s a n d i s a l s o s u f fi c i e n t t o r e d u c e t h e p r o d u c t i o n o f c y t o k i n e s . S i n c e i n fl a m m a t i o n a n d t u m o r i g e n e s i s c o n d i t i o n s o v e r l a p t o s o m e e x t e n t , t h e f u t u r e d e v e l o p m e n t o f s m a l l m o l e c u l e s t h a t t a r g e t N F — K B f o r i m p r o v e d c h e m o t h e r a p e u t i c t r e a t m e n t s w i l l c e r t a i n l y b e n e fi t f r o m t h e r e c e n t fi n d i n g s . i i i ) K i n a s e i n h i b i t i o n a n d M o d u l a t i o n o f N F - K B T h e N F - K B s i g n a l i n g c a s c a d e i n v o l v e s a v a r i e t y o f k i n a s e s . T h e r e h a v e b e e n n u m e r o u s s t u d i e s i n v o l v i n g k i n a s e s t h a t i n h i b i t t h e N F - K B s i g n a l i n g c a s c a d e . K i n a s e s p l a y s i g n i fi c a n t r o l e i n p h o s p h o r y l a t i o n i n b i o l o g i c a l p r o c e s s e s i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s a n d i n v a s i o n . G S K - B B , a s e r i n e / t h r e o n i n e k i n a s e p a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n r e g u l a t i o n o f g l y c o g e n s y n t h e s i s . 9 3 S e v e r a l r e p o r t s s u g g e s t t h e p r o - a p o p t o t i c r o l e o f G S K - 3 B i n H I V - 2 8 8 1 ‘ . t h . ‘ t a t , s t a u r o s p o r i n e i n d u c e d c e l l d e a t h , d i s r u p t i o n o f g s k - 3 fl c a u s e s l e t h a l i t y i n m o u s e e m b r y o n i c fi b r o b l a s t s ( M E F s ) . I n G S K - 3 B d e fi c i e n t M E F s , t h e r e i s a n i n t r i n s i c d e f e c t i n t h e a c t i v a t i o n o f N F - K B . 9 4 I n t r i g u i n g l y , s o m e m e c h a n i s m s o f c h e m o r e s i s t a n c e i n p a n c r e a t i c c a n c e r a r e d u e t o o v e r a c t i v e N F - K B s i g n a l i n g p a t h w a y s . ” T h u s , d i s s e c t i n g a n d e l u c i d a t i n g t h e m e c h a n i s m s c o n t r o l l i n g N F - K B - m e d i a t e d c e l l s u r v i v a l p a t h w a y s i n p a n c r e a t i c c a n c e r m a y a i d i n t h e i d e n t i fi c a t i o n o f n o v e l a n t i c a n c e r t a r g e t s . T h u s , t h e r e i s c o n fl i c t i n g i n f o r m a t i o n a b o u t t h e r o l e o f G S K - 3 B i n c e l l s u r v i v a l a n d d e a t h . O n o n e h a n d , G S K - 3 B i n a c t i v a t i o n l e a d s t o s u s t a i n e d B — c a t e n i n l e v e l s , w h i c h u l t i m a t e l y c u l m i n a t e i n e n h a n c e d c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n . T h i s h o w e v e r , d o e s n o t r e s o l v e w e l l w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t l o w B - c a t e n i n e x p r e s s i o n i s a s s o c i a t e d w i t h m o r e a g g r e s s i v e p a n c r e a t i c c a n c e r a n d p o o r s u r v i v a l . 9 6 I t h a s a l s o b e e n s u g g e s t e d t h a t G S K - 3 B p l a y s a k e y r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f N F - K B m e d i a t e d g e n e t r a n s c r i p t i o n . T h i s w o u l d p r e d i c t t h a t G S K - S B i n a c t i v a t i o n w o u l d d e c r e a s e c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d s u r v i v a l . A g g a r w a l e t a l s h o w e d t h a t i n g s k - 3 fl - / - M E F s , T N F - a c a n ’ t i n d u c e p h o s p h o r y l a t i o n a n d s u b s e q u e n t d e g r a d a t i o n o f I - K B , 9 4 b w h i l e W o o d g e t t e t a l i n d i c a t e t h a t t h e N F - K B i n a c t i v i t y l i e s d o w n s t r e a m o f I K B p h o s p h o r y l a t i o n i n g s k - 3 fi - l - M E F S . 9 4 a B i l l a d e a u e t a l s h o w e d t h a t t h e r e g u l a t i o n o f c e l l s u r v i v a l b y G S K - 3 B o c c u r s t h r o u g h a n N F K B - d e p e n d e n t p a t h w a y i n M E F s p o s t p h o s p h o r y l a t i o n s t e p . 9 7 T h e y e m p h a s i z e t h a t o v e r e x p r e s s i o n o f p 5 0 / p 6 5 u n i t , r e s c u e d c e l l s o f c e l l s u r v i v a l e f f e c t s o f G S K - 3 B . S u c h a n e f f e c t w a s n o t s e e n w i t h a c o n s t i t u t i v e l y a c t i v e m u t a n t o f I K K B . S c h w a b e e t a l s u g g e s t e d t h e r o l e o f G S K - B B i n h e p a t o c y t e s i n p h o s p h o r y l a t i n g p 6 5 s u b u n i t b e t w e e n 3 5 4 a n d 5 5 1 , t h o u g h i t s m e c h a n i s t i c e f f e c t i n p a n c r e a t i c c a n c e r c e l l s h a s n o t b e e n d e t e r m i n e d y e t “ , 8 2 9 G e m c i t a b i n e ( t r a d e n a m e G e m z a r ) i s a c l i n i c a l l y u s e d d r u g f o r t r e a t m e n t o f p a n c r e a t i c c a n c e r 9 9 a n d a l s o u s e d a s a r a d i a t i o n - s e n s i t i z i n g a g e n t . ' ° ' T h e c y t o t o x i c e f f e c t s o f g e m c i t a b i n e a r e e x e r t e d t h r o u g h i n c o r p o r a t i o n o f d F d C T P i n t o D N A w i t h t h e a s s i s t a n c e o f d F d C D P , r e s u l t i n g i n i n h i b i t i o n o f D N A s y n t h e s i s a n d i n d u c t i o n o f a p o p t o s i s . 1 0 0 I t i s c e l l - c y c l e p h a s e s p e c i fi c a n d i s a c t i v e i n S a n d G . / S - p h a s e s . ' ° ' P a n c r e a t i c c a n c e r c e l l s h a v e e l e v a t e d l e v e l s o f N F - K B w h i c h m a y f u r t h e r i n c r e a s e d u e t o t h e g e n o t o x i c b u r d e n o n c e l l s , t h u s , l e a d i n g t o i n d u c e d c h e m o r e s i s t a n c e . 9 5 H 2 N N H 2 N / N \ f 0 I 0 T V . 0 . t l | \ F 1 2 O H B r / 1 G e m c i t a b i n e ’ O H y m e n i a l d i s i n e l e o = 1 0 n M F i g u r e I - 9 . S t r u c t u r e s o f g e m c i t a b i n e a n d h y m e n i a l d i s i n e . A d m i n i s t r a t i o n o f a g e n t s t h a t i n h i b i t N F - K B a c t i v a t i o n l i k e g l i o t o x i n , M G - 1 3 2 o r s u l f a s a l a z i n e i n p a n c r e a t i c c a n c e r c e l l s c a n m a k e t h e m m o r e s e n s i t i v e t o g e m c i t a b i n e a n d o t h e r c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s s u c h a s V P - l 6 o r d o x o r u b i c i n , w h o s e m e c h a n i s m o f r e s i s t a n c e i s d u e t o i n c r e a s e d N F - K B a c t i v i t y . I n d e e d , t h e c o m b i n a t i o n o f N F - K B i n h i b i t o r s w i t h o t h e r c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s m a y b e m o r e e f f e c t i v e i n c a n c e r t r e a t m e n t a n d c l i n i c a l t r i a l s u s i n g s u c h t r e a t m e n t s t r a t e g i e s a r e c u r r e n t l y b e i n g e m p l o y e d i n s e v e r a l h u m a n c a n c e r s . ‘ 0 2 T h u s , i n h i b i t i o n o f G S K - 3 B m a y s e n s i t i z e g e m c i t a b i n e - r e s i s t a n t p a n c r e a t i c c a n c e r c e l l s t o g e m c i t a b i n e , b u t t h i s r e m a i n s t o b e a d d r e s s e d . W a n e t a l ' 0 3 h a v e s h o w n t h e k i n a s e i n h i b i t i o n p r o fi l e o f h y m e n i a l d i s i n e a n d a n a l o g s w i t h a n I C s o v a l u e o f 1 0 n M f o r t h e n a t u r a l p r o d u c t h y m e n i a l d i s i n e . P D T C i s a n o n - s e l e c t i v e i n h i b i t o r 3 0 o f N F - K B , t h o u g h i t s e l f i s c y t o t o x i c p r o b a b l y d u e t o i t s n o n - s e l e c t i v e n a t u r e . “ T h u s , G S K - 3 B i s u n i q u e l y a n d i m p o r t a n t l y i n v o l v e d i n p a n c r e a t i c c a n c e r c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d s u r v i v a l , p a r t i a l l y t h r o u g h i t s r e g u l a t i o n o f N F - K B a c t i v i t y . I t i s p r o b a b l e t h a t G S K - 3 B r e g u l a t e s o t h e r m o l e c u l a r p a t h w a y s a s w e l l t h a t m i g h t c o n t r i b u t e t o p a n c r e a t i c c a n c e r . T o s u m m a r i z e , t h e f a c t t h a t G S K - B B r e g u l a t e s s e v e r a l p r o t e i n s i n v o l v e d i n c o n t r o l l i n g c e l l c y c l e , s u r v i v a l a n d p r o l i f e r a t i o n , g r o w t h a n d m e t a b o l i s m , s u g g e s t s i t s b r o a d e r r o l e i n c a n c e r . i v ) I K B - k i n a s e a n d N F - K B : I K K c o m p l e x - a n i n t e g r a t o r o f a l l s i g n a l s t o a c t i v a t e N F K B . F o r m o s t c a s e s , t h e a c t i v a t i o n o f N F - K B r e q u i r e s I K B - a p h o s p h o r y l a t i o n a n d s u b s e q u e n t d e g r a d a t i o n a f t e r p o l y u b i q u i t i n a t i o n . H e n c e , i n h i b i t i o n o f p h o s p h o r y l a t i o n o f I K B - a c a n u l t i m a t e l y l e a d t o t h e i n h i b i t i o n o f t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f N F - K B . T h i s w o u l d i n c l u d e b o t h t h e a n t i - a p o p t o t i c g e n e s a s w e l l a s t h o s e r e s p o n s i b l e f o r t h e i m m u n e a n d i n fl a m m a t o r y r e s p o n s e s . T h a l i d o m i d e , w h i c h w a s u s e d a s a s e d a t i v e i n t h e 1 9 5 0 s , ' 0 5 i s a n a g e n t i n c l i n i c a l u s e t h a t i n h i b i t s N F - K B p a r t l y b y i n h i b i t i n g t h e I K B k i n a s e a c t i v i t y l e a d i n g t o i n h i b i t i o n o f t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f I K B a . l 0 6 3 1 N F m o O t h e r H ( K - i n h i b i t o r s a r e A 8 2 0 3 . ' 0 9 p a r t h e n o l i d e , “ 0 s u l i n d a c , ” 1 t h e o p h y l l i n e , ” 2 O O F T h a l i d o m i d e S u l i n d a c A s p i r i n l H O ” ” r ° 0 < ’ I N N \ H 2 O H P a r t h e n o l i d e T h e o p h y l l i n e F i g u r e I - 1 0 . I K B - K i n a s e i n h i b i t o r s N F - K B r e g u l a t e s I L - 8 w h i c h c o n t r o l s t h e d e v e l o p m e n t o f a n g i o g e n e s i s i n c e r t a i n m o d e l s . ‘ ° 7 ’ ' 0 8 S i n c e t h a l i d o m i d e i n h i b i t s N F - K B , t h a l i d o m i d e m a y f u n c t i o n a s a n a n t i - a n g i o g e n i c f a c t o r , a n d s u p p r e s s i o n o f N F - K B - r e g u l a t e d e x p r e s s i o n o f I L - 8 m i g h t p r o v e t o b e i m p o r t a n t i n a n t i - a n g i o g e n i c t h e r a p y i n c a n c e r s y s t e m s . T h e a b i l i t y o f t h a l i d o m i d e t o i n h i b i t H ( K a c t i v i t y c a u s e s s u p p r e s s i o n o f d o w n s t r e a m e v e n t s s u c h a s i n h i b i t i o n o f N F - K B - D N A b i n d i n g a n d t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y . N F - K B r e g u l a t e s g e n e s i n v o l v e d i n i n fl a m m a t o r y r e s p o n s e s a s w e l l a s t h o s e i n c e l l s u r v i v a l a n d i n h i b i t i o n o f a p o p t o s i s . H e n c e , i t i s l i k e l y t h a t i n h i b i t i o n o f N F - K B b y t h a l i d o m i d e m i g h t e x p l a i n i t s a n t i - i n fl a m m a t o r y a n d a n t i - o n c o g e n i c p r o p e r t i e s . B a l d w i n e t a l ‘ 0 6 s u g g e s t a p o s s i b i l i t y o f m o d u l a t i o n o f o t h e r f a c t o r s o r s i g n a l i n g p a t h w a y s w i t h t h a l i d o m i d e t h a t m a y b e i n v o l v e d i n i n fl a m m a t o r y o r o n c o g e n i c p o t e n t i a l . H e n c e , i n h i b i t i o n o f N F - K B c a n b e c o n s i d e r e d a u n i f y i n g m o d e l t o s u p p r e s s b o t h i n fl a m m a t i o n a n d a n g i o g e n e s i s . 8 8 , 1 1 3 a s p i r i n e t c . w h i c h b l o c k t h e e n z y m a t i c a c t i v i t y o f t h e k i n a s e . T h i s e f f e c t u l t i m a t e l y 3 2 V ) c u l m i n a t e s i n i n h i b i t i o n o f N F - K B a n d i t s t r a n s c r i p t i o n a l m a c h i n e r y . B o t h s u l i n d a c a n d a s p i r i n a r e n o n - s t e r o i d a l a n t i - i n fl a m m a t o r y a g e n t s . I n a d d i t i o n t o a n t i - i n fl a m m a t o r y p r o p e r t i e s , s u l i n d a c h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t o h a v e a r o l e i n t h e p r e v e n t i o n o f c o l o n c a n c e r . 1 ‘ 4 S u l i n d a c a n d i t s d e r i v a t i v e s , a s p i r i n a n d s o d i u m s a l i c y l a t e i n h i b i t t h e a c t i v i t y o f a n I K B k i n a s e B ( I K K B ) w h i c h i s r e q u i r e d t o a c t i v a t e t h e N F - K B p a t h w a y . m ’ ” 3 T h e r e i s m t h a t t h e g r o w t h i n h i b i t o r y a n d a n t i - e v i d e n c e p r o v i d e d b y Y a m a m o t o a n d c o w o r k e r s i n fl a m m a t o r y p r o p e r t i e s a r e d u e i n h i b i t i o n o f t h e a c t i v i t y o f c y c l o o x y g e n a s e s , a g e n e p r o d u c t o f N F - K B t r a n s c r i p t i o n . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e g r o w t h i n h i b i t o r y a n d a n t i - i n fl a m m a t o r y p r o p e r t i e s o f s u l i n d a c m a y b e r e g u l a t e d i n p a r t b y i n h i b i t i o n o f k i n a s e s t h a t r e g u l a t e t h e N F - K B p a t h w a y . v ) U b i q u i t i n a t i o n a n d P r o t e o s o m e i n h i b i t o r s I K K - m e d i a t e d p h o s p h o r y l a t i o n a t S e r 3 2 a n d S e r 3 6 i n c l u d e s r a p i d p o l y u b i q u i t i n a t i o n . T h e m o s t i m p o r t a n t s i t e s o f u b i q u i t i n y l a t i o n a r e L y s 2 1 a n d 2 2 o f t h e N - t e r m i n a l r e g i o n . P r o t e i n u b i q u i t i n y l a t i o n i s a t h r e e s t e p p r o c e s s . ” 5 F i r s t , t h e 7 6 a m i n o - a c i d p o l y p e p t i d e , u b i q u i t i n , i s a c t i v a t e d t h r o u g h a n A T P - d e p e n d e n t p r o c e s s b y E l - a u b i q u i t i n a c t i v a t i n g e n z y m e . T h e u b i q u i t i n i s t h e n t r a n s f e r r e d t o c y s t e i n e i n t h e a c t i v e s i t e o f a n E 2 e n z y m e - a u b i q u i t i n c a r r i e r p r o t e i n a n d fi n a l l y , t h e t r a n s f e r o f t h e a c t i v a t e d u b i q u i t i n t o t h e t a r g e t p r o t e i n i s c a t a l y z e d b y a n E 3 e n z y m e - t h e u b i q u i t i n l i g a s e . T h e E 3 e n z y m e p r o v i d e s t h e s p e c i fi c i t y t o r e c o g n i z e t h e s u b s t r a t e . A l t h o u g h t h e u b i q u i t i n y l a t i o n i s c o n s t i t u t i v e l y a c t i v e , i t o f f e r s t h e p o s s i b i l i t y o f i n h i b i t i o n b y f a c t o r s t h a t c a n b e r e g u l a t e d . S u c h a r e g u l a t i o n f o r N F - K B s i g n a l i n g t r a n s d u c t i o n i s n o t k n o w n . U b i q u i t i n a t i o n a l l o w s t h e p r o t e o s o m e t o d e g r a d e t h e p r o t e i n . O n c e I K B - a i s d e g r a d e d , t h e p 5 0 / p 6 5 u n i t t r a n s l o c a t e s 3 3 1 0 I i n h i p h o i n t o M u l t w i t h m y e l t h e r t l [ I a n g l t o t h e n u c l e u s a n d s t a r t s i t s t r a n s c r i p t i o n a l m a c h i n e r y . T h e r e a r e s e v e r a l p r o t e a s o m a l i n h i b i t o r s k n o w n t o i n h i b i t t h i s d e g r a d a t i o n . I n s u c h c a s e s , I K B - a u n d e r g o e s p h o s p h o r y l a t i o n b u t i t i s n o t d e g r a d e d . H e n c e , N F - K B i s p r e v e n t e d f r o m t r a n s l o c a t i n g i n t o t h e n u c l e u s a n d t h u s , i t s t r a n s c r i p t i o n i s p r e v e n t e d . i - B q u H A c E O . , O H ” H O V n - B u ( T N ( 3 " B - H = O Q ' H ? N \ / I \ n , N \ / u \ / \ . ' N H 1 N I - B U “ B u / \ n ’ o ‘ \ H 0 P h A L L N r e s - 3 4 1 o l - B U Y I L N H H o N H { K i t / N i - B u Y i s u ‘ Y o o C H O l a c - 1 3 2 F i g u r e 1 - 1 1 . P r o t e a s o m e I n h i b i t o r s M u l t i p l e m y e l o m a — a B - c e l l m a l i g n a n c y i s a r e s i s t a n c e d i s e a s e m a k i n g i t i n c u r a b l e o r w i t h a s i g n i fi c a n t r a t e o f m o r t a l i t y . ” 6 N F - K B l e v e l s a r e e l e v a t e d i n r e l a p s i n g m u l t i p l e m y e l o m a s u g g e s t i n g t h a t t h i s c o u l d b e u s e d a s a p r o g n o s t i c m a r k e r a s w e l l a s a t a r g e t i n t h e r a p y t o p r e v e n t p r o g r e s s i o n o f t h e d i s e a s e . I ' 7 ' ” 8 B o r t e z o m i b ® ( p r e v i o u s l y V e l c a d e o r P S - 3 4 1 ) c a u s e s i n h i b i t i o n o f d e g r a d a t i o n o f I K B - a , a n d m a r k e d l y r e d u c e s n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f N F - K B . “ 8 3 4 f c c h c e l l o f c a m h o u r c a m ' I n h i t h e i a n U L C h e r R B W h i 2 h . B y c o m b i n i n g a n o n - c y t o t o x i c d o s e o f P S - 3 4 1 w i t h c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s s u c h a s m e l p h a l a n o r d o x o r u b i c i n , i t w a s f o u n d t h a t t h e c e l l l i n e s b e c a m e s e n s i t i v e b y 1 0 5 - 1 0 6 f o l d t h a n w e r e n e c e s s a r y t o k i l l t h e s e c e l l s w i t h o u t P S - 3 4 1 . W e h a v e s h o w n t h e u s e o f n o v e l i m i d a z o l i n e s w h i c h s e n s i t i z e l e u k e m i a c e l l s t o w a r d s c h e m o t h e r a p y w i t h t o p o i s o m e r a s e - I i n h i b i t o r , c a m p t o t h e c i n . 8 7 P h N P h P h K I N 5 C O O H P h F i g u r e 1 - 1 2 . S t r u c t u r e o f i m i d a z o l i n e W e f o u n d t h a t t h e c h e m o s e n s i t i z i n g a g e n t ( F i g u r e I - l 2 ) w a s f o u n d t o s e n s i t i z e l e u k e m i a c e l l s a t l o w n a n o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s t o c a m p t o t h e c i n a n d d r a s t i c a l l y e n h a n c e t h e l e v e l o f c a m p t o t h e c i n m e d i a t e d a p o p t o s i s . C o m b i n a t i o n t h e r a p y o f C E M c e l l s w i t h c a m p t o t h e c i n a n d 1 0 n M i m i d a z o l i n e p r o v i d e d ~ 4 4 f o l d e n h a n c e m e n t o f e f fi c a c y a f t e r 4 8 h o u r s . T h e a b i l i t y o f t h e i m i d a z o l i n e t o e n h a n c e t h e a p o p t o t i c e v e n t s i n i t i a t e d b y c a m p t o t h e c i n i s p o s t u l a t e d t o b e v i a t h e i n h i b i t i o n o f t h e N F - K B s i g n a l i n g p a t h w a y . I n h i b i t i o n o f t h e N F - K B p a t h w a y w a s f o u n d t o o c c u r v i a t h e i n h i b i t i o n o f d e g r a d a t i o n o f t h e i n h i b i t o r y p r o t e i n I - K B a . T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e t h a t c o m b i n a t i o n t h e r a p y o f c l a s s i c a l a n t i c a n c e r a g e n t s w i t h s m a l l m o l e c u l e N F — K B i n h i b i t o r s h a s t h e p o t e n t i a l t o t a r g e t t h i s c h e m o r e s i s t a n c e a n d p r o v i d e s a n e w s t r a t e g y t o t r e a t c h e m o r e s i s t a n t t u m o r s . F . B c l z p r o t e i n s : l i f e o r d e a t h s w i t c h A p o p t o s i s i s a n o r d e r l y a n d s y n c h r o n i z e d p r o c e s s t h a t h a s d i s t i n c t s i g n a l i n g p a t h w a y s " 2 w h i c h c o n v e r g e a t e f f e c t o r c a s p a s e a c t i v a t i o n . P r o t e i n s o f t h e B c l - 2 f a m i l y s h a r e t h e B c l - 2 h o m o l o g y ( B H ) d o m a i n s a n d c a n b e h a v e a s p r o - o r a n t i - a p o p t o t i c p r o t e i n s . P r o - 3 5 I E A r p e o s p p o t o t n i s c e — — > - r e _ i d a d a B B 0 2 . 5 2 : : v ‘ M i “ h Q 7 . o : t c i s . e B — a “ k — * a x D C I y A t B o L h c O r o m e C o n d r i a s u r v i v a l m e m b e r s s u c h a s B c l - 2 a n d B e l - X L p r e s e r v e t h e m i t o c h o n d r i a l o u t e r m e m b r a n e i n t e g r i t y t o p r e v e n t t h e r e l e a s e o f a p o p t o g e n i c m o l e c u l e s l ' g " P r o - a p o p t o t i c m e m b e r s ( B a x - l i k e ) a c t a s s e n s o r s o f c e l l u l a r d a m a g e a n d i n i t i a t e t h e d e a t h p r o c e s s . ” 9 b P e r t u r b e d l e v e l s o f e i t h e r o f t h e s e p r o t e i n s m a y c o n t r i b u t e t o o n c o g e n e s i s a n d t u m o r - c e l l r e s i s t a n c e t o d r u g - i n d u c e d c e l l d e a t h . H e n c e , p r o - s u r v i v a l p r o t e i n s a r e a t t r a c t i v e t a r g e t s f o r i n d u c i n g c e l l d e a t h o r s e n s i t i z i n g c e l l s t o d e a t h i n d u c e d b y c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g s . U s e o f a n 1 8 - m e r a n t i s e n s e n u c l e o t i d e s e q u e n c e ( G e n a s e n s e o r G 3 1 3 9 ) t a r g e t i n g t h e t r a n s c r i p t i o n o f m R N A , e n t e r e d p h a s e I I t r i a l s . 1 1 9 C M i t o c h o n d r i a a r e i m p o r t a n t f o r t h e c e l l a s t h e y g e n e r a t e A T P a n d a l s o a c t i v e l y c o n t r i b u t e i n 8 c h r e g u l a t e d a p o p t o t i c c e l l d e a t h . 1 2 0 i t C o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n B a x f K t ) . ’ ' , 7 7 — 1 1 ; ? a m B c l 2 , 5 ? “ l " ‘ S m a c F i g u r e I - 1 3 . C o n t r o l o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p e r m e a b i l i z a t i o n b y B e l - 2 p r o t e i n s T h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m s i n r e s p o n s e t o t h e a p o p t o t i c s t i m u l i a n d t h e r o l e o f B e l - 2 p r o t e i n s i n r e g u l a t i n g t h e s e a r e a m a t t e r o f i n t e n s e c o n t r o v e r s y . A m o n g t h e m , i s a h y p o t h e s i s b y T h o m p s o n e t a l i n d i c a t i n g t h e f o r m a t i o n o f o u t e r m e m b r a n e c h a n n e l s b y p r o - a p o p t o t i c f a c t o r s s u c h a s B a x a n d B a k . K n o c k - o u t s t u d i e s i n M E F s i n d i c a t e d t h a t B a x a n d B a k a r e r e q u i r e d f o r p e r m e a b i l i z a t i o n i n r e s p o n s e t o t h e a p o p t o t i c s t i m u l i f r o m c y t o t o x i c d r u g s m B a x , w h i c h n o r m a l l y r e s i d e s i n t h e c y t o s o l c o u l d t r a n s l o c a t e t o t h e m i t o c h o n d r i a l o u t e r m e m b r a n e u p o n i n d u c t i o n o f a p o p t o s i s . 1 2 2 B a k o n t h e o t h e r h a n d i s 3 6 a s s o c i a t e d a t t h e o u t e r m e m b r a n e o f t h e m i t o c h o n d r i a a n d u n d e r g o e s c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s u p o n a p o p t o s i s . 1 2 3 I n s u c h a s s i t u a t i o n , B a d a n d B i m c a n b i n d t o B e l - 2 t o c a u s e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s s u c h t h a t i t d o e s n ’ t h a v e i n h i b i t o r y e f f e c t s o n B a x o r B a k . F i n a l l y , p r o - a p o p t o t i c B a x a n d B a k w o u l d f o r m c h a n n e l s t o r e l e a s e c y t o c h r o m e C i n t o t h e c e l l . i ) O v e r e x p r e s s i o n o f b c h : t a r g e t s o r t o o l s ? ? O v e r e x p r e s s i o n o f B e l - 2 w a s d e s c r i b e d a s a c o n s e q u e n c e o f t ( l 4 ; 1 8 ) t r a n s l o c a t i o n a n d h a s ' 2 4 b e e n c o n s i d e r e d a s a p r o g n o s t i c m a r k e r o f a c u t e m y e l o i d l e u k e r r l i a ' 2 5 a n d n o n - H o d g k i n ’ s l y m p h o m a s . ' 2 6 O t h e r c h a n g e s l i k e m u t a t i o n s i n t h e b a x g e n e m a n d c h a n g e s i n p r o a n d a n t i - a p o p t o t i c r a t i o s h a v e a l s o b e e n i d e n t i fi e d . ' 2 8 B a s e d o n t h e i m p o r t a n t r o l e o f B c l - 2 p r o t e i n s i n r e g u l a t i n g t h e m i t o c h o n d r i a l o u t e r m e m b r a n e p e r m e a b i l i z a t i o n a n d t h e i r f r e q u e n t l y m o d i fi e d e x p r e s s i o n s , t h e a n t i - a p o p t o t i c p r o t e i n s a s w e l l a s t h e p r o - a p o p t o t i c p r o t e i n s c o u l d b e u s e d a s t a r g e t s o r t o o l s i n c a n c e r c h e m o t h e r a p y . S t r a t e g i c , t e m p o r a l c o n t r o l o f p r o t e i n s m a y n o t c a u s e a b u r d e n o n t h e c e l l a n d c a n b e e x p l o i t e d f o r t h e r a p y . i i ) A n t i s e n s e o l i g o n u c l e o t i d e t a r g e t i n g B c 1 2 A n t i s e n s e o l i g o n u c l e o t i d e s t h e r a p y u t i l i z e s s h o r t , s y n t h e t i c s e q u e n c e s w h i c h b i n d t o t h e R N A s o t h a t t h e t r a n s l a t i o n i n t o p r o t e i n s i s p r e v e n t e d . S p e c i fi c D N A z R N A d u p l e x e s p r e v e n t t h e c o n v e r s i o n i n t o p r o t e i n s ( t h e f u n c t i o n a l e q u i v a l e n t o f a g e n e ) a n d h e n c e , b l o c k t h e t a r g e t o f t h e g e n e . ‘ 2 9 M e c h a n i s t i c a l l y , t h i s i n v o l v e s a v a r i e t y o f p r o c e s s e s s u c h a s i n h i b i t i o n o f s p l i c i n g a n d c l e a v a g e o f R N A b y R N A s e H f o u n d i n t h e c y t o p l a s m a s w e l l a s t h e n u c l e u s . 1 3 0 D e C a s a r e e t a l h a v e s h o w n t h e e f f e c t s o f o b l i m e r s e n o n t h e a n t i - t u m o r a c t i v i t y o f g i m a t e c a n , a t o p o - l i n h i b i t o r f r o m t h e c a m p t o t h e c i n f a m i l y c u r r e n t l y 1 3 1 u n d e r g o i n g p h a s e I I c l i n i c a l t r i a l s . O b l i m e r s e n i s a n a n t i s e n s e o l i g o n u c l e o t i d e t h a t 3 7 b i n d s t h e b c l - 2 m R N A s e q u e n c e a n d r e s u l t s i n t h e d e g r a d a t i o n o f b c l — 2 m R N A a n d d o w n - r e g u l a t i o n o f B e l - 2 p r o t e i n . I 3 2 J a n s e n e t a l a n d M i l l w a r d e t a l i n d e p e n d e n t l y s u g g e s t e d t h e t h e r a p e u t i c p o t e n t i a l o f o b l i m e r s e n c o m b i n e d w i t h s e v e r a l c y t o t o x i c a g e n t s a g a i n s t a v a r i e t y o f s o l i d a n d h e m a t o l o g i c m a l i g n a n c i e s t h r o u g h p r e c l i n i c a l a n d c l i n i c a l s t u d i e s m ' ' 3 4 I n p a r t i c u l a r , a c l i n i c a l s t u d y o f t h e d a c a r b a z i n e / o b l i m e r s e n c o m b i n a t i o n s u p p o r t e d b e n e fi c i a l o u t c o m e s i n m e l a n o m a p a t i e n t s r e c e i v i n g t h e c o m b i n a t i o n i n t e r m s o f p r o g r e s s i o n - f r e e s u r v i v a l . I 3 4 o N 9 r s N O - , 6 ’ O H " I N M O Q G i m a t e c a n D T I C F i g u r e I - 1 4 . S t r u c t u r e s o f t o p o - l i n h i b i t o r , g i m a t e c a n a n d D N A a l k y l a t o r , D T I C ( d a c a r b a z i n e ) . B o t h c e l l m o d e l s a s w e l l a s a n i m a l m o d e l s s h o w e d a n i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y t o g i m a t e c a n , i n p r e s e n c e o f o b l i m e r s e n . S e v e r a l c l i n i c a l t r i a l s f o r o b l i m e r s e n a r e o n g o i n g w i t h c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s s u c h a s d e x a m e t h a s o n e , m i t o t r e x o n e e t c . i i i ) S m a l l m o l e c u l e i n h i b i t o r s o f B c l - 2 f a m i l y . A n t i m y c i n A a n d i t s m e t h o x y d e r i v a t i v e b i n d t o t h e B H 3 b i n d i n g g r o o v e o f B e l - 2 a n d B e l - X L ; t h u s , i n d u c i n g m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y a n d a p o p t o s i s . ' 3 5 T w o c l a s s e s o f s m a l l m o l e c u l e s t h a t d i s r u p t t h e b i n d i n g o f B a k t o B e l - X L 1 3 6 3 8 B H 3 l - 1 , X = B r B H 3 1 - 2 , Y = C l , Z = B r F i g u r e 1 - 1 5 . S t r u c t u r e s o f A n t i m y c i n A 3 , H A - l 4 - 1 a n d D e g e t e r e v ’ s B H 3 - B c I - X L b i n d i n g i n h i b i t o r s H A l 4 - l d i r e c t l y b i n d s t o B e l - 2 a n d r e d u c e s t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l o f m i t o c h o n d i r a t o i n d u c e a p o p t o s i s v i a a c t i v a t i o n o f c a s p a s e - 3 . 1 3 7 M i t o c h o n d r i a i n g e n e r a l , a n d B e l - 2 p r o t e i n s i n p a r t i c u l a r , a r e p r o m i s i n g n e w t a r g e t s i n c a n c e r t h e r a p y o w i n g t o t h e i r c e n t r a l r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f a p o p t o s i s a s w e l l a s t h e i r i m p o r t a n c e i n t h e d e v e l o p m e n t o f r e s i s t a n c e t o c h e m o t h e r a p y . T h e c h e m i c a l i n h i b i t o r s d e v e l o p e d i n t h i s s t u d y c o u l d c i r c u m v e n t t h e u p s t r e a m a n t i - a p o p t o t i c b a r r i e r s i n t r a n s f o r m e d c e l l s i n v i t r o a n d m i g h t b e u s e d t o e x p l o r e t h e f e a s i b i l i t y o f a n t i - a p o p t o t i c a g e n t s a s n o v e l a n t i - c a n c e r t h e r a p i e s 3 9 G . S u m m a r y R e s i s t a n c e t o c h e m o t h e r a p y c a n a r i s e d u e t o a w i d e v a r i e t y o f n o n - o n c o g e n i c a n d o n c o g e n i c r e a s o n s . A c t i v a t i o n o f a n t i - a p o p t o t i c s i g n a l i n g p a t h w a y s h a v e c o m p r o m i s e d t h e e f fi c a c y o f a n t i t u m o r a g e n t s i n t h e c l i n i c . A n t i t u m o r d r u g s e x e r t t h e i r a n t i t u m o r a c t i v i t y v i a t h e i n i t i a t i o n o f a p o p t o t i c s i g n a l i n g p a t h w a y s s u c h a s a c t i v a t i o n o f p 5 3 , u l t i m a t e l y r e s u l t i n g i n c e l l d e a t h . M u t a t i o n s i n t h e p r o - a p o p o t i c f a c t o r s s u c h a s p 5 3 c o n t r i b u t e t o t h i s i n h e r e n t r e s i s t a n c e . S m a l l m o l e c u l e s h a v e p r o v i d e d t e m p o r a l c o n t r o l o v e r t h e l e v e l s o f b o t h a n t i - a p o p t o t i c a n d p r o - a p o p t o t i c f a c t o r s . T h e s e w o u l d n o t o n l y o f f e r a h a n d l e t o u n d e r s t a n d b i o l o g i c a l p a t h w a y s , b u t a l s o h e l p i n i d e n t i f y i n g t a r g e t s a n d m o d u l a t e t h e i r f u n c t i o n s f o r p o t e n t i a l t h e r a p e u t i c u s e i n f u t u r e . M o r e s t r a t e g i c a l l y d e s i g n e d n o v e l i n h i b i t o r s a r e d e s i r e d t o a d d r e s s t h e s p e c i fi c i n i s s u e s . I t i s p r o b a b l e t h a t a ‘ t a i l o r - m a d e ’ t h e r a p y t o t a r g e t s p e c i fi c p a t h w a y s i n c e r t a i n c a n c e r s p r o v e s m o s t b e n e fi c i a l . 4 O 1 ) 2 ) 3 ) 4 ) 5 ) 6 ) 7 ) 8 ) 9 ) 1 0 ) 1 1 ) 1 2 ) 1 3 ) 1 4 ) R e f e r e n c e s G r e e n , D . R . C e l l 1 9 9 8 , 9 4 , 6 9 5 — 6 9 8 . H e n g a r t n e r , M . O . N a t u r e 2 0 0 0 , 4 0 7 , 7 7 0 — 7 7 6 . H a n a h a n , D . ; W e i n b e r g , R . A . C e l l 2 0 0 0 , 1 0 0 , 5 7 - 7 0 . B l a g o s k l o n n y , M . V . C e l l D e a t h D i fi e r . 2 0 0 5 , 1 2 , 5 9 2 - 6 0 2 . M i d d l e t o n M . R . , M a r g i s o n , G . P . L a n c e t O n c o l . 2 0 0 3 , 4 , 3 7 - 4 4 . Z a i d i , N . H . ; A l l a y , E . ; A y i , T . C . ; L i , B . F . ; D u m e n c o , L . L . ; S y , M . S . ; G e r s o n , S . L . C a r c i n o g e n e s i s 1 9 9 5 , 1 6 , 1 0 4 7 - 1 0 5 3 . ( a ) G i a c c o n e G . ; V a n A r k - o t t e J . ; R u b i o , G . J . ; G a z d a r , A . F . ; B r o x t e r m a n , H . J . ; D i n g e m a n s , A . — M . C . ; F l e n s , M . J . ; S c h e p e r , R . J . ; P i n e d o , H . M . I n t . J . C a n c e r 1 9 9 6 , 6 6 , 7 6 0 - 7 6 7 . ( b ) M u r a s e , M . ; K o d e r a , Y . ; K o n d o , K . ; S e k i g u c h i , H . ; F u j i w a r a , M . ; K a s a i , Y . ; A k i y a m a , 8 . ; I t o , K . ; T a k a g i , H . J . S u r g . O n c o l . 1 9 9 6 , 6 1 , 2 2 3 - 2 2 9 . F i t z s i m m o n s , S . A . ; W o r k m a n , P . ; G r e v e r , M . ; P a u l i , K . ; C a m a l i e r , R . ; L e w i s , A . D . J . N a t l . C a n c e r I n s t . 1 9 9 6 , 8 8 , 2 5 9 - 2 6 9 . ( a ) H o l l s t e i n , M . ; S i d r a n s k y , D . ; V o g e l s t e i n , 8 . ; H a r r i s , C . C . S c i e n c e 1 9 9 1 , 2 5 3 , 4 9 - 5 3 . ( b ) B u r n s , T . F . ; E l - D e i r y , W . S . J . C e l l . P h y s i o l . 1 9 9 9 , 1 8 1 , 2 3 1 - 2 3 9 . W a n g , C . Y . ; M a y o , M . W . ; K o m e l u k , R . G . ; G o e d d e l , D . V . ; B a l d w i n A . 8 . , J r . S c i e n c e 1 9 9 8 , 2 8 1 , 1 6 8 0 - 1 6 8 3 . S c h o n , 0 . ; F r i e d l e r , A . ; B y c r o f t , M . ; F r e u n d , S . M . ; F e r s h t , A . R . J . M o l . B i o l . 2 0 0 2 , 3 2 3 , 4 9 1 - 5 0 1 . ( a ) M o m a n d , J . ; Z a m b e t t i , G . P . ; O l s o n , D . C . ; G e o r g e , D . L . ; L e v i n e , A . J . C e l l , 1 9 9 2 , 6 9 , 1 2 3 7 - 1 2 4 5 . ( b ) T h u t , C . J . ; G o o d r i c h , J . A . ; T j i a n , R . G e n e s D e v . 1 9 9 7 , 1 1 , 1 9 7 4 - 1 9 8 6 . ( c ) F r e e d m a n , D . A . ; W u , L . ; L e v i n e , A . J . , C e l l M o l . L i f e S c i . 1 9 9 9 , 5 5 , 9 6 - 1 0 7 . ( a ) H a u p t , Y . ; M a y a , R . ; K a z a z , A . ; O r e n , M . N a t u r e , 1 9 9 7 , 3 8 7 , 2 9 6 - 2 9 9 . ( b ) H o n d a , R . ; T a n a k a , H . ; Y a s u d a , H . F E B S L e t t . 1 9 9 7 , 4 2 0 , 2 5 - 2 7 . ( c ) K u b b u t a t , M . H . ; J o n e s , 8 . N . ; V o u s d e n , K . H . N a t u r e , 1 9 9 7 , 3 8 7 , 2 9 9 - 3 0 3 . ( ( 1 ) M i d g e l e y , C . A . ; L a n e , D . P . O n c o g e n e , 1 9 9 7 , 1 5 , 1 1 7 9 - 1 1 8 9 . B l a y d e s , J . P . ; G y r e , V . ; R o w s o n , J . M . ; W y n f o r d - T h o m a s , D . O n c o g e n e , 1 9 9 7 , 1 4 , 1 8 5 9 - 1 8 6 8 . 4 1 1 5 ) l 6 ) 1 7 ) 1 8 ) 1 9 ) 2 0 ) 2 1 ) 2 2 ) 2 3 ) 2 4 ) 2 5 ) 2 6 ) 2 7 ) ( a ) C h e n , L . ; L u , W . ; A g a r w a l , S . ; Z h o u , W . ; Z h a n g , R . ; C h e n , J . M o l . M e d . 1 9 9 9 , 5 , 2 1 - 3 4 . ( b ) K u s s i e , P . H . ; G o r i n a , S . ; M a r e c h a l , V . ; E l e n b a a s , B . ; M o r e a u , J . ; L e v i n e , A . J . ; P a v l e t i c h , N . P . S c i e n c e , 1 9 9 6 , 2 7 4 , 9 4 8 - 9 5 3 . C h e n e , P . M o l . C a n c e r R e s . 2 0 0 4 , 2 , 2 0 - 2 8 . S t o l l , R . ; R e n n e r , C . ; H a n s e n , 8 . ; P a l m e , S . ; K l e i n , C . ; B e l l i n g , A . ; Z e s l a w s k i , W . ; K a m i o n k a , M . ; R e h m , T . ; M u h l h a h n , P . ; S c h u m a c h e r , R . ; H e s s e , F . ; K a l u z a , B . ; V o e l t e r , W . ; E n g h , R . A . ; H o l a k , T . A . , B i o c h e m i s t r y 2 0 0 1 , 4 0 , 3 3 6 - 4 4 . Z h a o , J . ; W a n g , M . ; C h e n , J . ; L u o , A . ; W a n g , X . ; W u , M . ; Y i n , D . ; L i u , 2 . C a n c e r L e t t . 2 0 0 2 , 1 8 3 , 6 9 - 7 7 . Y i n , H . ; L e e , G . - Y . ; P a r k , H . S . ; P a y n e , G . A . ; R o d r i g u e z , J . M . ; S e b t i , S . M . ; H a m i l t o n , A . D . A n g e w . C h e m . I n t . E d . 2 0 0 5 , 4 4 , 2 7 0 4 - 2 7 0 7 . D u n c a n , S . J . ; G r u s c h o w , S . ; W i l l i a m s , D . H . ; M c N i c h o l a s , C . ; P u r e w a l , R . ; H a j e k , M . ; G e r l i t z , M . ; M a r t i n , S . ; W r i g l e y , S . K . ; M o o r e , M . J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 1 , 2 , 5 5 4 - 5 6 0 . M y e r s , M . C . ; W a n g , J . ; I e r a , J . A . ; B a n g , J . - K . ; H a r a , T . ; S a i t o , S . ; Z a m b e t t i , G . R . ; A p p e l l a , D . H . J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 5 , 1 2 7 , 6 1 5 2 . V a s s i l e v , L . T . ; V u , B . T . ; G r a v e s , B . ; C a r v a j a l , D . ; P o d l a s k i , F . ; F i l i p o v i c , Z . ; K o n g , N . ; K a m m l o t t , U . ; L u k a c s , G ; K l e i n , C . ; F o t o u h i , N . ; L i u , E . A . S c i e n c e 2 0 0 4 . 3 0 3 . 8 4 4 - 8 . ( a ) A p p e l l a , E ; A n d e r s o n , C . W . E u r . J . B i o c h e m . 2 0 0 1 , 2 6 8 , 2 7 6 4 - 7 2 . ( b ) K a p o o r , M . ; L o z a n o , G . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 8 , 9 5 , 2 8 3 4 - 2 8 3 7 . ( a ) A s h c r o f t , M . ; K u b b u t a t , M . H . ; V o u s d e n , K . H . M o l . C e l l . B i o l . 1 9 9 9 , 1 9 , 1 7 5 1 - 1 7 5 9 . ( b ) W u , 2 . ; E a r l e , J . ; S a i t o , S . ; A n d e r s o n , C . W . ; A p p e l l a , E . M o l . C e l l . B i o l . 2 0 0 2 , 2 2 , 2 4 4 1 - 2 4 4 9 . ( c ) T h o m p s o n , T . ; T o v a r , C . ; Y a n g , H . ; C a r v a j a l , D . ; V u , B . T . ; X u , Q . ; W a h l , G . M . ; H e i m b r o o k , D . C . ; V a s s i l e v , L . T . , J . B i o l . C h e m . 2 0 0 4 , 2 7 9 , 5 3 0 1 5 - 2 2 . ( a ) V o g e l s t e i n , B . ; L a n e , D . ; L e v i n e , A . J . N a t u r e 2 0 0 0 , 4 0 8 , 3 0 7 - 3 1 0 . ( b ) V o u s d e n , K . H . ; L o u , X . N a t . R e v . C a n c e r 2 0 0 2 , 2 , 5 9 4 - 6 0 4 . L e v i n e , A . J . C e l l 1 9 9 7 , 8 8 , 3 2 3 - 3 3 1 . ( a ) E l l e d g e , S . J . S c i e n c e , 1 9 9 6 , 2 7 4 , 1 6 6 4 . ( b ) M a r t i n , N . M . B . J . P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . B : B i o l o g y 2 0 0 1 , 6 3 , 1 6 2 - 1 7 0 . ( c ) H a r t w e l l , L . H . ; K a s t a n , M . B . S c i e n c e 1 9 9 4 , 2 6 6 , 1 8 2 1 - 1 8 2 8 . 4 2 2 8 ) 2 9 ) 3 0 ) 3 1 ) 3 2 ) 3 3 ) 3 4 ) 3 5 ) 3 6 ) 3 7 ) 3 8 ) ( 3 ) Z h o u , B . - B . ; E l l e d g e , S . J . N a t u r e , 2 0 0 0 , 4 0 8 , 4 3 3 - 4 3 9 . ( b ) A b r a h a m , R . T . G e n e s D e v . 2 0 0 1 , 1 5 , 2 1 7 7 - 2 1 9 6 . ( a ) C o r t e z , D . ; W a n g , Y . ; Q i n , J . ; E l l e d g e , S . J . S c i e n c e 1 9 9 9 , 2 8 6 , 1 1 6 2 - 1 1 6 6 . ( b ) L i m , D . - S . ; K i m , S . - T . ; X u , 3 . ; M a s e r , R . 8 . ; L i n , J . Y . ; P e t r i n i , J . H . J . ; K a s t a n , M . B . N a t u r e 2 0 0 0 , 4 0 4 , 6 1 3 - 6 1 7 . ( c ) Z h a o , S . ; W e n g , Y . - C . ; Y u a n , S . - S . F . ; L i n , Y . - T . ; H s u , H . - C . ; L i n , S . - C . J . ; G e r b i n o , E . ; S o n g , M . - H . ; Z d z i e n i c k a , M . Z . ; G a t t i , R . A . ; S h a y , J . W . , Z i v , Y . S . ; L e e , E . Y . - H . P . N a t u r e 2 0 0 0 , 4 0 5 , 4 7 3 . ( d ) G a t e i , M . ; Y o u n g , D . ; C e r o s a l e t t i , K . M . ; D e s a i - M e h t a , A . ; S p r i n g , K . ; K o z l o v , S . ; L a v i n , M . F . ; G a t t i , R . A . ; C o n c a n n o n , P . ; K h a n n a , K . N a t u r e G e n e t . 2 0 0 0 , 2 5 , 1 1 5 - 1 1 9 . ( a ) M a r t i n , S . G . ; L a r o c h e , T . ; S u k a , N . ; G r u n s t e i n , M . ; G a s s e r , S . M . C e l l 1 9 9 9 , 9 7 , 6 2 1 - 6 3 3 . ( b ) M i l l s , K . D . , S i n c l a i r , D . A . ; G u a r e n t e , L . C e l l 1 9 9 9 , 9 7 , 6 0 9 - 6 2 0 . R i t c h i e , K . B . ; M a l l o r y , J . C . ; P e t e s , T . D . M o l . C e l l . B i o l . 1 9 9 9 , 1 9 , 6 0 6 5 - 6 0 7 5 . ( a ) L o w e , S . W . ; S c h m i t t , E . M . ; S m i t h , S . W . ; O s b o r n e , B . A . ; J a c k s , T . N a t u r e 1 9 9 3 , 3 6 2 , 8 4 7 - 8 4 9 . ( b ) C l a r k e , A . R . ; P u r d i e , C . A . ; H a r r i s o n , D . J . ; M o r r i s , R . G . ; B i r d , C . C . ; H o o p e r M . L . ; W y l l i e , A . H . N a t u r e 1 9 9 3 , 3 6 2 , 8 4 9 - 8 5 2 . ( c ) X u , Y . B a l t i m o r e , D . G e n e s D e v . 1 9 9 6 , 1 0 , 2 4 0 1 - 2 4 1 0 . ( ( 1 ) H i r a o , A . ; K o n g , Y . Y . ; M a t s u o k a , S . ; W a k e h a m , A . ; R u l a n d , J . ; Y o s h i d a , H . ; L i u , D . ; E l l e d g e , S . J . ; M a k , T . W . S c i e n c e 2 0 0 0 , 2 8 7 , 1 8 2 4 - 1 8 2 7 . ( e ) W o o , R . A . ; M c L u r e , K . G . ; L e e s - M i l l e r , S . P . ; R a n c o u r t , D . E . ; L e e , P . W . N a t u r e 1 9 9 8 , 3 9 4 , 7 0 0 - 7 0 4 . J i m e n e z , G . S . ; B r y n t e s s o n , F . ; T o r r e s - A r z a y u s , M . I . ; P r i e s t l e y , A . ; B e e c h e , M . ; S a i t o , S . ; S a k a g u c h i , K . ; A p p e l l a , E . ; J e g g o , P . A . ; T a c c i o l i , G . E . ; W a h l , G . M . ; H u b a n k , M . N a t u r e 1 9 9 9 , 4 0 0 8 1 - 3 . V o l k m e r , E . ; K a r n i t z , L . M . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 9 , 2 7 4 , 5 6 7 - 5 7 0 . G r e e n , C . M . ; E r d j u m e n t - B r o m a g e , H . ; T e m p s t , P . ; L o w n d e s , N . F . C u r r . B i o l . 2 0 0 0 , 1 0 , 3 9 - 4 2 . E d w a r d s , R . J . ; B e n t l e y , N . J . ; C a r r , A . M . N a t u r e C e l l B i o l . 1 9 9 9 , I , 3 9 3 - 3 9 8 . ( a ) B r o w n , E . J . ; B a l t i m o r e , D . G e n e s D e v . 2 0 0 0 , 1 4 , 3 9 7 - 4 0 2 . ( b ) d e K l e i n , A . ; M u i j t j e n s , M . ; v a n O s , R . ; V e r h o e v e n , Y . ; S r n i t , B . ; C a r r , A . ; L e h m a n n , A . ; H o e i j m a k e r s , J . C u r r . B i o l . 2 0 0 0 , 1 0 , 4 7 9 - 4 8 2 . ( c ) L i u , Q . ; G u n t u k u , S . ; C u i , X . S . ; M a t s u o k a , S . ; C o r t e z , D . ; T a m a i , K . ; L u o , G . ; C a r a t t i n i - R i v e r a , S . ; D e M a y o , F . ; B r a d l e y , A . ; D o n e h o w e r , L . A . ; E l l e d g e , S . J . G e n e s D e v . 2 0 0 0 , 1 4 , 1 4 4 8 - 1 4 5 9 . ( a ) P a u l o v i c h , A . G . ; T o c z y s k i , D . P . ; H a r t w e l l , L . H . C e l l 1 9 9 7 , 8 8 , 3 1 5 - 2 1 . ( b ) P a u l o v i c h , A . G . ; H a r t w e l l , L . H . , C e l l 1 9 9 5 , 8 2 , 8 4 1 - 7 . 4 3 3 9 ) 4 0 ) 4 1 ) 4 2 ) 4 3 ) 4 4 ) 4 5 ) 4 6 ) 4 7 ) 4 8 ) ( a ) C l i b y , W . A . ; R o b e r t s , C . J . ; C i m p r i c h , K . A . ; S t r i n g e r , C . M . ; L a m b , J . R . ; S c h r e i b e r , S . L . ; F r i e n d , S . H . E M B O J . 1 9 9 8 , I 7 , 1 5 9 - 1 6 9 . ( b ) W r i g h t , J . A . ; K e e g a n , K . S . ; H e r e n d e e n , D . R . ; B e n t l e y , N . J . ; C a r r , A . M . ; H o e k s t r a , M . F . ; C o n c a n n o n , P . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 8 , 9 5 , 7 4 4 5 - 7 4 5 0 ( c ) S a v i t s k y , K . ; B a r - S h i r a , A . ; G i l a d , S . ; R o t m a n , G . ; Z i v , Y . ; V a n a g a i t e , L . ; T a g l e , D . A . ; S m i t h , S . ; U z i e l , T . ; S f e z , S . ; A s h k e n a z i , M . ; P e c k e r , 1 . ; F r y d m a n , M . ; H a m i k , R . ; P a t a n j a l i , S . R . ; S i m m o n s , A . ; C l i n e s , G . A . ; S a r t i e l , A . ; G a t t i , R . A . ; C h e s s a , L . ; S a n a ] , 0 . ; L a v i n , M . F . ; J a s p e r s , N . G . J . ; T a y l o r , A . M . R . ; A r l e t t , C . F . ; M i k i , T . ; W e i s s m a n , S . M . ; L o v e t t , M . ; C o l l i n s , F . S . ; S h i l o h , Y . S c i e n c e 1 9 9 5 , 2 6 8 , 1 7 4 9 - 5 3 . ( ( 1 ) M a t s u o k a , S . ; H u a n g , M . ; E l l e d g e , S . J . S c i e n c e 1 9 9 8 , 2 8 2 , 1 8 9 3 - 1 8 9 7 . ( e ) S a n c h e z , Y . , W o n g , C . , T h o m a , R . S . , R i c h m a n , R . , W u , Z . , P i w n i c a - W o r m s , H . , a n d E l l e d g e , S . J . S c i e n c e 1 9 9 7 , 2 7 7 , 1 4 9 7 - 1 5 0 1 . ( f ) C h a t u r v e d i , P . ; E n g , W . K . ; Z h u , Y . ; M a t t e m , M . R . ; M i s h r a , R . ; H u r l e , M . R . ; Z h a n g , X . ; A n n a n , R . 8 . ; L u , Q . ; F a u c e t t e , L . F . ; S c o t t , G . R ; L i , X . ; C a r r , S . A . ; J o h n s o n , R . K . ; W i n k l e r , J . D . ; Z h o u , B . B . O n c o g e n e 1 9 9 9 , 1 8 , 4 0 4 7 - 4 0 5 4 . B l a s i n a , A . ; V a n d e W e y e r , 1 . ; L a u s , M . C . ; L u y t e n , W . H . M . L . ; P a r k e r , A . E . ; M c G o w a n , C . C u r r . B i o l . 1 9 9 9 , 9 , 1 - 1 0 . ( a ) P e n g , C . - Y . ; G r a v e s , P . R . ; T h o m a , R . 8 . ; W u , 2 . ; S h a w , A . S . ; P i w n i c a - W o r m s , H . S c i e n c e 1 9 9 7 , 2 7 7 , 1 5 0 1 - 1 5 0 5 . ( b ) Y a n g , J . ; W i n k l e r , K . ; Y o s h i d a , M . ; K o m b l u t h , S . E M B O J . 1 9 9 9 , 1 8 , 2 1 7 4 - 2 1 8 3 . ( c ) D a l a l , S . N . ; S c h w e i t z e r , C . M . ; G a n , J . ; D e C a p r i o , J . M o l . C e l l . B i o l . 1 9 9 9 , 1 9 , 4 4 6 5 - 4 4 7 9 . ( d ) Z e n g , Y . ; P i w n i c a - W o r m s , H . M o l . C e l l . B i o l . 1 9 9 9 , 1 9 , 7 4 1 0 - 7 4 1 9 . E s a s h i , F . ; Y a n a g i d a , M . M o l . C e l l . 1 9 9 9 , 4 , 1 6 7 — 1 7 4 . T o c z y s k i , D . P . ; G a l g o c z y , D . J . ; H a r t w e l l , L . H . C e l l 1 9 9 7 , 9 0 , 1 0 9 7 — 1 1 0 6 . E v a n , G . ; L i t t l e g o o d , T . S c i e n c e , 1 9 9 8 , 2 8 1 , 1 3 1 7 - 1 3 2 2 . M e y n , M . S . C l i n G e n e t 1 9 9 9 , 5 5 , 2 8 9 — 3 0 4 . S a n d a l ] , L . L ; Z a k i a n , V . A . C e l l 1 9 9 3 , 7 5 , 7 2 9 - 7 3 9 . D i x o n , H . ; N o r b u r y , C . J . C e l l c y c l e 2 0 0 2 , I , 3 6 2 - 3 6 8 . ( a ) S ¢ r e n s e n , C . S . ; S y l j u l l s e n , R . G . ; F a l c k , J . ; S c h r o e d e r , T . ; R O n n s t r a n d , L . ; Z h o u , B . - B . ; B a r t e k , J . ; L u k a s , J . C a n c e r C e l l 2 0 0 3 , 3 , 2 4 7 — 2 5 8 . ( b ) C u r m a n , D . ; C i n e ] , B . ; W i l l i a m s , D . E . ; R u n d l e , N . ; B l o c k , W . D . ; G o o d a r z i , A . A . ; H u t c h i n s , J . R . ; C l a r k e , P . R . ; Z h o u , B . B . ; L e e s - M i l l e r , S . P . ; A n d e r s e n , R . J . ; R o b e r g e , M . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 1 , 2 7 6 , 1 7 9 1 4 - 9 . ( c ) J a c k s o n , J . R . ; G i l m a r t i n , A . ; I r n b u r g i a , C . ; W i n k l e r , J . D . ; M a r s h a l l , L . A . ; R o s h a k , A . C a n c e r R e s . 2 0 0 0 , 6 0 , 5 6 6 - 7 2 . ( d ) R o b e r g e , M . ; B e r l i n c k , R . G . ; X u , L . ; A n d e r s o n , H . J . ; L i m , L . Y . ; C u r m a n , D . ; S t r i n g e r , C . M . ; F r i e n d , S . H . ; D a v i e s , P . ; V i n c e n t , 1 . ; H a g g a r t y , S . J . ; K e l l y , M . 4 9 ) 5 0 ) 5 1 ) 5 2 ) 5 3 ) 5 4 ) 5 5 ) 5 6 ) 5 7 ) 5 8 ) T . ; B r i t t o n , R . ; P i e r s , E . ; A n d e r s e n , R . J . C a n c e r R e s . 1 9 9 8 , 5 8 , 5 7 0 1 - 6 . M e i j e r , L . ; R a y m o n d , E . A c c . C h e m . R e s . 2 0 0 3 , 3 6 , 4 1 7 - 4 2 5 . M a r k w a l d e r , J . A . ; A m o n e , M . R . ; B e n fi e l d , P . A . ; B o i s c l a i r , M . ; B u r t o n , C . R . ; C h a n g , C . H . ; C o x , S . S . ; C z e m i a k , P . M . ; D e a n , C . L . ; D o l e n i a k , D . ; G r a f s t r o m , R . ; H a r r i s o n , B . A . ; K a l t e n b a c h , R . E , 3 r d ; N u g i e l , D . A . ; R o s s i , K . A . ; S h e r k , S . R . ; S i s k , L . M . ; S t o u t e n , P . ; T r a i n o r , G . L . ; W o r l a n d , P . ; S e i t z , S . P . J . M e d . C h e m . 2 0 0 4 , 4 7 , 5 8 9 4 - 5 9 1 1 . M i s r a , R . N . ; X i a o , H . Y . ; K i m , K . S . ; L u , S . ; H a n , W . C . ; B a r b o s a , S . A . ; H u n t , J . T . ; R a w l i n s , D . B . ; S h a n , W . ; A h m e d , S . 2 . ; Q i a n , L . ; C h e n , B . C . ; Z h a o , R . ; B e d n a r z , M . S . ; K e l l a r , K . A . ; M u l h e r o n , J . G . ; B a t o r s k y , R . ; R o o n g t a , U . ; K a m a t h , A . ; M a r a t h e , P . ; R a n a d i v e , S . A . ; S a c k , J . S . ; T o k a r s k i , J . S . ; P a v l e t i c h , N . P . ; L e e , F . Y . ; W e b s t e r , K . R . ; K i m b a l l , S . D . , J . M e d . C h e m . 2 0 0 4 , 4 7 , 1 7 1 9 - 1 7 2 8 . ( a ) M i s r a , R . N . ; R a w l i n s , D . B . ; X i a o , H . Y . ; S h a n , W . ; B u r s u k e r , 1 . ; K e l l a r , K . A . ; M u l h e r o n , J . G . ; S a c k , J . S . ; T o k a r s k i , J . S . ; K i m b a l l , S . D . ; W e b s t e r , K . R . B i o o r g . M e d . C h e m . L e t t . 2 0 0 3 , 1 3 , 1 1 3 3 - 6 . ( b ) M i s r a , R . N . ; X i a o , H . ; R a w l i n s , D . B . ; S h a n , W . ; K e l l a r , K . A . ; M u l h e r o n , J . G . ; S a c k , J . S . ; T o k a r s k i , J . S . ; K i m b a l l , S . D . ; W e b s t e r , K . R . B i o o r g . M e d . C h e m . L e t t . 2 0 0 3 , 1 3 , 2 4 0 5 - 8 . M o s h i n s k y , D . J . ; B e l l a m a c i n a , C . R . ; B o i s v e r t , D . C . ; H u a n g , P . ; H u i , T . ; J a n c a r i k , J . ; K i m , S . H . ; R i c e , A . G . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 2 0 0 3 , 3 1 0 , 1 0 2 6 - 3 1 . L u k , K . C . ; S i m c o x , M . B . ; S c h u t t , A . ; R o w a n , K . ; T h o m p s o n , T . ; C h e n , Y . ; K a m m l o t t , U . ; D e P i n t o , W . ; D u n t e n , P . ; D e r r n a t a k i s , A . B i o o r g . M e d . C h e m . L e t t . 2 0 0 4 , 1 4 , 9 1 3 - 9 1 7 . M e t t e y , Y . ; G o m p e l , M . ; T h o m a s , V . ; G a m i e r , M . ; L e o s t , M . ; C e b a l l o s - P i c o t , I . ; N o b l e , M . ; E n d i c o t t , J . ; V i e r f o n d , J . M . ; M e i j e r , L . J . M e d . C h e m . 2 0 0 3 , 4 6 , 2 2 2 - 3 6 . S e o n g , Y . ; M i n , C ; L i , L . ; Y a n g , J . Y . ; K i m , S . ; C a o , X . ; K i m , K . ; Y u s p a , S . H . ; C h u n g , H . ; L e e , K . S . C a n c e r R e s . 2 0 0 3 , 6 3 , 7 3 8 4 - 7 3 9 1 . L i , Y . ; S u n , X . ; L a M o n t , J . T . ; P a r d e e , A . B . ; L i , C . J . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 2 0 0 3 1 0 0 , 2 6 7 4 — 2 6 7 8 . B a r t e k , J . ; L u k a s , J . C a n c e r c e l l 2 0 0 3 , 3 , 4 2 1 - 4 2 9 . ( b ) T a k a i , H . ; N a k a , K . ; O k a d a , Y . ; W a t a n a b e , M . ; H a r a d a , N . ; S a i t o , S . ; A n d e r s o n , C . W . ; A p p e l l a , B . ; N a k a n i s h i , M . ; S u z u k i , H . ; N a g a s h i m a , K . ; S a w a , H . ; I k e d a , K . ; M o t o y a m a , N . E M B O J . 2 0 0 2 , 2 1 , 5 1 9 5 - 5 2 0 5 . 4 5 5 9 ) 6 0 ) 6 1 ) 6 2 ) 6 3 ) 6 4 ) 6 5 ) 6 6 ) 6 7 ) 6 8 ) 6 9 ) 7 0 ) S h a r m a , V . ; T e p e , J . J . B i o o r g . M e d . C h e m . L e t t . 2 0 0 4 , 1 4 , 4 3 1 9 — 4 3 2 1 . S o r e n s o n , C . S . ; S y l j u é s e n , R . G . ; F a l c k , J . ; S c h r o e d e r , T . ; R b n n s t r a n d , L . ; K h a n n a , K . K . ; Z h o u , B . - B . ; B a r t e k , J . ; L u k a s , J . C a n c e r c e l l , 2 0 0 3 , 3 , 2 4 7 - 2 5 8 . M a i l a n d , N . ; F a l c k , J . ; L u k a s , C . ; S y l j u a s e n , R . G . ; W e l c k e r , M . ; B a r t e k , J . ; L u k a s , J . S c i e n c e , 2 0 0 0 , 2 8 8 , 1 4 2 5 - 1 4 2 9 . F a l c k , J . ; P e t r i n i , J . H . ; W i l l i a m s , B . R . ; L u k a s , J . ; B a r t e k , J . N a t . G e n e t . 2 0 0 2 , 3 0 , 2 9 0 — 2 9 4 . M a i l a n d , N . ; P o d t e l e j n i k o v , A . V . ; G r o t h , A . ; M a n n , M . ; B a r t e k , J . ; L u k a s , J . E M B O J . 2 0 0 2 , 2 1 , 5 9 2 1 - 5 9 2 9 . B a e u e r l e , P . A . ; H e n k e l , T . A n n u . R e v . I m m u n o l . 1 9 9 4 , 1 2 , 1 4 1 - 1 7 9 . B a l d w i n , A . S . , J r . A n n u . R e v . I m m u n o l . 1 9 9 6 , 1 4 , 6 4 9 - 6 8 3 . P e r k i n s , N . D . I n t . J . B i o c h e m . C e l l B i o l . 1 9 9 7 , 2 9 , 1 4 3 3 - 1 4 4 8 . W e b s t e r , G . A . ; P e r k i n s , N . D . M o l . C e l l B i o l . 1 9 9 9 , 1 9 , 3 4 8 5 - 3 4 9 5 . ( a ) D a s , K . C . ; W h i t e , C . W . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 7 , 2 7 2 , 1 4 9 l 4 - 1 4 9 2 0 . ( b ) B a l d w i n , A . S . J . C l i n . I n v e s t . 2 0 0 1 , 1 0 7 , 2 4 1 - 2 4 6 . ( c ) H i d e s h i m a , T . ; C h a u h a n , D . ; R i c h a r d s o n , P . , M i t s i a d e s , C . ; M i t s i a d e s , N . ; H a y a s h i , T . ; M u n s h i , N . ; D a n g , L . ; C a s t r o , A . ; P a l o m b e l l a , V . ; A d a m s , J . ; A n d e r s o n , K . C . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 2 , 2 7 7 , 1 6 6 3 9 - 1 6 6 4 7 . ( ( 1 ) B o t t e r o , V . ; B u s u t t i l , V . ; L o u b a t , A . ; M a g n e , N . ; F i s c h e l , J . L . ; M i l a n o , G . ; P e y r o n , J . F . C a n c e r R e s . 2 0 0 1 , 6 1 , 7 7 8 5 - 7 7 9 1 . ( e ) U r n , J . H . ; K a n g , C . D . ; L e e , B . G . ; K i m , D . W . ; C h u n g , B . S . ; K i m , S . H . O n c o g e n e 2 0 0 1 , 2 0 , 6 0 4 8 - 6 0 5 6 . ( f ) W e l d o n , C . B . ; B u r o w , M . E . ; R o l f e , K . W . ; C l a y t o n , J . L . ; J a f f e , B . M . ; B e c k m a n , B . S . S u r g e r y 2 0 0 1 , 1 3 0 , 1 4 3 - 1 5 0 . ( g ) A r l t , A . ; V o m d a m m , J . ; B r e i t e n b r o i c h , M . ; F o l s c h , U . R . ; K a l t h o f f , H . ; S c h m i d t , W . B . ; S c h a f e r , H . O n c o g e n e 2 0 0 1 , 2 0 , 8 5 9 - 8 6 8 . ( h ) L i u , 8 . ; Y u , Y . ; Z h a n g , M . ; W a n g , W . ; C a o , X . J . I m m u n o l . 2 0 0 1 , 1 6 6 , 5 4 0 7 - 5 4 1 5 . ( i ) K i m , J . Y . ; L e e , S . ; H w a n g b o , B . ; L e e , C . T . ; K i m , Y . W . ; H a n , S . K . ; S h i m , Y . S . ; Y o o , C . G . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 2 0 0 0 , 2 7 3 , 1 4 0 - 1 4 6 . L i n , Y . C . ; B r o w n , K . ; S i e b e n l i s t , U . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 1 9 9 5 , 9 2 , 5 5 2 - 5 5 6 . ( a ) K a r i n , M . ; L i n , A . N o t . I m m u n o l . 2 0 0 2 , 3 , 2 2 1 - 2 2 7 . ( b ) Z h o n g , H . ; S u Y a n g , H . ; E r d j u m e n t - B r o m a g e , H . ; T e m p s t , P . ; G h o s h , S . C e l l 1 9 9 7 , 8 9 , 4 1 3 - 4 2 4 . ( c ) S i z e m o r e , N . ; L e u n g , S . ; S t a r k , G . R . M o l . C e l l B i o l . 1 9 9 9 , 1 9 , 4 7 9 8 - 4 8 0 5 . ( d ) M a d r i d , L . V . ; W a n g , C . Y . ; G u t t r i d g e , D . C . ; S c h o t t e l i u s , A . J . ; B a l d w i n , A . 8 . , J r . ; M a y o , M . W . M o l . C e l l B i o l . 2 0 0 0 , 2 0 , 1 6 2 6 - 1 6 3 8 . 4 6 7 1 ) 7 2 ) 7 3 ) 7 4 ) 7 5 ) 7 6 ) 7 7 ) 7 8 ) 7 9 ) 8 0 ) 8 1 ) 8 2 ) 8 3 ) 8 4 ) 8 5 ) W u , M . X . ; A o , Z . ; P r a s a d , K . V . ; W u , R . ; S c h l o s s m a n , S . F . S c i e n c e 1 9 9 8 , 2 8 1 , 9 9 8 - 1 0 0 1 . P e r k i n s , N . D . ; F e l z i e n , L . K . ; B e t t s , J . C . ; L e u n g , K . ; B e a c h , D . H . ; N a b e l , G . J . , S c i e n c e 1 9 9 7 , 2 7 5 , 5 2 3 - 7 . ( a ) D e n g , C . ; Z h a n g , P . ; H a r p e r , J . W . ; E l l e d g e , S . J . ; L e d e r , P . C e l l 1 9 9 5 , 8 2 , 6 7 5 - 8 4 . ( b ) e l - D e i r y , W . S . ; H a r p e r , J . W . ; O ' C o n n o r , P . M . ; V e l c u l e s c u , V . E . ; C a n m a n , C . B . ; J a c k m a n , J . ; P i e t e n p o l , J . A . ; B u r r e l l , M . ; H i l l , D . B . ; W a n g , Y . ; W i m a n , K . G . ; M e r c e r , W . B . ; K a s t a n , M . B . ; K o h n , K . W . ; E l l e d g e , S . J . ; a n z l e r , K . W . ; V o g e l s t e i n , B . C a n c e r R e s . 1 9 9 4 , 5 4 , 1 1 6 9 - 7 4 . M i y a s h i t a , T . ; R e e d , J . C . C e l l 1 9 9 5 , 8 3 , 2 9 3 - 2 9 9 . ( a ) P e r k i n s , N . D . I n t . J . B i o c h e m . C e l l B i o l . 1 9 9 7 , 2 9 , l 4 3 3 - 1 4 4 8 . ( b ) N a k s h a t r i , H . ; B h a t - N a k s h a t r i , P . ; M a r t i n , D . A . ; G o u l e t , R . J . , J r . ; S l e d g e , G . W . , J r . M o l . C e l l . B i o l . 1 9 9 7 , 1 7 , 3 6 2 9 — 3 6 3 9 . H i e t a n e n , S . ; L a i n , S . ; K r a u s z , E ; B l a t t n e r , C . ; L a n e , D . P . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 2 0 0 0 , 9 7 , 8 5 0 1 - 8 5 0 6 . M a u r i c i , D . ; M o n t i , P . ; C a m p o m e n o s i , P . ; N o r t h , S . ; F r e b o u r g , T . ; F r o n z a , G . ; H a i n a u t , P . O n c o g e n e 2 0 0 1 , 2 0 , 3 5 3 3 - 3 5 4 0 . R e u t h e r , J . Y . ; R e u t h e r , G . W . ; C o r t e z , D . ; P e n d e r g a s t , A . M . ; B a l d w i n , A . 8 . , J r . G e n e s D e v . 1 9 9 8 , 1 2 , 9 6 8 - 8 1 . ( a ) M a d h u s u d a n , S . ; G a n e s a n , T . S . C l i n i c a l B i o c h e m . 2 0 0 4 , 3 7 , 6 1 8 - 6 3 5 . ( b ) D r u k e r , B . J . ; S a w y e r s , C . L . ; K a n t a r j i a n , H . ; R e s t a , D . J . ; R e e s e , S . R ; F o r d , J . M . ; C a p d e v i l l e , R . ; T a l p a z , M . N . E n g l . J . M e d . 2 0 0 1 ; 3 4 4 , 1 0 3 8 - 4 2 . N i m m a n a p a l l i , R . ; B h a l l a , K . C u r r . O p i n . O n c o l . 2 0 0 2 , 1 4 , 6 1 6 - 6 2 0 . K a r i n , M . ; B e n - N e r i a h , Y . A n n . R e v . o f I m m u n o l . 2 0 0 0 , 1 8 , 6 2 1 - 6 6 3 . ( a ) C h e n , F . E . ; H u a n g , D . - B . ; C h e n , Y . - Q . ; G h o s h , G . N a t u r e , 1 9 9 8 , 3 9 1 , 4 1 0 - 4 1 3 . ( b ) C h e n , Y . Q . ; G h o s h , S . ; G h o s h , G . N a t . S t r u c t . B i o l . , 1 9 9 8 , 5 , 6 7 - 7 3 . ( a ) B a e u e r l e , P . A . ; B a i c h w a l , V . R . A d v . I m m u n o l . 1 9 9 7 , 6 5 , 1 1 1 - 1 3 7 . ( b ) B a r n e s , P . J . ; K a r i n , M . N . E n g l . J . M e d . 1 9 9 7 , 3 3 6 , 1 0 6 6 - 1 0 7 1 . ( c ) S i e b e n l i s t , U . ; F r a n z o s o , G . ; B r o w n , K . A n n u . R e v . C e l l B i o l . 1 9 9 4 , 1 0 , 4 0 5 - 4 5 5 . B a i c h w a l , V . R . ; B a e u e r l e , P . A . C u r r . B i o l . 1 9 9 7 , 7 , R 9 4 - 9 6 . B e g , A . A . ; S h a , W . C . ; B r o n s o n , R . T . ; G h o s h , S . ; B a l t i m o r e , D . N a t u r e 1 9 9 5 , 3 7 6 , 1 6 7 — 1 7 0 . 4 7 8 6 ) 8 7 ) 8 8 ) 8 9 ) 9 0 ) 9 1 ) 9 2 ) 9 3 ) 9 4 ) 9 5 ) 9 6 ) 9 7 ) 9 8 ) 9 9 ) 1 0 0 ) W a n g , C . — Y . ; M a y o , M . W . ; B a l d w i n , A . S . J r , S c i e n c e 1 9 9 6 , 2 7 4 , 7 8 4 - 7 8 7 . ( a ) S h a r m a , V . ; L a n s d e l l , T . A . ; P e d d i b h o t l a , S . ; T e p e , J . J . C h e m . B i o l . 2 0 0 4 , 1 1 , 1 6 8 9 - 9 9 . ( b ) H u a n g , T . T . ; W u e r z b e r g e r - D a v i s , S . M . ; S e u f z e r , B . J . ; S h u m w a y , S . D . ; K u r a m a , T . ; B o o t h m a n , D . A . ; M i y a m o t o , S . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 0 , 2 7 5 , 1 3 , 9 5 0 1 - 9 5 0 9 . ( c ) Y e h , P . Y . ; C h u a n g , S . - E . ; Y e h , K . H . ; S o n g , Y . C . ; C h e n g , A . - L . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 2 0 0 3 , 6 6 , 2 5 - 3 3 . ( ( 1 ) S o d h i , A . ; S i n g h , R . A . K . I m m u n o l o g y L e t t . 1 9 9 8 , 6 3 , 9 - 1 7 . G r i l l i , M ; P i z z i , M ; M e m o , M ; S p a n o , P . F . S c i e n c e 1 9 9 6 , 2 7 4 , 1 3 8 3 - 1 3 8 5 . A m a n n , R ; P e s k a r , B . A . E u r . J . P h a r m a c o l . 2 0 0 2 , 4 4 7 , 1 - 9 . C a r t e r , B . D . ; K a l t s c h i m d t , C . ; K a l t s c h i m d t , B . ; O f f e n h a u s e r , N . ; B o h m - M a t t h a e i , R . ; B a e u e r l e , P . A . ; B a r d e , Y . — A . S c i e n c e 1 9 9 6 , 2 7 2 , 5 4 2 — 5 4 5 . G r i m m , S . ; B a u e r , M . K . A . ; B a e u e r l e , P . A . ; S c h u l z e - O s t h o f f , K . J . C e l l . B i o l . 1 9 9 6 , 1 3 4 , 1 3 — 2 3 . L i n , K . - I . ; L e e , S . - H . ; N a r a y a n a n , R . ; B a r a b a n , J . M . ; H a r d w i c k , J . M . R a t a n , R . R . J C e l l B i o l 1 9 9 5 , 1 3 1 , 1 1 4 9 — 1 1 6 1 . D o b l e , B . W . ; W o o d g e t t , J . R . J . C e l l . S c i . 2 0 0 3 , 1 1 6 , ( P t 7 ) , 1 1 7 5 - 8 6 . ( a ) H o e fl i c h K . P . ; L u o J . ; R u b i e E . A . ; T s a o M . S . ; J i n O . ; W o o d g e t t J . R . N a t u r e 2 0 0 0 , 4 0 6 , 8 6 — 9 0 . ( b ) T a k a d a Y . ; F a n g X . ; J a m a l u d d i n M . S . ; B o y d D . D . ; A g g a r w a l , B . B . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 4 , 2 7 9 , 3 9 5 4 1 — 5 4 . A r l t , A . ; G e h r z , A . ; M u e r k o s t e r , S . ; V o m d a m m , J . ; K r u s e , M . L . ; F o l s c h , U . R . ; S c h a f e r , H . O n c o g e n e 2 0 0 3 , 2 2 , 3 2 4 3 - 5 1 . W a t a n a b e , 1 . ; H a s e b e , T . ; S a s a k i , S . ; K o n i s h i , M . ; I n o u e , K . ; N a k a g o h r i , T . ; O d a , T . ; M u k a i , K . ; K i n o s h i t a , T . P a n c r e a s 2 0 0 3 , 2 6 , 3 2 6 - 3 3 . O u g o l k o v , A . V . ; F e m a n d e s - Z a p i c o , M . B . ; S a v o y , D . N . ; U r r u t i a , R . A . ; B i l l a d e a u , D . D . C a n c e r R e s . 2 0 0 5 , 6 5 , 2 0 7 6 - 2 0 8 1 . S c h w a b e , R . F . ; B r e n n e r , D . A . A m . J . P h y s i o l . G a s t r o i n t e s t . L i v e r P h y s i o l . 2 0 0 2 , 2 8 3 , G 2 0 4 - 1 1 . H e i n e m a n n V . O n c o l o g y 2 0 0 1 , 6 0 , 8 - 1 8 . T s a i , C . - M . ; C h a n g , K . - T . ; C h e n , J . - Y . ; C h e n , Y . - M . ; C h e n , M . - H . ; P e m g , R . - P . C a n c e r R e s . 1 9 9 6 , 5 6 , 7 9 4 - 8 0 1 . 4 8 1 0 1 ) 1 0 2 ) 1 0 3 ) 1 0 4 ) 1 0 5 ) 1 0 6 ) 1 0 7 ) 1 0 8 ) 1 0 9 ) 1 1 0 ) 1 1 1 ) 1 1 2 ) 1 1 3 ) 1 1 4 ) m p z / A v w w . c a n c e r h a c u p . g g . u k / T r e a t m e n t s / C h c m o t h e r a p y / l n d i v i d u a l d r u g s / G c m c i t a b i n e . ( a c c e s s e d 0 9 / 1 0 / 0 5 ) ( b ) R o b i n s o n , B . W . ; S h e w a c h , D . S . C l i n . C a n c e r R e s . 2 0 0 1 , 7 , 2 5 8 1 - 2 5 8 9 . O r l o w s k i , R . 2 . ; B a l d w i n , A . S . , J r . , T r e n d s i n M o l . M e d . 2 0 0 2 , 8 , 3 8 5 - 3 8 9 . W a n , Y . ; H u r , W . ; C h o , C . Y . ; L i u , Y . ; A d r i a n , F . J . ; L o z a c h , 0 . ; B a c h , S . ; M a y e r , T . ; F a b b r o , D . ; M e i j e r , L . ; G r a y , N . S . C h e m . B i o l . 2 0 0 4 , 1 1 , 2 4 7 - 5 9 . C u z z o c r e a , S . ; C h a t t e r j e e , P . K . ; M a z z o n , E . ; D u g o , L . ; S e n a i n o , 1 . ; B r i t t i , D . ; M a z z u l l o , G . ; C a p u t i , A . P . ; T h i e m e r m a n n , C . B r . J . P h a r m a c o l . 2 0 0 2 , I 3 5 , 4 9 6 - 5 1 0 . L e n z , W . T e r a t o l o g y 1 9 8 8 , 3 8 , 2 0 3 - 2 1 5 . K e i f e r , J . A . ; G u t t r i d g e , D . C . ; A s h b u m e r , B . P . ; B a l d w i n , A . S . , J r . , J . B i o l . C h e m . 2 0 0 1 , 2 7 6 , 2 2 3 8 2 - 7 . Y o s h i d a , S . ; O n o , M . ; S h o n o , T . ; I z u m i , H ; I s h i b a s h i , T . ; S u z u k i , H . ; K u w a n o , M . M o l . C e l l . B i o l . 1 9 9 7 , 1 7 , 4 0 1 5 - 4 0 2 3 . K o c h , A . B . ; P o l v e r i n i , P . J . ; K u n k e l , S . L . ; H a r l o w , L . A . ; D i P i e t r o , L . A . ; E l n e r , V . M . ; E l n e r , S . G . ; S t r i e t e r , R . M . S c i e n c e 1 9 9 2 , 2 5 8 , 1 7 9 8 - 1 8 0 1 . K a p a h i , P . ; T a k a h a s h i , T . ; N a t o l i , G . ; A d a m s , S . R . ; C h e n , Y . ; T s i e n , R . Y . ; K a r i n , M . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 0 , 2 7 5 , 3 6 0 6 2 - 6 . K w o k , B . H . ; K o h , B . ; N d u b u i s i , M . 1 . ; E l o f s s o n , M . ; C r e w s , C . M . C h e m . B i o l . 2 0 0 1 , 8 , 7 5 9 - 6 6 . Y a m a m o t o , Y . ; Y i n , M . — J . ; L i n , K . - M . ; G a y n o r , R . B . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 9 , 2 7 4 , 3 8 , 2 7 3 0 7 - 2 7 3 1 4 . S a g a r a , H . ; M a k i n o , S . ; C h i b a n a , N . ; O t a , M . ; H o l g a t e , S . T . ; C h u r c h , M . K . ; F u k u d a , T . I n t . A r c h . A l l e r g y I m m u n o l . 2 0 0 1 , 1 2 4 , 3 7 1 - 3 7 6 . ( a ) K o p p , B . ; G h o s h , S . S c i e n c e 1 9 9 4 , 2 6 5 , 9 5 6 - 9 5 9 . ( b ) Y i n , M . - J . ; Y a m a m o t o , Y . ; G a y n o r , R . B . N a t u r e 1 9 9 8 , 3 9 6 , 7 7 - 8 0 . ( a ) T h u n , M . J . ; N a m b o o d i r i , M . M . ; H e a t h , C . W . , J r . N . E n g l . J . M e d . 1 9 9 1 , 3 2 5 , 1 5 9 3 - 1 5 9 6 . ( b ) S u h , 0 . , M e t t l i n , C . , a n d P e t r e l l i , N . J . C a n c e r ( P h i l a . ) 1 9 9 3 , 7 2 , 1 1 7 1 - 1 1 7 7 ( c ) G i o v a n n u c c i , E . , R i m m , E . B . , S t a m p f e r , M . J . , C o l d i t z , G . A . , A s c h e r i o , A . , a n d W i l l e t t , W . C . A n n . I n t e r n . M e d . 1 9 9 4 , 1 2 1 , 2 4 1 - 2 4 6 . ( ( 1 ) G i o v a n n u c c i , E . , E g a n , K . M . , H u n t e r , D . J . , S t a m p f e r , M . J . , C o l d i t z , G . A . , W i l l e t t , W . C . , a n d S p e i z e r , F . E . N . E n g l . J . M e d . 1 9 9 1 , 3 3 3 , 6 0 9 - 6 1 4 . 4 9 1 1 5 ) 1 1 6 ) 1 1 7 ) 1 1 8 ) 1 1 9 ) 1 2 0 ) 1 2 1 ) 1 2 2 ) 1 2 3 ) 1 2 4 ) 1 2 5 ) 1 2 6 ) P i c k a r t , C . M . ; E d d i n s , M . J . B i o c h e m . B i o p h y . A c t a 2 0 0 4 , 1 6 9 5 , 5 5 - 7 2 . V e s c i o , R . A . ; B e r e n s o n , J . R . I n : J . S . B e r e k ( e d . ) , C a n c e r T r e a t m e n t , 5 ‘ h e d . , 2 0 0 1 , 1 5 0 3 - 1 5 3 9 . F e i n m a n , R . ; K o u r y , J . ; T h a m e s , M . ; B a r l o g i e , B . ; E p s t e i n , J . ; S i e g e ] , D . 8 . B l o o d 1 9 9 9 , 9 3 , 3 0 4 4 - 5 2 . M a , M . H . ; Y a n g , H . H . ; P a r k e r , K . ; M a n y a k , S . ; F r i e d m a n , J . M . ; A l t a m i r a n o , C . ; W u , 2 . Q . ; B o r a d , M . J . ; F r a n t z e n , M . ; R o u s s o s , E . ; N e e s e r , J . ; M i k a i l , A . ; A d a m s , J . ; S j a k - S h i e , N . ; V e s c i o , R . A . ; B e r e n s o n , J . R . C l i n . C a n c e r R e s . 2 0 0 3 , 9 , 1 1 3 6 - 4 4 . ( a ) S c h m i t t , B . ; C i m o l i , G . ; S t e y a e r t , A . ; B e r t r a n d , R . E x p . C e l l R e s . 1 9 9 8 , 2 4 0 , 1 0 7 - 1 2 1 . ( b ) L e t a i , A . ; B a s s i k , M . C . ; W a l e n s k y , L . D . ; S o r c i n e l l i , M . D . ; W e i l e r , S . ; K o r s m e y e r , S . J . C a n c e r C e l l 2 0 0 2 , 2 , 1 8 3 - 1 9 2 . ( c ) W e b b , A . ; C u n n i n g h a m , D . ; C o t t e r , P . ; C l a r k , P . A . ; d i S t e p h a n o , E ; R o s s , P . ; C o r b o , M . ; D z i e w a n o w s k a , Z . L a n c e t 1 9 9 7 , 3 4 9 , 1 1 3 7 . V a y s s i e r e , J . L . ; P e t i t , P . X . ; R i s l e r , Y . ; M i g n o t t e , B . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 1 9 9 4 , 9 1 , 1 1 7 5 2 . ( a ) L i n d s t e n , T . ; R o s s , A . J . ; K i n g , A . ; l o n g , W . X . ; R a t h m e l l , J . C . ; S h i e l s , H . A . ; U l r i c h , E . ; W a y m i r e , K . G . ; M a h a r , P . ; F r a u w i r t h , K . ; C h e n , Y . ; W e i , M . ; E n g , V . M . ; A d e l m a n , D . M . ; S i m o n , M . Q ; M a , A . ; G o l d e n , J . A . ; E v a n , G . ; K o r s m e y e r , S . J . ; M a c G r e g o r , G . R . ; T h o m p s o n , C . B . M a l . C e l l 2 0 0 0 , 6 , 1 3 8 9 . ( b ) W e i , M . C . ; Z o n g , W . X . ; C h e n g , E . H . ; L i n d s t e n , T . ; P a n o u t s a k o p o u l o u , V . ; R o s s , A . J . ; R o t h , K . A . ; M a c G r e g o r , G . R . ; T h o m p s o n , C . B . ; K o r s m e y e r , S . J . S c i e n c e , 2 0 0 1 , 2 9 2 , 7 2 7 . ( a ) A n t o n s s o n , B . ; M o n t e s s u i t , S . ; S a n c h e z , B . ; M a r t i n o u , J . C . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 1 , 2 7 6 , 1 1 6 1 5 . ( b ) E s k e s , R . ; D e s a g h e r , S . ; A n t o n s s o n , B . ; M a r t i n o u , J . C . M o l . C e l l . B i o l . 2 0 0 0 , 2 0 , 9 2 9 . ( a ) N e c h u s h t a n , A . ; S m i t h , C . L . ; L a m e n s d o r f , 1 . ; Y o o n , S . H . ; Y o u l e , R . J . J . C e l l B i o l . 2 0 0 1 , 1 5 3 , l 2 6 5 . ( b ) G r i f fi t h s , G . J . ; D u b r e z , L . ; M o r g a n , C . P . ; J o n e s , N . A . ; W h i t e h o u s e , J . ; C o r f e , B . M . ; D i v e , C . ; H i c k m a n , J . A . J . C e l l B i o l . 1 9 9 9 , 1 4 4 , 9 0 3 . T s u j i m o t o , Y . ; C o s m a n n , J . ; J a f f e , E . ; C r o c e , C . S c i e n c e , 1 9 8 5 , 2 2 8 , 1 4 4 0 . C a m p o s , L . ; R o u a u l t , J . P . ; S a b i d o , 0 . ; O r i o l , P . ; R o u b i , N . ; V a s s e l o n , C . ; A r c h i m b a u d , B . ; M a g a u d , J . P . ; G u y o t a t , D . B l o o d 1 9 9 3 , 8 1 , 3 0 9 1 . H e r m i n e , 0 . ; H a i o u n , C . ; L e p a g e , B . ; d ’ A g a y , M . F . ; B r i e r e , J . ; L a v i g n a c , C . ; F i l l e t , G . ; S a l l e s , G . ; M a r o l l e a u , J . P . ; D i e b o l d , J . ; R e y a s , F . ; G a u l a r d , P . B l o o d , 5 0 1 2 7 ) 1 2 8 ) 1 2 9 ) 1 3 0 ) 1 3 1 ) 1 3 2 ) 1 3 3 ) 1 3 4 ) 1 3 5 ) 1 3 6 ) 1 3 7 ) 1 9 9 6 , 8 7 , 2 6 5 . S t u r r n , I . ; K o h n e , C . H . ; W o l f f , G . ; P e t r o w s k y , H . ; H i l l e b r a n d , T . ; H a u p t m a n n , S . ; L o r e n z , M . ; ‘ D o r k e n , B . ; D a n i e l , P . T . J . C l i n . O n c o l . 1 9 9 9 , I 7 , 1 3 6 4 . S c h i l l e r , A . B . ; C l a r k , W . S . ; C o t s o n i s , G . ; L a w s o n , D . ; D e R o s e , P . B . ; C o h e n , C . C y t o m e t r y , 2 0 0 2 , 5 0 , 2 0 3 . J a n s e n , B . ; Z a n g e m e i s t e r - W i t t k e , U . L a n c e t O n c o l . 2 0 0 2 , 3 , 6 7 2 . D o n i s - K e l l e r , H . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 9 7 9 , 7 , 1 7 9 . D e C e s a r e , M . ; P e r e g o , P . ; R i g h e t t i , S . C . ; P r a t e s i , G . ; C a r e n i n i , N . ; R i v o l t i n i , L . ; Z u p i , G . ; D e l B u f a l o , D . ; B a l s a r i , A . ; Z u n i n o , F . E u r . J . C a n c e r 2 0 0 5 , 4 1 , 1 2 1 3 - 1 2 2 2 . ( a ) K l a s a , R . J . ; G i l l u m , A . M . ; K l e m , R . B . ; F r a n k e l , S . R . A n t i s e n s e N u c l e i c A c i d D r u g D e v 2 0 0 2 , 1 2 , 1 9 3 - 2 1 3 . ( b ) K i m , R . ; E m i , M . ; T a n a b e , K . ; T o g e , T . C a n c e r 2 0 0 4 , 1 0 1 , 2 4 9 1 - 2 5 0 2 . J a n s e n , B . ; W a c h e c k , V . ; H e e r e - R e s s , B . ; S c h l a g b a u e r - W a d l , H . ; H o e l l e r , C . ; L u c a s , T . ; H o e r m a n n , M . ; H o l l e n s t e i n , U . ; W o l f f , K . ; P e h a m b e r g e r , H . L a n c e t 2 0 0 0 , 3 5 6 , 1 7 2 8 - 1 7 3 3 . M i l l w a r d , M . J . ; B e d i k i a n , A . Y . ; C o n r y , R . M . ; G o r e , H . B . ; P e h a m b e r g e r , W . S t e r r y ; P a v l i c k , A . C . ; D e C o n t i , R . G ; G o r d o n , D . ; I t r i L . M . P r o c . A m . S o c . C l i n . O n e a l . 2 0 0 4 , 7 0 8 , 7 5 0 5 . K i m , K . M . ; G i e d t , C . D . ; B a s a n e z , G . ; O ’ N e i l , J . W . ; H i l l , J . J . ; H a n , Y . H . ; T z u n g , S . P . ; Z i m m e r b e r g , J . ; H o c k e n b e r y , D . M . ; Z h a n g , K . Y . B i o c h e m i s t r y 2 0 0 1 , 4 0 , 4 9 1 1 . D e g e t e r e v , A . ; L u g o v s k o y , A . ; C a r d o n e , M . ; M u l l e y , B . ; W a g n e r , G . ; M i t c h i s o n , T . ; Y u a n . J . N a t . C e l l B i o l . 2 0 0 1 , 3 , 1 7 3 - 1 8 2 . W a n g J . L . ; Z h a n g , 2 . J . ; C h o k s k i , S . ; S h a n , S . ; L u , 2 . ; C r o c e , C . m . ; A l n e m r i , E . S . ; K o m g o l d , R . ; H u a n g , 2 . C a n c e r R e s . 2 0 0 0 , 6 0 , 1 4 9 8 . 5 1 C H A P T E R I I 8 - S U B S T I T U T E D X A N T H I N E D E R I V A T I V E S : P O T E N T I A T I O N O F C H E M O T H E R A P Y B Y N F - K B I N H I B I T I O N A b s e n c e o f e v i d e n c e i s n o t e v i d e n c e f o r a b s e n c e . . . . . . . . . A . B i o l o g i c a l i m p o r t a n c e o f x a n t h i n e s c a f f o l d E x t r a c e l l u l a r a d e n o s i n e i s i n v o l v e d i n a v a r i e t y o f c y t o p r o t e c t i v e c e l l u l a r r e s p o n s e s l i k e t a m i n g t h e h e a r t a g a i n s t i s c h e m i a , c o u n t e r a c t i n g t h e d a m a g i n g e f f e c t s o f e x c i t o t o x i c i t y a n d s e i z u r e a c t i v i t y a n d s u p p r e s s i n g e x c e s s i v e i n fl a m m a t i o n a n d i m m u n e r e s p o n s e s . I T h e r e a r e n u m e r o u s p o s s i b i l i t i e s f o r t h e r a p e u t i c i n t e r v e n t i o n v i a m o d u l a t i o n o f a d e n o s i n e r e c e p t o r s . A d e n o s i n e h a s a w i d e r a n g e o f p h y s i o l o g o c a l a c t i v i t i e s a r i s i n g f r o m i t s i n t e r a c t i o n w i t h t h e P 1 p u r i n o c e p t o r , w h i c h i s a c l a s s o f G - p r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o r ( G P C R ) a n d h a s b e e n f u r t h e r s u b c l a s s i fi e d i n t o f o u r t y p e s - A . , A Z A , A 2 3 a n d A 3 . 2 U s u a l l y , t h e t h e r a p e u t i c i n t e r e s t s p e r t a i n i n g a d e n o s i n e r e c e p t o r s a r e r e l a t e d t o a n t i - i n fl a m m a t o r y e f f e c t s , 3 c a r d i o - p r o t e c t i v e , 4 c e r e b r o - p r o t e c t i v e , 5 a n t i - c a n c e r , 6 d i f f e r e n t i a t i o n a n d e m b r y o g e n e s i s 7 a n d a n t i - g l a u c o m a 8 e f f e c t s . B . X a n t h i n e d e r i v a t i v e s a n d i n fl a m m a t i o n r e l a t e d d i s o r d e r s . X a n t h i n e d e r i v a t i v e s r e l a x a d u l t a i r w a y s m o o t h m u s c l e ( A S M ) . S h a f f e r e t a l h a v e s h o w n a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n t h e a c t i v e t e n s i o n d u e t o a c e t y l c h o l i n e . 9 S e v e r a l o t h e r r e p o r t s s h o w t h e b r o n c h o d i l a t o r y e f f e c t o f c a f f e i n e a n d t h e o p h y l l i n e i n a s t h m a t i c p a t i e n t s b e t w e e n 8 - 1 0 y e a r s o f a g e . l o C a f f e i n e i s a l s o k n o w n t o r e d u c e t h e b r o n c h o c o n s t l i c t i o n e f f e c t i n m i l d a s t h m a d u e t o h i s t a m i n e . l l K o c a n d c o w o r k e r s p e r f o r m e d a n i m a l m o d e l s t o s h o w t h a t p e n t o x y p h y l l i n e u s a g e m a y 5 2 r e d u c e t h e r i s k s o f i s c h e m i c - r e p e r f u s i o n i n j u r y d u r i n g a n d f o l l o w i n g c a r d i o p u l m o n a r y b y p a s s a n d a o r t i c c r o s s - c l a m p i n g i n d i c a t i n g t h a t p e n t o x y p h y l l i n e w a s s h o w n t o h a v e p r e s e r v a t i v e e f f e c t s f o r m y o c a r d i a l f u n c t i o n s i n h e a r t a f t e r t r a u m a m A p a r t f r o m a d e n o s i n e i t s e l f a n d l o n g - e s t a b l i s h e d a n t a g o n i s t s s u c h a s t h e o p h y l l i n e a n d c a f f e i n e t h e r e a r e n o n e w a d e n o s i n e r e c e p t o r a g o n i s t o r a n t a g o n i s t d r u g m o l e c u l e s c u r r e n t l y i n c l i n i c a l u s e . I n V i e w o f t h e w i d e s p r e a d a c t i o n s o f a d e n o s i n e i n t h e c a r d i o v a s c u l a r s y s t e m a n d t h e p o s s i b l e r o l e o f a d e n o s i n e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f m a n y d i s e a s e s a f f e c t i n g t h e c a r d i o v a s c u l a r s y s t e m , n e w a g e n t s t h a t m o d u l a t e a d e n o s i n e a c t i o n s h a v e c o n s i d e r a b l e t h e r a p e u t i c p o t e n t i a l . T h e m a i n d i s e a s e s u n d e r c o n s i d e r a t i o n a r e h y p e r t e n s i o n , m y o c a r d i a l i s c h e m i a ( i n f a r c t i o n ) , c e r e b r a l i s c h e m i a ( s t r o k e ) , s u p r a v e n t r i c u l a r t a c h y c a r d i a , r e n a l f a i l u r e , h e a r t f a i l u r e a n d p e r i p h e r a l i s c h e m i a ( i n t e r m i t t e n t c l a u d i c a t i o n ) . T h e r e i s g r o w i n g i n t e r e s t i n t h e r o l e o f a d e n o s i n e i n i n fl a m m a t o r y d i s o r d e r s a s t h e y r e l a t e t o c e r e b r o v a s c u l a r a n d m y o c a r d i a l i s c h e m i a a n d a c t i o n s o f a d e n o s i n e r e c e p t o r a g o n i s t s a n d a n t a g o n i s t s o n n e u t r o p h i l a n d m a s t c e l l f u n c t i o n . A p p l i c a t i o n s i n t h e t r e a t m e n t o f r e n a l d y s f u n c t i o n a n d a s d i u r e t i c s ' Z b ' ' 2 ‘ : t r e a t m e n t o f a r e c l a i m e d f o r n o v e l a d e n o s i n e A , r e c e p t o r a n t a g o n i s t s , d e p r e s s i o n , 1 2 d a n d t r e a t m e n t o f s u p r a v e n t r i c u l a r a r r y t h m i a s m d i c t a t e t h e p o t e n t i a l o f x a n t h i n e a n d r e l a t e d m o l e c u l e s i n t h e r a p y . A d e n i n e d e r i v a t i v e s s u c h a s r e v e r s i n e ( F i g u r e I I - l ) h a v e b e e n s h o w n t o b e s e l e c t i v e A 3 a n t a g o n i s t s . I 3 3 X a n t h i n e s s u c h a s c a f f e i n e a n d t h e o p h y l l i n e a r e c l a s s i c a l a d e n o s i n e a n t a g o n i s t s b u t o f m u c h l o w a f fi n i t y f o r A 3 t h a n f o r A 1 , A 2 1 o r A 2 3 r e c e p t o r s . P S B - 1 0 a n d P S B - l l ( F i g u r e I I - l ) a r e w a t e r s o l u b l e d e r i v a t i v e s o f 5 3 x a n t h i n e s a n d h i g h l y p o t e n t a n t a g o n i s t s o f a d e n o s i n e . I n v i v o s t u d i e s s u g g e s t t h a t A 3 r e c e p t o r s a r e i n v o l v e d i n a n u m b e r o f d i s o r d e r s o f t h e c e n t r a l n e r v o u s a n d c a r d i o v a s c u l a r s y s t e m s ( A ; a n d A 2 A ) , p a i n ( A 1 ) a n d w o u n d h e a l i n g ( A 2 A ) a s w e l l a s t h o s e i n i n fl a m m a t i o n ( d i a b e t i c f o o t u l c e r s ( A z A ) , c o l o r e c t a l c a n c e r ( A 3 ) a n d r h e u m a t o i d a r t h r i t i s ( A 3 ) . 1 3 b 5 4 0 H 9 ' H N ‘ \ " . O H N N “ H N a t ' / > ” W W 0 I I N N V N H O X a n t h i n e A d e n o s i n e N N H / \ ( I \ N / _ N _ _ N H P h ) 1 R n N N A C l — Q — N i o \ [ J — g ) _ N N . H O H 0 z o \ H O . 3 O H P S B - 1 1 R = P h A r o f y l l i n e P S B - 1 0 R = 2 , 3 , 5 - t r i c h l o r o p h e n y l l B - M E C A o O / O o g 0 . H / u \ / \ / \ N N M N N \ / \ N I N > a t l / > 4 K ' , > a t , o N N o N N 0 I ? N l l H P e n t o x y p h y l l i n P r o p e n t o p h y l l i n e E n p r o f y l l i n e ° / o o / f i t ) “ ” 1 “ W T ) ’ | N I / > / C a f f e i n e ‘ l ' h e o p h y l l i n e T h e o b r o m i n e N A N H s / s H \ N \ N ~ 3 3 “ I » ” I » Q N = < / — \ O J ‘ N N C A N N H N — - < > — N o 1 | L / R e s e r v i n e T h i o c a f f e i n e T h i o t h e o p h y l l i n e F i g u r e I I - l . X a n t h i n e d e r i v a t i v e s T h e s e l e c t i v e A 3 r e c e p t o r a g o n i s t I B - M E C A ( F i g u r e I I - l ) h a s b e e n s h o w n t o i n d u c e b e h a v i o r a l d e p r e s s a n t e f f e c t s . ” a C h r o n i c t r e a t m e n t w i t h I B - M E C A i m p r o v e d t h e p o s t - i s c h e m i c c e r e b r a l b l o o d c i r c u l a t i o n w h i l e a c u t e t r e a t m e n t s s h o w e d o p p o s i t e e f f e c t s . 1 4 b A d e c r e a s e i n t h e i n t r a c e l l u l a r C A M P l e v e l s a f t e r 5 5 s t i m u l a t i o n w i t h C D 2 8 c a u s e s T - c e l l a c t i v a t i o n . P h o s p h o d i e s t e r a s e ( P D E 4 o r P D E 7 ) a p p e a r t o p a r t i c i p a t e p r e d o m i n a n t l y i n t h i s a c t i v a t i o n a n d i n h i b i t i o n o f t h e P D E 4 o r P D E 7 a c t i v i t y r e d u c e s T - c e l l a c t i v a t i o n a n d p r o d u c t i o n o f p r o - i n fl a m m a t o r y c y t o k i n e s . ” C . C o n t r o l l i n g k i n a s e s : x a n t h i n e s i n c a n c e r t h e r a p y A n i d e a l t a r g e t f o r s m a l l m o l e c u l e d r u g d i s c o v e r y i s o n e t h a t i s e s s e n t i a l f o r t h e d i s e a s e d s t a t e a n d n o n - e s s e n t i a l f o r n o r m a l t i s s u e s . A r e c e n t e m e r g i n g c l a s s o f s u c h a s t a r g e t i s B e r - A b ] , w h i c h i s t a r g e t e d b y t h e w e l l k n o w n a g e n t , G l e e v e c . I 6 A c o m m o n d r u g - l i k e f e a t u r e o f t h e k i n a s e f a m i l y i s t h e i r a b i l i t y t o b i n d t o A T P . T h e A T P b i n d s i n a h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t w h e r e i t i s s t a b i l i z e d b y h y d r o g e n - b o n d s . ” T h u s , p l a n a r , a r o m a t i c h e t e r o c y c l i c s t r u c t u r e s s u c h a s p u r i n e s a r e a m e n a b l e a s k i n a s e i n h i b i t o r s a n d h a v e m a d e k i n a s e s e m i n e n t d r u g t a r g e t s . T h e c e l l c y c l e p l a y s a v i t a l r o l e i n t h e g r o w t h , d e v e l o p m e n t a n d c e n t r a l r e g u l a t i o n o f a l l l i f e . ' 8 D e r e g u l a t i o n o f t h i s c o n t r o l v i a a c c u m u l a t i o n o f d e f e c t s i s o n e o f t h e i n i t i a l e v e n t s i n t h e d e v e l o p m e n t o f c a n c e r . 1 9 C e l l c y c l e a n d c e l l d i v i s i o n a r e i s t i g h t l y r e g u l a t e d a n d o r g a n i z e d b y b i o c h e m i c a l s i g n a l s i n v o l v i n g k i n a s e s . W h e n t h e c e l l c o m m i t s t o d i v i d e , i t p r e p a r e s f o r d i v i s i o n ( l a t e G l ) , d u p l i c a t e s D N A ( S - p h a s e ) , a n d s e p a r a t e s t h e c h r o m o s o m e s i n t o t h e d a u g h t e r n u c l e i ( M - p h a s e ) . T h e s e t r a n s i t i o n s a r e m e d i a t e d b y C D K S , c y c l i n s a n d a l s o c h e c k p o i n t k i n a s e s . 2 0 C y c l i n s a n d C D K s a r e r e g u l a t o r y p a r t n e r s a n d t h e i r a s s o c i a t i o n i n c r e a s e s t h e c a t a l y t i c a c t i v i t y o f C D K S . 2 ' M u t a n t s o f C D K s e i t h e r a r r e s t c e l l s a t G 2 / M o r c o u l d e v e n b l o c k c e l l c y c l e a t G 1 s t a g e . 2 2 C D K a c t i v i t y i s d e r e g u l a t e d i n c a n c e r . 5 6 ( 6 1 [ G I % - ( ’ S \ E t / V - — — 2 F r ’ a n s m " r m Q v p e p r r r l p s ' e a s s - ' i / O l o H g n e o r R s e u w t l l I 6 R l p r . E D l ’ ' z — — — @ l = _ . . _ . G w t h . e u - R s 1 @ e a a e P P v S r t r s r l ‘ 5 5 n s i W i ‘ o t n i p o o n U n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s , C D K s ( c o m p r i s i n g o f a c a t a l y t i c C D K s u b u n i t a n d a n a c t i v a t i n g c y c l i n ) , c o n t r o l v a r i o u s s t a g e s o f c e l l c y c l e b y a c t i n g a s o n / o f f s w i t c h e s . W h e n a C D K i s o n , t h e c e l l c y c l e p r o g r e s s e s t h r o u g h t h e s t a g e t h a t t h e p a r t i c u l a r C D K c o n t r o l s . W h e n a C D K i s o f f , t h e c e l l c y c l e s t o p s w h e n i t r e a c h e s t h e s t a g e c o n t r o l l e d b y t h a t C D K . 1 ) R e g u l a t i o n o f C D K s : W h e n fi r s t s y n t h e s i z e d t h e C D K s a r e n o t a c t i v e , h o w e v e r , b i n d i n g t o c y c l i n s i m p a r t s t h e m p a r t i a l a c t i v i t y ( F i g u r e I I - 2 a ) . | | - 2 a C D K l l - 2 b C D K i n a c t i v e “ H Q — ( 3 V 8 . N C E Y C I I l } p 1 6 I N K 4 _ _ l \ / C D K - C y c C D K - C y c P a r t i a l l y a c t i v e P a r t i a l l y a c t i v e C d k - A c t l v a t l n g . C d k - A c t l v a t l n g k : K l n a s e ( C A K ) p 2 7 c ' p \ / — — ' k : K l n a s e ( C A K ) C D K - C y c - P . C D K - C y c - P A c t i v e A c t i v e F i g u r e I I - 2 a . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f r e g u l a t i o n o f C D K a c t i v i t y . I I - 2 b . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f r e g u l a t i o n o f C D K a c t i v i t y i n p r e s e n c e o f p 1 6 o r p 2 7 ( i n h i b i t o r s o f C D K a c t i v i t y ) . l s T h i s i s a k e y s t e p s i n c e l e v e l s o f c y c l i n s a r e c o n t r o l l e d b y t r a n s c r i p t i o n a n d u b i q u i t i n - m e d i a t e d d e g r a d a t i o n . 2 l b C y c l i n b i n d i n g a c t i v a t e s t h e k i n a s e b y c a u s i n g 5 7 c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s . ” F u r t h e r , t h e r e g u l a t i o n i s c o n t r o l l e d b y a p h o s p h o r y l a t i o n e v e n t o n T h r b y C d k - A c t i v a t i n g K i n a s e ( C A K ) w h i c h i n c r e a s e s t h e a c t i v i t y o f t h e c o m p l e x > 1 0 0 f o l d s . 2 1 c p 1 6 I N K a n d p 2 7 C i p c a u s e i n h i b i t i o n o f f o r m a t i o n / a c c u m u l a t i o n o f t h e a c t i v e p h o s p h o r y l a t e d C D c h y c l i n c o m p l e x . p l 6 I N K c a u s e s a l l o s t e r i c c h a n g e s i n C d k t o p r o p o g a t e a n d a l t e r t h e c y c l i n b i n d i n g s i t e . T h e s e a l l o s t e r i c c h a n g e s b y p l 6 I N K d i s t o r t t h e a d j a c e n t A T P b i n d i n g s i t e l e a d i n g t o a r e d u c t i o n i n t h e A T P a f fi n i t y . 2 1 d p 2 7 o n t h e o t h e r h a n d , m i m i c s A T P a n d a l t e r s t h e s h a p e o f t h e c a t a l y t i c c l e f t ? ” H e n c e , d e c r e a s e i n d o w n r e g u l a t o r s o f C D K ( s u c h a s p 1 6 , p 2 1 o r p 2 7 ) o r a n i n c r e a s e i n c y c l i n a n d C D K s w o u l d u l t i m a t e l y c u l m i n a t e i n t h e s a m e e f f e c t , a n i n c r e a s e i n c e l l p r o l i f e r a t i o n . 2 3 A l m o s t a l l c a n c e r s c a n t h u s b e s e e n t o h a v e m u t a t i o n s o r d y s f u n c t i o n a l g e n e s w h i c h c a n l e a d t o i n c r e a s e d C D K a c t i v i t y . 2 0 F o r e x a m p l e , d e c r e a s e i n p 2 7 l e v e l s i n b r e a s t c a n c e r c e l l s c o n t r i b u t e s t o c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d i s a p r o g n o s t i c m a r k e r o f t h e d i s e a s e . O v e r e x p r e s s i o n o f c d c 2 5 A “ a n d f r e q u e n t m u t a t i o n s i n t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s s u c h a s p 1 6 , p 2 1 , R b e . g . h y p e r r n e t h y l a t i o n , 2 5 e x e m p l i f y a l a r g e v a r i e t y o f c a n c e r m u t a t i o n s a r i s i n g d u e t o d e r e g u l a t i o n o f C D K S . A l a r g e p e r c e n t a g e o f c a n c e r s a l s o g e t a n i n c r e a s e d C D K a c t i v i t y d u e t o a l t e r a t i o n s i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n i n c l u d i n g R a s , c y t o p l a s m i c k i n a s e s e t c . G i v e n t h e i m p o r t a n c e o f C D K S i n c e l l c y c l e c o n t r o l a n d t h e a l t e r e d e x p r e s s i o n i n c a n c e r s , t h e r e i s a c o n s i d e r a b l e e f f o r t f o c u s e d o n t h e d e v e l o p m e n t o f s m a l l m o l e c u l e i n h i b i t o r s o f C D K s o r t h e e n z y m a t i c a c t i v i t y o f t h e c y c l i n : C D K c o m p l e x . 6 - d i m e t h y l a m i n o p u r i n e w a s t h e fi r s t i n h i b i t o r f o r C D K l , t h o u g h i t w a s f o u n d t o b e f a i r l y n o n - s p e c i fi c a n d w e a k ( I C 5 0 = 1 2 0 u M ) ( F i g u r e I I - 3 ) 5 8 C O O H \ N / H ‘ N ’ © : C l t i l K 1 5 2 5 " ” H o ” , 2 ‘ 6 - d i m e t h y l a m i n o p u r i n e P U W 8 ' 6 " 0 ' - B l o 5 0 ( C D K 1 ) = 1 2 0 u M l o $ 0 ( C D K 1 ) = 0 . 0 0 6 l t M F i g u r e I I - 3 . S t r u c t u r e o f p u r i n e b a s e d k i n a s e i n h i b i t o r s C a f f e i n e a n d t h e o p h y l l i n e ( F i g u r e I I - l ) a r e n a t u r a l l y o c c u r r i n g m e t h y l x a n t h i n e c o m p o u n d s o f t e n f o u n d i n m i c r o m o l a r q u a n t i t i e s i n c i r c u l a t i o n a s a r e s u l t o f d i e t a r y i n t a k e . S h e p h e r d e t a l 2 6 “ s h o w e d t h a t c a f f e i n e a n d t h e o p h y l l i n e d i r e c t l y i n h i b i t p 1 1 0 8 a n d o t h e r p h o s p h o i n o s i t o l k i n a s e s ( P I 3 K ) . T h i s i n h i b i t i o n o f P 1 3 K b y m e t h y l x a n t h i n e s c o u l d h a v e b e n e fi c i a l t h e r a p e u t i c e f f e c t s i n a t l e a s t t h r e e s i t u a t i o n s . F i r s t l y , t h e o p h y l l i n e h a s b e e n d e s c r i b e d t o p r o m o t e a p o p t o s i s w h i l e c a f f e i n e c a n s e n s i t i z e c e l l s t o a p o p t o s i s 2 6 M i n d i c a t i n g t h a t t h e s e a g e n t s m i g h t p r o v e t o b e u s e f u l i n c a n c e r c h e m o t h e r a p y d i r e c t l y o r i n c o m b i n a t i o n w i t h o t h e r c l i n i c a l l y u s e d d r u g s . T h e p r o - a p o p t o t i c e v e n t s m a y o c c u r t h r o u g h i n h i b i t i o n o f A T M — a n d R a d 3 r e l a t e d k i n a s e . ” C l a s s I A P I 3 K S i n h i b i t a p o p t o s i s , h e n c e m e t h y l x a n t h i n e s t h a t a r e i n h i b i t o r s o f c l a s s [ A P I 3 K s w o u l d p r o m o t e a p o p t o s i s . 2 8 T h i s i n h i b i t i o n a f f e c t i n g P I 3 K , A T M a n d R a d - 3 r e l a t e d k i n a s e m i g h t b e u s e f u l i n t r e a t m e n t o f c a n c e r . ” C l a s s I B P I 3 K a c t i v i t y r e d u c e s A D P - i n d u c e d p l a t e l e t a g g r e g a t i o n , 3 0 i n d i c a t i n g t h a t i n h i b i t i o n o f P I 3 K m a y b e u s e f u l i n t r e a t i n g t h r o m b o s i s . F i n a l l y , t h e p 1 1 0 6 i s o f o r m o f c l a s s I A P I 3 K s i s e x p r e s s e d i n a l i m i t e d s u b p o p u l a t i o n o f c e l l s s u c h a s l e u k o c y t e s a n d m e l a n o m a c e l l s , ” a n d a s p e c i fi c i n h i b i t o r o f t h i s i s o f o r m m i g h t p r e v e n t i n fl a m m a t i o n o r c e l l m i g r a t i o n . 3 2 H o w e v e r , l o n g - t e r m i n h i b i t i o n o f p 1 1 0 8 i s 5 9 l i k e l y t o b e u n d e s i r a b l e b e c a u s e a n i m a l s i n w h i c h t h e p 1 1 0 5 g e n e i s d e l e t e d s h o w r e d u c e d B - a n d T - c e l l f u n c t i o n a n d a l s o d e v e l o p i n fl a m m a t o r y b o w e l d i s e a s e . 3 3 E f f e c t i v e a n t i - c a n c e r t h e r a p y c a u s e s g e n o t o x i c a g e n t s t o d a m a g e D N A a n d k i l l t h e d i v i d i n g c e l l s . H o w e v e r , i n a d d i t i o n t o c a u s i n g a p o p t o s i s , g e n o m i c i n s u l t s a l s o t r i g g e r c e l l c y c l e c h e c k p o i n t a c t i v a t i o n l e a d i n g t o c h e c k p o i n t a r r e s t a u g m e n t i n g t h e a b i l i t y o f t h e c e l l s t o r e p a i r t h e d a m a g e d D N A . “ ’ 3 5 Z h o u e t a l s h o w e d t h a t t h e a l k a l o i d c a f f e i n e a b o l i s h e s t h e m a m m a l i a n G 2 / A T M D N A d a m a g i n g c h e c k p o i n t b y i n h i b i t i n g t h e A T M - k i n a s e a c t i v i t y . 3 6 a R a d i a t i o n G e n o t o x i c d r u g A T M Q C A F F E I N E N u c l e u s / l ‘ 3 p 5 3 - P C h k 2 - P I P O ( P ) 8 2 1 6 - C d c 2 5 C C y t o p l a s m I t o 1 4 - 3 - 3 ( P ) 8 2 1 6 - C d c 2 5 C F i g u r e I I - 4 . S c h e m a t i c d i a g r a m s h o w i n g h o w c a f f e i n e o v e r r i d e s t h e a c t i v a t i o n o f G 2 / M c h e c k p o i n t b y i n h i b i t i n g A T M . 6 0 A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , a n a c t i v e C d c 2 ( C d k l ) p r o m o t e s e n t r y i n t o m i t o s i s ( F i g u r e I I - 2 b ) . T h i s h o w e v e r c a n b e i n h i b i t e d v i a p h o s p h o r y l a t i o n o f c d c 2 a t T h r l 4 a n d T y r 1 5 . 3 6 b H e n c e , e n t r y i n t o m i t o s i s c o u l d b e c o n s i d e r e d a s d e p e n d e n t o n t h e d e p h o s p h o r y l a t i o n e v e n t s a t T h r 1 4 a n d T y r 1 5 . T h e d u a l S p e c i fi c i t y p h o s p h a t a s e c d c 2 5 C , d e p h o s p h o r y l a t e s c d c 2 a n d c a t a l y s e s e n t r y i n t o m i t o s i s . 3 6 ° ’ d H y p e r p h o s p h o r y l a t i o n o f c d c 2 5 C a c t i v a t e s i t s p h o s p h a t a s e a c t i v i t y . 3 6 d P h o s p h o r y l a t i o n o f 8 2 1 6 c a n o c c u r i n a v a r i e t y o f s i t u a t i o n s s u c h a s c h k l , c h k 2 a n d C - T A K l , w h i c h a r e s p e c i fi c f o r 8 2 1 6 p h o s p h o r y l a t i o n i n c d c 2 5 C r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f a b i n d i n g s i t e f o r 1 4 - 3 - 3 f a m i l y o f p r o t e i n s . W h i l e C - T A K l i s a c y t o p l a s m i c p r o t e i n , s u g g e s t i n g a c y t o p l a s m i c r e t e n t i o n o f c d c 2 5 C u p o n p h o s p h o r y l a t i o n a n d s u b s e q u e n t s e q u e s t e r i n g b y 1 4 - 3 - 3 , . c h k 1 a n d c h k 2 a r e n u c l e a r p r o t e i n s a n d m a y p h o s p h o r y l a t e c d c 2 5 C u p o n e n t r y i n t o t h e n u c l e u s . 3 6 c W h e t h e r t h i s p h o s p h o r y l a t i o n p r o m p t s n u c l e a r e x p o r t i n m a m m a l i a n c e l l s i s u n k n o w n . R a d 2 4 , a h o m o l o g o f 1 4 - 3 - 3 i n S . p o m b e ( a y e a s t s t r a i n ) i s s u c c e s s f u l i n c a r r y i n g o u t t h i s e x p o r t . 3 6 f T h i s e x p o r t w a s n o t s e e n i n s t r a i n s l a c k i n g c h k l , i n d i c a t i n g t h a t u p o n D N A d a m a g e , c h k l m a y p r o m o t e a n u c l e a r e x p o r t o f c d c 2 5 p r o t e i n . Z h o u e t a l e m p h a s i z e d t h a t a l t h o u g h c a f f e i n e p r o v e d t o b e a u s e f u l t o o l i n p e r c e i v i n g t h e e x i s t e n c e o f D N A d a m a g e c h e c k p o i n t s , t h e u n d e r l y i n g m e c h a n i s m s t i l l r e m a i n e d u n c l e a r . 3 6 T h e a b i l i t y o f c a f f e i n e t o b l o c k r a d i a t i o n i n d u c e d G 2 a r r e s t w a s c o r r e l a t e d t o a d e c r e a s e i n r a d i a t i o n i n d u c e d p h o s p h o r y l a t i o n o f C d c 2 5 C a t S e r 2 1 6 , s u g g e s t i n g t h a t i t t a r g e t s o n e o f t h e p r o t e i n s ( p r o b a b l y A T M C h k 2 / C d s l ) i n v o l v e d i n t h e a c t i v a t i o n o f t h e C W c h e c k p o i n t . S i n c e A T M - d e fi c i e n t c e l l s a r e e x t r e m e l y s e n s i t i v e t o r a d i a t i o n , t h e s e r e s u l t s s t r o n g l y s u g g e s t t h a t i n h i b i t i o n o f 6 1 A T M b y c a f f e i n e i s r e s p o n s i b l e f o r t h e r a d i o s e n s i t i z i n g e f f e c t s o f t h i s c o m p o u n d . W h i l e m o s t d r u g d i s c o v e r y e f f o r t s f o c u s o n D N A - d a m a g i n g a g e n t s t o k i l l t u m o r c e l l s p r e f e r e n t i a l l y , a n a l t e r n a t i v e a p p r o a c h t o m a k e t h e c u r r e n t c h e m o t h e r a p y b e t t e r i s t o fi n d w a y s t o i n c r e a s e t u m o r - s p e c i fi c k i l l i n g b y m o d i f y i n g t u m o r - s p e c i fi c l 3 7 q u e s t i o n e d w h e t h e r p 5 3 n u l l c e l l s w h i c h r e s p o n s e s t o t h a t d a m a g e . P o w e l l e t a l a c k t h e G l - S a r r e s t a r e m o r e s e n s i t i v e t o X - r a y d a m a g e w h e n t r e a t e d w i t h a g e n t s t h a t o v e r r i d e G 2 - M a r r e s t ( C h k l ) . T h e y u s e d M E F S g e n e t i c a l l y m a t c h e d t o b e ( + ) o r ( - ) p 5 3 a n d r a t e m b r y o n i c fi b r o b l a s t s ( + ) o r ( - ) f o r w i l d - t y p e p 5 3 f u n c t i o n , i r r a d i a t e d w i t h a n d w i t h o u t c a f f e i n e ( a k n o w n c h e c k p o i n t i n h i b i t o r ) . T h e y o b s e r v e d t h a t l o w d o s e s o f c a f f e i n e c a u s e d a 5 0 % r e d u c t i o n i n c e l l p o p u l a t i o n u n d e r g o i n g t h e a r r e s t i n p 5 3 ( - ) c e l l s . H o w e v e r , a t h i g h e r d o s e s ( 2 m M c a f f e i n e ) , w h e r e s e n s i t i z a t i o n w a s s e e n i n b o t h p 5 3 ( + ) a n d p 5 3 ( - ) c e l l s , t h e r a d i o s e n s i t i z a t i o n a n d t h e G 2 — M o v e r r i d e w e r e m o r e p r o n o u n c e d i n t h e p 5 3 ( - ) c e l l s . T h e g r e a t e r c a f f e i n e - i n d u c e d r a d i o s e n s i t i z a t i o n i n p 5 3 ( - ) c e l l s s u g g e s t s t h a t p 5 3 , i n a d d i t i o n t o t h e G l - S c h e c k p o i n t c o n t r o l , m a y a l s o i n fl u e n c e a s p e c t s o f G 2 - M a r r e s t . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e a n o p p o r t u n i t y f o r a p r o fi t a b l e t h e r a p e u t i c i n t e r v e n t i o n b y c o m b i n i n g D N A - d a m a g i n g a g e n t s w i t h c o m p o u n d s t h a t d i s r u p t G Z - M a r r e s t i n t u m o r s l a c k i n g f u n c t i o n a l p 5 3 . P a r a l l e l t o t h e s y n t h e s i s o f a l i b r a r y o f c o m p o u n d s w i t h a x a n t h i n e b a s e d s t r u c t u r e , . D a l y e t a l s h o w e d a s t r u c t u r e b a s e d a c t i v i t y p r o fi l i n g f o r G 2 c h e c k p o i n t i n h i b i t i o n b y c a f f e i n e a n a l o g s . 3 9 S i n c e c a f f e i n e i n h i b i t s t h e G 2 c h e c k p o i n t , i t c a n o v e r r i d e G 2 a r r e s t . T u m o r c e l l s w h i c h a r e p 5 3 - / - , d o n o t a r r e s t a t G 1 ; h o w e v e r , t h e i r G 2 c h e c k p o i n t a l t h o u g h i m p a i r e d s t i l l p r o v i d e s t h e m w i t h a n o p p o r t u n i t y t o r e p a i r 6 2 D N A d a m a g e a n d c o n t i n u e t o d i v i d e . S i n c e c a f f e i n e i s n o t s u i t a b l e f o r c l i n i c a l u s e d u e t o i t s o t h e r p h a r m a c o l o g i c a l a c t i v i t i e s l i k e c o m p e t i t i v e a n t a g o n i s m a t a d e n o s i n e r e c e p t o r s , 3 9 i n h i b i t i o n o f p h o s p h o d i e s t e r a s e s 4 0 a n d a l s o t o x i c i t y a t c o n c e n t r a t i o n s r e q u i r e d t o c a u s e i n h i b i t i o n o f t h e c h e c k p o i n t , 4 ’ D a l y e t a l a n a l y z e d 5 6 a n a l o g s o f c a f f e i n e a n d f o u n d t h a t m e t h y l s u b s t i t u t i o n s a r e i m p o r t a n t a t p o s i t i o n R 1 a n d R 3 a n d n o b u l k y s u b s t i t u t i o n s a t N — 7 w e r e t o l e r a t e d ( F i g u r e I I - 5 ) . 3 9 W h i l e 8 - b r o m o a n d 8 - C F 3 s h o w e d e n h a n c e d a c t i v i t y , t h e 8 - p h e n y l a n a l o g s h o w e d l i m i t e d a c t i v i t y d u e t o s o l u b i l i t y i s s u e s . I n a d d i t i o n , t h e s t r u c t u r e a c t i v i t y p r o fi l e d o e s n o t c o r r e l a t e w i t h t h e a c t i v i t y p r o fi l e o f o t h e r t a r g e t s i n d i c a t i n g t h a t c a f f e i n e m i g h t h a v e a s p e c i fi c m e c h a n i s m f o r o v e r r i d i n g t h e G 2 a r r e s t . 0 E t h y l , P r o p y l I : i > R I ‘ N N A | \ > - — R 4 C Z : B r , C F 3 o N N R 2 R a U % b u l k n o t t o l e r a t e d f o r 6 2 i n h i b i t i o n M e t h y l F i g u r e I I - S . S t r u c t u r a l l y i m p o r t a n t s i t e s f o r C h k l i n h i b i t i o n a c t i v i t y o f C a f f e i n e E n t r y i n t o m i t o s i s i s c o n t r o l l e d b y C d c 2 k i n a s e . T h i s k i n a s e i s i n d i r e c t l y c o n t r o l l e d b y C h k 2 k i n a s e , a n e n z y m e t h a t g e t s p h o s p h o r y l a t e d a n d g e t s a c t i v a t e d a f t e r D N A d a m a g e i n a n A T M - d e p e n d e n t m a n n e r . ” 4 2 T h o u g h s o l u b i l i t y w a s a m a j o r p r o b l e m i n m o s t c a f f e i n e d e r i v a t i v e s , D a l y e t a l s h o w e d a g o o d c o r r e l a t i o n o f G 2 c h e c k p o i n t i n h i b i t i o n a n d t h e i r s y n e r g i s t i c c y t o t o x i c e f f e c t s w i t h i o n i z i n g r a d i a t i o n i n p 5 3 - / - c e l l s . 3 9 i i ) B e y o n d k i n a s e s : p u r i n e b i n d i n g t a r g e t s i n c a n c e r t h e r a p y K i n a s e s a r e a n i m p o r t a n t c l a s s o f e n z y m e s t h a t p u r i n e s b i n d t o d u e t o t h e i r d r u g - 6 3 l i k e c h a r a c t e r i s t i c s . H o w e v e r , k i n a s e s a r e n o t t h e o n l y e n z y m e s t h a t p u r i n e s c a n b i n d ; s o m e o t h e r e n z y m e s i m p o r t a n t i n o n c o l o g y a r e A T P a s e s , G T P a s e s , s u l p h o t r a n s f e r a s e s e t c . a ) A T P a s e s ( H s p 9 0 ) : H e a t S h o c k P r o t e i n 9 0 ( H s p 9 0 ) i s a n A T P d e p e n d e n t m o l e c u l a r c h a p e r o n e p r o t e i n s w h i c h a r e o v e r - e x p r e s s e d u p t o 1 0 f o l d s i n c a n c e r c e l l s . 4 3 M a n y o f t h e c l i e n t s o f H s p 9 0 a r e w e l l - k n o w n o n c o p r o t e i n s w h i c h a r e f r e q u e n t l y m u t a t e d a n d / o r o v e r - e x p r e s s e d s u c h a s p 5 3 , B c l - A b r e t c . A s s o c i a t i o n w i t h H s p 9 0 s t a b i l i z e s t h e s e o t h e r w i s e u n s t a b l e p r o t e i n s t o f u n c t i o n w e l l i n o n c o g e n i c s i g n a l i n g p a t h w a y s e s s e n t i a l t o m a i n t a i n t h e u n c o n t r o l l e d p r o l i f e r a t i o n o f t u m o r c e l l s . 4 4 O c c u p a n c y o f t h e A T P b i n d i n g s i t e c a u s e s d e s t a b i l i z a t i o n a n d e v e n t u a l u b i q u i t i n d e p e n d e n t d e g r a d a t i o n . 4 5 H e n c e , i n h i b i t i o n o f H s p 9 0 m a y b e c o n s i d e r e d v i t a l t o i n h i b i t a c t i v a t i o n o f s i g n a l i n g p a t h w a y s w h i c h m i g h t e f fi c i e n t l y d e v e l o p r e s i s t a n c e t o a s p e c i fi c d r u g t r e a t m e n t . 4 6 D e p e n d i n g o n c e l l u l a r c o n t e x t , s u c h i n h i b i t o r s m i g h t b e e f f e c t i v e i n c a u s i n g g r t h a r r e s t , d i f f e r e n t i a t i o n o r a p o p t o s i s . 4 7 I n h i b i t o r s o f I - I s p 9 0 c o u l d p r o v i d e c o n c u r r e n t d i s r u p t i o n o f o n c o g e n i c p a t h w a y s t o p r o v i d e t r e a t m e n t t o o b s t i n a t e t u m o r s . 1 7 A A G , a d e r i v a t i v e o f g e l d a n a m y c i n , w a s t h e fi r s t H s p 9 0 i n h i b i t o r t o e n t e r t h e c l i n i c a l t r i a l s . “ W h i l e i t p r o v i d e d e x t e n s i v e s t a b i l i z a t i o n o f t h e d i s e a s e i n a n i m a l m o d e l s a s w e l l a s p h a s e I t r i a l s , a n d a r e d u c t i o n i n t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f v a r i o u s m a r k e r s s u c h a s R a f - 1 , 4 8 b l 7 A A G w o u l d n o t b e c o m e a d r u g d u e t o i t s p o o r s o l u b i l i t y , l a c k o f a n e a s i e r s y n t h e t i c r o u t e , h e p a t o t o x i c i t y a s s o c i a t e d w i t h b e n z o q u i n o n e m o i e t y , n o s e l e c t i v i t y f o r t h e t y p e o f H s p 9 O S . 4 9 0 M 6 M 6 0 O M e R 1 = 0 H , F 1 2 = H , R 3 = 0 C H 3 , G e l d a n a m y c i n N \ \ H , = o o H 3 , R 2 = 0 C H 3 , R g = H , H e r b i m y c i n A I L N / C ' H , = O H , R 2 = H , R 3 = N H C H 2 0 H = C H 2 , 1 7 A A G 0 M 9 / O M e P U 2 4 F C I F i g u r e I I - 6 . S t r u c t u r e s o f s o m e H s p 9 0 i n h i b i t o r s T h e w a t e r - s o l u b l e a n a l o g s o f 1 7 A A G h a v e b e e n s y n t h e s i z e d t h o u g h t h e i r c l i n i c a l u s e i s y e t t o b e d e t e r m i n e d s 0 C o m p u t e r - m o d e l i n g s t u d i e s h a v e h e l p e d i n d e s i g n i n g t h e fi r s t p u r i n e b a s e d s m a l l m o l e c u l e H s p 9 0 i n h i b i t o r , P U 3 ( F i g u r e 1 1 - 6 ) , w h i c h s h o w e d i n h i b i t i o n a t ~ 1 5 u M . " 9 S u b s e q u e n t s t r u c t u r e o p t i m i z a t i o n r e v e a l e d t h a t P U 2 4 F C I d i s p l a y s a c t i v i t y s i m i l a r t o 1 7 A A G . 5 ' F u r t h e r , w h i l e c u r r e n t d r u g d e v e l o p m e n t e f f o r t s t a r g e t t h e N - t e r m i n a l A T P b i n d i n g s i t e , r e c e n t s t u d i e s s u g g e s t t h e e x i s t e n c e o f a h i d d e n C - t e r m i n a l A T P b i n d i n g p o c k e t f o r H s p 9 0 . 5 2 N o v o b i o c i n , a g y r a s e i n h i b i t o r o c c u p i e s t h i s s i t e a n d h a s b e e n s h o w n t o i n h i b i t H s p 9 0 a c t i v i t y a l s o . T h u s , i n h i b i t i o n o f b o t h N - t e r m i n a l a n d C - t e r m i n a l s i t e s c o u l d h a r n e s s t h e a n t i - c a n c e r p o t e n t i a l o f H s p 9 0 i n h i b i t o r s . b ) S u l p h o t r a n s f e r a s e s ( S T ) a r e e n z y m e s t h a t c a t a l y z e t h e t r a n s f e r o f a s u l f a t e f r o m t h e d o n o r m o l e c u l e P A P S ( 3 ’ p h o s p h o a d e n o s i n e 5 ’ p h o s p h o s u l f a t e ) t o a v a r i e t y o f i n t r a c e l l u l a r s u b s t r a t e s . S T e n z y m e s a r e b e i n g c o n s i d e r e d a s a 6 5 < 1 . . . t h e r a p e u t i c t a r g e t f o r i n fl a m m a t i o n a s w e l l a s c a n c e r . 5 3 S i n c e t h e s e e n z y m e s h a v e i m p o r t a n t r o l e i n d e t o x i fi c a t i o n m e c h a n i s m s , i t c a n b e h y p o t h e s i z e d t h a t t h e y m i g h t p o t e n t i a t e t h e e f f e c t o f c y t o t o x i c c h e m o t h e r a p e u t i c s . A m o n g v a r i o u s c l a s s e s o f i n h i b i t o r s , t h e p u r i n e b a s e d i n h i b i t o r ( F i g u r e I I - 7 ) s h o w s m a x i m u m p o t e n c y ( I C s o = 2 0 1 1 M ) a n d s e l e c t i v i t y f o r N - a c e t y l g l u c o s a m i n e - 6 - 0 - S T . 