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" : ’ 1 n u t 3 1 . . . i f } n . 1 : ‘ a o i r g V i t . . l l . . - l _ I n t } . . 5 . . . L . . 1 2 . : . . r \ ? / % f / ; j { u f 7 7 - / / / n - ’ - — - - o - I - - o - . - - - - - . - . - - - . - . - . - . - - - . - . - - . - . - . g 0 " a n l fi , U B R A R Y M l c h l a n S t a t e 7 8 W T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d I N V E S T I G A T I N G T H E F U N C T I O N A L R O L E S O F L I P I D S I N M E M B R A N E P R O T E I N C Y T O C H R O M E C O X I D A S E F R O M R H O D O B A C T E R S P H A E R O I D E S U S I N G M A S S S P E C T R O M E T R Y A N D L I P I D P R O F I L E M O D I F I C A T I O N p r e s e n t e d b y X I Z H A N G h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e P h . D . d e g r e e i n C h e m i s t r y a n d B i o c h e m i s t r y & M o l e c u l a r B i o l o g y M a j o r P r o f e s s o r ' s S i g n a t fi / 7 3 7 , 0 5 5 / / D a t e M S U i s a n A f fi n n a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y E m p l o y e r ' — . . . d M J A N { 3 f 2 0 1 2 " . 4 - - - _ P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 5 / 0 8 K t h r o l e o c a P r e s I C I R C / D a t e D u e . i n d d I N V E S T I G A T I N G T H E F U N C T I O N A L R O L E S O F L I P I D S I N M E M B R A N E P R O T E I N C Y T O C H R O M E C O X I D A S E F R O M R H O D O B A C T E R S P H A E R O I D E S U S I N G M A S S S P E C T R O M E T R Y A N D L I P I D P R O F I L E M O D I F I C A T I O N V O L U M E I B Y X i Z h a n g A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y C h e m i s t r y a n d B i o c h e m i s t r y & M o l e c u l a r B i o l o g y 2 0 0 9 A B S T R A C T I N V E S T I G A T I N G T H E F U N C T I O N A L R O L E S O F L I P I D S I N T H E M E M B R A N E P R O T E I N C Y T O C H R O M E C O X I D A S E F R O M R H O D O B A C T E R S P H A E R O I D E S U S I N G M A S S S P E C T R O M E T R Y A N D L I P I D P R O F I L E M O D I F I C A T I O N B y X i Z h a n g R e c e n t s u c c e s s e s i n X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y a t h i g h r e s o l u t i o n h a v e r e v e a l e d t h a t a n u m b e r o f l i p i d m o l e c u l e s r e m a i n b o u n d t o t h e m e m b r a n e p r o t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( C c O ) . T h e s e l i p i d b i n d i n g s i t e s a r e w e l l c o n s e r v e d i n C c O p u r i fi e d f r o m d i f f e r e n t b a c t e r i a l a n d b o v i n e s o u r c e s , i n s p i t e o f d i f f e r e n c e s i n t h e m e m b r a n e l i p i d c o m p o s i t i o n a n d p u r i fi c a t i o n a n d c r y s t a l l i z a t i o n p r o c e d u r e s , s u g g e s t i n g i m p o r t a n t s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l r o l e s . I n p a r t i c u l a r , c a r d i o l i p i n h a s b e e n p r o p o s e d t o b e e s s e n t i a l f o r t h e f u n c t i o n s o f C c O i n m a m m a l i a n s y s t e m s b y i n v i t r o l i p i d r e m o v a l / r e p l a c e m e n t s t u d i e s . T o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t s p e c i fi c l i p i d s a r e r e q u i r e d f o r C c O a s s e m b l y o r f u n c t i o n , i n v i v o l i p i d p r o fi l e m o d u l a t i o n w a s a c h i e v e d b y u s i n g a s e r i e s o f s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s t r a i n s o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s ( R . s p h a e r o i d e s ) t o e x p r e s s C c O , i n c l u d i n g t h e s p e c i fi c g l y c e r o p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( G P C h o ) , s u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l - g l y c e r i d e ( S Q D G ) a n d c a r d i o l i p i n ( C L ) d e fi c i e n t m u t a n t s . I n a d d i t i o n , m e t a b o l i c m o d i fi c a t i o n w a s u s e d t o c o l l e c t i v e l y c h a n g e t h e b a l a n c e b e t w e e n p h o s p h o l i p i d s a n d n o n - p h o s p h o l i p i d s b y t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h . T h e e f f e c t s o n c e l l g r o w t h , C c O e x p r e s s i o n , p u r i fi c a t i o n s t a b i l i t y , s u b u n i t c o m p o s i t i o n , a c t i v i t y , s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s a n d c r y s t a l l i z a t i o n o f t h e C c O w e r e e v a l u a t e d , a n d t h e l i p i d p r o fi l e s o f t h e c e l l m e m b r a n e s , p u r i fi e d C c O a n d C c O c r y s t a l s w e r e q u a n t i t a t i v e l y c h a r a c t e r i z e d b y m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n o r m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n . N o n e o f t h e G P C h o , S Q D G a n d C L l i p i d s w a s f o u n d t o b e e s s e n t i a l f o r R . s p h a e r o i d e s C c O p r o d u c t i o n , s t a b i l i t y , o r a c t i v i t y , i n d i c a t i n g t h a t e a c h o f t h e s e l i p i d s c o u l d b e f u n c t i o n a l l y c o m p e n s a t e d b y o t h e r l i p i d s , d e s p i t e t h e s i g n i fi c a n t l y d e p l e t e d q u a n t i t y o f t h e s p e c i fi c l i p i d ( < 5 % o f w i l d t y p e ) a n d a l t e r e d m e m b r a n e a n d C c O l i p i d p r o fi l e s . T h e l i p i d s i n t h e p u r i fi e d C c O a n d C c O c r y s t a l s r e fl e c t e d t h e s p e c i e s i n t h e m e m b r a n e t h o u g h a t d i f f e r e n t l e v e l s , b u t C c O d i d n o t d i s p l a y a s i g n i fi c a n t a c c u m u l a t i o n o f t h e d e p l e t e d t y p e o f l i p i d . C L - d e fi c i e n t C c O c o u l d b e c r y s t a l l i z e d u n d e r s i m i l a r c o n d i t i o n s t o t h e w i l d t y p e C c O , a n d p r o d u c e d 4 - s u b u n i t a n d 2 - s u b u n i t c r y s t a l s t h a t d i f f r a c t e d u p t o 3 . 2 A a n d 2 . 8 A r e s p e c t i v e l y . C o m b i n a t i o n o f C L - d e fi c i e n t m u t a t i o n w i t h p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c r e a t e d a fi v e - f o l d c l e a n e r C L - d e p l e t e d m u t a n t ( < 1 % C L ) , w h i c h d i s p l a y e d w i l d - t y p e p r o p e r t i e s o f t h e m e m b r a n e s a n d p u r i fi e d C c O , b u t t h e l i p i d p r o fi l e s w e r e d r a s t i c a l l y a l t e r e d . I t i s c o n c l u d e d t h a t t h e C L i n b a c t e r i a ( C L ( 1 8 : 1 ) 4 ) f u n c t i o n s v i a m e c h a n i s m s d i f f e r e n t f r o m t h e p r e v i o u s l y r e p o r t e d C L i n m a m m a l i a n s y s t e m s ( C L ( 1 8 : 2 ) 4 ) . A n o v e l t y p e o f n o n - p h o s p h o l i p i d , g l u t a m i n e l i p i d , w a s d i s c o v e r e d a n d f o u n d t o b e i n c r e a s e d i n t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h . T h e q u a n t i fi c a t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f l i p i d s w e r e m a d e p o s s i b l e b y a n i n - d e p t h i n v e s t i g a t i o n o f t h e g a s - p h a s e fi a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s o f l i p i d s i n i o n t r a p a n d t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r s . G P C h o n o n - c o v a l e n t a n i o n i c a d d u c t s , S Q D G , d i a c y l g l y c e r o l - N , N , N - t n ' m e t h y l - h o m o s e r i n e ( D G T S ) , o r n i t h i n e l i p i d s a n d g l u t a m i n e l i p i d s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y u s i n g d e u t e r i u m l a b e l i n g , H / D e x c h a n g e a n d m u l t i s t a g e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . T h e fi n g e r p r i n t i o n s f o r e a c h t y p e o f l i p i d w e r e p r o p o s e d . T h e f r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s o f t h e s e l i p i d s w e r e f o u n d t o b e h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e a n i o n i d e n t i t y , c h a r g e s t a t e / s i t e a n d i o n c o n f o r m a t i o n . T h e d i f fi c u l t i e s o f d e t e r g e n t a n d l i p i d e x t r a c t i o n f r o m m e m b r a n e p r o t e i n s w e r e a l s o e x a m i n e d . T o m y g r a n d p a r e n t s a n d p a r e n t s A C K N O W L E D G E M E N T T h e p r o j e c t i s t h e p r o d u c t o f t h e d u a l - d e g r e e p r o g r a m i n C h e m i s t r y a n d B i o c h e m i s t r y & M o l e c u l a r B i o l o g y u n d e r t h e j o i n t g u i d a n c e o f D r . S h e l a g h M . F e r g u s o n - M i l l e r a n d D r . G a v i n E . R e i d , i n c l o s e c o l l a b o r a t i o n w i t h D r . C h r i s t o p h B e n n i n g . M a n y p e o p l e h a v e h e l p e d m e t o m a k e t h e p r o g r a m s u c c e s s f u l . F i r s t a n d f o r m o s t , I w o u l d l i k e t o g i v e m y d e e p e s t g r a t i t u d e t o m y a d v i s o r D r . S h e l a g h M . F e r g u s o n - M i l l e r , w h o i s b e h i n d e v e r y s t e p o f p r o g r e s s a n d h a s m a d e e v e r y t h i n g i n t h i s p r o g r a m b e c o m e p o s s i b l e . H e r e v e r - p r e s e n t e n c o u r a g e m e n t , e x t r a o r d i n a r y s c i e n t i fi c i n s i g h t , e n o r m o u s c o u r a g e , p e r s e v e r a n c e a n d h a r d w o r k t o p u r s u e u n t r a v e l e d p a t h t o fi n d o u t t h e t r u t h i n s c i e n t i fi c r e s e a r c h h a v e b e e n t h e p e r p e t u a l s o u r c e o f i n s p i r a t i o n f o r m e t o p r o c e e d . S h e h a s l e d m e t h r o u g h a l l o f t h e d i f fi c u l t s i t u a t i o n s w i t h e x t r a o r d i n a r y g r a c e a n d c o u r a g e , a n d d e m o n s t r a t e d t o m e w h a t i s r i g h t . S h e w o u l d s p e n d h o u r s t o d r i v e m e t o g a i n t h e a c c e s s t o a f u n c t i o n a l m a s s s p e c t r o m e t e r t o o b t a i n t h e c o n fi r m a t i v e e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e , a n d s h e h a s m a d e i t p o s s i b l e f o r m e t o k e e p p u r s u i n g m a s s s p e c t r o m e t r y . S h e h a s a l s o t a u g h t m e t h e i m p o r t a n c e o f t h e e f f o r t s a n d a b i l i t y t o e s t a b l i s h s t r a t e g i c c o l l a b o r a t i o n s i n t h e n e w e r a o f b i o l o g i c a l r e s e a r c h . S h e l a g h i s n o t o n l y a n o u t s t a n d i n g r e s e a r c h a d v i s o r , s h e h a s a l s o m a d e a h u g e d i f f e r e n c e i n a s t u d e n t ’ s l i f e a n d s h e i s m y m e n t o r o f l i f e t i m e . I a m a l s o v e r y g r a t e fi i l t o t h e M i l l e r s f a m i l y f o r t h e i r w a r m e n c o u r a g e m e n t a n d u n d e r s t a n d i n g t h r o u g h o u t t h e s e y e a r s . I s i n c e r e l y t h a n k D r . G a v i n E . R e i d , w h o b e c a m e m y j o i n t - a d v i s o r i n t h e m i d d l e o f m y t h i r d y e a r i n t h e p r o g r a m , f o r g u i d i n g m e t h r o u g h t h e e x p l o r a t i o n o f t h e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n s o f l i p i d s a n d f o r t h e r i g o r o u s t r a i n i n g i n m a s s s p e c t r o m e t r y . H i s h i g h s t a n d a r d s o f r e q u i r e m e n t s i n u n d e r s t a n d i n g i n s t r u m e n t a t i o n a n d p e r f o r m i n g e f fi c i e n t e x p e r i m e n t s w o u l d a l s o b e n e fi t m y f u t u r e s c i e n t i fi c c a r e e r . I s i n c e r e l y t h a n k h i m f o r a l l o w i n g m e t h e e n o r m o u s a m o u n t o f t i m e t o w o r k o n t h e m a s s s p e c t r o m e t e r s a n d p r o v i d i n g m e w i t h h i s i n s i g h t f u l c o m m e n t s a n d c r i t i q u e s . I a m v e r y t h a n k f u l f o r t h e o p p o r t u n i t y t o s t a r t t h e l i p i d a n a l y s i s u s i n g m a s s s p e c t r o m e t r y i n h i s l a b , a n d I a m a l s o t h a n k f u l f o r t h e i n v a l u a b l e o p p o r t u n i t y t o g a i n a g l i m p s e o f t h e c h a l l e n g e s t h a t a p r o f e s s o r h a d t o a c c o m p l i s h t o l a u n c h a c a r e e r . E a c h o f m y c o m m i t t e e m e m b e r s h a s g o n e o u t o f h i s w a y t o h e l p m e t o a c c o m p l i s h t h i s j o u r n e y . D r . C h r i s t o p h B e n n i n g i s a l s o t h e j o i n t p r i n c i p l e i n v e s t i g a t o r o f t h e p r o j e c t , a n d h a s g i v e n m e i n v a l u a b l e a d v i c e a n d c r i t i q u e s , w h i c h w o u l d b e n e fi t n o t o n l y t h e r e s e a r c h p r o j e c t b u t a l s o m y f u t u r e c a r e e r . D r . J a c k T . W a t s o n , m y s e c o n d r e a d e r , h a s p r o v i d e d m e w i t h i n v a l u a b l e g u i d a n c e , a d v i c e a n d d i s c u s s i o n s t h r o u g h o u t t h e p r o g r a m , e s p e c i a l l y o n t h e q u a n t i fi c a t i o n o f l i p i d s d u r i n g t h e i n t e r i m o f t i m e w h e n I d i d n ’ t h a v e a m a s s s p e c t r o m e t r y a d v i s o r o n b o a r d . I a m v e r y t h a n k f u l t o D r . G a r y B l a n c h a r d , w h o i s a l s o t h e g r a d u a t e c o o r d i n a t o r o f t h e d e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y , f o r b e i n g w i l l i n g t o g o o u t o f h i s w a y t o h e l p t h e j o u r n e y o f a g r a d u a t e s t u d e n t ’ s a c a d e m i c p u r s u i t b e c o m e s u c c e s s f u l . I w o u l d l i k e t o t h a n k D r . J o h n A l l i s o n , p r o f e s s o r e m e r i t u s a n d m y j o i n t - a d v i s o r f o r t h e fi r s t t w o y e a r s o f t h e p r o g r a m , f o r i n t r o d u c i n g m e t o t h e f a s c i n a t i n g a r e a o f m a s s s p e c t r o m e t r y . I a l s o t h a n k D r . J u l i a B u s i k ( D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g y ) a n d D r . W a l t e r J . E s s e l m a n ( D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y a n d M o l e c u l a r G e n e t i c s ) f o r t h e o p p o r t u n i t y t o s t a r t t h e a p p l i c a t i o n o f t h e l i p i d a n a l y s i s m e t h o d s d e v e l o p e d h e r e t o t h e i n v e s t i g a t i o n o f d i a b e t i c r e t i n o p a t h y . v i E v e n t h o u g h a l l o f t h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n a r e o r i g i n a l a n d a c q u i r e d i n d e p e n d e n t l y , t h e y w o u l d n ’ t h a v e b e e n p o s s i b l e w i t h o u t t h e i n d i s p e n s i b l e c o l l a b o r a t i o n w i t h M s . B a n i t a T a m o t a n d D r . C a r r i e H i s e r . M s . B a n i t a T a m o t f r o m D r . B e n n i n g ’ s g r o u p n o t o n l y c r e a t e d t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t , b u t a l s o t a u g h t m e h o w t o r u n t h e b e a u t i fi r l T L C a n a l y s i s w i t h o u t r e s e r v a t i o n . D r . C a r r i e H i s e r e x p r e s s e d C c O i n a l l o f t h e s t r a i n s e x a m i n e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n , a n d s h e a l s o s h a r e d w i t h m e t h e “ p e r f e c t ” p r o t o c o l s f o r t h e g e l a n d o x y g r a p h a n a l y s e s . T h e h e l p a n d s u p p o r t f r o m a l l o f t h e F e r g u s o n - M i l l e r g r o u p m e m b e r s t h r o u g h o u t t h e s e y e a r s h a v e b e e n i n v a l u a b l e . D r . L i n g Q i n t a u g h t m e h o w t o p e r f o r m t h e p r o t e i n p u r i fi c a t i o n a n d c r y s t a l l i z a t i o n , a n d h a s k i n d l y s e r v e d a s t h e d r i v e r f o r t h e t r i p s o f c r y s t a l l o g r a p h y d a t a c o l l e c t i o n f o r t h e p a s t t w o y e a r s . T o g e t h e r w i t h D r . C a n i e H i s e r , D r . D e n i s e M i l l s h a s a l w a y s b e e n w i l l i n g t o h e l p m e t h r o u g h , a n d t h e y h a v e s p e n t v a l u a b l e a m o u n t s o f t i m e t o p r o o f - r e a d m y e n t i r e d i s s e r t a t i o n . I a m s i n c e r e l y t h a n k f u l t o D r . C a r r i e H i s e r , D r . D e n i s e M i l l s , D r . L i n g Q i n a n d D r . M a r t y n S h a r p e , f o r a l w a y s m a k i n g t h e m s e l v e s a v a i l a b l e f o r m y q u e s t i o n s , a n d f o r t h e v e r y h e l p f u l d i s c u s s i o n s t h r o u g h o u t t h e s e y e a r s o f s t u d y . I t h a n k N a m j o o n K i m , J i a n L i u a n d L e a n n f o r t h e h e l p f u l c o m m u n i c a t i o n s a n d w a r m e n c o u r a g e m e n t . I a l s o t h a n k t h e f o r m e r A l l i s o n g r o u p m e m b e r s , A n n e , J a m i e a n d E r i c f o r t h e i r h e l p i n t h e fi r s t t w o y e a r s o f t h e s t u d y . I t h a n k K r i s t y L u c i e n f o r p r e p a r i n g t h e c e l l c u l t u r e s . I t h a n k T o d d L y d i c f o r s h a r i n g t h e A d v i o n a u t o s a r n p l e r s e t t i n g s d u r i n g t h e S Q D G a n a l y s i s u s i n g t h e t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r a t D r . G a v i n R e i d ’ s l a b . I t h a n k M S U m a s s s p e c t r o m e t r y f a c i l i t y f o r t h e a c c e s s t o t h e M A L D I - T O F m a s s s p e c t r o m e t e r f o r t h e fi r s t t h r e e y e a r s o f t h e p r o g r a m . v i i L a s t b u t n e v e r t h e l e a s t , I a m d e e p l y t h a n k f u l t o m y g r a n d p a r e n t s f o r t h e i r u n r e s e r v e d l o v e a n d b e l i e f i n m e w i t h o u t c o n d i t i o n s , a n d t o m y p a r e n t s a n d s i s t e r f o r t h e i r c o m p l e t e u n d e r s t a n d i n g , e n c o u r a g e m e n t a n d s u p p o r t f r o m t h e o t h e r s i d e o f t h e P a c i fi c . V i i i T A B L E O F C O N T E N T S L I S T O F T A B L E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . X V I I I L I S T O F F I G U R E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x x L I S T O F S C H E M E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x x x l i L I S T O F A B B R E V I A T I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . X X X I V C H A P T E R 1 A N O V E R V I E W O F T H E S T R U C T U R A L A N D F U N C T I O N A L I M P A C T O F M E M B R A N E L I P I D S O N M E M B R A N E P R O T E I N S , W I T H A F O C U S O N C Y T O C H R O M E C O X I D A S E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I 1 . 1 I N T R O D U C T I O N : S T R U C T U R A L A N D F U N C T I O N A L R O L E S O F L I P I D S I N M E M B R A N E P R O T E I N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 . 2 L I P I D S I N C E L L M E M B R A N E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 . 2 . 1 L i p i d s : t h e b i o l o g i c a l m e m b r a n e e n v i r o n m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 . 2 . 1 . ] B a s i c s t r u c t u r e s o f l i p i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 . 2 . 1 . 2 D y n a m i c m o d i fi c a t i o n s o f l i p i d s t r u c t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 1 . 2 . 1 . 3 T y p i c a l b a c t e r i a l l i p i d s t r u c t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 1 . 2 . 1 . 4 C e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f l i p i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 1 . 2 . 2 B i o s y n t h e s i s o f l i p i d s a n d r e m o d e l i n g o f c a r d i o l i p i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 1 . 2 . 3 S t r u c t u r a l / p h y s i c a l f e a t u r e s u n d e r l y i n g t h e fi m c t i o n s o f l i p i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 1 . 3 T H E M E M B R A N E P R O T E I N C Y T O C H R O M E C O X I D A S E : S T R U C T U R E , F U N C T I O N , M E C H A N I S M A N D R E G U L A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I 5 1 . 3 . 1 O x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n a n d r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 1 . 3 . 2 S t r u c t u r e o f C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 1 . 3 . 2 . 1 E l e c t r o n t r a n s f e r m e t a l c e n t e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 1 . 3 . 2 . 2 P r o t o n t r a n s f e r p a t h w a y s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 1 . 3 . 2 . 3 S u b u n i t c h a r a c t e r i s t i c s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 1 . 3 . 2 . 4 B a c t e r i a l a a 3 - C c O a s a m o d e l f o r m a m m a l i a n i n m e c h a n i s t i c s t u d y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 1 . 3 . 2 . 5 L i p i d c o m p o n e n t s i n C c O a n d t h e i r s i g n i fi c a n c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 1 . 3 . 2 . 6 F u n c t i o n a n d m e c h a n i s m o f C c O a n d t h e i r a n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 1 . 3 . 3 R e g u l a t i o n o f C 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 1 . 4 M E M B R A N E B O U N D S U P E R - M O L E C U L A R C O M P L E X O R G A N I Z A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 1 . 4 . 1 T h e “ s t a t i c ” v e r s u s t h e “ fl u i d i c ” m o d e l o f o r g a n i z a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 1 . 5 I N T E R A C T I O N S O F L I P I D S W I T H M E M B R A N E P R O T E I N S A N D S U P E R - M O L E C U L A R C O M P L E X E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 1 . 5 . 1 I n t e r a c t i o n s e x p e r i e n c e d b y m e m b r a n e p r o t e i n s i n a m e m b r a n e e n v i r o n m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 1 . 5 . 2 E f f e c t s o f l i p i d s o n m e m b r a n e p r o t e i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 i x 1 . 5 . 2 . 1 L i p i d s i n t e r a c t w i t h m e m b r a n e p r o t e i n s t o m a i n t a i n i n t e g r i t y o f b i o l o g i c a l m e m b r a n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 1 . 5 . 2 . 2 L i p i d s a s s i s t w i t h m e m b r a n e p r o t e i n i n s e r t i o n , f o l d i n g , a s s e m b l y a n d t o p o l o g y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 1 . 5 . 2 . 3 L i p i d s a s s i s t w i t h a s s e m b l y a n d s t a b i l i z a t i o n o f s u p e r — m o l e c u l a r c o m p l e x e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 1 . 5 . 2 . 4 L i p i d s a f f e c t o r r e g u l a t e m e m b r a n e p r o t e i n a c t i v i t i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 1 . 5 . 2 . 5 B i n d i n g m o t i f s o f l i p i d s i n m e m b r a n e p r o t e i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 1 . 5 . 3 C a r d i o l i p i n a n d O X P H O S c o m p l e x e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 1 . 5 . 4 C a r d i o l i p i n a n d C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 1 . 6 M E M B R A N E P R O T E I N P U R I F I C A T I O N A N D C R Y S T A L L I Z A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 1 . 6 . 1 U s a g e o f d e t e r g e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 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i d e x c h a n g e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 9 1 . 8 L I P I D P R O F I L E M O D I F I C A T I O N A S T H E T O O L T O P R O B E P R O T E I N - L I P I D I N T E R A C T I O N S I N V I V O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 9 1 . 8 . 1 G e n e t i c m a n i p u l a t i o n o f l i p i d c o n t e n t a s t h e p r o b e i n v i v o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 9 1 . 8 . 2 P h o s p h a t e l i m i t i n g g r t h m e d i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 0 1 . 8 . 3 G r o w t h t e m p e r a t u r e s t r e s s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1 1 . 8 . 4 S a l t c o n c e n t r a t i o n ( o s m o t i c p r e s s u r e ) s t r e s s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1 1 . 9 S U M M A R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2 C H A P T E R 2 A N O V E R V I E W O F M A S S S P E C T R O M E T R Y S T R A T E G I E S E M P L O Y E D F O R L I P I D A N A L Y S I S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 2 . 1 M A S S S P E C T R O M E T R Y : T H E E N A B L I N G T O O L F O R L I P I D O M I C S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 2 . 2 S A M P L E P R E P A R A T I O N F O R M A S S S P E C T R O M E T R I C A N A L Y S I S O F L I P I D S . . . . . . . . . . . 5 4 2 . 2 . 1 L i p i d e x t r a c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 6 2 . 3 T R A D I T I O N A L M E T H O D S F O R L I P I D I D E N T I F I C A T I O N A N D Q U A N T I F I C A T I O N . . . . . . . 5 8 2 . 4 M A S S S P E C T R O M E T R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 0 2 . 4 . 1 I o n s o u r c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1 2 . 4 . 1 . 1 M A L D I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2 2 . 4 . 1 . 2 E S I . 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l e m a s s s p e c t r o m e t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 9 2 . 4 . 2 . 3 Q u a d r u p o l e i o n t r a p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2 2 . 4 . 2 . 4 M S / M S a n d M S n i n q u a d r u p o l e i o n t r a p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4 2 . 4 . 2 . 5 F a c t o r s a f f e c t i n g l i p i d a n a l y s i s r e s u l t s u s i n g q u a d r u p o l e i o n t r a p . . . . . . . . . 7 9 2 . 4 . 2 . 6 O t h e r d i s s o c i a t i o n m e t h o d s i n t h e q u a d r u p o l e i o n t r a p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 0 2 . 4 . 2 . 7 O t h e r m a s s ( m / z ) a n a l y z e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1 2 . 4 . 3 I o n d e t e c t i o n . . . . . 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t a t e : p o s i t i v e v s n e g a t i v e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2 2 . 6 . 3 . 2 F a t t y a c i d c h a i n p o s i t i o n s : s n - I v s s n - 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 5 2 . 6 . 3 . 3 H e a d g r o u p : a c i d i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 6 2 . 6 . 3 . 4 C o n f o r m a t i o n a l f a c t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 6 2 . 6 . 3 . 5 O t h e r f a c t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 7 2 . 6 . 4 I d e n t i fi c a t i o n o f d o u b l e b o n d p o s i t i o n i n C I D M S / M S a n d M S n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 7 2 . 7 Q U A N T I F I C A T I O N O F L I P I D S U S I N G M A S S S P E C T R O M E T R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 8 C H A P T E R 3 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 0 3 . 1 M A T E R I A L S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I 0 0 3 . 2 G R O W T H A N D E X P R E S S I O N O F C c o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 2 3 . 2 . 1 G r t h c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 2 3 . 2 . 2 R . s p h a e r o i d e s g r o w t h c u r v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 3 3 . 2 . 3 C o n s t r u c t i o n o f C L — d e fi c i e n t m u t a n t o f R . s p h a e r o i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 4 3 . 2 . 4 E n g i n e e r i n g R . s p h a e r o i d e s 2 . 4 . 1 a n d s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t s t r a i n s t o o v e r p r o d u c e C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 4 3 . 3 P U R I F I C A T I O N A N D C H A R A C T E R I Z A T I O N O F C c o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 3 . 3 . 1 I s o l a t i o n o f R . s p h a e r o i d e s c e l l m e m b r a n e p e l l e t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 3 . 3 . 2 P u r i fi c a t i o n o f C c O u s i n g F P L C a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 3 . 3 . 2 . 1 D e t e r g e n t s o l u b i l i z a t i o n o f m e m b r a n e p e l l e t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 3 . 3 . 2 . 2 F P L C p u r i fi c a t i o n o f C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 3 . 3 . 3 B C A p r o t e i n a s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 3 3 . 3 . 4 U V - V i s i b l e s p e c t r o s c o p y o f m e m b r a n e s u s p e n s i o n a n d p u r i fi e d C c O . . . . . . . 1 1 4 3 . 3 . 5 U r e a S D S - P A G E g e l e l e c t r o p h o r e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 4 3 . 3 . 6 S t e a d y s t a t e a c t i v i t y a s s a y o f t h e C c O b a s e d o n o x y g e n c o n s u m p t i o n . . . . . . 1 1 5 3 . 3 . 7 P h o s p h o r u s a n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 6 x i 3 . 4 C C O C R Y S T A L L I Z A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 l 7 3 . 4 . 1 F o u r - s u b u n i t C c O c r y s t a l l i z a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 8 3 . 4 . 2 T w o - s u b u n i t C c O c r y s t a l l i z a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 8 3 . 4 . 3 F l a s h - c o o l i n g o f t h e C c O c r y s t a l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 9 3 . 4 . 4 H a r v e s t i n g C c O c r y s t a l s f o r m a s s S p e c t r o m e t r y a n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 0 3 . 4 . 5 X - r a y d i f f r a c t i o n d a t a c o l l e c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 0 3 . 5 L I P I D E X T R A C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 0 3 . 5 . 1 E x t r a c t i o n o f l i p i d s f r o m i s o l a t e d m e m b r a n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 0 3 . 5 . 2 E x t r a c t i o n o f l i p i d s f r o m p u r i fi e d C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 1 3 . 5 . 2 . 1 A c e t o n e w a s h i n g t o r e m o v e d e t e r g e n t f r o m p u r i fi e d C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 2 3 . 5 . 2 . 2 D i l u t i o n - fi l t r a t i o n ( 3 k D a ) t o r e m o v e d e t e r g e n t f r o m p u r i fi e d C c O 1 2 3 3 . 5 . 3 E v a l u a t i o n o f e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y o f l i p i d s f r o m p u r i fi e d C c O . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 3 3 . 6 T H I N L A Y E R C H R O M A T O G R A P H Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 3 . 6 . 1 l - D t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 3 . 6 . 2 E v a l u a t i o n o f c l e a v a b l e d e t e r g e n t f o r p o t e n t i a l a p p l i c a t i o n i n l i p i d s e x t r a c t i o n fi o m p u r i fi e d C c O u s i n g T L C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 3 . 6 . 3 2 - D t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 5 3 . 6 . 4 Q u a n t i t a t i v e T L C l i p i d a n a l y s i s u s i n g l 4 C - l a b e l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 5 3 . 7 M A S S S P E C T R O M E T R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 6 3 . 7 . 1 C h a r a c t e r i z a t i o n o f l i p i d e x t r a c t s u s i n g E S I i o n i z a t i o n s o u r c e s . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 6 3 . 7 . 1 . 1 I d e n t i fi c a t i o n o f l i p i d s b y u s i n g E S I M S a n d C I D M S n o n a l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 6 3 . 7 . 1 . 2 P u l s e d - Q c o l l i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n M S n o n a l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 8 3 . 7 . 1 . 3 A n a l y s i s o f l i p i d e x t r a c t s u s i n g E S I M S a n d C 1 D M S / M S o n a t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 9 3 . 7 . 1 . 4 E x t e n s i v e i d e n t i fi c a t i o n o f l i p i d s u s i n g E S I M S n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 0 3 . 7 . 2 Q u a n t i fi c a t i o n o f l i p i d s u s i n g E S I M S a n d M S / M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 1 3 . 7 . 2 . 1 I n t e r n a l s t a n d a r d s f o r l i p i d q u a n t i fi c a t i o n u s i n g E S I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 1 3 . 7 . 2 . 2 E s t a b l i s h i n g t h e b a s i s f o r q u a n t i fi c a t i o n b y u s i n g i n t e r n a l s t a n d a r d s i n E S I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 2 3 . 7 . 2 . 3 Q u a n t i fi c a t i o n o f a b u n d a n t S p e c i e s i n l i p i d e x t r a c t s u s i n g E S I M S 1 3 3 3 . 7 . 2 . 4 Q u a n t i fi c a t i o n o f l o w - a b u n d a n c e o r o v e r l a p p i n g s p e c i e s i n l i p i d e x t r a c t s u s i n g E S I C I D M S / M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 4 3 . 7 . 2 . 5 “ P u r i fi c a t i o n ” a n d r e l a t i v e q u a n t i fi c a t i o n b e t w e e n m o l e c u l a r S p e c i e s o f t h e S Q D G u s i n g M S / M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 6 3 . 7 . 3 D i r e c t l i p i d a n a l y s i s u s i n g M A L D I - L I T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 6 3 . 7 . 3 . 1 D i r e c t l i p i d i d e n t i fi c a t i o n a n a l y s i s u s i n g M A L D I - L I T M S a n d M s “ . . 1 3 6 3 . 7 . 3 . 2 Q u a n t i t a t i v e l i p i d c o m p a r i s o n u s i n g M A L D I - L I T M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 8 3 . 7 . 4 O p t i m i z i n g t h e d e t e c t i o n o f l i p i d s a n d s u b u n i t s i n p u r i fi e d C c O e n z y m e u s i n g M A L D I - T O F M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 8 x i i N 3 . 8 M E T H O D S U S E D T o P R O B E T H E F R A G M E N T A T I O N M E C H A N I S M S O F L I P I D S I N C I D M S I N L I N E A R I O N T R A P M A S S S P E C T R O M E T E R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 3 . 8 . 1 S y n t h e s i s a n d f r a g m e n t a t i o n o f s t r u c t u r a l a n a l o g u e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 3 . 8 . 2 H / D e x c h a n g e o f l i p i d e x t r a c t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 3 . 8 . 3 T h e o r e t i c a l c a l c u l a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 1 C H A P T E R 4 M U L T I S T A G E T A N D E M M A S S S P E C T R O M E T R Y O F A N I O N I C P H O S P H A T I D Y L C H O L I N E L I P I D A D D U C T S R E V E A L S N O V E L D I S S O C I A T I O N P A T H W A Y S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 2 4 . 1 : S U M M A R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 2 4 . 2 I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 4 4 . 3 R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 6 4 . 3 . 1 D e p e n d e n c e o f t h e f o r m a t i o n o f a n i o n i c a d d u c t s o n t h e p h o s p h o l i p i d t y p e . . 1 4 6 4 . 3 . 2 N e g a t i v e i o n C I D M S / M S o f a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 a n d G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 7 4 . 3 . 3 C I D M S 3 e x p e r i m e n t s t o p r o b e t h e s t r u c t u r e o f t h e p r o d u c t i o n s f o r m e d b y n e u t r a l l o s s o f ( A + 1 5 ) f r o m t h e a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 5 4 . 3 . 4 D e u t e r i u m i s o t o p e l a b e l i n g a n d C I D M 3 3 e x p e r i m e n t s t o p r o b e t h e s t r u c t u r e o f t h e p r o d u c t i o n s f o r m e d b y n e u t r a l l o s s o f ( A + 6 0 ) f r o m t h e a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 1 4 . 3 . 5 D e u t e r i u m i s o t o p e l a b e l i n g a n d C I D M S 3 e x p e r i m e n t s t o p r o b e t h e s t r u c t u r e o f t h e p r o d u c t i o n s f o r m e d b y n e u t r a l l o s s o f ( A + 8 6 ) f r o m t h e a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 6 4 . 3 . 6 D e u t e r i u m i s o t o p e l a b e l i n g a n d C I D M 8 3 a n d M S 4 e x p e r i m e n t s t o p r o b e t h e s t r u c t u r e o f t h e [ M + A - 5 9 ] ' p r o d u c t i o n f o r m e d f r o m t h e H 2 P 0 4 ' a d d u c t s o f G P C h o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 9 4 . 3 . 7 D e u t e r i u m i s o t o p e l a b e l i n g a n d C I D M S 3 e x p e r i m e n t s t o p r o b e t h e s t r u c t u r e o f t h e [ M + A - ( A + l ) ] ' p r o d u c t i o n s f o r m e d f r o m t h e a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o a n d i s o t o p e e f f e c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 2 3 4 . 3 . 8 D e u t e r i u m i s o t o p e l a b e l i n g a n d C I D M S e x p e r i m e n t s t o p r o b e t h e s t r u c t u r e o f t h e [ M + A - ( A + l 6 ) ] " p r o d u c t i o n s f o r m e d f r o m M S / M S o f a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 9 4 . 3 . 9 R a t i o n a l i z i n g t h e e f f e c t s o f a n i o n s o n t h e g a s - p h a s e fi ' a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 0 4 . 3 . 1 0 C o m p e t i t i v e f o r m a t i o n o f a n i o n i c a d d u c t s w i t h G P C h o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 3 4 . 4 C O N C L U S I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 7 C H A P T E R 5 C H A R A C T E R I Z A T I O N O F O R N I T H I N E A N D G L U T A M I N E L I P I D S I N T H E C E L L M E M B R A N E S O F R H O D O B A C T E R S P H A E R O I D E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 8 x i i i 5 . 1 S U M M A R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 8 5 . 2 I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 0 5 . 3 R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 4 5 . 3 . 1 E S I - M S o f w i l d t y p e a n d G P C h o - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 4 5 . 3 . 2 I d e n t i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f o r n i t h i n e l i p i d s i n R . s p h a e r o i d e s b y u s i n g p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e M S n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 8 5 . 3 . 3 I d e n t i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f g l u t a m i n e l i p i d s i n R . s p h a e r o i d e s b y u s i n g p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e M S n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 4 5 . 3 . 4 S u m m a r y o f t h e o r n i t h i n e a n d g l u t a m i n e l i p i d s p e c i e s i d e n t i fi e d f r o m w i l d t y p e a n d G P C h o - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s c e l l m e m b r a n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 0 5 . 4 C O N C L U S I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 3 C H A P T E R 6 C H A R A C T E R I Z A T I O N O F S U L F O Q U I N O V O S Y L D I A C Y L - G L Y C E R I D E ( S Q D G ) A N D D I A C Y L G L Y C E R Y L - N , N , N - T R I M E T H Y L - H O M O S E R I N E ( D G T S ) L I P I D S E X T R A C T E D F R O M R H O D O B A C T E R S P H A E R O I D E S U S I N G T R I P L E Q U A D R U P O L E A N D L I N E A R I O N T R A P M A S S S P E C T R O M E T R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 4 6 . 1 S U M M A R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 4 6 . 2 I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 7 6 . 2 . 1 B i o l o g i c a l i n t e r e s t s i n S Q D G a n d D G T S l i p i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 7 6 . 2 . 2 C u r r e n t s t a t u s o f s t r u c t u r a l s t u d i e s o f S Q D G a n d D G T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 9 6 . 3 R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 3 6 . 3 . 1 F r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s o f S Q D G i n M S / M S a n d M S n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 3 6 . 3 . 1 . 1 C I D M S / M S o f S Q D G i n a t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r . . . . . . . . . 2 5 3 6 . 3 . 1 . 2 P Q D M S / M S f r a g m e n t a t i o n o f S Q D G l i p i d s i n a q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 8 6 . 3 . 1 . 3 C o l l i s i o n e n e r g y d e p e n d e n c e o n f r a g m e n t a t i o n i n a q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 9 6 . 3 . 1 . 4 M S n f r a g m e n t a t i o n o f S Q D G i n a q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 3 6 . 3 . 2 F r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s o f S Q D G i n C I D M S / M S a n d M S n . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 5 6 . 3 . 3 R e l a t i v e q u a n t i fi c a t i o n o f S Q D G i n l i p i d e x t r a c t u s i n g M S / M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 1 6 . 3 . 4 F r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s o f D G T S i n M S / M S a n d M S n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 5 6 . 3 . 4 . 1 C I D M S / M S a n d M S n f r a g m e n t a t i o n o f D G T S i n q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 5 6 . 4 C O N C L U S I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 1 C H A P T E R 7 M A S S S P E C T R O M E T R Y I D E N T I F I C A T I O N A N D S E L E C T I V E Q U A N T I F I C A T I O N O F R H O D O B A C T E R S P H A E R O I D E S M E M B R A N E L I P I D S : P R O B I N G T H E E F F E C T S O F L I P I D S P E C I F I C M U T A N T S O N C Y T O C H R O M E C O X I D A S E P R O D U C T I O N A N D A C T I V I T Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 3 x i v 7 . 1 S U M M A R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 3 7 . 2 I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 5 7 . 2 . 1 L i p i d s a n d t h e m e m b r a n e b o u n d r e d o x p r o t e i n C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 5 7 . 2 . 2 L i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s a s t h e t o o l t o p r o b e t h e f u n c t i o n s o f l i p i d s f o r C c O 2 8 6 7 . 2 . 3 P r o p e r t i e s o f t h e C c O p r o d u c e d f r o m t h e l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 8 7 . 2 . 3 . 1 C e l l g r o w t h , C c O e x p r e s s i o n i n m e m b r a n e s a n d p u r i fi c a t i o n s t a b i l i t y f r o m t h e S p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 8 7 . 2 . 3 . 2 U V - V i s s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s o f t h e p u r i fi e d C c O f r o m t h e f o u r s t r a i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 0 7 . 2 . 3 . 3 S D S - P A G E a n a l y s i s o f t h e p u r i fi e d C c O f r o m t h e f o u r s t r a i n s . . . . . . . . . . . . . 2 9 0 7 . 2 . 3 . 4 A c t i v i t y o f p u r i fi e d C c O f r o m t h e f o u r s t r a i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 2 7 . 2 . 3 . 5 A c t i v i t y s t a b i l i t y o f t h e p u r i fi e d C c O u n d e r t e m p e r a t u r e s t r e s s : W T a n d C L - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 2 7 . 2 . 4 L i p i d o m i c s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 5 7 . 2 . 5 C o m p l e t e l i p i d s t r u c t u r a l i d e n t i fi c a t i o n b y u s i n g M S n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 5 7 . 2 . 6 M e m b r a n e l i p i d s o f R . s p h a e r o i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 6 7 . 3 R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 7 7 . 3 . 1 I d e n t i fi c a t i o n o f m e m b r a n e l i p i d s i n t h e w i l d t y p e a n d t h e m u t a n t s . . . . . . . . . . . . . 2 9 7 7 . 3 . 1 . 1 T r a d i t i o n a l T L C a n a l y s i s o f t h e l i p i d p r o fi l e s o f m e m b r a n e s f r o m e a c h m u t a n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 7 7 . 3 . 1 . 2 I d e n t i fi c a t i o n o f l i p i d s i n t h e w i l d t y p e m e m b r a n e u s i n g M S / M S a n d M S 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 1 7 . 3 . 1 . 3 I o n o v e r l a p p i n g i n M S i l l u s t r a t e d b y M M P E a n d D M P E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 1 7 . 3 . 1 . 4 C h a n g e s i n t h e l i p i d s p e c i e s i n t h e m u t a n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 7 7 . 3 . 2 B a s i s f o r a b s o l u t e q u a n t i fi c a t i o n b y M S a n d M S / M S u s i n g i n t e r n a l s t a n d a r d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 8 7 . 3 . 3 Q u a n t i t a t i v e l i p i d p r o fi l e s o f m e m b r a n e s f r o m e a c h m u t a n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 0 7 . 3 . 3 . 1 Q u a n t i t a t i v e l i p i d p r o fi l e s o f m e m b r a n e s : a b u n d a n t m e m b r a n e l i p i d s u s i n g E S I M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 0 7 . 3 . 3 . 2 S u m m a r y o f t h e q u a n t i fi c a t i o n o f m e m b r a n e l i p i d s p e c i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 5 7 . 3 . 3 . 3 Q u a n t i fi c a t i o n o f t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t : t h e l o w - a b u n d a n c e c a r d i o l i p i n u s i n g E S I M S / M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 2 7 . 3 . 4 I n t e r p r e t i n g t h e p h y s i o l o g i c a l m e a n i n g o f t h e s p e c i fi c l i p i d d e fi c i e n c y i n m e m b r a n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 5 7 . 3 . 5 P r o fi l e s o f t h e l i p i d s m a i n t a i n e d i n t h e p u r i fi e d C c O : W T a n d C L - . . . . . . . . . . . . 3 3 7 7 . 4 C O N C L U S I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 6 C H A P T E R 8 L I P I D E X T R A C T I O N F R O M M E M B R A N E P R O T E I N S : E F F E C T S O F D E T E R G E N T A N D D E T E R G E N T R E M O V A L P R O C E D U R E S O N E X T R A C T I O N E F F I C I E N C I E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 9 8 . 1 S U M M A R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 9 8 . 2 I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 1 8 . 2 . 1 T h e n e e d t o r e m o v e d e t e r g e n t f r o m m e m b r a n e p r o t e i n s f o r l i p i d a n a l y s i s 3 5 1 X V 8 . 2 . 2 T h e i s s u e o f i n c o m p l e t e e x t r a c t i o n o f l i p i d s f r o m m e m b r a n e p r o t e i n s . . . . . . . . . 3 5 3 8 . 2 . 3 T h e v a r i a b l e s t h a t m i g h t a f f e c t t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 4 8 . 2 . 4 A p p r o a c h e s t o i m p r o v e t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m C c O . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 8 8 . 3 R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 0 8 . 3 . 1 E v a l u a t i o n o f t h e e f fi c i e n c y o f d e t e r g e n t r e m o v a l m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 0 8 . 3 . 1 . 1 D e t e r g e n t r e m o v a l b y a d i l u t i o n - fi l t r a t i o n m e t h o d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 0 8 . 3 . 1 . 2 A c e t o n e - w a s h i n g m e t h o d t o r e m o v e d e t e r g e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 7 8 . 3 . 2 W h a t a f f e c t s t h e e x t r a c t i o n o f l i p i d s f r o m m e m b r a n e p r o t e i n C c O . . . . . . . . . . . . . . 3 7 0 8 . 3 . 2 . 1 L y o p h i l i z a t i o n o f C c O p r i o r t o e x t r a c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 1 8 . 3 . 2 . 2 A c e t o n e w a s h i n g o f C c O p r i o r t o e x t r a c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 2 8 . 3 . 2 . 3 P a r t i a l d i g e s t i o n o f C c O t o a s s i s t w i t h t h e l i p i d r e l e a s e d u r i n g e x t r a c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 8 . 3 . 2 . 4 A d d i t i o n o f a c i d o r b a s e i n t h e e x t r a c t i o n s o l v e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 8 . 3 . 2 . 5 U r e a t r e a t m e n t o f C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 4 8 . 3 . 2 . 6 U s a g e o f c l e a v a b l e d e t e r g e n t f o r d e t e r g e n t r e m o v a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 4 8 . 3 . 3 F u t u r e d i r e c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 5 8 . 4 ' C O N C L U S I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 5 C H A P T E R 9 C R Y S T A L L I Z A T I O N O F C Y T O C H R O M E C O X I D A S E P R O D U C E D I N A C A R D I O L I P I N - D E F I C I E N T M U T A N T O F R H O D O B A C T E R S P H A E R O I D E S A N D I T S L I P I D P R O F I L E C H A R A C T E R I Z A T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 7 9 . 1 S U M M A R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 7 9 . 2 I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 8 9 . 2 . 1 W h y t h e f o c u s o f i n t e r e s t o n C L i n C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 8 9 . 2 . 2 E f f e c t o f C L d e fi c i e n c y o n R . s p h a e r o i d e s c e l l g r o w t h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 1 9 . 2 . 3 P r o d u c t i o n o f C 6 0 i n R . s p h a e r o i d e s W T a n d C L - c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 4 9 . 2 . 4 P r o p e r t i e s o f C c O p u r i fi e d f r o m w i l d t y p e a n d c l s m u t a n t c e l l l i n e s . . . . . . . . . . . . 3 8 6 9 . 3 R E S U L T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 8 9 . 3 . 1 M A L D I a n a l y s i s o f t h e m e m b r a n e l i p i d s e x p r e s s i n g C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 8 9 . 3 . 2 P u r i fi c a t i o n a n d c r y s t a l l i z a t i o n o f C c O fi o m c l s m u t a n t a n d w i l d t y p e . . . . . . . . 3 9 5 9 . 3 . 3 M A L D I a n a l y s i s o f t h e l i p i d s i n t h e r e - d i s s o l v e d f o u r - s u b u n i t C c O c r y s t a l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 7 9 . 4 D I S C U S S I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 5 9 . 4 . 1 R e s i d u a l C L i n t h e c a r d i o l i p i n d e fi c i e n t m u t a n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 5 9 . 4 . 2 M o l e c u l a r c o m p o n e n t s o f C L S p e c i e s i n R . s p h a e r o i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 6 9 . 4 . 3 C L a n d g r o w t h o f R . s p h a e r o i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 7 9 . 4 . 4 A r o l e f o r C L i n t h e f u n c t i o n o r a s s e m b l y o f C c O o f R . s p h a e r o i d e s . . . . ' . . . . . . . 4 0 8 9 . 4 . 5 L i p i d m u t a n t s o f R . s p h a e r o i d e s a s t o o l s f o r t h e s t u d y o f m e m b r a n e p r o t e i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 0 C H A P T E R 1 0 C H A R A C T E R I Z A T I O N O F A C A R D I O L I P I N - D E F I C I E N T M U T A N T O F R H O D O B A C T E R S P H A E R O I D E S , U N D E R P H O S P H A T E - L I M I T E D A N D x v i P H O S P H A T E - R I C H C O N D I T I O N S , W I T H R E G A R D T O C Y T O C H R O M E C O X I D A S E P R O D U C T I O N , A C T I V I T Y A N D L I P I D P R O F I L E M O D I F I C A T I O N . . . 4 1 2 1 0 . 1 S U M M A R Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 2 1 0 . 2 I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 4 1 0 . 2 . 1 L i p i d p r o fi l e m o d u l a t i o n u s i n g p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h m e d i a . . . . . . . . . . . . . 4 1 4 1 0 . 2 . 2 C o m b i n i n g s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a t i o n w i t h p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 5 1 0 . 3 R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 7 1 0 . 3 . 1 C e l l g r o w t h , C c O e x p r e s s i o n i n m e m b r a n e s a n d p u r i fi c a t i o n s t a b i l i t y . . . . . . . 4 1 7 1 0 . 3 . 2 C h a r a c t e r i z a t i o n o f C 6 0 p u r i fi e d f r o m t h e f o u r c e l l s a m p l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 0 1 0 . 3 . 2 . 1 U V - V i s S p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s o f t h e p u r i fi e d C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 0 1 0 . 3 . 2 . 2 S D S - P A G E a n a l y s i s o f t h e p u r i fi e d C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 2 1 0 . 3 . 2 . 3 A c t i v i t y a n a l y s i s o f t h e p u r i fi e d C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 4 1 0 . 3 . 3 Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e m e m b r a n e l i p i d s p r o fi l e f o r l o w - p h o s p h a t e g r o w t h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 6 1 0 . 3 . 4 Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e l i p i d s i n t h e m e m b r a n e g r o w n w i t h l o w - p h o s p h a t e u s i n g M A L D I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 5 1 0 . 3 . 5 A n a l y s i s o f t h e l i p i d s i n t h e p u r i fi e d C c O g r o w n w i t h l o w - p h o s p h a t e u s i n g M A L D I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 2 1 0 . 4 C O N C L U S I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 3 B I B L I O G R A P H Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 5 x v i i L I S T O F T A B L E S T A B L E 1 . 1 B a s i c s t r u c t u r e s o f l i p i d s f o u n d i n e u k a r y o t e s a n d b a c t e r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 T A B L E 1 . 2 A m i n o a c i d r e s i d u e s t h a t b i n d t h e h e a d g r o u p s o f n e g a t i v e l y c h a r g e d l i p i d s r e s o l v e d i n m e m b r a n e p r o t e i n c r y s t a l s t r u c t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 T A B L E 1 . 3 A m i n o a c i d r e s i d u e s t h a t b i n d t h e f a t t y a c i d t a i l s o f l i p i d s r e s o l v e d i n m e m b r a n e p r o t e i n c r y s t a l s t r u c t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 T A B L E 2 . 1 C h a r a c t e r i s t i c C I D M S / M S f r a g m e n t a t i o n s o f l i p i d s p r e v i o u s l y i d e n t i fi e d i n t h e l i t e r a t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 9 T A B L E 3 . 1 R . s p h a e r o i d e s s t r a i n s a n d C c O p l a s m i d s u s e d i n t h i s w o r k . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 7 T A B L E 4 . 1 N e g a t i v e i o n m o d e C I D M S / M S o f a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 a n d G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 1 . . 3 . . T A B L E 4 . 2 S u m m a r y o f t h e n e g a t i v e I o n m o d e C I D M S p r o d u c t I o n s o f v a r l o u s a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 4 T A B L E 5 . 1 S u m m a r y o f t h e o r n i t h i n e ( 0 L ) a n d g l u t a m i n e ( Q L ) l i p i d s p e c i e s e x t r a c t e d f r o m t h e c e l l m e m b r a n e s o f w i l d t y p e a n d G P C h o - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 2 T A B L E 7 . 1 I d e n t i fi c a t i o n o f t h e l i p i d i o n s i n p o s i t i v e i o n m o d e M S o f t h e m e m b r a n e e x t r a c t s o f t h e w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 3 T A B L E 7 . 2 I d e n t i fi c a t i o n o f t h e l i p i d i o n s i n n e g a t i v e i o n m o d e M S o f t h e m e m b r a n e e x t r a c t s o f t h e w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 5 T A B L E 7 . 3 L i p i d s p e c i e s i d e n t i fi e d i n t h e m e m b r a n e e x t r a c t s o f t h e w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 8 T A B L E 7 . 4 S u m m a r y o f l i p i d s e x t r a c t e d fi o m t h e m e m b r a n e s o f w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) a n d C L - d e fi c i e n t m u t a n t ( C L 3 + C c O ) , u s i n g M S a n d M S / M S : C L — d e fi c i e n t m e m b r a n e s a r e s i g n i fi c a n t l y d e p l e t e d i n c a r d i o l i p i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 5 T A B L E 7 . 5 S u m m a r y o f t h e p e r c e n t a g e o f c h a n g e s i n t h e q u a n t i t y o f p h o s p h o l i p i d s f r o m t h e l i p i d e x t r a c t s o f C c O p u r i fi e d f r o m t h e w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) a n d t h e C L - d e fi c i e n t s t r a i n ( C L 3 + C c O ) , i n c o m p a r i s o n t o t h e m e m b r a n e s . . . . 3 4 3 x v i i i T A B L E 8 . 1 P o t e n t i a l a p p r o a c h e s t o i m p r o v e t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m m e m b r a n e p r o t e i n s a t d i f f e r e n t s t a g e s o f l i p i d e x t r a c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 9 T A B L E 8 . 2 E f f e c t s o f f r e e z e - d r y i n g ( f r e - d ) a n d a c e t o n e w a s h i n g ( a c e - w ) o n t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m C c O B a s i c s t r u c t u r e s o f l i p i d s f o u n d i n e u k a r y o t e s a n d b a c t e r i a 3 7 0 T A B L E 9 . 1 S p e c t r a l a n d e n z y m a t i c p r o p e r t i e s o f C c O p u r i fi e d f r o m R . s p h a e r o i d e s w i l d - t y p e a n d B C - m 3 c e l l l i n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 7 T A B L E 9 . 2 C r y s t a l l o g r a p h y s c r e e n i n g r e s u l t s o f C c O c r y s t a l s o b t a i n e d f r o m R . s p h a e r o i d e s w i l d t y p e a n d c l s m u t a n t a t d i f f e r e n t c r y s t a l g r o w t h t e m p e r a t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 7 x i x L I S T O F F I G U R E S F I G U R E 1 . 1 T r a d i t i o n a l fl u i d m o s a i c m o d e l o f a b i o l o g i c a l m e m b r a n e i n m a m m a l i a n c e l l s c o n s t i t u t e d b y l i p i d b i l a y e r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 F I G U R E 1 . 2 M a j o r b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s f o r p h o s p h o l i p i d s , a n d t h e d i f f e r e n t c a r d i o l i p i n s y n t h e t i c p a t h w a y i n e u k a r y o t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 F I G U R E 1 . 3 T h e m i t o c h o n d r i a l r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s a n d A T P a s e t h a t a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n i n e u k a r y o t i c s y s t e m s . . . . . . 1 6 F I G U R E 1 . 4 C o m p a r i s o n o f R . s p h a e r o i d e s a n d b o v i n e m i t o c h o n d r i a l C c O s t r u c t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 F I G U R E 1 . 5 M e m b r a n e l i p i d s r e s o l v e d i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f R s C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 F I G U R E 1 . 6 C c O c r y s t a l s t r u c t u r e s s h o w i n g b o u n d l i p i d s , ( A ) b o v i n e h e a r t C c O s h o w i n g t h e l i p i d c o n t e n t , a n d ( B ) s u p e r i m p o s e d s t r u c t u r e s h o w i n g t h e c o n s e r v e d s i t e s f o r l i p i d s i n s u b u n i t s I a n d I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 F I G U R E 1 . 7 T h e o x y g e n c h e m i s t r y c y c l e o f t h e r e a c t i o n c a t a l y z e d b y C c O . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 F I G U R E 1 . 8 F i t t i n g o f a t o m i c s t r u c t u r e s o f t h e y e a s t c y t o c h r o m e b c 1 c o m p l e x ( r e d ) a n d t h e b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e o r c o m p l e x I V ( g r e e n ) i n t o s e l e c t e d E M p r o j e c t i o n m a p s f o r a s s i g n m e n t o f t h e a r r a n g e m e n t o f t h e 1 1 1 2 + N Z a n d 1 1 1 2 + W ] s u p e r c o m p l e x e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 F I G U R E 1 . 9 S c h e m e f o r d i m e r i c A T P s y n t h a s e f r o m m i t o c h o n d r i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 F I G U R E 1 . 1 0 I n t e r a c t i o n s t h a t d e t e r m i n e t h e s t r u c t u r e a n d s t a b i l i t y o f m e m b r a n e p r o t e i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 F I G U R E 1 . 1 1 L i q u i d c r y s t a l l o g r a p h i c s t r u c t u r e o f a fl u i d l i p i d b i l a y e r a n d i t s c o m p u t e d p o l a r i t y p r o fi l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 F I G U R E 1 . 1 2 D i f f e r e n c e i n t h e t o p o l o g i c a l o r g a n i z a t i o n o f L a c Y f r o m E . c o l i c e l l s c o n t a i n i n g ( t o p ) a n d g e n e t i c a l l y l a c k i n g ( b o t t o m ) G P E t n ( P E ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 F I G U R E 1 . 1 3 P s e u d o - a t o m i c m o d e l o f t h e 1 1 1 2 + 1 V 2 s u p e r - c o m p l e x w i t h a t t a c h e d c y t o c h r o m e c , s h o w i n g t h e i n t e r a c t i o n s o f c a r d i o l i p i n w i t h c o m p l e x e s I I I a n d I V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 X X F I G U R E 1 . 1 4 S c h e m a t i c o f t h e i s o l a t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s f r o m m e m b r a n e s u s i n g d e t e r g e n t d o d e c y l m a l t o s i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 F I G U R E 2 . 1 S c h e m a t i c S h o w i n g t h e g e n e r a l o p e r a t i o n o f a m a s s S p e c t r o m e t e r . . . . . . . . . . . 6 1 F I G U R E 2 . 2 S t a b i l i t y o f i o n s a t d i f f e r e n t m / z a s a f u n c t i o n o f U ( D C ) a n d V ( R F ) a m p l i t u d e s i n t h e q u a d r u p o l e e l e c t r i c fi e l d , a n d t h e t h r e e o p e r a t i o n m o d e s u n d e r d i f f e r e n t a p p l i c a t i o n s o f U a n d V ( m 1 < m 2 < m 3 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 8 F I G U R E 2 . 3 T h r e e t y p e s o f C I D M S / M S s c a n s t y p i c a l l y a p p l i e d i n a t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r : p r o d u c t i o n s c a n , p r e c u r s o r i o n s c a n a n d n e u t r a l l o s s s c a n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 0 F I G U R E 2 . 4 S t a b i l i t y d i a g r a m o f i o n s o f d i f f e r e n t m / z i n t h e 3 - D q u a d r u p o l e i o n t r a p ( u p p e r g r a p h ) , a n d t h e t r a p p i n g e f fi c i e n c y r e p r e s e n t e d b y t h e D e h m e l t p o t e n t i a l ( D ) i n e V ( l o w e r g r a p h , r i g h t a x i s ) a s a f u n c t i o n o f t h e q v a l u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 4 F I G U R E 2 . 5 O p e r a t i o n m o d e s o f q u a d r u p o l e i o n t r a p a s a f u n c t i o n o f t h e d r i v e R F a n d s u p p l e m e n t a r y R F a m p l i t u d e s i n a n M S / M S e x a m p l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 5 F I G U R E 3 . 1 F u l l l e n g t h a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f R . s p h a e r o i d e s C c O d e d u c e d f r o m t h e g e n o m e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 9 F I G U R E 3 . 2 T y p i c a l F P L C g r a d i e n t p r o fi l e u s e d i n t h e p u r i fi c a t i o n o f s u b u n i t 1 1 h i s - t a g g e d C c O i n t h i s s t u d y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 2 F I G U R E 3 . 3 V a p o r d i f f u s i o n c r y s t a l l i z a t i o n u s i n g ( A ) h a n g i n g d r o p s e t u p , a n d ( B ) s i t t i n g d r o p s e t u p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 8 F I G U R E 4 . ] N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e [ M + A ] ' p r e c u r s o r i o n s o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 f o r m e d b y a n i o n i c a d d u c t i o n w i t h ( A ) a c e t a t e ( m / z 7 9 2 ) a n d ( B ) m e t h y l c a r b o n a t e ( m / z 8 0 8 ) . . . . . . . . . . . . . 1 5 0 3 . F I G U R E 4 . 2 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e ( A ) C I D M S p r o d u c t I o n S p e c t r u m o f t h e m / z 7 1 8 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( A + C H 3 ) f r o m t h e a c e t a t e a d d u c t o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 i n F i g u r e 4 . 1 A . ( B ) C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e [ M — H ] ' p r e c u r s o r i o n o f N , N - d i m e t h y l p h o s p h a t i d y l - e t h a n o l a m i n e 1 6 : 0 / 1 6 : 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 7 F I G U R E 4 . 3 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r a o f t h e m e t h y l - c a r b o n a t e a d d u c t s o f ( A ) d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( m / z 8 1 2 ) , ( B ) G P C h o d 3 1 - 1 6 : O / d 3 1 - 1 6 : 0 ( m / z 8 7 0 ) a n d ( C ) d 1 3 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : O ( m / z 8 2 1 ) . . . . . . . . I 7 3 x x i F I G U R E 4 . 4 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e ( A ) C I D M S 3 p r o d u c t i o n S p e c t r u m o f t h e m / z 6 7 3 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( A H + ( C H 3 ) 3 N ) f r o m t h e m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 i n F i g u r e 4 . 1 3 . ( B ) C I D M S / M S p r o d u c t i o n S p e c t r u m o f t h e [ M - H ] ‘ p r e c u r s o r i o n o f p h o s p h a t i d y l e t h a n o l 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( m / z 6 7 5 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 5 F I G U R E 4 . 5 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e ( A ) C I D M S 3 p r o d u c t i o n s p e c t r a o f t h e m / z 6 7 3 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f [ A + ( C H 3 ) 3 N C H = C H 2 ] f r o m t h e m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 i n T a b l e 4 . 1 . ( B ) C I D M S / M S p r o d u c t i o n S p e c t r u m o f t h e [ M - H ] ‘ p r e c u r s o r i o n o f p h o s p h a t i d i c a c i d l 6 : 0 / 1 8 : 1 ( m / z 6 7 3 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 8 F I G U R E 4 . 6 ( A ) N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e p h o s p h a t e ( H z P O 4 ' ) a d d u c t o f G P C h o l 6 : 0 / 1 8 : 1 ( m / z 8 5 6 ) . ( B ) C I D M S 3 p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e m / z 7 9 7 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( C H 3 ) 3 N ( 5 9 D a ) f r o m F i g u r e 4 . 6 A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 1 F I G U R E 4 . 7 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e C I D M S 3 p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f ( A ) t h e m / z 7 3 2 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( A H ) f r o m t h e m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t o f G P C h o l 6 : 0 / 1 6 : 0 i n F i g u r e 4 . 1 8 . ( B ) t h e m / z 7 9 3 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( A D ) f r o m t h e m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t o f G P C h o d 3 1 - 1 6 z 0 / d 3 1 - 1 6 : O i n F i g u r e 4 . 3 B . ( C ) t h e m / z 7 9 4 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( A H ) fi ' o m t h e m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t o f G P C h o d 3 1 - 1 6 : O / d 3 1 - 1 6 2 0 i n F i g u r e 4 . 3 8 . . 1 8 5 F I G U R E 4 . 8 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r a o f t h e t r i fl u o r o a c e t a t e a d d u c t s o f ( A ) d 4 - G P C h o l 6 2 0 / 1 6 : 0 ( m / z 8 5 0 ) , ( B ) G P C h o d 3 1 - 1 6 : 0 / d 3 1 - 1 6 : 0 ( m / z 9 0 8 ) a n d ( C ) d 1 3 - G P C h o l 6 : 0 / l 6 : 0 ( m / z 8 5 9 ) . . . 1 8 8 F I G U R E 4 . 9 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e C I D M S 3 p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e m / z 7 1 7 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( A + l 6 ) fi ' o m t h e t r i fl u o r o a c e t a t e a d d u c t o f G P C h o 1 6 1 0 / 1 6 : 0 i n T a b l e 4 . 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 0 F I G U R E 4 . 1 0 M o s t s t a b l e s t r u c t u r e ( c a l c u l a t e d a t t h e P M 3 l e v e l o f t h e o r y ) f o r t h e a n i o n i c c h l o r i d e a d d u c t o f t h e m o d e l p h o s p h a t i d y l c h o l i n e l i p i d G P C h o 6 : 0 / 6 : 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 2 F I G U R E 4 . 1 1 D e p e n d e n c e o f t h e i o n a b u n d a n c e o f a n i o n i c a d d u c t s f o r m e d f r o m ( A ) f o r m a t e ( m / z 7 7 8 ) , ( B ) a c e t a t e ( m / z 7 9 2 ) , ( C ) c h l o r i d e ( m / z 7 6 8 ) a n d ( D ) x x i i m e t h y l c a r b o n a t e ( m / z 8 0 8 ) o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f a m m o n i u m f o r m a t e , a m m o n i u m a c e t a t e , a m m o n i u m c h l o r i d e a n d a m m o n i u m h y d r o x i d e , i n t h e s o l u t i o n o f c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) c o n t a i n i n g 5 u M G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 2 0 , a n a l y z e d i n n e g a t i v e i o n m o d e E S I M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 5 F I G U R E 4 . 1 2 T h e r a t i o o f i o n a b u n d a n c e s o f a n i o n i c a d d u c t s f o r m e d f r o m A ) [ M + f o r m a t e ] ‘ a n d [ M + a c e t a t e ] ' ( a t m / z 7 7 8 a n d m / z 7 9 2 ) a g a i n s t t h e r a t i o o f c o n c e n t r a t i o n s o f a m m o n i u m f o r m a t e / a m m o n i u m a c e t a t e i n s o l u t i o n , a n d B ) [ M + c h l o r i d e ] ' a n d [ M + f o r m a t e ] ' ( a t m / z 7 6 8 a n d m / z 7 7 8 ) a g a i n s t t h e r a t i o o f c o n c e n t r a t i o n s o f a m m o n i u m f o r m a t e / a m m o n i u m c h l o r i d e i n s o l u t i o n , i n n e g a t i v e i o n m o d e E S I M S , w h i l e t h e c o n c e n t r a t i o n o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 w a s m a i n t a i n e d a t 5 1 1 M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 6 F I G U R E 5 . 1 P o s i t i v e E S I M S o f c r u d e l i p i d e x t r a c t s i s o l a t e d f r o m t h e c e l l m e m b r a n e s o f ( A ) w i l d t y p e a n d ( B ) G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t R . s p h a e r o i d e s ( b o t h w i t h C c O o v e r - e x p r e s s i o n ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 7 F I G U R E 5 . 2 I d e n t i fi c a t i o n o f o r n i t h i n e l i p i d ( O L 3 — O H 2 0 : 1 / 2 0 z 2 ) a t m / z 7 3 1 f r o m F i g u r e 5 . 1 B b y p o s i t i v e i o n C I D M S / M S a n d M S 1 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 1 F I G U R E 5 . 3 I d e n t i fi c a t i o n o f o m i t h i n e l i p i d ( O L 3 - O H 2 0 : 1 / 2 0 z 2 ) ( m / z 7 2 9 ) f r o m F i g u r e 5 . 1 D b y n e g a t i v e i o n C I D M S / M S a n d M S n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 F I G U R E 5 . 4 T h e f r a g m e n t a t i o n o f o r n i t h i n e s t a n d a r d i n p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 8 F I G U R E 5 . 5 T h e f r a g m e n t a t i o n o f N a — a c e t y l o r n i t h i n e s t a n d a r d i n p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 9 F I G U R E 5 . 6 I d e n t i fi c a t i o n o f o r n i t h i n e l i p i d s ( O L 3 — O H 1 8 : 0 / 2 0 : 2 a n d O L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 0 ) a t m / z 7 0 5 f r o m F i g u r e 1 B b y ( A ) C I D M S / M S a n d b y ( B ) C I D M s n o f t h e m / z 6 8 7 i o n f r o m p a n e l A . ( C ) N e g a t i v e i o n C I D M S / M S o f t h e c o r r e s p o n d i n g i o n a t m / z 7 0 3 f r o m F i g u r e 1 D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 3 F I G U R E 5 . 7 I d e n t i fi c a t i o n o f o v e r l a p p i n g o r n i t h i n e ( 0 L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 9 : 1 ) a n d g l u t a m i n e ( Q L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 ) l i p i d s a t m / z 7 1 9 b y p o s i t i v e i o n E S I C I D M S / M S a n d M s n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 5 F I G U R E 5 . 8 I d e n t i fi c a t i o n o f o v e r l a p p i n g o r n i t h i n e ( O L 3 — O H 2 0 : 1 / 1 9 : 1 ) a n d g l u t a m i n e ( Q L 3 — O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 ) l i p i d s a t m / z 7 1 9 b y p o s i t i v e i o n E S I C I D n M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 7 x x i i i F I G U R E 5 . 9 C o m p a r i s o n o f t h e p o s i t i v e i o n m o d e E S I C I D M S / M S s p e c t r a o f m / z 1 8 9 , t h e [ M + H ] + i o n s g e n e r a t e d f r o m s y n t h e s i z e d a m i n o a c i d s t a n d a r d s : A ) N a - A c - G l n , B ) N a - A c - L y s , C ) N g - A c - L y s , D ) N 5 - M e - N a - A c - O m a n d E ) O - M e - N a - A c - O r n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 9 F I G U R E 5 . 1 0 C o m p a r i s o n o f t h e n e g a t i v e i o n m o d e E S I C I D M S / M S s p e c t r a o f m / z 1 8 7 , t h e [ M - H ] ' i o n s g e n e r a t e d f r o m s y n t h e s i z e d a m i n o a c i d s t a n d a r d s : A ) N a - A c - G l n , B ) N a - A c - L y s , C ) N 8 - A c - L y s , D ) N 5 - M e - N a - A c - O r n a n d E ) O - M e - N a - A c - O m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 1 F I G U R E 5 . 1 1 T h e f r a g m e n t a t i o n o f N a — p r o p y l g l u t a m i n e s t a n d a r d i n p o s i t i v e a n d + n e g a t i v e i o n m o d e s : A ) M S / M S o f [ M + H ] i o n s a t m / z 2 0 3 , B ) M S / M S o f [ M - H ] ' i o n s a t m / z 2 0 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 3 F I G U R E 5 . 1 2 I d e n t i fi c a t i o n o f o v e r l a p p i n g o r n i t h i n e ( O L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 9 : 1 ) a n d g l u t a m i n e ( Q L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 ) l i p i d s a t m / z 7 1 7 b y n e g a t i v e i o n E S I C I D M S / M S a n d M S 1 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 7 F I G U R E 6 . 1 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e E S I M S / M S o f m / z 8 1 9 ( S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ) u s i n g C I D o n t h e t r i p l e q u a d r u p o l e ( Q q Q ) m a s s S p e c t r o m e t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 5 F I G U R E 6 . 2 C o l l i s i o n - e n e r g y - r e s o l v e d C I D o f m / z 8 4 5 ( S Q D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 ) ( A ) , a n d m / z 8 1 9 ( S Q D G l 6 : 0 / 1 8 1 1 ) ( B ) i n M S / M S w h e n t h e c o l l i s i o n e n e r g y i s c h a n g e d f r o m 1 0 t o 7 0 V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 7 F I G U R E 6 . 3 N e g a t i v e i o n m o d e E S I M S / M S p r o d u c t i o n a n a l y s i s o f m / z 8 1 9 ( S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ) f r o m R . s p h a e r o i d e s , u s i n g p u l s e d - Q d i s s o c i a t i o n ( P Q D ) o n t h e q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p ( L I T ) m a s s S p e c t r o m e t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 8 F I G U R E 6 . 4 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e M S / M S p r o d u c t i o n S p e c t r u m o f m / z 8 1 9 ( S Q D G l 6 : 0 / 1 8 : 1 ) f r o m R . s p h a e r o i d e s C c O l i p i d e x t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 9 F I G U R E 6 . 5 N o r m a l i z e d c o l l i s i o n - e n e r g y - r e s o l v e d r e l a t i v e a b u n d a n c e o f e a c h p r o d u c t i o n g e n e r a t e d f r o m m / z 8 1 9 ( S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 z l ) f r o m R . s p h a e r o i d e s b y E S I - L I T u s i n g C I D M S / M S ( A ) , a n d P Q D M S / M S ( B ) f r a g m e n t a t i o n s , p l o t t e d a s t h e p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l a b u n d a n c e o f a l l t h e m a j o r p r o d u c t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 2 F I G U R E 6 . 6 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e M S 3 p r o d u c t i o n s p e c t r a o f m / z 8 1 9 ( S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ) f r o m R . s p h a e r o i d e s C c O l i p i d e x t r a c t S h o w n i n F i g u r e 6 . 4 . ( A ) M S 3 o f m / z 5 3 7 , ( B ) M S 3 o f m / z 5 6 3 , a n d ( C ) M S 3 o f p r o d u c t i o n m / z x x i v 2 2 5 g e n e r a t e d f r o m m / z 8 1 9 , w h i c h i s i d e n t i c a l t o M S 4 o f 2 2 5 , u s i n g c o l l i s i o n - i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ( C I D ) o n t h e E S I - l i n e a r i o n t r a p ( L I T ) m a s s s p e c t r o m e t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 4 F I G U R E 6 . 7 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e A ) M S / M S p r o d u c t i o n a n a l y s i s o f m / z 8 2 2 ( d 3 - S Q D G l 6 : 0 / 1 8 : 1 ) f r o m R . s p h a e r o i d e s m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t a f t e r i n - s o l u t i o n H / D e x c h a n g e u s i n g C D 3 O D . B ) M S 3 o f m / z 5 4 0 f r o m A ) , a n d C ) M S 3 o f m / z 5 6 6 f r o m A ) , a n d D ) M S 3 o f p r o d u c t i o n m / z 2 2 7 g e n e r a t e d f r o m 8 2 2 i n p a n e l A , u s i n g C I D o n t h e E S I - L I T m a s s s p e c t r o m e t e r ( h . g . = h e a d g r o u p ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 7 F I G U R E 6 . 8 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e E S I A ) M S a n d B ) C I D M S / M S p r e c u r s o r i o n s c a n f o r m / z 2 2 5 u s i n g t h e Q q Q m a s s s p e c t r o m e t e r , t o s e l e c t i v e l y i d e n t i f y a l l t h e S Q D G l i p i d s p e c i e s i n t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t f r o m t h e R . s p h a e r o i d e s 2 . 4 . 1 + C c O s t r a i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 3 F I G U R E 6 . 9 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e E S I A ) M S a n d B ) C I D M S / M S p r e c u r s o r i o n m a p p i n g f o r m / z 2 2 5 u s i n g t h e L I T m a s s s p e c t r o m e t e r , t o s e l e c t i v e l y i d e n t i f y a l l t h e S Q D G l i p i d s p e c i e s i n t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t f r o m t h e R . s p h a e r o i d e s C L 3 + C c O s t r a i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 4 F I G U R E 6 . 1 0 M A L D I M S s p e c t r u m ( A ) , a n d t h e l o w e n e r g y C I D M S / M S ( B ) a n d M S n ( C a n d D ) f r a g m e n t a t i o n o f t h e p r o t o n a t e d i o n s ( [ M + H ] + ) o f d i a c y l g l y c e r o l - N , N , N - t r i m e t h y l h o m o s e r i n e ( D G T S ) f r o m t h e m e m b r a n e o f R . s p h a e r o i d e s ( w i t h C 0 0 o v e r - e x p r e s s i o n ) a e r o b i c a l l y g r o w n u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t e d c o n d i t i o n s , u s i n g t h e M A L D I - q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p m a s s S p e c t r o m e t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 7 F I G U R E 7 . 1 R e d u c e d - o x i d i z e d U V - V i s s p e c t r o s c o p y o f d o d e c y l m a l t o S i d e - s o l u b i l i z e d m e m b r a n e s i s o l a t e d f r o m R . s p h a e r o i d e s 2 . 4 . 1 + C c O ( w i l d t y p e ) , a n d t h e s p e c i fi c C L - d e fi c i e n t ( C L 3 + C c O ) , S Q D G - d e fi c i e n t ( S B 1 K 1 + C c O ) a n d G P C h o - d e fi c i e n t ( C H B Z O + C c O ) s t a i n s , g r o w n u n d e r a e r o b i c c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 9 F I G U R E 7 . 2 R e d u c e d U V — V i s S p e c t r o s c o p y o f C c O p u r i fi e d f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s 2 . 4 . 1 + C c O ( w i l d t y p e ) , a n d t h e s p e c i fi c C L - d e fi c i e n t ( C L 3 + C c O ) , S Q D G - d e fi c i e n t ( S B 1 K 1 + C c O ) a n d G P C h o - d e fi c i e n t ( C H B Z O + C c O ) s t a i n s g r o w n u n d e r a e r o b i c c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 1 F I G U R E 7 . 3 S t e a d y - s t a t e o x y g e n c o n s u m p t i o n a c t i v i t y a n a l y s i s o f p u r i fi e d C c O u s i n g N i - N T A g r a v i t y c o l u m n f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s 2 . 4 . 1 + C c O ( w i l d t y p e ) , a n d t h e s p e c i fi c S i n g l e l i p i d t y p e d e fi c i e n t s t r a i n s C L 3 + C c O ( C L d e fi c i e n t ) , S B l K 1 + C c O ( S Q D G - d e fi c i e n t ) a n d C H B Z O + C c O ( G P C h o - X X V d e fi c i e n t ) , b e f o r e a n d a f t e r t h e a d d i t i o n o f a s o l e c t i n l i p i d s i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 3 F I G U R E 7 . 4 O x y g e n c o n s u m p t i o n a c t i v i t i e s o f t h e N i - N T A - p u r i fi e d C c O f r o m t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t ( C L 3 + C c O ) a n d t h e w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c 0 ) , a s a f u n c t i o n o f t e m p e r a t u r e ( e n z y m e s a r e i n c u b a t e d a t e a c h t e m p e r a t u r e f o r 1 m i n u t e i n 1 0 [ I L a l i q u o t s ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 4 F I G U R E 7 . 5 T L C o f l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e i s o l a t e d m e m b r a n e s o f t h e w i l d t y p e a n d t h e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s o f R . s p h a e r o i d e s , c o n t a i n i n g 2 . 3 p g m e m b r a n e p r o t e i n s d e t e r m i n e d b y t h e B C A a s s a y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 9 F I G U R E 7 . 6 T h e E S I M S s p e c t r a o f t h e l i p i d e x t r a c t f r o m t h e c e l l m e m b r a n e s o f t h e 2 . 4 . 1 w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s i n ( A ) p o s i t i v e , a n d ( B ) n e g a t i v e i o n m o d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 1 F I G U R E 7 . 7 P o s i t i v e i o n m o d e E S I M S / M S a n d M S 3 S p e c t r a o f m / z 7 5 8 i n t h e M S o f l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e c e l l m e m b r a n e s o f t h e w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s r e v e a l t h a t t h i s i s o t o p i c a l l y i s o l a t e d p r e c u r s o r i o n c o n t a i n s m u l t i p l e S p e c i e s l e a d b y G P C h o 3 4 : 2 , G P E t r 1 1 8 : 1 / 1 9 : 1 a n d N - M e G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 . . . . . . 3 1 2 F I G U R E 7 . 8 E S I M S / M S ( A ) , a n d M S 3 s p e c t r a o f m / z 7 8 0 fi ' o m F i g u r e 7 . 6 A ) r e v e a l i n g t h e o v e r l a p p i n g o f t h e s o d i u m a d d u c t i o n s o f G P C h o 3 4 : 2 ( B ) , N - M e G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 ( C ) a n d G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 : 1 ( D ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 3 F I G U R E 7 . 9 E S I M S / M S ( A ) , a n d M S 3 s p e c t r a o f m / z 7 5 6 f r o m F i g u r e 7 . 6 B ) i n t h e n e g a t i v e i o n m o d e , r e v e a l i n g t h e o v e r l a p p i n g o f t h e d e p r o t o n a t e d i o n s o f N - M e G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 ( B ) a n d G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 : 1 ( C ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 5 F I G U R E 7 . 1 0 C o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e p e a k a b u n d a n c e r a t i o s i n E S I M S a n d M S / M S s p e c t r a a n d t h e a c t u a l c o n c e n t r a t i o n r a t i o s o f G P E t n , G P G r o , G P C h o a n d C L l i p i d s t a n d a r d s c o n t a i n i n g t w o 1 8 : 1 f a t t y a c i d c h a i n s a n d t h e l i p i d s t a n d a r d s c o n t a i n i n g t w o 1 4 : 0 f a t t y a c i d c h a i n s , i n t h e l i p i d m i x t u r e s o l u t i o n s p r e p a r e d a t r a n d o m c o m b i n a t i o n s o f c o n c e n t r a t i o n s ( 0 — 1 2 1 1 M ) 3 1 9 F I G U R E 7 . 1 1 P o s i t i v e i o n m o d e E S I M S o f l i p i d s e x t r a c t e d f r o m c e l l m e m b r a n e s o f A ) w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) B ) C L - d e fi c i e n t ( C L 3 + C c O ) C ) S Q D G - d e fi c i e n t ( S B 1 K 1 + C c O ) a n d D ) G P C h o - d e fi c i e n t ( C H B 2 0 + C c O ) m u t a n t s o f R . s p h a e r o i d e s , w i t h t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s G P E t n , G P G r o , G P C h o a n d C L 1 4 : 0 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 , 2 , 2 a n d 1 u M , r e s p e c t i v e l y . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 1 F I G U R E 7 . 1 2 N e g a t i v e i o n m o d e E S I M S o f l i p i d s e x t r a c t e d f r o m c e l l m e m b r a n e s o f A ) w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) B ) C L - d e fi c i e n t ( C L 3 + C C O ) C ) S Q D G - d e f i c i e n t x x v i ( S B 1 K 1 + C c O ) a n d D ) G P C h o - d e fi c i e n t ( C H B 2 0 + C c O ) m u t a n t s o f R . s p h a e r o i d e s , w i t h t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s G P E t n , G P G r o , G P C h o a n d C L 1 4 : 0 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 , 2 , 2 a n d 1 1 1 M , r e s p e c t i v e l y . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 3 F I G U R E 7 . 1 3 S u m m a r y o f t h e q u a n t i fi c a t i o n o f t h e m a j o r p h o s p h o l i p i d i o n s o b s e r v e d i n t h e M S S p e c t r a o f t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e w i l d t y p e a n d t h e S p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t i n p o s i t i v e i o n m o d e , b a s e d o n t r i p l i c a t e e x t r a c t i o n s ( e x c e p t f o r d u p l i c a t e f o r t h e C H B Z O s a m p l e s ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 6 F I G U R E 7 . 1 4 S u m m a r y o f t h e q u a n t i fi c a t i o n o f t h e m a j o r l i p i d i o n s o b s e r v e d i n t h e M S S p e c t r a o f t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e w i l d t y p e a n d t h e S p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t i n n e g a t i v e i o n m o d e , b a s e d o n t r i p l i c a t e e x t r a c t i o n s ( d u p l i c a t e f o r t h e C H B Z O s a m p l e ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 7 F I G U R E 7 . 1 5 Q u a n t i t a t i v e p h o s p h o l i p i d c o m p o s i t i o n s i n t h e m e m b r a n e s o f i n t h e w i l d t y p e a n d t h e m u t a n t s t r a i n s , f r o m n e g a t i v e i o n m o d e M S a n a l y s i s . . . . . . . . 3 3 0 F I G U R E 7 . 1 6 T h e p e r c e n t a g e c h a n g e i n t h e q u a n t i t y o f e a c h t y p e o f m e m b r a n e l i p i d w i t h a v a i l a b l e i n t e r n a l s t a n d a r d s , r e l a t i v e t o t h e w i l d t y p e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 1 F I G U R E 7 . 1 7 N e g a t i v e i o n m o d e n a n o E S I M S a n d M S / M S o f l i p i d s e x t r a c t e d f r o m m e m b r a n e s o f w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) a n d c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t ( C L 3 + C c O ) R . s p h a e r o i d e s c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 3 F I G U R E 7 . 1 8 N e g a t i v e i o n m o d e n a n o E S I M S a n d M S / M S o f l i p i d s e x t r a c t e d f r o m C c O p u r i fi e d f r o m t h e w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) a n d c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t ( C L 3 + C c O ) R . s p h a e r o i d e s m e m b r a n e s u s i n g a N i - N T A g r a v i t y c o l u m n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 9 F I G U R E 7 . 1 9 T h e r a t i o o f t h e n u m b e r s o f m o l e s o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d fi ' o m t h e p u r i fi e d C c O t o t h e n u m b e r s o f m o l e s o f t h e o r i g i n a l p u r i fi e d C c O ( m o l e s / m o l e s ) , w h i c h s h o u l d i n d i c a t e t h e s t o i c h i o m e t r i c r e l a t i o n s h i p o f t h e l i p i d s i n C c O , a n d t h e r e l a t i v e q u a n t i fi c a t i o n o f o t h e r t y p e s o f l i p i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 1 F I G U R E 8 . 1 T h e e f fi c i e n c y o f d e t e r g e n t r e m o v a l b y t h e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n m e t h o d ( 3 k m o l e c u l a r w e i g h t c u t o f f ) f r o m t h e d e t e r g e n t - c o n t a i n i n g m e m b r a n e s a m p l e s , d i s p l a y e d b y t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( T L C ) o f t h e l i p i d s , e x t r a c t e d f r o m t h e r e s u s p e n d e d m e m b r a n e s ( 8 . 7 1 1 L , 1 . 2 5 m g o f t o t a l m e m b r a n e p r o t e i n s d e t e r m i n e d b y B C A a s s a y ) o f R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 A 4 s t r a i n , d i l u t e d w i t h 1 0 4 1 1 L o f t h e F P L C b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 0 5 % D D M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 1 F I G U R E 8 . 2 T h e e f f i c i e n c y o f d e t e r g e n t r e m o v a l b y t h e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n m e t h o d ( 3 k D a m o l e c u l a r w e i g h t c u t o f f ) f r o m t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e s i s d i s p l a y e d u s i n g T L C o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e s f r o m t h e x x v i i R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 A 4 s t r a i n , i n b u f f e r s c o n t a i n i n g 0 . 0 5 % D D M o r 0 . 2 % D M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 4 F I G U R E 8 . 3 N e g a t i v e i o n m o d e E S I M S o f l i p i d s e x t r a c t e d f r o m w i l d t y p e C c O e n z y m e p u r i fi e d b y N i - N T A g r a v i t y c o l u m n , a f t e r t h r e e r e p e a t s o f t h e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n s t e p s t o c l e a n u p t h e d e t e r g e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 6 F I G U R E 8 . 4 T h e e f fi c i e n c y o f d e t e r g e n t r e m o v a l b y t h e a c e t o n e - w a s h i n g m e t h o d f r o m t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e s , d i s p l a y e d b y T L C o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m 0 . 6 8 p g p u r i fi e d C c O e n z y m e s f r o m t h e R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 A 4 s t r a i n . . . 3 6 8 F I G U R E 9 . 1 G r o w t h c u r v e s o f R . s p h a e r o i d e s 2 . 4 . 1 a n d B C - m 3 s t r a i n s u n d e r A ) a n a e r o b i c p h o t o h e t e r o t r o p h i c g r o w t h , a n d B ) a e r o b i c c h e m o h e t e r o t r o p h i c g r o w t h c o n d i t i o n s , b o t h i n S i s t r o m ’ s m e d i a a t 3 0 o C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 3 F I G U R E 9 . 2 O p t i c a l d i f f e r e n c e s p e c t r a o f d i t h i o n i t e - r e d u c e d m i n u s f e r r i c y a n i d e - o x i d i z e d s o l u b i l i z e d m e m b r a n e s f r o m R . s p h a e r o i d e s s t r a i n s 2 . 4 . 1 ( w i l d - t y p e , g r a p h A ) a n d 2 . 4 . 1 + C c O ( w i t h C c O p l a s m i d p Y J 1 2 3 H , g r a p h B ) . 3 8 5 F I G U R E 9 . 3 N e g a t i v e i o n m o d e M A L D I - M S s p e c t r a o f i s o l a t e d m e m b r a n e s f r o m C L - p r o fi c i e n t a n d C L - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 0 F I G U R E 9 . 4 P o s i t i v e i o n m o d e M A L D I - M S s p e c t r a o f i s o l a t e d m e m b r a n e s f r o m R . s p h a e r o i d e s s t r a i n s : A ) w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) , B ) C L - d e fi c i e n t m u t a n t ( B C - m 3 + C c O ) , C ) w i l d t y p e w i t h c l s g e n e i n s e r t i o n ( 2 . 4 . 1 + C c O + c I s ) a n d D ) C L - d e fi c i e n t m u t a n t w i t h c l s g e n e i n s e r t i o n ( B C - m 3 + C c O + c I s ) , a n a l y z e d a t 0 . 2 5 m g / m L p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n . A l l s t r a i n s p r o d u c e C c O f r o m p Y 1 1 2 3 H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 3 F I G U R E 9 . 5 O x i d i z e d a n d r e d u c e d s p e c t r a o f F P L C - p u r i fi e d C c O f r o m A ) 1 6 9 W T ( W T ) a n d B ) 1 6 9 C L 3 ( C L - ) s t r a i n s g r o w n a e r o b i c a l l y a t 3 0 ° C . . . . . . . . . . . 3 9 6 F I G U R E 9 . 6 N e g a t i v e i o n m o d e M A L D I - M S s p e c t r a o f i s o l a t e d m e m b r a n e s a n d C c O p r o t e i n c r y s t a l s f r o m C L - p r o fi c i e n t a n d C L - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s . . . 3 9 9 F I G U R E 9 . 7 P o s i t i v e i o n m o d e M A L D I - M S s p e c t r a o f i s o l a t e d m e m b r a n e s ( A a n d B ) a n d C c O c r y s t a l s ( C a n d D ) f r o m C L - p r o fi c i e n t ( 1 6 9 W T ) a n d C L - d e fi c i e n t ( 1 6 9 C L 3 ) R . s p h a e r o i d e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 2 F I G U R E 9 . 8 I d e n t i fi c a t i o n o f t h e c a r d i o l i p i n m o l e c u l a r s p e c i e s i n t h e f o u r - s u b u n i t C c O c r y s t a l s f r o m C L - p r o fi c i e n t ( 1 6 9 W T ) a n d C L - d e fi c i e n t ( 1 6 9 C L 3 ) R . s p h a e r o i d e s u s i n g C I D M S / M S i n n e g a t i v e i o n m o d e o n a M A L D l - l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 3 x x v i i i F I G U R E 9 . 9 I d e n t i fi c a t i o n o f t h e m a j o r l i p i d s i o n s i n t h e C c O c r y s t a l s f r o m C L - p r o fi c i e n t ( 1 6 9 W T ) a n d C L — d e fi c i e n t ( 1 6 9 C L 3 ) R . s p h a e r o i d e s u s i n g C I D M S / M S i n p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s o n a M A L D I - l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 4 F I G U R E 1 0 . 1 R e d u c e d - o x i d i z e d U V - V i s s p e c t r o s c o p y o f t h e r e s u s p e n d e d m e m b r a n e s i s o l a t e d f r o m R . s p h a e r o i d e s s t r a i n s 1 6 9 - 2 . 4 . 1 ( W T ) a n d 1 6 9 C L 3 ( C L — ) g r o w n u n d e r n o r m a l P ( 2 0 m M K H 2 P O 4 ; P + ) , a n d l o w P ( 0 . 1 m M K H 2 P 0 4 ; P - ) c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 9 F I G U R E 1 0 . 2 R e d u c e d U V - V i s s p e c t r o s c o p y o f C c O p u r i fi e d f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s s t r a i n s : 1 6 9 - 2 . 4 . 1 g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) ; 1 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L — / P + ) ; 1 6 9 - 2 . 4 . 1 u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P - ) ; a n d 1 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L - / P - ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 1 F I G U R E 1 0 . 3 S D S - P A G E a n a l y s i s o f t h e C c O p u r i fi e d b y N i - N T A F P L C f r o m t h e R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s s t r a i n s 1 6 9 - 2 . 4 . 1 ( W T ) a n d 1 6 9 C L 3 ( C L - ) a e r o b i c a l l y g r o w n u n d e r n o r m a l P ( 2 0 m M K H 2 P O 4 ) ( P + ) , a n d l o w P ( 0 . 1 m M K H 2 P 0 4 ) ( P - ) c o n d i t i o n s , u s i n g c o n d i t i o n s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 a n d C o o m a s s i e b l u e f o r t h e s t a i n i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 3 F I G U R E 1 0 . 4 S t e a d y - s t a t e o x y g e n c o n s u m p t i o n a c t i v i t y a n a l y s i s o f t h e C c O p u r i fi e d b y N i - N T A F P L C f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s s t r a i n s l 6 9 - 2 . 4 . l ( W T ) a n d 1 6 9 C L 3 ( C L - ) g r o w n a e r o b i c a l l y u n d e r n o r m a l P ( 2 0 m M K H 2 P 0 4 ) ( P + ) , a n d l o w P ( 0 . 1 m M K H 2 P 0 4 ) ( P - ) c o n d i t i o n s , b e f o r e a n d a f t e r t h e a d d i t i o n o f a s o l e c t i n l i p i d s i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 5 F I G U R E 1 0 . 5 P o s i t i v e i o n m o d e E S I M S s p e c t r a o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e s a m e a m o u n t o f i s o l a t e d m e m b r a n e s o f R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 - 2 . 4 . 1 g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , 1 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L - / P + ) , 1 6 9 - 2 . 4 . 1 u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P - ) , a n d 1 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L - l P - ) , w i t h t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 , 2 , 2 a n d 1 1 1 M i n t h e c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) s o l v e n t c o n t a i n i n g 4 0 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s a r e d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 s e c t i o n 3 . 7 . 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 8 F I G U R E 1 0 . 6 S u m m a r y o f t h e q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s f r o m F i g u r e 1 0 . 5 u s i n g p o s i t i v e i o n m o d e E S I M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 1 F I G U R E 1 0 . 7 N e g a t i v e i o n m o d e E S I M S s p e c t r a o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e s a m e a m o u n t o f i s o l a t e d m e m b r a n e s o f R . s p h a e r o i d e s : W T / P + a n d C L — / P + x x i x g o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e , W T / P - a n d C L — / P - , g r o w n u n d e r l o w p h o s p h a t e , i n t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / 1 4 : O , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 , 2 , 2 a n d 1 u M i n t h e c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) s o l v e n t c o n t a i n i n g 4 0 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e . T h e m / z r a n g e o f 6 0 0 - 1 0 0 0 i s d i s p l a y e d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 4 F I G U R E 1 0 . 8 S u m m a r y o f t h e q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s f r o m F i g u r e 1 0 . 7 u s i n g n e g a t i v e i o n m o d e E S I M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 6 F I G U R E 1 0 . 9 N e g a t i v e i o n m o d e E S I M S s p e c t r a o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e s a m e a m o u n t o f i s o l a t e d m e m b r a n e s o f R . s p h a e r o i d e s l 6 9 - 2 . 4 . 1 g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , 1 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L - / P + ) , 1 6 9 - 2 . 4 . 1 u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P - ) , a n d 1 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L - / P - ) , i n t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / 1 4 1 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 , 2 , 2 a n d 1 u M i n t h e c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) s o l v e n t c o n t a i n i n g 4 0 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e . T h e r r r / z r a n g e o f 1 2 0 0 - 1 6 0 0 i s d i s p l a y e d f o r t h e c a r d i o l i p i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 9 F I G U R E 1 0 . 1 0 S u m m a r y o f t h e q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s o f C L u s i n g n e g a t i v e i o n m o d e E S I M S / M S w i t h w i d e b a n d i s o l a t i o n a n d a c t i v a t i o n , a n d t h e q u a n t i fi c a t i o n o f G P G r o a n d S Q D G l i p i d s b y M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 1 F I G U R E 1 0 . 1 1 P o s i t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a o f t h e s a m e a m o u n t o f i s o l a t e d m e m b r a n e s ( 1 1 1 L a t 0 . 2 5 m g / m L fi n a l m e m b r a n e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d b y B C A a s s a y ) o f R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 - 2 . 4 . 1 g o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , 1 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L - / P + ) , l 6 9 - 2 . 4 . 1 u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P - ) , a n d 1 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L - / P - ) , w i t h t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / 1 4 : O , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , 5 , 1 . 2 5 a n d 1 . 2 5 1 1 M , r e s p e c t i v e l y , i n t h e m o n o - p h a s e m i x t u r e w i t h t h e s a m p l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 4 6 F I G U R E 1 0 . 1 2 N e g a t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a o f t h e s a m e a m o u n t o f i s o l a t e d m e m b r a n e s ( 1 u L a t 0 . 2 5 m g / m L fi n a l m e m b r a n e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d b y B C A a s s a y ) o f R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 - 2 . 4 . 1 g o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , 1 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L - / P + ) , 1 6 9 - 2 . 4 . 1 u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P - ) , a n d 1 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L - l P — ) , w i t h t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , 5 , 1 . 2 5 a n d 1 . 2 5 u M i n t h e m o n o - p h a s e m i x t u r e w i t h t h e s a m p l e . T h e n r / z r a n g e f r o m 6 0 0 - 1 0 0 0 i s d i s p l a y e d 4 4 8 X X X F I G U R E 1 0 . 1 3 N e g a t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a i n t h e m / z r a n g e f r o m 1 2 0 0 - 1 6 0 0 , f o r t h e s a m e a m o u n t o f i s o l a t e d m e m b r a n e s ( 1 p L a t 0 . 2 5 m g / m L fi n a l m e m b r a n e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d b y B C A a s s a y ) o f W T a n d C L - R . s p h a e r o i d e s g r o w n u n d e r t h e s a m e s e t o f c o n d i t i o n s a s i n F i g u r e 1 0 . 1 2 , w i t h t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , 5 , 1 . 2 5 a n d 1 . 2 5 u M i n t h e m o n o - p h a s e m i x t u r e w i t h t h e s a m p l e , r e s p e c t i v e l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 0 F I G U R E 1 0 . 1 4 P o s i t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a o f t h e s a m e a m o u n t o f p u r i fi e d C C O ( 1 [ I L a t 0 . 5 m g / m L fi n a l C c O c o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d b y U V - V i s s p e c t r o s c o p y ) o f W T a n d C L - R . s p h a e r o i d e s g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , ( C L — / P + ) , a n d l o w p h o s p h a t e ( W T / P — ) , ( C L - / P - ) , w i t h t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , 5 , 1 . 2 5 a n d 1 . 2 5 1 1 M i n a m o n o - p h a s e m i x t u r e w i t h t h e s a m p l e , r e s p e c t i v e l y . T h e r e l a t i v e a b u n d a n c e i n t h e m / z r a n g e o f 7 0 6 - 8 3 0 i s e x p a n d e d 4 f o l d i n a l l f o u r p a n e l s f o r a c l e a r e r d i s p l a y o f t h e l i p i d s p e a k s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 4 F I G U R E 1 0 . 1 5 N e g a t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a o f t h e s a m e a m o u n t o f p u r i fi e d C c O ( 1 p L a t 0 . 5 m g / m L fi n a l C c O c o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d b y U V - V i s s p e c t r o s c o p y ) f r o m W T a n d C L - R . s p h a e r o i d e s g r o w n a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , w i t h t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / l 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , 5 , 1 . 2 5 a n d 1 . 2 5 1 1 M i n t h e m o n o - p h a s e m i x t u r e w i t h t h e s a m p l e , r e s p e c t i v e l y . T h e r e l a t i v e a b u n d a n c e s i n t h e m / z r a n g e s o f 7 0 0 - 8 5 0 a n d 6 6 0 - 6 7 0 , a r e e x p a n d e d 4 f o l d i n a l l f o u r p a n e l s f o r a c l e a r e r d i s p l a y o f t h e l i p i d s a n d t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s p e a k s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 7 F I G U R E 1 0 . 1 6 N e g a t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a i n t h e m / z r a n g e f r o m 1 2 0 0 - 1 6 0 0 , o f t h e s a m e a m o u n t o f p u r i fi e d C c O ( 1 u L a t 0 . 5 m g / m L fi n a l C c O c o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d b y U V - V i s S p e c t r o s c o p y ) o f R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 - 2 . 4 . l g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , 1 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L - / P + ) , 1 6 9 - 2 . 4 . l u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P - ) , a n d 1 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L - l P - ) , w i t h t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , 5 , 1 . 2 5 a n d 1 . 2 5 [ A M i n t h e m o n o - p h a s e m i x t u r e w i t h t h e s a m p l e , r e s p e c t i v e l y . I n p a n e l D , T h e r e l a t i v e a b u n d a n c e i n t h e m / z r a n g e o f 1 3 0 0 - 1 6 0 0 i s e x p a n d e d 1 . 5 f o l d f o r a c l e a r e r v i e w o f t h e C L r e g i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 0 I m a g e s i n t h i s d i s s e r t a t i o n a r e p r e s e n t e d i n c o l o r . x x x i L I S T O F S C H E M E S S C H E M E 1 . 1 T h e o v e r a l l r e a c t i o n c a t a l y z e d b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 S C H E M E 1 . 2 E l e c t r o n t r a n s f e r p a t h w a y i n a a 3 - t y p e c y t o c h r o m e c o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 S C H E M E 2 . 1 G e n e r a l s t r u c t u r e o f p h o s p h o l i p i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 9 + S C H E M E 2 . 2 F r a g r l e n t a t i o n o f G P C h o [ M + H ] i n C I D M S / M S i n p o s i t i v e i o n m o d e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3 S C H E M E 2 . 3 P o t e n t i a l f r a g n e n t a t i o n p a t h w a y s o f p h o s p h o l i p i d s i n n e g a t i v e i o n m o d e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 4 S C H E M E 3 . 1 T h e o v e r a l l r e a c t i o n c a t a l y z e d b y C c O , w h i c h i s a l s o t h e r e a c t i o n u s e d t o e v a l u a t e t h e s t e a d y s t a t e a c t i v i t y o f C c O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 I 6 S C H E M E 4 . 1 F o r m a t i o n o f m e t h y l c a r b o n a t e a n i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I 6 5 S C H E M E 4 . 2 P r o p o s e d M S / M S f r a g n e n t a t i o n p a t h w a y o f [ G P C h o + A ] ' t o l o s e ( A + C H 3 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 7 S C H E M E 4 . 3 P r o p o s e d M S 3 f r a g n e n t a t i o n p a t h w a y s o f [ G P C h o + A — ( A + C H 3 ) ] ' t o f o r m R C O O ’ o r n e u t r a l R C O O H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 0 3 S C H E M E 4 . 4 P r o p o s e d M S f r a g n e n t a t i o n p a t h w a y s o f [ G P C h o + A - ( A + C H 3 ) ] " t o f o r m k e t e n e n e u t r a l l o s s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I 7 1 S C H E M E 4 . 5 P r o p o s e d M S / M S f r a g n e n t a t i o n p a t h w a y o f [ G P C h o + A ] ' t o l o s e ( A H + ( C H 3 ) 3 ) N ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 4 S C H E M E 4 . 6 P r o p o s e d M S / M S f r a g n e n t a t i o n p a t h w a y o f [ G P C h o + A ] ' t o l o s e ( A + ( C H 3 ) 3 ) N C H = C H 3 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 6 S C H E M E 4 . 7 P r o p o s e d f r a g n e n t a t i o n p a t h w a y s o f [ G P C h o + H 2 P O 4 ] ' . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 2 S C H E M E 4 . 8 P r o p o s e d f r a g n e n t a t i o n p a t h w a y s o f [ G P C h o + A ] " t o l o s e A H a n d M S 3 o f [ G P C h o + A — A H ] ' . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I 8 6 x x x i i S C H E M E 4 . 9 P r o p o s e d f r a g n e n t a t i o n p a t h w a y s o f [ G P C h o + A ] ' t o l o s e a l t e r n a t i v e A H a n d M S 3 o f [ G P C h o + A - A H ] ' t o f o r m r a d i c a l a n i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 7 S C H E M E 5 . 1 S c h e m a t i c s t r u c t u r e o f a n o r n i t h i n e l i p i d ( O L ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 2 S C H E M E 5 . 2 P r o p o s e d p a t h w a y s f o r t h e m u l t i s t a g e g a s - p h a s e f r a g n e n t a t i o n r e a c t i o n s o f p r o t o n a t e d o r n i t h i n e l i p i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 S C H E M E 5 . 3 P r o p o s e d p a t h w a y s f o r t h e m u l t i s t a g e g a s - p h a s e f r a g n e n t a t i o n r e a c t i o n s o f d e p r o t o n a t e d o r n i t h i n e l i p i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 7 S C H E M E 5 . 4 P r o p o s e d p a t h w a y s f o r t h e m u l t i s t a g e g a s - p h a s e f r a g n e n t a t i o n r e a c t i o n s o f p r o t o n a t e d g l u t a m i n e l i p i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 5 S C H E M E 5 . 5 P r o p o s e d p a t h w a y s f o r t h e m u l t i s t a g e g a s - p h a s e f r a g n e n t a t i o n r e a c t i o n s o f d e p r o t o n a t e d g l u t a m i n e l i p i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 9 S C H E M E 6 . 1 G e n e r a l s t r u c t u r e s o f S Q D G a n d D G T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 8 S C H E M E 6 . 2 P r o p o s e d f r a g n e n t a t i o n p a t h w a y s o f S Q D G [ M - H ] ' i n M S / M S a n d M S 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 9 S C H E M E 6 . 3 P r o p o s e d f r a g n e n t a t i o n p a t h w a y o f f o r m i n g r r r / z 8 1 f r o m m / z 2 2 5 . . . . . . 2 7 0 S C H E M E 6 . 4 P r o p o s e d f r a g n e n t a t i o n p a t h w a y o f f o r m i n g m / z 9 5 f r o m m / z 2 2 5 . . . . . . 2 7 0 S C H E M E 6 . 5 P r o p o s e d f r a g n e n t a t i o n p a t h w a y o f f o r m i n g m / z 2 0 7 f r o m m / z 2 2 5 . . . . 2 7 1 + S C H E M E 6 . 6 P r o p o s e d f r a g n e n t a t i o n s o f D G T S [ M + H ] i n M S / M S a n d M S 3 i n p o s i t i v e i o n m o d e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 8 S C H E M E 1 0 . 1 P o s s i b l e f u n c t i o n a l i n t e r c h a n g e a b i l i t y b e t w e e n d i f f e r e n t t y p e s o f l i p i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 6 x x x i i i + [ M + H ] I M - H ] ' 2 , 5 - D H B A c A C A c e - w A D P A G C A T P A T T B C A B S A C c O C H C A C I C I D C L c l s C M C L I S T O F A B B R E V I A T I O N S p r o t o n a t e d i o n d e p r o t o n a t e d i o n 2 , 5 - d i h y d r o x y l b e n z o i c a c i d a n i o n a c e t a t e a l t e r n a t i n g c u r r e n t a c e t o n e - w a s h i n g a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e a u t o m a t i c g a i n c o n t r o l a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e 6 - a z a - 2 - t h i o t h i m i n b i c i n c h r o n i n i c a c i d , u s e d i n p r o t e i n a s s a y b o v i n e s e r u m a l b u m i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e a - c y a n o - 4 - h y d r o x y c i n n a m i c a c i d c h e m i c a l i o n i z a t i o n c o l l i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n c a r d i o l i p i n S p e c i fi c c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t m u t a n t c a r d i o l i p i n s y n t h a s e g e n e c r i t i c a l m i c e l l e c o n c e n t r a t i o n x x x i v C R M D C D D M D E A E D E S I D G H S D G T S D i l - f D M D M P E E 2 E 1 E S I E T D F A B F A D H 2 F m F P L C F r e - d F T - I C R c h a r g e r e s i d u e m o d e l d i r e c t c u r r e n t d o d e c y l m a l t o s i d e d i e t h y l a r n i n o e t h y l , p a c k i n g m a t e r i a l f o r i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g a p h y c o l u m n d e s o r p t i o n e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n d i a c y l g l y c e r o l h o m o s e r i n e d i a c y l g l y c e r y l - N , N , N - t r i m e t h y l h o m o s e r i n e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n d e c y l m a l t o s i d e N , N - d i m e t h y l p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e , N , N - M e 3 G P E t n b i m o l e c u l a r e l i m i n a t i o n e l e c t r o n i m p a c t i o n i z a t i o n e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n e l e c t r o n t r a n s f e r d i s s o c i a t i o n f a s t a t o m b o m b a r d m e n t r e d u c e d fl a v i n a d e n i n e d i n u c l e o t i d e f o r m a t e f a s t p r o t e i n l i q u i d c h r o m a t o g a p h y f r e e z e - d r y i n g ( l y o p h i l i z a t i o n ) F o u r i e r - t r a n s f o n n i o n c y c l o t r o n r e s o n a n c e m a s s s p e c t r o m e t e r X X X V G C - M S G G D G G P C h o G P C h o - G P E t n G P G r o G P I n s G P I n s P G P S e r H P L C i . s . I E M k D a L I T L M C O L P S L T Q M A L D I M E S M M P E g a s c h r o m a t o g a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y g l u c o s y l g a l a c t o s y l d i a c y l g l y c e r i d e p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s p e c i fi c G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l p h o s p h o r y l a t e d p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l p h o s p h a t i d y l s e r i n e h e a d g o u p h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g a p h y i n t e r n a l s t a n d a r d i o n e v a p o r a t i o n m o d e l k i l o D a l t o n q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p m a s s S p e c t r o m e t e r l o w - m a s s - c u t o f f l i p o p o l y s a c c a r i d e s l i n e a r t r a p q u a d r u p o l e , i n s t r u m e n t m o d e l b y T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c m e t h y l c a r b o n a t e m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n 2 - ( N - m o r p h o l i n o ) e t h a n e - s u l f o n i c a c i d N - m o n o m e t h y l p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e , N - M e G P E t n x x x v i M S M S / M S M S A M S n N A D + N A D H n a n o E S I , n E S I N i - N T A N L N M R N - p h a s e O L O r b i - T r a p O X P H O S p _ P + P E G - 4 0 0 P i p P E P - p h a s e m a s s s p e c t r o m e t r y t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y 5 - m e t h o x y s a l i c y l i c a c i d m u l t i s t a g e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e r e d u c e d n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e n a n o e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ( m o s t o f t h e t i m e E S I i s u s e d f o r n E S I ) n i c k e l - n i t r i l o t r i a c e t i c a c i d , p a c k i n g m a t e r i a l f o r a f fi n i t y c h r o m a t o g a p h y c o l u m n n e u t r a l l o s s n u c l e a r m a g l e t i c r e s o n a n c e n e g a t i v e s i d e o f t h e l i p i d b i l a y e r m e m b r a n e o f m i t o c h o n d r i a o r n i t h i n e l i p i d O r b i - t r a p m a s s S p e c t r o m e t e r , i n s t r u m e n t m o d e l b y T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n p h o s p h a t e - l i m i t i n g g o w t h p h o s p h a t e - a b u n d a n t g o w t h , n o r m a l p o l y e t h y l e n e g l y c o l , w i t h a v e r a g e m o l e c u l a r w e i g h t 4 0 0 D a p h o s p h a t e p l a s m a l o g e n G P E t n p o s i t i v e s i d e o f t h e l i p i d b i l a y e r m e m b r a n e o f m i t o c h o n d r i a x x x v i i P Q D P S D Q L Q 4 2 R F R s , R . s p h a e r o i d e s S D S - P A G E S M S N 2 S Q D G S Q D G - T L C T M H S T O F T S Q U V - V i s W T p u l s e d - Q c o l l i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n p o s t s o u r c e d e c a y g l u t a m i n e l i p i d t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s S p e c t r o m e t e r r a d i o f r e q u e n c y R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l u a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s S p h i n g o m y e l i n b i m o l e c u l a r n u c l e o p h i l i c s u b s t i t u t i o n r e a c t i o n s u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r i d e s p e c i fi c S Q D G - d e fi c i e n t m u t a n t t h i n l a y e r c h r o m a t o g a p h y N , N , N - t r i m e t h y l h o m o s e r i n e t i m e o f fl i g h t m a s s a n a l y z e r t r i p l e q u a d r u p o l e , i n s t r u m e n t m o d e l b y T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c u l t r a v i o l e t - v i s i b l e s p e c t r o s c o p y w i l d t y p e x x x v i i i C h a p t e r 1 A n O v e r v i e w o f t h e S t r u c t u r a l a n d F u n c t i o n a l I m p a c t o f M e m b r a n e L i p i d s o n M e m b r a n e P r o t e i n s , w i t h a F o c u s o n C y t o c h r o m e c O x i d a s e 1 . 1 I n t r o d u c t i o n : S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l r o l e s o f l i p i d s i n m e m b r a n e p r o t e i n s T h e r e c e n t l y s e q u e n c e d h u m a n g e n o m e r e v e a l e d t h a t 2 0 % t o 3 5 % o f t h e g e n o m e e n c o d e s p u t a t i v e m e m b r a n e p r o t e i n s , m a n y o f w h i c h h a v e k e y f u n c t i o n s [ 1 ] . R e c e n t l y e m e r g i n g e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t , i n a d d i t i o n t o p r o v i d i n g t h e h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t , l i p i d s c a n a s s i s t w i t h t h e i n s e r t i o n a n d f o l d i n g o f m e m b r a n e p r o t e i n s , a n d a r e i n v o l v e d i n s p e c i fi c i n t e r a c t i o n s , i n t h e r e g u l a t i o n o f s u p e r - m o l e c u l a r o r g a n i z a t i o n f o r m a t i o n a m o n g m e m b r a n e p r o t e i n c o m p l e x e s , i n t h e c o n t r o l o f m o l e c u l a r t r a n s p o r t a c r o s s c e l l m e m b r a n e s a n d i n m e d i a t i n g t h e s i g n a l i n g r e s p o n s e s o f c e l l s t o t h e i r e n v i r o n m e n t . 1 . 2 L i p i d s i n c e l l m e m b r a n e s 1 . 2 . 1 L i p i d s : t h e b i o l o g i c a l m e m b r a n e e n v i r o n m e n t L i p i d b i l a y e r s c o n s t i t u t e t h e b i o l o g i c a l m e m b r a n e e n v i r o n m e n t ( F i g u r e 1 . 1 ) , a n d p r o v i d e s p e c i a l i z e d p e r m e a b i l i t y b a r r i e r s f o r c e l l s a n d c e l l o r g a n e l l e s , i n w h i c h t h e b a s i c p r o c e s s e s o f r e s p i r a t i o n , p h o t o s y n t h e s i s , p r o t e i n a n d s o l u t e t r a n s p o r t , s i g r a l t r a n s d u c t i o n , a n d m o v e m e n t c a n t a k e p l a c e [ 1 ] . A fl u i d - m o s a i c m o d e l h a s b e e n p r o p o s e d f o r t h e s t r u c t u r e o f b i o l o g i c a l m e m b r a n e s c o n s t i t u t e d b y l i p i d b i l a y e r s ( F i g u r e 1 . 1 ) . I n t h e fl u i d - m o s a i c m o d e l , t h e l i p i d s a n d p r o t e i n s c a n m o v e a b o u t r e l a t i v e l y r a n d o m l y t o a d j u s t t o t h e c h a n g e s i n c o n d i t i o n s a n d a c t i v i t y o f t h e m e m b r a n e b o u n d p r o t e i n s , w h i l e k e e p i n g t h e m e m b r a n e s e a l e d . H o w e v e r , r e c e n t e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e i n c r e a s i n g l y s u g g e s t s t h a t m e m b r a n e s a r e a c t u a l l y m o r e m o s a i c t h a n r a n d o m l y fl u i d i c , a n d a r e p a c k e d w i t h p a t c h e s o f m i c r o d o m a i n s [ 2 ] . T h e t h i c k n e s s o f t h e h y d r o p h o b i c r e g i o n o f t h e l i p i d b i l a y e r i s a b o u t 3 2 A ( G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 b i l a y e r ) , b u t t h i n n i n g a n d t h i c k e n i n g o f t h e m e m b r a n e a d j a c e n t t o m e m b r a n e p r o t e i n s h a v e b e e n r e p o r t e d t o o c c u r [ 2 ] . L i p i d s h a v e b e e n b r o a d l y d e fi n e d a s b i o l o g i c a l c o m p o u n d s w i t h p r e d o m i n a n t l y h y d r o p h o b i c c h a r a c t e r i n c l u d i n g t h e d i v e r s i t y o f f a t s ( t r i g l y c e r i d e s ) , o i l s , w a x e s , c h o l e s t e r o l , s t e r o l s , h y d r o p h o b i c v i t a m i n s , m o n o g l y c e r i d e s , d i g l y c e r i d e s , a n d p h o s p h o l i p i d s . H o w e v e r , t h e l i p i d s w i t h t h e m o s t i n t e r e s t f o r r e s e a r c h a r e t h e a m p h i p h i l i c g o u p o f m o l e c u l e s t h a t t y p i c a l l y c o n t a i n a h y d r o p h i l i c m o i e t y w i t h e i t h e r a c h a r g e d o r p o l a r h e a d g o u p , a n d a h y d r o p h o b i c m o i e t y o f t e n c o n s i s t i n g o f l o n g f a t t y a c y l o r e s t e r c h a i n s . T h e p o l a r a n d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s m a k e t h e l i p i d s t e n d t o s e l f - a s s e m b l e i n t o a b i l a y e r m e m b r a n e o r c u r v e d m i c e l l e s t r u c t u r e s i n a n a q u e o u s e n v i r o n m e n t , d e p e n d i n g o n t h e r e l a t i v e s i z e s o f t h e p o l a r h e a d g r o u p a n d t h e h y d r o p h o b i c t a i l s ( F i g u r e 1 . 1 ) . o u t e r l e a f l e t i n t e g r a l p e r i p h e r a l _ _ l i p i d m e m b r a n e p r o t e i n s “ P ' d t a i l s i n n e r l e a f l e t P F O I G I N S h e a d g r o u p F i g u r e 1 . 1 T r a d i t i o n a l fl u i d m o s a i c m o d e l o f a b i o l o g i c a l m e m b r a n e i n m a m m a l i a n c e l l s c o n s t i t u t e d b y l i p i d b i l a y e r s . T h e i n s e r t i o n o f c h o l e s t e r o l i n c r e a s e s t h e r i g i d i t y o f t h e m e m b r a n e ( a d a p t e d f r o m h t t p : / / m e d i a - 2 . w e b . b r i t a n n i c a _ c o m / e b - m e d i a / 7 4 / 5 3 0 7 4 - 0 0 4 - 9 F 6 5 D 8 1 3 . j p g ) . R e c e n t m o d e l s d e p i c t m o r e c r o w d e d m e m b r a n e s w i t h p a t c h i n e s s , m a i n t a i n e d w i t h t h e a s s i s t a n c e o f c y t o s k e l e t o n s . 1 . 2 . 1 . 1 B a s i c s t r u c t u r e s o f l i p i d s S e v e r a l c o m m o n n o m e n c l a t u r e s y s t e m s h a v e b e e n a d o p t e d f o r t h e c l a s s i fi c a t i o n o f l i p i d s [ 3 , 4 ] . L i p i d s c a n b e c a t e g o r i z e d i n t o g l y c e r o l - l i p i d s a n d n o n - g l y c e r o l - l i p i d s . W i t h i n t h e n o n - g l y c e r o l l i p i d s , a p a r t i c u l a r g o u p o f l i p i d s t h a t c o n t a i n a m i n o a c i d s o r s i m p l e p e p t i d e s i n t h e h e a d g o u p a n d a n a n r i d e b o n d i n t h e b a c k b o n e a r e t e r m e d “ l i p o a m i n o a c i d s ” . B a s e d o n t h e p r e s e n c e o f p h o s p h a t e i n t h e h e a d g o u p , l i p i d s a r e a l s o d i v i d e d i n t o p h o s p h o l i p i d s a n d n o n - p h o s p h o l i p i d s , t h e l a t t e r o f w h i c h m a y c o n t a i n a n e g a t i v e l y - c h a r g e d s u l f a t e o r s u l fi t e g o u p . B a s e d o n t h e t o t a l c h a r g e s t a t e o f t h e l i p i d m o l e c u l e u n d e r p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s , l i p i d s a r e d i v i d e d i n t o n e u t r a l l i p i d s ( i n c l u d i n g z w i t t e r i o n i c l i p i d s ) , a n i o n i c l i p i d s ( n e g a t i v e l i p i d s ) a n d c a t i o n i c l i p i d s ( p o s i t i v e l i p i d s ) . A g o u p o f l i p i d s w i t h m o r e c o m p l i c a t e d s t r u c t u r e s o f t e n f o u n d i n t h e o u t e r l e a fl e t o f t h e o u t e r m e m b r a n e o f g a m - n e g a t i v e b a c t e r i a f o r m e d t h r o u g h v a r i o u s g l y c o s y l a t i o n a n d o t h e r m o d i fi c a t i o n s , b a s e d o n t h e b a s i c s t r u c t u r e o f l i p i d A , a r e t e r m e d l i p o - p o l y s a c c h a r i d e s ( L P S ) [ 5 ] , b u t i t i s n o t t h e c e n t r a l f o c u s o f i n t e r e s t i n t h e c u r r e n t s t u d y . T h e m o s t c o m m o n g o u p o f l i p i d s f o u n d i n m a m m a l i a n a n d b a c t e r i a l m e m b r a n e s i s p h o s p h o l i p i d s c o n t a i n i n g a p h o s p h a t e i n t h e h e a d g o u p a n d a g l y c e r o l b a c k b o n e ( T a b l e 1 . 1 ) . W h e r e a s p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( G P C h o ) a n d p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ( G P G r o ) a r e c l o s e t o r e c t a n g u l a r i n m o l e c u l a r s h a p e a n d a r e p r o n e t o f o r m b i l a y e r s , t h e p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( G P E t n ) h e a d g o u p i s r e l a t i v e l y s m a l l a n d i s k n o w n f o r i t s t e n d e n c y t o f o r m a c u r v e d s t r u c t u r e [ 6 ] . N o n - b i l a y e r - f o r m i n g s t e r o i d l i p i d s , s u c h a s c h o l e s t e r o l , n e v e r t h e l e s s a r e i n c o r p o r a t e d i n t o m e m b r a n e s a n d a r e i n v o l v e d i n i m p o r t a n t r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s . , , , l l l a a a a a a , , i i i s s e r r r m e m m e e t t m m m n n t t t m a a c c o c a a a l l a a a s m p b m p b m b e " e - - r r e e c c c i i i n g t t n n r o o t t t o i a a n i i i i w w a h t Z Z C s d i p o o 1 1 o 0 0 ' ' l n n 1 [ n l - d I p I I - d l p l l - a i r e t c a b d n a s e t o y r a k u e n v r n e - e i b t t l a b A n a i d n u o f s d C G S I P P P P i r o o p i l f o s e r u t c u r n t E h C r G P e S s n I P P P P G G G G G e n t i s c i s m a H l 3 H O l o e H 3 o ' / O H l a O C H 3 o + n r n e 3 i n a % e H h c d ‘ l i \ C \ o t i B 1 N 3 t y 9 o O ' r \ 0 s . I h e e / l 1 / c s l W : g Y \ y 1 l l O l o n i l e l / / d \ / y y y y d d O d H b o i i i \ i \ d H i a t / t t g t t o T a a ’ 0 a a a l h g | 0 ° > ) u h h ' h 8 l I h I p p p p ( O O - / / o o o o o s / s s s P / p s o O h O h h h h O _ _ p _ p p p _ p s l i a t d n a e n o b k c a B H e a d g r o u p A b b r e - v l a t i o n * G l y c e r o l P h o s p h o G l y c o S o u r c e s O P E y e s y e s _ . / \ o _ g o / \ J ) / \ O H H y e s y e s y e s y e s y e s y e s y e s y e s a n i o n i c a n i o n i c m a m m a l , p l a n t s , b a c t e r i a m a m m a l n n n n y y y y a a a a , s c , s , s s i l i i s s o i o o c c o c r s r r r t t i i i t e t e e e t t t t n n e t t t t n t t t a h a c e e e a c c c o o o o l t l a l h h a a h a h h h h p p - b t t p p b p p b p b t l a r t u e n - r e t c i n t o i i w Z o o o n n n S E Y L S G G D D G G M G e d l r e c y H H l O O g l H y 0 c a i d 0 3 l y 3 H H e d l r e c y l g l y c a i d l H H y y H H H \ \ o e l C s C : s s P . 3 t d o “ o O c l a r v o n i u q o f H t l 0 e c a l a g o n a c g y Y l l y g s l o y W c c l u a 0 u l i o s m g d _ ( T a b l e 1 . 1 c o n t i n u e d ) O H O 3 & 0 S Q D G M G l c - D A G y e s y e s n o n o y e s a n i o n i c H O d i a c y l g l y c e r y l - N , N , N - t r i m e t h y l h o m o s e r l n e R _ 3 T G t r i a c y l g l y c e r i d e T A G y e s n o n o n e u t r a l n e u t r a l m a m m a l , p l a n t s , y e a s t l a t n y a i r m s m i c e o t a t t c o e a m h h b c i - r e c n i o i n a t n t o i i w Z o n o n L D C e fl e c y l g l y c a i d ( T a b l e 1 . 1 c o n t i n u e d ) D A G y e s n o y e s n o n e u t r a l m a m m a l , p l a n t s , y e a s t m a m m a l , b a c t e r i a S M R 1 " H S p h i n g o m y e l i n O n g o o 0 6 + N H 3 ‘ 1 1 . n g 0 L o r n i t h i n e l i p i d n o n o n o Z w i t t e r - i o n i c l a m m a l a m m a m m - - r c e i t n t o i i r c e i t n t o i i w w Z Z o o n n s s e e y y s s e e y y C P p - o a h m n s e C a g P l o G p l C P e r e h t e o _ h l C y k P l G a 3 S c H E 3 1 3 3 H \ I C § 1 / e \ n H C E / i + e n i O l ~ l O o 0 \ h \ ’ c 0 I o ‘ 0 / h O \ P / o h c o h p p O s s o o % h h 0 “ O p p l y 2 l R y Y Y n n O 3 O 0 e 0 a m m s s / l " 1 I p p R p R a n a l p ) d e u n i t n o c ( [ f a b l e 3 0 : O C H } 0 W - 0 0 “ l i p i d A # G r a m . 0 C W n o n o y e s n e u t r a l n e g a t l v e W R . s p h a e r o i d e s b a c t e r i a o n o n o o . n n ] 5 [ e c n e r e f e r m o r f s i n w o . ] 4 [ l o 5 h . ) 0 s 4 r 0 . e 7 2 t s e l d i o r e t h s c o S - n 8 i . 6 H e r u t c u r t P p s A ( M e s h D n t I o i d P t n I a i L d n e o h c t l y a , s e r u t c b c u i r d g t o s e l d o n i e s y e l b a m i m p h r a r v o c e n o i r n e d u e e v a h t n a a ) C d 3 e H u n i t 3 n H o c 1 . 1 e l b a T ( C C 3 H t t c a s i v e A e d g r i r b p a b i h A C L C H 3 h o p a n 0 l d H 3 n o n o n e u t r a l b a c t e r i a H O H C O H n o n e u t r a l m a m m a l , p l a n t s H O * * n o n o n e u t r a l m a m m a l , p l a n t s 1 . 2 . 1 . 2 D y n a m i c m o d i fi c a t i o n s o f l i p i d s t r u c t u r e s I n a d d i t i o n t o t h e m a j o r b a s i c s t r u c t u r e s d e s c r i b e d a b o v e , v a r i e d s t r u c t u r e s o f l i p i d s a r e f o r m e d a s a c o n s e q u e n c e o f d y n a m i c m o d i fi c a t i o n p r o c e s s e s [ 7 , 8 ] . T h e m o d i fi c a t i o n c a n t a r g e t e i t h e r t h e h e a d g o u p o r t h e h y d r o p h o b i c c h a i n s . F o r e x a m p l e , c a r d i o l i p i n h e a d g o u p s h a v e b e e n f o u n d t o b e m o d i fi e d w i t h a l y s i n e a m i n o a c i d w h i c h f o r m s a n a c y l b o n d w i t h t h e h y d r o x y l i n t h e g l y c e r o l h e a d g o u p , d u r i n g a s p e c i fi c c e l l g o w t h p h a s e o f b a c t e r i a . L y s i n e m o d i fi c a t i o n o f t h e g l y c e r o l h e a d g o u p i n G P G r o h a s a l s o b e e n w e l l c h a r a c t e r i z e d i n t h e b a c t e r i u m S i n o r h i z o b i u m m e l i l o t i t o o c c u r u n d e r a c i d i c g o w t h c o n d i t i o n s o r w h e n t h e y g e t i n c o n t a c t w i t h t h e i r h o s t p l a n t s [ 7 ] . P h o s p h o r y l a t i o n o f t h e l i p i d A h e a d g o u p a t t h e h y d r o x y l g o u p c a n s w i t c h t h e n o n - t o x i c m o n o - p h o s p h a t e s t a t e i n t o t h e t o x i c d i - p h o s p h a t e s t a t e . I n a p o p t o s i s o f m a m m a l i a n c e l l s , t h e m a t u r e d f o r m o f c a r d i o l i p i n s , c o n t a i n i n g f o u r 1 8 : 2 p o l y - u n s a t u r a t e d f a t t y a c y l c h a i n s , a r e m o d i fi e d b y r e a c t i v e o x i d a t i v e s p e c i e s i n t o p e r o x i d i z e d c a r d i o l i p i n s w i t h a d d i t i o n o f p e r o x i d e t o t h e d o u b l e b o n d s , a l l o w i n g t h e m t o b i n d t o c y t o c h r o m e c , w h i c h i s t h o u g h t t o t r i g g e r t h e m a s s i v e r e l e a s e o f c y t o c h r o m e c f r o m m i t o c h o n d r i a , c a u s i n g c e l l a p o p t o s i s [ 8 - 1 0 ] . T h e c o m p o s i t i o n o f m e m b r a n e l i p i d s i n b a c t e r i a i s a l s o v e r y d e p e n d e n t o n t h e n u t r i e n t s i n t h e g o w t h m e d i a , s u c h a s t h e a v a i l a b i l i t y o f p h o s p h a t e [ 7 , 1 1 ] a n d e v e n t h e p r e s e n c e o f T r i s i n t h e b u f f e r [ 1 2 ] . 1 . 2 . 1 . 3 T y p i c a l b a c t e r i a l l i p i d s t r u c t u r e s B a c t e r i a l m e m b r a n e s d i f f e r f r o m m a m m a l i a n a n d y e a s t c e l l m e m b r a n e s i n t h a t t h e G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a h a v e a n o u t e r m e m b r a n e b i l a y e r , t h e o u t e r l e a fl e t o f w h i c h i s p r e d o m i n a n t l y c o m p o s e d o f t i g h t l y p a c k e d l i p o - p o l y s a c c h a r i d e s ( L P S ) . I t p l a y s a k e y r o l e 1 0 i n t h e b a c t e r i a ’ s i n t e r a c t i o n w i t h t h e i r h o s t d u r i n g i n f e c t i o n , i n a d d i t i o n t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e s , w h e r e t h e r e s p i r a t o r y e n z y m e s r e s i d e , w h i c h i s a l s o t h e f o c u s o f t h e c u r r e n t s t u d y . P h o t o s y n t h e t i c p u r p l e b a c t e r i a t h a t a r e a l s o c a p a b l e o f a e r o b i c g o w t h t h r o u g h r e s p i r a t i o n , s u c h a s R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s , m a k e a r i c h v a r i e t y o f l i p i d s , i n c l u d i n g p h o s p h o l i p i d s , s o m e o f w h i c h a r e n o t c o m m o n l y f o u n d i n b a c t e r i a , s u c h a s p h o s p h a t i d y l c h o l i n e [ 1 3 ] , g l y c o l i p i d s w h i c h a r e t y p i c a l l y f o u n d i n p h o t o s y n t h e t i c p l a n t c h l o r o p l a s t s , a s w e l l a s t h e p h o s p h a t e - f r e e a m i n o a c i d - c o n t a i n i n g b e t a i n e l i p i d s ( s e e C h a p t e r 6 ) , o r n i t h i n e l i p i d s a n d t h e m o r e r e c e n t l y d i s c o v e r e d g l u t a m i n e l i p i d s ( s e e C h a p t e r 5 ) . H o w e v e r , s p h i n g o l i p i d s a n d p l a s m a l o g e n G P E t n / G P C h o l i p i d s a r e t y p i c a l l y n o t r e p o r t e d f o r p u r p l e b a c t e r i a . T h e m a j o r t y p e s o f f a t t y a c y l c h a i n s i n b a c t e r i a l g l y c e r o l - b a c k b o n e l i p i d s ( i n c l u d i n g t h e t y p i c a l p h o s p h o l i p i d s ) a r e 1 8 : 1 , 1 6 : 0 , 1 8 : 0 , 1 6 : 1 , 2 0 : 0 , 2 0 : 1 , 2 0 : 2 , a n d t h e o d d - c a r b o n n u m b e r e d c y c l i c p r o p a n e - c o n t a i n i n g f a t t y a c i d s l 9 : l a n d 2 1 : 1 [ 1 3 , 1 4 ] . A n o t e o n t h e n o m e n c l a t u r e : i n 1 8 : 1 , f o r e x a m p l e , 1 8 r e p r e s e n t s t h e t o t a l n u m b e r o f c a r b o n i n t h e f a t t y a c y l c h a i n , a n d 1 r e p r e s e n t s t h e n u m b e r o f r i n g o r d o u b l e b o n d i n t h e f a t t y a c y l c h a i n ( o t h e r t h a n t h e c a r b o n y l g o u p ) . S h o r t e r c h a i n f a t t y a c i d 1 4 : 0 c a n b e d e t e c t e d b u t a t v e r y l o w l e v e l s [ 1 4 ] . O r n i t h i n e a n d g l u t a m i n e l i p i d s a l s o c o n t a i n t h e 3 - h y d r o x y l f a t t y . . . . l l . . . a c r d s . T h e fi r s t s r t e o f u n s a t u r a t r o n r s o f t e n r e p o r t e d t o b e A I n 1 8 : 1 f a t t y a c l d c h a l n s [ 1 5 ] . P o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s c o m m o n i n m a m m a l i a n c e l l s s u c h a s 1 8 : 2 , 2 0 : 4 ( a r a c h i d o n i c a c i d ) , 2 2 : 5 a n d 2 2 : 6 , a r e t y p i c a l l y n o t f o u n d i n p u r p l e b a c t e r i a [ 1 3 , 1 4 ] . T h e d o u b l e b o n d s i n t h e f a t t y a c i d c h a i n s a r e r a r e l y c o n j u g a t e d . l l 1 . 2 . 1 . 4 C e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f l i p i d s N o t a l l a r e a s o f t h e m e m b r a n e s a r e t h e s a m e . S i n c e t h e m e m b r a n e p r o t e i n s a r e e a c h d i f f e r e n t f r o m t h e o t h e r , t h e y h a v e i n d i v i d u a l r e q u i r e m e n t s f o r t h e i r l i g a n d s a n d c o m p l e m e n t s , s u c h a s l i p i d s , t o c a r r y o u t t h e i r f u n c t i o n s . I n f a c t , p a t c h e s o f l i p i d s a n d m e m b r a n e p r o t e i n s i n t h e m e m b r a n e s f o r m e d w i t h t h e a s s i s t a n c e o f c y t o s k e l e t o n s , t e r m e d d e t e r g e n t - r e s i s t a n t m e m b r a n e m i c r o d o m a i n s , o r l i p i d r a f t s , a r e b e i n g i n c r e a s i n g l y r e c o g n i z e d t o c o n t a i n u n i q u e l i p i d c o m p o s i t i o n s [ 2 ] , a n d a r e o f t e n f o u n d t o b e e n r i c h e d i n c h o l e s t e r o l , S p h i n g o m y e l i n a n d p l a s m a l o g e n G P E t n / G P C h o . I n e u k a r y o t i c c e l l s , c a r d i o l i p i n i s f o u n d a l m o s t e x c l u s i v e l y i n t h e m i t o c h o n d r i a , w h e r e t h e o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n c o m p l e x e s r e s i d e . P h o s p h o r y l a t e d G P I n s l i p i d s a n d l o n g c h a i n p o l y u n s a t u r a t e d l i p i d s a r e f o u n d t o b e h i g h l y e n r i c h e d i n r e t i n a a n d b r a i n c e l l s , w h e r e s i g r a l t r a n s d u c t i o n i s h i g h l y a c t i v e . T o a c c o m m o d a t e t h e p h y s i c a l s u r f a c e c u r v a t u r e , t h e t r i a n g u l a r - s h a p e d G P E t n l i p i d s a r e o f t e n f o u n d m o r e e n r i c h e d i n t h e i n n e r l e a fl e t o f m e m b r a n e s . 1 . 2 . 2 B i o s y n t h e s i s o f l i p i d s a n d r e m o d e l i n g o f c a r d i o l i p i n T h e m a j o r b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s o f l i p i d s i n b a c t e r i a h a v e b e e n e l u c i d a t e d b y u s i n g g e n e t i c a p p r o a c h e s o v e r t h e p a s t d e c a d e s ( F i g u r e 1 . 2 ) [ 1 4 , 1 6 - 1 8 ] . U n d e r e x t r e m e c o n d i t i o n s , a l t e r n a t i v e a n d m i n o r s y n t h e t i c p a t h w a y s c a n a l s o b e t u r n e d o n . T h e fi n a l s y n t h e s i s o f m e m b r a n e l i p i d s m a i n l y o c c u r s i n E R m e m b r a n e s o f e u k a r y o t i c c e l l s , a n d c y t o p l a s m m e m b r a n e s o f b a c t e r i a l c e l l s . W h i l e s i m i l a r s y n t h e t i c s t r a t e g i e s w e r e a d o p t e d b y e u k a r y o t i c a n d b a c t e r i a l s y s t e m s , s o m e r o u t e s a r e s i g r i fi c a n t l y d i f f e r e n t . F o r i n s t a n c e , i n t h e b a c t e r i a l s y s t e m , t h e 1 2 c a r d i o l i p i n i s m a d e f r o m t w o m o l e c u l e s o f G P G r o b y c a r d i o l i p i n s y n t h a s e [ 7 ] , w h e r e a s i n t h e e u k a r y o t i c s y s t e m ( i n c l u d i n g y e a s t a n d m a m m a l i a n c e l l s ) , t h e c a r d i o l i p i n i s m a d e f r o m o n e m o l e c u l e o f G P G r o a n d o n e m o l e c u l e o f C D P - d i a c y l g l y c e r o l ( F i g u r e 1 . 2 ) [ 9 , 1 0 , 1 9 ] ; f u r t h e r m o r e , i n m a m m a l i a n c e l l s ( b u t n o t y e t r e p o r t e d f o r y e a s t [ 2 0 ] ) , i t w a s r e c e n t l y f o u n d t h a t t h e i n i t i a l p r o d u c t s o f c a r d i o l i p i n l i p i d s a r e f u r t h e r r e m o d e l e d i n t o t h e m a t u r e f u n c t i o n a l f o r m o f C L ( 1 8 : 2 ) 4 b y t h e e n z y m e t a f a z z i n [ 9 , 2 1 ] . g l y c o l y s i s g l u c o n e o g e n e s i s G l u c o s e — > G l y c e r o l - 3 — p h o s p h a t e < — G l y c e r o l 4 . . . . . . A c y l - A C P ” ’ 3 B 1 6 A C P L y s o p h o s p h a t i d i c a c i d p / s c i : A c y l — A C P A C P P h o s p h a t i d i c a c i d s e r i n e c d S A K P P C T P { T g l y c e r o l - — 3 - - p h o s p h a t e C M P ? C D P - - d i a c y | g l y c e r o l . Q C M P . . 8 5 3 5 n e w P h o p h a t l d y l s e r l n e 5 P h o s p h a t i d y l g l y c e r o l - 3 - p h o s p h a t e C 0 2 M p s d P l _ , 5 p e p I , " P h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m l n e 5 _ S A M p m t A C M P 5 . - - - - - - - - - - - - - P h o s p h a t l d y l g l y c e r o l . S A H ’ I p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l M M P E ‘ l y 0 3 1 ‘ g l y c e r o l S A M > 1 p m t A C L C a r d i o l i p i n ( C L ) S A H : D M P E y S A M S A H ) 1 W A C L ( 1 8 : 2 ) 4 P h o s p h a t i d y l c h o l i n e F i g u r e 1 . 2 M a j o r b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s f o r p h o s p h o l i p i d s , a n d t h e d i f f e r e n t c a r d i o l i p i n s y n t h e t i c p a t h w a y i n e u k a r y o t e s ( y e a s t a n d m a m m a l i a n c e l l s , S h o w n i n d a s h e d a r r o w s ) . T h e g e n e s i d e n t i fi e d i n b a c t e r i a t o b e r e s p o n s i b l e f o r t h e r e a c t i o n s a r e r e p r e s e n t e d i n i t a l i c s ( a d a p t e d f r o m [ 7 ] ) . 1 3 1 . 2 . 3 S t r u c t u r a l / p h y s i c a l f e a t u r e s u n d e r l y i n g t h e f u n c t i o n s o f l i p i d s T h e p o t e n t i a l f u n c t i o n s o f l i p i d s a r e u n d e r l i n e d b y t h e p h y s i c a l a n d s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f t h e s e m o l e c u l e s . O n e f e a t u r e i s t h e m o l e c u l a r s h a p e o f t h e l i p i d . T h e r e l a t i v e S i z e o f t h e h e a d g o u p a n d t h e t a i l s d e t e r m i n e i f t h e l i p i d s a d o p t a r e c t a n g u l a r o r a t r i a n g u l a r s h a p e , a n d a r e t h u s p r o n e t o f o r m a b i l a y e r o r a c u r v e d m i c e l l e s u r f a c e i n s t e a d [ 6 ] . N o n - b i l a y e r f o r m i n g l i p i d s m i g h t r e p l a c e e a c h o t h e r . R e c e n t l y t h e n o n - b i l a y e r f o r m i n g g l y c o d i a c y l g l y c e r i d e l i p i d s w e r e f o u n d t o b e a b l e t o r e p l a c e t h e f u n c t i o n s o f G P E t n , b u t G P G r o , G P C h o o r C L c o u l d n o t [ 2 2 ] . A n o t h e r f e a t u r e i s t h e h e a d g o u p c h a r g e s t a t e . I t h a s b e e n w e l l e s t a b l i s h e d t h a t a n i o n i c l i p i d s G P G r o a n d S Q D G a r e i n t e r - r e p l a c e a b l e d u e t o t h e i r a n i o n i c h e a d g o u p s [ 1 4 ] . G P G r o w a s a l s o o f t e n p r o p o s e d t o r e p l a c e t h e f u n c t i o n o f C L i n m a m m a l i a n a n d y e a s t c e l l s , d u e t o t h e n e g a t i v e c h a r g e s a s w e l l a s s i m i l a r i t y i n t h e i r s t r u c t u r e s [ 2 3 ] . V i a e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s , t h e c h a r g e s t a t e o f t h e l i p i d s m i g h t a l s o a s s i s t w i t h t h e b i n d i n g o f p o s i t i v e l y c h a r g e d s u b s t r a t e s a n d p r o t e i n r e s i d u e s [ 1 ] . A t h i r d i s s u e i s t h e f a t t y a c i d c h a i n c o m p o s i t i o n . T h e u n s a t u r a t i o n S i t e s i n f a t t y a c i d c h a i n s a r e o f t e n f o u n d t o a d o p t t h e c i s c o n f o r m a t i o n , a n d i n t r o d u c e “ k i n k s ” i n t h e t a i l s m a k i n g t h e m m o r e fl e x i b l e a n d l e s s t i g h t l y p a c k e d . F u r t h e r m o r e , t h e p o l y u n s a t u r a t i o n o f t h e f a t t y a c i d c h a i n c a n s e r v e a s t h e t a r g e t f o r p e r o x i d a t i o n a s a p a r t o f t h e s i g r a l i n g c a s c a d e , s u c h a s t h e r e c e n t l y s o l v e d c a s e o f c a r d i o l i p i n 1 8 : 2 l i p i d s i n m a m m a l i a n m i t o c h o n d r i a [ 8 ] . A f o u r t h f e a t u r e r e l a t e s t o t h e m e t a b o l i s m o f l i p i d s , a p r o c e s s t h a t c a n r e l e a s e s e c o n d m e s s e n g e r s v i a b r e a k i n g d o w n t h e m e m b r a n e l i p i d s b y h i g h l y s t r u c t u r e - s e l e c t i v e l 4 p h o s p h o l i p a s e o r s p h i n g o m y e l i n a s e . T h e h i g h s e l e c t i v i t y i s o f t e n d i r e c t e d t o w a r d t h e b a c k b o n e s t r u c t u r e , a n d d i s t i n g u i s h e s b e t w e e n t h e g l y c e r o l a n d n o n - g l y c e r o l b a c k b o n e s . S p h i n g o m y e l i n l i p i d s d o n o t h a v e t h e g l y c e r o l b a c k b o n e , a n d t h e i r d e c o m p o s i t i o n s a r e t i g h t l y c o n t r o l l e d t o r e l e a s e c e r a m i d e s , a n i m p o r t a n t g o u p o f s i g r a l i n g m o l e c u l e s . O r n i t h i n e l i p i d s a r e r e s i s t a n t t o p h o s p h o l i p a s e s , a n d l i p i d A , s h a r i n g c h e m i c a l b o n d s i m i l a r i t y t o o r n i t h i n e l i p i d s , p l a y i m p o r t a n t r o l e s i n t h e b a c t e r i a l i n f e c t i o n m e c h a n i s m . 1 . 3 T h e m e m b r a n e p r o t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e : s t r u c t u r e , f u n c t i o n , m e c h a n i s m a n d r e g u l a t i o n 1 . 3 . 1 O x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n a n d r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s A s a n i m p o r t a n t p a r t o f m a i n t a i n i n g t h e b a l a n c e o f e n e r g y , l i v i n g c e l l s fi r n n e l m o s t o f t h e m e t a b o l i c e n e r g y o b t a i n e d f r o m f o o d i n t o t h e s t o c k o f N A D H a n d F A D H 2 t h r o u g h o x i d a t i o n — r e d u c t i o n r e a c t i o n s , w h i c h t h e y c a n c a s h i n t o t h e c u r r e n c y o f A T P t o s p e n d f o r c e l l u l a r a c t i v i t i e s s u c h a s b i o s y n t h e s i s , m e m b r a n e t r a n s p o r t a n d m o v e m e n t . A l t h o u g h A T P i s a l s o m a d e i n g l y c o l y s i s a n d T C A c y c l e v i a s u b s t r a t e - l e v e l p h o s p h o r y l a t i o n , t h e m a j o r i t y o f A T P s y n t h e s i s i s t h e r e s u l t o f o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n ( O X P H O S ) , w h e r e t h e e l e c t r o n s i n t h e r e d u c e d c o e n z y m e s N A D H a n d F A D H 2 a r e p a s s e d t h r o u g h a h i g h l y s y n c h r o n i z e d c h a i n o f p r o t e i n s a n d c o e n z y m e s , c a l l e d t h e e l e c t r o n t r a n s p o r t c h a i n , t o r e a c h a n d g e t c o n s u m e d b y m o l e c u l a r o x y g e n , t h e t e r m i n a l e l e c t r o n a c c e p t o r , c o n c o m i t a n t l y e s t a b l i s h i n g a p r o t o n g a d i e n t a c r o s s t h e m e m b r a n e 1 5 e m b e d d i n g t h e s e p r o t e i n s t o d r i v e t h e n e x t s t e p o f A T P s y n t h e s i s f r o m A D P ( F i g u r e 1 . 3 ) [ 2 4 ] . T h e m a c h i n e r y o f o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n i n m o s t e u k a r y o t i c o r g a n i s m s i s c o m p o s e d o f F l F o - A T P a s e ( c o m p l e x V ) a n d t h e f o u r e l e c t r o n t r a n s p o r t c h a i n c o m p l e x e s , n a m e l y , N A D H : u b i q u i n o n e r e d u c t a s e ( c o m p l e x I ) , s u c c i n a t e : u b i q u i n o n e r e d u c t a s e ( c o m p l e x 1 1 ) , u b i q u i n o l : c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e ( a l s o c a l l e d c y t o c h r o m e b e ] c o m p l e x , c o m p l e x I I I ) a n d c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( c o m p l e x I V ) , a l l e m b e d d e d i n t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s ( F i g u r e 1 . 3 ) . T h e s e o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n c o m p l e x e s a r e a l s o f o u n d i n t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e s o f m a n y a e r o b i c b a c t e r i a . C y t o c h r o m e 0 4 H + + i n t e r - 1 S } - H m e m b r a n e ‘ s p a c e ( P - p h a s e ) s u c c i n a t e f u m a r a t e H ” N A D H N A D + + C o m p l e x I I C o m p l e x l l l C o m p l e x I V + H S u c c i n a t e C y t o c h r o m e C y t o c h r o m e f N C o m p l e x I D e h y d r o g e n a s e b c 1 C o m p l e x c O x i d a s e A D P + P i A T P D e h Z A D H C o m p l e x V y r o g e n a s e R e s p i r a t o r y C h a i n C o m p l e x e s A T P S y n t h a s e F i g u r e 1 . 