“ , m m 2 . . . I 6 9 t u . . s 1 . fi 1 : : ‘ . . 1 . . Q “ . 1 . 5 . . i 5 . z s ! 7 w . a 4 1 o w N m r 1 l . i “ . m t 2 i a 5 \ d . ! 5 D . m 1 i } . : I “ fl . v u w 9 V b . r 1 ‘ . : ‘ . ‘ . . fl u H 3 \ u i . a . £ a . u $ . h . h . b « . O 5 u . r . L } i . t . v . “ “ 2 S « m m V ! fi . . . : n 1 1 5 i t \ j 7 - 5 “ . . o 4 $ t | ~ k . . . m K . . . m . . . n : } 1 i I V 9 i . k 2 n i . ” 0 x i - : . . . n g . % 5 . . 1 g 9 t . 2 y u b fi n . . fi . “ h w t i w é . . . h . u € . l \ . fl v fi . . r ‘ | " ‘ . . . z . x . 3 3 . . . 2 ~ ! . . . 2 . r L ¢ t ! ! - ” a n . . . ‘ u l r n . . . I } . 5 . . . . . . E t fi fi fi i h v i 6 . . . . . . “ s t . . . . . . . . . . . . t i c k e r i 1 . . . . . . & . . h c i . . . . h 4 . . l e m u fl q u . 5 “ . . . 5 3 : . . . . 0 9 . . . 4 6 . $ . 4 4 . m . i L I B R A R Y v . 1 M i c h i g a n S t a t e ~ U n i v e r s i t y T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d I D E N T I F I C A T I O N O F G E N E S I N V O L V E D I N T U M O R I G E N E S I S T H A T A R E D E R E G U L A T E D , W I T H A N E M P H A S I S O N A L T E R E D D N A M E T H Y L A T I O N p r e s e n t e d b y J E N N I F E R M A R I E P H I L L I P S h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e D O C T O R A L d e g r e e i n B I O C H E M I S T R Y A N D M O L E C U L A R B I O L O G Y 7 / ! M a j o r P r o f e s s o r ’ s S i g n a t u r e 6 / Z ‘ 3 / a ‘ 7 D a t e M S U i s a n A f fi r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y I n s t i t u t i o n P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T o A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 5 / 0 8 K : l P r o j / A o c & P r e s / C I R C I D a t e D m . i n d d I D E N T I F I C A T I O N O F G E N E S I N V O L V E D I N T U M O R I G E N E S I S T H A T A R E D E R E G U L A T E D , W I T H A N E M P H A S I S O N A L T E R E D D N A M E T H Y L A T I O N V O L U M E 1 B y J e n n i f e r M a r i e P h i l l i p s A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y I n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y 2 0 0 9 A B S T R A C T I D E N T I F I C A T I O N O F G E N E S I N V O L V E D I N T U M O R I G E N E S I S T H A T A R E D E R E G U L A T E D , W I T H A N E M P H A S I S O N A L T E R E D D N A M E T H Y L A T I O N B y J e n n i f e r M a r i e P h i l l i p s E p i g e n e t i c m o d i fi c a t i o n s , i n c l u d i n g D N A m e t h y l a t i o n , c a u s e h e r i t a b l e a l t e r a t i o n s i n g e n e e x p r e s s i o n v i a m e c h a n i s m s t h a t d o n o t a f f e c t t h e b a s e s e q u e n c e o f D N A . V a r i a t i o n s i n l e v e l s o f m e t h y l a t i o n ( i . e . 5 - m e t h y l c y t o s i n e ) a r e r e s p o n s i b l e f o r t r a n s c r i p t i o n a l c h a n g e s t h a t o c c u r d u r i n g n o r m a l d e v e l o p m e n t , a s w e l l a s d i s e a s e s t a t e s , i n c l u d i n g c a n c e r . T u m o r i g e n e s i s i s a m u l t i s t e p p r o c e s s t h a t i s c o m p r i s e d o f 3 e x p e r i m e n t a l l y - d e fi n e d s t a g e s : i n i t i a t i o n , p r o m o t i o n , a n d p r o g r e s s i o n . E p i g e n e t i c m e c h a n i s m s s u c h a s D N A m e t h y l a t i o n , p l u s m u t a t i o n s , c a n b e k e y c o n t r i b u t o r s t o e a c h p h a s e . T h e s e c h a n g e s f a c i l i t a t e t h e p r o g r e s s i v e c l o n a l e x p a n s i o n o f a b e r r a n t s u b p o p u l a t i o n s t h a t p o s s e s s g r o w t h a d v a n t a g e s , w h i c h u l t i m a t e l y r e s u l t s i n t h e d e v e l o p m e n t o f f r a n k t u m o r s . T h e o v e r a l l g o a l o f t h i s d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h w a s t o e l u c i d a t e p r o g r e s s i v e c h a n g e s , i n e x p r e s s i o n a n d D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s , o f g e n e s w h i c h p l a y k e y r o l e s i n l i v e r t u m o r i g e n e s i s i n d u c e d b y t h e n o n g e n o t o x i c h e p a t o c a r c i n o g e n p h e n o b a r b i t a l ( P B ) , w i t h a n e m p h a s i s o n t h e i r p o t e n t i a l t o a f f e c t s i g n a l i n g t h r o u g h c r i t i c a l p a t h w a y s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f c e l l g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n . M y h y p o t h e s i s s t a t e s t h a t g e n e s w h i c h a r e d e r e g u l a t e d u n i q u e l y i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e , a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t m i c e , a r e a m o n g t h o s e t h a t a r e m e c h a n i s t i c a l l y i m p o r t a n t f o r t u m o r i g e n e s i s . T w o d i s t i n c t m o d e l s y s t e m s , r e p r e s e n t i n g a c o n t i n u u m o f t r e a t m e n t , w e r e u t i l i z e d i n c o m b i n a t i o n t o e v a l u a t e P B - e l i c i t e d a l t e r a t i o n s t h a t a r o s e u n i q u e l y i n t h e s u s c e p t i b l e m i c e . G e n e s w e r e i d e n t i fi e d t h a t e x h i b i t e d u n i q u e a l t e r e d m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n s t a t u s e s i n 1 ) B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , a t 2 a n d / o r 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t , a n d 2 ) p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r t i s s u e fi o m c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) w i l d t y p e ( W T ) m i c e , a s c o m p a r e d t o l i v e r t i s s u e f r o m P B - t r e a t e d r e s i s t a n t C A R k n o c k o u t ( K O ) m i c e . N o t a b l y , m a n y o f t h e g e n e s a r e i n v o l v e d i n p a t h w a y s a n d p r o c e s s e s t h a t c a n c o n t r o l m a l i g n a n t g r t h ( e . g . , c e l l c y c l e , a p o p t o s i s , a n g i o g e n e s i s , i n v a s i o n / m e t a s t a s i s , e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n , p l u s t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - B a n d W n t s i g n a l i n g ) . T h e p r o g r e s s i v e n a t u r e o f c a r c i n o g e n e s i s i s d e m o n s t r a t e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n o r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s w e r e d i s r u p t e d a t 2 a n d / o r 4 w e e k s r e m a i n e d d e r e g u l a t e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r t i s s u e . U n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e s o f D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) g e n e s i n t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 a n d C A R W T m i c e , p l u s t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e y h a r b o r C A R r e s p o n s e e l e m e n t s ( C A R E S ) , s u g g e s t a p o t e n t i a l d i r e c t l i n k b e t w e e n P B a n d a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n . C A R E S w i t h i n n u m e r o u s a d d i t i o n a l g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n a n d / o r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y , i s e v i d e n c e o f t h e p o s s i b l e fi m c t i o n s o f C A R d u r i n g t u m o r d e v e l o p m e n t . S i g n i fi c a n t l y , c a n d i d a t e g e n e s f o r “ fi n g e r p r i n t s ” o f e a r l y a n d l a t e t i m e s o f P B t r e a t m e n t , i n c l u d i n g t u m o r s , a r e p r o p o s e d . M y d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h c u l m i n a t e d i n t h e i d e n t i fi c a t i o n o f g e n e s t h a t , b y v i r t u e o f t h e i r u n i q u e d e r e g u l a t i o n i n t u m o r — p r o n e , a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t m i c e , c o u l d c o n t r i b u t e t o t u m o r i g e n e s i s . C o l l e c t i v e l y , t h e s e d a t a p r o v i d e n o v e l i n s i g h t i n t o a d e t a i l e d p i c t u r e o f D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s t h a t f a c i l i t a t e P B - i n d u c e d h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . T h i s t h e s i s i s d e d i c a t e d t o m y a d o r a b l e h u s b a n d M a r k A n t h o n y W a s i l i v A C K N O W L E D G E M E N T S F i r s t a n d f o r e m o s t , I t h a n k G o d , b e c a u s e e v e r y t h i n g t h a t I a c c o m p l i s h i n m y l i f e i s a t t r i b u t a b l e t o H i m . “ W h e n s o m e o n e h a s b e e n g i v e n m u c h , m u c h w i l l b e r e q u i r e d i n r e t u r n ” ( L u k e 1 2 : 4 8 ) . M y f a m i l y h a s b e e n a c o n t i n u o u s s o u r c e o f s t r e n g t h a n d m o t i v a t i o n . I t h a n k m y m o t h e r , B e t h K r o s s e , a n d m y f a t h e r , K e n n e t h P h i l l i p s , w h o i n s t i l l e d i n m e t h e b e l i e f t h a t I c a n a c h i e v e a n y t h i n g t h a t I d r e a m o f , a n d w h o h a v e c o n t i n u a l l y g u i d e d m e w i t h t h e i r w i s e a d v i c e ; m y b r o t h e r s , D o u g l a s a n d G e o f f r e y P h i l l i p s , w h o , b y f o l l o w i n g t h e i r d r e a m s , h a v e i n s p i r e d m e t o p u r s u e m i n e , a n d w h o h a v e c o n s t a n t l y r e m i n d e d m e t h a t I s t o l e l i v e r s f r o m m i c e t h a t w e r e o n c e a l i v e © ; a n d , o f c o u r s e , m y a m a z i n g h u s b a n d ( a k a P u n s ) f o r b e l i e v i n g i n m e , f o r g i v i n g m e h o p e , c o n fi d e n c e , a n d c o u n s e l w h e n a l l s e e m e d l o s t , a n d m o s t i m p o r t a n t l y , f o r h e l p i n g m e t o k e e p l i f e i n p e r s p e c t i v e . I c o u l d n o t h a v e fi n i s h e d t h i s d i s s e r t a t i o n w i t h o u t t h e m , a n d o t h e r f a m i l y m e m b e r s a n d f r i e n d s w h o h a v e s u p p o r t e d m e d u r i n g m y t i m e h e r e . I t h a n k t h e f o l l o w i n g p e o p l e , w h o h a v e c o l l e c t i v e l y t a u g h t m e t h a t “ n o g r a d u a t e s t u d e n t i s a n i s l a n d ” : m y p r o f e s s o r s a t O h i o W e s l e y a n U n i v e r s i t y , D r s . G o l d s t e i n a n d T u h e l a - R e u n i n g , p l u s M r s . I c h i d a , f o r f o s t e r i n g m y i n t e r e s t i n s c i e n c e ; D r . A m m i e B a c h m a n , f o r b e i n g a g r e a t p r o f e s s i o n a l r o l e m o d e l a n d a n e v e n b e t t e r f r i e n d ; E m i l y F l y n n , f o r g i v i n g m e a c h a n c e i n G 1 0 2 ; D i m a A l k a w w a s , f o r h e r v i s i t s t o B - 4 2 3 ; L a u r e n M i c h a l s k i , f o r k e e p i n g t h i n g s fi m ; E m i l y E c k e n r o d e , f o r h e r a s s i s t a n c e i n t h e l a b ; E m i l y M c C l u r e , f o r h e r i n d u l g e n c e d u r i n g R T - P C R ; R T S F ( A n n e t t e T h e l e n ) , f o r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e ; C I T / B I T S , f o r s t i p e n d a n d t r a v e l s u p p o r t ; D r s . D a v i d J . D o o l i t t l e a n d G e o f f r e y M . C u r t i n , f o r t h e o p p o r t u n i t y t o c o l l a b o r a t e w i t h R J R T C o . ; D r . D a v i d F o r a n , f o r t h e c h a n c e t o d a b b l e i n F o r e n s i c S c i e n c e ; m y c o m m i t t e e m e m b e r s , D r s . A m o s t i , D e W i t t , K u o , a n d L a P r e s , f o r t h e i r s c i e n t i fi c i n s i g h t a n d a d v i c e ; a n d fi n a l l y , D r . J a y G o o d m a n , f o r t h e o p p o r t u n i t y t o w o r k i n h i s l a b o r a t o r y . G O S P A R T Y ! T A B L E O F C O N T E N T S P A G E L I S T O F T A B L E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i x L I S T O F F I G U R E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i i I N T R O D U C T I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 L i v e r C a n c e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l M u l t i s t a g e C a r c i n o g e n e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 T h e O r i g i n o f t h e C a n c e r S t e m C e l l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 F u n d a m e n t a l C h a r a c t e r i s t i c s o f a C a n c e r C e l l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 C e l l - C e l l I n t e r a c t i o n s i n C a n c e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 5 - M e t h y l c y t o s i n e D i s t r i b u t i o n a n d A b u n d a n c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 R e g u l a t i o n o f D N A M e t h y l a t i o n P a t t e r n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 D N A M e t h y l t r a n s f e r a s e E n z y m e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 D N A D e m e t h y l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 T r a n s c r i p t i o n a l R e g u l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 D N A M e t h y l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 D N A M e t h y l a t i o n a n d C h r o m a t i n A l t e r a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 R o l e s o f D N A M e t h y l a t i o n i n N o r m a l P h y s i o l o g y . . . . . . . . . . 2 6 R o l e s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n i n C a n c e r 2 9 H y p o m e t h y l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 l H y p e r m e t h y l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 E a r l y D N A M e t h y l a t i o n C h a n g e s F a c i l i t a t e T u m o r i g e n e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 R o d e n t M o d e l s o f L i v e r T u m o r i g e n e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 B 6 C 3 F l a n d C 5 7 B L / 6 M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 C A R W i l d t y p e a n d K n o c k o u t M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 O H y p o t h e s i s a n d O b j e c t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 5 S p e c i fi c A i m s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 9 R e f e r e n c e s f o r t h e I n t r o d u c t i o n , S u m m a r y , a n d D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 C H A P T E R 1 — I d e n t i fi c a t i o n o f G e n e s t h a t M a y P l a y C r i t i c a l R o l e s i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d L i v e r T u m o r i g e n e s i s D u e t o A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 8 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 5 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 9 A c k n o w l e d g e m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 A P P E N D I X I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 4 R e f e r e n c e s l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 1 R e f e r e n c e s 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 7 v i C H A P T E R 2 — P h e n o b a r b i t a l ( P B ) E l i c i t s U n i q u e , E a r l y C h a n g e s i n t h e E x p r e s s i o n o f H e p a t i c G e n e s t h a t A f f e c t C r i t i c a l P a t h w a y s i n T u m o r - P r o n e B 6 C 3 F 1 M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . l l 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 6 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 6 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 3 A c k n o w l e d g e m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 3 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 3 A P P E N D D ( I I : R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 9 C H A P T E R 3 — O r p h a n N u c l e a r R e c e p t o r C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) - M e d i a t e d A l t e r a t i o n s i n D N A M e t h y l a t i o n D u r i n g P h e n o b a r b i t a l ( P B ) P r o m o t i o n o f L i v e r T u m o r i g e n e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 7 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 8 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 9 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 3 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 0 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 3 A c k n o w l e d g e m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 9 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 9 A P P E N D I X I I I : R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 3 C H A P T E R 4 — M u l t i p l e G e n e s E x h i b i t P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) - M e d i a t e d D N A M e t h y l a t i o n C h a n g e s D u r i n g L i v e r T u m o r i g e n e s i s a n d i n L i v e r T u m o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 0 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 1 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 7 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 5 D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 7 A c k n o w l e d g e m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 5 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 5 A P P E N D I X I V : R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 0 C H A P T E R 5 — T h e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) F a c i l i t a t e s U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - I n d u c e d E x p r e s s i o n C h a n g e s o f G e n e s I n v o l v e d i n K e y P a t h w a y s i n P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d L i v e r T u m o r s . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 1 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 2 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 7 R e s u l t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 0 v i i D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 1 A c k n o w l e d g e m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 0 R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 0 A P P E N D I X V : R e s u l t s 3 3 5 S U M M A R Y : S p e c i fi c A i m s A d d r e s s e d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 8 D I S C U S S I O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 9 S i g n i fi c a n c e o f R e s e a r c h 1 . T h e u s e o f t w o m o d e l s y s t e m s ( e a c h c o n s i s t i n g o f a g r o u p o f l i v e r t u m o r - p r o n e a n d t u m o r - r e s i s t a n t m i c e ) t o e l u c i d a t e u n i q u e m o l e c u l a r a l t e r a t i o n s i n t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e , a c r o s s a c o n t i n u u m o f P B t r e a t m e n t , i s a n e x t r e m e l y e f f e c t i v e a p p r o a c h f o r a s s e s s i n g c h a n g e s w h i c h a r e c r i t i c a l f o r t u m o r d e v e l o p m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 9 2 . B o t h i n c r e a s e s a n d d e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n r e p r e s e n t k e y e v e n t s t h a t o c c u r d u r i n g t u m o r d e v e l o p m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 1 3 . U n i q u e l y a l t e r e d g e n e s , a n d c a n c e r - r e l a t e d p a t h w a y s / p r o c e s s e s i n w h i c h t h e y a r e i n v o l v e d , w e r e d i s c e r n e d i n P B - t r e a t e d l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 3 4 . A l t e r e d e x p r e s s i o n o f D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s , i n a d d i t i o n t o g e n e s i n v o l v e d i n l - c a r b o n m e t a b o l i s m , c o u l d r e p r e s e n t m e c h a n i s m s b y w h i c h u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s f o r m e d i n l i v e r - t u m o r s u s c e p t i b l e 5 . E v i d e n c e s u p p o r t s t h e r o l e o f C A R i n m e d i a t i n g g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s t h a t o c c u r i n r e s p o n s e t o P B t r e a t m e n t , a t b o t h e a r l y a n d l a t e r t i m e p o i n t s , w h i c h m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e c a r c i n o g e n e s i s p r o c e s s . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 8 C o n c l u s i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 1 L I S T O F R E F E R E N C E S U S E D I N I N T R O D U C T I O N A N D D I S C U S S I O N . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 v i i i L I S T O F T A B L E S T a b l e 1 . 1 P C R P r o d u c t s R e p r e s e n t i n g U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s i n L i v e r T u m o r - S e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 , a s C o m p a r e d t o R e l a t i v e l y R e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , M i c e w e r e C l o n e d a n d S u b j e c t e d t o B L A S T - l i k e A l i g n m e n t T o o l ( B L A T ) S e a r c h e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 T a b l e 2 . 1 Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f E x p r e s s i o n o f 3 D N A M e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) G e n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 9 T a b l e 2 . 2 E x p r e s s i o n o f G e n e s t h a t C o n t a i n P u t a t i v e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r R e s p o n s e E l e m e n t s ( C A R E S ) . . . . . . . . . 1 4 1 T a b l e 2 . 3 G e n e s E n c o d i n g D r u g - M e t a b o l i z i n g E n z y m e s t h a t w e r e I d e n t i fi e d a s U n i q u e l y A c t i v e i n B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 3 T a b l e 2 . 4 : Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f t h e E x p r e s s i o n o f 1 8 G e n e s t h a t w e r e U n i q u e l y A c t i v e i n L i v e r s o f B 6 C 3 F 1 M i c e a t 2 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 4 T a b l e 2 . 5 Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T — P C R ) A n a l y s i s o f t h e E x p r e s s i o n o f 1 1 G e n e s t h a t w e r e U n i q u e l y A c t i v e i n L i v e r s o f B 6 C 3 F l M i c e a t 4 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t . . . . . . . . . . 1 6 6 T a b l e 2 . 6 C o n n e c t i o n s B e t w e e n 5 C a n c e r - r e l a t e d P r o c e s s e s a n d G e n e s , I n c l u d i n g t h o s e w h i c h C a r r i e d F o r w a r d , t h a t w e r e U n i q u e l y A c t i v e i n B 6 C 3 F 1 M i c e F o l l o w i n g T r e a t m e n t w i t h P h e n o b a r b i t a l ( P B ) f o r 2 W e e k s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 8 T a b l e 2 . 7 C o n n e c t i o n s B e t w e e n 5 C a n c e r - r e l a t e d P r o c e s s e s a n d G e n e s , I n c l u d i n g t h o s e w h i c h C a r r i e d F o r w a r d , t h a t w e r e U n i q u e l y A c t i v e i n B 6 C 3 F 1 M i c e F o l l o w i n g T r e a t m e n t w i t h P h e n o b a r b i t a l ( P B ) f o r 4 W e e k s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 0 T a b l e 2 . 8 K i n a s e , P h o s p h a t a s e , P h o s p h a t a s e A c t i v a t o r ( R e g u l a t o r y S u b u n i t ) , a n d P h o s p h a t a s e R e g u l a t o r y ( I n h i b i t o r ) G e n e s I d e n t i fi e d a s U n i q u e l y A c t i v e i n L i v e r T u m o r - S u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 2 T a b l e 2 . 9 Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f G e n e s w h i c h E x h i b i t e d U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n L i v e r T u m o r - S u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 3 T a b l e 3 . 1 G C - r i c h R e g i o n s o f A l t e r e d M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n t h e L i v e r s o f C 3 H / H e C A R W T a n d K O M i c e T r e a t e d w i t h 0 . 0 5 % P h e n o b a r b i t a l f o r 2 3 o r 3 2 W e e k s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 1 T a b l e 4 . 1 G e n e s a n d G e n o m i c R e g i o n s I d e n t i fi e d f r o m U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s i n C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e i x ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r ) , a s C o m p a r e d t o R e s i s t a n t P B - T r e a t e d K n o c k o u t M i c e , w e r e C l o n e d a n d S u b j e c t e d t o B L A S T - l i k e A l i g n m e n t T o o l ( B L A T ) S e a r c h e s . . . . . . . . . . . . 2 3 6 T a b l e 4 . 2 G e n e s I d e n t i fi e d f r o m U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s i n C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r ) , a s C o m p a r e d t o R e s i s t a n t C A R K n o c k o u t M i c e , a n d t h e i r P o t e n t i a l F u n c t i o n a l S i g n i fi c a n c e i n T u m o r i g e n e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 1 T a b l e 4 . 3 G e n e s I d e n t i fi e d f r o m I d e n t i c a l , U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s t h a t F o r m e d i n B o t h C A R W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r ) a n d B 6 C 3 F ] ( 2 a n d / o r 4 W e e k T r e a t e d ) M 1 c e 2 5 3 T a b l e 4 . 4 I d e n t i c a l U n c h a r a c t e r i z e d G e n o m i c R e g i o n s I d e n t i fi e d f r o m I d e n t i c a l , U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s t h a t F o r m e d i n B o t h C 3 H / H e C A R W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r s ) a n d B 6 C 3 F l ( 2 a n d / o r 4 W e e k T r e a t e d L i v e r T i s s u e ) M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 9 T a b l e 5 . 1 Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f t h e E x p r e s s i o n o f 3 D N A M e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) G e n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 4 T a b l e 5 . 2 E x p r e s s i o n o f G e n e s t h a t C o n t a i n P u t a t i v e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r R e s p o n s e E l e m e n t s ( C A R E S ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 6 T a b l e 5 . 3 Q u a n t i t a t i v e R e a l - T i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f E x p r e s s i o n o f 3 D N A M e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) G e n e s i n 2 T y p e s o f L i v e r T u m o r - S u s c e p t i b l e M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 9 T a b l e 5 . 4 Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f t h e E x p r e s s i o n o f 2 2 G e n e s t h a t w e r e U n i q u e l y A c t i v e i n P r e c a n c e r o u s L i v e r T i s s u e a n d / o r I n d i v i d u a l L i v e r T u m o r 3 3 3 9 T a b l e 5 . 5 K i n a s e , P h o s p h a t a s e , a n d P h o s p h a t a s e R e g u l a t o r y ( I n h i b i t o r ) S u b u n i t G e n e s I d e n t i fi e d a s U n i q u e l y A c t i v e i n P r e c a n c e r o u s L i v e r T i s s u e a n d / o r I n d i v i d u a l L i v e r T u m o r s 3 4 1 T a b l e 5 . 6 Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - - P C R ) A n a l y s i s o f E x p r e s s i o n o f G e n e s T h a t E x h i b i t e d U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) ; - i n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) . . . . 3 4 3 T a b l e 5 . 7 Q u a n t i t a t i v e R e a l - T i m e P C R A n a l y s i s ( q R T - P C R ) o f E x p r e s s i o n o f G e n e s I d e n t i fi e d f r o m I d e n t i c a l , U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n 2 T y p e s o f L i v e r T u m o r - P r o n e M i c e . . . 3 4 6 T _ a _ b _ _ _ l e 6 . 1 E x p r e s s i o n o f G e n e s I d e n t i fi e d f r o m I d e n t i c a l P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R e g i o n s w o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t l o n ( R A M s ) 1 n 2 W T y p e s o f L i v e r T u m o r - P r o n e M i c e " . . . . . . . 3 5 6 T a b l e 6 . 2 G e n e s E x h i b i t i n g A l t e r e d E x p r e s s i o n a t E a r l y a n d L a t e T i m e s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 7 T a b l e 6 . 3 C o m m o n S i g n a l i n g P a t h w a y s a n d C e l l u l a r P r o c e s s e s I n v o l v i n g G e n e s t h a t E x h i b i t e d M e t h y l a t i o n a n d / o r E x p r e s s i o n C h a n g e s i n 2 T y p e s o f L i v e r - T u m o r P r o n e M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 8 x i L I S T O F F I G U R E S F i g u r e 1 . 1 M u l t i s t a g e C a r c i n o g e n e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 F i g u r e 1 . 2 D N A M e t h y l a t i o n , a H e r i t a b l e E p i g e n e t i c A l t e r a t i o n . . . . . . . . . . . 1 5 F i g g e 1 . 3 D N A m e t h y l a t i o n i s A f f e c t e d b y M u l t i p l e F a c t o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 F i g u r e 1 . 4 D N A M e t h y l a t i o n a n d 1 - C a r b o n M e t a b o l i s m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 F i g u r e 1 . 5 T h e F u n c t i o n s o f D N A M e t h y l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 F i g g e 1 . 6 A c t i v a t i o n o f t h e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3 F i g u r e 1 . 7 U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) t h a t F o r m e d i n t h e L i v e r s o f B 6 C 3 F 1 M i c e i n R e s p o n s e t o 2 o r 4 W e e k s o f T r e a t m e n t w i t h 0 . 0 5 % ( w / w ) P h e n o b a r b i t a l ( P B ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 6 F i g u r e 1 . 8 A S c h e m e t o C l a s s i f y C l o n e d P C R P r o d u c t s t h a t R e p r e s e n t U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d B 6 C 3 F l R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M S ) B a s e d o n t h e i r L o c a t i o n s W i t h i n t h e M o u s e G e n o m e a s D e t e r m i n e d b y B L A S T - l i k e S e q u e n c e A l i g n m e n t T o o l ( B L A T ) S e a r c h e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 3 F i g u _ r e 1 . 9 C o m m o n C e l l u l a r T a r g e t s o f G e n e s t h a t R e p r e s e n t R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n L i v e r T u m o r - S u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] M i c e a t 4 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t . . 7 8 F i g u r e 1 . 1 0 T h e P o s s i b l e F u n c t i o n a l S i g n i fi c a n c e , R e g a r d i n g T u m o r i g e n e s i s , o f S e l e c t e d G e n e s w h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n t h e B 6 C 3 F ] M o u s e F o l l o w i n g T r e a t m e n t w i t h P h e n o b a r b i t a l ( P B ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 2 F i g u r e 1 . 1 1 T h e D i s t r i b u t i o n o f G e n o m i c L o c a t i o n s t o W h i c h t h e P C R p r o d u c t s R e p r e s e n t i n g P B - i n d u c e d U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n B 6 C 3 F 1 M i c e A l i g n e d . . . . . 9 . 4 x i i F i g g e 1 . 1 2 T h e D i s t r i b u t i o n o f C h r o m o s o m e s W i t h i n t h e M o u s e G e n o m e t o W h i c h t h e P C R P r o d u c t s R e p r e s e n t i n g P B - i n d u c e d U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) 1 n B 6 C 3 F 1 M i c e A l i g n e d . 9 5 F i g u r e 1 . 1 3 F u n c t i o n a l B r e a k d o w n o f t h e P C R P r o d u c t s t h a t R e p r e s e n t U n i q u e P B - i n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n B 6 C 3 F 1 M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 6 F i g u _ r e 1 . 1 4 I n f o r m a t i c s A n a l y s i s o f R a ] G u a n i n e N u c l e o t i d e D i s s o c i a t i o n S t i m u l a t o r ( R a l g d s ) , a P o t e n t i a l O n c o g e n e t h a t I S U n i q u e l y H y p o m e t h y l a t e d i n B 6 C 3 F 1 M i c e a t 4 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t ” . . 9 7 F i g u r e 1 . 1 5 I n f o r m a t i c s A n a l y s i s o f T r a n s f o r m i n g G r o w t h F a c t o r B e t a R e c e p t o r I I ( T g f e r ) , a P o t e n t i a l O n c o g e n e t h a t i s U n i q u e l y H y p o m e t h y l a t e d i n B 6 C 3 F l M i c e a t 4 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 8 F i g u r e 1 . 1 6 C o m m o n C e l l u l a r R e g u l a t o r s o f G e n e s t h a t R e p r e s e n t U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) 1 n B 6 C 3 F 1 M i c e a t 4 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . 9 9 F i g u r e 1 . 1 7 T h e P o s s i b l e F u n c t i o n a l S i g n i fi c a n c e , R e g a r d i n g T u m o r i g e n e s i s , o f S e l e c t e d G e n e s W h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n t h e B 6 C 3 F 1 M o u s e F o l l o w i n g T r e a t m e n t w i t h P h e n o b a r b i t a l ( P B ) , I n c l u d i n g R e f e r e n c e s . . . . . . . . . . . . . 1 0 0 F i g u r e 2 . 1 I d e n t i fi c a t i o n o f U n i q u e l y A c t i v e G e n e s i n T u m o r — S u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 M i c e , a s C o m p a r e d t o t h e R e l a t i v e l y R e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , a t 2 o r 4 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t 1 2 7 F i g g e 2 . 2 T h e E x p r e s s i o n a n d / o r M e t h y l a t i o n S t a t u s e s o f G e n e s I n v o l v e d i n t h e C e l l C y c l e , A p o p t o s i s , a n d M i t o g e n — A c t i v a t e d P r o t e i n K i n a s e ( M A P K ) S i g n a l i n g w e r e A l t e r e d b y P h e n o b a r b i t a l ( P B ) a t 2 a n d 4 W e e k s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 1 F i g u r e 2 . 3 T h e E x p r e s s i o n a n d / o r M e t h y l a t i o n S t a t u s e s o f G e n e s I n v o l v e d i n A n g i o g e n e s i s a n d t h e E p i t h e l i a l - - M e s e n c h y m a l C e l l T r a n s i t i o n ( E M T ) w e r e A l t e r e d b y P h e n o b a r b i t a l ( P B ) a t 2 a n d 4 W e e k s . 1 3 4 F i g g e 2 . 4 T h e E x p r e s s i o n o f G e n e s I n v o l v e d i n E p i g e n e t i c - R e l a t e d P r o c e s s e s , a n d T h o s e t h a t a r e I n d i c a t i v e o f N u c l e a r R e c e p t o r A c t i v a t i o n , w a s A l t e r e d b y P h e n o b a r b i t a l ( P B ) a t 2 a n d 4 W e e k s . . . . . . . . . . . . . . 1 3 6 x i i i F i g u r e 2 . 5 S u m m a r y o f P a t h w a y s a n d P r o c e s s e s I n v o l v i n g G e n e s t h a t E x h i b i t e d U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - E l i c i t e d E x p r e s s i o n a n d / o r M e t h y l a t i o n C h a n g e s a t 2 a n d / o r 4 W e e k s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 4 F ' g g e 2 . 