5 4 ~ m g H 8 B r H 0 F i g u r e I I - 7 . P u r i n e - b a s e d S T i n h i b i t o r D . X a n t h i n e s i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n I X a n t h i n e b a s e d d r u g s h a v e l o n g b e e n k n o w n a s b r o n c h o d i a l a t o r s , a n t i - i n fl a m m a t o r y a g e n t s i n b o w e l d i s e a s e e t c . 5 s T h e o p h y l l i n e i n p a r t i c u l a r i s w i d e l y u s e d a s a n a n t i a s t h m a d r u g a n d i t n o t o n l y d i l a t e s b r o n c h i , b u t a l s o m o d u l a t e s t h e p r o d u c t i o n o f p r o i n fl a m m a t o r y c y t o k i n e s a n d i n h i b i t s i n fl a m m a t i o n ? 6 F i g u r e I I - 8 i l l u s t r a t e s t h e s u b - d i v i s i o n o f t h e a n t i - i n fl a m m a t o r y e f f e c t o f t h e o p h y l l i n e i n t o i m m u n o m o d u l a t i o n , a n t i - n e o p l a s i c a n d h y p e r c h o l e s t r e m i c e f f e c t . 6 6 A n t i - I n f l a m m a t o r y F i g u r e 1 1 - 8 . A n t i — i n fl a m m a t o r y a c t i v i t y ( A : A n a l g e s i c a d j u v a n t , I : i n fl a m m a t o r y , O z o r o p h a r y n g e a l ) o f t h e o p h y l l i n e c o r r e l a t e s t o i t s i m m u n o m o d u l a t o r y , a n t i - n e o p l a s i c a n d h y p e r c h o l e s t r i c e f f e c t s . T h e o p h y l l i n e i n h i b i t s N F - K B a c t i v a t i o n , a f a c t o r t h a t i s e s s e n t i a l f o r t h e e x p r e s s i o n o f p r o i n fl a m m a t o r y c y t o k i n e s . 5 7 F i n a l l y , I c h i y a m a e t a l s h o w e d t h e i n h i b i t i o n o f N F - K B b e i n g e f f e c t e d v i a i n h i b i t i o n o f I - K B p h o s p h o r y l a t i o n . 5 8 T h e i r r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r a p e u t i c t h e o p h y l l i n e ( p l a s m a t h e o p h y l l i n e i s 5 — 1 5 u g / m l , 2 8 - 8 3 1 1 M ) a d m i n i s t r a t i o n h a s a n a n t i - i n fl a m m a t o r y e f f e c t t h r o u g h i n h i b i t i o n o f N F - K B a c t i v a t i o n ( 2 0 1 1 M ) . T h e i r w e s t e r n b l o t a n a l y s i s r e v e a l e d i n h i b i t i o n o f p h o s p h o r y l a t i o n o f I K B — a s i m i l a r t o c o m p o u n d s l i k e P D T C , a s p i r i n , m o r p h i n e 5 9 e t c . 6 7 N S a k s / H P D T C A s p i r i n ( > 0 3 0 M 9 0 N H R o l i p r a m F i g u r e I I - 9 . S t r u c t u r e s o f s o m e I K B a i n h i b i t o r s . R o l i p r a m i s a p h o s p h o d i e s t e r a s e i n h i b i t o r a n d i n h i b i t e d I K B o . a t c o n c e n t r a t i o n s c o m p a r a b l e t o t h e o p h y l l i n e i n d i c a t i n g a p o s s i b i l i t y o f t h e i n h i b i t i o n o f I K B a v i a P D E i n h i b i t i o n . 5 8 I n t h e l i g h t o f t h e i m p o r t a n t b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f t h e x a n t h i n e s s c a f f o l d , w e s y n t h e s i z e d 8 - s u b s i t u t e d t h e o p h y l l i n e s a n d c a f f e i n e s . T h e s e w e r e t h e n s c r e e n e d t o m o d u l a t e t h e N F - K B s i g n a l t r a n s d u c t i o n . 0 0 0 0 \ N N \ N N \ N N \ N N A I ‘ > — ~ 0 2 A I ‘ > — e r A I \ > — N H 2 A I ‘ > - P h ° i i 0 ' I “ ° I 5 ° l ‘ u " - 1 1 1 - 2 “ - 3 " - 1 1 O O O O \ N N \ N N \ N N \ N N A I \ > — N 0 2 ) \ I \ > — B r A I \ ) — N H N H 2 A I ‘ > — P h o N N \ o N N \ o t i l N \ o N 3 P h " - 4 1 1 - 5 1 1 - 6 " - 1 2 F i g u r e I I - 1 0 . S t r u c t u r e s o f t h e o p h y l l i n e s a n d c a f f e i n e s . 6 8 \ E O o T fi f e 2 " - N H — H B r B r < H : O 0 C 2 N / 7 / + C 3 1 H 2 % 3 \ 1 0 ) o : N " : N N H \ > 6 o 1 N m ; N fl \ > _ R 0 2 0 ’ \ £ 0 3 I " ' 1 ' R = N 0 2 3 0 n ° , 5 S - 4 9 3 C 5 o 2 I , 3 % n e . : H o C T h e s y n t h e s i s o f t h e 8 - s u b s t i t u t e d t h e o p h y l l i n e s w a s p e r f o r m e d b y s t a r t i n g w i t h t h e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e s t a r t i n g m a t e r i a l s , f o l l o w i n g r o u t e s r e p o r t e d e a r l i e r . 0 ° C . 3 h , 7 0 % . _ _ _ . ’ " . 3 , R = N H 2 S c h e m e I I - l . S y n t h e s i s o f t h e o p h y l l i n e d e r i v a t i v e s T h e o p h y l l i n e w a s t r e a t e d w i t h c o n c . H N O 3 i n a c e t i c a n h y d r i d e a t l o w t e m p e r a t u r e t o f o r m 8 - n i t r o t h e o p h y l l i n e ( I I - 1 ) i n m o d e s t y i e l d , 6 0 w h i c h w a s r e d u c e d f u r t h e r w i t h S n a n d c o n e . H C I t o f o r m 8 - a m i n o t h e o p h y l l i n e ( I I - 3 ) . “ T h e o p h y l l i n e w a s s u b j e c t e d t o o x i d a t i v e b r o m i n a t i o n u s i n g I - I B r / H 2 0 2 ( I I - 2 ) . 6 2 T a b l e I I - l i l l u s t r a t e s t h e o t h e r r o u t e s t h a t w e r e t r i e d t o c o n v e r t “ - 1 t o “ - 3 . 6 3 o o \ N N 6 d ' \ N N A | \ > — N 0 2 _ _ _ . ' “ 0 " 0 " A l ‘ > - N H 2 0 I I ! p . o I f I f : 1 " - 3 E n t r y R e a c t i o n C o n d i t i o n s Y i e l d 1 Z n / c o n c . H C l 0 % 2 H I / H e a t d e c o m p o s e d 3 c y c l o h e x e n e / P d / C r e fl u x t r a c e s 4 N a 2 8 2 0 4 / N H 4 O H , N 3 2 8 0 4 t r a c e s 5 * N 3 2 8 2 0 4 , H 2 0 / E t O H 1 . 1 0 % 6 N a Z S Z O 4 / H z O / l , 4 - d i o x a n e ( l : l ) 0 % * e t h o x y t h e o p h y l l i n e w a s o b t a i n e d T a b l e I I - l . V a r i o u s a t t e m p t s t o r e d u c e “ - 1 t o “ - 3 . 6 9 V a r i o u s r e s e a r c h g r o u p s h a v e s h o w n t h e c o n v e r s i o n o f 8 - b r o m o i n t o t h e 8 - s u b s t i t u t e d a m i n e s ( F i g u r e I I - l 1 ) v i a a n u c l e o p h i l i c d i s p l a c e m e n t r e a c t i o n . 6 4 0 o N H 2 \ N H s z N H z \ N [ J N | ‘ > - B r : \ > — N H C A N N 2 4 h r e fl u x , 7 0 % o i l s ] I H I H F i g u r e I I - l l . N u c l e o p h i l l i c d i s p l a c e m e n t r e a c t i o n o f b r o m o t h e o p h y l l i n e . T h e s e w e r e s h o w n t o h a v e a n i m p o r t a n t h y p o t e n s i v e a n d s p a s m o l y t i c a c t i v i t y . 8 - a m i n o t h e o p h y l l i n e h a s a l s o f o u n d a p p l i c a t i o n i n t h e s y n t h e s i s o f f u s e d p u r i n e s . 6 5 O A J : : I : ; ‘ > - B r ‘ _ ’ — — — » G A E ; ‘ > - N H 2 " - 2 E n t r y R e a c t i o n C o n d i t i o n s Y i e l d 1 N H 4 0 H , M e O H , r e fl u x , 3 h 0 % 2 B n N H z , M e O H , H 2 0 , r e fl u x 0 % 3 B n N H z , M e O H , s e a l e d t u b e , 1 5 0 ° C t r a c e s 4 B n N H 2 , P d 2 ( d b a ) 3 , B I N A P , 0 % N a O t B u , t o l u e n e T a b ] ; l I - Z . A t t e m p t s t o w a r d s n u c l e o p h i l i c d i s p l a c e m e n t o n b r o m o t h e o p h y l l i n e “ - 2 . 7 O N H 3 a 2 / 8 H 2 0 4 Z O , N r t \ O N A . ' l - o J T I I N H N Z 2 H P I 1 ' 2 I h C , O C 7 I 9 r t , a % o I I N - O 8 P h " 2 H N C H \ O N A J T 8 - P h e n y l t h e o p h y l l i n e w a s s y n t h e s i z e d s t a r t i n g w i t h 5 - a m i n o u r a c i l ( S c h e m e I I - 2 ) w h i c h c a n b e s y n t h e s i z e d b y m e t h o d s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y b y o t h e r g r o u p s . “ 0 0 \ N H C N C H z c o z I - I \ N N a N O z \ N N o A A c z o 7 o % ’ A I ’ A I 0 N H 0 I I I N H 2 H Z O / A C O H o T N H 2 I r t , 1 h , 9 3 % 7 8 0 % " - 9 " - 1 0 o N a O H / E t O H \ N > N J ] : \ > — P h r e fl u x , 1 h , 9 4 % A N 0 I I I H " - 1 1 S c h e m e I I - 2 . S y n t h e s i s o f 8 - p h e n y l t h e o p h y l l i n e ( I I - l l ) N i t r o s y l a t i o n o f t h e s t a r t i n g m a t e r i a l g a v e c h a r a c t e r i s t i c p u r p l e - r e d m o n o - n i t r o s o c o m p o u n d i l l - 8 w h i c h w a s r e d u c e d t o f o r m t h e d i a m i n e “ - 9 . 6 7 T h e d i a m i n e w a s t h e n p r o t e c t e d w i t h b e n z o y l c h l o r i d e w h i c h w a s fi n a l l y c o n d e n s e d u n d e r a l k a l i n e c o n d i t i o n s t o f o r m t h e i m i d a z o l e m o i e t y , y i e l d i n g t h e d e s i r e d p r o d u c t I I - 1 1 . T h e c a f f e i n e d e r i v a t i v e s w e r e s y n t h e s i z e d e i t h e r u s i n g c a f f e i n e s c a f f o l d a s t h e s t a r t i n g m a t e r i a l o r m e t h y l a t i o n N - 7 p o s i t i o n o f t h e t h e o p h y l l i n e s ( S c h e m e I I - 3 ) . 6 8 O O 2 C A N : 1 d r y D M F , 8 1 % C A N N l l \ " - 4 S c h e m e “ - 3 . S y n t h e s i s o f I I - 4 f r o m I L ] . 7 1 O J | \ C " A N T I ” M I ” d 3 r y " D “ M F , “ i 7 5 0 / o C Q C S A O N N T l h I ‘ N H B n C a f f e i n e w a s s u b j e c t e d t o o x i d a t i v e b r o m i n a t i o n t o g i v e “ - 5 w h i c h w a s f u r t h e r s u b j e c t e d t o n u c l e o p h i l i c s u b s t i t u t i o n t o g i v e 1 1 - 6 ( S c h e m e I I - 4 ) . O O O ‘ \ N ‘ \ N ‘ \ N N H B r / H 2 0 2 N N H N H _ H O N A J I \ > > ) 3 ] : * 9 “ 2 f 2 = A J ] : ‘ > - N H N H 2 O T N \ H z g l s C ° 5 | 3 C N O [ r N \ 5 1 / o o T N \ " - 5 " - 6 S c h e m e I I - 4 . S y n t h e s i s o f I I - S a n d " - 6 N - 7 b e n z y l a t i o n o f [ L I ] u n d e r b a s i c c o n d i t i o n s a f f o r d e d " - 1 2 i n g o o d y i e l d s ( S c h e m e I I - S ) . 6 8 " - 1 1 “ - 1 2 S c h e m e I I - S . N - B e n z y l a t i o n o f [ L I ] . E . B i o l o g i c a l a c t i v i t y - e v a l u a t i o n a n d d i s c u s s i o n C a n c e r c h e m o t h e r a p y o f t e n u s e s D N A d a m a g i n g a g e n t s s u c h a s c a m p t o t h e c i n , c i s - p l a t i n e t c . w h i c h c a u s e i n d u c t i o n o f a p o p t o s i s i n t u m o r c e l l s t h r o u g h t o p o i s o m e r a s e - 1 1 i n h i b i t i o n , D N A a l k y l a t i o n a n d o f t e n c e l l c y c l e p e r t u r b a t i o n s . 6 9 A s a c e l l s u r v i v a l r e s p o n s e , m o s t c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s c a u s e a c t i v a t i o n o f a n u c l e a r f a c t o r N F - K B . N F - K B c o m p r i s e s a f a m i l y o f i n d u c i b l e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s r e s p o n s i b l e f o r i m m u n e a n d i n fl a m m a t o r y r e s p o n s e s . 7 0 I t a l s o m e d i a t e s t h e c o n t r o l o f c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n a n d a p o p t o s i s . H i g h l e v e l s o f N F - K B , r e s u l t i n i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f a n t i - a p o p t o t i c c e l l u l a r p r o t e i n s w h i c h l e a d t o u n i n t e r r u p t e d c e l l u l a r g r o w t h . T h i s i s t h e o n s e t o f c h e m o - r e s i s t a n c e i n t h e t u m o r c e l l s . M o r e o v e r , N F - K B a l s o s t i m u l a t e s c e l l 7 2 p r o l i f e r a t i o n b y a c t i v a t i n g t a r g e t g e n e s . H e n c e , N F - K B p r o b a b l y p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t u m o r i g e n e s i s t h r o u g h i n h i b i t i o n o f a p o p t o s i s a n d s t i m u l a t i o n o f c e l l p r o l i f e r a t i o n . F . N F - K B i n d e f e n s e a n d d i s e a s e T h e e u k a r y o t i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r N F - K B , i s i n v o l v e d i n a v a r i e t y o f c e l l u l a r p r o c e s s e s a n d c a n b e a c t i v a t e d b y a v a r i e t y o f s t i m u l i . T h e r e g u l a t i o n o f N F - I c B u l t i m a t e l y h a s b e e n s h o w n t o h a v e i n v o l v e m e n t o f i n t e r a c t i o n s w i t h a n i n h i b i t o r y p r o t e i n I K B t h a t k e e p s i t i n b o u n d s t a t e i n t h e c y t o p l a s m . T h e a c t i v a t i o n o f N F - K B i s a s s o c i a t e d w i t h i n d u c t i o n o f p h o s p h o r y l a t i o n o f I K B b y I K B - k i n a s e , f o l l o w e d b y i t s d e g r a d a t i o n l e a d i n g t o t h e n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e p 5 0 / p 6 5 s u b u n i t o f t h e c o m p l e x . I n t h e n u c l e u s , N F - K B b i n d s t o t h e t a r g e t D N A e l e m e n t s a n d p o s i t i v e l y r e g u l a t e s t h e t r a n s c r i p t i o n o f g e n e s i n v o l v e d i n i m m u n e a n d i n fl a m m a t o r y r e s p o n s e s , c e l l g r o w t h c o n t r o l a n d a p o p t o s i s . 7 | T h e d i r e c t i n v o l v e m e n t o f N F - K B i n r e g u l a t i o n o f i n fl a m m a t o r y c y t o k i n e s a n d g e n e s r e s p o n s i b l e i n g r o w t h c y c l e , i n d i c a t e s t h a t t h e a c t i v a t i o n o f N F - K B m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f c h r o n i c d i s e a s e s s u c h a s r h e u m a t o i d a r t h r i t i s , s e p t i c s h o c k a n d c a n c e r c h e m o - r e s i s t a n c e . 7 2 G . I n h i b i t i o n o f T r a n s l o c a t i o n o f t h e t r n a s c r i p t i o n a l l y a c t i v e p 5 0 1 p 6 5 h e t e r o d i m e r . T h e o p h y l l i n e a n d i t s 8 - s u b s t i t u t e d d e r i v a t i v e s w e r e e v a l u a t e d f o r t h e i r p o t e n t i a l i n h i b i t o r y a c t i v i t y a g a i n s t N F - K B i n h u m a n J u r k a t l e u k e m i a T - c e l l s . T h e a c t i v a t i o n o f N F - K B b y P M A / P H A w a s c o n fi r m e d i n J u r k a t c e l l s u s i n g a n E M S A a s s a y . ' 9 ° ' 7 3 J u r k a t c e l l s w e r e e x p o s e d t o p h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e ( P M A ) / p h y t o h e m a g g l u t i n i n ( P H A ) w h i c h a r e k n o w n t o a c t i v a t e N F - I c B . 7 3 7 3 i i u u u w u m M . , . . . T h e o p h y l l i n e w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l . “ 5 8 T h e a s s a y s a m p l e s w e r e p r e - i n c u b a t e d w i t h v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f t h e d r u g b e f o r e a c t i v a t i o n w i t h P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) . T h e P M A a c t i v a t i o n w a s p e r f o r m e d f o r 4 h . C e l l s w e r e h a r v e s t e d a n d n u c l e a r e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d b y D i g n a m e t a l . 7 4 T h e n u c l e a r e x t r a c t s w e r e e v a l u a t e d f o r N F - K B - D N A b i n d i n g a c t i v i t y u t i l i z i n g t h e fl u o r e s c e n t l y l a b e l e d N F - K B D N A c o n s e n s u s s e q u e n c e a n d r u n o n a 4 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . D N A + v » + + + 4 4 + 7 + + P M A / P I I A - . + a - p 6 5 - - I " - 1 2 - - - - - + + + + + T h e o p h y l l i n e - - - - + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 S u p e r s h i f t w i t h p 6 5 a n t i b o d y ‘ N F - k a p p a B - D N A c o m p l e x ‘ N o n - S p e c i fi c b i n d i n g L a n e l : D N A o n l y ; L a n e 2 : D N A + a c t i v a t e d c o n t r o l ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 [ L g / m l ) , 4 h ) ; L a n e 3 : D N A + a c t i v a t e d c o n t r o l ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 [ L g / m l ) , 4 h ) + A b p 6 5 ; L a n e 4 : D N A + u n a c t i v a t e d c o n t r o l ; L a n e 5 : D N A + a c t i v a t i o n ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) , 4 h ) + T h e o p h y l l i n e , l u M ; L a n e 6 : D N A + a c t i v a t i o n ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) , 4 h ) + C o m p o u n d I I - 1 2 , 1 0 n M ; L a n e 7 : D N A + a c t i v a t i o n ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) , 4 h ) + C o m p o u n d “ - 1 2 , 1 u M ; L a n e 8 : D N A + a c t i v a t i o n ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 j i g / m l ) , 4 h ) + C o m p o u n d I I - 1 2 , 0 . 1 u M ; L a n e 9 : D N A + a c t i v a t i o n ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) , 4 h ) + C o m p o u n d “ - 1 2 , 0 . 0 1 n M ; L a n e l O : D N A + a c t i v a t i o n ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) , 4 h ) + C o m p o u n d I I - 1 2 , 1 n M . F i g u r e I I - 1 2 . I n h i b i t i o n o f N F - K B - D N A b i n d i n g w i t h “ - 1 2 . 7 4 S i m i l a r e x p e r i m e n t s w e r e r u n f o r o t h e r t h e o p h y l l i n e d e r i v a t i v e s . F i g u r e I I - 1 3 i l l u s t r a t e s p 6 5 - D N A b i n d i n g f o r a l l c o m p o u n d s t e s t e d . P M A / P H A a c t i v a t i o n w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l ( F i g u r e I I — 1 2 , l a n e 2 , F i g u r e I I - l 3 , l a n e 2 ) . T h e N F - K B / D N A c o m p l e x w a s u n a m b i g u o u s l y i d e n t i f i e d b y t r e a t i n g t h e n u c l e a r e x t r a c t w i t h a N F - K B p 6 5 a n t i b o d y f o l l o w i n g P M A / F H A a c t i v a t i o n ( F i g u r e I I - 1 2 , l a n e 3 ; F i g u r e I I - l 3 , l a n e 3 ) . T r e a t m e n t o f t h e n u c l e a r e x t r a c t w i t h t h e p 6 5 a n t i b o d y r e s u l t e d i n a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n N F - K B / D N A b i n d i n g a n d t h e f o r m a t i o n o f a s u p e r s h i f t o f t h e c o m p l e x ( F i g u r e H - 1 2 , l a n e 3 ; F i g u r e I I - l 3 , l a n e 3 ) . A s a n e g a t i v e c o n t r o l , c e l l s a r e l e f t u n a c t i v a t e d ( t r e a t e d o n l y w i t h e q u i v o l u m e v e c t o r D M S O f o r t h e s a m e t i m e a s o t h e r a s s a y p l a t e s ) a n d t h e n u c l e a r e x t r a c t s w a s e x p o s e d t o t h e N F - K B c o n s e n s u s s e q u e n c e , r e s u l t i n g i n o n l y a s l i g h t b a c k g r o u n d l e v e l o f N F - K B - D N A b i n d i n g ( F i g u r e I I I - 1 2 , l a n e 4 ; F i g u r e I I - l 3 , l a n e 4 ) . P r e - t r e a t m e n t o f t h e J u r k a t c e l l s w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c o m p o u n d s ( I I - 1 , I I - 2 , “ - 3 , “ - 1 1 , I I - 1 2 ) r a n g i n g f r o m I O n M t o 1 n M ( F i g u r e I I - 1 2 , I I - l 3 , l a n e s 6 - 1 0 ) i l l u s t r a t e d a s i g n i fi c a n t r e d u c t i o n i n t h e a m o u n t o f N F - K B / D N A b i n d i n g a s c o m p a r e d t o t h a t w i t h o u t t h e p r e - t r e a t m e n t ( F i g u r e I I - 1 2 , I I - l 3 , l a n e 2 ) i n d i c a t i n g a n i n h i b i t i o n o f N F - K B a c t i v a t i o n . T h i s e f f e c t d e c r e a s e d i n a c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t m a n n e r . P r e - t r e a t m e n t w i t h t h e o p h y l l i n e , l u M ( F i g u r e I I - 1 2 , I I - 1 3 , l a n e s 5 ) w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l , s i n c e i t i s k n o w n t o i n h i b i t I K B - p h o s p h o r y l a t i o n a n d p r e v e n t N F - 1 < B t r a n s l o c a t i o n . ” ' 5 8 7 5 . _ . . , fl . . ; . . , D N A + + + + + + + + + + P M A / F H A - a - p 6 5 - - + C o m p o u n d - - - - - + + + + + T h e o p h y l l i n e - - - - + O 1 : I ; ; > - © ‘ E i N I ; \ > _ N H 2 . _ . 3 i . . g - a t 9 " _ - _ . ~ . - . u ‘ o . _ _ , ‘ N f L L N O w . 5 4 v . 1 . o i j ‘ r ‘ i o N I N ) — N 0 2 L a n e l : D N A o n l y ; L a n e 2 : D N A + a c t i v a t e d c o n t r o l ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) , 4 h ) ; L a n e 3 : D N A - I - a c t i v a t e d c o n t r o l ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) , 4 h ) + A b p 6 5 ; L a n e 4 : D N A + u n a c t i v a t e d c o n t r o l ; L a n e 5 : D N A + a c t i v a t i o n ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) , 4 h ) ~ I - T h e o p h y l l i n e , l u M ; L a n e 6 : D N A + a c t i v a t i o n ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) , 4 h ) + C o m p o u n d 1 0 M M ; L a n e 7 : D N A + a c t i v a t i o n ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) , 4 h ) + C o m p o u n d 1 u M ; L a n e 8 : D N A + a c t i v a t i o n ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) , 4 h ) + C o m p o u n d 0 . 1 u M ; L a n e 9 : D N A + a c t i v a t i o n ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) , 4 h ) + C o m p o u n d 0 . 0 1 u M ; L a n e l O : D N A + a c t i v a t i o n ( P M A ( 2 . 5 n g / m l ) / P H A ( 2 u g / m l ) , 4 h ) + C o m p o u n d 1 n M . F i g u r e I I - l 3 . p 6 5 - D N A b i n d i n g o f t h e o p h y l l i n e d e r i v a t i v e s ( C o m p o u n d = I I - 1 , I I - 2 , I I - 3 , I I - l l ) . C o m p a r i s o n o f t h e v a r i o u s d e r i v a t i v e s o f t h e o p h y l l i n e t o o n e a n o t h e r s h o w e d , t h a t w h i l e I I - 3 , " - 1 1 , a n d I I - 1 2 i n h i b i t e d t h e N F - K B - D N A b i n d i n g s i g n i fi c a n t l y , “ - 2 w a s a c t i v e o n l y a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s a n d I L ] w a s a v e r y w e a k i n h i b i t o r o f N F - 7 6 K B - D N A b i n d i n g . T h e s e p r e - l i m i n a r y , q u a l i t a t i v e E M S A r e s u l t s w e r e f u r t h e r q u a n t i fi e d u s i n g a n E L I S A b a s e d a s s a y . H . I n h i b i t i o n o f t r a n s l o c a t i o n o f N F - K B . N F - K B g e t s p h o s p h o r y l a t e d i n t h e n u c l e u s a t m u l t i p l e s i t e s b e f o r e i t b i n d s t o t h e D N A . H y p e r p h o s p h o r y l a t e d N F - K B b i n d s t i g h t e r t o t h e D N A . 7 5 E l e c t r o m o b i l i t y s h i f t a s s a y s g a v e a q u a l i t a t i v e r e s u l t o f w h e t h e r t h e o p h y l l i n e s i n h i b i t e d a n y s t e p u p s t r e a m o f t h e D N A b i n d i n g e v e n t ( F i g u r e I - S ) . A p h o s p h o - p 6 5 b a s e d E L I S A ( N e o g e n c o r p o r a t i o n ) w a s u s e d t o q u a n t i t a t e t h e a m o u n t o f p h o s p h o r y l a t e d N F — K B i n t h e n u c l e u s . P D T C , a n o n - s e l e c t i v e i n h i b i t o r o f N F - K B w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l f o r i n h i b i t i o n o f t r a n s l o c a t i o n o f N F - K B a c r o s s t h e n u c l e a r m e m b r a n e . 7 6 F i g u r e I I - l 4 i l l u s t r a t e s t h e p 6 5 t r a n s l o c a t i o n i n h i b i t i o n o f a l l t h e 8 - s u b s t i t u t e d t h e o p h y l l i n e d e r i v a t i v e s . O 5 1 2 5 " 0 § 1 0 0 ~ 3 7 5 4 § 2 = 5 5 0 + 3 g a n a b 4 5 3 0 “ J o ‘ \ § 3 ( 9 “ 2 $ 6 9 6 8 ‘ l - c ? ’ 9 a ! x ) { v { 3 ‘ g “ F i g u r e I I - l 4 . p 6 5 t r a n s l o c a t i o n m e a s u r e d b y E L I S A w i t h u n a c t i v a t e d c o n t r o l , P M A / P H A , P D T C , t h e o p h y l l i n e a n d 8 - s u b s t i t u t e d d e r i v a t i v e s i n p r e s e n c e o f P M A / F H A . 7 7 A c t i v a t i o n w i t h P M A / F H A f o r 4 h C o m p o u n d " - 2 , “ - 3 a n d “ - 1 1 i n h i b i t e d t h e t r a n s l o c a t i o n o f N F - K B a c r o s s t h e n u c l e a r m e m b r a n e c o m p a r a b l e t o P D T C ( u p t o 4 0 % ) , w h i l e t h e o p h y l l i n e s h o w e d o n l y u p t o 1 5 % e f f e c t a t l O u M a n d n i t r o t h e o p h y l l i n e d i d n o t s h o w a s i g n i fi c a n t e f f e c t , i n d i c a t i n g t h a t t h e 8 - s u b s t i t u t i o n i n I I - 2 , I I - 3 , a n d I I - l l i m p r o v e d t h e e f fi c a c y o f t h e x a n t h i n e n u c l e u s i n i n h i b i t i n g t h e t r a n s l o c a t i o n o f N F - K B . I . P o t e n t i a t i o n o f e f f e c t o f c a m p t o t h e c i n i n C E M c e l l s . E n c o u r a g e d b y t h e r e s u l t t h a t 8 - s u b s t i t u t e d t h e o p h y l l i n e s a r e m o r e p o t e n t t h a n t h e i r p a r e n t s c a f f o l d , w e t e s t e d i f t h e s e m o l e c u l e s c o u l d i n h i b i t t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y b y i n h i b i t i n g t h e a m o u n t o f a n t i - a p o p t o t i c f a c t o r s . F i g u r e I I - l S i l l u s t r a t e s t h e e f f e c t o f t h e 8 - s u b s t i t u t e d t h e o p h y l l i n e o n C E M c e l l s w h e n i n c u b a t e d w i t h C P T o v e r a 4 8 h o u r t i m e p e r i o d . 7 8 s l l e c c i t o t p o p a f o r e b m u N s l l e c c i t o t p o p a f o r e b m u N — o — — N o d r u g / N o C P T — . — C P T ( 0 . 1 p M ) + " - 1 ( 1 0 p M ) « - e " - 1 0 0 p M ) + C P T ( 0 . 1 u M ) o . l \ N N A I \ > — N 0 2 o T a fi 8 0 8 0 0 0 0 0 0 « 6 0 0 0 0 0 0 « 2 0 0 0 0 0 0 « T i m e ( h ) + N o d r u g / N o C P T + C P T ( 0 . 1 u M ) + " - 2 ( 1 0 n M ) — I — " - 2 ( 1 0 p M ) + C P T ( 0 . 1 p M ) O \ N J I N § _ B r 0 2 % ] : u T i m e ( h ) F i g u r e I I - 1 5 . P o t e n t i a t i o n w i t h I I - l a n d “ - 2 . T r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h s u b s t i t u t e d t h e o p h y l l i n e s ( 5 0 n M , 1 0 n M , 1 u M , 0 . 1 u M ) h a d m i n i m a l a p o p t o t i c e f f e c t u p t o 2 4 h . T r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h 1 0 0 n M C P T r e s u l t e d i n s o m e c e l l d e a t h s t a r t i n g a f t e r 1 2 h o u r s o f d r u g t r e a t m e n t ( F i g u r e I I - 7 9 s l l e c d a e d f o r e b m u N s l l e c d a e d f o r e b m u N 1 5 ) . C o m b i n a t i o n t r e a t m e n t o f t h e s u b s t i t u t e d t h e o p h y l l i n e s ( 0 . 1 u M ) w i t h C P T ( 1 0 0 n M ) r e s u l t e d i n e n h a n c e d c e l l d e a t h a f t e r 4 8 h o u r s ( F i g u r e H - l 6 ) . 8 0 0 0 0 0 0 _ + N o d r u g / N o C P T + C P T ( 0 . 1 M ) + " — 1 1 ( 1 0 y M ) 6 0 0 0 0 0 0 - — . — " - 1 1 ( 1 0 p M ) + C P T ( O . 1 p M ) O 1 . 1 % T i m e ( h ) + N o d r u g / n o C P T + C P T ( 0 . 1 0 y M ) + “ - 3 ( 1 0 , u M ) - . — l l - 3 ( 1 0 M ) + C P T ( 0 . 1 0 p M ) , I < / O I " \ N N A l \ > — N H 2 2 5 0 0 0 0 0 ‘ l O N u | 0 2 0 4 0 6 0 8 0 T i m e ( h ) 1 0 0 0 0 0 0 0 « 7 5 0 0 0 0 0 < F i g u r e “ - 1 6 . P o t e n t i a t i o n w i t h [ L I ] a n d I I - 3 . I L ] , “ - 3 a n d [ L I ] s h o w e d m o d e s t p o t e n t i a t i o n o f a p o p t o t i c r e s p o n s e t r i g g e r e d b y C P T . H o w e v e r , I I - 2 p r o t e c t e d c e l l s f r o m u n d e r g o i n g a p o p t o t i c r e s p o n s e . T h i s 8 0 l l i n e T h e o E p " m 1 y 2 3 1 1 h - " " " - - - " 1 H H H H H " B P H 0 H a r b 2 2 N N s w a r m ” 1 . 1 7 0 1 1 1 . . . . 3 9 3 2 i n d i c a t e s t h a t e i t h e r , o v e r 4 8 h , “ - 2 i s b e i n g m e t a b o l i z e d i n t o p r o d u c t s t h a t m a y n o t h a v e a n o p p o s i t e e f f e c t a n d p r o m o t e c e l l s u r v i v a l . A n o t h e r p o s s i b i l i t y i s t h a t N F - K B i n h i b i t i o n c a n n o t n e c e s s a r i l y b e c o r r e l a t e d w i t h e n h a n c e m e n t o f a p o p t o t i c r e s p o n s e . T a b l e I I - 3 i l l u s t r a t e s t h e c h e m o - p o t e n t i a t i o n i n d e x a s t h e a p o p t o t i c c e l l d e a t h w i t h r e s p e c t t o c e l l d e a t h b y c a m p t o t h e c i n b y i t s e l f . W e h a v e d e fi n e d ‘ c h e m o - p o t e n t i a t i o n i n d e x ’ ( C P I ) a s t h e r a t i o o f a p o p t o t i c c e l l d e a t h i n c o m b i n a t i o n w i t h a n N F - K B i n h i b i t o r t o t h e a p o p t o t i c c e l l d e a t h i n p r e s e n c e o f t h e c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g o n l y . T h u s , C P I = A p o p t o s i s c o m b o m m J A p o p t o s i s C P T S i n c e C P I i s d e p e n d e n t o n t h e r e l a t i v e a p o p t o t i c e v e n t s w i t h r e s p e c t t o t h e n e g a t i v e c o n t r o l ( v e c t o r a l o n e ) a n d t h e s e i n t u r n a r e d e p e n d e n t o n t h e e x p o s u r e ( c o n c e n t r a t i o n 8 t i m e ) , t h i s n u m b e r w o u l d v a r y b a s e d o n t h e t w o v a r i a b l e s . 0 \ N 3 3 1 , 1 8 2 0 I I I R , T a b l e I I - 3 . C h e m o p o t e n t i a t i o n i n d e x a f t e r 4 8 h a t 1 0 p M p r e t r e a t m e n t o f t h e o p h y l l i n e d e r i v a t i v e s . 8 1 T h i s d a t a s u g g e s t s t h a t i n h i b i t i o n o f N F - K B m i g h t l e a d t o p o t e n t i a t i o n o f c h e m o t h e r a p y i n c a n c e r p a t i e n t s . H o w e v e r , “ - 2 s h o w e d a n o p p o s i t e r e s u l t w h i c h m a y b e d u e t o a m e t a b o l i s m o f t h e m o l e c u l e o v e r 4 8 h . W h i l e c a f f e i n e h a s b e e n s h o w n t o p o t e n t i a t e t h e l e t h a l e f f e c t s o f t h e g e n o t o x i c a g e n t s s u c h a s c i s - p l a t i n , b y o v e r r i d i n g t h e 6 2 c h e c k p o i n t m e c h a n i s m , N F - K B i n h i b i t i o n h a s n ’ t b e e n p r o b e d . 7 7 O u r p r e l i m i n a r y r e s u l t s f o r 8 - s u b s t i t u t e d c a f f e i n e s i n d i c a t e s i m i l a r e f f e c t s a s t h e o p h y l l i n e s . J . M e t h y l x a n t h i n e s a n d s e p t i c s h o c k C l i n i c i a n s h a v e u s e d t h e t e r m s ‘ s e p s i s ’ a n d s e p t i c s h o c k w i t h o u t a c o m m o n d e fi n i t i o n . P h y s i o l o g i c a l a l t e r n a t i o n s a n d o r g a n d y s f u n c t i o n s e e n w i t h . b a c t e r i a l i n f e c t i o n s a l s o c a n r e s u l t f r o m a w i d e v a r i e t y o f c l i n i c a l i n s u l t s - ' 8 " b T h i s c l i n i c a l s t a t e , t e r m e d t h e s y s t e m i c i n fl a m m a t o r y r e s p o n s e s y n d r o m e ( S I R S ) , i s d e fi n e d b y t w o o r m o r e c h a n g e s i n t h e f o l l o w i n g f a c t o r s : b o d y t e m p e r a t u r e , h e a r t r a t e , r e s p i r a t o r y f u n c t i o n , a n d p e r i p h e r a l l e u k o c y t e c o u n t . S e p s i s i s d e fi n e d a s t h e s y s t e m i c h o s t r e s p o n s e t o i n f e c t i o n w i t h S I R S p l u s a d o c u m e n t e d i n f e c t i o n . S e v e r e s e p s i s i s d e fi n e d a s s e p s i s p l u s e n d - o r g a n d y s f u n c t i o n o r h y p o p e r f u s i o n . 7 8 c S e p t i c s h o c k i s d e fi n e d a s s e p s i s w i t h h y p o t e n s i o n , d e s p i t e fl u i d r e s u s c i t a t i o n , a n d e v i d e n c e o f i n a d e q u a t e t i s s u e p e r f u s i o n . 7 8 d W h i l e S I R S , s e p s i s , a n d s e p t i c s h o c k c o m m o n l y a r e a s s o c i a t e d w i t h b a c t e r i a l i n f e c t i o n , b a c t e r e m i a m a y n o t b e p r e s e n t . B a c t e r e m i a i s t h e p r e s e n c e o f v i a b l e b a c t e r i a w i t h i n t h e l i q u i d c o m p o n e n t o f b l o o d . B a c t e r e m i a m a y b e t r a n s i e n t , a s i t c o m m o n l y i s a f t e r i n j u r y t o a m u c o s a l s u r f a c e . B a c t e r e m i a m a y b e p r i m a r y ( w i t h o u t a n i d e n t i fi a b l e f o c u s o f i n f e c t i o n ) o r , m o r e o f t e n , s e c o n d a r y ( w i t h a n i n t r a v a s c u l a r o r e x t r a v a s c u l a r f o c u s o f i n f e c t i o n ) . 8 2 S e p t i c e m i a , s o m e t i m e s r e f e r r e d t o a s b a c t e r e m i a , i s a s y n d r o m e t h a t r e s u l t s f r o m a n a c u t e i n v a s i o n o f t h e b l o o d s t r e a m b y c e r t a i n m i c r o o r g a n i s m s o r t h e i r t o x i c p r o d u c t s s u c h a s L P S ( l i p o p o l y s a c c h a r i d e ) . 7 9 S e p t i c s h o c k i s m o s t c o m m o n l y c a u s e d b y g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . 7 9 S t a p h y l o c o c c i , s t r e p t o c o c c i a n d o t h e r g r a m - p o s i t i v e o r g a n i s m s , f u n g i a n d s o m e v i r u s e s a r e l e s s f r e q u e n t ( t h o u g h n o t o r i o u s ) . D u e t o b a c t e r i a l i n f e c t i o n i n s e p t i c s h o c k , i n t e r a c t i o n w i t h h o s t c e l l s a n d s e r u m p r o t e i n s i n i t i a t e s a s e r i e s o f r e a c t i o n s t h a t m a y u l t i m a t e l y l e a d t o c e l l i n j u r y a n d d e a t h . B a c t e r e m i a o c c u r s i n a b o u t 4 0 % o f p a t i e n t s w i t h g r a m - n e g a t i v e b a c t e r e m i a a n d i n a b o u t 2 0 % o f p a t i e n t s w i t h S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s b a c t e r e m i a . 7 9 A m o n g t h e v a r i o u s m e d i a t o r s t h a t a r e s t i m u l a t e d i n s e p t i c s h o c k a r e T N F - c a c h e t i n a n d I L - 1 , w h i c h i n t u r n w o u l d a c t i v a t e N F - K B . T N F - a p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t a n d p a t h o g e n e s i s o f s e p s i s . A n i m a l s s u b j e c t e d t o T N F — a s h o w h y p o t e n s i o n , a c i d o s i s , h y p e r g l y c e m i a , a n d v a s c u l a r l e a k s y n d r o m e - s i g n s i n s e p t i c s h o c k . P e n t o x y p h y l l i n e i n h i b i t s L P S m e d i a t e d T N F - a p r o d u c t i o n i n r a t s i n a d o s e d e p e n d e n t m a n n e r . 8 0 H e n c e , t e m p o r a l i n h i b i t i o n o f N F - c h w h i c h c a n m a i n t a i n t h e l e v e l s o f I L - 2 I T N F - a a n d c a u s e c y t o t o x i c i t y t o a n y o f t h e a b o v e s p e c i e s o f b a c t e r i a , c o u l d fi n d a p p l i c a t i o n s i n t r e a t m e n t o f s e p t i c s h o c k . E a r l i e r s t u d i e s r e v e a l t h a t t h e o p h y l l i n e , a m i n o t h e o p h y l l i n e a n d b r o m o t h e o p h y l l i n e h a v e b e e n u s e d a s b r o n c h o d i l a t o r s a g a i n s t a s t h m a a n d i n fl a m m a t i o n . O u r s t u d i e s o n c a f f e i n e s a n d t h e o p h y l l i n e s i n d i c a t e d t h a t p r o t e c t i o n a t N - 7 i n t h e i m i d a z o l e i n c r e a s e d t h e a n t i - m i c r o b i a l a c t i v i t y o f t h e s e c o m p o u n d s . A z o m y c i n , m e t r o n i d a z o l e a r e n i t r o i m i d a z o l e s w h i c h h a v e b e e n w i d e l y u s e d a g a i n s t b a c t e r i a a n d p a r a s i t e s . 8 | M e t r o n i d a z o l e i s a n a n t i b i o t i c e s p e c i a l l y e f f e c t i v e a g a i n s t a n a e r o b i c i n f e c t i o n s ( i n f e c t i o n s t h a t g r o w 8 3 w i t h o u t t h e p r e s e n c e o f o x y g e n . ) I n a d d i t i o n , i t h a s a n t i - i n fl a m m a t o r y p r o p e r t i e s i n t h e l a r g e i n t e s t i n e a n d i s a v e r y e f f e c t i v e a n t i - d i a r r h e a m e d i c a t i o n . 0 0 2 N Z \ N O H H \ N N / N i l k — N 0 2 | ‘ > — N 0 2 N ’ ) \ N o é l ‘ N N \ | M e t r o n i d a z o l e A z o m y c i n " - 4 F i g u r e I I - 1 7 . I m i d a z o l e b a s e d a n t i - b a c t e r i a l c o m p o u n d s E n c o u r a g e d b y t h e s e f a c t s w e t e s t e d c a f f e i n e d e r i v a t i v e s f o r a n t i - m i c r o b i a l a c t i v i t y a n d p o s s i b l e N F - K B i n h i b i t i o n w i t h L P S . i ) A n t i - b a c t e r i a l a c t i v i t y : A d i s c - d i f f u s i o n a s s a y w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e a n t i - b a c t e r i a l a c t i v i t y o f t h e x a n t h i n e b a s e d c o m p o u n d s . W h i l e n o n e o f t h e t h e o p h y l l i n e s s h o w e d a n y a c t i v i t y f o r a n y b a c t e r i a l s t r a i n , c a f f e i n e b a s e d m o l e c u l e s s h o w e d s o m e a c t i v i t y . O f a l l t h e c a f f e i n e s t e s t e d , “ - 4 p r o v e d t o b e m o s t p o t e n t w i t h v i r t u a l l y n o s e l e c t i v i t y b e t w e e n g r a m n e g a t i v e o r p o s i t i v e b a c t e r i a a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s ( F i g u r e I I - 1 8 ) . H o w e v e r , u p o n s e r i a l d i l u t i o n , t h e c o m p o u n d p r o v e d i n h i b i t o r y a c t i v i t y o n l y a g a i n s t g r a m ( + ) b a c t e r i a s u c h a s M . l u t e u s , S . a u r e u s , B . s u b t i l i s . T a b l e [ 1 4 i l l u s t r a t e s t h e a n t i - b a c t e r i a l e f f e c t o f m e t h y l x a n t h i n e - I I - 4 . 8 4 F i g u r e " - 1 8 . R e p r e s e n t a t i v e d i s c - d i f f u s i o n a s s a y f o r I I - 4 a g a i n s t S . a u r e u s . T h e d a r k e r r e g i o n s ( - ) ) a r e z o n e s o f i n h i b i t i o n . “ - 1 2 s h o w e d a c t i v i t y o n l y a g a i n s t E . c o l i a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s s u c h a s 2 0 0 p g a n d n o a c t i v i t y a s t h e c o n c e n t r a t i o n w a s r e d u c e d . Z o n e o f i n h i b i t i o n Z o n e o f i n h i b i t i o n B a c t e r i a D r u g ( c o n t r o l , 1 0 u g ) ( d r u g , 1 0 p g ) B a c i l l u s c e r e u s ( + ) " - 4 2 6 1 4 B a c i l l u s s u b t i l i s ( + ) " - 4 2 6 2 2 . 1 S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ( + ) " - 4 1 7 9 M i c r o c o c c u s l u r e u s ( + ) " - 4 2 5 - K l e b s i e l l a p n e u m o n e a a ( - ) " . 4 - 3 . 2 E n t e r o b a c t e r a e r o g e n e s ( - ) | | - 4 - - E s c h e r i c h i a c o l i ( - ) ” - 4 9 - P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ( - ) " . 4 - - T a b l e “ - 4 . A c t i v i t y o f c a f f e i n e s a g a i n s t g r a m ( + ) a n d g r a m ( - ) b a c t e r i a . F u r t h e r , t h i s d a t a w a s p l o t t e d t o c o m p a r e v a l u e s w i t h s t r e p t o m y c i n c o n t r o l a t 1 0 p g . Z o n e o f i n h i b i t i o n w a s c a l c u l a t e d f o r t h e I I - 4 a t 1 0 u g l o a d i n g c o n c e n t r a t i o n . 8 5 ) m m ( n o l t b l h n l f o e n o Z M O F i g u r e I I — l 9 i l l u s t r a t e s t h e a c t i v i t y a g a i n s t g r a m ( + ) a n d g r a m ( - ) b a c t e r i a a s z o n e o f i n h i b i t i o n ( m m ) a s a m e a s u r e o f d o s e d e p e n d e n c e . A . y = 5 . 1 7 7 L n ( x ) + 2 . 1 9 4 3 Z o n e o f i n h i b i t i o n ( m m ) 0 I I I T 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 A m o u n t ( u g ) y = 4 . 5 3 2 7 L n ( x ) + 1 1 . 7 3 2 0 T I l I 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 A m o u n t ( u g ) F i g u r e I I - 1 9 . A c t i v i t y o f I I — 4 a g a i n s t A . ( t o p ) B a c i l l u s c e r e u s , B . ( b o t t o m ) B a c i l l u s s u b t i l i s J l O ) m m ( n o i t i b i 8 h n I f o e n o Z y = 5 . 9 1 5 L n ( x ) - 5 . 3 3 9 8 8 N 1 O N — h 0 0 1 O 0 1 O U ! I O 1 Z o n e o f l n h l b l t i o n ( m m ) I f 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 A m o u n t ( u g ) O 0 1 _ O y = 4 . 9 7 7 3 L n ( x ) - 8 . 0 7 1 3 o l I I ' ~ V > V ; ) ‘ - K ~ ’ 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 A m o u n t ( u g ) F i g u r e I I - 1 9 ( c o n t d ’ ) : A c t i v i t y o f I I - 4 a g a i n s t C . S t a p h y l l o c o c c u s a u r e u s , D . K l e b s i e l l a p n e u m o n e a e . 8 7 i i ) N F - K B i s a c t i v a t e d b y L P S i n m a c r o p h a g e s . L i p o p o l y s a c c h a r i d e i s a m a j o r c e l l w a l l c o m p o n e n t o f g r a m ( - ) b a c t e r i a a n d t r i g g e r s t h e i n fl a m m a t o r y r e s p o n s e s a s s o c i a t e d w i t h s e p s i s , i n c l u d i n g i n c r e a s e d C A M ( c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e ) e x p r e s s i o n a n d r e l e a s e o f I L - 8 i n e n d o t h e l i a l c e l l s . 8 2 L i t t l e i s k n o w n , h o w e v e r , a b o u t t h e e n d o t h e l i a l - a c t i v a t i n g p r o p e r t i e s o f c e l l w a l l c o m p o n e n t s o f g r a m ( + ) b a c t e r i a o r h o w t h e s e e f f e c t s c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f s e p s i s . T h e c e l l w a l l s o f G r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a a r e m a d e u p o f a l a y e r o f p e p t i d o g l y c a n ( P e p G ) e m b e d d e d w i t h t e i c h o i c a c i d s , i n c l u d i n g l i p o t e i c h o i c a c i d ( L T A ) . 8 3 T h e e f f e c t s o f L T A a n d P e p G ( e s p e c i a l l y f r o m S . a u r e u s ) o n c e l l s o t h e r t h a n e n d o t h e l i a l c e l l s a r e q u i t e w e l l c h a r a c t e r i z e d a n d i n c l u d e i n d u c t i o n o f I L - 8 r e l e a s e a n d C A M e x p r e s s i o n i n m o n o c y t e s . 8 4 D N A 4 » + + + + + T N F - o r - + + - - - a - p 6 5 - - - - - L P S - - - - + - P M A / P H A - - - - - l 2 3 4 5 ‘ L - a . ‘ 4 g p 9 ’ 5 1 1 1 1 2 . ? ‘ 4 ‘ , ' 5 L a n e l : D N A o n l y ; L a n e 2 : D N A + a c t i v a t e d c o n t r o l ( T N F - a , 1 0 p M , 2 0 ’ ) ; L a n e 3 : D N A + a c t i v a t e d c o n t r o l ( T N F - a , 1 0 p M , 2 0 ’ ) + A b p 6 5 L a n e 4 : D N A + u n a c t i v a t e d c o n t r o l L a n e 5 : D N A + a c t i v a t i o n + L P S ( 0 . 1 u g / u l , 1 h ) L a n e 6 : D N A + a c t i v a t i o n P M A / P H A ( 2 . 5 n g / m l / 2 p g / m l , 4 h ) . F i g u r e I I - 2 0 . E M S A s h o w i n g N F - K B b i n d i n g i n T H P - l m o n o c y t e s w i t h L P S ( 1 u g / m L ) ; T N F - a ( 2 p g / m L ) w a s u s e d a s p o s i t i v e c o n t r o l . 8 8 i i i ) N i t r o c a f f e i n e ( I I - 4 ) i n h i b i t s L P S i n d u c e d a c t i v a t i o n o f N F - K B i n m a c r o p h a g e s . T H P — l m o n o c y t e s w e r e g r o w n i n R P M I - l 6 4 0 m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 7 % F B S a t 3 7 ° C a t 5 % C 0 2 a t m o s p h e r e . C e l l s a t 1 X 1 0 6 / m l w e r e p r e - i n c u b a t e d w i t h t h e d r u g s f o r 3 0 m i n u t e s p r i o r t o b e i n g a c t i v a t e d w i t h 0 . 1 u M L P S . I n c u b a t i o n w a s p e r f o r m e d f o r 1 h . C e l l s w e r e t h e n h a r v e s t e d a n d n u c l e a r e x t r a c t s p r e p a r e d . T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e f o u n d o u t a n d a n E M S A w a s p e r f o r m e d w i t h t h e N F - K B c o n s e n s u s o l i g o . D N A + + + + + + + L P S ' + ' ' ' ' ' 0 t - p 6 5 - - + ’ ' ' ' ' N i t r o c a f f e i n e - - - + + + . + + — - l 2 3 4 5 6 7 8 — - ‘ — - r _ - r + : ‘ . . : - . 1 1 . - . : f r 1 F ' f a ' . . ‘ i t . ' . . " ' : X ‘ ' ‘ 1 . . _ _ _ r , . 2 ; . . ' 1 " : 5 , . 1 . , . u r n - r " . t i n - 1 1 . 1 . ; 1 : g - . 1 ; m i - - - ' 1 w . . - m v : ~ - v m w - n ' e a - r i ' L a n e l : D N A o n l y ; L a n e 2 : D N A + a c t i v a t e d c o n t r o l ; L a n e 3 : D N A + a c t i v a t e d c o n t r o l + A b p 6 5 ; L a n e 4 : D N A + u n a c t i v a t e d c o n t r o l ; L a n e 5 : D N A + a c t i v a t i o n + P D T C ( 1 0 n M ) ; L a n e 6 : D N A + a c t i v a t i o n + 1 1 4 ( 1 0 n M ) ; L a n e 7 : D N A + a c t i v a t i o n + “ - 4 ( 1 u M ) ; L a n e 8 : D N A + a c t i v a t i o n + I I - 4 ( 0 . 1 n M ) ; L a n e 9 : D N A + a c t i v a t i o n + I I - 4 ( 0 . 0 1 n M ) . F i g u r e I I - 2 1 . E M S A s h o w i n g N F - K B b i n d i n g i n T H P - l m o n o c y t e s u p o n L P S a c t i v a t i o n i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f 1 1 4 . F r o m t h e a b o v e a n t i — m i c r o b i a l a s s a y a n d i n h i b i t i o n o f N F - K B , i t c a n b e h y p o t h e s i z e d t h a t c a f f e i n e b a s e d d e r i v a t i v e I I - 4 m i g h t b e e f f e c t i v e a g a i n s t s e p t i c s h o c k a n d S I R S . F u r t h e r , s t u d i e s t o i l l u s t r a t e t h e m e c h a n i s t i c d e t a i l s a r e r e q u i r e d . 8 9 K . C o n c l u s i o n 8 - s u b s t i t u t e d t h e o p h y l l i n e s w e r e f o u n d t o b e m o d e s t p o t e n t i a t o r s o f a p o p t o t i c e f f e c t s o f c a m p t o t h e c i n . C o m p o u n d “ - 2 , “ - 3 , “ - 1 1 i n h i b i t e d t h e t r a n s l o c a t i o n o f p r o i n fl a m m a t o r y p r o t e i n N F - c h a c r o s s t h e n u c l e a r m e m b r a n e i n P M A / P H A a c t i v a t e d h u m a n J u r k a t c e l l s . W h i l e I L ] , “ - 3 a n d “ - 1 1 w e r e f o u n d t o p o t e n t i a t e t h e a p o p t o s i s c a u s e d b y c a m p t o t h e c i n ( a s m e a s u r e d b y C h e m o p o t e n t i a t i o n i n d e x i n T a b l e I I - 2 ) , “ - 2 i n d i c a t e d j u s t t h e o p p o s i t e e f f e c t . T h e s e m u t u a l l y o p p o s i t e r e s u l t s p r o v i d e s t r o n g e v i d e n c e t h a t t h e x a n t h i n e n u c l e u s m a y n o t b e s o l e l y i n v o l v e d i n N F c h i n h i b i t i o n i n t h e i r p o t e n t i a t i v e e f f e c t o n c a m p t o t h e c i n . I t c a n b e s p e c u l a t e d h e r e t h a t i n h i b i t i o n o f N F - c h m a y o r m a y n o t c u l m i n a t e i n e n h a n c i n g t h e e f f e c t o f c h e m o t h e r a p y . A l l c a f f e i n e o r N - p r o t e c t e d s c a f f o l d s e x h i b i t e d p o t e n t a n t i — m i c r o b i a l a c t i v i t y . I I - 4 s h o w e d p o t e n t a c t i v i t y a g a i n s t S . A u r e u s ( a r e s i s t a n t s t r a i n i n c l i n i c a l s e t t i n g ) a n d a l s o s h o w e d i n h i b i t i o n o f N F - K B t r a n s l o c a t i o n w h e n a c t i v a t e d b y L P S , a n i m p o r t a n t c h e m i c a l s e c r e t e d i n b a c t e r i a l i n f e c t i o n . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t c o m p o u n d s l i k e “ - 4 , m i g h t fi n d i m p o r t a n t u s e i n t r e a t m e n t o f s e p t i c s h o c k . O p t i m a l c o m b i n a t i o n s o f v a r i o u s s u s b t i t u e n t s m a y l e a d t o m o r e p o t e n t a n d s e l e c t i v e i n h i b i t o r s . 9 0 L . E x p e r i m e n t a l S e c t i o n R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n o v e n - d r i e d g l a s s w a r e u n d e r n i t r o g e n a t m o s p h e r e , u n l e s s o t h e r w i s e n o t e d . A l l c o m m e r c i a l r e a g e n t s w e r e u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r i fi c a t i o n . A l l s o l v e n t s w e r e r e a g e n t g r a d e . T H F w a s f r e s h l y d i s t i l l e d f r o m s o d i u m / b e n z o p h e n o n e u n d e r n i t r o g e n . T o l u e n e , C H z C l z , a n d T M S C l w e r e f r e s h l y d i s t i l l e d f r o m C a H z u n d e r n i t r o g e n . A l l r e a c t i o n s w e r e m a g n e t i c a l l y s t i r r e d a n d m o n i t o r e d b y T L C w i t h A n a l t e c h 0 . 2 5 m m p r e - c o a t e d s i l i c a g e l p l a t e s . C o l u m n c h r o m a t o g r a p h y w a s c a r r i e d o u t o n s i l i c a g e l 6 0 ( 2 3 0 — 4 0 0 m e s h ) s u p p l i e d b y E M S c i e n c e . Y i e l d s r e f e r t o c h r o m a t o g r a p h i c a l l y a n d s p e c t r o s c o p i c a l l y p u r e c o m p o u n d s u n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d . M e l t i n g p o i n t s w e r e d e t e r m i n e d o n a M e l - T e m p ( L a b o r a t o r y d e v i c e s ) a p p a r a t u s w i t h a m i c r o s c o p e a t t a c h m e n t . I n f r a r e d s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a N i c o l e t I R / 4 2 s p e c t r o m e t e r . l H a n d ' 3 C N M R s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a V a r i a n G e m i n i - 3 0 0 s p e c t r o m e t e r o r a V a r i a n V X R - S O O s p e c t r o m e t e r . C h e m i c a l s h i f t s a r e r e p o r t e d r e l a t i v e t o t h e r e s i d u e p e a k s o f t h e s o l v e n t C D C ] ; ( 5 7 . 2 4 f o r ' H a n d 5 7 7 . 0 f o r I 3 C ) , D M S O - d 6 ( 5 2 4 9 ( 5 ) f o r ' H a n d 5 3 9 . 5 ( 7 ) f o r ' 3 C ) a n d C D g O D ( 5 3 . 3 ( 5 ) , 4 . 7 8 ( 1 ) f o r ' H a n d 5 4 9 . 0 ( 7 ) f o r ' 3 0 ) . H i g h r e s o l u t i o n m a s s s p e c t r a a n d F A B m a s s s p e c t r a w e r e o b t a i n e d a t t h e M a s s S p e c t r o m e t r y L a b o r a t o r y o f t h e D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , w i t h a J E O L A X - S O S H a n d a J E O L H X - l l O d o u b l e f o c u s i n g m a s s s p e c t r o m e t e r ( J E O L U S A , P e a b o d y , M A ) , r e s p e c t i v e l y . G a s c h r o m a t o g r a p h y / l o w r e s o l u t i o n m a s s s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a H e w l e t t — P a c k a r d 5 8 9 0 S e r i e s 1 1 g a s c h r o m a t o g r a p h c o n n e c t e d t o a T R I O - l E I m a s s s p e c t r o m e t e r . A l l c h e m i c a l s w e r e o b t a i n e d f r o m S i g m a - A l d r i c h C h e m i c a l C o . a n d u s e d a s r e c e i v e d . 9 1 C o m p o u n d I I - l : 1 , 3 - d i m e t h y 1 - 8 - n i t r o - l H - p u r i n e - 2 , 6 ( 3 H , 7 H ) - d i o n e O H \ N N A ) ‘ ] : / } - N 0 2 0 I } : N A s o l u t i o n o f t h e o p h y l l i n e ( 0 . 5 4 g , 3 m m o l ) w a s s u s p e n d e d i n A C 2 0 ( 5 m l ) a n d c o o l e d t o < 5 ° C i n w e t i c e . C o n c . I ‘ I N O 3 ( 0 . 4 5 m l , 1 0 m m o l ) w a s a d d e d d r o p - w i s e w i t h c o n s t a n t s t i r r i n g . T h e s t a r t i n g m a t e r i a l s l o w l y d i s s o l v e d a n d g a v e a d u l l y e l l o w s o l i d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r 2 h a t 0 ° C a n d t h e n m a i n t a i n e d a t 4 0 ° C i n a w a t e r b a t h f o r 1 0 m i n u t e s . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s b r o u g h t t o r o o m t e m p e r a t u r e a n d w a s w a s h e d w i t h E t 0 H / H 2 0 ( 1 : 1 , 1 0 m l ) . T h e b r i g h t y e l l o w s o l i d w a s fi l t e r e d a n d d r i e d . A s m a l l s a m p l e w a s r e c r y s t a l l i z e d f r o m 0 . 5 N H C I a s y e l l o w c r y s t a l s . Y i e l d : 4 9 % ; M P . d e c o m p o s e d a t 2 8 2 ° C . I H N M R : ( 5 0 0 M H z , D M S O - d 6 ) 8 3 . 2 2 ( s , 3 H ) , 3 . 3 9 ( s , 3 H ) 1 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , D M S O - d 6 ) 8 2 8 . 9 6 , 3 1 . 0 7 , 1 1 2 . 3 8 , 1 4 6 . 0 9 , 1 4 8 . 2 6 , 1 5 1 . 9 0 , 1 5 6 . 3 2 I R : ( N a C l ) 2 9 2 4 . 0 , 1 6 9 9 . 5 , 1 6 6 0 . 9 , 1 5 2 2 . 0 , 1 3 4 2 . 6 , 1 3 0 4 . 1 c m ' l . L R M S m / e ( C 7 H 7 N 5 0 4 ) ( M + ) 2 2 5 . 0 . C o m p o u n d “ - 2 : 8 - b r o m o - 1 , 3 - d i m e t h y l - l H - p u r i n e - 2 , 6 ( 3 H , 7 H ) - d i o n e O H 2 1 3 ‘ ] : ’ > - B ' o 1 ; : N A s o l u t i o n o f t h e o p h y l l i n e ( 2 0 0 m g ) i n 3 0 % H 2 0 2 i n H 2 0 ( 2 e q . ) w a s m a i n t a i n e d a t 0 ° C . H B r ( 2 e q . ) w a s a d d e d d r o p w i s e t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e . T h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o s t i r o v e r n i g h t . T h e w h i t e p r e c i p i t a t e t h a t a p p e a r e d w a s t h e n fi l t e r e d a n d d r i e d . Y i e l d : 7 3 % ; 9 2 M e t h o d 2 . A s u s p e n s i o n o f t h e o p h y l l i n e ( 1 g ) i n w a t e r w a s m i x e d w i t h a s o l u t i o n o f N B S ( 1 . 0 9 g , 6 . 1 1 m m o l ) a t 0 ° C . S t i r r e d f o r 3 h . A w h i t e p r e c i p i t a t e w a s f o r m e d w h i c h w a s fi l t e r e d , d r i e d , a n d c h a r a c t e r i z e d . M . P . > 2 6 0 ° C 1 H N M R : ( 5 0 0 M H z , D M S O - d 6 ) 8 3 . 2 1 ( s , 3 H ) , 3 . 3 8 ( s , 3 H ) 1 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , D M S O - d 6 ) 8 2 7 . 5 4 , 2 9 . 6 2 , 1 0 9 . 0 4 , 1 2 3 . 9 5 , 1 4 7 . 7 2 , 1 5 0 . 7 0 , 1 5 3 . 2 3 I R : ( N a C l ) 2 9 2 3 . 3 , 2 8 5 4 . 7 , 1 7 0 8 . 1 , 1 6 4 8 . 9 , 1 6 0 3 . 1 c m " . L R M S m / e ( 9 1 1 7 1 1 4 0 2 1 3 1 ) ( M + ) 2 5 9 . 8 , 2 5 7 . 8 C o m p o u n d “ - 3 : 8 - a m i n o - 1 , 3 - d i m e t h y l - l H - p u r i n e - 2 , 6 ( 3 H , 7 H ) - d i o n e O \ N H A I ’ > _ N H 2 0 N N A s o l u t i o n o f “ - 1 ( 1 g ) i n c o n c . H C l ( 8 m L ) w a s m a i n t a i n e d a t 0 ° C . S n ( 3 . 5 e q . ) w a s a d d e d i n s m a l l l o t s t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e . T h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o s t i r f o r 3 h w i t h c o n s t a n t c o o l i n g . T h e w h i t e p r e c i p i t a t e t h a t a p p e a r e d w a s t h e n fi l t e r e d a n d d r i e d . Y i e l d : 7 0 % ; M . P . 2 6 0 0 C . l H N M R : ( 5 0 0 M H z , T F A - d l ) 8 3 . 9 2 ( s , 3 H ) , 4 . 0 7 ( s , 3 H ) l 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , D M S O - d 6 ) 8 3 0 . 7 5 , 3 3 . 6 1 , 1 0 4 . 0 2 , 1 4 7 . 5 7 , 1 5 2 . 3 2 , 1 5 3 . 2 5 , 1 5 6 . 9 1 1 R : ( N a C l ) 3 4 1 0 . 0 , 3 1 0 5 . 0 , 1 7 1 6 . 9 , 1 6 6 4 . 8 . L R M S m / e ( C 7 H 7 N 5 0 4 ) ( M + ) 1 9 5 . 0 . C o m p o u n d I I - 4 : 1 , 3 , 7 - t r i m e t h y l - 8 - n i t r o - l H - p u r i n e - Z , 6 ( 3 H , 7 H ) - d i o n e ° / 2 1 3 1 ] : ’ > — N ° 2 0 i i i N M e t h o d A : A s u s p e n s i o n o f c a f f e i n e ( 1 . 9 4 g , 1 0 m m o l ) w a s d i s s o l v e d i n g l a c i a l a c e t i c a c i d ( 5 m l ) a t 1 0 0 ° C . 6 5 % c o n c . H N 0 3 ( 2 m l , 4 4 m m o l ) w a s a d d e d 9 3 l — — — _ d r o p w i s e w i t h c o n s t a n t s t i r r i n g . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s h e a t e d f o r 1 h a t 1 0 0 0 C . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d i n v a c u o . T h e r e s i d u e w a s t h e n e x t r a c t e d w i t h C H C 1 3 a n d 1 N N a H C 0 3 ( 2 0 m l ) t w i c e . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d e v a p o r a t e d . T h e s o l i d o b t a i n e d w a s r e c r y s t a l l i s e d i n m e t h a n o l . Y i e l d 2 0 % ( 2 3 8 m g ) M e t h o d B : A s o l u t i o n o f I L ] ( 5 0 0 m g , 2 . 3 m m o l ) a n d a n h y d r o u s K 2 C 0 3 i n d r y D M F ( 1 5 m l ) w a s a l l o w e d t o s t i r f o r 1 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . C H 3 1 ( 1 . 6 3 g , 1 1 . 5 m m o l ) w a s a d d e d a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e h e a t e d a t 8 0 ° C f o r 4 0 ’ . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s f u r t h e r a l l o w e d t o s t i r a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 8 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s e x t r a c t e d w i t h E t O A C / L i C l . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S 0 4 a n d c o n c e n t r a t e d i n v a c u o . A b r i g h t y e l l o w s o l i d w a s i s o l a t e d , y i e l d 8 1 % ( 4 3 0 m g ) ; M . P . = 1 7 O ° c ' H N M R : ( 5 0 0 M H z , C D C 1 3 ) 5 3 . 4 0 ( s , 3 H ) , 3 . 5 7 ( s , 3 H ) , 4 . 4 1 ( s , 3 H ) 1 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , C D C 1 3 ) 8 2 8 . 4 1 , 3 0 . 0 8 , 3 6 . 7 0 , 1 0 9 . 5 4 , 1 4 4 . 5 4 , 1 5 0 . 8 9 , 1 5 5 . 3 1 I R : ( N a C l ) 2 9 5 5 . 0 , 1 7 1 1 . 1 , 1 6 8 8 . 7 , 1 5 3 7 . 5 , 1 3 2 3 . 4 c m " . L R M S m / e ( C 7 H 7 N 5 0 4 ) ( M + ) 2 3 9 . 1 . A n a l . ( C g H o N 5 0 4 ) c ; C a l c d . H , 3 . 7 9 ; N , 2 9 . 2 8 ; f o u n d , 1 1 , 3 6 5 ; N , 2 8 . 6 0 . C o m p o u n d I I - 5 : 8 - b r o m o - 1 , 3 , 7 - t r i m e t h y l - l H - p u r i n e - 2 , 6 ( 3 H , 7 H ) - d i o n e ° / \ N N A J ] : ’ > _ B ' 0 1 r N A s o l u t i o n o f c a f f e i n e ( 5 g , 2 5 . 8 m m o l ) i n 3 0 % H 2 0 2 ( 2 . 9 2 m i , 2 8 . 4 m m o l ) i n H 2 0 ( 3 m l ) w a s m a i n t a i n e d a t 0 0 C . H B r ( 1 . 8 8 m i , 2 8 . 4 m m o l ) w a s a d d e d d r o p w i s e t o 9 4 t h e r e a c t i o n m i x t u r e . T h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o s t i r o v e r n i g h t . T h e w h i t e p r e c i p i t a t e t h a t a p p e a r e d w a s t h e n fi l t e r e d a n d d r i e d . Y i e l d : 3 5 % ( 2 . 4 5 g ) ; M . P . 1 6 6 ° c ' H N M R : ( 5 0 0 M H z , c o c h ) 5 3 . 3 8 ( s , 3 H ) , 3 . 5 4 ( s , 3 H ) , 3 . 9 4 ( s , 3 1 1 ) 1 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , c 0 0 1 3 ) 5 2 8 . 3 1 , 3 0 . 1 7 , 3 4 . 3 6 , 1 0 9 . 3 5 , 1 2 9 . 2 1 , 1 4 8 . 1 5 , 1 5 1 . 3 8 , 1 5 4 . 4 5 I R : ( N a C l ) 2 9 2 2 . 5 , 2 8 5 5 . 0 , 1 7 0 7 . 2 , 1 6 6 2 . 9 , 1 5 4 3 . 3 , 1 4 5 8 . 4 c m " . L R M S m l e ( C 7 H 7 N 5 0 4 ) ( M + ) 2 7 2 . 0 , 2 7 4 . 0 . C o m p o u n d I I - 6 : 8 - h y d r a z i n y l - l , 3 , 7 - t r i m e t h y l - l H - p u r i n e - 2 , 6 ( 3 H , 7 H ) - d i o n e ° / A j j : / > - N H N H 2 0 i i i N A s o l u t i o n o f [ L S ( 1 2 0 m g , 0 . 4 4 m m o l ) a n d h y d r a z i n e h y d r a t e ( 3 7 4 . 5 m g , 7 . 4 8 m m o l ) i n T I - I F ( 2 0 m l ) w a s r e fl u x e d f o r 1 . 2 5 h . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d i n v a c u o . A g r e e n i s h w h i t e s o l i d w a s i s o l a t e d . T h e s o l i d w a s r e c r y s t a l l i s e d i n m e t h a n o l , y i e l d 5 1 % ( 5 0 m g ) ; M . P . d e c o m p o s e d a t 2 8 9 ° C 1 H N M R : ( 5 0 0 M H z , D M S O - d 6 ) 8 3 . 1 6 ( s , 3 H ) , 3 . 3 7 ( s , 3 H ) , 3 . 5 5 ( s , 3 H ) , 4 . 3 5 ( b , 2 H ) , 8 . 0 5 ( b , 1 1 1 ) ' 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , D M S O - d 6 ) 8 2 7 . 2 3 , 2 9 . 3 8 , 3 7 . 0 , 1 4 8 . 0 2 , 1 5 0 . 9 7 , 1 5 3 . 1 5 , 1 5 6 . 5 2 , 1 6 8 . 6 1 I R : ( N a C l ) 3 2 5 2 . 4 , 2 9 2 6 . 5 , 1 7 4 9 . 7 , 1 7 0 5 . 9 1 6 6 2 . 9 , 1 6 l 6 . 6 , 1 5 3 9 . 4 c m “ . L R M S m / e ( 0 7 1 1 7 5 1 5 0 4 ) ( M + ) 2 2 4 . 1 . A n a l . ( C g H I 2 N 6 0 2 ) c ; H ; C a l c d . N , 3 7 . 4 8 ; f o u n d , N , 3 5 . 0 9 . C o m p o u n d I l - 7 : 6 - a m i n o - l , 3 - d i m e t h y l p y r i m i d i n e - 2 , 4 ( 1 H , 3 H ) - d i m e 9 5 A s o l u t i o n o f d i m e t h y l u r e a ( l g , 1 1 . 3 6 m m o l ) i n a c e t i c a n h y d r i d e ( 1 5 m l ) w a s h e a t e d w i t h c y a n o a c e t i c a c i d ( 1 . 1 g , 1 2 . 5 m m o l ) a t 7 5 0 C f o r 2 h i n a n o i l b a t h . A m i l d e x o t h e r m i c r e a c t i o n o c c u r r e d d u r i n g t h e fi r s t s t a g e s o f h e a t i n g d u r i n g w h i c h t h e h e a t i n g w a s r e m o v e d . T h e s o l v e n t w a s r e m o v e d i n v a c u o a n d w a t e r w a s a d d e d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s t h e n c o n c e n t r a t e d t o g i v e a b r o w n s l u r r y . T h i s w a s c o o l e d i n w e t i c e f o r 5 ‘ a n d n e u t r a l i z e d w i t h a 7 0 % ( w / v ) N a O H s o l u t i o n . A r e d d i s h b r o w n s o l i d w a s i s o l a t e d . Y i e l d : 7 0 % ( 1 . 2 3 g ) M . P . d e c o m p o s e d a t 2 8 2 ° C I H N M R : ( 3 0 0 M H z , D M S O - d 6 ) 8 3 . 0 5 ( s , 3 H ) , 3 . 2 2 ( s , 3 H ) , 4 . 6 7 ( s , 1 H ) , 6 . 7 7 ( b , 2 H ) l 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , D M S O - d 6 ) 8 2 7 . 0 3 , 2 9 . 2 7 , 7 4 . 8 7 , 1 5 1 . 5 9 , 1 5 4 . 8 8 , 1 6 1 . 4 1 , 1 6 8 . 6 1 I R : ( N a C l ) 3 3 5 0 . 2 , 2 9 2 6 . 5 , 1 6 2 0 . 2 c m " . L R M S m / e ( C 6 1 1 9 N 3 0 2 ) ( M + ) 1 5 5 . 1 . A n a l . ( C 6 H 9 N 3 0 2 ) C ; C a l c d . H , 5 . 8 5 ; f o u n d , 6 . 2 9 ; N . C o m p o u n d I ] - 8 : 6 - a m i n o - 1 , 3 - d i m e t h y l - S - n i t r o s o p y r i m i d i n e - 2 , 4 ( l H , 3 H ) - d i o n e 0 \ N J ‘ I N O C A N N H 2 A s u s p e n s i o n o f I I - 7 ( 5 0 0 m g ) w a s m a i n t a i n e d a t 6 0 0 C i n 5 0 % a q u e o u s a c e t i c a c i d ( 1 5 m l ) u n t i l t h e s o l i d d i s s o l v e d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s t h e n c o o l e d a n d N a N 0 2 ( 5 4 4 m g , 6 . 4 m m o l ) d i s s o l v e d i n 2 m l w a t e r w a s a d d e d d r o p w i s e o v e r a p e r i o d o f 3 0 ’ u s i n g a n s y r i n g e p u m p ( K d S c i e n t i fi c M o d e l 1 0 0 , S e r i a l N o . 1 9 0 1 6 ) 9 6 T h e s o l u t i o n t u r n e d d e e p m a g e n t a a n d a m a g e n t a s o l i d a p p e a r e d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r 1 h a n d t h e n c o o l e d t o 4 ° C t o f a c i l i t a t e c o m p l e t e p r e c i p i t a t i o n . T h e s o l i d w a s w a s h e d w i t h H 2 0 a n d i s o l a t e d , y i e l d 9 3 % ( 5 5 0 m g ) M . P . = 2 3 4 0 C 1 H N M R : ( 3 0 0 M H z , D M S O - d 6 ) 8 3 . 2 3 ( s , 3 H ) , 3 . 2 6 ( s , 3 H ) , 9 . 0 7 ( b r , s , 1 H ) , 1 2 . 9 4 ( b r , s , 2 H ) l 3 C N M R : ( 1 2 5 M H z , D M S O - d 6 ) 8 2 7 . 8 5 , 2 8 . 6 9 , 1 3 9 . 1 7 , 1 4 6 . 1 0 , 1 4 9 . 4 1 , 1 6 0 . 2 6 I R : ( N a C l ) 3 2 5 2 . 4 , 2 9 2 6 . 4 , 1 7 0 4 . 5 , 1 6 5 7 . 1 c m " . L R M S m / e ( C 6 H 3 N 4 0 3 ) ( M + ) 1 8 4 . 0 . C o m p o u n d I I - 9 : 5 , 6 - d i a m i n o - 1 , 3 - d i m e t h y l p y r i m i d i n e - 2 , 4 ( 1 H , 3 H ) - d i o n e 0 C A N N H 2 A s u s p e n s i o n o f I I - 8 ( 5 0 0 m g , 2 . 7 1 m m o l ) i n 1 0 m l N I L O H ( 1 2 . 5 % a q u e o u s s o l u t i o n ) w a s m i x e d w i t h N a 2 S 2 0 4 ( 9 4 3 . 1 m g , 5 . 4 2 m m o l ) d i s s o l v e d i n H 2 0 ( 2 m l ) . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s a l l o w e d t o s t i r f o r 3 0 ’ a n d t h e n s e t u p o n t h e r o t a r y e v a p o r a t o r t o r e d u c e i t s v o l u m e t o h a l f t h e o r i g i n a l v o l u m e . T h e o r a n g e s o l i d d i s s o l v e d a n d a c o l o r l e s s s o l u t i o n w a s o b t a i n e d . T h i s s o l u t i o n w a s t h e n c o o l e d t o — 2 0 ° C f o r 3 0 ’ . A b l u i s h w h i t e p r e c i p i t a t e w a s i s o l a t e d ; y i e l d 8 0 % ( 3 7 0 m g ) ; M . P . d e c o m p o s e d a t 2 0 4 0 C 1 H N M R : ( 3 0 0 M H z , D M S O - d 6 ) 8 2 . 9 4 ( b r , s , 2 H ) , 3 . l 2 ( s , 3 H ) , 3 . 2 7 ( s , 3 H ) , 6 . 1 5 ( b r , s , 2 H ) 1 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , D M S O - d 6 ) 8 2 7 . 6 1 , 2 9 . 7 5 , 9 6 . 0 3 , 1 4 4 . 6 4 , 1 4 9 . 7 6 , 1 5 8 . 9 5 1 R : ( N a C l ) 3 3 9 7 . 1 , 3 2 8 0 . 2 , 2 9 2 2 . 5 , 1 6 5 8 . 9 . 7 , 1 6 1 6 . 5 , 1 4 9 8 . 9 , 1 4 5 2 . 6 c m " . L R M S m / e ( C 6 H 1 0 N 4 0 2 ) ( M + ) 1 7 0 . 0 . H R M S m / e ( C 6 H 1 0 N 4 0 2 ) ( M + ) c a l c d . 1 7 0 . 0 8 0 4 ; f o u n d , 1 7 0 . 0 8 0 8 ; A n a l . 9 7 ( C 6 H 1 0 N 4 0 2 ) C ; C a l c d . : H , 6 . 2 6 ; N , 3 2 . 9 2 f o u n d : H , C a l c d . N , 3 7 . 4 8 ; f o u n d , N , 3 5 . 0 9 . C o m p o u n d I I - 1 0 : N - ( 6 - a m i n o - l , 2 , 3 , 4 - t e t r a h y d r o - 1 , 3 - d i m e t h y I - 2 , 4 - d i o x o p y r i m i d i n - S - y l ) b e n z a n r i d e A s u s p e n s i o n o f “ - 9 ( 8 0 0 m g , 4 . 7 m m o l ) w a s m a i n t a i n e d i n d r y p y r i d i n e ( 4 0 m l ) a t 0 0 C . B e n z o y l c h l o r i d e ( 5 9 9 . 8 u l , 5 . 1 7 m m o l ) w a s a d d e d d r o p w i s e w i t h c o n t i n u o u s s t i r r i n g . T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r 1 2 h d u r i n g w h i c h t h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o c o m e t o r o o m t e m p e r a t u r e : T h e s o l v e n t w a s t h e n r e m o v e d b y d i s t i l l a t i o n . A b r o w n c o l o r e d s l u r r y r e m a i n e d w h i c h w a s d i l u t e d w i t h w a t e r t o y i e l d a l i g h t b r o w n s o l i d . T h e s o l i d w a s t h e n i s o l a t e d a n d r e c r y s t a l l i s e d i n 1 : 1 E t 0 H / H 2 0 . Y i e l d : 7 9 % ( 1 . 0 1 g ) M . P . 2 2 5 ° C 1 H N M R : ( 3 0 0 M H z , D M S O - d 6 ) 8 3 . 1 3 ( s , 3 H ) , 3 . 3 2 ( s , 3 H ) , 6 . 7 2 ( b r , s , 2 H ) , 7 . 4 6 - 7 . 5 0 ( m , 3 H ) , 7 . 9 6 ( d , 2 H , J : 6 . 6 H z ) , 8 . 9 2 ( b r , s , 1 H ) l 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , D M S O - d 6 ) 5 2 7 . 5 5 , 3 0 . 0 2 , 8 7 . 4 1 , 1 2 7 . 9 4 , 1 2 8 . 0 0 , 1 3 1 . 1 5 , 1 3 4 . 5 5 , 1 5 0 . 6 3 , 1 5 2 . 3 2 , 1 5 9 . 2 8 , 1 6 6 . 6 0 1 R : ( N a C l ) 3 2 5 2 . 4 , 2 9 2 6 . 5 , 1 6 9 7 . 6 , 1 6 4 5 . 5 , 1 5 7 6 . 0 , 1 5 1 6 . 2 c m " . L R M S m / e ( C 1 3 H 1 4 N 4 0 3 ) ( M + ) 2 7 4 . 2 . H R M S m / e ( C 1 3 H 1 4 N 4 0 3 ) ( M + ) c a l c d . 2 7 4 . 1 0 6 6 ; f o u n d , 2 7 4 . 1 0 7 0 . C o m p o u n d I I - l l : 1 , 3 - d i m e t h y l - 8 - p h e n y l - l H - p u r i n e - Z , 6 ( 3 H , 7 H ) - d i o n e O \ N H A l ) — P h 0 1 r N 9 8 A s o l u t i o n o f I I - 1 0 ( 9 0 0 m g , 3 . 3 8 m m o l ) i n 2 N N a O H ( 1 5 m 1 ) / E t h a n o l ( S m l ) w a s r e fl u x e d f o r 1 h . C o o l e d t h e r e a c t i o n m i x t u r e t o 4 ° C . D i l u t e d t h e r e a c t i o n m i x t u r e w i t h 2 m l H 2 0 a n d a c i d i fi e d w i t h g l a c i a l H O A c t o p H = 5 . A w h i t e s o l i d w a s f o r m e d w h i c h w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d i s o l a t e d . T h e s o l i d w a s t h e n r e c r y s t a l l i s e d i n m e t h a n o l ; y i e l d 9 4 % , ( 0 . 7 9 g ) ; M . P . > 2 6 0 ° C l H N M R : ( 3 0 0 M H z , D M S O - d 6 ) 8 3 . 2 1 ( s , 3 H ) , 3 . 4 5 ( s , 3 H ) , 7 . 1 9 - 8 . 0 6 ( m , 5 H ) 1 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , D M S O - d 6 ) 8 2 7 . 3 4 , 2 8 . 8 2 , 1 1 0 . 1 4 , 1 2 6 . 3 2 , 1 2 8 . 7 7 , 1 2 8 . 9 1 , 1 3 0 . 1 2 , 1 4 8 . 4 8 , 1 4 9 . 7 1 , 1 5 1 . 1 8 , 1 5 4 . 2 6 I R : ( N a C l ) 2 9 2 6 . 5 , 1 6 9 7 . 6 , 1 6 4 3 . 6 , 1 2 1 7 . 2 c m " . L R M S m l e ( C . 3 H . 2 N 4 0 2 ) ( M + ) 2 5 6 . 1 . H R M S m / e ( C ( 3 H 1 2 N 4 0 2 ) ( M + ) c a l c d . 2 5 6 . 0 9 5 4 ; f o u n d , 2 5 6 . 0 9 6 0 ; A n a l . ( C 1 3 H 1 2 N 4 0 2 ) C , H , N . C o m p o u n d “ - 1 2 . 7 - b e n z y l - 1 , 3 - d i m e t h y l - 8 - p h e n y l - l H - p u r i n e - Z , 6 ( 3 H , 7 H ) - 0 P h ) \ N J I N > _ / P h 0 % “ ? N A s o l u t i o n o f [ L I ] ( 1 0 0 m g , 0 . 3 9 m m o l ) a n d a n h y d r o u s K 2 C 0 3 ( 5 3 . 9 m g , 0 . 3 9 d i o n e m m o l ) i n d r y D M F ( 2 m L ) w a s s t i r r e d f o r 1 0 m i n u t e s . B e n z y l b r o m i d e ( 7 3 . 3 m g , 0 . 4 3 m m o l ) w a s a d d e d d r o p w i s e a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e r e fl u x e d f o r 2 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e a n d e x t r a c t e d i n E t O A c / L i C l ( 3 X ) . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 S 0 4 a n d e v a p o r a t e d i n v a c u o . T h e w h i t e s o l i d w a s r e c r y s t a l l i s e d w i t h m e t h a n o l ; y i e l d 7 5 % ( 0 . 1 g ) ; M . P . 1 7 9 ° C w h i t e s o l i d ; l H N M R : ( 3 0 0 M H z , C D C 1 3 ) 8 3 . 3 9 ( s , 3 H ) , 3 . 6 4 ( s , 3 H ) , 5 . 6 2 ( s , 2 H ) , 9 9 7 . 0 2 - 7 . 5 4 ( m , 1 0 H ) l 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , C D C I 3 ) 8 2 8 . 0 2 , 2 9 . 8 0 , 4 9 . 3 5 , 1 0 7 . 9 3 , 1 2 6 . 4 1 , 1 2 7 . 9 0 , 1 2 8 . 5 5 , 1 2 8 . 8 7 , 1 2 8 . 9 6 , 1 2 9 . 2 1 , 1 3 0 . 5 1 , 1 3 6 . 6 1 , 1 4 8 . 5 7 , 1 5 1 . 7 2 , 1 5 2 . 6 2 , 1 5 5 . 1 8 I R : ( N a C l ) 2 9 5 1 . 5 , 1 7 0 3 . 3 8 , 1 6 6 0 . 9 2 , 1 5 4 1 . 3 2 , 1 4 5 2 . 6 c m " . L R M S m / e ( C 2 0 H I 3 N 4 0 2 ) ( M + ) 3 4 6 . 4 . E M S A a s s a y f o r N F - K B - D N A b i n d i n g E M S A a s s a y f o r N F - K B - D N A b i n d i n g : J u r k a t c e l l s ( E 6 - T I B c l o n e ; A m e r . T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n , R o c k v i l l e , M D ) w e r e g r o w n i n R P M I - l 6 4 0 m e d i a ( G i b c o - B R L , R o c k v i l l e , M D ) s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m , p e n i c i l l i n ( 6 1 4 n g / m L ) , s t r e p t o m y c i n ( 1 0 u g / m L ) a n d H E P E S b u f f e r , p H 7 . 2 a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 . C e l l s ( 1 . 6 X 1 0 ° c e l l s / m L ) w e r e s u b s e q u e n t l y t r e a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c o m p o u n d s t o b e t e s t e d f o r 3 0 m i n . a t 3 7 ° C a n d 5 % C 0 2 f o l l o w e d b y T N F - 0 1 ( 0 . 4 p g ) o r P M A / P H A ( S i g m a - A l d r i c h ) ( 1 . 0 1 1 M ) s t i m u l a t i o n f o r a n a d d i t i o n a l 3 0 m i n u t e s o r 5 h o u r s , r e s p e c t i v e l y . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n , w a s h e d i n i c e c o l d P B S a n d t h e n u c l e a r e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . 7 4 T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f t h e e x t r a c t s w a s d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o t h e B r a d f o r d m e t h o d ( 1 9 7 6 ) w i t h B i o R a d r e a g e n t s . N u c l e a r e x t r a c t s ( 2 0 p g t o t a l p r o t e i n ) w e r e i n c u b a t e d f o r 2 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h a d o u b l e s t r a n d e d C y 3 l a b e l e d N F - K B c o n s e n s u s o l i g o n u c l e o t i d e , 5 ' - A G T T G A G G G G A C T ' I T C C C A G G C - 3 ' ( 0 . 1 6 p m o l ) . T h e b i n d i n g m i x t u r e ( 2 5 1 1 L ) c o n t a i n e d 1 0 m M I - I E P E S - N a O H p H 7 . 9 , 4 m M t r i s - H C I , p H 7 . 9 , 6 . 0 m M K C l , 1 m M E D T A , 1 m M D T T , 1 0 % g l y c e r o l , 0 . 3 m g / m L b o v i n e s e r u m a l b u m i n a n d 1 p g o f p o l y ( d I . d C ) . T h e m i x t u r e w a s l o a d e d o n a 4 % p o l y a c r y l a m i d e g e l p r e p a r e d i n 1 X t r i s b o r a t e / E D T A b u f f e r a n d w a s e l e c t r o p h o r e s e d a t 3 0 0 V f o r 2 0 1 0 0 m i n u t e s . A f t e r e l e c t r o p h o r e s i s t h e g e l w a s a n a l y z e d u s i n g a p h o s p h o r i m a g e r ( B i o r a d F X p l u s ) f o r d e t e c t i o n o f t h e N F - K B - D N A b i n d i n g . M e a s u r e m e n t o f a p o p t o s i s u s i n g c a s p a s e 3 / 7 a s s a y C E M c e l l s ( C C R F — C E M ) ; A m e r . T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n , R o c k v i l l e , M D ) w e r e g r o w n i n R P M I - 1 6 4 0 M e d i a ( G i b c o - B R L , R o c k v i l l e , M D ) s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m , p e n i c i l l i n ( 6 1 4 n g / m L ) , s t r e p t o m y c i n ( 1 0 p g / m L ) a n d H E P E S b u f f e r , p H 7 . 2 a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 . D M S O w a s u s e d a s t h e v e c t o r f o r a l l d r u g s a n d w a s a d d e d i n t h e c o n t r o l e x p e r i m e n t s . C e l l c u l t u r e s w e r e t r e a t e d w i t h 1 0 1 1 M , 1 1 1 M o r 0 . 0 1 u M o f t h e c o m p o u n d s ( t h e o p h y l l i n e s ) a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 a t m o s p h e r e f o r 3 0 m i n u t e s . C a m p t o t h e c i n w a s a d d e d a t c o n c e n t r a t i o n s 0 . 1 1 1 M a n d f u r t h e r i n c u b a t e d . A n a l i q u o t e w a s t r a n s f e r r e d t o a 9 6 - w e l l p l a t e a t v a r i o u s t i m e p o i n t s 0 , 6 , 1 2 , 2 4 , 4 8 h o u r s a n d m i x e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f A p o - O N E T M H o m o g e n o u s C a s p a s e - 3 ” a s s a y ( P r o m e g a C o r p o r a t i o n ) r e a g e n t . T h e c o n t e n t s o f t h e p l a t e w e r e g e n t l y m i x e d a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e f o r 1 h o u r . T h e fl u o r e s c e n c e o f e a c h w e l l w a s t h e n m e a s u r e d o n a M o l e c u l a r I r n a g e r F X P r o a t 5 3 2 n m . A l l r e p o r t e d d a t a i s t h e a v e r a g e o f t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s u n l e s s o t h e r w i s e i n d i c a t e d . C h e m o p o t e n t i a t i o n i n d e x w a s f o u n d o u t w i t h r e s p e c t t o t h e c a m p t o t h e c i n c o n t r o l . I n h i b i t i o n o f t r a n s l o c a t i o n w i t h p 6 5 - E L I S A a s s a y T h e q u a n t i t y o f p 6 5 / p 5 0 h e t e r o d i m e r t h a t h a s t r a n s l o c a t e d i n t o t h e n u c l e u s w a s m e a s u r e d u s i n g a N F - c h p 6 5 s a n d w i c h E L I S A a s s a y ( I m g e n e x C o r p . ) . J u r k a t c e l l s w e r e g r o w n t o 1 . 0 X 1 0 ° c e l l s / m L a n d w e r e s u b s e q u e n t l y t r e a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c o m p o u n d s f o r 3 0 m i n . a t 3 7 ° C a n d 5 % C 0 2 1 0 1 f o l l o w e d b y P M A ( 5 0 0 p g / m l ) / P H A ( 1 0 p g / m l ) s t i m u l a t i o n f o r a n a d d i t i o n a l 4 h , r e s p e c t i v e l y . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d a f t e r 4 h a n d n u c l e a r e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d b y D i g n a m a n d c o w o r k e r s . " T h e N F - K B p 6 5 s a n d w i c h E L I S A a s s a y w a s u s e d t o m o n i t o r a n d q u a n t i f y p 6 5 t r a n s l o c a t i o n i n t o t h e n u c l e u s a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l . R e s u l t s w e r e r e a d o n B i o r a d ’ s M i c r o p l a t e B e n c h m a r k r e a d e r a t 4 0 5 n M . P D T C i s r e p o r t e d t o b e a n i n h i b i t o r o f N F - K B t r a n s l o c a t i o n a n d o u r d a t a c o n fi r m e d t h a t i t i n h i b i t e d N F - K B t r a n s l o c a t i o n a t c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 1 0 0 n M t o 5 . 0 p M ( d a t a n o t s h o w n ) . D i s c - D i f f u s i o n A s s a y f o r A n t i - M i c r o b i a l A c t i v i t y S i n g l e b a c t e r i a l c o l o n i e s w e r e g r o w n o n p r e - p o u r e d n u t r i e n t a g a r p l a t e s ( 2 3 g I L b o i l e d ( 1 ’ ) a n d a u t o c l a v e d ( 1 5 ’ ) ) o v e r n i g h t . M e u l l e r H i n t o n a g a r p l a t e s ( 3 8 g I L b o i l e d ( 1 ’ ) a n d a u t o c l a v e d ( 1 5 ’ ) ) w e r e p r e p a r e d . B l a n k d i s c s w e r e i m p r e g n a t e d a t 1 0 0 p g , 1 0 p g , 1 p g , 0 . 1 p g a n d 0 . 0 1 p g t o t a l c o m p o u n d . C o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e s t r e p t o m y c i n a n d p e n i c i l l i n d i s c s w e r e u s e d a s c o n t r o l s f o r g r a m p o s i t i v e a n d g r a m n e g a t i v e b a c t e r i a l s t r a i n s r e s p e c t i v e l y . S i n g l e c o l o n i e s w e r e p i c k e d f r o m t h e c u l t u r e s a n d s u s p e n d e d i n 5 m l s t e r i l e s a l i n e s o l u t i o n . ( T h e t u r b i d i t y w a s c o m p a r e d t o 0 . 5 X M c F a r l a n d s t a n d a r d s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 5 m 1 o f 1 . 1 7 5 % B a C l 2 . 2 H 2 0 i n 9 9 . 5 m l 1 % H 2 8 0 4 , T h i s s o l u t i o n s h o u l d a l w a y s b e s t o r e d i n d a r k a t r o o m t e m p e r a t u r e ) . T h e c o n t r o l a n d a s s a y d i s c s w e r e p u t o n t h e a g a r p l a t e s a n d a l l o w e d t o g r o w a t 3 5 ° C f o r 1 6 h . T h e z o n e o f i n h i b i t i o n w a s t h e n m e a s u r e d a n d M I C s w e r e c a l c u l a t e d . 1 0 2 M . 1 . 1 " 1 0 . l l . 1 2 . R e f e r e n c e s F r e d h o l m , B . B . ; A P , 1 . J . ; J a c o b s o n , K . A . ; K l o t z , K . N . ; L i n d e n , J . , . P h a r m a c o l . R e v . 2 0 0 1 , 5 3 , ( 4 ) , 5 2 7 - 5 2 . ( a ) M u l l e r , C . B . ; T h o r a n d , M . ; Q u r i s h i , R . ; D i e k m a n n , M . ; J a c o b s o n , K . A . P a d g e t t , W . L . ; D a l y , J . W . J . M e d . C h e m . 2 0 0 2 , 4 5 , 3 4 4 0 — 3 4 5 0 . ( b ) F r e d h o l m , B . B . ; A r s l a n , G . ; H a l l d a n e r , L . ; K u l l , B . ; S c h u l t e , G . ; W a s s e r m a n , W . N a u n y n - S c h m i e d b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l . 2 0 0 0 , 3 6 2 , 3 6 4 - 3 7 4 . S a j j a d i , F . G . ; T a k a b a y a s h i , K . ; F o s t e r , A . C . ; D o m i n g o , R . C . ; F i r e s t e i n , G . S . J . I m m u n o l . 1 9 9 6 , 1 5 6 , ( 9 ) , 3 4 3 5 - 4 2 . L i a n g , B . T . ; J a c o b s o n , K . A . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 1 9 9 8 , 9 5 , ( 1 2 ) , 6 9 9 5 - 9 . v o n L u b i t z , D . K . ; S i m p s o n , K . L . ; L i n , R . C . A n n . N Y A c a d . S c i . 2 0 0 1 , 9 3 9 . 8 5 - 9 6 . F i s h m a n , P . ; B a r - Y e h u d a , S . ; M a d i , L . ; C o h n , I . A n t i c a n c e r D r u g s 2 0 0 2 , 1 3 , ( 5 ) , 4 3 7 - 4 3 . F i s h m a n , P . ; M a d i , L . ; B a r - Y e h u d a , S . ; B a r e r , F . ; D e l V a l l e , L . ; K h a l i l i , K . , O n c o g e n e 2 0 0 2 , 2 1 , ( 2 5 ) , 4 0 6 0 - 4 . A v i l a , M . Y . ; S t o n e , R . A . ; C i v a n , M . M . I n v e s t O p h t h a l m o l V i s . S c i . 2 0 0 2 , 4 3 , ( 9 ) , 3 0 2 1 - 6 . M e h t a , P . N . ; P a n i t c h , H . B . ; W o l f s o n , M . R . ; S h a f f e r , T . H . P e d i a t r i c R e s . 1 9 9 1 , 2 9 ( 5 ) , 4 4 6 - 8 . ( a ) B e c k e r , A . B . ; S i m o n s , K . J . ; G i l l e s p i e , C . A . ; S i m o n s , F . E . R . N e w E n g l . J . M e d . 1 9 8 4 , 3 1 0 ( 1 2 ) , 7 4 3 - 7 4 6 . ( b ) S i m o n s , F . E . R . ; S i m o n s , K . J . ; B e c k e r , A . B . C u r r . C l i n . P r a c t i c e S e r . 1 9 8 4 , 8 , 1 - 8 . H e n d e r s o n , J . C . ; O ' C o n n e l l , F . ; F u l l e r , R . W . T h o r a x 1 9 9 3 , 4 8 ( 8 ) , 8 2 4 - 6 . ( a ) U l u s , A . T . ; A k s o y e k , A . ; K a t i r c i o g l u , S . F . ; G o k c e , P . ; K o c , B . P a n m i n e r v a m e d i c a 2 0 0 0 , 4 2 ( 4 ) , 2 5 3 - 6 . ( b ) B r o a d l e y , K e n n e t h J . E x p . O p i n . T h e r . P a t e n t s 2 0 0 0 , 1 0 ( 1 1 ) , l 6 6 9 - 1 6 9 2 . ( c ) H a r a d a , H . ; A s a n o , 0 . ; H o s h i n o , Y . ; Y o s h i k a w a , S . ; M a t s u k u r a , M . ; K a b a s a w a , Y . ; N i i j i m a , J . ; K o t a k e , Y . ; W a t a n a b e , N . ; K a w a t a , T . ; I n o u e , T . ; H o r i z o e , T . ; Y a s u d a , N . ; M i n a m i , H . ; N a g a t a , K . ; M u r a k a m i , M . ; N a g a o k a , J . ; K o b a y a s h i , S . ; T a n a k a , I . ; A b e , S . J . M e d . C h e m . 2 0 0 1 , 4 4 , 1 7 0 - 1 7 9 . ( d ) R o b e r t s , D . J . ; B r o a d l e y , K . J . L a n c e t 1 9 6 5 , 3 3 , 1 2 1 9 - 2 0 . 1 0 3 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 5 . 2 6 . ( a ) P e r r e i r a , M . ; J i a n g , J . - K . ; K l u t z , A . M . ; G a o , Z . - G . ; S h a i n b e r g , A . ; L u , C . ; T h o m a s , C . J . ; J a c o b s o n , K . A . J . M e d . C h e m . 2 0 0 5 , 4 8 , 4 9 1 0 - 4 9 1 8 . ( b ) Y a n , L ; B u r b i e l , J . C . ; M a a s s , A . ; M i l l l e r , C . E . E x p . O p i n . E m e r . D r u g s 2 0 0 3 , 8 , 5 3 7 - 5 7 6 . ( a ) J a c o b s o n , K . A . ; S i d d i q i , S . M . ; O l a h , M . B . ; J i , X . D . ; M e l m a n , N . ; B e l l a m k o n d a , K . ; M e s h u l a m , Y . ; S t i l e s , G . L . ; K i m , H . 0 . J . M e d . C h e m . 1 9 9 5 , 3 8 , 1 7 2 0 - 3 5 . ( b ) v o n L u b i t z , D . K . ; L i n , R . C . ; P o p i k , P . ; C a r t e r , M . F . ; J a c o b s o n , K . A . E u r . J . P h a r m a c o l . 1 9 9 4 , 2 6 3 , 5 9 . B u r n o u f , C . ; P r u n i a u x , M . P . C u r r . P h a r m . D e s . 2 0 0 2 , 8 , 1 2 5 5 . D r u k e r , B . J . ; T a l p a z , M . ; R e s t a , D . J . ; P e n g , B . ; B u c h d u n g e r , E . F o r d , J . M . ; L y d o n , N . B . ; K a n t a r j i a n , H . ; C a p d e v i l l e , R ; 0 h n o - J o n e s , S . ; S a w y e r s , C . L . N . E n g l . J . M e d . 2 0 0 1 , 3 4 4 , 1 0 3 1 - 1 0 3 7 . T r a x l e r , P . ; F u r e t , P . P h a r m a c o l . T h e r . 1 9 9 9 , 8 2 , 1 9 5 . ( a ) N u r s e , P . C e l l 2 0 0 0 , 1 0 0 , 7 1 - 7 8 . ( b ) N u r s e , P . S c i e n c e , 2 0 0 0 , 2 8 9 , 1 7 1 1 - 1 7 1 6 . H a n a h a n , D . ; W e i n b e r g , R . A . C e l l 2 0 0 0 , 1 0 0 , 5 7 - 7 0 . S h e r r , C . J . S c i e n c e 1 9 9 6 , 2 7 4 , 1 6 7 2 - 1 6 7 7 . ( a ) P a v l e t i c h , N . P . J . M o l . B i o l . 1 9 9 9 , 2 8 7 , 8 2 l - 8 2 8 . ( b ) M o r g a n , D . 0 . N a t u r e , 1 9 9 5 , 3 7 4 , 1 3 1 - 1 3 4 . ( c ) F i s h e r , R . P . ; M o r g a n , D . 0 . C e l l , 1 9 9 4 , 7 8 , 7 1 3 - 7 2 4 . ( d ) R u s s o , A . A . , T o n g , L . , L e e , I . 0 . , J e f f r e y , P . D . ; P a v l e t i c h , N . P . N a t u r e , 1 9 9 8 , 3 9 5 , 2 3 7 - 2 4 3 . v a n d e n H e u v e l , S . ; I - I a r l o w , E . S c i e n c e 1 9 9 3 , 2 6 2 , 2 0 5 0 - 2 0 5 4 . ( a ) W e i n b e r g , R . A . C e l l 1 9 9 5 , 8 1 , 3 2 3 - 3 3 0 . ( b ) H a t a k e y a m a , M . ; W e i n b e r g , R . A . P r o g . C e l l C y c l e R e s . 1 9 9 5 , 1 , 9 - 1 9 . C a n g i , M . G . ; C u k o r , B . ; S o u n g , P . ; S i g n o r e t t i , S . ; M o r e i r a , G . , J r . ; R a n a s h i n g e , M . ; C a d y , B . ; P a g a n o , M . ; L o d a , M . J . C l i n . I n v e s t . 2 0 0 0 , 1 0 6 , 7 5 3 - 7 6 1 . ( a ) B a y l i n , S . B . ; H e r m a n , J . G . T r e n d s G e n e t . 2 0 0 0 , 1 6 , 1 6 8 - 1 7 4 . ( b ) J o n e s , P . A . ; L a i r d , P . W . N a t . G e n e t . 1 9 9 9 , 2 1 , 1 6 3 - 1 6 7 . ( a ) F o u k a s , L . C . ; D a n i e l e , N . ; K t o r i , C . ; A n d e r s o n , K . E . ; J e n s e n , J . ; S h e p h e r d , P . R . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 2 , 2 7 7 , 3 7 1 2 4 - 3 7 1 3 0 . ( b ) Y a s u i , A . ; K o m i y a m a , A . I n t . J . H e m a t o l . 2 0 0 1 , 7 3 , 8 7 - 9 2 . ( c ) B a s u , S . ; M i t r a , R . H a e m a t o l o g i a 2 0 0 0 , 3 0 , 2 2 5 - 2 2 7 . ( ( 1 ) S a r k a r i a , J . N . ; B u s b y , E . C . ; 1 0 4 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . 3 7 . 3 8 . T i b e t t s , R . S . ; R o o s , P . ; T a y a , Y . ; K a r n i t z , L . M . ; A b r a h a m , R . T . C a n c e r R e s . 1 9 9 9 , 5 9 , 4 3 7 5 - 4 3 8 2 . B l a s i n a , A . ; P r o c e , B . D . ; T u r e n n e , G . A . ; M c G o w a n , C . H . C u r r . B i o l . 1 9 9 9 , 9 , 1 1 3 5 - 1 1 3 8 . V a n h a e s e b r o e c k , B . ; L e e v e r s , S . ; A h m a d i , K . ; T i m m s , J . ; K a t s o , R . ; D r i s c o l l P . C . ; W o s c h o l s k i , R . ; P a r k e r , P . J . ; W a t e r fi e l d , M . D . A n n u . R e v . B i o c h e m . 2 0 0 1 , 7 0 , 5 3 5 — 6 0 2 . S t e i n , R . C . ; W a t e r fi e l d , M . D . M o l . M e d . T o d a y 2 0 0 0 , 6 , 3 4 7 - 3 5 7 . H i r s c h , E . ; B o s c o , 0 . ; T r o p e l , P . ; L a f f a r g u e , M . ; C a l v e z , R . ; A l t r u d a , F . ; W y m a n n , M . ; M o n t r u c h c h i o , G . F A S E B J . 2 0 0 1 , 1 5 , 2 0 1 9 — 2 0 2 2 . V a n h a e s e b r o e c k , B . ; W e l h a m , M . J . ; K o t a n i , K . ; S t e i n , R . ; W a r n e , P . H . ; Z v e l e b i l , M . J . ; H i g a s h i , K . ; V o l i n i a , S . ; D o w n w a r d , J . ; W a t e r fi e l d , M . D . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 9 9 7 , 9 4 , 4 3 3 0 — 4 3 3 5 . V a n h a e s e b r o e c k , B . ; J o n e s , G . E . ; A l l e n , W . B . ; Z i c h a , D . ; H o o s h m a n d - R a d , R . ; S a w y e r , C . ; W e l l s , C . ; W a t e r fi e l d , M . D . ; R i d l e y , A . J . N a t . C e l l B i o l . 1 9 9 9 , 1 , 6 9 — 7 1 . 0 k k e n h a u g , K . ; B i l a n c i o , A . ; F a r j o t , G . ; P r i d d l e , H . ; S a n c h o , S . ; P e s k e t t , E . ; P e a r c e , W . ; M e e k , S . B . ; S a l p e k a r , A . ; W a t e r fi e l d , M . D . ; S m i t h , A . J . H . ; V a n h a e s e b r o e c k , B . S c i e n c e 2 0 0 2 , 2 9 7 , 1 0 3 1 — 1 0 3 4 . O ’ C o n n o r , P . M . C a n c e r S u r v . 1 9 9 7 , 2 9 , 1 5 1 - 1 8 2 . E l l e d g e , S . J . S c i e n c e 1 9 9 6 , 2 7 4 , 1 6 6 4 — 1 6 7 2 . ( a ) Z h o u , B . B . ; C h a t u r v e d i , P . ; S p r i n g , K . ; S c o t t , S . P . ; J o h a n s o n , R . A . ; M i s h r a , R . ; M a t t e r n , M . R . ; W i n k l e r , J . D . ; K h a n n a , K . K . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 0 , 2 7 5 , 1 0 3 4 2 - 1 0 3 4 8 . ( b ) N u r s e , P . C e l l 1 9 9 4 , 7 9 , 5 4 7 - 5 5 0 . ( c ) G a u t i e r , J . ; S o l o m o n , M . J . ; B o o h e r , R . N . ; B a z a n , J . F . ; K i r s c h n e r , M . W . C e l l 1 9 9 1 , 6 7 , 1 9 7 - 2 1 1 . ( ( 1 ) K u m a g a i , A . ; D u n p h y , W . G . C e l l 1 9 9 2 , 7 0 , 1 3 9 - 1 5 l . ( e ) D a l a l , S . N . ; S c h w e i t z e r , C . M . ; G a n , J . ; d e C a p r i o , J . A . M o l . C e l l B i o l . 1 9 9 9 , 1 9 , 4 4 6 5 - 4 4 7 9 . ( f ) L o p e z - G i r o n a , A . ; F u m a r i , B . ; M o n d e s e r t , 0 . ; R u s s e l l , P . 1 9 9 9 , 3 9 7 , 1 7 2 - 1 7 5 . P o w e l l , S . N . ; D e F r a n k , J . S . ; C o n n e l l , P . ; E o g a n , M . ; P r e f f e r , F . ; D o m b k o w s k i , D . ; T a n g , W . ; F r i e n d , S . C a n c e r R e s . 1 9 9 5 , 5 5 , 1 6 4 3 — 1 6 4 8 . J i a n g , X . ; L i m , L . Y . ; D a l y , J . W . ; L i , A . H . ; J a d o b s o n , K . A . I n t e r n a t . J . O n c o l . 2 0 0 0 , 1 6 , 9 7 1 - 9 7 8 . 1 0 5 3 9 . 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . 4 8 . 4 9 . 5 0 . ( a ) D a l y , J . W . ; P a d g e t t , W . L . ; S h a m i m , M . T . J . M e d . C h e m . 1 9 8 6 , 2 9 , 1 3 0 5 - 1 3 0 8 . ( b ) S h a m i m , M . T . ; U k e n a , D . ; P a d g e t t , W . L . ; D a l y , J . W . J . M e d . C h e m . 1 9 8 9 , 3 2 , 1 2 3 1 - 1 2 3 7 . ( c ) D a l y , J . W . ; H i d e , 1 . ; M u l l e r , C . B . ; S h a m i m , M . P h a r m a c o l . 1 9 9 1 , 4 2 , 3 0 9 - 3 2 1 . C h o i , O . H . ; S h a m i m , M . T . ; P a d g e t t , W . L . ; D a l y , J . W . L i f e S c i . 1 9 8 8 , 4 3 , 3 8 7 - 3 9 8 . A m a u d , M . 1 . P r o g . D r u g . R e s . 1 9 8 7 , 3 1 , 2 7 3 - 3 1 3 . ( a ) M a t s u o k a , S . ; H u a n g , M . ; E l l e d g e , S . J . S c i e n c e , 1 9 9 8 , 2 8 2 , 1 8 9 3 - 1 8 9 7 . ( b ) C h a t u r v e d i , P . ; E n g , W . K . ; Z h u , Y . ; M a t t e r n , M . R . ; M i s h r a , R . ; H u r l e , M . R . ; Z h a n g , X . ; A n n a n , R . S . ; L u , Q . ; F a u c e t t e , L . F . ; S c o t t , G . R ; L i , X . ; C a r r , S . A . ; J o h n s o n , R . K . W i n k l e r , J . D . ; Z h o u , B . - B . S . O n c o g e n e 1 9 9 9 , 1 8 , 4 0 4 7 - 4 0 5 4 . F e r r a r i n i , M . ; H e l t a i , S . ; Z o c c h i , M . R . ; R u g a r l i , C . I n t . J . C a n c e r 1 9 9 2 , 5 1 . 6 1 3 - 6 1 9 . N e c k e r s , L . ; S c h u l t e , T . W . ; M i m n a u g h , E . I n v e s t . N e w D r u g s , 1 9 9 9 , 1 7 , 3 6 1 - 3 7 3 . ( a ) S t e b b i n s , C . E . ; R u s s o , A . A . ; S c h n e i d e r , C . ; R o s e n , N . ; H a r t l , F . U . ; P a v l e t i c h , N . P . C e l l , 1 9 9 7 , 8 9 , 2 3 9 - 2 5 0 . ( b ) R o e , S . M . ; P r o d r o m o u , C . ; O ' B r i e n , R . ; L a d b u r y , J . E . ; P i p e r , P . W . ; P e a r l , 1 . . H . J . M e d . C h e m . 1 9 9 9 , 4 2 , 2 6 0 - 2 6 6 . N e c k e r s , L . T r e n d s M o l . M e d . 2 0 0 2 , 8 , S S S - S 6 1 . ( a ) M u n s t e r , P . N . ; S r e t h a p a n d i , M . ; M o a s s e r , M . M . ; R o s e n , N . C a n c e r R e s . 2 0 0 1 , 6 1 , 2 9 4 5 - 2 9 5 2 . ( b ) S r e t h a p a k d i , M . ; L i u , R . ; T a v o r a t h , R . ; R o s e n , N . C a n c e r R e s . 2 0 0 0 , 6 0 , 3 9 4 0 - 3 9 4 6 . ( a ) M a l o n e y , A . ; W o r k m a n , P . E x p . O p i n . B i o l . T h e r . 2 0 0 2 , 2 , 3 . ( b ) B a n e r j i , U . ; O ’ d o n n e l l , A . ; S c u r r , M . ; B e n s o n , C . ; B r o c k , C . ; H a n w e l l , J . ; S t a p l e t o n , S . ; R a y n a u d , F . ; S i m m o n s , L . ; T u r n e r , A . ; W a l t o n , M . ; W o r k m a n , P . ; J u d s o n , 1 . P r o c . A m . A s s o c . C a n c e r R e s . 2 0 0 2 , 4 3 , A b s t . 1 3 5 2 . C h i o s i s , G . ; T i m a u l , M . N . ; L u c a s , B . ; M u n s t e r , P . N . ; Z h e n g , F . F . ; S e p p - L o r e n z i n o , L . ; R o s e n , N . C h e m . B i o l . 2 0 0 1 , 8 , 2 8 9 - 2 9 9 . S m i t h , V . ; S a u s v i l l e , E . A . ; C a m a l i e r , R . F . ; F i e b i g , H . H . ; B u r g e r , A . M . E u r . J . C a n c e r 2 0 0 2 , 3 8 , S u p p l 7 , $ 6 0 - $ 6 0 . 1 0 6 5 1 . 5 2 . 5 3 . 5 4 . 5 5 . 5 6 . 5 7 . 5 8 . 5 9 . 6 0 . 6 1 . 6 2 . 6 3 . C h i o s i s , G . ; L u c a s , B . ; S h t i l , A . ; H u e z o , H . R o s e n , N . B i o o r g . M e d . C h e m . 2 0 0 2 , 1 0 , 3 5 5 5 - 3 5 6 4 . M a r c u , M . G . ; C h a d l i , A . ; B o u h o u c h e , 1 . ; C a t e l l i , M . ; N e c k e r s , L . M . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 0 , 2 7 5 , 3 7 1 8 1 - 3 7 1 8 6 . A r m s t r o n g , J . I . ; B e r t o z z i , C . R . C u r r . O p i n . D r u g D i s c . D e v . , 2 0 0 0 , 3 , 5 0 2 - 5 1 5 . B u r k a r t , M . D . ; W o n g , C . H . A n a l . B i o c h e m . 1 9 9 9 , 2 7 4 , 1 3 1 - 1 3 7 . F e e , J . P . H . P h a r m a c o l o g y f o r A n a e s t h e s i o l o g i s t s 2 0 0 5 , 1 4 7 - 1 5 1 . ( a ) C o w a r d , W . R . S a g a r a , H . ; C h u r c h , M . K . C l i n . E x p . A l l e r g y 1 9 9 8 , 2 8 , 4 2 — 4 6 . ( b ) Y o s h i m u r a , T . ; U s a m i , B . ; K u r i t a , C . ; W a t a n a b e , S . ; N a k a o , T . ; K o b a y a s h i , J . ; Y a m a z a k i , F . ; N a g a i , H . B i o l . P h a r m . B u l l . 1 9 9 5 , I 8 , 1 4 0 5 - 1 4 0 8 . ( a ) C o l l a r t , M . A . ; B a e u e r l e , P . ; V a s s a l l i , P . M o l . C e l l B i o l . 1 9 9 0 , 1 0 , 1 4 9 8 - 1 5 0 6 . ( b ) L i b e r r n a n n , T . A . ; B a l t i m o r e , D . M o l . C e l l B i o l . 1 9 9 0 , 1 0 , 2 3 2 7 - 2 3 3 4 . ( c ) M a t s u s a k a , T . ; F u j i k a w a , K . ; N i s h i o , Y . ; M u k a i d a , N . ; M a t s u s h i m a , K . ; K i s h i m o t o , T . ; A k i r a , S . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 1 9 9 3 , 9 0 , 1 0 1 9 3 — 1 0 1 9 7 . I c h i y a m a , T . ; H a s e g a w a , S . ; M a t s u b a r a , T . ; H a y a s h i , T . ; F u r u k a w a , S . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l . 2 0 0 1 , 3 6 4 , 5 5 8 - 5 6 1 . ( a ) Y i n , M . ; Y a m a m o t o , Y . ; G a y n o r , R . B . N a t u r e 1 9 9 8 , 3 9 6 , 7 7 — 8 0 . ( b ) L i u , S . F . ; Y e , X . ; M a l i k , A . B . M o l . P h a r m a c o l . 1 9 9 9 , 5 5 , 6 5 8 - 6 6 7 . ( c ) R o y , S . ; C a i n , K . J . ; C h a p i n , R . B . ; C h a r b o n e a u , R . G . ; B a r k e , R . A . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . 1 9 9 8 , 2 4 5 , 3 9 2 - 3 9 6 . M o s s e l h i , M . A . , P fl e i d e r e r , W . J . H e t e r o c y c l i c . C h e m . 1 9 9 3 , 3 0 , 1 2 2 1 - 1 2 2 8 . C a c a c e , F . ; M a s i r o n i , R . A n n a l i d i C h i m i c a 1 9 5 7 , 4 7 , 3 6 2 - 5 . ( a ) G a g a u z o v , 1 . ; P e i k o v , P . ; D a v k o v , D . ; S h a r a n k o v , K . F a r m a t s i y a , 1 9 8 7 , 3 7 , 8 - 1 0 . ( b ) M u k h o p a d h y a y , S . ; A n a n t h a k r i s h n a n , S . ; C h n a d a l i a , S . B . O r g . P r o c . R e s . D e v . 1 9 9 9 , 3 , 4 5 1 - 4 5 4 . ( a ) F a r a h , S . F . ; M c C l e l l a n d , R . A . C a n . J . C h e m . 1 9 9 3 , 7 1 , 4 2 7 - 3 2 . ( b ) K u m a r , J . S . D . ; H o , M . M . ; T o y o k u n i , T . T e t r a h e d r o n L e t t . 2 0 0 1 , 4 2 , 5 6 0 1 - 5 6 0 3 . ( 0 ) Y e h , M . - L . ; T a n g , F . - S . ; C h e n , S . - L . ; L i u , W . - C . ; L i n , L . - G . J . O r g . C h e m . 1 9 9 4 , 5 9 , 7 5 4 - 7 5 7 . ( ( 1 ) R e d e m a n n , C . T . ; R e d e m a n n , C . E . O r g . S y n . 1 9 5 5 3 , 6 9 - 7 2 . ( e ) I v a n o v , E . 1 . C h e m . H e t e r o c y c l i c C o m p d s . 1 9 9 8 , 3 4 , 7 1 9 - 7 2 2 . 1 0 7 6 5 . 6 6 . 6 7 . 6 8 . 6 9 . 7 0 . 7 1 . 7 2 . 7 3 . 7 4 . 7 5 . 7 6 . ( a ) L e s p a g n o l , A . ; T u d o , M . ; L a b i a u , 0 . ; R o b e l e t , A . ; B i z a r d - G r e g o i r e , N . A n n . P h a r m . F r . 1 9 6 8 , 2 6 , 2 0 7 - 2 1 4 . ( b ) O z o l a , V . ; R a m z a e v a , N . ; M a u r i n s h , Y . ; L i d a k s , M . N u c l e o s i d e s N u c l e o t i d e s 1 9 9 3 , 1 2 , 8 2 7 - 8 3 9 . U e d a , T . ; O h , R . ; N a g a i , S . - I . ; S a k a k i b a r a , J . J . H e t e r o c y c l i c C h e m . 1 9 9 8 , 3 5 ( 1 ) , 1 3 5 - 1 3 9 . ( a ) K a w a s a k i , I . ; T a g u c h i , N . ; Y o n e d a , Y . ; Y a r n a s h i t a , M . ; O h t a , S . H e t e r o c y c l e s , 1 9 9 6 , 4 3 , 7 , 1 3 7 5 . ( b ) P a w l o w s k i , M . ; G o r y c z y c a , M . P o l . J . C h e m . 1 9 8 1 , 5 5 , 8 3 7 . ( c ) W o l f e , J . P . ; B u c h w a l d , S . L . J . O r g . C h e m . 2 0 0 0 , 6 5 , 1 1 4 4 - 1 1 5 7 . ( d ) G i l l e t , L . C . J . ; S c h a r e r , O . D . 0 r g . L e t t . 2 0 0 2 , 4 ( 2 4 ) , 4 2 0 5 - 4 2 0 8 . ( a ) D a l y , J . W . ; P a d g e t t , W . ; S h a m i m , M . T . ; B u t t s - L a m b , P . ; W a t e r s , J J . M e d . C h e m . 1 9 8 5 , 2 8 , 4 8 7 - 4 9 2 . K i m , S . A . ; M a r s h a l l , M . A . ; M e l m a n , N . ; K i m , H . S . ; M i i l l e r , C . E . ; L i n d e n , J . ; J a c o b s o n , K . A . J . M e d . C h e m . 2 0 0 2 , 4 5 , 2 1 3 1 - 2 1 3 8 . ( a ) P o m m i e r , Y . , P o u r q u i e r , P . , F a n , Y . , a n d S t r u m b e r g , D . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 9 9 8 , 1 4 0 0 , 8 3 - 1 0 5 . ( b ) R a j s k i , S . R . ; W i l l i a m s , R . M . C h e m . R e v . 1 9 9 8 , 9 8 , 2 7 2 3 - 2 7 9 5 . ( a ) B o l a n d , M . P . B i o c h e m . S o c . T r a n s . 2 0 0 1 , 2 9 , 6 7 4 - 6 7 8 . ( b ) G u t t r i d g e , D . C . ; A l b a n e s e , C . ; R e u t h e r , J . Y . ; P e s t e l l , R . G . ; B a l d w i n , A . 8 . , J r . M o l . C e l l . B i o l . 1 9 9 9 , 1 9 , 5 7 8 5 - 5 7 9 9 . ( a ) B a r n e s , P . J . ; K a r i n , M . N E n g l J M e d 1 9 9 7 , 3 3 6 , 1 0 6 6 - 1 0 7 1 . ( b ) B a l d w i n , A . 8 . , J r . A n n u R e v I m m u n o l 1 9 9 6 , I 4 , 6 4 9 - 6 8 3 . ( c ) B a e u e r l e , P . A . ; B a l t i m o r e , D . S c i e n c e 1 9 8 8 , 2 4 2 , 5 4 0 - 5 4 6 . ( a ) B a e u e r l e , P . A . ; H e n k e l , T . A n n u . R e v . I m m u n o l . 1 9 9 4 , 1 2 , 1 4 1 - 1 7 9 . ( b ) T a k , P . P . ; F i r e s t e i n , G . S . J . C l i n . I n v e s t . 2 0 0 1 , 1 0 7 , 7 - 1 1 . ( a ) R o w l a n d , T . L . ; M c H u g h , S . M . ; D e i g h t o n , J . ; E w a n , P . W . ; D e a r m a n , R . J . ; K i m b e r , 1 . I n t . I m m u n o p h a r m a c o l . 2 0 0 1 , I , 4 9 - 6 1 . D i g n a m , J . D . ; L e b o v i t z , R . M . ; R o e d e r , R . G . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 9 8 3 , I I , 1 4 7 5 - 1 4 8 9 . L i , C . - C . H . ; D a i , R . M . ; C h e n , E . ; L o n g o , D . L . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 4 , 2 6 9 , 3 0 0 8 9 - 3 0 0 9 2 . C u z z o c r e a , S . ; C h a t t e r j e e , P . K . ; M a z z o n , B . ; D u g o , L . ; S e r r a i n o , 1 . ; B r i t t i , D . ; M a z z u l l o , G . ; C a p u t i , A . P . ; T h i e m e r m a n n , C . B r . J . P h a r m a c o l . 2 0 0 2 , 1 3 5 , 4 9 6 - 5 1 0 . 1 0 8 7 7 . 7 8 . 7 9 . 8 0 . 8 1 . 8 2 . 8 3 . 8 4 . S h i n o m i y a , N . ; T a k e m u r a , T . ; I w a m o t o , K . ; R o k u t a n d a , M . C y t o m e t r y , 1 9 9 7 , 2 7 , 3 6 5 - 3 7 3 . ( a ) B o n e , R . C . A n n . I n t e r n . M e d . 1 9 9 1 , 1 1 5 , 4 5 7 - 4 6 9 . ( b ) B o n e , R . C . C r i t . C a r e M e d . 1 9 9 4 , 2 2 , S 8 - 1 1 . ( c ) B o n e , R . C . ; S p r u n g , C . L . ; S i b b a l d , W . J . C r i t . C a r e M e d . 1 9 9 2 , 2 0 , 7 2 4 - 6 . ( ( 1 ) B o n e , R . C . ; B a l k , R . A . ; C e r r a , F . B . ; D e l l i n g e r , R . P . ; F e i n , A . M . ; K n a u s , W . A . ; S c h e i n , R . M . ; S i b b a l d , W . J . C h e s t 1 9 9 2 , 1 0 1 , 1 6 4 4 - 5 5 . ( a ) B o n e , R . C . A r c h . I n t e r n . M e d . 1 9 9 4 , 1 5 4 , 2 6 . ( b ) F r i e d m a n , G . , S i l v a , E . ; V i n c e n t . J . L . C r i t . C a r e M e d . 1 9 9 8 , 2 6 , 2 0 7 8 . ( c ) W h e e l e r , A . P . ; B e r n a r d . G . R . N . E n g l . J . M e d . 1 9 9 9 , 3 4 0 , 2 0 7 . J e n e i , B . ; P 6 c s i k , B . ; L a z a r , G . ; M e d g y e s i , G . A . I n fl a m m . r e s . 1 9 9 7 , 4 6 , 2 8 7 - 9 1 . S a m u e l s o n , J . A n t i m i c r o b i a l a g e n t s a n d c h e m o t h e r a p y , 1 9 9 9 , 1 5 3 3 . ( a ) R i e t s c h e l , E . T . ; B r a d e , H . S c i . A m . 1 9 9 2 , 2 6 7 , 5 4 . ( b ) B r o w n , Z . ; G e r r i t s e n , M . E . ; C a r l e y , W . W . ; S t r i e t e r , R . M . ; K u n k e l , S . L . ; W e s t w i c k , J . A m . J . P a t h o l . 1 9 9 4 , I 4 5 , 9 1 3 . ( c ) B l e a s e , K . ; S e y b o l d , J . ; A d c o c k , I . M . ; H e l l e w e l l , P . G . ; B u r k e - G a f f n e y , A . A m . J . R e s p i r . C e l l M o l . B i o l . 1 9 9 8 , I 8 , 6 2 0 . B o n e , R . C . J . C r i t . C a r e M e d . 1 9 9 3 , 8 , 5 1 . ( a ) S t a n d i f o r d , T . J . ; A r e n b e r g , D . A . ; D a n f o r t h , J . M . ; K u n k e l , S . L . ; V a n O t t e r e n , G . M . ; S t r i e t e r , R . M . I n f e c t . I m m u n . 1 9 9 4 , 6 2 , 1 1 9 . ( b ) C a r r a t e l l i , C . R . ; N u z z o , 1 . ; B e n t i v o g l i o , C . ; G a l d i e r o , M . F E M S I m m u n o l . M e d . M i c r o b i o l . 1 9 9 6 , 1 6 , 3 0 9 . 1 0 9 C H A P T E R I I I S E N S I T I Z A T I O N O F T U M O R C E L L S T O W A R D S C H E M O T H E R A P Y : E N H A N C I N G T H E A C T I V I T Y O F C A M P T O T H E C I N B Y N O V E L I M I D A Z O L I N E S A l l g r e a t p r o g r e s s t a k e s p l a c e w h e n t w o s c i e n c e s c o m e t o g e t h e r , a n d w h e n t h e i r r e s e m b l a n c e p r o c l a i m s i t s e l fi d e s p i t e t h e a p p a r e n t d i s p a r i t y o f t h e i r s u b s t a n c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H e n r i P o i n c a r e ’ A . I n t r o d u c t i o n - w h y i s a p o p t o s i s i m p o r t a n t ? C h e m o t h e r a p y f o r t h e t r e a t m e n t o f c a n c e r w a s i n t r o d u c e d m o r e t h a n fi f t y y e a r s a g o . W h i l e s o m e f o r m s o f c a r c i n o m a s h a v e s u c c e s s f u l l y b e e n t r e a t e d , t r e a t m e n t f o r c o m m o n e p i t h e l i a l t u m o r s o f b r e a s t , c o l o n , a n d l u n g h a s b e e n l e s s t h a n i m p r e s s i v e . U n d e r m o s t i d e a l c i r c u m s t a n c e s , c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g s a r e e x p e c t e d t o t a r g e t c a n c e r c e l l s a n d c a u s e c y t o t o x i c o r c y t o s t a t i c e f f e c t s t o r e d u c e t h e t u m o r b u r d e n w h i l e e v a d i n g d a m a g e t o n o r m a l c e l l s . H o w e v e r , i n r e a l i t y , c h e m o t h e r a p y s u f f e r s a r a n g e o f p e r p l e x i n g i s s u e s i n c l u d i n g s y s t e m i c t o x i c i t y , r a p i d m e t a b o l i s m a n d r e s i s t a n c e . C e l l d e a t h i s a n i n d i s p e n s a b l e p r o c e s s f o r n o r m a l e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t a n d a d u l t h o m e o s t a s i s . C e l l s d i e v i a e i t h e r o f t w o m e c h a n i s m s , n e c r o s i s o r a p o p t o s i s . I n s i d i o u s s t i m u l i i n a n d o u t s i d e t h e c e l l s d i s t u r b t h e h o m e o s t a t i c b a l a n c e w i t h i n t h e c e l l s l e a d i n g t o a c a t a s t r o p h i c l y s i s o f t e n c a l l e d m e s s y c e l l d e a t h . A p o p t o s i s h o w e v e r , i s a g e n e t i c a l l y c o n t r o l l e d f o r m o f p r o g r a m m e d c e l l d e a t h w i t h a s e q u e n t i a l , s t e p w i s e ‘ d e f e n s i v e m e c h a n i s m ’ t o n e a t l y r e m o v e i n f e c t e d , m u t a t e d o r d a m a g e d c e l l s . " 2 1 1 0 C o n v e n t i o n a l a n t i c a n c e r t h e r a p y i n v o l v i n g c h e m o t h e r a p y o r i o n i z i n g r a d i a t i o n i s a i m e d a t t h e i n d u c t i o n o f a p o p t o s i s i n c a n c e r c e l l s . 3 C h e m o t h e r a p e u t i c d r u g s i n d u c e a s e r i e s o f c e l l u l a r c h a n g e s t o i m p a c t p r o l i f e r a t i o n a n d c e l l s u r v i v a l a n d c a u s e a p o p t o s i s . C e l l d e a t h b y a p o p t o s i s i s a c c o m p a n i e d b y i n t e r c o n n e c t e d s e r i e s o f s e q u e n t i a l e v e n t s w h e r e c e l l s c o l l a p s e , t h e m e m b r a n e b l e b s , c h r o m a t i n c o n d e n s a t i o n a n d D N A d e g r a d a t i o n a r e w e l l - r e c o g n i z e d . 2 A l t e r a t i o n s i n a p o p t o t i c p a t h w a y s l e a d i n g t o e x c e s s i v e o r i n s u f fi c i e n t c e l l d e a t h c a n d i s r u p t t h e d e l i c a t e b a l a n c e b e t w e e n c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d c e l l d e a t h l e a d i n g t o a v a r i e t y o f d i s e a s e s s u c h a s A l z h e i m e r ’ s d i s e a s e a n d a l a r g e v a r i e t y o f c a n c e r s f ” " I n m a n y c a n c e r s , a p o p t o s i s i s a b n o r m a l l y d o w n r e g u l a t e d , e i t h e r b y t h e m u t a t i o n o f p r o - a p o p t o t i c p r o t e i n s o r b y t h e u p r e g u l a t i o n o f a n t i - a p o p t o t i c p r o t e i n s . 5 A b e r r a n t a p o p t o s i s p r o v i d e s a n i n t r i n s i c s u r v i v a l a d v a n t a g e t o c a n c e r c e l l s c a u s i n g g r o w t h a n d e x p a n s i o n o f t h e t u m o r , a n d r e s i s t a n c e t o p r o - a p o p t o t i c s i g n a l s i n c l u d i n g c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . ° ’ 7 1 3 . C u r r e n t l y u s e d c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . C u r r e n t c h e m o t h e r a p y c a n b e d i v i d e d i n t o e i t h e r b r i n g i n g o u t g e n o t o x i c s t r e s s v i a D N A t o p o - l a n d 2 i n h i b i t o r s s u c h a s c a m p t o t h e c i n ( c l i n i c a l l y u s e d a n a l o g s a r e t o p o t e c a n o r i r i n o t e c a n ) , e t o p o s i d e , d a u n o m y c i n o r D N A c r o s s l i n k e r s s u c h a s c i s - p l a t i n , o x a l i p l a t i n w h i c h u l t i m a t e l y c u l m i n a t e i n a n a p o p t o t i c r e s p o n s e . O t h e r c l i n i c a l l y u s e d a p p r o a c h e s f o r c h e m o t h e r a p y i n c l u d e u s e o f a n t i - t u b u l i n a g e n t s s u c h a s v i n c a a l k a l o i d s , t a x o l , m a y s t a n s i n e a n d r h i z o x i n . ° T h e s e c a u s e m i t o t i c c a t a s t r o p h e b y t a r g e t i n g t u b u l i n , a 1 0 0 k D a p r o t e i n a n d a p r i n c i p a l s u b u n i t o f m i c r o t u b u l e s w h i c h p a r t i c i p a t e i n s p i n d l e f o r m a t i o n a n d c h r o m o s o m a l s e g r e g a t i o n d u r i n g M - p h a s e o f c e l l c y c l e . A n t i m e t a b o l i t e s s u c h a s a n t i - f o l i c a c i d a g e n t s , r i b o n u c l e o t i d e r e d u c t a s e i n h i b i t o r s e t c . w h i c h i n d i r e c t l y 1 1 1 i n t e r f e r e w i t h t h e n u c l e i c a c i d b i o s y n t h e s i s a r e i m p o r t a n t c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . 8 F i g u r e I I I - l s h o w s t h e c o m m o n c l a s s e s o f d r u g s u s e d i n c h e m o t h e r a p y . H 3 N c i a — p i a t i n ( C D D P , D N A a l k y l a t o r ) c a m p t o t h e c i n ( C P T , T o p o - 1 I n h i b i t o r ) N M 8 0 \ ) — N H 2 0 A 0 N ‘ I : N > — > — \ — — ’ . I i N — N T r i m o t r o x a t o ( A n t i i o i a t o ) H 2 8 1 H C O O H A v i c i n , p y r i m i d i n e b i o s y n t h e s i s a n t a g o n i s t T a x o i ( T u b u l l n i n h i b i t o r ) F i g u r e I I I - 1 . S t r u c t u r e s o f c o m m o n l y u s e d d r u g s i n c h e m o t h e r a p y . i ) C a m p t o t h e c i n a n d i t s m e c h a n i s m o f a c t i o n . T h e a n t i t u m o r a g e n t c a m p t o t h e c i n ( C P T ) i s a c y t o t o x i c p l a n t a l k a l o i d i s o l a t e d f r o m t h e e x t r a c t s o f t h e f r u i t o f C a m p t o t h e c a a c u m i n a t a t h a t e x h i b i t s s p e c i fi c i t y f o r D N A t o p o i s o m e r a s e I a n d i n d u c e s a s t a b l e t e r n a r y t o p o i s o m e r a s e I - D N A c l e a v a b l e c o m p l e x . ° ' 9 C a m p t o t h e c i n e x h i b i t s i t s a n t i t u m o r a c t i v i t y v i a t h e f o r m a t i o n o f a s t a b l e t e r n a r y t o p o i s o m e r a s e I - D N A c l e a v a b l e c o m p l e x . ° ' ' ° S t a b i l i z a t i o n o f t h i s c l e a v e d D N A c o m p l e x i s r e c o g n i z e d a s d a m a g e d D N A a n d i n i t i a t e s a n a p o p t o t i c s i g n a l i n g p a t h w a y , 1 1 2 u l t i m a t e l y r e s u l t i n g i n c e l l d e a t h . 9 ' l l C P T - 1 1 a n d s e v e r a l w a t e r s o l u b l e a n a l o g u e s i n c l u d i n g t o p o t e c a n a n d i r i n o t e c a n h a v e s u c c e s s f u l l y p a s s e d c l i n i c a l t r i a l s i n t h e U n i t e d S t a t e s . 