3 T h e m i t o c h o n d r i a l r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s a n d A T P a s e t h a t a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n i n e u k a r y o t i c s y s t e m s ( s h o w i n g t h e s t r u c t u r e s o f c o m p l e x e s H I a n d I V fi o m b o v i n e h e a r t , V f r o m y e a s t , 1 1 f r o m E . c o l i a n d c y t o c h r o m e c f r o m h o r s e h e a r t ) ( a d a p t e d f r o m [ 2 5 ] ) . 1 6 T h e a r r a n g e m e n t o f t h e s e c o m p l e x e s i n u n i t s o f e l e c t r o n t r a n s f e r s u p e r - m o l e c u l a r c o m p l e x e s , r a t h e r t h a n a s f r e e a n d i n d e p e n d e n t p l a y e r s , i s e m p h a s i z e d b y a c c u m u l a t i n g e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e [ 2 6 ] . T h e c h a r g e d i s t r i b u t i o n o n t h e t w o S i d e s o f t h e m e m b r a n e i s a s y m m e t r i c d u e t o t h e s t o r a g e o f e n e r g y a s a n e l e c t r o c h e m i c a l / p H g a d i e n t ; t h e m a t r i x s i d e i s e l e c t r o n e g a t i v e a n d a l s o c a l l e d t h e n e g a t i v e S i d e o f t h e m e m b r a n e ( N - p h a s e ) . T h e e l e c t r o n t r a n s p o r t a n d o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n a r e m e m b r a n e - a s s o c i a t e d p r o c e s s e s , n o t o n l y i n t h a t t h e p r o t e i n s r e s p o n s i b l e f o r t h e s e r e a c t i o n s a r e m e m b r a n e b o u n d , b u t a l s o b e c a u s e t h e y r e l y o n t h e m e m b r a n e b a r r i e r a s a n e f fi c i e n t c a p a c i t o r t o b u i l d u p t h e p o t e n t i a l o f t h e p r o t o n a n d e l e c t r o c h e m i c a l g a d i e n t a c r o s s t h e m e m b r a n e t o d r i v e t h e r e a c t i o n s t o p r o c e e d , e m p h a s i z i n g t h e i n t e r a c t i v e n a t u r e o f t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e s e p r o t e i n s w i t h t h e m e m b r a n e l i p i d s . I n a d d i t i o n , l i p i d s w i t h s t e r o i d s t r u c t u r e s , s u c h a s d e o x y c h o l a t e , a r e a l s o e m e r g i n g a s p o t e n t i a l r e g u l a t o r s o f t h e c o m p l e x b y b i n d i n g a t s p e c i fi c s i t e s i n t h e c o m p l e x [ 2 7 ] . 1 . 3 . 2 S t r u c t u r e o f C c O T h e o v e r a l l r e a c t i o n t h a t c y t o c h r o m e c o x i d a s e c a t a l y z e s i s s h o w n i n S c h e m e 1 . 1 . D u r i n g e a c h c a t a l y t i c c y c l e , a t o t a l o f e i g h t p r o t o n s a r e t a k e n f r o m t h e m a t r i x S i d e ( N - p h a s e ) o f t h e m e m b r a n e , f o u r o f w h i c h a r e c o n s u m e d i n t h e r e d u c t i o n o f o x y g e n i n t o w a t e r a n d t h e o t h e r f o u r a r e t r a n s f e r r e d a c r o s s t h e m e m b r a n e t o t h e i n t e r - m e m b r a n e s p a c e ( P - p h a s e ) o f t h e m e m b r a n e t o g e n e r a t e a p r o t o n g a d i e n t . C 0 0 4 c y t c ( F e 2 + ) + 8 H + ( i n ) + 0 2 - — > 4 c y t c ( F e 3 + ) + 2 H 2 0 + 4 H + ( o u t ) ( R e d u c e d ) ( O x i d i z e d ) S c h e m e 1 . 1 T h e o v e r a l l r e a c t i o n c a t a l y z e d b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e l 7 T h e m a m m a l i a n C c O p u r i fi e d f r o m b o v i n e h e a r t i s f o u n d t o c o n t a i n t h i r t e e n s u b u n i t s , t w o i r o n s , t w o c o p p e r c e n t e r s , o n e z i n c , o n e m a g r e s i u r n a n d o n e c a l c i u m p e r m o l e c u l e o f C c O [ 2 8 , 2 9 ] . T h e m i t o c h o n d r i a l D N A - e n c o d e d s u b u n i t s I , I I a n d I I I a r e t h e b i g g e s t i n s i z e a n d a l s o c o n s t i t u t e t h e c a t a l y t i c c o r e f o r b o t h p r o t o n p u m p i n g a n d e l e c t r o n t r a n s f e r a c t i v i t i e s . T h e o t h e r t e n s u b u n i t s a r e e n c o d e d b y t h e n u c l e a r g e n o m e a n d c a n h a v e v a r i e d f o r m s ( i s o f o r m s ) i n d i f f e r e n t t i s s u e s , w i t h a s y e t u n k n o w n f u n c t i o n a l S i g n i fi c a n c e . 1 . 3 . 2 . 1 E l e c t r o n t r a n s f e r m e t a l c e n t e r s C y t o c h r o m e c o x i d a s e c a r r i e s o u t t h e o x i d a t i o n r e a c t i o n b y v i r t u e o f f o u r r e d o x a c t i v e m e t a l s i t e s , n a m e l y t h e S i x - c o o r d i n a t e h e m e a ( s u b u n i t 1 ) , t h e fi v e — c o o r d i n a t e h e m e a 3 ( s u b u n i t 1 ) , C u A ( t w o m i x e d - v a l e n c e c o p p e r i o n s C u 1 ' 5 + — C u l ' 5 + , s u b u n i t I I ) a n d C U B ( s u b u n i t 1 ) . T h e e l e c t r o n t r a n s f e r p a t h w a y i s S h o w n i n s c h e m e 1 . 2 . T h i s a a 3 - t y p e c y t o c h r o m e c o x i d a s e i s f o u n d i n m i t o c h o n d r i a , a n d i s a l s o f o u n d i n s o m e a e r o b i c b a c t e r i a i n c l u d i n g P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s a n d R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s i n t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e s u n d e r a e r o b i c g o w t h c o n d i t i o n s , a l o n g w i t h s e v e r a l o t h e r t y p e s o f o x i d a s e s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t t y p e s o f h e m e c e n t e r s . H o w e v e r , b a c t e r i a l C c O s h a v e o n l y o n e m o r e s u b u n i t i n a d d i t i o n t o s u b u n i t s I , I I a n d 1 1 1 , o n e m a g n e s i u m , o n e c a l c i u m , b u t n o z i n c . c y t c — > C u A — — > h e m e a — — > h e m e a 3 — > C U B — > 0 2 S c h e m e 1 . 2 E l e c t r o n t r a n s f e r p a t h w a y i n a a 3 - t y p e c y t o c h r o m e c o x i d a s e [ 3 0 ] 1 8 1 . 3 . 2 . 2 P r o t o n t r a n s f e r p a t h w a y s A s e r i e s o f s p e c i fi c a l l y a l i g r e d r e s i d u e s a n d w a t e r m o l e c u l e s i d e n t i fi e d a s t h e D - p a t h w a y a n d t h e K - p a t h w a y w e r e f o u n d t o b e r e s p o n s i b l e f o r t h e u p t a k e o f p r o t o n s f r o m t h e m a t r i x s i d e o f t h e m e m b r a n e [ 2 5 ] . E x i t a n d b a c k fl o w p a t h w a y s f o r p r o t o n t r a n s f e r a r e a l s o s u g g e s t e d b y e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e [ 3 1 , 3 2 ] . T h e m e c h a n i s m o f c o u p l i n g b e t w e e n e l e c t r o n t r a n s f e r a n d p r o t o n p u m p i n g r e m a i n s u n r e s o l v e d . 1 . 3 . 2 . 3 S u b u n i t c h a r a c t e r i s t i c s T h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s a a 3 - t y p e C c O d i s p l a y s 5 2 % h o m o l o g y i n s u b u n i t 1 , 3 9 % i n s u b u n i t I I a n d 4 9 % i n s u b u n i t I I I t o t h e b o v i n e h e a r t C c O s e q u e n c e [ 3 3 ] S u b u n i t I o f C c O c o n t a i n s t w e l v e t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s f o r m i n g t h r e e f o u r - h e l i x b u n d l e s i n a n a n t i c l o c k w i s e a r r a n g e m e n t a s v i e w e d f r o m t h e p e r i p l a s m i c s i d e [ 3 0 ] . B e i n g t h e m o s t c o n s e r v e d i n s e q u e n c e a n d s t r u c t u r e , i t p r o v i d e s t h e s c a f f o l d f o r h e m e a , h e m e a 3 a n d C u } ; t o r e s i d e , a n d c o n t a i n s t h e t w o p r o t o n u p t a k e p a t h w a y s ( D a n d K p a t h w a y s ) . S u b u n i t 1 1 c o n t a i n s o n e h y d r o p h o b i c l o o p a t t h e N - t e r m i n u s , t w o t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s t h a t i n t e r a c t w i t h s u b u n i t 1 , a n d o n e h y d r o p h i l i c e x t r a - m e m b r a n e g l o b u l a r d o m a i n a t t h e C - t e r m i n u s m a i n l y c o m p o s e d o f a t e n - s t r a n d e d B - b a r r e l w h i c h h a r b o r s t h e C u A m e t a l c e n t e r [ 3 0 ] . T h i s d o m a i n f o r m s a t i g h t l y i n t e g a t e d c a p o n t o p o f s u b u n i t I a n d a l s o s e r v e s a s t h e b i n d i n g S i t e s f o r t h e s u b s t r a t e , s o l u b l e c y t o c h r o m e c . 1 9 S u b u n i t 1 1 1 c o n t a i n s s e v e n t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s . S u b u n i t I V o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s c o n t a i n s o n l y o n e t r a n s m e m b r a n e h e l i x . S e v e r a l p r o t e o l y t i c f o r m s o f s u b u n i t s 1 1 a n d I V ( R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s ) a r e a l s o f o u n d t o e x i s t i n t h e fi n a l p u r i fi e d C c O . S e v e n o f t h e o t h e r t e n s u b u n i t s i n m a m m a l i a n C c O a l s o c o n t a i n h y d r o p h o b i c t r a n s m e m b r a n e h e l i x s t r u c t u r e s b u t n o n e h a v e h o m o l o g y t o t h e b a c t e r i a l s u b u n i t I V n o r d o t h e y s i t i n t h e s a m e p o s i t i o n r e l a t i v e t o t h e t h r e e c o r e s u b u n i t s . 1 . 3 . 2 . 4 B a c t e r i a l a a 3 - C c 0 a s a m o d e l f o r m a m m a l i a n C c O i n m e c h a n i s t i c s t u d y T h e r e c e n t s u c c e s s i n t h e c r y s t a l l i z a t i o n o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n C c O h a s l e d t o t w o t y p e s o f C c O s t r u c t u r e s , t h e m a m m a l i a n v e r s i o n o f C c O f r o m b o v i n e h e a r t , a n d t h e b a c t e r i a l C c O s f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s a n d R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s [ 2 8 , 3 4 , 3 5 ] . I n t h e b o v i n e h e a r t C c O c r y s t a l , a l l 1 3 s u b u n i t s a r e r e s o l v e d . T h e b a c t e r i a l C c O c o n t a i n e d o n l y 4 s u b u n i t s , a n d t h e s u b u n i t s I , I I , a n d I I I a r e h i g h l y a n a l o g o u s t o t h e s t r u c t u r e s o f t h e m a m m a l i a n s u b u n i t s ( F i g u r e 1 . 4 ) . S t r u c t u r e s o f a 2 s u b u n i t T h e r m o p h i l i c v e r s i o n o f C c O h a v e a l s o b e e n r e p o r t e d . A l o w e r r e s o l u t i o n s t r u c t u r e o f 6 0 3 o x i d a s e h a s a l s o b e e n d e t e r m i n e d . D u e t o t h e h i g h s i m i l a r i t y t o t h e b o v i n e C c O i n t h e c a t a l y t i c c o r e , b u t S i m p l e r s u b u n i t c o m p o s i t i o n , a s p e c t r a l l y a c c e s s i b l e c a t a l y t i c c e n t e r , a n d t h e e a s e o f s i t e - d i r e c t e d a m i n o a c i d m u t a g e n e s i s a n d l i p i d m a n i p u l a t i o n , R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s C 6 0 i s a g o o d m o d e l i n w h i c h t o s t u d y t h e m e c h a n i s m o f t h e m a m m a l i a n C c O , i n c l u d i n g t h e k e y a s p e c t s o f e l e c t r o n t r a n s f e r a n d p r o t o n p u m p i n g , e n z y m e r e g u l a t i o n a n d t h e e f f e c t s o f l i p i d s o n t h e e n z y m e . 2 0 F i g u r e 1 . 4 C o m p a r i s o n o f R . s p h a e r o i d e s a n d b o v i n e m i t o c h o n d r i a l C c O s t r u c t u r e s . T h e t h r e e c o r e s u b u n i t s I ( y e l l o w ) , 1 1 ( g e e n ) , a n d 1 1 1 ( c y a n ) a r e h i g h l y h o m o l o g o u s , a s w e l l a s t h e r e d o x a c t i v e c e n t e r s ( h e m e s a a n d a 3 a r e s h o w n i n r e d , a n d c o p p e r s a r e s h o w n i n p u r p l e ) . T h e n o n - h o m o l o g o u s s u b u n i t s , i n c l u d i n g s u b u n i t I V o f R s C c O a n d t h e a d d i t i o n a l 1 0 s u b u n i t s f r o m b o v i n e C c O a r e s h o w n i n g a y [ 3 0 ] . 1 . 3 . 2 . 5 L i p i d c o m p o n e n t s i n C c O a n d t h e i r s i g n i fi c a n c e M e m b r a n e p r o t e i n s a r e h i g h l y h y d r o p h o b i c a n d c o n t a i n a s i g n i fi c a n t p e r c e n t a g e o f a - h e l i c a l a n d B - b a r r e l s t r u c t u r e s . W h a t h o l d s t h e a - h e l i c a l b u n d l e s t r u c t u r e t o g e t h e r r e m a i n s t o b e e l u c i d a t e d . W h e r e a s m e m b r a n e p r o t e i n s a r e e m b e d d e d i n t h e m e m b r a n e f o r v a r i o u s r e a s o n s , C c O s i t s i n t h e m e m b r a n e f o r a n a d d i t i o n a l r e a s o n : t o d e v e l o p a p o t e n t i a l g a d i e n t . I t i s u s i n g t h e m e m b r a n e a s a s t o r a g e d e v i c e f o r t h e p o t e n t i a l g a d i e n t d e v e l o p e d 2 1 b y i t s p r o t o n p u m p i n g f u n c t i o n . T h e m e m b r a n e p o t e n t i a l i s i t s p r o d u c t , a n d t h e m e m b r a n e i s a n i n t e g a l p a r t n e r f o r C c O t o f u n c t i o n . T h e r e f o r e , t h e i n t e r a c t i o n o f C c O w i t h t h e m e m b r a n e i s l i k e l y t o b e m o r e c o m p l i c a t e d t h a n i n s o m e o t h e r m e m b r a n e p r o t e i n s . A t i g h t i n t e r a c t i o n w i t h t h e p h o s p h o l i p i d b i l a y e r i s r e q u i r e d t o m a i n t a i n t h e d i f f u s i o n b a r r i e r a n d k e e p i t s e a l e d . T h e l i p i d b i l a y e r h i n d e r s t h e d i f f u s i o n o f i o n s , a p r e r e q u i s i t e f o r t h e g e n e r a t i o n o f e l e c t r o c h e m i c a l p o t e n t i a l s u t i l i z e d f o r s y n t h e s i s o f A T P o r a c t i v e t r a n s p o r t [ 1 ] . T h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e f o u r - s u b u n i t R . s p h a e r o i d e s C c O r e s o l v e d a t t h e r e s o l u t i o n o f 2 . 3 - 2 . 8 A r e v e a l e d a t o t a l o f s i x l i p i d m o l e c u l e s , a l l i n t e r p r e t e d a s G P E t n l i p i d s [ 3 4 ] , f o u r o f w h i c h s u r r o u n d s u b u n i t I V , o n e fi l l s t h e V - s h a p e d c l e f t f o r m e d b y t h e h e l i x b u n d l e s i n s u b u n i t I I I , a n d t h e o t h e r o n e b i n d s a t t h e i n t e r f a c e b e t w e e n s u b u n i t s I I I a n d I . S u b u n i t I V d i s p l a y s n o d i r e c t c o n t a c t w i t h t h e o t h e r s u b u n i t s , b u t i s s t a b i l i z e d a n d a s s o c i a t e d w i t h t h e r e s t o f t h e c o m p l e x v i a t h e l a y e r o f l i p i d m o l e c u l e s i n b e t w e e n ( F i g u r e 1 . 5 ) . 2 2 F i g u r e 1 . 5 M e m b r a n e l i p i d s r e s o l v e d i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f R s C c O . T h e t w o fi g u r e s r e p r e s e n t a s i d e v i e w o n t h e l e f t a n d a t o p v i e w o n t h e r i g h t [ 3 0 , 3 4 ] . T h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f b o v i n e h e a r t C c O r e s o l v e d a t t h e r e s o l u t i o n o f 1 . 8 A r e v e a l e d 1 3 l i p i d m o l e c u l e s b o u n d t o t h e C 0 0 i n c l u d i n g t w o c a r d i o l i p i n s , f o u r 1 4 1 ‘ I p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l s , t h r e e p l r u s p h e t " , , o n e p h o s p h a t i d y l c h o l i n e a n d t h r e e t r i a c y l g l y c e r o l s ( F i g u r e 1 . 6 A ) [ 2 8 , 3 6 ] , a n d t h e i r f a t t y a c i d c h a i n s w e r e fi r r t h e r i d e n t i fi e d b y m a s s s p e c t r o m e t r y f o l l o w i n g l i p i d e x t r a c t i o n . I t w a s o b s e r v e d t h a t e a c h l i p i d h e a d g o u p h a s a s p e c i fi c b i n d i n g S i t e , a n d p r o p o s e d t h a t t h e fl e x i b i l i t y o f t h e f a t t y a c i d c h a i n s a r e a l s o c r i t i c a l i n c r e a t i n g a n e f f e c t i v e s p a c e - fi l l i n g f u n c t i o n . F u r t h e r m o r e , t h e p a l m i t a t e ( 1 6 : 0 ) f a t t y a c i d c h a i n s f r o m p h o s p h o t i d y l g l y c e r o l w e r e p r o p o s e d t o c o n t r o l t h e 0 2 t r a n s f e r p r o c e s s t h r o u g h b i n d i n g a n d b l o c k i n g t h e 0 2 t r a n s f e r p a t h w a y . T h e s e l e c t i v e b i n d i n g o f c i s - v a c c e n a t e n e a r t h e 0 2 t r a n s f e r w a s a l s o u s e d t o s u g g e s t t h a t t h e v a c c e n a t e 2 3 p l a y s a c r i t i c a l r o l e i n t h e 0 2 t r a n s f e r m e c h a n i s m [ 2 8 ] . T h e t w o c a r d i o l i p i n l i p i d s f r o m e a c h C c O m o n o m e r w e r e p r o p o s e d t o b e c r i t i c a l i n f o r m i n g C c O d i m e r s [ 3 6 ] . F i g u r e 1 . 6 C c O c r y s t a l s t r u c t u r e s s h o w i n g b o u n d l i p i d s , ( A ) l e f t , b o v i n e h e a r t C c O s h o w i n g t h e l i p i d c o n t e n t [ 3 6 ] , a n d ( B ) r i g h t , s u p e r i m p o s e d s t r u c t u r e s h o w i n g t h e c o n s e r v e d s i t e s f o r l i p i d s i n s u b u n i t s I a n d I I [ 3 5 ] . T h e t w o - s u b u n i t R . s p h a e r o i d e s C c O s t r u c t u r e r e s o l v e d a t 2 . 0 A w a s a l s o r e c e n t l y o b t a i n e d [ 3 5 ] , a n d a n u m b e r o f l i p i d f a t t y a c i d c h a i n s a n d d o d e c y l m a l t o s i d e m o l e c u l e s w e r e i d e n t i fi e d i n t h e s t r u c t u r e ( F i g u r e 1 . 6 B ) . W h e n s u p e r i m p o s e d o n t o s u b u n i t s I a n d I I o f b o v i n e h e a r t C c O a n d P . d e n i t r i fi c a n s C c O , t h e l i p i d b i n d i n g s i t e s p r e c i s e l y o v e r l a p p e d , i n s p i t e o f d i f f e r e n t p u r i fi c a t i o n m e t h o d s a n d d e t e r g e n t s [ 3 5 ] . 2 4 1 . 3 . 2 . 6 F u n c t i o n a n d m e c h a n i s m o f C c O a n d t h e i r a n a l y s i s B e c a u s e t h e a c t i v i t y o f c y t o c h r o m e o x i d a s e i s d e p e n d e n t o n v e r y f a s t e l e c t r o n t r a n s f e r r e a c t i o n s , i t i s u s u a l l y m e a s u r e d u s i n g r a p i d - k i n e t i c m e t h o d s a s w e l l a s s t e a d y - S t a t e m e t h o d s . T h e i n t e r m e d i a t e s t a t e s o f t h e o x y g e n c h e m i s t r y i n C 0 0 a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 1 . 7 [ 3 0 ] . F o r e a c h c a t a l y t i c c y c l e , f o u r e l e c t r o n s a r e t r a n s f e r r e d t o t h e b i n u c l e a r c e n t e r a n d c o m b i n e d w i t h d i o x y g e n a n d f o u r p r o t o n s a r e t a k e n f r o m t h e i n s i d e o f t h e m e m b r a n e t o f o r m 2 w a t e r s . F o u r a d d i t i o n a l p r o t o n s a r e t r a n s p o r t e d a c r o s s t h e m e m b r a n e , b u t a r e n o t s h o w n i n t h e fi g u r e s i n c e t h e p r o t o n p u m p i n g m e c h a n i s m i s u n k n o w n [ 3 0 ] . O x i d i z e d ( O ) _ C u B Z + - O H e — 6 % F 6 0 3 3 + - O H ( I . c \ F e r r y - 0 x 0 ( F ) H H 1 e _ R e d u c e d ( E ) C U B Z + _ O H C 1 + F e a 4 + = 0 2 _ “ 8 3 + ( H 2 0 ) 3 F 6 0 3 ‘ O H H “ ’ W F e — f J L H + I P u g ? ( P ) 2 e _ R e d u c e d ( R ) C U B — O I ‘ I 1 + F e a 3 4 + = 0 2 _ 0 2 C u B 2 + ( H 2 0 ) . Y . 0 2 B o u n d ( A ) ) F 6 6 1 3 ( H 2 0 ) . \ C U B 1 + F e a 3 2 + ” ' O = O ‘ < / Y H ( H 2 0 ) 2 F i g u r e 1 . 7 T h e o x y g e n c h e m i s t r y c y c l e o f t h e r e a c t i o n c a t a l y z e d b y C c O [ 3 O ] . 2 5 T h e c o m p l e x i t y i n t h e c o m p o s i t i o n o f t h e m u l t i - s u b u n i t p r o t e i n C c O , c o n t a i n i n g h e m e s , l i p i d s , d e t e r g e n t s a n d v a r i o u s f o r m s o f s u b u n i t s , m a k e s m a s s s p e c t r o m e t r y a v e r y i m p o r t a n t t o o l t o m a p b o t h i t s l i p i d a n d p r o t e i n c o m p o s i t i o n [ 3 7 ] . 1 . 3 . 3 R e g u l a t i o n o f C c O S e v e r a l m e c h a n i s m s a r e e m e r g i n g r e g a r d i n g t h e r e g u l a t i o n o f t h e r e d o x p r o t o n p u m p i n g m a c h i n e o f C 5 0 , a s s u g g e s t e d b y r e c e n t fi n d i n g s o f m u l t i p l e s i t e s o f p h o s p h o r y l a t i o n , t h e b i n d i n g o f d e o x y c h o l a t e i n a p r o t o n p a t h w a y [ 2 7 ] , a n d t h e e v i d e n c e f o r b a c k fl o w a s a m e c h a n i s m t o c o n t r o l t h e p r o t o n p u m p i n g e f fi c i e n c y [ 3 1 , 3 8 ] . N u c l e o t i d e s h a v e l o n g b e e n c o n s i d e r e d t o h a v e i m p o r t a n t r e g u l a t o r y e f f e c t s o n t h e a c t i v i t y o f C c O . T h e c h o l a t e b i n d i n g s i t e s d i s c o v e r e d i n b o v i n e C c O w e r e c o n s i d e r e d t o r e s e m b l e t h e b i n d i n g s i t e s f o r n u c l e o t i d e s , s u g g e s t i n g p o t e n t i a l r e g u l a t o r y S i t e s b y n u c l e o t i d e s [ 2 7 ] . T h e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e r e s o l v e d b o u n d d e o x y c h o l a t e m o l e c u l e i n R c h O c a n p o t e n t i a l l y b e fi r r t h e r c h a r a c t e r i z e d b y u s i n g m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s a n d c o m p u t a t i o n a l a n a l y s i s o f t h e p r o p e r t i e s a n d s p e c i fi c i t y o f t h e b i n d i n g S i t e . S p a n n i n g a c r o s s t h e m e m b r a n e , a n d r e s p o n d i n g t o t h e l i p i d m o l e c u l e s , r e g u l a t i o n o f t r a n s - m e m b r a n e C c O c o u l d a l s o i n v o l v e t h e c o n c e r t e d e f f e c t s o f l i p i d s , a l o n g w i t h p h o s p h o r y l a t i o n a n d s t e r o i d i n t e r a c t i o n s . S o m e l i p i d s m o l e c u l e s , p a r t i c u l a r l y t h o s e i n t h e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e , h a v e b e e n f o u n d t o b e a c t i v e l y i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f p r o t e i n a n d c e l l u l a r a c t i v i t y [ 1 ] . F o r i n s t a n c e , c a r d i o l i p i n a p p e a r s t o p a r t i c i p a t e i n f o r m a t i o n o f s u p e r c o m p l e x e s o f r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p o n e n t s ( s e e b e l o w ) . 2 6 1 . 4 M e m b r a n e b o u n d s u p e r - m o l e c u l a r c o m p l e x o r g a n i z a t i o n 1 . 4 . 1 T h e “ s t a t i c ” v e r s u s t h e “ fl u i d i c ” m o d e l o f o r g a n i z a t i o n R e g a r d i n g t h e a r r a n g e m e n t o f t h e c o m p l e x e s t h a t c a r r y o u t o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n i n t h e m e m b r a n e , a “ fl u i d i c ” m o d e l a n d a “ s t a t i c ” m o d e l h a v e b e e n p r o p o s e d o v e r t h e h i s t o r y [ 2 6 , 3 9 ] . I n t h e “ fl u i d i c ” m o d e l , e a c h i n d i v i d u a l c o m p l e x w a s d e p i c t e d a s b e i n g f r e e a n d s t r u c t u r a l l y i n d e p e n d e n t , w h i c h i s s u p p o r t e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t e a c h c o m p l e x c a n b e i n d i v i d u a l l y p u r i fi e d i n i t s f u l l y a c t i v e f o r m , a n d t h a t t h e e l e c t r o n c a r r i e r s u b i q u i n o n e a n d c y t o c h r o m e c c a n d i f f u s e a t m u c h f a s t e r r a t e s t h a n t h e p r o t e i n c o m p l e x e s [ 2 6 ] . H o w e v e r , t h e “ s t a t i c ” m o d e l , w h e r e t h e s e c o m p l e x e s a r e a s s e m b l e d i n t o a u n i t o f s u p e r - m o l e c u l a r c o m p l e x , i s b e i n g r e i n f o r c e d b y r e c e n t l y a c c u m u l a t i n g e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e u s i n g s i n g l e p a r t i c l e e l e c t r o n i c m i c r o s c o p y a s w e l l a s n a t i v e g e l a n a l y s i s a n d t h e u s e o f m i l d d e t e r g e n t s u c h a s d i g i t o n i n d u r i n g p u r i fi c a t i o n [ 3 9 - 4 1 ] . F u r t h e r m u t a t i o n s i n s p e c i fi c s u b u n i t s o f t h e c o m p l e x e s w e r e a l s o s h o w n t o a f f e c t t h e a s s e m b l y o f t h e s e s u p e r - c o m p l e x o r g a n i z a t i o n s . I t i s m o r e l i k e l y t h a t t h e a c t u a l a r r a n g e m e n t o f t h e s e c o m p l e x e s i s a d y n a m i c c o m b i n a t i o n o f b o t h t h e “ fl u i d ” a n d t h e “ s t a t i c ” a s p e c t s , c o n t a i n i n g b o t h m o n o m e r s a n d v a r i o u s f o r m s o f s u p e r - c o m p l e x e s t h a t a r e a s s e m b l e d d y n a m i c a l l y t o p e r f o r m c e r t a i n c e l l u l a r f u n c t i o n s a s p r o p o s e d b y F e r g u s o n - M i l l e r e t a 1 [ 4 2 ] . T h e m o s t w e l l e x a m i n e d s u p e r c o m p l e x e s a r e 1 1 1 2 + 1 V 1 , I I I z + I V 2 ( F i g u r e 1 . 8 ) [ 4 1 ] , a n d o l i g n e r s o f A T P s y n t h a s e ( V 2 ) ( F i g u r e 1 . 9 ) [ 4 3 ] . F u r t h e r m o r e , c o m p l e x V w a s f o u n d t o a f f e c t t h e a s s e m b l y o f I I I a n d I V [ 4 4 ] , a n d a n i n t r o d u c t i o n o f a r e g u l a t o r y r e g i o n i n 2 7 c o m p l e x V w a s a l s o f o u n d t o a f f e c t c o m p l e x I V [ 4 5 ] . C o m p l e x 1 w a s r e c e n t l y f o u n d b e i n v o l v e d i n f o r m i n g I + I I I + I V + c y t o c h r o m e c a n d 1 + I I I s u p e r c o m p l e x e s a s w e l l [ 3 9 ] . T h e a s s e m b l y o f t h e s e s u p e r - c o m p l e x e s w a s f o u n d t o a c t a s t h e d r i v i n g f o r c e t o f o r m l o c a l c u r v a t u r e o f t h e m e m b r a n e , a n d d y n a m i c a l l y a l t e r t h e c r i s t a e m e m b r a n e a n d t h e i n n e r b o u n d a r y m e m b r a n e r e g i o n s o f t h e i n n e r m e m b r a n e o f t h e m i t o c h o n d r i a [ 4 6 ] . M a t r i x - - F i g u r e 1 . 8 F i t t i n g o f a t o m i c s t r u c t u r e s o f t h e y e a s t c y t o c h r o m e b c l c o m p l e x ( r e d ) a n d t h e b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e o r c o m p l e x I V ( g r e e n ) i n t o s e l e c t e d E M p r o j e c t i o n m a p s f o r a s s i g n m e n t o f t h e a r r a n g e m e n t o f t h e 1 1 1 2 + W 2 a n d 1 1 1 2 + N 1 s u p e r c o m p l e x e s . O n e c o m m o n p s e u d o - a t o m i c m o d e l w a s c o n s t r u c t e d ( p r e s e n t e d i n t h e m e m b r a n e p l a n e i n t h e i n s e t o f D ) a n d u s e d f o r g e n e r a t i n g d i f f e r e n t o v e r l a y s c l o s e l y m a t c h i n g t h e I I I ; + I V 2 ( A - C ) a n d 1 1 1 2 + W ] ( D ) s u p e r c o m p l e x m a p s , r e s p e c t i v e l y [ 4 1 ] . 2 8 ( a ) b s u b u n i t O S C P s u b u n i t A T P s y n t h a s e « . 3 5 1 5 : e 1 3 1 [ t i l - f t ‘ . 4 2 2 : “ I " , ' F o r o t o r F i g u r e 1 . 9 S c h e m e f o r d i m e r i c A T P s y n t h a s e f r o m m i t o c h o n d r i a . E a c h A T P s y n t h a s e m o n o m e r c o n s i s t s o f t h e F 1 h e a d p i e c e a n d a c e n t r a l s t a l k r e g i o n ( y e l l o w ) c o n n e c t e d t o t h e m e m b r a n e - e m b e d d e d F 0 r o t o r ( g r e e n ) . R o t a t i o n o f t h e c o m p l e t e h e a d p i e c e i s p r e v e n t e d b y t h e b s u b u n i t o f t h e p e r i p h e r a l s t a l k ( b l u e ) , w h i c h i s c o n n e c t e d t o t h e t o p o f F ] b y t h e O S C P s u b u n i t ( p u r p l e ) a n d t o t h e r o t o r b y s u b u n i t a ( d a r k b l u e ) . O t h e r d i m e r - s p e c i f l c s u b u n i t s t h a t d o n o t h a v e d i r e c t f u n c t i o n a l i m p o r t a n c e f o r t h e m o n o m e r s a r e d e p i c t e d i n r e d . ( b ) P r o j e c t i o n m a p o f P o l y t o m e l l a A T P s y n t h a s e d i m e r s . S c a l e b a r = 1 0 n m . ( c ) P r o j e c t i o n m a p o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e A T P s y n t h a s e t r u e - d i m e r s . ( ( 1 ) P r o j e c t i o n m a p o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e A T P s y n t h a s e p s e u d o - d i m e r s [ 4 3 ] . 2 9 T h e o r g a n i z a t i o n o f t h e r e s p i r a t o r y - c h a i n s u p e r c o m p l e x e s h a s b e e n p r o p o s e d t o h a v e f u n d a m e n t a l f u n c t i o n a l i m p l i c a t i o n s [ 3 9 , 4 7 - 5 0 ] , i n c l u d i n g 1 ) a l l o w i n g e n h a n c e d e l e c t r o n t r a n s f e r r a t e s t h r o u g h e l e c t r o n c h a n n e l i n g , 2 ) f o r m i n g r e g u l a t o r y u n i t s o f r e s p i r a t i o n , 3 ) d e t e r m i n i n g t h e u l t r a s t r u c t u r e o f t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e , 4 ) i n c r e a s i n g t h e s t a b i l i t y o f O X P H O S c o m p l e x e s , a n d 5 ) e n h a n c i n g h e p r o t e i n i n s e r t i o n c a p a c i t y o f t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e [ 3 9 ] . T h e r e a r e a t l e a s t t w o a s p e c t s t o t h e s i g r i fi c a n c e o f t h e s u p e r r n o l e c u l a r o r g a n i z a t i o n , i n a d d i t i o n t o i t s r e g u l a t o r y p o s s i b i l i t i e s . O n t h e o n e h a n d , s o m e c o m p l e x e s s e e m e d t o a c t a s c h a p e r o n e s t o a s s i s t t h e a s s e m b l y o f t h e o t h e r c o m p l e x e s [ 4 4 ] . F o r e x a m p l e , c o m p l e x I w a s f o u n d t o b e u n a b l e t o a s s e m b l e w i t h o u t t h e p r e s e n c e o f c o m p l e x I V ( C c O ) . I n t h e y e a s t r e s p i r a t o r y c h a i n , A T P a s e i s a l s o r e q u i r e d f o r t h e a s s e m b l y o f c o m p l e x I V a n d t h e a s s e m b l y o f t h e s u p e r c o m p l e x o f I I I a n d I V [ 4 4 , 4 5 ] . O n t h e o t h e r h a n d , t h e o r g a n i z a t i o n o f s u p e r - m o l e c u l a r c o m p l e x e s w a s a b l e t o c o n t r o l t h e s h a p e o f t h e m e m b r a n e s [ 4 3 , 4 6 ] . R a t h e r t h a n s o l e l y r e l y i n g o n t h e r e o r g a n i z a t i o n o f t h e l i p i d d i s t r i b u t i o n i n t h e m e m b r a n e t o a l t e r t h e c u r v a t u r e , r e s h a p i n g o f t h e m e m b r a n e i s n o w e m e r g i n g a s a p r o c e s s t h a t i s m o r e a c t i v e l y m o d u l a t e d b y t h e f o r m a t i o n o f s u p e r - c o m p l e x e s . T h e f o r m a t i o n o f t h e s u p e r c o m p l e x i s f o u n d t o f o l l o w a w e l l c o n t r o l l e d s p e c i fi c o r i e n t a t i o n a n d c o n f o r m a t i o n . F o r i n s t a n c e , r e c e n t E l e c t r o n M i c r o s c o p y s t u d i e s r e v e a l e d t h a t i n t h e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e , t w o A T P a s e m o l e c u l e s c a n j o i n t o f o r m a w e l l - d e fi n e d c u r v e d d i m e r v i a t h e i r t r a n s m e m b r a n e d o m a i n s , d r a g g i n g a l o n g w i t h t h e m t h e l i p i d b i l a y e r , a n d s u b s e q u e n t l y c r e a t i n g a c u r v a t u r e o f t h e m e m b r a n e a s w e l l [ 4 3 , 4 6 , 5 1 ] . T h e a l t e r a t i o n i n t h e m e m b r a n e c u r v a t u r e i s a n i m p o r t a n t p r e c e d i n g s t e p f o r t h e f o l l o w i n g i n t e r a c t i o n s [ 3 9 ] . 3 O 1 . 5 I n t e r a c t i o n s o f l i p i d s w i t h m e m b r a n e p r o t e i n s a n d s u p e r - m o l e c u l a r c o m p l e x e s L i p i d m o l e c u l e s a r e r e s o l v e d i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f m a n y m e m b r a n e p r o t e i n s , i m p l y i n g a s i g r i fi c a n t r o l e i n p r o t e i n s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n . I n f a c t , i t h a s b e e n S h o w n t h a t S p e c i fi c l i p i d s a r e r e q u i r e d f o r c o r r e c t f o l d i n g a n d a s s e m b l y o f s o m e m e m b r a n e p r o t e i n s , s u c h a s t h e p l a n t l i g h t h a r v e s t i n g c o m p l e x a n d b a c t e r i a l l a c t o s e p e r m e a s e . O t h e r s t u d i e s o n b o v i n e a n d y e a s t c y t o c h r o m e b e ] , b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e , a n d b a c t e r i a l K c S A K i c h a n n e l , i n d i c a t e a r e q u i r e m e n t f o r s p e c i fi c l i p i d s f o r f u l l a c t i v i t y [ 5 2 , 5 3 ] . I n s o m e c a s e s , c o m p l e t e r e m o v a l o f b o u n d l i p i d i s f o u n d t o a b o l i s h p r o t e i n f u n c t i o n , a n e f f e c t t h a t i s r e v e r s i b l e b y a d d i n g b a c k l i p i d s [ 5 4 , 5 5 ] . I n a d d i t i o n t o t h e i r i n fl u e n c e o n a s s e m b l y a n d f u n c t i o n , b o u n d l i p i d s a l s o s t a b i l i z e t h e p r o t e i n s t r u c t u r e . A n u m b e r o f l i p i d m o l e c u l e s c o - p u r i f y w i t h C c O f r o m R . s p h a e r o i d e s , a n d t h e l i p i d b i n d i n g s i t e s i n t h e c o r e s u b u n i t s o f C c O a r e h i g h l y c o n s e r v e d f r o m b a c t e r i a t o m a m m a l s , e m p h a s i z i n g t h e i m p o r t a n c e o f l i p i d s i n t h e p r o t e i n s t r u c t u r e [ 3 5 ] . T h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e m e m b r a n e p r o t e i n a n d l i p i d s c a n b e e x a m i n e d f r o m t w o d i f f e r e n t p e r s p e c t i v e s ; t h e c h e m i c a l n a t u r e o f t h e i n t e r a c t i o n s , a n d t h e f u n c t i o n a l c o n s e q u e n c e o f t h e i n t e r a c t i o n s . 1 . 5 . 1 I n t e r a c t i o n s e x p e r i e n c e d b y m e m b r a n e p r o t e i n s i n a m e m b r a n e e n v i r o n m e n t T h e a s s e m b l y , f o l d i n g a n d s t a b i l i t y o f t h e h y d r o p h o b i c t r a n s m e m b r a n e p r o t e i n s a r e f u n d a m e n t a l l y d e t e r m i n e d b y t h e i n t e r a c t i o n s s u r r o u n d i n g t h e p r o t e i n s . B e s i d e s 3 1 i n t e r a c t i o n s o f t h e p o l y p e p t i d e c h a i n s w i t h t h e m s e l v e s , w a t e r , n e i g h b o r i n g l i p i d s , c o f a c t o r s , a n d w i t h t h e m e m b r a n e i n t e r f a c e ( F i g u r e 1 . 1 0 ) , t h e t h e r m o d y n a m i c a n d e l e c t r o s t a t i c p r o p e r t i e s o f t h e l i p i d b i l a y e r i t s e l f a r e i m p o r t a n t . L i k e p r o t e i n s , t h e l i p i d b i l a y e r a l s o s i t s a t a s t a t e o f m i n i m u m f r e e e n e r g y a s t h e r e s u l t o f t h e e q u i l i b r i u m o f n u m e r o u s i n t e r a c t i o n s . D i s t u r b a n c e o f t h i s e q u i l i b r i u m b y t h e i n t r o d u c t i o n o f p r o t e i n s o r o t h e r s o l u t e s , o r b y a n i s o t r o p i c m o t i o n a n d c h e m i c a l h e t e r o g e n e i t y c a n r e s u l t i n s o - c a l l e d b i l a y e r e f f e c t s ( F i g u r e 1 . 1 1 ) [ 5 6 ] . w i t h w a t e r ‘ s F i g u r e 1 . 1 0 I n t e r a c t i o n s t h a t d e t e r m i n e t h e s t r u c t u r e a n d s t a b i l i t y o f m e m b r a n e p r o t e i n s . T h e b l u e l i n e s r e p r e s e n t s c h e m a t i c a l l y t h e t o t a l t h i c k n e s s o f t h e l i p i d b i l a y e r , a n d t h e r e d l i n e s t h e c e n t r a l h y d r o c a r b o n c o r e b o u n d e d b y t h e i n t e r f a c i a l r e g i o n s . T h e p i n k m o l e c u l e i s t h e c o f a c t o r r e t i n a l i n b a c t e r i o r h o d o p s i n [ 5 6 ] . T h e l a t e r a l p r e s s u r e e x e r t e d b y t h e l i p i d b i l a y e r c a n a f f e c t t h e s t r u c t u r a l i n t e g r i t y o f m e m b r a n e p r o t e i n s . S o l u b i l i z a t i o n u s i n g d e t e r g e n t c a u s e d d e s t a b i l i z a t i o n i n g e n e r a l , d e c r e a s i n g t h e l a t e r a l p r e s s u r e a n d i n c r e a s i n g c o n f o r m a t i o n a l f r e e d o m o f t h e p r o t e i n , 3 2 w h i c h m i g h t a l s o e x p l a i n w h y m e m b r a n e p r o t e i n s a r e s o s e n s i t i v e t o t h e i r b u f f e r c o n d i t i o n s , a n d w h y i t h a s b e e n s o m u c h m o r e c h a l l e n g i n g t o o b t a i n h i g h - r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e s f r o m m e m b r a n e p r o t e i n s t h a n f r o m t h e s o l u b l e p r o t e i n s . l A i n t e r f a c e i n t e r f a c e h y d r o c a r b o n c o r e p r o b a b i l i t y c h o l i n e p h o s p h a t e g l y c e r o l . . P I S I A N P E E R Q M F C s w e a r / i ) - 3 0 - 2 0 — 1 0 0 1 0 2 0 3 0 c h a r g e d e n s i t y F i g u r e 1 . 1 1 L i q u i d c r y s t a l l o g a p h i c s t r u c t u r e o f a fl u i d l i p i d b i l a y e r a n d i t s c o m p u t e d p o l a r i t y p r o fi l e . A , s t r u c t u r e o f a G P C h o b i l a y e r ( 5 . 4 w a t e r s / l i p i d ) d e t e r m i n e d b y j o i n t r e fi n e m e n t o f x - r a y a n d n e u t r o n d i f f r a c t i o n d a t a ; B , p o l a r i t y p r o fi l e ( y e l l o w c u r v e ) o f t h e G P C h o b i l a y e r c o m p u t e d f r o m t h e a b s o l u t e v a l u e s o f a t o m i c p a r t i a l c h a r g e s [ 5 6 ] . 3 3 1 . 5 . 2 E f f e c t s o f l i p i d s o n m e m b r a n e p r o t e i n s I n m e m b r a n e s , l i p i d s d o f a r m o r e t h a n j u s t s t a t i c a l l y b u i l d t h e e n v i r o n m e n t f o r t h e o r g a n i z a t i o n a n d a c t i v i t i e s o f m e m b r a n e b o u n d p r o t e i n s a n d p r o t e i n c o m p l e x e s . L i p i d s a l s o p r o v i d e a n i n t e r a c t i v e p l a t f o r m f o r t h e m t o c o m m u n i c a t e w i t h o t h e r p r o t e i n s a n d o t h e r m o l e c u l e s , a n d a r e l i k e l y t o b e a c t i v e l y i n v o l v e d i n t h e s e p r o c e s s e s a s s u g g e s t e d b y e m e r g i n g e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e . M e m b r a n e l i p i d s g e n e r a l l y c o n t a i n a h y d r o p h i l i c h e a d g o u p a n d a l o n g h y d r o p h o b i c t a i l , b u t b o t h p a r t s h a v e b e e n i n c r e a s i n g l y f o u n d t o h a v e a v a s t d i v e r s i t y i n t e r m s o f t h e i r s p e c i fi c s t r u c t u r e s , e n a b l i n g t h e p o t e n t i a l l y d i v e r s i fi e d f u n c t i o n s o f d i f f e r e n t l i p i d s p e c i e s . R e c e n t s u c c e s s e s i n m e m b r a n e p r o t e i n X - r a y c r y s t a l l o g a p h y a t h i g h r e s o l u t i o n h a v e d i s c o v e r e d t h a t m a n y l i p i d m o l e c u l e s r e m a i n b o u n d i n t h e c r y s t a l s o f m e m b r a n e p r o t e i n s [ 2 8 , 3 4 - 3 6 ] . S u p e r i m p o s i t i o n o f t h e h i g h - r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e s o f m u l t i - s u b u n i t m e m b r a n e p r o t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e s p u r i fi e d f r o m d i f f e r e n t b a c t e r i a l a n d b o v i n e h e a r t s o u r c e s l e d t o t h e r e v e l a t i o n t h a t t h e r e a r e w e l l c o n s e r v e d s i t e s o f b o u n d l i p i d s , i n S p i t e o f t h e d i f f e r e n c e s i n t h e s o u r c e o f t h e m e m b r a n e l i p i d c o m p o s i t i o n s , a n d i n t h e p u r i fi c a t i o n a n d c r y s t a l l i z a t i o n p r o c e d u r e s [ 3 5 ] . A l t h o u g h t h e s i t e s a r e w e l l c o n s e r v e d , t h e l i p i d s a t s o m e s i t e s w e r e r e p l a c e d b y d e t e r g e n t s , r a i s i n g t h e q u e s t i o n o f l i p i d s p e c i fi c i t y r e q u i r e m e n t s f o r t h e b i n d i n g s i t e s . O n e s t r a i g h t f o r w a r d w a y t o a d d r e s s t h e s e q u e s t i o n s i s t o “ r e m o v e ” a p a r t i c u l a r t y p e o f l i p i d , a n d e x a m i n e t h e c o n s e q u e n c e s o f t h e m i s s i n g l i p i d s o n v a r i o u s a s p e c t s o f t h e s y s t e m . P r e v i o u s s t u d i e s r e m o v e d C L f r o m p u r i fi e d b o v i n e h e a r t C c O , a n d f o u n d t h a t t h e i n t e g i t y a n d a c t i v i t y o f C c O w e r e d e s t r o y e d [ 5 7 ] . S i m i l a r l y , r e v e r s i b l e i n a c t i v a t i o n r e s u l t e d w h e n t h e b o u n d C L w a s r e m o v e d u s i n g p h o s p h o l i p a s e d i g e s t i o n f r o m p u r i fi e d 3 4 c y t o c h r o m e b e ] c o m p l e x [ 5 4 ] , s u g g e s t i n g a n e s s e n t i a l r o l e o f c a r d i o l i p i n i n m a i n t a i n i n g t h e i n t e g i t y o f t h e s u p e r - m o l e c u l a r o r g a n i z a t i o n . 1 . 5 . 2 . 1 L i p i d s i n t e r a c t w i t h m e m b r a n e p r o t e i n s t o m a i n t a i n i n t e g r i t y o f b i o l o g i c a l m e m b r a n e s L i p i d s b i l a y e r s p r o v i d e t h e p h y s i c a l l y c o n t i n u o u s a n d s e a l e d c o m p a r t r n e n t a l i z a t i o n o f d i f f e r e n t c e l l u l a r o r g a n e l l e s , w h i c h i s e s s e n t i a l f o r c e l l u l a r p r o c e s s e s . T h r o u g h i n t e r a c t i o n s w i t h m e m b r a n e p r o t e i n s , l i p i d s b i l a y e r s a l s o m a n a g e t o m a i n t a i n a t i g h t l y e l e c t r o c h e m i c a l l y s e a l e d m e m b r a n e f o r m e c h a n i s m s t h a t r e q u i r e t h e g e n e r a t i o n a n d m a i n t e n a n c e o f e l e c t r o c h e m i c a l p o t e n t i a l s a c r o s s t h e m e m b r a n e , s u c h a s A T P s y n t h e s i s a n d a c t i v e t r a n s p o r t , t o o c c u r . 1 . 5 . 2 . 2 L i p i d s a s s i s t w i t h m e m b r a n e p r o t e i n i n s e r t i o n , f o l d i n g , a s s e m b l y a n d t o p o l o g y I t w a s f o u n d t h a t a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s a r e i m p o r t a n t i n d e t e r m i n i n g t h e m e m b r a n e p r o t e i n t o p o l o g y . A g e n e t i c d e fi c i e n c y i n G P E t n l i p i d s a f f e c t s t h e t o p o l o g y o f L a c Y f r o m E . c o l i . ( F i g u r e 1 . 1 2 ) [ 1 9 ] . I n t h e G P E t n - d e fi c i e n t m u t a n t , t r a n s m e m b r a n e h e l i x V I I w a s f o u n d o n t h e “ o u t ” s i d e o f t h e m e m b r a n e , c a u s i n g t h e l a c t o s e p e r r n e a s e t o m a l f u n c t i o n . T h e l i p i d m o n o g a l a c t o s y l d i a c y l g l y c e r o l ( M G c h A G , a l s o c a l l e d M G D G ) w a s f o u n d t o fi r l l y r e p l a c e G P E t n t o c r e a t e t h e c o r r e c t t o p o l o g y , w h e r e a s n e i t h e r C L n o r G P C h o c o u l d r e s t o r e t h e p r o p e r a c t i v i t y a n d t o p o l o g y o f L a c Y , a n e f f e c t t h a t t h e a u t h o r s r a t i o n a l i z e d t o o r i g i n a t e f r o m t h e n o n - b i l a y e r p r o n e s t r u c t u r a l f e a t u r e o f b o t h G P E t n a n d 3 5 M G c h A G , a n d t h e n e u t r a l c h a r g e s t a t e o f M G c h A G h e a d g r o u p t h a t w o u l d n o t d i s t u r b t h e c h a r g e b a l a n c e o f t h e m e m b r a n e s u r f a c e , a c c o r d i n g t o t h e “ p o s i t i v e i n s i d e r u l e ” [ 1 9 ] . F i g u r e 1 . 1 2 D i f f e r e n c e i n t h e t o p o l o g i c a l o r g a n i z a t i o n o f L a c Y f r o m E . c o l i c e l l s c o n t a i n i n g ( t o p ) a n d g e n e t i c a l l y l a c k i n g ( b o t t o m ) G P E t n ( P E ) [ 1 ] . 3 6 1 . 5 . 2 . 3 L i p i d s a s s i s t w i t h a s s e m b l y a n d s t a b i l i z a t i o n o f s u p e r - m o l e c u l a r c o m p l e x e s F o r t h e l i g h t - h a r v e s t i n g c o m p l e x 1 1 , i t h a s b e e n s h o w n t h a t t h e a s s e m b l y d e p e n d s o n d e fi n e d p h o s p h o l i p i d a n d g l y c o l i p i d S p e c i e s . I n b a c t e r i o r h o d o p s i n , a s i n g l e l i p i d h a s b e e n o b s e r v e d a t e v e r y c o n t a c t s i t e o f a d j a c e n t m o n o m e r s [ 1 ] . A l t h o u g h t h e h e a d g o u p w a s n o t u n e q u i v o c a l l y a s s i g l e d , t i g h t i n t e r a c t i o n s o f t h e p h o s p h a t e w i t h L y s - 4 0 w e r e p r o p o s e d b a s e d o n i t s i m p o r t a n t r o l e i n p u r p l e m e m b r a n e f o r m a t i o n . I t w a s c o n c l u d e d t h a t t h i s s p e c i fi c l i p i d a c t s a s t h e g l u e i n t r i m e r i z a t i o n o f b a c t e r i o r h o d o p s i n [ 1 ] . T h e i m p o r t a n c e o f c a r d i o l i p i n i n m i t o c h o n d r i a l s u p e r c o m p l e x f o r m a t i o n i s d i s c u s s e d b e l o w . 1 . 5 . 2 . 4 L i p i d s a f f e c t o r r e g u l a t e m e m b r a n e p r o t e i n a c t i v i t i e s H a r s h d e l i p i d a t i o n s d u r i n g p u r i fi c a t i o n w e r e f o u n d t o d e c r e a s e t h e a c t i v i t y o f C c O , w h e r e a s t h e p r e s e n c e o f s o y a s o l e c t i n c o n s i s t e n t l y e n h a n c e d t h e a c t i v i t y o f C c O i n v i t r o b y 2 0 - 4 0 % [ 2 7 ] . T h e a d d i t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d ( 2 0 : 4 ) w a s a l s o f o u n d t o p r o t e c t D 1 3 2 A , a s u i c i d e - p r o n e m u t a n t o f C c O , a g a i n s t s u i c i d a l i n a c t i v a t i o n [ 5 8 ] . 1 . 5 . 2 . 5 B i n d i n g m o t i f s o f l i p i d s i n m e m b r a n e p r o t e i n s L i p i d b i n d i n g w a s f o u n d t o b e s t a b i l i z e d b y m u l t i p l e n o n - c o v a l e n t i n t e r a c t i o n s i n v o l v i n g b o t h t h e l i p i d h e a d g o u p s a n d t h e h y d r o p h o b i c t a i l s w i t h p r o t e i n r e s i d u e s [ 1 , 5 8 ] . T h e r e c e n t l y r e s o l v e d a t o m i c s t r u c t u r e s o f m e m b r a n e p r o t e i n s w i t h t i g h t l y b o u n d l i p i d s , a s w e l l a s t h e s t r u c t u r e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s s t u d i e s , p r o v i d e d n e w i n s i g h t s i n t o p r o t e i n — l i p i d i n t e r a c t i o n s [ 1 ] . D i s t i n c t m o t i f s i n t h e a m i n o a c i d r e s i d u e s h a v e b e e n i d e n t i fi e d f o r s t a b i l i z i n g t h e i n t e r a c t i o n s w i t h t h e p h o s p h o l i p i d s h e a d g o u p s a n d s i d e c h a i n s f r o m r e s o l v e d m e m b r a n e p r o t e i n s t r u c t u r e s [ 1 ] . 3 7 B a s e d o n t h e s i t e s o f b i n d i n g , t h e r e s o l v e d t i g h t l y b o u n d l i p i d s a r e c l a s s i fi e d i n t o t h r e e g e n e r a l c a t e g o r i e s [ 1 ] : 1 ) t h e a n n u l a r s h e l l o f l i p i d s t h a t s u r r o u n d t h e m e m b r a n e p r o t e i n l i k e t h e b i l a y e r a n d a r e p r e s u m a b l y i m p o r t a n t f o r t h e p e r p e n d i c u l a r i n s e r t i o n o f t h e p r o t e i n , 2 ) t h e n o n - a n n u l a r l i p i d s t h a t fi l l i n t h e c a v i t i e s , c l e f t s o r p o r e s b e t w e e n s u b u n i t o r o l i g o m e r i c i n t e r f a c e s , a n d 3 ) t h e i n t e g a l l i p i d s t h a t b i n d i n u n u s u a l s i t e s o r o r i e n t a t i o n s a n d m i g h t p l a y r o l e s i n p r o t e i n a s s e m b l y a n d f o l d i n g [ l ] . T h e h e a d g o u p i s s t a b i l i z e d b y s t r o n g i n t e r a c t i o n s w i t h b a s i c r e s i d u e s s u c h a s a r g i n i n e a n d l y s i n e b y f o r m i n g i o n p a i r a n d h y d r o g e n b o n d s , a s w e l l a s w i t h a r o m a t i c r e s i d u e s ( T a b l e 1 . 2 ) [ 1 ] , w h e r e a s t h e r e s o l v e d l i p i d s t a i l s a r e s t a b i l i z e d b y a l a n i n e , l e u c i n e , p h e n y l a l a n i n e , i s o l e u c i n e , s e r i n e a n d h i s t i d i n e r e s i d u e s ( T a b l e 1 . 3 ) , l i k e l y t h r o u g h h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s [ 5 8 ] . 3 8 T a b l e 1 . 2 r e s o l v e d i n m e m b r a n e p r o t e i n c r y s t a l s t r u c t u r e s [ 1 ] . A m i n o a c i d r e s i d u e s t h a t b i n d t h e h e a d g o u p s o f n e g a t i v e l y c h a r g e d l i p i d s P L A A P r o t e i n C o m m e n t S p e c i e s P D B R e s . [ A ] P E K T B C l n , a n n u l a r G . g a l . l B C C 3 . 2 P E Y Q T B C l n , s a m e b i n d i n g s i t e a s G . g a l . l B C C 3 . 2 L 4 P E Y N Y Q K B C l n , a n n u l a r , L 4 S . c e r . 1 K B 9 2 . 3 P E N B C l n , d i m e r i n t e r f a c e , L 2 S . c e r . 1 K B 9 2 . 3 P E ( 4 ) R H S ; R W ; R ; K C O X n R . s p h . 1 M 5 6 2 . 3 P E ( 2 ) R ; K R C O X n B . t a u . l V 5 4 / 1 V 5 5 1 . 8 / 1 . 9 P E Y K R R C n , t h e r m o p h i l i c T . t e p . l E Y S 2 . 2 b a c t e r i a P E K K S D H n E . c o l . l N E K 2 . 6 P E ( 2 ) Q H K ; Y Q C O X p R . s p h . 1 M 5 6 2 . 3 P E ( l ) T C O X p B . t a u . 1 V 5 4 / 1 V 5 5 1 . 8 / 1 . 9 P C S B C 1 n , c a v i t y a t d i m e r S . c e r . 1 K B 9 2 . 3 i n t e r f a c e , L 1 P C R H E C O X n P . d e n . l Q L E 3 . 0 P C H C O X n B . t a u . l V 5 4 / 1 V 5 5 1 . 8 / 1 . 9 P C ( 3 ) T A C n B . t a u . l O K C 2 . 2 P C H S B C l p S . c e r . I P 8 4 2 . 5 P C R D C O X p P . d e n . l Q L E 3 . 0 P l K S T B C l p , i n t e g a l p r o t e i n S . c e r . l K B 9 2 . 3 l i p i d , L 3 P C ( 3 ) R H S ; R W C O X n B . t a u . 1 V 5 4 / 1 V 5 5 1 . 8 / 1 . 9 P C ( 3 ) R N R D ; R S P S I n S . e l o . l J B O 2 . 5 C L K , R H B C l n , c a v i t y a t d i m e r S . c e r . - 2 . 5 i n t e r f a c e , L 7 C L K Y K , Y H N B C l n , n e a r Q i s i t e ( p r o t o n S e e r . 1 K B 9 2 . 3 u p t a k e ) , L 5 C L R K Y D , H K K C O X n B . t a u . 1 V 5 4 / 1 V 5 5 1 . 8 / 1 . 9 C L H R , K W R C n R . s p h . 1 M 3 X 2 . 5 5 C L H R N , W H R C n , l i p i d i c c u b i c p h a s e R . s p h . l O G V 2 . 4 C L ( 2 ) S A C n B . t a u . l O K C 2 . 2 C L N D Y , H N C O X p B . t a u . 1 V 5 4 / 1 V 5 5 1 . 8 / 1 . 9 C L N T , N S F D H p , i n t e r f a c e o f a d j a c e n t E . c o l . l K Q F 1 . 6 m o n o m e r s D G K S B R n , i m p o r t a n t f o r t r i m e r H . h a ] . l B M l 3 . 5 f o r m a t i o n S L R K N B 6 F n , s u l f o l i p i d , c a v i t y a t C . r e i . 1 0 9 0 3 . 1 d i m e r i n t e r f a c e , s a m e p o s i t i o n a s L 1 a n d L 4 3 9 I — t h ( Z D 3 0 " L Z 3 0 K U S U K U T a b l e 1 . 3 A m i n o a c i d r e s i d u e s t h a t b i n d t h e f a t t y a c i d t a i l s o f l i p i d s r e s o l v e d i n m e m b r a n e p r o t e i n c r y s t a l s t r u c t u r e s [ 5 8 ] . K E Y : ( r ' l ’ ( ‘ l l r l - B r t t l l c l l l l i n s C o l o r c o d i n g a n d P a l m i t o y l c h a i n ( 1 ) l o c a t i o n o f G P C h o o r D M U I ) \ I l - ( I L ‘ C V I c l l z l i n . a . a . S p e c l e s C a l i . T h e r m u s M D 4 0 1 . 5 . 3 C a r d i o l i p i n a n d O X P H O S c o m p l e x e s L i p i d s , i n p a r t i c u l a r c a r d i o l i p i n w i t h i t s t w o p h o s p h a t e s a n d o n e g l y c e r o l i n t h e h e a d g r o u p a n d f o u r h y d r o p h o b i c f a t t y a c i d c h a i n s , i s f o u n d t o b e e s s e n t i a l f o r t h e a s s e m b l y o f s u p e r c o m p l e x e s f r o m 1 1 1 a n d I V [ 5 9 ] , a n d i s p r o p o s e d t o a c t a s a g l u e t o a s s i s t w i t h m a i n t a i n i n g t h e i n t e g r i t y o f t h e s e s u p e r — c o m p l e x e s ( F i g u r e 1 . 6 ) [ 4 1 ] . F i g u r e 1 . 1 3 s h o w s t h e p o s i t i o n o f c a r d i o l i p i n i n t h e s u p e r c o m p l e x o f 1 1 1 2 + 1 V 2 w i t h a t t a c h e d c y t o c h r o m e c f r o m y e a s t F i g u r e 1 . 1 3 P s e u d o - a t o m i c m o d e l o f t h e 1 1 1 2 + 1 V 2 s u p e r c o m p l e x w i t h a t t a c h e d c y t o c h r o m e c , s h o w i n g t h e i n t e r a c t i o n s o f c a r d i o l i p i n w i t h c o m p l e x e s I I I a n d I V . S a l m o n , c a r d i o l i p i n a n d G P E t n m o l e c u l e s o f t h e c o m p l e x I I I a n d s u b u n i t s C o x I ( n a v y b l u e ) , C o x I I ( g r e e n c y a n ) , C o x 1 1 1 ( h o t p i n k ) , C o x I V ( p u r p l e ) . C o x V l c ( b r o w n ) , C o x V H a ( y e l l o w o r a n g e ) , a n d C o x V I I c ( g r e e n y e l l o w ) o f t h e c o m p l e x I V , r e s p e c t i v e l y . ( A ) s i d e v i e w , ( B ) t o p v i e w , a n d ( C ) a n d ( D ) d e t a i l e d v i e w s o f t h e 1 1 1 2 + 1 V 2 s u p e r c o m p l e x [ 4 1 ] . 4 1 C a r d i o l i p i n ( C L ) i s o n e l i p i d w h o s e r e q u i r e m e n t h a s b e e n e s t a b l i s h e d b y b i o c h e m i c a l s t u d i e s o n t h e f u n c t i o n o f s e v e r a l m e m b r a n e p r o t e i n s fi ' o m b a c t e r i a l a n d m i t o c h o n d r i a l s o u r c e s [ 1 , 8 , 9 , 5 7 , 5 9 - 6 4 ] . D u e t o i t s u n i q u e s t r u c t u r e , h a v i n g f o u r r a t h e r t h a n t w o h y d r o p h o b i c f a t t y a c i d c h a i n s , c a r d i o l i p i n c a n b i n d m o r e s t r o n g l y t o m e m b r a n e p r o t e i n s a n d i s p e r c e i v e d t o a c t a s a “ s u p e r g l u e ” t o h e l p m a i n t a i n t h e i n t e g i t y o f m u l t i - p r o t e i n s u p e r - c o m p l e x e s [ 6 5 ] . D i g e s t i o n o f t i g h t l y b o u n d p h o s p h o l i p i d s i n a c t i v a t e s t h e c y t o c h r o m e b e ) c o m p l e x , w i t h o u t d i s t u r b i n g i t s s p e c t r a l p r o p e r t i e s , a n d r e a c t i v a t i o n d e p e n d s o n a d d i t i o n o f c a r d i o l i p i n [ 5 4 ] . T w o c a r d i o l i p i n m o l e c u l e s h a v e b e e n i d e n t i fi e d i n t h e s t r u c t u r e o f t h e y e a s t c y t o c h r o m e b e ; c o m p l e x [ 1 , 5 2 ] . O n e c a r d i o l i p i n i s b o u n d c l o s e t o t h e s i t e o f u b i q u i n o n e r e d u c t i o n a n d i s p r o p o s e d t o b e o f i m p o r t a n c e f o r t h e s t a b i l i t y o f t h e c a t a l y t i c s i t e a n d t o b e i n v o l v e d i n p r o t o n u p t a k e [ 5 2 ] . 1 . 5 . 4 C a r d i o l i p i n a n d C c O C a r d i o l i p i n h a s a l s o b e e n f o u n d t o b e S p e c i fi c a l l y e s s e n t i a l f o r t h e f u l l a c t i v i t y o f m a m m a l i a n h e a r t C c O [ 5 7 ] . H o w e v e r , t h e m o l e c u l a r b a s i s o f i t s f u n c t i o n i n C c O i s n o t u n d e r s t o o d . A l t h o u g h c a r d i o l i p i n s a r e i n v o l v e d i n t h e r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s [ 8 , 2 8 , 5 9 , 6 5 , 6 6 ] , p a r t i c u l a r l y C c O , i n b o t h b a c t e r i a l a n d e u k a r y o t i c s y s t e m s , t h e l a s t s t e p o f c a r d i o l i p i n b i o s y n t h e s i s f r o m G P G r o , a n d t h e f o l l o w i n g r e m o d e l i n g r e a c t i o n s , a r e t o t a l l y d i f f e r e n t b e t w e e n t h e s y s t e m s , a n d t h e fi n a l c o m p o s i t i o n o f c a r d i o l i p i n m o l e c u l a r s p e c i e s a r e a l s o v e r y d i f f e r e n t . T h e r e f o r e i t i s c o n c e i v a b l e t h a t t h e m e c h a n i s m t h r o u g h 4 2 w h i c h c a r d i o l i p i n e x e r t s i t s f u n c t i o n a l r o l e s m i g h t b e d i f f e r e n t a s w e l l , b e t w e e n t h e b a c t e r i a l a n d m a m m a l i a n s y s t e m s . I n m a m m a l i a n c e l l s , c a r d i o l i p i n c a n g e t p e r o x i d i z e d a t i t s d o u b l e b o n d s a n d f o r m a c o m p l e x w i t h c y t o c h r o m e c , w h i c h t h e n t r i g g e r s t h e r e l e a s e o f c y t o c h r o m e c f r o m m i t o c h o n d r i a u n d e r s t r e s s s t i m u l i , a n d l e a d s t o c e l l a p o p t o s i s [ 8 , 9 , 6 7 ] . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n o f t h e c a r d i o l i p i n m o l e c u l a r s p e c i e s r e v e a l e d t h a t h e a l t h y m a m m a l i a n s y s t e m s m a i n l y c o n t a i n c a r d i o l i p i n w i t h u n s a t u r a t e d 1 8 : 2 c h a i n s , p a r t i c u l a r l y C L ( l 8 : 2 ) 4 ( L a - C L ) [ 8 , 9 , 2 1 , 6 8 - 7 0 ] . A l t h o u g h C L c o n t a i n i n g 1 8 : 1 a n d 1 6 : 0 a r e a l s o f o u n d a t m u c h l o w e r a b u n d a n c e s , a t l e a s t s o m e o f t h e c r i t i c a l r o l e s o f c a r d i o l i p i n s e e m t o i n v o l v e t h e u n s a t u r a t e d C L ( 1 8 : 2 ) 4 s p e c i e s w h i c h h a s t h e p o t e n t i a l f o r o x i d a t i o n o f i t s d o u b l e b o n d s . D e c r e a s e d fi a c t i o n o f C L ( l 8 : 2 ) 4 l e a d s t o d e c r e a s e d a c t i v i t y o f C c O d o w n t o 5 0 % [ 6 8 ] , a n d c a u s e s m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n [ 6 9 ] . W h e n a d d i n g b a c k c a r d i o l i p i n s , C L ( 1 8 : 2 ) 4 i s m o r e e f f e c t i v e i n s t i m u l a t i n g C c O t h a n o t h e r c a r d i o l i p i n s p e c i e s . H o w e v e r , C L ( l 8 : 2 ) 4 i s n o t p r o d u c e d d i r e c t l y f r o m t h e b i o s y n t h e s i s o f l i p i d s i n m a m m a l i a n c e l l s , b u t i t i s f o r m e d t h r o u g h m o d i fi c a t i o n b y a c y l t r a n s f e r a s e s o n t h e i n i t i a l c a r d i o l i p i n s p e c i e s [ 9 ] . O n t h e o t h e r h a n d , m u t a t i o n s i n t h e a s s e m b l y , b u t n o t i n t h e c a t a l y t i c f u n c t i o n s o f C c O , w e r e f o u n d t o d e c r e a s e t h e b i o s y n t h e s i s o f c a r d i o l i p i n d o w n t o 5 0 % t o 6 0 % , w h e r e a s m u t a t i o n s i n c o m p l e x I I I o r c o m p l e x V d i d n o t d i s p l a y s u c h e f f e c t s o n c a r d i o l i p i n s y n t h e s i s [ 6 9 ] . I n m a r k e d c o n t r a s t , t h e b a c t e r i u m R . s p h a e r o i d e s m a k e s m a i n l y C L ( 1 8 : 1 ) 4 ( C h a p t e r s 7 , 9 a n d 1 0 ) . N o d e t e c t a b l e l e v e l s o f C L ( 1 8 : 2 ) 4 a r e s e e n e v e n w h e n t h e y a r e 4 3 g o w n u n d e r a e r o b i c c o n d i t i o n s a n d s u r v i v e v i a t h e r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s ( C h a p t e r s 7 , 9 a n d 1 0 ) . L i k e w i s e , y e a s t s p r e d o m i n a n t l y p r o d u c e c a r d i o l i p i n c o n t a i n i n g 1 8 : 1 a n d 1 6 : 1 f a t t y a c y l c h a i n s b u t n o t 1 8 : 2 [ 2 0 ] . S e v e r a l s t u d i e s u s i n g g e n e t i c m u t a g e n e s i s i n b a c t e r i a l a n d y e a s t s y s t e m s f o u n d t h a t t h e d e fi c i e n c y i n c a r d i o l i p i n d i d n o t s i g r i fi c a n t l y a f f e c t t h e a c t i v i t y o f C c O , n o r d i d i t a l o n e c a u s e t h e d y s fi r n c t i o n o f t h e m i t o c h o n d r i a i n y e a s t [ 7 1 ] , b u t t h e d o u b l e d e fi c i e n c y i n G P G r o a n d C L r e s u l t e d i n v e r y l i t t l e C c O p r o d u c t i o n a n d s e v e r e l y d y s f u n c t i o n a l m i t o c h o n d r i a , s u g g e s t i n g C L i s n o t e s s e n t i a l f o r C c O o r m i t o c h o n d r i a i n y e a s t , b u t i s f u n c t i o n a l l y r e p l a c e a b l e b y G P G r o l i p i d s [ 7 1 ] . 1 . 6 M e m b r a n e p r o t e i n p u r i fi c a t i o n a n d c r y s t a l l i z a t i o n S i n c e s t r u c t u r a l s t a b i l i t y i s a c r u c i a l f a c t o r f o r m e m b r a n e p r o t e i n c r y s t a l l i z a t i o n , r e t e n t i o n o f l i p i d m o l e c u l e s d u r i n g t h e p u r i fi c a t i o n s t e p s h a s b e e n e m p h a s i z e d f o r s u c c e s s f u l p r o t e i n c r y s t a l l i z a t i o n [ 3 5 , 7 2 ] . S u p p o r t i n g e v i d e n c e f o r t h e r o l e o f l i p i d s i n t h e c r y s t a l l i z a t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s i n c l u d e s t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e q u a l i t y o f E . c o l i l a c t o s e p e r r n e a s e c r y s t a l s c a n b e c o n t r o l l e d b y c h a n g i n g t h e p h o s p h o l i p i d l e v e l s [ 1 ] . A s i m i l a r o b s e r v a t i o n w a s m a d e r e g a r d i n g t h e c r y s t a l l i z a t i o n b e h a v i o r o f t h e c y t o c h r o m e b d f c o m p l e x , i n w h i c h a d d i t i o n o f l i p i d s i m p r o v e d t h e c r y s t a l l i z a b i l i t y o f t h e p r o t e i n [ 7 3 , 7 4 ] . S u c h e f f o r t s t o o b t a i n h i g h r e s o l u t i o n s t r u c t u r e s o f m e m b r a n e p r o t e i n s h a v e l e d t o t h e n e e d f o r c l o s e r s c r u t i n y o f t h e r o l e o f p r o t e i n - a s s o c i a t e d l i p i d m o l e c u l e s . 4 4 1 . 6 . 1 U s a g e o f d e t e r g e n t D e t e r g e n t s a r e n e e d e d i n t h e p u r i fi c a t i o n o f m o s t m e m b r a n e p r o t e i n s t o f o r m a m i c e l l e a r o u n d t h e p r o t e i n a n d p u l l i t o u t o f t h e l i p i d b i l a y e r m e m b r a n e i n t o t h e s o l u t i o n [ 6 , 7 5 , 7 6 ] ( F i g u r e 1 . 1 4 ) . M e m b r a n e p r o t e i n s s o m e t i m e s c a n a l s o b e i s o l a t e d u t i l i z i n g t h e i r e x i s t i n g l i p i d s a n d l y s o l i p i d s . T h i s m e c h a n i s m w a s a d o p t e d b y u s i n g c o b r a p h o s p h o l i p a s e A 2 t o c l e a v e t h e s n - 2 f a t t y a c i d c h a i n f r o m p h o s p h o l i p i d s a n d t u r n t h e m i n t o l y s o p h o s p h o l i p i d s , w h i c h t h e n a c t a s d e t e r g e n t s t o d i s s o l v e t h e m e m b r a n e s [ 2 4 ] . I n t h e p u r i fi c a t i o n o f b o v i n e h e a r t C c O , t h e m e m b r a n e s a r e d i s r u p t e d w i t h c h o l a t e [ 2 8 , 2 9 ] , a s t e r o i d d e t e r g e n t t h a t t e n d s t o i n i t i a l l y c r e a t e m e m b r a n e p a t c h e s . I n t h e p u r i fi c a t i o n o f C c O f r o m c y t o p l a s m i c m e m b r a n e s o f b a c t e r i a , d e t e r g e n t s a r e u s e d t h r o u g h o u t t h e p r o c e s s t o s o l u b i l i z e t h e m e m b r a n e p e l l e t s , t o k e e p t h e p r o t e i n f r o m d e f o r m a t i o n o r a g g r e g a t i o n , a n d t o k e e p i t i n t h e a c t i v e f o r m [ 3 5 , 7 5 , 7 7 ] . i r r i t - r “ P “ i , 1 , fi v , , . , , , l 5 , ] M e m b r a n e ‘ r r i r r R E I T } D e t e r g e n t M i c e l l e i t ! 1 ’ ; k g - ” - 4 l \ « a F i g u r e 1 . 1 4 S c h e m a t i c o f t h e i s o l a t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s f r o m m e m b r a n e s u s i n g d e t e r g e n t d o d e c y l m a l t o s i d e s ( a d a p t e d f r o m w w w . s c i e n c e . u o t t a w a . c a ) . 4 5 T h e e f f e c t s o f t h e d e t e r g e n t c l o s e l y d e p e n d o n t h e i r s t r u c t u r a l a n d p h y s i c a l p r o p e r t i e s a n d d i f f e r s i g r i fi c a n t l y b e t w e e n d e t e r g e n t s [ 6 , 7 8 , 7 9 ] . C o m p a r e d t o l i p i d s , d e t e r g e n t s h a v e m o l e c u l a r s h a p e s t h a t t e n d t o f o r m m i c e l l e s r a t h e r t h a n b i l a y e r s . T h e m o s t c o m m o n l y u s e d t y p e s o f d e t e r g e n t s h a v e r e l a t i v e l y s m a l l t a i l s ( 1 2 c a r b o n s o r l e s s ) a n d a l a r g e h e a d g o u p s o t h a t t h e y c a n f o r m m i c e l l e s w i t h t h e h e a d g o u p s p o i n t i n g o u t i n t o t h e a q u e o u s s o l u t i o n [ 6 ] . T h e c h a r g e s t a t e , p o t e n t i a l h y d r o g e n b o n d i n g s i t e s , h e a d g o u p s i z e , c h a i n l e n g t h a n d t h e m o l e c u l a r s h a p e a r e c r i t i c a l f a c t o r s t h a t d e t e r m i n e t h e a b i l i t y o f d e t e r g e n t s t o f o r m m i c e l l e s ( c r i t i c a l m i c e l l e c o n c e n t r a t i o n , C M C ) a n d t h e a g g e g a t i o n n u m b e r i n t h e m i c e l l e , w h i c h c a n t r a n s l a t e i n t o t h e o v e r a l l p o w e r t o r e m o v e p r o t e i n s f r o m t h e m e m b r a n e . T h e s o l u b i l i z a t i o n o f t h e p r o t e i n f r o m t h e m e m b r a n e s t a r t s t o o c c u r w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e d e t e r g e n t a p p r o a c h e s 1 C M C [ 8 0 ] . T h e d e t e r g e n t s a r e e v a l u a t e d b y t h e i r a b i l i t i e s t o a s s i s t w i t h t h e s o l u b i l i z a t i o n , m a i n t a i n i n g a c t i v i t y ( n o n - i n a c t i v a t i n g ) , a n d c r y s t a l l i z a t i o n o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n s [ 3 0 , 7 5 ] . W h i l e i o n i c d e t e r g e n t s , s u c h a s s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( S D S ) , u s u a l l y s o l u b i l i z e t h e m e m b r a n e e f fi c i e n t l y , t h e y a l m o s t a l w a y s d e s t a b i l i z e m e m b r a n e p r o t e i n s , c a u s i n g p r e c i p i t a t i o n a n d s i g l i fi c a n t i n a c t i v a t i o n . Z w i t t e r i o n i c d e t e r g e n t s o f t e n c a u s e i n a c t i v a t i o n a s w e l l , a n d t h e i r c h a r g e s t a t e s a r e s e n s i t i v e t o t h e p H . N o n - i o n i c d e t e r g e n t s s u c h a s m a l t o s i d e s a r e g e n e r a l l y c h a r a c t e r i z e d a s m i l d e r a n d c a u s e l e s s d i s r u p t i o n t o t h e p r o t e i n s ’ s t r u c t u r e s a n d a c t i v i t i e s [ 7 5 ] . S t e r o i d - b a s e d d e t e r g e n t s s u c h a s c h o l i c a c i d a n d d e o x y c h o l i c a c i d ( b i l e a c i d s ) . h a v e h i g h C M C v a l u e s a n d l o w a n d i o n i c - s t r e n g t h - d e p e n d e n t a g g e g a t i o n n u m b e r s , m a k i n g t h e m e a s i e r t o r e m o v e f o r r e c o n s t i t u t i o n . T h e y 4 o a r e m i l d a n d o f t e n l e a d t o l e s s i n a c t i v a t i o n , b u t h a v e b e e n f o u n d n o t h e l p f u l i n c r y s t a l l i z a t i o n [ 8 0 ] . T h e c h a i n l e n g t h o f t h e d e t e r g e n t c a u s e s d i f f e r e n c e s i n t h e p r o t e i n a c t i v i t y a n d s t a b i l i t y , e v e n w i t h t h e s a m e h e a d g o u p [ 7 5 , 7 9 ] . T h e c h a i n l e n g t h t h a t c a n b e s t m i m i c t h e m e m b r a n e l a y e r t h i c k n e s s s e e m s t o m a i n t a i n t h e h i g h e s t a c t i v i t y o f t h e p r o t e i n . S h o r t e r c h a i n s ( C 7 - C 1 0 ) c a u s e m o r e i n a c t i v a t i o n o f t h e p r o t e i n s t h a n l o n g e r c h a i n s ( C 1 2 - C 1 4 ) [ 7 5 , 8 0 ] . A l t h o u g h d e c y l m a l t o s i d e s ( C 1 0 ) l e a d s t o l o w e r p r o t e i n a c t i v i t y a n d s t a b i l i t y [ 7 5 ] , e x c h a n g i n g i n t o i t f r o m d o d e c y l m a l t o s i d e s ( C 1 2 ) , t h e d e t e r g e n t t h a t c a n m a i n t a i n t h e h i g h e s t a c t i v i t y o f C c O [ 7 5 ] , w a s f o u n d t o p r o d u c e C c O p r o t e i n c r y s t a l s w i t h h i g h e r r e s o l u t i o n [ 3 0 ] . I n g e n e r a l , t h e n o n - i o n i c d e t e r g e n t d o d e c y l m a l t o s i d e h a s b e e n f o u n d t o b e a p p l i c a b l e t o m o s t m e m b r a n e p r o t e i n s , n o t o n l y i n e f fi c i e n t s o l u b i l i z a t i o n a n d m a i n t a i n i n g a c t i v i t y , b u t a l s o i n c r y s t a l l i z a t i o n [ 6 , 3 0 , 7 5 , 8 0 ] . 1 . 6 . 2 C u b i c p h a s e t e c h n i q u e : m a k i n g l i p i d s t h e m e d i u m T o m a i n t a i n t h e l a t e r a l p r e s s u r e e x e r t e d b y l i p i d b i l a y e r s , m i n i m i z i n g b o t h t h e d i s t u r b a n c e a n d d i s o r d e r i n g o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n , t h e c u b i c p h a s e c r y s t a l l i z a t i o n m e t h o d w a s r e c e n t l y d e v e l o p e d t o c r y s t a l l i z e m e m b r a n e p r o t e i n s i n a l i p i d e n v i r o n m e n t [ 7 2 , 8 1 - 8 3 ] . I n t h i s m e t h o d , a b i c o n t i n u o u s m e m b r a n e f o r m e d b y m i x i n g l i p i d s a n d w a t e r i s u s e d a s a s u p p o r t m a t r i x f o r n u c l e a t i o n a n d c r y s t a l g o w t h . T h i s m e t h o d h a s b e e n p a r t i c u l a r l y s u c c e s s f u l w i t h a c l a s s o f m e m b r a n e p r o t e i n s w i t h s e v e n r o b u s t t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s i n c l u d i n g b a c t e r i o r h o d o p s i n , h a l o r h o d o p s i n , a n d s e n s o r y r h o d o p s i n I I [ 7 2 , 8 1 - 8 3 ] . 4 7 1 . 6 . 3 O p t i m i z a t i o n o f c r y s t a l l i z a t i o n u s i n g m a s s s p e c t r o m e t r y a s a t o o l M a s s s p e c t r o m e t r y h a s e m e r g e d a s a u s e f u l t o o l i n a s s i s t i n g w i t h t h e o p t i m i z a t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n c r y s t a l l i z a t i o n [ 8 4 ] . D i r e c t e d b y t h e m a s s s p e c t r o m e t r y d e t e c t i o n o f t h e h e t e r o g e n e o u s f o r m s o f t h e s u b u n i t s a n d t h e d e g a d a t i o n o f t h e p r o t e i n o v e r t i m e , m o l e c u l a r b i o l o g y m e t h o d s c a n b e a p p l i e d t o e n g i n e e r m o r e s t a b l e a n d h o m o g e n e o u s f o r m s o f p r o t e i n t h a t c o u l d p r o d u c e c r y s t a l s t h a t d i f f r a c t a t h i g h e r r e s o l u t i o n . M a s s S p e c t r o m e t r y h a s a l s o b e e n a p p l i e d t o i d e n t i f y t h e c o m p o n e n t s i n t h e p r o t e i n c r y s t a l s t h a t c o u l d n o t b e c o m p l e t e l y r e s o l v e d b y t h e c r y s t a l l o g a p h y d u e t o l i m i t e d r e s o l u t i o n [ 8 4 ] , s u c h a s t h e m o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f t h e l i p i d s a n d d e t e r g e n t s i n t h e m e m b r a n e p r o t e i n C c O c r y s t a l s [ 2 8 ] ( e a r l i e r fi n d i n g s p r e s e n t e d i n [ 3 0 ] ) . T h e e x t e n s i v e u s a g e o f d e t e r g e n t s i n m e m b r a n e p r o t e i n p u r i fi c a t i o n , h o w e v e r , o f t e n p o s e s a s a c h a l l e n g e i n m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s [ 8 5 ] , p a r t i c u l a r l y i n t h e l i p i d a n a l y s i s b y E S I t h r o u g h i n t e r f e r i n g w i t h t h e i o n i z a t i o n p r o c e s s , a n d h a s t o b e a d d r e s s e d b y u s i n g v a r i o u s a p p r o a c h e s ( C h a p t e r 8 ) . 1 . 7 S t r a t e g i e s u s e d t o i n v e s t i g a t e m e m b r a n e p r o t e i n - l i p i d i n t e r a c t i o n s 1 . 7 . 1 B i o c h e m i c a l e x t r a c t i o n a n d p h o s p h o l i p a s e d i g e s t i o n P r e v i o u s s t u d i e s r e m o v e d C L f r o m p u r i fi e d b o v i n e h e a r t C c O w i t h d e t e r g e n t , a n d i t w a s f o u n d t h a t t h e i n t e g i t y a n d a c t i v i t y o f C c O w a s d e s t r o y e d [ 5 4 , 5 7 ] . S i m i l a r l y , r e v e r s i b l e i n a c t i v a t i o n r e s u l t e d w h e n t h e b o u n d C L w a s r e m o v e d u s i n g p h o s p h o l i p a s e d i g e s t i o n f r o m t h e p u r i fi e d c y t o c h r o m e b e ; c o m p l e x [ 5 4 ] . T h e s e t y p e s o f i n v i t r o b i o c h e m i c a l a p p r o a c h e s c o u l d p o t e n t i a l l y d i s t u r b t h e e n z y m e s t r u c t u r e a n d d o n o t a d d r e s s t h e p o s s i b l e a d a p t a b i l i t y o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n s w i t h t h e i r l i p i d c o m p o n e n t s . 4 8 1 . 7 . 2 S p i n - l a b e l i n g c o m b i n e d w i t h E P R E P R c o u p l e d w i t h s p i n - l a b e l i n g h a s b e e n a p p l i e d t o m o n i t o r t h e c h a n g e i n t h e m e t a l s a t t h e i n fl u e n c e o f t h e s u r r o u n d i n g l i g a n d s a s a r e s u l t o f t h e c h a n g e s i n l i p i d s c o m p o n e n t s o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n s [ 8 6 , 8 7 ] . I t i s a l s o c o m b i n e d w i t h l H - N M R t o m o n i t o t h e d y n a m i c s o f t h e p r o t e i n c h a n g e a s a r e s u l t o f t h e a l t e r e d l i p i d s [ 8 6 , 8 7 ] . 1 . 7 . 3 3 1 P - N M R o f l i p i d s t o m o n i t o r t h e l i p i d e x c h a n g e S i n c e t h e p h o s p h o r u s a t o m s f r o m d i f f e r e n t t y p e s o f p h o s p h o l i p i d s h a v e d i s t i n c t i v e p o s i t i o n s o f c h e m i c a l s h i f t i n 3 1 P - N M R a n d t h e N M R m e t h o d s c a n b e q u a n t i t a t i v e , 3 1 P - N M R c a n b e a p p l i e d t o m o n i t o r t h e c h a n g e i n t h e q u a n t i t y o f p h o s p h o l i p i d s [ 8 8 , 8 9 ] . 1 . 8 L i p i d p r o fi l e m o d i f i c a t i o n a s t h e t o o l t o p r o b e p r o t e i n - l i p i d i n t e r a c t i o n s i n v i v o 1 . 8 . 1 G e n e t i c m a n i p u l a t i o n o f l i p i d c o n t e n t a s t h e p r o b e i n v i v o T h e d e v e l o p m e n t o f s t r a i n s o f m i c r o o r g a n i s m s i n w h i c h m e m b r a n e l i p i d c o m p o s i t i o n c a n b e g e n e t i c a l l y m a n i p u l a t e d i n v i a b l e c e l l s h a s p r o v i d e d a s e t o f r e a g e n t s t o p r o b e l i p i d f u n c t i o n s . T h e s e m u t a n t s h a v e u n c o v e r e d p r e v i o u s l y u n r e c o g n i z e d r o l e s f o r l i p i d s a n d p r o v i d e d i n v i v o v e r i fi c a t i o n f o r p u t a t i v e f u n c t i o n s d e s c r i b e d i n v i t r o [ 1 9 ] . S p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s o f y e a s t a n d b a c t e r i a h a v e b e e n c r e a t e d b y m u t a t i n g t h e l i p i d s y n t h a s e g e n e s t o p r o b e t h e e f f e c t s o f t h e p a r t i c u l a r t y p e o f l i p i d s o n 4 9 t h e a c t i v i t i e s o f y e a s t m i t o c h o n d r i a , a n d t h e r e s p i r a t o r y c o m p l e x e s , i n c l u d i n g d i s c u s s i o n s o n c y t o c h r o m e c o x i d a s e [ 5 9 , 6 9 , 7 1 ] . S e v e r a l S p e c i fi c l i p i d d e fi c i e n t s t r a i n s o f R . s p h a e r o i d e s h a v e a l s o b e e n d e v e l o p e d t o e x a m i n e t h e e f f e c t o f t h e p a r t i c u l a r l i p i d o n t h e o v e r a l l b a c t e r i a l v i a b i l i t y , g o w t h a n d b e h a v i o r . T h e m u t a n t G P C h o - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s s t r a i n C H B Z O ( s e l e c t e d f r o m c h e m i c a l l y - i n d u c e d m u t a n t f o r m s ) , c o n t a i n i n g n o m e a s u r a b l e G P C h o b e y o n d t h e b a c k g o u n d l e v e l , a n d a c c u m u l a t i n g t h e p r e c u r s o r G P E t n , w a s f o u n d t o b e h a v e S i m i l a r l y t o t h e w i l d t y p e s t r a i n 2 . 4 . 1 u n d e r n o r m a l g o w t h c o n d i t i o n s , i n s p i t e o f t h e S i g r i fi c a n t l y a l t e r e d m e m b r a n e l i p i d p r o p e r t i e s [ 9 0 ] . T h e m u t a n t S Q D G - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s s t r a i n S B l K l a l s o g e w n o r m a l l y l i k e t h e w i l d t y p e 2 . 4 . 1 , b u t w h e n b o t h S Q D G a n d G P G r o a r e d e fi c i e n t , t h e c e l l s c o u l d n o t s u r v i v e [ 1 4 ] . S p e c i fi c l i p i d “ r e m o v a l ” v i a g e n e t i c m a n i p u l a t i o n p r o v i d e s a m o r e n a t u r a l c o n t e x t t o o b s e r v e t h e c o n s e q u e n c e s o f l i p i d s u b s t i t u t i o n s t o t h e s y s t e m , b y a l l o w i n g t h e m e m b r a n e p r o t e i n s t o d e v e l o p a n d a d a p t t o t h e a l t e r e d l i p i d e n v i r o n m e n t f r o m t h e b e g i n n i n g . I n t h i s t h e s i s , t h r o u g h g e n e t i c m a n i p u l a t i o n o f t h e l i p i d c o m p o s i t i o n o f R . s p h a e r o i d e s , t h e a n a l y s i s o f a v a r i e t y o f s t r a i n s t h a t a r e e a c h i n t r i n s i c a l l y d e fi c i e n t i n a S p e c i fi c t y p e o f l i p i d w a s r e p o r t e d ( s e e T a b l e 3 . 1 i n C h a p t e r 3 f o r d e t a i l e d d e s c r i p t i o n s o f t h e s t r a i n s ) . T h e s e s t r a i n s p r o v i d e d a t o o l t o p r o b e t h e f u n c t i o n o f e a c h t y p e o f l i p i d i n t h e o v e r a l l b a c t e r i a l c e l l u l a r p r o c e s s e s a n d t h e e f f e c t s o n t h e s p e c i fi c m e m b r a n e p r o t e i n R . s p h a e r o i d e s C c O , i n v i v o a n d i n t h e p u r i fi e d s t a t e . 1 . 8 . 2 P h o s p h a t e l i n r i t i n g g r o w t h m e d i a 5 0 T h e l i p i d c o m p o s i t i o n o f b a c t e r i a a n d y e a s t w a s f o u n d t o r e s p o n d t o t h e g o w t h m e d i a b y d e v e l o p i n g c e r t a i n m e c h a n i s m s t o a d a p t t o t h e n u t r i t i o n s o u r c e s [ 1 1 , 1 2 , 9 1 - 9 3 ] . P h o s p h a t e - l i m i t i n g m e d i a g o w t h h a s b e e n p e r f o r m e d o n R . s p h a e r o i d e s a n d o t h e r p h o t o s y n t h e t i c b a c t e r i a [ 1 1 , 9 3 ] . M a n i p u l a t i o n o f t h e l i p i d p r o fi l e , v i a t h e m e t a b o l i c a p p r o a c h , p r o v i d e d a n o t h e r t o o l t o p r o b e t h e f u n c t i o n s o f t h e l i p i d s a n d t h e i r f u n c t i o n a l s u b s t i t u t i o n i n v i v o . 1 . 8 . 3 G r o w t h t e m p e r a t u r e s t r e s s D e v i a t i o n f r o m t h e c o m f o r t a b l e g o w t h t e m p e r a t u r e f o r b a c t e r i a h a s b e e n f o u n d t o c a u s e a c h a n g e i n t h e l i p i d c o m p o s i t i o n , i n b o t h t y p e s o f l i p i d s a n d t h e l i p i d f a t t y a c i d c h a i n c o m p o s i t i o n s [ 9 4 - 9 6 ] . T h e r e f o r e i t c a n b e u s e d a s a n o t h e r m e t a b o l i c t o o l t o m o d u l a t e t h e l i p i d p r o fi l e . F o r i n s t a n c e , h i g h e r g o w t h t e m p e r a t u r e s i n d u c e d a n i n c r e a s e i n o r n i t h i n e l i p i d a n d l i p i d s c o n t a i n i n g 2 - O H f a t t y a c i d c h a i n s [ 9 5 ] . O n t h e o t h e r h a n d , t h e i n c r e a s e o f g o w t h t e m p e r a t u r e c a n a l s o b e i n t r o d u c e d a s a s o u r c e o f s t r e s s , t o p r o b e t h e s t a b i l i t y o f t h e p r o t e i n c o m p l e x e s a n d t h e s u p e r - c o m p l e x o r g a n i z a t i o n s u n d e r a s t r e s s e d c o n d i t i o n . 1 . 8 . 4 S a l t c o n c e n t r a t i o n ( o s m o t i c p r e s s u r e ) s t r e s s I n c r e a s e i n s a l t c o n c e n t r a t i o n s i n t h e g o w t h m e d i a w a s a l s o f o u n d t o e n h a n c e t h e p r o d u c t i o n o f c a r d i o l i p i n , a s a m e c h a n i s m t o c o p e w i t h t h e h i g h o s m o t i c p r e s s u r e s t r e s s , a n d s u c h a h i g h s a l t s t r e s s - i n d u c e d i n c r e a s e i n c a r d i o l i p i n h a s b e e n u s e d t o p r o b e i t s fi r n c t i o n s [ 9 7 , 9 8 ] . 5 1 1 . 9 S u m m a r y M e m b r a n e p r o t e i n s p l a y i m p o r t a n t r o l e s i n m a n y p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s a n d a r e o f t e n k e y t a r g e t s f o r p h a r m a c o l o g i c a l i n t e r v e n t i o n . H o w e v e r , m e m b r a n e p r o t e i n s h a v e b e e n f o u n d d i f fi c u l t t o s t u d y , b o t h s t r u c t u r a l l y a n d f u n c t i o n a l l y . T h i s t h e s i s r e p o r t s a d v a n c e s i n t h e a n a l y s i s o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n C c O , u s i n g m a s s s p e c t r o m e t r y a p p r o a c h e s a n d g e n e t i c m a n i p u l a t i o n o f l i p i d c o n t e n t t o b e t t e r d e fi n e t h e r e q u i r e m e n t a n d s p e c i fi c i t y o f l i p i d i n t e r a c t i o n s . 5 2 C h : 4 C h a p t e r 2 A n O v e r v i e w o f M a s s S p e c t r o m e t r y S t r a t e g i e s E m p l o y e d f o r L i p i d A n a l y s i s 2 . 1 M a s s S p e c t r o m e t r y : t h e e n a b l i n g t o o l f o r l i p i d o m i c s A c c u r a t e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e e n o r m o u s l y d i v e r s i fi e d s t r u c t u r e s o f l i p i d s a n d f u r t h e r q u a n t i fi c a t i o n o f e a c h l i p i d m o l e c u l a r s p e c i e s , o v e r a w i d e r a n g e o f a b u n d a n c e , h a s r e m a i n e d a c h a l l e n g e u n t i l m a s s s p e c t r o m e t r y ( M S ) , w i t h i t s h i g h s e n s i t i v i t y a n d m u l t i s t a g e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y c a p a b i l i t y , b e c a m e a v a i l a b l e . A l o t o f o u r c u r r e n t k n o w l e d g e a b o u t t h e l i p i d c o m p o s i t i o n o f v a r i o u s b a c t e r i a h a s b e e n a c h i e v e d o v e r t h e p a s t d e c a d e s , w h e n t h e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e t y p e o f l i p i d s u s e d t o r e l y m a i n l y o n t h e s e l e c t i v e s p r a y o f t h e t h i n - l a y e r - c h r o m a t o g a p h y ( T L C ) p l a t e w i t h r e a g e n t s t h a t s e l e c t i v e l y r e a c t w i t h S p e c i fi c f u n c t i o n a l g o u p s , a n d t h e q u a n t i fi c a t i o n o f e a c h o f t h e l i p i d s r e l i e d o n r a d i o a c t i v e l a b e l i n g f o l l o w e d b y T L C s e p a r a t i o n , o r p h o s p h o r u s a n a l y s i s f o r t h e q u a n t i fi c a t i o n o f p h o s p h o l i p i d s [ 1 1 , 1 4 , 9 0 ] . M o r e d e t a i l s o f t h e l i p i d s t r u c t u r e w o u l d b e d e r i v e d f r o m g a s c h r o m a t o g a p h y - m a s s S p e c t r o m e t r y ( G C - M S ) a n a l y s i s f o l l o w i n g s a p o n i fi c a t i o n o f t h e r e - e x t r a c t e d l i p i d b a n d s s c r a p e d f r o m a T L C p l a t e , o r n u c l e a r m a g r e t i c r e s o n a n c e ( N M R ) a n a l y s i s o f p u r i fi e d l i p i d [ 1 1 , 1 4 , 9 0 , 9 9 ] . E l e c t r o n i m p a c t i o n i z a t i o n , fi e l d d e s o r p t i o n , p l a s m a d e s o r p t i o n , c h e m i c a l i o n i z a t i o n h a d b e e n u s e d t o a t t e m p t t h e a n a l y s i s o f l i p i d s [ 1 0 0 , 1 0 1 ] . F a s t a t o m b o m b a r d m e n t ( F A B ) - c o l l i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ( C I D ) t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ( M S / M S ) w a s l a t e r u s e d t o 5 3 c o n fi r m t h e l i p i d s t r u c t u r e s [ 1 1 , 1 0 2 - 1 0 9 ] . W i t h t h e r e c e n t a d v e n t o f m o d e r n t e c h n i q u e s i n m a s s S p e c t r o m e t r y , s u c h a s t h e “ s o f t ” m a t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n ( M A L D I ) , e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ( E S I ) a n d d e s o r p t i o n e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ( D E S I ) i o n i z a t i o n m e t h o d s , c o u p l e d w i t h l o w - e n e r g y C I D d i s s o c i a t i o n m e t h o d s , a n d i n c r e a s i n g l y m o r e v e r s a t i l e a n d s e n s i t i v e m a s s a n a l y z e r s i n c l u d i n g t h e q u a d r u p o l e i o n t r a p , t r i p l e q u a d r u p o l e , t i m e o f fl i g h t ( T O F ) , F o u r i e r t r a n s f o r m - i o n c y c l o t r o n r e s o n a n c e ( F T - I C R ) a n d O r b i - t r a p , s t r a t e g i e s c a n b e d e v e l o p e d f o r m o s t o f t h e l i p i d s t o b e q u i c k l y a n d a c c u r a t e l y i d e n t i fi e d w i t h s t r u c t u r a l d e t a i l s d i r e c t l y i n t h e c o m p l i c a t e d m i x t u r e , w i t h o u t t h e r e q u i r e m e n t o f p r e v i o u s p u r i fi c a t i o n a n d u s i n g a m i n i m u m s a m p l e a m o u n t [ 1 0 1 , 1 1 0 - 1 1 8 ] . A t t h e s a m e t i m e , q u a n t i fi c a t i o n o f i n d i v i d u a l l i p i d s p e c i e s c a n b e a c h i e v e d b y i n c o r p o r a t i n g l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s i n m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s . 2 . 2 S a m p l e p r e p a r a t i o n f o r m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s o f l i p i d s A s w i l l b e d i s c u s s e d b e l o w , l i p i d s a m p l e p r e p a r a t i o n i s h e a v i l y d e p e n d e n t o n t h e a n a l y t i c a l m e t h o d s t o b e a p p l i e d . T h e h i g h s t r u c t u r a l r e s o l u t i o n , s e n s i t i v i t y , a n d t a n d e m M S v e r s a t i l i t y o f m o d e r n m a s s s p e c t r o m e t r y o f t e n m a k e s e l a b o r a t e p r e - a n a l y s i s s e p a r a t i o n o f d i f f e r e n t t y p e s o f l i p i d s t u r n e c e s s a r y , a n d c a n b e a p p l i e d w i t h o n l y a m i n i m u m a m o u n t o f s a m p l e c o m p a r e d t o o t h e r t r a d i t i o n a l m e t h o d s . M A L D I c a n b e d i r e c t l y u s e d w i t h d e v e l o p e d T L C p l a t e s [ 1 1 9 , 1 2 0 ] m e m b r a n e p e l l e t s ( C h a p t e r s 9 a n d 1 0 ) , m e m b r a n e p r o t e i n s c o n t a i n i n g l i p i d s ( C h a p t e r s 9 a n d 1 0 ) , t i s s u e s l i c e s f o r l i p i d - d i s t r i b u t i o n i m a g i n g [ 1 2 1 - 1 2 5 ] , e v e n w h o l e p l a n k t o n o r b a c t e r i a l c e l l s [ 1 2 6 , 1 2 7 ] , a s w e l l a s l i p i d e x t r a c t s o l u t i o n s [ 5 , 1 1 4 , 1 2 8 - 1 3 0 ] . T h e E S I i o n s o u r c e o f t e n r e q u i r e s t h a t t h e 5 4 l i p i d s a r e e x t r a c t e d a n d s o l u b i l i z e d f o r t h e s p r a y , b u t i t d o e s n o t r e q u i r e t h e c h r o m a t o g a p h i c s e p a r a t i o n o f l i p i d e x t r a c t s . A l t h o u g h w h o l e c e l l s u s p e n s i o n h a s a l s o b e e n e l e c t r o s p r a y e d [ 1 3 1 ] , t h e i n f o r m a t i o n o b t a i n e d w a s v e r y l i m i t e d . H o w e v e r , d u e t o t h e h i g h s e n s i t i v i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y m e t h o d s , s e v e r a l c o n s i d e r a t i o n s h a v e t o b e t a k e n i n t o a c c o u n t d u r i n g t h e l i p i d s a m p l e p r e p a r a t i o n t h a t m i g h t a f f e c t t h e a n a l y s i s . G e n e r a l c o n s i d e r a t i o n s o f s a m p l e p r e p a r a t i o n i n c l u d e : k e e p i n g t h e l i p i d m o l e c u l e s i n t a C t i f l i p i d e x t r a c t i o n i s p e r f o r m e d ; t h e p H o f t h e s a m p l e , w h i c h c a n a f f e c t t h e i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y o f t h e l i p i d s a n d t h e c h a r g e s t a t e o f l i p i d i o n s a n d c a u s e h y d r o l y s i s o f s o m e t y p e s o f l i p i d s s u c h a s t h e p l a s m a l o g e n a t a c i d i c p H [ 1 1 7 , 1 3 2 ] ; t h e p r e s e n c e o f d e t e r g e n t s , w h i c h c a n s i g r i fi c a n t l y s u p p r e s s t h e i o n i z a t i o n o f l i p i d s i n E S I m o r e t h a n i n M A L D I d u e t o t h e E S I i o n i z a t i o n m e c h a n i s m [ 8 5 ] ( d i s c u s s e d b e l o w ) ; t h e p r e s e n c e o f s a l t ( f r o m b u f f e r s ) w h i c h c a n f o r m n o n - c o v a l e n t a l k a l i o r a n i o n i c a d d u c t s w i t h l i p i d s a n d c a n s u p p r e s s e f fi c i e n t i o n i z a t i o n ( C h a p t e r 4 ) ; c o n t a m i n a t i o n f r o m t h e c o n t a i n e r s s u c h a s p l a s t i c i z e r s [ 1 3 3 ] ; a n d a d d i t i v e s t h a t c a n p r o m o t e i o n i z a t i o n i n E S I s u c h a s v o l a t i l e a m m o n i u m s a l t s a n d a m m o n i u m h y d r o x i d e [ 1 3 4 ] ( a l s o s e e C h a p t e r 4 ) . F o r q u a n t i t a t i v e p r o fi l i n g o f l i p i d e x t r a c t s , t h e c h e m i c a l e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y a n d p r o p e r q u a n t i fi c a t i o n c o n t r o l a r e t h e u p s t r e a m k e y f a c t o r s t h a t d e t e r m i n e t h e v a l i d i t y o f q u a n t i fi c a t i o n . D e p e n d i n g o n t h e p u r p o s e o f t h e a n a l y s i s , w e l l - c a l i b r a t e d i n t e r n a l l i p i d s t a n d a r d s s h o u l d b e p r o p e r l y c h o s e n a n d i n c o r p o r a t e d i n t o t h e s a m p l e a t t h e s p e c i fi c s t e p o f s a m p l e p r e p a r a t i o n a t o p t i m a l c o n c e n t r a t i o n s . C o m p a r e d t o t h e h i g h l y r e p r o d u c i b l e m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s i t s e l f , t h e b i o l o g i c a l s a m p l e p r e p a r a t i o n c o n t r i b u t e s t o t h e m a j o r i t y o f t h e d e v i a t i o n . T h e r e f o r e , a t l e a s t t r i p l i c a t e i n d e p e n d e n t b i o l o g i c a l s a m p l e p r e p a r a t i o n s s h o u l d b e p e r f o r m e d , i n o r d e r t o o b t a i n v a l i d q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s . T h e 5 5 b a s i s o f l i p i d q u a n t i fi c a t i o n c a n b e t i s s u e o r c e l l w e t w e i g h t , d r y w e i g h t , c e l l n u m b e r , c e l l c u l t u r e p l a t e n u m b e r o r p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n . A l t h o u g h n o t a l w a y s r e q u i r e d , t h e c o u p l i n g o f l i q u i d c h r o m a t o g a p h y w i t h E S I m a s s S p e c t r o m e t r y d o e s p r o v i d e a n e x t r a d i m e n s i o n f o r l i p i d s e p a r a t i o n a n d c a n a s s i s t w i t h t h e l i p i d i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n . R e v e r s e - p h a s e l i q u i d c h r o m a t o g a p h y c a n s e p a r a t e l i p i d s i n t h e m i x t u r e b y t h e i r h y d r o p h o b i c t a i l s , w h i l e n o r m a l - p h a s e l i q u i d c h r o m a t o g a p h y c a n s e p a r a t e t h e l i p i d s b y h e a d - g o u p p o l a r i t y [ 1 1 5 , 1 3 5 ] . L i q u i d c h r o m a t o g a p h y i s p a r t i c u l a r l y u s e f u l , a n d i s p r o b a b l y t h e m o s t e f fi c i e n t m e t h o d , i n r e m o v i n g t h e c o n t a m i n a t i n g d e t e r g e n t s f r o m t h e l i p i d e x t r a c t s , w h i c h i s o f t e n a n i s s u e w i t h l i p i d e x t r a c t s f r o m l i p i d r a f t s a n d d e t e r g e n t - s o l u b i l i z e d m e m b r a n e p r o t e i n s ( C h a p t e r 8 ) . 2 . 2 . 1 L i p i d e x t r a c t i o n I d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f l i p i d s u s i n g E S I m a s s s p e c t r o m e t r y h a v e r e c e n t l y b e c o m e m o r e e x t e n s i v e l y a p p l i e d t o t h e l i p i d m i x t u r e e x t r a c t e d f r o m t i s s u e s , c e l l s , c e l l u l a r o r g a n e l l e s , l i p i d r a f t s a n d l i p i d - c o n t a i n i n g m e m b r a n e p r o t e i n s . S e v e r a l s y s t e m s h a v e p r e v i o u s l y b e e n d e v e l o p e d t o e x t r a c t l i p i d s f r o m t i s s u e s . A m o n g t h e m a r e t h e F o l c h e x t r a c t i o n [ 1 3 6 ] , a n d t h e o n e - p h a s e b a s e d B l i g h a n d D y e r m e t h o d [ 1 3 7 ] w h i c h w e r e i n i t i a l l y d e v e l o p e d f o r l i p i d e x t r a c t i o n f r o m fi s h t i s s u e w i t h h i g h w a t e r c o n t e n t , u s i n g c h l o r o f o r m a n d m e t h a n o l a s t h e s o l v e n t s , a n d c o u l d a c h i e v e e x t r a c t i o n y i e l d s o f ~ 9 0 % [ 1 3 7 - 1 3 9 ] . T h e s e m e t h o d s h a v e b e e n w i d e l y a p p l i e d i n m a s s s p e c t r o m e t r y - b a s e d a n a l y s i s w i t h S l i g h t m o d i fi c a t i o n s [ 1 1 1 , 1 4 0 , 1 4 1 ] , y e t t h e e f fi c i e n c y o f e x t r a c t i n g t h e l i p i d s f r o m t h e s e v a r i o u s s y s t e m s h a v e n o t b e e n d i s c u s s e d i n d e t a i l i n t h e s e r e c e n t 5 6 e _ _ , _ a p p l i c a t i o n s . T h e e s s e n t i a l p r i n c i p l e o f t h e B l i g h a n d D y e r e x t r a c t i o n m e t h o d i s t o m a x i m i z e t h e c o n t a c t o f t h e l i p i d s i n t h e t i s s u e w i t h t h e e x t r a c t i o n s o l v e n t b y d i s p e r s i n g t h e t i s s u e i n t o t h e o n e - p h a s e m i x t u r e f o r m e d b y c h l o r o f o r m , m e t h a n o l a n d w a t e r , f o l l o w e d b y a d d i t i o n o f a c e r t a i n a m o u n t o f w a t e r o r c h l o r o f o r m t o d r i v e t h e m i x t u r e t o s e p a r a t e i n t o t w o p h a s e s , a n d t h e l o w e r c h l o r o f o r m - r i c h p h a s e c o n t a i n s t h e l i p i d s [ 1 3 7 ] . T i s s u e a n d m a m m a l i a n c e l l s c a n b e d i r e c t l y s u b j e c t e d t o c h e m i c a l l i p i d e x t r a c t i o n , b u t G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a s u c h a s R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s h a v e t i g h t l y p a c k e d l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) c e l l w a l l s a n d o f t e n r e q u i r e c e l l l y s i s a n d m e m b r a n e p e l l e t i s o l a t i o n p r i o r t o l i p i d e x t r a c t i o n , o r t h e i n c o r p o r a t i o n o f K H 2 P 0 4 b u f f e r ( p H 4 . 7 ) a n d e x t e n s i v e v i b r a n t s h a k i n g t o a s s i s t w i t h c e l l - b r e a k i n g i n t h e c h l o r o f o r m a n d m e t h a n o l e x t r a c t i o n s o l v e n t [ 1 5 ] . I n a d d i t i o n t o t h e e x t r a c t i o n b y u s i n g o r g a n i c c h e m i c a l s o l v e n t s , m i c r o w a v e [ 1 4 2 ] , l i q u i d C 0 2 s u p e r fl u i d e x t r a c t i o n [ 1 4 2 ] , a n d “ i n - c e l l f r a c t i o n a t i o n ” u s i n g fi x e d S i l i c a - b a s e d s o r b e n t s o n s e q u e n t i a l p r e s s u r i z e d l i q u i d e x t r a c t i o n [ 1 4 3 ] h a v e a l s o b e e n a p p l i e d i n t h e l i p i d e x t r a c t i o n fi ' o m t i s s u e s o r c e l l s . I n a d d i t i o n t o t h e p o l a r i t y o f l i p i d s a n d t h e e x t r a c t i o n s o l v e n t s , a n u m b e r o f v a r i a b l e s h a v e b e e n r e p o r t e d t o a f f e c t t h e e f fi c i e n c y o f t h e c h e m i c a l l i p i d e x t r a c t i o n . I n t h e R o s e e x t r a c t i o n [ 1 4 4 ] , u s i n g c h l o r o f o r m : i s o - p r o p a n o l ( 7 : 1 1 , v / v ) i n s t e a d o f c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 2 : 1 , v / v ) i s f o u n d t o e x t r a c t t h e h y d r o p h o b i c l i p i d c o m p o n e n t s ( c h o l e s t e r o l s ) m o r e e f fi c i e n t l y a n d m i n i m i z e h e m e e x t r a c t i o n f r o m r e d b l o o d c e l l s . L e s s - t o x i c t - b u t y l m e t h y l e t h e r c a n r e p l a c e c h l o r o f o r m w i t h a S i m i l a r e x t r a c t i o n y i e l d , a n d m a k e t h e o p e r a t i o n e a s i e r b y c o n c e n t r a t i n g t h e l i p i d s i n t h e t o p l a y e r d u r i n g t h e p h a s e s e p a r a t i o n s t e p [ 1 4 5 ] . T h e e x t r a c t i o n o f c h a r g e d l i p i d i s o f t e n a s s i s t e d b y t h e a d d i t i o n o f c o u n t e r i o n s [ 1 4 6 ] . A c i d o r b a s e i s a l s o a p p l i e d , i n o r d e r t o a d j u s t t h e p H t o n e u t r a l i z e t h e 5 7 l i p i d s w i t h d i f f e r e n t c h a r g e s t a t e s i n s o l u t i o n a n d i n c r e a s e t h e i r s o l u b i l i t y i n h y d r o p h o b i c s o l v e n t s [ 5 3 ] . I n t h e t r a d i t i o n a l a n a l y s i s o f l i p i d s , t o t a l l i p i d s a r e o f t e n s e p a r a t e d i n t o t h e g e n e r a l t y p e s o f n e u t r a l , p o s i t i v e , a n d n e g a t i v e l i p i d s , u s i n g s o l i d - p h a s e e x t r a c t i o n , b y a d j u s t i n g t h e p H o f t h e e l u t i n g s o l v e n t s w i t h s t r o n g a c i d a n d b a s e t o n e u t r a l i z e t h e c h a r g e o f t h e l i p i d s . G e n e r a l l y , e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y i s o f t e n h i g h e r w i t h s m a l l e r s a m p l e s i z e i n a l a r g e r s o l v e n t v o l u m e a n d a t h i g h e r e x t r a c t i o n t e m p e r a t u r e [ 1 3 8 , 1 4 7 - 1 4 9 ] . H o w e v e r , l i p i d e x t r a c t i o n f r o m p u r i fi e d m e m b r a n e p r o t e i n s i s k n o w n t o b e m u c h m o r e d i f f i c u l t t h a n f r o m b u l k t i s s u e o r m e m b r a n e p e l l e t s , b e c a u s e t h e l i p i d s t h a t r e m a i n i n t h e p u r i fi e d m e m b r a n e p r o t e i n s a r e m o r e t i g h t l y b o u n d t o , o r b u r i e d i n s i d e , t h e h y d r o p h o b i c p o r t i o n o f t h e p r o t e i n s . T h e e x t r a c t i o n y i e l d i s o f t e n l o w a n d r e q u i r e s a d d i t i v e s t o h e l p r e m o v e t h e l i p i d s t h r o u g h i o n i c p a i r i n g , h y d r o p h o b i c r e p l a c i n g ( d e t e r g e n t ) , p r o t e i n d e n a t u r i n g , o r p r e v e n t i n g p r o t e i n s c a f f o l d s f r o m d e n a t u r i n g a n d a g g e g a t i n g ( d e t e r g e n t a n d i o n i c b u f f e r ) ( s e e C h a p t e r 8 f o r a d e t a i l e d d i s c u s s i o n ) . I n t h e r e c e n t a p p l i c a t i o n s o f q u a n t i t a t i v e l i p i d a n a l y s i s , e v e n t h o u g h t h e l i p i d e x t r a c t i o n y i e l d i s n o t d i r e c t l y e v a l u a t e d , t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s a r e o f t e n c h o s e n t o b e a d d e d t o t h e t i s s u e o r c e l l s , p r i o r t o l i p i d e x t r a c t i o n , a s s u m i n g t h a t t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y o f t h e a d d e d i n t e r n a l s t a n d a r d s i s t h e s a m e a s t h a t o f t h e e n d o g e n o u s l i p i d s . 2 . 3 T r a d i t i o n a l m e t h o d s f o r l i p i d i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n T r a d i t i o n a l l y t h e i d e n t i fi c a t i o n a n d s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f l i p i d s a r e c a r r i e d o u t u s i n g a t i m e - c o n s u m i n g m u l t i - s t e p p r o c e d u r e o n a r e l a t i v e l y l a r g e s c a l e . I t o f t e n r e q u i r e s t h e l i p i d s t o b e e x t r a c t e d a n d s e p a r a t e d u s i n g t h i n - l a y e r c h r o m a t o g a p h y ( o n e - 5 8 d i m e n s i o n a l a n d t w o - d i m e n s i o n a l ) , s o l i d - p h a s e e x t r a c t i o n , o r l i q u i d c h r o m a t o g a p h y . T h e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e l i p i d c l a s s i s b a s e d o n c o m p a r i s o n o f t h e m i g a t i o n p o s i t i o n w i t h k n o w n s t a n d a r d s , a n d t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f S p e c i fi c f u n c t i o n a l g o u p s i s d e t e r m i n e d b y u s i n g f u n c t i o n a l - g o u p - s e l e c t i v e c o l o r i m e t r i c s p r a y : m o l y b d a t e f o r p h o s p h a t e , n i n h y d r i n f o r f r e e a m i n o g o u p s , a n d a - n a p h t h o l f o r s u g a r g o u p s [ 1 1 , 1 4 , 1 5 , 9 0 ] . T h e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e f a t t y a c y l c h a i n s o f t e n e m p l o y s g e n e r i c s a p o n i fi c a t i o n r e a c t i o n s t o r e l e a s e t h e f a t t y a c i d c h a i n s , w h i c h a r e f u r t h e r d e r i v a t i z e d , t y p i c a l l y b y m e t h y l a t i o n , f o r g a s c h r o m a t o g a p h y a n a l y s i s . H i g h l y s t r u c t u r e - s e l e c t i v e l i p o l y t i c e n z y m e s , s u c h a s a s e r i e s o f r e g i o n - s e l e c t i v e e n z y m e s , w e r e a l s o a p p l i e d t o r e l a t e t h e s p e c i fi c f a t t y a c i d t o t h e s n - 1 o r s n - 2 p o s i t i o n s o n t h e g l y c e r o l b a c k b o n e [ 1 5 0 ] . N o t e t h a t t h e m e t h o d s d e s c r i b e d a b o v e a l s o r e q u i r e d t h e a v a i l a b i l i t y o f w e l l c h a r a c t e r i z e d l i p i d s t a n d a r d s a n d f a t t y a c i d s t a n d a r d s f o r t h e c o m p a r i s o n . T h e d e fi n i t i v e s t r u c t u r a l i d e n t i fi c a t i o n o f a n u n k n o w n l i p i d r e q u i r e s 1 H - N M R a n d 1 3 C - - N M R s t r u c t u r a l a n a l y s i s f o l l o w i n g l i p i d p u r i fi c a t i o n u s i n g T L C , a n d s c r a p i n g t h e s p e c i fi c b a n d s o f f t h e p l a t e a n d r e - e x t r a c t i o n . T h e t r a d i t i o n a l m e t h o d s o f a n a l y s i s o f t e n S h o w t h e q u a n t i fi c a t i o n o f e a c h g e n e r a l t y p e o f l i p i d a n d t h e q u a n t i fi c a t i o n o f o v e r a l l f a t t y a c y l c h a i n c o m p o s i t i o n s e p a r a t e l y . I n 3 1 P - N M R , t h e c h e m i c a l s h i f t o f p h o s p h o r u s i s d e p e n d e n t o n i t s c h e m i c a l e n v i r o n m e n t a n d i s f o u n d t o d i f f e r b e t w e e n t h e g e n e r a l t y p e s o f p h o s p h o l i p i d s . I t i s n o n - d e s t r u c t i v e , a n d t h e o r e t i c a l l y q u a n t i t a t i v e b a s e d o n t h e i n t e n s i t y o f e a c h p e a k , b u t t h e 3 1 P - N M R o f t h e b i o l o g i c a l s a m p l e s t a k e s a l o n g r e s o n a n c e t i m e , a n d r e q u i r e s a r e l a t i v e l y l a r g e l i p i d s a m p l e s i z e ( e g . 2 m g - 1 0 0 m g l i p i d s ) [ 8 9 , 1 5 1 ] i n o r d e r t o o b t a i n u s e f u l s p e c t r a . T o m a k e i t m o r e c o m p l i c a t e d , m u l t i p l e p e a k s a r e o f t e n o b s e r v e d t o b e g e n e r a t e d f r o m e a c h t y p e o f 5 9 l i p i d , w h i c h a r e v a r i a b l e , a n d d e p e n d e n t o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e l i p i d . T h e m o s t s e n s i t i v e a n d r e l i a b l e w a y t o q u a n t i f y t h e l i p i d s i s t o u s e t h e m e t a b o l i c r a d i o a c t i v e l a b e l i n g m e t h o d s b y i n c o r p o r a t i n g 1 4 C - a c e t a t e o r 1 4 C - l a b e l e d h e a d g o u p p r e c u r s o r s i n t h e g o w t h m e d i a , a n d c o m p a r i n g t h e r a d i o a c t i v i t y o f t h e c o r r e s p o n d i n g b a n d s a f t e r T L C s e p a r a t i o n . H o w e v e r , t h i s m e t h o d i s t i m e - c o n s u m i n g a n d e x p e n s i v e , a n d t h e r e a d i n g o f t h e q u a n t i fi c a t i o n i s s t i l l r e s t r i c t e d b y t h e r e s o l u t i o n o f t h e T L C s e p a r a t i o n . T h e t r a d i t i o n a l m e t h o d s h a v e b e e n e x t e n s i v e l y a p p l i e d f o r l i p i d a n a l y s i s i n p a s t d e c a d e s . H o w e v e r , t h e y t a k e a l o n g t i m e w i t h m u l t i p l e s t e p s , r i s k o x i d a t i o n d u e t o a l e n g t h y e x p o s u r e i n a i r , h a v e r e l a t i v e l y l o w e r s e n s i t i v i t y , a n d r e q u i r e a l a r g e s a m p l e s i z e . M o d e r n m a s s s p e c t r o m e t r y b a s e d m e t h o d s c a n o v e r c o m e a l l o f t h e s e p r o b l e m s . 2 . 4 M a s s S p e c t r o m e t r y M a s s s p e c t r o m e t r y i s e m e r g i n g a s a p o w e r f u l t o o l f o r l a r g e s c a l e l i p i d a n a l y s i s , b o t h i n e x t e n s i v e i d e n t i fi c a t i o n b a s e d o n d e t a i l e d s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n , a n d i n q u a n t i fi c a t i o n o f m o l e c u l a r s p e c i e s , w i t h l i t t l e o r n o r e q u i r e m e n t f o r p r o - a n a l y s i s l i p i d e x t r a c t i o n o r t h e s e p a r a t i o n o f t h e l i p i d e x t r a c t s . M a s s S p e c t r o m e t r y c a n n o t o n l y b e a p p l i e d t o q u i c k l y c o n fi r m t h e s t r u c t u r e o f c o m p l i c a t e d l i p i d s , w h i c h w e r e p r e v i o u s l y v e r y d i f f i c u l t t o a n a l y z e , s u c h a s l i p i d A , b u t m o s t i m p o r t a n t l y , i t c a n b e u s e d t o i n d e p e n d e n t l y e l u c i d a t e t h e t o t a l c h e m i c a l s t r u c t u r e s o f l i p i d s ( i n c l u d i n g n o v e l l i p i d s ) , w h i c h a r e e s s e n t i a l i n u n d e r s t a n d i n g t h e s t r u c t u r a l / f u n c t i o n a l i n t e r a c t i o n s o f l i p i d s w i t h m e m b r a n e p r o t e i n s , b u t a r e t y p i c a l l y d i f fi c u l t , i f n o t i m p o s s i b l e , t o b e o b t a i n e d f r o m o t h e r m e t h o d s a t h i g h s e n s i t i v i t y . 6 0 M a s s I o n D e t e c t o r I o n S o u r c e I V a c u u m P u m p s I F i g u r e 2 . 1 S c h e m a t i c s h o w i n g t h e g e n e r a l o p e r a t i o n o f a m a s s s p e c t r o m e t e r S a m p l e I I n l e t I : T h e o p e r a t i o n o f a m a s s s p e c t r o m e t e r ( F i g u r e 2 . 1 ) i n c l u d e s : 1 ) c r e a t i o n o f g a s - p h a s e i o n s , 2 ) s e p a r a t i o n o f t h e i o n s i n s p a c e o r t i m e b y t h e i r m a s s - t o - c h a r g e r a t i o ( m / z ) , 3 ) f r a g n e n t a t i o n o f i o n s a t a s e l e c t e d m / z t o o b t a i n s t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n ( o p t i o n a l ) , a n d 4 ) m e a s u r e m e n t o f t h e q u a n t i t y o f i o n s a t e a c h m / z . 2 . 4 . 1 I o n s o u r c e M a s s S p e c t r o m e t r y m e a s u r e s t h e m a s s t o c h a r g e r a t i o ( m / z , o f t e n u s e d i n t h e u n i t o f D a ) , a n d t h e a n a l y t e c a n b e c o n v e r t e d i n t o a c h a r g e d f o r m t h r o u g h v a r i o u s m e t h o d s i n t h e i o n i z a t i o n s t a g e . I n a d d i t i o n t o t h e e a r l i e r f a s t a t o m b o m b a r d m e n t ( F A B ) [ 1 0 2 ] a n d c h e m i c a l i o n i z a t i o n ( C I ) [ 1 0 0 , 1 0 1 ] , t h e s o f t e r a n d m o r e b i o m o l e c u l e - a m e n a b l e e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ( E S I ) [ 1 1 0 , 1 1 7 ] , m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n ( M A L D I ) [ 1 1 5 ] , a n d m o r e r e c e n t l y d e s o r p t i o n e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ( D E S I ) [ 1 1 2 ] a r e fi n d i n g i n c r e a s i n g l y i m p o r t a n t a p p l i c a t i o n s i n t h e f a s t , s e n s i t i v e , a c c u r a t e a n d d i r e c t a n a l y s i s o f b i o m o l e c u l e s , i n c l u d i n g l i p i d s , p r e s e n t i n d i f f e r e n t s a m p l e s t a t e s . 6 1 2 . 4 . 1 . 1 M A L D I M A L D I i n c l u d e s a l a s e r s o u r c e ( t y p i c a l l y U V ) a n d U V — a b s o r b i n g s m a l l o r g a n i c m o l e c u l e s a s t h e m a t r i x t o f o r m c o - c r y s t a l s w i t h t h e a n a l y t e d e p o s i t e d o n a s a m p l e p l a t e s u r f a c e . U p o n U V l a s e r r a d i a t i o n , t h e m a t r i x m o l e c u l e s a b s o r b t h e U V l i g h t a n d f o r m a p l u m e o f i o n s a n d n e u t r a l s , m e a n w h i l e d e s o r b i n g a n d i o n i z i n g t h e a n a l y t e m o l e c u l e s , l i k e l y t h r o u g h g a s - p h a s e p r o t o n t r a n s f e r [ 1 5 2 , 1 5 3 ] . A c i d i c m a t r i c e s a r e t h e r e f o r e o f t e n c h o s e n w i t h t h e i n t e n t i o n t o i n c r e a s e t h e f o r m a t i o n o f p o s i t i v e i o n s [ 1 0 1 , 1 1 5 ] ; h o w e v e r , n e g a t i v e i o n s a r e a l s o f o r m e d d u r i n g t h e M A L D I p r o c e s s , e v e n u n d e r h i g h l y a c i d i c p H c o n d i t i o n s [ 1 1 8 ] ( s e e a l s o C h a p t e r s 9 a n d 1 0 ) . T h e i o n s f o r m e d b y M A L D I a r e g e n e r a l l y s i n g l y c h a r g e d [ 1 5 4 ] . T h e i o n s a r e t h e n s e p a r a t e d a n d a n a l y z e d b y a n a p p r o p r i a t e e l e c t r i c fi e l d o r m a g r e t i c fi e l d i n t h e m a s s a n a l y z e r . T h e m a t r i x c a n b e d e p o s i t e d u s i n g s o l u t i o n b a s e d o r n o n - s o l u t i o n b a s e d m e t h o d s [ 1 2 2 , 1 5 5 ] . I n t h e s o l u t i o n b a s e d m e t h o d , d u e t o t h e d i f f e r e n c e i n s o l u b i l i t y , t h e v a r i o u s c o m p o n e n t s i n t h e m i x t u r e a r e l i k e l y t o f o r m h e t e r o g e n e o u s d i s t r i b u t i o n s i n t h e c o - c r y s t a l s . O b t a i n i n g m o r e h o m o g e n o u s s a m p l e s p o t s r e q u i r e s e m p i r i c a l o p t i m i z a t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n a n d t h e m a t r i x s o l v e n t c o m p o s i t i o n s . 2 . 4 . 1 . 2 E S I E l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n w a s fi r s t a p p l i e d b y P e n n e t a l . i n 1 9 8 9 i n m a s s s p e c t r o m e t e r s , w h e r e i o n s o f t h e a n a l y t e s a r e f o r m e d b y s p r a y i n g t h e s a m p l e s o l u t i o n u n d e r a n e l e c t r i c fi e l d [ 1 5 6 - 1 5 8 ] . T h e c h a r g e r e s i d u e m o d e l ( C R M ) [ 1 5 9 ] a n d t h e i o n e v a p o r a t i o n m o d e l ( I E M ) [ 1 6 0 , 1 6 1 ] h a v e b e e n p r o p o s e d t o e x p l a i n t h e m e c h a n i s m o f E S I , s u g g e s t i n g t h a t t h e i o n s a r e f o r m e d b y g e n e r a t i n g s m a l l c h a r g e d d r o p l e t s t h r o u g h C o u l o m b i c fi s s i o n , a n d b y c o n t i n u o u s e v a p o r a t i o n o f t h e d r o p l e t s o l v e n t , r e s p e c t i v e l y . 6 2 T h e E S I p r o c e s s i n v o l v e s v e r y l i t t l e i n t e r n a l e n e r g y t r a n s f e r a n d i s s h o w n t o b e t h e s o f t e s t i o n i z a t i o n t e c h n i q u e t h a t i s a m e n a b l e f o r t h e a n a l y s i s o f l a r g e l a b i l e b i o m o l e c u l e s , s u c h a s l i p i d s . B y u s i n g a l o w e r fl o w r a t e , d o w n t o t e n s o f n a n o l i t e r s p e r m i n u t e , n a n o e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ( n a n o E S I ) c a n h a v e a h i g h e r s e n s i t i v i t y w i t h l e s s c o n t a m i n a t i o n , p a r t i a l l y d u e t o a h i g h e r d e s o l v a t i o n e f fi c i e n c y c o m p a r e d t o c o n v e n t i o n a l E S I [ 1 6 2 ] . W h i l e a p u l s e - t y p e i o n s o u r c e s u c h a s M A L D I i s s e n s i t i v e t o t h e t o t a l n u m b e r o f i o n s g e n e r a t e d i n e a c h p u l s e o f l a s e r a b l a t i o n , t h e S i g r a l a b u n d a n c e i n E S I i s s e n s i t i v e t o t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e s a m p l e i o n s w h i c h a r e g e n e r a t e d i n a c o n t i n u o u s fl o w . 2 . 4 . 1 . 3 D i r e c t i m a g i n g c o u p l e d w i t h M A L D I a n d D E S I D E S I e m p l o y s a s t r e a m o f c h a r g e d s o l v e n t t o s p r a y o n t h e s a m p l e t o d e s o r b a n d i o n i z e t h e s u r f a c e m o l e c u l e s f o r a n a l y s i s [ 1 6 3 ] . B o t h M A L D I a n d D E S I c a n b e u s e d t o d i r e c t l y a n a l y z e s o l i d - p h a s e s a m p l e s w i t h o u t s o l u b i l i z a t i o n , a n d h a v e b e e n r e c e n t l y a p p l i e d i n t h e m o l e c u l a r i m a g i n g o f t i s s u e s l i c e s f o r t h e d i s t r i b u t i o n o f l i p i d s , p r o t e i n s o r m e t a b o l i t e s [ 1 2 1 - 1 2 5 , 1 6 3 , 1 6 4 ] . 2 . 4 . 1 . 4 F a c t o r s a f f e c t i n g t h e i o n i z a t i o n o f l i p i d s T h e i o n i z a t i o n o f l i p i d s i n E S I i s h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e s t r u c t u r e o f t h e l i p i d s . I n a d d i t i o n , s e v e r a l g e n e r a l f a c t o r s c o n t r i b u t e t o t h e i r i o n i z a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s , i n c l u d i n g t h e s o l v e n t c o m p o s i t i o n , t h e p H v a l u e o f t h e s o l u t i o n , t h e p r e s e n c e o f a d d i t i v e s s u c h a s a c i d s , b a s e s a n d a m m o n i u m s a l t s , a n d t h e p r e s e n c e o f o t h e r c a t i o n s o r a n i o n s [ 1 6 5 ] . B a s e d o n t h e i o n e v a p o r a t i o n m o d e l o f E S I , t h e g a s - p h a s e c h a r g e s t a t e s h o u l d b e l a r g e l y 6 3 d e p e n d e n t o n t h e i o n i z a t i o n o f t h e l i p i d s i n t h e s o l u t i o n , b u t t h e s o l u t i o n p K a v a l u e s a r e s h o w n t o b e i n s u f fi c i e n t t o e x p l a i n t h e f o r m a t i o n o f p r o t o n a t e d o r d e p r o t o n a t e d i o n s o b s e r v e d i n t h e p o s i t i v e o r n e g a t i v e i o n m o d e [ 1 6 6 ] . T h e a d d i t i o n o f l o w c o n c e n t r a t i o n s o f a m m o n i u m s a l t o r a m m o n i u m h y d r o x i d e c o u l d e n h a n c e i o n f o r m a t i o n o f l i p i d s i n b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s [ 1 3 4 ] . A l k a l i i o n s s u c h a s l i t h i u m a n d s o d i u m , a n d a n i o n s s u c h a s c h l o r i d e a n d a c e t a t e c a n e a s i l y f o r m n o n - c o v a l e n t a d d u c t i o n s w i t h l i p i d s [ 1 6 5 ] , a n d a r e i n t e n t i o n a l l y a d d e d t o g e n e r a t e a d d u c t i o n s f r o m n o n - p o l a r l i p i d s , s u c h a s t r i a c y l g l y c e r i d e s a n d c h o l e s t e r o l s [ 1 6 7 ] , f o r m o r e s e n s i t i v e a n a l y s i s . I n M A L D I , t h e i o n i z a t i o n e f f i c i e n c i e s o f d i f f e r e n t t y p e s o f l i p i d s a r e s t r o n g l y d e p e n d e n t o n t h e m a t r i x s e l e c t i o n , d u e t o m e c h a n i s m s t h a t a r e n o t e x p l a i n e d b y c o m p a r i s o n o f p K a v a l u e s [ 1 6 6 ] . M o d u l a t i o n o f t h e m a t r i x p H m i g h t a f f e c t t h e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s o f t h e s a m p l e m o l e c u l e s d u r i n g t h e M A L D I c o - c r y s t a l f o r m a t i o n , b u t t y p i c a l l y d o e s n o t a p p r e c i a b l y e n h a n c e i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y . I n s t e a d , a c h a n g e i n t h e s u r f a c e p H o f t h e c o - c r y s t a l s c a n d r a m a t i c a l l y a f f e c t t h e i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y ( p r e v i o u s fi n d i n g s n o t i n c l u d e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n ) . M A L D I o f t e n i n d u c e s p r o m p t o r f a s t f r a g n e n t a t i o n s o f t h e l i p i d s i n t h e s o u r c e t o a d i f f e r e n t e x t e n t [ 1 6 8 ] , d e p e n d i n g o n t h e l i p i d s t r u c t u r e a n d t h e m a t r i x , a n d i t h a s b e e n f o u n d t h a t G P E t n i s t h e m o s t l a b i l e t y p e o f p h o s p h o l i p i d , a n d a - c y a n o - 4 - h y d r o x y c i n n a m i c a c i d ( C H C A ) i s t h e m o s t “ h o t ” m a t r i x t h a t i n d u c e s t h e m o s t e x t e n s i v e i n - s o u r c e d e c o m p o s i t i o n ( p r e v i o u s fi n d i n g s n o t i n c l u d e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n ) . S i n c e s a l t s o f t e n e n d u p b e i n g c o n c e n t r a t e d o n t h e s u r f a c e o f t h e M A L D I s a m p l e s p o t s , d i r e t o t h e r e l a t i v e l y l a r g e r s o l u b i l i t y i n a q u e o u s s o l u t i o n , s a l t c o n t a m i n a t i o n s i g r i fi c a n t l y d e c r e a s e s . t h e e f fi c i e n c y o f f o r m i n g p r o t o n a t e d o r d e p r o t o n a t e d i o n s , a n d o f t e n c a u s e s t h e f o r m a t i o n o f a d d u c t i o n s o f l i p i d s w i t h 6 4 _ ( p 0 = — ( U — V c o s ( 0 t ) ( 2 ) m u l t i p l e a l k a l i c a t i o n s i n b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s ( p r e v i o u s fi n d i n g s n o t i n c l u d e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n ) . A d e s a l t i n g s t e p p r i o r t o a n a l y s i s i s o f t e n f o u n d t o i n c r e a s e t h e i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y o f l i p i d s ( p r e v i o u s fi n d i n g s n o t i n c l u d e d i n t h i s d i s s e r t a t i o n ) , a s w e l l a s p e p t i d e s [ 1 6 9 ] . 2 . 4 . 2 M a s s a n a l y z e r M a s s a n a l y z e r s m e a s u r e t h e r r r / z v a l u e s o f t h e g e n e r a t e d i o n s . T h e m a s s a n a l y z e r s t h a t a r e fi n d i n g r a p i d l y i n c r e a s i n g a p p l i c a t i o n s i n l i p i d a n a l y s i s i n c l u d e : t i m e o f fl i g h t ( T O F ) , t r i p l e q u a d r u p o l e ( Q q Q ) , q u a d r u p o l e i o n t r a p s ( 3 - D P a u l i o n t r a p a n d 2 - D l i n e a r i o n t r a p ) , h i g h - r e s o l u t i o n O r b i - t r a p , a n d F o u r i e r t r a n s f o r m - i o n c y c l o t r o n r e s o n a n c e ( F T - I C R ) m a s s a n a l y z e r s . 2 . 4 . 2 . 1 Q u a d r u p o l e m a s s a n a l y z e r T h e q u a d r u p o l e m a s s a n a l y z e r i s c o m p o s e d o f f o u r h y p e r b o l i c - s h a p e d r o d e l e c t r o d e s a s s e m b l e d i n p a ( 1 ) 0 = + ( U — V c o s w t ) r a l l e l , a n d t h e c o m b i n a t i o n o f a n a l t e r n a t i n g fi e l d r a d i o f r e q u e n c y ( A C o r R F ) a n d a c o n s t a n t fi e l d ( D C ) v o l t a g e a r e i m p o s e d o n t h e e l e c t r o d e s t o f o r m " a q u a d r u p o l e e l e c t r i c fi e l d . T h e s t a b i l i t y a n d m o v e m e n t o f i o n s i n t h e q u a d r u p o l e e l e c t r i c fi e l d a r e d e s c r i b e d b y t h e s o l u t i o n s o f t h e M a t h i e u e q u a t i o n s [ 1 7 0 ] a s d i s c u s s e d b e l o w . T h e c o m b i n e d p o t e n t i a l s a p p l i e d o n t h e o p p o s i t e s e t s o f e l e c t r o d e s a r e ( D o = + ( U — V c o s w t ) ( 1 ) 6 5 w h e r e U i s t h e a m p l i t u d e o f t h e D C p o t e n t i a l , V i s t h e a m p l i t u d e o f t h e A C p o t e n t i a l , t o i s t h e a n g u l a r v e l o c i t y o f t h e A C p o t e n t i a l ( e q u a l t o 2 7 w , 1 ) b e i n g t h e f r e q u e n c y ) , a n d t i s t i m e . T h e o v e r a l l fi e l d p o t e n t i a l ( I ) i n t h e q u a d r u p o l e i s t h u s 2 2 - U - V c o s c o t ‘ D x , y = ¢ 0 ( x 2 — y 2 ) / ’ 0 2 = ( x y X , ) ( 3 ) ’ 0 w h e r e x a n d y d e fi n e t h e p o s i t i o n f r o m t h e c e n t e r o f t h e r o d s , a n d T o i s t h e d i s t a n c e f r o m t h e c e n t e r o f t h e s p a c e t o t h e e l e c t r o d e . T h e m o v e m e n t o f a n i o n ( m / z ) i n x a n d y d i m e n s i o n s a s a r e s u l t o f t h e f o r c e e x p e r i e n c e d b y t h e i o n i n t h e e l e c t r i c fi e l d i s t h e r e f o r e : - 2 F x = m a x = m d — 2 x = — - z e 2 ? ( 4 ) d t a x 2 F y = m a y = m d — ; = — z e - 6 : D - ( 5 ) d t 5 y S u b s t i t u t i o n a n d r e a r r a n g e m e n t l e a d t o t h e e q u a t i o n s o f m o t i o n t h a t e s t a b l i s h t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e s p a c e c o o r d i n a t e s o f t h e i o n a n d t i m e , u n d e r t h e s t a b i l i t y b o u n d a r y c o n d i t i o n s o f x < r 0 a n d y < r 0 . 2 $ 2 5 + 2 2 9 2 ( U — V c o s c o t ) x = o ( 6 ) d t m r o d 2 y 2 2 c 2 — 2 ( U — V c o s c o t ) y = 0 ( 7 ) d t I n t o T h e y a r e s i m i l a r t o t h e e q u a t i o n s o l v e d b y M a t h i e u i n 1 8 6 6 [ 1 7 0 ] , d z u — — — + ( a u — 2 q u c o s 2 § ) u = 0 ( 8 ) d 5 2 6 6 T h e r e f o r e e q u a t i o n s 6 a n d 7 c a n b e d e s c r i b e d i n t h e f o r m o f M a t h i e u e q u a t i o n , w h e n a ) ! = — 9 4 ‘ 2 ( ) 8 2 e U m a ) r 0 4 z e V q u q u = ‘ 9 y = — 2 — 2 _ ( 1 1 ) m o ) r 0 P a r a m e t e r F ; i s d i m e n s i o n l e s s , a n d a u a n d q u a r e d i m e n s i o n l e s s a n d k n o w n a s t h e t r a p p i n g p a r a m e t e r s . R e a r r a n g e m e n t o f e q u a t i o n s 1 0 a n d 1 1 l e a d s t o : - 2 2 U z a u a n — I L L ( 1 2 ) 8 z e 2 2 m a ) q u u — r o ( 1 3 ) 4 z e w h i c h d e fi n e t h e s t a b i l i t y o f t h e i o n i n t h e q u a d r u p o l e fi e l d . T h e s t a b i l i t y a r e a s c a n b e r e p r e s e n t e d b y a t r i a n g u l a r a r e a i n a n a u - q u d i a g r a m , o r s i m i l a r l y a U - V d i a g r a m i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 . 2 . O b v i o u s l y , n o w t h e a b i l i t y o f a n m / z t o s t a b l y p a s s t h r o u g h t h e q u a d r u p o l e w i t h o u t h i t t i n g t h e b o u n d a r i e s d e p e n d s o n t h e v a l u e s o f T o , U , V a n d t o . B o t h r 0 a n d ( o a r e t y p i c a l l y fi x e d f o r a g i v e n i n s t r u m e n t g e o m e t r y . T h e s t a b i l i t y o f t h e i o n i s t h u s m a n i p u l a t e d t h r o u g h s u i t a b l e c h o i c e s o f U a n d V . U a n d V a r e t h e a c t u a l o p e r a t i n g p a r a m e t e r s f o r t h e q u a d r u p o l e m a s s a n a l y z e r . 6 7 B ) F a i p x e e x d : U a a = 0 . n 2 d 3 V 7 , a q t = m 3 ( : . 7 0 8 / C ) S c a n n i n g a t c o n s t a n t U / V A ) S e t V ; U = O 3 : . V F i g u r e 2 . 2 S t a b i l i t y o f i o n s a t d i f f e r e n t m / z a s a f u n c t i o n o f U ( D C ) a n d V ( R F ) a m p l i t u d e s i n t h e q u a d r u p o l e e l e c t r i c fi e l d , a n d t h e t h r e e o p e r a t i o n m o d e s u n d e r d i f f e r e n t a p p l i c a t i o n s o f U a n d V ( m 1 < m 2 < m 3 ) ( a d a p t e d f r o m [ 1 7 1 ] ) . T h e q u a d r u p o l e c a n o p e r a t e i n t h r e e m a j o r m o d e s b y s e t t i n g U a n d V a t d i f f e r e n t v a l u e s , a c c o r d i n g t o t h e s t a b i l i t y d i a g r a m ( F i g u r e 2 . 2 ) . 1 ) O p e r a t i o n a s a h i g h p a s s fi l t e r f o r i o n t r a n s m i s s i o n b y s e t t i n g U a t z e r o a n d k e e p i n g V s t a t i c ( F i g u r e 2 . 2 A ) . A l l t h e i o n s w i t h m / z h i g h e r t h a n t h a t c o r r e s p o n d i n g t o t h e l o w e s t a p p l i c a b l e V a r e s t a b l y t r a n s m i t t e d a n d i o n s w i t h l o w e r m / z a r e l o s t . 2 ) O p e r a t i o n a s a m a s s s e l e c t i v e d e v i c e b y a p p l y i n g U a n d V a t fi x e d a m p l i t u d e s t h a t p u t t h e g i v e n m / z a t t h e a p e x o f t h e s t a b i l i t y d i a g r a m , a t a = 0 . 2 3 7 a n d q = 0 . 7 0 8 ( F i g u r e 2 . 2 8 ) . I o n s w i t h a l l t h e o t h e r m / z a r e n o t s t a b l e a n d l o s t . 3 ) O p e r a t i o n a s a m a s s a n a l y z e r b y s c a n n i n g U a n d V i n c r e a s i n g l y , w h i l e k e e p i n g t h e r a t i o o f t h e i r a m p l i t u d e s c o n s t a n t ( F i g u r e 2 . 2 C ) . S t a b l e t r a j e c t o r i e s c a n b e o b t a i n e d f o r i o n s w i t h i n c r e a s i n g m / z , a n d t h e i o n s a r e t h e n s e q u e n t i a l l y m a s s 6 8 a n a l y z e d . T h e h i g h e r t h e U N r a t i o o f t h e o p e r a t i o n l i n e , t h e h i g h e r t h e m a s s r e s o l u t i o n , s i n c e f e w e r m / z s t a b i l i t y a r e a s c a n o v e r l a p i n t h e s m a l l e r a r e a a b o v e t h e o p e r a t i n g l i n e . I o n s t h a t c a n s t a b l y p a s s t h r o u g h t h e m a s s a n a l y z e r a r e s e q u e n t i a l l y t r a n s f e r r e d t o t h e n e x t s t a g e o f i o n m a n i p u l a t i o n o r t o t h e d e t e c t o r f o r i o n a b u n d a n c e m e a s u r e m e n t . 2 . 4 . 2 . 2 C I D M S / M S i n t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r T h e t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r i s d e s i g n e d a s t h r e e q u a d r u p o l e s c o n n e c t e d i n s e r i e s . Q u a d r u p o l e s Q 1 a n d Q 3 a r e b o t h s u p p l i e d w i t h D C a n d R F a n d c a n f u n c t i o n a s m a s s a n a l y z e r s , w h e r e a s q 2 h a s o n l y R F a n d c a n c o n fi n e a b a t h g a s , t h u s i t h a s n o m a s s a n a l y z i n g f u n c t i o n b u t c a n a c t t o f o c u s t h e i o n s a n d s e r v e a s a r e a c t i o n c e l l . S i m p l e M S c a n b e o b t a i n e d b y s e t t i n g Q 1 a t m a s s a n a l y z e r o p e r a t i o n m o d e , a n d b o t h q 2 a n d Q 3 a t h i g h p a s s fi l t e r o p e r a t i o n m o d e a s d e s c r i b e d e a r l i e r . T a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ( M S / M S ) i s a c h i e v e d b y s e t t i n g q u a d r u p o l e s Q 1 , q 2 a n d Q 3 a t d i f f e r e n t c o m b i n a t i o n s o f o p e r a t i o n m o d e s , b e c a u s e i n a t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r M S / M S h a s t o b e “ t a n d e m i n s p a c e ” , a n d a d i s c r e t e m a s s a n a l y z e r i s r e s p o n s i b l e f o r e a c h s t a g e o f m a s s s p e c t r o m e t r y . 6 9 Q 1 q 2 Q 3 M S / M S P r o d u c t i o n s c a n C I D . ~ — — — — a U , V fi x e d S c a n V S c a n U / V c o n s t a n t m / z P r e c u r s o r i o n s c a n . . S c a n U / V c o n s t a n t m / z N e u t r a l l o s s s c a n . § — § . F ' 0 ' _ > . . : - > _ - > o E » - ; 2 - > O I ; - > 0 S c a n U / V c o n s t a n t S c a n U / V c o n s t a n t m / z ( m / z ) ( m / z - — n e u t r a l l o s s ) F i g u r e 2 . 3 T h r e e t y p e s o f C I D M S / M S s c a n s t y p i c a l l y a p p l i e d i n a t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r : p r o d u c t i o n s c a n , p r e c u r s o r i o n s c a n a n d n e u t r a l l o s s s c a n . I n M S / M S , q 2 i s u s e d a s a c o l l i s i o n c e l l f o r t h e c o l l i s i o n - i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ( C I D ) a n d i s t y p i c a l l y fi l l e d w i t h A r , a n d a n o f f s e t D C v o l t a g e i s a p p l i e d t o i n c r e a s e t h e k i n e t i c e n e r g y o f t h e i o n s f o r e f fi c i e n t C I D d i s s o c i a t i o n , w h e r e a s Q 1 a n d Q 3 a r e s e t a t d i f f e r e n t c o m b i n a t i o n s o f t h e o p e r a t i o n m o d e s . T h e t h r e e t y p e s o f t y p i c a l l y u s e f u l M S / M S s c a n s , n a m e l y , t h e p r o d u c t i o n s c a n , t h e p r e c u r s o r i o n s c a n , a n d t h e n e u t r a l l o s s s c a n , a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 . 3 . I n t h e p r o d u c t i o n s c a n m o d e ( t h e m o s t c o m m o n t y p e o f M S / M S ) , Q 1 o p e r a t e s a s a m a s s s e l e c t i v e d e v i c e , a n d s e l e c t s o n l y t h e p r e c u r s o r i o n s w i t h t h e m / z o f c h o i c e t o p a s s t o q 2 f o r C I D f r a g m e n t a t i o n , a n d t h e n Q 3 o p e r a t e s a s a m a s s a n a l y z e r o f t h e p r o d u c t i o n s . I n t h e p r e c u r s o r i o n s c a n , Q 1 a c t s a s a m a s s a n a l y z e r a n d s c a n s a l l t h e p r e c u r s o r i o n s , w h i l e Q 3 a c t s a s a m a s s s e l e c t i v e d e v i c e a n d p a s s e s o n l y 7 0 a g i v e n m / z p r o d u c t i o n f o r d e t e c t i o n , s u c h t h a t t h e r e s u l t a n t M S / M S s h o w s a l l t h e p r e c u r s o r i o n s t h a t g i v e r i s e t o t h e p r o d u c t i o n a t t h e g i v e n m / z . T h e x a x i s s h o w s t h e m / z o f t h e p r e c u r s o r i o n s , a n d t h e y a x i s d i s p l a y s t h e c o r r e s p o n d i n g a b u n d a n c e o f t h e g i v e n p r o d u c t i o n . I n t h e n e u t r a l l o s s s c a n , Q 1 a n d Q 3 a c t a s c o u p l e d m a s s a n a l y z e r s , a n d a r e s c a n n e d c o n c o m i t a n t l y w i t h a c o n s t a n t o f f s e t o f m / z b e t w e e n t h e m , w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e g i v e n n e u t r a l l o s s , a n d a l l t h e p r e c u r s o r i o n s t h a t f r a g m e n t v i a t h e s a m e n e u t r a l l o s s a r e d i s p l a y e d i n t h e M S / M S s p e c t r u m . S i n c e t h e C I D f r a g m e n t a t i o n s o f l i p i d s a r e c h a r a c t e r i s t i c o f t h e c h e m i c a l s t r u c t u r e s o f t h e l i p i d t y p e , a n d o f t e n g e n e r a t e “ fi n g e r p r i n t ” p r o d u c t i o n s o r n e u t r a l l o s s e s , t h e p r e c u r s o r i o n s c a n a n d n e u t r a l l o s s s c a n s a r e p a r t i c u l a r l y u s e f u l i n s o r t i n g o u t t h e m o l e c u l a r s p e c i e s o f a s p e c i fi c l i p i d t y p e f r o m m i x t u r e s o f c o m p l e x l i p i d e x t r a c t s a s a w a y o f “ p u r i fi c a t i o n ” a n d i d e n t i fi c a t i o n a t i m p r o v e d s e n s i t i v i t y , a n d r e l a t i v e q u a n t i fi c a t i o n b e t w e e n t h e m o l e c u l a r s p e c i e s o f t h e s a m e l i p i d t y p e . T h e c o n fi g u r a t i o n o f t h e “ t r i p l e ” q u a d r u p o l e s a l l o w s o n l y t a n d e m M S / M S t o b e p e r f o r m e d . H o w e v e r , s i n c e t h e f r a g m e n t i o n s a r e f u r t h e r r e a c t i v a t e d b y c o l l i s i o n w i t h t h e b a t h g a s u p o n f o r m a t i o n , t h e p r o d u c t i o n s o b s e r v e d o f t e n r e s u l t f r o m t h e c o m b i n a t i o n o f p r i m a r y a n d s e c o n d a r y f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s . T h e e x t e n t o f C I D M S / M S f r a g m e n t a t i o n i n t r i p l e q u a d r u p o l e s i s a f u n c t i o n o f t h e p r e s s u r e o f b a t h g a s a n d t h e c o l l i s i o n e n e r g y ( D C o f f s e t ) a p p l i e d i n q 2 w i t h a g i v e n t y p e o f g a s ( A r ) . T h e l o w m a s s l i m i t i n M S / M S i s i m p o s e d b y t h e m i n i m a l l y a p p l i c a b l e R F a m p l i t u d e , a n d i s t y p i c a l l y s e t a t m / z 5 0 D a , b u t i t i s u s u a l l y n o t a l i m i t a t i o n i s s u e f o r l i p i d a n a l y s i s , b e c a u s e m o s t l i p i d fi n g e r p r i n t f r a g m e n t i o n s a r e o b s e r v e d a t m / z v a l u e s h i g h e r t h a n 5 0 D a . 7 1 2 . 4 . 2 . 3 Q u a d r u p o l e i o n t r a p A q u a d r u p o l e i o n t r a p i s e s s e n t i a l l y a q u a d r u p o l e i n 3 - D , b u t i n c o n t r a s t t o a q u a d r u p o l e , i t a c h i e v e s t h e q u a d r u p o l e e l e c t r i c fi e l d t h r o u g h t h e c o n fi g u r a t i o n o f a h y p e r b o l i c r i n g e l e c t r o d e a n d a p a i r o f h y p e r b o l i c e n d c a p s w i t h c e n t r a l h o l e s f o r i o n p a s s a g e , a n d f o r m s a 3 - D t r a p p i n g v o l u m e f o r t h e i o n s . O n l y a d r i v e R F ( 0 - 2 0 k V , a t s e c u l a r f r e q u e n c y o f 0 ) ) a p p l i e d t o t h e r i n g e l e c t r o d e i s r e q u i r e d t o f o r m t h e q u a d r u p o l e e l e c t r i c fi e l d , w h i l e a n a d d i t i o n a l l o w - a m p l i t u d e v a r i a b l e - f r e q u e n c y s u p p l e m e n t a r y R F ( 0 - 3 0 0 V ) i s a p p l i e d t o t h e e n d c a p e l e c t r o d e s t o f a c i l i t a t e i o n m a n i p u l a t i o n s . T h e r e f o r e t h e i o n s i n t h e q u a d r u p o l e i o n t r a p o p e r a t e a l o n g t h e l i n e o f a u = U = 0 i n t h e s t a b i l i t y d i a g r a m ( F i g u r e 2 . 4 ) a c c o r d i n g t o t h e M a t h i e u e q u a t i o n . T h e s o l u t i o n o f t h e M a t h i e u . . . 2 2 . . . . e q u a t i o n f o r t h e “ i d e a l ” 1 0 1 1 t r a p ( r 0 = 2 2 0 , r 0 a n d 2 0 b e l n g t h e r a d i a l a n d a x l a l d i s t a n c e s f r o m t h e c e n t e r o f t h e t r a p p i n g v o l u m e t o t h e e n d c a p s a n d t h e r i n g e l e c t r o d e , r e s p e c t i v e l y ) t h e n b e c o m e s : - 4 z e V q u = m r o z w z ( 1 4 ) I n p r a c t i c e , t h e i o n t r a p g e o m e t r y i s s t r e t c h e d ( 2 0 i s s t r e t c h e d b y 5 7 % i n q u a d r u p o l e i o n t r a p s o f M o d e l L C Q m a n u f a c t u r e d b y T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c , S a n J o s e , C A ) t o o v e r c o m e t h e m a s s s h i f t d u e t o a fi n i t e fi e l d , t h u s E q u a t i o n 1 4 t u r n s t o : - 8 2 e V 2 ( 1 5 ) T h i s i s t h e e q u a t i o n t h a t g o v e r n s t h e m o t i o n f o r i o n s i n a p r a c t i c a l i o n t r a p , a n d a l l o w s t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e i o n s t a b i l i t y p a r a m e t e r s f o r i o n s t o r a g e , t h e i o n f r e q u e n c i e s f o r i o n m a n i p u l a t i o n , t h e i o n e n e r g e t i c s f o r i o n a c t i v a t i o n , a n d t h e i o n s t o r a g e c a p a c i t y f o r 7 2 d y n a m i c r a n g e . S i n c e t o , 2 0 a n d ( 0 a r e c o n s t a n t f o r a g i v e n i n s t r u m e n t , V i s t h e o p e r a t i n g f a c t o r t h a t c o n t r o l s t h e q v a l u e , h e n c e t h e s t a b i l i t y , o f i o n s a t a p a r t i c u l a r m / z i n t h e i o n t r a p ( F i g u r e 2 . 4 ) . E q u a t i o n 1 5 i n d i c a t e s t h a t q i s p r o p o r t i o n a l t o V f o r a g i v e n m / z , a n d i n v e r s e l y p r o p o r t i o n a l t o m / z f o r a g i v e n V . I o n s a t a p a r t i c u l a r m / z m o v e a t t h e i r o w n c h a r a c t e r i s t i c s e c u l a r f r e q u e n c y u n d e r g i v e n V a n d q v a l u e s . N o t e t h a t e q u a t i o n 1 5 a l s o a p p l i e s t o t h e s u p p l e m e n t a r y R F . T h e e f fi c i e n c y o f i o n t r a p p i n g i s r e p r e s e n t e d b y t h e D e h m e l t p s e u d o w e l l p o t e n t i a l ( D , i n t h e u n i t o f e V ) w h i c h i s a f u n c t i o n o f t h e q v a l u e ( E q u a t i o n 1 6 ) . T h e p o t e n t i a l w e l l d e p t h D d e c i d e s t h e a m o u n t o f k i n e t i c e n e r g y t h a t a n i o n m a y a c q u i r e t h r o u g h r e s o n a n t - e x c i t a t i o n , b e f o r e b e i n g d e s t a b i l i z e d a n d e j e c t e d f r o m t h e t r a p . 0 : 3 ; - ( 1 6 ) T h e f u n d a m e n t a l a x i a l s e c u l a r f r e q u e n c y f o r a n i o n a t a g i v e n m / z i n t h e t r a p i s d e t e r m i n e d b y E q u a t i o n 1 7 , w h e r e Q i s t h e m a i n d r i v e f r e q u e n c y , a n d B i s t h e b o u n d a r y v a l u e a p p r o x i m a t e l y d e t e r m i n e d b y q a s s h o w n i n E q u a t i o n 1 8 . - 3 ( o — 2 ( 1 7 ) , 6 : q 2 / 2 ( 1 8 ) 7 3 0 , 2 - S t a b l e i g n s R F e ° q e j = c 0 t . i 9 o n a 0 8 t s q a t = i b l 0 i . 7 t y 8 b o u n d a r y O p e r a t i n g l i n e I I 1 . 0 1 . 2 q F i g u r e 2 . 4 S t a b i l i t y d i a g r a m o f i o n s o f d i f f e r e n t m / z i n t h e 3 - D q u a d r u p o l e i o n t r a p ( u p p e r g r a p h ) , a n d t h e t r a p p i n g e f fi c i e n c y r e p r e s e n t e d b y t h e D e h m e l t p o t e n t i a l ( D ) i n e V ( l o w e r g r a p h , r i g h t a x i s ) a s a f u n c t i o n o f t h e q v a l u e . T h e b a l l s o f i n c r e a s i n g s i z e r e p r e s e n t i o n s w i t h i n c r e a s i n g m / z . E R E r e p r e s e n t s t h e e n e r g y r e q u i r e d t o d e s t a b i l i z e a n d e j e c t t h e i o n s ( a d a p t e d f r o m [ 1 7 1 ] ) . 2 . 4 . 2 . 4 M S / M S a n d M s n i n q u a d r u p o l e i o n t r a p T a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y M S / M S a n d M S n i n q u a d r u p o l e i o n t r a p i s “ t a n d e m - i n - t i m e ” , a n d i s a c h i e v e d i n t h e s a m e t r a p s p a c e b y o p e r a t i n g a t d i f f e r e n t m o d e s a s a 7 4 f u n c t i o n o f t i m e ( F i g u r e 2 . 5 ) . S u c c e s s i v e m u l t i s t a g e f r a g m e n t a t i o n c a n b e c a r r i e d o u t s i m i l a r l y t o o b t a i n M S n s p e c t r a . E j e c t i o n f o r m a s s a n a l y s i s % g I s o l a t r o n F r a g m e n t a t i o n D r i v e R F g [ ( 0 3 0 k V ) a _ r S u p p l e m e n t a r y . . . . . 1 E R F ( 0 - 2 0 V ) L . - - . I | . _ I t i m e F i g u r e 2 . 5 O p e r a t i o n m o d e s o f q u a d r u p o l e i o n t r a p a s a f u n c t i o n o f t h e d r i v e R F a n d s u p p l e m e n t a r y R F a m p l i t u d e s i n a n M S / M S e x a m p l e ( a d a p t e d f r o m [ 1 7 2 ] ) . I o n m o t i o n s i n t h e i o n t r a p a r e c o n t r o l l e d b y t h e s e t t i n g s o f t h e d r i v e R F a n d t h e s u p p l e m e n t a r y R F . B a s e d o n t h e i o n m o t i o n s , t h e q u a d r u p o l e i o n t r a p c a n b e o p e r a t e d i n t h e f o l l o w i n g m o d e s : 1 ) T r a p p i n g i o n s i n t h e t r a p . I o n s i n j e c t e d i n t o t h e i o n t r a p a b o v e a c e r t a i n m / z v a l u e d e t e r m i n e d b y t h e a p p l i e d d r i v e R F a m p l i t u d e ( c o r r e s p o n d i n g t o q = 0 . 9 0 8 s t a b i l i t y l i m i t ) , h a v e s t a b l e t r a j e c t o r i e s ( F i g u r e 2 . 4 a n d E q u a t i o n 1 5 ) a n d c a n b e s t o r e d i n t h e t r a p . C o l l i s i o n w i t h t h e b a t h g a s H e ( t y p i c a l l y a t 1 0 ' 3 t o r r ) r e m o v e s e x c e s s i v e d y n a m i c e n e r g y f r o m t h e i o n s , d a m p e n s t h e i r t r a j e c t o r i e s , a n d h e l p s t o f o c u s t h e m i n t o t h e c e n t e r o f t h e t r a p f o r m o r e e f fi c i e n t t r a p p i n g . 7 5 2 ) 3 ) 4 ) I s o l a t i o n o f t h e p r e c u r s o r i o n s . A m o n g t h e v a r i e t y o f m e t h o d s t o i s o l a t e i o n s , t h e f r e q u e n c y n o t c h i s o l a t i o n i s a d o p t e d b y t h e i o n t r a p s m a n u f a c t u r e d b y T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c . T h e d r i v e R F a m p l i t u d e i s a t fi r s t i n c r e a s e d t o m o v e t h e i o n s o f i n t e r e s t c l o s e t o q = 0 . 7 8 , t h e n t h e s u p p l e m e n t a r y R F c o n t a i n i n g t h e c o m b i n a t i o n o f a n u m b e r o f f r e q u e n c i e s , e x c e p t f o r t h e f r e q u e n c i e s a r o u n d t h e m / z o f i n t e r e s t , i s a p p l i e d , s o t h a t a l l o f t h e i o n s , o t h e r t h a n t h e i o n s a t t h e m / z o f i n t e r e s t , a r e r e s o n a n t l y e j e c t e d o u t o f t h e t r a p . F r a g m e n t a t i o n o f i s o l a t e d p r e c u r s o r i o n s . S e l e c t i v e r e s o n a n t a c t i v a t i o n i s o f t e n e m p l o y e d t o f r a g m e n t t h e p r e c u r s o r i o n s . A l o w - a m p l i t u d e s u p p l e m e n t a r y R F a t t h e s e c u l a r f r e q u e n c y o f t h e p r e c u r s o r i o n s o f i n t e r e s t i s s u p e r i m p o s e d t o i n c r e a s e t h e k i n e t i c e n e r g y f o r t h e i o n s t o e n e r g e t i c a l l y c o l l i d e w i t h t h e b a t h g a s ( H e ) , r e s u l t i n g i n i n t e r n a l e n e r g y d e p o s i t i o n , a n d s u b s e q u e n t f r a g m e n t a t i o n T h e r e s u l t a n t p r o d u c t i o n s a r e c o o l e d b y c o l l i d i n g w i t h t h e b a t h g a s u p o n f o r m a t i o n , a n d p r e v e n t e d f r o m f u r t h e r d i s s o c i a t i o n , b e c a u s e t h e i r m / z v a l u e s , a n d t h u s t h e s e c u l a r f r e q u e n c i e s , a r e n o w d i f f e r e n t f r o m t h a t o f t h e p r e c u r s o r i o n . S u c h C I D d i s s o c i a t i o n i n a n i o n t r a p i s a s l o w - h e a t i n g t h e r m a l , r a t h e r t h a n d y n a m i c , p r o c e s s i n n a t u r e , a n d r e s u l t s i n a B o l t z m a n , o r t r u n c a t e d B o l t z m a n , e n e r g y d i s t r i b u t i o n o f i o n s p r i o r t o d i s s o c i a t i o n [ 1 7 3 ] , w h i c h m a k e s t h e l o w e s t e n e r g y d i s s o c i a t i o n p a t h w a y s d o m i n a t e t h e f r a g m e n t a t i o n , a n d t h e t a n d e m m a s s s p e c t r a e a s i e r t o p r e d i c t . W i t h o u t t h e r e s o n a n t e x c i t a t i o n , c o l l i s i o n o f t h e i o n s w i t h t h e b a t h g a s ( H e ) a l o n e i s n o t s u f fi c i e n t t o c a u s e t h e i o n s t o f r a g m e n t w i t h i n a s h o r t t i m e s p a n . E j e c t i o n o f i o n s f o r m a s s a n a l y s i s . F o r m a s s a n a l y s i s , w h i l e t h e s u p p l e m e n t a r y R F i s a p p l i e d a t a c e r t a i n a m p l i t u d e a n d f r e q u e n c y , t h e a m p l i t u d e o f t h e d r i v e R F i s 7 6 i n c r e a s e d t o s e q u e n t i a l l y b r i n g i o n s o f i n c r e a s i n g m / z i n t o r e s o n a n c e w i t h t h e s u p p l e m e n t a r y R F ( t y p i c a l l y a t q = 0 . 7 8 ) , s u c h t h a t t h e r a p i d i n c r e a s e i n k i n e t i c e n e r g y d u e t o r e s o n a n c e e j e c t s t h e i o n s f r o m t h e t r a p a n d s e n d s t h e m t o t h e d e t e c t o r f o r i o n a b u n d a n c e m e a s u r e m e n t ( F i g u r e s 2 . 4 a n d 2 . 5 ) . T h i s i s a l s o h o w a M S s p e c t r u m i s o b t a i n e d . T h e b o u n d a r y e j e c t i o n a t q = 0 . 9 0 8 s t a b i l i t y l i m i t i s n o t p r a c t i c a l l y u s e d , d u e t o l o w e r i o n t r a n s f e r e f fi c i e n c y . S i n c e t h e s l o w - h e a t i n g m e c h a n i s m f o r l o w e n e r g y C I D f r a g m e n t a t i o n i n q u a d r u p o l e i o n t r a p t y p i c a l l y r e s u l t s i n p r o d u c t i o n s f o r m e d fi o m a s i n g l e f r a g m e n t a t i o n w i t h t h e l o w e s t l e v e l o f e n e r g y r e q u i r e m e n t [ 1 7 3 ] , t h e p r o d u c t i o n s f r o m m u l t i p l e s t a g e s o f f r a g m e n t a t i o n a r e t y p i c a l l y n o t o b s e r v e d u n l e s s f u r t h e r M S n i s a p p l i e d . T h e b a t h g a s . - 3 . ( H e ) p r e s s u r e r s u s u a l l y s e t c o n s t a n t a t 1 0 t o r r , a n d t h e p e r c e n t a g e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f v a r i o u s p r o d u c t i o n s i s n o t s e n s i t i v e t o t h e n o r m a l i z e d c o l l i s i o n e n e r g y a p p l i e d i n t h e i o n t r a p o n c e t h e f r a g m e n t a t i o n , o c c u r s . S u c h a n i n s t r u m e n t a l p r o p e r t y m a k e s t h e M S / M S a n d M S n s p e c t r a o f l i p i d s a c q u i r e d f r o m t h e q u a d r u p o l e i o n t r a p h i g h l y r e p r o d u c i b l e a n d i n f o r m a t i v e i n t h e s t u d y o f l i p i d s g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s , a s w e l l a s f o r t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y - b a s e d i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n a n a l y s i s . H o w e v e r , a q u a d r u p o l e i o n t r a p h a s a l i m i t e d p r o d u c t i o n m / z r a n g e , o r i g i n a t i n g f r o m h o w t h e C I D f r a g m e n t a t i o n i s c a r r i e d o u t . T h e l o w e s t m / z l i m i t f o r m a s s a n a l y s i s , t e r m e d t h e l o w m a s s c u t - o f f ( L M C O ) i s a p e r c e n t a g e o f t h e p r e c u r s o r i o n m / z , d e t e r m i n e d b y t h e r a t i o o f t h e a c t i v a t i o n q ( t y p i c a l l y 0 . 2 5 ) a t w h i c h t h e p r e c u r s o r i o n i s a c t i v a t e d o v e r t h e s t a b i l i t y b o u n d a r y q ( 0 . 9 0 8 ) , a c c o r d i n g t o E q u a t i o n 1 5 a n d F i g u r e 2 . 4 . 7 7 T h e a c t i v a t i o n q c a n b e d e c r e a s e d t o p u s h t h e L M C O l o w e r , b u t t h e l o w e r t h e q , t h e s h a l l o w e r t h e p o t e n t i a l w e l l ( F i g u r e 2 . 4 a n d E q u a t i o n 1 6 ) , a n d m o r e i o n s w i l l b e c o m e l e s s s t a b l e a n d g e t l o s t d u r i n g t h e a c t i v a t i o n . I n l i p i d a n a l y s i s , t h e p r e c u r s o r i o n s a r e o f t e n s i n g l y o r d o u b l y c h a r g e d i n t h e r a n g e o f m / z 6 0 0 - 9 0 0 . F o r e x a m p l e , w h e n m / z 7 0 0 i s a c t i v a t e d a t q = 0 . 2 5 , t h e L M C O i s m / z 1 9 3 . T h i s i s u s u a l l y t o o h i g h t o d e t e c t m o s t o f t h e s i g n a t u r e M S / M S f r a g m e n t i o n s o f t h e l i p i d s . D e c r e a s i n g a c t i v a t i o n q t o 0 . 2 0 , L M C O i s t h e n m / z 1 5 4 , a l l o w i n g s o m e o f t h e l i p i d h e a d g r o u p f r a g m e n t i o n s t o b e d e t e c t e d , b u t i n c o m b i n a t i o n w i t h t h e s l o w - h e a t i n g d i s s o c i a t i o n m e c h a n i s m i n t h e i o n t r a p , c o n s i d e r i n g t h e c o m p l i c a t e d c o m p o s i t i o n s o f a l i p i d m i x t u r e , i t i s o f t e n n e c e s s a r y t o g o t o M S n f o r fi r r t h e r s t r u c t u r a l c o n fi r m a t i o n o f t h e m o l e c u l a r s p e c i e s o f t h e l i p i d s i n t h e m i x t u r e . A n o t h e r l i m i t a t i o n i n a n i o n t r a p i s t h e s p a c e c h a r g e e f f e c t a r i s i n g f r o m t h e C o u l o m b i c r e p u l s i o n b e t w e e n i o n s w i t h t h e s a m e c h a r g e t y p e o c c u p y i n g t h e s a m e s p a c e , m a k i n g i t n e c e s s a r y t o l i m i t t h e n u m b e r o f i o n s i n t h e t r a p . A u t o m a t i c g a i n c o n t r o l ( A G C ) i s t h u s a p p l i e d t o c o n t r o l t h e n u m b e r o f i o n s i n t h e t r a p a n d p r e v e n t t h e o c c u r r e n c e o f t h e s p a c e c h a r g e e f f e c t , b y i n c o r p o r a t i n g a t e s t i n g p r e - s c a n , a n d t h e n a d j u s t i n g t h e i o n i n j e c t i o n p a r a m e t e r s a c c o r d i n g l y . N o n e t h e l e s s , t h e q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r i s m a r k e d w i t h t h e v e r s a t i l i t y o f c a r r y i n g o u t g a s - p h a s e i o n m a n i p u l a t i o n s , i n c l u d i n g M S n ( t y p i c a l l y n = 2 t o 1 2 ) , h i g h M S / M S e f fi c i e n c y ( S O - 9 5 % ) d u e t o t h e c o n t i n u o u s a n d m a s s s e l e c t i v e a c t i v a t i o n o f t h e p r e c u r s o r i o n s , r a p i d a n a l y s i s ( u p t o 1 3 , 0 0 0 D a / s e c ) a n d f e m t o m o l e l i m i t s o f d e t e c t i o n , a n d i s t h e r e f o r e p a r t i c u l a r l y p o w e r f u l i n t h e i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f l i p i d s i n c o m p l e x m i x t u r e s w i t h o u t p r e v i o u s s e p a r a t i o n . I n a d d i t i o n t o 7 8 t h e o r i g i n a l 3 - D P a u l i o n t r a p , t h e 2 - D l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p h a s a l s o b e e n r e c e n t l y d e v e l o p e d w i t h m u c h h i g h e r s e n s i t i v i t y a n d i o n e f fi c i e n c y [ 1 7 0 ] . 2 . 4 . 2 . 5 F a c t o r s a f f e c t i n g l i p i d a n a l y s i s r e s u l t s u s i n g q u a d r u p o l e i o n t r a p S e v e r a l o p e r a t i n g p a r a m e t e r s o f t a n d e m M S d i r e c t l y a f f e c t t h e r e s u l t s o f l i p i d a n a l y s i s . S c a n n i n g t h e R F a t a s l o w e r r a t e i n c r e a s e s t h e r e s o l u t i o n , b u t p r o l o n g s t h e a n a l y s i s t i m e . I n t h e l i n e a r i o n t r a p L T Q ( T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c ) , t h e e n h a n c e d s c a n m o d e i s t y p i c a l l y s u f fi c i e n t t o o b t a i n u n i t r e s o l u t i o n o f t h e l i p i d p e a k s , w h i c h a r e m a i n l y s i n g l y o r d o u b l y c h a r g e d , w h e r e a s t h e z o o m a n d u l t r a - z o o m s c a n s t a k e t o o l o n g f o r t h e E S I l i p i d a n a l y s i s , b u t t h e i r r e s o l u t i o n s a r e s t i l l i n s u f fi c i e n t t o r e s o l v e t h e o v e r l a p p i n g s p e c i e s , w h i c h o f t e n d i f f e r o n l y b y a f e w h u n d r e d t h s o f o n e D a . T h e i n c r e a s e i n t h e a c t i v a t i o n q v a l u e i n c r e a s e s t h e t r a p p i n g e f fi c i e n c y , r e p r e s e n t e d b y t h e p s e u d o - p o t e n t i a l w e l l d e p t h , b u t a l s o r a i s e s l o w - m a s s - c u t - o f f , d i s a b l i n g d e t e c t i o n o f t h e s i g n a t u r e l o w e r m a s s f r a g m e n t i o n s o f t e n o b s e r v e d . T y p i c a l l y a n a c t i v a t i o n q o f 0 . 