6 P r i n c i p l e C o m p o n e n t A n a l y s i s ( P C A ) o f G e n e E x p r e s s i o n P a t t e r n s o f I n d i v i d u a l B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 M i c e w i t h i n C o n t r o l a n d P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - t r e a t e d G r o u p s a t 2 a n d 4 W e e k s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 0 F i g g e 2 . 7 D i s t r i b u t i o n o f G e n e E x p r e s s i o n D a t a G e n e r a t e d f r o m I n d i v i d u a l B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B U 6 M i c e w i t h i n C o n t r o l a n d P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - t r e a t e d G r o u p s a t 2 a n d 4 W e e k s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 1 F ' g g e 2 . 8 A S c h e m e t o C l a s s i f y C l o n e d P C R P r o d u c t s t h a t R e p r e s e n t U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d B 6 C 3 F 1 R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) B a s e d o n t h e i r L o c a t i o n s W i t h i n t h e M o u s e G e n o m e a s D e t e r m i n e d b y B L A S T - l i k e S e q u e n c e A l i g n m e n t T o o l ( B L A T ) S e a r c h e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 2 F i g g e 3 . 1 I d e n t i fi c a t i o n o f P B - I n d u c e d U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n t h e P r e c a n c e r o u s a s C o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k P B - T r e a t e d T i s s u e . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 2 F i g u r e 3 . 2 P r o g r e s s i v e C h a n g e s i n M e t h y l a t i o n : P B - I n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d M e t h y l a t i o n ( R A M s ) w h i c h C a r r y F o r w a r d f r o m P r e c a n c e r o u s t o T u m o r T i s s u e i n C 3 H / H e C A R W T M l c e 1 9 5 F i g u r e 3 . 3 T o t a l U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d M e t h y l a t i o n ( R A M s ) T h a t O c c u r r e d a s a R e s u l t o f P B T r e a t m e n t i n t h e T u m o r a s C o m p a r e d t o t h e P r e c a n c e r o u s T i s s u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 7 F ' g u r e 3 . 4 A S u m m a r y o f R e g i o n s o f A l t e r e d M e t h y l a t i o n ( R A M s ) t h a t C a r r y F o r w a r d f r o m t h e P r e c a n c e r o u s t o t h e T u m o r T i s s u e a n d T o t a l U n i q u e R A M s i n t h e T u m o r T i s s u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 0 F ' g g e 3 . 5 D e t e r m i n a t i o n o f P e r c e n t D i s s i m i l a r i t y B e t w e e n P r e c a n c e r o u s v s . C A R W T , 2 3 w k C o n t r o l , T u m o r v s . C A R W T , 2 3 w k C o n t r o l , a n d C A R K O , 2 3 w k P B v s . C A R K O , 2 3 w k C o n t r o l T i s s u e 2 0 2 F ' g u r e 3 . 6 G C - R i c h R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n : C o m p a r i s o n o f D i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E M - I n i t i a t e d , 0 . 0 5 % P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - p r o m o t e d P r e c a n c e r o u s T i s s u e ( C A R W i l d t y p e , 2 3 w k D E N / P B ) t o C o n t r o l ( C A R W i l d t y p e , x i v 2 3 w k D E N ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 4 F i g u r e 3 . 7 G C - R i c h R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n : C o m p a r i s o n o f D i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E M - I n i t i a t e d , 0 . 0 5 % P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - p r o m o t e d T u m o r T i s s u e ( C A R W i l d t y p e , 3 2 w k D E N / P B ) t o C o n t r o l ( C A R W i l d t y p e , 2 3 w k D E N ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 6 F ' g g e 3 . 8 G C - R i c h R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n : C o m p a r i s o n o f D i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) - I n i t i a t e d , 0 . 0 5 % P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - p r o m o t e d C A R K n o c k o u t ( K O ) T i s s u e ( C A R K O , 2 3 w k D E N / P B ) t o C o n t r o l ( C A R K O , 2 3 w k D E N ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 8 F ‘ g u r e 4 . 1 C o m m o n T a r g e t s o f G e n e s I d e n t i fi e d f r o m U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d P r e c a n c e r o u s L i v e r T i s s u e f r o m C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 3 F i g g e 4 . 2 C o m m o n T a r g e t s o f G e n e s I d e n t i fi e d f r o m U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d L i v e r T u m o r T i s s u e f r o m C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 4 F i g g e 4 . 3 G e n e s w h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e a n d w h i c h a r e P o t e n t i a l l y I n v o l v e d i n t h e R e g u l a t i o n o f A n g i o g e n e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 6 F i g u r e 4 . 4 G e n e s w h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e a n d w h i c h a r e P o t e n t i a l l y I n v o l v e d i n t h e R e g u l a t i o n o f A p o p t o s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 7 F i g g e 4 . 5 G e n e s w h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e a n d w h i c h a r e P o t e n t i a l l y I n v o l v e d i n t h e R e g u l a t i o n o f E p i t h e l i a l - M e s e n c h y m a l C e l l T r a n s i t i o n ( E M T ) . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 8 F i g u _ r e 4 . 6 G e n e s w h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e a n d w h i c h a r e P o t e n t i a l l y I n v o l v e d i n t h e R e g u l a t i o n o f M i g r a t i o n , I n v a s i o n a n d / o r M e t a s t a s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 9 F i g t u e 4 . 7 G e n e s w h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e a n d w h i c h a r e P o t e n t i a l l y I n v o l v e d i n t h e R e g u l a t i o n o f G r o w t h / S u r v i v a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 0 X V I I . - I I I ! I I I ! ‘ 5 F l t - I l - ( I ' l l F ' g u r e 4 . 8 T h e D i s t r i b u t i o n o f G e n o m i c L o c a t i o n s o f t h e A n n o t a t e d ( I n c l u d i n g U n c h a r a c t e r i z e d R e g i o n s ) P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 1 F ' g u r e 4 . 9 T h e C h r o m o s o m a l D i s t r i b u t i o n o f t h e A n n o t a t e d ( I n c l u d i n g U n c h a r a c t e r i z e d R e g i o n s ) P h e n o b a r b i t a l ( P B ) — i n d u c e d U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 2 F ' g u r e 4 . 1 0 F u n c t i o n a l B r e a k d o w n o f t h e G e n e s I d e n t i fi e d f r o m U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 3 F ' g u r e 4 . 1 1 I n f o r m a t i c A n a l y s i s o f c - A b l O n c o g e n e 1 , R e c e p t o r T y r o s i n e K i n a s e ( A b l I ) W h i c h R e p r e s e n t s a U n i q u e C a r r y F o r w a r d H y p o m e t h y l a t e d R A M i n B o t h t h e P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 4 F i g u r e 4 . 1 2 C o m m o n R e g u l a t o r s o f G e n e s t h a t w e r e i d e n t i fi e d f r o m U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 5 F i g u r e 4 . 1 3 I n f o r m a t i c A n a l y s i s o f E p h r i n B Z ( E f n b 2 ) , a G e n e I d e n t i fi e d f r o m I d e n t i c a l , U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s t h a t F o r m e d i n B o t h C 3 H / H e C A R W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r s ) a n d B 6 C 3 F ] ( 2 a n d / o r 4 W e e k s ) M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 6 F i g g e 4 . 1 4 C o m m o n T a r g e t s o f G e n e s I d e n t i fi e d f r o m I d e n t i c a l , U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s t h a t F o r m e d i n B o t h C 3 H / H e C A R W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r s ) a n d B 6 C 3 F 1 ( 2 a n d / o r 4 W e e k s ) M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 7 F i g u r e 4 . 1 5 C o m m o n R e g u l a t o r o f G e n e s I d e n t i fi e d f r o m I d e n t i c a l , U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) — i n d u c e d R A M s t h a t F o r m e d i n B o t h C 3 H / H e C A R W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r s ) a n d B 6 C 3 F ] ( 2 a n d / o r 4 W e e k s ) M i c e . . . . . . . 2 7 8 F i g u r e 5 . 1 I d e n t i fi c a t i o n o f U n i q u e l y A c t i v e G e n e s i n P r e c a n c e r o u s L i v e r T i s s u e a n d / o r I n d i v i d u a l L i v e r T u m o r s , a s C o m p a r e d t o L i v e r T i s s u e f r o m T u m o r - R e s i s t a n t C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) K n o c k o u t ( K O ) M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 1 x v i F i g g e 5 . 2 T h e E x p r e s s i o n a n d / o r M e t h y l a t i o n S t a t u s e s o f G e n e s I n v o l v e d i n t h e C e l l C y c l e , A p o p t o s i s , a n d M i t o g e n - a c t i v a t e d P r o t e i n K i n a s e ( M A P K ) S i g n a l i n g w e r e A l t e r e d i n P r e c a n c e r o u s a n d T u m o r T i s s u e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 7 F ' g u r e 5 . 3 T h e E x p r e s s i o n a n d / o r M e t h y l a t i o n S t a t u s e s o f G e n e s I n v o l v e d i n A n g i o g e n e s i s , C y t o s k e l e t o n O r g a n i z a t i o n / D y n a m i c s , a n d A d h e s i o n w e r e A l t e r e d i n P r e c a n c e r o u s a n d T u m o r T i s s u e 3 0 9 F ' g u _ r e 5 . 4 T h e E x p r e s s i o n a n d / o r M e t h y l a t i o n S t a t u s e s o f G e n e s I n v o l v e d i n P a t h w a y s A s s o c i a t e d w i t h D e v e l o p m e n t a n d D i f f e r e n t i a t i o n w e r e A l t e r e d i n P r e c a n c e r o u s a n d T u m o r T i s s u e 3 1 2 F i g u r e 5 . 5 S u m m a r y o f S i g n a l i n g P a t h w a y s a n d P r o c e s s e s I n v o l v i n g G e n e s t h a t E x h i b i t e d U n i q u e E x p r e s s i o n a n d / o r M e t h y l a t i o n C h a n g e s i n P r e c a n c e r o u s a n d T u m o r T l s s u e 3 2 3 F i g u r e 5 . 6 P r i n c i p l e C o m p o n e n t A n a l y s i s ( P C A ) o f G e n e E x p r e s s i o n P a t t e r n s E x h i b i t e d i n T i s s u e S a m p l e s f r o m C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e ( W T ) a n d K n o c k o u t ( K O ) M i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 6 F i g u r e 5 . 7 D i s t r i b u t i o n o f M i c r o a r r a y D a t a t h a t w e r e G e n e r a t e d u s i n g R N A I s o l a t e d f r o m C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e ( W T ) a n d K n o c k o u t ( K O ) M o u s e T i s s u e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 7 F ' g u r e 5 . 8 I d e n t i fi c a t i o n o f U n i q u e l y A c t i v e G e n e s i n P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r I n d i v i d u a l L i v e r T u m o r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 8 x v i i I N T R O D U C T I O N L i v e r C a n c e r L i v e r c a n c e r r e p r e s e n t s a g r o u p o f h i s t o p a t h o l o g i c a l l y d i v e r s e n e o p l a s m s , i n c l u d i n g b i l e d u c t c y s t a d e n o c a r c i n o m a , e p i t h e l i o d h a e m a n g i o e n d o t h e l i o m a , h a e m a n g i o s a r c o m a , h e p a t o b l a s t o m a , h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a ( H C C ) , a n d i n t r a h e p a t i c b i l e d u c t c a r c i n o m a ( c h o l a n g i o c a r c i n o m a ) ( A n t h o n y 2 0 0 2 ) . H C C i s t h e m o s t c o m m o n t y p e o f l i v e r c a n c e r , a c c o u n t i n g f o r 8 3 % o f a l l c a s e s ( A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y , 2 0 0 5 ) , a n d g l o b a l l y , i s t h e 5 t h m o s t c o m m o n m a l i g n a n c y ( B r u i x e t a l . , 2 0 0 4 ) . I n h u m a n s , r i s k f a c t o r s f o r H C C d e v e l o p m e n t i n c l u d e a g e n t s t h a t c a u s e c h r o n i c l i v e r i n j u r y a n d c i r r h o s i s , i n c l u d i n g t h o s e t h a t a r e v i r a l ( c h r o n i c i n f e c t i o n b y h e p a t i t i s B a n d C ) , t o x i c ( a l c o h o l c o n s u m p t i o n a n d A fl a t o x i n B 1 i n g e s t i o n ) , a n d m e t a b o l i c ( d i a b e t e s , n o n - a l c o h o l i c f a t t y l i v e r d i s e a s e ) , a m o n g o t h e r s ( B r u i x e t a l . , 2 0 0 4 ; P a r i k h , 2 0 0 7 ) . I t i s c r i t i c a l , f o r e f f e c t i v e c a n c e r d i a g n o s i s , p r o g n o s i s , a n d t h e r a p y , t o d e v e l o p a m o r e c o m p r e h e n s i v e u n d e r s t a n d i n g o f t h e c o m p l e x m e c h a n i s m s , i n c l u d i n g s i g n a l i n g n e t w o r k s , w h i c h c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o l o g y o f t h e d i s e a s e . G e n e t i c a n d e p i g e n e t i c a l t e r a t i o n s o f o n c o g e n e s a n d t u m o r s u p p r e s s o r s , p l u s t h e p e r t u r b a t i o n o f n u m e r o u s s i g n a l i n g p a t h w a y s , h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n h u m a n H C C . S p e c i fi c e v e n t s t h a t a r e t h o u g h t t o p l a y a r o l e i n i t s p a t h o g e n e s i s i n c l u d e l o s s - o f - f u n c t i o n m u t a t i o n s i n t h e p 5 3 t u m o r s u p p r e s s o r , m u t a t i o n a n d o v e r e x p r e s s i o n o f B - c a t e n i n , o v e r e x p r e s s i o n o f E r b B r e c e p t o r s , a n d o v e r e x p r e s s i o n o f h e p a t o c y t e g r o w t h f a c t o r ( H G F ) a n d i t s r e c e p t o r ( F a r a z i a n d D e P i n h o , 2 0 0 6 ) . A d d i t i o n a l g e n e s , t y p i c a l l y i n v o l v e d i n g r o w t h a n d s u r v i v a l , e x h i b i t m u t a t i o n s a n d / o r e x p r e s s i o n c h a n g e s i n H C C : p 7 3 , R b , M d m Z , A P C , E — c a d h e r i n , p 1 6 ’ N K ‘ “ , G a n k y r i n , t h e R a s i n h i b i t o r s R A S S F I A a n d N O R E I A , c - m y c a n d c y c l i n D 1 , a m o n g o t h e r s ( B e r a s a i n e t a l . , 2 0 0 7 ) . I n c r e a s e d l e v e l s o f D N A m e t h y l a t i o n ( i . e . 5 - m e t h y l c y t o s i n e ) i n m u l t i p l e g e n e s , i n c l u d i n g b u t n o t l i m i t e d t o p l 6 “ “ , E — c a d h e r i n , C O X Z , A S C , a n d D L C I h i g h l i g h t t h e i m p o r t a n c e o f e p i g e n e t i c c h a n g e s i n H C C ( F a r a z i a n d D e P i n h o , 2 0 0 6 ) . S e v e r a l g r o w t h f a c t o r s , r e c e p t o r s , a n d s i g n a l i n g p a t h w a y s w h i c h a r e n o r m a l l y i n v o l v e d i n t h e r e g e n e r a t i v e a n d p r o t e c t i v e r e s p o n s e s o f t h e l i v e r t o a c u t e i n j u r y ( e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) f a m i l y o f g r o w t h f a c t o r s ; H G F ; i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r , I G F ; t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - B , T G F - B ; a n d W n t ) a p p e a r t o b e d e r e g u l a t e d d u r i n g h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s , r e s u l t i n g i n d e v e l o p m e n t a n d m a i n t e n a n c e o f t h e t r a n s f o r m e d p h e n o t y p e ( B e r a s a i n e t a l . , 2 0 0 7 ) . M u l t i s t a g e C a r c i n o g e n e s i s C a r c i n o g e n e s i s i s a c o m p l e x , m u l t i s t e p / m u l t i s t a g e p r o c e s s , i n v o l v i n g t h e a c c u m u l a t i o n o f b o t h g e n e t i c a n d e p i g e n e t i c c h a n g e s t h a t u l t i m a t e l y r e s u l t i n t h e d e v e l o p m e n t o f a f r a n k t u m o r f r o m a s i n g l e , i n i t i a t e d c e l l ( F e i n b e r g e t a l . , 2 0 0 6 ; N o w e l l , 1 9 7 6 ) . T h e r e a r e 3 d i s t i n c t , e x p e r i m e n t a l l y - d e fi n e d s t a g e s o f t u m o r i g e n e s i s : i n i t i a t i o n , p r o m o t i o n , a n d p r o g r e s s i o n ( P i t o t a n d D r a g a n , 1 9 9 1 ) ( F i g u r e 1 . 1 ) . W h i l e t h i s c l a s s i c a l v i e w i s c o n c e p t u a l l y i m p o r t a n t , i t i s a n o v e r s i m p l i fi c a t i o n o f o u r i n c r e a s i n g u n d e r s t a n d i n g o f t h e p l e t h o r a o f b i o l o g i c a l p r o c e s s e s t h a t a r e a l t e r e d d u r i n g t h e t r a n s f o r m a t i o n p r o c e s s ( L o e b a n d H a r r i s , 2 0 0 8 ) . T h e fi r s t s t a g e , i n i t i a t i o n , i s a p e r m a n e n t c h a n g e t h a t o c c u r s s p o n t a n e o u s l y , o r i n r e s p o n s e t o c a r c i n o g e n t r e a t m e n t ( P i t o t a n d D r a g a n , 1 9 9 1 ) . T h e fi r s t c r i t i c a l , h e r i t a b l e e v e n t t h a t r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f a n i n i t i a t e d c e l l c a n b e e i t h e r a m u t a t i o n ( L o e b a n d H a r r i s , 2 0 0 8 ) o r a n e p i g e n e t i c a l t e r a t i o n , e . g . c h a n g e i n D N A m e t h y l a t i o n ( E s t e l l e r , O ’ i n i t E v i e a n t i n g t ® ‘ C l o — n a l e X P n s i o n a " ‘ V I N I T I A T I O N 2 “ ‘ 1 C r i t i c a l E v e n t P R O M O T I O N ~ C l o n a l E x a n s i o n ~ P ‘ ~ ~ ~ C l o n a l E x p a n S i o n g P R O G R E S S I O N F i g u _ r e 1 . 1 M u l t i s t a g e C a r c i n o g e n e s i s . T h e 3 e x p e r i m e n t a l l y - d e fi n e d s t a g e s o f c a r c i n o g e n e s i s a r e i n i t i a t i o n , p r o m o t i o n , a n d p r o g r e s s i o n . I n i t i a t i o n o c c u r s w h e n a c e l l ( 0 ) a c q u i r e s a c r i t i c a l , h e r i t a b l e c h a n g e ( e . g . , m u t a t i o n o r a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ) , r e p r e s e n t e d b y a l i n e t h r o u g h t h e c i r c l e s . A p r o m o t i n g a g e n t f a c i l i t a t e s t h e s e l e c t i v e c l o n a l e x p a n s i o n o f t h e i n i t i a t e d c e l l b y c o n f e r r i n g a g r o w t h a d v a n t a g e u p o n i t , r e l a t i v e t o n e i g h b o r i n g c e l l s . A b e r r a n t c l o n a l e x p a n s i o n s c o n t i n u e u n t i l t h e p r o g r e s s i o n s t a g e i s r e a c h e d , w h e r e b y c e l l s c a n p r o l i f e r a t e a u t o n o m o u s l y . ( A d a p t e d f r o m G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) 2 0 0 7 a ; G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) , e i t h e r o f w h i c h c a n r e s u l t i n t h e a c q u i s i t i o n o f a p r o l i f e r a t i v e a d v a n t a g e . T r e a t m e n t w i t h t h e p o t e n t a l k y l a t i n g m u t a g e n d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) c a u s e s t h e d e v e l o p m e n t o f p u t a t i v e l y i n i t i a t e d h e p a t o c y t e s , s o m e o f w h i c h c a n d e v e l o p i n t o a l t e r e d h e p a t i c f o c i ( A H F ) , t h e p r e s m n e d p r e c u r s o r s o f l i v e r t u m o r s ( P i t o t a n d D r a g a n , 1 9 9 4 ) . T h e s e c o n d s t a g e o f c a r c i n o g e n e s i s i s p r o m o t i o n , d u r i n g w h i c h a r e v e r s i b l e , s e l e c t i v e c l o n a l e x p a n s i o n o f t h e i n i t i a t e d c e l l o c c u r s , r e s u l t i n g i n t h e g e n e r a t i o n o f e x c e e d i n g l y a b e r r a n t s u b c l o n e p o p u l a t i o n s t h a t h a v e a c c u m u l a t e d c r i t i c a l , h e r i t a b l e c h a n g e s ( i . e . m u t a t i o n a n d e p i g e n e t i c a l t e r a t i o n s ) t h a t p r o v i d e t h e m w i t h g r o w t h a d v a n t a g e s o v e r n e i g h b o r i n g c e l l s ( F e i n b e r g e t a 1 . , 2 0 0 6 ; P i t o t a n d D r a g a n , 1 9 9 1 ) . T h e r e v e r s i b l e n a t u r e o f p r o m o t i o n i s i l l u s t r a t e d b y c e s s a t i o n o f t r e a t m e n t w i t h a p r o m o t i n g s t i m u l u s , w h i c h c a u s e s a d e c r e a s e i n t h e n u m b e r o f h y p e r p l a s t i c f o c i . T h i s c a n o c c u r v i a c e l l d e a t h / a p o p t o s i s o r a r c h i t e c t u r a l “ r e m o d e l i n g ” ( P i t o t a n d D r a g a n , 1 9 9 4 ) . A d d i t i o n a l l y , p r o m o t i n g a g e n t s ( e . g . p h e n o b a r b i t a l , d i e l d r i n ) a r e t h r e s h o l d - e x h i b i t i n g , i . e . t h e r e e x i s t s a d o s e b e l o w w h i c h t h e r e a r e n o e f f e c t s ( P i t o t a n d D r a g a n , 1 9 9 1 ) . T h e fi n a l i r r e v e r s i b l e s t a g e i s p r o g r e s s i o n , i n w h i c h m a l i g n a n t l e s i o n s a p p e a r ( P i t o t a n d D r a g a n , 1 9 9 4 ) . D u r i n g p r o g r e s s i o n , c e l l s g r o w a u t o n o m o u s l y , f o c i - i n - f o c i d e v e l o p , a n d g e n e t i c a l t e r a t i o n s ( e . g . e l e v a t e d c h r o m o s o m a l d a m a g e , k a r y o t y p i c i n s t a b i l i t y , a n d a l t e r a t i o n s i n p l o i d y ) a r e e v i d e n t ( P i t o t a n d D r a g a n , 1 9 9 4 ; P i t o t e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e O r i g i n o f t h e C a n c e r S t e m C e l l T h e o r i g i n o f t h e c a n c e r c e l l i s h i g h l y d e b a t e d . T h e r e a r e 3 p o s s i b i l i t i e s , w h i c h a r e n o t m u t u a l l y e x c l u s i v e , w i t h r e g a r d t o w h i c h t y p e o f c e l l ( s ) m i g h t r e c e i v e t h e fi r s t g e n e t i c o r e p i g e n e t i c “ h i t ” , a n d b e c o m e t h e i n i t i a t e d c e l l ( i . e . “ c a n c e r s t e m c e l l ” ) : s t e m c e l l s , p r o g e n i t o r c e l l s , a n d / o r d i f f e r e n t i a t e d c e l l s ( B j e r k v i g e t a l . , 2 0 0 5 ) . A n i c h e o f t i s s u e - s p e c i fi c s t e m c e l l s m i g h t e x i s t , a n d p r e s u m a b l y , c h a n g e s i n g e n e s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f s e l f - r e n e w a l w o u l d b e i m p o r t a n t f o r t h e d e v e l o p m e n t o f t h e i n i t i a t e d c e l l ( B j e r k v i g e t a l . , 2 0 0 5 ) . A d u l t s t e m c e l l s a r e c a p a b l e o f b o t h s e l f - r e n e w a l a n d m u l t i - l i n e a g e d i f f e r e n t i a t i o n , a n d t h e r e i s e v i d e n c e t h a t m u t a t i o n s w i t h i n h a e m a t o p o e t i c s t e m c e l l s c a u s e t r a n s f o r m a t i o n , r e s u l t i n g i n m u l t i p l e t y p e s o f l e u k e m i a ( R e y a e t a l . , 2 0 0 1 ) . H o w e v e r , a d u l t l i v e r s t e m c e l l s h a v e n o t y e t b e e n i s o l a t e d ( D a b e v a a n d S h a f r i t z , 2 0 0 3 ) . T h e i n i t i a t e d c a n c e r c e l l m i g h t a l s o b e d e r i v e d f r o m p r o g e n i t o r c e l l s . I n t h i s c a s e , t h e t r a n s f o r m a t i o n e v e n t m u s t c o n f e r t h e s a m e e x t e n s i v e s e l f - r e n e w a l p r o p e r t i e s t o t h e p r o g e n i t o r c e l l a s t h e s t e m c e l l ; i f n o t , t h e p r o g e n i t o r c e l l w o u l d d i f f e r e n t i a t e . I n s u p p o r t o f t h i s , m o u s e m o d e l s h a v e b e e n c r e a t e d i n w h i c h r e s t r i c t e d , h a e m a t o p o i e t i c p r o g e n i t o r c e l l s g i v e r i s e t o m y e l o i d l e u k e m i a ( R e y a e t a l . , 2 0 0 1 ) . S e v e r a l l a b o r a t o r i e s h a v e p r o v i d e d e v i d e n c e o f v a r i o u s g r o u p s o f i n t r a h e p a t i c p r o g e n i t o r c e l l s ( D a b e v a a n d S h a f r i t z , 2 0 0 3 ; D a n a t a l . , 2 0 0 6 ; W a n g e t a l . , 2 0 0 3 ) , i n c l u d i n g , b u t n o t l i m i t e d t o , “ o v a l ” c e l l s . I n t e r e s t i n g l y , i t i s p o s s i b l e t h a t e x t r a h e p a t i c p r o g e n i t o r s a r e d e r i v e d f r o m b o n e m a r r o w ( T h e i s e e t a l . , 2 0 0 0 ) . M o r e o v e r , m a t u r e c e l l s m i g h t d e - d i f f e r e n t i a t e a n d b e c o m e c a p a b l e o f s e r v i n g a s t h e i n i t i a t e d c a n c e r c e l l . M a t u r e h e p a t o c y t e s c a n p r o l i f e r a t e i n a c o m p e n s a t o r y f a s h i o n , e . g . f o l l o w i n g p a r t i a l h e p a t e c t o m y ( S t e e r , 1 9 9 5 ) , o r i n r e s p o n s e t o t r e a t m e n t w i t h m i t o g e n s s u c h a s p h e n o b a r b i t a l ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ; K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 a ) . I n d e e d , m a t u r e h e p a t o c y t e s c a n d i v i d e u p t o 1 2 t i m e s ( R h i m e t a l . , 1 9 9 4 ) . F u r t h e r m o r e , u p o n a d d i t i o n o f c e r t a i n g e n e s , c e l l s c a n b e g e n e r a t e d w h i c h p o s s e s s s t e m - l i k e p r o p e r t i e s ( i . e . i n d u c e d p l u r i p o t e n t , i P S , c e l l s ) . I n t r o d u c t i o n o f 4 t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( 0 c t 3 / 4 , S o x 2 , c - M y c , a n d K l f 4 ) i n t o m o u s e e m b r y o n i c o r a d u l t fi b r o b l a s t s ( T a k a h a s h i e t a l . , 2 0 0 7 ; W e r n i g e t a l . , 2 0 0 7 ) r e s u l t e d i n t h e f o r m a t i o n o f i P S c e l l s . I m p o r t a n t l y , a d u l t m o u s e l i v e r c e l l s h a v e a l s o b e e n r e p r o g r a m m e d t o a s t e m - l i k e s t a t e ( A o i e t a l . , 2 0 0 8 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e 3 s t u d i e s i m p l y t h a t i t i s p o s s i b l e f o r m a t u r e , d i f f e r e n t i a t e d c e l l s t o r e v e r t i n t o a d e - d i f f e r e n t i a t e d s t a t e . C o m b i n e d w i t h t h e f a c t t h a t m a t u r e h e p a t o c y t e s c a n r e p l i c a t e , i t a p p e a r s p o s s i b l e t h a t a l t e r a t i o n s w i t h i n m a t u r e , d i f f e r e n t i a t e d c e l l s i n t h e l i v e r ( e . g . h e p a t o c y t e s ) c o u l d u l t i m a t e l y l e a d t o t u m o r f o r m a t i o n . F u n d a m e n t a l C h a r a c t e r i s t i c s o f a C a n c e r C e l l C a n c e r c e l l s a c q u i r e 6 m a j o r f e a t u r e s t h a t f a c i l i t a t e t h e i r o p t i m a l g r o w t h , a n d s u b s e q u e n t l y , t u m o r d e v e l o p m e n t : s e l f - s u f fi c i e n c y i n g r o w t h s i g n a l s , i n s e n s i t i v i t y t o a n t i - g r o w t h s i g n a l s , e v a d i n g a p o p t o s i s , l i m i t l e s s r e p l i c a t i v e p o t e n t i a l , s u s t a i n e d a n g i o g e n e s i s , a n d t i s s u e i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s ( H a n a h a n a n d W e i n b e r g , 2 0 0 0 ) . T h e s e c h a r a c t e r i s t i c s a r e c e n t r a l t o t h e t u m o r i g e n e s i s p r o c e s s , a n d s o a b r i e f o v e r v i e w o f e a c h o f t h e m i s p r o v i d e d . I N e o p l a s t i c c e l l s p o s s e s s n u m e r o u s t o o l s t h a t e n a b l e t h e m t o b e c o m e i n d e p e n d e n t f r o m e x o g e n o u s g r o w t h s i g n a l s , a n d t h e s e c o n t r i b u t e , i n p a r t , t o t h e u n c o n t r o l l e d g r o w t h u n i v e r s a l l y e x h i b i t e d b y t u m o r s . S e v e r a l m e c h a n i s m s a r e r e s p o n s i b l e f o r t h i s p h e n o m e n o n . G r o w t h f a c t o r s ( e . g . E G F a n d I G F ) , c a u s e q u i e s c e n t c e l l s t o e n t e r t h e c e l l c y c l e , a n d t h e s e , i n a d d i t i o n t o t h e i r c o g n a t e r e c e p t o r s , a r e o v e r e x p r e s s e d i n t u m o r c e l l s ( A a r o n s o n , 1 9 9 1 ) . F u r t h e r m o r e , p r o d u c t i o n o f g r o w t h f a c t o r s b y c a n c e r c e l l s c a n r e s u l t i n t h e i r o w n p r o l i f e r a t i o n , a s i n t h e c a s e o f p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r i n g l i o b l a s t o m a m u l t i f o r m e ( L o k k e r e t a l . , 2 0 0 2 ) . G r o w t h f a c t o r r e c e p t o r s , w h i c h t r a n s d u c e g r o w t h s i g n a l s fi ' o m t h e e x t r a c e l l u l a r t o t h e i n t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t , a r e a l s o a l t e r e d i n c a n c e r c e l l s , a s w e l l a s t m n o r - a s s o c i a t e d s t r o m a l c e l l s . I n p a r t i c u l a r , E G F r e c e p t o r s a r e c o m m o n l y o v e r e x p r e s s e d o r e x h i b i t a c t i v a t i n g m u t a t i o n s i n c a n c e r , r e s u l t i n g i n t h e i r c o n s t i t u t i v e a c t i v a t i o n a n d c o n s e q u e n t l y , c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n a n d s u r v i v a l ( Z h a n g e t a 1 . , 2 0 0 7 ) . E x t r a c e l l u l a r m a t r i x r e c e p t o r s ( i . e . i n t e g r i n s ) m e d i a t e s i g n a l s , d e r i v e d f r o m m a t r i x c o m p o n e n t s , t h a t g o v e r n i n t r a c e l l u l a r e v e n t s a n d c o n t r i b u t e t o g r o w t h . F o r e x a m p l e , c u e s f r o m S h c - r e l a t e d i n t e g r i n s h e l p a c t i v a t e t h e R a s - m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ( M A P K ) p a t h w a y , a n i m p o r t a n t s i g n a l i n g c a s c a d e t h a t r e g u l a t e s c r u c i a l r e s p o n s e s s u c h a s g r o w t h a n d s u r v i v a l ( G i a n c o t t i a n d R u o s l a h t i , 1 9 9 9 ) . I n d e e d , a c t i v a t i n g R a s m u t a t i o n s a r e o b s e r v e d i n a p p r o x i m a t e l y 3 0 % o f h u m a n c a n c e r s , l e a d i n g t o d e r e g u l a t i o n o f d o w n s t r e a m e f f e c t o r s a n d a b e r r a n t p r o l i f e r a t i o n a n d s u r v i v a l ( S c h u b b e r t e t a l . , 2 0 0 7 ) . C a n c e r c e l l s c a n a v o i d s i g n a l s t h a t i m p e d e t h e i r g r o w t h b y b l o c k i n g c e l l c y c l e p r o g r e s s i o n o r c i r c u m v e n t i n g d i f f e r e n t i a t i o n . A c h i e f p a t h w a y i n v o l v e d i n s u p p r e s s i n g c e l l u l a r g r o w t h i n v o l v e s t h e r e t i n o b l a s o m a ( R b ) p r o t e i n , a n d i t s a c t i v a t o r p 1 6 , b o t h o f w h i c h a r e d e r e g u l a t e d i n a w i d e r a n g e o f h u m a n c a n c e r s . I n h i b i t i o n o f t h e p R B p a t h w a y l e a d s t o c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n d u e t o t h e a c t i v a t i o n o f r e l e v a n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( K a y e , 2 0 0 2 ) . I n t u m o r s , t h i s c a n b e a c h i e v e d i n a v a r i e t y o f w a y s , i n c l u d i n g l o s s o f f u n c t i o n o f p R B , p 1 6 , a n d a n u m b e r o f p r o t e i n s t h a t a c t a s a n t i - m i t o g e n i c a g e n t s t o , d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y , e n h a n c e p R B s i g n a l i n g , s u c h a s T G F - B , S m a d 4 , a n d p 1 5 ( r e v i e w e d i n H a n a h a n a n d W e i n b e g , 2 0 0 0 ) . C e l l s c a n a l s o a v o i d t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n , a n d b y d o i n g s u c h , e s c a p e g r o w t h s u p p r e s s i o n . D u r i n g d e v e l o p m e n t , t h e c - m y c f u n c t i o n s i n c o n j u n c t i o n w i t h i t s h e t e r o d i m e r i c b i n d i n g p a r t n e r M a x t o s t i m u l a t e t r a n s c r i p t i o n a n d g r o w t h , w h i l e M a x b i n d s a n o t h e r p r o t e i n ( M a d ) , r e s u l t i n g i n a n t i - p r o l i f e r a t i v e e f f e c t s , i n c l u d i n g d i f f e r e n t i a t i o n ( F o l e y a n d E i s e n m a n , 1 9 9 9 ) . F u r t h e r m o r e , s i n c e c - m y c o v e r e x p r e s s i o n c a n i m p e d e d i f f e r e n t i a t i o n a n d f a c i l i t a t e g r o w t h , i t i s s i g n i fi c a n t t h a t t h i s p r o t e i n i s o v e r e x p r e s s e d i n a v a r i e t y o f c a n c e r s . T u m o r c e l l s c a n e s c a p e d e a t h i n a n o t h e r m a n n e r , t h a t i s , t h e y a r e a b l e t o e v a d e a p o p t o s i s . T h i s i s c r u c i a l , s i n c e p r o g r a m m e d c e l l d e a t h i s a w a y t o e l i m i n a t e m u t a t e d , t r a n s f o r m e d , o r o t h e r w i s e a b e r r a n t c e l l s . I n t h e c o n t e x t o f t u m o r i g e n e s i s , c e l l s c a n a v o i d a p o p t o s i s i n s e v e r a l w a y s . C a s p a s e s a r e t h e c e n t r a l p l a y e r s i n t h e i n d u c t i o n o f t h e a p o p t o t i c p r o g r a m , a n d t h u s , i t i s n o t u n e x p e c t e d t h a t t h e i r r e d u c e d e x p r e s s i o n c o n s t i t u t e s a s u r v i v a l m e c h a n i s m ( P h i l c h e n k o v e t a l . , 2 0 0 4 ; S h i v a p u r k a r e t a l . , 2 0 0 3 ) . F u n c t i o n a l d e f e c t s a r e a l s o a p p a r e n t i n p o s i t i v e ( e . g . F A D D , B c 1 2 ) o r n e g a t i v e ( e . g . S u r v i v i n ) r e g u l a t o r s o f c a s p a s e a c t i v i t y ( P h i l c h e n k o v e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e p 5 3 p r o t e i n , w h i c h i s a c t i v a t e d i n r e s p o n s e t o c e l l u l a r s t r e s s o r D N A d a m a g e , i s c a p a b l e o f s t i m u l a t i n g a t r a n s c r i p t i o n a l p r o g r a m t h a t i n d u c e s a p o p t o s i s ( V o g e l s t e i n e t a l . , 2 0 0 0 ) . I n a c t i v a t i o n o f p 5 3 o c c u r s i n a p p r o x i m a t e l y 5 0 % o f h u m a n c a n c e r s , a n d s i n c e p 5 3 - d e p e n d e n t a p o p t o s i s c a n i n h i b i t t u m o r g r o w t h , t h i s r e p r e s e n t s a t a c t i c t h a t c a n c e r c e l l s u s e t o r e s i s t p r o g r a m m e d c e l l d e a t h , t h u s p o t e n t i a l l y f a c i l i t a t i n g c l o n a l e x p a n s i o n d u r i n g c a r c i n o g e n e s i s . S u r v i v a l f a c t o r s a l s o c o n t r i b u t e t o t h e c a p a b i l i t y o f c e l l s t o e l u d e a p o p t o t i c c e l l d e a t h . V a r i o u s r e c e p t o r s , i n c l u d i n g t h o s e f o r c y t o k i n e s ( e . g . I L - 3 ) a n d g r o w t h f a c t o r s , t r a n s m i t s u r v i v a l s i g n a l s v i a t h e p h o s p h o i n o s i t i d e 3 - O H k i n a s e ( P B - k i n a s e ) p a t h w a y . I n p a r t i c u l a r , I G F - l i s a n e x t r a c e l l u l a r s u r v i v a l s i g n a l t h a t c a n i n h i b i t a p o p