1 ° c a m p t o t h e c i n o I r i n o t e c a n O T o p o l s o m e r a s e - l l é ® — ’ . _ 3 ’ 2 H 5 ’ C P T F i g u r e I I I - 2 . ( T O P ) S t r u c t u r e s o f c l i n i c a l l y u s e d a n a l o g s o f c a m p t o t h e c i n . ( B O T T O M ) C P T s t a b i l i z e s t h e 3 ’ - p h o s p h o r y l e n d o f D N A c o m p l e x w i t h p r o t e i n . 1 1 3 S u p e r c o i l e d D N A i s r e l a x e d b y c a t a l y t i c a m o u n t s o f t o p o i s o m e r a s e - 1 o v e r s e v e r a l c y c l e s ( F i g u r e 1 1 1 - 2 ) a n d c r e a t e s a s i n g l e s t r a n d e d n i c k , u n w i n d s t h e s u p e r c o i l , r e s e a l s t h e b a c k b o n e a n d fi n a l l y d i s s o c i a t e s f r o m t h e D N A . ’ ° ° I n p r e s e n c e o f c a m p t o t h e c i n h o w e v e r , t h e D N A r e m a i n s n i c k e d a n d o n c e c o l l i d e s w i t h t h e r e p l i c a t i o n f o r k d o e s n o t a l l o w D N A r e p l i c a t i o n u l t i m a t e l y l e a d i n g t o c e l l s d e a t h . 8 i i ) C i s - p l a t i n a n d D N A a l k y l a t i o n . S i m i l a r t o c a m p t o t h e c i n , t h e c l i n i c a l l y u s e d D N A d a m a g i n g a g e n t , c i s - p l a t i n ( C D D P ) , e x e r t s i t s a n t i c a n c e r a c t i v i t y t h r o u g h D N A d a m a g e v i a c o v a l e n t b i n d i n g t o D N A b a s e p a i r s a n d i n i t i a t e s a n a p o p t o t i c s i g n a l i n g p a t h w a y } ; ' 3 F i g u r e I H - 3 s h o w s ( 1 , 2 ) , ( 1 , 3 ) i n t r a - s t r a n d c r o s s l i n k i n g a n d i n t e r - s t r a n d c r o s s l i n k s . C i s - p l a t i n f o r m s c r o s s l i n k s a t N - 7 o f t h e g u a n i n e w h i c h l e a d s t o i n h i b i t i o n o f r e p l i c a t i o n , t r a n s c r i p t i o n , D N A r e p a i r a n d c e l l d e a t h . 1 , 2 i n t r a s t r a n d 1 , 3 i n t r a s t r a n d i n t e r - s t r a n d c r o o a i i n k i n g H 3 N C I H s N ' P t ‘ o C i s - p i a t i n C a r b o p i a t i n O x a l o p i a t i n F i g u r e I I I - 3 . ( T O P ) I n t r a a n d I n t e r s t r a n d c r o s s l i n k i n g o f c i s - p l a t i n w i t h D N A . ( B O T T O M ) W a t e r s o l u b l e a n a l o g s o f c i s - p l a t i n - c a r b o p l a t i n a n d o x a l o p l a t i n . 1 1 4 C i s - p l a t i n u n d e r g o e s a q u a t i o n t o f o r m [ P t ( N H 3 ) 2 ( O H 2 ) C l ] + a n d [ P t ( N H 3 ) 2 ( O H 2 ) 2 ] 2 + w h i c h a r e m o r e r e a c t i v e s p e c i e s t h a n c i s - p l a t i n i t s e l f . C a r b o p l a t i n i s m o r e s t a b l e t h a n c i s - p l a t i n d u e t o i t s s i x - m e m b e r e d r i n g a n d s h o w s s i m i l a r a c t i v i t y a n d c r o s s r e s i s t a n c e a s c i s - p l a t i n . 1 5 O x a l i p l a t i n h o w e v e r , i s a c t i v e e v e n a g a i n s t c i s - p l a t i n r e s i s t a n t L 1 2 1 0 l e u k e m i a c e l l l i n e s . 1 5 C o n c o m i t a n t w i t h t h e i n i t i a t i o n o f t h e a p o p t o t i c c e l l s i g n a l , i n r e s p o n s e t o d r u g - i n d u c e d D N A a s s a u l t ( b o t h c a m p t o t h e c i n a n d c i s - p l a t i n ) , a r a n g e o f s i g n a l i n g c a s c a d e s i n v o l v e d i n c e l l c y c l e a r r e s t a n d D N A r e p a i r a r e a l s o a c t i v a t e d . T h e s e a r e t i g h t l y c o n t r o l l e d b y u p s t r e a m r e g u l a t o r y p a t h w a y s i n c l u d i n g t h e p r o - a p o p t o t i c i n o s i t o l t r i p h o s p h a t e ( I n s P 3 ) p a t h w a y 1 6 a n d t h e s u r v i v a l P I ( 3 ) k i n a s e - A k t - d e p e n d e n t p a t h w a y a s w e l l a s k e y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s p 5 3 a n d N F - K B H " ' 9 a n d c o m p r o m i s e t h e o v e r a l l e f fi c a c y o f c h e m o t h e r a p e u t i c a n t i c a n c e r t r e a t m e n t . F i g u r e I I I - 4 i l l u s t r a t e s s o m e s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s w h e n D N A d a m a g e i s s e n s e d . C I S - P L A T I N l A p o p t o s i s F A K T . c - A B L N F - K B a c t i v a t i o n , / M A P K I E R K I J N K A c t " ? p 5 3 S U R V I V A L M D M 2 , p 2 1 e t c C e l l c y c l e c h e c k p o i n t s 1 D N A r e p a i r F i g u r e I I I - 4 . V a r i o u s s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s a r e t r i g g e r e d u p o n D N A d a m a g e . 1 1 5 T h e u l t i m a t e d e c i s i o n w h e t h e r a c e l l w o u l d s u r v i v e o r u n d e r g o c e l l d e a t h i s d e p e n d e n t u p o n t h e o u t c o m e o f t h e s e s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s . F i g u r e I I I - 5 i l l u s t r a t e s t h e f u t u r e o f t h e c e l l a f t e r D N A d a m a g e . C I S - P L A T I N C e l l c y c l e a r r e s t / \ S i g n a l i n g c a s c a d e - R e p a i r f a i l u r e A — — — > 0 1 0 3 1 8 D N A r e p a l r U n n e c e s s a r y p p r e p a i r s u m v a ' A T P d e p l e t i o n N e c r o s i s F i g u r e I I I - 5 . F u t u r e o f t h e c e l l a f t e r D N A d a m a g e . C . D N A d a m a g e , m u t a t i o n s a n d s u r v i v a l p a t h w a y s M u l t i - d r u g r e s i s t a n c e i s o n e o f t h e m a i n o b s t a c l e s i n c h e m o t h e r a p y o f c a n c e r . T h e P - g l y c o p r o t e i n s e t s u p a n e n e r g y - d e p e n d e n t e f fl u x m e c h a n i s m w h i c h p u m p s t h e d r u g o u t o f t h e c e l l . M o s t m o d u l a t o r s o f t h i s c a t e g o r y e i t h e r d i r e c t l y b i n d t o t h e P - g l y c o p r o t e i n s o r i n h i b i t t h e e f fl u x a c t i o n b y i n d i r e c t m e c h a n i s m s s u c h a s e x p r e s s i o n o f m d r I a n d m m ] g e n e s . 2 0 T h u s , M D R c a n o f t e n b e a t t r i b u t e d t o o v e r - e x p r e s s i o n o f t h e m d r l g e n e t h a t c o d e s f o r a n A T P - d e p e n d e n t , t r a n s m e m b r a n e P - g l y c o p r o t e i n ( P - g p ) e f fl u x p u m p p a t h w a y , w h i c h r a p i d l y e x p o r t s m a n s t r u c t u r a l l y u n - r e l a t e d d r u g s f r o m t h e c e l l , i n c l u d i n g a n t h r a c y c l i n e s , d a u n o m y c i n , d o x o r u b i c i n , b l e o m y c i n e t c . I t s i n h i b i t i o n b y c o m b i n a t i o n o f c h e m o s e n s i t i z e r s o r e v e n c o m b i n a t i o n o f d r u g s f o r a d d i t i v e t o x i c i t y i s a n a c t i v e fi e l d o f r e s e a r c h . 7 E x p r e s s i o n o f a l l M D R 1 g e n e p r o d u c t s h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h a p o o r p r o g n o s i s i n c l i n i c a l s t u d i e s . S e v e r a l r e s e a r c h g r o u p s 1 1 6 m u s t i n e c r : a 0 E s M t 8 M M 9 0 V e r 9 0 a 0 M p a N \ C 0 m N i i 0 N H / \ — / 0 . t A l m l r i n e s e r i e s F ‘ C y c l o s p o r i n N H N O m S A h a v e d e m o n s t r a t e d i n a l a b o r a t o r y s e t t i n g t h a t r e s i s t a n c e m e d i a t e d b y t h e P - g l y c o p r o t e i n m a y b e m o d u l a t e d b y a w i d e v a r i e t y o f c o m p o u n d s i n c l u d i n g v e r a p a n r i l a n d c y c l o s p o r i n e ( F i g u r e I I I - 6 ) , w h i c h g e n e r a l l y h a v e l i t t l e o r n o e f f e c t b y t h e m s e l v e s o n t h e t u m o r c e l l s , b u t w h e n u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h a n t i - n e o p l a s t i c a g e n t s , t h e y d e c r e a s e , a n d i n s o m e i n s t a n c e s e v e n e l i m i n a t e , d r u g r e s i s t a n c e . — \ - ~ § _ N m O / \ > ' — N / \ - : / \ ‘ N = \ _ : . . Q F i g u r e I I I - 6 . S t r u c t u r e s o f P - g l y c o p r o t e i n m o d u l a t o r s . i ) M D R a n d p r o t e a s o m a l i n h i b i t i o n . T h e 2 6 8 p r o t e o s o m e i s a h i g h l y c o n s e r v e d m u l t i - c a t a l y t i c p r o t e a s e r e s p o n s i b l e f o r A T P - a n d u b i q u i t i n - d e p e n d e n t d e g r a d a t i o n o f a l l s h o r t - l i v e d a n d 7 0 — 9 0 % o f a l l l o n g l i v e d 1 1 7 p r o t e i n s i n c l u d i n g c y c l i n A , B a n d B , p 2 1 a n d p 2 7 , p 5 3 , c J u n , c F o s , a n d I c h . 2 2 H e n c e , t h e 2 6 S p r o t e o s o m e c o n t r o l s c e l l c y c l e , s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s , a p o p t o s i s a n d m a j o r f u n c t i o n s o f t h e i m m u n e s y s t e m . 2 ° ° R e m a r k a b l y , t h e H I V p r o t e a s e i n h i b i t o r r i t o n a v i r w a s i d e n t i fi e d a s a n i n h i b i t o r o f b o t h t h e P - g l y c o p r o t e i n a n d t h e p r o t e a s o m e . ” O w i n g t o t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f m o l e c u l e s l i k e r i t o n a v i r a n d c y c l o s p o r i n e A o f b o t h p r o t e a s o m e a n d P - g p a c t i v i t i e s , P a j o n k e t a l i n v e s t i g a t e d w h e t h e r t h e r e o c c u r s a c r o s s s p e c i fi c i t y b e t w e e n P - g p a n d p r o t e a s o m e a c t i v i t i e s . T h e e x i s t e n c e o f t h i s c r o s s s p e c i fi c i t y m i g h t e x p l a i n t h e e f f e c t s o f P - g p i n h i b i t o r s o n m u l t i p l e c e l l u l a r p a r a m e t e r s t h a t s e e m e x t r i n s i c t o a p u m p i n g f u n c t i o n o f P - g p a n d p r o v i d e i n s i g h t s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f m o r e s e l e c t i v e P - g p i n h i b i t o r s . 2 2 T h e y f o u n d t h a t m o d u l a t o r s o f P - g l y c o p r o t e i n s s u c h a s v e r a p i m i l w e r e p r o t e a s o m a l i n h i b i t o r s a n d v i c e v e r s a w a s t r u e f o r M G 1 3 2 . T u m o r c e l l s i n g e n e r a l e x h i b i t a l t e r e d p a t t e r n s o f e x p r e s s i o n o f p r o t e a s o m e s u b u n i t s t h a n n o r m a l c e l l s . 2 3 I n h i b i t i o n o f p r o t e a s o m e f u n c t i o n i n d u c e s a p o p t o s i s o f t u m o r c e l l s z " a n d s e n s i t i z e s t h e s u r v i v i n g t u m o r c e l l s t o t h e a c t i o n s o f c h e m o t h e r a p y a n d r a d i a t i o n t h e r a p y . 2 6 T h e r e f o r e , p r o t e a s o m e i n h i b i t o r s m i g h t o v e r c o m e P - g p - r e l a t e d M D R , w i t h a c c o m p a n y i n g c h e m o - a n d r a d i o s e n s i t i z i n g e f f e c t s . O n t h e o t h e r h a n d , d i r e c t i n h i b i t i o n o f p r o t e a s o m e f u n c t i o n m i g h t b e a n a d d i t i o n a l m a j o r m e c h a n i s m o f a c t i o n f o r a n t h r a c y c l i n e s . S u c h i n h i b i t i o n c o u l d c o n t r i b u t e t o t h e i r a b i l i t y t o e n h a n c e t h e e f fi c a c y o f o t h e r c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g s , i n d e p e n d e n t o f t h e i r a b i l i t y t o e n h a n c e t h e e f fi c a c y o f o t h e r c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g s , i n d e p e n d e n t o f t h e i r a b i l i t y t o r e v e r s e M D R . A p a r t f r o m m u l t i - d r u g r e s i s t a n c e , t h e r e a r e o t h e r o n c o g e n i c a n d n o n - o n c o g e n i c f a c t o r s w h i c h c o n t r i b u t e t o d r u g - i n d u c e d r e s i s t a n c e . U n f o r t u n a t e l y , d u e t o m u t a t i o n s t h a t i n t e r f e r e w i t h d r u g - i n d u c e d i n i t i a t i o n o r e x e c u t i o n o f a p o p t o s i s , t h e p r o - a p o p t o t i c 1 1 8 r e s p o n s e i s a b n o r m a l l y d o w n - r e g u l a t e d a n d p r o v i d e s a n i n t r i n s i c s u r v i v a l a d v a n t a g e i n m a n y t y p e s o f c a n c e r s . ° ’ ‘ 8 M o r e o v e r , t h i s i n t r i n s i c c e l l u l a r r e s i s t a n c e h a s a l s o b e e n a t t r i b u t e d t o t h e a c t i v a t i o n o f a n t i - a p o p t o t i c s i g n a l i n g p a t h w a y s c o n c o m i t a n t t o a c t i v a t i o n o f a p o p t o t i c s i g n a l u p o n e x p o s u r e t o c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . ” 2 7 C h r i s t m a n e t a l 2 8 o b s e r v e d t h a t 8 . 9 % o f t h e g e n e s o f i n fl a m m a t i o n w e r e c h a n g e d u p o n t r e a t m e n t w i t h c a m p t o t h e c i n . T h i s s u g g e s t e d t h a t C P T m a y i n d u c e g e n e s i n v o l v e d i n i n fl a m m a t i o n . E G F R a n d N F - I C B h a v e b e e n i m p l i c a t e d a s t h e t w o m a j o r a n t i - a p o p t o t i c s i g n a l i n g p a t h w a y s i n d u c e d i n H e L a c e l l s a f t e r C P T t r e a t m e n t . 2 8 I n H e l a c e l l s , c D N A m i c r o a r r a y s u s i n g a l l a n n o t a t e d h u m a n g e n e s h a v e b e e n u s e d t o e s t a b l i s h t h e a s s o c i a t i o n b e t w e e n c h a r a c t e r i s t i c g e n e e x p r e s s i o n p a t t e r n s i n r e s p o n s e t o c a m p t o t h e c i n . 2 8 T h e s e s t u d i e s p r o v i d e d . a s t r i k i n g e v i d e n c e t h a t a d m i n i s t r a t i o n o f c a m p t o t h e c i n r e s u l t e d i n u p - r e g u l a t i o n i n a l a r g e n u m b e r o f g e n e s c o n t r o l l e d b y N F - K B . 2 8 T h e c o m b i n a t i o n o f t h e s e a n t i - a p o p t o t i c m e c h a n i s m s h a s r e s u l t e d i n a n i n c r e a s e d d o s e i n t e n s i t y o f c h e m o t h e r a p e u t i c s , o f t e n w i t h o u t t h e a n t i c i p a t e d i m p r o v e d t h e r a p e u t i c r e s u l t s . 2 9 T h e s e a r c h f o r n e w c h e m o t h e r a p e u t i c s t r a t e g i e s h a s t h e r e f o r e s h i f t e d t o s m a l l m o l e c u l e s t h a t c a n s e l e c t i v e l y i n d u c e a p o p t o s i s i n c a n c e r c e l l s o r r e t a r d t h e c e l l u l a r c h e m o r e s i s t a n c e . 3 ° 3 2 S t r a t e g i e s u s i n g c o m b i n a t i o n s o f i n d u c e r s o f a p o p t o s i s a n d / o r i n h i b i t o r s o f a n t i - a p o p t o t i c f a c t o r s a n d t r a d i t i o n a l c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g s m a y p r o v i d e a n i m p r o v e d a l t e r n a t i v e t o c o n v e n t i o n a l c h e m o t h e r a p y . ” 3 3 3 ° " i i ) N F - K B : f r o m i n n o c e n t b y s t a n d e r t o a m a j o r c u l p r i t T h e m a m m a l i a n n u c l e a r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r , N F - K B , i s a m u l t i - s u b u n i t c o m p l e x i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f g e n e t r a n s c r i p t i o n , i n c l u d i n g i m m u n e a n d i n fl a m m a t o r y r e s p o n s e s , c e l l g r o w t h a n d t h e r e g u l a t i o n o f a p o p t o s i s . ” 3 8 F i v e d i s t i n c t s u b u n i t s o f N F - K B a r e 1 1 9 f o u n d i n m a m m a l i a n c e l l s , w h i c h i n c l u d e , N F - K B I ( p 1 0 5 / p 5 0 ) , N F - K B Z ( p 1 0 0 / p 5 2 ) , R e l A ( p 6 5 ) , R e l B a n d c - R e l . 3 8 T h e s e s u b u n i t s c a n c o m p o s e a v a r i e t y o f h o m o - o r h e t e r o d i m e r s , b o u n d a t a c o m m o n s e q u e n c e k n o w n a s K B s i t e , w h i c h a r e u s e d t o c o n t r o l t h e s p e c i fi c i t y a n d s e l e c t i v i t y o f s p e c i fi c D N A c o n t r o l e l e m e n t s . ” 4 ° I n m o s t u n s t i m u l a t e d m a m m a l i a n c e l l s N F - K B e x i s t s m a i n l y a s a h o m o d i m e r ( p 5 0 / p 5 0 ) o r h e t e r o d i m e r ( p 5 0 / p 6 5 ) i n t h e c y t o p l a s m i n t h e f o r m o f a n i n a c t i v e c o m p l e x w i t h t h e i n h i b i t o r y p r o t e i n I - K B ( F i g u r e I I I - 7 ) . M a n y c e l l u l a r s t i m u l i i n c l u d i n g : a n t i n e o p l a s t i c a g e n t s ’ w . 2 7 . 4 1 - 4 8 v i r u s e s ( e . g . H I V ) , c y t o k i n e s , p h o r b o l e s t e r s a n d o x i d a t i v e s t r e s s , r e s u l t i n t h e I K K m e d i a t e d p h o s p h o r y l a t i o n o f I - K B o n s e r i n e s 3 2 a n d 3 6 , f o l l o w e d b y u b i q u i t i n y l a t i o n a n d s u b s e q u e n t d e g r a d a t i o n b y t h e 2 6 S p r o t e o s o m e . 3 7 D e g r a d a t i o n o f 1 - K B e n s u r e s t h e r e l e a s e o f N F - K B . 4 9 U p o n r e l e a s e , N F - K B t r a n s l o c a t e s i n t o t h e n u c l e u s w h e r e t h e s u b u n i t s b i n d w i t h s p e c i fi c D N A c o n t r o l e l e m e n t s a n d i n i t i a t e g e n e t r a n s c r i p t i o n ( F i g u r e I I I - 6 ) . P r i o r t o D N A b i n d i n g , a d d i t i o n a l p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n e v e n t s a r e r e q u i r e d f o r o p t i m a l a n d s p e c i fi c g e n e t r a n s c r i p t i o n s “ 3 A n t i a p o p t o t i c g e n e s s u c h a s , T R A F I , T R A F Z , c - I A P I , c - I A P Z , I X A P , a n d [ E X - I L , a r e d i r e c t l y r e g u l a t e d b y N F - K B , a n d a b r o g a t e t h e a p o p t o t i c s i g n a l s i n r e s p o n s e t o t h e c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . ” 5 4 1 2 0 m a m « 2 ; : 3 “ ! 4 1 : 1 " 1 . " E x t r a c e l l u l a r F i g u r e I I I - 7 . G e n e r a l N F - K B a c t i v a t i o n p a t h w a y b y c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . T u m o r i g e n e s i s r e q u i r e s s i x e s s e n t i a l a l t e r a t i o n s t o n o r m a l c e l l p h y s i o l o g y , s e l f - s u f fi c i e n c y i n g r o w t h s i g n a l s , i n s e n s i t i v i t y t o g r o w t h i n h i b i t i o n , e v a s i o n o f a p o p t o s i s , i m m o r t a l i z a t i o n , s u s t a i n e d a n g i o g e n e s i s , t i s s u e i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s . 5 N F - c h c a n 1 2 1 i n d u c e m a n y o f t h e a b o v e a l t e r a t i o n s i n t u m o r c e l l s a n d i s a l s o s h o w n t o b e c o n s t i t u t i v e l y a c t i v a t e d i n m a n y m a l i g n a n c i e s ? S i n c e N F - K B h a s b e e n r e c o g n i z e d a s a n i n h i b i t o r o f p r o g r a m m e d c e l l d e a t h a n d i s c o n s t i t u t i v e l y a c t i v a t e d i n m a n y f o r m s o f c a n c e r , f a c t o r s i n d u c e d b y N F - K B s u c h a s c I A P s ( c e l l u l a r i n h i b i t o r o f a p o p t o s i s ) , m e m b e r s o f t h e B e ] ; f a m i l y a r e f o u n d i n h i g h e r l e v e l s . 5 l N F - K B a l s o a t t e n u a t e s t h e a p o p t o s i s t r i g g e r e d b y g e n o t o x i c a s s a u l t s . C o n s t i t u t i v e l e v e l s o f N F - K B n o t o n l y c o n f e r r e s i s t a n c e t o t h e t u m o r s t o c h e m o t h e r a p y a n d r a d i a t i o n t h e r a p y , b u t a l s o a r e r e s p o n s i b l e f o r e m e r g e n c e o f n e o p l a s m s ( c a n c e r s ) b y p r e v e n t i n g r e m o v a l o f d a m a g e d c e l l s . ‘ 9 T h e s e a r e u s u a l l y r e m o v e d b y p 5 3 p a t h w a y . 5 5 H o w e v e r ; t h e r e i s s u f fi c i e n t e v i d e n c e f o r t r a n s c r i p t i o n a l a n t a g o n i s m b e t w e e n p 5 3 a n d N F - i c B . 4 0 N F - K B m e d i a t e d a n t i - a p o p t o t i c c e l l u l a r r e s p o n s e i n d u c e d b y D N A d a m a g i n g a g e n t s m a y a l s o r e s u l t f r o m t h e N F - K B m e d i a t e d i n i t i a t i o n o f c e l l u l a r D N A r e p a i r m e c h a n i s m s . 4 9 T o p o i s o m e r a s e i n h i b i t o r s a r e i n t h i s c o n t e x t a l s o c o n s i d e r e d D N A d a m a g i n g a g e n t s , s i n c e t h e y e x e r t t h e i r a p o p t o t i c m o d e o f a c t i o n v i a t h e s t a b i l i z a t i o n o f a t e r n a r y D N A - d r u g - p r o t e i n c l e a v a b l e c o m p l e x . ' 1 I n a d d i t i o n t o t h e i n d u c t i o n o f a n t i a p o p t o t i c g e n e t r a n s c r i p t i o n , t h e t o p o i s o m e r a s e I i n h i b i t o r c a m p t o t h e c i n w a s f o u n d t o i n d u c e t h e N F - K B m e d i a t e d a c t i v a t i o n o f p r o m - o n c o g e n e s s u c h a s c - M y c a n d c y c l i n D 1 a n d i n d i r e c t d e r e g u l a t i o n o f t h e r e t i n o b l a s t o m a t u m o r s u p p r e s s o r p r o t e i n ( R b p r o t e i n ) . ' 9 b ' 2 7 " 5 7 ’ 5 8 T h u s , c h e m o t h e r a p e u t i c t r e a t m e n t b y t h e s e a g e n t s o f t e n f a i l s a s a r e s u l t o f a N F - K B - m e d i a t e d d o u b l e s t i m u l u s , c a u s i n g c h e m o r e s i s t a n c e a n d f a v o r i n g u n c o n t r o l l e d c e l l g r o w t h . I n h i b i t i o n o f t h e n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f N F - K B , b l o c k s t h i s i n d u c t i o n o f g e n e t r a n s c r i p t i o n a n d w a s f o u n d t o s e n s i t i z e t u m o r c e l l s t o c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s a n d e n h a n c e t h e i r a n t i t u m o r e f fi c a c y . “ ‘ 6 ' 5 7 ' 5 9 ' 6 ° 1 2 2 D . I n fl a m m a t i o n a n d c a n c e r T h e l i n k b e t w e e n i n fl a m m a t i o n a n d c a n c e r d a t e s b a c k t o 1 8 6 3 w h e n R u d o l f V i r c h o w d i s c o v e r e d l e u c o c y t e s i n n e o p l a s t i c t i s s u e “ ) I n fl a m m a t i o n e n v i r o n m e n t i s p o s t u l a t e d t o h e l p i n d e v e l o p m e n t o f t u m o r i g e n e s i s . I t h a s b e e n e s t a b l i s h e d n o w t h a t t h e t u m o r m i c r o c n v i r o n m e n t r e s e m b l e s t h e i n fl a m m a t i o n s i t e t o a l a r g e e x t e n t w i t h a d v a n t a g e s t o w a r d s t u m o r d e v e l o p m e n t , n e o v a s c u l a r i z a t i o n a n d m e t a s t a s i s . F u r t h e r m o r e , t h i s i n fl a m m a t i o n - s i t e t u m o u r g e n e r a t e d m i c r o c n v i r o n m e n t , s i m i l a r t o a n i n fl a m m a t i o n s i t e a p a r t f r o m i t s s i g n i fi c a n t r o l e i n c a n c e r p r o g r e s s i o n a n d p r o t e c t i o n f r o m t h e i m m u n e s y s t e m , h a s a c o n s i d e r a b l e a d v e r s e e f f e c t t o t h e s u c c e s s o f t h e v a r i o u s c u r r e n t c a n c e r t r e a t m e n t s . I t h a s r e c e n t l y b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t t h e i n fl a m m a t o r y r e s p o n s e i n c a n c e r c a n g r e a t l y a f f e c t t h e d i s p o s i t i o n a n d c o m p r o m i s e . t h e p h a r m a c o d y n a m i c s o f c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . 6 | C a r c i n o g e n e s i s c a n b e d i v i d e d i n t o m a i n l y t h r e e s t a g e s , i n i t i a t i o n ( f o r m a t i o n o f g e n e t i c a l l y s t a b l e a l t e r a t i o n s ) p r o m o t i o n ( w h i c h i n v o l v e s t h e p r o l i f e r a t i o n o f g e n e t i c a l l y a l t e r e d c e l l s ) a n d p r o g r e s s i o n ( w h i c h i n v o l v e s a n i n c r e a s e i n t h e s i z e o f t h e t u m o r , t h e s p r e a d i n g o f t h e t u m o r a n d t h e a c q u i s i t i o n o f a d d i t i o n a l g e n e t i c c h a n g e s ) . D u r i n g t h e fi r s t p h a s e o f t u m o r i g e n e s i s , t u m o r i n i t i a t i o n , t h e c a r c i n o g e n s ( b o t h p h y s i c a l a n d c h e m i c a l ) m u t a t e t h e D N A o f t h e c e l l , l e a d i n g t o t h e a c t i v a t i o n o f o n c o g e n e s a n d / o r t h e i n a c t i v a t i o n o f t u m o r - s u p p r e s s o r g e n e s ( m o s t c o m m o n l y t h o s e t h a t e n c o d e K R A S a n d p 5 3 , r e s p e c t i v e l y ” > 0 T h e s e c o n d p h a s e o f t u m o r i g e n e s i s , t u m o r p r o m o t i o n , i s c h a r a c t e r i z e d b y t h e c l o n a l e x p a n s i o n o f i n i t i a t e d c e l l s , o w i n g t o i n c r e a s e d c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d ] o r r e d u c e d c e l l d e a t h . I n fl a m m a t i o n s e e m s t o b e a n i m p o r t a n t t u m o r p r o m o t e r a n d s e v e r a l c y t o k i n e s — s u c h a s i n t e r l e u k i n - 1 ( I L - 1 ) , I L - 6 a n d t u m o r - n e c r o s i s f a c t o r — c a n p r o m o t e 1 2 3 t u m o r g r o w t h . F i n a l l y , i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s , a s w e l l a s a n i n c r e a s e i n t u m o r s i z e , a r e t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e t h i r d p h a s e o f t u m o r i g e n e s i s , t u m o r p r o g r e s s i o n . D u r i n g t h i s s t a g e , a d d i t i o n a l a c q u i r e d m u t a t i o n s c a n l e a d t o f u r t h e r g r o w t h a d v a n t a g e f o r t h e c a n c e r a n d i t b e c o m e s m a l i g n a n t f ’ 2 i ) R o l e o f N F - K B i n c a n c e r . S e v e r a l o f t h e p r o - i n fl a m m a t o r y c y t o k i n e s a n d c h e m o k i n e s — s u c h a s T N F , I L - 1 , I L - 6 ( a l l e n c o d e d b y t a r g e t g e n e s o f t h e I K B - d e p e n d e n t N F - x B - a c t i v a t i o n p a t h w a y ) a r e a s s o c i a t e d w i t h t u m o u r d e v e l o p m e n t a n d p r o g r e s s i o n i n h u m a n s a n d m i c e . 6 0 F u r t h e r m o r e , m a n y o n c o g e n e s a n d c a r c i n o g e n s c a u s e a c t i v a t i o n o f N F - K B , w h e r e a s c h e m i c a l s w i t h k n o w n c h e m o p r e v e n t i v e p r o p e r t i e s c a n i n t e r f e r e w i t h N F - K B a c t i v a t i o n . 6 3 F i g u r e I I I - 7 i l l u s t r a t e s t h e c l a s s i c a l N F - K B a c t i v a t i o n p a t h w a y a n d p r o v i d e s a l i n k b e t w e e n N F - i c B , i n fl a m m a t i o n a n d c a n c e r . 6 4 A l t e r n a t i v e l y , N F - K B - a c t i v a t i o n c o u l d o c c u r v i a a n u p s t r e a m k i n a s e N F - x B - i n d u c i n g k i n a s e ( N I K ) — w h i c h a c t i v a t e s I K K - a h o m o d i m e r s , i n d e p e n d e n t l y o f e i t h e r I K K - B o r I K K - y . T h i s f a c i l i t a t e s p h o s p h o r y l a t i o n a n d p r o c e s s i n g o f p 1 0 0 t o y i e l d p 6 5 u n i t . “ P r o - i n fl a m m a t o r y c y t o k i n e s p r o m o t e t u m o r i n i t i a t i o n a n d p r o g r e s s i o n . W h i l e K a r i n e t a l h a v e s u g g e s t e d t h e r o l e o f N F - K B m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n i n t u m o r i n i t i a t i o n i n c o l o n a n d l i v e r c a n c e r i n t w o s e p a r a t e s t u d i e s , 6 4 ’ ‘ 6 B a l k w i l l e r a l f u r t h e r h i g h l i g h t e d t h a t T N F - d e fi c i e n t c e l l s w e r e r e s i s t a n t t o s k i n c a r c i n o g e n e s i s , w h e n t h e c e l l s w e r e s u b j e c t e d t o 7 , l Z - d i m e t h y l b e n z a t h r a c e n e a s t h e c a r c i n o g e n a n d p h o r b o l C S I C I ' w a s U S C d a s a t u m o r p r o m o t e r . “ N F - K B s i g n a l i n g m i g h t a l s o b e c r u c i a l i n t u m o r p r o g r e s s i o n . S e v e r a l N F - K B - r e g u l a t e d g e n e s t h a t e n c o d e a d h e s i o n m o l e c u l e s , M M P s , s e r i n e p r o t e a s e s , h e p a r a n a s e a n d 1 2 4 c h e m o k i n e s w e r e s h o w n t o b e e s s e n t i a l f o r t u m o r i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s . 6 8 T h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n c a n c e r c e l l s a n d t h e i n h e r e n t a n d / o r a d a p t i v e i m m u n e s y s t e m s i s c o m p l e x a n d o u t c o m e m a y n o t b e p r e d i c t e d a t a l l t i m e s . W h e r e a s m a n y o f t h e p r e v i o u s l y m e n t i o n e d p r o - i n fl a m m a t o r y c y t o k i n e s p r o m o t e t u m o r d e v e l o p m e n t , t h e i m m u n e s y s t e m a l s o h a s t h e m e a n s t o r e s t r i c t c a n c e r d e v e l o p m e n t a n d p r o g r e s s i o n t h r o u g h i m m u n o - s u r v e i l l a n c e m e c h a n i s m s . " 9 T h i s l a t t e r o b s e r v a t i o n h o w e v e r , h a s n o t f o u n d c l i n i c a l i m p l i c a t i o n s y e t . E . T h e r a p e u t i c r e l e v a n c e o f N F - K B i n h i b i t i o n i n c a n c e r T h e p o s s i b i l i t y t o p r o g r a m t h e i m m u n e s y s t e m i n s u c h a w a y t h a t i t w i l l e f fi c i e n t l y d e s t r o y v a r i o u s t y p e s o f c a n c e r s , w i t h f e w e r s i d e - e f f e c t s h a s b e e n a m a t t e r o f i n t e r e s t t o a l o t o f r e s e a r c h g r o u p s . I n t h i s c o n t e x t , s e v e r a l v a c c i n e s f o r c a n c e r h a v e b e e n d e v e l o p e d t h o u g h t h i s s t r a t e g y r e q u i r e s t h e u s e o f a d j u v a n t s f o r a c t i v a t i o n o f i n h e r e n t i m m u n e s y s t e m . 7 ° N S A I D s ( C O X - 2 i n h i b i t o r s ) w e r e f o u n d t o b e e f f e c t i v e i n r e d u c i n g t u m o u r l o a d i n p a t i e n t s . 7 | H o w e v e r ; t h e s e s u f f e r o f h i g h i n c i d e n c e o f c a r d i o v a s c u l a r s i d e - e f f e c t s , a n d h a v e f a i l e d a s c h e m o p r e v e n t i v e d r u g s i n l a r g e p r o s p e c t i v e . 7 2 i ) T e m p o r a l c o n t r o l o f N F - K B B a l d w i n e t a l h a v e d e m o n s t r a t e d t h e c o n t r o l o f i n d u c i b l e c h e m o r e s i s t a n c e t h r o u g h i n h i b i t i o n o f N F - K B u s i n g a m u t a t e d f o r m o f I - K B O L , a n a t u r a l i n h i b i t o r o f N F - K B . 5 6 I n a n o t h e r s t u d y , P i e t t e e t a l s h o w e d t h a t t h e o v e r e x p r e s s i o n o f I K B - a I m u t a t e d I K B - a r e g u l a t e d t h e c y t o t o x i c i t y c a u s e d b y c a m p t o t h e c i n . 7 3 T h e s e p i o n e e r i n g s t u d i e s i l l u s t r a t e d t h e c l i n i c a l p o t e n t i a l o f N F - K B i n h i b i t o r s i n c o m b i n a t i o n c h e m o t h e r a p y . T h e r e a r e n u m e r o u s n a t u r a l a n d s y n t h e t i c i n h i b i t o r s o f N F - K B r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e 7 4 w h i c h i n c l u d e m a n y a n t i o x i d a n t s s u c h a s p y r r o l i n e d i t h i o c a r b a m a t e o r P D T C , 7 5 ' k i n a s e 1 2 5 i n h i b i t o r s s u c h a s h y m e n i a l d i s i n e a n d a n a l o g u e s , 7 6 S C - 5 1 4 , " i n h i b i t o r s o f I - K B d e g r a d a t i o n s u c h a s t h e p r o t e o s o m e i n h i b i t o r s l a c t a c y s t i n 7 8 a n d P s - 3 4 1 7 9 a n d t h e s e s q u i t e r p e n e l a c t o n e s I K K i n h i b i t o r s i l l u s t r a t e d b y p a r t h e n o l i d e . 8 0 E v e n t h o u g h m a n y o f t h e s e a g e n t s i n d i c a t e i n h i b i t i o n o f t h e a n t i - a p o p t o t i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r , e n h a n c e m e n t o f c h e m o t h e r a p e u t i c s h a s b e e n l i m i t e d . T h e m o s t s u c c e s s f u l e x a m p l e o f c o m b i n a t i o n t h e r a p y u s i n g c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s w i t h N F - K B i n h i b i t o r s h a s b e e n i l l u s t r a t e d b y t h e p r o t e a s o m e i n h i b i t o r b o r t e z o m i b ® ( p r e v i o u s l y c a l l e d v e l c a d e a n d P S - 3 4 l ) , w h i c h w a s a p p r o v e d b y F D A i n 2 0 0 3 f o r u e a t m e n t o f m u l t i p l e m y e l o m a a s a s i n g l e a g e n t s a n d i s c u r r e n t l y i n P h a s e I I c l i n i c a l t r i a l s i n t h e U S . ” ' 8 " 8 2 O B ( O H ) [ N \ N N H — { 2 I , H ’ . . c l — < P S - 3 4 1 F i g u r e I I I - 8 . S t r u c t u r e o f B o r t e z o m i b ® ( P S - 3 4 1 ) . B o r t e z o m i b i n h i b i t s t h e n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f N F - c h v i a t h e i n h i b i t i o n o f t h e 2 6 S p r o t e a s o m e - m e d i a t e d d e g r a d a t i o n o f I — K B ( F i g u r e I I I - 7 ) . S i n c e b o r t e z o m i b e x h i b i t s c e l l s i g n i fi c a n t c y t o t o x i c i t y i t m a y b e u s e d a s a s i n g l e a g e n t o r i n c o m b i n a t i o n r e g i m e n t s w i t h c l a s s i c a l a n t i c a n c e r a g e n t s p r o v i d i n g a m o r e t h a n a d d i t i v e a p o p t o t i c r e s p o n s e ? ” 8 3 F . N F - K B m o d u l a t i o n a n d e n h a n c e m e n t o f e f fi c a c y o f D N A d a m a g i n g a g e n t s . i ) S y n t h e s i s o f i m i d a z o l i n e s T h e t r a n s - i m i d a z o l i n e s c a f f o l d w a s p r e p a r e d fi r t h e fi r s t t i m e b y S a t y a m a h e s h w a r P e d d i b h o t l a i n o u r l a b , v i a a h i g h l y d i a s t e r e o s e l e c t i v e m u l t i c o m p o n e n t , s i l i c o n m e d i a t e d 1 , 3 - d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n r e a c t i o n ( S c h e m e I I I - l ) . 8 4 T h i s n o v e l o n e p o t s y n t h e s i s w a s 1 2 6 u s e d t o g e n e r a t e a l a r g e l i b r a r y o f i m i d a z o l i n e s c a f f o l d s . T h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t s c a f f o l d c o n t a i n s a f o u r - p o i n t d i v e r s i t y a p p l i c a b l e t o a l k y l , a r y l , a c y l a n d h e t e r o c y c l i c s u b s t i t u t i o n s . A f t e r s c r e e n i n g a s m a l l n u m b e r o f L e w i s a c i d s w e f o u n d t h a t T M S C l p r o m o t e s t h e r e a c t i o n o f o x a z o l o n e s a n d i m i n e s t o a f f o r d t h e i m i d a z o l i n e s s c a f f o l d s i n g o o d y i e l d s a s s i n g l e d i a s t e r e o m e r s ( S c h e m e I I I - l ) . R 4 \ \ N R a R 1 _ < \ C 0 2 H N a R e F - m 7 " § / ” 3 3 1 % 9 ' H z T M S - 1 - w e R 4 N X R ‘ * 0 R a F l 2 0 H C I S c h e m e I I I - 1 . S y n t h e s i s o f i m i d a z o l i n e , a ) A c y l c h l o r i d e , N a O H ( a q ) , E t 2 0 , o v e r n i g h t ; b ) E D C I , C H Z C l z , 2 h , r o o m t e m p e r a t u r e , 6 5 - 7 5 % o v e r a l l ; c ) T M S C l , R 4 N H 2 , R 3 C H O , C H 2 C I 2 , r e fl u x 4 h , r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t , 4 5 - 8 0 % . I m i d a z o l i n e s w e r e i s o l a t e d a s a s i n g l e d i a s t e r e o m e r a n d t h e d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y a p p e a r s t o p r i m a r i l y a r i s e f r o m t h e s t e r i c i n t e r a c t i o n o f t h e b u l k y s i l y l g r o u p o f t h e a z l a c t o n e a n d t h e p h e n y l m o i e t y o f t h e i m i n e ( S c h e m e 1 1 1 - 2 ) . 1 2 7 \ S S S ; H P h C 0 2 H M a j o r G B " B n . _ . . 0 “ P l " ! P h c i t } : ( : 1 ) P h — < \ : l P h \ S ; i § ( f h P h C O 2 H 3 M i n o r S c h e m e I I I - 2 . P r o p o s e d r a t i o n a l f o r d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y o f t r a n s - i m i d a z o l i n e s c o m p o u n d 1 1 1 ( 1 - 8 ) . * N o t e : o n l y r e p r e s e n t a t i v e i m i d a z o l i n e s a r e b e i n g s h o w n i n t h i s t h e s i s . i i ) B i o l o g i c a l A c t i v i t y - s e n s i t i z a t i o n o f c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s a ) I m i d a z o l i n e s a n d i n fl a m m a t i o n A n t a g o n i z i n g p r o - i n fl a m m a t o r y c y t o k i n e s s u c h a s T N F - a a n d i n t e r l e u k i n s h a v e b e e n r e c o g n i z e d a s v a l i d g o a l s i n t h e d e v e l o p m e n t o f n e w d r u g c a n d i d a t e s f o r t h e t r e a t m e n t o f c h r o n i c i n fl a m m a t o r y c o n d i t i o n s s u c h a s r h e u m a t o i d a r t h r i t i s a n d i n fl a m m a t o r y b o w e l d i s e a s e . ” B o t h i m i d a z o l i n e s a n d i m i d a z o l e s h a v e b e e n s h o w n t o h a v e a n t i - i n fl a m m a t o r y a c t i v i t y . 8 6 A m o n g t h e v a r i o u s e n z y m e s a s t a r g e t s f o r a n t i - i n fl a m m a t i o n t h e r a p y , a s e r i n e / t h r e o n i n e k i n a s e t e r m e d p 3 8 M A P ( m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n ) k i n a s e h a s b e c o m e o n e o f t h e m a i n t a r g e t s , 3 1 : 9 “ E 1 Z \ Y z | I \ F i g u r e I I I - 9 . S t r u c t u r e s o f i m i d a z o l e b a s e d a n t i - i n fl a m m a t o r y c o m p o u n d s 1 2 8 o w i n g t o i t s i m p o r t a n c e i n t h e b i o s y n t h e s i s a n d r e l e a s e o f b o t h T N F - a a n d L l fl . 8 5 b E x e m p l i fi e d b y S B 2 0 3 5 8 0 ( F i g u r e I H - 9 ) , s e v e r a l i n h i b i t o r s o f p 3 8 M A P k i n a s e w i t h a n i m i d a z o l i n e o r i m i d a z o l e c o r e r i n g h a v e b e e n s y n t h e s i z e d . 8 5 c S B 2 0 3 5 8 0 b i n d s i n t h e A T P p o c k e t o f p 3 8 M A P k i n a s e s “ B a s e d o n t h e l i n k b e t w e e n i n fl a m m a t i o n a n d c a n c e r a n d i m i d a z o l e s a n d i m i d a z o l i n e s b e i n g a n t i - i n fl a m m a t o r y c o m p o u n d s , w e p r o b e d i m i d a z o l i n e s f o r a n t i - t u m o r a c t i v i t y . b ) C y t o t o x i c i t y o f i m i d a z o l i n e s T h e l i b r a r y o b t a i n e d v i a T M S C l - m e d i a t e d c y c l o a d d i t i o n r e a c t i o n , w a s e v a l u a t e d f o r t h e i r b i o l o g i c a l a c t i v i t y . U p o n s c r e e n i n g o f t h e s e a g e n t s u s i n g t h e s t a n d a r d t r y p a n b l u e e x c l u s i o n m e t h o d , w e f o u n d t h a t t h e s e i m i d a z o l i n e s c a f f o l d s e x h i b i t e d n o a p p a r e n t c y t o t o x i c i t y ( F i g u r e I I I - 1 0 ) w h e n u s e d a s s i n g l e a g e n t s , 4 _ + c e t l s a l o n e + I r n i d a z o l i n e I l l - 4 1 0 ” M + l m i d a z o l i n e I I I - 4 1 [ 1 M + I r n i d a z o l i n e I l l - 4 0 . 1 p M + l m i d a z o l i n e I l l - 4 0 . 0 1 / 1 M — o — l m i d a z o l l n e I l l - 4 0 . 0 0 1 M " b — + — | m i d a z o l i n e I l l - 4 0 . 1 n M , . x 3 i 2 d ) . 2 . 7 . O i E a Z O l T T T f T fl 0 1 0 2 0 T l m e ( h ) 3 ° 4 0 5 0 6 0 F i g u r e I I I - 1 0 . I m i d a z o l i n e s a r e n o t c y t o t o x i c . C e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f 1 1 1 - 4 ( l O u M , l u M , 0 . 1 u M , 0 . 0 1 n M , 1 n M , 0 . 1 n M ) f o r 4 8 h . T i m e p o i n t s r e p r e s e n t a v e r a g e s o v e r t w o s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . 1 2 9 h o w e v e r f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s r e v e a l e d t h a t t h i s a g e n t s d r a s t i c a l l y e n h a n c e d t h e l e v e l o f a p o p t o s i s i n d u c e d b y c h e m o t h e r a p e u t i c s . c ) S e n s i t i z a t i o n o f c a n c e r c e l l s t o w a r d c a m p t o t h e c i n T h e i m i d a z o l i n e s ( I I I - l - I I I - 8 ) w e r e e v a l u a t e d f o r t h e i r a b i l i t y t o e n h a n c e t h e a c t i v i t y o f c a m p t o t h e c i n ( C P T ) i n c a n c e r c e l l s b y e v a l u a t i n g t h e l e v e l o f a p o p t o s i s i n d u c e d b y c a m p t o t h e c i n i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f i m i d a z o l i n e s . I n d u c t i o n o f a p o p t o s i s i s t h e h a l l m a r k o f m o s t c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s , i n c l u d i n g c a m p t o t h e c i n . 9 ’ 8 7 I n v e s t i g a t i o n o f t h e i m i d a z o l i n e s a s a p o p t o t i c m o d u l a t o r s , r e v e a l e d t h a t t h e s e a g e n t s d r a s t i c a l l y e n h a n c e d t h e l e v e l o f a p o p t o s i s i n d u c e d b y c a m p t o t h e c i n ( e r s q u a r e s , F i g u r e 1 1 1 - 1 1 ) . T h e l e v e l o f i n d u c t i o n o f a p o p t o t i c c e l l d e a t h w a s m e a s u r e d u s i n g a c a s p a s e - b a s e d b i p h a s i c s c r e e n u s i n g t h e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e c a s p a s e b a s e d A p o - O n e a s s a y T M f r o m P r o m e g a C o r p o r a t i o n . C a s p a s e a c t i v a t i o n p l a y s a c e n t r a l r o l e i n t h e e x e c u t i o n o f a p o p t o s i s v i a t h e p r o t e o l y t i c c l e a v a g e o f m u l t i p l e p r o t e i n s u b s t r a t e s b y c a s p a s e - 3 , - 6 a n d - 7 . 8 8 A s t h e fi r s t p h a s e , t h e o p t i m i z a t i o n o f c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g w a s c a r r i e d o u t s u c h t h a t i t p e r t u r b s t h e c e l l m a c h i n e r y b u t d o e s n o t c a u s e e x t e n s i v e a p o p t o s i s . T h i s w a s d o n e u s i n g b o t h c a s p a s e b a s e d a s s a y a s w e l l a s M T S a s s a y f r o m P r o m e g a C o r p o r a t i o n , W I , w h i c h t a k e s a d v a n t a g e o f t h e r e d u c t i o n p o t e n t i a l o f t h e l i v e c e l l s ( a p p e n d i x 1 ) . T r e a t m e n t o f t h e C E M l e u k e m i a T - c e l l s w i t h c o m p o u n d I I I - 4 ( o r a n y o t h e r t r a n s - i m i d a z o l i n e s ) d i d n o t i n d u c e s i g n i fi c a n t a m o u n t s o f a p o p t o s i s ( t e s t e d u p t o 1 0 [ 1 M f o r 4 8 h b y c e l l c o u n t , F i g u r e I I I - 1 0 ) , i n d i c a t i n g t h a t i m i d a z o l i n e s e x h i b i t s n o s i g n i fi c a n t c e l l c y t o t o x i c i t y . T h e i m i d a z o l i n e I I I - 4 w a s s u b s e q u e n t l y s c r e e n e d f o r i t s a b i l i t y t o e n h a n c e a p o p t o s i s i n d u c e d b y t h e c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t , c a m p t o t h e c i n ( C P I ‘ ) . 1 0 a A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( a l s o i l l u s t r a t e d i n F i g u r e I I I - 7 ) c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s s u c h a s c a m p t o t h e c i n a c t i v a t e t h e a n t i - a p o p t o t i c 1 3 0 f a c t o r , N F - c h . ' 9 ° C a m p t o t h e c i n c a u s e s c e l l d e a t h v i a a p o p t o t i c m e c h a n i s m s w h i c h u n d e r g o fi n a l e x e c u t i o n t h r o u g h t h e a c t i v a t i o n o f c a s p a s e s . 1 C a s p a s e s a r e c o n s t i t u t i v e l y p r e s e n t i n a l l c e l l s t h a t r e s i d e i n t h e c y t o s o l a s a p r o e n z y m e . T h e s e c o n v e r t i n t o f u l l y f u n c t i o n a l c a s p a s e s u p o n p r o t e o l y t i c c l e a v a g e . ” 8 8 C a s p a s e s s u c h a s c a s p a s e - 3 i s o f t e n c a l l e d ‘ e x e c u t i o n e r ’ o r ‘ e f f e c t o r ’ o f a p o p t o s i s . " C l e a v a g e o f N F - t c B r e g u l a t e s p r o g r a m m e d c e l l d e a t h v i a c r o s s t a l k w i t h t h e c a s p a s e s . ” C a s p a s e - m e d i a t e d c l e a v a g e o f R e l A a n d I K K - B c a n p r e v e n t N F - t c B a c t i v a t i o n s ” c C a s p a s e s c a n a l s o c l e a v e I K B t o g e n e r a t e a d e g r a d a t i o n - r e s i s t a n t N F - K B i n h i b i t o r . 8 9 d H e n c e , a s s h o w n i n F i g u r e I I I - l l , a c t i v e c a s p a s e - 3 a n d - 7 w e r e m e a s u r e d u s i n g a p r o fl u o r e s c e n t c a s p a s e - 3 n c o n s e n s u s s u b s t r a t e , b i s - ( N - C B Z - L - a s p a r t y l - L - g l u t a m y l - L — v a l y l - a s p a r t i c a c i d a m i d e ) r h o d a m i n e 1 1 0 ( Z - D E V D - R l l O ) . T h e l y s i s b u f f e r e f fi c i e n t l y l y s e s c u l t u r e d m a m m a l i a n c e l l s a n d s u p p o r t s o p t i m a l c a s p a s e - 3 N e n z y m a t i c a c t i v i t y . T h e s u b s t r a t e a n d b u f f e r w e r e c o m b i n e d t o m a k e t h e r e a g e n t t h a t w a s a d d e d t o t h e s a m p l e s . U p o n c l e a v a g e o n t h e C - t e r m i n a l s i d e o f t h e a s p a r t a t e r e s i d u e i n t h e D E V D p e p t i d e s u b s t r a t e s e q u e n c e b y c a s p a s e - 3 H e n z y m e s , t h e r h o d a m i n e 1 1 0 b e c o m e s fl u o r e s c e n t w h e n e x c i t e d a t a w a v e l e n g t h o f 4 9 8 n m . T h e a m o u n t o f fl u o r e s c e n t p r o d u c t g e n e r a t e d i s r e p r e s e n t a t i v e o f t h e a m o u n t o f a c t i v e c a s p a s e - 3 N p r e s e n t a n d t h e o v e r a l l a p o p t o s i s u n d e r g o n e . I n o r d e r t o fi n d o u t t h e e f fi c a c y o f v a r i o u s i m i d a z o l i n e s , w e d e fi n e d a t h r e s h h o l d i n d e x t o q u a l i t a t i v e l y fi n d a n y s i g n i fi c a n t l e a d m o l e c u l e s . C h e m o p o t e n t i a t i o n i n d e x ( C I ) w a s d e fi n e d a s a b a s i c r e s u l t o f t h e a s s a y t o d e t e r m i n e i f a n i m i d a z o l i n e c o u l d p o t e n t i a t e t h e e f fi c a c y o f c a m p t o t h e c i n i n l e u k e m i a c e l l s . C h e m o p o t e n t i a t i o n I n d e x : A p o p t o s i s i m i d a z o l j n ¢ 9 1 C P r I A p o p t o s i s C W 1 3 1 4 . m - r a t C h e m o p o t e n t i a t i o n o n E n t r y t r a n s - l m l d a z o l l n e I n d e x E n t r y t r a n s - I m i d u o l l n e I n d e x ( 1 1 1 " . 4 8 1 1 1 ( 1 1 ! " 1 4 8 1 0 F / I ? I l l - 1 P h 1 . 4 ( + I - 0 . 8 3 ) m - s P M “ 2 . 4 4 ( + / - 0 . 0 1 ) P M H F . P h “ P h I l l - 2 N c 0 2 5 , 2 . 3 ( + / - o . 9 3 ) I I I - e A l i c o z l " 0 . 9 7 ( + / - o . 0 1 ) P H N - . 0 0 2 H = F . © F i r - x P h I l l - 3 P H N I c o z a 2 . 3 ( + / - o . 1 1 ) I l l - 7 P M [ ‘ N S H 1 . 0 5 ( + / - o . 0 0 2 ) i n - . C 0 2 H 0 * P h I I I - 4 P b ’ 3 1 . ” , _ 3 . 9 8 ( + l - O . 8 5 ) I l l - 8 1 . 4 ( + / - o . 0 3 ) N C O Z H P H ‘ N . P fi o z H E n h a n c e m e n t o f C P T - i n d u c e d a p o p t o s i s i n C E M c e l l s w a s fi r s t i n v e s t i g a t e d a t c o n c e n t r a t i o n s o f 5 1 0 n M C P T , a t w h i c h C P T h a s b e e n r e p o r t e d t o c a u s e D N A a b e r r a t i o n s b u t n o s i g n i fi c a n t l e v e l s o f a p o p t o s i s i n l e u k e m i a c e l l s . 9 0 F i g u r e I I I - l l i l l u s t r a t e s t h e e f f e c t o f t h e i m i d a z o l i n e o n C E M c e l l s w h e n i n c u b a t e d w i t h C P T o v e r a 4 8 h o u r t i m e p e r i o d . C l e a r l y , u p t o 4 8 h t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e s a s a s i n g l e a g e n t d i d n o t a c t i v a t e c a s p a s e - 3 i n d i c a t i n g t h a t t r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h c o m p o u n d I I I - 3 h a d n o e f f e c t o n t h e l e v e l o f a p o p t o s i s . T r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h 1 0 n M C P T r e s u l t e d i n s o m e T a b l e I I I - l . C h e m o p o t e n t i a t i o n i n d e x o f i m i d a z o l i n e s w i t h c a m p t o t h e c i n . c e l l d e a t h s t a r t i n g a f t e r 1 2 h o u r s o f d r u g t r e a t m e n t ( F i g u r e I I I - l 1 ) . 1 3 2 ? i s i l l e c i c i t “ o t p o p N A f o r e b m u N 1 5 0 0 0 0 0 - 1 0 0 0 0 0 0 - 5 0 0 0 0 0 i 0 l l 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 T i m e ( h ) + N o d r u g + C o m p o u n d 1 1 1 - 4 ( 1 0 n M ) + C P T 1 0 n M + C P T 1 0 n M ; + C o m p o u n d I I I - 4 ( 1 0 n M ) I l l - 4 + C P T . 1 2 h I l l - 4 + C P T , 4 8 h F i g u r e I I I - 1 1 a . S e n s i t i z a t i o n o f C E M c e l l s t o c a m p t o t h e c i n b y i m i d a z o l i n e I I I - 4 , m e a s u r e d o v e r 4 8 h o u r s . D a t a r e p o r t e d a s a n a v e r a g e o f t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s ( e r r o r m a r g i n s a r e i n c l u d e d ) F i g u r e I I I - 1 1 i l l u s t r a t e s c e l l d e a t h t h r o u g h a p o p t o s i s a s a f u n c t i o n o f t i m e f o r c e l l s a l o n e ( d a r k b l u e t r i a n g l e ) , i m i d a z o l i n e o n l y ( p i n k s q u a r e s ) , C P T ( 1 0 n M ) ( l i g h t b l u e t r i a n g l e ) a n d C P T ( 1 0 n M ) i n p r e s e n c e o f i m i d a z o l i n e ( 1 0 n M ) ( r e d 1 3 3 _ m e " ° " t C C g . f s e q u ' h e d 4 § 7 E C . x e p g ¥ M l C P T 0 + 0 0 9 . 1 5 l m e m l l - 4 C P T 0 + 0 1 9 0 5 n m M m I l l - 4 C T C + 9 1 5 a C P . 8 2 . 2 9 N T N n n M l ) l - 4 ( T 0 0 . > 9 l 5 l 0 0 I 1 1 - . . n M ) ( 4 . 0 . 0 . 0 s q u a r e s ) . I I I - 1 1 b . C o m b i n a t i o n p r e - t r e a t m e n t w i t h I I I - 4 , 4 8 h , a l l t r e a t m e n t s s t a i n e d w i t h Y o P r o - l a n d v i s u a l i z e d u s i n g fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . C o m b i n a t i o n t r e a t m e n t o f t h e n o n - c y t o t o x i c i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 ( 1 0 n M ) w i t h C P T ( 1 0 n M ) r e s u l t e d i n e n h a n c e m e n t o f a p o p t o t i c c e l l d e a t h a f t e r 4 8 h o u r s ( r e d s q u a r e s , F i g u r e I I I - l l ) . A s i m i l a r o b s e r v a t i o n w a s m a d e w h e n t h e c e l l s w e r e p r e - i n c u b a t e d w i t h 1 1 1 - 4 ( 1 0 0 n M ) f o l l o w e d b y C P T t r e a t m e n t a n d s t a i n e d w i t h Y o - P r o d y e t o b e v i s u a l i z e d u n d e r a fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e ( F i g u r e I I I - 1 1 b ) . T h e m e m b r a n e i n t e g r i t y w a s c o m p r o m i s e d u p t o 4 8 h ( a c h a r a c t e r i s t i c f e a t u r e o f a p o p t o s i s ) a n d c a u s e d i n c r e a s e i n fl u o r e s c e n c e . A d d i t i o n a l e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n o r d e r t o q u a n t i f y t h i s e n h a n c e m e n t o f t h e a p o p t o t i c s i g n a l d u e t o t r e a t m e n t w i t h I I I - 4 i n l e u k e m i a c e l l s . B r i e fl y , t h e s t u d y w a s d i v i d e d i n t o t w o s e t s o f e x p e r i m e n t s , o n e i n v o l v i n g c o n t i n u o u s e x p o s u r e o f t h e a g e n t s t o t h e c e l l s a n d a n o t h e r s u b j e c t i n g t h e c e l l s t o a n i n i t i a l e x p o s u r e o f t h e d r u g , f o l l o w e d b y r e m o v a l o f d r u g a n d s u p p l e m e n t i n g w i t h f r e s h m e d i a . C e l l s w e r e p r e - i n c u b a t e d w i t h l , 1 0 a n d 1 0 0 n M c o n c e n t r a t i o n s o f t h e i m i d a z o l i n e I I I - 4 f o l l o w e d b y e x p o s u r e t o a t i t r a t i o n r a n g e o f C P T c o n c e n t r a t i o n s . V a r i o u s t i m e p o i n t s w e r e o b t a i n e d a n d t h e d a t a w a s a n a l y z e d . T a b l e H I - 2 a n d F i g u r e I I I - 1 2 i l l u s t r a t e t h e e f f e c t o n C C 9 5 f o r c a m p t o t h e c i n o n c e l l s p r e - t r e a t e d w i t h i m i d a z o l i n e . T a b l e 1 1 1 - 2 . C o m p a r i s o n o f c y t o t o x i c c o n c e n t r a t i o n c a u s i n g 9 5 % c e l l c y t o t o x i c i t y i n 1 3 4 s i s o t p o p a % c o n t i n u o u s e x p o s u r e a n d w a s h e d c e l l s a n d i s a n a v e r a g e o f t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . N T : N o t t e s t e d T h e C C 9 5 o f C P T w a s i n c r e a s e d b y 7 5 . 1 f o l d , w h e n t h e c e l l s w e r e p r e - t r e a t e d w i t h 0 . 1 u M i m i d a z o l i n e f o r 1 h o u r . T h i s f o l d e n h a n c e m e n t w a s r e d u c e d t o 2 9 . 1 f o l d e n h a n c e m e n t o f e f fi c a c y w h e n t h e a m o u n t o f i m i d a z o l i n e w a s d e c r e a s e d t o 1 n M ( T a b l e I I I — l , s e e a p p e n d i x 2 f o r g r a p h s ) . A s a n t i c i p a t e d , t h e c o n t i n u o u s e x p o s u r e r e s u l t e d i n o v e r a l l h i g h e r c e l l c y t o t o x i c i t y d u e t o a l o n g e r e x p o s u r e t i m e . W h e n t h e c e l l s w e r e w a s h e d w i t h l X P B S a f t e r 1 h o f c a m p t o t h e c i n t r e a t m e n t , t h e C C 9 5 d r o p p e d t o 2 0 . 9 f o l d s e n h a n c e m e n t o f C P T i n d u c e d c e l l d e a t h ( C C 9 5 ) . 1 1 0 - C E M c e l l s 1 0 0 . . A 0 . 1 t t M I l l - 4 — > C P T 9 0 - I C P T . I 8 0 1 - 1 7 0 - I 8 0 - 5 0 - 4 0 d 3 0 . 2 0 - 1 0 1 I S 0 ' I I I I I - ‘ 1 3 - 1 2 - 1 1 - 1 0 - 9 - 8 - 7 - 6 - l l o g l C P ' H M i l F i g u r e I I I - 1 2 . C C 9 5 c u r v e s f o r C P T a l o n e a n d c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t w i t h 1 1 1 - 4 . T h e r e d t r i a n g l e s s h o w c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t o f i m i d a z o l i n e a n d c a m p t o t h e c i n . B l u e s q u a r e s a r e c a m p t o t h e c i n a l o n e . V a l u e s a r e a v e r a g e s o f t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . P = 0 . 0 0 2 4 S i m i l a r p o t e n t i a t i o n w a s s e e n w i t h p r e - t r e a t m e n t o f t h e p r o t e a s o m a l i n h i b i t o r , A L L N f o l l o w e d b y c a m p t o t h e c i n t r e a t m e n t . I t i s i m p o r t a n t t o n o t e h o w e v e r , t h a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f A L L N c a u s e d s i g n i fi c a n t a d d i t i v e c y t o t o x i c i t y ( s e e a p p e n d i x 3 ) . 1 3 5 d ) C e l l d e a t h d e t e r m i n e d b y T r y p a n B l u e E x c l u s i o n P a r a l l e l t o t h e A p o - O n e a s s a y , c e l l s w e r e c o u n t e d b y t h e T r y p a n B l u e E x c l u s i o n m e t h o d t o fi n d o u t t h e n u m b e r o f v i a b l e c e l l s . C e l l s w e r e p r e - i n c u b a t e d w i t h 0 . 1 u M , 0 . 0 1 [ 1 M a n d 1 n M i m i d a z o l i n e I I I - 4 , t h e n , v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f c a m p t o t h e c i n w e r e a d d e d a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e f o r 0 , 2 4 , 4 8 h . W e l l - m i x e d a l i q u o t s o f t h e s e c e l l c u l t u r e s w e r e t h e n m i x e d w i t h e q u a l v o l u m e o f 0 . 0 4 % t r y p a n b l u e d y e a n d o n l y t h e t r a n s p a r e n t c e l l s ( v i a b l e ) w e r e c o u n t e d w i t h a h e m a c y t o m e t e r u n d e r t h e m i c r o s c o p e . R e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e c o n t r o l w i t h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f C P T ( 5 0 [ . L M ) c a u s e d s i g n i fi c a n t r e d u c t i o n i n c e l l v i a b i l i t y ( p i n k s q u a r e s , F i g u r e I I I - 1 3 ) . M o d e r a t e c o n c e n t r a t i o n s o f C P T ( 0 . 0 1 n M ) i n d u c e d c e l l d e a t h u p t o 4 8 h , t h o u g h ~ 4 0 % o f t h e c e l l p o p u l a t i o n p a s s e d t h e t r y p a n b l u e t e s t a n d w a s v i a b l e ( g r e e n t r i a n g l e s , F i g u r e I I I - 1 3 ) . C l e a r l y , a p r e - t r e a t m e n t w i t h 0 . 1 p M I I I - 4 r e d u c e d t h e c e l l v i a b i l i t y b y n e a r l y 2 0 % s t a r t i n g a t 2 4 h w h i c h w a s m a i n t a i n e d o v e r 4 8 h ( r e d s q u a r e s , F i g u r e 1 1 1 - 1 3 ) . 1 3 6 s l 5 l e c ‘ 8 ' e l b a i v f o § 8 r 8 e b m u a N a % + N o d r u g + C P T 5 0 M + C P T 0 . 0 1 u M + 0 . 1 p M | | l - 4 - > C P T 0 . 0 1 1 . 1 M 1 6 0 * g 1 4 0 — 8 a ) 1 2 0 - E 1 0 0 i t . 2 8 0 — 3 6 0 8 E 4 0 * 2 2 0 0 l T I I l l 0 1 0 2 4 0 5 0 6 0 Q l ' i m e ( h : ) 0 + N o d m g + C P T 5 0 p M + C P T 0 . 0 1 [ 1 M + 0 . 0 1 u M I l l - 4 - > C P T 0 . 0 1 M O ‘ l F i g u r e I I I - 1 3 . M e a s u r e m e n t o f n u m b e r o f v i a b l e c e l l s u s i n g t h e T r y p a n B l u e M e t h o d e ) P a t h w a y o f a p o p t o t i c m o d u l a t i o n . I n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e p o t e n t i a l m o l e c u l a r p a t h w a y t h r o u g h w h i c h t h e i m i d a z o l i n e e x e r t i t s a p o p t o t i c m o d u l a t i o n , w e e v a l u a t e d i t s a b i l i t y t o i n h i b i t C P T i n d u c t i o n o f N F - K B a c t i v a t i o n . I n h i b i t i o n o f t h e N F - t c B s i g n a l i n g c a s c a d e m a y o c c u r a t s e v e r a l d i f f e r e n t s t e p s i n i t s a c t i v a t i o n p a t h w a y ( F i g u r e I I I - 7 ) . I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e r e t h e i m i d a z o l i n e 1 3 7 i n t e r s e c t e d t h e N F - K B a c t i v a t i o n p a t h w a y w e e x a m i n e d t h e e f f e c t o f i m i d a z o l i n e o n C P T i n d u c e d N F - t c B a c t i v a t i o n i n e a c h o f t h e s t e p s s h o w n i n F i g u r e 1 1 1 - 7 . 1 . N F - K B a c t i v a t i o n b y c a m p t o t h e c i n . A c t i v a t i o n o f N F - t c B b y c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s s u c h a s t h e c a m p t o t h e c i n h a s w e l l b e e n d o c u m e n t e d b y s e v e r a l g r o u p s i n d i f f e r e n t c e l l l i n e s , i n c l u d i n g C E M l e u k e m i a T - c e l l s . l 9 T h e s t a b i l i z a t i o n o f a t o p o i s o m e r a s e I — D N A c l e a v a b l e c o m p l e x b y c a m p t o t h e c i n a c t i v a t e s c e l l s u r v i v a l s i g n a l i n g p a t h w a y s m e d i a t e d b y t h e n u c l e a r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r N F - K B . ' 9 ' 2 7 " T h e a c t i v a t i o n o f N F - K B b y c a m p t o t h e c i n w a s c o n fi r m e d i n C E M c e l l s u s i n g a n E M S A a s s a y . ' 9 ° ' 3 6 ‘ T h e c e l l n u c l e i w e r e i s o l a t e d a n d e v a l u a t e d f o r N F - t c B - D N A b i n d i n g a c t i v i t y u t i l i z i n g t h e fl u o r e s c e n t l y l a b e l e d N F - t c B D N A c o n s e n s u s s e q u e n c e . T N F a a c t i v a t i o n w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l ( F i g u r e I I I - 1 4 a , l a n e 2 ) . T h e N F - t c B / D N A c o m p l e x w a s u n a m b i g u o u s l y i d e n t i fi e d b y t r e a t i n g t h e n u c l e a r e x t r a c t w i t h a N F - t c B p 6 5 a n t i b o d y f o l l o w i n g T N F a a c t i v a t i o n a n d C P T a c t i v a t i o n ( F i g u r e I I I - 1 4 a , l a n e 3 a n d 6 , r e s p e c t i v e l y ) . T r e a t m e n t o f t h e n u c l e a r e x t r a c t w i t h t h e p 6 5 a n t i b o d y r e s u l t e d i n a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n N F - t c B / D N A b i n d i n g a n d t h e f o r m a t i o n o f a s u p e r s h i f t o f t h e c o m p l e x ( F i g u r e I I I - 1 4 a , l a n e 3 a n d 6 ) . A s a n e g a t i v e c o n t r o l , c e l l s a r e l e f t u n a c t i v a t e d a n d t h e n u c l e a r e x t r a c t s w a s e x p o s e d t o t h e N F - K B c o n s e n s u s s e q u e n c e , r e s u l t i n g i n o n l y a s l i g h t b a c k g r o u n d l e v e l o f N F - t c B - D N A b i n d i n g ( F i g u r e I I I - 1 4 a , l a n e 4 ) . T r e a t m e n t o f t h e C E M c e l l s w i t h c a m p t o t h e c i n c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 1 0 [ 1 M t o 0 . 1 n M ( F i g u r e I I I - 1 4 a , l a n e s 5 , 7 - 1 0 ) i l l u s t r a t e d a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f N F - K B / D N A b i n d i n g d u e t o N F - K B a c t i v a t i o n . T h i s a c t i v a t i o n d e c r e a s e d a s t h e c o n c e n t r a t i o n o f C P T d e c r e a s e d w i t h s i g n i fi c a n t a c t i v a t i o n u p t o 0 . 0 1 u M C P T a n d v i r t u a l l y w e a k / n o a c t i v a t i o n a t 1 n M a n d 0 . 1 n M r e s p e c t i v e l y . N o n - s p e c i fi c b i n d i n g w a s m i n i m a l d u e t o t h e a d d i t i o n o f 1 u g p o l y 1 3 8 d I . d C . M i y a m o t o a n d c o w o r k e r s h a v e s h o w n t h a t a c t i v a t i o n o f N F - K B a l s o l e d t o a n i n c r e a s e d N F - K B m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n . ' 9 c W e c o n fi r m e d s i m i l a r r e s u l t s i n H e L a c e l l s w h i c h h a v e b e e n d i s c u s s e d l a t e r i n t h i s c h a p t e r . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t a c t i v a t i o n o f N F - K B i n C E M c e l l s t r a n s l a t e s i n t o i n c r e a s e d N F - K B m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n . D N A + + + + + + + + + + + T N F - 0 L - + + - - - - - - - - a - p 6 5 - - + - - + - - — - - C P T — - - - + + + + + + + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 ' S u p e r s h i t t u - - N F - K B / D N A . , n o n - s p e c i f i c 1 ! < 2 b i n d i n g a . _ , m a i n - I i ‘ 5 ” N A F i g u r e I I I - 1 4 a . E M S A a s s a y f o r N F - K B a c t i v a t i o n b y c a m p t o t h e c i n ( C P T ) i n C E M c e l l s . L a n e 1 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o n u c l e o t i d e ( 0 . 1 6 p m o l fl t ) ; L a n e 2 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( T N F - a ) ; L a n e 3 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / l ) + n u c l e a r e x t r a c t ( T N F - a + p 6 5 a n t i b o d y ; L a n e 4 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( u n a c t i v a t e d ) ; L a n e 5 : N F — K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 0 u M C P T ) ; L a n e 6 : N F - t c B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A . ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 0 u M C P T ) + p 6 5 a n t i b o d y ; L a n e 7 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 u M C P T ) ; L a n e 8 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 0 . 1 u M C P T ) ; L a n e 9 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 0 . 0 1 [ 1 M C P T ) ; L a n e l O : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / X ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 n M C P T ) ; L a n e 1 1 : N F - t c B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 0 . 1 n M C P T ) . A l l i n c u b a t i o n s w i t h C P T w e r e p e r f o r m e d f o r 2 h . T h e p o s i t i v e c o n t r o l w i t h T N F - a w a s i n c u b a t e d f o r 1 5 ’ . A s i m i l a r e x p e r i m e n t w a s c a r r i e d o u t i n J u r k a t c e l l s , a n o t h e r l e u k e m i a c e l l l i n e ; h o w e v e r , n o a c t i v a t i o n o f N F - K B w a s s e e n i n t h i s T - c e l l l i n e . T h e c e l l n u c l e i w e r e i s o l a t e d a n d e v a l u a t e d f o r N F - K B - D N A b i n d i n g a c t i v i t y u t i l i z i n g t h e fl u o r e s c e n t l y l a b e l e d N F - K B 1 3 9 D N A c o n s e n s u s s e q u e n c e . T N F - a a c t i v a t i o n w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l ( F i g u r e I I I - 1 4 b , l a n e 2 ) . T h e N F - K B / D N A c o m p l e x w a s u n a m b i g u o u s l y i d e n t i fi e d b y t r e a t i n g t h e n u c l e a r e x t r a c t w i t h a N F - K B p 6 5 a n t i b o d y f o l l o w i n g T N F - a a c t i v a t i o n ( F i g u r e I I I - 1 4 b , l a n e 3 , r e s p e c t i v e l y ) . D N A + + i t t 1 4 + 1 t T N F - o r + 1 ‘ a — p 6 5 - + - - + - _ _ - C l ’ l ' - - - _ + 4 + + + 7 + 1 2 3 4 5 o 7 s 9 t o q ' ‘ ' - ' - ’ : S u p e r s h i f t w i t h p 6 5 a n t i b o d y . - N F - k a p p a B — D N A c o m p l e x 1 - - _ - . . ' N o n - S p e c i f i c b i n d i n g 3 “ “ . H U H H “ F r e e D N A p r o b e F i g u r e I I I - 1 4 b . E M S A a s s a y f o r N F - K B a c t i v a t i o n b y c a m p t o t h e c i n ( C P T ) i n J u r k a t c e l l s . L a n e I : N F - t c B c o n s e n s u s o l i g o n u c l e o t i d e ( 0 . 1 6 p m o l / K ) ; L a n e 2 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( T N F - a ) ; L a n e 3 : N F - t c B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / X ) + n u c l e a r e x t r a c t ( T N F - a + p 6 5 a n t i b o d y ; L a n e 4 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( u n a c t i v a t e d ) ; L a n e 5 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 0 1 1 M C P T ) ; L a n e 6 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / l ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 0 M M C P T ) + p 6 5 a n t i b o d y ; L a n e 7 : N F — K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / K ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 u M C P T ) ; L a n e 8 : N F - t c B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l M ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 0 . 1 p M C P T ) ; L a n e 9 : N F - t c B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 0 . 0 1 u M C P T ) ; L a n e l O : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 n M C P T ) ; A l l i n c u b a t i o n s w i t h C P T w e r e p e r f o r m e d f o r 2 h . T h e p o s i t i v e c o n t r o l w i t h T N F - a w a s i n c u b a t e d f o r 1 5 ’ . T r e a t m e n t o f t h e n u c l e a r e x t r a c t w i t h t h e p 6 5 a n t i b o d y r e s u l t e d i n a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n N F - K B / D N A b i n d i n g ( F i g u r e I I I - 1 4 b , l a n e 3 ) . A s a n e g a t i v e c o n t r o l , c e l l s a r e l e f t u n a c t i v a t e d a n d t h e n u c l e a r e x t r a c t s w a s e x p o s e d t o t h e N F - K B c o n s e n s u s s e q u e n c e , r e s u l t i n g i n o n l y a s l i g h t b a c k g r o u n d l e v e l o f N F - t c B - D N A b i n d i n g ( F i g u r e I I I - l 4 , l a n e 4 ) . T r e a t m e n t o f t h e J u r k a t c e l l s w i t h c a m p t o t h e c i n c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 1 0 M M 1 4 0 t o 1 n M ( F i g u r e I I I - 1 4 b , l a n e s 5 , 7 - 1 0 ) i l l u s t r a t e d n o N F - t c B / D N A b i n d i n g i n d i c a t i n g t h a t C P T c o u l d n o t a c t i v a t e N F - t c B i n J u r k a t c e l l s . i i . N F - K B a c t i v a t i o n b y C P T i n C E M c e l l s i s t r a n s i e n t a n d a f u n c t i o n o f t i m e . A c t i v a t i o n o f N F - K B i s t r a n s i e n t a n d d e p e n d s o n e x p o s u r e t i m e . T h i s w a s c o n fi r m e d b y t r e a t i n g C E M c e l l s a t l o g p h a s e w i t h 1 0 1 1 M c a m p t o t h e c i n o r D M S O f o r 3 0 m i n u t e s a n d l , 2 , 4 , 6 , l 4 , a n d 2 4 h o u r s ( F i g u r e I I I - 1 5 3 ) . M a x i m a l N F - c h a c t i v a t i o n w a s a t 2 h o u r s a n d d e c r e a s e d a f t e r 4 h o u r s c o n fi r m i n g a p o s t - i n d u c t i o n s e l f r e p r e s s i o n l o o p d u r i n g t h e e a r l y h o u r s o f i n c u b a t i o n w i t h c a m p t o t h e c i n c o n s i s t e n t w i t h e a r l i e r r e p o r t s . 1 9 c T h e s e r e s u l t s w e r e c o n fi r m e d o n a n E L I S A a s s a y f o r I K B - 0 . p h o s p h o r y l a t i o n a l s o ( F i g u r e 1 1 1 - 1 5 b ) , w h e r e t h e I - t c B a p h o s p h o r y l a t i o n i n c r e a s e d w i t h t i m e u p t o 6 0 m i n u t e s a n d t h e n b e g a n t o d e c r e a s e r a p i d l y o w i n g t o p r o t e a s o m a l d e g r a d a t i o n ( F i g u r e I I I - 7 ) . D N A + + + + + + + + + + T N F - 0 t - + + - - - - - - - a - p 6 5 - - + - - + - - - - C P I ‘ - - - - + + + + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 ' " " ' ( 1 : : S u p e t s h i n n . . . . ' 4 F t o « o . C : p 6 5 - D N A c o m p l e x F i g u r e I I I - 1 5 a . E M S A a s s a y f o r N F - t c B a c t i v a t i o n b y c a m p t o t h e c i n ( C P T ) i n C E M c e l l s , T i m e c o u r s e . L a n e 1 : g e l s h i f t f o r N F - t c B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( T N F - a ) ; L a n e 2 : g e l s h i f t f o r N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( T N F - a + p 6 5 a n t i b o d y ; L a n e 3 : g e l s h i f t f o r N F - t c B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( u n a c t i v a t e d ) ; L a n e 4 : g e l s h i f t f o r N F - t c B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l D t ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 0 u M C P T , 3 0 ’ ) ; L a n e 5 : g e l s h i f t f o r N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l D t ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 0 1 1 M C P T , 1 h ) ; L a n e 6 : g e l s h i f t f o r N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l D t ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 0 [ 1 M C P T , 2 h ) ; L a n e 7 : g e l s h i f t f o r N F - t c B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 0 1 4 M C P T , 4 h ) ; L a n e 8 : g e l s h i f t f o r N F - t c B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / X ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 0 1 1 M C P T , 6 h ) ; L a n e 9 : g e l s h i f t f o r N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( l O u M C P T , 1 4 h ) ; L a n e 1 0 : g e l s h i f t f o r N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 0 [ 1 M C P T , 2 4 h ) . A l l i n c u b a t i o n s w i t h C P T a t I O u M . T h e p o s i t i v e c o n t r o l w i t h T N F - a w a s i n c u b a t e d f o r 2 0 ’ . 1 4 1 T h a n t m t r h t b e | - F N B r a o p f p a k - I s e u l a d v n d a e z B i a l p a p m a r k o N 0 . 0 . , a r b i t r a r y u n i t s 8 8 8 8 0 N o d r u g C F T Z p M . O P T Z p M . C P T 2 u M . C P l ' Z p M . C P l ’ Z u M . 1 2 0 n i n u t e s 1 0 0 r r i n u t e s 8 0 m ' n u t e s 6 0 m ' n u t e s 3 0 m ' n u t e s F i g u r e I I I - 1 5 b . T i m e d e p e n d e n t a c t i v a t i o n o f I K B - a . 1 2 0 + A v e r a g e N F - K B + A v e r a g e l - K B 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 T l m e ( m l n ) F i g u r e I I I - 1 5 c . C o m p a r i s o n o f I K B d e g r a d a t i o n a n d N F - K B - D N A b i n d i n g o v e r t i m e . T h e k i n e t i c s o f N F - K B a c t i v a t i o n a n d I K B - d e g r a d a t i o n d e p e n d o n t h e a c t i v a t i o n s i g n a l a n d i t s c o n c e n t r a t i o n . F i g u r e ( I I I - 1 5 c ) i l l u s t r a t e s t h e d e g r a d a t i o n o f I - t c B a ( p i n k t r i a n g l e s ) m o n i t o r e d v i a E L I S A b a s e d s t u d i e s ( F i g u r e I I I - 1 5 b ) o v e r 2 h a n d i n c r e a s e i n N F - t c B ( b l u e r h o m b u s ) w i t h m o s t o p t i m u m v a l u e f o r a t 2 h ( F i g u r e I I I - 1 5 a ) . F r o m F i g u r e I I I - 1 5 , i t c a n b e d e d u c e d t h a t a s I - K B d e g r a d e s a s a f u n c t i o n o f t i m e , N F - t c B a c c u m u l a t e s i n t h e 1 4 2 n U l c fi i L K l fi l l l n d u T h w p m h i n h fi i n v m i n d w l 3 N 2 V m fi c a m S d e ( F r i g i n h o u s s e q u e C c u n P u r c T b e e ) a . A c f o t n e s r e a n s 2 u 1 n I I I - t i A o s 6 . p i e l S r t i r o u d c , l u s t r a t t u e t h d r e s o e n u c i n ( l f F P C e i D P i g u T T w r C ) , e e r e I P D T s i I I - l o C 7 a t n e d d l a , t h e i m a n a i d d d d a z o l t i r t e i a o t n i e n d e w I i o f I t i I m h - i 4 . t d h a e z l a b e l e d o l i n e I I i I c - B 4 n u c l e u s w i t h a m a x i m a l a c c u m u l a t i o n a t 2 h . A n i n c r e a s e i n N F - t c B b i n d i n g l e a d s t o e f fi c i e n t i n c r e a s e o f N F - K B m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n , 1 9 " w h i c h p r e s u m a b l y t r a n s c r i b e s f o r I - t c B - a . T h i s n e w l y s y n t h e s i z e d I - t c B a c a n c a u s e n u c l e a r e x p o r t o f N F - t c B , t h u s s e t t i n g u p a p o s t - i n d u c t i o n s e l f r e p r e s s i o n a u t o - r e g u l a t o r y l o o p . i i i . I n h i b i t i o n o f c a m p t o t h e c i n i n d u c e d N F - K B - D N A b i n d i n g b y i m i d a z o l i n e I I I - 4 . I n d u c t i o n o f N F - K B a c t i v a t i o n c a n p r o c e e d v i a a w i d e r a n g e o f s i g n a l i n g p a t h w a y s ? " 9 2 T h u s , i n h i b i t i o n o f N F - t c B a c t i v a t i o n c a n p r o c e e d v i a t h e m e d i a t i o n o f m a n y d i f f e r e n t p a t h w a y s . “ M o d u l a t o r s o f t h e s e p a t h w a y s m a y t h e r e f o r e a c t a s g e n e r a l a c t i v a t i o n i n h i b i t o r s , w h e r e a s o t h e r s m a y i n h i b i t s p e c i fi c i n d u c t i o n p a t h w a y s . " I n o r d e r t o i n v e s t i g a t e w h e t h e r t h e i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n h i b i t s t h e s p e c i fi c p a t h w a y o f c a m p t o t h e c i n i n d u c e d N F - c h a c t i v a t i o n , w e e x a m i n e d t h e i n h i b i t i o n o f c a m p t o t h e c i n i n d u c e d N F - K B — D N A b i n d i n g i n t h e p r e s e n c e o f t h e c o m p o u n d I I I - 4 . C E M c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n o f i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 , 3 0 m i n u t e s p r i o r t o t h e t r e a t m e n t b y c a m p t o t h e c i n ( 1 u M ) . P y r r o l i d i n e d i t h i o c a r b o x y l i c a c i d ( P D T C , F i g u r e I I I - l 6 ) i s a n o n - s e l e c t i v e N F - i c B i n h i b i t o r - ' 5 ‘ a n d w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l . P h \ \ P h 3 e ( + ) P h ~ < N F H \ C N ’ U ‘ S N W N m o o n P h c a m p t o t h e c i n p y r r o l i d i n e d i t h i o c a r b a m a t e I l l - 4 ( S P _ 4 _ 8 4 ) i n h i b i t e d c a m p t o t h e c i n i n d u c e d N F - t c B n u c l e a r b i n d i n g i n a d o s e d e p e n d e n t m a n n e r . 1 4 3 D l ‘ F i g o l i g p m p m C X l p r r C O ) ( I p n C l I a l K I e t s I c o ( C ( t C n e t c n a M c n t u n t l a e J s / n n H o t o ) t t + r p i r a n r p n n u + ; o s a s c M o M L t a m I P o - c ; T a e l t i i L y + u l : a z n i N o c n l t 5 a o + a c o x ) p M g v u g t 1 6 a F l r n - i U C n ( t a e u t i ; u e u T P l f n l i e P u 1 m ( i s N T o b e . C a T o 1 . s ) i F ) 0 r a d d 1 + o l r v 6 L B n : . i c c t p o 6 0 c e M P a a I ) T 1 ( ; e 5 a t o n P N 6 e c I I t / I T I e x o t a F + e L D p d N i n - t - n N C n K a 7 1 o d t F s ) F ) e B b 0 q n i : e - e ; . c l a m 4 T r I n n ( - ; o N ; s L B 1 L . N n . o , 1 ) 0 c [ ( K : d F u a 5 A L - L n y s a 6 K a M + 0 e F L s o l : b a e B l - u i n p e e i n n t m u i 1 n e s c c c i m 3 M 2 g d 4 u B d o l o : 8 o : i I : s n a C e / r ( n C a K I a ( h B ( r 0 I r P 1 A B i e . 1 . I 1 b e ) . T e 1 - . c x 0 i x t ) 0 x 6 c 4 0 I / n N c a s z ( 0 N A N P g F N o r F o o e . i ; e s s b t - t i 6 - g x ) l F - T - F n n l 1 y c n + c e u K t L o K p s ( B i a a s B n r B e B 0 m n o e c u m 0 o . I c c 1 I t l c i c . l o s / o ‘ n I 2 o I d o 1 i a n o s 4 1 . s 6 g n : n - u ( A n l g n F + m ( n e N e p o ; i 0 z l o s e s M ) ) . e n i s - o L s i s o 0 u n t u a u s l n m . u e c D s n u M s ( 1 i u s B t s 0 6 d c o I ) o p o 1 z . a e C l o - g n g p g I i + o i i : I l c l 6 9 m o l P e l a i o l T r g 4 o o l i o m N n o s e u / n + u X ( ( ( c t ( e e o F x s n i s l - 0 0 0 l 0 ) 0 . . e . / t I . r I a . n u 1 1 a 1 I c 1 X 0 c s ) 6 6 6 g 6 r - t + B 1 E F o p p + n p e c 4 u ( i m m m l u o x ) 1 M g o o o i n c n t . : M u l l l L u l s S g r 0 o c e a r a D D D A e i c e . t t t t n m n l a u . m c g : l M a t l F n e l o o c e I L . r e I + + s 1 a a 1 + . x 1 6 0 I e t 0 - n n o o r n x : P z C 7 l p u c c r i N i 1 e n l l u t a u u I c ‘ e - + 0 a ( e r ) ) ) s i e M ( d u D N A o n l y ( l a n e 1 , F i g u r e H I - l 7 ) s e r v e d a s a n e g a t i v e c o n t r o l l a n e f o r t h e g e l s h i f t . T N F - a a c t i v a t e d N F - t c B ( l a n e 2 , F i g u r e I I I - 1 7 ) w a s u s e d a p o s i t i v e c o n t r o l f o r g e l s h i f t w h i c h w a s u n a m b i g u o u s l y d e t e r m i n e d w i t h a p 6 5 a n t i b o d y u s e d t o p r o v i d e a s u p e r s h i f t ( l a n e 3 , F i g u r e I I I - 1 7 ) a n d t h e u n a c t i v a t e d c o n t r o l ( l a n e 4 , F i g u r e I I I - 1 7 ) . D N A + + + + + + + + + + + T N F - 0 t - + + - - - - - - - - - a - p 6 5 - - + - - + - - - - - C P T - - - - + + + + + + + + l m i d a z o l i n c - - - - - - - + + + + + P D T C - - - - - - - - - _ - p m o l / A . ) + n u c l e a r e x t r a c t ( 1 . 0 u M C P T + 0 . 1 n M i m i d a z o l i n e I I I - 4 ) A l l i n c u b a t i o n s w i t h C P T w e r e p e r f o r m e d f o r 2 h . T h e p o s i t i v e c o n t r o l w i t h T N F - a w a s i n c u b a t e d f o r 0 . 5 h . 1 4 4 C i 1 h r 5 2 1 1 a c t T r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h c a m p t o t h e c i n r e s u l t e d i n t h e a c t i v a t i o n o f N F - t c B a s i n d i c a t e d b y t h e s t r o n g b a n d o f t h e N F - i c B - D N A c o m p l e x ( l a n e 5 , F i g u r e I I I - l 7 ) . I n h i b i t i o n o f D N A b i n d i n g i n t h e p r e s e n c e o f t h e n o n - s e l e c t i v e N F - t c B i n h i b i t o r P D T C r e s u l t e d i n a d e c r e a s e o f b i n d i n g a s a n t i c i p a t e d ( l a n e 6 , F i g u r e I I I - 1 7 ) . A s i m i l a r d e c r e a s e o f c a m p t o t h e c i n i n d u c e d D N A b i n d i n g u p o n t r e a t m e n t o f i m i d a z o l i n e I I I - 4 ( c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 1 u M t o 0 . 1 n M ) i s c l e a r l y i l l u s t r a t e d i n l a n e s 8 - 1 2 . C o m p a r i s o n o f l a n e 5 ( a c t i v a t e d b y 1 u M C P T ) w i t h l a n e 7 ( a c t i v a t e d b y 1 u M C P T + 1 u M c o m p o u n d 1 1 1 4 ) i n d i c a t e s a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n N F - K B - D N A c o m p l e x f o r m a t i o n . T h i s e f f e c t r e d u c e d a s t h e c o n c e n t r a t i o n o f i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 w a s d e c r e a s e d ; i n d i c a t i n g t h a t t h e i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 i n h i b i t e d t h e C P T m e d i a t e d a c t i v a t i o n o f N F - t c B i n a d o s e d e p e n d e n t m a n n e r . i v ) I n h i b i t i o n o f c a m p t o t h e c i n i n d u c e d n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f N F - K B b y i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 T h e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d E M S A s t u d i e s i n d i c a t e t h a t i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 i n h i b i t s t h e b i n d i n g o f N F - K B t o i t s c o n s e n s u s s e q u e n c e . T h i s m a y b e d u e t o a d i r e c t i n h i b i t i o n o f D N A b i n d i n g o r d u e t o t h e a b s e n c e o f N F - t c B i n t h e n u c l e u s . W e t h e r e f o r e i n v e s t i g a t e d t h e a b i l i t y o f c o m p o u n d 1 1 1 - 4 t o i n h i b i t t h e n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f N F - t c B u s i n g a p 6 5 s a n d w i c h E L I S A a s s a y ( F i g u r e 1 1 1 - 1 8 ) . T h e E L I S A c a p t u r e s t h e p h o s p h o r y l a t e d p 6 5 ( a n a c t i v e f o r m o f N F - t c B f o r D N A b i n d i n g ) w h i c h i s d e t e c t e d s p e c i fi c a l l y u s i n g a s e c o n d a r y a n t i b o d y . T h i s a n t i b o d y c o n j u g a t e i s f u r t h e r t r e a t e d w i t h a l k a l i n e p h o s p h a t a s e a n t i b o d y w h i c h l i b e r a t e s p - n i t r o p h e n o l f r o m c h r o m a g e n , p - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e . H e n c e , t h e a m o u n t o f c o l o r d e v e l o p e d d u e t o p - n i t r o p h e n o l g e n e r a t e d c a n b e c o r r e l a t e d t o t h e a m o u n t o f p 6 5 u n i t p r e s e n t i n t h e s a m p l e . 1 4 5 A c t i v a t i o n o f N F - K B w a s c a r r i e d o u t f o r a p e r i o d o f 0 . 5 h o u r s f o r T N F - a a n d 2 h o u r s f o r c a m p t o t h e c i n a f t e r w h i c h t h e n u c l e a r e x t r a c t s w e r e i s o l a t e d . T N F - a a c t i v a t i o n o f N F - t c B w a s u s e d a s p o s i t i v e c o n t r o l a n d t h e l e v e l t r a n s l o c a t e d p 6 5 w a s n o r m a l i z e d t o 1 0 0 % . T h e n e g a t i v e c o n t r o l i n c l u d e d t h e l e v e l o f n u c l e a r p 6 5 w i t h o u t a c t i v a t i o n ( 0 % t r a n s l o c a t i o n ) " 5 T r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h T N F - a o r C P T ( 1 . 0 u M ) r e s u l t e d i n a s i g n i fi c a n t i n c r e a s e i n n u c l e a r N F - t c B a s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e I I I - 7 ( l S t a n d 3 r d c o l u m n , F i g u r e I I I - 1 8 a ) . P r e t r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h t h e n o n - s e l e c t i v e N F - K B i n h i b i t o r P D T C ( 5 1 4 M ) i n d i c a t e d a s i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n o f n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n a f t e r C P T a c t i v a t i o n ( 4 ‘ h c o l u m n ) . P r e t r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h t h e i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 , 3 0 m i n u t e s p r i o r t o a c t i v a t i o n r e s u l t e d i n a s i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n o f t r a n s l o c a t i o n ( 5 t h c o l u m n ) . V a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g o f t h e i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 ( a s l o w a s 1 n M ) r e s u l t e d i n i n h i b i t i o n o f t r a n s l o c a t i o n . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w i t h H e L a c e l l s a c t i v a t e d w i t h T N F - a ( F i g u r e I I I - 1 8 b ) a s w e l l a s J u r k a t c e l l s a c t i v a t e d w i t h P M A / P H A ( d a t a n o t s h o w n ) . C l e a r l y , fi g u r e ( I I I - 1 8 a a n d I I I - 1 8 b ) i l l u s t r a t e t h a t b o t h T N F - o . a n d C P T w e r e a b l e t o i n d u c e N F - t c B t r a n s l o c a t i o n a c r o s s t h e n u c l e a r m e m b r a n e w h e n c o m p a r e d t o t h e n e g a t i v e c o n t r o l i n b o t h C E M a n d H e L a c e l l s ( c o l u m n 2 , F i g u r e I I I - l 8 a a n d b ) . 1 4 6 c 1 2 0 . 0 fi 1 0 0 ; O 2 U ) 8 0 - 8 b 6 0 1 L 0 < 0 . 9 4 0 ~ c d ) a 2 0 « a : Q 0 _ . . C P T ( 1 p M ) + C P T ( 1 u M ) + W a b h a t ‘ b a c t t v a t t o n C F ‘ T U I I M ) F D T C ( 5 p M ) ” “ 0 1 ” . ” L . S e r i e s t 1 0 0 5 1 . 2 6 9 2 . 3 4 6 5 . 8 7 5 8 . 9 c 1 2 0 — . 9 g 1 0 0 - 2 g 8 0 — ( U = . u , 6 0 ‘ 8 . , _ . 4 0 1 c Q ) 9 2 0 ~ 0 . ) ' 1 o N o T N F - a ( 1 T N F - a ( 1 T N F - a ( 1 T N F - a ( 1 T N F - a l p h a a c t i v a t i o n u M ) + P D T C p M ) + | | l - 4 u M ) + I l l - 4 u M ) + l l l - 4 ( S p M ) ( 0 . 0 1 p M ) ( 0 . 0 0 1 u M ) ( 0 . 0 0 0 1 1 1 M ) l S e r i e s 1 1 0 0 6 1 . 0 4 7 3 2 6 2 . 6 9 6 7 . 4 3 7 0 . 1 1 F i g u r e I I I - 1 8 a . T O P : L e v e l o f n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n m e a s u r e d b y p 6 5 E L I S A a s s a y o f c o m p o u n d I I I - 4 i n C E M c e l l s w i t h a c t i v a t i o n b y c a m p t o t h e c i n . A l l v a l u e s h a v e b e e n n o r m a l i z e d t o t h e p o s i t i v e c o n t r o l t o s h o w p e r c e n t a g e t r a n s l o c a t i o n . D a t a r e p o r t e d a s a n a v e r a g e o f t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . I I I - 1 8 b . B O T T O M : L e v e l o f n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n m e a s u r e d b y p 6 5 E L I S A a s s a y o f c o m p o u n d I I I - 4 i n H e L a c e l l s w i t h a c t i v a t i o n b y T N F - a . A l l v a l u e s h a v e b e e n n o r m a l i z e d t o t h e p o s i t i v e c o n t r o l t o s h o w p e r c e n t a g e t r a n s l o c a t i o n . D a t a r e p o r t e d a s a n a v e r a g e o f t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . 1 4 7 H o w e v e r , t h e k i n e t i c s o f T N F - a a n d C P T a r e d i f f e r e n t i n T - c e l l s a n d a r e a f u n c t i o n o f b o t h t i m e a n d c o n c e n t r a t i o n . P D T C ( a n o n - s p e c i fi c k i n a s e i n h i b i t o r ) 7 5 ‘ i n h i b i t e d t h e n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f N F - t c B c a u s e d b y C P T ( 1 n M ) a n d T N F - a i n C E M a n d H e L a c e l l s r e s p e c t i v e l y . C o m p a r i s o n o f a c t i v a t i o n o f C E M c e l l s w i t h C P T ( 1 u M ) u p o n p r e t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e ( c o l u m n 5 , F i g u r e I I I - 1 8 a ) t o C P T ( 1 n M ) ( c o l u m n 3 , F i g u r e I I I - 1 8 a ) i n d i c a t e s i n d i c a t e t h a t t h e i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n h i b i t s t h e n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f N F - t c B a t t h e l o w n a n o m o l a r l e v e l . v ) I n h i b i t i o n o f k i n a s e a c t i v i t y P r o t e i n k i n a s e s p l a y a n e s s e n t i a l r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f a v a r i e t y o f c e l l u l a r p r o c e s s e s s u c h a s t r a n s c r i p t i o n i n v o l v i n g c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n , g r o w t h a n d m e t a b o l i s m , a n d a p o p t o s i s . ” b A b b e r a n t r o l e s i n t h e a c t i v i t y o f k i n a s e s c a n l e a d t o d i s e a s e s s u c h a s c a n c e r , a l z h e i m e r ’ s d i s e a s e a n d d i a b e t e s ? “ K i n a s e s a r e a c t i v e p a r t i c i p a n t s i n a c t i v a t i o n o f N F - t c B ( F i g u r e I I I - 7 ) . I - K B p h o s p h o r y l a t i o n r e q u i r e s t h e a c t i v a t i o n o f e n d o g e n o u s k i n a s e s I K K o . a n d I K K B . m ' 9 2 ’ 9 3 I n h i b i t i o n o f I - K B p h o s p h o r y l a t i o n w i l l r e s u l t i n t h e s e q u e s t e r i n g o f N F — K B i n t h e c y t o p l a s m . W e t h e r e f o r e e v a l u a t e d t h e i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 f o r i t s e f f e c t o n t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e i n h i b i t o r y p r o t e i n I - K B b y i t s e n d o g e n o u s k i n a s e s I K K a a n d I K K B . N o i n h i b i t i o n o f k i n a s e a c t i v i t y w a s o b s e r v e d ( t e s t e d a t 1 0 M ) . A l t e r n a t i v e l y , i n h i b i t i o n o f N F - K B t r a n s l o c a t i o n m a y b e t h e r e s u l t o f t h e u p s t r e a m i n h i b i t i o n o f k i n a s e a c t i v i t y i n a v a r i e t y o f k i n a s e p a t h w a y s . W e t h e r e f o r e e v a l u a t e d t h e i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 f o r i t s i n h i b i t i o n o f t h e s e v e r a l k i n a s e s e i t h e r r e l a t e d t o t h e N F - t c B p a t h w a y o r o t h e r a p o p t o t i c s i g n a l i n g p a t h w a y s . C o m p o u n d 1 1 1 - 4 w a s s e n t t o U p s t a t e N Y f o r t h e k i n a s e s a s s a y . T h e k i n a s e s t e s t e d i n c l u d e d : A M P K , A x l , B l k , C D K 2 / c y c l i n E , C D K S / p 3 5 , c - R A F , F e s , F 1 1 3 , F y n , I G F - l R , I R , J N K l a l , J N K 2 0 1 2 , J N K 3 , L e k , L y n ( h u m a n ) , M A P K l , 1 4 8 M A P K Z ( h u m a n ) , M E K l , M K K 4 , M K K 6 , M K K 7 b , M S K l , p 7 0 S 6 K , P D K l , P A K 2 , P K A ( h u m a n ) , P K B B , P K C O t , P K C t t t , P K C S , P K C S , P K C m u , S G K , S y k , T r k B , Y e s ( h ) , Z A P - 7 0 . T a b l e 1 1 1 - 3 s h o w s t h e k i n a s e i n h i b i t i o n f o r t h e a b o v e m e n t i o n e d k i n a s e s a t 1 u M I I I - 4 . K i n a s e % i n h i b i t i o n S D K i n a s e % i n h i b i t i o n S D C o n t r o l 1 0 0 - - M A P K 2 ( h u m a n ) 1 0 1 a : 4 A M P K 9 3 a : 2 M E K l 9 9 : 1 : 3 A x l ( h ) 9 6 a : 3 M K K 4 9 6 : 1 : 9 B l k ( m ) 1 1 8 : 1 : l 4 M K K 6 9 6 : 1 : 5 C D K 2 / c y c l i n E ( h ) 9 8 i t : 1 M K K 7 b 7 1 : 1 : 6 C D K S / p 5 3 ( h ) 9 5 : 1 : 4 M S K l 1 0 3 : 1 : l c - R A F 1 0 0 : 1 : 1 p 7 0 S 6 K 9 6 : 1 : 4 F e s 9 6 ¢ 1 5 P D K l 9 9 : 1 : 6 F l t 3 1 1 0 a : 2 P A K 2 1 0 1 a : 1 2 F y n 1 0 0 : 1 : 2 P K A 8 3 : 1 : 9 I G F - l R 1 1 0 : 1 : 1 1 P K B B 1 0 0 : 1 : 0 I K K ( 0 t ) 1 0 1 : 1 : l P K C a 1 0 8 : 1 : l I K K ( B ) 8 5 a : 6 P K C w 7 1 : 1 : 7 I R 1 0 2 a : 7 P K C 8 1 0 0 a : 2 J N K l a l 9 5 : t 1 P K C e 9 9 a t 1 J N K 2 0 t 2 9 9 : 1 : 0 P K C u 9 9 : 1 : 2 J N K 3 1 1 2 : 1 : 1 0 S G K 9 8 : 1 : 6 L c k 8 0 i t : 1 S y K 8 5 a : l L y n ( h u m a n ) 7 2 : 1 : 7 T r k B 1 0 3 $ 1 2 M A P K ] 9 5 i t : 6 Y e s ( h ) 1 0 5 : 1 : 7 Z A P - 7 0 1 1 1 a : 4 T a b l e 1 1 1 - 3 . K i n a s e i n h i b i t i o n d a t a f o r 1 1 1 - 4 a g a i n s t k i n a s e s f r o m N F - t c B s i g n a l i n g a n d a p o p t o s i s m o d u l a t i o n . N o i n h i b i t i o n o f a n y o f t h e s e k i n a s e s w a s d e t e c t e d ( t e s t e d u p t o 1 u M c o n c e n t r a t i o n s o f t h e i m i d a z o l i n e ) . B a s e d o n t h e s e i n v i t r o s t u d i e s i t i s u n l i k e l y t h a t i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n h i b i t s n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n v i a t h e i n h i b i t i o n o f k i n a s e a c t i v i t y . 1 4 9 v i . E f f e c t o f i m i d a z o l i n e I I I - 4 o n 1 4 : 8 1 : p h o s p h o r y l a t i o n W e h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n h i b i t s t h e t r a n s l o c a t i o n o f N F - t c B a c r o s s t h e n u c l e a r m e m b r a n e i n r e s p o n s e t o s t i m u l a t i o n b y c a m p t o t h e c i n . T h e i n v i t r o s t u d i e s f o r k i n a s e i n h i b i t i o n d i d n o t s h o w a n y a c t i v i t y o f k i n a s e s T h e t r a n s l o c a t i o n o f N F - K B r e q u i r e s t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f i t s i n h i b i t o r y p r o t e i n , I - K B , f o l l o w e d b y t h e s u b s e q u e n t d e g r a d a t i o n b y t h e 2 6 S p r o t e o s o m e r e s u l t i n g i n t h e l i b e r a t i o n o f N F - t c B . 9 4 T h u s , t h e e f f e c t o f t h e i m i d a z o l i n e o n I - c h p h o s p h o r y l a t i o n a n d d e g r a d a t i o n w a s i n v e s t i g a t e d u s i n g a p S 3 2 E L I S A o n c y t o p l a s m i c e x t r a c t s . T h e e x p e r i m e n t w a s d e s i g n e d i n a m a n n e r t h a t b o t h t h e p h o s p h o r y l a t i o n e v e n t o f I K B - a a s w e l l a s i t s d e g r a d a t i o n c o u l d b e t a r g e t e d a t t h e s a m e t i m e . T h i s w a s a c h i e v e d b y u t i l i z i n g t w o d i f f e r e n t c o n t r o l s , A L L N ( N - a c e t y l - L e u - L e u - n o r l e u c i n a l ) a p r o t e a s o m a l i n h i b i t o r w c ' 9 5 ' 9 ° a n d p a r t h e n o l i d e , a s p e c i fi c i n h i b i t o r f o r I K K - k i n a s e . 8 0 A t i m e c o u r s e e x p e r i m e n t u s i n g 2 u M C P T w a s p e r f o r m e d t o o p t i m i z e t h e l e v e l s o f I - t c B - a d e g r a d a t i o n a s a f u n c t i o n o f t i m e . T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t 2 h o u r s w a s t h e m o s t o p t i m u m t i m e p e r i o d f o r I - t c B p h o s p h o r y l a t i o n ( F i g u r e I I I - 1 5 b ) a t 2 u M C P T . F u r t h e r , c e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h v a r y i n g a m o u n t s o f A L L N ( 1 0 0 n M , 5 0 n M , 1 0 1 1 M , 1 p M , 0 . 1 p M , 0 . 0 1 n M ) o r p a r t h e n o l i d e ( 1 0 0 n M , 5 0 1 1 M , 2 0 n M , 5 u M , l u M , 0 . 1 u M , 0 . 0 1 n M ) a n d t r e a t e d w i t h C P T ( 2 n M ) f o r 6 0 ’ t o g e t I K B - p h o s p h o r y l a t i o n p r o fi l e s o f t h e t w o c o n t r o l s . A s a n t i c i p a t e d , t h e p r o t e a s o m e i n h i b i t o r , A L L N s h o w e d a c c u m u l a t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d I - K B ( 1 C 5 0 = 0 . 2 n M ) w h e r e a s t h e I K K k i n a s e i n h i b i t o r i n d i c a t e d a d e c r e a s e i n p h o s p h o r y l a t i o n ( 1 C 5 0 = 1 3 . 5 u M ) ( F i g u r e I I I - 1 9 a a n d b ) . P a r a l l e l t o t h e I - K B - ( l p h o s p h o r y l a t i o n a s s a y s , w e d e t e r m i n e d t h e c y t o t o x i c i t y o f b o t h A L L N a n d p a r t h e n o l i d e i n C E M c e l l s t o a s c e r t a i n t h e l o w e r i n g i n v a l u e i s n o t s e e n d u e t o c y t o t o x i c e f f e c t s o f t h e d r u g s e s p e c i a l l y p a r t h e n o l i d e ( s e e a p p e n d i x 4 ) . 1 5 0 1 2 0 - i - B u i - B u ‘ 3 ’ n - B u i ’ l L N J fi r " r s ” N H A c H C H O F i g u r e I I I - 1 9 a . P h o s p h o r y l a t e d I - t c B ( a t s e r i n e 3 2 a n d s e r i n e 3 6 ) i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f A L L N u p o n a c t i v a t i o n b y C P T . A l l v a l u e s w e r e n o r m a l i z e d t o m a x i m u m a c c u m u l a t i o n s e e n i n A L L N c o n t r o l . A l l e x p e r i m e n t s w e r e r u n i n d u p l i c a t e a n d d a t a r e p o r t e d a s t h e a v e r a g e o f t h e t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . A c t i v a t i o n o f N F - K B w a s i n i t i a t e d u s i n g c a m p t o t h e c i n ( 2 p M ) a n d T N F - a ( 1 p g ) . 1 5 1 I I I - 1 9 b . P h o s p h o r y l a t e d I - t c B ( a t s e r i n e 3 2 a n d s e r i n e 3 6 ) i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f P a r t h e n o l i d e u p o n a c t i v a t i o n b y C P I ‘ . A l l v a l u e s w e r e n o r m a l i z e d t o m a x i m u m a c c u m u l a t i o n s e e n i n A L L N c o n t r o l . A l l e x p e r i m e n t s w e r e r u n i n d u p l i c a t e a n d d a t a r e p o r t e d a s t h e a v e r a g e o f t h e t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . A c t i v a t i o n o f N F - i c B w a s i n i t i a t e d u s i n g c a m p t o t h e c i n ( 2 n M ) a n d T N F - a ( 1 p g ) . F i n a l l y , w e i n v e s t i g a t e d t h e e f f e c t o f i m i d a z o l i n e I I I - 4 o n I - K B O . p h o s p h o r y l a t i o n . C y t o p l a s m i c e x t r a c t s f r o m C P T t r e a t e d c e l l s w i t h o r w i t h o u t a p r e - t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e w e r e a n a l y z e d f o r p h o s p h o r y l a t i o n a t s e r - 3 2 a n d 3 6 ( F i g u r e I I I - 2 0 ) . A L L N , a 5 ’ 9 ° a n d p a r t h e n o l i d e , a n I K K i n h i b i t o r 8 0 w e r e u s e d a s c o n t r o l s t o p r o t e a s o m e i n h i b i t o r 9 m a r k t h e t w o s t e p s i n v o l v e d i n I - K B d e g r a d a t i o n l e a d i n g t o N F - t c B t r a n s l o c a t i o n a n d g e n e t r a n s c r i p t i o n . P a r a l l e l t o t h e p S 3 2 E L I S A , t h e t o t a l I - t c B l e v e l s i n w e r e m e a s u r e d t o a c c u r a t e l y d e t e r m i n e t h e p e r c e n t p h o s p h o r y l a t i o n . U p o n p r e t r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h i m i d a z o l i n e I I I - 4 , a c c u m u l a t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d I - K B a w a s o b s e r v e d ( F i g u r e 1 1 1 - 2 0 ) . 1 5 2 T h e v a l u e s w e r e n o r m a l i z e d t o t h e t o t a l a m o u n t o f I - t c B r e s u l t i n g i n a n I C s o v a l u e I - K B p h o s p h o r y l a t i o n o f 0 . 1 9 M M . 1 2 0 - 8 1 0 0 - E E s o — . 9 s 6 . - Q . ' 5 . E 4 0 D 0 $ 2 0 - O . 2 E 0 — 2 , _ ~ I \ a K " x « k A 4 K 2 0 ° ‘ 6 ° ( 5 ? c 3 c 3 c 3 ( 3 0 Q C 3 ( 3 Q « \ fl 1 fl 9 " " c 3 . t ” x ” x ” x ” x ” \ " x ' 4 5 ‘ “ o “ \ y “ 9 ‘ “ 9 “ “ x “ y “ ’ 3 ‘ “ Y " < 9 0 Q 5 6 ’ o 0 6 ‘ 6 9 s \ “ s F i g u r e I I I - 2 0 . R e l a t i v e a m o u n t o f p h o s p h o r y l a t e d I - i c B ( a t s e r i n e 3 2 a n d s e r i n e 3 6 ) i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f i m i d a z o l i n e I I I - 4 u p o n a c t i v a t i o n b y C P T . A l l v a l u e s w e r e n o r m a l i z e d t o m a x i m u m a c c u m u l a t i o n s e e n i n A L L N c o n t r o l . A l l e x p e r i m e n t s w e r e r u n i n d u p l i c a t e a n d d a t a r e p o r t e d a s t h e a v e r a g e o f t h e t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . A c t i v a t i o n o f N F — K B w a s i n i t i a t e d u s i n g c a m p t o t h e c i n ( 2 1 1 M ) . A L L N ( 5 0 1 1 M ) a n d P a r t h e n o l i d e ( 5 0 p . M ) w e r e u s e d a s c o n t r o l s f o r p r o t e a s o m a l a n d I K K i n h i b i t i o n , r e s p e c t i v e l y . T h e c o n t r o l f o r p a r t h e n o l i d e s h o w s a n e g a t i v e b a r d u e t o i t s c e l l c y t o t o x i c i t y o v e r t h e c o u r s e o f t h e e x p e r i m e n t . S i m i l a r e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d u s i n g T N F - a t o a c t i v a t e t h e l e u k e m i a c e l l s . B o t h T N F - c t a n d c a m p t o t h e c i n a r e k n o w n t o a c t i v a t e N F - K B b y I - K B d e g r a d a t i o n f o l l o w i n g p h o s p h o r y l a t i o n a t s e r 3 2 a n d s e r 3 6 i n C E M c e l l s t h o u g h w i t h v a r y i n g k i n e t i c s . 7 3 C o n s i s t e n t w i t h t h e s e s t u d i e s w e f o u n d t h a t t h e i m i d a z o l i n e s i n h i b i t e d t h e N F — t c B s i g n a l i n g p a t h w a y i n T N F - a a c t i v a t e d c e l l s m o r e e f f e c t i v e l y t h a n w i t h c a m p t o t h e c i n i l l u s t r a t e d b y a n I C s o v a l u e o f 2 . 1 n M ( s e e a p p e n d i x 5 ) . T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e t h a t 1 5 3 s U L i F % i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n h i b i t s n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f N F - c h v i a t h e i n h i b i t i o n o f I - t c B d e g r a d a t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d I t c B a . v i i . I n h i b i t i o n o f C P T i n d u c e d N F - K B t r a n s c r i p t i o n b y i m i d a z o l i n e I I I - 4 T o d e m o n s t r a t e t h e a b i l i t y o f i m i d a z o l i n e I I I - 4 t o a f f e c t N F - K B m e d i a t e d g e n e t r a n s c r i p t i o n w e e v a l u a t e d t h e i n h i b i t i o n o f N F - K B m e d i a t e d l u c i f e r a s e p r o d u c t i o n u s i n g a l u c i f e r a s e r e p o r t e r a s s a y . H e L a c e l l s w e r e t r a n s f e c t e d w i t h 6 X K B d r i v e n r e p o r t e r g e n e p N F - K B - L u c a n d w e r e a c t i v a t e d w i t h T N F - a o r c a m p t o t h e c i n ( 3 n M ) i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f i m i d a z o l i n e I I I - 4 , p a r t h e n o l i d e , A L L N o r D M S O c o n t r o l a n d l u c i f e r a s e p r o d u c t i o n w a s a s s a y e d u s i n g D u a l - G l o r e p o r t e r a s s a y ( P r o m e g a C o r p o r a t i o n ) . A c o n s t i t u t i v e l y a c t i v a t e d p l a s m i d p F C - M E K K ( S t r a t a g e n e ) w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l f o r t r a n s f e c t i o n . p C I S — C K ( S t r a t a g e n e ) w a s u s e d a s t h e n e g a t i v e c o n t r o l f o r t h e K B - d r i v e n r e p o r t e r g e n e . p R L - T K w a s u s e d a s a c o - r e p o r t e r ( P r o m e g a C o r p o r a t i o n ) . 1 2 0 : t o o l s o l 6 0 : 4 o ~ 2 0 — 0 + F i g u r e I I I - 2 1 . M e a s u r i n g t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f N F - c h v i a L u c i f e r a s e r e p o r t e r a s s a y i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 . 1 5 4 s t i n u t h g i l e v i t a l e R T h e i m i d a z o l i n e i n h i b i t e d t h e N F - K B i n d u c e d t r a n s c r i p t i o n b y 5 2 % a n d a n I C s o v a l u e o f 0 . 9 5 u M w h e n c e l l s w e r e a c t i v a t e d b y T N F - a . W h e n t h e s a m e a s s a y w a s e m p l o y e d t o m e a s u r e t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f N F - i c B w i t h r e s p e c t t o a c t i v a t i o n w i t h C P T , a s i m i l a r e f f e c t i n d e c r e a s e i n l u c i f e r a s e a c t i v i t y w a s s e e n ( F i g u r e H I - 2 2 ) . 1 2 0 1 1 1 0 - § 9 0 - 8 0 - 7 0 - 6 0 - 5 0 t . t u - 1 3 4 ' 2 4 ' 1 - 1 ' 0 - ' 9 i t - 7 - 6 - 5 I o g [ l m l d a z o l i n e ( M ) ] F i g u r e I I I - 2 2 . I r n i d a z o l i n e I I I - 4 i n h i b i t s N F - t c B i n d u c e d t r a n s c r i p t i o n i n a c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t m a n n e r . R e l a t i v e l i g h t u n i t s h a v e b e e n n o r m a l i z e d t o c o - r e p o r t e r . V a l u e s h a v e b e e n n o r m a l i z e d t o t h e p o s i t i v e c o n t r o l ( c o n s t i t u t i v e l y a c t i v a t e d p l a s m i d p F C - M E K K ) . A l l v a l u e s a r e a v e r a g e s o f t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . T h e i m i d a z o l i n e i n h i b i t e d t h e C P T i n d u c e d N F - K B t r a n s c r i p t i o n b y u p t o 3 5 % p r o v i d i n g a n I C s o v a l u e o f 9 . 8 u M ( F i g u r e I I I - 2 2 ) . v i i i . L u c i f e r a s e e n z y m e a s s a y : I m i d a z o l i n e d o e s n o t a f f e c t t h e l u c i f e r a s e e n z y m e d i r e c t l y T o c o n fi r m t h e i n h i b i t i o n o f N F - t c B m e d i a t e d l u c i f e r a s e p r o d u c t i o n b y i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 a n d t h e l u c i f e r a s e e n z y m e i t s e l f , w e i n c u b a t e d p u r i fi e d l u c i f e r a s e e n z y m e w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n o f i m i d a z o l i n e a n d t h e v e h i c l e ( D M S O ) a t 0 ° C f o r 1 h . T h e s e w e r e t h e n 1 5 5 e U L R a n a l y z e d f o r l u c i f e r a s e a c t i v i t y . I m i d a z o l i n e s d i d n o t a p p e a r t o a f f e c t t h e a c t i v i t y o f t h e e n z y m e ( F i g u r e I I I - 2 3 ) . 3 0 0 0 0 0 0 0 - 2 5 0 0 0 0 0 0 . 2 0 0 0 0 0 0 0 ~ 1 5 0 0 0 0 0 0 : 1 0 0 0 0 0 0 0 ; 5 0 0 0 0 0 0 - 0 4 $ 9 6 1 ‘ . 1 . 1 i » > 1 > \ r - 4 } c 9 0 # S ‘ g p 0 « S ‘ Q Q ( 0 ‘ 9 6 F i g u r e I I I - 2 3 . I r n i d a z o l i n e I I I - 4 d o e s n o t d i r e c t l y b i n d t o t h e l u c i f e r a s e e n z y m e . F r o m t h e a b o v e a s s a y s w e f o u n d t h a t t h e i m i d a z o l i n e s c a f f o l d a s a p o t e n t i n h i b i t o r o f t h e N F - i c B s i g n a l i n g p a t h w a y v i a t h e i n h i b i t i o n o f t h e d e g r a d a t i o n o f i t s i n h i b i t o r y p r o t e i n I K B . “ I n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e s c o p e o f t h i s a d j u v a n t t h e r a p y , w e f u r t h e r i n v e s t i g a t e d t h e e f f e c t o f i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n a v a r i e t y o f c e l l l i n e s a n d i t s e f f e c t o n s e v e r a l c l i n i c a l l y u s e d c h e m o t h e r a p e u t i c d r u g s . W e w e r e a b l e t o s h o w t h e a b i l i t y o f i m i d a z o l i n e I I I - 4 t o s e l e c t i v e l y s e n s i t i z e c a n c e r c e l l s t o w a r d s C P I ‘ a n d C D D P i n C E M ( a c u t e l e u k e m i a ) , H T 1 0 8 0 ( fi b r o s a r c o m a ) , a n d H e L a ( c e r v i c a l c a r c i n o m a ) c e l l s b u t n o t i n t h e n o n - c a n c e r o u s S L 8 9 ( fi b r o b l a s t ) c e l l l i n e . F i g u r e I I I - 2 4 ( b o t t o m ) i l l u s t r a t e s t h e e f f e c t o f t h e i m i d a z o l i n e I I I - 4 o n C E M c e l l s w h e n i n c u b a t e d w i t h C P T o v e r a 4 8 h o u r t i m e p e r i o d . E n h a n c e m e n t o f C P T - i n d u c e d a p o p t o s i s i n C E M c e l l s w a s i n v e s t i g a t e d a t c o n c e n t r a t i o n s 5 1 0 n M C P T , a t w h i c h i t c a u s e s D N A a b e r r a t i o n s 1 5 6 b u t n o s i g n i fi c a n t a p o p t o s i s i n l e u k e m i a c e l l s 2 4 W e h a d s h o w n p r e v i o u s l y t h a t t r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h t h e i m i d a z o l i n e s h a d n o e f f e c t o n t h e l e v e l o f a p o p t o s i s ( F i g u r e I I I - 1 0 , I I I - l l , I I I - 2 4 ) i n d i c a t i n g t h a t i m i d a z o l i n e s d o n o t e x h i b i t s i g n i fi c a n t c e l l c y t o t o x i c i t y . T r e a t m e n t w i t h 1 0 n M C P T r e s u l t e d i n s o m e c e l l d e a t h s t a r t i n g a f t e r 1 2 h o u r s . C o m b i n a t i o n t r e a t m e n t o f t h e n o n - c y t o t o x i c i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 ( 1 0 n M ) w i t h C P I ‘ ( 1 0 n M ) r e s u l t e d i n c o m p l e t e a p o p t o t i c c e l l d e a t h a f t e r 4 8 h o u r s ( F i g u r e I I I - 2 4 , b o t t o m ) . i x . P o s t t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e I I I - 4 d o e s n o t p o t e n t i a t e t h e C P T i n d u c e d a p o p t o s i s . P r e v i o u s l y , w e h a d s h o w n t h a t p r e - t r e a t m e n t o f C E M c e l l s w i t h i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n h i b i t e d t h e D N A b i n d i n g a c t i v i t y o f N F - t c B ( F i g u r e I I I - l 7 ) , d e g r a d a t i o n o f 1 4 : 8 0 ( F i g u r e 1 1 1 - 2 0 ) a n d t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f N F - t c B ( F i g u r e I I I - 2 2 ) i n d u c e d b y C P T . ” T o f u r t h e r e v a l u a t e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e N F - t c B s i g n a l i n g e v e n t s a n d a p o p t o s i s i n d u c t i o n b y C P T , w e d e t e r m i n e d t h e e f f e c t o f p r e - a n d p o s t - t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e o n C P T i n d u c e d a p o p t o s i s i n C E M c e l l s . F i g u r e I I I - 2 4 d e m o n s t r a t e s t h a t p r e t r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 s i g n i fi c a n t l y e n h a n c e s a p o p t o s i s , w h e r e a s a d d i t i o n o f t h e i m i d a z o l i n e 1 h a f t e r C P T t r e a t m e n t d o e s n o t e f f e c t t h e i n d u c t i o n o f a p o p t o s i s ( f o r b o t h w a s h e d a n d c o n t i n u o u s e x p o s u r e , a l s o s e e a p p e n d i x 6 ) . T h i s d i f f e r e n t i a l e f f e c t o f p r e - o r p o s t - t r e a t m e n t w i t h 1 1 1 - 4 i n d i c a t e s t h a t t h e p r e - s u r v i v a l a c t i v a t i o n o f N F - t c B b y C P T p r e c e d e s t h e a p o p t o t i c s i g n a l i n g i n C E M c e l l s . T h e i n h i b i t i o n d u e t o i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n t h e D N A b i n d i n g a c t i v i t y o f N F - t c B ( F i g u r e I I I - 1 7 ) , d e g r a d a t i o n o f I - t c B u ( F i g u r e I I I - 2 0 ) a n d t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f N F - K B ( F i g u r e I I I - 2 2 ) i n d u c e d b y C P T a n d e n h a n c e m e n t o f a p o p t o s i s u p o n p r e - t r e a t m e n t o f 1 5 7 C E M c e l l s w i t h I I I - 4 s u g g e s t s t h a t a c t i v a t i o n o f N F - K B i s r e q u i r e d f o r a p o p t o s i s i n C E M c e l l s . T h i s e f f e c t c o r r e l a t e s t o t h e f a c t t h a t C P T i n d u c e d N F - K B a c t i v a t i o n i n C E M c e l l s i s s e e n u p t o 6 h ( m o s t o p t i m u m a t 2 h , F i g u r e I I I - 1 5 a ) w h i l e t h e a p o p t o t i c r e s p o n s e i n C E M c e l l s d o e s n o t t r i g g e r o f f u n t i l a f t e r 6 h . T h e c o m b i n a t i o n p r e - t r e a t m e n t h o w e v e r , s h o w e d e n h a n c e m e n t o f a p o p t o t i c s i g n a l s t a r t i n g 6 h . C o m b i n e d t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e a p o p t o s i s i n d u c t i o n i n C E M l e u k e m i a c e l l s b y C P T i s d e p e n d e n t o n p r i o r a c t i v a t i o n o f N F - K B s i g n a l i n g c a s c a d e . 