2 0 - 0 . 2 5 e n a b l e s b o t h e f fi c i e n t t r a p p i n g a n d t h e d e t e c t i o n o f c o m m o n f r a g m e n t i o n s f r o m l i p i d h e a d g r o u p s . T h e l o n g e r t h e a c t i v a t i o n t i m e , t h e m o r e e n e r g y t h e p r e c u r s o r i o n s c a n r e c e i v e i n o r d e r t o f r a g m e n t , a n d 3 0 m s e c i s a p p l i c a b l e f o r m o s t l i p i d s i o n s , b u t i t c a n b e r a i s e d t o p o t e n t i a l l y i n c r e a s e f r a g m e n t a t i o n e f fi c i e n c y . A u t o m a t i c g a i n c o n t r o l w a s a d o p t e d t o c o n t r o l t h e n u m b e r o f i o n s i n t h e t r a p , i n o r d e r t o p r e v e n t t h e s p a c e c h a r g e e f f e c t s , w h i c h c a n s k e w m / z d e t e c t i o n a n d q u a n t i t a t i v e p r o p e r t i e s a n d d e c r e a s e r e s o l u t i o n . T h e t a r g e t n u m b e r l i m i t s t h e n u m b e r o f i o n s s t o r e d i n t h e t r a p b e f o r e t h e y a r e e j e c t e d , a n d f o r t h e e n h a n c e d s c a n m o d e i n l i p i d a n a l y s i s u s i n g a n 7 9 E S I s o u r c e , i t i s t y p i c a l l y 1 e 4 f o r M S , a n d 3 e 4 f o r M S / M S i n a T h e r m o l i n e a r i o n t r a p . M a x i m u m i n j e c t i o n t i m e d e fi n e s t h e t i m e a l l o w e d f o r t h e p r o d u c t i o n s t o fi l l t h e t r a p b e f o r e t h e y a r e e j e c t e d f o r d e t e c t i o n . U s u a l l y , a h i g h e r m a x i m u m i n j e c t i o n t i m e c a n s i g n i fi c a n t l y i m p r o v e t h e d e t e c t e d t a n d e m M S s p e c t r a o f l o w e r a b u n d a n c e p r e c u r s o r i o n s a n d l e s s s t a b l e fi a g m e n t a t i o n s . I t w o r k s c l o s e l y w i t h t h e t a r g e t n u m b e r s e t t i n g , a n d i s p a r t i c u l a r l y i m p o r t a n t w h e n M S / M S i s u s e d f o r q u a n t i fi c a t i o n a n a l y s i s . I f t h e m a x i m u m i n j e c t i o n t i m e i s “ m a x e d o u t ” b e f o r e t h e t a r g e t n u m b e r i s r e a c h e d , t h e n t h e c o n v e r s i o n a l g o r i t h m o f t h e i o n a b u n d a n c e i s d i f f e r e n t , a n d t h e r e s u l t a n t M S / M S s p e c t r u m c a n n o t b e d i r e c t l y u s e d f o r a q u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n . T h e p r e c u r s o r i o n s c a n a n d n e u t r a l l o s s s c a n M S / M S s p e c t r a r e s u l t s a r e s i m i l a r t o t h o s e fi ' o m t h e t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r b u t a r e o b t a i n e d t h r o u g h d i f f e r e n t o p e r a t i o n m e c h a n i s m s , a n d c a n b e o b t a i n e d f r o m t h e i o n t r a p s b y i n c o r p o r a t i n g s p e c i fi c d a t a p r o c e s s i n g i n t h e “ i o n m a p p i n g ” o p t i o n s o f t h e T h e r m o i n s t r u m e n t s . 2 . 4 . 2 . 6 O t h e r d i s s o c i a t i o n m e t h o d s i n t h e q u a d r u p o l e i o n t r a p T h e i o n t r a p p i n g f u n c t i o n o f a q u a d r u p o l e i o n t r a p a l l o w s a n u m b e r o f g a s - p h a s e r e a c t i o n s t o b e a p p l i e d t o t h e t r a p p e d i o n s i n s u c h a “ r e a c t o r , ” i n c l u d i n g t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s , t h r o u g h s e v e r a l a p p r o a c h e s . I n a d d i t i o n t o C I D , s e l e c t e d p r e c u r s o r i o n s c a n a l s o b e f r a g m e n t e d o r m a n i p u l a t e d i n t h e q u a d r u p o l e i o n t r a p u s i n g m e t h o d s s u c h a s c o l l i s i o n w i t h a r e a c t i v e g a s ( s u c h a s o z o n e o r D 2 0 ) [ 1 7 4 , 1 7 5 ] , a l a s e r b e a m ( l a s e r i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ) [ 1 7 1 ] a n d p o t e n t i a l l y a n e l e c t r o n b e a m ( e l e c t r o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ) [ 1 7 1 ] , a n d e l e c t r o n t r a n s f e r d i s s o c i a t i o n ( E T D ) [ 1 7 6 ] . 8 0 T h e r e c e n t p u l s e d - Q d i s s o c i a t i o n ( P Q D ) m e t h o d w a s d e v e l o p e d [ 1 7 7 ] t o a d d r e s s t h e l o w m a s s c u t - o f f i s s u e i n C I D f r a g m e n t a t i o n b y q u i c k l y a c t i v a t i n g t h e i o n s a t q = 0 . 7 5 , a n d t h e L M C O c a n b e e x t e n d e d d o w n t o m / z 3 0 f o r l i p i d p r e c u r s o r i o n s . A l t h o u g h t h e t r a p p i n g a n d fi ' a g m e n t a t i o n e f fi c i e n c y a r e o f t e n l o w a n d m o r e s e n s i t i v e t o t h e c o l l i s i o n e n e r g y c h o i c e , a n d h i g h e r e n e r g y f r a g m e n t a t i o n c h a n n e l s a r e p o t e n t i a l l y i n t r o d u c e d , i t c a n b e a s u p p l e m e n t t o l i p i d C I D a n a l y s i s f o r q u i c k l o w - m a s s fi n g e r p r i n t i o n i d e n t i fi c a t i o n i n M S / M S . g E T D , w h i c h c a n k e e p t h e p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n s o f p e p t i d e s i n t a c t w h i l e i n d u c i n g f r a g m e n t a t i o n s a t s i t e s d i f f e r e n t f r o m t h o s e o f C I D d i s s o c i a t i o n [ 1 7 6 ] , h a s a l s o b e e n r e c e n t l y a p p l i e d t o s o d i u m a d d u c t s o f G P C h o l i p i d s t a n d a r d s i n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e f r a g m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s [ 1 7 8 ] . 2 . 4 . 2 . 7 O t h e r m a s s ( m / z ) a n a l y z e r s I n a d d i t i o n t o t r i p l e q u a d r u p o l e a n d q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s a n a l y z e r s , m e d i u m t o h i g h r e s o l u t i o n m a s s a n a l y z e r s s u c h a s T O F , a n d h i g h r e s o l u t i o n m a s s a n a l y z e r s s u c h a s F T - I C R a n d O r b i - t r a p , h a v e a l s o b e e n a p p l i e d i n l i p i d i d e n t i fi c a t i o n b y r e l y i n g o n t h e a c c u r a t e m e a s u r e m e n t o f m / z a t h i g h r e s o l u t i o n i n M S [ 1 7 9 ] . F T - I C R c a n c a r r y o u t t a n d e m - i n - t i m e M S / M S b y i n c o r p o r a t i n g C I D , w h e r e a s T O F a n d O r b i - t r a p a r e r e s t r i c t e d t o o n l y o n e s t a g e o f m a s s m e a s u r e m e n t , a n d t a n d e m M S / M S c a n o n l y b e a c h i e v e d i n - s p a c e t h r o u g h c o u p l i n g w i t h a q u a d r u p o l e i o n t r a p ( L I T - O r b i - t r a p ) , o r 3 T O P ( T O F - T O F ) m a s s s p e c t r o m e t e r . 8 1 2 . 4 . 3 I o n d e t e c t i o n I o n d e t e c t o r s m e a s u r e t h e a b u n d a n c e o f i o n s e j e c t e d a t d i f f e r e n t m / z . M o s t o f t h e m o d e r n m a s s s p e c t r o m e t e r s u s e a n e l e c t r o n m u l t i p l i e r f o r t h e d e t e c t i o n o f i o n a b u n d a n c e . F o r t h e n e g a t i v e i o n m o d e , n e g a t i v e i o n s a r e a t fi r s t c o n v e r t e d t o p o s i t i v e i o n s a n d t h e n m e a s u r e d w i t h t h e s a m e i n s t r u m e n t . 2 . 5 T o o l s t o u n r a v e l t h e m e c h a n i s m s o f M S ' I f r a g m e n t a t i o n o f l i p i d s T h e f r a g m e n t a t i o n o f l i p i d s d e p e n d s o n t h e s t r u c t u r e , p o l a r i t y , c h a r g e s t a t e , a n d c h a r g e d i s t r i b u t i o n o f t h e l i p i d i o n s . U n d e r s t a n d i n g h o w t h e l i p i d s f r a g m e n t i s o f e s s e n t i a l i m p o r t a n c e t o t h e a p p l i c a t i o n o f d e t e r m i n i n g t h e d i f f e r e n t t y p e s o f l i p i d s b y t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ( s e e C h a p t e r 1 f o r l i p i d s t r u c t u r e s ) . B e c a u s e o f t h e i r m o l e c u l a r c o m p o s i t i o n a n d i o n i z a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s , m o s t l i p i d s p r e s e n t i n c e l l m e m b r a n e s f a l l i n t h e n a r r o w r a n g e b e t w e e n m / z 6 0 0 a n d 1 6 0 0 r e s u l t i n g i n s i g n i fi c a n t o v e r l a p p i n g o f p e a k s i n M S , a n d t h e y a r e p a r t i c u l a r l y c r o w d e d i n t h e m / z 6 0 0 - 9 0 0 r e g i o n . T h e s e r e g i o n s a r e f u r t h e r c o m p l i c a t e d b y t h e v a r i o u s c a t i o n i c o r a n i o n i c a d d u c t s f o r m e d b y t h e l i p i d s . S i m p l y m a t c h i n g t h e m / z o f t h e M S p e a k s w i t h t h e c a l c u l a t e d m a s s e s o f p o s s i b l e l i p i d s c a n l e a d t o s i g n i fi c a n t a m b i g u i t y , e v e n w i t h h i g h r e s o l u t i o n a n a l y z e r s . I n M S / M S o r f u r t h e r M S n , t h e p r e c u r s o r i o n s f o r m e d f r o m d i f f e r e n t l i p i d s , w h i c h f r a g m e n t c h a r a c t e r i s t i c a l l y a c c o r d i n g t o t h e i n d i v i d u a l l i p i d ’ s m o l e c u l a r s t r u c t u r e , m a k e s p o s s i b l e t h e u n a m b i g u o u s i d e n t i fi c a t i o n o f e a c h l i p i d s p e c i e s , p a r t i c u l a r l y t h o s e t h a t o v e r l a p a t t h e s a m e m / z v a l u e . T a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y i s n o t o n l y e s s e n t i a l f o r l i p i d i d e n t i fi c a t i o n , b u t i s a l s o v e r y u s e f u l i n i m p r o v i n g t h e s e n s i t i v i t y 8 2 a n d a c c u r a c y o f l i p i d q u a n t i fi c a t i o n u s i n g c o m p l e x u n - s e p a r a t e d l i p i d m i x t u r e s a t a m i n i m u m s a m p l e a m o u n t , b y e l i m i n a t i n g t h e i n t e r f e r e n c e f r o m c h e m i c a l n o i s e i n M S . I t i s t h e r e f o r e o f p i v o t a l i m p o r t a n c e t o g a i n a s o l i d u n d e r s t a n d i n g o f t h e f r a g m e n t a t i o n p r o c e s s o f l i p i d s , a n d w h a t f a c t o r s m i g h t a f f e c t t h e i r f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r . H o w e v e r , t h e k n o w l e d g e o f g a s - p h a s e l i p i d f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r i n m o d e r n m a s s s p e c t r o m e t e r s i s s o f a r r e l a t i v e l y l i m i t e d c o m p a r e d t o t h a t o f p e p t i d e s . ‘ S o fi ’ i o n i z a t i o n s o u r c e s s u c h a s M A L D I a n d E S I c a n g e n e r a t e a b u n d a n t i n t a c t l i p i d p r e c u r s o r i o n s , a n d i n c o m b i n a t i o n w i t h l o w - e n e r g y C I D M S / M S a n d M S “ , t h e y p r o v i d e p o w e r f u l t o o l s f o r p r o b i n g t h e g a s - p h a s e b e h a v i o r o f l i p i d i o n s . S e v e r a l t o o l s t h a t h a v e b e e n s u c c e s s f u l l y a p p l i e d i n u n r a v e l i n g t h e g a s - p h a s e b e h a v i o r o f a m i n o a c i d a n d p e p t i d e i o n s c a n a l s o b e a p p l i e d t o s t u d y i n g l i p i d i o n s . 2 . 5 . 1 P r o b i n g f r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s a n d p r o d u c t i o n s t r u c t u r e s u s i n g M S / M S a n d M S n e x p e r i m e n t s T a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y , p a r t i c u l a r l y l o w - e n e r g y C I D M S / M S i n t h e t r i p l e q u a d r u p o l e , a n d C I D M S / M S a n d M S n i n t h e q u a d r u p o l e i o n t r a p , c a n n o t o n l y p r o v i d e s i g n a t u r e f r a g m e n t a t i o n s p e c t r a o f t h e p r e c u r s o r i o n s , b u t a l s o c o n s t r u c t a f r a g m e n t a t i o n t r e e t o t r a c e t h e o r i g i n o f e a c h o f t h e p r o d u c t i o n s , e i t h e r t h r o u g h t h e u s e o f c o l l i s i o n - e n e r g y - r e s o l v e d C I D M S / M S p r o d u c t i o n a b u n d a n c e p l o t s t o r e v e a l t h e fi r s t a n d s e c o n d - g e n e r a t i o n p r o d u c t i o n s ( t r i p l e q u a d r u p o l e ) , o r t h r o u g h s e q u e n t i a l M S n s p e c t r a ( q u a d r u p o l e i o n t r a p ) . T h e s t r u c t u r a l i d e n t i t y o f t h e p r o d u c t i o n s c a n b e e s t a b l i s h e d b y 8 3 f u r t h e r M S 1 1 a n a l y s i s a n d b y c o m p a r i s o n w i t h t h e M S / M S f r a g m e n t a t i o n o f i n d e p e n d e n t l y s y n t h e s i z e d t a r g e t s t r u c t u r e s o r s t r u c t u r a l a n a l o g s o f t h e p r o d u c t s . 2 . 5 . 2 S t r u c t u r a l l a b e l i n g E l u c i d a t i o n o f t h e m e c h a n i s m s o f f r a g m e n t a t i o n u s u a l l y r e q u i r e s a r e v e l a t i o n o f t h e s p e c i fi c f u n c t i o n a l g r o u p o r a t o m s i n v o l v e d i n t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s . C h e m i c a l m o d i fi c a t i o n o f a k e y f u n c t i o n a l g r o u p w o u l d s i g n i fi c a n t l y a f f e c t t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n c h a n n e l s , b y s h u t t i n g d o w n t h e p r e v i o u s r e a c t i o n , a n d s o m e t i m e s b y o p e n i n g u p n e w r o u t e s a n d g e n e r a t i n g n e w p r o d u c t i o n s . T y p i c a l c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s t r a t e g i e s i n c l u d e c o v a l e n t m e t h y l a t i o n , a c e t y l a t i o n o r p r o p y l a t i o n o f t h e h y d r o x y l , c a r b o x y l o r a m i n o g r o u p s , t o a l t e r t h e n u c l e o p h i l i c p r o p e n s i t y a n d e l i m i n a t e t h e a v a i l a b i l i t y o f t h e a c i d i c O H o r N H p r o t o n s ( C h a p t e r 5 ) . G u a n i d i n e m o d i fi c a t i o n w h i c h h a s b e e n a p p l i e d t o p e p t i d e s [ 1 8 0 , 1 8 1 ] c a n a l s o b e a p p l i e d t o s w i t c h t h e c h a r g e s t a t e p r o p e n s i t y o f l i p i d s . 2 . 5 . 3 I s o t o p i c l a b e l i n g M o b i l e p r o t o n t r a n s f e r a n d d e p r o t o n a t i o n h a v e b e e n i n c r e a s i n g l y d i s c o v e r e d t o b e c r i t i c a l s t e p s i n t h e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n o f p e p t i d e s a n d l i p i d s u s i n g t h e s l o w - h e a t i n g l o w - e n e r g y C I D d i s s o c i a t i o n i n p o s i t i v e o r n e g a t i v e i o n m o d e [ 1 8 2 , 1 8 3 ] . T h e i n v o l v e m e n t o f p r o t o n s a t d i f f e r e n t l o c a t i o n s c a n l e a d t o d i f f e r e n t f r a g m e n t a t i o n c h a n n e l s . I s o t o p i c l a b e l i n g i s a n e f fi c i e n t w a y t o l o c a t e t h e p r o t o n s i n v o l v e d i n t h e s e r e a c t i o n s . T y p i c a l l y s o l u t i o n - p h a s e d e u t e r i u m / h y d r o g e n e x c h a n g e ( C H 3 O D o r D 2 0 ) i s e m p l o y e d t o l a b e l c o n v e n t i o n a l a c t i v e h y d r o g e n s s u c h a s t h o s e o n O H a n d N H f u n c t i o n a l g r o u p s [ 1 8 4 ] . G a s - p h a s e d e u t e r i u m / h y d r o g e n e x c h a n g e i n t h e t r a p , b y i n t r o d u c i n g D 2 0 i n t o t h e 8 4 b a t h g a s a t a c e r t a i n p r e s s u r e , h a s a l s o b e e n e x p l o r e d f o r a m i n o a c i d s i o n s [ 1 7 4 ] . H o w e v e r , s i n c e s c r a m b l i n g r e a c t i o n s c a n h a p p e n a t a t i m e - s c a l e f a s t e r t h a n t h a t o f i o n d i s s o c i a t i o n v i a C I D w i t h i n t h e i o n t r a p o r q u a d r u p o l e , c a u t i o n h a s t o b e t a k e n w h i l e i n t e r p r e t i n g t h e o b s e r v e d p r o d u c t i o n s p e c t r a . O n t h e o t h e r h a n d , u n l i k e s o l u t i o n - p h a s e r e a c t i o n s , t r a n s f e r s o f n o n - e x c h a n g e a b l e p r o t o n s a r e o fi e n f o u n d t o b e a c t i v e l y i n v o l v e d i n t h e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n o f l i p i d s , a n d t h e s e p r o t o n s c a n b e i d e n t i fi e d b y l a b e l i n g t h r o u g h s y n t h e t i c i n c o r p o r a t i o n [ 1 8 5 ] . O t h e r s t a b l e i s o t o p i c l a b e l i n g s u c h a s 1 3 C , 1 5 N , a n d 1 8 O l a b e l i n g c a n a l s o b e p o t e n t i a l l y a p p l i e d t o e l u c i d a t e t h e b e h a v i o r o f s p e c i fi c f u n c t i o n a l g r o u p s i n t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n o f l i p i d s . 2 . 5 . 4 C o m p u t a t i o n a n d t h e o r e t i c a l m o d e l i n g A b i n i t i o c a l c u l a t i o n i s a c o m p l e m e n t a r y t o o l t o M S 1 1 a n d l a b e l i n g e x p e r i m e n t s , i n o r d e r t o g a i n i n s i g h t s i n t o t h e m o s t e n e r g y - f a v o r e d r e a c t i o n p a t h w a y s b y e v a l u a t i n g t h e e n e r g i e s o f t h e p o t e n t i a l s t r u c t u r e s o f t h e r e a c t a n t s a n d p r o d u c t s [ 1 8 6 ] . 2 . 6 F r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f l i p i d s I n t h e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y o f l i p i d s , a r a n g e o f f r a g n e n t a t i o n c h a n n e l s c a n b e o b s e r v e d , d e p e n d i n g o n t h e s t r u c t u r e , p o l a r i t y a n d c h a r g e s t a t e o f t h e i n d i v i d u a l l i p i d p r e c u r s o r i o n s . F o r e x a m p l e , t h e c h a r a c t e r i s t i c C I D f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s o f G P C h o l i p i d s i n p o s i t i v e i o n m o d e i s t h e f o r m a t i o n o f m / z 1 8 4 c o r r e s p o n d i n g t o t h e p h o s p h a t i d y l c h o l i n e h e a d g r o u p , b u t i n n e g a t i v e i o n m o d e G P C h o l i p i d s i o n i z e b y 8 5 f o r m i n g n o n - c o v a l e n t a d d u c t i o n s w i t h a n i o n s , a n d t h e f r a g m e n t a t i o n i s h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e i d e n t i t y o f t h e a n i o n s ( s e e C h a p t e r 4 f o r a d e t a i l e d d i s c u s s i o n ) . T h e p h o s p h a t e - f r e e n o n - g l y c e r o l - c o n t a i n i n g o r n i t h i n e a n d g l u t a m i n e l i p i d s e a c h p r o d u c e s d i f f e r e n t s e t s o f h e a d g r o u p s p e c i fi c fi n g e r p r i n t i o n s i n C I D M S / M S i n b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s ( s e e C h a p t e r 5 f o r d e t a i l e d d i s c u s s i o n ) . T h e c h a r a c t e r i s t i c C I D M S / M S f r a g m e n t a t i o n s o f t h e c o m m o n t y p e s o f p h o s p h o l i p i d s e x a m i n e d i n r e c e n t s t u d i e s h a v e b e e n c o m p r e h e n s i v e l y s u m m a r i z e d i n s e v e r a l r e v i e w s [ 1 1 7 , 1 8 7 ] . T h e r e f o r e , o n l y a b r i e f s u m m a r y o n t h e k e y a s p e c t s o f c o n s i d e r a t i o n s i n f r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s w i l l b e p r e s e n t e d i n t h i s c h a p t e r . 2 . 6 . 1 F o r m s o f l i p i d s p r e c u r s o r i o n s I n E S I , m o s t l i p i d s f o r m s i n g l y c h a r g e d i o n s i n p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e , i n t h e f o r m o f p r o t o n a t e d i o n s , d e p r o t o n a t e d i o n s , n o n - c o v a l e n t c a t i o n i c a d d u c t i o n s ( a l k a l i o r a m m o n i u m ) , o r a n i o n i c a d d u c t i o n s . M u l t i p l e p h o s p h a t e g r o u p s i n t h e l i p i d s c a n a l s o l e a d t o t h e f o r m a t i o n o f m u l t i p l y c h a r g e d n e g a t i v e i o n s . T h e o b s e r v e d i o n i z a t i o n a n d c h a r g e s t a t e d i s t r i b u t i o n o f l i p i d s a r e d i r e c t l y d e p e n d e n t o n t h e l i p i d s t r u c t u r e s , s p r a y v o l t a g e , i n s t r u m e n t p r e s s u r e a n d s o l v e n t d e s o l v a t i o n c o n d i t i o n s i n t h e m a s s s p e c t r o m e t e r , a n d p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n d e t e r m i n i n g h o w t h e i o n fi ' a g m e n t s i n t h e s u b s e q u e n t M S / M S r e a c t i o n s . A l t h o u g h , d u e t o t h e c h a r g e a c c u m u l a t i o n p r o c e s s ' i n t h e d r o p l e t s a n d c h a r g e m o d i fi c a t i o n t h r o u g h e l e c t r o c h e m i c a l p r o c e s s i n t h e p r o b e t i p , t h e g a s - p h a s e i o n i z a t i o n a n d c h a r g e s t a t e d o e s n o t s i m p l y r e fl e c t t h e c h a r g e s t a t e i n s o l u t i o n d u r i n g E S I , t h e c o m p o n e n t s i n t h e s o l u t i o n s u c h a s a n a m m o n i u m h y d r o x i d e a d d i t i v e , a n d v a r i o u s o t h e r c a t i o n s a n d a n i o n s , s i g n i fi c a n t l y a f f e c t t h e c h a r g e s t a t e o f t h e i o n s o b s e r v e d i n t h e 8 6 g a s p h a s e ( C h a p t e r 4 ) . H o w e v e r , i o n i z a t i o n o f l i p i d s i s n o t s i m p l y d e t e r m i n e d b y t h e s o l u t i o n - p h a s e p K a v a l u e s , s i n c e n e g a t i v e l y c h a r g e d l i p i d i o n s c a n b e o b s e r v e d a t a n E S I s o l u t i o n p H m u c h l o w e r t h a n 7 . L i p i d i o n s g e n e r a t e d b y D E S I w e r e f o u n d t o b e v e r y s i m i l a r t o t h o s e b y E S I [ 1 1 2 ] . I n M A L D I , a l l o f t h e l i p i d s a r e o b s e r v e d a s s i n g l y c h a r g e d i o n s i n p o s i t i v e o r n e g a t i v e i o n m o d e s , i n c l u d i n g t h e p r o t o n a t e d i o n s , a l k a l i - a d d u c t p o s i t i v e i o n s , a n d d e p r o t o n a t e d i o n s , p r o b a b l y b e c a u s e t h e d e n s i t y o f r e a c t i v e s p e c i e s i n M A L D I c a n s t r i p t h e m u l t i p l e c h a r g e s s u c h t h a t o n l y t h e s i n g l y c h a r g e d i o n s c a n s u r v i v e . 2 . 6 . 2 C h a r a c t e r i s t i c M S / M S f i n g e r p r i n t s f o r l i p i d c l a s s i d e n t i f i c a t i o n T h e m o s t c o m m o n l y o b s e r v e d c h a r a c t e r i s t i c M S / M S f r a g m e n t a t i o n s o f g l y c e r o p h o s p h o l i p i d s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . 1 b a s e d o n t h e m a j o r s i t e s o f c l e a v a g e s h o w n i n S c h e m e 2 . 1 . I t i s c l e a r t h a t m o s t c a s e s o f d i s s o c i a t i o n o c c u r a t t h e p h o s p h a t i d e b o n d s o r a c y l e s t e r b o n d s , b u t d u e t o d i f f e r e n c e s i n t h e c h a r g e s t a t e o f t h e i o n a n d t h e i d e n t i t y o f t h e p o l a r h e a d g r o u p , t h e s a m e m o i e t y c a n b e c l e a v e d i n d i f f e r e n t f o r m s . F o r e x a m p l e , d e p e n d i n g o n t h e l i p i d t y p e , i n b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s , t h e f a t t y a c y l c h a i n s c a n b e l o s t a s a f a t t y a c i d o r a s a n e u t r a l k e t e n e ( e q u i v a l e n t t o d e h y d r a t e d f a t t y a c i d ) . I n n e g a t i v e i o n m o d e , i t c a n a l s o b e c l e a v e d a s f a t t y a c i d a n i o n s . I t c a n a l s o b e s e e n f r o m T a b l e 2 . 1 t h a t t h e f o r m a t i o n o f n o n - c o v a l e n t a d d u c t i o n s w i t h a n a n i o n o r c a t i o n , s i g n i fi c a n t l y c h a n g e t h e f r a g m e n t a t i o n c h a n n e l s o f t h e l i p i d i o n s . F o r i n s t a n c e , w h i l e t h e p r o t o n a t e d G P C h o i s w e l l c h a r a c t e r i z e d t o f r a g m e n t b y f o r m i n g t h e p h o s p h a t i d y l c h o l i n e h e a d g r o u p i o n a t m / z 1 8 4 , t h e a d d u c t i o n o f G P C h o b y t h e s o d i u m i o n s w i t c h e s t h e r e a c t i o n t o r e s u l t i n t h e f o r m a t i o n o f t h e n e u t r a l l o s s o f 5 9 D a 8 7 c o r r e s p o n d i n g t o t r i m e t h y l a m i n e , w h i c h i s a l s o h i g h l y c h a r a c t e r i s t i c t o t h e h e a d g r o u p [ 1 8 8 ] . 8 8 e c n ] ] 9 0 3 9 1 1 [ [ e r e f e r * e d ' g ’ ' ' ' 3 3 3 3 a v n o , , , , 3 + . a 3 3 3 3 3 e b e ‘ l c r u t a r e t s i s l o e l h l t a r n n i t , , o , , u e i ‘ ' H H d t O O n O O e c fi O O O O 3 S u C C 5 i t M 1 R R d C C o R R n I r z z z S p / / / L L M m N m m N I e d i y l s u o i o n v I e r p s d i p i l f o s n o i e v i t a g ' ] H - e M n [ e c n e r e ] t 0 a t n e m g a r d f n f e 9 1 r [ ’ e g a v S o a b e M l c 2 / S M I D s s I o C c i t s l l a r t n u i o e r i n e t t c S c a M r I u d o a h S r 1 4 1 L C M p N 1 . 2 e o l i n b e a v T i t + 1 H i + s o M p [ e p y t d i p i l S c h e m e 2 . 1 0 0 \ O G P A [ M - H ] ' G P E t n ” ” 2 1 5 3 1 + 3 + 3 ' + + [ M + L i ] N L 1 4 7 ( L i ) 2 [ 1 9 1 ] + [ M + N a / K ] N L 4 3 . + 2 + [ M - H + N I ] N L 1 2 3 ( N i ) 2 4 r . ] e 5 t 8 p 1 [ a h C c A , / ) s k a ' l o e r I p 9 C 5 e ) c A 3 e 3 3 l 5 5 H 3 1 C + 5 z L / l p i t l 1 u y l P 5 g G 1 - A L z P N / 7 8 L N m m ( G ( m N ' l H ' M [ ] 2 9 1 [ 9 5 L 8 1 L N N ) K d / + ] a N e u n i t n o c 1 . 2 e l b a T ( + ] H + + M M [ [ o r G P G 9 0 G P C h o [ M + H ] + m / z 1 8 4 + [ M + U ] + [ M + 2 L i ] m / z 1 8 4 [ 1 8 8 ] [ M + C l / A c ] ‘ 5 [ 1 8 5 ] , 1 + 3 + 3 ' C h a p t e r 4 S M + [ M + N a / K ] N L 5 9 + [ M + H ] m / z 1 8 4 + [ M + N a / K l N L 5 9 [ M + m . c . ] ‘ [ M - H l ' R C O O ' , N L ( R C O O H + g l y c e r o l ) , N L R C O O H , m / z 1 5 3 3 3 | 1 + 3 , 1 + 3 ' 1 + 3 + 3 ' [ 1 9 3 ] C L + [ M + N a / K ] N [ 1 9 4 ] [ M — H l ' [ 1 9 5 ] p P E + [ M + N a / K ] [ 1 9 6 ] [ M - H l ‘ G P S e r + [ M + H ] N L 1 8 5 + [ M + N a / K l N L 8 8 [ 1 9 7 ] [ M - 2 H + N a / K ] ‘ N L 8 7 m / z 1 5 3 1 1 + 3 + 3 ' [ 1 9 7 ] 1 ] 6 9 ] 9 8 1 r e 9 , t 1 8 p [ 0 a 1 h [ C 1 4 2 8 9 z l L m N ) 0 2 H O + = H C H O = O O H C C O R ' C ( R R L L L N N N ) d e u n i t n o c 1 . 2 e l P - s b n a I T P ( G 9 1 G P I n s W - W ' m / z 2 4 1 m l z 1 5 3 2 1 + 3 + 3 ' [ 1 9 8 ] [ M - 2 H ] 2 ‘ 2 S Q D G W - W ' m / z 2 2 5 N L R C O O H O L + [ M + H ] N L H 2 0 C h a p t e r 5 W ' W ' N L R 2 C O O H T G + [ M + L i ] + [ M + N H 4 ] [ 2 0 0 ] [ 1 6 7 ] I y s o G P C h o + [ M + N a ( N a h [ 2 0 1 ] [ M + C l ] - [ 2 0 1 ] * T h e n u m b e r s d e s i g n a t e t h e s i t e s o f c l e a v a g e a c c o r d i n g t o t h e i l l u s t r a t i o n s h o w n i n S c h e m e 2 . 1 . 2 . 6 . 3 M e c h a n i s t i c a s p e c t s o f t h e f r a g m e n t a t i o n o f l i p i d s i n C I D - M S I M S a n d M S n T h e fi n a l f r a g m e n t a t i o n p r o d u c t i o n s p e c t r a a r e u s u a l l y d e t e r m i n e d b y t h e c o m p e t i t i o n o f s e v e r a l p o t e n t i a l f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s . W h e t h e r t h e f r a g m e n t a t i o n t a k e s p l a c e v i a c h a r g e - d r i v e n o r v i a c h a r g e - r e m o t e m e c h a n i s m s i s d e t e r m i n e d b y t h e c o m b i n a t i o n o f s e v e r a l f a c t o r s [ 2 0 2 , 2 0 3 ] . C o m p a r i s o n o f t h e f r a g m e n t a t i o n o f p h o s p h o l i p i d s w i t h t h a t o f t h e p h o s p h a t e - f r e e l i p i d s i n d i c a t e d t h a t t h e n u c l e o p h i l i c o r n e g a t i v e l y c h a r g e d p h o s p h a t e g r o u p p l a y s a k e y r o l e i n d i c t a t i n g t h e f r a g m e n t a t i o n c h a n n e l s . A s a n e x a m p l e t o i l l u s t r a t e h o w t h e c h a r g e d f u n c t i o n a l g r o u p a n d c h a r g e s t a t e c o u l d a f f e c t t h e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f l i p i d s i n p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s , t h e i n t r o d u c t i o n w i l l f o c u s o n t h e G P E t n l i p i d s [ 1 9 0 ] , w h i c h c a n b e d e t e c t e d i n b o t h E S I a n d M A L D I ( u s i n g a p p r o p r i a t e m a t r i x ) b o t h i n p o s i t i v e a n d i n n e g a t i v e i o n m o d e s , a n d a r e o f t e n t h e m a j o r c o m p o n e n t s o f m e m b r a n e l i p i d s a n d e s s e n t i a l f o r s o m e m e m b r a n e p r o t e i n s . 2 . 6 . 3 . 1 C h a r g e s t a t e : p o s i t i v e v s n e g a t i v e I n E S I , G P E t n f o r m s p r o t o n a t e d i o n s t h a t c a r r y t h e p o s i t i v e c h a r g e a t t h e a m i n o g r o u p o r c a r b o n y l g r o u p i n p o s i t i v e i o n m o d e ( n o t e t h a t a m i n o p r o t o n s c a n b e m o b i l e i n t h e g a s p h a s e ) , a n d d e p r o t o n a t e d i o n s t h a t c a r r y t h e n e g a t i v e c h a r g e a t t h e p h o s p h a t e g r o u p i n n e g a t i v e i o n m o d e . A s s h o w n i n T a b l e 2 . 1 , i n M S / M S t h e p r o t o n a t e d G P E t n m a i n l y f r a g m e n t s b y l o s i n g t h e p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e h e a d g r o u p a s a n e u t r a l l o s s o f 1 4 1 D a ( c l e a v a g e s i t e 2 , S c h e m e 2 . 1 a n d T a b l e 2 . 1 ) , w h e r e a s d e p r o t o n a t e d G P E t n 9 2 i , H 2 S / M — S M > W 9 H w + . . i R U r p r e d o m i n a n t l y f r a g m e n t s b y c l e a v i n g t h e f a t t y a c i d c h a i n s ( c l e a v a g e s i t e s 4 a n d 4 ' , S c h e m e 2 . 1 a n d T a b l e 2 . 1 ) . T h e fi ' a g r n e n t a t i o n i n p o s i t i v e i o n m o d e i s p r o p o s e d t o o c c u r v i a n u c l e o p h i l i c a t t a c k o n t h e s n - 2 p r o t o n i n i t i a t e d b y t h e p h o s p h a t e o x y g e n f o l l o w i n g a p r o t o n m i g r a t i o n t o p u t t h e p o s i t i v e c h a r g e o n t h e c a r b o n y l g r o u p o f t h e f a t t y a c i d c h a i n s [ 1 1 7 ] . T h e c o n t r a s t o f G P E t n l o s i n g t h e h e a d g r o u p a s a n e u t r a l l o s s , t o G P C h o l o s i n g t h e h e a d g r o u p a s a p o s i t i v e p r o d u c t i o n ( S c h e m e 2 . 2 ) , p o i n t s t o t h e k e y f a c t t h a t G P C h o h e a d g r o u p h a s a fi x e d p o s i t i v e c h a r g e t h a t c a n n o t m i g r a t e . T h e c o m p a r i s o n o f G P E t n w i t h G P C h o s u g g e s t s t h a t t h e d i s s o c i a t i o n a t s i t e 2 i s d o m i n a t e d b y t h e n u c l e o p h i l i c p h o s p h a t e g r o u p i n p o s i t i v e i o n m o d e , a n d a p p e a r s i n d e p e n d e n t o f t h e p o s i t i v e c h a r g e s i t e . O H I R 1 \ " / ° m / z 1 8 4 0 3 ° = < o . 5 ” i f = 5 ; S c h e m e 2 . 2 F r a g m e n t a t i o n o f G P C h o [ M + H ] + i n C I D M S / M S i n p o s i t i v e i o n m o d e I n n e g a t i v e i o n m o d e , t h e n e u t r a l l o s s o f k e t e n e h a s b e e n p r o p o s e d t o b e f o r m e d v i a a c h a r g e - r e m o t e c i s - l , 2 e l i m i n a t i o n m e c h a n i s m , i n i t i a t e d b y n u c l e o p h i l i c a t t a c k o f t h e a c y l e s t e r o x y g e n o n t h e a d j a c e n t a - p r o t o n i n t h e f a t t y a c y l c h a i n [ 1 1 7 ] . ( S c h e m e 2 . 3 A ) A l t h o u g h t h e n e u t r a l l o s s o f f a t t y a c i d R C O O H c a n a l s o o c c u r s i m i l a r l y v i a c h a r g e - r e m o t e e l i m i n a t i o n ( S c h e m e 2 . 3 B ) , i t s f o r m a t i o n i s o f t e n p r o p o s e d a s a p h o s p h a t e n e g a t i v e c h a r g e - d i r e c t e d a t t a c k o n t h e g l y c e r o l h y d r o g e n o r c a r b o n , f o l l o w e d b y a n i n t r a - i o n - n e u t r a l - c o m p l e x p r o t o n t r a n s f e r s t e p f r o m t h e m o r e a c i d i c p h o s p h a t e p r o t o n ( S c h e m e 9 3 2 . 3 C ) [ 1 6 6 , 1 8 5 ] . A l t e r n a t i v e l y , i t m i g h t a l s o o c c u r v i a a c o n c e r t e d o n e - s t e p n e g a t i v e - c h a r g e - a s s i s t e d c i s - l , 2 e l i m i n a t i o n o f t h e g l y c e r o l p r o t o n ( S c h e m e 2 . 3 D ) [ 1 1 7 ] T h e s i t e o f c h a r g e , e s p e c i a l l y t h e fi x e d n e g a t i v e c h a r g e , c a n a l s o a f f e c t w h e t h e r t h e f r a g m e n t a t i o n c a n o c c u r t h r o u g h c h a r g e - d i r e c t e d , c h a r g e — a s s i s t e d o r c h a r g e - r e m o t e m e c h a n i s m s v i a E 2 e l i m i n a t i o n o r n e i g h b o r i n g g r o u p - a s s i s t e d c i s - e l i m i n a t i o n [ 2 0 3 ] . ( A ) 0 R 2 V 6 0 . a n d R z y k ‘ 0 O H 0 - u R 0 & 0 — i i — o w — > R 1 \ A / O _ l | ) " 0 \ / \ N H 1 T l N H 2 T o 9 2 O O ( B ) c h a r g e - r e m o t e c i s - 1 , 2 e l i m i n a t i o n o O R A o ' ' - \ o a n d R A G “ 0 ) H _ “ I I ( C ) c h a r g e - d r i v e n A n e i g h b o r i n g g r o u p - a s s i s t e d e l i m i n a t i o n R 2 \ } ? \ / ( I I ) a n d O p r o t o n R I T O O — P _ O \ / \ N H 2 t r a n s f e r R 2 ( 0 H E ? R 1 O \ / \ / O - P - O \ / \ R O O — P - O \ / \ ' N H Z 1 \ H / l N H 2 — > o o ( I o O H H H V _ — _ / _ R 2 0 - 1 ? a n d R l T O W O — l — O W N H Z O H 0 S c h e m e 2 . 3 P o t e n t i a l f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s o f p h o s p h o l i p i d s i n n e g a t i v e i o n m o d e 9 4 2 . 6 . 3 . 2 F a t t y a c i d c h a i n p o s i t i o n s : s n - I v s s n - Z T h e n e g a t i v e i o n m o d e f r a g m e n t a t i o n s o f d e p r o t o n a t e d G P E t n l i p i d s a r e f o u n d t o f o r m R 2 C O O ' m o r e p r e f e r a b l y t h a n R 1 C O O ’ i n C I D M S / M S , a n d t h e r a t i o o f t h e t w o p r o d u c t i o n s a r e s t e a d y a t a b o u t 2 : 1 i n t h e i o n t r a p a n d a t o p t i m a l c o l l i s i o n e n e r g i e s i n t r i p l e q u a d r u p o l e [ 1 9 0 , 2 0 4 ] . T h e o b s e r v e d d i f f e r e n t i a t i o n b e t w e e n t h e a b u n d a n c e o f s n - I a n d s n - 2 f a t t y a c y l a n i o n p r o d u c t i o n s o r n e u t r a l l o s s e s c a n b e u n d e r s t o o d i n V i e w o f t h e s t a t i s t i c s o f t h e a v a i l a b i l i t y o f c r i t i c a l t a r g e t s , t h e c o n f o r m a t i o n a l s t r a i n a d v a n t a g e f o r t h e r e a c t i o n , t h e e n e r g y l e v e l o f t h e p r o d u c t i o n s , a n d m o s t i m p o r t a n t l y , t h e m e c h a n i s m o f f r a g m e n t a t i o n . I f t h e r e l e a s e o f R C O O ' f a t t y a c i d o c c u r s v i a d i r e c t n u c l e o p h i l i c a t t a c k b y t h e n e g a t i v e c h a r g e o f t h e p h o s p h a t e o n t h e g l y c e r o l c a r b o n b a c k b o n e ( S N 2 m e c h a n i s m , S c h e m e 2 . 3 C ) [ 2 0 4 ] , t h e n t h e a v a i l a b i l i t y o f t h e C t a r g e t t o f o r m R 2 C O O ' a n d R 1 C O O ' i s o n e f o r e a c h ( 1 : 1 ) ; b u t t h e R Z C O O ' c h a n n e l f o r m s a fi v e - m e m b e r e d r i n g w h i l e t h e R 1 C O O ' c h a n n e l f o r m s a s i x - m e m b e r e d r i n g p h o s p h a t i d e , t h e r e l a t i v e e n e r g y l e v e l o f w h i c h s h o u l d t h e n b e t h e m a j o r d e t e r m i n a n t f o r t h e p r o d u c t i o n a b u n d a n c e r a t i o o f R 1 C O O ' a n d R Z C O O ’ . I f t h e f r a g m e n t a t i o n o c c u r s b y t h e c h a r g e - d i r e c t e d E 2 f r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m ( S c h e m e 2 . 3 D ) , i n i t i a t e d b y t h e p h o s p h a t e n e g a t i v e c h a r g e - d i r e c t e d d e p r o t o n a t i o n o f t h e g l y c e r o l b a c k b o n e p r o t o n s , t h e n t h e f a t t y a c i d a n i o n R 2 C O O ' i s f o r m e d v i a d e p r o t o n a t i o n o f t h e s n - 1 a n d s n - 3 p r o t o n s w i t h t h e a v a i l a b i l i t y o f f o u r H , w h e r e a s t h e f o r m a t i o n o f R 1 C O O ' i s f o r m e d b y t h e d e p r o t o n a t i o n o f a n s n - 2 p r o t o n w i t h o n l y o n e H 9 5 a v a i l a b l e . T h e s t a t i s t i c a l r a t i o o f a v a i l a b l e t a r g e t p r o t o n s , a n d t h u s t h e p r o b a b i l i t y o f o c c u r r e n c e b e t w e e n t h e t w o c h a n n e l s , i s 4 : 1 . H o w e v e r , w h e n t h e h e a d g r o u p i s c h a n g e d , t h e r e l a t i v e t e n d e n c y o f t h e s n - 1 a n d s n - 2 t o f o r m f a t t y a c i d a n i o n , f a t t y a c i d n e u t r a l l o s s o r k e t e n e n e u t r a l l o s s c a n b e v e r y d i f f e r e n t . 2 . 6 . 3 . 3 H e a d g r o u p : a c i d i t y G P E t n , G P G r o a n d G P A c a n a l l f o r m d e p r o t o n a t e d i o n s , b u t t h e i r f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s a r e v e r y d i f f e r e n t [ 1 8 9 , 1 9 0 ] . T h e d i f f e r e n c e r e fl e c t s t h e i m p o r t a n t i n v o l v e m e n t o f t h e p o l a r h e a d g r o u p i n t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n c h a n n e l s , a n d t h e m e c h a n i s m s h a v e b e e n r a t i o n a l i z e d i n t e r m s o f t h e l i p i d h e a d g r o u p g a s - p h a s e a c i d i t y [ 1 6 6 ] . 2 . 6 . 3 . 4 C o n f o r m a t i o n a l f a c t o r s I n o r d e r f o r t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s t o o c c u r , t h e f u n c t i o n a l g r o u p s o r a t o m s i n t h e p r e c u r s o r i o n s h a v e t o b e p o s i t i o n e d i n a f a v o r a b l e c o n f o r m a t i o n . I n c o n t r a s t t o t h e m u l t i p l e c l e a v a g e s i t e s i n G P E t n a n d G P G r o l i p i d s w i t h a fl e x i b l e h e a d g r o u p , t h e o p t i o n s o f f r a g m e n t a t i o n c h a n n e l s a r e a p p r e c i a b l y l i m i t e d i n g l y c o - l i p i d s , w h i c h c o n t a i n c o n f o r m a t i o n a l l y m o r e r i g i d h e a d g r o u p s t r u c t u r e s , s u c h a s t h e s u g a r r i n g . I n S Q D G t h a t c o n t a i n s a s u g a r r i n g c o n n e c t e d t o t h e d i a c y l g l y c e r i d e m o i e t y ( s e e T a b l e 1 . 1 C h a p t e r 1 f o r s t r u c t u r e ) , a l l o f t h e f r a g m e n t a t i o n s o b s e r v e d i n M S / M S a n d M S 3 o f t h e l y s o S Q D G p r o d u c t i o n s o r i g i n a t e f r o m t h e s a m e a n d o n l y s i t e , o f c l e a v a g e e q u i v a l e n t t o s i t e 2 i n S c h e m e 2 . 1 ( s e e C h a p t e r 6 f o r a d e t a i l e d d i s c u s s i o n ) . T h e f r a g m e n t a t i o n i n v o l v e s p r o t o n t r a n s f e r f r o m s p e c i fi c s i t e s o n t h e s u g a r r i n g , a n d c a n p o t e n t i a l l y b e a p p l i e d , i n t u r n , t o 9 6 d i s t i n g u i s h b e t w e e n c o n f o r m a t i o n a l i s o m e r s . I t a l s o r e i n f o r c e d t h e a c t i v e r o l e s t h a t t h e h e a d g r o u p p l a y s i n l i p i d f r a g m e n t a t i o n . C o n f o r m a t i o n a l s t r a i n a d v a n t a g e , s u c h a s t h e f o r m a t i o n o f 5 o r 6 - m e m b e r r i n g s i n t h e p r o d u c t i o n m i g h t a l s o a f f e c t t h e c o m p e t i t i o n b e t w e e n f r a g m e n t a t i o n c h a n n e l s . 2 . 6 . 3 . 5 O t h e r f a c t o r s I n a d d i t i o n t o t h e m a j o r f a c t o r s d i s c u s s e d a b o v e , a f e w o t h e r s t r u c t u r a l f a c t o r s a l s o a f f e c t t h e l i p i d fi ' a g m e n t a t i o n . W h e n t h e s n - 1 f a t t y a c i d c h a i n o f G P E t n i s c h a n g e d i n t o e s t e r o r v i n y l e s t e r ( p l a s m a l o g e n ) t a i l s , t h e f r a g m e n t a t i o n p r e f e r e n c e i s a l t e r e d a n d i t c a n b e u s e d t o d i s t i n g u i s h p l a s m a l o g e n G P E t n [ 1 3 2 ] . T h e n u m b e r o f c h a r g e s a l s o i n fl u e n c e s t h e fi a g m e n t a t i o n p r e f e r e n c e , w h i c h i s i l l u s t r a t e d b y t h e d i f f e r e n t f r a g m e n t a t i o n s p e c t r a o b s e r v e d b e t w e e n s i n g l y a n d d o u b l y d e p r o t o n a t e d i o n s o f c a r d i o l i p i n ( s e e C h a p t e r 7 ) . T h e f o r m a t i o n o f n o n - c o v a l e n t a d d u c t i o n i o n s c a n d r a s t i c a l l y c h a n g e t h e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f l i p i d s . T h e p o s i t i v e a l k a l i - a d d u c t i o n s h a v e b e e n d i s c u s s e d e a r l i e r ( T a b l e 2 . 1 ) , a n d t h e n e g a t i v e a n i o n a d d u c t s i s e x a m i n e d i n d e t a i l i n C h a p t e r 4 u s i n g G P C h o a s t h e e x a m p l e . 2 . 6 . 4 I d e n t i fi c a t i o n o f d o u b l e b o n d p o s i t i o n i n C I D - M S I M S a n d M S n U n d e r E I , h i g h e n e r g y C I D o r u n d e r l o w e n e r g y C I D w i t h s l i g h t l y h i g h e r e n e r g y s e t t i n g s , l i p i d p r o d u c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e f a t t y a c i d c h a i n s c a n s o m e t i m e s f u r t h e r f r a g m e n t i n t h e n e x t s t a g e o f t a n d e m M S a n d g e n e r a t e f r a g m e n t s p e c t r a c h a r a c t e r i s t i c f o r t h e i r d o u b l e b o n d p o s i t i o n s , b u t d u e t o t h e h i g h e r e n e r g y r e q u i r e d t o b r e a k t h e f a t t y a c i d c h a i n s , t h e fi ' a g m e n t a t i o n t e n d s t o b e n o t s o e f fi c i e n t , a n d t h e a b u n d a n c e o f t h e s p e c t r a 9 7 u s u a l l y t e n d s t o b e l o w [ 2 0 5 ] . R e c e n t l y , t h e o x i d a t i o n r e a c t i o n s o f a l k e n e s h a v e b e e n a p p l i e d t o a s s i s t w i t h t h e f a c i l e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e d o u b l e b o n d p o s i t i o n i n M S / M S o r M 8 3 , b y i n d u c i n g c l e a v a g e a t h i g h l y s p e c i fi c s i t e s . I n a d d i t i o n t o i n - s o l u t i o n t r e a t m e n t o f t h e l i p i d s w i t h O s O 4 t o f o r m v i c i n a l d i - h y d r o x y l a t i o n [ 2 0 6 ] , i n - s o u r c e o z o n o l y s i s , o r i n - t r a p o z o n e - i n d u c e d d i s s o c i a t i o n , h a v e b e e n s h o w n t o e f f e c t i v e l y a n d c o n v e n i e n t l y d e t e r m i n e t h e d o u b l e b o n d p o s i t i o n i n a l l o f t h e c o m m o n t y p e s o f p h o s p h o l i p i d s [ 1 7 5 , 2 0 7 ] . T h e c u r r e n t s t u d y h a s a d v a n c e d t h e u n d e r s t a n d i n g o f t h e f r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s o f G P C h o a s n o n - c o v a l e n t a n i o n i c a d d u c t i o n s , t h e l i p o a m i n o a c i d l i p i d s , i n c l u d i n g o r n i t h i n e l i p i d s a n d n o v e l g l u t a m i n e l i p i d s , a n d o t h e r p h o s p h a t e - f r e e l i p i d s , s u c h a s S Q D G a n d D G T S , a n d t h e r e s u l t s a r e d i s c u s s e d i n d e t a i l i n C h a p t e r s 4 , 5 a n d 6 . 2 . 7 Q u a n t i f i c a t i o n o f l i p i d s u s i n g m a s s s p e c t r o m e t r y E S I M S a n d M S / M S c a n a l s o b e a p p l i e d i n t h e s e n s i t i v e a n d a c c u r a t e q u a n t i fi c a t i o n o f a p a r t i c u l a r m o l e c u l a r s p e c i e s o f l i p i d i n a c o m p l e x l i p i d e x t r a c t m i x t u r e b y i n c o r p o r a t i n g a s i n g l e o r a s e t o f l i p i d s a s i n t e r n a l s t a n d a r d s t o t h e l i p i d e x t r a c t s , o r t o t h e t i s s u e p r i o r t o l i p i d e x t r a c t i o n [ 1 1 0 , 2 0 8 - 2 1 0 ] . A l i n e a r r e l a t i o n s h i p w a s t y p i c a l l y f o u n d b e t w e e n t h e p e a k h e i g h t a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o f a p u r e l i p i d s t a n d a r d b e t w e e n 0 — 5 0 u M b y E S I M S ( s e e a l s o C h a p t e r 7 ) , b u t t h e l i n e a r i t y i s n o t v a l i d a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s [ 2 0 9 ] . H o w e v e r , i n t h e a c t u a l s a m p l e , s i n c e t h e i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y o f l i p i d s i n a m i x t u r e c a n b e s t r i k i n g l y d i f f e r e n t d e p e n d i n g o n t h e h e a d g r o u p b u t l i p i d s o f t h e s a m e h e a d g r o u p i o n i z e w i t h s i m i l a r e f fi c i e n c y [ 1 6 5 ] , i d e a l l y l i p i d s o f t h e s a m e h e a d 9 8 g r o u p , b u t w i t h f a t t y a c i d c h a i n s t y p i c a l l y n o t f o u n d i n n a t u r e , a r e c h o s e n a s t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s [ 1 1 0 ] , a n d t h e q u a n t i fi c a t i o n i s a c h i e v e d b a s e d o n t h e l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e r a t i o o f p e a k a b u n d a n c e s a n d t h e r a t i o o f c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s a m p l e a n d t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s . L i p i d q u a n t i fi c a t i o n w i t h h i g h e r s e n s i t i v i t y a n d a c c u r a c y c a n b e a c h i e v e d t h r o u g h C I D M S / M S i n p r e c u r s o r i o n s c a n , o r n e u t r a l l o s s s c a n m o d e o n a t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r [ 2 1 0 , 2 1 1 ] , o r b y s i m i l a r o p t i o n s i n t h e q u a d r u p o l e i o n t r a p . M S / M S l i p i d q u a n t i fi c a t i o n t a k e s a d v a n t a g e o f t h e l i p i d f r a g m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s , a n d c a n s i g n i fi c a n t l y i m p r o v e t h e q u a n t i fi c a t i o n s e n s i t i v i t y a n d a c c u r a c y b y e l i m i n a t i n g t h e i n t e r f e r e n c e s f r o m o v e r l a p p i n g p r e c u r s o r i o n s a n d f r o m c h e m i c a l n o i s e [ 2 1 2 - 2 1 5 ] . I t i s t h e r e f o r e a n i d e a l m e t h o d f o r t h e a n a l y s i s o f c o m p l e x s m a l l - a m o u n t l i p i d m i x t u r e s w i t h o u t e l a b o r a t e p r e - a n a l y s i s s e p a r a t i o n . Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f l i p i d e x t r a c t s u s i n g i n t e r n a l s t a n d a r d s i n M A L D I i n s t r u m e n t h a s a l s o b e e n d e s c r i b e d [ 1 1 5 , 1 2 9 , 1 3 0 , 2 1 6 ] . 9 9 C h a p t e r 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 3 . 1 M a t e r i a l s M e t h a n o l ( H P L C g r a d e ) , p o l y e t h y l e n e g l y c o l ( a v e r a g e m o l w t 4 0 0 , P E G - 4 0 0 ) , 1 , 3 - b i s [ t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) m e t h y l a m i n o ] - p r o p a n e ( B I S - T r i s p r o p a n e ) , b e n z e n e s u l f o n i c a c i d , a m m o n i u m d i h y d r o g e n p h o s p h a t e , L - o m i t h i n e , L — l y s i n e , L — g l u t a m i n e , N a - a c e t y l L - o r n i t h i n e , N a - a c e t y l L — l y s i n e , N g — a c e t y l L — l y s i n e , s o y b e a n a s o l e c t i n , M A L D I m a t r i c e s 2 , 5 - d i h y d r o x y l b e n z o i c a c i d ( 2 , 5 - D H B ) , u - c y a n o - 4 - h y d r o x y c i n n a m i c a c i d ( C H C A ) , s i n a p i n i c a c i d ( S A ) , 6 - a z a - 2 - t h i o t h i m i n ( A T T ) a n d 5 - m e t h o x y s a l i c y l i c a c i d ( M S A ) , a n d i s o l a t e d l i p i d s t a n d a r d s f r o m p o r c i n e b r a i n p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( G P I n s ) a n d p h o s p h o r y l a t e d p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( G P I n s - P ) w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a - A l d r i c h ( S t . L o u i s , M O ) . E t h a n o l w a s p u r c h a s e d f r o m t h e A A P E R A l c o h o l a n d C h e m i c a l C o . ( S h e l b y v i l l e , K Y ) . I S O p r o p a n o l a n d e t h y l e t h e r w e r e f r o m J a d e S c i e n t i fi c ( C a n t o n , M I ) . A m m o n i u m a c e t a t e , a m m o n i u m fl u o r i d e , a m m o n i u m c h l o r i d e , a m m o n i u m b i c a r b o n a t e , K O H , H C l , d e o x y c h o l a t e , K C l , K H 2 P O 4 , a c e t i c a n h y d r i d e , a m m o n i u m b i c a r b o n a t e , s o d i u m c i t r a t e , a n h y d r o u s s o d i u m b i s u l f a t e , g l a c i a l a c e t i c a c i d , a c e t o n i t r i l e , c h l o r o f o r m ( A C S a n d H P L C g r a d e s ) , a n d t h e t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y p l a t e s ( S i 2 5 0 ) w e r e p u r h a s e d f r o m M a l l i n c k r o d t B a k e r ( P h i l l i p s b u r g , N J ) . A m m o n i u m i o d i d e , f o r m i c a c i d a n d h y d r o b r o m i c a c i d ( 4 8 % ) w e r e f r o m S p e c t r u m Q u a l i t y P r o d u c t s ( G a r d e n a , C A ) . 1 0 0 A m m o n i u m t h i o c y a n a t e w a s p u r c h a s e d f r o m F i s h e r S c i e n t i fi c ( F a i r l a w n , N J ) . A m m o n i u m h y d r o x i d e ( 2 8 . 0 — 3 0 . 0 % ) , a m m o n i u m n i t r a t e , L - a s c o r b i c a c i d , s u l f u r i c a c i d a n d h y d r o g e n p e r o x i d e ( 3 0 % , m / v ) w e r e f r o m C o l u m b u s C h e m i c a l I n d u s t r i e s ( C o l u m b u s , W I ) . T r i fl u o r o a c e t i c a c i d ( S e q u a n a l g r a d e ) w a s o b t a i n e d f r o m P i e r c e ( R o c k f o r d , I L ) . P r o p i o n i c a n h y d r i d e a n d i o d o m e t h a n e w e r e p u r c h a s e d f r o m E M D C h e m i c a l s ( G i b b s t o w n , N J ) . C D 3 O D ( D , 9 9 . 8 % ) a n d C D C l 3 ( D , 9 9 . 8 % ) w e r e p u r c h a s e d f r o m C a m b r i d g e I s o t o p e L a b o r a t o r i e s ( A n d o v e r , M A ) . N i 2 + - N T A r e s i n w a s f r o m Q i a g e n ( S a n t a C l a r i t a , C A ) . H i g h p u r i t y d o d e c y l m a l t o s i d e ( D D M ) , d e c y l m a l t o s i d e ( D M ) a n d a s w i t c h a b l e d e t e r g e n t ( N ' - d o d e c y l - N , N - d i m e t h y l - a c e t i m i d a r n i d e b i c a r b o n a t e ) w e r e f r o m A n a t r a c e I n c . ( M a u m e e , O H ) . P r o t e i n a s s a y r e a g e n t s a n d g e l p r o t e i n l a d d e r s t a n d a r d s w e r e f r o m B i o - R a d ( H e r c u l e s , C A ) . E D T A a n d T r i s ( 2 9 9 % ) w e r e p u r c h a s e d f r o m I n v i t r o g e n L i f e T e c h n o l o g i e s ( C a r l s b a d , C A ) . D N a s e I a n d R N a s e A ( b o v i n e p a n c r e a s ) w e r e f r o m C a l b i o c h e m . S o d i u m c h l o r i d e ( G R A C S ) w a s f r o m M e r c k K G a A ( D a r r n s t a d t , G e r m a n y ) . 2 - ( N - M o r p h o l i n o ) e t h a n e - s u l f o n i c a c i d ( M E S ) w a s f r o m R e s e a r c h O r g a n i c s ( C l e v e l a n d , O H ) . 1 - a m i n o - 2 - n a p h t h o l - 4 - s u l f o n i c a c i d w a s f r o m E a s t m a n K o d a k C o m p a n y ( R o c h e s t e r , N Y ) . T h e 2 0 0 1 1 L c o n t a m i n a t i o n - f r e e g l a s s v i a l s u s e d f o r l i p i d s e x t r a c t i o n f o r m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s w e r e p u r c h a s e d f r o m S U N - S r i C h r o m a t o g r a p h y A c c e s s o r i e s ( R o c k w o o d , T N ) . N e t — a c e t y l a t i o n a n d N a — p r o p y l a t i o n o f L - g l u t a r n i n e a n d O - m e t h y l a t i o n o f N a — a c e t y l L - o m i t h i n e w e r e p e r f o r m e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d [ 2 1 7 ] . N 5 - m e t h y l a t i o n o f N a - a c e t y l L - o r n i t h i n e w a s p e r f o r m e d b y r e a c t i n g N a - a c e t y l L — o m i t h i n e w i t h a 1 0 0 f o l d 1 0 1 e x c e s s o f C H 3 I i n 5 0 m M N H 4 H C O 3 a q u e o u s b u f f e r a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r u p t o 4 8 h o u r s . S o l v e n t s w e r e fi l t e r e d w i t h a s i n t e r e d g l a s s f u n n e l ( p o r e s i z e 4 - 8 p m ) p r i o r t o u s e . S y n t h e t i c l i p i d s t a n d a r d s G P C h o ( 1 6 : 0 / 1 6 z 0 ) , G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 , d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 , G P C h o d 3 1 - 1 6 z 0 / d 3 1 - 1 6 : 0 , G P C h o d 3 1 - 1 6 : 0 / 1 8 : 1 , d 1 3 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 , G P A 1 6 : 0 / 1 8 : 1 , G P E t n 1 6 : 0 / 1 6 : 0 , 1 , 2 - d i p a 1 m i t o y l - s n - g l y c e r o - 3 - p h o s p h o e t h a n o l - a m i n e N , N - d i m e t h y l , l , 2 - d i p a l m i t o y l - s n - g l y c e r o - 3 - p h o s p h o e t h a n o l , h e x a d e c y l p h o s p h o c h o l i n e , G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , C L ( l 4 : 0 ) 4 , G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , C L ( 1 8 : 1 ) 4 w e r e p u r c h a s e d f r o m A v a n t i P o l a r L i p i d s I n c . ( A l a b a s t e r , A L ) . T h e n o m e n c l a t u r e o f t h e l i p i d s a d o p t e d t h e s y s t e m r e c o m m e n d e d b y t h e L I P I D M A P S c o n s o r t i u m i n 2 0 0 5 [ 4 ] ( s e e T a b l e 1 . 1 ) . 3 . 2 G r o w t h a n d e x p r e s s i o n o f C c O 3 . 2 . 1 G r o w t h c o n d i t i o n s A l l o f t h e n o r m a l - p h o s p h a t e R . s p h a e r o i d e s s t r a i n s w e r e g r o w n i n S i s t r o m ’ s s u c c i n a t e - b a s a l s a l t s m e d i u m a t t h e K H Z P O 4 c o n c e n t r a t i o n o f 2 0 m M ( p H 7 . 0 ) w i t h a p p r o p r i a t e a n t i b i o t i c s a s d e s c r i b e d e a r l i e r [ 2 1 8 , 2 1 9 ] . T h e c e l l s w e r e g r o w n o n a g a r - s o l i d i fi e d m e d i u m o r i n l i q u i d c u l t u r e s a t 3 0 ° C u n d e r a n a e r o b i c p h o t o h e t e r o t r o p h i c [ 1 6 ] o r a e r o b i c c h e m o h e t e r o t r o p h i c [ 2 2 0 ] c o n d i t i o n , a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . W h e n r e q u i r e d , a r n p i c i l l i n ( 5 0 u g / m L ) , k a n a m y c i n ( 2 5 u g / m L ) , t e t r a c y c l i n e ( 1 u g / m L ) , c h l o r a r n p h e n i c o l ( 2 5 u g / m L ) , o r s t r e p t o m y c i n ( 5 0 u g / m L ) p l u s s p e c t i n o m y c i n ( 5 0 u g / m L ) w a s a d d e d t o 1 0 2 t h e m e d i a . F o r t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h , t h e 2 0 m M K H 2 P O 4 i n t h e S i s t r o m ' s m e d i a w a s r e p l a c e d w i t h 5 0 m M H E P E S - K O H a n d 0 . 1 m M K H 2 P 0 4 ( p H 6 . 8 ) . A l l t h e s t r a i n s o v e r - e x p r e s s i n g C c O w e r e g r o w n a e r o b i c a l l y o n p l a t e s i n S i s t r o m ' s m e d i a c o n t a i n i n g 5 0 u g / m L s p e c t i n o m y c i n , 5 0 u g / m L s t r e p t o m y c i n a n d 1 u g / m L t e t r a c y c l i n e p H 7 . 0 a t 3 0 ° C f o r 3 - 5 d a y s , t h e n t h e c e l l s w e r e p i c k e d a n d i n o c u l a t e d i n t o s m a l l fl a s k s w i t h 1 0 0 m L o f S i s t r o m ' s m e d i a c o n t a i n i n g t h e s a m e a n t i b i o t i c s a n d g r o w n f o r t w o d a y s a t 3 0 ° C w i t h v i g o r o u s s h a k i n g a t 2 5 0 r p m . T h e n 5 0 m L o f s t a r t e r c u l t u r e w a s u s e d t o i n o c u l a t e a 2 . 8 L F e m b a c h fl a s k w i t h 8 0 0 m L S i s t r o m ' s m e d i a c o n t a i n i n g 1 u g / m L t e t r a c y c l i n e , 2 5 u g / m L s t r e p t o m y c i n a n d 2 5 u g / m L s p e c t i n o m y c i n . T h e F e m b a c h fl a s k s w e r e s h a k e n a t 2 5 0 r p m a t 3 0 ° C f o r 2 - 3 d a y s u n t i l t h e U V — V i s u a l a b s o r b a n c e a t 6 5 0 n m e x c e e d e d 1 . 2 a n d t h e p H r e a c h e d o v e r 8 . 5 . E s c h e r i c h i a c o l i c e l l s w e r e g r o w n i n L B m e d i u m a t 3 7 ° C . W h e n r e q u i r e d , a n t i b i o t i c s w e r e a d d e d t o t h e s o l i d m e d i a o r l i q u i d c u l t u r e s a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f 5 0 u g / m L o f a r n p i c i l l i n , k a n a m y c i n o r c h l o r a r n p h e n i c o l . 3 . 2 . 2 R . s p h a e r o i d e s g r o w t h c u r v e s T h i s p a r t o f t h e e x p e r i m e n t s w a s p e r f o r m e d b y c o l l a b o r a t o r D r . C a r r i e H i s e r f r o m D r . S h e l a g h F e r g u s o n - M i l l e r ’ s g r o u p , a n d t h e r e s u l t s a r e i n c l u d e d a s i n t r o d u c t i o n s . F o r p h o t o s y n t h e t i c g r o w t h c u r v e s , 2 . 4 . 1 ( w i l d - t y p e ) [ 2 2 1 ] a n d B C - m 3 ( c l s d e l e t i o n , a l s o c a l l e d C L 3 ) [ 1 5 ] s t r a i n s w e r e g r o w n i n 2 5 0 m L s i d e a r m fl a s k s fi l l e d c o m p l e t e l y w i t h S i s t r o m ’ s m e d i u m u n d e r a p p r o x i m a t e l y 3 0 u m o l m - z s ' 1 l i g h t w i t h o u t s h a k i n g . F o r a e r o b i c g r t h c u r v e s , s t r a i n s 2 . 4 . 1 a n d B C - m 3 w e r e g r o w n a t 3 0 ° C i n 5 0 1 0 3 m L o f S i s t r o m ' s m e d i u m i n 2 5 0 m L s i d e - a r r n fl a s k s w i t h v i g o r o u s s h a k i n g ( 2 5 0 r p m ) . I n e a c h c a s e , c e l l d e n s i t i e s w e r e m e a s u r e d i n a K l e t t p h o t o m e t e r w i t h a # 6 6 fi l t e r . 3 . 2 . 3 C o n s t r u c t i o n o f C L - d e fi c i e n t m u t a n t o f R . s p h a e r o i d e s T h i s p a r t o f t h e e x p e r i m e n t s w a s p e r f o r m e d b y c o l l a b o r a t o r B a n i t a T a m o t f r o m D r . C h r i s t o p h B e n n i n g ’ s g r o u p [ 1 5 ] a n d i s n o t i n c l u d e d a s t h e r e s u l t s o f t h e p r e s e n t d i s s e r t a t i o n . I n e s s e n c e , t h e g e n e f o r c a r d i o l i p i n s y n t h a s e ( c l s ) w a s i s o l a t e d f r o m R . s p h a e r o i d e s g e n o m i c D N A , a n d a m u t a n t s t r a i n o f R . s p h a e r o i d e s w i t h t h e c l s g e n e d e l e t e d ( c a l l e d B C - m 3 o r C L 3 ) w a s c r e a t e d [ 1 5 ] . 3 . 2 . 4 E n g i n e e r i n g R . s p h a e r o i d e s 2 . 4 . 1 a n d s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t s t r a i n s t o o v e r p r o d u c e C c O T h i s p a r t o f t h e e x p e r i m e n t s w a s p e r f o r m e d b y c o l l a b o r a t o r D r . C a r r i e H i s e r f r o m D r . S h e l a g h F e r g u s o n - M i l l e r ’ s g r o u p , a n d i s n o t i n c l u d e d a s t h e r e s u l t s o f t h e d i s s e r t a t i o n . T h e R . s p h a e r o i d e s s t r a i n s 2 . 4 . 1 , B C - m 3 ( a l s o c a l l e d C L 3 ) a n d B C - m 2 ( C L 2 ) [ 1 5 ] , S B l K l a n d S B 1 K 2 [ l 6 ] , a n d C H B Z O [ 9 0 ] w e r e g e n e r a t e d a s d e s c r i b e d e a r l i e r . T o o v e r p r o d u c e a s u b u n i t I C - t e r m i n a l h i s t i d i n e - t a g g e d v e r s i o n o f t h e C c O e n z y m e , t h e p R K - p Y J 1 2 3 H p l a s m i d [ 2 2 0 ] c a r r y i n g t h e g e n e s c o d i n g f o r a w i l d - t y p e C c O w a s t r a n s f e r r e d b y c o n j u g a t i o n f r o m E . c o l i 8 1 7 - ] i n t o R . s p h a e r o i d e s s t r a i n s 2 . 4 . 1 , C H B 2 0 , S B l K l ( a n d S B 1 K 2 ) a n d C L 3 ( a l s o c a l l e d B C - m 3 ) ( a n d C L 2 , a n o t h e r c l s m u t a n t c l o n e p r o d u c e d i n p a r a l l e l ) a s d e s c r i b e d [ 2 2 0 ] t o c r e a t e s t r a i n s 2 . 4 . 1 + C c O C H B 2 0 + C c O S B l K l + C c O ( a n d S B 1 K 2 + C c O ) a n d C L 3 + C c O ( a n d C L 2 + C c O ) , r e s p e c t i v e l y . T h e 1 0 4 s e q u e n c e S N H H H H H H w a s d i r e c t l y a d d e d t o t h e C t e r m i n u s i n s u b u n i t I . T h e s e s t r a i n s w e r e g r o w n a e r o b i c a l l y i n S i s t r o m ' s m e d i a c o n t a i n i n g 1 u g / m L t e t r a c y c l i n e a t 3 0 ° C . T o a d d b a c k t h e c l s g e n e t o t h e o v e r p r o d u c i n g s t r a i n s , t h e c l s g e n e w a s s u b - c l o n e d i n t o a n a l t e r e d v e r s i o n o f p B B R l - M C S [ 2 2 2 ] w h i c h h a d t h e c h l o r a r n p h e n i c o l r e s i s t a n c e c a s s e t t e r e p l a c e d b y t h e s t r e p t o m y c i n / s p e c t i n o m y c i n r e s i s t a n c e c a s s e t t e f r o m p H P 4 S Q . T h i s e x p r e s s i o n p l a s m i d , w h i c h c a n c o - e x i s t w i t h p R K - p Y J 1 2 3 H i n t h e s a m e c e l l , w a s t r a n s f e r r e d b y c o n j u g a t i o n f r o m E . c o l i S 1 7 - 1 i n t o R . s p h a e r o i d e s s t r a i n s 2 . 4 . 1 + C c O a n d C L 3 + C c O t o c r e a t e s t r a i n s 2 . 4 . l + C c O + c l s a n d C L 3 + C c O + c I s , r e s p e c t i v e l y . T h e s e s t r a i n s w e r e g r o w n a e r o b i c a l l y i n S i s t r o m ' s m e d i a c o n t a i n i n g 1 u g / m L t e t r a c y c l i n e a n d 5 u g / m L e a c h o f s t r e p t o m y c i n a n d s p e c t i n o m y c i n . I n a d d i t i o n , s t r a i n s 2 . 4 . 1 + C c O , C L 3 + C c O , 2 . 4 . 1 + C c O + c l s a n d C L 3 + C c O + c l s w e r e a l s o g r o w n u n d e r 3 7 ° C a s a h i g h t e m p e r a t u r e s t r e s s w h i l e k e e p i n g a l l t h e o t h e r c o n d i t i o n s i d e n t i c a l . T o o v e r p r o d u c e a v e r s i o n o f C c O s u i t a b l e f o r c r y s t a l l i z a t i o n , p l a c i n g a h i s t i d i n e t a g o n t h e C t e r m i n u s o f s u b u n i t I I m o i n t i n g t o w a r d t h e o u t s i d e o f t h e m e m b r a n e o n t h e t o p ) a n d a s h o r t e n e d v e r s i o n o f s u b u n i t I V w e r e f o u n d t o i m p r o v e m o l e c u l a r h o m o g e n e i t y [ 3 5 ] , w h e r e t h e H H H H H H h i s t i d i n e t a g w a s u s e d t o r e p l a c e t h e C - t e r r n i n a l s e q u e n c e A R G G T Y a f t e r s i x t e e n a m i n o a c i d s w e r e c l e a v e d f r o m t h e C t e r m i n u s o f t h e g e n o m i c s e q u e n c e o f s u b u n i t I I ( F i g u r e 3 . 1 ) . T h e r e f o r e , t h e p C H l 6 9 p l a s m i d [ 3 5 ] c a r r y i n g t h e s e v e r s i o n s o f t h e C c O g e n e s w a s t r a n s f e r r e d b y c o n j u g a t i o n i n t o t h e B C - m 3 ( a l s o c a l l e d C L 3 ) m u t a n t s t r a i n t o c r e a t e s t r a i n 1 6 9 C L 3 . T h e C L — p r o fi c i e n t c r y s t a l l o g r a p h y s t r a i n u s e d a s t h e c o n t r o l h e r e i n i s 1 6 9 - 2 . 4 . 1 , w h i c h i s d e r i v e d f r o m a w i l d - t y p e 2 . 4 . 1 s t r a i n t o w h i c h t h e p C H l 6 9 p l a s m i d w a s a d d e d [ 2 2 0 ] . 1 0 5 3 . 1 . T h e v a r i o u s R . s p h a e r o i d e s s t r a i n s u s e d i n t h e d i s s e r t a t i o n a r e d e s c r i b e d i n T a b l e 1 0 6 T a b l e 3 . 1 R . s p h a e r o i d e s s t r a i n s a n d C c O p l a s m i d s u s e d i n t h i s w o r k h D e s c r i p t i o n R . s p a e r o l d e s s t r a i n * # C c O p l a s m i d B a c k g r o u n d S o u r c e C h a p t e r g e n o m e p R K - p Y J 1 2 3 H W T ( W T ) H i s - t a g c o x I W T c o x I . 2 . 4 . 1 + C c 0 W T c o x I I W T c o x I I [ 5 2 2 2 ? ] , 2 ’ 9 6 ’ 7 ’ ( 3 0 / 3 7 ° C ) W T c o x I I I W T c o x I I I ’ W T c o x I V W T c o x I V ( C L _ ) A s a b o v e e x c e p t [ 2 2 0 ] ' C L i g g j o g ” ° C ) A s a b o v e d e l e t i o n o f c l s g e n e [ 1 5 ] I 6 ’ 7 ’ 8 ’ 9 _ A s W T e x c e p t S Q D G - _ g i g a f + é c o A s a b o v e d e fi c i e n c y b y [ 3 3 ’ 7 c h e m i c a l m u t a t i o n A s W T e x c e p t ( G P C h o - ) _ [ 2 2 0 ] ; C H B Z O + C c O A s a b o v e G P C h e d e fi c i e n c y b y [ 9 0 ] 5 , 7 c h e m i c a l m u t a t i o n [ 2 2 0 1 ' A s W T e x c e p t a n ’ 2 . 4 . 1 + C c 0 + c l s . D r . ( 3 0 ] 3 7 ° C ) A s a b o v e : g d l t l o n a l p l a s m i d f o r C a r r i e 9 H i s e r A s W T e x c e p t [ 2 2 0 ] ; C L 3 + C c O + c I s A s a b o v e d e l e t i o n o f c / s g e n e , D r . 9 ( 3 0 / 3 7 ° C ) a n d a n a d d i t i o n a l C a r r i e p l a s m i d f o r c l s H i s e r p C H 1 6 9 Y 2 2 0 0 W T c o x I W T c o x I E g g - W T H i s - t a g c o x I I n o c o x I I [ 2 2 0 ] 9 W T c o x I I I n o c o x I I I s h o r t c o x I V W T c o x I V W T ( W T ) W T c o x I D r . 1 6 9 - 2 . 4 . 1 A s a b o v e W T c o x I I C a r r i e 9 , 1 0 ( P + / P - ) W T c o x I I I H i s e r W T c o x I V ( C L — ) D r . 1 6 9 C L 3 A s a b o v e 3 2 : 3 3 : ? ? ? “ C a r r i e 9 , 1 0 ( P + / P — ) H i s e r n o c o x I ( W T ) 1 6 9 A 4 A s a b o v e W T c o x H [ 3 5 ] 8 W T c o x I I I ( P + l P _ ) n o c o x I V p C H 3 7 ( W T ) W T c o x I , 3 7 A 4 H i s - t a g c o x I I , A s a b o v e [ 3 5 ] 6 ( P + / P - ) W T c o x I I I , n o c g I V 1 0 7 ( T a b l e 3 . 1 c o n t i n u e d ) * G r o w t h w a s u n d e r 3 0 ° C w i t h n o r m a l c o n c e n t r a t i o n o f p h o s p h a t e ( 2 0 m M ) u n l e s s s p e c i fi e d o t h e r w i s e . # P + r e p r e s e n t s n o r m a l p h o s p h a t e c o n c e n t r a t i o n ( 2 0 m M ) ; P — r e p r e s e n t s l o w p h o s p h a t e c o n c e n t r a t i o n ( 0 . 1 m M ) i n g r o w t h m e d i u m . @ S o u r c e s f o r t h e p l a s m i d a n d t h e g e n o m e a r e s e p a r a t e d b y “ ; ” i f d i f f e r e n t . 1 0 8 S u b u n i t I M A D A A I H G H E H D R R G F F T R W F M S T N H K D I G V L Y L F T G G L V G L I S V A F T V Y M R M E L M A P G V Q F M C A E H L E S G L V K G F F Q S L W P S A V E N C T P N G H L W N V M I T G H G I L M M F F V V I P A L F G G F G N Y F M P L H I G A P D M A F P R M N N L S Y W L Y V A G T S L A V A S L F A P G G N G Q L G S G I G W V L Y P P L S T S E S G Y S T D L A I F A V H L S G A S S I L G A I N M I T T F L N M R A P G M T M H K V P L F A W S I F V T A W L I L L A L P V L A G A I T M L L T D R N F G T T F F Q P S G G G D P V L Y Q H I L W F F G H P E V Y I I V L P A F G [ V S H V I A T F A K K P I F G Y L P M V Y A M V A I G V L G F V V W A H H M Y T A G L S L T Q Q S Y F M M A T M V I A V P T G I K I F S W I A T M W G G S I E L K T P M L W A L G F L F L F T V G G V T G I V L S Q A S V D R Y Y H D T Y Y V V A H F H Y V M S L G A V F G I F A G I Y F W I G K M S G R Q Y P E W A G K L H F W M M F V G A N L T F F P Q H F L G R Q G M P R R Y I D Y P E A F A T W N F V S S L G A F L S F A S F L F F L G V I F Y T L T R G A R V T A N N Y W N E H A D T L E W T L T S P P P E H T F E Q L P K R E D W E R A P A H + ( S N H H H l l H H ) S u b u n i t I I M R H S T T L T G C A T G A A G L L A A T A A A A Q Q Q S L E I I G R P Q P G G T G F Q P S A S P V A T Q I H W L D G F I L V I I A A I T I F V T L L I L Y A V W R F H E K R N K V P A R F T H N S P L E I A W T I V P I V I L V A I G A F S L P V L F N Q Q E I P E A D V T V K V T G Y Q W Y W G Y E Y P D E E I S F E S Y M I G S P A T G G D N R M S P E V E Q Q L I E A G Y S R D E F L L A T D T A M V V P V N K T V V V Q V T G A D V I H S W T V P A F G V K Q D A V P G R L A Q L W F R A E R E G I F F G Q C S E L C G l S H A Y M P I T V K V V S E E A Y A A W L E Q A R G G T Y E L S S V L P A T P A G V S V E ( H H l l l I I M ) S u b u n i t I I I M A H A K N H D Y H I L P P S I W P F M A S V G A F V M L F G A V L W M H G S G P W M G L I G L V V V L Y T M F G W W S D V V T E S L E G D H T P V V R L G L R W G F I L F I M S E V M F F S A W F W S F F K H A L Y P M G P E S P I I D G I F P P E G I I T F D P W H L P L I N T L I L L C S G C A A T W A H H A L V H E N N R R D V A W G L A L A I A L G A L F T V F Q A Y E Y S H A A F G F A G N I Y G A N F F M A T G F I — I G F H V I V G T I F L L V C L [ R V Q R G H F T P E K H V G F E A A I W Y W H F V D V V W L F L F A S I Y I W G Q S u b u n i t I V M A E T N K G T G P M A D H S H P A H G H V A G S M D I T Q Q E K T F A G F V R M V T W A A V V I V A A L I F L A L A N A F i g u r e 3 . 1 F u l l l e n g t h a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f R . s p h a e r o i d e s C c O d e d u c e d f r o m t h e g e n o m e . T h e i n c o r p o r a t i o n o f t h e h i s t i d i n e t a g a t t a c h e d t o t h e C - t e r m i n u s o f s u b u n i t I o r s u b u n i t I I i s s h o w n i n b l u e a n d r e d , r e s p e c t i v e l y [ 3 0 ] . I n s u b u n i t I , S N H H H H H H w a s a d d e d t o t h e C t e r m i n u s , w h e r e a s i n s u b u n i t I I , s i x t e e n a m i n o a c i d s w e r e c l e a v e d f r o m t h e C t e r m i n u s , a n d A R G G T Y w a s r e p l a c e d w i t h H H H H H H h i s t i d i n e t a g . 1 0 9 3 . 3 P u r i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n a n d C c O 3 . 3 . 1 I s o l a t i o n o f R . s p h a e r o i d e s c e l l m e m b r a n e p e l l e t s R . s p h a e r o i d e s c e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n i n a G S - 3 r o t o r a t 1 4 , 0 0 0 g f o r 2 0 m i n u t e s a n d r e - s u s p e n d e d i n p H 6 . 5 b u f f e r c o n t a i n i n g 5 0 m M K H 2 P 0 4 a n d 1 m M E D T A . A f t e r a d d i t i o n o f D N a s e I a n d R N a s e , t h e r e - s u s p e n d e d c e l l s w e r e h o m o g e n i z e d a n d l y s e d b y p a s s i n g t h r o u g h F r e n c h p r e s s t w i c e u n d e r 2 0 , 0 0 0 p s i a t 4 ° C . T h e m i x t u r e w a s t h e n c e n t r i f u g e d a t 3 0 , 0 0 0 g f o r 3 0 m i n u t e s a t 4 ° C t o r e m o v e t h e p r e c i p i t a t e d u n b r o k e n c e l l s a n d d e b r i s , a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s t h e n s u b j e c t e d t o u l t r a c e n t r i f u g a t i o n a t 2 0 0 , 0 0 0 g f o r 9 0 m i n u t e s a t 4 ° C t o p r e c i p i t a t e t h e m e m b r a n e p e l l e t s [ 2 2 0 ] . T h e m e m b r a n e p e l l e t s w e r e t h e n r e s u s p e n d e d o n i c e i n t h e b u f f e r c o n t a i n i n g 4 0 m M K C ] a n d 1 0 m M T r i s p H 8 . 0 ( o r w i t h a d d i t i o n a l 1 m M i m i d a z o l e a n d 2 0 0 m M K C l f o r s u b u n i t I I h i s - t a g l a b e l e d v e r s i o n s ) , q u i c k - f r o z e n i n l i q u i d N 2 a n d s t o r e d a t - 8 0 ° C f o r f u r t h e r u s e . A t y p i c a l y i e l d o b t a i n e d f r o m fi f t e e n 2 . 8 L F e m b a c h fl a s k s o f 1 6 9 - 2 . 4 . 1 o r 1 6 9 C L 3 c e l l c u l t u r e s w a s a p p r o x i m a t e l y 4 0 m g C c O . 3 . 3 . 2 P u r i fi c a t i o n o f C c O u s i n g F P L C a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y 3 . 3 . 2 . 1 D e t e r g e n t s o l u b i l i z a t i o n o f m e m b r a n e p e l l e t s P r i o r t o l o a d i n g t o t h e N i 2 + - N T A c o l u m n , t h e m e m b r a n e p e l l e t s w e r e t h a w e d , h o m o g e n i z e d a n d d i l u t e d t o fi n a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 m g / m L ( b a s e d o n a B C A p r o t e i n a s s a y o f t h e m e m b r a n e s u s p e n s i o n ) u s i n g t h e m e m b r a n e r e s u s p e n s i o n b u f f e r d e s c r i b e d a b o v e , a n d 1 % ( m / v ) fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f d o d e c y l m a l t o s i d e w a s a d d e d t o t h e 1 1 0 m e m b r a n e s u s p e n s i o n f o l l o w e d b y v i g o r o u s s t i r r i n g a t 4 ° C f o r 3 0 m i n u t e s t o s o l u b i l i z e t h e m e m b r a n e p e l l e t s . T h e m i x t u r e w a s t h e n s u b j e c t e d t o u l t r a c e n t r i f u g a t i o n a t 2 0 0 , 0 0 0 g f o r 3 0 m i n u t e s a t 4 ° C t o s e p a r a t e t h e u n s o l u b l i z e d m e m b r a n e p e l l e t p r e c i p i t a n t s f r o m t h e s o l u b l i z e d m e m b r a n e s u p e r n a t a n t , w h i c h w a s i m m e d i a t e l y l o a d e d t o t h e F P L C c o l u m n . 3 . 3 . 2 . 2 F P L C p u r i f i c a t i o n o f C 6 0 T o e n a b l e t h e p u r i fi c a t i o n o f C c O p r o t e i n u s i n g a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y a s d e s c r i b e d i n d e t a i l b e l o w , t h e C c O o v e r - e x p r e s s e d i n a v a r i e t y o f R . s p h a e r o i d e s s t r a i n s ( T a b l e 3 . 1 ) w e r e h i s t i d i n e - t a g g e d a t t h e C - t e r m i n u s o f s u b u n i t I o r s u b u n i t 1 1 ( F i g u r e 3 . 1 ) . T h e s u b u n i t 1 h i s - t a g g e d C c O e n z y m e s w e r e p u r i fi e d b y u s i n g a h o m e - p a c k e d N i 2 + - N T A g r a v i t y c o l u m n a n d c o n c e n t r a t e d w i t h a C e n t r i p l u s Y M l O O fi l t e r u n i t ( m o l e c u l a r w e i g h t c u t o f f 1 0 0 k D a ; m a x i m u m v o l u m e 1 5 m l , M i l l i p o r e ) b y D r . C a n i e H i s e r a s d e s c r i b e d e a r l i e r [ 2 2 0 ] , a n d t h e fi n a l p u r i fi e d C c O w a s i n t h e b u f f e r c o n t a i n i n g 5 0 m M K C l , 0 . 0 5 % ( m / v ) d o d e c y l m a l t o s i d e a n d 1 0 m M T r i s a t p H 8 . 0 . T h e s u b u n i t I I h i s - t a g g e d C c O e n z y m e s w e r e p u r i fi e d b y u s i n g a h o m e - p a c k e d c o l u m n o f N i 2 + - N T A ( t y p i c a l c o l u m n v o l u m e 2 0 m L ) o n a n F P L C s y s t e m ( A K T A , P h a r m a c i a ) s i m i l a r l y t o t h e m e t h o d s d e s c r i b e d e a r l i e r [ 3 5 ] . T h e b o u n d C c O w a s e l u t e d b y i n c r e a s i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f i m i d a z o l e , w h i c h c o m p e t e s w i t h h i s t i d i n e t a g f o r N i 2 + - N T A . F P L C b u f f e r A c o n t a i n e d 0 . 0 5 % d o d e c y l m a l t o s i d e , 2 2 0 m M K C l , 1 0 m M T r i s p H 8 . 0 a n d 1 0 m M i m i d a z o l e , a n d b u f f e r B c o n t a i n e d 0 . 0 5 % d o d e c y l m a l t o s i d e , 2 2 0 m M K C l , 1 0 m M T r i s p H 8 . 0 a n d 1 5 0 m M i m i d a z o l e . T h e c o l u m n w a s e q u i l i b r a t e d w i t h 4 c o l u m n v o l u m e s o f b u f f e r A b e f o r e t h e s o l u b i l i z e d m e m b r a n e p r o t e i n s w e r e l o a d e d t o t h e 1 1 1 L c o l u m n a t a t y p i c a l fl o w r a t e o f 0 . 2 5 m L / m i n . T h e l o a d e d c o l u m n w a s t h e n w a s h e d w i t h 1 1 c o l u m n v o l u m e s o f b u f f e r A , a f t e r w h i c h t h e p e r c e n t a g e o f b u f f e r B w a s r a i s e d t o e l u t e t h e b o u n d p r o t e i n s . T h e t y p i c a l l y a p p l i e d e l u t i o n g r a d i e n t p r o fi l e o f b u f f e r B i s s h o w n i n F i g u r e 3 . 2 . U V - V i s a b s o r b a n c e a t w a v e l e n g t h 2 8 0 n m w a s r e c o r d e d t o m o n i t o r t h e e l u t i o n o f p r o t e i n c o m p o n e n t s . 1 0 0 - w a s h i n g e l u t i n g l o a d i n g B u f f e r B ( % , v / v ) w - + — — — — - — — — — — - — - — — — _ - — ( D V 1 4 2 3 V o l u m e ( f r a c t i o n s ) F i g u r e 3 . 2 T y p i c a l F P L C g r a d i e n t p r o fi l e u s e d i n t h e p u r i fi c a t i o n o f s u b u n i t 1 1 h i s - t a g g e d C c O i n t h i s s t u d y [ 3 5 ] . A l l t h e p e a k s i n t h e F P L C p r o fi l e w e r e e x a m i n e d u s i n g r e d u c e d m i n u s o x i d i z e d U V - V i s s p e c t r o s c o p y f r o m 5 0 0 t o 7 0 0 n m t o m o n i t o r t h e c o m p o s i t i o n o f p r o t e i n a n d t h e p u r i t y o f C c O . T h e fl o w - t h r o u g h f r a c t i o n s d u r i n g s a m p l e l o a d i n g w e r e a l s o e x a m i n e d t o c h e c k f o r o v e r fl o w o f b i n d i n g . A l l t h e f r a c t i o n s u n d e r t h e s e c o n d p e a k o f t h e e l u t i o n p r o fi l e , u s u a l l y c o n t a i n i n g t h e p u r e C c O , w e r e c o l l e c t e d , d i l u t e d w i t h b u f f e r A t o a b o u t 1 0 0 m L , a n d i m m e d i a t e l y c o n c e n t r a t e d t o a b o u t 0 . 5 m L b y u s i n g a N 2 p r e s s u r e 1 1 2 c o n c e n t r a t i n g u n i t a t 4 ° C t o r e m o v e t h e i m i d a z o l e . T h e s a m p l e w a s t h e n d i l u t e d t o 5 0 m L u s i n g t h e d e t e r g e n t e x c h a n g e b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 2 % ( m / v ) d e c y l m a l t o s i d e , 5 0 m M N a C l a n d 1 0 m M T r i s p H 8 . 0 , a n d c o n c e n t r a t e d t o a b o u t 0 . 5 m L . T h i s p r o c e s s w a s r e p e a t e d o n e m o r e t i m e , a n d t h e fi n a l c o n c e n t r a t e d d e t e r g e n t - e x c h a n g e d C c O w a s c o l l e c t e d i n c e n t r i f u g e t u b e s , a n d k e p t a t 4 ° C f o r c r y s t a l l i z a t i o n s e t u p o r q u i c k - f r o z e n i n l i q u i d N 2 a n d s t o r e d a t - 8 0 ° C i n a l i q u o t s f o r f u r t h e r a n a l y s i s . 3 . 3 . 3 B C A p r o t e i n a s s a y T o t a l p r o t e i n l e v e l s w e r e d e t e r m i n e d b y u s i n g t h e B C A T M P r o t e i n A s s a y K i t ( T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c ) u s i n g 1 - 2 0 p g B S A ( 2 m g / m L i n 0 . 9 % s a l i n e a n d 0 . 0 5 % s o d i u m a z i d e ) a s t h e s t a n d a r d f o r m e m b r a n e s a m p l e s . H o w e v e r , t h e B C A a s s a y i s b a s e d . . 2 + . + . . . . o n t h e r e d u c t i o n r e a c t i o n o f C u i n t o C u b y p r o t e i n s 1 n a l k a l i n e m e d i u m , w h e r e e a c h o n e C u + c a n t h e n b e c h e l a t e d b y t w o b i c i n c h r o n i n i c a c i d ( B C A ) m o l e c u l e s t o d e v e l o p t h e p u r p l e - c o l o r . T h e e f f e c t s o f t h e s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n , t h e s e q u e n c e l e n g t h a n d t h e f o u r r e s i d u e s o f c y s t e i n e , c y s t i n e , t r y p t o p h a n a n d t y r o s i n e o n t h e c o l o r f o r m a t i o n w i t h B C A r e q u i r e a c a l i b r a t i o n c u r v e t o b e e s t a b l i s h e d u s i n g s t a n d a r d s a s c l o s e t o t h e s a m p l e a s p o s s i b l e . T h e r e f o r e , p u r i fi e d C c O w i t h a U V - V i s s p e c t r o s c o p i c a l l y d e t e r m i n e d c o n c e n t r a t i o n w a s u s e d a s t h e s t a n d a r d f o r t h e r e d i s s o l v e d / r e s u s p e n d e d C c O c r y s t a l s a m p l e s . T h e p r o t e i n s a m p l e s a n d s t a n d a r d s w e r e d i l u t e d t o 1 0 0 u L u s i n g a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 2 5 % ( m / v ) d e o x y c h o l a t e , 4 0 m M K C ] a n d 1 0 m M T r i s p H 1 1 . 2 . S u c h a d i l u t i n g s o l u t i o n w a s d e v e l o p e d t o o p t i m i z e t h e r e a c t i o n e f fi c i e n c y f o r m e m b r a n e 1 1 3 p r o t e i n s , a n d t o m i n i m i z e t h e i n t e r f e r e n c e f r o m d e t e r g e n t . 2 m L o f t h e f r e s h l y m i x e d s o l u t i o n o f r e a g e n t A a n d r e a g e n t B a t 5 0 : 1 ( v / v ) w a s a d d e d t o e a c h s a m p l e t e s t t u b e , m i x e d w e l l a n d i n c u b a t e d i n 6 0 ° C w a t e r b a t h f o r 3 0 m i n u t e s . T h e n t h e s a m p l e s w e r e q u i c k l y c h i l l e d i n i c e - w a t e r b a t h a n d l e t s t a n d i n r o o m t e m p e r a t u r e , a n d t h e a b s o r p t i o n a t 5 6 2 n m w a s r e c o r d e d u s i n g 1 c m - t h i c k c u v e t t e o n t h e U V - V i s s p e c t r o p h o t o m e t e r w i t h i n 1 0 m i n u t e s . E a c h o f t h e s t a n d a r d s a n d s a m p l e s w a s a n a l y z e d i n t r i p l i c a t e . 3 . 3 . 4 U V - V i s i b l e s p e c t r o s c o p y o f m e m b r a n e s u s p e n s i o n a n d p u r i fi e d C c O U V - V i s i b l e o p t i c a l s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a P e r k i n - E l m e r L a m b d a 4 0 P U V - v i s i b l e s p e c t r o p h o t o m e t e r . F o r t h e c r u d e m e m b r a n e s a m p l e s , d i t h i o n i t e - f u l l y — r e d u c e d m i n u s f e r r i c y a n i d e - f u l l y - o x i d i z e d s p e c t r a w e r e c o l l e c t e d f r o m 5 0 0 t o 7 0 0 n m w a v e l e n g t h s a n d t h e l e v e l o f C c O w a s q u a n t i fi e d b y u s i n g t h e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t 1 3 5 6 0 6 - 6 3 0 = 2 4 c m . l m M ' l [ 2 2 0 ] . F o r t h e p u r i fi e d C c O s a m p l e s , a U V - V i s i b l e p r o fi l e w a s d i r e c t l y c o l l e c t e d f r o m t h e o r i g i n a l s a m p l e w i t h a n d w i t h o u t r e d u c t i o n w i t h s o d i u m d i t h i o n i t e f r o m 2 5 0 t o 7 0 0 n m , a n d t h e l e v e l o f C c O w a s q u a n t i fi e d b y u s i n g t h e e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t A 5 6 0 6 - 6 4 0 = 4 0 c h m M - 1 [ 2 2 0 ] . T o c o u n t e r a c t t h e a c i d i t y o f t h e r e d u c i n g a g e n t , t h e s a m p l e s w e r e d i l u t e d w i t h t h e b u f f e r c o n t a i n i n g 1 m M E D T A , 0 . 1 % d o d e c y l m a l t o s i d e a n d 1 0 0 m M H E P E S p H 7 . 4 p r i o r t o t h e a n a l y s i s . A t l e a s t t r i p l i c a t e s p e c t r a w e r e c o l l e c t e d f o r e a c h s a m p l e . 3 . 3 . 5 U r e a S D S - P A G E g e l e l e c t r o p h o r e s i s S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) w a s a p p l i e d t o m o n i t o r t h e p r o t e i n c o m p o s i t i o n s o f t h e t w o e l u t e d p e a k s fi o m F P L C , a n d t h e 1 1 4 s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f p u r i fi e d C c O . A b r o a d r a n g e m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n m a r k e r s t a n d a r d ( 2 - 2 1 2 k D a ) a n d 1 0 p g ( 5 u L o f 2 p g / u L C c O ) p r o t e i n d i l u t e d i n b u f f e r c o n t a i n i n g 4 0 % g l y c e r o l , 2 5 m M T r i s p H 6 . 5 , 8 % ( m / v ) S D S a n d 0 . 0 8 % ( m / v ) b r o m o p h e n o l b l u e w e r e l o a d e d o n t o a n 8 % ( m / v ) a c r y l a m i d e s t a c k i n g g e l ( p H 6 . 8 ) o n t o p o f t h e u r e a - c o n t a i n i n g 1 8 % ( m / v ) a c r y l a m i d e s e p a r a t i n g g e l ( p H 8 . 8 ) , a n d w e r e e l e c t r o p h o r e s e d a t 1 0 0 V a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r a b o u t t w o h o u r s u n t i l t h e d y e f r o n t r a n o f f t h e g e l . T h e g e l w a s t h e n s t a i n e d w i t h C o o m a s s i e b l u e a n d d e s t a i n e d w i t h 7 . 5 % ( m / v ) a c e t i c a c i d f o r 2 - 3 t i m e s [ 7 7 ] , s e a l e d i n c e l l o p h a n e fi l m s , d r i e d o v e r n i g h t a n d s c a n n e d f o r t h e i m a g e . 3 . 3 . 6 S t e a d y s t a t e a c t i v i t y a s s a y o f t h e C c O b a s e d o n o x y g e n c o n s u m p t i o n T h e s t e a d y s t a t e a c t i v i t y o f C c O w a s e v a l u a t e d i n v i e w o f i t s r a t e o f o x y g e n c o n s u m p t i o n w i t h c y t o c h r o m e c a s t h e e l e c t r o n d o n o r a c c o r d i n g t h e r e a c t i o n s h o w n i n s c h e m e 3 . 1 . T h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n e d 3 0 u M c y t o c h r o m e c , 1 m M T M P D , 2 . 8 m M a s c o r b i c a c i d , 0 . 0 5 % d o d e c y l m a l t o s i d e i n 5 0 m M K H 2 P 0 4 p H 6 . 5 b u f f e r w h i c h h a d b e e n f u l l y p r e - s a t u r a t e d w i t h a t m o s p h e r i c o x y g e n u n d e r r o o m t e m p e r a t u r e . A s o l e c t i n l i p i d s ( 1 . 1 m g / m L fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f s o y b e a n a s o l e c t i n a n d 0 . 0 2 % ( m / v ) fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f c h o l a t e ) w e r e a l s o a d d e d t o t h e m i x t u r e f o r c o m p a r i s o n . T h e c o n s u m p t i o n o f o x y g e n w a s r e c o r d e d p o l a r o g r a p h i c a l l y i n a G i l s o n o x y g r a p h w i t h a C l a r k - t y p e e l e c t r o d e . T h e p h o s p h a t e - f r e e b u f f e r B i s - T r i s p r o p a n e p H 7 . 4 w a s u s e d i n s t e a d o f K H 2 P 0 4 f o r t h e e x p e r i m e n t s o f c o m p a r i n g 1 6 9 - 2 . 4 . 1 a n d 1 6 9 C L 3 C c O p u r i fi e d f o r m t h e n o r m a 1 - p h o s p h a t e / l o w - p h o s p h a t e g r o w t h c o n d i t i o n s . T h e t u m o v e r 1 1 5 n u m b e r o f t h e e n z y m a t i c a c t i v i t y w a s c a l c u l a t e d a s m o l e s o f c y t o c h r o m e c o x i d i z e d p e r m o l e o f e n z y m e p e r s e c o n d ( i . e . s e c - l ) . C 0 0 4 c y t 0 2 + + 8 H + ( i n ) + 0 2 — + 4 c y t 6 “ + 2 H 2 0 + 4 H + ( o u t ) S c h e m e 3 . 1 T h e o v e r a l l r e a c t i o n c a t a l y z e d b y C 0 0 , w h i c h i s a l s o t h e r e a c t i o n u s e d t o e v a l u a t e t h e s t e a d y s t a t e a c t i v i t y o f C c O . 3 . 3 . 7 P h o s p h o r u s a n a l y s i s T o q u a n t i t a t i v e l y m e a s u r e t h e p h o s p h o r u s c o n t e n t i n t h e p u r i fi e d C c O , l i p i d e x t r a c t s , a n d m e m b r a n e s a m p l e s , s e v e r a l p r e v i o u s l y r e p o r t e d p h o s p h o r u s a n a l y s i s m e t h o d s w e r e e v a l u a t e d , a n d t h e m e t h o d d e v e l o p e d b y B a r t l e t t e t a l i n 1 9 5 9 [ 2 2 4 ] w a s c h o s e n t o u s e w i t h a f e w a d a p t a t i o n s d u e t o i t s r o b u s t n e s s a n d r e p r o d u c i b i l i t y . I n a t y p i c a l a s s a y , 2 0 u L o f 2 0 0 u M C c O w a s d i l u t e d w i t h H 2 0 t o a fi n a l v o l u m e o f 2 m L i n a n e w g l a s s t e s t t u b e , a n d m i x e d w i t h 0 . 2 m L o f 1 0 M H 2 8 0 4 . T h e b u f f e r o f t h e e n z y m e w a s u s e d a s t h e b l a n k c o n t r o l . N o n a q u e o u s s a m p l e s s u c h a s t h e l i p i d e x t r a c t s i n m e t h a n o l : c h l o r o f o r m a n d t h e r e m a i n s f r o m l i p i d e x t r a c t i o n w e r e d r i e d u n d e r v a c u u m p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f 2 m L H 2 0 , a n d a p p r o p r i a t e b u f f e r o r o r g a n i c s o l u t i o n w a s u s e d a s t h e b a c k g r o u n d c o n t r o l a n d p r o c e s s e d i d e n t i c a l l y . K H 2 P 0 4 i n a q u e o u s s o l u t i o n s o r C L ( 1 8 2 1 ) 4 l i p i d s t a n d a r d i n m e t h a n o l : c h l o r o f o r m s o l u t i o n s c o n t a i n i n g 0 , 0 . 0 2 , 0 . 0 4 , 0 . 0 6 , 0 . 0 8 a n d 0 . 1 0 m o l e o f e q u i v a l e n t p h o s p h o r u s w e r e u s e d a s t h e s t a n d a r d s f o r p h o s p h o r u s q u a n t i fi c a t i o n , a n d t r e a t e d i d e n t i c a l l y t o t h e u n k n o w n s a m p l e s . 1 1 6 A s h i n g o f t h e s a m p l e s w a s p e r f o r m e d b y i n c u b a t i o n a t 1 5 0 - 1 6 0 0 C f o r a t l e a s t 3 h o u r s , f o l l o w e d b y a d d i t i o n o f 5 0 - 2 0 0 p L o f p h o s p h o r u s - f r e e h y d r o g e n p e r o x i d e ( 3 0 % , m / v ) t o e a c h s a m p l e t u b e a n d a n o t h e r 1 . 5 h o u r s o f h e a t i n g a t t h e s a m e t e m p e r a t u r e , u n t i l t h e s o l u t i o n s b e c a m e c l e a r . T h e n t h e s a m p l e s w e r e c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e , a n d d i l u t e d w i t h 4 . 4 m L o f H 2 0 , f o l l o w e d b y t h e a d d i t i o n o f 0 . 2 m L f r e s h F i s k e - S u b b a R o w r e a g e n t [ 2 2 4 ] , p r e p a r e d b y m i x i n g 1 5 g a n h y d r o u s s o d i u m b i s u l fi t e , 0 . 2 5 g l - a m i n o - Z - n a p h t h o l - 4 - s u l f o n i c a c i d a n d 0 . 5 g a n h y d r o u s s o d i u m s u l fi t e i n 1 0 0 m L w a t e r ( fi l t e r e d t h r o u g h 0 . 2 2 p m fi l t e r a n d k e p t i n d a r k a t 4 ° C ) , a n d 0 . 2 m L 5 % a m m o n i u m m o l y b d a t e . T h e s a m p l e s w e r e m i x e d t h o r o u g h l y a n d h e a t e d f o r 1 0 m i n u t e s i n a b o i l i n g w a t e r b a t h , t h e n t h e t e s t t u b e s w e r e q u e n c h e d i n i c e - w a t e r b a t h a n d t h e a b s o r b a n c e a t 8 3 0 n m w a s r e c o r d e d . E a c h o f t h e s a m p l e s a n d s t a n d a r d s w e r e r u n i n t r i p l i c a t e . 3 . 4 C c O c r y s t a l l i z a t i o n T o o b t a i n R . s p h a e r o i d e s C c O c r y s t a l s , a h a n g i n g d r o p c r y s t a l l i z a t i o n s e t - u p w a s u s e d f o r i n i t i a l c o n d i t i o n s c r e e n i n g a n d t h e n a s i t t i n g d r o p s e t - u p w a s u s e d t o o b t a i n t h e c r y s t a l s f o r f u r t h e r e x a m i n a t i o n ( F i g u r e 3 . 3 ) . 1 1 7 A B H a n g i n g - d r o p v a p o r d i f f u s i o n S i t t i n g - d r o p v a p o r d i f f u s i o n c r y s t a l l i z a t i o n c r y s t a l l i z a t i o n . C o v e r S l i d e . . T a p e O O I ’ O I - “ “ “ T - D r o p S o l u t i o n I : — _ — : _ — - l » - - R e s e r v o i r S o l u t i o n l 0 - . . . . . . . D r o p S o l u t i o n - - R e s e r v o i r S o l u t i o n F i g u r e 3 . 3 V a p o r d i f f u s i o n c r y s t a l l i z a t i o n u s i n g ( A ) h a n g i n g d r o p s e t u p , a n d ( B ) s i t t i n g d r o p s e t u p ( a d a p t e d f r o m [ 3 0 ] ) . 3 . 4 . 1 F o u r - s u b u n i t C c O c r y s t a l l i z a t i o n I n t h e s i t t i n g d r o p s e t u p , t y p i c a l l y 1 0 u L o f 8 0 u M C c O i n b u f f e r c o n t a i n i n g 5 0 m M N a C l , 0 . 2 0 % d e c y l m a l t o s i d e a n d 1 0 m M T r i s p H 8 . 0 w a s m i x e d w i t h 5 u L o f t h e r e s e r v o i r s o l u t i o n c o n t a i n i n g 1 0 0 m M s o d i u m c i t r a t e p H 5 . 7 ( o r 1 0 0 m M M E S p H 6 . 3 ) , 1 0 0 m M N a C l a n d 1 8 - 2 2 . 5 % P E G - 4 0 0 , a n d 5 u L o f t h e c r y s t a l l i z a t i o n a d d i t i v e s o l u t i o n c o n t a i n i n g 5 % h e p t a n e t r i o l , 3 3 m M M g C 1 2 , a n d 0 . 0 2 6 % d o d e l c y l m a l t o s i d e s [ 3 0 ] . A f t e r i n c u b a t i n g t h e c r y s t a l l i z a t i o n d r o p a t 4 ° C f o r o n e w e e k , t r i a n g u l a r o r h e x a g o n a l c r y s t a l s u s u a l l y s t a r t e d t o a p p e a r , b u t t h e c r y s t a l s w e r e n o t h a r v e s t e d u n t i l a f t e r f o u r t o fi v e w e e k s o f g r o w t h w h e n t h e y h a d r e a c h e d t h e s i z e o f a p p r o x i m a t e l y 0 . 2 x 0 . 2 x 0 . 1 m m t o 0 . 7 x 0 . 7 x 0 . 3 m m . I n t h e h a n g i n g d r o p i n i t i a l s c r e e n i n g , t h e v o l u m e o f s a m p l e s i z e s w a s d e c r e a s e d b y 5 f o l d . 3 . 4 . 2 T w o - s u b u n i t C c O c r y s t a l l i z a t i o n 1 1 8 B y c h a n g i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f C c O t o 1 2 0 u M , i n c r e a s i n g P E G - 4 0 0 c o n c e n t r a t i o n t o 2 4 - 2 6 % i n t h e r e s e r v o i r s o l u t i o n , a n d u s i n g 3 2 m M M g C 1 2 a n d 1 . 3 m M C d C l z i n t h e a d d i t i v e s o l u t i o n , C c O c r y s t a l s c o n t a i n i n g o n l y s u b u n i t s I a n d I I c a n b e o b t a i n e d [ 3 0 ] . F o r t h e 1 6 9 - 2 . 4 . 1 a n d 1 6 9 C L 3 s t r a i n s , h o w e v e r , t h e s e c r y s t a l s w e r e o n l y a b l e t o b e o b t a i n e d a t 2 0 0 C , b u t n o t a t 4 ° C . H e a v y p r o t e i n p r e c i p i t a t i o n o c c u r r e d i m m e d i a t e l y a f t e r m i x i n g o f t h e d r o p c o n t e n t s , f r o m w h i c h f o o t b a l l - s h a p e d o r fl o w e r p e t a l c l u s t e r - s h a p e d t w o - s u b u n i t c r y s t a l s g r a d u a l l y a p p e a r e d a f t e r a b o u t t w o w e e k s a n d r e a c h e d f u l l s i z e o f a p p r o x i m a t e l y 0 . 2 x 0 . 2 x 0 . 1 m m i n t h r e e t o f o u r w e e k s . 3 . 4 . 3 F l a s h - c o o l i n g o f t h e C c O c r y s t a l s P i c k i n g a n d f r e e z i n g o f t h e c r y s t a l s w e r e p e r f o r m e d i n a n e n v i r o n m e n t o f m i n i m i z e d - h u m i d i t y a t 4 ° C o r 2 0 ° C d e p e n d i n g o n t h e c r y s t a l g r o w t h t e m p e r a t u r e , u s i n g t h e p r o c e d u r e s d e v e l o p e d e a r l i e r [ 3 0 ] . B e f o r e h a r v e s t i n g t h e c r y s t a l s f r o m t h e c r y s t a l l i z a t i o n d r o p u s i n g c r y o l o o p s , t h e d r o p w a s e q u i l i b r a t e d w i t h 3 0 u L s t a b l i z i n g s o l u t i o n a n d g r a d u a l l y w i t h 1 0 0 u L c r y o p r o t e c t i o n s o l u t i o n . T h e s t a b l i z i n g s o l u t i o n w a s d e s i g n e d t o m i m i c t h e fi n a l c o m p o s i t i o n i n t h e c r y s t a l l i z a t i o n d r o p a n d c o n t a i n e d 9 1 m M s o d i u m c i t r a t e p H 5 . 7 ( o r 9 1 m M M E S p H 6 . 3 ) , 9 1 m M N a C l , 1 1 8 m M T r i s p H 8 . 0 , 3 0 m M M g C 1 2 , 2 . 5 % h e p t a n e t r i o l , 0 . 1 6 % d e c y l m a l t o s i d e , 0 . 0 1 6 % d o d e c y l m a l t o s i d e a n d 1 8 - 2 0 % P E G - 4 0 0 , d e p e n d i n g o n t h e s p e c i fi c d r o p . T h e c r y o p r o t e c t i o n s o l u t i o n c o n t a i n e d a h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f P E G - 4 0 0 ( 3 2 % ) , w i t h a l l t h e o t h e r c o m p o n e n t s i d e n t i c a l t o t h e s t a b l i z i n g 1 1 9 s o l u t i o n . T h e c r y s t a l s w e r e i m m e d i a t e l y i m m e r s e d i n t o l i q u i d N 2 a n d s t o r e d u n t i l x - r a y d a t a c o l l e c t i o n . 3 . 4 . 4 H a r v e s t i n g C c O c r y s t a l s f o r m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s F o r t h e m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s , a b o u t a h u n d r e d o f t h e c r y s t a l s g r o w n u n d e r s i m i l a r c o n d i t i o n s w e r e e a c h t r a n s f e r r e d , b y u s i n g a c l e a n c r y o l o o p u n d e r a m i c r o s c o p e , f r o m t h e c r y s t a l l i z a t i o n w e l l i n t o a c l e a n w e l l c o n t a i n i n g f r e s h 4 ° C M i l l i - Q w a t e r . T h e c r y s t a l s w e r e t h e n r i n s e d b r i e fl y , a n d c o l l e c t e d i n a n e w w e l l c o n t a i n i n g t y p i c a l l y 1 0 u L M i l l i - Q w a t e r o r t h e e x c h a n g e b u f f e r w i t h o u t t h e d e t e r g e n t . T h e c r y s t a l m i x t u r e w a s t h e n t r a n s f e r r e d i n t o a n E p p e n d o r f c e n t r i f u g a t i o n t u b e , v o r t e x e d v i g o r o u s l y , a n d t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d b y t h e B C A a s s a y u s i n g B S A a n d p u r i fi e d C c O o f k n o w n c o n c e n t r a t i o n ( d e t e r m i n e d b y U V - V i s ) a s t h e s t a n d a r d s . T h e r e d i s s o l v e d / r e s u s p e n d e d c r y s t a l m i x t u r e s w e r e t h e n d i l u t e d t o t h e s a m e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n f o r m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s . 3 . 4 . 5 X — r a y d i f f r a c t i o n d a t a c o l l e c t i o n X - r a y d i f f r a c t i o n d a t a w e r e c o l l e c t e d a t L S - C A T a n d G M / C A - C A T a t t h e A d v a n c e d P h o t o n S o u r c e o f t h e A r g o n n e N a t i o n a l L a b o r a t o r y ( A r g o n n e , I L ) , u s i n g M A R C C D - M 1 6 5 d e t e c t o r a n d r o t a t i o n d a t a c o l l e c t i o n m e t h o d . 3 . 5 L i p i d e x t r a c t i o n 3 . 5 . 1 E x t r a c t i o n o f l i p i d s f r o m i s o l a t e d m e m b r a n e s 1 2 0 F o r t h e r e s u l t s d e s c r i b e d i n C h a p t e r s 5 a n d 7 , t r i p l i c a t e s o f 1 0 u L o f t h e s u s p e n d e d m e m b r a n e s fi o m e i t h e r w i l d t y p e o r m u t a n t R . s p h a e r o i d e s c e l l s ( d i l u t e d w i t h w a t e r t o a p p r o x i m a t e l y 1 . 4 m g / m L p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n e d b y B C A a s s a y ) w e r e f r e e z e - d r i e d , a n d l i p i d s e x t r a c t e d b y t h e s e q u e n t i a l a d d i t i o n o f 2 x 5 0 u L c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 2 : 1 , v / v ) , 1 x 5 0 u L e t h y l e t h e r : e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) , a n d 2 x 5 0 p L c h l o r o f o r m : m e t h a n o l : a m m o n i u m h y d r o x i d e ( 1 0 0 : 5 0 z 2 , v / v / v ) f o l l o w e d b y v i g o r o u s v o r t e x i n g a n d r e m o v a l o f t h e s o l u t i o n a t e a c h s t e p [ 5 3 ] . T h e e x t r a c t s w e r e c o m b i n e d , t h e n d r i e d u n d e r v a c u u m a n d r e — d i s s o l v e d i n 5 0 u L c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) p r i o r t o m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s . F o r l - D T L C a n a l y s i s , a b o u t 2 0 - 4 0 u L o f t h e t o t a l 5 0 u L e x t r a c t s w o u l d b e u s e d , b u t t h e s a m e a m o u n t w a s a p p l i e d f o r e a c h s a m p l e i n c o m p a r i s o n . F o r t h e e x p e r i m e n t s o f t h e n o r m a l - p h o s p h a t e a n d l o w - p h o s p h a t e g r o w t h c o m p a r i s o n ( C h a p t e r 1 0 ) , t r i p l i c a t e s o f 2 0 u L o f t h e m e m b r a n e s u s p e n s i o n s d i l u t e d w i t h w a t e r t o 1 m g / m L p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w e r e s u b j e c t e d t o t h e l i p i d e x t r a c t i o n u s i n g t h e s a m e p r o c e d u r e s a s d e s c r i b e d a b o v e , e x c e p t t h a t t h e s o l v e n t e t h y l e t h e r : e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) w a s c h a n g e d t o e t h y l e t h e r : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) . F o r c o m p a r i s o n , s i m p l e e x t r a c t i o n s u s i n g o n l y 3 x 5 0 u L c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) o r o n l y 3 x 5 0 u L c h l o r o f o r m : m e t h a n o l : a m m o n i u m h y d r o x i d e ( 1 0 0 2 5 0 2 2 , v / v / v ) w e r e a l s o p e r f o r m e d o n t h e f r e e z e - d r i e d m e m b r a n e s a m p l e s . A l l o f t h e s e e x t r a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n 2 5 0 u L g l a s s v i a l s s h o w n t o c o n t a i n n o c o n t a m i n a t i o n . 3 . 5 . 2 E x t r a c t i o n o f l i p i d s f r o m p u r i f i e d C c O E x t r a c t i o n o f l i p i d s f r o m 1 0 u L o f C c O e n z y m e ( a p p r o x . 1 4 0 u M i n t h e b u f f e r c o n t a i n i n g 5 0 m M K C l a n d 0 . 0 5 % w / v d o d e c y l m a l t o s i d e f o r t h e s u b u n i t I h i s - t a g g e d 1 2 1 v e r s i o n , o r i n t h e b u f f e r c o n t a i n i n g 5 0 m M N a C l a n d 0 . 2 % d e c y l m a l t o s i d e f o r t h e s u b u n i t I I h i s - t a g g e d v e r s i o n ) p u r i fi e d f r o m t h e w i l d t y p e a n d m u t a n t R . s p h a e r o i d e s c e l l s , w a s c a r r i e d o u t u s i n g t h e s a m e p r o c e d u r e d e s c r i b e d a b o v e , f o l l o w i n g i n i t i a l w a s h i n g o f t h e f r e e z e - d r i e d e n z y m e s t h r e e t i m e s w i t h 1 m L a n h y d r o u s a c e t o n e a t 4 ° C , o r d i l u t i o n a n d fi l t r a t i o n u s i n g a m e m b r a n e w i t h a 3 k D a m o l e c u l a r w e i g h t c u t o f f ( M i l l i p o r e ) ( C h a p t e r 8 ) . O t h e r e x t r a c t i o n m e t h o d s w e r e a l s o e v a l u a t e d t o i m p r o v e t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m p u r i fi e d C c O . U s i n g t h e m o d i fi e d B l i g h & D y e r e x t r a c t i o n [ 2 8 , 1 3 7 ] , 1 0 0 u L o f d i l u t e d e n z y m e a t 5 0 u M w a s d i r e c t l y m i x e d w i t h 2 m L o f c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) i n a 1 0 m L g l a s s t e s t t u b e w i t h a t e fl o n — l i n e d s c r e w c a p t o f o r m a o n e - p h a s e m i x t u r e . T h e m i x t u r e w a s v i g o r o u s l y v o r t e x e d f o r 5 m i n a n d l e t s t a n d i n i c e o r i n r o o m t e m p e r a t u r e f o r a b o u t 2 0 m i n , f o l l o w e d b y t h e a d d i t i o n o f 1 m L d e t e r g e n t - f r e e a q u e o u s b u f f e r c o n t a i n i n g 5 0 m M N a C l a n d 1 0 m M T r i s p H 8 . 0 , a n d c e n t r i f u g a t i o n 4 ° C f o r 2 0 m i n u t e s t o d r i v e t h e s e p a r a t i o n o f p h a s e s , w h e r e t h e c h l o r o f o r m - r i c h l o w e r p h a s e a n d t h e m e t h a n o l / w a t e r - r i c h u p p e r p h a s e w e r e s e p a r a t e d w i t h a t h i n fi l m o f p r o t e i n f o r m e d i n b e t w e e n . T h e fi l m w a s c a r e f u l l y p i e r c e d w i t h a g l a s s p i p e t t e a n d t h e b o t t o m l a y e r w a s p o o l e d i n a c l e a n t e s t t u b e a n d w a s h e d o n c e m o r e w i t h 1 m L d e t e r g e n t - f r e e a q u e o u s b u f f e r , w h i l e t h e t o p l a y e r a n d t h e p r o t e i n fi l m w e r e e x t r a c t e d t w i c e m o r e w i t h 2 m L o f c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) b y v i g o r o u s v o r t e x i n g f o r 5 m i n a n d c e n t r i f u g a t i o n f o r 2 0 m i n . T h e c o m b i n e d b o t t o m l a y e r s w e r e t h e n d r i e d u n d e r v a c u u m f o r fi r r t h e r p h o s p h o r u s a n a l y s i s . T h e s e e x t r a c t i o n e x p e r i m e n t s w e r e d o n e i n t r i p l i c a t e . 3 . 5 . 2 . 1 A c e t o n e w a s h i n g t o r e m o v e d e t e r g e n t f r o m p u r i fi e d C c O 1 2 2 T y p i c a l l y 1 0 p L o f t h e p u r i fi e d C c O w a s fi ' e e z e - d r i e d a n d w a s h e d w i t h 1 m L c o l d a n h y d r o u s a c e t o n e [ 2 2 5 ] i n E p p e n d o r f c e n t r i f u g e t u b e s a t 4 ° C f o l l o w e d b y v o r t e x i n g a n d s o n i c a t i n g f o r 3 m i n a n d c e n t r i f u g a t i o n a t 5 0 0 0 r p m f o r 5 m i n t o r e m o v e t h e a c e t o n e s o l u t i o n , f o r t h r e e t i m e s . T h e w a s h e d e n z y m e i n t h e f o r m o f a g r e e n p o w d e r w a s t r a n s f e r r e d t o a n e w g l a s s v i a l , d r i e d a g a i n u n d e r v a c u u m a n d s u b j e c t e d t o l i p i d e x t r a c t i o n u s i n g t h e p r o c e d u r e s d e s c r i b e d a b o v e . 3 . 5 . 2 . 2 D i l u t i o n - fi l t r a t i o n ( 3 k D a ) t o r e m o v e d e t e r g e n t f r o m p u r i fi e d C c O T y p i c a l l y 1 0 u L o f t h e p u r i fi e d C c O w a s d i l u t e d w i t h 5 0 0 u L o f t h e d e t e r g e n t - f r e e b u f f e r c o n t a i n i n g 5 0 m M K C l a n d 1 0 m M T r i s p H 8 . 0 , v o r t e x e d f o r 3 m i n , a n d c e n t r i f u g e d a t 1 4 k r p m ( i n a c e n t r i f u g a l fi l t e r u n i t w i t h a 3 K m o l e c u l a r w e i g h t c u t o f f fi l t e r ) a t 4 ° C f o r a b o u t 2 0 - 3 0 m i n u n t i l t h e fi n a l v o l u m e o f s o l u t i o n o n t o p o f t h e fi l t e r r e a c h e d 5 0 u L . T h e fi l t r a t e w a s r e m o v e d a n d c o l l e c t e d s e p a r a t e l y , a n d 5 0 0 u L o f d e t e r g e n t - f r e e b u f f e r w a s a d d e d a g a i n t o d i l u t e t h e e n z y m e , a n d t h e p r o c e s s w a s r e p e a t e d t w i c e m o r e . T h e fi n a l w a s h e d e n z y m e w a s t r a n s f e r r e d t o g l a s s v i a l , d r i e d a g a i n u n d e r v a c u u m a n d s u b j e c t e d t o l i p i d e x t r a c t i o n u s i n g t h e p r o c e d u r e s d e s c r i b e d a b o v e . 3 . 5 . 3 E v a l u a t i o n o f e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y o f l i p i d s f r o m p u r i fi e d C c O P h o s p h o r u s a n a l y s i s a s d e s c r i b e d a b o v e w a s a p p l i e d t o t h e l i p i d e x t r a c t s , t h e r e m a i n s a f t e r e x t r a c t i o n , a n d t h e e n z y m e w i t h o u t e x t r a c t i o n i n t r i p l i c a t e t o o b t a i n t h e p e r c e n t a g e y i e l d o f e x t r a c t i o n . T o e v a l u a t e h o w t h e e n z y m e p r e - e x t r a c t i o n t r e a t m e n t s a f f e c t e d t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y , t h e s a m e a m o u n t s o f p u r i fi e d C c O , p u r i fi e d C c O a f t e r b e i n g f r e e z e - d r i e d , a n d p u r i fi e d C c O a f t e r b e i n g f r e e z e - d r i e d f o l l o w e d b y a n h y d r o u s 1 2 3 a c e t o n e w a s h i n g , w e r e e a c h s u b j e c t e d t o t h e l i p i d e x t r a c t i o n p r o c e d u r e s d e s c r i b e d e a r l i e r i n t r i p l i c a t e , a n d p h o s p h o r u s a n a l y s i s w a s a p p l i e d t o t h e e x t r a c t s , t h e r e m a i n s f r o m e x t r a c t i o n , a n d t h e p r o t e i n w i t h o u t e x t r a c t i o n . 3 . 6 T h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y 3 . 6 . 1 l - D t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y S i l i c a T L C p l a t e s w i t h o r w i t h o u t t h e c o n c e n t r a t i n g b a n d w e r e s o a k e d w i t h 2 M ( N H 4 ) 2 S O 4 s o l u t i o n a n d i n c u b a t e d a t 1 2 0 ° C f o r 3 h o u r s t o m a k e t h e p l a t e s a c i d i c . T y p i c a l l y t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m 8 . 7 u L m e m b r a n e ( a t a b o u t 1 4 0 m g / m L p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n ) o r 0 . 6 7 m g p u r i fi e d C c O ( a t a b o u t 2 0 - 4 0 u L v o l u m e ) u s i n g t h e s o l v e n t s d e s c r i b e d a b o v e w e r e l o a d e d t o t h e p l a t e s , w h i c h w e r e d e v e l o p e d b y a c e t o n e : t o l u e n e : w a t e r ( 9 1 : 3 0 : 7 , v / v / v ) f o r a b o u t 5 0 - 6 0 m i n u t e s t o r e a c h a b o u t 9 0 % o f t h e p l a t e l e n g t h ( C h a p t e r s 7 a n d 8 ) [ 9 0 ] . T h e l i p i d s w e r e t h e n v i s u a l i z e d b y i o d i n e v a p o r s t a i n . F o r t h e s p o t s t o b e s c r a p e d o f f t h e p l a t e a n d r e - e x t r a c t e d f o r m a s s s p e c t r o m e t r y i d e n t i fi c a t i o n a n a l y s i s , t h e a r e a o v e r t h e s p o t s w a s c o v e r e d w i t h a l u m i n u m f o i l d u r i n g t h e i o d i n e v a p o r s t a i n i n g , f o l l o w e d b y e x t r a c t i o n u s i n g c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) . 3 . 6 . 2 E v a l u a t i o n o f c l e a v a b l e d e t e r g e n t f o r p o t e n t i a l a p p l i c a t i o n i n l i p i d s e x t r a c t i o n f r o m p u r i fi e d C c O u s i n g T L C T o e x p l o r e t h e p o t e n t i a l o f r e m o v i n g t h e i n t e r f e r e n c e o f d e t e r g e n t f o r M S a n d i m p r o v i n g e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y o f l i p i d s f r o m p u r i fi e d C c O , a s t r u c t u r a l l y s w i t c h a b l e t y p e o f d e t e r g e n t f r o m A n a t r a c e ( b i c a r b o n a t e s a l t , C 1 7 H 3 6 N 2 0 3 , m . w . 3 1 6 . 4 8 ) c o n t a i n i n g 1 2 4 a S c h i f f b a s e b o n d l i n k a g e c l e a v a b l e b y a r g o n g a s b u b b l i n g a t 6 0 ° C w a s t e s t e d . H o w e v e r , i t w a s n o t f u r t h e r i n v e s t i g a t e d i n t h e c u r r e n t s t u d y , b e c a u s e a t 5 m M ( i . e . , 1 0 c m c ) i t c a u s e d i n s t a n t p r e c i p i t a t i o n o f C c O ( a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 5 u M a n d 1 5 u M ) , i t s N , N - d i m e t h y l - a m i n o h e a d g r o u p p r e d o m i n a n t l y i o n i z e d e v e n i n M A L D I M S u s i n g 2 , 5 - D H B a s t h e m a t r i x s u c h t h a t n o l i p i d s p e a k s w e r e o b s e r v a b l e i n e i t h e r p o s i t i v e o r n e g a t i v e i o n m o d e e x c e p t f o r i t s p r o t o n a t e d i o n a t m / z 2 2 5 ( + v e ) , a n d a d j u s t i n g t h e p H o f t h e b u f f e r f r o m 8 . 0 t o 9 . 0 m a d e n o d i f f e r e n c e . 3 . 6 . 3 2 - D t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y 2 - D T L C w a s p e r f o r m e d b y B a n i t a T a m o t f r o m D r . B e n n i n g ’ s g r o u p [ 1 5 ] , a n d t h e r e s u l t s a r e n o t i n c l u d e d a s p a r t o f t h e p r e s e n t d i s s e r t a t i o n . L i p i d e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d a n d l o a d e d o n t o a c t i v a t e d S i l i c a T L C p l a t e s a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d [ 1 4 ] . T h e l i p i d s w e r e s e p a r a t e d b y t w o - d i m e n s i o n a l T L C u s i n g c h l o r o f o r m - m e t h a n o l - w a t e r ( 6 5 : 2 5 : 4 , v / v / v ) f o r t h e fi r s t d i m e n s i o n a n d c h l o r o f o r m - m e t h a n o l - a c e t i c a c i d - w a t e r ( 1 7 0 : 2 5 : 2 5 : 4 , v / v / v / v ) f o r t h e s e c o n d d i m e n s i o n . L i p i d s w e r e v i s u a l i z e d b y c h a r r i n g w i t h 5 0 % H 2 S 0 4 [ 1 4 ] . 3 . 6 . 4 Q u a n t i t a t i v e T L C l i p i d a n a l y s i s u s i n g l 4 C - l a b e l i n g l 4 C - l a b e l i n g q u a n t i fi c a t i o n w a s p e r f o r m e d b y B a n i t a T a m o t f r o m D r . B e n n i n g ’ s g r o u p [ 1 5 ] , a n d t h e r e s u l t s a r e n o t i n c l u d e d a s p a r t o f t h e p r e s e n t d i s s e r t a t i o n . L i p i d s f r o m a e r o b i c a l l y - g r o w n o v e r n i g h t c u l t u r e s w e r e t h e n l a b e l e d b y i n c u b a t i n g t h e c u l t u r e s w i t h [ 1 - 1 4 C ] - a c e t a t e a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d [ 2 2 6 ] . L i p i d e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d a n d s e p a r a t e d b y t w o - d i m e n s i o n a l T L C a s d e s c r i b e d a b o v e . T h e p l a t e s w e r e e x p o s e d t o a 1 2 5 p h o s p h o i m a g e r ( G E H e a l t h c a r e , P i s c a t a w a y , N J ) t o o b t a i n a n i m a g e o f t h e l a b e l e d l i p i d s . T h e l i p i d s o n t h e T L C p l a t e s w e r e t h e n v i s u a l i z e d b y i o d i n e s t a i n i n g a n d t h e r a d i o a c t i v i t y i n t h e i n d i v i d u a l s p o t s w a s m e a s u r e d b y u s i n g a l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r [ 2 2 6 ] . T h e r e l a t i v e a m o u n t o f e a c h l i p i d w a s c a l c u l a t e d a s t h e p e r c e n t a g e o f t o t a l r a d i o a c t i v i t y p r e s e n t i n t h e l i p i d s a m p l e . 3 . 7 M a s s s p e c t r o m e t r y 3 . 7 . 1 C h a r a c t e r i z a t i o n o f l i p i d e x t r a c t s u s i n g E S I i o n i z a t i o n s o u r c e s 3 . 7 . 1 . 1 I d e n t i fi c a t i o n o f l i p i d s b y u s i n g E S I M S a n d C I D M S n o n a l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r M o s t o f t h e m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s o f l i p i d e x t r a c t s w a s p e r f o r m e d u s i n g a l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r ( T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c m o d e l L T Q , S a n J o s e , C A ) , e q u i p p e d w i t h a n a n o e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n s o u r c e ( n a n o E S I ) , a l t h o u g h t r a d i t i o n a l E S I a n d s t a t i c n a n o E S I s o u r c e s w e r e a l s o a p p l i e d f o r c o m p a r i s o n i n t h e e a r l y s t a g e s o f e x p e r i m e n t s . T o t a l l i p i d e x t r a c t s f r o m e a c h m e m b r a n e s a m p l e o b t a i n e d u s i n g t h e p r o c e d u r e s d e s c r i b e d a b o v e w e r e d i l u t e d 4 f o l d ( 2 0 f o l d f o r t h e i n d i v i d u a l s p e c i fi c - l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s ) u s i n g C H C l 3 z C H 3 O H ( 1 : 1 , v / v ) c o n t a i n i n g 4 0 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e , i m m e d i a t e l y p r i o r t o i n t r o d u c t i o n t o t h e m a s s s p e c t r o m e t e r b y d i r e c t i n f u s i o n t h r o u g h n o n - c o a t e d s i l i c a t i p s w i t h i n t e r n a l d i a m e t e r s o f 3 0 p m ( N e w O b j e c t i v e , I n c . W o b u m , M A ) , a t a fl o w r a t e o f 0 . 3 o r 0 . 5 u L / m i n . N a n o E S I 1 2 6 c o n d i t i o n s w e r e o p t i m i z e d t o m a x i m i z e t h e s e n s i t i v i t y a n d s t a b i l i t y o f t h e p r e c u r s o r i o n s o f i n t e r e s t w h i l e m i n i m i z i n g ‘ i n - s o u r c e ’ fi ' a g m e n t a t i o n . T y p i c a l n a n o E S I c o n d i t i o n s w e r e : h e a t e d c a p i l l a r y t e m p e r a t u r e 1 8 0 ° C , s p r a y v o l t a g e 1 . 8 k V , c a p i l l a r y v o l t a g e 2 0 V a n d t u b e l e n s v o l t a g e 7 5 V . M a s s s p e c t r a ( M S ) w e r e a c q u i r e d f r o m m / z 1 5 0 t o 2 0 0 0 u s i n g e n h a n c e d s c a n m o d e . C o l l i s i o n - i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ( C I D ) M S / M S a n d M S n e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d u s i n g h e l i u m a s t h e c o l l i s i o n g a s u s i n g a n a c t i v a t i o n t i m e o f 3 0 m s . C o l l i s i o n e n e r g i e s w e r e o p t i m i z e d f o r e a c h p r e c u r s o r i o n o f i n t e r e s t . T y p i c a l l y , a n a c t i v a t i o n q v a l u e o f 0 . 2 w a s u s e d i n o r d e r t o a c h i e v e a r e a s o n a b l e l o w - m a s s - c u t o f f w h i l e s t i l l m a i n t a i n i n g g o o d s e n s i t i v i t y , a n d d e p e n d i n g o n t h e a c t i v a t i o n q v a l u e s , t h e c o r r e s p o n d i n g o p t i m a l c o l l i s i o n e n e r g i e s a p p l i e d w e r e 2 0 % , 2 5 % o r 3 0 % f o r t h e p h o s p h o l i p i d s , o r n i t h i n e l i p i d s a n d g l u t a m i n e l i p i d s , a n d h a d t o b e i n c r e a s e d t o 3 5 % o r 4 0 % f o r t h e S Q D G l i p i d s . T h e i s o l a t i o n w i d t h r e q u i r e d t o o b t a i n i s o t o p i c a l i s o l a t i o n o f p r e c u r s o r i o n s w a s t y p i c a l l y 1 . 2 D a f o r p r o t o n a t e d a n d d e p r o t o n a t e d i o n s , a n d 1 . 5 - 2 . 0 D a f o r n o n - c o v a l e n t c a t i o n i c o r a n i o n i c a d d u c t i o n s [ 1 8 5 ] . T h e s p e c t r a s h o w n w e r e t y p i c a l l y t h e a v e r a g e o f 5 0 - 3 0 0 s c a n s . E a c h s c a n w a s t y p i c a l l y a n a v e r a g e o f t h r e e m i c r o s c a n s . T h e t a r g e t n u m b e r w a s s e t a t 1 e 4 f o r M S a n d 3 e 4 f o r M S “ . T h e m a x i m u m i n j e c t i o n t i m e w a s t y p i c a l l y s e t a t 5 0 m s f o r M S a n d M S n f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n a n a l y s i s , b u t i n c r e a s e d t o 1 0 0 m s o r 5 0 0 m s f o r q u a n t i fi c a t i o n p u r p o s e t o p r e v e n t m a x o u t w h i c h i s g o i n g t o b e s p e c i fi e d b e l o w . F o r t h e s t u d y o f a n i o n i c a d d u c t i o n s o f s y n t h e s i z e d p h o s p h o l i p i d s s t a n d a r d s i n C h a p t e r 4 , m a s s s p e c t r o m e t r y e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d u s i n g t h e T h e r m o m o d e l L T Q 1 2 7 l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r e q u i p p e d w i t h n a n o s p r a y i o n i z a t i o n s o u r c e . S y n t h e s i z e d p h o s p h o l i p i d s s t a n d a r d s ( 5 u M ) i n C H 3 O H / C H C 1 3 ( 1 : 1 , v / v ) c o n t a i n i n g 0 . 1 - 2 0 m M a m m o n i u m s a l t s w e r e i n t r o d u c e d t o t h e m a s s s p e c t r o m e t e r a t a t y p i c a l fl o w r a t e o f 0 . 2 u L / m i n . S p e c t r a w e r e a c q u i r e d i n n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e . T y p i c a l n E S I c o n d i t i o n s w e r e : s p r a y v o l t a g e 1 . 5 k V , h e a t e d c a p i l l a r y t e m p e r a t u r e 2 0 0 ° C , c a p i l l a r y v o l t a g e — 2 0 V , t u b e l e n s v o l t a g e — 7 5 V . U n l e s s o t h e r w i s e s p e c i fi e d , C I D - M S / M S a n d M S 1 1 s p e c t r a w e r e a c q u i r e d a t a n a c t i v a t i o n q v a l u e o f 0 . 2 u s i n g a n i s o l a t i o n w i d t h o f 2 . 0 D a t o o b t a i n s t a b l e i s o l a t i o n o f t h e n o n - c o v a l e n t a n i o n i c a d d u c t s p r e c u r s o r i o n s , a n o r m a l i z e d c o l l i s i o n e n e r g y o f 3 0 % a n d a n a c t i v a t i o n t i m e o f 3 0 m s . T h e s p e c t r a s h o w n w e r e t h e a v e r a g e o f 8 0 s c a n s . F o r t h e S Q D G a n a l y s i s s h o w n i n c h a p t e r 6 , C I D M S / M S e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n n e g a t i v e i o n m o d e u s i n g a c o l l i s i o n e n e r g y o f 4 0 % f o r a d u r a t i o n o f 3 0 m s a n d a n a c t i v a t i o n q v a l u e o f 0 . 2 . E a c h s p e c t r u m w a s t h e a v e r a g e o f 1 0 0 s c a n s c o n t a i n i n g t h r e e m i c r o s c a n s f o r e a c h s c a n . I o n m a p p i n g e x p e r i m e n t s t o s c r e e n f o r t h e p a r e n t i o n s p r o d u c i n g t h e S Q D G s i g n a t u r e p r o d u c t i o n a t m / z 2 2 5 . 0 8 w e r e p e r f o r m e d w i t h a s t e p s i z e o f 0 . 1 i n c e n t r o i d m o d e , o v e r t h e M S r a n g e o f m / z 1 5 0 - 2 0 0 0 . 3 . 7 . 1 . 2 P u l s e d - Q c o l l i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n M S n o n a l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p I n o r d e r t o a d d r e s s t h e l o w m a s s c u t o f f i s s u e d e l i m i t e d b y t h e a c t i v a t i o n a n d d e t e c t i o n m e t h o d s o f C I D i n l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p , a n a l t e r n a t i v e q u i c k P u l s e d - Q C o l l i s i o n I n d u c e d D i s s o c i a t i o n ( P Q D ) fi ' a g m e n t a t i o n w a s u s e d t o e x t e n d t h e m a s s r a n g e f o r f r a g m e n t i o n d e t e c t i o n t o a m u c h l o w e r v a l u e , t y p i c a l l y m / z 5 0 ( o r a s l o w a s m / z 3 0 ) 1 2 8 f o r l i p i d p r e c u r s o r i o n s , v i a a n a c t i v a t i o n p u l s e o f h i g h q a t 0 . 7 f o l l o w e d b y a q u i c k d r o p o f q v a l u e d o w n t o 0 . 0 5 t o t r a p t h e f r a g m e n t s i o n s f o r d e t e c t i o n . T h e e f fi c i e n c y o f f r a g m e n t a t i o n a n d t r a p p i n g w a s m o r e s e n s i t i v e t o t h e c o l l i s i o n e n e r g y i n P Q D , w h i c h w a s o p t i m i z e d a t a r o u n d 2 0 % f o r t h e d u r a t i o n o f 0 . 0 1 m s . N e a r l y a l l u s e f u l l i p i d fi n g e r p r i n t f r a g m e n t i o n s , n o t i n c l u d i n g s o d i u m o r p o t a s s i u m a d d u c t s , c o u l d b e r e v e a l e d a b o v e m / z 5 0 i n P Q D M S / M S . 3 . 7 . 1 . 3 A n a l y s i s o f l i p i d e x t r a c t s u s i n g E S I M S a n d C I D M S I M S o n a t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r F o r e x p e r i m e n t s o n t h e T h e r m o T S Q t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r ( T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c M o d e l T S Q , S a n J o s e , C A ) e q u i p p e d w i t h t h e s a m e n a n o E S I i o n s o u r c e t h r o u g h d i r e c t i n f u s i o n , t h e o n l y d i f f e r e n c e i n s a m p l e p r e p a r a t i o n w a s t h a t t h e l i p i d e x t r a c t w a s a b o u t 4 f o l d m o r e c o n c e n t r a t e d , d u e t o t h e l o w e r s e n s i t i v i t y i n t h e T S Q t r i p l e q u a d i n s t r u m e n t , b u t f o r t h e a u t o s a m p l e r c h i p - b a s e d n a n o E S I s o u r c e ( A d v i o n B i o s y s t e m s n a n o m a t e 1 0 0 R o b o t , I t h a c a , N Y ) , t h e l i p i d e x t r a c t s w e r e fi n a l l y d i l u t e d i n m e t h a n o l : c h l o r o f o r m : i s o p r o p a n o l ( 1 : 2 : 4 , v / v / v ) c o n t a i n i n g 4 0 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e p r i o r t o t h e a n a l y s i s , a n d t h e s a m e l i p i d c o n c e n t r a t i o n c o u l d b e u s e d a s i n t h e l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p . O n t h e t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r ( T S Q ) , M S w a s p e r f o r m e d u s i n g h e a t e d c a p i l l a r y t e m p e r a t u r e 1 5 0 ° C , a n d s p r a y v o l t a g e 1 . 5 k V u s i n g t h e a u t o s a m p l e r n a n o E S I s o u r c e . T h e fl o w r a t e i n n e g a t i v e i o n m o d e w a s e s t i m a t e d t o b e a b o u t 0 . 1 5 u L / m i n . C o l l i s i o n - e n e r g y - r e s o l v e d f r a g m e n t a t i o n c u r v e s w e r e o b t a i n e d b y v a r y i n g t h e c o l l i s i o n e n e r g y f r o m 0 t o 8 0 V a t a s t e p o f 5 V o n t h e i s o t o p i c a l l y i s o l a t e d p r e c u r s o r 1 2 9 i o n s . O p t i m a l M S / M S f r a g m e n t a t i o n s p e c t r a f o r S Q D G w e r e o b t a i n e d u n d e r c o l l i s i o n g a s ( A r ) p r e s s u r e 1 . 5 m T o r r ( q 2 ) a n d c o l l i s i o n e n e r g y 6 0 V u n l e s s s p e c i fi e d o t h e r w i s e . T y p i c a l l y Q 1 a n d Q 3 p e a k w i d t h s w e r e b o t h s e t a t 0 . 5 D a . P a r e n t i o n s c a n s f o r p r e d o m i n a n t s i g n a t u r e p r o d u c t i o n a t m / z 2 2 5 . 0 8 ( — v e ) w e r e t h e n p e r f o r m e d u n d e r s u c h s e t t i n g s o v e r t h e M S r a n g e o f m / z 3 0 0 - 1 5 0 0 D a . P r e c u r s o r i o n s c a n s f o r m / z 1 1 5 ( + v e ) a n d m / z 1 3 1 ( - - v e ) w e r e c a r r i e d o u t s i m i l a r l y f o r i d e n t i f y i n g o r n i t h i n e l i p i d s , a n d m / z 1 4 7 ( + v e ) , m / z 1 2 9 ( + v e ) a n d m / z 1 4 5 ( — v e ) f o r g l u t a m i n e l i p i d s . T h e s a m p l e s w e r e a l l c o m p l e x l i p i d e x t r a c t s w i t h o u t p r e v i o u s s e p a r a t i o n . 3 . 7 . 1 . 4 E x t e n s i v e i d e n t i fi c a t i o n o f l i p i d s u s i n g E S I M S n F o r t h e c o m p r e h e n s i v e l i p i d i d e n t i fi c a t i o n r e s u l t s t o b e d e s c r i b e d i n C h a p t e r s 7 a n d 9 , l i p i d p r e c u r s o r i o n s t h a t h a d n o r m a l i z e d r e l a t i v e a b u n d a n c e s h i g h e r t h a n 1 % i n M S w e r e f u r t h e r e x a m i n e d b y M S / M S a n d M S n b o t h m a n u a l l y a n d i n t h e d a t a - d e p e n d e n t a c q u i s i t i o n m o d e . A u t o m a t i c a c q u i s i t i o n o f M S / M S a n d M 8 3 u s i n g d a t a d e p e n d e n t a c q u i s i t i o n w a s a p p l i e d t o e x a m i n e M S / M S s p e c t r a o f t y p i c a l l y t h e m o s t a b u n d a n t 4 0 p e a k s d e t e c t e d f r o m m / z 6 0 0 - 9 5 0 i n M S i n b o t h p o s i t i v e i o n a n d n e g a t i v e i o n m o d e s , a n d f u r t h e r M S 3 s p e c t r a o f t h e t e n m o s t a b u n d a n t M S / M S f r a g m e n t i o n s . F o r t h o s e l i p i d s f o r w h i c h s y n t h e s i z e d l i p i d s t a n d a r d s w i t h t h e s a m e h e a d g r o u p w e r e a v a i l a b l e , t h e m o l e c u l a r s t r u c t u r e o f t h e p e a k s w a s d e t e r m i n e d b y c o m p a r i n g t h e f r a g m e n t i o n s p e c t r a w i t h t h o s e f r o m t h e s t a n d a r d s . F o r t h o s e l i p i d s w i t h o u t s y n t h e s i z e d l i p i d s t a n d a r d s a v a i l a b l e , t h e s t r u c t u r e s w e r e r a t i o n a l i z e d b a s e d o n o u r k n o w l e d g e o f t h e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s o f t h e i o n s f o r m e d b y l i p i d s a n d o t h e r m o l e c u l e s . I n 1 3 0 M S / M S a n d M S “ , t h e a c t i v a t i o n q v a l u e w a s o p t i m i z e d t o a c h i e v e l o w e r m a s s c u t o f f w h i l e s t i l l m a i n t a i n i n g g o o d s e n s i t i v i t y . P u l s e d - Q D i s s o c i a t i o n ( P Q D ) M S / M S w a s a l s o a p p l i e d t o p r o v i d e a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n o n t h e l o w m a s s f r a g m e n t i o n s . 3 . 7 . 2 Q u a n t i fi c a t i o n o f l i p i d s u s i n g E S I M S a n d M S / M S 3 . 7 . 2 . 1 I n t e r n a l s t a n d a r d s f o r l i p i d q u a n t i fi c a t i o n u s i n g E S I A l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d m i x t u r e c o n t a i n i n g G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , C L ( l 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 p M , 2 u M , 2 u M a n d 1 u M , r e s p e c t i v e l y , w a s a p p l i e d f o r t h e a b s o l u t e q u a n t i fi c a t i o n o f t h e s e t y p e s o f l i p i d s i n t h e e x t r a c t s a m p l e s . T h e r a t i o o f c o n c e n t r a t i o n s o f 4 / 2 / 2 / 1 u M w a s c h o s e n b a s e d o n t h e r e l a t i v e p e a k a b u n d a n c e o f t h e c o r r e s p o n d i n g t y p e s o f l i p i d s i n t h e a c t u a l e x t r a c t s a m p l e . W h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f l i p i d s a p p l i e d w e r e h i g h e r t h a n 5 u M , s i n g l y c h a r g e d h o m o - d i m e r s o r h e t e r o - d i m e r s w e r e o f t e n o b s e r v e d i n t h e m / z r a n g e o f 1 4 0 0 - 1 6 0 0 , c o m p l i c a t i n g t h e s p e c t r a a n d i n t e r f e r i n g w i t h t h e d e t e c t i o n o f c a r d i o l i p i n s p e c i e s . S t o c k s o l u t i o n s o f 1 0 0 0 u M s t a n d a r d l i p i d s i n c h l o r o f o r m ( t y p i c a l l y 1 - 2 m L ) w e r e p r e p a r e d b y q u i c k l y w e i g h i n g t h e s t a n d a r d p o w d e r s o n a b a l a n c e o f d e t e c t i o n l i m i t 0 . 0 1 m g , a n d s t o r e d a t - 8 0 ° C . T h e 1 0 0 0 u M s t o c k s o l u t i o n s o f G P E t n ( l 4 : 0 / l 4 2 0 ) , G P G r o ( 1 4 : 0 / 1 4 : 0 ) , G P C h o ( 1 4 : 0 / 1 4 : 0 ) a n d C L ( l 4 : 0 ) 4 w e r e t h e n m i x e d a n d d i l u t e d t o m a k e a 2 5 / 1 2 . 5 / 1 2 . 5 / 6 . 2 5 u M i n t e r n a l s t a n d a r d m i x t u r e s t o c k s o l u t i o n i n c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v , t y p i c a l l y 1 m L ) a n d s t o r e d a t - 8 0 ° C f o r f u r t h e r u s a g e . T o m a k e t h e s a m p l e f o r q u a n t i t a t i v e m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s , a c e r t a i n v o l u m e o f t h e 2 5 / 1 2 . 5 / 1 3 1 1 2 . 5 / 6 . 2 5 u M i n t e r n a l s t a n d a r d s m i x t u r e w a s a d d e d t o g l a s s v i a l s ( 1 6 u L f o r t h e p r e p a r a t i o n o f 1 0 0 u L M S s a m p l e ) , m i x e d w i t h a c e r t a i n v o l u m e o f t h e e x t r a c t s ( t y p i c a l l y 2 5 u L f o r f o u r f o l d d i l u t e d M S s a m p l e o f fi n a l v o l u m e 1 0 0 u L ) , d r i e d u n d e r v a c u u m , a n d k e p t a t — 8 0 ° C . D i r e c t l y p r i o r t o M S i n f u s i o n , t h e y w e r e f u l l y r e d i s s o l v e d w i t h 1 0 0 u L o f c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) c o n t a i n i n g 4 0 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e . 3 . 7 . 2 . 2 E s t a b l i s h i n g t h e b a s i s f o r q u a n t i fi c a t i o n b y u s i n g i n t e r n a l s t a n d a r d s i n E S I T o e s t a b l i s h t h e b a s i s f o r l i p i d q u a n t i fi c a t i o n u s i n g E S I , s y n t h e s i z e d l i p i d s t a n d a r d s G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , a n d C L ( 1 8 : 1 ) 4 w e r e m i x e d a t r a n d o m i n d i v i d u a l c o n c e n t r a t i o n s f r o m 0 t o 2 0 u M , w i t h t h e i n t e r n a l s t a n d a r d m i x t u r e o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( l 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 p M , 2 u M , 2 u M a n d 1 u M , i n t h e s o l v e n t o f C H C 1 3 : C H 3 O H ( 1 : 1 , v / v ) c o n t a i n i n g a m m o n i u m h y d r o x i d e a t a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 4 0 m M , a n d t h e r a t i o o f t h e a b u n d a n c e o f t h e m o n o i s o t o p i c p e a k s o f t h e i o n s f o r m e d f r o m t h e 1 8 : 1 l i p i d s o v e r t h e c o r r e s p o n d i n g 1 4 : 0 s t a n d a r d s i n t h e f o r m o f d e p r o t o n a t e d i o n s , a n i o n i c a d d u c t i o n , d o u b l y c h a r g e d d e p r o t o n a t e d i o n , w e r e p l o t t e d a g a i n s t t h e r a t i o o f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f 1 8 : 1 1 i p i d s v e r s u s t h e 1 4 : 0 l i p i d s i n t r o d u c e d i n t h e s o l u t i o n t o g e n e r a t e t h e c a l i b r a t i o n c u r v e . F o r t h e c a r d i o l i p i n s t a n d a r d s , t h e r a t i o o f t h e i s o l a t i o n a n d c o r r e s p o n d i n g f r a g m e n t i o n s o f C L ( 1 8 : 1 ) 4 ( m / z 6 9 9 ) o v e r C L ( l 4 : 0 ) 4 ( m / z 5 9 1 ) i n M S / M S w a s a l s o e x a m i n e d i n a u t o m a t i c a c q u i s i t i o n m o d e w i t h a l t e r n a t i v e s c a n n i n g o f t h e f r a g m e n t i o n s 1 3 2 o f t h e t w o p r e c u r s o r i o n s u n d e r i d e n t i c a l s e t t i n g s , a n d i t w a s u s e d t o e s t a b l i s h t h e b a s i s f o r q u a n t i fi c a t i o n u s i n g f r a g m e n t i o n s i n M S / M S . F o r q u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n s b e t w e e n t h e w i l d t y p e a n d t h e m u t a n t s , t h e r e l a t i v e c h a n g e s i n t h e l i p i d s w e r e r e p r e s e n t e d b y t h e r a t i o o f t h e s e p h o s p h o l i p i d s s p e c i e s t o t h e c o r r e s p o n d i n g 1 4 : 0 s t a n d a r d s . T h e a b s o l u t e a m o u n t o f t h e G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , a n d C L ( 1 8 : 1 ) 4 l i p i d s c o u l d b e c a l c u l a t e d f r o m s l o p e o f t h e c a l i b r a t i o n c u r v e a n d t h e k n o w n c o n c e n t r a t i o n o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s . T h e i s o t o p i c d i s t r i b u t i o n o f d i f f e r e n t t y p e o f l i p i d s w i t h v a r i o u s c h a i n l e n g t h s w e r e a l s o c a l c u l a t e d , a l t h o u g h t h i s l e v e l o f c o r r e c t i o n w a s c o n t a i n e d i n t h e s l o p e o f t h e e x p e r i m e n t a l c a l i b r a t i o n c u r v e f o r t h e 1 8 : 1 l i p i d s . 3 . 7 . 2 . 3 Q u a n t i fi c a t i o n o f a b u n d a n t s p e c i e s i n l i p i d e x t r a c t s u s i n g E S I M S Q u a n t i t a t i v e m a s s s p e c t r o m e t r y e x p e r i m e n t s o n l i p i d e x t r a c t s w e r e p e r f o r m e d u s i n g a T h e r m o L T Q l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r e q u i p p e d w i t h a n a n o s p r a y i o n i z a t i o n s o u r c e ( n a n o E S I ) . T o t a l l i p i d e x t r a c t s f r o m e a c h m e m b r a n e s a m p l e w e r e d i l u t e d b y 4 f o l d , u s i n g C H C l 3 : C H 3 O H ( 1 : 1 , v / v ) c o n t a i n i n g a m m o n i u m h y d r o x i d e a t a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 4 0 m M , a n d i n t e r n a l s t a n d a r d s G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , C L ( l 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 u M , 2 u M , 2 u M a n d 1 u M , r e s p e c t i v e l y , p r i o r t o i n t r o d u c t i o n t o t h e m a s s s p e c t r o m e t e r b y d i r e c t i n f u s i o n t h r o u g h n o n - c o a t e d s i l i c a t i p s w i t h i n t e r n a l d i a m e t e r s o f 3 0 p m ( N e w O b j e c t i v e , I n c . W o b u m , M A ) a t a t y p i c a l fl o w r a t e o f 0 . 3 u L / m i n u n l e s s s p e c i fi e d o t h e r w i s e . 1 3 3 T y p i c a l n a n o E S I c o n d i t i o n s f o r q u a n t i fi c a t i o n w e r e : h e a t e d c a p i l l a r y t e m p e r a t u r e , 1 8 0 ° C , s p r a y v o l t a g e 1 . 8 k V , c a p i l l a r y v o l t a g e 2 0 V ( — 2 0 V f o r n e g a t i v e i o n m o d e ) a n d t u b e l e n s v o l t a g e 7 5 V ( - 7 5 V f o r n e g a t i v e i o n m o d e ) . Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m e a c h t y p e o f s a m p l e w a s p e r f o r m e d o n t h r e e i n d e p e n d e n t e x t r a c t i o n s , e a c h M S s p e c t r u m b e i n g a n a v e r a g e o f 1 0 0 - 2 5 0 s p e c t r a w i t h 3 m i c r o - s c a n s a c q u i r e d p e r s p e c t r u m f r o m m / z 1 5 0 t o 2 0 0 0 , i n b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s . I n t e n s i t i e s o f a l l t h e i o n s d e t e c t e d i n e a c h s a m p l e w e r e fi r s t n o r m a l i z e d t o t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s o b s e r v e d i n M S , a n d t h e n c o n v e r t e d i n t o t h e q u a n t i t y o f e a c h l i p i d u s i n g c o n v e r s i o n f a c t o r s p r e v i o u s l y d e t e r m i n e d f r o m e x p e r i m e n t s u s i n g l i p i d s t a n d a r d m i x t u r e s . 3 . 7 . 2 . 4 Q u a n t i fi c a t i o n o f l o w - a b u n d a n c e o r o v e r l a p p i n g s p e c i e s i n l i p i d e x t r a c t s u s i n g E S I C I D M S I M S E S I C I D M S / M S w a s a p p l i e d t o q u a n t i f y t h e l o w - a b u n d a n c e s p e c i e s o r t h e s p e c i e s o v e r l a p p i n g a t t h e s a m e m / z i n M S u s i n g t h e p h o s p h o l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d m i x t u r e . Q u a n t i fi c a t i o n o f l o w - a b u n d a n c e c a r d i o l i p i n u n d e t e c t a b l e i n t h e M S s p e c t r a w a s b a s e d o n M S / M S i n n e g a t i v e i o n m o d e u s i n g i n t e r n a l s t a n d a r d C L ( l 4 : 0 ) 4 . M S a n d M S / M S s p e c t r a o f c a r d i o l i p i n l i p i d s f o r e a c h s a m p l e w e r e a c q u i r e d u s i n g a n a u t o m a t i c s e q u e n t i a l a c q u i s i t i o n e x p e r i m e n t , d u r i n g w h i c h a n i n i t i a l M S s c a n w a s f o l l o w e d b y C I D M S / M S ( H e , c o l l i s i o n e n e r g y 3 0 % , i s o l a t i o n w i d t h 1 . 5 , a c t i v a t i o n Q v a l u e 0 . 2 ) o f p r e c u r s o r i o n s o f C L ( l 4 : 0 ) 4 i n t e r n a l s t a n d a r d a t m / z 1 2 3 9 . 8 0 a n d o f C L ( l 8 : 1 ) 4 i n t h e l i p i d e x t r a c t a t m / z 1 4 5 5 . 9 6 . M S / M S w a s a c q u i r e d f r o m m / z 3 2 0 t o 2 0 0 0 . O v e r 2 5 0 c y c l e s o f s u c h a s e q u e n c e w e r e a c q u i r e d f o r e a c h s a m p l e . T h e a b u n d a n c e o f t h e m a j o r f r a g m e n t 1 3 4 f r o m C L ( 1 8 : 1 ) 4 a t m / z 6 9 9 i n t h e c o n s e q u e n t s p e c t r u m a v e r a g e d f r o m 2 5 0 s c a n s w a s n o r m a l i z e d t o t h a t o f t h e m a j o r fi ' a g m e n t f r o m i n t e r n a l s t a n d a r d C L ( l 4 : 0 ) 4 a t m / z 5 9 1 , a n d t h e r a t i o w a s u s e d f o r c o m p a r i s o n b e t w e e n l i p i d s e x t r a c t e d f r o m e n z y m e a n d m e m b r a n e s a m p l e s f r o m w i l d - t y p e a n d c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s c e l l s . F o r t h e n o r r n a l - p h o s p h a t e / l o w - p h o s p h a t e g r o w t h e x p e r i m e n t s o f 1 6 9 - 2 . 4 . 1 a n d 1 6 9 C L 3 s t r a i n s ( a s w e l l a s t h e 3 7 A 4 s t r a i n ) t o b e d e s c r i b e d w i t h d e t a i l s i n C h a p t e r 1 0 , e x t e n s i v e M S / M S q u a n t i fi c a t i o n e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t u s i n g t h e a u t o m a t i c a c q u i s i t i o n m o d e i n b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e f o r t h e r e g i o n s o f m / z 6 0 0 - 1 6 0 0 . F o r a l l t h e p e a k s w i t h n o r m a l i z e d r e l a t i v e a b u n d a n c e i n M S h i g h e r t h a n 1 0 % i n c l u d i n g t h e p e a k s o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s , t h e M S / M S s p e c t r a o f i s o t o p i c a l l y i s o l a t e d p r e c u r s o r i o n s ( i s o l a t i o n w i d t h 1 . 2 D a ; 0 . 8 D a f o r d o u b l y c h a r g e d i o n s ) w e r e c o l l e c t e d w i t h 5 0 m s m a x i m u m i n j e c t i o n t i m e u n d e r a n M S / M S t a r g e t n u m b e r o f 3 e 4 a n d a c t i v a t i o n q v a l u e o f 0 . 2 . F o r a l l t h e p e a k s a b o v e 1 % b u t e q u a l t o o r b e l o w 1 0 % a s w e l l a s a l l t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s a g a i n , t h e m a x i m u m i n j e c t i o n t i m e w a s i n c r e a s e d t o 1 0 0 m s , a n d t h e n u m b e r o f s c a n s c o l l e c t e d w a s i n c r e a s e d t o a b o u t f o u r f o l d o f t h o s e h i g h e r t h a n 1 0 % w h e n e v e r p o s s i b l e . E a c h s c a n w a s t h e a v e r a g e o f t h r e e m i c r o s c a n s . T h e c o l l i s i o n e n e r g y a p p l i e d w a s 3 0 % f o r p o s i t i v e i o n m o d e a n d 2 5 % f o r n e g a t i v e i o n m o d e . O n e a d d i t i o n a l a u t o m a t i c s c a n w a s p e r f o r m e d i n c l u d i n g t h e w i d e b a n d i s o l a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f t h e c a r d i o l i p i n r e g i o n s u s i n g i s o l a t i o n w i d t h o f 1 0 D a , a n d t h e M S / M S o f a l l t h e S Q D G s p e c i e s u s i n g c o l l i s i o n e n e r g y o f 3 5 % , u n d e r m a x i m u m i n j e c t i o n t i m e o f 1 0 0 m s r e g a r d l e s s o f t h e a b u n d a n c e i n M S . T h e s e e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d o n t r i p l i c a t e e x t r a c t i o n s a m p l e s . A f t e r i t w a s f o u n d t h a t t h e 1 0 0 m s m a x i m u m i n j e c t i o n t i m e w a s n o t s u f fi c i e n t f o r a l l t h e M S / M S b e l o w 1 0 % t o r e a c h t h e t a r g e t n u m b e r o f 3 e 4 , t h e s e M S / M S e x p e r i m e n t s 1 3 5 w e r e r e p e a t e d o n c e f o r e a c h s t r a i n u s i n g m a x i m u m i n j e c t i o n t i m e s e t t i n g o f 5 0 0 m s , w h i c h w a s f o u n d t o b e s u f fi c i e n t f o r m o s t i d e n t i fi a b l e p e a k s t o r e a c h t h e t a r g e t n u m b e r o f 3 e 4 i n C I D M S / M S . 3 . 7 . 2 . 5 “ P u r i fi c a t i o n ” a n d r e l a t i v e q u a n t i fi c a t i o n b e t w e e n m o l e c u l a r s p e c i e s o f t h e S Q D G u s i n g M S I M S A p r e c u r s o r i o n s c a n m o d e M S / M S e x p e r i m e n t o n t h e t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r a n d , s i m i l a r l y t h e v a r i o u s i o n m a p p i n g s c a n o p t i o n s i n t h e l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p , w e r e a p p l i e d t o i s o l a t e a l l t h e S Q D G m o l e c u l a r s p e c i e s f r o m t h e o t h e r t y p e s o f l i p i d s i n t h e l i p i d s e x t r a c t s , s o m e o f w h i c h o v e r l a p p e d a t t h e s a m e m / z i n M S , b a s e d o n t h e S Q D G - c h a r a c t e r i s t i c m / z 2 2 5 ( — v e ) f r a g m e n t i o n s i n M S / M S . T h e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f t h e s e p e a k s i n p r e c u r s o r i o n s c a n M S / M S w e r e a l s o u s e d t o r e l a t i v e l y q u a n t i f y t h e s e S Q D G m o l e c u l a r s p e c i e s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t f a t t y a c i d c h a i n s , s i n c e t h e s e S Q D G l i p i d s f r a g m e n t i n C I D M S / M S w i t h s i m i l a r e f fi c i e n c y i n s p i t e o f t h e s l i g h t d i f f e r e n c e i n t h e f a t t y a c i d c h a i n c o m p o s i t i o n . T h e e x p e r i m e n t a l s e t t i n g s w e r e t h e s a m e a s t h o s e s p e c i fi e d a b o v e i n t h e i d e n t i fi c a t i o n s e c t i o n . 3 . 7 . 3 D i r e c t l i p i d a n a l y s i s u s i n g M A L D I - L I T 3 . 7 . 3 . 1 D i r e c t l i p i d i d e n t i fi c a t i o n a n a l y s i s u s i n g M A L D I - L I T M S a n d M S ' 1 M a s s s p e c t r o m e t r y a n d t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s o f i s o l a t e d m e m b r a n e s , p u r i fi e d C c O a n d r e d i s s o l v e d C c O p r o t e i n c r y s t a l s w e r e p e r f o r m e d u s i n g a l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r e q u i p p e d w i t h a m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r 1 3 6 d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n s o u r c e ( m o d e l v M A L D I - L T Q , T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c , S a n J o s e , C A ) . C r y s t a l s w e r e r i n s e d b r i e fl y i n w a t e r a t 4 ° C t o r e m o v e r e s i d u a l p r o t e i n p r e c i p i t a t e a n d o t h e r w e l l - s o l u t i o n c o m p o n e n t s l o o s e l y a t t a c h e d t o t h e s u r f a c e o f t h e c r y s t a l s b e f o r e r e - d i s s o l v i n g b y e x t e n s i v e v o r t e x i n g i n w a t e r . O n e u L o f e i t h e r r e s u s p e n d e d m e m b r a n e ( a t a p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 2 5 m g / m l d e t e r m i n e d b y t h e B C A a s s a y u s i n g b o v i n e s e r u m a l b u m i n a s t h e s t a n d a r d ) , 1 u L o f p u r i fi e d C c O ( 2 5 u M ) , o r 1 u L o f r e d i s s o l v e d C c O c r y s t a l s o l u t i o n ( a t a C c O c o n c e n t r a t i o n o f 8 . 3 u M [ i . e . 1 . 0 0 m g / m L ] d e t e r m i n e d b y t h e B C A a s s a y u s i n g p u r i fi e d C c O s o l u t i o n w i t h U V - V i s d e t e r m i n e d c o n c e n t r a t i o n a s t h e s t a n d a r d ) w e r e a p p l i e d t o i n d i v i d u a l s p o t s o n t h e s t a i n l e s s s t e e l s a m p l e p l a t e a n d d r i e d i n a i r . S u b s e q u e n t l y , 1 u L o f 0 . 1 M ( f o r m e m b r a n e s a m p l e s ) o r 0 . 5 M ( f o r p u r i fi e d e n z y m e a n d c r y s t a l s a m p l e s ) 2 , 5 - h y d r o x y b e n z o i c a c i d d i s s o l v e d i n a c e t o n i t r i l e : w a t e r ( 2 : 1 , v / v ) w a s a d d e d . M S a n d M S / M S s p e c t r a w e r e a c q u i r e d i n n e g a t i v e a n d p o s i t i v e i o n m o d e s u s i n g e n h a n c e d r e s o n a n c e e j e c t i o n s c a n c o n d i t i o n s . T y p i c a l o p t i m a l l a s e r p o w e r s e t t i n g w a s 2 0 f o r t h e p o s i t i v e i o n m o d e a n d 3 0 f o r t h e n e g a t i v e i o n m o d e u s i n g 2 , 5 - D H B a s t h e m a t r i x . T h e m / z r a n g e f o r M S a c q u i s i t i o n w a s m / z 2 0 0 - 2 0 0 0 . M S / M S a n d M S n s p e c t r a w e r e a c q u i r e d u s i n g c o l l i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ( C I D ) a t n o r m a l i z e d c o l l i s i o n e n e r g y o f 3 0 % , a n i s o l a t i o n w i d t h o f 1 . 2 o r 1 . 5 D a t o a c h i e v e i s o t o p i c a l i s o l a t i o n , a n d a n a c t i v a t i o n q v a l u e o f 0 . 2 , o r u s i n g P Q D M S / M S f r a g m e n t a t i o n a t a c t i v a t i o n q v a l u e o f 0 . 7 , i s o l a t i o n w i d t h 1 . 2 D a , c o l l i s i o n e n e r g y a r o u n d 2 3 % o p t i m i z e d f o r i n d i v i d u a l t y p e s o f l i p i d s a n d t h e l o w m a s s l i m i t s e t t i n g a t m / z 5 0 . T h e s p e c t r a s h o w n w e r e t h e a v e r a g e o f 2 5 0 s c a n s . 1 3 7 3 . 7 . 3 . 2 Q u a n t i t a t i v e l i p i d c o m p a r i s o n u s i n g M A L D I - L I T M S I n o r d e r t o m a k e a r e l a t i v e l y q u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n o f i n d i v i d u a l l i p i d c o n t e n t s b e t w e e n d i f f e r e n t s t r a i n s d i r e c t l y u s i n g M A L D I , a n i n t e r n a l s t a n d a r d m i x t u r e c o n t a i n i n g G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( l 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 p M , 5 u M , 1 . 2 5 u M a n d 1 . 2 5 u M , r e s p e c t i v e l y , i n m e t h a n o l w a s a d d e d t o t h e m e m b r a n e s u s p e n s i o n ( 0 . 2 5 m g / m L fi n a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n ) , o r t h e p u r i fi e d C c O s o l u t i o n ( 4 . 2 u M fi n a l C c O c o n c e n t r a t i o n , i . e . 0 . 5 m g / m L p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n ) t o f o r m o n e - p h a s e m i x t u r e s . T h e n 1 u L o f t h e m i x t u r e w a s a p p l i e d t o t h e v M A L D I p l a t e , a n d d r i e d i n a i r , f o l l o w e d b y t h e a p p l i c a t i o n o f l p L o f 0 . 1 M ( f o r m e m b r a n e s a m p l e s ) o r 0 . 5 M ( f o r p u r i fi e d e n z y m e s a m p l e s ) o f 2 , S - D H B d i s s o l v e d i n a c e t o n i t r i l e : w a t e r ( 2 : 1 , v / v ) . T h e d a t a a c q u i s i t i o n s e t t i n g s w e r e t h e s a m e a s d e s c r i b e d a b o v e . 3 . 7 . 4 O p t i m i z i n g t h e d e t e c t i o n o f l i p i d s a n d s u b u n i t s i n p u r i fi e d C c O e n z y m e u s i n g M A L D I - T O F M S M A L D I - T O F M S e x p e r i m e n t s o n e n z y m e s o l u t i o n s w i t h o u t e x t r a c t i o n w e r e p e r f o r m e d b y M A L D I d e l a y e d - e x t r a c t i o n t i m e - o f - fl i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y ( m o d e l V o y a g e r - D E S T R , P e r S p e c t i v e B i o s y s t e m s , F r a m i n g h a m , M A ) e q u i p p e d w i t h n i t r o g e n l a s e r ( 3 3 7 n m , 3 n s p u l s e ) . 0 . 8 u L o f r e s u s p e n d e d m e m b r a n e o r 5 u M C c O p u r i fi e d f r o m d i f f e r e n t s t r a i n s o f R . s p h a e r o i d e s w a s a p p l i e d o n t o t h e 1 0 0 - w e l l g o l d c o a t e d s t e e l M A L D I p l a t e , f o l l o w e d b y a d d i t i o n o f 0 . 8 u L 1 M 2 , 5 - h y d r o x y b e n z o i c a c i d d i s s o l v e d i n a c e t o n i t r i l e : w a t e r ( 1 : 1 , v / v ) . A d j u s t i n g t h e p H o f t h e m a t r i x s o l u t i o n t o 7 - 8 b y u s i n g 1 3 8 a m m o n i u m h y d r o x i d e w a s a l s o t e s t e d . T h e M A L D I - T O F m a s s s p e c t r a w e r e c o l l e c t e d u n d e r d e l a y e d e x t r a c t i o n l i n e a r n e g a t i v e i o n m o d e , e a c h b e i n g a n a v e r a g e o f 1 0 0 s h o t s . A s o n e m e t h o d t o e n h a n c e t h e d e t e c t i o n o f c a r d i o l i p i n l i p i d s i n n e g a t i v e i o n m o d e , p a r t i c u l a r l y i n t h e p u r i fi e d e n z y m e s a m p l e s i n M A L D I - T O P , 1 u L o f a m m o n i u m a c e t a t e 0 . 1 M s o l u t i o n a t 4 ° C w a s a p p l i e d o n t o p o f t h e c o c r y s t a l i z e d s a m p l e s p o t s , a n d i n s t a n t l y r e m o v e d w i t h a k i m w i p e t i s s u e . A m m o n i u m c h l o r i d e , a m m o n i u m c i t r a t e , a m m o n i u m h y d r o z i d e w e r e a l s o t e s t e d , a n d t h e y w e r e a l s o t e s t e d b y p r e m i x i n g t h e m w i t h t h e a n a l y t e o r t h e m a t r i x s o l u t i o n s , o r l e t t i n g t h e 1 u L s o l u t i o n d r y o n t o p o f t h e c o c r y s t a l s p o t s , b u t t h e o n l y m e t h o d f o u n d t o g i v e o b v i o u s e n h a n c e m e n t o f t h e d e t e c t i o n o f c a r d i o l i p i n w a s t h e p r o c e d u r e o f c o l d a m m o n i u m a c e t a t e w a s h i n g d e s c r i b e d a b o v e . D e t e c t i o n o f t h e s u b u n i t p r o fi l e o f t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e s a n d t h e r e — d i s s o l v e d c r y s t a l s w a s a p p l i e d t o m o n i t o r t h e i n c o r p o r a t i o n o f t h e s u b u n i t s , p a r t i c u l a r l y t h e s u b u n i t I V w h i c h h a d a l t e r n a t i v e f o r m s o f d i f f e r e n t l e n g t h s a n d c o u l d i n t r o d u c e a s i g n i fi c a n t d e g r e e o f h e t e r o g e n e i t y t o t h e e n z y m e c o m p o s i t i o n . T h e s e r e s u l t s w e r e e v e n t u a l l y u s e d t o o p t i m i z e t h e c o n s t r u c t o f C c O p l a s m i d t o a s s i s t c r y s t a l l i z a t i o n o f h i g h e r d i f f r a c t i o n r e s o l u t i o n . M a t r i x 2 , 5 - D H B w a s u s e d t o m o n i t o r t h e s u b u n i t s b e l o w m o l e c u l a r w e i g h t 1 5 k D a ( i n t h e c a s e o f R . s p h a e r o i d e s , t h e v a r i o u s f o r m s o f s u b u n i t I V ) , a s w e l l a s t h e l i p i d s i n b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s . A T T a n d S A m a t r i c e s w e r e u s e d t o d e t e c t t h e b i g g e r s u b u n i t s I , I I a n d I I I . T h e r e l a t i v e c o n c e n t r a t i o n s o f C c O a n d d e t e r g e n t w e r e o p t i m i z e d a n d f o u n d t o b e c r i t i c a l i n i m p r o v i n g t h e i s o l a t i o n a n d r e s o l u t i o n o f t h e d e t e c t i o n o f t h e s e b i g h y d r o p h o b i c s u b u n i t s . C H C A w a s n o t c h o s e n a s t h e o p t i m a l m a t r i x b e c a u s e i t w a s f o u n d t h a t t h i s w a s n o t a s e f fi c i e n t i n d e t e c t i n g t h e s u b u n i t s o f 1 3 9 h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t , a n d i t i n d u c e d h i g h e r d e g r e e o f d e c o m p o s i t i o n o f l i p i d s p r i o r t o d e t e c t i o n e v e n a t m i n i m u m l a s e r p o w e r . 