t o s i s w h i c h i s s t i m u l a t e d b y f r o m m u l t i p l e s i g n a l s ( K u r m a s h e v a a n d H o u g h t o n , 2 0 0 6 ) . T h e s u r v i v a l e f f e c t s a r e g e n e r a l l y m e d i a t e d b y a c t i v a t i o n o f v - a k t m u r i n e t h y m o m a v i r a l o n c o g e n e h o m o l o g l ( A K T ) p l u s i t s d o w n s t r e a m e f f e c t o r P I 3 - k i n a s e ( D o w n w a r d , 1 9 9 8 ) , a n d a r e l a r g e l y d e p e n d e n t o n t h e s u p p r e s s i o n o f a p o p t o s i s ( T o r e t s k y e t a l . , 1 9 9 9 ) . I n t e r e s t i n g l y , e l e v a t e d A K T a c t i v i t y h a s b e e n r e p o r t e d i n s e v e r a l c a n c e r s ( B e l l a c o s a e t a l . , 1 9 9 5 ) . M o r e o v e r , l o s s o f t h e t u m o r s u p p r e s s o r p h o s p h a t a s e a n d t e n s i n h o m o l o g ( P T E N ) , w h i c h c a n b l o c k A K T - m e d i a t e d s u r v i v a l , h a s b e e n o b s e r v e d i n a v a s t a r r a y o f h u m a n n e o p l a s m s ( C a n t l e y a n d N e e l , 1 9 9 9 ) . I n o r d e r t o e v o l v e i n t o a m a c r o s c o p i c t u m o r , c a n c e r c e l l s m u s t n o t o n l y d i s r u p t g r o w t h a n d d e a t h p a t h w a y s , t h e y m u s t a l s o e v a d e t h e p r o g r a m t h a t l i m i t s t h e n u m b e r o f t i m e s a c e l l c a n m u l t i p l y ( i . e . s e n e s c e n c e ) ( H a y fl i c k , 1 9 9 7 ) . M o s t t u m o r c e l l s i n c u l t u r e h a v e a c h i e v e d t h i s , a s t h e y s e e m t o p o s s e s s a n i m m o r t a l i z e d p h e n o t y p e ( H a y fl i c k , 1 9 9 7 ) . E x c e s s i v e t e l o m e r e m a i n t e n a n c e i s t h e p r i m a r y m e c h a n i s m b y w h i c h c e l l s c a n b y p a s s p r o l i f e r a t i o n l i m i t s . T e l o m e r e s , r e g i o n s o f r e p e t i t i v e D N A f o u n d a t t h e e n d o f c h r o m o s o m e s t h a t s e r v e t o p r o t e c t t h e m f r o m d e g r a d a t i o n , a r e l e n g t h e n e d b y t h e t e l o m e r a s e e n z y m e . P r o g r e s s i v e s h o r t e n i n g o f t h e t e l o m e r e s a f t e r e a c h r o u n d o f D N A r e p l i c a t i o n e v e n t u a l l y i n d u c e s s e n e s c e n c e , a p o p t o s i s , o r g e n o m i c i n s t a b i l i t y ( B i a n c h i a n d S h o r e , 2 0 0 8 ) . T y p i c a l l y , n o r m a l c e l l s d o n o t e x h i b i t t e l o m e r a s e a c t i v i t y , h o w e v e r , c e l l s f r o m 8 5 - 9 0 % o f h u m a n c a n c e r s p e c i m e n s s e e m t o h a v e r e - a c t i v a t e d t h e e n z y m e ( S h a y a n d B a c c h e t t i , 1 9 9 7 ) . T h e r e m a i n i n g c e l l s u t i l i z e a m e c h a n i s m c a l l e d “ a l t e r n a t i v e l e n g t h e n i n g o f t e l o m e r e s ( A L T ' ) ” t o l e n g t h e n a n d s t a b i l i z e t e l o m e r e s ( B r y a n e t a 1 . , 1 9 9 5 ) . T h u s , e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t m a i n t a i n i n g t e l o m e r e l e n g t h i s a m e a n s b y w h i c h c a n c e r c e l l s c a n a c h i e v e a n i n d e fi n i t e r e p l i c a t i v e c a p a c i t y , p e r m i t t i n g t h e c l o n a l e x p a n s i o n t h a t e v e n t u a l l y r e s u l t s i n t u m o r f o r m a t i o n . A n g i o g e n e s i s , t h e s p r o u t i n g a n d b r a n c h i n g o f n e w b l o o d v e s s e l s f r o m p r e e x i s t i n g c a p i l l a r i e s , i s e s s e n t i a l f o r t r a n s f o r m a t i o n a s w e l l a s t h e g r o w t h o f t h e t u m o r m a s s , s i n c e i t m a i n t a i n s a s u f fi c i e n t s u p p l y o f o x y g e n a n d m e t a b o l i t e s t o n e o p l a s t i c c e l l s , a s w e l l a s r e m o v e s w a s t e b y p r o d u c t s ( B e r g e r s a n d B e n j a r n i n , 2 0 0 3 ) . W h e n t h e b a l a n c e o f p r o - a n g i o g e n i c a n d a n t i - a n g i o g e n i c r e g u l a t o r s s h i f t s t o w a r d s t h e p r o - a n g i o g e n i c s t a t e , t h e s t i m u l a t i o n o f t u m o r v a s c u l a t u r e ( i . e . t h e “ a n g i o g e n i c s w i t c h ” ) o c c u r s ( B e r g e r s a n d B e n j a m i n , 2 0 0 3 ) . P o s i t i v e r e g u l a t o r s o f t h e p r o c e s s i n c l u d e g r o w t h f a c t o r s , s u c h a s V E G F a n d F G F ( M a d r i o t a a n d P e p p e r , 1 9 9 7 ) , a s w e l l a s i n t e g r i n s a n d a d h e s i o n s ( R fi e g g a n d M a r i o t t i , 2 0 0 3 ; T e i e t a l . , 2 0 0 2 ) . P r o - a n g i o g e n i c f a c t o r s c a n b e p r o d u c e d a n d s e c r e t e d b y t u m o r c e l l s o r h o s t c e l l s t h a t h a v e m i g r a t e d t o t h e t u m o r ( e . g . i m m u n e c e l l s ) , i n a d d i t i o n t o c o m p o n e n t s o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( R i b a t t i e t a l . , 2 0 0 7 ) . A d d i t i o n a l l y , a n g i o g e n e s i s i n h i b i t o r s ( e . g . t h r o m b o s p o n d i n - l ) a r e d o w n - r e g u l a t e d ( R i b a t t i e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h u s , t u m o r c e l l s , i n c o n j u n c t i o n w i t h s t r o m a l c e l l s , h a v e d e v e l o p e d m e t h o d s o f e n h a n c i n g v a s c u l a t u r e d e v e l o p m e n t i n o r d e r t o a u g m e n t t u m o r g r o w t h . L a s t l y , c a n c e r c e l l s a r e c a p a b l e o f d i s s e m i n a t i n g f r o m t h e p r i m a r y t u m o r , i n v a d i n g t h e s u r r o u n d i n g t i s s u e , a n d m e t a s t a s i z i n g t o d i s t a n t s i t e s . D i m i n i s h e d c e l l — t o - c e l l a d h e s i o n a n d i n c r e a s e d c e l l - t o — m a t r i x a d h e s i o n i s c r i t i c a l f o r i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s ( J i a n g , 1 9 9 8 ) . A c c o r d i n g l y , p r o t e i n s p o s s e s s i n g a d h e s i v e p o t e n t i a l , n a m e l y , c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e s ( c e l l - c e l l i n t e r a c t i o n s ) a n d i n t e g r i n s ( c e l l - m a t r i x i n t e r a c t i o n s ) , a r e a l t e r e d d u r i n g t u m o r i g e n e s i s . I t h a s b e e n e s t a b l i s h e d t h a t d y s f u n c t i o n o f c a d h e r i n s , a f a m i l y o f c e l l a d h e s i o n p r o t e i n s , c o n t r i b u t e s t o t u m o r c e l l i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s . I n d e e d , i t i s w e l l - k n o w n t h a t l o s s o f E - c a d h e r i n p r o m o t e s t u m o r c e l l p r o g r e s s i o n b y f a c i l i t a t i n g t h e s e 1 0 p r o c e s s e s ( J e a n e s e t a l . , 2 0 0 8 ) . I n t e g r i n s a r e g l y c o p r o t e i n s t h a t b i n d a w i d e r a n g e o f e x t r a c e l l u l a r m a t r i x m o l e c u l e s ( e . g . fi b r o n e c t i n ) , a n d t h e y c a n c o n t r o l c e l l - m a t r i x a d h e s i o n , i n a d d i t i o n t o c e l l s h a p e a n d m i g r a t i o n , w h i c h a r e a l l v i t a l e v e n t s d u r i n g i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s ( H o o d a n d C h e r e s h , 2 0 0 2 ) . E x t r a c e l l u l a r p r o t e a s e s c a n a l t e r b i o l o g i c a l a d h e s i o n , a s w e l l a s p r o m o t e t h e d e g r a d a t i o n o f m u l t i p l e p r o t e i n s t h a t i n fl u e n c e t u m o r b e h a v i o r . F o r e x a m p l e , c e l l u l a r i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s i s f a c i l i t a t e d b y m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e - 7 ( M M P - 7 ) w h i c h i s c a p a b l e o f d e g r a d i n g b a s e m e n t m e m b r a n e p r o t e i n s ( D e C l e r c k e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e s e 6 b a s i c t r a i t s t h a t a c e l l a c q u i r e s p e r m i t i t s t r a n s f o r m a t i o n a n d c o n t r o l i t s m a l i g n a n t g r o w t h . A n e x t e n s i v e a r r a y o f o n c o g e n e s a n d t u m o r s u p p r e s s o r s t h a t c o n t r i b u t e t o t h e s e b i o l o g i c a l e n d p o i n t s h a v e b e e n , a n d c o n t i n u e t o b e , i d e n t i fi e d . S p e c i fi c a l l y , m u l t i p l e k e y o n c o g e n i c p a t h w a y s h a v e b e e n d i s c e r n e d , t h a t s e r v e t o d r i v e t u m o r i g e n e s i s w h e n a s s o c i a t e d c o n s t i t u e n t s a r e d e r e g u l a t e d : p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e s a n d t h e i r a s s o c i a t e d s i g n a l i n g n e t w o r k s ( e . g . fi b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r , F G F ) , W r i t , H e d g e h o g , N o t c h , R a s ( i n c l u d i n g c y t o s k e l e t o n p r o t e i n s ) , m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e s ( M A P K ) , P I 3 - k i n a s e , c y t o k i n e s , T g f - B , a n d n u c l e a r p r o t e i n s , s u c h a s J u n ( H u n t e r , 1 9 9 7 ) . S i g n i fi c a n t l y , s i g n a l i n g n e t w o r k s i n v o l v i n g t r a n s c r i p t i o n a l p r o g r a m s t h a t r e g u l a t e p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n ( e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n , E M T , p l u s t h e a f o r e m e n t i o n e d W n t , T g f - B , a n d N o t c h p a t h w a y s ) , a n d w h i c h a r e c r i t i c a l f o r n o r m a l d e v e l o p m e n t , o f t e n d e m o n s t r a t e a b e r r a n t a c t i v i t y i n c a r c i n o g e n e s i s ( K e l l e h e r e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s e m p h a s i z e t h e i m p o r t a n c e o f d e r e g u l a t i o n o f e m b r y o l o g i c a l p a t h w a y s i n t u m o r b i o l o g y . l l C e l l - C e l l I n t e r a c t i o n s i n C a n c e r I n a d d i t i o n t o f o c u s i n g o n c r i t i c a l s i g n a l i n g p a t h w a y s w i t h i n c a n c e r c e l l s , i t i s i m p e r a t i v e t o r e fl e c t o n t h e n o t i o n t h a t m u l t i p l e c e l l t y p e s c o o p e r a t e t o e n h a n c e t u m o r i g e n e s i s . H e p a t o c y t e s c o m p r i s e a p p r o x i m a t e l y 6 0 % o f t h e l i v e r c e l l p o p u l a t i o n , w h i l e n o n - p a r e n c h y m a l c e l l s ( e . g . s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s , K u p f f e r c e l l s , I t o / h e p a t i c s t e l l a t e c e l l s , i n t r a h e p a t i c l y m p h o c y t e s ) c o n s t i t u t e t h e r e m a i n i n g 4 0 % ( K m i e é , 2 0 0 1 ) . T h e f u n c t i o n s o f h e p a t o c y t e s , i n b o t h n o r m a l a n d p a t h o l o g i c a l s t a t e s , c a n b e m o d u l a t e d b y a d j a c e n t , n o n p a r e n c h y m a l c e l l s . F o r e x a m p l e , h e p a t o c y t e s a n d I t o c e l l s c o o p e r a t e t o d e p o s i t a n e x t r a c e l l u l a r m a t r i x i n v i t r o ( L o r é a l e t a l . , 1 9 9 3 ) . I t i s w e l l - e s t a b l i s h e d t h a t t h e c o m p l e x t u m o r m i c r o e n v i r o n m e n t , c o n t a i n i n g e x t r a c e l l u l a r m a t r i x , g r o w t h f a c t o r s a n d c y t o k i n e s , a n d a v a r i e t y o f n o n - e p i t h e l i a l c e l l t y p e s ( e . g . i m m u n e c e l l s , fi b r o b l a s t s ) s u b s t a n t i a l l y i n fl u e n c e s t u m o r d e v e l o p m e n t ( L i e t a l . , 2 0 0 7 ) . I n d e e d , c y t o k i n e p r o d u c t i o n b y n o n - p a r e n c h y m a l l i v e r c e l l s s t i m u l a t e s D N A s y n t h e s i s p r e f e r e n t i a l l y i n i n i t i a t e d h e p a t o c y t e s , l i k e l y f a c i l i t a t i n g t u m o r p r o m o t i o n ( D r u c k e r e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e r e f o r e , i t i s i m p o r t a n t t o c o n s i d e r i n t e r a c t i o n s b e t w e e n v a r i o u s l i v e r c e l l t y p e s w h e n a s s e s s i n g p e r t u r b a t i o n s i n k e y g e n e s a n d p a t h w a y s p u t a t i v e l y i n v o l v e d i n c a n c e r , i n o r d e r t o m o r e t h o r o u g h l y c o m p r e h e n d t h e m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g t h e d i s e a s e . 5 - M e t h y l c y t o s i n e : D i s t r i b u t i o n a n d A b u n d a n c e T h e e p i g e n e t i c m a r k S - m e t h y l c y t o s i n e f o r m s u p o n t h e c o v a l e n t a d d i t i o n o f a m e t h y l g r o u p t o t h e 5 - p o s i t i o n o f t h e c y t o s i n e r i n g . T h i s b a s e i s n o t m u t a g e n i c b e c a u s e i t s t i l l b a s e p a i r s w i t h g u a n i n e . 5 - m e t h y l c y t o s i n e i s f o u n d a t a p p r o x i m a t e l y 7 0 % o f a l l g e n o m i c C p G d i n u c l e o t i d e s ( E h r l i c h , 1 9 8 2 ; N a v e h - M a n y a n d C e d a r , 1 9 8 1 ) . F u r t h e r m o r e , 1 2 t h e m a j o r i t y o f 5 - m e t h y l c y t o s i n e i s l o c a t e d w i t h i n r e p e t i t i v e g e n o m i c r e g i o n s s u c h a s s a t e l l i t e D N A a n d p a r a s i t i c e l e m e n t s , i n c l u d i n g l o n g i n t e r s p e r s e d e l e m e n t s ( L I N E S ) , s h o r t i n t e r s p e r s e d e l e m e n t s ( S I N E S ) , a n d e n d o g e n o u s r e t r o v i r u s e s ( Y o d e r e t a l . , 1 9 9 7 ) . I n g e n e r a l , t h e g e n o m e i s C p G - p o o r ( i n t r o n i c a n d i n t e r g e n i c r e g i o n s ) , w h i l e m o s t o f t h e i n t e r m i t t e n t C p G s i t e s r e m a i n m e t h y l a t e d . C o n v e r s e l y , G C - r i c h C p G i s l a n d s a r e a s s o c i a t e d w i t h a p p r o x i m a t e l y 6 0 % o f a l l p r o m o t e r s a n d , w i t h f e w e x c e p t i o n s , a r e l a r g e l y u n m e t h y l a t e d i n h u m a n s a n d m i c e ( A n t e q u e r a , 2 0 0 3 ) . O r i g i n a l l y , a C p G i s l a n d w a s d e fi n e d a s a s t r e t c h o f D N A g r e a t e r t h a n 2 0 0 b p l o n g , w i t h a G + C c o n t e n t a b o v e 5 0 % a n d a r a t i o o f o b s e r v e d C p G / e x p e c t e d C p G g r e a t e r t h a n 0 . 6 0 ( G a r d i n e r - G a r d e n a n d F r o m m e r , 1 9 8 7 ) . A r e v i s e d , m o r e s t r i n g e n t s e t o f c r i t e r i a i d e n t i fi e s a C p G i s l a n d a s a r e g i o n w h i c h i s g r e a t e r t h a n 5 0 0 b p l o n g , p o s s e s s e s a G + C c o n t e n t o f a t l e a s t 5 5 % , a n d h a s a n o b s e r v e d C p G / e x p e c t e d C p G r a t i o o f a t l e a s t 0 . 6 5 ( T a k a i a n d J o n e s , 2 0 0 2 ) . I t i s e s t i m a t e d t h a t t h e r e a r e 4 5 , 0 0 0 a n d 3 7 , 0 0 0 C p G i s l a n d s i n t h e h u m a n a n d m o u s e g e n o m e s , r e s p e c t i v e l y ( A n t e q u e r a a n d B i r d , 1 9 9 3 ) . I t i s t h e o r i z e d t h a t C p G i s l a n d s r e m a i n u n m e t h y l a t e d f o r 3 r e a s o n s : 1 ) d e m e t h y l a t i o n p r o c e s s e s r e m o v e m e t h y l a t i o n f r o m C p G i s l a n d s a f t e r t h e y h a v e b e e n d e n o v o m e t h y l a t e d , 2 ) e n z y m e s r e s p o n s i b l e f o r c y t o s i n e m e t h y l a t i o n d o n o t e f fi c i e n t l y m e t h y l a t e G C - r i c h D N A , o r 3 ) g e n o m i c f o o t p r i n t i n g o c c u r s , i n w h i c h t r a n s f a c t o r s , s u c h a s t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s , b i n d t o D N A a n d i n h i b i t m e t h y l a t i o n ( C r o s s a n d B i r d , 1 9 9 5 ) . W i t h r e g a r d s t o t h e t h i r d h y p o t h e s i s , C p G i s l a n d s , o f t e n a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d g e n e e x p r e s s i o n , m i g h t b e “ f o o t p r i n t s ” o f e a r l y D N A r e p l i c a t i o n i n t e r m e d i a t e s , a n d t h u s , a c t a s r e p l i c a t i v e o r i g i n s ( C r o s s a n d B i r d , 1 9 9 5 ) . W h i l e g e n e - a s s o c i a t e d C p G i s l a n d s c a n b e l o c a t e d w i t h c o d i n g r e g i o n s , m o s t a r e f o u n d w i t h i n p r o m o t e r r e g i o n s , a n d m e t h y l a t i o n o f 1 3 t h e s e c a n p r e v e n t t r a n s c r i p t i o n ( J o n e s , 1 9 9 9 ) . C p G d i n u c l e o t i d e s a r e t h e p r e f e r r e d s i t e o f D N A m e t h y l a t i o n , h o w e v e r , n o n - C p G m e t h y l a t i o n a l s o e x i s t s . M e t h y l a t i o n a t C p C , C p A , a n d C p T d i n u c l e o t i d e s h a s b e e n d e t e c t e d i n m o u s e e m b r y o n i c s t e m c e l l s , a n d m e t h y l a t i o n a t t h e 2 l a t t e r s i t e s i s l i k e l y e s t a b l i s h e d b y D n m t 3 a ( D o d g e e t a l . , 2 0 0 2 ; R a m s a h o y e e t a l . , 2 0 0 0 ) . A d d i t i o n a l l y , C p r G m e t h y l a t i o n i n m a m m a l s h a s b e e n a s s e s s e d ( C l a r k e t a l . , 1 9 9 5 ) . I n h u m a n s , n o n - C p G m e t h y l a t i o n i n t h e p r o m o t e r r e g i o n o f a s c h i z o p h r e n i a - r e l a t e d g e n e ( s y t I 1 ) c o r r e l a t e d w i t h d e c r e a s e d e x p r e s s i o n , d e m o n s t r a t i n g t h a t n o n - C p G m e t h y l a t i o n m i g h t b e b i o l o g i c a l l y r e l e v a n t ( I n o u e a n d O i s h i , 2 0 0 5 ) . T h u s , d i v e r s e m e t h y l a t i o n p a t t e r n s t h r o u g h o u t t h e g e n o m e p r e s u m a b l y h a v e c o m p l e x b i o l o g i c a l e f f e c t s . R e g u l a t i o n o f D N A M e t h y l a t i o n P a t t e r n s M e t h y l a t i o n p a t t e r n s a r e p r i m a r i l y e s t a b l i s h e d a n d m a i n t a i n e d b y D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) e n z y m e s a n d p u t a t i v e d e m e t h y l a s e s ( F i g u r e 1 . 2 ) . R e p l i c a t i o n o f m e t h y l a t e d D N A r e s u l t s i n a n i n t e r m e d i a t e s t a t e o f h e m i - m e t h y l a t i o n , w h i c h i s r e s t o r e d t o a f u l l m e t h y l a t i o n s t a t u s b y t h e m a i n t e n a n c e m e t h y l a s e , D n m t l . D e n o v o m e t h y l t r a n s f e r a s e s c a n a d d m e t h y l g r o u p s t o c o m p l e t e l y u n m e t h y l a t e d D N A . M e t h y l a t e d D N A c a n b e c o m e h y p o m e t h y l a t e d i n a p a s s i v e ( r e p l i c a t i o n - d e p e n d e n t ) o r a c t i v e ( r e p l i c a t i o n - i n d e p e n d e n t ) m a n n e r . I n a d d i t i o n t o e n z y m e s , m e t h y l a t i o n p a t t e r n s a r e s h a p e d b y a l t e r a t i o n s i n o t h e r p r o c e s s e s a s w e l l ( F i g u r e 1 . 3 ) . T h e m e t h y l g r o u p u t i l i z e d i n 5 - m e t h y l c y t o s i n e s y n t h e s i s r e a c t i o n s i s d e r i v e d d i r e c t l y f r o m S - a d e n o s y l r n e t h i o n i n e ( S A M ) , w h i c h i s g e n e r a t e d a s a r e s u l t o f l - c a r b o n m e t a b o l i c r e a c t i o n s . T h u s , l e v e l s o f S A M , l - c a r b o n m e t a b o l i s m s u b s t r a t e s , o r t h e r e l e v a n t e n z y m e s m i g h t c o n t r i b u t e t o c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n p a t t e r n s ( U l r e y e t a l . , 2 0 0 5 ) ( F i g u r e 1 . 4 ) . 1 4 n o l t a c l l p o r A N D t u o h t l w n o l t a l y h t o m o D M o t l ‘ l y l a t e d D N A o n , o n , I I # - S ’ G G C C A C G T G A C C G G - Z i ’ 3 ’ - C C G G T G C A C T G G C C - 5 ’ s " . 9 H . . . S ’ G G C C A C G T G A C C G G - 3 ’ 3 ’ - C C G G T G C A C T G G C C - S ’ d o n o v o m e t h y l a t i o n D N A r e p l i c a t i o n w i t h n o m a i n t o n m c o m e t h y l a t i o n S ’ G G C C A C G T G A C C G G J ’ ; 3 ’ - C C G G T G C A C T G G C C - 5 ’ H y p o m e t h y l a t e d D N A F r g u ' r e 1 . 2 D N A M e t h y l a t i o n , a H e r i t a b l e E p i g e n e t i c M o d i fi c a t i o n . I m m e d i a t e l y a f t e r r e p l i c a t i o n , D N A e x i s t s i n a h e m i m e t h y l a t e d s t a t e , a s t h e n e w l y s y n t h e s i z e d s t r a n d h a s n o t y e t b e e n m e t h y l a t e d t o m a t c h t h e p a t t e r n o f t h e p a r e n t s t r a n d . F o l l o w i n g D N A s y n t h e s i s , t h e m a i n t e n a n c e m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D N M T l ) a d d s m e t h y l g r o u p s t o t h e a p p r o p r i a t e p o s i t i o n s o f t h e u n m e t h y l a t e d s t r a n d . I f r e p l i c a t i o n o c c u r s w i t h o u t m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n , t h e D N A b e c o m e s h y p o m e t h y l a t e d i n a “ p a s s i v e ” f a s h i o n . D N A c a n a l s o d e m e t h y l a t e b y a n “ a c t i v e ” m e c h a n i s m ( i . e . w i t h o u t D N A r e p l i c a t i o n ) , h o w e v e r , i t i s n o t c l e a r e x a c t l y w h i c h e n z y m e s a r e r e s p o n s i b l e f o r t h i s p r o c e s s . A l t e r n a t i v e l y , h y p o m e t h y l a t e d D N A c a n b e c o m e m e t h y l a t e d v i a 2 c h a r a c t e r i z e d d e n o v o m e t h y l t r a n s f e r a s e s ( D N M T 3 A a n d D N M T 3 B ) . ( A d a p t e d f r o m H e r g e r s b e r g , 1 9 9 1 ) 1 5 fi g u r e — l g D N A M e t h y l a t i o n i s A fi e c t e d b y M u l t i p l e F a c t o r s . T h e p r o c e s s o f D N A m e t h y l a t i o n i s d e p e n d e n t u p o n n u m e r o u s f a c t o r s . V a r i a t i o n o f a n y o n e o f t h e s e e l e m e n t s c a n d r a m a t i c a l l y a f f e c t n o r m a l D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s . N o t e t h a t c e l l u l a r d i f f e r e n t i a t i o n c a n b e a l t e r e d b y D N A m e t h y l a t i o n , a n d D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s c a n b e c h a n g e d u p o n c e l l u l a r d i f f e r e n t i a t i o n , h e n c e t h e p r e s e n c e o f t h e d o u b l e - h e a d e d a r r o w . ( A d a p t e d f r o m G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) . r H o m o c y s t e i n e ] 5 M T H F B e t a i n e " ‘ F ” " 1 " ? ? ? \ g y C h o l i n e L M e t h i o n i n a l s C y t o s i n e - D N A m e t h y l t r a r f ‘ s f e r a s e l 5 - m e t h y l c y t o s i n e D N A F i g u r e 1 . 4 D N A M e t h y l a t i o n a n d l - C a r b o n M e t a b o l i s m . T h e p r o c e s s o f D N A m e t h y l a t i o n i s d e p e n d e n t u p o n m u l t i p l e f a c t o r s , i n c l u d i n g o n e - c a r b o n m e t a b o l i c p a t h w a y s . T h e m e t h y l g r o u p s u t i l i z e d f o r D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e r e a c t i o n s o r i g i n a t e f r o m a v a r i e t y o f c o f a c t o r s a n d m e t h y l d o n o r s , s u c h a s c h o l i n e a n d f o l a t e . U l t i m a t e l y , D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e e n z y m e s t r a n s f e r a m e t h y l g r o u p f r o m S - a d e n o s y l r n e t h i o n i n e ( S A M ) t o t h e 5 p o s i t i o n o f t h e c y t o s i n e r i n g , r e s u l t i n g i n t h e g e n e r a t i o n o f 5 - m e t h y l c y t o s i n e a n d S - a d e n o s y l h o m o c y s t e i n e ( S A H ) . A b b r e v i a t i o n s : 5 M T H F , 5 - m e t h y l t e t r a h y d r o f o l a t e ; T I - I F , t e t r a h y d r o f o l a t e . ( A d a p t e d f r o m D o l i n o y e t a l . , 2 0 0 6 ) 1 7 R e g u l a t i o n o f D N A M e t h y l a t i o n P a t t e r n s : D N A M e t h y l t r a n s f a s e E n z y m e s E u k a r y o t i c D n m t l p r e f e r s h e m i - m e t h y l a t e d D N A a s a s u b s t r a t e , a n d a s s u c h , h a s b e e n d e s c r i b e d a s t h e m a j o r m a i n t e n a n c e m e t h y l t r a n s f e r a s e t h a t m e t h y l a t e s n e w l y r e p l i c a t e d D N A . I n d e e d , D n m t l a c c u m u l a t e s a t r e p l i c a t i o n f o c i d u r i n g t h e S - p h a s e o f t h e c e l l c y c l e ( L e o n h a r d t e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e e n z y m e e x h i b i t s a 5 - t o 3 0 - f o l d g r e a t e r r a t e o f m e t h y l t r a n s f e r t o h e m i - m e t h y l a t e d , a s c o m p a r e d t o u n m e t h y l a t e d s u b s t r a t e s , i s h i g h l y p r o c e s s i v e , a n d s h o w s n o s e q u e n c e s p e c i fi c i t y ( G o y a l e t a l . , 2 0 0 6 ) . D N A r e p l i c a t i o n a p p e a r s t o b e c o u p l e d t o t h e p r o c e s s o f D N A m e t h y l a t i o n , a s D n m t l c a n i n t e r a c t w i t h P C N A ( a c r i t i c a l c o m p o n e n t o f t h e D N A r e p l i c a t i o n m a c h i n e r y ) ( S c h e r m e l l e h e t a l . , 2 0 0 7 ) . W h i l e t h i s r e l a t i o n s h i p i s n o t c r i t i c a l f o r m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n , i t e n h a n c e s t h e p o s t - r e p l i c a t i v e m e t h y l a t i o n e f fi c i e n c y t h e e n z y m e ( S c h e r m e l l e h e t a l . , 2 0 0 7 ) . D n m t l c a n a l s o b e r e c r u i t e d t o s i t e s o f D N A r e p a i r , s u g g e s t i n g a m e c h a n i s m b y w h i c h i t c o u l d m o r e p r o fi c i e n t l y r e - e s t a b l i s h e p i g e n e t i c s t a t u s a f t e r r e p a i r o f d a m a g e d D N A ( M o r t u s e w i c z , 2 0 0 5 ) . A v a r i e t y o f m u t a n t a l l e l e s , p r o d u c i n g v a r y i n g d e g r e e s o f D n m t l e x p r e s s i o n , h a v e b e e n e m p l o y e d t o m o r e f u l l y e l u c i d a t e i t s b i o l o g i c a l r o l e s . D n m t I ' " m i c e d i e d u r i n g e a r l y e m b r y o g e n e s i s a n d e x h i b i t a s u b s t a n t i a l l o s s o f D N A m e t h y l a t i o n ( L i e t a l . , 1 9 9 2 ) . O t h e r e f f e c t s o f d e c r e a s e d / a b s e n t D n m t l e x p r e s s i o n i n c l u d e a b n o r m a l i m p r i n t i n g , a b e r r a n t X - c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n , a n d d e m e t h y l a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f p a r t i c u l a r t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s ( L i e t a l . , 1 9 9 3 ; P a n n i n g a n d J a e n i s c h , 1 9 9 6 ; W a l s h a n d B e s t o r , 1 9 9 9 ) . C o n v e r s e l y , p h e n o t y p e s o f D n m t l o v e r e x p r e s s i o n i n e m b r y o n i c s t e m c e l l s i n c l u d e l e t h a l i t y , g e n o m i c h y p e r r n e t h y l a t i o n , a n d l o s s o f i m p r i n t i n g ( B i n i s z k i e w i c z e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h u s , i t a p p e a r s t h a t a d e l i c a t e b a l a n c e o f D n m t l e x p r e s s i o n a n d / o r a c t i v i t y i s n e c e s s a r y 1 8 f o r p r o p e r m e t h y l a t i o n l e v e l s a n d c e l l u l a r f u n c t i o n . T h e r e e x i s t t w o c l o s e l y r e l a t e d d e n o v o m e t h y l t r a n s f e r a s e s , D n m t 3 a a n d D n m t 3 b , w h i c h c a n a d d m e t h y l g r o u p s t o u n m e t h y l a t e d s u b s t r a t e s w i t h o u t d i s c e m a b l e s e q u e n c e s p e c i fi c i t y ( O k a n o e t a l . , 1 9 9 8 ) . I n m a m m a l s , d e n o v o m e t h y l a t i o n i s a c r i t i c a l f a c t o r i n k e y p r o c e s s e s , i n c l u d i n g t r a n s p o s o n s u p p r e s s i o n , g e n o m i c i m p r i n t i n g , a n d X - c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n . W h i l e t h e s e e n z y m e s a r e b o t h e x p r e s s e d a t l o w l e v e l s i n s o m a t i c c e l l s , a n d h i g h l e v e l s i n e m b r y o n i c s t e m c e l l s , e a r l y e m b r y o s , a n d d e v e l o p i n g g e r m c e l l s , t h e y a r e t o g e t h e r r e s p o n s i b l e f o r d e n o v o m e t h y l a t i o n d u r i n g d e v e l o p m e n t ( O k a n o e t a l . , 1 9 9 9 ; C h e n e t a l . , 2 0 0 3 ; H a t a e t a l . , 2 0 0 2 ) . M o r e o v e r , D n m t l a n d D n m t 3 a / 3 b h a v e d i s t i n c t f u n c t i o n s , a s e v i d e n c e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t n e i t h e r D n m t l o v e r e x p r e s s i o n i n D n m t 3 a ' / ' / 3 b " ' e m b r y o n i c s t e m c e l l s n o r o v e r e x p r e s s i o n o f D n m t 3 a i n D n m t 1 ' / ' c e l l s p r o p e r l y r e - e s t a b l i s h e d n o r m a l m e t h y l a t i o n p a t t e r n s ( C h e n e t a l . , 2 0 0 3 ) . D n m t 3 a a n d D n m t 3 b a p p e a r t o m e t h y l a t e d i f f e r e n t t a r g e t s a n d h a v e s p e c i a l i z e d b i o l o g i c a l r o l e s . D n m t 3 a i s a s s o c i a t e d w i t h h e t e r o c h r o m a t i n ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 1 ) a n d i s e s s e n t i a l f o r b o t h p a t e r n a l a n d m a t e r n a l i m p r i n t i n g ( K a n e d a e t a l . , 2 0 0 4 ) . D n m t 3 a a l o n e c a n m e t h y l a t e m a j o r s a t e l l i t e r e p e a t s w i t h i n t h e p e r i c e n t r o m e r i c r e g i o n a n d a s p e c i fi c C p G s i t e w i t h i n t h e X i s t p r o m o t e r r e g i o n ( C h e n e t a l . , 2 0 0 3 ) , p l u s n o n - C p G s i t e s ( R a m s a h o y e e t a l . , 2 0 0 0 ) . C o n v e r s e l y , D n m t 3 b l o c a l i z e s t o b o t h c e n t r o m e r i c a n d p e r i c e n t r o m e r i c h e t e r o c h r o m a t i n a n d i s p r i m a r i l y r e s p o n s i b l e f o r m e t h y l a t i o n a t c e n t r o m e r i c m i n o r s a t e l l i t e r e p e a t s ( O k a n o e t a l . , 1 9 9 9 ) . I n m o u s e e m b r y o n i c fi b r o b l a s t s , i n a c t i v a t i o n o f D n m t 3 b r e s u l t s i n g l o b a l D N A h y p o m e t h y l a t i o n , c h r o m o s o m a l i n s t a b i l i t y , a n d s p o n t a n e o u s i m m o r t a l i z a t i o n o r p r e m a t u r e s e n e s c e n c e ( D o d g e e t a l . , 2 0 0 5 ) , w h e r e a s i n a c t i v a t i o n o f D n m t 3 a d o e s n o t . I n a c t i v a t i n g m u t a t i o n s i n D n m t 3 b a r e r e s p o n s i b l e f o r 1 9 I C F ( i m m u n o d e fi c i e n c y , c e n t r o m e r e i n s t a b i l i t y , a n d f a c i a l a n o m a l i e s ) s y n d r o m e , w h i c h i s c h a r a c t e r i z e d b y s e v e r e h y p o m e t h y l a t i o n o f c l a s s i c a l s a t e l l i t e D N A ( X u e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e r e i s a n e l e v a t e d l e v e l o f c o m p l e x i t y w i t h r e g a r d t o t h e f u n c t i o n s o f D n m t l , 3 a , a n d 3 b , a s t h e d e n o v o m e t h y l t r a n s f e r a s e s a r e i n v o l v e d i n m a i n t a i n i n g g l o b a l m e t h y l a t i o n p a t t e r n s , w h i c h h a s t y p i c a l l y b e e n t h o u g h t t o b e t h e r o l e o f D n m t l . T h i s i s e v i d e n c e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t i n a c t i v a t i o n o f D n m t 3 a a n d 3 b i n e m b r y o n i c s t e m c e l l s c a u s e d d e m e t h y l a t i o n o f i m p r i n t e d g e n e s , n o n i m p r i n t e d g e n e s , a n d r e p e t i t i v e e l e m e n t s ( C h e n e t a l . , 2 0 0 3 ) . A f t e r t r e a t m e n t o f c e l l s w i t h a D N A d e m e t h y l a t i n g a g e n t , D n m t 3 a a n d D n m t 3 b w e r e n e c e s s a r y t o r e s t o r e m e t h y l a t i o n p a t t e r n s t o d i s t i n c t g e n o m i c s e q u e n c e s t h a t D n m t l c o u l d n o t r e - m e t h y l a t e a l o n e , f u r t h e r s u p p o r t i n g t h e c o o p e r a t i o n o f a l l 3 D n m t ’ s i n p r e s e r v i n g n o r m a l m e t h y l a t i o n p a t t e r n s ( L i a n g e t a l . , 2 0 0 2 ) . D n m t 3 L i s a c a t a l y t i c a l l y i n a c t i v e p a r a l o g t h a t c a n s t i m u l a t e t h e d e n o v o m e t h y l t r a n s f e r a s e a c t i v i t y o f D n m t 3 a ( C h e d i n e t a l . , 2 0 0 2 ) . I n o o c y t e s , D n m t 3 L i s e s s e n t i a l f o r t h e m e t h y l a t i o n o f d i f f e r e n t i a l l y m e t h y l a t e d r e g i o n s i n m a t e r n a l l y i m p r i n t e d g e n e s i n o o c y t e s ( B o u r c ' h i s e t a l . , 2 0 0 1 ) . I n e a r l y g e r m c e l l s , a b l a t i o n o f t h e D n m t 3 L g e n e c a u s e d d e m e t h y l a t i o n o f l o n g t e r m i n a l r e p e a t ( L T R ) a n d n o n - L T R r e t r o t r a n s p o s o n s , r e s u l t i n g i n t h e t r a n s c r i p t i o n o f t h e s e s e q u e n c e s i n s p e r r n a t o g o n i a a n d s p e r r n a t o c y t e s ( B o u r c ' h i s a n d B e s t o r , 2 0 0 4 ) . F i n a l l y , D n m t 2 h a s w e a k D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e a c t i v i t y , a n d p r i m a r i l y m e t h y l a t e s a s p a r t i c a c i d t r a n s f e r R N A , i n d i c a t i n g a l i m i t e d f u n c t i o n a l r o l e i n t h e D N A m e t h y l a t i o n p r o c e s s ( J e l t s c h e t a l . , 2 0 0 6 ) . R e g u l a t i o n o f D N A M e t h y l a t i o n P a t t e r n s : D N A D e m e t h y l a t i o n D N A c a n b e c o m e d e m e t h y l a t e d i n t w o w a y s . P a s s i v e d e m e t h y l a t i o n i s t h e r e s u l t 2 0 o f a l a c k o f m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n f o l l o w i n g D N A s y n t h e s i s ( H o w l e t t a n d R e i k , 1 9 9 1 ) . I n d e e d , m o s t o f t h e g e n o m e - w i d e d e m e t h y l a t i o n t h a t o c c u r s d u r i n g e a r l y d e v e l o p m e n t i s p a s s i v e i n n a t u r e ( R o u g i e r e t a l . , 1 9 9 8 ) . A l t e r n a t i v e l y , a c t i v e d e m e t h y l a t i o n ( i . e . i n d e p e n d e n t o f D N A r e p l i c a t i o n ) a l s o r e s u l t s i n h y p o m e t h y l a t e d D N A . A f t e r f e r t i l i z a t i o n , t h e p a t e r n a l g e n o m e b e c o m e s g l o b a l l y h y p o m e t h y l a t e d b y a n a c t i v e m e c h a n i s m ( O s w a l d e t a l . , 2 0 0 0 ) . F u r t h e r m o r e , t h e p r o m o t e r r e g i o n s o f t h e 1 1 2 ( B r u n i q u e l e t a l . , 2 0 0 3 ) a n d p S 2 / T F F 1 ( M é t i v i e r e t a l . , 2 0 0 8 ) g e n e s a r e a l s o a c t i v e l y d e m e t h y l a t e d . E v i d e n c e o f t h e e x i s t e n c e o f b o n a fi d e d e m e t h y l a s e s i n m a m m a l s i s c o n t r o v e r s i a l . I n i t i a l l y , d e m e t h y l a s e a c t i v i t y w a s d e c u m e n t e d i n t w o d i f f e r e n t m o d e l s y s t e m s ( G j e r s e t a n d M a r t i n 1 9 8 2 ; W e i s s e t a l . , 1 9 9 6 ) , b u t