1 5 8 - 0 — N o d r u g P o s t T r e a t m e n t — I — l m i d a z o l i n e I l l - 4 h ( 1 0 0 n M ) ' — * — C P T ( 1 O n M , 2 ) — 0 — — C P T ( 1 0 n M ) 2 h - - > l m ‘ d a z o l i n e I l l - 4 ( 1 0 0 n M ) 7 0 0 0 0 0 : % 6 0 0 0 0 0 — N O . c é 5 0 0 0 0 0 - l E 4 0 0 0 0 0 — ‘ 5 3 0 0 0 0 0 « g 2 0 0 0 0 0 - 2 1 0 0 0 0 0 1 0 I I F l 0 2 0 T i m e ( h ) 4 0 6 0 — e — N o d r u g + C o n p o u n d “ M ( 1 0 " M P r e t r e a t m e n t + C P T ( 1 0 n M ) 4 0 0 0 0 0 0 - + c p r ( 1 0 n M ) + C o m p o u n d I I - 4 ( 1 0 n M ) 3 5 0 0 0 0 0 : 1 2 g 3 0 0 0 0 0 0 - : 3 2 5 0 0 0 0 0 8 3 2 0 0 0 0 0 0 . ' 5 - 1 5 0 0 0 0 0 . 8 § 1 0 0 0 0 0 0 . Z s o o o o o i 0 " 0 T m : - S R ) 4 0 5 0 6 0 F i g u r e I I I - 2 4 3 ( t o p ) . C a s p a s e 3 / 7 a c t i v i t y i n C E M c e l l s p o s t - t r e a t e d w i t h n o d r u g c o n t r o l , i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 ( 1 0 n M ) , C P T ( 1 0 n M ) , a n d t h e c o m b i n a t i o n o f i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 ( 1 0 n M ) a n d C P T ( 1 0 n M ) o v e r 4 8 h o u r s ; I I I - 2 4 b ( b o t t o m ) . C a s p a s e 3 / 7 a c t i v i t y i n C E M c e l l s p r e - t r e a t e d w i t h n o d r u g c o n t r o l , i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 ( 1 0 n M ) , C P T ( 1 0 n M ) , a n d t h e c o m b i n a t i o n o f i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 ( 1 0 n M ) a n d C P T ( 1 0 n M ) o v e r 4 8 h o u r s . 1 5 9 x . P o t e n t i a t i o n b y I m i d a z o l i n e s c a f f o l d r e q u i r e s D N A d a m a g e W e i n v e s t i g a t e d i f i m i d a z o l i n e I I I - 4 c o u l d p o t e n t i a t e d r u g - m e d i a t e d c e l l d e a t h b y v a r i o u s a n t i - c a n c e r a g e n t s i n c l u d i n g t a x o l ( a n t i - t u b u l i n a g e n t , w h i c h i n h i b i t s t h e d e p o l y m e r i z a t i o n o f m i c r o t u b u l e s i n t o t u b u l i n r e s u l t i n g i n b l o c k a g e o f t h e c e l l ' s a b i l i t y t o b r e a k d o w n t h e m i t o t i c s p i n d l e d u r i n g m i t o s i s ) , v i n c r i s t i n e ( a n t i - t u b u l i n a g e n t , w h i c h p r e v e n t s t h e c e l l f r o m m a k i n g t h e s p i n d l e s i t n e e d s t o b e a b l e t o m o v e i t s c h r o m o s o m e s a r o u n d a s i t d i v i d e s ) , c a m p t o t h e c i n ( t o p o i s o m e r a s e - l i n h i b i t o r , w h i c h p r e v e n t s t h e u n c o i l i n g o f s u p e r - c o i l e d D N A d u r i n g D N A r e p l i c a t i o n , t r a n s c r i p t i o n e t c . ) a n d c i s p l a t i n ( D N A c r o s s - l i n k i n g a g e n t , w h i c h i n h i b i t s D N A r e p l i c a t i o n ) ! " ' 5 I n C E M c e l l s , a g e n t s t h a t i n d u c e d D N A - d a m a g e , ( c i s - p l a t i n a n d c a m p t o t h e c i n ) c o n s i s t e n t l y s h o w e d a s t r o n g e n h a n c e m e n t o f a p o p t o s i s , o n p r e - t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e ( F i g u r e I I I - 2 4 b o t t o m ) . H o w e v e r , I I I - 4 f a i l e d t o s i g n i fi c a n t l y e n h a n c e t u b u l i n i n h i b i t o r s s u c h a s t a x o l a n d v i n c r i s t i n e i n C E M c e l l s ( F i g u r e I I I - 2 5 ) . A s i n d i c a t e d p r e v i o u s l y , i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 d o e s n o t i n i t i a t e a n a p o p t o t i c r e s p o n s e 8 a s i n g l e a g e n t ( c o l u m n 2 , F i g u r e I I I - 2 5 ) . C o l u m n s 3 - 8 ( F i g u r e I I I - 2 5 t o p ) i n d i c a t e t h a t v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f t a x o l ( 1 1 1 M , 0 . 1 u M , 0 . 0 1 1 1 M , 1 n M , 0 . 1 n M , 0 . 0 1 n M ) i n c r e a s e t h e a p o p t o t i c c e l l s i n c u l t u r e . P i e - t r e a t m e n t w i t h 1 1 1 - 4 ( 1 0 n M ) f o l l o w e d b y i n c u b a t i o n w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n o f t a x o l ( 1 n M , 0 . 1 n M , 0 . 0 1 n M ) d i d n o t s h o w a n a p p r e c i a b l e i n c r e a s e i n a p o p t o s i s . T h i s r e s u l t w a s n o t l i m i t e d t o t h e a n t i - t u b u l i n a g e n t t a x o l , b u t w a s f u r t h e r s e e n i n t h e v i n c a a l k a l o i d s - v i n c r i s t i n e ( F i g u r e I I I - 2 5 , b o t t o m ) a n d v i n b l a s t i n e . O n l y s u b - n a n o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f t a x o l a n d v i n c a a l k a l o i d s w e r e s t u d i e d s i n c e e a r l i e r o p t i m i z a t i o n w i t h c e l l v i a b i l i t y a s s a y s s h o w e d s e v e r e c e l l t o x i c i t y a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h e d r u g . 1 6 0 1 0 0 0 0 0 0 0 — % 8 0 0 0 0 0 0 — 0 O “ 3 ‘ 5 . 6 0 0 0 0 0 0 — O Q . G ‘ 6 ' 4 0 0 0 0 0 0 — 3 3 . D g 2 0 0 0 0 0 0 2 _ 0 — 4 \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0 6 s . s ‘ “ e s . 1 ” o f Q . s Q ‘ s g s . 0 N o s V ‘ \ o ‘ \ 0 ‘ o - o ‘ \ 9 ' o - \ t . ‘ s " < 1 " , + ° ‘ o ‘ 4 1 * , e ‘ + o ‘ x s ’ 8 ’ s ' Q ‘ o " o ‘ \ 9 ' o - + o ‘ 0 * « ‘ 0 + + « 9 4 ° 5 0 0 0 0 0 0 1 2 4 0 0 0 0 0 0 - a O . 9 g e o m - ‘ 5 2 0 0 0 0 0 0 ~ : 5 . 2 1 0 0 0 0 0 0 - 0 . 4 ‘ \ “ \ ® ¢ \ ® ‘ ® ‘ R \ ® ® \ 9 o \ \ o 9 ' Q - o \ P ' 9 0 D - ) 1 9 ' o - ) - \ $ 9 g o . 0 0 o \ - § ° ‘ \ \ \ \ > \ \ \ \ \ \ \ \ \ ) . > \ \ \ \ ( $ 3 . 6 9 0 g ? . § ° ‘ 5 ? \ \ x \ 9 ‘ 8 s h x « 3 " x \ x \ \ \ $ 9 “ 4 4 ‘ 4 - ¢ . 6 “ 4 o , \ I ‘ \ 8 ‘ ‘ 9 ‘ 3 ) 4 4 ‘ 0 0 $ < 0 \ e x “ o - 1 o 9 . 0 e } x ‘ 0 ° \ Q } Q 9 0 ‘ ) \ . ‘ é ‘ o \ \ . 3 0 , . a s s o “ a s " a s s s ° o " < 5 “ : $ 5 8 0 5 ‘ 4 5 ( 5 ‘ 9 4 ' “ e d ) . 9 i t “ . 1 “ $ 0 “ 9 6 ¢ " 5 ‘ 4 4 4 ‘ A F i g u r e I I I - 2 5 . I r n i d a z o l i n e I I I - 4 d o e s n o t s e n s i t i z e C E M c e l l s t o t u b u l i n i n h i b i t o r s . 1 6 1 F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n r e v e a l e d t h a t u n l i k e C P T , t a x o l d i d n o t a c t i v a t e N F - K B i n C E M c e l l s . C P T a c t i v a t e d N F - K B i n a d o s e d e p e n d e n t m a n n e r ( F i g u r e 1 1 1 - 1 4 a n d F i g u r e I I I - 2 6 ) . D N A + + + + + + + + + + + T N F 4 1 - - — - - - - a - p 6 5 - - + - - + , T 3 X 0 1 - - - - + + + + + + + 1 2 3 4 S 6 7 1 0 l l C E M / T a x o l F i g u r e I I I - 2 6 . E M S A f o r a c t i v a t i o n o f N F - K B b y v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f T a x o l . T N F - a w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l . T h e c e l l n u c l e i w e r e i s o l a t e d a n d e v a l u a t e d f o r N F - K B - D N A b i n d i n g a c t i v i t y u t i l i z i n g t h e fl u o r e s c e n t l y l a b e l e d N F - K B D N A c o n s e n s u s s e q u e n c e . T N F a . a c t i v a t i o n w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l ( F i g u r e I I I — 2 6 , l a n e 2 ) . T h e N F - K B / D N A c o m p l e x w a s u n a m b i g u o u s l y i d e n t i fi e d b y t r e a t i n g t h e n u c l e a r e x t r a c t w i t h a N F - K B p 6 5 a n t i b o d y f o l l o w i n g T N F a a c t i v a t i o n ( F i g u r e I I I - 2 6 , l a n e 3 ) . T r e a t m e n t o f t h e n u c l e a r e x t r a c t w i t h t h e p 6 5 a n t i b o d y r e s u l t e d i n a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n N F - K B / D N A b i n d i n g a n d t h e f o r m a t i o n o f a s u p e r s h i f t o f t h e c o m p l e x . A s a n e g a t i v e c o n t r o l , c e l l s a r e l e f t u n a c t i v a t e d a n d t h e n u c l e a r e x t r a c t s w e r e e x p o s e d t o t h e N F - K B c o n s e n s u s s e q u e n c e , r e s u l t i n g i n n o a c t i v a t i o n N F - K B ( F i g u r e I I I - 2 6 , l a n e 4 ) . T r e a t m e n t o f t h e C E M c e l l s w i t h t a x o l c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 1 u M t o 0 . 0 1 n M ( d i l u t e d 1 0 f o l d s , F i g u r e I I I - 2 6 , l a n e s 5 , 7 - 1 1 ) d i d n o t a c t i v a t e N F - K B . A c t i v a t i o n o f N F - K B s i g n a l i n g c a s c a d e r e q u i r e s a n i n t a c t n u c l e u s a n d t o p o i s o m e r a s e - 1 m e d i a t e d n u c l e a r d a m a g e i n C E M c e l l s . ’ 9 c T h i s s u g g e s t s t h a t t h e d r u g - i n d u c e d a p o p t o t i c a n d a n t i - a p o p t o t i c s i g n a l i n g p a t h w a y s r e l a t e d t o D N A d a m a g e a r e c r u c i a l t o t h e e n h a n c e m e n t o f e f fi c a c y b y n o n - c y t o t o x i c i m i d a z o l i n e I I I - 4 . T h i s i s i n c o n t r a s t t o 1 6 2 p r o t e a s o m e i n h i b i t o r b o r t e z o m i b ® ( P S 3 4 1 ) , w h i c h i n h i b i t s t h e N F - K B p a t h w a y a n d p o t e n t i a t e s t h e e f f e c t o f t u b u l i n - i n h i b i t o r t a x o l a s w e l l a s D N A d a m a g i n g a g e n t s , d o x o r u b i c i n a n d c i s - p l a t i n i n p a n c r e a t i c c e l l l i n e s a n d p a n c r e a t i c e f f u s i o n l y m p h o m a s . ” 9 8 C h i a o a n d c o - w o r k e r s 9 8 " s h o w e d t h a t m u t a t e d I K B a a n d P S - 3 4 l c o m p l e t e l y a b o l i s h t h e R e l A c o n s t i t u t i v e a c t i v i t y i n t h e p a n c r e a t i c c a n c e r c e l l s . H o w e v e r , P S - 3 4 l , b u t n o t e x p r e s s i o n o f m u t a t e d I K B a , s e n s i t i z e d c e l l s t o a p o p t o s i s i n d u c e d b y T a x o l . T h e y s u g g e s t e d a r e a c t i v a t i o n o f R e l A i n d u c e d b y t a x o l i n p a n c r e a t i c c a n c e r c e l l s t h a t e x p r e s s m u t a t e d I K B a o c c u r r e d t h r o u g h p h o s p h o r y l a t i o n a n d d e g r a d a t i o n o f I K B B . P S 3 4 1 , o n t h e o t h e r h a n d , c o m p l e t e l y a b r o g a t e s t h e d e g r a d a t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d I K B w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h t h e r o l e o f N F - K B i n a p o p t o s i s . k ) S e l e c t i v e p o t e n t i a t i o n o f a p o p t o t i c e f f e c t o f D N A d a m a g i n g a g e n t s b y I m i d a z o l i n e s i n c a n c e r c e l l s E n c o u r a g e d b y t h e fi n d i n g t h a t N F - K B m o d u l a t i o n c o u l d p o t e n t i a t e t h e e f f e c t o f D N A d a m a g i n g a g e n t s i n c h e m o t h e r a p y u p o n p r e - t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e I I I - 4 , w e n o w i n v e s t i g a t e d v a r i o u s c a n c e r o u s a n d n o n — c a n c e r o u s c e l l l i n e s f o r t h i s e f f e c t . T h e e f f e c t o f i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 w a s e v a l u a t e d o n c a n c e r c e l l s ; C E M , H T 1 0 8 0 , H e L a a n d n o n - c a n c e r o u s fi b r o b l a s t c e l l s ( S L 8 9 ) . T h i s w a s q u a n t i fi e d b y c a l c u l a t i n g t h e c o n c e n t r a t i o n a t w h i c h C P I ‘ a n d C D D P i n d u c e d 9 5 % a p o p t o s i s ( C C 9 5 ) w i t h a n d w i t h o u t p r e t r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 ( 1 0 0 n M f o r 1 h o u r , C C 9 5 c o m b i n a t i o n ) . C e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f c a m p t o t h e c i n o r c i s - p l a t i n i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f i m i d a z o l i n e ( 1 0 0 n M ) . C e l l s w e r e m o n i t o r e d o v e r 4 8 h a n d t h e l e v e l o f c a s p a s e - 3 w a s m e a s u r e d . C C 9 5 w e r e c a l c u l a t e d i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 . 1 6 3 T a b l e 1 1 1 - 4 a n d a p p e n d i x 7 c l e a r l y i n d i c a t e t h a t o n l y t h e c a n c e r o u s c e l l l i n e s e x h i b i t e d s t r o n g e n h a n c e m e n t o f a p o p t o s i s . T h e C C 9 5 v a l u e s o f b o t h C P T a n d C D D P d r o p p e d d r a s t i c a l l y ( u p t o 7 4 f o l d f o r C P T a n d 1 4 f o l d f o r C D D P ) u p o n p r e t r e a t m e n t o f c a n c e r o u s c e l l s w i t h t h e i m i d a z o l i n e ( T a b l e I I I - 3 a n d F i g u r e I I I - 2 7 ) . N o i n c r e a s e i n a p o p t o s i s w a s s e e n i n t h e n o n - c a n c e r o u s fi b r o b l a s t s ( S L 8 9 ) u p o n p r e t r e a t m e n t w i t h t h e n o n - c y t o t o x i c i m i d a z o l i n e I I I - 4 ( T a b l e I I I - 3 a n d F i g u r e I I I - 2 7 ) . c c s s F o l d C e l l L i n e D r u g C C 9 5 C o m b i n a t i o n E n h a n c e m e n t C E M C P T 4 4 n M 0 . 6 n M 7 4 C E M C D D P 1 5 o u t 1 . 1 1 1 M 1 4 H T 1 0 8 0 C P T 8 6 w 6 . 7 w 1 3 H T 1 0 8 0 C D D P 5 3 w 5 . 2 w 1 0 H e L a C P T 1 . 4 8 t t M 0 . 0 6 u m 2 4 H e L a C D D P 0 . 3 m 0 . 0 6 W , 5 S L 8 9 C P T 1 5 1 1 M 1 6 1 1 M 1 S L 8 9 C D D P 0 . 5 W 0 . 6 W 1 T a b l e 1 1 1 - 4 . C a n c e r c e l l s p e c i fi c e n h a n c e m e n t o f e f fi c a c y . * D a t a r e p o r t e d a s a n a v e r a g e o f t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s a f t e r 4 8 h o u r d r u g e x p o s u r e . T h e i r r r i d a z o l i n e i t s e l f i n d u c e d n o s i g n i fi c a n t l e v e l s o f a p o p t o s i s ( t e s t e d u p t o 1 0 m M ) . C P T = c a m p t o t h e c i n , C D D P = c i s - p l a t i n . 1 6 4 ’ s i s o t p o p bO l a % 1 1 0 - 1 0 0 d A I % a p o p t o s i s O I 5 0 . 1 t t M l l l - 4 - > C P T C P T I - 1 2 - 1 1 - 1 0 - 9 C E M c e l l s I - 8 - 7 - 6 - £ I o g [ C P T ( M ) ] S L 8 9 c e l l s . 0 . 1 t t M l l l - 4 - - > C P T - C P T - 1 0 F i g u r e 1 1 1 - 2 7 A ( t o p ) . C C 9 5 c o m p a r i s o n o f C P I ‘ w i t h a n d w i t h o u t i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n C E M l e u k e m i a c e l l s . 2 7 B ( b o t t o m ) . C C 9 5 o f C P T w i t h a n d w i t h o u t i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n n o n - c a n c e r o u s fi b r o b l a s t c e l l s . D a t a r e p o r t e d a s a n a v e r a g e o f t w o i n d e p e n d e n t I I U I I l I - 1 3 - 1 2 - 1 1 - 1 0 - 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4 - 3 I O Q I C P T l M l l e x p e r i m e n t s a f t e r 4 8 h o u r d r u g e x p o s u r e . x i i ) C o r r e l a t i o n b e t w e e n p o t e n t i a t i o n a n d N F - K B a c t i v a t i o n . O u r d a t a i n d i c a t e s t h a t s e n s i t i z a t i o n o f c e l l s t o c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s u s i n g i m i d a z o l i n e I I I - 4 e x h i b i t s a s t r o n g c o r r e l a t i o n w i t h N F - K B a c t i v a t i o n . F o r e x a m p l e , C E M c e l l s s h o w e d o n l y m o d e r a t e a c t i v a t i o n o f N F - K B b y C D D P ( 2 3 p M , F i g u r e I I I - 2 8 ) 1 6 5 r e s u l t i n g i n m o d e r a t e f o l d e n h a n c e m e n t ( 1 4 f o l d ) c o m p a r e d t o t h e s t r o n g a c t i v a t i o n ( 2 0 . 0 1 u M , F i g u r e I I I - 2 8 ) a n d e n h a n c e m e n t ( 7 4 f o l d ) w i t h C P T . T h i s o b s e r v a t i o n w a s n o t i c e a b l e a c r o s s t h e p a n e l o f c e l l l i n e s ( F i g u r e I I I - 2 8 a n d T a b l e 1 1 1 - 3 ) . T h e a b i l i t y o f t h e i m i d a z o l i n e I I I - 4 t o e n h a n c e t h e a p o p t o t i c l e v e l s c a u s e d b y c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s s u c h a s C P T a n d C D D P w e r e f o u n d t o b e a f u n c t i o n o f s e n s i t i v i t y t o N F - K B a c t i v a t i o n a n d d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o i t . 1 6 6 T u N C F - o . - p P 5 6 T - - - + - - + + - - - - - - 1 + - + - - + - i - t - 1 + t D N A 4 + + + + - : ~ + + + + + C E M / C P T . i n ! w ‘ l l l ; ’ 1 ‘ H T 1 0 8 0 / C P T ’ 1 ' ‘ H e L a / C P T t - l . . 1 « - " " D N A 1 1 1 + l + + + + + + T N F - a . - + + - - - - - - - - a - p 6 5 - - 5 + - - + - - - - - C D D P - - - - + + + + - + - + - + - l 2 3 4 5 6 7 9 1 0 1 1 m u . . . m _ C E M / C D D P _ , . . . . i . . . H I l O 8 0 l C D D P [ — ° . . . . . . . . . . . . _ . _ . . H e L a / C D D P u . . . , ” , t ] F i g u r e I I I - 2 8 a ( t o p ) . E M S A f o r N F - K B i n C E M , H T 1 0 8 0 , H e L a c e l l s a c t i v a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f C P T ( 1 0 p M , 1 p M , 0 . 1 u M , 0 . 0 1 1 1 M , 1 n M , 0 . 1 n M ) . T N F - a w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l . 1 1 1 - 2 8 b ( b o t t o m ) . E M S A f o r N F - K B i n C E M , H T 1 0 8 0 , H e L a c e l l s a c t i v a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f C D D P ( 1 0 1 1 M , 3 u M , l u M , 0 . 3 p M , 0 . 1 p M , a n d 0 . 0 3 1 1 M ) . T N F - a w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l . I n p a r t i c u l a r S L 8 9 c e l l s , w h i c h s h o w e d n o e n h a n c e m e n t w i t h t h e i m i d a z o l i n e t r e a t m e n t ( F i g u r e I I I - 2 9 , T a b l e I I I - 3 ) a n d w e r e c o m p l e t e l y i n s e n s i t i v e t o N F - K B a c t i v a t i o n w h e n t r e a t e d w i t h v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f e i t h e r C P T , C D D P o r T N F - 0 . ( F i g u r e 1 1 1 - 2 9 ) . 1 6 7 < — — 3 1 3 9 — — > H e L a D N A + + + + + + + + + + + + T N F - a . - + + - - - - + + a - p 6 5 - - + - - + - - - - 1 C P T / C D D P - - - - + + + + + + - _ S L 8 9 / C P T ' e S l B 9 / C D D P ‘ ' , . a F i g u r e I I I - 2 9 . E M S A f o r N F - K B a c t i v a t i o n i n S L 8 9 c e l l s . C e l l s w e r e a c t i v a t e d w i t h T N F — 0 1 a n d C P T ( 1 0 1 1 M , l u M , 0 . 1 u M , 0 . 0 1 p . M , 1 n M , 0 . 1 n M ) a n d C D D P ( 1 0 p M , 3 M M , 1 u M , 0 . 3 u M , 0 . 1 1 1 M ) . H e L a c e l l s a c t i v a t e d w i t h T N F - a w e r e u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l . T h e s u p e r s h i f t w i t h a n t i b o d y s p e c i fi c f o r p 6 5 u n i t i s s h o w n i n l a n e 1 2 . T h i s o b s e r v a t i o n w a s f u r t h e r s u p p o r t e d b y t h e N F - K B d r i v e n t r a n s c r i p t i o n s t u d i e d v i a l u c i f e r a s e b a s e d r e p o r t e r a s s a y i n H e L a a n d S L 8 9 c e l l s . B o t h T N F - 0 1 a s w e l l a s C P T a c t i v a t e d N F - K B a n d e n h a n c e d N F - K B b a s e d t r a n s c r i p t i o n i n H e L a c e l l s ( F i g u r e I H - 3 0 ) . S L 8 9 c e l l s w e r e d e v o i d o f a n y s i g n i fi c a n t N F - K B t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y ( F i g u r e H I — 3 0 ) c o r r e l a t i n g w e l l w i t h t h e i n a b i l i t y t o s h o w p o t e n t i a t i o n o f D N A d a m a g e i n p r e s e n c e o f i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 . 1 6 8 3 6 . “ s t i n u t h g i l e v i t a l e R S L 8 9 H e L a T N F - 0 1 . ( 2 P Q / m l ) i ? 5 : - b l T N F - 0 1 ( 2 p g l m l ) C P T ( 3 1 . 1 M ) ‘ P p F C M E K K p N F - K B L u c p N F x B L u c p N F - x B L u c p N F - K B L u c F i g u r e I I I - 3 0 . S L 8 9 c e l l s d o n o t s h o w N F - K B m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y w i t h e i t h e r T N F - a o r C P T . p F C M E K K c a u s e s c o n s t i t u t i v e a c t i v a t i o n o f N F - K B . p C I S - C K , d o e s n o t c o n t a i n t h e e n h a n c e r e l e m e n t f o r N F - K B a n d s e r v e s a s a n e g a t i v e c o n t r o l . T N F - 0 . a n d C P T a r e k n o w n t o a c t i v a t e N F - K B i n a v a r i e t y o f c e l l l i n e s . x i i i . C h e m i c a l r e s o l u t i o n o f 1 1 1 - 4 a n d b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f t h e e n a n t i o m e r s . E n c o u r a g e d b y t h e a b i l i t y o f t h e r a c e m i c I I I - 4 i n p o t e n t i a t i n g t h e e f f e c t o f D N A d a m a g i n g a g e n t s s u c h a s c a m p t o t h e c i n a n d c i s - p l a t i n , w e f u r t h e r i n v e s t i g a t e d t h e e f f e c t s o f t h e p r e - t r e a t m e n t o f e n a n t i o m e r s f o l l o w e d b y e x p o s u r e t o c a m p t o t h e c i n o n c a n c e r o u s c e l l s . R a c e m i c 1 1 1 - 4 w a s c h e m i c a l l y r e s o l v e d u s i n g a n E D C I - m e d i a t e d e s t e r i fi c a t i o n w i t h R ( + ) - l - p h e n y l e t h a n o l y i e l d i n g t w o d i a s t e r e o m e r i c e s t e r s , 1 1 1 - 9 a n d I I I - 1 0 , w h i c h o n h y d r o l y s i s a f f o r d e d t h e ( S , S ) e n a n t i o m e r 1 1 1 - 4 a a n d ( R , R ) e n a n t i o m e r 1 1 1 - 4 b i n o v e r a l l 4 4 % y i e l d ( S c h e m e I I I - 3 ) . P h P h P h P h \ N I P h l l H O / l \ E D C I , D M A P , C H 2 0 1 2 K N P h \ \ N “ p h P " — < ‘ . 0 0 2 1 - 1 > ” 1 ‘ 1 3 : 0 0 H + P i t - ( x N . N . 2 . H C O H P h 2 ) 2 N N a O H / E t O H , r e fl u x , t h e n H C I ' — N 2 4 4 % o v e r a l l P h P h ( : 0 I l l - 4 ( S , S ) t i t - 4 a ( R , R ) I l l - 4 b S c h e m e I I I - 3 . C h e m i c a l r e s o l u t i o n o f r a c e m i c I I I - 4 i n t o e n a n t i o m e r s . 1 6 9 T h e e n a n t i o m e r s w e r e c r y s t a l l i z e d a n d t h e i r a b s o l u t e c o n fi g u r a t i o n w a s d e t e r m i n e d b y X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y ( F i g u r e I I I - 3 1 ) . F i g u r e I I I - 3 1 . X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e s o f I I I - 4 b ( l e f t , R , R ) a n d I I I - 4 a ( r i g h t , S , S ) . T h e d i a s t e r e o m e r i c e s t e r s , I I I - 9 , 1 1 1 - 1 0 a n d t h e e n a n t i o m e r s I I I - 4 a a n d I I I - 4 b w e r e t e s t e d f o r e n h a n c e m e n t o f a p o p t o s i s f o r a p e r i o d o f 4 8 h w i t h C P T ( F i g u r e I H - 3 2 ) . N o n e o f t h e c o m p o u n d s i n d u c e d a n y s i g n i fi c a n t c e l l d e a t h o v e r 4 8 h o u r s , h o w e v e r t h e ( R , R ) e n a n t i o m e r I I I - 4 b p o t e n t i a t e d t h e a p o p t o t i c e f f e c t o f C P T ( C C 9 5 c o m b i n a t i o n = 0 . 5 3 n M , 8 3 f o l d e n h a n c e m e n t ) n e a r l y 5 t i m e s m o r e t h a n t h e ( S , S ) e n a n t i o m e r I I I - 4 a ( C C 9 5 c o m b i n a t i o n 2 2 . 4 n M , 1 8 f o l d e n h a n c e m e n t ) . T h e e s t e r s d i d n o t s h o w a s i g n i fi c a n t e n h a n c e m e n t o f a p o p t o s i s a s d e t e r m i n e d b y t h e c a s p a s e b a s e d A p o - O n e a s s a y T M ( C C 9 5 I I I - 9 = 7 7 . 2 n M , C C 9 5 I I I - 1 0 : 5 4 . 3 n M ) . F i g u r e I I I - 3 2 i l l u s t r a t e s t h e e f f e c t s o f p r e — t r e a t m e n t o f t h e d i a s t e r e o m e r i c e s t e r s a n d t h e e n a n t i o m e r s . 1 7 0 1 I i n I l a 7 2 e D . O O O . < I o \ ° 1 " I : I l I I I 1 - 1 3 - 1 2 - 1 1 - 1 0 - 9 - 6 | O g [ C P T ( M ) ] E n t r y C o n d i t i o n s C C 9 5 E n h g g c l g m e n t 1 C P T 4 4 n M - 2 | | | - 9 - - > C P T 7 7 . 2 n M 0 . 6 3 l l l - 1 0 - - > C P T 5 4 . 3 n M 0 . 8 4 | | | - 4 - - - > C P T 0 . 6 n M 7 5 . 1 5 I l l - 4 a - - - > C P T 2 . 4 n M 1 8 . 4 6 | | | - 4 b - - - > C P T 0 . 5 n M 8 3 . 6 F i g u r e I I I - 3 2 . C a s p a s e 3 / 7 a c t i v i t y m e a s u r e d i n C E M c e l l s . C C 9 5 c o m p a r i s o n f o r C P T i n C E M l e u k e m i a c e l l s i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f r a c e m i c I I I - 4 , t h e d i a s t e r e o m e r s 1 1 1 - 9 a n d 1 1 1 - 1 0 a n d t h e e n a n t i o m e r s I I I - 4 a a n d I I I - 4 b . D a t a r e p o r t e d a s a n a v e r a g e o f t w o s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . x i v . F A C S a n a l y s i s . S i n c e a p o p t o s i s c a n ’ t b e d e s c r i b e d b y o n e a s s a y , C E M c e l l s w e r e s u b j e c t e d t o F A C S a n a l y s i s . B r i e fl y , c e l l s w e r e p r e - i n c u b a t e d w i t h t h e I I I - 4 , I I I - 4 a a n d I I I - 4 b f o r 4 0 ’ f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h C P T ( 0 . 0 1 n M ) f o r 1 2 h a n d 4 8 h t o m a r k t h e e a r l y a n d l a t e p h a s e s o f a p o p t o s i s . C e l l s w e r e h a r v e s t e d a t t h e d e s i r e d t i m e p o i n t a n d w a s h e d w i t h l X P B S . F u r t h e r , c e l l s w e r e s t a i n e d , a n d s o r t e d o n a f l o w c y t o m e t e r . 1 7 1 ‘ 0 1 3 0 1 ‘ 0 1 1 O 3 3 . ) 5 . 2 ( + l - 2 . 5 1 0 1 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 0 ‘ 1 0 ‘ 0 1 0 1 1 0 2 Y o P r o — 1 G m Y o P r o - 1 G m a é ' : " ' — 3 4 , e a : 3 - i . g é d 8 % . ; ° ' O O ! 3 ' 0 5 3 . ' ° " ° " ‘ ° . _ E . Y . ' . o ’ . a J L _ 1 ' 1 o n . 0 1 . { 7 " " o \ _ — ‘ 6 3 l . ' ' . ‘ : 0 3 . 3 . 3 : . . . , - ’ . ' \ . ' - ' - ‘ ~ ' l . . . . V . . . ‘ - . - . 3 w . - ~ . . ' ’ 1 ‘ “ 3 5 5 8 1 1 1 . . 3 & 3 " ; ' o 3 1 8 : : 9 ) : ) ? A . 0 } . 2 , . i : ' ’ 4 r u n - ( l 4 " 3 1 1 % ? " 1 0 1 9 ) 1 0 " ‘ 1 1 Y o P r o o - t G m o ' é ‘ l l ‘ h 1 0 0 1 0 Y o l - " 1 r 0 - 1 G 1 r l t f 3 1 F i g u r e I I I - 3 3 a . F A C S a n a l y s i s ( T O P ) c e l l s a l o n e , r a c e m i c 1 1 1 - 4 ( 0 . 1 u M ) ; ( B O T T O M ) I I I - 4 b ( 0 . 1 u M ) , I I I - 4 a ( 0 . 1 p t M ) ; T h e l o w e r r i g h t q u a d r a n t i n d i c a t e s t h e % a p o p t o s i s ( + / - s t a n d a r d d e v i a t i o n ) f o r t h e s a m p l e . A s c o n fi r m e d b y t h e fl o w c y t o m e t r y e x p e r i m e n t s , c o m p o u n d s I I I - 4 , I I I - 4 a o r I I I - 4 b d i d n o t i n d u c e a p o p t o s i s t h e m s e l v e s ( F i g u r e I I I - 3 3 a ) a s c o m p a r e d t o t h e c e l l s b y t h e m s e l v e s . 1 7 2 “ I I I I 3 O ‘ 1 I I I I I L ‘ 0 1 w 3 o 1 . W . d L J 2 — R J — L i A M fl u ‘ L l P L M M A ‘ L ” 2 0 1 I d L e L R l P - fl h 0 1 d r I 5 : e 3 1 0 ‘ 2 9 " o — - — - — ~ — « 0 ' O ' 2 : , . " " 5 6 3 + 1 . 2 4 ) : 3 . 2 1 0 1 0 1 0 1 1 ' 0 2 1 0 3 1 o " - 1 0 1 ' 0 1 ' 0 1 1 0 2 1 o 3 1 0 ‘ Y o P r o — 1 G r n Y o P r o - 1 G r n E X : 3 1 2 , 1 " 3 3 g t 8 I r a a “ _ O 3 2 . ; N i f : m i t t - L 5 1 8 ) . ' fl r l fl f l l . 1 0 1 0 1 0 1 1 0 2 1 o 3 1 0 ‘ W e 1 0 1 7 ” 1 1 0 2 1 0 3 1 0 4 Y o P r o — 1 G m Y o P r o - 1 G r n F i g u r e I I I - 3 3 b . F A C S a n a l y s i s ( T O P ) C P T ( 0 . 0 1 M M ) , I I I - 4 9 C P T ( 0 . 0 1 u M ) ; ( B O T T O M ) I I I - 4 b - ) C P I ‘ ( 0 . 0 1 u M ) , I l l - 4 3 9 C ” ( 0 . 0 1 p M ) . T h e l o w e r r i g h t q u a d r a n t i n d i c a t e s t h e % a p o p t o s i s ( + / - s t a n d a r d d e v i a t i o n ) f o r t h e s a m p l e . 1 7 3 H o w e v e r , a f t e r C P T t r e a t m e n t , t h e p e r c e n t o f c e l l s t h a t b e c a m e Y o P r o - l p o s i t i v e i n c r e a s e d . C P T a l o n e i n d u c e d a p o p t o s i s i n C E M c e l l s u p t o 5 8 % . T h i s e f f e c t w a s f u r t h e r p r o n o u n c e d u p o n p r e - t r e a t m e n t w i t h r a c e m i c 1 1 1 - 4 ( 7 2 % ) a s w e l l a s i t s e n a n t i o m e r s I I I - 4 a ( R , R ) ( 8 0 % ) a n d I I I - 4 b ( S , S ) ( 6 7 % ) . F u r t h e r , c o n c o m i t a n t t o t h e i n c r e a s e i n t h e d y e ’ s a b i l i t y t o e n t e r t h e c e l l s , t h e r e w a s a d e c r e a s e i n t h e c e l l s i z e ( m e a n f o r w a r d s c a t t e r ) d e c r e a s e d f r o m v i a b l e c e l l s ( 5 2 9 ) f o r v i a b l e C E M c e l l s t o 5 0 9 u p o n C P T t r e a t m e n t a n d 4 5 7 f o r p r e - t r e a t m e n t w i t h I I I - 4 a ( h i g h l y fl u o r e s c e n t p o p u l a t i o n ) , a c o m m o n f e a t u r e o f a p o p t o t i c c e l l s . x v . N F - K B - p 5 3 c r o s s t a l k W e b s t e r a n d P e r k i n 4 0 h a v e d e m o n s t r a t e d t h e e f f e c t o n t r a n s c r i p t i o n u p o n D N A d a m a g e . M a n y c e l l u l a r s t i m u l i r e s u l t i n t h e i n d u c t i o n o f b o t h t h e t u m o r s u p p r e s s o r p 5 3 a n d N F - k o b o . I n c o n t r a s t t o a c t i v a t i o n o f p 5 3 , w h i c h i s a s s o c i a t e d w i t h t h e i n d u c t i o n o f a p o p t o s i s , 9 9 s t i m u l a t i o n o f N F - k o b o h a s b e e n s h o w n t o p r o m o t e r e s i s t a n c e t o p r o g r a m m e d c e l l d e a t h . 3 8 T h i s s u g g e s t s a r e g u l a t o r y m e c h a n i s m m u s t t o i n t e g r a t e t h e s e o p p o s i n g o u t c o m e s a n d a t i g h t l y c o o r d i n a t e d c r i t i c a l c e l l u l a r d e c i s i o n - m a k i n g e v e n t . F u r t h e r , C o l l i n s e t a l s h o w e d t h a t C R E B b i n d i n g p r o t e i n i s t h e c o m m o n n u c l e a r i n t e g r a t o r a n d t h a t p 6 5 a n d p 5 3 s u p p r e s s e a c h o t h e r a n d c o m p e t e f o r t h e C B P / p 3 0 0 w h i c h i s e s s e n t i a l t o f o r m D N A - t r a n s c r i p t i o n a l c o m p l e x . 1 0 0 E n c o u r a g e d b y t h e s e f a c t s , w e w a n t e d t o d e t e r m i n e i f t h e i n h i b i t i o n o f N F - K B c a n c o r r e l a t e d o w n t o a p r o - a p o p t o t i c p r o t e i n p 5 3 . B r i e fl y , H T 1 0 8 0 w i t h w t p 5 3 w e r e t r a n s f e c t e d w i t h p 5 3 L u c . p R L T K w a s u s e d a s a c o - t r a n s f e c t i n g a g e n t . T r a n s f e c t e d c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h C P T ( 0 . 0 1 n M , a c t i v a t e s N F - K B , 2 h ; a c t i v a t e s p 5 3 , 8 h ) i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f 1 1 1 - 4 . F i g u r e I I I - 3 3 c l e a r l y i n d i c a t e s a c c u m u l a t i o n o f p 5 3 . T h i s r e s u l t t a l l i e s 1 7 4 w e l l w i t h t h e f a c t t h a t I I I - 4 i n h i b i t e d N F - K B v i a d e g r a d a t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d I - K B - a . S i n c e , t h e r e i s a m p l e e v i d e n c e t h a t N F - K B a n d p 5 3 c r o s s t a l k a n d t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f o n e o u t w e i g h s t h e o t h e r , 9 9 ‘ ' 0 0 i n h i b i t i o n o f N F - K B w o u l d l e a d t o m o r e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f p 5 3 . 1 2 0 - E 1 0 0 — 5 a 8 0 - 3 . 2 6 , . § 0 g 4 0 - O ( I 2 0 — o + + ~ t - + 4 - a 4 ‘ « / \ I x I x \ \ < 2 » a < 2 » e a o “ ) a “ . u ‘ , 8 x 9 x 9 , 8 , 9 o \ \ \ V 0 0 Q 4 5 V 6 1 ‘ Q 6 5 Q 9 ’ ‘ 8 ‘ ‘ 5 5 « 2 ° 3 5 ‘ " 0 ‘ 9 « 0 * 0 ‘ 3 ‘ « 9 . 9 8 9 < 2 , 9 6 ‘ 9 6 9 4 9 0 + < 2 " 6 ‘ I x « 0 { ' 9 x Q 0 ( 3 5 ' " x Q 6 ) ( 9 ’ x 0 « + 6 ’ « ’ 1 ‘ $ ’ a . X ‘ b \ ’ 6 9 > ? ‘ 2 6 Q F i g u r e I I I - 3 4 . E n h a n c e d p 5 3 t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y i n H T 1 0 8 0 d u e t o i n h i b i t i o n o f N F - K B b y I I I - 4 F i g u r e I I I - 3 4 s h o w s t h e e n h a n c e m e n t o f t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y d u e t o p 5 3 . W e h a v e s h o w n p r e v i o u s l y t h a t i m i d a z o l i n e I I I - 4 m o d u l a t e t h e l e v e l s o f N F - K ‘ B a n d i n h i b i t i t s t r a n s l o c a t i o n v i a b l o c k i n g t h e d e g r a d a t i o n o f I - K B b y t h e p r o t e o s o m e . T h i s i n h i b i t i o n o f t r a n s l o c a t i o n r e d u c e s t h e l e v e l s o f N F - K B i n t h e n u c l e u s f o r N F - K B - D N A b i n d i n g . I t h a s b e e n w e l l d o c u m e n t e d t h a t c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s a c t i v a t e b o t h t h e p 5 3 ( p r o - a p o p t o t i c ) ' 0 3 a n d t h e N F - K B ( a n t i - a p o p t o t i c ) 1 9 “ p a t h w a y s . U n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s , t h e p 5 3 t u m o r l 7 5 s u p p r e s s o r p r o t e i n i s r a p i d l y d e g r a d e d b y t h e 2 6 S p r o t e a s o m e ' o ' i n a p r o c e s s m e d i a t e d b y M D M 2 . ' ° 2 A f t e r c e l l u l a r s t r e s s e s , s u c h a s e x p o s u r e t o D N A - d a m a g i n g a g e n t s , t h e h a l f - l i f e o f t h e p 5 3 p r o t e i n i s s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s e d , a n d p 5 3 a c c u m u l a t e s i n t h e n u c l e u s o f t r e a t e d c e l l s . ‘ 0 3 T h e m e c h a n i s m b y w h i c h t h e s t a b i l i t y o f p 5 3 i s i n c r e a s e d a f t e r c e l l u l a r s t r e s s i s n o t f u l l y u n d e r s t o o d , b u t i t i s l i k e l y t h a t m o d i fi c a t i o n s s u c h a s p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e p 5 3 p r o t e i n i t s e l f a r e i n v o l v e d . I n h i b i t i o n o f t h e 2 6 S p r o t e a s o m e r e s u l t s i n t h e r a p i d a c c u m u l a t i o n o f p 5 3 ' 0 ' a n d o f p 5 3 - i n d u c i b l e g e n e p r o d u c t s s u c h a s p 2 1 W A F l , M D M 2 , a n d B a x . ‘ 0 4 S i n c e , p 6 5 a n d p 5 3 c o m p e t e f o r t h e s a m e C R E B - p r o t e i n t o i n i t i a t e t h e t r a n s c r i p t i o n p r o c e s s , l o w l e v e l s o f p 6 5 ( i n p r e s e n c e o f a p r o t e a s o m a l i n h i b i t o r ) w o u l d a l l o w p 5 3 t o b i n d t o C R E B b i n d i n g p r o t e i n a n d s t a r t i t s t r a n s c r i p t i o n . A L L N ( c o l u m n 7 , F i g u r e I H - 3 4 ) s h o w e d a s i m i l a r s y s t e m a s d e s c r i b e d a b o v e . P r e v i o u s s t u d i e s c o n fi r m e d t h a t t h e p r o t e a s o m a l i n h i b i t o r A L L N i n h i b i t s t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f N F - K B b y p r e v e n t i n g i t s t r a n s l o c a t i o n a c r o s s t h e n u c l e a r m e m b r a n e . C o m p o u n d I I I - 4 ( c o l u m n 8 , F i g u r e I I I - 3 4 ) a l s o i n d i c a t e s s i m i l a r a c c u m u l a t i o n o f p 5 3 a n d s u b s e q u e n t e n h a n c e m e n t i n i t s t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y w h e n c o m p a r e d t o C P T t r e a t m e n t a l o n e ( c o l u m n 6 , F i g u r e I I I - 3 4 ) . T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e t h a t p r e - t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e I I I - 4 e n h a n c e s t h e a p o p t o t i c i n d u c t i o n d u e t o D N A d a m a g i n g a g e n t s s u c h a s c a m p t o t h e c i n b y m o d u l a t i o n o f N F - K B w h i c h f u r t h e r t r a n s l a t e s i n t o a c c u m u l a t i o n o f p 5 3 l e a d i n g t o a n i n c r e a s e i n t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f p 5 3 . x v i . C P T - I I I - 4 s t a c k i n g i n t e r a c t i o n s . S e l f - a g g r e g a t i o n o f s o m e C 1 7 1 “ d r u g s i s r e g a r d e d a s a n a d d i t i o n a l f a c t o r a f f e c t i n g t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f t h e m e d i c a t i o n s . ' 0 5 T h e t e n d e n c y t o s e l f - a g g r e g a t i o n h a s p r o v i d e d a d i m i n i s h e d t e n d e n c y t o o t h e r n o n - s p e c i fi c i n t e r a c t i o n s a n d t h e r e f o r e i n c r e a s e s t h e r a t e o f 1 7 6 a c c u m u l a t i o n w i t h i n t h e c e l l s a n d , c o n s e q u e n t l y , t h e a v a i l a b i l i t y a t t h e r e c e p t o r s i t e . B a s e d o n s u c h s t u d i e s , w e w a n t e d t o a s c e r t a i n i f 1 1 1 - 4 a n d C P T m i g h t h a v e s u c h i n t e r a c t i o n s t o f o r m i o n p a i r . W e a l l o w e d C P T a n d 1 1 1 - 4 t o i n c u b a t e f o r 3 h i n D M S O a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d a n N M R w a s r e c o r d e d f o r t h e m i x t u r e ( F i g u r e I I I - 3 5 ) . N o c h a n g e w a s s e e n i n t h e N M R v a l u e s o f e i t h e r C P T o r i m i d a z o l i n e i n d i c a t i n g n o c h e m i c a l c h a n g e i n e i t h e r o r t h e m . 1 7 7 l l l l Z l “ l l l l l l l l l Z ' l l l l i l l z l - l l L l l O m o L J l J l l L I I l l o l l l m r i V l V l o l l W l l w l 0 l ; l l l l L l L 9 L 9 1 l l l l L l l L ‘ l l m l 8 l l r J ” ( r a J t l l 2 t — 6 r - d S l J ‘ % M I — w I L 0 l 1 l t M L “ i i l l l l J l L i l I I 2 1 l l l l “ l l l a l “ L l l J l l I ' l l i l l l l l l l l l L J l S L 8 l l l l l l l l L J l l I ‘ 0 i l l l l l l l l l l Z l L r l l l S l l 1 L l l l l l S l l l J l 9 l 6 l l l l 0 1 l l l l l I l I i l l l 2 1 l l 1 l - l l l l ' r - l l w l J e L n I i l l l u l a z o m m s s n l l L L i l l l l l l v a n ! L B t a s h l n t a m s l s l e l L a l m l s l l a J s w l l n l ' l s s l 6 - I I I u o n r fi l L J l l l ! I I a l l l [ L i l l m l l l k 1 7 8 G . F u t u r e d i r e c t i o n s . i ) S t r u c t u r e - A c t i v i t y R e l a t i o n s h i p b a s e d o n I I I - 4 a s t h e p a r e n t s c a f f o l d . C o m p o u n d I I I - 4 w a s u s e d a s p a r e n t s c a f f o l d t o b u i l d a l O - m e m b e r l i b r a r y f o r s t r u c t u r e - — a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p . T h i s c o l l e c t i o n o f c o m p o u n d s c o m p r i s e d o f s o m e t r a n s - i m i d a z o l i n e s s y n t h e s i z e d p r e v i o u s l y b y o t h e r r e s e a r c h e r s i n o u r g r o u p . 8 4 T h e f o u r p o i n t d i v e r s i t y w a s a l t e r e d o n t h e p a r e n t s c a f f o l d i n a m u t u a l l y e x c l u s i v e m a n n e r a s s h o w n i n S c h e m e I I I - 4 . P h P h 0 3 V I P “ p r . t h o C O O H \ ( N P h I “ C O O H P h w P h / X Z " " 2 1 1 : 2 5 5 P h N / N N _ . - C O O H n ~ \ K P “ 4 N . ' C O O H P h I l l - 2 0 \ p h p h \ I R 3 I l l - 1 7 N ” P h P h P h j o \ P h N P h P h \ 6 I \ E 2 1 1 1 - 1 9 , _ . - C O O M e I I I - 4 P h \ P “ I l l - 1 3 P fi \ \ P h P fi C O N H z I I I - 1 8 P h N P h N ‘ 6 I P h Y P h " F 2 2 N i C O O H K I M . , e i l l - 1 6 Y H 0 0 0 I I I - 7 S c h e m e I I I - 4 . S t r u c t u r e - A c t i v i t y R e l a t i o n s h i p b a s e d o n I I I - 4 . T h e s e i m i d a z o l i n e s w e r e t h e n s u b j e c t e d t o a p r e l i m i n a r y s c r e e n t o fi n d o u t t h e C h e m o p o t e n t i a t i o n i n d e x . T a b l e I I I - 5 s h o w s t h e i m p o r t a n c e o f a p h e n y l g r o u p a t R 2 p o s i t i o n . W e h a v e s e e n f r o m t a b l e I I I - l t h a t a M e c o u l d n o t b e t o l e r a t e d a t R 2 , 1 7 9 w h e n t h e p h e n o t y p e u n d e r i n v e s t i g a t i o n i s e n h a n c e m e n t o f a p o p t o s i s i n d u c e d b y C P T . E n t r y t r a n s - l m l d a z o l l n e C h e m o p o t e n t i a t i o n I n d e x 6 1 w , 4 8 h I I I - 1 3 I l l - 1 6 I l l - 1 9 P h \ « \ N 5 C O O H P h \ l H m C K N 2 : P h N 5 C O O M e P h P h P h N P h P N ~ « N 2 C O O H P h P h P h 7 ; O N I Q N ; C O O H 1 . 4 ( + / - 0 . 0 3 ) 1 . 2 ( + / - 0 . 0 5 ) 1 . 0 ( + / - 0 . 0 1 ) 0 . 9 ( + / - 0 . 0 ) T a b l e 1 1 1 - 5 . S t r u c t u r e - a c t i v i t y p r o fi l i n g b a s e d o n c h e m o - p o t e n t i a t i o n i n d i c e s . B a s e d o n t h e c h e m o - p o t e n t i a t i o n i n d i c e s , w e a r e a t t e m p t i n g t o q u a n t i f y t h e e n h a n c e m e n t o f a p o p t o s i s o f t h i s S A R m o d e l . i i ) T a r g e t v a l i d a t i o n o f c o m b i n a t i o n t h e r a p y w i t h c a m p t o t h e c i n a n d t h e i m i d a z o l i n e I I I - 4 ( S P _ 4 _ 8 4 ) . a ) M i c r o c h i p a n a l y s i s f o r c o m b i n a t i o n s t u d i e s w i t h c a m p t o t h e c i n a n d 1 1 1 - 4 T h e r e l e v a n c e o f a t a r g e t i n a d i s e a s e p r o c e s s n e e d s ‘ v a l i d a t i o n ’ . T h e q u e s t i o n w h e t h e r t h e d e s i r e d e f f e c t o n a d i s e a s e d s t a t e c a n b e a c h i e v e d b y i n fl u e n c i n g a 1 8 0 b i o l o g i c a l s y s t e m o r p r o c e s s r e q u i r e s d e fi n i t i v e p r o o f m o s t c l e a r l y a n s w e r e d b y c l i n i c a l s t u d i e s . H o w e v e r , e a r l y s t a g e s o f d e v e l o p m e n t r e q u i r e i n v o l v e m e n t o f t a r g e t v a l i d a t i o n v i a b i o c h e m i c a l e x p e r i m e n t a t i o n , s t u d y i n g d i f f e r e n t i a l g e n e e x p r e s s i o n i n h e a l t h y a n d d i s e a s e d t i s s u e u s i n g g e n e c h i p s , f u n c t i o n a l s t u d i e s o f p r o t e i n s a n d a n i m a l m o d e l s . D N A m i c r o a r r a y s o f f e r t r e m e n d o u s a d v a n t a g e s o v e r t r a d i t i o n a l ‘ s i n g l e - g e n e ’ m e t h o d s s u c h a s n o r t h e r n h y b r i d i z a t i o n , r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e - P C R e t c . T h e s e h a v e b e e n d e v e l o p e d t o s i m u l t a n e o u s l y a n a l y z e t h e e x p r e s s i o n p a t t e r n s o f t h o u s a n d s o f g e n e s . b ) T h e p r o c e s s o f g e n e c h i p a r r a y T y p i c a l l y , h i g h d e n s i t y c D N A s a r e d e l i v e r e d i n a r o b o t i c s y s t e m o n c o a t e d s u r f a c e s s u c h a s a m i c r o s c o p i c g l a s s s l i d e a n d i m m o b i l i z e d t o t h e s u r f a c e . E a c h D N A f r a g m e n t r e p r e s e n t i n g a g e n e i s a s s i g n e d a s p e c i fi c l o c a t i o n o n t h e a r r a y , u s u a l l y a g l a s s s l i d e , a n d t h e n m i c r o s c o p i c a l l y s p o t t e d ( < 1 m m ) t o t h a t 1 8 1 l o c a t i o n . ‘ 0 6 e N o d r u g ( n e g a t i v e c o n t r o l k T r e a t m e n t ( t e s t ) \ ‘ \ R N A s a m p l e \ R N A s a m p l e l R e v e r s e t r a n s c r i p t i o n 1 c D N A c D N A l T r a n s c r i p t i o n I c R N A ‘ c R N A C y - 3 l a b e l e d \ W M C y - s l a b e l e d D o w n - r e g u l a t e d U p - r e g u l a t e d H y b r i d i z a t l l ; . - » $ - F i g u r e I I I - 3 6 . G e n e r a l s c h e m e f o r a m i c r o c h i p a r r a y a s s a y T h i s m i c r o a r r a y i s t h e n h y b r i d i z e d w i t h a c o m p l e x m i x t u r e o f fl u o r e s c e n t l y l a b e l e d n u c l e o t i d e s d e r i v e d f r o m a s o u r c e s u c h a s c e l l c u l t u r e , p a t i e n t d e r i v e d s a m p l e s , e t c . T h e c h i p s a r e t h e n w a s h e d a n d t h e n s c a n n e d u n d e r a l a s e r . T y p i c a l l y t h i s p r o c e s s c o u l d b e c a r r i e d o u t a s a o l i g o n u c l e o t i d e a r r a y o r a c D N A a r r a y s y s t e m . W h i l e t h e f o r m e r r e q u i r e p r o b e d e s i g n , t h e y h a v e g r e a t e r h y d r i d i z a t i o n s p e c i fi c i t y . c D N A m i c r o a r r a y s o n t h e o t h e r h a n d r e p r e s e n t t h e w h o l e g e n o m e o n a c h i p , h e n c e a n a l y z e a t a ‘ g l o b a l ’ l e v e l . ' 0 7 T h e a b i l i t y t o a n a l y z e t h e a c t i v i t y o f e v e r y g e n e i n a c e l l i s a p o w e r f u l t o o l . I t h e l p s i n a n s w e r i n g t y p i c a l q u e s t i o n s s u c h a s : w h a t i s d i f f e r e n t i n t h e b r a i n o f a p a t i e n t w i t h A l z h e i m e r d i s e a s e ? C a n w e u n d e r s t a n d w h y c a n c e r o c c u r s ? O r 1 8 2 p e r h a p s , w h a t i s h a p p e n i n g i n a b l o o d v e s s e l t h a t i s d e v e l o p i n g a c a r d i o v a s c u l a r p l a q u e ? M i c r o a r r a y t e c h n o l o g y c a n h e l p i n i d e n t i fi c a t i o n o f g e n e s a n d h e l p i n b r i n g i n g o u t t h e p o t e n t i a l o f a t a r g e t e d t h e r a p y . ' m ’ " ’ 9 D i f f e r e n t i a l g e n e e x p r e s s i o n i n - b e t w e e n t i s s u e t y p e s a l s o u n c o v e r s f a c t s a b o u t d e v e l o p m e n t a n d d i f f e r e n t i a t i o n t o w a r n u s w h i c h g e n e s w o u l d b e h a r m f u l t o t a r g e t f o r d i s e a s e t h e r a p y . F o r e x a m p l e i t w o u l d n o t b e w i s e t o t a r g e t a g e n e t h a t i s f o u n d t o p r o m o t e c a n c e r b u t i s a l s o i m p o r t a n t t o h e a r t f u n c t i o n . S o m e g e n e s c o u l d b e r e g u l a r l y a s s a y e d i n o r d e r t o d e t e r m i n e a p e r s o n ’ s r i s k o f d e v e l o p i n g a p a r t i c u l a r d i s e a s e o r d e t e r m i n e t h e c o m p l e x i t y o f t h e s a m e . ’ ° 9 ' " 0 B e s i d e s t h e a b i l i t y t o d e t e r m i n e t h e e f fi c a c y i n m o d e o f a c t i o n o f a s m a l l m o l e c u l e , m i c r o a r r a y s a l s o d e t e r m i n e t h e t h e r a p e u t i c i n d e x o f a c o m p o u n d b y h e l p i n g t o d e t e r m i n e t h e p o t e n t i a l t o x i c b u r d e n . T h e a i m o f t h i s fi e l d - t o x i c o g e n o m i c s - i s t o p r o v i d e a n e f f e c t i v e s c r e e n f o r t o x i c i t y b a s e d o n c h a n g e s i n g e n e e x p r e s s i o n . I t h a s a l s o b e e n s p e c u l a t e d t h a t a r r a y t e c h n o l o g y c o u l d d i a g n o s e d i s e a s e s a t v e r y e a r l y s t a g e s , s o t h a t t h e r a p y c o u l d b e c o m m e n c e d b e f o r e t h e d i s e a s e h a s t h e c h a n c e c a u s e d e t r i m e n t a l e f f e c t s . 1 ' 0 c ) G e n e c h i p a r r a y a n d C a n c e r C a n c e r i s k n o w n t o b e a r e s u l t a s w e l l a s a c a u s e f o r n u m e r o u s c h a n g e s i n g e n e e x p r e s s i o n s . “ 5 F o r e x a m p l e , m o r e t h a n 5 0 % c a n c e r s u n d e r g o a m u t a t i o n i n p 5 3 , a p r o - a p o p t o t i c p r o t e i n . C o m p a r a t i v e s t u d i e s b e t w e e n h e a l t h y a n d d i s e a s e d c e l l s h a v e h e l p e d i n r a p i d i d e n t i fi c a t i o n o f g e n e p r o fi l e s f o r a p a r t i c u l a r t y p e o f c a n c e r . ' ° 6 ‘ ' 0 8 F i n a l l y , t h e r e i s e v i d e n c e o f u s e o f m i c r o a r r a y a n a l y s i s i n d r u g 1 8 3 d e s i g n a n d s c r e e n i n g , t o d e t e r m i n e t h e e x p r e s s i o n o f i m p o r t a n t g e n e s w i t h c o m p o u n d s . 1 0 5 C h r i s t m a n e t a l s t u d i e d t h e g e n e s a n d p a t h w a y s r e g u l a t e d b y t h e m i n H e l a c e l l s u p o n t r e a t m e n t w i t h c a m p t o t h e c i n ? “ T h e y f o u n d a n u p - r e g u l a t i o n i n N F - K B a n d E G F R p a t h w a y s u p o n c a m p t o t h e c i n t r e a t m e n t a n d f u r t h e r s h o w e d t h a t a d j u v a n t t h e r a p y w i t h E G F R i n h i b i t o r A G l 4 7 8 i n c r e a s e d t h e a p o p t o t i c r e s p o n s e o f c a m p t o t h e c i n i n H e L a c e l l s . M i c r o a r r a y s s t i l l n e e d t o u n d e r g o s o m e o p t i m i z a t i o n b e f o r e t h e y c a n b e u s e d i n s u c h c l i n i c a l s c r e e n s , d u e t o t h e p r o b l e m o f f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s c a u s e d b y g e n e s r e a c t i n g w i t h t h e a r r a y i n a n i n a p p r o p r i a t e m a n n e r . C u r r e n t m i c r o a r r a y t e c h n o l o g y a t i t s b e s t s t i l l i n c o r r e c t l y r e p o r t t h e e x p r e s s i o n o f a b o u t 1 % o f g e n e s i t s c r e e n s . A c o m b i n a t i o n w i t h b i o c h e m i c a l e x p e r i m e n t s w o u l d a l m o s t a l w a y s b e r e q u i r e d t o p r o v e a n y s c r e e n i n g r e s u l t s . I m p r o v e m e n t s i n t h e t e c h n o l o g y a r e t h e r e f o r e r e q u i r e d b e f o r e s u c h s c r e e n s a r e f e a s i b l e . ( 1 ) A n i m a l m o d e l s : i n v i v o s t u d i e s E a r l i e r , i n a n a c t i v e c o l l a b o r a t i o n w i t h C h e m g e n i c s T h e r a p e u t i c s I n c o r p o r a t i o n , M e n l o P a r k , C A w e s t u d i e d t h e e f f e c t o f t h e s e d r u g s i n m o u s e m o d e l s . R I F - l t u m o r c e l l s w e r e i n j e c t e d s u b - c u t a n e o u s l y a n d a l l o w e d t o g r o w t o a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 m m 3 . A d m i n i s t r a t i o n o f d r u g s w a s t h e n s t a r t e d a n d t h e n u m b e r o f d a y s t h a t t h e t u m o r t o o k t o r e a c h ‘ f o u r t i m e s ’ i t s o r i g i n a l s i z e , w e r e c o u n t e d ( F i g u r e I I I - 3 7 ) . N o w , i n v i v o m o d e l s a r e b e i n g s t u d i e s i n c o l l a b o r a t i o n w i t h t h e C a r c i n o g e n e s i s L a b a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n c l u d i n g t h e p h a r m a c o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f I I I - 1 8 4 4 . P r e l i m i n a r y s t u d i e s i n v o l v e d s u b c u t a n e o u s i n j e c t i o n a n d g r o w t h o f t u m o r s i n n u d e m i c e . C G X - E 0 6 0 - > € - U n t r e a t e d C o n t r o l R I F - 1 T u m o r s - * — C i s p l a t i n - ’ - C a m p t o t h e c i n ’ 5 6 ‘ - - S P - 4 - 8 4 ( 1 1 1 - 4 ) 0 . 5 5 - / < + C D D P + 5 9 - 4 - 3 4 ( 1 1 1 4 ) g i 4 p A ; j , 4 — c r r + S I M - 8 4 ( m 4 ) 0 > - - , ‘ " = P h I n c - . 5 3 1 ‘ \ \ S 3 2 - N P h M ] : E 1 N ; _ C O O H G q q - 1 d c 1 c 1 . — D a y s F i g u r e I I I - 3 7 . D e c r e a s e i n t h e t u m o r s i z e i n R I F - 1 t u m o r s . T u m o r v o l u m e ( y - a x i s ) v s . D a y s ( x - a x i s ) t o ‘ f o u r t i m e s ’ v o l u m e . C h e m o t h e r a p e u t i c d r u g : 8 m g / 1 k g ; I m i d a z o l i n e s : 4 m g / 1 k g . 3 6 b T h e s e h o w e v e r , c a u s e d t o o m u c h t u m o r b u r d e n f o r t h e a n i m a l s . C e l l s a r e n o w i n j e c t e d i n t r a p e r i t o n e a l l y a n d a l l o w e d t o d e v e l o p a s c i t e s . E a r l i e r o p t i m i z a t i o n s t u d i e s r e v e a l t h a t 4 0 m g / k g o f 1 1 1 - 4 d o e s n o t c a u s e c y t o t o x i c i t y a n d w a s a b l e t o s h o w p o t e n t i a t i v e a c t i v i t y w i t h c i s - p l a t i n . C o n c e n t r a t i o n h i g h e r t h a n 6 0 m g / k g c a u s e s e v e r l i v e r c y t o t o x i c i t y a n d t h o s e l o w e r t h a n 2 0 m g / k g d o n o t h a v e a p o t e n t i a t i v e e f f e c t . F u r t h e r o p t i m i z a t i o n i n g e n e r a t i o n o f t u m o r s a n d p r o b i n g p o t e n t i a t i v e e f f e c t s o f r a c e m i c I I I - 4 a n d e n a n t i o m e r s I I I - 4 a a n d b a r e b e i n g i n v e s t i g a t e d i n a n i m a l m o d e l s b y t h e c a r c i n o g e n e s i s l a b . H . S i g n i f i c a n c e 1 8 5 W e h a v e d e s c r i b e d a n o v e l c l a s s o f N F - K B i n h i b i t o r s , i m i d a z o l i n e I I I - 4 , t h a t i s u n i q u e w i t h r e s p e c t t o i t s i n s i g n i fi c a n t t o x i c i t y a n d r e m a r k a b l e a b i l i t y t o e n h a n c e t h e a n t i c a n c e r e f fi c a c y o f t h e c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t c a m p t o t h e c i n . A n t i t u m o r d r u g s e x e r t t h e i r a n t i t u m o r a c t i v i t y v i a t h e i n i t i a t i o n o f a p o p t o t i c s i g n a l i n g p a t h w a y s u l t i m a t e l y r e s u l t i n g i n c e l l d e a t h . C o n v e n t i o n a l c h e m o t h e r a p y s u f f e r s a c o m p r o m i s e d c l i n i c a l e f fi c a c y d u e t o t h e i n d u c t i o n o f a n t i - a p o p t o t i c f a c t o r s , s u c h a s N F - K B , c o n c u r r e n t w i t h t h e d e s i r e d i n d u c t i o n o f p r o g r a m m e d c e l l d e a t h . I n h i b i t i o n o f t h i s a n t i - a p o p t o t i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r r e t a r d s t h i s c e l l u l a r r e s i s t a n c e . T h e i m i d a z o l i n e I I I - 4 i s t h e l e a d c o m p o u n d f r o m a n o v e l c l a s s o f n o n - t o x i c s m a l l m o l e c u l e s t h a t e n h a n c e t h e e f fi c a c y o f t h e D N A d a m a g i n g a g e n t s a t l o w n a n o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s . C o m b i n a t i o n t h e r a p y o f C E M c e l l s w i t h c a m p t o t h e c i n a n d t h e i m i d a z o l i n e I I I - 4 , p r o v i d e d ~ 7 4 f o l d e n h a n c e m e n t o f e f fi c a c y a f t e r 4 8 h o u r s . T h i s i s p o s t u l a t e d t o p r o c e e d v i a t h e i n h i b i t i o n o f t h e p r o - s u r v i v a l s i g n a l i n g p a t h w a y s , s u c h a s N F - K B , i n a h i g h l y c e l l - s p e c i fi c m a n n e r . I n h i b i t i o n o f t h e N F - K B p a t h w a y w a s f o u n d t o o c c u r v i a t h e i n h i b i t i o n o f d e g r a d a t i o n o f t h e i n h i b i t o r y p r o t e i n I - K B a . I n p a r t i c u l a r , i m i d a z o l i n e I I I - 4 s e l e c t i v e l y s e n s i t i z e d c a n c e r c e l l s t o g e n o t o x i c s t r e s s a t l o w n a n o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s . N o s u c h e f f e c t w a s s e e n i n n o n - c a n c e r o u s fi b r o b l a s t s . T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e t h e p o t e n t i a l o f s m a l l m o l e c u l e N F - K B i n h i b i t o r s t o s e n s i t i z e t u m o r c e l l s t o w a r d s c l a s s i c a l a n t i c a n c e r a g e n t s i n o r d e r t o t a r g e t t h i s c h e m o r e s i s t a n c e a n d e n h a n c e t h e o v e r a l l e f fi c a c y o f a n t i c a n c e r t r e a t m e n t . W o r k t o w a r d s i d e n t i f y i n g t h e t a r g e t , d e t a i l e d m e c h a n i s m o f a c t i o n a n d c l i n i c a l p o t e n t i a l o f t h e s e a g e n t s i s c u r r e n t l y u n d e r i n v e s t i g a t i o n i n o u r l a b o r a t o r i e s . 1 8 6 I . E x p e r i m e n t a l S e c t i o n R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n o v e n - d r i e d g l a s s w a r e u n d e r n i t r o g e n a t m o s p h e r e , u n l e s s o t h e r w i s e n o t e d . A l l c o m m e r c i a l r e a g e n t s w e r e u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r i fi c a t i o n . A l l s o l v e n t s w e r e r e a g e n t g r a d e . T H F w a s f r e s h l y d i s t i l l e d f r o m s o d i u m / b e n z o p h e n o n e u n d e r n i t r o g e n . T o l u e n e , C H 2 C 1 2 , a n d T M S C l w e r e f r e s h l y d i s t i l l e d f r o m C a H z u n d e r n i t r o g e n . A l l r e a c t i o n s w e r e m a g n e t i c a l l y s t i r r e d a n d m o n i t o r e d b y T L C w i t h A n a l t e c h 0 . 2 5 m m p r e - c o a t e d s i l i c a g e l p l a t e s . C o l u m n c h r o m a t o g r a p h y w a s c a r r i e d o u t o n s i l i c a g e l 6 0 ( 2 3 0 — 4 0 0 m e s h ) s u p p l i e d b y E M S c i e n c e . Y i e l d s r e f e r t o c h r o m a t o g r a p h i c a l l y a n d s p e c t r o s c o p i c a l l y p u r e c o m p o u n d s u n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d . M e l t i n g p o i n t s w e r e d e t e r m i n e d o n a M e l - T e m p ( L a b o r a t o r y d e v i c e s ) a p p a r a t u s w i t h a m i c r o s c o p e a t t a c h m e n t . I n f r a r e d s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a N i c o l e t I R / 4 2 s p e c t r o m e t e r . ’ H a n d 1 3 C N M R s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a V a r i a n G e m i n i - 3 0 0 s p e c t r o m e t e r o r a V a r i a n V X R - S O O s p e c t r o m e t e r . C h e m i c a l s h i f t s a r e r e p o r t e d r e l a t i v e t o t h e r e s i d u e p e a k s o f t h e s o l v e n t C D C ] ; ( 8 7 . 2 4 f o r ' H a n d 5 7 7 . 0 f o r I 3 C ) , D M S O - d 6 ( 5 1 4 9 ( 5 ) f o r ' H a n d 8 3 9 . 5 ( 7 ) f o r ' 3 C ) a n d C D 3 O D ( 8 3 . 3 ( 5 ) , 4 . 7 8 ( l ) f o r I H a n d 6 4 9 . 0 ( 7 ) f o r ” 0 . H i g h r e s o l u t i o n m a s s s p e c t r a a n d F A B m a s s s p e c t r a w e r e o b t a i n e d a t t h e M a s s S p e c t r o m e t r y L a b o r a t o r y o f t h e D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , w i t h a J E O L A X - S O S H a n d a J E O L H X - l l O d o u b l e f o c u s i n g m a s s s p e c t r o m e t e r ( J E O L U S A , P e a b o d y , M A ) , r e s p e c t i v e l y . G a s c h r o m a t o g r a p h y / l o w r e s o l u t i o n m a s s s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a H e w l e t t — P a c k a r d 5 8 9 0 S e r i e s H g a s c h r o m a t o g r a p h c o n n e c t e d t o a T R I O - 1 E I m a s s s p e c t r o m e t e r . A l l c h e m i c a l s w e r e o b t a i n e d f r o m S i g m a - A l d r i c h C h e m i c a l C o . a n d u s e d a s r e c e i v e d . 1 8 7 C o m p o u n d I I I - 4 . d l - ( 3 S , 4 S ) - 1 - B e n z y l - 2 , 4 , 5 - t r i p h e n y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 1 H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d P 1 1 W ” H f : N " ' C O O H P h A s o l u t i o n o f b e n z a l d e h y d e ( 0 . 6 g , 5 . 7 m m o l ) , b e n z y l a m i n e ( 0 . 6 1 g , 5 . 7 m m o l ) i n d r y d i c h l o r o m e t h a n e ( 1 2 0 m L ) w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 2 h . 2 , 4 - D i p h e n y 1 - 4 H - o x a z o l i n - S - o n e ( 1 . 3 5 g , 5 . 7 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 8 g , 7 . 4 m m o l ) w e r e a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 6 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e p r o d u c t w a s p u r i fi e d b y s i l i c a - g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y w i t h 1 : 5 e t h a n o l / e t h y l a c e t a t e t o a f f o r d 2 . 1 g o f t h e p r o d u c t i n 6 5 % y i e l d a s a n o f f - w h i t e s o l i d . M . P . ; d e c o m p o s e s a t 1 5 3 - 1 5 5 ° C . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) : d 3 . 8 ( 1 H , d , J = 1 5 . 6 H z ) , 4 . 6 2 ( 1 H , d , J = 1 5 . 6 H z ) , 4 . 9 8 ( 1 H , s ) , 6 . 5 8 ( 2 H , d , J = 8 . 1 H z ) , 7 . 0 5 - 7 . 6 5 ( 1 6 H , m ) , 7 . 9 ( 2 H , d , J = 7 . 2 H z ) ; ” C N M R ( 7 5 M H z ) ( C D C 1 3 ) : d 4 8 . 3 , 7 5 . 6 , 7 9 . 1 , 1 2 3 . 1 , 1 2 5 . 7 , 1 2 6 . 7 , 1 2 7 . 3 , 1 2 7 . 4 , 1 2 7 . 9 , 1 2 8 . 1 , 1 2 8 . 2 , 1 2 8 . 8 , 1 2 8 . 9 , 1 2 9 , 1 2 9 . 3 , 1 3 2 . 9 , 1 3 3 . 8 . 1 3 6 , 1 4 3 . 1 , 1 6 4 . 8 , 1 6 8 . 1 ; I R ( n e a t ) : 3 4 0 0 c m ' l ( v e r y b r o a d ) , 1 7 3 8 c m " ; H R M S ( E l ) : c a l c u l a t e d f o r C 2 9 H 2 4 N 2 0 2 [ ( M - H ) - C 0 2 ] + 3 8 7 . 1 5 2 6 a n d o b s e r v e d [ ( M - H ) - C 0 2 ] + 3 8 7 . 1 5 3 9 . C o m p o u n d I I I - 4 a a n d I I I - 4 b . I n a fl a m e d r i e d fl a s k , u n d e r n i t r o g e n , a w e l l - s t i r r e d s u s p e n s i o n o f 1 - B e n z y l - 2 , 4 , 5 - t r i p h e n y l - 4 , 5 - d i h y d r o - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d ( 0 . 1 g , 0 . 1 8 m m o l ) i n d r y m e t h y l e n e c h l o r i d e ( 2 0 m l ) w a s m a i n t a i n e d a t 0 ° C . T o t h i s m i x t u r e w a s a d d e d E D C I . H C 1 ( 3 6 m g , 0 . 1 8 m m o l ) , f o l l o w e d b y D M A P ( 2 2 m g , 0 . 1 8 m m o l ) a n d s t i n e d f o r 2 0 m i n u t e s . 1 8 8 ( R ) - ( + ) - 1 - P h e n y l - e t h a n o l ( 4 3 . 5 m g , 2 e q . , 0 . 3 6 m m o l ) w a s a d d e d a n d m i x t u r e s t i r r e d o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e r e a c t i o n m i x t u r e s w a s w a s h e d , 2 N H C I ( 2 x 2 0 m l ) , s a t u r a t e d s o d i u m b i c a r b o n a t e ( 2 x 2 0 m l ) , a n d t h e n w i t h b r i n e ( 2 0 m l ) . T h e o r g a n i c l a y e r d r i e d o v e r s o d i u m s u l f a t e a n d e v a p o r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . T h e c r u d e p r o d u c t w a s p u r i fi e d b y c o l u m n s i l i c a - g e l c h r o m a t o g r a p h y u s i n g 4 0 % e t h e r / h e x a n e m i x t u r e . T h e s e w e r e c h a r a c t e r i z e d a n d s u b j e c t e d t o h y d r o l y s i s u n d e r r e fl u x w i t h 2 N N a O H / E t O H s e p a r a t e l y . T h e r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e c o o l e d a n d a c i d i fi e d t o p H = 3 a n d e x t r a c t e d w i t h C H C 1 3 . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d a n d e v a p o r a t e d i n v a c u o t o o b t a i n t h e t w o e n a n t i o m e r s i n 4 4 % y i e l d . S , S , R - l - B e n z y l - Z , 4 , 5 - t r i p h e n y l - 4 , S - d i h y d r o - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d 1 - p h e n y I - e t h y l e s t e r , I I I - 9 P b P h ’ \ N ' “ O H O P h P h / k N y P h O [ a ] D = + 1 9 . 4 5 ° , c = 1 , C H C l 3 ; I H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C 1 3 : 5 : 0 . 8 7 3 ( d , J = 6 . 6 , 3 H ) , 3 . 7 3 ( d , J = 1 5 H z , 1 H ) , 4 . 5 6 ( d , J = 1 5 H z , 1 H ) , 4 . 9 3 ( s , 1 H ) , 5 . 2 3 ( q , J : 6 . 5 , 1 H ) , 6 . 7 3 - 7 . 7 2 ( m , 2 5 H ) ; 1 3 C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) C D C 1 3 : 2 1 . 8 0 , 4 8 . 5 3 , 7 2 . 7 7 , 7 3 . 2 6 , 8 2 . 3 2 , 1 2 5 . 7 3 , 1 2 6 . 7 5 , 1 2 7 . 2 3 , 1 2 7 . 3 0 , 1 2 7 . 3 8 , 1 2 7 . 9 4 , 1 2 8 . 2 6 , 1 2 8 . 3 7 , 1 2 8 . 5 4 , 1 2 8 . 5 8 , 1 2 8 . 7 4 , 1 3 0 . 2 9 , 1 3 0 . 3 4 , 1 3 6 . 4 7 , 1 3 7 . 6 9 , 1 4 1 . 3 7 , 1 4 3 . 5 8 , 1 6 5 . 3 8 , 1 6 9 . 7 9 ; I R ( C H C 1 3 ) : 3 5 8 4 . 2 , 3 0 6 3 . 4 , 3 0 3 2 . 5 , 2 9 2 6 . 4 , 2 8 5 5 . 0 , 1 7 3 6 . 1 , 1 5 9 5 . 3 , 1 4 9 5 . 0 , 1 4 1 2 . 1 , 1 0 6 4 . 8 c m ' l E I M S : m / z = 5 3 7 . 2 ( M + H ) , 3 8 7 . 3 ( M - C O O C H ( M e ) P h ) . H R M S ( F A B + ) ( C 3 7 H 3 3 0 2 N 2 ) ( M + H ) 5 3 7 . 2 5 4 2 , f o u n d , 5 3 7 . 2 5 4 2 . 1 8 9 R , R , R - l - B e n z y l - 2 , 4 , 5 - t r i p h e n y l - 4 , 5 - d i h y d r o - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d 1 - p h e n y l - e t h y l e s t e r , I I I - 1 0 . 4 P u . . 0 p . h N é X o J L O K P h / k N P h [ 0 t ] D = - 7 . 7 7 ° , c = 1 , C H C I 3 ; l H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C 1 3 : 5 1 . 2 0 5 ( d , J = 6 . 6 , 3 H ) , 3 . 7 3 ( d , J = 1 5 H z , 1 H ) , 4 . 5 6 ( d , J = 1 5 H z , 1 H ) , 4 . 9 5 ( s , 1 H ) , 5 . 2 3 ( q , 1 : 6 . 5 , 1 H ) , 6 . 8 0 - 7 . 8 1 ( m , 2 5 H ) 1 3 C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) C D C 1 3 : 2 1 . 7 5 , 4 8 . 5 0 , 7 3 . 4 2 , 7 3 . 4 9 , 8 2 . 8 7 , 1 2 6 . 0 1 , 1 2 6 . 8 7 , 1 2 7 . 1 4 , 1 2 7 . 2 9 , 1 2 7 . 3 5 , 1 2 7 . 9 5 , 1 2 7 . 9 9 , 1 2 8 . 1 3 , 1 2 8 . 2 0 , 1 2 8 . 4 0 , 1 2 8 . 5 7 , 1 2 8 . 7 5 , 1 3 0 . 2 3 , 3 6 . 7 2 , 1 3 7 . 2 8 , 1 4 1 . 0 0 , l 4 3 . 9 5 , 1 6 5 . 5 0 , 1 6 9 . 9 4 ; I R ( C H C 1 3 ) : 3 5 8 4 . 2 , 3 0 6 3 . 4 , 3 0 3 2 . 5 , 2 9 2 4 . 5 , 2 8 5 5 . 0 , 1 7 3 6 . 2 , 1 5 9 5 . 3 , 1 4 9 5 . 0 , 1 4 1 2 . 1 , 1 0 6 4 . 8 c m ' 1 E I M S : m / z = 5 3 7 . 3 ( M - l - H ) , 3 8 7 . 3 ( M - C O O C H ( M e ) P h ) H R M S ( F A B + ) ( C 3 7 H 3 3 0 2 N 2 ) ( M + H ) 5 3 7 . 2 5 4 2 , f o u n d , 5 3 7 . 2 5 4 2 . ( 4 8 , S S ) - 1 - b e n z y l - 4 , S - d i h y d r o - Z , 4 , S - t r i p h e n y l - 1 H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d , I I I - 4 a P h \ \ P h N P h ~ ( \ l " ' H , < ° N . i 3 1 1 0 " H M . P . d e c o m p o s e d a t 1 4 8 - 1 4 9 ° C . [ ( I h ) : - 4 7 . 5 8 ° , c = 1 , C H C 1 3 ; ' H N M R ( 3 0 0 M H z ) , c o c a : 5 3 . 9 6 ( d , J = 1 5 H z , 1 H ) , 4 . 8 1 ( d , J = 1 5 H z , 1 H ) , 5 . 0 5 ( s , 1 H ) , 6 . 6 1 ( 2 H , d , J = 8 . 1 H z ) , 7 . 0 9 - 7 . 9 2 ( 1 6 H , m ) , 7 . 9 0 ( 2 H , d , J = 7 . 2 H z ) , 1 1 . 4 2 ( s , 1 H ) 1 3 C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) C D C 1 3 : 4 9 . 3 7 , 7 5 . 3 3 , 7 6 . 0 6 , 1 2 1 . 2 9 , 1 2 5 . 9 3 , 1 2 7 . 6 5 , 1 2 9 . 2 4 , 1 2 9 . 4 0 , 1 2 9 . 4 2 , 1 2 9 . 8 6 , 1 3 0 . 0 2 , 1 3 0 . 1 4 , 1 3 0 . 7 6 , 1 3 1 . 6 9 , 1 3 1 . 8 2 , 1 3 2 . 1 8 , 1 3 4 . 6 2 , 1 3 8 . 5 4 , 1 6 6 . 6 9 , 1 6 7 . 7 1 ; 1 9 0 I R ( C H C 1 3 ) : 3 5 8 4 . 2 , 3 0 6 3 . 4 , 2 9 2 4 . 5 , 1 7 4 3 . 9 , 1 5 5 8 . 9 , 1 4 5 6 . 4 , 1 2 5 3 . 9 c m ' l E I M S : m / z = 3 8 7 . 3 ( N I - C O O H ) I ' I R M S ( F A B + ) ( C 2 9 H 2 5 0 2 N 2 ) ( M + H ) 4 3 3 . 1 9 1 6 , f o u n d , 4 3 3 . 1 9 1 4 . ( 4 R , 5 R ) - 1 - b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 2 , 4 , 5 - t r i p h e n y l - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d ( I I I - 4 b . H C l ) P h \ \ N f h P h \ “ H o ‘ W x P h O - H M . P . d e c o m p o s e d a t 1 4 7 - 1 4 8 ° C . [ 0 1 1 0 : + 4 7 . 8 7 ° , c = 1 , C H C 1 3 ; M . P . d e c o m p o s e d a t 1 4 7 - 1 4 9 ° C . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C l 3 : 5 4 . 0 2 ( d , J = 1 5 H z , 1 H ) , 4 . 8 4 ( d , J = 1 5 H z , 1 H ) , 5 . 0 9 ( s , 1 H ) , 6 . 6 1 ( 2 H , d , J = 8 . 1 H z ) , 7 . 1 2 - 7 . 7 7 ( 1 6 H , m ) , 7 . 9 7 ( 2 H , d , J = 7 . 2 H z ) 1 3 C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) C D C 1 3 : 4 8 . 7 6 , 7 4 . 9 6 , 7 7 . 0 3 , 1 2 1 . 4 5 , 1 2 5 . 9 0 , 1 2 6 . 5 7 , 1 2 7 . 1 5 , 1 2 8 . 2 9 , 1 2 8 . 4 8 , 1 2 8 . 5 7 , 1 2 8 . 8 1 , 1 2 9 . 1 2 , 1 2 9 . 3 9 , 1 2 9 . 5 6 , 1 2 9 . 6 5 , 1 3 0 . 0 9 , 1 3 2 . 4 7 , 1 3 2 . 8 4 , 1 3 3 . 0 1 , 1 3 4 . 1 4 , 1 3 9 . 9 6 , 1 6 5 . 8 4 , 1 6 8 . 3 4 ; I R ( C H C 1 3 ) : 3 5 8 4 . 2 , 3 0 6 3 . 4 , 2 9 2 4 . 5 , 1 7 4 1 . 9 , 1 5 5 6 . 7 , 1 4 5 6 . 4 , 1 2 2 1 . 1 c m ’ l E I M S : m / z = 3 8 6 . 3 ( M - C O O H - H ) H R M S ( F A B + ) ( C 2 9 H 2 5 0 2 N 2 ) ( M + H ) 4 3 3 . 1 9 1 6 , f o u n d , 4 3 3 . 1 9 1 5 . L R M S ( F A B - ) 3 5 , 3 7 . ( 4 S , S S ) - b e n z y l 1 - b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 2 , 4 , 5 - t r i p h e n y l - 1 H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l a t e , I I I - 1 1 P h 7 P h N D 7 " . . N , 0 P H : ( ‘ 2 \ / O I n a fl a m e d r i e d fl a s k , u n d e r n i t r o g e n , a w e l l - s t i r r e d s u s p e n s i o n o f 1 1 1 - 4 ( 0 . 0 5 6 g , 0 . 1 3 m m o l ) i n d r y m e t h y l e n e c h l o r i d e ( 2 0 m l ) w a s m a i n t a i n e d a t 0 ° C . T o t h i s m i x t u r e w a s a d d e d E D C I . H C 1 ( 2 7 . 5 m g , 0 . 1 4 m m o l ) , f o l l o w e d b y D M A P ( 1 7 . 5 m g , 0 . 1 4 m m o l ) a n d 1 9 1 s t i r r e d f o r 2 0 m i n u t e s . B e n z y l a l c o h o l ( 1 5 . 4 m g , 0 . 1 4 m m o l ) w a s a d d e d a n d m i x t u r e s t i r r e d o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e r e a c t i o n m i x t u r e s w a s w a s h e d , 2 N H C l ( 2 x 2 0 m l ) , s a t u r a t e d s o d i u m b i c a r b o n a t e ( 2 x 2 0 m l ) , a n d t h e n w i t h b r i n e ( 2 0 m l ) . T h e o r g a n i c l a y e r d r i e d o v e r s o d i u m s u l f a t e a n d e v a p o r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . T h e c r u d e p r o d u c t w a s p u r i fi e d b y c o l u m n s i l i c a - g e l c h r o m a t o g r a p h y u s i n g 4 0 % e t h e r / h e x a n e m i x t u r e . A l o w m e l t i n g w a x y s o l i d w a s o b t a i n e d i n 7 0 % y i e l d ( 4 7 . 1 m g ) ; ( 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C 1 3 : 5 : 3 . 5 9 ( m , 2 H ) , 3 . 9 1 ( d , 1 H , J = 9 . 3 H z ) , 4 . 2 6 ( s , b r , 1 H ) , 4 . 6 6 ( s , 1 H ) , 4 . 7 8 ( d , 1 H , J = 9 . 3 H z ) , 6 . 7 4 - 7 . 9 1 ( m , 2 0 H ) ; 1 3 C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) C D C 1 3 : 2 9 . 6 9 , 4 9 . 0 0 , 6 6 . 7 6 , 7 3 . 9 3 , 1 2 5 . 6 8 , 1 2 7 . 0 6 , 1 2 7 . 5 5 , 1 2 7 . 7 2 , 1 2 7 . 8 2 , 1 2 8 . 5 3 , 1 2 8 . 5 9 , 1 2 8 . 7 4 , 1 2 8 . 8 5 , 1 2 9 . 0 8 , 1 3 0 . 9 1 , 1 6 6 . 7 4 ; I R ( C H C 1 3 ) : 3 2 4 5 . 3 , 2 9 2 4 . 5 , 1 5 9 3 . 4 , 1 3 9 0 . 9 c m " . E I M S : m / z = 3 8 7 . 2 ( M - C H 2 0 H ) . H R M S ( E l ) : m / z c a l c d . f o r C 2 9 H 2 6 N 2 0 [ M + H ] , 5 2 2 . 2 3 0 7 ; f o u n d , 5 2 2 . 2 3 8 6 . ( 4 8 , S S ) - l - b e n z y | - 4 , S - d i h y d r o - S - ( Z - n i t r o p h e n y l ) - 2 , 4 - d i p h e n y l - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d , 1 1 1 - 1 2 0 N P h 2 N O P h ~ < N L . _ C O O H P b A s o l u t i o n o f o - n i t r o b e n z a l d e h y d e ( 1 g , 6 . 6 m m o l ) , b e n z y l a m i n e ( 0 . 7 g , 6 . 6 m m o l ) i n b e n z e n e ( 1 0 0 m l ) w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 3 h . B e n z e n e w a s r e m o v e d i n v a c u o a n d C H 2 C 1 2 ( a n h y d r o u s ) w a s a d d e d 2 , 4 - d i p h e n y l - 4 H o x a z o l i n - S - o n e ( 1 . 3 g , 5 . 4 8 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 8 g , 7 . 1 2 m m o l ) w e r e a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d a t r . t f o r 4 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p u r i fi e d o n a s i l i c a p l u g u n d e r 3 0 % M e O H i n 1 9 2 E t O A c ; y i e l d : 1 5 % ( 0 . 3 9 g ) l H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C 1 3 : 5 : 3 . 9 5 ( d , 1 H , J = 9 . 0 H z ) , 4 . 7 3 ( d , 1 H , J = 9 . 0 H z ) , 6 . 1 5 ( s , 1 H ) , 6 . 6 3 - 8 . 0 0 ( m , 1 9 H ) ; I R ( C H C I 3 ) : 2 9 2 4 . 5 , 1 7 4 0 . 0 1 , 1 6 3 5 . 8 , 1 5 2 7 . 3 , 1 3 5 2 . 3 c m " . E I M S : m / z = 3 8 7 . 2 ( M - C O 0 M e ) . H R M S ( E l ) : m / z c a l c d . f o r C 2 9 H 2 3 N 3 O 4 [ M - l - H ] , ( F A B + ) 4 7 8 . 1 7 7 0 ; f o u n d , 4 7 8 . 1 7 7 0 . ( F A B - ) n o 3 5 , 3 7 . A n a l . C a l c d . ( C 2 9 H 2 3 N 3 0 4 ) C . H . N . ( 4 S , 5 S ) - m e t h y l l - b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 2 , 4 , 5 - t r i p h e n y l - 1 H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l a t e , I I I - 1 3 P h ’ \ H I " ) 1 P " \ N ” P u A s o l u t i o n o f 1 1 1 - 4 ( 0 . 4 8 g , 1 . 1 1 m m o l ) i n M e O H ( 8 m l ) w a s m a i n t a i n e d a t 0 ° C . T M S C H N ; ( 2 M s o l u t i o n i n e t h e r ) w a s a d d e d d r o p w i s e ( 0 . 8 7 m l , 1 . 7 3 m m o l ) a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r 5 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s c o n c e n t r a t e d i n v a c u o a n d t h e p r o d u c t w a s s u b j e c t e d t o c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( g r a d i e n t , fi r s t r u n 1 : 1 E t 2 0 : h e x a n e ) a n d t h e n b y e l u t i n g w i t h e t h e r . T h e o n l y p r o d u c t ( R f = 0 . 5 5 ) w a s i s o l a t e d . T h e f r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d a n d a n d d r i e d i n v a c u o t o g i v e a l o w m e l t i n g s o l i d i n 7 0 % y i e l d ( 0 . 3 6 g ) ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C 1 3 : 8 : 3 . 1 8 ( s , 3 H ) , 3 . 8 4 ( d , 1 H , J = 9 . 6 H z ) , 4 . 6 2 ( d , 1 H , J = 9 . 6 H z ) , 4 . 9 3 ( s , 1 H ) , 6 . 7 0 - 7 . 7 5 ( m , 2 0 H ) ; 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C I 3 : 4 8 . 6 9 , 5 1 . 8 6 , 7 3 . 8 3 , 8 2 . 5 1 , 1 2 6 . 7 3 , 1 2 7 . 0 9 , 1 2 7 . 3 5 , 1 2 7 . 4 5 , 1 2 8 . 0 3 , 1 2 8 . 3 3 , 1 2 8 . 3 8 , 1 2 8 . 4 5 , 1 2 8 . 5 9 , 1 2 8 . 8 7 , 1 3 0 . 4 3 , 1 3 6 . 4 3 , 1 3 7 . 7 2 , 1 4 3 . 8 5 , 1 6 5 . 5 8 , 1 7 1 . 3 0 ; I R ( C H C 1 3 ) : 3 0 6 3 . 4 , 2 9 4 7 . 6 , 1 7 3 4 . 2 , 1 5 9 5 . 3 , 1 4 4 8 . 7 3 c m " . E I M S : m / z = 3 8 7 . 2 ( M - C O 0 M e ) . H R M S ( E I ) : m / z c a l c d . f o r C 3 0 H 2 7 N 2 0 2 [ M + ] , 4 4 6 . 2 0 7 3 ; f o u n d , 4 4 6 . 2 0 7 2 . ( 4 S , S S ) - 1 - b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 2 , 4 , 5 - t r i p h e n y l - l H - i m i d a z o l - 4 - y l ) m e t h a n o l , I I I - 1 4 1 9 3 P h P h F W T " P r . N { H 2 0 1 4 p fi A w e l l s t i r r e d s o l u t i o n o f L i A l H 4 ( 5 1 . 3 m g , 1 . 3 8 m m o l ) i n T H F ( 6 m l ) w a s m a i n t a i n e d a t 0 ° C f o r 1 0 ’ . A d d e d a s o l u t i o n o f 1 1 1 - 1 3 ( 0 . 4 2 g , 1 . 1 6 m m o l ) i n T H F ( 2 m l ) d r o p w i s e a n d a l l o w e d t o s i t r f o r 3 0 ’ . T h e r e a c t i o n w a s f o l l o w e d u p w i t h T L C . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s d i l u t e d w i t h a n e x c e s s o f E t O A c ( 5 0 m l ) a n d q u e n c h e d w i t h i c e c o l d s a t . N I - I 4 C l ( c a u t i o n : N H 4 C 1 s o l u t i o n k e p t a t 0 ° C f o r a b o u t 3 0 m i n . ; a n d s h o u l d b e a d d e d w i t h e x t r e m e c a r e ; h i g h l y e x o t h e r m i c r e a c t i o n a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e s h o u l d b e a t 0 ° C ) . E x t r a c t e d t h e p r o d u c t f r o m t h e o r g a n i c l a y e r a n d e v a p o r a t e d t h e o r g a n i c l a y e r i n v a c u o . P u r i fi e d t h e p r o d u c t o n c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y b y e l u t i n g w i t h e t h e r . C o l o r l e s s l o w m e l t i n g s o l i d w a s o b t a i n e d i n 6 2 % y i e l d ( 0 . 2 4 g ) ; l H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C l 3 I 8 : 3 . 5 9 ( m , 2 H ) , 3 . 9 1 ( d , 1 H , J = 9 . 3 H z ) , 4 . 2 6 ( 5 , b r , 1 H ) , 4 . 6 6 ( s , 1 H ) , 4 . 7 8 ( d , 1 H , J = 9 . 3 H z ) , 6 . 7 4 - 7 . 9 1 ( m , 2 0 H ) ; l 3 C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) C D C 1 3 : 2 9 . 6 9 , 4 9 . 0 0 , 6 6 . 7 6 , 7 3 . 9 3 , 1 2 5 . 6 8 , 1 2 7 . 0 6 , 1 2 7 . 5 5 , 1 2 7 . 7 2 , 1 2 7 . 8 2 , 1 2 8 . 5 3 , 1 2 8 . 5 9 , 1 2 8 . 7 4 , 1 2 8 . 8 5 , 1 2 9 . 0 8 , 1 3 0 . 9 1 , 1 6 6 . 7 4 ; I R ( C H C 1 3 ) : 3 2 4 5 . 3 , 2 9 2 4 . 5 , 1 5 9 3 . 4 , 1 3 9 0 . 9 c m " . E I M S : m / z = 3 8 7 . 2 ( M - C H 2 0 H ) . H R M S ( E 1 ) : m / z c a l c d . f o r C 2 9 H 2 6 N 2 0 [ M + H ] , 4 1 9 . 2 1 2 2 ; f o u n d , 4 1 9 . 2 1 2 2 . ( 4 S , 5 R ) - 5 - ( e t h o x y c a r b o n y l ) - 1 - b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 2 , 4 - d i p h e n y l - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d , 1 1 1 - 1 5 1 9 4 A s o l u t i o n o f e t h y l g l y o x a l a t e ( 0 . 9 5 g , 9 . 3 4 m m o l ) a s a 5 0 % s o l u t i o n i n t o l u e n e ( 1 . 0 3 g m l " ) , b e n z y l a m i n e ( 1 g , 9 . 3 4 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H z C l z ( 5 0 m l ) w a s s t i r r e d o v e r N a 2 8 0 4 ( a n h y d r o u s , 5 g ) u n d e r n i t r o g e n f o r 5 h . 2 , 4 - d i p h e n y l - 4 H o x a z o l i n — S - o n e ( 0 . 5 g , 2 . 1 1 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 2 9 g , 2 . 7 4 m m o l ) w e r e a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d a t r . t f o r 4 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d b y M e O H — e t h e r ( 1 : 7 ) ; y i e l d : 6 5 % 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C 1 3 + 5 d r o p s C D 3 0 D : 6 : 0 . 7 4 ( m , 3 H ) , 3 . 6 6 ( m , 2 H ) , 4 . 3 2 ( d , 1 H , J = 1 1 . 7 H z ) , 4 . 8 1 ( d , 1 H , J = 1 1 . 7 H z ) , 5 . 7 3 ( s , 1 H ) , 7 . 1 3 - 7 . 6 9 ( m , 1 5 H ) ; 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C 1 3 : 1 3 . 1 5 , 5 0 . 4 9 , 6 1 . 8 8 , 7 0 . 7 6 , 7 7 . 2 , 1 2 2 . 1 , 1 2 6 . 9 , 1 2 7 . 6 , 1 2 8 . 1 3 , 1 2 8 . 5 3 , 1 2 8 . 9 , 1 2 9 . 2 4 , 1 2 9 . 4 6 , 1 3 2 . 0 7 , 1 3 3 . 5 3 , 1 3 4 . 2 3 , 1 6 5 . 6 4 . 1 6 6 . 7 9 , 1 7 0 . 0 8 I R ( C H C l 3 ) : 2 9 2 4 . 5 , 1 7 3 8 . 1 . 0 1 , 1 6 3 9 . 7 c m " . E I M S : m / z = 3 8 3 . 3 ( M — C O O H ) . C h e m i c a l s a n d a n t i b o d i e s C a m p t o t h e c i n a n d T N F - a w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a . A L L N w a s p u r c h a s e d f r o m C a l b i o c h e m . P a r t h e n o l i d e a n d m o n o c l o n a l a n t i b o d y f o r s u p e r s h i f t s f o r p 6 5 w e r e p u r c h a s e d f r o m S a n t a c r u z B i o t e c h n o l o g y . H e L a c e l l s w e r e a k i n d g i f t f r o m P r o f . J o h n L a P r e s , D e p t . o f B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . C e l l c u l t u r e . C E M c e l l s ( ( C C R F - C E M ) ; A m e r . T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n , R o c k v i l l e , M D ) w e r e g r o w n i n R P M I - 1 6 4 0 M e d i a ( G i b c o - B R L , R o c k v i l l e , M D ) s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m , p e n i c i l l i n ( 6 1 4 n g / m L ) , s t r e p t o m y c i n ( 1 0 u g / m L ) a n d H E P E S b u f f e r , p H 7 . 2 a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 . H T 1 0 8 0 a n d H e l a c e l l s w e r e c u l t u r e d i n D M E M s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m , p e n i c i l l i n ( 6 1 4 n g / m L ) , s t r e p t o m y c i n ( 1 0 u g / m L ) a n d H E P E S b u f f e r , p H 7 . 2 a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 . S L 8 9 c e l l s w e r e c u l t u r e d i n M E M s u p p l e m e n t e d 1 9 5 w i t h 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m , p e n i c i l l i n ( 6 1 4 n g / m L ) , s t r e p t o m y c i n ( 1 0 r i g / m L ) a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 . O p t i m i z a t i o n o f c o n c e n t r a t i o n s o f c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s f o r a p o p t o s i s . C e l l s w e r e c u l t u r e d a s d e s c r i b e d a b o v e . D M S O w a s u s e d a s t h e v e c t o r f o r a l l d r u g s a n d a d d e d i n t h e c o n t r o l e x p e r i m e n t s . C e l l c u l t u r e s w e r e t r e a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f t h e C a m p t o t h e c i n o r c i s - p l a t i n a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 A t t i m e p o i n t s 0 , 6 , 1 2 , 2 4 , 4 8 h , a n a l i q u o t e o f t h e c e l l c u l t u r e w a s t r a n s f e r r e d t o a 9 6 - w e l l p l a t e a n d m i x e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f A p o - O N E T M H o m o g e n o u s C a s p a s e - 3 / 7 a s s a y r e a g e n t ( P r o m e g a C o r p o r a t i o n ) . T h e c o n t e n t s o f t h e p l a t e w e r e g e n t l y m i x e d a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e f o r 3 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e fl u o r e s c e n c e o f e a c h w e l l w a s t h e n m e a s u r e d o n a M o l e c u l a r I m a g e r F X P r o a t 5 3 2 n m . A l l r e p o r t e d d a t a i s t h e a v e r a g e o f t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s u n l e s s o t h e r w i s e i n d i c a t e d . C e l l s w e r e c u l t u r e d a s d e s c r i b e d a b o v e . D M S O w a s u s e d a s t h e v e c t o r f o r a l l d r u g s a n d a d d e d i n t h e c o n t r o l e x p e r i m e n t s . C e l l c u l t u r e s w e r e t r e a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c y t o t o x i c a g e n t ( t a x o l , v i n c r i s t i n e , v i n b l a s t i n e . c a m p t o t h e c i n , t o p o t e c a n , e t o p o s i d e , d a u n o m y c i n , d o x o r u b i c i n o r c i s - p l a t i n ) a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 A t t i m e p o i n t s 0 , 6 , 1 2 , 2 4 , 4 8 h , a n a l i q u o t e ( 1 0 0 p l ) o f t h e c e l l c u l t u r e w a s t r a n s f e r r e d t o a 9 6 - w e l l p l a t e a n d m i x e d w i t h 2 0 u ] o f M T S a s s a y r e a g e n t ( P r o m e g a C o r p o r a t i o n ) . T h e c o n t e n t s o f t h e p l a t e w e r e g e n t l y m i x e d a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e f o r 6 0 m i n u t e s a t 3 7 ° C . T h e fl u o r e s c e n c e o f e a c h w e l l w a s t h e n m e a s u r e d o n a B i o r a d m i c r o p l a t e r e a d e r a t 4 9 0 n m . A l l r e p o r t e d d a t a i s t h e a v e r a g e o f t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s u n l e s s o t h e r w i s e i n d i c a t e d . 1 9 6 M e a s u r e m e n t o f a p o p t o s i s u s i n g c a s p a s e 3 n a s s a y C E M c e l l s ( C C R F - C E M ) ; A m e r . T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n , R o c k v i l l e , M D ) w e r e g r o w n i n R P M I - l 6 4 0 M e d i a ( G i b c o - B R L , R o c k v i l l e , M D ) s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m , p e n i c i l l i n ( 6 1 4 n g / m L ) , s t r e p t o m y c i n ( 1 0 u g / m L ) a n d H E P E S b u f f e r , p H 7 . 2 a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 . D M S O w a s u s e d a s t h e v e c t o r f o r a l l d r u g s a n d w a s a d d e d i n t h e c o n t r o l e x p e r i m e n t s . C e l l c u l t u r e s w e r e t r e a t e d w i t h 0 . 1 n M , 0 . 0 1 1 1 M o r 1 n M o f t h e i m i d a z o l i n e 1 1 1 - 4 a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 a t m o s p h e r e f o r 3 0 m i n u t e s . C a m p t o t h e c i n w a s a d d e d a t c o n c e n t r a t i o n s 5 0 n M , 1 1 1 M , 0 . 3 u M , 0 . 1 u M , 0 . 0 3 n M , 0 . 0 1 n M , 3 n M , 1 n M o r 0 . 3 n M a n d f u r t h e r i n c u b a t e d . A n a l i q u o t e w a s t r a n s f e r r e d t o a 9 6 - w e l l p l a t e a t v a r i o u s t i m e p o i n t s 0 , 6 , 1 2 , 2 4 , 4 8 h o u r s a n d m i x e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f A p o - O N E T M H o m o g e n o u s C a s p a s e - 3 / 7 a s s a y ( P r o m e g a C o r p o r a t i o n ) r e a g e n t . T h e c o n t e n t s o f t h e p l a t e w e r e g e n t l y m i x e d a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e f o r 1 h o u r . T h e fl u o r e s c e n c e o f e a c h w e l l w a s t h e n m e a s u r e d o n a M o l e c u l a r I m a g e r F X P r o a t 5 3 2 n m . A l l r e p o r t e d d a t a i s t h e a v e r a g e o f t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s u n l e s s o t h e r w i s e i n d i c a t e d . T h e s e w e r e t h e n p u t i n t o G r a p h P a d p r i s m a n d C C 9 5 w e r e c a l c u l a t e d u s i n g t h e e q u a t i o n f o r t h e s i g r n o i d a l c u r v e f o r v a r i a b l e s l o p e . D a t a w a s n o r m a l i z e d b e t w e e n m a x i m u m a n d m i n i m u m c e l l d e a t h r e l a t i v e t o t h e r e s p e c t i v e c o n t r o l s e t s . E M S A a s s a y f o r N F - K B - D N A b i n d i n g E M S A a s s a y f o r N F - K B - D N A b i n d i n g : C E M c e l l s ( C C R F - C E M ; A m e r . T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n , R o c k v i l l e , M D ) w e r e g r o w n i n R P M I - l 6 4 0 m e d i a ( G i b c o - B R L , R o c k v i l l e , M D ) s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m , p e n i c i l l i n ( 6 1 4 n g / m L ) , s t r e p t o m y c i n ( 1 0 u g / m L ) a n d H E P E S b u f f e r , p H 7 . 2 a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 . C e l l s ( 1 . 6 x 1 0 ° c e l l s / m L ) w e r e s u b s e q u e n t l y t r e a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c o m p o u n d I I I - 4 f o r 3 0 m i n . a t 1 9 7 3 7 ° C a n d 5 % C 0 2 f o l l o w e d b y T N F - a ( 0 . 4 p g ) o r c a m p t o t h e c i n ( S i g m a - A l d r i c h ) ( l . 0 u M ) s t i m u l a t i o n f o r a n a d d i t i o n a l 3 0 m i n u t e s o r 2 h o u r s , r e s p e c t i v e l y . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n , w a s h e d i n i c e c o l d P B S a n d t h e n u c l e a r e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . 9 7 T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f t h e e x t r a c t s w a s d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o t h e B r a d f o r d m e t h o d ( 1 9 7 6 ) w i t h B i o R a d r e a g e n t s . N u c l e a r e x t r a c t s ( 2 0 p g t o t a l p r o t e i n ) w e r e i n c u b a t e d f o r 2 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h a d o u b l e s t r a n d e d C y 3 l a b e l e d N F - K B c o n s e n s u s o l i g o n u c l e o t i d e , 5 ' - A G ’ I T G A G G G G A C T I ‘ I ‘ C C C A G G C - 3 ' ( 0 . 1 6 p m o l ) . T h e b i n d i n g m i x t u r e ( 2 5 u L ) c o n t a i n e d 1 0 m M H E P E S - N a O H p H 7 . 9 , 4 m M t r i s - H C I , p H 7 . 9 , 6 . 0 m M K C l , 1 m M E D T A , 1 m M D ' l ' l ‘ , 1 0 % g l y c e r o l , 0 . 3 m g / m L b o v i n e s e r u m a l b u m i n a n d 1 u g o f p o l y ( d I . d C ) . T h e m i x t u r e w a s l o a d e d o n a 4 % p o l y a c r y l a m i d e g e l p r e p a r e d i n 1 X t r i s b o r a t e / E D T A b u f f e r a n d w a s e l e c t r o p h o r e s e d a t 2 0 0 V f o r 2 0 m i n u t e s . A f t e r e l e c t r o p h o r e s i s t h e g e l w a s a n a l y z e d u s i n g a p h o s p h o r i m a g e r ( B i o r a d F X p l u s ) f o r d e t e c t i o n o f t h e N F - K B - D N A b i n d i n g . I n h i b i t i o n o f t r a n s l o c a t i o n w i t h p 6 5 - E L I S A a s s a y T h e q u a n t i t y o f p 6 5 / p 5 0 h e t e r o d i m e r t h a t h a s t r a n s l o c a t e d i n t o t h e n u c l e u s w a s m e a s u r e d u s i n g a N F - K B p 6 5 s a n d w i c h E L I S A a s s a y ( I m g e n e x C o r p . ) . C E M c e l l s w e r e g r o w n t o 1 . 6 X 1 0 6 c e l l s / m L a n d w e r e s u b s e q u e n t l y t r e a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c o m p o u n d I I I - 4 f o r 3 0 m i n . a t 3 7 ° C a n d 5 % C 0 2 f o l l o w e d b y T N F - a ( 0 . 4 p g ) o r c a m p t o t h e c i n ( 1 . 0 u M ) s t i m u l a t i o n f o r a n a d d i t i o n a l 3 0 m i n u t e s o r 2 h , r e s p e c t i v e l y . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d a f t e r 3 0 m i n u t e s a n d n u c l e a r e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d b y D i g n a m a n d c o w o r k e r s . 9 7 T h e N F - K B p 6 5 s a n d w i c h E L I S A a s s a y w a s u s e d t o m o n i t o r a n d q u a n t i f y p 6 5 t r a n s l o c a t i o n i n t o t h e n u c l e u s a c c o r d i n g t o t h e 1 9 8 m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l . R e s u l t s w e r e r e a d o n B i o r a d ’ s M i c r o p l a t e B e n c h m a r k r e a d e r a t 4 0 5 n M . P D T C i s r e p o r t e d t o b e a n i n h i b i t o r o f N F - K B t r a n s l o c a t i o n a n d o u r d a t a c o n fi r m e d t h a t i t i n h i b i t e d N F - K B t r a n s l o c a t i o n a t c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 1 0 0 n M t o 5 . 0 [ 1 M ( d a t a n o t s h o w n ) . I n h i b i t i o n o f I - K B a d e g r a d a t i o n i n C E M c e l l s C E M c e l l s ( C C R F - C E M ; A m e r . T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n , R o c k v i l l e , M D ) w e r e g r o w n i n R P M I - l 6 4 0 M e d i a ( G i b c o - B R L , R o c k v i l l e , M D ) s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m , p e n i c i l l i n ( 6 1 4 n g / m L ) , s t r e p t o m y c i n ( 1 0 u g / m L ) a n d H E P E S b u f f e r , p H 7 . 2 a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 . C e l l s ( 1 . 6 X 1 0 6 c e l l s / m L ) w e r e s u b s e q u e n t l y t r e a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f t h e c o m p o u n d I I I - 4 , A L L N ( 5 0 n M ) , p a r t h e n o l i d e ( 5 0 n M ) o r v e h i c l e ( D M S O ) f o r 1 h a t 3 7 ° C a n d 5 % C 0 2 f o l l o w e d b y T N F - a ( 0 . 4 p g ) o r c a m p t o t h e c i n ( S i g m a - A l d r i c h ) ( 2 . 0 u M ) s t i m u l a t i o n f o r a n a d d i t i o n a l 4 m i n u t e s o r 1 h , r e s p e c t i v e l y . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n , w a s h e d i n i c e c o l d P B S a n d t h e c y t o p l a s m i c e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d b y t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l . T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f t h e e x t r a c t s w a s d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o t h e M e t h o d o f B r a d f o r d ( 1 9 7 6 ) w i t h B i o R a d ’ s B r a d f o r d r e a g e n t . E x t r a c t s w e r e d i l u t e d a n d s u b j e c t e d t o t h e I - K B a ( p S 3 2 ) a n d I - K B a ( t o t a l ) E L I S A ( B i o s o u r c e I n t e r n a t i o n a l , C A ) t o m e a s u r e a n d q u a n t i f y t h e e f f e c t o f i m i d a z o l i n e o n t h e p h o s p h o r y l a t i o n s t a t u s o f I - I c B a . R e s u l t s w e r e r e a d o n B i o r a d ’ s M i c r o p l a t e B e n c h m a r k r e a d e r a t 4 5 0 n M . I n h i b i t i o n o f N F - K B m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n i n H e L a c e l l s T r a n s i e n t t r a n s f e c t i o n s w e r e p e r f o r m e d u s i n g l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 . B r i e fl y , 0 . 8 u g o f p l a s m i d D N A , w a s c o m b i n e d w i t h l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 ( I n v i t r o g e n ) ( 1 . 5 u L ) . T h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 0 ’ a n d m i x e d w i t h t h e c e l l s w i t h o u t 1 9 9 s e r u m . C e l l s w e r e t r a n s f e c t e d f o r 5 h o u r s a t 3 7 ° C i n 5 % C 0 2 . C e l l s w e r e a l l o w e d t o g r o w i n c o m p l e t e m e d i u m f o r 1 5 h o u r s i n 5 % C 0 2 . V a r i o u s t r e a t m e n t s w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f i m i d a z o l i n e I I I - 4 , p a r t h e n o l i d e ( 5 0 n M ) o r A L L N ( 5 0 u M ) w e r e p e r f o r m e d f o r 1 h o u r f o l l o w e d b y a t r e a t m e n t w i t h T N F - a ( 1 0 n g / u L ) o r c a m p t o t h e c i n ( 3 n M ) f o r 5 h o u r s o r 1 0 . 5 h o u r s , r e s p e c t i v e l y . C e l l s w e r e w a s h e d w i t h l X P B S . W a s h e d c e l l s w e r e a s s a y e d f o r l u c i f e r a s e p r o d u c t i o n u s i n g t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l f o r b o t h l u c i f e r a s e a s w e l l a s r e n i l l a l u c i f e r a s e ( c o - r e p o r t e r ) u s i n g t h e D u a l - G l o r e p o r t e r a s s a y ( P r o m e g a ) . T h e r e s u l t s w e r e r e a d o n a V e r i t a s m i c r o p l a t e l u m i n o m e t e r ( T u r n e r B i o s y s t e m s , C A ) a s r e l a t i v e l i g h t u n i t s . V a l u e s f r o m t h e l u c i f e r a s e a c t i v i t y w e r e n o r m a l i z e d t o t h o s e w i t h r e n i l l a l u c i f e r a s e . L u c i f e r a s e e n z y m e a s s a y . P u r i fi e d L u c i f e r a s e , i s o l a t e d f r o m P h o t i n u s p y r a l i s ( P r o m e g a , W I ) , w a s r e s u s p e n d e d i n B S A ( 1 m g / m L ) . T h e e n z y m e w a s i n c u b a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f t h e i m i d a z o l i n e o r D M S O f o r 1 h o u r a t 0 ° C o n w e t i c e . A n a l i q u o t e o f t h e s a m p l e s w a s t h e n a s s a y e d o n t h e l u m i n o m e t e r a s d e s c r i b e d a b o v e . I n v i t r o k i n a s e A s s a y : C o m p o u n d I I I - 4 w a s t e s t e d i n v i t r o a g a i n s t t h e k i n a s e s i n d i c a t e d b y U p s t a t e , U K u s i n g a K i n a s e P r o fi l e r A s s a y a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l . B r i e fl y , i n a fi n a l v o l u m e o f 2 5 u l , t h e k i n a s e w a s i n c u b a t e d w i t h t h e d e s i r e d b u f f e r a n d t h e r e q u i r e d p o l y p e p t i d e s u b s t r a t e , i n p r e s e n c e o f 1 0 m M m a g n e s i u m a c e t a t e a n d 7 - 3 3 P - A T P ( 1 0 1 1 M ) . A f t e r i n c u b a t i o n f o r 4 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h e r e a c t i o n w a s s t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f 3 % H 3 P O 4 ( 5 [ 1 1 ) . A 1 0 u l o f t h e r e a c t i o n w a s t h e n s p o t t e d o n 3 P 3 0 fi l t e r r n a t a n d w a s h e d 3 X i n 7 5 m M H 3 P O 4 a n d fi n a l l y i n m e t h a n o l . S a m p l e s w e r e t h e n d r i e d a n d s i g n a l s c o u n t e d o n a s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r . 2 0 0 F A C S a n a l y s i s . C E M c e l l s w e r e c u l t u r e d a s d e s c r i b e d a b o v e . C e l l c u l t u r e s w e r e t r e a t e d w i t h 0 . 1 u M o f t h e i m i d a z o l i n e I I I - 4 , I I I - 4 a o r I I I - 4 b a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 a t m o s p h e r e f o r 3 0 m i n u t e s . C a m p t o t h e c i n w a s a d d e d a t 0 . 0 1 1 1 M a n d f u r t h e r i n c u b a t e d f o r 1 2 a n d 4 8 h t o m a r k e a r l y a n d l a t e a p o p t o t i c e v e n t s . C e l l s w e r e t h e n h a r v e s t e d , w a s h e d i n l X P B S . C e l l s w e r e s t a i n e d w i t h Y o - P r o l a n d p r o p i d i u m i o d i d e t o m a r k t h e a p o p t o t i c c e l l s . T h e s e w e r e t h e n a n a l y z e d o n a B D B i o s c i e n c e s V a n t a g e S E ( S a n J o s e , C A ) fl o w c y t o m e t e r u s i n g a 5 3 0 / 3 0 b a n d p a s s fi l t e r f o r Y o — P r o l a n d 6 6 0 / 2 0 ( b a n d p a s s fi l t e r ) f o r P I r e s p e c t i v e l y . F l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . C E M c e l l s ( C C R F - C E M ) w e r e c u l t u r e d a s d e s c r i b e d a b o v e . C e l l c u l t u r e s w e r e t r e a t e d w i t h 0 . 1 u M o f t h e i m i d a z o l i n e I I I - 4 , I I I - 4 a o r I I I - 4 b a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 a t m o s p h e r e f o r 3 0 m i n u t e s . C a m p t o t h e c i n w a s a d d e d a t 0 . 0 1 1 1 M a n d f u r t h e r i n c u b a t e d f o r 1 2 a n d 4 8 h t o m a r k e a r l y a n d l a t e a p 0 p t o t i c e v e n t s . C e l l s w e r e t h e n h a r v e s t e d , s t a i n e d w i t h Y o - P r o - l a n d v i s u a l i z e d u n d e r a fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e O l y m p u s C K 2 u s i n g a B P 4 8 0 - 5 5 0 C fi l t e r . 2 0 1 1 0 . l l . 1 2 . 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . R e f e r e n c e s . ( a ) G r e e n , D . R . C e l l 1 9 9 8 , 9 4 , 6 9 5 - 6 9 8 . ( b ) H e n g a r t n e r , M . O . N a t u r e 2 0 0 0 , 4 0 7 , 7 7 0 - 7 7 6 . T o m a s e l l i , K . J . D r u g D e v e l o p m e n t R e s . 2 0 0 1 , 5 2 , 5 0 5 - 5 0 7 . S c h m i t t , C . A . ; L o w e , S . W . J . P a t h o l . 1 9 9 9 , 1 8 7 , 1 2 7 - 3 7 . ( b ) F e s i k , S . W . C e l l , 2 0 0 0 , 1 0 3 , 2 7 3 - 2 8 2 . T h o m p s o n , C . B . S c i e n c e 1 9 9 5 , 2 6 7 , 1 4 5 6 - 1 4 6 2 . H a n a h a n , D . ; W e i n b e r g , R . A . C e l l 2 0 0 0 , 1 0 0 , 5 7 - 7 0 . J o h n s t o n e , R . W . ; R u e fl i , A . A . ; L o w e , S . W . C e l l 2 0 0 2 , 1 0 8 , 1 5 3 - 1 6 4 . L o w e , S . W . ; L i n , A . W . C a r c i n o g e n e s i s 2 0 0 0 , 2 1 , 4 8 5 - 4 9 5 . F o y e , W . 0 . C a n c e r C h e m o t h e r a p e u t i c A g e n t s ( W a s h i n g t o n : A C S ) 1 9 9 5 . P o m m i e r , Y . ; P o u r q u i e r , P . ; F a n , Y . ; S t r u m b e r g , D . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 9 9 8 , 1 4 0 0 , 8 3 - 1 0 5 . ( a ) W a l l , M . E . M e d . R e s . R e v . 1 9 9 8 , 1 8 , 2 9 9 - 3 1 4 . ( b ) T h o m a s , C . J . , R a h i e r , N . J . ; H e c h t , S . M . B i o o r g . M e d . C h e m . 2 0 0 4 , 1 2 , 1 5 8 5 - 6 0 4 . ( b ) M a c d o n a l d , T . L . ; L a b r o l i , M . A . ; T e p e , J . J . I n C o m p r e h e n s i v e n a t u r a l p r o d u c t s c h e m i s t r y 1 9 9 9 , V o l u m e 7 , E T . K o o l , e d . ( A m s t e r d a m : E l s e v i e r - N o r t h H o l l a n d ) , p p . 5 9 3 - 6 1 4 . ( d ) H s i a n g , Y . H . ; H e r t z b e r g , R . ; H e c h t , S . ; L i u , L . F . J . B i o l . C h e m . 1 9 8 5 , 2 6 0 , 1 4 8 7 3 — 1 4 8 7 8 . P o u r q u i e r , P . ; P o m m i e r , Y . A d v . C a n c e r R e s . 2 0 0 1 , 8 0 , 1 8 9 - 2 1 6 . ( a ) W a n g , D . ; L i p p a r d , S . J . N a t . R e v . D r u g D i s c o v . 2 0 0 5 , 4 , 3 0 7 - 2 0 . ( b ) B a r n e s , K . R . ; L i p p a r d , S . J . M e t . I o n s . B i o l . S y s t . 2 0 0 4 , 4 2 , 1 4 3 - 7 7 . ( a ) C o h e n , S . M . ; L i p p a r d , S . J . P r o g . N u c l e i c A c i d R e s . M o l . B i o l . 2 0 0 1 , 6 7 , 9 3 - 1 3 0 . ( b ) J a m i e s o n , E . R . ; L i p p a r d , S . J . C h e m . R e v . 1 9 9 9 , 9 9 , 2 4 6 7 - 2 4 9 8 . ( c ) S e d l e t s k a , Y . , G i r a u d - P a n i s , M . J . ; M a l i n g e , J . M . C u r r . M e d . C h e m . A n t i - C a n c . A g e n t s 2 0 0 5 , 5 , 2 5 1 - 2 6 5 . W o n g , B . ; G i a n d o m e n i c o , C . M . C h e m . R e v . 1 9 9 9 , 9 9 , 2 4 5 1 - 2 4 6 6 . R i x e , 0 . ; O r t u z a r , W . ; A l v a r e z , M . ; P a r k e r , R . ; R e e d , E . ; P a u l ] , K . ; F o j o , T . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 1 9 9 6 , 5 2 , 1 8 5 5 - 1 8 6 5 . ( a ) O r r e n i u s , S . ; Z h i v o t o v s k y , B . ; N i c o t e r a , P . N a t . R e v . M o l . C e l l B i o l . 2 0 2 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 5 . 2 6 . 2 0 0 3 , 4 , 5 5 2 - 6 5 . ( b ) Y u a n , Z . - M . ; U t s u g i s a w a , T . ; H u a n g , Y . ; I s h i k o , T . ; N a k a d a , S . ; K h a r b a n d a , S . ; W e i c h s e l b a u m , R . ; K u f e , D . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 7 , 2 7 2 , 2 3 4 8 5 - 8 . ( c ) V i v a n c o , I . ; S a w y e r s , C . L . N a t . R e v . C a n c e r 2 0 0 2 , 2 , 4 8 9 - 5 0 1 . A v e n d a fi o , C . ; M e n é n d e z , J . C . C u r r . M e d C h e m . 2 0 0 2 , 9 , 1 5 9 - 1 9 3 . L o w e , S . W . ; L i n , A . W . C a r c i n o g e n e s i s 2 0 0 0 , 2 1 , 4 8 5 - 9 5 . ( 3 ) W a n g , C . Y . ; M a y o , M . W . ; K o m e l u k , R . G . ; G o e d d e l , D . V . ; B a l d w i n A , 8 . , J r . S c i e n c e 1 9 9 8 , 2 8 1 , 1 6 8 0 - 1 6 8 3 . ( b ) W a n g , C . Y . ; M a y o , M . W . ; B a l d w i n , A . 8 . , J r . S c i e n c e 1 9 9 6 , 2 7 4 , 7 8 4 - 7 . ( c ) H u a n g , T . T . ; W u e r z b e r g e r - D a v i s , S . M . ; S e u f z e r , B . J . ; S h u m w a y , S . D . ; K u r a m a , T . ; B o o t h m a n , D . A . ; M i y a m o t o , S . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 0 , 2 7 5 , 9 5 0 1 - 9 5 0 9 . ( d ) P i r e t , B . ; P i e t t e , J . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 9 9 6 , 2 4 , 4 2 4 2 - 4 2 4 8 . ( e ) X u , Y . ; V i l l a l o n a - C a l e r o , M . A . A n n . O n c o l . 2 0 0 2 , 1 3 , 1 8 4 1 - 1 8 5 1 . ( 1 ) B o t t e r o , V . ; B u s u t t i l , V . ; L o u b a t , A . ; M a g n e , N . ; F i s c h e l , J . L . ; M i l a n o , G . ; P e y r o n , J . F . C a n c e r R e s . 2 0 0 1 , 6 1 , 7 7 8 5 - 7 7 9 1 . ( a ) B e l l a m y , W i l l i a m T . A n n . R e v . P h a r m a c o l . T o x i c o l . 1 9 9 6 , 3 6 , 1 6 1 - 8 3 . ( b ) T e i c h e r , B . A . ; A r a , G . ; H e r b s t , R . ; P a l o m b e l l a , V . J . ; A d a m s , J . C l i n . C a n c e r R e s . 1 9 9 9 , 5 , 2 6 3 8 - 2 6 4 5 . ' ( a ) D r e w e , J . ; G u t m a n n , H . ; F r i c k e r , G . ; T o r o k , M . ; B e g l i n g e r , C . ; H u w y l e r , J . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 1 9 9 9 , 5 7 , 1 1 4 7 - 1 1 5 2 . ( b ) S c h m i d t k e , G . ; H o l z h u t t e r , H . G . ; B o g y o , M . ; K a i r i e s , N . ; G r o l l , M . ; d e G i u l i , R . ; E m c h , S . ; G r o e t t r u p , M . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 9 , 2 7 4 , 3 5 7 3 4 - 3 5 7 4 0 . F e k e t e , M . R . ; M c B r i d e , W . H . ; P a j o n k , F . B M C c a n c e r 2 0 0 5 , 5 , 1 1 4 . ( a ) A m s t e r d a m , A . ; P i t z e r , F . ; B a u m e i s t e r , W . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 1 9 9 3 , 9 0 , 9 9 - 1 0 3 . ( b ) K u m a t o r i , A . ; T a n a k a , K . ; I n a m u r a , N . ; S o n e , S . ; O g u r a , T . ; M a t s u m o t o , T ; T a c h i k a w a , T . ; S h i n , S . ; I c h i h a r a , A . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 1 9 9 0 , 8 7 , 7 0 7 1 - 7 0 7 5 . ( a ) Q i u , J . H . ; A s a i , A . ; C h i , S . ; S a i t o , N . ; H a m a d a , H . ; K i r i n o , T . J . N e u r o s c i . 2 0 0 0 , 2 0 , 2 5 9 - 2 6 5 . ( b ) P a s q u i n i , L . A . ; B e s i o , M . M . ; A d a m o , A . M . ; P a s q u i n i , J . M . ; S o t o , E . F . J . N e u r o s c i . R e s . 2 0 0 0 , 5 9 , 6 0 1 - 6 1 1 . B o l d , R . J . ; V i r u d a c h a l a m , S . ; M c C o n k e y , D . J . J . S u r g . R e s . 2 0 0 1 , 1 0 0 , 1 1 - 1 7 . P a j o n k , F . ; P a j o n k , K . ; M c B r i d e , W . I n t . J . R a d i a t . O n c o l . B i o l . P h y s . 2 0 0 0 , 4 7 , 1 0 2 5 - 1 0 3 2 . ' 2 0 3 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . 3 7 . 3 8 . 3 9 . ( a ) C u s a c k , J . C . ; L i u , R . ; B a l d w i n , A . 8 . D r u g R e s i s t . U p d a t e 1 9 9 9 , 2 , 2 7 1 - 2 7 3 . ( b ) W e l d o n , C . B . ; B u r o w , M . E . ; R o l f e , K . W . ; C l a y t o n , J . L . J a f f e ; B . M . ; B e c k m a n , B . 8 . S u r g e r y 2 0 0 1 , 1 3 0 , 1 4 3 - 5 0 . ( c ) P o m e r a n t z , J . L . ; B a l t i m o r e , D . N a t u r e 2 0 0 0 , 4 0 6 , 2 6 - 2 9 . ( ( 1 ) B o l a n d , M . P . B i o c h e m . S o c . T r a n s . 2 0 0 1 , 2 9 , 6 7 4 - 8 . ( e ) P o m m i e r , Y . ; S o r d e t , 0 . ; A n t o n y , S . ; H a y w a r d , R . L . ; K o h n , K . W . O n c o g e n e 2 0 0 4 , 2 3 , 2 9 3 4 - 4 9 . ( 1 ) M a y o , M . W . ; B a l d w i n , A . S . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 2 0 0 0 , I 4 7 0 , M 5 5 - 6 2 . ( a ) C a r s o n , J . P . ; Z h a n g , N . ; F r a m p t o n , G . M . ; G e r r y , N . P . ; L e n b u r g , M . E . ; C h r i s t m a n , M . F . C a n c e r R e s . 2 0 0 4 , 6 4 , 2 0 9 6 - 2 1 0 4 . ( b ) Z h o u , Y . ; G w a d r y , F . G . ; R e i n h o l d , W . C . ; M i l l e r , L . D . ; S m i t h , L . H . ; S c h e r f , U . ; L i u , E . T . ; K o h n , K . W . ; P o m m i e r , Y . ; W e i n s t e i n , J . N . C a n c e r R e s . 2 0 0 2 , 6 2 , 1 6 8 8 - 1 6 9 5 . M a k i n , G . ; H i c k m a n , J . A . C e l l T i s s u e R e s . 