3 . 8 M e t h o d s u s e d t o p r o b e t h e f r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s o f l i p i d s i n C I D M S n i n l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r 3 . 8 . 1 S y n t h e s i s a n d f r a g m e n t a t i o n o f s t r u c t u r a l a n a l o g u e s A m i n o a c i d a n d N - a c e t y l a t e d a n d N - p r o p y l a t e d a m i n o a c i d s t a n d a r d s w e r e a n a l y z e d a s 1 0 0 u M s o l u t i o n s i n H Z O : C H 3 O H ( 1 : 1 , v / v ) c o n t a i n i n g 4 0 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e . 3 . 8 . 2 H I D e x c h a n g e o f l i p i d e x t r a c t s H / D e x c h a n g e o f t h e l i p i d e x t r a c t s w a s a c h i e v e d b y d r y i n g t h e o r i g i n a l l i p i d e x t r a c t s u n d e r v a c u u m a n d r e d i s s o l v i n g i n C D C l 3 : C D 3 O D ( 1 : 1 , v / v ) s o l v e n t . T h i s p r o c e s s w a s r e p e a t e d t w i c e , a n d 9 0 % - 9 9 % o f e a c h l i p i d s p e c i e s o f d i f f e r e n t t y p e s o f l i p i d s w a s f u l l y e x c h a n g e d [ 1 8 4 ] . T h e e x a m i n a t i o n o f t h e H / D e x c h a n g e d l i p i d e x t r a c t s w a s p e r f o r m e d b y u s i n g t h e t r a d i t i o n a l E S I s o u r c e i n a s o l v e n t o f C D C 1 3 2 C D 3 O D ( 1 : 1 , v / v ) c o n t a i n i n g 4 0 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e u n d e r c o n d i t i o n s o p t i m i z e d t o m i n i m i z e b a c k e x c h a n g e . F o r 1 u L / m i n s a m p l e i n f u s i o n fl o w r a t e , t y p i c a l E S I c o n d i t i o n s w e r e : h e a t e d c a p i l l a r y t e m p e r a t u r e 1 8 0 ° C , s p r a y v o l t a g e 4 . 0 k V , s h e a t h g a s ( N 2 ) fl o w r a t e 1 2 a r b i t r a r y u n i t s , 1 4 0 a u x i l i a r y g a s ( N 2 ) fl o w r a t e 1 5 a r b i t r a r y u n i t s a n d s w e e p g a s ( N 2 ) fl o w r a t e 1 0 a r b i t r a r y u n i t s . F u l l y H / D e x c h a n g e d p r e c u r s o r i o n s f o r o r n i t h i n e l i p i d s , g l u t a m i n e l i p i d s , G P E t n , G P G r o a n d S Q D G l i p i d s w e r e e x a m i n e d b y M S / M S a n d M S 1 1 w i t h i s o t o p i c i s o l a t i o n . 3 . 8 . 3 T h e o r e t i c a l c a l c u l a t i o n s T h e l o w e s t - e n e r g y c o n f o r m a t i o n f o r G P C h o a n i o n i c a d d u c t s i n C h a p t e r 4 w a s c a l c u l a t e d u s i n g s e m i - e m p i r i c a l c o m p u t a t i o n s a t t h e P M 3 l e v e l o f t h e o r y . 1 4 1 C h a p t e r 4 M u l t i s t a g e T a n d e m M a s s S p e c t r o m e t r y o f A n i o n i c P h o s p h a t i d y l - c h o l i n e L i p i d A d d u c t s R e v e a l s N o v e l D i s s o c i a t i o n P a t h w a y s T 4 . 1 S u m m a r y T h e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f v a r i o u s a n i o n i c a d d u c t s o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e l i p i d s h a v e b e e n e x a m i n e d b y e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n a n d m u l t i s t a g e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y i n a l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r . T h e C I D M S / M S a n d M S n f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f t h e a n i o n i c a d d u c t s w e r e f o u n d t o b e h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e i d e n t i t y o f t h e a n i o n s . C o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s r e p o r t s , M S / M S o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e l i p i d i o n s f o r m e d b y a n i o n i c a d d u c t i o n w i t h f o r m a t e , a c e t a t e a n d c h l o r i d e r e s u l t e d i n a d o m i n a n t p r o d u c t i o n c o r r e s p o n d i n g t o t h e l o s s o f ( A + C H 3 ) f r o m t h e [ M + A ] ' p r e c u r s o r i o n s . I n c o n t r a s t , M S / M S o f o t h e r a n i o n - a d d u c t e d p r e c u r s o r i o n s g a v e r i s e t o m u l t i p l e p r o d u c t s , i n c l u d i n g [ M + A - ( A + C H 3 ) ] ' , [ M + A - ( A H ) ] ' , [ M + A - ( A H + C H 3 ) ] ' , [ M + A - ( A H + ( C H 3 ) 3 N ) ] ' , [ M + A - ( A + ( C H 3 ) 3 N C H = C H 2 ) ] ' a n d [ M + A - ( C H 3 ) 3 N ) ] ' . I n o r d e r t o g a i n e v i d e n c e f o r t h e s t r u c t u r e s o f t h e s e p r o d u c t i o n s , a n d 1 ' P a r t o f t h e r e s u l t s d e s c r i b e d i n t h i s c h a p t e r w e r e p u b l i s h e d i n I n t . J . M a s s S p e c t r o m 2 0 0 6 ; 2 5 2 : 2 4 2 - 2 5 5 ( Z h a n g X a n d R e i d G E ) 1 4 2 t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h t h e y w e r e f o r m e d , e a c h o f t h e p r o d u c t s f o r m e d b y M S / M S w e r e s u b j e c t e d t o f u r t h e r a n a l y s i s b y M S 3 a n d M 8 4 . T h e M S / M S a n d M S n f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f s e v e r a l d e u t e r i u m i s o t o p e - l a b e l e d p h o s p h a t i d y l c h o l i n e l i p i d s t a n d a r d s , a s w e l l a s a u t h e n t i c o r s t r u c t u r a l l y a n a l o g o u s l i p i d s t a n d a r d s c o r r e s p o n d i n g t o t h e p r o p o s e d p r o d u c t i o n s t r u c t u r e s w e r e a l s o e x a m i n e d t o g a i n e v i d e n c e t o s u p p o r t t h e p r o p o s e d m e c h a n i s m s . T h e r e s u l t s f r o m t h i s s t u d y i n d i c a t e t h a t g r e a t c a r e m u s t b e t a k e n t o c o n t r o l t h e i d e n t i t y o f t h e a n i o n s e m p l o y e d d u r i n g l i p i d i s o l a t i o n , p u r i fi c a t i o n a n d s e p a r a t i o n , i n o r d e r t o a l l o w t h e d e v e l o p m e n t a n d a p p l i c a t i o n o f s e n s i t i v e a n d r o b u s t n e u t r a l l o s s s c a n m e t h o d s f o r m a s s s p e c t r o m e t r y b a s e d l i p i d i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s . 1 4 3 4 . 2 I n t r o d u c t i o n T h e i d e n t i fi c a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n a n d q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f b i o l o g i c a l l y i m p o r t a n t l i p i d s i s a n i m p o r t a n t s t e p t o w a r d t h e d e v e l o p m e n t o f a n i m p r o v e d u n d e r s t a n d i n g o f t h e f u n c t i o n a l r o l e o f i n t e g r a l p h o s p h o l i p i d s i n l a r g e m u l t i - s u b u n i t m e m b r a n e p r o t e i n c o m p l e x e s [ 6 , 3 4 , 3 7 , 6 3 , 2 2 7 , 2 2 8 ] a n d l i p i d m i c r o d o m a i n s [ 2 2 9 - 2 3 2 ] . I n p r e v i o u s s t u d i e s e m p l o y i n g m a s s s p e c t r o m e t r y , t h e o b s e r v a t i o n o f n e u t r a l a n d a c i d i c l i p i d s p e c i e s i n e i t h e r p o s i t i v e o r n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e h a s b e e n f o u n d t o b e h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e i d e n t i t y o f t h e l i p i d h e a d g r o u p [ 1 1 0 , 1 1 7 , 1 4 0 , 2 3 3 - 2 3 5 ] . F o r e x a m p l e , a b u n d a n t p r e c u r s o r i o n s o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( G P C h o ) [ 1 8 8 ] a n d S p h i n g o m y e l i n ( S M ) [ 1 9 2 ] l i p i d s a r e r e a d i l y o b s e r v e d i n p o s i t i v e i o n m o d e , w h i l e p h o s p h a t i d i c a c i d ( G P A ) [ 1 8 9 ] , p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ( G P G r o ) [ 1 9 3 ] , p h o s p h a t i d y l s e r i n e ( G P S e r ) [ 1 9 7 ] , p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( G P I n s ) [ 1 9 8 , 2 3 6 ] a n d c a r d i o l i p i n ( C L ) [ 1 9 5 ] a r e o b s e r v e d i n n e g a t i v e i o n m o d e ; p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( G P E t n ) l i p i d s c a n b e o b s e r v e d i n b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s , a l b e i t a t s i g n i fi c a n t l y l o w e r a b u n d a n c e w h e n i n t h e p r e s e n c e o f o t h e r l i p i d s p e c i e s [ 1 9 0 , 2 3 4 , 2 3 5 ] . T h i s v a r i a b i l i t y i n i o n y i e l d a s a f u n c t i o n o f l i p i d s t r u c t u r e m a y r e s u l t i n p o o r i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s c a p a b i l i t i e s f o r M S m e t h o d s a p p l i e d t o c o m p l e x l i p i d s a m p l e s , a n d o f t e n r e q u i r e s t w o s e p a r a t e a n a l y s e s w i t h d i f f e r e n t o p t i m a l s a m p l e p r e p a r a t i o n m e t h o d s f o r e a c h i o n i z a t i o n m o d e [ 1 1 0 , 1 1 7 , 1 4 0 , 2 3 3 - 2 3 5 ] . T h u s , t h e a b i l i t y t o o b s e r v e b o t h n e u t r a l a n d a c i d i c l i p i d s i n a s i n g l e i o n i z a t i o n m o d e , w i t h h i g h s e n s i t i v i t y a n d r e p r o d u c i b i l i t y , w o u l d f a c i l i t a t e t h e d e v e l o p m e n t o f m o r e c o m p r e h e n s i v e m e t h o d s f o r l i p i d i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n , 1 4 4 w i t h a r e d u c e d r e q u i r e m e n t f o r e x t e n s i v e s a m p l e e x t r a c t i o n o r p u r i fi c a t i o n p r i o r t o a n a l y s i s . P r e v i o u s l y , c a t i o n i c a d d u c t i o n ( e . g . , L i + , N a + ) [ 1 1 0 , 1 1 6 , 1 4 0 , 1 8 8 , 1 9 2 , 2 0 8 , 2 3 7 ] h a s b e e n a p p l i e d t o t h e a n a l y s e s o f l i p i d e x t r a c t s c o n t a i n i n g G P E t n , S M , G P A , G P G r o , G P S e r , G P I n s a n d C L i n o r d e r t o e n h a n c e t h e s e n s i t i v i t y o f t h e G P E t n , G P A , G P G r o , G P S e r , G P I n s , a n d C L l i p i d s p e c i e s i n p o s i t i v e i o n i z a t i o n m o d e . H o w e v e r , d i f fi c u l t i e s i n r e p r o d u c i b l y f o r m i n g c a t i o n i c a d d u c t s , d u e t o c o m p e t i t i o n b e t w e e n e a c h o f t h e p h o s p h o l i p i d s p e c i e s f o r a d d u c t f o r m a t i o n , a n d t h e p o s s i b i l i t y o f d i - c a t i o n i c a d d u c t i o n i n a d d i t i o n t o m o n o - c a t i o n i c a d d u c t i o n , p o t e n t i a l l y l i m i t s t h e a p p l i c a b i l i t y o f t h i s a p p r o a c h . I n c o n t r a s t , a d d u c t i o n w i t h f o r m a t e ( H C O z ’ ) , a c e t a t e ( C H 3 C O Z ' ) a n d c h l o r i d e ( C l ' ) a n i o n s h a s p r e v i o u s l y b e e n o b s e r v e d t o r e s u l t i n t h e s e l e c t i v e a d d u c t i o n o f G P C h o a n d S M l i p i d s p e c i e s i n n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e [ 1 1 6 , 1 3 5 , 2 1 1 , 2 3 5 ] . D i s s o c i a t i o n o f t h e s e a d d u c t s ( A ) b y e i t h e r i n - s o u r c e d i s s o c i a t i o n [ 1 1 7 , 2 3 8 - 2 4 0 ] , o r b y C I D M S / M S [ l 1 0 , 1 1 6 , 1 1 7 , 1 3 5 , 2 1 1 , 2 4 1 - 2 4 4 ] h a s r e s u l t e d i n t h e e x c l u s i v e l o s s o f ( A + 1 5 ) f r o m t h e s e i o n s , e n a b l i n g t h e u s e o f n e u t r a l l o s s C I D M S / M S s c a n m e t h o d s i n t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r s f o r t h e s e l e c t i v e i d e n t i fi c a t i o n o f G P C h o a n d S M l i p i d s p e c i e s f r o m w i t h i n c o m p l e x l i p i d m i x t u r e s [ 1 1 0 , 1 3 5 , 2 1 1 , 2 4 4 , 2 4 5 ] . D e s p i t e t h e g r e a t p o t e n t i a l o f e m p l o y i n g a n i o n i c a d d u c t i o n f o r t h e s e l e c t i v e a n a l y s i s o f G P C h o o r S M l i p i d s i n n e g a t i v e i o n m o d e , t o g e t h e r w i t h m o s t o t h e r l i p i d s s p e c i e s , t h e n e g a t i v e i o n f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o l i p i d s h a v e n o t b e e n e x p l o r e d i n d e t a i l , i n c o n t r a s t t o t h e d e t a i l e d s t u d i e s p r e v i o u s l y u n d e r t a k e n t o e l u c i d a t e t h e m e c h a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f p r o t o n a t e d o r c a t i o n i c l i p i d i o n s i n p o s i t i v e i o n m o d e [ 1 1 6 , 1 1 7 , 1 8 8 , 1 9 1 , 1 9 2 , 1 9 7 ] , o r f o r d e p r o t o n a t e d 1 4 5 l i p i d i o n s i n n e g a t i v e i o n m o d e [ 1 1 7 , 1 8 9 , 1 9 0 , 1 9 3 , 1 9 5 , 1 9 7 , 1 9 8 , 2 0 4 , 2 4 6 - 2 4 9 ] . H e r e , i n o r d e r t o d e v e l o p a n i m p r o v e d u n d e r s t a n d i n g o f t h e c h a r a c t e r i s t i c i o n i z a t i o n a n d f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s o f a n i o n i c G P C h o a d d u c t s , a n d t o t a k e a d v a n t a g e o f t h i s a n i o n i c a d d u c t i o n f o r d e v e l o p i n g i m p r o v e d m e t h o d s f o r l i p i d i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n i n c o m p l e x m i x t u r e s , a b r o a d r a n g e o f a n i o n s h a v e b e e n e v a l u a t e d f o r t h e f o r m a t i o n o f a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o b y e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n , a n d c h a r a c t e r i z e d t h e i r f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s b y m u l t i s t a g e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ( M S n ) i n a l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r . B a s e d o n t h e s e r e s u l t s , t o g e t h e r w i t h t h o s e o b t a i n e d b y d i s s o c i a t i o n o f D - l a b e l e d l i p i d s t a n d a r d s a n d a u t h e n t i c o r s t r u c t u r a l l y a n a l o g o u s l i p i d s , m e c h a n i s m s f o r e a c h o f t h e o b s e r v e d f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s a r e p r o p o s e d . 4 . 3 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 4 . 3 . 1 D e p e n d e n c e o f t h e f o r m a t i o n o f a n i o n i c a d d u c t s o n t h e p h o s p h o l i p i d t y p e T h e t e n d e n c y t o f o r m n o n - c o v a l e n t a n i o n i c a d d u c t s w a s h e r e f o u n d t o b e d e p e n d e n t o n t h e s t r u c t u r e o f t h e l i p i d . H e r e G P C h o , G P E t n , G P G r o a n d C L l i p i d s t a n d a r d s w e r e e x a m i n e d i n d i v i d u a l l y a s w e l l a s i n a m i x t u r e , i n t h e p r e s e n c e o f a v a r i e t y o f a n i o n s a t g i v e n c o n c e n t r a t i o n s . I n d i v i d u a l l y , G P C h o i s t h e t y p e o f l i p i d t h a t t e n d s t o f o r m a n i o n i c a d d u c t s i n n e g a t i v e i o n m o d e t h e m o s t e f fi c i e n t l y , d u e t o t h e r e l a t i v e l y s t r o n g e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s w i t h t h e fi x e d p o s i t i v e c h a r g e i n t h e t r i m e t h y l a m i n e h e a d g r o u p . H o w e v e r , t h e f o r m a t i o n o f c h l o r i d e a d d u c t s o f G P E t n w a s a l s o o b s e r v e d t h o u g h a t m u c h l o w e r e f fi c i e n c y o f f o r m a t i o n . S i m p l e a n i o n i c a d d u c t ( [ M + A ] ' ) f o r m a t i o n o f 1 4 6 G P G r o a n d C L l i p i d s w a s n o t o b s e r v a b l e i n n e g a t i v e i o n m o d e . I n a m i x t u r e o f t h e s e l i p i d s t a n d a r d s a t e q u a l c o n c e n t r a t i o n s , t h e a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o w a s t h e p r e d o m i n a n t t y p e o f a n i o n i c a d d u c t s t h a t w a s o b s e r v e d t o f o r m . 4 . 3 . 2 N e g a t i v e i o n C I D M S I M S o f a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 a n d G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 I n o r d e r t o c h a r a c t e r i z e t h e C I D M S / M S a n d M S n f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f v a r i o u s a n i o n i c ( A ) a d d u c t s o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e l i p i d s , a m m o n i u m s a l t s ( 0 . 1 - 1 0 m M ) o f a c e t a t e ( C H 3 C O z ' ) , f o r m a t e ( H C O Z ' ) , c h l o r i d e ( C l ' ) , b r o m i d e ( B r ' ) , i o d i d e ( 1 ' ) , fl u o r i d e ( F ' ) , t h i o c y a n a t e ( S C N ' ) , n i t r a t e ( N O 3 ' ) , p h o s p h a t e ( H 2 P 0 4 ' ) , h y d r o x i d e ( O H ' ) , b i c a r b o n a t e ( H C O 3 ' ) , t r i fl u o r o a c e t a t e ( C F 3 C O Z ' ) , b e n z e n e s u l f a t e ( C 6 H 5 S O 3 ' ) o r s u l f a t e ( H S O 4 ’ ) s a l t s w e r e a d d e d t o 5 u M s o l u t i o n s o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( m o l e c u l a r w e i g h t 7 3 3 ) o r G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ( m o l e c u l a r w e i g h t 7 5 9 ) , t h e n i n t r o d u c e d t o t h e m a s s . . . . . . + s p e c t r o m e t e r b y n E S I . I n p o s r t r v e r o m z a t r o n m o d e , p r o t o n a t e d p r e c u r s o r r o n s [ M + H ] f o r t h e G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 a n d G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 l i p i d s p e c i e s w e r e r e a d i l y o b s e r v e d a t m / z 7 3 4 a n d m / z 7 6 0 , r e s p e c t i v e l y . A s e x p e c t e d , i n n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e , d e p r o t o n a t e d p r e c u r s o r i o n s [ M — H ] ' w e r e n o t o b s e r v e d , c o n s i s t e n t w i t h t h e p r e s e n c e o f t h e ' fi x e d p o s i t i v e c h a r g e ' q u a t e r n a r y a l k y l a m m o n i u m i o n w i t h i n t h e p h o s p h o c h o l i n e h e a d g r o u p . I n s t e a d , a b u n d a n t a n i o n i c [ M + A ] ' a d d u c t s w e r e o b s e r v e d a s t h e d o m i n a n t p r e c u r s o r i o n s . T h e m / z v a l u e s o b s e r v e d b y a d d u c t i o n o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 a n d G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 w i t h 1 4 7 e a c h o f t h e a n i o n s i n d i c a t e d a b o v e a r e l i s t e d i n T a b l e 4 . 1 , a n d t h e m a j o r f r a g m e n t a t i o n s o b s e r v e d b y M S / M S a n d M S 3 a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e s 4 . 1 a n d 4 . 2 , r e s p e c t i v e l y . T h e p r o d u c t i o n s p e c t r u m o b t a i n e d b y C I D M S / M S o f t h e [ M + A ] ' a c e t a t e a d d u c t i o n o f G P C h o 1 6 1 0 / 1 6 : 0 i s s h o w n i n F i g u r e 4 . 1 A . I t c a n b e s e e n t h a t a s i n g l e p r o d u c t i o n a t m / z 7 1 8 , f o r m e d b y t h e n e u t r a l l o s s o f 7 4 D a a n d c o r r e s p o n d i n g t o t h e l o s s o f ( A + 1 5 ) , w a s o b s e r v e d a s t h e e x c l u s i v e p r o d u c t , c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s l y r e p o r t e d i n - s o u r c e f r a g m e n t a t i o n [ 1 1 7 , 2 3 8 - 2 4 0 ] a n d C I D M S / M S [ 1 1 0 , 1 1 6 , 1 1 7 , l 3 5 , 2 1 1 , 2 4 1 - 2 4 5 ] r e s u l t s u s i n g t r i p l e q u a d r u p o l e a n d q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t r y i n s t r u m e n t a t i o n . I d e n t i c a l p r o d u c t i o n s p e c t r a w e r e o b s e r v e d b y C I D M S / M S o f t h e f o r m a t e , c h l o r i d e , b r o m i d e a n d i o d i d e a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( n e u t r a l l o s s e s o f 6 0 D a , 5 0 D a , 9 4 / 9 6 D a a n d 1 4 2 D a , r e s p e c t i v e l y ) , a n d f o r t h e a c e t a t e , f o r m a t e a n d c h l o r i d e a d d u c t s o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 . I n c o n t r a s t , w h e n 1 0 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e o r a m m o n i u m b i c a r b o n a t e w a s a d d e d t o t h e G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 l i p i d c o n t a i n i n g s o l u t i o n s , a n a b u n d a n t p r e c u r s o r i o n a t m / z 8 0 8 ( + 7 5 D a ) w a s o b s e r v e d , w h i c h d i d n o t c o r r e s p o n d t o e i t h e r o f t h e e x p e c t e d h y d r o x i d e ( + 1 7 D a , m / z 7 5 0 ) o r b i c a r b o n a t e ( + 6 1 D a , m / z 7 9 4 ) a d d u c t i o n s ( T a b l e 4 . 1 ) . F u r t h e r m o r e , i n c o n t r a s t t o t h a t o b s e r v e d f r o m t h e a c e t a t e , f o r m a t e a n d c h l o r i d e a d d u c t s o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 , C I D M S / M S o f t h e m / z 8 0 8 a d d u c t i o n s ( F i g u r e 4 . 1 B ) r e s u l t e d i n f o r m a t i o n o f t h e - ( A + 1 5 ) p r o d u c t i o n a t a r e l a t i v e a b u n d a n c e o f o n l y 1 % . I n s t e a d , t h e m a j o r p r o d u c t i o n s c o r r e s p o n d e d t o n e u t r a l l o s s e s o f ( A H ) , ( A + l 6 ) , ( A + 6 0 ) a n d ( A + 8 6 ) f r o m t h e p r e c u r s o r i o n . I n t e r e s t i n g l y , p r e c u r s o r i o n s c o r r e s p o n d i n g t o [ M - 1 5 ] ' , [ M - 6 0 ] ‘ a n d [ M — 8 6 ] ' i o n s h a v e a l s o b e e n o b s e r v e d p r e v i o u s l y f o r G P C h o l i p i d s f o r m e d b y f a s t a t o m b o m b a r d m e n t ( F A B ) i n a s e c t o r o r t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r u n d e r 1 4 8 n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e c o n d i t i o n s w h e n C H 3 O H / C H C 1 3 w a s u s e d a s t h e s o l v e n t a n d t r i e t h y l a m i n e [ 2 0 2 , 2 5 0 - 2 5 2 ] o r d i e t h y l a m i n e [ 2 5 3 ] w a s u s e d a s t h e m a t r i x . T h e s t r u c t u r e s o f t h e s e i o n s w e r e a s s i g n e d t o b e [ M — C H 3 ] ’ , [ M - ( C H 3 ) 3 N ] ' , a n d [ M - ( C H 3 ) 3 N C H = C H 2 ] ' , r e s p e c t i v e l y , u s i n g s e c t o r F A B c o l l i s i o n a s s i s t e d d i s s o c i a t i o n ( C A D ) M S / M S [ 2 5 2 ] . G i v e n t h a t a m m o n i u m h y d r o x i d e a n d a m m o n i u m b i c a r b o n a t e a r e c o m m o n l y e m p l o y e d a s a p H m o d i fi e r i n n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e M S a n a l y s i s t o p r o m o t e t h e f o r m a t i o n o f a b u n d a n t [ M - H ] ' p r e c u r s o r i o n s f r o m n e u t r a l a n d a c i d i c p h o s p h o l i p i d s s u c h a s G P E t n , G P A , G P G r o , G P S e r , G P I n s a n d C L [ 2 3 3 , 2 3 4 ] i t i s i m p o r t a n t t h a t t h e i d e n t i t y o f t h e a n i o n i c s p e c i e s r e s p o n s i b l e f o r a d d u c t i o n o f t h e G P C h o p h o s p h o l i p i d s i n t h e p r e s e n c e o f a m m o n i u m h y d r o x i d e a n d a m m o n i u m b i c a r b o n a t e i s d e t e r m i n e d . F u r t h e r m o r e , a s t h e c h a r a c t e r i s t i c l o s s o f ( A + 1 5 ) b y C I D M S / M S f r o m a c e t a t e , f o r m a t e a n d c h l o r i d e a d d u c t s o f G P C h o a n d S M h a v e b e e n u s e d p r e v i o u s l y f o r t h e s e l e c t i v e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e s e l i p i d s p e c i e s b y n e u t r a l - l o s s s c a n m o d e a n a l y s i s , t h e f o r m a t i o n o f t h i s p r o d u c t i o n a t o n l y l o w r e l a t i v e a b u n d a n c e d u e t o c o m p e t i t i v e a d d u c t i o n o f G P C h o o r S M w i t h o t h e r a n i o n i c s p e c i e s c o u l d s e v e r e l y l i m i t t h e s e n s i t i v i t y o f s u c h a p p r o a c h e s . T h e r e f o r e , i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e i d e n t i t y o f t h e + 7 5 D a a n i o n i c a d d u c t o f G P C h o i n t h e p r e s e n c e o f a m m o n i u m h y d r o x i d e a n d a m m o n i u m b i c a r b o n a t e , a n d t o c h a r a c t e r i z e t h e m e c h a n i s m s a n d r e s u l t a n t p r o d u c t i o n s t r u c t u r e s f o r m e d b y C I D M S / M S , t h e f o r m a t i o n a n d fi a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f a r a n g e o f a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 a n d G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 w e r e e x a m i n e d b y M S / M S a n d m u l t i s t a g e ( u p t o M S 4 ) t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . 1 4 9 T h e p r o d u c t i o n s o b s e r v e d b y C I D M S / M S o f t h e v a r i o u s a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 a n d G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 a r e s h o w n i n T a b l e 4 . 1 . T h e a p p e a r a n c e a n d r e l a t i v e a b u n d a n c e o f t h e s e p r o d u c t i o n s w e r e o b s e r v e d t o v a r y c o n s i d e r a b l y , d e p e n d i n g o n t h e i d e n t i t y o f t h e a n i o n . T h e m a j o r C I D M S 3 p r o d u c t i o n s a r e s h o w n i n T a b l e 4 . 2 . _ — ( A + C H 3 ) 1 0 0 ‘ A 7 1 8 6 0 - r ? 4 0 ‘ ° \ _ 5 0 ’ 2 0 — 7 9 2 o g ' l g 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 . o - ( A H + ( C H ) N ) _ < 1 0 0 - B 3 8 7 3 ( A H + C H 3 ) C D _ 7 1 7 3 8 0 8 E 8 0 : 2 I — A H g 6 0 ' 7 3 2 4 0 : ‘ ( A + ( C H 3 ) 3 N C H = C H 2 ) 6 4 7 l ; § ‘ ; ‘ + C H 3 ) 2 0 : 8 0 8 _ 4 1 . 9 \ l i 2 0 0 3 6 0 4 6 0 5 6 0 6 K ) 7 6 0 8 0 0 9 b 0 1 6 0 0 m / z F i g u r e 4 . 1 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e [ M + A ] ' p r e c u r s o r i o n s o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 f o r m e d b y a n i o n i c a d d u c t i o n w i t h ( A ) a c e t a t e ( m / z 7 9 2 ) a n d ( B ) m e t h y l c a r b o n a t e ( m / z 8 0 8 ) . 1 5 0 ) H 1 2 , 5 2 , 0 ) ) C 0 5 ; 5 C 1 5 5 1 1 , 2 3 2 ( ( ) H 3 H , 1 7 5 _ 7 , 5 _ 1 1 O ( O C C O . + O + C N 3 C 9 6 ; 1 ) ; 1 5 8 3 3 m ] 3 + , + H ) 1 H H H A 5 1 9 5 A C 9 ( ( 1 3 1 ( 3 - ( C - ( C — 1 : 8 1 / 0 ) : e 6 1 o h c n a d N ) 3 n 2 + C u ) 7 A H 3 4 P ( b H C 6 — C H ( C M 8 5 / 9 2 7 1 8 7 2 4 1 7 9 . 2 9 3 2 1 3 1 _ 3 l - 4 l N P 0 l C 2 C / _ H C S H O o h C 0 : 6 1 / P 0 G : 6 1 G A e d v n i a t a 0 l : e 6 R 1 / % 0 : ( 6 s 1 n o o I h t C c + P H d 3 u ) G A o f r ( o — P H C s t c ) 3 H C + A ( — u d d Z N S a c i n o i n a f o S M / S 3 7 6 2 3 7 4 1 D I C e d o m n o i e v i t a g e N 9 4 4 6 0 3 8 1 5 1 T a b l e 4 . 1 L i p i d A n i o n ( A ) G a s - P h a s e A c i d i t y ( k J / m o l ) a [ M + A ] _ P r e c u r s o r I o n ( m / z ) I n t e r - m o l e c u l a r I n t e r - m o l e c u l a r E 2 — ( A H + ( C H 3 ) 3 N ) I n t r a - m o l e c u l a r E 2 7 1 8 7 1 7 b m C H 3 C 0 2 — 7 9 2 1 0 0 H C O z ~ 1 4 1 9 7 7 8 1 0 0 1 2 9 3 . 7 8 6 0 1 0 0 1 B r — 1 3 3 1 . 8 1 0 0 1 3 7 2 . 8 7 6 8 1 0 0 F 1 5 2 9 . 3 7 5 2 1 0 0 7 9 1 1 0 0 N 0 3 1 0 0 1 3 5 1 1 0 0 2 1 N D 8 2 2 1 0 0 4 0 1 4 7 4 1 1 6 8 ; 2 2 . ) ; 5 2 5 . 2 ) ( , ) 1 8 2 ( 1 , 9 . 3 ' ( ' O 0 ; O 2 0 . C C ) 3 7 1 1 3 3 4 H ( H 5 7 1 1 C C 4 0 4 7 0 1 4 6 0 5 8 8 _ 4 _ O 2 P 0 2 C H 1 : 8 1 / 0 : 6 1 H H / 2 ) H ' d e u 3 C O 3 n H C H C O i t n o c 1 . 4 e l b a T ( 1 5 2 C H Z O H H - 2 H ) , ( 4 1 9 ) , 1 8 2 2 6 5 3 3 1 0 0 — ( A H + 5 9 + C 1 5 H 3 1 C O z H — Z H ) , ( 4 1 9 ) , 1 0 H ' / C H 3 O H 8 0 8 6 2 1 0 0 3 6 - ( A H + 5 9 + C 1 5 H 3 1 C 0 2 H - 2 H ) , ( 4 1 9 ) , 6 0 H C O 3 _ / C H 3 O H 8 0 8 1 0 0 3 4 - ( A H + 5 9 + C 1 5 H 3 1 C 0 2 H - 2 H ) , ( 4 1 9 ) , 3 C F 3 C 0 2 _ 1 3 2 8 8 4 6 1 0 0 - ( A H + 5 9 + C 1 5 H 3 1 C O Z H - 2 H ) , ( 4 1 9 ) , 5 8 ; C 1 5 H 3 1 C O O _ , ( 2 5 5 ) , 5 C 6 H 5 S O 3 — 8 9 0 1 0 0 - ( A + 8 6 + C 1 5 H 3 1 C O Z H ) , ( 3 9 1 ) . 1 ; C 1 5 H 3 1 C O O _ , ( 2 5 5 ) , 1 7 5 8 7 4 3 6 9 9 6 7 3 C H 3 C 0 2 - 8 1 8 1 0 0 1 0 0 7 9 4 1 0 0 ) ) ; 1 2 , , ) ) 5 1 5 8 + + H H 2 2 N N 2 2 3 3 — - ( ( , , ) ) H H ' ' 3 3 2 2 O O H H 0 0 O O C C ; C C C C ( ( 3 3 4 1 3 + + 3 3 3 3 2 2 H H ) H H H H 1 , A A 7 7 9 5 7 9 1 1 ( 1 ( 1 1 1 4 4 — C - C ( C C ( 5 3 8 1 0 0 o 0 0 g 1 1 ) v . t s i n . k o o b b 6 7 5 e 1 5 4 5 9 5 7 w / / : p t t h ( e s a b a t a d T S I N e h t 4 2 m e c 3 o 7 8 8 r n f a n e d n k u a b t A a t % a d , ) y z t / i m d d e ( i n c , i A n o m r e i s e ‘ ) d e / 2 t t H a ' Q c e h O 3 C P u d u o 3 3 - d s o t a r o G N P n H c F H C C i t n o c 1 . 4 e l b a T ( 1 5 3 2 2 2 2 8 3 3 3 3 5 7 7 7 7 7 H O 3 H / / H H C ' ' 3 3 O O / O O 3 3 ‘ C C H H H H C O H C 1 : 8 1 o h / C 0 : P 6 1 s n o I r o s 2 . 4 r e l b a u c e r T P j S M G 1 5 4 S u m m a r y o f t h e n e g a t i v e i o n m o d e C I D M S 3 p r o d u c t i o n s o f v a r i o u s a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o [ M + A - ( A + l ) ] " M G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 A - H C O 3 ' / C H 3 C H 2 0 H O H - / C H 3 O H C F 3 C 0 2 ' 7 5 8 M S 3 P r o d u c t I o n s m / z , r e l a t i v e a b u n d a n c e , i d e n t i t y 2 2 4 , < l , 7 ; 2 5 5 , l 0 0 , R C O O ' ; 2 6 9 , 3 0 , R ' C H = C ( O C H 3 ) O - ; 4 3 5 , 4 , - ( N ( C H 3 ) 3 + R ' C H = C = O ) ; 4 6 3 , 2 , ? ; 4 7 6 , 1 , — R C O O H ; 4 9 4 , 1 2 , - R ' C H = C = O ; 7 1 7 , 1 , - C H 3 2 5 5 , 1 0 0 , R C O O ' ; 2 6 9 , 2 1 , R ' C H = C ( O C H 3 ) O ' ; 4 3 5 , 3 , - ( 5 9 + R ' C H = C = O ) ; 4 6 3 , 2 , ? ; 4 7 6 , 1 , — R C O O H ; 4 9 4 , 1 4 , - R ' C H = C = O ; 7 1 7 , 1 , - C H 3 2 2 4 , < l , ? ; 2 5 5 , 1 0 0 , R C O O - ; 2 6 9 , 2 3 , R ' C H = C ( O C H 3 ) O - ; 4 3 5 , 4 , 1 - ( 5 9 + R ' C H = C = O ) ; 4 6 3 , 1 , ? ; 4 7 6 , 1 , - R C O O H ; 4 9 4 , 1 3 , — R ' C H = C = O ; 7 1 7 , 1 , ' C H 3 2 5 5 , l 0 0 , R C O O - ; 2 6 9 , 1 , R ' C H = C ( O C H 3 ) O ' ; 4 7 6 , 1 0 , - R C O O H ; 4 9 4 , < l , — R ' C H = C = O 2 5 5 , 3 5 , R 1 C O O - ; 2 6 9 , 6 , R 1 ' C H = C ( O C H 3 ) O ' ; 2 8 1 , 1 0 0 , R 2 C 0 0 - ; 2 9 5 , 2 2 , R 2 ' C H = C ( O C H 3 ) O - ; 4 3 5 , 1 , - ( 5 9 + R 2 ' C H = C = O ) ; 4 6 0 , 3 , - ( 5 9 + R 1 ' C H = C = O ) ; 4 9 4 , 1 8 , * R z ' C H = C = O ; 5 2 0 , 1 , - R 1 ' C H = C = O ; 7 4 3 , 2 , - C H 3 2 5 5 , 3 8 , R 1 C O O ' ; 2 6 9 , 1 0 , R 1 ' C H = C ( O C H 3 ) O ' ; 2 8 1 , 1 0 0 , R 2 C O O - ; 2 9 5 , 2 2 , R 2 ' C H = C ( O C H 3 ) O ' ; 4 9 4 , 1 5 , - R 2 ' C H = C = O ; 5 2 0 , 1 , — R 1 ' C H = C = O ; 7 4 3 , < l , - C H 3 . 0 O O O = = = 3 C C C 1 1 ; ’ , O 4 1 , ) 3 9 H = = = H H H C C C ' ' ' R R R 9 C - - - 2 O O = ( , , , ; 4 5 ' O C C = = 1 1 , , H 0 0 9 , 0 8 4 ; 8 8 4 4 ; ; H O H C C C R ' ' - R R 3 1 - - 4 3 0 0 - H H O 3 O O O d , 3 , d 2 5 - 8 , d , , 0 5 O O C C C R 1 R R - , 5 , 7 6 , 5 ; 8 5 9 - - , , , 1 2 2 O < 2 1 2 5 = , , , ; ; C 2 2 2 ' ‘ 6 6 6 ; = O O 4 4 4 ' H O O C C O C ; ; ; ) ' ’ ' ' R R - - 3 0 1 H 3 3 C d d O , , ( 0 0 C 0 0 = 1 1 R O O O - O O O 0 C C C 3 R R R d , , , — 0 0 0 , 0 0 0 2 1 1 1 , , , H , , , 5 6 C 6 5 5 5 8 8 ' 2 5 5 5 2 2 2 2 2 R 5 ) D A ( - 9 4 3 4 6 6 8 9 9 9 3 3 7 7 7 7 7 7 H H O O 3 3 ' - H H 2 2 0 0 C C ) d C C ‘ / / e 3 ‘ 3 ' N F H F C H - i C O O C 4 o : C 6 6 P 1 e l h / C - 1 P 3 G d d 1 [ G 0 - : 4 6 M ( — A + u n t n o c 2 . l b a T ( / 0 + 0 A h : o 1 C S ' ] ) 5 1 1 5 5 7 5 8 2 5 5 , 3 2 , R 1 C O O ' ; 2 6 9 , < 1 , R 1 ' C H = C ( O C H 3 ) O ' ; 2 8 1 , 1 0 0 , R 2 C O O ‘ ; 2 9 5 , 1 , R z ' C H = C ( O C H 3 ) O ' ; 4 9 4 , 9 , R Z ' C H = C = O ; 5 2 0 , 2 , — R 1 ' C H = C = O ; 7 4 3 , < 1 , — C H 3 G P C h o O H ‘ / C H 3 0 H d 3 1 - 1 6 2 0 / 1 8 : 1 2 8 1 , 1 0 0 , R 2 C O O - ; 2 8 5 , 1 9 , d 3 0 - R 1 C O O - ; 2 8 6 , 5 4 , d 3 1 - R 1 C O O ' ; 2 9 5 , 2 7 , R 2 ' C H = C ( O C H 3 ) O - ; 2 9 9 , 2 , d 3 0 - R 1 ' C H = C ( O C H 3 ) O ' ; 4 6 1 , 3 , - 3 2 8 ; 5 2 5 , 1 7 , - R 2 ' C H = C = O ; 7 7 4 , 2 , - C H 3 ( 1 3 1 - 1 6 2 0 O H ' / C H 3 O H C F 3 C 0 2 - 2 8 5 , 3 4 , d 3 0 - R C O O ' ; 2 8 6 , 1 0 0 , d 3 1 - R C O O ' ; 2 9 9 , 1 , d 3 0 - R ' C H = C ( O C H 3 ) O ' ; 3 0 0 , 1 , d 3 0 - R ' C H = C ( O C H 3 ) O ‘ ; 5 2 6 , 3 , — d 3 0 - R ' C H = C = O 2 2 8 , 1 , ? ; 2 5 5 , 1 0 0 , R C O O ' ; 2 6 9 , 2 4 , R ' C H = C ( O C H 3 ) O ‘ ; 4 3 8 , 3 , - ( N ( C H 3 ) 3 + R ' C H = C = O , 2 9 8 ) ; 4 6 3 , 2 , - 2 7 3 ; 4 8 0 , 2 , - R C O O H ; 4 9 8 , 1 2 , — - R ' C H = C = O ; 7 2 1 , 4 , — C H 3 2 5 5 , 1 0 0 , R C O O ' ; 2 6 9 , 2 , R ' C H = C ( O C H 3 ) O ' ; 4 8 0 , 2 , - R C O O H ; 4 9 8 , 1 9 , - R ' C H = C = O G P C h o C H 3 C 0 2 - 1 6 1 0 / 1 6 2 0 7 1 8 7 1 8 7 1 8 ; ; ; ; H O H H H O O = C = H C O = O O O = O O C O C O O O = O ' ; ; = ' ' 2 C = C C = C = C C O O R O O 2 2 C 2 H = 2 H H = O O — = = C O R R = R H C C , R C C C C C 1 1 5 = ’ — - H - = = C 2 , , C , 1 ' R R — ' ' ; H H = 1 1 ' 1 R , - - 1 , 1 1 H , , 1 , 0 0 - R 1 1 R O R C C , H 2 2 R 2 — 3 3 - O , 2 — 1 ' ' C , C d d 6 6 - 6 4 6 , , 5 R R ' 4 4 4 4 4 , , 4 3 2 , , - 2 - R 6 , , R , 6 ; 5 , , ’ ' ' ' , , 0 - 0 6 , 0 , 1 0 5 5 0 6 , O O O O 5 5 1 O 5 , 2 1 1 0 5 , , ; ; , 5 1 C C C C ; 2 2 0 6 O O O O 8 8 = 7 ; ; ; ; 6 1 6 1 ? — , 0 0 2 ; C , 5 2 2 2 2 H H H 8 8 0 6 ; H = ; ; 4 4 8 R R R R 0 O O 4 H 0 H - ' 4 O O , , , , 0 0 0 O O C ; ? , ; ; 0 0 0 0 C C C ; 0 C ' O O 2 H H 1 ' ; 0 0 0 0 O O H 2 2 1 1 C 1 2 C C , 1 1 1 1 R O 3 O O O , , , , R 9 R R 1 R — O R R 1 1 1 1 - - - R 4 - , C - - C C O , — 8 8 8 8 , , 1 1 1 2 , ; R R 1 1 R 1 C 2 2 2 2 , d d , 1 ? , - - R 8 , ; ; ; ; 8 8 , 8 , , , 1 , , 2 1 , , , - 1 ' ‘ ' 8 ' 8 8 0 l 8 , 0 8 2 1 8 8 1 1 O O O O 4 4 4 , 1 8 4 , , 1 8 < < 2 4 O O O O 5 , , , C C C C ; ; ; ; ; 2 2 , 4 2 2 2 O O O ; 1 8 8 1 1 1 ; 1 O 6 6 6 8 2 - 2 R R R O R = = = = 4 4 4 2 O ‘ O , , , , = C C C C ; ; O O ; ; ; = C 2 = = = 3 2 7 ; ' ‘ C C ' " ' = H H H H 4 4 4 3 ' O O 1 1 O O O H C , , , , C C C O O O R R O O O C ' O C C 5 5 5 5 ' ' ' - - C C C ' 2 C 2 2 5 5 5 5 2 2 2 1 1 R R R 2 R 1 R R 2 2 2 2 R R R 3 3 , , , R - R , , ; ; ; ; - - — d d 0 0 0 - , , 0 0 ? ? , ? ? , 0 0 0 , , , 6 , , 0 0 0 , , , 2 1 1 1 1 2 8 2 1 1 5 5 1 1 1 1 8 8 7 , , , , , , , , , , < < < < 1 1 1 , , , , , , , 5 5 5 5 0 0 1 1 6 6 4 4 0 0 0 4 4 5 5 5 5 8 8 8 8 8 8 2 2 8 2 8 2 8 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 2 2 2 4 4 4 4 8 8 8 8 4 4 4 4 4 5 5 1 1 1 1 4 4 4 4 4 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 H 0 2 H H 2 2 ' - ) 0 4 4 - ' 0 - C O d C O O 3 3 C Z 3 3 - - e u n O O H H 3 O 3 P C C C C F 2 H C ’ l P 2 i H H / / C H C H C H t n o c 2 . 4 o 1 : 8 1 e l b a T ( h / C 0 : P 6 G 1 1 5 6 C F 3 C 0 2 ’ H 2 P 0 4 ' 2 5 5 , 1 0 0 , R C O O ' ; 4 6 2 , 1 , - R C O O H ; 4 8 0 , 7 , - R ' C H = C = O G P C h o d 3 1 - l 6 2 0 / 1 8 : 1 C H 3 C 0 2 ’ ; ? , 1 , 3 9 4 ; ' O O C R ; O O C R - , 2 , 0 8 4 - ; 3 H C - 3 — H , C 7 ~ 6 , , 8 3 2 2 7 , 9 9 6 ; O O C ; 3 H C N 3 H O O C R — 2 , C - R 0 - 0 , 1 2 , 2 3 d , 2 1 , 7 O 8 = 2 = H C ' R - 0 3 3 R C ' - R R 1 - - 3 0 0 d 3 3 , d d 0 , - 0 1 1 2 , C 0 ; ' O O , 2 2 , 6 9 0 1 4 9 , 6 2 C ; R - 1 ) 3 3 H 4 6 4 ; - ; O O d C d C + O - , , 0 2 0 , 1 2 , 1 6 5 8 ; 2 O = C O O — O C 2 , R 2 C 4 1 R , ( 8 - 2 7 , 5 2 — R , 0 0 , 3 4 1 , , 1 ' ; ; 8 2 = , O 6 - 3 2 3 H O O C H C 9 H 1 O 4 C N ; 3 ' H O C O 4 C ) e c ; - ' O O , 7 n 5 a , C d 1 8 C 2 n R — R u , 7 , b , 3 9 a 4 2 ; , , , , 9 3 1 6 5 5 5 2 3 o , , w H 8 8 5 1 7 l 5 C 2 2 6 5 2 ( 2 N 2 2 2 7 2 2 2 1 7 7 7 7 H H 0 O 2 3 - 2 - ' 2 2 ' / H H ) 0 0 4 d C C O - C C 3 3 / H - 0 O 3 C e 3 3 P O 3 O H ' 3 u n i t n o H F 2 C C H C F H C C C H H O H C / ' ] ) 6 c l 2 . / 0 0 2 : 4 o 6 6 + O A : ( o 6 l - e / h h 1 1 - - A 1 1 + : C O l C b P a 3 3 T G d d ( M P 6 [ l G 1 5 7 7 8 0 7 8 0 7 8 0 2 8 5 , 2 1 , d 3 o - R C O O ' ; 2 8 6 , 1 0 0 , d 3 1 - R C O O ' ; 5 1 2 , 2 , - d 3 o - R ' C H = C = O d 4 - G P C h o C H 3 C 0 2 ' 1 6 : 0 / 1 6 : 0 C l ' C F 3 C 0 2 ' 2 5 5 , 1 0 0 , R C O O ' ; 4 6 6 , 2 , - R C O O H , 4 8 4 , 1 8 , - R ' C H = C = O 2 5 5 , 1 0 0 , R C O O ' ; 4 6 6 , 2 , - R C O O H , 4 8 4 , 1 8 , - R ' C H = C = O 2 5 5 , 1 0 0 , R C O O ' ; 4 6 6 , 2 , - R C O O H , 4 8 4 , 1 8 , - R ' C H = C = O 7 1 7 7 1 7 2 5 5 , 4 , R C O O ' ; 4 1 9 , 2 3 , - ( R C O O + 4 3 ) ; 4 6 2 , 1 0 0 , — R C O O ; 4 8 0 , 2 , - R C O O ; 6 7 3 , 2 1 , - C H 3 N C H 3 ; 7 2 8 , 2 2 , — C H 3 2 5 5 , 2 , R c o o ' ; 4 1 9 , 2 3 , - ( R C O O + 4 3 ) ; 4 6 2 , 1 0 0 , — R C O O ; 4 8 0 , 1 , ~ R C O O ; 6 7 3 , 2 2 , - C H 3 N C H 3 ; 7 2 8 , 1 5 , - C H 3 2 5 5 , 3 , R C O O ’ ; 4 1 9 , 2 8 , - ( R C O O + 4 3 ) ; 4 6 2 , 1 0 0 , - R C O O ; 4 8 0 , 2 , - R C O O ; 6 7 3 , 2 6 , — C H 3 N C H 3 ; 7 2 8 , 1 7 , — C H 3 G P C h o O H ‘ I C H 3 O H 1 6 : 0 / 1 8 : 1 H C O 3 ' / C H 3 O H 7 4 3 7 4 3 ; O = C = H C ' R - , 2 , 7 1 4 H H O O O O C C R R - - , , 6 6 , , 5 5 3 3 4 4 ; ; ; O O = = C C = = H H C C ' O O C R , 0 0 ' ' l R R - - , 5 5 , , 2 1 2 , , ; 7 7 1 1 4 4 ) O Z ; ; H H ' ' - O O O O O C C R R , , 0 0 H O O C O C R R - ( 0 0 , 1 1 , , 5 5 , 0 1 1 , , 7 5 5 5 3 3 2 2 2 4 4 9 9 1 1 3 3 3 3 7 7 7 2 2 7 7 7 7 7 7 7 7 7 6 6 6 6 H H H H 0 0 0 O H 3 3 3 0 3 H H H 2 H - C C C H C / / / C / H 2 - ' O 0 4 3 3 C O ‘ ‘ “ 3 — O H 3 P H H H H H C C F 2 O O O H C O H C / / / 0 0 0 0 : : h o o O : : C 6 6 6 P 6 1 1 h h / / 1 l G C C - 1 - 1 1 : P P 3 3 8 0 0 - : : 4 6 6 G d G d d 1 1 1 1 5 8 ( T a b l e 4 . 2 c o n t i n u e d ) c r 3 c 0 2 ' 7 4 3 2 5 5 , 2 3 , R 1 C O O ' ; 2 8 1 , 1 1 , R 2 C O O " ; 4 6 2 , 1 0 0 , - R 2 C O O ; 4 8 0 , 1 8 , - 2 6 3 ; 6 9 9 , 2 8 , — C H 3 N C H 3 ; 7 2 8 , 1 8 , - C H 3 2 8 1 , 1 0 , R 2 C O O - ; 2 8 6 , 1 2 , d 3 1 - R 1 C O O ' ; 4 9 3 , 1 0 0 , - R 2 C O O ; 5 1 1 , 1 7 , ? ; 7 3 0 , 2 0 , — C H 3 N C H 3 ; 7 6 4 , 1 9 , — C H 3 d 3 1 - l 6 : 0 C F 3 C 0 2 - C F 3 C 0 2 ' 2 8 6 , 2 7 , R C O O ' ; 4 5 0 , 1 5 , - ( R C O O + 4 3 ) ; 4 9 3 , 1 0 0 , — R C O O ; 7 3 5 , 3 6 , - C H 3 N C H 3 ; 7 6 4 , 3 2 , - C H 3 2 8 6 , 1 4 , R C O O ' ; 4 5 0 , 2 7 , — ( R C O O + 4 3 ) ; 4 9 3 , 1 0 0 , — R C O O ; 7 3 5 , 9 , - C H 3 N C H 3 ; 7 6 4 , 2 0 , - C H 3 2 5 5 , 7 , R C O O ‘ ; 4 2 3 , 2 7 , — ( R C O O + 4 3 ) ; 4 6 6 , 1 0 0 , — R C O O ; 4 8 4 , 2 , — R C O O ; 6 7 7 , 6 , - C H 3 N C H 3 ; 7 0 6 , 2 7 , - C H 3 2 5 5 , 7 , R C O O ’ ; 4 2 3 , 2 5 , - ( R C O O + 4 3 ) ; 4 6 6 , 1 0 0 , — R C O O ; 4 8 4 , 4 , — R C O O ; 6 7 7 , 5 , — C H 3 N C H 3 ; 7 0 6 , 2 3 , — C H 3 [ M + A - ( A + 6 0 ) | ' G P C h o H C O 3 - / 6 7 3 2 5 5 , 1 0 0 , R C O O ' ; 4 1 7 , 1 , - R ' C H = C = O ; 4 3 5 , 6 , - R C O O H 2 5 5 , 1 0 0 , R C O O ' ; 4 1 7 , 2 , - R ' C H = C = O ; 4 3 5 , 6 , - R C O O H O O C = = O ; ; ' ‘ H = = C O O O ; ; C H = O O ' O C C O O C H C = ; ; 1 1 O = ' C H R R 1 C C 1 ' ; H H O O C R 1 H - - 1 R = 0 0 R O O — — 3 3 - O R ' H C ' 2 R — C C 1 O , 0 — d d , 2 R 2 1 C , 3 , , 5 , R R - 5 2 d 7 9 < 2 - — 1 1 R , , , , . , , 4 1 , , 1 l 1 — 1 , 1 , 6 6 5 5 6 , , < < 2 4 4 1 8 8 4 5 8 , 5 , , , 6 2 2 8 4 ; 7 7 7 ; ; ; 2 2 ; 3 ? H ; H 1 ; 1 1 H H O ' H 4 4 H 4 4 O O ' = O C O O 0 O O O ? ' O O ‘ O O ; ; ; ; C O = C 0 O O C ' ' ‘ " C C H C 1 O C 1 C O O O O 2 2 R 2 C 2 C 1 R O O O O R R - 2 R R 2 R C C C C ' R — 2 2 2 2 1 - , R R R R R , 1 1 < , R - - - - — 4 , 1 , , - 1 , d 9 1 4 d 2 , , , , , - , , d , 1 , , 3 0 0 0 0 0 , , 9 0 0 0 0 , 3 3 2 7 1 6 4 6 5 1 1 1 1 , , , 1 4 6 6 4 4 6 , 4 4 4 , , , , 4 4 2 2 2 1 ; 1 1 1 1 8 8 8 6 O ; ; ; ; ; 8 8 8 2 2 2 4 8 ' ' ' O O = 2 2 2 2 O O O ; ; ; ; = = C ; ; ; ; ' ' ' C C = O O O H C C C ' ' ' ' O O O = = H O O O O O O O H H C O 1 1 1 O O O O C C C O C C ’ - - - R R R C C C C 2 2 2 C ' ' 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 R R R R 3 3 3 R R R R R R — , , , R d d d , , , , — — , 0 0 0 , , , — 4 3 0 8 , , 1 0 0 0 6 5 4 4 4 4 3 3 9 1 , 1 1 1 5 5 4 , , , , , , , , , , , , , 1 , 5 5 5 5 5 5 5 1 6 6 6 1 1 3 5 5 5 5 3 3 3 8 8 8 8 8 8 4 2 2 2 2 4 4 2 4 4 2 2 2 2 2 0 3 7 H O 3 H C ' / H 2 - / O ' 0 4 3 C 0 ' 3 O 3 P 1 1 C F 2 H ) 9 5 + D 4 5 A 3 ( 3 7 — 7 H O 3 H C / ' 4 O - P H 2 0 C H C H O H 1 : o 8 1 h / C 0 : P 6 G 1 0 2 6 l - 1 3 d - ] ) 1 6 + A ( - A + M [ 1 5 9 ( T a b l e 4 . 2 c o n t i n u e d ) 6 9 9 6 9 9 6 9 9 6 9 9 G P C h o O H ' / C H 3 O H d 3 1 - 1 6 2 0 / 1 8 : 1 e r r / € 1 1 3 , 0 1 1 H 2 P O 4 - 7 2 9 - ( A D + 5 9 ) 7 3 0 G P C h o O H ‘ l C H 3 O H d 3 1 - 1 6 2 0 / 7 3 5 2 8 5 , 2 0 , d 3 0 - R 1 C O O ‘ ; 2 8 6 , 5 6 , d 3 1 - R 1 C O O ' ; 4 6 7 , 9 , - d 3 0 - R ' C H = C = O 2 8 5 , 1 0 0 , d 3 0 - R 1 C O O ' ; 2 8 6 , 9 0 , d 3 1 - R 1 C O O ‘ ; 4 6 6 , 1 , — d 3 0 - R ' C H = C = O 2 8 5 , 1 6 , d 3 o - R 1 C O O ' ; 2 8 6 , 1 0 0 , d 3 1 - R 1 C O O ' ; 2 8 7 , l 3 , d 3 2 - R 1 C O O ' ? ; 4 4 8 , 2 , ? ; 4 6 7 , 4 , — d 3 0 - R ' C H = C = O ; 3 6 2 — , 0 2 , 7 3 4 ; O = C = 0 H 0 C ' R - , 8 , 8 3 4 ; h c - , 0 0 1 , 9 1 4 H ; O O C ' O O C R 2 - , 3 , 0 R , 4 , 1 2 8 4 2 ; ' O O C ; " O 0 O 0 C R 1 0 , 1 R 0 0 3 - 3 1 , , 5 5 3 7 5 , 5 5 4 2 2 4 0 7 7 3 0 4 4 7 7 6 6 6 ' H 2 ' O 0 4 - H d O - / 3 3 C H O 3 H C ) / e l b a T ( e - u n H i O t n o c 2 . 4 o ’ ] ) 6 8 1 + : A 8 ( 1 — h / A 3 0 O H 3 P ' C C F 2 H H N / H H C C O 1 : o 8 1 h / O 3 C C 0 0 + : : P M P 6 6 G G 1 [ 1 1 6 0 d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 C F 3 C 0 2 ' 6 7 6 - ( A D + 5 9 ) 6 7 6 — ( A D + 5 9 ) 2 5 5 , 1 0 0 , R C O O ' ; 4 2 0 , 2 , - R C O O H ; 4 3 8 , 8 , - R ' C H = C = O [ M + A - ( A + 5 9 ) ] ' C F 3 C 0 2 ’ G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 H C O 3 ' / C H 3 C H 2 0 H O H - / C H 3 O H 6 4 7 6 4 7 6 4 7 6 4 7 1 5 3 , 4 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ' ; 2 5 5 4 3 1 1 0 0 0 " ; 3 9 1 , 1 0 0 , - R C O O H ; 4 0 9 , 1 0 , — R ' C H = C = O 1 5 3 , 5 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ' ; 2 5 5 , 4 1 , R C O O ' ; 3 9 1 , 1 0 0 , - — R C O O H ; 4 0 9 , 2 1 , - R ' C H = C = O 1 5 3 , 7 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ' ; 2 5 5 , 4 4 , R C O O ' ; 3 9 1 , 1 0 0 , - R C O O H ; 4 0 9 , 2 3 , - R ' C H = C = O 1 5 3 , 6 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ' ; 2 5 5 , 4 2 , R C O O ' ; 3 9 1 , 1 0 0 , — R C O O H ; 4 0 9 , 2 3 , - R ' C H = C = O 1 5 3 , 2 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ' ; 2 5 5 , 3 0 , R C O O ' ; 3 9 1 , 1 0 0 , - R C O O H ; 4 0 9 , 1 5 , — R ' C H = C = O 1 5 3 , 8 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ‘ ; 2 5 5 3 9 3 0 0 0 3 3 9 1 , 1 0 0 , — R C O O H ; 4 0 9 , 2 6 , — R ' C H = C = O 1 5 3 , 2 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ‘ ; 2 5 5 , 3 6 , R 1 C O O ' ; 2 8 1 , 1 2 , R 2 C O O ' ; 3 9 1 , 1 0 0 , — c h 0 0 1 1 ; 4 0 9 , 1 8 , - R 2 ' C H = C = O ; 4 1 7 , 4 4 , — R 1 C O O H ; 4 3 5 , 1 , — R 1 ' C H = C = O ) D — ( 3 3 4 3 4 7 7 0 0 0 6 6 7 7 7 H H O O 3 3 - / 2 H ' 0 - 4 H H - C C 4 3 C O O / / 0 3 O 3 P 3 . “ 1 C F 2 H H H 2 1 H C C O O [ H / 0 1 6 o h l C - 1 1 : P 3 8 G d 1 1 6 1 ( T a b l e 4 . 2 c o n t i n u e d ) 6 7 3 1 5 3 , 3 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ' ; 2 5 5 , 4 2 , R 1 C O O ' ; 2 8 1 , 1 3 , R 2 C O O ‘ ; 3 9 1 , 1 0 0 , - R 2 C O O H ; ' 4 0 9 , 3 0 , - R 2 ' C H = C = O ; 4 1 7 , 3 8 , - R 1 C O O H ; 4 3 5 , 2 , - R 1 ' C H = C = O 1 5 3 , 2 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ' ; 2 5 5 , 4 1 , R 1 C O O ' ; 2 8 1 , 1 2 , R 2 C O O ' ; 3 9 1 , 1 0 0 , - R 2 C O O H ; 4 0 9 , 2 6 , - R 2 ' C H = C = O ; 4 1 7 , 2 9 , — R 1 C O O H ; 4 3 5 , 2 , - R 1 ' C H = C = O 1 5 3 , 6 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ’ ; 2 5 5 , 3 6 , R 1 C O O ' ; 2 8 1 , 1 4 , R 2 C O O ' ; 3 9 1 , 1 0 0 , — R 2 C O O H ; 4 0 9 , 2 9 , — R 2 ’ C H = C = O ; 4 1 7 , 4 2 , — R 1 C O O H ; 4 3 5 , 5 , — R 1 ' C H = C = O 2 8 1 , 1 0 , R 2 C O O - ; 2 8 4 , 5 , d 2 9 - R 2 C O O - ; 2 8 5 , 5 8 , d 3 0 - R 1 C O O ' ; 2 8 6 , 3 7 , d 3 1 - R 1 C O O - ; 4 1 7 , 2 6 , - d 3 1 - R 1 C O O H ; 4 2 0 , 7 , — d 1 - R 2 C O O H ; 4 2 1 , 1 0 0 , - R 2 C O O H ; 4 2 2 , 9 6 , - R 2 C O O H ; 4 4 0 , 2 0 , - R 2 ' C H = C = O 2 8 1 , 7 , R 2 C O O ' ; 2 8 4 , 7 , d 2 9 - R 2 C O O ' ; 2 8 5 , 3 5 , d 3 0 - R 1 C O O ' ; 4 1 7 , 1 1 , — d 3 1 - R 1 C O O H ; 4 2 0 , 3 7 , — d 1 - R 2 C O O H ; 4 2 1 , 1 0 0 , — R 2 C O O H ; 4 3 9 , 2 7 , — R 2 ' C H = C = O 2 8 1 , 1 5 , R 2 C O O - ; 2 8 2 , 7 , R 2 C 0 0 - ; 2 8 4 , 1 l , d 2 9 - R 2 C O O - ; 2 8 5 , 4 4 , d 3 0 - R 1 C O O - ; 2 8 6 , 4 2 , d 3 1 - R 1 C O O ' ; 4 1 7 , 3 5 , — d 3 1 - R 1 C O O H ; 4 1 8 , 1 4 , * d 3 2 - R 1 C O O H ; 4 2 0 , 1 5 , - d 1 - R 2 C O O H ; 4 2 1 , 8 8 , - d 1 - R 2 C O O H ; 4 2 2 , 1 0 0 , - R 2 C O O H ; 4 3 9 , 1 2 , - d 1 - R 2 ' C H = C = O ; 4 4 0 , 4 4 , - R 2 ' C H = C = O ; H O ; ) 2 H C 2 H C O 4 C O R - 1 d — , 3 5 , P H + H O O C 2 , 1 R O 6 , 2 = 4 C ; = ‘ H O C O ' C R R - - 0 1 3 3 d d , - ( 7 - 1 4 , 1 ; 1 , ) 1 2 9 H 3 C ; 2 ' H O C ; O 4 2 , ) 5 6 2 C O 2 2 , P 6 , 8 1 4 2 4 R H 2 , C H H 2 + , O 2 C H 2 ; 1 = ' 8 ; C C H O H O O C O R - C 2 C 4 = ; - H 4 O C O P O P ' H O 2 + 0 R H 3 R — - C H d , 5 3 , , , R - O 0 0 , C 0 0 4 , 1 1 1 , 2 , , 1 O ( 5 2 8 2 5 , R 9 7 5 ( 0 4 2 2 4 4 - 6 9 8 0 4 1 7 7 6 7 H H 0 O 3 3 H H C C — ) 4 / / 0 ‘ ‘ P d e u n ' 2 0 C 3 H H F 2 i O C O H ' t ] n ) o c 2 . 4 o / 0 0 : : 9 8 + A 1 : o 8 6 1 6 ( e h 1 1 l - - C b 1 1 — A a 3 3 P + T G d d m ( h / C 0 : P 6 G 1 1 6 2 7 0 9 2 8 5 , 1 7 , d 3 0 - R C O O ' ; 2 8 6 , 3 5 , d 3 1 - R C O O ' ; 4 2 1 , 5 2 , — d 3 0 - R C O O H ; 4 2 2 , 1 0 0 , - d 3 1 - R C O O H ; 4 4 1 , 1 1 , — d 3 0 - R ' C H = C = O d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 6 4 8 1 5 3 , 1 1 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ' , 1 5 4 , 3 , d l - P O 4 ( C H 2 ) 2 ‘ ; 2 5 5 , 3 2 , R C O O ' ; 2 5 6 , 2 1 , d 1 - R C O O ' ; 3 9 1 , 1 0 0 , - R C O O H ; 3 9 2 , 6 5 , - d 1 - R C O O H ; 4 0 9 , 7 , - d 1 - R ' C H = C = O ; 4 1 0 , 4 5 , — R ' C H = C = O 1 5 3 , 1 3 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ' ; 1 5 4 , 6 , d l - P O 4 ( C H 2 ) 2 ‘ ; 2 5 5 , 4 2 , R C O O ‘ ; 2 5 6 , 3 4 , d 1 - R C O O ' ; 3 9 1 , 1 0 0 , - R C O O H ; 3 9 2 , 7 8 , — d 1 - R C O O H ; 4 0 9 , 1 1 , - d 1 - R ' C H = C = O ; 4 1 0 , 5 6 , — R ' C H = C = O [ M + A - 5 9 l ' G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 H 2 P O 4 - 2 5 5 , 4 , R C O O ' ; 3 9 1 , 1 6 , - ( R C O O H + H P O 4 C H 2 C H 2 ) ; 4 0 9 , 2 , — ( R ' C H = C = O + H P O 4 C H 2 C H 2 ) ; 6 4 7 , 1 0 0 , - H P O 4 C H 2 C H 2 ; 7 1 1 , 1 2 , ? H 2 P O 4 - 7 9 7 ; 2 H C 2 H ; C ) 4 2 O H P C H 2 - H , C 0 4 0 1 O , - 1 3 d 6 ( P 9 - , H 0 , 3 , 7 3 , 0 7 + H ; 4 O ) 4 5 — , 0 0 ' O 1 O 1 , O 2 4 C H ; ; ) - 2 R C - 2 3 6 3 C 1 R , O ? ; 0 1 H O 3 ' 0 H , C C ; 2 C O d 4 2 ) , 1 , 2 O 8 ( O 2 5 R C H 6 P ' , R C 7 H 5 H 2 1 , 4 ; C , , ) 2 ; O 1 O 5 + 8 ; 1 H 2 2 ? 2 P , = 8 , H C H 2 H C 2 2 5 C 4 C + = 4 ; 2 O 2 H D - H P ; H C O 5 2 O ' ; C ' H C O ? , 0 4 , 5 2 1 O O + 4 C C O 4 R , ) O e 6 O _ 1 O C 2 , R R 3 = P 0 P R - H - 3 C 6 H ( l c n a 1 1 = — + d d 3 3 H n - ; ( d d ? H u , , 0 C — ? b , , , O 1 ' 0 3 5 , , 5 a O 1 1 2 1 2 1 , , , , , , , w 6 6 C R 2 0 3 4 5 o 8 8 2 0 7 l 2 4 1 ( 2 R 4 - 2 4 7 7 1 ( 8 9 9 9 9 0 2 8 1 1 1 1 5 4 4 4 4 4 - - 4 C 0 4 3 1 O 2 P 1 . 2 / ‘ 1 1 1 H 0 H O 3 H / / 0 0 h : 0 0 2 1 C 6 o o 6 P 6 1 h / 1 h 1 C C - 1 - 1 G 0 1 : - : P P 3 8 4 6 1 : 3 8 G d d G d 1 1 1 1 6 3 ( T a b l e 4 . 2 c o n t i n u e d ) G P C h o 1 . 1 2 1 9 0 4 - d 3 1 - l 6 z 0 / d 3 1 - 1 6 : 0 8 3 3 [ M + A — ( A H + N ( C H 3 ) 3 + 1 6 : 0 C O O H ) ] - 7 7 5 2 5 5 , 3 , R C O O ’ ; 3 9 1 , 1 8 , - ( R C O O H + H P O 4 C D 2 C D 2 ) ; 4 0 9 , 2 , - ( R ' C H = C = O + H P O 4 C D 2 C D 2 ) ; 6 4 7 , 1 0 0 , - ( H P O 4 C D 2 C D 2 ) ; 7 1 5 , 5 , ? G P C h o H C O 3 - / l : l : 6 0 / 6 0 C H 3 O H C F 3 C 0 2 - 1 2 5 , 3 7 , ? ; 1 6 3 , 9 , ? ; 1 7 9 , 4 , ? ; 2 5 5 , 5 0 , R C O O ' ; 3 6 3 , 1 0 0 , - 5 6 G P C h o O H - / 1 6 : 0 / 1 8 : 1 C H 3 O H H C O 3 - l C H 3 O H C F 3 C 0 2 ' 4 1 9 1 2 5 , 3 7 , ? ; 1 6 3 , 8 , ? ; 1 7 9 , 4 , ? ; 2 5 5 , 5 0 , R 1 C O O " ; 3 6 3 , 1 0 0 , - 5 6 1 2 5 , 2 1 , ? ; 1 6 3 , 6 , ? ; 1 7 9 , 4 , ? ; 2 5 5 , 3 8 , R 1 C O O ' ; 3 6 3 , 1 0 0 , - 5 6 1 2 5 , 9 , ? ; 1 2 6 , 8 , ? ; 1 6 3 , 6 , ? ; 2 2 4 , 4 , ? ; 2 8 6 , 7 8 , d 3 1 - R 1 C O O ‘ ; 3 9 4 , 1 0 0 , — 5 6 6 5 — , 0 0 1 , 7 6 3 ; ' O ' - O O O C O O C C R , 3 3 ‘ O O C 2 R - 1 d , 0 0 1 , 6 Z 2 3 R R , , , 5 0 5 0 2 1 , ; 1 0 0 1 , l ? 8 8 8 - 4 d , 9 2 2 2 ; ; ; ’ ' - 2 2 2 , ) ) ) 7 2 2 2 6 1 ; ? - H H C C ( ( 4 4 O O 4 P P d , , H C ( 4 O P , , 4 4 , 9 0 7 2 3 1 1 , , , 3 3 3 2 5 5 1 1 1 5 1 - ” - H ] ) 1 1 O O 3 C 2 7 7 1 1 2 1 1 9 9 2 0 0 R 4 4 4 3 3 4 C 0 H R 1 O 3 + 3 ) : 6 1 + 3 H ) C 4 3 - ' - - 3 - ) H 0 4 4 4 4 H / C 3 d O O O O C e ‘ u 1 ( 1 2 P P P ( P n . 1 + N 1 2 2 2 N 2 0 1 H + H H H i t n H A o + c o 8 H A + 8 2 h 2 2 0 / 0 / 1 1 : : 0 0 : : . C ( 6 6 2 ( : 8 8 4 o o o o o P 1 1 — 1 — 1 6 6 e A G A / h h h / h h / / 1 1 - + 1 1 + C C C C C 0 0 0 0 1 1 - - : : : : : : 4 6 6 8 6 6 M P P M P P P 3 3 8 d G G d G G d G 1 1 1 1 1 1 [ [ l b a T ( 1 6 4 C F 3 C 0 2 " 4 2 3 1 2 9 , 4 4 , d 4 - ? ; 1 6 7 , 1 2 , d 4 - ? ; 2 5 5 , 3 1 , R C O O ' ; 3 6 7 , 1 0 0 , - 5 6 9 7 , < 1 , H 2 P O 4 ' ; 1 5 3 , 2 8 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ' ; 2 5 5 , 1 0 0 , R C O O ’ 1 5 3 , 3 0 , P O 4 ( C H 2 ) 2 ' ; 2 5 5 , 1 0 0 , R I C O O ' W h e n e t h a n o l w a s e m p l o y e d i n t h e l i p i d c o n t a i n i n g s o l u t i o n s , t h e [ M + A ] ‘ a d d u c t i o n s fi o m G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 a n d G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 i n t h e p r e s e n c e o f a m m o n i u m h y d r o x i d e o r a r r u n o n i u m b i c a r b o n a t e w e r e o b s e r v e d a t m / z v a l u e s 1 4 D a h i g h e r , i . e . , a n a d d u c t m a s s o f 8 9 D a , c o m p a r e d t o 7 5 D a w h e n m e t h a n o l w a s u s e d , i n d i c a t i n g t h a t t h e a l c o h o l w a s i n v o l v e d i n f o r m a t i o n o f t h e a d d u c t . T h u s , t h e + 7 5 a n d + 8 9 D a a d d u c t i o n s o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f a m m o n i u m h y d r o x i d e o r a m m o n i u m b i c a r b o n a t e a r e p r o p o s e d t o b e f o r m e d b y t h e p r o c e s s s h o w n i n S c h e m e 4 . 1 , i n v o l v i n g r e a c t i o n o f t h e h y d r o x i d e a n i o n w i t h a t m o s p h e r i c C 0 2 t o i n i t i a l l y f o r m t h e b i c a r b o n a t e a n i o n , f o l l o w e d b y r e a c t i o n w i t h m e t h a n o l o r e t h a n o l i n t h e s o l v e n t t o y i e l d a m e t h y l c a r b o n a t e ( 7 5 D a ) o r e t h y l c a r b o n a t e ( 8 9 D a ) a n i o n , r e s p e c t i v e l y . _ _ C H 3 O H C " ) _ H O + C 0 2 — * H o — c - o — — > H 3 C - O — C - O S c h e m e 4 . 1 F o r r n a t i o n o f m e t h y l c a r b o n a t e a n i o n 4 . 3 . 3 C I D M S 3 e x p e r i m e n t s t o p r o b e t h e s t r u c t u r e o f t h e p r o d u c t i o n s f o r m e d b y n e u t r a l l o s s o f ( A + 1 5 ) f r o m t h e a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o M S 3 o f a l l t h e p r o d u c t i o n s f o r m e d b y t h e l o s s o f ( A + l 5 ) f r o m e a c h o f t h e a n i o n i c a d d u c t s w e r e f o u n d t o y i e l d i d e n t i c a l p r o d u c t i o n s p e c t r a , i n d i c a t i n g t h e f o r m a t i o n o f a c o m m o n p r o d u c t i o n i n e a c h c a s e . P r e v i o u s s t u d i e s h a v e p r o p o s e d t h a t t h e l o s s o f ( A + 1 5 ) f r o m t h e a c e t a t e , f o r m a t e o r c h l o r i d e a d d u c t s o f G P C h o o c c u r s v i a m e t h y l g r o u p t r a n s f e r fi o m t h e q u a t e r n a r y a l k y a m m o n i u m i o n o n t h e p h o s p h a t i d y l c h o l i n e h e a d g r o u p o f t h e G P C h o l i p i d t o t h e a n i o n , r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f a n N , N - d i m e t h y l - 1 6 5 5 ’ p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e l i p i d s p e c i e s [ 1 1 0 , 1 1 6 , ] 1 7 , 1 3 5 , 2 1 1 , 2 3 8 , 2 4 1 - 2 4 4 ] ( S c h e m e 4 . 2 ) . T o c o n fi r m t h i s h e r e , t h e M S 3 s p e c t r a o f t h e — ( A + 1 5 ) n e u t r a l l o s s p r o d u c t i o n o b t a i n e d b y M S / M S o f t h e G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 a c e t a t e a n i o n i c a d d u c t ( F i g u r e 4 . 2 A ) w a s c o m p a r e d w i t h t h e M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f a n a u t h e n t i c N , N - d i m e t h y l - p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e 1 6 : 0 / 1 6 : 0 l i p i d i o n p r e p a r e d i n s o l u t i o n a n d i n t r o d u c e d t o t h e m a s s s p e c t r o m e t e r b y n E S I ( F i g u r e 4 . 2 B ) . I t c a n b e s e e n f r o m F i g u r e 4 . 2 t h a t t h e p r o d u c t i o n s p e c t r a a r e i d e n t i c a l , i n d i c a t i n g t h a t t h e l o s s o f ( A + 1 5 ) d o e s c o r r e s p o n d t o f o r m a t i o n o f a n [ M + A - ( A + C H 3 ) ] ' p r o d u c t i o n a s a r e s u l t o f m e t h y l g r o u p t r a n s f e r f r o m t h e p h o s p h o c h o l i n e h e a d g r o u p t o t h e a n i o n . 1 6 6 R C O O — 1 0 0 : A 2 5 5 7 9 2 8 0 - 7 1 8 6 0 - A 4 2 3 4 0 : — R C O O H — ( R ' C H = C = O ) 8 2 0 - 4 6 2 4 8 0 7 1 8 § - \ 1 i ' U - f g 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 < 1 : 1 0 0 _ B R C O O ' . E - 2 5 5 7 1 8 . « s 8 0 - I § . 1 6 0 + 4 0 : — R C O O H — ( R ' C H = C = O ) 2 0 . 4 6 2 4 8 0 7 1 8 r \ l l 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 m / z F i g u r e 4 . 2 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e ( A ) C I D M S 3 p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e m / z 7 l 8 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( A + C H 3 ) f r o m t h e a c e t a t e a d d u c t o f G P C h o 1 6 2 0 / 1 6 : 0 i n F i g u r e 4 . 1 A . ( B ) C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e [ M - H ] ' p r e c u r s o r i o n o f N , N - d i m e t h y l p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e 1 6 : 0 / 1 6 : 0 . A . A . r i m 0 0 N < C H 3 / l l \ M S I M S H 3 C \ / C H 3 - / U \ _ ( ' ; C H 3 0 R 2 — — — > N / O 0 R 2 1 1 0 T O O 0 S c h e m e 4 . 2 P r o p o s e d M S / M S f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y o f [ G P C h o + A ] ’ t o l o s e ( A + C H 3 ) 1 6 7 T h e m a j o r p r o d u c t i o n ( m / z 2 5 5 ) o b s e r v e d i n F i g u r e 4 . 2 c o r r e s p o n d s t o t h e f o r m a t i o n o f R C O O ' , b y d i s s o c i a t i o n o f o n e o f t h e t w o e s t e r l i n k a g e s o f t h e f a t t y a c i d c h a i n s w i t h i n t h e 1 6 : 0 / 1 6 : 0 p h o s p h o l i p i d i o n . A p r o d u c t i o n c o r r e s p o n d i n g t o t h e l o s s o f t h e n e u t r a l f a t t y a c i d c h a i n ( - R C O O H , m / z 4 6 2 ) w a s a l s o o b s e r v e d a t l o w a b u n d a n c e . T h e R g r o u p i s u s e d h e r e t o i n d i c a t e t h e f a t t y a c i d c h a i n w i t h o u t s p e c i f y i n g i t s o r i g i n fi o m e i t h e r t h e s n - 1 o r s n - 2 p o s i t i o n o f t h e g l y c e r o l b a c k b o n e , i . e . , t h e R C O O ' m / z 2 5 5 p r o d u c t i o n i n F i g u r e 4 . 2 r e p r e s e n t s C 1 5 H 3 1 C O O ' . F o r t h e 1 6 : 0 / 1 8 : 1 p h o s p h o l i p i d s , t h e o r i g i n o f t h e f a t t y a c i d c h a i n i s s p e c i fi e d b y a s u b s c r i p t n o t a t i o n , i . e . , R 1 C O O ' r e p r e s e n t s a f a t t y a c i d p r o d u c t i o n f o r m e d b y d i s s o c i a t i o n a t t h e s n - 1 p o s i t i o n o f t h e g l y c e r o l b a c k b o n e . A p o t e n t i a l m e c h a n i s m f o r f o r m a t i o n o f t h e R C O O ‘ a n d — ( R C O O H ) p r o d u c t i o n s , v i a a ‘ c h a r g e - d i r e c t e d ’ n e i g h b o r i n g g r o u p p a r t i c i p a t i o n r e a c t i o n m e c h a n i s m i n v o l v i n g n u c l e o p h i l i c a t t a c k f r o m t h e p h o s p h a t e o x y g e n a n i o n a t a n e l e c t r o p h i l i c c a r b o n a d j a c e n t t o t h e f a t t y a c i d e s t e r l i n k a g e o n t h e g l y c e r o l b a c k b o n e , r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f a n i n i t i a l i o n - n e u t r a l c o m p l e x , i s s h o w n i n S c h e m e 4 . 3 A [ 1 1 7 , 1 8 9 , 1 9 0 , 1 9 8 , 2 0 4 , 2 4 7 , 2 4 9 , 2 5 4 ] . S i m p l e d i s s o c i a t i o n o f t h i s i o n - n e u t r a l c o m p l e x w o u l d r e s u l t i n f o r m a t i o n o f t h e R C O O ’ p r o d u c t i o n , a n d l o s s o f a n R C O O H n e u t r a l w o u l d b e o b s e r v e d i f i n t e r m o l e c u l a r p r o t o n t r a n s f e r w i t h i n t h e c o m p l e x o c c u r s p r i o r t o i t s s e p a r a t i o n ( n o t e t h a t o n l y o n e o f t h e p o s s i b l e p a t h w a y s f o r p r o t o n t r a n s f e r i s s h o w n ) . T h e r e l a t i v e a b u n d a n c e s o f t h e t w o p r o d u c t i o n s w o u l d t h e r e f o r e b e e x p e c t e d t o b e d e p e n d e n t o n t h e l i f e t i m e o f t h e i o n - n e u t r a l c o m p l e x , a n d t h e r e l a t i v e g a s - p h a s e a c i d i t i e s o f t h e t w o n e u t r a l s p e c i e s t h a t m a y b e f o r m e d . N o t e t h a t o n l y t h e p a t h w a y f o r t h e e l i m i n a t i o n o f t h e s n - 2 f a t t y a c i d c h a i n , v i a a S - m e m b e r e d t r a n s i t i o n s t a t e i s s h o w n i n S c h e m e 4 . 3 . 1 6 8 F r a g m e n t a t i o n o f t h e s n - 1 f a t t y a c i d c h a i n w o u l d p r o c e e d v i a a s i m i l a r m e c h a n i s m , i n v o l v i n g a 6 - m e m b e r e d t r a n s i t i o n s t a t e . A ‘ c h a r g e - r e m o t e ’ m e c h a n i s m i n v o l v i n g a c i s - 1 , 4 e l i m i n a t i o n p a t h w a y h a s a l s o b e e n p r o p o s e d p r e v i o u s l y f o r f o r m a t i o n o f t h e - ( R C O O H ) p r o d u c t i o n s f r o m t h e d i s s o c i a t i o n o f d e p r o t o n a t e d p h o s p h o l i p i d s ( S c h e m e 4 . 3 B ) [ 1 9 0 ] . A n a l t e r n a t i v e m e c h a n i s m i n v o l v i n g t h e f o r m a t i o n o f a n i o n - n e u t r a l c o m p l e x f o l l o w i n g a ‘ c h a r g e - d i r e c t e d ’ E 2 e l i m i n a t i o n r e a c t i o n c o u l d a l s o b e u s e d t o e x p l a i n t h e f o r m a t i o n o f t h e s e p r o d u c t i o n s ( S c h e m e 4 . 3 C ) . I t i s n o t p o s s i b l e f r o m t h e s t u d i e s p e r f o r m e d h e r e t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e n e i g h b o r i n g g r o u p p a r t i c i p a t i o n a n d E 2 e l i m i n a t i o n r e a c t i o n p a t h w a y s , a s t h e p r o d u c t i o n s t r u c t u r e s i n e a c h c a s e w o u l d b e i d e n t i c a l . I t h a s b e e n n o t e d t h a t a p o s s i b l e w a y o f r e s o l v i n g t h i s i s s u e w o u l d b e t o e x a m i n e t h e fi ' a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f a m u l t i p l y c h a r g e d p r e c u r s o r i o n o f t h e G P C h o a d d u c t , t h a t c o n t a i n s a n i n e r t c h a r g e o n t h e n e u t r a l s p e c i e s l o s t f r o m t h e s i n g l y c h a r g e d G P C h o a d d u c t , r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f s t r u c t u r a l l y d i s t i n c t p r o d u c t i o n s a m e n a b l e t o f u r t h e r a n a l y s i s [ 2 5 5 ] . T h e p r e s e n c e o f t h e c i s - l , 4 e l i m i n a t i o n p a t h w a y c o u l d p o t e n t i a l l y b e d e t e r m i n e d v i a d e u t e r i u m l a b e l i n g o f t h e g l y c e r o l b a c k b o n e . T h e p r o d u c t i o n o b s e r v e d a t m / z 4 8 0 i n F i g u r e 4 . 2 c o r r e s p o n d s t o l o s s o f o n e o f t h e 1 6 : 0 f a t t y a c i d c h a i n s a s a n e u t r a l k e t e n e C 1 4 H 2 9 C H C O ( l a b e l e d a s - ( R ' C H = C = O ) ) . N o t e t h a t t h e R ( o r R 1 o r R 2 f o r s n - I a n d s n - 2 s p e c i fi c f a t t y a c i d c h a i n l i n k a g e s ) g r o u p i s u s e d h e r e t o i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f t h e a l k y l c h a i n . F o r m a t i o n o f t h i s k e t e n e n e u t r a l - l o s s p r o d u c t i o n m a y p o t e n t i a l l y o c c u r v i a a ‘ c h a r g e - d i r e c t e d ’ E 2 e l i m i n a t i o n r e a c t i o n , i n i t i a t e d b y n u c l e o p h i l i c a t t a c k f r o m t h e p h o s p h a t e o x y g e n a n i o n t o o n e o f t h e 0 1 - h y d r o g e n s a d j a c e n t t o t h e c a r b o x y l g r o u p o n t h e f a t t y a c i d c h a i n s ( S c h e m e 4 . 4 A ) , o r b y a ‘ c h a r g e - r e m o t e ’ 4 - m e m b e r e d c i s - l , 2 e l i m i n a t i o n r e a c t i o n m e c h a n i s m ( S c h e m e 4 . 4 B ) 1 6 9 [ 1 8 9 , 1 9 3 , 2 4 6 - 2 4 8 ] . H o w e v e r , i t i s d i f fi c u l t t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e s e m e c h a n i s t i c p o s s i b i l i t i e s , f o r e x a m p l e b y t h e u s e o f d e u t e r i u m i s o t o p e l a b e l i n g o r f u r t h e r M S n d i s s o c i a t i o n , d u e t o t h e l i k e l i h o o d o f i n t r a m o l e c u l a r p r o t o n t r a n s f e r o c c u r r i n g w i t h i n t h e r e s u l t a n t p r o d u c t i o n s . 0 H 3 C N C H 3 0 — a n d I I ( A ) O N e i g h b o r i n g G r o u p 0 r o _ O R / + H 3 C \ N . C H 3 ? M S 3 H 3 C \ , C H 3 - 0 t h H t r a n s f e r l \ / O - P R fi / R i l l / O _ _ . N K / 9 8 0 R 1 0 P \ O ) \ / O R 1 H + t r a n s f e r \ j 0 ( B ) _ _ C i r - 1 , 2 E l i m i n a t i o n R 2 H 3 C \ N ’ C H B S ? / K O M S 3 H 3 C \ / C l ' l 3 L O — P ‘ J ( v N O i ° r " ‘ ‘ 0 O ( C ) E 2 E l i m i n a t i o n F O 1 + O _ H t r a n s f e r H 3 C - N / C H 3 9 ) k R M S H 3 C \ N , C H 3 0 o i a z 2 — > K / O ’ P ‘ o ‘ o R K / O J ' 4 0 o R O \ [ J / i / T 1 D H W \ [ 1 / 1 H + t r a n s f e r V “ O _ _ O _ H \ , C H r F L 3 t _ a n 0 . . 1 3 ‘ O O 0 R 2 0 1 1 W T R 1 0 S c h e m e 4 . 3 P r o p o s e d M S 3 f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s o f [ G P C h o + A — ( A + C H 3 ) ] ' t o f o r m R C O O ’ o r n e u t r a l R C O O H 1 7 0 ( A ) E 2 E l i m i n a t i o n H . H C C H L / H 3 C \ N / C C i \ / O — — ] i \ O \ / K / O R 1 0 T _ _ _ / a n d O — C — C \ ( B ) C i s - l , 2 E l i m i n a t i o n H 3 C \ / C H 3 _ N L , 0 O H H 3 C \ N , C ( H H K / o — l l \ 0 \ ) \ / O R 1 | \ : 3 O J 0 \ fl / 0 " \ O \ ) \ / l i l o O \ " / R 1 a n d O = C = C < O H R 2 ' 0 S c h e m e 4 . 4 P r o p o s e d M S 3 f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s o f [ G P C h o + A - ( A + C H 3 ) ] ' t o f o r m k e t e n e n e u t r a l l o s s 4 . 3 . 4 D e u t e r i u m i s o t o p e l a b e l i n g a n d C I D M S 3 e x p e r i m e n t s t o p r o b e t h e s t r u c t u r e o f t h e p r o d u c t i o n s f o r m e d b y n e u t r a l l o s s o f ( A + 6 0 ) f r o m t h e a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o I n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e s t r u c t u r e o f t h e p r o d u c t i o n f o r m e d b y l o s s o f ( A + 6 0 ) f r o m t h e a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 , t h e C I D M S / M S f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f a d 4 - l a b e l e d d e r i v a t i v e o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 , w h e r e t h e d e u t e r i u m l a b e l s a r e i n c o r p o r a t e d i n t o t h e C H Z C H Z p o s i t i o n s o f t h e p h o s p h o c h o l i n e h e a d g r o u p , w a s e x a m i n e d . F r o m t h e p r o d u c t i o n s p e c t r u m o b t a i n e d b y C I D M S / M S o f t h e m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t o f d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( m / z 8 1 2 , F i g u r e 4 . 3 A ) f o r m e d b y 1 7 1 a d d i t i o n o f 1 0 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e t o t h e l i p i d c o n t a i n i n g s o l u t i o n o f C H 3 O H / C H C 1 3 , t h e l o s s o f ( A + 6 1 ) w a s o b s e r v e d a t r r r / z 6 7 6 , i n c o n t r a s t t o t h e l o s s o f ( A + 6 0 ) o b s e r v e d a t m / z 6 7 3 f o r t h e G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 i o n i n F i g u r e 4 . 1 B , i n d i c a t i n g t h a t o n e o f t h e d e u t e r i u m l a b e l s i n t h e p h o s p h o c h o l i n e h e a d g r o u p o f t h e d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 l i p i d w a s l o s t f r o m t h e r e s u l t a n t p r o d u c t i o n d u r i n g t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n . B a s e d o n t h i s , a m e c h a n i s m f o r f o r m a t i o n o f t h e [ M + A — ( A H + ( C H 3 ) 3 N ) ] ' v i n y l p h o s p h a t i d i c a c i d p r o d u c t i o n , b y d e p r o t o n a t i o n o f t h e m e t h y l e n e g r o u p a d j a c e n t t o t h e p h o s p h a t e v i a a n E 2 e l i m i n a t i o n r e a c t i o n i n i t i a t e d b y t h e a n i o n , i s p r o p o s e d i n S c h e m e 4 . 5 . 1 7 2 — ( A D + ( C H 3 ) 3 N ) - A H A 6 7 6 7 3 6 1 0 0 d 4 — ( A H + C H 3 ) 8 0 2 8 1 7 - 7 2 1 6 0 * ( A - l - C l ‘ l 3 ) 4 0 — ( A + ( C H 3 ) 3 N C D C D 2 ) 7 2 2 — ( ( C H 3 ) 2 N A 6 4 8 8 1 2 2 0 + R C O O C H 3 ) 4 2 3 I I ‘ 4 . l V 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 — ( A H + ( C H 3 ) 3 N ) 7 3 5 ; § Q H + C H 3 ) § 1 B T ; 0 0 ( 1 6 2 8 7 0 — ( A D + ( C H 3 ) 3 N ) 7 3 4 — A D 8 8 0 g / 7 9 3 ( ( 1 ‘ ( A + ( C H 3 ) 3 N C H C H 2 ) — A H E 6 0 7 0 9 7 9 4 4 0 . . D < 7 0 8 8 7 0 2 0 3 4 2 8 ° 1 l T “ ; 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 M c d 4 1 3 8 8 3 1 7 7 2 2 ? ‘ A H 1 0 0 1 3 _ ( A + C D 3 3 ) 7 2 8 A D 7 4 5 8 0 £ 8 2 1 - ( A D + ( C D 3 ) 3 N ) 6 7 6 7 \ 7 4 4 6 0 — ( A D + ( C D 3 ) 2 C D 2 H N ) 6 7 7 p , — ( A D + ( C D 3 ) 2 C H 2 D N ) 6 7 8 / 4 0 — ( A + ( C D 3 ) 3 N Z C D C D 2 ) 6 4 8 ’ 2 0 4 2 3 \ 4 2 0 0 3 0 0 4 0 0 ' 6 0 0 9 0 0 1 0 0 0 m / z F i g u r e 4 . 3 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r a o f t h e m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t s o f ( A ) d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( m / z 8 1 2 ) , ( B ) G P C h o d 3 1 - 1 6 : 0 / d 3 1 - 1 6 : 0 ( m / z 8 7 0 ) a n d ( C ) d 1 3 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( n r / z 8 2 1 ) . 1 7 3 i 0 C H 3 ( " 3 0 R 2 M S / M S O 0 2 2 * l O — P ~ - P \ H 3 C + ( H H - O - ( ( 3 ) 3 ) \ O A . S c h e m e 4 . 5 P r o p o s e d M S / M S f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y o f [ G P C h o + A ] ' t o l o s e ( A H + ( C H 3 ) 3 ) N ) M S 3 o f a l l t h e p r o d u c t i o n s f o r m e d b y t h e l o s s o f ( A H + ( C H 3 ) 3 N ) f r o m e a c h o f t h e a n i o n i c a d d u c t s w e r e f o u n d t o y i e l d i d e n t i c a l p r o d u c t i o n s p e c t r a , i n d i c a t i n g t h e f o r m a t i o n o f a c o m m o n p r o d u c t i o n . T o o b t a i n f u r t h e r e v i d e n c e t o s u p p o r t t h e p r o p o s e d v i n y l p h o s p h a t i d i c a c i d p r o d u c t i o n s t r u c t u r e , t h e M S 3 s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m t h e m / z 6 7 3 p r o d u c t i o n o f t h e G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t i n F i g u r e 4 . 1 B ( F i g u r e 4 . 4 A ) w a s c o m p a r e d t o t h e M S / M S f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f a s t r u c t u r a l l y r e l a t e d l i p i d a n a l o g , p h o s p h a t i d y l e t h a n o l 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( m / z 6 7 5 ) ( F i g u r e 4 . 4 B ) . T h e d i f f e r e n c e o f o n e d o u b l e b o n d i n t h e h e a d g r o u p d i d n o t a f f e c t t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o b s e r v e d f o r t h e s e s t r u c t u r a l l y a n a l o g o u s i o n s . I n d e e d , a s i d e f r o m a 2 - D a m a s s s h i f t o b s e r v e d b e t w e e n t h e p r o d u c t i o n s c o n t a i n i n g t h e h e a d g r o u p , t h e s a m e f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s a n d e s s e n t i a l l y i d e n t i c a l p r o d u c t i o n a b u n d a n c e s w e r e o b s e r v e d f o r b o t h s p e c t r a , c o n s i s t e n t w i t h t h e p r o p o s e d p r o d u c t i o n s t r u c t u r e . F u r t h e r m o r e , t h e p r o d u c t i o n s o b s e r v e d i n F i g u r e 4 . 4 c o r r e s p o n d t o t h e s a m e f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s , a n d s i m i l a r p r o d u c t i o n a b u n d a n c e s , t o t h o s e o b s e r v e d i n F i g u r e 4 . 2 , i n d i c a t i n g t h a t n e i t h e r o f t h e h e a d g r o u p s o f t h e p r o p o s e d 1 7 4 - — ( A + C H 3 ) a n d - ( A H + ( C H 3 ) 3 N ) n e u t r a l l o s s p r o d u c t i o n s t r u c t u r e s a r e i n v o l v e d i n t h e i r 3 . . s u b s e q u e n t M S f r a g r n e n t a t r o n r e a c t i o n s . R C O O ‘ 1 0 0 ' A 2 5 5 8 0 _ 8 0 8 4 6 7 3 6 0 ‘ § 4 0 : — R C O O H ‘ 0 ’ 4 1 7 — ( R ' C H = C = O ) 6 7 3 0 2 0 ' t 4 3 5 1 g 7 \ fi 1 ' V g 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 ' 2 R C O O ‘ g 1 0 0 7 B 2 5 5 . . . 1 E 8 0 - 1 £ 6 7 5 a , - M 6 0 “ 3 4 0 : " R C O O H _ ( R 1 C H = C = O ) 2 0 _ 4 1 9 4 3 7 6 7 5 4 \ 1 1 1 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 m / 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 2 F i g u r e 4 . 4 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e ( A ) C I D M S 3 p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e m / z 6 7 3 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( A H + ( C H 3 ) 3 N ) f r o m t h e m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 i n F i g u r e 4 . 1 B . ( B ) C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e [ M — H ] ' p r e c u r s o r i o n o f p h o s p h a t i d y l e t h a n o l 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( m / z 6 7 5 ) . 1 7 5 I » ! 1 > 4 . 3 . 5 D e u t e r i u m i s o t o p e l a b e l i n g a n d C I D M S 3 e x p e r i m e n t s t o p r o b e t h e s t r u c t u r e o f t h e p r o d u c t i o n s f o r m e d b y n e u t r a l l o s s o f ( A + 8 6 ) f r o m t h e a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o T o e l u c i d a t e t h e s t r u c t u r e o f t h e m / z 6 4 7 p r o d u c t i o n s f o r m e d b y n e u t r a l l o s s o f ( A + 8 6 ) f r o m t h e [ M + A ] ' a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 , t h e C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m t h e d 4 - G P C h o l 6 : O / 1 6 : O m e t h y l c a r b o n a t e l i p i d a d d u c t w a s e x a m i n e d ( F i g u r e 4 . 3 ) . I t c a n b e s e e n f r o m F i g u r e 4 . 3 A t h a t a p r o d u c t i o n c o r r e s p o n d i n g t o t h e l o s s o f ( A + 8 9 ) a t m / z 6 4 8 w a s f o r m e d , i n c o n t r a s t t o t h e l o s s o f ( A + 8 6 ) o b s e r v e d a t m / z 6 4 7 f o r t h e G P C h o l 6 : 0 / 1 6 : 0 i o n i n F i g u r e 4 . 1 3 , i n d i c a t i n g t h a t t h r e e d e u t e r i u m s w e r e l o s t a s p a r t o f t h e n e u t r a l s p e c i e s u p o n d i s s o c i a t i o n o f t h e a d d u c t . B a s e d o n t h i s b e h a v i o r , a m e c h a n i s m f o r f o r m a t i o n o f t h e [ M + A — ( A + ( C H 3 ) 3 N C H = C H 2 ) ] ' p r o d u c t i o n , v i a a c h a r g e - d i r e c t e d E 2 e l i m i n a t i o n r e a c t i o n i n i t i a t e d b y t h e d e p r o t o n a t e d p h o s p h a t e o x y g e n a n d r e s u l t i n g i n l o s s o f t h e c h o l i n e h e a d g r o u p t o y i e l d p h o s p h a t i d i c a c i d , i s p r o p o s e d i n S c h e m e 4 . 6 . o / ’ \ 3 C H H 9 “ O i R O O i I 0 R 2 M S / M S I 2 l l C - N w o l l O \ / l \ / O \ " / R l > O — F O W O T R I ' + O — ( A + ( C H ) N C H = C H ) 0 S c h e m e 4 . 6 P r o p o s e d M S / M S f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y o f [ G P C h o + A ] ' t o l o s e ( A + ( C H 3 ) 3 ) N C H = C H 3 ) 1 7 6 T h e p r o p o s e d p h o s p h a t i d i c a c i d s t r u c t u r e o f t h e [ M + A — ( A + ( C H 3 ) 3 N C H = C H 2 ) ] ' p r o d u c t i o n f r o m t h e G P C h o a n i o n i c a d d u c t s w a s f u r t h e r s u p p o r t e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t M S 3 f r a g m e n t a t i o n o f t h e 1 6 : 0 / 1 8 : 1 l i p i d — [ A + ( C H 3 ) 3 N C H = C H 2 ) ] n e u t r a l l o s s p r o d u c t i o n ( F i g u r e 4 . 5 A ) w a s e s s e n t i a l l y i d e n t i c a l t o t h e M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m t h e [ M - H ] ' i o n o f t h e a u t h e n t i c p h o s p h a t i d i c a c i d 1 6 : 0 / 1 8 : 1 l i p i d i o n p r e p a r e d i n s o l u t i o n a n d i n t r o d u c e d t o t h e m a s s s p e c t r o m e t e r b y n E S I ( F i g u r e 4 . 5 B ) . M S 3 o f a l l t h e p r o d u c t i o n s f o r m e d b y t h e l o s s o f [ A + ( C H 3 ) 3 N C H = C H 2 ) ] f r o m e a c h o f t h e a n i o n i c a d d u c t s w e r e f o u n d t o y i e l d i d e n t i c a l p r o d u c t i o n s p e c t r a , i n d i c a t i n g t h e f o r m a t i o n o f a c o m m o n p h o s p h a t i d i c a c i d p r o d u c t i o n i n e a c h c a s e . 1 7 7 ” 8 5 f 9 3 " a ) ’ 5 8 g * 1 , ) a ' 4 1 1 0 8 6 2 4 0 8 6 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 - " - - - ‘ - ] - A - 4 l J - - * . 7 + ’ + 1 1 0 R 5 1 1 3 2 ( R 5 2 1 3 0 R 0 2 2 1 I / I 2 / R / / R 0 2 0 C C 2 1 C C C 2 H H 5 5 , O O C R 2 = = O O O 0 5 5 c 2 0 Z 8 C C h ' O 1 0 ‘ 1 I 3 8 3 " r l ” = C 0 H = O O O “ O ) ) o o - 0 0 3 ' v 3 0 0 1 ( 0 9 _ 4 / “ { s i 1 ( 0 . r l " 0 0 9 — 4 x t 7 4 4 9 4 — 4 9 R — 4 R _ 4 — 4 1 1 C H = C ' O C 0 0 4 H ' 0 : = C R 1 ( 3 7 R 5 2 5 1 ( : 3 ' R 1 5 2 7 C 2 5 0 0 m C O H C H = O H = “ = = 0 / C Z O C ) 6 = ) = 6 O 0 0 0 ) 0 ) 0 6 6 7 i 7 1 3 7 3 7 0 0 0 0 8 6 4 3 3 7 6 7 3 9 9 0 0 0 0 8 8 0 0 0 g 0 A 0 0 0 1 B 1 0 0 0 — R 1 C O O H F i g u r e 4 . 5 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e ( A ) C I D M S 3 p r o d u c t i o n s p e c t r a o f t h e m / z 6 7 3 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f [ A + ( C H 3 ) 3 N C H = C H 2 ] f r o m t h e m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 i n T a b l e 4 . 1 . ( B ) C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e [ M — H ] ' p r e c u r s o r i o n o f p h o s p h a t i d i c a c i d 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ( m / z 6 7 3 ) . 1 7 8 4 . 3 . 6 D e u t e r i u m i s o t o p e l a b e l i n g a n d C I D M S 3 a n d M S 4 e x p e r i m e n t s t o p r o b e t h e s t r u c t u r e o f t h e [ M + A — 5 9 l ' p r o d u c t i o n f o r m e d f r o m t h e H 2 P 0 4 ' a d d u c t s o f G P C h o C I D M S / M S o f t h e d i h y d r o g e n p h o s p h a t e H z P O 4 ' a n i o n i c a d d u c t o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ( F i g u r e 4 . 6 A ) r e s u l t e d i n f o r m a t i o n o f t h e — ( A + C H 3 ) , — ( A H + ( C H 3 ) 3 N ) a n d — ( A + ( C H 3 ) 3 N C H C H 2 ) n e u t r a l l o s s p r o d u c t i o n s d e s c r i b e d a b o v e , a s w e l l a s a u n i q u e p r o d u c t i o n a t m / z 7 9 7 c o r r e s p o n d i n g t o t h e n e u t r a l l o s s o f 5 9 D a f r o m t h e [ M + A ] ’ p r e c u r s o r i o n . A s i m i l a r l o s s w a s a l s o o b s e r v e d b y M S / M S o f t h e d i h y d r o g e n p h o s p h a t e a n i o n i c a d d u c t o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( T a b l e 4 . 1 ) . T h e f o r m a t i o n o f t h i s 5 9 D a n e u t r a l l o s s p r o d u c t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h t h e m e c h a n i s m s h o w n i n S c h e m e 4 . 7 , i n v o l v i n g ‘ c h a r g e - d i r e c t e d ’ n u c l e o p h i l i c a t t a c k b y t h e p h o s p h a t e a n i o n o n a n e l e c t r o p h i l i c c a r b o n i n t h e c h o l i n e h e a d g r o u p , r e s u l t i n g i n e l i m i n a t i o n o f ( C H 3 ) 3 N a n d c o v a l e n t i n c o r p o r a t i o n o f t h e a n i o n . M S 3 o f t h i s p r o d u c t i o n r e s u l t e d i n t h e l o s s o f 1 2 4 D a , c o n s i s t e n t w i t h a c o m p o s i t i o n o f C 2 H 5 P O 4 , a s t h e m a j o r fi ' a g m e n t a t i o n p a t h w a y ( F i g u r e 4 . 6 8 ) . T h i s l o s s c o u l d o c c u r b y a n E 2 e l i m i n a t i o n r e a c t i o n p a t h w a y s i m i l a r t o t h a t s h o w n i n S c h e m e 6 f o r t h e l o s s o f ( A + ( C H 3 ) 3 N C H = C H 2 ) , o r b y a n e i g h b o r i n g g r o u p p a t h w a y f o l l o w i n g i n t r a m o l e c u l a r p r o t o n t r a n s f e r b e t w e e n t h e t w o p h o s p h a t e s w i t h i n t h e p r o d u c t i o n , t o y i e l d p h o s p h a t i d i c a c i d ( S c h e m e 4 . 7 ) . T h e s e t w o m e c h a n i s m s c a n b e r e a d i l y d i s t i n g u i s h e d f r o m e a c h o t h e r b y e x a m i n a t i o n o f t h e M S 3 s p e c t r a o b t a i n e d f r o m t h e [ M + A - ( C H 3 ) 3 N ] ‘ p r o d u c t i o n o f t h e d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 p h o s p h a t e a d d u c t . 1 7 9 D i s s o c i a t i o n o f t h e a d d u c t b y t h e E 2 e l i m i n a t i o n p a t h w a y w o u l d r e s u l t i n t h e l o s s o f 1 2 7 D a ( H 2 P O 4 C D C D 2 ) , w h e r e a s d i s s o c i a t i o n b y t h e n e i g h b o r i n g g r o u p p a t h w a y w o u l d r e s u l t i n t h e l o s s o f 1 2 8 D a ( H P O 4 C D 2 C D 2 ) . T h e e x c l u s i v e l o s s o f 1 2 8 D a w a s o b s e r v e d f r o m t h e d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 l i p i d ( d a t a n o t s h o w n ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e l o s s o f 1 2 4 f r o m t h e [ M + A - ( C H 3 ) 3 N ] ' p r o d u c t i o n o f t h e G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 d i h y d r o g e n p h o s p h a t e a d d u c t c o r r e s p o n d e d t o t h e c y c l i c H P O 4 C H 2 C H 2 n e u t r a l s h o w n i n S c h e m e 4 . 7 . F i n a l l y , M S 4 o f t h e [ M + A - ( ( C H 3 ) 3 N + H P O 4 C H 2 C H 2 ) ] ' p r o d u c t i o n a t m / z 6 7 3 i n F i g u r e 4 . 6 B w a s o b s e r v e d t o y i e l d a n i d e n t i c a l s p e c t r u m ( d a t a n o t s h o w n ) t o t h a t o b t a i n e d b y M S I M S o f t h e p h o s p h a t i d i c a c i d 1 6 : 0 / 1 8 : 1 s t a n d a r d i n F i g u r e 4 . 5 B , f u r t h e r c o n fi r m i n g t h e s t r u c t u r e o f t h i s p r o d u c t i o n . 1 8 0 — ( A + C H 3 ) 1 0 0 — 7 4 4 8 0 ‘ 1 8 5 6 ( A H + ( C H ) N ) ' _ 3 3 — ( C H 3 ) 3 N 6 0 : 6 9 : 9 7 9 7 g 4 0 % - ( A + ( C H 3 ) 3 N C H C 6 P % ) g 2 0 - 2 5 5 2 8 1 3 9 } 4 1 7 8 5 6 5 ‘ . r “ 1 r ” f 1 ' i “ O 1 1 1 I I 1 7 m 1 1 § 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 - 0 — H P O C H C H : 5 1 0 0 ‘ B 6 7 3 4 2 2 5 : 8 0 ‘ 8 5 6 fi _ 7 9 7 a d 6 0 — 4 0 - 2 0 ; 2 5 5 2 8 1 3 9 1 4 1 7 7 9 7 7 l . 6 l . 1 i 2 0 0 3 6 ) 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 m / z F i g u r e 4 . 6 ( A ) N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e p h o s p h a t e ( H 2 P 0 4 ‘ ) a d d u c t o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ( m / z 8 5 6 ) . ( B ) C I D M S 3 p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e m / z 7 9 7 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( C H 3 ) 3 N ( 5 9 D a ) f r o m F i g u r e 4 . 6 A . 1 8 1 H 3 H o H / C 3 - C : _ 1 _ ) _ C \ 0 O ) e \ \ / l 3 ” ? 0 a n O d _ 0 7 0 \ H O . g i \ 0 | R \ 2 n / O \ / 0 l ‘ R k \ - O - / E O H \ O \ / O / / Z 0 / R O 0 — — l M T R > 3 N S — ( M l / H — S — C ‘ M 3 — S ) 3 — — L \ \ / / 0 > / \ P O O O — H K 0 O 0 K , — _ ‘ , \ 0 E O P / \ H O O / W \ O U 0 / \ L / 0 0 l F \ O / R T R O 2 2 T R o 0 I R 1 / \ , \ , O H 0 o 0 ” o l H + t r a n s f e r S c h e m e 4 . 7 P r o p o s e d f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s o f [ G P C h o + H 2 P O 4 ] ' 4 . 3 . 7 D e u t e r i u m i s o t o p e l a b e l i n g a n d C I D M S 3 e x p e r i m e n t s t o p r o b e t h e s t r u c t u r e o f t h e [ M + A - ( A + l ) ] ’ p r o d u c t i o n s f o r m e d f r o m t h e a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o a n d i s o t o p e e f f e c t C I D M S I M S s p e c t r a o f n e g a t i v e l y c h a r g e d G P C h o i o n s f o r m e d b y a n i o n i c a d d u c t i o n w i t h e t h y l c a r b o n a t e , m e t h y l c a r b o n a t e a n d t r i fl u o r o a c e t a t e a l l r e s u l t e d i n t h e n e u t r a l l o s s o f A H . T h e f o r m a t i o n o f t h e s e p r o d u c t i o n s r e q u i r e s e i t h e r ( i ) d e p r o t o n a t i o n o f t h e G P C h o l i p i d t o y i e l d a p r o d u c t i o n c o n t a i n i n g a s i n g l e n e g a t i v e c h a r g e s i t e i . e . , n e u t r a l i z a t i o n o f t h e q u a t e r n a r y a l k y l a m m o n i u m i o n w i t h i n t h e c h o l i n e h e a d g r o u p , o r ( i i ) d e p r o t o n a t i o n o f t h e G P C h o l i p i d a t a s i t e r e m o t e t o t h e c h o l i n e h e a d g r o u p t o y i e l d a z w i t t e r i o n i c p r o d u c t i o n . T o d e t e r m i n e t h e s i t e o f d e p r o t o n a t i o n f o r t h i s n e u t r a l l o s s , t h e M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r a o b t a i n e d f r o m t h e m e t h y l c a r b o n a t e a n i o n i c a d d u c t s o f d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 , d 6 2 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 , a n d d 1 3 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 w e r e e x a m i n e d . T h e 1 8 2 e x c l u s i v e l o s s o f A H ( m / z 7 3 6 ) f r o m t h e d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t i o n ( F i g u r e 4 . 3 A ) i n d i c a t e s t h a t t h e d e p r o t o n a t i o n r e a c t i o n d o e s n o t i n v o l v e a n y o f t h e C H 2 C H 2 h y d r o g e n s w i t h i n t h e p h o s p h o c h o l i n e h e a d g r o u p . I n c o n t r a s t , t h e l o s s o f A D ( m / z 7 9 3 ) f r o m t h e d 6 2 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t i o n ( F i g u r e 4 . 3 B ) i n d i c a t e s t h a t t h e d e p r o t o n a t i o n r e a c t i o n d o e s i n v o l v e a h y d r o g e n f r o m w i t h i n t h e f a t t y a c i d . T h e l o s s o f A H f r o m t h e s a m e p r e c u r s o r i o n o f d 6 2 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( m / z 7 9 4 i n F i g u r e 4 . 3 B ) a n d t h e l o s s o f A D f r o m t h e d 1 3 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 l i p i d ( m / z 7 4 4 i n F i g u r e 4 . 3 C ) i n d i c a t e d a s e c o n d s i t e f o r d e p r o t o n a t i o n , l i k e l y i n v o l v i n g a h y d r o g e n f r o m a n N - m e t h y l g r o u p o f t h e p h o s p h o c h o l i n e h e a d g r o u p . M S 3 o f t h e A H n e u t r a l l o s s p r o d u c t i o n f r o m t h e G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t a t n r / z 7 3 2 i n F i g u r e 1 B r e v e a l e d a u n i q u e p r o d u c t i o n a t m / z 2 6 9 , 1 4 m a s s u n i t s h i g h e r t h a n t h e R C O O ' i o n a t m / z 2 5 5 ( F i g u r e 4 . 7 A ) . L i k e w i s e , a p r o d u c t i o n a t m / z 2 7 2 , 1 7 m a s s u n i t s h i g h e r t h a n t h e R C O O ' i o n w a s o b s e r v e d f r o m t h e M S 3 o f d 1 3 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( d a t a n o t s h o w n ) . B a s e d o n t h e d a t a o b t a i n e d f r o m F i g u r e 4 . 3 B , w h i c h i n d i c a t e d t h a t d e p r o t o n a t i o n c a n o c c u r f r o m t h e f a t t y a c i d c h a i n s , a m e c h a n i s m f o r t h e f o r m a t i o n o f t h i s m / z 2 6 9 p r o d u c t i o n i s p r o p o s e d i n S c h e m e 4 . 8 ( p a t h w a y b ) . D e p r o t o n a t i o n o f a a - C H 2 g r o u p a d j a c e n t t o e i t h e r o f t h e c a r b o n y l g r o u p s i n t h e f a t t y a c i d c h a i n s w o u l d i n i t i a l l y y i e l d a n e n o l a t e a n i o n , w h i c h m a y t h e n u n d e r g o r e a r r a n g e m e n t b y m e t h y l g r o u p t r a n s f e r f r o m t h e q u a t e r n a r y a l k y l a m m o n i u m i o n o f t h e c h o l i n e h e a d g r o u p . M S 3 o f t h i s r e a r r a n g e d p r o d u c t i o n w o u l d g i v e r i s e t o t h e p r o d u c t i o n 1 8 3 a t r r r / z 2 6 9 , c o r r e s p o n d i n g t o R ' C H = C O ( O C H 3 ) " , v i a a s i m i l a r n e i g h b o r i n g g r o u p e l i m i n a t i o n r e a c t i o n m e c h a n i s m t o t h a t p r o p o s e d e a r l i e r f o r f o r m a t i o n o f t h e R C O O ' p r o d u c t i o n s . E v i d e n c e f o r t h i s m e c h a n i s m w a s p r o v i d e d b y i n d i v i d u a l l y s u b j e c t i n g t h e - ( A D ) a n d — ( A H ) n e u t r a l l o s s p r o d u c t i o n s f r o m t h e d 6 2 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 l i p i d a d d u c t , i . e , w h e r e t h e i s o m e r i c p r o d u c t i o n s f o r m e d b y d e p r o t o n a t i o n a t t h e t w o o r m o r e d i f f e r e n t s i t e s w i t h i n t h e G P C h o l i p i d a d d u c t i o n a r e r e s o l v e d f r o m e a c h o t h e r , t o f u r t h e r d i s s o c i a t i o n b y M S 3 ( F i g u r e s 4 . 7 B a n d 4 . 7 C , r e s p e c t i v e l y ) . F r o m t h e s e s p e c t r a , i t c a n b e s e e n t h a t a n e q u i v a l e n t p r o d u c t i o n t o t h e o n e a t m / z 2 6 9 i n F i g u r e 4 . 7 A i s o n l y o b s e r v e d f r o m t h e - ( A D ) n e u t r a l l o s s p r o d u c t ( m / z 2 9 9 i n F i g u r e 4 . 7 B ) , i n d i c a t i n g t h a t t h i s i o n i s f o r m e d b y d e p r o t o n a t i o n o f t h e f a t t y a c i d c h a i n . 1 8 4 1 0 0 A R C O O ' 8 0 2 5 5 8 0 8 6 0 R ' C H = C O ( O C H 3 ) ' 7 3 2 2 6 9 4 0 a " , — ( R ' C H = C = O ) 2 0 4 9 4 7 3 2 1 i g ? 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 V d - R C O O ' - 8 1 0 0 1 3 2 8 5 F 2 8 6 1 0 0 3 0 2 8 5 2 8 6 d 3 1 - R C O O 8 0 8 5 3 0 7 9 3 “ g d 3 0 - R ' C D = C O ( O C H 3 ) ' : s 6 0 2 9 9 a ) 2 7 0 2 8 0 2 9 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 , 3 2 0 2 9 9 7 9 3 : 2 1 5 2 5 t D r I I I l I I I l 1 D d 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 1 0 0 C 2 3 6 1 0 0 d 3 0 - R C O O ‘ 2 8 6 d 3 1 ' R C O O ' 8 0 8 8 0 2 8 i 7 9 4 6 0 2 9 9 2 8 5 f 4 0 7 ‘ 2 7 0 2 8 0 2 9 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 2 0 2 9 9 7 9 4 . 5 2 6 z , 1 v 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 m / z F i g u r e 4 . 7 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e C I D M S 3 p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f ( A ) t h e m / z 7 3 2 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( A H ) f r o m t h e m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 i n F i g u r e 4 . 1 B . ( B ) t h e m / z 7 9 3 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( A D ) fi o m t h e m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t o f G P C h o d 3 1 - 1 6 : 0 / d 3 1 - 1 6 : 0 i n F i g u r e 4 . 3 B . ( C ) t h e m / z 7 9 4 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( A H ) f r o m t h e m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t o f G P C h o d 3 1 - 1 6 z 0 / d 3 1 - 1 6 : 0 i n F i g u r e 4 . 3 B . 1 8 5 / C H 0 “ + N \ C H 3 _ \ R 1 a n d - 3 n o o a 1 M 8 3 b m - C H H , M S / M S C l / C H + \ C H O 2 _ _ , F \ C H 6 \ R 2 ' 0 _ ‘ o 3 H O ‘ F ’ O \ v / l \ v / O \ H / A \ R f A H 0 \ / / O \ J > i : v / O \ W / \ W { . u 1 0 O c " ) o b 1 M 5 3 H C \ , C H 3 N 3 o H I I 3 C \ ( ) O — P Y 0 ) \ / O H C C H O \ fl / \ e r 3 \ N / 3 ( I ) O D / K / R Z ' O K / O - h ‘ O W O a n d ' _ O - 0 / l \ / R 2 S c h e m e 4 . 8 P r o p o s e d f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s o f [ G P C h o + A ] ‘ t o l o s e A H a n d M S 3 o f [ G P C h o + A — A H ] ' I n t e r e s t i n g l y , C I D M S / M S o f t h e t r i fl u o r o a c e t a t e a d d u c t o f t h e d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 a n d d 6 2 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 l i p i d s r e s u l t e d i n e x c l u s i v e A H l o s s ( m / z 7 3 6 a n d m / z 7 9 4 i n F i g u r e s 4 . 8 A a n d 4 . 8 B , r e s p e c t i v e l y ) , w h i l e t h a t o f d 1 3 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 p r o d u c e d o n l y A D l o s s ( n r / z 7 4 4 i n F i g u r e 4 . 8 C ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e d e p r o t o n a t i o n r e a c t i o n i n v o l v e d a h y d r o g e n ( o r d e u t e r i u m ) f r o m a n N - m e t h y l g r o u p o f t h e 1 8 6 p h o s p h o c h o l i n e h e a d g r o u p ( S c h e m e 4 . 9 , p a t h w a y a ) . F u r t h e r m o r e , M S 3 o f e a c h o f t h e s e p r o d u c t i o n s i n d i c a t e d t h a t t h e c h a r a c t e r i s t i c m e t h y l g r o u p t r a n s f e r p r o d u c t i o n w a s a l m o s t a b s e n t i n e a c h c a s e ( d a t a n o t s h o w n ) , f u r t h e r i n d i c a t i n g t h a t t h e d e p r o t o n a t i o n r e a c t i o n d i d n o t i n v o l v e a h y d r o g e n f r o m t h e f a t t y a c i d c h a i n s . T h e s e d i f f e r e n c e s o b s e r v e d b y d i s s o c i a t i o n o f t h e n e u t r a l l o s s p r o d u c t i o n s f r o m t h e m e t h y l c a r b o n a t e a n d t r i fl u o r o a c e t a t e a d d u c t s i n d i c a t e t h a t t h e s i t e o f d e p r o t o n a t i o n , a n d t h e r e f o r e t h e s t r u c t u r e s o f t h e - ( A H ) n e u t r a l l o s s M S / M S p r o d u c t i o n a t m / z 7 9 4 , a r e h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e i d e n t i t y o f t h e a n i o n . C H 3 + I l I ’ C H 3 _ \ C H 3 0 O ‘ I z / O W O T R I a n d 0 R 2 l l 0 O a T M 8 3 0 H 3 0 b 1 M 5 3 1 0 o R C H 2 l 2 I I o — \ C H 3 a n d H 3 C - N / \ / \ O v K / O T R I S c h e m e 4 . 9 P r o p o s e d f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s o f [ G P C h o + A ] ' t o l o s e a l t e r n a t i v e A H a n d M S 3 o f [ G P C h o + A — A H ] ' t o f o r m r a d i c a l a n i o n s 1 8 7 1 0 0 A d ; ( ( C H 3 ) 2 N A ‘ ( A D + ( C H 3 ) 3 N 6 ) — ( A H + C H 3 ) + R C 0 0 C H 9 s o 8 5 0 4 2 3 ’ 7 — 1 ( A + C H 3 ) 6 0 7 2 2 4 0 ( A + ( C H 3 ) 3 N C D C D 2 ) 8 5 0 2 0 2 5 5 6 4 8 A I I I L l 1 l l l l I § 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 ~ A H 1 0 0 0 3 1 0 0 - B d 6 2 — ( ( C H 3 ) 2 N A - ( A H + ( C H 3 ) 3 N ) 7 9 4 0 0 — ( A H g + C ( I ) H 3 ) r : ‘ + d R C O O C H ) 7 3 5 7 7 9 < 6 8 0 — 9 0 8 3 1 3 ' g _ g 4 5 0 — ( A + C H 3 ) 3 6 0 - / 7 8 0 fi 4 0 - — ( A + ( C H 3 ) 3 N C H C H 2 ) , g 2 0 : 7 0 9 9 0 8 ' 3 _ 2 8 6 l 7 t M 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 1 0 0 _ C d ] , — ( A D + ( C D 3 ) 2 C H 2 D N ) 6 7 8 - D — — ( ( C D 3 ) 2 N A — ( A D + < C D 3 ) 3 N > 7 4 4 — ( A D + C D 3 ) 8 0 : + R C O O C D 3 ) 6 7 6 7 2 6 6 0 - 8 5 9 4 2 3 r / - ( A + C D 3 ) 4 0 : g ~ ( A + ( C D 3 ) 3 N C D C D 2 . / 7 2 8 2 0 + 6 4 8 3 5 9 j 2 5 5 . . l 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 m / z F i g u r e 4 . 8 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r a o f t h e t r i fl u o r o a c e t a t e a d d u c t s o f ( A ) d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( m / z 8 5 0 ) , ( B ) G P C h o d 3 1 - 1 6 1 0 / d 3 1 - 1 6 : 0 ( m / z 9 0 8 ) , a n d ( C ) d 1 3 — G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( m / z 8 5 9 ) . 1 8 8 4 . 3 . 8 D e u t e r i u m i s o t o p e l a b e l i n g a n d C I D M S 3 e x p e r i m e n t s t o p r o b e t h e s t r u c t u r e o f t h e [ M + A - ( A + 1 6 ) ] ‘ p r o d u c t i o n s f o r m e d f r o m M S I M S o f a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o T h e ( A + 1 6 ) n e u t r a l l o s s C I D M S / M S p r o d u c t i o n o b s e r v e d a t m / z 7 1 7 f r o m t h e m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( F i g u r e 4 . 1 8 ) , s h o u l d c o n t a i n o n e n i t r o g e n a t o m b u t h a s a n o d d m a s s , s u g g e s t i n g t h a t i t i s a n o d d - e l e c t r o n s p e c i e s g e n e r a t e d f r o m t h e e v e n - e l e c t r o n p r e c u r s o r i o n [ M + A ] ' v i a t h e c o m b i n e d l o s s e s o f A H a n d a C H 3 " r a d i c a l . T h i s n e u t r a l l o s s w a s f o u n d a t p a r t i c u l a r l y h i g h a b u n d a n c e f r o m t h e t r i fl u o r o a c e t a t e a d d u c t o f b o t h t h e G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 a n d G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 l i p i d s p e c i e s ( T a b l e 4 . 1 ) . M S / M S a n a l y s i s o f t h e C F 3 C 0 2 ' a d d u c t s o f d 4 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 a n d d 6 2 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( F i g u r e s 4 . 8 A a n d 4 . 8 B , r e s p e c t i v e l y ) b o t h r e s u l t e d o n l y i n t h e n e u t r a l l o s s o f ( A H + C H 3 - ) , w h i l e t h e d 1 3 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( F i g u r e 4 . 8 C ) e x c l u s i v e l y l o s t ( A D + C D 3 ° ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e p r o t o n i n v o l v e d i n s u c h a n e u t r a l l o s s o r i g i n a t e s o n l y f r o m a n N - m e t h y l g r o u p o f t h e p h o s p h o c h o l i n e h e a d g r o u p ( S c h e m e 4 . 9 , p a t h w a y b ) . M S 3 o f t h e m / z 7 1 7 p r o d u c t i o n g e n e r a t e d b y n e u t r a l l o s s o f ( A + l 6 ) f r o m t h e t n ' fl u o r o a c e t a t e a d d u c t o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 i n T a b l e 4 . 1 r e s u l t e d i n t h e s p e c t r u m s h o w n i n F i g u r e 4 . 9 . N e u t r a l l o s s e s o f 1 5 D a ( m / z 7 0 2 ) , 4 3 D a ( m / z 6 7 3 ) , 2 5 5 D a ( m / z 4 6 2 ) a n d 2 9 8 D a ( m / z 4 1 9 ) w e r e o b s e r v e d , c o r r e s p o n d i n g t o e v e n e l e c t r o n s p e c i e s g e n e r a t e d v i a t h e l o s s o f n e u t r a l r a d i c a l s C H 3 ° , C 2 H 6 N ' , R C O O ' a n d R C O O C H Z N C H 3 3 r e s p e c t i v e l y , i n a d d i t i o n t o a p r o d u c t i o n a t m / z 2 5 5 ( R C O O ' ) . S i m i l a r l o s s e s o f n e u t r a l r a d i c a l s C D 3 ' , 1 8 9 C 2 D 5 H N ' , R C O O ' a n d R C O O C D Z N C D 3 ' w e r e o b s e r v e d f r o m t h e M S 3 s p e c t r u m o f t h e d 1 3 - G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 l i p i d s p e c i e s . ” a — ( R c o o - ) 3 : ; 1 0 0 : 4 6 2 7 5 2 0 8 0 - 5 - — ( C H 3 - ) 7 ” ' 8 6 0 ‘ 7 0 2 = 3 j ‘ ( R C O O C H z N C H 3 ' ) _ _ C H N ' ’ 3 ’ ' 2 4 0 " 4 1 9 ( 2 6 6 7 ; { I f > j 2 0 : R 0 0 0 “ 4 8 0 ‘ 7 1 7 a s . - 2 § 5 g é a ) I I I I I I I I I M 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 m / 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 Z F i g u r e 4 . 9 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e C I D M S 3 p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f t h e m / z 7 1 7 p r o d u c t i o n f o r m e d v i a t h e n e u t r a l l o s s o f ( A + l 6 ) f r o m t h e t r i fl u o r o a c e t a t e a d d u c t o f G P C h o l 6 : O / 1 6 : O i n T a b l e 4 . 1 . 4 . 3 . 9 R a t i o n a l i z i n g t h e e f f e c t s o f a n i o n s o n t h e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f a n i o n i c a d d u c t s o f G P C h o A p r e v i o u s a b i n i t i o c o m p u t a t i o n a l s t u d y o n t h e g a s - p h a s e s t r u c t u r e o f z w i t t e r i o n i c G P C h o h a s p r e d i c t e d t h a t t h e p h o s p h o c h o l i n e h e a d g r o u p a d o p t s a c y c l i c c o n f o r m a t i o n , s t a b i l i z e d b y m u l t i p l e i n t r a m o l e c u l a r e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e p h o s p h a t e o x y g e n s a n d t h e N - m e t h y l g r o u p s w i t h i n t h e c h o l i n e h e a d g r o u p [ 2 5 6 ] . A n o t h e r s t u d y t o e x a m i n e t h e e f f e c t o f h y d r a t i o n o n t h e g a s - p h a s e s t r u c t u r e o f G P C h o l i p i d m o l e c u l e s h a s f o u n d a s t r o n g i n t e r a c t i o n b e t w e e n w a t e r m o l e c u l e s a n d t h e p h o s p h a t e o x y g e n s , a s w e l l a s w i t h m e t h y l a n d m e t h y l e n e m o i e t i e s o f t h e c h o l i n e h e a d g r o u p , r e s u l t i n g i n a h y d r a t i o n d r i v e n c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e o f t h e G P C h o h e a d 1 9 0 g r o u p [ 2 5 7 ] . E x t e n s i v e c o m p u t a t i o n a l s t u d i e s t o d e t e r m i n e t h e g a s - p h a s e s t r u c t u r e s o f t h e v a r i o u s a n i o n i c G P C h o l i p i d a d d u c t s d e s c r i b e d a b o v e w e r e b e y o n d t h e s c o p e o f t h i s s t u d y . H o w e v e r , i t i s r e a s o n a b l e t o e x p e c t t h a t t h e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s o b s e r v e d f o r t h e v a r i o u s G P C h o l i p i d a n i o n i c a d d u c t s a r e l i k e l y t o b e h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e a b i l i t y o f t h e a n i o n t o d i s r u p t t h e s e i n t r a m o l e c u l a r e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s , f o r e x a m p l e b y f o r m i n g m u l t i p l e i n t e r m o l e c u l a r e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s w i t h t h e N - m e t h y l g r o u p s w i t h i n t h e c h o l i n e h e a d g r o u p o r b y f o r m i n g s t r o n g h y d r o g e n b o n d s [ 2 5 7 , 2 5 8 ] w i t h t h e p h o s p h a t e o x y g e n s o f t h e p h o s p h o c h o l i n e h e a d g r o u p , o r d u e t o t h e a b i l i t y o f t h e a n i o n t o f o r m s t r o n g h y d r o g e n b o n d s w i t h t h e g l y c e r o l b a c k b o n e o r t h e e s t e r l i n k a g e o f f a t t y a c i d c h a i n s , h e n c e o p e n i n g u p a l t e r n a t i v e d i s s o c i a t i o n p a t h w a y s . I n o r d e r t o o b t a i n a r u d i m e n t a r y p i c t u r e o f t h e m a j o r i n t e r - a n d i n t r a - m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n s a s s o c i a t e d w i t h f o r m a t i o n o f t h e a n i o n i c G P C h o a d d u c t s , a p r e l i m i n a r y c o n f o r m a t i o n a l s e a r c h w a s c o n d u c t e d a t t h e P M 3 s e m i e m p i r i c a l l e v e l o f t h e o r y o f t h e c h l o r i d e - G P C h o a n i o n i c a d d u c t , u s i n g t h e m o d e l p h o s p h a t i d y l c h o l i n e l i p i d G P C h o 6 : 0 / 6 : 0 . P M 3 l e v e l c a l c u l a t i o n s w e r e p e r f o r m e d d u e t o t h e l a r g e s i z e o f t h e l i p i d s t r u c t u r e s , t h e r e b y m a k i n g a b i n i t i o o r d e n s i t y f u n c t i o n a l t h e o r y s e a r c h e s c o m p u t a t i o n a l l y p r o h i b i t i v e . F i g u r e 4 . 1 0 s h o w s t h e l o w e s t e n e r g y c o n f o r m a t i o n f o u n d f o r t h e G P C h o 6 : 0 / 6 : 0 l i p i d w i t h t h e c h l o r i d e a n i o n i c a d d u c t . I t c a n b e s e e n f r o m F i g u r e 4 . 1 0 t h a t t h e c h l o r i d e a n i o n i s e x c l u s i v e l y a s s o c i a t e d w i t h t h e l i p i d s p e c i e s v i a i n t e r m o l e c u l a r e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s w i t h t w o o f t h e c h o l i n e m e t h y l g r o u p s , w h i l e t h e r e m a i n i n g c h o l i n e m e t h y l g r o u p i s i n v o l v e d i n a n i n t r a m o l e c u l a r e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n w i t h t h e a n i o n i c p h o s p h a t e o x y g e n . T h e t w o a c y l f a t t y a c i d c h a i n s w e r e f o u n d t o b e c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h e a c h o t h e r b y t h e f o r m a t i o n o f m u l t i p l e i n t r a m o l e c u l a r h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s . O v e r a l l , t h e s e i n t e r a c t i o n s a r e 1 9 1 c o n s i s t e n t w i t h t h e e x p e r i m e n t a l l y o b s e r v e d f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r f o r t h i s a d d u c t , i n v o l v i n g t h e e x c l u s i v e l o s s o f ( A + C H 3 ) v i a a n i n t e r m o l e c u l a r 8 N 2 r e a c t i o n . . 1 . 7 8 A f \ l - 7 5 A ' 5 I 1 . 7 3 A \ 1 . 7 4 A f » - 1 - 7 3 A ! V F i g u r e 4 . 1 0 M o s t s t a b l e s t r u c t u r e ( c a l c u l a t e d a t t h e P M 3 l e v e l o f t h e o r y ) f o r t h e a n i o n i c c h l o r i d e a d d u c t o f t h e m o d e l p h o s p h a t i d y l c h o l i n e l i p i d G P C h o 6 : 0 / 6 : 0 . T h e c o m p e t i t i o n b e t w e e n 8 N 2 a n d E 2 r e a c t i o n s i n t h e g a s - p h a s e , s u c h a s t h o s e i n v o l v i n g t h e l o s s o f ( A + C H 3 ) , ( A H + ( C H 3 ) 3 N ) a n d ( A + ( C H 3 ) 3 N C H C H 2 ) v i a i n t e r m o l e c u l a r 8 N 2 , i n t e r m o l e c u l a r E 2 o r i n t r a m o l e c u l a r E 2 r e a c t i o n s i n t h e w o r k d e s c r i b e d h e r e , r e s p e c t i v e l y , h a v e b e e n t h e s u b j e c t o f s e v e r a l p r e v i o u s s t u d i e s b y G r o n e r t e t . a l . [ 5 6 ] . N o t a b l y , B e a u c h a m p a n d c o - w o r k e r s h a v e r e c e n t l y o b s e r v e d c o m p e t i t i o n b e t w e e n 8 N 2 a n d E 2 p a t h w a y s f o r r e a c t i o n o f t h e t r i p h o s p h a t e d i a n i o n w i t h c h o l i n e , a c l o s e l y r e l a t e d s y s t e m t o t h a t e x a m i n e d h e r e [ 5 7 ] . A l s o , O ’ H a i r a n d c o - w o r k e r s h a v e 1 9 2 r e c e n t l y d e s c r i b e d a n 8 N 2 r e a c t i o n f o r t h e f r a g m e n t a t i o n a G P C h o d i m e r i n p o s i t i v e i o n m o d e M S / M S , r e s u l t i n g i n g a s - p h a s e c r o s s - l i n k i n g v i a t h e l o s s o f N ( C H 3 ) 3 [ 2 5 9 ] . H o w e v e r , n o n e o f t h e s e s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d a c l e a r c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e o b s e r v e d g a s - p h a s e 8 N 2 o r E 2 fi ' a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s a s a f u n c t i o n o f t h e g a s - p h a s e a c i d i t y ( T a b l e 4 . 1 ) , n u c l e o p h i l i c s t r e n g t h [ 2 6 0 ] , h a r d / s o fi a c i d b a s e p r o p e r t i e s [ 2 6 1 ] o r s t e r i c a c c e s s i b i l i t y o f t h e i n v e s t i g a t e d s p e c i e s . T h u s , i t i s l i k e l y t h a t i t i s a c o m b i n a t i o n o f t h e s e f a c t o r s , t o g e t h e r w i t h t h e r e s p e c t i v e a c t i v a t i o n b a r r i e r s , t h a t c o n t r o l t h e e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d b r a n c h i n g r a t i o s f o r t h e o b s e r v e d f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s . F u r t h e r s t u d i e s i n v o l v i n g m o l e c u l a r d y n a m i c s i m u l a t i o n s c o m b i n e d w i t h m o l e c u l a r o r b i t a l c a l c u l a t i o n s a r e c u r r e n t l y u n d e r w a y t o o b t a i n m o r e d e t a i l e d i n s i g h t s i n t o t h e n a t u r e o f t h e v a r i o u s a n i o n - G P C h o l i p i d i n t e r a c t i o n s , a n d t h e i r r o l e i n c o n t r o l l i n g t h e o b s e r v e d f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s . 4 . 3 . 1 0 C o m p e t i t i v e f o r m a t i o n o f a n i o n i c a d d u c t s w i t h G P C h o T h e b i n d i n g a f fi n i t y o f d i f f e r e n t a n i o n s w i t h t h e G P C h o l i p i d s w a s a l s o f o u n d t o d i f f e r s i g n i fi c a n t l y d e p e n d i n g o n t h e i d e n t i t y o f t h e a n i o n s . I n s o l u t i o n s o f c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) c o n t a i n i n g 5 u M G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 , a m m o n i u m f o r m a t e , a m m o n i u m a c e t a t e , a m m o n i u m c h l o r i d e o r a m m o n i u m h y d r o x i d e ( f o r m i n g m e t h y l c a r b o n a t e ) w e r e a d d e d i n d i v i d u a l l y f r o m 0 , 0 . 1 m M t o 2 0 m M , a n d t h e c o n s e q u e n t p e a k a b u n d a n c e o f [ M + A ] ' a t m / z 7 7 8 , m / z 7 9 2 , m / z 7 6 8 o r m / z 8 0 8 , r e s p e c t i v e l y , w a s p l o t t e d a g a i n s t t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e a n i o n s i n s o l u t i o n ( F i g u r e 4 . 1 1 ) . I n t h e c a s e o f f o r m a t e a n d a c e t a t e ( F i g u r e 4 . 1 1 A a n d 4 . 1 1 B ) , t h e a b u n d a n c e s o f t h e a n i o n i c a d d u c t i o n i n c r e a s e d r a p i d l y 1 9 3 w i t h t h e i n c r e a s e i n a n i o n c o n c e n t r a t i o n i n t h e s o l u t i o n p r i o r t o 5 m M a n d 1 0 m M , r e s p e c t i v e l y , b u t t h e n s l o w l y d e c r e a s e d a s t h e a n i o n c o n c e n t r a t i o n f u r t h e r i n c r e a s e d . I n t h e c a s e o f c h l o r i d e , h o w e v e r , t h e h i g h e s t a b u n d a n c e w a s r e a c h e d a t a s e a r l y a s a b o u t 1 m M c h l o r i d e ( F i g u r e 4 . 1 1 C ) , r e fl e c t i n g a h i g h e r a f fi n i t y o f c h l o r i d e t o G P C h o l i p i d s , b u t a f t e r 1 0 m M , s e r i o u s c l o g g i n g o f t h e s p r a y t i p d u e t o p r e c i p i t a t i o n o f t h e n o n v o l a t i l e c h l o r i d e s a l t p r e v e n t e d t h e f o r m a t i o n o f a s t a b l e s p r a y . E v e n t h o u g h t h e o p t i m a l a b u n d a n c e o f c h l o r i d e a d d u c t s w a s r e a c h e d a t m u c h l o w e r a n i o n c o n c e n t r a t i o n , t h e o p t i m a l a b u n d a n c e o f t h e a d d u c t i o n w a s m u c h l o w e r c o m p a r e d t o t h o s e o f t h e v o l a t i l e f o r m a t e a n d a c e t a t e i n F i g u r e s 4 . 1 1 A a n d 4 . 1 1 B . W h e n o n l y a m m o n i u m h y d r o x i d e w a s a d d e d , t h e i o n a b u n d a n c e o f m e t h y l c a r b o n a t e a d d u c t i n c r e a s e d s t e a d i l y u n t i l a b o u t 1 5 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e ( F i g u r e 4 . 1 1 D ) , a n d n o a d v e r s e e f f e c t s o n t h e s p r a y w e r e o b s e r v e d . T h e s p e e d b y w h i c h t h e s e a n i o n i c a d d u c t i o n r e a c h e d s a t u r a t i o n ( F i g u r e 4 . 1 1 ) , i n t h e o r d e r o f c h l o r i d e > f o r r n a t e > a c e t a t e > m e t h y l c a r b o n a t e , a l s o r e fl e c t s t h e o r d e r o f a f fi n i t y o f t h e s e a n i o n s t o G P C h o l i p i d s . 1 9 4 ' A 5 6 4 ? H C O Z ' ( m / z 7 7 8 ) 4 e 4 ‘ l I 3 6 4 ‘ 5 % A l A L a 2 6 4 ‘ A ] . i Q < 1 j + 1 e 4 ‘ A E . 0 - ‘ “ d w ~ w O “ Q B : 3 , C H 3 C O Z ’ ‘ 5 ‘ 5 6 4 : ( m / z 7 9 2 ) ' 5 5 4 6 4 : 3 e 4 - 2 6 4 : Q U 1 e 4 j 0 . . 0 " 5 ' 1 ' 0 ' 1 ' 5 ' 2 ' 0 i 4 ‘ C C l ' ( m / z 7 6 8 ) . ‘ fi o < > J ‘ 1 D C H 3 O C 0 2 ' ( N H 4 O H ) ( m / z 8 0 8 ) m o 0 o O o 0 ‘ 5 ' 1 ' 0 ' 1 ' 5 ' 2 ' 0 C o n c e n t r a t i o n o f N H 4 A ( m M ) F i g u r e 4 . 1 1 D e p e n d e n c e o f t h e i o n a b u n d a n c e o f a n i o n i c a d d u c t s f o r m e d f r o m ( A ) f o r m a t e ( m / z 7 7 8 ) , ( B ) a c e t a t e ( m / z 7 9 2 ) , ( C ) c h l o r i d e ( m / z 7 6 8 ) a n d ( D ) m e t h y l c a r b o n a t e ( m / z 8 0 8 ) o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f a m m o n i u m f o r m a t e , a m m o n i u m a c e t a t e , a m m o n i u m c h l o r i d e a n d a m m o n i u m h y d r o x i d e , i n t h e s o l u t i o n o f c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) c o n t a i n i n g 5 u M G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 , a n a l y z e d i n n e g a t i v e i o n m o d e E S I M S _ B y k e e p i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 l i p i d c o n s t a n t a t 5 u M , a n d v a r y i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f a n i o n m i x t u r e c o n t a i n i n g f o r m a t e a n d a c e t a t e , a n d t h e 1 9 5 m i x t u r e c o n t a i n i n g f o r m a t e a n d c h l o r i d e s y s t e m a t i c a l l y , t h e r a t i o o f t h e c o n s e q u e n t a n i o n i c a d d u c t i o n a b u n d a n c e s o f [ M + f o r m a t e ] ' / [ M + a c e t a t e ] ' w a s p l o t t e d a g a i n s t t h e r a t i o o f [ a m m o n i u m f o r m a t e ] / [ a m m o n i u m a c e t a t e ] c o n c e n t r a t i o n s i n s o l u t i o n ( F i g u r e 4 . 1 2 A ) , a n d t h e s i m i l a r l y t h e r a t i o o f [ M + c h l o r i d e ] ' / [ M + f o r m a t e ] ' a g a i n s t [ a m m o n i u m c h l o r i d e ] / [ a m m o n i u m f o r m a t e ] w a s a l s o p l o t t e d ( F i g u r e 4 . 1 2 B ) . T h e r e s u l t s i n F i g u r e s 4 . 1 2 A a n d 4 . 1 2 8 s h o w e d t h a t t h e a b i l i t y t o f o r m a d d u c t s o f t h e s e a n i o n s i n d e e d f o l l o w t h e o r d e r o f c h l o r i d e > f o r m a t e > a c e t a t e . T h e e f fi c i e n c y o f f o r m a t e t o f o r m a d d u c t s w i t h G P C h o i s a b o u t fi v e f o l d a s g r e a t a s t h a t o f t h e a c e t a t e ( F i g u r e 4 . 1 2 A ) . o O Q ) ' V r Y I Y r I V 1 7 f Y ' I ' 2 ‘ 2 5 - A 3 0 . . . B E [ M + F m ] " / [ M + A c ] ' g . [ M + C l ] ' / [ M + F m ] ' : 2 0 ' 2 5 . . o . 3 1 5 — 0 2 0 ? O H 0 £ 6 — 1 a d 1 0 - 1 5 . 8 E l § 1 0 1 a 5 1 D D " : 3 5 ‘ . L a . . 8 < 1 1 2 3 4 5 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 . 0 C o n c e n t r a t i o n R a t i o o f N H 4 A i n S o l u t i o n F i g u r e 4 . 1 2 T h e r a t i o o f i o n a b u n d a n c e s o f a n i o n i c a d d u c t s f o r m e d f r o m A ) [ M + f o r m a t e ] ' a n d [ M + a c e t a t e ] ' ( a t m / z 7 7 8 a n d m / z 7 9 2 ) a g a i n s t t h e r a t i o o f c o n c e n t r a t i o n s o f a m m o n i u m f o r m a t e / a m m o n i u m a c e t a t e i n s o l u t i o n , a n d B ) [ M + c h l o r i d e ] ' a n d [ M + f o r m a t e ] ’ ( a t m / z 7 6 8 a n d m / z 7 7 8 ) a g a i n s t t h e r a t i o o f c o n c e n t r a t i o n s o f a m m o n i u m f o r m a t e / a m m o n i u m c h l o r i d e i n s o l u t i o n , i n n e g a t i v e i o n m o d e E S I M S , w h i l e t h e c o n c e n t r a t i o n o f G P C h o 1 6 : 0 / 1 6 : 0 w a s m a i n t a i n e d a t 5 u M . 1 9 6 4 . 4 C o n c l u s i o n s P h o s p h o c h o l i n e c o n t a i n i n g l i p i d s s u c h a s G P C h o a r e r e a d i l y o b s e r v e d i n n e g a t i v e i o n m o d e b y a d d u c t i o n w i t h a r a n g e o f d i f f e r e n t a n i o n i c s p e c i e s . H o w e v e r , t h e o b s e r v e d M S I M S f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f t h e [ M + A ] ' i o n s f o r m e d f r o m t h e s e a n i o n i c a d d u c t s a r e h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e i d e n t i t y o f t h e a n i o n s . B a s e d o n r e s u l t s o f M S n e x p e r i m e n t s o f e a c h o f t h e s e a d d u c t s , a s w e l l a s M S / M S a n d M S n e x p e r i m e n t s u s i n g d e u t e r i u m l a b e l e d l i p i d s a n d a u t h e n t i c l i p i d s t a n d a r d s , s t r u c t u r e s a n d m e c h a n i s m s f o r t h e f o r m a t i o n o f e a c h o f t h e p r o d u c t i o n s h a v e b e e n p r o p o s e d . T h e r e s u l t s f r o m t h i s s t u d y i n d i c a t e t h a t g r e a t c a r e m u s t b e t a k e n t o c o n t r o l t h e i d e n t i t y o f t h e a n i o n s e m p l o y e d d u r i n g l i p i d i s o l a t i o n , p u r i fi c a t i o n a n d s e p a r a t i o n , i n o r d e r t o a l l o w t h e d e v e l o p m e n t a n d a p p l i c a t i o n o f s e n s i t i v e a n d r o b u s t n e u t r a l - l o s s s c a n m e t h o d s f o r m a s s s p e c t r o m e t r y - b a s e d l i p i d i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s . 1 9 7 C h a p t e r 5 C h a r a c t e r i z a t i o n o f O r n i t h i n e a n d G l u t a m i n e L i p i d s i n t h e C e l l M e m b r a n e s o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s 1 5 . 1 S u m m a r y T h e i d e n t i fi c a t i o n a n d s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f a s e r i e s o f o r n i t h i n e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e c e l l m e m b r a n e s o f w i l d t y p e R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s , a s w e l l a s f r o m a g 1 y c e r o p h o s p h o c h o l i n e - d e fi c i e n t s t r a i n , h a s b e e n a c h i e v e d b y m u l t i s t a g e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y o f t h e i r p r o t o n a t e d a n d d e p r o t o n a t e d p r e c u r s o r i o n s i n a l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p . S y s t e m a t i c e x a m i n a t i o n o f t h e m u l t i s t a g e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f t h e s e i o n s , c o m b i n e d w i t h t h e u s e o f h y d r o g e n / d e u t e r i u m e x c h a n g e , h a s e n a b l e d t h e p a t h w a y s r e s p o n s i b l e f o r s e q u e n t i a l l o s s e s o f t h e 3 - h y d r o x y l i n k e d f a t t y a c y l c h a i n ( R 2 ) a n d t h e a m i d e l i n k e d 3 - O H f a t t y a c i d c h a i n ( R 1 ) f r o m t h e s e l i p i d s , a s w e l l a s f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e p r e v i o u s l y r e p o r t e d o r n i t h i n e s p e c i fi c ‘ fi n g e r p r i n t ’ i o n a t m / z 1 1 5 i n p o s i t i v e i o n m o d e , t o b e d e t e r m i n e d . A d d i t i o n a l l y , t h e f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s r e s p o n s i b l e f o r f o r m a t i o n o f a p r e v i o u s l y u n r e p o r t e d p r o d u c t i o n , s p e c i fi c f o r t h e o r n i t h i n e l i p i d h e a d g r o u p a t m / z 1 3 1 i n n e g a t i v e i o n m o d e , h a v e b e e n e x a m i n e d . B a s e d o n t h e s e r e s u l t s , a n d b y c o m p a r i s o n w i t h t h e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f m o d e l l i p o a m i n o a c i d s t a n d a r d c o m p o u n d s , a s e r i e s o f n o v e l g l u t a m i n e c o n t a i n i n g l i p i d s h a v e a l s o b e e n I P a r t o f t h e r e s u l t s d e s c r i b e d i n t h i s c h a p t e r w e r e p u b l i s h e d i n J . A m . S o c . M a s s S p e c t r o m . 2 0 0 9 ; 2 0 : 1 9 8 - 2 1 2 ( Z h a n g X , F e r g u s o n - M i l l e r S M a n d R e i d G E ) . 1 9 8 i d e n t i fi e d , w i t h a n a l o g o u s s t r u c t u r e s , b u t w i t h m a s s e s 1 4 D a h i g h e r t h a n s e v e r a l o f t h e o r n i t h i n e l i p i d s o b s e r v e d i n t h i s s t u d y . C h a r a c t e r i s t i c ‘ fi n g e r p r i n t ’ i o n s i n d i c a t i v e o f t h e s e g l u t a m i n e l i p i d s w e r e f o u n d a t m / z 1 4 7 , 1 3 0 a n d 1 2 9 i n p o s i t i v e i o n m o d e , a n d a t m / z 1 4 5 a n d 1 2 7 i n n e g a t i v e i o n m o d e . T h e r e s u l t s f r o m t h i s s t u d y e s t a b l i s h a n e x p e r i m e n t a l b a s i s f o r fi x t u r e e f f o r t s a i m e d a t t h e s e n s i t i v e i d e n t i fi c a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n a n d q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f o r n i t h i n e a n d g l u t a m i n e l i p i d s i n c o m p l e x u n f r a c t i o n a t e d c e l l u l a r e x t r a c t s . 1 9 9 5 . 2 I n t r o d u c t i o n O r n i t h i n e l i p i d s ( 0 L ) b e l o n g t o a c l a s s o f f a t t y a c y l a t e d a m i n o a c i d s t h a t d o n o t c o n t a i n e i t h e r g l y c e r o l o r p h o s p h a t e . S i n c e t h e i r d i s c o v e r y o v e r 4 0 y e a r s a g o [ 2 6 2 - 2 6 4 ] , o r n i t h i n e l i p i d s h a v e b e e n f o u n d t o b e b r o a d l y d i s t r i b u t e d a m o n g ’ a n u m b e r o f g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a a n d s e v e r a l g r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a [ 7 ] . O r n i t h i n e l i p i d s a r e a l s o k n o w n t o b e p r e d o m i n a n t l y l o c a t e d i n t h e o u t e r m e m b r a n e s [ 2 6 5 ] a n d r e s i s t a n t t o p h o s p h o l i p a s e s [ 2 6 6 ] . H o w e v e r , t h e f u n c t i o n o f t h e O L s p e c i e s i n t h e s e b a c t e r i a r e m a i n s u n c l e a r . O r n i t h i n e l i p i d s c o n s t i t u t e d i f f e r e n t p r o p o r t i o n s o f t h e t o t a l m e m b r a n e l i p i d s d e p e n d i n g o n t h e i n d i v i d u a l b a c t e r i u m a n d g r o w t h c o n d i t i o n s , r a n g i n g f r o m a r o u n d 2 % i n m a n y b a c t e r i a g r o w n u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s , t o b e i n g n e a r l y t h e s o l e p o l a r l i p i d p r e s e n t u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t e d g r o w t h c o n d i t i o n s i n P s e u d o m o n a s fl u o r e s c e n s [ 2 6 7 ] . A n i n c r e a s e i n t h e a b u n d a n c e o f O L u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r t h c o n d i t i o n s , a l o n g w i t h s u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r i d e ( S Q D G ) a n d d i a c y l g l y c e r y l - N , N , N — t r i m e t h y l - h o m o s e r i n e ( D G T S ) l i p i d s , h a s a l s o b e e n o b s e r v e d i n R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s ( R . s p h a e r o i d e s ) , a s r e v e a l e d b y T L C u s i n g 1 4 C - l a b e l i n g q u a n t i fi c a t i o n [ 1 1 ] . I n S i n o r h i z o b i u m m e l i l o t i , e i t h e r 0 L o r D G T S a r e r e q u i r e d u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g c o n d i t i o n s t o e n s u r e n o r m a l c e l l y i e l d s [ 9 3 ] . A l s o i n S i n o r h i z o b i u m m e l i l o t i , a n 0 L g e n e t i c d e fi c i e n c y h a s b e e n s h o w n t o b e c o m p e n s a t e d f o r b y i n c r e a s e s i n p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( G P E t n ) / N - m e t h y l G P E t n , p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( G P C h o ) a n d p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ( G P G r o ) , a n d r e s u l t e d i n o n l y s u b t l e e f f e c t s o n t h e g r o w t h a n d d e l a y e d n o d u l e f o r m a t i o n [ 2 6 8 ] . O L s h a v e a l s o b e e n i m p l i c a t e d i n h i g h t e m p e r a t u r e t o l e r a n c e i n B u r k h o l d e r i a c e p a c i a [ 9 5 ] a n d i n a c i d t o l e r a n c e i n R h i z o b i u m t r o p i c i [ 2 6 9 ] . 2 0 0 O L S f r o m B o r d e t e l l a p e r t u s s i s a n d F l a v o b a c t e r i u m m e n i n g o s e p t i c u m h a v e b e e n s h o w n t o h a v e a n u m b e r o f b i o l o g i c a l f u n c t i o n s , i n c l u d i n g h e m a g g l u t i n a t i o n , a n d s t i m u l a t i o n o f m a c r o p h a g e s [ 2 6 6 , 2 7 0 - 2 7 2 ] . I t i s a l s o k n o w n t h a t 0 L i s c r i t i c a l t o o b t a i n i n g t h e o p t i m a l b i o s y n t h e t i c y i e l d s o f c y t o c h r o m e c s p e c i e s i n R h o d o b a c t e r c a p s u l a t u s [ 2 7 3 ] . F i n a l l y , 0 L h a s r e c e n t l y b e e n n o t e d t o b e o n e o f t h e l i p i d s p e c i e s t h a t r e m a i n a s s o c i a t e d t o t h e c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( C c O ) , a f t e r b e i n g p u r i fi e d a n d c r y s t a l l i z e d f r o m R . s p h a e r o i d e s ( C h a p t e r 9 ) . T o d a t e , o r n i t h i n e i s t h e o n l y t y p e o f n o n - g l y c e r o l n o n - p h o s p h a t e l i p o a m i n o a c i d r e p o r t e d t o b e p r e s e n t i n R . s p h a e r o i d e s [ 1 1 , 1 4 , 9 0 , 2 7 4 ] . H o w e v e r , l i p i d s c o n t a i n i n g l y s i n e , s e r i n e o r s e r i n e - g l y c i n e d i p e p t i d e s , w i t h a n a l o g o u s b a c k b o n e s t r u c t u r e s t o C L h a v e p r e v i o u s l y b e e n o b s e r v e d i n A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s [ 2 7 5 ] a n d F l a v o b a c t e r i u m m e n i n g o s e p t i c u m [ 2 7 0 , 2 7 2 ] . U n f o r t u n a t e l y , l i t t l e d e t a i l r e g a r d i n g t h e m o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f O L i n R . s p h a e r o i d e s i s a v a i l a b l e , w i t h p r i o r w o r k l i m i t e d t o t h e i r i d e n t i fi c a t i o n b a s e d o n t h e i r m i g r a t i o n p o s i t i o n o n T L C p l a t e s a n d t h e n i n h y d r i n - p o s i t i v e ( a m i n o g r o u p ) a n d m o l y b d a t e - n e g a t i v e ( n o p h o s p h a t e g r o u p ) s p r a y r e s u l t s [ 1 1 , 1 4 , 9 0 , 2 7 4 ] . O r n i t h i n e l i p i d s t y p i c a l l y c o n t a i n a n o r n i t h i n e h e a d g r o u p t h a t i s c o n n e c t e d v i a i t s N a — a m i n o g r o u p t o a 3 - O H f a t t y a c i d ( R 1 ) , w i t h a s e c o n d f a t t y a c i d c h a i n ( R 2 ) e s t e r i fi e d t o t h e 3 — O H g r o u p o f t h e fi r s t f a t t y a c i d ( S c h e m e 5 . 1 ) [ 7 , 9 5 , 1 0 2 , 1 0 6 , 1 0 7 , 2 6 3 - 2 7 2 , 2 7 6 - 2 8 2 ] . H o w e v e r , a n i n c r e a s e i n g r o w t h t e m p e r a t u r e fi ' o m 2 5 t o 4 0 ° C h a s a l s o b e e n s h o w n t o p r o m o t e t h e i n c o r p o r a t i o n o f a 2 — O H f a t t y a c y l g r o u p t o t h e s e c o n d f a t t y a c i d t o C L i n B u r k h o l d e r i a c e p a c i a [ 9 5 ] . F u r t h e r m o r e , t h e i n c o r p o r a t i o n o f 1 4 C - l a b e l e d o r n i t h i n e i n 2 0 1 R h i z o b i u m t r o p i c i r e v e a l e d f o u r d i f f e r e n t f o r m s o f 1 A ’ C — l a b e l e d l i p i d p r o d u c t s , t w o o f w h i c h w e r e a m i n o - n e g a t i v e i n n i n h y d r i n t e s t [ 2 6 9 ] . H O O H z N 0 R 1 " ) 1 N ) l \ / l \ 0 R 2 H E , _ _ . J R 1 S c h e m e 5 . 1 S c h e m a t i c s t r u c t u r e o f a n o r n i t h i n e l i p i d ( O L ) M a s s s p e c t r o m e t r y ( M S ) c o u p l e d w i t h e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ( E S I ) o r m a t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ( M A L D I ) h a s e m e r g e d a s a n a t t r a c t i v e m e t h o d t o a n a l y z e i n t a c t , n o n - v o l a t i l e , p o l a r l i p i d s , a n d i s b e i n g i n c r e a s i n g l y a p p l i e d t o a w i d e r a n g e o f l i p i d s t u d i e s [ 1 1 7 , 1 8 7 ] . H o w e v e r , d u e t o t h e i r m o l e c u l a r c o m p o s i t i o n a n d i o n i z a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s t o m a i n l y f o r m i o n s o f l o w c h a r g e s t a t e s u n d e r t h e t y p i c a l l y a p p l i e d e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s , t h e p r e c u r s o r i o n s f o r m o s t m e m b r a n e l i p i d s f a l l i n t o a r e l a t i v e l y n a r r o w m / z r a n g e b e t w e e n 6 0 0 — 1 6 0 0 D a , r e s u l t i n g i n s i g n i fi c a n t c r o w d i n g a n d p o t e n t i a l o v e r l a p p i n g o f p e a k s i n t h e r e s u l t a n t m a s s s p e c t r a , p a r t i c u l a r l y i n t h e r e g i o n o f m / z f r o m 6 0 0 t o 9 0 0 . T h e m a s s s p e c t r a a r e f u r t h e r c o m p l i c a t e d b y t h e p r e s e n c e o f v a r i o u s c a t i o n i c o r a n i o n i c a d d u c t s f r o m t h e l i p i d s t h a t m a y b e p r e s e n t i n t h e m i x t u r e ( e . g . , [ M + H ] + a n d [ M + N a ] + i n p o s i t i v e i o n m o d e , a n d [ M — H f , [ M + C l ] _ o r [ M + C H 3 0 C 0 2 1 ‘ i n n e g a t i v e i o n m o d e ) [ 1 1 7 , 1 8 7 ] , a s w e l l a s b y t h e p r e s e n c e o f m u l t i p l e l i p i d i s o m e r s w i t h i d e n t i c a l e l e m e n t a l c o m p o s i t i o n s a t a g i v e n m / z v a l u e , u n d i s t i n g u i s h a b l e e v e n b y h i g h M S r e s o l u t i o n . T h e r e f o r e , t h e u s e o f t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ( M S / M S ) o r m u l t i s t a g e 2 0 2 t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ( M S n ) i s g e n e r a l l y r e q u i r e d t o u n a m b i g u o u s l y i d e n t i f y a n d c h a r a c t e r i z e t h e i n d i v i d u a l l i p i d s p e c i e s t h a t m a y b e p r e s e n t , b a s e d o n t h e c h a r a c t e r i s t i c p r o d u c t i o n s t h a t a r e f o r m e d u p o n f r a g m e n t a t i o n . N u m e r o u s p r e v i o u s s t u d i e s h a v e b e e n c a r r i e d o u t t o e x a m i n e t h e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f O L [ 1 0 2 , 1 0 6 , 1 0 7 , 2 6 8 , 2 7 3 , 2 8 0 - 2 8 2 ] . F r o m t h e s e s t u d i e s , a c h a r a c t e r i s t i c l o w m a s s p r o d u c t i o n a t m l z 1 1 5 , r e s u l t i n g f r o m t h e d i s s o c i a t i o n o f p r o t o n a t e d O L i n p o s i t i v e i o n i z a t i o n m o d e M S I M S , a n d c o r r e s p o n d i n g t o t h e f o r m a t i o n o f a 3 - a m i n o - 2 - o x o p i p e r i d i n i u m i o n , h a s b e e n c o n s i s t e n t l y o b s e r v e d [ 1 0 2 , 1 0 6 , 2 6 8 , 2 7 3 , 2 8 0 , 2 8 1 ] . T h i s i o n m a y t h e r e f o r e b e c o n s i d e r e d a ‘ fi n g e r p r i n t ’ i o n f o r o r n i t h i n e l i p i d i d e n t i fi c a t i o n . H o w e v e r , t h i s p r o d u c t i o n i s n o t g e n e r a l l y o b s e r v e d d u e t o t h e i n h e r e n t l o w m a s s c u t o f f ( L M C O ) i m p o s e d o n p r o d u c t i o n d e t e c t i o n w h e n p e r f o r m i n g c o l l i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ( C I D ) — M S / M S i n q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r s u n d e r t y p i c a l o p e r a t i n g c o n d i t i o n s . I n t h i s c a s e , f u r t h e r d i s s o c i a t i o n ( i . e . , M S ” ) o f t h e h i g h m a s s p r o d u c t i o n s t h a t a r e i n i t i a l l y f o r m e d d u r i n g M S / M S m a y b e r e q u i r e d t o p r o v i d e i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e p r e s e n c e a n d i d e n t i t y o f t h e O L s p e c i e s . W i t h t h e e x c e p t i o n o f a s i n g l e r e p o r t i n t h e l i t e r a t u r e [ 1 0 2 ] , l i t t l e i n f o r m a t i o n i s a v a i l a b l e r e g a r d i n g t h e n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e C I D M S / M S f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f O L s p e c i e s . A n i m p r o v e d u n d e r s t a n d i n g o f t h e f u n d a m e n t a l g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f o r n i t h i n e l i p i d s u s i n g m o d e r n m a s s s p e c t r o m e t r y i n s t r u m e n t a t i o n , i n b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e s , i s t h e r e f o r e c r i t i c a l t o t h e d e v e l o p m e n t o f s e n s i t i v e u n e q u i v o c a l i d e n t i fi c a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n a n d q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s s t r a t e g i e s f o r t h i s c l a s s o f l i p i d m o l e c u l e , a n d f o r s u b s e q u e n t l y d e t e r m i n i n g t h e i r f u n c t i o n a l r o l e s . T h e 2 0 3 r e s u l t s f r o m t h e s e s t u d i e s c o u l d a l s o b e a p p l i e d t o e l u c i d a t i o n o f t h e p r e s e n c e a n d s t r u c t u r e s o f o t h e r l i p o a m i n o a c i d s p e c i e s t h a t m a y b e p r e s e n t . H e r e i n , t h e s e q u e n t i a l fi a g m e n t a t i o n p a t h w a y s r e s p o n s i b l e f o r f o r m a t i o n o f t h e d i a g n o s t i c o r n i t h i n e l i p i d s p e c i fi c p r o d u c t i o n a t m / z 1 1 5 i n p o s i t i v e i o n i z a t i o n m o d e , a s w e l l a s f o r t h e f o r m a t i o n o f a r e l a t e d ‘ fi n g e r p r i n t ’ i o n f o r o r n i t h i n e l i p i d s a t m / z 1 3 1 i n n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e , h a v e b e e n d e l i n e a t e d . T h e i d e n t i t i e s o f t h e m a j o r o r n i t h i n e l i p i d s i s o l a t e d f r o m t h e c e l l m e m b r a n e s o f w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s , a s w e l l a s f r o m a G P C h o d e fi c i e n t s t a i n , h a v e b e e n d e t e r m i n e d u s i n g m u l t i s t a g e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y i n a l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r , c o u p l e d w i t h a n a l y s i s o f t h e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f m o d e l l i p o a m i n o a c i d s t a n d a r d s . F u r t h e r m o r e , s e v e r a l n o v e l g l u t a m i n e - c o n t a i n i n g l i p i d s h a v e b e e n i d e n t i fi e d i n e a c h o f t h e s e s a m p l e s . C h a r a c t e r i s t i c p r o d u c t i o n s , i n d i c a t i v e o f t h e g l u t a m i n e l i p i d s p e c i e s , h a v e b e e n i d e n t i fi e d a t m / z 1 2 9 , 1 3 0 a n d 1 4 7 i n p o s i t i v e i o n i z a t i o n m o d e , a n d a t m / z 1 2 7 a n d 1 4 5 i n n e g a t i v e i o n m o d e . 5 . 3 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 5 . 3 . 1 E S I - M S o f w i l d t y p e a n d G P C h o - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s M a s s s p e c t r a o f m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s o b t a i n e d f r o m w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s , a s w e l l a s f r o m a G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t o f R . s p h a e r o i d e s , a c q u i r e d i n b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e s a r e s h o w n i n F i g u r e s 5 . 1 A a n d 5 . 1 B , a n d i n F i g u r e s 5 . 1 C a n d 5 . 1 D , r e s p e c t i v e l y . A s t h e l i p i d e x t r a c t s e x a m i n e d h e r e w e r e c o m p r i s e d o f c o m p l i c a t e d m i x t u r e s , a n d w e r e i n t r o d u c e d t o t h e m a s s s p e c t r o m e t e r w i t h o u t p r i o r s e p a r a t i o n , t h e m / z v a l u e s o f i n d i v i d u a l i o n s c o u l d c o r r e s p o n d t o a n u m b e r o f d i f f e r e n t 2 0 4 m o l e c u l a r c o m p o s i t i o n s . T h u s , a l l l i p i d s w h o s e p r e c u r s o r i o n s h a d n o r m a l i z e d r e l a t i v e a b u n d a n c e s h i g h e r t h a n 1 % i n t h e m a s s s p e c t r u m w e r e s u b j e c t e d t o a n a l y s i s b y u s i n g C I D M S n i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e i r i d e n t i t i e s . T h e i d e n t i t i e s o f s e v e r a l o f t h e m a j o r l i p i d s o b s e r v e d i n t h e m o s t a b u n d a n t i o n s i n t h e s e s p e c t r a a r e l a b e l e d i n F i g u r e 5 . 1 . T h e f o c u s o f t h e s t u d y d e s c r i b e d i n t h i s c h a p t e r h o w e v e r , w a s a s e r i e s o f o d d m / z i o n s , i n c l u d i n g t h e i t a l i c i z e d a n d u n d e r l i n e d i o n s a t m / z 7 0 5 , m / z 7 1 9 a n d m / z 7 3 1 i n p o s i t i v e i o n m o d e , a n d a t m / z 7 0 3 , m / z 7 1 7 a n d m / z 7 2 9 i n n e g a t i v e i o n m o d e . A c c o r d i n g t o t h e n i t r o g e n r u l e , t h e s e i o n s s h o u l d c o n t a i n z e r o o r a n e v e n n u m b e r o f n i t r o g e n a t o m s , a n d t h e r e f o r e c o u l d c o r r e s p o n d t o p u t a t i v e p r o t o n a t e d a n d d e p r o t o n a t e d i o n s f o r v a r i o u s 0 L s p e c i e s , r e s p e c t i v e l y . A c o m p a r i s o n o f t h e s p e c t r a o b t a i n e d f r o m t h e w i l d t y p e a n d t h e G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t l i p i d e x t r a c t s i n d i c a t e d a n a p p a r e n t i n c r e a s e o f t h e r e l a t i v e a b u n d a n c e s o f v a r i o u s i o n s i n t h e G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t , i n c l u d i n g t h e p u t a t i v e o r n i t h i n e l i p i d i o n s . P r e v i o u s l y , i n t h e a b s e n c e o f o v e r - e x p r e s s i o n o f C c O , t h e G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t s h o w e d n o i n c r e a s e i n 0 L c o n t e n t , a s q u a n t i fi e d b y T L C w i t h 1 4 C l a b e l i n g [ 9 0 ] . M o r e r e c e n t l y , s i m i l a r s t u d i e s u s i n g m a s s s p e c t r o m e t r y h a v e b e e n c a r r i e d o u t t o c o m p a r e t h e w i l d t y p e a n d G P C h o - d e fi c i e n t s t r a i n s w h e n C c O i s o v e r - e x p r e s s e d i n t h e s e s y s t e m s ( C h a p t e r 7 ) . H e r e , i t w a s n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e i f t h e o b s e r v e d c h a n g e s i n a b u n d a n c e s f o r t h e p u t a t i v e o r n i t h i n e l i p i d i o n s b e t w e e n t h e w i l d t y p e a n d G P C h o - d e fi c i e n t s t r a i n s , o b t a i n e d w i t h C 0 0 o v e r - e x p r e s s i o n , w a s r e fl e c t i v e o f r e a l c h a n g e s i n t h e i r c o n c e n t r a t i o n s , o r w h e t h e r t h e a p p a r e n t i n c r e a s e s w e r e s i m p l y d u e t o t h e r e m o v a l o f i o n i z a t i o n s u p p r e s s i o n e f f e c t s i n t h e G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t , d u e t o t h e u n a v a i l a b i l i t y o f a u t h e n t i c o r n i t h i n e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s . R e g a r d l e s s o f t h i s l i m i t a t i o n , i t w a s o f 2 0 5 p a r t i c u l a r i n t e r e s t t o d e t e r m i n e t h e p r e s e n c e a n d s t r u c t u r a l c o m p o s i t i o n o f t h e o r n i t h i n e l i p i d s i n t h e s e s a m p l e s , a n d t o d e v e l o p a c o m p r e h e n s i v e u n d e r s t a n d i n g o f t h e i r f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s u s i n g M S 1 1 f o r u s e i n f u r t h e r i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n a p p l i c a t i o n s . T h e h i g h e r i o n a b u n d a n c e s o f t h e s e i o n s i n t h e G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t m a d e i t t h e s a m p l e o f c h o i c e i n w h i c h t o i n v e s t i g a t e t h e s e s p e c i e s . H o w e v e r , t h e c o r r e s p o n d i n g i o n s i n t h e w i l d t y p e l i p i d e x t r a c t w e r e a l s o e x a m i n e d i n p a r a l l e l . 2 0 6 S P C h ° ( 1 8 : l / 1 8 2 1 ) 1 . 6 8 e 5 1 0 0 A ( + ) M S G P E t n ( 7 1 8 z l / 1 8 : 1 ) G P C h o ( 1 8 : 1 / 1 9 : 1 ) 8 0 W T 4 4 8 0 0 + 6 0 G P C h o ( 1 8 : 1 / 1 8 : 1 ) + K 4 7 0 5 7 _ 1 9 7 6 6 7 8 3 8 . 0 8 8 4 2 8 6 9 1 7 0 3 8 - 7 1 I 6 : 7 _ 3 1 7 5 8 8 7 2 3 I I 8 7 9 9 . 0 1 . ‘ 4 « ‘ 1 1 . . L I L L L k 8 3 8 L L 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 A 2 . 2 0 e 5 7 4 4 . , \ ° 1 0 0 B ( + ) M S ‘ 0 ; 8 0 G P C h o - D e fi c i e n t O 5 6 0 M 1 , 1 _ 7 6 6 7 8 2 8 7 9 “ U 4 0 I ‘ I ' a . _ 7 l 6 ; 5 ' : ‘ 5 ‘ 2 0 6 9 1 : 0 3 " I I I — 3 1 7 5 8 : i 2 0 1 g 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 G 7 P 3 G r o 8 5 0 9 0 0 9 5 0 E 3 . 7 8 e 4 G P E t n ( 1 8 - 1 / 1 7 8 - 2 1 ) 7 8 ( 1 8 1 / 1 8 1 ) S Q D G ( 1 6 : 0 / 1 8 : 0 ) £ 1 8 8 3 5 1 — m s C L ( 1 8 : 1 § 4 7 . 7 3 ; ; S Q D G ( 1 5 0 / 1 6 0 ) _ : 1 . . S Q D G ( 1 8 1 / 1 8 1 ) 7 2 , 7 8 S Q g D G 4 0 — — — . ; 7 2 9 , ( l 8 : 0 / 1 8 : 1 ) 7 0 1 7 1 4 . 5 _ { 7 5 6 . 8 : 9 , 4 I , » 4 7 2 0 6 8 9 3 ‘ I V { 1 ? V a 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 5 3 6 6 4 7 7 3 1 0 0 D ( — ) M S 7 4 2 8 0 G P C h o - D e fi c i e n t — I Z 8 1 9 8 4 7 7 9 3 3 8 2 1 8 4 1 . } 8 4 , 8 6 2 J ; A . L A } 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 F i g u r e 5 . 1 P o s i t i v e E S I M S o f c r u d e l i p i d e x t r a c t s i s o l a t e d f r o m t h e c e l l m e m b r a n e s o f ( A ) w i l d t y p e a n d ( B ) G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t R . s p h a e r o i d e s ( b o t h w i t h C c O o v e r - e x p r e s s i o n ) . T h e n e g a t i v e i o n m o d e E S I M S s p e c t r a a r e s h o w n i n p a n e l s ( C ) a n d ( D ) , r e s p e c t i v e l y . O n l y t h o s e i o n s w i t h i n t h e s e l e c t e d m / z r a n g e o f i n t e r e s t ( 6 0 0 — 9 5 0 ) a r e d i s p l a y e d . T h e i t a l i c u n d e r l i n e d n u m b e r s r e p r e s e n t i o n s o f i n t e r e s t t o t h i s s t u d y . 2 0 7 5 . 3 . 2 I d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f o r n i t h i n e l i p i d s i n R . s p h a e r o i d e s b y u s i n g p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e M S n T h e M S / M S a n d M S n s p e c t r a f o r t h e i o n a t m / z 7 3 1 i n p o s i t i v e i o n m o d e , a n d f o r t h e c o r r e s p o n d i n g i o n a t m / z 7 2 9 i n n e g a t i v e i o n m o d e o b s e r v e d i n t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t o f t h e G P C h o - d e fi c i e n t s t r a i n o f R . s p h a e r o i d e s a r e s h o w n i n F i g u r e s 5 . 2 a n d 5 . 3 , r e s p e c t i v e l y . F i g u r e 5 . 2 A s h o w s t h e p o s i t i v e i o n m o d e M S / M S f o r m / z 7 3 1 . I n t h i s s p e c t r u m , t h e m o s t a b u n d a n t p r o d u c t i o n o b s e r v e d a b o v e t h e l o w m a s s c u t o f f o f m / z 1 6 0 ( a t a n a p p l i e d a c t i v a t i o n q v a l u e o f 0 . 2 ) w a s m / z 7 1 3 , f o r m e d v i a t h e l o s s o f w a t e r f r o m t h e p r o t o n a t e d p r e c u r s o r i o n ( S c h e m e 5 . 1 ) . T h e o t h e r a b u n d a n t p r o d u c t i o n s i n t h i s s p e c t r u m p r o v i d e d i n f o r m a t i o n o n t h e f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n o f t h e p r e c u r s o r i o n , w h i c h w a s m o r e c l e a r l y r e v e a l e d b y M S 3 a n a l y s i s o f t h e [ M + H — H 2 0 ] + p r o d u c t i o n . T h i s i o n u n d e r w e n t f u r t h e r f r a g m e n t a t i o n v i a ( i ) t h e l o s s o f a 2 0 : 2 R 2 f a t t y a c i d c h a i n a s a n e u t r a l k e t e n e ( - R 2 ' C H = C = O , m / z 4 2 3 ) , w h e r e 2 0 a n d 2 r e p r e s e n t t h e n u m b e r o f c a r b o n s a n d t h e n u m b e r o f r i n g s a n d d o u b l e b o n d s r e s p e c t i v e l y . ( i i ) t h e c o m b i n e d l o s s o f R Z ' C H = C = O + H 2 0 o r t h e l o s s o f a n e u t r a l f a t t y a c i d ( R 2 C O O H ) ( m / z 4 0 5 ) , a n d ( i i i ) t h e c o m b i n e d l o s s o f R 2 C 0 0 H + H 2 0 ( m / z 3 8 7 ) ( F i g u r e 5 . 2 8 ) . F u r t h e r d i s s o c i a t i o n o f t h e [ M + H — H 2 0 - R 2 ' C H = C = O ] + ( m / z 4 2 3 ) p r o d u c t i o n f r o m F i g u r e 5 . 2 A l e d t o t h e d o m i n a n t l o s s o f H 2 0 t o y i e l d t h e p r o d u c t i o n a t m / z 4 0 5 ( F i g u r e 5 . 2 C ) . M S 3 o f t h e m / z 4 0 5 p r o d u c t i o n o b s e r v e d i n F i g u r e 2 A w a s t h e n u s e d t o d e m o n s t r a t e t h a t t h i s i o n u n d e r w e n t f u r t h e r d i s s o c i a t i o n v i a t h e l o s s o f a n e u t r a l k e t e n e ( 2 0 : 1 R 1 " C H = C = C = O ) t o y i e l d t h e 2 0 8 c h a r a c t e r i s t i c ‘ fi n g e r p r i n t ’ i o n f o r t h e o r n i t h i n e l i p i d a t m / z 1 1 5 ( i . e . , [ o r n i t h i n e — H 2 0 + H ] + ) ( F i g u r e 5 . 2 D ) . T h u s , t h e s t r u c t u r e o f t h e o r n i t h i n e l i p i d i o n a t m / z 7 3 1 i s p r o p o s e d t o c o r r e s p o n d t o O L 3 - O H 2 0 : 1 / 2 0 : 2 ( n o t e t h a t t h e a c y l c h a i n d e s i g n a t i o n s f o r t h e O L ( e . g . , O L 3 - O H 2 0 : 1 / 2 0 2 2 ) a r e l i s t e d i n t h e o r d e r o f R 1 a n d R 2 ) . T o c o n fi r m i t s i d e n t i t y , t h e p r o d u c t i o n a t m / z 1 1 5 w a s s u b j e c t e d t o f u r t h e r d i s s o c i a t i o n b y M 8 4 ( F i g u r e 5 . 2 E ) , a n d w a s c o m p a r e d t o t h e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f t h e [ M + H - H 2 0 ] + o r [ M + H - H z O - C H 2 C O ] + p r o d u c t i o n s f o r m e d b y M S / M S o r M S 3 o f t h e [ M + H ] + p r e c u r s o r i o n s o f a u t h e n t i c o r n i t h i n e ( F i g u r e 5 . 4 B ) o r N a - a c e t y l - o m i t h i n e ( F i g u r e 5 . 5 C ) s t a n d a r d s , r e s p e c t i v e l y . T h e r e s u l t a n t s p e c t r a , r e v e a l i n g t h e l o s s e s o f N H 3 ( m / z 9 8 ) , H 2 0 ( m / z 9 7 ) , C O ( m / z 8 7 ) a n d N H 3 + C O ( m / z 7 0 ) , w e r e i d e n t i c a l , t h e r e b y p r o v i d i n g c o m p e l l i n g e v i d e n c e f o r i t s s t r u c t u r e . F u r t h e r e v i d e n c e f o r t h e i d e n t i t y o f t h i s o r n i t h i n e l i p i d w a s p r o v i d e d b y o b s e r v i n g t h e i n c o r p o r a t i o n o f fi v e d e u t e r i u m a t o m s u p o n H / D e x c h a n g e a n d M S a n a l y s i s o f t h i s i o n ( i . e . , m / z 7 3 1 w a s o b s e r v e d t o s h i f t t o m / z 7 3 6 ) . H o w e v e r , a s e x t e n s i v e d e u t e r i u m s c r a m b l i n g o f t h e d e u t e r a t e d p r e c u r s o r i o n u p o n C I D M S / M S , p r e s u m a b l y r e s u l t i n g f r o m e x c h a n g e b e t w e e n t h e d e u t e r i u m a t o m s i n t h e a m i n o a n d a m i d e g r o u p s w i t h t h e C a h y d r o g e n a t o m s i n t h e b a c k b o n e , w a s o b s e r v e d , a s e v i d e n c e d b y t h e l o s s e s o f H 2 0 , H O D , a n d D 2 0 , f u r t h e r m e c h a n i s t i c d e t a i l s r e g a r d i n g t h e s e l o s s e s c o u l d n o t b e o b t a i n e d . T h u s , w h i l e S c h e m e 5 . 2 s h o w s a p o t e n t i a l p a t h w a y f o r f o r m a t i o n o f t h e i o n a t m / z 1 1 5 , v i a t h e ‘ c h a r g e - d i r e c t e d ’ l o s s o f w a t e r f r o m t h e [ M + H ] + p r e c u r s o r i o n , f o l l o w e d b y t h e ‘ c h a r g e - r e m o t e ’ s e q u e n t i a l l o s s e s o f k e t e n e 2 0 9 ( — R 2 ' C H = C = O ) , w a t e r a n d k e t e n e ( R 1 " C H = C = C = O ) , a l t e r n a t e c h a r g e - r e m o t e a n d c h a r g e - d i r e c t e d p a t h w a y s c a n n o t b e r u l e d o u t . 2 1 0 F i g u r e 5 . 2 I d e n t i fi c a t i o n o f o r n i t h i n e l i p i d ( O L 3 - O H 2 0 : 1 / 2 0 2 2 ) a t m / z 7 3 1 fi ' o m F i g u r e 5 . 1 B b y p o s i t i v e i o n C I D M S / M S a n d M S “ . ( A ) M S / M S o f m / z 7 3 1 , ( B ) M S 3 o f m / z 7 1 3 f r o m p a n e l A , ( C ) M S 3 o f m / z 4 2 3 f r o m p a n e l A , ( D ) M S 3 o f m / z 4 0 5 f r o m p a n e l A , a n d ( E ) M S 4 o f m / z 1 1 5 f r o m p a n e l D . 2 1 1 J U [ m ’ z 7 3 ] f r } : 1 1 ( B ) M S : c f i f m ' Z 4 0 5 8 5 " ” — ( 2 0 : 2 R 2 C 0 0 H + H 2 0 ) - H o 6 e 3 2 1 0 0 A ( + ) M S / M S 4 0 5 7 1 3 7 3 1 8 0 — ( 2 0 : 2 R 2 C 0 0 H + 2 H 2 0 ) + 3 8 7 — ( 2 0 : 2 R Z ' C H = C = O + H 2 0 ) — 2 H 2 0 6 0 [ 2 0 : 2 R Z ' C H = C = O + H ] \ 4 2 3 _ . _ _ 6 9 5 + 2 0 - . 3 0 9 . , 5 4 4 1 5 9 9 7 3 1 I F f l u “ s " ‘ 9 , i 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 5 _ 2 6 e 2 — 2 0 : 2 R Z C O O H 7 3 1 1 0 0 - B ( + ) M s 3 4 0 5 — H 2 0 8 0 ; — ( 2 0 : 2 R 2 c 0 0 H + H 5 2 8 C ; ) + 1 2 0 7 1 3 6 0 : [ 2 0 2 2 1 1 ' C H = C = O + H ] + — 2 0 : 2 R ' C H = C = O 6 9 5 4 0 - 2 2 9 1 3 6 3 3 ‘ 4 2 3 2 - 0 m _ ( O m _ H 2 0 ) 2 0 : \ 3 0 9 I ' 1 5 8 1 5 9 9 ( ‘ 7 1 3 § - . L . K j 1 . I . x I v " 1 . i . 8 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 9 9 1 O 8 0 0 E 3 9 2 8 2 3 7 3 1 4 0 2 5 S 1 0 0 C ( + ) M S — ( 2 0 : 2 R Z ' C H = C = O + H 2 0 ) 4 2 3 ' 2 2 3 [ O r n + H - H 2 0 ] + _ 2 H 2 0 a . ) 1 1 5 _ ( 0 m — H 2 0 ) 3 8 7 3 1 4 1 3 0 9 \ 4 2 3 E 2 0 1 5 7 , - 3 6 0 i g I ‘ I l I I I 7 I 1 Y I I 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 H 4 8 0 4 5 0 6 . 4 5 e 2 7 3 1 3 8 2 7 1 0 0 D ( + ) M 5 3 — ( 2 0 : 2 R 2 c 0 0 H + H 2 0 ) 0 5 8 0 _ + — C H = c = o 6 0 [ O r n + H H 2 0 ] _ ( O m _ H 2 0 ) 2 3 6 3 2 0 9 7 2 7 3 \ I 3 5 9 V I 4 0 5 5 1 " I ' 1 8 4 ‘ ] i 1 0 0 ( 1 1 1 % 0 + C O ) 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 1 . 4 0 e 2 _ 3 7 3 1 4 — ( 2 0 : 2 R C O O H + H 0 ) 1 0 0 E ( + ) M S 0 5 2 2 8 0 1 1 5 — 2 0 1 R 1 " C H = C = C = O 4 0 ” C O 9 7 3 H 3 1 1 5 2 0 I I fi r 8 1 . l ‘ I , I . I . I 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 m / z 2 1 2 H H 1 H fi H V Q o M S I M S H H — o n 0 0 H ’ “ N V N M O j ) J \ R 2 H + t r a n s f e r H N M O k R z m / z 7 3 1 H 1 - H 2 0 N O 1 1 % . » . [ 4 1 2 8 / 0 s z H m / I : 4 2 3 H m / Z 7 1 3 l _ H 2 0 H \ , H H . , H ( ” I 0 0 — R 1 " C H = C = C = O G I G 8 1 l e " N H 2 m / z 4 0 5 m / z 1 1 5 S c h e m e 5 . 2 P r o p o s e d p a t h w a y s f o r t h e m u l t i s t a g e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f p r o t o n a t e d o r n i t h i n e l i p i d s F i g u r e 5 . 3 s h o w s t h e M S / M S a n d M S 3 s p e c t r a o b t a i n e d b y d i s s o c i a t i o n o f t h e d e p r o t o n a t e d [ M - H ] ' p r e c u r s o r i o n a t m / z 7 2 9 f r o m t h e G P C h o - d e fi c i e n t s t r a i n o f R . s p h a e r o i d e s . T h e M S / M S s p e c t r u m ( F i g u r e 5 . 3 A ) w a s d o m i n a t e d b y t h e l o s s o f a n e u t r a l 2 0 : 2 f a t t y a c i d ( R 2 C O O H , m / z 4 2 1 ) , c o n s i s t e n t w i t h t h a t o b s e r v e d f r o m t h e p o s i t i v e i o n m o d e d a t a . T h i s l o s s i s p r o p o s e d i n S c h e m e 5 . 3 t o o c c u r v i a c h a r g e d n e i g h b o r i n g g r o u p - 2 1 3 a s s i s t e d c i s - l , 2 e l i m i n a t i o n r e a c t i o n . T h i s p r o p o s e d m e c h a n i s m w a s s u p p o r t e d b y t h e r e s u l t s f r o m M S / M S o f t h e f u l l y H / D e x c h a n g e d p r e c u r s o r i o n ( 3 e x c h a n g e s o b s e r v e d ) , w h e r e t h e l o s s o f R Z C O O H w a s p r e d o m i n a n t l y o b s e r v e d , r a t h e r t h a n R 2 C O O D ( d a t a n o t s h o w n ) , i n d i c a t i n g t h a t i t i s t h e C a l - p r o t o n t h a t i s m a i n l y i n v o l v e d r a t h e r t h a n t h e e x c h a n g e a b l e o n e s . S u b s e q u e n t M S 3 o f t h e m / z 4 2 1 p r o d u c t i o n f r o m t h e p r o t o n a t e d p r e c u r s o r i o n r e s u l t e d i n t h e l o s s o f C 0 2 ( m / z 3 7 7 ) , a s w e l l a s t h e l o s s o f a n e u t r a l k e t e n e ( - R 1 " C H = C = C = O ) o r i g i n a t i n g f r o m t h e 3 — O H 2 0 : 1 f a t t y a c i d , t h e r e b y y i e l d i n g a p r o d u c t i o n a t m / z 1 3 1 t h a t c o r r e s p o n d s t o d e p r o t o n a t e d o r n i t h i n e ( F i g u r e 5 . 3 B ) . A s u g g e s t e d p a t h w a y f o r t h e s e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s , c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s r e p o r t s i n t h e l i t e r a t u r e d e s c r i b i n g t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f d e p r o t o n a t e d a m i n o a c i d s [ 1 8 3 , 2 8 3 , 2 8 4 ] , i s s h o w n i n S c h e m e 5 . 