n o p o t e n t i a l d e m e t h y l a s e p r o t e i n s w e r e d e s c r i b e d . A n R N A - d e p e n d e n t S m e C g l y c o s y l a s e i n t h e c h i c k e m b r y o l y s a t e s ( J o s t , 1 9 9 3 ) w a s l a t e r r e v e a l e d a s t h y m i n e D N A g l y c o s y l a s e . H o w e v e r , t h i s e n z y m e i s q u i t e i n e f fi c i e n t a t r e m o v i n g 5 - m e t h y l c y t o s i n e , a n d t h u s i t a n u n l i k e l y d e m e t h y l a s e c a n d i d a t e ( C o r t a z a r e t a l . , 2 0 0 7 ) . A d d i t i o n a l l y , h u m a n M B D 4 p o s s e s s e s 5 - m e t h y l c y t o s i n e D N A g l y c o s y l a s e a c t i v i t y ( Z h u e t a l . , 2 0 0 0 ) . A n o t h e r g r o u p d i s c o v e r e d M B D 2 , a d e m e t h y l a s e t h a t c o u l d r e m o v e m e t h y l g r o u p s u s i n g o n l y w a t e r a s a c o f a c t o r ( B h a t t a c h a r y a e t a 1 . , 1 9 9 9 ) , h o w e v e r , t h e i r fi n d i n g s c o u l d n o t b e r e p r o d u c e d . M B D 3 a p p e a r s t o i n d u c e a c t i v e d e m e t h y l a t i o n a n d t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n o f s p e c i fi c g e n o m i c t a r g e t s ( B r o w n e t a l . , 2 0 0 8 ) . M o s t r e c e n t l y , c o n fl i c t i n g r e p o r t s h a v e e m e r g e d r e g a r d i n g t h e a b i l i t y o f G A D D 4 5 a t o p a r t i c i p a t e i n a c t i v e d e m e t h y l a t i o n ( O o i a n d B e s t o r , 2 0 0 8 ) . A n o t h e r p a t h w a y t h a t c a n r e s u l t i n d e m e t h y l a t i o n i n v o l v e s o x i d a t i v e d e a m i n a t i o n . I n v i t r o s t u d i e s h a v e a s c e r t a i n e d t h a t D n m t 3 a a n d 3 b m e d i a t e d e a r n i n a t i o n o f 5 - m e t h y l c y t o s i n e , r e s u l t i n g i n t h e g e n e r a t i o n o f t h y m i n e , w h i c h p r o d u c e s a 2 1 t h y m i n e z g u a n i n e m i s m a t c h p a i r ( M é t i v i e r e t a l . , 2 0 0 8 ) . I t w a s t h e n p r o p o s e d t h a t b a s e e x c i s i o n r e p a i r m a c h i n e r y i s r e c r u i t e d a n d c o n v e r t s t h e b a s e p a i r b a c k t o g u a n i n e z u n m e t h y l a t e d c y t o s i n e ( M é t i v i e r e t a l . , 2 0 0 8 ) . I n s u m m a r y , t h e e x i s t e n c e o f a b o n a fi d e a c t i v e d e m e t h y l a s e e n z y m e r e m a i n s c o n t r o v e r s i a l . T r a n s c r i p t i o n a l R e g u l a t i o n : D N A M e t h y l a t i o n T r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s i o n , d u e t o D N A h y p e r m e t h y l a t i o n , c a n b e a c c o m p l i s h e d i n m u l t i p l e w a y s . S t e r i c b l o c k i n g b y t h e m e t h y l g r o u p s o f t r a n s f a c t o r s c a n p r e v e n t t h e m f r o m b i n d i n g t h e i r c o g n a t e c i s e l e m e n t s . M e t h y l a t i o n a t a C A M P - r e s p o n s i v e e l e m e n t i m p e d e s t r a n s c r i p t i o n f a c t o r b i n d i n g a n d b l o c k s t r a n s c r i p t i o n i n v i t r o a n d i n v i v o ( I g u c h i - A r i g a a n d S c h a f f n e r , 1 9 8 9 ) . A d d i t i o n a l l y , m e t h y l a t i o n o f s p e c i fi c C p G d i n u c l e o t i d e s a b r o g a t e s t h e b i n d i n g o f a k e y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r ( M L T F ) a n d p r e v e n t s g e n e t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e a d e n o v i r u s m a j o r l a t e p r o m o t e r ( W a t t a n d M o l l o y , 1 9 8 8 ) . T h e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r C T C F , i n v o l v e d i n t h e i m p r i n t i n g p r o c e s s a t t h e H 1 9 / I g 2 l o c u s , c a n b i n d t o a D N A s e q u e n c e o n t h e m a t e r n a l a l l e l e , b e t w e e n t h e I n g p r o m o t e r a n d i t s d o w n s t r e a m e n h a n c e r , e f f e c t i v e l y r e p r e s s i n g I g f 2 t r a n s c r i p t i o n . O n t h e p a t e r n a l a l l e l e , h o w e v e r , C T C F b i n d i n g i s i n h i b i t e d b y m e t h y l a t i o n o f i t s b i n d i n g s i t e , a l l o w i n g t h e e n h a n c e r e l e m e n t t o a c t i v a t e 1 3 7 2 t r a n s c r i p t i o n ( B e l l a n d F e l s e n f e l d , 2 0 0 0 ) . D N A m e t h y l a t i o n c a n a l s o c o n t r i b u t e t o t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l b y i n t e r a c t i n g w i t h m e t h y l - b i n d i n g p r o t e i n s t h a t a r e a t t r a c t e d t o 5 - m e t h y l c y t o s i n e . T h e s e p r o t e i n s i n t e r p r e t t h e i n f o r m a t i o n e n c o d e d b y t h e m e t h y l a t i o n m a r k s a n d p a r t i c i p a t e i n t h e r e c r u i t m e n t o f e n z y m e s a n d a d d i t i o n a l t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s o r s , w h i c h c u l m i n a t e i n g e n e s i l e n c i n g . T h e t w o c l a s s e s o f m e t h y l - b i n d i n g p r o t e i n s a r e t h o s e o f t h e M B D f a m i l y ( M e C P 2 , M B D l , 2 2 M B D 2 , M B D 3 a n d M B D 4 ) ( H e n d r i c h a n d B i r d , 1 9 9 8 ) , a n d t h o s e t h a t p o s s e s s K a i s o - l i k e z i n c fi n g e r s ( K a i s o , Z B T B 4 a n d Z B T B 3 8 ) ( F i l i o n e t a l . , 2 0 0 6 ) . F o u r o f t h e M B D p r o t e i n s ( e x c l u d i n g M B D 4 ) r e c r u i t a n d p h y s i c a l l y i n t e r a c t w i t h s l i g h t l y d i f f e r e n t c o m b i n a t i o n s o f e n z y m e s a n d t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s o r s , i n c l u d i n g c h r o m a t i n - m o d i f y i n g e n z y m e s a n d n u c l e o s o m e r e m o d e l i n g p r o t e i n s ( H D A C l , H D A C 2 , S u v 3 9 h 1 , S E T D B I , M i - 2 , S i n 3 A ) ( L o p e z - S e r r a a n d E s t e l l e r , 2 0 0 8 ) . I n t h i s f a s h i o n , t h e c h r o m a t i n i s r e s t r u c t u r e d i n t o a r e p r e s s i v e f o r m , t h u s a b r o g a t i n g t r a n s c r i p t i o n . I n h u m a n c a n c e r , h y p e r m e t h y l a t e d p r o m o t e r s o f t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s c o n t a i n e d d i v e r s e g r o u p s o f M B D s , w h i c h w e r e d e p e n d e n t u p o n b o t h t h e g e n e a n d t h e t u m o r t y p e ( L o p e z - S e r r a e t a l . , 2 0 0 6 ) . A l l o f t h e a f o r e m e n t i o n e d z i n c fi n g e r p r o t e i n s c a n a l s o p a r t i c i p a t e i n m e t h y l a t i o n - d e p e n d e n t t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s i o n ( F i l i o n e t a l . , 2 0 0 6 ; Y o o n e t a l . , 2 0 0 3 ) . N o n e t h e l e s s , i t i s s t i l l e l u s i v e a s t o w h e t h e r , a n d h o w , m e t h y l - b i n d i n g p r o t e i n s a r e t a r g e t e d t o s p e c i fi c g e n o m i c r e g i o n s t o e x e r t t h e i r e f f e c t s . A l t h o u g h D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s h a v e b e e n d i s c u s s e d i n t h e c o n t e x t o f t h e p a r a d i g m “ i n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n l e a d t o d e c r e a s e s i n g e n e e x p r e s s i o n ” a n d v i c e v e r s a , i t i s c r u c i a l t h a t o n e c o n s i d e r s u n c o n v e n t i o n a l s i t u a t i o n s a s w e l l . A b e r r a n t h y p e r m e t h y l a t i o n o f i m p r i n t i n g c o n t r o l r e g i o n s ( I C R ) a t a n i m p r i n t e d l o c u s c a n c a u s e i n c r e a s e d I g 2 e x p r e s s i o n t h a t i s a s s o c i a t e d w i t h c a n c e r ( E h r l i c h , 2 0 0 2 ; F e i n b e r g , 2 0 0 1 ; S t e e n m a n e t a 1 . , 1 9 9 4 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e g r o w t h s u p p r e s s o r g e n e I g fi ' 2 i s i m p r i n t e d i n m i c e , a n d m e t h y l a t i o n w i t h i n a D M R o n t h e m a t e r n a l a l l e l e i s r e s p o n s i b l e f o r m a t e r n a l e x p r e s s i o n o f t h e g e n e ( W u t z e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h u s , i n t h e s e e x a m p l e s , D N A h y p e r m e t h y l a t i o n c o n t r i b u t e s t o t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n , i n d i c a t i n g t h a t i t i s e n t i r e l y p o s s i b l e f o r e l e v a t e d m e t h y l a t i o n l e v e l s t o f a c i l i t a t e g e n e e x p r e s s i o n . T h i s c o n c e p t h a s 2 3 i m p l i c a t i o n s i n m y r e s e a r c h , a s g e n e e x p r e s s i o n d i d n o t a l w a y s i n v e r s e l y c o r r e l a t e w i t h m e t h y l a t i o n s t a t u s ( a s s u m i n g D N A m e t h y l a t i o n c o n t r o l s t r a n s c r i p t i o n ) , a n d t h e r e f o r e , o n e m u s t c o n s i d e r a l t e r n a t i v e s t o t h e p a r a d i g m a t i c w a y o f d r i n k i n g . T r a n s c r i p t i o n a l R e g u l a t i o n : D N A M e t h y l a t i o n a n d C h r o m a t i n A l t e r a t i o n s T w o t y p e s o f e p i g e n e t i c m o d i fi c a t i o n s , D N A m e t h y l a t i o n a n d c h r o m a t i n a l t e r a t i o n s , a r e c l o s e l y i n t e r t w i n e d , a n d t h e l a t t e r m u s t b e c o n s i d e r e d w h e n e l u c i d a t i n g t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h c h a n g e s i n D N A m e t h y l a t i o n e x e r t t r a n s c r i p t i o n a l e f f e c t s . C h r o m a t i n s t r u c t u r e c o n t r o l s t h e s p a t i a l a n d t e m p o r a l c h a n g e s i n g e n e e x p r e s s i o n n e c e s s a r y a t d i f f e r e n t s t a g e s o f l i f e , a n d a d d i n g t o t h e d y n a m i c n a t u r e o f t h i s o r g a n i z a t i o n a r e e n z y m e - c a t a l y z e d p o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n s ( e . g . a c e t y l a t i o n , m e t h y l a t i o n ) t o t h e N - t e r m i n a l t a i l s o f h i s t o n e p r o t e i n s ( K o u z a r i d e s , 2 0 0 7 ) . T h e s e h e r i t a b l e m o d i fi c a t i o n s , a n d c o m b i n a t i o n s o f t h e m , a r e c o l l e c t i v e l y r e f e r r e d t o a s t h e “ h i s t o n e c o d e ” ( S t r a h l a n d A l l i s , 2 0 0 0 ) , w h i c h p l a y s k e y r o l e s i n 2 d i s t i n c t p r o c e s s e s : 1 ) a l t e r a t i o n s i n n u c l e o s o m e s t r u c t u r e , a n d 2 ) r e c r u i t m e n t o f n o n h i s t o n e p r o t e i n s ( e . g . H P - l ) , t h a t m o d u l a t e g e n e e x p r e s s i o n , p l u s o t h e r c h r o m a t i n f u n c t i o n s ( K o u z a r i d e s , 2 0 0 7 ) . A c o m p l e x a n d v a r i a b l e r e l a t i o n s h i p e x i s t s b e t w e e n D N A m e t h y l a t i o n a n d h i s t o n e m o d i fi c a t i o n s , w i t h r e g a r d . t o t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l . F o r e x a m p l e , D n m t l a n d D n m t 3 a d i r e c t l y a s s o c i a t e w i t h h i s t o r i c m e t h y l t r a n s f e r a s e s , s u g g e s t i n g t h e i m p o r t a n c e o f i n t e r p l a y b e t w e e n t h e s e 2 e p i g e n e t i c m e c h a n i s m s f o r t h e e n h a n c e m e n t o f g e n e s i l e n c i n g ( F u k s e t a l . , 2 0 0 3 ) . F u r t h e r m o r e , D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e e n z y m e s h a v e b e e n s h o w n t o a s s o c i a t e w i t h h i s t o n e d e a c e t y l a s e s ( B u r g e r s e t a l . , 2 0 0 2 ) . I n d e e d , h i s t o n e m o d i fi c a t i o n s a n d D N A 2 4 m e t h y l a t i o n n o t o n l y c o o p e r a t e t o s i l e n c e g e n e s , b u t a l s o p a r t i c i p a t e i n f e e d b a c k l o o p s t h a t f u r t h e r a u g m e n t t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s i o n ( F u k s , 2 0 0 5 ) . T h e h i e r a r c h i c a l t i m i n g o f t h e s e e v e n t s , h o w e v e r , r e m a i n s c o n t r o v e r s i a l . I n o t h e r w o r d s , D N A m i g h t i n i t i a t e h i s t o n e m o d i fi c a t i o n s , h i s t o n e m o d i fi c a t i o n s m i g h t i n fl u e n c e D N A m e t h y l a t i o n , a n d / o r n u c l e o s o m e r e m o d e l i n g m i g h t f a c i l i t a t e D N A m e t h y l a t i o n . I n f a c t , t h e r e i s e v i d e n c e t o s u p p o r t e a c h o f t h e s e p o s s i b i l i t i e s . I n s o m e i n s t a n c e s , D N A m e t h y l a t i o n i s t h e i n i t i a l c h a n g e t h a t s t i m u l a t e s a l t e r a t i o n s i n g e n e e x p r e s s i o n , a n d c h r o m a t i n m o d i fi c a t i o n s o c c u r s u b s e q u e n t t o t h i s . A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , m e t h y l - b i n d i n g p r o t e i n s c a n r e c r u i t c h r o m a t i n - m o d i f y i n g a n d n u c l e o s o m e - r e m o d e l i n g e n z y m e s , i n c l u d i n g h i s t o n e d e a c e t y l a s e s , w h i c h h a v e t h e c a p a c i t y t o a f f e c t g e n e e x p r e s s i o n . W i t h i n t h e c o n t e x t o f c a n c e r , g e n e s i l e n c i n g h a s b e e n a s s e s s e d u s i n g D N A m e t h y l a t i o n a n d h i s t o n e d e a c e t y l a s e i n h i b i t o r s , a n d r e s u l t s i n d i c a t e t h a t D N A m e t h y l a t i o n p l a y s t h e d o m i n a n t r o l e i n g e n e e x p r e s s i o n ( C a m e r o n e t a l . , 1 9 9 9 ) . I n s o m e s i t u a t i o n s , m o d i fi c a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n a r e s e c o n d a r y t o h i s t o n e m o d i fi c a t i o n s , a n d t h e f o r m e r p r o v i d e s a n a d d i t i o n a l r e p r e s s i v e l a y e r t h a t “ l o c k s i n ” g e n e s i l e n c i n g , e . g . d u r i n g X - c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n , h y p e r m e t h y l a t i o n s t a b i l i z e s s i l e n c i n g , b u t d o e s n o t i n s t i g a t e i t ( H e a r d , 2 0 0 4 ) . T r i m e t h y l a t i o n o f l y s i n e 9 o n h i s t o n e H 3 c a n g u i d e D n m t 3 b t o s a t e l l i t e r e p e a t e l e m e n t s i n p e r i c e n t r i c h e t e r o c h r o m a t i n , t h u s d i c t a t i n g D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s ( L e h n e r t z e t a l . , 2 0 0 3 ) . A l s o , g e n e s i l e n c i n g c a n o c c u r i n c o n j u n c t i o n w i t h h i s t o n e m o d i fi c a t i o n s , w i t h o u t r e l e v a n t D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 3 ) . A T P - d e p e n d e n t c h r o m a t i n r e m o d e l i n g i n v o l v e s e v e n t s w h i c h a l t e r n u c l e o s o m e s t r u c t u r e . N u c l e o s o m e r e m o d e l i n g c o m p l e x e s b e l o n g t o 4 m a j o r f a m i l i e s : S W I / S N F , 2 5 I S W I , N U R D / M i - 2 / C H D , a n d I N O 8 O ( W a n g e t a l . , 2 0 0 7 ) . F u r t h e r d e m o n s t r a t i n g t h e c o m p l e x i t y o f t h e i n t e g r a t i o n o f D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s w i t h o t h e r e p i g e n e t i c p r o c e s s e s , l a c k o f L s h , a m e m b e r o f t h e S N F 2 f a m i l y o f c h r o m a t i n r e m o d e l i n g p r o t e i n s , r e s u l t s i n a b e r r a n t g l o b a l m e t h y l a t i o n l e v e l s , i m p l y i n g t h a t c h r o m a t i n r e m o d e l i n g i s c r i t i c a l f o r t h e e s t a b l i s h m e n t o f p r o p e r D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s ( D e n n i s e t a l . , 2 0 0 1 ) . M o r e o v e r , t h e c h r o m a t i n - r e m o d e l i n g f a c t o r s B r m a n d B r g I , w h i c h c a n m o d u l a t e t r a n s c r i p t i o n t h e m s e l v e s , t r i g g e r D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t u l t i m a t e l y a f f e c t g e n e e x p r e s s i o n ( B a n i n e e t a l . , 2 0 0 5 ) . T h u s , t h e p r o c e s s e s o f D N A m e t h y l a t i o n , h i s t o r i c m o d i fi c a t i o n , a n d n u c l e o s o m e r e m o d e l i n g c o n c e r t e d l y r e g u l a t e g e n e t r a n s c r i p t i o n , a s w e l l a s t h e a c t i o n s o f o n e a n o t h e r . R o l e s o f D N A M e t h y l a t i o n i n N o r m a l P h y s i o l o g y I n n o r m a l p h y s i o l o g i c a l s i t u a t i o n s , D N A m e t h y l a t i o n p l a y s a v a r i e t y o f r o l e s i n c e l l s . F o r e x a m p l e , d y n a m i c c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n p a t t e r n s d u r i n g d e v e l o p m e n t a r e e s p e c i a l l y s i g n i fi c a n t . T h e g e n o m e s o f p r i m o r d i a l g e r m c e l l s a r e g l o b a l l y d e m e t h y l a t e d b y e m b r y o n i c d a y 1 3 t o 1 4 , a n d a l t h o u g h i t i s n o t k n o w n i f t h i s p r o c e s s i s a c t i v e o r p a s s i v e i n n a t u r e , i t i s c r u c i a l f o r t h e r e s e t t i n g o f i m p r i n t i n g m a r k s ( R e i k e t a l . , 2 0 0 1 ) . S e v e r a l d a y s l a t e r , r e m e t h y l a t i o n o f s i n g l e - c o p y g e n e s a n d i m p r i n t e d l o c i o c c u r s w i t h i n t h e g e n o m e s o f b o t h m a l e a n d f e m a l e p r i m o r d i a l g e r m c e l l s . P o s t - f e r t i l i z a t i o n , a s e c o n d b r o a d w a v e o f d e m e t h y l a t i o n t a k e s p l a c e i n e a r l y e m b r y o s : t h e p a t e r n a l g e n o m e i s d e m e t h y l a t e d i n a n a c t i v e m a n n e r , a n d t h e m a t e r n a l i n a p a s s i v e m a n n e r . S i m u l t a n e o u s l y , c e r t a i n i m p r i n t e d g e n e s a n d r e p e a t s e q u e n c e s a r e p r o t e c t e d , s u c h t h a t t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s p e r s i s t , h o w e v e r , t h e m e c h a n i s m ( s ) r e s p o n s i b l e f o r t h i s a r e u n c l e a r . F i n a l l y , 2 6 p o s t z y g o t i c p a t e r n a l a n d m a t e r n a l g e n o m e s a r e r e m e t h y l a t e d t o v a r y i n g d e g r e e s ( R e i k e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e r e i s l i m i t e d e v i d e n c e t h a t m e t h y l a t i o n r e g u l a t e s c e l l - t y p e s p e c i fi c g e n e s d u r i n g d e v e l o p m e n t , a n d t h e p u r p o s e s o f a n y k n o w n c h a n g e s r e m a i n l a r g e l y u n d e t e r m i n e d . E x p r e s s i o n o f t h e m a s p i n g e n e i s c o n t r o l l e d b y D N A m e t h y l a t i o n , a n d w a s u n m e t h y l a t e d a n d e x p r e s s e d i n c e l l s o f e p i t h e l i a l o r i g i n , b u t m e t h y l a t e d a n d r e p r e s s e d i n m e s e n c h y m a l a n d h a e m a t o p o e t i c c e l l s ( F u t s c h e r e t a l . , 2 0 0 2 ) . A d d i t i o n a l s t u d i e s h a v e r e v e a l e d g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n i s m o d u l a t e d b y d i f f e r e n t i a t i o n - a s s o c i a t e d m e t h y l a t i o n c h a n g e s d u r i n g n o r m a l d e v e l o p m e n t , s u c h a s T F I I u / B - l i k e f a c t o r ( A l f ) , i n t e r f e r o n - g a m m a ( I fi r y ) , a n d t e s t i s - s p e c i fi c g e n e s ( o f t h e M A G E - L A G E - G A G E - B A G E s u p e r f a m i l y ) ( E h r l i c h , 2 0 0 3 ) . T w o k e y d e v e l o p m e n t a l p r o c e s s e s , e a c h n o n - m e n d e l i a n f o r m s o f i n h e r i t a n c e w h e r e b y o n e a l l e l e i s s i l e n c e d d u r i n g e m b r y o g e n e s i s , i n v o l v e a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n . X - c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n i s r e q u i r e d f o r d o s a g e c o m p e n s a t i o n o f X - l i n k e d g e n e s i n f e m a l e c e l l s , a n d r e s u l t s i n t h e s i l e n c i n g o f t h e r e d u n d a n t X c h r o m o s o m e . T h e i n i t i a t i o n o f s i l e n c i n g i s m a i n l y r e g u l a t e d b y a n o n c o d i n g R N A ( X i s t ) , f o l l o w e d b y d i s t i n c t c h r o m a t i n a l t e r a t i o n s , i n c l u d i n g h i s t o r i c m e t h y l a t i o n , w h i c h c o o p e r a t e t o f o r m r e p r e s s i v e h e t e r o c h r o m a t i n ( H e a r d , 2 0 0 4 ) . T h e n , i n c r e a s e d D N A m e t h y l a t i o n l e v e l s “ l o c k i n ” s t a b l e s i l e n c i n g o f t h e i n a c t i v e X c h r o m o s o m e , b u t d o n o t c o n t r i b u t e t o t h e i n i t i a t i o n o f i t ( H e a r d , 2 0 0 4 ; S a d o e t a l . , 2 0 0 4 ) . A t c e r t a i n l o c i , D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s a l s o c o n t r o l i m p r i n t i n g , a p r o c e s s b y w h i c h m o n o a l l e l i c e x p r e s s i o n i s m a i n t a i n e d i n t h e c e l l v i a s i l e n c i n g o f e i t h e r t h e p a t e r n a l o r m a t e r n a l a l l e l e . A n e x a m p l e o f a n i m p r i n t e d l o c u s a t w h i c h m e t h y l a t i o n p l a y s a v i t a l 2 7 r o l e i s t h e I g 2 / H 1 9 r e g i o n . T h e g r o w t h f a c t o r I g f 2 i s p a t e r n a l l y e x p r e s s e d a n d t h e n o n c o d i n g R N A H 1 9 i s m a t e r n a l l y e x p r e s s e d ( R e i k a n d M u r r e l l , 2 0 0 0 ) . T h e m a t e r n a l i m p r i n t i n g c o n t r o l r e g i o n ( I C R ) o f H 1 9 r e m a i n s u n m e t h y l a t e d , a l l o w i n g t h e b i n d i n g o f t h e C T C F p r o t e i n , t h u s i n h i b i t i n g I n g t r a n s c r i p t i o n b y b l o c k i n g t h e a c t i o n s o f d o w n s t r e a m e n h a n c e r e l e m e n t s , a n d f a c i l i t a t i n g H 1 9 t r a n s c r i p t i o n . C o n v e r s e l y , t h e m e t h y l a t e d I C R o f t h e p a t e r n a l a l l e l e p r e v e n t s C T C F b i n d i n g a n d H 1 9 t r a n s c r i p t i o n , c o n c u r r e n t l y d r i v i n g t r a n s c r i p t i o n o f I g 2 , w h o s e p r o m o t e r c a n b e i n fl u e n c e d b y t h e e n h a n c e r s ( R e i k a n d M u r r e l l , 2 0 0 0 ) . I t i s h y p o t h e s i z e d t h a t D N A m e t h y l a t i o n m a i n t a i n s g e n o m i c i n t e g r i t y v i a 3 m a i n m e c h a n i s m s . O n e r o l e o f i n t e r g e n i c m e t h y l a t i o n m i g h t b e t h e i n h i b i t i o n o f c r y p t i c t r a n s c r i p t i o n a l i n i t i a t i o n . W h i l e d a t a s u p p o r t i n g t h i s i d e a i s s p a r s e i n m a m m a l s , i t h a s b e e n s h o w n t h a t 5 - m e t h y l c y t o s i n e c a n b l o c k t r a n s c r i p t i o n a l e l o n g a t i o n i n p l a n t s ( Z i l b e r m a n e t a l . , 2 0 0 7 ) . S e c o n d l y , m e t h y l a t i o n m i g h t s i l e n c e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s , a s m o s t r e p e a t e l e m e n t s i n m a m m a l s a r e m e t h y l a t e d ( Y o d e r e t a l . , 1 9 9 7 ) . M o r e o v e r , D n m t l ' l ' m o u s e e m b r y o s e x h i b i t i n c r e a s e d t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n o f I A P r e t r o t r a n s p o s o n s ( W a l s h e t a 1 . , 1 9 9 8 ) , a n d s i m i l a r l y , i n g e r m c e l l s w h i c h l a c k 2 c o f a c t o r s ( L s h a n d , s e p a r a t e l y , D n m t 3 L ) w h i c h a r e e s s e n t i a l f o r t h e m a i n t e n a n c e o f m e t h y l a t i o n p a t t e r n s , I A P a n d / o r L I N E - l e l e m e n t s b e c o m e r e a c t i v a t e d ( B o u r c ’ h i s a n d B e s t o r , 2 0 0 4 ; D e L a F u e n t e e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h i r d l y , g e n o m i c i n s t a b i l i t y i s a s s o c i a t e d w i t h g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n ( C h e n e t a l . , 1 9 9 8 ) . M o u s e e m b r y o n i c fi b r o b l a s t s l a c k i n g D n m t 3 b e x h i b i t n o t o n l y d e m e t h y l a t i o n , b u t c h r o m o s o m a l a b n o r m a l i t i e s a n d a l t e r a t i o n s i n p l o i d y , a s w e l l ( D o d g e e t a l . , 2 0 0 5 ) . F u r t h e r m o r e , d e l e t i o n o f D n m t l a n d D n m t 3 b i n a h u m a n c e l l l i n e r e s u l t s i n c h r o m o s o m a l a b n o r m a l i t i e s ( K a r p f a n d M a t s u i , 2 0 0 5 ) . I t h a s b e e n 2 8 o b s e r v e d t h a t t e l o m e r i c r e g i o n s i n D N M T I " ' a n d D N M T 3 a , 3 b ' / ' m o u s e e m b r y o n i c s t e m c e l l s b e c o m e h y p o m e t h y l a t e d a n d e x h i b i t a n i n c r e a s e d f r e q u e n c y o f r e c o m b i n a t i o n ( G o n z a l o e t a l . , 2 0 0 6 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a i m p l i c a t e D N A m e t h y l a t i o n i n a v a r i e t y o f c e l l u l a r p r o c e s s e s t h a t a r e e s s e n t i a l f o r n o r m a l g r o w t h a n d v i a b i l i t y . R o l e s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n i n C a n c e r D u e t o t h e p l e i o t r o p i c b i o l o g i c a l e f f e c t s o f D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s , i t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t a b e r r a n t m e t h y l a t i o n p l a y s a r o l e i n n u m e r o u s d i s e a s e s , i n c l u d i n g m u l t i p l e i m p r i n t i n g d i s o r d e r s , F r a g i l e X s y n d r o m e , i m m u n o d e fi c i e n c y , c e n t r o m e r i c i n s t a b i l i t y , a n d f a c i a l a n o m a l i e s ( I C F ) s y n d r o m e , a n d s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s ( R o b e r t s o n , 2 0 0 5 ) . T h e f o c u s o f m y d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h i s c a r c i n o g e n e s i s , h o w e v e r , a n d s o t h e d i v e r s e r o l e s t h a t D N A m e t h y l a t i o n p l a y s w i t h i n t h e c o n t e x t o f t u m o r d e v e l o p m e n t ( F i g u r e 1 . 5 ) w i l l b e d i s c u s s e d . T u m o r i g e n e s i s r e s u l t s f r o m t h e a c c u m u l a t i o n o f h e r i t a b l e c h a n g e s t h a t c o n f e r g r o w t h a d v a n t a g e s u p o n p a r t i c u l a r c e l l s , w h i c h e v e n t u a l l y a c q u i r e t h e 6 f u n d a m e n t a l f e a t u r e s o f a c a n c e r c e l l ( H a n a h a n a n d W e i n b e r g , 2 0 0 0 ) . E p i g e n e t i c c h a n g e s ( e . g . D N A m e t h y l a t i o n , h i s t o n e m o d i fi c a t i o n s , a n d m i c r o R N A s ) a r e c e n t r a l t o t h e c a r c i n o g e n e s i s p r o c e s s . D N A h y p o m e t h y l a t i o n , a s w e l l a s m u t a t i o n , c a n e l e v a t e g e n e e x p r e s s i o n w h i l e h y p e r m e t h y l a t i o n , a s w e l l a s m u t a t i o n , c a n s i l e n c e i t ( E s t e l l e r , 2 0 0 7 a ; G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e i n t e r p l a y b e t w e e n e p i g e n e t i c c h a n g e s a n d m u t a t i o n i n a s i n g l e p a t h w a y h a s b e e n d e m o n s t r a t e d , a n d m u s t b e t a k e n i n t o a c c o u n t i n o r d e r t o m o r e c o m p r e h e n s i v e l y u n d e r s t a n d c a n c e r . F o r e x a m p l e , i n c o l o n c a n c e r c e l l s , g e n e s i n v o l v e d i n W n t s i g n a l i n g a r e b o t h h y p e r m e t h y l a t e d ( S F R P I , S F R P Z , S F R P 4 , S F R P 5 ) a n d m u t a t e d ( C T N N B I , g e n e t h a t e n c o d e s B - c a t e n i n ) , a n d t h e s e a l t e r a t i o n s 2 9 r ' o r e e l e f x s u l t s t n p s u c r u m l r e o e s t a s s i s r i i n h i g h e x p r e s m p o e p w t r e h x e y s p l s r a o e t r s i o s s s n e o d n u l s i i o n o n n i n l o w e A a c r e ‘ o D i i n e o h n i c g o h g e e x n p x b s p e e r r d r e e s s i o n r e a s m s n t D e t r s a l h e i y s o u l n s u e t h ' o r D f e l e s t t y s l c r u r a l a t r m e 1 A i N t t s o n s s i n t i e n a s i l o n e a n p c a i t n t m i b t e v l t e a h t g e e s m t r y i l l o n e n a r e g i o n r i e o n n t s ' D d r i e e f c f g e i e e r r o e n s u l t s i n m a a n s i e a e t r d l l s y u m l e m t y h t e h t s i l e n c i n g t n e r n a l l y a l m t a a i t b o e m n d a i f s o l e a s d c p o s i n N o r m a l D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s * D e c r e e s e d m e t h y l a t i o n ' l n c r e a s e d m e t h y l a t i o n ' l n c r e a s e d m e t h y l a t i o n n c r e a s e d m e t h y l a t i o n o i o f t u m o r s u p p r e s s o r s o f o n c o g e n e s r e s u l t s o f t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s d i f f e r e n t i a l l y m e t h y l a t e d W m * C e l l c y e n t r y ‘ A c t i v a t i o n o f o n c o g e n e s ' E v e s i o n o f a p o p t o s i s ' A c t i v a t i o n o f t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s ‘ D N A r e p a i r d e f e c t s ( e . g . . r e t r o t r a n s p o s o n s ) ‘ A n g i o g e n e s i s ' G e n o r n i c i n s t a b i l i t y ' L o s s o f c e l l a d h e s i o n ' L o s s o f i m p r i n t i n g ' l n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s F r g u ’ r e 1 . 5 T h e f u n c t i o n s o f D N A m e t h y l a t i o n A b e r r a n t a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n c a n l e a d t o a v a r i e t y o f c e l l u l a r c h a n g e s t h a t c a n f a c i l i t a t e t u m o r d e v e l o p m e n t . B o t h h y p o m e t h y l a t i o n a n d h y p e r m e t h y l a t i o n p l a y c r i t i c a l r o l e s d u r i n g c a r c i n o g e n e s i s . C p G s i t e s a r e d e p i c t e d ( | ) , a n d t h e s e a r e u n m e t h y l a t e d ( w h i t e c i r c l e s ) o r m e t h y l a t e d ( g r a y c i r c l e s ) . G e n o m i c r e g i o n s a r e p r o m o t e r r e g i o n s ( - ) , t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s ) , o r d i f f e r e n t i a l l y m e t h y l a t e d r e g i o n s , D M R s ( 1 : 1 ) . ( A d a p t e d f r o m E s t e l l e r , 2 0 0 7 a n d G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) 3 0 c o m p l e m e n t o n e a n o t h e r , c u l m i n a t i n g i n t h e c o n s t i t u t i v e a c t i v a t i o n o f W n t s i g n a l i n g ( B a y l i n a n d O h m , 2 0 0 6 ) . R o l e s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n i n C a n c e r : H y p o m e t h y l a t i o n H y p o m e t h y l a t i o n o f C p G d i n u c l e o t i d e s w a s t h e fi r s t e p i g e n e t i c a b e r r a t i o n t o b e l i n k e d t o c a n c e r : h u m a n c a n c e r g e n o m e s w e r e h y p o m e t h y l a t e d , a s c o m p a r e d t o t h e i r n o r m a l c o u n t e r p a r t s ( F e i n b e r g a n d V o g e l s t e i n , 1 9 8 3 a ) . T h i s o b s e r v a t i o n w a s c o n fi r m e d i n s u b s e q u e n t s t u d i e s , a s g l o b a l m e t h y l a t i o n l e v e l s w e r e d e c r e a s e d i n a v a r i e t y o f h u m a n t u m o r s ( G a m a - S o s a e t a l . , 1 9 8 3 ) . I t i s p r e s u m e d t h a t h y p o m e t h y l a t i o n c a n c o n t r i b u t e t o c a n c e r b y s e v e r a l m e c h a n i s m s : t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n o f o n c o g e n e s , c h r o m o s o m a l i n s t a b i l i t y , a c t i v a t i o n o f t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s , a n d l o s s o f i m p r i n t i n g ( E s t e l l e r , 2 0 0 8 ; F e i n b e r g a n d T y c k o , 2 0 0 4 ) . T h e r e a r e m u l t i p l e e x a m p l e s i n w h i c h h y p o m e t h y l a t i o n o f o n c o g e n e p r o m o t e r s c a n r e s u l t i n i n c r e a s e d g e n e e x p r e s s i o n . H y p o m e t h y l a t i o n a n d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e , b u t n o t i n t h o s e t h a t a r e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t , o c c u r r e d i n r e s p o n s e t o t r e a t m e n t w i t h t h e n o n g e n o t o x i c l i v e r t u m o r p r o m o t e r p h e n o b a r b i t a l ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . I n d e e d , h y p o m e t h y l a t i o n o f R a s o n c o g e n e s i n c a r c i n o g e n e s i s h a s p r e v i o u s l y b e e n s h o w n ( F e i n b e r g a n d V o g e l s t e i n , 1 9 8 3 b ) . O t h e r e x a m p l e s o f o n c o g e n e s t h a t e x h i b i t h y p o m e t h y l a t i o n a n d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n i n c l u d e c y c l i n D 2 i n g a s t r i c c a r c i n o m a ( O s h i r n o e t a l . , 2 0 0 3 ) , H P V - 1 6 D N A i n c e r v i c a l c a n c e r ( B a d a l e t a l . , 2 0 0 3 ) , a n d t h e S l O O A 4 m e t a s t a s i s - a s s o c i a t e d g e n e i n c o l o n c a n c e r ( N a k a m u r a a n d T a k e n a g a , 1 9 9 8 ) . 