2 0 0 0 , 3 0 1 , 1 4 3 - 1 5 2 . N e s t e r e n k o , V . ; P u t t , K . S . ; H e r g e n r o t h e r , P . J . J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 3 , 1 2 5 , 1 4 6 7 2 - 1 4 6 7 3 . N i c h o l s o n , D . W . N a t u r e 2 0 0 0 , 4 0 7 , 8 1 0 - 8 1 6 . H a y a k a w a , Y . ; K i m , J . W . ; A d a c h i , H . ; S h i n - y a , K . ; F u j i t a , K . - I . ; S e t o , H . J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 8 , 1 2 0 , 3 5 2 4 - 3 5 2 5 . M i t s i a d e s , N . ; M i t s i a d e s , C . S . ; R i c h a r d s o n , P . G . ; P o u l a k i , V . ; T a i , Y . T . ; C h a u h a n , D . ; F a n o u r a k i s , G . ; G u , X . ; B a i l e y , C . ; J o s e p h , M . ; L i b e r r n a n n , T . A . ; S c h l o s s m a n , R . ; M u n s h i , N . C . ; H i d e s h i m a , T . ; A n d e r s o n , K . C . B l o o d 2 0 0 3 , 1 0 1 , 2 3 7 7 - 2 3 8 0 . W e a v e r K . D . ; Y e y e o d u , S . ; C u s a c k J . C . ; J r . ; B a l d w i n A . 8 . , J r . ; E w e n d M . G . J . N e u r o - O n c o l . 2 0 0 3 , 6 1 , 1 8 7 - 1 9 6 . C h e n , L . ; A g r a w a l , 8 . ; Z h o u , W . ; Z h a n g , R . ; C h e n , J . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 1 9 9 8 , 9 5 , 1 9 5 - 2 0 0 . ( a ) S h a r m a , V . ; L a n s d e l l , T . A . ; P e d d i b h o t l a , S . ; T e p e , J . J . C h e m . B i o l . 2 0 0 4 , I I , 1 6 8 9 - 1 6 9 9 . ( b ) T e p e , J . J . ; S h a r m a , V . ; L a n s d e l l , T . ; P e d d i b h o t l a , S . ; M i c h a e l s , S . ; B r o w n , D . M . 2 0 0 3 , A b s t r a c t s o f P a p e r s , 2 2 5 t h A C S N a t i o n a l M e e t i n g , N e w O r l e a n s , L A , U n i t e d S t a t e s , M a r c h 2 3 - 2 7 , 2 0 0 3 . B a e u e r l e , P . A . ; H e n k e l , T . A n n u . R e v . I m m u n o l . 1 9 9 4 , 1 2 , 1 4 1 - 1 7 9 . B a l d w i n , A . 8 . , J r . A n n u . R e v . I m m u n o l . 1 9 9 6 , 1 4 , 6 4 9 - 6 8 3 . P e r k i n s , N . D . I n t . J . B i o c h e m . C e l l B i o l . 1 9 9 7 , 2 9 , 1 4 3 3 - 1 4 4 8 . 2 0 4 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . 4 8 . 4 9 . 5 0 . 5 1 . 5 2 . 5 3 . 5 4 . 5 5 . 5 6 . W e b s t e r , G . A . ; P e r k i n s , N . D . M o l . C e l l B i o l . 1 9 9 9 , 1 9 , 3 4 8 5 - 3 4 9 5 . D a s , K . C . ; W h i t e , C . W . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 7 , 2 7 2 , 1 4 9 1 4 - 1 4 9 2 0 . B a l d w i n , A . S . J . C l i n . I n v e s t . 2 0 0 1 , 1 0 7 , 2 4 1 - 2 4 6 . H i d e s h i m a , T . ; C h a u h a n , D . ; R i c h a r d s o n , P . ; M i t s i a d e s , C . ; M i t s i a d e s , N . ; H a y a s h i , T . ; M u n s h i , N . ; D a n g , L . ; C a s t r o , A . ; P a l o m b e l l a , V . ; A d a m s , J . ; A n d e r s o n , K . C . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 2 , 2 7 7 , 1 6 6 3 9 - 1 6 6 4 7 . U m , J . H . ; K a n g , C . D . ; L e e , B . G . ; K i m , D . W . ; C h u n g , B . S . ; K i m , S . H . O n c o g e n e 2 0 0 1 , 2 0 , 6 0 4 8 - 6 0 5 6 . A r l t , A . ; V o m d a m m , J . ; B r e i t e n b r o i c h , M . ; F o l s c h , U . R . ; K a l t h o f f , H . ; S c h m i d t , W . E . ; S c h a f e r , H . O n c o g e n e 2 0 0 1 , 2 0 , 8 5 9 - 8 6 8 . L i u , S . ; Y u , Y . ; Z h a n g , M . ; W a n g , W . ; C a o , X . J . I m m u n o l . 2 0 0 1 , 1 6 6 , 5 4 0 7 - 5 4 1 5 . K i m , J . Y . ; L e e , S . ; H w a n g b o , B . ; L e e , C . T . ; K i m , Y . W . ; H a n , S . K . ; S h i m , Y . S . ; Y o o , C . G . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 2 0 0 0 , 2 7 3 , 1 4 0 - 1 4 6 . ' L i n , Y . C . ; B r o w n , K . ; S i e b e n l i s t , U . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 1 9 9 5 , 9 2 , 5 5 2 - 5 5 6 . K a r i n , M . ; L i n , A . N o t . I m m u n o l . 2 0 0 2 , 3 , 2 2 1 - 2 2 7 . Z h o n g , H . ; S u Y a n g , H . ; E r d j u m e n t - B r o m a g e , H . ; T e m p s t , P . ; G h o s h , S . C e l l 1 9 9 7 , 8 9 , 4 1 3 - 4 2 4 . S i z e m o r e , N . ; L e u n g , S . ; S t a r k , G . R . M o l . C e l l B i o l . 1 9 9 9 , 1 9 , 4 7 9 8 - 4 8 0 5 . M a d r i d , L . V . ; W a n g , C . Y . ; G u t t r i d g e , D . C . ; S c h o t t e l i u s , A . J . ; B a l d w i n , A . S . ; J r . ; M a y o , M . W . M o l . C e l l B i o l . 2 0 0 0 , 2 0 , 1 6 2 6 - 1 6 3 8 . W u , M . X . ; A o , Z . ; P r a s a d , K . V . ; W u , R . ; S c h l o s s m a n , S . F . S c i e n c e 1 9 8 8 , 2 8 1 , 9 9 8 - 1 0 0 1 . L e v i n e , A . J . C e l l , 1 9 9 7 , 8 8 , 3 2 3 - 3 3 1 . B o l a n d , M . P . B i o c h e m . S o c . T r a n s . 2 0 0 1 , 2 9 , 6 7 4 - 6 7 8 . C u s a c k , J . C . , J r . ; L i u , R . ; B a l d w i n , A . 8 . , J r . C a n c e r R e s . 2 0 0 0 , 6 0 , 2 3 2 3 - 2 3 3 0 . 2 0 5 5 7 . 5 8 . 5 9 . 6 0 . 6 1 . 6 2 . 6 3 . 6 5 . 6 6 . 6 7 . 6 8 . 6 9 . 7 0 . 7 1 . 7 2 . 7 3 . G u t t r i d g e , D . C . ; A l b a n e s e , C . ; R e u t h e r , J . Y . ; P e s t e l l , R . G . , B a l d w i n , A . 8 . , J r . M o l . C e l l B i o l . 1 9 9 9 , 1 9 , 5 7 8 5 - 5 7 9 9 . J o n e s , D . R . ; B r o a d , R . M . ; M a d r i d , L . V . ; B a l d w i n , A . 3 . , J r . ; M a y o , M . W . A n n . T h o r a c S u r g . 2 0 0 0 , 7 0 , 9 3 0 - 9 3 6 ; d i s c u s s i o n 9 3 6 - 9 3 7 . C u s a c k , J . C . , J r . ; L i u , R . ; H o u s t o n , M . ; A b e n d r o t h , K . ; E l l i o t t , P . J . ; A d a m s , J . ; B a l d w i n , A . 8 . , J r . C a n c e r R e s . 1 2 0 0 1 , 6 1 , 3 5 3 5 - 3 5 4 0 . B a l k w i l l , F . ; M a n t o v a n i , A . L a n c e t 2 0 0 1 , 3 5 7 , 5 3 9 - 5 4 5 . S l a v i e r o , K . A . ; C l a r k e , S . J . ; R i v o r y , L . P . L a n c e t O n c o l . 2 0 0 3 , 4 , 2 2 4 - 3 2 . K a r i n , M ; G r e t e n , F . R . N a t u r e R e v . I m m u n o l . 2 0 0 5 , 5 , 7 4 9 - 7 5 9 . B h a r t i , A . C . ; A g g a r w a l , B . B . A n n . N Y A c a d . S c i . 2 0 0 2 , 9 7 3 , 3 9 2 - 3 9 5 . G r e t e n , F . ; E c k m a n n , L . ; G r e t e n , T . ; P a r k , J . ; L i , Z . ; E g a n , L . ; K a g n o f f , M . ; K a r i n M . C e l l , 2 0 0 4 , 1 1 8 , 2 8 5 - 2 9 6 . B o n i z z i , G . ; K a r i n , M . T r e n d s I m m u n o l . 2 0 0 4 , 2 5 , 2 8 0 — 2 8 8 . M a e d a , S . ; K a m a t a , H . ; L u o , J . L . ; L e f f e r t , H . ; K a r i n , M . C e l l 2 0 0 5 , 1 2 1 , 9 7 7 - 9 9 0 . M o o r e , R . J . ; O w e n s , D . M . ; S t a m p , G . ; A m o t t , C . ; B u r k e , F . ; E a s t , N . ; H o l d s w o r t h , B . ; T u r n e r , L . ; R o l l i n s , B . ; P a s p a r a k i s , M . ; K o l l i a s , G . ; B a l k w i l l , F . N a t u r e M e d . 1 9 9 9 , 5 , 8 2 8 — 8 3 1 . ( a ) C o u s s e n s , L . M . ; W e r b , 2 . N a t u r e 2 0 0 2 , 4 2 0 , 8 6 0 — 8 6 7 . ( b ) P o l l a r d , J . W . N a t u r e R e v . C a n c e r 2 0 0 4 , 4 , 7 1 - 7 8 . ( c ) K a r i n , M . ; C a o , Y . ; G r e t e n , F . R . ; L i , Z . W . N a t u r e R e v . C a n c e r 2 0 0 2 , 2 , 3 0 1 — 3 1 0 . D u n n , G . P . ; O l d , L . J . ; S c h r e i b e r , R . D . I m m u n i t y 2 0 0 4 , 2 1 , 1 3 7 - 1 4 8 . D r a n o f f , G . N a t u r e R e v . C a n c e r 2 0 0 4 , 4 , 1 1 - 2 2 . K o e h n e , C . H . ; D u b o i s , R . N . S e m i n . O n c o l . 2 0 0 4 , 3 1 , 1 2 - 2 1 . B r e s a l i e r , R . S . ; S a n d l e r , R . S . ; Q u a n , H . ; B o l o g n e s e , J . A . ; O x e n i u s , B . ; H o r g a n , K . ; L i n e s , C . ; R i d d e l l , R . ; M o r t o n , D . ; L a n a s , A . ; K o n s t a m , M . A . ; B a r o n , J . A . N . E n g l . J . M e d . 2 0 0 5 , 3 5 2 , 1 0 9 2 — 1 1 0 2 . H a b r a k e n , Y . ; P i r e t , B . ; P i e t t e , J . B i o c h e m i c a l P h a r m a c o l . 2 0 0 1 , 6 2 , 6 0 3 - 6 1 6 . 2 0 6 7 4 . 7 5 . 7 6 . 7 7 . 7 8 . 7 9 . 8 0 . 8 1 . 8 2 . 8 3 . E p i n a t , J . C . ; G i l m o r e , T . D . O n c o g e n e 1 9 9 9 , 1 8 , 6 8 9 6 - 6 9 0 9 . C u z z o c r e a , S . ; C h a t t e r j e e , P . K . ; M a z z o n , E . ; D u g o , L . ; S e r r a i n o , 1 . ; B r i t t i , D . ; M a z z u l l o , G . ; C a p u t i , A . P . ; T h i e m e r m a n n , C . B r . J . P h a r m a c o l . 2 0 0 2 , 1 3 5 , 4 9 6 - 5 1 0 . ( a ) R o s h a k , A . ; J a c k s o n , J . R . ; C h a b o t - F l e t c h e r , M . ; M a r s h a l l , L . A . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 1 9 9 7 , 2 8 3 , 9 5 5 - 9 6 1 . ( b ) B r e t o n , J . J . ; C h a b o t - F l e t c h e r , M . C . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 1 9 9 7 , 2 8 2 , 4 5 9 - 4 6 6 . ( c ) S h a r m a , S . ; T e p e , J . J . B i o o r g . M e d . C h e m . L e t t . 2 0 0 4 , 1 4 , 4 3 1 9 - 4 3 2 1 . ( d ) M e i j e r , L . ; T h u n n i s s e n , A . M . ; W h i t e , A . W . ; G a m i e r , M . ; N i k o l i c , M . ; T s a i , L . H . ; W a l t e r , J . ; C l e v e r l e y , K . B . ; S a l i n a s , P . C . ; W u , Y . Z . ; B i e m a t , J . ; M a n d e l k o w , E . M . ; K i m , S . H . ; P e t t i t , G . R . C h e m . B i o l . 2 0 0 0 , 7 , 5 1 - 6 3 . ( e ) W a n , Y . ; H u r , W . ; C h o , C . Y . ; L i u , Y . ; A d r i a n , F . J . ; L o z a c h , O . ; B a c h , S . ; M a y e r , T . ; F a b b r o , D . ; M e i j e r , L . ; G r a y , N . S . C h e m . B i o l . 2 0 0 4 , 1 1 , 2 4 7 - 2 5 9 . K i s h o r e , N . ; S o m m e r s , C . ; M a t h i a l a g a n , S . ; G u z o v a , J . ; Y a o , M . ; H a u s e r , S . ; H u y n h , K . ; B o n a r , S . ; M i e l k e , C . ; A l b e e , L . ; W e i e r , R . ; G r a n e t o , M . ; H a n a n , C . ; P e r r y , T . ; T r i p p , C . S . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 3 , 2 7 8 , 3 2 8 6 1 - 3 2 8 7 1 . ( a ) G r i s h a m , M . B . ; P a l o m b e l l a , V . J . ; E l l i o t t , P . J . ; C o n n e r , E . M . ; B r a n d , S . ; W o n g , H . L . ; P i e n , C . ; M a z z o l a , L . M . ; D e s t r e e , A . ; P a r e n t , L . ; A d a m s , J . M e t h o d s E n z y m o l . 1 9 9 9 , 3 0 0 , 3 4 5 - 3 6 3 . ( b ) N e m e t h , Z . H . ; W o n g , H . R . ; O d o m s , K . ; D e i t c h , E . A . ; S z a b o , C . ; V i z i , E . S . ; H a s k o , G . M o l . P h a r m a c o l . 2 0 0 4 , 6 5 , 3 4 2 - 3 4 9 . ( c ) F e n t e a n y , G . ; S t a n d a e r t , R . F . ; S o o n g y u C h o i , W . S . ; C o r e y , E . J . ; S c h r e i b e r , S . L . S c i e n c e 1 9 9 5 , 2 6 8 , 7 2 6 . T e i c h e r , B . A . ; A r a , G . ; H e r b s t , R . ; P a l o m b e l l a , V . J . ; A d a m s , J . C l i n . C a n c e r R e s . l 9 9 9 , 5 , 2 6 3 8 - 2 6 4 5 . ( a ) K w o k , B . H . ; K o h , B . ; N d u b u i s i , M . I . ; E l o f s s o n , M . ; C r e w s , C . M . C h e m B i o l 2 0 0 1 , 8 , 7 5 9 - 7 6 6 . ( b ) H e h n e r , S . P . ; H o f m a n n , T . G . ; D r o g e , W . ; S c h m i t z , M . L . J . I m m u n o l . 1 9 9 9 , 1 6 3 , 5 6 1 7 - 5 6 2 3 . K a n e , R . C . ; B r o s s , P . F . ; F a r r e l l , A . T . ; P a z d u r , R . T h e O n c o l o g i s t 2 0 0 3 , 8 . 5 0 8 - 5 1 3 . S h a h , S . A . ; P o t t e r , M . W . ; M c D a d e , T . P . ; , R i c c i a r d i , R . ; P e r u g i n i , R . A . ; E l l i o t t , P . J . ; A d a m s , J . ; C a l l e r y , M . P . J . C e l l . B i o c h e m . 2 0 0 1 , 8 2 , 1 1 0 - 1 2 2 . M a , M . H . ; Y a n g , H . H . ; P a r k e r , K . ; M a n y a k , S . ; F r i e d m a n , J . M . ; A l t a m i r a n o , C . ; W u , Z . Q . ; B o r a d , M . J . ; F r a n t z e n , M . ; R o u s s o s , E . ; N e e s e r , J . ; M i k a i l , A . ; A d a m s , J . ; S j a k - S h i e , N . ; V e s c i o , R . A . ; B e r e n s o n , J . R . C l i n . C a n c e r R e s . 2 0 0 3 , 9 , 1 1 3 6 - 1 1 4 4 . 2 0 7 8 4 . 8 5 . 8 6 . 8 7 . 8 8 . 8 9 . 9 1 . 9 2 . 9 3 . ( a ) P e d d i b h o t l a , S . ; T e p e , J . J . S y n t h e s i s 2 0 0 3 , 9 , 1 4 3 3 - 1 4 4 0 . ( b ) P e d d i b h o t l a , S . ; J a y a k u m a r , S . ; T e p e , J . J . O r g . L e t t . 2 0 0 2 , 4 , 3 5 3 3 - 3 5 3 5 . ( c ) ( a ) R u t g e e r t s , P . ; D ’ H a e n s , G . ; T a r g a n , S . ; V a s i l i a u s k a s , E . ; H a n a u e r , S . B . ; P r e s e n t , D . H . ; M a y e r , L . ; V a n H o g e z a n d , R . A . ; B r a a k m a n , T . ; D e W o o d y , K . L . ; S c h a i b l e , T . F . ; V a n D e v e n t e r , S . J . H . G a s t r o e n t e r o l o g y 1 9 9 9 , 1 1 7 , 7 6 1 - 7 6 9 . ( b ) L e e , J . C . ; L a y d o n , J . T . ; M c D o n n e l l , P . C . ; G a l l a g h e r , T . F . ; K u m a r , S . ; G r e e n , D . ; M c N u l t y , D . ; B l u m e n t h a l , M . J . ; H e y s , J . R . ; L a n d v a t t e r , S . W . ; S t r i c k l e r , J . E . ; M c L a u g h l i n , M . M . ; S i e m e n s , I . R . ; F i s h e r , S . M . ; L i v i , G . P . ; W h i t e , J . R . ; A d a m s , J . L . ; Y o u n g , P . R . N a t u r e 1 9 9 4 , 3 7 2 , 7 3 9 - 7 4 5 . ( c ) B o e h m , J . C . ; A d a m s , J . L . E x p . O p i n . T h e r . P a t . 2 0 0 0 , 1 0 , 2 5 - 3 7 . ( d ) T o n g , L . ; P a v , S . ; W h i t e , D . M . ; R o g e r s , S . ; C r a n e , K . M . ; C y w i n , C . L . ; B r o w n , M . L . ; P a r g e l l i s , C . A . N o t . S t r u c t . B i o l . 1 9 9 7 , 4 , 3 1 1 - 3 1 6 . ( a ) R e g u n a t h a n , S . ; F e i n s t e i n , D . L . ; R e i s , D . J . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 1 9 9 9 , 8 8 1 , 4 1 0 - 4 1 9 . ( b ) H o u g h t o n , A . K . ; W e s t l u n d , K . N . N e u r o R e p o r t 1 9 9 6 , 7 , 1 4 9 7 - 1 5 0 1 . ( c ) L a u f e r , S . A ; W a g n e r , G . K . J . M e d . C h e m . 2 0 0 2 , 4 5 , 2 7 3 3 - 2 7 4 0 . L a n s i a u x , A . ; F a c o m p r e , M . ; W a t t e z , N . ; H i l d e b r a n d , M . P . ; B a l , C . ; D e m a r q u a y , D . ; L a v e r g n e , O . ; B i g g , D . C . ; B a i l l y , C . M o l . P h a r m a c o l . 2 0 0 1 , 6 0 , 4 5 0 - 4 6 1 . ( a ) N i c h o l s o n , D . W . ; T h o m b e r r y , N . A . S c i e n c e 2 0 0 3 , 2 9 9 , 2 1 4 - 2 1 5 . ( b ) N i c h o l s o n , D . W . ; T h o m b e r r y , N . A . T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 9 9 7 , 2 2 , 2 9 9 - 3 0 6 . ( c ) T h o m b e r r y , N . A . C h e m . B i o l . 1 9 9 8 , 5 , R 9 7 - 1 0 3 . ( a ) L u o , J . L . ; K a m a t a , H . ; K a r i n , M . J . C l i n . I n v e s t . 2 0 0 5 , 1 1 5 , 2 6 2 5 - 3 2 . ( b ) L e v k a u , B . ; S c a t e n a , M . ; G i a c h e l l i , C . M . ; R o s s , R . ; R a i n e s , E . W . N a t . C e l l B i o l . 1 9 9 9 , 1 , 2 2 7 — 2 3 3 . ( c ) T a n g , G . ; Y a n g , J . ; M i n e m o t o , Y . ; L i n , A . M o l . C e l l . 2 0 0 1 , 8 , 1 0 0 5 — 1 0 1 6 . ( ( 1 ) R e u t h e r , J . Y . ; B a l d w i n , A . 8 . , J r . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 9 , 2 7 4 , 2 0 6 6 4 - 2 0 6 7 0 . J o h n s o n , N . ; N g , T . T . C . ; P a r k i n , J . M . L e u k e m i a R e s . 1 9 9 7 , 2 1 , 9 6 1 - 9 7 2 . D e l h a s e , M . ; H a y a k a w a , M . ; C h e n , Y . ; K a r i n , M . S c i e n c e 1 9 9 9 , 2 8 4 , 3 0 9 - 3 1 3 . K a r i n , M . O n c o g e n e 1 9 9 9 , 1 8 , 6 8 6 7 - 6 8 7 4 . S a k u r a i , H . ; C h i b a , H . ; M i y o s h i , H . S u g i t a , T . ; T o r i u m i , W . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 9 , 2 7 4 , 3 0 3 5 3 - 3 0 3 5 6 . 2 0 8 9 4 . 9 5 . 9 6 . 9 7 . 9 8 . 9 9 . 1 0 0 . 1 0 1 . 1 0 2 . 1 0 3 . 1 0 4 . 1 0 5 . 1 0 6 . 1 0 7 . 1 0 8 . 1 0 9 . T h a n o s , D . ; M a n i a t i s , T . C e l l 1 9 9 5 , 8 0 , 5 2 9 - 5 3 2 . T o z a w a , K . ; O k a m o t o , T . ; H a y a s h i , Y . ; S a s a k i , S . ; K a w a i , N . ; K o h r i , K . U r o l o g i c a l R e s . 2 0 0 2 , 3 0 , 5 3 - 5 8 . S c h o w , S . R . ; J o l y , A . C e l l I m m u n o l . 1 9 9 7 , 1 7 5 , 1 9 9 - 2 0 2 . D i g n a m , J . D . ; L e b o v i t z , R . M . ; R o e d e r , R . G . N u c l e i c A c i d s R e s . l 9 8 3 , 1 1 , 1 4 7 5 - 1 4 8 9 . ( a ) A n , J . ; S u n , Y . ; F i s h e r , M . ; R e t t i g , M . B . L e u k e m i a 2 0 0 4 , 1 8 , 1 6 9 9 - 7 0 4 . ( b ) D o n g , Q . G . ; S c l a b a s , G . M . ; F u j i o k a , S . ; S c h m i d t , C . ; P e n g , B . ; W u , T . ; T s a o , M . - S . ; E v a n s , D . B ; A b b r u z z e s e ; J . L . ; M c D o n n e l l , T . J . ; C h i a o , P . J . O n c o g e n e , 2 0 0 2 , 2 1 , 6 5 1 0 - 6 5 1 9 . ( a ) H a u p t , S . ; B e r g e r , M . ; G o l d b e r g , Z . ; H a u p t , Y . J . C e l l . S c i . 2 0 0 3 , 1 1 6 , 4 0 7 7 - 8 5 . ( b ) H a u p t , S . ; L o u r i a - H a y o n , I . ; H a u p t , Y . J . C e l l . B i o c h e m . 2 0 0 3 , 8 8 , 7 6 - 8 2 . W a d g a o n k a r , R . ; P h e l p s , K . M . ; H a q u e , 2 . ; W i l l i a m s , A . J . ; S i l v e r r n a n , E . S . ; C o l l i n s , T . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 9 , 2 7 4 , 1 8 7 9 - 1 8 8 2 . M a k i , C . G . ; H u i b r e g t s e , J . M . ; H o w l e y , P . M . C a n c e r R e s . 1 9 9 6 , 5 6 , 2 6 4 9 — 2 6 5 4 . H a u p t , Y . ; M a y a , R . ; K a z a z , A . ; O r e n , M . N a t u r e 1 9 9 7 , 3 8 7 , 2 9 6 — 2 9 9 . K a s t a n , M . ; O n y e k w e r e , 0 . ; S i d r a n s k y , D . ; V o g e l s t e i n , B . ; C r a i g , R . C a n c e r R e s . 1 9 9 1 , 5 1 , 6 3 0 4 — 6 3 1 1 . ( a ) G a z o s L o p e s , U . ; E r h a r d t , P . , Y a o , R . ; C o o p e r , G . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 7 , 2 7 2 , 1 2 8 9 3 — 1 2 8 9 6 . ( b ) C h a n g , Y . C . ; L e e , Y . S . ; T e j i m a , T . ; T a n a k a , K . ; O m u r a , S . ; H e i n t z , N . H . ; M i t s u i , Y . ; M a g a e , J . C e l l G r o w t h D i fl e r . 1 9 9 8 , 9 , 7 9 — 8 4 . N a b i e v , I . ; F l e u r y , F . ; K u d e l i n a , 1 . ; P o m m i e r , Y . ; C h a r t o n , F . ; R i o u J . - F . ; A l i x , A . J . P . ; M a n f a i t , M . B i o c h e m i c a l P h a r m a c o l . 1 9 9 8 , 5 5 , 1 1 6 3 - 1 1 7 4 . S c h e n a M . , 2 0 0 3 . M i c r o a r r a y A n a l y s i s . W i l e y - L i s s . ( H o b o k e n , N J ) , 6 3 0 . C h e u n g V . G . ; M o r l e y , M . ; A g u i l a r , F . ; M a s s i m i , A . ; K u c h e r l a p a t i R . ; C h i l d s , G . N a t . G e n e t . 1 9 9 9 , 2 1 ( 1 S u p p l ) , 1 5 - 9 . H e l l e r M . J . A n n u . R e v . B i o m e d . E n g . 2 0 0 2 , 4 , 1 2 9 - 5 3 . J a i n K . K . P h a r m a c o g e n o m i c s 2 0 0 0 , 1 , 2 8 9 - 3 0 7 . 2 0 9 1 1 0 . C r o w t h e r D . J . C u r r . O p i n . P h a r m a c o l . 2 0 0 2 , 2 , 5 5 1 - 4 . 2 1 0 T E 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l e ‘ 3 5 . : . 1 x r . 0 1 : 1 1 . 1 . . ! 1 9 c ‘ “ fi g , " H I - H 5 1 5 3 » : 1 ? » I . 1 ] , . 2 : 3 1 . . . S . l a s ; % d . ! % fi a l : § % u fl § 5 . . . . . V L . 1 . 1 5 , . n u v q u A c a n . R u s k ; { E e u k h v f n r l { 1 1 1 5 5 2 3 , ' A 3 “ 7 l o w 7 H i ) V J . 1 5 L H A R Y M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T o A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 2 / 0 5 p : / C l R C / D a t e D u e . i n d d - p . 1 S T R A T E G I C I M P R O V E M E N T S I N E F F I C A C Y O F D N A D A M A G I N G C H E M O T H E R A P E U T I C D R U G S T H R O U G H M O D U L A T I O N O F S U R V I V A L F A C T O R S . V O L U M E 1 1 B y V a s u d h a S h a n n a A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y 2 0 0 6 C H A P T E R I V A P P L I C A T I O N O F T R A N S - I M I D A Z O L I N E S I N C H E M I S T R Y A N D B I O L O G Y T h e r e d o e s n ' t e x i s t a c a t e g o r y o f s c i e n c e t o w h i c h w e c a n g i v e t h e n a m e a p p l i e d s c i e n c e . T h e r e a r e s c i e n c e a n d t h e a p p l i c a t i o n o f s c i e n c e , b o u n d t o g e t h e r a s t h e f r u i t t o t h e t r e e w h i c h b e a r s i t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . L o u i s P a s t e u r A . I n t r o d u c t i o n P r e s e n t d a y o r g a n i c a n d m e d i c i n a l c h e m i s t r y a i m a t t h e d e s i g n a n d s m a l l s c a l e s y n t h e s i s o f d r u g c a n d i d a t e s a n d l a r g e s c a l e p r o d u c t i o n o f m o l e c u l e s v a l u a b l e a s h u m a n t h e r a p e u t i c a g e n t s . W i t h t h e r a p i d e x p l o r a t i o n o f p o t e n t i a l d r u g c a n d i d a t e s v i a h i g h t h r o u g h p u t s c r e e n i n g , t h e c u r r e n t c h a l l e n g e i s t h e i n c r e a s i n g d e m a n d f o r n o v e l s m a l l m o l e c u l e s t o s a t i s f y a n d s u s t a i n t h e s c r e e n i n g e f f o r t s . T h e s e a r c h f o r m o l e c u l e s o f t h e r a p e u t i c v a l u e d e p e n d s o n n e w l e a d s d i s c o v e r e d V i a a r a t i o n a l l y d e s i g n e d s y n t h e s i s o r s c r e e n i n g o f l i b r a r i e s g e n e r a t e d v i a c o m b i n a t o r i a l s y n t h e s i s . W i t h t h e p r o g r e s s a c h i e v e d i n t h e fi e l d o f f u n c t i o n a l g e n o m i c s a n d p r o t e o m i c s , m o r e i n f o r m a t i o n a b o u t t h e s t r u c t u r e s a n d e n v i r o n m e n t o f t h e b i o m o l e c u l e s i s a v a i l a b l e . T o k e e p p a c e w i t h s u c h f o r m i d a b l e a d v a n c e i n b i o l o g i c a l r e s e a r c h , t h e i d e n t i fi c a t i o n a n d o p t i m i z a t i o n o f n e w s c a f f o l d s w i t h s p e c i fi c i t y t o w a r d s t h e i r t a r g e t c o n s t i t u t e s t h e b o t t l e n e c k i n b i o l o g i c a l a n d m e d i c i n a l c h e m i s t r y . T h u s , t h e r e i s t r e m e n d o u s n e e d t o d e v e l o p m o r e m e t h o d s f o r l i g a n d o p t i m i z a t i o n t o i l l u s t r a t e t h e f u n c t i o n s o f v a r i o u s b i o m o l e c u l e s . l T h e c o m p l e t i o n o f t h e H u m a n G e n o m e p r o j e c t h a s o u t l i n e d a n e t w o r k o f c e l l u l a r p r o c e s s e s . T h e n a t u r e a n d a m o u n t o f p r o t e i n s , a n d t h e i r i n t e r p l a y h a s c r e a t e d p a r a m o u n t i n t e r e s t i n i n v e s t i g a t i n g i n t e r v e n t i o n o f t h e s e c e l l u l a r p r o c e s s e s b y s m a l l m o l e c u l e s . W h i l e c o m b i n a t o r i a l c h e m i s t r y w a s c o n s i d e r e d t o b e fi r m l y i n t e g r a t e d t o t h e d r u g 2 1 1 d i s c o v e r y e n t e r p r i s e f o r l e a d i d e n t i fi c a t i o n a n d o p t i m i z a t i o n , u n f o r t u n a t e l y , t h e p r e d i c t e d s c o p e o f c o m b i n a t o r i a l s y n t h e s i s i n t e r m s o f a c c e s s i n g ‘ d r u g - l i k e m o l e c u l e s ’ d i d n o t r e a c h i t s p i n n a c l e a n d i n f a c t c e r t a i n l i b r a r i e s d i d n o t y i e l d e v e n a s i n g l e t a r g e t m o l e c u l e . 2 H e n c e , t h e c h a l l e n g e i n d e s i g n i n g a f o c u s e d l i b r a r y o f ‘ d r u g - l i k e ’ c o m p o u n d s s t i l l p e r s i s t s . B . A l t e r n a t i v e a p p r o a c h e s t o t h e s a m e p r o b l e m U p o n c o m p a r i s o n b e t w e e n c o m b i n a t o r i a l l i b r a r i e s , n a t u r a l p r o d u c t s a n d d r u g m o l e c u l e s , F e h e r a n d S c h m i d t s u g g e s t e d t h a t t h e p r o p e r t i e s o f c o m b i n a t o r i a l l i b r a r i e s c o u l d b e i m p r o v e d b y i n c o r p o r a t i o n o f n a t u r a l p r o d u c t l i k e c h a r a c t e r . 3 S i m i l a r s t u d i e s w e r e a l s o p e r f o r m e d b y H e n k e l e t a l a n d S c h n e i d e r e t a 1 i n d e p e n d e n t l y . 4 H a n s s k e e t a l r e p o r t e d a n a p p r o a c h b i a s e d o n n a t u r a l - p r o d u c t l i b r a r y c a l l e d ‘ d i v e r s i t y m o d i fi e d n a t u r a l s c a f f o l d s ’ ( D Y M O N S ) i n w h i c h d i v e r s e s u b s t i t u e n t s a r e i n t r o d u c e d t o n a t u r a l p r o d u c t c o r e s . s B a j o r a t h d e s c r i b e d ‘ n a t u r a l / s y n t h e t i c h y b r i d l i b r a r i e s ’ k n o w n a s ‘ M e t a F o c u s ( M e t a b o l i t e F o c u s e d ) ’ l i b r a r i e s . 6 O n c e a b i o l o g i c a l l y a c t i v e n a t u r a l c o m p o u n d i s i d e n t i fi e d , a v a i l a b l e s i m i l a r c o m p o u n d s a r e e x a m i n e d f o r s i m i l a r a c t i v i t y a n d a l l c o u l d b e p l a c e d u n d e r o n e l i b r a r y . I n t h e s e c o n d p h a s e , c o m p o u n d a r r a y s s i m i l a r t o t h e i n i t i a l l y i d e n t i fi e d n a t u r a l p r o d u c t a r e p r e p a r e d . i . N a t u r e s e t s a n e x a m p l e - n a t u r a l - p r o d u c t g u i d e d s y n t h e s i s N a t u r e h a s a l r e a d y i d e n t i fi e d n a t u r a l p r o d u c t s a s s t r u c t u r e s w i t h b i o l o g i c a l r e l e v a n c e i n a ‘ u n i v e r s e ’ o f c h e m i c a l s t r u c t u r e s . 7 H i s t o r i c a l l y , 6 0 % o f c a n c e r d r u g s a n d 7 5 % o f t h o s e f o r i n f e c t i o u s d i s e a s e s a r e p r o v i d e d b y N a t u r e . 8 T h i s p r o v i d e s a m p l e r e a s o n t o m a k e e f f o r t s t o d e s i g n l i b r a r i e s b a s e d o n s u c h ‘ n a t u r a l - p r o d u c t l i k e ’ s c a f f o l d s . H o w e v e r , N a t u r e i s f a i r l y r e s t r i c t i v e i n e x p l o i t i n g t h e i n n u m e r a b l e p r o t e i n s a n d a l l o w s a c c e s s t o s p e c i fi c f o l d s 2 1 2 a n d d o m a i n s . T h i s f o r m s a m a t r i x l i k e g r i d w i t h v a r i a t i o n s o f s c a f f o l d s f o r i n d i v i d u a l s i t e s o n p r o t e i n s , a n d d e c i p h e r i n g a l l t h e m a t c h e s s t i l l r e m a i n s a c h a l l e n g e . O n e o f t h e c a t e g o r i c a l h a l l m a r k s o f n a t u r a l p r o d u c t s i s t h e i r e x q u i s i t e l e v e l o f t h r e e d i m e n s i o n a l s o p h i s t i c a t i o n . T h e d i v e r s i t y o f r i n g s k e l e t o n s , t h e p r e s e n t a t i o n o f t h e f u n c t i o n a l i t i e s e t c . a r e b e y o n d t h e c a p a c i t y o f m e d i c i n a l c h e m i s t r y . R e p r e s e n t a t i v e N a t u r a l p r o d u c t s N a t u r a l P r o d u c t L i b r a r y R e f e r e n c e n ‘ H H O N R N ’ N \ S — N 9 N \ O M e \ / ‘ 7 b . . H Q R C i r c u m d a t i n D , F l = O M e C i r c u m d a t i n E , R = H \ R N \ N / t / fi \ s \ S \ \ 1 0 R 1 H , R ‘ [ I 1 8 C a m a l e x i n I - l : O 1 1 " = O H R , O R 2 N a k i j i q u i n o n e A , A A = G I y F i g u r e I V - l . N a t u r a l p r o d u c t l i k e s c a f f o l d s . W i t h t h e p l e t h o r a o f e m e r g i n g t a r g e t s f o r d r u g d i s c o v e r y , n a t u r a l p r o d u c t - l i k e l i b r a r i e s s e r v e a s v e h i c l e s t o p r o b e b i o l o g i c a l a c t i v i t y . F i g u r e I V - l s h o w s a f e w e x a m p l e s O f 2 1 3 n a t u r a l - p r o d u c t l i k e s c a f f o l d s b e i n g p u r s u e d b y v a r i o u s r e s e a r c h g r o u p s . 9 ' ” S t r u c t u r e - a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p s c a n b e b e t t e r u n d e r s t o o d o n a p h a r m a c o l o g i c a l l y r i c h p l a t f o r m w h i c h w o u l d e n a b l e u s t o i d e n t i f y n e w t h e r a p e u t i c t a r g e t s . 8 i i ) D i v e r s i t y o r i e n t e d s y n t h e s i s . A p r o m i s i n g m e t h o d b e g i n s b y s y n t h e s i z i n g s t r u c t u r a l l y c o m p l e x a n d d i v e r s e s m a l l m o l e c u l e s i n a n e f fi c i e n t m a n n e r u s i n g d i v e r s i t y o r i e n t e d s y n t h e s i s . D i v e r s i t y o r i e n t e d s y n t h e s i s a s c o i n e d b y S c h r e i b e r e t a l f o r c h e m i c a l g e n e t i c s a i m s a t m o d e r a t e s i z e d l i b r a r i e s o f c o m p o u n d s w i t h h u g e t h r e e d i m e n s i o n a l c o m p l e x i t y , f u n c t i o n a l i t y , a n d d i v e r s i t y a n d t h u s t h e s e s c a f f o l d s c a n b e r e g a r d e d a s ‘ n a t u r a l - p r o d u c t l i k e ’ . ' 2 ° ' 1 4 S u c h s c a f f o l d s u s u a l l y c o m p r i s e o f c y c l i c s t r u c t u r e s a n d a h i g h d e g r e e o f s t e r e o c h e m i c a l c o n t e n t . D i v e r s i t y - o r i e n t e d s y n t h e s i s ( D O S ) s t r a t e g i c a l l y c o n s t r u c t s l i b r a r i e s w i t h s t e r e o c h e m i c a l , S k e l e t a l a n d f u n c t i o n a l g r o u p d i v e r s i t y w i t h t h e a i m t o c r e a t e a b r o a d d i s t r i b u t i o n o f c o m p o u n d s i n c h e m i c a l s p a c e . 1 2 V e r y o f t e n , m o d e r n d r u g d i s c o v e r y i n v o l v e s s c r e e n i n g m o l e c u l e s f o r a k n o w n p r o t e i n t a r g e t o r m o d u l a t i o n o f a b i o l o g i c a l p a t h w a y . W h i l e t a r g e t o r i e n t e d s y n t h e s e s o f s m a l l m o l e c u l e s a r e c o n s i d e r e d a s f o c u s e d l i b r a r i e s , s o m e t i m e s , d r u g d i s c o v e r y p r o c e s s c a n a l s o i n v o l v e s c r e e n i n g o f c o m p o u n d s a n d t h e i r a b i l i t y t o m o d u l a t e p a t h w a y s , w i t h o u t a p a r t i c u l a r p r o t e i n t a r g e t . T h i s l a t t e r c a s e w o u l d b e b e n e fi c i a l i n e v o l v i n g f o r w a r d a n a l y s i s t o s y n t h e s i z e c o m p l e x b u i l d i n g b l o c k s a n d d i v e r s e s m a l l m o l e c u l e s f o r a p a r t i c u l a r p h e n o t y p e . A n i m p o r t a n t a i m o f d i v e r s i t y o r i e n t e d s y n t h e s i s i s t o b u i l d a c o l l e c t i o n o f m o l e c u l e s a b l e t o p e r t u r b a b i o l o g i c a l p a t h w a y , l e a d i n g t o t a r g e t i d e n t i fi c a t i o n b e i n g m o d u l a t e d b y s m a l l m o l e c u l e s . T h i s i s a n a l o g o u s t o g e n e t i c s w h e r e r a n d o m m u t a t i o n s c o u l d b e g e n e r a t e d a n d t h e n s c r e e n e d f o r 2 1 4 a p h e n o t y p e . F r o m t h e p e r s p e c t i v e o f d r u g d i s c o v e r y , t h i s a p p r o a c h c a n h e l p i n s i m u l t a n e o u s i d e n t i fi c a t i o n o f p r o t e i n s w h i c h c o u l d s e r v e a s t a r g e t s f o r t h e r a p e u t i c i n t e r v e n t i o n ( t h e r a p e u t i c t a r g e t v a l i d a t i o n ) a n d m o l e c u l e s t h a t m o d u l a t e f u n c t i o n s o f t h o s e t h e r a p e u t i c t a r g e t s ( c h e m i c a l t a r g e t v a l i d a t i o n ) . l 3 i i i ) W h e r e d o s m a l l m o l e c u l e s f i t i n ? I n c o n t r a s t t o o n e s y n t h e s i s - o n e S k e l e t o n a p p r o a c h , D O S t a r g e t s a c c e s s i n g b o t h s k e l e t a l a n d s t e r e o c h e m i c a l d i v e r s i t y t o c r e a t e a w i d e d i s p l a y o f f u n c t i o n a l i t y a s w e l l a s 3 D s p a c e . A c h i e v i n g s u c h a i m s c o u l d f a c i l i t a t e t h e s e a r c h f o r s p e c i fi c s m a l l m o l e c u l e m o d u l a t o r s f o r d i v e r s e b i o m o l e c u l e s . S m a l l - m o l e c u l e s c a f f o l d s o f f e r a h a n d l e t o d i s s e c t b i o l o g i c a l p a t h w a y s , i d e n t i f y t a r g e t s a n d m o d u l a t e t h e i r f u n c t i o n s f o r p o t e n t i a l t h e r a p e u t i c u s e . 1 4 S m a l l m o l e c u l e s p o s s e s n u m e r o u s a d v a n t a g e s i n t h e d r u g d i s c o v e r y p r o c e s s a s c o m p a r e d w i t h p e p t i d e s ( m e t a b o l i c a l l y s t a b l e a n d b i o a v a i l a b l e ) a n d n a t u r a l p r o d u c t s ( e a s i e r a c c e s s , g r e a t e r s o l u b i l i t y a n d s u p p o r t f o r s t r u c t u r e a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p s ) . A c c e s s i n g s m a l l m o l e c u l e s v i a D O S i s b e n e fi c i a l i n p a r t i c u l a r s i n c e o n e c o m p o u n d c a n b e c o n v e r t e d i n t o m u l t i p l e s t r u c t u r a l l y u n i q u e s c a f f o l d s . B r u m m o n d e t a l h a v e s h o w n a c c e s s t o t h r e e d i f f e r e n t t y p e s o f s c a f f o l d s s t a r t i n g f r o m a l k y n y l a l l e n e s . ” / / C s z O ‘ — B z C - N — — > M e o g é C N / / " ' 3 a D C \ M e O C i 0 B z C N O M 9 0 0 0 / F i g u r e I V - 2 . A c c e s s i n g d i v e r s e s c a f f o l d s 2 1 5 B e s i d e s t h e s c a f f o l d a n d R - g e n e r a t i n g d i v e r s i t y , s t e r e o c h e m i s t r y o f f e r s a t h i r d d i m e n s i o n f o r d i v e r s i t y i n D O S . C o n t r o l o v e r s t e r e o c h e m i c a l d i v e r s i t y i n p a r t i c u l a r , i n c r e a s e s t h e n u m b e r o f r e l a t i v e o r i e n t a t i o n s o f p o t e n t i a l m a c r o m o l e c u l e - i n t e r a c t i n g e l e m e n t s i n s m a l l m o l e c u l e s . H e n c e , i n o r d e r t o a c c e s s s m a l l m o l e c u l e s i n c h e m i c a l s p a c e t h a t c a n o v e r l a p w i t h t h e b i o l o g i c a l s p a c e w i t h t a r g e t s , s u i t a b l y f u n c t i o n a l i z e d ‘ d r u g - l i k e ’ p r i v i l e g e d s t r u c t u r e s ( w h i c h c a n b i n d t o o n e o r m o r e t a r g e t s ) a r e r e q u i r e d t h a t h a v e t h r e e d i m e n s i o n a l r i g i d i t y a n d a r e a c c e s s e d t h r o u g h h i g h y i e l d i n g , r e l i a b l e c l e a n r e a c t i o n s . C . A z l a c t o n e s : s i m i l a r i t y , d i v e r s i t y a n d c o m p l e x i t y . O n e o f t h e v e r y i m p o r t a n t f e a t u r e s i n D O S i s t o u s e a s u b s t r a t e h a v i n g t h e p o t e n t i a l o f d i v e r s e r e a c t i v i t y w i t h d i f f e r e n t r e a g e n t s a n d p r o d u c e d i f f e r e n t s k e l e t o n s . I n o u r e f f o r t t o s y n t h e s i z e b i o l o g i c a l l y a c t i v e s m a l l m o l e c u l e h e t e r o c y c l e s , w e f o c u s e d o n a z l a c t o n e ( 5 - o x a z o l o n e ) o n a c c o u n t o f i t s v e r s a t i l e n a t u r e . A z l a c t o n e s w e r e fi r s t d i s c o v e r e d b y P l o c l ( 1 8 8 3 ) , h o w e v e r t h e s e w e r e n a m e d b y E r l e n m e y e r i n 1 8 9 3 . 1 6 A z l a c t o n e s g a i n e d e m i n e n c e a n d h a v e b e e n u s e d a s i m p o r t a n t s y n t h o n s d u e t o t h e a b i l i t y t o u n d e r g o r a c e m i z a t i o n w h e n e x p o s e d t o n u c l e o p h i l e s s u c h a s a l c o h o l s , a n d o t h e r a m i n o a c i d s i n p e p t i d e s y n t h e s i s . ” ' 8 T r a d i t i o n a l l y , t h e a z l a c t o n e i s s y n t h e s i z e d b y a d e h y d r a t i o n r e a c t i o n a f t e r a c t i v a t i o n o f t h e c a r b o x y l g r o u p o f t h e N - a c y l a m i n o a c i d . T h e N - a c y l a m i n o a c i d s a r e c o n v e n i e n t l y p r e p a r e d v i a a S c h o t t e n - B a u m a n n r e a c t i o n o n t h e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e a m i n o a c i d o r a c y l a t i o n o f a m i n o a c i d e s t e r s f o l l o w e d b y h y d r o l y s i s u n d e r m i l d a l k a l i n e c o n d i t i o n s . ' 8 " 9 2 1 6 0 U C N % R / 0 a c t i v a t i o n 0 f c a r b o x y l g r o u p R _ _ < \ O I S 0 E H ( O H u s i n g ( R C O ) 2 0 , D C C , E D C I @ R N R 2 F t : - H , a l k y l o r a c y l m u n c h n o n e F i g u r e I V - 3 . C y c l o d e h y d r a t i o n o f N - a c y l - a - a m i n o a c i d s t o a z l a c t o n e s / m fi n c h n o n e s . T h e c h o i c e o f t h e c a r b o x y l g r o u p a c t i v a t o r d e p e n d s o n t h e a m i n o a c i d s u b s t r a t e a n d s t a b i l i t y O f t h e r e s u l t i n g a z l a c t o n e . U s e o f ( C H 3 C O ) z O , ( C F 3 C O ) z O O f t e n s u f f e r o f s i d e r e a c t i o n s a n d i n s t a b i l i t y o f t h e a z l a c t o n e t o t h e a c i d g e n e r a t e d i n t h e r e a c t i o n . ” 2 ' U s e o f A c z O a n d o t h e r a c i d a n h y d r i d e s g i v e s r i s e t o m i i n c h n o n e s ( 1 , 3 o x a z o l i u m o x i d e s ) . 2 3 W h i l e D C C u s u a l l y g i v e s h i g h y i e l d i n g r e a c t i o n , r e m o v a l O f t h e u r e a a n d i s o l a t i o n o f p u r e a z l a c t o n e f r o m t h e r e a c t i o n m i x t u r e m a y n o t b e S i m p l e . 2 2 E D C I ( w a t e r s o l u b l e c a r b o d i i m i d e s a l t ) i s f r e e o f e i t h e r o f t h e s e p r o b l e m s a n d a f f O r d s t h e a z l a c t o n e i n v e r y h i g h y i e l d s a n d p u r i t y . ” T h e a z l a c t o n e i s a n a c t i v a t e d c y c l i c e s t e r o f t h e c o r r e s p o n d i n g a m i n o a c i d t h a t c a n p r o v i d e a v a r i e t y o f p r o d u c t s v i a a n u c l e o p h i l i c a t t a c k o r a n e l e c t r o p h i l i c a t t a c k t o g i v e a C 4 - a l k y l a t e d p r o d u c t . N : R 1 Y O y ] N E W / w % I O [ f 0 N N € E + \ n F ‘ 2 a z l a c t o n e ( S a t u r a t e d ) a z l a c t o n e ( u n s a t u r a t e d ) F i g u r e I V - 4 . N u c l e o p h i l i c a n d e l e c t r o p h i l i c s i t e s o n s a t u r a t e d a n d u n s a t u r a t e d a z l a c t o n e . N : N u c l e o p h i l c : E + E l e c t r o p h i l c . F o r e x a m p l e , d u e t o a c i d i c n a t u r e o f C 4 - H b o n d , m o n o s u b s t i t u t e d a z l a c t o n e s c a n r e a c t w i t h e l e c t r o p h i l e s . R e a c t i o n s s u c h a s a l k y l a t i o n , a r y l a t i o n , a c y l a t i o n , C l a i s e n r e a r r a n g e m e n t , M i c h a e l a d d i t i o n , a d d i t i o n o f d i a z o n i u m s a l t s e t c . h a v e b e e n w e l l 2 1 7 d o c u m e n t e d . 2 3 C o n d e n s a t i o n b e t w e e n c a r b o n y l g r o u p s a n d a z l a c t o n e y i e l d s u n s a t u r a t e d a z l a c t o n e s w h e r e t h e e x o c y c l i c b o n d c a n u n d e r g o a d d i t i o n a l r e a c t i o n s w i t h n u c l e o p h i l e s . 2 4 F u r t h e r , r e a c t i o n o f a l c o h o l s o r N - t c r m i n a t e d p e p t i d e s , w i t h t h e k e t e n e t a u t o m e r ( l e s s s t a b l e ) p r o v i d e s a c c e s s t o ( i t - a m i n o a c i d a n d p e p t i d e d e r i v a t i v e s , 2 5 a n d a [ 2 + 2 ] c y c l o a d d i t i o n w i t h i m i n e s y i e l d s p e p t i d e - b a s e d [ 3 - l a c t a m s . 2 6 F i g u r e I V - 5 i l l u s t r a t e s a w i d e r a n g e o f s k e l e t a l d i v e r s i t y t h a t c a n b e a c c e s s e d v i a a z l a c t o n e t e m p l a t e a s t h e O R R 4 . 2 N H C O R , O N R R . . . fi N H C O R , \ R N 3 R 4 R 1 C O H N R 2 0 2 — p y r i d o n e N 9 3 A M N M e 2 i f / N p y r i m i d i n o n e . R 3 A r R 4 fl / a c t a m M e z N M N , R 4 s u b s t r a t e m a t e r i a l . R , \ O H 1 ) A r H / A r c r 3 “ ( I l / A n , R ‘ N R ? o x a z o l e 4 - h y d r o x y p y r i d i n e N a H / R 3 X o o M e O Z C 0 0 2 M e M 9 0 2 0 o I } 1 ) M e o z c \ / R M R , \ o c o M e 4 R 1 \ N R 2 A g ( O A c ) , T H F C H ( O R ) 3 . A 0 2 0 , N R R a 2 p y r r o l i n e 2 ) T M S C H N 2 A d i s u b s t i i u t e d a z l a c t o n e O o n , | m o o r i n n o c n , R 2 p y r o n e F i g u r e I V - 5 . G e n e r a t i o n o f d i v e r s e h e t e r o c y c l e s f r o m a z l a c t o n e t e m p l a t e . 2 1 8 D . 1 , 3 d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n o n a z l a c t o n e t e m p l a t e O t h e r r e a c t i o n s o f a z l a c t o n e s i n c l u d e t h e h i g h l y v e r s a t i l e 1 , 3 d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n s O f N - a l k y l a t e d a z l a c t o n e s ( m i i n c h n o n e s ) w i t h v a r i o u s d i p o l a r o p h i l e s p r o v i d e a g e n e r a l m e t h o d f o r t h e s y n t h e s i s O f p h a r m a c o l o g i c a l l y r e l e v a n t a r o m a t i c h e t e r o c y c l e s l i k e p y r r o l e s , ” i m i d a z o l e s , 2 8 o x a z o l e s , 2 3 ° p y r r o l i n e s , 2 9 a n d i n d o l e d e r i v a t i v e s e t c . 3 0 T h e a z l a c t o n e , ( w h i c h i s i n e q u i l i b r i u m w i t h t a u t o m e r i c k e t e n e i n t e r m e d i a t e ) , u n d e r g o e s a [ 2 + 2 ] c y c l o a d d i t i o n r e a c t i o n w h e n h e a t e d w i t h t h e i m i n e s ( F i g u r e I V - 5 ) t o y i e l d B - l a c t a m s v i a a S t a u d i n g e r - t y p e r e a c t i o n . I t i s n o w w e l l k n o w n t h a t u n d e r s u c h c o n d i t i o n s , 1 , 3 d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n d o e s n o t o c c u r . T h i s c o u l d b e a t t r i b u t e d t o t w o r e a s o n s , e i t h e r m e s o i o n i c o x a z o l i u m o x i d e , w h i c h h a s t h e n i t r o g e n a t o m u n s u b s t i t u t e d , i s n o t i n r e a s o n a b l e c o n c e n t r a t i o n a n d / o r t h e i m i n e n i t r o g e n i s n o t n u c l e o p h i l i c e n o u g h . H e n c e f o r m a t i o n o f k e t e n e t a k e s p r e d o m i n a n c e , w h i c h r e a c t s r e a d i l y w i t h t h e i m i n e s t o a f f o r d t h e B - l a c t a m . 1 8 ’ 3 ‘ I n 1 9 7 0 , H u i s g e n h a d r e p o r t e d t h a t a m o d e r a t e e q u i l i b r i u m c o n c e n t r a t i o n o f t h e m e s o i o n i c t a u t o m e r i s e s s e n t i a l f o r t h e l , 3 - d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n l e a d i n g t o h e t e r o c y c l e f o r m a t i o n ( F i g u r e I V - 6 ) . 2 3 a O 9 O A R , \ < O / 0 R 4 R 3 . R 4 R 3 A n , R 3 N R 4 2 R s _ A I I ‘ R ( 9 R 2 7 R 1 N R 2 R 1 U R z r ' K o n A r I : — 1 A r N A r 9 ‘ 1 [ q t / 4 N R a I R F i g u r e I V - 6 . 1 , 3 d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n r e a c t i o n o n m i i n c h n o n e s . 2 1 9 T h e a z l a c t o n e s a r e l o c k e d i n t h e m e s o i o n i c f o r m b y N - m e t h y l a t i o n a n d a r e e x t r e m e l y r e a c t i v e d i p o l e s , w h i c h a f f o r d t h e h e t e r o c y c l e s i n v e r y h i g h y i e l d s . H o w e v e r , d u e t o t h e h a r s h r e a c t i o n c o n d i t i o n s a n d t h e e a s e o f a r o m a t i z a t i o n u n d e r t h e s e s t a n d a r d c o n d i t i o n s , t h e s t e r e o c h e m i c a l i n f o r m a t i o n g e n e r a t e d i n t h e c y c l o a d d i t i o n r e a c t i o n i s l o s t . C 0 2 M 8 I \ / 0 0 2 M e O ' 2 / \ I N — > 0 0 2 M B — — > P I ' I M e 6 - ) R 1 0 R 1 [ : 1 8 1 M e F i g u r e I V - 7 . S y n t h e s i s o f p y r r o l e s f r o m m i l n c h n o n e s . E . S y n t h e s i s o f n o v e l d i h y d r o h e t e r o c y c l i c s c a f f o l d s : h a r n e s s i n g t h e p o t e n t i a l o f L e w i s a c i d m e d i a t e d g e n e r a t i o n o f m i i n c h n o n e s A S p a r t o f o u r p r o g r a m f o c u s e d o n g e n e r a t i n g s t r u c t u r a l l y a n d s t e r e o c h e m i c a l l y d i v e r s e h e t e r o c y c l i c s c a f f o l d s , o t h e r m e m b e r s i n o u r l a b o r a t o r y ( S a t y a m a h e s h w a r P e d d i b h o t l a ) h a v e r e p o r t e d t h e u s e o f a L e w i s a c i d m e d i a t e d g e n e r a t i o n o f m i i n c h n o n e s a s a m i l d a n d S t e r e o s e l e c t i v e p r o c e s s t o a c c e s s h i g h l y s u b s t i t u t e d d i h y d r o h e t e r o c y c l i c s c a f f o l d s s u c h a s i m i d a z o l i n e s a n d A ' - p y r r o l i n e s . 3 2 ' 3 " . R 4 0 O L X R ‘ O H X ) l R 1 ‘ < \ I ‘ — . : ; _ — ‘ D O G R 3 N . R I 2 L 6 - ) 9 2 ( O H > 5 9 R O . ) R I a s 2 I R 6 ? Y R R 1 - < \ N « ‘ 8 2 I L ’ 4 3 I 0 0 2 H ' 0 ‘ Y = O , N , - C H S c h e m e I V - l . S y n t h e s i s o f d i h y d r o h e t e r o c y c l e s f r o m m t i n c h n o n e s . 2 2 0 C o n t r o l o f t h e s t e r e o - , r e g i o - , a n d e n a n t i o s e l e c t i v i t y o f 1 , 3 - d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n s w i t h L e w i s a c i d s i s a r e l a t i v e l y n e w a r e a o f r e s e a r c h a n d h a s n o t b e e n f u l l y e x p l o r e d . C o m p e t i t i o n b e t w e e n a n e l e c t r o p h i l i c d i p o l a r o p h i l e a n d t h e d i p o l e f o r t h e L e w i s a c i d f o r i n s t a n c e c a n r e s u l t i n a s l o w e r r e a c t i o n . S u c h b i n d i n g i n t e r a c t i o n s o f 1 , 3 - d i p o l e s t o a L e w i s a c i d a r e b a s e d o n t h e t y p i c a l p r e s e n c e o f L e w i s b a s i c s i t e s o n t h e l , 3 - d i p o l e s . A c c o r d i n g l y , L e w i s a c i d i c r e a g e n t s m a y c o m b i n e w i t h t h e b a s i c s i t e s o n c e r t a i n I , 3 - d i p o l e s , m a k i n g r e l a t i v e l y S t a b l e s a l t - l i k e c o m p l e x e s . O p t i m i z a t i o n o f t h e c o - o r d i n a t i n g p o w e r o f L e w i s a c i d s , t h e l a b i l i t y a n d e x c h a n g e a b i l i t y o f t h e s e l i g a n d s m u s t b e d o n e i n o r d e r t o i n c r e a s e r a t e s o f r e a c t i o n s . F . C h e m i c a l s i g n i f i c a n c e o f i m i d a z o l i n e s T h e m o s t d i r e c t c h e m i c a l u t i l i t y o f i m i d a z o l i n e s h a s b e e n t h e i r c o n v e r s i o n t o c h i r a l d i a m i n e s , 3 5 w h i c h a r e w i d e l y p r e f e r r e d g r o u p o f l i g a n d s f o r a s y m m e t r i c s y n t h e s i s . M a c M i l l a n e t a l h a v e r e p o r t e d a v e r y i m p r e s s i v e u s e o f i m i d a z o l i d i n o n e s , 3 " a s o r g a n o c a t a l y s t s f o r h i g h l y e n a n t i o s e l e c t i v e i n d o l e a l k y l a t i o n s a n d D i e l s - A l d e r r e a c t i o n s . F u r t h e r m o r e , c h i r a l 2 - i m i d a z o l i n e s h a v e a t t r a c t e d c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t a s t e m p l a t e s f o r 3 7 b . 3 7 C a n d h a v e a s y m m e t r i c s y n t h e s i s , 3 7 “ a n d a s c h i r a l l i g a n d s f o r a s y m m e t r i c c a t a l y s i s f o u n d w i d e a p p l i c a t i o n a s p o t e n t N - h e t e r o c y c l i c c a r b e n e l i g a n d s t h a t u n l i k e t h e p h o s p h i n e s , d o n o t d i s s o c i a t e f r o m t h e t r a n s i t i o n m e t a l s a n d h e n c e p r o v i d e s t u r d y c a t a l y s t s . ” d E f fi c i e n t S t e r e o s e l e c t i v e s y n t h e s e s o f i m i d a z o l i n e s h a s b e e n v e r y l i m i t e d w i t h r e s p e c t t o c o n t r o l o f d i a s t e r e o c h e m i c a l d i v e r s i t y a n d h a s p r i m a r i l y p r o v i d e d t h e a n t i - p r o d u c t s . 3 8 O r r u e t a l d e v e l o p e d a n o v e l m u l t i c o m p o n e n t r e a c t i o n f o r t h e c o m b i n a t o r i a l s y n t h e s i s o f 2 ~ i m i d a z o l i n e s p r e s u m a b l y v i a a s t e p w i s e a l d o l s y n t h e s i s o f t h e i s o c y a n i d e t o t h e i n s i t u 2 2 1 g e n e r a t e d i m i n e f o l l o w e d b y r i n g c l o s u r e 3 8 a T h e y f u r t h e r i n c r e a s e d t h e s c o p e o f t h e i r r e a c t i o n t o s t u d y t h e i n fl u e n c e o f m o r e s t e r i c a l l y d e m a n d i n g g r o u p s o n a m i n e s a n d c a r b o n y l c o m p o u n d s ( i n c l u d i n g k e t o n e s ) . T h e y a l s o s h o w e d t h e c a t a l y t i c u s e o f A g O A c i n f a c i l i t a t i n g t h e f o r m a t i o n o f 2 - i m i d a z o l i n e s f r o m t h e i s o c y a n i d e s . 3 8 b R e c e n t l y , A m d t s e n e t a l d e v e l o p e d a c a t a l y t i c s y n t h e s i s o f m i i n c h n o n e s , u s i n g P d ( 0 ) m e t a l c a t a l y z e d c a r b o n y l a t i o n o f s i m p l e b u i l d i n g b l o c k s s u c h a s a c i d c h l o r i d e s a n d i m i n e s . 3 8 C C a s e y e t a l h a v e d e s c r i b e d a n o v e l m o d u l a r a p p r o a c h f o r t h e p r e p a r a t i o n o f e n a n t i o p u r e 2 - i m i d a z o l i n e s f r o m e n a n t i o p u r e B - a m i n o a l c o h o l s . 3 8 d 0 R e / R R A 3 4 a S O Z N C I Z R h ( l l ) , F e ( | l l ) N 0 2 R 5 = R 3 0 0 , R 6 = H L i ‘ s a p p r o a c h _ _ F l 2 n N H H O . R R z N H z ” 1 ‘ H ' R 3 ‘ “ _ < N R s _ ‘ 2 R a c o x ] 5 R S C H O R 1 \ j . H N " R . N ' 1 , C a s e y s a p p r o a c h 2 4 R 3 R 4 C H N C O r r u s a p p r o a c h R 4 O , , o . A r n d t s e n s a p p r o a c h l l 0 “ 2 _ _ . O C ‘ N f r — R ) L N J K R P d ( 0 ) , b i p y R a R , 3 R 1 2 R 1 C O C I R Z V N ‘ R , F i g u r e I V - 8 . S t e r e o s e l e c t i v e s y n t h e s i s o f a n t i - i m i d a z o l i n e s . G . B i o l o g i c a l i m p o r t a n c e o f i m i d a z o l i n e s T h e s t e r e o c h e r r r i c a l d i v e r s i t y o f s m a l l d i h y d r o h e t e r o c y c l i c s c a f f o l d s p r e s e n t s n o v e l t e r r i t o r y i n t e r m s o f b o t h s t r u c t u r e a n d b i o l o g i c a l a c t i v i t y . T h e i m i d a z o l i n e a n d t h e i r a r o m a t i c c o u n t e r p a r t s - — i m i d a z o l e s c a f f o l d , h a v e a t t r a c t e d c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t o w i n g t o 2 2 2 t h e i r b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s . 3 8 I r n i d a z o l i n e s e x h i b i t i m p o r t a n t p h a r m a c o l o g i c a l a c t i v i t i e s 3 9 a i n t h e i n fl a m m a t i o n p a t h w a y s , i n c l u d i n g a - r e c e p t o r s t i m u l a t i o n , a — a d r e n e r g i c i n h i b i t i o n , v a s o d e p r e s s o r a c t i v i t y , a n t i - h i s t a m i n i c , a n d c h o l i n o m i m e t i c a c t i v i t y . T h e s e e x h i b i t a n t i - i n f l a m m a t o r y , 3 9 b a n t i - n o c i c e p t i v e , a n t i o x i d a n t , i m m u n o - m o d u l a t i n g a c t i v i t i e s 3 9 C a n d a r e u s e f u l i n t e r m e d i a t e s f o r t h e s y n t h e s i s o f m o l e c u l e s w i t h p h a r m a c o l o g i c a l a c t i v i t i e s s u c h a s a n t i - h y p e r c h o l e s t e r o l e m i c , a n t i - d i a b e t i c , a n t i - h y p e r t e n s i v e , o r a n t i - c a n c e r a c t i v i t y . 3 9 ' " d C y c l i c u r e a s a n d t h i o u r e a s a r e i n h i b i t h u m a n i m m u n o d e fi c i e n c y v i r u s ( H I V ) p r o t e a s e a n d H I V r e p l i c a t i o n . 3 9 ¢ F u r t h e r , 2 - i m i d a z o l i n e s s e r v e a s b u i l d i n g b l o c k s f o r t h e s y n t h e s i s o f p h a r m a c e u t i c a l l y r e l e v a n t m o l e c u l e s s u c h a s a z a p e n a m s , d i o x o c y c l a m s , a n d d i a z a p i n o n e s . 3 5 a A l s o , 2 - i m i d a z o l i n e s ( s u i t a b l y f u n c t i o n a l i z e d ) c a n b e c o n v e r t e d t o 2 , 3 - d i a m i n o a c i d s , w h i c h c o u l d b e u s e d i n a n t i b i o t i c s y n t h e s i s . 8 H 0 2 0 > H 0 2 0 " " O J l - l B u H N H r o d e n t C N S c h o l e c y s t o k i n i n i n h i b i t o r s e r a t o n i n r e c e p t o r a g o n i s t s , _ ‘ N H N \ N H C l 3 ; H N N H O n 4 6 ' N ’ . H O F 0 o r K , N \ N H i n v i v a a n t i - h y p e r g l y c e m i c s t r e p t o l i d i n e l a c t a m a c t i v i t y i n r a t s c o r e o f s t r e p t o t h r i c i n a n t i b i o t i c s F i g u r e I V - 9 . B i o l o g i c a l a c t i v i t y o f 2 - i m i d a z o l i n e n u c l e u s . 2 2 3 I m i d a z o l i n e d e r i v a t i v e s , s u c h a s m i d a g l i z o l e a n d d e r i g l i d o l e h a v e b e e n i d e n t i fi e d a s p r o m i s i n g a n t i - h y p e r g l y c e m i c a g e n t s 3 9 c a n d c l o n i d i n e i s a k n o w n a n t i h y p e r t e n s i v e a g e n t , c l o n i d i n e ( F i g u r e I V - I O ) . ‘ ° H H N N N E " Y E l S J N ’ H " \ C l M i d a g l i z o l e D e r i g l i d o l e C l o n i d i n e F i g u r e I V - 1 0 . E x a m p l e s o f a n t i h y p e r g l y c e m i c a n d a n t i - h y p e r t e n s i v e a g e n t s . S i n c e t h e 1 9 9 0 3 , p r e s e n c e o f i m i d a z o l i n e ( 1 ) r e c e p t o r s i n v a r i o u s t i s s u e s h a s g a i n e d c o n s e n s u s . " I S t u d y i n g t h e r o l e o f i m i d a z o l i n e s i n v a r i o u s p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s c o u l d p r o v i d e i n v a l u a b l e i n f o r m a t i o n f o r t r e a t i n g e f fi c a c i o u s l y a v a r i e t y o f d i s o r d e r s s u c h a s h y p e r t e n s i o n , d i a b e t e s m e l l i t u s , g a s t r i c u l c e r , e n d o g e n o u s d e p r e s s i o n , a n d s t r o k e . I m i d a z o l i n e d e r i v a t i v e s h a v e b e e n s t u d i e d a s e s t r o g e n r e c e p t o r m o d u l a t o r s . 4 0 I m i d a z o l i n e r i n g s c a n s u b s t i t u t e f o r a n a m i n o a c i d i n a p e p t i d e , 4 2 m a k i n g i t l e s s s u s c e p t i b l e t o p r o t e o l y t i c c l e a v a g e a n d h e n c e i m p r o v e t h e s t a b i l i t y a n d t h e r a p e u t i c u t i l i t y p e p t i d e s . D e v e l o p m e n t o f s m a l l - m o l e c u l e i n h i b i t o r s o f n o n - e n z y m e p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s h a s b e e n a h e r c u l e a n t a s k b e c a u s e b i n d i n g p o c k e t s o n p r o t e i n s u r f a c e s i n v o l v e d a r e s h a l l o w a n d d y n a m i c a s c o m p a r e d t o e n z y m e s w h i c h h a v e w e l l d e fi n e d a n d r i g i d b i n d i n g p o c k e t s o r a c t i v e s i t e s . 4 4 M o r e o v e r , t h e a r e a o f e x p a n s e f o r p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s i s l a r g e . A S a n e x c e p t i o n t o t h i s i d e a , t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f M D M 2 b o u n d t o a p e p t i d e f r o m t h e t r a n s a c t i v a t i o n d o m a i n o f p 5 3 h a s r e v e a l e d t h a t N H D M Z p o s s e s s e s a r e l a t i v e l y d e e p h y d r o p h o b i c p o c k e t t h a t i s fi l l e d p r i m a r i l y b y t h r e e s i d e c h a i n s f r o m t h e h e l i c a l r e g i o n o f t h e p e p t i d e . 4 5 T h i s w e l l - d e fi n e d p o c k e t o n t h e M D M 2 h i g h l i g h t s t h e f a c t t h a t s m a l l 2 2 4 m o l e c u l e s m i g h t b l o c k t h e i n t e r a c t i o n o f M D M 2 w i t h p 5 3 . C i s - i m i d a z o l i n e a n a l o g s n a m e d N u t l i n s 4 6 a r e o n e s u c h c l a s s o f m o l e c u l e s w h e r e t h e i m i d a z o l i n e s c a f f o l d r e p l a c e s t h e h e l i c a l b a c k b o n e o f t h e p 5 3 p e p t i d e a n d p r o j e c t s t h e t h r e e g r o u p s i n t o t h e p o c k e t s n o r m a l l y o c c u p i e d b y P M ” , T r p ” , a n d L e u 2 6 o f p 5 3 . F i g u r e I V - l l . ( A ) O v e r l a y o f p 5 3 a n d n u t l i n . ( B ) N u t l i n i n t h e d e e p p o c k e t o f M D M 2 . 4 6 T h i s b i n d i n g o f c i s - i m i d a z o l i n e s t o N fl 3 M 2 i n t h e p 5 3 b i n d i n g p o c k e t , l e a d s t o a c c u m u l a t i o n o f p 5 3 l e a d i n g t o c e l l c y c l e a r r e s t , a p o p t o s i s , a n d g r o w t h i n h i b i t i o n o f h u m a n t u m o r x e n o g r a f t s i n n u d e m i c e . 4 6 T h i s e x a m p l e h a s s e r v e d a s a n a r c h e t y p e f o r d e v e l o p m e n t o f o t h e r s m a l l m o l e c u l e i n h i b i t o r s o f p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s ( S M P P I ’ s ) . O C l “ I N K / “ Y O O W N ? H c e r — < C < > — < \ : 3 0 0 2 ” ‘ i : t C O Z H O ' n u t l l n " S P - 4 - 8 4 s y n - i m i d a z o l i n e I V - 4 - 1 F i g u r e I V - 1 2 . S t r u c t u r e o f n u t l i n ( s y n - i m i d a z o l i n e ) , S P - 4 — 8 4 ( a n t i - i m i d a z o l i n e ) , I V - 4 - l . T h e d i V e r s e b i o - a c t i v i t y o f a n t i - i m i d a z o l i n e s i s e x e m p l i fi e d b y t h e u n i q u e a n t i c a n c e r P Y O p e r - t i e s o f a n t i - i m i d a z o l i n e s ( S P - 4 - 8 4 , d e s c r i b e d a s I I I - 4 i n t h i s c h a p t e r H I o f t h i s 2 2 5 t h e s i s ) . ‘ 7 T h e a n t i - i m i d a z o l i n e S P - 4 - 8 4 w a s f o u n d t o b e a d r a s t i c e n h a n c e r o f t h e c h e m o t h e r a p e u t i c e f fi c a c y o f a n t i c a n c e r a g e n t s t h r o u g h a p o s s i b l e m o d u l a t i o n o f t h e a n t i - a p o p t o t i c N F - K B s i g n a l i n g p a t h w a y . 4 7 H . L e w i s a c i d m e d i a t e d s y n t h e s i s o f a n t i - i m i d a z o l i n e s v i a t h e g e n e r a t i o n o f m i i n c h n o n e s W e p r e v i o u s l y r e p o r t e d t h e p r e p a r a t i o n o f a n t i - i m i d a z o l i n e s u s i n g t r i m e t h y l s i l y l c h l o r i d e m e d i a t e d l , 3 d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n o n t h e a z l a c t o n e t e m p l a t e i n g o o d y i e l d s a n d h i g h d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y ( S c h e m e I V - 2 ) . 3 2 ' 3 4 W e e n v i s i o n e d t h a t a L e w i s a c i d c o o r d i n a t i o n t o n i t r o g e n o f t h e a z l a c t o n e w o u l d i n c r e a s e t h e e q u i l i b r i u m c o n c e n t r a t i o n o f m u n c h n o n e i n t e r m e d i a t e a n d m e d i a t e t h e a z o m e t h i n e y l i d e - i m i n e c y c l o a d d i t i o n r e a c t i o n . T h e c h o i c e o f t h e i m i n e w a s i m p o r t a n t a s u n a c t i v a t e d o r e l e c t r o n r i c h i m i n e s h a v e r a r e l y b e e n u s e d w i t h m i l n c h n o n e s b e f o r e ( t o s y l i m i n e s l e a d t o e n h a n c e d a r o m a t i z a t i o n ) . , R 4 N H ) l o 6 ’ 0 R / u — N H 3 8 1 . 4 — ' > R 1 R 2 ) N I g ' a t i e m I E " R 2 ° a : ‘ 9 4 O 0 3 0 - 5 0 % l V - A , R R - P h ; R - M 6 ; R = B n R 1 ~ < \ N I R Z 1 3 - 2 - 4 N ’ R ‘ R 4 R 1 ) ' N R a \ _ _ _ > 0 3 $ 0 9 R 3 R 1 — < \ 1 R 2 " ‘ 8 ‘ N C O z H L . A . ’ 6 3 R 2 S c h e m e I V - 2 . L e w i s a c i d m e d i a t e d g e n e r a t i o n o f m t i n c h n o n e a n d c y c l o a d d i t i o n I n C a s e o f 2 - p h e n y l i m i d a z o l i n e s , h i g h d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y w a s a t t r i b u t e d t o A ( l , 3 ) S t r a i n , i n t h e a z l a c t o n e d i p o l e , w h i c h p r e v e n t s c o - p l a n a r i t y o f P h , T M S a n d R 2 g r o u p s . I n O r d e r t o p r e v e n t s t e r i c i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e b u l k y s i l y l g r o u p o f t h e a z l a c t o n e a n d R 3 2 2 6 g r o u p o f i m i n e , t h e e n d o a p p r o a c h o f t h e i m i n e w a s f a v o r e d r e s u l t i n g i n a n t i - i s o m e r a s t h e m a j o r o r s o l e p r o d u c t ( S c h e m e I V - 3 , p a t h a ) . 3 3 R 4 R e 0 o ‘ R P h g g N N 3 o 0 K : S ' \ H R 2 C O ? ” p h _ . < \ I R S e n d o m a j o r N H N - R R . 3 1 3 8 ; b P h ( ‘ 9 N O T : — - > [ a h — ( 3 : 2 3 N - - “ 2 5 1 - 7 8 % \ S i / \ R N 0 0 H 3 ‘ 3 2 m i n o r 2 9 x 0 S c h e m e I V - 3 . P r o p o s e d t r a n s i t i o n s t a t e s f o r d i a s t e r e o s e l e c t i v e s y n t h e s i s o f a n t i - i m i d a z o l i n e s . H o w e v e r , b y r e d u c i n g t h e r e s o n a n c e s t a b i l i z a t i o n o f t h e c a r b o c a t i o n i n t h e d i p o l e b y c h a n g i n g t h e e l e c t r o n i c n a t u r e o f t h e R . s u b s t i t u e n t , a s i g n i fi c a n t c h a n g e i n d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y w a s o b s e r v e d ( e n t r i e s 1 - 4 , T a b l e I V - l ) . R e p l a c e m e n t o f t h e p h e n y l g r o u p b y a b e n z y l o r a m e t h y l m o i e t y s i g n i fi c a n t l y e r o d e d t h e s t e r e o s e l e c t i v i t y ( e n t r i e s 1 - 3 , T a b l e I V - l ) . F u r t h e r , s w i t c h i n g t h e P h a n d M e g r o u p s a t R ; a n d R 2 p o s i t i o n s f a v o r e d t h e f o r m a t i o n o f s y n - i m i d a z o l i n e ( w i t h r e s p e c t t o R 2 a n d R 3 ) a s t h e m a j o r p r o d u c t i n 9 0 : 1 0 r a t i o ( c o m p a r e e n t r y 1 a n d 4 , T a b l e I V - l ) . 2 2 7 R 1 " < \ : O I [ H 2 N 3 R - R R \ 4 : > R 1 — < . n \ ‘ 3 R z l + R 1 — < R \ 4 : 1 2 : 5 - n u b O H z T M S C I ( 1 . 3 e q . ) C O 2 H C O Z H 2 C l 2 s y n - a n t l - E n t r y C o m p o u n d R 1 I 1 2 R 3 R 4 Y i e l d s y n z a n t l l V - 1 - 1 P h M e P h B n 7 5 > 5 2 9 5 l V - 2 - 1 B n M e P h B n 7 6 3 3 : 6 7 I V - 3 - 1 M e M e P h B n 1 2 * 5 0 : 5 0 l V - I H M e P h P h B n 7 2 9 0 : 1 0 * T h e a z l a c t o n e f o r e n t r y 2 i s v o l a t i l e r e s u l t i n g i n l o w i s o l a t e d y i e l d s T a b l e I V - l . I n fl u e n c e o f R . g r o u p o n d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y . I n t r i g u e d b y t h e c l e a r r e v e r s a l o f d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y , w e i n v e s t i g a t e d t h e r o l e o f t h e R 1 a n d R 2 s u b s t i t u e n t s o n t h e a z l a c t o n e t e m p l a t e . I n v i e w o f a p o t e n t i a l d i v e r s e b i o l o g i c a l r e s p o n s e r e s u l t i n g f r o m t h e s t e r e o c h e m i c a l d i v e r s i t y o f t h e s e i m i d a z o l i n e s c a f f o l d s , w e i d e n t i fi e d a t r i m e t h y l s i l y l c h l o r i d e m e d i a t e d s u b s t r a t e c o n t r o l l e d 1 , 3 - d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n f o r t h e d i a s t e r e o s e l e c t i v e f o r m a t i o n o f s y n - o r a n t i - i m i d a z o l i n e s . 2 2 8 B - l a c t a m ” 0 , . ‘ N H H fi p h 4 — K C H 2 P h I V - A J L J L . _ L . 2 L _ _ [ I I I I I T I I I 9 l o I I I I 8 1 5 I I r I — I g T I I 7 l I I I I 7 I O I I I I 6 1 5 I I I I I I I I I I T I I S I O I I I I I I I I I I O I I I I 3 I I I I I I T I T T I I I I I [ I I I I I I I I I I I I I I I I I I I l 0 . 0 9 . 5 . 0 8 5 . 7 5 . . 0 6 . 6 0 . . 5 5 0 . 4 . 5 3 . 5 3 . 0 2 . 5 2 . 0 1 . 5 l . 0 0 . 5 T r a n s - l m l d a z o l l n e B n P h \ N P h — < \ 1 M 9 N 0 0 2 H m m W W L ' 1 0 " I I I Y Y fi r t I Y Y Y I I j I T I I T r I ' I I Y V I I I ‘ [ I T r T I T I I j T l I i j l C l o - I m i d a z o l i n e 3 " . N P h M ° _ < \ N : . £ P h ' ‘ w a s - 1 0 0 2 ’ H U J L W 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 r 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l l l l l l l l l l l l l l l l l 8 . 0 7 . 5 7 . 0 6 . 5 6 . 0 5 . 5 5 . 0 4 . 5 4 . 0 3 . 5 3 . 0 2 . 5 2 . 0 1 . 5 1 . 0 0 . 5 0 . 0 F i g u r e I V - 1 3 . ( a ) I H s p e c t r a f o r a r e p r e s e n t a t i v e B - l a c t a m ( I V - A ) , t r a n s - i m i d a z o l i n e ( I V - 1 - 1 ) a n d c i s - i m i d a z o l i n e ( I V - 4 - 1 ) . 2 2 9 Z‘ B - l a c t a m Z I I I ’ I , . ‘ . \ \ P h \ \ 1 C H Z P h I I I I T _ I I I I I I I I I I I T I I I I I j T j . A L L ' L — L J L , L , L L 2 0 0 I 7 5 1 5 0 l 2 5 m o 5 0 2 5 T r a n s - I m i d a z o l i n e 3 “ . N P h P h — < \ I M e N C O g H l V - 1 - 1 o n - . - 1 . . . h i s L - . v v — v ' v v v w w v ' — v w v w — — — v w ‘ v V v V “ v v — v w 2 " ) 0 ' “ ' l ; 5 " 1 1 | 5 0 ' t r i g s fi r v ‘ l i h ) 7 1 5 5 1 0 r 2 5 C l o - I m i d a z o l i n e 3 " . N 1 P 1 : M ° _ < \ N . _ P h ‘ H I v a r - 1 C O 2 F i g u r e I V - 1 3 b . ” C s p e c t r a f o r a r e p r e s e n t a t i v e B - l a c t a m ( I V - A ) , t r a n s - i m i d a z o l i n e ( I V - 1 - 1 ) a n d c i s - i m i d a z o l i n e ( I V - 4 - 1 ) . 2 3 0 m L L L i l . L - 1 A I I I I I I I i r I I I I I I T I I I I I I T I I I I I I I I I I I I I I T I I T _ I 2 0 0 1 7 5 1 5 0 1 2 5 1 m 7 5 5 0 2 5 0 F i g u r e I V - 1 3 b . ( c o n t d . ’ ) l 3 C s p e c t r a f o r a r e p r e s e n t a t i v e B - l a c t a m ( I V - A ) , t r a n s - i m i d a z o l i n e ( I V - l - l ) a n d c i s — i m i d a z o l i n e ( I V - 4 - 1 ) . T h e a z l a c t o n e s w e r e p r e p a r e d f r o m t h e N - a c e t y l a m i n o a c i d s v i a a n E D C I - m e d i a t e d d e h y d r a t i o n p r o c e s s a s p r e v i o u s l y r e p o r t e d . ” ' 8 ’ 2 2 T h e N - a c y l p - m e t h o x y p h e n y l g l y c i n e ( a m i n o a c i d s f o r e n t r i e s 1 0 a n d 1 1 , T a b l e I V - 2 ) w a s s y n t h e s i z e d b y e m p l o y i n g a m o d i fi e d p r o c e d u r e o f W a s s e r m a n e t a l . 4 8 T h e c y c l o a d d i t i o n r e a c t i o n s w e r e c o n d u c t e d u n d e r m i l d r e f l u x c o n d i t i o n s i n d i c h l o r o m e t h a n e o r T H F i n p r e s e n c e o f 1 . 3 e q u i v a l e n t s o f T M S C I . T h e i m i d a z o l i n e p r o d u c t s w e r e i s o l a t e d b y p r e c i p i t a t i o n . S y n - i m i d a z o l i n e s w e r e r e - p r e c i p i t a t e d f r o m t h e m i x t u r e i n m o d e s t t o g o o d y i e l d s a n d t h e s y n - c o n fi g u r a t i o n ( r e l a t i v e t o R 2 a n d R 3 ) w a s c o n fi r m e d u n a m b i g u o u s l y b y X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y ( F i g u r e I V - l 4 ) . 2 3 1 C ( 2 5 ) C ( 2 6 ) Q 0 C ( 2 2 ) ‘ 3 » . 0 1 2 4 1 1 ? » ‘ v c ( i \ ‘ R . C ( 2 0 ) , I ‘ M C 1 2 3 1 1 1 1 2 L 3 4 ' 1 ' ) , 0 ( 6 ) I 2 ; ) ; , \ C ( 2 7 ) , I ) . A ” ? v ’ c 1 5 1 C ( 2 8 ) C ( 2 ) ‘ , " l ( M 3 1 5 3 C 4 , ( 3 ‘ 1 5 ) 0 ( 9 ) / ' ‘ ‘ $ ’ 1 . ; ) ’ : / C ( 7 ) / ~ , ' ° C ( 1 9 ) ’ ~ ’ . ' C ( 1 8 ) O r 0 0 8 ) ’ 5 ? ) 1 ; C ( 1 7 ) " / 7 0 ( 1 5 ) C ( 2 1 ) ( 2 2 , ' 0 1 1 6 1 1 3 . S , , \ i ’ ” A , 1 . 3 C ( 2 0 ) - 0 5 ' ‘ C ( 1 4 ) , 0 c m N l l l 9 3 ° ‘ 2 ’ 0 ‘ 1 9 ‘ . . 2 \ ” 2 , ' 1 8 ) I , “ \ 1 ‘ « m m ' ‘ 4 0 ( 5 ) ‘ 3 ‘ ) C ( 6 ) ‘ " ‘ 4 ’ 1 . 7 : ) \ C i Z S l 9 “ C ( 1 3 ) ’ " C ( 1 2 ) 2 “ . C ( 2 6 ) 3 : ; 0 ( 2 7 ) 0 0 F i g u r e I V - l 4 . X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e o f c o m p o u n d I V - 4 - 1 ( t o p ) , I V - 4 - 6 ( m i d d l e ) , I V - S - 1 ( b o t t o m ) . 2 3 2 C ( 1 9 ) 0 F i g u r e I V - 1 4 . ( c o n t d . ’ ) X - - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e o f c o m p o u n d I V - 4 - 1 ( t o p ) , I V - 4 - 6 ( m i d d l e ) , I V - S - l ( b o t t o m ) . I n o r d e r t o u n d e r s t a n d t h e r o l e o f t h e R 2 g r o u p i n t h e d i a s t e r e o c h e m i c a l o u t c o m e o f t h e r e a c t i o n , t h e R 2 g r o u p w a s v a r i e d w h i l e R . w a s m a i n t a i n e d a s m e t h y l o r p h e n y l . E n t r y C o m p o u n d R 1 R 2 R a R 4 Y i e l d s y n z a n t l 5 [ I V - 5 4 M e B n P h B n 5 5 7 5 : 2 5 6 l V - 6 - 1 P h B n P h B n 4 5 > 5 : 9 5 7 l V - 7 - 1 M e i P r P h B n 7 9 5 0 : 5 0 8 l V - 8 - 1 P h i P r P h B n 7 1 > 5 : 9 5 9 l V - 9 - 1 P h P h P h B n 6 5 > 5 : 9 5 1 0 l V - 1 0 - 2 M e p - O M e P h p - N O z P h B n 6 6 > 9 5 : 5 1 1 l V - 1 1 - 2 P h p - O M e P h p - N O z P h S o 5 3 > 5 : 9 5 T a b l e I V - 2 . I n f l u e n c e o f R 2 f a v o r i n g s y n - i m i d a z o l i n e s . T h e a n t i - d i a s t e r e o m e r w a s o b t a i n e d w i t h R , a s a p h e n y l g r o u p a n d R 2 a n a l k y l o r a r y l g r o u p ( e n t r i e s 6 , 8 a n d 9 , T a b l e I V - 2 ) . 2 3 3 H o w e v e r , w h e n R 1 i s m e t h y l , a n d R 2 i s m e t h y l , b e n z y l o r i s o - p r o p y l ( e n t r y 3 , T a b l e I V - l ; e n t r i e s 5 a n d 7 , T a b l e I V - 2 ) a m i x t u r e o f d i a s t e r e o m e r s w a s o b t a i n e d . S y n - i m i d a z o l i n e s w e r e o b t a i n e d a s t h e m a j o r o r s o l e p r o d u c t s w i t h t h e R 2 s u b s t i t u e n t a s a n a r y l g r o u p ( e n t r y 4 , T a b l e I V - l ; e n t r y 1 0 , T a b l e I V - 2 ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t a p o s s i b l e r o l e o f 1 : - s t a c k i n g i n t e r a c t i o n s b e t w e e n n e i g h b o r i n g n - d o n o r R 2 a n d 1 t — a c c e p t o r R 3 ( t h e c e n t r o i d - c e n t r o i d d i s t a n c e b e t w e e n R 2 a n d R 3 i n I V - 4 - l w a s f o u n d t o b e 3 . 9 8 A , c o r r e s p o n d i n g t o a v a n d e r W a a l s c o n t a c t ) . 4 9 J . V a r i a t i o n o f R 3 a n d R 4 S o m e c o n t r o l o n t h e d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y w a s o b s e r v e d b a s e d o n t h e e l e c t r o n i c n a t u r e o f t h e i n c o m i n g d i p o l a r o p h i l e . E l e c t r o n d o n a t i n g g r o u p s a t R 3 r e s u l t e d i n r e d u c e d s y n - d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y ( e n t r y 1 4 , T a b l e I V - 3 ) , w h i l e e l e c t r o n - w i t h d r a w i n g g r o u p s e n h a n c e d s y n - d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y ( e n t r y 1 6 , T a b l e I V - 3 ) . N o t s u r p r i s i n g l y , w h e n R . i s p h e n y l , t h e n a t u r e o f R 2 , R 3 o r R 4 d i d n o t c o m p r o m i s e t h e a n t i - d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y ( e n t r i e s 6 , 8 , 9 , 1 1 , T a b l e I V - 2 ; e n t r i e s 1 3 , 1 5 , 1 7 , 1 9 , 2 1 , T a b l e I V - 3 ) . A b u l k y g r o u p s u c h a s i s o - p r o p y l a t t h e R 3 p o s i t i o n d i d n o t a f f o r d a n y i m i d a z o l i n e a n d o n l y y i e l d e d B - l a c t a m , p r e s u m a b l y v i a a t r a d i t i o n a l [ 2 + 2 ] c y c l o a d d i t i o n r e a c t i o n ( e n t r y 1 2 , T a b l e I V - 3 ) . B o t h a r y l a s w e l l a s s u b s t i t u t e d a l k y l g r o u p s a r e t o l e r a t e d a t R 4 P o s i t i o n ( e n t r y 4 , T a b l e I V - l ; e n t r i e s 2 0 a n d 2 2 , T a b l e I V - 3 ) . 2 3 4 E n t r y C o m p o u n d R 1 H z 8 3 R 4 Y i e l d s y n z a n t l 1 2 ( V 4 4 M e P h ' P r B n 0 * - 4 - m e t h o x y . 1 3 l V - 1 - 4 P h M e p h e n y l B n 7 8 > 5 9 5 4 - m e t h o x y . 1 4 ~ 4 4 M e P h p h e n y l B n 6 0 6 0 . 4 0 1 5 l V - 1 - 5 P h M e 4 - n i t r o p h e n y l B n 5 1 > 5 : 9 5 1 6 I V - 4 - 5 M e P h 4 - n i t r o p h e n y l B n 7 1 > 9 5 : 5 1 7 I V - 1 - 6 P h M e - C O O E t B n 6 5 > 5 : 9 5 1 8 ~ 4 6 M e P h - C O O E t B n 3 2 > 9 5 : 5 1 9 I V - 1 - 7 P h M e P h - C H 2 0 0 0 M e 7 O > 5 : 9 5 2 0 I V - 4 - 7 M e P h P h C H Z C O O M e 4 4 > 9 5 : 5 2 1 l V - 1 - 3 P h M e P h 4 - f l u o r o p h e n y l 7 4 > 5 : 9 5 2 2 l V - 4 - 8 M e P h P h 4 - f l u o r o p h e n y l 2 0 > 9 5 : 5 2 3 I V - 1 - 9 P h M e P h n - B u 5 ' > 9 5 : 5 2 4 l V - 4 - 9 M e P h P h n - B u 4 3 > 5 : 9 5 T a b l e I V - 3 . V a r i a t i o n o f R 3 a n d R 4 . * M a i n p r o d u c t i s B - l a c t a m . T h e a b o v e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t R . c o n t r o l s t h e b r a n c h p o i n t o f t h e s t e r e o c h e m i c a l d i v e r s i t y . W h e n R 1 i s a r y l , t h e a n t i - d i a s t e r e o m e r i s e x c l u s i v e l y f o r m e d v i a t h e e n d o a p p r o a c h ( F i g u r e I V - l S ) . U p o n c o o r d i n a t i o n w i t h t h e T M S g r o u p , t h e m u n c h n o n e g e t s l o c k e d i n a n a n t i - d i p o l e o r i e n t a t i o n . A c y c l i c a z o m e t h i n e y l i d e s d e r i v e d f r o m a - i m i n o e s t e r s h a v e b e e n p r o p o s e d t o a d o p t a p r e f e r r e d s y n o r i e n t a t i o n i n p r e s e n c e o f L e w i s a c i d s d u e t o c h e l a t i o n w i t h t h e c a r b o x y l o x y g e n . s o E n d o - a p p r o a c h f a v o r e d d u e t o s t e r i c i n t e r a c t i o n b e t w e e n T M S a n d P h ( R 2 ) g r o u p ( S c h e m e I V - 4 ) . 2 3 5 A B a c y c l i c a z o m e t h i n e Y l i d e M fl n c h n o n e a n t i - d i p o l e s y n - d i p o l e P h M e M , o O M e M e \ 4 k 8 \ $ 9 , . o L \ x ' \ 5 ' " " " " " N ‘ 1 O / S i " " " N ‘ . A 9 , 6 M e / ' e ' . M e 9 % / ‘ N R . 1 \ / P h 9 ‘ L I 6 ' ) M 6 3 { P h 0 M i i O _ J M e ) ‘ e g ‘ P h : ' 3 I / N \ H H P h l e n d o l e x o P h M e M e ( 9 M e ‘ 3 - - - » N / ’ \ O H \ . , , , , , , N ’ C H M e ’ I M e 7 s ' M e P h P h \ M e < \ 0 M e N O H N P h — \ P h H P h a n t i s y n S c h e m e l V - 4 . P r o p o s e d m e c h a n i s t i c r a t i o n a l e f o r t h e f o r m a t i o n o f s y n - i m i d a z o l i n e s . H o w e v e r , w h e n R 1 i s a l k y l , R 2 n e e d s t o b e a r y l t o o b t a i n s y n - i m i d a z o l i n e s w i t h h i g h d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h i s s w i t c h i n d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y i s t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e e m a p p r o a c h d u e t o f a v o r a b l e n — s t a c k i n g i n t e r a c t i o n s b e t w e e n R 2 ( P h ) a n d R 3 ( P h ) . K . C o n c l u s i o n W e h a v e i d e n t i fi e d a n e f f i c i e n t b r a n c h p o i n t f o r e n h a n c i n g t h e s t e r e o c h e m i c a l d i v e r s i t y o f i m i d a z o l i n e s c a f f o l d s b y m a n i p u l a t i o n o f t h e s u b s t i t u e n t s o n t h e g e n e r a l a z l a c t o n e t e m p l a t e . T h e p r e v i o u s l y r e p o r t e d h i g h a n t i - d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y c o u l d b e c o m p l e t e l y r e v e r s e d f a v o r i n g t h e s y n - i m i d a z o l i n e s i n s y n t h e t i c a l l y u s e f u l y i e l d s . 2 3 6 L . E x p e r i m e n t a l S e c t i o n R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n o v e n - d r i e d g l a s s w a r e u n d e r n i t r o g e n a t m o s p h e r e , u n l e s s o t h e r w i s e n o t e d . A l l c o m m e r c i a l r e a g e n t s w e r e u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r i fi c a t i o n . A l l s o l v e n t s w e r e r e a g e n t g r a d e . T H F w a s f r e s h l y d i s t i l l e d f r o m s o d i u m / b e n z o p h e n o n e u n d e r n i t r o g e n . T o l u e n e , C H 2 C l 2 , a n d T M S C l w e r e f r e s h l y d i s t i l l e d f r o m C a H 2 u n d e r n i t r o g e n . A l l r e a c t i o n s w e r e m a g n e t i c a l l y s t i r r e d a n d m o n i t o r e d b y T L C w i t h A n a l t e c h 0 . 2 5 m m p r e - c o a t e d s i l i c a g e l p l a t e s . C o l u m n c h r o m a t o g r a p h y w a s c a r r i e d o u t o n s i l i c a g e l 6 0 ( 2 3 0 — 4 0 0 m e s h ) s u p p l i e d b y E M S c i e n c e . Y i e l d s r e f e r t o c h r o m a t o g r a p h i c a l l y a n d s p e c t r o s c o p i c a l l y p u r e c o m p o u n d s u n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d . M e l t i n g p o i n t s w e r e d e t e r m i n e d o n a M e l - T e m p ( L a b o r a t o r y d e v i c e s ) a p p a r a t u s w i t h a m i c r o s c o p e a t t a c h m e n t . I n f r a r e d s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a N i c o l e t I R / 4 2 s p e c t r o m e t e r . ‘ H a n d 1 3 C N M R s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a V a r i a n G e m i n i - 3 0 0 s p e c t r o m e t e r o r a V a r i a n V X R - S O O s p e c t r o m e t e r . C h e m i c a l s h i f t s a r e r e p o r t e d r e l a t i v e t o t h e r e s i d u e p e a k s o f t h e s o l v e n t C D C 1 3 ( 5 7 . 2 4 f o r ' H a n d 5 7 7 . 0 f o r I 3 C ) , D M S O - d 6 ( 5 2 . 4 9 ( 5 ) f o r ' H a n d 5 3 9 . 5 ( 7 ) f o r ' 3 C ) a n d C D 3 O D ( 5 3 . 3 ( 5 ) , 4 . 7 8 ( 1 ) f o r ' H a n d 5 4 9 . 0 ( 7 ) f o r 1 3 C ) . H i g h r e s o l u t i o n m a s s s p e c t r a a n d F A B m a s s s p e c t r a w e r e o b t a i n e d a t t h e M a s s S p e c t r o m e t r y L a b o r a t o r y o f t h e D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , w i t h a J E O L A X - S O S H a n d a . l E O L H X - l 1 0 d o u b l e f o c u s i n g m a s s s p e c t r o m e t e r ( J E O L U S A , P e a b o d y , M A ) , r e s p e c t i v e l y . G a s c h r o m a t o g r a p h y / l o w r e s o l u t i o n m a s s s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a H e w l e t t — P a c k a r d 5 8 9 0 S e r i e s I I g a s c h r o m a t o g r a p h c o n n e c t e d t o a T R I O - l E I m a s s s p e c t r o m e t e r . A l l c h e m i c a l s w e r e 2 3 7 o b t a i n e d f r o m S i g m a - A l d r i c h C h e m i c a l C o . a n d u s e d a s r e c e i v e d . N - a c e t y l p h e n y l g l y c i n e w a s o b t a i n e d f r o m B a c h e m C 0 . G e n e r a l p r o c e d u r e f o r s y n t h e s i s o f i m i n e s A s o l u t i o n o f a l d e h y d e ( l m m o l ) i n b e n z e n e / t o l u e n e ( 2 0 m l ) w a s r e fl u x e d w i t h t h e a m i n e ( 1 m m o l ) f o r 2 h T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d u n d e r v a c u u m t o a f f o r d t h e i m i n e i n g o o d y i e l d s . T h e s e i m i n e s w e r e u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r i fi c a t i o n . N o t e : I V - I - 6 ( ( E ) - e t h y l 2 - ( b e n z y l i m i n o ) a c e t a t e ) w a s s y n t h e s i z e d o n b y s t i r r i n g e t h y l g l y o x a l a t e ( l e q . ) a n d b e n z y l a m i n e ( l . l e q . ) o v e r N a 2 S O 4 i n C H 2 C l 2 . D u e t o i t s i n s t a b i l i t y , t h e i m i n e w a s n o t i s o l a t e d o r c h a r a c t e r i z e d . I V - I - 3 w a s s y n t h e s i z e d b y s t i r r i n g i s o p r o p a n a l ( 1 e q . ) a n d b e n z y l a m i n e ( 1 . 0 1 e q . ) o v e r a l u m i n a f o r 7 h a t r o o m t e m p e r a t u r e . ( E ) - N - b e n z y l i d e n e ( p h e n y l ) m e t h a n a m i n e , I V - I - l ( H U M E ) l H N N I R ( 3 0 0 M H z ) , C D C l 3 : 5 : 4 . 8 3 ( s , 2 H ) , 7 . 2 2 - 7 . 9 6 ( m , 1 0 H ) , 8 . 3 9 ( s , 1 H ) ; 1 3 C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) C D C l 3 : 6 4 . 9 9 , 1 2 6 . 9 7 , 1 2 7 . 9 9 , 1 2 8 . 2 6 , 1 2 8 . 4 8 , 1 2 8 . 5 8 , 1 3 0 . 7 7 , 1 3 6 . 0 6 , 1 3 9 . 2 1 , 1 6 2 . 0 5 ; I R ( C H C 1 3 ) : 3 0 6 3 . 3 , 3 0 2 8 . 6 , 2 8 4 3 . 4 , 1 6 4 3 . 5 , 1 4 5 2 . 6 c m " . E I M S : m / z = 1 9 5 . 3 ( M + ) . ( E ) - N - ( 4 - n i t r o b e n z y l i d e n e ) ( p h e n y l ) m e t h a n a m i n e , I V - I - 2 2 3 8 ' H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C l 3 : 5 : 4 . 8 7 ( s , 2 H ) , 7 2 3 - 7 3 5 ( 1 1 ) , 5 H ) , 7 . 9 1 ( d , 2 H , J = 8 . 4 H z ) , 8 . 2 3 ( d , 2 H , J = 8 . 4 H z ) , 8 . 4 4 ( s , 1 H ) ; l 3 C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) C D C l 3 : 6 5 . 1 9 , 1 2 3 . 8 7 , 1 2 7 . 3 1 , 1 2 8 . 0 6 , 1 2 8 . 6 5 , 1 2 8 . 9 2 , 1 3 8 . 4 1 , 1 4 1 . 5 6 , 1 5 9 . 4 4 ; I R ( C H C 1 3 ) : 3 0 3 0 . 6 , 2 8 5 1 . 1 , 1 6 4 7 . 4 , 1 6 4 5 . 5 , 1 6 0 3 . 1 , 1 5 2 2 . 4 , 1 3 4 4 . 6 c m " . E I M S : m / z = 2 3 9 . 8 M + ) . ( E ) - N - ( 2 - m e t h y l p r o p y l i d e n e ) ( p h e n y l ) m e t h a n a m i n e , I V - I - 3 9 5 1 5 0 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C l 3 : 8 : l . 0 9 ( d , 6 H , J = 6 . 9 H z ) , 2 . 5 ( m , 1 H ) , 4 . 5 4 ( s , 2 H ) , 7 . 2 5 - 7 . 3 1 ( m , 5 H ) , 7 . 6 2 ( d , 1 H , J = 4 . 2 H z ) ; ” C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) C D C l 3 : 1 9 . 2 5 , 3 4 . 0 3 , 6 4 . 7 1 , 1 2 6 . 7 3 , 1 2 7 . 6 8 , 1 2 8 . 3 1 , 1 3 9 . 3 8 , 1 7 0 . 8 7 ; I R ( C H C 1 3 ) : 3 0 2 8 . 6 , 2 9 6 4 . 1 , 2 8 7 2 . 4 , 2 8 2 8 , 1 6 7 0 . 6 , 1 4 5 2 . 6 c m " . E I M S : m / z = 1 6 0 . 7 ( M + ) . ( E ) - N - ( 4 - m e t h o x y b e n z y l i d e n e ) ( p h e n y l ) m e t h a n a m i n e , I V - I - 4 M O U N V Q 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C l 3 : 8 : 3 . 8 2 ( s , 3 H ) , 4 . 7 8 ( s , 2 H ) , 6 . 9 0 ( d , 2 H , J = 8 . 1 H z ) , 7 . 2 3 - 7 . 3 3 ( m , S H ) , 7 . 7 l ( d , 2 H , J = 8 . 1 H z ) , 8 . 2 9 ( s , 1 H ) ; 1 3 C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) C D C l 3 : 5 5 . 3 3 , 6 4 . 9 3 , 1 1 3 . 9 5 , 1 2 6 . 8 7 , 1 2 7 . 9 2 , 1 2 8 . 4 2 , 1 2 9 . 8 0 , 1 6 1 . 3 0 ; I R ( C H C 1 3 ) : 3 0 2 8 . 6 , 2 9 2 8 . 2 , 2 8 3 7 . 7 , 1 6 4 7 . 4 , 1 6 0 0 . 9 , 1 5 1 2 . 4 , 1 2 5 1 . 9 c m " . E I M S : m / z = 2 2 5 . 3 ( M ) . 2 3 9 ( E ) - m e t h y l 2 - ( b e n z y l i d e n e a m i n o ) a c e t a t e , I V - I - 7 @ N V C O O M G 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C l 3 : 5 : 3 . 7 6 ( s , 3 H ) , 4 . 4 1 ( s , 2 H ) , 7 . 4 0 - 7 . 7 7 ( m , 5 H ) , 8 . 2 8 ( s , 1 H ) ; C D C l 3 : 5 2 . 1 3 , 6 1 . 9 8 , 1 2 8 . 6 0 , 1 3 1 . 2 4 , 1 3 5 . 4 9 , 1 6 5 . 4 5 , 1 7 0 . 5 5 ; I R ( C H C I 3 ) : 2 9 2 4 . 1 , 1 7 4 3 . 9 , 1 6 4 7 . 4 , 1 1 9 9 . 9 c m " , E I M S : m / z = 1 7 8 . 0 ( M + ) . ( E ) - N - b e n z y l i d e n e - 4 - f l u o r o b e n z e n a m i n e , l V - I - 8 C H ” O F ' H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C l 3 : 5 : 7 . 0 6 - 7 . 9 0 ( m , 9 H ) , 8 . 4 l ( s , 1 H ) ; l 3 C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) C D C l 3 : 1 1 5 . 4 8 , 1 1 5 . 9 7 , 1 2 2 . 2 1 , 1 2 8 . 7 6 , 1 3 0 . 0 8 , 1 3 5 . 9 9 , 1 4 7 . 9 8 , 1 5 9 . 5 8 , 1 6 0 . 1 7 , 1 6 2 , 8 3 ; I R ( C H C I 3 ) : 3 0 2 8 . 6 , 2 8 8 0 . 0 , 1 6 8 5 . 8 , 1 6 2 3 . 3 c m " . E I M S : m / z = 1 9 8 . 3 ( M + H ) . ( E ) - N - b e n z y l i d e n e b u t a n - l - a m i n e , l l V - I - 9 C H I H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C l 3 : 5 : 0 . 9 5 ( t , 3 H , J = 6 . 9 H z ) , l . 4 0 ( m , 2 H ) , l . 6 8 ( m , 2 H ) , 3 . 6 1 ( q , 2 H , J = 6 . 9 H z ) , 7 . 3 4 - 7 . 7 4 ( m , 5 H ) , 8 . 2 5 ( s , 1 H ) ; 1 3 C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) C D C l 3 : 1 3 . 8 0 , 2 0 . 3 6 , 3 2 . 9 1 , 6 1 . 3 7 , 1 2 7 . 9 0 , 1 2 8 . 2 2 , 1 2 8 . 4 5 , 1 3 0 . 3 2 , 1 3 6 . 2 7 , 2 4 0 1 6 0 . 6 0 , 1 7 1 . 9 3 I R ( C H C I 3 ) : 3 0 2 6 . 7 , 2 9 5 9 . 1 , 2 8 7 2 . 4 , 1 6 4 7 . 4 , 1 3 7 7 . 4 c m " . E I M S : m / z = 1 6 0 . 5 ( M + ) . G e n e r a l P r o c e d u r e f o r s y n t h e s i z i n g a z l a c t o n e s O O R E D C I . H C I ) L 3 : = ( 1 ) — « N I F 1 2 ( = 1 , i i C O O H C H 2 0 l 2 A s o l u t i o n o f b e n z o y l a m i n o a c i d ( 2 m m o l ) a n d E D C I . H C I ( 2 m m o l ) i n d i c h l o r o m e t h a n e ( 2 0 m l ) w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r 1 h u n t i l t h e s t a r t i n g m a t e r i a l d i s a p p e a r e d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d s u c c e s s i v e l y w i t h c o l d ( c o n t a i n i n g i c e ) w a t e r , a q u e o u s N a H C O 3 ( 1 0 m l ) a n d w a t e r ( 1 0 m l ) . T h e s o l u t i o n w a s d r i e d o v e r a n h y d r o u s m a g n e s i u m s u l f a t e , fi l t e r e d a n d t h e s o l v e n t e v a p o r a t e d t o d r y n e s s i n v a c u o p r o v i d i n g t h e o x a z o l o n e s a s s o l i d s o r o i l s . 1 2 - p h e n y l - 4 - m e t h y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e I V - l C y c l o d e h y d r a t i o n o f N - b e n z o y l - L — a l a n i n e ( 2 g , 1 0 m m o l ) w i t h E D C I . H C I ( 1 . 9 2 g 1 0 m m o l . ) g a v e 1 . 8 1 g o f I V - l i n 9 0 % y i e l d . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) : 8 1 . 6 ( 3 H , d , J = 7 . 4 H z ) , 4 . 4 6 ( 1 H , q , I : 7 . 5 H z ) , 7 . 4 7 ( 3 H , m ) , 8 . 0 ( 2 H , d ) ; 1 3 C N M R ( 7 5 M H z ) ( C D C 1 3 ) : 8 1 6 . 1 , 6 0 . 3 , 1 2 5 . 3 , 1 2 7 . 2 , 1 2 8 . 2 , 1 3 2 , 1 6 0 . 7 , 1 7 8 . 2 ; I R ( n e a t ) : 1 8 2 8 c m " , 1 6 5 3 c m " . 2 - B e n z y l - 4 - m e t h y I - 4 H - o x a z o l - 5 - o n e , I V - 2 . 0 o m g r 2 4 1 C y c l o d e h y d r a t i o n o f N - p h e n a c e t y l a l a n i n e ( 4 g , 1 9 . 3 m m o l ) w i t h E D C I . H C I ( 3 . 7 1 g , 1 9 . 3 m m o l ) g a v e 3 . 1 g o f I V - 2 a s v i s c o u s o i l i n 8 5 % y i e l d . P a r t i a l d a t a : l H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) : 5 1 . 4 7 ( 3 H , d , J = 6 . 9 H z ) , 4 . 3 5 - 4 . 5 ( 2 H , m ) , 4 . 7 7 ( 1 H , q , J = 7 . 5 H z ) , 7 . 3 8 ( 2 H , t , J = 7 . 2 H z ) , 7 . 4 8 ( 1 H , t , J = 7 . 2 H z , 7 . 7 2 ( 2 H , d , J = 7 . 8 H z ) ; I R ( n e a t ) c m " , 1 8 2 4 c m " , 1 6 7 6 c m " . 2 , 4 - d i m e t h y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e I V - 3 O M e — Q Z I M e 1 V - 3 C y c l o d e h y d r a t i o n o f N - a c e t y l - a l a n i n e ( 4 g , 3 0 m m o l ) w i t h E D C I . H C l ( 6 . 3 g , 3 3 m m o l . ) g a v e 2 . 0 g o f I V - 3 i n 6 0 % y i e l d . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) : 6 1 . 3 7 ( 3 H , t , J = 8 H z ) , 2 . 0 5 ( 3 H , s ) , 4 . 0 - 4 . 1 6 ( 1 H , m ) ; 1 3 C N M R ( 7 5 M H z ) ( C D C 1 3 ) 8 1 7 9 . 2 , 1 6 2 . 6 , 6 0 . 4 , 1 6 . 4 , 1 5 . 1 ; I R ( n e a t ) c m " , 1 8 2 6 c m " , 1 6 8 6 c m " . 2 - m e t h y l - 4 - p h e n y l o x a z o l - 5 ( 4 H ) - o n e , I V - 4 \ ( N C y c l o d e h y d r a t i o n o f N - a c e t y l - p h e n y l g l y c i n e ( 2 g , 7 . 3 8 m m o l ) w i t h E D C I . H C I ( 1 . 4 2 g , 1 0 m m o l . ) g a v e 1 . 7 7 g o f l V - 4 a s a w h i t e s o l i d i n 9 5 % y i e l d . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C l 3 : 8 : 2 . 1 8 ( s , 3 H ) , 5 . 1 6 ( s , 1 H ) , 6 . 8 2 - 7 . 3 5 ( m , 5 H ) , 1 3 C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) C D C l 3 : 6 7 . 2 0 , 1 2 6 . 3 6 , 1 2 8 . 3 0 , 1 2 8 . 3 9 , 1 2 8 . 6 0 , 1 3 2 . 8 7 , 1 6 3 . 6 8 , 1 7 6 . 2 ; I R ( C H C I 3 ) : 2 9 2 4 . 5 , 1 8 2 6 . 8 , 1 6 3 2 . 1 , 1 2 5 7 . 8 c m " . E I M S : m / z = 1 7 5 . 0 ( M + ) . 2 4 2 4 - b e n z y l - 2 - m e t h y l o x a z o l - 5 ( 4 H ) - o n e , I V - 5 . O 3 3 1 . . I V - 5 C y c l o d e h y d r a t i o n o f N - a c e t y l - p h e n y l a l a n i n e ( 1 g , 4 . 8 2 m m o l ) w i t h E D C I . H C I ( 1 . 0 1 g , 5 . 3 1 m m o l . ) g a v e 0 . 5 9 g o f I V - S a s a w h i t e s o l i d i n 6 5 % y i e l d . P a r t i a l d a t a : I R ( C H C I 3 ) : 1 8 2 6 . 8 , 1 6 4 0 . 2 c m ' 1 E I M S : m / z = 1 8 9 . 2 ( M + ) . 2 - p h e n y l - 4 - b e n z y l - 4 H - o x a z o l i n - S - o n e I V — 6 O O P h fi N i / P h I V - 6 C y c l o d e h y d r a t i o n o f N - b e n z o y l - L - p h e n y l a l a n i n e ( 2 g , 7 . 3 8 m m o l ) w i t h E D C I . H C I ( 1 . 4 2 g , 1 0 m m o l . ) g a v e 1 . 7 7 g o f I V - 6 a s a w h i t e s o l i d i n 9 5 % y i e l d . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) : 5 3 . 1 7 ( 1 H , d d , J ) = 6 . 6 H z , J 2 = 1 3 . 8 H z ) , 3 . 3 5 ( 1 H , d d , J ) = 5 . 1 H z , J 2 = 1 3 . 8 H z ) , 4 . 6 7 ( 1 H , d d , J ) = 5 . 1 H z , J 2 = 6 . 6 H z ) , 7 . 1 7 - 7 . 2 5 ( 5 H , m ) , 7 . 3 9 - 7 . 4 5 ( 2 H , m ) , 7 . 5 - 7 . 5 5 ( 1 H , m ) , 7 . 8 6 - 7 . 9 ( 2 H , m ) ; 1 3 C N M R ( 7 5 M H z ) ( C D C 1 3 ) : 5 3 7 . 3 , 6 6 . 5 , 1 2 5 . 7 , 1 2 7 . 2 , 1 2 7 . 8 , 1 2 8 . 4 , 1 2 8 . 7 , 1 2 9 . 6 , 1 3 2 . 7 , 1 3 5 . 2 , 1 6 1 . 7 , 1 7 7 . 6 ; I R ( n e a t ) : 1 8 2 3 c m " , 1 6 4 8 c m " . 4 - i s o p r o p y l - 2 - m e t h y l o x a z o l - 5 ( 4 H ) - o n e , I V - 7 0 o \ i N 2 4 3 C y c l o d e h y d r a t i o n o f N - a c e t y l - L - v a l i n e ( 1 g , 7 . 0 9 m m o l ) w i t h E D C I . H C I ( 1 . 4 9 g 7 . 8 m m o l . ) g a v e 0 . 8 g o f I V - 8 a s a l o w m e l t i n g s o l i d i n 9 0 % y i e l d . P a r t i a l d a t a : 1 8 2 2 c m " , 1 6 5 1 c m ' 1 . E I M S : m / z = l 4 l . l ( M + ) . 2 - p h e n y l - 4 - i s o p r o p y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e I V - 8 O O P h — < \ N l V - 8 C y c l o d e h y d r a t i o n o f N - b e n z o y l - L — v a l i n e ( 6 g , 2 7 m m o l ) w i t h E D C I . H C I ( 5 . 2 g 2 7 m m o l . ) g a v e 4 . 9 3 g o f I V - 8 a s a l o w m e l t i n g s o l i d i n 9 0 % y i e l d . P a r t i a l d a t a : 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) : 8 1 . 0 5 5 ( 3 H , d , J = 6 . 9 H z ) , 1 . 1 2 ( 3 H , d , J = 6 . 9 H z ) , 2 . 3 - 2 . 4 1 ( 1 H , m ) , 4 . 2 9 ( 1 H , d , J : 4 . 5 H z ) , 7 . 4 7 ( 3 H , t , J = 7 H z ) , 7 . 5 6 ( 3 H , t , J = 7 . 2 H z ) , 7 . 9 9 ( 2 H , d , J = 7 . 8 H z ) ; 1 3 C N M R ( 7 5 M H z ) ( C D C 1 3 ) : 8 1 7 . 1 8 , 1 8 . 3 3 , 7 0 . 1 3 , 1 2 5 . 3 8 , 1 2 7 . 6 1 , 1 2 8 . 1 1 , 1 2 8 . 4 7 , 1 3 2 . 5 , 1 6 1 . 7 , 1 7 7 . 1 3 ; I R ( n e a t ) : 1 8 2 6 c m " , 1 6 5 7 c m " . 2 , 4 - d i p h e n y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e I V - 9 o o P h — < \ I N P h l V - 9 C y c l o d e h y d r a t i o n o f N - b e n z o y l - L - p h e n y l g l y c i n e ( 2 g , 7 . 8 m m o l ) w i t h E D C I . H C l ( 1 . 5 g 7 . 8 m m o l . ) g a v e 1 . 3 g o f I V - 9 i n 7 0 % y i e l d . 1 H N M R ( 3 0 0 I v fl - I z ) ( C D C 1 3 ) : 8 5 . 5 ( 1 H , s ) , 7 . 3 5 - 7 . 6 5 ( 8 H , m ) , 8 . 0 5 - 8 . 1 5 ( 2 H , m ) ; 1 3 C N M R ( 7 5 M H z ) ( C D C 1 3 ) : 8 1 7 6 . 4 , 1 6 2 . 8 , 1 3 3 . 9 , 1 3 3 . 2 , 1 2 9 . 2 , 1 2 9 . 1 8 , 1 2 9 . 1 , 1 2 9 . 0 , 1 2 8 . 9 9 , 1 2 8 . 9 6 , 1 2 8 . 9 , 1 2 8 . 7 , 1 2 8 . 4 , 1 2 7 . l , 1 2 6 . 1 , 6 8 . 4 ; I R ( n e a t ) 1 8 2 5 c m " , 1 6 5 5 c m " . E I ( L R M S ) : 2 3 7 . 2 . 2 4 4 9 1 . 1 3 9 . . . 4 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) - 2 - m e t h y l o x a z o l - 5 ( 4 H ) - o n e , I V - 1 0 0 C y c l o d e h y d r a t i o n o f N - a c e t y l - ( 4 - m e t h o x y ) p h e n y l g l y c i n e I V - 1 7 ( 0 . 5 g , 2 . 2 4 m m o l ) w i t h E D C I . H C I ( 0 . 4 7 g , 2 . 4 6 m m o l . ) g a v e 0 . 3 2 g o f I V - 1 0 i n 7 0 % y i e l d . P a r t i a l d a t a : I R ( C H C I 3 ) : 2 9 2 0 . 2 , 1 8 3 2 . 8 , 1 6 4 3 . 5 , 1 1 2 0 . 2 c m " . E I M S : m / z = 2 0 6 . 2 ( M + ) . 4 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) - 2 - p h e n y l o x a z o l - 5 ( 4 H ) - o n e , I V - l 1 O O H A N O M e C y c l o d e h y d r a t i o n o f N - b e n z o y l - ( 4 - m e t h o x y ) P h e n y l g l y c i n e I V - l 8 ( 0 . 5 g , 1 . 7 4 m m o l ) w i t h E D C I . H C I ( 0 . 3 7 g , 1 . 9 2 m m o l . ) g a v e 0 . 3 g o f I V - l l i n 6 5 % y i e l d . P a r t i a l d a t a : I R ( C H C I 3 ) : 2 9 2 9 . 2 , 1 8 3 0 . 8 , 1 6 4 5 . 5 , 1 1 1 8 . 2 c m " . E I M S : m / z = 2 6 7 . 2 ( M + ) . N O T E : t h e s t e r e o c h e m i c a l o u t c o m e o f t h e r e a c t i o n w a s c o n fi r m e d b y t h e N O E S Y ] D f o r b o t h t h e p h e n y l / m e t h y l a n d m e t h y l / p h e n y l s u b s t i t u t i o n s a t R 1 a n d R 2 . C o m p o u n d I V - 2 3 w a s i s o l a t e d a s t h e m e t h y l e s t e r . 2 4 5 C o m p o u n d I V - 1 - 1 : d l - ( 4 S , S S ) - 1 - b e n z y l - 4 - m e t h y 1 2 , 5 - d i p h e n y l - 4 , 5 - d i h y d r o - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d P h P h W N : 4 a n 1 1 3 9 1 . 5 % C H 3 . . . ” A s o l u t i o n o f b e n z a l d e h y d e ( 0 . 0 6 g , 0 . 5 7 m m o l ) , b e n z y l a m i n e ( 0 . 0 6 1 g , 0 . 5 7 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C l 2 ( 1 5 m l ) w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 2 h 2 - P h e n y l - 4 - m e t h y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 1 g , 0 . 5 7 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 0 8 g , 0 . 7 4 m m o l ) w e r e a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s r e f l u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 6 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C l 2 / h e x a n e s ( 1 : 1 ) ; y i e l d : 7 5 % ( 0 . 1 5 5 g ) ; w h i t e s o l i d ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) D M S O — d o : 8 1 . 8 ( 3 H , s ) , 4 . 0 5 ( 1 H , d , J = 1 5 H z ) , 4 . 9 5 ( 1 H , d , J = 1 4 . 8 H z ) , 5 . 0 5 ( 1 H , s ) , 7 . 0 5 ( 2 H , s ) , 7 . 2 5 - 7 . 5 4 ( 8 H , m ) , 7 . 7 4 ( 2 H , t , J = 7 . 2 H z ) , 7 . 8 3 ( 1 H , t , J = 6 . 9 H z ) , 8 . 0 ( 2 H , d , J = 8 . 4 H z ) ; N O B S Y l D : ( I i . - ) H 2 ) 1 . 5 % ‘ 3 C N M R ( 7 5 M H z ) D M S O - d 6 : 8 2 5 . 2 , 4 8 . 8 , 7 0 . 4 , 7 3 . 3 , 1 2 2 . 3 , 1 2 7 . 8 , 1 2 8 . 3 , 1 2 8 . 5 , 1 2 8 . 9 , 1 2 9 . 1 , 1 2 9 . 3 , 1 2 9 . 6 , 1 2 9 . 7 , 1 3 2 . 3 , 1 3 3 . 2 , 1 3 4 , 1 6 6 . 1 , 1 6 9 . 5 ; I R ( n e a t ) : 3 3 5 0 c m " , 1 7 3 8 c m " ; M . P . 1 8 5 - 1 9 0 ° c ; H R M S ( E 1 ) : m / z c a l c d . f o r C 2 4 H 2 1 N 2 0 2 [ M - H ] , 3 6 9 . 1 6 0 3 ; f o u n d , 3 6 9 . 1 6 1 0 . C o m p o u n d I V - 2 - 1 : d I - ( 4 S , 5 S ) - l , 2 - d i b e n z y l - 4 - m e t h y l 5 - p h e n y l - 4 , 5 - d i h y d r o - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d a n d d l - ( 4 S , 5 R ) - 1 , 2 d i b e n z y l - 4 - m e t h y l - 5 - p h e n y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 1 H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c A c i d : 2 4 6 P h 3 H N . = P h B n A g " “ C O z H A s o l u t i o n o f b e n z a l d e h y d e ( 1 . 1 3 g , 1 0 . 5 8 m m o l ) , b e n z y l a m i n e ( 1 . 1 3 g , 1 0 . 5 8 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 ( 2 5 0 m l ) w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 2 h 2 - B e n z y l - 4 - m e t h y l - 4 H o x a z o l i n - S - o n e ( 2 g , 1 0 . 5 8 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 1 . 4 8 g , 1 0 . 5 8 m m o l ) w e r e a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 6 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m , d r = 2 : l . T h e p r o d u c t c i s i s o m e r w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C l 2 - E t 2 0 ; y i e l d : 3 0 % ( 0 . 6 g ) ; W h i t e s o l i d . T h e t r a n s - i s o m e r w a s t h e n p r e c i p i t a t e d o u t f r o m t h e m o t h e r l i q u o r . A s m a l l a m o u n t ‘ w a s t h e n r e p r e c i p i t a t e d t o r e m o v e t r a c e s o f t h e C i s - i s o m e r . y i e l d : 1 7 % ( 0 . 1 5 g ) . C i s l H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 1 . 7 4 ( 3 H , s ) , 3 . 6 7 ( 1 H , d , J = 1 5 . 3 H z ) , 4 . 1 1 ( 1 H , d , J = 1 4 . 7 H z ) , 4 . 3 8 ( l H , s ) , 4 . 4 6 ( 1 H , d , J = 1 4 . 7 H z ) 4 . 5 9 ( l H , d , J = 1 5 . 3 H z ) , 6 . 7 7 ( 2 H , d , J = 7 H z ) , 7 . 0 0 — 7 . 6 0 ( 1 3 H , m ) ; ” C N M R ( 7 5 1 M H z ) C D C l 3 : [ I ] 2 2 . 1 , 3 2 . 4 , 4 8 . 1 , 7 0 . 6 , 7 1 . 1 , 1 2 7 . 6 , 1 2 8 . 3 , 1 2 8 . 6 , 1 2 8 . 9 , 1 2 9 . 1 , 1 2 9 . 2 , 1 2 9 . 7 , 1 3 2 . 2 , 1 3 2 . 8 , 1 3 3 . 5 , 1 6 4 . 8 , 1 7 5 . 1 ; H R M S ( F A B ) : m / z c a l c d f o r C 2 5 H 2 5 N 2 O 2 [ M + H ] , 3 8 5 . 1 8 9 8 ; f o u n d , 3 8 5 . 1 9 1 6 ; I R ( n e a t ) : 3 3 5 0 c m " , 1 6 2 4 c m " . T r a n s : ‘ H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 1 . 1 4 ( 3 H , s ) , 3 . 9 4 ( l H , d , J = 1 5 . 6 H z ) , 4 . 2 4 ( 2 H , q , J = 8 . 7 H z ) , 4 . 5 6 ( 1 H , d , J = 1 5 H z ) , 5 . 7 4 ( l H , s ) , 6 . 6 5 ( 2 H , d , J = 7 . 5 H z ) , 7 . 0 0 — 7 . 4 0 ( 1 3 H , m ) N O E S Y l D ( H . - > H 2 ) 0 . 9 % ; 1 3 C N M R ( 7 5 M H z ) C D C l 3 : C ] 2 7 . 1 , 3 8 . 7 , 4 8 . 6 , 7 1 . 5 , 7 3 . 5 , 1 2 7 . 9 , 1 2 8 . 3 , 1 2 8 . 5 , 1 2 8 . 7 , 1 2 8 . 9 , 1 2 9 , 1 2 9 . 3 , 1 2 9 . 4 , 1 2 9 . 5 , 1 2 9 . 8 , 1 2 0 . 9 , 1 3 2 . 2 , 1 3 3 . 5 , 1 3 4 . 2 , 1 6 5 . 6 , 1 7 0 . 6 ; H R M S 2 4 7 ( F A B ) : m / z c a l c d f o r C 2 5 H 2 5 N 2 O 2 [ M + H ] , 3 8 5 . 1 8 9 8 ; f o u n d , 3 8 5 . 1 9 1 7 ; I R ( n e a t ) : 3 3 5 0 c m " , 1 7 3 8 c m " . C o m p o u n d I V - 3 - l : d l - ( 4 R , 5 S ) - 1 - b e n z y l - 4 , S - d i h y d r o - Z , 4 - d i m e t h y l - 5 - p h e n y l - 1 H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d 0 % ' ; C H 3 1 H 1 ) C O O H A m i x t u r e o f 2 - m e t h y l - 4 - m e t h y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 6 9 g , 6 . 1 0 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 8 5 g , 7 . 9 3 m m o l ) i n a n h y d r o u s T H F w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h T h e i m i n e o f b e n z a l d e h y d e a n d b e n z y l a m i n e ( 1 . 4 3 g , 7 . 3 2 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a 2 S O 4 a n d f i l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C 1 2 : e t h e r ( 1 : 3 ) t o g i v e t h e c o m p o u n d i n 1 : 1 d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y ; y i e l d : 1 2 % , ( 0 . l 9 m g , d r = 1 : 1 ) ; d i r t y - w h i t e s o l i d , 2 5 m g . o f t h e c i s p r o d u c t w a s i s o l a t e d f r o m t h i s m i x t u r e u s i n g C H C l 3 z e t h e r ( 1 : 4 ) f o r c h a r a c t e r i z a t i o n ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 1 . 0 8 ( 3 H , s ) , 8 2 . 4 3 ( 3 H , s ) , 4 . 1 7 ( 1 H , d , J = 1 5 . 6 H z ) , 4 . 5 3 ( 1 H , d , J = 1 5 . 8 H z ) , 5 . 8 3 ( 1 H , s ) , 6 . 9 9 - 7 . 3 6 ( 1 0 H , m ) . l 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C l 3 : 1 2 . 3 5 , 2 1 . 8 5 , 4 8 . 0 6 , 7 0 . 2 2 , 7 1 . 0 3 , 1 2 7 . 0 3 , 1 2 8 . 6 1 , 1 2 8 . 6 8 , 1 2 9 . 0 3 , 1 2 9 . 3 5 , 1 3 3 . 1 4 , 1 3 3 . 2 , 1 6 3 . 7 1 , 1 7 4 . 7 7 . I R ( n e a t ) : 2 9 2 4 . 5 c m " , 1 6 2 4 . 3 c m ' 1 . L R M S ( E I ) ( M - C O 2 H ) : 2 6 3 . 1 N O B S Y l D : ( H 1 9 H 2 ) 0 % H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 1 9 H 2 1 N 2 O 2 ( M + H ) . 3 0 9 . 1 6 0 4 , f o u n d , 3 0 9 . 1 6 0 3 . 2 4 8 C o m p o u n d I V - 4 - l : d l - ( 4 R , 5 S ) - l - b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 2 - m e t h y l - 4 , 5 - d i p h e n y l - 1 H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d P l ' l W N \ N " ( C O O H P h A m i x t u r e o f 2 - m e t h y l 4 - p h e n y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 1 5 g , 0 . 8 5 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 0 9 3 g , 1 . 1 1 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C l 2 w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f b e n z a l d e h y d e a n d b e n z y l a m i n e ( 0 . l 7 g , 0 . 8 5 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 1 0 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a S h e d w i t h w a t e r a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a 2 S O 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g m e t h a n o l : e t h e r ( 1 : 5 ) t o g i v e t h e t i t l e d c o m p o u n d ; y i e l d : 7 3 % ( 0 . 2 7 g , d r - = 9 : 1 ) ; w h i t e s o l i d ; t h e c i s i m i d a z o l i n e w a s o b t a i n e d b y r e - p r e c i p i t a t i o n f r o m m e t h a n o l : e t h e r ( l : 4 ) o f t h e a b o v e m i x t u r e . l H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 2 . 2 9 ( 3 H , s ) , 3 . 9 8 ( 1 H , d , J = 1 5 . 0 H z ) , 4 . 5 1 ( 1 H , d , J = 1 5 . 0 H z ) , 6 . 0 9 ( 1 H , s ) , 6 . 8 7 - 7 . 2 9 ( 1 5 H , m ) . l 3 C N M R ( 7 5 1 M H z ) C D C l 3 : 8 1 1 . 6 8 , 4 8 . 2 9 , 7 3 . 0 5 , 7 7 . 9 1 , 1 2 3 . 3 , 1 2 6 . 7 9 , 1 2 7 . 2 2 , 1 2 7 . 5 5 , 1 2 7 . 9 5 , 1 2 8 . 5 6 , 1 2 8 . 6 8 , 1 2 8 . 9 2 , 1 2 9 . 5 2 , 1 3 3 . 3 3 . 1 3 3 . 9 4 , 1 3 7 . 2 6 , 1 6 4 . 2 8 , 1 7 2 . 4 3 ; I R ( n e a t ) : 3 0 3 4 . 4 c m “ , 2 9 2 4 . 5 c m " , 1 6 3 5 . 8 c m " . L R M S ( E 1 ) : 3 2 4 . 2 ( M - C O 2 H — H ) ; H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 2 4 H 2 3 N 2 O 2 ( M + H ) . 3 7 1 . 1 7 6 0 , f o u n d , 3 7 1 . 1 7 5 9 . M . P . d e c o m p o s e s a t 1 6 1 ° C . 2 4 9 C o m p o u n d 1 V - 5 - 1 : d l - ( 4 R , 5 S ) - 1 , 4 - d i b e n z y l - 4 , S - d i h y d r o - 2 - m e t h y l - 5 - p h e n y l - 1 H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d A m i x t u r e o f 2 - m e t h y l - 4 - b e n z y l - 4 H — o x a z o l i n — 5 - o n e ( 0 . 6 g , 2 . 9 3 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 5 9 g , 5 . 4 9 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f b e n z a l d e h y d e a n d b e n z y l a m i n e ( 0 . 9 9 g , 3 . 8 0 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 9 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a 2 S O 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s t h e n e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C I 2 : e t h e r ( 1 : 2 ) . Y i e l d : 5 5 % ( 0 . 6 2 g ) ; ' H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 2 . 2 4 ( 3 H , s ) , 2 . 4 9 ( 2 H , q , J = 1 5 . 0 H z ) , 4 . 0 5 ( 1 H , d , J = 1 5 . 0 H z ) , 4 . 5 2 ( 1 H , d , J = 1 5 . 0 H z ) , 5 . 5 5 ( 1 H , s ) , 6 . 1 8 - 7 . 4 6 ( 1 5 H , m ) 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C l 3 : 8 1 2 . 8 9 , 4 1 . 2 1 , 4 8 . 2 9 , 7 2 . 1 1 , 7 3 . 8 4 , 1 2 6 . 6 5 , 1 2 7 . 1 9 , 1 2 7 . 6 8 , 1 2 8 . 9 1 , 1 2 9 . 2 7 , 1 2 9 . 5 5 , 1 2 9 . 8 3 , 1 3 0 . 8 2 , 1 3 1 . 6 2 , 1 3 2 . 7 3 , 1 3 3 . 2 2 , 1 3 5 . 3 7 , 1 6 6 . 3 3 , 1 7 3 . 4 1 I R ( n e a t ) : 2 9 2 6 . 5 c m " , 1 5 9 9 . 2 c m " . N O B S Y l D : ( H i - 9 H 2 ) 0 % L R M S ( E 1 ) : 3 3 9 . 2 ( M - C O 2 H ) , 3 8 3 . 2 ( M - H ) . H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 2 5 H 2 4 N 2 O 2 ( M + H ) , 3 8 5 . 1 9 1 4 , f o u n d , 3 8 5 . 1 9 1 6 . M . P . d e c o m p o s e s a t 2 1 7 - 2 1 8 ° C . 2 5 0 C o m p o u n d I V - 6 - 1 : d l - ( 4 S , 5 S ) - 1 , 4 - d i b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 2 , 5 - d i p h e n y l - 1 H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d P h Y - Z ( 1 4 1 ) 1 1 c h 9 5 % A m i x t u r e o f 2 - p h e n y l - 4 - b e n z y l — 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 8 g , 2 . 9 7 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 4 2 g , 3 . 8 6 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f b e n z a l d e h y d e a n d b e n z y l a m i n e ( 0 . 6 4 g , 3 . 2 6 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a 2 S O 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s t h e n e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C l 2 : e t h e r ( 1 : 3 ) . Y i e l d : 4 5 % , ( 0 . 5 9 g ) ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D 3 O D : 8 3 . 4 2 ( 2 H , q , J = 1 5 . 0 H z ) , 4 . 0 3 5 ( 1 H , d , J = 1 5 . 0 H z ) , 4 . 8 1 ( 1 H , d , J = 1 5 . 0 H z ) , 5 . 1 7 ( 1 H , s ) , 6 . 5 6 - 7 . 8 5 ( 2 0 H , m ) 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D 3 O D : 8 4 4 . 4 , 5 0 . 3 7 , 7 2 . 4 2 , 7 5 . 6 5 , 1 2 3 . 5 0 , 1 2 9 . 3 4 , 1 2 9 . 9 9 , 1 3 0 . 3 7 , 1 3 1 . 1 6 , 1 3 2 . 0 6 , 1 3 3 . 2 3 . 1 3 3 . 6 2 , 1 3 4 . 3 9 , 1 3 5 . 1 8 , 1 6 7 . 8 5 , 1 7 0 . 4 5 , I R ( n e a t ) : 2 9 2 2 . 5 c m " , 1 7 4 3 . 8 c m " . N O B S Y l D : ( H I - ) H 2 ) 9 . 5 % L R M S ( E 1 ) : 4 0 1 . 3 ( M - C O 2 H ) . H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 3 0 H 2 7 N 2 O 2 ( M + H ) , 4 4 7 . 2 0 7 4 , f o u n d , 4 4 7 . 2 0 7 3 . M . P . d e c o m p o s e s a t 2 3 2 ° C . 2 5 1 C o m p o u n d I V - 7 - 1 : d l — ( 4 R , S S ) 1 - b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 4 - i s o p r o p y l - 2 - m e t h y l - 5 - p h e n y l - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d P h _ \ N H 0 % — ‘ < \ O H N C H ( H ) ( H 2 ) H 3 0 ‘ , H 1 J 3 3 4 . 7 0 / 0 4 . 5 % ) A m i x t u r e o f 2 - m e t h y l ~ 4 - i s o - p r o p y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 4 g , 2 . 8 4 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 3 9 g , 3 . 6 8 m m o l ) i n a n h y d r o u s T H F w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f b e n z a l d e h y d e a n d b e n z y l a m i n e ( 0 . 6 6 g , 3 . 4 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a 2 S O 4 , fi l t e r e d a n d e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C l 2 : e t h e r ( 1 : 5 ) t o g i v e t h e c o m p o u n d i n 1 : 1 d i a s t e r e o s e l e c t i v i t y ; y i e l d : 7 9 % ( 6 5 1 m g , d r = 1 : l ) a s a w h i t e s o l i d . ~ 2 0 0 m g o f t h e c i s c o m p o u n d w a s i s o l a t e d f r o m t h i s m i x t u r e u s i n g C H C l 3 : e t h e r ( l : 4 ) f o r c h a r a c t e r i z a t i o n ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 0 . 6 5 ( 3 H , d , J = 6 . 9 H z ) , 8 0 . 9 6 ( 3 H , d , J = 6 . 6 H z ) , 1 . 8 1 ( 1 H , m ) , 2 . 3 7 ( 3 H , s ) , 3 . 9 8 ( 1 H , d , J = 1 6 . 8 H z ) , 4 . 4 6 ( 1 H , d , J = 1 6 . 2 H z ) , 5 . 7 8 ( 1 H , s ) , 6 . 9 7 - 7 . 3 6 ( 1 0 H , m ) . 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C l 3 : 1 2 . 5 5 , 1 8 . 4 , 1 8 . 7 4 , 3 1 . 1 3 , 4 8 . 0 7 , 7 2 . 2 2 , 7 7 . 3 4 , 1 2 6 . 9 2 , 1 2 8 . 2 2 , 1 2 8 . 8 7 , 1 2 9 . 3 3 , 1 3 2 . 8 4 , 1 3 3 . 3 , 1 6 5 . 2 0 , 1 7 2 . 5 3 . I R ( n e a t ) : 2 9 2 6 . 3 c m " , 1 6 0 1 . 1 c m " . L R M S ( E I ) ( M - C O 2 ) : 3 5 5 . 2 H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 2 | H 2 5 N 2 O 2 ( M + H ) , 3 3 7 . 1 9 1 6 , f o u n d , 3 3 7 . 1 9 1 8 . N O B S Y l D : ( H i - ) H 2 ) 4 . 6 7 % , ( H i - ) H 3 ) 4 . 4 5 % , ( H I - ) H 4 ) 0 % . M . P . d e c o m p o s e s a t 1 1 5 ° C . 