3 . T h e f o r m a t i o n o f t h e m / z 1 3 1 i o n i n n e g a t i v e i o n m o d e i s a l s o c o n s i s t e n t w i t h t h e s e q u e n t i a l f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o b s e r v e d f o r t h e c o r r e s p o n d i n g p r e c u r s o r i o n i n p o s i t i v e i o n m o d e a n a l y s i s . A l s o , M S 4 o f t h e m / z 1 3 1 p r o d u c t i o n ( F i g u r e 5 . 3 C ) r e s u l t e d i n i d e n t i c a l s p e c t r a t o t h o s e o b t a i n e d b y M S / M S o r M S 3 o f d e p r o t o n a t e d o r n i t h i n e o r N a - a c e t y l o r n i t h i n e s t a n d a r d s , r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e 5 . 4 C a n d F i g u r e 5 . 5 E ) , t h e r e b y c o n fi r m i n g i t s i d e n t i t y . A n a l y s i s o f t h e c o m p l e m e n t a r y p a i r o f p r e c u r s o r i o n s o b s e r v e d a t m / z 7 3 1 a n d m / z 7 2 9 i n p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e s , a s w e l l a s c o m p a r i s o n o f t h e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f t h e i r c h a r a c t e r i s t i c ‘ fi n g e r p r i n t ’ i o n s o b s e r v e d a t m / z 1 1 5 a n d m / z 1 3 1 , r e s p e c t i v e l y , w i t h t h o s e o f a u t h e n t i c o r n i t h i n e o r N a — a c e t y l o r n i t h i n e s t a n d a r d s , p r o v i d e i n s i g h t s i n t o t h e m u l t i s t a g e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f o r n i t h i n e l i p i d s , 2 1 4 t h e r e b y m a k i n g p o s s i b l e t h e r a p i d a n d u n a m b i g u o u s a s s i g n m e n t o f t h e s e s p e c i e s i n a n u n s e p a r a t e d c o m p l e x l i p i d m i x t u r e , w i t h o u t r e q u i r e m e n t f o r i n d e p e n d e n t s y n t h e s i s o f a n e n t i r e O L l i p i d s t a n d a r d . — 2 0 : 2 R Z C O O H 5 . 3 9 e 2 4 2 1 7 2 9 1 0 0 A ( — ) M S I M S g 8 0 6 0 — 2 0 : 2 R ' C H = C = O _ 4 0 4 : 9 2 ) 2 H 2 0 [ M - H l ' 6 9 3 2 0 . . 7 2 9 : \ ° ‘ - . . ' . . L 1 . 2 , “ 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 0 — C 0 2 5 8 . 0 9 e 1 3 7 2 9 3 7 7 a 1 0 0 B ( - ) M S _ - 2 o : 2 R Z C O O H B 3 0 [ O m — H ] 4 2 1 < 6 0 [ O m ‘ l i ‘ 3 1 — ( C o z + H 2 0 ) — H 2 0 0 4 0 ‘ H 2 0 1 - ( O m - 2 H ) — 0 m 3 6 0 4 0 3 > 1 1 3 _ - . . ' 5 2 0 2 6 6 2 9 1 2 9 3 3 4 2 1 g . ¥ i s s . ” - 4 , - ‘ w 3 : . M 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 2 . 3 7 2 2 2 0 : 2 R C O O H 1 3 1 1 0 0 C ( — ) M s 4 4 2 1 2 _ H o 8 0 3 — 2 0 : 1 R 1 " C H = C = C = O 1 1 2 3 6 0 - ( H 2 0 + C O ) “ N H 3 4 0 1 1 4 _ _ — 2 H 2 0 ; 6 ' 0 ' 8 ' 0 1 1 6 0 ' 1 ' 2 0 1 4 0 m / z F i g u r e 5 . 3 I d e n t i fi c a t i o n o f o r n i t h i n e l i p i d ( O L 3 - O H 2 0 : 1 / 2 0 : 2 ) ( m / z 7 2 9 ) f r o m F i g u r e 5 . 1 D b y n e g a t i v e i o n C 1 D M S / M S a n d M S n . ( A ) M S / M S o f m / z 7 2 9 , ( B ) M S 3 o f m / z 4 2 1 f r o m p a n e l A , a n d ( C ) M S 4 o f m / z 1 3 1 f r o m p a n e l B . 2 1 5 T h e o r n i t h i n e h e a d g r o u p i n t h e s t r u c t u r e s s h o w n i n S c h e m e s 5 . 2 a n d 5 . 3 a r e l i n k e d t o t h e f a t t y a c i d c h a i n v i a a n N a a m i d e b o n d , c o n s i s t e n t w i t h t h e s t r u c t u r e s o f O L p r e v i o u s l y p r o p o s e d f o r o t h e r b a c t e r i a . T h e l i n k a g e o f t h e o r n i t h i n e h e a d g r o u p t o t h e f a t t y a c i d s c o u l d a l s o p o t e n t i a l l y o c c u r b y f o r m i n g a n N 5 a m i d e b o n d . H o w e v e r , d i s s o c i a t i o n o f t h i s s p e c i e s w o u l d n o t r e s u l t i n t h e s a m e p r o d u c t i o n s o b s e r v e d h e r e b y M S / M S a n d M 8 3 i n e i t h e r p o s i t i v e o r n e g a t i v e i o n m o d e s . F o r e x a m p l e , C I D M S / M S o f p r o t o n a t e d a m i n o a c i d s c o n t a i n i n g a f r e e a - a m i n o g r o u p a r e w e l l k n o w n t o r e s u l t i n t h e c o m b i n e d l o s s o f H 2 0 a n d C O ( 4 6 D a ) , t h e r e b y a l l o w i n g i t t o b e d i s r e g a r d e d . 2 1 6 O m / z H 7 2 9 M S I M S l : - R 2 C 0 0 H H O a O H “ L T Q ; m / z H 4 2 1 O — C 0 2 1 , l — R 1 " C H = C = C = O H I ‘ 1 r - \ O ‘ H c . e ‘ i a a — » d N H H + t r a n s f e r m / z l 3 l . 1 * 3 N ( ' 0 H + t r a n s f e r 0 3 o * — - * 1 7 1 - H m / z l l 3 S c h e m e 5 . 3 P r o p o s e d p a t h w a y s f o r t h e m u l t i s t a g e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f d e p r o t o n a t e d o r n i t h i n e l i p i d s _ _ . “ L A P , O \ H + N H 2 f \ _ / \ N / 0 - m / z 3 7 7 t r a n s f e r m / z 3 7 7 H \ , H o o - N N H 2 m / z 1 3 1 m / 2 1 1 3 2 1 7 [ 0 m + H — H 2 0 1 + 1 . 5 2 8 6 1 1 5 + 1 0 0 . A ( + ) M S / M S [ 0 m + H - N H 3 ] . , 1 1 6 8 0 3 1 3 3 ‘ 6 0 : g 4 0 : 2 0 ‘ . . f ' fl j I . f ' $ 9 6 0 _ ( N H 3 2 % ) 1 0 0 1 2 0 1 4 0 3 7 . 5 2 e 5 3 7 0 3 g 1 0 0 ; N H M S ' 2 8 0 j 1 3 3 5 % 6 0 3 1 1 5 - H 2 0 [ O m + H - H 2 0 ] + a , 4 0 ; - C O 9 7 ‘ Q N H 3 1 1 5 1 % 2 0 ‘ 8 ‘ 7 I t 6 3 6 O 8 0 1 0 0 1 2 0 O m H _ 1 4 o 7 . 2 7 e 2 [ 1 3 1 1 1 0 0 - C ( - ) M S / M S J 1 3 1 “ H 0 8 0 ‘ g 1 1 2 3 6 0 : - ( H 2 0 + C O ) — N H 3 4 0 : — < H 2 0 + H 2 c = 0 ) 8 3 . . ‘ 8 5 - 2 H 2 0 , 1 1 4 2 0 : A I 9 5 5 ' 6 0 r 8 ' 0 ' I b o 1 ' 2 0 1 4 0 m / z F i g u r e 5 . 4 T h e f r a g m e n t a t i o n o f o r n i t h i n e s t a n d a r d i n p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s : A ) M S / M S o f [ M + H ] + i o n s a t m / z 1 3 3 , B ) M S 3 o f m / z 1 1 5 g e n e r a t e d i n p a n e l A , a n d C ) M S I M S o f [ M — H ] ' i o n s a t m / z 1 3 1 . 2 1 8 F i g u r e 5 . 5 T h e f r a g m e n t a t i o n o f N a — a c e t y l o r n i t h i n e s t a n d a r d i n p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s : A ) M S / M S o f [ M + H ] + i o n s a t m / z 1 7 5 , B ) M S 3 o f m / z 1 5 7 g e n e r a t e d i n p a n e l A , C ) M S 4 o f m / z 1 1 5 g e n e r a t e d i n p a n e l B , D ) M S / M S o f [ M - H ] ' i o n s a t m / z 1 7 3 , a n d E ) M S 3 o f m / z 1 3 1 g e n e r a t e d i n p a n e l D . 2 1 9 ) % ( e c n a d n u b A e v i t a l e R i n p o s i t i v e a n d M S 3 o f m l 1 5 - ‘ . ‘ M S o f [ M ‘ “ 7 — H 2 0 2 . 3 2 e 6 1 5 7 1 0 0 A ( + ) M S I M S 8 0 1 7 5 — C H — c — o + H o _ N H 3 6 0 ( 2 ‘ “ 2 ) 1 5 8 1 1 5 [ M + H ] + 4 0 ‘ 2 H 2 0 1 7 5 2 0 1 1 : 9 7 . : - ‘ 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 . 0 0 e 6 - ( C H 2 = C = 0 ) 1 0 0 B ( + ) M s 3 1 1 5 8 0 1 7 5 6 0 . . . 1 5 7 — H o [ M + H — H 0 ] 4 ° 1 3 % , 1 5 7 2 6 ' 0 8 ' 0 1 6 0 1 9 0 1 4 0 1 6 0 1 s 0 2 6 0 9 . 3 1 e 5 3 — ( N H 3 + C O ) 1 0 0 C ( + ) M S 7 0 8 0 1 7 5 6 0 1 5 7 _ H O + 2 [ O m + H — H O ] 4 0 1 1 5 — c o 9 7 ‘ N H 3 1 1 5 2 9 8 2 0 8 ‘ 7 1 " " ‘ 6 O 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 2 . 2 9 e 5 ‘ ( C H 2 = C = 0 ) 1 0 0 D ( — ) M S I M S 1 3 1 3 0 1 7 3 6 0 g — 0 0 2 [ M - H l ' 4 0 1 2 9 1 7 3 2 0 x , ‘ l 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 7 . 5 8 6 3 3 _ H 2 0 [ O m - H ] - 1 0 0 E H M S ( H O + H c - O ) 1 1 3 1 3 1 8 0 1 7 3 2 8 3 2 _ _ N H 3 6 0 1 3 1 8 5 ( H 2 0 + C 0 ) 1 1 4 4 0 " ‘ a — 2 H 2 0 x “ 2 0 1 9 5 l ; 7 6 b ' 8 ‘ 0 ‘ l o o 1 ' 2 0 ' 1 2 1 0 m / z 2 2 0 E l u c i d a t i o n o f t h e f r a g m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f d i f f e r e n t t y p e s o f l i p i d s i s p a r t i c u l a r l y u s e f u l w h e n d e a l i n g w i t h c o m p l i c a t e d l i p i d m i x t u r e s , s i n c e o v e r l a p p i n g o f m u l t i p l e p r e c u r s o r i o n s a t t h e s a m e m / z f r e q u e n t l y o c c u r s . F i g u r e s 5 . 6 A a n d 5 . 6 8 s h o w t h e M S / M S a n d M S 3 s p e c t r a o f t h e p o s i t i v e i o n m o d e p r e c u r s o r i o n o b s e r v e d a t m / z 7 0 5 i n F i g u r e 5 . 1 3 a n d i t s [ M + H — H 2 0 ] + p r o d u c t i o n , r e s p e c t i v e l y . S i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d i n F i g u r e 5 . 2 A , t h e l o s s o f w a t e r w a s o b s e r v e d a s a d o m i n a n t fi ' a g m e n t a t i o n p a t h w a y i n t h e p o s i t i v e i o n m o d e M S / M S s p e c t r u m , a l o n g w i t h a s e e m i n g l y c o m p l i c a t e d s e t o f o t h e r p r o d u c t i o n s . H o w e v e r , M S 3 o f t h e [ M + H — H 2 0 ] + i o n a t m / z 6 8 7 ( F i g u r e 5 . 6 B ) c o n fi r m e d t h a t t h e s e i o n s o r i g i n a t e d f r o m t h e i n i t i a l w a t e r l o s s p r o d u c t i o n , i n d i c a t i v e o f t h e p r e s e n c e o f 1 8 : 1 a n d 2 0 : 2 f a t t y a c i d c h a i n s . T h e p r o d u c t i o n s a t m / z 4 2 3 , 4 0 5 a n d 3 8 7 c o r r e s p o n d t o l o s s o f t h e 1 8 : 1 f a t t y a c i d c h a i n a s a n e u t r a l k e t e n e ( 1 8 : 1 R Z ' C H = C = O ) , a n e u t r a l f a t t y a c i d ( 1 8 : 1 R 2 C O O H o r 1 8 : 1 R 2 ' C H = C = O + H 2 0 ) a n d a f a t t y a c i d + w a t e r ( 1 8 : 1 R 2 C 0 0 H + H Z O ) , r e s p e c t i v e l y , w h i l e m / z 3 9 7 , 3 7 9 a n d 3 6 1 a l l c o r r e s p o n d t o t h e l o s s o f t h e 2 0 : 2 f a t t y a c i d c h a i n ) . T h i s s u g g e s t e d t h e p r e s e n c e o f t w o s e p a r a t e o r n i t h i n e l i p i d s p e c i e s a t s i m i l a r r e l a t i v e a b u n d a n c e s . S u b s e q u e n t M S 3 a n a l y s i s o f t h e m / z 4 0 5 p r o d u c t i o n ( t h e r e s u l t a n t s p e c t r u m w a s i d e n t i c a l t o F i g u r e 5 . 2 D ) , a s w e l l a s t h e m / z 3 7 9 p r o d u c t i o n ( d a t a n o t s h o w n ) , b o t h l e d t o f o r m a t i o n o f t h e m / z 1 1 5 o r n i t h i n e ‘ fi n g e r p r i n t ’ i o n v i a t h e l o s s o f a 2 0 : 1 a n d 1 8 : 0 f a t t y a c i d , r e s p e c t i v e l y , i n d i c a t i n g t h a t t h e i d e n t i t y o f t h e t w o l i p i d s p r e s e n t a t m / z 7 0 5 c o r r e s p o n d e d t o C L 3 — O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 a n d C L 3 — O H 1 8 : 0 / 2 0 : 2 . 2 2 1 C o n fi r m a t i o n o f t h e s e l i p i d s w e r e o b t a i n e d b y M S / M S o f t h e c o r r e s p o n d i n g n e g a t i v e i o n m o d e p r e c u r s o r o b s e r v e d a t m / z 7 0 3 ( F i g u r e 5 . 6 C ) . F r o m t h i s s p e c t r u m , t w o m a j o r p r o d u c t i o n s w e r e f o r m e d , c o r r e s p o n d i n g t o t h e n e u t r a l l o s s e s o f 1 8 : 1 R Z C O O H ( m / z 4 2 1 ) a n d 2 0 : 2 R Z C O O H ( m / z 3 9 5 ) f a t t y a c i d c h a i n s , r e s p e c t i v e l y . M S 3 o f t h e s e p r o d u c t s b o t h r e s u l t e d i n f o r m a t i o n o f t h e c h a r a c t e r i s t i c m / z 1 3 1 p r o d u c t i o n v i a t h e l o s s o f n e u t r a l 2 0 : 1 a n d 1 8 : 0 k e t e n e m o l e c u l e s ( R 1 " C H = C = C = O ) , r e s p e c t i v e l y ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e y a l s o d i s p l a y e d t h e s a m e r e l a t i v e a b u n d a n c e s a s t h e t w o s e t s o f p r o d u c t i o n s f o r m e d i n p o s i t i v e i o n m o d e M S / M S a n d M S 3 . 2 2 2 4 . 9 3 e 2 _ . 1 0 0 A ( + ) M S / M S 2 0 ‘ 2 ‘ H z o R Z ‘ C H = C = O + H 2 0 6 8 7 7 0 5 8 0 ~ ( 1 8 z l R 2 c 0 0 H + 2 H 2 0 ) 3 s 7 3 9 7 — ( 1 3 : 1 R 2 c o o m i i z o ) g 6 0 — ( 2 0 : 2 R C O O H + H 2 0 ) 3 7 9 . j - g g " , 4 0 5 — ( 2 0 ; 2 R 2 C 0 0 H + 2 H 2 0 ) 3 6 1 ' — l 8 : 1 R 2 ' C H = C = O + H 2 0 _ 2 H 2 0 [ M + H ] + [ 2 0 : 2 R 2 ' C H = C = O + H ] + 4 2 3 - O m 6 6 9 7 0 5 A 2 0 2 9 1 v 6 ' 5 9 9 ' - ‘ ° \ ° ‘ 1 ' L 1 1 ' l ' I ' 1 L " fl ‘ 0 ’ 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 § 5 7 9 8 1 ‘ 2 0 2 R z ' C H : C = 0 - 1 8 : 1 R 2 C O O H 7 0 5 a ; 1 0 0 - B ( + ) M S 3 3 9 ? 4 0 5 — H 2 0 3 8 0 ; - ( 1 8 : l R Z C O O H + H Z O ) 3 8 7 E “ ‘ - § _ H 0 6 8 7 , Q 6 0 - — 2 0 : 2 R Z C O O H 3 7 9 - 1 8 : l R 2 ' C H = C = O 6 6 9 g 4 0 : 3 6 3 : , ‘ 3 2 3 — 0 m — ( O r n — H 2 0 ) ‘ 5 3 3 2 0 - [ 2 0 2 2 R 2 " C H = C = C = O + H ] + ’ , . ' 5 , ; 5 “ 5 5 5 5 7 3 ' 6 8 7 _ V . ' = a - , 2 ? } i . 1 , I . a y n , _ D 4 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 2 . 6 2 e 2 £ 2 1 5 1 3 ” R 2 9 0 0 “ 7 0 3 1 0 0 2 C H M S M S — 2 o : 2 R Z C O O H g 8 0 - 3 9 5 . — H o 6 0 5 _ 2 _ 4 0 1 ( 1 6 1 1 R 0 0 0 ] [ 1 8 : 1 R C O O ] ‘ 6 3 5 [ M B ] 2 0 : 2 5 3 2 8 1 — c o 2 6 5 9 \ 7 0 3 - a s “ a i 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 m / z F i g u r e 5 . 6 I d e n t i fi c a t i o n o f o r n i t h i n e l i p i d s ( 0 L 3 - O H 1 8 : 0 / 2 0 : 2 a n d C L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 0 ) a t m / z 7 0 5 f r o m F i g u r e 1 B b y ( A ) C I D M S / M S a n d b y ( B ) C I D M S n o f t h e m / z 6 8 7 i o n f r o m p a n e l A . ( C ) N e g a t i v e i o n C 1 D M S / M S o f t h e c o r r e s p o n d i n g i o n a t m / z 7 0 3 f r o m F i g u r e I D . 2 2 3 5 . 3 . 3 I d e n t i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f g l u t a m i n e l i p i d s i n R . s p h a e r o i d e s b y u s i n g p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e M S n S i m i l a r t o t h a t s e e n i n F i g u r e 5 . 6 A , M S I M S o f t h e p r o t o n a t e d p r e c u r s o r i o n a t m / z 7 1 9 f r o m t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s o f b o t h t h e w i l d t y p e a n d G P C h o - d e fi c i e n t s t r a i n s o f R . s p h a e r o i d e s r e s u l t e d i n t h e d o m i n a n t l o s s o f w a t e r ( m / z 7 0 1 ) , a l o n g w i t h m u l t i p l e p r o d u c t s c o r r e s p o n d i n g t o t h e l o s s o f e i t h e r a 1 9 : 1 ( m / z 4 2 3 , 4 0 5 a n d 3 8 7 ) o r a n 1 8 : 1 ( m / z 4 5 5 , 4 3 7 , 4 2 0 a n d 4 1 9 ) f a t t y a c y l c h a i n ( F i g u r e s 5 . 7 A a n d 5 . 7 8 , r e s p e c t i v e l y ) . H o w e v e r , M S 3 o f t h e [ M + H - - - H 2 O ] + p r o d u c t i o n ( F i g u r e 5 . 7 3 ) r e s u l t e d i n f o r m a t i o n o f o n l y t h e 1 9 : 1 l o s s p r o d u c t i o n s e r i e s , s u g g e s t i n g t h a t a n o n - o m i t h i n e c o n t a i n i n g l i p i d s p e c i e s w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e 1 8 : 1 l o s s p r o d u c t i o n s . S u b s e q u e n t f r a g m e n t a t i o n o f t h e m / z 4 0 5 p r o d u c t i o n i n F i g u r e 5 . 7 C ( t h e r e s u l t a n t s p e c t r u m w a s a g a i n i d e n t i c a l t o F i g u r e 5 . 2 D ) r e s u l t e d i n t h e l o s s o f a 2 0 : 1 f a t t y a c i d , a l l o w i n g c o n fi r m a t i o n o f t h e m / z 7 1 9 o r n i t h i n e l i p i d t h a t w a s p r e s e n t a s b e i n g O L 3 — O H 2 0 : 1 / 1 9 : 1 . A c c o r d i n g t o t h e n i t r o g e n r u l e , t h e u n k n o w n l i p i d s p e c i e s t h a t w a s a l s o p r e s e n t a t m / z 7 1 9 i n a d d i t i o n t o t h e O L 3 — O H 2 0 : 1 / 1 9 : 1 l i p i d i o n s h o u l d c o n t a i n a n e v e n n u m b e r o f n i t r o g e n a t o m s . 2 2 4 - ( 1 8 : l R Z C O O H + H 2 0 ) 4 1 9 4 9 & 2 , ~ ( 1 8 2 1 R 2 C O O H + N H 3 ) 4 2 0 7 0 2 1 1 0 0 A ( + ) M S I M S - 1 9 : 1 R Z C O O H 8 0 — ( 1 9 : 1 R 2 C 0 0 H + H 2 0 ) 4 0 5 . 4 2 3 ‘ N H 3 7 1 9 5 ; — 1 . 8 1 c h 0 0 1 1 7 0 2 6 0 g 5 5 " 4 3 7 + i f - ' ' _ 2 H 0 M + H 4 0 — ( 1 9 : 1 R 2 0 0 0 H + 2 H 3 2 8 q ) g " 4 5 1 8 1 R 2 C H S = 7 C 8 = O 6 7 8 3 5 [ 7 1 9 1 2 0 R ’ 5 . g . 2 9 1 1 1 l l 1 ’ ' l . A A ‘ 1 1 . i f . V 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 3 1 9 . 1 R C O O H + H 2 4 o — ( 1 8 : 1 R 2 C 0 0 H + H 2 0 ) 4 1 9 + 1 2 0 5 3 - 7 4 9 3 ( 2 5 ) { — ( 1 8 1 R 2 C 0 0 H + N H 3 ) 4 2 0 7 0 1 a 1 0 0 B ( + ) M S / M S _ 1 9 1 R 2 C O O H + 1 1 1 3 3 8 0 7 1 9 4 2 3 — 2 H 2 0 7 0 2 < 6 0 : g ~ ; 8 I 1 R Z C O O H 6 8 3 g “ 2 ’ 4 0 — ( 1 9 : 1 R 2 C 0 0 H + 2 H 2 0 ) 5 5 ' . 8 4 3 2 1 8 1 R 2 ' C H — = C o — O r n \ ; [ M + H ] H 2 0 3 8 7 i I t i 2 2 9 1 5 7 8 5 8 7 j ; o I . r . l ‘ 5 . A : . a d 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 7 4 6 e 2 — 1 9 : 1 c h o o u 7 1 9 1 0 0 C ( + ) M S 7 0 1 2 8 0 _ . _ _ 6 0 — ( 1 9 : 1 R 2 C 0 0 H + H 2 0 ) 4 ‘ 2 1 3 - 1 R 2 0 H ‘ C ‘ 0 _ H o 4 0 3 8 7 ‘ ( O m ' H z m 6 8 3 2 0 2 9 1 " a 5 8 7 1 . 7 0 1 * 1 1 l i 1 i 2 0 0 3 0 0 4 6 0 5 6 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 m / z F i g u r e 5 . 7 I d e n t i fi c a t i o n o f o v e r l a p p i n g o r n i t h i n e ( 0 L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 9 : 1 ) a n d g l u t a m i n e ( Q L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 ) l i p i d s a t m / z 7 1 9 b y p o s i t i v e i o n E S I C I D M S / M S a n d M S n . ( A ) M S / M S o f m / z 7 1 9 f r o m t h e w i l d t y p e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t i n F i g u r e 5 . 1 A , ( B ) M S I M S o f m / z 7 1 9 f r o m t h e G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t m e m b r a n e e x t r a c t i n F i g u r e 5 . 2 8 . ( C ) M S 3 o f m / z 7 0 1 f r o m p a n e l B . 2 2 5 F i g u r e 5 . 8 A s h o w s t h e M S 3 s p e c t r u m o f t h e m / z 4 3 7 i o n f r o m F i g u r e 5 . 7 8 . T h e m o s t a b u n d a n t p r o d u c t i o n s i n t h i s s p e c t r a w e r e s e e n a t m / z 4 2 0 a n d m / z 4 1 9 , c o r r e s p o n d i n g t o t h e l o s s o f w a t e r a n d a m m o n i a , r e s p e c t i v e l y . N o t a b l y , a l t h o u g h t h e c h a r a c t e r i s t i c o r n i t h i n e s p e c i fi c i o n a t m / z 1 1 5 w a s n o t o b s e r v e d , a s e r i e s o f p r o d u c t i o n s a t m / z 1 4 7 , 1 3 0 a n d 1 2 9 w e r e f o r m e d , v i a t h e n e u t r a l l o s s o f a 2 0 : 1 k e t e n e ( - R 5 " C H = C = C = O ) f r o m t h e m / z 4 3 7 p r e c u r s o r i o n o r f u r t h e r f r o m t h e m / z 4 2 0 a n d 4 1 9 p r o d u c t i o n s , r e s p e c t i v e l y . I m p o r t a n t l y , t h e i o n a t m / z 1 4 7 c o r r e s p o n d s t o t h e m / z o f p r o t o n a t e d o r n i t h i n e w i t h t h e a d d i t i o n o f + 1 4 D a , w h i l e t h e i o n s a t m / z 1 3 0 a n d 1 2 9 c o r r e s p o n d t o t h e m / z o f p r o t o n a t e d o r n i t h i n e w i t h t h e a d d i t i o n o f + 1 4 D a , m i n u s a m m o n i a a n d w a t e r , r e s p e c t i v e l y . T h i s + 1 4 D a m a s s s h i fi c o u l d p o t e n t i a l l y r e s u l t f r o m s u b s t i t u t i o n o f o r n i t h i n e b y l y s i n e ( a n a l o g o u s t o i n c o r p o r a t i o n o f a m e t h y l e n e g r o u p i n t o t h e o r n i t h i n e a m i n o a c i d s i d e c h a i n ) [ 2 8 5 ] , o r v i a N — o r O - m e t h y l a t i o n o f o r n i t h i n e t o y i e l d N - M e o r n i t h i n e o r o m i t h i n e - O M e , r e s p e c t i v e l y . A l t e r n a t i v e l y , t h e + 1 4 D a m a s s s h i f t c o u l d r e s u l t f r o m s u b s t i t u t i o n o f t h e o r n i t h i n e l i p i d b y g l u t a m i n e ( a n a l o g o u s t o o x i d a t i o n o f t h e 5 m e t h y l e n e g r o u p o f t h e o r n i t h i n e a m i n o a c i d s i d e c h a i n ) . N — m e t h y l a t i o n i s a c o m m o n l y o b s e r v e d p r o c e s s i n l i p i d b i o s y n t h e s i s i n R . s p h a e r o i d e s . F o r i n s t a n c e , G P C h o c a n b e s y n t h e s i z e d b y c o n s e c u t i v e N - m e t h y l a t i o n o f G P E t n b y t h e a c t i o n o f G P E t n N — m e t h y l t r a n s f e r a s e [ 9 0 ] , a n d b o t h m o n o N — M e — G P E t n ( + 1 4 D a s h i f t ) a n d N , N — d i M e - G P E t n ( + 2 8 D a s h i f t ) i n t e r m e d i a t e s h a v e b e e n p r e v i o u s l y i d e n t i fi e d [ 9 0 ] . S i m i l a r l y , t h e a m i n o g r o u p i n d i a c y l g l y c e r o l h o m o s e r i n e ( D G H S ) c a n b e c o n s e c u t i v e l y N — m e t h y l a t e d t o y i e l d d i a c y l g l y c e r o l - N , N , N - t r i m e t h y l h o m o s e r i n e ( D G T S ) , a s u b s t i t u t e f o r G P C h o u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c o n d i t i o n s [ 2 7 4 ] . 2 2 6 . . l 1 ° D \ 3 g . g g 0 3 8 A ° < ' . ' E 4 1 1 6 1 4 1 3 0 . 8 6 4 2 0 0 8 5 4 2 8 6 4 2 . 6 4 2 0 8 4 1 0 0 O 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 O 0 0 0 0 0 0 ° 9 3 5 ; - . ‘ 2 1 1 1 0 7 8 1 I l A [ B C G ( ( . 0 + + ) + 2 n 1 . . ) + ) l ( D ( + ) 0 [ " 4 3 : 5 G ] “ 0 0 . ‘ 2 J 3 4 1 4 ‘ 4 H 1 M H M - [ S s s S 0 M . ' ' M 0 0 : 6 6 6 F i g u r e 5 . 8 I d e n t i fi c a r n i t h i n e ( 0 R 2 C O O - ( H 3 G 2 l 6 1 3 l 1 n 1 0 c R I 0 h 1 § g 0 " 7 4 7 4 1 1 0 C 1 H 1 = 1 3 3 1 3 2 9 5 6 9 7 9 - — 1 8 0 0 1 ( 8 2 : 0 . 2 G 1 : 1 l 9 ‘ ~ 2 0 2 8 0 o 8 0 1 l + . . . . 7 4 1 3 1 2 . . - 0 5 : 9 - 7 4 4 1 7 1 3 4 4 1 1 ) — 1 m g + C 0 H 3 a p p i n . 1 1 2 - ' 9 7 3 - f 0 0 0 — “ / 1 c 0 c 0 0 z o n + H G 4 [ 1 . H L N H 2 i o ° n - 3 l 7 4 N n + 5 H + i 2 H 5 + C + + 3 H 0 8 8 0 8 2 . 2 ’ 8 ] ] 0 0 ) 3 0 0 8 0 + 8 8 5 4 4 ‘ 5 l l o f o C v O ) 2 0 ) - 8 ( 4 e r N l ( ' t ( . C . n : : H c - 3 = C . 2 1 1 ‘ 1 R & & 1 1 1 1 L 2 0 - N 0 h O 1 C 2 1 = ‘ R 5 0 0 R 0 " 1 0 ” 0 C 3 5 O C 3 - 3 ) H h 1 3 0 I 4 3 1 H 1 = C = C 0 O H 1 O C = C H = 9 ' 2 5 H 2 0 0 4 1 9 — 4 N 2 0 4 3 § 7 4 ‘ 5 r . I 0 1 3 7 4 6 ) 0 1 ) ) . 4 + + 2 2 / 1 1 0 H N 0 0 1 9 H : 2 1 O 1 1 = = O : 1 3 0 H . j a n d — H 2 0 g l u t a m i n e ( Q L 3 — O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 ) l i p i d s a t m / z 7 1 9 b y p o s i t i v e i o n E S I C I D M S n . ( A ) M S 3 o f m / z 4 3 7 f r o m F i g u r e 5 . 7 3 , ( B ) M S 4 o f m / z 1 4 7 f r o m p a n e l B , ( C ) M S 4 o f m / z 1 3 0 f r o m p a n e l B , a n d ( D ) M S 4 o f m / z 1 2 9 f r o m p a n e l B . 2 2 7 S t a r k d i f f e r e n c e s w e r e o b s e r v e d h o w e v e r , b e t w e e n t h e p r o d u c t i o n s o b s e r v e d b y M S 3 o f m / z 4 3 7 ( F i g u r e 5 . 8 A ) w i t h t h o s e f o r m e d b y M S / M S o f p r o t o n a t e d N a — a c e t y l l y s i n e , N g — a c e t y l l y s i n e , N a - a c e t y l — N g — M e o r n i t h i n e a n d N a - a c e t y l o r n i t h i n e - O M e ( F i g u r e 5 . 9 ) , a s w e l l a s b e t w e e n t h e M 8 4 s p e c t r a o b t a i n e d f r o m t h e m / z 1 4 7 , 1 3 0 a n d 1 2 9 p r o d u c t i o n s f r o m F i g u r e 5 . 8 A ( F i g u r e s 5 . 8 B , 5 . 8 C a n d 5 . 8 D , r e s p e c t i v e l y ) , a n d t h e M S / M S o r M S 3 s p e c t r a o b t a i n e d b y d i s s o c i a t i o n o f p r o t o n a t e d l y s i n e , N g - M e — o r n i t h i n e a n d o r n i t h i n e - O M e ( d a t a n o t s h o w n ) , t h e r e b y r u l i n g o u t t h e s e p o s s i b l e s t r u c t u r e s . I n p o s i t i v e i o n m o d e M S / M S ( F i g u r e 5 . 9 ) , N a — A c — N g — M e - o m i t h i n e s h o w e d a d i s t i n c t n e u t r a l l o s s o f N H Z C H 3 ( 3 1 D a , F i g u r e 5 . 9 D ) a n d N a — A c - o m i t h i n e - O M e p r e d o m i n a n t l y f r a g m e n t e d b y l o s i n g C H 3 O H ( 3 2 D a , F i g u r e 5 . 9 1 3 ) , w h e r e a s C a , C 5 , C 7 o r C g — m e t h y l o r n i t h i n e s h o u l d a l l t e n d t o p r e d o m i n a n t l y l o s e w a t e r ( 1 8 D a ) . T h e s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e s i n t h e n e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e M S 3 o f m / z 4 3 5 ( F i g u r e 5 . 9 B ) f r o m t h e M S / M S o f t h e s e N — a c e t y l l y s i n e o r o r n i t h i n e d e r i v e d s t a n d a r d s ( F i g u r e 5 . l O B - D ) fi l r t h e r d e n i e d t h e s e s t r u c t u r e s . N o t a b l y , t h e n e g a t i v e i o n m / z 1 4 5 f r o m a l l f o r m s o f l y s i n e s t a n d a r d s d i s p l a y e d p r e d o m i n a n t l y t h e p r o d u c t i o n s a t m / z 9 7 a n d m / z 9 9 v i a t h e n e u t r a l l o s s e s o f H 2 0 + C H 2 = O a n d H 2 0 + C O , r e s p e c t i v e l y ( d a t a n o t s h o w n ) , s t r i k i n g l y d i f f e r e n t f r o m t h e m / z 1 4 5 o f t h e u n k n o w n l i p i d . 2 2 8 F i g u r e 5 . 9 C o m p a r i s o n o f t h e p o s i t i v e i o n m o d e E S I C I D M S / M S s p e c t r a o f m / z 1 8 9 , t h e [ M + H ] + i o n s g e n e r a t e d f r o m s y n t h e s i z e d a m i n o a c i d s t a n d a r d s : A ) N a - A c - G l n , B ) N a - A c - L y s , C ) N g - A c - L y s , D ) N 5 - M e - N a - A c - O m a n d E ) O - M e - N a - A c - O r n . 2 2 9 7 . 6 7 . 4 ( + ) M S / M S - < C H 2 = C = 0 > — N H , . . _ _ ( 3 1 + H + 1 7 2 1 0 0 . A N a A c G l n - ( H 2 0 + C O ) [ 5 1 4 7 ] 8 0 : + 1 4 3 — H o 6 0 q E 1 8 9 [ G 1 n + H - N H 3 ] 1 3 0 . “ . 1 7 1 2 4 0 I [ G l n + H - H 2 0 ] + 1 2 9 5 \ [ M + H ] + 2 0 : 1 0 1 ' 4 4 , . . . ; 5 / l m 1 8 9 . - ‘ “ 5 . . : . . - . 4 ! 3 ‘ ‘ . fl ' . 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 . 6 4 e 6 [ L y s + H - H 2 0 ] + 1 0 0 1 B N a - A c - L y s 1 2 9 [ L y s + H - — N H 3 ] + _ N H 3 8 0 _ 1 3 0 _ 2 H 0 1 7 2 - 1 8 9 5 ’ + 2 1 6 0 ' l g g [ L Y S ' l ' H ] 1 5 3 - H 2 0 l + 1 5 1 4 7 1 7 1 5 [ M + H ] A : 8 Z 8 4 1 0 1 1 2 : j X x } L i ” : I ? ” c , \ " ’ l - 4 1 l 0 8 6 O 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 1 0 0 1 C N - A c - L y s 1 2 6 G . s : 3 , 8 0 1 s p e c t r a o f 1 1 1 5 1 3 9 ' 2 6 0 5 g 1 8 9 - ( 1 % n g . g 4 0 I [ M + H ] + A ) N a - A c - G l n . 3 l E 2 0 1 8 4 l 1 5 . 5 9 . o . ‘ 5 6 O 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 C - O m - 4 . 7 1 8 5 ' m fi ' M e ' O m + H - H 2 0 ] + _ N H Z C H 3 1 0 0 D N a - M e - N a - A c - O r n 1 2 9 _ ( C H 2 = C = O ) 1 5 8 g o [ N a - M e - O r n + H ] + i ‘ H 2 0 6 0 g 1 8 9 1 4 7 5 1 7 1 4 0 3 1 5 3 i [ M + H ] 2 0 8 4 5 . 4 " ; 1 8 9 I x , “ 1 ’ l 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 1 0 0 - E O - M e — N a — A c - O r n 1 5 7 — N H 3 8 0 l 1 7 2 6 0 } g ‘ 8 9 [ o w n — 1 1 2 0 ] + _ H 2 0 5 + 4 0 Z 1 1 5 1 7 1 f , [ M + H ] ‘ — ( C H 3 O H + H 2 0 ) ‘ f 1 8 9 2 0 2 l 1 3 9 J ‘ 5 L 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 m / 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 z 2 3 0 - M S / M _ _ 1 . 5 6 e 4 ( ) S [ G l n _ H _ N H 3 ] - c o 2 H 2 0 1 0 0 : A N a - A c - G l n 1 2 8 1 4 3 8 0 : 1 8 7 [ G l n - H - H 2 0 ] ' 5 5 - ( C H 2 = _ C = O ) - N H 6 0 5 g 1 2 7 5 [ G l n - H ] 1 7 0 4 0 : - < H 2 0 + 0 0 2 ) E 5 1 4 s . 1 M - H 1 ' . 1 2 5 5 1 8 7 2 0 1 ‘ 1 » ” E l 5 6 O 8 0 1 6 0 1 ' 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 I . 5 5 e 5 [ L y s - H ] ‘ 1 0 0 : B N a - A c - L y s 1 4 5 A 8 0 : ‘ 3 6 O : [ M — H ] ' 8 4 0 : 1 8 7 g 2 0 - f g 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 ' 2 1 . 0 4 e 5 [ L y s - H l ' . g 1 0 0 : C N g - A c - L y s 1 4 5 E 2 8 : d ) - _ . [ M - H ] M 4 0 1 1 4 3 1 8 7 2 0 - 3 . 6 1 A I 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 1 . 9 3 6 4 [ N a - M e - O m - H l - 1 0 0 : D N s - M e - N a - A c - O r n 1 4 5 8 0 ; 6 0 ' - 4 0 j [ N I — H ] . 1 4 3 1 8 7 2 0 1 g 4 6 O 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 m / z F i g u r e 5 . 1 0 C o m p a r i s o n o f t h e n e g a t i v e i o n m o d e E S I C I D M S I M S s p e c t r a o f m / z 1 8 7 , t h e [ M - H ] ' i o n s g e n e r a t e d f r o m s y n t h e s i z e d a m i n o a c i d s t a n d a r d s : A ) N a - A c - G l n , B ) N a - A c - L y s , C ) N g - A c - L y s , D ) N g - M e - N a - A c - O r n a n d E ) O - M e — N a - A c - O r n . 2 3 1 r I n c o n t r a s t , t h e p r o d u c t i o n s o b s e r v e d b y M S 3 o f m / z 4 3 7 ( F i g u r e 5 . 8 A ) c l o s e l y r e s e m b l e d t h o s e f o r m e d b y M S / M S o f N a - a c e t y l o r N a — p r o p y l g l u t a m i n e ( F i g u r e s 5 . 9 A a n d 5 . 1 1 A r e s p e c t i v e l y ) , w h i l e t h e s p e c t r a s h o w n i n F i g u r e s 5 . 8 B , 5 . 8 C a n d 5 . 8 D w e r e f o u n d t o b e e s s e n t i a l l y i d e n t i c a l t o t h e s p e c t r a o b t a i n e d b y d i s s o c i a t i o n o f t h e [ M + H ] + , [ M + H - - N H 3 ] + a n d [ M + H — H 2 0 ] + i o n s f r o m p r o t o n a t e d g l u t a m i n e ( d a t a n o t s h o w n ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e + 1 4 D a m a s s s h i f t h a d r e s u l t e d f r o m t h i s s u b s t i t u t i o n . T h e s t r u c t u r e o f t h e p r o p o s e d g l u t a m i n e l i p i d ( Q L ) i o n a t m / z 7 1 9 t h e r e f o r e c o r r e s p o n d s t o Q L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 . P o t e n t i a l m e c h a n i s m s t o r a t i o n a l i z e t h e p r o d u c t i o n f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s o b s e r v e d f o r t h i s g l u t a m i n e - c o n t a i n i n g l i p i d , a n d f o r f o r m a t i o n o f t h e m / z 1 4 7 , 1 3 0 a n d 1 2 9 ‘ fi n g e r p r i n t ’ i o n s , a r e s h o w n i n S c h e m e 5 . 4 . N o t e t h a t t h e p a t h w a y l e a d i n g t o t h e m / z 1 2 9 p r o d u c t i o n i n S c h e m e 5 . 4 i s s h o w n t o o c c u r v i a n u c l e o p h i l i c a t t a c k f r o m t h e c a r b o n y l o x y g e n o f t h e g l u t a m i n e a m i d e s i d e c h a i n . T h i s p r o p o s e d p a t h w a y i s c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s m e c h a n i s t i c s t u d i e s o n t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f p r o t o n a t e d p e p t i d e i o n s . H o w e v e r , a n a l t e r n a t i v e p a t h w a y i n v o l v i n g n u c l e o p h i l i c a t t a c k f r o m t h e a m i d e n i t r o g e n , r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f a p r o t o n a t e d 3 - a m i n o h e x a h y d r o - 2 , 6 — p y r i d i n e d i o n e p r o d u c t i o n , c a n n o t b e r u l e d o u t . T h e d e a m i n a t i o n f r a g m e n t a t i o n c h a n n e l i n M S 3 o f m / z 4 3 7 ( F i g u r e 5 . 8 A ) , s e e m e d t o b e l e s s f a v o r e d w i t h t h e i n c r e a s e i n t h e l e n g t h o f t h e N - a c y l c h a i n ( c o m p a r i n g w i t h t h e M S / M S o f N a — a c e t y l o r N a - p r o p y l g l u t a m i n e i n F i g u r e s 5 . 9 A a n d 5 . 1 1 A , r e s p e c t i v e l y ) . 2 3 2 n 1 . 2 A B + — 8 ( ( g £ ) M 2 0 S 3 / M [ G S l [ G n + H - H 2 - 0 ) 2 I M M 0 S 1 - . 0 G 0 [ l S 1 [ G n l - n H — — H H 1 1 0 2 - Q 3 5 ' £ M ’ £ 1 0 2 o 5 “ o 1 2 0 0 8 6 4 2 8 6 4 . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 2 e 5 3 N , 5 ' 1 ] l + 0 2 1 ] N 0 H — + 9 H 2 ] 1 2 . I ‘ E 3 ' : 7 3 ] + H 0 . 4 ‘ - 1 1 £ [ 0 0 ( 3 ( [ 1 1 ’ L C 9 C G 4 + 2 3 7 - 4 n ' n 0 1 3 l 5 H 1 4 3 + 1 H ] + . . . . . . 3 2 1 I 0 5 — 1 8 . 8 a 0 H 8 3 0 2 = 1 6 H H ] ' + C H 0 C ) = _ 0 ) 2 . 2 0 2 . 4 0 2 + ] H 3 H ] _ + 2 . 0 0 1 3 M 0 _ 2 0 1 [ M 2 H [ o N 8 4 2 _ { * 5 5 ‘ N H 3 N — p r o p y l - G l n 5 - 6 6 6 5 ‘ 1 - ( H 2 0 + C O ) 1 8 6 8 ' 0 1 0 0 1 ' 2 0 1 4 0 1 5 0 1 8 0 2 0 0 £ 2 0 2 4 0 m / z F i g u r e 5 . 1 1 T h e f r a g m e n t a t i o n o f N a — p r o p y l g l u t a m i n e s t a n d a r d i n p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s : A ) M S / M S o f [ M + I - I ] + i o n s a t m / z 2 0 3 , B ) M S I M S o f [ M - H ] ' i o n s a t m / z 2 0 1 . 2 3 3 T h e f u l l y H / D e x c h a n g e d f o r m o f m / z 7 1 9 s h i f t e d t o m / z 7 2 4 b y i n c o r p o r a t i n g fi v e d e u t e r i u m a t o m s . T h e p r o d u c t i o n a t m / z 4 5 5 i n F i g u r e 5 . 7 B s h i f t e d p r e d o m i n a n t l y t o m / z 4 6 0 b y l o s i n g R 2 ' C H = C = O , a n d w h e n m / z 4 6 0 f u r t h e r f r a g m e n t e d i n M 5 3 , H O D w a s o b s e r v e d a s t h e p r e d o m i n a n t n e u t r a l l o s s , a l t h o u g h H 2 0 a n d D 2 0 l o s s e s a l s o o c c u r r e d a t m u c h l o w e r a b u n d a n c e . T h e l o s s o f w a t e r c o n t a i n i n g o n e e x c h a n g e a b l e p r o t o n a n d o n e n o n - e x c h a n g a b l e C a - p r o t o n s u p p o r t e d t h e m e c h a n i s m o f s e q u e n t i a l l y l o s i n g k e t e n e a n d w a t e r t o f o r m m / z 4 3 7 d e s c r i b e d i n S c h e m e 5 . 4 . 2 3 4 - l o 0 O ’ H N W / / M O Q H ” 2 “ a > o ‘ 0 L I O N H m “ Z N , H “ + V o i o i “ Q N — H H 2 m / z 1 4 7 \ ‘ N H B o o U — R = 1 " C H — = C . / o — H R ‘ " C - = H R o 1 O = m / C V 9 l E O z 4 1 O o o Z N " C H H = 2 C N U = + U O I + q R ] o r — R 2 C H = C = 0 R I " m / z 7 1 9 \ R : C O O H O — 2 0 m / z 4 5 5 O / H J \ / \ R l " m / z 4 3 7 H + t r a n s V O l fi t r a n s f e r - N H 3 H 0 0 0 H O 0 + 0 ’ H a o 0 4 1 5 , 1 1 l ” O " / O H Z N V O M H N ; / R l N / R n 1 5 1 L / R 1 " 1 1 H H H l a n 4 2 0 . . H 2 0 1 o 0 O H ( 5 + ” ” 9 5 L / R 1 , N { \ . / H H H N H z N H 2 m / z 1 3 0 m / z 1 2 9 S c h e m e 5 . 4 P r o p o s e d p a t h w a y s f o r t h e m u l t i s t a g e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f p r o t o n a t e d g l u t a m i n e l i p i d s 2 3 5 F u r t h e r e v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f t h i s Q L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 g l u t a m i n e c o n t a i n i n g l i p i d w a s o b t a i n e d b y i n s p e c t i o n o f t h e M S / M S , M 8 3 , M 8 4 a n d M S 5 s p e c t r a o b t a i n e d f r o m t h e n e g a t i v e i o n p r e c u r s o r a t m / z 7 1 7 i n F i g u r e 5 . 1 D . ( F i g u r e s 5 . 1 2 A — 5 . 1 2 D ) . S i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d i n t h e p o s i t i v e i o n m o d e s p e c t r a , M S / M S o f t h e n e g a t i v e i o n p r e c u r s o r l e d t o t h e n e u t r a l l o s s o f e i t h e r a 1 9 : 1 ( m / z 4 2 1 ) o r 1 8 : 1 ( m / z 4 3 5 ) f a t t y a c i d ( — R 2 C O O H ) ( F i g u r e 5 . 1 2 A ) . M S 3 o f t h e m / z 4 2 1 i o n r e s u l t e d i n l o s s o f C 0 2 , a s w e l l a s t h e l o s s o f a 2 0 : 2 k e t e n e t o y i e l d t h e ‘ fi n g e r p r i n t ’ o r n i t h i n e s p e c i fi c p r o d u c t i o n a t m / z 1 3 1 , c o n fi r m i n g t h e p r e s e n c e o f t h e O L 3 — O H 2 0 : 1 / 1 9 : 1 o r n i t h i n e l i p i d ( d a t a n o t s h o w n ) . M S 3 f r a g m e n t a t i o n o f t h e m / z 4 3 5 i o n l e d t o t h e l o s s e s o f N H 3 ( m / z 4 1 8 ) , H 2 0 ( m / z 4 1 7 ) , C 0 2 ( m / z 3 9 1 ) a n d C 0 2 + H 2 0 ( m / z 3 7 3 ) , a s w e l l a s t h e f o r m a t i o n o f p r o d u c t i o n s a t m / z 1 4 5 , 1 2 8 a n d 1 2 7 ( F i g u r e 5 . 1 2 8 ) . S i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d i n p o s i t i v e i o n m o d e t h e r e f o r e , t h e s e i o n s c o r r e s p o n d t o t h e [ M - H ] ' , [ M - H - N H 3 ] ' a n d [ M - H — H 2 0 ] ' i o n s o f d e p r o t o n a t e d g l u t a m i n e . I n d e e d , t h e M S 4 s p e c t r a o f t h e m / z 1 4 5 f r o m F i g u r e 5 . 1 2 8 ( F i g u r e s 5 . 1 2 C ) a n d t h e f u r t h e r M S 5 s p e c t r a o f i t s p r o d u c t i o n a t m / z 1 2 7 w e r e f o u n d t o b e i d e n t i c a l t o t h e M S / M S a n d M S 3 s p e c t r a a c q u i r e d fi o m a n a u t h e n t i c d e p r o t o n a t e d g l u t a m i n e s t a n d a r d ( d a t a n o t s h o w n ) . P o t e n t i a l m e c h a n i s m s t o r a t i o n a l i z e t h e f o r m a t i o n o f t h e m / z 1 4 5 a n d 1 2 7 g l u t a m i n e s p e c i fi c ‘ fi n g e r p r i n t ’ i o n s a r e s h o w n i n S c h e m e 5 . 5 . N o t e t h a t t h e p a t h w a y f o r f o r m a t i o n o f t h e m / z 1 2 7 p r o d u c t i o n s f r o m t h e m / z 4 3 5 p r o d u c t c o u l d a l s o p o t e n t i a l l y o c c u r v i a n u c l e o p h i l i c a t t a c k f r o m t h e c a r b o n y l o x y g e n o f t h e g l u t a m i n e a m i d e s i d e c h a i n f o l l o w i n g i n i t i a l p r o t o n t r a n s f e r f r o m t h e a m i d e n i t r o g e n t o t h e c a r b o x y l a t e a n i o n , a n a l o g o u s t o t h a t s h o w n i n S c h e m e 5 . 4 . 2 3 6 r ” . 1 0 0 - A ( — ) M S / N I S 4 2 1 - l 8 : l R Z C O O H 7 1 7 8 0 3 4 3 5 g 6 0 3 _ . 1 4 0 : ( 1 8 . 1 R C 0 0 H + H % ( 1 ) 7 ) - 1 8 : 1 R ‘ C H = C = O _ H o [ M _ H ] _ J 2 . 4 5 3 6 9 9 7 1 7 2 0 - 3 , , . . , 1 ‘ - A t - . u ' r . ' 1 V 1 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 O 8 0 0 A 7 . 4 5 e Z 3 7 1 7 _ 4 1 2 7 E : 1 0 0 1 B ( — ) M S 4 3 ? “ R Z C O O H - N H 3 _ 4 1 8 « g 2 8 3 1 , 2 7 [ G l n — H - H Z O ] 1 ’ - § 4 0 1 , 1 . 1 2 8 [ G m - H ' N H J — ( C 0 2 + H 2 0 ) - 3 ( ; ( 1 ) 2 E 2 0 : v ! 1 ' 1 4 5 [ G 1 n - H ] ‘ - G l n 3 7 3 , 3 4 3 5 2 % ~ 1 / l j . . 3 3 9 ' . 1 1 1 1 " g 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 . . . “ H 2 0 § 3 . 2 2 e 2 4 I 7 1 7 1 2 7 g 1 0 0 . C ( - ) M S 3 g 1 8 : l R Z C O O H 8 0 3 — 2 o : 1 R 1 " C H = C = C = O - N H 3 ' 1 4 5 1 2 8 6 0 : I 1 4 0 ‘ 0 _ C 0 2 - 2 H 2 0 i 1 4 5 2 0 1 1 0 1 1 0 9 r ’ 1 J \ h 1 i 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 9 7 8 2 1 : 2 9 0 7 1 7 8 0 1 — 2 0 : 1 R 1 " C H = C = C = O 6 0 1 1 2 7 j " ( N H + C 0 ) ‘ ( N H = C = O ) — c o : 3 : 3 8 2 8 4 9 9 O 1 2 7 - ‘ a i H ’ j 3 7 6 O 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 m / z F i g u r e 5 . 1 2 I d e n t i fi c a t i o n o f o v e r l a p p i n g o r n i t h i n e ( 0 L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 9 : 1 ) a n d g l u t a m i n e ( Q L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 ) l i p i d s a t m / z 7 1 7 b y n e g a t i v e i o n E S I C I D M S / M S a n d M s “ . ( A ) M S / M S o f m / z 7 1 7 f r o m F i g u r e 1 D , ( B ) M s 3 o f m / z 4 3 5 f r o m p a n e l A , ( C ) M S 4 o f m / z 1 4 5 f r o m p a n e l B , a n d ( D ) M S 4 o f m / z 1 2 7 f r o m p a n e l B . 2 3 7 I m p o r t a n t l y , t h e s e p r o p o s e d m e c h a n i s m s w e r e s u p p o r t e d b y t h e r e s u l t s f r o m H / D e x c h a n g e e x p e r i m e n t s . F o r e x a m p l e , M S / M S o f t h e d e u t e r a t e d p r e c u r s o r i o n s a t m / z 7 2 0 ( t h r e e e x c h a n g e s ) r e s u l t e d i n l o s s o f t h e 1 8 : 1 f a t t y a c i d a s R Z C O O H r a t h e r t h a n R 2 C O O D , i n d i c a t i n g t h a t t h i s l o s s m a i n l y o c c u r s b y a c i s - l , 2 e l i m i n a t i o n m e c h a n i s m . M S 3 o f m / z 4 3 5 r e s u l t e d i n f o r m a t i o n o f m / z 1 4 5 v i a l o s s o f R 1 " C H = C = C = O , c o n s i s t e n t w i t h t h e c h a r g e - d i r e c t e d f r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s h o w n i n t h e l e fi b r a n c h o f S c h e m e 5 . 5 . I n c o n t r a s t , t h e l o s s o f w a t e r w a s o b s e r v e d a t m / z 4 1 8 ( D 2 0 ) a n d m / z 4 1 9 ( H O D ) , a t s i m i l a r a b u n d a n c e s , i n d i c a t i n g t h a t t h i s l o s s c o u l d i n v o l v e b o t h e x c h a n g e a b l e p r o t o n s a n d t h e n o n - e x c h a n g e a b l e C O L - p r o t o n . I n t e r e s t i n g l y , t h e s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s e d a b u n d a n c e o f t h e m / z 4 3 5 g l u t a m i n e c o n t a i n i n g p r o d u c t i o n i n t h e n e g a t i v e i o n m o d e M S / M S s p e c t r u m i n F i g u r e 5 . 1 2 A r e l a t i v e t o t h a t o f t h e m / z 4 2 1 o m i t h i n e - c o n t a i n i n g p r o d u c t i o n , c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f t h e c o r r e s p o n d i n g i o n s i n t h e p o s i t i v e i o n m o d e s p e c t r u m ( c o m p a r e F i g u r e s 5 . 1 2 A a n d 5 . 7 3 ) i s c o n s i s t e n t w i t h a n e x p e c t e d i m p r o v e m e n t i n t h e i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y f o r t h e g l u t a m i n e l i p i d p r e c u r s o r i o n i n n e g a t i v e m o d e , d u e t o t h e p r e s e n c e o f i t s l e s s b a s i c a m i d e f u n c t i o n a l g r o u p , c o m p a r e d t o a p r i m a r y a m i n e i n t h e o r n i t h i n e l i p i d . I n c o n t r a s t , 0 L a r e e x p e c t e d t o e x h i b i t s o m e p r e f e r e n t i a l i o n i z a t i O n i n p o s i t i v e m o d e d u e t o t h e p r e s e n c e o f t h e m o r e b a s i c p r i m a r y a m i n e c o m p a r e d t o t h e a m i d e f u n c t i o n a l g r o u p . 2 3 8 O o 0 1 - O / l k R z 0 H 4 H Z N R l " N H o m / z 7 1 7 M S / M S l - R 2 C O O H 0 0 0 : 1 1 ” ‘ Q N C — H , § b R l " H + t r a n s f e r H O m / z 4 3 5 - ‘ \ O O 0 - ” — R 1 " C H = C = C = O H N v J _ _ N R 1 " - H 0 0 0 H \ 0 m / z 4 3 5 I N + H N H Z H t r a n s f e r l — H 2 0 H N o o H U r i ; - R I " N V 0 m / z 4 1 7 l — R I " C H = C = C = O N H m / z 1 2 7 S c h e m e 5 . 5 P r o p o s e d p a t h w a y s f o r t h e m u l t i s t a g e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f d e p r o t o n a t e d g l u t a m i n e l i p i d s 2 3 9 5 . 3 . 4 ‘ S u m m a r y o f t h e o r n i t h i n e a n d g l u t a m i n e l i p i d s p e c i e s i d e n t i f i e d f r o m w i l d t y p e a n d G P C h o - d e f i c i e n t R . s p h a e r o i d e s c e l l m e m b r a n e s U s i n g t h e c h a r a c t e r i s t i c m u l t i s t a g e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s o f t h e 0 L a n d Q L l i p i d s d e s c r i b e d a b o v e , a l l o f t h e i o n s a p p e a r i n g a b o v e 1 % n o r m a l i z e d r e l a t i v e a b u n d a n c e i n t h e p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e m a s s s p e c t r a f o r t h e w i l d t y p e a n d G P C h o - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s c e l l m e m b r a n e s w e r e e x a m i n e d h e r e . T h e i d e n t i t i e s o f a l l t h e l i p i d s i d e n t i fi e d f r o m t h i s s t u d y a r e l i s t e d i n T a b l e 5 . 1 . I n t e r e s t i n g l y , n o n e o f t h e m a j o r O L m o l e c u l a r s p e c i e s r e p o r t e d p r e v i o u s l y i n b a c t e r i a S i n o r h i z o b i u m m e l i l o t i [ 1 0 6 ] a n d R h o d o b a c t e r c a p s u l a t u s [ 2 7 3 ] w e r e f o u n d t o b e a b u n d a n t i n R . s p h a e r o i d e s . T h e R 1 3 - O H f a t t y a c y l c h a i n s c o n n e c t e d t o t h e a m i n o a c i d h e a d g r o u p p r e d o m i n a n t l y c o n s i s t o f 3 - O H 1 8 : 0 , 1 8 : 1 , 2 0 : 0 a n d 2 0 : 1 c h a i n s . T h e R 2 s e c o n d f a t t y a c y l c h a i n a t t a c h e d v i a t h e 3 — O H g r o u p w e r e f o u n d t o p r i m a r i l y c o n s i s t o f 1 8 : 0 , 1 8 : 1 , 1 9 : 1 , 2 0 : 2 , 2 0 : 3 a n d 2 1 : 1 c h a i n s . B a s e d o n p r i o r r e p o r t s i n t h e l i t e r a t u r e [ 1 0 7 , 1 8 7 ] , t h e 1 9 : 1 a n d 2 1 : 1 c h a i n s a r e l i k e l y t o c o n t a i n a c y c l o p r o p a n e g r o u p , f o r m e d v i a t h e a d d i t i o n o f C H 2 o n t o a d o u b l e b o n d o f a n 1 8 : ] o r 2 0 : 1 f a t t y a c i d , r a t h e r t h a n c o n t a i n i n g a n o d d n u m b e r o f c a r b o n s i n t h e b a c k b o n e [ 2 8 6 ] . G l u t a m i n e - c o n t a i n i n g l i p i d s h a v e n o t p r e v i o u s l y b e e n r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e , a n d t h e i r o r i g i n r e m a i n s u n k n o w n . T h e p r e s e n c e o f a s i d e c h a i n c a r b o n y l g r o u p i n g l u t a m i n e l i p i d s s h o u l d m a k e t h i s l i p i d u n r e a c t i v e w i t h t h e n i n h y d r i n r e a g e n t . I n f a c t , N a - a c e t y l g l u t a m i n e w a s f o u n d h e r e t o g i v e a n e g a t i v e n i n h y d r i n t e s t r e s u l t ( d a t a n o t s h o w n ) . T h u s , a l t h o u g h e v i d e n c e i s l a c k i n g , i t i s i n t r i g u i n g t o s p e c u l a t e t h a t t h e n i n h y d r i n — n e g a t i v e p h o s p h a t e - f r e e l i p i d s p e c i e s o b s e r v e d f o l l o w i n g i n c o r p o r a t i o n o f 1 4 C - 2 4 0 l a b e l e d o r n i t h i n e a s a s u b s t r a t e f o r a p o t e n t i a l h o m o l o g o f a s p a r t y l / a s p a r i g i n a l B — h y d r o x y l a s e i n R h i z o b i u m t r o p i c i [ 2 6 9 ] , c o r r e s p o n d t o g l u t a m i n e l i p i d s . T h e p o s s i b i l i t y o f t h e s e g l u t a m i n e l i p i d s a p p e a r i n g a s a r t i f a c t s d u e t o o x i d a t i o n o f o r n i t h i n e l i p i d s p e c i e s d u r i n g s a m p l e p r e p a r a t i o n c a n n o t b e r u l e d o u t . H o w e v e r , i f t h i s h a d o c c u r r e d , i t w o u l d b e e x p e c t e d t h a t t h e m o r e s u s c e p t i b l e d o u b l e b o n d s i n t h e f a t t y a c i d c h a i n s o f t h e o r n i t h i n e l i p i d s w o u l d n o t b e f o u n d i n t a c t . E f f o r t s t o c h e m i c a l l y o x i d i z e t h e 5 — m e t h y l e n e g r o u p o f N — a c e t y l — o m i t h i n e , u s i n g c o n d i t i o n s p r e v i o u s l y d e m o n s t r a t e d t o r e s u l t i n t h e e f f e c t i v e o x i d a t i o n o f m e t h i o n i n e , c y s t e i n e , S — a l k y l c y s t e i n e a n d t r y p t o p h a n [ 2 8 7 ] , d i d n o t y i e l d N — a c e t y l - g l u t a m i n e , i n d i c a t i n g t h e s t a b i l i t y o f t h e o r n i t h i n e h e a d g r o u p t o o x i d a t i v e m o d i fi c a t i o n s . F u r t h e r m o r e , d e s p i t e t h e w i d e v a r i e t y o f o r n i t h i n e l i p i d s o b s e r v e d h e r e , o n l y a l i m i t e d n u m b e r o f g l u t a m i n e l i p i d s w e r e o b s e r v e d , a n d t h e r e l a t i v e a b u n d a n c e s o f t h e s e l i p i d s d i d n o t r e fl e c t t h o s e o f t h e o r n i t h i n e l i p i d s . T h e a r t i fi c i a l o x i d a t i o n w o u l d n o t b e e x p e c t e d t o d i s p l a y s u c h s e l e c t i v i t y . 2 4 1 d l i w f o ) 1 0 1 1 1 t : : : : : n 8 1 1 1 1 6 8 8 9 s e 1 / / / / e 1 i / 1 0 1 n a r b m e m l l e c e h t m o r f d e t c a c : 0 : : : ) fi 0 : 0 0 0 L e 8 2 2 2 2 Q d 1 H H H 1 ( 1 - H o O 0 O O O h - - - - - 3 3 3 3 3 C P G ( L L L L L Q Q Q Q Q 1 1 : : 8 8 1 1 / / 1 0 : : 0 0 r 2 2 t x e s e i c e p s d i p i l ) L H H O O - - 3 3 L L Q Q ) 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 0 2 3 1 s : : : : : : t : : : : : : : d 0 8 0 0 0 0 : n 8 6 8 9 8 9 1 Q i 1 2 9 2 2 2 1 2 1 1 1 1 1 2 ( p 1 / / / / / / / / / / / / / e e : : : : : : : : : : : : : i i c 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 1 l / n i L ) i 1 8 6 8 8 8 0 0 0 0 0 0 0 0 e 2 2 2 2 2 2 2 2 f : 1 1 1 1 1 m e n 8 0 L a d H H H H H H H H H H H H H t - ( i 1 h O O O O O O O O O O O O O H u o t l h i g C - - - - - - - - - - - - - O 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 - 3 d n a ) L 0 ( e n i h t i n r o e h t f o y r a m m n r O P 3 G L L L L L L L L L L L L L L ( C O O O 0 O 0 O 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 l 1 2 2 2 3 3 : : : : : : : : : : : 9 0 0 0 0 0 1 8 9 9 1 1 2 2 2 2 2 2 1 1 1 2 / / / / / / / / / / / 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 : : : : : : : : : : : 8 8 8 8 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 H H H H H H H H H H H O O O O O O O O O O O - - - - - - - - - - - 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 . L . L L L L L L L L L 1 C 0 0 C O C C C C C O - u l S H z 5 9 3 5 9 1 1 l 8 0 0 2 7 0 3 m 6 6 7 7 7 7 7 — M l 1 . 5 e l b + ] Z < / 1 7 7 3 5 3 l H + I I 7 9 0 0 0 3 3 I 6 6 7 7 7 7 7 a M T [ 2 4 2 a t y p e a n d G P C h o - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s O r n i t h i n e L i p i d s ( 0 L ) ( w i l d t y p e L G l u t a m i n e L i p i d s ( Q L ) ( w i l d t y p e ) G l u t a m i n e L i p i d s C L 3 - O H 1 8 : 1 / 1 9 : 1 6 9 3 6 9 1 0 L 3 - O H 1 8 : 0 / 1 9 : 1 C L 3 - O H 2 0 : 0 / 1 8 : 1 O L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 0 7 1 9 7 1 7 7 2 1 7 1 9 C L 3 - O H 2 0 : 0 / 2 0 : 2 7 4 7 7 4 5 O L 3 - O H 2 0 : l / 2 1 : 1 7 4 9 7 4 7 a O n l y t h o s e i o n s w i t h r e l a t i v e a b u n d a n c e > 1 % i n t h e M S s p e c t r a w e r e e x a m i n e d . 5 . 4 C o n c l u s i o n s T h e m o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f o r n i t h i n e l i p i d ( 0 L ) a n d n o v e l g l u t a m i n e l i p i d ( Q L ) s p e c i e s e x t r a c t e d f r o m t h e m e m b r a n e s o f w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s , a s w e l l a s f r o m a G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t , h a v e b e e n d e t e r m i n e d b y u s i n g m u l t i s t a g e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y i n a l i n e a r q u a d r u p o l e i o n t r a p . T h e g l u t a m i n e l i p i d s w e r e f o u n d t o s h a r e a n a n a l o g o u s s t r u c t u r e w i t h t h e o r n i t h i n e l i p i d s , w h e r e t h e a m i n o a c i d h e a d g r o u p i s c o n n e c t e d t o t h e fi r s t f a t t y a c i d v i a a n a m i d e b o n d a t t h e N a — p o s i t i o n , a n d t h e s e c o n d f a t t y a c i d i s i n c o r p o r a t e d v i a a n e s t e r b o n d w i t h a 3 - O H g r o u p w i t h i n t h e fi r s t f a t t y a c i d . C h a r a c t e r i s t i c ‘ fi n g e r p r i n t ’ p r o d u c t i o n s f o r O L s a r e o b s e r v e d a t m / z 1 1 5 i n p o s i t i v e i o n m o d e a n d a t m / z 1 3 1 i n n e g a t i v e i o n m o d e , w h e r e a s a n a l o g o u s ‘ fi n g e r p r i n t ’ i o n s f o r Q L s a r e o b s e r v e d a t m / z 1 4 7 , 1 3 0 a n d 1 2 9 i n p o s i t i v e i o n m o d e , a n d a t m / z 1 4 5 a n d 1 2 7 i n n e g a t i v e i o n m o d e . T h e f u n d a m e n t a l k n o w l e d g e o b t a i n e d h e r e r e g a r d i n g t h e m u l t i s t a g e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f b o t h o r n i t h i n e a n d g l u t a m i n e l i p i d s e s t a b l i s h e s t h e b a s i s f o r f u t u r e a p p l i c a t i o n s a i m e d t o w a r d t h e s e n s i t i v e i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f t h e s e l i p i d s p e c i e s i n c o m p l e x l i p i d m i x t u r e s . 2 4 3 (11111111111111!11711111” A ” 7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 6 3 4 0 7 9 . I t c a : » n A 5 . 4 v . . i . . . . : . h fi t n u ‘ u D u ‘ ‘ s . fi . d s J “ A . . . n . fl fi w h . r “ a . m n A . . M . I h ? t 1 . $ s & i . a k a x . . . . : . . " . 1 . . 2 n . . . . 3 3 v 1 4 t u t n . . A . A w - . n . . . . . i F . » a 5 i s . A , y t a r a . w . ‘ . 3 w I . . A A a u 1 u : ‘ . , . . I a V . . . . . . . A A . . n v . . . . A L o . : l K r x i A “ . a ? 2 1 . ‘ . . . V l u I . x i fi ! . s t . I . a o . h ¢ 0 P . { | 2 h . u . t I 9 H n i A o : b i I “ . q a ‘ u n 3 g g a i . , ‘ ! 5 A . , u : . u . ? s . . . k 2 . é . . v . ‘ » . k . 4 w § m 3 g r . . . u a u . n u r w w ‘ t i a r i - . . . l ~ . a e . I W . M . . . m E ; 1 . . fl x . ? . w 4 v k A . . A . f . 4 3 F ’ A . . v h . . 4 . . ‘ . w . ' . n . z b i u v g n . a « h u . x . . A . . . A . p 3 V . L m « a . d L R H ( i s : A . 1 9 1 1 ' s . ! { 9 . 2 1 1 . } : [ 3 4 5 1 1 . 0 ‘ 2 5 : } ; . 3 w i l t » : 1 3 . 5 . h 1 t c ‘ 2 u k r u x n t h fi n a s u l fi i é x . . . 1 1 9 . i . l l ( N i l . A u g . . . 1 . x c . I t a l t ! u M a . a ” . ‘ V C . L 4 0 4 k v fi b x u , v a n ? r 4 4 3 4 ” » ? ‘ t h m 7 4 3 3 3 " } ” I ' m — 3 L I B R A R Y M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T o A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 5 / 0 8 K z l P r o l e o c 8 P r e s / C I R C I D a t e D u e . i n d d I N V E S T I G A T I N G T H E F U N C T I O N A L R O L E S O F L I P I D S I N M E M B R A N E P R O T E I N C Y T O C H R O M E C O X I D A S E F R O M R H O D O B A C T E R S P H A E R O I D E S U S I N G M A S S S P E C T R O M E T R Y A N D L I P I D P R O F I L E M O D I F I C A T I O N V O L U M E I I B Y X i Z h a n g A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y C h e m i s t r y a n d B i o c h e m i s t r y & M o l e c u l a r B i o l o g y 2 0 0 9 C h a p t e r 6 C h a r a c t e r i z a t i o n o f S u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r i d e ( S Q D G ) a n d D i a c y l g l y c e r y l - N , N , N - t r i m e t h y l h o m o s e r i n e ( D G T S ) L i p i d s E x t r a c t e d f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s u s i n g T r i p l e Q u a d r u p o l e a n d L i n e a r I o n T r a p M a s s S p e c t r o m e t r y 6 . 1 S u m m a r y T h e p o l a r n o n - p h o s p h o l i p i d s s u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r o l ( S Q D G , n e g a t i v e l y c h a r g e d ) a n d d i a c y l g l y c e r y l - t n ' m e t h y l h o m o s e r i n e ( D G T S , p o s i t i v e l y c h a r g e d ) w e r e b o t h f o u n d t o b e t h e m a j o r t y p e s o f m e m b r a n e l i p i d s o b s e r v e d i n R . s p h a e r o i d e s u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g a n a e r o b i c [ 1 1 ] o r a e r o b i c g r o w t h c o n d i t i o n s ( s e e C h a p t e r 1 0 f o r a d e t a i l e d d i s c u s s i o n ) . I n c o n t r a s t , u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e g r o w t h c o n d i t i o n s , S Q D G w a s p r e s e n t i n t h e m e m b r a n e a t a m u c h l o w e r a b u n d a n c e c o m p a r e d t o p h o s p h o l i p i d s , w h e r e a s D G T S w a s t y p i c a l l y n o t d e t e c t a b l e u s i n g e i t h e r l 4 C - r a d i o a c t i v e l a b e l i n g [ l l ] o r m a s s s p e c t r o m e t r y ( s e e C h a p t e r s 7 , 9 a n d 1 0 f o r d e t a i l s ) . S i n c e t h e d r a s t i c a l l y a l t e r e d l i p i d p r o fi l e s t i l l e n a b l e s t h e s u r v i v a l o f t h e b a c t e r i a , a n d e v e n t h e u n h a m p e r e d e x p r e s s i o n o f a f u l l y a c t i v e f o u r - s u b u n i t m e m b r a n e p r o t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( s e e C h a p t e r 1 0 ) , a n d S Q D G h a s b e e n c l e a r l y d e t e c t e d i n t h e C c O c r y s t a l s e v e n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e g r o w t h ( s e e C h a p t e r 9 ) , i t w a s o f i m p o r t a n c e t o e x a m i n e a n d u n d e r s t a n d t h e f r a g m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f S Q D G a n d D G T S , i n o r d e r t o b e a b l e t o a c h i e v e a n 2 4 4 a c c u r a t e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e i r m o l e c u l a r s t r u c t u r e s , a n d t h e s e n s i t i v e q u a n t i fi c a t i o n o f e a c h m o l e c u l a r s p e c i e s u s i n g a m i n i m u m a m o u n t o f s a m p l e , s u c h a s t h e p u r i fi e d p r o t e i n a n d t h e C c O p r o t e i n c r y s t a l s ( s e e C h a p t e r 9 f o r a p i c t u r e o f c r y s t a l ) . I n s p i t e o f t h e i r p o t e n t i a l p h y s i o l o g i c a l s i g n i fi c a n c e [ 2 8 8 , 2 8 9 ] , S Q D G a n d D G T S l i p i d s t r u c t u r e s a n d f r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s h a v e n o t b e e n e x a m i n e d s y s t e m a t i c a l l y u s i n g m o d e r n m a s s s p e c t r o m e t r y t e c h n i q u e s , s u c h a s t h e l o w - e n e r g y C I D t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y c o u p l e d w i t h “ s o f t ” i o n i z a t i o n m e t h o d s i n c l u d i n g M A L D I a n d E S I , w h i c h h a v e f o u n d i n c r e a s i n g l y e x t e n s i v e a p p l i c a t i o n s i n t h e n e w a r e a s o f l i p i d o m i c s a n d m e t a b o l o m i c s [ 5 9 , 1 1 7 , 2 9 0 ] . T h e f e w p r e v i o u s c a s e s o f l i p i d b i o c h e m i s t r y s t u d i e s t h a t h a v e u s e d m a s s s p e c t r o m e t r y t o h e l p c o n fi r m S Q D G a n d D G T S e m p l o y e d m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h r e l a t i v e l y h i g h e r e n e r g y , w h e r e t h e s p e c t r a c a n b e d i f f e r e n t f r o m t h o s e o f l o w - e n e r g y m a s s s p e c t r o m e t r y [ 1 1 , 9 9 , 1 0 6 , 1 0 8 , 2 9 1 ] . B y u s i n g a c o m b i n a t i o n o f c o l l i s i o n - e n e r g y — r e s o l v e d t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ( M S / M S ) , m u l t i s t a g e t a n d e m s p e c t r o m e t r y ( M S n ) a n d H / D e x c h a n g e , t h e f r a g m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f S Q D G a n d D G T S l i p i d s f r o m c o m p l e x m i x t u r e s ( l i p i d e x t r a c t s o r m e m b r a n e p e l l e t s ) w e r e e x a m i n e d . W i t h o u t r e q u i r e m e n t f o r m e t h o d s s u c h a s c h r o m a t o g r a p h y a n d N M R , i d e n t i fi c a t i o n c o u l d b e a c h i e v e d b y u s i n g m / z 2 2 5 ( - v e ) f o r S Q D G , a n d m / z 2 3 6 ( a s w e l l a s t h e l o w e r - a b u n d a n c e m / z 1 4 4 i f t h e l o w - m a s s - c u t o f f a l l o w s , + v e ) f o r D G T S a s t h e fi n g e r p r i n t p r o d u c t i o n s i n t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ( M S / M S ) . T h e s e fi n g e r p r i n t M S / M S p r o d u c t i o n s w e r e t h e n u s e d t o m a s s - s p e c t r o m e t r i c a l l y “ s e p a r a t e ” S Q D G l i p i d s o u t o f c o m p l e x t o t a l l i p i d s e x t r a c t s , a n d a t t h e s a m e t i m e q u a n t i f y b e t w e e n a l l t h e S Q D G m o l e c u l a r s p e c i e s w i t h d i f f e r e n t f a t t y a c i d s 2 4 5 c h a i n s b y u s i n g a p r e c u r s o r i o n s c a n i n a t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r , o r b y p r e c u r s o r i o n m a p p i n g i n a q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r . 2 4 6 6 . 2 I n t r o d u c t i o n 6 . 2 . 1 B i o l o g i c a l i n t e r e s t s i n S Q D G a n d D G T S l i p i d s S Q D G i s a t y p e o f a n i o n i c , b i l a y e r - f o r m i n g , g l y c o l i p i d t h a t c o n t a i n s a n e g a t i v e l y - c h a r g e d q u i n o v o s y l s u l fi t e g r o u p i n s t e a d o f a p h o s p h a t e g r o u p , a n d d i a c y l g l y c e r y l - t r i m e t h y l h o m o s e r i n e ( D G T S ) i s a t y p e o f c a t i o n i c p h o s p h a t e - f r e e l i p i d , c o m p o s e d o f a d i a c y l - g l y c e r i d e b a c k b o n e c o n n e c t e d t o a p o s i t i v e l y - c h a r g e d N , N , N - t r i m e t h y l h o m o s e r i n e h e a d g r o u p ( S c h e m e 6 . 1 ) . S Q D G i s a b u n d a n t i n t h e m e m b r a n e s o f m o s t p h o t o s y n t h e t i c b a c t e r i a , h i g h e r p l a n t s , m o s s e s , f e r n s a n d a l g a e [ 1 4 , 2 8 9 , 2 9 2 ] . I n c o n t r a s t t o p h o s p h o l i p i d s , S Q D G c o n t a i n s a n e g a t i v e l y c h a r g e d s u l fi t e l i n k e d v i a a S - C b o n d t o t h e 6 - C o f t h e q u i n o v o s e s u g a r r i n g a t t a c h e d t o t h e g l y c e r o l b a c k b o n e . S Q D G h a s b e e n f o u n d t o b e p r e f e r e n t i a l l y , t h o u g h n o t e x c l u s i v e l y , a s s o c i a t e d w i t h p h o t o s y n t h e t i c o r g a n i s m s [ 1 4 , 2 8 9 , 2 9 2 ] . A l t h o u g h S Q D G i s f o u n d t o b e n o t e s s e n t i a l f o r a n o x y g e n i c p h o t o s y n t h e s i s , a n d n o e v i d e n c e h a s s u g g e s t e d t h a t S Q D G h a s a n e s s e n t i a l r o l e i n t h e o x y g e n i c p h o t o s y n t h e s i s [ 1 4 ] , i t d o e s d e m o n s t r a t e c o n d i t i o n a l i m p o r t a n c e u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g c o n d i t i o n s [ 2 8 9 ] , a n d b e c o m e s e s s e n t i a l w h e n p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ( G P G r o ) i s d e p l e t e d [ 2 8 9 , 2 9 2 ] . S Q D G h a s a l s o b e e n f o u n d t o i n h i b i t D N A p o l y m e r a s e s a n d t o h a v e a n t i t u m o r a n d a n t i v i r a l e f f e c t s , p r o b a b l y d u e t o i t s a n i o n i c d e t e r g e n t - l i k e s t r u c t u r e [ 2 9 3 ] . M o r e r e c e n t l y , t h e p o l a r n o n - p h o s p h o l i p i d s S Q D G ( n e g a t i v e l y c h a r g e d ) a n d D G T S ( p o s i t i v e l y c h a r g e d ) w e r e b o t h f o u n d t o b e t h e m a j o r t y p e s o f m e m b r a n e l i p i d s i n R . s p h a e r o i d e s u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g a n a e r o b i c o r a e r o b i c c o n d i t i o n s ( s e e C h a p t e r 1 0 f o r a d e t a i l e d d i s c u s s i o n ) . I n c o n t r a s t , u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e g r o w t h c o n d i t i o n s , S Q D G 2 4 7 w a s p r e s e n t i n t h e m e m b r a n e a t a n a b u n d a n c e m u c h l o w e r t h a n t h e p h o s p h o l i p i d s , w h e r e a s D G T S w a s t y p i c a l l y n o t d e t e c t a b l e u s i n g e i t h e r 1 4 C - r a d i o a c t i v e l a b e l i n g [ l l ] o r m o d e r n m a s s s p e c t r o m e t r y ( s e e C h a p t e r s 7 , 9 a n d 1 0 f o r d e t a i l s ) . M o r e i m p o r t a n t l y , h o w e v e r , d e s p i t e a d r a s t i c a l l y a l t e r e d l i p i d p r o fi l e , t h e b a c t e r i a w e r e s t i l l v i a b l e a n d r e s u l t e d i n t h e t h e u n h a m p e r e d e x p r e s s i o n o f a f u l l y a c t i v e f o u r — s u b u n i t m e m b r a n e p r o t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( s e e C h a p t e r 1 0 f o r d e t a i l s ) . S Q D G h a s a l s o b e e n c l e a r l y d e t e c t e d i n C c O c r y s t a l s , p a r t i c u l a r l y i n t h e c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t v e r s i o n , e v e n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e g r o w t h c o n d i t i o n s ( s e e C h a p t e r 9 f o r d e t a i l s ) . o = s = o C H 3 0 5 ° O l a , H a c — r l H i I D O L : S Q D G ” " 3 " a : " 1 W T R O ‘ D G T S H T S M - S c h e m e 6 . 1 G e n e r a l s t r u c t u r e s o f S Q D G a n d D G T S T h e m a j o r b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s o f S Q D G a n d D G T S i n b a c t e r i a h a v e b e e n r e c e n t l y e l u c i d a t e d b y u s i n g g e n e t i c a p p r o a c h e s , b u t t h e i r f u n c t i o n s s t i l l l a r g e l y r e m a i n t o b e d e fi n e d , i n a d d i t i o n t o t h e g e n e r a l p r o p o s i t i o n t h a t S Q D G c a n f u n c t i o n a l l y r e p l a c e G P G r o d u e t o t h e n e g a t i v e l y c h a r g e d h e a d g r o u p , a n d D G T S c a n r e p l a c e G P C h o l i k e l y d u e t o t h e fi x e d p o s i t i v e c h a r g e o n t h e N , N , N - t r i m e t h y l h e a d g r o u p [ 1 1 , 1 4 ] . T h e i r p h y s i o l o g i c a l s i g n i fi c a n c e s u g g e s t e d b y t h e r e c e n t fi n d i n g s o u t l i n e d i n C h a p t e r s 7 a n d 1 0 , t h e r e f o r e , m a k e s i t v e r y i m p o r t a n t t o b e a b l e t o a c c u r a t e l y i d e n t i f y t h e i r m o l e c u l a r 2 4 8 s t r u c t u r e s a n d q u a n t i f y e a c h m o l e c u l a r s p e c i e s u s i n g a m i n i m u m a m o u n t o f s a m p l e , e s p e c i a l l y w h e n a n a l y z i n g t r a c e s o f l i p i d s t h a t r e m a i n b o u n d i n t h e p u r i fi e d C c O p r o t e i n , a n d t h e m i c r o - s c a l e C c O p r o t e i n c r y s t a l s . 6 . 2 . 2 C u r r e n t s t a t u s o f s t r u c t u r a l s t u d i e s o f S Q D G a n d D G T S T r a d i t i o n a l l y , t h e s e p a r a t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f S Q D G h a s r e l i e d o n t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( T L C ) c o m b i n e d w i t h a s e r i e s o f fi m c t i o n a l - g r o u p - s e l e c t i v e s p r a y s , i n c l u d i n g a p o s i t i v e r e a c t i o n w i t h a - n a p h t h o l s p r a y w h i c h c a n s p e c i fi c a l l y r e a c t w i t h t h e s u g a r s t r u c t u r e t o d e v e l o p a c o l o r , a n d a n e g a t i v e r e a c t i o n w i t h p h o s p h a t e a n d a m i n o g r o u p t e s t s [ 1 5 ] ( s e e C h a p t e r 2 f o r a d e t a i l e d d e s c r i p t i o n ) . I n o r d e r t o o b t a i n a n y c o n v i n c i n g e v i d e n c e o f t h e n e w s t r u c t u r e , N M R ( 1 H a n d 1 3 C ) h a s m o s t l y b e e n a r e q u i r e m e n t [ 1 1 , 2 7 4 , 2 9 4 , 2 9 5 ] , b u t t y p i c a l l y r e q u i r e s a l a r g e a m o u n t o f s a m p l e a n d r i g o r o u s l i p i d p u r i fi c a t i o n , o f t e n u s i n g T L C [ 1 1 , 2 7 4 , 2 9 5 ] . R e c e n t l y , m a s s s p e c t r o m e t r y - b a s e d m e t h o d s h a v e b e e n a p p l i e d t o h e l p c o n fi r m t h e p r e s e n c e o f S Q D G , o n c e t h e l i p i d s t r u c t u r e h a s b e e n p a r t i a l l y c h a r a c t e r i z e d u s i n g N M R m e t h o d s , i n c l u d i n g F A B - s e c t o r h i g h - e n e r g y c o l l i s i o n - i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ( C I D ) M S / M S [ 1 0 8 , 1 9 9 , 2 9 1 , 2 9 6 ] , M A L D I - T O F p o s t - s o u r c e d e c a y ( P S D ) [ 9 9 ] , E S I - C I D M S / M S i n t r i p l e q u a d r u p o l e [ 1 5 0 ] , a n d m o r e r e c e n t l y E S I - l o w - e n e r g y C I D M S / M S i n i o n t r a p [ 2 9 6 , 2 9 7 ] , a n d M A L D I - t r a p T O F C I D M S n [ 2 9 8 ] i n t h e n e g a t i v e i o n m o d e . T h e q u a n t i fi c a t i o n o f t h i s t y p e o f l i p i d h a s b e e n d e p e n d e n t o n s i l i c a g e l T L C i n c o m b i n a t i o n e i t h e r w i t h m e t a b o l i c r a d i o a c t i v e l a b e l i n g , o r w i t h g a s c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y ( G C - M S ) , a f t e r s c r a p i n g t h e i d e n t i fi e d s p o t o f f t h e p l a t e f o l l o w e d b y r e - e x t r a c t i o n , s a p o n i fi c a t i o n a n d c h e m i c a l d e r i v a t i z a t i o n [ 1 1 , 9 9 , 2 6 2 , 2 9 9 ] . 2 4 9 P r i o r t o t h e a d v e n t o f h i g h l y s e n s i t i v e m u l t i - s t a g e m a s s s p e c t r o m e t r y ( M S n ) e x p e r i m e n t s t h a t c a n b e c a r r i e d o u t i n q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r s , m a n y c a s e s o f l i p i d b i o c h e m i s t r y s t u d i e s h a v e r e l i e d o n t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h r e l a t i v e l y h i g h e r c o l l i s i o n e n e r g i e s t o a s s i s t w i t h t h e c o n fi r m a t i o n o f S Q D G a n d D G T S . M o r e r e c e n t l y , l o w - e n e r g y C I D t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y c o u p l e d w i t h “ s o f t ” M A L D I a n d E 8 1 i o n s o u r c e s h a s f o u n d i n c r e a s i n g e x t e n s i v e a p p l i c a t i o n s i n t h e n e w e r a s o f l i p i d o m i c s a n d m e t a b o l o m i c s [ 5 9 , 1 1 7 , 2 9 0 ] . A f e w r e c e n t c a s e s t h a t a p p l i e d t h e s e m e t h o d s h a v e r a t i o n a l i z e d t h e f o r m a t i o n o f c h a r a c t e r i s t i c p r o d u c t i o n s f r o m S Q D G a n d D G T S l i p i d s u n d e r l o w - e n e r g y C I D c o n d i t i o n s [ 9 3 , 1 9 9 ] , b u t t h e m e c h a n i s m f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e s e i o n s h a s n o t b e e n s y s t e m a t i c a l l y i n v e s t i g a t e d . I n m o s t o f t h e s e s t u d i e s , S Q D G l i p i d s w e r e i d e n t i fi e d b y t h e o b s e r v a t i o n o f t h e c h a r a c t e r i s t i c p r o d u c t i o n s a t m / z 8 1 ( H S O 3 ‘ ) [ 1 5 0 ] o r 8 0 ( $ 0 3 " s e e n i n F A B - C I D M S / M S ) [ 9 9 , 1 0 8 , 2 9 1 ] a n d t h e fi ' a g m e n t i o n a t m / z 2 2 5 i n s o m e s t u d i e s [ 9 9 , 1 0 8 , ] 5 0 , 2 9 1 , 2 9 6 , 2 9 8 ] . O n t h e o t h e r h a n d , t h e D G T S l i p i d s h a v e b e e n i d e n t i fi e d b a s e d o n t h e o b s e r v a t i o n o f a g r o u p o f m u l t i p l e p r o d u c t i o n s c o n s i s t i n g o f m / z 5 8 , 5 9 , 8 3 , 8 4 , 1 0 2 , 1 1 7 , 1 3 0 , 1 4 4 , 1 6 2 , 2 0 2 a n d 2 3 6 , i n c l u d i n g b o t h e v e n - e l e c t r o n c a t i o n s a n d r a d i c a l c a t i o n s , b y u s i n g F A B - C I D M S / M S [ 1 1 , 1 0 6 ] . M o r e r e c e n t l y t h e p r o d u c t i o n s a t m / z 1 4 4 a n d m / z 2 3 6 o b s e r v e d i n E S I - C I D M S / M S i n a h y b r i d q u a d r u p o l e - T O F m a s s s p e c t r o m e t e r w e r e p r o p o s e d t o c o m e f r o m D G T S [ 9 3 ] . H o w e v e r , t h e r e l a t i v e a b u n d a n c e s o f t h e s e p r o d u c t i o n s a r e h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e e n e r g y a p p l i e d i n t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s i n t h e s e t y p e s o f m a s s s p e c t r o m e t e r s , a n d t h e e x t e n t o f d i fi ‘ e r e n t l e v e l s o f f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s a r e d i f fi c u l t t o c o n t r o l ( s e e C h a p t e r 2 f o r a d e t a i l e d e x p l a n a t i o n ) , s u c h t h a t t h e s p e c t r a c a n b e q u i t e d i f f e r e n t f r o m t h o s e o b t a i n e d b y l o w - e n e r g y i o n t r a p 2 5 0 t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y , m a k i n g i t d i f fi c u l t t o u s e t h e s e i o n s o r t h e s e s p e c t r a a s t h e r e f e r e n c e f o r l i p i d i d e n t i fi c a t i o n i n f u t u r e s t u d i e s . I t i s t h e r e f o r e i m p o r t a n t t o u n d e r s t a n d m o r e c l e a r l y t h e f r a g m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f S Q D G i n m o d e r n m a s s s p e c t r o m e t r y . A g o o d u n d e r s t a n d i n g o f t h e f r a g m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s i s c r i t i c a l f o r a c c u r a t e i d e n t i fi c a t i o n a n d f u r t h e r q u a n t i fi c a t i o n o f S Q D G l i p i d i n c o m p l i c a t e d l i p i d m i x t u r e s . W i t h t h e a v a i l a b i l i t y o f c o l l i s i o n e n e r g y r e s o l v e d l o w - e n e r g y C I D M S / M S i n t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r [ 3 0 0 ] , a n d t h e C I D M S n e x p e r i m e n t s [ 1 7 3 ] i n t h e q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r t o g e t h e r w i t h t h e o p t i o n o f q u i c k p u l s e d - Q d i s s o c i a t i o n ( P Q D ) , m o r e a b u n d a n t a n d r e l i a b l e e x p e r i m e n t a l i n f o r m a t i o n c a n b e g a i n e d t o w a r d u n d e r s t a n d i n g t h e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f t h i s a n i o n i c l i p i d , w h i c h p o i n t s t o w a r d m o r e a c c u r a t e a n d s e n s i t i v e i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f t h i s t y p e o f l i p i d . M o s t l i p i d s p r i m a r i l y f o r m s i n g l y c h a r g e d p r e c u r s o r i o n s w i t h t h e e x c e p t i o n o f l i p i d s s u c h a s C L a n d p h o s p h o r y l a t e d p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( G P I n s - P n ) , w h i c h f o r m d o u b l y o r m u l t i p l y c h a r g e d p r e c u r s o r i o n s i n t h e n e g a t i v e i o n m o d e [ 1 1 7 ] . S t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n f o r t h e i r i d e n t i fi c a t i o n i s o f t e n p r o v i d e d b y t h e o b s e r v a t i o n o f c h a r a c t e r i s t i c n e u t r a l l o s s a n d / o r l o w m / z p r o d u c t i o n s , s u c h a s t h e f a t t y a c i d c h a i n i o n s a n d t h e i o n s f o r m e d f r o m t h e h e a d g r o u p s u c h a s P O 4 C H 2 C H C H 2 0 H ’ a t m / z 1 5 3 f r o m a f e w t y p e s o f p h o s p h o l i p i d s [ 1 1 7 , 1 8 7 ] , a n d S O 3 C H 2 C 5 H 7 O 4 ' a t m / z 2 2 5 s p e c i fi c a l l y f r o m S Q D G l i p i d s ( t o b e d e s c r i b e d i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n s ) . T h e n e e d t o o b s e r v e t h e s e l o w e r - m a s s fi a g m e n t i o n s p o s e s a c h a l l e n g e f o r i o n t r a p i n s t r u m e n t s d u e t o t h e l o w m a s s c u t o f f i s s u e [ 1 7 0 ] . T h e l o w e s t p r o d u c t i o n m / z v a l u e d e t e c t a b l e i n t h e q u a d r u p o l e i o n t r a p i s l i m i t e d 2 5 1 b y t h e a c t i v a t i o n q v a l u e . I n c o n v e n t i o n a l l o w - e n e r g y C I D o n t h e q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r , t h e a c t i v a t i o n o f f r a g m e n t i o n s i s t y p i c a l l y p e r f o r m e d a t a q v a l u e o f a r o u n d 0 . 2 5 ( S e e C h a p t e r 2 f o r a d e t a i l e d d e s c r i p t i o n ) , c o r r e s p o n d i n g t o a l o w - m a s s - ' c u t o f f ( L M C O ) a t a r o u n d m / z 2 5 0 ( f o r p r e c u r s o r i o n a t m / z 9 0 8 ) , w h i c h i s o f t e n h i g h e r t h a n t h e m / z o f f r a g m e n t i o n s c h a r a c t e r i s t i c f o r t h e l i p i d h e a d g r o u p . C o m p l e t e i d e n t i fi c a t i o n o f l i p i d s o f t e n r e q u i r e s M S n e v e n i n t h e n e g a t i v e i o n m o d e . T h e a b i l i t y o f t h e i n s t r u m e n t t o d e t e c t t h e s e l o w e r m a s s f r a g m e n t i o n s c a n p o t e n t i a l l y e n h a n c e t h e a c c u r a c y o f l i p i d i d e n t i fi c a t i o n i n t h e M S / M S s t a g e , w h i c h i n t u r n m a k e s M S / M S b a s e d i o n m a p p i n g e x p e r i m e n t s , s u c h a s p r e c u r s o r i o n m a p p i n g o r t h e p r o d u c t i o n m a p p i n g , m o r e p o w e r f u l f o r t h e r a p i d a n d a c c u r a t e p r o fi l i n g o f l i p i d s i n c o m p l e x s a m p l e s . H o w e v e r , a l t h o u g h d e c r e a s i n g t h e a c t i v a t i o n q v a l u e c a n e x t e n d t h e l o w m a s s c u t o f f , m a k i n g i o n s a t l o w e r m / z m o r e d e t e c t a b l e , i t a l s o c a u s e s m o r e p r e c u r s o r i o n s t o b e c o m e u n s t a b l e i n t h e a c t i v a t i o n s t e p , l e a d i n g t h e m t o b e l o s t b e f o r e t h e y a r e f r a g m e n t e d . A l t e r n a t i v e l y , P Q D f r a g m e n t a t i o n c a n b e u s e d t o e x t e n d t h e m a s s r a n g e f o r f r a g m e n t i o n d e t e c t i o n t o a m u c h l o w e r v a l u e [ 1 7 7 ] , t y p i c a l l y m / z 5 0 f o r l i p i d p r e c u r s o r i o n s , w h i c h i s a c h i e v e d t h r o u g h a p p l y i n g a p u l s e a t h i g h q ( 0 . 7 ) f o r a c t i v a t i o n f o l l o w e d b y a q u i c k d r o p o f t h e q v a l u e d o w n t o 0 . 0 5 t o t r a p t h e f r a g m e n t i o n s f o r d e t e c t i o n . H o w e v e r , s u c h a m e t h o d c a n p o t e n t i a l l y o p e n u p m o r e f r a g m e n t a t i o n c h a n n e l s d u e t o t h e h i g h e r a c t i v a t i o n e n e r g y i n t r o d u c e d t o t h e p r e c u r s o r i o n , a n d e n h a n c e t h e p e r c e n t a g e o f t h e p r e c u r s o r i o n s t h a t u n d e r g o f r a g m e n t a t i o n , y e t r i s k l o s i n g o v e r a l l s i g n a l s d u r i n g a c t i v a t i o n a t s u c h a h i g h q v a l u e . I n o r d e r t o p e r f o r m s e n s i t i v e a n d a c c u r a t e l i p i d i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n u s i n g t h e p r e c u r s o r i o n s c a n , a h i g h e r a b u n d a n c e o f t h e c h a r a c t e r i s t i c f r a g m e n t i o n i s d e s i r e d , w h i c h i s a t r a d e o f f b e t w e e n h i g h e r f r a g m e n t a t i o n 2 5 2 p e r c e n t a g e a n d h i g h e r a b u n d a n c e o f t h e i o n s t h a t g o t o f r a g m e n t a t i o n . N o n e t h e l e s s , P Q D c a n p o t e n t i a l l y p r o v i d e u s e f u l i n f o r m a t i o n c o m p l e m e n t a r y t o t h a t p r o v i d e d b y C I D , a n d i t h a s n e v e r b e e n r e p o r t e d i n t h e a p p l i c a t i o n o f l i p i d a n a l y s i s , s o t h e f r a g m e n t a t i o n o f S Q D G v i a P Q D f r a g m e n t a t i o n w a s a l s o e x a m i n e d i n t h i s c h a p t e r . 6 . 3 R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n 6 . 3 . 1 F r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s o f S Q D G i n M S / M S a n d M S I 1 I n o r d e r t o u n d e r s t a n d t h e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f S Q D G , t h e S Q D G l i p i d s i n a t o t a l l i p i d e x t r a c t f r o m R . s p h a e r o z ' d e s i s o l a t e d m e m b r a n e p e l l e t s , o r t h e p u r i fi e d C c O , w e r e e x a m i n e d u s i n g E S I c o n n e c t e d w i t h t r i p l e q u a d r u p o l e o r q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r s , a n d l o w - e n e r g y C I D fi ' a g m e n t a t i o n s . P Q D fi a g m e n t a t i o n i n t h e i o n t r a p w a s a l s o c h a r a c t e r i z e d . T h e m o l e c u l a r s p e c i e s o f S Q D G i n t h e m e m b r a n e w e r e f o u n d t o b e s i m i l a r t o t h o s e i n t h e p u r i fi e d a n d c r y s t a l l i z e d e n z y m e s ( u s i n g b o t h M A L D I a n d E 8 1 ) b a s e d o n t h e c o m p l e t e i d e n t i fi c a t i o n o f e a c h m o l e c u l a r s p e c i e s u s i n g M S n ( s e e C h a p t e r 9 f o r s o m e o f t h e d a t a ) . A l s o , t h e fi ' a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s o f t h e S Q D G s p e c i e s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t f a t t y a c i d c h a i n s ( 1 6 : 0 , 1 8 : 1 o r 1 8 : 0 ) a r e v e r y s i m i l a r t o e a c h o t h e r . H e r e , S Q D G 1 6 : 1 / 1 8 : 1 a t m / z 8 1 9 i s m a i n l y s h o w n a s t h e e x a m p l e f o r t h e p u r p o s e o f i l l u s t r a t i o n . 6 . 3 . 1 . 1 C I D M S / M S o f S Q D G i n a t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r F i g u r e 6 . 1 s h o w s t h e n e g a t i v e i o n m o d e E S I - C I D M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r a o f m / z 8 1 9 f r o m t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t o f R . s p h a e r o i d e s u n d e r o p t i m i z e d c o l l i s i o n 2 5 3 e n e r g y ( w h e r e t h e p r e c u r s o r i o n i s a t a b o u t t h e s a m e a b u n d a n c e l e v e l a s t h e m o s t a b u n d a n t p r o d u c t i o n ) o b t a i n e d o n t h e t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r , u s i n g i s o t o p i c i s o l a t i o n o f t h e p r e c u r s o r i o n . T h e p r e d o m i n a n t p r o d u c t i o n s o b s e r v e d i n F i g u r e 6 . 1 a r e m / z 2 2 5 , c o r r e s p o n d i n g t o t h e d e h y d r a t e d d e p r o t o n a t e d s u l f o q u i n o v o s e h e a d g r o u p , f o l l o w e d b y m / z 5 3 7 a n d m / z 5 6 3 , c o r r e s p o n d i n g t o t h e p r o d u c t i o n s f o r m e d v i a n e u t r a l l o s s e s o f t h e 1 6 : 0 a n d 1 8 : 1 f a t t y a c i d c h a i n s , r e s p e c t i v e l y , i n t h e f o r m o f R C O O H . T h e f a t t y a c i d c h a i n s c a n a l s o b e o b s e r v e d a s f a t t y a c i d a n i o n s a t m / z 2 5 5 ( 1 6 : 0 R C O O ' ) a n d m / z 2 8 1 ( 1 8 : 1 R C O O ' ) , a l b e i t a t r e l a t i v e l y l o w a b u n d a n c e . O t h e r l e s s - a b u n d a n t p r o d u c t i o n s t h a t o r i g i n a t e f r o m t h e h e a d g r o u p a r e a l s o o b s e r v e d a t m / z 8 1 a n d m / z 1 6 5 . O b s e r v a t i o n o f t h e m o s t p r e d o m i n a n t i o n a t m / z 2 2 5 i s i n c o n t r a s t w i t h e a r l i e r r e p o r t s t h a t s h o w e d m / z 8 1 t o b e a n a b u n d a n t S Q D G c h a r a c t e r i s t i c p r o d u c t i o n i n C I D M S / M S i n a t r i p l e q u a d r u p o l e m a d e b y a d i f f e r e n t m a n u f a c t u r e r [ 1 5 0 ] . N o t e t h a t t h e C I D i n t h e t r i p l e q u a d r u p o l e c a n i n v o l v e b o t h p r i m a r y a n d s e c o n d a r y f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s d e p e n d i n g o n t h e c o l l i s i o n e n e r g y a n d g a s p r e s s u r e a p p l i e d d u r i n g t h e f r a g m e n t a t i o n ( s e e C h a p t e r 2 f o r a d e t a i l e d e x p l a n a t i o n ) , t h u s t h e d i f f e r e n c e m i g h t a r i s e f r o m t h e d i f f e r e n c e i n e n e r g y s e t t i n g s . 2 5 4 I ‘ L g . ( C 6 H 9 0 4 ) S O 3 _ 2 2 5 $ 3 1 0 0 . , 8 1 9 B “ 8 0 - C I D [ S Q D G _ H ] - o a - ' g . 5 2 5 0 R 1 C 0 0 — ( 1 8 : 1 R Z C O O H ) 8 1 9 “ g 6 0 - 5 3 7 4 ° ‘ — - 1 6 K ) R I i fi 4 0 — 1 8 : 1 R 2 C O O ’ [ 5 E 3 ‘ C 0 0 ) . 2 — 8 1 1 6 5 2 3 1 / i 2 " l l g t h l l r l l n u l l . 1 1 . 1 . . . I L . . . . I I I I I I 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 Z F i g u r e 6 . 1 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e E S I M S / M S o f m / z 8 1 9 ( S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ) u s i n g C I D o n t h e t r i p l e q u a d r u p o l e ( Q q Q ) m a s s s p e c t r o m e t e r . T h e c o l l i s i o n - e n e r g y - r e s o l v e d C I D e x p e r i m e n t s w e r e t h e n p e r f o r m e d i n t h e t r i p l e q u a d r u p o l e f o r m / z 8 1 9 , a s w e l l a s f o r m / z 8 4 5 ( S Q D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 ) , b y s y s t e m a t i c a l l y i n c r e a s i n g t h e c o l l i s i o n e n e r g y a t a fi x e d b a t h g a s p r e s s u r e ( F i g u r e 6 . 2 ) . E a c h m a j o r p r o d u c t i o n w a s p l o t t e d a s a p e r c e n t a g e f r a c t i o n o f t h e t o t a l a b u n d a n c e o f a l l t h e o b s e r v e d m a j o r p r o d u c t i o n s a n d t h e p r e c u r s o r i o n . A s s h o w n i n F i g u r e 6 . 2 A , o n c e t h e c o l l i s i o n e n e r g y r e a c h e d t h e t h r e s h o l d f o r f r a g m e n t a t i o n ( a t ~ 2 5 V i n F i g u r e 6 . 2 A ) , t h e p e r c e n t a g e o f t h e p r e c u r s o r i o n a t m / z 8 4 5 g r a d u a l l y d e c r e a s e d , w h i l e t h e a b u n d a n c e p e r c e n t a g e s o f t h e fi r s t — g e n e r a t i o n p r o d u c t i o n s s t a r t e d t o i n c r e a s e . T h e s e i o n s m a i n l y i n c l u d e d m / z 5 6 3 , t h e p r o d u c t i o n f o r m e d v i a n e u t r a l l o s s o f 1 8 : 1 R C O O H , a n d m / z 2 2 5 , t h e h e a d g r o u p p r o d u c t i o n . A v e r y l o w l e v e l ( c l o s e t o z e r o ) o f m / z 8 1 w a s o b s e r v a b l e . N o i o n a t m / z 8 0 w a s o b s e r v a b l e . W h e n t h e c o l l i s i o n e n e r g y i n c r e a s e d t o a b o u t 5 0 V ( F i g u r e 6 . 2 A ) , t h e a b u n d a n c e p e r c e n t a g e o f m / z 5 6 3 s t a r t e d t o d r o p , w h i l e t h e a b u n d a n c e p e r c e n t a g e o f m / z 2 2 5 k e p t i n c r e a s i n g , s u g g e s t i n g t h a t m / z 2 2 5 c o u l d a l s o b e g e n e r a t e d f r o m m / z 5 6 3 v i a s e c o n d a r y 2 5 5 f r a g m e n t a t i o n a t a h i g h e r c o l l i s i o n e n e r g y , i n a d d i t i o n t o b e i n g d i r e c t l y g e n e r a t e d f r o m m / z 8 4 5 a s a fi r s t - g e n e r a t i o n p r o d u c t i o n . O n l y a f t e r t h e c o l l i s i o n e n e r g y r e a c h e d 5 5 V , d i d t h e a b u n d a n c e p e r c e n t a g e o f m / z 2 2 5 s t a r t t o d e c r e a s e , a n d t h e a b u n d a n c e p e r c e n t a g e o f m / z 8 1 s t a r t e d t o i n c r e a s e , e x c e e d i n g t h a t o f m / z 2 2 5 a n d a l l o t h e r i o n s a f t e r t h e c o l l i s i o n e n e r g y r e a c h e d a b o u t 6 6 V . H o w e v e r a s t h e c o l l i s i o n e n e r g y a p p r o a c h e d 7 0 V ( F i g u r e 6 . 2 A ) , t h e a b s o l u t e a b u n d a n c e o f t h e i o n s i n t h e s p e c t r u m b e c a m e t o o l o w t o b e o f p r a c t i c a l u s e . T h e r e f o r e , m / z 2 2 5 , r a t h e r t h a n m / z 8 1 , a p p e a r s t o b e a m o r e r o b u s t fi n g e r p r i n t p r o d u c t i o n f o r S Q D G i d e n t i fi c a t i o n i n C I D M S / M S . S i m i l a r t r e n d s w e r e o b s e r v e d f r o m t h e c o l l i s i o n - e n e r g y - r e s o l v e d C I D o f m / z 8 1 9 s h o w n i n F i g u r e 6 . 2 8 , u s i n g t h e a u t o s a m p l e r E S I i o n s o u r c e u n d e r s l i g h t l y d i f f e r e n t b a t h g a s p r e s s u r e s e t t i n g s . 2 5 6 ) % ( e c n a d n u b A f o n o i t c a r F — _ f ; ‘ , 3 ‘ . w . v , 4 u _ v - . . ~ x _ v " V — v — - _ v _ 2 5 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5 7 0 B 6 0 - 4 o 2 0 - + 8 4 5 — 3 — 5 8 1 — 5 - 5 6 3 — v - 2 9 5 — i — 2 8 1 + 2 2 5 + 2 0 7 + 1 6 5 — 0 — 1 5 3 — « ‘ J — 1 4 9 + 1 2 5 — 0 — 9 5 + 8 1 — - - — 8 1 - 0 — 9 5 - A — 1 6 5 — o — 2 2 5 — € > — 2 5 5 — » - 2 8 1 — ' : » — 2 8 3 — - o — 5 3 7 - r r — 5 6 3 - D — 8 1 9 C o l l i s i o n E n e r g y ( V ) F i g u r e 6 . 2 C o l l i s i o n - e n e r g y - r e s o l v e d C I D o f ( A ) m / z 8 4 5 ( S Q D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 ) , a n d ( B ) m / z 8 1 9 ( S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ) i n M S / M S , w h e r e t h e c o l l i s i o n e n e r g y w a s c h a n g e d f r o m 1 0 t o 7 0 V . T h e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f t h e p r o d u c t i o n w a s p l o t t e d a s a p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l a b u n d a n c e s o f a l l m a j o r i o n s . E x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n n e g a t i v e i o n m o d e u s i n g E S I o n a t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r . 2 5 7 1 0 ' 2 ' 0 ' 3 ' 0 ' 4 0 ' 5 ' 0 ' 6 ' 0 ' 7 ' 0 ' 6 . 3 . 1 . 2 P Q D M S / M S f r a g m e n t a t i o n o f S Q D G l i p i d s i n a q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p F i g u r e 6 . 3 s h o w s t h e M S / M S s p e c t r u m o f m / z 8 1 9 u s i n g P Q D f r a g m e n t a t i o n i n t h e q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r i n t h e m / z r a n g e o f 5 0 - 1 0 0 0 . S i m i l a r t o t h e s p e c t r u m i n F i g u r e 6 . 1 , P Q D f r a g m e n t a t i o n a l s o r e v e a l e d t h a t t h e p r e d o m i n a n t f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y w a s t h e f o r m a t i o n o f m / z 2 2 5 , f o l l o w e d b y l o s s o f t h e t w o f a t t y a c i d s a s R C O O H n e u t r a l s . T h e p r o d u c t i o n a t m / z 8 1 w a s g e n e r a t e d a t v e r y l o w a b u n d a n c e . O t h e r p r o d u c t i o n s t h a t o r i g i n a t e d f r o m t h e h e a d g r o u p i n c l u d i n g m / z 9 5 , m / z 1 2 5 , m / z 1 6 5 a n d m / z 2 0 7 w e r e a l s o o b s e r v e d a t r e l a t i v e l y l o w a b u n d a n c e . A l s o t h e f r e e f a t t y a c i d R C O O ' p r o d u c t i o n s w e r e f o r m e d o n l y a t v e r y l o w a b u n d a n c e s ( F i g u r e 6 . 3 ) . [ S Q D G ‘ H I ' , 3 1 0 0 _ h . g . ( 0 6 1 1 9 0 0 3 0 3 — 8 1 9 8 1 9 g _ 2 2 5 P Q D ! 0 g 8 0 : 1 6 : 0 R 1 C O O ' g 6 0 _ 1 6 5 2 5 5 — ( l 8 : l R 2 C O O H ) 5 3 7 n _ g 4 0 — 1 2 5 2 0 7 1 8 : 1 R 2 C O O ' [ — ( 1 6 : 0 R , C O O H ) . 2 ‘ 8 1 2 8 1 5 6 3 E 2 0 - k / i g - l L l I r J I I L J . I I I . 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 m / z F i g u r e 6 . 3 N e g a t i v e i o n m o d e E S I M S / M S p r o d u c t i o n a n a l y s i s o f m / z 8 1 9 ( S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ) f r o m R . s p h a e r o i d e s , u s i n g p u l s e d - Q d i s s o c i a t i o n ( P Q D ) o n t h e q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p ( L I T ) m a s s s p e c t r o m e t e r . 2 5 8 6 . 3 . 1 . 3 C o l l i s i o n e n e r g y d e p e n d e n c e o n f r a g m e n t a t i o n i n a q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p T h e C I D M S / M S s p e c t r u m o f t h e d e p r o t o n a t e d i o n s f o r S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 a t m / z 8 1 9 b y u s i n g t h e q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p a f t e r i s o t o p i c p r e c u r s o r i o n i s o l a t i o n i s s h o w n i n F i g u r e 6 . 4 . F o r t h e p r e c u r s o r i o n a t m / z 8 1 9 , t h e l o w - m a s s - c u t o f f w a s m / z 1 6 0 w h e n t h e a c t i v a t i o n q v a l u e w a s s e t a t 0 . 2 . F i g u r e 6 . 4 s h o w e d a v e r y c l e a n M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f m / z 8 1 9 , a n d w a s d o m i n a t e d b y t w o f r a g m e n t a t i o n c h a n n e l s i n v o l v i n g f o r m a t i o n o f t h e c h a r a c t e r i s t i c m / z 2 2 5 h e a d g r o u p i o n a n d n e u t r a l l o s s o f t h e R C O O H g r o u p s . 4 . 4 e 2 - ( 1 8 : 1 c h o o n ) Q 1 0 0 7 5 3 7 — ( 1 6 : 0 R 1 C O O H ) 8 1 9 ° . — 5 6 3 ‘ 0 ’ _ h . g . ( C 6 H 9 0 4 ) S O 3 ° 8 0 2 2 5 - ( 1 8 : 1 R z ’ C H = C = O ) g - 5 5 5 g : 6 0 ‘ { / 3 ‘ 1 6 : 0 R 1 c 0 0 ' ; < 1 4 0 ‘ 2 5 5 _ I - ( 1 6 : 0 R 1 ’ C H = C = O ) [ S Q D G — H ] ' o - 1 8 1 1 R 2 C O O i 5 8 1 8 1 9 E 2 0 1 2 0 7 2 8 1 i i : 3 ] ‘ ( / ’ v j / I £ 2 1 - . . V I 2 0 0 3 0 0 4 6 0 5 6 0 6 0 0 7 6 0 8 0 0 9 6 0 Z F i g u r e 6 . 4 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e M S / M S p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f m / z 8 1 9 ( S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ) f r o m R . s p h a e r o i d e s C c O l i p i d e x t r a c t ( h . g . = h e a d g r o u p ) . T o e x a m i n e h o w t h e c o l l i s i o n e n e r g y a f f e c t e d t h e C I D a n d P Q D f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f S Q D G o n t h e q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p ( n o t e t h a t t h e n o r m a l i z e d c o l l i s i o n e n e r g y i s a d o p t e d b y t h e T h e r m o L T Q i n s t r u m e n t s ) , n o r m a l i z e d - c o l l i s i o n - e n e r g y — 2 5 9 r e s o l v e d C I D a n d P Q D e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d f o r m / z 8 1 9 b y s t e a d i l y i n c r e a s i n g t h e n o r m a l i z e d c o l l i s i o n e n e r g y s e t t i n g s f r o m t h e t h r e s h o l d v a l u e o f p r o d u c t i o n g e n e r a t i o n t o t h e p o i n t w h e r e t h e o v e r a l l i o n a b u n d a n c e w a s t o o l o w t o b e p r a c t i c a l l y u s e f u l . T h e n o r m a l i z e d c o l l i s i o n e n e r g y — r e s o l v e d C I D e x p e r i m e n t s o f m / z 8 1 9 i n t h e q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p c o n fi r m e d a s l i g h t d e p e n d e n c e o f t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n d e g r e e s o n t h e c o l l i s i o n e n e r g y ( F i g u r e 6 . 5 A ) [ 1 7 3 ] . T h e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f t h e p r o d u c t i o n s a t m / z 5 6 3 , 5 3 7 a n d 2 2 5 i n c r e a s e d s t e a d i l y a t a s i m i l a r s l o p e w i t h a n i n c r e a s e i n c o l l i s i o n e n e r g y u s i n g C I D a t a n a c t i v a t i o n q o f 0 . 2 o n t h e l i n e a r i o n t r a p , i n d i c a t i n g t h a t t h e s e t h r e e t y p e s o f p r o d u c t i o n s w e r e f o r m e d i n p a r a l l e l t h r o u g h o n e - s t e p f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s . T h e y a l s o r e m a i n e d t h e t h r e e m a j o r p r o d u c t i o n s t h r o u g h o u t a n o r m a l i z e d c o l l i s i o n e n e r g y r a n g e o f 1 8 % t o 3 1 % . A t a n o r m a l i z e d c o l l i s i o n e n e r g y o f a b o u t 4 0 % , t h e p r e c u r s o r i o n s w e r e c o m p l e t e l y f r a g m e n t e d a n d t h e s e t h r e e i o n s b e c a m e t h e m o s t a b u n d a n t p r o d u c t i o n s . T h e r e f o r e a t t h e n o r m a l l o w e n e r g y C I D M S / M S , t h e p r o d u c t i o n s o f t h e s e t h r e e i o n s a r e t h e p r e d o m i n a n t l o w - e n e r g y f r a g m e n t a t i o n c h a n n e l s . T h e p r o d u c t i o n a t m / z 2 2 5 r e m a i n s t h e p r e d o m i n a n t h e a d g r o u p i o n o b s e r v e d a t a n y v a l u e o f n o r m a l i z e d c o l l i s i o n e n e r g y a b o v e t h e f r a g m e n t a t i o n t h r e s h o l d . T h e i o n a t m / z 8 1 w a s n o t o b s e r v a b l e i n t h e M S / M S s p e c t r u m d u e t o t h e l o w m a s s c u t o f f i n C I D . I n t h e P Q D f r a g m e n t a t i o n w i t h l o w - m a s s c u t o f f a t m / z 5 0 , t h e p r o d u c t i o n a t m / z 8 1 r e m a i n e d a t v e r y l o w a b u n d a n c e r e g a r d l e s s o f t h e a p p l i e d c o l l i s i o n e n e r g y ( F i g u r e 6 . 5 B ) . D u e t o t h e s l o w - h e a t i n g n a t u r e o f t h e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r ( s e e C h a p t e r 2 f o r a d e t a i l e d e x p l a n a t i o n ) , t h e p r o d u c t i o n s o b s e r v e d a r e m a i n l y t h e r e s u l t s o f p r i m a r y 2 6 0 f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s a n d f u r t h e r s e c o n d a r y d i s s o c i a t i o n i s p r e v e n t e d . T h e r e f o r e , t h e r e a s o n w h y m / z 8 1 i s n o t o b s e r v e d i n t h e i o n t r a p a s a m a j o r p r o d u c t i o n r e g a r d l e s s o f t h e c o l l i s i o n e n e r g y , i s p r o b a b l y b e c a u s e f o r m a t i o n o f m / z 8 1 r e q u i r e s a m u c h h i g h e r e n e r g y t h a n t h e o t h e r f r a g m e n t a t i o n c h a n n e l s . T h e r e f o r e , m / z 8 1 i s n o t a p r a c t i c a l l y c o n v e n i e n t fi n g e r p r i n t p r o d u c t i o n f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f S Q D G , b u t r a t h e r m / z 2 2 5 i s d e m o n s t r a t e d t o b e a c l e a r a n d a b u n d a n t fi n g e r p r i n t f o r t h e S Q D G h e a d g r o u p s t r u c t u r e . 2 6 1 1 0 0 - A C I D L I T M S / M S 8 0 - 6 0 - + 8 1 1 + 9 5 A 4 0 ‘ + 1 2 5 x J , + 1 4 9 E “ / J / O — < — 1 5 3 g 2 0 ‘ “ + 1 6 5 ' 2 + 1 8 9 . 8 0 F a i “ W + 2 0 7 < 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 + 2 2 5 9 3 1 0 0 - * 3 — 2 5 5 8 - B P Q D L I T M S / M S 2 8 1 8 8 0 - ’ . 4 . . _ 2 8 3 E i ’ — 0 — 5 3 7 + 5 5 6 6 0 ‘ ’ + 5 6 3 — < ~ — 5 8 1 4 0 . i + 8 1 9 2 0 — 0 - - - = r e fi ‘ fi ' i — g é " 2 4 2 6 2 8 3 0 3 2 N o r m a l i z e d C o l l i s i o n E n e r g y F i g u r e 6 . 5 N o r m a l i z e d c o l l i s i o n — e n e r g y - r e s o l v e d r e l a t i v e a b u n d a n c e o f e a c h p r o d u c t i o n g e n e r a t e d f r o m m / z 8 1 9 ( S Q D G 1 6 2 0 / 1 8 : 1 ) f r o m R . s p h a e r o i d e s b y E S I - L I T u s i n g C I D M S / M S ( A ) , a n d P Q D M S / M S ( B ) f r a g m e n t a t i o n s , p l o t t e d a s t h e p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l a b u n d a n c e o f a l l t h e m a j o r p r o d u c t i o n s . 2 6 2 6 . 3 . 1 . 4 M S n f r a g m e n t a t i o n o f S Q D G i n a q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p M S 3 a n a l y s e s o f t h e m / z 5 6 3 ( F i g u r e 6 . 6 A ) a n d m / z 5 3 7 ( F i g u r e 6 6 3 ) p r o d u c t i o n s fi o m F i g u r e 6 . 4 i n d i c a t e d t h a t t h e y b o t h f r a g m e n t e d t o g e n e r a t e m / z 2 2 5 a s t h e o n l y p r e d o m i n a n t p r o d u c t i o n o b s e r v e d a b o v e t h e l o w - m a s s c u t o f f . M S 3 o f m / z 2 2 5 ( F i g u r e 6 . 6 C ) s h o w e d t h a t i t i s i n d e e d a S Q D G h e a d g r o u p i o n , a n d r u l e d o u t t h e p o s s i b i l i t y o f i t b e i n g a 1 4 : 1 f a t t y a c i d R C O O ' i o n w h i c h a l s o h a s a n m / z v a l u e a t 2 2 5 . M o r e i m p o r t a n t l y , i t s p r o d u c t i o n s p e c t r u m w a s h i g h l y s p e c i fi c t o t h e S Q D G h e a d g r o u p s t r u c t u r e . m / z 2 2 5 p r e d o m i n a n t l y f r a g m e n t s b y l o s i n g w a t e r t o g e n e r a t e m / z 2 0 7 ; h o w e v e r , t h e p r o d u c t i o n a t m / z 8 1 i s n o w o b s e r v a b l e , b u t s t i l l a t m u c h l o w e r r e l a t i v e a b u n d a n c e . T h e o r d e r o f C I D p r o d u c t i o n g e n e r a t i o n s r e v e a l e d b y t h e i o n t r e e c o n s t r u c t e d b y t h e M S H i n t h e q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p i s v e r y c o n s i s t e n t w i t h t h e i o n h i e r a r c h y s u g g e s t e d b y t h e c o l l i s i o n - e n e r g y - r e s o l v e d C I D i n a t r i p l e q u a d r u p o l e a s d i s c u s s e d i n t h e e a r l i e r s e c t i o n . 2 6 3 5 . 5 8 . 2 1 h . g . ( C 6 H 9 0 4 ) S O 3 ' 1 0 0 . A M S 2 2 5 I 8 1 9 ~ - 1 6 : O R 1 C O O H 8 0 : t 5 6 3 6 0 : 1 8 : 1 R Z C O O ' O 4 0 1 2 8 1 2 8 3 5 6 3 1 6 5 A 2 0 . . 1 _ 2 0 : . \ i / i § 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 8 6 . 8 3 e 1 3 h - g - ( 0 6 H 9 0 4 ) 3 0 3 ' 5 1 0 0 - B M S 2 2 5 - : 8 1 9 1 : 8 0 3 1 6 : 0 R 1 C O O - 1 8 : 1 R 2 C O O H S “ - 2 5 5 I 5 3 7 . 2 6 0 : O a ; : 3 2 1 6 5 [ 2 3 1 2 8 3 5 3 7 . _ . « 2 0 7 E l ‘ I . L “ k I l M \ J / F I I I f g 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 1 0 . 2 ‘ " H 2 0 1 0 0 C M s 3 - 1 0 0 2 0 7 8 1 9 - 1 2 5 8 0 c n z s o z g c s m - 6 0 2 2 5 6 0 H S O 3 ' 1 6 5 4 0 8 1 - 2 H 2 0 2 2 5 2 0 l 1 8 9 i . . 2 . l I - . n I I 1 1 — | " — — I — ! r r I I I I 6 0 1 0 0 1 4 0 2 2 0 2 6 0 3 0 0 F i g u r e 6 . 6 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e M S 3 p r o d u c t i o n s p e c t r a o f m / z 8 1 9 ( S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ) f r o m R . s p h a e r o i d e s C c O l i p i d e x t r a c t s h o w n i n F i g u r e 6 . 4 . ( A ) M S 3 o f m / z 5 3 7 , ( B ) M s 3 o f m / z 5 6 3 , a n d ( C ) M s 3 o f p r o d u c t i o n m / z 2 2 5 g e n e r a t e d f r o m m / z 8 1 9 , w h i c h i s i d e n t i c a l t o M S 4 o f 2 2 5 , u s i n g c o l l i s i o n - i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ( C I D ) o n t h e E S I - l i n e a r i o n t r a p ( L I T ) m a s s s p e c t r o m e t e r ( h . g . = h e a d g r o u p ) . 2 6 4 B o t h t h e c o l l i s i o n - e n e r g y - r e s o l v e d C I D e x p e r i m e n t s i n t h e t r i p l e q u a d r u p o l e a n d t h e M S n e x p e r i m e n t s i n t h e q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p c l e a r l y s h o w t h a t t h e f r a g m e n t a t i o n o f d e p r o t o n a t e d S Q D G i o n s p r e d o m i n a n t l y y i e l d a c h a r a c t e r i s t i c h e a d g r o u p fi n g e r p r i n t i o n a t m / z 2 2 5 , a s w e l l a s t h e n e u t r a l l o s s o f t h e f a t t y a c i d c h a i n s a s R C O O H . T h u s , i n b o t h t h e t r i p l e q u a d r u p o l e a n d t h e l i n e a r i o n t r a p , t h e p r o d u c t i o n o f S Q D G a t m / z 2 2 5 i s t h e i o n t o s e e k , b e c a u s e i t i s a l w a y s t h e m o s t a b u n d a n t p r o d u c t i o n , a n d i t i s m u c h m o r e a b u n d a n t t h a n m / z 8 1 , a n d t h e m / z 8 0 p r o d u c t i o n i s n o t o b s e r v e d i n l o w - e n e r g y C I D . 6 . 3 . 2 F r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s o f S Q D G i n C I D M S / M S a n d M S n T h e f o r m a t i o n o f R C O O H n e u t r a l l o s s e s f r o m S Q D G o b v i o u s l y r e q u i r e s a d e p r o t o n a t i o n r e a c t i o n . T h e m e c h a n i s m s o f h o w t h e c h a r a c t e r i s t i c f r a g r n e n t a t i o n s o f S Q D G , d e s c r i b e d a b o v e , o c c u r w e r e t h e n i n v e s t i g a t e d b y u s i n g H / D e x c h a n g e e x p e r i m e n t s . H / D e x c h a n g e s h o u l d o c c u r i n t h e t h r e e O H g r o u p s o f t h e s u g a r r i n g i n t h e S Q D G . A f t e r i n c u b a t i n g t h e t o t a l m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t w i t h C D 3 O D ( 9 9 . 9 % ) f o r t h r e e t i m e s a n d d r i e d u n d e r v a c u u m , t h e e x c h a n g e l e v e l i n t o t h e f u l l y e x c h a n g e d p r e c u r s o r i o n f o r m o f S Q D G c a n r e a c h o v e r 9 0 % o f t h e t o t a l , u s i n g t h e t y p i c a l n a n o E S I i o n s o u r c e u n d e r c a r e f u l c o n t r o l . A l l t h e S Q D G i o n s i n c o r p o r a t e d t h r e e d e u t e r i u m a t o m s a n d d i s p l a y e d a 3 D a s h i f t i n t h e M S s p e c t r a ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e H / D e x c h a n g e e x p e r i m e n t s c a n t h u s b e u s e d t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e h y d r o x y l O H p r o t o n s a n d t h e C - H p r o t o n s . T h e p r e v i o u s m / z 8 1 9 ( S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ) n o w s h i f t e d t o m / z 8 2 2 ( d 3 - S Q D G 2 6 5 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ) , a n d i t s C I D M S / M S a n d M S 3 p r o d u c t i o n s p e c t r a f o l l o w i n g i s o t o p i c i s o l a t i o n a r e s h o w n i n F i g u r e 6 . 7 . 2 6 6 — ( ] 8 : 1 R 2 C O O H 5 4 ) 0 — ( 1 6 - 0 R I C O O H ) 7 9 1 0 0 3 A M S / M S 5 6 6 8 2 2 h - 8 - 2 ( 2 d r C 6 H 9 0 4 ) 3 0 3 ~ ( 1 8 ; 1 R 2 C H = 4 3 4 ) ) I 2 5 5 1 6 0 R I C O O 5 ( 5 1 8 6 0 R ’ C H — C = O ) [ S Q D G H ] — _ ' 1 _ _ 2 0 8 . . . . . 2 8 1 1 8 . 1 R 2 C O O 5 ? “ N i l 8 2 2 ( D 3 ) 6 i i 4 6 0 5 6 0 6 0 0 7 1 5 0 8 0 0 9 1 5 0 A 0 . 1 0 8 h . g . ( d z - C 6 H 9 0 4 ) S O 3 — g 1 0 0 2 2 7 3 2 3 5 F : 8 0 B 1 9 6 ( S D 1 ) $ 5 6 6 1 6 0 R 1 C O O H g 6 0 2 0 9 ( 1 3 2 ) 0 " U 4 0 1 8 0 § 2 0 , 5 6 6 ( D 3 ) _ 0 2 8 6 ( D 3 ) ‘ < I r I T I l l g 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 E 0 . 6 2 h . g . 2 ( 2 d 2 - C 6 H 9 0 4 ) S O 3 a " 1 0 0 t 8 2 2 8 0 — 1 8 : 1 R 2 C O O H 6 0 2 0 8 0 3 1 ) 5 4 0 4 0 1 2 8 6 ( D 3 ) 0 , 1 l l 7 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 1 . 0 — ( 0 2 0 + H 2 0 ) _ D 0 1 0 0 4 1 ) M 8 3 1 8 9 2 0 8 2 8 2 2 0 1 2 8 0 2 9 0 1 1 — H D O _ 2 0 9 2 2 7 H S 0 3 ( 9 5 1 2 5 ~ 6 0 1 " 8 1 ' 1 3 5 1 6 5 5 1 0 1 0 L I 1 4 0 “ 2 2 7 ( D 2 ) l . . A 5 1 8 0 2 2 0 2 6 0 3 0 0 m / z F i g u r e 6 . 7 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e A ) M S / M S p r o d u c t i o n a n a l y s i s o f m / z 8 2 2 ( d 3 - S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ) f r o m R . s p h a e r o i d e s m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t a f t e r i n - s o l u t i o n H / D e x c h a n g e u s i n g C D 3 O D . B ) M S 3 o f m / z 5 4 0 f r o m A ) , a n d C ) M S 3 o f m / z 5 6 6 f r o m A ) , a n d D ) M S 3 o f p r o d u c t i o n m / z 2 2 7 g e n e r a t e d f r o m 8 2 2 i n p a n e l A , u s i n g C I D o n t h e E S I - L I T m a s s s p e c t r o m e t e r ( h . g . = h e a d g r o u p ) . 2 6 7 T h e p r o d u c t i o n s n o w a t m / z 5 4 0 a n d m / z 5 6 6 e a c h d i s p l a y e d a 3 D a s h i f t , i n d i c a t i n g t h a t t h e f a t t y a c i d s a r e l o s t a s n e u t r a l R C O O H a n d d o n o t c o n t a i n a n y d e u t e r i u m . T h e r e f o r e t h e f o r m a t i o n o f R C O O H i s m o r e l i k e l y t o h a v e o c c u r r e d b y d e p r o t o n a t i n g t h e g l y c e r o l b a c k b o n e C - H p r o t o n s ( S c h e m e 6 . 2 ) , a n d d o e s n o t d i r e c t l y i n v o l v e t h e h y d r o x y l g r o u p s i n t h e h e a d g r o u p . F o u r C - H p r o t o n s a r e a v a i l a b l e f o r t h e f o r m a t i o n o f R 2 C O O H ( s n - I a n d s n - 3 ) , a n d o n e C - H p r o t o n i s a v a i l a b l e f o r R I C O O H ( r m - 2 ) . H o w e v e r , s u c h a p o p u l a t i o n d i f f e r e n c e i s n o t r e fl e c t e d i n t h e a c t u a l r e l a t i v e a b u n d a n c e s o f t h i s t y p e o f p r o d u c t i o n s f r o m e i t h e r m / z 8 1 9 ( F i g u r e 6 . 7 A ) o r m / z 8 4 7 ( S Q D G 1 8 : 0 / 1 8 : 1 , d a t a n o t s h o w n ) . I t a l s o r a i s e s t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e p r e c u r s o r i o n s a t m / z 8 1 9 c o n t a i n a m i x t u r e o f S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 a n d S Q D G 1 8 : 1 / 1 6 : 0 i s o m e r s . O n t h e o t h e r h a n d , t h e h e a d g r o u p p r o d u c t i o n i s n o w o b s e r v e d a t m / z 2 2 7 , s h o w i n g a 2 D a s h i f t f r o m m / z 2 2 5 , a n d t h u s t h e i n c o r p o r a t i o n o f t w o d e u t e r i u m s . S u c h e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e s u p p o r t s t h e f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s p r o p o s e d i n S c h e m e 6 . 2 , i n v o l v i n g t h e g e n e r a t i o n o f m / z 2 2 5 ( p a t h w a y a ) a n d R C O O H n e u t r a l l o s s e s ( p a t h w a y s 1 ) a n d c ) v i a c h a r g e - r e m o t e c i s - e l i m i n a t i o n p r o c e s s e s [ 2 0 2 , 3 0 1 ] . T h e r e a s o n t h a t t h e n e g a t i v e c h a r g e o n t h e s u l fi t e i s n o t d i r e c t l y i n v o l v e d i n t h e s e r e a c t i o n s i s p r o b a b l y d u e t o t h e c o n f o r m a t i o n a l r i g i d i t y o f t h e s u g a r r i n g . N o t e t h a t t h e m / z 8 1 9 i o n w a s a l s o o b s e r v e d a n d f r a g m e n t e d i n t h e M A L D I - q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p , a n d n o d i f f e r e n c e w a s f o u n d i n t h e M S / M S ( s e e C h a p t e r 1 0 ) a n d M S 3 s p e c t r a , s u g g e s t i n g t h a t s u c h c h a r g e - r e m o t e f r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s a l s o a p p l y t o t h e d e p r o t o n a t e d S Q D G i o n s g e n e r a t e d i n M A L D I [ 3 0 2 ] . 2 6 8 O ) k a n d ( D ) H O R 2 0 ) ( D ) I o o R ( D ) H . . \ / \ / T 1 m / z 5 6 3 ( D 3 , m / z 5 6 6 ) 0 M s 3 M S / M S b : 8 : M S / M S o 0 R 1 0 ( D ) H O 6 T ( ' 3 ? O o m / z 8 1 9 ( D 3 , m / z 8 2 2 ) c m / z 2 2 5 ( D 2 , m / z 2 2 7 ) M S / M S 3 1 ] M S o = s = o o o ( D ) H O 0 / “ \ R H O J ) 2 ( D ) ‘ 1 ’ O V K 0 ( D ) H ‘ , " a n d i ( D ) H O R 1 m / z 5 3 7 ( D 3 , m / z 5 4 0 ) S c h e m e 6 . 2 P r o p o s e d f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s o f S Q D G [ M — H ] ' i n M S / M S a n d M S 3 T h e f r a g m e n t a t i o n s p e c t r u m o f m / z 2 2 5 g e n e r a t e d d i r e c t l y f r o m m / z 8 1 9 u p o n M S / M S ( F i g u r e 6 . 6 C ) w a s i d e n t i c a l t o t h a t o f m / z 2 2 5 g e n e r a t e d f r o m M S 3 ( d a t a n o t s h o w n ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e y h a v e t h e s a m e s t r u c t u r e . C o m p a r i n g t h e p r o d u c t i o n s p e c t r u m o f m / z 2 2 5 ( F i g u r e 6 . 6 C ) w i t h t h a t o f t h e H / D e x c h a n g e d v e r s i o n a t m / z 2 2 7 2 6 9 ( F i g u r e 6 . 7 D ) , a l s o g i v e s s o m e c l u e s o f h o w t h e m / z 8 1 i o n , w h i c h i s o b s e r v e d i n b o t h v e r s i o n s , i s f o r m e d . S i n c e m / z 8 1 c o r r e s p o n d s t o t h e e l e m e n t a l c o m p o s i t i o n o f H S O 3 ‘ , n o h y d r o x y l p r o t o n i s d i r e c t l y i n v o l v e d . A p r o p o s e d m e c h a n i s m o f f o r m i n g m / z 8 1 f r o m m / z 2 2 5 v i a c h a r g e - d r i v e n p r o c e s s i s s h o w n i n S c h e m e 6 . 3 . M s 3 C " ) 0 — — > O — S — O H a n d ( 0 ) H O / % H O O ( D ) m / z 2 2 5 ( D 2 , m / z 2 2 7 ) m / z 8 1 S c h e m e 6 . 3 P r o p o s e d f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y o f f o r m i n g m / z 8 1 f r o m m / z 2 2 5 I n a d d i t i o n t o m / z 8 1 , t h e f o r m a t i o n o f m / z 9 5 f r o m m / z 2 2 5 ( F i g u r e 6 . 6 C ) i s a l s o l i k e l y t o b e m a i n l y t h r o u g h a c h a r g e - d r i v e n p r o c e s s ( S c h e m e 6 . 4 ) . T h e f o r m a t i o n o f m / z 2 0 7 f r o m m / z 2 2 5 v i a w a t e r l o s s , h o w e v e r , s e e m s t o b e a b l e t o o c c u r v i a s e v e r a l p a t h w a y s , l e d b y t h e c h a r g e - r e m o t e p a t h w a y s p r o p o s e d i n S c h e m e 6 . 5 , s i n c e b o t h D 2 0 ( p a t h w a y a ) a n d H D O ( p a t h w a y b ) l o s s e s a r e o b s e r v e d i n F i g u r e 6 . 6 D . “ I " " o — s = o - ( H N 3 0 M 8 3 ( ' 3 \ o - — - > H O — : 0 a n d ( D ) 1 5 0 % ( D ) H o 5 ] H O 0 H 0 0 C H 2 ( D ) ( D ) m / z 2 2 5 ( 1 ) 2 , m / z 2 2 7 ) m / z 9 5 S c h e m e 6 . 4 P r o p o s e d f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y o f f o r m i n g m / z 9 5 f r o m m / z 2 2 5 2 7 0 i 2 0 0 — 5 ( D 2 , m / z 2 2 7 ) ( D ) H m / O r m m / / ' . z ' 0 \ v 2 — m / z 2 2 5 ( D 2 , m / z 2 2 7 ) M M — — S a S b - 3 - > > ‘ i z f m 0 i 5 / 7 O 0 H : O 2 ( D m ) / z 0 0 0 O 2 0 7 — 0 ( D 1 , m / z 2 0 8 ) a n d H 2 a n d H 2 O 0 D ( 2 ( H 0 O 0 ) ) S c h e m e 6 . 5 P r o p o s e d f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y o f f o r m i n g m / z 2 0 7 f r o m m / z 2 2 5 T h e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f t h e d e p r o t o n a t e d S Q D G i o n s d e m o n s t r a t e d a b o v e s u g g e s t e d t h a t , a l t h o u g h c h a r g e - d r i v e n f r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s a r e o f t e n f a v o r e d i n t h e fi a g m e n t a t i o n o f l i p i d s i n t h e n e g a t i v e i o n m o d e , t h e r i g i d i t y o f t h e s u g a r r i n g s i t t i n g b e t w e e n t h e n e g a t i v e l y c h a r g e d s u l fi t e g r o u p a n d t h e r e s t o f t h e m o l e c u l e i n S Q D G p o s e s a h i g h p r i c e i n e n e r g y , a n d s i g n i fi c a n t l y r e s t r i c t e d t h e e x t e n t t o w h i c h t h e n e g a t i v e c h a r g e c o u l d b e i n v o l v e d i n t h e c l e a v a g e o f t h e e s t e r o r e t h e r b o n d s . 6 . 3 . 3 R e l a t i v e q u a n t i f i c a t i o n o f S Q D G i n l i p i d e x t r a c t u s i n g M S / M S H a v i n g g a i n e d a n u n d e r s t a n d i n g o f t h e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f S Q D G l i p i d s , a n d r e c o g n i z e d t h a t t h e p r o d u c t i o n a t m / z 2 2 5 i s a p r a c t i c a l fi n g e r p r i n t f o r S Q D G , s u c h a 2 7 1 c h a r a c t e r i s t i c w a s t h e n a p p l i e d i n t h e s e p a r a t i o n a n d r e l a t i v e q u a n t i fi c a t i o n o f S Q D G m o l e c u l a r s p e c i e s f r o m t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . F i g u r e 6 . 8 s h o w s t h e n e g a t i v e i o n m o d e M S s p e c t r u m o f R . s p h a e r o i d e s m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t ( F i g u r e 6 . 8 A ) , a n d t h e p r e c u r s o r i o n s c a n C I D - M S / M S s p e c t r u m f o r t h e p r o d u c t i o n a t m / z 2 2 5 ( F i g u r e 6 . 8 B ) , u s i n g t h e t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r . F i g u r e 6 . 7 B c l e a r l y s h o w s t h a t t h e m a i n S Q D G l i p i d s s p e c i e s a r e S Q D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 ( m / z 8 4 5 ) , S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 ( m / z 8 1 9 ) , S Q D G 1 8 : 0 / 1 8 z l ( m / z 8 4 7 ) , S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 0 ( m / z 8 2 1 ) a n d S Q D G 1 6 : 0 . / 1 6 : 0 ( m / z 7 9 3 ) , i n t h e o r d e r o f d e c r e a s i n g r e l a t i v e a b u n d a n c e . T h e s e p a r a t i o n a n d r e l a t i v e q u a n t i fi c a t i o n o f S Q D G i s t h u s a c h i e v e d a t a h i g h s e n s i t i v i t y i n M S / M S a n d t h e c h e m i c a l n o i s e i s s i g n i fi c a n t l y r e d u c e d c o m p a r e d t o t h e M S [ 2 1 2 - 2 1 5 ] . 2 7 2 7 7 3 1 0 0 - A l 8 0 : 8 4 5 6 0 : 7 4 2 8 2 1 I 8 f 7 a ; _ 8 1 9 1 . E , 4 0 — 7 9 3 \ ‘ J i ) 8 ‘ 7 2 7 7 5 6 [ 8 6 0 g 2 0 - J " g - ( j ; 6 5 0 7 6 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 6 0 9 5 0 o 8 4 5 . 2 1 0 0 - 1 3 E _ C I D Q Q 8 1 9 8 4 7 O _ c , 8 0 _ q [ 2 2 5 8 2 1 2 6 0 - j 4 0 - 7 9 3 2 0 - L I 6 5 0 7 6 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 6 0 9 5 0 m / z F i g u r e 6 . 8 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e E S I A ) M S a n d B ) C I D M S / M S p r e c u r s o r i o n s c a n f o r m / z 2 2 5 u s i n g t h e Q q Q m a s s s p e c t r o m e t e r , t o s e l e c t i v e l y i d e n t i f y a l l t h e S Q D G l i p i d s p e c i e s i n t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t f r o m t h e R . s p h a e r o i d e s 2 . 4 . 1 + C c O s t r a i n . T h e i o n m a p p i n g o p t i o n i n t h e q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r a l s o d e m o n s t r a t e d i t s a p p l i c a b i l i t y t o g e n e r a t e s i m i l a r f u n c t i o n s b y p l o t t i n g a l l t h e p r e c u r s o r i o n s t h a t g i v e r i s e t o m / z 2 2 5 a n d c o n v e r t i n g t h e h o r i z o n t a l a x i s f r o m t h e t i m e d i m e n s i o n 2 7 3 i n t o t h e m a s s r a n g e ( F i g u r e 6 . 9 ) . T h e r e s o l u t i o n o f t h e p e a k s i n F i g u r e 6 . 9 8 c a n b e i m p r o v e d b y s e l e c t i n g f o r s m a l l e r p r e c u r s o r i o n m / z s t e p s d u r i n g t h e s c a n n i n g . 1 0 0 _ G P G I ‘ O 1 . S . 7 7 3 A - 6 6 5 8 0 : 8 4 5 6 0 - ( q ; - 7 4 2 8 i ] 8 4 7 g ; 4 0 - 8 1 9 0 - 7 9 3 J g 2 0 — 7 2 7 7 5 6 ' I \ x j I 8 6 0 g ' m - : 3 6 5 0 7 6 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 6 0 9 5 0 E 1 0 0 - 8 4 5 B E _ C I D L I T i 8 1 9 8 2 1 8 4 7 o 8 0 _ 0 4 - 2 2 5 \ * g . 6 0 - 4 o - 6 5 0 7 6 0 7 5 0 8 6 0 8 5 o 9 6 0 9 5 0 m / z F i g u r e 6 . 9 N e g a t i v e i o n i z a t i o n m o d e E S I A ) M S a n d B ) C I D M S / M S p r e c u r s o r i o n m a p p i n g f o r m / z 2 2 5 u s i n g t h e L I T m a s s s p e c t r o m e t e r , t o s e l e c t i v e l y i d e n t i f y a l l t h e S Q D G l i p i d s p e c i e s i n t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t f r o m t h e R . s p h a e r o i d e s C L 3 + C c O s t r a i n . 2 7 4 6 . 3 . 4 F r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f D G T S i n M S / M S a n d M S n I n c o m b i n a t i o n w i t h N M R a n a l y s i s f o l l o w i n g T L C s e p a r a t i o n [ 1 1 ] , D G T S h a s b e e n c o n fi r m e d t o e x i s t i n R . s p h a e r o i d e s u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c o n d i t i o n s b y u s i n g F A B C I D M S / M S , b a s e d o n t h e o b s e r v a t i o n o f a c o m p l i c a t e d s e r i e s o f p r o d u c t i o n s i n p o s i t i v e i o n m o d e i n c l u d i n g m / z 2 3 6 a n d m / z 1 6 2 [ 1 1 , 1 0 6 ] , w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e p r o t o n a t e d i o n o f t h e t r i m e t h y l h o m o s e r i n e h e a d g r o u p m o i e t y . H o w e v e r , t h e f r a g m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f D G T S u n d e r l o w - e n e r g y C I D M S / M S a n d M S n c o n d i t i o n s h a v e n o t b e e n c h a r a c t e r i z e d i n d e t a i l a n d t h e f r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s a r e n o t w e l l u n d e r s t o o d , m a k i n g i t a c h a l l e n g e t o q u i c k l y a n d a c c u r a t e l y i d e n t i f y t h e D G T S m o l e c u l a r s t r u c t u r e s f r o m a c o m p l e x m i x t u r e b y u s i n g o n l y m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h o u t p r i o r s e p a r a t i o n . H e r e t h e D G T S l i p i d s f r o m t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s o f R . s p h a e r o i d e s g r o w n u n d e r a e r o b i c p h o s p h a t e - l i m i t i n g c o n d i t i o n s w e r e e x a m i n e d i n d e t a i l u s i n g l o w e n e r g y C I D M S / M S a n d M S n , a n d P Q D M S / M S , i n a q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p , a n d t h e p a t h w a y s f o r t h e o r i g i n s o f s e v e r a l c h a r a c t e r i s t i c p r o d u c t i o n s h a v e b e e n r a t i o n a l i z e d . 6 . 3 . 4 . 1 C I D M S / M S a n d M S ' 1 f r a g m e n t a t i o n o f D G T S i n q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p T h e m o s t a b u n d a n t i o n d e t e c t e d i n t h e M S o f R . s p h a e r o i d e s m e m b r a n e s u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c o n d i t i o n s i s a t m / z 7 6 4 , b y u s i n g e i t h e r E S I f o l l o w i n g l i p i d e x t r a c t i o n o r b y M A L D I d i r e c t l y o n t h e m e m b r a n e p e l l e t s ( F i g u r e 6 . 1 0 A ) . P r e v i o u s l i p i d g e n e t i c s s t u d i e s o n R . s p h a e r o i d e s [ 1 1 ] a n d S i n o r h i z o b i u m m e l i l o t i [ 9 3 , 1 0 6 , 2 6 8 ] h a v e r e p o r t e d t h a t D G T S i s a m a j o r m e m b r a n e l i p i d c o m p o n e n t i n p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h 2 7 5 a n d i t s s t r u c t u r e h a s b e e n c o n fi r m e d b y T L C , N M R a n d F A B C I D M S / M S , a n d i t s b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s i n R . s p h a e r o i d e s h a v e b e e n e l u c i d a t e d [ 1 1 , 2 7 4 , 3 0 3 ] . S i n c e D G T S c a r r i e s a fi x e d p o s i t i v e c h a r g e , i t i s e x p e c t e d t o i o n i z e a t h i g h e f fi c i e n c y i n p o s i t i v e i o n m o d e M A L D I o r E S I , a n d t h u s m / z 7 6 4 i s p o s s i b l y f o r m e d b y D G T S l i p i d s . B a s e d o n i t s m o l e c u l a r w e i g h t , m / z 7 6 4 m i g h t b e t h e p r o t o n a t e d i o n o f D G T S 1 8 : 1 / 1 8 : 1 . I n o r d e r t o fi n d o u t t h e i d e n t i t y o f m / z 7 6 4 , M S / M S a n d M S 1 1 a n a l y s e s w e r e c a r r i e d o u t o n t h e q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p ( F i g u r e s 6 . 1 0 B - 6 . 1 0 D ) . I n M S / M S ( F i g u r e 6 . 1 0 B ) , a b o v e t h e l o w - m a s s c u t o f f , m / z 7 6 4 m a i n l y f r a g m e n t s b y l o s i n g 1 8 : 1 R C O O H ( m / z 4 8 2 ) a n d k e t e n e 1 8 : 1 R ' C H = C = O ( m / z 5 0 0 ) . T h e l o w e r - a b u n d a n c e p r o d u c t i o n a t m / z 2 3 6 c o r r e s p o n d s t o t h e n e u t r a l l o s s o f t w o 1 8 : 1 R ' C H = C = O k e t e n e s , s u g g e s t i n g t h a t i t m i g h t b e a h e a d g r o u p i o n . I n t h e M S 3 f r a g m e n t a t i o n , m / z 5 0 0 p r e d o m i n a n t l y l o s e s w a t e r t o f o r m m / z 4 8 2 . I t a l s o f o r m s m / z 2 3 6 v i a t h e n e u t r a l l o s s o f t h e o t h e r 1 8 : 1 R ' C H = C = O k e t e n e , a n d m / z 1 4 4 w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e d e h y d r a t e d p r o t o n a t e d i o n o f t r i m e t h y l h o m o s e r i n e , b o t h a t l o w a b u n d a n c e ( F i g u r e 6 . 1 0 C ) . T h e M S 3 f r a g m e n t a t i o n o f m / z 4 8 2 o p e n s u p s e v e r a l fi a g m e n t a t i o n c h a n n e l s , a n d t h e s p e c t r u m c o n t a i n e d a f e w p r o d u c t i o n s t h a t c o n t a i n t h e i n f o r m a t i o n o n t h e h e a d g r o u p i d e n t i t y ( F i g u r e 6 . 1 0 D ) . T h e m o s t a b u n d a n t p r o d u c t i o n f r o m m / z 4 8 2 i s m / z 1 4 4 , t h e d e h y d r a t e d t r i m e t h y l h o m o s e r i n e i o n . O t h e r p r o d u c t i o n s i n c l u d e t h e n e u t r a l l o s s o f C 0 2 ( m / z 4 3 8 ) , t h e l o s s o f 1 8 : 1 R C O O H ( m / z 2 0 0 ) a n d t h e l o s s o f 1 8 : 1 R ' C H = C = O k e t e n e ( m / z 2 1 8 ) . T h e s e f r a g m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s c a n b e e x p l a i n e d b y a D G T S 1 8 : 1 / 1 8 : 1 s t r u c t u r e , t h r o u g h t h e f r a g m e n t a t i o n p a t h w a y s p r o p o s e d i n S c h e m e 6 . 6 . N o r a d i c a l c a t i o n s w e r e o b s e r v e d h e r e u p o n l o w - e n e r g y C I D i n t h e q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p . 2 7 6 L A 6 0 0 2 . 5 e 3 1 0 0 0 0 O 0 O 2 3 6 1 R e l a t i v e A b u n d a n c e ( % ) 3 . 8 4 e 2 1 0 0 8 0 1 4 4 6 0 4 0 f 2 0 l 1 0 0 1 4 4 A - L A 6 4 0 — 2 ( 1 8 : l R ' C H = C = O ) 2 + z 7 6 4 , _ 7 6 4 [ D G T S 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + H ] + [ D G T S 1 6 : 0 / 1 8 : 1 + H ] + + 7 3 8 8 0 2 ? [ D G T S 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + K ] A M S 1 + 7 0 7 9 8 3 . . . L . ; L A L L - a . 1 . A . . ¥ . L A n . . . L L 7 2 0 1 I J [ G G D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + K 7 0 0 ' 8 0 0 ‘ 9 0 0 . 1 0 0 0 - ( 1 8 : 1 R C O O H ) - ( 1 8 : 1 R ’ C H = C = O ) : 7 6 4 B M S / M S 4 8 2 5 0 0 O 7 6 4 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 — H 2 0 4 8 2 C M s 3 1 5 0 0 o — ( 1 8 2 : 3 1 6 R ’ C H = C = O ) 5 0 0 1 i I I 2 0 0 ' 3 0 0 ' 4 0 0 5 0 0 ' 6 0 0 H S + H — H 0 ] 6 8 ' 9 “ M 2 + 7 6 4 4 8 2 [ T M H S - I ' l l ] ~ 1 8 1 1 R C O O H D M s 3 s o / 1 6 2 4 8 2 r 6 0 1 4 0 l 2 0 f — ( l 8 : l R C O O H ) - C 0 2 ‘ 8 7 4 3 8 2 0 0 - ( l 8 : l R ' C H = C = O ) 3 9 5 I 1 8 3 0 0 ' 4 0 0 ' 5 0 0 ' 6 0 0 m / 2 0 0 T M H S = t r i m e t h y l h o m o s e r i n e 2 F i g u r e 6 . 1 0 M A L D I M S s p e c t r u m ( A ) , a n d t h e l o w - e n e r g y C I D M S / M S ( B ) a n d M S 1 1 ( C a n d D ) f r a g m e n t a t i o n o f t h e p r o t o n a t e d i o n s ( [ M + H ] + ) o f d i a c y l g l y c e r o l - N , N , N - t r i m e t h y l h o m o s e r i n e ( D G T S ) f r o m t h e m e m b r a n e o f R . s p h a e r o i d e s ( w i t h C c O o v e r - e x p r e s s i o n ) a e r o b i c a l l y g r o w n u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t e d c o n d i t i o n s , u s i n g t h e M A L D I - q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r . T M H S r e p r e s e n t s t r i m e t h y l h o m o s e r i n e . 2 7 7 R V . ? f f O o / \ / 3 \ S 1 6 8 / e ( 3 0 0 5 M 3 z 1 3 2 z H / \ 4 O z / / d \ m o / m O = 0 m \ / o m n o / \ H \ \ i 3 e / / C 2 H = C 6 N C Z v i H / \ C , 1 R — 6 C i r s N N o p C O / Q / C E t \ i - 3 H 3 3 H n / C 3 H H H E 3 S O H H / 2 \ 0 i 3 S M d 0 n / . a \ O 8 1 2 S M 0 O H / 3 3 M O 0 = C 2 H — = H C C / ' 0 z / m ' i 1 R — R h m \ 0 S M n i + ] H + M [ S T G 0 / f | D N + H O % — C o 0 C 3 3 H s n H o O v 0 i t a t 3 H C O 0 e m 0 n C 2 m 2 z \ R — 3 H 3 H N / m g a r f C e C d — s C 3 H 2 6 o p o r P 6 . 6 e m 3 H 1 e z / h c C N m S — c i H 4 4 1 z / m ' ) 5 . H 3 C — / N R 2 ' — R 2 ' C H = C = - 0 C H 3 H 3 C Y } ) H M / C o \ j \ r [ fi 0 \ H 3 H 0 \ C I ) 0 C — 0 W M S / M S m 1 - ' - ' - H 0 b H 0 \ H \ / ‘ \ : / H / o : d ( n o t e . C H 2 R 1 — R 1 , C H 2 R 2 - R 2 m / z 7 6 4 M S / M S i — R 1 C O O C H = C H O H I H 3 \ / N a H 3 C — N e / + W / \ ” 3 ’ c h O H ’ / R 1 c o o o / C C H = c = — C H 2 m / z 4 3 8 T h e m u l t i p l e c h a n n e l s i n t h e f r a g m e n t a t i o n o f m / z 5 0 0 a r e p r o b a b l y b e c a u s e o f t h e fl e x i b i l i t y o f t h e i o n s t r u c t u r e . H o w e v e r , a c o m m o n f e a t u r e i s t h a t m o s t o f t h e s e p a t h w a y s a r e i n i t i a t e d b y n u c l e o p h i l i c a t t a c k o n t h e r e l a t i v e l y a c i d i c O H p r o t o n , a - p r o t o n s o r C - H p r o t o n a d j a c e n t t o a p o s i t i v e c h a r g e c e n t e r b y t h e e l e c t r o n p a i r o n a h y d r o x y l , e s t e r o r e t h e r o x y g e n . I n c o n t r a s t t o G P C h o l i p i d s , a l t h o u g h D G T S h a s a s i m i l a r N , N , N - t r i m e t h y l q u a t e r n a r y a m i n e h e a d g r o u p c a r r y i n g a fi x e d p o s i t i v e c h a r g e , D G T S d o e s n o t h a v e t h e n e g a t i v e l y c h a r g e d p h o s p h a t e g r o u p b u t h a s a c a r b o x y l g r o u p a s t h e n u c l e o p h i l i c c e n t e r , a n d s u c h a d i f f e r e n c e i n t h e c h e m i c a l s t r u c t u r e s w i t c h e s D G T S i n t o a v e r y d i f f e r e n t s e t o f f r a g m e n t a t i o n c h a n n e l s i n C I D M S / M S a n d M S n b y s h u t t i n g o f f t h e f r a g m e n t a t i o n c h a n n e l s i n i t i a t e d o r a s s i s t e d b y t h e s t r o n g n u c l e o p h i l i c g r o u p o f p h o s p h a t e , s u c h a s t h e - f o r m a t i o n o f m / z 1 8 4 h e a d g r o u p i o n , a fi n g e r p r i n t f o r G P C h o . I n s t e a d , m o s t o f t h e f r a g m e n t a t i o n s o f D G T S i n M S / M S o c c u r v i a c h a r g e - r e m o t e p r o c e s s b e c a u s e i t s p o s i t i v e c h a r g e i s fi x e d a n d n o t m o b i l e . A l s o d u e t o t h e fi x e d p o s i t i v e c h a r g e , D G T S i s e x p e c t e d t o h a v e a s t r o n g t e n d e n c y t o f o r m n o n - c o v a l e n t a d d u c t s w i t h a n i o n s s u c h a s c h l o r i d e a n d m e t h y l c a r b o n a t e , l i k e G P C h o , a n d t h e a n i o n i c a d d u c t i o n s o f D G T S c a n a l s o b e o b s e r v e d i n n e g a t i v e i o n m o d e E S I . I n a d d i t i o n , D G T S s t r o n g l y f o r m s n o n - c o v a l e n t a l k a l i a d d u c t i o n s w i t h p o t a s s i u m p r e s e n t i n t h e s a m p l e p r e p a r a t i o n s i m i l a r l y t o G P C h o i n p o s i t i v e i o n m o d e M A L D I ( F i g u r e 6 . 9 A ) , p r o b a b l y d u e t o t h e c a r b o x y l g r o u p . I n c o n t r a s t t o S Q D G , D G T S h a s o n e p o s i t i v e c h a r g e c e n t e r w h i l e S Q D G h a s o n e n e g a t i v e c h a r g e c e n t e r . H o w e v e r , t h e D G T S c h a r g e i s fi x e d o n t h e t r i m e t h y l h o m o s e r i n e a n d i s d i f f i c u l t t o b e c o m e m o b i l e , a n d t h e S Q D G c h a r g e i s r e s t r a i n e d b y t h e r i g i d s u g a r r i n g . S u c h c o m p a r i s o n s i n t h e f r a g m e n t a t i o n o f D G T S w i t h G P C h o a n d S Q D G a l s o 2 7 9 p r o v i d e i n s i g h t s i n t o t h e c h e m i c a l n a t u r e o f t h e r o l e s o f c h a r g e s i n t h e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f l i p i d s . I n s u m m a r y , t h e M S / M S p r o d u c t i o n a t m / z 2 3 6 c a n t h e r e f o r e b e a p p l i e d a s t h e fi n g e r p r i n t f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f D G T S l i p i d s i n p o s i t i v e i o n m o d e , a n d t h e l o w e r - a b u n d a n c e m / z 1 4 4 c a n b e u s e d a s a s u p p l e m e n t a r y e v i d e n c e w h e n t h e l o w m a s s c u t - o f f p e r m i t s . 2 8 0 6 . 4 C o n c l u s i o n s M u l t i s t a g e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y c o m b i n e d w i t h H / D e x c h a n g e , a n d a n e n e r g y - r e s o l v e d - fi a g m e n t a t i o n p l o t , w e r e e m p l o y e d t o g a i n i n s i g h t s i n t o t h e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n m e c h a n i s m s o f S Q D G l i p i d i o n s . U n d e r l o w - e n e r g y C I D c o n d i t i o n s , m / z 2 2 5 i s a p r a c t i c a l “ fi n g e r p r i n t i o n ” f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f S Q D G l i p i d s . T h e i m p r o v e d u n d e r s t a n d i n g o f t h e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f S Q D G a l s o d e m o n s t r a t e d i t s s i g n i fi c a n c e i n e n a b l i n g t h e a p p l i c a t i o n o f q u a n t i fi c a t i o n u s i n g M S / M S c h a r a c t e r i s t i c f r a g m e n t a t i o n s i n m o d e r n m a s s s p e c t r o m e t r y . M u l t i s t a g e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y o f D G T S a l s o e l u c i d a t e d i t s f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r u n d e r l o w - e n e r g y C I D c o n d i t i o n s , a n d p r o v i d e d v a l u a b l e g u i d a n c e i n t o t h e q u i c k , s e n s i t i v e a n d c o m p l e t e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e m o l e c u l a r s p e c i e s o f t h i s t y p e o f l i p i d b y u s i n g m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h o u t h a v i n g t o r e s o r t t o o t h e r t i m e - a n d - s a m p l e — c o n s u m i n g m e t h o d s . T h e C I D M S / M S p r o d u c t i o n a t m / z 2 3 6 c a n t h e r e b y b e u s e d a s t h e fi n g e r p r i n t p r o d u c t i o n f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f D G T S , a n d i t c a n b e a s s i s t e d b y t h e l o w e r - a b u n d a n c e i o n a t m / z 1 4 4 , w h i c h h a s b e e n d i s c u s s e d e a r l i e r [ 1 0 6 ] , w h e n l o w - m a s s - c u t o f f p e r m i t s . A l t h o u g h S Q D G a n d D G T S h a v e b e e n r e c o g n i z e d i n t r a d i t i o n a l p l a n t a n d b a c t e r i a l l i p i d b i o c h e m i c a l s t u d i e s f o r o v e r o n e d e c a d e , i n t h e u n d e r s t a n d i n g o f f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s i n m a s s s p e c t r o m e t r y , b o t h S Q D G a n d D G T S b e l o n g t o t h e l e s s - s t u d i e d p o l a r n o n - p h o s p h o l i p i d s . E x a m i n a t i o n o f t h e fi ' a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s o f S Q D G i n n e g a t i v e i o n m o d e , a n d D G T S i n p o s i t i v e i o n m o d e , a l s o p r o v i d e d i n s i g h t s i n t o h o w t h e c h e m i c a l s t r u c t u r e o f l i p i d s a f f e c t t h e i r g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r , w h i c h i s 2 8 1 p a r t i c u l a r l y v a l u a b l e i n r e c o g n i z i n g a n d u n d e r s t a n d i n g f u t u r e u n k n o w n l i p i d s w i t h n e w s t r u c t u r e s , o r n e w m o d i fi c a t i o n s o n l i p i d s t r u c t u r e . 2 8 2 C h a p t e r 7 M a s s S p e c t r o m e t r y I d e n t i fi c a t i o n a n d S e l e c t i v e Q u a n t i fi c a t i o n o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s M e m b r a n e L i p i d s : P r o b i n g t h e E f f e c t s o f L i p i d S p e c i fi c M u t a n t s o n C y t o c h r o m e c O x i d a s e P r o d u c t i o n a n d A c t i v i t y 7 . 1 S u m m a r y M S a n d M S / M S a n d M S n - b a s e d l i p i d i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n m e t h o d s h a v e b e e n d e v e l o p e d a n d a p p l i e d t o t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e m e m b r a n e l i p i d p r o fi l e s o f t h e w i l d t y p e a n d a s e r i e s o f s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s o f R . s p h a e r o i d e s , i n c l u d i n g t h e G P C h o - d e fi c i e n t , S Q D G - d e fi c i e n t a n d C L - d e fi c i e n t m u t a n t s . T h e s e q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s l 4 C - l a b e l i n g q u a n t i fi c a t i o n s t u d i e s [ 1 5 , 1 6 , 9 1 ] , a n d t h e d i f f e r e n c e s i n t h e m e m b r a n e l i p i d p r o fi l e s o b s e r v e d b e t w e e n t h e s e s t r a i n s c a n b e c o r r e l a t e d w i t h t h e l i p i d b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s , a n d a r e s u g g e s t i v e o f t h e p o t e n t i a l f u n c t i o n a l r e p l a c e m e n t s b e t w e e n l i p i d s . M o r e i m p o r t a n t l y , t h e s e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s a r e u s e d a s a n i m p o r t a n t s e t o f t o o l s t o p r o b e t h e f u n c t i o n a l r o l e o f t h e i n d i v i d u a l t y p e s o f l i p i d s i n t h e m e m b r a n e p r o t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( C c O ) i n v i v o . T h e c h a n g e s i n t h e m e m b r a n e l i p i d p r o fi l e s o f t h e s e m u t a n t s , w h i c h s e t t h e b a c k g r o u n d t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f l i p i d s o n t h e C c O p r o d u c e d a n d p u r i fi e d f r o m t h e s e l i p i d e n v i r o n m e n t s , a r e 2 8 3 c h a r a c t e r i z e d i n t h i s c h a p t e r f o l l o w i n g a d e s c r i p t i o n o f t h e c o n s e q u e n t c e l l g r o w t h , C c O e x p r e s s i o n a n d C c O p r o p e r t i e s . N o n e o f t h e s e s i n g l e s p e c i fi c l i p i d d e fi c i e n c i e s w e r e f o u n d t o b e d e t r i m e n t a l t o t h e p r o p e r t i e s o f C c O , i n c l u d i n g t h e c e l l g r o w t h , C c O e x p r e s s i o n y i e l d , C c O p u r i fi c a t i o n y i e l d , U V - V i s s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s , s u b u n i t c o m p o s i t i o n , s t e a d y s t a t e a c t i v i t y , o r t h e t e m p e r a t u r e - d e p e n d e n c e o n t h e a c t i v i t y o f t h e C c O p u r i fi e d f r o m t h e s e s t r a i n s , i n s p i t e o f t h e s i g n i fi c a n t c h a n g e s i n t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e p u r i fi e d C c O a s r e v e a l e d b y m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s . 2 8 4 7 . 2 I n t r o d u c t i o n 7 . 2 . 1 L i p i d s a n d t h e m e m b r a n e b o u n d r e d o x p r o t e i n C c O I n b i o l o g i c a l m e m b r a n e s , l i p i d s d o f a r m o r e t h a n s t a t i c a l l y p r o v i d e t h e e n v i r o n m e n t f o r t h e o r g a n i z a t i o n a n d a c t i v i t i e s o f m e m b r a n e b o u n d p r o t e i n s a n d p r o t e i n c o m p l e x e s . L i p i d s a l s o p r o v i d e a n i n t e r a c t i v e p l a t f o r m f o r t h e m t o c o m m u n i c a t e w i t h o t h e r p r o t e i n s a n d o t h e r m o l e c u l e s , a n d a r e l i k e l y t o b e a c t i v e l y i n v o l v e d i n t h e s e p r o c e s s e s , a s s u g g e s t e d b y e m e r g i n g e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e [ l , 1 9 , 2 2 , 3 4 , 3 5 , 5 2 , 5 4 , 5 5 , 5 9 , 3 0 4 - 3 0 7 ] . M e m b r a n e l i p i d s g e n e r a l l y c o n t a i n a h y d r o p h i l i c h e a d g r o u p a n d a l o n g h y d r o p h o b i c t a i l , b u t b o t h p a r t s h a v e b e e n i n c r e a s i n g l y f o u n d t o h a v e v a s t d i v e r s i t y i n t e r m s o f t h e i r s p e c i fi c s t r u c t u r e s , e n a b l i n g t h e p o t e n t i a l l y d i v e r s i fi e d f u n c t i o n s o f d i f f e r e n t l i p i d s p e c i e s . R e c e n t s u c c e s s e s i n m e m b r a n e p r o t e i n X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y a t h i g h r e s o l u t i o n r e v e a l e d t h a t l i p i d m o l e c u l e s r e m a i n b o u n d i n t h e c r y s t a l s o f m e m b r a n e p r o t e i n s [ 3 4 - 3 6 ] . S u p e r i m p o s i t i o n o f t h e h i g h - r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e s o f t h e m u l t i - s u b u n i t m e m b r a n e p r o t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e , p u r i fi e d f r o m d i f f e r e n t b a c t e r i a l a n d b o v i n e h e a r t s o u r c e s , l e d t o t h e d i s c o v e r y o f s e v e r a l w e l l c o n s e r v e d s i t e s o f b o u n d l i p i d s , i n s p i t e o f d i f f e r e n c e s i n t h e s o u r c e m e m b r a n e l i p i d c o m p o s i t i o n s , a n d i n t h e p u r i fi c a t i o n a n d c r y s t a l l i z a t i o n p r o c e d u r e s [ 3 5 ] . A l t h o u g h t h e b i n d i n g s i t e s w e r e w e l l c o n s e r v e d , t h e l i p i d s a t s o m e s i t e s w e r e r e p l a c e d b y d e t e r g e n t s , r a i s i n g q u e s t i o n s a b o u t t h e s p e c i fi c i t y r e q u i r e m e n t s f o r l i p i d s a t t h e s e b i n d i n g s i t e s . O n e s t r a i g h t f o r w a r d w a y t o a d d r e s s t h e s e q u e s t i o n s i s t o “ r e m o v e ” a p a r t i c u l a r t y p e o f l i p i d , a n d e x a m i n e t h e c o n s e q u e n c e s o f t h e m i s s i n g l i p i d s o n v a r i o u s a s p e c t s o f t h e s y s t e m . P r e v i o u s s t u d i e s r e m o v e d C L f r o m p u r i fi e d b o v i n e h e a r t C c O u s i n g 2 8 5 p h o s p h o l i p a s e d i g e s t i o n , a n d f o u n d t h a t t h e i n t e g r i t y a n d a c t i v i t y o f C c O w e r e d e s t r o y e d [ 5 4 ] . S i m i l a r l y , r e v e r s i b l e i n a c t i v a t i o n r e s u l t e d w h e n t h e b o u n d C L w a s r e m o v e d u s i n g p h o s p h o l i p a s e d i g e s t i o n f r o m p u r i fi e d c y t o c h r o m e b e ] c o m p l e x [ 5 4 ] . T h e s e t y p e s o f i n v i t r o a p p r o a c h e s c o u l d p o t e n t i a l l y d i s t u r b t h e e n z y m e s t r u c t u r e , a n d c o u l d n o t e x a m i n e t h e p o s s i b i l i t y o f t h e a d a p t a b i l i t y / fl e x i b i l i t y o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n s w i t h t h e i r l i p i d c o m p o n e n t s . S p e c i fi c l i p i d “ r e m o v a l ” v i a g e n e t i c m a n i p u l a t i o n , h o w e v e r , p r o v i d e s a m o r e n a t u r a l c o n t e x t t o o b s e r v e t h e c o n s e q u e n c e s t o t h e s y s t e m , b y a l l o w i n g t h e m e m b r a n e p r o t e i n s t o a d a p t t o t h e i r a l t e r e d l i p i d e n v i r o n m e n t f r o m t h e v e r y b e g i n n i n g . 7 . 2 . 2 L i p i d - d e f i c i e n t m u t a n t s a s t h e t o o l t o p r o b e t h e f u n c t i o n s o f l i p i d s f o r C c O S e v e r a l s p e c i fi c l i p i d d e fi c i e n t s t r a i n s o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s h a v e b e e n d e v e l o p e d t o e x a m i n e t h e p h y s i o l o g i c a l e f f e c t o f t h e p a r t i c u l a r l i p i d o n t h e o v e r a l l b a c t e r i a l v i a b i l i t y a n d g r o w t h [ 1 3 ] . T h e c h e m i c a l l y m u t a t e d G P C h o - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s s t r a i n C H B Z O , i n w h i c h t h e G P E t n m e t h y l t r a n s f e r a s e i s m u t a t e d , c o n t a i n s n o m e a s u r a b l e G P C h o [ 9 0 ] . T h e s t r a i n a c c u m u l a t e d t h e p r e c u r s o r , G P E t n , b u t b e h a v e d s i m i l a r l y t o t h e w i l d t y p e s t r a i n 2 . 4 . 1 u n d e r t h e n o r m a l a n a e r o b i c g r o w t h c o n d i t i o n s [ 9 0 ] . T h e c h e m i c a l l y m u t a t e d S Q D G - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s s t r a i n S B l K l a l s o g r o w s n o r m a l l y c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e s t r a i n 2 . 4 . 1 , b u t w h e n b o t h S Q D G a n d G P G r o a r e d e fi c i e n t , t h e c e l l s d o n o t s u r v i v e [ 1 4 , 1 6 ] . M o r e r e c e n t l y , a s p e c i fi c c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t m u t a n t o f R . s p h a e r o i d e s w a s a l s o g e n e r a t e d b y d e l e t i o n o f t h e c a r d i o l i p i n s y n t h a s e g e n e [ 1 5 ] . T h e s e g e n e t i c m a n i p u l a t i o n s o f t h e l i p i d c o m p o s i t i o n o f R . s p h a e r o i d e s t h u s p r o v i d e a s e t o f s t r a i n s t h a t a r e e a c h i n t r i n s i c a l l y d e fi c i e n t i n a s p e c i fi c t y p e o f l i p i d , 2 8 6 w h i c h c a n b e u s e d a s a t o o l t o p r o b e t h e f u n c t i o n o f e a c h t y p e o f t h e s e l i p i d s w i t h r e g a r d t o t h e o v e r a l l b a c t e r i a l c e l l u l a r p r o c e s s e s a n d m o r e s p e c i fi c a l l y , t o t h e e x p r e s s i o n a n d a c t i v i t y o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n R . s p h a e r o i d e s C c O , i n v i v o . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e c h a n g e s i n t h e m e m b r a n e l i p i d p r o fi l e s o f t h e s e m u t a n t s s e t s t h e b a c k g r o u n d f o r fi r r t h e r e x a m i n a t i o n o f t h e e f f e c t s o n t h e C c O g r o w n a n d p u r i fi e d f r o m t h e s e a l t e r e d l i p i d e n v i r o n m e n t s . T h e m u l t i - s u b u n i t m e m b r a n e - b o u n d p r o t e i n c o m p l e x , c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( C c O ) , c o n t a i n s f r o m 4 t o 1 3 s u b u n i t s , h e m e s , m e t a l i o n s a n d s e v e r a l l i p i d s p e c i e s e v e n a f t e r p u r i fi c a t i o n a n d c r y s t a l l i z a t i o n s t e p s [ 3 0 ] . T h e X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y o f C c O p u r i fi e d f r o m b o v i n e h e a r t , P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s a n d R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s ( R . s p h a e r o i d e s ) h a s r e v e a l e d a n u m b e r o f c o n s e r v e d l i p i d b i n d i n g s i t e s [ 3 5 ] . P r e v i o u s m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s h a s a l s o i d e n t i fi e d c e r t a i n l i p i d s w h i c h a r e r e t a i n e d w i t h i n t h e p u r i fi e d e n z y m e a n d p r o t e i n c r y s t a l s , s u g g e s t i n g i m p o r t a n t r o l e s f o r t h e s e l i p i d s i n t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f C c O . C a r d i o l i p i n i n p a r t i c u l a r h a s b e e n r e p o r t e d t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f C c O f r o m m a m m a l i a n m i t o c h o n d r i a [ 1 0 ] . I n c r e a s i n g e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t t h e m a m m a l i a n c a r d i o l i p i n m a i n l y f u n c t i o n s i n t h e f o r m o f C L ( 1 8 : 2 ) 4 , r a t h e r t h a n a n y o t h e r f o r m o f c a r d i o l i p i n [ 8 , 2 1 ] . H o w e v e r , s u c h a t y p e o f p o l y u n s a t u r a t e d c a r d i o l i p i n s p e c i e s i s n o t f o u n d i n R . s p h a e r o i d e s . I t i s t h e r e f o r e v e r y i m p o r t a n t t o d e t e r m i n e t h e s p e c i fi c m o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f t h e l i p i d s r a t h e r t h a n j u s t t h e g e n e r a l t y p e s o f l i p i d s , u s i n g m e t h o d s s u c h a s m a s s s p e c t r o m e t r y , i f a c l e a r e r p i c t u r e o f h o w l i p i d s f u n c t i o n a l l y i n t e r a c t w i t h C c O i s t o b e g a i n e d . ‘ T o e x a m i n e t h e p o t e n t i a l s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l r o l e s o f l i p i d s i n R . s p h a e r o i d e s C c O , t h e C c O p r o t e i n s a r e e x p r e s s e d a n d p u r i fi e d f r o m t h e s e r i e s o f s p e c i fi c l i p i d - 2 8 7 d e fi c i e n t m u t a n t s , i n c l u d i n g t h e C L - d e fi c i e n t , S Q D G - d e fi c i e n t a n d G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t s , a s w e l l a s t h e w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s ( s e e T a b l e 3 . 1 i n C h a p t e r 3 f o r d e t a i l e d d e s c r i p t i o n s o f t h e s t r a i n s ) . S u c h a n a p p r o a c h o f s p e c i fi c l i p i d “ r e m o v a l ” v i a g e n e t i c m a n i p u l a t i o n p r o v i d e s a m o r e n a t u r a l c o n t e x t t o o b s e r v e t h e c o n s e q u e n c e s t o t h e C c O i n v i v o , a s c o m p a r e d t o t h e i n v i t r o e x t r a c t i o n o r d i g e s t i o n p r o c e s s e s . H e r e t h e p r o p e r t i e s o f t h e C c O f r o m t h e s e m u t a n t s h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d i n t e r m s o f t h e i r e x p r e s s i o n , a c t i v i t y a n d s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s , a n d t h e c h a n g e s i n t h e l i p i d s i n t h e C 0 0 a r e d e t e r m i n e d b y q u a n t i t a t i v e E S I M S a n d M S / M S ( f o r t h e C L — d e fi c i e n t m u t a n t ) m e t h o d s . 7 . 2 . 3 P r o p e r t i e s o f t h e C c O p r o d u c e d f r o m t h e l i p i d - d e f i c i e n t m u t a n t s 7 . 2 . 3 . 1 C e l l g r o w t h , C c O e x p r e s s i o n i n m e m b r a n e s a n d p u r i fi c a t i o n s t a b i l i t y f r o m t h e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s A l l o f t h e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s a r e v i a b l e a n d c a n g r o w t o s i m i l a r o p t i c a l d e n s i t y , a n d e x p r e s s C c O a t y i e l d s s i m i l a r t o t h e w i l d t y p e ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e h e m e a a n d b c l a b s o r p t i o n p e a k s d i d n o t d i s p l a y a n y s h i f t f r o m t h e w i l d t y p e . T h e r e l a t i v e a m o u n t s o f C c O c o m p a r e d t o o t h e r c o m p l e x e s s u c h a s t h e b c l c o m p l e x i n t h e m u t a n t s a r e a l s o n o t s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h a t o f t h e w i l d t y p e ( F i g u r e 7 . 1 ) . T h e p u r i fi c a t i o n y i e l d o f C c O f r o m t h e s e s t r a i n s b y u s i n g N i - N T A g r a v i t y c o l u m n s a r e a l s o s i m i l a r t o t h a t o f t h e w i l d t y p e ( D r . C a r r i e H i s e r , d a t a n o t s h o w n ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e s t a b i l i t y o f t h e a s s o c i a t i o n o f t h e s u b u n i t s i n t h e C c O i s n o t s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t fi o m t h a t o f t h e w i l d t y p e . 2 8 8 — W T ( 2 . 4 . 1 + C C O ) 0 . 0 8 ‘ H e m e s b c , H e m e a “ " C L — ( C L 3 + C c O ) _ 5 5 0 / 5 6 0 n m 6 0 6 n m . . . . . . . . S Q D G — ( S B 1 K 1 + C C O ) 0 _ 0 6 — - ' G P C h o - ( C H B 2 0 + C C O ) 4 I I 8 0 . 0 4 ‘ l a I V ‘ I , ‘ I \ ' 8 d I , \ v ’ 5 " . , . _ \ g " / ’ 3 . “ : ~ ~ q u ¢ l fl a h h n u b - ” N u . " ‘ 5 ‘ I ' . - . 3 . , 8 0 . 0 2 r ’ . . . . - . , . . , M . . . . . . . . ~ - 1 I . ’ 1 " . _ 4 n , " . . . _ 0 . 0 0 " ' g . f \ . . j " , “ E A - j \ " f ' . " \ . . V — . - . J - . " ’ . - \ I ° . ‘ ~ " w ° ' v - 0 0 2 fi f ' I ' l | I l 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0 W a v e l e n g t h ( n m ) F i g u r e 7 . 1 R e d u c e d - o x i d i z e d U V - V i s s p e c t r o s c o p y o f d o d e c y l m a l t o s i d e - s o l u b i l i z e d m e m b r a n e s i s o l a t e d f r o m R . s p h a e r o i d e s 2 . 4 . 1 + C c 0 ( w i l d t y p e ) , a n d t h e s p e c i fi c C L - d e fi c i e n t ( C L 3 + C c O ) , ( C H B 2 0 + C c O ) s t a i n s , g r o w n u n d e r a e r o b i c c o n d i t i o n s . T h e e x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d b y D r . C a r r i e H i s e r . S Q D G - d e fi c i e n t 2 8 9 ( S B l K 1 + C c O ) a n d G P C h o - d e fi c i e n t 7 . 2 . 3 . 2 U V - V i s s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s o f t h e p u r i f i e d C c O f r o m t h e f o u r s t r a i n s T h e r e d u c e d s p e c t r a o f t h e C c O p u r i fi e d b y u s i n g N i - N T A c h r o m a t o g r a p h y f r o m t h e f o u r s t r a i n s , i n c l u d i n g t h e w i l d t y p e ( 2 . 4 . l + C c O ) , a n d t h e s p e c i fi c s i n g l e l i p i d d e fi c i e n t s t r a i n s C L — d e fi c i e n t ( C L 3 + C c O ) , S Q D G - d e fi c i e n t ( S B l K l + C c O ) a n d G P C h o - d e fi c i e n t ( C H B 2 0 + C c O ) s t a i n s , a r e s h o w n i n F i g u r e 7 . 2 . T h e y d i s p l a y n o a p p r e c i a b l e d i f f e r e n c e s i n t e r m s o f t h e w a v e l e n g t h o f t h e p e a k s , a n d t h e r e l a t i v e i n t e n s i t y b e t w e e n t h e S o r e t ( 4 4 5 n m ) a n d a l p h a b a n d s o f h e m e a a t 6 0 6 n m . T h e f a c t t h a t n o p e a k s h i f t i s o b s e r v e d s u g g e s t s t h a t t h e c o o r d i n a t i o n s t a t e o f t h e h e m e a c a t a l y t i c c e n t e r i n t h e C c O i s n o t d i s t u r b e d i n a n y o f t h e s e m u t a n t s . 