3 1 G e n o m i c i n s t a b i l i t y , i n t h e c o n t e x t o f c a n c e r , i s a s s o c i a t e d w i t h h y p o m e t h y l a t i o n . I n h u m a n h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a , h y p o m e t h y l a t i o n o f h e t e r o c h r o m a t i c s a t e l l i t e 2 D N A i n c h r o m o s o m e 1 c o r r e l a t e d w i t h a c o p y g a i n o f t h e q - a n n ( W o n g e t a l . , 2 0 0 1 ) . M o r e o v e r , r e d u c e d g e n o m i c h y p o m e t h y l a t i o n i n N fl H ' p 5 3 “ " m i c e c a u s e s c a n c e r a n d i s t h o u g h t t o p r o m o t e l o s s o f h e t e r o z y g o s i t y ( E d e n e t a l . , 2 0 0 3 ) . A d d i t i o n a l l y , d i s r u p t i o n o f t h e D n m t l g e n e i n m u r i n e e m b r y o n i c s t e m c e l l s r e s u l t e d i n i n c r e a s e d m u t a t i o n r a t e s d u e t o m i t o t i c r e c o m b i n a t i o n o r c h r o m o s o m e l o s s ( C h e n e t a l . , 1 9 9 8 ) . L o s s o f i m p r i n t i n g i s o f t e n o b s e r v e d i n c a n c e r . H y p o m e t h y l a t i o n o f a d i f f e r e n t i a l l y m e t h y l a t e d r e g i o n d o w n s t r e a m o f t h e fi r s t p r o m o t e r o f I n g o n t h e m a t e r n a l a l l e l e r e s u l t s i n l o s s o f i m p r i n t i n g a n d i n c r e a s e d I g fl e x p r e s s i o n ( C u i e t a l . , 2 0 0 3 ; S u l l i v a n e t a l . , 1 9 9 9 ) . L o s s o f I g fl i m p r i n t i n g o c c u r s i n W i l m s t u m o r s ( B j o m s s o n e t a l . , 2 0 0 7 ; S u l l i v a n e t a l . , 1 9 9 9 ) , a n d i s a s s o c i a t e d w i t h a n i n c r e a s e d r i s k f o r c o l o r e c t a l t u m o r i g e n e s i s ( C u i e t a l . , 2 0 0 3 ) . F i n a l l y , h y p o m e t h y l a t i o n o f D N A c a n c a u s e r e a c t i v a t i o n o f t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s ( B o u r c ’ h i s a n d B e s t o r , 2 0 0 4 ) . T y p i c a l l y , g e n o m i c s e q u e n c e s , i n c l u d i n g e n d o g e n o u s r e t r o v i r u s e s a n d r e t r o t r a n s p o s o n s ( e . g . h u m a n l o n g i n t e r s p e r s e d r e p e t i t i v e e l e m e n t 1 , L I N E - l ) b e c o m e h y p o m e t h y l a t e d d u r i n g c a n c e r ( E h r l i c h , 2 0 0 2 ; S c h u l z e t a l . , 2 0 0 6 ) . I n c h r o n i c m y e l o g e n o u s l e u k e m i a , p r o m o t e r h y p o m e t h y l a t i o n o f L I N E - 1 e l e m e n t s w a s a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d l e v e l s o f t r a n s c r i p t ( b o t h s e n s e a n d a n t i s e n s e ) a n d p o o r e r s u r v i v a l ( R o m a n - G o m e z e t a l . , 2 0 0 5 ) . F u r t h e r m o r e , i t h a s a l s o b e e n s u g g e s t e d t h a t t r a n s c r i p t i o n o f t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s c a n c o n t r i b u t e t o c a n c e r n o t o n l y b y i n t e r f e r i n g w i t h e n d o g e n o u s t r a n s c r i p t i o n ( W h i t e l a w a n d M a r t i n , 2 0 0 1 ) , b u t a l s o b y i n s e r t i o n a l m u t a g e n e s i s , g e n o m i c r e a r r a n g e m e n t , a n d t h e g e n e r a t i o n o f d o u b l e - s t r a n d e d D N A b r e a k s , 3 2 l e a d i n g t o g e n o m i c i n s t a b i l i t y ( C o l l i e r a n d L a r g a e s p a d a , 2 0 0 7 ) . T h e r e f o r e , g e n o m i c h y p o m e t h y l a t i o n c a n f a c i l i t a t e o n c o g e n e e x p r e s s i o n a n d p o s e s i g n i fi c a n t p r o b l e m s t o t h e i n t e g r i t y o f t h e g e n o m e , p a r t i c u l a r l y w i t h i n t h e c o n t e x t o f t u m o r i g e n e s i s . R o l e s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n i n C a n c e r : H y p e r m e t h y l a t i o n P a r a d o x i c a l l y , h y p e r m e t h y l a t i o n o f t h e g e n o m e o c c u r s i n c o n j u n c t i o n w i t h h y p o m e t h y l a t i o n , a n d a l s o i n fl u e n c e s t h e c a r c i n o g e n e s i s p r o c e s s . A s o p p o s e d t o h y p o m e t h y l a t i o n , a n e x t e n s i v e b o d y o f l i t e r a t u r e e x i s t s t h a t d e s c r i b e s a p l e t h o r a o f g e n e s w h o s e p r o m o t e r s e x h i b i t i n c r e a s e d m e t h y l a t i o n a n d d i m i n i s h e d e x p r e s s i o n ( E s t e l l e r , 2 0 0 7 a ) . I n d e e d , g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n c a n b e s i l e n c e d b y h y p e r m e t h y l a t i o n p a r t i c i p a t e i n a v a r i e t y o f b i o l o g i c a l p r o c e s s e s , s u c h a s g r o w t h s u p p r e s s i o n , D N A r e p a i r , c e l l a d h e r e n c e , m e t a s t a s i s , a n g i o g e n e s i s , a p o p t o s i s a n d t h e c e l l c y c l e ( e . g . t h e D N A r e p a i r g e n e M L H l , t h e c e l l c y c l e i n h i b i t o r s p l 6 m m A a n d R b , a n d A P C , a n i n h i b i t o r o f B - c a t e n i n ) ( E s t e l l e r , 2 0 0 7 a ) . F u r t h e r r n o r e , r e c e n t e f f o r t s h a v e r e s u l t e d i n t h e i d e n t i fi c a t i o n o f m i c r o R N A s t h a t f u n c t i o n a s t u m o r s u p p r e s s o r s , a n d h y p e r m e t h y l a t i o n o f t h e i r p r o m o t e r s i s a s s o c i a t e d w i t h d e c r e a s e d t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y ( L u j a m b i o a n d E s t e l l e r , 2 0 0 7 ) . R e s u l t s f r o m a m a s s i v e s t u d y t h a t a n a l y z e d p r o m o t e r r e g i o n m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f 1 2 t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s i n 6 0 0 i n d i v i d u a l t u m o r s , r e p r e s e n t i n g 1 5 t u m o r t y p e s , l e d t o t h e c o n c l u s i o n t h a t d i f f e r e n t c a n c e r s h a v e p a r t i c u l a r p r o fi l e s o f h y p e r m e t h y l a t e d g e n e s ( E s t e l l e r e t a l . , 2 0 0 1 ) . F o r i n s t a n c e , p 1 6 e x h i b i t e d i n c r e a s e d m e t h y l a t i o n a c r o s s a b r o a d r a n g e o f t u m o r s , w h i l e i n c r e a s e d m e t h y l a t i o n o f p 1 5 w a s m o r e r e s t r i c t e d , o c c u r r i n g s o l e l y i n l y m p h o m a s a n d l e u k e m i a ( E s t e l l e r e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h u s , i t i s i n s t r u c t i v e t o c o n s i d e r t h e s p e c i fi c h y p e r m e t h y l a t i o n p r o fi l e s o f i n d i v i d u a l t u m o r s i n o r d e r t o g a i n a m o r e c o m p l e t e 3 3 u n d e r s t a n d i n g o f h o w h y p e r m e t h y l a t i o n i n fl u e n c e s c a r c i n o g e n e s i s , a s t h i s h a s s i g n i fi c a n t i m p l i c a t i o n s f o r d i a g n o s i s , p r o g n o s i s , a n d t r e a t m e n t . S i l e n c i n g o f g e n o m i c r e g i o n s b y D N A h y p e r m e t h y l a t i o n i s n o t a l w a y s l i m i t e d t o s i n g l e p r o m o t e r s . I n f a c t , D N A s p a n n i n g a 4 M b r e g i o n a c r o s s c h r o m o s o m e 2 w a s s u b j e c t e d t o t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s i o n i n c o l o r e c t a l c a n c e r c e l l s , a n d b o t h D N A h y p e r m e t h y l a t i o n a n d h i s t o n e H 3 l y s i n e 9 m e t h y l a t i o n w e r e a s s o c i a t e d w i t h g e n e s i l e n c i n g ( F r i g o l a e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h i s s t u d y r a i s e s t h e c o n c e p t o f “ s e e d i n g , ” i . e . t h e a b i l i t y o f m e t h y l a t i o n c h a n g e s t o s p r e a d t o n e a r b y u n m e t h y l a t e d s i t e s . I t i s k n o w n t h a t m e t h y l a t e d f o c i o f C p G s i t e s c a n c a u s e n e i g h b o r i n g u n m e t h y l a t e d s i t e s , i n c l u d i n g p r o m o t e r r e g i o n s , t o g a i n t h i s m o d i fi c a t i o n ( T u r k e r , 1 9 9 9 ) . I n s e r t i o n o f p r o v i r a l D N A i n t o a h o s t g e n o m e r e s u l t s i n m e t h y l a t i o n o f t h e h o s t ’ s fl a n k i n g r e g i o n s ( J a h n e r a n d J a e n i s c h , 1 9 8 5 ) . T h i s m i g h t b e r e l e v a n t t o m y r e s e a r c h , a s I o b s e r v e d m a n y m e t h y l a t i o n c h a n g e s w i t h i n e x o n s a n d i n t r o n s o f g e n e s , a n d a s u b s e t o f t h e s e a l t e r a t i o n s m i g h t b e r e fl e c t i v e o f c r i t i c a l c h a n g e s t h a t h a v e o c c u r r e d , o r w i l l o c c u r , i n r e g u l a t o r y p r o m o t e r r e g i o n s . C o m p o u n d s t h a t a r e c a p a b l e o f p r e v e n t i n g D N A m e t h y l a t i o n h a v e b e e n i n s t r u m e n t a l i n c a n c e r t h e r a p y d e v e l o p m e n t . D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) i n h i b i t o r s c a n b e d i v i d e d i n t o 2 c l a s s e s ( Y o o a n d J o n e s , 2 0 0 6 ) . N u c l e o s i d e s a n a l o g s ( e . g . 5 - A z a c i t i d i n e , 5 - A z a - 2 ’ - d e o x y c i t i d i n e ) c o n t a i n a m o d i fi e d c y t o s i n e r i n g a t t a c h e d t o a r i b o s e o r d e o x y r i b o s e s u g a r , a r e c o n v e r t e d t o n u c l e o t i d e s , i n c o r p o r a t e i n t o D N A a n d / o r R N A , a n d s u b s e q u e n t l y b l o c k D n m t a c t i v i t y . A l t e r n a t i v e l y , n o n - n u c l e o s i d e a n a l o g s ( e . g . H y d r a l a z i n e , P r o c a i n a m i d e ) b i n d d i r e c t l y t o D n m t e n z y m e s t o i n h i b i t t h e m ( Y o o a n d J o n e s , 2 0 0 6 ) . T h e r e h a s b e e n s o m e s u c c e s s u s i n g s u c h a g e n t s i n a c l i n i c a l s e t t i n g . 3 4 V i d a z a ® ( 5 - a z a c i t i d i n e ) a n d a n d D e c i t a b i n e ® ( 5 - a z a - 2 ' - d e o x y c i t i d i n e ) a r e F D A - a p p r o v e d f o r t r e a t m e n t o f m y e l o d y s p l a s t i c s y n d r o m e s , w h i c h a r e c h a r a c t e r i z e d b y i n h i b i t i o n o f h e m a t o p o i e s i s a n d a n i n c r e a s e d r i s k o f d e v e l o p i n g a c u t e m y e l o g e n o u s l e u k e m i a . D e c i t a b i n e ® h a s a l s o b e e n u t i l i z e d s u c c e s s f u l l y t o r e m e d y a c u t e a n d c h r o n i c m y e l o g e n o u s l e u k e m i a s ( d e V o s a n d v a n O v e r v e l d , 2 0 0 5 ) . E a r l y D N A M e t h y l a t i o n C h a n g e s F a c i l i t a t e T u m o r i g e n e s i s T h e r e a r e c i t e d e x a m p l e s o f r e l e v a n t m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t o c c u r e a r l y d u r i n g n e o p l a s t i c p r o g r e s s i o n , s u p p o r t i n g t h e n o t i o n t h a t a l t e r e d m e t h y l a t i o n i s a d r i v i n g f o r c e o f t u m o r i g e n e s i s , a s o p p o s e d t o a c o n s e q u e n c e o f t h e p r o c e s s . I n h u m a n c o l o n c a n c e r , g e n e - s p e c i fi c h y p o m e t h y l a t i o n w a s d e t e c t e d i n b o t h b e n i g n a n d m a l i g n a n t l e s i o n s ( G o e l z e t a l . , 1 9 8 5 ) . A d d i t i o n a l l y , h y p o m e t h y l a t i o n w a s o b s e r v e d i n n o r m a l - a p p e a r i n g r e c t a l m u c o s a i n c o l o r e c t a l c a n c e r p a t i e n t s , a s c o m p a r e d t o c a n c e r - f r e e i n d i v i d u a l s ( C r a v o e t a 1 . , 1 9 9 4 ) . I n a d d i t i o n , t u m o r s u p p r e s s o r s a r e h y p e r m e t h y l a t e d a t a n e a r l y s t a g e , w i t h i n c r e a s i n g f r e q u e n c y d u r i n g t u m o r p r o g e s s i o n ( F e i n b e r g e t a l . , 2 0 0 6 ) . M e t h y l a t i o n c h a n g e s i n t h e i n i t i a l s t a g e s o f c o l o n c a n c e r u l t i m a t e l y f a c i l i t a t e a c t i v a t i o n o f W n t s i g n a l i n g , w h i c h d r i v e s p r o l i f e r a t i o n a n d s u r v i v a l ( B a y l i n a n d O h m , 2 0 0 6 ) . O n e m a i n f o c u s o f m y d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h i s t h e i d e n t i fi c a t i o n o f g e n e s p l u s c e l l u l a r p r o c e s s e s a n d s i g n a l i n g p a t h w a y s , t h a t m i g h t b e i n v o l v e d d u r i n g e a r l y s t a g e s o f t u m o r i g e n e s i s . S u c h g e n e s a y i n c l u d e t h o s e w h o s e r e g u l a t i o n m i g h t b e c o n t r o l l e d b y a b e r r a n t m e t h y l a t i o n c h a n g e s . R o d e n t M o d e l s o f L i v e r T u m o r i g e n e s i s 3 5 C h e m i c a l c a r c i n o g e n s w e r e h i s t o r i c a l l y c o n s i d e r e d t o b e g e n o t o x i n s , i . e . c h e m i c a l s w h i c h d i r e c t l y , o r i n d i r e c t l y v i a m e t a b o l i t e s , c a u s e p r o m u t a g e n i c a d d u c t s o r o t h e r t y p e s o f D N A d a m a g e , i n c l u d i n g c h r o m o s o m a l b r e a k a g e , f u s i o n , d e l e t i o n , n o n - d i s j u n c t o n , a n d m i s - s e g r e g a t i o n ( L u c h , 2 0 0 5 ) . H o w e v e r , t h i s c o n c e p t h a d t o b e r e c o n c i l e d w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t n o t a l l m u t a g e n i c c o m p o u n d s c a u s e t u m o r s , a n d a d d i t i o n a l l y , n o t a l l c a r c i n o g e n s a r e m u t a g e n s . N o n g e n o t o x i c c a r c i n o g e n s ( i . e . t h o s e t h a t d o n o t c a u s e m u t a t i o n s ) a f f e c t t h e b a l a n c e o f p r o l i f e r a t i o n a n d c e l l d e a t h , a n d a r e c a p a b l e o f c a u s i n g t u m o r i g e n e s i s b y m e c h a n i s m s s u c h a s i m m u n o s u p p r e s s i o n , i n fl a m m a t i o n , r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s g e n e r a t i o n , r e c e p t o r a c t i v a t i o n , a n d e p i g e n e t i c a l t e r a t i o n s ( L u c h , 2 0 0 5 ) . R o d e n t l i v e r m o d e l s h a v e t r a d i t i o n a l l y b e e n u t i l i z e d t o e v a l u a t e t h e c a r c i n o g e n i c i t y o f b o t h g e n o t o x i n s a n d n o n g e n o t o x i n s . W h i l e t h e r e a r e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e c a n c e r p r o c e s s i n m i c e a n d h u m a n s ( R a n g a r a j a n a n d W e i n b e r g , 2 0 0 3 ) , m o u s e m o d e l s h a v e b e e n , a n d c u r r e n t l y a r e , e x t r e m e l y b e n e fi c i a l f o r e l u c i d a t i n g a s p e c t s o f t h e h u m a n t u m o r i g e n e s i s p r o c e s s . F o r e x a m p l e , m a n y g e n e s ( e . g . P T E N , M L H l , p 5 3 ) a r e d i s r u p t e d i n c a n c e r s t h a t d e v e l o p i n b o t h s p e c i e s ( H e r z i g a n d C h r i s t o f o r i , 2 0 0 2 ) . T h e r e f o r e , i t i s l i k e l y t h a t t h a t g e n e s w h i c h u n d e r l i e t u m o r i g e n e s i s i n h u m a n s a n d r o d e n t s a r e l a r g e l y t h e s a m e , a n d t h e i r d i s p a r a t e s e n s i t i v i t i e s c a n b e a t t r i b u t e d , a t l e a s t i n p a r t , t o g e n e r e g u l a t i o n . B o t h l i v e r t u m o r i g e n e s i s m o d e l s e m p l o y e d i n m y d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h i n v o l v e a t l e a s t 1 g r o u p o f m i c e t h a t i s s u s c e p t i b l e , a n d 1 g r o u p t h a t i s r e s i s t a n t , t o p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d c a r c i n o g e n e s i s . B y e v a l u a t i n g a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n t h a t o c c u r u n i q u e l y i n t h e s u s c e p t i b l e , a s c o m p a r e d t o t h e r e s i s t a n t m i c e , o n e c a n f o c u s u p o n c h a n g e s t h a t m i g h t b e d i r e c t l y r e l a t e d t o t u m o r f o r m a t i o n . 3 6 B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 M i c e T h e fi r s t m o d e l s y s t e m i n c l u d e s t h e r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 s t r a i n a n d t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] s t o c k ( c r o s s b e t w e e n t h e h i g h l y s u s c e p t i b l e C 3 H / H e p a t e r n a l s t r a i n a n d t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m a t e r n a l s t r a i n ) . G e n e t i c b a c k g r o u n d i s a c o n t r i b u t i n g f a c t o r t o l i v e r t u m o r s u s c e p t i b i l i t y i n t h e s e m i c e , a s t h e i n c i d e n c e s o f s p o n t a n e o u s t u m o r f o r m a t i o n i n s u s c e p t i b l e C 3 H / H e a n d B 6 C 3 F ] a n d t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e a r e 6 1 % [ 1 - 4 t u m o r s / t u m o r - b e a r i n g a n i m a l ( T B A ) ] , 2 9 % ( 1 - 2 t 1 u n o r s / T B A ) a f t e r 1 2 m o n t h s , a n d 0 % a f t e r 1 8 m o n t h s , r e s p e c t i v e l y ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) . T h e t u m o r - s e n s i t i v e m i c e a r e a l s o m o r e p r o n e t o c h e m i c a l l y - i n d u c e d c a r c i n o g e n e s i s . S p e c i fi c a l l y , t h e C 3 H / H e s t r a i n i s 2 0 - 5 0 X m o r e s u s c e p t i b l e t o l i v e r t u m o r f o r m a t i o n t h a n t h e C 5 7 B L / 6 , i n r e s p o n s e t o t r e a t m e n t w i t h t h e m u t a g e n s d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D r i n k w a t e r a n d G i n s l e r , 1 9 8 6 ) a n d N - e t h y l - N - n i t r o s o u r e a ( H a n i g a n e t a l . , 1 9 8 8 ) , a n d s t r a i n - s p e c i fi c d i f f e r e n c e s a r e a l s o o b s e r v e d u p o n p h e n o b a r b i t a l ( P B ) t r e a t m e n t . P B , a s e d a t i v e a n d a n t i c o n v u l s a n t , i s a p r o t o t y p i c a l n o n g e n o t o x i c r o d e n t l i v e r t u m o r p r o m o t e r t h a t i n d u c e s x e n o b i o t i c - m e t a b o l i z i n g e n z y m e s , i n c l u d i n g t h o s e o f t h e P h a s e I ( e . g . c y t o c h r o m e P 4 5 0 s a n d c y t o c h r o m e P 4 5 0 o x i d o r e d u c t a s e ) a n d P h a s e 1 1 ( e . g . g l u t a t h i o n e - S - t r a n s f e r a s e s a n d U D P - g l u c u r o n y l t r a n s f e r a s e ) c l a s s e s ( W h y s n e r e t a l . , 1 9 9 6 ) . I n r o d e n t s , P B t r e a t m e n t c a u s e s h e p a t i c h y p e r t r o p h y , h y p e r p l a s i a , a d e n o m a s a n d h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a s ( W h y s n e r e t a l . , 1 9 9 6 ) . F o r e x a m p l e , u p o n c h r o n i c e x p o s u r e t o a p r o m o t i n g d o s e o f P B i n d r i n k i n g w a t e r ( 0 . 0 5 % , w / w ) f o r 1 2 m o n t h s , 1 0 0 % o f t h e s u s c e p t i b l e C 3 H / H e ( 1 0 + t u m o r s / T B A ) a n d B 6 C 3 F l ( 3 - 8 t u m o r s / T B A ) m i c e d e v e l o p l i v e r t u m o r s , w h i l e c o n v e r s e l y , a f t e r 1 8 m o n t h s , t h e r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e d e v e l o p n o n e ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) . A d d i t i o n a l l y , t r e a t m e n t w i t h 0 . 0 5 % P B i n d u c e s h e p a t i c D N A 3 7 s y n t h e s i s i n B 6 C 3 F 1 m i c e , e . g . 1 - 4 w e e k s ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ; K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 a ) , a n d i n C 5 7 B L / 6 m i c e , e . g . 1 - 2 w e e k s ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ) . F u r t h e r m o r e , t h e r a t e o f a p o p t o s i s d e c r e a s e s i n h e p a t o c y t e s w i t h i n d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E M - i n i t i a t e d p r e n e o p l a s t i c l e s i o n s w h i c h a r e o b s e r v e d f o l l o w i n g 3 0 a n d 6 0 d a y s o f p r o m o t i o n b y P B ( K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 b ) . T h e h e p a t o c a r c i n o g e n s s e n s i t i v i t y ( H c s ) l o c u s a p p e a r s t o b e r e s p o n s i b l e f o r a p p r o x i m a t e l y 8 5 % o f t h e a f o r e m e n t i o n e d s u s c e p t i b i l i t y d i f f e r e n c e s ( D r i n k w a t e r a n d G i n s l e r , 1 9 8 6 ; D r i n k w a t e r e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h i s H c s l o c u s s p e c i fi c a l l y a f f e c t s t h e p r o m o t i o n s t a g e o f c a r c i n o g e n e s i s , a s t h e C 3 H a l l e l e e l e v a t e s l i v e r t u m o r y i e l d b y i n c r e a s i n g t h e s i z e a n d g r o w t h r a t e o f p r e n e o p l a s t i c l e s i o n s i n t h e C 3 H / H e a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 g r o u p ( H a n i g a n e t a l . , 1 9 8 8 ) . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e a l l e l e s o f t h e C 3 H / H e a n d C 5 7 B L / 6 m i c e a r e s e m i d o m i n a n t , s u c h t h a t t h e h e t e r o z y g o u s B 6 C 3 F 1 e x h i b i t s i n t e r m e d i a t e s u s c e p t i b i l i t y ( D r i n k w a t e r e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h r e e a d d i t i o n a l r e g i o n s , l o c a t e d o n c h r o m o s o m e s 2 , 5 a n d 1 9 , a l s o e x h i b i t a s i g n i fi c a n t l i n k a g e w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t o c e l l u l a r t u m o r f o r m a t i o n ( M a n e n t i e t a 1 . , 1 9 9 4 ) . F u r t h e r m o r e , e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t i t i s t h e h e p a t o c y t e s t h e m s e l v e s ( v e r s u s a c o m p o n e n t o f t h e c e l l u l a r m i c r o e n v i r o n m e n t ) w h i c h h a r b o r i n t r i n s i c d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e C 3 H / H e a n d C 5 7 B L / 6 m i c e a n d c o n t r i b u t e t o t h e d i f f e r e n t i a l s u s c e p t i b i l i t i e s ( L e e e t a l . , 1 9 9 1 ) . V a r i a t i o n s i n p r o l i f e r a t i o n ! g r o w t h b e t w e e n t h e g r o u p s r e m a i n t h e f o c u s o f t h e d i s p a r a t e s e n s i t i v i t i e s , p a r t i c u l a r l y s i n c e a p o p t o s i s d o e s n o t a p p e a r t o p l a y a m a j o r r o l e ( B u r s c h e t a l . , 2 0 0 5 a ; B u r s c h e t a l . , 2 0 0 5 b ) . T h e r e a r e o t h e r p r o c e s s e s t h a t s h o w s t r a i n - r e l a t e d d i f f e r e n c e s a m o n g t h e s e g r o u p s , a n d i t i s p o s s i b l e t h a t t h e a f o r e m e n t i o n e d H c s c o n t a i n s r e l e v a n t g e n e s . F o r e x a m p l e , g a p 3 8 j u n c t i o n a l c o m m u n i c a t i o n ( G J I C ) , w h i c h p e r m i t s i n t e r c e l l u l a r c o n t a c t , i n c l u d i n g t r a n s p o r t o f i o n s a n d s m a l l m o l e c u l e s , i s a p p a r e n t l y a n i n t e g r a l p a r t o f i n h i b i t i n g t u m o r i g e n e s i s i n c e r t a i n s y s t e m s . I n d e e d , m o s t c a n c e r c e l l s e x h i b i t d e c r e a s e d G J I C ( T r o s k o a n d C h a n g , 2 0 0 1 ) . I n t e r e s t i n g l y , P B i n h i b i t s G J I C i n h e p a t o c y t e s f r o m t u m o r - s e n s i t i v e B 6 C 3 F ] b u t n o t t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e ( W a r n e r e t a l . , 2 0 0 3 ) . I n r e s p o n s e t o P B a d m i n i s t r a t i o n , D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n l i v e r a l s o o c c u r i n a s t r a i n - s p e c i fi c m a n n e r . D a t a f r o m o u r l a b o r a t o r y i n d i c a t e t h a t l e v e l s o f g l o b a l h y p o m e t h y l a t i o n d e c r e a s e d t o a g r e a t e r e x t e n t i n l i v e r s o f s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , a f t e r 1 , 2 , a n d 4 w e e k s o f 0 . 0 5 % ( w / w ) P B i n d r i n k i n g w a t e r , w h i l e t h e C 5 7 B L / 6 g r o u p e x h i b i t e d h i g h e r p r o l i f e r a t i v e a c t i v i t y , i m p l y i n g t h a t t h e B 6 C 3 F ] . m i c e a r e l e s s c a p a b l e o f m a i n t a i n i n g n o r m a l m e t h y l a t i o n p a t t e r n s ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ) . F u r t h e r m o r e , a t 2 w e e k s , P B e l i c i t e d g r e a t e r l e v e l s o f h y p e r m e t h y l a t i o n a t t h e i n t e r n a l a n d e x t e r n a l c y t o s i n e s o f 5 ’ - C C G G - 3 ’ s i t e s w e r e o b s e r v e d i n t h e s u s c e p t i b l e m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t g r o u p ( C 3 H / H e > > B 6 C 3 F ] > C 5 7 B L / 6 ) , f u r t h e r s u g g e s t i n g t h a t a l t e r e d m e t h y l a t i o n p a t t e r n s a r e m o r e a f f e c t e d i n t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e ( W a t s o n a n d G o o d m a n , 2 0 0 2 ) . M o s t r e c e n t l y , u n i q u e r e g i o n s o f a l t e r e d m e t h y l a t i o n ( R A M s ) w e r e i d e n t i fi e d i n B 6 C 3 F 1 m i c e a s c o m p a r e d t o t h e i r r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 c o u n t e r p a r t , i n r e s p o n s e t o a 0 . 0 5 % ( w / w ) p r o m o t i n g d o s e o f P B a t 2 a n d 4 w e e k s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e l o g i c a l e x t e n s i o n o f t h i s w o r k , i d e n t i f y i n g t h e g e n e s i n w h i c h t h e s e m e t h y l a t i o n c h a n g e s o c c u r r e d , a n d t h e n d e t e r m i n i n g w h e t h e r e x p r e s s i o n l e v e l s r e l a t e t o t h e i r a l t e r e d m e t h y l a t i o n s t a t u s e s , w a s o n e o f t h e m a i n f o c a l p o i n t s o f m y d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h . T h e m e c h a n i s m s o f P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s r e m a i n e l u s i v e , a l t h o u g h 3 9 s e v e r a l d e t a i l s h a v e e m e r g e d . M o l e c u l a r c h a n g e s w i t h i n s e v e r a l g e n e s h a v e b e e n a s c e r t a i n e d , i n c l u d i n g m u t a t i o n s i n t h e g e n e e n c o d i n g B - c a t e n i n ( A y d i n l i k e t a l . , 2 0 0 1 ) , i n c r e a s e d H a - r a s e x p r e s s i o n ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 7 ) , H a - r a s h y p o m e t h y l a t i o n ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) , K i - r a s h y p o m e t h y l a t i o n ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) , h y p o m e t h y l a t i o n a n d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f r a f ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) , a n d a m p l i fi c a t i o n o f c - m y c ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) . A d d i t i o n a l l y , c o n n e x i n 3 2 , t h e m a j o r h e p a t i c g a p j u n c t i o n - f o r m i n g p r o t e i n , i s e s s e n t i a l f o r P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s ( M o e n n i k e s e t a l . , 2 0 0 0 ) . F i n a l l y , c h r o n i c P B t r e a t m e n t a p p e a r s t o e v o k e m i t o - i n h i b i t o r y e f f e c t s , a n d i t i s t h o u g h t t h a t t u m o r p r o g e n i t o r c e l l s e s c a p e t h i s g r o w t h i n h i b i t i o n . I n d e e d , a f t e r c o n t i n u a l e x p o s u r e , n o r m a l h e p a t o c y t e s e x h i b i t e d d e c r e a s e d l e v e l s o f e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r ( E G F R ) a n d i n c r e a s e d l e v e l s o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - b e t a ( T G F - B ) , T G F - B r e c e p t o r s , a n d m a n n o s e 6 - p h o s p h a t e / i n s u l i n g r o w t h f a c t o r I I r e c e p t o r ( M 6 P - I G F 2 r ) , w h i c h c a n a c t i v a t e T G F - B ( r e v i e w e d i n C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ) . C o n v e r s e l y , P B - a s s o c i a t e d l i v e r l e s i o n s r e v e a l e d d e c r e a s e d l e v e l s o f M 6 P - I G F 2 r ( p r e c a n c e r o u s l e s i o n s ) a n d T G F - B ( p r e c a n c e r o u s l e s i o n s a n d t u m o r s ) . C r i t i c a l d a t a g e n e r a t e d f r o m m y d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h h a s a d d e d t o t h e a f o r e m e n t i o n e d o b s e r v a t i o n s a n d a i d e d i n t h e i d e n t i fi c a t i o n o f i n d i v i d u a l g e n e s ( i n c l u d i n g t h o s e w h o s e r e g u l a t i o n m i g h t b e a f f e c t e d b y a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ) , p l u s k e y s i g n a l i n g p a t h w a y s a n d p r o c e s s e s , t h a t m i g h t u n d e r l i e t u m o r p r o m o t i o n b y P B . I m p o r t a n t l y , t h e e x p r e s s i o n a n d m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f t h e g e n e s d i s c e r n e d a r e u n i q u e i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F l , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e . C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t _ v _ p _ e a n d K n o c k o u t M i c e C o m p l e x s i g n a l i n g n e t w o r k s , i n v o l v i n g c r o s s t a l k o f p a t h w a y s c o m p r i s e d o f 4 0 m u l t i p l e n u c l e a r r e c e p t o r s , a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e m e t a b o l i s m o f d r u g s a n d x e n o b i o t i c s . T h e s e s a m e r e c e p t o r s r e g u l a t e h o m e o s t a t i c p r o c e s s e s , i n c l u d i n g m e t a b o l i s m o f e n d o g e n o u s s u b s t a n c e s ( e . g . g l u c o s e , l i p i d s ) . T h r e e m a j o r n u c l e a r r e c e p t o r s t h a t f u n c t i o n a s x e n o - s e n s o r s , m o d u l a t i n g g e n e e x p r e s s i o n i n r e s p o n s e t o d r u g t r e a t m e n t o r x e n o b i o t i c e x p o s u r e i n o r d e r t o i n a c t i v a t e a n d / o r e l i m i n a t e t h e s e s u b s t a n c e s , a r e t h e a r y l h y d r o c a r b o n r e c e p t o r ( A h R ) , c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) , a n d p r e g n a n e X r e c e p t o r ( P X R ) ( P a s c u s s i e t a l . , 2 0 0 8 ) . C A R i s p r e d o m i n a n t l y e x p r e s s e d i n t h e l i v e r , a n d i s c a p a b l e o f h e t e r o d i m e r i z i n g w i t h t h e r e t i n o i c a c i d r e c e p t o r ( R X R ) t o r e g u l a t e g e n e e x p r e s s i o n ( B a e s e t a l . , 1 9 9 4 ) . P a r t i c u l a r c i s e l e m e n t s w i t h i n t h e g e n o m e a r e a s s o c i a t e d w i t h C A R - m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n ( C h e n e t a l . , 2 0 0 3 ; G e r b a l - C h a l o i n e t a l . , 2 0 0 2 ; G o o d w i n e t a l . , 2 0 0 2 ; H o n k a k o s k i e t a l . , 1 9 9 8 ; S u e y o s h i e t a l . , 1 9 9 9 ; S u g a t a n i e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h i s r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e l y a c t i v a t e s t r a n s c r i p t i o n i n a b s e n c e o f a l i g a n d ( C h o i e t a l . , 1 9 9 7 ) , a n d C A R a c t i v i t y c a n b e s u p p r e s s e d b y t h e b i n d i n g o f 1 o f 2 a n d r o s t a n e m e t a b o l i t e s , a n d r o s t a n o l ( m u r i n e a n d h u m a n C A R ) a n d a n d r o s t e n o l ( m u r i n e C A R o n l y ) ( F o r m a n e t a l . , 1 9 9 8 ; S u e y o s h i a n d N e g i s h i , 2 0 0 1 ) . C A R p a r t i c i p a t e s i n b i o l o g i c a l p a t h w a y s i n v o l v i n g e n d o g e n o u s s u b s t a n c e s , i n c l u d i n g t h y r o i d h o r m o n e m e t a b o l i s m ( Q a t a n a n i e t a l . , 2 0 0 5 ) , b i l i r u b i n c l e a r a n c e ( H u a n g e t a l . , 2 0 0 3 ) , a n d b i l e a c i d d e t o x i fi c a t i o n ( S a i n i e t a l . , 2 0 0 4 ) . H o w e v e r , C A R i s m o s t r e c o g n i z e d f o r i t s m e d i a t i o n o f t h e i n d u c t i o n o f g e n e s e n c o d i n g d r u g - m e t a b o l i z i n g e n z y m e s , i n c l u d i n g c y t o c h r o m e P 4 5 0 s ( e . g . C y p b l 0 , C y p 3 a 1 1 ) a n d o t h e r s ( e . g . N A D P H - c y t o c h r o m e P 4 5 0 r e d u c t a s e , a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e 1 ) , p l u s d r u g t r a n s p o r t e r s ( e . g . M r p I - 3 ) , i n r e s p o n s e t o x e n o b i o t i c e x p o s u r e ( M a g l i c h e t a l . , 2 0 0 2 ; U e d a e t a l . , 2 0 0 2 ) . P B i n d i r e c t l y a c t i v a t e s C A R ( i . e . d o e s n o t b i n d t o t h e r e c e p t o r ) , w h i l e o t h e r c o m p o u n d s a c t a s d i r e c t l i g a n d s f o r 4 1 C A R i n h u m a n a n d m i c e ( e . g . C I T C O a n d T C P O B O P , r e s p e c t i v e l y ) ( S w a l e s a n d N e g i s h i , 2 0 0 4 ) . T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n b y C A R i n v o l v e s t w o s e p a r a t e , t e m p o r a l a n d s p a t i a l a c t i v a t i o n e v e n t s t h a t h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d b u t n o t f u l l y e l u c i d a t e d ( T i m s i t a n d N e g i s h i , 2 0 0 7 ) ( F i g u r e 1 . 6 ) . I n n o r m a l h e p a t o c y t e s , C A R i s c o m p l e x e d w i t h h e a t s h o c k p r o t e i n 9 0 ( H S P 9 0 ) a n d c y t o p l a s m i c C A R r e t e n t i o n p r o t e i n ( C C R P ) . U p o n P B t r e a t m e n t , C A R d i s s o c i a t e s f r o m t h e s e p r o t e i n s a n d t r a n s l o c a t e s t o t h e n u c l e u s . T h e s p e c i fi c d e t a i l s o f t h i s t r a n s l o c a t i o n a r e n o t e n t i r e l y c l e a r , b u t i t i s k n o w n t h a t P B c a u s e s t h e r e c r u i t m e n t o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e 2 A ( P P 2 A ) t o t h e C A R : H S P 9 0 c y t o p l a s m i c c o m p l e x ( Y o s h i n a r i e t a l . , 2 0 0 3 ) , a n d t h a t o k a d a i c a c i d , a p h o s p h a t a s e i n h i b i t o r w h i c h c a n i n h i b i t P P 2 A , b l o c k s t h e P B - i n d u c e d n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f C A R ( K a w a r n o t o e t a l . , 1 9 9 9 ) . A d d i t i o n a l l y , t h i s t r a n s l o c a t i o n e v e n t a p p e a r s t o e n t a i l i n t e r a c t i o n o f C A R w i t h a h o m o d i m e r o f t h e m e m b r a n e - a s s o c i a t e d s u b u n i t o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e 1 , P P P 1 R 1 6 A ( R 1 6 A ) . T h e R 1 6 A r e s i d u e s d i r n e r i z e a t a r e g i o n c o n t a i n i n g p r o t e i n k i n a s e A p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s , a n d R 1 6 A i s c a p a b l e o f i n h i b i t i n g p r o t e i n p h o s p h a t a s e l - b e t a ( P P l B ) , w h i c h c a n b l o c k C A R t r a n s l o c a t i o n ( S u e y o s h i e t a l . , 2 0 0 8 ) . I n a d d i t i o n , h e p a t o c y t e g r o w t h f a c t o r t r e a t m e n t c a n a c t i v a t e M E K 1 / 2 , r e s u l t i n g i n t h e p h o s p h o r y l a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f M A P K l / 3 a n d t h e s u b s e q u e n t i n h i b i t i o n o f t h e n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n ( K o i k e e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h e s e c o n d a c t i v a t i o n e v e n t w h i c h i s n e c e s s a r y f o r t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n b y C A R i n v o l v e s p h o s p h o r y l a t i o n , a s e v i d e n c e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t C A R - m e d i a t e d i n d u c t i o n o f t h e C y p r I 0 g e n e c a n b e b l o c k e d b y K N - 6 2 ( a C a 2 + / c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r ) w i t h o u t a f f e c t i n g n u c l e a r a c c u m u l a t i o n ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 3 ) . H o w e v e r , t h e p a r t i c u l a r k i n a s e ( s ) i n v o l v e d h a v e n o t y e t b e e n r e p o r t e d . 4 2 fi x 7 ‘ 1 ’ V ’ - I , I i f ? / O o e c t l v a t o r t a t . F r g u ' r e 1 . 