2 5 2 C o m p o u n d I V - 8 - 1 : d I - ( 4 S , 5 S ) - 1 - b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 4 - i s o p r o p y l - 2 , 5 - d i p h e n y l - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d i n P h \ ( N H P h I i ; C 0 2 H 4 % " ° c ( H 3 ) 9 4 4 . 9 3 4 3 ; A m i x t u r e o f 2 - p h e n y l - 4 - i s o - p r o p y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 4 4 g , 2 . 1 7 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 3 0 g , 2 . 8 2 m m o l ) i n a n h y d r o u s T H F w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f b e n z a l d e h y d e a n d b e n z y l a m i n e ( 0 . 5 1 m g , 2 . 6 0 5 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a 2 S O 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C l 2 : e t h e r ( 1 : 5 ) t o g i v e t h e t i t l e d c o m p o u n d ; y i e l d , 7 1 % ( 0 . 6 1 g ) ; w h i t e s o l i d ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C 1 3 + 2 d r o p s D M S O - d 6 : 8 0 . 5 9 ( 3 H , d , J = 6 . 6 H z ) , 8 0 . 8 6 ( 3 H , d , J = 6 . 6 H z ) , 2 . 1 5 ( 1 H , m ) , 3 . 7 2 ( 1 H , d , J = 1 4 . 7 H z ) , 4 . 5 0 ( 1 H , s ) , 4 . 6 4 ( 1 H , d , J = 1 5 . 0 H z ) , 6 . 6 6 - 7 . 6 8 ( 1 5 H , m ) . l 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C l 3 + 2 d r o p s D M S O - d 6 : 8 1 5 . 1 4 , 1 7 . 4 2 , 3 6 . 0 7 , 4 8 . 8 6 , 6 9 . 7 1 , 7 7 . 6 0 , 1 2 1 . 2 6 , 1 2 8 . 4 8 , 1 2 8 . 7 9 , 1 2 8 . 9 3 , 1 2 9 . 2 6 , 1 2 9 . 4 6 , 1 2 9 . 7 4 , 1 3 0 . 8 2 , 1 3 2 . 5 8 , 1 3 3 . 9 5 , 1 6 5 . 5 0 , 1 6 8 . 7 2 . I R ( n e a t ) : 3 3 4 5 c m " , l 7 3 2 c m ' 1 . L R M S ( E l ) ( M - C O 2 ) : 3 5 5 . 2 H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 2 6 H 2 7 N 2 O 2 ( M + H ) , 3 9 9 . 2 0 7 3 , f o u n d , 3 9 9 . 2 0 6 9 . N O B S Y l D : ( H I - ) H 2 ) 3 . 7 3 % , ( H I - 9 H 3 ) 4 . 9 8 % , ( H I - ) H 4 ) 4 . 0 2 % . M . P . d e c o m p o s e s a t 2 1 0 ° C . 2 5 3 C o m p o u n d I V - 9 - 1 : d l - ( 4 S , 5 8 ) - l - b e n z y l - 2 , 4 , S t r i p h e n y l - 4 , S - d i h y d r o - I H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c A c i d P h 7 . P h P h \ g — Z c o z l i ’ P h A s o l u t i o n o f b e n z a l d e h y d e ( 0 . 6 g , 5 . 7 m m o l ) , b e n z y l a m i n e ( 0 . 6 1 g , 5 . 7 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 ( 1 2 0 m l ) w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 2 h . 2 , 4 - D i p h e n y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 1 . 3 5 g , 5 . 7 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 8 g , 7 . 4 m m o l ) w e r e a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 6 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e p r o d u c t w a s p u r i fi e d b y s i l i c a - g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( E t O H — E t O A c , 1 : 5 ) ; y i e l d : 6 5 % ( 2 . 1 g ) ; o f f - w h i t e s o l i d ; ' H N M R ( 3 0 0 M H z ) D M S O - d o z 8 3 . 8 0 ( l H , d , J = 1 5 . 6 H z ) , 4 . 6 2 ( l H , d , J = 1 5 . 6 H z ) , 4 . 9 8 ( 1 H , s ) , 6 . 5 8 ( 2 H , d , J = 8 . 1 H z ) , 7 . 0 5 - 7 . 6 5 ( 1 6 H , m ) , 7 . 9 0 ( 2 H , d , J = 7 . 2 H z ) 1 3 C N M R ( 7 5 1 M H z ) D M S O — d o : 8 2 9 . 7 , 4 8 . 3 , 7 5 . 6 , 7 9 . 1 , 1 2 3 . 1 , 1 2 5 . 7 , 1 2 6 . 7 , 1 2 7 . 3 , 1 2 7 . 4 , 1 2 7 . 9 , 1 2 8 . 1 , 1 2 8 . 2 , 1 2 8 . 8 , 1 2 8 . 9 , 1 2 9 , 1 2 9 . 3 , 1 3 2 . 9 , 1 3 3 . 8 , 1 3 6 , 1 4 3 . 1 , 1 6 4 . 8 , 1 6 8 . 1 d m p 1 5 3 — 1 5 5 ° C . H R M S ( E 1 ) : m / z c a l c d f o r C 2 3 H 2 3 N 2 [ ( M — H ) - C 0 2 ] , 3 8 7 . 1 5 2 6 ; f o u n d , 3 8 7 . 1 5 3 9 . I R ( n e a t ) : 3 4 0 0 c m " , 1 7 3 8 c m " C o m p o u n d 1 V - 1 0 - 2 : d l - ( 4 R , S S ) - 1 - b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 4 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) - 2 - m e t h y l - 5 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - l H - i m i d a z o l e — 4 - c a r b o x y l i c a c i d 2 5 4 A m i x t u r e o f 2 - m e t h y l - 4 - ( p - m e t h o x y ) p h e n y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 1 5 g , 0 . 6 2 8 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 0 8 8 g , 0 . 8 2 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f p - n i t r o b e n z a l d e h y d e a n d b e n z y l a m i n e ( 0 . 1 8 2 g , 0 . 7 6 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d a t r . t . f o r 8 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r ( 3 X ) a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a 2 S O 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C l 2 / h e x a n e ( 1 : 1 ) t o g i v e t h e c i s c o m p o u n d o n l y ; y i e l d : 6 6 % , ( 0 . 1 8 g ) ; p a l e y e l l o w s o l i d , ' H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 2 . 1 6 ( 3 H , s ) , 3 . 5 4 ( 3 H , s ) , 3 . 8 8 ( 1 H , d , J = 1 5 H z ) , 4 . 4 9 ( 1 H , d , J = 1 5 H z ) , 6 . 1 6 ( 1 H , s ) , 6 . 4 1 - 7 . 9 2 ( 1 3 H , m ) . 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C l 3 : 1 2 . 1 2 , 4 8 . 4 8 , 5 5 . 0 2 , 7 1 . 4 5 , 7 7 . 2 5 , 1 1 3 . 3 5 , 1 2 3 . 3 4 , 1 2 6 . 4 4 , 1 2 7 . 3 5 , 1 2 7 . 5 4 , 1 2 7 . 7 5 , 1 2 9 . 0 6 , 1 2 9 . 4 8 , 1 3 2 . 1 7 , 1 4 0 . 9 1 , 1 4 7 . 6 1 , 1 5 8 . 9 4 , 1 6 4 . 9 , 1 7 1 . 9 1 I R ( n e a t ) : 3 3 4 6 . 9 , 2 9 1 8 . 8 c m “ , 1 6 0 8 . 8 c m " ' 1 5 1 4 . 3 c m " , 1 1 3 2 c m " . L R M S ( E 1 ) ( M - C O 2 H ) : 3 9 9 . 9 H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 2 5 H 1 9 N 3 0 3 ( M + H ) , 4 4 6 . 1 7 1 6 , f o u n d , 4 4 6 . 1 7 1 5 . M . P . d e c o m p o s e s a t 2 0 6 - 2 0 7 ° C . C o m p o u n d I V - 1 1 - 2 : d l - ( 4 S , 5 S ) - l - b e n z y l - 4 , S - d i h y d r o - 4 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) - 5 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - 2 - p h e n y l - l H - i m i d a z o I e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d A m i x t u r e o f 2 - p h e n y l - 4 - ( p - m e t h o x y ) p h e n y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 2 g , 0 . 7 9 1 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 1 l g , 1 . 0 3 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C l 2 w a s 2 5 5 a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f p - n i t r o b e n z a l d e h y d e a n d b e n z y l a m i n e ( 0 . 2 3 g , 0 . 9 5 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d a t r . t . f o r 8 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r ( S K ) a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a 2 S O 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C l 2 / h e x a n e ( 1 : 1 ) t o g i v e t h e t r a n s c o m p o u n d o n l y ; y i e l d : 5 3 % , ( 0 . 2 1 g ) ; b r i g h t y e l l o w s o l i d , 1 H N M R ( 5 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 3 . 7 3 ( 1 H , d , J = 1 5 H z ) , 3 . 7 5 ( 3 H , s ) , 4 . 6 4 ( 1 H , d , J = 1 5 H z ) , 4 . 9 9 ( 1 H , s ) , 6 1 6 - 8 1 9 ( 1 8 H , m ) . 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C l 3 : 4 8 . 9 8 , 5 5 . 1 4 , 7 2 . 9 0 , 7 9 . 2 9 , 1 1 3 . 5 9 , 1 2 2 . 4 8 , 1 2 4 . 0 2 , 1 2 6 . 6 4 , 1 2 7 . 0 6 , 1 2 8 . 6 9 , 1 2 8 . 8 6 , 1 2 9 . 1 6 , 1 2 9 . 2 8 , 1 2 9 . 2 6 . 1 2 9 . 4 5 , 1 3 3 . 0 0 , 1 3 4 . 0 9 , 1 4 4 . 1 9 , 1 4 8 . 1 5 , 1 5 8 . 9 9 , 1 6 4 . 8 6 , 1 6 8 . 7 8 I R ( n e a t ) : 2 9 2 4 . 8 c m “ , 2 8 7 0 c m " , 1 6 3 0 o m " , 1 6 0 8 . 8 c m " ' 1 5 2 0 . 1 e m " , 1 3 4 8 . 4 c m " . L R M S ( E 1 ) ( M - C O 2 H - H ) : 4 6 1 . 3 H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 3 0 H 2 6 N 3 0 5 ( M + H ) , 5 0 8 . 1 8 7 2 , f o u n d , 5 0 8 . 1 8 7 1 . M . P . d e c o m p o s e s a t 1 2 2 ° C . C o m p o u n d I V - 4 - 3 : N - ( 1 - b e n z y | - 2 - i s o p r o p y l - 3 - m e t h y l - 4 - o x o a z e t i d i n - 3 - y l ) b e n z a m i d e P l ' ) k N \ \ o . . ‘ \ \ M 9 ( H 5 ) ( H O M O ' 9 1 N ( H 6 ) C O P h “ 2 M 9 ( H 3 ) A m i x t u r e o f 2 - p h e n y l - 4 - m e t h y l — 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 7 g , 4 . 1 3 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 3 4 g , 3 . 1 7 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f i s o — b u t y r a l d e h y d e a n d b e n z y l a m i n e ( 0 . 8 8 g , 4 . 5 4 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 8 h 2 5 6 a n d t h e n s t i r r e d a t r . t . f o r 8 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r ( 2 X ) a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a 2 S O 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g e t h e r t o g i v e t h e fl - l a c t a m o n l y ; y i e l d : 7 8 . 2 % , ( 1 . 0 2 g ) ; w h i t e s o l i d , 1 H N M R ( 5 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 0 . 8 8 ( 3 H , d , J = 6 . 6 H z ) , 0 . 9 8 ( 3 H , d , J = 6 . 6 H z ) , 1 . 6 5 ( 3 H , s ) , 2 . 2 1 ( 1 H , m ) , 3 . 0 5 ( 1 H , d , J = 8 . 4 H z ) , 4 . 1 7 ( 1 H , d , J = 1 5 H z ) , 4 . 9 9 ( 1 H , d , J = 1 5 H z ) , 6 . 2 0 ( 1 H , 8 , b r ) , 7 . 2 3 - 7 . 8 2 ( 1 0 H , m ) . 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C l 3 : 2 0 . 1 4 , 2 0 . 5 6 , 2 8 . 6 5 , 4 6 . 1 5 , 6 6 . 2 4 , 7 1 . 7 5 , 1 2 7 . 0 , 1 2 7 . 6 9 , 1 2 8 . 3 l , 1 2 8 . 6 7 , 1 2 8 . 8 1 , 1 3 1 . 8 5 , 1 3 3 . 9 7 , 1 3 5 . 8 9 , 1 6 7 . 1 , 1 6 9 . 9 5 I R ( n e a t ) : 3 3 2 1 . 8 , 2 9 6 8 . 8 e m " , 2 8 7 2 . 4 c m " , 1 7 4 3 . 9 c m " , l 6 6 6 . 7 c m " ' 1 5 3 7 . 5 e m " , 1 3 1 5 . 6 c m " . L R M S ( E I ) : 4 1 3 . 1 ( M + ) ; M . P . 1 4 1 ° C . N O E S Y I D ( H i - ) H 2 ) 0 % ; ( H 1 - ) H 5 ) 2 . 9 1 % ( H 2 9 H 3 ) 2 . 2 1 % ( H 2 - ) H 4 ) 3 . l % ( 1 1 6 - ) H 5 ) 4 . 2 5 % C o m p o u n d I V - 1 - 4 . ( l l - ( 4 S , 5 S ) - 1 - b e n z y I - 5 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) - 4 - m e t h y l - 2 - p h e n y l - 4 , S - d i h y d r o - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c A c i d P h W O M e P h \ « N A s o l u t i o n o f p - a n i s a l d e h y d e ( 0 . 0 7 7 g , 0 . 5 7 m m o l ) , b e n z y l a m i n e ( 0 . 0 6 1 g , 0 . 5 7 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C l 2 ( 1 5 m l ) w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 2 h . 2 - P h e n y l — 4 m e t h y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 1 g , 0 . 5 7 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 0 8 g , 0 . 7 4 m m o l ) w e r e a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 6 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C l 2 — h e x a n e s ( 1 : 1 ) ; 2 5 7 y i e l d : 7 8 % ( 0 . 1 8 g ) ; l H N M R ( 3 0 0 M H z ) D M S O - d 6 : 8 1 . 8 ( 3 H , s ) , 3 . 8 ( 3 H , s ) , 3 . 9 5 ( 1 H , d , J = 1 5 . 3 H z ) , 4 . 5 ( 1 H , s ) , 4 . 9 ( 1 H , d , J = 1 5 H z ) , 6 . 8 3 - 6 . 9 2 ( 4 H , m ) , 7 . 0 8 - 7 . 1 9 ( 3 H , m ) , 7 . 3 - 7 . 4 ( 3 H , d d , J ; = 5 . 1 H z , J 2 = 1 . 8 H z ) , 7 . 5 4 - 7 . 6 2 ( 2 H , t , J = 7 . 2 H z ) , 7 6 2 - 7 . 6 8 ( 1 H , t , J = 7 . 2 H z ) , 7 . 9 ( 2 H , d , J = 6 . 9 H z ) ; 1 3 C N M R ( 7 5 M H z ) D M S O - d 6 : E ] 2 5 . 3 , 4 8 . 8 , 5 5 . 6 , 7 0 . 9 , 7 4 . 1 , 1 1 5 . 2 , 1 2 2 . 2 , 1 2 3 , 1 2 5 . 5 , 1 2 7 . 9 , 1 2 8 . 4 , 1 2 9 . 2 , 1 2 9 . 3 , 1 2 9 . 6 , 1 2 9 . 9 , 1 3 2 . 8 , 1 3 4 . 2 , 1 6 1 . 1 , 1 6 6 . 3 , 1 6 8 . 4 ; I R ( n e a t ) : 3 3 8 8 c m ‘ 1 , 1 7 3 8 c m “ ; M . P . 2 0 5 — 2 0 8 ° c ; H R M S ( E l ) : m / z c a l c d . f o r C 2 5 H 2 3 N 2 0 3 [ M - H ] , 3 9 9 . 1 7 0 9 ; f o u n d , 3 9 9 . 1 7 1 7 . C o m p o u n d I V - 4 - 4 : d l - ( 4 R , 5 S ) - l - b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 5 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) — 2 - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d P h \ \ O M e N ‘ 6 N w c o o n P h A m i x t u r e o f 2 - m e t h y l - 4 - p h e n y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 9 g , 5 . 1 4 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 7 3 g , 6 . 7 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f p - a n i s a l d e h y d e a n d b e n z y l a m i n e ( 1 . 1 6 g , 5 . 1 4 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e f l u x f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N 3 2 8 0 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C l z z e t h e r ( 1 : 3 ) t o g i v e t h e t i t l e d c o m p o u n d ; y i e l d : 6 0 % , ( 1 . 2 3 g , d r = 3 : 2 ) ; d i r t y - w h i t e s o l i d ; t h e c i s i m i d a z o l i n e w a s o b t a i n e d b y r e - p r e c i p i t a t i o n f r o m m e t h a n o l : e t h e r ( l z 5 ) o f t h e a b o v e m i x t u r e ; w h i t e s o l i d ; I H 2 5 8 N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C 1 3 : 6 2 . 1 9 ( 3 H , s ) , 3 . 9 2 ( 1 H , d , J = 1 5 . 6 H z ) , 4 . 5 2 ( 1 H , d , J = 1 5 . 6 H z ) , 6 . 1 7 ( 1 H , s ) , 6 . 8 8 - 7 . 9 0 ( 1 4 H , m ) 1 3 C N M R + D E P T ( 1 2 5 M H z ) C D C l 3 : 6 1 1 . 4 ( C H 3 ) , 4 7 . 8 ( C H 2 ) , 5 5 . 0 4 ( - O C H 3 ) , 7 2 . 3 ( - C H ) , 7 7 . 2 , 1 2 5 . 6 ( ~ C H ) , 1 2 6 . 4 ( - C H ) , 1 2 7 . 2 ( - C H ) , 1 2 7 . 7 ( - C H ) , 1 2 8 . 5 ( - C H ) , 1 2 9 . 2 ( - C H ) , 1 3 3 . 1 ( - C H ) , 1 3 6 . 9 ( - C H ) , 1 5 9 . 4 , 1 6 3 . 8 , 1 7 2 . 5 . I R ( n e a t ) : 2 9 5 5 c m " , 2 9 2 4 . 5 c m " , 2 8 5 5 . 0 c m " , 1 7 0 1 c m " ( b r ) , 1 6 0 6 . 9 c m " , 1 4 6 2 c m " . L R M S ( E I ) : 3 5 4 . 2 ( M - C 0 2 H ) ; H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 2 5 H 2 5 N 2 0 3 ( M + H ) , 4 0 1 . 1 8 6 7 , f o u n d , 4 0 1 . 1 8 6 5 . M . P . d e c o m p o s e s a t 1 3 8 ° C . C o m p o u n d I V - l - S : d 1 - ( 4 8 , 5 S ) - 1 - b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 4 - m e t h y l - 5 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - 2 - p h e n y l - l H - i m i d a z o l e 4 - c a r b o x y l i c a c i d N 0 2 P " \ \ N P h _ < ‘ N . C O O H ‘ ’ A m i x t u r e o f 2 - p h e n y l - 4 - m e t h y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 6 8 g , 3 . 8 8 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 5 5 g , 5 . 0 4 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C l 2 w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f p - n i t r o b e n z a l d e h y d e a n d b e n z y l a m i n e ( 0 . 9 4 g , 3 . 8 8 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 8 b a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a 2 8 0 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g m e t h a n o l : e t h e r ( 1 : 5 ) t o g i v e t h e t i t l e d c o m p o u n d ; y i e l d : 5 1 % ( 0 . 7 0 g ) ; y e l l o w s o l i d ; 1 H N M R ( 5 0 0 M H z ) D M S O - d 6 : 8 2 . 2 9 ( 3 H , s ) , 3 . 9 8 ( 1 H , d , J = 1 5 . 0 H z ) , 4 . 5 1 ( 1 H , d , J = 1 5 . 0 H z ) , 6 . 0 9 ( 1 H , s ) , 6 . 8 7 - 7 . 2 9 ( 1 5 H , m ) . 2 5 9 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) D M S O - d 6 : 8 2 2 . 6 2 , 4 9 . 6 1 , 7 0 . 7 8 , 7 2 . 6 4 , 1 1 6 . 5 1 , 1 2 2 . 6 0 , 1 2 2 . 2 2 , 1 2 6 . 8 8 , 1 2 8 . 6 3 , 1 2 9 . 6 7 , 1 2 9 . 9 3 , 1 3 0 . 3 2 , 1 3 4 . 8 6 , 1 4 0 . 6 4 , 1 4 8 . 9 3 , 1 6 7 . 3 9 , 1 6 9 . 7 8 . I R ( n e a t ) : 2 9 8 2 . 5 c m " , 1 7 4 5 . 8 c m " , 1 6 0 6 . 9 c m " , 1 5 2 2 . 5 c m " . L R M S ( B I ) ( M - C O z H ) : 3 7 0 . 2 . H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 2 4 H 2 1 N 3 0 4 ( M + H ) , 4 1 6 . 1 6 1 4 , f o u n d , 4 1 6 . 1 6 1 0 . M . P . d e c o m p o s e s a t 2 3 8 ° C . C o m p o u n d I V - 4 - 5 : ( l l - ( 4 R , 5 S ) - 1 - b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 2 - m e t h y l - 5 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - 4 - p h e n y l - 1 H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d P h \ \ N 0 2 N \ N " ' C O O H P h A m i x t u r e o f 2 - m e t h y l 4 - P h e n y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 9 g , 5 . 1 4 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 7 3 g , 6 . 7 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 w a s s t i r r e d u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f 4 - n i t r o b e n z a l d e h y d e a n d b e n z y l a m i n e ( 1 . 2 3 g , 5 . 1 4 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o g e n t l y r e fl u x f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a 2 8 0 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g m e t h a n o l : e t h e r ( 1 : 5 ) t o g i v e t h e t i t l e d c o m p o u n d ; y i e l d : 7 2 % ( 1 . 5 4 3 ) ; W h i t e s o l i d ; l H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 2 . 1 9 ( 3 H , s ) , 3 . 9 2 ( 1 H , d , J = 1 5 . 6 H z ) , 4 . 5 2 ( 1 H , d , J = 1 5 . 6 H z ) , 6 . 1 7 ( 1 H , s ) , 6 . 8 8 - 7 . 9 0 ( 1 4 H , m ) . 1 3 C N M R ( 7 5 M H z ) C D C 1 3 : 8 1 1 . 8 , 4 8 . 4 , 7 1 . 5 , 7 7 . 5 , 1 2 3 . 3 , 1 2 6 . 2 , 1 2 7 . 4 , 1 2 7 . 8 , 1 2 8 . 1 , 1 2 9 . 1 , 1 2 9 . 3 , 1 2 9 . 4 , 1 3 2 . 2 , 1 3 5 . 8 , 1 4 0 . 7 , 1 4 7 . 6 , 1 6 5 . 5 , 1 7 1 . 4 ; I R ( n e a t ) : 2 9 2 4 . 5 2 6 0 C ) \ ( N N f o O C O H c m " , 1 6 0 6 . 9 c m " . L R M S ( E 1 ) : 3 6 9 . 3 ( M - C O z H - H ) ; H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 2 4 H 2 2 N 3 0 4 ( M + H ) , 4 1 6 . 1 6 1 0 , f o u n d , 4 1 6 . 1 6 1 1 . M . P . d e c o m p o s e s a t 1 5 4 ° C . C o m p o u n d I V - l - 6 : d l - ( 4 S , 5 R ) - 5 - ( e t h o x y c a r b o n y l ) - l - b e n z y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 4 - m e t h y l - Z - p h e n y l - 1 H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d ( 0 E 1 ' r ‘ O o A m i x t u r e o f 2 - p h e n y l - 4 - m e t h y l l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 0 7 2 g , 0 . 4 1 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 5 8 g , 0 . 5 3 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f e t h y l g l y o x y l a t e a n d b e n z y l a m i n e w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d f o r 4 h a t r . t . T h e s o l v e n t w a s r e m o v e d i n v a c u o a n d 2 5 0 m l e t h e r w a s a d d e d . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g e t h e r a n d t h e n m a i n t a i n g t h e m i x t u r e a t - 2 0 ° C f o r 4 0 h . y i e l d : 6 5 % , ( 0 . 0 9 7 g ) ; w h i t e s o l i d ; l H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 1 . 2 8 3 ( 3 H , t , J = 6 . 9 H z ) , l . 7 7 ( 3 H , s ) , 4 . 2 4 ( 2 H , q , J = 7 . 8 H z ) , 4 . 3 9 ( 1 H , d , J = l 4 . 7 H z ) , 4 . 8 8 ( 1 H , d , J = 1 4 . 7 H z ) , 4 . 9 3 ( 1 H , s ) , 7 0 8 - 7 8 8 ( 1 0 H , m ) . 1 3 C N M R ( 7 5 M H z ) C D C l 3 : 8 1 3 . 9 1 , 2 5 . 2 7 , 5 0 . 8 2 , 6 2 . 9 1 , 7 0 . 1 1 , 7 7 . 2 1 , 1 2 1 . 1 0 , 1 2 7 . 9 5 , 1 2 9 . 4 7 , 1 2 9 . 5 8 , 1 2 9 . 7 2 , 1 2 9 . 8 0 , 1 3 1 . 2 9 , 1 3 4 . 5 1 , 1 6 5 . 6 2 , 1 6 6 . 4 9 , 1 6 9 . 9 2 I R ( n e a t ) : 3 3 1 0 c m " , 2 9 2 6 . 4 c m " , 2 8 5 3 . 1 c m " , 1 7 4 1 . 9 c m " , 1 7 3 8 c m " , 1 6 5 8 . 9 c m " , 1 2 0 3 . 7 c m “ . L R M S ( E 1 ) : 3 2 1 . 2 ( M - C 0 2 H ) ; H R M S ( + F A B ) : m / z c a l c d f o r C 2 1 H 2 3 N 2 0 4 ( M + H ) , 3 6 7 . 1 6 6 0 , f o u n d 3 6 7 . 1 6 5 8 ; ( — F A B ) : 3 5 , 3 7 , m / z f o r C 2 | H 2 1 N 2 0 4 ( M - H ) 3 6 5 . 4 ; M . P . d e c o m p o s e s a t 1 2 4 ° C . 2 6 1 C o m p o u n d I V - 4 - 6 : d I - ( 4 R , 5 R ) - 5 - ( e t h o x y c a r b o n y l ) - l - b e n z y l - 4 , S - d i h y d r o - Z - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d P h N C O O E t fl i P h C O O H A m i x t u r e o f 2 - m e t h y l - 4 - p h e n y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 8 1 g , 4 . 6 7 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 6 6 g , 6 . 0 7 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f e t h y l g l y o x y l a t e a n d b e n z y l a m i n e w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a 2 8 0 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g m e t h a n o l : e t h e r ( 1 : 5 ) t o g i v e t h e t i t l e d c o m p o u n d ; y i e l d : 3 2 % ( 0 . 5 4 8 ) ; w h i t e s o l i d ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 0 . 6 9 5 ( 3 H , t , J = 7 . 2 H z ) , 2 . 6 6 ( 3 H , s ) , 3 . 2 4 ( 1 H , m ) , 3 . 5 2 ( 1 H , m ) , 4 . 3 6 ( 1 H , d , J : 1 5 H z ) , 4 . 7 9 ( 1 H , d , J = 1 5 . 0 H z ) , 5 . 3 3 ( 1 H , s ) , 7 . 2 2 - 7 . 4 0 ( 1 0 H , m ) . l 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C l 3 : 8 1 3 . 0 5 , 1 3 . 2 8 , 5 0 . 1 6 , 6 2 . 1 7 , 6 9 . 6 4 , 7 4 . 7 5 , 1 2 6 . 7 6 , 1 2 7 . 5 4 , 1 2 8 . 6 2 , 1 2 8 . 7 3 , 1 2 9 . 1 9 , 1 2 9 . 3 4 , 1 2 9 . 4 3 , 1 2 9 . 5 1 , 1 3 1 . 4 1 , 1 3 1 . 6 7 , 1 6 5 . 4 2 , 1 6 8 . 4 5 , 1 6 8 . 6 6 I R ( n e a t ) : 2 9 2 4 . 5 c m ' l , 1 7 4 3 . 9 c m " , 1 5 9 5 c m " , 1 2 1 1 c m " . L R M S ( E 1 ) : 3 2 0 . 1 ( M - C 0 2 H - H ) ; H R M S ( + F A B ) : m / z c a l c d f o r C 2 1 H 2 3 N 2 0 4 ( M + H ) , 3 6 7 . 1 6 5 8 , f o u n d 3 6 7 . 1 6 5 7 ; M . P . d e c o m p o s e s a t 8 6 ° C . C o m p o u n d I V - 1 - 7 . d l - ( 4 S , S S ) - 1 - m e t h o x y c a r b o n y l m e t h y l - 4 - m e t h y l - 2 , 5 d i p h e n y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 1 H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c A c i d 2 6 2 M 9 0 2 0 1 P h P h T o a w e l l s t i r r e d s o l u t i o n o f 2 - p h e n y l - 4 - m e t h y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 5 g , 2 . 8 5 m m o l ) a n d T M S C l ( 0 . 3 7 g , 3 . 4 2 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C l 2 ( 5 0 m l ) w a s a d d e d a s o l u t i o n o f ( b e n z y l i d e n e - a m i n o ) - a c e t i c a c i d m e t h y l e s t e r ( 0 . 6 g , 3 . 4 2 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 ( 2 0 m l ) a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 1 0 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C 1 2 - h e x a n e s ( 1 : 1 ) ; y i e l d : 7 0 % ( 0 . 7 g ) ; w h i t e s o l i d ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) D M S O — d 6 : 8 1 . 9 9 ( 3 H , ( 1 H , d , J = 1 8 . 3 H z ) , 4 . 5 3 ( 1 H , d , J = 1 8 . 3 H z ) , 5 . 3 9 ( 1 H , s ) , 7 . 4 7 - 7 . 5 0 ( 5 H , m ) , 7 . 7 4 - 7 . 8 7 ( 5 H , m ) ; 1 3 C N M R ( 7 5 M H z ) D M S O - d b z 8 2 4 . 2 3 , 5 2 . 0 9 , 7 0 . 8 3 , 7 5 . 3 8 , 1 2 1 . 8 4 , 1 2 8 . 2 6 , 1 2 8 . 6 9 , 1 2 9 . 5 2 , 1 2 9 . 7 5 , 1 3 1 . 7 8 , 1 3 4 . 0 2 , 1 6 7 . 5 9 , 1 6 8 . 6 2 , 1 6 9 . 1 9 ; I R ( n e a t ) : 3 4 6 8 c m " , 1 7 4 7 c m " _ H R M S ( E 1 ) : m / z c a l c d . f o r C 2 0 H 2 . N 2 0 4 [ M + H ] 3 5 2 . 1 5 0 1 , f o u n d , 3 5 3 . 1 5 0 7 . M . P . d e c o m p o s e s a t 2 1 5 - 2 1 7 ° C . C o m p o u n d I V - 4 - 7 : d l - ( 4 R , 5 S ) - l - ( ( m e t h o x y c a r b o n y l ) m e t h y l ) - 4 , 5 - d i h y d r o - 2 - m e t h y l - 4 , 5 - d i p h e n y l - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d 0 M 0 0 : \ N P h ‘ — < \ . H ” 1 . . . . P h A m i x t u r e o f 2 - m e t h y l - 4 - p h e n y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 4 5 g , 2 . 5 8 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 3 6 g , 3 . 3 5 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 w a s s t i r r e d u n d e r 2 6 3 n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f g l y c i n e m e t h y l e s t e r a n d b e n z a l d e h y d e ( 3 . 0 9 9 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o g e n t l y r e fl u x f o r 8 b a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d t h e a q u e o u s l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e a q u e o u s l a y e r w a s t h e n e x t r a c t e d i n n - B u O H . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a Z S O 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C 1 2 : e t h e r ( 1 : 7 ) t o g i v e t h e t i t l e d c o m p o u n d ; y i e l d : 4 4 % ( 0 . 4 g ) ; d i r t y - w h i t e s o l i d ; l H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 2 . 6 3 ( 3 H , s ) , 3 . 6 1 ( 3 H , s ) , 3 . 8 4 ( 1 H , d , J = 1 7 . 4 H z ) , 4 . 3 6 ( 1 H , d , J = 1 7 . 4 H z ) , 5 . 9 4 ( 1 H , s ) , 7 . 0 2 - 7 . 7 4 ( 1 0 H , m ) 1 3 c N M R ( 7 5 M H z ) C D C 1 3 : 8 1 2 . 8 3 , 4 5 . 2 3 , 5 2 . 9 7 , 7 5 . 9 6 , 7 7 . 2 0 , 1 2 6 . 3 2 , 1 2 8 . 1 9 , 1 2 8 . 6 8 , 1 2 8 . 9 2 , 1 2 9 . 5 7 , 1 3 0 . 5 6 , 1 3 0 . 9 5 , 1 3 8 . 5 9 , 1 6 6 . 9 1 , 1 6 7 . 7 7 , 1 7 0 . 7 7 ; I R ( n e a t ) : 2 9 2 4 . 5 c m " , 1 7 4 7 . 7 3 c m " , 1 5 9 9 . 1 9 c m " . L R M S ( E 1 ) : 3 0 8 . 2 ( M - C 0 2 H - H ) ; H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 2 0 H 2 1 N 2 0 4 ( M + H ) , 3 5 3 . 1 5 0 1 , f o u n d , 3 5 3 . 1 5 0 2 . M . P . : d e c o m p o s e d a t 7 8 ° C C o m p o u n d I V - 1 - 8 . ( l l - ( 4 8 , 5 8 ) - 1 - ( 4 - fl u o r o p h e n y l ) - 4 - m e t h y l - 2 , 5 - d i p h e n y l - 4 , 5 - d i h y d r o - l H - i m i d a z o l e - 4 c a r b o x y l i c a c i d F N P h P h T I C . . . “ A s o l u t i o n o f b e n z a l d e h y d e ( 0 . 0 6 0 g , 0 . 5 7 m m o l ) , 4 - fl u o r o a n i l i n e ( 0 . 0 6 3 g , 0 . 5 7 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 ( 1 5 m l ) w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 2 h . 2 P h e n y l - 4 - m e t h y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 1 g , 0 . 5 7 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e 2 6 4 ( 0 . 0 8 g , 0 . 7 4 m m o l ) w e r e a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s r e fl u x e d u n d e r n i t r o g e n f o r 6 h a n d t h e n s t i r r e d o v e r n i g h t a t r . t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C 1 2 — h e x a n e s ( 1 : 1 ) t o g i v e t h e t i t l e d c o m p o u n d ; y i e l d : 7 4 % ( 0 . 1 6 g ) ; w h i t e s o l i d ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) D M S O - d 6 : 8 1 . 9 8 ( 3 H , s ) , 5 . 9 8 ( 1 H , s ) , 7 . 0 5 - 7 . 6 5 ( 1 4 H , m ) 1 3 C N M R ( 7 5 1 M H z ) D M S O ' d fi : 8 2 5 . 2 , 7 1 . 2 , 7 7 . 9 , 1 1 6 . 9 , 1 1 7 , 1 1 7 . 1 , 1 1 7 . 3 , 1 2 3 , 1 2 5 . 1 , 1 2 5 . 3 , 1 2 9 . 3 . 1 2 9 . 4 , 1 2 9 . 6 , 1 3 0 . 1 , 1 3 0 . 3 , 1 3 0 . 4 , 1 3 0 . 5 , 1 3 2 . 5 , 1 3 3 . 3 , 1 3 4 . 5 , 1 6 0 . 4 , 1 6 3 . 7 , 1 6 5 . 3 , 1 7 0 . 4 ; I R ( n e a t ) : 3 4 5 0 c m " , 1 7 4 4 c m " ; M . P . 2 3 0 — 2 3 2 ° C . H R M S ( B I ) : m / z c a l c d f o r C 2 3 H 1 8 F N 2 0 2 [ M - H ] , 3 7 3 . 1 3 5 2 ; f o u n d , 3 7 3 . 1 3 5 9 . C o m p o u n d I V - 4 - 8 : d l - ( 4 R , 5 S ) - l - ( 4 - fl u o r o p h e n y l ) - 4 , 5 - d i h y d r o - 2 - m e t h y 1 - 4 , 5 - d i p h e n y l - 1 H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d ) 3 A m i x t u r e o f 2 - m e t h y l - 4 - p h e n y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 6 g , 3 . 4 3 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 4 8 g , 4 . 4 5 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f b e n z a l d e h y d e a n d p — fl u o r o a n i l i n e ( 0 . 8 2 g , 4 . 1 1 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d a t r . t . f o r 6 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N 3 2 8 0 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g e t h e r t o g i v e t h e c i s c o m p o u n d o n l y ; y i e l d : 2 0 % , ( 0 . 2 5 5 g ) ; 2 6 5 d i r t y - w h i t e s o l i d , 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C 1 3 : 8 1 . 8 3 ( 3 H , s ) , 6 . 6 4 ( 1 H , s ) , 7 . 0 4 - 7 . 4 0 ( 1 4 H , m ) . 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C 1 3 : 1 2 . 6 8 , 7 6 . 5 2 , 7 8 . 1 7 , 1 1 7 . 3 2 , 1 2 6 . 7 8 , 1 2 7 . 5 7 , 1 2 8 . 1 3 , 1 2 8 . 4 4 , 1 2 8 . 7 5 , 1 2 9 . 0 5 , 1 2 9 . 2 0 , 1 3 0 . 9 1 , 1 3 4 . 1 3 , 1 3 6 . 2 8 , 1 6 0 . 9 6 , 1 6 4 . 8 2 , 1 7 2 . 5 4 . I R ( n e a t ) : 3 3 4 6 . 9 , 2 9 1 8 . 8 c m " , 1 6 5 3 . 2 c m " . L R M S ( E 1 ) ( M - C O z H ) : 3 2 9 . 3 H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 2 3 H 1 9 N 2 0 2 F ( M + H ) , 3 7 5 . 1 5 0 8 , f o u n d , 3 7 5 . 1 5 0 8 . M . P . d e c o m p o s e s a t 1 6 2 - 1 6 3 ° C . C o m p o u n d I V - 1 - 9 : d l - ( 4 S , 5 S ) - m e t h y l l - b u t y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 4 - m e t h y l - 2 , 5 - d i p h e n y l - I H i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l a t e ” l e " ' M 9 ( 1 ) 1 . 9 ° / o A m i x t u r e o f 2 - p h e n y l - 4 - m e t h y l - 4 H - o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 3 5 g , 2 . 0 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 3 5 g , 2 . 6 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f b e n z a l d e h y d e a n d n - b u t y l a m i n e ( 0 . 3 9 g , 2 . 4 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 1 0 h a n d t h e n s t i r r e d a t r . t . f o r 6 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s u b j e c t e d t o m e t h y l a t i o n u s i n g T M S C H N ; a n d f u r t h e r p u r i fi e d o v e r s i l i c a u s i n g c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( e t h e r : h e x a n e 7 : 3 ) . y i e l d : 5 % , ( 0 . 0 4 g ) ; 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C 1 3 : 8 0 . 7 2 ( 3 H , t , J = 6 . 9 H z ) , 0 . 9 5 ( 2 H , m ) , l . 0 9 ( 3 H , s ) , 1 . 2 9 ( 2 H , m ) , 2 . 9 8 ( 1 H , m ) , 3 . 3 9 ( 1 H , m ) , 3 . 8 9 ( 3 H , s ) , 5 . 3 6 ( 1 H , s ) , 7 . 4 3 - 7 . 8 5 ( 1 0 H , m ) . l 3 C N M R ( 7 4 . 9 M H z ) C D C l 3 : 1 3 . 4 9 , 1 9 . 6 0 , 2 9 . 3 4 , 2 9 . 5 1 , 4 5 . 6 8 , 5 2 . 8 0 , 6 9 . 3 8 , 7 7 . 2 0 , 1 2 7 . 0 2 , 1 2 8 . 1 , 1 2 8 . 5 4 , 1 2 8 . 6 1 . 1 2 8 . 6 9 , 1 2 9 . 9 1 , 1 3 0 . 5 8 , 1 3 1 . 7 9 , 1 6 6 . 3 3 , 1 7 2 . 0 6 N O E S Y l D ( H I - ) H z ) 1 . 9 % ; I R 2 6 6 ( n e a t ) : 2 9 2 6 . 4 c m " , 2 8 4 0 . 0 c m " , 1 7 4 1 . 9 c m " , 1 6 5 3 c m " . L R M S ( E 1 ) ( M - C O z H ) : 2 9 1 . 1 H R M S ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 2 2 H 2 7 N 2 0 2 ( M + H ) , 3 5 1 . 2 0 7 3 , f o u n d , 3 5 1 . 2 0 7 2 . C o m p o u n d I V - 4 - 9 : d l — ( 4 R , 5 S ) - 1 - b u t y l - 4 , 5 - d i h y d r o - 2 - m e t h y l - 4 , 5 - d i p h e n y l - l H - i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x y l i c a c i d A m i x t u r e o f 2 - m e t h y l - 4 - p h e n y l — 4 H — o x a z o l i n - 5 - o n e ( 0 . 3 9 g , 2 . 2 3 m m o l ) a n d c h l o r o t r i m e t h y l s i l a n e ( 0 . 3 1 g , 2 . 8 9 m m o l ) i n a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 w a s a l l o w e d t o s t i r u n d e r n i t r o g e n f o r 0 . 5 h . T h e i m i n e o f b e n z a l d e h y d e a n d n - b u t y l a m i n e ( 0 . 4 3 g , 2 . 6 7 m m o l ) w a s t h e n a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o r e fl u x f o r 8 h a n d t h e n s t i r r e d a t r . t . f o r 1 0 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s w a s h e d w i t h w a t e r ( 2 X ) a n d t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d w i t h N a 2 S O 4 a n d fi l t e r e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r v a c u u m . T h e p r o d u c t w a s p r e c i p i t a t e d u s i n g C H 2 C 1 2 / h e x a n e / e t h e r ( 1 : 1 5 : 0 3 ) t o g i v e t h e c i s c o m p o u n d o n l y ; y i e l d : 4 3 % , ( 0 . 3 1 8 g ) ; w h i t e s o l i d , 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C 1 3 : 8 0 . 8 9 1 ( 3 H , t , J = 7 . 2 H z ) , 1 . 2 6 ( 2 H , m ) , 1 . 4 9 ( 2 H , m ) , 2 . 2 0 ( 3 H , s ) , 2 . 8 9 ( 1 H , m ) , 3 . 2 8 ( 1 H , m ) 6 . 2 5 ( 1 H , s ) , 6 . 9 7 - 7 . 4 3 ( 1 0 H , m ) . l 3 C N M R ( 7 4 . 9 M H z ) C D C 1 3 : 1 1 . 7 0 , 1 3 . 5 2 , 1 9 . 6 9 , 2 9 . 5 2 , 4 4 . 3 1 , 7 1 . 9 8 , 7 7 . 1 9 , 1 2 5 . 9 0 , 1 2 6 . 6 0 , 1 2 7 . 1 6 , 1 2 7 . 7 5 , 1 2 8 . 2 9 , 1 2 8 . 5 2 , 1 2 9 . 5 5 , 1 3 3 . 3 3 , 1 6 4 . 3 4 , 1 7 2 . 3 6 I R ( n e a t ) : 2 9 3 0 . 2 c m " , 2 8 7 0 . 0 c m ' ' . 1 6 3 9 . 7 c m " , 1 5 9 5 . 3 c m “ " 1 3 4 4 . 6 c m " . L R M S ( E 1 ) ( M - C O Z H ) : 2 9 1 . 1 H R M S 2 6 7 ( F A B + ) : m / z c a l c d f o r C 2 1 H 2 4 N 2 0 2 ( M + H ) , 3 3 7 . 1 9 1 5 , f o u n d , 3 3 7 . 1 9 1 7 . M . P . d e c o m p o s e s a t 1 2 4 ° C . M o d i f i c a t i o n o f W a s s e r m a n ’ s s y n t h e s i s f o r a c y l p - m e t h o x y p h e n y l g l y c i n e ( C o m p o u n d 3 0 a n d 3 1 ) E 1 0 M 8 6 I d t M 9 0 n z o y p e r o x 1 9 B r 5 1 5 - c r o w — — — r : M e o 0 C C I 4 , 3 h r e f l u x b e n z e n e l V - 1 2 l V - 1 3 H 2 , 1 0 0 p s i “ 4 9 0 % : A 0 2 0 . P y M e o ‘ O — f o s t O H , 1 0 % P d / C M N H A c I V - 1 4 l V - 1 5 B z C l L i O H 2 N N a O H , E t O H e t h e r , 2 0 h H O L i O H O N H B Z E t O H H O l V - 1 6 " H R l V - 1 7 , R = A c l V - 1 8 , R = B z C o m p o u n d I V - 1 2 : e t h y l 2 - b r o m o - 2 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) a c e t a t e C O O E t w e B r A m i x t u r e o f e t h y l ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) a c e t a t e ( 5 g , 0 . 0 2 5 m m o l ) , N - b r o m o s u c c i n i d e ( 4 . 8 9 4 g , 0 . 0 2 7 5 m m o l ) a n d b e n z o y l p e r o x i d e ( 2 5 m g ) i n C C l 4 w a s r e fl u x e d f o r 3 h a n d t h e n a l l o w e d t o s t a n d o v e r n i g h t t o p r e c i p i t a t e a n y d i s s o l v e d s u c c i n i m i d e . T h e m i x t u r e w a s t h e n fi l t e r e d a n d c o n c e n t r a t e d t o g i v e d a r k y e l l o w o i l i n q u a n t i t a t i v e y i e l d . ' H N M R ( 5 0 0 M H z ) C D C l 3 : a 1 . 2 9 ( 3 H , t , J = 1 6 . 5 H z ) , 3 . 8 1 ( 3 H , s ) , 4 . 2 4 ( 2 H , q , J = 1 4 . 0 H z ) , 5 . 3 6 ( 1 H , s ) , 6 . 8 9 ( 2 H , d , J = 1 5 H z ) , 7 . 5 1 ( 2 H , d , J = 1 5 H z ) . 1 3 ( 3 N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C 1 3 : 5 1 3 . 8 3 , 4 6 . 7 3 , 5 5 . 2 3 , 2 6 8 6 2 . 2 9 , 1 1 4 . 1 1 , 1 2 7 . 7 2 , 1 3 0 . 0 0 , 1 6 0 . 1 7 , 1 6 8 . 3 2 . I R ( n e a t ) : 2 9 8 2 . 5 c m " , 1 7 4 5 . 8 c m ' ‘ , 1 6 0 8 . 8 c m " , 1 1 7 8 . 6 c m " . L R M S ( E 1 ) : 2 7 1 . 0 , 2 7 3 . 0 C o m p o u n d I V - 1 3 : e t h y l 2 - a z i d o - 2 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) a c e t a t e C O O E t M e O — © — < N 3 A s o l u t i o n o f 1 5 - c r o w n - 5 ( 1 5 0 1 1 L , 0 . 7 m m o l ) i n 6 0 m l b e n z e n e w a s r e fl u x e d f o r 2 h w i t h a z e o t r o p i c r e m o v a l o f w a t e r . O n c o o l i n g , 3 g ( 1 0 m m o l ) o f t h e b r o m o e t h y l e s t e r a n d 0 . 7 1 g ( 1 0 m m o l ) o f s o d i u m a z i d e w e r e a d d e d . T h e m i x t u r e w a s s t i r l e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 8 h a n d t h e n p a s s e d t h r o u g h a s i l i c a c o l u m n e l u t i n g w i t h b e n z e n e . T h e fi l t r a t e w a s c o n c e n t r a t e d a n d d r i e d t o g i v e 8 2 % ( 2 . 6 3 g ) o f l i g h t o i l . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C 1 3 : 8 1 . 2 2 ( 3 H , t , J = 6 . 9 H z ) , 3 . 7 7 ( 3 H , s ) , 4 . 2 0 ( 2 H , q , J = 6 . 9 H z ) , 4 . 8 6 ( 1 H , s ) , 6 . 9 0 ( 2 H , d , J = 8 . 7 H z ) , 7 . 5 1 ( 2 H , d , J = 8 . 7 H z ) . 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C 1 3 : 8 1 3 . 4 6 , 5 4 . 6 6 , 6 1 . 4 5 , 6 4 . 2 4 , 1 1 3 . 9 , 1 2 5 . 5 8 , 1 2 8 . 5 7 , 1 2 9 . 6 6 , 1 5 9 . 8 0 , 1 6 8 . 8 8 . I R ( n e a t ) : 2 9 8 2 . 5 c m " , 2 1 0 4 . 6 e m " , 1 7 4 1 . 9 e m " , 1 6 1 0 . 8 c m " , 1 5 1 4 . 3 c m " , 1 1 7 8 . 6 e m " . L R M S ( E 1 ) : 2 3 5 . 0 C o m p o u n d I V - l 4 : e t h y l 2 - a m i n o - 2 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) a c e t a t e O M e H 2 N C O O E t A m i x t u r e o f 1 . 9 g ( 8 . 0 8 m m o l ) o f a z i d e e s t e r , 1 . 8 9 g p - t o l u e n e s u l p h o n i c a c i d m o n o h y d r a t e ( 9 . 9 4 m m o l ) a n d 0 . 3 g o f 1 0 % P d / C i n 1 0 0 m l 9 5 % e t h a n o l w a s h y d r o g e n a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e a t 1 0 0 p s i f o r 2 4 h . T h e m i x t u r e w a s fi l t e r e d t h r o u g h a p a d o f c e l i t e a n d c o n c e n t r a t e d t o g i v e y e l l o w c r y s t a l s . T h e s e w e r e t h e n 2 6 9 w a s h e d w i t h s a t u r a t e d N a H C O 3 a n d e x t r a c t e d t w i c e i n e t h e r t o g i v e t h e a m i n o a c i d e s t e r i n 7 1 % y i e l d ( 1 . 2 g ) . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C 1 3 : 8 1 . 0 0 ( 3 H , t , J = 8 . 7 H z ) , 2 . 0 8 ( 1 H , s , b r ) , 3 . 5 6 ( 3 H , s ) , 3 . 9 4 ( 2 H , q , J = 7 . 2 H z ) , 4 . 3 4 ( 1 H , s ) , 6 . 7 5 ( 2 H , d , J = 8 . 7 H z ) , 7 . 1 1 ( 2 H , d , J = 8 . 7 H z ) . 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C 1 3 : 8 1 3 . 4 6 , 5 4 . 5 1 , 5 7 . 4 8 , 6 0 . 4 7 , 1 1 3 . 2 , 1 2 7 . 4 2 , 1 2 9 . 6 5 , 1 3 2 . 0 8 , 1 5 8 . 6 5 , 1 7 3 . 6 . I R ( n e a t ) : 3 4 0 0 c m " , 2 8 0 0 c m “ , 1 7 3 4 . 2 e m " , 1 6 1 0 . 8 c m " , 1 5 1 2 . 3 c m " , 1 1 3 8 . 2 c m " . L R M S ( 1 3 1 ) : 2 0 9 . 9 ( M fi i ) C o m p o u n d I V - l S : e t h y l 2 - a c e t a m i d o - 2 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) a c e t a t e O M e O > — H N 0 V 0 A m i x t u r e o f a m i n o a c i d e s t e r ( 2 3 0 m g , 1 . 1 m m o l ) a n d p y r i d i n e ( 1 . 6 5 m m o l ) i n C H 2 C 1 2 w a s m a i n t a i n e d a t 0 ° C f o r fi v e m i n u t e s . A 0 2 0 ( 1 . 2 1 m m o l ) w a s a d d e d d r o p - w i s e a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s b r o u g h t t o r o o m t e m p e r a t u r e a n d s t i r r e d f o r 8 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s t h e n w a s h e d w i t h s a t u r a t e d s o l u t i o n o f N H 4 C l ( a q . ) a n d t h e o r g a n i c l a y e r c o l l e c t e d . T h e o r g a n i c l a y e r w a s f u r t h e r w a s h e d w i t h N a H C 0 3 ( a q . ) a n d fi n a l l y w i t h b r i n e . T h e o r g a n i c l a y e r w a s d r i e d o v e r N a 2 8 0 4 a n d t h e s o l v e n t r e m o v e d i n v a c u o t o g i v e t h e p r o d u c t i n 8 0 % ( 0 . 2 2 g ) y i e l d . ' H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C 1 3 : 8 1 . 1 9 ( 3 H , t , J = 6 . 0 H z ) , 2 . 0 0 ( 1 H , s ) , 3 . 7 8 ( 3 H , s ) , 4 . 1 6 ( 2 H , q , J = 7 H z ) , 5 . 4 7 ( 2 H , d , J = 3 . 0 H z ) , 6 . 3 5 ( 2 H , d , J = 6 . 0 H z ) , 6 . 8 4 ( 2 H , d , J = 6 . 0 H z ) , 7 . 2 5 ( 2 H , d , J = 6 . 0 H z ) . 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C 1 3 : 8 1 3 . 6 8 , 2 2 . 4 5 . 5 4 . 3 8 , 5 5 . 8 7 , 6 1 . 2 1 , 1 1 3 . 8 6 , 1 2 7 . 5 2 , 1 2 8 . 2 5 , 1 5 9 . 2 0 , 1 6 9 . 4 3 , 1 7 0 . 8 9 . I R ( n e a t ) : 2 7 0 3 2 8 7 . 1 c m " , 2 9 8 0 . 4 c m “ , 2 8 3 9 . 6 o m " , 1 7 4 l . 9 e m " , 1 6 5 5 . 1 c m " , 1 5 1 4 . 3 c m " , 1 1 7 8 . 7 c m " . L R M S ( E I ) : 2 5 0 . 7 ( M + ) C o m p o u n d I V - l 6 : e t h y l 2 - ( b e n z a m i d o ) - 2 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) a c e t a t e O M e O > — H N O \ / P h 0 A m i x t u r e o f a m i n o a c i d e s t e r ( 1 . 5 g , 7 . 1 7 m m o l ) i n e t h e r ( 1 0 0 m l ) a n d 2 N N a O H ( 1 5 0 m l ) w a s m a i n t a i n e d a t 0 ° C f o r 1 5 m i n u t e s . A d i l u t e d s o l u t i o n o f b e n z o y l c h l o r i d e ( 0 . 9 1 5 m l , 7 . 8 9 m m o l ) i n e t h e r ( 5 0 m l ) w a s v e r y s l o w l y a d d e d u s i n g a d r o p p i n g f u n n e l . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s b r o u g h t t o r o o m t e m p e r a t u r e a n d s t i r r e d f o r 2 0 h . T h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d a n d d r i e d o v e r N a 2 8 0 4 . T h e s o l v e n t w a s r e m o v e d i n v a c u o t o g i v e t h e p r o d u c t i n 7 2 % y i e l d ( 1 . 6 2 g ) . l H N M R ( 3 0 0 M H z ) C D C l 3 : 8 1 . 1 1 ( 3 H , t , J = 6 . 9 H z ) , 3 . 6 3 ( 3 H , s ) , 4 . 1 7 ( 2 H , q , J = 7 . 2 H z ) , 5 . 6 7 ( 1 H , d , J = 5 . 7 H z ) , 6 . 8 5 ( 2 H , d , J = 8 . 1 H z ) , 7 . 0 7 - 7 . 5 1 ( 6 H , m ) , 7 . 7 8 ( 2 H , d , J = 8 . 1 H z ) . 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C 1 3 : 8 1 4 . 0 1 , 5 5 . 3 0 , 5 6 . 2 7 , 6 1 . 9 6 , 1 1 4 . 3 4 , 1 2 7 . 1 1 , 1 2 8 . 5 3 , 1 2 8 . 5 7 , 1 2 8 . 8 1 , 1 3 1 . 7 9 , 1 3 3 . 7 0 , 1 5 9 . 6 8 , 1 6 6 . 5 8 , 1 7 0 . 2 3 . I R ( n e a t ) : 3 3 2 1 . 8 c m " , 2 9 3 6 . 0 c m " , 2 8 3 7 . 6 e m " , 1 7 4 0 . 0 c m " , 1 6 5 3 . 2 c m " , 1 5 1 2 . 3 e m " , 1 2 5 0 . 0 c m " . L R M S ( E I ) : 3 1 3 . 1 ( M + ) 2 7 1 C o m p o u n d I V - l 7 : 2 - a c e t a m i d o - 2 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) a c e t i c a c i d O M e A m i x t u r e o f E t h y l 2 - a c e t a m i d o - 2 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) a c e t a t e ( 1 g , 4 . 2 2 m m o l ) a n d L i O H . H 2 0 ( 8 . 4 4 m m o l ) i n E t O H w a s m a i n t a i n e d a t r . t . f o r 2 0 h . R e m o v e d t h e s o l v e n t i n v a c u o a n d a d d e d 2 . 5 m l w a t e r . A c i d i fi e d u s i n g c o n c . H C l d r o p - w i s e t o p H = 2 w h i l e m a i n t a i n i n g t h e r e a c t i o n m i x t u r e a t 0 ° C o n i c e . F i l t e r e d a n d d r i e d u n d e r v a c u u m t o o b t a i n d i r t y w h i t e s o l i d i n 8 1 % y i e l d ( 0 . 7 2 m g ) . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) D M S O - d 6 : 8 1 . 8 6 ( 3 H , s ) , 3 . 7 3 ( 3 H , s ) , 5 . 2 0 ( 2 H , d , J = 7 . 5 H z ) , 6 . 9 0 ( 2 H , d , J = 8 . 7 H z ) , 7 . 2 7 ( 2 H , d , J = 8 . 7 H z ) , 8 . 5 1 ( 2 H , d , J = 6 . 0 H z ) . l 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) D M S O - d 6 : 8 2 2 . 2 4 , 5 5 . 1 5 , 5 6 . 6 3 , 1 1 3 . 8 9 , 1 2 8 . 8 9 , 1 2 9 . 1 2 , 1 5 8 . 9 5 . 1 6 9 . 0 3 , 1 7 2 . 3 0 . I R ( n e a t ) : 3 3 2 0 . 0 c m " , 2 9 2 4 . 4 c m " , 2 8 3 9 . 6 c m " , l 7 1 6 . 9 c m " , 1 5 1 4 . 3 c m " , 1 2 4 8 . 1 c m " . L R M S ( E 1 ) : 2 2 3 . 1 ( M + ) C o m p o u n d I V - 1 8 : 2 - ( b e n z a m i d o ) - 2 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) a c e t i c a c i d O M e o > — H N O ‘ H P h 0 A m i x t u r e o f E t h y l 2 - a c e t a m i d o - 2 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) a c e t a t e ( 1 . 6 1 g , 5 . 1 6 m m o l ) a n d L i O H . H 2 0 ( 1 0 . 3 3 m m o l ) i n E t O H w a s m a i n t a i n e d a t r . t . f o r 2 0 h . R e m o v e d t h e s o l v e n t i n v a c u o a n d a d d e d 2 . 5 m l w a t e r . A c i d i fi e d u s i n g c o n c . H C l d r o p - w i s e t o p H = 2 w h i l e m a i n t a i n i n g t h e r e a c t i o n m i x t u r e a t 0 ° C o n i c e . F i l t e r e d a n d d r i e d 2 7 2 u n d e r v a c u u m t o o b t a i n d i r t y w h i t e s o l i d i n 7 3 . 5 % y i e l d ( 1 . 0 8 g ) . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) D M S O - d 6 : 8 3 . 7 7 ( 3 H , s ) , 5 . 4 9 ( 1 H , d , J = 9 H z ) , 6 . 9 3 ( 2 H , d , J = 8 . 4 H z ) , 7 . 4 1 - 7 . 5 0 2 ( 5 H , m ) , 7 . 9 0 ( 2 H , d , J = 8 . 4 H z ) 8 . 9 3 ( 1 H , d , J : 6 . 9 H z ) . 1 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) D M S O - d 6 : 8 5 5 . 1 1 , 5 6 . 4 0 , 1 1 3 . 6 7 , 1 2 7 . 5 8 , 1 2 8 . 1 6 , 1 2 9 . 2 4 , 1 2 9 . 4 9 , 1 3 1 . 3 6 , 1 3 3 . 8 8 , 1 5 8 . 8 3 , 1 6 6 . 0 2 , 1 7 2 . 0 4 . I R ( n e a t ) : 3 3 2 0 . 0 c m " , 2 9 2 8 . 3 c m " , 1 7 2 4 . 5 c m “ , 1 6 0 3 . 1 c m " , 1 5 1 4 . 3 e m " , 1 1 7 6 . 7 c m " ; L R M S ( E l ) : 2 8 5 . 1 ( M + ) 2 - ( b e n z a m i d o ) - 3 - p h e n y l p r o p a n o i c a c i d , I V - 1 9 O P h / ‘ L H O O C N H P h A m i x t u r e o f a m i n o a c i d e s t e r ( 1 0 g , 6 0 . 5 6 m m o l ) i n e t h e r ( 3 5 0 m L ) a n d 2 N N a O H ( 4 0 0 m L ) w a s m a i n t a i n e d a t 0 ° C f o r 1 5 m i n u t e s . A d i l u t e d s o l u t i o n o f b e n z o y l c h l o r i d e ( 7 . 7 2 m L , 6 6 . 6 2 m m o l ) i n e t h e r ( 5 0 m L ) w a s v e r y s l o w l y a d d e d u s i n g a d r o p p i n g f u n n e l . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s b r o u g h t t o r o o m t e m p e r a t u r e a n d s t i r r e d f o r 2 0 h . T h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d a n d d l i e d o v e r N 3 2 8 0 4 . T h e s o l v e n t w a s r e m o v e d i n v a c u o t o g i v e t h e p r o d u c t i n 9 5 . 2 % y i e l d , ( 1 5 . 5 2 g ) . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) D M S O d 6 : 8 3 . 1 1 ( 2 H , m ) , 4 . 6 5 ( 1 H , s ) , 7 . 1 5 - 7 . 9 7 ( 1 0 H , m ) , 8 . 7 6 ( 1 H , d , J = 7 . 5 H z ) . l 3 C N M R ( 1 2 5 M H z ) C D C l 3 : 8 3 6 . 2 8 , 5 4 . 3 5 , 1 2 6 . 4 2 , 1 2 7 . 4 5 , 1 2 8 . 2 4 , 1 2 8 . 3 0 , 1 2 8 . 6 3 , 1 2 9 . 1 5 , 1 2 9 . 3 5 , 1 3 1 . 4 4 , 1 3 2 . 9 3 , 1 3 3 . 9 6 , 1 3 8 . 3 2 , 1 6 6 . 5 0 , 1 7 3 . 2 8 . I R ( n e a t ) : 3 4 0 0 . 1 c m " , 3 2 7 8 . 8 c m " , 2 9 3 6 . 0 c m " , 1 6 8 6 . 8 0 ( b r ) c m ' ' . L R M S ( E 1 ) : 2 6 9 . 1 ( M + ) . 2 - ( b e n z a m i d o ) - 2 - p h e n y l a c e t i c a c i d , I V - 2 0 2 7 3 0 P h H N C O O H 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) , C D C 1 3 : 8 : 5 . 5 3 ( d , 1 H , J = 7 . 5 H z ) , 7 . 2 6 - 7 . 8 8 ( m , 1 0 H ) , 8 . 9 7 ( d , 1 H , J = 7 . 5 H z , e x c h a n g e a b l e ) , 1 2 . 8 6 ( s , b r , 1 H ) l 3 C N M R ( 7 4 . 4 M H z ) D M S O - d 6 : 5 6 . 8 1 , 1 2 7 . 6 7 , 1 2 7 . 8 4 , 1 2 8 . 1 2 , 1 2 8 . 1 6 , 1 2 8 . 3 6 , 1 2 8 . 5 3 , 1 2 9 . 2 3 , 1 3 1 . 4 3 , 1 3 2 . 8 3 , 1 3 3 . 7 4 , 1 3 7 . 1 4 , 1 6 6 . 2 6 , 1 7 1 . 8 8 ; I R ( C H C I 3 ) : 2 9 2 4 . 5 , 1 7 1 8 . 8 , 1 6 3 0 . 1 , 1 5 2 9 . 8 c m " . E I M S : m / z = 2 5 5 . 0 ( M + ) . A n a l . C a l c d . ( C 1 5 H 1 3 N O 3 ) C , H , N . 2 7 4 1 0 . 1 1 . 1 2 . 1 3 . 1 4 . 1 5 . R e f e r e n c e s J a n v i e r , P . ; S u n , X . ; B i e n a y m e , H . ; Z h u , J . J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 2 , 1 2 4 , 1 1 , 2 5 6 0 — 2 5 6 7 . B r e i n b a u e r , R . ; V e t t e r , I . R . ; W a l d m a n n , H . A n g e w . C h e m . I n t . E d . E n g l . 2 0 0 1 , 4 1 ( 1 6 ) , 2 8 7 8 - 2 8 9 0 . F e h e r , M . ; S c h m i d t , J . M . J . C h e m . I n f C o m p u t . S c i . 2 0 0 3 , 4 3 , 2 1 8 - 2 2 7 . ( a ) H e n k e l , T . ; B r u n n e , R . M . ; M i i l l e r , H . ; R e i c h e l , F . A n g e w . C h e m . I n t . E d . E n g l . 1 9 9 9 , 3 8 , 6 4 3 - 6 4 7 . ( b ) L e e , M . - L . ; S c h n e i d e r , G . J . C o m b . C h e m . 2 0 0 1 , 3 , 2 8 4 - 2 8 9 . A b e l , U . ; K o c h , C . ; S p e i t l i n g , M . ; H a n s s k e , F . G . C u r r . O p i n . C h e m . B i o l . 2 0 0 2 , 6 , 4 5 3 - 4 5 8 . B a j o r a t h , J . J . C o m p u t . A i d e d . M a l . D e s . 2 0 0 2 , 1 6 , 4 3 1 - 4 3 9 . N e w m a n , D . J . ; C r a g g , G . M . ; S n a d e r , K . M . J . N a t . P r o d . 2 0 0 3 , 6 6 , 1 0 2 2 - 1 0 3 7 . B o l d i , A . M . C u r r . O p i n . C h e m . B i o l . 2 0 0 4 , 8 , 2 8 1 - 2 8 6 . G l i e d e r , A . ; T h o m a s , A . W . S y n t h e s i s 2 0 0 3 , 1 7 0 7 - 1 7 1 1 . Z o u , N . ; L i u , J . — F . ; J i a n g , B . J . C o m b . C h e m . 2 0 0 3 , 5 , 7 5 4 - 7 5 5 . K i s s a u , L . ; S t a h l , P . ; M a z i t s c h e k , R . ; G i a n n i s , A . ; W a l d m a n n , H . J . M e d . C h e m . 2 0 0 3 , 4 6 , 2 9 1 7 - 2 9 3 1 . ( a ) S c h r e i b e r , S . L . ; N i c o l a o u , K . C . ; D a v i e s , K . C h e m . B i o l . 2 0 0 2 , 9 , 1 - 2 ; ( b ) W e b b , T . R . C u r r . O p i n . D r u g . D i s c o v . D e v e l . 2 0 0 5 , 8 , 3 0 3 - 3 0 8 . ( 2 ) ( a ) A r y a , P . ; J o s e p h , R . ; G a n , Z . ; R a k i c , B . C h e m . B i o l . 2 0 0 5 , 1 2 , 1 6 3 - 1 8 0 ; ( 1 ) ) B u r k e , M . D . ; B e r g e r , E . M . ; S c h r e i b e r , S . L . S c i e n c e 2 0 0 3 , 3 0 2 , 6 1 3 - 6 1 8 ; ( c ) B u r k e , M . D . ; S c h r e i b e r , S . L . A n g e w . C h e m . I n t . E d . E n g l . 2 0 0 4 , 4 3 , 4 6 - 5 8 ; ( ( 1 ) K u r u v i l l a , F . G . ; S h a m j i , A . F . ; S t e m s o n , S . M . ; H e r g e n r o t h e r , P . J . ; S c h r e i b e r , S . L . N a t u r e 2 0 0 2 , 4 1 6 , 6 5 3 - 6 5 7 . ( a ) T h o m p s o n , L . A . ; E l l m a n , J . A . C h e m . R e v . 1 9 9 6 , 9 6 , 5 5 5 - 5 6 0 . ( b ) B a l k e n h o h l , F . ; V o n d e m B u s s c h e - H i l n n e f e l d , C . ; L a n s k y , A . ; Z e c h e l , C . A n g e w . C h e m . I n t . E d . E n g l . 1 9 9 6 , 3 5 , 2 2 8 9 - 2 3 3 7 . S c h r e i b e r , S . L . S c i e n c e , 2 0 0 0 , 2 8 7 , 1 9 6 4 . B r u m m o n d , K . M . ; M i t a s e v , B . O r g . L e t t . 2 0 0 4 , 6 , 2 2 4 5 - 2 2 4 8 . 2 7 5 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . C a r t e r , H . E . O r g a n i c R e a c t i o n s 3 , J o n W i l e y a n d S o n s , I N C . , N e w Y o r k , 1 9 4 7 , 1 9 8 - 2 3 9 . C o m f o r t h , J . W . I n C l a r k e , H . T . , J o h n s o n , J . , R o b i n s o n , R . , E d s . , C h e m i s t r y o f P e n i c i l l i n ; P r i n c e t o n U n i v e r s i t y P r e s s , P r i n c e t o n , N . J . , 1 9 4 8 , 6 8 8 - 8 4 8 . M u k e l j e e , A . K . H e t e r o c y c l e s 1 9 8 7 , 2 6 , 1 0 7 7 - 1 0 9 7 . G e o r g e , G . 1 . ; B o g e , T . C . ; C h e r u v a l l a t h , Z . S . ; H a r l i m a n , G . C . B . ; H e p p e r l e a n d , M . ; P a r k , H . B i o o r g . M e d . C h e m . L e t t . 1 9 9 4 , 4 , 3 3 5 - 3 3 8 . B o y d , G . V . , I n P o t t s , K . T . , E d . , C o m p r e h e n s i v e H e t e r o c y c l i c C h e m i s t r y , 6 , P e r g a m o n P r e s s , O x f o r d , U K , 1 9 8 4 , 1 7 7 - 2 3 4 . ( a ) B e r g m a n , J . ; L i d g r e e n , G . T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 8 9 , 3 0 , 4 5 9 7 - 4 6 0 0 ; ( b ) B e n o i t o n , N . L . I n t . J . P r o t e i n . R e s . 1 9 9 1 , 3 8 , 2 8 5 - 2 8 6 . C h e n , F . M . F . ; K u r o d a , K . ; B e n o i t o n , N . L . S y n t h e s i s 1 9 7 0 , 2 3 0 . ( a ) G o t h a r d t , H . ; H u i s g e n , R . ; B a y e r , H . O . J . A m . C h e m . S o c . 1 9 7 0 , 1 0 3 , 4 3 4 0 . ( b ) P a d w a , A . , I n T a y l o r , E . C . ; W e i s s b e r g e r , A . , E d s . , 1 , 3 - D i p o l a r C y c l o a d d i t i o n C h e m i s t r y , G e n e r a l H e t e r o c y c l i c C h e m i s t r y S e r i e s , J o n W i l e y a n d S o n s , I N C . , N e w J e r s e y , 1 9 8 4 . ( c ) G r i b b l e , G . W . , I n P a l m e r , D . C . , E d . , O x a z o l e s : S y n t h e s i s , R e a c t i o n s a n d S p e c t r o s c o p y , V o l u m e 6 0 P a r t A , T h e C h e m i s t r y o f H e t e r o c y c l i c C o m p o u n d s ; J o n W i l e y a n d S o n s , I N C . , N e w J e r s e y , 2 0 0 2 ; 4 7 3 - 5 7 6 . C a t i v i e l a , C . ; D i a z - d e - V i l l e g a s , M . D . , I n P a l m e r , D . C . , E d . , O x a z o l e s : S y n t h e s i s , R e a c t i o n s a n d S p e c t r o s c o p y , V o l u m e 6 0 : P a r t B , T h e C h e m i s t r y o f H e t e r o c y c l i c C o m p o u n d s ; J o n W i l e y a n d S o n s , I N C . , N e w J e r s e y , 2 0 0 2 , 1 3 0 - 2 9 9 . B a y e r , H . 0 . ; H u i s g e n , R . ; K n o r r , R . ; S c h a e f e r , F . C . C h e m . B e r . 1 9 7 0 , 1 0 3 , 2 5 8 1 . ( a ) F u n k e , E . ; H u i s g e n , R . C h e m . B e r . 1 9 7 1 , 1 0 4 , 3 2 2 2 . ( b ) P r a j a p a t i , D . ; M a h a j a n , A . R . ; S a n d h u , J . S . J . C h e m . S o c . P e r k i n T r a n s . 1 . 1 9 9 2 , 7 3 4 . ( a ) G i n g l i c h , H . L . ; B a u m , J . S . I n O x a z o l e s : T u r c h i , I . J . , E d . ; W i l e y : N e w Y o r k , 1 9 8 6 ; V o l . 4 5 , p 7 3 1 . ( b ) P o t t s , K . T . I n 1 , 3 - D i p o l a r C y c l o a d d i t i o n C h e m i s t r y ; P a d w a , A . , E d . ; W i l e y : N e w Y o r k , 1 9 8 4 ; V o l . 2 , p 1 . ( c ) K e a t i n g , T . A . ; A r m s t r o n g , R . W . J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 6 , 1 1 8 , 2 5 7 4 . ( d ) S a n t i a g o , B . ; D a l t o n , C . R . ; H u b e r , E . W . ; K a n e , J . M . J . O r g . C h e m . 1 9 9 5 , 6 0 , 4 9 4 7 . ( a ) B i l o d e a u , M . T . ; C u n n i n g h a m , A . M . J . O r g . C h e m . 1 9 9 8 , 6 3 , 2 8 0 0 . ( b ) C o n s o n n i , R . ; D a l l a C r o c e , P . ; F e r r a c c i o l i , R . ; L a R o s a , C . J . C h e m . R e s . S y n o p . 1 9 9 1 , 7 , 1 8 8 . H u i s g e n , R . ; G o t t h a r d t , H . ; B a y e r , H . 0 . C h e m . B e r . 1 9 7 0 , 1 0 3 , 2 3 6 8 . 2 7 6 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . 3 7 . 3 8 . 3 9 . N a y y a r , N . K . ; H u t c h i s o n , D . R . ; M a r t i n e l l i , M . J . J . O r g . C h e m . 1 9 9 7 , 6 2 , 9 8 2 . ( a ) A v a l o s , M . ; B a b i a n o , R . ; C i n t a s , P . ; H u r s t h o u s e , M . B . ; J i m e n e z , J . L . ; L i g h t , M . E . ; L o p e z , 1 . ; P a l a c i o s , J . C . ; S i l v e r o , G . C h e m i s t r y 2 0 0 1 , 7 , 3 0 3 3 . ( b ) P r a s a d , K . K . ; P e t r z i l k a , T . H e l v . C h i m . A c t a 1 9 7 5 , 5 8 , 2 5 0 4 . ( a ) P e d d i b h o t l a , S . ; J a y a k u m a r , S . ; T e p e , J . J . O r g . L e t t . 2 0 0 2 , 4 ( 2 0 ) , 3 5 3 3 - 3 5 3 5 . ( b ) P e d d i b h o t l a , S . ; T e p e , J . J . S y n t h e s i s 2 0 0 3 , 9 , 1 4 3 3 - 1 4 4 0 . P e d d i b h o t l a , S . ; T e p e , J . J . J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 4 , 1 2 6 ( 4 0 ) , 1 2 7 7 6 - 1 2 7 7 7 . P e d d i b h o t l a , S . L e w i s a c i d m e d i a t e d i n s i t u g e n e r a t i o n o f m i i n c h n o n e s a i m e d a t d i v e r s i t y o r i e n t e d s y n t h e s i s o f n i t r o g e n c o n t a i n i n g d i h y d r o h e t e r o c y c l e s , P h . D . T h e s i s , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M I , 2 0 0 4 . ( a ) D a i , L . ; L i n , Y . ; H o u , X . ; Z h o u , Y . P u r e . A p p l . C h e m . 1 9 9 9 , 7 1 ( 6 ) , 1 0 3 3 . ( b ) L u c e t , D . ; L e G a l l , T . ; M i o s k o w s k i , C . A n g e w . C h e m . I n t . E d . 1 9 9 8 , 3 7 , 2 5 8 0 . ( c ) Z h o u , X . ; L i n , Y . ; D a i , L . ; S u n , J . ; X i a , L . ; T a n g , M . J . O r g . C h e m . 1 9 9 9 , 6 4 , 1 3 3 1 . ( a ) J o n e s , R . C . E ; H o w a r d , K . J . ; S n a i t h , J . S . T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 9 6 , 3 7 , 1 7 0 7 - 1 7 1 0 . ( b ) J o n e s , R . C . E ; H o w a r d , K . J . ; S n a i t h , J . S . T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 9 6 , 3 7 , 1 7 1 1 - 1 7 1 4 . ( c ) D a l k o , P . 1 . ; L a n g l o i s , Y . C h e m . C o m m u n . 1 9 9 8 , 3 3 1 - 3 3 2 . ( a ) M e n g e s , F . ; N e u b u r g e r , M . ; P f a l t z , A . O r g . L e t t . 2 0 0 2 , 4 , 4 7 1 3 - 4 7 1 6 . ( b ) H e r r m a n n , W . A . A n g e w . C h e m . I n t . E d . 2 0 0 2 , 4 1 , 1 2 9 0 - 1 3 0 9 . ( c ) H e r m a n n , W . A . ; G o o s s e n , L . J . ; S p e i g l e r , M . O r g a n o m e t a l l i c s . 1 9 9 8 , I 7 , 1 1 7 2 . ( d ) B e t s c h a r t , C . ; H e g e d u s , L . S . J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 2 , 1 1 4 , 5 0 1 0 - 5 0 1 7 . ( a ) B o n , R . S . ; H o n g , C . ; B o u m a , M . J . ; S c h m i t z , R . F . ; d e K a n t e r , F . J . ; L u t z , M . ; S p e k , A . L . ; O r r u , R . V . O r g . L e t t . 2 0 0 3 , 5 , 3 7 5 9 - 3 7 6 2 . ( b ) B o n , R . S . ; v a n V l i e t , B . ; S p r e n k e l s , N . E . ; S c h m i t z , R . F . ; d e K a n t e r , F . J . ; S t e v e n s , C . V . ; S w a n , M . ; B i c k e l h a u p t , F . M . ; G r o e n , M . B . ; O r r u , R . V . J . O r g . C h e m . 2 0 0 5 , 7 0 , 3 5 4 2 - 3 5 5 3 . ( c ) D h a w a n , R . ; D g h a y m , R . D . ; A m d t s e n , B . A . J . A m . C h e m . S o c . 2 0 0 3 , 1 2 5 , 1 4 7 4 - 1 4 7 5 . ( d ) B o l a n d , N . A . ; C a s e y , M . ; H y n e s , S . J . ; M a t t h e w s , J . W . ; S m y t h , M . P . J . O r g . C h e m . 2 0 0 2 , 6 7 , 3 9 1 9 - 3 9 2 2 . ( a ) D a r d o n v i l l e , C . ; R o z a s , 1 . M e d R e s R e v 2 0 0 4 , 2 4 , 6 3 9 - 6 6 1 ; ( b ) U e n o , M . ; I r n a i z u m i , K . ; S u g i t a , T . ; T a k a t a , 1 . ; T a k e s h i t a , M . I n t . J . I m m u n o p h a r m a c o l . 1 9 9 5 , 1 7 , 5 9 7 - 6 0 3 ; ( c ) F u r u k a w a , 0 . ; M u r a k a m i , T . ; S u g i t a , T . ; U e n o , M . ; T a k a t a , 1 . ; T o s a , T . I n t . J . I m m u n o p h a r m a c o l . 1 9 9 3 , 1 5 , 5 1 5 - 5 1 9 ; ( ( 1 ) S c h a f e r , S . G . ; K a a n , E . C . ; C h r i s t e n , M . 0 . ; L o w - K r o g e r , A . ; M e s t , H . J . ; M o l d e r i n g s , G . J . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 1 9 9 5 , 7 6 3 , 6 5 9 - 6 7 2 ; ( e ) B o u s q u e t , P . ; B r u b a n , V . ; S c h a n n , S . ; F e l d m a n , J . P h a r m . A c t a . H e l v . 2 0 0 0 , 7 4 , 2 0 5 - 2 0 9 ; ( D B o u s q u e t , P . ; F e l d m a n , J . D r u g s 1 9 9 9 , 5 8 , 7 9 9 - 8 1 2 . 2 7 7 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . 4 8 . 4 9 . 5 0 . ( a ) A c h a r y a , A . N . ; O s t r e s h , J . M ; H o u g h t e n , R . A . J . C o m b . C h e m . 2 0 0 1 , 3 , 6 1 2 . ( b ) C o n c e l l o n , J . M . ; R i e g o , E . ; S u a r e z , J . R . ; G a r c i a - G r a n d a , S . ; R o s a r i o D l ’ a z , M . O r g . L e t t . 2 0 0 4 , 6 , 4 4 9 9 . ( c ) A c h a r y a , A . N . ; O s t r e s h , J . M ; H o u g h t e n , R . A . J . O r g . C h e m . 2 0 0 1 , 6 6 , 8 6 7 3 . ( d ) C h e m , J . - W . ; L i a w , Y . - C . ; C h e n , C . - S . ; R o n g , J . - G . ; H u a n g , C . - L . ; C h a n , C . - H . ; W a n g , A . H . - J . H e t e r o c y c l e s 1 9 9 3 , 3 6 , 1 0 9 1 - 1 1 0 3 . ( e ) D e L u c c a , G . V . J . O r g . C h e m . 1 9 9 8 , 6 3 , 4 7 5 5 - 4 7 6 6 . M u n k , S . A . ; H a r c o u r t , D . ; A m b r u s , G . ; D e n y s , L . ; G l u c h o w s k i , C . ; B u r k e , J . A . ; K h a r l a m b , A . B . ; M a n p l a p a z , C . A . ; P a d i l l o , E . U . ; R u n d e , E . ; W i l l i a m s , L . ; W h e e l e r , L . A . ; G a r s t , M . E J . M e d . C h e m . 1 9 9 6 , 3 9 , 3 5 3 3 . R e g u n a t h a n , S . , F e i n s t e i n , D . L . , R e i s , D . J . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 1 9 9 9 8 8 1 , 4 1 0 - 4 1 9 . ( 3 ) G i l b e r t , 1 . H . ; R e e s , D . C . ; C r o c k e t t , A . K . ; J o n e s , R . C . F . T e t r a h e d r o n 1 9 9 5 , 5 1 , 6 3 1 5 . ( b ) J o n e s , R . C . F . ; D i c k s o n , J . J . P e p t i d e S c i . 2 0 0 0 , 6 , 6 2 1 - 6 2 4 . A r k i n , M . R . ; W e l l s , J . A . N a t u r e R e v . D r u g D i s c o v . 2 0 0 4 , 3 ( 4 ) , 3 0 1 - 3 1 7 . K u s s i e , P . H . ; G o r i n a , S . ; M a r e c h a l , V . ; E l e n b a a s , B . ; M o r e a u , J . ; L e v i n e , A . J . ; P a v l e t i c h , N . P . S c i e n c e , 1 9 9 6 , 2 7 4 , 9 4 8 - 9 5 3 . V a s s i l e v , L . T . ; V u , B . T . ; G r a v e s , B . ; C a r v a j a l , D . ; P o d l a s k i , F . ; F i l i p o v i c , Z . ; K o n g , N . ; K a m m l o t t , U . ; L u k a c s , G ; K l e i n , C . ; F o t o u h i , N . ; L i u , E . A . S c i e n c e 2 0 0 4 , 3 0 3 , 8 4 4 - 8 4 8 . S h a r m a , V . ; L a n s d e l l , T . ; P e d d i b h o t l a , S . ; T e p e , J . J . C h e m . B i o l . 2 0 0 4 , I I , 1 6 8 9 - 1 6 9 9 . W a s s e r m a n , H . H . ; H l a s t a , D . J . ; T r e m p e r , A . W . ; W u , J . S . J . O r g . C h e m . l 9 8 1 , 4 6 , 2 9 9 9 . ( a ) B l o n d e a u , P . ; v a n d e r L e e , A r i e ; B a r b o i u , M . I n o r g . C h e m . 2 0 0 5 , 4 4 , 5 6 4 9 - 5 6 5 3 . ( b ) S h a n , S h a n g ; H u , W e i X i a o ; X u , D u a n J u n . A c t a C r y s t a l l o g r a p h i c a , S e c t i o n E : S t r u c t u r e R e p o r t s O n l i n e 2 0 0 4 , E 6 0 ( 1 1 ) , 0 2 0 5 9 - 0 2 0 6 1 . ( c ) H a n e l i n e , M a s o n R . ; T s u n o d a , M i t s u k i m i ; G a b b a i e , F r a n c o i s P . J . A m C h e m S o c . 2 0 0 2 , 1 2 4 ( 1 4 ) , 3 7 3 7 - 3 7 4 2 . ( d ) C o a t e s , G . W . ; l D u n n , A . R . ; H e n l i n g , L . M . ; Z i l l e r , J . W . ; L o b k o v s k y , E . B . ; G r u b b s , R . H . J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 8 , 1 2 0 ( 1 5 ) , 3 6 4 1 - 3 6 4 9 . ( e ) C o r e y , E . J . ; N o e , M . C . J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 6 , 1 1 8 , 3 1 9 - 3 2 9 . G r i g g , R . ; L a n s d e l l , M . 1 . ; T h o m t o n - P e t t , M . T e t r a h e d r o n 1 9 9 9 , 5 5 , 2 0 2 5 - 2 0 4 4 . 2 7 8 C H A P T E R V C H E C K P O I N T K I N A S E I N H I B I T O R S : A T C R O S S R O A D S T O L I F E A N D C E L L D E A T H T o b e o r n o t t o b e , t h a t i s t h e q u e s t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . W i l l i a m S h a k e s p e a r e A . I n t r o d u c t i o n D e s p i t e a n i m p r o v e d u n d e r s t a n d i n g o f t h e u n d e r l y i n g c a u s e s o f c a n c e r , t h e d i s e a s e i s o n t h e r i s e i n m o s t d e v e l o p i n g c o u n t r i e s . M o s t c l i n i c a l c a s e s a r e e i t h e r t r e a t e d w i t h r a d i a t i o n o r s o m e f o r m o f c h e m o t h e r a p y . T h i s i n v o l v e s a b i - f a c e t e d c h a l l e n g e , t o i d e n t i f y n e w " l e s s - t o x i c " a n t i - c a n c e r d r u g s f r o m t h e c o n v e n t i o n a l t r e a t m e n t s a n d t o i m p r o v e t h e e x i s t i n g t h e r a p i e s , s o t h a t t h e y b e c o m e m o r e e f f e c t i v e i n t h e b a t t l e a g a i n s t c a n c e r . B o t h r a d i a t i o n a s w e l l a s c h e m o t h e r a p e u t i c t r e a t m e n t s t e n d t o b e m o r e t o x i c t o r a p i d l y d i v i d i n g c a n c e r c e l l s . 1 H o w e v e r , t h e i r s p e c i fi c i t y t o w a r d s c a n c e r o u s c e l l s i s f a r f r o m s u f fi c i e n t . T h i s l e a d s t o d e b i l i t a t i n g s i d e e f f e c t s t h a t o f t e n c o m p r o m i s e t h e e f fi c a c y o f c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s i n c l i n i c . 2 R e s i s t a n c e , w h i c h i s a f o c a l p o i n t t o t h e f a i l u r e t o c a n c e r t h e r a p y o f t e n s e e m s t o s t e m f r o m t h e a b i l i t y o f t h e t u m o r t o o v e r c o m e a n d r e p a i r t h e D N A d a m a g e . D N A r e p l i c a t i o n i s a p r o c e s s t h a t r e q u i r e s a c c u r a c y a n d p r e c i s i o n a n d r e l i e s o n s u r v e i l l a n c e m e c h a n i s m s , w h i c h m o n i t o r D N A d a m a g e a n d i n i t i a t e D N A r e p a i r . 3 D N A r e p a i r i s a ‘ d o u b l e e d g e d s w o r d ’ i n t u m o r b i o l o g y . W h i l e , t h e e n t i r e r e p a i r m a c h i n e r y i s v i t a l t o t h e m a i n t e n a n c e o f g e n o m i c i n t e g r i t y , v i a b i l i t y a n d p r o l i f e r a t i o n o f n o r m a l c e l l s , t h e i n t r o d u c t i o n o f m u t a t i o n s m a y l e a d t o t h e d e v e l o p m e n t o f n e o p l a s t i c c e l l s a n d 2 7 9 c a n c e r . V e r y o f t e n , t h e i n a b i l i t y t o c a r r y o u t ‘ n o r m a l ’ r e p a i r f u n c t i o n i n g o n c h r o m o s o m a l i n s u l t s l e a d s t o t h e t r a n s f o r m a t i o n o f n o r m a l c e l l s i n t o m a l i g n a n c i e s . 4 I t i s t h e s e r e p a i r p a t h w a y s t h a t c o n f e r r e s i s t a n c e t o t h e g e n o t o x i c b u r d e n o f m o s t e s t a b l i s h e d t h e r a p i e s . T h u s , i n o r d e r t o u t i l i z e t h e p o t e n t i a l o f r e p a i r m e c h a n i s m s a n d d e v e l o p n o v e l a n t i - c a n c e r t h e r a p i e s t o m o d u l a t e t h e m , w e n e e d a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e m e c h a n i s m o f t h e s e D N A r e p a i r p a t h w a y s . B y t a r g e t i n g s o m e o f t h e i m p o r t a n t p r o t e i n s i n t h e D N A r e p a i r p r o c e s s e s i t i s h o p e d t h a t , i n c o m b i n a t i o n w i t h t h e e x i s t i n g t h e r a p i e s , w e c a n i m p r o v e t h e e f f e c t i v e n e s s o f t r e a t m e n t s . T u m o r i g e n e s i s i s a m u l t i - s t e p p r o c e s s t h a t r e v e a l s g e n e t i c m o d i fi c a t i o n s , w h i c h d r i v e t h e p r o g r e s s i v e t r a n s f o r m a t i o n o f n o r m a l c e l l s i n t o m a l i g n a n t c e l l s . D N A d a m a g e f u e l s t h i s " g e n o m i c i n s t a b i l i t y " . D u e t o a p l e t h o r a o f f a c t o r s ( e n d o g e n o u s a n d e x o g e n o u s ) c a u s i n g a v a r i e t y o f d a m a g e s , n o s i n g l e r e p a i r p r o c e s s c a n c o p e . T h i s h a s l e d t o n u m e r o u s s o p h i s t i c a t e d a n d i n t e r a c t i v e r e p a i r s y s t e m s . 5 M u l t i - c e l l u l a r o r g a n i s m s r e s p o n d t o c h r o m o s o m a l i n s u l t s b y a c t i v a t i n g a c o m p l e x d a m a g e r e s p o n s e p a t h w a y . U p o n D N A d a m a g e , c e l l c y c l e c h e c k p o i n t s g e t a c t i v a t e d , w h i c h d e l a y c e l l c y c l e p r o g r e s s i o n a n d a l l o w D N A r e p a i r . A m u l t i - f a c e t e d i n v o l v e m e n t o f t h e s e c h e c k p o i n t 3 ' “ t e l o m e r e l e n g t h ° a n d t h e i n d u c t i o n o f a p o p t o t i c c e l l p a t h w a y s r e g u l a t e s D N A r e p a i r , d e a t h . ° ‘ 8 P r o t e i n k i n a s e s r e g u l a t e a h o s t o f c e l l u l a r p r o c e s s e s s u c h a s g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n , c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d a p o p t o s i s . 9 D N A d a m a g e c a u s e d b y r a d i a t i o n o r c h e m o t h e r a p y t r i g g e r s t h e D N A d a m a g e - r e s p o n s i v e p r o t e i n k i n a s e s A T M a n d A T R , w h i c h a c t i v a t e C h k l a n d C h k 2 . C h k l a n d C h k 2 i n t u r n p h o s p h o r y l a t e C d c 2 5 a n d p r e v e n t C d c 2 a c t i v a t i o n , r e s u l t i n g i n c e l l c y c l e a r r e s t . l o H e n c e , s m a l l m o l e c u l e s t h a t c a n 2 8 0 i n h i b i t t h e c h e c k p o i n t s m a y e n h a n c e t h e e f fi c a c y o f D N A d a m a g i n g c h e m o t h e r a p e u t i c s o r r a d i a t i o n t h e r a p y . ” B . S y n t h e t i c e f f o r t s t o w a r d s n a t u r a l e n d s . C o m b i n a t o r i a l c h e m i s t r y a l l o w s f o r t h e s y n t h e s i s o f v a s t l i b r a r i e s w i t h n u m e r o u s c o m p o u n d s - m i l l i o n s o f c o m p o u n d s a r e r e a l i z a b l e b y o n e c h e m i s t o n t h e i r o w n i n a f e w w e e k s u s i n g s p l i t - p o o l c o m b i n a t o r i a l t e c h n i q u e s . 1 2 H o w e v e r , t h e l i m i t a t i o n i s t h a t t h e l i b r a r i e s p r o d u c e d a r e a f o c u s e d c l a s s o f c o m p o u n d s t h a t h a v e l i m i t e d s t r u c t u r a l d i v e r s i t y . T h i s t e c h n i q u e p r o b a b l y g o t i n s p i r a t i o n f r o m N a t u r e ’ s w a y o f p r o d u c i n g p r i m a r y a n d s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s i n p r e s e n c e o f e n z y m e s . N a t u r e ’ s t e c h n i q u e t o p r o d u c e u n i q u e b i o a c t i v e l i b r a r i e s c a n b e c o n s i d e r e d t o b e a n a l o g o u s a n d i n h a r m o n y t o t h e c o m b i n a t o r i a l g e n e r a t i o n o f s y n t h e t i c l i b r a r i e s , e a c h a p p r o a c h p r o v i d i n g a c c e s s t o v e r y d i f f e r e n t t y p e s o f l e a d c o m p o u n d s . ‘ 3 H o w e v e r , t h e r e i s a s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e p r o c e s s e s . T h e g e n e r a t i o n o f c o m b i n a t o r i a l l i b r a r i e s h a s b e e n c o n s t r a i n e d p r i m a r i l y b y t h e a v a i l a b i l i t y o f r e a g e n t s a n d s u i t a b l e r e a c t i o n s . I n c o n t r a s t , t h e g e n e r a t i o n o f d i v e r s e n a t u r a l p r o d u c t r e q u i r e s s u b t l e c h e m i s t r y i n v o l v i n g v a r i a t i o n i n r e s t r i c t e d n u m b e r o f p r e c u r s o r s a n d t h e a v a i l a b l e b i o s y n t h e t i c r e a c t i o n s i n t h e c o n t e x t o f a b i o l o g i c a l u t i l i t y . O n e o f t h e i n t r i g u i n g f a m i l y o f s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s d i s p l a y e d b y m a r i n e s p o n g e s i s t h e p y r r o l e - i m i d a z o l e a l k a l o i d f a m i l y w i t h m e m b e r s l i k e p a l a u ’ a m i n e M ( k n o w n a s a p h a r m a c e u t i c a l f r o m a s p o n g e ) , o r o i d i n , ' 5 p h a k e l l i n , ‘ ° h y m e n i n ” e t c . w h i c h p r o v i d e a w i d e v a r i e t y o f b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s ( F i g u r e V - l ) . 2 8 1 H N \ N H 2 N ~ < / W u w w N O r o i d i n H B r F i g u r e V - l . R e p r e s e n t a t i v e s t r u c t u r a l g r o u p s s y n t h e s i z e d b y p h y l u m P o r i f e r a . T h e m a r i n e s p o n g e m e t a b o l i t e h y m e n i a l d i s i n e ( F i g u r e V - 2 ) w a s o r i g i n a l l y i s o l a t e d f r o m t h e s p o n g e s H y m e n i a l d i s o n a l d i s , A x i n e l l a v e r r u c o s a a n d A c a n t e l l a a u r a n t i a c a i n e a r l y 1 9 8 0 8 a n d i t s s t r u c t u r e w a s e s t a b l i s h e d o n t h e b a s i s o f X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y . ' ° ' H y m e n i a l d i s i n e a n d d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e w e r e s h o w n t o p o s s e s s p o t e n t a c t i v i t y a g a i n s t P 3 8 8 l e u k e m i a c e l l l i n e , ‘ 8 ° L 5 1 7 8 y m o u s e l y m p h o m a c e l l s 1 8 c a n d e v e n s o m e i n s e c t i c i d a l a c t i v i t y . 1 8 c T h e h y m e n i a l d i s i n e s f o r m a u n i q u e c l a s s o f n a t u r a l p r o d u c t s i n c l u d i n g h y m e n i n , s t e v e n s i n e a n d a x i n o h y d a n t o i n ( F i g u r e V - 2 ) w i t h a c o m m o n p y r r o l o [ 2 , 3 - c ] a z e p i n e l i n g a t t a c h e d t o a c y c l i c g u a n i d i n e o r h y d a n t o i n r i n g . 2 8 2 O N \ H N 4 N T V N J K L n / g ’ n H Z N m W N H Z H 3 - a m i n o 1 - ( 2 a m i n o i m i d a z o l - 4 - y l ) p r o p - 1 - e n e R O r o i d i n R = B ' = B r O H N H y m e n i d i n R = H , R ' = B r \ H \ C l a t h r o d i n R = R ' = H N N \ B r > L N H H 2 N O / H D i s p a c a m i d e R = B r H 2 N ' < N ‘ ” W M o n o b r o m o d i s p a c a m i d e F 1 = H I B r K e r a m a d i n e H H N O N O N o H 2 N ~ < \ H 2 N ~ < \ 0 = < N \ N \ u \ \ N H \ N H \ N H I N I N \ B r H O H H 0 B r N H O H y m e n i a l d i s i n e D e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e A x i n o h y d a n t o i n H H N N O H 2 N ‘ < \ N H B r I \ N H 1 \ N B r N o N H B r H 0 S t e v e n s i n e ( o r i l i n e ) H y m e n i n A l d i s i n e F i g u r e v 2 . T h e O r o i d i n a n d H y m e n i a l d i s i n e f a m i l i e s . O r o i d i n s h o w e v e r , a r e c h e m i c a l l y d i s t i n c t d u e t o t h e p r e s e n c e o f t h e 2 - a m i n o i m i d a z o l e r i n g , a b r o m i n a t e d o r n o n - b r o m i n a t e d p y r r o l a c a r b o x a m i d e , a n d a t h r e e C l o n g a l k y l c h a i n ( f u n c t i o n a l i z e d o r n o n - f u n c t i o n a l i z e d ) c o n n e c t i n g t h e s e h e t e r o c y c l i c m o i e t i e s . T h e s e a r e p o t e n t a n t a g o n i s t s f o r s e r o t i n e r g i c a n d h i s t a m i n e r g i c r e c e p t o r s . 1 9 H y m e n i a l d i s i n e a n d o t h e r o r o i d i n c o m p o u n d s ( F i g u r e V - 2 ) h a v e b e e n e s t a b l i s h e d t o b e p o t e n t a n t i - 2 8 3 p r o l i f e r a t i v e , a n t i - n e u r o d e g e n e r a t i v e a n d a n t i - i n fl a m m a t o r y a g e n t s i n v a r i o u s c e l l l i n e s a n d a n i m a l m o d e l s . 2 ° 2 3 ’ 2 ° C . H y m e n i a l d i s i n e a n d k i n a s e i n h i b i t i o n . P r o t e i n k i n a s e s p l a y a n e s s e n t i a l r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f a v a r i e t y o f c e l l u l a r p r o c e s s e s s u c h a s t r a n s c r i p t i o n i n v o l v i n g c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n , g r o w t h a n d m e t a b o l i s m , a n d a p o p t o s i s . 9 A b b e r a n t r o l e s i n t h e a c t i v i t y o f k i n a s e s c a n l e a d t o d i s e a s e s s u c h a s c a n c e r , a l z h e i m e r ’ s d i s e a s e a n d d i a b e t e s . 2 7 S e v e r a l s m a l l m o l e c u l e s h a v e b e e n s y n t h e s i z e d f o r k i n a s e i n h i b i t i o n a n d w h i l e m o s t t a r g e t t h e A T P b i n d i n g p o c k e t o f t h e k i n a s e , t h e r e a r e s o m e m o l e c u a l e s w h i c h i n h i b i t k i n a s e s i n a n o n - A T P b i n d i n g m a n n e r . 2 ° M o s t m o l e c u l e s t h a t b e l o n g t o t h e f o r m e r c l a s s a r e h e t e r o c y c l e s s u c h a s p y r i m i d i n e s , p u r i n e s , i n d o l i n o n e s , i m i d a z o l e s e t c . ” A p p r o x i m a t e l y 4 6 k i n a s e i n h i b i t o r s a r e n o w i n c l i n i c a l t r i a l s f o r t a r g e t i n g c a n c e r , a n g i o g e n e s i s , l e u k e m i a , i n fl a m m a t i o n e t c . 2 0 T h e m a r i n e s p o n g e m e t a b o l i t e s h y m e n i a l d i s i n e i s a p o t e n t i n h i b i t o r o f a v a r i e t y o f k i n a s e s i n c l u d i n g M E K - l , o s x a h a n d C K 1 . 2 2 I n a d d i t i o n , h y m e n i a l d i s i n e a n d d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e e x h i b i t i n h i b i t i o n o f t h e 0 2 c e l l c y c l e c h e c k p o i n t a t m i c r o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s . l o H y m e n i a l d i s i n e w a s f o u n d t o b e a p o t e n t k i n a s e i n h i b i t o r o f s e v e r a l c l o s e l y r e l a t e d C D K ’ s . 2 1 I n a d d i t i o n , h y m e n i a l d i s i n e w a s f o u n d t o b e a p o t e n t N F - K B i n h i b i t o r 2 0 a n d a c t s a s a c o m p e t i t i v e n a n o m o l a r i n h i b i t o r o f t h e c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e s , G S K - 3 B a n d C K l w i t h I C s o ’ s o f 1 0 n M a n d 3 5 n M , r e s p e c t i v e l y . 2 | C r y s t a l l o g r a p h i c d a t a p o r t r a y e d t h e b i n d i n g o f t h e k i n a s e i n h i b i t o r i n t h e A T P b i n d i n g p o c k e t o f t h e k i n a s e s . 2 2 I n a d d i t i o n , I r e l a n d a n d c o - w o r k e r s h a v e i d e n t i fi e d h y m e n i a l d i s i n e a s a v e r y p o t e n t 2 8 4 A c t i v a t l o n o f ‘ c y t o p l a s m m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e k i n a s e - 1 ( M E K - l ) i n h i b i t o r w i t h l o w n a n o m o l a r I C s o v a l u e s ( 1 C 5 0 = 6 n M ) . 2 3 H y m e n i a l d i s i n e w a s a l s o i s o l a t e d f r o m t h e s p o n g e S t y l l i s a m a s s a a s a c o m p o u n d f o r t h e i n h i b i t i o n o f R a f / M e k - l / M A P K c a s c a d e . 2 3 R a f / M E K / M A P K p r o t e i n s p l a y a v e r y i m p o r t a n t r o l e i n c e l l u l a r s i g n a l i n g p r o c e s s e s . A l l e u k a r y o t i c o r g a n i s m s c o n s e r v e t h i s R a s - M A P K s i g n a l i n g c a s c a d e ( M A P K m o d u l e , F i g u r e V — 3 ) w h e r e i t i s m a i n l y i n v o l v e d i n r e l a y i n g s i g n a l s f r o m t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x i n t o t h e c y t o s o l a n d n u c l e u s . 2 4 E x t r a c e r l l u l a r s l g n a l ‘ 1 ; V ‘ m e m b r a n e K l n a s e s F i g u r e V - 3 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n M A P K p a t h w a y . T h e c a s c a d e i s a c t i v a t e d b y ‘ a c t i v e ’ R a s ( g u a n o s i n e 5 ’ - t r i p h o s p h a t e - l o a d e d ) , w h i c h r e c r u i t s R a f - 1 t o t h e i n n e r c e l l m e m b r a n e . H e r e , R a f - l g e t s p h o s p h o r y l a t e d a n d a c t i v a t e d . 2 8 5 T h i s a c t i v a t e d R a f - 1 p h o s p h o r y l a t e s a n d a c t i v a t e s t h e k i n a s e , M E K ( M A P k i n a s e k i n a s e ) , o n t w o d i f f e r e n t s e r i n e r e s i d u e s . 2 4 T h i s t r i g g e r s a s e r i e s o f p h o s p h o r y l a t i o n e v e n t s w h i c h c u l m i n a t e i n a c t i v a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i m p o r t a n t i n c e l l s u r v i v a l a n d d i f f e r e n t i a t i o n . 2 5 D . B i o l o g i c a l r e l e v a n c e o f t h e a m i n o i m i d a z o l o n e r i n g a n d a m i n o i m i d a z o l e s . H e t e r o c y c l i c c o m p o u n d s h a v e l o n g b e e n k n o w n t o e x h i b i t r e m a r k a b l e b i o l o g i c a l a n d p h a r m a c o l o g i c a l p r o p e r t i e s . W h i l e t r a d i t i o n a l a p p r o a c h e s i n u n d e r s t a n d i n g t h e m e d i a t o r s i n c h r o n i c i n fl a m m a t i o n a n d c a n c e r i n c l u d e d i r e c t t a r g e t i n t e r v e n t i o n s u c h a s u s e o f a n e n z y m e i n h i b i t o r , r e c e n t a d v a n c e s i n e l u c i d a t i o n o f r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n t r a n s c r i p t i o n h a v e s h i f t e d t h e f o c u s a t t h e l e v e l o f g e n e t r a n s c r i p t i o n . N F - c h i s o n e s u c h i m p o r t a n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r t h a t m a y b e t h e r a p e u t i c a l l y m o d u l a t e d a n d fi n d a p p l i c a t i o n s i n c l i n i c a l u s e . T h e 2 - a m i n o i m i d a z o l o n e r i n g i s a s t r u c t u r a l c o m p o n e n t o f c o m p o u n d s t h a t i n h i b i t N F - c h a c t i v a t i o n a n d p r o t e i n k i n a s e C . 2 1 M e i j e r e t a 1 2 ° s h o w e d a s t r u c t u r e b a s e d a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p w i t h C d k s , C K l a n d G S K - 3 B a n d p r o p o s e t h a t t h e b i n d i n g p a t t e r n o f t h e s e m o l e c u l e s w a s s i m i l a r f o r a l l t h r e e k i n a s e s . F i g u r e V - 4 h i g h l i g h t s t h e i m p o r t a n t r e g i o n s f o r t h e a c t i v i t y o f h y m e n i a l d i s i n e - l i k e m o l e c u l e s . T h e a c t i v i t y o f g l y c o a m i d i n e r i n g r e d u c e d d r a m a t i c a l l y w h e n a l k y l a t e d o r a c y l a t e d . S i m i l a r l y , t h e p r e s e n c e o f f r e e N H i n t h e i n d o l e o r p y r r o l e m o i e t y w a s i m p o r t a n t f o r a c t i v i t y . F u r t h e r , w h i l e h a l o g e n s u b s t i t u t i o n s ( R 1 a n d R 2 ) d i d n o t a f f e c t t h e a c t i v i t y o n t h e p y r r o l e s o r i n d o l e s , N 0 2 o r M e S O z r e d u c e d t h e a c t i v i t y . 2 8 6 I n d o l e a z e p i n e H y m e n i a l d i s i n e F i g u r e V - 4 . S t r u c t u r e b a s e d a c t i v i t y f o r i n d o l e a z e p i n e a n d h y m e n i a l d i s i n e a n a l o g s . F u n c t i o n a l i t i e s i n r e d a r e e s s e n t i a l a n d t h o s e i n b l u e a r e n o n - e s s e n t i a l . E . T o t a l s y n t h e s e s o f h y m e n i a l d i s i n e f a m i l y . D u e t o e x c e l l e n t b i o l o g i c a l a n d m e d i c i n a l a c t i v i t i e s a l o n g w i t h u n i q u e s t r u c t u r a l f e a t u r e s , t h e o r o i d i n a n d h y m e n i a l d i s i n e f a m i l i e s h a v e a t t r a c t e d t h e a t t e n t i o n o f v a r i o u s r e s e a r c h g r o u p s . L i n d e l a n d H o f f m a n n s h o w e d t h e s y n t h e s i s o f d i s p a c a m i d e , ( a m e m b e r o f t h e o r o i d i n f a m i l y a s s u m e d t o b e a d i r e c t p r e c u r s o r o f p y r r o l o a z e p i n o n e s u c h a s h y m e n i a l d i s i n e ) f r o m t h i o h y d a n t o i n . ° ° O n l y t h r e e t o t a l s y n t h e s e s h a v e b e e n r e p o r t e d i n l i t e r a t u r e f o r t h e s y n t h e s i s o f h y m e n i a l d i s i n e . T h e fi r s t s y n t h e s i s w a s a c c o m p l i s h e d b y A n n o u r a a n d c o w o r k e r s i n 1 9 9 5 3 ' a n d i s i l l u s t r a t e d i n S c h e m e V - 1 . 2 8 7 1 ) $ 0 0 1 2 , D M F ( e a t ) t o l u e n e , 6 0 ° C U 2 ) E t a N , D C M , r t m “ F \ / \ u C 0 2 ” N H Z C H c h Z C O Z M e 3 ' N 0 0 2 “ ” H o 3 ) N B S , T H F , r t . 3 5 % o 1 ) ( E t O ) 2 P O C H Z C O Z E t , 1 ) 1 0 % N a O H - M e O H ( 2 : 1 ) , r t N a H , D M F , 5 0 ° C P P A - P 2 0 5 . 1 0 0 ° c / \ 2 ) K H M D S , T H F , - 7 8 ° c ” N S E M > 2 ) N a H , S E M C I , D M F , r t B r N o 1 1 . 5 % 3 ) M S C I , 5 1 3 M D C M , 0 ° C M 3 0 2 Y _ _ H N \ / \ 1 ) g u a n i d i n e , D M F , 5 0 ° C a . N N S E M , - / \ N H , 2 ) 5 % 1 : 1 H C l - M e O H , 8 0 c a . N S E M 0 H o 6 5 % . 2 9 % H y m e n i a l d i s i n e S c h e m e V - l . T o t a l s y n t h e s i s o f h y m e n i a l d i s i n e b y A n n o u r a e t a l . C o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e p y r r o l e - 2 - c a r b o x y l i c a c i d w a s t r e a t e d w i t h S O C ] ; / c a t . D M F i n t o l u e n e f o l l o w e d b y c o n d e n s a t i o n w i t h B - a l a n i n e m e t h y l e s t e r t o g i v e t h e c o r r e s p o n d i n g e s t e r w h i c h w a s t h e n b r o m i n a t e d w i t h N B S t o a f f o r d t h e 2 - b r o m o p y r r o l e d e r i v a t i v e i n m o d e s t y i e l d s . H y d r o l y s i s o f t h e e s t e r a n d s u b s e q u e n t c y c l i z a t i o n i n p r e s e n c e o f P P A a f f o r d e d a m i x t u r e o f 2 - b r o m o a n d 3 - b r o m o p r o d u c t w h i c h c o u l d o n l y b e s e p a r a t e d a f t e r c o n v e r s i o n i n t o N - S E M p r o t e c t e d d e r i v a t i v e s . H o m e r - E m m o n s r e a c t i o n w i t h e t h y l d i e t h y l p h o s p h o n o a c e t a t e / N a H g a v e t h e a , B - a n d [ S q - u n s a t u r a t e d e s t e r s w h i c h w h e n d e p r o t o n a t e d w i t h K H M D S i n T H F g e n e r a t e d t h e e s t e r a n i o n , w h i c h w a s t h e n q u e n c h e d w i t h 2 - b e n z e n e s u l f o n y l - 3 - p h e n y l o x a z i r i d i n e ( D a v i e s ’ s s a l t ) t o g i v e t h e a - h y d r o x y - B . ‘ Y - 2 8 8 u n s a t u r a t e d e s t e r s . T h e s e w e r e t h e n c y c l i s e d w h e n t r e a t e d w i t h g u a n i d i n e i n D M F . F i n a l l y , S E M g r o u p s w e r e d e p r o t e c t e d t o y i e l d h y m e n i a l d i s i n e a n d d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e i n g o o d y i e l d s . T h i s s y n t h e s i s y i e l d e d h y m e n i a l d i s i n e i n o v e r a l l 0 . 7 % y i e l d i n t e n s t e p s . H o r n e a n d c o - w o r k e r s s y n t h e s i z e d h y m e n i a l d i s i n e a n d d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e i n 1 9 9 7 3 2 a s s h o w n i n S c h e m e V - 2 . M o s t i m p o r t a n t l y , t h e k e y s t e p i n t h e s y n t h e s i s w a s t h e p r e f e r e n t i a l h e t e r o d i m e l i z a t i o n o f t w o a z a f u l v e n e a n d 2 - a m i n o i m i d a z o l e u n d e r a c i d i c c o n d i t i o n s . T h i s c o u p l i n g s t r a t e g y a l l o w e d a s u c c e s s f u l c r e a t i o n o f t h e c a r b o n - c a r b o n b o n d t h a t c o n n e c t s t h e t w o h e t e r o c y c l i c m o i e t i e s o f t h e n a t u r a l p r o d u c t . A c o m p e t i n g r e a c t i o n c r i t i c a l t o t h e s u c c e s s o f t h i s a p p r o a c h w a s m o n o m e r s e l f - d i m e r i z a t i o n , w h i c h i s c o m m o n l y o b s e r v e d f o r p y r r o l e s a n d i n d o l e s . H o w e v e r , f o r 2 , 3 - d i b r o m i n a t e d p y r r o l e m o i e t i e s , t h e s e l f - d i m e r i z a t i o n w a s n o t a p r o b l e m s i n c e t h e n u c l e o p h i l i c p o s i t i o n w a s b l o c k e d ( S c h e m e V - 2 ) . A s u c c e s s f u l r o u t e t o h y m e n i a l d i s i n e r e q u i r e d a r e g i o s e l e c t i v e d e b r o m i n a t i o n a n d c o n v e r s i o n o f a m i n o i m i d a z o l e m o i e t y t o a m i n o i m i d a z o l o n e o n h y m e n i n . U s e o f m i l d c o n d i t i o n s s u c h a s H 2 0 / H O A C y i e l d e d 3 - b r o m o - 4 , 5 ’ d i h y d r o h y m e n i a l d i s i n e w h i c h w h e n s u b j e c t e d t o C H 3 S O 3 H , H B r ( c a t . ) a f f o r d e d a m i x t u r e o f h y m e n i a l d i s i n e a n d d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e v i a a p h o t o d e b r o m i n a t i o n / o x i d a t i o n s t e p . T h i s s y n t h e s i s p r o v i d e d h y m e n i a l d i s i n e a n d d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e i n o v e r a l l 2 . 0 % a n d 0 . 3 % y i e l d i n 6 s t e p s . W h i l e t h e s y n t h e s i s i n v o l v e s s o m e t i m e c o n s u m i n g r e a c t i o n c o n d i t i o n s r e q u i r i n g u p t o 7 d a y s , t h e e f f o r t i s c o n c i s e a n d a c c e s s e s t h e d e s i r e d m o l e c u l e s i n 6 s t e p s . 2 8 9 R H R _ N R / \ H 1 ) S w e m / \ H Z N ( L ) N N W O H = 3 N H H o 2 ) T F A , r . t . , 7 d 6 5 % N H 0 = H R = H , 1 1 % R = B r B = B r , 8 0 % H N Y “ H 2 \ N \ t ° l / \ / 3 ' R B r a , C H 3 8 0 3 H , L : H O A c / H 7 2 2 0 , r e f l u x : 2 1 % H y m e n i n H R = B O . : 1 H 2 , P d / C , N a O A c , 1 0 0 % D e b r o m o h y m e n l n , R = H Y H H 2 N H Y o N B r C H 3 8 0 3 H , H B r ( c a t . ) N \ 9 0 ° C , l e d ! b e , 1 2 3 1 1 r B r / \ N H s e a 1 1 / N \ N H o H y m e n i a l d i i i n e D e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e 3 3 % 2 7 % S c h e m e V - 2 . T o t a l s y n t h e s i s o f h y m e n i a l d i s i n e a n d d e b r o m o h y m e n i a l d s i n e b y H o m e e t a l . F u r t h e r , H o m e a n d c o - w o r k e r s s y n t h e s i z e d d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e i n 4 s t e p s i n 3 8 % y i e l d s t a r t i n g w i t h 2 - ( 1 , 3 - d i o x o l a n - 2 - y l ) e t h a n a m i n e a n d t h e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e 4 , 5 - d i b r o m o p y r r o l - Z - y l t r i c h l o r o m e t h y l k e t o n e a s s h o w n i n S c h e m e V - 3 . 3 3 2 9 0 H B f N [ W N W B , : M g H I B 1 ) C H 3 8 0 3 H , 4 5 ° C , 4 d 0 B r 2 ) 2 - a r n i n o i m i d a z o l e , 4 5 ° C , 4 d H H 2 N N Y H R 8 ' 2 ( 2 6 q . ) , r . t . R N \ H 2 , 1 0 % P d / C / \ H O A c / N a O A c / N \ N a O A c R N H H N / N H o . = R = B r , 0 8 5 ‘ ? H y m e s r g g ; R B r ° D e b r o m o h y m e n i a l d i S i n e 7 5 % S c h e m e V - 3 . H o m e ’ s p r a c t i c a l s y n t h e s i s o f d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e . V e r y r e c e n t l y , i n a n e f f o r t t o s y n t h e s i z e t h e C a n m a r i n e a l k a l o i d s , P a p e o e t a l s y n t h e s i s e d ( Z ) - h y m e n i a l d i s i n e a n d ( Z ) - d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e w i t h a k e y s t e p b e i n g t h e c o n d e n s a t i o n b e t w e e n a l d i s i n e a n d t h e i m i d a z o l i n o n e b a s e d g l y c o c i a m i d i n e p r e s u r s o r ( F i g u r e V - 7 ) . 3 4 T h i s s y n t h e s i s a f f o r d e d h y m e n i a l d i s i n e a n d d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e i n 8 % a n d 1 5 % r e s p e c t i v e l y . T h i s s y n t h e s i s p r o v i d e d a f a c i l e m e t h o d o l o g y t o p r e v e n t t h e s c r a m b l i n g o f B r u n d e r a c i d i c c o n d i t i o n s w h e n s u b j e c t e d t o c y c l i z a t i o n u n d e r P P A S ’ " 3 2 2 9 1 / \ N H C H C H c o o s m c n H C O O E t Q C O C C I a 2 2 2 4 / \ N \ / \ H T E A , C H a c N , r . t . N 9 7 % H 0 . P Y " ° ' ° ” P m : N B S , C H 3 0 H / T H F 1 : 2 2 - b r o m o p y r r o l e a m r d e 5 7 % M O S [ N O Y O M O S N 1 ) N a O H , r . t . , 9 8 % H C I / \ o W ’ 2 ) P P A , P 2 0 5 , 1 2 0 ° C 7 N N H P y , C H Z C I Z , 4 0 ° C 0 \ 8 1 % H o H 2 N H \ W o 0 . 5 N N H 3 , d i o x a n e _ N r . t . , o v e r n i g h t / \ — 3 0 % N H N H S c h e m e V - 4 . S y n t h e s i s o f d e b r o m o h y m e n i l a d i s i n e a n d h y m e n i a l d i s i n e b y P a p e o e t a l . F . S y n t h e s i s o f I n d o l e a z e p i n e s C o n c u r r e n t t o o u r s t u d i e s , M e i j e r e t a l r e p o r t e d t h e u s e o f a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y a n d i n v i t r o e n z y m a t i c p r o fi l i n g a g a i n s t 6 0 k i n a s e s t o i d e n t i f y a d d i t i o n a l t a r g e t s f o r h y m e n i a l d i s i n e a n d i t s a n a l o g s . 2 0 T h e y a d o p t e d a s y n t h e t i c m e t h o d o l o g y s i m i l a r t o H o m e e t a l t o a c c e s s t h e i n d o l e a z e p i n e s . A s a p a r t o f a p r o g r a m t o d e v e l o p a n a l o g s o f t h e o r o i d i n f a m i l y o f n a t u r a l p r o d u c t s , a n d s t u d y t h e i r i m p o r t a n t b i o l o g i c a l t a r g e t s , w e w e r e i n t e r e s t e d i n s i m i l a r s c a f f o l d s ( S c h e m e V - l ) . 2 9 2 F i g u r e V - S . S t r u c t u r e o f V - l , V - 2 c o m p a r e d t o n a t u r a l p r o d u c t h y m e n i a l d i s i n e I n o r d e r t o k e e p t h e s y n t h e s i s c o n c i s e , w e w a n t e d t o c o n s e r v e t h e g l o b a l s t r a t e g y o f c o n d e n s i n g t h e t w o f r a g m e n t s t o g e t h e r a s f o r t h e n a t u r a l p r o d u c t . R e t r o s y n t h e t i c a l l y , w e e n v i s i o n e d t h e i n d o l e a z e p i n e t o b e d e r i v e d f r o m t h e a z e p i n e r i n g ( F i g u r e V - 6 ) . O \ N H N o R : H o r M e A l d i s i n e R : H o r M e F i g u r e V - 6 . R e t r o s y n t h e t i c a n a l y s i s f o r i n d o l e a z e p i n e . T h e s y n t h e s i s o f t h e i n d o l - a l d i s i n e o r i n d o l o a z e p i n e s k e t e t o n w a s a c h i e v e d v i a a s l i g h t l y m o d i fi e d r o u t e a s r e p o r t e d i n t h e s y n t h e s i s o f a l d i s i n e . ” 3 4 T h e a l d i s i n e c o u l d b e s y n t h e s i z e d i n a s i m i l a r m a n n e r a d e s c r i b e d b y o t h e r s s t a r t i n g f r o m t h e i n d o l e c a r b o x y l i c a c i d . S t a r t i n g w i t h t h e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e 2 - i n d o l e c a r b o x y l i c a c i d , c o n d e n s a t i o n w i t h 2 9 3 t h e e t h y l e s t e r o f B - a l a n i n e i n t h e p r e s e n c e o f E D C I . H C I a n d D M A P , p r o v i d e d t h e i n d o l e V - 3 . M e t h y l a t i o n o f t h e i n d o l e n i t r o g e n w i t h M e l a n d K 2 C 0 3 p r o c e e d e d i n n e a r q u a n t i t a t i v e y i e l d s , r e n d e r i n g t h e N - m e t h y l i n d o l e , V - 4 , w h i c h w a s u s e d f o r t h e s y n t h e s i s o f V - 2 . H y d r o l y s i s o f e s t e r s V - 3 a n d V - 4 f o l l o w e d b y t h e P z O s l M e S O 3 H m e d i a t e d c y c l i z a t i o n p r o v i d e d t h e k e y i n t e r m e d i a t e a l d i s i n e d e r i v a t i v e s V - 7 a n d V - 8 ( S c h e m e V - 2 ) . f s z t \ 0 0 H H 2 N C H Z C H 2 C 0 2 E ; \ H N L i O H / H Z O N 2 E D C I / C H Z C I Z N o H 9 8 % H V - 3 , R = H M e l , K 2 0 0 3 V - 4 , R = M 1 0 0 % O c o z n H N f P 2 0 5 m M e S O H \ N H I I O R R V - 5 , R = H , 9 3 % V - 7 , R = H , 8 5 % V - 6 , R = M e , 9 3 % V - 8 , R = M e , 7 5 % A l d i s i n e S c h e m e V - S . S y n t h e s i s o f N - H ( V - 7 ) a n d N - M e a l d i s i n e ( V - 8 ) . G . C o n d e n s a t i o n w i t h h y d a n t o i n a n d t h i o h y d a n t o i n t o t h e a l d i s i n e . L i n d e l a n d H o f f m a n n s h o w e d t h e s y n t h e s i s o f d i s p a c a m i d e ( F i g u r e V - 7 ) , ( a m e m b e r o f t h e o r o i d i n f a m i l y o r i g i n a l l y i s o l a t e d f r o m A g e l a s d i s p a r a n d a s s u m e d t o b e a d i r e c t p r e c u r s o r o f p y r r o l o a z e p i n o n e s u c h a s h y m e n i a l d i s i n e ) fi ' o m t h i o h y d a n t o i n . 3 o T h i s c o u l d t h e n b e s u b j e c t e d t o m e t h y l a t i o n a t S a n d n u c l e o p h i l l i c d i s p l a c e m e n t b y 2 9 4 B r 8 H Y o p i p e r i d i n e 3 ' o N B r / l H " N / \ H H N \ / \ C H O = B r N / # 5 H o E t O H / H z o . r . t . , 4 h u g 8 0 % 0 B r B r ' 3 . \ N / > = ~ ~ + e r / \ n v x i w H H { ‘ 1 H o 0 S M D i s p a c a m i d e F i g u r e V - 7 . C o n d e n s a t i o n w i t h t h i o h y d a n t o i n . T h i s s t r a t e g y h a d a t w o f o l d a d v a n t a g e , fi r s t , i t s e r v e d a s a p r e c u r s o r f o r i n d o l e a z e p i n e s a n d s e c o n d l y , i t s e l f w a s a n a n a l o g t o t h e n a t u r a l p r o d u c t a x i n o h y d a n t o i n w h i c h i s a n i n h i b i t o r o f p r o t e i n k i n a s e C . H o m e e t a l h a v e a c c o p l i s h e d a l i n e a r s y n t h e s i s o f b r o m o a x i n o h y d a n t o i n s a n d d e b r o m o a x i n o h y d a n t o i n s f r o m o m i t h i n e m e t h y l e s t e r ( F i g u r e H o N H N H N H z \ : H Z 1 | : / \ N H / \ N H R 1 N R ‘ N , 1 , O v . 8 ) . 3 6 g , 0 M 9 0 H R 2 H N \ 0 fl R ‘ : > M e o w 0 % ” N H 2 F i g u r e V - 8 . H o m e ’ s s t r a t e g y f o r t h e s y n t h e s i s o f a x i n o h y d a n t o i n . 2 9 5 H o w e v e r , o u r e f f o r t s t o c o u p l e t h e a l d i s i n e t o t h i o h y d a n t o i n d i d n o t a f f o r d t h e d e s i r e d p r o d u c t a t r o o m t e m p e r a t u r e ( S c h e m e V - 6 ) . H o s N 0 2 0 % I r i d i n e N \ \ H N f O — W “ ” ” . . N O E t O H / H 2 0 \ N H N V - 7 0 S c h e m e V - 6 . C o n d e n s a t i o n b e t w e e n a l d i s i n e V - 7 a n d t h i o h y d a n t o i n . U p o n h e a t i n g , a n e w p r o d u c t w a s s e e n w h i c h w a s p a r t i a l l y c h a r a c t e r i z e d t o b e a s e l f - c o n d e n s a t i o n p r o d u c t o f t h e t h i o h y d a n t o i n . T h e a l d i s i n e r e m a i n e d u n r e a c t e d e v e n a f t e r 2 4 h o f r e fl u x . H e n c e , a t t h i s t i m e i t w a s s p e c u l a t e d t h a t t h e a l d i s i n e i s u n r e a c t i v e t o t h e s e c o n d i t i o n s d u e t o c o n j u g a t i o n o f t h e C = O w i t h t h e a r o m a t i c i n d o l e s y s t e m a n d p r o b a b l y r e q u i r e s m o r e r i g o r o u s c o n d i t i o n s . M e a n w e l l e t a l h a v e s h o w n H o m e r - W a d s w o r t h - E m m o n s r e a c t i o n a t C - 5 o f t h e h y d a n t o i n a n d a l d e h y d e s a n d k e t o n e s w i t h c o n j u g a t e d s y s t e m s s u c h a s i s a t i n u n d e r b a s i c c o n d i t i o n s . T h e r e a c t i o n p r o c e e d s v i a t h e f o r m a t i o n o f t h e p h o s p h o n a t e o f t h e h y d a n t o i n . 3 7 2 9 6 o o N N H i ) = 0 ( E t 0 ) 2 0 P 4 E ' o . . ( E t O ) 2 O P o N R o O N H F H ‘ l ) \ ~ N H R N 0 3 P \ 0 / 0 3 0 ’ 0 . , o N N o R H F i g u r e V - 9 . C o n d e n s a t i o n o f i s a t i n w i t h h y d a n t o i n p h o s p h o n a t e . H o w e v e r , o u r a t t e m p t s t o u s e t h i s s t r a t e g y p r o v e d t o b e f u t i l e p r e s u m a b l y d u e t o a s t e r i c a l l y e n c u m b e r e d b e t a i n e r i n g i n t h e t r a n s i t i o n s t a t e a n d a p o o r e l e c t r o p h i l i c c a r b o n y l g r o u p i n t h e a l d i s i n e . T h e s e r e s u l t s c o r r e l a t e d t o t h e i r r e s u l t s W i t h n o o r p o o r y i e l d s f o r c y c l o p e n t a n o n e a n d a c e t o p h e n o n e ( S c h e m e V - 7 ) . B r H 7 1 % ( E t O ) 2 O P L i O H E t O H ” : 5 \ N H + C ) e r l x fl f o , O E t N H O 0 ’ P \ O E t O B A c O H / 8 0 ° C C S T > _ _ _ O r 2 / i : ) = 0 ( E t O ) 3 P / A c O H , r . . t ( ) 2 ) : ) = 0 V - 9 O S c h e m e V - 7 . P r e p a r a t i o n o f C - 5 u n s a t u r a t e d h y d a n t o i n d e r i v a t i v e s u n d e r H o m e r - W a d s w o r t h - E m m o n s c o n d i t i o n s . W e r e v i s e d o u r s y n t h e t i c s t r a t e g y a n d e n v i s i o n e d t h a t t h e a n a l o g s V - 2 a n d V - 3 c o u l d b e s y n t h e s i z e d b y c o n d e n s a t i o n o f a l d i s i n e a n d t h e o x a z a l o n e m o e i t i e s t o g i v e a s c a f f o l d 2 9 7 s i m i l a r t o t h e n a t u r a l p r o d u c t . T h e k e y s t e p i n t h i s s t r a t e g y ( F i g u r e V - l O ) i n v o l v e d s e l f c o n d e n s a t i o n p r o d u c t s m a k i n g t h e p u r i fi c a t i o n c h a l l e n g i n g . O \ N H N O A l d i s i n e R : H o r M e F i g u r e V - 1 0 . R e v i s e d r e t r o s y n t h e s i s f o r V - 2 a n d V - 3 . P r a g e r a n d T s o p e l a s 3 8 “ h a v e s h o w n a k n o e v e n a g e l r e a c t i o n w i t h d i e t h y l m a l o n a t e w h i c h w a s t h e n u s e d t o u n d e r g o n u c l e o p h i l i c s u b s t i t u t i o n a n d w h i c h c o u l d f u r t h e r c y c l i z e t o y i e l d h y m e n i a l d i s i n e . C O O E t 0 E t O O C E t O O C V C O O E t _ / \ 1 * — ’ N N ” T I C I 4 / N \ N H H 0 H O H C O O E t H z N N H \ 5 1 : “ \ ‘ T O N H 2 N N H 2 _ H C I \ / \ ’ N H / \ N N H H F i g u r e V - l l . P r a g e r ’ s K n o v e n e g e l ’ s a p p r o a c h t o s y n t h e s i z e d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e 2 9 8 W e d e v i s e d a m o d e l s y s t e m f o r q u i c k l y t e s t v a r i o u s c o n d i t i o n s t h e c o n v e r s i o n o f a z l a c t o n e i n t o t h e i m i d a z o l o n e ( a s i n V - 2 ) . a - T e t r a l o n e w a s u s e d a s a m o d e l f o r a l d i s i n e a n d w a s c o u p l e d w i t h a z l a c t o n e ( p r e v i o u s l y s y n t h e s i z e d f r o m h i p p u r i c a c i d u s i n g E D C I ) u n d e r s l i g h t l y m o d i fi e d l e w i s a c i d m e d i a t e d k n o e v e n a g e l c o n d i t i o n s d e s c r i b e d b y P r a g e r a n d T s o p e l a s ( S c h e m e V - 8 ) . O o + F r i — ( S T T i C l 4 ( m a c h ) ? ! N T H F , - 1 0 ° C " O ° C V - 1 0 S c h e m e V - 8 . a - T e t r a l o n e c o n d e n s e d t o o x a z o l o n e u n d e r k n o e v e n a g e l c o n d i t i o n s . T h i s a z l a c t o n e c o u p l e d t e t r a l o n e w a s t h e n s u b j e c t e d t o n u c l e o p h i l l i c r i n g o p e n i n g u s i n g g u a n i d i n e u n d e r v a r i o u s a l k a l i n e c o n d i t i o n s . T a b l e V - l i l l u s t r a t e s t h e e f f o r t s t o w a r d s t h i s r i n g o p e n i n g r e a c t i o n . 2 9 9 H 2 N ) = N N H H N O + A — — — > I 0 0 . . . . . . . 0 0 B a s e S o l v e n t R e s u l t N o n e T o l u e n e , r e f l u x s t a r t i n g m a t e r i a l d e c o m p o s e d T E A T o l u e n e , r e f l u x s t a r t i n g m a t e r i a l d e c o m p o s e d K 2 0 0 3 D i o x a n e , r e f l u x s t a r t i n g m a t e r i a l d e c o m p o s e d g l a c i a l A c O H , K O H w a t e r , r e f l u x t r a c e s o f p r o d u c t T a b l e V - l . N u c l e o p h i l i c s u b s t i t u t i o n w i t h g u a n i d i n e o n m o d e l c o m p o u n d V - 1 3 . S e v e r a l e f f o r t s i n v o l v i n g 2 - m e t h y l a z l a c t o n e c o n d e n s e d t o t e t r a l o n e V - l 4 a s w e l l a s a l d i s i n e V - 1 5 w e r e a b a n d o n e d d u e t o i n s t a b i l i t y o f t h e c o m p o u n d s . T h e 2 - m e t h y l a z l a c t o n e w a s p a r t i c u l a r l y s u s c e p t i b l e t o h y d r o l y s i s o n c o n t a c t w i t h m o i s t u r e . S i m i l a r t o s c h e m e V - 8 , T i C l 4 m e d i a t e d a l d o l c o n d e n s a t i o n w i t h t h e p h e n y l o x a z o l o n e V - 1 0 p r o v i d e d t h e o x a z o l o n e s u c c e s s f u l l y i n 5 5 % a n d 5 6 % y i e l d f o r c o m p o u n d s V - l l a n d V - 1 2 . 3 0 0 0 P h 0 P h x i r o \ fi 0 \ N H N N \ N c w e _ R T i C l fl H F \ N H R - H - V ' 7 p y n d l n e F i = M e v - e N ' - 1 0 ° C - - > O ° C , 2 h , 5 0 t h e n r . t . o v e r n i g h t v - 1 1 , R = H , 5 5 % V - 1 2 , R = M e , 5 6 % S c h e m e V - 9 . K n o e v e n a g e l c o n d e n s a t i o n b e t w e e n a l d i s i n e ( V - 7 , V - 8 ) a n d a z l a c t o n e ( V - 1 0 ) . P r e v i o u s l y , o t h e r r e s e a r c h e r s i n o u r g r o u p ( D r . G u a n g Y i J i n a n d K e v i n W . A n d e r s o n ) 3 8 b h a d u s e d m o d i fi e d p r o c e d u r e s o f t h o s e d e s c r i b e d i n S c h e m e V - 9 i n a t t e m p t e d s y n t h e s e s o f h y m e n i a l d i s i n e , d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e a n d t h e N - m e t h y l i n d o l e a z e p i n e . M u k e r j e e e t a l h a v e s h o w n a T E A m e d i a t e d r e a c t i o n o f S - b e n z y l i s o t h i o u r o n i u m c h l o r i d e w i t h u n s a t u r a t e d 2 - o x a l i d i n o n - 5 - o n e t o s y n t h e s i z e t h e g l y c o a m i d i n e r i n g . 3 9 N H B n . J L T E A H O O P h \ < \ s N H z H C I = H 2 N \ < \ N o N \ R 2 E t O l - l , r e f l u x \ R 2 R 1 R 1 F i g u r e V - 1 2 . M u k e r j e e ’ s T E A m e d i a t e d c o n v e r s i o n o f o x a z o l o n e i n t o i m i d a z o l o n e . F u e t a l h a v e s h o w n a s o l i d p h a s e s y n t h e s i s o f 2 a m i n o i m i d a z o l o n e s . 4 0 3 0 1 . _ N ) H N R E n = P t 1 4 2 3 5 6 7 8 P ‘ E E a R ‘ H S M e D M F , < \ o N h . r ~ y 0 q \ , q c q H \ H M B e , e e e a q L U U i . H H V a - , . . N V B . , . . 1 T T a T N S 5 5 - s E e 6 9 F F i i 1 . Z 1 = = 3 5 e 3 0 E t N 2 0 A A A O : : l 1 e q O ¢ ¢ M . - - E t e o N a — ( i O x N L O . ( 2 e q R 1 0 > c 0 ° ) . 1 H + B r i N E E t t t O H H N S , O O E t O s E H H H o d t Z H C l D s H E i - , , e , o v t B e r r O u n e e f e e n H O r l a F a x M ’ b S . 0 I t fl — H N u u u x x t x u l d e fl H \ \ R N N < \ 9 5 % T F » s a o q ° . c A : . 1 N H 3 N . ) N . \ \ 2 . H O H E H z N ‘ B a o l v s e e n F R l i F l e t i S S R p p u i 8 e s e e t t p e e n n r e r 2 c c n i i a a o o n n m m c c l n g g e e % p p o d d o o g g g n n i n M M N e e R R t t e t s s e e h h = = h d d < t g ’ N H , , s s , o o 0 \ N H N R , e V , 1 - V e e s s t t e e 0 2 - r r f f o o r r m m e e d d \ H M l l y y y l e s t e r f o r m e d ‘ ' R 1 F i g u r e V - l 3 . S o l i d s u p p o r t s y n t h e s i s o f 2 - a m i n o i m i d a z o l o n e s . T r e a t m e n t o f t h e o x a z o l o n e d e r i v a t i v e s V - 9 a n d V - 1 0 w i t h t h e S - b e n z y l t h i o u r e a u n d e r b a s i c c o n d i t i o n s p r o v i d e d t h e fi n a l p r o d u c t s V - l a n d V - 2 i n m o d e s t y i e l d s . T a b l e V - 2 i l l u s t r a t e s t h e v a r i o u s r e a c t i o n c o n d i t i o n s u s e d . W e m o d i fi e d o u r r e a c t i o n c o n d i t i o n s b a s e d o n s t u d i e s d o n e e a r l i e r b y D r . G u a n g Y i J i n i n o u r l a b o r a t o r y . " g e n e r a t i o n o f k e t e n e c a u s e d r a p i d d e c o m p o s i t i o n o f t h e s t a r t i n g m a t e r i a l T a b l e V - 2 . N u c l e o p h i l i c r i n g o p e n i n g o f t h e a z l a c t o n e u n d e r a l k a l i n e c o n d i t i o n s . 3 0 2 U s e o f D M F a s a s o l v e n t i n s t e a d o f E t O H o n l y a f f o r d e d t h e p r o d u c t i n t r a c e a m o u n t . G e n e r a t i o n o f L i O E t u s i n g L i H a n d e t h a n o l ( e n t r y 6 i n t a b l e V - 2 ) , a f f o r d e d t h e p r o d u c t a n d t h e s y n t h e s i s f o r V - l a n d V - 2 w a s a c c o m p l i s h e d i n fi v e s t e p s a n d o v e r a l l y i e l d o f 1 2 % a n d 3 1 % r e s p e c t i v e l y . ” 4 1 A l l o u r a t t e m p t s i n u s i n g h i g h b o i l i n g , p o l a r b u t a p r o t i c s o l v e n t s l e d t o d e c o m p o s i t i o n o f t h e s t a r t i n g m a t e r i a l p r e s u m a b l y d u e t o t h e f o r m a t i o n o f t h e k e t e n e f r o m t h e a z l a c t o n e s V - l l a n d V - 1 2 . C o m p o u n d V - 2 w a s s u c c e s s f u l l y c r y s t a l l i z e d f r o m m e t h a n o l a n d i t s c r y s t a l s t r u c t u r e i s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e V - 8 . C l e a r l y i n d i c a t e d i n t h i s c r y s t a l s t r u c t u r e i s t h e Z - d o u b l e b o n d a t t h e C ( 8 ) - C ( 9 ) p o s i t i o n o f V - 2 a s f o u n d i n t h e n a t u r a l p r o d u c t h y m e n i a l d i s i n e ( F i g u r e V - 1 4 ) . C ( 2 5 ) 0 ‘ 2 4 ) 0 ‘ 1 5 ) ‘ 3 4 . 