7 . 2 . 3 . 3 S D S - P A G E a n a l y s i s o f t h e p u r i f i e d C c O f r o m t h e f o u r s t r a i n s S D S - P A G E g e l a n a l y s i s o f t h e p u r i fi e d C c O f r o m R . s p h a e r o i d e s 2 . 4 . 1 + C c 0 ( w i l d t y p e ) , a n d t h e s p e c i fi c s i n g l e l i p i d t y p e d e fi c i e n t s t r a i n s C L 3 + C c O ( C L - d e fi c i e n t ) , S B l K 1 + C c O ( S Q D G - d e fi c i e n t ) a n d C H 8 2 0 + C c O ( G P C h o - d e fi c i e n t ) , u s i n g u r e a a s t h e r e d u c i n g r e a g e n t a n d b l u e C o o m a s s i e f o r t h e s t a i n i n g , s h o w s n o a p p r e c i a b l e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e f o u r s a m p l e s o f C c O i n t e r m s o f s u b u n i t c o m p o s i t i o n a n d t h e s i z e o f t h e s u b u n i t s t h a t a r e r e s o l v e d b y t h e S D S - P A G E m e t h o d , a n d i t i s c l e a r t h a t e a c h C c O c o n t a i n s f o u r s u b u n i t s ( D r . C a r r i e H i s e r ; d a t a n o t s h o w n ) . T h e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n c y i n C L , S Q D G o r G P C h o d i d n o t c a u s e t h e s u b u n i t s t o b e l o s t , p a r t i c u l a r l y s u b u n i t I V , w h i c h i s n o t d i r e c t l y c o n n e c t e d t o t h e r e s t o f t h e e n z y m e , b u t i s h e l d v i a a l a y e r o f p h o s p h o l i p i d s [ 3 4 ] . 2 9 0 0 . 4 ' S o r e t — - - " - - - - - - - - - - ' W C S G T Q L P — C D 4 L ( h G 2 ( , C — o — ) ) l . 3 ( ( 1 S + C + C C B H c l c B O K O 2 + C c O ) 0 + C c O ) e c n a b r O [ J \ o s b A H e m e a 6 0 6 n m l I l I l I 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0 W a v e l e n g t h ( n m ) F i g u r e 7 . 2 R e d u c e d U V - V i s s p e c t r o s c o p y o f C c O p u r i fi e d f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s 2 . 4 . 1 + C c O ( w i l d t y p e ) , a n d t h e s p e c i fi c C L — d e fi c i e n t ( C L 3 + C c O ) , S Q D G - d e fi c i e n t ( S B l K l + C c O ) a n d G P C h o — d e fi c i e n t ( C H B 2 0 + C c O ) s t a i n s g r o w n u n d e r a e r o b i c c o n d i t i o n s . T h e p r o t e i n s w e r e p u r i fi e d b y u s i n g t h e N i - N T A g r a v i t y c o l u m n s . T h e e x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d b y D r . C a r r i e H i s e r . 2 9 1 7 . 2 . 3 . 4 A c t i v i t y o f p u r i f i e d C c O f r o m t h e f o u r s t r a i n s T h e s t e a d y s t a t e a c t i v i t i e s o f t h e C c O f r o m t h e s e f o u r s t r a i n s w e r e e v a l u a t e d b y o x y g e n c o n s u m p t i o n e x p e r i m e n t s i n t h e p r e s e n c e o f c y t o c h r o m e c a s t h e s u b s t r a t e , a n d t h e r e s u l t s a r e s h o w n i n F i g u r e 7 . 3 . T h e a c t i v i t i e s o f t h e s e C c O e n z y m e s d o n o t d i f f e r g r e a t l y b e y o n d w h a t m i g h t b e s e e n i n t h e d i f f e r e n t b a t c h e s o f t h e w i l d t y p e e n z y m e ( D r . C a r r i e H i s e r , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . T h e a d d i t i o n o f a s o l e c t i n l i p i d s i n t h e a s s a y l e a d s t o a n i n c r e a s e i n a c t i v i t y b y 2 0 - 3 0 % i n e a c h c a s e , t h e t y p i c a l v a l u e o b s e r v e d f o r t h e w i l d t y p e C c O [ 2 7 ] . T h e r e f o r e t h e s p e c i fi c l i p i d d e fi c i e n c y i n C L , S Q D G o r G P C h o d i d n o t s e r i o u s l y h a m p e r t h e C c O a c t i v i t y , a n d t h e C c O f r o m t h e s e s t r a i n s a r e n o t p a r t i c u l a r l y m o r e s e n s i t i v e t o t h e a d d e d l i p i d s t h a n t h a t o f t h e w i l d t y p e C c O i s . 7 . 2 . 3 . 5 A c t i v i t y s t a b i l i t y o f t h e p u r i fi e d C c O u n d e r t e m p e r a t u r e s t r e s s : W T a n d C L - F i g u r e 7 . 4 s h o w s t h e o x y g e n c o n s u m p t i o n a c t i v i t i e s o f t h e N i - N T A - p u r i fi e d C c O f r o m t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t ( C L 3 + C c O ) a n d t h e w i l d t y p e ( 2 . 4 . l + C c O ) , a t i n c r e a s i n g i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e . B o t h C c O e n z y m e s d i s p l a y e d s t e a d i l y d e c r e a s e d a c t i v i t i e s w i t h a n i n c r e a s e i n t e m p e r a t u r e f r o m 2 0 t o 8 5 ° C , b u t t h e C c O f r o m t h e c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t m u t a n t d o e s n o t s e e m t o b e s i g n i fi c a n t l y m o r e u n s t a b l e t o a t e m p e r a t u r e i n c r e a s e t h a n t h e C c O f r o m t h e w i l d t y p e . 2 9 2 B E L I Z E w i t h o u t a d d e d a s o l e c t i n w i t h a d d e d a s o l e c t i n F i g u r e 7 . 3 S t e a d y - s t a t e o x y g e n c o n s u m p t i o n a c t i v i t y a n a l y s i s o f p u r i fi e d C c O u s i n g N i - N T A g r a v i t y c o l u m n f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s 2 . 4 . 1 + C c O ( w i l d t y p e ) , a n d t h e s p e c i fi c s i n g l e l i p i d t y p e d e fi c i e n t s t r a i n s C L 3 + C c O ( C L - d e fi c i e n t ) , S B l K l + C c O ( S Q D G - d e fi c i e n t ) a n d C H B 2 0 + C c O ( G P C h o — d e fi c i e n t ) , b e f o r e a n d a f t e r t h e a d d i t i o n o f a s o l e c t i n l i p i d s i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e . T h e d a t a s h o w n a r e t h e a v e r a g e s o f t r i p l i c a t e a s s a y s , a n d t h e e r r o r b a r i s t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n . T h e e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d b y D r . C a r r i e H i s e r . 2 9 3 2 0 0 0 - : ] W T C c O ( 2 . 4 . 1 + C c O ) A e C L - C c O ( C L 3 + C c O ) ' o 1 5 0 0 - i a g . i i E o a m : 5 1 0 0 0 ‘ a i ] s : ' m [ i ] 5 ’ e 5 9 Q g 5 0 0 - e E [ I I a 0 ' l ' l ' s 2 0 4 o 6 0 8 0 I n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e ( ° C ) F i g u r e 7 . 4 O x y g e n c o n s u m p t i o n a c t i v i t i e s o f t h e N i - N T A - p u r i fi e d C c O f r o m t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t ( C L 3 + C c O ) a n d t h e w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) , a s a f u n c t i o n o f t e m p e r a t u r e ( e n z y m e s a r e i n c u b a t e d a t e a c h t e m p e r a t u r e f o r 1 m i n u t e i n 1 0 p L a l i q u o t s ) . T h e r e s u l t s s h o w n a r e f r o m t h e d u p l i c a t e e x p e r i m e n t s f o r t h e C L - d e fi c i e n t s t r a i n a n d t r i p l i c a t e s f o r t h e w i l d t y p e . T h e e r r o r b a r i s t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n ( s h o w n o n l y f o r t h e w i l d t y p e ) . T h e e x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d b y D r . C a r r i e H i s e r . 2 9 4 7 . 2 . 4 L i p i d o m i c s A c c u r a t e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e e n o r m o u s l y d i v e r s i fi e d s t r u c t u r e s o f l i p i d s a n d f u r t h e r q u a n t i fi c a t i o n o f e a c h l i p i d m o l e c u l a r s p e c i e s o v e r a w i d e r a n g e o f a b u n d a n c e h a s b e e n a m a j o r c h a l l e n g e . W i t h t h e a v a i l a b i l i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h i t s h i g h s e n s i t i v i t y a n d m u l t i s t a g e M S / M S ( i . e . M S “ ) c a p a b i l i t y , a p p r o a c h e s t o t h i s p r o b l e m a r e n o w p o s s i b l e . T h e r e c e n t d e v e l o p m e n t s i n m a s s s p e c t r o m e t r y t e c h n o l o g i e s a r e b e i n g i n c r e a s i n g l y a p p l i e d t o l i p i d o m i c s a n d l i p i d b i o c h e m i s t r y s t u d i e s [ 5 9 , 1 l l , 1 1 2 , l l 7 , 1 4 0 , 2 0 7 , 2 9 0 ] , w h e r e u n p r e c e d e n t e d d e t a i l s o f t h e l i p i d s t r u c t u r e a n d q u a n t i fi c a t i o n a r e r e v e a l e d a t h i g h s e n s i t i v i t y a n d v e r s a t i l i t y ( s e e C h a p t e r 2 f o r a d e t a i l e d d e s c r i p t i o n ) . 7 . 2 . 5 C o m p l e t e l i p i d s t r u c t u r a l i d e n t i f i c a t i o n b y u s i n g M S n I n t h e M S s p e c t r a o f l i p i d m i x t u r e s , s u c h a s t h e l i p i d e x t r a c t s f r o m b i o l o g i c a l s a m p l e s , a s i g n i fi c a n t d e g r e e o f m a s s o v e r l a p p i n g i s l i k e l y t o o c c u r , p a r t i c u l a r l y i n t h e m / z 6 0 0 - 9 0 0 r e g i o n . T h e s e r e g i o n s a r e f u r t h e r c o m p l i c a t e d b y t h e f o r m a t i o n o f v a r i o u s n o n - c o v a l e n t c a t i o n i c o r a n i o n i c a d d u c t s o f t h e l i p i d s . S i m p l y m a t c h i n g t h e m / z o f t h e M S p e a k s w i t h t h e c a l c u l a t e d m a s s e s o f t h e p o s s i b l e l i p i d s c a n l e a d t o s i g n i fi c a n t a m b i g u i t y , b e c a u s e o f t e n t h e o v e r l a p p i n g s p e c i e s a r e s t r u c t u r a l i s o m e r s w i t h e x a c t l y t h e s a m e m o l e c u l a r w e i g h t s . H o w e v e r , C I D M S / M S ( a n d M S n e x p e r i m e n t s i n q u a d r u p o l e l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r s ) c a n p o t e n t i a l l y d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e s e s p e c i e s b y t h e i r f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s , w h i c h a r e h i g h l y s e n s i t i v e t o t h e i r c h e m i c a l s t r u c t u r e s . T h e s e m e t h o d s c a n a l s o b e u s e d t o a c h i e v e u n a m b i g u o u s s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f 2 9 5 e a c h o f t h e l i p i d s p e c i e s e v e n i f t h e y o v e r l a p a t t h e s a m e m / z v a l u e i n M S , w i t h o u t t h e t r a d i t i o n a l r e q u i r e m e n t o f i n d e p e n d e n t l y s y n t h e s i z e d s t a n d a r d s o r N M R f o l l o w i n g e l a b o r a t e p u r i fi c a t i o n s . M S n i s a v e r y i m p o r t a n t t o o l w h e n d e a l i n g w i t h b i o l o g i c a l s a m p l e s , w h i c h o f t e n c o n t a i n a l o t o f b i o l o g i c a l l y s i g n i fi c a n t l i p i d s w i t h u n k n o w n s t r u c t u r e s o r s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s t h a t c o u l d n o t b e r e v e a l e d b y t r a d i t i o n a l m e t h o d s . T h e h i g h s e n s i t i v i t y o f M S n i n b o t h i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n m a k e s i t a n i d e a l t o o l t o e x a m i n e t h e l i p i d s i n t h e m e m b r a n e p e l l e t s , i n t h e p u r i fi e d C c O o b t a i n e d a t l i m i t e d y i e l d , a n d i n t h e C c O c r y s t a l s h a r v e s t e d a t t h e s i z e d i m e n s i o n o f a f e w t e n t h s o f o n e m i l l i m e t e r . 7 . 2 . 6 M e m b r a n e l i p i d s o f R . s p h a e r o i d e s P r e v i o u s s t u d i e s b a s e d m a i n l y o n T L C a n a l y s i s a n d 1 4 C - l a b e l l i n g h a v e f o u n d t h a t t h e m e m b r a n e s o f w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s s t r a i n 2 . 4 . 1 c o n t a i n p h o s p h a t i d y l - e t h a n o l a m i n e ( G P E t n ) , p h o s p h o t i d y l c h o l i n e ( G P C h o ) , p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ( G P G r o ) a n d c a r d i o l i p i n ( C L ) , a n d t h e n o n p h o s p h o l i p i d s s u l f o l i p i d s ( S Q D G ) a n d o m i t h i n e l i p i d s ( O L ) , w h e n t h e g r o w t h m e d i a c o n t a i n e d a b u n d a n t p h o s p h a t e , w h e r e p h o s p h o l i p i d s a r e t h e p r e d o m i n a n t c o m p o n e n t s [ 1 6 , 9 0 ] . U n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c o n d i t i o n s , t h e n o v e l p h o s p h a t e - f r e e g l y c o l i p i d s g l u c o s y l g a l a c t o s y l - d i a c y l g l y c e r i d e ( G G D G ) a n d d i a c y l g l y c e r y l - t r i m e t h y l h o m o s e r i n e ( D G T S ) a r e p r o d u c e d , a n d t h e S Q D G a n d O L a r e i n c r e a s e d [ 1 1 ] . D G T S i s p r o p o s e d t o f u n c t i o n a l l y c o m p e n s a t e f o r G P C h o , S Q D G f o r G P G r o a n d C L f o r G P E t n , b a s e d o n t h e s i m i l a r i t y o f t h e c h a r g e s t a t e i n t h e h e a d g r o u p [ 1 1 , 1 4 ] . T h e c h a r a c t e r i s t i c f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s o f G P C h o a n d o t h e r p h o s p h o l i p i d s , 2 9 6 O L , g l u t a r n i n e l i p i d s ( Q L ) S Q D G a n d D G T S h a v e b e e n d i s c u s s e d i n p r e v i o u s c h a p t e r s ( s e e C h a p t e r s 2 , 4 , 5 a n d 6 f o r d e t a i l e d d e s c r i p t i o n s ) . T h a t b e i n g s a i d , t h e r e h a s n o t b e e n a n y c o m p r e h e n s i v e d e t a i l e d m o l e c u l a r s t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n , o r q u a n t i fi c a t i o n , o f t h e m o l e c u l a r s p e c i e s f r o m e i t h e r t h e w i l d t y p e o r a n y o f t h e s e l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s o f R . s p h a e r o i d e s p r i o r t o t h e c u r r e n t s t u d y . B y t a k i n g a d v a n t a g e o f t h e k n o w l e d g e o f t h e f r a g m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s e l i p i d s , t h e l i p i d c o m p o s i t i o n s i n t h e w i l d t y p e a n d t h e i n d i v i d u a l l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s t h a t a r e s p e c i fi c a l l y d e fi c i e n t i n C L , S Q D G a n d G P C h o , a l l o f w h i c h a r e v i a b l e a n d c a n p r o d u c e C c O , h a v e b e e n e x t e n s i v e l y e x a m i n e d b y u s i n g E S I f o l l o w i n g l i p i d e x t r a c t i o n , f o r b o t h t h e m e m b r a n e a n d t h e p u r i fi e d C c O . 7 . 3 R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n s 7 . 3 . 1 I d e n t i fi c a t i o n o f m e m b r a n e l i p i d s i n t h e w i l d t y p e a n d t h e m u t a n t s A d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f t h e s p e c i fi c s t r a i n s s t u d i e d i n t h i s c h a p t e r c a n b e f o u n d i n T a b l e 3 . 1 i n C h a p t e r 3 . T h e i s o l a t e d m e m b r a n e p e l l e t s w e r e r e s u s p e n d e d , m e a s u r e d f o r m e m b r a n e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s , a n d t h e n t h e l i p i d s w e r e e x t r a c t e d f o r E S I a n a l y s i s u s i n g t h e m e t h o d s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 . 7 . 3 . 1 . 1 T r a d i t i o n a l T L C a n a l y s i s o f t h e l i p i d p r o fi l e s o f m e m b r a n e s f r o m e a c h m u t a n t B e f o r e a p p l y i n g t h e n e w m e t h o d s o f m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s , t r a d i t i o n a l T L C a n a l y s i s w a s a p p l i e d t o t h e a n a l y s i s o f m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e w i l d t y p e a n d 2 9 7 t h e s p e c i fi c l i p i d d e fi c i e n t m u t a n t s ( s e e C h a p t e r 3 f o r a d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f m e t h o d s ) . A l t h o u g h t h e y c a n o n l y s h o w t h e g e n e r a l t y p e s o f l i p i d s i n c l u d i n g G P G r o , G P E t n G P C h o , S Q D G a n d C L l i p i d a s a m i g r a t i o n b a n d , a n d d o n o t r e s o l v e C L w e l l , u s i n g t h e c o n d i t i o n s a p p l i e d h e r e , i t d o e s s h o w t h e g e n e r a l f e a t u r e t h a t t h e G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t s h o w s n o G P C h o , a n d t h e S Q D G - d e fi c i e n t m u t a n t s h o w s n o S Q D G b y t h e i o d i n e v a p o r s t a i n . H o w e v e r , t h e i d e n t i fi c a t i o n o f s p e c i fi c l i p i d m o l e c u l a r s p e c i e s , a n d t h e i r c h a n g e s i n t h e m u t a n t s a r e n o t a b l e t o b e p r o v i d e d b y T L C . 2 9 8 F i g u r e 7 . 5 T L C o f l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e i s o l a t e d m e m b r a n e s o f t h e w i l d t y p e a n d t h e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s o f R . s p h a e r o i d e s , c o n t a i n i n g 2 . 3 p g m e m b r a n e p r o t e i n s d e t e r m i n e d b y t h e B C A a s s a y . L a n e 1 , w i l d t y p e s t r a i n 2 . 4 . 1 + C c O ; l a n e s 2 a n d 3 , S Q D G - d e fi c i e n t s t r a i n s S B l K 1 + C c O a n d S B l K 2 + C c O , r e s p e c t i v e l y ; l a n e 4 , G P C h o - d e fi c i e n t s t r a i n C H B Z O + C c O g l a n e s 5 a n d 6 , C L - d e fi c i e n t s t r a i n s B C - m 2 + C c O a n d B C - m 3 + C c O ( a l s o c a l l e d C L 3 + C c O ) , r e s p e c t i v e l y . T h e s i l i c a g e l T L C p l a t e c o n t a i n i n g a c o n c e n t r a t i n g b a n d w a s t r e a t e d w i t h ( N H 4 ) 2 S O 4 , d e v e l o p e d b y u s i n g a c e t o n e : t o l u e n e : w a t e r ( 9 1 : 3 0 : 7 , v / v / v ) , a n d v i s u a l i z e d b y i o d i n e v a p o r s t r a i n . T h e s e c o n d i t i o n s a r e n o t a b l e t o r e s o l v e t h e C L l i p i d s . 2 9 9 5 9 . 6 I + . 0 : 0 1 0 E m a m u O D O m . _ O o . _ 0 n _ 0 a m m E o I 0 c o m m v 7 . 3 . 1 . 2 I d e n t i f i c a t i o n o f l i p i d s i n t h e w i l d t y p e m e m b r a n e u s i n g M S / M S a n d M S 3 T h e l i p i d e x t r a c t s w e r e t h e n a p p l i e d t o s y s t e m a t i c m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s . F i g u r e 7 . 6 s h o w s t h e M S s p e c t r a o f t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s o f t h e 2 . 4 . 1 w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s i n p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e E S I . A fi r s t g l a n c e s h o w s t h a t t h e l i p i d i o n s o b s e r v e d i n t h e p o s i t i v e i o n m o d e a r e v e r y d i f f e r e n t f r o m t h o s e i n t h e n e g a t i v e i o n m o d e . S i n c e t h e i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y o f l i p i d s d e p e n d h e a v i l y o n h e a d g r o u p s , t h e a p p a r e n t a b u n d a n c e o f t h e i o n s o b s e r v e d i n M S o fi e n d o e s n o t r e p r e s e n t t h e t r u e r e l a t i v e a m o u n t o f t h e l i p i d s i n s o l u t i o n w h e n c o m p a r i n g l i p i d s w i t h d i f f e r e n t h e a d g r o u p s . H o w e v e r , w i t h i n t h e s a m e l i p i d t y p e , s u c h a r o u g h q u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n c a n b e m a d e , u n l e s s t h e r e i s s e r i o u s o v e r l a p o f t h e l i p i d t y p e s a t t h e s a m e m / z v a l u e . 1 . 6 8 e 5 1 0 0 A 0 0 O O N - b O N O o — O o 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 7 7 3 1 4 0 0 1 6 0 0 1 8 0 0 L o \ 1 0 \ a s k R e l a t i v e A b u n d a n c e ( % ) 8 . O i l 7 4 7 4 8 0 7 1 4 7 1 7 7 9 3 1 9 8 2 8 4 3 1 1 8 6 2 6 0 6 3 9 k “ 7 2 7 { 7 5 6 l ) [ J [ I 4 0 “ r ‘ 2 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 3 0 0 8 5 0 9 0 0 9 3 0 1 4 5 6 d 1 4 2 9 a , M A 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 1 8 0 0 m / z F i g u r e 7 . 6 T h e E S I M S s p e c t r a o f t h e l i p i d e x t r a c t f r o m t h e c e l l m e m b r a n e s o f t h e w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s ( 2 . 4 . 1 + C c O ) i n ( A ) t h e p o s i t i v e , a n d ( B ) t h e n e g a t i v e i o n m o d e s . 3 0 1 O n l y t h o s e p e a k s t h a t h a d r e l a t i v e a b u n d a n c e s h i g h e r t h a n 1 % i n M S ( F i g u r e 7 . 6 ) w e r e f u r t h e r e x a m i n e d b y M S / M S a n d M S n . U s i n g b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e M S / M S a n d M S “ , t h e m o l e c u l a r s p e c i e s o f G P E t n , N - m e t h y l - G P E t n ( N - M e G P E t n ; M M P E ) , N , N - d i m e t h y l G P E t n ( N , N - M 6 2 G P E t n ; D M P E ) , G P C h o , G P G r o , S Q D G , C L a n d t w o s e r i e s o f l i p i d s t h a t w e r e d e t e r m i n e d t o b e o r n i t h i n e l i p i d s a n d g l u t a m i n e l i p i d s w e r e i d e n t i fi e d . T h e r e s u l t s r e v e a l t h a t t h e s e l i p i d s i n c l u d e a w i d e s p e c t r u m o f f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n s . T h e s p e c i fi c s p e c i e s i d e n t i fi e d b y M S / M S a n d M S n f o r t h e o b s e r v e d p r e c u r s o r i o n s i n M S a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 7 . 1 f o r t h e p o s i t i v e i o n m o d e , a n d i n T a b l e 7 . 2 f o r t h e n e g a t i v e i o n m o d e . T h e c o m b i n e d i d e n t i fi c a t i o n r e s u l t s f r o m b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 7 . 3 . 3 0 2 . s e d i o L r Q e a h p 1 : s 9 . R “ e p y t d l i w e h t f o s t c a 1 / 1 : 0 2 H O - 3 L O a N + 1 : 8 1 / 0 : 1 : r 6 t x e e n a r b m e m e h t f o n t S E M P G 4 3 1 o o h h C C P P G G 1 1 : : 8 8 1 1 / / 2 2 1 1 1 0 : : : : : : 4 5 4 5 8 8 3 3 3 3 1 1 n n n n n n t t t t t t E E E E E E P P P P P P G G G G G G e 2 2 2 2 2 2 Z d o 0 M - m N 6 6 6 8 9 e M M M M M M - - - - - - N N N N N N n o i e v i t i s o p n i s , , , . , , , N N N N N N N a N + ? 1 1 1 1 : : : : 8 8 8 9 1 1 1 1 / / / 2 1 0 1 / : : : : 1 5 : 8 8 8 3 1 1 1 8 1 n n n n n n n o i d i p i l t E t t t t t E E E E E P P P P P P G G G G G G e e e e e e M M M M M M e - - - - - - h t f o n o i N N N N N N a N + ? 1 t 0 1 1 1 1 1 1 1 1 z a : : : : : : : : c fi i 6 8 8 8 8 9 8 6 : 8 K 1 1 1 1 1 1 1 1 + 8 1 / / / / / / / / 1 / 1 1 0 1 2 1 0 1 1 / 0 2 3 3 t : : : : : : : 1 : : : : : : n e d 8 5 6 6 8 8 8 8 8 5 8 9 8 : 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 3 3 3 9 1 I n n n n n n n n n n n n n n n t t t t t t t t t t t t t t t 1 E E E E E E E E E E E E E E E . P P P P P P P P P P P P P P P 7 G G G G G G G G G G G G G G G e l b 1 l 9 9 0 0 0 1 1 1 3 1 3 4 4 5 6 6 7 7 7 8 8 8 : 3 3 5 7 6 8 9 0 4 6 8 0 6 0 2 4 0 2 4 a T m 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 3 0 3 G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 : 1 + N a G P E t n 3 9 : 4 G P E t n 1 8 z 1 / 1 8 z 1 + K G P E t n 1 8 : 0 / 1 8 : 1 + K G P C h o G P C h o 2 8 : 2 + N a ? G P C h o 3 2 : 2 G P C h o 3 3 : 2 G P C h o 3 3 : 1 G P C h o ? + N a / K G P C h o 3 4 : 2 G P C h o 3 5 : 2 G P C h o 3 5 : 1 G P C h o 3 4 : 2 + N a C L C L 3 - O H 1 8 : 1 / 1 9 : 1 0 L 3 - 0 H 1 8 : 0 / 1 9 : 1 0 L 3 — O H 1 8 : 1 / 2 0 : 2 0 L 3 - O H 1 8 : 0 / 2 0 : 3 0 L 3 - O H 1 8 : 0 / 2 0 : 2 0 L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 0 L 3 - O H 2 0 : 0 / 1 8 : 1 O L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 0 0 L 3 - O H 2 0 : 1 / 2 0 : 2 O L 3 - O H 2 0 : 0 / 2 0 : 3 Q L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 a a K N N + + + ) 1 2 1 0 1 ? 2 8 K : : 8 1 8 9 1 / 1 1 / / 2 / / a 0 N 0 0 : 2 : : c 0 + 8 8 6 t 2 1 1 1 e ? ( ? o o o o o o o h h h h h h h C C C C C C C P P P P P P P G G G G G G G K K + 1 : 8 1 / 0 : 8 1 + 1 : 8 1 / 1 : 8 1 2 4 3 2 : : : : 7 8 8 8 3 3 3 3 n n n n n t t t t t n t E E E E E P P P P E P P G G G G G G 2 2 2 2 2 2 9 6 6 8 6 6 . M M M M M M 3 - - - - - - N N N N N N , , , . , , N N N N N N . 7 d n a a N 2 K + . + 7 ? / 1 , : 1 8 K K 1 + + / K / a 1 1 0 N : : : + 8 6 6 . 7 s e 1 l 3 ? 3 n n n n t t t t E E E E P P P P G G G G e e e e M M M M - - - - N N N N ? a K a + N N N N K K + + + + + + ? ? ? a a 1 1 1 2 / / a z 2 : : ) d e b a T r o f , O c C + 1 . 4 . 2 n N 8 9 8 2 K K K K i u 2 + 1 1 1 + + / n ] / / / 4 : 2 1 1 1 1 0 + ? 3 3 a N i t n : : s : : : : : : 8 6 6 8 8 7 1 K + 0 7 3 2 4 3 3 ? ? 3 + 1 1 1 o 0 c : n n n n n n n n n n n 1 . 7 e l b a T ( t t t t t t t t t t t 6 E E E 3 E E E E E E E E P P P P P P P P P P P r G G G G G G G G G G G o 6 2 6 8 0 8 8 9 9 9 0 0 7 7 7 7 8 8 = e p y t d l i W * a r t 3 0 4 8 1 0 8 1 2 8 7 9 G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 G P C h o 3 4 : 2 + K G P C h o 3 6 : 3 + N a G P C h o 3 4 : 1 + K G P C h o 1 8 : 1 / 1 9 : 1 G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 0 + K G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + N a T a b l e 7 . 2 I d e n t i fi c a t i o n o f t h e l i p i d i o n s i n n e g a t i v e i o n m o d e M S o f t h e m e m b r a n e e x t r a c t s o f t h e w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s . 6 8 9 7 1 4 7 1 6 7 1 7 7 1 9 7 4 2 7 4 4 7 4 5 7 4 7 7 5 6 7 7 0 7 7 3 7 7 5 7 8 7 7 9 3 8 0 0 8 0 2 8 1 8 8 1 9 8 2 0 8 2 1 8 3 1 8 4 5 8 4 7 8 6 0 8 7 3 G P E t n N - M e G P E t n N , N - M 6 2 G P E t n G P C h o G P E t n 1 8 : 1 / 1 6 : 1 G P E t n 1 6 : 1 / 1 8 : 1 G P E t n 1 8 : 1 / 1 6 : 0 G P E t n 1 6 : 0 / 1 8 : 1 G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 G P E t n 1 8 : 0 ! 1 8 2 1 N , N - M e 2 G P E t n 1 6 : 0 / 1 8 : 1 G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 0 N . N - M 6 2 G P E t n 1 8 : 1 / 1 6 : 0 G P E t n 1 9 : 1 / 1 8 : 1 N - M e G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 : 1 G P E t n 1 8 : 1 / 2 0 : 1 N - M e G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 : 1 N . N - M e 2 G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 G P E t n 2 0 : 1 / 1 8 : 1 N - M e G P E t n 1 9 : 1 / 1 8 : 1 G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + C l G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + N a C l G P E t n 1 8 : 0 / 1 8 : 1 + N a C I G P C h o 1 8 : 0 / 1 6 : 1 + A c G P C h o 1 6 : 1 / 1 8 : 0 + A c G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + C l G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 2 1 + K C I N . N - M e 2 G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + G P E t n 1 9 : 1 / 1 8 : 1 + K C I f o r m a t e G P C h o 1 8 : 1 / 1 9 : 1 + C l G P C h O 1 9 z 1 / 1 8 : 1 + C I G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + m . c . 3 0 5 ( T a b l e 7 . 2 c o n t i n u e d ) m / z 6 8 9 7 1 4 7 1 6 7 1 7 7 1 9 7 4 2 7 4 4 7 4 5 7 4 7 7 5 6 7 7 0 7 7 3 7 7 5 7 8 7 7 9 3 8 0 0 8 0 2 8 1 8 8 1 9 8 2 0 8 2 1 8 3 1 8 3 4 8 4 5 8 4 7 8 7 3 G P G r o G P G r o 1 6 : 1 / 1 8 : 1 G P G r o 1 8 : 1 / 1 6 : 1 G P G r o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 G P G r o 1 8 : 1 / 1 6 : 0 G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 G P G r o 1 8 : 0 / 1 8 : 1 G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 0 G P G r o 1 9 : 1 / 1 8 : 1 G P G r o 1 8 : 1 / 1 9 : 1 G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 1 1 + N a C I G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + K C I S Q D G S Q D G 1 6 : 0 / 1 6 : 0 O L 3 - O H 2 0 : 1 / 2 5 : 5 ? S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 S Q D G 1 8 : 1 / 1 6 : 0 S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 0 S Q D G 1 8 1 0 / 1 6 2 0 S Q D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 S Q D G 1 8 : 1 / 1 8 : 0 S Q D G 1 8 : 0 / 1 8 : 1 S Q D G 1 9 : 1 / 1 8 : 1 S Q D G 1 8 : 1 / 1 9 : 1 S Q D G 1 8 : 1 / 2 0 : 1 S Q D G 2 0 : 1 / 1 8 : 1 O L O L 3 - O H 1 8 : 1 / 1 9 : 1 O L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 9 : 1 0 L 3 - O H 2 0 : 0 / 1 9 : 1 O L 3 - O H 2 0 2 1 / 2 1 1 1 0 L 3 - O H 2 0 2 0 / 2 1 : 1 0 L 3 - O H 2 0 : 1 / 2 4 : 1 3 0 6 C L C L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 Q L 3 - O H 2 0 : 0 / 1 8 : 1 T h e m a j o r l i p i d t y p e s d e t e c t e d a n d i d e n t i fi e d i n t h e p o s i t i v e i o n m o d e b e t w e e n m / z 6 0 0 a n d 9 5 0 ( T a b l e 7 . 1 ) a r e G P E t n , M M P E , D M P E , G P C h o , 0 L a n d Q L . B o t h o f t h e t w o f a t t y a c i d c o m p o n e n t s i n O L a n d Q L l i p i d s c o u l d b e u n e q u i v o c a l l y a s s i g n e d w i t h t h e M S / M S , M 8 3 a n d M S 4 d a t a . E x t e n s i v e N a ‘ L / K + a d d u c t i o n s o f G P E t n a n d G P C h o w e r e a l s o f o r m e d , b u t t h e N a J r / K + a d d u c t s o f O L w e r e p r o b a b l y f o r m e d a s w e l l . T h e N a J r / K J r a d d u c t s a s s i s t e d w i t h fi r r t h e r a s s i g n m e n t o f t h e i n d i v i d u a l f a t t y a c i d c o m p o n e n t s i n G P C h o a n d G P E t n . T h e m a j o r l i p i d t y p e s d e t e c t e d a n d i d e n t i fi e d i n t h e n e g a t i v e i o n m o d e b e t w e e n m / z 6 0 0 a n d 9 5 0 ( T a b l e 7 . 2 ) a r e G P G r o , G P E t n , M M P E , D M P E , G P C h o ( i n t h e f o r m s o f v a r i o u s a n i o n i c a d d u c t s ) , S Q D G , C L , C L a n d Q L . B o t h o f t h e f a t t y a c i d c o m p o n e n t s o f t h e s e l i p i d s w e r e i d e n t i fi e d , b u t t h e p o s i t i o n a s s i g n m e n t b a s e d o n c o m p a r i s o n t o t h e r e l a t i v e s n - I / s n - Z r a t i o s o f t h e s y n t h e s i z e d l i p i d s t a n d a r d s s h o w e d t h a t t h e r e w a s o f t e n a m i x t u r e o f a s n - I / s n - Z c o m b i n a t i o n , a l t h o u g h o n e o f t h e m o f t e n d o m i n a t e d . T h e e x c e p t i o n i s t h e S Q D G s p e c i e s f o r w h i c h t h e s t a n d a r d s n - I / s n - Z r a t i o i s n o t a v a i l a b l e . B u t t h e t w o f a t t y a c i d s i n O L a n d Q L l i p i d s c o u l d b e u n e q u i v o c a l l y a s s i g n e d b a s e d o n t h e M S / M S , M S 3 a n d M S 4 s p e c t r a b e c a u s e o f t h e t a n d e m c o n n e c t i o n o f t h e i r t w o f a t t y a c i d c h a i n s , c o n s i s t e n t w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g s p e c t r a i n p o s i t i v e i o n m o d e . 3 0 7 . * * s e d i o r 1 0 : : 8 6 1 1 / / 0 1 0 : 8 1 / e 1 2 2 2 2 0 a : : : : : : : : h p s . 8 2 3 4 3 2 3 3 3 3 6 8 6 1 1 1 o o o o o o o o o R h h h h h h h h h e p y t d l i w e C C C C C C C C C P P P P P P P P P G G G G G G G G G 1 0 : h : t f o 8 6 1 1 / / 2 0 1 s : : t c a r : 4 3 6 8 1 1 t n n n n x e t t t t E E E E e P P P P n a r b m e m e G G G G z 2 Z z e e e e M M M M - - - - N N N N . . . . h N N N N t n i d e fi i t n e d i s e i n c e t p E s P d G i p i e l M e - N h t f o y 1 1 1 0 r a m m u S 3 2 2 : : 6 8 8 6 1 1 1 1 / / / / 1 1 0 1 : : : : 8 6 8 6 1 1 1 1 . n n n n n 7 t t t t t e E E E E E l P P P P P b a T G G G G G 3 0 8 G P E t n 3 5 : 2 N - M e G P E t n 3 5 : 2 N . N - M e 2 G P E t n 3 5 : 2 G P C h o 3 5 : 2 N . N - M e 2 G P E t n 3 5 : 1 G P C h o 3 5 : 1 G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 N - M e G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 N . N - M e Z G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 G P E t n 1 8 2 0 / 1 8 2 1 N - M e G P E t n 1 8 : 0 / 1 8 : 1 N . N - M e 2 G P E t n 1 8 : 0 / 1 8 2 1 G P C h o 1 8 2 0 / 1 8 : 1 G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 0 G P E t n 1 9 2 1 / 1 8 : 1 N - M e G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 : 1 N . N - M e 2 G P E t n 3 7 : 2 G P C h o 1 8 : 1 / 1 9 : 1 G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 : 1 N - M e G P E t n 1 9 : 1 / 1 8 2 1 G P C h o 1 9 : 1 1 1 8 z 1 G P E t n 3 7 : 1 G P E t n 1 8 : 1 / 2 0 : 1 N . N - M e 2 G P E t n 3 8 : 2 G P E t n 2 0 2 1 / 1 8 2 1 G P E t n 2 0 : 2 / 1 8 : 1 N . N - M e 2 G P E t n 3 8 : 3 G P C h o 2 0 2 / 1 8 : 1 G P E t n 3 8 : 4 N . N - M e 2 G P E t n 3 8 : 4 G P E t n 4 1 : 3 ? 1 2 8 1 1 : 8 1 / / 1 0 : : 0 0 2 2 H H O O - - 3 3 L L L Q Q Q 1 2 3 1 2 2 2 : 1 2 9 0 0 1 1 1 / 1 : 2 2 2 2 / / / / 1 0 1 0 : : : : 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 H H H H H O O O O O - - - - - 3 3 3 3 3 L L L L L O O O 0 O 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 : : : 2 2 : : 2 2 : : 2 6 6 8 6 8 8 8 8 8 9 0 8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 / / / / / / / / / / / 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 / 1 : : : 2 : : : 2 : : : : 6 6 8 6 8 8 8 8 9 8 8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 2 G G G G G G G G G G G G D D D D D D D D D D D D Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q S S S S S S S S S S S S 0 2 6 1 / 3 4 ) ) 1 : 8 1 2 8 1 1 ( ( L L L C C C 3 0 9 ( T a b l e 7 . 3 c o n t i n u e d ) G P G r o G P G r o 1 6 2 1 / 1 8 2 1 G P G r o 1 8 2 1 / 1 6 2 1 G P G r o 1 6 : 0 / 1 8 : 1 G P G r o 1 8 : 1 / 1 6 : 0 G P G r o 1 8 2 1 / 1 8 2 1 G P G r o 1 8 2 0 / 1 8 2 1 G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 0 G P G r o 1 9 2 1 l 1 8 2 1 G P G r o 1 8 : 1 / 1 9 : 1 S Q D G C L C L 3 - O H 1 8 2 1 / 1 9 2 1 O L 3 - O H 1 8 2 0 / 1 9 2 1 O L 3 - O H 1 8 : 1 / 2 0 : 2 O L 3 - O H 1 8 2 0 / 2 0 2 3 O L 3 - O H 1 8 : 0 / 2 0 : 2 O L 3 - O H 2 0 2 1 / 1 8 2 1 O L 3 - O H 2 0 2 0 / 1 8 2 1 O L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 2 0 O L 3 - O H 2 0 : 0 / 1 9 2 1 * * L i p i d s s h o w n i n b o l d w e r e i d e n t i fi e d b y u s i n g b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s . C o m b i n i n g t h e e x p e r i m e n t s u s i n g b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s , t h e i d e n t i fi e d m o l e c u l a r s p e c i e s o f l i p i d s d e t e c t a b l e i n t h e w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) R . s p h a e r o i d e s m e m b r a n e s , t h a t w e r e a b o v e 1 % r e l a t i v e a b u n d a n c e i n M S , a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 7 . 3 . I n c l u d e d w e r e a s e r i e s o f p h o s p h o l i p i d s G P E t n , M M P E , D M P E , G P C h o , G P G r o a n d C L , a n d n o n - p h o s p h o l i p i d s S Q D G , C L a n d Q L . N o s p e c i e s o f p h o s p h a t i d y l s e r i n e ( G P S e r ) , p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( G P I n s ) , o r s p h i n g o m y e l i n ( S M ) w e r e d e t e c t e d a b o v e 1 % n o r m a l i z e d r e l a t i v e a b u n d a n c e i n M S . T h e s e r e s o l v e d s p e c i fi c m o l e c u l a r s p e c i e s s h o w t h a t t h e h y d r o p h o b i c c h a i n s i d e n t i fi e d i n t h e g l y c e r i d e l i p i d s a r e m a i n l y a c y l f a t t y a c i d s w i t h o n e o r z e r o u n s a t u r a t i o n ( r i n g o r d o u b l e b o n d ) , s u c h a s 1 6 2 1 , 1 6 : 0 , 1 8 : 1 , 1 8 : 0 a n d 2 0 2 1 . O d d c a r b o n - n u m b e r f a t t y a c i d 1 9 : 1 a n d 2 1 2 1 , p r o b a b l y c o n t a i n i n g t h e c y c l i c p r o p a n y l f u n c t i o n a l g r o u p s ( c y c ) , w e r e a l s o f o u n d t o b e p r e s e n t i n m o s t o f t h e s e s p e c i e s , e x c e p t f o r C L , l i k e l y d u e t o i t s l o w a b u n d a n c e . S p e c i e s c o n t a i n i n g t w o 1 8 2 1 f a t t y a c i d c h a i n s w e r e t h e p r e d o m i n a n t s p e c i e s f o r a l l o f t h e p h o s p h o l i p i d s . S Q D G c o n t a i n i n g 1 6 2 0 / 1 8 2 1 , 1 6 2 0 / 1 8 2 0 a n d 1 8 2 1 / 1 8 2 0 w e r e f o u n d t o b e c l o s e t o S Q D G 1 8 2 1 / 1 8 : 1 i n a b u n d a n c e . I n O L a n d Q L , t h e t w o f a t t y a c i d s a r e n o t a t t a c h e d t o t h e g l y c e r o l b a c k b o n e b u t a r e l i n k e d v i a a n e s t e r b o n d f o r m e d b e t w e e n t h e 3 - O H p o s i t i o n o f t h e fi r s t f a t t y a c i d a n d t h e c a r b o x y l g r o u p o f t h e s e c o n d f a t t y a c i d . I n t h e s e l i p i d s , t h e fi r s t f a t t y a c i d s w e r e f o u n d t o b e m a i n l y 3 - O H 1 8 : 1 , 3 - O H 1 8 : 0 , 3 — O H 2 0 : 1 a n d 3 - O H 2 0 : 0 , a n d t h e s e c o n d f a t t y a c i d s w e r e n o t o n l y 1 8 2 1 , 1 8 2 0 , c y c l 9 2 1 , a n d c y c 2 1 2 1 , b u t a l s o 2 0 2 2 a n d p o s s i b l y 2 0 : 3 . T h e O L c o n t a i n i n g 3 - O H 2 0 : 1 a n d 2 0 : 2 f a t t y a c i d s w a s t h e m o s t a b u n d a n t O L s p e c i e s , a n d t h e Q L c o n t a i n i n g 3 - O H 2 0 : 1 a n d 1 8 : ] w a s t h e m o s t a b u n d a n t s p e c i e s a m o n g t h i s t y p e . 3 1 0 A l l o f t h e f a t t y a c i d c o m b i n a t i o n s o f M M P E a n d D M P E w e r e a l s o f o u n d i n G P E t n a n d G P C h o , c o n fi r m i n g t h e p r e v i o u s fi n d i n g t h a t b o t h M M P E a n d D M P E a r e t h e i n t e r m e d i a t e s i n t h e b i o s y n t h e s i s o f G P C h o f r o m G P E t n b y t h e e n z y m e m e t h y l t r a n s f e r a s e i n R . s p h a e r o i d e s [ 9 0 ] , a n d t h a t t h e s e i n t e r m e d i a t e s r e m a i n i n s e r t e d i n t h e m e m b r a n e w h i l e t h e m e t h y l t r a n s f e r a s e m a k e s t h e s e q u e n t i a l m e t h y l a t i o n m o d i fi c a t i o n o n t h e h e a d g r o u p [ 9 0 ] . 7 . 3 . 1 . 3 I o n o v e r l a p p i n g i n M S i l l u s t r a t e d b y M M P E a n d D M P E A l t h o u g h M M P E a n d D M P E a r e c o m m o n i n t e r m e d i a t e s i n t h e b i o l o g i c a l s y n t h e s i s o f G P C h o f r o m G P E t n , t h e m o s t a b u n d a n t p h o s p h o l i p i d c o m p o n e n t s , t h e i d e n t i fi c a t i o n o f M M P E a n d D M P E h a s n o t b e e n l a r g e l y d e s c r i b e d p r e v i o u s l y b y m a s s s p e c t r o m e t r y m e t h o d s . T h e r e a s o n i s p r o b a b l y t h a t t h e i r p r e c u r s o r i o n s o fi e n s i t a t a n r n / z t h a t c o n t a i n s a n o v e r w h e l m i n g n u m b e r o f o v e r l a p p i n g i o n s . T h e 1 4 D a s h i f t i n t h e a d d i t i o n o f o n e N - m e t h y l g r o u p , c a n a l s o c o r r e s p o n d t o t h e a d d i t i o n o f o n e m o r e c a r b o n i n t h e f a t t y a c i d c h a i n i n t h e G P E t n l i p i d s , o r o n e l e s s c a r b o n i n t h e G P C h o l i p i d s . A t h i r d r e a s o n i s t h a t t h e y d o n o t h a v e v e r y d i s t i n c t i v e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s , b u t a r e m o r e o r l e s s s i m i l a r t o G P E t n . H o w e v e r , t h e s u b t l e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e i r f r a g m e n t i o n s a n d t h o s e o f t h e G P E t n i n M S / M S a n d M S 3 e n a b l e d t h e u n e q u i v o c a l i d e n t i fi c a t i o n o f t h e M M P E a n d D M P E l i p i d s a m o n g a l l k i n d s o f o v e r l a p p i n g s p e c i e s . F i g u r e 7 . 7 d e m o n s t r a t e s t h a t t h e p r e c u r s o r i o n a t m / z 7 5 8 i n p o s i t i v e i o n m o d e M S c o n t a i n s N - M e G P E t n 1 8 2 1 / 1 8 : 1 , i n a d d i t i o n t o G P C h o 3 4 : 2 , G P E t n 1 8 2 1 / 1 9 2 1 . W h i l e G P E t n f r a g m e n t s b y l o s i n g t h e h e a d g r o u p a s a n e u t r a l l o s s o f 1 4 1 D a , t h e N - M e G P E t n l o s e s t h e h e a d g r o u p a s a n e u t r a l l o s s o f 1 5 5 D a . 3 1 1 G P C h o 3 4 : 2 G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 : 1 N - M e G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 1 . 0 2 e 3 1 0 0 - 1 8 4 [ G P C h o h . g . ) + ; 7 5 8 A “ ) M S / M S 8 0 % - M e G P E t n h . g . ( 1 5 5 ) ' G P E m h - g - ( ‘ 4 ‘ ) 6 0 : 6 0 3 , 6 ” . = ( 1 8 4 + 9 7 ) _ y — ( C H 2 = C H N H 2 ) 4 0 j 2 8 1 M e z G P E t n h . g . ( 1 5 6 3 : ) 7 1 5 7 5 8 A 2 ° y " - ‘ a v “ . . - i 8 8 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 a ) - 3 3 8 3 o 1 . 8 9 e 1 + g 1 0 0 — - 3 5 2 2 7 9 7 5 § G P E t n h . g . ( 1 4 1 ) B ( ) M S g 8 0 : 2 6 5 — 1 9 : 1 R C O O H 6 1 7 . 1 : 6 0 - 3 2 1 . : - g l y c e r o l : 5 4 0 ; i " 5 4 3 . 5 . 2 0 6 1 7 7 ‘ : i A h i 4 . l L . I n . 1 “ | r A 1 . . l . 1 I ' a d 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 - 3 3 8 — 1 8 : 1 R C O O H 7 5 3 3 { 0 1 0 1 - 8 1 2 6 5 3 2 1 2 6 0 3 M e G P E t n h - g - ( 1 5 5 ) C ( ' 0 M S : 3 : - 3 5 6 - g l y c e r o l 2 2 4 7 5 2 9 6 0 3 4 0 ; 2 0 l I I I l I i . r r : l 1 1 1 - ' . ' l l 1 . r . 2 0 0 3 0 0 4 0 0 m / 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 Z F i g u r e 7 . 7 P o s i t i v e i o n m o d e E S I M S / M S a n d M S 3 s p e c t r a o f m / z 7 5 8 i n t h e M S o f l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e c e l l m e m b r a n e s o f t h e w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s r e v e a l t h a t t h i s i s o t o p i c a l l y i s o l a t e d p r e c u r s o r i o n c o n t a i n s m u l t i p l e s p e c i e s , i n c l u d i n g t h e m a j o r c o m p o n e n t s o f G P C h o 3 4 : 2 , G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 : 1 a n d N - M e G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 : A ) M S / M S o f m / z 7 5 8 f r o m F i g u r e 7 . 6 A , B ) M 8 3 o f m / z 6 1 7 f r o m p a n e l A , a n d C ) M s 3 o f m / z 6 0 3 f r o m p a n e l A . 3 1 2 l 2 0 0 l 0 3 0 4 0 0 7 8 2 0 — 3 ( C H Z = C H N H C H 3 ) ( 5 7 I 0 0 7 P I 0 4 — 6 H 3 2 5 5 ) l 0 — 0 H 2 P 0 4 6 N | 6 0 0 a 3 0 2 1 0 . 8 6 4 0 9 0 0 8 0 0 0 0 1 0 3 9 0 0 + ( C ) M S G P C h o 3 4 : 2 + N a G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 2 1 + N a N - M e G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 2 1 + N a — ( C H 2 = C H N H C H 3 ) - C H 2 C H 2 P O 4 H _ ( C H 3 ) 3 N 7 2 3 4 . 6 8 e 1 7 8 0 5 6 7 2 1 — ( C H 2 = C H N H 2 ) 1 0 0 g - G P E t n h . g . / 7 3 7 8 0 6 3 9 — H O 6 0 ‘ G P C h O h . g . 2 4 0 — 1 8 . 1 R C O O H 5 9 7 7 / 6 2 A ( + ) M S / M S 4 9 8 . 0 E 0 . . . 2 0 0 3 0 0 4 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 1 0 0 — ( C H 3 ) 3 N ( 5 9 ) 5 9 7 ( ) 8 0 7 2 1 6 0 4 0 — C H Z C H 2 P 0 4 N a 5 7 5 R e l a t i v e A b u n d a n c e ( % ) N O L r . 1 0 . 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 3 . 3 3 ’ H 3 P 0 4 1 0 0 7 8 9 ( C H 2 = C H N H 2 ) ( 4 3 ) 6 3 9 D ( ’ 9 M 3 3 8 0 7 7 — H P O N 2 4 a 6 0 6 1 7 4 0 — 1 8 : 1 R Z ' C H = C = O 2 0 4 7 3 I . I l a : ‘ 1 l l . 7 1 I u A 7 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 m / 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 Z F i g u r e 7 . 8 E S I M S / M S ( A ) , a n d M S 3 s p e c t r a o f r r r / z 7 8 0 f r o m F i g u r e 7 . 6 A ) r e v e a l i n g t h e o v e r l a p p i n g o f s o d i u m a d d u c t i o n s o f G P C h o 3 4 : 2 ( B ) , N - M e G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 ( C ) , a n d G P E t n 1 8 2 1 / 1 9 2 1 ( D ) . 3 1 3 T h e p r e c u r s o r i o n a t m / z 7 8 0 i n t h e p o s i t i v e i o n m o d e M S ( F i g u r e 7 . 8 ) i s 2 2 D a h i g h e r t h a n m / z 7 5 6 , a n d m i g h t c o r r e s p o n d t o t h e s o d i u m a d d u c t i o n . T h e E S I M S / M S a n d M S n s p e c t r a ( F i g u r e 7 . 8 ) o f m / z 7 8 0 i n t h e l i p i d e x t r a c t f r o m t h e c e l l m e m b r a n e s o f t h e w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s r e v e a l t h a t t h i s i s o t o p i c a l l y i s o l a t e d p r e c u r s o r i o n a g a i n c o n t a i n s a m i x t u r e o f G P C h o 3 4 : 2 , G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 : 1 a n d N - M e G P E t n 1 8 2 1 / 1 8 2 1 i n t h e s o d i u m a d d u c t f o r m . I n t h e M S / M S o f t h e s o d i u m a d d u c t i o n s , w h i l e G P C h o l o s e s t h e h e a d g r o u p a s a n e u t r a l l o s s o f 5 9 D a a n d G P E t n l o s e s 4 3 D a , t h e N - M e G P E t n l i p i d l o s e s t h e h e a d g r o u p a s a 5 7 D a n e u t r a l l o s s . I n M S 3 , t h e m / z d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o p r e d o m i n a n t p r o d u c t i o n s a r e 2 2 D a i n e a c h c a s e ( F i g u r e s 7 . 8 B - D ) c o r r e s p o n d i n g t o t h e m a s s o f ( s o d i u m - h y d r o g e n ) , f u r t h e r c o n fi r m i n g t h a t t h e p r e c u r s o r s i o n a r e a l l s o d i u m a d d u c t i o n s . T h e n e g a t i v e i o n m o d e d e p r o t o n a t e d i o n c o r r e s p o n d i n g t o m / z 7 5 8 , i s m / z 7 5 6 . T h e m / z 7 5 6 p r e c u r s o r i o n w a s f r a g m e n t e d ( F i g u r e 7 . 9 ) a n d w a s f o u n d t o c o n t a i n t h e d e p r o t o n a t e d i o n s o f t h e G P E t n 1 8 2 1 / 1 9 : 1 a n d N - M e G P E t n 1 8 2 1 / 1 8 : 1 l i p i d s , b u t n o t G P C h o , w h i c h i s n o t e x p e c t e d t o b e o b s e r v e d a s a d e p r o t o n a t e d i o n . L i k e w i s e , t h e o t h e r N - M e G P E t n a n d N , N - M e 2 G P E t n s p e c i e s s h o w n i n T a b l e s 7 . 1 - 7 . 3 a r e i d e n t i fi e d b y u s i n g M S / M S a n d M S “ . 3 1 4 G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 : 1 N - M e G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 8 6 3 2 1 8 : 1 R C O O _ - e 2 8 1 _ 1 0 0 1 9 1 R C 0 0 ‘ g 7 5 6 A ( ) M S / M s 8 0 2 6 5 ~ 1 8 : 1 R C O O H ‘ 1 9 3 1 R ' C H = C = 0 6 0 4 7 , 4 — 1 g ; 1 R v C H : C : O “ ( C H 2 = C H N H C H 3 ) 4 0 2 5 3 ~ 1 9 2 1 R C O O H 4 9 2 6 9 9 2 0 4 6 0 ; ‘ - . , » i 7 5 6 A 1 ‘ a * 1 l v ’ v 2 ‘ : 3 0 0 4 0 0 _ 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 8 5 . 0 2 e 1 £ 5 1 R C O O 7 5 6 B ( - ) M 8 3 5 1 0 0 — — 1 8 : 1 R ' C H = C = O . g 1 8 2 1 R C O O 4 9 2 = 8 0 2 8 1 3 6 0 < 1 4 0 2 1 , 0 2 1 4 - 6 1 “ 5 ‘ 1 9 6 _ , . - ‘ 2 2 8 4 3 1 - ~ 2 0 , , E 7 . 7 ? ! a 5 3 2 6 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 5 . 3 9 . 2 1 $ 2 1 1 R C O O 7 5 6 C ( _ ) M 5 3 1 0 0 — 1 9 : 1 R ’ C H = C = O 8 0 4 7 8 6 0 2 1 4 _ 6 1 4 0 1 9 6 2 5 3 4 1 7 2 0 2 1 2 * v ‘ 2 ‘ 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 m / z F i g u r e 7 . 9 E S I M S / M S ( A ) , a n d M S 3 s p e c t r a o f m / z 7 5 6 f r o m F i g u r e 7 . 6 B ) i n t h e n e g a t i v e i o n m o d e , r e v e a l i n g t h e o v e r l a p p i n g o f t h e d e p r o t o n a t e d i o n s o f N - M e G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 ( B ) , a n d G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 : 1 ( C ) . T h e s i t u a t i o n o f o v e r l a p r e v e a l e d h e r e r a i s e d a n a l a r m a g a i n s t q u a n t i fi c a t i o n b y u s i n g M S p e a k a b u n d a n c e o r a r e a , e v e n i f a n i n t e r n a l s t a n d a r d i s i n c l u d e d . I t c a n b e c l e a r l y s e e n t h a t m o s t p e a k s i n M S a c t u a l l y c o n t a i n o v e r l a p p i n g m u l t i p l e s p e c i e s , i n c l u d i n g b o t h t h e p r o t o n a t e d a n d d e p r o t o n a t e d i o n s a n d a d d u c t i o n s . H o w e v e r , q u a n t i fi c a t i o n b y M S p e a k i n t e n s i t y o r p e a k a r e a i s n o t a b l e t o t a k e t h i s i n t o 3 1 5 c o n s i d e r a t i o n . T h e r e f o r e , b e f o r e a n y q u a n t i fi c a t i o n u s i n g M S , e s p e c i a l l y w h e n d e a l i n g w i t h l i p i d e x t r a c t s f r o m b i o l o g i c a l s a m p l e s , t h e i d e n t i t y o f t h e p r e c u r s o r i o n s h o u l d b e e x a m i n e d a t fi r s t f o r o v e r l a p s , a n d o n l y t h o s e i o n s t h a t a r e f o u n d t o b e d o m i n a t e d b y o n e s p e c i e s c a n b e q u a n t i fi e d b y M S u s i n g i n t e r n a l s t a n d a r d t o y i e l d c o n v i n c i n g r e s u l t s . T h e s e r e s u l t s a l s o s u g g e s t t h a t M S / M S q u a n t i fi c a t i o n b y u s i n g t h e c h a r a c t e r i s t i c f r a g m e n t a t i o n s i n M S / M S i n a q u a d r u p o l e i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r i s s o m e t i m e s n e c e s s a r y i n o r d e r t o a c h i e v e a c c u r a t e l i p i d q u a n t i fi c a t i o n f r o m t h e c o m p l e x b i o l o g i c a l l i p i d e x t r a c t s , w h i c h i s a p p l i e d e x t e n s i v e l y i n C h a p t e r 1 0 . T h e r e f o r e , i n t h i s c h a p t e r , o n l y t h o s e M S p e a k s t h a t h a v e b e e n d e t e r m i n e d t o b e p r e d o m i n a n t l y o n e s p e c i e s b y u s i n g M S / M S a r e s h o w n f o r q u a n t i fi c a t i o n . O n l y t h e G P E t n , G P C h o , G P G r o a n d C L p h o p h o l i p i d s c o m p o n e n t s , f o r w h i c h i n t e r n a l s t a n d a r d s w i t h t h e s a m e h e a d g r o u p a r e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e , a r e s h o w n f o r a b s o l u t e q u a n t i fi c a t i o n . S i n c e S Q D G d o e s n o t h a v e a n i n t e r n a l s t a n d a r d t h a t i s c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e , i t w a s r e l a t i v e l y q u a n t i fi e d b e t w e e n t h e s t r a i n s b y c o m p a r i s o n t o t h e G P G r o 1 4 2 0 / 1 4 : 0 i n t e r n a l s t a n d a r d . T h e M S / M S q u a n t i fi c a t i o n w a s o n l y a p p l i e d t o t h e C L l i p i d s i n t h e w i l d t y p e 2 . 4 . 1 + C c 0 a n d t h e C L - d e fi c i e n t C L 3 + C c O s t r a i n s f o r t h e l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e m e m b r a n e s a n d f r o m t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e s i n t h i s c h a p t e r . 3 1 6 7 . 3 . 1 . 4 C h a n g e s i n t h e l i p i d s p e c i e s i n t h e m u t a n t s I n t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s , o t h e r t h a n t h o s e l i p i d s t h a t a r e g e n e t i c a l l y d e fi c i e n t , m o s t o f t h e o t h e r l i p i d s s e e n i n t h e w i l d t y p e a r e a l s o s e e n i n t h e m u t a n t s , a l t h o u g h a t d i f f e r e n t r e l a t i v e i o n a b u n d a n c e s . T h e d i f f e r e n c e i n t h e a p p a r e n t i o n a b u n d a n c e m i g h t r e fl e c t t h e a c t u a l c o n c e n t r a t i o n d i f f e r e n c e i n s o l u t i o n , b u t m a y a l s o a r i s e d u e t o a c h a n g e i n i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y a f f e c t e d b y t h e m i s s i n g t y p e s o f l i p i d s . T h e r e f o r e , i n o r d e r t o p e r f o r m a q u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n o f t h e l i p i d p r o fi l e s i n t h e m u t a n t s , p r o p e r i n t e r n a l s t a n d a r d s h a v e t o b e i n c l u d e d . 3 1 7 f r o m C L ( 1 8 3 1 ) 4 v s m / z 5 9 1 f r o m i n t e r n a l s t a n d a r d C L ( 1 4 : 1 ) 4 ) . 7 . 3 . 2 B a s i s f o r a b s o l u t e q u a n t i f i c a t i o n b y M S a n d M S / M S u s i n g i n t e r n a l s t a n d a r d s T h e i o n f o r m s o b s e r v e d a n d t h e i o n i z a t i o n e f fi c i e n c i e s a r e v e r y d i f f e r e n t b e t w e e n d i f f e r e n t t y p e s o f l i p i d s i n e i t h e r E S I o r M A L D I , a n d a r e h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e p o l a r h e a d g r o u p o f t h e l i p i d s , t h e s o l v e n t c o n d i t i o n s , a n d t h e o t h e r c o m p o n e n t s i n t h e s o l u t i o n ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , l i p i d s w i t h t h e s a m e h e a d g r o u p a r e f o u n d t o f o r m t h e s a m e t y p e s o f i o n s i n M S a n d h a v e s i m i l a r i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y , a l t h o u g h t h e c h a i n l e n g t h m a y s l i g h t l y a f f e c t t h e i o n i z a t i o n . T h e r e f o r e l i p i d s f r o m d i f f e r e n t s a m p l e s c a n b e q u a n t i fi e d b y i n c o r p o r a t i n g a n i n t e r n a l s t a n d a r d t h a t h a s t h e s a m e h e a d g r o u p b u t d i f f e r s i n t h e c h a i n l e n g t h . I n o r d e r t o p r o v e t h a t t h e i o n a b u n d a n c e r a t i o i s l i n e a r l y d e p e n d e n t o n t h e c o n c e n t r a t i o n r a t i o , t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e M S p e a k a b u n d a n c e r a t i o a n d t h e i n - s o l u t i o n c o n c e n t r a t i o n r a t i o w a s fi r s t e x a m i n e d u s i n g a s e r i e s o f l i p i d m i x t u r e s a m p l e s , b y u s i n g 1 8 : 1 / 1 8 : 1 s y n t h e s i z e d l i p i d s a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n c o m b i n a t i o n s a s t h e m o d e l s f o r t h e l i p i d e x t r a c t s , a n d 1 4 : 0 / 1 4 : 0 s y n t h e s i z e d l i p i d s a s t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s ( s e e t h e t a b l e i n F i g u r e 7 . 1 0 f o r t h e s p e c i fi c s a m p l e c o m p o s i t i o n s ) . S i m i l a r l y t h e i s o l a t i o n a n d f r a g m e n t a t i o n o f C L l i p i d s b y M S f M S w e r e a l s o e x a m i n e d . T h e r e s u l t s r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 7 . 1 0 s h o w t h a t t h e r e l a t i v e p e a k a b u n d a n c e r a t i o a g a i n s t t h e i n t e r n a l s t a n d a r d i n M S i s a l i n e a r f u n c t i o n o f t h e r e l a t i v e c o n c e n t r a t i o n i n s o l u t i o n f o r e a c h l i p i d i n t h e l i p i d m i x t u r e , w i t h i n t h e r a n g e o f c o n c e n t r a t i o n s e x a m i n e d . I n a d d i t i o n t o t h e M S p e a k a b u n d a n c e o f t h e d e p r o t o n a t e d i o n s o f C L , G P E t n a n d G P G r o , S U C h l i n e a r i t y i s a l s o f o u n d f o r t h e d o u b l y c h a r g e d d e p r o t o n a t e d C L , t h e n o n - c o v a l e n t a n i o n i c a d d u c t i o n s o f G P C h o f o r m e d w i t h c h l o r i d e o r m e t h y l c a r b o n a t e , a n d m o r e 1 m p o t t a n t l y , t h e i s o l a t i o n a n d f r a g m e n t i o n s o f C L i n M S / M S ( f r a g m e n t i o n m / z 6 9 9 3 1 8 9 3 E . , » ’ - C L M S ' fi - ’ _ 2 - 0 0 ; l u C L M S 2 , g 2 - A C L M S / M S i s o l . 5 . . , , , , - 8 0 C L M S / M S f r a g . s " U , - , ' O G P E t n M S S 1 ‘ 2 . o a G P C h o + C l M S 2 % - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , , G P C h o + m , . . M s T e , , , , , , o - - - - - - - - - - - - - - - o G P G r o M s E a - - - - - O I ) - - - - - - - - e a 0 ' 2 l I l l 1 : 9 O 1 2 3 4 1 — 1 L i p i d c o n c e n t r a t i o n r a t i o 1 8 : 1 / 1 4 : 0 S a m p l e Q r M ) # 1 # 2 # 3 # 4 # 5 # 6 G P E t n 1 8 2 1 / 1 8 2 1 0 1 2 8 4 2 1 G P G r o l 8 z l / 1 8 2 1 0 0 . 5 4 2 1 8 G P C h o l 8 z l / l 8 z l 0 4 1 2 8 0 . 5 C L ( 1 8 : l ) 4 0 0 . 2 5 0 . 5 1 2 4 I n t e r n a l s t a n d a r d s G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 4 4 4 4 4 4 G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 2 2 2 2 2 2 G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 2 2 2 2 2 2 C L ( 1 4 : 0 ) 4 1 1 1 1 1 1 F i g | J r e 7 . 1 0 C o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e p e a k a b u n d a n c e r a t i o s i n E S I M S a n d M S / M S S p e c t r a a n d t h e a c t u a l c o n c e n t r a t i o n r a t i o s o f G P E t n , G P G r o , G P C h o a n d C L l i p i d S t a f l d a r d s c o n t a i n i n g t w o 1 8 : 1 f a t t y a c i d c h a i n s a n d t h e l i p i d s t a n d a r d s c o n t a i n i n g t w o 1 4 : 0 f a t t y a c i d c h a i n s , i n t h e l i p i d m i x t u r e s o l u t i o n s p r e p a r e d a t r a n d o m c o m b i n a t i o n s o f c o n c e I ‘ l t l ' a t i o n s ( O — 1 2 1 1 M ) . T h e c o m p o s i t i o n s o f t h e l i p i d s t a n d a r d m i x t u r e s u s e d f o r c o n S t l ' l l c t i n g t h e q u a n t i fi c a t i o n c a l i b r a t i o n p l o t a r e s h o w n i n t h e t a b l e ( m . c . = m e t h y l 0 . . . . a r b o l l a t e , 1 5 0 1 . : i s o l a t i o n , fi a g . = fi a g m e n t a t r o n ) . 3 1 9 t h e p r e c u r s o r i o n s b y M S / M S ( d a t a n o t s h o w n ) . S u c h l i n e a r i t y c a n t h e n b e u s e d a s t h e b a s i s t o q u a n t i f y l i p i d m o l e c u l a r s p e c i e s i n a m o r e c o m p l e x l i p i d m i x t u r e b y i n c o r p o r a t i n g a l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d c o n t a i n i n g t h e s a m e h e a d g r o u p . 7 . 3 . 3 Q u a n t i t a t i v e l i p i d p r o fi l e s o f m e m b r a n e s f r o m e a c h m u t a n t T h e l i p i d q u a n t i fi c a t i o n m e t h o d s u s i n g M S a n d M S / M S d e v e l o p e d a b o v e w e r e t h e n a p p l i e d t o t h e q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e w i l d t y p e a n d t h e G P C h o , S Q D G a n d C L s p e c i fi c l i p i d d e fi c i e n t m u t a n t s . 7 . 3 . 3 . 1 Q u a n t i t a t i v e l i p i d p r o fi l e s o f m e m b r a n e s : a b u n d a n t m e m b r a n e l i p i d s u s i n g E S I M S F i g u r e s 7 . 1 1 a n d 7 . 1 2 s h o w t h e M S s p e c t r a o f t h e m e m b r a n e l i p i d s e x t r a c t s f r o m t h e w i l d t y p e a n d t h e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t s t r a i n s i n p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s , r e s p e c t i v e l y , w i t h t h e i n c o r p o r a t i o n o f l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s . T h e l i p i d s p e c i e s t o b e q u a n t i fi e d b y M S h e r e h a v e e a c h b e e n d e t e r m i n e d t o b e t h e p r e d o m i n a n t c o m p o n e n t o f 3 2 0 F i g u r e 7 . 1 1 P o s i t i v e i o n m o d e E S I M S o f l i p i d s e x t r a c t e d f r o m c e l l m e m b r a n e s o f A ) w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c 0 ) B ) C L - d e fi c i e n t ( C L 3 + C c O ) C ) S Q D G - d e fi c i e n t ( S B l K 1 + C c O ) a n d D ) G P C h o - d e fi c i e n t ( C H B 2 0 + C c O ) m u t a n t s o f R . s p h a e r o i d e s , w i t h t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s G P E t n , G P G r o , G P C h o a n d C L 1 4 : 0 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 , 2 , 2 a n d 1 1 1 M , r e s p e c t i v e l y . 3 2 1 [ G P G r o i . s . + N H 4 I + 7 0 0 [ G P C h o i . s . + N a f r . + 4 _ 0 2 8 5 3 6 8 4 ‘ “ 7 1 6 [ G P C h o 1 . 3 . + K ] + 1 0 0 — G P C h 0 1 2 S - 6 7 8 3 5 , , , / 7 4 4 [ G P E t n 1 8 1 / 1 8 : 1 + H ] A — 1 ’ ’ 7 7 2 G P C h o 8 0 * 3 7 8 6 [ G P C h 0 1 8 : 1 / 1 8 1 + H ] W T 6 0 : 3 m e m — G P E ’ m - s - , , 7 9 2 [ G P G r o l 8 z 1 / 1 8 : 1 + N H 4 ] + 4 0 — 6 3 6 , _ 8 0 0 [ G P C h o 1 8 : 1 / 1 9 : 1 + H ] 2 0 - 3 " I 8 8 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 1 3 6 3 3 2 5 7 4 4 [ G P E t n l 8 2 1 / 1 8 : 1 + H ] + B 3 , 1 ‘ 7 7 2 G P C h o 8 0 — ' , / + C L — A _ 7 8 6 [ G P C h 0 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + H ] \ ° — 1 m e m 8 . ; 6 0 _ , / 7 9 2 [ G P G r o l 8 z 1 / 1 8 : 1 + N H 4 ] + g 4 0 - 8 0 0 [ G P C h o 1 8 : 1 / 1 9 : 1 + H ] + g 2 0 — ‘ ' 8 8 0 Q l l l l f l I < 2 3 9 3 0 ( 5 ) 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 + 9 0 0 9 5 0 0 . e 7 4 4 G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + . 2 0 ° ” ’ [ , 7 7 Z G P C h H ] C r e — 1 0 E 8 0 _ 3 7 8 6 [ G P C h 0 1 8 1 / 1 8 : 1 + H ] + S Q D G — 9 ‘ 6 0 : 3 1 m e m 1 / 7 9 2 [ G P G r o l 8 : 1 / 1 8 : 1 + N H 4 ] 4 0 - * 8 0 0 [ G P C h o 1 8 1 / 1 9 - 1 + 1 1 ] 2 0 3 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 5 . 9 7 e 5 6 7 8 1 _ 0 0 - 7 1 9 [ O L , Q L + H 1 + D 8 0 - . / , 7 3 l [ O L + H ] + G P C h o - 6 0 - f 1 7 4 4 [ G P E t n 1 8 1 / 1 8 : 1 + H ] m e m 4 0 : 7 1 6 3 3 3 1 7 9 2 [ G P G r 0 1 8 1 / 1 8 1 + N H 4 ] 2 0 ‘ v ; 3 M § 7 7 Q . 1 1 L L r L A l l A n 1 . l 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 m / z 3 2 2 F i g u r e 7 . 1 2 N e g a t i v e i o n m o d e E S I M S o f l i p i d s e x t r a c t e d f r o m c e l l m e m b r a n e s o f A ) w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) B ) C L - d e fi c i e n t ( C L 3 + C c O ) C ) S Q D G - d e fi c i e n t ( S B l K l + C c O ) a n d D ) G P C h o - d e fi c i e n t ( C H B Z O + C c O ) m u t a n t s o f R . s p h a e r o i d e s , w i t h t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s G P E t n , G P G r o , G P C h o a n d C L 1 4 : 0 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 , 2 , 2 a n d 1 u M , r e s p e c t i v e l y . 3 2 3 7 4 2 [ G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 - H ] _ 6 3 1 1 3 4 7 2 C L 8 . 2 1 1 2 7 3 7 7 3 [ G P G r o l 8 : 1 / 1 8 : 1 — H ] _ 1 0 0 7 [ 1 - 1 ' , l , 2 8 1 9 [ S Q D G 1 6 : 0 / 1 6 : 0 - H ] _ A 8 0 6 6 5 < . ‘ 8 4 5 [ S Q D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 - H ] " W T ' [ G P C h o l 8 : 1 / 1 8 : 1 + C H 3 O C 0 2 ] — m m 6 0 1 8 6 0 _ _ e 6 3 4 1 , 1 , [ C L 1 8 . 1 - H ] 4 0 3 1 2 3 9 1 4 5 6 2 0 6 1 9 _ , , 1 1 . 1 1 1 . 1 l 1 1 l u l . _ L _ , 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 f b g 6 e 4 [ G P E t n l 8 z l / 1 8 : 1 - H ] _ 7 7 3 [ G P G r o l 8 : l / 1 8 : l - H ] _ B 7 4 2 8 1 9 [ S Q D G 1 6 : 0 / 1 6 : 0 - H ] — C L — 8 0 8 4 5 [ S Q D G I S : 1 / 1 8 : 1 - H ] _ g ? 6 0 - 3 3 " [ G P C h 0 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + C H 3 O C 0 2 ] _ m e m j 4 0 6 3 4 8 6 0 x 4 i n a l l p a n e l s 0 ’ I 1 2 3 9 « g 2 0 6 1 9 g l . ‘ , 2 L 1 1 1 1 1 u m I 1 1 1 1 1 l ” I 1 “ — I < 5 ) 5 5 M 6 0 0 7 0 0 _ 8 0 0 9 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 " a 1 3 5 0 — [ G P E t n l s ‘ l / l i j z ' m m 7 7 3 [ G P G r o l 8 : 1 / 1 8 : 1 - H ] _ C H — 1 % 8 0 - 6 6 5 1 , \ [ G P C h o l 8 z l / l 8 2 1 1 2 3 9 S Q D G - m - 3 ’ + C H 3 O C O z ] m e m 6 0 : 6 3 4 \ . 8 6 0 4 0 _ 1 4 5 6 [ C L 1 8 : 1 - H ] _ ’ 6 1 9 J 2 0 — _ . U n a A - ” l I l l L L L J L L I - M . 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 _ 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 1 5 2 2 1 e 4 7 4 2 [ G P E t n l 8 : 1 / 1 8 : 1 - H ] 0 0 — 7 5 2 [ G P G r o l 8 : l / 1 8 : l - H ] _ 1 2 3 9 D 8 0 — 6 6 5 7 7 3 G P C h o - - 8 1 9 [ S Q D G 1 6 : 0 m e m 6 0 : 6 3 4 / 1 6 : 0 - H ] — 4 0 _ 8 4 5 [ S Q D G 1 8 : 1 1 4 5 6 [ C L 1 8 : 1 - H ] _ _ ‘ v / 1 8 : 1 - H ] ‘ , ‘ 2 0 — 6 1 9 9 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 m / z 7 . 3 . 3 . 2 S u m m a r y o f t h e q u a n t i f i c a t i o n o f m e m b r a n e l i p i d s p e c i e s B a s e d o n t h e M S p e a k a b u n d a n c e n o r m a l i z e d t o i n d i v i d u a l i n t e r n a l s t a n d a r d s , t h e q u a n t i t y o f e a c h l i p i d s p e c i e s o b s e r v e d b y M S i n t h e w i l d t y p e a n d t h e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t w a s o b t a i n e d , a n d t h e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n F i g u r e 7 . 1 1 f o r p o s i t i v e i o n m o d e a n d F i g u r e 7 . 1 2 f o r n e g a t i v e i o n m o d e . 3 2 5 G P E t n W I J / W d l 8 : l / 1 8 : 1 G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 G P C h o " . . ' W T ( 2 . 4 . 1 + C C O ) 1 8 : 1 / 1 9 : 1 C L - ( C L 3 + C c O ) - S Q D G - ( S B 1 K 1 + C c O ) - G P C h o - ( C H B 2 0 + C c O ) F T l ' 1 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 R a t i o o f l i p i d s / m e m b r a n e p r o t e i n s ( u m o l / 1 1 g ) I ' l I F i g u r e 7 . 1 3 S u m m a r y o f t h e q u a n t i fi c a t i o n o f t h e m a j o r p h o s p h o l i p i d i o n s o b s e r v e d i n fi l e M S s p e c t r a o f t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e w i l d t y p e a n d t h e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t i n p o s i t i v e i o n m o d e , b a s e d o n t r i p l i c a t e e x t r a c t i o n s ( e x c e p t f o r d u p l i c a t e f o l ? t h e C H B 2 0 s a m p l e ) . T h e d a t a s h o w n a r e t h e m e a n v a l u e s , a n d t h e e r r o r b a r i s t h e S 1 : = E l _ m d a r d d e v i a t i o n ( e x c e p t f o r t h e C H B 2 0 s a m p l e ) . T h e q u a n t i fi e d l i p i d s i n c l u d e G P E t n 1 8 2 1 / 1 8 : l ( m / z 7 4 4 ) , G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 ( m / z 7 8 6 ) , a n d G P C h o 1 8 : 1 / 1 9 : 1 ( m / z 8 0 0 ) . F o r a 1 1 o f t h e p h o s p h o l i p i d s q u a n t i fi e d h e r e , t h e l i p i d c o n c e n t r a t i o n s i n t h e E S I M S s a m p l e I e W i t h i n t h e l i n e a r r a n g e a s s h o w n i n F i g u r e 7 . 1 0 . 3 2 6 F i g u r e 7 . 1 4 S u m m a r y o f t h e q u a n t i fi c a t i o n o f t h e m a j o r l i p i d i o n s o b s e r v e d i n t h e M S s p e c t r a o f t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e w i l d t y p e a n d t h e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t i n n e g a t i v e i o n m o d e , b a s e d o n t r i p l i c a t e e x t r a c t i o n s ( d u p l i c a t e f o r t h e C H B Z O s a m p l e ) . l n p a n e l A , t h e p h o s p h o l i p i d s G P E t n , G P G r o , C L a n d G P C h o a r e q u a n t i fi e d a g a i n s t t h e i r i n d i v i d u a l l 4 : 0 / 1 4 : 0 i n t e r n a l s t a n d a r d s , b u t i n p a n e l B , S Q D G l i p i d s a r e r e l a t i v e l y q u a n t i fi e d w i t h r e f e r e n c e t o t h e G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 i n t e r n a l s t a n d a r d . T h e d a t a s h o w n a r e t h e m e a n v a l u e s , a n d t h e e r r o r b a r i s t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n ( e x c e p t f o r t h e C H B Z O s a m p l e ) . F o r a l l o f t h e p h o s p h o l i p i d s q u a n t i fi e d h e r e , t h e l i p i d c o n c e n t r a t i o n s i n t h e E S I M S s a m p l e s a r e w i t h i n t h e l i n e a r r a n g e a s s h o w n i n F i g u r e 7 . 1 0 . 3 2 7 G P E t n A 1 8 : 1 / 1 8 : 1 G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 C L ( 1 8 : 1 ) 4 G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 5 0 3 1 0 0 3 1 5 0 3 2 0 0 0 R a t i o o f l i p i d s / m e m b r a n e p r o t e i n s ( u m o l / 1 1 g ) S Q D G B 1 6 : 0 / 1 6 : 0 3 V / / / / A W T ( 2 . 4 . 1 + C C O ) - C L - ( C L 3 + C c O ) . . . . . . . . . S Q D G - S Q D G - ( S B 1 K 1 + C C O ) 1 6 : 0 / 1 & 1 - G P C h o - ( C H B 2 0 + C c O ) S Q D G 1 6 0 M 8 0 S Q D G J 8 fl fl 8 : 1 S Q D G 1 8 : 0 / 1 8 : 1 l ' l ' l ' ‘ l 2 6 8 0 R e l a t i v e q u a n t i t y o f l i p i d s ( A r b i t r a r y u n i t ) 3 2 8 T h e q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s s h o w n i n F i g u r e s 7 . 1 3 a n d 7 . 1 4 p r o v i d e a p i c t u r e o f t h e r e l a t i v e c o m p o s i t i o n o f d i f f e r e n t t y p e s o f l i p i d s i n t h e m e m b r a n e s o f t h e w i l d t y p e a n d t h e m u t a n t s . B e c a u s e t h e a b u n d a n c e s o f t h e S Q D G l i p i d s a r e n o r m a l i z e d t o t h e G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 l i p i d s , t h e b a r l e n g t h i n t h e fi g u r e s s h o u l d b e b e u s e d f o r c o m p a r i s o n b e t w e e n t h e w i l d t y p e a n d t h e i n d i v i d u a l s t r a i n s w i t h c a u t i o n , a s t h e y d o n o t n e c e s s a r i l y i n d i c a t e t h e i r r e a l c o n c e n t r a t i o n s , a n d s h o u l d n o t b e c o m p a r e d t o o t h e r t y p e s o f l i p i d s . N o n e t h e l e s s , F i g u r e s 7 . 1 3 a n d 7 . 1 4 r e v e a l t h a t i n a l l o f t h e s t r a i n s , G P E t n i s t h e m o s t a b u n d a n t p h o s p h o l i p i d , f o l l o w e d b y G P C h o ( e x c e p t f o r t h e G P C h o - d e fi c i e n t s t r a i n ) , G P G r o a n d t h e n C L . T h e q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s o f G P E t n a n d G P C h o ( a s m e t h y l C a r b o n a t e a d d u c t i n n e g a t i v e i o n m o d e ) l i p i d s f r o m t h e p o s i t i v e i o n m o d e a n d n e g a t i v e i o n m o d e M S a r e v e r y s i m i l a r , b u t t h e p o s i t i v e i o n m o d e r e s u l t s s h o w a s m a l l e r r e l a t i v e S t a n d a r d d e v i a t i o n , b e c a u s e t h e i o n a b u n d a n c e s o f t h e s e s p e c i e s a r e h i g h e r , a n d t h e r e i s l e s s o v e r l a p a t t h e s e m / z v a l u e s i n t h e p o s i t i v e i o n m o d e t h a n t h o s e i n t h e n e g a t i v e i o n m o d e . F i g u r e 7 . 1 5 s u m m a r i z e s t h e r e l a t i v e q u a n t i t y o f l i p i d s b y t h e s t r a i n s . I n a d d i t i o n t o t h e d e fi c i e n t l i p i d s t h a t a r e n o t d e t e c t a b l e b y E S I M S i n t h e s e m u t a n t s , t h e m o s t a p p r e c i a b l e d i f f e r e n c e s a r e : G P E t n i n c r e a s e s s i g n i fi c a n t l y i n t h e G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t , G P C i r o i n c r e a s e s i n b o t h C L - d e fi c i e n t m u t a n t a n d S Q D G - d e fi c i e n t m u t a n t , w h i l e G P C h o r e m a i n s r e l a t i v e l y u n c h a n g e d i n t h e s e t w o m u t a n t s . 3 2 9 ) g 1 1 / l o m u ( s n i e t o r p e n a r b m e m / s d i p i l f o 0 6 1 1 R I j l J 1 4 3 ’ " ? 1 G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 - G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 _ G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 _ C L ( 1 8 : 1 ) 4 N O O I p — i M O l 1 I A 1 — 1 O O O L . 0 ) O ) 0 X 0 0 0 8 3 X k 0 } : f l " / S Q l " \ i g u r e 7 . 1 5 Q u a n t i t a t i v e p h o s p h o l i p i d c o m p o s i t i o n s i n t h e m e m b r a n e s o f i n t h e w i l d t Y I J e a n d t h e m u t a n t s t r a i n s , f r o m n e g a t i v e i o n m o d e M S a n a l y s i s . I n o r d e r t o d i s p l a y t h e c h a n g e s m o r e c l e a r l y , t h e p e r c e n t a g e o f c h a n g e r e l a t i v e t o t 1 j ~ 0 s e i n t h e w i l d t y p e a r e c a l c u l a t e d a n d p r e s e n t e d i n F i g u r e 7 . 1 6 . F i g u r e 7 . 1 6 s h o w s t h a t , c o r I l p a r e d t o t h e w i l d t y p e , t h e m e m b r a n e f r o m t h e c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t m u t a n t c o n t a i n s 3 0 % m o r e G P G r o l 8 2 1 / 1 8 2 1 , a b o u t t h e s a m e l e v e l o f G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 a n d G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , a n d n o c a r d i o l i p i n w i t h i n t h e l i m i t o f d e t e c t i o n b y M S , b u t n o t b y M S / M S ( s e e b § 1 O w s e c t i o n 7 . 3 . 3 . 3 ) . T h e S Q D G - d e fi c i e n t m u t a n t a l s o d i s p l a y e d a ~ 3 0 % i n c r e a s e i n 3 3 0 e w t a l e r 8 1 ( l m l p s o h p n i l e g n a h c y ‘ i t h e a m o u n t o f G P G r o . T h e G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t h a s a 4 0 % i n c r e a s e i n G P E t n l i p i d s a n d n o c h a n g e i n G P G r o . - G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 - G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 - G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 _ C L ( 1 8 : 1 ) 4 6 0 - t o W T ( % ) 1 p 1 t O u a n t l “ fi i g u r e 7 . 1 6 T h e p e r c e n t a g e c h a n g e i n t h e q u a n t i t y o f e a c h t y p e o f m e m b r a n e l i p i d " i t h a v a i l a b l e i n t e r n a l s t a n d a r d s , r e l a t i v e t o t h e w i l d t y p e . 3 3 1 7 . 3 . 3 . 3 Q u a n t i f i c a t i o n o f t h e C L - d e f i c i e n t m u t a n t : t h e l o w - a b u n d a n c e c a r d i o l i p i n u s i n g E S I M S / M S A l t h o u g h u n d e t e c t a b l e b y M S , t h e p r e s e n c e o f C L ( 1 8 : l ) 4 i n t h e m e m b r a n e s f r o m c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t R s p h a e r o i d e s c e l l s w a s c l e a r l y r e v e a l e d b y M S / M S . Q u a n t i fi c a t i o n b y M S / M S u s i n g t h e i n t e r n a l s t a n d a r d C L ( 1 4 : 0 ) 4 f u r t h e r r e v e a l e d t h a t t h e q u a n t i t y o f C L ( 1 8 : 1 ) 4 i n t h e m e m b r a n e o f t h e c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t m u t a n t w a s a c t u a l l y 2 . 4 % o f t h e q u a n t i t y o f C L ( 1 8 : l ) 4 i n t h e w i l d t y p e ( F i g u r e 7 . 1 7 ) . T h e q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t u s i n g M S / M S i s s i m i l a r t o t h e r e s u l t u s i n g M S f o r t h e w i l d t y p e ( F i g u r e s 7 . 1 7 A a n d 7 . 1 7 C ) . T a b l e 7 . 6 s u m m a r i z e s t h e r e l a t i v e c h a n g e s o f t h e m a j o r p h o s p h o l i p i d s o f t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e , b y u s i n g t h e c o m b i n a t i o n o f M S a n d M S / M S q u a m t i fi c a t i o n . 3 3 2 F i g u r e 7 . 1 7 N e g a t i v e i o n m o d e n a n o E S I M S a n d M S / M S o f l i p i d s e x t r a c t e d f r o m m e m b r a n e s o f w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C C O ) a n d c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t ( C L 3 + C c O ) R . s p h a e r o i d e s c e l l s . A ) M S o f t h e w i l d t y p e , B ) M S o f t h e c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t m u t a n t , C ) M S / M S o f m / z 1 2 4 0 a n d 1 4 5 6 f r o m A , a n d D ) M S / M S o f m / z 1 2 4 0 a n d 1 4 5 6 f r o m B . T h e i n t e r n a l s t a n d a r d s m i x t u r e c o n t a i n i n g G P E t n , G P G r o , G P C h o a n d C L 1 4 : 0 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 , 2 , 2 a n d 1 p M , r e s p e c t i v e l y , w a s i n c l u d e d i n t h e l i p i d e x t r a c t f o r q u a n t i fi c a t i o n . T h e M S m a s s r a n g e w a s b r o k e n d o w n t o m / z 6 0 0 - 9 0 0 a n d m / z 1 2 0 0 - 1 6 0 0 , a n d t h e m / z 1 2 0 0 - 1 6 0 0 r e g i o n i n p a n e l s A a n d B w a s e x p a n d e d 5 t i m e s i n a b u n d a n c e t o s h o w t h e p o t e n t i a l C L p e a k s m o r e c l e a r l y . 3 3 3 — L C m e m 1 3 2 e ] 3 % 1 1 8 0 . . 2 7 4 4 7 0 0 0 6 1 0 0 6 0 0 4 0 0 6 . 1 . . : l B . I . : “ . e I 0 . H l _ 0 ] 4 : 7 ] ‘ H ] — . 1 . 1 1 0 2 0 c ' - ! " 0 “ . ‘ 3 d i l - l l 4 e ] . 1 2 0 C ] O 2 3 ] o 1 m 4 i 2 L 3 0 H 0 C H 0 C C + 0 ] l 3 : 1 H 8 C ] + 1 + 1 0 1 0 2 1 0 5 ] 0 8 C h 8 C — C [ u 0 ] + H 1 3 ’ 1 — g H l C i : 8 1 + 0 : s ] l l 6 O h C o n ‘ 1 H 4 P ] 1 6 4 I I G P ‘ C 1 1 + C ’ h C + l I : G l G 0 P : 0 P — 8 o G 8 [ 0 C 1 o 2 1 8 h [ 1 G [ + 8 h 0 [ C 0 C l ] n : P t 1 P 3 0 G _ 1 P — [ = 3 7 3 3 ; , 3 H 5 E G [ 4 3 v 0 G 0 ] h [ i : C / P 4 1 H G 4 [ 1 1 / m 2 1 1 G - 1 P 0 0 7 0 5 0 0 4 ’ G 6 1 [ 1 0 1 ’ 0 _ [ 1 0 0 1 31 3 3 4 f ” x 5 A V [ G P C h o “ A L L ; 1 i i 1 u [ C 1 1 4 . - 0 ~ H ] " [ C L l 8 z l - H ] — I , I I £ 2 2 3 6 3 1 2 4 0 I . C r ‘ m “ ” 1 ( % ) o o u c p u n q v 9 1 1 3 1 1 2 1 9 0 0 3 , 6 0 0 [ C 1 1 . 4 0 2 H ] 3 : [ G P E m 1 4 0 — H ] l _ l i l L 2 e 4 [ ( ; } : ( ; ’ z ) [ : ; 1 ) ( j h ( ) l ‘ 1 . 0 ' h ( : l ] : ) ( 5 < — — — > 1 . 8 6 e 2 7 2 1 8 h p 6 0 0 x 2 0 i f u " . 3 6 3 £ 2 2 3 1 1 8 0 0 7 2 7 T 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 D 6 0 0 I / / l 7 5 0 8 0 0 8 5 0 1 2 0 0 T I 6 5 0 7 0 0 1 4 0 0 3 i L J l 8 0 0 l 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 r e t i n g t h e p h y s i o l o g i c a l m e a n i n g o f t h e s p e c i f i c l i p i d d e fi c i e n c y i n 7 m 3 e . 4 I n m b r a t n e r e p s T a b l e 7 . 4 S u m m a r y o f l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e m e m b r a n e s o f w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C C O ) a n d C L — d e fi c i e n t m u t a n t ( C L 3 + C c O ) , u s i n g M S a n d M S / M S : C L - d e fi c i e n t m e m b r a n e s a r e s i g n i fi c a n t l y d e p l e t e d i n c a r d i o l i p i n . n m o l l i p i d * / m g p r o t e i n * * S a m p l e G P E t n G P G r o G P C h o C L 1 8 : 1 z p h o s p h o - 1 8 : 1 1 8 : 1 1 8 : 1 M S / M S l i p i d W T m e m ( 2 . 4 . 1 + C C O ) “ 1 3 3 1 8 1 3 1 7 6 C L — m e m ( C L 3 + C c O ) 8 3 4 2 1 7 0 . 3 2 1 4 4 % l i p i d 7 5 0 / 0 1 2 8 0 / 0 9 8 0 / 0 2 . 4 0 / 0 8 2 0 / 0 ( C L - / W T ) m e m * n m o l o f l i p i d w a s d e t e r m i n e d b y E S I M S a n d M S / M S o f l i p i d e x t r a c t u s i n g i n t e r n a l s t a n d a r d s . * " ‘ m g o f p r o t e i n w a s d e t e r m i n e d b y B C A a s s a y u s i n g B S A a s t h e s t a n d a r d . A n i n c r e a s e o f G P G r o b u t n o t G P C h o i n t h e S Q D G - d e fi c i e n t m u t a n t i s i n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s u s i n g T L C a n d 1 4 C - l a b e l l i n g e x p e r i m e n t s w h i c h f o u n d t h a t t h e g r o w t h o f t h e c e l l s i s n o t a f f e c t e d b y t h e S Q D G , b u t t h e c e l l s b e c a m e u n v i a b l e W h e n b o t h S Q D G a n d G P G r o w e r e d e p l e t e d [ 1 4 , 1 6 ] . S Q D G w a s t h u s p r o p o s e d t o b e a b l e t 0 f u n c t i o n a l l y r e p l a c e G P G r o [ 1 4 , 1 6 ] , b e c a u s e b o t h h a v e a n e g a t i v e l y c h a r g e d h e a d g r o u p [ 1 4 ] , a n d t o g e t h e r , t h e y c a n m e e t t h e c e l l s ’ r e q u i r e m e n t f o r a c e r t a i n a m o u n t o f 3 3 5 m e m b r a n e l i p i d s w i t h n e g a t i v e l y c h a r g e d h e a d g r o u p s . G P G r o i s n o t a m a j o r p r e c u r s o r f o r s y n t h e s i z i n g S Q D G [ 1 3 ] , t h u s s u c h a n i n c r e a s e i n G P G r o p r o d u c t i o n i s p r o b a b l y d u e t o t h e n e e d f o r m a i n t a i n i n g p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n . A n i n c r e a s e i n G P E t n , b u t n o t G P G r o , w a s o b s e r v e d h e r e a n d i n t h e o r i g i n a l G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t ( C H B Z O ) , a n d i t c a n b e p a r t i a l l y e x p l a i n e d w i t h r e g a r d t o t h e b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s o f G P C h o f r o m G P E t n [ 1 3 , 9 0 ] , a n d i t s e e m s t h a t t h i s p a t h w a y i s s o m e w h a t i n d e p e n d e n t f r o m t h e G P G r o l i p i d s ( s e e C h a p t e r 1 f o r a d e t a i l e d d e s c r i p t i o n ) . N o n e t h e l e s s , t h e c o n s e q u e n c e i s t h a t a G P C h o - d e fi c i e n c y a n d a b u n d a n t G P E t n d i d n o t a f f e c t t h e g r o w t h o f t h e c e l l s . B o t h G P E t n a n d G P C h o c a r r y a p o s i t i v e c h a r g e i n t h e h e a d g r o u p i n a d d i t i o n t o t h e n e g a t i v e l y c h a r g e d p h o s p h a t e . A n i n c r e a s e i n G P G r o i n t h e C L — d e fi c i e n t m u t a n t c a n a l s o b e e x p l a i n e d b y c o n s i d e r i n g t h e p a t h w a y s u s e d t o s y n t h e s i z e C L f r o m G P G r o b y t h e m u t a t e d c a r d i o l i p i n s y n t h a s e . T h e s p e c i fi c f u n c t i o n a l r e p l a c e m e n t o f C L b y G P G r o h a s b e e n p r o p o s e d r e p e a t e d l y i n p r e v i o u s s t u d i e s , p a r t i c u l a r l y f o r C c O a n d o t h e r m e m b r a n e - b o u n d r e d o x c o m p l e x e s [ 5 4 ] . I n s p i t e o f t h e s i g n i fi c a n t d e fi c i e n c y o f t h e s p e c i fi c t y p e o f l i p i d s i n t h e m e m b r a n e l i p i d P I ‘ O fi l e s , n o a p p r e c i a b l e p h y s i o l o g i c a l d e f e c t s a r e o b s e r v e d i n t h e m u t a n t s . T h i s s u g g e S t S t h a t n o n e o f t h e i n d i v i d u a l l i p i d s a r e e s s e n t i a l f o r t h e R . s p h a e r o i d e s c e l l s p e r s e . T h e o b S e r v e d c h a r a c t e r i s t i c i n c r e a s e i n o t h e r t y p e s o f l i p i d s , h o w e v e r , m a y s u g g e s t t h a t t h e s e 0 t h e r l i p i d s c a n r e p l a c e t h e f u n c t i o n s o f t h e d e fi c i e n t l i p i d s , s u c h a s w a s p r o v e d i n t h e c a s e o f S Q D G a n d G P G r o [ 1 4 , 1 6 ] , o r e a c h m u t a n t m u s t h a v e d e v e l o p e d m e c h a n i s m t 0 0 0 p e w i t h t h e a l t e r e d l i p i d s . I t i s n o t l i k e l y t h a t t h e c e l l s w o u l d b e i n d i f f e r e n t t o t h e i r 3 3 6 l i p i d p r o fi l e s . E l u c i d a t i n g h o w t h e l i p i d s c a n r e p l a c e e a c h o t h e r , c a n p r o v i d e v a l u a b l e i n s i g h t i n t o h o w a n d w h y t h e l i p i d s m a y a f f e c t t h e m e m b r a n e p r o t e i n C c O . T h e r e s u l t s h e r e s h o w t h a t n o n e o f t h e i n d i v i d u a l t y p e s o f d e fi c i e n t l i p i d s a r e e s s e n t i a l f o r t h e c e l l s p e r s e . T h e l i p i d p r o fi l e c h a r a c t e r i z a t i o n s o f t h e m e m b r a n e s e s t a b l i s h e d t h e b a c k g r o u n d t o e x a m i n e t h e C c O p u r i fi e d f r o m t h e s e m u t a n t s , i n o r d e r t o g a i n f u r t h e r i n s i g h t o n t h e f u n c t i o n a l r o l e s o f l i p i d s i n t h e m e m b r a n e p r o t e i n C c O . 7 . 3 . 5 P r o f i l e s o f t h e l i p i d s m a i n t a i n e d i n t h e p u r i fi e d C c O : W T a n d C L - C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p r o p e r t i e s o f t h e C c O p u r i fi e d f r o m t h e w i l d t y p e a n d t h e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t s t r a i n s , s h o w e d n o a p p r e c i a b l e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e C c O ( s e e t h e i n t r o d u c t i o n ) , a l t h o u g h t h e i r m e m b r a n e l i p i d e n v i r o n m e n t s w e r e s h o w n t o h a v e b e e n a l t e r e d s i g n i fi c a n t l y . T h e p o s s i b l e r e a s o n s f o r t h e c l o s e - t o w i l d t y p e b e h a v i o r o f C c O fi — o m t h e C L , S Q D G o r G P C h o - d e fi c i e n t m u t a n t a r e : 1 ) T h e p r o fi l e s o f t h e l i p i d s a s s o c i a t e d w i t h t h e p u r i fi e d C c O a r e s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h o s e o f t h e b u l k m e r r l b r a n e , d u e t o p r e f e r e n t i a l e n r i c h m e n t o f t h e s p e c i fi c t y p e s o f l i p i d s b y t h e C c O . F o r e x a m p l e , i n t h e C L — d e fi c i e n t m u t a n t , t h e C 0 0 m i g h t a c c u m u l a t e a l l o f t h e C L t h a t i t c a n f r o m t h e d e p l e t e d p o o l o f C L i n t h e m e m b r a n e s , t o a l e v e l c l o s e t o t h a t i n t h e C c O f r o m m e W i l d t y p e , a n d t h u s g u a r a n t e e i t s n o r m a l a c t i v i t y ; 2 ) I f t h e p r o fi l e o f t h e l i p i d s a s s ( ) Q i a t e d w i t h t h e p u r i fi e d C c O r e s e m b l e s t h a t o f t h e m e m b r a n e a n d s h o w s n o d r a m a t i c e t l r i c 1 1 m e n t o f a s p e c i fi c t y p e o f l i p i d , t h e n t h e c e l l s a n d C c O m u s t h a v e d e v e l o p e d l fi r t l e c l i a m i s m s t o c o m p e n s a t e f o r i t s a l t e r e d l i p i d p r o fi l e ; 3 ) T h e c e l l s a n d t h e C c O a r e 1 i l p l e t e l y u n a f f e c t e d b y t h e l a c k o f l i p i d s s u c h a s c a r d i o l i p i n , w h i c h s e e m s u n l i k e l y . 3 3 7 T h e s e p o s s i b i l i t i e s c a n b e d i s t i n g u i s h e d b y q u a n t i t a t i v e l y e x a m i n i n g t h e l i p i d c o m p o n e n t s i n t h e p u r i fi e d C c O . T h e r e f o r e , t h e l i p i d s i n t h e p u r i fi e d e n z y m e s f r o m t h e C L — d e fi c i e n t m u t a n t a n d t h e w i l d t y p e w e r e e x a m i n e d b y u s i n g M A L D I M S a n d M S / M S a n a l y s i s d i r e c t l y o n t h e p u r i fi e d e n z y m e s ( s e e C h a p t e r 9 f o r s o m e o f t h e d a t a ) , a n d q u a n t i t a t i v e E S I M S a n d M S / M S a n a l y s i s o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e s e p u r i fi e d C c O s f o l l o w i n g f r e e z e - d r y i n g a n d c o l d a n h y d r o u s a c e t o n e - w a s h i n g s t e p s t o r e m o v e t h e i n t e r f e r i n g d e t e r g e n t s . E S I M S c o u l d n o t d e t e c t C L i n t h e l i p i d e x t r a c t e d f r o m C c O o f t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t , b u t M S / M S a n a l y s i s r e v e a l s t h a t t h e r e i s s t i l l a l o w a m o u n t o f c a r d i o l i p i n i n t h e C c O f r o m t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t , a t 5 % r e l a t i v e t o t h a t o f t h e C c O f r o m t h e w i l d t y p e ( F i g u r e 7 . 1 8 ) . T h i s i s a b o u t a t w o - f o l d e n r i c h m e n t o f C L i n t h e e n z y m e c o m p a r e d t o t h e 2 . 4 % i n t h e m e m b r a n e s o f t h e C L - m u t a n t a n d t h e w i l d t y p e , b u t 5 % i s s t i l l a l o w a m o u n t , a n d d o e s n o t s u g g e s t a s i g n i fi c a n t l e v e l o f s p e c i fi c a c c u m u l a t i o n a n d e n r i c h m e n t o f t h e d e p l e t e d C L i n C c O . T h e r e s u l t s f r o m b o t h q u a n t i t a t i v e E S I M S a 1 1 d M S / M S ( f o r C L l i p i d ) a r e s u m m a r i z e d i n F i g u r e 7 . 1 9 . 3 3 8 F i g u r e 7 . 1 8 N e g a t i v e i o n m o d e n a n o E S I M S a n d M S / M S o f l i p i d s e x t r a c t e d f r o m C c O p u r i fi e d f r o m t h e w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C C O ) a n d c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t ( C L 3 + C c O ) R . s p h a e r o i d e s m e m b r a n e s u s i n g a N i - N T A g r a v i t y c o l u m n . L i p i d e x t r a c t i o n w a s p e r f o r m e d a f t e r f r e e z e - d r y i n g a n d t h r e e r e p e a t s o f c o l d a n h y d r o u s a c e t o n e - w a s h i n g s t e p s t o r e m o v e d e t e r g e n t s . A ) M S o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e w i l d t y p e C c O ( W T ) , B ) M S o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t m u t a n t ( C L ' ) , C ) M S / M S o f m / z 1 2 4 0 a n d 1 4 5 6 f r o m p a n e l A , a n d D ) M S / M S o f m / z 1 2 4 0 a n d 1 4 5 6 f r o m p a n e l B . T h e i n t e r n a l s t a n d a r d s m i x t u r e c o n t a i n i n g G P E t n , G P G r o , G P C h o a n d C L 1 4 : 0 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 , 2 , 2 a n d 1 u M , r e s p e c t i v e l y , w a s i n c l u d e d i n t h e l i p i d e x t r a c t f o r q u a n t i fi c a t i o n . T h e M S m a s s r a n g e w a s b r o k e n d o w n t o m / z 6 0 0 - 9 0 0 a n d m / z 1 2 0 0 - 1 6 0 0 , a n d t h e r e g i o n o f m / z 1 2 0 0 - 1 6 0 0 i n p a n e l s A a n d B w a s e x p a n d e d 5 t i m e s i n a b u n d a n c e t o s h o w t h e p o t e n t i a l C L p e a k s m o r e c l e a r l y . 3 3 9 7 _ A — V — ‘ 1 ‘ “ 1 1 v ’ 1 0 0 0 z 5 3 1 / 8 . . m 7 2 7 ] 1 2 3 1 8 l 0 2 ‘ 0 5 8 8 5 0 0 2 2 5 1 2 ' 2 £ 0 0 0 0 1 6 I * 3 , 6 I 6 2 2 2 1 3 e e e e W 7 5 1 1 8 7 0 0 1 4 0 4 7 7 ‘ 9 9 . . 4 1 1 F 0 4 . . 2 1 1 . ] 0 0 2 ] I 6 6 0 0 0 H s 1 1 C — s O i l . . 1 A B 3 z ] 5 H C " , 5 0 L 0 1 0 x X + I — H ] 8 " H " ) ? 0 4 ] 0 [ 1 4 . 1 — C 4 4 - e - . 9 4 4 8 1 2 9 ] ] 4 L ' o 1 2 3 ' ] C [ 2 1 0 h L 0 ; 1 0 1 C r C 0 C 0 . ] P 2 1 C 0 / c [ ] G 1 0 H + 7 + — l ] 3 [ H 1 3 — : 2 H ] 8 0 2 1 — 8 C 0 . 1 0 : 0 H 1 l 8 5 l 5 8 I 0 C C + z o ‘ 8 + I O 1 h z 8 C / 1 0 s H h i : ] 0 3 o 0 . r P h — M o ‘ C H H 4 G G C 1 m _ r 1 0 — _ P 1 [ C 0 o P P ] G 0 0 0 : l ] G l G P 8 h C G 8 z l h G C [ [ 8 [ C P 8 1 + C [ ] 0 n t P ’ - , 4 G 0 P I ] G [ — 0 0 1 I + n G t [ - ' E . § P i 7 f 4 % G I H . i E 5 o i H [ - [ H h 0 h o — — ‘ ‘ 4 L _ C _ 0 o . o 0 5 7 0 0 E I 4 P [ 5 L _ 0 t — 5 0 E 6 P ‘ . 4 G [ P 0 G 4 [ V 1 L ; L 0 0 C 6 [ 0 0 6 7 2 - P ] 7 ] M H H n G r [ G H 2 ~ C 3 , 1 - ‘ 0 - 1 P 4 m G 1 . G [ / 1 P M 1 m 1 G G / [ g : : c 3 = ‘ [ G 0 0 1 3 4 0 x 1 1 l 1 2 4 0 1 4 5 6 1 V 1 1 0 0 0 ( % ) o o u e p u a n 9 1 1 1 1 1 2 1 9 3 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 D C c O C L — 1 2 4 0 1 4 5 6 ‘ v = + C l ] ; 2 ' l L L i 1 . 1 1 1 L 6 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 F i g u r e 7 . 1 9 T h e r a t i o o f t h e n u m b e r s o f m o l e s o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e p u r i fi e d C c O t o t h e n u m b e r s o f m o l e s o f t h e o r i g i n a l p u r i fi e d C c O ( m o l e s / m o l e s ) , w h i c h s h o u l d i n d i c a t e t h e s t o i c h i o m e t r i c r e l a t i o n s h i p o f t h e l i p i d s i n C c O , a n d t h e r e l a t i v e q u a n t i fi c a t i o n o f o t h e r t y p e s o f l i p i d s . O n l y t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t ( C L 3 + C c O ) a n d t h e w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C C O ) a r e e x a m i n e d . T h e l i p i d s a r e e x t r a c t e d u s i n g t h e m e t h o d s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 , a fi e r f r e e z e - d r y i n g a n d t h r e e t i m e s o f a c e t o n e - w a s h i n g , t o r e m o v e t h e d e t e r g e n t s . T h e r e s u l t s s h o w n a r e t h e a v e r a g e o f m u l t i p l e r e p e a t s o f e x t r a c t i o n s . I n p a n e l A , t h e p h o s p h o l i p i d s a r e q u a n t i fi e d a g a i n s t t h e i r i n d i v i d u a l i n t e r n a l s t a n d a r d s i n M S a n d M S / M S ; i n p a n e l B , t h e S Q D G l i p i d s a r e r e l a t i v e l y q u a n t i fi e d w i t h r e f e r e n c e t o t h e G P G r o i n t e r n a l s t a n d a r d i n M S . T h e d a t a s h o w n a r e t h e m e a n v a l u e s , a n d t h e e r r o r b a r i s t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n . F o r a l l o f t h e p h o s p h o l i p i d s q u a n t i fi e d h e r e , t h e l i p i d c o n c e n t r a t i o n s i n t h e E S I M S s a m p l e s a r e w i t h i n t h e l i n e a r r a n g e a s s h o w n i n F i g u r e 7 . 1 0 . 3 4 1 G P E t n 1 8 : 1 / 1 m m A G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 C L W W ( 1 8 : 1 ) 4 G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 0 0 : 2 ' 0 . ' 4 I 0 . 6 I 0 . 8 M o l e s o f e x t r a c t e d l i p i d s / m o l e s o f C 0 0 S Q D G B 1 6 : 0 / 1 8 : 1 S Q D G l 6 : 0 / 1 8 : 0 m W T C c O ( 2 . 4 . 1 + C C O ) C L - C C O ( C L 3 + C c O ) S Q D G 1 8 : 0 / 1 8 : 0 I ' I ' I ' I ' I 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 R e l a t i v e q u a n t i t y o f e x t r a c t e d l i p i d s ( A r b i t r a r y u n i t ) 3 4 2 T a b l e 7 . 5 S u m m a r y o f c h a n g e s i n t h e q u a n t i t y o f p h o s p h o l i p i d s f r o m t h e l i p i d e x t r a c t s o f C c O p u r i fi e d f r o m t h e w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C C O ) a n d t h e C L - d e fi c i e n t s t r a i n ( C L 3 + C c O ) , i n c o m p a r i s o n t o t h e m e m b r a n e s a s s h o w n i n T a b l e 7 . 4 . m o l l i p i d * / m o l C C O * * S a m p l e G P E t n G P G r o G P C h o C L 1 8 = 1 Z p h o s p h o - 1 8 : 1 1 8 : 1 1 8 : 1 M S / M S l i p i d W T C C O ( 2 . 4 . 1 + C C 0 ) 0 . 2 2 0 . 2 9 0 . 1 5 0 . 4 6 1 . 1 C L — C c o . . . 1 . 0 2 1 . 1 ‘ ( C L 3 + C c O ) 0 3 2 0 6 2 0 5 o % " D i d 1 4 9 0 / 2 1 5 0 / 9 5 % 5 4 % 1 0 0 % _ g C L - v s W T C c o ° ° ' _ _ n m o l l i p i d * / m g p r o t e i n * * w r e c o ¥ ( 1 4 . 1 m m ) 1 . 8 2 . 4 1 . 3 3 . 8 9 . 3 C L - C c o . . 1 . . . ¥ ( C L 3 + C c O ) 2 7 5 2 2 o 2 9 3 % " D i d 1 4 9 0 / 2 1 5 0 / 9 5 0 / 5 4 % 1 0 0 ° / _ C L - v s W T C c o ° ° ° ' ° a s : s t a n d a r d s . m o l o f l i p i d w a s d e t e r m i n e d b y E S I M S a n d M S / M S o f l i p i d e x t r a c t s u s i n g i n t e r n a l 7 " 2 " ‘ m o l o f C 0 0 p r o t e i n w a s d e t e r m i n e d b y U V — V i s s p e c t r o s c o p y , a n d c o n v e r t e d t o m g b y u s i n g 1 2 0 k D a a s t h e m o l e c u l a r w e i g h t . 3 4 3 A l t h o u g h n o d r a m a t i c a c c u m u l a t i o n o f C L i s o b s e r v e d , t h e r e s u l t s i n F i g u r e 7 . 1 9 d o s h o w t h a t t h e l i p i d c o m p o s i t i o n i n p u r i fi e d C c O a r e d i f f e r e n t fi o m t h a t o f t h e b u l k m e m b r a n e i n t e r m s o f t h e r e l a t i v e q u a n t i t y o f d i f f e r e n t t y p e s o f l i p i d s . I n c o n t r a s t t o t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t t h a t c o n t a i n s a p r e d o m i n a n t a m o u n t o f G P E t n , t h e l i p i d e x t r a c t f r o m t h e p u r i fi e d C c O f r o m t h e w i l d t y p e c o n t a i n s G P E t n , G P G r o , G P C h o a n d C L a t s i m i l a r q u a n t i t i e s , a n d i t a l s o c o n t a i n s a v a r i e t y o f S Q D G , b u t t h e S Q D G c a n n o t b e c o m p a r e d q u a n t i t a t i v e l y t o t h e p h o s p h o l i p i d s d u e t o t h e l a c k o f a n i n t e r n a l s t a n d a r d o f i t s o w n . T h e l i p i d e x t r a c t e d f r o m t h e C c O f r o m t h e C L — d e fi c i e n t m u t a n t s h o w s t h e s a m e l e v e l o f G P C h o a n d a l l o f t h e S Q D G s p e c i e s , a s l i g h t i n c r e a s e i n G P E t n , a n d a n e a r l y t w o - f o l d i n c r e a s e i n G P G r o , c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e C c O . T h e f r a c t i o n a l c h a n g e i n t h e l i p i d a b u n d a n c e s e x t r a c t e d f r o m t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t a n d t h e w i l d t y p e C c O a r e s h o w n i n T a b l e 7 . 5 w i t h c o m p a r i s o n t o t h e m e m b r a n e s . T h e a b s o l u t e q u a n t i fi c a t i o n o f p h o s p h o l i p i d s i n t h e l i p i d e x t r a c t b y E S I , h o w e v e r , a l s o r e v e a l s t h a t t h e q u a n t i t i e s o f t h e p h o s p h o l i p i d s e x t r a c t e d f r o m p u r i fi e d C c O , a f t e r a c e t o n e - w a s h i n g t o r e m o v e d e t e r g e n t s , a r e s i g n i fi c a n t l y l o w e r t h a n t h e n u m b e r o b t a i n e d f r o m t h e i n o r g a n i c p h o s p h a t e a n a l y s i s , a n d a r e a l s o l o w e r t h a n t h e e x p e c t e d s t o i c h i o m e t r i c c o m p o s i t i o n o f l i p i d s p e r C c O m o l e c u l e . P h o s p h o r u s a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h e N i - N T A g r a v i t y c o l u m n p u r i fi e d C c O fi ' o m 2 . 4 . 1 + C c O o r f r o m C L 3 + C c O s t r a i n s e a c h c o n t a i n a b o u t 1 0 p h o s p h a t e s p e r C c O ( T a b l e 8 . 2 i n C h a p t e r 8 ) b a s e d o n d u p l i c a t e o r t r i p l i c a t e e x p e r i m e n t s , a n d t h e F P L C p u r i fi e d C c O f r o m 1 6 9 - 2 4 1 a n d 1 6 9 C L 3 s t r a i n s c o n t a i n 7 - 8 a n d 6 - 7 p h o s p h a t e s p e r C c O , r e s p e c t i v e l y . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e l i p i d e x t r a c t i o n i s n o t c o m p l e t e a n d t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y i s o n l y 2 0 - 3 0 % . T h i s i s s u e o f i n c o m p l e t e l i p i d e x t r a c t i o n f r o m t h e p u r i fi e d C c O a fi e r 3 4 4 a c e t o n e - w a s h i n g i s c o n fi r m e d b y a m o r e d e t a i l e d e x a m i n a t i o n d e s c r i b e d i n C h a p t e r 8 , a n d t h e i s s u e s a s s o c i a t e d w i t h m e m b r a n e p r o t e i n s l i p i d e x t r a c t i o n s a r e a l s o d i s c u s s e d i n C h a p t e r 8 . D u e t o t h e i n c o m p l e t e e x t r a c t i o n , i t w a s i m p o r t a n t t o s u b s t a n t i a t e t h e fi n d i n g o f l o w c a r d i o l i p i n l e v e l s i n t h e m u t a n t C c O b y a n o t h e r m e t h o d . A n i n d e p e n d e n t n o n - c h e m i c a l e x t r a c t i o n m e t h o d o f r e l e a s i n g t h e l i p i d s , b y M A L D I ( m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n ) , c a n b e u s e d a s a c o m p l e m e n t t o c h e m i c a l e x t r a c t i o n . I n t h e n e g a t i v e i o n m o d e M A L D I M S a n a l y s i s o f p u r i fi e d C c O , t h e C L l i p i d i n t h e C c O f r o m t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t c a n b e o b s e r v e d , b u t s t i l l a t a b u n d a n c e s m u c h l o w e r t h a n t h a t o f t h e w i l d t y p e . T h e s e r e s u l t s r u l e d o u t t h e fi r s t p o s s i b l e r e a s o n d e s c r i b e d e a r l i e r t h a t t h e C c O c o u l d a c c u m u l a t e C L t o t h e w i l d t y p e l e v e l fi o m t h e d e p l e t e d C L p o o l i n t h e m e m b r a n e , a n d s u p p o r t t h e s e c o n d p o s s i b i l i t y p r o p o s e d a b o v e t h a t t h e C c O a n d t h e c e l l s c a n a d a p t t o t h e a l t e r e d l i p i d p r o fi l e i n v i v o . T h e C c O r e q u i r e m e n t f o r l i p i d s i s l i k e l y t o b e r e s t r i c t e d t o c e r t a i n s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f a f e w t y p e s o f l i p i d , r a t h e r t h a n b e i n g s p e c i fi c f o r a n e n t i r e l i p i d s t r u c t u r e . T h e i n v i v o n a t u r e o f t h e s e s t u d i e s o n t h e l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s s e e m s t o r e v e a l a d i f f e r e n t l e v e l o f fl e x i b i l i t y i n t h e l i p i d r e q u i r e m e n t o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n s . I n p a r t i c u l a r , t h e r e s u l t s f r o m t h e C c O o f t h e C L — d e fi c i e n t m u t a n t o f R . s p h a e r o i d e s b r i n g t h e p r e v i o u s c o n c l u s i o n s d r a w n f r o m t h e m a m m a l i a n C c O a n d C L i n t o q u e s t i o n [ 8 , 5 4 ] . T h e t w o s y s t e m s m i g h t h a v e d i f f e r e n t m e c h a n i s m s o f C L l i p i d - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s . T h e C L - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s C c O i s t h e r e f o r e b e i n g f u r t h e r p u r s u e d b y u S i n g x - r a y c r y s t a l l o g r a p h y ( C h a p t e r 9 ) , a n d b y u s i n g a c o m b i n a t i o n w i t h t h e m e t a b o l i c - l i p i d p r o fi l e m o d u l a t i o n a p p r o a c h ( C h a p t e r 1 0 ) . 3 4 5 7 . 4 C o n c l u s i o n s T h e s e r i e s o f s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s o f R . s p h a e r o i d e s , w h i c h a r e s p e c i fi c a l l y d e fi c i e n t i n C L , S Q D G a n d G P C h o l i p i d s , r e s p e c t i v e l y , w e r e f o u n d t o b e n o t o n l y v i a b l e u n d e r a e r o b i c g r o w t h , b u t c a n a l s o e x p r e s s t h e R . s p h a e r o i d e s C c O a t g o o d y i e l d a n d g r o w r o b u s t l y . T o u n d e r s t a n d t h e s i g n i fi c a n c e o f t h e s e fi n d i n g s , t h e m e m b r a n e s i s o l a t e d f r o m t h e s e s t r a i n s a r e a n a l y z e d b y s y s t e m a t i c m a s s s p e c t r o m e t r y a p p r o a c h e s . M S / M S a n d M S n a n a l y s i s e l u c i d a t e d a n u m b e r o f l i p i d m o l e c u l a r s p e c i e s i n t h e w i l d t y p e a n d t h e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t s , w h i c h w e r e n o t i d e n t i fi a b l e b y u s i n g M S , b u t c o u l d b e p h y s i o l o g i c a l l y i m p o r t a n t . T h e M S a n d M S / M S - b a s e d q u a n t i fi c a t i o n m e t h o d b y i n c o r p o r a t i n g a s e t o f l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s i s a l s o s h o w n t o b e a m e n a b l e f o r q u a n t i t a t i v e l i p i d a n a l y s i s o f c o m p l e x l i p i d m i x t u r e s . Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s o f t h e w i l d t y p e a n d t h e m u t a n t s r e v e a l s c h a r a c t e r i s t i c v a r i a t i o n s i n t h e o v e r a l l m e m b r a n e l i p i d c o m p o s i t i o n i n d u c e d b y t h e s p e c i fi c d e fi c i e n c y i n c e r t a i n l i p i d c l a s s e s , a n d t h e r e l a t i o n s h i p c a n b e u n d e r s t o o d i n t h e c o n t e x t o f l i p i d b i o s y n t h e s i s , a s w e l l a s p o t e n t i a l p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n a l s u b s t i t u t i o n s . I n g e n e r a l , t h e C L - d e fi c i e n c y a n d t h e S Q D G - d e fi c i e n c y c a u s e d s i g n i fi c a n t i n c r e a s e s i n G P G r o l i p i d , b u t d i d n o t a f f e c t t h e l e v e l o f G P C h o i n t h e m e m b r a n e s , a n d t h e G P C h o - d e fi c i e n c y c a u s e d i n c r e a s e i n G P E t n l i p i d s , b u t n o t G P G r o l i p i d s i n t h e m e m b r a n e s . T h e r e s u l t s h e r e s h o w t h a t n o n e o f t h e i n d i v i d u a l t y p e s o f d e fi c i e n t l i p i d s a r e e s s e n t i a l f o r t h e c e l l s p e r s e . T h e l i p i d p r o fi l e c h a r a c t e r i z a t i o n s o f t h e m e m b r a n e s 3 4 6 w e . “ . . _ ” . 3 4 4 ” . l ‘ ” n n o . 5 e s t a b l i s h e d a b a c k g r o u n d t o e x a m i n e t h e C c O p u r i fi e d fi ' o m t h e s e m u t a n t s , i n o r d e r t o g a i n f u r t h e r i n s i g h t o n t h e f u n c t i o n a l r o l e s o f l i p i d s i n t h e m e m b r a n e p r o t e i n C c O . T h e i n d i v i d u a l s p e c i fi c d e fi c i e n c i e s i n C L , G P C h o , o r S Q D G l i p i d s i n t h e m e m b r a n e s o f R . s p h a e r o i d e s d i d n o t p r e v e n t t h e e x p r e s s i o n o f C 0 0 a t c l o s e - t o - w i l d t y p e y i e l d , a n d t h e C c O p u r i fi e d f r o m t h e s e m u t a n t s d i s p l a y e d t h e c l o s e - t o - w i l d - t y p e s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s , s u b u n i t c o m p o s i t i o n a n d s t e a d y s t a t e a c t i v i t y . T h e C c O f r o m t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t a l s o d i s p l a y e d s i m i l a r - t o - w i l d - t y p e a c t i v i t y s t a b i l i t y w i t h i n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e . Q u a n t i t a t i v e E S I M S a n d M S / M S a n a l y s i s o f l i p i d e x t r a c t s f r o m C c O o f t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t r e v e a l e d i n c r e a s e d G P G r o ( ~ 1 0 0 % ) a n d G P E t n ( ~ 5 0 % ) a b u n d a n c e s , b u t s i g n i fi c a n t l y d e c r e a s e d C L ( ~ 9 5 % ) , c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e e n z y m e . D i r e c t M A L D I M S a n d M S / M S a n a l y s i s o f t h e p u r i fi e d e n z y m e r e v e a l e d s i m i l a r r e s u l t s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e u n a f f e c t e d c e l l u l a r a n d e n z y m a t i c p r o p e r t i e s s u g g e s t t h a t n o n e o f t h e C L , S Q D G o r G P C h o l i p i d s a r e e s s e n t i a l t o t h e f u n c t i o n s o f C c O p e r s e , a l t h o u g h C c O m i g h t h a v e a p r e f e r e n c e f o r C L . F u r t h e r m o r e , t h e a l t e r e d l i p i d p r o fi l e s i n t h e C c O a r e s u g g e s t i v e o f a n i n v i v a a d a p t a b i l i t y / fl e x i b i l i t y i n t h e l i p i d r e q u i r e m e n t o f R . s p h a e r o i d e s ' C c O , i n c o n t r a r y t o fi n d i n g s f r o m m a m m a l i a n C c O a n d i t s C L . T h e C L - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s C c O t h e r e f o r e r e q u i r e s f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n b y x - r a y c r y s t a l l o g r a p h y , a n d b y u s i n g t h e c o m b i n a t i o n w i t h t h e m e t a b o l i c l i p i d p r o fi l e m o d u l a t i o n a p p r o a c h . T h e q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o n t h e l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e C c O a l s o r e v e a l s l o w c h e m i c a l e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y ( 2 0 - 3 0 % ) f r o m t h e p u r i fi e d C c O a fi e r a c e t o n e - w a s h i n g t o 3 4 7 1 6 1 1 1 0 ‘ u p i n r e m o v e d e t e r g e n t s . T h e s e i s s u e s o f l i p i d e x t r a c t i o n f r o m m e m b r a n e p r o t e i n s a r e f o l l o w e d u p i n C h a p t e r 8 . 3 4 8 C h a p t e r 8 L i p i d E x t r a c t i o n f r o m M e m b r a n e P r o t e i n s : E f f e c t s o f D e t e r g e n t a n d D e t e r g e n t R e m o v a l P r o c e d u r e s o n E x t r a c t i o n E f fi c i e n c i e s 8 . 1 S u m m a r y A s t h e p r e s e n c e o f e v e n t h e n o n - i o n i c d e t e r g e n t s c a n i n t r o d u c e a s e r i o u s c h a l l e n g e f o r l i p i d m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s , p a r t i c u l a r l y f o r E S I , t h e q u a n t i t a t i v e m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s o f t h e l i p i d s f r o m t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e s r e q u i r e s r e m o v a l o f i n t e r f e r i n g d e t e r g e n t s d o w n t o a l e v e l t h a t i s c o m p a t i b l e w i t h t h e E S I i o n s o u r c e . H o w e v e r , t h e d e t e r g e n t r e m o v a l p r o c e d u r e m i g h t f u r t h e r l i m i t t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y o f t h e l i p i d s f r o m t h e m e m b r a n e p r o t e i n s . I n t h i s c h a p t e r , a p p r o a c h e s t o d e t e r g e n t r e m o v a l f r o m t h e h i g h l y h y d r o p h o b i c a n d s t r u c t u r a l l y s e n s i t i v e C c O , a n d t h e e f f e c t s o f t r e a t m e n t s o f C c O o n t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m t h e p u r i fi e d p r o t e i n , w e r e e x a m i n e d . T h e e f f e c t i v e n e s s o f t h e a p p r o a c h e s f o r d e t e r g e n t - r e m o v a l , i n c l u d i n g c o l d a n h y d r o u s a c e t o n e - w a s h i n g a n d d i l u t i o n - fi l t r a t i o n , w a s e v a l u a t e d , m a i n l y b y u s i n g t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( T L C ) . O t h e r p o t e n t i a l a p p r o a c h e s , s u c h a s p r o t e i n d i g e s t i o n a n d t h e u s a g e o f a c l e a v a b l e d e t e r g e n t , w e r e a l s o t e s t e d . T h e e x t r a c t i o n o f t h e f e w l i p i d s m a i n t a i n e d b y p u r i fi e d h y d r o p h o b i c m e m b r a n e p r o t e i n s a r e k n o w n t o b e d i f fi c u l t , a n d t h e E S I q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s i n C h a p t e r 7 h a v e r e v e a l e d s u b - s t o i c h i o m e t r i c r a t i o o f t h e l i p i d s i n t h e e x t r a c t s . H e r e t h e e x a c t p h o s p h o l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y w a s e v a l u a t e d b y q u a n t i t a t i v e l y m e a s u r i n g t h e p h o s p h a t e i n t h e 3 4 9 p u r i fi e d C 6 0 , i n b o t h t h e l i p i d s e x t r a c t s o f t h e C c O , a n d i n t h e r e s i d u a l p r o t e i n a f t e r c h e m i c a l e x t r a c t i o n s , a n d a l s o e x a m i n e d w a s w h i c h s t e p o f C c O s a m p l e p r o c e s s i n g i s d e t r i m e n t a l , a n d w h a t i s b e n e fi c i a l f o r m o r e e f fi c i e n t l i p i d e x t r a c t i o n , a n d s u g g e s t e d d i r e c t i o n s f o r c o n t i n u e d i n v e s t i g a t i o n s i n t h e f u t u r e . 3 5 0 8 . 2 I n t r o d u c t i o n S i n c e t h e d e t e r g e n t t h a t i s r e q u i r e d f o r t h e p u r i fi c a t i o n a n d s o l u b i l i z a t i o n o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n C c O w a s f o u n d t o s t r o n g l y i n t e r f e r e w i t h l i p i d E S I i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y a s w e l l a s T L C a n a l y s i s [ 2 2 5 ] , c o l d a n h y d r o u s a c e t o n e - w a s h i n g , f o l l o w i n g l y o p h i l i z a t i o n o f t h e e n z y m e h a s b e e n u s e d t o r e m o v e t h e d e t e r g e n t [ 2 2 5 ] i n o r d e r t o o b t a i n a c c e p t a b l e E S I s e n s i t i v i t i e s f o r t h e l i p i d s . H o w e v e r , p r e v i o u s E S I M S a n d M S / M S a n a l y s i s o f t h e s e l i p i d e x t r a c t s a s s h o w n i n C h a p t e r 7 r e s u l t e d i n r e p r o d u c i b l e s u b - s t o i c h i o m e t r i c r a t i o s o f d i f f e r e n t t y p e s o f p h o s p h o l i p i d s i n c l u d i n g p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ( G P G r o ) , p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( G P E t n ) , p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( G P C h o ) a n d c a r d i o l i p i n ( C L ) i n t h e p u r i fi e d e n z y m e , w h i c h i s c o n t r a d i c t o r y t o t h e c u r r e n t k n o w l e d g e o f t h e s t o i c h i o m e t r y o f l i p i d s i n t h e C c O e n z y m e b y p h o s p h o r u s a n a l y s i s ( C h a p t e r 7 ) . M S q u a n t i fi c a t i o n u s i n g l i p i d s t a n d a r d s h a s s h o w e d t h a t t h i s p r o b l e m w a s n o t d u e t o t h e d e t e c t i o n e f fi c i e n c y i n M S . S u c h a l o w r e c o v e r y o f l i p i d e x t r a c t p o t e n t i a l l y c o m p r o m i s e d t h e q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s o f t h e l i p i d s , i n p a r t i c u l a r t h e l i k e l y l o w - a b u n d a n c e c a r d i o l i p i n i n t h e c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t m u t a n t . T h e r e f o r e t h e a i m i s t o fi n d t h e h i g h - e f fi c i e n c y l i p i d e x t r a c t i o n p r o c e d u r e s f o r m e m b r a n e p r o t e i n C c O t h a t a r e c o m p a t i b l e w i t h E S I M S a n d t a n d e m M S a n a l y s i s . 8 . 2 . 1 T h e n e e d t o r e m o v e d e t e r g e n t f r o m m e m b r a n e p r o t e i n s f o r l i p i d a n a l y s i s I d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f l i p i d s u s i n g E S I m a s s s p e c t r o m e t r y h a s r e c e n t l y b e c o m e m o r e e x t e n s i v e l y a p p l i e d t o l i p i d m i x t u r e s e x t r a c t e d fi ' o m t i s s u e s , c e l l s , c e l l u l a r o r g a n e l l e s , l i p i d r a f t s a n d l i p i d - c o n t a i n i n g m e m b r a n e p r o t e i n s [ 2 2 9 ] . S u r f a c e - 3 5 1 a c t i v e d e t e r g e n t s a r e k n o w n t o a f f e c t t h e m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s o f t h e l i p i d s , p e p t i d e s a n d p r o t e i n s i n a d e t r i m e n t a l w a y b y s i g n i fi c a n t l y s u p p r e s s i n g t h e i r i o n i z a t i o n e f fi c i e n c i e s [ 8 5 ] , p r o b a b l y d u e t o t h e i r h i g h t e n d e n c y t o i o n i z e o r f o r m n o n - c o v a l e n t a d d u c t i o n s i n b o t h E S I a n d M A L D I i o n i z a t i o n s , a l t h o u g h M A L D I c a n g e n e r a l l y b e m o r e t o l e r a n t o f d e t e r g e n t s t h a n E S I , d u e t o d i f f e r e n t i o n i z a t i o n m e c h a n i s m s ( s e e C h a p t e r 2 f o r a d e t a i l e d d e s c r i p t i o n ) . N o n - i o n i c d e t e r g e n t s , s u c h a s t h e d o d e c y l m a l t o s i d e ( D D M ) a n d t h e d e c y l m a l t o s i d e ( D M ) a p p l i e d i n t h e C c O p u r i fi c a t i o n s ( w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s a t 5 1 0 a n d 4 8 2 D a , r e s p e c t i v e l y ) , a r e f o u n d t o h a v e t h e l e a s t d e t r i m e n t a l e f f e c t s [ 8 5 ] . I n t h e M A L D I a n a l y s i s o f t h e s u b u n i t s t h a t h a v e m o l e c u l a r w e i g h t s o f s e v e r a l t h o u s a n d s , o r s e v e r a l t e n s o f t h o u s a n d s o f D a l t o n s , t h e d e t e r g e n t s c a n i m p r o v e t h e d e t e c t i o n o f t h e s e h y d r o p h o b i c s u b u n i t s b y a s s i s t i n g w i t h t h e d i s s o c i a t i o n f r o m t h e r e s t o f t h e p r o t e i n s w h e n a p p l i e d a t o p t i m a l c o n c e n t r a t i o n s ( d a t a n o t s h o w n ) , b u t f o r t h e l i p i d a n a l y s i s , w h i c h i s t h e f o c u s o f t h e c u r r e n t s t u d y , t h e s e d e t e r g e n t s s t r o n g l y t e n d t o f o r m p r o t o n a t e d o r d e p r o t o n a t e d i o n s a n d s e v e r a l t y p e s o f a d d u c t i o n s i n t h e m / z r a n g e t h a t o v e r l a p s w i t h t h o s e o f t h e c o m m o n t y p e s o f l i p i d s , a n d s i g n i fi c a n t l y h a m p e r s t h e e f f e c t i v e a n a l y s i s o f t h e l i p i d s . I t i s p a r t i c u l a r l y c h a l l e n g i n g w h e n t h e s a m p l e o f i n t e r e s t i s t h e f e w l i p i d s m a i n t a i n e d b y t h e p u r i fi e d C c O , w h i l e t h e m i n i m a l d e t e r g e n t c o n c e n t r a t i o n t h a t i s r e q u i r e d i n t h e b u f f e r i n o r d e r t o p r e v e n t t h e p r o t e i n f r o m p r e c i p i t a t i o n a n d i n a c t i v a t i o n , i s m u c h h i g h e r t h a n t h e l i p i d s [ 7 5 ] . T h e r e f o r e , i n o r d e r t o o b t a i n a c c u r a t e q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e l i p i d s i n t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e s , t h e s e d e t e r g e n t s h a v e t o b e r e m o v e d a t s u f fi c i e n t e f fi c i e n c y t o m a k e t h e s a m p l e s a m e n a b l e f o r m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s . 3 5 2 8 . 2 . 2 T h e i s s u e o f i n c o m p l e t e e x t r a c t i o n o f l i p i d s f r o m m e m b r a n e p r o t e i n s T h e q u a n t i fi c a t i o n a n a l y s i s o f t h e l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e p u r i fi e d C c O u s i n g m a s s s p e c t r o m e t r y b y i n c o r p o r a t i n g a p p r o p r i a t e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s ( C h a p t e r 7 ) s u g g e s t e d t h a t t h e l i p i d e x t r a c t e d f r o m t h e p u r i fi e d p r o t e i n C c O g i v e s s u b - s t o i c h i o m e t r i c r a t i o s o f p h o s p h a t e / C c O , a n d i t i s m u c h l o w e r t h a n t h e r e s u l t s f r o m p h o s p h a t e a n a l y s i s o f t h e p u r i fi e d C c O . A l l o f t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e e x t r a c t i o n m e t h o d s t h a t h a v e b e e n p r e v i o u s l y a p p l i e d e x t e n s i v e l y i n t h e l i p i d e x t r a c t i o n f r o m t i s s u e s , m e m b r a n e p e l l e t s , a n d e v e n m e m b r a n e p r o t e i n s [ 5 3 , 1 3 7 , 1 4 7 ] , d i d n o t e x t r a c t t h e l i p i d s t h a t r e m a i n b o u n d t o t h e p u r i fi e d m e m b r a n e p r o t e i n C c O a t h i g h y i e l d . L i p i d e x t r a c t i o n f r o m p u r i fi e d m e m b r a n e p r o t e i n s i s k n o w n t o b e m u c h m o r e d i f fi c u l t t h a n f r o m b u l k t i s s u e o r m e m b r a n e p e l l e t s [ 5 3 ] , b e c a u s e t h e l i p i d s t h a t r e m a i n i n t h e p u r i fi e d m e m b r a n e p r o t e i n s a r e m o r e t i g h t l y b o u n d t o , o r b u r i e d i n s i d e , t h e h y d r o p h o b i c p o r t i o n o f t h e p r o t e i n s . T h e e x t r a c t i o n y i e l d i s o f t e n l o w , a n d r e q u i r e s a d d i t i v e s s u c h a s s a l t t o h e l p r e m o v e t h e l i p i d s t h r o u g h i o n i c p a i r i n g , a n d t o p r e v e n t t h e p r o t e i n s f r o m d e n a t u r a t i o n a n d a g g r e g a t i o n . 3 5 3 8 . 2 . 3 T h e v a r i a b l e s t h a t m i g h t a f f e c t t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y T h e w i d e l y c i t e d B l i g h a n d D y e r e x t r a c t i o n m e t h o d w a s o r i g i n a l l y d e v e l o p e d f o r l i p i d e x t r a c t i o n f r o m fi s h t i s s u e t h a t c o n t a i n s ~ 8 0 % ( m / m ) w a t e r , a n d t h e e x t r a c t i o n y i e l d c a n r e a c h a b o v e 9 0 % [ 1 3 7 - 1 3 9 ] . T h e k e y p o i n t t o s u c h a h i g h y i e l d i s t h e m a x i m u m c o n t a c t b e t w e e n t h e s o l v e n t a n d t h e l i p i d s i n t h e t i s s u e , w h i c h i s a c h i e v e d b y s u s p e n d i n g t h e s a m p l e i n a m o n o - p h a s e m i x t u r e o f c h l o r o f o r m : m e t h a n o l a n d w a t e r [ 1 3 7 ] . T h e B l i g h a n d D y e r m e t h o d h a s s i n c e t h e n b e e n a p p l i e d e x t e n s i v e l y i n a l l k i n d s o f s y s t e m s w i t h s l i g h t m o d i fi c a t i o n s , a n d i n m o s t o f t h e r e c e n t l i p i d o m i c s a n a l y s e s , t h e i s s u e o f e x t r a c t i o n y i e l d w a s t y p i c a l l y n o t d i r e c t l y e v a l u a t e d , b u t w a s b y p a s s e d b y a d d i n g l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s t o t h e t i s s u e s o r c e l l s p r i o r t o l i p i d e x t r a c t i o n [ 1 1 1 , 1 4 0 , 1 4 1 ] , a s s u m i n g t h a t t h e e n d o g e n o u s l i p i d s w i l l b e e x t r a c t e d a t t h e s a m e e f fi c i e n c y . a s t h e s p i k e d f r e e l i p i d s s t a n d a r d s . H o w e v e r , p r i o r t o t h e a p p l i c a t i o n o f M S t o l i p i d a n a l y s i s , a s e r i e s o f p a p e r s h a d e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f d i f f e r e n t e x t r a c t i o n c o n d i t i o n s a n d p r e - e x t r a c t i o n s a m p l e t r e a t m e n t s o n t h e e f fi c i e n c y o f l i p i d e x t r a c t i o n , a n d a n u m b e r o f v a r i a b l e s h a v e b e e n r e p o r t e d t o a f f e c t t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y s u m m a r i z e d a s f o l l o w s . U s i n g l i p i d q u a n t i fi c a t i o n s t h r o u g h 1 4 C - r a d i o a c t i v e l a b e l i n g [ 3 0 8 ] , p h o s p h a t e a n a l y s i s [ 1 4 7 ] , d r y w e i g h t m e a s u r e m e n t [ 1 3 6 - 1 3 8 ] o r 3 1 P - N M R a n a l y s i s [ 8 9 ] , s e v e r a l s t u d i e s h a v e f o u n d t h a t t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y i s h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e n a t u r e o f t h e s a m p l e s [ 8 9 , 1 4 7 , 3 0 9 , 3 1 0 ] , s u c h a s t h e r a t i o o f l i p i d t o p r o t e i n c o m p o n e n t s , a n d t h e h y d r o p h o b i c i t y o f t h e s a m p l e s , a s w e l l a s s e v e r a l a s p e c t s o f t h e o p e r a t i o n c o n d i t i o n s . M o r e i m p o r t a n t l y , w h e n i t c o m e s t o s a m p l e s t h a t c o n t a i n a h i g h c o m p o s i t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s , t h e m a x i m u m c o n t a c t o f t h e l i p i d s w i t h t h e s o l v e n t i s n o t j u s t a 3 5 4 m a t t e r o f f o r m i n g a m o n o - p h a s e s o l u t i o n , b u t i s s i g n i fi c a n t l y a f f e c t e d b y t h e m e m b r a n e p r o t e i n s t h a t m a n y o f t h e l i p i d s a r e a s s o c i a t e d w i t h . H i g h e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y r e q u i r e s b r e a k i n g t h e l i p i d s f r e e f r o m t h e a s s o c i a t i o n s w i t h o t h e r l i p i d s a n d t h e h y d r o p h o b i c p r o t e i n s . T h e d e n a t u r a t i o n , a g g r e g a t i o n , a n d t h e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n t h e f o l d i n g o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n s , w h i c h a r e a l l v e r y s e n s i t i v e t o t h e s o l v e n t s , c o u l d s i g n i fi c a n t l y l i m i t t h e s o l v e n t a c c e s s i b i l i t y t o t h e l i p i d s a n d l e a d t o a l o w l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y . 1 ) 2 ) 3 ) L i p i d s / m e m b r a n e p r o t e i n c o m p o s i t i o n r a t i o . I n t h e m e m b r a n e - p r o t e i n - r i c h b o v i n e h e a r t m i t o c h o n d r i a , t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y i s m u c h l o w e r t h a n i n t h e m e m b r a n e p r o t e i n - f r e e p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s [ 1 4 7 ] . T h e e x t r a c t i o n o f l i p i d s f r o m p u r i fi e d m e m b r a n e p r o t e i n , h o w e v e r , w o u l d b e c o n s i d e r a b l y m u c h m o r e d i f f i c u l t , d u e t o a t i g h t e r a s s o c i a t i o n , a n d a h i g h e r s e n s i t i v i t y , o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n t o t h e e x t r a c t i o n s o l v e n t . F o r e x a m p l e , c a r d i o l i p i n a s s o c i a t e d w i t h t h e b o v i n e h e a r t C c O h a s b e e n s h o w n t o b e d i f fi c u l t t o e x t r a c t , a n d n e e d s t h e a d d i t i o n o f a m m o n i u m h y d r o x i d e a n d s e v e r a l e x t r a c t i o n s t e p s [ 5 3 ] . E x t r a c t i o n t e m p e r a t u r e . H i g h e r e x t r a c t i o n t e m p e r a t u r e s ( 0 t o 3 1 ° C ) l e a d t o h i g h e r l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y [ 1 4 7 ] . C o u n t e r i o n s . T h e e x t r a c t i o n o f c h a r g e d l i p i d s i s o f t e n a s s i s t e d b y t h e a d d i t i o n o f c o u n t e r i o n s v i a f o r m i n g n e u t r a l i o n p a i r s o r c o m p l e x e s . T h e a d d i t i o n o f n e u t r a l s a l t s [ 1 4 3 , 1 4 6 ] , p a r t i c u l a r l y t h e d i v a l e n t s a l t s , s u c h a s C a C l z a n d M g C 1 2 ( 0 - 5 0 m M ) , a r e f o u n d t o i n c r e a s e t h e p h o s p h o l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m m i t o c h o n d r i a , a n d t h e s a l t N a S C N c a n i m p r o v e t h e e x t r a c t i o n m o r e e f fi c i e n t l y t h a n N a C l [ 1 4 7 ] . 3 5 5 4 ) 5 ) 6 ) S o l v e n t p H . T h e e f f e c t o f s o l v e n t p H i s v a r i a b l e d e p e n d i n g o n t h e s a m p l e s [ 1 4 7 ] . T h e d i l u t e d a c e t i c a c i d [ 3 1 1 ] , B C ] , o r N H 4 O H i s o f t e n u s e d t o a d j u s t t h e s o l v e n t p H i n o r d e r t o n e u t r a l i z e t h e c h a r g e s t a t e s o f t h e l i p i d s a n d t h u s i n c r e a s e t h e i r s o l u b i l i t y i n h y d r o p h o b i c s o l v e n t s . H o w e v e r , s o m e l i p i d s [ 1 3 9 ] s u c h a s p l a s m a l o g e n s [ 1 1 7 , 1 3 2 ] t h a t c o n t a i n v i n y l b o n d s a r e e x t r e m e l y s e n s i t i v e t o a c i d i c p H a n d i n s t a n t l y d e c o m p o s e , a n d g l y c e r i d e l i p i d s , i n g e n e r a l , t e n d t o u n d e r g o h y d r o l y s i s i n h i g h l y b a s i c c o n d i t i o n s [ 3 1 2 ] . S a m p l e / s o l v e n t s i z e r a t i o . I n g e n e r a l , a s m a l l e r s a m p l e s i z e i n a l a r g e r s o l v e n t v o l u m e c a n i m p r o v e t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y [ 1 3 8 , 1 4 9 ] . P o l a r i t y o f s o l v e n t . L o n g e r c h a i n l e n g t h i n t h e a l c o h o l s o l v e n t ( C 1 t o C 4 ) w a s f o u n d t o h a v e h i g h e r l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m m i t o c h o n d r i a [ 1 4 7 ] . A t i n d i v i d u a l o p t i m a l c o n d i t i o n s , a l c o h o l s c a n r e a c h o v e r a 7 0 % e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m t h e m i t o c h o n d r i a , b u t e t h y l e t h e r c a n o n l y r e a c h a b o u t a 3 0 % e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f o r t h e p o l a r p h o s p h o l i p i d s [ 1 4 7 ] . A n o t h e r c o m p l i c a t i o n i s t h a t a s m a l l p o r t i o n o f t h e m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s a r e s o l u b l e i n t h e c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 2 : l , v / v ) e x t r a c t i o n s o l v e n t o f t h e B l i g h a n d D y e r m e t h o d [ 1 4 7 ] . I n a d d i t i o n t o t h e c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 2 : 1 , v / v ) s o l v e n t , c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) , d i e t h y l e t h e r [ 1 4 6 , 3 0 9 ] , h e x a n e [ 1 4 8 , 3 1 0 ] , b e n z e n e [ 3 0 8 ] , i - p r o p a n o l [ 3 0 9 ] , t - b u t y l m e t h y l e t h e r [ 1 4 5 ] , m e t h a n o l o n l y [ 8 9 ] , a n d s o m e o t h e r t h e n o n h a l o g e n a t e d s o l v e n t s ( t h e J e n s o n m e t h o d ) [ 3 0 9 ] h a v e a l s o b e e n a p p l i e d i n d i f f e r e n t s y s t e m s , w i t h c o m p a r a b l e o r s l i g h t l y l o w e r e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y [ 1 4 5 , 1 4 8 , 3 0 9 , 3 1 0 ] . W h i l e t h e c h l o r o f o r m : m e t h a n o l s o l v e n t c a n e f fi c i e n t l y e x t r a c t m o s t t y p e s o f l i p i d s [ 1 3 7 ] , t h e e t h e r a n d a c e t o n e s o l v e n t s e x t r a c t n o n p o l a r l i p i d s m o r e e f fi c i e n t l y 3 5 6 7 ) 8 ) 9 ) [ 1 4 7 , 3 0 8 , 3 1 3 ] . L i p i d a r t i f a c t s m i g h t a l s o a r i s e w h e n t h e s o l v e n t s a r e i n t r o d u c e d t o b i o l o g i c a l s a m p l e s i n a p p r o p r i a t e l y , e i t h e r t h r o u g h e n z y m a t i c a c t i o n o r c h e m i c a l r e a c t i o n , s u c h a s t h e g e n e r a t i o n o f p h o s p h a t i d y l m e t h a n o l [ 3 1 4 ] , a n d t h e f o r m a t i o n o f i m i n e i n p l a s m a l o g e n b y a c e t o n e [ 3 1 3 ] . D e n a t u r i n g r e a g e n t . T h e a d d i t i o n o f u r e a ( 0 - 6 M ) g e n e r a l l y d e c r e a s e s t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m m i t o c h o n d r i a e v e n i n t h e p r e s e n c e o f s a l t [ 1 4 7 ] . L y o p h i l i z a t i o n . T h e a n t i - d e n a t u r i n g l y o p h i l i z a t i o n ( f r e e z e - d r y i n g ) o f m i t o c h o n d r i a W a s s h o w n t o i n c r e a s e t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y [ 1 4 7 ] . L y o p h i l i z a t i o n o f s e v e r a l o t h e r s y s t e m s , s u c h a s b r a i n t i s s u e [ 3 1 5 ] , y e a s t c e l l s [ 3 0 8 ] a n d o y s t e r t i s s u e [ 1 3 9 ] , w e r e a l s o f o u n d t o g i v e a h i g h e r e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y t h a n e x t r a c t i n g fi ' o m t h e a q u e o u s s o l u t i o n . T h e c o n t a c t o f t h e m e m b r a n e w i t h c h l o r o f o r m : m e t h a n o l : w a t e r s o l v e n t w a s f o u n d t o i n s t a n t l y d e n a t u r e a n d d e s t r o y t h e a c t i v i t i e s o f s e v e r a l m e m b r a n e - a s s o c i a t e d p r o t e i n s , w h e r e a s l i p i d e x t r a c t i o n u s i n g a n h y d r o u s c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( o r w i t h l e s s t h a n 5 % w a t e r , v / v ) f r o m t h e f r e e z e - d r i e d s a m p l e w a s f o u n d t o m a i n t a i n t h e e n z y m e s ’ a c t i v i t i e s [ 3 1 5 ] . R e m o v a l o f w a t e r i s l i k e l y t o w e a k e n t h e h y d r o p h i l i c i n t e r a c t i o n s o f t h e l i p i d s w i t h t h e p r o t e i n s a n d o t h e r l i p i d s a n d h e l p r e l e a s e t h e l i p i d s . H o w e v e r , d r y i n g u s i n g e i t h e r h e a t o r a v a c u u m w a s f o u n d t o r e d u c e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y [ 1 3 9 ] o r w a s l e s s r e l i a b l e [ 3 1 6 ] ; t h e r e f o r e , i t s e e m s t h a t t h e m i n i m a l d e g r e e o f d e s t r u c t i o n t o t h e p r o t e i n s t r u c t u r e b y f r e e z e - d r y i n g i s t h e k e y r e a s o n . P r o t e i n d i g e s t i o n . D i g e s t i n g b o v i n e h e a r t m i t o c h o n d r i a w i t h p r o n a s e a t 2 3 ° C f o r 6 h o u r s w a s f o u n d t o a p p r e c i a b l y i n c r e a s e t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y [ 1 4 7 ] , p r o b a b l y b y d e s t r u c t i n g t h e p r o t e i n s t r u c t u r e s t h a t a s s o c i a t e w i t h t h e l i p i d s . 3 5 7 8 . 2 . 4 A p p r o a c h e s t o i m p r o v e t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f f i c i e n c y f r o m C c O E a c h i n d i v i d u a l m e m b r a n e p r o t e i n c a n b e v e r y d i f f e r e n t f r o m a n o t h e r , a n d a l t h o u g h s o m e m e m b r a n e p r o t e i n s c a n b e d i r e c t l y s o l u b l e i n h y d r o p h o b i c o r g a n i c s o l v e n t s , C c O i n s t a n t l y p r e c i p i t a t e s i n c h l o r o f o r m a n d m e t h a n o l , b u t i t w a s f o u n d t o b e p a r t i a l l y s o l u b i l i z e d i n t h e B l i g h a n d D y e r m o n o - p h a s e s o l v e n t m i x t u r e o f c h l o r o f o r m , m e t h a n o l a n d w a t e r , a n d f o r m a l i g h t - g r e e n s o l u t i o n o r fi n e s u s p e n s i o n ( d a t a n o t s h o w n ) . N o n e t h e l e s s , t h e g e n e r a l v a r i a b l e s t h a t m i g h t a f f e c t l i p i d e x t r a c t i o n f r o m m e m b r a n e p r o t e i n s , s u m m a r i z e d a b o v e , p r o v i d e t a r g e t s t o a d d r e s s t h i s i s s u e . S o m e o f t h e p o t e n t i a l a p p r o a c h e s , a n d g e n e r a l c o n s i d e r a t i o n s t o i m p r o v e t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m C c O a r e p r o p o s e d i n T a b l e 8 . 1 . A l t h o u g h o n l y a f e w o f t h e s e a p p r o a c h e s w e r e e x p e r i m e n t a l l y c a r r i e d o u t i n t h e c u r r e n t s t u d y , t h e y c a n b e h e l p f u l f o r f u r t h e r e f f o r t s i n t h e f u t u r e . 3 5 8 T a b l e 8 . 1 P o t e n t i a l a p p r o a c h e s t o i m p r o v e t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m m e m b r a n e p r o t e i n s a t d i f f e r e n t s t a g e s o f l i p i d e x t r a c t i o n . d e t e r g e n t r e m o v a l p r e - e x t r a c t i o n . c o l d a n h y d r o u s a c e t o n e - w a s h i n g f o l l o w i n g f r e e z e - d r y i n g o f C C O . d i l u t i o n - fi l t r a t i o n o f C c O s o l u t i o n s w i t h d e t e r g e n t - f r e e b u f f e r u s i n g f i l t e r s w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t c u t o f f o f 3 k D a . e x c h a n g i n g t h e D O M a n d D M d e t e r g e n t s i n t h e C c O s o l u t i o n i n t o a c l e a v a b l e d e t e r g e n t . a d d i n g b i o b e a d s t o C c O s o l u t i o n s t o a b s o r b a n d r e m o v e t h e d e t e r g e n t a f t e r e x t r a c t i o n a c e t o n e - w a s h i n g o f d r i e d l i p i d e x t r a c t e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y e x t r a c t i o n f r e e z e - d r y i n g o f C 6 0 p r i o r t o e x t r a c t i o n . e n z y m a t i c d i g e s t i o n o f C c O p r i o r t o e x t r a c t i o n . k e e p i n g C c O i n d e t e r g e n t d u r i n g e x t r a c t i o n . e x t r a c t i o n s o l v e n t . a m m o n i u m h y d r o x i d e ( a m m o n i u m c a t i o n , p H ) . s a l t ( c a t i o n s t o p a i r w i t h a n i o n i c l i p i d s ) . e x t r a c t i o n s o l v e n t v o l u m e 3 5 9 8 . 3 R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n s 8 . 3 . 1 E v a l u a t i o n o f t h e e f f i c i e n c y o f d e t e r g e n t r e m o v a l m e t h o d s T h e p r e s e n c e o f d e t e r g e n t a f f e c t s t h e m i g r a t i o n p o s i t i o n s o f l i p i d s i n t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( T L C ) , b u t t o a m u c h l e s s e x t e n t t h a n i t a f f e c t s m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s , t h u s , T L C w a s e m p l o y e d h e r e t o e v a l u a t e t h e e f fi c i e n c y o f d e t e r g e n t r e m o v a l u s i n g d i f f e r e n t m e t h o d s . 8 . 3 . 1 . 1 D e t e r g e n t r e m o v a l b y a d i l u t i o n - fi l t r a t i o n m e t h o d T h e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n m e t h o d i s e s s e n t i a l l y u s i n g a d e t e r g e n t - f r e e b u f f e r t o d i l u t e t h e e n z y m e s o l u t i o n s t h a t c o n t a i n D D M o r D M d e t e r g e n t , f o l l o w e d b y u s i n g a s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t c u t o f f fi l t e r t o r e m o v e t h e f r e e d e t e r g e n t s b y c e n t r i f u g a t i o n . T h e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n m e t h o d f o r d e t e r g e n t r e m o v a l w a s t e s t e d a t fi r s t b y u s i n g t h e m e m b r a n e s u s p e n s i o n , d i l u t e d i n t h e d e t e r g e n t - c o n t a i n i n g b u f f e r , a s t h e m o d e l f o r t h e C c O e n z y m e s o l u t i o n ( F i g u r e 8 . 1 ) . T h e s a m p l e s w e r e a l l f r e e z e - d r i e d p r i o r t o l i p i d e x t r a c t i o n u s i n g c h l o r o f o r m : m e t h a n o l o r c h l o r o f o r m : m e t h a n o l : a m m o n i u m h y d r o x i d e ( s e e C h a p t e r 2 f o r a d e t a i l e d d e s c r i p t i o n ) . T h e fi r s t t h r e e l a n e s i n F i g u r e 8 . 1 s h o w t h a t t h e fi l t e r - t h r o u g h s o l u t i o n c o n t a i n s m a i n l y t h e d e t e r g e n t s , b u t m o s t o f t h e l i p i d s a r e n o t l o s t . L a n e s 4 , 7 a n d 1 0 s h o w t h a t i n c r e a s i n g l y m o r e d e t e r g e n t s a r e r e m o v e d f r o m t h e m o d e l s a m p l e w i t h t h e i n c r e a s e i n t h e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n s t e p s . L a n e s 1 0 a n d 1 1 s h o w t h a t a f t e r t h r e e c y c l e s o f d i l u t i o n - fi l t r a t i o n , m o s t o f t h e d e t e r g e n t s a r e r e m o v e d f r o m t h e s a m p l e . L a n e s 4 , 5 , a n d 6 s h o w s t h a t t h e fi r s t l i p i d e x t r a c t i o n c a n g e t m o s t o f t h e l i p i d s o u t , a n d t h e t h i r d t i m e o f e x t r a c t i o n c o n t a i n s v e r y f e w l i p i d s , t h e r e f o r e e x t r a c t i n g t h e l i p i d s t w i c e w o u l d b e s u f fi c i e n t . 3 6 0 F i g u r e 8 . 1 T h e e f fi c i e n c y o f d e t e r g e n t r e m o v a l b y t h e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n m e t h o d ( 3 k D a m o l e c u l a r w e i g h t c u t o f f ) fi ' o m t h e d e t e r g e n t - c o n t a i n i n g m e m b r a n e s a m p l e s , d i s p l a y e d b y t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( T L C ) o f t h e l i p i d s , e x t r a c t e d f r o m t h e r e s u s p e n d e d m e m b r a n e s ( 8 . 7 u L , 1 . 2 5 m g o f t o t a l m e m b r a n e p r o t e i n s d e t e r m i n e d b y B C A a s s a y ) o f R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 A 4 s t r a i n , d i l u t e d w i t h 1 0 4 1 . 1 L o f t h e F P L C b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 0 5 % D D M . L a n e s 1 , 2 a n d 3 a r e t h e fi r s t t i m e , s e c o n d t i m e , a n d t h i r d t i m e fi l t e r - t h r o u g h s o l u t i o n s , r e s p e c t i v e l y ; l a n e s 4 , 5 a n d 6 a r e t h e fi r s t , s e c o n d a n d t h i r d t i m e l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e e n z y m e s , r e s p e c t i v e l y , f o l l o w i n g o n e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n s t e p ; l a n e s 7 , 8 a n d 9 a r e t h e fi r s t , s e c o n d a n d t h i r d t i m e l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e e n z y m e s , r e s p e c t i v e l y , f o l l o w i n g t w i c e o f t h e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n s t e p ; l a n e l e , 1 1 a n d 1 2 a r e t h e fi r s t , s e c o n d a n d t h i r d t i m e l i p i d e x t r a c t s f r o m t h e e n z y m e s , r e s p e c t i v e l y , f o l l o w i n g t h r e e r e p e a t s o f t h e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n s t e p s ; l a n e 7 i s t h e l i p i d e x t r a c t e d f r o m t h e d e t e r g e n t - f r e e m e m b r a n e , f o r c o m p a r i s o n . T h e s i l i c a g e l T L C p l a t e i s t r e a t e d w i t h ( N H 4 ) 7 _ S O 4 , d e v e l o p e d b y u s i n g a c e t o n e : t o l u e n e : w a t e r ( 9 1 : 3 0 : 7 , v / v / v ) , a n d v i s u a l i z e d b y i o d i n e v a p o r s t r a i n . C a r d i o l i p i n i s n o t r e s o l v e d u s i n g t h e s e c o n d i t i o n s . T h e b r i g h t b a n d s a r e t h e d e t e r g e n t s . 3 6 1 H e m e s ? G P G r o O L D D M . S Q D G G P E t n G P C h o o r i g i n 3 6 2 T h e s a m e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n p r o c e d u r e s w e r e a p p l i e d o n t h e p u r i fi e d C c O s o l u t i o n s ( w i l d t y p e C c O f r o m 1 6 9 A 4 s t r a i n , p u r i fi e d b y F P L C ) , a n d t h e r e s u l t s a r e s h o w n i n F i g u r e 8 . 2 . L a n e s 1 t h r o u g h 3 s h o w t h a t t h e fi l t e r - t h r o u g h s o l u t i o n s f r o m C c O p u r i fi e d b y a N i - N T A c o l u m n a n d e x c h a n g e d i n t o t h e D M d e t e r g e n t b u f f e r ( s h o w n i n l a n e 5 ) c o n t a i n m a i n l y t h e d e t e r g e n t w i t h n o a p p r e c i a b l e a m o u n t o f l i p i d s . L a n e s 4 , 5 , 6 a n d 7 s h o w t h a t a f t e r t h r e e t i m e s o f d i l u t i o n - fi l t r a t i o n , t h e d e t e r g e n t s i n C c O c a n b e d e c r e a s e d t o a l e v e l t h a t i s c o m p a t i b l e w i t h t h e T L C . H o w e v e r , t h e c o m p a r i s o n o f t h e s e l a n e s w i t h l a n e 8 , t h e m e m b r a n e m o d e l , s h o w s t h a t r e m o v i n g d e t e r g e n t f r o m t h e m e m b r a n e i s m u c h m o r e e f f e c t i v e t h a n fi o m t h e p u r i fi e d C c O , p r o b a b l y b e c a u s e t h e d e t e r g e n t s i n t h e h i g h l y h y d r o p h o b i c C c O p r o t e i n s o l u t i o n s a s s o c i a t e w i t h p r o t e i n s m o r e s t r o n g l y . 3 6 3 F i g u r e 8 . 2 T h e e f fi c i e n c y o f d e t e r g e n t r e m o v a l b y t h e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n m e t h o d ( 3 k D a m o l e c u l a r w e i g h t c u t o f f ) f r o m t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e s i s d i s p l a y e d u s i n g T L C o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e s f r o m t h e R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 A 4 s t r a i n , i n b u f f e r s c o n t a i n i n g 0 . 0 5 % D D M o r 0 . 2 % D M . L a n e s 1 , 2 a n d 3 a r e t h e fi r s t t i m e , s e c o n d t i m e , a n d t h i r d t i m e fi l t e r - t h r o u g h s o l u t i o n s , r e s p e c t i v e l y ; l a n e s 4 a n d 5 a r e t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m C c O a f t e r N i - N T A F P L C p u r i fi c a t i o n a n d c o n c e n t r a t i o n i n D D M b u f f e r , w i t h o u t a n d w i t h e x c h a n g e i n t o t h e D M b u f f e r , r e s p e c t i v e l y ; l a n e s 6 a n d 7 a r e t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m C c O a f t e r N i - N T A a n d a D E A E t w o - s t e p F P L C p u r i fi c a t i o n a n d c o n c e n t r a t i o n i n D D M b u f f e r , w i t h o u t a n d w i t h e x c h a n g e i n t o t h e D M b u f f e r , r e s p e c t i v e l y ; l a n e 7 i s t h e l i p i d e x t r a c t e d f r o m t h e D D M d e t e r g e n t - c o n t a i n i n g m e m b r a n e , f o r c o m p a r i s o n . A l l t h e s a m p l e s w e r e t r e a t e d b y d i l u t i o n — fi l t r a t i o n t h r e e t i m e s a n d e x t r a c t e d t w i c e . T h e s i l i c a g e l T L C p l a t e i s t r e a t e d w i t h ( N H 4 ) Z S O 4 , d e v e l o p e d b y u s i n g a c e t o n e : t o l u e n e : w a t e r ( 9 1 : 3 0 : 7 , v / v / v ) , a n d v i s u a l i z e d b y i o d i n e v a p o r s t r a i n . C a r d i o l i p i n i s n o t r e s o l v e d u s i n g t h e s e c o n d i t i o n s . T h e b r i g h t b a n d s a r e t h e d e t e r g e n t s . 3 6 4 H e m e s ? G P C h o o r i g i n 1 2 3 4 5 6 7 8 3 6 5 [ C L ( 1 8 : 1 ) 4 — 2 H 1 2 ‘ r ; 2 - 2 7 9 4 7 2 7 : 6 7 7 3 . 6 [ G P G r o l 8 z 1 / 1 8 z l — H ] _ g \ , 1 0 0 — _ a , _ . 7 9 3 . 4 [ S Q D G 1 6 : 0 / 1 6 : 0 — H ] 0 g 8 0 - 1 Q 8 4 5 . 6 [ 3 Q D G 1 8 z 1 / 1 8 2 1 — H 1 ‘ c ~ , = . - 5 6 0 : t l c i c r g c r r l l i c z r k s E 4 0 — . 2 - . - E 2 0 — ‘ V v ‘ 3 2 4 1 . 1 1 . 1 1 . . . 1 1 . . 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 m / z F i g u r e 8 . 3 N e g a t i v e i o n m o d e E S I M S o f l i p i d s e x t r a c t e d f r o m w i l d t y p e C c O e n z y m e p u r i fi e d b y N i - N T A g r a v i t y c o l u m n , a f t e r t h r e e c y c l e s o f t h e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n s t e p s t o r e m o v e t h e d e t e r g e n t . T h e l i p i d e x t r a c t fi o m t h e p u r i fi e d C c O a f t e r d i l u t i o n - fi l t r a t i o n t r e a t m e n t w a s t h e n a p p l i e d t o E S I M S a n a l y s i s ( F i g u r e 8 . 3 ) . F i g u r e 8 . 3 s h o w s t h e E S I M S s p e c t r u m o f t h e l i p i d e x t r a c t o f C c O ( F P L C N i - N T A p u r i fi e d a n d D M e x c h a n g e d ) a f t e r t h r e e c y c l e s o f d i l u t i o n - fi l t e r i n g s t e p s t o r e m o v e t h e d e t e r g e n t . A l t h o u g h s t i l l p r e s e n t , t h e d e t e r g e n t p e a k s w e r e s i g n i fi c a n t l y r e d u c e d , a n d t h e l i p i d p e a k s c o u l d b e c l e a r l y o b s e r v a b l e i n M S . I t d e m o n s t r a t e s t h a t t h r e e c y c l e s o f d i l u t i o n - fi l t r a t i o n u s i n g a 3 k D a m o l e c u l a r w e i g h t c u t o f f fi l t e r c a n r e m o v e a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f t h e d e t e r g e n t s , a n d i t i s s u f fi c i e n t t o o b t a i n a p r a c t i c a l l y u s e f u l s p e c t r u m u s i n g a n E S I s o u r c e . 3 6 6 8 . 3 . 1 . 2 A c e t o n e - w a s h i n g m e t h o d t o r e m o v e d e t e r g e n t M e m b r a n e l i p i d s a r e s h o w n t o h a v e v e r y l o w s o l u b i l i t y i n c o l d a n h y d r o u s a c e t o n e [ 2 2 5 ] , b u t t h e n o n - i o n i c d o d e c y l m a l t o s i d e a n d d e c y l m a l t o s i d e d e t e r g e n t s c a n b e r e l a t i v e l y m o r e s o l u b l e , t h e r e f o r e a n h y d r o u s a c e t o n e w a s h i n g o f f r e e z e - d r i e d C c O e n z y m e u n d e r 4 ° C w a s c a r r i e d o u t t o r e m o v e t h e d e t e r g e n t w i t h o u t l o s i n g t h e l i p i d s [ 2 2 5 ] . F i g u r e 8 . 4 s h o w s t h e e f fi c i e n c y o f d e t e r g e n t r e m o v a l f r o m p u r i fi e d C c O i n t h e D D M a n d D M c o n t a i n i n g b u f f e r s u s i n g t h i s a p p r o a c h . A f t e r t h r e e r o u n d s o f a c e t o n e - w a s h i n g , t h e d e t e r g e n t w a s s i g n i fi c a n t l y r e d u c e d , b u t s t i l l s h o w e d a s t r o n g b a n d i n t h e T L C ( t h e b r i g h t y e l l o w b a n d s a r e t h e d e t e r g e n t , t h e u p p e r o n e i s D D M a n d t h e l o w e r o n e i s D M ) . A g a i n , t h e d e t e r g e n t r e m o v a l f r o m t h e m e m b r a n e , s u s p e n d e d i n t h e s a m e d e t e r g e n t c o n t a i n i n g b u f f e r , i s m u c h m o r e e f fi c i e n t , a n d b a r e l y a n y d e t e r g e n t c a n b e d e t e c t e d i n t h e T L C ( l a n e 5 ) . T h i s d e m o n s t r a t e s t h a t t h i s m e t h o d c a n r e m o v e d e t e r g e n t f r o m p u r i fi e d C c O , b u t m o r e i m p o r t a n t l y , i t a g a i n r e e m p h a s i z e s t h e f a c t t h a t t h e m e m b r a n e p r o t e i n s a s s o c i a t e s t r o n g l y w i t h t h e l i p i d s a n d t h e d e t e r g e n t s , i n s t e a d o f h a v i n g t h e m l o o s e l y h a n g i n g a r o u n d . C o m p a r e d t o F i g u r e 8 . 3 , t h e a c e t o n e - w a s h i n g a p p l i e d h e r e w a s s l i g h t l y l e s s e f f e c t i v e i n d e t e r g e n t r e m o v a l t h a n t h e d i l u t i o n - fi l t r a t i o n m e t h o d . T h e fi n a l l i p i d e x t r a c t w a s a l s o a n a l y z e d b y E S I M S ( d a t a n o t s h o w n ) , a n d l i p i d i o n s c a n b e o b s e r v e d . 3 6 7 F i g u r e 8 . 4 T h e e f fi c i e n c y o f d e t e r g e n t r e m o v a l b y t h e a c e t o n e - w a s h i n g m e t h o d f r o m t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e s , d i s p l a y e d b y T L C o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m 0 . 6 8 1 1 g p u r i fi e d C c O e n z y m e s f r o m t h e R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 A 4 s t r a i n . L a n e s 1 a n d 2 a r e t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m C c O a f t e r N i - N T A F P L C p u r i fi c a t i o n a n d c o n c e n t r a t i o n i n D D M b u f f e r , w i t h o u t a n d w i t h e x c h a n g e i n t o t h e D M b u f f e r , r e s p e c t i v e l y , a f t e r t h r e e a c e t o n e - w a s h i n g s t e p s t o r e m o v e d e t e r g e n t ; l a n e s 3 a n d 4 a r e t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m C c O a f t e r N i - N T A a n d D E A E t w o - s t e p F P L C p u r i fi c a t i o n a n d c o n c e n t r a t i o n i n D D M b u f f e r , w i t h o u t a n d w i t h e x c h a n g e i n t o t h e D M b u f f e r , r e s p e c t i v e l y , a f t e r a c e t o n e w a s h i n g ; l a n e s 5 a n d 6 a r e t h e l i p i d e x t r a c t e d f r o m t h e D D M d e t e r g e n t - c o n t a i n i n g m e m b r a n e a f t e r d e t e r g e n t r e m o v a l u s i n g a c e t o n e - w a s h i n g ( a c e - w ) a n d d i l u t i o n - fi l t r a t i o n ( d i l - f ) , r e s p e c t i v e l y , f o r c o m p a r i s o n . A l l t h e s a m p l e s w e r e s u b j e c t e d t o d i l u t i o n - fi l t r a t i o n t h r e e t i m e s a n d e x t r a c t e d t w i c e . T h e s i l i c a g e l T L C p l a t e i s t r e a t e d w i t h ( N H 4 ) 2 S O 4 , d e v e l o p e d b y u s i n g a c e t o n e : t o l u e n e : w a t e r ( 9 1 : 3 0 : 7 , v / v / v ) , a n d v i s u a l i z e d b y a n i o d i n e v a p o r s t a i n . C a r d i o l i p i n i s n o t r e s o l v e d u s i n g t h e s e c o n d i t i o n s . T h e b r i g h t b a n d s a r e t h e d e t e r g e n t s . 3 6 8 3 6 9 8 . 3 . 2 W h a t a f f e c t s t h e e x t r a c t i o n o f l i p i d s f r o m m e m b r a n e p r o t e i n 0 . 0 T h e l y o p h i l i z a t i o n ( f r e e z e - d r y i n g ) o f C c O a n d t h e a c e t o n e - w a s h i n g o f t h e d r i e d C c O w e r e t h e t w o m a j o r s t e p s o f s a m p l e t r e a t m e n t a p p l i e d p r i o r t o l i p i d e x t r a c t i o n i n o r d e r t o r e m o v e d e t e r g e n t ; h o w e a c h a f f e c t s t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y w a s t h e r e b y e x a m i n e d b y c o m p a r i n g t h e p h o s p h o l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y ( m e a s u r e d b y p h o s p h a t e a n a l y s i s [ 2 2 4 ] ) , w h e n t h e C c O i s e x t r a c t e d a s a n a q u e o u s s o l u t i o n w i t h n e i t h e r o f t h e s e t r e a t m e n t ( _ / _ ) , a f t e r f r e e z e - d r y i n g b u t w i t h o u t a c e t o n e - w a s h i n g ( f r e - d / _ ) , a n d a f t e r b o t h f r e e z e - d r y i n g a n d a c e t o n e - w a s h i n g ( f r e - d / a c e - w ) , a s s h o w n i n T a b l e 8 . 2 . T a b l e 8 . 2 E f f e c t s o f f r e e z e - d r y i n g ( f r e - d ) a n d a c e t o n e w a s h i n g ( a c e - w ) o n t h e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m C c O m o l l i p i d * l m o l C c 0 * * S a m p l e C C O W / O l i p i d C c O a f t e r % e x t r a c t i o n e x t r a c t i o n e x t r a c t e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y w ' r C c O f r e - d l a c e - w 1 0 . 4 2 . 4 0 . 9 2 2 . 7 % ( 2 . 4 . 1 + C C O ) _ / _ 1 0 . 4 4 . 7 1 . 5 4 3 . 2 % f r e - d / _ 1 0 . 4 7 . 1 2 . 1 6 8 . 0 % ( S E - + 2 3 % ) f r e - d l a c e - w 1 0 . 1 2 . 1 4 . 1 2 1 . 1 % * m o l o f l i p i d w a s d e t e r m i n e d b y p h o s p h o r u s a s s a y [ 2 2 4 ] . " m o l o f C 0 0 p r o t e i n w a s d e t e r m i n e d b y U V - V i s s p e c t r o s c o p y . T h e r e s u l t s i n T a b l e 8 . 