6 A c t i v a t i o n o f t h e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) . T h e a c t i v a t i o n o f C A R b y c o m p o u n d s s u c h a s p h e n o b a r b i t a l ( P B ) , r e s u l t i n g i n t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f i t s t a r g e t g e n e s , r e q u i r e s 2 d i s t i n c t s t e p s : 1 ) t r a n s l o c a t i o n f r o m t h e c y t o s o l t o t h e n u c l e u s , a n d 2 ) a c t i v a t i o n w i t h i n t h e n u c l e u s . A s o f y e t , n o P B r e c e p t o r h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d , a n d t h u s i t a p p e a r s t h a t i t s a c t i v a t i o n o f C A R o c c u r s t h r o u g h a n i n d i r e c t m e c h a n i s m , w h i c h h a s n o t b e e n f u l l y e l u c i d a t e d . T h e t e x t c o n t a i n s g r e a t e r d e t a i l o f t h e e v e n t s w h i c h a r e d e p i c t e d i n t h i s s c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n . A b b r e v i a t i o n s : C C R P , c y t o p l a s m i c C A R r e t e n t i o n p r o t e i n ; H S P , h e a t s h o c k p r o t e i n ; M A P K , m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ; M E K , m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e k i n a s e ; P B R E M , P B - r e s p o n s i v e e n h a n c e r m o d u l e ; P P l B , p r o t e i n p h o s p h a s e 1 b e t a ; P P - 2 A , p r o t e i n p h o s p h a t a s e 2 A ; R 1 6 A , P P P 1 R 1 6 A , a m e m b r a n e - a s s o c i a t e d s u b u n i t o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e 1 ; R X R , r e t i n o i d X r e c e p t o r ; X R E M , x e n o b i o t i c - r e s p o n s i v e e n h a n c e r m o d u l e . ( A d a p t e d f r o m K o i k e e t a l . , 2 0 0 7 ; S u e y o s h i e t a l . , 2 0 0 8 ; S w a l e s a n d N e g i s h i , 2 0 0 4 ) 4 3 C A R i s n e c e s s a r y f o r P B - i n d u c e d h e p a t o m e g a l y i n m o u s e l i v e r ( W e i e t a l . , 2 0 0 0 ) , a n d c h r o n i c C A R a c t i v a t i o n i n r e s p o n s e t o P B o r T C P O B O P r e s u l t s i n h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s ( H u a n g e t a l . , 2 0 0 5 ) . A d d i t i o n a l l y , C A R i s e s s e n t i a l f o r t u m o r p r o m o t i o n b y P B i n d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) - i n i t i a t e d C 3 H / H e m i c e ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h u s , C A R w i l d t y p e ( W T ) m i c e a r e c o n s i d e r e d t o b e s u s c e p t i b l e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s , w h i l e C A R k n o c k o u t ( K O ) m i c e a r e t u m o r - r e s i s t a n t , h o w e v e r t h e m e c h a n i s m s o f t u m o r d e v e l o p m e n t r e q u i r e e l u c i d a t i o n . M i c r o a r r a y d a t a a n a l y s i s o f P B - t r e a t e d C A R W T a n d K O m i c e r e v e a l e d t h a t o f 1 3 8 g e n e s ( o u t o f 8 , 7 3 6 t o t a l g e n e s / E S T s ) w h o s e e x p r e s s i o n w a s a l t e r e d , a p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e s e c h a n g e s w e r e C A R - d e p e n d e n t ( U e d a e t a l . , 2 0 0 2 ) , i n d i c a t i n g t h a t P B h a s e f f e c t s w h i c h a r e C A R - i n d e p e n d e n t , a s w e l l . A m a j o r c o m p o n e n t o f m y d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h w a s c o m p r i s e d o f a n e x t e n s i v e a n a l y s i s o f e x p r e s s i o n c h a n g e s i n P B - t r e a t e d C A R W T a n d K O m i c e , e m p h a s i z i n g t h o s e c h a n g e s t h a t o c c u r r e d u n i q u e l y i n t h e s u s c e p t i b l e W T g r o u p s ( 2 3 w e e k s P B , p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d 3 2 w e e k s , l i v e r t u m o r t i s s u e ) , i n o r d e r t o e l u c i d a t e p o t e n t i a l m e c h a n i s m s o f l i v e r t u m o r i g e n e s i s . A d d i t i o n a l l y , s i n c e P B a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n u n i q u e l y i n t u m o r - s u s c e p t i b l e ( i . e . B 6 C 3 F 1 ) , a s c o m p a r e d t o r e l a t i v e l y r e s i s t a n t ( i . e . C 5 7 B L / 6 ) m i c e , I h y p o t h e s i z e d t h a t P B m i g h t i n d u c e u n i q u e m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n s u s c e p t i b l e C A R W T m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e s i s t a n t C A R K 0 , a n d t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e s e m i g h t b e p l a y i n g c r i t i c a l m e c h a n i s t i c r o l e s d u r i n g P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s . T h e r e f o r e , a n o t h e r c o m p o n e n t o f m y r e s e a r c h i n v o l v e d d i s c e r n i n g u n i q u e m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n t h e s u s c e p t i b l e C A R W T , a s c o m p a r e d t o t h e r e s i s t a n t C A R K O m i c e . T h e a n a l y s i s o f b o t h D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n a l t e r a t i o n s w a s a n e f f e c t i v e a p p r o a c h t o o b t a i n a m o r e c o m p r e h e n s i v e u n d e r s t a n d i n g o f h o w P B p r o m o t e s l i v e r t u m o r i g e n e s i s . 4 4 H y p o t h e s i s a n d O b j e c t i v e s T h i s d i s s e r t a t i o n c o n s i s t s o f 3 p r o j e c t s t h a t w e r e d e s i g n e d t o t e s t t h e f o l l o w i n g o v e r a l l h y p o t h e s i s : g e n e s w h i c h a r e d i s r g g u l a t e d u n i g u e l y i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e , a s c o m p a r e d t o t u m o r - r e s i s t a n t m i c e , a r e a m o n g t h o s e w h i c h a r e m e c h a n i s t i c a l _ l y i m m r t a n t f o r t u m o r _ 1 g ' e n e s i s . I n o r d e r t o e x p l o r e t h i s b r o a d c o n c e p t , m y r e s e a r c h w a s c o m p r i s e d o f 2 m a j o r f a c e t s ( a s s e s s m e n t o f D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s a n d g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s ) t h a t a r e c o m p l e m e n t a r y , a s D N A m e t h y l a t i o n c a n r e g u l a t e g e n e e x p r e s s i o n . T h r e e s u b h y p o t h e s e s p r o v i d e c o m p e l l i n g s u p p o r t f o r t h e o v e r a l l h y p o t h e s i s : 1 ) R e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M s ) d i s c e r n e d u n i q u e l y i n s u s c e p t i b l e m i c e a r e c r i t i c a l f o r t u m o r i g e n e s i s a n d t h u s , t h e a b i l i t y o f a n a n i m a l t o m a i n t a i n n o r m a l m e t h y l a t i o n p a t t e r n s i s r e l a t e d i n v e r s e l y t o i t s s u s c e p t i b i l i t y t o t u m o r d e v e l o p m e n t . 2 ) C h a n g e s i n g e n e e x p r e s s i o n d i s c e r n e d u n i q u e l y i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e a r e c r u c i a l f o r l i v e r t u m o r i g e n e s i s . 3 ) U n i q u e R A M s a n d g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s o b s e r v e d i n 2 g r o u p s o f t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e , a t e a r l y a n d l a t e r t i m e p o i n t s , m i g h t b e e s p e c i a l l y i m p o r t a n t f o r l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T h e o v e r a l l g o a l o f t h i s d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h w a s t o e l u c i d a t e p r o g r e s s i v e c h a n g e s , i n e x p r e s s i o n a n d m e t h y l a t i o n s t a t u s , o f g e n e s w h i c h p l a y k e y r o l e s i n l i v e r t u m o r i g e n e s i s i n d u c e d b y t h e p r o m o t i n g a g e n t p h e n o b a r b i t a l ( P B ) , w i t h a n e m p h a s i s o n t h e i r p o t e n t i a l t o a f f e c t s i g n a l i n g t h r o u g h c r i t i c a l p a t h w a y s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f c e l l g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n . T o a c h i e v e t h i s , 2 m u r i n e m o d e l s y s t e m s w e r e u t i l i z e d : 1 ) P B - p r o m o t e d B 6 C 3 F 1 ( l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e ) a n d C 5 7 B L / 6 ( r e l a t i v e l y t u m o r - r e s i s t a n t ) m i c e . 4 5 2 ) D i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) - i n i t i a t e d , P B - p r o m o t e d C 3 H / H e C A R w i l d t y p e ( W T ) ( l i v e r t m n o r - s u s c e p t i b l e ) a n d C A R k n o c k o u t ( K O ) ( l i v e r t u m o r - r e s i s t a n t ) m i c e . E a c h o f t h e s e m o d e l s i s c h a r a c t e r i z e d b y o n e g r o u p o f m i c e t h a t a r e p r o n e t o P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s , a n d o n e g r o u p t h a t a r e t u m o r - r e s i s t a n t . A d d i t i o n a l l y , o n e m o d e l i n v o l v e d e a r l y t i m e s ( B 6 C 3 F 1 , 2 a n d 4 w e e k s ) o f P B t r e a t m e n t , w h i l e t h e s e c o n d m o d e l i n v o l v e d l a t e r t i m e p o i n t s ( C A R W T , 2 3 w e e k s / p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d 3 2 w e e k s / l i v e r t u m o r s ) . T h e c o m b i n a t i o n o f t h e s e t w o s y s t e m s a f f o r d e d m e t h e o p p o r t u n i t y t o i d e n t i f y i n d i v i d u a l g e n e s a l t e r e d u n i q u e l y i n l i v e r s o f t u r n o r - p r o n e m i c e , a n d t o e x p l o r e s i g n a l i n g n e t w o r k s t h a t a r e a f f e c t e d a c r o s s a c o n t i n u u m o f P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s . I n d e e d , a n y m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n c h a n g e s w h i c h o c c u r r e d a t b o t h e a r l y a n d l a t e r t i m e p o i n t s m i g h t b e e s p e c i a l l y s i g n i fi c a n t . A s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d , s o m e d e t a i l s o f l i v e r t u m o r p r o m o t i o n b y P B h a v e b e e n a s c e r t a i n e d , b u t o t h e r m e c h a n i s m s r e m a i n e l u s i v e . H i s t o r i c a l l y , o u r l a b o r a t o r y h a s f o c u s e d u p o n t h e r o l e o f P B - e l i c i t e d D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s a s a m e c h a n i s m t h a t f a c i l i t a t e s l i v e r t u m o r f o r m a t i o n . W e h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e a r e l e s s c a p a b l e o f m a i n t a i n i n g n o r m a l m e t h y l a t i o n p a t t e r n s t h a n a r e t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ; W a t s o n a n d G o o d m a n , 2 0 0 2 ) . M o r e o v e r , u s i n g a n o v e l , m o r e a c c u r a t e a n d s e n s i t i v e a p p r o a c h ( v . W a t s o n a n d G o o d m a n , 2 0 0 2 ) , t h a t i n v o l v e s m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n , a r b i t r a r i l y p r i m e d P C R , a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s , u n i q u e P B - e l i c i t e d r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M s ) w e r e d e t e c t e d i n l i v e r s o f s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L 6 / , a t 2 a n d 4 w e e k s o f t r e a t m e n t ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . 4 6 M y r e s e a r c h l o g i c a l l y e x t e n d e d t h i s w o r k , a s I d e t e r m i n e d w h i c h g e n e s / g e n o m i c r e g i o n s h a r b o r e d t h e s e u n i q u e m e t h y l a t i o n c h a n g e s . E x p r e s s i o n l e v e l s o f a s u b s e t o f t h e s e g e n e s r e l a t e d t o t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s , i n d i c a t i n g a p o t e n t i a l t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t o r y r o l e f o r D N A m e t h y l a t i o n i n r e s p o n s e t o P B . F i n a l l y , c o m p r e h e n s i v e e x p r e s s i o n a n a l y s i s o f R N A fi ' o m b o t h P B - t r e a t e d B 6 C 3 F l a n d C 5 7 B L / 6 m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s r e s u l t e d i n t h e e l u c i d a t i o n o f u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e s i n t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e . T o g e t h e r , e v a l u a t i o n o f g e n e s w h o s e m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n s t a t u s e s w e r e a l t e r e d b y P B , f o l l o w e d b y s i g n a l i n g p a t h w a y a n a l y s i s , p r o v i d e d a m o r e c o m p l e t e p i c t u r e o f h o w l i v e r t u m o r p r o m o t i o n m i g h t o c c u r , s t a r t i n g a t v e r y e a r l y t r e a t m e n t t i m e p o i n t s . T h e s e c o n d m o d e l s y s t e m i n v o l v e s D E N - i n i t i a t e d , P B - p r o m o t e d C 3 H / H e m i c e t h a t a r e s u s c e p t i b l e ( C A R W T ) a n d r e s i s t a n t ( C A R K O ) t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . C A R W T m i c e e x p o s e d t o P B f o r 2 3 w e e k s d e v e l o p e d p r e c a n c e r o u s l i v e r l e s i o n s , w h i l e e x p o s u r e f o r 3 2 w e e k s r e s u l t e d i n l i v e r t u m o r d e v e l o p m e n t . M o r e o v e r , K O m i c e t r e a t e d w i t h P B f o r 2 3 o r 3 2 w e e k s d i d n o t d e v e l o p l i v e r t u m o r s . I n l i g h t o f t h e o b s e r v a t i o n s t h a t P B e l i c i t s 1 ) C A R - m e d i a t e d e f f e c t s i n t h e l i v e r ( H u a n g e t a l . , 2 0 0 5 ; U e d a e t a l . , 2 0 0 2 ; W e i e t a l . , 2 0 0 0 ; Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) , a n d 2 ) u n i q u e m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) , I e x p l o r e d t h e p o s s i b i l i t y t h a t P B c o u l d i n d u c e m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n C A R W T ( 2 3 w e e k s , p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d 3 2 w e e k s , l i v e r t u m o r s ) a n d K O ( 2 3 w e e k s ) m i c e . I t h e n d i s c e r n e d t h o s e w h i c h o c c u r r e d u n i q u e l y i n t h e s u s c e p t i b l e W T g r o u p s . S u b s e q u e n t l y , I d e t e r m i n e d i n w h i c h g e n e s / g e n o m i c r e g i o n s t h e s e R A M s o c c u r r e d , a n d i n v e s t i g a t e d w h e t h e r t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f a s u b s e t o f t h e g e n e s r e l a t e d t o t h e i r e x p r e s s i o n l e v e l s . I c o n c l u d e d t h e w o r k i n t h i s m o d e l s y s t e m w i t h a n e x a m i n a t i o n o f u n i q u e 4 7 e x p r e s s i o n c h a n g e s i n t h e P B - t r e a t e d s u s c e p t i b l e C A R W T g r o u p s , a s c o m p a r e d t o t h e P B - t r e a t e d r e s i s t a n t C A R K O m i c e . T h e r e f o r e , a n a l o g o u s t o t h e s t u d i e s p e r f o r m e d i n t h e B 6 C 3 F l - C 5 7 B L / 6 m o d e l s y s t e m , a n i n - d e p t h a s s e s s m e n t o f D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n a l t e r a t i o n s w a s u n d e r t a k e n i n o r d e r t o p r o v i d e a d e t a i l e d p i c t u r e o f h o w P B m i g h t f u n c t i o n a t l a t e r t i m e p o i n t s ( i . e . 2 3 a n d 3 2 w e e k s ) t o p r o m o t e l i v e r t u m o r s i n t h e s u s c e p t i b l e C A R W T m i c e . T h e fi n a l c o m p o n e n t o f t h i s d i s s e r t a t i o n i n v o l v e d t h e c o m p a r i s o n o f m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n a l t e r a t i o n s t h a t w e r e d i s c e r n e d i n l i v e r t i s s u e a t e a r l y ( B 6 C 3 F 1 , 2 a n d 4 w e e k s ) a n d l a t e r t i m e p o i n t s ( 2 3 w e e k s , p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d 3 2 w e e k s , l i v e r t u m o r s ) o f P B t r e a t m e n t . I n t h i s f a s h i o n , a n e x t r e m e l y t h o r o u g h a n a l y s i s o f d e r e g u l a t e d g e n e s , i n c l u d i n g t h o s e a f f e c t e d b y a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n , a n d t h e s i g n a l i n g p a t h w a y s a n d p r o c e s s e s i n w h i c h t h e y p a r t i c i p a t e , w a s p e r f o r m e d a c r o s s a c o n t i n u u m o f P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s . I h y p o t h e s i z e d t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e g e n e s w h i c h e x h i b i t e d u n i q u e c h a n g e s i n l i v e r - t u m o r s u s c e p t i b l e m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e i r r e s i s t a n t c o u n t e r p a r t s , a r e m e c h a n i s t i c a l l y c r i t i c a l f o r t u m o r d e v e l o p m e n t . U l t i m a t e l y , fi n g e r p r i n t s o f a l t e r e d g e n e e x p r e s s i o n a n d D N A m e t h y l a t i o n , a t e a r l y a n d l a t e t i m e s ( i n c l u d i n g t u m o r s ) o f P B e x p o s u r e , w e r e p r o p o s e d . 4 8 T h e s e 3 p r o j e c t s , i n c l u d i n g t h e a s s o c i a t e d s p e c i f i c a i m s , w e r e d e s i g n e d t o c o m p r e h e n s i v e l y e v a l u a t e t h e a f o r e m e n t i o n e d h y p o t h e s e s : P R O J E C T 1 ( C h a p t e r s 1 a n d 2 ) : I d e n t i fi c a t i o n o f g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d h e p a t i c m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n c h a n g e s i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e , a t 2 a n d 4 w e e k s o f t r e a t m e n t . a ) T o a s c e r t a i n k e y g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M S ) i n s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s : C h a p t e r 1 b ) T o d e t e m r i n e h o w e x p r e s s i o n o f k e y g e n e s ( i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n B 6 C 3 F 1 m i c e , a s d i s c e r n e d i n A i m l a ) r e l a t e s t o t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s , a n d i f t r a n s c r i p t l e v e l s a r e a l t e r e d u n i q u e l y i n B 6 C 3 F 1 m i c e : C h a p t e r 2 c ) T o d e t e r m i n e i f e x p r e s s i o n l e v e l s o f 3 D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) g e n e s c h a n g e u n i q u e l y i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t : C h a p t e r 2 d ) T o p e r f o r m m i c r o a r r a y a n a l y s i s a n d s u b s e q u e n t l y e l u c i d a t e u n i q u e g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s i n B 6 C 3 F 1 m i c e , a t 2 a n d 4 w e e k s : C h a p t e r 2 e ) T o i d e n t i f y p u t a t i v e C A R r e s p o n s e c i s e l e m e n t s ( C A R E S ) w i t h i n s e l e c t e d g e n e s , i n c l u d i n g 3 D n m t ’ s , w h o s e m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n s t a t u s e s a r e a l t e r e d u n i q u e l y i n B 6 C 3 F 1 m i c e d u e t o 2 a n d / o r 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t : C h a p t e r 2 P R O J E C T 2 ( C h a p t e r s 3 , 4 , a n d 5 ) : I d e n t i fi c a t i o n o f g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e P B - i n d u c e d m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n c h a n g e s i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e C A R w i l d t y p e ( W T ) m i c e a t 2 3 ( p r e c a n c e r o u s l i v e r ) a n d 3 2 ( l i v e r t u m o r s ) w e e k s o f t r e a t m e n t , a s c o m p a r e d t o t u m o r - r e s i s t a n t C A R k n o c k o u t ( K O ) m i c e a t 2 3 w e e k s . 4 9 a ) T o c o m p a r e c h a n g e s i n G C - r i c h m e t h y l a t i o n p a t t e r n s i n t u m o r - s u s c e p t i b l e C A R W T a n d r e s i s t a n t K O m i c e , a n d t o d i s c e r n u n i q u e R A M s i n t h e C A R W T g r o u p s ( b o t h p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d l i v e r t u m o r s ) : C h a p t e r 3 b ) T o a s c e r t a i n k e y g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e R A M S i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s : C h a p t e r 4 c ) T o d e t e r m i n e h o w e x p r e s s i o n o f k e y g e n e s ( i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n C A R W T m i c e , a s d i s c e r n e d i n A i m 2 b ) r e l a t e s t o t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s , a n d i f t r a n s c r i p t l e v e l s a r e a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s : C h a p t e r 5 d ) T o d e t e r m i n e i f e x p r e s s i o n l e v e l s o f 3 D n m t g e n e s c h a n g e u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s : C h a p t e r 5 e ) T o p e r f o r m m i c r o a r r a y a n a l y s i s a n d s u b s e q u e n t l y e l u c i d a t e u n i q u e g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s : C h a p t e r 5 f ) T o i d e n t i f y p u t a t i v e C A R E S w i t h i n s e l e c t e d g e n e s , i n c l u d i n g 3 D n m t ’ s , w h o s e m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n s t a t u s e s a r e a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s : C h a p t e r 5 P R O J E C T 3 ( C h a p t e r s 4 a n d 5 ) : C o m p a r i s o n o f g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e P B - e l i c i t e d a l t e r e d m e t h y l a t i o n a n d / o r g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s i n b o t h t y p e s o f l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e , a t e a r l y ( i . e . 2 a n d 4 w e e k s ) a n d l a t e ( i . e . 2 3 w e e k s , p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d 3 2 w e e k s , l i v e r t u m o r s ) t i m e p o i n t s . a ) T o c o m p a r e g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e R A M S i n b o t h t h e P B - t r e a t e d s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] a n d C A R W T m i c e : C h a p t e r 4 5 0 b ) T o c o m p a r e t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e R A M s , p l u s 3 D n m t ’ s , i n b o t h P B - t r e a t e d s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] a n d C A R W T m i c e : C h a p t e r 5 c ) T o c o m p a r e g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n i s a l t e r e d u n i q u e l y , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s , i n b o t h t h e P B - t r e a t e d s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F l a n d C A R W T m i c e : C h a p t e r 5 R E F E R E N C E S F O R T H E I N T R O D U C T I O N A N D D I S C U S S I O N S E C T I O N S A R E L I S T E D O N P A G E S 3 7 3 - 3 9 1 . 5 1 C H A P T E R 1 T h i s c h a p t e r r e p r e s e n t s a m a n u s c r i p t t h a t w a s p u b l i s h e d i n T o x i c o l o g i c a l S c i e n c e s 1 0 4 , p . 8 6 - 9 9 , 2 0 0 8 . T h e a u t h o r s a r e J e n n i f e r M . P h i l l i p s a n d J a y I . G o o d m a n . 5 2 A B S T R A C T A b e r r a n t D N A m e t h y l a t i o n p l a y s i m p o r t a n t r o l e s i n t u m o r i g e n e s i s a n d t h e n o n g e n o t o x i c r o d e n t t u m o r p r o m o t e r p h e n o b a r b i t a l ( P B ) a l t e r s m e t h y l a t i o n p a t t e r n s t o a g r e a t e r e x t e n t i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t m i c e ( W a t s o n a n d G o o d m a n , 2 0 0 2 ) . U n i q u e h e p a t i c r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M s ) w e r e i d e n t i fi e d i n s e n s i t i v e B 6 C 3 F l , a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , m i c e a t 2 o r 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t u s i n g a n o v e l a p p r o a c h i n v o l v i n g m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n , a r b i t r a r i l y p r i m e d P C R a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . P C R p r o d u c t s r e p r e s e n t i n g 9 0 o f t h e 1 7 0 ( 5 3 % ) t o t a l u n i q u e B 6 C 3 F l R A M S a t 2 o r 4 w e e k s w e r e c l o n e d a n d s u b j e c t e d t o B L A S T - L i k e A l i g n m e n t T o o l ( B L A T ) s e a r c h e s w h i c h r e s u l t e d i n 5 1 g e n e m a t c h e s ; s o m e o f t h e s e h a v e d o c u m e n t e d o n c o g e n i c o r t u m o r s u p p r e s s o r r o l e s . I m p o r t a n t l y , u n i q u e l y h y p o m e t h y l a t e d g e n e s p l a y r o l e s i n a n g i o g e n e s i s a n d i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s ( e . g . , c h y m a s e 1 , t y r o s i n e k i n a s e n o n r e c e p t o r 2 , a n d p o s s i b l y e p h r i n B 2 a n d t r i p l e f u n c t i o n a l d o m a i n , P T P R F i n t e r a c t i n g ) , i n c l u d i n g t h o s e i n v o l v e d i n t h e e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n ( t r a n s c r i p t i o n f a c t o r 4 , t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a r e c e p t o r I I a n d r a l g u a n i n e n u c l e o t i d e d i s s o c i a t i o n s t i m u l a t o r ) . C o m m o n c e l l u l a r t a r g e t s a n d r e g u l a t o r s o f t h e g e n e s r e p r e s e n t i n g u n i q u e B 6 C 3 F l R A M s w e r e u n c o v e r e d , i n d i c a t i n g t h a t t h e y m i g h t a c t i n c o n c e r t t o m o r e e f fi c i e n t l y p r o m o t e t u m o r i g e n e s i s . G e n e s n o t p r e v i o u s l y a s s o c i a t e d w i t h m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s e x h i b i t e d a l t e r e d m e t h y l a t i o n a t t h e s e v e r y e a r l y t i m e s f o l l o w i n g P B t r e a t m e n t . W e h y p o t h e s i z e t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e u n i q u e P B - i n d u c e d B 6 C 3 F ] R A M S r e p r e s e n t k e y e v e n t s f a c i l i t a t i n g t r a n s f o r m a t i o n , w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h a c a u s a t i v e r o l e o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n d u r i n g e a r l y s t a g e s o f t u m o r i g e n e s i s . 5 3 I N T R O D U C T I O N D N A m e t h y l a t i o n , i . e . , 5 - m e t h y l c y t o s i n e , o c c u r s a t a p p r o x i m a t e l y 7 0 % o f C p G d i n u c l e o t i d e s ( N a v e h — M a n y a n d C e d a r , 1 9 8 1 ) a n d e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t m e t h y l a t i o n a t n o n - C p G s i t e s s u c h a s C p A a n d C p T i s m e d i a t e d b y D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e 3 a ( R a m s a h o y e e t a l . , 2 0 0 0 ) . D N A m e t h y l a t i o n s i l e n c e s r e t r o t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s , c o n t r o l s g e n o m i c i m p r i n t i n g a n d r e g u l a t e s t i s s u e - s p e c i fi c g e n e e x p r e s s i o n d u r i n g d e v e l o p m e n t ( R e i k , 2 0 0 7 ) . A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n i s a n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m t h a t p l a y s m u l t i p l e r o l e s d u r i n g t u m o r f o r m a t i o n ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 ) . C a r c i n o g e n e s i s i s a m u l t i s t e p / m u l t i s t a g e p r o c e s s i n v o l v i n g t h e p r o g r e s s i v e c l o n a l e x p a n s i o n o f c e l l s w h i c h h a v e a c c u m u l a t e d c r i t i c a l , h e r i t a b l e a l t e r a t i o n s w i t h i n t u m o r s u p p r e s s o r s a n d o n c o g e n e s , p r o v i d i n g t h e m w i t h g r o w t h a d v a n t a g e s o v e r n e i g h b o r i n g c e l l s ( F e i n b e r g e t a l . , 2 0 0 6 ; H a n a h a n a n d W e i n b e r g , 2 0 0 0 ; N o w e l l , 1 9 7 6 ) . T h e k e y m o d i fi c a t i o n s i n g e n e s t h a t c o n t r i b u t e t o c r u c i a l p r o c e s s e s c a n b e m u t a t i o n s a n d / o r e p i g e n e t i c a l t e r a t i o n s s i n c e t h e s e m i g h t b e f u n c t i o n a l l y i d e n t i c a l . M u t a t i o n a s w e l l a s D N A h y p e r m e t h y l a t i o n c a n s i l e n c e t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s , w h i l e m u t a t i o n a s w e l l a s h y p o m e t h y l a t i o n c a n a c t i v a t e o n c o g e n e s ( G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) . P h e n o b a r b i t a l ( P B ) i s t h e p r o t o t y p i c a l n o n g e n o t o x i c r o d e n t l i v e r t u m o r p r o m o t e r t h a t c a u s e s h y p e r t r o p h y , h y p e r p l a s i a a n d u p r e g u l a t i o n o f d r u g m e t a b o l i z i n g e n z y m e s , e . g . , c y t o c h r o m e P 4 5 0 3 ( W h y s n e r e t a l . , 1 9 9 6 ) . S o m e d e t a i l s r e g a r d i n g P B - i n d u c e d t u m o r p r o m o t i o n h a v e e m e r g e d . I n N - n i t r o s o d i e t h y l a m i n e ( D E N ) - i n i t i a t e d B 6 C 3 F 1 m i c e , a t u m o r p r o m o t i n g d o s e o f P B ( 0 . 0 5 % , w / w ) c a u s e d a n i n c r e a s e i n f o c a l D N A s y n t h e s i s a n d a s i m u l t a n e o u s d e c r e a s e i n a p o p t o s i s , l i k e l y f a c i l i t a t i n g p r e n e o p l a s t i c l e s i o n g r o w t h i n t h e l i v e r ( K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 b ) . D E N - i n i t i a t e d C o n n e x i n 3 2 - n u l l m i c e d e v e l o p 5 4 l i v e r t t u n o r s a t a h i g h r a t e t h a t i s n o t e n h a n c e d b y P B t r e a t m e n t ( M o e n n i k e s e t a l . , 2 0 0 0 ) , i n d i c a t i n g t h a t i n h i b i t i o n o f g a p j u n c t i o n a l i n t r a c e l l u l a r c o m m m r i c a t i o n ( G J I C ) i s k e y i n t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f P B ; i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t i n h i b i t i o n a n d d o w n - r e g u l a t i o n o f G J I C a r e i n v o l v e d i n t u m o r p r o m o t i o n a n d p r o g r e s s i o n ( T r o s k o a n d C h a n g , 2 0 0 1 ) . A d d i t i o n a l l y , t h e n u c l e a r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) m e d i a t e s P B - i n d u c e d h e p a t o m e g a l y i n m o u s e l i v e r ( W e i e t a l . , 2 0 0 0 ) a n d i t i s e s s e n t i a l f o r t u m o r p r o m o t i o n b y P B i n D E N - i n i t i a t e d C 3 H / H e m i c e ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . F u r t h e r m o r e , D E N - i n i t i a t e d C A R w i l d - t y p e m i c e , p r o m o t e d w i t h P B f o r 2 3 ( p r e c a n c e r o u s l i v e r l e s i o n s p r e s e n t ) o r 3 2 ( l i v e r t u m o r s p r e s e n t ) w e e k s , e x h i b i t e d u n i q u e h e p a t i c r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M s ) a s c o m p a r e d t o D E N - i n i t i a t e d C A R k n o c k - o u t m i c e p r o m o t e d f o r 2 3 w e e k s ( P h i l l i p s e t a l . , 2 0 0 7 ) . I m p o r t a n t l y , m e t h y l a t i o n p a t t e r n s a r e d i s r u p t e d t o a g r e a t e r e x t e n t i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e , a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t , m i c e u p o n t r e a t m e n t w i t h 0 . 0 5 % ( w / w ) P B , i n c l u d i n g h i g h e r l e v e l s o f h y p e r m e t h y l a t i o n i n t h e 2 s e n s i t i v e g r o u p s ( C 3 H / H e > > B 6 C 3 F 1 > C 5 7 B L / 6 ) ( W a t s o n a n d G o o d m a n , 2 0 0 2 ) . A f t e r 1 2 m o n t h s o f t r e a t m e n t w i t h 0 . 0 5 % ( w / w ) P B i n d r i n k i n g w a t e r , 1 0 0 % o f B 6 C 3 F ] a n d n o C 5 7 B L / 6 m i c e d e v e l o p l i v e r t u m o r s ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) . I t i s h y p o t h e s i z e d t h a t t h e i r d i f f e r e n t i a l a b i l i t i e s t o m a i n t a i n n o r m a l m e t h y l a t i o n p a t t e r n s c o n t r i b u t e t o t h e d i s p a r i t y i n t h e i r l i v e r t u m o r s u s c e p t i b i l i t i e s ( W a t s o n a n d G o o d m a n , 2 0 0 2 ) . A n i m p o r t a n t q u e s t i o n t o a d d r e s s i s , i n w h i c h g e n e s d o c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n p l a y a k e y r o l e ? O n e a p p r o a c h m i g h t h a v e b e e n t o l o o k f o r P B - i n d u c e d c h a n g e s i n e x p r e s s i o n ( e . g . , a m i c r o a r r a y s t u d y ) f o l l o w e d b y m e t h y l a t i o n a n a l y s i s o f t h o s e g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n w a s a l t e r e d . T h e p r o b l e m h e r e l i e s w i t h t h e t e d i o u s t a s k o f e v a l u a t i n g m e t h y l a t i o n s t a t u s i n , p o s s i b l y , t h o u s a n d s o f g e n e s p l u s t h e 5 5 l i k e l i h o o d t h a t a t e a r l y t i m e s f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h P B s o m e k e y g e n e s m i g h t e x h i b i t m o d i fi e d m e t h y l a t i o n b u t n o t y e t t o t h e e x t e n t t h a t e x p r e s s i o n w a s a f f e c t e d . T h e r e f o r e , w e d e c i d e d t o fi r s t l o o k f o r a l t e r e d m e t h y l a t i o n w i t h t h e u n d e r s t a n d i n g t h a t t h i s c o u l d b e f o l l o w e d - u p w i t h e x p r e s s i o n a n a l y s i s . R A M s w e r e d e t e c t e d b y a n o v e l a p p r o a c h i n v o l v i n g m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n , a r b i t r a r i l y p r i m e d P C R , a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . U n i q u e R A M s i n t h e s e n s i t i v e B 6 C 3 F l , a s c o m p a r e d t o t h e r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , m i c e i n r e s p o n s e t o 2 o r 4 w e e k s o f 0 . 0 5 % ( w / w ) P B t r e a t m e n t w e r e d i s c e r n e d ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . I t i s h y p o t h e s i z e d t h a t a m o n g t h e P B - i n d u c e d u n i q u e R A M S i n t h e s e n s i t i v e m i c e a r e t h o s e t h a t p l a y c r i t i c a l m e c h a n i s t i c r o l e s e a r l y d u r i n g p r o m o t i o n o f t u m o r i g e n e s i s . O n l y a f e w g e n e s , i n c l u d i n g C A R ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) , h a v e p r e v i o u s l y b e e n l i n k e d t o m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s . P r o m o t i o n b y P B ( A y d i n l i k e t a l . , 2 0 0 1 ) a n d 2 , 2 ’ , 4 , 4 ’ , 5 , 5 ’ - h e x a c h l o r o b i p h e n y l ( P C B 1 5 3 ) ( S t r a t h m a n n e t a l . , 2 0 0 6 ) l e a d t o t u m o r s w i t h m u t a t i o n s i n t h e B - c a t e n i n g e n e , p o s s i b l y t h e r e s u l t o f s e l e c t i v e c l o n a l e x p a n s i o n o f c e l l s b e a r i n g t h e m u t a t i o n . M y c a m p l i fi c a t i o n o c c u r s i n l i v e r t u m o r s w i t h n o d e t e c t a b l e m e t h y l a t i o n c h a n g e s ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) . M o u s e l i v e r t u m o r s d i s p l a y a c t i v a t i n g H a - r a s m u t a t i o n s ( W i s e m a n e t a l . , 1 9 8 6 ) , i n a d d i t i o n t o h y p o m e t h y l a t i o n o f t h e 5 ’ r e g i o n ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) a n d i n c r e a s e d H a — r a s e x p r e s s i o n ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 7 ) . S i m i l a r l y , K i - r a s i s h y p o m e t h y l a t e d i n l i v e r t u m o r s a n d t h i s c h a n g e m i g h t b e e s s e n t i a l , t h o u g h n o t n e c e s s a r i l y s u f fi c i e n t , f o r o v e r e x p r e s s i o n ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) . P B i n d u c e s h y p o m e t h y l a t i o n o f t h e r a f o n c o g e n e i n B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r , w h i c h c o u l d l e a d t o i n c r e a s e d e x p r e s s i o n ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . 5 6 I n t h i s s t u d y , u n i q u e R A M s t h a t f o r m e d i n h e p a t i c D N A o f s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 , a s c o m p a r e d w i t h r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , m i c e a t a n e a r l y s t a g e o f P B p r o m o t i o n ( B a c h m a n e t a 1 . , 2 0 0 6 b ) w e r e a n n o t a t e d . P C R p r o d u c t s r e p r e s e n t i n g u n i q u e R A M s w e r e c l o n e d a n d t h e B L A S T - L i k e A l i g n m e n t T o o l ( B L A T ) w a s e m p l o y e d t o a s c e r t a i n w i t h w h i c h g e n e s , n o n - p r o t e i n - c o d i n g r e g i o n s , a n d “ i m a n n o t a t e d ” r e g i o n s o f t h e g e n o m e t h e s e R A M s a r e a s s o c i a t e d . A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n w a s d i s c e r n e d i n a n u m b e r o f g e n e s t h a t h a v e n o t p r e v i o u s l y b e e n i m p l i c a t e d i n m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s , t h o u g h m a n y h a v e b e e n a s s o c i a t e d w i t h t u m o r i g e n e s i s i n o t h e r s p e c i e s , i n c l u d i n g h u m a n s . A n i n f o r m a t i c s a p p r o a c h w a s t h e n u t i l i z e d t o e l u c i d a t e b i o l o g i c a l p a t h w a y s t h a t m i g h t b e d i s r u p t e d b y P B - i n d u c e d a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n a n d , t h e r e f o r e , c o n t r i b u t e t o c a r c i n o g e n e s i s . 5 7 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S A n i m a l s , T r e a t m e n t s a n d T i s s u e S a m p l e s B 6 C 3 F ] ( C 5 7 B L / 6 > < C 3 H / H e ) a n d C 5 7 B L / 6 m i c e w e r e a c q u i r e d ( C h a r l e s R i v e r L a b o r a t o r i e s , W i l m i n g t o n , M A ) a n d r a n d o m l y a s s i g n e d t o c o n t r o l o r t r e a t m e n t g r o u p s w i t h 6 o r 7 a n i m a l s p e r g r o u p ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . P h e n o b a r b i t a l w a s a d m i n i s t e r e d i n d r i n k i n g w a t e r a t a c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 0 5 % ( w / w ) f o r 2 o r 4 w e e k s a n d l i v e r t i s s u e w a s h a r v e s t e d a s d e s c r i b e d ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . T r e a t m e n t , h o u s i n g a n d c a r e w e r e i n a c c o r d a n c e w i t h t h e A n i m a l U s e a n d C a r e G u i d e l i n e s o f M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . D N A i s o l a t i o n L i v e r t i s s u e w a s h o m o g e n i z e d i n l m l o f T R I z o l R e a g e n t ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A ) a n d D N A w a s i s o l a t e d v i a t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . E v a l u a t i o n o f D N A M e t h y l a t i o n S t a t u s b y A r b i t r a r i l y P r i m e d P C R a n d C a p i l l a r y E l e c t r o p h o r e s i s D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s w a s e v a l u a t e d b y a n a r b i t r a r i l y p r i m e d P C R , c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s p r o c e d u r e ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 a ) . T h i s t e c h n i q u e p e r m i t s t h e s i m u l t a n e o u s e v a l u a t i o n o f t r e a t m e n t - r e l a t e d h y p o m e t h y l a t i o n s ( l e s s m e t h y l a t i o n i n a r e g i o n t h a t w a s m e t h y l a t e d i n c o n t r o l ) , h y p e r m e t h y l a t i o n s ( m o r e m e t h y l a t i o n i n a r e g i o n t h a t w a s m e t h y l a t e d i n c o n t r o l ) a n d n e w m e t h y l a t i o n s ( m e t h y l a t i o n i n a r e g i o n t h a t w a s n o t m e t h y l a t e d i n c o n t r o l ) i n n u m e r o u s r e g i o n s o f t h e g e n o m e . R e s t r i c t i o n D i g e s t s 5 8 E a c h D N A s a m p l e w a s s u b j e c t e d t o t h r e e s e p a r a t e d o u b l e r e s t r i c t i o n d i g e s t s t h a t w e r e p e r f o r m e d i n d u p l i c a t e w i t h a ) a m e t h y l a t i o n - i n s e n s i t i v e e n z y m e a n d b ) a m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e e n z y m e . D i g e s t i o n w i t h a m e t h y l a t i o n - i n s e n s i t i v e e n z y m e , R s a I o r B f a I , e n s u r e s c o m p l e t e d i g e s t i o n b y t h e m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e e n z y m e , M s p I , H p a I I , o r B s s H I I . R e s t r i c t i o n d i g e s t i o n w i t h R s a I / M s p l , R s a I / H p a I I a n d B f a I / B s s H I I w a s c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . M s p I a n d H p a I I r e c o g n i z e 5 ’ C C G G 3 ’ s i t e s a n d c u t b e t w e e n t h e i n t e r n a l c y t o s i n e a n d g u a n i n e . M s p I w i l l n o t r e s t r i c t D N A i f t h e e x t e r n a l c y t o s i n e i s m e t h y l a t e d , w h i l e H p a I I w i l l n o t r e s t r i c t D N A i f t h e i n t e r n a l c y t o s i n e i s m e t h y l a t e d . B s s H I I r e c o g n i z e s 5 ’ G C G C G C 3 ’ s i t e s a n d c u t s b e t w e e n t h e fi r s t g u a n i n e a n d c y t o s i n e r e s i d u e s a n d w i l l n o t r e s t r i c t D N A i f s e v e r a l c o m b i n a t i o n s o f c y t o s i n e s i n t h e s e q u e n c e a r e m e t h y l a t e d . B f a I S i t e s a p p e a r l e s s f r e q u e n t l y i n C p G i s l a n d s t h a n R s a I s i t e s a n d , t h u s , C p G i s l a n d s a r e m o r e i n t a c t f o l l o w i n g d i g e s t i o n o f D N A w i t h t h e f o r m e r e n z y m e a s c o m p a r e d t o t h e l a t t e r ( S h i r a i s h i e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e r e f o r e , t h e u s e o f B f a I i n c o m b i n a t i o n w i t h B s s H I I , a 6 - b a s e r a r e c u t t e r w i t h a G C - r i c h r e c o g n i t i o n s e q u e n c e , p r o v i d e s a n a d d i t i o n a l , i m p o r t a n t “ w i n d o w ” i n t o o u r D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s a n a l y s i s w h i c h c o m p l e m e n t s t h e d a t a o b t a i n e d w i t h t h e R s a I / M s p I a n d R s a I / H p a I I d i g e s t s . A r b i t r a r i l y P r i m e d P C R ( A P - P C R ) a n d C a p i l l a r y E l e c t r o p h o r e t i c S e p a r a t i o n o f P r o d u c t s A P - P C R a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) , h o w e v e r , t w o c o r r e c t i o n s w e r e m a d e : t h e fi v e c y c l e s t a g e o f t h e A P - P C R r e a c t i o n w a s f o l l o w e d b y 3 0 c y c l e s ( n o t 4 0 c y c l e s a s s t a t e d o r i g i n a l l y ) , s t a r t i n g w i t h a d e n a t u r a t i o n s t e p o f 9 4 ° C f o r 3 0 s ( n o t 1 5 s a s s t a t e d o r i g i n a l l y ) . T h e d i g e s t e d D N A w a s s u b j e c t e d t o A P - P C R u s i n g a s i n g l e a r b i t r a r y p r i m e r , 5 ’ A A C C C T C A C C C T A A C C C C 5 9 G G 3 ’ ( G o n z a l g o e t a l . , 1 9 9 7 ) w h i c h w a s fl u o r e s c e n t l y l a b e l e d a t t h e 5 ’ e n d w i t h H E X T M ( I n t e g r a t e d D N A T e c h n o l o g i e s , C o r a l v i l l e , I A ) . T h i s p r i m e r b i n d s w e l l t o G C - r i c h r e g i o n s a n d t h e 5 ’ C C G G 3 ’ s e q u e n c e a t i t s 3 ’ e n d i n c r e a s e s t h e p r o b a b i l i t y o f b i n d i n g t o t h e M s p I a n d H p a I I r e s t r i c t i o n s i t e s , p e r m i t t i n g t h e d e t e c t i o n o f m e t h y l a t i o n a t t h e s i t e o f p r i m e r a n n e a l i n g a n d b e t w e e n s i t e s o f p r i m e r a n n e a l i n g . D a t a A n a l y s i s T h e r e s u l t i n g P C R p r o d u c t s w e r e e v a l u a t e d w i t h r e g a r d t o t h e i r s i z e , i n b a s e p a i r s , a n d c o r r e s p o n d i n g p e a k a r e a s , u s i n g t h e E x c e l ® p r o g r a m . A c o n s e n s u s , a v e r a g e p e a k a r e a w a s c a l c u l a t e d f o r e a c h e x p e r i m e n t a l g r o u p . T h i s p e r m i t s t h e c o n s e n s u s p e a k a r e a o f a c o n t r o l g r o u p t o b e c o m p a r e d w i t h t h e c o n s e n s u s p e a k a r e a o f a t r e a t m e n t g r o u p , i n o r d e r t o d e t e r m i n e i f t h e r e a r e d i f f e r e n c e s i n m e t h y l a t i o n a t a p a r t i c u l a r P C R p r o d u c t s i z e , a n d i f s o , t h e s e P C R p r o d u c t s a r e c o n s i d e r e d t o b e r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M S ) . T r e a t r n e n t - r e l a t e d R A M S i n c l u d e : a ) h y p o m e t h y l a t i o n s , b o t h 1 0 0 % d e c r e a s e s , a n d d e c r e a s e s w h i c h a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) w h e n c o m p a r e d t o c o n t r o l , b ) h y p e r m e t h y l a t i o n s , w h i c h a r e i n c r e a s e s t h a t a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) w h e n c o m p a r e d t o c o n t r o l a n d c ) n e w m e t h y l a t i o n s , i n w h i c h P C R p r o d u c t f o r m e d f o l l o w i n g t r e a t m e n t b u t d i d n o t f o r m u n d e r c o n t r o l c o n d i t i o n s . A d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f t h e d a t a a n a l y s i s p r o c e d u r e w a s p r o v i d e d p r e v i o u s l y ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 a ; B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) a n d i n c l u d e d t h e f o l l o w i n g c o m p a r i s o n s : l ) B 6 C 3 F ] , 2 w e e k 0 . 0 5 % P B v s . B 6 C 3 F l , 2 w e e k c o n t r o l d a t a , 2 ) C 5 7 B L / 6 , 2 w e e k 0 . 0 5 % P B v s . C 5 7 B L / 6 , 2 w e e k c o n t r o l d a t a , 3 ) B 6 C 3 F ] , 4 w e e k 6 0 0 . 0 5 % P B v s . B 6 C 3 F l , 4 w e e k c o n t r o l d a t a a n d 4 ) C 5 7 B L / 6 , 4 w e e k 0 . 0 5 % P B v s . C 5 7 B L / 6 , 4 w e e k c o n t r o l d a t a ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . C o m m o n a n d U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) I n o r d e r t o d e t e r m i n e i f t h e R A M S t h a t o c c u r r e d a t t h e s a m e P C R p r o d u c t S i z e i n t w o t r e a t m e n t g r o u p s a r e e q u i v a l e n t ( c o m m o n R A M S ) o r d i f f e r e n t ( u n i q u e R A M S ) , t w o - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) t e s t s , p < 0 . 0 5 , w e r e p e r f o r m e d ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . I n t h i s w a y , f o r e x a m p l e , u n i q u e R A M s i n t h e B 6 C 3 F 1 , 4 w e e k 0 . 0 5 % P B - t r e a t e d g r o u p a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 , 4 w e e k 0 . 0 5 % P B - t r e a t e d g r o u p w e r e i d e n t i fi e d . I n a d d i t i o n , o n e - w a y A N O V A , p < 0 . 0 5 , w a s u s e d t o d i s c e r n u n i q u e B 6 C 3 F l 0 . 0 5 % P B - i n d u c e d R A M s t h a t “ c a r r i e d f o r w a r ” f r o m t h e 2 t o 4 w e e k t i m e p o i n t . I d e n t i f i c a t i o n o f P B - i n d u c e d U n i q u e B 6 C 3 F ] R A M s C l o n i n g a n d S e q u e n c i n g o f A P - P C R P r o d u c t s I n o r d e r t o i d e n t i f y i n w h a t r e g i o n s o f t h e g e n o m e t h e P B - i n d u c e d u n i q u e B 6 C 3 F ] R A M S o c c u r r e d , t h e A P - P C R p r o d u c t s w e r e fi r s t c l o n e d u s i n g a n i n - g e l a p p r o a c h . T h e A P - P C R p r o d u c t s a n d a 1 0 0 b a s e p a i r D N A l a d d e r ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A ) w e r e e l e c t r o p h o r e s e d t h r o u g h a 3 % N u S i e v e ® G T G ® l o w m e l t i n g t e m p e r a t u r e a g a r o s e g e l ( L o n z a B i o s c i e n c e s , B a s e l , S w i t z e r l a n d ) . P o r t i o n s o f t h e g e l t h a t c o n t a i n e d P C R p r o d u c t s w i t h i n 1 0 0 b a s e p a i r s i z e r a n g e s w e r e e x c i s e d , m e l t e d a n d u s e d f o r i n - g e l c l o n i n g r e a c t i o n s p r e p a r e d w i t h t h e p G E M ® - T E a s y V e c t o r K i t ( P r o m e g a , M a d i s o n , W I ) . C l o n e s t h a t c o n t a i n e d P C R p r o d u c t i n s e r t s w e r e p u r i fi e d a n d s e q u e n c e d a t t h e R e s e a r c h T e c h n o l o g y a n d S u p p o r t F a c i l i t y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . S e q u e n c i n g r e a c t i o n s 6 1 w e r e p r e p a r e d u s i n g e i t h e r S P 6 o r T 7 s e q u e n c i n g p r i m e r s ( a s d e s c r i b e d i n t h e p G E M ® - T E a s y V e c t o r T e c h n i c a l M a n u a l ; P r o m e g a , M a d i s o n , W I ) a n d s u b s e q u e n t l y r u n o n a n A B I 3 7 3 0 x 1 G e n e t i c A n a l y z e r . C o m p a r i s o n o f t h e S i z e s o f C l o n e d A P - P C R P r o d u c t s t o t h e S i z e s o f U n i q u e R A M s A f t e r t h e s e q u e n c e s w e r e o b t a i n e d , t h e s i z e s o f t h e c l o n e d p r o d u c t s w e r e c o m p a r e d t o t h e s i z e s o f t h e u n i q u e R A M S i n o r d e r t o d e t e r m i n e w h i c h c l o n e d p r o d u c t s r e p r e s e n t e d u n i q u e B 6 C 3 F l R A M s a t t h e 2 o r 4 w e e k t i m e p o i n t s . I n m a n y i n s t a n c e s , i t c a n b e c o n fi d e n t l y s t a t e d t h a t a p a r t i c u l a r c l o n e d p r o d u c t r e p r e s e n t s a s i n g l e R A M a n d a s s u c h , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h a t R A M i s u n a m b i g u o u s . H o w e v e r , t h e r a w d a t a a n a l y s i s p e r f o r m e d t o e s t a b l i s h i f a R A M o c c u r r e d i n a t r e a t m e n t a s c o m p a r e d t o a c o n t r o l g r o u p ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 a ) i s b a s e d o n t h e u n d e r s t a n d i n g t h a t t h e A B I 3 1 3 0 G e n e t i c A n a l y z e r c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s i n s t r u m e n t d o e s n o t d e t e c t P C R p r o d u c t s i z e s w i t h 1 0 0 % a c c u r a c y . T h e r e f o r e , i n c e r t a i n i n s t a n c e s d u r i n g t h e a n a l y s i s o f t h e r a w d a t a , P C R p r o d u c t s i z e s a r e c o m b i n e d . S i x o r s e v e n a n i m a l s p e r e x p e r i m e n t a l g r o u p w e r e u s e d a n d r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n s w e r e p e r f o r m e d i n d u p l i c a t e , f o l l o w e d b y A P - P C R , f o r a t o t a l o f 1 2 o r 1 4 r e a c t i o n s . I f m u l t i p l e P C R p r o d u c t s i z e s w i t h i n 2 b a s e p a i r s o f o n e a n o t h e r d i s p l a y e d p r o d u c t i n l e s s t h a n h a l f o f t h e 1 2 o r 1 4 A P - P C R r e a c t i o n s , t h e s e p r o d u c t s w e r e c o n s i d e r e d t o b e “ i d e n t i c a l ” a n d w e r e s u b s e q u e n t l y c o m b i n e d . T h i s p r o c e d u r e h a s i m p l i c a t i o n s f o r a n a l y s i s o f t h e c l o n i n g d a t a . F o r e x a m p l e , 2 R A M s o c c u r u n i q u e l y i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 4 w e e k s a s a r e s u l t o f R s a F H p a I I d i g e s t i o n : a n e w m e t h y l a t i o n a t 3 0 6 b p a n d a h y p o m e t h y l a t i o n a t 3 1 0 b p ( F i g . 1 . 7 ) . A P C R p r o d u c t o f 3 0 8 b p w a s c l o n e d a n d a B L A T s e a r c h s h o w e d t h a t t h e p r o d u c t s p a n s t h e t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e o f N K 2 6 2 t r a n s c r i p t i o n f a c t o r r e l a t e d , l o c u s 6 ( k a 6 - 2 ) ( T a b l e 1 . 1 ) . D u e t o o u r b a s i c d a t a a n a l y s i s a s s u m p t i o n , w e w e r e n o t a b l e t o u n a m b i g u o u s l y s t a t e w h e t h e r k a 6 - 2 r e p r e s e n t s t h e n e w l y m e t h y l a t e d R A M a t 3 0 6 b p o r t h e h y p o m e t h y l a t e d R A M a t 3 1 0 b p . T h e “ m e t h y l a t i o n s t a t u s ” d a t a c o l u m n i n T a b l e 1 . 1 r e fl e c t s t h i s l i m i t a t i o n , w h e r e 1 6 % ( 1 4 / 8 5 ) o f t h e g e n e s , a n d r e g i o n s o f t h e g e n o m e w h i c h a r e g r e a t e r t h a n 1 0 k b a w a y f r o m a k n o w n g e n e , a r e t e n t a t i v e l y c l a s s i fi e d a s h a v i n g m u l t i p l e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s a t e i t h e r 2 o r 4 w e e k s ( e . g . , H y p o / N e w f o r a s i n g l e r e g i o n a t 4 w e e k s ) . A n a l y s i s o f A P - P C R P r o d u c t S e q u e n c e s T h e s e q u e n c e s w e r e s u b j e c t e d t o B L A T d a t a b a s e s e a r c h e s o f t h e m o u s e g e n o m e ( U C S C G e n o m e B r o w s e r , J u l y 2 0 0 7 m o u s e a s s e m b l y , h t t p : / / g e n o m e . u c s c . e d u / c g i - b i n / t h l a t ) i n o r d e r t o a s c e r t a i n i n w h i c h r e g i o n s o f t h e g e n o m e t h e u n i q u e P B - i n d u c e d B 6 C 3 F ] R A M S o c c u r r e d . T h e B L A T p r o g r a m a l l o w s a n u c l e o t i d e o r a m i n o a c i d s e q u e n c e t o b e a l i g n e d t o a n i n d e x o f t h e e n t i r e g e n o m e o f a n a n i m a l . I n t h e c a s e o f D N A s e q u e n c e q u e r i e s , B L A T c a n d e t e c t s e q u e n c e a l i g n m e n t s o f 9 5 % o r g r e a t e r s i m i l a r i t y o f r e g i o n s w i t h l e n g t h s o f 2 5 o r m o r e b a s e p a i r s . A d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n a b o u t t h e g e n o m i c r e g i o n ] g e n e i s l i s t e d , i n c l u d i n g , b u t n o t l i m i t e d t o : g e n e i n f o r m a t i o n , s e q u e n c e c o n s e r v a t i o n b e t w e e n s p e c i e s , G C p e r c e n t a g e a n d t h e l o c a t i o n o f s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s a n d r e p e a t e l e m e n t s . T h e u n i q u e R A M s w e r e c l a s s i fi e d a c c o r d i n g t o a s c h e m e t h a t i n d i c a t e s w h e r e , i n r e l a t i o n t o a g e n e ( e . g . , w i t h i n a n i n t r o n , w i t h i n a n e x o n , u p s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e ) , t h e y a r e l o c a t e d ( F i g . 1 . 8 ) . G e n e s t h a t w e r e i d e n t i fi e d u s i n g B L A T s e a r c h e s w e r e s u b j e c t e d t o b i o l o g i c a l p a t h w a y a n a l y s i s v i a P a t h w a y S t u d i o 5 . 0 ( A r i a d n e G e n o m i c s , R o c k v i l l e , M D ) . I n t h i s f a s h i o n , p a t h w a y s f o r t h e i n d i v i d u a l g e n e s 6 3 w e r e e l u c i d a t e d . I n a d d i t i o n , c o m m o n c e l l u l a r t a r g e t s ( F i g . 1 . 9 ) a n d r e g u l a t o r s ( F i g . 1 . 1 6 ) o f t h e u n i q u e B 6 C 3 F ] g e n e s o f i n t e r e s t a t 4 w e e k s w e r e d i s c e r n e d . 6 4 R E S U L T S F i g u r e 1 d e p i c t s t h e 1 7 0 t o t a l u n i q u e R A M s w h i c h w e r e d e t e c t e d f o l l o w i n g a t u m o r - p r o m o t i n g d o s e o f p h e n o b a r b i t a l f o r 2 o r 4 w e e k s i n t h e s e n s i t i v e B 6 C 3 F l , a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e , i n c l u d i n g 8 c a r r y f o r w a r d R A M S t h a t w e r e o b s e r v e d a t b o t h t h e 2 a n d 4 w e e k t i r n e p o i n t s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . W e h y p o t h e s i z e d t h a t a m o n g t h e u n i q u e R A M S i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , s o m e a r e p l a y i n g c r i t i c a l m e c h a n i s t i c r o l e s d u r i n g l i v e r t u m o r f o r m a t i o n . I n t h i s s t u d y , P C R p r o d u c t s w e r e c l o n e d t h a t r e p r e s e n t 9 0 ( 5 3 % ) o f t h e u n i q u e R A M S a n d t h e s e p r o d u c t s w e r e a n n o t a t e d v i a t h e B L A T s e q u e n c e a l i g n m e n t t o o l ( T a b l e 1 . 1 ) . S e l e c t e d l i t e r a t u r e r e f e r e n c e s f o r T a b l e 1 . 1 a r e l o c a t e d i n t h e A p p e n d i x ( R e f e r e n c e s l ) . R A M S w e r e a l s o c l a s s i fi e d b a s e d o n t h e i r l o c a t i o n r e l a t i v e t o a k n o w n g e n e ( F i g . 1 . 8 , T a b l e 1 . 1 a n d F i g . 1 . 1 1 ) a n d c h r o m o s o m a l d i s t r i b u t i o n ( F i g . 1 . 1 2 ) . A l l o f t h e a n n o t a t e d g e n e s w e r e s u b s e q u e n t l y i n v e s t i g a t e d v i a a n i n f o r m a t i c s a p p r o a c h i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e f u n c t i o n o f t h e g e n e , i n a d d i t i o n t o a n y g e n e p r o d u c t s t h a t a r e c o m m o n c e l l u l a r t a r g e t s a n d / o r r e g u l a t o r s o f t h e u n i q u e R A M s o f i n t e r e s t a t 4 w e e k s . T w o r e p r e s e n t a t i v e p a t h w a y s o f i n d i v i d u a l u n i q u e B 6 C 3 F 1 R A M S i n a d d i t i o n t o a f u n c t i o n a l s u m m a r y o f t h e s e R A M S c a n b e f o u n d i n t h e A p p e n d i x ( F i g s . 1 . 1 3 - 1 . 1 5 ) . A s e x p l a i n e d i n t h e M e t h o d s , s o m e i d e n t i fi e d R A M s c o u l d u n a m b i g u o u s l y b e a s s i g n e d a s p e c i fi c m e t h y l a t i o n s t a t u s ( T a b l e 1 . 1 ) . H y p o m e t h y l a t e d R A M s a t 2 w e e k s w e r e c o i l e d - c o i l d o m a i n c o n t a i n i n g 1 3 7 ( C c d c 1 3 7 ) , d e a d b o x p o l y p e p t i d e 5 4 ( D d x 5 4 ) , m y o f e r l i n ( F e r ] [ 3 ) , p r o t e i n p h o s p h a t a s e 4 c , c a t a l y t i c s u b u n i t ( P p p 4 c ) , s o l u t e c a r r i e r f a m i l y 9 ( s o d i u m / h y d r o g e n e x c h a n g e r ) , m e m b e r 5 ( S l c 9 a 5 ) a n d W S C d o m a i n - c o n t a i n i n g l ( W s c h ) . A t 4 w e e k s , h y p o m e t h y l a t e d R A M S w e r e A D A M m e t a l l o p e p t i d a s e w i t h 6 5 C a r r y 9 8 T o t a l U n i q u e R A M s 7 2 T o t a l U n i q u e R A M s i n F o r w a r d i n B 6 C 3 F 1 L i v e r , B 6 C 3 F ] L i v e r , 2 w e e k s 0 . 0 5 % P B R A M s ’ 4 w e e k s 0 . 0 5 % P B o e e o o o H Y P O M , o o o o o o o a c c e s s 9 5 o o o o o o o o o o o o e o G O G o o o o o o o O ° o ° o ° e ° o ° o ° o ° o 3 ' o ° o ° o ° o ° o ° o ° o ° o ° o o 5 . o o o o o o o o o o e . 9 o o o o o o 1 5 s a 2 2 H Y P E R M ° o ° o ° o ° o ° o e e o o o o G s o o o o e N E W M o ° ° ° ° ° ° ° 2 3 ° ° ° 9 ° ° ° 9 ° o ° o ° o ° o ° o ° o ° o ° o F r g u ' r e 1 . 7 U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) t h a t F o r m e d i n t h e L i v e r s o f B 6 C 3 F ] M i c e i n R e s p o n s e t o 2 o r 4 W e e k s o f T r e a t m e n t w i t h 0 . 0 5 % ( w / w ) P h e n o b a r b i t a l ( P B ) . L i v e r t u m o r s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 a n d r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e w e r e t r e a t e d f o r 2 o r 4 w e e k s w i t h a t u m o r - p r o m o t i n g d o s e ( 0 . 0 5 % , w / w ) o f P B . R A M S w e r e d e t e c t e d i n b o t h g r o u p s b y a p r o c e d u r e i n v o l v i n g m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n , a r b i t r a r i l y p r i m e d P C R a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . U n i q u e R A M S i n t h e B 6 C 3 F ] , a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 , m i c e w e r e i d e n t i fi e d a t 2 ( 0 ) a n d 4 ( 0 ) w e e k s . T h o s e t h a t w e r e o b s e r v e d a t b o t h t h e 2 a n d 4 w e e k t i m e p o i n t s a r e r e f e r r e d t o a s c a r r y f o r w a r d R A M s ( 9 ) . 6 6 d t i e b r i h ) n a 1 p m o i ( s y t t n i e v C i s g t a c a a r , o c ] u p t F p 3 i - P m 4 t n A C 6 B e v i 2 l 9 n i t g e ( e ( o t ) ) i r a s s t e n e S a g h n p a ) 4 n n p a h l a n i t n o o h e G i t g a e s z i i ( t c n m i o a e l n s s - o c i K t o f g i 0 o l r 1 x l h s h e n i + a ) r r g o b o p e s u e r p r n e r t ( o m l m e 6 f v p m i c r n o u e i 1 n ) T ( g e t e i i B t s i i s t - u o p 8 s n i n t u c p n s o o s a a l e q y r a e r n a l r c o i b t b e r r t d u e e i c v b g y s m h / r u d i h - m e f t s n e L n / e n / m e i e u t M n t t t d o R o o c s e i h r r i L a l i r u a . a e a i n i S o e d S c c d P u e g e e M e M s S r M A R d e c u d n i - ) B 6 6 o 2 9 1 7 5 i i . B . l i i . A . l 7 c p a n A P 7 1 4 i 0 ( l 3 1 o 4 0 8 8 l i r 3 _ 7 _ _ _ 3 1 1 a 3 h h n n t i b r a n n i t r l r r b 4 h o 5 n e c s h W x d D P e u q i n U e k i l e 1 m e 4 o 0 e p 5 r 1 2 s y r e d 1 c e r n n c d 7 a t o t g fi d i n i n t i y i e s a 1 i t o b p c s d a f , p i e n n e m i l l n t y n e n e t i n e p g p o o e p s e o x n e e y r o n r m l p i t s t o s u l t r a u l s d , h o e e a e c b u p e y K B m t b o a r l p y r h r m g p m x r o s 5 - o m e s n e m r i t i i - o n b h R t e m h i i b c a s M c a o e s u l o i s 7 r l s w o f h - l a i e t r o b t P t D t t a m a l t r y i s t a s r l A b d o f r m t , a c a e e r y o u i h i D n o c D G 3 T c P s m m A w A W i u d o r P R f o o o o 0 o p p p p y y y y 5 p K ( y C H H H H H H P 1 . 1 ) H e o ) p p p p l p ( H y y y y y H H H H d ( o o o o b a T 6 7 P r o t e i n p h o s p h a t a s e 4 c , P p p 4 c l . A . i i i S o l u t e c a r r i e r f a m i l y 9 , S I c 9 a 5 r i h r _ 0 0 1 0 8 1 3 3 2 l . C . i H y p o W S C d o m a i n c o n t a i n i n g 1 ( M ) ( 1 2 0 m l . A . i i i U n k n o w n i t h r _ 0 2 8 0 4 1 l . A . i i i C o r e p r e s s o r o f n u c l e a r r e c e p t o r s ( 3 ) M y o f e r l i n F e r 1 1 3 i n n r 2 8 3 5 l . A . i i i 0 0 3 2 1 3 l . A . i i i U n k n o w n T h i i h r _ o o 9 3 7 7 l . A . i i i P h y s i o l o g y o f a d r e n e r g i c n e u r o n s ( 5 ) h o m o l o g W b s c r l 7 l . A . i i i « a J ( 6 ) K c n k l 0 r n n _ 0 2 9 9 1 1 l . C . i i ( 7 ) A d a m t s I 7 r t h r _ 0 0 1 0 3 3 3 7 7 U n k n o w n A r fi p l r n n _ 0 0 1 0 8 1 0 9 3 1 . A . i i i i . ) A n a p h a s e p r o m o t i n g H y p o c o m p l e x s u b u n i t 7 N M _ 0 1 9 8 0 5 l . B . i D o w n r e g u l a t i o n l i n k e d t o b r e a s t c a n c e r ( 9 ) H y p o B - c e l l s c a f f o l d p r o t e i n w i t h ( M ) a n k y r i n r e p e a t s l B a n k ] r n n _ o o 1 o 3 3 3 5 0 s a , l F ) 2 r o 1 m 3 ( C s u t i r 6 s B e e e n v g o e n e i t i s n e S - r o m u T o g i g n A o c n O ) l 3 a 1 i ( n o e n i i e ) t c h 0 a t 2 y r d ( e i t n a n l ) g 5 v i L s d e n d ; i s e n e g e r t r g m 2 u o ( t o e p o l u e d ) n 4 o e e d n c e i s t n y i h e t a 1 e i ( d + r 2 c e l r a h M a t x i A o m e b - n m C s e a R o l v t e - c L a s d e c u d n i — ) B P ( l a t i b r a b o n e h P e u q e i t i d t o t n m r i o u a t d e a H W q u n v i P e n b o U C i i i i . . A A . . l l i i i i i i . . A A . . l l 2 5 1 7 _ 0 n 8 n r i l l n 2 3 g n a r z a U m t d m g n i t n e s e r p C e M 0 e S n i a r e m c e r e g o o d o i t n a h n e n i a R s t c d o r d a a t l o l 0 e e u 4 p i - h W r a l m c i n s e n n o a n o i t p u D c u t 7 l m P i a a l n i o a r - R x i l o o e o g s r o C b m o s a c l t s n t d i , i n 7 t n u i c d c P d e u - o r a i r a o o F h R d p T f C c 0 n D U 0 ) ) ) ) ) ) ) U D n h h h N h N N N N M M W N 4 d d M ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( G ( i t 0 o o o 0 p 0 0 ° 0 o 0 > O p p X P ( r e n a Y y y y p p p p p p p P p y y y y y y Y y i h J i i H H H H I H l I P I H H H y H o c 1 . 1 e l b a T o 3 d 1 l i g o n c i - n e a l t i n 6 8 C o m p a r e d t o R e l a t i v e l y R e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , M i c e w e r e C l o n e d a n d S u b j e c t e d t o B L A S T - l i k e A l i g n m e n t T o o l ( B L A T ) S e a r c h e s C M T l A d u p l i c a t e d r e g i o n t r a n s c r i t 4 C d r t 4 r r h r _ 0 2 5 4 9 6 l . C . i i U n k n o w n C h y m a s e 1 l . C . i i F a c i l i t a t e s l o c a l p r o d u c t i o n o f a n g i o t e n s i n I I ( 1 l ) C u t - l i k e 2 C u t 1 2 H y p 0 ( N D F b x w 7 L o s s o f f r m c t i o n m u t a t i o n s i n c a n c e r ( 1 5 ) M e t e o r i n , g l i a l c e l l d i f f e r e n t i a t i o n r e u l a t o r - l i k e l . A . i i i N e r v o u s s y s t e m d e v e l o p m e n t ( 1 6 ) O d d O z / t e n - m h o m o l o g 2 l . A . i i i T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n ( l 7 ) R a l g d s ‘ l . A . i i i M e d i a t e s R a s s i g n a l s ( 1 8 ) I n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s ( 1 D S e m a p h o r i n 3 G l . A . i i R e p e l s y m p a t h e t i c a x o n s ( l 9 ) S t r o m a l i n t e r a c t i o n m o l e c u l e 1 S t i m I l . A . i i i T e d d ] l . A . i i i P o t e n t i a l g r o w t h s u p p r e s s o r ( 2 1 ) C a r d i o g e n e s i s ( 2 2 ) T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r , b e t a r e c e p t o r 1 1 T g e r R e c e p t o r f o r T g f b ( 2 3 ) T h r e o n i n e a l d o l a s e T h a l l . B . i i s u p p r e s s o r ( 2 4 ) T y r o s i n e k i n a s e n o n - r e c e p t o r 2 T n l t 2 l . A . i i i I n t r a c e l l u l a r k i n a s e t h a t m i g h t b e i n v o l v e d i n c e l l g r o w t h / m o v e m e n t ( 2 6 ) T r a n s i e n t r e c e p t o r p o t e n t i a l c a t i o n c h a n n e l , s u b f a m i l y M , m e m b e r 3 T r p m 3 h n n r 0 0 1 0 3 5 2 3 9 l . A . i i i I n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s ( 2 7 ) C a l c i u m s i g n a l i n g a n d h o m e o s t a s i s ( 2 8 ) C c d c 1 3 7 U n k n o w n s a , l t s a ) e 0 s r 3 F e b ( 3 h c C r 6 a n s i e n d i e l e t B S e v ) i T t l a l l e c u g r e e c A r i n s L n B e ( S - l r o o o m T a c n w o D s n ) 2 i r i s n e u 3 e i s o a ( z m T t n r e e s h n s c e e e r m g d v e o ) p n i g i e 1 p h c r 9 g e ) / r 3 s L ( c n 9 i n n n i s o e f 3 d ( a 2 c i s s n l w ( w a o s d i r t A o d e n o i b p S e a c k k n i n c f a o t r f o p p p r o t a n c r r a a e e r t M k n d o b n c s n i i u s n r o a e p d i U n m f n U e n a c r A i a s o i r l i m n a a r d t y a ) l 8 y a t 3 l ( o a ) S b t e l e R - T d c A u L d B n o i t - ) d B e P t ( c e - a i m n r t l c i l a e m o i s e a t l i a o y h c a c t u y c u e e d l s N n G I M I r P i i i . A o i c s c i d l j . l a b t u i S b r d a n b a o n d e e h n P o e l u C q e i r I - 4 p c 7 n e U w a a t f a g a i l g n e T S D i c t i n M e n , i s e 6 g e n t r o / p L n i r e B R 7 i p a d t e s t 5 n t o a , 2 e 3 4 e 0 s 1 a r n e i e f e - - d s t l y a i n o t n a r t - e i p r e N t C b m c t c i c n o n s i a c - - a l e a ) 3 s n u - 3 n d a i s s a h r l e a , o l , a N - 2 t a r o t a c f i i - c a l r s P i o s d i s s d n d e h a n r o m s r R o e t h a b - s l a h l - m y l p y 6 n a e l s , ) 2 a o 2 i g m 3 m l 1 t - s R a t o c a y n c n P ( c C A p h n o r t 6 a u e l a 5 3 T e a c 1 r 1 P H y o p r m i a i t l e d v e i u t n a i l e t R T a 3 B a m n g S a a T ( ) ) ) ) H H H H ( ( ( ( w w w w n e e e e o o t c 1 d . e 1 r e a l p b m a o T C N N N N 6 9 H y p e r ( M ) R N A b i n d i n g m o t i f p r o t e i n 1 0 R b m l 0 N M _ 1 4 5 6 2 7 l . A . i i H y p e r ( M ) I h a p 3 N M _ 1 7 5 1 5 2 l . A . i i U n k n o w n N e w ( H ) N e w ( H ) B r a i n - s p e c i fi c a n g i o g e n e s i s i n h i b i t o r 3 B a r ' 3 N M _ 1 7 5 6 4 2 M i g h t s u p p r e s s b r a i n t u m o r p r o g e s s i o n ( 2 9 ) N e w ( H ) N e w ( H ) C 6 3 0 0 0 7 B 1 9 R i k N M _ 1 8 2 8 0 8 l . A . i i i N e w ( M ) N e w ( H ) B c a t 2 N M _ 0 0 9 7 3 7 l . A . i i B c l 2 - l i k e l 3 B c I Z I l 3 N M _ 1 5 3 5 1 6 l . A . i i i O v e r e x p r e s s i o n a s s o c i a t e d w i t h c h i l d h o o d A L L ( 3 3 ) D i s c s , l a r g e h o m o l o g - a s s o c i a t e d p r o t e i n 4 N M _ 1 4 6 1 2 8 l . A . i i i M i g h t b e i n v o l v e d i n c l u s t e r i n g a t p o s t s y n a p t i c d e n s i t y r e g i o n s ( 3 4 ) N e w ( H ) N u c l e a r r e c e p t o r c o m p r e s s o r 2 N c o r Z N M _ 0 1 1 4 2 4 l . A . i i i ( 3 5 ) R e t i n o i d X r e c e p t o r b e t a e r b N M _ 0 1 1 3 0 6 l . A . i i i B i n d i n g p a r t n e r o f v a r i o u s n u c l e a r r e c e p t o r s ( 3 6 ) D e c r e a s e d e x p r e s s i o n i n l u n g / p r o s t a t e c a n c e r s ( 3 7 2 1 . 1 3 ) l . A . i i i T m e m I 0 4 l . A . i i i N e w W S C d o m a i n c o n t a i n i n g 1 W s c h l . A . i i i U n k n o w n s i r a n ) l o 1 u i 5 l l s ( e s c e r h p t x i e w n o i t a m d d r e s a e o t f a s i n e c a r o ' c s n e s D a i i i i i i . . A A . . l l 4 6 4 6 4 3 5 7 2 1 4 7 3 8 5 0 1 3 8 0 1 0 1 1 1 1 8 2 _ _ _ _ M M M M _ M N N N N N 4 f c T ] d c s W 1 g e t a h 4 g i n s o n e n p r i o t t c a g i a t n a o f n o u j n l o D c h p s s a ' t 1 a r h c t n 5 ) i p , h - p o i 4 t - 2 b a p , - p n E m 1 i o i 1 6 S l r ) t e c i m s u n q a i y z n d 3 - C 9 S 5 r b 3 o t 3 i P s s o n n I T e W U ( I ( ) B ( o p y H 7 0 T a b l e 1 . 1 c o n t i n u e d P C R P r o d u c t s R e p r e s e n t i n g U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s i n L i v e r T u m o r - S e n s i t i v e B 6 C 3 F ] , a s C o m p a r e d t o R e l a t i v e l y R e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , M i c e w e r e C l o n e d a n d S u b j e c t e d t o B L A S T - l i k e A l i g n m e n t T o o l ( B L A T ) S e a r c h e s N e w ( H ) H y p o ( M ) P l e c k s t r i n h o m o l o g y d o m a i n c o n t a i n i n g , f a m i l y F , m e m b e r 1 P l e k h fl l . C . i i I n d u c t i o n o f c a s p a s e - i n d e p e n d e n t a p o p t o s i s ( 4 0 ) H y p o ( H ) a n d / o r H y p o f ( B , H ) P r i c k l e - l i k e p r o t e i n 2 P r i c k l e Z N M _ 0 0 1 0 8 1 1 4 6 T i s s u e / p l a n a r p o l a r i t y v i a t h e W N T / P C P s i g n a l i n g p a t h w a y ( 4 1 ) E x p r e s s i o n d e t e c t e d i n g a s t r i c a n d u t e r i n e c a n c e r s ( 4 2 ) W n t s i g n a l i n g ( 4 3 ) E x p r e s s i o n i n c r e a s e d i n c a n c e r ( 4 4 a , b ) N e w ( M ) U b e Z D I l . B . i i I n v o l v e d i n u b i q u i t i n a t i o n ( 4 5 ) U b i q u i t i n a t i o n o f t h e t u m o r s u p p r e s s o r p 5 3 ( 4 6 ) N u c l e a r f a c t o r , e r y t h r o i d d e r i v e d 2 , l i k e 2 N f e 2 1 2 N M _ 0 1 0 9 0 2 K e y r e g u l a t o r o f m a n y d e t o x i f y i n g e n z y m e s ( 4 7 ) U n k n o w n N K 2 t r a n s c r i p t i o n f a c t o r r e l a t e d , l o c u s 6 N l o c 2 - 6 N M _ 1 8 3 2 4 3 H o m e o d o m a i n p r o t e i n ( 4 8 ) Z i n c fi n g e r a n d S C A N d o m a i n c o n t a i n i n g 2 2 2 3 0 0 7 1 2 2 N M _ o o r o 0 1 4 4 7 l . A . i P o t e n t i a l t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t o r ( 4 9 ) I n p p S a 3 H y d r o l y z e s s e c o n d m e s s e n g e r m o l e c u l e s ( 5 0 , 5 1 ) n w o n k n U s u o i r a V 4 7 4 1 8 0 6 0 9 _ M X i i i . A . l o r p t P ) w H e , fi B l ( f r o o / p d y n H a s s M M A A R R 5 4 4 - 2 4 3 3 4 s e t i i i s n o i d d e e z z i i r r e e t t t a c c l g s ' a a r r a a h h c c m n n m U U s k w 2 t a e r a s e ) ) ) ) M M H ( ( ( M ( o o o 0 s p p p p u t a t s n o i t a l y h t e y y y y H H H H ) ) H H ( ( o o p p M y y H H 7 1 T a b l e 1 . 