2 5 } C ( 2 3 ) 0 ( 5 ) . " F i g u r e V - 1 4 . X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e o f V - 2 . M e O H . 3 0 3 T h e p u r i fi c a t i o n s t e p s f o r V - l a n d V - 2 w e r e v e r y t e d i o u s . A m o r e a d v a n t a g e o u s m e t h o d f o r i n c o r p o r a t i n g t h e a m i n o i m i d a z o l o n e r i n g c o u l d b e t h r o u g h a s o l i d - p h a s e m e t h o d w h i c h m i g h t m a k e t h e p u r i fi c a t i o n e a s i e r a n d m i g h t i n c r e a s e t h e y i e l d . W e t r i e d t o u s e t h e s o l i d p h a s e s y n t h e s i s u s e d b y F u e t a t e a r l i e r . 4 0 A c c o r d i n g l y , R i n k A m i d e M B H A r e s i n w a s t r e a t e d w i t h F M o c - N C S i n C H 2 C 1 2 t o a f f o r d t h e F M o c p r o t e c t e d i s o c y a n a t e a d d i t i o n p r o d u c t . T h i s w a s t h e n d e p r o t e c t e d w i t h 2 0 % p i p e r i d i n e i n D M F a n d m e t h y l a t e d i n D M F t o y i e l d S - m e t h y l i s o t h i o u r o n i u m s a l t o n s o l i d s u p p o r t . T r e a t m e n t o f t h e a , B u n s a t u r a t e d o x a z o l o n e d e r i v a t i v e V - l l w a s t r e a t e d w i t h t h e S - m e t h y l i s o t h i o u r o n i u m s a l t o n s o l i d s u p p o r t . U n l i k e o u r e x p e c t e d r e s u l t , t h i s s t r a t e g y y i e l d e d t h e p r o d u c t o n l y i n v e r y s m a l l t r a c e s p r o b a b l y d u e t o t h e s t e r i c a l l y d e m a n d i n g k e t o n e f u n c t i o n a l i t y ( S c h e m e V - l O ) a n d h a s n o w b e e n a b a n d o n e d . S c h e m e V - 1 0 . S o l i d s u p p o r t s y n t h e s i s o f V - 1 . 3 0 4 H . S t u d i e s t o w a r d s i m i d a z o l e b a s e d h y m e n i a l d i s i n e a n a l o g s W e h a v e s h o w n t h e s y n t h e s i s o f t h e i n d o l e b a s e d d e r i v a t i v e s o f h y m e n i a l d i s i n e . W e t u r n e d o u t f o c u s n o w t o i m i d a z o l e b a s e d a n a l o g s V - 1 6 a n d V - 1 7 ( F i g u r e V - 1 5 ) . H H Z N Y N H 2 N n H Z N W / N H N ) 0 W T o N ’ o N \ \ n \ a . / \ ' 2 ” \ © — < \ ' N N ” ‘ N N H N N H H O o O H y m e n i a l d i s i n e V - 1 6 V - 1 7 F i g u r e V - l S . S t r u c t u r e s o f i m i d a z o l e b a s e d V - 1 6 a n d V - l 7 c o m p a r e d t o h y m e n i a l d i s i n e . P r e v i o u s l y , a s p a r t o f o u r p r o g r a m t o d e v e l o p s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t s c a f f o l d s c o n t a i n i n g a h i g h d e g r e e o f d i v e r s i t y , o u r l a b o r a t o r y f o c u s e d o n d e v e l o p i n g a s t e r e o s e l e c t i v e s y n t h e s i s o f s u b s t i t u t e d i m i d a z o l i n e s . 4 2 I n 1 9 7 0 , S t e g l i c h r e p o r t e d t h a t 4 - ( d i m e t h y l a m i n o ) p y r i d i n e ( D M A P ) a n d 4 - ( p y r r o l i d i n o ) p y r i d i n e ( P P Y ) c a t a l y z e t h e r e a r r a n g e m e n t o f O - a c y l a t e d a z l a c t o n e s t o t h e i r C - a c y l a t e d i s o m e r s , t h e r e b y g e n e r a t i n g b o t h a n e w c a r b o n - c a r b o n b o n d a n d a n e w q u a t e r n a r y s t e r e o c e n t e r ( F i g u r e V - 1 6 ) . 4 3 x o o D M A P 0 0 T \ / > ’ R 2 0 » l f a ? o N o r P P Y : - N R 1 X R 1 R a c e m i c F i g u r e V - l 6 . R e a r r a n g e m e n t o f O - a c y l a t e d p r o d u c t t o C - a c y l a t e d i s o m e r . F u e r a l h a v e u s e d p l a n a r c h i r a l d e r i v a t i v e s o f D M A P a s e n a n t i o s e l e c t i v e c a t a l y s t s f o r t h i s r e a r r a n g e m e n t . ‘ 4 W e e x a m i n e d o u r i n - h o u s e l , 3 d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n t o f u r n i s h f o r t h e 3 0 5 s y n t h e s i s o f V - 2 0 . H i p p u r i c a c i d w a s fi r s t c o n v e r t e d i n t o t h e o x a z a l o n e i n p r e s e n c e o f E D C I . H C I t o g i v e V - 1 0 i n 8 0 % y i e l d . V - 1 0 w a s t h e n s u b j e c t e d t o C - 4 a c y l a t i o n u s i n g m e t h y l o r t h o c h l o r o f o r m a t e i n p r e s e n c e o f T E A a n d D M A P i n 3 0 % y i e l d ( S c h e m e V - l 1 ) . H o w e v e r , V - 1 8 w a s f o u n d t o o c c u r p r i m a r i l y i n t h e e n o l f o r m w h i c h d i d n o t a f f o r d t h e i m i d a z o l i n e w h e n s u b j e c t e d t o t h e N S C ] m e d i a t e d l , 3 d i p o l a r c y c l o a d d i t i o n r e a c t i o n c o n d i t i o n s d u e t o t h e i n a b i l i t y f o r t h e s e t t i n g u p o f t h e d i p o l e . 0 P h P h 0 P h Y o C I A O M e A 7 q u o 1 7 ? O H P h / ‘ N 4 \ c l o o e r N ' f o D M A P . T H F , " r ; T M S C I / / ' o O M o T E A e O M e w e * 3 0 % v - 1 e P h P h \ \ P h ( C O O H c o c a , 0 ” A N P h N C O D E ) — — » ' C O " ’ _ < N _ L _ _ , P h — < \ I \ < \ P h \ I N A C O O H N C O O H N o c c u r s “ . 2 0 . C O O M e S c h e m e V - l l . A t t e m p t e d c o n v e r s i o n o f h i p p u r i c a c i d t o 2 ~ p h e n y l i m i d a z o l e d i o i c a c i d O u r n e x t s t r a t e g y w a s a m o d i fi e d r o u t e d e s c r i b e d b y D a l y e t a t 4 6 f o r s y n t h e s i s o f 8 - p h e n y l x a n t h i n e s . D A M N w a s c o n d e n s e d w i t h P h C O C ) i n p r e s e n c e o f p y r i d i n e t o y i e l d m o n o - a c y l a t e d D A M N ( V - l 9 ) i n n e a r l y q u a n t i t a t i v e y i e l d . V - l 9 w a s t h e n s u b j e c t e d t o a l k a l i n e h y d r o l y s i s i n p r e s e n c e o f N a O H , w h i c h y i e l d e d o n l y 8 % o f t h e d e s i r e d p r o d u c t ( S c h e m e V - 1 2 ) . 3 0 6 N C ” “ 2 P y r i d i n e H N H 2 1 + P h C O C l F ’ h N j A C N N c N H 2 9 8 % 0 C N v - 1 9 N a O H fl C O O H r e f l u ; ; / 4 4 h ’ P h _ < \ N I 0 C O O H v - 2 o S c h e m e V - 1 2 . C o n v e r s i o n o f D A M N i n t o 2 - p h e n y l i m i d a z o l e - d i a c i d . B a s e d o n t h e u n s u c c e s s f u l a t t e m p t s f o r s y n t h e s i s o f t h e s t a r t i n g m a t e r i a l ( c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e a t $ 2 5 0 p e r 1 0 m g ) w e r e v i s e d t h e r e t r o s y n t h e t i c p l a n t o s t a r t w i t h t a r t a r i c a c i d ( c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e $ 7 p e r 2 5 g ) ( F i g u r e V - 1 7 ) . H H Z N W N o N \ H H N H m P h - ‘ < \ N O ) P h — — < \ N C O O H P h ’ < \ \ : : | 1 0 0 0 H ‘ : : > H O W O H F i g u r e V - 1 7 . R e t r o s y n t h e t i c a n a l y s i s f o r V - 2 0 . T a r t a r i c a c i d w a s t r e a t e d w i t h c o n c . I - I N O 3 , f u m i n g H N O g , a n d c o n e . H 2 8 0 4 a t 3 8 ° C w h i c h w a s c o o l e d f o r 1 h i n a n i c e b a t h t o f o r m t h e d i n i t r a t e ( S c h e m e V - 1 3 ) w h i c h w a s n e u t r a l i z e d a n d c o n d e n s e d w i t h P h C H O t o f o r m V - 2 0 . 3 0 7 H O O H c o n e . H N O 3 , f u m i n g H N 0 3 , H C O O H N c o n c . H 2 8 0 . 0 ° C . 1 h z H o - z — g r m 4 i P h — < \ I P h C H O , N H 4 O H . r . t . . 1 8 h N C O O H O O V - 2 0 S c h e m e V - 1 3 . S y n t h e s i s o f V - 2 0 f r o m t a r t a r i c a c i d . V - 2 0 w a s t r e a t e d w i t h S O C ] ; t o a f f o r d t h e a c i d c h l o r i d e w h i c h u n d e r w e n t s e l f c o n d e n s a t i o n t o g i v e a d i m e r , V - 2 1 ( S c h e m e V - 1 4 ) . 4 8 T h e u n s t a b l e a c i d c h l o r i d e d i m e r w a s fi r s t c o n v e r t e d t o t h e m e t h y l d i e s t e r s a n d t h e d i m e r w a s fi n a l l y c l e a v e d w i t h B - a l a n i n e e t h y l e s t e r t o a f f o r d V - 2 2 i n 9 9 % y i e l d . S o m e i n i t i a l s t e p s o f t h i s s y n t h e s i s w e r e b a s e d o n e f f o r t s b y D r . G u a n g Y i J i n w h o u s e d a N - B n p r o t e c t e d a m i n e t o o p e n t h e d i m e r e s t e r . W e o p t i m i z e d t h e s e r e a c t i o n c o n d i t i o n s ( S c h e m e V - l 4 ) a n d u s e d S E M a n d P M B g r o u p o n t h e N . H C I O C 0 P h H O O C N s o c : M N ’ £ 2 N N I 9 ‘ ? “ — ’ \ N \ H O O C N b e n z e n e Y 3 8 % P h 0 C O O ) V - 2 0 v - 2 1 O C O O E t N 1 ) M e O H , T E A , C H 2 C | 2 , 3 h , N N > P h — < I H 2 ) O ' H ' H z N g g z / C O O B u 0 0 2 M e V - 2 2 S c h e m e V - l 4 . C o n v e r s i o n o f V - 2 0 t o V - 2 2 v i a a d i m e r i z e d a c i d c h l o r i d e . O u r n e x t s t e p w a s t o p r o t e c t t h e i m i d a z o l i c a n d a m i d e n i t r o g e n a n d c y c l i z e t h e m o l e c u l e v i a a f a v o r e d 7 e x o - t r i g D i e c k m a n n ’ s c y c l i z a t i o n r e a c t i o n ( S c h e m e V - 1 5 ) . O u r fi r s t c h o i c e f o r t h i s r e a c t i o n w a s S E M p r o t e c t i o n a s u s e d b y A n n o u r a e t a l . 3 ' S E M p r o t e c t i o n s 3 0 8 o n i m i d a z o l e s h a s a l s o b e e n s h o w n b y s e v e r a l o t h e r g r o u p s . 4 9 H o w e v e r , a l l a t t e m p t s t o p r o t e c t b o t h t h e i m i d a z o l e a n d t h e a m i d e w e r e f u t i l e a n d t h e r e a c t i o n d e c o m p o s e d d u r i n g i s o l a t i o n o n s i l i c a c o l u m n . o 0 P h / N N / \ / C O O E t N N / \ / C O O E t ‘ H < N l H S E M C I , b a s e ; P h — - < ’ | S E M 0 0 2 M B 0 ° C - > l ' . t . g E M C 0 2 M 6 V - 2 2 s o l v e n t S E M C I = ( C H 3 ) 3 S i C H 2 C H Z O C l - I 2 C l E n t r y S o l v e n t B a s e Y i e l d i s o l a t e d 1 D M F N a H , 2 . 1 e q 0 % 2 T H F K H , 2 . 1 e q 0 % S c h e m e V - 1 5 . S E M p r o t e c t i o n o n t h e i m i d a z o l e r i n g . A n e x c e s s u p t o 1 0 e q . b a s e t o c a r r y o u t t h e p r o t e c t i o n s a n d t h e c y c l i z a t i o n a s a o n e p o t p r o c e d u r e w a s a l s o u n s u c c e s s f u l . A t t h i s p o i n t w e r e v i s e d o u r e a r l i e r a p p r o a c h f o r t h e r i n g o p e n i n g o f t h e d i m e r w i t h a p r i m a r y a m i n e t o a s e c o n d a r y a m i n e ( S c h e m e V - l 6 ) . W e t a r g e t e d t w o s e c o n d a r y a m i n e , N - b e n z y l — [ 3 a l a n i n e e t h y l e s t e r a n d N - p — m e t h o x y b e n z y l - B - a l a n i n e e t h y l e s t e r V - 2 3 . P r e v i o u s s t u d i e s b y D r . G u a n g Y i J i n , s h o w e d t h a t d e p r o t e c t i o n o f N - b e n z y l g r o u p f r o m t h e a z e p i n e r i n g w a s t e d i o u s a n d h a d t o b e a b a n d o n e d . U s e o f P M B g r o u p h o w e v e r w a s t e d i o u s a t t h e r i n g o p e n i n g s t e p s i n c e t h e a m i n e w a s m o r e a c t i v e a n d l i g h t s e n s i t i v e . P u r i fi c a t i o n o n s i l i c a g e l l e d t o d e c o m p o s i t i o n o f a l o t o f p r o d u c t m a t e r i a l . 3 0 9 M e O O C 0 P h P M B V N \ / \ o \ N \ v - 2 3 N N N N \ N \ N > P h — ‘ < / l ‘ Y N a H , T H F N P M B C O O M e 7 % H 0 0 2 m V - 2 4 S c h e m e V - 1 6 . R i n g o p e n i n g w i t h s e c o n d a r y a m i n e s . W e t r i e d r e v e r s i n g t h e s e q u e n c e o f a d d i t i o n f o r c o n v e r s i o n f r o m a c i d c h l o r i d e d i m e r t o t h e 4 , 5 s u b s t i t u t e d i m i d a z o l e r i n g . H o w e v e r , n o n e o f t h e s e e f f o r t s i m p r o v e d t h e r e s u l t s a n y f u r t h e r . V - 2 4 w a s t h e n c o n v e r t e d t o t h e N - b e n z y l a t e d p r o d u c t V - 2 5 u n d e r F i n k e l s t e i n c o n d i t i o n s a n d w a s s u b j e c t e d t o K H M D S f o r c y c l i z a t i o n . P r e l i m i n a r y r e s u l t s s h o w e d a s u c c e s s f u l r e a c t i o n , t h o u g h f u r t h e r o p t i m i z a t i o n i s r e q u i r e d t o w a r d s t h e t o t a l s y n t h e s i s o f V - 1 7 . I . K i n a s e i n h i b i t i o n w i t h i n d o l e a z e p i n e s R o b e r g e a n d c o - w o r k e r s h a v e s h o w n t h e i n h i b i t i o n o f t h e 6 2 D N A d a m a g e c h e c k p o i n t b y d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e a s w e l l a s h y m e n i a l d i s i n e i n c e l l s . ' ° I n h i b i t i o n o f C h k l a n d C h k 2 b y d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e w a s r e p o r t e d t o b e a t I C s o v a l u e s o f 3 H M a n d 3 . 5 n M , r e s p e c t i v e l y . B o t h d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e a n d h y m e n i a l d i s i n e s h o w e d c o m p a r a b l e I C s o v a l u e s f o r i n h i b i t i o n o f G ; c h e c k p o i n t a t 8 u M a n d 6 n M , r e s p e c t i v e l y . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e b r o m i n e a t t h e C 2 p o s i t i o n o f h y m e n i a l d i s i n e d i d n o t s i g n i fi c a n t l y i n fl u e n c e t h e i n h i b i t i o n o f t h e G ; c h e c k p o i n t . ” T h e i n d o l e - b a s e d h y m e n i a l d i s i n e d e r i v a t i v e V - l w a s f o u n d t o c o n t a i n p o t e n t a n t i - i n fl a m m a t o r y a c t i v i t y a s w e l l a s a n t i - p r o l i f e r a t i v e a c t i v i t y . 2 6 C o n c u r r e n t l y w i t h o u r 3 1 0 s t u d i e s , t h e i n h i b i t i o n o f p u r i fi e d G S K - 3 B , C D K S / p 2 5 a n d C D K l / c y c l i n B b y s e v e r a l h y m e n i a l d i s i n e d e r i v a t i v e s w a s i n v e s t i g a t e d ; t h e i n d o l e a n a l o g u e s e x h i b i t e d k i n a s e i n h i b i t i o n p r o fi l e s s i m i l a r t o t h o s e o f t h e p y r r o l e - b a s e d c o m p o u n d . 2 0 W e d i s c o v e r e d p o t e n t i n h i b i t o r y a c t i v i t y o f i n d o l o a z e p i n e V - l a g a i n s t c h e c k p o i n t k i n a s e s C h k l a n d C h k 2 . V - l a n d V - 2 w e r e s e n t t o U p s t a t e N . Y . f o r k i n a s e i n h i b i t i o n s t u d i e s . T a b l e V - 3 i l l u s t r a t e s t h e c o m p a r i s o n b e t w e e n t h e i n v i t r o a c t i v i t y o f i n d o l o a z e p i n e V - l , V - 2 h y m e n i a l d i s i n e a n d d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e . C o m p o u n d V - l e x h i b i t s v e r y p o t e n t i n h i b i t i o n o f C h k 2 a c t i v i t y i n t h e l o w n a n o m o l a r r a n g e . I n t e r e s t i n g l y , u n l i k e t h e n a t u r a l p r o d u c t h y m e n i a l d i s i n e a n d d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e , c o m p o u n d V - l e x h i b i t s a l s o v e r y p o t e n t s e l e c t i v i t y f o r t h e c h e c k p o i n t k i n a s e C h k 2 . K i n a s e V - l V - 2 H y m e n i a l d i s i n e D e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e I C s o ( n M ) 1 C 5 0 ( n M ) C K l ( h ) 1 3 5 2 > 1 0 0 0 0 3 5 N A C K 2 ( h ) > 1 0 0 0 0 > l O O O O 7 0 0 0 N A M E K l ( h ) 8 9 > 1 0 0 0 0 6 8 2 4 P K C ( h ) 2 5 3 9 > l O O O O 7 0 0 N A P K C I I ( h ) 3 3 8 1 > 1 0 0 0 0 1 2 0 0 N A C h k l 2 3 7 > 1 0 0 0 0 1 9 5 0 7 2 5 C h k 2 8 1 2 5 0 0 4 2 1 8 3 T a b l e V - 3 . I C s o v a l u e s f o r k i n a s e i n h i b i t i o n b y c o m p o u n d V - l , V - 2 , h y m e n i a l d i s i n e a n d d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e . N A : v a l u e n o t a v a i l a b l e . 3 1 1 = V - 1 v s C h k 2 ( h ) g 1 0 0 - c 8 7 5 4 E S 5 0 - E . 2 g 2 5 - < 0 . . - ' fi - l l I I - 9 - 8 - 7 - e - 5 l o g " , c o n e ( M ) F i g u r e V - l 8 . D o s e d e p e n d e n c e a c t i v i t y o f C h k 2 w i t h v a r y i n g V - l . T h e s e k i n a s e i n h i b i t i o n s t u d i e s s u g g e s t t h a t a n a l o g s o f h y m e n i a l d i s i n e m a y i m p r o v e i t s o v e r a l l k i n a s e p r o fi l e a n d s i g n i fi c a n t l y a f f e c t i t s k i n a s e s e l e c t i v i t y . F u r t h e r i n v i v o s t u d i e s w o u l d h e l p i n v a l i d a t i n g t h e d r u g t h e r a p e u t i c p o t e n t i a l o f h y m e n i a l d i s i n e a n a l o g s f o r c a n c e r t h e r a p y a n d n e u r o d e g e n e r a t i v e d i s e a s e s . J . I n h i b i t i o n o f c y t o k i n e p r o d u c t i o n b y h y m e n i a l d i s i n e d e r i v a t i v e s E l e v a t e d l e v e l s o f c y t o k i n e s , s u c h a s i n t e r l e u k i n - 1 ( I L - 1 ) , i n t e r l e u k i n - 2 ( I L - 2 ) , i n t e r l e u k i n — 6 ( I L - 6 ) , i n t e r l e u k i n — 8 ( I L - 8 ) a n d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - 0 t ( T N F - a ) h a v e b e e n l i n k e d t o m a n y d i s o r d e r s i n c l u d i n g C r o h n ’ s d i s e a s e a n d p s o r i a s i s . I n a d d i t i o n , t h e s e p r o i n fl a m m a t o r y c y t o k i n e s p l a y a n e s s e n t i a l r o l e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f r h e u m a t o i d a r t h r i t i s a n d o s t e o a r t h r i t i s ? “ 5 2 T h e i n h i b i t i o n o f c y t o k i n e s , i n p a r t i c u l a r T N F — a , h a s b e e n s u c c e s s f u l i n s e v e r a l c l i n i c a l t r i a l s f o r t h e t r e a t m e n t o f r h e u m a t o i d a r t h r i t i s . 5 3 H o w e v e r , v a r i a b i l i t y i n r e s p o n s e s t o t h e s e a n t i - i n f l a m m a t o r y d r u g s i s f o u n d d u e t o t h e c o m p l e x n e t w o r k o f a l t e r n a t i v e c y t o k i n e m e d i a t e d p a t h w a y s . 5 4 I n h i b i t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s 3 1 2 t h a t c o n t r o l t h e e x p r e s s i o n o f s e v e r a l p r o - i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s , s u c h a s t h e n u c l e a r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r N F - K B , m a y o v e r c o m e t h e s e p r o b l e m s a n d p r o v i d e s a n a l t e r n a t i v e s t r a t e g y i n t h e t r e a t m e n t o f t h e s e i n fl a m m a t o r y d i s o r d e r s . 5 5 D u e t o i t s c r i t i c a l r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e s , N F - K B h a s b e c o m e a n i n c r e a s i n g l y s i g n i fi c a n t t h e r a p e u t i c t a r g e t i n d i s e a s e s s u c h a s a s t h m a , r h e u m a t o i d a r t h r i t i s , m u l t i p l e s c l e r o s i s a n d A l z h e i m e r ’ s d i s e a s e . ” H y m e n i a l d i s i n e w a s f o u n d t o i n h i b i t v a r i o u s p r o i n fl a m m a t o r y c y t o k i n e s , s u c h a s I L - 1 , I L - 6 , I L - 8 a n d n i t r i c o x i d e i n a v a r i e t y o f c e l l l i n e s . ” I n v e s t i g a t i o n o f t h e p r o m i s i n g a n t i - i n fi a m m a t o r y p r o p e r t i e s o f h y m e n i a l d i s i n e r e v e a l e d t h a t t h e n o v e l b r o m o p y r r o l e a l k a l o i d i n h i b i t s c y t o k i n e p r o d u c t i o n t h r o u g h i n h i b i t i o n o f t h e N F - K B s i g n a l i n g p a t h w a y . G e ] s h i f t a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t h y m e n i a l d i s i n e s e l e c t i v e l y r e d u c e d N F - K B n u c l e a r b i n d i n g a n d n o t t h e D N A b i n d i n g o f o t h e r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s s u c h a s C / E B P , A P - l o r S P 1 . 2 | R e c e n t l y , M e i j e r e r a l r e p o r t e d t h a t t h e p o t e n t N F - K B i n h i b i t o r h y m e n i a l d i s i n e a c t s a s a c o m p e t i t i v e n a n o m o l a r i n h i b i t o r o f t h e c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e s , G S K - B B a n d C K l . 2 2 C r y s t a l l o g r a p h i c d a t a p o r t r a y e d t h e b i n d i n g o f t h e k i n a s e i n h i b i t o r i n t h e A T P b i n d i n g p o c k e t o f t h e k i n a s e s . C o n s i d e r i n g t h e p o t e n t i a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n N F - K B a c t i v a t i o n a n d G S K - 3 , t h i s m i g h t s u g g e s t a p o t e n t i a l p a t h w a y f o r t h i s k i n a s e i n h i b i t o r . ” I n a d d i t i o n , I r e l a n d a n d c o - w o r k e r s h a v e r e c e n t l y a l s o i d e n t i fi e d h y m e n i a l d i s i n e a s a v e r y p o t e n t m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e k i n a s e - l ( M E K - l ) i n h i b i t o r w i t h l o w n a n o m o l a r I C s o v a l u e s . 2 3 3 1 3 K . I n d o l e a z e p i n e s i n h i b i t P M A / P H A i n d u c e d c y t o k i n e p r o d u c t i o n i n j u r k a t c e l l s a n d L P S i n d u c e d T N F - a p r o d u c t i o n i n m a c r o p h a g e s . H y m e n i a l d i s i n e a n d i n d o l o a z e p i n e s V - l a n d V - 2 w e r e e v a l u a t e d f o r t h e i r p o t e n t i a l a n t i - i n fi a m m a t o r y a c t i v i t y b y e x a m i n i n g t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f N F - K B i n h u m a n J u r k a t l e u k e m i a T - c e l l s a n d T H P — 1 c e l l s ( h u m a n m o n o c y t i c l e u k e m i a c e l l l i n e ) b y o t h e r r e s e a r c h e r s i n o u r l a b o r a t o r y . C o m p o u n d V - l w a s s h o w n t o i n h i b i t I L - 2 a n d T N F - O t p r o d u c t i o n , w h e r e a s t h e m e t h y l a t e d p r o d u c t V - 2 w a s d e p l e t e d o f a n y s i g n i fi c a n t a c t i v i t y . T h e n a t u r a l p r o d u c t h y m e n i a l d i s i n e w a s f o u n d t o i n h i b i t I L - 2 a n d T N F - c r p r o d u c t i o n a s w e l l , w i t h s i m i l a r I C s o v a l u e s . E x p o s u r e o f h u m a n J u r k a t l e u k e m i a T - c e l l s t o p h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e ( P M A / F H A ) a n d T H P - 1 c e l l s t o l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) , a c t i v a t e s t h e N F - K B m e d i a t e d g e n e t r a n s c r i p t i o n o f s e v e r a l p r o - i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s , i n c l u d i n g I L - 2 , I L - 6 , I L - 8 a n d T N F - o r . T h e a n t i - o x i d a n t a n d n o n - s e l e c t i v e N F - K B i n h i b i t o r , p y r r o l i d i n e d i t h i o c a r b a m a t e ( P D T C ) h a s b e e n r e p o r t e d t o r e p r e s s a c t i v a t i o n o f N F - K B a n d w a s u s e d a s a c o n t r o l i n a l l e x p e r i m e n t s . T h e e f f e c t o f h y m e n i a l d i s i n e a n d t h e i n d o l o a z e p i n e s V - l a n d V - 2 o n N F - K B ’ s t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y w a s e v a l u a t e d b y m e a s u r i n g t h e l e v e l o f I L - 2 a n d T N F - c t p r o d u c t i o n u s i n g a c o m p e t i t i v e e n z y m e i m m u n o a s s a y ( E I A ) . T h e i n h i b i t i o n o f I L - 2 w a s e v a l u a t e d i n J u r k a t c e l l s a f t e r P M A / F H A a c t i v a t i o n . 5 7 T h e i n h i b i t i o n o f T N F - o r w a s e v a l u a t e d i n T H P - 1 c e l l s a f t e r L P S a c t i v a t i o n . N F - K B m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n o f I L - 2 p r o d u c t i o n w a s e x a m i n e d b y e x p o s i n g t h e c e l l s t o P D T C o r c o m p o u n d s V - l , V - 2 , o r h y m e n i l a d i s i n e , 3 0 m i n u t e s p r i o r t o P M A a c t i v a t i o n . A f t e r 2 4 h o u r s , t h e c e l l f r e e s u p e m a t a n t s w e r e c o l l e c t e d a n d s u b j e c t e d t o E I A f o r t h e q u a n t i fi c a t i o n o f t o t a l I L - 2 p r o d u c t i o n . 3 1 4 I L - 2 p r o d u c t i o n T N F - a p r o d u c t i o n C o m p o u n d I C 5 0 ( u M ) I C s o U I M ) P D T C 5 . 1 2 ( + / - 0 . 4 1 ) 6 . 1 1 ( + / - 0 . 5 3 ) H y m e n i a l d i s i n e 2 . 4 1 ( + / - 0 . 7 1 ) 1 . 3 6 ( + / - 0 . 2 5 ) V - l 3 . 5 5 ( + / - 0 . 0 9 ) 8 . 1 6 ( + / - 0 . 3 1 ) V - 2 > 1 0 > 1 0 T a b l e V - 4 . I n h i b i t i o n o f C y t o k i n e ( I L - 2 a n d T N F - c t ) p r o d u c t i o n m e a s u r e d b y E I A f o r P D T C , h y m e n i a l d i s i n e a n d c o m p o u n d s V - l a n d V - 2 . a V a l u e s a r e m e a n s o f t w o e x p e r i m e n t s ; s t a n d a r d d e v i a t i o n i s g i v e n i n p a r e n t h e s e s . P D T C H y m e n i a l d i s i n e 3 - 3 . 2 . 5 . é ’ ' i \ 1 . 5 . a t i : t . ' ‘ 7 ‘ 0 . 5 « é o l 0 0 . 1 1 1 0 0 0 . 1 1 1 0 C o n c e n t r a t i o n ( p M ) C o n c e n t r a t i c n ( p M ) V - 1 V - 2 3 - 3 « g 2 . 6 . 2 . 5 . . . g . E , 1 . 5 « 3 , 1 5 ‘ 2 ‘ 1 i : 1 1 3 0 . 5 ' 1 _ ' 1 0 . 5 D 4 - o . , 0 0 . 1 1 1 0 0 0 . 1 1 1 0 C o n c e n t r a t i o n ( p M ) C o n c e r t r a t i o a n ) F i g u r e V - l 9 . I L - 2 p r o d u c t i o n m e a s u r e d b y B I A w i t h P D T C , h y m e n i a l d i s i n e a n d c o m p o u n d s V - l a n d V - 2 . h y m e n i a l d i s i n e e x h i b i t e d s i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n o f I L - 2 p r o d u c t i o n w i t h a n I C 5 0 v a l u e o f 2 . 4 u M ( T a b l e V - 4 ) . T r e a t m e n t o f t h e J u r k a t c e l l s w i t h c o m p o u n d s V - l a t c o n c e n t r a t i o n s 3 1 5 r a n g i n g f r o m 0 . 1 M t o 1 0 1 1 M e x h i b i t e d a l s o a s i g n i fi c a n t d o s e r e s p o n s e i n h i b i t i o n o f I L - 2 p r o d u c t i o n ( F i g u r e V - l 9 ) . C o m p o u n d V - l e x h i b i t e d a n i n h i b i t i o n o f I L - 2 p r o d u c t i o n w i t h a n I C s o v a l u e o f 3 . 5 u M . I n t e r e s t i n g l y , b l o c k a g e o f t h e N - i n d o l e p o s i t i o n w i t h a m e t h y l g r o u p , c o m p o u n d V - 2 , i n d i c a t e d n o s i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n o f I L - 2 p r o d u c t i o n ( F i g u r e V - 3 , m e a s u r e d u p t o 1 0 M ) . T h i s f u r t h e r s u p p o r t s t h e s i g n i fi c a n c e o f t h e p y r r o l i c N - H - m o i e t y i n p o t e n t i a l h y d r o g e n b o n d i n g i n t e r a c t i o n s . W e a l s o e x a m i n e d h y m e n i a l d i s i n e a n d c o m p o u n d s V - l a n d V - 2 f o r t h e i r a b i l i t y t o i n h i b i t T N F - o r p r o d u c t i o n i n L P S s t i m u l a t e d T H P - 1 c e l l s . T r e a t m e n t o f T I - I P - l c e l l s w i t h P D T C a n d c o m p o u n d s V - l , V - 2 o r h y m e n i a l d i s i n e , 3 0 m i n u t e s p r i o r t o L P S a c t i v a t i o n , r e s u l t e d i n a s i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n o f T N F — o r p r o d u c t i o n a f t e r a 3 h o u r i n c u b a t i o n p e r i o d ( T a b l e V - 4 ) . H y m e n i a l d i s i n e w a s f o u n d t o b e a p o t e n t i n h i b i t o r o f T N F - a p r o d u c t i o n w i t h a n I C s o v a l u e o f 1 . 4 1 . 1 M . C o m p o u n d V - l w a s a l s o f o u n d t o i n h i b i t T N F - c r p r o d u c t i o n , a l b e i t l e s s p o t e n t t h a n h y m e n i a l d i s i n e ( I C s o = 8 . 2 M ) . T h e m e t h y l a t e d i n d o l o a z e p i n e V - 2 w a s a g a i n d e p l e t e d o f a n y s i g n i fi c a n t a c t i v i t y ( t e s t e d u p t o 1 0 n M , T a b l e V - 4 ) . L . I n h i b i t i o n o f N F - K B - D N A b i n d i n g b y h y m e n i a l d i s i n e a n a l o g s . I n h i b i t i o n o f t h e D N A - b i n d i n g o f N F - K B b y i n d o l e a z e p i n e s o r h y m e n i a l d i s i n e w a s e v a l u a t e d b y e x a m i n i n g t h e n u c l e a r e x t r a c t s o f P M A / P H A a c t i v a t e d J u r k a t c e l l s u s i n g g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( E M S A ) . N u c l e a r e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d ( b y T e r i L a n s d e l l ) f r o m J u r k a t c e l l s t h a t w e r e t r e a t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f P D T C , h y m e n i a l d i s i n e , c o m p o u n d V - l a n d c o m p o u n d V - 2 f o r 3 0 m i n u t e s b e f o r e P M A / P H A s t i m u l a t i o n f o r a n a d d i t i o n a l 3 0 m i n u t e s . F i g u r e V - l 6 s h o w s t h e N F - - K B D N A b i n d i n g w i t h s u p e r s h i f t . P D T C ( L a n e 4 ) s h o w s a r e d u c t i o n i n t h e N F - K B - D N A b i n d i n g i n d u c e d b y P M A / P H A . C o m p o u n d V - 1 3 1 6 b i n d i n g < 2 h 5 . 4 . ) U H U H a ' ( 5 . 0 M ) i n d i c a t e d a p p r o x i m a t e l y 4 9 % i n h i b i t i o n o f N F - K B - D N A b i n d i n g , a s c o m p a r e d t o a p p r o x i m a t e l y 4 6 % f o r h y m e n i a l d i s i n e ( 5 . 0 u M ) . D N A + + + + + + + + + + + P M A / F H A - + + ~ - - - - - - - a - p 6 5 - - + - - + - - - - - P D T C - — - + + - - _ - - _ H M D - - — - - + + - - - - V - l - - - - _ _ _ + + - _ V - 2 N F — K B - D N A . s u p e r s h i f t < 3 ‘ . . N F - K B - D N A _ I ’ c o m p l e x l . - . ‘ c . . . ' , ( I ' n o n - s p e c i f i c F i g u r e V - 2 0 . E M S A a s s a y f o r N F - K B - D N A b i n d i n g i n h i b i t i o n b y c o m p o u n d V - l , V - 2 , a n d h y m e n i a l d i s i n e . L a n e 1 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( + P M A / P H A ) + A n t i b o d y p 6 5 ; L a n e 2 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / l ) + n u c l e a r e x t r a c t ( P M A / P H A ) ; L a n e 3 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / k ) + n u c l e a r e x t r a c t ( - P M A / - P H A ) ; L a n e 4 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / k ) + n u c l e a r e x t r a c t ( P M A / P H A ) + 5 u M P D T C ; L a n e 5 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / K ) + n u c l e a r e x t r a c t ( P M A / P H A ) + 1 1 1 M P D T C ; L a n e 6 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l D t ) + n u c l e a r e x t r a c t ( P M A / P H A ) + 5 1 1 M h y m e n i a l d i s i n e ; L a n e 7 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( P M A / P H A ) + 1 1 1 M h y m e n i a l d i s i n e ; L a n e 8 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / k ) + n u c l e a r e x t r a c t ( P M A / P H A ) + 5 1 1 M V - l ; L a n e 9 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / A ) + n u c l e a r e x t r a c t ( P M A / P H A ) + 1 1 1 M V - l ; L a n e 1 0 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / k ) + n u c l e a r e x t r a c t ( P M A / P H A ) + 5 u M c o m p o u n d V - 2 ; L a n e 1 1 : N F - K B c o n s e n s u s o l i g o ( 0 . 1 6 p m o l / l t ) + n u c l e a r e x t r a c t ( P M A / P H A ) + 1 1 1 M V - 2 . H M D z H y m e n i a l d i s i n e ; P D T C : P y r r o l l i d i n e d i t h i o c a r b a m a t e C o m p o u n d V - 2 , h o w e v e r , f a i l e d t o s h o w a n y s i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n . S i m i l a r t o t h e s t u d i e s r e p o r t e d o n h y m e n i a l d i s i n e , n o s i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n o f D N A b i n d i n g w a s o b s e r v e d w h e n i n d o l e a z e p i n e s V - l o r V - 2 w e r e t e s t e d f o r i n h i b i t i o n o f D N A b i n d i n g w i t h t h e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r A P - l . ‘ 5 3 1 7 M . C y t o t o x i c i t y p r o f i l e o f h y m e n i a l d i s i n e a n d i t s i n d o l e a z e p i n e a n a l o g s . W e o b s e r v e d i n h i b i t i o n o f P M A / P H A i n d u c e d c y t o k i n e ( I L - 2 ) p r o d u c t i o n i n j u r k a t c e l l s a n d L P S i n d u c e d T N F - a p r o d u c t i o n i n m a c r o p h a g e s . W e a l s o o b s e r v e d n o t i c e a b l e i n h i b i t i o n o f N F - K B - D N A b i n d i n g b y E M S A s t u d i e s . H o w e v e r , t h e s e e f f e c t s w o u l d b e s e e n i f a n y o f t h e c o m p o u n d s t e s t e d w e r e h i g h l y c y t o t o x i c , e s p e c i a l l y i n c a s e o f I L - 2 p r o d u c t i o n , s i n c e i n c u b a t i o n w a s c a r r i e d o u t f o r a p e r i o d o f 2 4 h . H e n c e , h y m e n i a l d i s i n e a n d c o m p o u n d s V - l a n d V - 2 w e r e t e s t e d f o r t h e i r c y t o t o x i c i t y a n d w e r e f o u n d t o e x h i b i t s i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n o f c e l l g r o w t h . C e l l s w e r e t r e a t e d a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 1 0 n M t o 5 1 1 M c o n c e n t r a t i o n s o v e r a 4 8 h o u r t i m e p e r i o d . H y m e n i a l d i s i n e a n d c o m p o u n d V - l i n d i c a t e d s i m i l a r i n h i b i t i o n o f c e l l g r o w t h w i t h 6 1 5 0 o f 1 . 6 1 W a n d 1 . 7 3 1 1 M r e s p e c t i v e l y , w h e r e a s c o m p o u n d V - 2 i n d i c a t e d w e a k e r i n h i b i t i o n o f c e l l g r o w t h ( G l s o = 1 4 . 3 M ) . I n h i b i t i o n o f c e l l g r o w t h “ m m “ 0 1 5 0 ( q u P D T C N I T H y m e n i a l d i s i n e 1 . 6 1 ( + / - 0 . 6 2 ) V - l 1 . 7 3 ( + / - 0 . 0 8 8 ) V - 2 1 4 . 3 ( + / - 2 . 4 1 ) T a b l e V - S . I n h i b i t i o n o f c e l l g r o w t h w i t h h y m e n i a l d i s i n e a n d c o m p o u n d s V - l a n d V - 2 i n C E M l e u k e m i a T - c e l l s . a V a l u e s s h o w n a r e a v e r a g e o f t w o e x p e r i m e n t s . S t a n d a r d d e v i a t i o n i s g i v e n i n p a r e n t h e s e s . 3 1 8 2 5 0 _ — e - — % c e l l g r o w t h ( C e l l s a l o n e ) — - — — % c e l l g r o w t h ( H y m e n i a l d i s i n e . 5 u M ) _ 2 0 0 < 2 a 1 5 0 4 3 ( a i 1 0 0 1 3 2 5 0 « o I l l 1 l l 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 T i m e ( h ) 2 5 0 _ + % c e l l g r o w t h ( C e l l s a l o n e ) + % c e l l g r o w t h ( V - 1 , 5 y M ) 2 0 0 - T u g 1 5 0 ~ 3 fl ' § 1 0 0 4 3 2 5 0 _ o l l ’ l l l l 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 T i m e ( h ) — o — % c e l l g r o w t h ( C e l l s A l o n e ) + % c e l l g r o w t h ( V - 2 , 5 p M ) 1 4 0 - 1 2 0 < 2 1 0 0 I 5 , s o « W a 6 0 ~ 0 3 2 4 0 a 2 0 - 0 l r l T 7 l 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 T i m e ( h ) F i g u r e V - 2 1 . S u r v i v a l c u r v e s s h o w i n g c e l l g r o w t h i n p r e s e n c e o f 5 u M h y m e n i a l d i s i n e , V - l , V - 2 . 3 1 9 T h e i n h i b i t i o n o f c e l l g r o w t h w i t h i n d o l e a z e p i n e s o r h y m e n i a l d i s i n e c o u l d t h e r e f o r e a c c o u n t f o r s o m e o f t h e i n h i b i t i o n o f I L - 2 p r o d u c t i o n s e e n i n t h e J u r k a t c e l l s , w h e r e I L - 2 p r o d u c t i o n w a s m e a s u r e d 2 4 h o u r s a f t e r P M A s t i m u l a t i o n . H o w e v e r , i n h i b i t i o n o f T N F - c r p r o d u c t i o n w a s m e a s u r e d w i t h i n 3 h o u r s a f t e r L P S s t i m u l a t i o n a n d n o s i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n o f c e l l g r o w t h w a s a p p a r e n t a t t h i s t i m e i n t e r v a l . N . C o n c l u s i o n W e s u c c e s s f u l l y s y n t h e s i z e d V - l a n d V - 2 , a n a l o g s o f t h e n a t u r a l p r o d u c t h y m e n i a l d i s i n e . T h e k i n a s e i n h i b i t i o n s t u d i e s s u g g e s t t h a t a n a l o g s o f h y m e n i a l d i s i n e m a y i m p r o v e i t s o v e r a l l k i n a s e p r o fi l e a n d s i g n i fi c a n t l y a f f e c t i t s k i n a s e s e l e c t i v i t y . W h i l e f u r t h e r i n v i v o s t u d i e s a r e r e q u i r e d i n v a l i d a t i n g t h e d r u g t h e r a p e u t i c p o t e n t i a l o f h y m e n i a l d i s i n e a n a l o g s f o r c a n c e r t h e r a p y a n d n e u r o d e g e n e r a t i v e d i s e a s e s , t h e s e s m a l l m o l e c u l e s s h o w r e m a r k a b l e p r o m i s e i n t a r g e t i n g C h k 2 i n h i b i t i o n i n a ‘ t a i l o r - m a d e ’ f a s h i o n . T h e s e w e r e a n e w c l a s s o f i n d o l o a z e p i n e i n h i b i t o r o f t h e p r o - i n f l a m m a t o r y p r o t e i n N F - K B . I n h i b i t i o n o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f N F - K B b y t h e i n d o l o a z e p i n e c o m p o u n d s V - l a n d V - 2 w a s e v a l u a t e d b y m e a s u r i n g I L - 2 a n d T N F - a p r o d u c t i o n i n J u r k a t a n d T H ? - 1 c e l l s . T h e f r e e i n d o l o a z e p i n e V - l a n d h y m e n i a l d i s i n e e x h i b i t e d p o t e n t i n h i b i t i o n o f I L - 2 a n d T N F - o . p r o d u c t i o n , w h e r e a s t h e N - m e t h y l i n d o l o a z e p i n e V - 2 w a s d e p l e t e d o f a n y s i g n i fi c a n t a c t i v i t y . H y m e n i a l d i s i n e a n d i n d o l o a z e p i n e V - l w e r e f o u n d t o i n h i b i t D N A b i n d i n g b y N F - K B . G e l e l e c t r o p h o r e s i s a s s a y s i n d i c a t e d t h a t n o n e o f t h e c o m p o u n d s h a d a n y n o t a b l e e f f e c t o n t h e D N A b i n d i n g o f t h e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r A P - l . T h e i n d o l o a z e p i n e V - l p r o v i d e s t h e r e f o r e a n e w s y n t h e t i c a l l y r e a d i l y a v a i l a b l e s c a f f o l d f o r f u r t h e r o p t i m i z a t i o n f o r c y t o k i n e i n h i b i t i o n . T h e f u r t h e r c l i n i c a l p o t e n t i a l a n d d e t a i l s o n 3 2 0 t h e m o d e o f a c t i o n o f t h i s n e w c l a s s o f i n d o l o a z e p i n e s i s c u r r e n t l y u n d e r i n v e s t i g a t i o n i n o u r l a b o r a t o r y . 3 2 1 0 . E x p e r i m e n t a l S e c t i o n R e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n fl a m e - d r i e d g l a s s w a r e u n d e r n i t r o g e n o r a r g o n a t m o s p h e r e , u n l e s s o t h e r w i s e n o t e d . C o m m e r c i a l s o l v e n t s a n d r e a g e n t s w e r e u s e d a s r e c e i v e d . A n h y d r o u s s o l v e n t s w e r e d i s p e n s e d f r o m a d e l i v e r y s y s t e m w h i c h p a s s e s t h e s o l v e n t s t h r o u g h p a c k e d c o l u m n s ( t e t r a h y d r o f u r a n , m e t h y l e n e c h l o r i d e : d r y n e u t r a l a l u m i n a ) . A l l r e a c t i o n s w e r e m a g n e t i c a l l y s t i r r e d a n d m o n i t o r e d b y T L C w i t h 0 . 2 5 “ M p r e - c o a t e d s i l i c a g e l p l a t e s a n d c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y w a s c a r r i e d o u t o n S i l i c a G e ) 6 0 ( 2 3 0 — 4 0 0 m e s h ) s u p p l i e d b y E M S c i e n c e . Y i e l d s r e f e r t o c h r o m a t o g r a p h i c a l l y a n d s p e c t r o s c o p i c a l l y p u r e c o m p o u n d s u n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d . M e l t i n g p o i n t s w e r e d e t e r m i n e d o n a M e l - T e m p ( L a b o r a t o r y d e v i c e s ) a p p a r a t u s w i t h a m i c r o s c o p e a t t a c h m e n t . I n f r a r e d s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a N i c o l e t I R / 4 2 s p e c t r o m e t e r . I H a n d 1 3 C N M R s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a V a r i a n G e m i n i - 3 0 0 s p e c t r o m e t e r , V a r i a n V X R - 5 0 0 s p e c t r o m e t e r a n d U n i t y + - 5 0 0 s p e c t r o m e t e r . C h e m i c a l s h i f t s a r e r e p o r t e d r e l a t i v e t o t h e r e s i d u e p e a k s o f t h e s o l v e n t C D C l 3 ( 7 . 2 4 p p m f o r 1 H a n d 7 7 . 0 p p m f o r I 3 C ) . H R M S w e r e o b t a i n e d a t t h e M a s s S p e c t r o m e t r y F a c i l i t y o f t h e M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y w i t h a J E O L J M S H X - l l O m a s s s p e c t r o m e t e r . G a s c h r o m a t o g r a p h y / l o w r e s o l u t i o n m a s s s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a H e w l e t — P a c k a r d 5 8 9 0 S e r i e s 1 1 g a s c h r o m a t o g r a p h c o n n e c t e d t o a T R I O - l E I m a s s s p e c t r o m e t e r . C o m b u s t i o n a n a l y s i s w a s c a r r i e d o u t o n P e r k i n E l m e r S e r i e s H 2 4 0 0 C H N S / O A n a l y z e r . 3 2 2 G e n e r a l P r o c e d u r e . 3 - [ ( 1 H - I n d o l e - 2 - c a r b o n y l ) - a m i n o ] - p r o p i o n i c a c i d e t h y l e s t e r , V - 3 \ H N f C O O E t : H 0 T o a m i x t u r e o f 2 - i n d o l e c a r b o x y l i c a c i d ( 5 . 0 1 g , 3 1 . 1 1 m m o l ) , 4 - ( d i m e t h y l a m i n o ) p y r i d i n e ( 6 . 4 4 g , 5 2 . 7 2 m m o l ) i n 1 5 0 m L a n h y d r o u s C H 2 C 1 2 w a s a d d e d N - ( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) - N ' - e t h y l c a r b o d i i m i d e h y d r o c h l o r i d e ( E D C I . H C I ) ( 7 . 1 3 g , 3 7 . 2 1 m m o l ) a n d B - a l a n i n e e t h y l e s t e r h y d r o c h l o r i d e ( 5 . 7 1 g , 3 7 . 2 1 m m o l ) a t 0 ° C . T h e m i x t u r e t h e n w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r 4 h o u r s a n d a l l o w e d t o w a r m t o r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 0 h o u r s . T h e s o l u t i o n w a s w a s h e d w i t h w a t e r ( 5 0 m L ) a n d 1 0 % H C ) ( 5 0 m L ) . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s t h e n d r i e d o v e r a n h y d r o u s N a Z S O 4 , fi l t e r e d a n d c o n c e n t r a t e d t o y i e l d p r o d u c t V - 3 a s a w h i t e s o l i d ( 7 . 9 5 g , 9 8 % ) . T h e s o l i d w a s r e c r y s t a l l i z e d i n m e t h a n o l . M . P . 1 5 8 - 1 6 0 ° C . 1 H N M R : ( 5 0 0 M H z , C D C 1 3 — 2 d r o p s a c e t o n e ) 6 1 . 1 7 ( t , 3 H , J = 7 . 5 H z ) , 2 . 5 8 ( t , 2 H , J = 6 . 5 H z ) , 3 . 6 7 ( q , 2 H , J = 6 . 0 H z ) , 4 . 0 8 ( q , 2 H , J = 7 H z ) , 6 . 8 1 ( s , 1 H ) , 7 . 0 1 ( t , 1 H , J = 7 . 5 H z ) , 7 . 0 9 ( s , 1 H ) , 7 . 1 4 ( t , 1 H , J = 7 H z ) , 7 . 3 5 ( d , 1 H , J = 8 . 5 H z ) , 7 . 5 2 ( d , 1 H , J = 8 . 5 H z ) , 9 . 8 6 ( s , 1 H ) . 1 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , C D C 1 3 ) 8 1 3 . 9 , 3 3 . 9 , 3 5 . 0 , 6 0 . 6 , 1 0 2 . 3 , 1 1 1 . 9 , 1 2 0 . 3 , 1 2 1 . 7 , 1 2 4 . 2 , 1 2 7 . 5 , 1 3 0 . 6 , 1 3 6 . 4 , 1 6 1 . 7 , 1 7 2 . 3 . I R : ( N a C l ) 3 3 7 7 , 3 3 5 2 , 1 7 1 6 , 1 6 2 4 , 1 5 5 2 , 1 3 2 5 , 1 2 0 7 , 7 4 8 c m " . H R M S m / e ( C I 4 H 1 5 N 2 0 3 ) ( M ) 2 6 0 . 1 1 6 1 , f o u n d 2 6 0 . 1 1 5 9 . A n a l . ( C 1 4 H 1 6 N 2 0 3 ) C a l c d : C , 6 4 . 6 ; H , 6 . 2 0 ; N , 1 0 . 7 6 ; f o u n d : C , 6 4 . 2 2 ; H , 6 . 3 4 ; N , 1 0 . 6 7 . 3 2 3 3 - [ ( l - M e t h y l - 1 H - i n d o l e - Z - c a r b o n y 1 ) - a m i n o ] - p r o p i o n i c a c i d e t h y l e s t e r , V - 4 \ H N — / — C O O E 1 : i t ) . 0 A s o l u t i o n o f c o m p o u n d V - 3 ( 2 . 5 g , 9 . 5 7 m m o l ) , K 2 C 0 3 ( 5 . 9 4 g , 4 3 . 0 6 m m o l ) a n d i o d o m e t h a n e ( 1 . 4 9 m L , 2 3 . 9 2 m m o l ) i n a c e t o n i t r i l e ( 7 5 m L ) w a s s t i r r e d a t r e fl u x f o r 2 4 h o u r s . T h e m i x t u r e w a s c o o l e d , fi l t e r e d a n d t h e fi l t r a t e w a s e v a p o r a t e d i n v a c u o . T h e s o l i d w a s t h e n w a s h e d w i t h 1 N H C l a n d e x t r a c t e d i n C H 2 C 1 2 . T h e c r u d e m a t e r i a l w a s f u r t h e r p u r i fi e d b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y o n s i l i c a g e l ( C H 2 C 1 2 - E t O A c 3 : 1 ) t o y i e l d c o m p o u n d V - 4 ( 2 . 6 4 g ) a s w h i t e s o l i d ( 1 0 0 % ) . T h e p r o d u c t w a s r e c r y s t a l l i z e d w i t h d i c h l o r o m e t h a n e : e t h e r ( 1 : 1 ) M . P . 7 5 - 7 7 ° C . ' H N M R : ( 3 0 0 M H z , C D C l 3 ) 8 1 . 2 8 ( t , 3 H , J = 7 . 2 H z ) , 2 . 6 7 ( m , 2 H ) , 3 . 7 2 ( m , 2 H ) , 4 . 0 7 ( s , 3 H ) , 4 . 2 2 ( q , 2 H , J = 6 . 9 H z ) , 6 . 8 6 ( s , 1 H ) , 7 . 0 5 - 7 . 6 5 ( m , 4 H ) . l 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , C D C 1 3 ) 8 1 4 . 1 , 3 1 . 4 , 3 3 . 9 , 3 4 . 8 , 6 0 . 7 , 1 0 3 . 8 , 1 1 0 . 0 , 1 2 0 . 4 , 1 2 1 . 7 , 1 2 3 . 9 , 1 2 5 . 9 , 1 3 1 . 8 , 1 3 8 . 9 , 1 6 2 . 4 , 1 7 2 . 7 . I R ( N a C l ) : 3 2 6 5 , 1 7 3 0 , 1 6 3 0 , 1 5 5 4 , 1 4 6 0 , 1 3 8 3 , 1 3 1 9 , 1 1 8 4 c m " . H R M S m / e ( C 1 5 H 1 3 N 2 0 3 ) ( M ) 2 7 4 . 1 3 1 7 , f o u n d 2 7 4 . 1 3 1 5 . A n a l . ( C 1 5 H 1 3 N 2 0 3 ) C a l c d : C , 6 5 . 6 8 ; H , 6 . 6 1 ; N , 1 0 . 2 1 ; f o u n d : C , 6 4 . 5 5 ; H , 6 . 4 4 ; N , 1 0 . 1 0 . 3 - [ ( 1 H - i n d o l e - Z - c a r b o n y l ) - a m i n o ] - p r o p i o n i c a c i d , V - S O H N f c o W H O 3 2 4 A m i x t u r e o f c o m p o u n d V - 3 ( 6 . 1 g , 2 3 . 4 m m o l ) a n d L i O H . H 2 0 ( 1 . 9 6 g , 4 6 . 7 m m o l ) w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e i n e t h a n o l ( 3 0 0 m L ) f o r 2 0 h o u r s , t h e e t h a n o l w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s i n v a c u o . T h e r e s i d u e w a s d i s s o l v e d i n w a t e r ( 5 0 m L ) a n d a c i d i fi e d t h e s o l u t i o n t o p H = 3 w i t h c o n c e n t r a t e d B C ) t o f o r m a w h i t e s o l i d . T h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o s t a n d a t 0 ° C f o r 3 0 m i n u t e s a n d t h e p r o d u c t w a s i s o l a t e d b y fi l t r a t i o n . T h e s o l i d w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d r e c r y s t a l l i z e d w i t h m e t h a n o l t o a f f o r d c o m p o u n d V - 5 ( 5 . 0 3 g 9 3 % ) . M . P . 2 3 2 ° C . I H N M R : ( 3 0 0 M H z , d 6 - D M S O ) 8 2 . 5 5 ( t , 2 H , J = 7 . 2 H z ) , 3 . 4 7 ( q , 2 H , J = 6 . 9 H z ) , 7 . 0 1 ( t , 1 H , J = 7 . 2 H z ) , 7 . 0 4 ( s , 1 H ) , 7 . 1 3 ( t , 1 H , J = 7 . 2 H z ) , 7 . 4 1 ( 1 H , J = 8 . 1 H z ) , 7 . 5 7 ( 1 H , J = 8 . 1 H z ) , 8 . 5 2 ( s , 1 H ) , 1 1 . 5 5 ( s , 1 H ) , 1 2 . 2 5 ( s , 1 H ) ; 1 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z ) ( d 6 - D M S O ) 8 3 4 . 6 , 3 5 . 9 , 1 0 3 . 2 , 1 1 2 . . 9 , 1 2 0 . 3 , 1 2 2 . 1 , 1 2 3 . 9 , 1 2 7 . 8 , 1 3 2 . 4 , 1 3 7 . 1 , 1 6 1 . 8 , 1 7 3 . 4 ; I R ( N a C l ) : 3 4 2 2 , 3 2 7 3 , 1 7 4 5 , 1 7 0 7 , 1 6 4 3 , 1 5 4 9 , 1 4 1 7 , 1 3 4 1 , 1 2 5 9 , 7 4 6 c m " ; H R M S m / e ( C 1 2 H 1 2 N 2 0 3 ) ( M ) 2 3 2 . 0 8 4 8 , f o u n d 2 3 2 . 0 8 4 4 . A n a l . ( C 1 2 H 1 2 N 2 0 3 ) C a l c d : C ; H , 5 . 2 1 ; N , 1 2 . 0 6 ; f o u n d : H , 5 . 2 7 ; N , 1 1 . 7 9 . 3 - [ ( 1 - M e t h y l - 1 H - i n d o l e - Z - c a r b o n y l ) - a m i n o ] - p r o p i o n i c a c i d , V - 6 H N f C O O Q M N 0 M e P r o c e d u r e s i m i l a r a s f o r c o m p o u n d V - S t o p r o v i d e c o m p o u n d V - 6 f r o m V - 4 ( 2 . 1 6 g , 9 3 % ) . T h e p r o d u c t w a s r e c r y s t a l l i z e d i n m e t h a n o l . M . P . 1 6 0 - 1 6 2 ° C . ' H N M R : ( 3 0 0 M H z , d 6 - D M S O ) 8 2 . 4 9 ( t , 2 H , J = 7 . 2 H z ) , 3 . 4 6 ( q , 2 H , J = 6 . 6 H z ) , 3 . 9 5 ( s , 3 H ) , 7 . 0 7 - 7 . 6 4 ( m , 5 H ) , 8 . 5 3 ( t , 1 H , J = 5 . 7 H z ) . l 3 C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , 3 2 5 d 6 - D M S O ) o 3 1 . 1 , 3 3 . 7 , 3 5 . 0 , 1 0 4 . 0 , 1 1 0 . 2 , 1 1 9 . 9 , 1 2 1 . 3 , 1 2 3 . 3 , 1 2 5 . 5 , 1 3 2 . 1 . 1 3 8 . 2 , 1 6 1 . 8 , 1 7 2 . 6 . 1 R ( N a C l ) : 3 3 7 7 , 2 9 2 2 , 1 7 1 4 , 1 6 0 1 , 1 5 5 0 , 1 4 6 4 , 1 4 2 3 , 1 2 8 0 , 1 2 2 6 , 1 1 9 0 , 9 0 8 c m " . H R M S m / e ( C 1 3 H 1 4 N 2 0 3 ) ( M ) 2 4 6 . 1 0 0 4 , f o u n d 2 4 6 . 1 0 1 6 . A n a l . ( C 1 3 H 1 4 N 2 0 3 ) C a l c d : c , 6 3 . 4 0 ; H , 5 . 7 3 ; N , 1 1 . 3 8 ; f o u n d : c , 6 2 . 3 9 ; H , 5 . 9 4 ; N , 1 1 . 1 2 . 3 , 4 - D i h y d r o - 2 H , 1 0 H - a z e p i n o [ 3 , 4 - b ] i n d o l e - 1 , 5 - d i o n e , V - 7 0 \ N H N H o C o m p o u n d V - S ( 2 g , 8 . 6 m m o l ) w a s a d d e d t o a c l e a r s o l u t i o n o f P 2 0 5 ( 1 . 3 3 g , 9 . 4 4 m m o l ) i n M e 8 0 3 H ( 7 0 m L ) a t 6 0 ° C . T h e m i x t u r e w a s h e a t e d t o 1 1 0 ° C f o r 1 . 5 h o u r , a n d t h e n c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s p o u r e d i n t o i c e - w a t e r a n d s t i r r e d f o r 3 0 m i n u t e s . T h e b u f f - c o l o r e d s o l i d w a s t h e n fi l t e r e d a n d d i s s o l v e d i n a c e t o n e ( 2 5 0 m L ) , fi l t e r e d a g a i n , a n d t h e fi l t r a t e w a s c o n c e n t r a t e d t o g i v e a l i g h t b r o w n s o l i d w h i c h w a s f u r t h e r p u r i fi e d b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( 2 0 % a c e t o n e i n C H 2 C 1 2 ) o n s i l i c a g e l t o y i e l d c o m p o u n d V - 7 ( 1 . 5 6 g , 8 5 % ) M p : 2 5 7 - 2 6 0 ° C . ' H N M R ( 3 0 0 M H z , d 6 - D M S O ) 5 2 . 8 0 - 2 . 8 5 ( m , 2 H ) , 3 . 4 0 - 3 . 4 6 ( m , 2 H ) , 7 . 2 2 - 7 . 3 8 ( m , 2 H ) , 7 . 5 1 ( d , 1 H , J = 9 . 0 H z ) , 8 . 2 8 ( d , 1 H , J = 9 . 0 H z ) , 8 . 7 2 ( m , 1 H ) , 1 2 . 4 1 ( s , 1 H ) : l 3 c N M R ( 7 4 . 4 7 M H z , d 6 - D M S O ) 8 3 6 . 5 , 4 4 . 0 , 1 1 2 . 6 , 1 1 3 . 7 , 1 2 2 . 6 , 1 2 2 . 7 , 1 2 4 . 7 , 1 2 6 . 0 , 1 3 4 . 5 , 1 3 5 . 6 , 1 6 2 . 3 , 1 9 5 . 0 ; I R : ( N a C l ) 3 1 6 3 , 1 6 6 2 , 1 6 2 8 , 1 5 2 3 , 1 4 3 7 , 1 4 0 8 c m “ ; L R M S ( E 1 ) : M + = 2 1 4 . 3 ; 3 2 6 H R M S m / e ( C l e m N z O z X M ) 2 1 4 . 0 7 4 2 , f o u n d 2 1 4 . 0 7 4 0 . A n a l . ( C 1 4 H 1 6 N 2 0 3 ) C a l c d : C , 6 7 . 2 8 ; H , 4 . 7 1 ; N , 1 3 . 0 8 ; f o u n d : C , 6 5 . 3 6 ; H , 4 . 6 6 ; N , 1 2 . 5 3 . 1 0 - M e t h y l - 3 , 4 o d i h y d r o - 2 H , 1 0 H - a z e p i n o [ 3 , 4 - b ] i n d o l e - 1 , S - d i o n e , V - 8 O \ N H N M e O P r o c e d u r e s i m i l a r a s f o r c o m p o u n d V - 7 t o p r o v i d e c o m p o u n d V - 8 f r o m V - 6 ( 1 . 3 g , 7 5 % ) . T h e p r o d u c t w a s r e c r y s t a l l i z e d i n m e t h a n o l . M p Z O O - 2 0 5 ° C . 1 H N M R : ( 5 0 0 M H z , d 6 - D M S O ) 8 2 . 7 7 ( t , 2 H , J = 5 . 5 H z ) , 3 . 3 9 ( t , 2 H , J = 5 . 5 , 4 . 5 H z ) , 3 . 9 9 ( s , 3 H ) , 7 . 2 7 ( t , 1 H , J = 7 . 0 , 8 . 0 H z ) , 7 . 3 7 ( t , 1 H , J = 7 . 5 H z ) , 7 . 6 2 ( d , 1 H , J = 8 . 0 H z ) , 8 . 2 7 ( d , 1 H , J = 8 . 0 H z ) , 8 . 7 7 ( t , 1 H , J = 5 . 0 , 6 . 0 H z ) ; l 3 C N M R : ( 1 2 4 . 1 M H z , d 6 - D M S O ) 8 3 2 . 4 , 3 6 . 6 , 4 4 . 9 , 1 1 0 . 9 , 1 1 4 . 7 , 1 2 2 . 6 , 1 2 3 . 1 , 1 2 4 . 5 , 1 2 5 . 0 , 1 3 4 . 7 , 1 3 7 . 9 , 1 6 2 . 3 , 1 9 5 . 6 . I R ( N a C l ) : 3 2 0 4 , 3 0 0 0 , 2 9 2 4 , 1 6 6 2 , 1 6 4 1 , 1 5 0 6 , 1 4 7 3 , 1 3 7 1 , 7 2 4 c m " ; H R M S m / e ( C 1 3 H 1 2 N 2 0 2 ) 0 V 1 ) 2 2 8 . 0 8 9 9 , f o u n d 2 2 8 . 0 8 8 7 . A n a l . ( C 1 3 H 1 2 N 2 0 2 ) C a l c d : C , 6 8 . 4 1 ; H , 5 . 3 0 ; N , 1 2 . 2 7 ; f o u n d : C , 6 5 . 8 0 ; H , 5 . 3 7 ; N , 1 1 . 4 2 . d i e t h y l 2 , 5 - d i o x o i m i d a z o l i d i n - 4 - y l - 4 - p h o s p h o n a t e , V - 9 : H 0 N i > = ° ( 1 5 1 0 ) , , 0 1 D N A m i x t u r e o f h y d a n t o i n ( 2 0 0 m g , 2 m m o l ) , a n d a c e t i c a c i d ( 1 . 0 m L ) w a s h e a t e d t o 8 5 ° C i n a n o i l b a t h . A n a d d i t i o n f u n n e l w a s c h a r g e d w i t h b r o m i n e ( 3 5 2 m g , 0 . 1 1 3 3 2 7 m L , 2 . 2 m o l e ) a n d a s m a l l a m o u n t o f b r o m i n e ( 4 d r o p s ) i n t r o d u c e d i n t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e w i t h v i g o r o u s s t i r l i n g . O n c e t h e c o l o r d i s s i p a t e d , t h e r e m a i n d e r o f t h e b r o m i n e w a s a d d e d r a p i d l y d r o p w i s e o v e r a p p r o x i m a t e l y 5 m i n t o a f f o r d a c l e a r s o l u t i o n . A f t e r b e i n g s t i r r e d a t 8 5 ° C f o r 3 0 m i n , t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s c o o l e d t o 3 0 ° C i n a n i c e b a t h a n d t r i e t h y l p h o s p h i t e ( 0 . 4 6 5 g , 0 . 4 8 m L , 2 . 8 m m o l e ) i n t r o d u c e d s l o w l y s u c h t h a t t h e i n t e r n a l t e m p e r a t u r e w a s a t 4 0 — 4 5 ° C . A f t e r t h e a d d i t i o n w a s c o m p l e t e d , t h e m i x t u r e w a s s t i r r e d a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e f o r 9 0 m i n . T h e s o l v e n t w a s r e m o v e d i n v a c u o a n d t h e r e s i d u e d i l u t e d w i t h E t z O ( 1 0 m L ) w i t h s t i r r i n g t o i n d u c e p r e c i p i t a t i o n o f a w h i t e s o l i d . T h e m i x t u r e w a s p o u r e d o n t o d i e t h y l e t h e r ( 5 0 m L ) w i t h v i g o r o u s s t i r r i n g . A f t e r 3 0 m i n , fi l t r a t i o n a f f o r d e d V - 9 ( 7 1 % ) , w h i c h w a s u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r i fi c a t i o n . M . P . 1 6 1 - 1 6 3 ° C . H 1 N M R ( D M S O - d 6 ) 8 1 . 2 5 ( 6 H , t , J = 7 H z ) , 4 . 1 0 ( 4 H , m ) , 4 . 7 6 ( l H , d , J = 1 5 H z ) , 8 . 4 2 ( 1 H , b s , N H ) , 1 0 . 9 2 ( 1 H , b s , N H ) ; I R ( K B r ) 1 7 7 5 , 1 7 2 0 , 1 2 5 0 , 1 0 3 5 c m - ' 2 - p h e n y l o x a z o l - 5 ( 4 H ) - o n e , V - 1 0 : P h fi o f o N P u l v e r i z e d H i p p u r i c a c i d ( 1 g , 5 . 5 m m o l ) w a s t a k e n i n a fl a m e d r i e d fl a s k i n 1 0 0 m l C H 2 C 1 2 , E D C I . H C I ( 1 . 2 g , 6 . 1 m m o l ) w a s a d d e d a n d t h e r e a c t i o n a l l o w e d t o s t i r f o r 1 h a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e r e a c t i o n m i c t u r e w a s t h e n e x t r a c t e d w i t h 1 X N a H C 0 3 ( s a t . ) t w i c e . T h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d a n d w a s h e d w i t h N a C l ( s a t . ) o n c e . A g a i n t h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d d r i e d o v e r a n h y d r o u s N a 2 8 0 4 a n d d r i e d i n v a c u o . Y i e l d : 0 . 7 g , 8 0 % ' H N M R ( 3 0 0 M H z , d 6 - D M S O ) 5 4 . 4 1 ( s , 2 1 1 ) , 3 2 8 7 . 4 7 ( d , 2 H , J = 7 . 5 H z ) , 7 . 5 6 ( t , 1 H , J = 7 . 5 H z ) , 7 . 9 6 ( d , 2 H , J : 7 . 5 H z ) ; 1 3 C N M R ( 7 4 . 4 7 M H z , d 6 - C D C 1 3 ) 8 5 5 . 0 2 , 1 2 5 . 8 1 , 1 2 7 . 7 9 , 1 2 8 . 8 2 , 1 3 2 . 8 3 , 1 6 3 . 4 6 , 1 7 5 . 9 5 ; I R : ( n e a t ) 3 1 0 7 , 3 0 4 2 , 2 9 4 9 , 1 8 1 6 . 3 , 1 6 5 8 . 9 , 1 4 5 2 . 6 c m " ; L R M S m / e ( C 9 H 7 N 0 2 ) ( M ) 1 6 1 . 0 . 5 - ( 5 - o x o - 2 - p h e n y l - o x a z o l - 4 - y l i d e n e ) - 3 , 4 , 5 , l O - t e t r a h y d r o - Z H - a z e p i n o [ 3 , 4 - b ] i n d o I - 1 - o n e , V - l l A s o l u t i o n o f T i C l 4 ( 2 . 0 4 m L , 1 8 . 6 8 m m o l ) i n C H 2 C 1 2 ( 2 1 m L ) w a s a d d e d i n t o T H F ( 6 5 m L ) a t - 1 0 ° C . C o m p o u n d V - 7 ( 1 g , 4 . 6 7 m m o l ) a n d 2 - p h e n y l a z l a c t o n e ( 1 . 5 0 g , 9 . 3 4 m m o l ) w e r e s u b s e q u e n t l y a d d e d a n d a l l o w e d t o s t i r a t 0 ° C f o r 2 0 m i n u t e s . P y r i d i n e ( 2 . 0 9 m L , 3 7 . 3 6 m m o l ) w a s t h e n a d d e d o v e r a 3 0 m i n u t e s p e r i o d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r a d d i t i o n a l 2 h o u r s a n d t h e n a l l o w e d t o s t i r o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e . N H a C l ( 8 0 m L , s a t u r a t e d s o l u t i o n i n w a t e r ) w a s a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r 1 0 m i n u t e s a n d s u b s e q u e n t l y e x t r a c t e d w i t h e t h y l a c e t a t e ( 3 X ) . T h e o r g a n i c e x t r a c t s w e r e c o m b i n e d d r i e d , fi l t e r e d , c o n c e n t r a t e d a n d t h e r e s i d u e w a s p u r i fi e d u s i n g c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y o n s i l i c a g e l ( E t O A c - h e x a n e 7 : 3 ) t o y i e l d c o m p o u n d V - l l ( 0 . 9 1 g , 5 5 % ) a s r e d d i s h - y e l l o w s o l i d . M p : 2 4 7 - 2 5 0 ° C . I H N M R ( 3 0 0 M H z , d 6 - D M S O ) 8 3 . 3 6 - 3 . 4 7 ( m , 4 H ) , 7 . 1 4 ( t , 1 H , J = 8 . 1 H z ) , 7 . 3 0 ( t , 1 H , J = 9 . 0 H z ) , 7 . 4 9 - 7 . 5 8 ( m , 4 H ) , 3 2 9 7 . 8 1 - 7 . 8 7 ( m , 3 H ) , 8 . 4 5 - 8 . 5 6 ( m , 1 H ) , 1 2 . l l ( s , 1 H ) ; l 3 C N I V I R ( 7 4 . 4 7 M H z , d 6 - D M S O ) 8 3 7 . 7 , 3 8 . 6 , 1 1 2 . 9 , 1 1 5 . 3 , 1 2 1 . 0 , 1 2 5 . 1 , 1 2 5 . 3 , 1 2 6 . 5 , 1 2 7 . 4 , 1 2 9 . 0 , 1 2 9 . 8 , 1 3 3 . 2 , 1 3 4 . 0 , 1 3 6 . 9 , 1 4 6 . 3 , 1 5 8 . 4 , 1 6 5 . 0 , 1 6 6 . 1 ; I R : ( K B r — p e l l e t ) 3 3 5 8 , 3 1 7 9 , 1 7 4 9 , 1 6 5 3 , 1 6 3 3 , 1 4 4 8 c m " ; H R M S m / e ( C 2 1 H 1 5 N 3 0 3 ) ( M ) 3 5 7 . 1 1 1 3 , f o u n d 3 5 7 . 1 1 0 6 . l O - M e t h y l - S - ( 5 - o x o - 2 - p h e n y l - o x a z o l - 4 - y l i d e n e ) - 3 , 4 , 5 , l O - t e t r a h y d r o - Z H - a z e p i n e [ 3 , 4 - b l i n d o l - l - o n e , V - 1 2 o P h ~ < \ N \ \ N H N M e 0 P r o c e d u r e s i m i l a r a s f o r c o m p o u n d V - l l t o p r o v i d e c o m p o u n d V - 1 2 f r o m V - 8 ( 0 . 7 3 g , 5 6 % ) a s a y e l l o w s o l i d . M p : 1 8 9 - 1 9 2 ° C . I H N M R : ( 3 0 0 M H z , C D C I 3 ) 8 3 . 5 4 ( t , 2 H , J = 3 . 3 , 3 . 6 H z ) , 3 . 5 9 ( t , 2 H , J = 2 . 7 , 3 . 3 H z ) , 4 . 0 9 ( s , 3 H ) , 6 . 9 4 ( s , 1 H ) , 7 . 2 4 - 7 . 2 7 ( m , 1 H ) , 7 . 3 8 - 7 . 4 9 ( m , 5 H ) , 7 . 7 8 ( d , 1 H , J = 4 . 8 H z ) , 7 . 9 2 ( d , 2 H , J = 6 . 0 H z ) ; ” C N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , C D C 1 3 ) 8 3 1 . 9 , 3 8 . 2 , 3 8 . 4 , 1 1 0 . 1 , 1 1 5 . 8 , 1 2 1 . 3 , 1 2 4 . 3 , 1 2 5 . 0 , 1 2 5 . 1 , 1 2 5 . 8 , 1 2 7 . 5 , 1 2 8 . 7 , 1 3 0 . 0 , 1 3 1 . 7 , 1 3 2 . 4 , 1 3 8 . 5 , 1 4 4 . 5 , 1 5 9 . 4 , 1 6 5 . 3 , 1 6 5 . 9 . I R : ( N a C l ) 1 7 8 4 , 1 7 5 3 , 1 6 6 2 , 1 6 3 3 , 1 4 7 3 c m " ; L R M S ( E l ) : 3 7 1 . 1 ( M ) ; H R M S m / e ( C 2 2 H 1 7 N 3 0 3 ) ( M ) 3 7 1 . 1 2 7 0 , f o u n d 3 7 1 . 1 2 6 8 . 3 3 0 ( 4 Z ) - 4 - ( 2 , 3 - d i h y d r o n a p h t h a l e n - 4 ( 1 H ) - y l i d e n e ) - 2 - p h e n y l o x a z o l - S ( 4 H ) - o n e , V - 1 3 : A s o l u t i o n o f T i C l 4 ( 1 . 5 m L , 1 3 . 6 8 m m o l ) i n C H 2 C 1 2 ( 1 4 m L ) w a s a d d e d i n t o T H F ( 4 5 m L ) a t - 1 0 ° C . a - t e t r a l o n e ( 0 . 5 g , 3 . 4 2 m m o l ) a n d 2 - p h e n y l a z l a c t o n e ( 1 . 1 g , 6 . 8 4 m m o l ) w e r e s u b s e q u e n t l y a d d e d a n d a l l o w e d t o s t i r a t 0 ° C f o r 2 0 m i n u t e s . P y r i d i n e ( 1 . 5 3 m L , 2 7 . 3 5 m m o l ) w a s t h e n a d d e d o v e r a 3 0 m i n u t e s p e r i o d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r a d d i t i o n a l 2 h o u r s a n d t h e n a l l o w e d t o s t i r o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e . N H a C l ( 6 0 m L , s a t u r a t e d s o l u t i o n i n w a t e r ) w a s a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r 1 0 m i n u t e s a n d s u b s e q u e n t l y e x t r a c t e d w i t h e t h y l a c e t a t e ( 3 X ) . T h e o r g a n i c e x t r a c t s w e r e c o m b i n e d d r i e d , fi l t e r e d , c o n c e n t r a t e d a n d t h e r e s i d u e w a s p u r i fi e d u s i n g c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y o n s i l i c a g e l u s i n g h e x a n e t o y i e l d c o m p o u n d V - 1 3 ( 0 . 5 2 g , 5 7 % ) a s y e l l o w s o l i d . l H N M R ( 3 0 0 M H z , C D C I 3 ) 8 1 . 9 0 - 1 . 9 9 ( m , 2 H ) , 2 . 8 5 ( t , 2 H , J = 6 . 3 H z ) , 3 . 3 3 ( t , 2 H , J : 6 . 3 H z ) , 7 . 1 8 - 8 . 9 3 ( m , 9 H ) ; l 3 C N M R ( 7 4 . 4 7 M H z , C D C 1 3 ) 8 2 2 . 3 3 , 2 8 . 0 5 , 3 0 . 4 1 , 1 2 5 . 9 4 , 1 2 6 . 0 7 , 1 2 7 . 7 5 , 1 2 8 . 7 4 , 1 2 8 . 8 3 , 1 3 0 . 7 1 , 1 3 2 . 4 7 , 1 3 2 . 6 5 , 1 3 2 . 9 6 , 1 4 2 . 5 3 , 1 4 8 . 5 7 , 1 6 0 . 1 1 , 1 6 6 . 8 6 ; L R M S m / e ( C 1 9 H 1 5 N 0 2 ) ( M ) 2 8 9 . 1 . 3 3 1 ( 4 Z ) - 4 - ( 2 , 3 - d i h y d r o n a p h t h a l e n - 4 ( 1 H ) - y l i d e n e ) - 2 - m e t h y l o x a z o l - 5 ( 4 H ) - o n e , V - 1 4 . A s o l u t i o n o f T i C l 4 ( 1 . 1 1 m L , 1 0 . 0 9 m m o l ) i n C H 2 C 1 2 ( 5 m L ) w a s a d d e d i n t o T H F ( 2 5 m L ) a t - 1 0 ° C . a - t e t r a l o n e ( 0 . 3 6 g , 2 . 5 2 m m o l ) a n d 2 - p h e n y l a z l a c t o n e ( 0 . 5 g , 5 . 0 4 m m o l ) w e r e s u b s e q u e n t l y a d d e d a n d a l l o w e d t o s t i r a t 0 ° C f o r 2 0 m i n u t e s . P y r i d i n e ( 1 . 1 3 m L , 2 0 . 1 8 m m o l ) w a s t h e n a d d e d o v e r a 3 0 m i n u t e s p e r i o d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s t i r r e d a t 0 ° C f o r a d d i t i o n a l 2 h o u r s a n d t h e n a l l o w e d t o s t i r o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e . N H a C l ( 4 0 m L , s a t u r a t e d s o l u t i o n i n w a t e r ) w a s a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r 1 0 m i n u t e s a n d s u b s e q u e n t l y e x t r a c t e d w i t h e t h y l a c e t a t e ( 3 X ) . T h e o r g a n i c e x t r a c t s w e r e c o m b i n e d d r i e d , fi l t e r e d , c o n c e n t r a t e d a n d t h e r e s i d u e w a s p u r i fi e d u s i n g c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y o n s i l i c a g e l u s i n g h e x a n e t o y i e l d c o m p o u n d V - l 4 ( 0 . 3 5 g , 6 1 % ) a s y e l l o w s o l i d . P a r t i a l c h a r a c t e r i s a t i o n o f v . 1 4 . ' H N M R ( 3 0 0 M H z , c 0 0 1 3 ) 8 1 . 9 0 - 1 . 9 9 ( m , 2 H ) , 2 . 8 5 ( t , 2 H , J = 6 . 3 H z ) , 3 . 3 3 ( t , 2 H , J : 6 . 3 H z ) , 7 . 1 8 - 8 . 9 3 ( m , 9 H ) ; 1 3 C N M R ( 7 4 . 4 7 M H z , C D C l 3 ) 8 1 5 . 3 1 , 2 2 . 2 9 , 2 7 . 6 8 , 3 0 . 2 6 , 1 2 5 . 9 4 , 1 2 6 . 0 3 , 1 2 6 . 6 9 , 1 2 7 . 9 9 , 1 2 8 . 6 8 , 1 3 0 . 5 9 , 1 3 2 . 4 3 , 1 4 2 . 2 7 , 1 4 7 . 9 6 , 1 6 2 . 2 4 , . 1 6 7 . 1 4 . I R ( n e a t ) : 2 9 3 5 . 1 , 2 8 5 5 , 1 7 5 6 . 8 , 1 6 4 8 . 8 , 1 2 7 0 . 9 c m " ; L R M S ( C 1 4 H 1 3 N 0 2 ) m / e ( M ) 2 2 7 . 3 3 3 2 5 - ( 2 - A m i n o - 5 - o x o - 1 , 5 - d i h y d r o - i m i d a z o l - 4 - y l i d e n e ) - 3 , 4 , 5 , l O - t e t r a h y d r o - Z H - a z e p i n o [ 3 , 4 - b ] i n d o l - l - o n e , V - l H o H 2 N ‘ < \ N \ O \ N H H o L i H ( 1 6 m g , 2 m m o l ) w a s d i s s o l v e d i n e t h a n o l ( 6 0 m L ) a n d t o t h i s s o l u t i o n S - b e n z y l i s o t h i o u r o n i u m c h l o r i d e ( 4 0 5 m g , 2 m m o l ) w a s a d d e d a n d a l l o w e d t o s t i r u n t i l t h e s o l u t i o n b e c a m e c l e a r . C o m p o u n d V - l l ( 1 5 0 m g , 0 . 4 m m o l ) w a s a d d e d a n d t h e r e a c t i o n w a s h e a t e d a t r e fl u x f o r 4 8 h o u r s . A f t e r c o o l i n g t h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d i n v a c u o . E t h a n o l ( 2 0 m L ) a d d e d a n d s u b s e q u e n t l y e v a p o r a t e d 3 t i m e s . E t h a n o l ( 5 m L ) w a s a d d e d a g a i n a n d t h e r e a c t i o n w a s r e fl u x e d f o r 3 h o u r s . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d i n v a c u u m , 1 N H C l ( , q ) ( 1 5 m L ) w a s a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s e x t r a c t e d w i t h n - b u t a n o l ( 3 x 1 5 m L ) , t h e e x t r a c t s w e r e w a s h e d w i t h b r i n e ( 3 x 1 0 m L ) , d r i e d , c o n c e n t r a t e d a n d t h e p r o d u c t w a s p u r i fi e d t w i c e b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y o n s i l i c a g e l ( C H 2 C 1 2 : M e O H , 4 : 1 ) t o y i e l d c o m p o u n d V - l ( 3 5 m g , 2 8 % ) a s a l i g h t y e l l o w s o l i d . M p : > 2 6 0 ° C ; V - l : 1 H N M R ( 3 0 0 M H z , d 6 - D M S O ) 8 3 . 2 0 - 3 . 4 0 ( b r , 4 H ) , 7 . 1 6 ( t , 1 H , J = 1 2 . 0 H z ) , 7 . 2 9 ( t , 1 H , J = 1 2 . 0 H z ) , 7 . 5 2 ( m , 2 H ) , 8 . 3 0 - 8 . 5 0 ( m , 2 H ) , 9 . 0 5 - 9 . 2 5 ( b r . , 1 H ) , 1 0 . 3 0 - 1 0 . 4 0 ( m , 1 H ) , 1 2 . 4 8 ( s , 1 H ) ; l 3 C N M R : ( 1 2 4 . 1 M H z ) , d 6 - D M S O ) 8 3 6 . 5 , 3 9 . 2 , 1 1 2 . 7 , 1 1 3 . 5 , 1 2 1 . 9 , 1 2 2 . 3 , 1 2 2 . 8 , 1 2 4 . 5 , 1 2 5 . 0 , 1 2 8 . 6 , 1 3 2 . 8 , 1 3 7 . 0 , 1 5 4 . 6 , 1 6 3 . 4 , 1 6 5 . 5 ; I R : ( K B r - p e l l e t ) 3 2 9 4 , 1 6 2 0 , 1 4 7 5 , 1 2 5 1 c m ' ; L R M S ( E 1 ) : 2 9 5 . 1 ( M ) ; H R M S ( F A B ) ( C 1 5 H 1 4 N 5 0 2 ) ( M + H ) 2 9 6 . 1 1 4 8 , f o u n d 2 9 6 . 1 1 4 4 . V - 1 . H C I : I H N M R ( 5 0 0 M H Z , 3 3 3 d 6 - D M S O ) 8 3 . 2 7 - 3 . 3 8 ( b r , 4 H ) , 7 . 1 6 ( t , 1 H , J = 7 . 5 H z ) , 7 . 2 8 ( t , 1 H , J = 7 . 5 H z ) , 7 . 4 0 ( d , 1 H , 8 H z ) , 7 . 4 9 ( d , 1 H , 8 H 2 ) 8 . 1 8 ( b r , 1 H ) , 8 . 4 9 ( h r , 1 1 1 ) , 1 2 . 0 8 ( s , 1 H ) ; l 3 C N M R : ( 1 4 8 . 9 M H z ) , d 6 - D M S O ) 8 3 4 . 4 , 4 0 . 0 , 1 1 2 . 7 , 1 1 4 . 2 , 1 1 6 . 6 , 1 2 0 . 4 , 1 2 1 . 5 , 1 2 3 . 9 , 1 2 8 . 3 , 1 2 8 . 6 , 1 3 0 . 4 , 1 3 6 . 2 , 1 6 0 . 1 , 1 6 6 . 5 , 1 7 7 . 1 L R M S ( E l ) : 2 9 5 . 2 ( M ) ; F A B + ( L R M S ) : 2 9 6 . 0 7 F A B - ( L R M S ) : 3 4 . 9 9 , 3 7 . 0 A n a l . C a l c d ( C 1 5 H 1 5 N 5 0 2 C l ) : C , 5 4 . 3 ; H , 4 . 2 5 ; N , 2 1 . 1 1 ; f o u n d : C , 5 5 . 8 5 ; H , 4 . 2 7 ; N , 2 0 . 6 1 . 5 - ( 2 - A m i n o - S - o x o - 1 , S - d i h y d r o - i m i d a z o I - 4 - y l i d e n e ) - 1 0 - m e t h y l - 3 , 4 , 5 , 1 0 - t e t r a h y d r o - Z H - a z e p i n o [ 3 , 4 - b ] i n d o l - l - o n e , V - 2 H o H 2 N ‘ < \ N \ O \ N H ' 1 ) . 0 P r o c e d u r e s i m i l a r a s f o r c o m p o u n d V - l t o p r o v i d e c o m p o u n d V - 2 f r o m V - 1 2 . T h e p r o d u c t V - 2 w a s p u r i fi e d b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y o n s i l i c a g e l e l u t i n g w i t h C H 2 C 1 2 : M e O H , ( 8 5 : 1 5 ) f o l l o w e d b y C H 2 C 1 2 : M e O H , ( 8 8 : 1 2 ) t o y i e l d c o m p o u n d V - 3 a s l i g h t y e l l o w s o l i d ( 9 6 m g , 3 1 % ) . M p : > 2 6 0 ° C . 1 H N M R : ( 3 0 0 M H z , d 6 - D M S O ) 8 2 . 9 9 - 3 . 4 8 ( m , 4 H ) 3 . 9 2 ( s , 3 H ) , 7 . 1 9 ( t , 1 H , J = 7 . 2 H z ) , 7 . 3 6 ( t , 1 H , J = 6 . 6 H z ) , 7 . 5 5 ( d , 1 H , J = 8 . 1 H z ) , 7 . 6 5 ( d , 1 H , J = 8 . 4 H z ) , 8 . 5 7 ( t , 1 H , J = 5 . 1 1 1 2 ) , 9 . 1 5 9 2 5 ( b r - s , l H ) , 1 0 . 4 8 ( s , 1 H ) ; l 3 c N M R : ( 7 4 . 4 7 M H z , d “ - D M S O ) 8 3 2 . 1 , 3 7 . 1 , 3 8 . 4 , 1 1 1 . 7 , 1 1 2 . 6 , 1 2 2 . 1 , 1 2 2 . 2 , 1 2 3 . 5 , 1 2 3 . 7 , 1 2 5 . 1 , 1 2 8 . 1 , 1 3 2 . 8 , 1 3 8 . 5 , 1 5 4 . 6 , 1 6 3 . 0 , 1 6 5 . 1 ; I R : ( K B r - p e l l e t ) 3 2 1 1 , 1 6 9 9 , 1 6 3 5 , 1 5 0 8 , 1 4 7 7 3 3 4 c m " ; L R M S ( 1 3 1 ) : 3 0 8 . 7 ( M ) ; H R M S m / e ( C . , H . , N , o z ) ( M ) 3 0 9 . 1 3 0 4 , f o u n d 3 0 9 . 1 2 9 1 . M e t h y l 4 , 5 - d i h y d r o - 5 - o x o - 2 - p h e n y l o x a z o l e - 4 - c a r b o x y l a t e , V - 1 8 . P h \ " ’ 0 0 " f O O M e A s o l u t i o n o f V - 1 0 ( 1 . 8 6 m m o l ) i n T H F ( 2 0 m L ) a t 0 ° C w a s m i x e d w i t h m e t h y l c h l o r o f o r m a t e ( 2 . 0 4 6 m m o l ) , D M A P ( 0 . 0 9 3 m m o l ) a n d T E A ( 2 . 0 4 6 m m o l ) , a n d a l l o w e d t o s t i r f o r 3 h . A d a r k b r o w n p r e c i p i t a t e w a s f o r m e d w h i c h w a s fi l t e r e d , d r i e d a n d c h a r a c t e r i z e d . Y i e l d : 1 0 0 m g , 3 0 % . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( D M S O - d 6 ) 8 T M S : 3 . 6 5 8 ( 3 H , s ) , 7 . 5 0 4 ( 3 H , 8 ) , 7 . 9 1 4 ( 2 H , s ) . ” C N M R ( 7 5 M H z ) ( D M S O - d 6 ) 8 : 5 0 . 1 , 1 2 5 . 8 , 1 2 7 . 6 , 1 2 8 . 3 , 1 2 9 . 0 , 1 3 0 . 9 , 1 4 6 . 2 , 1 6 2 . 0 , 1 6 6 . 3 , 1 6 7 . 7 I R ( N a C l , C D C 1 3 ) : 3 2 0 0 , 2 9 2 4 . 4 , 1 7 7 8 . 6 , 1 6 3 5 . 8 c m " . M S ( E I ) : M - ( C O O M e ) , 1 6 1 . 0 . N - ( ( Z ) - 2 - a m i n o - l , 2 - d i c y a n o v i n y l ) b e n z a m i d e , V - 1 9 . N C I H T P h N C N l - E A s u s p e n s i o n o f D A M N ( 9 . 2 5 m m o l ) i n p y r i d i n e ( 4 0 m L , d r y ) a t 0 ° C w a s m i x e d w i t h b e n z o y l c h l o r i d e ( 1 0 . 1 8 m m o l ) w i t h c o n t i n u o u s s t i r r i n g . T h e m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r 1 2 h a n d t h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d . A d d e d 1 0 m L H 2 0 a n d fi l t e r e d . D r i e d t o o b t a i n V - 1 9 i n 2 . 1 g , 9 8 % y i e l d . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( D M S O - d 6 ) 8 T M S : 7 . 4 2 4 ( 2 H , s , e x c h a n g e a b l e ) , 7 . 4 9 4 - 7 . 5 1 9 ( 3 H , m ) , 7 . 9 2 8 ( 2 H , d , J = 7 . 8 H z ) , 9 . 6 ( 1 H , s , e x c h a n g e a b l e ) . ” c N M R ( 7 5 M H z ) ( D M S O - d 6 ) 8 : 5 0 . 1 , 1 2 5 . 8 , 3 3 5 1 2 7 . 6 , 1 2 8 . 3 , 1 2 9 . 0 , 1 3 0 . 9 , 1 4 6 . 2 , 1 6 2 . 0 , 1 6 6 . 3 , 1 6 7 . 7 I R ( N a C l , C D C 1 3 ) : 3 3 2 1 . 8 , 3 2 0 4 . 1 , 2 9 2 4 . 4 , 2 2 0 8 . 7 , 1 7 7 6 . 6 , 1 6 3 9 . 7 c m " . M S ( E I ) : M ” : 2 1 2 . 4 ( e x p e c t e d = 2 1 2 g / m o l ) . A n a l . C a l c d . F o r . C a n N a O : C ; H , 3 . 8 ; N , 2 6 . 4 . F o u n d H , 4 . 1 ; N , 2 2 . 8 7 . 2 - p h e n y l - 1 H - i m i d a z o l e - 4 , 5 - d i c a r b o x y l i c a c i d , V - 2 0 : H C O O H P h — < \ I N C O O H T a r t a r i c a c i d ( 1 g , 6 . 6 7 m m o l ) w a s s u s p e n d e d i n a m e c h a n i c a l l y s t i r r e d m i x t u r e o f c o n c . H N O 3 a n d f u m i n g H N O 3 . C o n c . H 2 8 0 4 w a s a d d e d u n t i l t e m p e r a t u r e r o s e t o 3 8 0 C . T h e t e m p e r a t u r e a t t h i s s t a g e w a s m a i n t a i n e d b e t w e e n 3 8 - 4 3 ° C . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s t h e n c h i l l e d i n i c e f o r l b a n d t h e n fi l t e r e d t h r o u g h g l a s s w o o l o r a s i n t e r e d f u n n e l . D r i e d a n d a d d e d c r u s h e d i c e w i t h v i g o r o u s s t i r r i n g . C o o l e d t o - 1 0 ° C . N e u t r a l i z e d w i t h c o n e . N I L O H ( ~ 4 5 m l ) . A d d e d P h C H O ( 0 . 7 g , 6 . 6 6 m m o l ) a n d N H . ; O H ( 2 0 m l ) a n d s t i r r e d a t 0 0 C f o r 2 0 h . N e u t r a l i z e d w i t h c o n c . H C I . F i l t e r e d , d r i e d a n d c h a r a c t e r i z e d V - 2 0 . Y i e l d ( 5 0 % ) I H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( D M S O - d 6 ) 8 : 7 . 0 4 ( 1 H , s , e x c h a n g e a b l e ) , 7 . 2 1 6 ( 1 H , s , e x c h a n g e a b l e ) , 7 . 3 8 6 ( 1 H , s , e x c h a n g e a b l e ) , 7 . 5 4 - 7 . 5 6 ( 3 H , m ) , 7 . 1 6 4 ( 2 H , d , J = 8 . 1 H z ) . 1 3 C N M R ( 1 2 4 . 4 M H z ) ( D M S O - d 6 ) 8 : 1 2 4 . 6 , 1 2 7 . 8 , 1 2 8 . 8 , 1 3 0 . 5 , 1 3 1 . 4 , 1 4 5 . 2 , 1 6 0 . 5 I R ( N a C l , C D C 1 3 ) : 2 9 2 4 . 4 ( b r o a d ) , 1 5 9 5 . 3 , 1 4 8 7 . 3 c m " . M S ( E I ) : W : 2 3 2 . 3 ( e x p e c t e d = 2 3 2 . 2 g / m o l ) . A n a l . C a l c d . F o r . C ; . H g N a n z C , 5 6 . 9 ; H , 3 . 4 7 ; N , 1 2 . 0 6 . F o u n d C , 5 5 . 0 5 ; H , 3 . 3 ; N , 1 2 . 2 3 . 3 3 6 D i m e r i z e d a c i d c h l o r i d e o f t h e 2 - p h e n y l i m i d a z o l e d i c a r b o x y l i c a c i d , V - Z l . c r o c 0 P h P h 0 C O C ) A s u s p e n s i o n o f V - 2 0 ( 1 g , 4 . 3 1 m m o l ) i n d r y b e n z e n e ( 1 0 m L ) c o n t a i n i n g D M F ( 0 . 5 m L ) a n d S O C ) ; ( 7 . 5 m L ) w a s s t i r r e d a t 8 5 ° C f o r 6 h . E v a p o r a t e d t h e s o l v e n t a n d c o n c e n t r a t e d i n v a c u o t o g i v e t h e d i m e r a s a y e l l o w s o l i d . Y i e l d : 0 . 7 5 g , 3 8 % y i e l d . M . P . > 2 6 0 ° c ' H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( D M S O - d 6 ) 6 : 7 . 3 4 - 7 . 7 6 ( 1 0 H , m ) l 3 C N M R ( 1 2 4 . 4 M H z ) ( D M S O - d 6 ) 8 : 1 2 1 . 9 , 1 2 7 . 8 , 1 2 8 . 9 , 1 2 9 . 6 , 1 3 0 . 7 , 1 4 1 . 7 , 1 4 9 . 1 1 3 , 1 5 0 . 1 , 1 6 2 . 6 I R ( N a C l , C D C 1 3 ) : 2 9 2 6 . 4 , 1 7 5 1 . 9 , 1 6 1 0 . 7 c m " . M S ( E I ) : W : 4 6 4 . 0 ( e x p e c t e d = 4 6 4 . 0 g / m o l ) . A n a l . C a l c d . F o r . s z H m N 4 C 1 2 0 4 : C , 5 6 . 7 9 ; H , 2 . 1 7 ; N , 1 2 . 0 4 . F o u n d C , 5 0 . 1 2 ; H , 2 . 0 2 ; N , 1 0 . 2 5 ( c o r r e s p o n d s t o t h e m o n o m e r , t h e m o l e c u l e p r o b a b l y f r a g m e n t e d o n h e a t i n g ) . M e t h y l 4 - ( 2 - ( e t h o x y c a r b o n y l ) e t h y l c a r b a m o y l ) - 2 - p h e n y l - l H - i m i d a z o l e - S - c a r b o x y l a t e , V - 2 2 . N N N C O O E t P h — < ’ | H N 0 0 2 M e A s u s p e n s i o n o f V - 2 1 ( 0 . 4 3 m m o l ) w a s s t i r r e d i n M e O H f o r 3 h a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e y e l l o w s o l i d ( d i e s t e r ) w a s fi l t e r e d a n d d r i e d i n v a c u o . T h i s s o l i d w a s t h e n t a k e n i n C H 2 C 1 2 a n d m i x e d w i t h B - a l a n i n e H C l ( 0 . 8 6 m m o l ) a n d T E A ( 2 . 5 8 m m o l a n d s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t . T h e s o l i d d i s s o l v e d . E v a p o r a t e d t h e s o l v e n t a n d e x t r a c t e d i n E t O A c / Z N H C l . W a s h e d t h e o r g a n i c l a y e r a n d d r i e d t o o b t a i n 9 9 . 3 % p r o d u c t . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C l 3 ) 8 T M S : 1 . 2 5 3 3 7 ( 3 H , t , J = 7 . 2 H z ) , 2 . 6 1 ( 2 H , t , J = 6 H z ) , 3 . 7 1 ( 2 H , t , J = 6 . 3 H z ) , 4 . 0 0 4 ( 3 , s ) , 4 . 1 7 0 ( 2 H , q , I = 6 . 9 H z ) , 4 . 7 3 7 ( 1 H , s , b r o a d ) , 7 . 4 2 - 7 . 4 4 ( 3 H , m ) , 7 . 9 6 - 8 . 0 0 2 ( 2 H , m ) . l 3 C N N I R ( 1 2 4 . 4 M H Z ) ( C D C l 3 ) 5 : 1 3 . 8 , 3 4 . 0 , 3 4 . 9 , 5 2 . 5 , 6 0 . 8 , 1 2 5 . 9 , 1 2 6 . 2 , 1 2 7 . 9 , 1 2 8 . 5 , 1 2 9 . 4 , 1 3 0 . 6 , 1 3 3 . 0 , 1 4 9 . 2 , 1 5 9 . 7 , 1 6 5 . 4 , 1 7 1 . 9 I R ( N a C l , C D C 1 3 ) ; 3 2 3 1 . 1 , 3 0 7 6 . 8 , 2 9 2 8 . 3 , 1 7 3 4 . 2 , 1 6 8 7 . 9 , 1 6 4 3 . 5 , 1 1 8 8 . 3 c m ' l . M S ( E I ) : M : 3 4 5 . 1 ( e x p e c t e d = 3 4 5 . 1 g / m o l ) . A n a l . C a l c d . F o r . C 1 7 H 1 9 N 3 0 5 : C , 5 9 . 1 ; H , 5 . 5 5 ; N , 1 2 . 1 7 . F o u n d C , 5 8 . 3 2 ; H , 5 . 6 ; N , 1 1 . 3 8 . E t h y l 3 - ( 4 - m e t h o x y p h e n e t h y l a m i n o ) p r o p a n o a t e , V - 2 3 . H P M E K / N \ / \ c o o r s t A s u s p e n s i o n o f B - a l a n i n e e t h y l e s t e r ( 6 . 1 6 g , 4 0 . 1 m m o l ) i n 1 5 0 m l a b s o l u t e e t h a n o l w a s m a i n t a i n e d a t r o o m t e m p e r a t u r e . p — a n i s a l d e h y d e ( 5 g , 3 6 . 4 m m o l ) a n d T E A ( 4 . 0 5 m l , 4 0 . 1 m m o l ) w e r e a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s s t i r r e d f o r a b o u t 6 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s c o n c e n t r a t e d i n v a c u o t o y i e l d a y e l l o w w h i t e s o l i d . E t h a n o l ( 5 0 m l ) w a s a d d e d t o d i s s b l v e t h i s s o l i d . N a C N B H 3 ( 2 . 5 2 g , 4 0 . 1 m m o l ) w a s a d d e d t o t h i s r e a c t i o n m i x t u r e . T h e m i x t u r e t u r n e d t u r b i d i n a b o u t 3 m i n u t e s . A l l o w e d t o s t i r f o r 3 0 m i n u t e s f o r t h e r e a c t i o n t o g o t o c o m p l e t i o n . E v a p o r a t e d t h e s o l v e n t a n d a d d e d E t O A c . W a s h e d w i t h 1 N H C l . C o l l e c t e d t h e o r g a n i c l a y e r . D r i e d t h e o r g a n i c l a y e r o v e r N 3 2 8 0 4 , fi l t e r e d a n d e v a p o r a t e d i n v a c u o t o o b t a i n 6 . 5 4 g , 7 6 % o f t h e s e c o n d a r y a m i n e . l H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C l 3 ) 8 : 1 . 0 6 ( 3 H , t , J = 7 . 2 H z ) , 2 . 3 2 ( 2 H , t , J = 6 . 6 H z ) , 2 . 6 9 ( 2 H , t , J = 6 . 6 H z ) , 3 . 5 4 ( 2 H , s ) , 3 . 5 8 ( 3 H , s ) , 3 . 9 3 ( 2 H , q , J = 7 . 2 H z ) , 6 . 6 5 ( 2 H , d , J = 9 . 0 H z ) , 7 . 0 3 ( 2 H , d , J : 8 . 7 H z ) . l 3 C N M R ( 1 2 4 . 4 M H z ) ( C D C l 3 ) 8 : 1 3 . 9 , 3 4 . 4 3 , 4 4 . 0 7 , 5 2 . 8 1 , 5 4 . 8 0 , 5 9 . 9 9 , 3 3 8 fl — a m ‘ fi F . 1 1 3 . 4 0 , 1 2 8 . 8 8 , 1 3 2 . 0 2 , 1 5 8 . 2 7 , 1 7 2 . 4 0 I R ( N a C l , C D C 1 3 ) : 3 3 0 0 . 1 , 2 9 8 0 . 2 , 2 8 3 5 . 7 , 1 7 3 2 . 3 , 1 5 1 2 . 4 , 1 0 3 5 . 9 c m " . M e t h y l 4 - ( N - ( 2 - ( e t h o x y c a r b o n y l ) e t h y l ) - N - ( 4 - m e t h o x y b e n z y l ) c a r b a m o y l ) - 2 - p h e n y l - l H - i m i d a z o I e - S - c a r b o x y l a t e , V - 2 4 . 0 w o n H N C O " ’ M ‘ D C O O E t 0 M 6 A s u s p e n s i o n o f V - 2 1 ( 0 . 1 5 m m o l ) w a s s t i r r e d i n M e O H f o r 3 h a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e y e l l o w s o l i d ( d i e s t e r ) w a s fi l t e r e d a n d d r i e d i n v a c u o . T h i s s o l i d w a s t h e n t a k e n i n C H 2 C 1 2 a n d m i x e d w i t h N - p - m e t h o x y b e n z y l B e a l a n i n e t h e y ] e s t e r . H C l ( 7 6 . 1 m g , 0 . 3 2 m m o l ) a n d T E A ( 9 2 . 7 m g , 0 . 9 1 m m o l ) a n d s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 6 h . E v a p o r a t e d t h e s o l v e n t a n d e x t r a c t e d i n E t O A c / 2 N H C l . W a s h e d t h e o r g a n i c l a y e r a n d d r i e d . T h e p r o d u c t w a s p u r i fi e d b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y i n E t O A c t o o b t a i n 7 % p r o d u c t . P a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n : H 1 N M R ( C D C 1 3 ) : 8 1 . 1 4 ( 3 H , t , J = 6 . 6 H z ) , 2 . 6 4 ( 2 H , m ) , 3 . 4 6 ( 2 H , m ) , 3 . 7 6 ( 3 H , 8 ) 3 . 8 7 2 ( 3 H , s ) , 4 . 1 2 ( 2 H , m ) , 4 . 4 5 ( 1 H , s ) , 4 . 7 5 ( 1 H , s ) , 6 . 8 9 - 7 . 9 2 ( 9 H , m ) . M e t h y l 4 - ( N - ( 2 - ( e t h o x y c a r b o n y l ) e t h y l ) - N - ( 4 - m e t h o x y b e n z y l ) c a r b a m o y l ) - l - ( 4 - m e t h o x y b e n z y l ) - 2 - p h e n y l - l H - i m i d a z o l e - S - c a r b o x y l a t e , V - 2 5 V - 2 4 ( 2 0 0 m g , 0 . 4 2 m m o l ) , p - m e t h o x y b e n z y l c h l o r i d e ( 1 2 1 . 1 m g , 0 . 8 5 m m o l ) , K I ( 1 0 m g , 0 . 0 6 m m o l ) , K 2 C 0 3 ( 2 3 6 . 8 m g , 1 . 7 2 m m o l ) i n a c e t o n e w e r e r e f l u x e d 3 3 9 f o r 8 h . T h e s o l v e n t w a s r e m o v e d i n v a c u o a n d e x t r a c t e d i n E t O A c a n d N 1 1 4 C l . T h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d a n d d r i e d o v e r N a 2 S O 4 . T h e r e a c t i o n w a s fi l t e r e d a n d d r i e d i n v a c u o . T h e p r o d u c t w a s p u r i fi e d o n a s i l i c a g e l c o l u m n u n d e r a g r a d i e n t c o l u m n h e x a n e : e t h e r ( 1 : 9 ) . T h e p r o d u c t w a s d r i e d a n d c h a r a c t e r i z e d . P a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f V - 2 5 . H 1 ( N M R ) ( C D C l 3 ) : 1 . 1 8 ( m , 3 H ) , 2 . 5 4 8 ( 2 H , m ) , 2 . 1 0 7 ( 2 H , m ) , 3 . 6 9 ( 3 H , s ) , 3 . 7 0 ( 3 H , s ) , 3 . 7 1 ( 3 H , s ) , 4 . 0 5 ( q , 2 H , J = 6 . 6 H z ) , 4 . 4 0 ( s , 3 H ) , 4 . 5 0 ( s , 1 H ) , 6 . 7 3 - 7 . 2 5 ( 1 3 H , m ) I n h i b i t i o n o f c e l l g r o w t h : C E M c e l l s ( C C R F — C E M ; A m e r . T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n , R o c k v i l l e , M D ) w e r e g r o w n i n R P M I - l 6 4 0 M e d i a ( G i b c o - B R L , R o c k v i l l e , M D ) s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % F e t a l B o v i n e S e r u m , p e n i c i l l i n ( 6 1 4 n g / m L ) , s t r e p t o m y c i n ( 1 0 u g / m L ) a n d H E P E S b u f f e r , p H 7 . 2 a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 . D M S O w a s u s e d a s t h e v e c t o r f o r a l l d r u g s a n d a d d e d i n t h e c o n t r o l e x p e r i m e n t s . C e l l c u l t u r e s w e r e t h e n t r e a t e d w i t h 1 0 1 1 M , 1 1 1 M , 0 . 1 1 1 M o r 1 0 n M o f t h e d r u g i n d u p l i c a t e a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e a t 3 7 ° C , 5 % C 0 2 . C e l l s w e r e s t a i n e d w i t h 4 % t r y p a n b l u e s o l u t i o n i n P B S , a n d c o u n t e d u n d e r t h e m i c r o s c o p e ( T h o m a s S c i e n t i fi c , F i s h e r S c i e n t i fi c ) i n d u p l i c a t e . T h i s w a s r e p e a t e d f o r 0 h , 2 h , 6 h , 1 2 h , 2 4 h a n d 4 8 h . T h e d a t a p o i n t s o b t a i n e d w e r e t h e n p l o t t e d a n d a p o i n t - t o - p o i n t c u r v e w a s d r a w n t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f t h e d r u g o n t h e c e l l s . 3 4 0 1 0 . 1 1 . 1 2 . R e f e r e n c e s K i b e r s t i s , P . A . S c i e n c e 2 0 0 1 , 2 9 2 , 3 9 9 — 4 0 1 . F e r b e r , D . S c i e n c e 1 9 9 9 , 2 8 5 , 1 6 5 1 - 1 6 5 3 . Z h o u , B . - B . S . , E l l e d g e , S . J . N a t u r e 2 0 0 0 , 4 0 8 , 4 3 3 - 4 3 9 . M a r t i n , N . M . B . J . P h o t o c h e m . P h o t o b i o l . B 2 0 0 1 , 6 3 , 1 6 2 - 1 7 0 . P o n d e r , B . A . J . N a t u r e 2 0 0 1 , 4 1 1 , 3 3 6 — 3 4 1 . Z h a o , S . ; W e n g , Y . - C . ; Y u a n , S . - S . F . ; L i n , Y . - T . ; H s u , H . - C . ; L i n , S . - C . J . ; G e r b i n o , B ; S o n g , M . - H . ; Z d z i e n i c k a , M . Z . ; G a t t i , R . A . ; S h a y , J . W . , Z i v , Y . S . ; L e e , E . Y . - H . P . N a t u r e 2 0 0 0 , 4 0 5 , 4 7 3 . ( a ) N a i t o , T . M a t s u u r a , A . ; I s h i k a w a , F . N a t . g e n e t . 1 9 9 8 , 2 0 , 2 0 3 - 2 0 6 . ( b ) R i t c h i e , K . B . ; M a l l o r y , J . C . ; P e t e s , T . D . M o l . C e l l . B i o l . 1 9 9 9 , 1 0 , 6 0 6 5 - 6 0 7 5 . L o w e , S . W . ; S c h m i t t , E . M . ; S m i t h , S . W . ; O s b o r n e , B . A . ; J a c k s , T . N a t u r e 1 9 9 3 , 3 6 2 , 8 4 7 - 8 4 9 . ( a ) S i e l e c k i , T . M . ; B o y l a n , J . F . ; B e n fi e l d , P . A . ; T r a i n o r , G . L . J . M e d . C h e m . 2 0 0 0 , 4 3 , 1 - 1 8 . ( b ) S r i d h a r , R . H a n s o n - P a i n t o n , 0 . ; C o o p e r , D . R . P h a r m . r e s . 2 0 0 0 , 1 7 , 1 3 4 5 - 1 3 5 3 . ( c ) T r a x l e r , P . ; B o l d , G . ; B u c h d u n g e r , E . ; C a r a v a t t i , G . ; F u r e t , P . ; M a n l e y , P . ; O ' R e i l l y , T . ; W o o d , J ; Z i m m e r m a n n , J . M e d . R e s . R e v . 2 0 0 1 , 2 1 , 4 9 9 - 5 1 2 . ( ( 1 ) S c a p i n , G . D r u g d i s c o v e r y t o d a y 2 0 0 1 , 7 . ( e ) T o o g o o d , P . 1 . M e d . R e s . R e v . 2 0 0 1 , 2 1 , 4 8 7 - 4 9 8 . ( f ) B r i d g e s , A . J . C h e m . R e v . 2 0 0 1 , 1 0 1 , 2 5 4 1 - 2 5 7 2 . C u r m a n , D . ; C i n e l , B . ; W i l l i a m s , D . E . ; R u n d l e , N . ; B l o c k , W . D . ; G o o d a r z i , A . A . ; H u t c h i n s , J . R . ; C l a r k e , P . R . ; Z h o u , B . - B . ; L e e s - M i l l e r , S . P . ; A n d e r s e n , R . J . ; R o b e r g e , M . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 1 , 2 7 6 , 1 7 9 1 4 - 1 7 9 1 9 . ( a ) R u n d l e , N . T . ; X u , L . ; A n d e r s o n , R . J . ; R o b e r g e , M . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 1 , 2 7 6 , 4 8 2 3 1 - 4 8 2 3 6 . ( b ) J a c k s o n , J . R . ; G i l m a r t i n , A . ; I m b u r g i a , C . ; W i n k l e r , J . D . ; M a r s h a l l , L . A . ; R o s h a k , A . C a n c e r R e s . 2 0 0 0 , 6 0 , 5 6 6 - 5 7 2 . ( c ) K o n i a r a s , K . ; C u d d i h y , A . R . ; C h r i s t o p o u l o s , H . ; H o g g , A . ; O ' C o n n e l l , M . J . O n c o g e n e 2 0 0 1 , 2 0 , 7 4 5 3 - 7 4 6 3 . ( ( 1 ) Z h o u , B . - B . S . , A n d e r s o n , H . J . ; E l l e d g e , S . J . C a n c e r B i o l o g y a n d T h e r a p y 2 0 0 3 , 2 , $ 1 6 - 8 2 2 . ( e ) Y u , Q . ; L a R o s e , J . ; Z h a n g , H . ; T a k e m u r a , H . ; K o h n , K . W . ; P o m m i e r , Y . C a n c e r R e s . 2 0 0 2 , 6 2 , 5 7 4 3 - 5 7 4 8 . T e r r e t t , N . K . C o m b i n a t o r i a l C h e m i s t r y , O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s , 1 9 9 8 . 3 4 1 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . ( a ) S c h r e i b e r , S . L . S c i e n c e 2 0 0 0 , 2 8 7 , 1 9 6 4 - 1 9 6 9 . ( b ) O r t h o l a n d , J . — Y . ; G a n e s a n , A . C u r r . O p i n . C h e m . B i o l . 2 0 0 4 , 8 , 2 7 1 - 2 8 0 . ( a ) G a r r i d o - H e m a n d e z , H . ; N a k a d a i , M . ; V i m o l r a t a n a , M . ; L i , Q . ; D o u n d o u l a k i s , T . ; H a r r a n , P . G . A n g e w . C h e m . I n t . E d . 2 0 0 5 , 4 4 , 7 6 5 - 7 6 9 . ( b ) K i n n e l , R . B . ; G e h r e n , H . - P . ; S c h e u e r , P . J . ; G r a v a l o s , D . G . ; F a i r c l o t h , G . T . E u r . P a t . A p p l . 1 9 9 4 , E P 9 4 - 3 0 2 7 7 0 , 1 9 9 4 0 4 1 9 . O l o f s o n , A . ; Y a k u s h i j i n , K . ; H o r n e , D . A . J . O r g . C h e m . 1 9 9 8 , 6 3 , 1 2 4 8 - 1 2 5 3 . P o u l l e n n e c , K . G . ; K e l l y , A . T . ; R o m o , D . O r g . L e t t . 2 0 0 2 , 4 , I 6 , 2 6 4 5 - 2 6 4 8 . M o u r a b i t , A . A . ; P o t i e r , P . E u r . J . O r g . C h e m . 2 0 0 1 , 2 3 7 - 2 4 3 . ( a ) C i m i n o , G . ; D e R o s a , S . ; D e S t e f a n o , D . ; M a z z a r e l l a , L . ; P u l i t i , R . ; S o d a n o , G . T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 8 2 , 2 3 , 7 6 7 - 7 6 8 . ( b ) P e t t i t , G . R . ; h e r a l d , C . L . ; L e e t , J . E . ; G u p t a , R . ; S c h a u f e l b e r g e r , D . E . ; B a t e s , R . B . ; C l e w l o w , P . J . ; D o u b e k , D . L . ; M a n f r e d i , K . P . C a n . J . C h e m . 1 9 9 0 , 6 8 , 1 6 2 1 . ( c ) S u p r i y o n o , A . ; S c h w a r t z , B . ; W r a y , V . ; W i t t e , L . ; M u l l e r , W . E . G . ; v a n S o e s t , R . ; S u m a r y o n o , W . ; P r o k s c h , P . N a t u r f o r s c h . 1 9 9 6 , 5 0 0 , 6 6 9 . ( a ) C a fi e r i , F . ; F a t t o r u s s o , E . ; M a n g o n i , A . ; T a g l i a l a t e l a - S c a f a t i , O . T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 9 6 , 3 7 , 3 5 8 7 . ( b ) K o b a y a s h i , J . ; O h i z u m i , Y . ; N a k a m u r a , H . ; H i r a t a , Y . E x p e r i e n t i a 1 9 8 6 , 4 2 , 1 1 7 6 . W a n , Y . ; H u r , W . ; C h o , C . Y . ; L i u , Y . ; A d r i a n , F . J . ; L o z a c h , 0 . ; B a c h , S . ; M a y e r , T . ; F a b b r o , D . ; M e i j e r , L . ; G r a y , N . S . C h e m . B i o l . 2 0 0 4 , I I , 2 4 7 - 2 5 9 . ( a ) B r e t o n , J . J . ; C h a b o t - F l e t c h e r , M . C . J . P h a m i a c o l . E x p . T h e r . 1 9 9 7 , 2 8 2 , 4 5 9 - 4 6 6 ; ( b ) B a d g e r , A . M . ; C o o k , M . N . ; S w i f t , B . A . ; N e w m a n - T a r r , T . M . ; G o w e n , M . ; L a r k , M . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 1 9 9 9 , 2 9 0 , 5 8 7 - 5 9 3 . ( c ) R o s h a k , A . ; J a c k s o n , J . R . ; C h a b o t - F l e t c h e r , M . ; M a r s h a l l , L . A . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 1 9 9 7 , 2 8 3 , 9 5 5 - 9 6 1 . M e i j e r , L . ; T h u n n i s s e n . , A . - M . W . H . ; W h i t e , A . W . ; G a m i e r , M . ; N i k o l i c , M . ; T s a i , L . - H . ; W a l t e r , J . ; C l e v e r l e y , K . E . ; S a l i n a s , P . C . ; W u , Y . Z . ; B i e r n a t , J . ; M a n d e l k o w , E . M . ; K i m , S . - H . ; P e t t i t , G . R . C h e m . B i o l . 2 0 0 0 , 7 , 5 1 - 6 3 . T a s d e m i r , D . ; M a l l o n , R . ; G r e e n s t e i n , M . ; F e l d b e r g , L . R . ; K i m , S . C . ; C o l l i n s , K . ; W o j c i e c h o w i c z , D . ; M a n g a l i n d a n , G . C . ; C o n c e p c i é n , G . P . ; H a r p e r , M . K . ; I r e l a n d , C . M . J . M e d . C h e m . 2 0 0 2 , 4 5 , 5 2 9 - 5 3 2 . 3 4 2 1 _ 2 4 . 2 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . K o l c h , W . B i o c h e m . J . 2 0 0 0 , 3 5 1 ( 2 ) , 2 8 9 - 3 0 5 . M u l d e r , K . M . C y t o k i n e G r o w t h F a c t o r R e v . 2 0 0 0 , 1 1 ( 1 - 2 ) , 2 3 - 3 5 . S h a n n a , V . ; L a n s d e l l , T . A . ; J i n , G . Y . ; T e p e , J . J . J . M e d C h e m . 2 0 0 4 , 4 7 ( 1 4 ) , 3 7 0 0 - 3 7 0 3 . ( a ) G a r r e t t , M . D . ; F a t t a e y , A . C u r r . O p i n . G e n e D e v . 1 9 9 9 , 9 , 1 0 4 — 1 1 1 . ( b ) M a l u m b r e s , M . ; B a r b a c i d , M . N a t . R e v . C a n c e r 2 0 0 1 , I , 2 2 2 — 2 3 l . ( c ) A l i , A . ; H o e f l i c h , K . P . ; W o o d g e t t , J . R . C h e m . R e v . 2 0 0 1 , 1 0 1 , 2 5 2 7 - 2 5 4 0 . ( d ) I m a h o r i , K . ; U c h i d a , T . J . B i o c h e m . ( T o k y o ) 1 9 9 7 , 1 2 1 , 1 7 9 — 1 8 8 . ( e ) M a r t i n e z , A . ; C a s t r o , A . ; D o r r o n s o r o , I . ; A l o n s o , M . M e d . R e s . R e v . 2 0 0 2 , 2 2 , 3 7 3 — 3 8 4 . ( a ) P r o fi t , A . A . ; L e e , T . R . ; L a w r e n c e , D . S . J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 9 , 1 2 1 , 2 8 0 — 2 8 3 . ( b ) M a r t i n e z , A . ; A l o n s o , M . ; C a s t r o , A . ; P e r e z , C . ; M o r e n o , F . J . J . M e d . C h e m . 2 0 0 2 , 4 5 , 1 2 9 2 - 1 2 9 9 . ( a ) T r a x l e r , P . ; B o l d , G . ; F r e i , J . ; L a n g , M . ; L y d o n , N . ; M e t t , H . ; B u c h d u n g e r , E . ; M e y e r , T . ; M u e l l e r , M . ; F u r e t , P . J . M e d . C h e m . 1 9 9 7 , 4 0 , 3 6 0 1 — 3 6 1 6 . ( b ) V e s e l y , J . ; H a v l i c e k , L . ; S t m a d , M . ; B l o w , J . J . ; D o n e l l a - D e a n a , A . ; P i n n a , L . ; L e t h a m , D . S . ; K a t o , J . ; D e t i v a u d , L . ; L e c l e r c , S . ; e t a l . , E u r . J . B i o c h e m . 1 9 9 4 , 2 2 4 , ( 2 ) , 7 7 1 - 8 6 . ( c ) F o n g , T . A . T . ; S h a w v e r , L . K ; S u n , L . ; T a n g , C . ; A p p , H . ; P o w e l l , T . J . ; K i m , Y . H . ; S c h r e c k , R . ; W a n g , X . ; R i s a u , W . U l l r i c h A . ; H i r t h K . P . ; M c M a h o n G . C a n c e r R e s . 1 9 9 9 , 5 9 , 9 9 - 1 0 6 . ( d ) L e e , J . C . ; B a d g e r , A . M . ; G r i s w o l d , D . E . ; D u n n i n g t o n , D . ; T r u n e h , A . ; V o t t a , B . ; W h i t e , J . R . ; Y o u n g , P . R . ; B e n d e r , P . E . A n n . N Y A c a d S c i . 1 9 9 3 , 6 9 6 , 1 4 9 — 1 7 0 . L i n d e l , T . ; H o f f m a n n , H . T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 9 7 , 3 8 , 5 2 , 8 9 3 5 - 8 9 3 8 . A n n o u r a , H . ; T a t s o u k a , T . T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 9 5 , 3 6 , 3 , 4 1 3 - 4 1 6 . X u , Y i n g - X i , Y a k u s h i j i n , K . ; H o r n e , D . A . J . O r g . C h e m . 1 9 9 7 , 6 2 , 4 5 6 - 4 6 4 . S o s a , A . C . B . ; Y a k u s h i j i n , K . ; H o r n e , D . A . J . O r g . C h e m . 2 0 0 0 , 6 5 , 6 1 0 - 6 1 1 . C h a c u n - L e f e v r e , L . ; J o s e p h , B . ; M é r o u r , J . - Y . T e t r a h e d r o n , 2 0 0 0 , 5 6 , 4 4 9 1 - 4 4 9 9 . W a r e , E . C h e m . R e v . 1 9 5 0 , 4 6 , 4 0 3 - 4 7 0 . S o s a , A . C . B . ; Y a k u s h i j i n , K . ; H o r n e , D . A . J . O r g . C h e m . 2 0 0 2 , 6 7 , 4 4 9 8 - 4 5 0 0 . 3 4 3 3 7 . 3 8 . 3 9 . 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . 4 8 . 4 9 . M e a n w e l l , N . A . ; R o t h , H . R . ; S m i t h , E . C . ; W e d d i n g , D . L . ; W r i g h t , J . J . K . J . O r g . C h e m , 1 9 9 1 , 5 6 , 6 8 9 7 - 6 9 0 4 . ( a ) P r a g e r , R . H . ; T s o p e l a s , C . A u s t . J . C h e m . 1 9 9 2 , 4 5 , 1 7 7 1 - 1 7 7 7 . ( b ) A n d e r s o n , K . W . T r i fl u o r o m e t h a n e s u l f o n i c a c i d c a t a l y z e d F r i e n d e l - C r a f t s a c y l a t i o n w i t h B - l a c t a m s a n d s t u d i e s t o w a r d s t o t a l s y n t h e s i s o f h y m e n i a l d i s i n e , M S . T h e s i s , M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y , E a s t L a n s i n g , M I , 2 0 0 2 . M u k e r j e e , A . K . ; J o s e p h , K . ; H o m a m i , S . - S . ; T i k d a r i , A . M . H e t e r o c y c l e s , 1 9 9 1 , 3 2 , 7 , 1 3 1 7 - 1 3 2 5 . F u , M . ; F e r n a n d e z , M . ; S m i t h , M . L . ; F l y g a r e , J . A . O r g . L e t t . 1 9 9 9 , 1 , 1 3 5 1 - 1 3 5 3 . S h a r m a , V . ; T e p e , J . J . B i o o r g . M e d . C h e m . L e t t . 2 0 0 4 , 4 3 , 4 3 1 9 - 4 3 2 1 . ( a ) P e d d i b h o t l a , S . ; J a y a k u m a r , S . ; T e p e , J . J . O r g . L e t t . 2 0 0 2 , 4 , 3 5 3 3 - 3 5 3 5 . ( b ) P e d d i b h o t l a , S . ; T e p e , J . J . S y n t h e s i s 2 0 0 3 , 9 , 1 4 3 3 - 1 4 4 0 . ( a ) S t e g l i c h , W . ; H fi fl e , G . T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 7 0 , 4 7 2 7 - 4 7 3 0 . ( b ) H b f l e , G . ; S t e g l i c h , W . ; V o r b r i l g g e n , H . A n g e w . C h e m , I n t . E d . E n g l . 1 9 7 8 , 1 7 , 5 6 9 - 5 8 3 . ( c ) H a s s n e r , A . ; K r e p s k i , L . R . ; A l e x a n i a n , V . T e t r a h e d r o n l 9 7 8 , 3 4 , 2 0 6 9 - 2 0 7 6 . R u b l e , J . C . ; F u . G . C . J . A m C h e m . S o c . 1 9 9 8 , 1 2 0 , 1 1 5 3 2 - 1 1 5 3 3 . S t e g l i c h , W . ; H fi f l e , G . A n g e w . C h e m , I n t . E d . E n g l . 1 9 6 9 , 8 , 9 8 1 - 9 8 1 . D a l y , J . W . ; P a d g e t t , W . ; S h a m i m , M . T . ; B u t t s - L a m b , P . ; W a t e r s , J . J . M e d . C h e m . 1 9 8 5 , 2 8 , 4 8 7 - 4 9 2 . ' ( a ) A n d e r s o n , W . K . ; B h a t t a c h a r j e e , D . ; H o u s t o n , D . M . J . M e d . C h e m . 1 9 8 9 , 3 2 , 1 1 9 - 1 2 7 . ( b ) S n y d e r , H . R . ; H e n d r i c k , R . G . ; B r o k s , L . A . O r g . S y n t h . 1 9 4 7 , 2 2 , 6 5 . ( a ) Y a s u d a , N . ; I w a g a m i , H . ; N a k a n i s h i , E . ; N a k a m i y a , T . ; S a s a k i , Y . ; M u r a t a , T . J . A n t i b i o t . 1 9 8 3 , 3 6 , 2 4 2 . ( b ) Y a s u d a , N . J . H e t e r o c y c l i c C h e m . 1 9 8 5 , 2 2 , 4 1 3 - 4 1 6 . ( a ) M u c h o w s k i , J . M . ; S o l a s , D . R . J . O r g . C h e m 1 9 8 4 , 4 9 , 2 0 3 - 2 0 5 . ( b ) M a t t e w s , D . P . ; W h i t t e n , J . P . ; M c C a r t h y , J . R . J . H e t e r o c y c l i c C h e m . 1 9 8 7 , 2 4 , 6 8 9 - 6 9 2 . ( c ) W h i t t e n , J . P . ; M a t t e w s , D . P . ; M c C a r t h y , J . R . J . O r g . C h e m . 1 9 8 6 , 5 1 , 1 8 9 1 - 1 8 9 4 . ( ( 1 ) L i p s h u t z , B . H . ; V a c c a r o , W . ; H u f f , B . T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 8 6 , 2 7 , 4 0 9 5 - 4 0 9 8 . 3 4 4 5 0 . 5 1 . 5 2 . 5 3 . 5 4 . 5 5 . 5 6 . 5 7 . G e r a r d , C . ; R o l l i n s , B . J . N a t I m m u n o l 2 0 0 1 , 2 , 1 0 8 - 1 1 5 . H a r r i s , E . D . , J r . N . E n g l . J . M e d . 1 9 9 0 , 3 2 2 , 1 2 7 7 - 1 2 8 9 . B a e u e r l e , P . A . ; H e n k e l , T . A n n u . R e v . I m m u n o l . 1 9 9 4 , 1 2 , 1 4 1 - 1 7 9 . M o r e l a n d , L . W . J . R h e u m a t o l . 1 9 9 9 , 2 6 S u p p l 5 7 , 7 - 1 5 . H a n d e l , M . L . ; N g u y e n , L . Q . ; L e h m a n n , T . P . C l i n E x p P h a r m a c o l P h y s i o l 2 0 0 0 , 2 7 , 1 3 9 - 1 4 4 . T a k , P . P . ; F i r e s t e i n , G . S . J C l i n I n v e s t 2 0 0 1 , 1 0 7 , 7 - 1 1 . Y a m a m o t o , Y . ; G a y n o r , R . B . C u r r M o l M e d 2 0 0 1 , 1 , 2 8 7 - 2 9 6 . M a h o n , T . M . ; O ' N e i l l , L . A . J . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 5 , 2 7 0 , 2 8 5 5 7 - 2 8 5 6 4 . 3 4 5 1 - C H A P T E R V I S T R A T E G I C B I O - R E D U C T I V E A C T I V A T I O N O F T H E P R O D R U G S E L E C T I V E L Y I N T U M O R C E L L S Y o u c a n ’ t t e l l a b o o k b y i t s c o v e r ! . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . I n t r o d u c t i o n T h e d o u b l e h e l i c a l D N A i s t h e r i c h e s t s o u r c e o f i n f o r m a t i o n i n a l i v i n g o r g a n i s m . T h e s e q u e n c e c o d e s f o r R N A s y n t h e s i s v i a t r a n s c r i p t i o n w h i c h f u r t h e r g e t s t r a n s l a t e d i n t o p r o t e i n a n d e n z y m e s y n t h e s i s i m p o r t a n t f o r m e t a b o l i s m , g r o w t h , a n d s u r v i v a l o f l i v i n g b e i n g s . C u r r e n t c h e m o t h e r a p y r e l i e s p r i m a r i l y o n d r u g s s u c h a s c a m p t o t h e c i n , ' c i s - p l a t i n , 2 e t o p o s i d e , 3 b l e o m y c i n 4 e t c . w h i c h c a u s e g e n o t o x i c s t r e s s t o t h e c a n c e r c e l l . H o w e v e r , t h e c l i n i c a l e f fi c a c y o f t h e s e d r u g s i s c o m p r o m i s e d d u e t o a c t i v a t i o n o f s u r v i v a l f a c t o r s s u c h a s N F - i c B 5 a n d M D M 2 , 6 r e s i s t a n c e d u e t o a c t i v a t e d P - g l y c o p r o t e i n s 7 o r p o o r a v a i l a b i l i t y a t t h e s i t e o f a c t i o n . F u r t h e r , m o s t c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s a r e n o n - s e l e c t i v e . T h e y t a r g e t c e l l s w h i c h r e p l i c a t e f a s t , i n c l u d i n g t h o s e o f t h e g u t a n d b o n e m a r r o w . 8 C h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s r e q u i r e e f fi c i e n t p e n e t r a t i o n i n t o t h e c y t o s o l o f t h e t a r g e t c e l l s i n o r d e r t o r e a c h t h e i r i n t r a c e l l u l a r t a r g e t s a n d e x e r t t h e i r t h e r a p e u t i c a c t i v i t y . N i t r o - a n a l o g s f o r c a m p t o t h e c i n - i r i n o t e c a n a n d t o p o t e c a n a r e m o r e w a t e r s o l u b l e , h o w e v e r , t h e y t o o s u f f e r o f t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t o x i c s i d e e f f e c t s . 8 S o m e c l i n i c a l l y u s e d c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s , s u c h a s b l e o m y c i n a n d c i s p l a t i n , e x e r t a n o n p e r r n e a n t o r s e m i p e r r n e a n t c h a r a c t e r . 9 T h e s e n s i t i v i t y o f t u m o r c e l l s t o b l e o m y c i n i s h i g h l y v a r i a b l e d u e t o i t s l i m i t e d p e n e t r a t i o n t h r o u g h t h e p l a s m a m e m b r a n e . H o w e v e r , a n e w t e c h n o l o g y p h o t o c h e m i c a l i n t e r n a l i z a t i o n ( P C I ) i m p r o v e s t h e u t i l i z a t i o n o f m a c r o m o l e c u l e s i n c a n c e r t h e r a p y i n a s i t e - s p e c i fi c m a n n e r . 9 S o m e a n t i t u m o r a g e n t s s u c h a s C C - 1 0 6 5 a n d 3 4 6 d u o c a r m y c i n s a r e n a t u r a l l y o c c u r r i n g a n t i b i o t i c s w h i c h s e l e c t i v e l y a l k y l a t e t h e D N A i n a s e q u e n c e s p e c i fi c m a n n e r . 1 0 T h e s e f o r m a u n i q u e c l a s s o f c o m p o u n d s s h o w i n g i n s i t u a c t i v a t i o n w h i c h m i g h t b e c o n s i d e r e d s p e c i a l i z e d s u b s e t s o f p r o d r u g s . T h e s e u n d e r g o a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e u p o n D N A - b i n d i n g a n d g e t a c t i v a t e d f o r n u c l e o p h i l i c a t t a c k . " N H 2 N \ N 1 C ? M 9 0 0 0 T “ . 1 . . . H N D N A H N O M e O / 0 N / O M e 0 fl W e 0 u O M e O M e O M e D u o c a r m y c l n S A F i g u r e V I - l . D N A a l k y l a t i o n r e a c t i o n w i t h ‘ D u o c a r m y c i n S A . A p r o d r u g i s a p h a r m a c o l o g i c a l s u b s t a n c e ( d r u g ) w h i c h i s a d m i n i s t e r e d i n a l a t e n t , i n a c t i v e ( o r s i g n i fi c a n t l y l e s s a c t i v e ) f o r m . O n c e a d m i n i s t e r e d , t h e p r o d r u g i s m e t a b o l i z e d i n t h e b o d y u n d e r s p e c i fi c p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s ( i n v i v o ) i n t o t h e a c t i v e c o m p o u n d . T h e r a t i o n a l e b e h i n d t h e u s e o f a p r o d r u g i s g e n e r a l l y f o r A D M E ( A b s o r p t i o n , D i f f u s i o n , M e t a b o l i s m , E x c r e t i o n ) o p t i m i z a t i o n . P r o d r u g s a r e u s u a l l y d e s i g n e d t o i m p r o v e o r a l b i o a v a i l a b i l i t y - p o o r a b s o r p t i o n f r o m t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t i s u s u a l l y a l i m i t i n g f a c t o r , a n d i s o f t e n d u e t o t h e c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e d r u g . I n r a t i o n a l d r u g d e s i g n , t h e k n o w l e d g e o f c h e m i c a l p r o p e r t i e s l i k e l y t o i m p r o v e a b s o r p t i o n a n d t h e m a j o r m e t a b o l i c p a t h w a y s i n t h e b o d y a l l o w s t h e m o d i fi c a t i o n o f t h e s t r u c t u r e o f n e w c h e m i c a l e n t i t i e s f o r i m p r o v e d b i o a v a i l a b i l i t y . H o w e v e r , s o m e t i m e s t h e u s e o f a p r o d r u g i s u n i n t e n t i o n a l , e s p e c i a l l y i n t h e c a s e o f s e r e n d i p i t o u s d r u g d i s c o v e r i e s , a n d t h e d r u g , i s o n l y i d e n t i fi e d a s a p r o d r u g a f t e r e x t e n s i v e d r u g m e t a b o l i s m s t u d i e s . C u r r e n t l y u s e d p r o d r u g f o r m u l a t i o n s i n c l u d e e n a l a p r i l ( a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n g e n z y m e , A C E i n h i b i t o r ) , f o r t h e t r e a t m e n t o f 3 4 7 . ' 6 1 h e a r t f a i l u r e w h i c h h a s b e e n d e v e l o p e d a s i t s p r o d r u g b y M e r c k C o . T h e a c t i v e f o r m e n i l a p r i l a t i s a c t i v a t e d i n s i t u i n p r e s e n c e o f e s t e r a s e . 0 o H H E t O O C N x z / k n : > H O O C N J N D H O O C e s t e r a s e H : E n a ' a p fi ' E n a l a p r i l a t F i g u r e V I - 2 . C o n v e r s i o n o f d r u g ( e n a l i p r a t ) f r o m p r o d r u g ( e n a l a p r i l ) A m o n g a n t i - t u m o r a g e n t s , n i t r o g e n m u s t a r d s h a v e g a i n e d m a x i m u m i m p o r t a n c e a n d h a v e b e e n u s e d e x t e n s i v e l y f o r D N A c r o s s - l i n k i n g . 1 2 H O O J k H N N H 0 H . 1 . \ ” Z N - 7 : 0 F i g u r e V I - 3 . C o m m o n l y k n o w n n i t r o g e n m u s t a r d s . A f t e r m u c h d i l e m m a p e r t a i n i n g t o t h e m e c h a n i s m o f i n t e r s t r a n d c r o s s - l i n k i n g , r e s e a r c h f r o m H o p k i n ’ s a n d G r u e n b e r g ’ s g r o u p s i n d e p e n d e n t l y a s c e r t a i n e d t h e c o v a l e n t c r o s s - l i n k i n g w i t h D N A v i a a z i r i d i n i u m f o r m a t i o n f o l l o w e d b y a l k y l a t i o n t o a f f o r d t h e N 7 t o N 7 i n t e r s t r a n d c r o s s - l i n k i n g ( F i g u r e v 1 4 ) . ‘ 3 3 4 8 l f o r / V N C l — — - < N , 1 N " ” 2 L : < N ’ J ‘ C I H o W ” 0 7 6 1 7 1 H H _ H H O H 0 : ' - o 9 H 8 - o e r - 0 ' o - \ + W } + O M o n o - a d d u c t / \ / \ / N N H 0 ' ° ( N I N ’ J ‘ N H R o ' 1 ' 8 H I R E " ? H o 2 ” 2 N 1 I 1 + 1 ’ N H 2 H 2 N J \ \ N N o _ _ _ ’ N / l “ ’ 1 \ N g , H H N J \ ‘ N . 3 ’ F l 0 : 1 3 - 0 - ( ' 3 . F i g u r e V I - 4 . P r o p o s e d m e c h a n i s m o f D N A - D N A c r o s s l i n k i n g w i t h N - m u s t a r d s . N - 7 t o N - 7 i n t e r s t r a n d c r o s s - l i n k B . H y p o x i a a n d P r o d r u g s T u m o r h y p o x i a , a d e fi c i e n c y o f o x y g e n d u e t o a n i n e f fi c i e n t v a s c u l a t u r e , i s a l i m i t i n g f a c t o r i n b o t h t h e r a d i o t h e r a p y a n d c h e m o t h e r a p y o f s o l i d t u m o r s . M P a r a d o x i c a l l y , i t i s a l s o a n a t t r a c t i v e t h e r a p e u t i c t a r g e t , b e c a u s e s e v e r e h y p o x i a o c c u r s o n l y i n s o l i d t u m o r t i s s u e . T h e h y p o x i c e n v i r o n m e n t c a u s e s r e s i s t a n c e d u e t o v a r i o u s r e a s o n s . F i r s t l y , t h e c e l l s a r e d i s t a n t f r o m t h e b l o o d v e s s e l s , h e n c e d r u g s t h a t a r e a d m i n i s t e r e d i n t r a v e n o u s l y o r o r a l l y c a n ’ t r e a c h t h e s i t e o f a c t i o n ( F i g u r e V I - 5 ) . l s S e c o n d l y , c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n d e c r e a s e s i n s i d e t h e s o l i d t u m o r . " 5 T h i r d l y , h y p o x i a s e l e c t s f o r p 5 3 m u t a t e d c e l l s a n d f i n a l l y , i t a l s o u p - r e g u l a t e s a n t i - a p o p t o t i c f a c t o r s v i a a c t i v a t i o n o f t h e H I P p r o t e i n . l 7 T h u s , i n r e s p o n s e t o c y t o t o x i c t h e r a p y , a t u m o r s e l e c t s f o r t h e m a l i g n a n t t y p e , 1 8 i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f t u m o r i n v a s i o n ' 9 a n d c o u l d e v e n c o m p r o m i s e t r e a t m e n t b y s u r g e r y . 