2 s h o w s t h a t t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m t h e a c e t o n e - W a s h e d C c O i s t h e l o w e s t a t 2 3 % , a n d i t c o n s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t s r e v e a l e d b y a b s o l u t e l i p i d q u a n t i fi c a t i o n u s i n g M S i n C h a p t e r 7 , t h a t f r o m t h e w e t e n z y m e i s 4 3 % , b u t i t w a s i n c r e a s e d b y o v e r 0 . 5 f o l d b y l y o p h i l i z a t i o n p r i o r t o t h e e x t r a c t i o n a n d r e a c h e d 6 8 % . 3 7 0 8 . 3 . 2 . 1 L y o p h i l i z a t i o n o f C c O p r i o r t o e x t r a c t i o n T h e l y o p h i l i z a t i o n ( f r e e z e - d r y i n g ) s t e p o f C 0 0 s a m p l e s w a s i n i t i a l l y a p p l i e d b e c a u s e t h e a c e t o n e - w a s h i n g s t e p r e q u i r e s a n h y d r o u s c o n d i t i o n s t o p r e v e n t l o s s o f l i p i d s , b u t a s e c o n d c o n s i d e r a t i o n i s t h a t l y o p h i l i z a t i o n w o u l d i n t r o d u c e t h e l e a s t d e g r e e o f d e s t r u c t i v e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n C 6 0 d u r i n g s o l v e n t r e m o v a l , w h i c h s e e m s t o b e t h e c a s e , a n d i s d e m o n s t r a t e d t o i m p r o v e t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m 4 3 % f o r w e t C c O , t o 6 8 % ( T a b l e 8 . 2 ) . T h e b e n e fi c i a l e f f e c t o f l y o p h i l i z a t i o n f o r l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y h a s b e e n o b s e r v e d i n a f e w e a r l i e r a p p l i c a t i o n s , a l t h o u g h n o t a s s i g n i fi c a n t a s i n t h e c u r r e n t c a s e . A n e a r l i e r s t u d y t h a t e x a m i n e d t h e l i p i d e x t r a c t i o n f r o m y e a s t u s i n g m e t h a n o l q u a n t i fi e d b y l 4 C - l a b e l l i n g , a l s o f o u n d t h a t t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f o l l o w s t h e o r d e r o f f r e e z e - d r i e d c e l l s > w e t c e l l s > a c e t o n e w a s h e d - d r i e d c e l l s [ 3 0 8 ] . c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 2 : 1 , v / v ) e x t r a c t i o n o f t h e f r e e z e - d r i e d b r a i n t i s s u e a l s o h a s a h i g h e r l i p i d e x t r a c t i o n y i e l d t h a n e x t r a c t i n g t h e t i s s u e u s i n g a q u e o u s s o l u t i o n , a n d t h e p r o t e i n s a r e o f t e n m o r e s t a b l e t o a n h y d r o u s o r g a n i c s o l u t i o n s , a n d c h l o r o f o r m : m e t h a n o l m i x t u r e a c t s a s a s t r o n g d e n a t u r a n t f o r p r o t e i n s o n l y i n t h e p r e s e n c e o f w a t e r [ 3 1 5 ] . T h e r a t i o n a l e i s t h a t t h e n o n - a q u e o u s e x t r a c t i o n m a i n t a i n s t h e m e m b r a n e p r o t e i n a c t i v i t i e s a n d s t r u c t u r e , a n d i s t h e r e f o r e l e s s d e n a t u r i n g t h a n t h e c h l o r o f o r m : m e t h a n o l : w a t e r a q u e o u s s o l u t i o n [ 3 1 5 ] . W h y d o e s f r e e z e - d r y i n g i m p r o v e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f r o m m i t o c h o n d r i a a n d b r a i n ? F i r s t o f a l l , d e n a t u r a t i o n o f t h e p r o t e i n l i m i t s t h e c o n t a c t o f s o l v e n t s w i t h l i p i d s , a n d h e n c e d e c r e a s e s t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y , b u t t h e f r e e z e - d r y i n g c a n r e m o v e t h e w a t e r w i t h o u t s i g n i fi c a n t l y d e s t r o y i n g t h e s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n o r c a u s i n g 3 7 1 d e n a t u r a t i o n . S e c o n d , t h e r e m o v a l o f w a t e r e l i m i n a t e d t h e h y d r o p h i l i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n l i p i d a n d p r o t e i n s , a n d o t h e r l i p i d s . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t , i n c o n t r a s t t o t h e l i p i d e x t r a c t i o n f r o m b u l k m e m b r a n e s a n d c e l l s , i n t h e e x t r a c t i o n o f l i p i d s f r o m m e m b r a n e p r o t e i n s o r m e m b r a n e p r o t e i n - r i c h s a m p l e s , t h e m o n o - p h a s e s o l v e n t i s n o t t h e o n l y c o n s i d e r a t i o n t o m a x i m i z e t h e s o l v e n t c o n t a c t w i t h l i p i d s . P r o t e i n d e n a t u r a t i o n a n d p a r t i a l a g g r e g a t i o n i s a m a j o r r e a s o n t h a t l i m i t s t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y o f l i p i d s fi o m t h e m e m b r a n e p r o t e i n C c O . T h e r e f o r e , s t r a t e g i e s s h o u l d b e d e v e l o p e d t o t a r g e t t h e p r o t e i n s a n d t h e i r a s s o c i a t i o n s w i t h t h e l i p i d s . E x t r a c t i n g l i p i d s w h i l e k e e p i n g t h e G e o i n a n a t i v e , o r c l o s e - t o - n a t i v e , s t a t e m i g h t t h e n i m p r o v e t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y . D e t e r g e n t i s o f t e n r e q u i r e d b y R . s p h a e r o i a ’ e s C c O t o m a i n t a i n i t s p r o p e r c o n f o r m a t i o n a n d p r e v e n t a g g r e g a t i o n , b u t t h e D D M a n d D M d e t e r g e n t s i n t e r f e r e w i t h m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s . T h e r e f o r e , a d e t e r g e n t t h a t c a n b e c l e a v e d i n t o l e s s i n t e r f e r i n g p i e c e s c a n p o t e n t i a l l y b e a p p l i e d d u r i n g t h e e x t r a c t i o n , a n d c l e a v e d a n d r e m o v e d a f t e r l i p i d e x t r a c t i o n . P r e v e n t i n g , o r m i n i m i z i n g t h e p r o t e i n f r o m d e n a t u r a t i o n i n o r g a n i c s o l u t i o n d u r i n g e x t r a c t i o n , b y f r e e z e - d r y i n g C c O a n d u s i n g a n h y d r o u s s o l v e n t i s h e r e p r o v e n t o w o r k . 8 . 3 . 2 . 2 A c e t o n e w a s h i n g o f C c O p r i o r t o e x t r a c t i o n A c e t o n e w a s h i n g o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n C c O p r i o r t o l i p i d e x t r a c t i o n i s r e p e a t e d l y s h o w n t o b e d e t r i m e n t a l t o t h e e x t r a c t i o n a n d g i v e s t h e l o w e s t l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y a t a r o u n d 2 0 - 2 5 % f r o m b o t h t h e w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) a n d t h e c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t ( C L 3 + C c O ) s t r a i n s ( T a b l e 8 . 2 ) , p r o b a b l y b y c a u s i n g s e v e r e d e n a t u r a t i o n o f t h e 3 7 2 p r o t e i n . I n f a c t , a c e t o n e i s a f r e q u e n t l y u s e d a s t h e r e a g e n t t o a g g r e g a t e a n d p r e c i p i t a t e p r o t e i n s i n p r o t e o m i c e x p e r i m e n t s . 8 . 3 . 2 . 3 P a r t i a l d i g e s t i o n o f C 6 0 t o a s s i s t w i t h t h e l i p i d r e l e a s e d u r i n g e x t r a c t i o n D i g e s t i n g t h e p r o t e i n s i n t o s m a l l e r p i e c e s c a n a l s o p o t e n t i a l l y r e d u c e t h e b i n d i n g o f l i p i d s [ 1 4 7 ] , a n d h e n c e m a k e s t h e m m o r e a c c e s s i b l e t o s o l v e n t s . I n i t i a l l y t h e p u r i fi e d C c O w a s t r e a t e d w i t h t r y p s i n d i g e s t i o n u n d e r 3 7 0 C f o r 2 4 h o u r s , b u t i n t h i s t r i a l n o p e p t i d e s w e r e d e t e c t e d i n t h e fi n a l s o l u t i o n , u s i n g t h e l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r ( m / z r a n g e 5 0 - 2 0 0 0 ) , a n d t h e p r o t e i n w a s f o u n d t o p r e c i p i t a t e t h r o u g h o u t t h e p r o c e d u r e . T h e r e f o r e , t h e d i g e s t i o n c o n d i t i o n s n e e d t o b e f u r t h e r o p t i m i z e d . T h e e f f e c t i v e d i g e s t i o n o f a m e m b r a n e p r o t e i n o f t e n r e q u i r e s t h a t i t b e m o r e o r l e s s s o l u b l e a n d n o t a g g r e g a t e d , b u t t h e p r e v e n t i o n o f a g g r e g a t i o n o f t e n r e q u i r e s t h e d e t e r g e n t t o b e p r e s e n t a t a s u f fi c i e n t l y h i g h c o n c e n t r a t i o n [ 7 5 ] . N o v e l t y p e s o f d e t e r g e n t t h a t c a n i m p r o v e t h e m e m b r a n e p r o t e i n d i g e s t i o n , a n d a r e c o m p a t i b l e w i t h p e p t i d e a n a l y s i s , h a v e b e c o m e r e c e n t l y a v a i l a b l e a n d c a n p o t e n t i a l l y h e l p t o a d d r e s s t h i s i s s u e . 8 . 3 . 2 . 4 A d d i t i o n o f a c i d o r b a s e i n t h e e x t r a c t i o n s o l v e n t A d d i t i o n o f a c i d o r b a s e i s u s e d t o a d j u s t t h e p H a n d a c t a s i o n p a i r s , a l t h o u g h t h e b u f f e r o f C c O a l r e a d y h a s s u f fi c i e n t l y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f s a l t . A m m o n i u m h y d r o x i d e h a s b e e n r o u t i n e l y i n c l u d e d i n t h e e x t r a c t i o n m e t h o d s e m p l o y e d t h r o u g h o u t t h e c u r r e n t s t u d y , b e c a u s e p r e v i o u s r e p o r t s s h o w e d t h a t i t c a n h e l p w i t h t h e e x t r a c t i o n o f c a r d i o l i p i n [ 5 3 ] . H e r e , i t w a s f o u n d t o b e a b l e t o s l i g h t l y i m p r o v e t h e o v e r a l l e x t r a c t i o n o f a l l t h e m a j o r t y p e s o f p h o s p h o l i p i d s , a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f c h l o r o f o r m : m e t h a n o l : 2 8 % ( m / v ) 3 7 3 a m m o n i u m h y d r o x i d e ( 6 5 : 3 3 : 3 , v / v / v ) ( d a t a n o t s h o w n ) . A l s o t e s t e d w a s r e p l a c e m e n t o f t h e a m m o n i u m h y d r o x i d e w i t h v o l a t i l e a c e t i c a c i d a t c o n c e n t r a t i o n s f r o m 1 2 5 m M t o 5 0 0 ' m M u n d e r e x t r a c t i o n t e m p e r a t u r e s o f 4 ° C o r 2 0 ° C , i n t r i p l i c a t e , a n d n o s i g n i fi c a n t c h a n g e i n t h e o v e r a l l p h o s p h o l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y w a s o b s e r v e d ( d a t a n o t s h o w n ) . 8 . 3 . 2 . 5 U r e a t r e a t m e n t o f C c O W h i l e a c e t o n e c a u s e s p r o t e i n s t o a g g r e g a t e a n d p r e c i p i t a t e , u r e a i s a s t r o n g d e n a t u r i n g r e a g e n t t h a t c a n k e e p t h e p r o t e i n u n f o l d e d , s o i t s h o u l d a f f e c t t h e C c O l i p i d e x t r a c t i o n . I n i n i t i a l a t t e m p t s , t h e a d d i t i o n o f 6 M u r e a t o t h e C c O a f t e r t h e a c e t o n e - w a s h i n g s t e p s e e m e d t o b r i n g t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y b a c k u p ( d a t a n o t s h o w n ) , b u t m o r e r e p e a t s w o u l d b e n e e d e d i n o r d e r t o d r a w a n y m e a n i n g f u l c o n c l u s i o n s . 8 . 3 . 2 . 6 U s a g e o f c l e a v a b l e d e t e r g e n t f o r d e t e r g e n t r e m o v a l A t y p e o f c l e a v a b l e d e t e r g e n t m a d e b y t h e A n a t r a c e c o m p a n y c a n b e d e g r a d e d i n t o p r o d u c t s t h a t h a v e a m u c h s m a l l e r m o l e c u l a r w e i g h t t h r o u g h h y d r o l y s i s o f a S c h i f f b a s e f u n c t i o n a l g r o u p , u n d e r m i l d r e a c t i o n c o n d i t i o n s . T h e r e f o r e , s u b s t i t u t i n g t h e o r i g i n a l D D M o r D M d e t e r g e n t i n t h e C c O b u f f e r i n t o t h i s t y p e o f d e t e r g e n t , p e r f o r m i n g t h e l i p i d e x t r a c t i o n , a n d t h e n d e g r a d i n g t h e d e t e r g e n t c o n t a i n e d i n t h e l i p i d e x t r a c t s , m i g h t b e o n e a p p r o a c h t o r e m o v e t h e i n t e r f e r e n c e o f t h e m a l t o s i d e d e t e r g e n t f o r t h e m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s o f t h e l i p i d e x t r a c t s . H o w e v e r , t h i s t y p e o f d e t e r g e n t w a s f o u n d t o c a u s e i n s t a n t p r e c i p i t a t i o n o f C c O u p o n c o n t a c t , p r o b a b l y d u e t o t h e p o s i t i v e l y c h a r g e d a m i n o h e a d g r o u p i n t h e d e t e r g e n t . O n t h e o t h e r h a n d , b e c a u s e o f t h e p o s i t i v e l y c h a r g e d a m i n o g r o u p , i n m a s s s p e c t r o m e t r y , t h i s d e t e r g e n t i s t h e p r e d o m i n a n t i o n s p e c i e s , e v e n a t t h e m i n i m a l 3 7 4 c o n c e n t r a t i o n r e q u i r e d t o s o l u b i l i z e m e m b r a n e p r o t e i n s , a n d i t s i g n i fi c a n t l y s u p p r e s s e d t h e i o n i z a t i o n o f a n y o t h e r s p e c i e s , i n c l u d i n g l i p i d s , a n d e v e n t h e n o n - i o n i c m a l t o s i d e d e t e r g e n t s . T h e p r o d u c t i o n c a r r i e s t h e s a m e h e a d a m i n o g r o u p , a n d i s e x p e c t e d t o c a u s e s i m i l a r l y s e r i o u s i o n i z a t i o n s u p p r e s s i o n p r o b l e m s . N o n e t h e l e s s , t h e s t r a t e g y o f u s i n g d e t e r g e n t d u r i n g e x t r a c t i o n , a n d r e m o v a l a f t e r e x t r a c t i o n , i s p r o m i s i n g . 8 . 3 . 3 F u t u r e d i r e c t i o n s A l l o f t h e e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d i n t h i s c h a p t e r w e r e a t t e m p t s t o r e m o v e d e t e r g e n t p r i o r t o t h e l i p i d e x t r a c t i o n , w h i c h a l m o s t i n e v i t a b l y c a u s e s d e n a t u r a t i o n o f C c O , a n d d e c r e a s e s t h e e f fi c i e n c y o f t h e f o l l o w i n g l i p i d e x t r a c t i o n . T h e o t h e r a p p r o a c h i s t o e x t r a c t t h e l i p i d s w i t h t h e d e t e r g e n t , a n d l a t e r s e p a r a t e t h e d e t e r g e n t s f r o m t h e l i p i d e x t r a c t . I n f a c t , l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h a s b e e n r e p o r t e d t o b e t h e o n l y m e t h o d c u r r e n t l y a v a i l a b l e t o e f f e c t i v e l y r e m o v e d e t e r g e n t f r o m t h e l i p i d e x t r a c t s o f s y s t e m s s u c h a s d e t e r g e n t - r e s i s t a n t m i c r o d o m a i n s , t o m a k e i t a m e n a b l e f o r m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s . 8 . 4 C o n c l u s i o n s D e t e r g e n t r e m o v a l a n d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y a r e t h e t w o k e y i s s u e s i n t h e a p p l i c a t i o n o f q u a n t i t a t i v e l i p i d a n a l y s i s o f m e m b r a n e p r o t e i n s b y m a s s s p e c t r o m e t r y . B y u s i n g t h e m o r e d e t e r g e n t - t o l e r a n t m e t h o d o f T L C , t h e e f fi c i e n c y o f d e t e r g e n t r e m o v a l m e t h o d s i n c l u d i n g t h e p r e v i o u s l y a p p l i e d c o l d a n h y d r o u s a c e t o n e - w a s h i n g , a n d a n e w d i l u t i o n - fi l t r a t i o n m e t h o d w e r e e x a m i n e d , a n d t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t b o t h c a n b r i n g t h e d e t e r g e n t i n t h e e x t r a c t d o w n t o a l e v e l t h a t i s a m e n a b l e t o t h e E S I i o n s o u r c e . H o w e v e r , 3 7 5 t h e a c e t o n e - w a s h i n g s t e p w a s f o u n d t o s e v e r e l y d e c r e a s e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y ( 2 0 - 2 5 % ) , p r o b a b l y b y d e n a t u r i n g a n d a g g r e g a t i n g C c O p r o t e i n s . O n t h e o t h e r h a n d , fi e e z i n g — d r y i n g o f C c O p r i o r t o l i p i d e x t r a c t i o n c a n i m p r o v e t h e e f fi c i e n c y t o 6 8 % , p r o b a b l y b y m a i n l y p r e v e n t i n g p r o t e i n f r o m a g g r e g a t i o n . I n i t i a l e x p e r i m e n t a l r e s u l t s , u s i n g o t h e r p o t e n t i a l a p p r o a c h e s t o a d d r e s s b o t h i s s u e s , h a v e a l s o b e e n d i s c u s s e d . W h i l e t h e t r a d i t i o n a l B l i g h a n d D y e r b a s e d e x t r a c t i o n m e t h o d s [ 1 3 7 ] , w h i c h w e r e d e v e l o p e d f o r l i p i d - a b u n d a n t c e l l s a n d t i s s u e s , e m p h a s i z e t h e f o r m a t i o n o f a m o n o - p h a s e e x t r a c t i o n s o l v e n t t o m a x i m i z e l i p i d - s o l v e n t c o n t a c t , t h e a c c e s s i b i l i t y o f s o l v e n t t o l i p i d s i n t h e m e m b r a n e p r o t e i n l i p i d e x t r a c t i o n s e e m s t o b e m o r e a f f e c t e d b y t h e f o l d i n g s t a t e o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n s . T h e p r o m i s i n g s o l u t i o n s t o i m p r o v e l i p i d e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y s h o u l d p r o b a b l y t a r g e t o n k e e p i n g t h e m e m b r a n e p r o t e i n f r o m d e n a t u r a t i o n a n d a g g r e g a t i o n d u r i n g l i p i d e x t r a c t i o n . 3 7 6 C h a p t e r 9 C r y s t a l l i z a t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e P r o d u c e d i n a C a r d i o l i p i n - D e fi c i e n t M u t a n t o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s a n d i t s L i p i d P r o fi l e C h a r a c t e r i z a t i o n § 9 . 1 S u m m a r y T h e l i p i d e n v i r o n m e n t o f m e m b r a n e p r o t e i n s i s c r i t i c a l f o r t h e i r f u n c t i o n i n v i v o , a n d m a n y s t u d i e s i n d i c a t e a r o l e f o r l i p i d s i n t h e i r s t r u c t u r e , f u n c t i o n a n d a s s e m b l y . H i g h r e s o l u t i o n c r y s t a l s o f m e m b r a n e p r o t e i n s f u r t h e r r e v e a l s s p e c i fi c a l l y b o u n d l i p i d s , l e a d i n g t o t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e p r o p e r l i p i d e n v i r o n m e n t m a y b e i m p o r t a n t f o r w e l l - o r d e r e d c r y s t a l f o r m a t i o n . T o t e s t a p r o p o s e d r e q u i r e m e n t f o r c a r d i o l i p i n i n t h e f u n c t i o n a n d c r y s t a l l i z a t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e , a c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t m u t a n t o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o z ' d e s w a s c o n s t r u c t e d T h e c a r d i o l i p i n s y n t h a s e ( c l s ) g e n e o f R . s p h a e r o i d e s w a s i d e n t i fi e d a n d d i s r u p t e d , c a u s i n g a g r e a t e r t h a n 9 0 % r e d u c t i o n i n c a r d i o l i p i n c o n t e n t . T h e c y t o c h r o m e c o x i d a s e p r o d u c e d i n t h e m u t a n t s t r a i n w a s a c t i v e , a n d a n a l y s i s o f i t s s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d c r y s t a l l i z e d f o r m i n d i c a t e d a n o r m a l a s s e m b l y o f t h e p r o t e i n c o m p l e x . C a r d i o l i p i n l e v e l s w e r e s i m i l a r l y r e d u c e d i n t h e m e m b r a n e s a n d i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e c r y s t a l s d e r i v e d f r o m t h e c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t m u t a n t , a s d e t e r m i n e d b y m a s s § P a r t o f t h e c o n t e n t s d e s c r i b e d i n t h i s c h a p t e r w a s p r e p a r e d i n t h e m a n u s c r i p t e n t i t l e d “ C y t o c h r o m e c O x i d a s e P r o d u c e d i n a C a r d i o l i p i n - D e fi c i e n t M u t a n t o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s i s F u l l y F u n c t i o n a l a n d C r y s t a l l i z a b l e ” b y B a n i t a T a m o t , X i Z h a n g , C a r r i e H i s e r , G a v i n E . R e i d , S h e l a g h F e r g u s o n - M i l l e r a n d C h r i s t o p h B e n n i n g . 3 7 7 s p e c t r o m e t r y . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t a n a l t e r e d l i p i d e n v i r o n m e n t t h a t i n c l u d e s v e r y l o w c a r d i o l i p i n l e v e l s d o e s n o t i m p a c t c y t o c h r o m e c o x i d a s e f u n c t i o n o r i t s c r y s t a l l i z a b i l i t y . 9 . 2 I n t r o d u c t i o n 9 . 2 . 1 W h y t h e f o c u s o f i n t e r e s t o n C L i n C 6 0 L i p i d m o l e c u l e s a r e r e s o l v e d i n c r y s t a l s t r u c t u r e s o f m a n y m e m b r a n e p r o t e i n s , i m p l y i n g a s i g n i fi c a n t r o l e i n p r o t e i n s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n . I n f a c t , i t h a s b e e n s h o w n t h a t s p e c i fi c l i p i d s a r e r e q u i r e d f o r c o r r e c t f o l d i n g a n d a s s e m b l y o f s o m e m e m b r a n e p r o t e i n s , s u c h a s t h e p l a n t l i g h t h a r v e s t i n g c o m p l e x [ 3 1 7 ] a n d t h e b a c t e r i a l l a c t o s e p e r m e a s e [ 3 1 8 - 3 2 0 ] . O t h e r s t u d i e s o n b o v i n e a n d y e a s t c y t o c h r o m e b c ] , b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e , a n d b a c t e r i a l K c s A K + c h a n n e l , i n d i c a t e a r e q u i r e m e n t f o r s p e c i fi c l i p i d s f o r fi r l l a c t i v i t y [ 5 2 - 5 4 , 3 2 1 ] . I n s o m e c a s e s , c o m p l e t e r e m o v a l o f t h e b o u n d l i p i d w a s f o u n d t o a b o l i s h p r o t e i n f u n c t i o n , a n e f f e c t t h a t i s r e v e r s i b l e b y a d d i n g b a c k l i p i d s [ 5 4 , 5 5 , 3 2 2 ] . I n a d d i t i o n t o t h e i r i n fl u e n c e o n a s s e m b l y a n d f u n c t i o n , b o u n d l i p i d s a l s o s t a b i l i z e t h e p r o t e i n s t r u c t u r e [ 7 3 ] . S i n c e s t r u c t u r a l s t a b i l i t y i s a c r u c i a l f a c t o r f o r m e m b r a n e p r o t e i n c r y s t a l l i z a t i o n , r e t e n t i o n o f l i p i d m o l e c u l e s d u r i n g t h e p u r i fi c a t i o n s t e p s h a s b e e n e m p h a s i z e d f o r s u c c e s s f u l p r o t e i n c r y s t a l l i z a t i o n [ 6 , 3 5 ] . S u p p o r t i n g e v i d e n c e f o r t h e r o l e o f l i p i d s i n t h e c r y s t a l l i z a t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s i n c l u d e s t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e q u a l i t y o f E . c o l i l a c t o s e p e r m e a s e c r y s t a l s c a n b e c o n t r o l l e d b y c h a n g i n g t h e p h o s p h o l i p i d l e v e l s [ 3 2 3 ] . A s i m i l a r o b s e r v a t i o n w a s m a d e r e g a r d i n g t h e c r y s t a l l i z a t i o n b e h a v i o r o f t h e c y t o c h r o m e b 6 f c o m p l e x , i n w h i c h t h e a d d i t i o n o f l i p i d s i m p r o v e d t h e c r y s t a l l i z a b i l i t y o f t h e p r o t e i n [ 7 3 ] . S u c h e f f o r t s , t o o b t a i n h i g h r e s o l u t i o n 3 7 8 s t r u c t u r e s o f m e m b r a n e p r o t e i n s , h a v e l e d t o t h e n e e d f o r c l o s e r s c r u t i n y o f t h e r o l e o f p r o t e i n - a s s o c i a t e d l i p i d m o l e c u l e s . C y t o c h r o m e c o x i d a s e ( C c O ) h a s s e r v e d a s a m o d e l s y s t e m f o r s t u d y i n g t h e i n v o l v e m e n t o f l i p i d i n m e m b r a n e p r o t e i n s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n [ 3 2 4 , 3 2 5 ] b e c a u s e o f i t s s p e c t r a l l y - a c c e s s i b l e m e t a l c e n t e r s , w h i c h p r o v i d e s e n s i t i v e i n t r i n s i c p r o b e s f o r m o n i t o r i n g s t r u c t u r a l i n t e g r i t y a s w e l l a s a c t i v i t y . A s t h e t e r m i n a l e n z y m e o f t h e r e s p i r a t o r y e l e c t r o n t r a n s p o r t c h a i n , C c O t r a n s f e r s e l e c t r o n s f r o m c y t o c h r o m e c t o o x y g e n a n d a c t s a s a p r o t o n p u m p [ 2 5 , 3 2 6 ] . U n d e r s t a n d i n g t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f e l e c t r o n t r a n s f e r a n d p r o t o n p u m p i n g r e q u i r e s d e v e l o p i n g r e p r o d u c i b l e m e t h o d s f o r o b t a i n i n g h i g h r e s o l u t i o n s t r u c t u r e s o f t h e w i l d - t y p e a n d m u t a n t f o r m s o f C 0 0 , i n c l u d i n g t h o s e fi o m R . s p h a e r o i d e s , a m o d e l s y s t e m f o r t h e m a m m a l i a n m i t o c h o n d r i a l e n z y m e [ 3 3 ] . A n u m b e r o f l i p i d m o l e c u l e s c o - p u r i f y w i t h C c O f r o m R . s p h a e r o i d e s [ 3 4 , 3 5 , 3 7 ] a n d t h e l i p i d b i n d i n g s i t e s i n t h e c o r e s u b u n i t s o f C c O a r e h i g h l y c o n s e r v e d f r o m b a c t e r i a t o m a m m a l s , e m p h a s i z i n g t h e i m p o r t a n c e o f l i p i d s i n t h e p r o t e i n s t r u c t u r e . C a r d i o l i p i n ( C L ) i s o n e l i p i d w h o s e r e q u i r e m e n t h a s b e e n e s t a b l i s h e d b y b i o c h e m i c a l s t u d i e s i n t h e f u n c t i o n o f s e v e r a l m e m b r a n e p r o t e i n s f r o m b a c t e r i a l a n d m i t o c h o n d r i a l s o u r c e s [ 1 , 5 3 , 5 4 , 3 2 7 ] . H o w e v e r , t h e m o l e c u l a r b a s i s o f i t s f u n c t i o n i n C c O i s n o t u n d e r s t o o d . A l t h o u g h c a r d i o l i p i n i s f o u n d t o b e i n v o l v e d i n t h e r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s , p a r t i c u l a r l y C c O , i n b o t h b a c t e r i a l a n d e u k a r y o t i c s y s t e m s , t h e l a s t s t e p o f c a r d i o l i p i n b i o s y n t h e s i s f r o m G P G r o , a n d t h e f o l l o w i n g r e m o d e l i n g r e a c t i o n s , a r e t o t a l l y d i f f e r e n t b e t w e e n t h e t w o s y s t e m s [ 7 , 8 , 6 1 ] , a n d t h e fi n a l c o m p o s i t i o n o f t h e c a r d i o l i p i n m o l e c u l a r s p e c i e s a r e a l s o v e r y d i f f e r e n t . T h e r e f o r e , i t i s c o n c e i v a b l e t h a t t h e m e c h a n i s m 3 7 9 t h r o u g h w h i c h c a r d i o l i p i n e x e r t s i t s fi r n c t i o n a l e f f e c t s m i g h t b e d i f f e r e n t a s w e l l , b e t w e e n t h e b a c t e r i a l a n d m a m m a l i a n s y s t e m s . D u e t o i t s u n i q u e s t r u c t u r e , c o m p o s e d o f t w o p h o s p h a t e s a n d o n e g l y c e r o l i n t h e h e a d g r o u p a n d f o u r h y d r o p h o b i c f a t t y a c i d c h a i n s , c a r d i o l i p i n c a n b i n d t o m e m b r a n e p r o t e i n s m o r e t e n a c i o u s l y t h a n l i p i d s w i t h t w o a l k y l c h a i n s . I t i s p e r c e i v e d t o a c t a s a “ s u p e r g l u e ” t o h e l p m a i n t a i n t h e i n t e g r i t y o f m u l t i - p r o t e i n s u p e r - c o m p l e x e s [ 6 5 , 6 6 ] . B e y o n d t h a t , c a r d i o l i p i n h a s a l s o b e e n f o u n d t o b e s p e c i fi c a l l y e s s e n t i a l f o r t h e f u l l a c t i v i t y o f m a m m a l i a n h e a r t C c O [ 5 4 , 6 8 ] . I n m a m m a l i a n c e l l s , c a r d i o l i p i n c a n g e t p e r o x i d i z e d a t i t s d o u b l e b o n d s a n d f o r m a c o m p l e x w i t h c y t o c h r o m e c , w h i c h t h e n t r i g g e r s t h e r e l e a s e o f c y t o c h r o m e c f r o m m i t o c h o n d r i a u n d e r s t r e s s s t i m u l i , l e a d i n g t o c e l l a p o p t o s i s [ 8 , 6 7 - 6 9 ] . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n o f t h e c a r d i o l i p i n m o l e c u l a r s p e c i e s i n v o l v e d i n v a r i o u s p r o c e s s e s r e v e a l e d t h a t h e a l t h y m a m m a l i a n s y s t e m s m a i n l y c o n t a i n c a r d i o l i p i n w i t h u n s a t u r a t e d 1 8 : 2 c h a i n s , p a r t i c u l a r l y C L ( 1 8 : 2 ) 4 [ 8 , 6 8 , 7 0 ] . A l t h o u g h C L c o n t a i n i n g 1 8 : 1 a n d 1 6 : 0 , t h e d o m i n a n t s p e c i e s i n b a c t e r i a , a r e a l s o f o u n d a t m u c h l o w e r a b u n d a n c e s [ 7 0 ] , t h e c r i t i c a l r o l e s o f c a r d i o l i p i n s e e m t o r e s i d e i n t h e u n s a t u r a t e d C L ( 1 8 : 2 ) 4 s p e c i e s t h r o u g h p o t e n t i a l o x i d a t i o n o f i t s d o u b l e b o n d s . A d e c r e a s e d f r a c t i o n o f C L ( 1 8 : 2 ) 4 l e a d s t o d e c r e a s e d a c t i v i t y o f C c O d o w n t o a b o u t 4 0 % , a n d c a u s e s m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n [ 6 8 ] . W h e n a d d i n g b a c k c a r d i o l i p i n s , C L ( 1 8 : 2 ) 4 i s m o r e e f f e c t i v e i n s t i m u l a t i n g C c O t h a n o t h e r c a r d i o l i p i n s p e c i e s [ 6 0 ] . H o w e v e r , C L ( 1 8 : 2 ) 4 i s n o t p r o d u c e d d i r e c t l y f r o m t h e b i o s y n t h e s i s o f l i p i d s i n m a m m a l i a n c e l l s , b u t i s f o r m e d t h r o u g h t h e m o d i fi c a t i o n b y a c y l t r a n s f e r a s e s o f t h e i n i t i a l c a r d i o l i p i n s p e c i e s [ 8 ] . I n t e r e s t i n g l y , m u t a t i o n s a f f e c t i n g t h e a s s e m b l y , b u t n o t t h e c a t a l y t i c f u n c t i o n s o f C c O , 3 8 0 w e r e f o u n d t o d e c r e a s e t h e b i o s y n t h e s i s o f c a r d i o l i p i n d o w n t o 5 0 % t o 6 0 % , w h e r e a s m u t a t i o n s i n c o m p l e x I I I o r c o m p l e x V , t h e A T P a s e , d i d n o t d i s p l a y s u c h e f f e c t s o n c a r d i o l i p i n s y n t h e s i s [ 6 2 ] . I n s t a r k c o n t r a s t , R . S p h a e r o i d e s w a s f o u n d t o m a k e m a i n l y C L ( 1 8 : 1 ) 4 , b u t n o d e t e c t a b l e l e v e l s o f C L ( 1 8 : 2 ) 4 , e v e n w h e n g r o w n u n d e r a e r o b i c c o n d i t i o n s a n d s u r v i v e v i a t h e r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s ( C h a p t e r 7 ) . L i k e w i s e , y e a s t s p r e d o m i n a n t l y p r o d u c e c a r d i o l i p i n c o n t a i n i n g 1 6 : 1 a n d 1 8 : 1 f a t t y a c y l c h a i n s b u t n o t 1 8 : 2 [ 2 0 ] . S e v e r a l s t u d i e s , u s i n g g e n e t i c m u t a g e n e s i s i n b a c t e r i a l a n d y e a s t s y s t e m s , f o u n d t h a t t h e d e fi c i e n c y i n c a r d i o l i p i n d i d n o t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t t h e a c t i v i t y o f C c O , n o r d i d i t a l o n e c a u s e t h e d y s f u n c t i o n o f m i t o c h o n d r i a i n y e a s t [ 2 3 , 7 1 , 3 2 8 ] , b u t t h e d o u b l e d e fi c i e n c y i n G P G r o a n d C L r e s u l t e d i n v e r y l i t t l e C c O p r o d u c t i o n a n d s e v e r e l y d y s f u n c t i o n a l m i t o c h o n d r i a [ 2 3 ] , s u g g e s t i n g C L i s n o t e s s e n t i a l f o r C c O o r m i t o c h o n d r i a i n y e a s t , b u t i s f u n c t i o n a l l y r e p l a c e a b l e b y G P G r o l i p i d s . T o t e s t t h e r o l e o f C L i n R . s p h a e r o i d e s C c O , C c O w a s e x p r e s s e d i n a C L - d e fi c i e n t m u t a n t b y t h e d i s r u p t i o n o f t h e c l s g e n e e n c o d i n g t h e e n z y m e C L s y n t h a s e , w h i c h h a d b e e n c o n s t r u c t e d e a r l i e r [ 1 5 ] , a n d a c e t a t e 1 4 C - l a b e l i n g r e v e a l e d t h a t t h e l e v e l o f C L i n t h e m u t a n t w a s r e d u c e d t o l e s s t h a n 1 0 % o f t h e w i l d t y p e [ 1 5 ] . 9 . 2 . 2 E f f e c t o f C L d e f i c i e n c y o n R . s p h a e r o i d e s c e l l g r t h T o a n a l y z e t h e e f f e c t o f t h e d e c r e a s e d C L o n t h e o v e r a l l g r o w t h o f R . s p h a e r o i d e s c e l l s , t h e p h o t o s y n t h e t i c a n d r e s p i r a t o r y g r o w t h o f t h e w i l d t y p e a n d t h e m u t a n t w a s c o m p a r e d . U n d e r t h e c o n d i t i o n s u s e d i n t h i s s t u d y , n o s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e s w e r e 3 8 1 o b s e r v e d i n t h e p h o t o s y n t h e t i c g r o w t h f o r b o t h l i n e s ( F i g u r e 9 . 1 A ) . H o w e v e r , r e s p i r a t o r y g r t h w a s s l i g h t l y r e d u c e d i n t h e m u t a n t , a s i n d i c a t e d b y t h e i n c r e a s e d l a g t i m e a n d l o w e r fi n a l c e l l d e n s i t y ( F i g u r e 9 . 1 B ) . T h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e r e i s a r e q u i r e m e n t o f C L f o r o p t i m a l r e s p i r a t o r y g r o w t h . 3 8 2 3 5 0 A a n a e r o b i c 3 0 0 ‘ W T ( 2 4 1 ) + 2 5 0 ‘ " " " C L - ( C L 3 ) 2 0 0 - M . “ g ; 1 5 0 - C 3 1 0 0 - f ; 5 0 - 8 I I I I I I I 3 0 8 1 6 2 4 3 2 4 0 4 8 5 6 6 4 g 1 6 0 . 3 1 4 0 1 B a e r o b i c < 1 2 0 . . + W T ( 2 . 4 . 1 ) " * " C L - ( C L 3 ) 1 0 0 - 8 0 - ~ 6 0 ~ 4 0 - 2 0 0 2 4 T 6 1 ' ; 1 2 1 6 2 1 2 3 2 7 T i m e ( H o u r ) F i g u r e 9 . 1 G r o w t h c u r v e s o f R . s p h a e r o i d e s w i l d t y p e ( A ; W T ; 2 . 4 . 1 ) a n d C L - d e fi c i e n t m u t a n t ( 0 ; C L — ; C L 3 , a l s o c a l l e d B C - m 3 ) s t r a i n s u n d e r A ) a n a e r o b i c p h o t o h e t e r o t r o p h i c g r o w t h , a n d B ) a e r o b i c c h e m o h e t e r o t r o p h i c g r o w t h c o n d i t i o n s , b o t h i n S i s t r o m ’ s m e d i a a t 3 0 ° C . T h e p r e s e n t e d d a t a a r e t h e a v e r a g e o f t h r e e i n d e p e n d e n t g r o w t h c u l t u r e s a n d t h e e r r o r b a r s a r e t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n s ( T h e e x p e r i m e n t s s h o w n h e r e w e r e p e r f o r m e d b y B a n i t a T a m o t a n d D r . C a r r i e H i s e r ) . 3 8 3 9 . 2 . 3 P r o d u c t i o n o f C c O i n R . s p h a e r a i d e s W T a n d C L — c e l l s T h e w i l d - t y p e 2 . 4 . 1 s t r a i n o f R . s p h a e r o i d e s n a t u r a l l y p r o d u c e s a l o w l e v e l o f C c O i n i t s m e m b r a n e s w h e n g r o w n u n d e r a e r o b i c c o n d i t i o n s ( F i g u r e 9 . 2 A ) . S i n c e t h i s s t r a i n h a s b e e n u s e d t o p r o d u c e a v a r i e t y o f l i p i d m u t a n t s [ 1 4 , 9 0 , 2 7 4 ] , i t w a s n e c e s s a r y t o d e m o n s t r a t e t h a t i t w a s a s u i t a b l e h o s t f o r C c O o v e r p r o d u c t i o n , i n o r d e r t o p r o v i d e a m o d e l s y s t e m f o r t e s t i n g t h e r o l e o f l i p i d s i n C c O a c t i v i t y . O p t i c a l d i f f e r e n c e s p e c t r a p r o v i d e a f a c i l e m e t h o d t o c a l c u l a t e t h e c o n c e n t r a t i o n o f C c O . I n t h e d i f f e r e n c e s p e c t r u m o f s o l u b i l i z e d m e m b r a n e p r o t e i n s o f t h e w i l d - t y p e 2 . 4 . 1 s t r a i n ( F i g u r e 9 . 2 A ) , t h e 6 0 6 n m p e a k , w h i c h i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f t h e a - t y p e h e m e s o f C c O , i s s m a l l r e l a t i v e t o t h e s i z e o f t h e 5 6 0 n m p e a k , w h i c h r e p r e s e n t s t h e l e v e l o f b - t y p e h e m e s o f t h e b c l c o m p l e x ( c o m p l e x I I I ) . A f t e r t h e C c O g e n e s w e r e i n t r o d u c e d a s p a r t o f t h e p l a s m i d p R K - p Y 1 1 2 3 H ( 2 . 4 . 1 + C c O ) , t h e p e a k c o r r e s p o n d i n g t o t h e 6 0 6 n m p e a k s t r o n g l y i n c r e a s e d c o n s i s t e n t w i t h o v e r p r o d u c t i o n o f C c O ( F i g u r e 9 . 2 B ) . W h e n t h i s p l a s m i d w a s i n t r o d u c e d i n t o t h e B C - m 3 C L - d e fi c i e n t s t r a i n , t h e r e l a t i v e l e v e l s o f C c O e x p r e s s i o n w e r e v a r i a b l e d e p e n d i n g o n t h e c u l t u r i n g t i m e a n d s i z e o f t h e c u l t u r e ( d a t a n o t s h o w n ) . H i g h l e v e l s o f € 1 9 0 w e r e p r o d u c e d i n s m a l l e r c u l t u r e s , w h i l e t h e l e v e l s o f C c O w e r e u s u a l l y l o w e r i n l a r g e r c u l t u r e s g r o w n f o r l o n g e r t i m e s f o r t h e p u r p o s e s o f l a r g e - s c a l e C c O p r o t e i n p r o d u c t i o n . T h i s o b s e r v a t i o n p o s s i b l y i n d i c a t e s a g r e a t e r s e n s i t i v i t y o f t h e m u t a n t t o s t r e s s e x p e r i e n c e d d u r i n g s u b c u l t u r i n g a n d d i l u t i o n i n t o l a r g e r fl a s k s . 3 8 4 5 6 0 n m 6 0 6 n m A b s o r b a n c e Q B ‘ / V \ ’ \ " 2 . 4 . 1 + C c O I | | 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 W a v e l e n g t h ( n m ) F i g u r e 9 . 2 O p t i c a l d i f f e r e n c e s p e c t r a o f d i t h i o n i t e - r e d u c e d m i n u s f e r r i c y a n i d e - o x i d i z e d s o l u b i l i z e d m e m b r a n e s f r o m R . s p h a e r o i d e s s t r a i n s 2 . 4 . 1 ( w i l d - t y p e , g r a p h A ) a n d 2 . 4 . 1 + C c O ( w i t h C c O p l a s m i d p Y J 1 2 3 H , g r a p h B ) , s h o w i n g t h e l e v e l s o f G o o ( i n d i c a t e d b y h e m e a p e a k a t 6 0 6 n m ) p r o d u c e d i n R . s p h a e r o i d e s 2 . 4 . 1 s t r a i n s w i t h o u t C c O g e n e s a d d e d o n a p l a s m i d . T h e s p e c t r a a r e n o r m a l i z e d t o t h e 5 6 0 n m ( h e m e b ) p e a k . T h e e x p e r i m e n t s s h o w n h e r e w e r e p e r f o r m e d b y D r . C a r r i e H i s e r . 3 8 5 [ I 1 1 1 1 1 i t a d . 9 . 2 . 4 P r o p e r t i e s o f C c O p u r i fi e d f r o m w i l d t y p e a n d c l s m u t a n t c e l l l i n e s T a b l e 9 . 1 s h o w s t h e s p e c t r a l p r o p e r t i e s a n d e n z y m a t i c a c t i v i t i e s o f C c O p r o t e i n p u r i fi e d f r o m f o u r R . s p h a e r o i d e s c e l l l i n e s o v e r p r o d u c i n g a s u b u n i t I - h i s t i d i n e — t a g g e d w i l d - t y p e v e r s i o n o f C c O . T h e S o r e t a n d a l p h a b a n d s i n t h e o p t i c a l ( r e d u c e d - o n l y ) s p e c t r a a r e d i a g n o s t i c f o r t h e n a t i v e s t a t e a n d t h e a m o u n t o f t h e h e m e c e n t e r s o f C c O . T h e p o s i t i o n s o f t h e s e m a x i m a f r o m t h e C L — d e fi c i e n t m u t a n t c e l l l i n e ( B C - m 3 + C c O ) a n d t h e C L - p r o fi c i e n t c o n t r o l ( 2 . 4 . 1 + C c O ) w e r e t h e s a m e , i n d i c a t i n g t h a t t h e a b s e n c e o f t h e C I S g e n e i n B C - m 3 + C c O d i d n o t i m p a i r i t s a b i l i t y t o c o r r e c t l y a s s e m b l e a n d i n s e r t t h e m e t a l c e n t e r s i n t o C c O . A d d i t i o n o f a c o p y o f t h e C I S g e n e o n a p l a s m i d t o e i t h e r t h e m u t a n t c e l l l i n e ( t o c r e a t e B C - m 3 + C c O + c l s ) o r t h e c o n t r o l c e l l l i n e ( t o c r e a t e 2 . 4 . 1 + C c O + c l s ) d i d n o t a l t e r t h e d i f f e r e n c e s p e c t r a m a x i m a o f t h e p u r i fi e d e n z y m e s . T h e e n z y m a t i c a c t i v i t i e s o f C c O p u r i fi e d f r o m B C - m 3 + C c O a n d 2 . 4 . 1 + C c O w e r e a l s o v e r y s i m i l a r , i n d i c a t i n g t h a t t h e e n z y m e p u r i fi e d f r o m t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t c e l l s i s a s a c t i v e a s t h a t p u r i fi e d fi ' o m t h e c o n t r o l c e l l s . T h e a c t i v i t i e s o f t h e C c O p r o t e i n s f r o m t h e t w o c e l l l i n e s w i t h t h e c l s g e n e a d d e d b a c k w e r e s i m i l a r t o e a c h o t h e r , b u t s l i g h t l y h i g h e r t h a n t h e a c t i v i t i e s f r o m t h e t w o l i n e s w i t h o u t t h e a d d e d c l s g e n e . T h e a c t i v i t i e s o f a l l p u r i fi e d C c O s i n c r e a s e d i n t h e p r e s e n c e o f e x t e r n a l l y - a d d e d l i p i d s . T h i s c o m m o n l y o b s e r v e d p h e n o m e n o n w a s s o m e w h a t v a r i a b l e a n d i s g e n e r a l l y r e l a t e d t o t h e e x t e n t o f d e l i p i d a t i o n o f C c O d u r i n g t h e p u r i fi c a t i o n p r o c e s s [ 3 3 ] . T h e p e r c e n t i n c r e a s e s w i t h a d d e d l i p i d s w e r e s i m i l a r f o r C c O f r o m a l l c e l l l i n e s . 3 8 6 C 2 2 B B e l . . C C l - 4 4 - L 1 1 i + + 3 n C C + 3 + . . m m e c C c O 0 c C l s + c c o O + c l s G W W c A A G c e 1 : l i c c l t t m n d G “ s s t e e T T y w A n y y i p d e p p t e d e e A h t e h d i d h w d d c e r r t e fi a t e l i d c p i ) S P P ( 4 4 4 4 p r u n 4 4 4 4 e o r m 5 5 5 5 f 0 ) e s o C ( 6 6 6 6 6 n 0 0 0 0 m 6 6 6 6 A w L ( 1 1 1 1 c i i 5 t p t " i i h ) 0 3 0 5 0 6 0 0 0 2 4 0 1 y t t v o d i u s A d 1 : 1 1 : 4 1 1 1 0 0 0 0 A ( A c 8 1 1 1 1 v e t “ i d ) 4 4 1 0 0 0 d 3 6 4 5 3 0 i t y d 1 1 1 1 L w i 5 1 1 1 s 1 i p 0 2 1 6 t i “ 0 0 4 0 h d * 1 ” d d 0 * 9 1 0 1 e 1 @ t i h d s a i d e v e 1 i A A 2 2 3 2 c t n c d r i d 8 7 3 4 : : 1 1 1 s t 2 4 m 4 e y L 1 1 / 0 % % n i p 1 i w i 1 * a 1 T a b l e 9 . 1 S p e c t r a l a n d e n z y m a t i c p r o p e r t i e s o f C 0 0 p u r i fi e d f r o m R . s p h a e r o i d e s w i l d - t y p e a n d B C - m 3 ( a l s o c a l l e d C L 3 ) c e l l l i n e s I . I A l l s t r a i n s p r o d u c e d H i s - t a g g e d C c O f r o m p Y J 1 2 3 H . T h e p o s i t i o n s o f t h e S o r e t a n d a l p h a p e a k s f r o m t h e o p t i c a l s p e c t r a o f d i t h i o n i t e - r e d u c e d C c O a r e l i s t e d . T h e m o l e c u l a r a c t i v i t y o f p u r i fi e d C c O a t p H 6 . 5 i s p r e s e n t e d a s t u r n o v e r n u m b e r ( m o l e s c y t o c h r o m e c o x i d i z e d p e r m o l e C c O p e r s e c o n d ) i n t h e a b s e n c e o r p r e s e n c e o f e x t e r n a l l y - a d d e d l i p i d s . @ . # . T h e n u m b e r o f r n d e p e n d e n t m e a s u r e m e n t s w a s 2 * , 3 , o r 5 . ( T h e e x p e r r m e n t s s h o w n h e r e w e r e p e r f o r m e d b y D r . C a r r i e H i s e r ) . 3 8 7 9 . 3 R e s u l t s 9 . 3 . 1 M A L D I a n a l y s i s o f t h e m e m b r a n e l i p i d s e x p r e s s i n g C c O T h e n e g a t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a o b t a i n e d b y d i r e c t a n a l y s i s o f i s o l a t e d m e m b r a n e s f r o m t h e w i l d - t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) a n d C L - d e fi c i e n t ( B C - m 3 + C c O ) s t r a i n s o f R . s p h a e r o i d e s a r e s h o w n i n F i g u r e s 9 . 3 A a n d 9 . 3 B , r e s p e c t i v e l y , a n d t h e M S s p e c t r a o f t h e t w o w i t h i n s e r t i o n o f t h e C L s y n t h a s e g e n e ( 2 . 4 . 1 + C c O + c l s a n d B C - m 3 + C c O + c l s ) a r e s h o w n i n F i g u r e s 9 . 3 C a n d 9 . 3 D , r e s p e c t i v e l y . N o t e t h a t w h i l e M A L D I i s n o t g e n e r a l l y c o n s i d e r e d t o b e a r i g o r o u s l y q u a n t i t a t i v e m e t h o d , d u e t o i s s u e s a s s o c i a t e d w i t h m a t r i x / s a m p l e h e t e r o g e n e i t y , w h e n e x p e r i m e n t s o n e a c h s a m p l e a r e p e r f o r m e d i n p a r a l l e l u n d e r i d e n t i c a l s a m p l e h a n d l i n g a n d d a t a a c q u i s i t i o n c o n d i t i o n s , w i t h m u l t i p l e r e p l i c a t e s s u c h a s t h e e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d h e r e , s e m i - q u a n t i t a t i v e i n f o r m a t i o n c a n b e o b t a i n e d . S i m i l a r l i p i d s , i n c l u d i n g G P E t n , G P G r o , S Q D G , a n d C L , w e r e o b s e r v e d i n t h e i s o l a t e d m e m b r a n e s o f b o t h s t r a i n s ( c o m p a r e F i g u r e s 9 . 3 A a n d 9 . 3 B ) , a l b e i t w i t h d i f f e r e n t a b u n d a n c e s . T h e m a j o r m o l e c u l a r s p e c i e s o f l i p i d s d e t e c t e d i n t h e s e s t r a i n s i n n e g a t i v e i o n m o d e M A L D I M S i n c l u d e t h e p h o s p h o l i p i d s G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 a n d G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , s u l f o l i p i d s S Q D G 1 6 : 0 / 1 6 : 0 , S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 , S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 0 , S Q D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 a n d S Q D G 1 8 : 0 / 1 8 z l , a n d c a r d i o l i p i n s C L ( 1 8 : 1 ) 4 , C L ( 1 6 : 1 ) 1 ( 1 8 : 1 ) 3 , C L ( 1 6 : 0 ) 1 ( 1 8 : 1 ) 3 a n d C L ( 1 8 : 0 ) 1 ( 1 8 : 1 ) 3 . N o t a b l y , t h e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f C L i n t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t m e m b r a n e w a s o b s e r v e d t o b e a p p r o x i m a t e l y 5 % c o m p a r e d t o t h e m e m b r a n e s a m p l e f r o m t h e C L - p r o fi c i e n t s t r a i n , r e l a t i v e t o t h e i o n a b u n d a n c e s o f S Q D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 a n d S Q D G l 8 : 0 / 1 8 : 1 l i p i d s , t h e m o s t a b u n d a n t i o n s w i t h i n t h e r a n g e o f d i s p l a y . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e 3 8 8 r e s u l t s o b t a i n e d f r o m r a d i o i s o t o p e l a b e l i n g d a t a [ 1 5 ] . I n c o n t r a s t , t h e a b u n d a n c e o f t h e G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 a n d S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 0 l i p i d s p e c i e s a p p e a r e d t o i n c r e a s e i n t h e c l s m u t a n t m e m b r a n e . T h e i d e n t i t i e s o f e a c h o f t h e m e m b r a n e l i p i d s p e c i e s l a b e l e d i n t h e s e fi g u r e s w e r e c o n fi r m e d b y t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ( M S / M S ) a n a l y s i s ( d a t a n o t s h o w n ) . F i g u r e 9 . 3 C s h o w s t h e m a s s s p e c t r u m o f t h e w i l d t y p e a n d c l s m u t a n t e x p r e s s i n g C c O a f t e r i n s e r t i o n o f t h e c l s p l a s m i d . A s e x p e c t e d , t h e m e m b r a n e l i p i d p r o fi l e f r o m t h e 2 . 4 . 1 + C c O + c l s s t r a i n s h o w n i n F i g u r e 9 . 3 C w a s v e r y s i m i l a r t o t h a t o f 2 . 4 . 1 + C c O s h o w n i n F i g u r e 9 . 3 A . C o m p a r e d t o F i g u r e 9 . 3 B , h o w e v e r , t h e a d d i t i o n o f c l s t h e C L — d e fi c i e n t m u t a n t r e s u l t e d i n o n l y a m o d e r a t e i n c r e a s e i n t h e C L a b u n d a n c e ( F i g u r e 9 . 3 D ) . 3 8 9 F i g u r e 9 . 3 N e g a t i v e i o n m o d e M A L D I - M S s p e c t r a o f i s o l a t e d m e m b r a n e s f r o m C L — p r o fi c i e n t a n d C L - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s . A ) W i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) , B ) C L - d e fi c i e n t m u t a n t ( B C - m 3 + C c O ) , C ) W i l d t y p e w i t h c l s g e n e ( 2 . 4 . 1 + C c O + c l s ) a n d D ) C L - d e fi c i e n t m u t a n t w i t h c l s g e n e ( B C - m 3 + C c O + c l s ) , e a c h a t 0 . 2 5 m g / m L m e m b r a n e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n . T h e i d e n t i t i e s o f l a b e l e d i o n s i n e a c h s p e c t r u m w e r e c o n fi r m e d b y M S / M S e x p e r i m e n t s . I o n s l a b e l e d w i t h a s t e r i s k s w e r e i d e n t i fi e d a s 2 , 5 - D H B m a t r i x c l u s t e r a d d u c t s . A l l s t r a i n s w e r e p r o d u c e d f r o m p Y J 1 2 3 H C c O . 3 9 0 ) % ( e c n a d n u b A e v i t a l e R 7 4 2 . 5 [ G P E t n l 8 z l / 1 8 : 1 — H ] ‘ 7 7 3 . 5 [ G P G 1 6 1 8 : 1 / 1 8 : 1 — H 1 ' 1 7 9 3 . 5 [ S Q D G 1 6 2 0 / 1 6 : 0 — H ] ‘ ' r 8 1 9 5 [ S Q D G 1 6 . 0 / 1 8 : 1 H 1 ' _ _ ' / ‘ . 8 2 1 . 5 [ S Q D G 1 6 0 / 1 8 - 0 H 1 ' l 4 5 6 - 0 [ C L ( 1 8 - 1 ) 4 - H l ! l l l . 1 l , ‘ . . . . . . 8 4 7 . 5 [ S Q D G 1 8 : 0 / 1 8 . 1 H 1 ' K 1 . 1 . - 8 4 5 . 5 [ S Q D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 - H ] ' K " 6 0 1 4 2 8 . 0 [ C L 1 6 : 1 ( 1 8 : 1 ) 3 - H ] ' 4 0 1 4 3 0 . 0 [ C L 1 6 : 0 ( 1 8 : 1 ) 3 - H ] ; 2 0 i l l - L I I “ . 4 1 _ . . l d l A L ‘ A - 8 . 1 r I I I fi — - — r — — I ' — — 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 8 1 9 5 1 4 . 1 4 3 1 6 3 8 2 1 5 8 4 5 . 5 9 5 9 B v . 1 4 9 7 . 9 8 0 7 9 3 - 5 8 4 7 . 5 7 7 3 . 5 6 0 7 4 2 5 1 5 3 5 . 8 4 0 1 * ; 1 4 5 6 . 0 [ C L ( 1 8 : 1 ) 4 - H ] ' 2 ° 1 . 1 1 . 5 . fi _ fi _ _ I _ — — I _ — I _ ' — ‘ I — - T fi - _ 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 1 0 0 8 4 7 . 5 \ 1 4 9 5 . 9 C 8 0 7 4 2 5 1 4 9 7 . 9 6 0 1 1 4 2 8 . 0 [ C L 1 6 : 1 ( 1 8 : 1 ) 3 - H ] ' 4 0 6 9 9 - ' 1 4 3 0 . 0 [ C L 1 6 : O ( 1 8 : 1 ) - H 1 ' 1 5 3 5 . 8 3 \ 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 _ 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 4 . 7 8 e 3 3 1 9 5 8 4 5 5 _ L - _ l s m e m 1 0 0 3 5 8 2 1 5 8 4 7 5 1 4 5 6 0 [ C L ( 1 8 : 1 ) 4 - H ] ' 1 4 9 5 9 D 8 0 1 4 9 7 9 6 0 7 4 2 . 5 \ 7 7 3 ? v 1 4 2 8 . 0 [ C L 1 6 . 1 ( 1 8 : l ) 3 - H T § 1 5 3 5 . 8 1 4 3 0 . 0 [ C L 1 6 : 0 ( 1 8 : 1 ) 3 - H 1 ' 1 2 0 _ I “ 1 1 1 1 1 . 1 . L I A L n l l l A _ ' | . ‘ L l L I “ 6 0 0 ' 1 0 0 0 1 2 0 0 ' 1 4 0 0 ' 1 6 ' 0 0 m / z 3 9 1 T h e p o s i t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a o f t h e m e m b r a n e s o f t h e w i l d - t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) a n d C L — d e fi c i e n t ( B C - m 3 + C c O ) s t r a i n s , a n d t h e s t r a i n s w i t h a c l s i n s e r t i o n ( 2 . 4 . 1 + C c O + c l s a n d B C - m 3 + C c O + c l s ) o f R . s p h a e r o i d e s a r e s h o w n i n F i g u r e s 9 . 4 . A b u n d a n t G P C h o l i p i d s p e c i e s , a s w e l l a s o r n i t h i n e l i p i d s ( 0 L ) , a n d a n o v e l t y p e o f g l u t a r n i n e l i p i d s ( Q L ) ( C h a p t e r 5 ) , w e r e o b s e r v e d . T h e p o s i t i v e i o n m o d e M A L D I M S m a i n l y r e v e a l e d G P C h o l i p i d s ( G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , G P C h o 1 8 : 1 / 1 9 : 1 ) a n d G P E t n l i p i d s ( G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 ) a s p r o t o n a t e d i o n s a n d a s n o n - c o v a l e n t a l k a l i a d d u c t i o n s w i t h s o d i u m a n d p o t a s s i u m , a n d t h e l o w e r - a b u n d a n c e i o n s o f o r n i t h i n e l i p i d s ( O L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 9 : 1 ) a n d g l u t a m i n e l i p i d s . C o m p a r i s o n o f F i g u r e 9 . 4 A w i t h F i g u r e 9 . 4 8 s u g g e s t e d t h a t t h e G P C h o , G P E t n a n d o r n i t h i n e l i p i d s m o l e c u l a r s p e c i e s a r e n o t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t e d b y t h e c l s m u t a t i o n , e i t h e r i n m o l e c u l a r d i v e r s i t y o r i n r e l a t i v e q u a n t i t y . . A s i m i l a r c o n c l u s i o n c a n b e o b t a i n e d a f t e r t h e c l s g e n e i n s e r t i o n ( F i g u r e s 9 . 4 C a n d 9 . 4 D ) . N o t e t h a t , a l t h o u g h n o t d i s p l a y e d i n F i g u r e 9 . 4 , t h e c a r d i o l i p i n C L ( 1 8 : 1 ) 4 c a n s o m e t i m e s a l s o b e o b s e r v e d a s s i n g l y p o s i t i v e - c h a r g e d d i - s o d i u m a d d u c t i o n s a t m / z 1 4 9 5 . 9 i n t h e p o s i t i v e i o n m o d e M A L D I M S u s i n g 2 , 5 - d i h y d r o x y l b e n z o i c a c i d ( 2 , S - D H B ) a s t h e m a t r i x f o r t h e w i l d t y p e ( s e e C h a p t e r 3 f o r a d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f m e t h o d s ) . 3 9 2 F i g u r e 9 . 4 P o s i t i v e i o n m o d e M A L D I - M S s p e c t r a o f i s o l a t e d m e m b r a n e s f r o m R . S p h a e r o i d e s s t r a i n s : A ) w i l d t y p e ( 2 . 4 . 1 + C c O ) , B ) C L — d e fi c i e n t m u t a n t ( B C - m 3 + C c O ) , C ) w i l d t y p e w i t h c l s g e n e i n s e r t i o n ( 2 . 4 . 1 + C c O + c l s ) a n d D ) C L - d e fi c i e n t m u t a n t w i t h c l s g e n e i n s e r t i o n ( B C - m 3 + C c O + c l s ) , a n a l y z e d a t 0 . 2 5 m g / m L p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n . A l l s t r a i n s p r o d u c e C c O f r o m p Y J 1 2 3 H . 3 9 3 ) % ( e c n a d n u b A e v i t a l e R 7 8 6 [ G P C h 0 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + H ] + 8 0 0 [ G P C h o l 8 : 1 / 1 9 : 1 + H ] + / 8 0 8 [ G P C h 0 1 8 : 1 / 1 8 2 1 + N a ] + \ . 5 . 6 6 e 4 7 6 6 [ G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + N a ] + 1 1 / 8 2 4 [ G P C h 0 1 8 . 1 / 1 8 2 1 + K ] + A 1 0 0 \ 1 . . 1 1 1 6 0 7 4 4 [ G P E t n 1 8 : l / 1 8 : 1 + H ] ' 1 ‘ 4 0 7 1 9 [ 0 L / 3 i ' 9 9 3 2 0 1 \ i 1 8 3 8 [ G P C h 0 1 8 : 1 / 1 9 : 1 + K ] + 2 0 6 1 8 . H ] . > ‘ , I L M _ n L 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 5 . 8 8 4 8 0 8 1 8 6 0 . 8 0 0 4 0 6 0 3 7 1 9 7 6 6 3 8 3 8 2 0 6 1 8 1 7 4 4 ) , A A L A - L a u e . A 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 8 . 2 8 e 4 7 8 6 c 8 0 6 0 3 6 0 7 1 9 7 6 6 8 0 ? 8 0 0 : 3 6 1 8 l 7 4 4 l " ; 8 3 8 A A i A i - L L A - L L L L 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 5 . 1 2 e 4 8 2 4 7 8 6 C L - c / s m e m D 8 0 8 8 3 8 6 1 0 0 8 0 6 0 1 7 6 6 4 0 6 0 3 7 1 9 7 4 4 l 8 0 0 1 2 0 6 1 1 8 1 1 . 1 1 0 0 6 5 0 0 l - l . 7 0 0 7 ? 8 0 0 m / z 3 9 4 1 1 1 . - 8 5 0 9 0 0 9 5 0 9 . 3 . 2 P u r i fi c a t i o n a n d c r y s t a l l i z a t i o n o f C 6 0 f r o m c l s m u t a n t a n d w i l d t y p e L i k e t h e B C - m 3 + C c O ( a l s o c a l l e d C L 3 + C c O ) s t r a i n d e s c r i b e d e a r l i e r , t h e C c O p r e p a r e d f r o m t h e c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t s t r a i n 1 6 9 C L 3 ( w i t h a g e n o m e c o n t a i n i n g w i l d t y p e c o x I , I I , I I I a n d I V , a n d t h e d e l e t i o n o f c l s , a n d a p l a s m i d c o n t a i n i n g w i l d t y p e c o x I a n d I I I , h i s t i d i n e - t a g g e d c o x I I a n d s h o r t c o x I V ) , w h i c h i s s p e c i a l l y d e s i g n e d f o r c r y s t a l l i z a t i o n , i s a l s o e x p r e s s e d a t h i g h y i e l d , a n d t h e C c O p u r i fi e d b y u s i n g t h e F P L C w i t h N i - N T A c o l u m n s h a d U V - V i s s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s t h a t c l o s e l y r e s e m b l e t h o s e o f t h e w i l d t y p e ( F i g u r e 9 . 5 ) . T h e p u r i fi e d C c O s a l l c o n t a i n f o u r s u b u n i t s ( I , I I I I I a n d I V ) a s r e v e a l e d b y M A L D I - T O F M S a n d S D S - P A G E a n a l y s e s ( s e e C h a p t e r 1 0 f o r t h e S D S - P A G E o f t h e p u r i fi e d l 6 9 - 2 . 4 . 1 a n d 1 6 9 C L 3 C c O s ; o t h e r d a t a n o t s h o w n ) . T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l s o f C c O , m e a s u r e d b y U V - V i s s p e c t r o s c o p y , c o m p a r e d t o t h e t o t a l m e m b r a n e p r o t e i n s m e a s u r e d b y t h e B C A a s s a y ( s e e C h a p t e r 3 f o r a d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f t h e m e t h o d s ) c o n s i s t e n t l y i n d i c a t e d a h i g h e r l e v e l i n t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t t h a n i n t h e w i l d t y p e , u s i n g t h e l a r g e - c u l t u r e - v o l u m e g r o w t h s , b u t s e e m e d t o b e v a r i a b l e i n s m a l l - c u l t u r e g r o w t h s . T h e F P L C - p u r i fi e d f r o m c a r d i o l i p i n — c o n t a i n i n g s t r a i n s , 1 6 9 W T a n d 1 6 9 - 2 . 4 . 1 C c O s ( s e e T a b l e 3 . 1 i n C h a p t e r 3 f o r d e t a i l e d d e s c r i p t i o n s o f t h e s t r a i n s ) , w e r e a n a l y z e d b y p h o s p h a t e a n a l y s i s a n d f o u n d t o c o n t a i n 7 - 8 p h o s p h a t e s p e r m o l e c u l e o f C c O , a n d t h e p u r i fi e d c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t 1 6 9 C L 3 C c O c o n t a i n e d a b o u t 6 - 7 p h o s p h a t e s p e r C c O ( C h a p t e r 7 ) . 3 9 5 e c n a b r o s b A 1 - . — . . . . . . . _ . _ . _ I . > . — — . . . . — - — _ — _ - _ " - . _ n _ " 2 ‘ _ _ - — — o _ — — " — . , ‘ . I _ _ W T ( 1 6 9 W T ) o x i d i z e d — . - W T ( 1 6 9 W T ) f u l l y - r e d u o e d - - - - - - - - C L - ( 1 6 9 0 L 3 ) o x i d i z e d - - - - C L - ( 1 6 9 0 L 3 ) f u l I y - r e d u o e d A V V T m a g m n ) I ' 1 ' 1 ' 1 ' 1 1 C L - ( 1 6 9 C L 3 ) s - - “ . - . u n - l . _ fl . . . ~ - _ _ _ ‘ H e m e a 6 0 6 n m I \ I \ \ " I n k , . u - t z g l w n n r x f — w l I l l l l l 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 W a v e l e n g t h ( n m ) F i g u r e 9 . 5 O x i d i z e d a n d r e d u c e d s p e c t r a o f F P L C - p u r i fi e d C c O f r o m A ) 1 6 9 W T ( W T ) a n d B ) 1 6 9 C L 3 ( C L - ) s t r a i n s g r o w n a e r o b i c a l l y a t 3 0 ° C . U s i n g C c O p u r i fi e d f r o m c a r d i o l i p i n - c o n t a i n i n g ( 1 6 9 W T a n d l 6 9 - 2 . 4 . 1 ) s t r a i n s a n d c l s m u t a n t ( 1 6 9 C L 3 ) s t r a i n s , b o t h f o u r - s u b u n i t C c O c r y s t a l s a n d t w o - s u b u n i t C c O c r y s t a l s ( s u b u n i t I a n d I I ) w e r e o b t a i n e d u n d e r t h e s a m e r a n g e o f c r y s t a l l i z a t i o n c o n d i t i o n s , a s i n d i c a t e d b y t h e X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y a n a l y s i s . F u r t h e r m o r e , t h e r e s o l u t i o n o b t a i n e d f o r t h e f o u r - s u b u n i t C c O c r y s t a l s f r o m t h e C L — d e fi c i e n t m u t a n t w a s 3 9 6 s i m i l a r t o t h a t o f f o u r - s u b u n i t c r y s t a l s ( 3 . 2 A ) f r o m t h e C L — p r o fi c i e n t s t r a i n ( T a b l e 9 . 2 ) , b a s e d o n d o z e n s o f p u r i fi c a t i o n r e p e a t s o f t h e w i l d t y p e a n d t h e m u t a n t g r o w n i n p a r a l l e l o v e r t w o y e a r s ’ e f f o r t s . T h u s , t h e s t r o n g l y d e c r e a s e d l e v e l s o f C L o b s e r v e d i n t h e m e m b r a n e l i p i d p r o fi l e d i d n o t p r e v e n t t h e c r y s t a l l i z a t i o n o f f o u r - s u b u n i t o r t w o - s u b u n i t C 0 0 . T h e f o u r - s u b u n i t C c O c r y s t a l s g e n e r a t e d f r o m 1 6 9 W T a n d 1 6 9 C L 3 w e r e f u r t h e r r e d i s s o l v e d / r e s u s p e n d e d a n d e x a m i n e d b y M A L D I a n a l y s i s . T a b l e 9 . 2 C r y s t a l l o g r a p h y s c r e e n i n g r e s u l t s o f C c O c r y s t a l s o b t a i n e d f r o m C c O e x p r e s s e d i n t h e R . s p h a e r o i d e s w i l d t y p e ( C L + ) ( 1 6 9 W T a n d 1 6 9 - 2 . 4 . l ) a n d c l s m u t a n t ( C L - ) ( 1 6 9 C L 3 ) a t d i f f e r e n t c r y s t a l g r o w t h t e m p e r a t u r e s . C C O c r y s t a l 4 - s u b u n i t 2 - s u b u n i t ( I a n d I I ) r e s o l u t i o n 4 0 c 2 0 ° C 1 6 9 W T ( C L - 1 ; ) 3 . 4 A n / a 1 6 9 - 2 . 4 . 1 ( C L + ) 3 . 3 A 2 . 9 A 1 6 9 C L 3 ( C L - ) 3 . 2 A 3 . 3 A 9 . 3 . 3 M A L D I a n a l y s i s o f t h e l i p i d s i n t h e r e - d i s s o l v e d f o u r - s u b u n i t C c O c r y s t a l s F i g u r e 9 . 6 s h o w s t h e n e g a t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a o b t a i n e d b y d i r e c t a n a l y s i s o f t h e i s o l a t e d m e m b r a n e s o f C L - p r o fi c i e n t ( 1 6 9 W T ) a n d C L - d e fi c i e n t ( 1 6 9 C L 3 ) c r y s t a l l o g r a p h y s t r a i n s ( F i g u r e s 9 . 6 A a n d 9 . 6 B , r e s p e c t i v e l y ) t h a t w e r e s p e c i a l l y e n g i n e e r e d a n d o p t i m i z e d f o r s u b s e q u e n t c r y s t a l l i z a t i o n o f t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e , a n d t h e s p e c t r a o b t a i n e d f r o m t h e r e - d i s s o l v e d c r y s t a l s g r o w n f r o m t h e s e s t r a i n s 3 9 7 ( F i g u r e 9 . 6 C a n d 9 . 6 D , r e s p e c t i v e l y ) . F i g u r e 9 . 7 s h o w s t h e M A L D I M S o f t h e s e s a m p l e s i n p o s i t i v e i o n m o d e . T h e d a t a i n F i g u r e s 9 . 6 A a n d 9 . 6 3 ( n e g a t i v e i o n m o d e ) a n d F i g u r e s 9 . 7 A a n d 9 7 3 ( p o s i t i v e i o n m o d e ) i n d i c a t e t h a t t h e s e s t r a i n s d e s i g n e d w i t h o p t i m i z a t i o n f o r c r y s t a l l o g r a p h y h a d m e m b r a n e l i p i d p r o fi l e s t h a t w e r e s i m i l a r t o t h o s e s t r a i n s u s e d f o r a l l t h e o t h e r a n a l y s e s ( F i g u r e 9 . 3 A a n d 9 . 3 8 , a n d F i g u r e s 9 . 4 A a n d 9 . 4 8 , r e s p e c t i v e l y ) . M A L D I a n a l y s i s o f r e - d i s s o l v e d c r y s t a l s o f C 6 0 p r o d u c e d f r o m t h e s e t w o s t r a i n s r e v e a l s t h a t i n t h e C L - p r o fi c i e n t s t r a i n , 1 6 9 W T ( F i g u r e 9 . 6 C ) , a b u n d a n t G P G r o a n d C L l i p i d s p e c i e s w e r e r e t a i n e d . T h e p r e s e n c e o f t h e s e s p e c i e s , a s w e l l a s G P E t n a n d a l l o f t h e S Q D G s p e c i e s o b s e r v e d i n t h e m e m b r a n e , a l b e i t a t l o w a b u n d a n c e , w e r e c o n fi r m e d b y C I D M S / M S ( F i g u r e s 9 . 8 a n d 9 . 9 A - C ) . I n a d d i t i o n t o t h e a b u n d a n t C L ( 1 8 : 1 ) 4 , m i n o r s p e c i e s o f C L ( 1 6 : 1 ) 1 ( 1 8 : 1 ) 3 a n d C L ( 1 6 : 0 ) 1 ( 1 8 2 1 ) 3 w e r e a l s o f o u n d t o b e r e t a i n e d i n t h e p r o t e i n c r y s t a l s , i n t r o d u c i n g a p o t e n t i a l s o u r c e o f h e t e r o g e n e i t y . I n t h e p o s i t i v e i o n m o d e , G P C h 0 1 8 2 1 / 1 8 z l a n d C L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 9 : l w e r e a l s o o b s e r v e d t o b e m a i n t a i n e d i n t h e f o u r - s u b u n i t C c O c r y s t a l s ( F i g u r e s 9 . 7 a n d 9 . 9 D ) . I n c o n t r a s t , t h e r e - d i s s o l v e d C c O c r y s t a l s f r o m t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t , 1 6 9 C L 3 , ( F i g u r e 9 . 6 D ) c l e a r l y r e v e a l e d s i g n i fi c a n t l y d e c r e a s e d l e v e l s o f C L l i p i d s p e c i e s a s w e l l a s h i g h e r a b u n d a n c e s o f t h e S Q D G s p e c i e s , c o m p a r e d t o t h o s e o b s e r v e d i n t h e c r y s t a l s f r o m t h e C L - p r o fi c i e n t s t r a i n . T h e G P G r o l i p i d s p e c i e s w e r e a l s o o b s e r v e d t o i n c r e a s e i n a b u n d a n c e t o s o m e e x t e n t . G P E t n , G P C h o a n d C L ( p o s i t i v e i o n m o d e ) l i p i d s w e r e o b s e r v e d i n t h e p o s i t i v e i o n m o d e a t s i m i l a r l e v e l s c o m p a r e d t o t h o s e i n t h e c r y s t a l s a m p l e o f t h e C L - p r o fi c i e n t s t r a i n ( F i g u r e s 9 . 7 C a n d 9 . 7 D ) . 3 9 8 F i g u r e 9 . 6 N e g a t i v e i o n m o d e M A L D I - M S s p e c t r a o f i s o l a t e d m e m b r a n e s a n d C c O p r o t e i n c r y s t a l s f r o m C L - p r o fi c i e n t a n d C L - d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s . A ) I s o l a t e d m e m b r a n e f r o m C L - p r o fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s ( 1 6 9 W T ) , B ) i s o l a t e d m e m b r a n e f r o m C L - d e fi c i e n t m u t a n t R . s p h a e r o i d e s ( 1 6 9 C L 3 ) , C ) C c O p r o t e i n c r y s t a l s f r o m C L - p r o fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s ( 1 6 9 W T ) , a n d D ) C c O p r o t e i n c r y s t a l s f r o m C L — d e fi c i e n t R . s p h a e r o i d e s m u t a n t ( 1 6 9 C L 3 ) . A l l s t r a i n s p r o d u c e m o d i fi e d C c O f r o m p C H 1 6 9 , a n d t h e c r y s t a l c o n t a i n s f o u r s u b u n i t s . I o n s l a b e l e d w i t h a s t e r i s k s w e r e i d e n t i fi e d a s 2 , 5 - D H B m a t r i x c l u s t e r a d d u c t s . T h e i d e n t i t i e s o f l a b e l e d i o n s i n e a c h s p e c t r u m w e r e c o n fi r m e d b y M S / M S e x p e r i m e n t s ( s e e F i g u r e s 9 . 8 a n d 9 . 9 f o r s o m e o f t h e s p e c t r a ) . 3 9 9 1 4 3 0 . 0 [ C L 1 6 : 0 ( 1 8 : 1 ) 3 - H ] _ 1 5 3 5 . 8 ) % ( e c n a d n A 0 N 0 u b A e v i t a l e R O ’ I O O O - C O O D r - I \ A ( b L » 7 4 2 . 5 [ G P E t n 1 8 : l / l 8 : l - H ] _ 7 7 3 . 5 [ G P G r o l 8 : 1 / 1 8 : l — H ] _ 7 9 3 . 5 [ S Q D G l 6 2 0 / 1 6 2 0 - H ] — 1 1 8 1 9 . 5 [ S Q D G l 6 z 0 / 1 8 z l - H ] _ 8 2 1 . 5 [ S Q D G 1 6 2 0 / 1 8 2 0 - H ] _ 1 4 5 6 . 0 [ C L ( 1 8 : 1 ) 4 - H ] _ v . . . . . . . . . . . . . 8 4 5 . 5 [ S Q D G 1 8 z 1 / 1 8 : 1 — H 1 ‘ < - - - - - - - - - - - 8 4 7 . 5 [ S Q D G 1 8 z 0 / 1 8 2 1 - H ] _ 1 1 4 9 5 9 1 4 2 8 . 0 [ C L 1 6 ; 1 ( 1 8 : 1 ) 3 - H 1 ‘ é 1 4 9 7 - 9 1 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 “ 9 ' 5 8 2 1 . 5 . 1 8 4 5 5 C ' - m e m 7 9 3 5 ‘ - 5 - . 8 4 7 . 5 1 4 9 5 . 9 7 7 3 - 5 1 1 4 9 7 . 9 7 4 2 ' . 5 1 1 4 5 6 . 0 [ C L ( 1 8 : 1 ) 4 - H ] _ 1 5 3 5 . 8 . 1 1 . L L A L L J . 1 I L A l k L L l l l . ‘ . A A 1 ; . . . - l n I t { _ A ‘ 6 0 0 I I I I I I I 1 — — l ’ — ‘ _ 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 X 2 1 4 5 6 . 0 C L 1 8 : 1 ) 4 ' H ] - " " - A C 1 * “ U c r y s t a l 1 4 9 5 . 9 1 4 2 8 . 0 [ C L 1 6 : 1 ( 1 8 : 1 ) 3 - H ] - 1 4 9 7 . 9 L 4 0 1 4 3 0 . 0 [ C L 1 6 : 0 ( 1 8 : 1 ) 3 - H 1 \ 2 0 _ i 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 ' 1 4 ' 0 0 ' 1 6 0 0 7 . 5 2 e 3 , , 8 1 9 - 5 8 4 5 5 x 2 1 4 9 5 9 D ' 1 0 0 8 2 1 . 5 . . 8 0 * - C L " c r y s t a l 1 4 9 7 . 9 6 0 - 1 4 5 6 . 0 [ C L ( 1 8 : 1 ) 4 - H ] _ 0 . 2 - 0 . 7 e r 4 0 ’ . 1 ' 2 0 “ L A L m l I L L I I L I n ; ‘ 4 _ . _ . 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 ‘ 1 2 0 0 1 4 0 0 ' 1 6 ' 0 0 m / z 4 0 0 ' 1 - c e l l 1 1 1 1 M S : 1 0 1 1 1 8 1 1 1 m u c h ‘ 1 f o u n d ( C L U E t n e c h 5 1 1 1 1 1 5 1 1 1 0 1 8 0 9 . 3 2 1 1 I t i s a l s o n o t e w o r t h y t h a t t h e m a j o r m o l e c u l a r s p e c i e s o f c a r d i o l i p i n i n t h e i s o l a t e d c e l l m e m b r a n e s a n d t h e C c O c r y s t a l s c o n t a i n s C L w i t h f o u r 1 8 : 1 f a t t y a c y l c h a i n s C L ( 1 8 : 1 ) 4 ( F i g u r e 9 . 3 , a n d F i g u r e s 9 . 8 A - B ) . T w o m i n o r s p e c i e s o f c a r d i o l i p i n c o n t a i n i n g C L ( 1 6 : 1 ) 1 ( 1 8 : 1 ) 3 , C L ( 1 6 : O ) 1 ( 1 8 : 1 ) 3 a n d C L ( l 8 : O ) 1 ( 1 8 : 1 ) 3 w e r e d e t e c t e d a t m u c h l o w e r a b u n d a n c e s ( F i g u r e 9 . 8 ) . H o w e v e r , t h e p r e d o m i n a n t c a r d i o l i p i n s p e c i e s f o u n d i n m a m m a l i a n m i t o c h o n d r i a c o n t a i n i n g t e t r a l i n o l e o y l f a t t y a c y l c h a i n s , L 4 C L ( C L ( 1 8 : 2 ) 4 ) , w h i c h w e r e p r o v e n t o b e e s s e n t i a l f o r t h e n o r m a l f u n c t i o n o f m a m m a l i a n c y t o c h r o m e c o x i d a s e a n d m i t o c h o n d r i a [ 8 , 6 8 , 7 0 ] , i s n o t o b s e r v e d i n M S o f a n y o f t h e s t r a i n s o f R . s p h a e r o i d e s e x a m i n e d i n t h e c u r r e n t s t u d y . T h e C I D M S / M S e v i d e n c e f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f s o m e o f t h e m a j o r l i p i d m o l e c u l a r s p e c i e s t h a t r e m a i n b o u n d i n t h e f o u r - s u b u n i t C c O c r y s t a l s i s s h o w n i n F i g u r e 9 . 8 a n d F i g u r e 9 . 9 . 4 0 1 7 8 6 [ G P C h o l 8 : l / 1 8 : 1 + H ] + 8 O O I G P C h 0 1 8 1 / 1 9 1 + H ] 8 0 8 [ G P C h 0 1 8 : 1 / 1 8 1 . 1 1 1 1 1 + / 8 2 4 [ G P C h o l 8 : 1 / 1 8 : 1 + K ] A 1 . + i 8 0 - 7 4 4 [ G P E t n 1 8 1 / 1 8 2 1 + H ] \ ' C L + m e m _ 1 - 3 1 3 . 4 7 6 6 [ G P E t n 1 8 1 / 1 8 . 1 + N a ] + \ . 1 0 0 - 1 1 6 0 ; 7 1 9 [ 0 L 3 o H 2 0 : 1 \ 1 J 1 8 3 8 [ G P C h o l 8 : 1 / 1 9 ; 1 + 1 < 1 + 4 0 ; 6 0 3 / 1 9 : 1 + H 1 2 0 1 £ 1 8 ‘ . 1 . 2 1 - . . 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 : ) 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 A 1 . 7 8 4 3 8 0 g 6 0 6 0 3 g 4 0 8 3 8 ' 3 2 0 . l - A n - E 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 ' 3 3 4 4 . 3 4 7 1 9 [ 0 L 3 0 1 1 2 0 4 7 1 9 1 1 4 1 1 ] + 8 5 2 1 1 1 6 1 1 1 6 1 2 ? ‘ 3 ‘ 1 0 7 1 9 [ Q L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 + H 1 + 7 2 1 [ Q L 3 0 s z 1 / 1 8 : 0 + H 1 + 7 3 1 [ 0 L 3 - : O H 2 0 1 / 2 0 : 2 + H 1 + 6 3 0 7 1 9 8 3 5 7 2 1 7 3 1 7 8 6 8 0 8 C C L + c r y s t a l 7 8 6 [ G P C h o l 8 z l / 1 8 : 1 + H ] + A L A 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 7 . 1 3 6 3 8 5 2 1 0 0 C L - c r y s t a l D 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 F i g u r e 9 . 7 P o s i t i v e i o n m o d e M A L D I - M S s p e c t r a o f i s o l a t e d m e m b r a n e s ( A a n d B ) a n d C c O c r y s t a l s ( C a n d D ) f r o m C L - p r o fi c i e n t ( 1 6 9 W T ) a n d C L - d e fi c i e n t ( 1 6 9 C L 3 ) R . s p h a e r o i d e s . 4 0 2 { 3 7 3 - 3 % 6 9 9 3 1 4 5 5 . 9 A 8 0 o 1 6 Q C L 3 6 0 ” € 5 9 c r y s t a l 4 0 4 1 7 8 3 5 ' C L ( 1 8 1 1 ) 4 2 0 i . n . i . . . L . . L . . L A J L L ‘ L I L . L I I I I I “ — 1 — I I 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 1 8 0 0 $ 9 1 6 3 6 2 6 9 9 1 4 5 5 . 9 B E 8 0 1 6 9 W T g 6 0 c r y s t a l “ U . g 4 0 4 1 7 8 3 5 C L ( 1 8 . 1 ) 4 é 2 ° 1 . l . . E 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 1 8 0 0 ( U 3 1 4 2 9 . 9 M 1 0 0 6 9 9 g ” 2 9 9 1 6 9 W T 2 3 6 7 3 c r y s t a l 4 0 4 1 7 8 0 1 9 8 3 5 C L ( 1 6 1 0 ) 1 1 : 1 2 0 1 L a A . . . l J “ A “ . I n n . L A U I L ‘ . L ( 8 ) 3 I I I I I — _ T ' I I 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 1 8 0 0 1 4 2 7 . 8 1 0 0 g 1 4 2 ” 1 6 9 W T 2 3 c r y s t a l 6 9 9 - 4 0 6 7 1 / A ” ( 1 8 3 - 1 1 1 2 0 4 1 7 I I l l “ L 1 . 1 “ A M A . 3 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 m 1 / 2 0 0 1 4 0 0 1 6 0 0 1 8 0 0 Z F i g u r e 9 . 8 I d e n t i fi c a t i o n o f t h e c a r d i o l i p i n m o l e c u l a r s p e c i e s i n t h e f o u r - s u b u n i t C c O c r y s t a l s f r o m C L - p r o fi c i e n t ( 1 6 9 W T ) a n d C L — d e fi c i e n t ( 1 6 9 C L 3 ) R . s p h a e r o i d e s u s i n g C I D M S / M S i n n e g a t i v e i o n m o d e o n a M A L D I - l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r . 4 0 3 A 8 . 1 8 e 1 2 8 1 1 8 : 1 R C 0 0 ' 1 0 0 [ 1 1 7 7 3 1 6 Q C L 3 8 0 0 c r y s t a l : 8 4 1 7 5 0 9 7 7 3 G P G r o 1 1 1 1 1 1 . l I l 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 \ ° 1 1 6 3 5 . 3 1 5 3 7 8 1 9 B 3 1 ; 8 0 \ 5 6 3 $ 8 1 9 1 6 9 W T E 6 0 2 2 5 h e a d g r o u p c r y S t a l 2 1 6 : 0 / 1 8 : 1 g 0 1 J . . l l . I . . 4 . “ L A . “ - l m t 1 . . - - n . I ] . . 1 . a t . » L I , 0 T I I I I I . 1 ; 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 < 6 2 2 . B e ] 8 4 7 C 1 0 0 8 4 7 1 6 9 W T 8 0 5 6 3 c r y s t a l 6 0 4 0 2 2 5 h e a d g r o u p R 5 6 5 S Q D G 1 8 : 0 / 1 8 : 1 2 0 h L , . . . . a . . . A _ 1 A . l 4 . . 4 . . . : L I I J . 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 4 . 4 3 e I 7 0 1 — ( 1 1 2 0 ) D 1 0 0 7 1 9 ( + v e ) 8 0 4 0 5 g 1 6 9 W T 6 0 c r y s t a l 4 0 2 9 1 3 8 7 4 2 3 C L 3 - O H 2 0 \ . \ . l 2 0 : 1 / 1 9 : 1 I . . 1 . L r . 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 8 0 0 7 0 0 8 0 0 m / z F i g u r e 9 . 9 I d e n t i fi c a t i o n o f t h e m a j o r l i p i d s i o n s i n t h e C c O c r y s t a l s f r o m C L - p r o fi c i e n t ( 1 6 9 W T ) a n d C L - d e fi c i e n t ( 1 6 9 C L 3 ) R . s p h a e r o i d e s u s i n g C I D M S / M S i n p o s i t i v e a n d n e g a t i v e i o n m o d e s o n a M A L D I - l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r . 4 0 4 9 . 4 D i s c u s s i o n s 9 . 4 . 1 R e s i d u a l C L i n t h e c a r d i o l i p i n d e f i c i e n t m u t a n t T o u n d e r s t a n d t h e r o l e o f C L i n C 6 0 o f R . s p h a e r o i d e s , t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t B C - m 3 ( a l s o c a l l e d C L 3 ) w a s c o n s t r u c t e d b y i n a c t i v a t i o n o f t h e g e n e ( c l s ) i d e n t i fi e d a s e n c o d i n g C L s y n t h a s e b y i t s a b i l i t y t o c o m p l e m e n t t h e p s s - l c l s d o u b l e m u t a n t o f E . c o l i [ 3 2 9 ] . T h e c l s - e n c o d e d e n z y m e c a t a l y z e s t h e s y n t h e s i s o f C L f r o m t w o G P G r o m o l e c u l e s [ 3 3 0 ] . L i p i d a n a l y s i s s h o w e d a s i g n i fi c a n t r e d u c t i o n i n t h e l e v e l o f C L i n t h e m u t a n t m e m b r a n e s ( F i g u r e 9 . 3 a n d F i g u r e 9 . 6 ) , b u t a l o w a m o u n t o f C L ( < 1 0 % w t ) w a s d e t e c t e d b y q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e l i p i d s u s i n g r a d i o i s o t o p e l a b e l i n g a n d b y m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s o f l i p i d s i n t h e m e m b r a n e a n d r e - d i s s o l v e d c r y s t a l s f r o m t h e m u t a n t ( F i g u r e 9 . 6 a n d 9 . 8 ) . T h e s o u r c e o f t h i s r e s i d u a l C L i n t h e m u t a n t s t i l l n e e d s t o b e d e t e r m i n e d . B a s e d o n t h e o b s e r v a t i o n s m a d e i n t h e E . c o l i c l s k n o c k - o u t m u t a n t , w h i c h s h o w s a l o w a m o u n t o f C L [ 3 3 1 ] , i t c a n b e s p e c u l a t e d t h a t a n a l t e r n a t i v e p a t h w a y f o r C L b i o s y n t h e s i s c o u l d a l s o e x i s t i n R . s p h a e r o i d e s . I n t h e E . c o l i c l s k n o c k o u t m u t a n t , o v e r e x p r e s s i o n o f t h e p s s g e n e l e d t o a n i n c r e a s e i n t h e C L l e v e l [ 3 3 1 ] , s u g g e s t i n g t h a t p h o s p h a t i d y l s e r i n e s y n t h a s e h a s C L s y n t h a s e a c t i v i t y . I n a s i m i l a r e x p e r i m e n t , i t h a s b e e n o b s e r v e d t h a t t h e e x p r e s s i o n o f t h e p s s g e n e ( G e n B a n k p r o t e i n I D Y P _ 3 5 3 7 9 7 ) f r o m R . s p h a e r o i d e s i n t h e E . c o l i S D 9 s t r a i n r e s u l t e d i n t h e s y n t h e s i s o f C L ( u p t o 1 % ) w h i c h s h o w e d d e p e n d e n c e o n t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f t h e g e n e [ 1 5 ] . T h u s , a s o b s e r v e d f o r E . c o l i , p h o s p h a t i d y l s e r i n e s y n t h a s e m a y b e t h e s o u r c e o f t h e r e s i d u a l C L i n t h e B C - m 3 m u t a n t o f R . s p h a e r o i d e s [ 1 5 ] . 4 0 5 9 . 4 . S p i a l e . \ 1 9 . 4 . 2 M o l e c u l a r c o m p o n e n t s o f C L s p e c i e s i n R . s p h a e r o i d e s F u r t h e r t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h e C L m o l e c u l a r s p e c i e s i n t h e m e m b r a n e , t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e s , a n d t h e C c O p r o t e i n c r y s t a l s , a r e m a i n l y C L ( 1 8 : 1 ) 4 , w h i l e m u c h l e s s a b u n d a n t C L ( 1 6 : 1 ) 1 ( 1 8 : 1 ) 3 a n d C L ( 1 6 : O ) 1 ( 1 8 : 1 ) 3 a r e a l s o p r e s e n t i n a l l o f t h e s t a g e s o f p u r i fi c a t i o n a n d c r y s t a l l i z a t i o n . I n c o n t r a s t t o t h e m a m m a l i a n m i t o c h o n d r i a , w h e r e C L ( 1 8 : 2 ) 4 a n d n o t C L ( 1 8 : 1 ) 4 i s t h e p r e d o m i n a n t a n d f u n c t i o n a l l y e s s e n t i a l s p e c i e s , t h e R . s p h a e r o i d e s c o n t a i n e d n o C L ( 1 8 : 2 ) 4 d e t e c t a b l e b y M S i n t h e m e m b r a n e o r i n t h e p u r i fi e d a n d c r y s t a l l i z e d C c O p r o t e i n c o m p l e x . O n e o f t h e e s s e n t i a l f u n c t i o n a l r o l e s o f c a r d i o l i p i n f o r t h e r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s , i n p a r t i c u l a r c y t o c h r o m e c o x i d a s e , a n d f o r t h e o v e r a l l m i t o c h o n d r i a i n m a m m a l i a n s y s t e m s , h a s b e e n p r o p o s e d t o b e d u e t o t h e p e r o x i d i z a b i l i t y o f t h e 1 8 : 2 u n s a t u r a t e d f a t t y a c y l c h a i n s , a n d t h e 1 8 : 1 a c y l c h a i n c o m p o n e n t s [ 8 , 6 8 , 7 0 ] . C L ( 1 8 : 2 ) 4 i s f o u n d t o b e t h e p r e d o m i n a n t C L s p e c i e s i n h e a l t h y m i t o c h o n d r i a , a n d a r e l a t i v e d e c r e a s e o f t h e 1 8 : 2 c a r d i o l i p i n c o m p o n e n t h a s b e e n c o r r e l a t e d t o f a i l i n g m i t o c h o n d r i a [ 6 8 , 7 0 ] . C L ( 1 8 : 2 ) 4 w a s a l s o f o u n d t o a c t i v a t e c y t o c h r o m e c o x i d a s e m o r e e f fi c i e n t l y t h a n o t h e r l i p i d s [ 6 0 ] . T h e 1 8 : 2 a c y l c h a i n i s a s e n s i t i v e t a r g e t f o r p e r o x i d a t i o n b y r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s p r o d u c e d m a i n l y i n t h e r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s ; b y f o r m i n g a c o m p l e x w i t h c y t o c h r o m e c , p e r o x i d i z e d c a r d i o l i p i n t r i g g e r s t h e r e l e a s e o f c y t o c h r o m e c f r o m t h e m i t o c h o n d r i a , l e a d i n g t o c e l l a p o p t o s i s [ 6 7 ] . C o m p a r e d t o t h e m o r e u n s a t u r a t e d 1 8 : 2 a c y l c h a i n s , t h e 1 8 : 1 f a t t y a c y l c h a i n s p r o d u c e d p r e d o m i n a n t l y i n b a c t e r i a a r e l e s s o f a t a r g e t f o r o x i d a t i o n . T h e o b s e r v e d d i fi ‘ e r e n c e i n c a r d i o l i p i n m o l e c u l a r c o m p o n e n t s i m p l i e s f u n d a m e n t a l d i f f e r e n c e s i n t h e f u n c t i o n a l r o l e s t h a t c a r d i o l i p i n m i g h t p l a y i n t h e b a c t e r i a l 4 0 6 o r y e a s t s y s t e m a n d i n t h e m a m m a l i a n s y s t e m s , a n d t h i s b r i n g s a c a u t i o n a r y n o t e f o r i n t e r p r e t i n g t h e r e s u l t s o b t a i n e d f r o m b a c t e r i a l s y s t e m s , v e r s u s t h o s e f r o m m a m m a l i a n s y s t e m s . 9 . 4 . 3 C L a n d g r o w t h o f R . s p h a e r o i d e s T h e B C - m 3 C L - d e fi c i e n t m u t a n t s h o w e d s o m e d e c r e a s e d g r o w t h u n d e r r e s p i r a t o r y c o n d i t i o n s , s u g g e s t i n g t h a t a n o r m a l l e v e l o f C L i s i m p o r t a n t f o r r o b u s t r e s p i r a t o r y g r o w t h . A s i m i l a r e f f e c t o f C L d e fi c i e n c y o n r e s p i r a t o r y g r o w t h h a s b e e n o b s e r v e d i n a S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e c r d I A m u t a n t , i n w h i c h t h e l o s s o f C L a f f e c t s t h e s t a b i l i t y o f t h e r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s [ 6 5 , 6 6 , 3 3 2 ] . T h e p h o t o s y n t h e t i c g r o w t h o f t h e B C - m 3 m u t a n t w a s n o t a f f e c t e d , p r o b a b l y b e c a u s e o t h e r l i p i d s s u c h a s G P G r o s u b s t i t u t e d f o r C L . I t h a s b e e n s h o w n t h a t G P G r o i s p r e f e r e n t i a l l y i n c r e a s e d i n p u r p l e b a c t e r i a d u r i n g p h o t o s y n t h e t i c g r o w t h [ 3 3 3 ] . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e l e v e l o f C L n e e d e d f o r p h o t o s y n t h e t i c g r t h i s n o t a s h i g h a s t h a t n e e d e d f o r r e s p i r a t o r y g r o w t h , a n d t h e r e f o r e t h e l o w l e v e l o f C L r e t a i n e d b y t h e B C - m 3 m u t a n t c o u l d b e s u f fi c i e n t u n d e r p h o t o s y n t h e t i c c o n d i t i o n s . A l t e r n a t i v e l y , C L m a y b e o n l y r e q u i r e d d u r i n g s t r e s s s i t u a t i o n s . O s m o t i c s t r e s s d u r i n g g r o w t h h a s b e e n s h o w n t o i n c r e a s e C L s y n t h e s i s i n R . s p h a e r o i d e s [ 3 3 4 ] . V a r i a b l e , b u t o f t e n l o w e r , l e v e l s o f C c O p r o d u c t i o n w a s o b s e r v e d f r o m B C - m 3 C c O o v e r p r o d u c i n g c u l t u r e s , a r e s p o n s e w h i c h m a y b e d u e t o t h e a d d e d s t r e s s o f s u b c u l t u r i n g , d i l u t i o n a n d g r o w t h a t h i g h o x y g e n l e v e l s a n d h i g h p H ( a p p r o a c h i n g s t a t i o n a r y p h a s e ) . D e t e r m i n i n g a s p e c i fi c r o l e o f C L d u r i n g r e s p i r a t o r y g r t h i n R . s p h a e r o i d e s r e q u i r e s f u r t h e r a n a l y s i s b e y o n d t h e s c o p e o f t h i s w o r k . 4 0 7 9 - 4 - 4 A r o l e f o r C L i n t h e f u n c t i o n o r a s s e m b l y o f C 6 0 o f R . s p h a e r o i d e s L o w l e v e l s o f C L d i d n o t a p p r e c i a b l y a f f e c t t h e a s s e m b l y o f C c O i n t h e B C - m 3 m u t a n t o r t h e a c t i v i t y o f t h e p u r i fi e d e n z y m e ( T a b l e 9 . 2 ) . T h i s C c O a l s o c r y s t a l l i z e d i n t h e s a m e m a n n e r a s t h a t p u r i fi e d f r o m C L - p r o fi c i e n t c e l l s , p r o d u c i n g f o u r - s u b u n i t c r y s t a l s t h a t d i f f r a c t e d t o t h e s a m e l e v e l a s c r y s t a l s fi ' o m t h e C L p r o fi c i e n t s t r a i n . I t w a s C r i t i c a l t o d e t e r m i n e w h e t h e r , d e s p i t e t h e l o w C L l e v e l s , C c O w a s a b l e t o p r e f e r e n t i a l l y s e q u e s t e r e n o u g h C L f o r i t s n e e d s . H o w e v e r , t h e M S a n a l y s e s r e p r o d u c i b l y d e m o n s t r a t e d t h a t t h e p u r i fi e d e n z y m e a n d t h e c r y s t a l s d i d n o t c o n c e n t r a t e C L t o a n y l e v e l a b o v e t h a t f o u n d i n t h e m e m b r a n e s . I t i s t e m p t i n g t o c o n c l u d e t h a t C L i s n o t e s s e n t i a l f o r t h e S t r u C t u r e , fi m c t i o n o r c r y s t a l l i z a t i o n o f C c O , c o n s i s t e n t w i t h s e v e r a l p r e v i o u s s t u d i e s u s i n g b a c t e r i a l a n d y e a s t s y s t e m s [ 2 3 , 7 1 , 3 2 8 ] , d e s p i t e n u m e r o u s b i o c h e m i c a l a n d b i o p h y s i c a l s t u d i e s i n m a m m a l i a n s y s t e m s [ 8 , 5 4 , 5 7 , 6 8 ] w h i c h s u g g e s t o t h e r w i s e . A l o w I e V e l o f C L i s s t i l l p r e s e n t i n t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e a n d c r y s t a l s ( F i g u r e s 9 . 6 a n d 9 . 8 ) f r o m t h e m u t a n t , a n d t h i s s m a l l a m o u n t o f C L m u s t b e m o r e r i g o r o u s l y q u a n t i fi e d t o a b s o l u t e l y e s t a b l i s h t h a t i t i s n o t r e p r e s e n t a t i v e o f a t i g h t l y a n d s t o i c h i o m e t r i c a l l y b o u n d Q L t h a t i s n o t r e l e a s e d b y e i t h e r s o l v e n t e x t r a c t i o n o r M A L D I - M S m e t h o d s . A n o t h e r p o s s i b i l i t y i s t h a t C L m a y o n l y b e r e q u i r e d f o r m a i n t a i n i n g s u p e r c o m p l e x e s b e t w e e n C c O a n d o t h e r m e m b r a n e p r o t e i n s o f t h e r e s p i r a t o r y c h a i n , a n d n o t f o r t h e s t a b i l i t y o r a c t i v i t y o f C c O a l o n e . E x p e r i m e n t s i n y e a s t s u g g e s t t h a t c o I t t r p l e x e s I I I ( b c l ) a n d I V ( C c O ) d o n o t f o r m t h e n o r m a l l e v e l o f s u p e r c o m p l e x e s i n t h e m i t o c h o n d r i a o f C L - d e fi c i e n t m u t a n t s , a n d C L - d e fi c i e n t y e a s t c u l t u r e s a l s o g r e w m o r e 4 0 8 5 1 C ) s l o w l y a n d t o a l o w e r fi n a l d e n s i t y t h a n w i l d - t y p e y e a s t c u l t u r e s [ 6 5 ] . S i m i l a r l y , t h e B C - 1 1 1 3 m u t a n t s h o w e d s l o w e r g r t h u n d e r r e s p i r a t o r y c o n d i t i o n s i n t h i s s t u d y ( F i g u r e 9 . 1 ) . W h e n a n a l y z i n g C c O d i r e c t l y , m a s s s p e c t r o m e t r i c d a t a s u g g e s t s t h a t o t h e r l i p i d s s u b s t i t u t e f o r C L . A r e l a t i v e i n c r e a s e i n t h e l e v e l s o f S Q D G a n d G P G r o w a s o b s e r v e d i n r e - d i s s o l v e d c r y s t a l s f r o m t h e l 6 9 / C L 3 m u t a n t s t r a i n ( F i g u r e s 9 . 6 C a n d 9 . 6 D ) . T h e i n c r e a s e i n G P G r o i n t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t w a s a l s o o b s e r v e d i n t h e m e m b r a n e s a r r n p l e s b y r a d i o i s o t o p e l a b e l i n g a n d m a s s s p e c t r o m e t r y . E a r l i e r s t u d i e s c o m p a r i n g t h e y e a s t c l s m u t a n t ( C L - d e fi c i e n t ) a n d p g s m u t a n t ( G P G r o a n d C L - d e fi c i e n t ) s u g g e s t e d t h a t C L i s n o t e s s e n t i a l f o r t h e f u n c t i o n s o f C c O o r m i t o c h o n d r i a i n y e a s t [ 2 3 , 7 1 , 3 2 8 ] , b u t c a n b e fi — ‘ l n c t i o n a l l y r e p l a c e d b y G P G r o [ 2 3 ] . T h e d i f f e r e n c e i n S Q D G w a s n o t a s o b v i o u s i n m e m b r a n e p r e p a r a t i o n s a n a l y z e d b y t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y o r b y m a s s s p e c t r o m e t r y , i 1 T 1 1 3 1 3 1 i n g t h a t i t m a y r e fl e c t t h e s e l e c t i v i t y o f C c O , n o t a g e n e r a l m e t a b o l i c r e s p o n s e a t t h e c e l l 1 . 1 1 a r l e v e l . S p e c i fi c a l l y b o u n d S Q D G m o l e c u l e s h a d b e e n p r e v i o u s l y r e s o l v e d i n t h e c r y s t a l s o f c y a n o b a c t e r i a l p h o t o s y s t e r n 1 1 [ 3 3 5 , 3 3 6 ] . T h e i n c r e a s e d a b u n d a n c e o f S Q D G i n fi l e r e - d i s s o l v e d C c O c r y s t a l s s u g g e s t s a p o s s i b l e c o m p e n s a t o r y r o l e f o r S Q D G d u r i n g C L d e fi c i e n c y , s i n c e b o t h a r e a n i o n i c l i p i d s , a n d S Q D G w a s f o u n d t o i n c r e a s e i n R . S p h a e r o i d e s m e m b r a n e s u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c o n d i t i o n s [ 1 4 ] . S t u d i e s i n R h o d o b a c t e r c a p s u l a t u s , w h i c h h a s n e i t h e r a C L n o r a n a a 3 - t y p e o x i d a s e , h a v e s u g g e s t e d a S i l n i l a r f u n c t i o n f o r o r n i t h i n e l i p i d [ 2 7 3 ] . T h i s t y p e o f l i p i d i s p r e s e n t i n t h e R . S p h a e r o i d e s m e m b r a n e s [ 1 8 4 ] b u t i s n o t a p p r e c i a b l y a l t e r e d i n B C - m 3 m e m b r a n e s , a s S e e n b y t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y a n d m a s s s p e c t r o m e t r y [ 1 8 4 ] . I n a p r e v i o u s s t u d y [ 3 5 ] h i g h r e s o l u t i o n ( 2 . 0 A ) , 2 - s u b u n i t w i l d - t y p e C c O c r y s t a l s W e r e o b t a i n e d w h i c h a p p e a r t o c o n t a i n a p o t e n t i a l C L b i n d i n g s i t e , b a s e d o n h o m o l o g y 4 0 9 w i t h t h e b o v i n e e n z y m e , e v e n t h o u g h t h e h e a d g r o u p w a s n o t r e s o l v e d . I t w a s a l s o f o u n d i n t h e c u r r e n t s t u d y t h a t t h e 2 - s u b u n i t c r y s t a l f o r m o f C 6 0 c a n b e p r o d u c e d f r o m t h e e n z y m e p u r i fi e d f r o m t h e 1 6 9 C L 3 m u t a n t s t r a i n ( T a b l e 9 . 3 ) . A n a l y s i s o f t h e s e c r y s t a l s s h o w e d t h a t t h e y d i f f r a c t a s w e l l a s t h e c r y s t a l s f r o m t h e C L - p r o fi c i e n t s t r a i n , b u t f u r t h e r a n a l y s i s w i l l . d e t e r m i n e w h e t h e r t h e p u t a t i v e C L b i n d i n g s i t e i s o c c u p i e d b y C L o r s u b s t i t u t e d b y S Q D G o r G P G r o . W h i l e a l l t h e r e c e n t s t u d i e s o n c a r d i o l i p i n i n m a m m a l i a n s y s t e m s p o i n t t o w a r d s a n e s s e n t i a l f u n c t i o n a l r o l e f o r t h i s l i p i d i n t h e r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s a n d m i t o c h o n d r i a , e n c o d e d i n t h e p o l y u n s a t u r a t e d 1 8 : 2 f a t t y a c y l c h a i n s , m o s t s t u d i e s w i t h t h e y e a s t a n d b a c t e r i a l s y s t e m s u s i n g a g e n e t i c s p e c i fi c - l i p i d - d e fi c i e n c y a p p r o a c h f o r s p e c i fi c l i p i d d e fi c i e n c y , f o u n d t h a t c a r d i o l i p i n a l o n e i s n o t e s s e n t i a l , a n d i t s f u n c t i o n s c a n b e r e p l a c e d b y l i p i d s s u c h a s G P G r o [ 2 3 , 7 1 , 3 2 8 ] , w h e r e a s t h e c o m b i n e d C L a n d G P G r o d e fi c i e n c y i n y e a s t s e v e r e l y a f f e c t s t h e a c t i v i t y o f b o t h C 0 0 a n d m i t o c h o n d r i a . 9 . 4 . 5 L i p i d m u t a n t s o f R . s p h a e r o i d e s a s t o o l s f o r t h e s t u d y o f m e m b r a n e p r o t e i n s O n e o f t h e m o t i v a t i o n s f o r s t u d y i n g t h e p r o d u c t i o n , p r o p e r t i e s , a n d c r y s t a l l i z a t i o n o f C 0 0 i n t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t o f R . s p h a e r o i d e s w a s t o t e s t t h e h y p o t h e s e s t h a t 1 ) C L i s a n e c e s s a r y c o m p o n e n t o f t h e f u l l y f u n c t i o n a l e n z y m e i n R . s p h a e r o z ' d e s ; a n d 2 ) t h e s p e c i fi c l i p i d c o m p o s i t i o n o f a m e m b r a n e p r o t e i n s a m p l e i s a n i m p o r t a n t f a c t o r i n a c h i e v i n g h i g h q u a l i t y c r y s t a l s . T h e b a s i s f o r t h e fi r s t h y p o t h e s i s w a s a w e a l t h o f b i o c h e m i c a l e v i d e n c e s u p p o r t i n g a r o l e f o r C L i n C 0 0 f u n c t i o n i n m a m m a l i a n s y s t e m s [ 1 , 3 2 4 , 3 2 5 , 3 3 7 ] . T h e b a s i s f o r t h e s e c o n d h y p o t h e s i s w a s t h e o b s e r v a t i o n o f s p e c i fi c a l l y b o u n d a n d c o n s e r v e d l i p i d s i n h i g h r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e s o f m e m b r a n e p r o t e i n s . A 4 1 0 f u n 0 1 6 1 1 1 0 1 ' C 1 4 c o m t h e $ 1 1 1 1 1 0 1 1 p 0 5 . h e n a d d 1 1 : 1 1 1 1 : 1 f u r t h e r m o t i v a t i o n f o r t h e s e s t u d i e s w a s t o e s t a b l i s h R . s p h a e r o i d e s a s a t o o l f o r t h e o v e r p r o d u c t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s , f r o m m a n y s o u r c e s , f o r s t r u c t u r a l s t u d i e s [ 3 3 8 ] b y p r o v i d i n g v e r s i o n s o f R . s p h a e r o i d e s w i t h d i f f e r e n t a n d c o n t r o l l e d l i p i d c o m p o s i t i o n s . T h e r e s u l t s s h o w n h e r e i n d e m o n s t r a t e t h a t i t i s p o s s i b l e t o o v e r p r o d u c e C c O i n a C L - d e fi c i e n t m u t a n t , a n d t h a t t h e p u r i fi e d e n z y m e i s f u l l y a c t i v e a n d g i v e s w e l l - r e s o l v e d c r y s t a l s , d e s p i t e a v e r y l o w C L c o n t e n t . T h e s e r e s u l t s a r g u e s t r o n g l y a g a i n s t b o t h o f t h e s t a r t i n g h y p o t h e s e s . H o w e v e r , h i g h e r r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e s , a n d a m o r e c o m p l e t e l y C L - d e fi c i e n t m u t a n t , a r e n e e d e d t o d i s p r o v e t h e s e h y p o t h e s e s , o r t o e s t a b l i s h w h e t h e r s o m e o f t h e r o l e s o f C L c a n b e s a t i s f a c t o r i l y s u b s t i t u t e d b y o t h e r l i p i d s p e c i e s . S i n c e a d d i t i o n a l l i p i d m u t a n t s o f R . s p h a e r o i d e s a r e c u r r e n t l y a v a i l a b l e [ 1 4 , 9 0 , 2 7 4 ] , c o m b i n i n g d i f f e r e n t l i p i d d e fi c i e n c i e s i n t o o n e e x p r e s s i o n s t r a i n , i n p r i n c i p l e , w i l l b e p o s s i b l e . T h i s a p p r o a c h , i n c o m b i n a t i o n w i t h t h e a n a l y t i c a l t e c h n i q u e s d e m o n s t r a t e d h e r e , w i l l e n a b l e n a r r o w i n g d o w n o f t h e s p e c i fi c i t y f o r C L r e p l a c e m e n t b y o t h e r l i p i d s . I n a d d i t i o n , t h e s e m u t a n t s p r o v i d e t o o l s f o r t h e p r o d u c t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n c o m p l e x e s t h a t p o s s i b l y r e q u i r e s p e c i fi c l i p i d e n v i r o n m e n t s f o r t h e i r s u c c e s s f u l o v e r p r o d u c t i o n a n d c r y s t a l l i z a t i o n . 4 1 1 C h a p t e r 1 0 C h a r a c t e r i z a t i o n o f a C a r d i o l i p i n - D e fi c i e n t M u t a n t o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s , u n d e r P h o s p h a t e - L i m i t e d a n d P h o s p h a t e - R i c h C o n d i t i o n s , w i t h R e g a r d t o C y t o c h r o m e c O x i d a s e P r o d u c t i o n , A c t i v i t y a n d L i p i d P r o fi l e M o d i fi c a t i o n 1 0 . 1 S u m m a r y I n t h i s c h a p t e r , a m e t a b o l i c a p p r o a c h w a s e m p l o y e d t o a l t e r t h e l i p i d p r o fi l e s o f t h e C c O - e x p r e s s i n g s t r a i n s o f R . s p h a e r o i d e s i n v i v o b y u s i n g a p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h m e d i u m . T h e p r o fi l e s o f a l l t h e p h o s p h o l i p i d s a n d n o n - p h o s p h o l i p i d s a r e c h a n g e d , i n c o n t r a s t t o t h e r e s u l t s f r o m t h e s i n g l e s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n c y a p p r o a c h a p p l i e d i n t h e p r e v i o u s c h a p t e r s . S u c h a l t e r a t i o n s c a n p r o v i d e f u r t h e r i n s i g h t i n t o t h e i n t e r - c h a n g e a b i l i t y b e t w e e n t h e p h o s p h o l i p i d s a n d n o n - p h o s p h o l i p i d s , i n a d d i t i o n t o t h e s i n g l e r e p l a c e m e n t p o s s i b i l i t i e s p r o p o s e d i n p r e v i o u s c h a p t e r s . T h e c o m b i n a t i o n o f t h e c o l l e c t i v e m e t a b o l i c d e fi c i e n c y a p p r o a c h w i t h t h e g e n e t i c s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n c y a p p r o a c h a l s o c r e a t e d a c l e a n e r C L — d e fi c i e n t s t r a i n t h a t c o n t a i n e d a b a r e l y d e t e c t a b l e l e v e l o f C L e v e n b y u s i n g M S / M S . T h e c e l l g r o w t h , C c O e x p r e s s i o n , a n d C c O p r o p e r t i e s w e r e c h a r a c t e r i z e d f o r t h e 1 6 9 - 2 . 4 . 1 ( W T ) a n d 1 6 9 C L 3 ( C L — ) s t r a i n s a e r o b i c a l l y g r o w n u n d e r p h o s p h a t e - a b u n d a n t a n d p h o s p h a t e - l i m i t i n g c o n d i t i o n s , r e s p e c t i v e l y , a n d t h e l i p i d 4 1 2 p r o fi l e s i n t h e m e m b r a n e a n d p u r i fi e d C c O fi ' o m t h e s e f o u r s a m p l e s w e r e e x a m i n e d b y q u a n t i t a t i v e E S I o r M A L D I M S a n d M S / M S . 4 1 3 1 0 . 2 I n t r o d u c t i o n 1 0 . 2 . 1 L i p i d p r o fi l e m o d u l a t i o n u s i n g p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h m e d i a T h e l i p i d b i o s y n t h e s i s o f b a c t e r i a i s h i g h l y s e n s i t i v e a n d a d a p t a b l e t o t h e c o m p o n e n t s i n t h e g r t h m e d i a [ 1 1 ] . I n a d d i t i o n t o t h e g e n e t i c m u t a t i o n s d e s c r i b e d i n C h a p t e r s 7 a n d 9 , t h e l i p i d p r o fi l e o f b a c t e r i a c a n a l s o b e m o d u l a t e d t h r o u g h m e t a b o l i c a p p r o a c h e s s u c h a s u s i n g l o w - p h o s p h a t e g r o w t h m e d i a [ 1 1 , 9 3 , 1 0 6 ] . S i n c e l i m i t e d p h o s p h a t e i n t h e g r o w t h m e d i a a f f e c t s a l l t y p e s o f p h o s p h a t e - c o n t a i n i n g l i p i d s , t h i s e x p e r i m e n t c a n b e u s e d a s a n o t h e r t o o l t o e v a l u a t e t h e f u n c t i o n a l s i g n i fi c a n c e o f p h o s p h o l i p i d s , a n d t h e p o t e n t i a l fi m c t i o n s o f n o n - p h o s p h o l i p i d s , i n v i v o , b y e x a m i n i n g w h e t h e r a n d h o w t h e p h o s p h o l i p i d s a n d n o n - p h o s p h o l i p i d s d i s p l a y f u n c t i o n a l e q u i v a l e n c e . P r e v i o u s s t u d i e s o f b o t h R . s p h a e r o i d e s [ 1 1 ] a n d S i n o r h i z o b i u m m e l i t o t i [ 9 3 , 1 0 6 ] f o u n d t h a t t h e b a c t e r i a c a n b e v i a b l e a t p h o s p h a t e c o n c e n t r a t i o n s a s l o w a s 0 . 1 m M ( c o m p a r e d t o t h e n o r m a l 2 0 m M [ 1 1 ] ) , b u t p h o s p h a t e - l i m i t i n g m e d i a s i g n i fi c a n t l y c h a n g e d t h e o v e r a l l m e m b r a n e l i p i d p r o fi l e s . T h e a m o u n t s o f p h o s p h o l i p i d s a r e s e e n t o b e s i g n i fi c a n t l y r e d u c e d , a n d n o v e l t y p e s o f p h o s p h a t e - f r e e l i p i d s a r e p r o d u c e d a t h i g h a b u n d a n c e [ 1 1 ] . P r e v i o u s l i p i d b i o c h e m i s t r y s t u d i e s f o u n d t h a t i n g r o w t h m e d i a c o n t a i n i n g a b u n d a n t p h o s p h a t e [ 1 6 , 9 0 ] , t h e m e m b r a n e s o f t h e w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s s t r a i n 2 . 4 . 1 c o n t a i n p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( G P E t n ) , p h o s p h o t i d y l c h o l i n e ( G P C h o ) , p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ( G P G r o ) a n d c a r d i o l i p i n ( C L ) , a n d t h e n o n p h o s p h o l i p i d s s u c h a s s u l f o l i p i d s s u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r i d e ( S Q D G ) a n d o r n i t h i n e l i p i d s ( 0 L ) , b u t p h o s p h o l i p i d s a r e t h e p r e d o m i n a n t c o m p o n e n t s . U n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h 4 1 4 c o n d i t i o n s , t h e n o v e l n o n - p h o s p h o l i p i d s g l y c o l i p i d s g l u c o s y l g a l a c t o s y l d i a c y l g l y c e r i d e ( G G D G ) a n d d i a c y l g l y c e r y l - N , N , N - t r i m e t h y l h o m o s e r i n e ( D G T S ) s t a r t e d t o b e p r o d u c e d , a n d t h e p r o d u c t i o n o f S Q D G a n d C L w e r e i n c r e a s e d [ 1 1 ] . D G T S i s p r o p o s e d t o f u n c t i o n a l l y c o m p e n s a t e f o r G P C h o , S Q D G f o r G P G r o , a n d C L f o r G P E t n , b a s e d o n t h e s i m i l a r i t y o f t h e c h a r g e s t a t e i n t h e h e a d g r o u p [ 1 1 , 1 4 , 2 8 9 ] . D G T S w a s a l s o f o u n d t o b e t h e p r e d o m i n a n t t y p e o f l i p i d s i n S i n o r h i z o b i u m m e l i t o t i u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h [ 9 3 ] . 1 0 . 2 . 2 C o m b i n i n g s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n t m u t a t i o n w i t h p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h A m u t a t i o n c a n c a u s e a s p e c i fi c d e fi c i e n c y i n a p a r t i c u l a r t y p e o f l i p i d , s u c h a s G P C h o , c a r d i o l i p i n ( C L ) o r S Q D G , b u t a t t h e s a m e t i m e , t h e a m o u n t o f s o m e o t h e r t y p e s o f l i p i d s a r e o f t e n s e e n t o i n c r e a s e , w h i c h i s t e m p t i n g t o i n t e r p r e t a s a c o m p e n s a t o r y m e c h a n i s m t o f u l fi l l t h e r e q u i r e d b i o l o g i c a l f u n c t i o n s . F o r e x a m p l e , i n t h e G P C h o - d e fi c i e n t s t r a i n w h e r e t h e p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e m e t h y l t r a n s f e r a s e i s m u t a t e d , G P E t n s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s e s , a n d t h e G P E t n i s r a t i o n a l i z e d t o b e a b l e t o f u n c t i o n a l l y r e p l a c e G P C h o b e c a u s e b o t h G P E t n a n d G P C h o c a n c a r r y a p o s i t i v e c h a r g e i n t h e h e a d g r o u p , a n d a r e h i g h l y s i m i l a r i n t h e r e s t o f t h e s t r u c t u r e [ 9 0 ] . A c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n c y w h i c h i s o f t e n c r e a t e d b y m u t a t i n g t h e c a r d i o l i p i n s y n t h a s e [ 1 5 , 2 3 ] , p r o d u c e d a n i n c r e a s e d l e v e l o f G P G r o l i p i d s , a n d i n t h a t s t u d y w h e n b o t h G P G r o a n d C L a r e g e n e t i c a l l y d e p l e t e d , t h e s t r a i n i s f o u n d n o t v i a b l e . T h e r e f o r e i t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e h i g h s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y o f G P G r o t o C L m a k e s G P G r o t h e e s s e n t i a l l i p i d t h a t c a n f u n c t i o n a l l y r e p l a c e C L [ 2 3 ] . O n t h e o t h e r h a n d S Q D G a n d G P G r o l i p i d s a p p e a r t o b e i n t e r - c h a n g e a b l e i n R . s p h a e r o i d e s b e c a u s e b o t h h a v e n e g a t i v e c h a r g e i n t h e h e a d g r o u p , 4 1 5 a n d ' o n 5 4 h e a d f u n c p h o s g r a n t h e 1 g m a n d t h e d e p l e t i o n o f b o t h S Q D G a n d G P G r o i s l e t h a l [ 1 4 ] . A n e f f e c t o f G P E t n - d e p l e t i o n o n s o m e m e m b r a n e p r o t e i n s c a n b e r e s t o r e d b y a t y p e o f p h o s p h o l i p i d c o n t a i n i n g a g l y c o h e a d g r o u p d u e t o s i m i l a r i t y i n t h e m o l e c u l a r s h a p e [ 1 ] . O n e q u e s t i o n r a i s e d f r o m c o m p a r i n g t h e s e p r e v i o u s fi n d i n g s i s , a r e s u c h t y p e s o f f u n c t i o n a l c o m p a t i b i l i t y d e t e r m i n e d m o r e b y t h e p h o s p h a t e g r o u p , b y t h e p h o s p h a t i d y l g l y c e r i d e s t r u c t u r e , b y t h e n e g a t i v e o r p o s i t i v e c h a r g e s t a t e , b y t h e h e a d g r o u p f u n c t i o n a l g r o u p s , o r b y t h e m o l e c u l a r s h a p e ? I f S Q D G c a n r e p l a c e G P G r o d u e t o t h e n e g a t i v e c h a r g e , a n d G P G r o c a n r e p l a c e C L l i k e l y d u e t o t h e s i m i l a r p h o s p h a t e h e a d g r o u p s , c a n t h e n o n - p h o s p h o l i p i d S Q D G t h e n r e p l a c e C L ( S c h e m e 1 0 . 1 ) ? ? fl \ I I I F S Q D G + — — > G P G r o D G T S ( — - — > G P C h o 0 L < - — — — > G P E t n Q L D D G D S c h e m e 1 0 . 1 P o s s i b l e f u n c t i o n a l i n t e r c h a n g e a b i l i t y b e t w e e n d i f f e r e n t t y p e s o f l i p i d s S i n c e m e t a b o l i c p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c a n d e c r e a s e t h e p r o d u c t i o n o f t h e e n t i r e s e t o f p h o s p h o l i p i d s , a n d i n c r e a s e t h e r e l a t i v e a m o u n t o f p o l a r n o n - p h o s p h o l i p i d s , i t s c o m b i n a t i o n w i t h t h e g e n e t i c a l l y p r o d u c e d s p e c i fi c l i p i d - d e fi c i e n c y s h o u l d b e a b l e t o p r o v i d e d e e p e r i n s i g h t s i n t o t h e f u n c t i o n a l s u b s t i t u t a b i l i t y b e t w e e n d i f f e r e n t t y p e s o f l i p i d s , a n d t h e r e f o r e a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e e s s e n t i a l i t y o f a p a r t i c u l a r t y p e o f l i p i d s , s u c h a s c a r d i o l i p i n . 4 1 6 I n t h i s c h a p t e r , t h e w i l d t y p e ( 1 6 9 - 2 . 4 . 1 ; W T ) a n d t h e c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t s t r a i n ( 1 6 9 C L 3 ; C L - ) o f R . s p h a e r o i d e s g r o w n i n n o r m a l - p h o s p h a t e a n d l o w - p h o s p h a t e m e d i a w e r e c o m p a r e d a n d t h e C c O e x p r e s s i o n l e v e l u n d e r t h e s e f o u r c o n d i t i o n s w e r e e x a m i n e d . T h e e n z y m e s o b t a i n e d f r o m t h e s e t w o d i f f e r e n t s t r a i n s u n d e r t h e s e t w o d i f f e r e n t g r o w t h c o n d i t i o n s w e r e c h a r a c t e r i z e d i n t h e m e m b r a n e , a n d a f t e r F P L C p u r i fi c a t i o n , w i t h r e s p e c t t o t h e U V - V i s s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s , s u b u n i t - c o m p o s i t i o n a n d e n z y m a t i c a c t i v i t y . T h e l i p i d p r o fi l e o f t h e m e m b r a n e a n d t h e p u r i fi e d e n z y m e s w a s a n a l y z e d b y u s i n g q u a n t i t a t i v e E S I a n d M A L D I M S a n d M S / M S , t o r e l a t e t h e o b s e r v e d b e h a v i o r s o f C c O a n d t h e R . s p h a e r o i d e s , t o t h e l i p i d c o m p o s i t i o n . 1 0 . 3 R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n s 1 0 . 3 . 1 C e l l g r o w t h , C c O e x p r e s s i o n i n m e m b r a n e s a n d p u r i fi c a t i o n s t a b i l i t y T h e w i l d t y p e ( 1 6 9 - 2 . 4 . l ; W T ) a n d t h e C L - d e fi c i e n t - m u t a n t s t r a i n ( 1 6 9 C L 3 ; C L — ) w e r e g r o w n i n p a r a l l e l w i t h b o t h p h o s p h a t e - l i m i t i n g a n d p h o s p h a t e - r i c h c o n d i t i o n s , a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 a n d i n t h e fi g u r e l e g e n d t o F i g u r e 1 0 . 1 . N o o b v i o u s d i f f e r e n c e w a s o b s e r v e d i n t h e c e l l c u l t u r e o p t i c a l d e n s i t y t h a t t h e s e c e l l s r e a c h a t h a r v e s t . T h e U V - V i s s p e c t r o s c o p i c a n a l y s i s o f t h e i s o l a t e d m e m b r a n e a l s o s h o w s v e r y s i m i l a r s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s f o r a l l o f t h e s e f o u r s a m p l e s w i t h n o a b s o r p t i o n p e a k s h i f t ( 6 0 6 n m ) o b s e r v e d ( F i g u r e 1 0 . 1 ) . T h e s e fi n d i n g s i n d i c a t e t h a t t h e R . s p h a e r o i d e s c a n m a k e t h e C c O i n n o r m a l a m o u n t s a n d l e v e l s o f p r o d u c t i o n , a n d w i t h t h e n o r m a l s t r u c t u r e a s r e fl e c t e d i n t h e n a t i v e s p e c t r a o f t h e r e d o x a c t i v e m e t a l c e n t e r s , e v e n w i t h b o t h C L — d e fi c i e n c y a n d p h o s p h a t e - d e fi c i e n c y . T h e p u r i fi c a t i o n p r o fi l e s f r o m N i - N T A F P L C a r e a l s o v e r y s i m i l a r 4 1 7 o f f t h e 0 1 5 f o r t h e s e f o u r s a m p l e s , i n t e r m o f t h e p e a k e l u t i o n c o n d i t i o n s a n d t h e r e l a t i v e a b u n d a n c e s o f t h e e l u t e d p e a k s ( d a t a n o t s h o w n ) , a s w e l l a s p u r i fi c a t i o n y i e l d s . I t a p p e a r s t h a t n e i t h e r t h e C L — d e fi c i e n c y n o r p h o s p h a t e - d e fi c i e n c y , n o r b o t h , a f f e c t s t h e p r o d u c t i o n , a s s e m b l y , o r s t a b i l i t y o f t h e m u l t i - s u b u n i t c o m p l e x p r o t e i n C c O , d u r i n g e n z y m e p u r i fi c a t i o n . 4 1 8 H e m e a — m e m W T / P + H e m e b c l 5 5 0 / 5 6 0 n m 3 6 0 6 n m - - - - - - - - m e m C L — / P + ' ' — ' m e m W T / P — 0 0 2 8 _ . m e m C L — / P — 0 0 2 4 — 0 . 0 2 0 — ‘ 1 ’ 5 . , _ = . 0 . = ' . = . — e 0 0 1 6 " ' I I " . . . I I : E l “ 3 . 3 - ” : 6 . / I I I ; \ \ ‘ \ . 1 . “ a m ' . ! - A . . . . - ; . . 1 : . ; $ ' . : . 3 . ’ \ [ ' 5 i ‘ - , ' \ . ( V c . , _ . . . o . » v e " ' 2 0 . 0 1 2 — " ' . r v ; : \ ‘ k / ' f l ' r , ‘ l I " " " ‘ \ I : | | \ I I ” , i “ \ . W I ’ V ' M I I " \ I ’ \ " I . “ ~ . " " - 0 . 0 0 8 — . / , I ' 1 “ , " ( “ i f g . ’ a 0 . 0 0 4 T i g 0 . r r 1 1 I l l l I I 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0 W a v e l e n g t h ( n m ) F i g u r e 1 0 . 1 R e d u c e d - o x i d i z e d U V - V i s s p e c t r o s c o p y o f t h e r e s u s p e n d e d m e m b r a n e s i s o l a t e d f r o m R s p h a e r o i d e s s t r a i n s l 6 9 - 2 . 4 . 1 ( W T ) a n d 1 6 9 C L 3 ( C L — ) g r o w n u n d e r n o r m a l P ( 2 0 m M K H 2 P O 4 ; P + ) , a n d l o w P ( 0 . 1 m M K H 2 P O 4 ; P - ) c o n d i t i o n s . S p e c t r a a r e o f f s e t t o s h o w c h a r a c t e r i s t i c s m o r e c l e a r l y . G r a y = W T g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) ; B l u e = C L — u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L — / P + ) ; G r e e n = W T u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P - ) ; a n d R e d = C L — u n d e r l o w P ( C L — / P — ) . P u r i fi c a t i o n w a s p e r f o r m e d u s i n g N i - N T A c o l u m n o n a F P L C s y s t e m a s d e s c r i b e d e a r l i e r ( C h a p t e r 3 ) . 4 1 9 1 0 . 3 . 2 1 0 . 3 . 1 s a m p c o n d u n d e S o r e s h i fi C 3 1 3 p h 0 1 0 . 3 . 2 C h a r a c t e r i z a t i o n o f C c O p u r i fi e d f r o m t h e f o u r c e l l s a m p l e s 1 0 . 3 . 2 . 1 U V - V i s s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s o f t h e p u r i fi e d C c O T h e r e d u c e d s p e c t r a o f t h e G e o p u r i fi e d u s i n g N i - N T A F P L C f r o m t h e f o u r s a m p l e s a r e s h o w n i n F i g u r e 1 0 . 2 , a s i s o l a t e d f r o m c e l l s g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e c o n d i t i o n s , l 6 9 - 2 . 4 . 1 ( W T / P + ) a n d l 6 9 C L 3 ( C L - / P + ) , a n d t h e s a m e s t r a i n s g r o w n u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P - a n d C L — / P - ) . T h e y d i s p l a y n o a p p r e c i a b l e d i f f e r e n c e i n t e r m s o f t h e a b s o r p t i o n w a v e l e n g t h o f t h e p e a k s , o r t h e r e l a t i v e i n t e n s i t y b e t w e e n t h e S o r e t ( 4 4 5 n m ) a n d a l p h a ( 6 0 6 n m ) h e m e a / a 3 a b s o r p t i o n p e a k s . T h e f a c t t h a t n o p e a k s h i f t i s o b s e r v e d , i n d i c a t e s t h a t t h e c o o r d i n a t i o n s t a t e o f t h e h e m e a a n d h e m e a 3 - C u B c a t a l y t i c c e n t e r a r e n o t d i s t u r b e d i n t h e C c O p u r i fi e d f r o m t h e s e p h o s p h a t e - l i m i t i n g o r p h o s p h a t e - r i c h c o n d i t i o n s . 4 2 0 0 . 1 2 — 5 S o r e t 5 ' : 4 4 5 n m - — C 0 0 W T / P + . . . . . . . . C c O C L “ / P + 0 . 1 0 - — - - C c O W T / P — - - - - C c O C L — / P — 8 0 0 8 — g fi fi H m n e a g fl f fl i 6 0 6 n n 1 a 0 . 0 6 — ' g 1 — D . 3 / , ' 1 L g : 0 . 0 4 J I : j I t ” , [ [ 1 2 - L , 3 " " " " . 1 0 . . - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . I , I I I v - s o ‘ . “ . , " . . , . . l - l I l 4 0 0 4 5 0 5 0 0 S é O 6 0 0 6 5 0 I 7 0 0 W a v e l e n g t h ( n m ) F i g u r e 1 0 . 2 R e d u c e d U V - V i s s p e c t r o s c o p y o f C c O p u r i fi e d f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s s t r a i n s : G r a y = 1 6 9 - 2 . 4 . 1 g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) ; b l u e = l 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L - / P + ) ; g r e e n = 1 6 9 — 2 . 4 . 1 u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P — ) ; a n d r e d = l 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L — / P - ) . P u r i fi c a t i o n w a s p e r f o r m e d u s i n g N i - N T A c o l u m n o n a F P L C s y s t e m a s d e s c r i b e d e a r l i e r ( C h a p t e r 3 ) . 4 2 1 1 0 . 3 . 2 . 2 S D S - P A G E a n a l y s i s o f t h e p u r i fi e d C c O S D S - P A G E a n a l y s i s o f t h e p u r i fi e d C c O f r o m t h e s e f o u r s a m p l e s u s i n g u r e a a s t h e d e n a t u r a t i o n r e a g e n t i s s h o w n i n F i g u r e 1 0 . 3 . I t i s c l e a r t h a t e a c h s a m p l e o f C c O c o n t a i n s a l l o f t h e f o u r s u b u n i t s , a n d t h e r e i s n o a p p r e c i a b l e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e f o u r s a m p l e s i n t e r m s o f s u b u n i t c o m p o s i t i o n a n d t h e s i z e o f t h e s u b u n i t s t h a t a r e r e s o l v a b l e b y t h e S D S - P A G E m e t h o d . T h e S D S - P A G E a n a l y s i s f o r t h e p e a k t h a t e l u t e d b e f o r e t h e p u r e C c O i n F P L C p u r i fi c a t i o n w a s a l s o p e r f o r m e d i n t h e s a m e g e l ( d a t a n o t s h o w n ) . T h i s p e a k c o n t a i n s o t h e r r e s p i r a t o r y c o m p l e x e s s u c h a s a c y t o c h r o m e b c l ( C o m p l e x I I I ) , w h i c h a l s o s e e m s t o b e u n a f f e c t e d b y t h e g r o w t h c o n d i t i o n s o r t h e C L — m u t a t i o n . I r n p o r t a n t l y , t h e c o m b i n a t i o n o f p h o s p h a t e - d e fi c i e n c y a n d c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n c y d i d n o t c a u s e t h e C c O s u b u n i t s t o d i s s o c i a t e f r o m e a c h o t h e r d u r i n g p u r i fi c a t i o n . T h i s i s p a r t i c u l a r l y i n t e r e s t i n g w i t h r e s p e c t t o s u b t m i t I V ( s e e F i g u r e 1 . 5 i n C h a p t e r 1 ) , w h i c h i s c o n n e c t e d t o t h e r e s t o f t h e e n z y m e v i a a l a y e r o f p h o s p h o l i p i d s , i d e n t i fi e d a s 4 p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e m o l e c u l e s i n t h e f o u r - s u b u n i t R . s p h a e r o i d e s C c O [ 3 4 ] . 4 2 2 ’ 9 / c } Q < 2 Q < 2 8 ‘ \ / \ M A / \ 3 " $ 0 « S U b l « S u b l l 4 — S u b l l l 6 . 5 k D a — L g . . . . 3 . . ‘ , m 4 . . . . . . S u b I V 6 6 . 4 k D a — L ! 4 2 . 7 k D a — > 5 2 7 . 0 k D a — ~ 2 0 . 0 k D a — L . . . 1 4 . 3 k D a — L . . . A 3 . 4 k D a — p . 1 2 3 4 5 F i g u r e 1 0 . 3 S D S — P A G E a n a l y s i s o f t h e C c O p u r i fi e d b y N i - N T A F P L C f r o m t h e R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s s t r a i n s 1 6 9 - 2 . 4 . l ( W T ) a n d l 6 9 C L 3 ( C L — ) a e r o b i c a l l y g r o w n u n d e r n o r m a l P ( 2 0 m M K H 2 P 0 4 ) ( P + ) , a n d l o w P ( 0 . 1 m M K H 2 P O 4 ) ( P — ) c o n d i t i o n s , u s i n g c o n d i t i o n s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 a n d C o o m a s s i e b l u e f o r t h e s t a i n i n g : l a n e 1 = m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s ; l a n e 2 = l 6 9 - 2 . 4 . 1 g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) ; l a n e 3 = 1 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L — / P + ) ; l a n e 4 = 1 6 9 - 2 . 4 . 1 u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P — ) ; a n d l a n e 5 = l 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L — / P — ) . 4 2 3 O X ' U l l S i l l a d l p i l l t h e 0 . 0 h r 1 0 . 3 . 2 . 3 A c t i v i t y a n a l y s i s o f t h e p u r i fi e d C 0 0 T h e s t e a d y s t a t e a c t i v i t i e s o f t h e C c O fi o m t h e s e f o u r s a m p l e s w e r e e v a l u a t e d b y o x y g e n c o n s u m p t i o n m e a s u r e m e n t s i n t h e p r e s e n c e o f c y t o c h r o m e c a s t h e s u b s t r a t e , u n d e r c o n d i t i o n s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 a n d t h e l e g e n d t o F i g u r e 1 0 . 4 [ 7 7 ] . T h e r e s u l t s s h o w n i n F i g u r e 1 0 . 4 d e m o n s t r a t e t h a t a l l f o u r s a m p l e s h a v e s i m i l a r a c t i v i t y , a n d t h e a d d i t i o n o f s o y a s o l e c t i n , w h i c h i s a l i p i d m i x t u r e c o n t a i n i n g G P E t n , G P C h o , p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( G P I n s ) , p h o s p h a t i d i c a c i d ( G P A ) , l y s o G P C h o a n d o t h e r u n s p e c i fi e d l i p i d s ( i n f o r m a t i o n f r o m A v a n t i P o l a r L i p i d s I n c . A l a b a s t e r , A L ) , i n t h e a s s a y i n c r e a s e s t h e a c t i v i t y b y 2 0 — 3 0 % f o r a l l o f t h e s e e n z y m e s a m p l e s , w h i c h i s t y p i c a l f o r p u r i fi e d o x i d a s e i s o l a t e d u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s . T h u s t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r t h c o n d i t i o n , a n d t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h i n c o m b i n a t i o n w i t h t h e g e n e t i c C L — d e fi c i e n c y d i d n o t a f f e c t t h e U V - V i s s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s , t h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n , o r t h e a c t i v i t y o f t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e s , o r , a s i n d i c a t e d e a r l i e r , t h e c e l l g r t h a n d r e l a t i v e C c O e x p r e s s i o n l e v e l . H o w e v e r , t h e l i p i d p r o fi l e s i n t h e c e l l s a r e e x p e c t e d t o h a v e c h a n g e d [ 1 1 ] . D o t h e s e u n a f f e c t e d e n z y m a t i c p r o p e r t i e s c o m e f r o m a n u n a l t e r e d l i p i d p r o fi l e , f r o m t h e a d a p t a b i l i t y t o t h e a l t e r e d l i p i d b a c k g r o u n d i n v i v o , o r fi o m t h e fl e x i b i l i t y i n t h e l i p i d s t r u c t u r a l r e q u i r e m e n t o f C c O ? T o a n s w e r t h i s q u e s t i o n , t h e l i p i d p r o fi l e s i n t h e m e m b r a n e a n d i n t h e p u r i fi e d C c O e n z y m e s w e r e t h e n e x a m i n e d b y u s i n g q u a n t i t a t i v e E S I a n d M A L D I M S a n d M S / M S m e t h o d s , w i t h t h e i n c o r p o r a t i o n o f l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s . 4 2 4 ) 1 ' c ? e s ( r e b e m u n r e v o n r u T w 8 w / o a s o l e c t i n w / a d d e d a s o l e c t i n i n a s s a y L [ \ J . O - Q " q " Q ’ Q ’ Q " < 2 “ Q ’ Q ’ \ \ \ \ \ , F i g u r e 1 0 . 4 S t e a d y - s t a t e o x y g e n c o n s u m p t i o n a c t i v i t y a n a l y s i s o f t h e C c O p u r i fi e d b y N i - N T A F P L C f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s s t r a i n s l 6 9 - 2 . 4 . l ( W T ) a n d 1 6 9 C L 3 ( C L — ) g r o w n a e r o b i c a l l y u n d e r n o r m a l P ( 2 0 m M K H 2 P 0 4 ) ( P + ) , a n d l o w P ( 0 . 1 m M K H 2 P O 4 ) ( P - ) c o n d i t i o n s , b e f o r e a n d a f t e r t h e a d d i t i o n o f a s o l e c t i n l i p i d s i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e : 1 6 9 - 2 . 4 . 1 g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , 1 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L — / P + ) , 1 6 9 - 2 . 4 . 1 u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P - ) , a n d 1 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L — l P - ) . T h e d a t a s h o w n a r e t h e m e a n v a l u e s f r o m t r i p l i c a t e e x t r a c t i o n s , a n d t h e e r r o r b a r i s t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n . C o n d i t i o n s f o r t h e a s s a y a r e d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 a n d r e f e r e n c e [ 7 7 ] . 4 2 5 1 0 . 1 . 3 g l ' O W f r o m c o m p h 0 ( W C 0 1 1 a d h r 1 0 . 3 . 3 Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e m e m b r a n e l i p i d s p r o fi l e f o r l o w - p h o s p h a t e g r o w t h F i g u r e 1 0 . 5 s h o w s t h e p o s i t i v e i o n m o d e E S I M S s p e c t r a o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e m e m b r a n e s o b t a i n e d f r o m t h e f o u r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s : W T / P + , C L - / P + , W T / P - , a n d C L — / P - . T h e i n t e r n a l s t a n d a r d s w e r e G P E t n , G P G r o , G P C h o a n d C L l i p i d s c o n t a i n i n g 1 4 : 0 / 1 4 : 0 f a t t y a c i d c h a i n s a t t h e fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 , 2 , 2 a n d 1 u M . F i g u r e 1 0 . 5 A i s t h e M S s p e c t r u m o f t h e W T ( 1 6 9 - 2 . 4 . 1 ) g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) . W h e n c o m p a r e d t o F i g u r e 1 0 . 5 C , W T g r o w n u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P - ) , a c o m p l e t e l y d i f f e r e n t l i p i d p r o fi l e i s s e e n . N e i t h e r o f t h e p r e d o m i n a n t c o m p o n e n t s i n F i g u r e 1 0 . 5 A , t h e G P C h o a n d t h e G P E t n l i p i d s , a r e o b s e r v a b l e b y M S i n F i g u r e 1 0 . 5 C g r o w n u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g c o n d i t i o n s ; i n s t e a d , a n e w s e t o f i o n s a r e n o w d o m i n a n t . T h e i d e n t i t i e s o f t h e l i p i d s p e c i e s w e r e d e t e r m i n e d b y M S / M S a n d M S n ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e m o s t a b u n d a n t i o n o b s e r v e d f o r t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h ( F i g u r e 1 0 . 5 C ) a t m / z 7 6 4 w a s d e t e r m i n e d t o b e t h e p o l a r p h o s p h a t e - f r e e l i p i d , D G T S . I t f o r m s a s o d i u m a d d u c t i o n a t m / z 7 8 6 , t h e s a m e m / z a s t h e p r o t o n a t e d i o n o f G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 , b u t M S / M S a n a l y s i s o f m / z 7 8 6 r e v e a l e d o n l y a v e r y l o w l e v e l o f G P C h o . I n a d d i t i o n , t h e p h o s p h a t e - f r e e g l y c o l i p i d s G G D G w e r e a l s o o b s e r v e d i n t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h m e m b r a n e s ( F i g u r e 1 0 . 5 C ) . T h e d r a s t i c c h a n g e i n t h e l i p i d s o b s e r v a b l e b y p o s i t i v e i o n m o d e E S I , w a s a l s o r e v e a l e d i n t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t u n d e r h i g h ( F i g u r e 1 0 . 5 8 ) a n d l o w - p h o s p h a t e ( F i g u r e 1 0 . 5 D ) g r o w t h c o n d i t i o n s . A c o m p a r i s o n o f F i g u r e s 1 0 . 5 A w i t h 1 0 . 5 8 , a n d F i g u r e 1 0 . 5 C w i t h 1 0 . 5 D , h o w e v e r , s h o w s t h a t t h e l i p i d s p e c i e s d e t e c t e d b y t h e p o s i t i v e i o n m o d e E S I a r e v e r y s i m i l a r b e t w e e n t h e W T a n d t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t , w h e t h e r 4 2 6 t h e y a r e g r o w n w i t h a b u n d a n t - p h o s p h a t e o r l i m i t i n g p h o s p h a t e , a l t h o u g h t h e e x a c t q u a n t i t y m i g h t d i f f e r . T h i s m i g h t b e e x p e c t e d s i n c e t h e m a j o r d i f f e r e n c e i n l e v e l s o f c a r d i o l i p i n i t s e l f i s t y p i c a l l y n o t s e e n i n t h e p o s i t i v e i o n m o d e u n d e r t h e s e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s . A c l e a r e r p i c t u r e o f t h e q u a n t i t a t i v e m e m b r a n e l i p i d p r o fi l e c h a n g e i n t h e p o s i t i v e i o n m o d e M S c a n b e d e r i v e d f r o m t h e q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s s u m m a r i z e d i n F i g u r e 1 0 . 6 . F i g u r e 1 0 . 6 o n l y s u m m a r i z e s t h e d o m i n a n t c o m p o n e n t i f s e v e r a l s p e c i e s o v e r l a p a t t h e s a m e p r e c u r s o r i o n m / z . T h e p h o s p h o l i p i d s G P G r o , G P E t n , G P C h o a n d C L c a n b e q u a n t i fi e d b y t h e i r i n d i v i d u a l i n t e r n a l s t a n d a r d s , b u t t h o s e l i p i d s t h a t d o n o t h a v e i n t e r n a l s t a n d a r d s o f t h e i r o w n c a n o n l y b e r e l a t i v e l y q u a n t i fi e d b y r e f e r r i n g t o a p h o s p h o l i p i d s t a n d a r d w i t h t h e c l o s e s t s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y , a n d s h o u l d b e i n t e r p r e t e d w i t h c a u t i o n . T h u s t h e q u a n t i t y o f t h e G P C h o a n d G P E t n l i p i d s s h o w n i n F i g u r e 1 0 . 6 r e p r e s e n t t h e i r a b s o l u t e c o n c e n t r a t i o n s , a n d c a n b e c o m p a r e d w i t h e a c h o t h e r . T h e D G T S l i p i d h a s a fi x e d p o s i t i v e c h a r g e a n d i t s i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y s h o u l d c l o s e l y r e s e m b l e G P C h o , a n d c a n t h e r e f o r e b e r e l a t i v e l y q u a n t i fi e d b y t h e G P C h o i n t e r n a l s t a n d a r d , w h i l e t h e O L o r g l u t a r n i n e l i p i d s ( Q L ) a n d t h e G G D G l i p i d s a r e r e l a t i v e l y q u a n t i fi e d w i t h r e f e r e n c e t o t h e G P E t n i n t e r n a l s t a n d a r d , a n d e a c h c a n b e c o m p a r e d w i t h i n i t s o w n l i p i d t y p e , b u t c o u l d n o t b e c o m p a r e d t o t h e p h o s p h o l i p i d s . 4 2 7 F i g u r e 1 0 . 5 P o s i t i v e i o n m o d e E S I M S s p e c t r a o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e s a m e a m o u n t o f i s o l a t e d m e m b r a n e s o f R . s p h a e r o i d e s l 6 9 - 2 . 4 . l g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , l 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L - / P + ) , l 6 9 - 2 . 4 . 1 u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P - ) , a n d l 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L - l P - ) , w i t h t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 , 2 , 2 a n d 1 u M i n t h e c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) s o l v e n t c o n t a i n i n g 4 0 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s a r e d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 s e c t i o n 3 . 7 . 2 . 4 2 8 AO ) % ( e c n a d n u b A e v i t a l e R r e s a m e n o r m a l d e r 1 0 W h e l i p i d a n d C L : 1 , W V ) a s c r i b e d [ G P C h o i . s . + K ] + [ G P C h o i s . + N a ] + , 7 1 6 7 0 0 [ G P E t n l 8 2 1 / 1 8 : 1 + H ] + 1 . 0 1 e 5 G P C h o 1 ' 3 3 / 7 4 4 A ( + ) M S 1 0 0 6 7 8 [ G P C h 0 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + H ] + W T / P + ‘ ‘ 7 8 6 [ G P C h o l 8 z 1 / 1 8 : 1 + K ] + 4 0 8 2 4 2 0 4 1 1 . 1 1 . . f . m r r 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 7 . 9 8 . 2 4 6 1 0 g ? i . s . [ i i E t n 1 8 2 1 / 1 8 : 1 + H ] + + B ( + ) M S 1 0 0 . [ G P C h 0 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + H ] C L _ / P + G P E t n i . s . 1 3 5 - v 7 8 6 6 3 6 [ G P C h 0 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + K ] + 8 2 4 2 0 m l - . - . 1 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 + 9 0 0 9 5 0 G T S l S : 1 / 1 8 : 1 + 7 8 7 e 4 0 L 9 % , , _ H ] . + C ( + ) M S 8 0 , i - S - . [ D G T S l S 2 1 / 1 8 : 1 + K ] + 6 0 G P C h 0 1 . S . 1 7 1 6 i 8 0 2 , [ G G D G 1 8 z l / 1 8 : 1 + K ] + e ' 9 8 3 A l | . _ I l _ ‘ . 1 L L A k L L “ L L . 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 4 0 G P E t n i . S . 6 7 8 . . + 6 . 8 3 e 4 O L E E E T S I S ' l / I S ' H H ] + D ( + ) M S 1 0 0 Q L 7 0 5 [ D G T S l 8 z 1 / 1 8 : 1 + N a ] C L _ / P _ 8 0 , i . s . ” f 6 [ D G T S l 8 : 1 / 1 8 : 1 + K ] + 4 0 G P E t n i s . 6 7 8 [ G G D G 1 8 z l / 1 8 : 1 + K ] 2 0 6 3 6 v L i k 9 8 3 W i l l i a m L l _ A . . . _ L J J L A A L 2 ; . A _ \ ‘ L J L _ _ 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 m / z 4 2 9 G P E t m e r e : a b u n . G G D d e fi c c o n s i d e fi c w i l d D D C R O T H F i g u r e 1 0 . 6 s h o w s t h a t , i n t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h , t h e r e i s n o G P C h o o r G P E t n l i p i d s b e y o n d 5 % o f n o r m a l i z e d r e l a t i v e a b u n d a n c e i n M S , b u t i n s t e a d , t h e r e i s a n i n c r e a s e d l e v e l o f 0 L , a n d a h i g h l e v e l o f D G T S l i p i d s a s w e l l a s G G D G l i p i d s . T h e m o s t a b u n d a n t d o m i n a n t f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n f o r D G T S i s D G T S 1 8 : 1 / 1 8 : 1 . T h e D G T S a n d G G D G l i p i d s a r e n o t d e t e c t a b l e i n t h e n o r m a l - p h o s p h a t e g r o w t h c o n d i t i o n s . T h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t h a s a s l i g h t l y h i g h e r l e v e l o f G P E t n l i p i d s c o m p a r e d t o t h e w i l d t y p e , c o n s i s t e n t w i t h e a r l i e r fi n d i n g s ( C h a p t e r 7 ) , b u t i n t h e l o w - p h o s p h a t e g r o w t h , t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t d i d n o t c o n t a i n a n a p p r e c i a b l y h i g h e r l e v e l o f 0 L t h a n t h e w i l d t y p e , a l t h o u g h O L h a s b e e n p r o p o s e d t o b e f u n c t i o n a l l y s u b s t i t u t a b l e w i t h G P E t n . B e t w e e n t h e w i l d t y p e a n d t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t , t h e r e i s n o s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e i n t h e D G T S , o r D D G D l e v e l u n d e r l o w p h o s p h a t e g r o w t h , a n d n o d i f f e r e n c e i n t h e G P C h o l e v e l i n t h e n o r m a l p h o s p h a t e g r o w t h . 4 3 0 F i g u r e 1 0 . 6 S u m m a r y o f t h e q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s f r o m F i g u r e 1 0 . 5 u s i n g p o s i t i v e i o n m o d e E S I M S . T h e l i p i d s a r e e x t r a c t e d fi o m t h e m e m b r a n e s g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + a n d C L — / P + ) , o r u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P - a n d C L — / P - ) . I n p a n e l A , t h e p h o s p h o l i p i d s G P E t n a n d G P C h o a r e q u a n t i fi e d a g a i n s t t h e i r i n d i v i d u a l i n t e r n a l s t a n d a r d s a n d e x p r e s s e d w i t h r e s p e c t t o m e m b r a n e p r o t e i n m e a s u r e d b y B C A a s s a y ( C h a p t e r 3 ) ; i n p a n e l B , D G T S i s r e l a t i v e l y q u a n t i fi e d w i t h r e f e r e n c e t o t h e G P C h o s t a n d a r d , a n d t h e O L , D M P E a n d G G D G a r e r e l a t i v e l y q u a n t i fi e d a g a i n s t t h e G P E t n s t a n d a r d . T h e d a t a s h o w n a r e t h e m e a n v a l u e s f r o m t r i p l i c a t e e x t r a c t i o n s , a n d t h e e r r o r b a r i s t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n . 4 3 1 - — _ — — — — — — - — _ — — — - V l l l l l / l l l l l l l l l l l l l l l l r l l l l l l l l l t l l l l ‘ q l / ‘ s t C W X ’ A ’ I ' . . : 7 . ; ‘ 1 . h . v . G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 G P E t n l 8 : 1 / 1 8 : 0 W fi A G P E t n 1 8 : 1 / 1 9 : 1 ? E W T / P + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - W C L - / P + . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G P C h o 1 6 : 0 / 1 8 : 0 ? m W T / p - G P C h o l 8 : 1 / 1 8 : I W C L - / P - " " " " " " " " " " G P C h o 1 8 : 0 / 1 8 2 1 F ‘ G P C h o 1 8 : 1 / 1 9 : 1 ? l I | I l I l I | 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 R a t i o o f l i p i d s / m e m b r a n e p r o t e i n s ( u m o l / p g ) L D M P E 1 8 z l / l 8 z l fl B D G T S 1 6 2 0 / 1 8 2 1 D G T S 1 8 : 1 / 1 8 : 1 D G T 8 1 8 2 0 / 1 8 2 1 O L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 O L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 0 0 L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 9 : 1 G G D G 1 8 z l / 1 8 : 1 2 4 6 R e l a t i v e q u a n t i t y o f l i p i d s ( A r b i t r a r y u n i t s ) 4 3 2 t h e s e n e a r l m o d e r e v e a g r a m g r o w l t h e s e m a i n l 2 : 1 ! b e e n S Q D E “ p h ; z l L i k e w i s e , t h e n e g a t i v e i o n m o d e E S I M S a n a l y s i s o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e s e f o u r s a m p l e s i s s h o w n i n F i g u r e 1 0 . 7 f r o m m / z 6 0 0 t o 1 0 0 0 . I n c o n t r a s t t o t h e n e a r l y c o m p l e t e a p p a r e n t d e p l e t i o n ( < 5 % ) i n G P C h o a n d G P E t n s e e n i n p o s i t i v e i o n m o d e , t h e n e g a t i v e i o n m o d e M S a n d f u r t h e r i d e n t i fi c a t i o n u s i n g M S / M S a n d M S n r e v e a l e d t h a t t h e G P G r o l i p i d s s t i l l r e m a i n a t m e a s u r a b l e l e v e l s u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h i n b o t h t h e w i l d t y p e a n d t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t ; h o w e v e r , i n t h e l o w - p h o s p h a t e g r o w t h , a p p r e c i a b l e i n c r e a s e s i n o t h e r t y p e s o f n o n - p h o s p h o l i p i d s a r e o b s e r v e d . A m o n g t h e s e i s t h e p e a k a t m / z 7 1 7 i n F i g u r e s 1 0 . 7 C a n d 1 0 . 7 D , w h i c h w a s d e t e r m i n e d t o b e m a i n l y t h e g l u t a r n i n e l i p i d Q L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 , w i t h a l o w l e v e l o f o v e r l a p p i n g 0 L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 9 : 1 . T h i s i s t h e fi r s t t i m e t h a t t h e r e c e n t l y d i s c o v e r e d t y p e o f g l u t a m i n e l i p i d h a s b e e n f o u n d t o v a r y u n d e r d i f f e r e n t g r o w t h c o n d i t i o n s . T h e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f t h e S Q D G i o n s a l s o i n c r e a s e d . T h e q u a n t i fi c a t i o n o f t h e r e s o l v e d s p e c i e s i n n e g a t i v e i o n m o d e M S ( w i t h t h e e x c e p t i o n o f C L ; s e e b e l o w ) a r e s u m m a r i z e d i n t h e b a r g r a p h i n F i g u r e 1 0 . 8 , b y u s i n g t h e p h o s p h o l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s . S Q D G l i p i d s w e r e r e l a t i v e l y q u a n t i fi e d b y r e f e r r i n g t o G P G r o i n t e r n a l s t a n d a r d s , a n d Q L , O L , G G D G , M M P E a n d D M P E l i p i d s w e r e r e l a t i v e l y q u a n t i fi e d b y u s i n g t h e G P E t n s t a n d a r d . N o w i t i s c l e a r e r t h a t t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c a u s e s t h e G P G r o l i p i d s t o d r o p b y ~ 5 0 % f o r b o t h t h e w i l d t y p e a n d t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t , i n t h e s p e c i e s c o n t a i n i n g 1 8 : 1 / 1 8 : 1 a n d 1 8 : 0 / 1 8 : 1 f a t t y a c i d s . H o w e v e r t h e s a t u r a t e d s p e c i e s G P G r o 1 8 : 0 / 1 8 : 0 , w h i c h w a s b a r e l y o b s e r v a b l e u n d e r n o r m a l - p h o s p h a t e g r o w t h , w a s n o w o b s e r v e d a s o n e o f t h e m a i n s p e c i e s o f G P G r o u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r t h c o n d i t i o n s f o r b o t h t h e w i l d t y p e a n d t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t . 4 3 3 F i g u r e 1 0 . 7 N e g a t i v e i o n m o d e E S I M S s p e c t r a o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e s a m e a m o u n t o f i s o l a t e d m e m b r a n e s o f R . s p h a e r o i d e s z W T / P + a n d C L — / P + g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e , W T / P - a n d C L - / P - , g r o w n u n d e r l o w p h o s p h a t e , i n t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / 1 4 z O , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 , 2 , 2 a n d 1 u M i n t h e c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) s o l v e n t c o n t a i n i n g 4 0 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e . T h e m / z r a n g e o f 6 0 0 - 1 0 0 0 i s d i s p l a y e d . 4 3 4 G P E 0 u 4 q 0 . e , t , n . 3 e 3 P 6 t 3 V n L 6 E G = l A $ “ . < , 1 8 g a g 9 3 ; 1 5 0 1 0 3 4 6 2 8 6 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 6 . 0 0 4 2 2 0 8 6 4 2 0 3 0 0 0 0 0 0 0 . 1 1 : 4 2 3 ; 1 3 ‘ 1 : 1 } 1 3 1 ] - : : 6 6 4 i 0 . 0 6 . G 0 G 0 8 P 4 P E G P E Q 6 t 6 1 r 6 6 S G r 6 6 6 6 3 2 5 i . 5 . 5 . 0 5 . 0 0 5 5 6 6 I o s ' P . . 1 3 n 4 G 4 L 4 l 3 h 1 2 3 . 7 [ G P E 0 l t 7 0 # o 6 7 S . . ‘ i 5 6 r — 0 I G . l - S I 0 . 0 I ‘ n - . ‘ 0 S . 5 5 Z Q C f 5 I 8 L L z l 1 0 4 0 L L 0 Z 4 1 [ 7 G 7 — _ G P 3 T r 8 H ] [ 7 — G 7 P 3 G 8 8 P 3 P 3 G 7 G 7 [ 7 ' r [ 7 6 V 1 G G 8 q I G 0 S 0 s 0 G 0 S r S I 8 t 0 Q o 1 0 Q r 0 r 0 0 Q 2 p v 1 8 D 1 l 1 , ‘ D _ 9 — H ] _ ] G 9 D 9 T G - H G — G G H ] D / 1 1 : l 8 8 8 / Q 8 l S f / v S 1 1 5 5 ’ 5 V D / 1 Q 0 i 1 8 8 Q 0 G 0 l D S Q - H D G : D 1 [ L : S fl G [ l G S 1 z : G S G P P M + + S - _ — S _ P ] P H M — l H ] / / , ) 1 - W ( W 1 4 9 9 9 C 8 T _ 0 - 0 : T l 5 L 5 8 5 H L 3 z 0 - 0 l 0 0 G 0 0 0 8 B C 1 z 8 l : 1 / 1 / D 9 7 1 / 1 8 7 2 4 2 — 7 7 7 Q 0 . 1 p 7 . — 7 } " r 5 ‘ 7 7 [ G P C h o i . 3 . + C 1 ] “ 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 4 3 5 F i g u r e 1 0 . 8 S u m m a r y o f t h e q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s fi o m F i g u r e 1 0 . 7 u s i n g n e g a t i v e i o n m o d e E S I M S . T h e l i p i d s a r e e x t r a c t e d f r o m t h e W T a n d C L - s t r a i n s ( W T / P + ) a n d ( C L — / P + ) , g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e , a n d ( W T / P — ) a n d ( C L - / P — ) , g r o w n u n d e r l o w p h o s p h a t e c o n d i t i o n s . I n p a n e l A , p h o s p h o l i p i d s G P E t n a n d G P G r o a r e q u a n t i fi e d a g a i n s t t h e i r i n d i v i d u a l i n t e r n a l s t a n d a r d s ; i n p a n e l B , D G T S i s r e l a t i v e l y q u a n t i fi e d w i t h r e f e r e n c e t o t h e G P C h o s t a n d a r d , a n d t h e O L , Q L , M M P E , D M P E a n d G G D G a r e r e l a t i v e l y q u a n t i fi e d a g a i n s t t h e G P E t n s t a n d a r d . T h e d a t a s h o w n a r e t h e m e a n v a l u e s f r o m t r i p l i c a t e e x t r a c t i o n s , a n d t h e e r r o r b a r i s t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n . F o r a l l o f t h e p h o s p h o l i p i d s q u a n t i fi e d h e r e , t h e l i p i d c o n c e n t r a t i o n s i n t h e E S I s a m p l e s a r e w i t h i n t h e l i n e a r r a n g e a s s h o w n i n F i g u r e 7 . 1 0 . 4 3 6 ‘. a r e w i t h i n t h e , g n e g a t i v e i o n ( w r / P + ) a n d , g r o w “ u n d e r a r e q u a n t i fi e d l u a n t i fi e d w i t h 1 d G G D G a r e 3 m e a n v a l u e s F o r a l l o f t h e G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 0 . - _ - - - - - — - - - - - - ‘ - y . — - - - - - . q - - - - - - - - - - — - - n . - - - _ - - — - - - - — - - - u — c o - - - - - - - - - - o - u - - - - - - - - - - - - G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 " . ' G P G r o 1 8 : 0 / 1 8 : 1 G P G r o 1 8 : 0 / 1 8 : 0 G P G r o 1 8 : 1 / 1 9 : 1 M M P E 1 8 : 1 / 1 8 : 1 D M P E 1 8 : 1 / 1 8 : 1 S Q D G 1 6 : 0 / 1 6 : 0 S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 S Q D G 1 6 : O / 1 8 : O ' S Q D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 _ _ - m - - - - - - - - - - - - . - - — - - - - - - - - — - - — - - — _ - - — - - — - - - — - - — - — - — - u . - - - - _ - - - - - - - - - _ - - - - _ - - - — _ — — - — - . - — - - - ~ — n ~ - - _ - - - — - - - - — — - — - — - - - - — - _ - - - - — - - - _ _ - - — — - - - - — ‘ - - — — - - - - - - - - - - - — - - - - - - - — - . - - - _ _ l I l I l I l I 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 R a t i o o f l i p i d s / m e m b r a n e p r o t e i n s ( u m o l / u g ) I I I I I l 1 2 5 1 5 0 1 7 5 - - - - - - - ‘ - - - - - - - - - - - - - - - - - - u - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - — D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - — - - - - - S Q D G 1 8 : 0 / 1 8 : 1 ' S Q D G 1 8 : 0 / 1 8 : 0 Q L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 Q L 3 - O H 2 0 : 0 / 1 8 : 1 O L 3 - O H 1 8 : 1 / 2 0 : 2 O L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 0 L 3 - O H 2 0 : 0 / 1 8 : 1 0 L 3 - O H 2 0 : 0 / 2 0 : 1 0 L 3 - O H l 8 : 0 / 1 9 : 1 G G D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 . . . . . . . B _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ E W T / P + ' - C L - l P + " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " _ i l m m W T / P - " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " - C L - l P - - - - - - - - - - - - - I 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 R e l a t i v e q u a n t i t y o f l i p i d s ( A r b i t r a r y u n i t s ) 4 3 7 O n t h e o t h e r h a n d , t h e S Q D G l i p i d s w e r e f o u n d t o i n c r e a s e b y 2 — 3 f o l d i n t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h f o r b o t h t h e w i l d t y p e a n d t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t ( F i g u r e 1 0 . 8 ) . T h e s a t u r a t e d m o l e c u l a r s p e c i e s o f S Q D G , s u c h a s t h e S Q D G 1 6 : 0 / 1 6 : 0 ( m / z 7 9 3 ) a n d S Q D G 1 8 : 0 / 1 8 : 0 ( m / z 8 4 9 ) s h o w e d a n i n c r e a s e o f n e a r l y 3 f o l d , h i g h e r t h a n t h e u n s a t u r a t e d S Q D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 s p e c i e s . T h e Q L l i p i d s i n c r e a s e d d r a m a t i c a l l y ( o v e r 5 f o l d ) i n t h e l o w - p h o s p h a t e g r o w t h a n d t h e i n c r e a s e o f Q L 3 - O H 2 0 : 1 / 1 8 : 1 ( m / z 7 1 7 ) i s s l i g h t l y m o r e a p p r e c i a b l e i n t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t t h a n i n t h e w i l d t y p e ( F i g u r e 1 0 . 8 ) . T h e n e g a t i v e i o n m o d e E S I M S s p e c t r a o f t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t s h o w i n g m / z 1 2 0 0 - 1 6 0 0 , t h e m / z r a n g e o f t h e c a r d i o l i p i n s p e c i e s , i s d i s p l a y e d i n F i g u r e 1 0 . 9 . C a r d i o l i p i n , t h e l i p i d t h a t i s o f t h e m o s t i n t e r e s t t o o u r s t u d y , h o w e v e r , i s r o u g h l y s h o w n t o d e c r e a s e u n d e r l o w p h o s p h a t e g r o w t h b y o n l y a b o u t 2 0 % c o m p a r e d t o l e v e l s i n t h e n o r m a l - p h o s p h a t e g r t h i n t h e w i l d t y p e ( F i g u r e s 1 0 . 9 A a n d 1 0 . 9 C ) . F o r t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e g r o w t h , t h e C L i s b e l o w t h e d e t e c t i o n l i m i t i n E S I M S ( C h a p t e r 7 ; F i g u r e 1 0 . 9 B ) ; t h e r e f o r e t h e q u a n t i fi c a t i o n o f C L i s b a s e d o n t h e w i d e b a n d M S / M S i s o l a t i o n a n d f r a g m e n t a t i o n o f t h e p r e c u r s o r i o n m / z f o r C L ( 1 8 : 1 ) 4 a n d t h e C L ( 1 4 : 0 ) 4 i n t e r n a l s t a n d a r d , s u m m a r i z e d i n F i g u r e 1 0 . 1 0 . A l l o f t h e i o n s a b o v e 5 % i n n o r m a l i z e d r e l a t i v e a b u n d a n c e i n M S h a v e b e e n q u a n t i fi e d b y M S / M S i n t h i s e x p e r i m e n t , b u t o n l y t h e C L M S / M S q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s a r e g o i n g t o b e d i s c u s s e d h e r e . S i n c e C L i s o f t e n p r o p o s e d t o b e s u b s t i t u t a b l e b y G P G r o , a n d G P G r o h a s b e e n s h o w n t o b e f u n c t i o n a l l y e x c h a n g e a b l e w i t h S Q D G , t h e q u a n t i fi c a t i o n o f C L ( b y M S / M S ) a n d G P G r o , a n d r e l a t i v e q u a n t i fi c a t i o n o f S Q D G l i p i d s ( b y M S ) a r e i n c l u d e d i n F i g u r e 1 0 . 1 0 . 4 3 8 F i g u r e 1 0 . 9 N e g a t i v e i o n m o d e E S I M S s p e c t r a o f t h e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m t h e s a m e a m o u n t o f i s o l a t e d m e m b r a n e s o f R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 - 2 . 4 . 1 g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , 1 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L - / P + ) , 1 6 9 - 2 . 4 . 1 u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P — ) , a n d 1 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L - / P - ) , i n t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 4 , 2 , 2 a n d 1 u M i n t h e c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , v / v ) s o l v e n t c o n t a i n i n g 4 0 m M a m m o n i u m h y d r o x i d e . T h e m / z r a n g e o f 1 2 0 0 - 1 6 0 0 i s d i s p l a y e d f o r t h e c a r d i o l i p i n . 4 3 9 ) % ( e c n a d n u b A e v i t a l e R 2 . 0 6 5 3 6 0 2 2 4 1 0 0 0 7 0 0 o 0 7 6 1 . 0 8 - 0 8 6 2 4 1 : 1 , v l v ) ' 2 C [ 1 L 3 ( 9 [ 1 C 2 L 3 1 ( 9 1 0 3 ) - 4 . . 5 : 0 1 . 4 5 4 ) ' 0 — 0 H ] _ i . s . 1 4 M ' 1 M [ C ( H 8 0 ' 0 = ) 1 C [ 4 — H j 7 3 . 0 0 1 H . 5 ] 8 I 1 ) 1 3 5 4 - 7 ? 4 0 4 N ) _ 5 5 0 1 ( 8 H . 1 _ l \ C ' 8 ‘ L 1 , " ‘ 3 C D _ T ( ) / W M S P - ( L _ - ) / M P S - C 3 . 8 9 e 3 [ C L ( 1 4 . - 0 ) 4 — H ] ' i . s . A ( — ) M S 1 0 0 1 2 3 9 . 5 [ C L ( 1 8 : 1 ) 4 - H ] _ W T / P + 8 0 1 4 5 5 - 8 l 1 2 0 0 1 3 0 0 1 4 0 0 ' 1 5 ' 0 0 1 . 9 9 e 3 _ B _ M S 0 0 [ C L ( 1 4 : 0 ) 4 — H ] i s . N O C L ? C ( L Z / P + 8 0 1 2 3 9 . 5 b “ t h e s a m e r n o r m a l i n d e r l o w 6 0 ' t h e l l p l d 2 0 a n d C L 1 2 0 0 ‘ 1 3 0 0 ' 1 4 ' 0 0 ‘ 1 5 ' 0 0 , _ 1 6 0 0 i s 1 2 0 0 ‘ 1 3 0 0 ' 1 4 0 0 ' 1 5 0 0 Z 4 4 0 F i g u r e 1 0 . 1 0 S u m m a r y o f t h e q u a n t i fi c a t i o n r e s u l t s o f C L u s i n g n e g a t i v e i o n m o d e E S I M S / M S w i t h w i d e b a n d i s o l a t i o n a n d a c t i v a t i o n , a n d t h e q u a n t i fi c a t i o n o f G P G r o a n d S Q D G l i p i d s b y M S . T h e l i p i d s a r e e x t r a c t e d f r o m t h e 1 6 9 - 2 . 4 . l g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , 1 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L — / P + ) , 1 6 9 - 2 . 4 . 1 u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P — ) , a n d l 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L - / P - ) . I n p a n e l A , C L ( 1 8 : 1 ) 4 i s q u a n t i fi e d a g a i n s t t h e C L ( 1 4 : 0 ) 4 i n t e r n a l s t a n d a r d b y t h e m o s t a b u n d a n t f r a g m e n t i o n s ( m / z 6 9 9 v s . m / z 5 9 1 ) , G P G r o l i p i d s a r e q u a n t i fi e d a g a i n s t t h e i r i n d i v i d u a l i n t e r n a l s t a n d a r d s i n M S ; i n p a n e l B , S Q D G i s r e l a t i v e l y q u a n t i fi e d w i t h r e f e r e n c e t o t h e G P G r o s t a n d a r d i n M S . T h e d a t a s h o w n a r e t h e m e a n v a l u e s f r o m t r i p l i c a t e e x t r a c t i o n s , a n d t h e e r r o r b a r i s t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n . F o r a l l o f t h e p h o s p h o l i p i d s q u a n t i fi e d h e r e , t h e l i p i d c o n c e n t r a t i o n s i n t h e E S I s a m p l e s a r e w i t h i n t h e l i n e a r r a n g e a s s h o w n i n F i g u r e 7 . 1 0 . 4 4 1 s r “ 1 4 i “ P M ” , r i d 1 , s s 1 o 1 - ‘ “ i n 3 - p r , ° o “ G ‘ 0 . G 2 G : P P 0 1 G G 1 1 / / 8 r r 9 1 1 8 8 0 0 0 1 0 S : S S : : S S S : : : 0 / Q Q / / Q Q / / Q Q / 6 6 6 8 8 8 6 8 8 1 D D 1 1 D D 1 1 1 D D 8 8 8 1 1 1 1 l 1 0 1 0 0 o : o : G : G : G G : : G : G : 1 0 1 1 I 0 I 1 2 R a t i o o f l i p . l i 5 d I s / m e m b r a n e l 5 r 2 p l o t e i n s ( n m 3 7 l / 1 _ _ _ _ _ | . _ 5 1 _ _ g _ B _ o _ _ _ _ _ E - - - I 0 T I ' T T / / / / - - P P P P + + - - W C W C L L l ) _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ' l fl C L ( 1 8 : 1 ) 4 G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 G P G r o 1 8 : 0 / 1 8 : l i 1 2 3 R e l a t i v e q u a n t i t y o f l i p i d s ( A r b i t r a r y u n i t s ) 4 4 2 T h e M S / M S q u a n t i fi c a t i o n o f C L s h o w n i n t h e fi r s t r o w o f F i g u r e 1 0 . 1 0 c l e a r l y i n d i c a t e s t h a t , fi r s t o f a l l , t h e l e v e l o f c a r d i o l i p i n i n t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t w a s f u r t h e r d e c r e a s e d b y t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h , a n d t h e r e f o r e , a fi v e - f o l d “ c l e a n e r ” C L - d e fi c i e n t s a m p l e i s o b t a i n e d b y t h e c o m b i n a t i o n o f t h e C L - d e fi c i e n t m u t a t i o n a n d t h e l o w - p h o s p h a t e g r o w t h : C L — / P - g a v e 0 . 9 5 % v s . C L — / P + 5 . 