2 0 3 4 9 P r o l i f e r a t i o n C a p i l l a r y 0 2 D r u g C o n c e n t r a t i o F i g u r e V I - S . D e p l e t i o n o f o x y g e n , d r u g c o n c e n t r a t i o n i n s o l i d t u m o r c e l l s . S i n c e t h e o x y g e n - d e p l e t e d r e d u c t i v e m i c r o e n v i r o n m e n t o f h y p o x i c c e l l s i s u n i q u e t o s o l i d t u m o r s , i t c a n b e e x p l o i t e d f o r t h e r a p y b y n o n - t o x i c , h y p o x i a - a c t i v a t e d p r o d r u g s . C o n c e p t u a l l y , ' t r i g g e r ' u n i t s i n t h e s e d r u g s a r e s e l e c t i v e l y a c t i v a t e d i n h y p o x i c c e l l s t o r e l e a s e o r a c t i v a t e a t o x i c ' e f f e c t o r ' , c a p a b l e o f k i l l i n g s u r r o u n d i n g o x y g e n a t e d t u m o r c e l l s . U s e f u l t r i g g e r s i n c l u d e n i t r o a r o m a t i c s , q u i n o n e s , N - o x i d e s , a n d t r a n s i t i o n m e t a l s . ” F i g u r e V I - 6 i l l u s t r a t e s t h e c u r r e n t e x a m p l e s u s i n g r e d u c i n g e n v i r o n m e n t t o t a r g e t D N A a n d c a u s e g e n o t o x i c b u r d e n t o t u m o r c e l l s . 3 5 0 Z T r P e F i g u V I - 7 . C o n - v e r s i o n o f p r o d H ‘ O Z g T r P u T P Z i n t o a c t i v e T p o o B p i T o s Z l o a n * o i m n f g o o r r a a t e o - p z o i s o m e r a s e - 2 " 0 . 2 N o \ 1 e - r e d u c t a s e s : N / £ N _ . I N N / f \ 0 0 - \ § / \ \ / N N 0 2 2 \ C I D N A t o u . N 0 2 — N 0 2 _ C O N H z C O N H Z H 2 0 0 N H 2 1 e - r e d u _ c t a s e s t 0 2 N 0 A g 0 2 N 2 S N 2 3 8 6 2 _ J D N A c r o s s l l n k o F i g u r e V I - 6 . U s e o f n i t r o i m i d a z o l e s a n d m a s k e d N - m u s t a r d s f o r t a r g e t i n g D N A . D e n n y e r a l d e s c r i b e n i t r o g r o u p a s a n e l e c t r o n i c s w i t c h , 2 ' ” r e d i s t r i b u t i n g t h e e l e c t r o n d e n s i t y t o a c t i v a t e t h e N - m u s t a r d u p o n r e d u c t i o n . T h e y f o u n d t h a t t h e 2 - a m i n e ( o r t h o t o t h e a m i d e ) w a s t h e m e t a b o l i t e a n d a b o u t 2 0 0 0 f o l d s s t r o n g e r t h a n t h e i n a c t i v e p r o d r u g m o i e t y . ” A n o t h e r p r o d r u g , N - o x i d e t i r a p a z a m i n e ( T P Z ) d i s c o v e r e d b y B r o w n a n d L e e 2 2 t w o d e c a d e s a g o i s n o w i n p h a s e 1 1 ] c l i n i c a l t r i a l s . F i g u r e V 1 - 7 i l l u s t r a t e s t h e r e d u c t i o n m e c h a n i s m o f T P Z l e a d i n g t o t o p o i s o m e r a s e - 2 p o i s o n i n g . 0 . I N g N . ( ' 3 - - H 2 0 C ( N N H C E M ” - e - , H + _ C E N E / a r r ’ N N H 1 3 ‘ : N H 2 o o z q z ' 2 . O H \ ‘ p o i s i o n i n g . C o n c u r r e n t t o o u r s t u d i e s , N i c u l e s c u - D u v a z e t a l 2 3 d e s c r i b e d s e l f - i m m o l a t i v e n i t r o g e n m u s t a r d p r o d r u g s c l e a v a b l e b y c a r b o x y p e p t i d a s e C P G 2 ( F i g u r e V I - 8 ) . 3 5 1 C P G Z c l e a v a g e p o s i t i o n i X . . M a i z e - 0 H . 8 2 “ C l O O 1 ) C P G Z 7 : C ' , N \ H R ’ \ H R I — N 2 1 ' C 0 2 I / ' _ N \ / \ s p o n t a n e o u s 1 , 6 e l i m i n a t i o n - C 0 2 V C I H R , N I > e r + / \ / \ C l Z D R U G F i g u r e V I - 8 . S e l f - i m m o l a t i o n p r o d r u g g e n e r a t e s D N A c r o s s l i n k e r u p o n C P G 2 a c t i v t i y . C . R e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f D N A c r o s s - l i n k e r s . M i t o m y c i n C , ( F i g u r e V I - 9 ) a q u i n o n e a n t i b i o t i c t h a t r e q u i r e s r e d u c t i v e m e t a b o l i s m f o r a c t i v i t y , i s t h e p r o t o t y p e a n t i c a n c e r d r u g o f t h i s c l a s s o f d r u g s t h a t g e t a c t i v a t e d u p o n h y p o x i c c o n d i t i o n s . 2 4 3 5 2 0 0 - “ . - H 2 N \ \ fl H z N H 2 N D N A A - — > D N A — > N N H “ : 8 9 - o N H 2 0 . N H 2 0 D N A O x i d a t i o n \ D N A — ’ N o . N H 2 0 D N A H z N \ D N A N O N H 2 F i g u r e V I - 9 . A c t i v a t i o n o f m i t o m y c i n C ( M M C ) u n d e r r e d u c i n g c o n d i t i o n s . S o m e i m p o r t a n t b i o - r e d u c t i v e l y a c t i v a t e d d r u g s b e l o n g t o t h e F R - s e r i e s - F R 6 6 9 7 9 a n d F R 9 0 0 4 8 2 , w h i c h u n d e r g o N - O b o n d c l e a v a g e u n d e r r e d u c i n g c o n d i t i o n s t o y i e l d 2 6 w e r e t h e p i o n e e r s t o p r o p o s e t h e m i t o s e n e - l i k e i n t e r m e d i a t e s . G o t o a n d F u k u y a m a r e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f t h e F R 9 0 0 4 8 2 b e f o r e c r o s s l i n k i n g t o D N A . M M C s u n d e r g o e l e c t r o p h i l i c a c t i v a t i o n v i a a o n e o r t w o - e l e c t r o n r e d u c t i o n o n t h e q u i n i n e m o i e t y ( F i g u r e V I - 9 ) . D e r i v i n g f r o m t h i s m o d e l , t h e y p r o p o s e d t h e r e d u c t i v e c l e a v a g e o f N - O b o n d t o g e n e r a t e a n i l i n e d e r i v a t i v e w h i c h c o u l d c y c l i z e a n d d e h y d r a t e t o g i v e a z i r i d i n o m i t o s e n e - l i k e i n t e r m e d i a t e s r e s p o n s i b l e f o r t h e i r D N A d a m a g i n g a c t i v i t y . ” 2 7 3 5 3 F u r t h e r , W i l l i a m s a n d R a j s k i , d e m o n s t r a t e d t h e r e d u c t i o n w i t h F e ” , a n d p r o p o s e d a m e c h a n i s m f o r t h e r e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f F R 0 9 9 4 8 2 i n p r e s e n c e o f t h i o l s a n d F e ( I I I ) s a l t s ( F i g u r e v r - r o ) . 2 7 O C O N H z O C O N H z O H C F R - 9 0 0 4 8 2 2 F e 2 + D C D N H 2 D H { 0 O H D C D N H 2 O H C N D H c N N H H F i g u r e V I - 1 0 . P r o p o s e d m o d e l f o r F e ( 1 H ) - m e d i a t e d r e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f F R 9 0 0 4 8 2 . E n c o u r a g e d b y t h e a b i l i t y t o s e l e c t i v e l y u s e h y p o x i c c o n d i t i o n s , w e d e s i g n e d p r o d r u g m o l e c u l e s f o r N - m u s t a r d ( d r u g ) . F i g u r e V I - l l s h o w s t h e r a t i o n a l e a n d m e c h a n i s m f o r g e n e r a t i o n o f N - m u s t a r d f r o m t h e d r u g . 3 5 4 O X I C C E L L 1 e - r e d u c t a s e s . _ N D . 6 2 0 2 H Y P O X I C C E L L D 1 9 ' ” E r m a “ : D = T O X I C D R U G C l C l H C l 0 . f o g F 3 ' o H o O \ C , v r - 1 v r - 2 “ - 3 R O h y p o x i a - m e d i a t e d ] I R ’ N ‘ O J L N / \ / C l ; N M S e n z y m e - m e d i a t e d f C l b i o - a c t i v a t i o n i n T u m o r c e l l N A c r o s s l i n k s H 2 N N H 2 C e l l d e a t h F i g u r e V I - l 1 . ( T o p ) . R a t i o n a l e f o r t h e d e s i g n o f t h e p r o d r u g . ( M i d d l e ) S t r u c t u r e o f t h e p r o d r u g m o d e l s y s t e m . ( B o t t o m ) m e c h a n i s m f o r p r o d r u g r e d u c t i v e a c t i v a t i o n . E n c o u r a g e d b y t h e r e d u c t i v e a c t i v a t i o n s t u d i e s o n m o l e c u l e s s u c h a s m i t o m y c i n C a n d F R s e r i e s o f D N A c r o s s l i n k i n g a g e n t s , w e d e s i g n e d D N A c r o s s l i n k e r s ( F i g u r e V I - l l ) w h i c h w o u l d u n d e r g o c l e a v a g e a t t h e N - O b o n d . T h i s w o u l d l e a d t o t h e d e c a r b o x y l a t i o n a n d l i b e r a t i o n o f t h e N - m u s t a r d t o c r o s s - l i n k D N A . 3 5 5 ' 1 ‘ - . t . h T h e s e w e r e t r e a t e d a s a m o d e l s y s t e m f o r i d e n t i fi c a t i o n o f t u m o r s e l e c t i v e N F - K B “ p r o d r u g s ” t h r o u g h t h e i n c o r p o r a t i o n o f a r e d u c t i v e m o d e o f a c t i v a t i o n o f k n o w n N F - K B i n h i b i t o r s . A s d e s c r i b e d e a r l i e r ( C h a p t e r s l - S ) e x t r a c e l l u l a r s t i m u l i s u c h a s T N F - a , L P S , U V l i g h t , h y p o x i a a s w e l l a s a n t i - n e o p l a s t i c a g e n t s a c t i v a t e N F - i c B . 2 8 N F - K B a c t i v a t i o n l e a d s t o i n h i b i t i o n o f a p o p t o s i s a n d a c t i v a t i o n o f p r o t o - o n c o g e n e s w h i c h i n d i r e c t l y i n h i b i t t u m o r r e p r e s s o r p r o t e i n s . 2 9 T h u s , c h e m o t h e r a p e u t i c t r e a t m e n t o f t e n f a i l s a s a r e s u l t o f N F - K B d o u b l e s t i m u l u s c a u s i n g r e s i s t a n c e a n d u n f a v o r a b l e c e l l g r o w t h . ” 2 9 I n h i b i t i o n o f N F - K B h a s b e e n i d e n t i fi e d a s a p o t e n t i a l t h e r a p e u t i c t a r g e t i n d i s e a s e s s u c h a s c a n c e r a n d i n fl a m m a t i o n . T h e i m p e d i m e n t t h a t h a s o b v i a t e d i t s c l i n i c a l u t i l i t y a s a t a r g e t p r o t e i n i n c a n c e r t r e a t m e n t i s w i d e v a r i e t y o f N F - K B m e d i a t e d g e n e p r o d u c t s . A n a l t e r n a t i v e t o t h i s c o u l d b e a t u m o r s e l e c t i v e p r o d r u g m o i e t y t o c i r c u m v e n t t h e s i d e e f f e c t s . S a n g u a n a r i n e F i g u r e V I - 1 2 . R e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f N F - K B b y s a n g u a n a r i n e p r o d r u g s F i g u r e V I - 1 2 s h o w s t h e p r o d r u g f o r t h e I - i c B - a p h o s p h o r y l a t i o n i n h i b i t o r s a n g u a n a r i n e 3 ° T o q u i c k l y d e t e r m i n e t h e p r o o f o f p r i n c i p l e a n d c h e c k i f o u r d e s i g n f o r t h e p r o d r u g 3 5 6 I f ; . L ' J ‘ I - . m o i e t y w o u l d w o r k , w e f o c u s e d o n n i t r o g e n m u s t a r d s a s t h e ‘ d r u g ’ , f o r i n v i t r o a n a l y s i s o f t h e r e d u c t i v e c l e a v a g e o f t h e N - O b o n d a n d p l a n n e d f o r i n v i v o s t u d i e s i n c e l l l i n e s s u c h a s m u r i n e l e u k e m i a c e l l l i n e , L 2 1 0 a n d P 3 8 8 , c o l o r e c t a l c a r c i n o m a c e l l l i n e s C o l o n 2 6 a n d m e l a n o m a c e l l l i n e B 1 6 . 3 | T h e N - m u s t a r d r e l e a s e d i n t h e t u m o r c e l l s c a n c r o s s l i n k t h e D N A s t r a n d s b y a l k y l a t i o n , a n d h e n c e p r e v e n t t h e i n d e fi n i t e c e l l u l a r g r o w t h . D N A c r o s s - l i n k e r s p r o v e d t o b e a g o o d m o d e l f o r t h e p r o d r u g r e d u c t i v e a c t i v a t i o n b e c a u s e t h e s y n t h e s i s r e q u i r e s l i m i t e d n u m b e r o f s t e p s a n d i s t i m e - e f fi c i e n t . D . R e t r o - s y n t h e t i c a n a l y s i s f o r t h e p r o d r u g T h e r e t r o - s y n t h e t i c a n a l y s i s f o r V I - l w a s b a s e d o n f o r m a t i o n o f h y d r o x a m i c a c i d f r o m b e n z o i c a c i d ( F i g u r e V I - 1 3 ) . T h i s c o u l d t h e n b e c o n v e r t e d t o a c a r b o n a t e w h i c h w o u l d u n d e r g o a n u c l e o p h i l i c s u b s t i t u t i o n ( a s i l l u s t r a t e d i n S c h e m e V I - l ) a n d fi n a l l y a s u b s t i t u t i o n o f h y d r o x y l g r o u p s b y C 1 v i a a n S N ; m e c h a n i s m . 0 o z ” 0 : 5 8 8 : 1 } . F i g u r e V I - l 3 . R e t r o s y n t h e t i c a n a l y s i s o f V I - l 3 5 7 | M e t E N h e H r O N , , H a . é H C I g f / a n ; ( 2 ) 3 , “ O H P h O T E A C C O H C l > 2 C | 2 © K N O \ I l r O P h I 8 h 7 5 % W 5 N i w ° . . 9 0 w e I \ / \ " " " " " " " ” O 0 ” : © / K T T 0 “ D M F - " ( c a t . ) , T E A , C H 2 0 1 2 0 C H Z C I Z C l M o H , O N ( D A M O N 0 S c h e m e V I - l . S y n t h e s i s o f V I - l f r o m b e n z o i c a c i d . T h i s s y n t h e t i c r o u t e s u f f e r e d l o w y i e l d d u e t o n u c l e o p h i l i c s u b s t i t u t i o n o n V I - S t o y i e l d V I - 4 a s a b y - p r o d u c t i n d i c a t i n g t h e c l e a v a g e o f b o t h t h e C - 0 b o n d s o f t h e c a r b o n a t e V I - 5 . W e m o d i fi e d t h e r o u t e b y e m p l o y i n g a s y m m e t r i c a l c a r b o n a t e V I - 7 , w h i c h c o u l d b e c o n d e n s e d w i t h d i e t h a n o l a m i n e . H o w e v e r , u p o n p u r i fi c a t i o n , t h e p r o d u c t V I - 6 d e c o m p o s e d . W e f u r t h e r m o d i fi e d o u r s y n t h e t i c r o u t e t o t a k e a d v a n t a g e o f t h e n u c l e o p h i l i c i t y o f N i n d i e t h a n o l a m i n e . C o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e d i e t h a n o l a m i n e w a s p r o t e c t e d u s i n g p h e n y l c h l o r o f o r m a t e u n d e r m i l d b a s i c c o n d i t i o n s t o g i v e V I - 8 i n m o d e r a t e y i e l d s . 3 2 T h i s p r o t e c t e d a l c o h o l w a s t h e n s u b j e c t e d t o s u b s t i t u t i o n w i t h S O C l z i n C H C 1 3 3 3 t o g i v e a p r o t e c t e d N - m u s t a r d V I - 9 i n 9 4 % y i e l d . ( S c h e m e V I - 2 ) D i e t h a n o l a m i n e w a s a l s o s u b j e c t e d t o N - b e n z y l a t i o n t o g i v e V I - 1 0 i n m o d e s t y i e l d s . T h i s w a s c o n v e r t e d i n t o a N - m u s t a r d V I - l l ( c a u t i o n : D N A c r o s s l i n k e r ” ) i n 8 0 % y i e l d . H o w e v e r , c o n v e r s i o n o f V I - 3 5 8 . “ 4 p 1 1 t o V I - 9 v i a a v o n B r a u n r e a c t i o n 3 4 i n C H 2 C 1 2 a s w e l l a s C H 3 C N d i d n o t w o r k ( S c h e m e V I - 2 ) . O § , O H h O C O C \ P h S O C I G Y M . . . P I = / \ / N \ / \ 2 H O / \ / N \ / \ O H T E A C H 0 2 H O C I A / N \ / \ C l 2 V i - B C H C I 3 , r e fl u x V l - O 8 h 6 0 % 4 h 9 4 % P h H 1 / P h . B n B r , K 2 0 0 , S O C | 2 r / \ / N \ / \ v N = H O O H r e fl u x , 1 . 5 h H O N \ A O H C H C l a . r e f l u x C I N N V \ C I 8 8 % V l - 1 0 4 h 8 0 % V I - 1 1 P h ) 3 : O Y O W N r — — % P h o 0 ' / \ / N \ / \ C ' / \ / \ / \ C ' C H 2 C 1 2 , r . t . C i m C l V I - 1 ‘ I 2 0 1 1 S c h e m e V I - 2 . C o n v e r s i o n o f d i e t h a n o l a m i n e i n t o p r o t e c t e d a n d u n p r o t e c t e d N - m u s t a r d s ( n e g a t i v e a n d p o s i t i v e c o n t r o l s f o r i n v i t r o s t u d i e s ) T h e c o n v e r s i o n o f t h e p r o t e c t e d a l c o h o l s i n t o a l k y l h a l i d e s w a s t r i e d u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s a s s h o w n i n T a b l e V I - l . S O C ] ; i n c h l o r o f o r m u n d e r r e fl u x c o n d i t i o n s p r o v i d e d m o s t s a t i s f a c t o r y r e s u l t s . O fi / O \ R O Y O V R H O / \ / N \ / \ O H i C ' A / N \ / \ C ' m V l - 9 E n t r y R C o n d i t i o n s Y i e l d 1 C H 2 P h S O C I 2 , 0 ° C - > r . t . 6 0 % 2 C n g h S O C I Z . d r y D M F 0 % 3 T F i O C S O C I 2 , r e fl u x , 2 h 9 3 % 4 P h ( C O C | ) 2 . D M F ( 1 d r o p ) 4 4 % H 2 0 1 2 5 P h $ 0 0 1 2 , C H C l 3 , r e f l u x 9 4 % T a b l e V I - l . C o n v e r s i o n o f p r o t e c t e d a l c o h o l t o t h e a l k y l h a l i d e . 3 5 9 V I - 9 w a s t h e n c o n d e n s e d w i t h V I - 4 i n p r e s e n c e o f a b a s e t o f o r V I - l . 3 5 W h e n t h e l e a v i n g g r o u p w a s a p h e n y l , t h i s c o n v e r s i o n w a s n o t f a c i l e u n d e r T E A / C H 2 C 1 2 o r K H / T I - I F . W e m o d i fi e d t h e p r o t e c t i n g g r o u p t o p - n i t r o p h e n y l a n d / o r C l ( V I - 1 3 ) a n d c o u p l e d t h e r e s u l t i n g c a r b a m a t e w i t h t h e h y d r o x a m i c a c i d i n p r e s e n c e o f a b a s e . T a b l e V I - 2 s u m m a r i z e s t h e r e a c t i o n u n d e r v a r i o u s b a s i c c o n d i t i o n s . T h e r e a c t i o n y i e l d s d e p e n d e d o n t h e c h o i c e o f l e a v i n g g r o u p a n d t h e b a s e r e q u i r e d . 0 o N 0 Y 0 . J L N P B a s e : N I C I / r \ L C I O O H O J N 1 0 , i h B a s e S o l v e n v c e t e l y s t T e m p e r a t u r e Y i e l d P h N a H T H F I - 4 2 ° C 0 % P h K H T H F / 1 8 - c r o w n - 6 0 ° C 0 % C l K H T H F / 1 8 - c r o w n - 6 0 ° C - > r . t . 8 0 % C l T E A C H z c l z 0 ° C - > r . t . 9 1 % N 0 2 — ‘ © — § ‘ T E A C H Z C I Z 0 ° C - > t ‘ . t . 0 ° / o N 0 2 0 % p U l V . K 2 0 0 3 C H 2 0 1 2 0 ° C - > r . 1 . 0 % N 0 2 — . » § - K H T H F / 1 8 - c r o w n - 6 0 ° C - ' > r . t . 7 9 % T a b l e V I - 2 . C o n v e r s i o n o f t h e c a r b a m a t e i n t o t h e p r o d r u g m o i e t y V I - l . A s i m i l a r r o u t e f o r V I - 2 d i d n o t a f f o r d t h e p r o d u c t a n d d e c o m p o s e d . A n o t h e r r o u t e f o r t h e s y n t h e s i s o f V I - 2 w a s t r i e d u s i n g d i o x a z a l o n e a s s h o w n i n S c h e m e V I - 4 . V I - l 4 w a s s y n t h e s i z e d b y c o n d e n s a t i o n o f h y d r o x y l a m i n e t o b e n z o y l c h l o r i d e . T h e d i o x a z a l o n e w a s 3 6 0 s y n t h e s i z e d f r o m V I - 1 4 b y c o n d e n s a t i o n w i t h C D C ] ; ( p h o s g e n e ) a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y b y O v e r b e r g e r e t a l . 3 6 0 o © * ° ' — — - » ~ “ 2 ° “ d ” “ “ 2 Q W " H : N a 2 0 0 3 E t h e r N ’ O E t h e r , 9 7 % V H 4 6 7 % V I - 1 5 S c h e m e V I - 3 . C o n v e r s i o n o f V I - 1 4 i n t o t h e d i o x a z a l o n e V I - l S . T h e d i o x a z a l o n e w a s t h e n c o n d e n s e d w i t h t h e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e d i e t h a n o l a m i n e i n n “ . 1 ‘ N Z “ ! ! ! 1 1 p r e s e n c e o f T E A a t r o o m t e m p e r a t u r e . W e e x p e c t e d t o c o n v e r t t h e p r o t e c t e d d i o l i n t o t h e d i - a l k y l h a l i d e u s i n g S O C ] ; H o w e v e r , t h e d i o l V I - l 6 c y c l i z e d i n t r a m o l e c u l a r l y t o y i e l d t h e 5 - m e m b e r e d r i n g f o l l o w i n g B a l d w i n ’ s r u l e ( S - e x o t r i g , f a v o r e d ) , a n d y i e l d e d V I - 1 7 a n d V I - l 4 . r ° ° 0 ‘ ’ u \ 0 Y O . J | \ P h C Y fl P h N o k o T E A . c u z c r z , N H H C I E O H H L “ N r . . t , 6 h : J / \ L . m i l l / I N l c r H O O H W W ” 0 l 0 N H ‘ O H H O q u / O + 6 v r - 1 7 v r - 1 4 S c h e m e V I - 4 . F o r m a t i o n o f 2 - o x a z o l i d i n o n e r i n g V I - l 7 . F u r t h e r , V I - 3 w a s s y n t h e s i z e d s t a r t i n g f r o m c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e n i t r o b e n z e n e . 3 6 1 N H 2 2 h 4 . 9 2 7 H % 2 0 T E 0 A ° C H . Z > C C r Z I t o r w e v “ - r ‘ r 2 e 0 3 C 3 H " C H B 3 l n B r / , C 4 H P y 8 3 , h 0 H o t h . r e t r . , 8 r h t . . 4 3 0 5 % % 0 7 : 0 : 0 N 0 2 5 % R h - C N H O H C I N 0 1 D I C E O O I 1 S c h e m e V I - S . S y n t h e s i s o f V I - 1 8 a n d c o n v e r s i o n t o V I - 3 . C o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e n i t r o b e n z e n e w a s t r e a t e d w i t h 5 % R h - C a n d h y d r a t e d h y d r a z i n e 3 7 f o r 2 h a t r o o m t e m p e r a t u r e t o a f f o r d V I - 1 8 w h i c h w a s t h e n c o n d e n s e d w i t h c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e c a r b a m o y l c h l o r i d e t o f o r m V I - 3 . T h e p r o d u c t w a s p u r i fi e d b u t e v e n a f t e r s e v e r a l c o l u m n s , a n u n k n o w n i m p u r i t y c o - e l u t e d w i t h t h e p r o d u c t a n d c o u l d n o t b e p u r i fi e d a n y f u r t h e r ( S c h e m e V I - 5 ) . W e f u r t h e r f o c u s e d o n t h e d e v e l o p m e n t o f a n a l o g s o f t h i s p r o d r u g m o i e t y f o r w h i c h a n u m b e r o f h y d r o x a m i c a c i d s a n d h y d r o x y l a m i n e s w e r e p r e p a r e d 3 8 R E n t r y R R e a c t i o n C o n d l t l o n e Y l e l d T a b l e V I - 3 . S y n t h e s i s o f N - a l k y l a t e d h y d r o x y l a m i n e . B o t h V I - 1 9 a n d V I - 2 0 w e r e v e r y u n s t a b l e . V l - 1 9 w a s i s o l a t e d a s i t s o x a l a t e s a l t ; h o w e v e r , a l l e f f o r t s t o i s o l a t e V I - 2 0 w e r e f u t i l e . B e f o r e w e p r o g r e s s e d a n y f u r t h e r , w e w a n t e d t o d e t e r m i n e i f o u r d e s i g n o f t h e p r o - d r u g m o i e t y w o u l d s h o w d i f f e r e n t i a l a c t i v i t y u n d e r o x i c a n d h y p o x i c c o n d i t i o n s . F o r t h i s , w e 3 6 2 fi r s t c a l c u l a t e d t h e r e d u c t i o n p o t e n t i a l v a l u e s f o r t h e N - O b o n d u s i n g c y c l i c v o l t a m m e t r y e x p e r i m e n t s . E . E l e c t r o c h e m i c a l d a t a f o r v 1 . 1 , v 1 . 4 a n d V H 4 : 3 9 F o r a l l t h e s e p r o d r u g s , a m a j o r c o n c e r n f o r u s w a s t o d e t e r m i n e t h e r e d u c t i o n p o t e n t i a l v a l u e s f o r t h e s e c o m p o u n d s . W e a d d r e s s e d t h i s p r o b l e m u s i n g c y c l i c v o l t a m m e t r y . A l l e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n n o n - a q u e o u s s o l v e n t . A n h y d r o u s C H 3 C N t h a t w a s p a s s e d t h r o u g h a l u m i n a a n d s t o r e d w i t h m o l e c u l a r s i e v e s w a s u s e d a s t h e s o l v e n t . F e r r o c e n e a n d l , 4 - b e n z o q u i n o n e w e r e u s e d a s s t a n d a r d s t o s t a n d a r d i z e t h e w o r k i n g e l e c t r o d e a n d a l s o c a l i b r a t e t h e r e f e r e n c e e l e c t r o d e , A g / A g N O 3 ( i n C H 3 C N ) . S i n c e t h e p r o d r u g d e c o m p o s e s o n r e d u c t i o n , o n l y t h e r e d u c t i o n h a l f c y c l e w a s s e e n . T h e r e d u c t i o n p o t e n t i a l f o u n d f o r t h e d i f f e r e n t c o m p o u n d s a r e a s s h o w n b e l o w i n T a b l e V I - 4 . E n t r y R e d u c t l o n P o t e n t l a K V ) f t / P " g o - o . 3 o r Y [ : I / K N D H — O . 2 6 5 H O N H G H - o . 2 5 4 T a b l e V I - 4 . R e d u c t i o n p o t e n t i a l o f p r o d r u g V I - l , V I - 4 , a n d V I - l 4 . F i g u r e V I - l 4 s h o w s t h e c y c l i c v o l t a m e t r y c u r v e f o r t h e c o m p o u n d V I - l . I t i s c l e a r l y e v i d e n t f r o m t h e c u r v e , t h a t o n c e , r e d u c e d t h e c o m p o u n d c a n ’ t g o t h r o u g h t h e r e v e r s e c y c l e d u e t o i t s d e c o m p o s i t i o n i n t o C 0 2 a n d t h e m u s t a r d g a s . 3 6 3 C a e r . L o . 4 0 0 : - v - l : a . . . L 5 5 0 : - t t ' 6 0 : , f = j I D - 7 . 0 9 ' - 1 e a ; ; - 9 . 0 - ‘ L I t 1 l - - 1 0 0 0 I I I T I T I ‘ I ’ I I j I T I I I I I I T I I I I I I I 1 . 2 0 . 8 0 . 4 O - O . 4 - 0 . 8 - 1 . 2 - 1 . 6 P o t e n t i a l I V I I I I I ’ I T T T I I I I T I I I T I I I I I I ' I I I I - 1 . 2 fi I t ' l l r r t l [ r i l r l t r r r l 0 - 0 . 1 - O . 2 - 0 . 3 - O . 4 - 0 . 5 - 0 . 6 - 0 . 7 - O . 8 - O . 9 - 1 . 0 P o t e n t i a l / V F i g u r e V I - l 4 . C y c l i c v o l t a m e t r y f o r V I - l . ( T O P ) : B l a n k c o n t r o l ( B O T T O M ) : V l - l i n C H 3 C N 3 6 4 C t I o i A / n p o t e " n r e d u c \ A C I t i a l = - O . 3 6 V I n a t u m o r c e l l , t h e r e d o x p o t e n t i a l v a r i e s b e t w e e n 0 . 3 - 0 . 4 5 V 3 9 i n d i c a t i n g t h a t t h e p r o d r u g s h o u l d u n d e r g o r e d u c t i o n r e a d i l y . D e n n y e t a l h a v e s h o w n v a r i o u s a n a l o g s o f n i t r o b e n z y l q u a r t e m a r y s a l t s w i t h r e d u c t i o n p o t e n t i a l s i n t h e r a n g e o f ~ 0 3 t o - 0 . 4 6 t o u n d e r g o r e d u c t i o n i n t u m o r c e l l s ( F i g u r e V I - 1 5 ) . 3 9 b F i g u r e V I - l S . D e n n y ’ s n i t r o b e n z y l q u a r t e m a r y s a l t s a s a p r o d r u g f o r N - m u s t a r d . F . I n - v i t r o b i o - r e d u c t i v e a c t i v a t i o n s t u d i e s T h e p r o d r u g V I - l w a s n o w s u b j e c t e d t o r e d u c t i v e a c t i v a t i o n s t r a t e g y , w h i c h w o u l d l i b e r a t e t h e D N A c r o s s l i n k e r a n d c a n b e v i s u a l l y s e e n o n a d e n a t u r i n g a l k a l i n e a g a r o s e g e l . ” W e s y n t h e s i z e d a n e g a t i v e c o n t r o l , C b z - p r o t e c t e d N - m u s t a r d ( V I - 2 1 ) f o r t h i s e x p e r i m e n t . T h e C - O b o n d c a n u n d e r g o r e d u c t i v e c l e a v a g e a t a p o t e n t i a l o f ~ 2 . 2 V , a v a l u e m u c h h i g h e r t h a n t h e r e d u c t i o n p o t e n t i a l p r o v i d e d b y t h e r e d u c t i v e e n v i r o n m e n t i n a t u m o r c e l l i n t r i n s i c a l l y o r t h a t p r o v i d e d b y m o s t r e d u c i n g a g e n t s i n i n v i t r o e x p e r i m e n t s O 0 P h 3 C l C O O C H z P h Y V 3 0 0 2 / \ / \ / \ = N H O O H 1 : 1 N a 2 0 0 3 2 H 2 0 H O / \ / \ / \ O H C H C I 3 , r e f l u x 9 8 % 1 4 h o u r s “ ' 2 0 w a s G I N N \ / \ C l V l - 2 1 S c h e m e V I - 6 . S y n t h e s i s o f V I - 2 0 . 3 6 5 G . C r o s s - l i n k i n g s t u d i e s w i t h t h e p r o - d r u g T h e p r o d r u g w a s n o w s u b j e c t e d t o r e d u c t i v e a c t i v a t i o n s t r a t e g y u s i n g a w i d e v a r i e t y o f r e d u c i n g a g e n t s , w h i c h c o u l d p o s s i b l y m i m i c t h e t u m o r c e l l . S u p e r c o i l e d p l a s m i d D N A p B R 3 2 2 w a s l i n e a r i z e d u s i n g E c o R l r e s t r i c t i o n e n z y m e . T h e l i n e a r i t y a n d c o n c e n t r a t i o n o f t h e l i n e a r D N A w a s d e t e r m i n e d b y c a r r y i n g o u t d e n s i t o m e t r y e x p e r i m e n t s o n a n e u t r a l a g a r o s e g e l ( F i g u r e V I - l 6 ) . 1 2 L a n e l : A H I N D - I I I m a r k e r , L a n e 2 : L i n e a r i z e d p B R 3 2 2 r u n o n a n e u t r a l a g a r o s e g e l f o r l h . D e n s i t o m e t r y c a l c u l a t i o n s s h o w t h e s i z e o f t h e l i n e a r i z e d p l a s m i d t o b e 5 . 1 k b . F i g u r e V I - 1 6 . N e u t r a l a g a r o s e g e l t o c h e c k t h e l i n e a r i t y , c o n c e n t r a t i o n a n d s i z e o f t h e p l a s m i d . E n c o u r a g e d b y t h e c o m p l e t e d i g e s t i o n o f t h e D N A , w e p r o c e e d e d t o a t t e m p t a d e n a t u r i n g a l k a l i n e a g a r o s e g e l t o s e p a r a t e t h e s i n g l e s t r a n d e d D N A f r o m t h e d o u b l e s t r a n d e d c r o s s - l i n k e d D N A . F o r t h i s , t h e p r o d r u g w a s i n c u b a t e d w i t h t h e l i n e a r i z e d D N A , i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f t h e r e d u c i n g a g e n t . I n t h e p r e s e n c e o f t h e r e d u c i n g a g e n t t h e N - O b o n d i n t h e p r o d r u g w a s e x p e c t e d t o g e t r e d u c e d l e a d i n g t o d e c a r b o x y l a t i o n a n d l i b e r a t i o n o f t h e f r e e N - 3 6 6 . ‘ 3 3 d - s " " 1 m u s t a r d w h i c h w o u l d t h e n c r o s s l i n k a c r o s s t h e D N A m o l e c u l e . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s r u n o n a d e n a t u r i n g g e l t o s e p a r a t e s i n g l e s t r a n d e d D N A f r o m t h e c r o s s l i n k e d D N A . M i t o m y c i n C , w h i c h g e t s r e d u c t i v e l y a c t i v a t e d w a s u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l . H o w e v e r , s o m e o f t h e r e d u c i n g a g e n t s d i d n o t a c t i v a t e n r i t o m y c i n C . T h u s , w e o p t i m i z e d t h e r e d u c i n g p o w e r o f v a r i o u s r e d u c i n g a g e n t s , l i k e D T T , N a 2 8 2 0 4 , B - m e r c a p t o e t h a n o l , C y t o c h r o m e C r e d u c t a s e f o r m i t o m y c i n C . R e d u c i n g A g e n t E f f e c t o n M i t o m y c i n C D i t h i o t h r e i t o l ( D T T ) 2 m M r e d u c e d M M C i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f F e 2 + N a 2 8 2 0 4 , 1 0 m M r e d u c e d M M C i n p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f F e 2 + F e 2 + l E D T A , 1 0 0 m M N o r e d u c t i o n i n M M C C y t o c h r o o m e C r e d u c t a s e C r u d e e n z y m e c l e a v e d D N A T a b l e V I - S . O p t i m i z i n g t h e r e d u c i n g a g e n t f o r M M C r e d u c t i v e a c t i v a t i o n . A H I N D I I I w a s e m p l o y e d a s a m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d ( l a n e 1 , F i g u r e V I - l 6 ) . C o n t r o l r e a c t i o n s w e r e p e r f o r m e d l i n e a r i z e d D N A o n l y ( l a n e 2 , F i g u r e V I - l 6 ) a n d w i t h a n a u t h e n t i c s a m p l e o f m i t o m y c i n C ( 1 m M , 2 m M D T T ) . A s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e V I - l 6 , i n c u b a t i o n o f m i t o m y c i n C w i t h t h e D N A d u p l e x i n a b s e n c e o f a r e d u c i n g a g e n t l e a d s t o n o d e t e c t a b l e c r o s s - l i n k e d p r o d u c t ( l a n e 3 ) . A s s h o w n , o n l y t h e r e a c t i o n s d e p i c t e d i n l a n e s 4 , 5 , 7 , 9 a n d 1 0 p r o d u c e d t h e i n t e r s t r a n d D N A - D N A c r o s s - l i n k . 3 6 7 1 2 3 4 5 6 ' 7 8 9 1 0 , i . - - - ' - S i n g l e s t r a n d e d D N A fl W , M ' . J [ ‘ - c r o s s l i n k e d D N A L a n e 1 : M o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d A H I N D I I I ( 0 . 5 p g ) L a n e 2 : D N A ( 0 . 5 r 1 g ) ( n e g a t i v e c o n t r o l ) L a n e 3 : D N A ( 0 . 5 p g ) + l m M m i t o m y c i n C L a n e 4 : D N A ( 0 . 5 u g ) + l m M m i t o m y c i n C + 2 m M D T T ( p o s i t i v e c o n t r o l f o r r e d u c t i v e a c t i v a t i o n ) L a n e 5 : D N A ( O . 5 p . g ) + 1 m M m i t o m y c i n C + 2 m M D T I ‘ + F e 2 + ( 0 . 5 u M ) ( p o s i t i v e c o n t r o l f o r r e d u c t i v e a c t i v a t i o n ) L a n e 6 : D N A ( 0 . 5 p g ) + F e 2 + ( 0 . 5 u M ) L a n e 7 : D N A ( 0 . 5 t t g ) + l m M m i t o m y c i n C + l O O m M N a z S z O 4 ( p o s i t i v e c o n t r o l f o r r e d u c t i v e a c t i v a t i o n ) + F e 2 + ( 0 . 5 u M ) L a n e 8 : D N A ( 0 . 5 u g ) + 1 m M m i t o m y c i n C + F e 2 + ( 0 . 5 u M ) L a n e 9 : D N A ( 0 . 5 u g ) + 1 . 0 m M V I - l L a n e 1 0 : D N A ( 0 . 5 u g ) + 1 . 0 m M V I - l + 2 m M D T I ‘ . F i g u r e V I - l 7 . R e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f V I - l . M i t o m y c i n C u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l f o r r e d u c t i v e a c t i v a t i o n . W e a l s o e m p l o y e d t h e N - m e t h y l m u s t a r d a n d N - b e n z y l m u s t a r d . H o w e v e r , b o t h c o m p o u n d s d i d n o t g i v e a c r i s p b a n d f o r d o u b l e s t r a n d e d D N A ( d a t a n o t s h o w n ) . W e o b s e r v e d t h a t t h e p r o d r u g g r o u p w a s a b l e t o c r o s s - l i n k D N A e v e n w i t h o u t r e d u c t i o n ( L a n e 9 , F i g u r e V I - 1 7 ; L a n e 6 , F i g u r e V I - 1 8 ) . c r o s s l i n k e d D N A " ‘ — S i n g l e s t r a n d e d D N A L a n e 1 : z i I - I I N D I I I m a r k e r ( 5 u L ) + 5 u L w a t e r L a n e 2 : p B R 3 2 2 ( 0 . 5 u g ) L a n e 3 : p B R 3 2 2 ( 0 . 5 u g ) + m i t o m y c i n C ( l m M ) L a n e 4 : p B R 3 2 2 ( 0 . 5 u g ) + m i t o m y c i n C ( l m M ) + F e 2 + l E D T A ( 1 0 0 m M ) L a n e S : p B R 3 2 2 ( 0 . 5 u g ) + V I - l ( l m M ) L a n e 6 : p B R 3 2 2 ( 0 . 5 p g ) + V I - l ( l m M ) L a n e 7 : p B R 3 2 2 ( 0 . 5 p g ) + V I - l ( l m M ) + F e 2 + l E D T A ( 1 0 0 m M ) L a n e 8 : p B R 3 2 2 ( 0 . 5 u g ) + F e 2 + / E D T A ( 1 0 0 m M ) . F i g u r e V I - 1 8 . R e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f V I - l i n p r e s e n c e o f F e 2 + l E D T A . W e p r o p o s e t h a t t h i s c o u l d b e d u e t o h y d r o l y s i s o f t h e p r o d r u g m o i e t y u n d e r a l k a l i n e p H . T h e p H o f t h e d e n a t u r i n g g e l i s 1 2 . 8 - 1 2 . 9 ( e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d ) . A t t h i s p H , i n 3 6 8 a c c o r d a n c e w i t h S c h e m e V I — 7 , t h e p r o d r u g V I - l u n d e r g o e s h y d r o l y s i s a n d l i b e r a t e s t h e N - m u s t a r d w h i c h c r o s s l i n k s t h e D N A . T h i s o b s e r v a t i o n c a n b e s u p p o r t e d b y o b s e r v a t i o n s m a d e b y G r u e n h e r t e t a t 4 0 w h e r e t h e y f o u n d a p H d e p e n d e n c e f o r t h e s t a b i l i t y o f t h e M M C c r o s s l i n k e d a n d N - m u s t a r d - c r o s s l i n k e d D N A . T h e y c o u l d o b s e r v e c r o s s l i n k e d d o u b l e s t r a n d e d D N A a t p H = 1 2 . 3 b u t n o t a t p H = l 4 . S i n c e , w e h a v e a n i n t e r m e d i a t e p H r a n g e ; w e p r o b a b l y h a v e s o m e h y d r o l y z e d d o u b l e s t r a n d e d D N A - M M C c o m p l e x f o r t h e p o s i t i v e c o n t r o l a s w e l l . C l 0 C l ‘ O H R H H — 1 2 5 O 0 ) - H ' O ' O H C l H m . H 0 % N \ / \ C l — — > C l / V N \ / \ C ' O c r o s s l i n k e r r e l e a s e d S c h e m e V I - 7 . H y d r o l y s i s o f t h e p r o d r u g V I - l T o a s c e r t a i n t h i s h y p o t h e s i s , w e r a n a g e l u s i n g C D D P a s t h e p o s i t i v e c o n t r o l . C D D P i s a c l i n i c a l l y u s e d D N A d a m a g i n g a g e n t w h i c h c a u s e s D N A d a m a g e b y c r o s s - l i n k i n g a t N 7 o f d G . 2 T h e p r o d r u g V I - l w a s n o t a c t i v a t e d u n d e r r e d u c i n g c o n d i t i o n s ( F i g u r e V I - l 9 ) b u t w a s o n l y i n c u b a t e d w i t h D N A . T h o u g h , t h i s g e l w a s o v e r l o a d e d w i t h t h e m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r , t h e g e l c l e a r l y s h o w s c r o s s l i n k e d D N A s i m i l a r t o t h a t f r o m N - m u s t a r d ( l a n e 4 , 5 , 6 , F i g u r e V I - l 9 ) . 3 6 9 c r o s s l i n k e d D N A S i n g l e s t r a n d e d D N A 1 2 3 4 5 6 L a n e 1 : ’ 1 H I N D I I I m a r k e r ( 5 p L ) + 5 p L w a t e r L a n e 2 : p B R 3 2 2 ( 0 . 5 p g ) L a n e 3 : p B R 3 2 2 ( 0 . 5 p g ) + C i s - P l a t i n ( l m M ) L a n e 4 : p B R 3 2 2 ( 0 . 5 p g ) + N - c a r b a m o y l c h l o r i d e 2 , 2 ’ - b i s c h l o r o e t h y l a m i n e ( l m M ) L a n e 5 : p B R 3 2 2 ( 0 . 5 p g ) + V I - l ( l m M ) L a n e 6 : p B R 3 2 2 ( 0 . 5 p g ) + V I - l ( l m M ) . F i g u r e V I - 1 9 . V I - l u n d e r g o e s h y d r o l y s i s u n d e r a l k a l i n e c o n d i t i o n s . I n a t u m o r c e l l , t h e p h y s i o l o g i c a l p H i s 7 . 4 , a n d h e n c e , t h e p r o d r u g i s n o t e x p e c t e d t o u n d e r g o h y d r o l y s i s i n v i v o . A s a n a l t e r n a t i v e t o t h e a l k a l i n e a g a r o s e g e l , w e s e t u p a d e n a t u r i n g p o l y a c r y l a m i d e - u r e a g e l ( D P A G E ) . N o d e n a t u r a t i o n c o u l d b e s e e n o n a 5 % T B E / 6 M D P A G E o r a 2 5 % T B E / 6 M D P A G E g e l . T h e f o l l o w i n g p r o p o s e d a l t e r a t i o n s m i g h t a d d r e s s t h e a b o v e p r o b l e m : 0 S i n c e , t h e D N A u s e d f o r a p o l y a c r y l a m i d e g e l i s a 1 0 b a s e p a i r o l i g o n u c l e o t i d e , i t m a y n o t b e a b l e t o p r o v i d e t h e a c t u a l b i n d i n g s i t e f o r t h e N - m u s t a r d a n d C D D P . I n o r d e r t o o v e r c o m e t h i s , w e c o u l d s y n t h e s i z e o u r o w n d o d e c a o r t r i d e c a n u c l e o t i d e s e q u e n c e . 0 O t h e r a n a l y t i c a l t o o l s s u c h a s U V a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t r y c o u l d a l s o b e u s e d t o d e t e c t a n d a n a l y z e t h e D N A c r o s s l i n k i n g . “ T h e s e s t u d i e s o n D N A c r o s s l i n k e r s w e r e i n i t i a l l y s t a r t e d a s m o d e l s t u d i e s f o r p r o — d r u g a c t i v a t e d N F - K B i n h i b i t o r s . U n f o r t u n a t e l y , t h e o p t i m i z a t i o n f o r d e t e c t i o n o f t h e D N A - c r o s s l i n k s d i d n o t p r o v e t o b e s u c c e s s f u l . 3 7 0 t i : fi ‘ m z fl H . B i o - r e d u c t i v e l y a c t i v a t e d N F - K B i n h i b i t o r s o f c a f f e i n e a n d t h e o p h y l l i n e A m o n g t h e v a r i o u s k n o w n i n h i b i t o r s o f N F — c h , w e s e l e c t e d t h e x a n t h i n e d e r i v a t i v e s , b e c a u s e o f t h e i r e a s y a v a i l a b i l i t y a n d l o w / m i n i m a l t o x i c i t y . O u r i n i t i a l s t u d i e s i n c l u d e d t h e o p h y l l i n e a n d i t s d e r i v a t i v e s . T h e o p h y l l i n e h a s b e e n i d e n t i fi e d a s a n N F - c h i n h i b i t o r b y p r e v e n t i n g t h e t r a n s l o c a t i o n o f t h e p r o t e i n a c r o s s t h e n u c l e a r m e m b r a n e . " 2 E a r l i e r s t u d i e s r e v e a l t h a t t h e o p h y l l i n e , a m i n o t h e o p h y l l i n e a n d b r o m o t h e o p h y l l i n e h a v e b e e n u s e d a s a g a i n s t a s t h m a a n d i n f l a m m a t i o n , t h o u g h , t h e c o m p l e t e m o d e o f a c t i o n i s n o t k n o w n . S i n c e N F - c h p r o m o t e s c h e m o r e s i s t a n c e a n d i s a l s o i n v o l v e d i n i n fl a m m a t i o n i n 4 3 w e s o u g h t t o s y n t h e s i z e a s m a l l m o l e c u l e t h a t w o u l d e x p l o i t t h e r e d u c i n g c e l l s , c o n d i t i o n s o f t h e t u m o r c e l l s t o g e n e r a t e a n N F - K B i n h i b i t o r i n v i v o . D e n n y e t a l h a v e e m p h a s i z e d t h a t n i t r o i n r i d a z o l e s c a n b e h a v e a s a n e l e c t r o n i c s w i t c h f o r b i o - r e d u c t i v e a c t i v a t i o n . 2 | T h e y o b s e r v e d t h a t w h e n n i t r o i r r r i d a z o l e s w e r e r e d u c e d i n a t u m o r c e l l , t h e y b e c a m e m o r e c y t o t o x i c . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e n i t r o g r o u p c o u l d a c t a s a p r o d r u g m o i e t y f o r a m i n o / h y d r o x y l a m i n o g r o u p s , w h i c h a r e c y t o t o x i c i n n a t u r e . I n t h e l i g h t o f t h e a b o v e f a c t s , w e i n i t i a l l y h y p o t h e s i z e d t h a t n i t r o t h e o p h y l l i n e ( I I - 1 ) c o u l d a c t a s a p r o d r u g t o u n d e r g o r e d u c t i o n u n d e r h y p o x i a i n t h e t u m o r c e l l a n d g e n e r a t e a m i n o t h e o p h y l l i n e ( I I - 3 ) . E n c o u r a g e d b y t h e s e f a c t s , w e s y n t h e s i z e d a n d t e s t e d t h e s e s m a l l m o l e c u l e s f o r N F - K B a c t i v i t y ( C h a p t e r 2 ) . H o w e v e r , w e s u c c e s s f u l l y s y n t h e s i z e d b o t h “ - 1 a n d " - 3 a m o n g m a n y o t h e r 7 a n d 8 - s u b s t i t u t e d t h e o p h y l l i n e s a n d c a f f e i n e s . H o w e v e r , w h e n t h e s e w e r e t e s t e d f o r N F - K B a c t i v i t y , b o t h I L ] a n d I I - 3 w e r e f o u n d t o m o d e s t l y i n h i b i t N F - K B t r a n s l o c a t i o n a c r o s s t h e n u c l e a r m e m b r a n e . H e n c e , w e d e d u c e d t h a t t h i s m a y n o t fi n d a c l i n i c a l l y r e l e v a n t r e s u l t d u e t o a b s e n c e o f d i f f e r e n t i a l s e l e c t i v i t y i n N F - K B i n h i b i t i o n . F u r t h e r , i n o r d e r t o e n h a n c e 3 7 1 f : - — - . - - r r — - : i t h e s p e c i fi c i t y o f t h e N F - c h i n h i b i t o r , w e f u n c t i o n a l i z e d 8 - a m i n o t h e o p h y l l i n e w i t h t h e p r o d r u g g r o u p - ] . R e d u c t i v e a c t i v a t i o n o f p r o d r u g g r o u p o n 8 - a m i n o t h e o p h y l l i n e ( I I - 3 ) , a N F - K B i n h i b i t o r W e h a v e e a r l i e r s h o w n 8 - a m i n o t h e o p h y l l i n e ( I I - 3 , s e e c h a p t e r 2 p a g e 6 9 ) t o b e a n i n h i b i t o r o f N F - c h a m o n g o t h e r d e r i v a t i v e s o f t h e o p h y l l i n e l i k e 8 - n i t r o t h e o p h y l l i n e ( I I - 1 ) a n d 8 - b r o m o t h e o p h y l l i n e ( I I - 2 ) . I n o r d e r t o e x p l o i t t h e d r u g a c t i v i t y o f a m i n o t h e o p h y l l i n e , s p e c i fi c a l l y i n t u m o r c e l l s w e f u n c t i o n a l i z e d “ - 3 w i t h t h e p r o d r u g g r o u p d e s c r i b e d e a r l i e r w i t h t h e a i m t o s t u d y t h e e f f e c t o f t h e m o l e c u l e ( V I - 2 4 ) i n J u r k a t c e l l s i n v i v a u n d e r a e r o b i c a n d a n a e r o b i c c o n d i t i o n s . 8 - a m i n o t h e o p h y l l i n e ( I I - 4 ) w a s f o u n d t o b e a p o t e n t i n h i b i t o r o f N F - c h a n d i n h i b i t e d N F - c h - D N A b i n d i n g e v e n a t 0 . 0 1 M ( C h a p t e r 2 ) . Z i m m e r e t a l h a v e p r e p a r e d 8 - s u b s t i t u t e d c a f f e i n e s a n d t h e 0 p h y i l i n e s w h i c h d i d n o t h a v e a n y c a r c i n o g e n i c a c t i v i t y a n d i n f a c t w e r e p o t e n t i a l a n t i c a n c e r c o m p o u n d s . 4 4 C o t e e t a l 7 - s u b s t i t u t e d d e r i v a t i v e s o f 8 - a m i n o t h e o p h y l l i n e c a n b e u s e d a s c o r o n a r y v a s o d i l a t o r s a n d d i u r e t i c s . 4 3 S u b s t i t u t e d a m i n o p u r i n e s h a v e a l s o b e e n s h o w n t o h a v e b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y a n d m a y p o s s e s s c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m d e p r e s s o r e f f e c t . 4 5 R e t r o s y n t h e t i c a l l y , t h e p r o d r u g m o i e t y c o u l d b e c o u p l e d t o t h e a r r r i n o t h e o p h y l l i n e ( I I - 3 ) u s i n g t h e d i o x a z a l o n e t e m p l a t e ( S c h e m e V I — 8 ) . 3 7 2 O o \ N N \ , H \ N H 0 X I H : 9 " ) i H fi r m » . 0 l l ] N H 0 % O ‘ N 0 C A T " i H o r ' a / H v r - 2 1 j : o , 0 W h e n R = H : 1 ) < 3 _ P ( I f ) @ i ‘ H " ' N H P h “ . 1 5 V H 4 S c h e m e V I - 8 . R e t r o s y n t h e t i c a n a l y s i s o f V I - 2 1 . A s e x p l a i n e d p r e v i o u s l y , V I - l 4 w a s p r e p a r e d v i a c o n d e n s a t i o n o f b e n z o y l c h l o r i d e a n d h y d r o x y l a m i n e i n p r e s e n c e o f m i l d b a s e N a z C O g , V I - l 4 w a s t h e n c o n d e n s e d w i t h C D C ] ; t o g i v e t h e d i o x a z a l o n e V I - l S . E f f o r t s t o w a r d s V I - 1 5 w i t h c a r b o n y i d i i r n i d a z o i e a s t h e c o n d e n s a t i o n a g e n t d i d n o t a f f o r d t h e p r o d u c t . V I - l S w a s n o w s u b j e c t e d t o c o n d e n s a t i o n w i t h a m i n o t h e o p h y l l i n e ( I I - 3 ) ( T a b l e V I - 6 ) . T h e r e a c t i o n p r o c e e d e d s l u g g i s h l y o n l y i n t h e p r e s e n c e o f a m i l d b a s e . 0 o \ N H \ N J I N , H N J } : \ > — N ’ I \ > — ~ — - a t ~ 0 N N . 0 . 0 0 % ? ” H H I H 0 % ” V l - 2 2 E n t r y R e a c t i o n C o n d i t i o n s Y i e l d V I - 1 5 , C H z c l z 0 % 2 V l - 1 5 . C H Z C l z . T E A 1 0 % T a b l e V I - 6 . T o w a r d s f u n c t i o n a l i z a t i o n o f N F - K B i n h i b i t o r , “ - 3 . 3 7 3 S i n c e t h e y i e l d o f t h e r e a c t i o n w a s l o w i t w a s d i f fi c u l t t o c o m p l e t e l y c h a r a c t e r i z e i t . H e n c e , t o a s c e r t a i n t h e p r e s e n c e o f t h e c o m p o u n d , a c o m p a r a t i v e s t u d y w o u l d b e d o n e v i a a d i f f e r e n t s y n t h e t i c r o u t e . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , N - m e t h y l h y d r o x a m i c a c i d w a s s y n t h e s i z e d f r o m b e n z o y l c h l o r i d e a n d f u r t h e r c o n d e n s e d w i t h C 0 0 ; t o a f f o r d t h e c a r b o n a t e V I - 7 ( S c h e m e V I - 9 ) . ° ° i i J O L N H M e O H . H C I C O C | 2 , 0 0 ‘ P h / l k C l = P h J L N ’ O H P “ N T ' i ‘ P “ | T E A , C H 2 0 | 2 I 0 W 4 V I - 7 O " . 3 \ N J I N y - ’ H N A N f 0 0 H T E A , C H Z C I Z 0 T o \ N / V I - 2 2 S c h e m e V I - 9 . S y n t h e s i s o f f u n c t i o n a l i z e d a m i n o t h e o p h y l l i n e V I - 2 2 . V I - 7 w a s s u b j e c t e d t o t r e a t m e n t w i t h a m i n o t h e o p h y l l i n e i n p r e s e n c e o f T E A t o y i e l d t h e d e s i r e d f u n c t i o n a l i z e d a m i n o t h e o p h y l l i n e V I - 2 2 . C o n c u r r e n t l y , w e a l s o p u r s u e d a c o n d e n s a t i o n r e a c t i o n b e t w e e n 1 1 - 3 a n d “ - 6 w i t h p - n i t r o p h e n y l c h l o r o f o r r n a t e u n d e r b a s i c c o n d i t i o n s w h i c h c o u l d t h e n b e f u n c t i o n a l i z e d w i t h t h e p r o d r u g m o i e t y ( S c h e m e V I - 1 0 ) . 3 7 4 ” W E 3 . . . . — . . ' r C h g — © - I H 0 N N o — Q — N O 2 7 : 7 } : / > " " ” 2 O i l / N I > — N H / N T E A 0 ° C - - > r . . t o r r - a O Y N N N 0 2 C Y N I H i s t — ( c ; N H - N H N H / N \ " ] : N / > _ 2 T E A , 0 ° C - - > r t fi / i i N ) — O " - 6 v r - 2 4 0 2 N { H 3 0 o = ( \ \ N J E E N ‘ ? ’ N H N C A N N \ ‘ H ' v r - 2 5 S c h e m e V I - 1 0 . C o n v e r s i o n o f “ - 3 a n d I l l - 6 i n t o t h e i r c h l o r o f o r r n a t e w h i c h w o u l d g i v e t h e i r f u n c t i o n a l i z e d f o r m . B o t h “ - 3 a n d 1 1 - 6 r e a c t e d w i t h p - n i t r o p h e n y i c h l o r o f o r m a t e t h o u g h t h e i r r e a c t i v i t y w a s d i f f e r e n t i a l . T h i s i s p r o b a b l y d u e t o t h e f a c t t h a t t h e a r r r i n o g r o u p i n 1 1 - 3 p a r t i c i p a t e s i n r e s o n a n c e a n d h e n c e i s n o t a s s t r o n g l y n u c l e o p h i l i c a s t h e t e r m i n a l a m i n o g r o u p i n “ - 6 . J . C o n c l u s i o n . W e s u c c e s s f u l l y s y n t h e s i z e d V I - l p r o d r u g . W e f u r t h e r s u c c e s s f u l l y f u n c t i o n a l i z e d a m i n o t h e o p h y l l i n e , s h o w n t o b e a p o t e n t N F - c h i n h i b i t o r i n C h a p t e r 2 . U n f o r t u n a t e l y , t h e c o m m o n l y u s e d D N A c r o s s - l i n k i n g e x p e r i m e n t s h y d r o l y z e d t h e p r o d r u g , i n d i c a t i n g t h a t e i t h e r t h e m e t h o d o f d e t e c t i o n h a s t o b e a l t e r e d o r t h e d e s i g n o f t h e p r o d r u g w o u l d h a v e t o b e c h a n g e d . 3 7 5 K . E x p e r i m e n t a l S e c t i o n N - m e t h y l N - h y d r o x y b e n z a m i d e , V I - 4 O C K L T Q H A s u s p e n s i o n o f 1 . 8 G R N - m e t h y l h y d r o x y l a m i n e . H C l ( 1 . 9 4 8 g , 2 3 . 4 m m o l ) a n d N 3 2 C O 3 ( 2 . 4 8 8 g , 2 3 . 4 8 m m o l ) i n 1 2 5 m l e t h e r w a s c o o l e d a t 0 ° C . A d d e d b e n z o y l c h l o r i d e ( 2 . 4 7 7 m i , 2 1 . 3 m m o l ) a n d 5 m l H 2 0 t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e . T h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o w a r m t o r o o m t e m p e r a t u r e a n d s t i r r e d f o r 3 h . F i l t e r e d o f f t h e s o l i d a n d e x t r a c t e d t h e r e a c t i o n m i x t u r e i n E t O A c . C o l l e c t e d t h e o r g a n i c l a y e r , d r i e d o v e r N a s t 4 , F i l t e r e d a n d e v a p o r a t e d t h e s o l v e n t i n v a c u o . P u r i fi e d t h e p r o d u c t b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y w i t h E t O A c / H e x a n e ( 1 : 1 ) . C o l l e c t e d t h e f r a c t i o n s , d r i e d i n v a c u o t o g e t a w a x y l o w - m e l t i n g s o l i d . Y i e l d : 6 0 % ( 2 . 8 7 g ) R f : 0 . 2 5 ; ' H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C l 3 ) a r m s : 3 . 3 6 ( s , 3 ) , 7 . 4 6 ( m , 5 ) , 8 . 9 ( s b r o a d , 1 ) ” C N M R ( 7 4 . 4 9 M I - I z ) ( C D C 1 3 ) 6 : 3 8 . 3 6 , 1 2 7 . 8 8 , 1 2 8 . 2 8 , 1 3 0 . 6 6 , 1 3 2 . 7 6 , 1 6 7 . 6 5 I R ( C H C I 3 ) : 3 1 6 7 . 5 2 , 2 9 2 4 . 4 6 , 1 6 0 1 . 1 2 , 1 5 7 4 . 1 1 , 1 2 1 9 . 1 7 . E I ( L R M S ) m / z 1 5 1 ( M + ) . O - ( N - m e t l r y l N - b e n z o y l ) O ’ - P h e n y l c a r b o n a t e , V I - S O © / U \ N ’ O Y O ' O P h A s o l u t i o n o f V I - 4 ( 6 0 m g , 0 . 3 9 m m o l ) i n 1 0 m l C H 2 C 1 2 w a s m a i n t a i n e d a t 0 ° C . T E A ( 0 . 0 6 m i , 0 . 4 4 m m o l ) w a s a d d e d t o t h e r e a c t i o n fl a s k . P h O C O C l ( 0 . 0 5 5 m l , 0 . 4 4 m m o l ) w a s a d d e d d r o p w i s e a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 h . T h e r e a c t i o n w a s m o n i t o r e d b y T L C t o g o t o c o m p l e t i o n . T h e 3 7 6 r e a c t i o n m i x t u r e w a s e x t r a c t e d i n 3 2 0 a n d s a t u r a t e d N H 4 C 1 . T h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d , d r i e d o v e r N a Z S O 4 a n d d r i e d i n v a c u o . T h e p r o d u c t w a s p u r i fi e d b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y u s i n g 1 0 % E t O A c i n h e x a n e . Y i e l d : 7 5 % , ( 0 . 1 4 g ) R f = 0 . 2 5 . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) S T M S : 3 . 5 3 ( s , 3 H ) , 7 . 4 6 ( m , 1 0 H ) ; 1 3 C ( N M R ) ( 7 4 . 4 9 M H z ) ( C D C 1 3 ) 5 : 3 7 . 5 2 , 1 2 0 . 7 0 , 1 2 6 . 9 7 , 1 2 8 . 3 2 , 1 2 8 . 3 3 , 1 2 8 . 6 3 , 1 2 9 . 9 5 , 1 3 1 . 6 4 , 1 3 3 . 1 0 , 1 5 0 . 8 8 , 1 5 2 . 7 9 , 1 7 1 . 2 7 ; I R ( C D C 1 3 ) : 2 9 2 4 . 4 6 , 1 7 9 7 . 8 9 , 1 6 7 2 . 5 0 , 1 5 9 1 . 4 8 c m ‘ l E I ( L R M S ) ( m / z ) : 1 7 7 ( M + ) H R M S ( C 1 5 H 1 3 N O 4 ) C a l c d . ( M + H , E S ) 2 7 2 . 0 9 2 3 , f o u n d : 2 7 2 . 0 9 3 1 . P h e n y l b i s ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) c a r b a m a t e , V l - 8 0 Y 0 ? “ H o ’ V N w O H A s o l u t i o n o f d i e t h a n o l a m i n e ( 5 0 0 m g , 4 . 7 6 m m o l ) i n 1 0 m l C H 2 C 1 2 w a s m a i n t a i n e d a t 0 ° C . T E A ( 7 2 8 . 9 p l , 5 . 2 3 m m o l ) w a s a d d e d t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e . P h O C O C l ( 6 5 7 . 2 p l , 5 . 2 3 m m o l ) w a s a d d e d d r o p w i s e a n d a l l o w e d t o s t i r a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 h . E x t r a c t e d i n 3 2 0 a n d s a t u r a t e d N H 4 C 1 . T h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d , d r i e d o v e r N a 2 8 0 4 a n d d r i e d i n v a c u o . T h e p r o d u c t w a s p u r i fi e d b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y u s i n g 2 0 % a c e t o n e i n C H 2 C 1 2 . Y i e l d : 6 0 % ( 0 . 6 4 g ) I H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) S T M S : 3 . 5 3 ( m , 4 H ) , 3 . 7 ( s , 4 H ) , 4 . 4 ( s , b r , 2 H ) , 7 . 0 5 - 7 . 2 5 ( m , 5 H ) ; 1 3 C N M R ( 7 4 . 4 9 M I - I z ) ( C D C 1 3 ) 6 : 5 2 . 4 2 , 5 2 . 7 2 , 6 1 . 0 1 , 6 1 . 6 0 , 1 2 1 . 6 3 , 1 2 5 . 4 8 , 1 2 9 . 2 9 , 1 5 0 . 9 9 , 1 5 5 . 2 9 3 ; I R ( C D C 1 3 ) : 3 4 0 0 . 9 , 2 9 3 2 . 2 , 1 7 0 1 . 4 , 1 2 0 7 . 6 c m " E 1 ( L R M S ) ( m / z ) : 2 2 6 ( M + H ) ; H R M S ( C n H l s N O 4 ) C a l c d . ( M + N a , E S ) 2 4 8 . 0 8 9 9 , f o u n d : 2 4 8 . 0 9 0 6 . 3 7 7 ” . . 1 - “ t ‘ . I J P h e n y l b i s ( 2 - c h l o r o e t h y l ) c a r b a m a t e , V I - 9 O Y O ‘ P h C I / V ' K / ‘ c r A s o l u t i o n o f V I - 8 ( 0 . 6 g , 2 . 6 4 m m o l ) i n C H C 1 3 ( 1 0 m L ) w a s r e fl u x e d w i t h S O C ] ; ( 2 . 3 1 m l , 3 1 . 6 8 m m o l ) f o r 4 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s e v a p o r a t e d i n v a c u o . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s e v a p o r a t e d i n v a c u o . Y i e l d : 9 4 % ( 0 . 6 6 g ) I H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( d 6 - C D C 1 3 ) 8 T M S : 3 . 7 5 - 3 . 8 6 ( m , 8 H ) , 7 . 1 4 - 7 . 4 2 ( m , 5 H ) ; ‘ 3 C ( 7 4 . 4 9 M H z ) ( C D C l 3 ) 6 : 4 2 . 1 2 , 4 2 . 3 1 , 5 1 . 2 9 , 5 1 . 5 7 , 1 2 1 . 9 0 , 1 2 6 . 0 0 , 1 2 9 . 7 0 , 1 5 1 . 1 6 , 1 5 4 . 5 4 I R ( C H C 1 3 ) : 2 9 6 3 . 0 4 , 1 7 2 2 . 6 5 , 1 4 1 0 . 1 4 , 1 2 0 5 . 6 6 c m ’ I E I ( L R M S ) ( m / z ) : 2 6 1 ( M + ) H R M S ( C 1 1 H 1 3 0 2 C 1 2 N ) C a l c d . ( M + ) 2 6 1 . 0 3 2 3 , f o u n d : 2 6 l . 0 3 2 0 . N - b e n z y l - d i e t h a n o l a m i n e , V I - 1 0 . P h W H o ’ V N \ / \ 0 H A s o l u t i o n o f d i e t h a n o l a m i n e ( 3 5 0 m g , 3 . 3 2 m m o l ) a n d K 2 C 0 3 ( 4 5 9 . 3 m g , 3 . 3 2 m m o l ) i n 1 0 m l w a t e r w a s m a i n t a i n e d a t r o o m t e m p e r a t u r e . B e n z y l b r o m i d e ( 0 . 5 1 g , 2 . 9 9 m m o l ) w a s a d d e d d r o p w i s e a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s r e fl u x e d f o r 1 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s c o o l e d a n d e x t r a c t e d w i t h e t h e r . T h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d , d r i e d o v e r N a Z S O 4 a n d d r i e d i n v a c u o . T h e p r o d u c t w a s p u r i fi e d b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y u s i n g 1 5 % e t h a n o l i n C H C I 3 . Y i e l d : 8 8 % ( 0 . 5 7 g ) 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) 6 T M S : 2 . 6 8 ( m , 4 H ) , 3 . 4 9 ( s , 2 4 H ) , 3 . 6 1 ( m , 4 H ) , 3 . 7 2 ( s , , 2 H ) , 7 . 1 5 - 7 . 3 4 ( m , 5 H ) ; l 3 C N M R ( 7 4 . 4 9 M H z ) ( C D C l 3 ) 8 : 5 5 . 9 7 , 5 9 . 4 3 , 5 9 . 7 5 , 1 2 7 . 5 3 , 1 2 8 . 6 8 , 1 2 9 . 2 8 , 1 3 8 . 7 9 ; I R ( C D C 1 3 ) : 3 3 6 4 . 3 , 2 9 2 8 . 5 , 1 4 5 2 . 6 , 1 0 2 6 . 3 c m ' 1 E I ( L R M S ) ( m / z ) : 1 6 4 . 2 ( M - 3 l ) ; H R M S ( C a n N O z ) C a l c d . ( M + ) 1 9 5 . 1 2 5 9 , f o u n d : 1 9 5 . 1 2 5 2 . 3 7 8 N - b e n z y l - Z - c h l o r o - N - ( Z - c h l o r o e t h y l ) e t h a n a m i n e ( N - B e n z y l 2 , 2 , ’ b i s ( d i c h l o r o e t h a n a m i n e ) , V I - l 1 . P h \ 1 C l / V N V \ C I A s o l u t i o n o f V I - 1 0 ( 1 2 5 m g , 0 . 6 4 m m o l ) i n 1 0 m 1 C H C l 3 w a s r e fl u x e d w i t h S O C ] ; ( 0 . 1 9 m l , 2 . 5 6 m m o l ) f o r 7 h o u r s u n d e r n i t r o g e n . T h e s o l v e n t w a s d r i e d i n v a c u o . Y i e l d : 8 0 % ( 0 . 1 2 g ) 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C l 3 ) S T M S : 3 . 5 4 ( s , 4 H ) , 4 . 0 7 ( s , 4 H ) , 4 . 4 6 ( s , 2 H ) , 7 . 5 ( m , 5 H ) ; 1 3 C N M R ( 7 4 . 4 9 M H z ) ( C D C 1 3 ) : 8 3 6 . 9 0 , 5 4 . 1 7 , 5 8 . 8 5 , 1 2 7 . 9 3 , 1 2 9 . 9 6 , 1 3 0 . 8 7 , 1 3 1 . 6 0 I R ( C H C 1 3 ) : 2 9 2 4 . 1 4 , 2 4 3 0 . 0 7 , 1 6 5 2 . 9 , 1 4 5 7 . 4 2 c m ’ l E I ( L R M S ) ( m / z ) : 2 3 1 ( M + ) ; H R M S ( C r . H . 5 N C 1 2 ) C a l c d . ( M + ) 2 3 1 . 0 5 7 9 , f o u n d : 2 3 1 . 0 5 8 2 . 4 - n i t r o p h e n y l b i s ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) c a r b a m a t e , V I - 1 2 . n o 2 0 Y 0 H O / \ / N \ / \ O H A s o l u t i o n o f d i e t h a n o l a m i n e ( 1 0 0 m g , 0 . 9 5 2 m m o l ) , p - n i t r o p h e n y l c h l o r o f o r m a t e ( 2 1 1 m g , 1 . 0 4 7 m m o l ) a n d T E A ( 0 . 1 4 5 m L , 1 . 0 4 7 m m o l ) i n C H 2 C 1 2 ( 1 5 m L ) , w a s s t i r r e d f o r 8 h . E v a p o r a t e d t h e s o l v e n t a n d e x t r a c t e d i n E t O A c / N H 4 C 1 . C o l l e c t e d t h e o r g a n i c l a y e r , d r i e d o v e r N a Z S O 4 a n d e v a p o r a t e d t h e s o l v e n t . P u r i fi e d w i t h c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y b y e l u t i n g w i t h E t O A c . R f : 0 . 3 I H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) 6 T M S : 3 . 1 ( s , b r o a d , 2 H ) , 3 . 6 4 ( t , 2 H , J = 4 . 6 5 H z ) , 3 . 7 1 ( t , 2 H , J = 4 . 8 H z ) , 3 . 9 7 ( m , 4 H ) , 7 . 3 4 ( d , 2 H , J = 9 H z ) , 8 . 2 8 ( d , 2 H , J = 9 H z ) l 3 C ( 7 4 . 4 9 M H z ) 3 7 9 q a : ; m ~ . . . . n I ( C D C l 3 ) 8 : 5 2 . 2 5 , 6 1 . 1 1 , 1 2 2 . 2 7 , 1 2 5 . 0 5 , 1 4 5 . 0 6 , 1 5 3 . 9 6 , 1 5 5 . 9 6 ; I R ( C H C 1 3 ) : 3 3 7 3 . 9 3 , 2 9 6 1 . 1 1 , 1 7 1 3 . 0 1 , 1 5 2 2 . 0 3 , 1 3 4 8 . 4 1 c m " l E I ( L R M S ) 2 3 9 ( M - 3 l ) . 4 - n i t r o p h e n y ] b i s ( 2 - c h ] o r o e t h y l ) c a r b a m a t e , V I - 1 3 N 0 2 0 Y 0 C I / V N \ / \ C I A s o l u t i o n o f V l - 1 2 ( 3 5 0 m g , 1 . 2 9 m m o l ) i n C H C 1 3 ( 1 5 m L ) w a s r e fl u x e d w i t h S O C ] ; ( 0 . 9 4 5 m ] , 1 2 . 9 m m o l ) f o r 7 h . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s e v a p o r a t e d i n v a c u o . A w h i t e s o l i d c r y s t a l l i z e d w h i c h w a s f u r t h e r p u r i fi e d w i t h 6 0 % E t ; O / h e x a n e . R f : 0 . 6 . Y i e l d : 7 5 % ( 0 . 2 9 g ) 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( d 6 - C D C 1 3 ) 8 T M S : 3 . 9 ( m , 8 H ) , 7 . 3 4 ( d , 2 H , J = 9 H z ) , 8 . 2 8 ( d , 2 H , J = 9 H z ) l 3 C ( 7 4 . 4 9 M H z ) ( C D C l 3 ) 8 : 4 1 . 4 3 , 5 1 . 0 1 , 1 2 2 . 1 9 , 1 2 5 . 0 7 , 1 4 5 . 0 1 7 , 1 5 2 . 9 2 , 1 5 5 . 4 8 I R ( C H C 1 3 ) : 2 9 6 3 . 1 1 , 1 7 2 6 . 5 1 , 1 5 2 2 . 0 3 , 1 3 4 6 . 4 1 c m ' l E I ( L R M S ) ( m / z ) : 1 6 8 , 1 7 0 ( M - 0 M P N 0 2 D - N - h y d r o x y b e n z a m i d e V I - 1 4 O d K N I O H H A s u s p e n s i o n o f 1 . 8 G R h y d r o x y l a m i n e . H C ] ( 5 3 . 1 7 6 m g , 0 . 7 8 2 m m o l ) a n d N a ; C O 3 ( 8 2 . 8 m g , 0 . 7 8 2 m m o l ) i n 7 5 m l e t h e r w a s m a i n t a i n e d a t 0 ° C . B e n z o y l c h l o r i d e ( 0 . 0 8 2 5 m L , 0 . 7 1 1 m m o l ) w a s a d d e d d r o p w i s e . T h e r e a c t i o n w a s c o o l e d f u r t h e r a n d 3 . 5 m L H ; O w a s a d d e d t o i t . T h e r e a c t i o n w a s w a r m e d t o r o o m t e m p e r a t u r e a n d s t i r r e d f o r 3 h . F i l t e r e d o f f t h e s o l i d a n d e x t r a c t e d t h e r e a c t i o n 3 8 0 m i x t u r e i n E t O A c . C o l l e c t e d t h e o r g a n i c l a y e r a n d d r i e d i t o v e r N a 2 8 0 4 . E v a p o r a t e d o f f t h e o r g a n i c s o l v e n t i n v a c u o . R e c r y s t a l l i s e d i n E t O A c . Y i e l d : 9 7 % ( 0 . 9 5 g ) M . P . : 1 2 1 ° C 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D 3 C O C D 3 ) S T M S : 7 . 4 5 ( t , 2 H , J : 4 . 5 H z ) , 7 . 5 4 ( t , 1 H , J = 2 . 7 H z ) , 7 . 8 4 ( d , 2 H , J = 4 . 8 H z ) , 8 . 3 ( b r o a d , s , 1 H ) , 1 0 . 2 ( b r o a d , s , 1 H ) ; l 3 C N M R ( 7 4 . 4 9 M H z ) ( C D 3 C O C D 3 ) : 1 2 7 . 8 2 , 1 2 9 . 3 1 , 1 3 2 . 2 9 , 1 3 3 . 2 3 1 , 1 6 6 . 1 3 I R : 1 5 7 5 . 2 9 , 1 6 2 1 . 7 3 , 1 6 4 5 . 6 9 , 3 2 9 7 . 3 2 c m " E 1 ( L R M S ) : l l 9 ( M - H ) . H R M S ( C 7 H 7 N 0 2 ) C a l c d . ( M + ) 1 3 7 . 0 4 7 7 , f o u n d : 1 3 7 . 0 4 7 2 . 3 « P h e n y l l , 4 , 2 - d i o x a z o l - S - o n e , V H S 0 O C H ? N , A s o l u t i o n o f V I - l 4 ( 2 0 0 m g , 1 . 4 5 8 m m o l ) i n 1 0 0 m L e t h e r w a s m a i n t a i n e d a t - 7 8 ° C f o r 1 0 m i n u t e s . P h o s g e n e ( 1 5 8 . 7 7 m g , 1 . 6 0 4 3 m m o l ) w a s a d d e d d r o p w i s e w i t h c o n t i n u o u s s t i r r i n g u n t i l t h e s o l i d d i s s o l v e d . S t i r r e d t h e r e a c t i o n m i x t u r e a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t . E v a p o r a t e d t h e s o l v e n t i n v a c u o . l H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) B T M S : 7 . 5 3 ( t , 2 H , J : 6 . 3 H z ) , 7 . 6 3 ( t , 1 H , J = 2 . 4 H z ) , 7 . 8 4 ( d , 2 H , J : 7 . 2 H z ) 1 3 C ( N M R ) ( 7 4 . 4 9 M H z ) ( C D C 1 3 ) : 1 2 0 . 2 7 , 1 2 6 . 6 3 , 1 2 9 . 3 8 , 1 3 3 . 7 4 , 1 5 3 . 7 9 , 1 6 3 . 5 6 I R : 2 9 2 4 . 4 6 , 1 8 6 5 . 4 , 1 8 1 9 . 1 , c m ’ l E I ( L R M S ) : 1 6 3 ( M + ) , 1 1 9 , 1 0 5 . A n a l . ( C 7 H 5 N O 3 ) C a l c d : C , 5 8 . 6 ; H , 3 . 0 9 ; N , 8 . 5 9 ; O , 2 9 . 4 2 ; f o u n d : C , 5 9 . 6 6 ; H , 3 . 3 1 ; N , 8 . 2 2 : 0 , 2 8 . 8 1 . N - h y d r o x y b e n z e n a m i n e V I - 1 8 p H G m 3 8 1 N i t r o b e n z e n e ( 1 0 0 m g , 0 . 8 m m o l ) w a s d i s s o l v e d i n 2 m l T H F . 5 % R h - C ( 1 0 m g ) w a s a d d e d t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e . H y d r a z i n e h y d r a t e ( 7 9 . 2 p l , 6 5 % a q u e o u s s o l u t i o n , 1 . 6 2 m m o l ) w a s a d d e d d r o p w i s e a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s a l l o w e d t o s t i r a t r o o m t e m p e r a t u r e . F i t e r e d t h e r e a c t i o n t h r o u g h c e l i t e , a n d e x t r a c t e d i n E t ; O / w a t e r . C o l l e c t e d t h e o r g a n i c l a y e r , d r i e d o v e r N a 2 8 0 4 a n d e v a p o r a t e d i n v a c u o . A p a l e y e l l o w s o l i d w a s o b t a i n e d . Y i e l d : 7 0 % ( 6 0 m g ) . M . P . 7 1 ° C . 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) 8 T M S : 6 . 6 5 - 7 . 1 5 ( m , 5 H ) , 8 . 2 ( s , 1 H , e x c h a n g e a b l e ) , 8 . 2 3 ( s , 1 H , e x c h a n g e a b l e ) l 3 C ( N M R ) ( 7 4 . 4 9 M H z ) ( D M S O - d 6 ) : 1 1 2 . 8 6 , 1 1 9 . 1 0 , 1 2 9 . 2 9 , 1 5 1 . 9 9 ; I R : 3 2 4 4 . 4 6 , 1 4 9 6 . 9 c m ‘ l E 1 ( L R M S ) : 1 0 9 . 1 ( M + ) . N - h y d r o x y - N - m e t h y l b e n z e n a m i n e , V I - 1 9 p H Q t A s o l u t i o n o f V I - 1 8 ( 5 0 m g , 0 . 4 6 m m o l ) i n C H 3 O H ( 5 m l ) w a s m a i n t a i n e d i n d a r k a t 0 ° C . C H 3 1 ( 1 m l , 6 . 6 m m o l ) w a s a d d e d a n d t h e r e a c t i o n w a s s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 4 h . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d a n d a s a t u r a t e d s o l u t i o n o f o x a l i c a c i d ( 0 . 7 M , 3 m l ) w a s a d d e d . T h e r e a c t i o n w a s d r i e d u n d e r v a c u u m ( f r e e z e - d r y ) . N o t e : t h i s i s a v e r y u n s t a b l e h y d r o x y l a m i n e a n d s h o u l d b e u s e d i m m e d i a t e l y a f t e r i s o l a t i o n . Y i e l d : 4 0 % 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D 3 O D ) 8 T M S : 3 . l l ( s , 3 H ) , 7 . 5 6 - 7 . 6 1 ( m , 5 H ) ; l 3 C ( 7 4 . 4 9 M H z ) ( C D C 1 3 ) 8 : 3 8 . 0 6 , 1 2 3 . 2 9 , 1 2 4 . 1 9 , 1 3 0 . 9 3 , 1 3 1 . 4 7 , 1 3 8 . 2 0 ; E I ( L R M S ) 1 2 1 , 1 0 7 ( M - C H 3 ) . B e n z y l b i s ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) c a r b a m a t e , V I - 2 0 H o / \ / N \ / \ O H 3 8 2 A s o l u t i o n o f d i e t h a n o l a m i n e ( 1 0 0 m g , 0 . 9 5 2 m m o l ) , b e n z y l c h l o r o f o r m a t e ( 2 4 3 m g , 1 . 4 3 m m o l ) a n d N a 2 C 0 3 ( 0 . 5 3 g , 1 M , 1 0 m l , ) i n d i o x a n e ( 1 0 m l ) , w a s s t i r r e d f o r 1 4 h i n a 5 0 m l r o u n d b o t t o m fl a s k . A d d e d N 1 1 4 C l t o n e u t r a l i z e a n d e x t r a c t e d i n E t O A c . C o l l e c t e d t h e o r g a n i c l a y e r , d r i e d o v e r N a 2 8 0 4 a n d e v a p o r a t e d i n v a c u o . P u r i fi e d w i t h c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y b y e l u t i n g w i t h E t O A c . R f : 0 . 3 Y i e l d : 9 7 % ( 0 . 2 4 2 g ) l H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) 8 T M S : 3 . 4 9 ( s , 2 H ) , 3 . 7 6 ( s , 2 H ) , 3 . 8 3 ( s , 2 H ) , 4 . 1 4 ( s , 2 H ) , 5 . 1 4 ( s , 2 H ) , 7 . 3 2 - 7 . 3 7 ( m , 5 H ) ; 1 3 C ( 7 4 . 4 9 M H z ) ( C D C l 3 ) 8 : 5 2 . 0 5 , 5 2 . 5 6 , 6 1 . 3 9 , 6 1 . 6 8 , 6 7 . 3 3 , 1 2 7 . 8 4 , 1 2 8 . 0 8 , 1 2 8 . 5 1 , 1 3 6 . 2 9 , 1 5 6 . 8 0 ; I R ( C H C I 3 ) : 3 3 8 7 . 4 3 , 2 9 6 1 . 1 1 , 1 7 0 1 . 4 , 1 6 8 4 . 6 , 1 3 4 8 . 4 1 c m ' l E I ( L R M S ) 2 3 9 . 2 ( M + ) . H R M S ( C 1 2 H 1 7 N O 4 ) C a l c d . ( M + ) 2 3 9 . 1 1 5 8 , f o u n d : 2 3 9 . l 1 4 8 . B e n z y l b i s ( 2 - c h l o r o e t h y l ) c a r b a m a t e , V I - 2 1 A s o l u t i o n o f V I - 2 0 ( 1 0 0 m g , 0 . 4 2 m m o l ) i n 1 5 m l C H C I 3 w a s r e fl u x e d w i t h S O C 1 2 ( 0 . 0 9 1 m l , 1 . 2 5 m m o l ) f o r 3 h o u r s u n d e r n i t r o g e n . C o o l e d t h e r e a c t i o n m i x t u r e a n d d r i e d t h e s o l v e n t i n v a c u o . Y i e l d : 9 3 % ( 0 . 1 2 g ) I H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C l 3 ) 8 T M S : 3 . 4 2 ( m , 2 H ) , 3 . 7 3 - 3 . 8 9 ( m , 4 H ) , 4 . 6 1 ( m , 2 H ) , 5 . l 9 ( s , 2 H ) , 7 . 3 3 — 7 . 3 9 ( m , 5 H ) ; l 3 C N M R ( 7 4 . 4 9 M H z ) ( C D C 1 3 ) : 8 4 9 . 3 2 , 4 9 . 8 4 , 6 0 . 6 6 , 6 0 . 8 7 , 5 4 . 1 7 , 6 7 . 9 5 , 1 2 8 . 2 5 , 1 2 8 . 5 1 , 1 2 8 . 8 6 , 1 3 6 . 4 6 , 1 5 5 . 7 0 [ R ( C H C 1 3 ) : 2 9 1 8 . 6 7 , 2 8 5 1 . 1 5 , 1 7 0 1 . 4 3 , 1 4 6 2 . 2 3 c m ' l E I ( L R M S ) ( m / z ) : 1 7 6 ( M - N ( C H 2 ) 4 C 1 2 ) 3 8 3 ( D A W N N - ( O - ( N - m e t h y l p h e n y l h y d r o x a m i c a c i d ) ) 2 , 2 ’ - b i s - ( c h l o r o e t h y l a m i n e ) c a r b a m a t e V I - l C l I n a 5 0 m l r o u n d b o t t o m fl a s k s u f fi c i e n t l y c h a r g e d w i t h N 2 , 2 , 2 ’ - b i s - ( c h l o r o e t h y l a m i n e ) c a r b a m o y l c h l o r i d e ( l O O m g , 0 . 4 9 m m o l ) w a s s t i r r e d a t 0 ° C i n C H 2 C l 2 ( 7 m l ) . T E A w a s a d d e d ( 1 3 7 . 0 2 u l , 0 . 9 7 m m o l ) d r o p w i s e . V I - 4 ( 9 5 . 4 m g , 0 . 5 8 m m o l ) d i s s o l v e d i n 3 m l C H 2 C 1 2 w a s a d d e d a n d t h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o s t i r a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 2 h . T h e s o l v e n t w a s r e m o v e d a n d t h e r e a c t i o n w a s e x t r a c t e d w i t h e t h e r a n d N H 4 C I . T h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d a n d d r i e d o v e r N a 2 S 0 4 . T h e c o m p o u n d w a s p u r i fi e d o v e r s i l i c a c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y e l u t i n g w i t h 1 : 1 E t O A c / h e x a n e . Y i e l d : 0 . 1 4 2 g , 9 0 % A l t e r n a t i v e l y , i n a 5 0 m l r o u n d b o t t o m fl a s k s u f fi c i e n t l y c h a r g e d w i t h N 2 , K H ( 4 2 . 6 m g , 0 . 6 4 m m o l ) a n d 1 8 - c r o w n - 6 ( 1 0 m g , 0 . 0 3 m m o l ) w a s m a i n t a i n e d i n T H F ( 1 0 m l ) a t 0 ° C . N - ( p - n i t r o p h e n y l ) c a r b a m a t e , V I - l 3 ( 1 0 0 m g , 0 . 3 2 m m o l ) a n d W 4 ( 1 0 4 . 4 m g , 0 . 6 4 m m o l ) i n 1 0 m L T H F w e r e a d d e d a n d t h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o s t i r a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t . T h e s o l v e n t w a s e v a p o r a t e d a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s e x t r a c t e d i n E t O A c / N 1 1 4 C l . T h e p r o d u c t w a s p u r i fi e d o n s i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y i n 1 : 1 E t O A c / H e x a n e . R f : 0 . 5 Y i e l d : 8 0 % ( 0 . 0 8 3 g ) l H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) 8 T M S : 3 . 2 8 ( m , 2 H ) , 3 . 3 8 ( s , 3 H ) , 3 . 4 0 - 3 . 5 5 ( m , 6 H ) , 7 . 2 8 ( m , 5 H ) ; ” C ( 7 4 . 4 9 M H z ) ( C D C 1 3 ) 8 : 3 7 . 3 7 , 4 1 . 1 5 , 4 1 . 2 4 , 3 8 4 5 0 . 3 3 , 5 1 . 7 1 , 1 2 7 . 3 9 , 1 2 8 . 2 5 , 1 3 0 . 8 4 , 1 3 3 . 6 1 , 1 5 3 . 6 1 , 1 7 1 . 3 3 ; I R ( C H C I 3 ) : 2 9 2 4 . 5 , 1 7 4 7 . 7 3 , 1 6 6 8 . 6 c m ’ l E 1 ( L R M S ) 1 6 8 ( M — N ( M e ) O C O P h ) . N - ( O - ( p h e n y l h y d r o x y l a m i n e » 2 , 2 ’ - b i s - ( c h l o r o e t h y l a m i n e ) c a r b a m a t e V I - l H ‘ N — H C I 6 M . I n a 5 0 m l r o u n d b o t t o m fl a s k s u f fi c i e n t l y c h a r g e d w i t h N 2 , 2 , 2 ’ - b i s - ( c h l o r o e t h y l a m i n e ) c a r b a m o y l c h l o r i d e ( l O O m g , 0 . 4 9 m m o l ) w a s s t i r r e d a t 0 ° C i n C H 2 C 1 2 ( 7 m l ) . T E A w a s a d d e d ( 6 8 . 4 1 1 1 , 0 . 4 9 m m o l ) d r o p w i s e . V I - l 8 ( 5 8 . 5 m g , 0 . 5 4 m m o l ) d i s s o l v e d i n 3 m l C H 2 C 1 2 w a s a d d e d a n d t h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o s t i r a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 8 h . T h e s o l v e n t w a s r e m o v e d a n d t h e r e a c t i o n w a s e x t r a c t e d w i t h e t h e r a n d N H 4 C l . T h e o r g a n i c l a y e r w a s c o l l e c t e d a n d d r i e d o v e r N a 2 S O 4 . T h e c o m p o u n d w a s p u r i fi e d o v e r s i l i c a c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y e l u t i n g w i t h C H 2 C l 2 . N o t e : t w o d o u b l e t b e t w e e n 8 8 - 8 . 5 ( n o t e x c h a n g e a b l e ) c o e l u t e d w i t h t h e p r o d u c t . F u r t h e r , p u r i fi c a t i o n a t t e m p t s s t a r t e d d e c o m p o s i n g t h e p r o d u c t . P a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f V I - 3 : 1 H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C l 3 ) 8 T M S : 3 . 6 6 - 3 . 9 3 ( m , 8 H ) , 7 . 4 7 - 7 . 5 5 1 ( m , 5 H ) ; I R ( C H C I 3 ) : 3 0 6 7 . 9 , 2 9 2 4 . 6 , 1 7 4 9 . 6 , 1 4 8 1 . 6 c m " . B i s - ( O , O ’ - ( N - m e t h y 1 b e n z a m i d e ) ) c a r b o n a t e V I - 7 O O , 0 0 4 N N G K : 1 1 ) , 1 J 0 A s o l u t i o n o f N - m e t h y l p h e n y l h y d r o x a m i c a c i d ( 3 0 0 m g , 1 . 8 4 m m o l ) a n d T E A ( 0 . 5 7 m l , 4 . 0 4 m m o l ) i n 1 2 m l C H 2 C 1 2 w a s m a i n t a i n e d a t 0 ° C . C O C l 2 ( 4 2 8 . 6 3 8 5 1 1 L , 4 . 0 4 m m o l ) w a s a d d e d d r 0 p w i s e a n d s t i r r e d o v e m i g h t T h e s o l v e n t w a s d r i e d i n v a c u o a n d c h a r a c t e r i z e d . P a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f v 1 - 7 : ‘ H ( N M R ) ( 3 0 0 M H z ) ( C D C l 3 ) 8 T M S : 3 . 3 2 ( s , 9 ) * , 7 . 4 5 ( m , 1 5 ) I R ( C H C I 3 ) : 2 9 2 6 . 3 9 c m " , 1 8 1 7 . 1 c m " , 1 6 7 6 . 3 c m ” l * c a n ’ t p u r i f y t h e c o m p o u n d d u e t o s t a b i l i t y r e a s o n s a n d w a s u s e d i m m e d i a t e l y . R e a c t i o n o f A m i n o t h e o p h y l l i n e w i t h c a r b o n y l b i s - ( O - ( N - m e t h y l b e n z a m i d e » , V I - 2 2 . o \ N N ’ H A I N \ > — N ) — O o 0 N . . I H o / N A s o l u t i o n o f 3 9 4 . 9 m g ( 1 . 1 2 2 m m o l ) 6 a n d 0 . 1 5 7 m L T E A i n 1 5 m L C H 2 C 1 2 w a s s t i r r e d o v e r n i g h t w i t h 2 0 0 m g ( 1 . 0 2 m m o l ) o f A m i n o t h e o p h y l l i n e . A r e d s o l i d s e p a r a t e d i n a b o u t a n h o u r t h o u g h i t w a s n o t i d e n t i fi e d t o b e t h e p r o d u c t . A l l o w e d t h e r e a c t i o n t o c o n t i n u e . E x t r a c t e d i n E t O A c / N I L C I . C o l l e c t e d t h e o r g a n i c l a y e r . P u r i fi c a t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n r e q u i r e d . 4 - n i t r o p h e n y 1 2 , 3 , 6 , 9 - t e t r a h y d r o - l , 3 - d i m e t h y l - 2 , 6 - d i o x o - l H - p u r i n - 8 - y l c a r b a m a t c , V I - 2 3 I H O O N 0 Y l h b — h z — Q / N N E l n o 2 3 8 6 A s o l u t i o n o f l l - 3 . H C I ( 1 5 0 m g , 0 . 6 5 m m o l ) , p - n i t r o p h e n y l c h l o r o f o r m a t e ( 2 6 1 m g , 1 . 2 9 m m o l ) a n d T E A ( 0 . 4 5 m L , 3 . 2 3 m m o l ) i n C H 3 C N ( 1 0 m L ) , w a s s t i r r e d f o r 1 8 h . E v a p o r a t e d t h e s o l v e n t a n d e x t r a c t e d i n E t O A c / N a 2 C 0 3 . C o l l e c t e d t h e o r g a n i c l a y e r , d r i e d o v e r N a 2 S 0 4 a n d e v a p o r a t e d t h e s o l v e n t . Y i e l d : 5 % ( 1 2 . 0 2 m g ) P a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f v 1 - 2 3 . : ' H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C 1 3 ) 6 T M S : 3 . 4 2 ( m , 6 H ) , 7 . 3 0 ( d , 2 H , J = 8 . 4 H z ) , 8 . 2 4 ( d , 2 H , J = 9 H z ) 4 - n i t r o p h e n y l 2 , 3 , 6 - t r i h y d r o - 1 , 3 , 7 - t r i m e t h y 1 - 2 , 6 - d i o x o - 1 H - p u r i n - 8 - h y d r a z i n y l c a r b a m a t e , V l - 2 4 ( F i g : [ fi g — 3 % 0 2 N A s o l u t i o n o f I I - 6 ( 5 0 m g , 0 . 2 2 3 m m o l ) , p - n i t r o p h e n y l c h l o r o f o r m a t e ( 4 9 . 4 m g , 0 . 2 4 m m o l ) a n d T E A ( 3 4 . 8 1 1 1 , 0 . 2 4 m m o l ) i n C H 2 C 1 2 ( 1 5 m l ) , w a s s t i r r e d f o r 1 8 h . E v a p o r a t e d t h e s o l v e n t a n d e x t r a c t e d i n E t O A c / N a 2 C 0 3 . C o l l e c t e d t h e o r g a n i c l a y e r , d r i e d o v e r N a 2 S O 4 a n d e v a p o r a t e d t h e s o l v e n t . Y i e l d : 5 0 % ( 4 3 . 5 m g ) P a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f v 1 . 2 4 : ' H N M R ( 3 0 0 M H z ) ( C D C l 3 ) 8 T M S : 3 . 3 8 ( s , 3 H ) , 3 . 5 6 ( s , 3 H ) , 3 . 9 6 ( s , 3 H ) , 7 . 2 6 ( d , 2 H , J = 9 . 3 H z ) , 7 . 4 8 ( s , 1 H ) , 8 . 2 0 ( d , 2 H , J = 9 . 6 H z ) . 3 8 7 ' I L i n e a r i s i n g t h e p l a s m i d u s i n g E c o R l r e s t r i c t i o n e n z y m e : S u p e r c o i l e d p B R 3 2 2 ( 3 0 1 1 L , 3 0 1 1 g ) w a s i n c u b a t e d w i t h E c o R l ( n e w E n g l a n d B i o l a b s , 6 1 1 1 ) , E c o R l b u f f e r ( 1 0 X , 2 0 1 1 1 ) a n d 1 4 4 1 1 1 H 2 O f o r 2 h a t 3 7 ° C i n a w a t e r b a t h . N a O A c ( 2 0 1 1 1 , 3 M ) a n d e t h a n o l ( 4 4 0 1 1 1 ) w e r e a d d e d a n d t h e s o l u t i o n w a s c o o l e d a t - 7 0 ° C f o r 1 0 m i n u t e s . T h e m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d a t 1 4 0 0 0 r p m f o r 1 5 m i n u t e s a n d e t h a n o l w a s d e c a n t e d o f f . T h e r e m a i n d e r r e s i d u e w a s e v a p o r a t e d i n v a c u o a n d r e s u s p e n d e d i n 6 0 1 1 1 T E b u f f e r . N o t e : V o l u m e o f E t O H = ( R e a c t i o n v o l u m e + V o l u m e o f N a O A c ) * 2 T h e c o n c e n t r a t i o n o f D N A w a s t h e n c h e c k e d b y U V s p e c t r o s c o p y a t 2 6 0 n M o n a U V s p e c t r o m e t e r S p e c t r o n i c I n s t r u m e n t s G e n e s y s 5 . P r e p a r e d a 0 . 8 % a g a r o s e g e l ( 0 . 2 g a g a r o s e m o l e c u l a r b i o l o g y g r a d e ( F i s h e r S c i e n t i fi c ) i n 2 5 m l 1 X T B E ) . H e a t e d i n a m i c r o w a v e t o d i s s o l v e ( 3 2 ” ) a n d p o u r e d . A l l o w e d t o c o o l f o r a n h o u r . A H H V D - I I I f r a g m e n t s w e r e u s e d a s m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r . F o r l a n e l , 1 . 0 1 1 1 l H H V D - I I I w a s m i x e d w i t h 9 1 1 1 H 2 0 a n d w a r m e d t o 6 0 ° C . I t w a s s l o w l y c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e . T h i s s t e p i s r e q u i r e d f o r t o s e p a r a t e b a n d s 2 a n d 4 i n t h e m a r k e r f r a g m e n t s ( 9 4 1 6 a n d 2 3 2 2 k b r e s p e c t i v e l y ) . F o r l a n e 2 , 1 1 1 1 l i n e a r i z e d p l a s m i d w a s m i x e d w i t h 9 1 1 1 H 2 O . B o t h t h e s a m p l e s w e r e m i x e d w i t h 2 1 1 1 t r a c k i n g d y e ( 4 0 % g l y c e r o l , 0 . 0 2 % b r o m o p h e n o l b l u e , 2 5 0 m M T r i s H C I ( p H 6 . 8 ) i n n u c l e a s e f r e e w a t e r ) a n d l o a d e d o n t h e g e l . T h e g e l w a s r u n a t 8 0 V f o r l h i n 1 X T B E b u f f e r w i t h 1 0 1 1 L E t h i d i u m b r o m i d e . T h e a m o u n t o f l i n e a r i z e d p B R 3 2 2 w a s q u a n t i t a t e d b y U V a n a l y s i s a s d e s c r i b e d b y P . N . B o r e r i n t h e H a n d b o o k o f B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r 3 8 8 B i o l o g y , C R C P r e s s , 1 9 7 5 , i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e o p t i c a l d e n s i t y m e a s u r e m e n t s o b t a i n e d b y U V a b s o r p t i o n a t 2 6 0 n m . F o r t h i s p l a s m i d D N A s u b s t r a t e t h e c o n v e r s i o n f a c t o r w a s d e t e r m i n e d t o b e a n O D 2 6 0 o f 1 ) 5 0 1 1 g / m L . D e n a t u r i n g A l k a l i n e a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . S u p e r c o i l e d p l a s m i d p B R 3 2 2 w a s l i n e a r i s e d u s i n g t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d a b o v e . T h e D N A w a s s u b j e c t e d t o e t h a n o l p r e c i p i t a t i o n , c e n t r i f u g a t i o n a t 1 4 0 0 0 r p m , a n d t h e r e s u l t i n g D N A w a s d i s s o l v e d i n s t e r i l e H 2 O o r T E b u f f e r . T h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e r e s u l t i n g D N A w a s f o u n d o u t . R e a c t i o n s w e r e p r e p a r e d a s f o l l o w s L a n e 1 , 0 . 5 1 1 g h H I N D — I I I m a r k e r , l a n e 2 , 0 . 5 1 1 g l i n e a r i s e d p B R 3 2 2 , l a n e 3 - 9 , 0 . 5 1 1 g D N A + t r e a t m e n t f o r 1 0 1 1 L r e a c t i o n v o l u m e . T h e a g a r o s e g e l s w e r e p r e p a r e d b y a d d i n g 5 0 m L o f a 5 0 m M N a C l / 2 m M E D T A ( a t p H ) 8 ) t o 0 . 6 g o f a g a r o s e . T h e s u s p e n s i o n w a s h e a t e d i n a m i c r o w a v e o v e n u n t i l a l l o f t h e a g a r o s e w a s d i s s o l v e d ( 4 5 s ) . T h e g e l w a s p o u r e d a n d w a s a l l o w e d t o c o o l a n d s o l i d i f y f o r l h a t r o o m t e m p e r a t u r e . A f t e r 1 h t h e g e l w a s s o a k e d i n a n a l k a l i n e r u n n i n g b u f f e r ( 2 5 m L o f 2 N N a O H , 2 m L o f 0 . 5 M E D T A i n l L o f H 2 0 ) f o r a n a d d i t i o n a l h o u r . T h e c o m b w a s r e m o v e d , a n d t h e b u f f e r w a s r e f r e s h e d p r i o r t o e l e c t r o p h o r e s i s . A g a r o s e l o a d i n g d y e ( 5 1 1 L , 3 0 0 m M N a O H , 6 m M E D T A , 1 8 % F i c o l l t y p e 4 0 0 i n w a t e r , 0 . 1 5 % b r o m o c r e s o l g r e e n , 0 . 2 5 % x y l e n e c y a n o l F F ) w a s a d d e d t o t h e s a m p l e s ( 1 0 1 1 L ) , a n d t h e s a m p l e s w e r e l o a d e d i n t o t h e w e l l s . T h e g e l w a s r u n f o r 4 h a t 4 0 m A / 9 0 V w h i c h r e s u l t e d i n a t r a v e l i n g d i s t a n c e o f a p p r o x i m a t e l y 8 c m . T h e g e l w a s t h e n n e u t r a l i z e d f o r 4 5 m i n i n a 1 M T r i s p H = 7 I 1 . 5 M N a C l s o l u t i o n , w h i c h w a s r e f r e s h e d e v e r y 1 5 m i n . T h e g e l w a s s u b s e q u e n t l y s t a i n e d i n a n e t h i d i u m b r o m i d e s o l u t i o n ( 2 0 0 1 1 L o f a 1 0 m g / m L e t h i d i u m b r o m i d e s o l u t i o n 3 8 9 i n 1 L o f 1 M T r i s / 1 . 5 M N a C l b u f f e r a t p H = 7 . 5 ) f o r 1 h . T h e b a c k g r o u n d s t a i n i n g w a s t h e n r e m o v e d b y s o a k i n g t h e g e l i n a s o l u t i o n o f 5 0 m M N H 4 O A c a n d 1 0 m M B - m e r c a p t o e t h a n o l . G e l s w e r e v i s u a l i z e d o n a U V t r a n s i l l u m i n a t o r a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g P o l a r o i d b l a c k a n d w h i t e fi l m N o . 6 6 7 a n d s c a n n e d o n B i o r a d F o x p r o p l u s p h o s p h o r i m a g e r . N o t e : A n a l t e r n a t i v e p r o t o c o l c o u l d b e u s e d - ~ T h e a g a r o s e g e l s w e r e p r e p a r e d b y a d d i n g 2 5 m L o f a 5 0 m M N a O H / 2 m M E D T A ( a t p H = 8 ) t o 0 . 3 g o f a g a r o s e . T h e s u s p e n s i o n w a s h e a t e d i n a m i c r o w a v e o v e n u n t i l a l l o f t h e a g a r o s e w a s d i s s o l v e d ( 4 5 s ) . T h e w a t e r l o s t w a s b a l a n c e d b y w e i g h t . T h e g e l w a s p o u r e d a n d w a s a l l o w e d t o c o o l a n d s o l i d i f y f o r 1 h a t r o o m t e m p e r a t u r e . A f t e r 1 h t h e g e l w a s s o a k e d i n a n a l k a l i n e r u n n i n g b u f f e r ( 2 5 m L o f 2 N N a O H , 2 m L o f 0 . 5 M E D T A i n 1 L o f H 2 0 ) f o r a n a d d i t i o n a l h o u r . T h e c o m b w a s r e m o v e d , a n d t h e b u f f e r w a s r e f r e s h e d p r i o r t o e l e c t r o p h o r e s i s . A g a r o s e l o a d i n g d y e ( 5 1 1 L , 3 0 0 m M N a O H , 6 m M E D T A , 1 8 % F i c o l l t y p e 4 0 0 i n w a t e r , 0 . 1 5 % b r o m o c r e s o l g r e e n , 0 . 2 5 % x y l e n e c y a n o l F F ) w a s a d d e d t o t h e s a m p l e s ( 1 0 1 1 L ) , a n d t h e s a m p l e s w e r e l o a d e d i n t o t h e w e l l s . T h e g e l w a s r u n f o r 4 l l a t 2 5 0 m A / 6 0 V w h i c h r e s u l t e d i n a t r a v e l i n g d i s t a n c e o f a p p r o x i m a t e l y 7 c m . T h e g e l w a s t h e n n e u t r a l i z e d f o r 4 5 m i n i n a 1 0 0 m M T r i s p H = 7 . 9 s o l u t i o n , w h i c h w a s r e f r e s h e d e v e r y 1 5 m i n . T h e g e l w a s s u b s e q u e n t l y s t a i n e d i n a n e t h i d i u m b r o m i d e s o l u t i o n ( 1 0 0 1 1 L o f a 1 0 m g / m L e t h i d i u m b r o m i d e s o l u t i o n i n 1 0 0 m L o f 1 0 0 m M T r i s b u f f e r a t p H = 7 . 9 f o r 2 0 ’ . T h e b a c k g r o u n d s t a i n i n g w a s t h e n r e m o v e d b y s o a k i n g t h e g e l i n a s o l u t i o n o f 5 0 m M N H 4 O A c a n d 1 0 m M B - m e r c a p t o e t h a n o l . G e l s w e r e v i s u a l i z e d o n a U V 3 9 0 t r a n s i l l u m i n a t o r a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g P o l a r o i d b l a c k a n d w h i t e fi l m N o . 6 6 7 a n d s c a n n e d o n B i o r a d F o x p r o p l u s p h o s p h o r i m a g e r . C y c l i c v o l t a m m e t r y P r e p a r e d a 0 . 1 M b l a n k s o l u t i o n o f t - B u t y l a m m o n i u m b r o m i d e i n H P L C g r a d e d r y C H 3 C N . P r e p a r e d t h e a n a l y t e s o l u t i o n i n d r y C H 3 C N . S p a r g e d t h e s o l u t i o n s w i t h n i t r o g e n a n d s t a r t e d t h e r e d o x c y c l e t o g e t t h e b a c k g r o u n d . T h e w o r k i n g e l e c t r o d e u s e d w a s g o l d e l e c t r o d e , c o u n t e r e l e c t r o d e w a s P t e l e c t r o d e a n d t h e r e f e r e n c e e l e c t r o d e w a s A g / A g N 0 3 i n C H 3 C N ( n o n - a q u e o u s c o n d i t i o n s ) . T h e v a l u e o b t a i n e d w a s E 0 0 , " w h i c h w a s t h e n c o r r e c t e d w i t h r e s p e c t t o t h e h y d r o g e n e l e c t r o d e . T h e p r o d r u g d e c o m p o s e d u p o n r e d u c t i o n , h e n c e o n l y t h e r e d u c t i o n h a l f c y c l e w a s s e e n . T h e m e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d o n C . H . I n s t r u m e n t s E l e c t r o c h e m i c a l B e n c h M o d e l C H I 6 5 0 A a n d d a t a a c q u i r e d u s i n g w o r k s t a t i o n C H 1 6 5 0 v e r s i o n 4 . 0 3 9 1 1 0 . 1 1 . 1 2 . R e f e r e n c e ( a ) T h o m a s , C . J . ; R a h i e r , N . J . ; H e c h t , S . M . B i o o r g . M e d . C h e m . 2 0 0 4 , 1 2 , 1 5 8 5 - 6 0 4 . ( b ) P o m m i e r , Y . ; P o u r q u i e r , P . ; F a n , Y . ; S t r u m b e r g , D . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 9 9 8 , 1 4 0 0 , 8 3 - 1 0 5 . ( 0 ) M a c d o n a l d , T . L . ; L a b r o l i , M . A . ; T e p e , J . J . i n C o m p r e h e n s i v e n a t u r a l p r o d u c t s c h e m i s t r y ( e d . K o o l , E . T . ) 5 9 3 - 6 1 4 ( E l s e v i e r - N o r t h H o l l a n d , A m s t e r d a m , 1 9 9 9 ) . ( a ) W a n g , D . : L i p p a r d , S . J . N a t . R e v . D r u g D i s c o v . 2 0 0 5 , 4 , 3 0 7 - 2 0 . ( b ) B a r n e s , K . R . ; L i p p a r d , S . J . M e t . I o n s B i o l . S y s t . 2 0 0 4 , 4 2 , 1 4 3 - 7 7 . ( c ) C o h e n , S . M . ; L i p p a r d , S . J . P r o g . N u c l e i c A c i d R e s . M o l . B i o l . 2 0 0 1 , 6 7 , 9 3 - 1 3 0 . ( ( 1 ) J a m i e s o n , E . R . ; L i p p a r d , S . J . C h e m . R e v . 1 9 9 9 , 9 9 , 2 4 6 7 - 9 8 . ( e ) S e d l e t s k a , Y . , G i r a u d - P a n i s , M . J . & M a l i n g e , J . M . C u r r . M e d . C h e m . A n t i - C a n e . A g e n t s 2 0 0 5 , 5 , 2 5 1 - 6 5 . ( a ) D w a r a k a n a t h , B . S . ; K h a i t a n , D . ; M a t h u r , R . I n d i a n J . E x p . B i o l . 2 0 0 4 , 4 2 , 6 4 9 - 6 5 9 . ( b ) H o l d e n J . A . A n n . C l i n . L a b S c i . 1 9 9 7 , 2 7 , 4 0 2 — 4 1 2 . P o d d e v i n , B ; O r l o w s k i , S . ; B e l e h r a d e k , J . , J r . ; M i r , L . M . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 1 9 9 1 , 4 2 , s u p p l $ 6 7 - 7 5 . ( a ) W a n g , c . Y . ; M a y o , M . w . ; B a l d w i n A . 8 . J r . , S c i e n c e 1 9 9 6 , 2 7 4 , 7 8 4 — 7 8 7 . ( b ) S h a n n a , V . ; L a n s d e l l , T . ; P e d d i b h o t l a , S . ; T e p e , J . J . C h e m . B i o l . 2 0 0 4 , 1 1 , 1 6 8 9 - 1 6 9 9 . ( a ) L e v a v - C o h e n , Y . ; H a u p t , S . ; H a u p t , Y . G r o w t h F a c t o r s 2 0 0 5 , 2 3 , 1 8 3 - 1 9 2 . ( b ) K l e i n , C . ; V a s s i l e v , L . T . B r . J . C a n c e r 2 0 0 4 , 9 1 ( 8 ) , 1 4 1 5 - 1 4 1 9 . C o l e , S . P . C . ; B h a r d w a j , G . ; G e r l a c h , J . H . ; M a c k i e , J . E . ; G r a n t , C . E . ; A l m q u i s t , K . C . ; S t e w a r t , A . J . ; K u r z , E . U . ; D u n c a n , A . M . V . ; D e e l e y , R . G . S c i e n c e 1 9 9 2 , 2 5 8 , 1 6 5 0 - 1 6 5 4 . H e c h t , J . R . O n c o l o g y 1 9 9 8 , 1 2 , 7 2 - 7 8 . ( a ) H y a c i n t h e , M . ; J a r o s z e s k i , M . J . ; D a n g , V . V . ; C o p p o l a , D . ; K a r l , R . C . ; G i l b e r t , R . A . ; H e l l e r , R . C a n c e r 1 9 9 9 , 8 5 , 4 0 9 - 4 1 7 . ( b ) B e r g , K . ; S e l b o , P . K . ; P r a s m i c k a i t e , L . ; T j e l l e , T . E . ; S a n d v i g , K . ; M o a n , J . ; G a u d e m a c k , G . ; F o d s t a d , 0 . ; K j o l s r u d , S . ; A n h o l t , H . ; R o d a ] , G . H . ; R o d a l , S . K . ; H o g s e t , A . C a n c e r R e s . 1 9 9 9 , 5 9 , 1 1 8 0 - 1 1 8 3 . B o g e r , D . L . ; J o h n s o n , D . S . A n g e w . C h e m . I n t . E d . E n g l . 1 9 9 6 , 3 5 , 1 4 3 9 . W o l k e n b e r g , S . E . ; B o g e r , D . L . C h e m . R e v . 2 0 0 2 , 1 0 2 , 7 , 2 4 7 7 - 2 4 9 5 . L a w l e y , P . D . B i o E s s a y s 1 9 9 5 , 1 7 , 5 6 1 . 3 9 2 1 3 . 1 4 . 1 5 . 1 6 . l 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 5 . ( a ) H o p k i n s , P . B . ; R a u c h e r , S . ; M i l l a r d , J . T . J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 0 , 1 1 2 , 2 4 5 9 . ( b ) i j a n g , J . 0 . ; G r u e n e b e r g , D . A . ; L o e c h l e r , E . L . C a n c e r R e s . 1 9 8 9 , 4 9 , 6 5 2 9 . ( c ) R i n k , S . M . ; S o l o m o n , M . S . ; T a y l o r , M . J . ; S h a r a n a b a s a v a , R . B . ; M c L a u g h l i n , L . W . ; H o p k i n s , P . B . J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 3 , 1 1 5 , 2 5 5 1 . B r o w n , J . M . M o l . M e d . t o d a y 2 0 0 0 , 6 , 1 5 7 - 1 6 2 . T a n n o c k , I . F . L a n c e t 1 9 9 8 , 3 5 ] , s u p p l . 2 ( 9 - 1 6 ) . T a n n o c k , I . F . B r . J . C a n c e r 1 9 6 8 , 2 2 , 2 5 8 - 2 7 3 . W a r t e n b e r g , M . ; L i n g , F . C . ; M i i s c h e n , M . ; K l e i n , F . ; A c k e r , H . ; G a s s m a n n , M . ; P e t r a t , K . ; P i i t z , V . ; H e s c h e l e r , J . ; S a u e r , H . F A S E B J . 2 0 0 3 , 1 7 , 5 0 3 - 5 0 5 . H a r r i s , A . L . N a t . R e v . C a n c e r 2 0 0 2 , 2 , 3 8 - 4 7 . S u b a r s k y , P . ; H i l l , R . P . C l i n . E x p . M e t a s t a s i s 2 0 0 3 , 2 0 , 2 3 7 - 2 5 0 . H o c k e l , M . ; S c h l e n g e r , K . ; A r a l , B . ; M i t z e , M . ; S c h a f f e r , U . ; V a u p e l , P . C a n c e r r e s . 1 9 9 6 , 5 6 , 4 5 0 9 - 4 5 1 5 . ( a ) S i i m , B . G . ; D e n n y , W . A . ; W i l s o n , W . R . O n c o l . R e s . 1 9 9 6 , 9 , 3 5 7 — 3 6 9 . ( b ) H e l s b y , N . A . ; W h e e l e r , S . J . ; P r u i j n , F . B . ; P a l m e r , B . D . ; Y a n g , S . D e n n y , W . A . ; W i l s o n , W . R . C h e m . R e s . T o x i c o l . 2 0 0 3 , 1 6 , 4 6 9 - 4 7 8 . ( a ) Z e m a n , E . M . ; B r o w n , J . M . ; L e m m o n , M . J . ; H i r s t , V . K . ; L e e , W . W . I n t . J . R a d i a t . 0 n c o l . B i o l . P h y s . 1 9 8 6 , 1 2 , 1 2 3 9 — 1 2 4 2 . ( b ) B r o w n , J . M . & L e m m o n , M . J . C a n c e r R e s . 1 9 9 0 , 7 4 5 — 7 7 4 9 . ( c ) B r o w n , J . M . B r . J . C a n c e r 1 9 9 3 , 6 7 , 1 1 6 3 — 1 1 7 0 . N i c u l e s c u - D u v a z , D . ; N i c u l e s c u - D u v a z , 1 . ; F r i e d l o s , F . ; M a r t i n , J . ; L e h o u r i t i s , P . ; M a r a i s , R . ; S p r i n g e r , C . J . J . M e d . C h e m . 2 0 0 3 , 4 6 , 1 6 9 0 - 1 7 0 5 . ( a ) P a n , S . S . ; A n d r e w s , P . A . ; G l o v e r , C . G . J . B i o l . C h e m . 1 9 8 4 , 2 5 9 , 2 , 9 5 9 - 9 6 6 . ( b ) G r u e n h e r t , D . C . ; C l e a v e r , J . E . B i o c h e m . B i o p h y s . r e s . C o m m . 1 9 8 4 , 1 2 3 , 2 , 5 4 9 - 5 5 4 . ( a ) P a z , M . M . ; H o p k i n s , P . B . T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 9 7 , 3 8 , 3 , 3 4 3 - 3 4 6 . ( b ) C e c h , T . R . B i o c h e m i s t r y 1 9 8 1 , 2 0 , 1 4 3 1 - 1 4 3 7 . ( c ) P a z , M . M . ; H o p k i n s , P . B . J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 7 , 1 1 9 , 5 9 9 9 - 6 0 0 5 . ( d ) W i l l i a m s , R . B . ; R a j s k i , S . R . T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 9 2 , 3 3 , 2 1 , 2 9 2 9 - 2 9 3 2 . ( e ) W i l l i a m s , R . B . ; R a j s k i , S . R . T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 9 3 , 3 4 , 4 4 , 7 0 2 3 - 7 0 2 6 . ( f ) T e p e , J . J . ; W i l l i a m s , R . B . A n g e w . C h e m . I n t . E d . 1 9 9 9 , 3 8 , 3 5 0 1 - 3 5 0 3 . ( g ) N a o e , Y . ; 3 9 3 2 6 . 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . 3 7 . 3 8 . 3 9 . I n a r n i , M . ; K a w a m u r a , 1 . ; N i s h i g a k i , F . ; T s u j i m o t o , S . ; M a t s u m o t o , S . ; M a n d a , T . ; S h i m o m u r a , K . J p n . J . C a n c e r R e s . 1 9 9 8 , 8 9 , 6 6 6 - 6 7 2 . F u k u y a m a , T . ; G o t o , S . T e t r a h e d r o n L e t t . 1 9 8 9 , 3 0 , 6 4 9 1 . R a j s k i , S . R . ; W i l l i a m s , R . M . C h e m . R e v . 1 9 9 8 , 9 8 , 2 7 2 3 - 2 7 9 5 . ( a ) D a s , K . C . ; W h i t e , C . W . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 7 , 2 7 2 , 1 4 9 1 4 - 1 4 9 2 0 . ( b ) H u a n g , T . T . ; W u e r z b e r g e r - D a v i s , S . M . ; S e u f z e r , B . J . ; S h u m w a y , S . D . ; K u r a m a , T . B o o t h m a n , D . A . ; M i y a m o t o , S . J . B i o l . C h e m . 2 0 0 0 , 2 7 5 , 9 5 0 1 - 9 5 0 9 . S h e r r , C . J . S c i e n c e , 1 9 9 6 , 2 7 4 , 1 6 7 2 - 1 6 7 7 . C h a t u r v e d i , M . M . , K u m a r , A . ; D a m a y , B . G . ; C h a i n e y , B . N . ; A g a r w a l , S . ; A g g a r w a l , B . B . J . B i o l . C h e m . 1 9 9 7 , 2 7 2 , 3 0 1 2 9 - 3 0 1 3 4 . M a t s u b a , Y . ; E d a t s u g i , H . ; M i t a , 1 ; M a t s u n a g a , A . ; N a k a n i s h i , 0 . C a n c e r C h e m o t h e r . P h a r m a c o l . 2 0 0 0 , 4 6 , 1 - 9 . ( a ) H o b s o n , J . D . ; M c C l u s k e y , J . G . J . C h e m . S o c . ( C ) 1 9 6 7 , 2 0 1 5 - 2 0 1 7 . ( b ) A d a m a i k , R . W . ; S t a w i n s k i , J . T e t r a h e d r o n L e t t . 2 2 , 1 9 3 5 - 1 9 3 6 . ( a ) S a r a f , S . ; E d u n , M . ; K h a n , M . A . H e t e r o c y c l e s 1 9 8 5 , 2 3 , 5 , 1 1 7 3 - 1 1 8 0 . ( b ) J o n e s , G . B . ; M a t t h e w s , l . E . T e t r a h e d r o n 1 9 9 7 , 5 3 , 4 3 , 1 4 5 9 9 - 1 4 6 1 4 . ( c ) C h e n ; Z h i - L o n g ; W e i - Q i n , W . ; F a n g , 2 . ; D e - Y u , X . H e t e r o c y c l e s 1 9 9 8 , 4 8 , 9 , 1 7 3 9 - 1 7 4 5 . ( d ) B i a n c h i n i , C . ; F a m e t t i , E . ; G l e n d e n n i n g , L . ; G r a z i a n i , M . ; N a r d i n , G . ; P e r u z z i n i , M . ; R o c c h i n i , E . ; Z a n o b i n o , F . O r g a n o m e t a l l i c s , 1 9 9 3 , 1 4 , 1 4 8 9 - 1 5 0 2 . C o o l e y , J . H . ; E v a i n , E . J . S y n t h e s i s , 1 9 8 8 , 1 - 7 . C o m i n s D . ; W e g l a r z M . . A . J . O r g . C h e m . 1 9 8 8 , 5 3 , 4 4 3 7 — 4 4 4 2 . M i t r a , S . ; O v e r b e r g e r , C . G . J . O r g . C h e m . 1 9 8 8 , 5 3 , 2 6 7 4 - 2 6 7 7 . E n t w i s t l e , l . D . ; G i l k e r s o n , T . ; J o h n s t o n e , R . A . W . ; T e l f o r d , R . P . T e t r a h e d r o n , 1 9 7 8 , 3 4 , 2 1 3 - 2 1 5 . ( a ) K i n g , R . S . ; S h a r m a , V . ; P e d e r s o n , L . C . ; K a k u t a , Y . ; N e g i s h i , M . ; D u f f e l , M . W . C h e m . R e s . T o x i c o l . 2 0 0 0 , 1 3 , 1 2 5 1 - 1 2 5 8 . ( b ) B o r d w e l l , F . G . ; L i u , W . B . J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 6 , 1 1 8 , 8 7 7 7 - 8 7 8 1 . ( a ) T a n n o c k , I . F . B r . J . R a d i o l . 1 9 7 2 , 4 5 , 5 1 5 - 4 2 4 . ( b ) T e r c e l , M . ; W i l s o n , W . R . ; A n d e r s o n , R . F . ; D e n n y , W . A . J . M e d . C h e m . 1 9 9 6 , 3 9 , 1 0 8 4 - 3 9 4 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 5 . 1 0 9 4 . ( c ) F o y e , W . O . I n : C a n c e r C h e m o t h e r a p e u t i c A g e n t s , A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y , W a s h i n t o n , D C . C h a p t e r 1 5 , 5 0 0 - 5 2 3 . G r u e n e r t , D . C . ; C l e a v e r , J . E . B i o c h e m . B i o p h y . R e s . C o m m . 1 9 8 4 , 1 2 3 , 5 4 9 - 5 5 4 . H a r t w i g , J . F . ; P i l , P . M . ; L i p p a r d , S . J . J . A m . C h e m . S o c . 1 9 9 2 , 1 1 4 , 8 2 9 2 - 8 2 9 3 . S a g a r a , H . ; M a k i n o , S . ; C h i b a n a , N . ; O t a , M . ; H o l g a t e , S . T . ; C h u r c h , M . K . ; F u k u d a , T . I n t . A r c h . A l l e r g y I m m u n o l 2 0 0 1 , 1 2 4 , 3 7 1 - 3 7 6 . C o t e , R . F R M 2 1 0 5 1 9 6 3 1 1 2 6 , 1 9 6 3 . Z i m m e r , H . ; M a t a l l i a , J . B . ; A t c h l e y , R . O h i o J . S c i e n c e 1 9 6 3 , 6 3 , 9 7 - 1 0 2 . G l u s h k o v , R . G . ; O v c h a r o v a , I . M . ; K o p t e n k o v a , V . A . ; N i k i t i n , V . B . ; K a m i n k a , M . E . ; M a s h k o v s k i i , M . D . K h i m - F a r m . Z h . 1 9 8 7 , 2 1 , 5 5 - 5 9 . 3 9 5 A P P E N D I X 3 9 6 1 ) O p t i m i z a t i o n o f c y t o t o x i c i t y o f v a r i o u s c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s i n C E M c e l l s . M e a s u r i n g c e l l v i a b i l i t y a t 4 8 h w i t h M T S a s s a y . 2 E 1 . 5 8 . S 1 8 0 . 5 0 g \ \ \ \ 0 6 ‘ " \ 9 ‘ } . 0 9 a “ . 5 3 “ e \ o ~ Q . \ \ 0 \ \ \ 8 ‘ ~ 0 0 " ' 9 \ 0 9 ° C ) 0 ‘ a 0 " x 0 ‘ @ ‘ s Q \ ° \ ‘ 6 ‘ 6 ‘ 0 ( 9 Q ' 2 ' Q 2 g 1 . 5 E . 5 1 B 0 0 . 5 0 6 , 6 9 \ § \ § § \ S “ o o x x x e N 0 \ o - 9 9 % 0 ‘ 9 6 é b D ' 6 0 < 2 4 9 8 9 ° 0 9 ‘ < [ > 0 a , \ o 0 0 9 3 9 7 y t i l i b a i v l l e C 8 . 5 1 l 0 0 . 5 . o i - a 9 . » \ \ \ \ 8 ° 8 ‘ , 8 ) 8 * . 3 “ ‘ 8 0 < 6 9 i t , ( J x i t , \ - < ~ o . \ i é ‘ 6 8 6 9 ° 9 Q 0 6 5 " ° ‘ l e ° ° e o 2 - J . 1 L u N o d r u g P a c l i t a x e l P a c l i t a x e l P a c l i t a x e l P a c l i t a x e l ( 1 0 1 1 M ) ( 1 1 1 M ) ( 0 . 1 / 1 M ) ( 0 . 0 1 , u M ) T h i s a s s a y w a s i m p o r t a n t t o d e t e r m i n e t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e s e d r u g s t o p e r t u r b t h e c e l l u l a r s y s t e m b u t n o t c a u s e e x t e n s i v e a p o p t o s i s . 3 9 8 s i s o t p o p a % 2 ) M e a s u r e o f I n d u c t i o n o f a p o p t o s i s t h r o u g h c a s p a s e a c t i v i t y u s i n g A p o - O n e A s s a y 1 1 0 - 1 0 0 - 9 0 - 8 0 . 7 o - 6 0 - 5 0 - 4 0 - A C P T + 1 0 n M I m i d a z o l i n e l C P T ' l ' l l I - 1 3 - 1 2 - 1 1 - 1 0 - 9 - 8 - 7 - 6 - 5 l o g [ C P T ( M ) ] T h e r e d t r i a n g l e s s h o w c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t o f i m i d a z o l i n e a n d c a m p t o t h e c i n . B l u e s q u a r e s a r e c a m p t o t h e c i n a l o n e . V a l u e s a r e a v e r a g e s o f t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . P = 0 . 0 0 5 1 1 1 0 - 1 0 0 . A C P T + 1 t h i d a z o l i n e 9 0 . I C P T 8 0 - . 2 7 o - « 1 £ 3 6 0 - 8 a 5 0 - £ 3 4 0 - 3 0 - 2 0 - 1 0 - I 3 v I ' 4 i f I I I I - 1 3 - 1 2 - 1 1 - 1 0 - 9 - 8 - 7 - 6 - 5 l o g [ ( C P T M ) ] T h e r e d t r i a n g l e s s h o w c o m b i n a t i o n t r e a t m e n t o f i m i d a z o l i n e a n d c a m p t o t h e c i n . B l u e s q u a r e s a r e c a m p t o t h e c i n a l o n e . V a l u e s a r e a v e r a g e s o f t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . P = 0 . 0 0 0 4 3 9 9 W W m i c 6 W . : 2 8 8 . o . 8 6 3 2 E f f e c t o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f A L L N , a n d l a c t a c y s t i n ( p r o t e a s o m a l i n h i b i t o r s ) o n a p o p t o t i c i n d u c t i o n b y C a m p t o t h e c i n . 3 ) w i t h 5 0 1 1 M A L L N w i t h 5 1 1 M A L L N W W W W . 2 . 3 0 : 9 3 3 . o . 3 8 3 2 4 0 0 1 1 1 M L a c t a c y s t i n ( ” 7 0 0 0 0 0 E e o o o o o g s o o o o o 8 4 0 0 0 0 0 2 3 0 0 0 0 0 0 5 2 0 0 0 0 0 . 0 5 1 0 0 0 0 0 0 I x « ’ \ I x ’ \ 6 ° 9 $ c 3 c 3 ( 3 c ? ( 3 & 6 / ‘ 0 4 ‘ 0 ‘ 9 0 8 Q " ‘ 2 ‘ 8 " < 2 " < 2 " 6 ‘ ' \ ¢ ‘ 3 ‘ é ‘ x ‘ O C ) 0 C ) O C ) e o g o l x o x t h J o Q N ‘ l o $ 8 5 1 9 8 0 ” ( 3 % ° ' ° ' o 9 o 9 @ @ § 9 n \ o 5 9 % 9 \ o & q 9 \ ( b e 0 ' Q 0 . $ 9 . 0 ' 1 ’ Q ’ 1 0 1 ° . 1 ° . t o " ? 9 ‘ * 9 ' ° ° 8 " = 6 " ( 5 ‘ 6 ° 0 ‘ ? 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A c t i v a t i o n o f N F - c h w a s 4 0 2 s l l e c c i t o t p o p a f o r e b m u N s l l e c c i t o t p A o p A f o r e b m u N i n i t i a t e d u s i n g T N F - a ( 0 . 4 p g ) . T h e c o n t r o l f o r p a r t h e n o l i d e s h o w s a n e g a t i v e b a r b e c a u s e i t i s c y t o t o x i c a t t h e e x p o s u r e - t i m e a t w h i c h t h e e x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d ( d a t a n o t s h o w n ) . 6 ) P o s t - t r e a t m e n t o f C E M c e l l s w i t h i m i d a z o l i n e I I I - 4 . C e l l s w e r e t r e a t e d w i t h 0 . 0 1 1 1 M C P T f o r 1 , 2 a n d 4 h a n d p o s t - t r e a t m e n t p e r f o r m e d w i t h e a c h 0 . 1 1 1 M a n d 0 . 0 1 1 1 M i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n c o n t i n u o u s e x p o s u r e a s w e l l a s w i t h c e l l - w a s h a n d s u p p l e m e n t i n g w i t h f r e s h m e d i a . i . C P I i n c u b a t i o n ( 0 . 0 1 1 1 M , 4 h ) f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e 0 . 1 1 1 M ( c o n t i n u o u s e x p o s u r e ) — o — - C e l l s a l o n e — 6 — h i d a z o l i n e I N 0 . 1 1 1 M - n - — 0 . 0 1 1 1 M C P T , 4 h + 0 . 0 1 M C P T , 4 h - - > 0 . 1 M h i d a z o l i n e I - 4 / i i . C P T i n c u b a t i o n ( 0 . 0 1 1 1 M , 2 h ) f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e 0 . 1 1 1 M ( c o n t i n u o u s e x p o s u r e ) + N o d r u g + h i d a z o l i n e I l l - 4 ( 1 0 0 n M ) + C P T ( 1 0 n M ) , 2 h — 0 — C F ’ T ( 1 0 n M ) . 2 h - - > | m ' d a z o l i n e I l l - 4 ( 1 0 0 n M ) 7 0 0 0 0 0 0 2 0 T l r m ( h ) 4 0 6 0 4 0 3 ? i s l e c c i t o t p i o p a f o i r e b m u N s l l e c c i t o t p o p a f o r e b m u N i i i . C P I ‘ i n c u b a t i o n ( 0 . 0 1 1 1 M , 1 h ) f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e 0 . 1 1 1 M ( c o n t i n u o u s e x p o s u r e ) — o — C e l s a l o n e — - o — m ' d a z o l ‘ n e I - 4 0 . 1 1 M + 0 . 0 1 u M C P T , 1 h + 0 . 0 1 M C P T , 1 h - - > 0 . 1 M h i d a z o l i n e l I - 4 2 0 0 0 0 0 ~ 0 I 1 f 7 r j 0 1 0 2 0 T l r r s e c i h ) 4 0 5 0 6 0 i v . C P T i n c u b a t i o n ( 0 . 0 1 1 1 M , 2 h ) f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e 0 . 1 1 1 M ( w a s h e d c e l l s ) — o — C e l s a l o n e + h ‘ i d a z o h e 0 . 1 1 1 M + 0 . 0 1 u M C F l ' , 2 h w a s h + 0 . 0 1 u M C P T , 2 h . w a s h - - > 0 . 1 M h i d a z o l i n e 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 T r n e ( h ) O 4 0 4 v . C P T i n c u b a t i o n ( 0 . 0 1 1 1 M , 4 h ) f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e 0 . 0 1 1 1 M ( c o n t i n u o u s e x p o s u r e ) 0 0 0 0 0 0 + fi ' i d l s m 1 1 1 4 0 . 1 _ a z o r 1 i o n r m b e p n h ” M + 0 . . 0 1 u M C F T 4 h - > 0 0 1 p M I ' n d a z o l n e I - 4 . 1 2 8 0 0 0 0 0 — 0 ) D g 5 : ; 6 0 0 0 0 0 — ‘ 5 4 0 0 0 0 0 - 2 2 0 0 0 0 0 4 0 ‘ 1 . o 1 0 2 0 3 0 4 o 5 0 6 0 T m e ( h ) v i . C P T i n c u b a t i o n ( 0 . 0 1 1 1 M , 2 h ) f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e 0 . 0 1 1 1 M ( c o n t i n u o u s e x p o s u r e ) + 0 5 1 3 a l o n e + h i d a z o l i n e l l - 4 0 . 1 M 1 o o o o o o _ + 0 . 0 1 u M C P T . 2 h — Q — 0 . 0 1 1 1 M C P T . 2 h - - > 0 . 0 1 1 1 M W a z o i h e I l - 4 m a t 8 0 0 0 0 0 - O 8 . 3 6 0 0 0 0 0 - 8 N ‘ 5 4 0 0 0 0 0 . B E 2 2 0 0 0 0 0 - 0 1 4 r t i t t 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 T l r r e ( h ) 4 0 5 s l l e c c i t o ) t 0 p o p a f o r e b m u N a i i s l l e c c i t o ) O 8 § t p o p a f o r e b m A 8 u o N t E 0 v i i . C P T i n c u b a t i o n ( 0 . 0 1 1 1 M , 1 h ) f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e 0 . 0 1 1 1 M ( c o n t i n u o u s e x p o s u r e ) — o — C e l | s a l o n e — I — h i d a z o l i n e I l l - 4 0 . 1 ” M + 0 . 0 1 1 1 M C F ’ I ' J h + 0 . 0 1 1 1 M C P T , 1 h - - > 0 . 0 1 1 1 M h i d a z o l ' n e l - 4 1 0 0 0 0 0 0 - 3 0 T l m e ( h ) v i i i . C 1 7 1 " i n c u b a t i o n ( 0 . 0 1 1 1 M , 2 h ) f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e 0 . 0 1 1 1 M ( W a s h e d c e l l s ) — 0 — C e l l s a l o n e + h i d a z o l ' n e [ 4 0 . 1 1 1 M + 0 . 0 1 p M C F ’ I . 2 h , w a s h - — I — 0 . 0 1 M C P T . 2 h , w a s h - - > 0 . 0 1 1 1 M h i d a z o l ' n e I l - 4 1 1 o 8 8 8 8 8 8 4 0 6 s l l e c c i t o t p o p a f o r e b m u N s l l e c c i t o t p o p a f o r e b m u N i x . C P T i n c u b a t i o n ( 0 . 0 1 1 1 M , 4 h ) f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e 0 . 0 0 1 1 1 M ( c o n t i n u o u s e x p o s u r e ) — 0 — C e l l s a l o n e . — - — h i d a z o l ' n e l ~ 4 0 . 1 1 M + 0 . 0 1 1 1 M C P T . 4 h 1 ° ° ° ° ° ° ‘ _ . _ 0 . 0 1 1 1 M 0 P T . 4 h - - > 0 . 0 0 1 1 1 M h i d a z o l i n e 0 4 4 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 1 I . . . . . . 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 T t m e ( h ) x . C P T i n c u b a t i o n ( 0 . 0 1 1 1 M , 2 h ) f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e 0 . 0 0 1 1 1 M ( c o n t i n u o u s e x p o s u r e ) — o — C ‘ e l l s a l o n e — ‘ — h i d a z o l i n e l l - 4 0 . 1 1 1 M + 0 . 0 1 p M C P T . 2 h 1 0 0 0 0 0 0 - + 0 . 0 1 u M C F ’ l ' . 2 h - - > 0 . 0 0 1 1 1 M h i d a z o l ' n e I l - 4 T i n e ( h ) 4 0 7 s l l e c c i t o t p o p a f o r e b m u N s l l e c c i t o t p o p a f o r e b m u N x i . C P T i n c u b a t i o n ( 0 . 0 1 1 1 M , 1 h ) f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e 0 . 0 0 1 1 1 M ( c o n t i n u o u s e x p o s u r e ) — o — C e l l s a l o n e — I — h i d a z o l ' n e l 4 0 . 1 p M + 0 . 0 1 1 1 M C F T , 1 h 1 0 0 0 0 0 0 i + 0 . 0 1 1 1 M C P T , 1 h - - > 0 . 0 0 1 1 1 M h i d a z o l ' n e I l - 4 T m ( h ) x i i . C P T i n c u b a t i o n ( 0 . 0 1 1 1 M , 2 h ) f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l i n e 0 . 0 0 1 1 1 M ( w a s h e d c e l l s ) . — 0 — C e l l s a l o n e + h i d a z o l ' n e l 4 0 . 1 M + 0 . 0 1 p M G ’ T , 2 h , w a s h 1 0 0 0 0 0 0 - _ . _ 0 . 0 1 1 1 M o e r . 2 h , w a s h - - > 0 . 0 0 1 M l r n i d a z o l i n e I - 4 T m a ( h ) 4 0 8 7 ) P o t e n t i a t i o n o f c i s p a t i n ( C D D P ) o r c a m p t o t h e c i n ( C P T ) w i t h i m i d a z o l i n e I I I - 4 i n d i f f e r e n t c e l l t y p e s . i . S L 8 9 c e l l s w i t h C D D P 1 1 C D D P 1 0 . 1 1 1 M C b n ' p o u n d l l l - 4 - - > C D D P 1 1 1 . 2 ( I ) 2 9 - 1 O Q ( B l o \ ° . . - 2 - 1 1 - 9 - ' - - 5 - 4 - 3 _ , . l o g [ C D D P ( M ) ] i i . H T 1 0 8 0 w i t h C D D P 1 1 1 ' C D D P 1 0 . 1 1 1 M C o n ' p o u n d I I l - 4 - - > C D D P I . 2 ( n . 9 . O . O Q ( B o \ ° - 1 1 - 1 0 - 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4 - 3 l o g [ C D D P ( M ) ] 4 0 9 s i s o t p o p a % - 1 5 . 0 - 1 2 . 5 - 1 - 1 2 - i 1 4 ' 0 0 l l . o 0 g - 7 D . D 5 P [ C ' . 0 - ) 5 ] ( M - 2 . 5 0 . 0 - o 9 g - D 8 D [ C - 7 ) ] P ( M - 6 - 5 - 4 i i i . H e L a w i t h C D D P 1 . 0 . 1 1 1 M C o r r p o u n d l I - 4 - - > C D D P - c o o p 1 2 0 - H i v . C E M c e l l s w i t h C D D P 1 1 0 - 1 0 0 - , ( m , 9 0 ' . 0 . 1 1 1 M C o n ' p o u n d l l l - 4 - - > G D D P a , 8 0 - n a 7 . 9 ° - 5 5 ’ 1 8 2 1 L 1 . 1 J — — . - — . . a — t 4 1 0 V - H T 1 0 8 0 w i t h C P T s i s o t p o p a o / ° ‘ ' 1 1 2 1 - d . 1 1 - - - s O i O s N o . - t p - o - s p a - % - N l - — - 1 3 - 1 2 u M C o r r 0 C - 1 P T / 1 - 0 / . 0 - p 1 o 1 ‘ ‘ _ . , _ 6 - 9 _ 8 ( M ) ] D - 1 [ 0 C D D l o g u n d 1 1 1 4 W o P w n - l 7 o . g 5 [ - 5 M . ) 0 ] C P T ( - 2 . 5 0 . 0 v i . H e L a w i t h C P T A A 1 1 N . ; 4 1 1 lllllllllllllllllllllllll 3 1 2 9 3 0 2 8 4 5 1 2 8 8