5 % , r e l a t i v e t o t h e w i l d t y p e W T / P + C L l e v e l , a n d a n o v e r - fi v e - f o l d f u r t h e r d e p l e t i o n o f t h e C L s e e n i n t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t C L — / P + i s n o w s e e n i n t h e c o m b i n e d d e p l e t i o n s a m p l e C L - / P — . S e c o n d l y , t h e C L i n t h e w i l d t y p e u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h C L — / P + , i s m a i n t a i n e d a t 7 3 % o f t h e l e v e l i n t h e n o r m a l - p h o s p h a t e g r o w t h . T h i s c a n b e c o m p a r e d w i t h G P E t n a n d G P C h o w h i c h a r e f o u n d t o b e n e a r l y c o m p l e t e l y d e p l e t e d b y t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h ( 0 . 1 m M p h o s p h a t e v s . t h e n o r m a l 2 0 m M p h o s p h a t e ) . T h e l i m i t e d p h o s p h a t e s e e m s t o h a v e p r i o r i t i e s o f d e s t i n a t i o n f o r m a k i n g l i p i d s . T h e fi r s t p r i o r i t y i s t h e c a r d i o l i p i n ( 7 3 % m a i n t a i n e d ) , f o l l o w e d b y G P G r o ( 5 0 % m a i n t a i n e d ) , w h i l e G P E t n a n d G P C h o p r o b a b l y h a v e t h e l o w e s t p r i o r i t y . W h i l e b o t h G P G r o a n d C L d e c r e a s e b y d i f f e r e n t d e g r e e s , t h e S Q D G l i p i d s i n c r e a s e s i g n i fi c a n t l y i n t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c o n d i t i o n s . A l l o f t h e S Q D G , G P G r o a n d C L l i p i d s c a r r y a n e g a t i v e c h a r g e i n t h e h e a d g r o u p . T h e s u m o f t h e n e g a t i v e c h a r g e f r o m a l l t h e n e g a t i v e l y c h a r g e d l i p i d s m a y b e r e q u i r e d t o b e m a i n t a i n e d a t a c e r t a i n l e v e l f o r t h e i r p h y s i o l o g i c a l n e e d s [ 1 4 ] . T h e n e a r l y c o m p l e t e d e p l e t i o n i n t h e p o s i t i v e l y c h a r g e d G P C h o l i p i d s a n d t h e d r a m a t i c i n c r e a s e i n t h e D G T S c a r r y i n g t h e s a m e z w i t t e r i o n i c c e n t e r c o n t a i n i n g a fi x e d p o s i t i v e c h a r g e i n t h e t r i m e t h y l a m i n o g r o u p , h o w e v e r , s u g g e s t t h a t z w i t t e r i o n i c c e n t e r c o n t a i n i n g t h e fi x e d p o s i t i v e c h a r g e i n t h e G P C h o l i p i d s i s a l s o e s s e n t i a l , b u t n o t t h e 4 4 3 e n t i r e m o l e c u l e ; i f t h e c e n t e r c a n b e p r o v i d e d b y a n o t h e r t y p e o f n o n - p h o s p h o l i p i d , t h e l i m i t e d p h o s p h a t e s o u r c e w i l l n o t b e w a s t e d t o m a k e t h e r e s t o f t h e G P C h o s t r u c t u r e . T h e a p p r e c i a b l y i n c r e a s e d a m o u n t o f l i p i d s w i t h s a t u r a t e d f a t t y a c i d c h a i n s i n t h e r e m a i n i n g G P G r o a n d S Q D G i n t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c a n p r o b a b l y b e r e l a t e d t o t h e m e m b r a n e l i p i d i n t e r a c t i o n s . T h e p h o s p h a t e g r o u p , b y f o r m i n g h y d r o g e n b o n d s a n d e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s , i s o n e o f t h e f o r c e s t h a t k e e p t h e m e m b r a n e a t t h e a p p r o p r i a t e t i g h t n e s s a n d fl e x i b i l i t y . T h e d e fi c i e n c y i n p h o s p h a t e , a n d t h e d e c r e a s e i n t h e t o t a l a m o u n t o f p h o s p h o l i p i d s , l i m i t e d t h e c o n t r i b u t i o n b y s u c h i n t e r a c t i o n s f r o m p h o s p h a t e g r o u p s . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e i n c r e a s e i n t h e d e g r e e o f s a t u r a t i o n i n t h e f a t t y a c i d c h a i n s h e l p s t o c o m p e n s a t e f o r t h e l o s s b y m a k i n g t h e m e m b r a n e t i g h t e r b y i n c r e a s i n g t h e r i g i d i t y a n d h y d r o p h o b i c i t y o f t h e l i p i d t a i l [ 3 3 9 ] . I n s u m m a r y , i t w a s f o u n d t h a t , i n r e s p o n s e t o t h e l i m i t e d p h o s p h a t e c o n c e n t r a t i o n i n t h e g r o w t h m e d i a , t h e l i p i d p r o fi l e o f R . s p h a e r o i d e s m e m b r a n e s , b o t h t h e w i l d t y p e ( 1 6 9 - 2 . 4 . 1 ) a n d t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t ( 1 6 9 C L 3 ) , i n d e e d c h a n g e d d r a s t i c a l l y , t h e r e f o r e t h e c l o s e - t o - w i l d - t y p e b e h a v i o r s e e n i n t h e p u r i fi e d C c O a n d t h e c e l l s a r e p r o b a b l y t h e r e s u l t o f a d a p t a t i o n s o f t h e l i p i d e n v i r o n m e n t i n v i v o . I n p a r t i c u l a r , t h e c o m b i n a t i o n o f C L - d e fi c i e n c y m u t a t i o n a n d t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c a n c r e a t e a s i g n i fi c a n t l y c l e a n e r ( b y 5 f o l d ) C L - d e fi c i e n t s t r a i n . H o w e v e r , a l l t h e r e s u l t s d i s c u s s e d s o f a r a r e o b t a i n e d f r o m e x t r a c t s o f R h o d o b a c t e r m e m b r a n e s . I n o r d e r t o u n d e r s t a n d m o r e a b o u t t h e n a t u r e o f t h e p o t e n t i a l r o l e s o f C L f o r R . s p h a e r o i d e s C c O , i t i s n e c e s s a r y t o l o o k d i r e c t l y a t t h e l i p i d s t h a t a r e a s s o c i a t e d w i t h t h e p u r i fi e d C c O , w h i c h c a n b e d o n e m o r e r e a d i l y u s i n g M A L D I . 4 4 4 1 0 . 3 . 4 Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e l i p i d s i n t h e m e m b r a n e g r o w n w i t h l o w - p h o s p h a t e u s i n g M A L D I D u e t o t h e d e t e r g e n t i n t e r f e r e n c e a n d i n c o m p l e t e c h e m i c a l e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y i s s u e s w i t h E S I a n a l y s i s o f t h e l i p i d e x t r a c t f r o m t h e m e m b r a n e p r o t e i n C c O , t h e d i r e c t M A L D I M S a n d M S / M S a n a l y s i s w a s u s e d t o o b t a i n a r e l a t i v e l y q u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n o f t h e l i p i d s i n t h e p u r i fi e d C c O , b y i n c o r p o r a t i n g a s e t o f i n t e r n a l s t a n d a r d s a t a p p r o p r i a t e c o n c e n t r a t i o n s . T h e s a m e m e t h o d s w e r e a p p l i e d t o t h e a n a l y s i s o f r e s u s p e n d e d m e m b r a n e p e l l e t s , a n d t h e M A L D I s p e c t r a w e r e c o m p a r e d t o t h o s e o f t h e E S I s p e c t r a o n t h e m e m b r a n e l i p i d e x t r a c t . I r n p o r t a n t l y , s i m i l a r c o n c l u s i o n s c o u l d b e d r a w n a b o u t t h e r e l a t i v e l y q u a n t i t a t i v e c h a n g e s i n t h e l i p i d s a s a r e s u l t o f t h e C L - d e fi c i e n c y o r t h e p h o s p h a t e — l i m i t i n g g r o w t h . F i g u r e 1 0 . 1 1 s h o w s t h e M A L D I M S s p e c t r a o f t h e m e m b r a n e s f r o m R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 - 2 . 4 . 1 ( W T ) a n d 1 6 9 C L 3 ( C L — ) g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , ( C L — l P + ) , a n d l o w p h o s p h a t e ( W T / P — ) , ( C L - / P — ) , i n t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / 1 4 z 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 . F i g u r e s 1 0 . 1 1 C a n d 1 0 . 1 1 D s h o w t h a t t h e D G T S i s t h e p r e d o m i n a n t s p e c i e s o b s e r v e d i n p o s i t i v e i o n m o d e i n t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h , a n d G P C h o i s n e a r l y c o m p l e t e l y d e p l e t e d , c o n s i s t e n t w i t h t h e E S I a n a l y s i s . 4 4 5 F i g u r e 1 0 . 1 1 P o s i t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a o f t h e s a m e a m o u n t o f i s o l a t e d m e m b r a n e s ( 1 u L a t 0 . 2 5 m g / m L fi n a l m e m b r a n e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d b y B C A a s s a y ) o f R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 - 2 . 4 . 1 g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , 1 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L - / P + ) , 1 6 9 - 2 . 4 . l u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P — ) , a n d 1 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L - / P - ) , w i t h t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , 5 , 1 . 2 5 a n d 1 . 2 5 1 1 M , r e s p e c t i v e l y , i n t h e m o n o - p h a s e m i x t u r e w i t h t h e s a m p l e . T h e m / z r a n g e f r o m 6 0 0 - 1 0 0 0 i s d i s p l a y e d . 4 4 6 ) % ( e c n a d n u b A e v i t a l e R 4 2 2 0 2 : 4 1 0 0 % 3 0 0 8 1 6 8 6 1 L . 0 0 6 1 8 4 6 6 0 0 3 . i 3 . 6 . G . 6 5 0 P C u n k 5 6 i 0 0 s 8 C Q h n L o 6 L d 7 i 7 . 7 0 0 7 5 t 7 i 7 s 1 . 6 . e 1 1 0 . 0 ‘ 1 T ) 6 G 4 S [ 7 ” : t 5 1 7 5 0 fl 7 . 0 l 8 D . 8 g e h m 0 . T 0 8 G 6 m 8 - z T 1 1 8 A 1 8 G 2 1 S [ 8 / l D 0 L A ; 8 0 / 0 z G / + 1 G 1 G 1 8 [ H 2 [ - 0 ; 4 + 1 4 1 3 8 / 1 n 8 8 u 5 D 1 + G N 8 G D G 1 a : 9 1 1 K 8 1 : 1 . . 0 ] 8 0 : + M . . 9 . 0 0 / 1 8 I L ] + 8 1 / A 1 . : D < 8 ) K 8 ] 3 L ] / m 3 1 9 C ; 9 + 5 L 1 ( 5 1 9 + 9 0 + - 0 + . M 1 . | S m - J P e + - . - 1 1 i s o l a t e d . i n e d b y T / 1 " " l , d / e t d a r d S o f a t fi n a l m e w i t h 7 6 6 [ G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + N a ] + 7 4 4 [ G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + H ] + " 7 8 6 [ G P C h o l 8 1 / 1 8 1 + H ] + 8 0 0 [ G P C h 0 1 8 1 / 1 9 1 + H ] " 8 0 8 [ G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + 1 \ 1 a ] + [ G z P C h o l 8 1 / 1 8 1 + 1 < ] + 1 . 4 3 e 4 4 M S 1 0 0 [ G P C h o ' z . s + K ] + i 8 2 A V ( V % / P + 7 1 6 2 3 G P C h 0 1 . 3 m e m G P E t n i . 6 7 8 3 ' 8 3 8 [ G P C h o 1 8 : 1 / 1 9 : 1 + K ] + 4 o 2 0 _ L 1 . 1 L L A . “ L L ; 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 6 . 0 3 e 3 8 2 4 B ( + ) M S 1 2 1 ( 1 ) 7 6 6 8 0 8 C L - / P + [ G P C h o i u s + K ] J r 7 8 6 6 0 G P E t n i . s 7 1 6 7 4 4 8 , 3 8 m m 4 0 6 3 6 3 " " 2 0 L ‘ - L ‘ . 1 . V i k L L + L 1 : L L ‘ E : _ 1 — _ i r i A “ 6 0 0 6 5 0 7 0 0 , 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 C L l - s - [ D G T S l 8 : 1 / 1 8 1 + H ] + ” 1 2 0 % 4 9 4 Q L 7 0 5 7 1 6 ( 6 4 [ D G T S l 8 2 1 / 1 8 : 1 + N a ] + a w a 3 0 G P C h o i - S - 7 . 3 6 [ 1 ) G T S 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + K ] + m m 6 0 G P E t n i s . 6 7 8 8 0 2 4 4 7 F i g u r e 1 0 . 1 2 N e g a t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a o f t h e s a m e a m o u n t o f i s o l a t e d m e m b r a n e s ( 1 1 1 L a t 0 . 2 5 m g / m L fi n a l m e m b r a n e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d b y B C A a s s a y ) o f R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 - 2 . 4 . 1 g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , 1 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L — l P + ) , l 6 9 - 2 . 4 . 1 u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P - ) , a n d 1 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L — / P - ) , w i t h t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o l 4 : 0 / 1 4 1 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , 5 , 1 . 2 5 a n d 1 . 2 5 1 1 M i n t h e m o n o - p h a s e m i x t u r e w i t h t h e s a m p l e . T h e m / z r a n g e f r o m 6 0 0 — 1 0 0 0 i s d i s p l a y e d . 4 4 8 [ G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 2 1 — H ] _ 5 . 0 6 e 3 6 9 1 7 . 4 2 [ G P G r o t 8 z 1 / 1 8 : 1 — H ] ‘ A ( - ) M S S Q D G W T / P + m e m 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 _ o o 9 5 0 [ G P E t n 1 8 : 1 / 1 8 2 1 — H ] _ [ G P G r o l 8 2 1 / 1 8 : 1 — H ] 2 8 1 8 3 5 6 3 7 4 . 2 . 7 7 3 S Q D G B C ? [ “ 1 3 5 V — + 8 8 0 7 5 ' S Q D G m e m g 6 0 G P G r o z ‘ . 3 . 7 3 3 8 ' r : 4 0 6 6 5 B 2 0 < . L L _ I L , “ 2 ’ 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 a T 5 4 . 9 8 e 3 _ ‘ 3 ‘ 1 0 0 7 2 8 S Q D G C ( ) M S G P G r o i . 3 . m e m : 3 6 6 5 6 ‘ 3 1 7 1 2 2 0 “ 3 1 S Q D G L . . . x ‘ L L L ‘ I L L 1 . 1 . 4 . 1 . . . 7 [ m a i l . L L M J L 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 1 . 5 I e 3 S Q D G D ( _ ) M S 1 0 0 8 D G 8 0 Q C L - / P — - 7 2 8 4 0 7 1 2 S Q D G 2 0 ‘ L _ ‘ L l i fi i A L L R L L J L A L M ‘ L n 1 . . I f I 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 m / z 4 4 9 F i g u r e 1 0 . 1 3 N e g a t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a i n t h e m / z r a n g e f r o m 1 2 0 0 - 1 6 0 0 , f o r t h e s a m e a m o u n t o f i s o l a t e d m e m b r a n e s ( 1 1 1 L a t 0 . 2 5 m g / m L fi n a l m e m b r a n e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d b y B C A a s s a y ) o f W T ( 1 6 9 — 2 . 4 . 1 ) a n d C L — ( 1 6 9 C L 3 ) R . s p h a e r o i d e s g r o w n u n d e r t h e s a m e s e t o f c o n d i t i o n s a s i n F i g u r e 1 0 . 1 2 , w i t h t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , 5 , 1 . 2 5 a n d 1 . 2 5 1 1 M i n t h e m o n o - p h a s e m i x t u r e w i t h t h e s a m p l e , r e s p e c t i v e l y . 4 5 0 ) 0 - 1 6 0 0 , g m b r a n e l 6 9 C L 3 ) t h e l i p i d d e L m i r t t l l f e [ C L ( 1 8 : 1 ) 4 — H ] _ 1 0 0 [ C L ( 1 6 : 0 ) 1 ( 1 8 : 1 ) 3 — H ] - m m 8 0 [ C L ( 1 4 : 0 ) 4 — H ] _ i . s . 1 4 2 9 . 8 1 5 3 3 . 8 6 0 1 2 3 9 . 5 1 5 3 5 . 8 1 2 0 0 1 3 0 0 1 4 0 0 1 5 0 0 1 4 9 5 . 8 1 5 3 3 . 8 A 1 0 6 2 e 3 1 4 9 7 . 9 1 5 3 5 . 8 8 0 ‘ fi _ _ _ _ _ B ( — ) M S [ C L ( 1 4 . 0 ) 4 H ] L S . [ C L ( 1 8 . 1 ) 4 H ] C L _ / 1 3 + 6 0 1 2 3 9 . 5 1 4 5 5 . 8 m e m ' 1 R e l a t i v e A b u n d a n c e ( % . ’ 2 0 1 2 0 0 ' 1 3 0 0 ' 1 4 0 0 Y 1 5 0 0 1 5 3 3 . 8 4 . 2 9 2 _ 0 0 e [ C L ( 1 4 : 0 ) 4 — H ] i s . . 1 4 9 5 . 8 1 5 3 5 " " 8 0 1 2 3 9 . 5 [ C L ( 1 8 : 1 ) 4 — H ] T v 1 4 9 7 . 8 C ( - ) M S 1 4 5 5 . 8 W T / P — ‘ 1 1 i . I V 1 2 0 0 ' 1 3 0 0 1 4 0 0 T 1 5 0 0 _ _ 1 5 3 3 . 8 2 . 8 0 e 2 [ ( 1 7 1 4 0 ) 4 — H ] 1 . 3 . 1 4 9 5 ' 8 1 5 3 5 . 8 1 0 0 ; 1 2 3 9 . 5 8 0 . 6 0 3 ' 4 0 1 2 0 5 v ‘ 1 2 0 0 1 3 0 0 1 4 0 0 1 5 0 0 z 4 5 1 L i k e w i s e , t h e n e g a t i v e i o n m o d e M A L D I M S ( F i g u r e 1 0 . 1 2 ) a l s o r e v e a l s t h e p a r t i a l r e t e n t i o n o f G P G r o l i p i d s , a n d t h e i n c r e a s e i n S Q D G , p a r t i c u l a r l y i n t h e s a t u r a t e d S Q D G s p e c i e s , i n r e s p o n s e t o t h e l o w - p h o s p h a t e g r o w t h . T h e m / z 1 2 0 0 - 1 6 0 0 r e g i o n o f t h e M S i n n e g a t i v e i o n m o d e i n F i g u r e 1 0 . 1 3 s h o w s t h a t C L c a n b e d e t e c t e d f o r t h e w i l d t y p e s a m p l e g r o w n u n d e r p h o s p h a t e - l i m i t i n g c o n d i t i o n s ( W T / P - ) a t 6 4 % o f t h e l e v e l o f C L i n W T / P + , a n d i n t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e g r t h c o n d i t i o n s ( C L - l P + ) a t 2 1 % o f t h e l e v e l o f C L i n W T / P + , b u t c a n n o t b e d e t e c t e d i n t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t u n d e r l o w - p h o s p h a t e g r o w t h c o n d i t i o n s ( C L — / P — ) , d u e t o a m u c h d e c r e a s e d q u a n t i t y . T h i s s h o w s a h i g h e r s e n s i t i v i t y o f M A L D I f o r d e t e c t i o n o f c a r d i o l i p i n , c o m p a r e d t o t h e E S I , u n d e r t h e c o n d i t i o n s a p p l i e d . 1 0 . 3 . 5 M A L D I a n a l y s i s o f l i p i d s i n p u r i fi e d C c O g r o w n u n d e r l o w - p h o s p h a t e c o n d i t i o n s T h e c o m p a r i s o n o f t h e M A L D I M S s p e c t r a o f t h e m e m b r a n e i n c l u d i n g i n t e r n a l s t a n d a r d s w i t h t h o s e o f t h e E S I M S a n d M S / M S s h o w s t h a t t h e M A L D I a n a l y s i s m e t h o d c a n y i e l d v a l i d q u a n t i t a t i v e r e s u l t s b y i n c l u d i n g i n t e r n a l s t a n d a r d s , a n d r u n n i n g t r i p l i c a t e e x p e r i m e n t s . F u r t h e r m o r e , w h e n w o r k i n g w i t h p u r i fi e d e n z y m e w i t h h i g h l e v e l s o f d e t e r g e n t , i t o f f e r s a s i g n i fi c a n t a d v a n t a g e . T h e M A L D I M S s p e c t r a o f t h e C c O p u r i fi e d b y N i - N T A F P L C f r o m t h e R . s p h a e r o i d e s l 6 9 - 2 . 4 . 1 a n d 1 6 9 C L 3 g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P a n d C L - / P + ) , a n d u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P — a n d C L — / P — ) , c o n t a i n i n g p h o s p h o l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s , a r e s h o w n i n F i g u r e 1 0 . 1 4 ( p o s i t i v e i o n m o d e M S ) , F i g u r e 1 0 . 1 5 ( n e g a t i v e i o n m o d e M S i n t h e r e g i o n o f m / z 6 0 0 - 1 0 0 0 ) a n d F i g u r e 1 0 . 1 6 ( n e g a t i v e i o n m o d e i n t h e 4 5 2 r e g i o n o f m / z 1 2 0 0 - 1 6 0 0 ) . T h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e M A L D I i s s t i l l m a d e d i f fi c u l t b y t h e d e t e r g e n t p e a k s , a n d t h e q u a n t i fi c a t i o n c a p a b i l i t y i s s t i l l l o w . N o n e t h e l e s s , t h e i n c l u s i o n o f i n t e r n a l s t a n d a r d s p r o v i d e s a r e l a t i v e l y q u a n t i t a t i v e p i c t u r e o f t h e a l t e r a t i o n s i n t h e l i p i d c o m p o s i t i o n s i n t h e s e f o u r d i f f e r e n t s a m p l e s . 4 5 3 F i g u r e 1 0 . 1 4 P o s i t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a o f t h e s a m e a m o u n t o f p u r i fi e d C C O ( 1 1 1 L a t 0 . 5 m g / m L fi n a l C c O c o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d b y U V - V i s s p e c t r o s c o p y ) o f W T ( 1 6 9 - 2 . 4 . 1 ) a n d C L — ( 1 6 9 C L 3 ) R . s p h a e r o i d e s g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , ( C L — l P + ) , a n d l o w p h o s p h a t e ( W T / P - ) , ( C L — / P - ) , w i t h t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , 5 , 1 . 2 5 a n d 1 . 2 5 1 1 M i n a m o n o - p h a s e m i x t u r e w i t h t h e s a m p l e , r e s p e c t i v e l y . T h e r e l a t i v e a b u n d a n c e i n t h e m / z r a n g e o f 7 0 6 - 8 3 0 i s e x p a n d e d 4 f o l d i n a l l f o u r p a n e l s f o r a c l e a r e r d i s p l a y o f t h e l i p i d s p e a k s . 4 5 4 p u r i fi e d O S C O P Y ) l o s p h a t c : e o f t h e l a n d C L 1 1 1 ’ 8 W i t h 5 8 3 0 i s x 4 i n a l l p a n e l s r | 6 5 8 [ G P E t n i s . + N a ] + G P E t n i s . 6 3 6 6 7 8 G P C h o i — S - J : 8 6 [ G P C h o 1 8 1 / 1 8 : 1 + H ] : . + - - t . . [ G P C h o 1 S + N a ] ? . . . . . . . . . . 8 0 8 [ G P C h 0 1 8 : 1 / 1 8 : 1 + N a ] 8 . 0 6 6 3 7 0 0 . 1 0 0 1 8 0 j . t ' 8 5 2 [ h e m e a ] + A V “ ) M S 6 0 ' 1 W T / P + 4 0 v 8 3 5 C 6 0 2 0 e L L h L 1 A # 1 . ] . L A L A _ _ _ 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 7 8 6 [ G P C h o l 8 : 1 / 1 8 : 1 + H ] $ 3 1 1 0 3 4 “ 7 0 0 8 0 8 [ G P C h o l 8 1 / 1 8 1 + N a ] B ( + ) M S ‘ 0 ’ 8 5 2 [ h e m e a ] C L - / P + o C c O 3 5 § 8 3 5 _ D < . J r “ ? * 1 , ‘ é ’ 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 a 3 2 5 0 0 5 6 3 [ D G T S I 8 : 1 / 1 8 : 1 + H ] + 8 5 2 1 h e m e a l + C ( + ) M S 8 0 : 7 6 4 W T / P — 6 0 : g " C c O 4 0 ; 6 7 8 8 7 0 0 8 3 5 2 0 : 1 . 6 5 8 1 1 1 1 . 1 1 1 . 1 3 1 . 1 1 1 - - 1 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 4 . 8 3 e 3 [ D G T s r 8 : 1 / 1 8 : 1 + H ] + 3 5 2 [ h e m e a ] + D ( + ) M S 1 0 0 7 6 4 C - L / P — 8 0 i f ! C C O 6 0 6 7 c ? [ G G D G 1 8 z 0 / 1 8 : 0 + K ] + 4 0 6 5 8 ‘ “ 8 3 5 9 8 7 2 0 : 1 _ 1 1 1 1 _ L k I L L L 1 4 L A A L . L 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 m / z 4 5 5 F i g u r e 1 0 . 1 4 s h o w s t h a t i n t h e p o s i t i v e i o n m o d e M S o f t h e p u r i fi e d C c O f r o m t h e n o r m a l - p h o s p h a t e g r o w t h o f t h e W T ( W T / P + ) ( F i g u r e 1 0 . 1 4 A ) a n d t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t ( C L - / P + ) ( F i g u r e 1 0 . 1 4 B ) , t h e p h o s p h o l i p i d G P C h o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 i s t h e m a j o r c o m p o n e n t ( s h o w n a s p r o t o n a t e d i o n s a n d s o d i u m a d d u c t i o n s ) . T h e G P E t n l i p i d p e a k s a r e n o t o b s e r v e d p a r t l y d u e t o t h e s u p p r e s s e d i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y i n t h e p r e s e n c e o f t h e d e t e r g e n t s a n d t h e h i g h e r e x t e n t o f i n - s o u r c e d e c o m p o s i t i o n . T h e h e m e a p e a k s ( m / z 8 5 2 , 8 3 5 ; s t r u c t u r e s c o n fi r m e d b y M S / M S ) o f t h e p u r i fi e d C c O c a n b e c l e a r l y o b s e r v e d i n M S a t h i g h a b u n d a n c e f o r a l l f o u r s a m p l e s . U n d e r l o w - p h o s p h a t e g r o w t h , t h e C 6 0 f r o m t h e t w o s t r a i n s ( W T / P + ) a n d ( C L - / P + ) d i s p l a y e d n o d e t e c t a b l e G P C h o , b u t a n e w n o n - p h o s p h o l i p i d D G T S 1 8 : 1 / 1 8 : 1 b e c a m e t h e l i p i d o b s e r v e d a t t h e h i g h e s t i o n a b u n d a n c e . T h e n e g a t i v e i o n m o d e M S s p e c t r a o f t h e C c O f r o m t h e n o r m a l - p h o s p h a t e g r o w t h o f W T ( W T / P + ) ( F i g u r e 1 0 . 1 5 A ) a n d C L - d e fi c i e n t m u t a n t ( C L — / P + ) ( F i g u r e 1 0 . 1 5 B ) s h o w t h a t t h e G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 a n d a s e r i e s o f S Q D G l i p i d s a r e r e t a i n e d i n t h e p u r i fi e d C c O , a n d b y r e f e r r i n g t o t h e G P G r o i n t e r n a l s t a n d a r d a t m / z 6 6 5 , t h e G P G r o l 8 z l / 1 8 z l l i p i d l e v e l c a n b e s e e n t o i n c r e a s e i n C L — l P + , c o m p a r e d t o W T / P + , w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t s b y E S I a n a l y s i s f o l l o w i n g l i p i d e x t r a c t i o n . H o w e v e r , u n d e r l o w - p h o s p h a t e g r o w t h , C c O f r o m W T / P - s t i l l s h o w s t h e e x i s t e n c e o f G P G r o 1 8 : 1 / 1 8 : 1 a t a b o u t 5 0 % o f t h e l e v e l o f G P G r o i n W T / P + , b y r e f e r r i n g t o t h e G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 i n t e r n a l s t a n d a r d ( F i g u r e 1 0 . 1 5 C ) , b u t i t i s n o t c l e a r l y r e s o l v e d i n t h e C L — / P - s a m p l e ( F i g u r e 1 0 . 1 5 D ) . S Q D G l i p i d s c a n b e o b s e r v e d i n b o t h t h e W T / P - a n d t h e C L - / P - C c O s a m p l e s . 4 5 6 F i g u r e 1 0 . 1 5 N e g a t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a o f t h e s a m e a m o u n t o f p u r i fi e d C c O ( 1 1 1 L a t 0 . 5 m g / m L fi n a l C c O c o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d b y U V - V i s s p e c t r o s c o p y ) f r o m W T ( 1 6 9 - 2 . 4 . l ) a n d C L — ( 1 6 9 C L 3 ) R . s p h a e r o i d e s g r o w n a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , w i t h t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , 5 , 1 . 2 5 a n d 1 . 2 5 1 1 M i n t h e m o n o - p h a s e m i x t u r e w i t h t h e s a m p l e , r e s p e c t i v e l y . T h e r e l a t i v e a b u n d a n c e s i n t h e m / z r a n g e s o f 7 0 0 - 8 5 0 a n d 6 6 0 - 6 7 0 , a r e e x p a n d e d 4 f o l d i n a l l f o u r p a n e l s f o r a c l e a r e r d i s p l a y o f t h e l i p i d s a n d t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s p e a k s . 4 5 7 ) % ( e c n a d n u b A e v i t a l e R x 4 i n a l l p a n e l s m l 1 [ G P G r o l 8 2 1 / l 8 : 1 — H ] _ A ( - ) M S W T / P + — C C O 7 7 3 8 1 9 [ S Q D G 1 6 : 0 / 1 8 : 1 — H ] _ ‘ 3 8 4 5 [ S Q D G 1 8 z l / 1 8 2 1 — H ] 3 3 8 5 7 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 1 . 3 1 e 4 6 8 1 [ G P G r o l S z 1 / 1 8 z l — H ] — B ( _ ) M S 0 7 7 3 _ 8 0 G P G m i - s . 8 1 9 [ S Q D G I 6 : 0 / 1 8 : 1 — H j C L - / P + 8 4 5 [ S Q D G 1 8 : 1 / 1 8 : 1 - H ] _ C C O . . . . . - , 8 5 7 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 7 . 7 8 , 3 6 8 1 [ G P G r o t § : 7 1 3 / 1 8 : 1 — H ] _ C ( _ ) M S 0 0 _ , [ S Q D G 1 8 z l / 1 8 z l — H ] W . “ P _ 8 0 3 , 8 4 5 6 0 1 C c O 3 7 8 5 3 8 5 7 V 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 [ S Q D G 1 8 i l / l 8 2 1 — H ] _ C L - / P — , 8 4 5 C C O 3 7 8 5 3 8 5 7 E l 1 ; - 1 v a 1 * 1 1 1 1 1 . 2 - 1 7 5 0 8 0 0 8 5 0 9 0 0 9 5 0 m / z 4 5 8 F i g u r e 1 0 . 1 6 s h o w s t h e n e g a t i v e i o n m o d e M S s p e c t r a o f t h e f o u r C C O s a m p l e s i n t h e m a s s r a n g e o f m / z 1 2 0 0 - 1 6 0 0 t o d i s p l a y t h e C L s p e c i e s . I n W T / P + C C O ( F i g u r e 1 0 . 1 6 A ) , s e v e r a l C L s p e c i e s a r e d e t e c t a b l e i n c l u d i n g t h e m o s t a b u n d a n t C L ( 1 8 : 1 ) 4 a t m / z 1 4 5 5 . 8 , a n d t h e l e s s a b u n d a n t C L ( 1 6 : 0 ) 1 ( 1 8 : l ) 3 a t m / z 1 4 2 9 . 8 , b u t C L ( 1 8 : 2 ) 4 ( e x p e c t e d m / z 1 4 4 8 . 8 ) i s n o t o b s e r v e d t o b e p r e s e n t h e r e i n t h e R . s p h a e r o i d e s C c O . T h e n e g a t i v e l y c h a r g e d s o d i u m o r p o t a s s i u m a d d u c t o f C L ( 1 8 : 1 ) 4 c o u l d a l s o b e o b s e r v e d a t m / z 1 4 7 8 . 9 a n d m / z 1 4 9 4 . 9 , r e s p e c t i v e l y . T h e a b u n d a n t i o n s a t 1 4 9 5 . 8 a n d 1 4 9 7 . 8 , h o w e v e r , d i s p l a y e d c h a r a c t e r i s t i c f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r s i n M S / M S a n d M S I 1 t h a t a r e n o t r e l a t e d t o C L l i p i d s o r a n y k n o w n p h o s p h o l i p i d s ( d a t a n o t s h o w n ) . I n C C O f r o m t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t C L - / P + ( F i g u r e 1 0 . 1 6 B ) , t h e l e v e l o f C L i s s i g n i fi c a n t l y r e d u c e d , b u t C L ( 1 8 : 1 ) 4 i s s t i l l o b s e r v a b l e a t l o w a b u n d a n c e , a b o u t ~ 3 0 % o f t h a t i n W T / P + C C O , ( c o m p a r e d t o 2 1 % o f t h a t i n W T / P + f o r m e m b r a n e s d e t e r m i n e d b y M A L D I M S I n t h e l o w - p h o s p h a t e g r o w t h , h o w e v e r , t h e W T / P — C C O ( F i g u r e 1 0 . 1 6 C ) c o n t a i n s a b u n d a n t i o n s o f C L 1 8 : 1 / 1 8 : 1 a n d C L ( 1 6 : 0 ) 1 ( 1 8 : l ) 3 . B y r e f e r r i n g t o t h e C L ( 1 4 : 0 ) 4 i n t e r n a l s t a n d a r d s , t h e C L i n W T / P - C c O ( F i g u r e 1 0 . 1 6 C ) i s a b o u t 7 0 % o f t h e q u a n t i t y o f C L i n t h e W T / P + C c O ( F i g u r e 1 0 . 1 6 D ) , r e fl e c t i n g t h e r e l a t i v e C L l e v e l i n t h e m e m b r a n e s . I n s t a r k c o n t r a s t , t h e C c O f r o m C L — l P - c o n t a i n s n o d e t e c t a b l e C L i o n s ( F i g u r e 1 0 . 1 6 D ) , a l s o c o n s i s t e n t w i t h i t s m e m b r a n e c o n t e n t o f C L . 4 5 9 F i g u r e 1 0 . 1 6 N e g a t i v e i o n m o d e M A L D I M S s p e c t r a i n t h e m / z r a n g e f r o m 1 2 0 0 - 1 6 0 0 , o f t h e s a m e a m o u n t o f p u r i fi e d C C O ( l p L a t 0 . 5 m g / m L fi n a l C c O c o n c e n t r a t i o n s , d e t e r m i n e d b y U V - V i s s p e c t r o s c o p y ) o f R . s p h a e r o i d e s 1 6 9 - 2 . 4 . 1 g r o w n u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( W T / P + ) , 1 6 9 C L 3 u n d e r n o r m a l p h o s p h a t e ( C L - l P + ) , 1 6 9 - 2 . 4 . 1 u n d e r l o w p h o s p h a t e ( W T / P — ) , a n d 1 6 9 C L 3 u n d e r l o w P ( C L - l P - ) , w i t h t h e p r e s e n c e o f t h e l i p i d i n t e r n a l s t a n d a r d s o f G P E t n 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P G r o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 , G P C h o 1 4 : 0 / 1 4 : 0 a n d C L ( 1 4 : 0 ) 4 a t fi n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , 5 , 1 . 2 5 a n d 1 . 2 5 p M i n t h e m o n o - p h a s e m i x t u r e w i t h t h e s a m p l e , r e s p e c t i v e l y . I n p a n e l D , T h e r e l a t i v e a b u n d a n c e i n t h e m / z r a n g e o f 1 3 0 0 - 1 6 0 0 i s e x p a n d e d 1 . 5 f o l d f o r a c l e a r e r v i e w o f t h e C L r e g i o n . 4 6 0 ) % ( - — o A O e c n a d n u b A e v i t a l e R 0 0 - 1 6 0 0 : : n t r a t i o n s : r n o r m a l m d e t 1 0 w { m e m d ) a n d C L 6 m i x t u r e ; r a n g e o f [ C L ( 1 8 : 1 ) 4 — H ] _ 1 - 3 e 3 C L 1 4 . - 0 , — H - i . s . 1 4 5 5 8 A — M S 1 0 0 i 2 3 g 5 ) 4 ] 1 4 9 5 8 w i / H 8 0 ' [ C L ( 1 6 : 0 ) 1 ( 1 8 : 1 ) 3 — H ] _ 1 4 9 7 . 8 6 0 , - 1 4 2 9 . 8 1 5 3 3 . 8 C 6 0 2 0 1 2 0 0 1 3 0 0 1 4 0 0 1 5 0 0 - - 1 4 9 5 . 8 C L 1 4 . - 0 - H . . 1 0 0 8 6 1 2 3 9 . 5 ) 4 ] ” 1 4 9 7 . 8 B ( - ) M S 8 0 [ C L ( 1 8 2 1 ) 4 — H ] ‘ C L — / P + 6 0 ' 1 4 5 5 . 8 1 5 3 3 _ 8 C c o ‘ 3 . 1 5 3 5 . 8 1 2 0 0 1 3 0 0 1 5 0 0 1 4 0 0 _ [ C L ( 1 8 : 1 ) 4 — H ] 6 - 7 9 2 [ C L ( 1 4 : 0 ) 4 — H ] _ i . s . 1 4 5 5 . 8 1 4 9 5 . 8 C ( — ) M S 1 2 3 9 . 5 [ C L ( 1 6 : 0 ) 1 ( 1 8 2 1 ) 3 — H ] — 1 4 9 7 - 8 W T / P — 1 4 2 9 . 8 C c O ' 1 1 2 0 0 1 3 0 0 _ 1 4 0 0 1 5 0 0 [ C L ( 1 4 : 0 ) 4 - H ] i . 3 . x 1 5 1 . 0 3 e 3 1 2 3 9 5 I l 1 0 0 N o C L ? D H M S 1 2 0 0 1 3 0 0 ' 1 4 ' 0 0 ' 1 5 0 0 Z 4 6 1 C o m b i n i n g t h e r e s u l t s s e e n f r o m b o t h t h e p o s i t i v e a n d t h e n e g a t i v e i o n m o d e M S o f t h e W T a n d C L — C c O u n d e r n o r m a l a n d l o w - p h o s p h a t e g r o w t h c o n d i t i o n s , i t i s c l e a r t h a t , i n t h e w i l d t y p e s a m p l e ( W T / P - ) , t h e l o w - p h o s p h a t e g r o w t h ( P — ) c a u s e s t h e n e a r l y c o m p l e t e d e p l e t i o n o f G P C h o f r o m t h e p u r i fi e d C C O , a n d a b o u t 5 0 % d e p l e t i o n i n G P G r o , b u t m a i n t a i n e d 7 0 % o f t h e l e v e l o f C L i n t h e n o r m a l - p h o s p h a t e g r o w t h , s i m i l a r t o t h e m e m b r a n e l i p i d c o m p o s i t i o n a s q u a n t i fi e d e a r l i e r b y E S I . O n t h e o t h e r h a n d , t h e n o n - p h o s p h o l i p i d D G T S i n c r e a s e d a n d S Q D G s p e c i e s c a n b e d e t e c t e d i n t h e C c O fi o m W T / P - . W h e n o n l y l o w - p h o s p h a t e g r o w t h i s a p p l i e d , t h e w i l d t y p e d e m o n s t r a t e d p r e f e r e n t i a l s y n t h e s i s a n d i n c o r p o r a t i o n o f t h e p h o s p h o l i p i d C L i n b o t h m e m b r a n e a n d C c O c o m p a r e d t o o t h e r l i p i d s s u c h a s G P C h o , s u g g e s t i n g t h a t C C O i s h i g h l y fl e x i b l e i n i t s r e q u i r e m e n t f o r G P C h o o r n o n - p h o s p h o l i p i d D G T S , b u t i s l e s s fl e x i b l e w i t h r e s p e c t t o C L , a n d d e m o n s t r a t e s a p r i o r i t y o f C L s y n t h e s i s a n d i n c o r p o r a t i o n . H o w e v e r , i n t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t e n z y m e s a m p l e ( C L — / P — ) , t h e c o m b i n a t i o n o f C L - d e fi c i e n t m u t a t i o n a n d t h e l o w - p h o s p h a t e g r o w t h c a u s e d n e a r l y c o m p l e t e d e p l e t i o n o f n o t o n l y C L b u t a l s o G P C h o . I t r e s u l t e d i n a n i n c r e a s e i n t h e n o n - p h o s p h o l i p i d D G T S , d e p l e t e d G P G r o b u t c l e a r l y i d e n t i fi a b l e S Q D G , a l o n g w i t h , m o s t i m p o r t a n t l y , d e p l e t i o n o f C L d o w n t o b e l o w d e t e c t a b l e l e v e l s . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e C c O p u r i fi e d fi o m t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t f r o m l o w - p h o s p h a t e g r o w t h m a i n t a i n e d i t s n a t i v e a c t i v i t y a n d e n z y m e p r o p e r t i e s b y a m e a n s o t h e r t h a n t h e s e l e c t i v e e n r i c h m e n t o f C L i n t h e i s o l a t e d e n z y m e . E v e n a t s i g n i fi c a n t l y d e p l e t e d l e v e l o f C L , G P G r o , a n d G P C h o , t h e i n c r e a s e i n D G T S a n d S Q D G ( a n d p r o b a b l y a l s o Q L , w h i c h i s t y p i c a l l y m o r e d i f fi c u l t t o d e t e c t b y M A L D I ) e n a b l e s C C O t o b e f u l l y f u n c t i o n a l . 4 6 2 T h e r e f o r e , u n d e r n o r m a l s u p p l y o f p h o s p h a t e , C c O h a s p r e f e r e n t i a l s p e c i fi c i t y f o r C L l i p i d s . S u c h a p r e f e r e n c e c a n b e s u b s t i t u t a b l e b y G P G r o w h e n C L i s n o t a b l e t o b e s y n t h e s i z e d , b u t w h e n b o t h G P G r o a n d C L a r e u n a v a i l a b l e , t h e r e q u i r e m e n t f o r C L a p p e a r s t o b e s u c c e s s f u l l y r e p l a c e d b y n e g a t i v e l y c h a r g e d n o n - p h o s p h o l i p i d s s u c h a s S Q D G . 1 0 . 4 C o n c l u s i o n s P h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c o n d i t i o n s c a u s e d s i g n i fi c a n t s e l e c t i v e c h a n g e s i n t h e l i p i d p r o fi l e s o f b o t h t h e R h o d o b a c t e r m e m b r a n e a n d p u r i fi e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e . T h e b a c t e r i a u n d e r l i m i t e d p h o s p h a t e c o n d i t i o n s d i s p l a y p r i o r i t i e s f o r m a k i n g d i f f e r e n t t y p e s o f l i p i d s . T h e fi r s t p r i o r i t y i s t h e c a r d i o l i p i n ( 7 3 % m a i n t a i n e d ) , f o l l o w e d b y G P G r o ( 5 0 % m a i n t a i n e d ) , a n d t h e n G P E t n a n d G P C h o . T h e l a t t e r t w o l i p i d s p r o b a b l y h a v e a n O p t i o n f o r s u b s t i t u t i o n w i t h t h e n o n - p h o s p h o l i p i d s D G T S t h a t c a r r y t h e s a m e fi x e d p o s i t i v e c h a r g e c e n t e r , s u g g e s t i n g t h a t t h e fi x e d p o s i t i v e c h a r g e , n o t t h e e n t i r e m o l e c u l e , i s i m p o r t a n t . T h e a p p r e c i a b l y i n c r e a s e d a m o u n t o f l i p i d s w i t h s a t u r a t e d f a t t y a c i d c h a i n s i n t h e r e m a i n i n g G P G r o a n d S Q D G i n t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c o u l d b e r e l a t e d t o t h e r e q u i r e m e n t t o s t r e n g t h e n t h e m e m b r a n e s b y i n c r e a s i n g t h e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s . Q L a s w e l l a s S Q D G w e r e f o u n d t o i n c r e a s e b y 2 - 5 f o l d i n t h e l o w - p h o s p h a t e g r o w t h , s u g g e s t i n g t h e i r f u n c t i o n a l s u b s t i t u t a b i l i t y f o r o t h e r l i p i d s . I n t h e e n d , t h e p h o s p h a t e - l i m i t i n g g r o w t h c o m b i n e d w i t h t h e c l s m u t a t i o n p r o d u c e d a m u c h “ c l e a n e r ” C L - d e p l e t e d s t r a i n . E S I a n d M A L D I M S r e v e a l e d s i m i l a r c h a n g e s i n t h e r e l a t i v e a b u n d a n c e s o f l i p i d 4 6 3 s p e c i e s b e t w e e n W T a n d t h e m u t a n t s i n t h e m e m b r a n e o f t h e b a c t e r i a , t h e C L l e v e l s b e i n g r e d u c e d t o O - 0 . 9 % i n t h e m e m b r a n e a n d p u r i fi e d e n z y m e . H o w e v e r , t h e p u r i fi e d b a c t e r i a l R . s p h a e r o i d e s C C O d e m o n s t r a t e d l i m i t e d s e n s i t i v i t y t o t h e m o d i fi e d l i p i d e n v i r o n m e n t , i n t e r m s o f s u b u n i t c o m p o s i t i o n , e n z y m e a c t i v i t y , e x p r e s s i o n l e v e l o r s t a b i l i t y d u r i n g p u r i fi c a t i o n . W h i l e t h e w i l d t y p e P — C c O m a i n t a i n e d 7 0 % o f t h e C L l e v e l c o m p a r e d t o n o r m a l - p h o s p h a t e g r o w t h , r e fl e c t i n g s i g n i fi c a n t s e l e c t i o n a b i l i t y o f t h e b a c t e r i a f o r C L c o m p a r e d t o o t h e r p h o s p h o l i p i d s l e v e l i n t h e m e m b r a n e s , t h e c o m b i n a t i o n o f C L - d e fi c i e n c y w i t h P - g r o w t h c r e a t e d a C C O t h a t w a s e s s e n t i a l l y c o m p l e t e l y d e p l e t e d i n C L , b u t f u l l y a c t i v e . T h e r e f o r e t h e s i g n i fi c a n t l a c k o f C L d i d n o t a p p r e c i a b l y a f f e c t t h e a s s e m b l y o f C C O i n t h e C L - d e fi c i e n t m u t a n t o r t h e a c t i v i t y o f t h e p u r i fi e d e n z y m e . T h e s e fi n d i n g s s u g g e s t t h a t , fi r s t o f a l l , C L i s n o t e s s e n t i a l f o r t h e a c t i v e f o r m o f b a c t e r i a l C c O p e r s e e v e n t h o u g h C c O h a s a p r e f e r e n c e o f i n c o r p o r a t i n g C L . I n s t e a d , C C O d i s p l a y s s o m e l e v e l o f fl e x i b i l i t y f o r a C L r e q u i r e m e n t , w h i c h c a n b e f u l fi l l e d b y G P G r o , w h e n a v a i l a b l e . S e c o n d , t h e r e q u i r e m e n t f o r C L i s n o t o n l y s a t i s fi e d b y G P G r o l i p i d s w i t h h i g h s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y t o C L , b u t c a n a l s o b e s a t i s fi e d w i t h n o n - p h o s p h o l i p i d s s u c h a s S Q D G , a n d p o t e n t i a l l y Q L a s w e l l , w h e n p h o s p h o l i p i d s a r e n o t a v a i l a b l e a t s u f fi c i e n t a m o u n t . C L i n b a c t e r i a ( C L ( 1 8 : 1 ) 4 ) s e e m s t o f u n c t i o n v i a m e c h a n i s m s d i f f e r e n t f r o m m a m m a l i a n s y s t e m s ( C L ( 1 8 : 2 ) 4 ) [ 8 , 2 1 ] . F u r t h e r i n s i g h t o f t h e r o l e o f l i p i d s i n C c O m i g h t b e g a i n e d f r o m e x a m i n a t i o n o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s ( C h a p t e r 9 ) . 4 6 4 B I B L I O G R A P H Y 4 6 5 1 0 . l l . 1 2 . B I B L I O G R A P H Y P a l s d o t t i r H , H u n t e C . L i p i d s i n m e m b r a n e p r o t e i n s t r u c t u r e s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , B i o m e m b r 2 0 0 4 ; 1 6 6 6 : 2 - 1 8 E n g e l m a n D M . M e m b r a n e s a r e m o r e m o s a i c t h a n fl u i d i c . N a t u r e 2 0 0 5 ; 4 3 8 : 5 7 8 - 5 8 0 I U P A C - I U B . I U P A C - I U B c o r n m i s i o n o n b i o c h e m i c a l n o m e n c l a t u r e . T h e n o m e n c l a t u r e o f l i p i d s . B i o c h e m J 1 9 7 8 ; I 7 1 : 2 1 - 3 5 F a h y E , S u b r a m a n i a m S , B r o w n H A , G l a s s C K , M e r r i l l A H , J r . , M u r p h y R C , R a e t z C R H , R u s s e l l D W , S e y a m a Y , S h a w W , S h i m i z u T , S p e n e r F , v a n M e e r G , V a n N i e u w e n h z e M S , W h i t e S H , W i t z t u m J L , D e n n i s E A . A c o m p r e h e n s i v e c l a s s i fi c a t i o n s y s t e m f o r l i p i d s . J L i p i d R e s 2 0 0 5 ; 4 6 : 8 3 9 - 8 6 2 K a l t a s h o v I A , D o r o s h e n k o V , C o t t e r R J , T a k a y a m a K , Q u r e s h i N . C o n fi r m a t i o n o f t h e s t r u c t u r e o f l i p i d A d e r i v e d f r o m t h e l i p o p o l y s a c c h a r i d e o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s b y a c o m b i n a t i o n o f M A L D I , L S I M S a n d t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . A n a l C h e m 1 9 9 7 ; 6 9 : 2 3 1 7 - 2 3 2 2 G a r a v i t o R M , F e r g u s o n - M i l l e r S . D e t e r g e n t s a s t o o l s i n m e m b r a n e b i o c h e m i s t r y . J B i o l C h e m 2 0 0 1 ; 2 7 6 : 3 2 4 0 3 - 3 2 4 0 6 L o p e z - L a r a I M , S o h l e n k a m p C , G e i g e r O . M e m b r a n e l i p i d s i n p l a n t - a s s o c i a t e d b a c t e r i a : T h e i r b i o s y n t h e s e s a n d p o s s i b l e f u n c t i o n s . M o l P l a n t - M i c r o b e I n t e r a c t 2 0 0 3 ; 1 6 : 5 6 7 - 5 7 9 C h i c c o A J , S p a r a g n a G C . R o l e o f c a r d i o l i p i n a l t e r a t i o n s i n m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n a n d d i s e a s e . A m J P h y s i o l 2 0 0 7 ; 2 9 2 : C 3 3 - C 4 4 S c h l a m e M . C a r d i o l i p i n s y n t h e s i s f o r t h e a s s e m b l y o f b a c e r i a l a n d m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s . J L i p i d R e s 2 0 0 8 ; 4 9 : 1 6 0 7 - 1 6 2 0 S c h l a m e M , R u a D , G r e e n b e r g M L . T h e b i o s y n t h e s i s a n d f u n c t i o n a l r o l e o f c a r d i o l i p i n . P r o g L i p i d R e s 2 0 0 0 ; 3 9 : 2 5 7 - 2 8 8 B e n n i n g C , H u a n g Z - H , G a g e D A . A c c u m u l a t i o n o f a n o v e l g l y c o l i p i d a n d a b e t a i n e l i p i d i n c e l l s o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s g r o w n u n d e r p h o s p h a t e l i m i t a t i o n . A r c h B i o c h e m B i o p h y s 1 9 9 5 ; 3 1 7 : 1 0 3 - 1 1 1 S c h m i d P , K u m a r V , W e i s B , S c h m i d H . P h o s p h o t i d y l T r i s r a t h e r t h a n N - a c y l p h o s p h a t i d y l s e r i n e i s s y n t h e s i z e d b y R h o d o p s e u d o m o n a s s p h a e r o i d e s g r o w n i n T r i s - c o n t a i n i n g m e d i a . B i o c h e m i s t r y 1 9 9 1 ; 3 0 : 1 7 4 6 - 1 7 5 1 4 6 6 1 3 . 1 4 . 1 5 . l 6 . 1 7 . 1 8 . 1 9 . 2 0 . 2 1 . 2 2 . 2 3 . 2 4 . 2 5 . 2 6 . T a m o t B , B e n n i n g C . M e m b r a n e l i p i d b i o s y n t h e s i s i n p u r p l e b a c t e r i a . T h e P u r p l e P h o t o t r o p i c B a c t e r i a 2 0 0 8 ; S p r i n g e r S c i e n c e a n d B u s i n e s s M e d i a B . V . : 1 1 9 - 1 3 4 B e n n i n g C , B e a t t y J T , P r i n c e R C , S o m e r v i l l e C R . T h e s u l f o l i p i d s u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r o l i s n o t r e q u i r e d f o r p h o t o s y n t h e t i c e l e c t r o n t r a n s p o r t i n R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s b u t e n h a n c e s g r o w t h u n d e r p h o s p h a t e l i m i t a t i o n . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 9 9 3 ; 9 0 : 1 5 6 1 - 1 5 6 5 T a m o t B . C o n s t r u c t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a c a r d i o l i p i n - d e fi c i e n t m u t a n t i n R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . I n : M S . T h e s i s M S U ; 2 0 0 6 B e n n i n g C , S o m e r v i l l e C R . I s o l a t i o n a n d g e n e t i c c o m p l e m e n t a t i o n o f a s u l f o l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . J B a c t e r i o l 1 9 9 2 ; I 7 4 : 2 3 5 2 - 2 3 6 0 B e n n i n g C , O h t a H . T h r e e e n z y m e s y s t e m s f o r g a l a c t o g l y c e r o l i p i d b i o s y n t h e s i s a r e c o o r d i n a t e l y r e g u l a t e d i n p l a n t s . J B i o l C h e m 2 0 0 5 ; 2 8 0 : 2 3 9 7 - 2 4 0 0 B e n n i n g C . G e n e t i c m u t a n t s c r e e n i n g b y d i r e c t m e t a b o l i t e a n a l y s i s . A n a l B i o c h e m 2 0 0 4 ; 3 3 2 : 1 - 9 D o w h a n W , M i l e y k o v s k a y a E , B o g d a n o v M . D i v e r s i t y a n d v e r s a t i l i t y o f l i p i d - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s r e v e a l e d b y m o l e c u l a r g e n e t i c a p p r o a c h e s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , B i o m e m b r 2 0 0 4 ; 1 6 6 6 : 1 9 - 3 9 G a s p a r M L , A r e g u l l i n M A , J e s c h S A , N u n e z L R , V i l l a - G a r c i a M , H e n r y S A . T h e e m e r g e n c e o f y e a s t l i p i d o m i c s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , M o l C e l l B i o l L i p i d s 2 0 0 7 ; 1 7 7 1 : 2 4 1 - 2 5 4 X u Y , M a l h o t r a A , R e n M , S c h l a m e M . T h e e n z y m a t i c f u n c t i o n o f t a f a z z i n . J B i o l C h e m 2 0 0 6 ; 2 8 1 : 3 9 2 1 7 - 3 9 2 2 4 X i e J , B o g d a n o v M , H e a c o c k P , D o w h a n W . P h o s p h a t i d y l e t h a n o l a r n i n e a n d m o n o g l u c o s y l d i a c y l g l y c e r o l a r e i n t e r c h a n g e a b l e i n s u p p o r t i n g t o p o g e n e s i s a n d f u n c t i o n o f t h e p o l y t o p i c m e m b r a n e p r o t e i n l a c t o s e p e r m e a s e . J B i o l C h e m 2 0 0 6 ; 2 8 1 : 1 9 1 7 2 - 1 9 1 7 8 C h a n g S - C , H e a c o c k P N , M i l e y k o v s k a y a E , V o e l k e r D R , D o w h a n W . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e g e n e ( C L S l ) e n c o d i n g c a r d i o l i p i n s y n t h a s e i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . J B i o l C h e m 1 9 9 8 ; 2 7 3 : 1 4 9 3 3 - 1 4 9 4 1 G a r r e t t R H , G r i s h a m C M . B i o c h e m i s r y 2 n d e d i t i o n . H a r c o u r t , I n c 1 9 9 9 : H o s l e r J P , F e r g u s o n - M i l l e r S , M i l l s D A . E n e r g y t r a n s d u c t i o n : p r o t o n t r a n s f e r t h r o u g h t h e r e s p i r a t o r y c o m p l e x e s . A n n u R e v B i o c h e m 2 0 0 6 ; 7 5 : 1 6 5 - 1 8 7 S c h a g g e r H . R e s p i r a t o r y c h a i n s u p e r c o m p l e x e s . I U B M B L i f e 2 0 0 1 ; 5 2 : 1 1 9 - 1 2 8 4 6 7 2 7 . 2 8 . 2 9 . 3 0 . 3 1 . 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . 3 7 . Q i n L , M i l l s D A , B u h r o w L , H i s e r C , F e r g u s o n - M i l l e r S . A c o n s e r v e d s t e r o i d b i n d i n g s i t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 2 0 0 8 ; 4 7 : 9 9 3 1 - 9 9 3 3 S h i n z a w a - I t o h K , A o y a m a H , M u r a m o t o K , T e r a d a H , K u r a u c h i T , T a d e h a r a Y , Y a m a s a k i A , S u g i m u r a T , K u r o n o S , T s u j i m o t o K , M i z u s h i m a T , Y a m a s h i t a E , T s u k i h a r a T , Y o s h i k a w a S . S t r u c t u r e s a n d p h y s i o l o g i c a l r o l e s o f 1 3 i n t e g r a l l i p i d s o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . E M B O J 2 0 0 7 ; 2 6 : 1 7 1 3 - 1 7 2 5 Y o s h i k a w a S , S h i n z a w a - I t o h K , T s u k i h a r a T . X - r a y s t r u c t u r e a n d t h e r e a c t i o n m e c h a n i s m o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J I n o r g B i o c h e m 2 0 0 0 ; 8 2 : 1 - 7 Q i n L . X — r a y c r y s t a l l o g r a p h i c s t u d i e s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . I n , P h . D . D i s s e r t a t i o n M S U ; 2 0 0 5 M i l l s D A , F e r g u s o n - M i l l e r S . I n fl u e n c e o f s t r u c t u r e , p H a n d m e m b r a n e p o t e n t i a l o n p r o t o n m o v e m e n t i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , B i o e n e r g 2 0 0 2 ; 1 5 5 5 : 9 6 - 1 0 0 M i l l s D A , S c h m i d t B , H i s e r C , W e s t l e y E , F e r g u s o n - M i l l e r S . M e m b r a n e p o t e n t i a l - c o n t r o l l e d i n h i b i t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e b y z i n c . J B i o l C h e m 2 0 0 2 ; 2 7 7 : 1 4 8 9 4 - 1 4 9 0 1 H o s l e r J P , F e t t e r J , T e c k l e n b u r g M M J , E s p e M , L e r m a C , F e r g u s o n - M i l l e r S . C y t o c h r o m e a a 3 o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s a s a m o d e l f o r m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e c - o x i d a s e . P u r i fi c a t i o n , k i n e t i c s , p r o t o n p u m p i n g , a n d s p e c t r a l a n a l y s i s . J B i o l C h e m 1 9 9 2 ; 2 6 7 : 2 4 2 6 4 - 2 4 2 7 2 S v e n s s o n - E k M , A b r a m s o n J , L a r s s o n G , T o m r o t h S , B r z e z i n s k i P , I w a t a S . T h e x - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e s o f w i l d - t y p e a n d E Q ( I - 2 8 6 ) m u t a n t c y t o c h r o m e c o x i d a s e s f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . J M o l B i o l 2 0 0 2 ; 3 2 1 : 3 2 9 - 3 3 9 Q i n L , H i s e r C , M u l i c h a k A , G a r a v i t o R M , F e r g u s o n - M i l l e r S . I d e n t i fi c a t i o n o f c o n s e r v e d l i p i d / d e t e r g e n t - b i n d i n g s i t e s i n a h i g h - r e s o l u t i o n s t r u c t u r e o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 2 0 0 6 ; 1 0 3 : 1 6 1 1 7 - 1 6 1 2 2 T s u k i h a r a T , A o y a m a H , Y a m a s h i t a E , T o m i z a k i T , Y a m a g u c h i H , S h i n z a w a - I t o h K , N a k a s h i m a R , Y a o n o R , Y o s h i k a w a S . T h e w h o l e s t r u c t u r e o f t h e l 3 - s u b u n i t o x i d i z e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e a t 2 . 8 A . S c i e n c e ( W a s h i n g t o n , D C ) 1 9 9 6 ; 2 7 2 : 1 1 3 6 - 1 1 4 4 D i s t l e r A M , A l l i s o n J , H i s e r C , Q i n L , H i l m i Y , F e r g u s o n - M i l l e r S M . M a s s s p e c t r o m e t r i c d e t e c t i o n o f p r o t e i n , l i p i d a n d h e m e c o m p o n e n t s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e fi ' o m R . s p h a e r o i d e s a n d t h e s t a b i l i z a t i o n o f n o n - c o v a l e n t c o m p l e x e s f r o m t h e e n z y m e . E u r M a s s S p e c t r o m 2 0 0 4 ; 1 0 : 2 9 5 - 3 0 8 4 6 8 3 8 . 3 9 . 4 0 . 4 1 . 4 2 . 4 3 . 4 5 . 4 6 . 4 7 . 4 8 . 4 9 . M i l l s D A , F e r g u s o n - M i l l e r S . P r o t o n u p t a k e a n d r e l e a s e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e : s e p a r a t e p a t h w a y s i n t i m e a n d s p a c e ? B i o c h i m B i o p h y s A c t a , B i o e n e r g 1 9 9 8 ; 1 3 6 5 : 4 6 - 5 2 B o e k e m a E J , B r a u n H - P . S u p r a m o l e c u l a r S t r u c t u r e o f t h e M i t o c h o n d r i a l O x i d a t i v e P h o s p h o r y l a t i o n S y s t e m . J B i o l C h e m 2 0 0 7 ; 2 8 2 : 1 - 4 H e i n e m e y e r J , L e w e j o h a n n D , B r a u n H - P . B l u e - n a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s f o r t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o t e i n c o m p l e x e s i n p l a n t s . M e t h o d s M o l B i o l ( T o t o w a , N J , U S ) 2 0 0 7 ; 3 5 5 : 3 4 3 - 3 5 2 H e i n e m e y e r J , B r a u n H - P , B o e k e m a E J , K o u r i l R . A s t r u c t u r a l m o d e l o f t h e c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e / o x i d a s e s u p e r c o m p l e x f r o m y e a s t m i t o c h o n d r i a . J B i o l C h e m 2 0 0 7 ; 2 8 2 : 1 2 2 4 0 - 1 2 2 4 8 F e r g u s o n - M i l l e r S , H o c h m a n J , S c h i n d l e r M . A g g r e g a t i o n a n d d i f f u s i o n i n t h e m i t o c h o n d r i a l e l e c t r o n - t r a n s f e r c h a i n : r o l e i n e l e c t r o n fl o w a n d e n e r g y t r a n s f e r . B i o c h e m S o c T r a n s 1 9 8 6 ; 1 4 : 8 2 2 - 8 2 4 D u d k i n a N V , H e i n e m e y e r J , S u n d e r h a u s S , B o e k e m a E J , B r a u n H - P . R e s p i r a t o r y c h a i n s u p e r c o m p l e x e s i n t h e p l a n t m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e . T r e n d s P l a n t S c i 2 0 0 6 ; 1 1 : 2 3 2 - 2 4 0 S a d d a r S , D i e n h a r t M K , S t u a r t R A . T h e F 1 F o - A T P s y n t h a s e c o m p l e x i n fl u e n c e s t h e a s s e m b l y s t a t e o f t h e c y t o c h r o m e b c l - c y t o c h r o m e o x i d a s e s u p e r c o m p l e x a n d i t s a s s o c i a t i o n w i t h t h e T I M 2 3 m a c h i n e r y . J B i o l C h e m 2 0 0 8 ; 2 8 3 : 6 6 7 7 - 6 6 8 6 S h e n H , W a l t e r s D E , M u e l l e r D M . I n t r o d u c t i o n o f t h e c h l o r o p l a s t r e d o x r e g u l a t o r y r e g i o n i n t h e y e a s t a t p s y n t h a s e i m p a i r s c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J B i o l C h e m 2 0 0 8 ; 2 8 3 : 6 6 7 7 - 6 6 8 6 W i t t i g I , S c h a g g e r H . S t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l A T P s y n t h a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 2 0 0 8 ; I 7 7 7 : 5 9 2 - 5 9 8 S t u a r t R A . S u p e r c o m p l e x o r g a n i z a t i o n o f t h e o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n e n z y m e s i n y e a s t m i t o c h o n d r i a . J B i o e n e r g B i o m e m b r 2 0 0 8 ; 4 0 : 4 1 1 - 4 1 7 D u d k i n a N V , S u n d e r h a u s S , B o e k e m a E J , B r a u n H - P . T h e h i g h e r l e v e l o f o r g a n i a t i o n o f t h e o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n s y s t e m : m i t o c h o n d r i a l s u p e r c o m p l e x e s . J B i o e n e r g B i o m e m b r 2 0 0 8 ; 4 0 : 4 1 9 - 4 2 4 S c h a g g e r H , d e C o o R , B a u e r M F , H o f m a n n S , G o d i n o t C , B r a n d t U . S i g n i fi c a n c e o f r e s p i r a s o m e s f o r t h e a s s e m b l y / s t a b i l i t y o f h u m a n r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x I . J B i o l C h e m 2 0 0 4 ; 2 7 9 : 3 6 3 4 9 - 3 6 3 5 3 4 6 9 5 0 . 5 1 . 5 2 . 5 3 . 5 4 . 5 5 . 5 6 . 5 7 . 5 8 . 5 9 . 6 0 . 6 1 . 6 2 . S c h a g g e r H , P f e i f f e r K . S u p e r c o m p l e x e s i n t h e r e s p i r a t o r y c h a i n s o f y e a s t a n d m a m m a l i a n m i t o c h o n d r i a . E M B O J 2 0 0 0 ; 1 9 : 1 7 7 7 - 1 7 8 3 W i t t i g I , C a r r o z z o R , S a n t o r e l l i F i l i p p o M , S c h a g g e r H . S u p e r c o m p l e x e s a n d s u b c o m p l e x e s o f m i t o c h o n d r i a l o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 2 0 0 6 ; I 7 5 7 : 1 0 6 6 - 1 0 7 2 L a n g e C , N e t t J H , T r u m p o w e r B L , H u n t e C . S p e c i fi c r o l e s o f p r o t e i n - p h o s p h o l i p i d i n t e r a c t i o n s i n t h e y e a s t c y t o c h r o m e b c l c o m p l e x s t r u c t u r e . E M B O J 2 0 0 1 ; 2 0 : 6 5 9 1 - 6 6 0 0 A w a s t h i Y C , C h u a n g T F , K e e n a n T W , C r a n e F L . T i g h t l y b o u n d c a r d i o l i p i n i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 9 7 1 ; 2 2 6 : 4 2 - 5 2 G o m e z B , J r . , R o b i n s o n N C . P h o s p h o l i p a s e d i g e s t i o n o f b o u n d c a r d i o l i p i n r e v e r s i b l y i n a c t i v a t e s b o v i n e c y t o c h r o m e b c l . B i o c h e m i s t r y 1 9 9 9 ; 3 8 : 9 0 3 1 - 9 0 3 8 S c h a g g e r H , H a g e n T , R o t h B , B r a n d t U , L i n k T A , v o n J a g o w G . P h o s p h o l i p i d s p e c i fi c i t y o f b o v i n e h e a r t b c l c o m p l e x . E u r J B i o c h e m 1 9 9 0 ; 1 9 0 : 1 2 3 - 1 3 0 W h i t e S H , L a d o k h i n A S , J a y a s i n g h e S , H r i s t o v a K . H o w m e m b r a n e s s h a p e p r o t e i n s t r u c t u r e J B i o l C h e m 2 0 0 1 ; 2 7 6 : 3 2 3 9 5 - 3 2 3 9 8 R o b i n s o n N C , Z b o r o w s k i J , T a l b e r t L H . C a r d i o l i p i n - d e p l e t e d b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e : b i n d i n g s t o i c h i o m e t r y a n d a f fi n i t y f o r c a r d i o l i p i n d e r i v a t i v e s . B i o c h e m i s t r y 1 9 9 0 ; 2 9 : 8 9 6 2 - 8 9 6 9 Q i n L , S h a r p e M A , G a r a v i t o R M , F e r g u s o n - M i l l e r S . C o n s e r v e d l i p i d - b i n d i n g s i t e s i n m e m b r a n e p r o t e i n s : a f o c u s o n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . C u r r O p i n S t r u c t B i o l 2 0 0 7 ; I 7 : 4 4 4 - 4 5 0 Z h a n g M , M i l e y k o v s k a y a E , D o w h a n W . C a r d i o l i p i n i s e s s e n t i a l f o r o r g a n i z a t i o n o f c o m p l e x e s I I I a n d I V i n t o a s u p e r c o m p l e x i n i n t a c t y e a s t m i t o c h o n d r i a . J B i o l C h e m 2 0 0 5 ; 2 8 0 : 2 9 4 0 3 - 2 9 4 0 8 Y a m a o k a - K o s e k i S , U r a d e R , K i t o M . C a r d i o l i p i n s f r o m r a t s f e d d i f f e r e n t d i e t a r y l i p i d s a f f e c t b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e a c t i v i t y . J N u t r 1 9 9 1 ; 1 2 1 : 9 5 6 - 9 5 8 S c h l a m e M , G r e e n b e r g M L . C a r d i o l i p i n s y n t h a s e f r o m y e a s t . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 9 9 7 ; 1 3 4 8 : 2 0 1 - 2 0 6 Z h a o M , S c h l a m e M , R u a D , G r e e n b e r g M L . C a r d i o l i p i n s y n t h a s e i s a s s o c i a t e d w i t h a l a r g e c o m p l e x i n y e a s t m i t o c h o n d r i a . J B i o l C h e m 1 9 9 8 ; 2 7 3 : 2 4 0 2 - 2 4 0 8 4 7 0 6 3 . 6 4 . 6 5 . 6 6 . 6 7 . 6 8 . 6 9 . 7 0 . 7 1 . 7 2 . 7 3 . C a r n a r a - A r t i g a s A , B r u n e D , A l l e n J P . I n t e r a c t i o n s b e t w e e n l i p i d s a n d b a c t e r i a l r e a c t i o n c e n t e r s d e t e r m i n e d b y p r o t e i n c r y s t a l l o g r a p h y . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 2 0 0 2 ; 9 9 : 1 1 0 5 5 - 1 1 0 6 0 S c h a g g e r H . R e s p i r a t o r y c h a i n s u p e r c o m p l e x e s o f m i t o c h o n d r i a a n d b a c t e r i a . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , B i o e n e r g 2 0 0 2 ; 1 5 5 5 : 1 5 4 - 1 5 9 Z h a n g M , M i l e y k o v s k a y a E , D o w h a n W . G l u i n g t h e r e s p i r a t o r y c h a i n t o g e t h e r . C a r d i o l i p i n i s r e q u i r e d f o r s u p e r c o m p l e x f o r m a t i o n i n t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e J B i o l C h e m 2 0 0 2 ; 2 7 7 : 4 3 5 5 3 - 4 3 5 5 6 P f e i f f e r K , G o h i l V , S t u a r t R o s e m a r y A , H u n t e C , B r a n d t U , G r e e n b e r g M i r i a m L , S c h a g g e r H . C a r d i o l i p i n s t a b i l i z e s r e s p i r a t o r y c h a i n s u p e r c o m p l e x e s . J B i o l C h e m 2 0 0 3 ; 2 7 8 : 5 2 8 7 3 - 5 2 8 8 0 M c M i l l i n J B , D o w h a n W . C a r d i o l i p i n a n d a p o p t o s i s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , M o l C e l l B i o l L i p i d s 2 0 0 2 ; 1 5 8 5 : 9 7 - 1 0 7 S p a r a g n a G C , C h i c c o A J , M u r p h y R C , B r i s t o w M R , J o h n s o n C A , R e e s M L , M a x e y M L , M c C u n e S A , M o o r e R L . L o s s o f c a r d i a c t e t r a l i n o l e o y l c a r d i o l i p i n i n h u m a n a n d e x p e r i m e n t a l h e a r t f a i l u r e . J L i p i d R e s 2 0 0 7 ; 4 8 : 1 5 5 9 - 1 5 7 0 H u a n g Z , J i a n g J , T y u r i n V A , Z h a o Q , M n u s k i n A , R e n J , B e l i k o v a N A , F e n g W , K u m i k o v I V , K a g a n V E . C a r d i o l i p i n d e fi c i e n c y l e a d s t o d e c r e a s e d c a r d i o l i p i n p e r o x i d a t i o n a n d i n c r e a s e d r e s i s t a n c e o f c e l l s t o a p o p t o s i s . F r e e R a d i c a l B i o l M e d 2 0 0 8 ; 4 4 : 1 9 3 5 - 1 9 4 4 S p a r a g n a G C , J o h n s o n C A , M c C u n e S A , M o o r e R L , M u r p h y R C . Q u a n t i t a t i o n o f c a r d i o l i p i n m o l e c u l a r s p e c i e s i n s p o n t a n e o u s l y h y p e r t e n s i v e h e a r t f a i l u r e r a t s u s i n g e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y . J L i p i d R e s 2 0 0 5 ; 4 6 : 1 1 9 6 - 1 2 0 4 J i a n g F , R i z a v i H S , G r e e n b e r g M L . C a r d i o l i p i n i s n o t e s s e n t i a l f o r t h e g r o w t h o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e o n f e r r n e n t a b l e o r n o n - f e r r n e n t a b l e c a r b o n s o u r c e s . M o l M i c r o b i o l 1 9 9 7 ; 2 6 : 4 8 1 - 4 9 1 L a n d a u E M , R o s e n b u s c h J P . L i p i d i c c u b i c p h a s e s : a n o v e l c o n c e p t f o r t h e c r y s t a l l i z a t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 9 9 6 ; 9 3 : 1 4 5 3 2 - 1 4 5 3 5 Z h a n g H , K u r i s u G , S m i t h J L , C r a m e r W A . A d e fi n e d p r o t e i n - d e t e r g e n t - l i p i d c o m p l e x f o r c r y s t a l l i z a t i o n o f i n t e g r a l m e m b r a n e p r o t e i n s : T h e c y t o c h r o m e b 6 f c o m p l e x o f o x y g e n i c p h o t o s y n t h e s i s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 2 0 0 3 ; 1 0 0 : 5 1 6 0 - 5 1 6 3 4 7 1 7 4 . 7 5 . 7 6 . 7 7 . 7 8 . 7 9 . 8 0 . 8 1 . 8 2 . 8 3 . 8 4 . T o y o s h i m a C , N a k a s a k o M , N o m u r a H , O g a w a H . C r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e c a l c i u m p u m p o f S a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m a t 2 . 6 A r e s o l u t i o n . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 0 0 0 ; 4 0 5 : 6 4 7 - 6 5 5 T h o m p s o n D A . C y t o c h r o m e c o x i d a s e p u r i fi e d b y a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y i n l a u r y l m a l t o s i d e : t h e e f f e c t s o f d e t e r g e n t , l i p i d d e p l e t i o n , a n d s u b u n i t 1 1 1 r e m o v a l o n f u n c t i o n . I n : P h . D . D i s s e r t a t i o n M S U ; 1 9 8 4 M a r o n e P A , T h i y a g a r a j a n P , W a g n e r A M , T i e d e D M . E f f e c t o f d e t e r g e n t a l k y l c h a i n l e n g t h o n c r y s t a l l i z a t i o n o f a d e t e r g e n t - s o l u b i l i z e d m e m b r a n e p r o t e i n : c o r r e l a t i o n o f p r o t e i n - d e t e r g e n t p a r t i c l e s i z e a n d p a r t i c l e - p a r t i c l e i n t e r a c t i o n w i t h c r y s t a l l i z a t i o n o f t h e p h o t o s y n t h e t i c r e a c t i o n c e n t e r f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . J C r y s t a l G r o w t h 1 9 9 9 ; 2 0 7 : 2 1 4 - 2 2 5 H i s e r C , M i l l s D A , S c h a l l M , F e r g u s o n - M i l l e r S . C - T e r r n i n a l T r u n c a t i o n a n d H i s t i d i n e - T a g g i n g o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e S u b u n i t I I R e v e a l s t h e N a t i v e P r o c e s s i n g S i t e , S h o w s I n v o l v e m e n t o f t h e C - T e r m i n u s i n C y t o c h r o m e 0 B i n d i n g , a n d I m p r o v e s t h e A s s a y f o r P r o t o n P u m p i n g . B i o c h e m i s t r y 2 0 0 1 ; 4 0 : 1 6 0 6 - 1 6 1 5 F e r g u s o n - M i l l e r S , V a n A k e n T , R o s e v e a r P . E f f e c t s o f a l k y l g l y c o s i d e d e t e r g e n t s o n t h e p h y s i c a l a n d k i n e t i c p r o p e r t i e s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e . E l e c t r o n T r a n s p O x y g e n U t i l , [ I n t S y m p I n t e r a c t I r o n P r o t e i n s O x y g e n E l e c t r o n T r a n s p ] 1 9 8 2 : 2 9 7 - 3 0 3 T h o m p s o n D A , S u a r e z - V i l l a f a n e M , F e r g u s o n - M i l l e r S . T h e a c t i v e f o r m o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . E f f e c t s o f d e t e r g e n t , t h e i n t a c t m e m b r a n e , a n d r a d i a t i o n i n a c t i v a t i o n . B i o p h y s J 1 9 8 2 ; 3 7 : 2 8 5 - 2 9 3 l e M a i r e M , C h a r n p e i l P , M u l l e r J V . I n t e r a c t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s a n d l i p i d s w i t h s o l u b i l i z i n g d e t e r g e n t s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , B i o m e m b r 2 0 0 0 ; I 5 0 8 : 8 6 - 1 1 1 L u e c k e H , S c h o b e r t B , R i c h t e r H - T , C a r t a i l l e r J - P , L a n y i J K . S t r u c t u r e o f b a c t e r i o r h o d o p s i n a t 1 . 5 5 A r e s o l u t i o n J M o l B i o l 1 9 9 9 ; 2 9 1 : 8 9 9 - 9 1 1 K o l b e M , B e s i r H , E s s e n L - O , O e s t e r h e l t D . S t r u c t u r e o f t h e l i g h t - d r i v e n c h l o r i d e p u m p h a l o r h o d o p s i n a t 1 . 8 A r e s o l u t i o n . S c i e n c e 2 0 0 0 ; 2 8 8 : 1 3 9 0 - 1 3 9 6 G o r d e l i y V I , L a b a h n J , M o u k h a r n e t z i a n o v R , E f r e m o v R , G r a n z i n J , S c h l e s i n g e r R , B u e l d t G , S a v o p o l T , S c h e i d i g A J , K l a r e J P , E n g e l h a r d M . M o l e c u l a r b a s i s o f t r a n s m e m b r a n e s i g n a l l i n g b y s e n s o r y r h o d o p s i n I I - t r a n s d u c e r c o m p l e x . N a t u r e 2 0 0 2 ; 4 1 9 : 4 8 4 - 4 8 7 C o h e n S L , C h a i t B T . M a s s s p e c t r o m e t r y a s a t o o l f o r p r o t e i n c r y s t a l l o g r a p h y . A n n u R e v B i o p h y s B i o m o l S t r u c t 2 0 0 1 ; 3 0 : 6 7 - 8 5 4 7 2 8 5 . 8 6 . 8 7 . 8 8 . 8 9 . 9 0 . 9 1 . 9 2 . 9 3 . 9 4 . 9 5 . C r i s t o n i S , B e m a r d i L R . D e v e l o p m e n t o f n e w m e t h o d o l o g i e s f o r t h e m a s s s p e c t r o m e t r y s t u d y o f b i o o r g a n i c m a c r o m o l e c u l e s . M a s s S p e c t r o m R e v 2 0 0 3 ; 2 2 : 3 6 9 - 4 0 6 M a r s h D . E l e c t r o n s p i n r e s o n a n c e i n m e m b r a n e r e s e a r c h : P r o t e i n - l i p i d i n t e r a c t i o n s . M e t h o d s 2 0 0 8 ; 4 6 : 8 3 - 9 6 M a r s h D . P r o t e i n m o d u l a t i o n o f l i p i d s , a n d v i c e - v e r s a , i n m e m b r a n e s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , B i o m e m b r 2 0 0 8 ; 1 7 7 8 : 1 5 4 5 — 1 5 7 5 S c h i l l e r J , Z s c h o m i g O , P e t k o v i c M , M u l l e r M , A r n h o l d J , A r n o l d K . L i p i d a n a l y s i s o f h u m a n H D L a n d L D L b y M A L D I - T O F m a s s s p e c t r o m e t r y a n d 3 1 P - N M R . J L i p i d R e s 2 0 0 1 ; 4 2 : 1 5 0 1 - 1 5 0 8 B y r d w e l l W C , S a t o H , S c h w a r z A K , B o r c h m a n D , Y a p p e r t M C , T a n g D . 3 1 P N M R q u a n t i fi c a t i o n a n d m o n o p h a s i c s o l v e n t p u r i fi c a t i o n o f h u m a n a n d b o v i n e l e n s p h o s p h o l i p i d s . L i p i d s 2 0 0 2 ; 3 7 : 1 0 8 7 - 1 0 9 2 A r o n d e l V , B e m r i n g C , S o m e r v i l l e C R . I s o l a t i o n a n d f u n c t i o n a l e x p r e s s i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i o f a g e n e e n c o d i n g p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e m e t h y l t r a n s f e r a s e ( E C 2 . 1 . 1 . 1 7 ) f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . J B i o l C h e m 1 9 9 3 ; 2 6 8 : 1 6 0 0 2 - 1 6 0 0 8 W r i e s s n e g g e r T , G i i b i t z G , L e i n t e r E , I n g o l i c E , C r e g g J , d e l a C r u z B , D a u m G . L i p i d c o m p o s i t i o n o f p e r o x i s o m e s f r o m t h e y e a s t P i c h i a p a s t o r i s g r o w n o n d i f f e r e n t c a r b o n s o u r c e s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 2 0 0 7 ; 1 7 7 1 : 4 5 5 - 4 6 1 C i p a k A , J a g a n j a c M , T e h l i v e t s O , K o h l w e i n S D , Z a r k o v i c N . A d a p t a t i o n t o o x i d a t i v e s t r e s s i n d u c e d b y p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s i n y e a s t . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 2 0 0 8 ; I 7 8 1 : 2 8 3 - 2 8 7 L o p e z - L a r a I M , G a o J - L , S o t o M J , S o l a r e s - P e r e z A , W e i s s e n m a y e r B , S o h l e n k a m p C , V e r r o i o s G P , T h o m a s - O a t e s J , G e i g e r O . P h o s p h o r u s - f r e e m e m b r a n e l i p i d s o f S i n o r h i z o b i u m m e l i l o t i a r e n o t r e q u i r e d f o r t h e s y m b i o s i s w i t h a l f a l f a b u t c o n t r i b u t e t o i n c r e a s e d c e l l y i e l d s u n d e r p h o s p h o r u s - l i m i t i n g c o n d i t i o n s o f g r o w t h . M o l P l a n t - M i c r o b e I n t e r a c t 2 0 0 5 ; 1 8 : 9 7 3 - 9 8 2 C u l l e n J , P h i l l i p s M C , S h i p l e y G G . E f f e c t s o f t e m p e r a t u r e o n t h e c o m p o s i t i o n a n d p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e l i p i d s o f P s e u d o m o n a s fl u o r e s c e n s . B i o c h e m J 1 9 7 1 ; 1 2 5 : 7 3 3 - 7 4 2 T a y l o r C J , A n d e r s o n A J , W i l k i n s o n S G . P h e n o t y p i c v a r i a t i o n o f l i p i d c o m p o s i t i o n i n B u r k h o l d e r i a c e p a c i a : a r e s p o n s e t o i n c r e a s e d g r o w t h t e m p e r a t u r e i s a g r e a t e r c o n t e n t o f 2 - h y d r o x y a c i d s i n p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e a n d o r n i t h i n e a m i d e l i p i d . M i c r o b i o l o g y ( R e a d i n g , U K ) 1 9 9 8 ; 1 4 4 : 1 7 3 7 - 1 7 4 5 4 7 3 9 6 . 9 7 . 9 8 . 9 9 . 1 0 0 . 1 0 1 . 1 0 2 . 1 0 3 . 1 0 4 . 1 0 5 . 1 0 6 . H a r a H , C o t t e r R J . A s s e s s m e n t o f t h e e f f e c t o f g r t h t e m p e r a t u r e o n t h e l i p i d c o m p o s i t i o n o f S e r r a t i a m a r c e s c e n s u s i n g l a s e r d e s o r p t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y . R a p i d C o m m u n M a s s S p e c t r o m 1 9 8 7 ; 1 : 1 0 3 - 1 0 4 L o p a l c o P , L o b a s s o S , B a b u d r i F , C o r c e l l i A . O s m o t i c s h o c k s t i m u l a t e s d e n o v o s y n t h e s i s o f t w o c a r d i o l i p i n s i n a n e x t r e m e h a l o p h i l i c a r c h a e o n . J L i p i d R e s 2 0 0 4 ; 4 5 : 1 9 4 - 2 0 1 d e L e o V , C a t u c c i L , V e n t r e l l a A , M i l a n o F , A g o s t i a n o A , C o r c e l l i A . C a r d i o l i p i n i n c r e a s e s i n c h r o m a t o p h o r e s i s o l a t e d f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s a f t e r o s m o t i c s t r e s s : S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l r o l e s . J L i p i d R e s 2 0 0 8 : p u b l i s h e d o n l i n e a h e a d o f p r i n t R o s s a k M , S c h a f e r A , X u N , G a g e D A , B e n n i n g C . A c c u m u l a t i o n o f s u l f o q u i n o v o s y l - l - O - d i h y d r o x y a c e t o n e i n a s u l f o l i p i d - d e fi c i e n t m u t a n t o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s i n a c t i v a t e d i n s q u . A r c h B i o c h e m B i o p h y s 1 9 9 7 ; 3 4 0 : 2 1 9 - 2 3 0 L i n Y Y . C h e m i c a l i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y o f s t e r o i d s a n d o t h e r l i p i d s . M a s s S p e c t r o m R e v 1 9 8 4 ; 3 : 3 1 9 - 3 5 5 S c h i l l e r J , A r n h o l d J , B e n a r d S , M u l l e r M , R e i c h l S , A r n o l d K . L i p i d a n a l y s i s b y m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n a n d i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y : a m e t h o d o l o g i c a l a p p r o a c h . A n a l B i o c h e m 1 9 9 9 ; 2 6 7 : 4 6 - 5 6 T o m e r K B , C r o w F W , K n o c h e H W , G r o s s M L . F a s t a t o m b o m b a r d m e n t a n d m a s s s p e c t r o m e t r y / m a s s s p e c t r o m e t r y f o r a n a l y s i s o f a m i x t u r e o f o r r r i t h i n e - c o n t a i n i n g l i p i d s f r o m T h i o b a c i l l u s t h i o o x i d a n s . A n a l C h e m 1 9 8 3 ; 5 5 : 1 0 3 3 - 1 0 3 6 C o l e M J , E n k e C G . D i r e c t d e t e r m i n a t i o n o f p h o s p h o l i p i d s t r u c t u r e s i n m i c r o o r g a n i s m s b y f a s t a t o m b o m b a r d m e n t t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t r y . A n a l C h e m 1 9 9 1 ; 6 3 : 1 0 3 2 - 1 0 3 8 H e l l e r D N , M u r p h y C M , C o t t e r R J , F e n s e l a u C , U y O M . C o n s t a n t n e u t r a l l o s s s c a n n i n g f o r t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f b a c t e r i a l p h o s p h o l i p i d s d e s o r b e d b y f a s t a t o m b o m b a r d m e n t . A n a l C h e m 1 9 8 8 ; 6 0 : 7 8 7 - 2 7 9 1 H e l l e r D N , C o t t e r R J , F e n s e l a u C . P r o fi l i n g o f b a c t e r i a b y f a s t a t o m b o m b a r d m e n t m a s s s p e c t r o m e t r y . A n a l C h e m 1 9 8 7 ; 5 9 : 2 8 0 6 - 2 8 0 9 G e i g e r O , R o h r s V , W e i s s e n m a y e r B , F i n a n T M , T h o m a s - O a t e s J E . T h e r e g u l a t o r g e n e p h o B m e d i a t e s p h o s p h a t e s t r e s s - c o n t r o l l e d s y n t h e s i s o f t h e m e m b r a n e l i p i d d i a c y l g l y c e r y l - N , N , N - t r i m e t h y l h o m o s e r i n e i n R h i z o b i u m ( S i n o r h i z o b i u m ) m e l i l o t i . M a l M i c r o b i a l 1 9 9 9 ; 3 2 : 6 3 - 7 3 4 7 4 1 0 7 . 1 0 8 . 1 0 9 . 1 1 0 . 1 1 1 . 1 1 2 . 1 1 3 . 1 1 4 . 1 1 5 . 1 1 6 . 1 1 7 . C e m y R L , T o m e r K B , G r o s s M L . D e s o r p t i o n i o n i z a t i o n c o m b i n e d w i t h t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y : a d v a n t a g e s f o r i n v e s t i g a t i n g c o m p l e x l i p i d s , d i s a c c h a r i d e s a n d o r g a n o m e t a l l i c c o m p l e x e s . O r g M a s s S p e c t r o m 1 9 8 6 ; 2 1 : 6 5 5 - 6 6 0 G a g e D A , H u a n g Z H , B e n n i n g C . C o m p a r i s o n o f s u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r o l f r o m s p i n a c h a n d t h e p u r p l e b a c t e r i u m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s b y f a s t a t o m b o m b a r d m e n t t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . L i p i d s 1 9 9 2 ; 2 7 : 6 3 2 - 6 3 6 R i e k h o f W R , R u c k l e M E , L y d i c T A , S e a r s B B , B e n n i n g C . T h e s u l f o l i p i d s 2 ' - O - a c y l - s u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r o l a n d s u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r o l a r e a b s e n t f r o m a C h l a m y d a m o n a s r e i n h a r d t i i m u t a n t d e l e t e d i n S Q D l . P l a n t P h y s i o l 2 0 0 3 ; 1 3 3 : 8 6 4 - 8 7 4 H a n X , G r o s s R W . S h o t g u n l i p i d o m i c s : e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s a n d q u a n t i t a t i o n o f c e l l u l a r l i p i d o m e s d i r e c t l y f r o m c r u d e e x t r a c t s o f b i o l o g i c a l s a m p l e s . M a s s S p e c t r o m R e v 2 0 0 5 ; 2 4 : 3 6 7 - 4 1 2 W a t s o n A D . L i p i d o m i c s : a g l o b a l a p p r o a c h t o l i p i d a n a l y s i s i n b i o l o g i c a l s y s t e m s . J L i p i d R e s 2 0 0 6 ; 4 7 : 2 1 0 1 - 2 1 1 1 M a n i c k e N E , W i s e m a n J M , I f a D R , C o o k s R G . D e s o r p t i o n E l e c t r o s p r a y I o n i z a t i o n ( D E S I ) M a s s S p e c t r o m e t r y a n d T a n d e m M a s s S p e c t r o m e t r y ( M S / M S ) o f P h o s p h o l i p i d s a n d S p h i n g o l i p i d s : I o n i z a t i o n , A d d u c t F o r m a t i o n , a n d F r a g m e n t a t i o n . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 8 ; 1 9 : 5 3 1 - 5 4 3 M a r t o J A , W h i t e F M , S e l d o m r i d g e S , M a r s h a l l A G . s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f p h o s p h o l i p i d s b y m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o n r e s o n a n c e m a s s s p e c t r o m e t r y . A n a l C h e m 1 9 9 5 - ; 6 7 : 3 9 7 9 - 3 9 8 4 F u j i w a k i T , Y a m a g u c h i S , S u k e g a w a K , T a k e t o m i T . A p p l i c a t i o n o f d e l a y e d e x t r a c t i o n m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e - o f - fl i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y f o r a n a l y s i s o f s p h i n g o l i p i d s i n t i s s u e s f r o m s o h i n g o l i p i d o s i s p a t i e n t s . J C h r o m a t o g r B 1 9 9 9 ; 7 3 1 : 4 5 - 5 2 S c h i l l e r J , S u e s s R , A r n h o l d J , F u c h s B , L e s s i g J , M u e l l e r M , P e t k o v i c M , S p a l t e h o l z H , Z s c h o e m i g 0 , A r n o l d K . M a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n a n d i o n i z a t i o n t i m e - o f - fl i g h t ( M A L D I - T O F ) m a s s s p e c t r o m e t r y i n l i p i d a n d p h o s p h o l i p i d r e s e a r c h . P r a g L i p i d R e s 2 0 0 4 ; 4 3 : 4 4 9 - 4 8 8 H a n X , G r o s s R W . S t r u c t u r a l d e t e r m i n a t i o n o f p i c o m o l e a m o u n t s o f p h o s p h o l i p i d s v i a e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 1 9 9 5 ; 6 : 1 2 0 2 - 1 2 1 0 P u l f e r M , M u r p h y R C . E l e c t r o s p r a y m a s s s p e c t r o m e t r y o f p h o s p h o l i p i d s . M a s s S p e c t r o m R e v 2 0 0 3 ; 2 2 : 3 3 2 - 3 6 4 4 7 5 1 1 8 . 1 1 9 . 1 2 0 . 1 2 1 . 1 2 2 . 1 2 3 . 1 2 4 . 1 2 5 . 1 2 6 . 1 2 7 . 1 2 8 . 1 2 9 . S c h i l l e r J , S u s s R , P e t k o v i c M , Z s c h o m i g O , A r n o l d K . N e g a t i v e - i o n m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n a n d i o n i z a t i o n t i m e - o f - fl i g h t m a s s s p e c t r a o f c o m p l e x p h o s p h o l i p i d m i x t u r e s i n t h e p r e s e n c e o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e : a c a u t i o n a r y n o t e o n p e a k a s s i g n m e n t . A n a l B i o c h e m 2 0 0 2 ; 3 0 9 : 3 1 1 - 3 1 4 G u s e v A I , V a s s e u r O J , P r o c t o r A , S h a r k e y A G , H e r c u l e s D M . I m a g i n g o f t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a r n s u s i n g m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y . A n a l C h e m 1 9 9 5 ; 6 7 : 4 5 6 5 - 4 5 7 0 G u i t t a r d J , H r o n o w s k i X L , C o s t e l l o C E . D i r e c t m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s o f g l y c o s p h i n g o l i p i d s o n t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h i c p l a t e s a n d t r a n s f e r m e m b r a n e s . R a p i d C o m m u n M a s s S p e c t r o m 1 9 9 9 ; 1 3 : 1 8 3 8 - 1 8 4 9 M c D o n n e l l L A , H e e r e n R M A . I m a g i n g m a s s s p e c t r o m e t r y . M a s s S p e c t r o m R e v 2 0 0 7 ; 2 6 : 6 0 6 - 6 4 3 P u o l i t a i v a l S M , B u m u m K E , C o r n e t t D S , C a p r i o l i R M . S o l v e n t - f r e e m a t r i x d r y - c o a t i n g f o r M A L D I i m a g i n g o f p h o s p h o l i p i d s . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 8 ; 1 9 : 8 8 2 - 8 8 6 C a p r i o l i R M . P e r s p e c t i v e s o n i m a g i n g m a s s s p e c t r o m e t r y i n b i o l o g y a n d m e d i c i n e . P r a t e a m i c s 2 0 0 8 ; 8 : 3 6 7 9 - 3 6 8 0 C a p r i o l i R M , F a r m e r T B , G i l e J . M o l e c u l a r i m a g i n g o f b i o l o g i c a l s a m p l e s : l o c a l i z a t i o n o f p e p t i d e s a n d p r o t e i n s u s i n g M A L D I - T O F M S . A n a l C h e m 1 9 9 7 ; 6 9 : 4 7 5 1 - 4 7 6 0 S c h w a r t z S A , C a p r i o l i R M . M o l e c u l a r i m a g i n g b y m a s s s p e c t r o m e t r y . M e d A p p l M a s s S p e c t r o m 2 0 0 8 : 5 3 3 - 5 5 4 B a s i l e F , B e v e r l y M B , A b b a s - H a w k s C , M o w r y C D , V o o r h e e s K J , L . H T . D i r e c t m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s o f i n s i t u t h e r m a l l y h y d r o l y z e d a n d m e t h y l a t e d l i p i d s f r o m w h o l e b a c t e r i a l c e l l s . A n a l C h e m 1 9 9 8 ; 7 0 : 1 5 5 5 - 1 5 6 2 I s h i d a Y , N a k a n i s h i O , H i r a o S , T s u g e S , U r a b e J , S e k i n o T , N a k a n i s h i M , K i m o t o T , O h t a n i H . D i r e c t a n a l y s i s o f l i p i d s i n s i n g l e z o o p l a n k t e r i n d i v i d u a l s b y m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y . A n a l C h e m 2 0 0 3 ; 7 5 : 4 5 1 4 - 4 5 1 8 S m i t h P B W , S n y d e r A P , H a r d e n C S . C h a r a c t e r i z a t i o n o f b a c t e r i a l p h o s p h o l i p i d s b y e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . A n a l C h e m 1 9 9 5 ; 6 7 : 1 8 2 4 - 1 8 3 0 P e t k o v i é M , S c h i l l e r J , M i i l l e r J , M i i l l e r M , A r n o l d K , A r n h o l d J . T h e s i g n a l - t o - n o i s e r a t i o a s t h e m e a s u r e f o r t h e q u a n t i fi c a t i o n o f l y s o p h o s p h o l i p i d s b y m a t r i x - 4 7 6 1 3 0 . 1 3 1 . 1 3 2 . 1 3 3 . 1 3 4 . 1 3 5 . 1 3 6 . 1 3 7 . 1 3 8 . 1 3 9 . 1 4 0 . a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i s a t i o n t i m e - o f - fl i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y . A n a l y s t 2 0 0 1 ; 1 2 6 : 1 0 4 2 - 1 0 5 0 S u g i y a m a E , H a r a A , U e m u r a K . A q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f s e r u m s u l f a t i d e b y m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e - o f - fl i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h d e l a y e d i o n e x t r a c t i o n . A n a l B i o c h e m 1 9 9 9 ; 2 7 4 : 9 0 — 9 7 V a i d y a n a t h a n S , R o w l a n d J J , K e l l D B , G o o d a c r e R . D i s c r i m i n a t i o n o f a e r o b i c e n d o s p o r e — f o r m i n g b a c t e r i a v i a e l e c t r o s p r a y - i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y o f w h o l e c e l l s u s p e n s i o n s . A n a l C h e m 2 0 0 1 ; 7 3 : 4 1 3 4 - 4 1 4 4 H a n X , H o l t z m a n D M , M c K e e D W , J r . P l a s m a l o g e n d e fi c i e n c y i n e a r l y A l z h e i m e r ' s d i s e a s e s u b j e c t s a n d i n a n i m a l m o d e l s : m o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n u s i n g e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y . J N e u r o c h e m 2 0 0 1 ; 7 7 : 1 1 6 8 - 1 1 8 0 K e l l e r B O , L i L . N a n o l i t e r s o l v e n t e x t r a c t i o n c o m b i n e d w i t h m i c r o s p o t M A L D I T O F m a s s s p e c t r o m e t r y f o r t h e a n a l y s i s o f h y d r o p h o b i c b i o m o l e c u l e s . A n a l C h e m 2 0 0 1 ; 7 3 : 2 9 2 9 - 2 9 3 6 C h e n g C , G r o s s M L , P i t t e n a u e r E . C o m p l e t e S t r u c t u r a l E l u c i d a t i o n o f T r i a c y l g l y c e r o l s b y T a n d e m S e c t o r M a s s S p e c t r o m e t r y . A n a l C h e m 1 9 9 8 ; 7 0 : 4 4 1 7 - 4 4 2 6 H o u j o u T , Y a m a t a r r i K , I m a g a w a M , S h i m i z u T , T a g u c h i R . A s h o t g u n t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s o f p h o s p h o l i p i d s w i t h n o r m a l - p h a s e a n d / o r r e v e r s e - p h a s e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y / e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y . R a p i d C o m m u n M a s s S p e c t r o m 2 0 0 5 ; 1 9 : 6 5 4 - 6 6 6 F o l c h J , L e e s M , S t a n l e y G G S . A s i m p l e m e t h o d f o r t h e i s o l a t i o n a n d p u r i fi c a t i o n o f t o t a l l i p i d e s f r o m a n i m a l t i s s u e s . J B i o l C h e m 1 9 5 7 ; 2 2 6 : 4 9 7 - 5 0 9 B l i g h E G , D y e r W J . A r a p i d m e t h o d o f t o t a l l i p i d e x t r a c t i o n a n d p u r i fi c a t i o n . C a n J B i a c h e m P h y s i o l 1 9 5 9 ; 3 7 : 9 1 1 - 9 1 7 I v e r s o n S J , L a n g S L C , C o o p e r M H . C o m p a r i s o n o f t h e B l i g h a n d D y e r a n d F o l c h m e t h o d s f o r t o t a l l i p i d d e t e r m i n a t i o n i n a b r o a d r a n g e o f m a r i n e t i s s u e . L i p i d s 2 0 0 1 ; 3 6 : 1 2 8 3 - 1 2 8 7 K a t y a l S L , B a r i l a r o L , H a n i n I . L i p i d c o m p o s i t i o n o f d i f f e r e n t a r e a s o d m u r i n e b r a i n : e f f e c t s o f l i p i d e x t r a c i t o n p r o c e d u r e s . L i p i d s 1 9 8 5 ; 2 0 : 2 0 1 - 2 0 3 H a n X , G r o s s R W . G l o b a l a n a l y s e s o f c e l l u l a r l i p i d o m e s d i r e c t l y f r o m c r u d e e x t r a c t s o f b i o l o g i c a l s a m p l e s b y E S I m a s s s p e c t r o m e t r y : A b r i d g e t o l i p i d o m i c s . J L i p i d R e s 2 0 0 3 ; 4 4 : 1 0 7 1 - 1 0 7 9 4 7 7 1 4 1 . 1 4 2 . 1 4 3 . 1 4 4 . 1 4 5 . 1 4 6 . 1 4 7 . 1 4 8 . 1 4 9 . 1 5 0 . 1 5 1 . 1 5 2 . 1 5 3 . H a n X , Y a n g K , C h e n g H , F i k e s K N , G r o s s R W . S h o t g u n l i p i d o m i c s o f p h o s p h o e t h a n o l a m i n e - c o n t a i n i n g l i p i d s i n b i o l o g i c a l s a m p l e s a f t e r o n e - s t e p i n s i t u d e r i v a t i z a t i o n . J L i p i d R e s 2 0 0 5 ; 4 6 : 1 5 4 8 - 1 5 6 0 C a r r a p i s o A I , G a r c i a C . D e v e l o p m e n t i n l i p i d a n a l y s i s z s o m e n e w e x t r a c t i o n t e c h n i q u e s a n d i n s i t u t r a n s e s t e r i fi c a t i o n . L i p i d s 2 0 0 0 ; 3 5 : 1 1 6 7 - 1 1 7 7 P o e r s c h m a n n J , C a r l s o n R . N e w f r a c t i o n a t i o n s c h e m e f o r l i p i d c l a s s e s b a s e d o n " i n - c e l l f r a c t i o n a t i o n " u s i n g s e q u e n t i a l p r e s s u r i z e d l i q u i d e x t r a c t i o n . J C h r o m a t o g r A 2 0 0 6 ; 1 1 2 7 : 1 8 - 2 5 R o s e H G , O k l a n d e r M . I m p r o v e d p r o c e d u r e f o r t h e e x t r a c t i o n o f l i p i d s f r o m h u m a n e r y t h r o c y t e s . J L i p i d R e s 1 9 6 5 ; 6 : 4 2 8 - 4 3 1 M a t y a s h V , L i e b i s c h G , K u r z c h a l i a T V , S h e v c h e n k o A , S c h w u d k e D . L i p i d e x t r a c t i o n b y m e t h y l - t e r t - b u t y l e t h e r f o r h i g h - t h r o u g h p u t l i p i d o m i c s . J L i p i d R e s 2 0 0 8 ; 4 9 : 1 1 3 7 - 1 1 4 6 P a r e n t i - C a s t e l l i G , B e r t o l i E , S e c h i A M , S i l v e s t r i n i M G , L e n a z G . E f f e c t s o f s o l u b l e a n d m e m b r a n e p r o t e i n s u p o n d i e t h y l e t h e r e x t r a c t i o n o f a q u e o u s p h o h p h o l i p i d d i s p e r s i o n s . L i p i d s 1 9 7 8 ; 1 4 : 2 2 1 - 2 2 8 L e n a z G , P a r e n t i - C a s t e l l i G , S e c h i A M , M a s o t t i L . L i p i d - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s i n m i t o c h o n d r i a . I I I . S o l v e n t e x t r a c t i o n o f p h o s p h o l i p i d s f r o m m i t o c h o n d r i a l p r e p a r a t i o n s . A r c h B i o c h e m B i o p h y s 1 9 7 2 ; 1 4 8 : 3 9 1 - 3 9 9 C e r t i k M , P e t e r A , J a n S . E f f e c t o f e x t r a c t i o n m e t h o d s o n l i p i d y i e l d a n d f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n o f l i p i d s c l a s s e s c o n t a i n i n g y - l i n o l e n i c a c i d e x t r a c t e d f r o m f u n g i . J A m O i l C h e m S o c 1 9 9 6 ; 7 3 : 3 5 7 - 3 6 5 A m e t a j B N , B o b e G , L u Y , Y o u n g J W , B e i t z D C . E f f e c t o f s a m p l e p r e p a r a t i o n , l e n g t h o f t i m e , a n d s a m p l e s i z e o n q u a n t i fi c a t i o n o f t o t a l l i p i d s f r o n b o v i n e l i v e r . J A g r i c F o o d C h e m 2 0 0 3 ; 5 1 : 2 1 0 5 - 2 1 1 0 K e u s g e n M , C u r t i s J M , T h i b a u l t P , W a l t e r J A , W i n d u s t A , A y e r S W . S u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r o l s f r o m t h e a l g a H e t e r a s i g m a c a r t e r a e . L i p i d s 1 9 9 7 ; 3 2 : 1 1 0 1 - 1 1 1 2 S o t i r h o s N , H e r s l é i f B , K e n n e L . Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f p h o s p h o l i p i d s b y 3 ' P - N M R . J L i p i d R e s 1 9 8 6 ; 2 7 : 3 8 6 - 3 9 2 K a r a s M , H i l l e n k a m p F . L a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n o f p r o t e i n s w i t h m o l e c u l a r m a s s e s e x c e e d i n g 1 0 , 0 0 0 d a l t o n s . A n a l C h e m 1 9 8 8 ; 6 0 : 2 2 9 9 - 2 3 0 1 Z e n o b i R , K n o c h e n m u s s R . I o n f o r m a t i o n i n M A L D I m a s s s p e c t r o m e t r y . M a s s S p e c t r o m R e v 1 9 9 8 ; I 7 : 3 3 7 - 3 6 6 4 7 8 1 5 4 . 1 5 5 . 1 5 6 . 1 5 7 . 1 5 8 . 1 5 9 . 1 6 0 . 1 6 1 . 1 6 2 . 1 6 3 . 1 6 4 . 1 6 5 . 1 6 6 . B u d n i k B A , M o y e r S C , P i t t m a n J L , I v l e v a V B , S o m m e r U , C o s t e l l o C E , O ' C o n n o r P B . H i g h p r e s s u r e M A L D I - F T M S : i m p l i c a t i o n s f o r p r o t e o m i c s . I n t J M a s s S p e c t r o m 2 0 0 4 ; 2 3 4 : 2 0 3 - 2 1 2 V o r r n O , R o e p s t o r f f P , M a n n M . I m p r o v e d r e s o l u t i o n a n d v e r y h i g h s e n s i t i v i t y i n M A L D I T O F o f m a t r i x s u r f a c e s m a d e b y f a s t e v a p o r a t i o n . A n a l C h e m 1 9 9 4 ; 6 6 : 3 2 8 1 - 3 2 8 7 M a n n M , P e n n J B . E l e c t r o s p r a y m a s s s p e c t r o m e t r y : p r i n c i p l e s a n d m e t h o d s . M a s s S p e c t r o m 1 9 9 2 ; 1 : 1 - 3 5 F e n n J B , M a n n M , M e n g C K , W o n g S F , W h i t e h o u s e C M . E l e c t r o s p r a y I o n i z a t i o n f o r M a s s S p e c t r o m e t e r o f L a r g e B i o m o l e c u l e s . S c i e n c e ( W a s h i n g t o n , D C ) 1 9 8 9 ; 2 4 6 : 6 4 - 7 1 F e n n J B , M a n n M , M e n g C K , W o n g S F , W h i t e h o u s e C M . E l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n - p r i n c i p l e s a n d p r a c t i c e . M a s s S p e c t r o m R e v 1 9 9 0 ; 9 : 3 7 - 7 0 G o m e z A , T a n g K . C h a r g e a n d fi s s i o n o f d r o p l e t s i n e l e c t r o s t a t i c s p r a y s . P h y s F l u i d s 1 9 9 4 ; 6 : 4 0 4 - 4 1 4 T h o m s o n B T , I r i b a m e J V . F i e l d i n d u c e d i o n e v a p o r a t i o n f r o m l i q u i d s u r f a c e s a t a t m o s p h e r i c p r e s s u r e . J C h e m P h y s 1 9 7 9 ; 7 1 : 4 4 5 1 - 4 4 6 3 I r i b a m e J V , T h o m s o n B T . O n t h e e v a p o r a t i o n o f s m a l l i o n s f r o m c h a r g e d d r o p l e t s . J C h e m P h y s 1 9 7 6 ; 6 4 : 2 2 8 7 - 2 2 9 4 W i l m M , M a n n M . A n a l y t i c a l p r o p e r t i e s o f t h e n a n o e l e c t r o s p r a y i o n s o u r c e . A n a l C h e m 1 9 9 6 ; 6 8 : 1 - 8 W i s e m a n J M , I f a D R , Z h u Y , K i s s i n g e r C B , M a n i c k e N E , K i s i n g e r P T , C o o k s R G . D e s o r p t i o n e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y : i m a g i n g d r u g s a n d m e t a b o l i t e s i n t i s s u e s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 2 0 0 8 ; 1 0 5 : 1 8 1 2 0 - 1 8 1 2 5 C o r n e t t D S , ‘ R e y z e r M L , C h a u r a n d P , C a p r i o l i R M . M A L D I i m a g i n g m a s s s p e c t r o m e t r y : m o l e c u l a r s n a p s h o t s o f b i o c h e m i c a l s y s t e m s . N a t M e t h o d s 2 0 0 7 ; 4 : 8 2 8 - 8 3 3 H a n X , Y a n g K , Y a n g J , F i k e s K N , C h e n g H , G r o s s R W . F a c t o r s I n fl u e n c i n g t h e E l e c t r o s p r a y I n t r a s o u r c e S e p a r a t i o n a n d S e l e c t i v e I o n i z a t i o n o f G l y c e r o p h o s p h o l i p i d s . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 6 ; I 7 : 2 6 4 - 2 7 4 T h o m a s M C , M i t c h e l l T W , B l a n k s b y S J . A c o m p a r i s o n o f t h e g a s p h a s e a c i d i t i e s o f p h o s p h o l i p i d h e a d g r o u p s : e x p e r i m e n t a l a n d c o m p u t a t i o n a l s t u d i e s . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 5 ; 1 6 : 9 2 6 - 9 3 9 4 7 9 1 6 7 . 1 6 8 . 1 6 9 . 1 7 0 . 1 7 1 . 1 7 2 . 1 7 3 . 1 7 4 . 1 7 5 . 1 7 6 . 1 7 7 . 1 7 8 . M c A n o y A M , W u C C , M u r p h y R C . D i r e c t q u a l i t a t i v e q n a l y s i s o f t r i a c y l g l y c e r o l s b y e l e c t r o s p r a y m a s s s p e c t r o m e t r y u s i n g a l i n e a r i o n t r a p . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 5 ; 1 6 : 1 4 9 8 - 1 5 0 9 A l - S a a d K A , Z a b r o u s k o v V , S i e m s W F , K n o w l e s N R , H a r m a n R M , H i l l H H J . M a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n t i m e - o f - fl i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y o f l i p i d s : i o n i z a t i o n a n d p r o m p t f r a g m e n t a t i o n p a t t e r n s . R a p i d C o m m u n M a s s S p e c t r o m 2 0 0 3 ; I 7 : 8 7 - 9 6 X u Y , B r u e n i n g M L , W a t s o n J T . N o n - s p e c i fi c , o n - p r o b e c l e a n u p m e t h o d s f o r M A L D I - M S s a m p l e s . M a s s S p e c t r o m R e v 2 0 0 3 ; 2 2 : 4 2 9 - 4 4 0 D o u g l a s D J , F r a n k A J , M a o D . L i n e a r i o n t r a p s i n m a s s s p e c t r o m e t r y . M a s s S p e c t r o m R e v 2 0 0 5 ; 2 4 : 1 - 2 9 d e H o f f r n a n n E , S t r o o b a n t V e d s . M a s s S p e c t r o m e t r y P r i n c i p l e s a n d A p p l i c a t i o n s 2 n d e d : J o h n W i l e y a n d S o n s , N e w Y o r k ; 2 0 0 2 G l i s h G , V a c h e t R . Q u a d r u p o l e I o n T r a p M a s s S p e c t r o m e t r y . I n , A S M S l e c t u r e n o t e s ; 2 0 0 7 M c L u c k e y S A , G o e r i n g e r D E . S l o w h e a t i n g m e t h o d s i n t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . J M a s s S p e c t r o m 1 9 9 7 ; 3 2 : 4 6 1 - 4 7 4 R e i d G E , S i m p s o n R J , O ' H a i r R A J . G a s p h a s e i o n c h e m i s t r y o f b i o m o l e c u l e s . 1 7 . P r o b i n g t h e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f p r o t o n a t e d g l y c i n e o l i g o m e r s v i a m u l t i s t a g e m a s s s p e c t r o m e t r y a n d g a s p h a s e i o n m o l e c u l e h y d r o g e n / d e u t e r i u m e x c h a n g e . I n t J M a s s S p e c t r o m 1 9 9 9 ; 1 9 0 / 1 9 1 : 2 0 9 - 2 3 0 T h o m a s M C , M i t c h e l l T W , H a r m a n D G , D e e l e y J M , N e a l o n J R , B l a n k s b y S J . O z o n e - i n d u c e d d i s s o c i a t i o n : e l u c i d a t i o n o f d o u b l e b o n d p o s i t i o n w i t h i n m a s s - s e l e c t e d l i p i d i o n s . A n a l C h e m 2 0 0 8 ; 8 0 : 3 0 3 — 3 1 1 S y k a J E , C o o n J J , S c h r o e d e r M J , S h a b a n o w i t z J , H u n t D F . P e p t i d e a n d p r o t e i n s e q u e n c e a n a l y s i s b y e l e c t r o n t r a n s f e r d i s s o c i a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y P r o c N a t l A c a d S c i U S A 2 0 0 4 ; 1 0 1 : 9 5 2 8 — 9 5 3 3 T h e r m o S c i e n t i fi c . P u l s e d Q c o l l i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ( P Q D ) o n l i n e a r i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r s . T h e r m o S c i e n t i f i c P r o d u c t S u p p o r t B u l l e t i n 2 0 0 6 ; 1 2 4 : 6 2 5 7 7 - 6 2 5 7 8 L i a n g X , L i u J , L e B l a n c Y , C o v e y T , P t a k A C , B r e n n a J T , M c L u c k e y S A . E l e c t r o n t r a n s f e r d i s s o c i a t i o n o f d o u b l y s o d i a t e d g l y c e r o p h o s p h o c h o l i n e l i p i d s . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 7 ; 1 8 : 1 7 8 3 - 1 7 8 8 4 8 0 1 7 9 . 1 8 0 . 1 8 1 . 1 8 2 . 1 8 3 . 1 8 4 . 1 8 5 . 1 8 6 . 1 8 7 . 1 8 8 . 1 8 9 . S c h w u d k e D , H a n n i c h J T , S u r e n d r a n a t h V , G r i m a r d V , M o e h n ' n g T , B u r t o n L , K u r z c h a l i a T , S h e v c h e n k o A . T o p - d o w n l i p i d o m i c s c r e e n s b y m u l t i v a r i a t e a n a l y s i s o f h i g h - r e s o l u t i o n s u r v e y m a s s s p e c t r a . A n a l C h e m 2 0 0 7 ; 7 9 : 4 0 8 3 - 4 0 9 3 L e i t n e r A , F o e t t i n g e r A , L i n d n e r W . I m p r o v i n g f r a g m e n t a t i o n o f p o o r l y f r a g m e n t i n g p e p t i d e s a n d p h o s p h o p e p t i d e s d u r i n g c o l l i s i o n - i n d u c e d d i s s o c i a t i o n b y m a l o n d i a l d e h y d e m o d i fi c a t i o n o f a r g i n i n e r e s i d u e s . J M a s s S p e c t r o m 2 0 0 7 ; 4 2 : 9 5 0 - 9 5 9 A h n Y H , J i E S , L e e J Y , C h o K , Y o o J S . A r g i n i n e - m i m i c l a b e l i n g w i t h g u a n i d i n o e t h a n e t h i o l t o i n c r e a s e m a s s s e n s i t i v i t y o f l y s i n e - t e r m i n a t e d p h o s p h o p e p t i d e s b y m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i z a t i o n t i m e - o f - fl i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y . R a p i d C o m m u n M a s s S p e c t r o m 2 0 0 7 ; 2 1 : 2 2 0 4 - 2 2 1 0 W y s o c k i V H , T s a p r a i l i s G , S m i t h L L , B r e c i L A . M o b i l e a n d l o c a l i z e d p r o t o n s : a f r a m e w o r k f o r u n d e r s t a n d i n g p e p t i d e d i s s o c i a t i o n . J M a s s S p e c t r o m 2 0 0 0 ; 3 5 : 1 3 9 9 — 1 4 0 6 E c k e r s l e y M , B o w i e J H , H a y e s R N . C o l l i s i o n - i n d u c e d d i s s o c i a t i o n s o f d e p r o t o n a t e d a l p h a - a m i n o a c i d s . T h e o c c u r r e n c e o f s p e c i fi c p r o t o n t r a n s f e r s p r e c e d i n g f r a g m e n t a t i o n . I n t J M a s s S p e c t r o m I o n P r o c e s s e s 1 9 8 9 ; 9 3 : 1 9 9 - 2 1 3 Z h a n g X , F e r g u s o n - M i l l e r S M , R e i d G E . C h a r a c t e r i z a t i o n o f o r n i t h i n e a n d g l u t a r n i n e l i p i d s e x t r a c t e d f r o m c e l l m e m b r a n e s o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 9 ; 2 0 : 1 9 8 - 2 1 2 Z h a n g X , R e i d G E . M u l t i s t a g e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y o f a n i o n i c p h o s p h a t i d y l c h o l i n e l i p i d a d d u c t s r e v e a l s n o v e l d i s s o c i a t i o n p a t h w a y s . I n t J M a s s S p e c t r o m 2 0 0 6 ; 2 5 2 : 2 4 2 - 2 5 5 O ' H a i r R A J , R e i d G B . T h e s e a r c h f o r s t a b l e g a s p h a s e b l i o n s d e r i v e d f r o m a l i p h a t i c a m i n o a c i d s : a c o m b i n e d e x p e r i m e n t a l a n d a b i n i t i o s t u d y . R a p i d C o m m u n M a s s S p e c t r o m 2 0 0 0 ; 1 4 : 1 2 2 0 - 1 2 2 5 G r i f fi t h s W J . T a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y i n t h e s t u d y o f f a t t y a c i d s , b i l e a c i d s , a n d s t e r o i d s . M a s s S p e c t r o m R e v 2 0 0 3 ; 2 2 : 8 1 - 1 5 2 H s u F - F , B o h r e r A , T u r k J . F o r m a t i o n o f l i t h i a t e d a d d u c t s o f g l y c e r o p h o s p h o c h o l i n e l i p i d s f a c i l i t a t e s t h e i r i d e n t i fi c a t i o n b y e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 1 9 9 8 ; 9 : 5 1 6 - 5 2 6 H s u F - F , T u r k J . C h a r g e - d r i v e n f r a g m e n t a t i o n p r o c e s s e s i n d i a c y l g l y c e r o p h o s p h a t i d i c a c i d s u p o n l o w - e n e r g y c o l l i s i o n a l a c t i v a t i o n . A m e c h a n i s t i c p r o p o s a l . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 0 ; 1 1 : 7 9 7 - 8 0 3 4 8 1 1 9 0 . 1 9 1 . 1 9 2 . 1 9 3 . 1 9 4 . 1 9 5 . 1 9 6 . 1 9 7 . 1 9 8 . 1 9 9 . 2 0 0 . H s u F - F , T u r k J . C h a r g e - r e m o t e a n d c h a r g e - d r i v e n f r a g m e n t a t i o n p r o c e s s e s i n d i a c y l g l y c e r o p h o s p h o e t h a n o l a m i n e u p o n l o w - e n e r g y c o l l i s i o n a l a c t i v a t i o n : a m e c h a n i s t i c p r o p o s a l . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 0 ; 1 1 : 8 9 2 - 8 9 9 H s u F - F , T u r k J . C h a r a c t e r i z a t i o n o f p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e a s a l i t h i a t e d a d d u c t b y t r i p l e q u a d r u p o l e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n . J M a s s S p e c t r o m 2 0 0 0 ; 3 5 : 5 9 6 - 6 0 6 H s u F - F , T u r k J . S t r u c t u r a l D e t e r m i n a t i o n o f S p h i n g o m y e l i n b y T a n d e m M a s s S p e c t r o m e t r y W i t h E l e c t r o s p r a y I o n i z a t i o n . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 0 ; 1 1 : 4 3 7 — 4 4 9 H s u F - F , T u r k J . S t u d i e s o n p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l w i t h t r i p l e q u a d r u p o l e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n : f r a g m e n t a t i o n p r o c e s s e s a n d s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 1 ; 1 2 : 1 0 3 6 - 1 0 4 3 H s u F - F , T u r k J . C h a r a c t e r i z a t i o n o f c a r d i o l i p i n a s t h e s o d i a t e d I o n s b y p o s i t i v e - i o n e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n w i t h m u l t i p l e s t a g e q u a d r u p o l e i o n - t r a p m a s s s p e c t r o m e t r y . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 6 ; I 7 : 1 1 4 6 - 1 1 5 7 H s u F - F , T u r k J , R h o a d e s E R , R u s s e l l D G , S h i Y , G r o i s m a n E A . S t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f c a r d i o l i p i n b y t a n d e m q u a d r u p o l e a n d m u l t i p l e - s t a g e q u a d r u p o l e i o n - t r a p m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 5 ; 1 6 : 4 9 1 - 5 0 4 Z e m s k i B , K a r i n A , M u r p h y R C . E l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y o f g l y c e r o p h o s p h o e t h a n o l a m i n e p l a s m a l o g e n p h o s p h o l i p i d s . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 4 ; 1 5 : 1 4 9 9 - 1 5 0 8 H s u F - F , T u r k J . S t u d i e s o n p h o s p h a t i d y l s e r i n e b y t a n d e m q u a d r u p o l e a n d m u l t i p l e s t a g e q u a d r u p o l e i o n - t r a p m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n : s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n a n d t h e f r a g m e n t a t i o n p r o c e s s e s . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 5 ; 1 6 : 1 5 1 0 - 1 5 2 2 H s u F - F , T u r k J . C h a r a c t e r i z a t i o n o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l , p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 4 - p h o s p h a t e , a n d p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 4 , 5 - b i s p h o s p h a t e b y e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y : a m e c h a n i s t i c s t u d y . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 0 ; 1 I : 9 8 6 - 9 9 9 G o l i k J , D i c k e y J K , T o d d e r u d G , L e e D , A l f o r d J , H u a n g S , K l o h r S , E u s t i c e D , A r u f f o A , A g l e r M L . I s o l a t i o n a n d s t r u c t u r e d e t e r m i n a t i o n o f s u l f o n o q u i n o v o s y l d i p a l m i t o y l g l y c e r i d e , a P - s e l e c t i n r e c e p t o r i n h i b i t o r f r o m t h e a l g a D i c t y o c h l o r i s f r a g r a n s . J N a t P r o d 2 0 0 7 ; 6 0 : 3 8 7 - 3 8 9 H s u F - F , T u r k J . S t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t r i a c y l g l y c e r o l s a s l i t h i a t e d a d d u c t s b y e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y u s i n g l o w - e n e r g y c o l l i s i o n a l l y 4 8 2 2 0 1 . 2 0 2 . 2 0 3 . 2 0 4 . 2 0 5 . 2 0 6 . 2 0 7 . 2 0 8 . 2 0 9 . 2 1 0 . 2 1 1 . a c t i v a t e d d i s s o c i a t i o n o n a t r i p l e s t a g e q u a d r u p o l e i n s t r u m e n t . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 1 9 9 9 ; 1 0 : 5 8 7 - 5 9 9 H a n X , G r o s s R W . S t r u c t u r a l d e t e r m i n a t i o n o f l y s o p h o s p h o l i p i d r e g i o i s o m e r s b y e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . J A m C h e m S o c 1 9 9 6 ; 1 1 8 : 4 5 1 - 4 5 7 G r o s s M L . C h a r g e - r e m o t e f r a g m e n t a t i o n : a n a c c o u n t o f r e s e a r c h o n m e c h a n i s m s a n d a p p l i c a t i o n s . I n t J M a s s S p e c t r o m 2 0 0 0 ; 2 0 0 : 6 1 1 - 6 2 4 O ' H a i r R A J , R e i d G E . N e i g h b o r i n g g r o u p v e r s u s c i s - e l i m i n a t i o n m e c h a n i s m s f o r s i d e c h a i n l o s s fi ' o m p r o t o n a t e d m e t h i o n i n e , m e t h i o n i n e s u l f o x i d e a n d t h e i r p e p t i d e s g a s p h a s e i o n c h e m i s t r y o f b i o m o l e c u l e s . E u r M a s s S p e c t r o m 1 9 9 9 ; 5 : 3 2 5 - 3 3 4 H v a t t u m E , H a g e l i n G , L a r s e n A . S t u d y o f m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n t h e c o l l i s i o n - i n d u c e d d i s s o c i a t i o n o f c a r b o x y l a t e a n i o n s f r o m g l y c e r o p h o s p h o l i p i d s u s i n g n e g a t i v e i o n e l e c t r o s p r a y t a n d e m q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t r y . R a p i d C o m m u n M a s s S p e c t r o m 1 9 9 8 ; 1 2 : 1 4 0 5 - 1 4 0 9 M u r p h y R C , F i e d l e r J , H e v k o J . A n a l y s i s o f n o n v o l a t i l e l i p i d s b y m a s s s p e c t r o m e t r y . C h e m R e v 2 0 0 1 ; 1 0 1 : 4 7 9 - 5 2 6 M o e M K , A n d e r s s e n T , S t r u m M B , J e n s e n E . T o t a l s t r u c t u r e c h a r a c t e r i z a t i o n o f u n s a t u r a t e d a c i d i c p h o s p h o l i p i d s p r o v i d e d b y v i c i n a l d i - h y d r o x y l a t i o n o f f a t t y a c i d d o u b l e b o n d s a n d n e g a t i v e e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 5 ; 1 6 : 4 6 - 5 9 T h o m a s M C , M i t c h e l l T W , H a r m a n D G , D e e l e y J M , M u r p h y R C , B l a n k s b y S J . E l u c i d a t i o n o f d o u b l e b o n d p o s i t i o n i n u n s a t u r a t e d l i p i d s b y o z o n e e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y . A n a l C h e m 2 0 0 7 ; 7 9 : 5 0 1 3 - 5 0 2 2 H a n X , G r o s s R W . E l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o s c o p i c a n a l y s i s o f h u m a n e r y t h r o c y t e p l a s m a m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 9 9 4 ; 9 1 : 1 0 6 3 5 - 1 0 6 3 9 K i m H - Y , W a n g T - C L , M a Y - C . L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y / m a s s s p e c t r o m e t r y o f p h o s p h o l i p i d s u s i n g e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n . A n a l C h e m 1 9 9 4 ; 6 6 : 3 9 7 7 - 3 9 8 2 E k r o o s K , C h e m u s h e v i c h I V , S i m o n s K , S h e v c h e n k o A . Q u a n t i t a t i v e p r o fi l i n g o f p h o s p h o l i p i d s b y m u l t i p l e p r e c u r s i r i o n s c a n n i n g o n a h y b r i d q u a d r u p o l e t i m e - o f - fl i g h t m a s s s p e c t r o m e t e r . A n a l C h e m 2 0 0 2 ; 7 4 : 9 4 1 - 9 4 9 H o u j o u T , Y a m a t a n i K , N a k a n i s h i H , I m a g a w a M , S h i m i z u T , T a g u c h i R . R a p i d a n d s e l e c t i v e i d e n t i fi c a t i o n o f m o l e c u l a r s p e c i e s i n p h o s p h a t i d y l c h o l i n e a n d 4 8 3 2 1 2 . 2 1 3 . 2 1 4 . 2 1 5 . 2 1 6 . 2 1 7 . 2 1 8 . 2 1 9 . 2 2 0 . 2 2 1 . 2 2 2 . s p h i n g o m y e l i n b y c o n d i t i o n a l n e u t r a l l o s s s c a n n i n g a n d M 8 3 . R a p i d C o m m u n M a s s S p e c t r o m 2 0 0 4 ; 1 8 : 3 1 2 3 - 3 1 3 0 B u s c h K L . C h e m i c a l N o i s e , P a r t I V : R e d u c t i o n o f N o i s e t h r o u g h I n f o r m a t i c s . S p e c t r o s c o p y 2 0 0 4 ; 1 9 : 4 4 - 5 2 B u s c h K L . C h e m i c a l n o i s e i n m a s s s p e c t r o m e t r y . P a r t I . S p e c t r o s c o p y ( D u l u t h , M N , U n i t e d S t a t e s ) 2 0 0 2 ; 1 7 : 3 2 - 3 4 , 3 6 - 3 7 B u s c h K L . C h e m i c a l n o i s e i n m a s s s p e c t r o m e t r y . P a r t I I - e f f e c t s o f c h o i c e s i n i o n i z a t i o n m e t h o d s o n c h e m i c a l n o i s e . S p e c t r o s c o p y ( D u l u t h , M N , U n i t e d S t a t e s ) 2 0 0 3 ; 1 8 : 5 6 , 5 8 , 6 0 - 6 2 B u s c h K L . C h e m i c a l n o i s e i n m a s s s p e c t r o m e t r y . P a r t I I I - m o r e m a s s s p e c t r o m e t r y / m a s s s p e c t r o m e t r y . S p e c t r o s c o p y ( D u l u t h , A / I N , U n i t e d S t a t e s ) 2 0 0 3 ; 1 8 : 5 2 - 5 5 B e n a r d S , A r n h o l d J , L e h n e r t M , S c h i l l e r J , A r n o l d K . E x p e r i m e n t s t o w a r d q u a n t i fi c a t i o n o f s a t u r a t e d a n d p o l y u n s a t u r a t e d d i s c y l g l y c e r o l s b y m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n a n d i o n i z a t i o n t i m e - o f - fl i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y . C h e m i s t r y a n d P h y s i c s o f L i p i d s 1 9 9 9 ; 1 0 0 : 1 1 5 - 1 2 5 R e i d G E , S i m p s o n R J , O ' H a i r R A J . A m a s s s p e c t r o m e t r i c a n d a b i n i t i o s t u d y o f t h e p a t h w a y s f o r d e h y d r a t i o n o f s i m p l e g l y c i n e a n d c y s t e i n e - c o n t a i n i n g p e p t i d e + [ M + H ] i o n s . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 1 9 9 8 ; 9 : 9 4 5 - 9 5 6 S i s t r o m W R . A r e q u i r e m e n t f o r s o d i u m i n t h e g r o w t h o f R h o d o p s e u d o m o n a s s p h e r o i d e s . J G e n M i c r o b i o l 1 9 6 0 ; 2 2 : 7 7 8 - 7 8 5 S i s t r o m W R . T h e k i n e t i c s o f t h e s y n t h e s i s o f p h o t o p i g m e n t s i n R h o d o p s e u d o m o n a s s p h e r o i d e s . J G e n M i c r o b i o l 1 9 6 2 ; 2 8 : 6 0 7 - 6 1 6 Z h e n Y , Q i a n J , F o l l m a n n K , H a y w a r d T , N i l s s o n T , D a h n M , H i l m i Y , H a m e r A G , H o s l e r J P , F e r g u s o n - M i l l e r S . O v e r e x p r e s s i o n a n d p u r i fi c a t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . P r o t e i n E x p r e s s i o n P u r i f 1 9 9 8 ; 1 3 : 3 2 6 - 3 3 6 v a n N i e l C B . T h e c u l t u r e , g e n e r a l p h y s i o l o g y , m o r p h o l o g y , a n d c l a s s i fi c a t i o n o f t h e n o n - s u l f u r p u r p l e a n d b r o w n b a c t e r i a . B a c t e r i o l R e v 1 9 4 4 ; 8 : 1 - 1 1 8 K o v a c h M E , E l z e r P H , H i l l D S , R o b e r t s o n G T , F a r r i s M A , R o o p R M , 2 n d , P e t e r s o n K M . F o u r n e w d e r i v a t i v e s o f t h e b r o a d - h o s t - r a n g e c l o n i n g v e c t o r p B B R l M C S , c a r r y i n g d i f f e r e n t a n t i b i o t i c - r e s i s t a n c e c a s s e t t e s . G e n e 1 9 9 5 ; 1 6 6 : 1 7 5 - 1 7 6 4 8 4 2 2 3 . 2 2 4 . 2 2 5 . 2 2 6 . 2 2 7 . 2 2 8 . 2 2 9 . 2 3 0 . 2 3 1 . 2 3 2 . 2 3 3 . B e n n i n g C . I n , ( G e n e t i c a n a l y s i s o f t h e p a t h w a y f o r t h e b i o s y n t h e s i s o f t h e p l a n t s u l f o l i p i d i n t h e p u r p l e b a c t e r i u m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s P h . D . D i s s e r t a t i o n M S U 1 9 9 1 B a r t l e t t G R . P h o s p h o r u s a s s a y i n c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y . J B i o l C h e m 1 9 5 9 ; 2 3 4 : 4 6 6 - 4 6 8 H i l m i Y . U s e o f m u t a g e n e s i s , n o v e l d e t e r g e n t s , a n d l i p i d a n a l y s i s t o o p t i m i z e c o n d i t i o n s f o r a c h i e v i n g h i g h r e s o l u t i o n 3 - d i m e n s i o n a l c r y s t a l s t r u c t u r e o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P h . D . D i s s e r t a t i o n M S U ; 2 0 0 2 W e i s s e n m a y e r B , G e i g e r O , B e n n i n g C . D i s r u p t i o n o f a g e n e e s s e n t i a l f o r s u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r o l b i o s y n t h e s i s i n S i n o r h i z o b i u m m e l i l o t i h a s n o d e t e c t a b l e e f f e c t o n r o o t n o d u l e s y m b i o s i s . M o l P l a n t - M i c r o b e I n t e r a c t 2 0 0 0 ; 1 3 : 6 6 6 - 6 7 2 T s u k i h a r a T , S h i m o k a t a K , K a t a y a m a Y , S h i m a d a H , M u r a m o t o K , A o y a m a H , M o c h i z u k i M , S h i n z a w a - i t o h K , Y a m a s h i t a E , Y a o M , I s h i m u r a Y , Y o s h i k a w a S . T h e l o w - s p i n h e m e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e a s t h e d r i v i n g e l e m e n t o f t h e p r o t o n - p u m p i n g p r o c e s s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 2 0 0 3 ; 1 0 0 : 1 5 3 0 4 - 1 5 3 0 9 C a r t a i l l e r J - P , L u e c k e H . X - r a y c r y s t a l l o g r a p h i c a n a l y s i s o f l i p i d - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s i n t h e b a c t e r i o d o p s i n p u r p l e m e m b r a n e . A n n u R e v B i o p h y s B i o m o l S t r u c t 2 0 0 3 ; 3 2 : 2 8 5 - 3 1 0 P i k e L J , H a n X , C h u n g K - N , G r o s s R W . L i p i d r a f t s a r e e n r i c h e d i n a r a c h i d o n i c a c i d a n d p l a s m e n y l e t h a n o l a m i n e a n d t h e i r c o m p o s i t i o n i s i n d e p e n d e n t o f c a v e o l i n - l e x p r e s s i o n : A q u a n t i t a t i v e e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n / m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s . B i o c h e m i s t r y 2 0 0 2 ; 4 1 : 2 0 7 5 - 2 0 8 8 S i m o n s K , V a z W L C . M o d e l s y s t e m s , l i p i d r a f t s , a n d c e l l m e m b r a n e s . A n n u R e v B i o p h y s B i o m o l S t r u c t 2 0 0 4 ; 3 3 : 2 6 9 - 2 9 5 P i k e L J , H a n X , G r o s s R W . E p i d e r m a l g r t h f a c t o r r e c e p t o r s a r e l o c a l i z e d t o l i p i d r a f t s t h a t c o n t a i n a b a l a n c e o f i n n e r a n d o u t e r l e a fl e t l i p i d s : a s h o t g u n l i p i d o m i c s s t u d y J B i o l C h e m 2 0 0 5 ; 2 8 0 : 2 6 7 9 6 - 2 6 8 0 4 B r u g g e r B , E r b e n G , S a n d h o f f R , W i e l a n d F T , L e h m a n n W D . Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f b i o l o g i c a l m e m b r a n e l i p i d s a t t h e l o w p i c o m o l e l e v e l b y n a n o - e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 9 9 7 ; 9 4 : 2 3 3 9 - 2 3 4 4 Z a c a r i a s A , B o l a n o w s k i D , B h a t n a g a r A . C o m p a r a t i v e m e a s u r e m e n t s o f m u l t i c o m p o n e n t p h o s p h o l i p i d m i x t u r e s b y e l e c t r o s p r a y m a s s s p e c t r o s c o p y : r e l a t i n g i o n i n t e n s i t y t o c o n c e n t r a t i o n . A n a l B i o c h e m 2 0 0 2 ; 3 0 8 : 1 5 2 - 1 5 9 4 8 5 2 3 4 . 2 3 5 . 2 3 6 . 2 3 7 . 2 3 8 . 2 3 9 . 2 4 0 . 2 4 1 . 2 4 2 . 2 4 3 . K o i v u s a l o M , H a i m i P , H e i k i n h e i m o L , K o s t i a i n e n R , S o m e r h a r j u P . Q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f p h o s p h o l i p i d c o m p o s i t i o n s b y E S I - M S : e f f e c t s o f a c y l c h a i n l e n g t h , u n s a t u r a t i o n , a n d l i p i d c o n c e n t r a t i o n o n i n s t r u m e n t r e s p o n s e . J L i p i d R e s 2 0 0 1 ; 4 2 : 6 6 3 - 6 7 2 T a g u c h i R , H o u j o u T , N a k a n i s h i H , Y a m a z a k i T , I s h i d a M , I m a g a w a M , S h i m i z u T . F o c u s e d l i p i d o m i c s b y t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . J C h r o m a t o g r a p h y B 2 0 0 5 ; 8 2 3 : 2 6 - 3 6 M i l n e S B , I v a n o v a P T , D e C a m p D , H s u e h R C , B r o w n H A . A t a r g e t e d m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l p h o s p h a t e s p e c i e s . J L i p i d R e s 2 0 0 5 ; 4 6 : 1 7 9 6 - 1 8 0 2 H a n X , G u b i t o s i - K l u g R A , C o l l i n s B J , G r o s s R W . A l t e r a t i o n s i n i n d i v i d u a l m o l e c u l a r s p e c i e s o f h u m a n p l a t e l e t p h o s p h o l i p i d s d u r i n g t h r o m b i n s t i m u l a t i o n : e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y - f a c i l i t a t e d i d e n t i fi c a t i o n o f t h e b o u n d a r y c o n d i t i o n s f o r t h e m a g n i t u d e a n d s e l e c t i v i t y o f t h r o m b i n - i n d u c e d p l a t e l e t p h o s p h o l i p i d h y d r o l y s i s . B i o c h e m i s t r y 1 9 9 6 ; 3 5 : 5 8 2 2 - 5 8 3 2 H a r r i s o n K A , M u r p h y R C . N e g a t i v e e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n o f g l y c e r o p h o s p h o - c h o l i n e l i p i d s : f o r m a t i o n o f [ M - 1 5 ] ' i o n s o c c u r s v i a c o l l i s i o n a l d e c o m p o s i t i o n o f a d d u c t a n i o n s . J M a s s S p e c t r o m 1 9 9 5 ; 3 0 : 1 7 7 2 - 1 7 7 3 D e L o n g C J , B a k e r P R S , S a m u e l M , C u i Z , T h o m a s M J . M o l e c u l a r s p e c i e s c o m p o s i t i o n o f r a t l i v e r p h o s p h o l i p i d s b y E S I - M S / M S : t h e e f f e c t o f c h r o m a t o g r a p h y . J L i p i d R e s 2 0 0 1 ; 4 2 : 1 9 5 9 - 1 9 6 8 K a r l s s o n A A , M i c h e l s e n P , O d h a m G . M o l e c u l a r s p e c i e s o f s p h i n g o m y e l i n : d e t e r m i n a t i o n b y h i g h - p e r f o n n a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y / m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h e l e c t r o s p r a y a n d h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y / t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h a t m o s p h e r i c p r e s s u r e c h e m i c a l i o n i z a t i o n . J M a s s S p e c t r o m 1 9 9 8 ; 3 3 : 1 1 9 2 - 1 1 9 8 L e h m a n n W D , K o e s t e r M , E r b e n G , K e p p l e r D . C h a r a c t e r i z a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f r a t b i l e p h o s p h a t i d y l c h o l i n e b y e l e c t r o s p r a y - t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . A n a l B i o c h e m 1 9 9 7 ; 2 4 6 : 1 0 2 - 1 1 0 K e r w i n J L , T u i n i n g a A R , E r i c s s o n L H . I d e n t i fi c a t i o n o f m o l e c u l a r s p e c i e s o f g l y c e r o p h o s p h o l i p i d s a n d s p h i n g o m y e l i n u s i n g e l e c t r o s p r a y m a s s s p e c t r o m e t r y . J L i p i d R e s 1 9 9 4 ; 3 5 : 1 1 0 2 - 1 1 1 4 K h a s e l e v N , M u r p h y R C . S t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f o x i d i z e d p h o s p h o l i p i d p r o d u c t s d e r i v e d f r o m a r a c h i d o n a t e - c o n t a i n i n g p l a s m e n y l g l y c e r o p h o s p h o c h o l i n e . J L i p i d R e s 2 0 0 0 ; 4 1 : 5 6 4 - 5 7 2 4 8 6 2 4 4 . 2 4 5 . 2 4 6 . 2 4 7 . 2 4 8 . 2 4 9 . 2 5 0 . 2 5 1 . 2 5 2 . 2 5 3 . U r a n S , L a r s e n A , J a c o b s e n P B , S k o t l a n d T . A n a l y s i s o f p h o s p h o l i p i d s p e c i e s i n h u m a n b l o o d u s i n g n o n n a l - p h a s e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y c o u p l e d w i t h e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n i o n - t r a p t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . J C h r o m a t o g r B 2 0 0 1 ; 7 5 8 : 2 6 5 - 2 7 5 P a c e t t i D , M a l a v o l t a M , B o c c i F , B o s e l l i E , F r e g a N G . H i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y / e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n i o n - t r a p t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s a n d q u a n t i fi c a t i o n o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e m o l e c u l a r s p e c i e s i n t h e s e r u m o f c y s t i c fi b r o s i s s u b j e c t s s u p p l e m e n t e d w i t h d o c o s a h e x a e n o i c a c i d . R a p i d C o m m u n M a s s S p e c t r o m 2 0 0 4 ; 1 8 : 2 3 9 5 - 2 4 0 0 L a r s e n A , U r a n S , J a c o b s e n P B , S k o t l a n d T . C o l l i s i o n - i n d u c e d d i s s o c i a t i o n o f g l y c e r o p h o s p h o l i p i d s u s i n g e l e c t r o s p r a y i o n - t r a p m a s s s p e c t r o m e t r y . R a p i d C o m m u n M a s s S p e c t r o m 2 0 0 1 ; 1 5 : 2 3 9 3 - 2 3 9 8 H s u F - F , T u r k J . S t u d i e s o n s u l f a t i d e s b y q u a d r u p o l e i o n - t r a p m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n : s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n a n d t h e fi ' a g m e n t a t i o n p r o c e s s e s t h a t i n c l u d e a n u n u s u a l i n t e r n a l g a l a c t o s e r e s i d u e l o s s a n d t h e c l a s s i c a l c h a r g e - r e m o t e f r a g m e n t a t i o n . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 4 ; 1 5 : 5 3 6 - 5 4 6 H s u F - F , T u r k J , S h i Y , G r o i s m a n E A . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a c y l p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l s fi o m S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m b y t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 4 ; 1 5 : 1 - 1 1 M a z z e l l a N , M o l i n e t J , S y a k t i A D , D o d i A , D o u m e n q P , A r t a u d J , B e r t r a n d J - C . B a c t e r i a l p h o s p h o l i p i d m o l e c u l a r s p e c i e s a n a l y s i s b y i o n - p a i r r e v e r s e d - p h a s e H P L C / E S I / M S . J L i p i d R e s 2 0 0 4 ; 4 5 : 1 3 5 5 - 1 3 6 3 J e n s e n N J , T o m e r K B , G r o s s M L . F a s t a t o m b o m b a r d m e n t a n d t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y o f p h o s p h a t i d y l s e r i n e a n d p h o s p h a t i d y l c h o l i n e . L i p i d s 1 9 8 6 ; 2 1 : 5 8 0 - 5 8 8 H u a n g Z H , G a g e D A , S w e e l e y C C . C h a r a c t e r i z a t i o n o f d i a c y l g l y c e r y l p h o s p h o c h o l i n e m o l e c u l a r s p e c i e s b y F A B - C A D - M S / M S : a g e n e r a l m e t h o d n o t s e n s i t i v e t o t h e n a t u r e o f t h e f a t t y a c y l g r o u p s . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 1 9 9 2 ; 3 : 7 1 - 7 8 H a y a s h i A , M a t s u b a r a T , M o r i t a M , K i n o s h i t a T , N a k a m u r a T . S t r u c t u r a l a n a l y s i s o f c h o l i n e p h o s p h o l i p i d s b y f a s t a t o m b o m b a r d m e n t m a s s s p e c t r o m e t r y a n d t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . J B i o c h e m 1 9 8 9 ; 1 0 6 : 2 6 4 - 2 6 9 K a y g a n i c h - H a r r i s o n K A , R o s e D M , M u r p h y R C , M o r r o w J D , R o b e r t s L J , I I . C o l l i s i o n - i n d u c e d d i s s o c i a t i o n o f F 2 - i s o p r o s t a n e — c o n t a i n i n g p h o s p h o l i p i d s . J L i p i d R e s 1 9 9 3 ; 3 4 : 1 2 2 9 - 1 2 3 5 4 8 7 2 5 4 . 2 5 5 . 2 5 6 . 2 5 7 . 2 5 8 . 2 5 9 . 2 6 0 . 2 6 1 . 2 6 2 . 2 6 3 . 2 6 4 . 2 6 5 . 2 6 6 . L e e C Y , L e s i m p l e A , L a r s e n A , M a m e r O , G e n e s t J . E S I - M S q u a n t i t a t i o n o f i n c r e a s e d s p h i n g o m y e l i n i n N i e m a n n - P i c k d i s e a s e t y p e B H D L . . J L i p i d R e s 2 0 0 5 ; 4 6 : 1 2 1 3 - 1 2 2 8 G r o n e r t S . Q u a d r u p o l e i o n t r a p s t u d i e s o f f u n d a m e n t a l o r g a n i c r e a c t i o n s . M a s s S p e c t r o m R e v 2 0 0 5 ; 2 4 : 1 0 0 - 1 2 0 L a n d i n J , P a s c h e r I , C r e m e r D . E f f e c t o f a P o l a r E n v i r o n m e n t o n t h e C o n f o r m a t i o n o f P h o s p h o l i p i d H e a d G r o u p s A n a l y z e d w i t h t h e O n s a g e r C o n t i n u u m S o l v a t i o n M o d e l . J o u r n a l o f P h y s i c a l C h e m i s t r y A 1 9 9 7 ; 1 0 1 : 2 9 9 6 - 3 0 0 4 P o h l e W , D . R . ; G , B o h l M , M r a z k o v a E , H o b z a P . L i p i d h y d r a t i o n : h e a d g r o u p C H m o i e t i e s a r e i n v o l v e d i n w a t e r b i n d i n g B i o p o l y m e r s 2 0 0 4 ; 7 4 : 2 7 - 3 1 C a i Y , C o n c h a M C , M u r r a y J S , C o l e R B . E v a l u a t i o n o f t h e r o l e o f m u l t i p l e h y d r o g e n b o n d i n g i n o f f e r i n g s t a b i l i t y t o n e g a t i v e i o n a d d u c t s i n e l e c t r o s p r a y m a s s s p e c t r o m e t r y . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 2 ; 1 3 : 1 3 6 0 - 1 3 6 9 J a m e s P F , P e r u g i n i M A , O ’ H a i r R A J . S o u r c e s o f a r t i f a c t s i n t h e e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r a o f s a t u r a t e d d i a c y l g l y c e r o p h o s p h o c h o l i n e s : F r o m c o n d e n s e d p h a s e h y d r o l y s i s r e a c t i o n s t h r o u g h t o g a s p h a s e i n t e r c l u s t e r r e a c t i o n s . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 2 0 0 6 ; 1 7 : 3 8 4 - 3 9 4 S t r e i t w e i s e r A . S o l v o l y t i c d i s p l a c e m e n t r e a c t i o n s a t s a t u r a t e d c a r b o n a t o m s C h e m R e v 1 9 5 6 ; 5 6 : 5 7 1 - 7 5 2 H o T - L . T h e h a r d s o f t a c i d s b a s e s ( H S A B ) p r i n c i p l e a n d o r g a n i c c h e m i s t r y . C h e m R e v 1 9 7 5 ; 7 5 : 1 - 2 0 G o r c h e i n A . T h e s e p a r a t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f t h e l i p i d s o f R h o d o p s e u d o m o n a s s p h e r o i d e s . P r o c R o y S o c , S e r B 1 9 6 8 ; 1 7 0 : 2 7 9 - 2 9 7 S h i v e l y J M , K n o c h e H W . I s o l a t i o n o f a n o m i t h i n e - c o n t a i n i n g l i p i d f r o m T h i a b a c i l l u s t h i o o x i d a n s . J B a c t e r i o l 1 9 6 9 ; 9 8 : 8 2 9 - 8 3 0 K n o c h e H W , S h i v e l y J M . T h e s t r u c t u r e o f a n o m i t h i n e - c o n t a i n i n g l i p i d f r o m T h i o b a c i l l u s t h i o o x i d a n s . J B i o l C h e m 1 9 7 2 ; 2 4 7 : 1 7 0 - 1 7 8 W i l k i n s o n B J , S m e n t K A , M a y b e r r y W R . O c c u r r e n c e , l o c a l i z a t i o n , a n d p o s s i b l e s i g n i fi c a n c e o f a n o m i t h i n e - c o n t a i n i n g l i p i d i n P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s . A r c h M i c r o b i a l 1 9 8 2 ; 1 3 1 : 3 3 8 - 3 4 3 K a w a i Y , Y a n o I . O m i t h i n e - c o n t a i n i n g l i p i d o f B a r d e t e l l a p e r t u s s i s , a n e w t y p e o f h e m a g g l u t i n i n . E u r J B i o c h e m 1 9 8 3 ; 1 3 6 : 5 3 1 - 5 3 8 4 8 8 2 6 7 . 2 6 8 . 2 6 9 . 2 7 0 . 2 7 1 . 2 7 2 . 2 7 3 . 2 7 4 . 2 7 5 . 2 7 6 . M i n n i k i n D E , A b d o l r a h i m z a d e h H . R e p l a c e m e n t o f p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e a n d a c i d i c p h o s p h o l i p i d s b y a n o m i t h i n e - a m i d e l i p i d a n d a m i n o r p h o s p h o r u s - f r e e l i p i d i n P s e u d o m o n a s fl u o r e s c e n s N C M B 1 2 9 . F E B S ( F e d E u r B i o c h e m S o c ) L e t t 1 9 7 4 ; 4 3 : 2 5 7 - 2 6 0 W e i s s e m n a y e r B , G a o J - L , L o p e z - L a r a I M , G e i g e r 0 . I d e n t i fi c a t i o n o f a g e n e r e q u i r e d f o r t h e b i o s y n t h e s i s o f o r n i t h i n e - d e r i v e d l i p i d s . M a l M i c r o b i a l 2 0 0 2 ; 4 5 : 7 2 1 - 7 3 3 R o j a s - J i m e n e z K , S o h l e n k a m p C , G e i g e r O , M a r t i n e z - R o m e r o E , W e r n e r D , V i n u e s a P . A C I C c h l o r i d e c h a n n e l h o m o l o g a n d o m i t h i n e - c o n t a i n i n g m e m b r a n e l i p i d s o f R h i z o b i u m t r a p i c i C I A T 8 9 9 a r e i n v o l v e d i n s y m b i o t i c e f fi c i e n c y a n d a c i d t o l e r a n c e . M a l P l a n t - M i c r o b e I n t e r a c t 2 0 0 5 ; 1 8 : 1 1 7 5 - 1 1 8 5 K a w a i Y , A k a g a w a K . M a c r o p h a g e a c t i v a t i o n o f a n o m i t h i n e - c o n t a i n i n g l i p i d o r a s e r i n e - c o n t a i n i n g l i p i d . I n f e c t I m m u n 1 9 8 9 ; 5 7 : 2 0 8 6 - 2 0 9 1 K a w a i Y , N a k a g a w a Y , M a t u y a r n a T , A k a g a w a K , I t a g a w a K , F u k a s e K , K u s u m o t o S , N i s h i j i m a M , Y a n o I . A t y p i c a l b a c t e r i a l o m i t h i n e - c o n t a i n i n g l i p i d N a l p h a - ( D ) - [ 3 - ( h e x a d e c a n o y l o x y ) h e x a d e c a n o y l ] - o r n i t h i n e i s a s t r o n g s t i m u l a n t f o r m a c r o p h a g e s a n d a u s e f u l a d j u v a n t . F E M S I m m u n o l M e d M i c r o b i o l 1 9 9 9 ; 2 3 : 6 7 - 7 3 K a w a i Y , I s h i d a O k a w a r a A , O k u y a m a H , K u r a F , S u z u k i K . M o d u l a t i o n o f c h e m o t a x i s , 0 2 ' p r o d u c t i o n a n d m y e l o p e r o x i d a s e r e l e a s e f r o m h u m a n p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e s b y t h e o m i t h i n e - c o n t a i n i n g l i p i d a n d t h e s e r i n e - g l y c i n e - c o n t a i n i n g l i p i d o f F l a v o b a c t e r i u m . F E M S I m m u n o l M e d M i c r o b i o l 2 0 0 0 ; 2 8 : 2 0 5 - 2 0 9 A y g u n - S u n a r S , M a n d a c i S , K o c h H - G , M u r r a y I V J , G o l d fi n e H , D a l d a l F . O m i t h i n e l i p i d i s r e q u i r e d f o r o p t i m a l s t e a d y - s t a t e a m o u n t s o f c - t y p e c y t o c h r o m e s i n R h o d o b a c t e r c a p s u l a t u s . M a l M i c r o b i o l 2 0 0 6 ; 6 1 : 4 1 8 - 4 3 5 K l u g R M , B e n n i n g C . T w o e n z y m e s o f d i a c y l g l y c e r y l - O - 4 ’ - ( N , N , N , - t r i m e t h y l ) - h o m o s e r i n e b i o s y n t h e s i s a r e e n c o d e d b y b t a A a n d b t a B i n t h e p u r p l e b a c t e r i u m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 2 0 0 1 ; 9 8 : 5 9 1 0 - 5 9 1 5 Y a s u t a k a T , Y u z i Y , K e i j i K . A n e w l y s i n e - c o n t a i n i n g l i p i d s i s o l a t e d f r o m A g r a b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s . A g r i c B i o l C h e m 1 9 7 6 ; 4 0 : 1 4 4 9 - 1 4 5 0 G a o J - L , W e i s s e n m a y e r B , T a y l o r A M , T h o m a s - O a t e s J , L o p e z - L a r a I M , G e i g e r 0 . I d e n t i fi c a t i o n o f a g e n e r e q u i r e d f o r t h e f o r m a t i o n o f l y s o - o r n i t h i n e l i p i d , a n i n t e r m e d i a t e i n t h e b i o s y n t h e s i s o f o m i t h i n e - c o n t a i n i n g l i p i d s . M a l M i c r o b i a l 2 0 0 4 ; 5 3 : 1 7 5 7 - 1 7 7 0 4 8 9 2 7 7 . 2 7 8 . 2 7 9 . 2 8 0 . 2 8 1 . 2 8 2 . 2 8 3 . 2 8 4 . 2 8 5 . 2 8 6 . 2 8 7 . 2 8 8 . 2 8 9 . 2 9 0 . T h i e l e O W , B i s w a s C J , H u n n e m a n D H . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n o m i t h i n e - c o n t a i n i n g l i p i d f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r t fi c a n s . E u r J B i o c h e m 1 9 8 0 ; 1 0 5 : 2 6 7 - 2 7 4 D e e s C , S h i v e l y J M . L o c a l i z a t i o n a n d q u a n t i t a t i o n o f t h e o r n i t h i n e l i p i d o f T h i a b a c i l l u s t h i o o x i d a n s . J B a c t e r i a l 1 9 8 2 ; 1 4 9 : 7 9 8 - 7 9 9 C h o m a A , K o m a n i e c k a 1 . A n a l y s i s o f p h o s p h o l i p i d s a n d o m i t h i n e - c o n t a i n i n g l i p i d s f r o m M e s o r h i z o b i u m s p p . S y s t A p p l M i c r o b i a l 2 0 0 2 ; 2 5 : 3 2 6 - 3 3 1 L i n s c h e i d M , D i e h l B W K , Q v e r m o h l e M , R i e d l I , H e i n z E . M e m b r a n e l i p i d s o f R h o d o p s e u d o m o n a s v i r i d i s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , L i p i d s L i p i d M e t a b 1 9 9 7 ; 1 3 4 7 : 1 5 1 - 1 6 3 H i l k e r D R , G r o s s M L , K n o c k e H W , S h i v e l y J M . T h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e m a s s s p e c t r u m o f a n o m i t h i n e - c o n t a i n i n g l i p i d f r o m T h i a b a c i l l u s t h i o o x i d a n s . B i o m e d M a s s S p e c t r o m 1 9 7 8 ; 5 : 6 4 - 7 1 H i l k e r D R , K n o c h e H W , G r o s s M L . T h e r m o l y s i s c h e m i c a l i o n i z a t i o n o f a c o m p l e x p o l a r l i p i d . B i o m e d M a s s S p e c t r o m 1 9 7 9 ; 6 : 3 5 6 - 3 5 8 B o w i e J H , B r i n k w o r t h C S , D u a S . C o l l i s i o n - i n d u c e d f r a g m e n t a t i o n s o f t h e [ M - H ] - p a r e n t a n i o n s o f u n d e r i v a t i z e d p e p t i d e s : a n a i d t o s t r u c t u r e d e t e r m i n a t i o n a n d s o m e u n u s u a l n e g a t i v e i o n c l e a v a g e s . M a s s S p e c t r o m R e v 2 0 0 2 ; 2 1 : 8 7 - 1 0 7 B o w i e J H . T h e f r a g m e n t a t i o n s o f e v e n - e l e c t r o n o r g a n i c n e g a t i v e i o n s . M a s s S p e c t r o m R e v 1 9 9 0 ; 9 : 3 4 9 - 3 7 9 Y a l c i n T , H a r r i s o n A G . I o n c h e m i s t r y o f p r o t o n a t e d l y s i n e d e r i v a t i v e s . J M a s s S p e c t r o m 1 9 9 6 ; 3 1 : 1 2 3 7 - 1 2 4 3 G r o g a n D W , C r o n a n J E J . C y c l o p r o p a n e r i n g f o r m a t i o n i n m e m b r a n e l i p i d s o f b a c t e r i a M i c r o b i a l M o l B i o l R e v 1 9 9 7 ; 6 1 : 4 2 9 - 4 4 1 R e i d G E , R o b e r t s K D , K a p p E A , S i m p s o n R J . S t a t i s t i c a l a n d m e c h a n i s t i c a p p r o a c h e s t o u n d e r s t a n d i n g t h e g a s - p h a s e f r a g m e n t a t i o n b e h a v i o r o f m e t h i o n i n e s u l f o x i d e c o n t a i n i n g p e p t i d e s . J P r a t R e s 2 0 0 4 ; 3 : 7 5 1 - 7 5 9 G u e l e r S , S e e l i g e r A , H a e r t e l H , R e n g e r G , B e n n i n g C . A n u l l m u t a n t o f S y n e c h a c a c c u s s p . P C C 7 9 4 2 d e fi c i e n t i n t h e s u l f o l i p i d s u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r o l . J B i o l C h e m 1 9 9 6 ; 2 7 1 : 7 5 0 1 - 7 5 0 7 B e n n i n g C . B i o s y n t h e s i s a n d f u n c t i o n o f t h e s u l f o l i p i d s u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r o l . A n n u R e v P l a n t P h y s i o l P l a n t M a l B i o l 1 9 9 8 ; 4 9 : 5 3 - 7 5 W e n k M . T h e e m e r g i n g fi e l d o f l i p i d o m i c s . N a t u r e R e v i e w s 2 0 0 5 ; 4 : 5 9 4 - 6 0 8 4 9 0 V l 2 9 1 . 2 9 2 . 2 9 3 . 2 9 4 . 2 9 5 . 2 9 6 . 2 9 7 . 2 9 8 . 2 9 9 . 3 0 0 . 3 0 1 . 3 0 2 . K i m Y H , Y o o J S , K i m M S . S t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f s u l f o q u i n o v o s y l , m o n o g a l a c t o s y l a n d d i g a l a c t o s y l d i a c y l g l y c e r o l s b y F A B - C I D - M S / M S . J o u r n a l o f M a s s S p e c t r o m e t r y 1 9 9 7 ; 3 2 : 9 6 8 - 9 7 7 B e n n i n g C . Q u e s t i o n s r e m a i n i n g i n s u l f o l i p i d b i o s y n t h e s i s : A h i s t o r i c a l p e r s p e c t i v e . P h o t o s y n t h R e s 2 0 0 7 ; 9 2 : 1 9 9 - 2 0 3 O h t a K , M i z u s h i n a Y , H i r a t a N , T a k e m u r a M , S u g a w a r a F , M a t s u k a g e A , Y o s h i d a S , S a k a g u c h i K . S u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r o l , K M O 4 3 , a n e w p o t e n t i n h i b i t o r o f e u k a r y o t i c D N A p o l y m e r a s e s a n d H I V - r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e t y p e 1 f r o m a m a r i n e r e d a l g a , G i g a r t i n a t e n e l l a . C h e m P h a m B u l l 1 9 9 8 ; 4 6 : 6 8 4 - 6 8 6 H a n a s h i m a S , M i z u s h i n a Y , Y a m a z a k i T , O h t a K , T a k a h a s h i S , S a h a r a H , S a k a g u c h i K , S u g a w a r a F . S y n t h e s i s o f s u l f o q u i n o v o s y l a c y l g l y c e r o l s , i n h i b i t o r s o f E u k a r y o t i c D N A P o l y m e r a s e a a n d b . B i a a r g M e d C h e m 2 0 0 1 ; 9 : 3 6 7 - 3 7 6 C e d e r g r e n R A , H o l l i n g s w o r t h R I . O c c u r r e n c e o f s u l f o q u i n o v o s y l d i a c y l g l y c e r o l i n s o m e m e m b e r s o f t h e f a m i l y R h i z o b i a c e a e . J L i p i d R e s 1 9 9 4 ; 3 5 : 1 4 5 2 - 1 4 6 1 S p r o t t G D , L a r o c q u e S , C a d o t t e N , D i c a i r e C J , M c G e e M , B r i s s o n J R . N o v e l p o l a r l i p i d s o f h a l o p h i l i c e u b a c t e r i u m P l a n a c a c c u s H 8 a n d a r c h a e o n H a l a f e r a x v a l c a n i i . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , M o l C e l l B i o l L i p i d s 2 0 0 3 ; 1 6 3 3 : 1 7 9 - 1 8 8 v a n M o o y B A S , F r e d r i c k s H F , E v a n s C T , D e v o l A H . S u l f o l i p i d s d r a m a t i c a l l y d e c r e a s e p h o s p h o r u s d e m a n d b y p i c o c y a n o b a c t e r i a i n o l i g o t r o p h i c m a r i n e e n v i r o n m e n t s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 2 0 0 6 ; 1 0 3 : 8 6 0 7 - 8 6 1 2 N a u m a n n I , D a r s o w K H , W a l t e r C , L a n g e H A , B u c h h o l z R . I d e n t i fi c a t i o n o f s u l f o g l y c o l i p i d s f r o m t h e a l g a P a r p h y r i d i u m p u r p u r e u m b y m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n / i o n i s a t i o n q u a d r u p o l e i o n t r a p t i m e - o f - fl i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y . R a p i d C o m m u n M a s s S p e c t r o m 2 0 0 7 ; 2 1 : 3 1 8 5 - 3 1 9 2 I m h o f f J F . P o l a r l i p i d s a n d f a t t y a c i d s i n t h e g e n u s R h a d a b a c t a r . S y s t e m a t i c a n d A p p l i e d M i c r o b i o l o g y 1 9 9 1 ; 1 4 : 2 2 8 - 2 3 4 O ' H a i r R A J , S t y l e s M L , R e i d G E . R o l e o f t h e s u l fl r y d r y l g r o u p o n t h e g a s p h a s e f r a g m e n t a t i o n r e a c t i o n s o f p r o t o n a t e d c y s t e i n e a n d c y s t e i n e c o n t a i n i n g p e p t i d e s . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 1 9 9 8 ; 9 : 1 2 7 5 - 1 2 8 4 C h e n g C , G r o s s M L . A p p l i c a t i o n s a n d m e c h a n i s m s o f c h a r g e - r e m o t e f r a g m e n t a t i o n . M a s s S p e c t r o m R e v 2 0 0 0 ; 1 9 : 3 9 8 - 4 2 0 D o m i n g u e s M R M , S . - M a r q u e s M G O , V a l e C A M , N e v e s M G , C a v a l e i r o J A S , F e r r e r - C o r r e i a A J , N e m i r o v s k i y O V , G r o s s M L . D o c h a r g e - r e m o t e f r a g m e n t a t i o n s o c c u r u n d e r m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n p o s t - 4 9 1 3 0 3 . 3 0 4 . 3 0 5 . 3 0 6 . 3 0 7 . 3 0 8 . 3 0 9 . 3 1 0 . 3 1 1 . 3 1 2 . 3 1 3 . 3 1 4 . s o u r c e d e c o m p o s i t i o n s a n d m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n c o l l i s i o n a l l y a c t i v a t e d d e c o m p o s i t i o n s ? J A m S o c M a s s S p e c t r o m 1 9 9 9 ; 1 0 : 2 1 7 - 2 2 3 R i e k h o f W R , A n d r e C , B e n n i n g C . T w o e n z y m e s , B t a A a n d B t a B , a r e s u f fi c i e n t f o r b e t a i n e l i p i d b i o s y n t h e s i s i n b a c t e r i a . A r c h B i o c h e m B i o p h y s 2 0 0 5 ; 4 4 1 : 9 6 - 1 0 5 M a r s h D , P a l i T . T h e p r o t e i n - l i p i d i n t e r f a c e : p e r s p e c t i v e s f r o m m a g n e t i c r e s o n a n c e a n d c r y s t a l s t r u c t u r e s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , B i o m e m b r 2 0 0 4 ; 1 6 6 6 : 1 1 8 - 1 4 1 d e M a t t e i s M A , G o d i A . P r o t e i n - l i p i d i n t e r a c t i o n s i n m e m b r a n e t r a f fi c k i n g a t t h e G o l g i c o m p l e x . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , B i o m e m b r 2 0 0 4 ; 1 6 6 6 : 2 6 4 - 2 7 4 v a n D a l e n A , d e K r u i j f f B . T h e r o l e o f l i p i d s i n m e m b r a n e i n s e r t i o n a n d t r a n s l o c a t i o n o f b a c t e r i a l p r o t e i n s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 2 0 0 4 ; 1 6 9 4 : 9 7 - 1 0 9 L e e A G . H o w l i p i d s a f f e c t t h e a c t i v i t i e s o f i n t e g r a l m e m b r a n e p r o t e i n s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , B i o m e m b r 2 0 0 4 ; 1 6 6 6 : 6 2 - 8 7 S o b u s M T , H o m l u n d C E . E x t r a c t i o n o f l i p i d s f r o m y e a s t . L i p i d s 1 9 7 6 ; 1 1 : 3 4 1 - 3 4 8 J e n s e n S , L i s b e t h H , J d r u n d s d o t t i r H , G é r a n O . A q u a n t i t a t i v e l i p i d e x t r a c t i o n m e t h o d f o r r e s i d u e a n a l y s i s o f fi s h i n v o l v i n g n o n h a l o g e n a t e d s o l v e n t s . J A g r i c F o o d C h e m 2 0 0 3 ; 5 1 : 5 6 0 7 - 5 6 1 1 D r o u i l l a r d K G , H a g e n H , H a f f e r G D . E v a l u a t i o n o f c h l o r o f o r m / m e t h a n o l a n d d i c h l o r o m e t h a n e / h e x a n e e x t r a c t a b l e l i p i d s a s s u r r o g a t e m e a s u r e s o f s a m p l e p a r t i t i o n c a p a c i t y f o r o r g a n o c h l o r i n e s i n fi s h t i s s u e . C h e m o s p h e r e 2 0 0 4 ; 5 5 : 3 9 5 - 4 0 0 P h i l l i p s F , P r i v e t t O S . A s i m p l i fi e d p r o c e d u r e o f t h e q u a n t i t a t i v e e x t r a c t i o n o f l i p i d s fi o m b r a i n t i s s u e . L i p i d s 1 9 7 8 ; 1 4 : 5 9 0 - 5 9 5 S i l i p o A , L a n z e t t a R , A m o r e s a n o A , P a r r i l l i M , M o l i n a r o A . A m m o n i u m h y d r o x i d e h y d r o l y s i s : a v a l u a b l e s u p p o r t i n t h e M A L D I - T O F m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l y s i s o f l i p i d A f a t t y a c i d d i s t r i b u t i o n . J L i p i d R e s 2 0 0 2 ; 4 3 : 2 1 8 8 - 2 1 9 5 H e l m y F M , H a c k M H . A n e t h a n o l a m i n e p l a s m a l o g e n a r t i f a c t f o r m e d b y a c e t o n e e x t r a c t i o n o f f r e e z e - d r i e d t i s s u e . L i p i d s 1 9 6 6 ; 1 : 2 7 9 - 2 8 1 R o u g h a n P G , S l a c k C R , H o l l a n d R . G e n e r a t i o n o f p h o s p h o l i p i d a r t e f a c t s d u r i n g e x t r a c t i o n o f d e v e l o p i n g s o y b e a n s e e d s w i t h m e t h a n o l i c s o l v e n t s . L i p i d s 1 9 7 8 ; 1 3 : 4 9 7 - 5 0 3 4 9 2 3 1 5 . 3 1 6 . 3 1 7 . 3 1 8 . 3 1 9 . 3 2 0 . 3 2 1 . 3 2 2 . 3 2 3 . 3 2 4 . 3 2 5 . K u r i h a r a T , N i s h i z a w a Y , T a k a h a s h i Y . T h e u s e o f n o n a q u e o u s c h l o r o f o r m / m e t h a n o l e x t r a c t i o n f o r t h e d e l i p i d a t i o n o f b r a i n w i t h m i n i m a l l o s s o f e n z y m e a c t i v i t i e s . B i o c h e m J 1 9 7 7 ; 1 6 5 : 1 3 5 - 1 4 0 S a l m i n e n J - P . E f f e c t s o f s a m p l e d r y i n g a n d s t o r a g e , a n d c h o i c e o f e x t r a c t i o n s o l v e n t a n d a n a l y s i s m e t h o d s o n t h e y i e l d o f b i r c h l e a f h y d r o l y z a b l e t a n n i n s . J C h e m E c 0 1 2 0 0 3 ; 2 9 : 1 2 8 9 - 1 3 0 5 N u s s b e r g e r S , D o e r r K , W a n g D N , K u h l b r a n d t W . L i p i d - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s i n c r y s t a l s o f p l a n t l i g h t - h a r v e s t i n g c o m p l e x . J M o l B i o l 1 9 9 3 ; 2 3 4 : 3 4 7 - 3 5 6 B o g d a n o v M , S u n J , K a b a c k H R , D o w h a n W . A p h o s p h o l i p i d a c t s a s a c h a p e r o n e i n a s s e m b l y o f a m e m b r a n e t r a n s p o r t p r o t e i n . J B i o l C h e m 1 9 9 6 ; 2 7 1 : 1 1 6 1 5 - 1 1 6 1 8 B o g d a n o v M , D o w h a n W . P h o s p h o l i p i d - a s s i s t e d p r o t e i n f o l d i n g : p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e i s r e q u i r e d a t a l a t e s t e p o f t h e c o n f o r m a t i o n a l m a t u r a t i o n o f t h e p o l y t o p i c m e m b r a n e p r o t e i n l a c t o s e p e r m e a s e . E m b a J 1 9 9 8 ; 1 7 : 5 2 5 5 - 5 2 6 4 B o g d a n o v M , U m e d a M , D o w h a n W . P h o s p h o l i p i d - a s s i s t e d r e f o l d i n g o f a n i n t e g r a l m e m b r a n e p r o t e i n . M i n i m u m s t r u c t u r a l f e a t u r e s f o r p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e t o a c t a s a m o l e c u l a r c h a p e r o n e . J B i o l C h e m 1 9 9 9 ; 2 7 4 : 1 2 3 3 9 - 1 2 3 4 5 V a l i y a v e e t i l F l , Z h o u Y , M a c K i n n o n R . L i p i d s i n t h e s t r u c t u r e , f o l d i n g , a n d 4 . f u n c t i o n o f t h e K c s A K c h a n n e l . B i o c h e m i s t r y 2 0 0 2 ; 4 1 : 1 0 7 7 1 - 1 0 7 7 7 Y u C A , Y u L . S t r u c t u r a l r o l e o f p h o s p h o l i p i d s i n u b i q u i n o l - c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e . B i o c h e m i s t r y 1 9 8 0 ; 1 9 : 5 7 1 5 - 5 7 2 0 G u a n L , S m i m o v a I N , V e m e r G , N a g a m o r i S , K a b a c k H R . M a n i p u l a t i n g p h o s p h o l i p i d s f o r c r y s t a l l i z a t i o n o f a m e m b r a n e t r a n s p o r t p r o t e i n . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 2 0 0 6 ; 1 0 3 : 1 7 2 3 - 1 7 2 6 M a r s h D , H o r v a t h L l . S t r u c t u r e , d y n a m i c s a n d c o m p o s i t i o n o f t h e l i p i d - p r o t e i n i n t e r f a c e . P e r s p e c t i v e s f r o m s p i n - l a b e l l i n g . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 9 9 8 ; 1 3 7 6 : 2 6 7 - 2 9 6 P o w e l l G L , K n o w l e s P F , M a r s h D . S p i n - l a b e l s t u d i e s o n t h e s p e c i fi c i t y o f i n t e r a c t i o n o f c a r d i o l i p i n w i t h b e e f h e a r t c y t o c h r o m e o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 1 9 8 7 ; 2 6 : 8 1 3 8 - 8 1 4 5 4 9 3 3 2 6 . 3 2 7 . 3 2 8 . 3 2 9 . 3 3 0 . 3 3 1 . 3 3 2 . 3 3 3 . 3 3 4 . 3 3 5 . 3 3 6 . 3 3 7 . M i l l s D A , F e r g u s o n - M i l l e r S . U n d e r s t a n d i n g t h e m e c h a n i s m o f p r o t o n m o v e m e n t l i n k e d t o o x y g e n r e d u c t i o n i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e : l e s s o n s f r o m o t h e r p r o t e i n s . F E B S L e t t 2 0 0 3 ; 5 4 5 : 4 7 - 5 1 F y f e P K , I s a a c s N W , C o g d e l l R J , J o n e s M R . D i s r u p t i o n o f a s p e c i fi c m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n w i t h a b o u n d l i p i d a f f e c t s t h e t h e r m a l s t a b i l i t y o f t h e p u r p l e b a c t e r i a l r e a c t i o n c e n t r e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a , B i o e n e r g 2 0 0 4 ; 1 6 0 8 : 1 1 - 2 2 T u l l e r G , H r a s t n i k C , A c h l e i t n e r G , S c h i e fi h a l e r U , K l e i n F , D a u m G . Y D L 1 4 2 c e n c o d e s c a r d i o l i p i n s y n t h a s e ( C l s l p ) a n d i s n o n - e s s e n t i a l f o r a e r o b i c g r o w t h o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . F E B S L e t t 1 9 9 8 ; 4 2 1 : 1 5 - 1 8 S h i b u y a I , M i y a z a k i C , O h t a A . A l t e r a t i o n o f p h o s p h o l i p i d c o m p o s i t i o n b y c o m b i n e d d e f e c t s i n p h o s p h a t i d y l s e r i n e a n d c a r d i o l i p i n s y n t h a s e s a n d p h y s i o l o g i c a l c o n s e q u e n c e s i n E s c h e r i c h i a c o l i . J B a c t e r i a l 1 9 8 5 ; 1 6 1 : 1 0 8 6 - 1 0 9 2 H i r s c h b e r g C B , K e n n e d y E P . M e c h a n i s m o f t h e e n z y m a t i c s y n t h e s i s o f c a r d i o l i p i n i n E s c h e r i c h i a c o l i . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 9 7 2 ; 6 9 : 6 4 8 - 6 5 1 N i s h i j i m a S , A s a m i Y , U e t a k e N , Y a r n a g o e S , O h t a A , S h i b u y a I . D i s r u p t i o n o f t h e E s c h e r i c h i a c o l i c l s g e n e r e s p o n s i b l e f o r c a r d i o l i p i n s y n t h e s i s . J B a c t e r i a l 1 9 8 8 ; 1 7 0 : 7 7 5 - 7 8 0 Z h o n g Q , G o h i l V M , M a L , G r e e n b e r g M L . J o u r n a l o f B i o l o g i c a l C h e m i s t r y 2 0 0 4 ; 2 7 9 : 3 2 2 9 4 - 3 2 3 0 0 R u s s e l l N J , H a r w o o d J L . C h a n g e s i n t h e a c y l l i p i d c o m p o s i t i o n o f p h o t o s y n t h e t i c b a c t e r i a g r o w n u n d e r p h o t o s y n t h e t i c a n d n o n - p h o t o s y n t h e t i c c o n d i t i o n s . B i o c h e m J 1 9 7 9 ; 1 8 1 : 3 3 9 - 3 4 5 C a t u c c i L , D e p a l o N , L a t t a n z i o V M T , A g o s t i a n o A , C o r c e l l i A . N e o s y n t h e s i s o f c a r d i o l i p i n i n R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s u n d e r o s m o t i c s t r e s s . B i o c h e m i s t r y 2 0 0 4 ; 4 3 : 1 5 0 6 6 - 1 5 0 7 2 L o l l B , K e r n J , S a e n g e r W , Z o u n i A , B i e s i a d k a J . T o w a r d s c o m p l e t e c o f a c t o r a r r a n g e m e n t i n t h e 3 . 0 A r e s o l u t i o n s t r u c t u r e o f p h o t o s y s t e m 1 1 N a t u r e 2 0 0 5 ; 4 3 8 : 1 0 4 0 - 1 0 4 4 J o n e s M R . L i p i d s i n p h o t o s y n t h e t i c r e a c t i o n c e n t r e s : S t r u c t u r a l r o l e s a n d f u n c t i o n a l h o l e s . P r o g r e s s i n L i p i d R e s e a r c h 2 0 0 7 ; 4 6 : 5 6 - 8 7 H u n t e C . S p e c i fi c p r o t e i n - l i p i d i n t e r a c t i o n s i n m e m b r a n e p r o t e i n s . B i o c h e m S o c T r a n s 2 0 0 5 ; 3 3 : 9 3 8 - 9 4 2 4 9 4 3 3 8 . L a i b l e P D , S c o t t H N , H e n r y L , H a n s o n D K . T o w a r d s h i g h e r - t h r o u g h p u t m e m b r a n e p r o t e i n p r o d u c t i o n f o r s t r u c t u r a l g e n o m i c s i n i t i a t i v e s . J S t r u c t F u n c t G e n o m i c s 2 0 0 4 ; 5 : 1 6 7 - 1 7 2 3 3 9 . C r o n a n J E . B a c t e r i a l m e m b r a n e l i p i d s : W h e r e d o w e s t a n d ? A n n u R e v M i c r o b i a l 2 0 0 3 ; 5 7 : 2 0 3 - 2 2 4 4 9 5 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I l I l l l l u l l l u l l l l l l l l u m l l l l l l n l r