1 c o n t i n u e d P C R P r o d u c t s R e p r e s e n t i n g U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s i n L i v e r T u m o r - S e n s i t i v e B 6 C 3 F ] , a s C o m p a r e d t o R e l a t i v e l y R e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , M i c e w e r e C l o n e d a n d S u b j e c t e d t o B L A S T - l i k e A l i g n m e n t T o o l ( B L A T ) S e a r c h e s ( H ) ’ ( M ) P r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e , r e c e p t o r t y p e 0 N M _ 0 1 1 2 1 6 T r a n s m e m b r a n e p r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e ( 5 2 ) T u m o r s u p p r e s s o r ( 5 2 ) H y p o ( M ) o r N e w ( M ) h E p h r i n 1 3 2 E fi r b 2 N M _ 0 1 0 1 1 1 l . A . i i i V a s c u l a r d e v e l o p m e n t / a n g i o g e n e s i s i n a d u l t m i c e ( 5 3 a ) A n g i o g e n e s i s a n d i n v a s i o n ( 5 3 a — c ) H y p o ( M ) o r N e w ( M ) h T r i p l e f u n c t i o n a l d o m a i n ( P T P R F i n t e r a c t i n g ) T r i o l . A . i i C y t o s k e l e t o n r e m o d e l i n g a n d c e l l g r o w t h ( 5 4 ) I n v a s i o n ( 5 5 ) H y p o ( M ) o r H y p e r ( M ) a n d / o r N e w ( B ) f ’ h S r c — r e l a t e d k i n a s e l a c k i n g C - a n d N - t e r m i n a l N M _ 0 1 1 4 8 1 l . A . i H y p o a t 2 a n d / o r 4 w k s ( B / H / M ) l 7 R A M s H y p e r a t 2 a n d / o r 4 w k s O B / H / M ) U n c h a r a c t e r i z e d i 2 R A M s N e w a t 2 a n d / o r 4 w k s ( B / H / M ) U n c h a r a c t e r i z e d i U n c h a r a c t e r i z e d i o m s i t e a t 2 a n d 4 w k s ! h . 2 w k s t a t u s i s a m b i g u o u s 2 R A M s 4 w k s t a t u s i s u n a m b i g u o u s H y p o ( M ) M u l t i p l e g e n e h i t s ' 2 3 7 b p M u l t i p l e g e n e h i t s ' 2 6 0 b p V a r i o u s M u l t i p l e g e n e h i t s I 2 9 5 b p V a r i o u s M u l t i p l e g e n e h i t s i V a r i o u s U n c h a r a c t e r i z e d ” 2 5 9 b p N M M M M V l o e o v T e n m o I a I s i t s . t n a e e e p g . m i e h t n t i e s n m n h t H t i e e d n l , o e e . n o t g t g . d a i o t e d S g - i r l o A d e e ( e e t c e n p i t l s g e n i r t t r a ) o l s o m c I i a e u fi t p r e n T i k t n s r e i l - s M e a a e c g h t n m e r i a a p s v d o s i T . s L S I l n t o c e o m a n A I i s u h i t e d L a t r h B c p o i a i c f t s r H n r o M t , a r s s e t p v i y w d R e d I e A e R t I r H C f e s e t . m w e a t a b i d s r c c n t P R e e n k e o o B j x r o y c b ( s e f f 0 i b u f 1 s u t e d a f d d d S n i d - p n z e n e m n l n i e a y e d t h e o a t c b h t n ) B a n p s s s n e e e i u A u r M P d e n a r q ( e n d A t o e i c p a e n e e l o i t R e s t s d b r a r t l C c i e e i 2 g t h s l i M r a t f b e t c M e o A e r r s d o r a r 1 e A a b e o w r e l R a n t a e y n 1 ) R n e b r e t v s . e e a n l s c i h c a p t h k s d e u e e d r P h i d i i e M s n c t o e p t t o i h e l w n r r e e u h u e t e p , t q i s w r 6 e m e 4 s i o f d r / s s - M s R n t m o M p e e C n L r o U c h e n B a a i n A g 7 n 5 t t o n t r y P s R r e b a i 2 e n r a i t b l e C l e l t i d t a u f a e y a s t n t t h c n e n o n t fi e r a e i e i s t o s t m t d e e c d h h i n e g t t v i i r e t s t e a t t n p a r i h r m a i p r n n e l p e R s e e p r d c e d p h e i m m s x e n i c e e t R e t t h r b s s h o m n e t s y t l c e v a a o n p a w s h o e e s e i o r r n t r r e b i s e o t t o s t r g e f e y u t e t g t r o e t d h a n h i s o i t c t d B B h r o e t a P P i o i d . l t c g e h t i a c h r P l e n f f s t m e e . f r p t i R i o o ) m R e e o s o i e I v ( o c t C i n n n o s s e s m I t h k k e P t s e e s a l d l e M n n i s g p e e s M . g d A i e e i e e h e g r t w w B d e e h r t r A t . H e o o u s e u a 2 4 n n R a r m r t e R z l n p s o a i e e u p e o o r e r d i n t t h r n h m / o i a a f t m f h e t i e a t d t n o p a f c t n g t o n d r C o n a c r n o M M c s e a a o w o e c l h s n A A e a i e r o r t a s I i o r h w a a r o p t 1 s S R R b e e h c i t o a . e r , m g s t f f h a s 1 ) M o t e e c i t c 1 u e u u m fi e y e a n e u o r c q q F i h T l T n r n r l n e i i e e r 3 i A A t t o o b e L n n h a d C L n h / i e d e d g h h I n a G B U T U G C n d n e T B ' i T T i B ( b " c d e a r a { g h f ’ 7 2 l O k b Z k b 5 ’ T S S 3 ’ 2 k b 1 0 k b l l * 1 : I 4 I 1 ! ! 1 ) A s s o c i a t e d w i t h a g e n e A . W i t h i n a g e n e i . S p a n s t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e ( T S S ) a n d / o r 5 ’ u n t r a n s l a t e d r e g i o n i i . E x o n i i i . I n t r o n B . U p s t r e a m f r o m t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e i . 5 2 k b i i . _ < _ 1 0 k b a n d > 2 k b C . D o w n s t r e a m f r o m l a s t e x o n / i n t r o n i . _ < _ 2 k b i i . _ < _ 1 0 k b a n d > 2 k b 2 ) > 1 0 k b a w a y f r o m e i t h e r t h e t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e o r t h e l a s t e x o n / i n t r o n 3 ) R e p e a t e l e m e n t : m u l t i p l e “ t o p ” h i t s a n d o n e / s e v e r a l a r e a s s o c i a t e d w i t h a g e n e ( s ) 4 ) R e p e a t e l e m e n t : m u l t i p l e “ t o p ” h i t s a n d n o h i t s a r e a s s o c i a t e d w i t h a g e n e ( s ) F m r e 1 . 8 A S c h e m e t o C l a s s i f y C l o n e d P C R P r o d u c t s t h a t R e p r e s e n t U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d B 6 C 3 F ] R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) B a s e d o n t h e i r L o c a t i o n s W i t h i n t h e M o u s e G e n o m e a s D e t e r m i n e d b y B L A S T - l i k e S e q u e n c e A l i g n m e n t T o o l ( B L A T ) S e a r c h e s ( U C S C G e n o m e B r o w s e r ) . P C R p r o d u c t s r e p r e s e n t i n g u n i q u e B 6 C 3 F l R A M s w e r e c l o n e d a n d s u b j e c t e d t o B L A T s e a r c h e s . D e p e n d i n g o n w h e r e , i n r e l a t i o n t o a g e n e , t h e P C R p r o d u c t a l i g n e d , i t w a s a s s i g n e d a p a r t i c u l a r g e n o m i c c l a s s i fi c a t i o n . F o r e x a m p l e , a n y P C R p r o d u c t s d e s i g n a t e d a s l . B . i . a r e l o c a t e d l e s s t h a n o r e q u a l t o 2 k i l o b a s e s u p s t r e a m f r o m a n a n n o t a t e d g e n e . 7 3 t h r o m b o s p o n d i n t y p e 1 m o t i f , 1 7 ( A d a m t s I 7 ) , a n a p h a s e p r o m o t i n g c o m p l e x s u b u n i t 7 ( A n a p c 7 ) , A D P - r i b o s y l a t i o n f a c t o r i n t e r a c t i n g p r o t e i n 1 ( A r fi p l ) , B - c e l l s c a f f o l d p r o t e i n w i t h a n k y r i n r e p e a t s 1 ( B a n k I ) , C M T I A d u p l i c a t e d r e g i o n t r a n s c r i p t 4 ( C d r t 4 ) , c h y m a s e 1 ( C m a I ) , c u t - l i k e 2 ( C u t l Z ) , d e a d b o x p o l y p e p t i d e 5 4 ( D d x 5 4 ) , m y o f e r l i n ( F e r 1 1 3 ) , F - b o x a n d W D - 4 0 d o m a i n p r o t e i n 7 , a r c h i p e l a g o h o m o l o g ( D r o s o p h i l a ) ( F b x w 7 ) , m e t e o r i n , g l i a l c e l l d i f f e r e n t i a t i o n r e g u l a t o r - l i k e ( M e t r n l ) , o d d O z / t e n - m h o m o l o g 2 ( 0 d 2 2 ) , p l e c k s t r i n h o m o l o g y d o m a i n c o n t a i n i n g , f a m i l y F ( w i t h F Y V E d o m a i n ) m e m b e r 1 ( P l e k h fl ) , p r i c k l e - l i k e p r o t e i n 2 ( P r i c k l e Z ) , r a l g u a n i n e n u c l e o t i d e d i s s o c i a t i o n s t i m u l a t o r ( R a l g d s ) , s e m a d o m a i n , i m m u n o g l o b u l i n d o m a i n ( l g ) , s h o r t b a s i c d o m a i n , s e c r e t e d , ( s e m a p h o r i n ) 3 G ( S e m a 3 g ) , s t r o m a l i n t e r a c t i o n m o l e c u l e 1 ( S t i m I ) , t r a n s c r i p t i o n f a c t o r 4 ( T c f 4 ) , t r a n s c r i p t i o n a l e n h a n c e r f a c t o r - 1 ( T e a d I ) , t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r , b e t a r e c e p t o r I I ( T g f e r ) , t h r e o n i n e a l d o l a s e ( 7 7 1 a ] ) , t y r o s i n e k i n a s e n o n - r e c e p t o r 2 ( T n k 2 ) , a n d t r a n s i e n t r e c e p t o r p o t e n t i a l c a t i o n c h a n n e l , s u b f a m i l y M , m e m b e r 3 ( T r p m 3 ) . C a r r y f o r w a r d h y p o m e t h y l a t i o n s w e r e t h o s e t h a t w e r e s e e n a t b o t h t h e 2 a n d 4 w e e k t i m e p o i n t s : g r o w t h - a r r e s t s p e c i fi c 2 l i k e 3 ( G a 3 2 1 3 ) , p o t a s s i u m c h a n n e l , s u b f a m i l y K , m e m b e r 1 0 ( K c n k I 0 ) , t y r o s i n e h y d r o x y l a s e ( 7 7 1 ) , W i l l i a m s - B e u r e n s y n d r o m e c h r o m o s o m e r e g i o n 1 7 h o m o l o g ( W b s c r I 7 ) , a p r o b a b l e r e p e a t e l e m e n t w h i c h w a s l i n k e d t o m u l t i p l e c h r o m o s o m e s ( 2 9 5 b p ) , a n d a P C R p r o d u c t w h i c h a l i g n e d t o a n u n c h a r a c t e r i z e d r e g i o n ( 4 7 9 b p ) . R A M S t h a t w e r e u n a m b i g u o u s l y a s s i g n e d a h y p e r m e t h y l a t e d s t a t u s a t 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t w e r e c o i l e d - c o i l e d d o m a i n c o n t a i n i n g 1 3 7 ( C c d c 1 3 7 ) , R N A b i n d i n g m o t i f p r o t e i n 1 0 ( R m e 0 ) a n d T H A P d o m a i n c o n t a i n i n g a n d a p o p t o s i s a s s o c i a t e d p r o t e i n 3 ( T h a p 3 ) . F u r t h e r m o r e , u n a m b i g u o u s n e w m e t h y l a t i o n s a t 4 w e e k s w e r e b r a n c h e d c h a i n 7 4 a m i n o t r a n s f e r a s e 2 , m i t o c h o n d r i a l ( B c a t 2 ) , b c 1 2 - l i k e l 3 ( B c 1 2 1 1 3 ) , D i s c s , l a r g e h o m o l o g - a s s o c i a t e d p r o t e i n 4 ( D l g a p 4 ) , n u c l e a r r e c e p t o r c o r e p r e s s o r 2 ( N c 0 r 2 ) , r e t i n o i d X r e c e p t o r b e t a ( e r b ) , S T 6 ( a l p h a - N - a c e t y l - n e u r a m i n y l - Z , 3 - b e t a - g a l a c t o s y l - l , 3 ) - N - a c e t y l g a l a c t o s a m i n i d e a l p h a - 2 , 6 — s i a l y l t r a n s f e r a s e 3 ( S i a t 7 c ) , t r a n s m e m b r a n e p r o t e i n 1 0 4 ( T m e m 1 0 4 ) , u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n g e n z y m e E 2 D 1 ( U b e 2 d 1 ) a n d W S C d o m a i n - c o n t a i n i n g 1 ( W s c d l ) . C a r r y f o r w a r d n e w l y m e t h y l a t e d R A M s w e r e b r a i n - s p e c i fi c a n g i o g e n e s i s i n h i b i t o r 3 ( B a i 3 ) , R I K E N c D N A C 6 3 0 0 0 7 B 1 9 g e n e ( T a f a — I ) a n d a n u n c h a r a c t e r i z e d r e g i o n ( 5 2 4 b p ) . W i t h r e g a r d s t o i n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n a t 2 w e e k s , p l e c k s t r i n h o m o l o g y d o m a i n c o n t a i n i n g , f a m i l y F ( w i t h F Y V E d o m a i n ) m e m b e r 1 ( P l e k h fl ) w a s n e w l y m e t h y l a t e d , a n d t h e r e w e r e n o u n a m b i g u o u s e x a m p l e s o f h y p e r m e t h y l a t i o n s . S i n c e t h e d a t a a n a l y s i s p r o c e d u r e s o m e t i m e s i n v o l v e d t h e c o m b i n a t i o n o f P C R p r o d u c t s i z e s t h a t a r e w i t h i n 2 b a s e p a i r s o f o n e a n o t h e r , i n a d d i t i o n t o t h e f a c t t h a t 3 d i f f e r e n t m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e e n z y m e p a i r s w e r e u t i l i z e d , s i t u a t i o n s o c c u r r e d i n w h i c h i t w a s n o t p o s s i b l e t o u n a m b i g u o u s l y a s s i g n a s p e c i fi c m e t h y l a t i o n s t a t u s t o a R A M . F o r e x a m p l e , i n t h e c a s e o f N f e 2 1 2 , r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n b y R s a I / H p a I I f o l l o w e d b y A P - P C R a n d C E r e s u l t e d i n t h e d e t e c t i o n o f 2 R A M s , e a c h w i t h i n 2 b a s e p a i r s o f t h e c l o n e d P C R p r o d u c t , t h a t p o s s e s s e d d i f f e r e n t m e t h y l a t i o n s t a t u s e s ( T a b l e 1 . 1 ) . B e c a u s e o f t h e i 2 b a s e p a i r c o m b i n a t i o n r u l e o f t h e d a t a a n a l y s i s p r o c e d u r e , o n e c a n n o t b e c e r t a i n w h e t h e r N f e 2 1 2 i s h y p o m e t h y l a t e d o r n e w l y m e t h y l a t e d a t 2 w e e k s b a s e d o n d i g e s t i o n w i t h R s a I / H p a I I . I n t h e c a s e o f P r i c k I e Z , R s a I / H p a I I d i g e s t i o n r e v e a l e d a h y p o m e t h y l a t e d R A M w h i l e t h e B f a I / B s s H I I d i g e s t r e v e a l e d a n e w l y R A M a t 2 w e e k s ( T a b l e 1 . 1 ) . T h u s , P r i c k I e Z c o u l d r e p r e s e n t o n e o r b o t h o f t h e s e R A M s s i n c e d i f f e r e n t r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n s w e r e u t i l i z e d , e a c h o f w h i c h r e v e a l s i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e m e t h y l a t i o n p a t t e r n s o f 7 5 d i f f e r e n t c y t o s i n e s a t a n d w i t h i n t h e s i t e s o f p r i m e r a n n e a l i n g . T h e r e f o r e , m u l t i p l e g e n e s w e r e d i s c e r n e d w h i c h c o u l d n o t b e a s s i g n e d a s p e c i fi c m e t h y l a t i o n s t a t u s . T a b l e 1 . 1 i n d i c a t e s t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s a n d p a r t i c u l a r t r e a t m e n t p e r i o d s a t w h i c h t h e s e g e n e s d i s p l a y e d a l t e r e d m e t h y l a t i o n . T h e s e g e n e s w e r e : e p h r i n B 2 ( E fi r b Z ) , z i n c fi n g e r a n d S C A N d o m a i n c o n t a i n i n g 2 2 ( Z s c a n 2 2 ) , i n o s i t o l p o l y p h o s p h a t e - S - p h o s p h a t a s e A ( I n p p 5 a ) , n u c l e a r f a c t o r , e r y t h r o i d d e r i v e d 2 , l i k e 2 ( N f e 2 1 2 ) , N K 2 t r a n s c r i p t i o n f a c t o r r e l a t e d , l o c u s 6 ( k a 2 - 6 ) , p r i c k l e - l i k e p r o t e i n 2 ( P r i c k I e Z ) , p r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e , r e c e p t o r t y p e 0 ( P t p r o ) , s r c - r e l a t e d k i n a s e l a c k i n g C - t e r m i n a l r e g u l a t o r y t y r o s i n e a n d N - t e r m i n a l m y r i s t y l a t i o n s i t e s ( S r m s ) , t r a n s c r i p t i o n f a c t o r 4 ( T c f 4 ) , t r i p l e f u n c t i o n a l d o m a i n ( P T P R F i n t e r a c t i n g ) ( T r i o ) , u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n g e n z y m e E 2 D l ( U b e 2 d 1 ) a n d W S C d o m a i n - c o n t a i n i n g 1 ( W s c d l ) . T h e r e w e r e 5 P C R p r o d u c t s w h i c h e a c h a s s o c i a t e d w i t h m u l t i p l e h i t s t h a t d i s p l a y e d t h e h i g h e s t B L A T s c o r e s , i n d i c a t i n g t h a t m a n y t o p h i t s f o r e a c h P C R p r o d u c t s h o w e d t h e f e w e s t m i s m a t c h e s a s c o m p a r e d t o t h e s e q u e n c e o f i n t e r e s t . A s s u c h , a n y o f t h e s e t o p h i t s m i g h t c o r r e s p o n d t o t h e P C R p r o d u c t s e q u e n c e . F u r t h e r m o r e , a l l o f t h e t o p h i t s f o r a p a r t i c u l a r P C R p r o d u c t r e p r e s e n t e d r e g i o n s o n v a r i o u s c h r o m o s o m e s , y e t t h e p r o d u c t a l i g n e d t o t h e i d e n t i c a l r e p e t i t i v e e l e m e n t . T h e r e f o r e , t h e s e 5 R A M s ( 2 3 7 , 2 5 9 , 2 6 0 , 2 9 5 a n d 4 4 2 — 4 4 5 b p ) a p p e a r t o b e l i n k e d t o a d i f f e r e n t , s p e c i fi c r e p e t i t i v e e l e m e n t , a n d t h u s w e a r e u n a b l e t o d e t e r m i n e w i t h c e r t a i n t y w h i c h g e n o m i c r e g i o n t h e u n i q u e R A M r e p r e s e n t s . B L A T s e a r c h e s a l s o r e v e a l e d t h a t r e g i o n s o f t h e g e n o m e , r e p r e s e n t e d b y 2 7 R A M s , a r e u n c h a r a c t e r i z e d ( i . e . l o c a t e d m o r e t h a n 1 0 k b a w a y f r o m a k n o w n g e n e ) . O f t h e s e 2 7 R A M s , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f 2 2 w e r e u n a m b i g u o u s a n d t h e r e f o r e c o u l d b e c l a s s i fi e d a s e i t h e r h y p o - ( 1 7 R A M s ) , h y p e r - ( 2 R A M s ) o r n e w - ( 3 7 6 R A M s ) m e t h y l a t i o n s a t a p a r t i c u l a r t i m e p o i n t . T h r e e o f t h e 2 7 u n c h a r a c t e r i z e d R A M s c o u l d b e a s s i g n e d a s p e c i fi c m e t h y l a t i o n s t a t u s a t b o t h t h e 2 a n d 4 w e e k t i m e p o i n t s , a l t h o u g h t h e c h a n g e s w e r e o p p o s i t e i n d i r e c t i o n ( e . g . , t h e R A M w a s h y p o m e t h y l a t e d a t 2 w e e k s a n d n e w l y m e t h y l a t e d a t 4 w e e k s ) . F i n a l l y , f o r 2 o u t o f t h e 2 7 u n c h a r a c t e r i z e d R A M s , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s a t 4 w e e k s w e r e u n a m b i g u o u s , w h i l e t h e s t a t u s e s a t 2 w e e k s w e r e n o t ( e . g . , a t 2 w e e k s , t h e R A M i s e i t h e r h y p o - o r n e w l y m e t h y l a t e d ) . I n o r d e r t o u n c o v e r i n t e r c o n n e c t i o n s b e t w e e n t h e g e n e s w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s c h a n g e d u n i q u e l y i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , a n i n f o r m a t i c s p r o g r a m w a s u t i l i z e d t o i d e n t i f y t h e i r c o m m o n p r o t e i n t a r g e t s a n d r e g u l a t o r s a t 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t . F i g u r e 1 . 9 i l l u s t r a t e s t h e c o m m o n c e l l u l a r t a r g e t s o f s e v e r a l o f t h e u n i q u e R A M s o f i n t e r e s t a t 4 w e e k s ; t h o s e g e n e s l i s t e d i n T a b l e 1 . 1 t h a t d o n o t a p p e a r i n F i g u r e 1 . 9 d o n o t p o s s e s s t a r g e t s t h a t a r e i n c o m m o n w i t h a n y o f t h e o t h e r 4 w e e k g e n e s . A s e x a m p l e s , i n t e r l e u k i n 8 ( I L - 8 ) i s a c o m m o n t a r g e t o f C m a l , N c o r 2 a n d c h 4 a n d s i m i l a r l y , v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ( V e g f ) i s a c o m m o n t a r g e t o f C m a l , c h 4 a n d T g f b r 2 . I n t h i s w a y , p o t e n t i a l c o m m o n t a r g e t s o f m u l t i p l e R A M s o f i n t e r e s t w e r e a s c e r t a i n e d i n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r c o m m o n c e l l u l a r p r o c e s s e s m i g h t b e a f f e c t e d w h i c h m i g h t m o r e e f fi c i e n t l y f a c i l i t a t e t u m o r i g e n e s i s . A d d i t i o n a l l y , c o m m o n c e l l u l a r r e g u l a t o r s o f t h e g e n e s o f i n t e r e s t a t 4 w e e k s w e r e i d e n t i fi e d a n d t h i s fi g u r e i s l o c a t e d i n t h e A p p e n d i x ( F i g . 1 . 1 6 ) . 7 7 F i n r e 1 . 9 C o m m o n C e l l u l a r T a r g e t s o f G e n e s t h a t R e p r e s e n t R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n L i v e r T u m o r - S u s c e p t i b l e B 6 C 3 F l M i c e a t 4 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t . A n i n f o r m a t i c s a p p r o a c h w a s u t i l i z e d t o u n c o v e r c e l l u l a r t a r g e t s t h a t c a n b e a f f e c t e d b y 2 o r m o r e g e n e s r e p r e s e n t i n g u n i q u e P B - i n d u c e d B 6 C 3 F l R A M s a t 4 w e e k s . E n t i t i e s t h a t l a c k a H , Y , o r N a r e c o m m o n t a r g e t s . T h e a r r o w s p o i n t t o w a r d s t h e c o m m o n t a r g e t : p o s i t i v e ( m e - 2 o ) a n d n e g a t i v e ( - - - - - - - | ) e f f e c t s a r e s h o w n . T h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f a u n i q u e R A M i s i n d i c a t e d b y H ( h y p o m e t h y l a t i o n ) , Y ( h y p e r m e t h y l a t i o n ) o r N ( n e w m e t h y l a t i o n ) . A c o m b i n a t i o n o f l e t t e r s ( e . g . , H o r Y ) d e n o t e s a R A M w i t h a n a m b i g u o u s m e t h y l a t i o n s t a t u s a t 4 w e e k s . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t t h e s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h e a c h g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s o r n u c l e a r r e c e p t o r s ( 0 ) , l i g a n d s ( O ) , k i n a s e s ( C ‘ ) , m e m b r a n e r e c e p t o r s ( ' i P ) , a n d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( 1 7 E ) . 7 8 D I S C U S S I O N F o l l o w i n g a d m i n i s t r a t i o n o f a l i v e r t u m o r p r o m o t i n g d o s e o f P B ( 0 . 0 5 % , w / w ) f o r 2 o r 4 w e e k s , 1 7 0 u n i q u e R A M s w e r e i d e n t i fi e d i n l i v e r s o f B 6 C 3 F 1 m i c e , w h i c h a r e s e n s i t i v e t o P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s , a s c o m p a r e d t o t h e r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 ( F i g u r e 1 . 7 ) ( B a c h m a n e t a 1 . , 2 0 0 6 b ) . T h e c u r r e n t s t u d y f o c u s e d u p o n a n n o t a t i n g t h o s e u n i q u e R A M s v i a B L A T s e a r c h e s i n o r d e r t o d e t e r m i n e i n w h i c h g e n o m i c r e g i o n s t h e s e m e t h y l a t i o n c h a n g e s o c c u r r e d a n d d i s c e r n i n g t h e p r o c e s s e s t h a t t h e s e R A M s m i g h t a f f e c t w h i c h c o u l d f a c i l i t a t e t u m o r i g e n e s i s . P C R p r o d u c t s w e r e c l o n e d t h a t r e p r e s e n t 9 0 o f t h e 1 7 0 R A M s , a n d 5 1 g e n e s w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s c h a n g e d u n i q u e l y i n t h e s e n s i t i v e m i c e w e r e a s c e r t a i n e d . T h e s e g e n e s a n d t h e i r f u n c t i o n s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 . 1 . P C R p r o d u c t s r e p r e s e n t i n g 2 7 R A M s a l i g n e d t o r e g i o n s o f t h e m o u s e g e n o m e w h i c h a r e l o c a t e d f u r t h e r t h a n 1 0 k b a w a y fi o m a n y k n o w n g e n e s . P r i o r t o t h i s s t u d y , o n l y a f e w s p e c i fi c g e n e s , i n a d d i t i o n t o C A R ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) w e r e a s s o c i a t e d w i t h m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s , e . g . , H a - r a s , r a f , m y c a n d 0 7 2 a n ( B - C a t e n i n ) ( A y d i n l i k e t a l . , 2 0 0 1 ; C o u n t s e t a l . , 1 9 9 7 ; R a y e t a l . , 1 9 9 4 ; V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ; W i s e m a n e t a l . , 1 9 8 6 ) ; t h e s e g e n e r a l l y w e r e i d e n t i fi e d l a t e d u r i n g t u m o r i g e n e s i s . I t i s p o s s i b l e t h a t s o m e o f t h e a l t e r e d m e t h y l a t i o n o b s e r v e d a f t e r c a r c i n o m a d e v e l o p m e n t m i g h t h a v e a r i s e n s e c o n d a r i l y , r a t h e r t h a n h a v i n g b e e n c a u s a l . T h e r e f o r e w e a r e i n t e r e s t e d i n u n d e r s t a n d i n g t h e r o l e ( s ) o f m e t h y l a t i o n c h a n g e s o c c u r r i n g e a r l y d u r i n g t h e m u l t i - s t a g e t r a n s f o r m a t i o n p r o c e s s . T h e t i m e - d e p e n d e n c e o f t h e u n i q u e P B - i n d u c e d B 6 C 3 F ] R A M s , a s w e l l a s t h e i d e n t i fi c a t i o n o f s e v e r a l c h a n g e s w h i c h w e r e o b s e r v e d a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s ( “ c a r r y f o r w a r ” R A M s ) , s u p p o r t t h e n o t i o n t h a t t h i s a n o m a l o u s m e t h y l a t i o n p l a y s a c a u s a t i v e r o l e i n t u m o r f o r m a t i o n ( B a c h m a n e t a l . , 7 9 2 0 0 6 b ) . T h e c u r r e n t d a t a s u p p o r t o u r h y p o t h e s i s t h a t t h i s a p p r o a c h c a n d i s c e r n “ n e w ” g e n e s w h i c h m i g h t b e i n v o l v e d i n P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s d u e t o a b e r r a n t m e t h y l a t i o n ( T a b l e 1 . 1 ) . I n d i v i d u a l l y , t h e g e n e s w i t h a l t e r e d m e t h y l a t i o n s t a t u s e s m i g h t b e c r i t i c a l ; h o w e v e r , i m p o r t a n t l y , e v i d e n c e p r e s e n t e d h e r e s u g g e s t s t h a t t h e s e g e n e s c a n i n fl u e n c e c o m m o n c e l l u l a r p r o c e s s e s . I n o t h e r w o r d s , u n i q u e R A M s m i g h t c o o p e r a t e t o i n c r e a s e / d e c r e a s e c e l l u l a r f u n c t i o n s , i . e . , u p - r e g u l a t i o n o f o n c o g e n e s a n d d o w n - r e g u l a t i o n o f s u p p r e s s o r g e n e s , w h i c h d r i v e t u m o r i g e n e s i s . F o r e x a m p l e , P B a l t e r e d m e t h y l a t i o n p a t t e r n s o f m u l t i p l e g e n e s i n v o l v e d i n i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s . A t 4 w e e k s , T g f b r 2 , T c f 4 a n d R a l g d s w e r e h y p o m e t h y l a t e d u n i q u e l y a n d B a c h m a n e t a l . ( 2 0 0 6 b ) d e m o n s t r a t e d H a - r a s h y p o m e t h y l a t i o n a n d i t s i n c r e a s e d e x p r e s s i o n i n B 6 C 3 F 1 m i c e . T h e s e 4 g e n e s a r e a s s o c i a t e d w i t h t h e e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n ( E M T ) , a m e c h a n i s m o f t u m o r p r o g r e s s i o n u l t i m a t e l y l e a d i n g t o i n v a s i o n a n d m i g r a t i o n . S e v e r a l e v e n t s a r e l i n k e d t o E M T , i n c l u d i n g b u t n o t l i m i t e d t o t h e d o w n - r e g u l a t i o n o f E - c a d h e r i n , w h i c h c a n s e q u e s t e r B - c a t e n i n , r e n d e r i n g t h i s p r o t e i n u n a v a i l a b l e f o r h e t e r o d i m e r i z i n g w i t h c h 4 a n d f a c i l i t a t i n g t r a n s c r i p t i o n g e n e s w h i c h p r o m o t e p r o l i f e r a t i o n , p l u s t h e i n i t i a t i o n o f T g f - B a n d R a s s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s ( T h i e r y , 2 0 0 2 ) . A d d i t i o n a l l y , T n k 2 a n d R a l g d s ( h y p o m e t h y l a t e d , 4 w e e k s ) , a l o n g w i t h 1 3 m e a n d T r i o ( b o t h p o s s i b l y h y p o m e t h y l a t e d , 4 w e e k s ) p l a y c r u c i a l r o l e s d u r i n g i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s ( G a l e e t a 1 . , 1 9 9 6 ; N a k a d a e t a l . , 2 0 0 4 ; v a n d e r H o r s t e t a l . , 2 0 0 0 ; W a r d e t a l . , 2 0 0 1 ; Y o s h i z u k a e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e e x i s t e n c e o f c o m m o n c e l l u l a r t a r g e t s a n d r e g u l a t o r s o f a s u b s e t o f t h e u n i q u e g e n e s i n d i c a t e t h a t k e y s i g n a l i n g p r o c e s s e s a r e p o t e n t i a l l y a f f e c t e d ( F i g . 1 . 9 a n d F i g . 1 . 1 6 ) . I n v o l v e d i n a n g i o g e n e s i s a r e E f n b 2 ( p o s s i b l y h y p o m e t h y l a t e d , 4 w e e k s ) 8 0 ( M a e k a w a e t a l . , 2 0 0 3 ) , a n d c h 4 a n d C m a l ( b o t h h y p o m e t h y l a t e d , 4 w e e k s ) , b o t h o f w h i c h c a n u p r e g u l a t e V e g f ( K a t a d a e t a l . , 2 0 0 2 ; Z h a n g e t a l . , 2 0 0 1 ) . A n i n c r e a s e i n N f - k B a c t i v i t y m i g h t r e s u l t f r o m P p p 4 c ( h y p o m e t h y l a t e d , 4 w e e k s ) , w h i c h a c t i v a t e s i t ( H u e t a l . , 1 9 9 8 ) a n d N c o r 2 ( n e w l y m e t h y l a t e d , 4 w e e k s ) , w h i c h i n h i b i t s i t ( L e e e t a l . , 2 0 0 0 ) . N f - x B - i n d u c e d s e c r e t i o n o f I L - 6 f r o m l i v e r m a c r o p h a g e s i n c r e a s e s t u m o r c e l l s u r v i v a l a n d g r o w t h , p r o m o t i n g c a r c i n o g e n e s i s ( L a w r e n c e e t a l . , 2 0 0 7 ) a n d a N f - x B — d e p e n d e n t i n c r e a s e i n I L - 8 e x p r e s s i o n c o n t r i b u t e s t o b o t h a n g i o g e n e s i s a n d m e t a s t a s i s i n t u m o r c e l l s ( K a r a s h i m a e t a l . , 2 0 0 3 ) . F u r t h e r m o r e , c o m m o n t a r g e t s a n d r e g u l a t o r s o f I L - 6 a n d I L - 8 w e r e d e m o n s t r a t e d ( F i g . 1 . 9 a n d F i g . 1 . 1 6 ) . I L - 6 m i g h t b e u p r e g u l a t e d v i a r e l i e v i n g i n h i b i t i o n b y N c o r 2 ( S o n g e t a l . , 2 0 0 5 ) ; w e s h o w t h a t N c o r 2 i s n e w l y m e t h y l a t e d a t 4 w e e k s a n d t h u s p o s s i b l y s i l e n c e d . I L - 6 c a n u p r e g u l a t e R a l g d s i n l e u k e m i c c e l l s ( S e n g a e t a l . , 2 0 0 1 ) a n d E f n b 2 i n K a p o s i s a r c o m a c e l l s ( M a s o o d e t a l . , 2 0 0 5 ) . R a l g d s m e d i a t e s t h e s u r v i v a l o f t r a n s f o r m e d c e l l s v i a t h e J N K / S A P K p a t h w a y , a n d a l s o i s e s s e n t i a l f o r s k i n t u m o r f o r m a t i o n i n m i c e ( G o n z a l e z - G a r c i a e t a l . , 2 0 0 5 ) . T h u s , I L - 6 m i g h t i n d i r e c t l y c o n t r i b u t e t o s u r v i v a l , a n g i o g e n e s i s , i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s . S i m i l a r l y , I L - 8 c a n b e r e g u l a t e d b y s e v e r a l g e n e s r e p r e s e n t i n g u n i q u e R A M s : c h 4 a n d C m a l ( h y p o m e t h y l a t e d , 4 w e e k s ) u p - r e g u l a t e I L - 8 i n l i v e r a n d E o L - l c e l l s , r e s p e c t i v e l y ( L e v y e t a l . , 2 0 0 2 ; T e r a k a w a e t a l . , 2 0 0 6 ) , w h i l e N c o r 2 ( n e w l y m e t h y l a t e d , 4 w e e k s ) c a n b l o c k I L - 8 t r a n s c r i p t i o n ( H o b e r g e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e r e f o r e , I L - 6 a n d I L - 8 , c o m m o n t a r g e t s a n d / o r r e g u l a t o r s o f s e v e r a l k e y g e n e s , m i g h t f a c i l i t a t e t h e c l o n a l e x p a n s i o n o f p r e n e o p l a s t i c c e l l s b y f u r t h e r c o n t r i b u t i n g t o c e l l g r o w t h / s u r v i v a l , a n g i o g e n e s i s , i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s . F i g u r e 1 . 1 0 s u m m a r i z e s t h e p o s s i b l e f u n c t i o n a l s i g n i fi c a n c e , r e g a r d i n g t u m o r i g e n e s i s , o f s e l e c t e d g e n e s w h i c h e x h i b i t e d a l t e r e d m e t h y l a t i o n u n i q u e l y i n t h e 8 1 0 . 0 5 % P B f o r 2 o r 4 w e e k s B 6 C 3 F ] v s . C 5 7 B L / 6 H r a s l I d e n t i fi e d a n d a n n o t a t e d u n i q u e R A M s i n s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 m i c e l ' l g d s , 4 w k l E p i t h e l i a l - - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n @ ’ I n v a s i o n a n d m e t s t a s i s T u m o r c e l l F g g L r ' r e 1 . 1 0 T h e P o s s i b l e F u n c t i o n a l S i g n i fi c a n c e , R e g a r d i n g T u m o r i g e n e s i s , o f S e l e c t e d G e n e s w h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n t h e B 6 C 3 F l M o u s e F o l l o w i n g T r e a t m e n t w i t h P h e n o b a r b i t a l ( P B ) . T h e c u r r e n t s t u d y i d e n t i fi e d r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M s ) a t 2 o r 4 w e e k s o f 0 . 0 5 % P B t r e a t m e n t a n d a n n o t a t e d 5 1 g e n e s t h a t r e p r e s e n t t h e s e r e g i o n s . S e v e r a l o f t h e s e g e n e s a r e w e l l - d o c u m e n t e d a s p l a y i n g c r i t i c a l r o l e s i n t u m o r i g e n e s i s ( d a r k g r a y o v a l s ) . U n i q u e P B - i n d u c e d h y p o m e t h y l a t i o n a n d d e c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s ( l i g h t g r a y o v a l ) i n B 6 C 3 F 1 m i c e h a s b e e n d e m o n s t r a t e d ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . T h e a p p r o p r i a t e t i m e p o i n t o f P B t r e a t m e n t i s d e n o t e d ( 2 o r 4 w k ) , a n d t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f t h e R A M s a r e i n d i c a t e d b y H ( h y p o m e t h y l a t i o n ) , Y ( h y p e r m e t h y l a t i o n ) o r N ( n e w m e t h y l a t i o n ) . R A M s w i t h a n a m b i g u o u s m e t h y l a t i o n s t a t u s a r e i n d i c a t e d b y t h e p r e s e n c e o f 2 l e t t e r s ( i . e . H o r Y ) . I n t e r l e u k i n 6 ( I L - 6 ) i s a c o m m o n 4 w e e k r e g u l a t o r , a n d i n t e r l e u k i n 8 ( I L - 8 ) a n d v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ( V E G F ) a r e c o m m o n 4 w e e k t a r g e t s , o f m u l t i p l e g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n t h e l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e ( w h i t e o v a l s ) . R A L G D S i s a k e y d o w n s t r e a m e f f e c t o r o f H R A S . S e l e c t e d l i t e r a t u r e r e f e r e n c e s f o r t h e r e l a t i o n s h i p s d e p i c t e d i n t h i s d i a g r a m a r e n o t e d i n t h e A p p e n d i x ( F i g . 7 a n d R e f e r e n c e s 2 ) . 8 2 B 6 C 3 F 1 m o u s e f o l l o w i n g P B t r e a t m e n t , a l o n g w i t h a s u b s e t o f k e y c o m m o n t a r g e t s / r e g u l a t o r s o f t h e s e g e n e s . S e l e c t e d l i t e r a t u r e r e f e r e n c e s f o r t h e r e l a t i o n s h i p s d e p i c t e d i n t h i s fi g u r e a r e n o t e d i n t h e A p p e n d i x ( F i g . 1 . 1 7 a n d R e f e r e n c e s 2 ) . S i n c e o u r a p p r o a c h f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f u n i q u e R A M s i n t h e s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 m i c e i n v o l v e d i s o l a t i o n o f D N A f r o m h o m o g e n i z e d w h o l e l i v e r , i t i s i m p o s s i b l e t o d e t e r m i n e w h e t h e r e a c h m e t h y l a t i o n c h a n g e o c c u r r e d i n t h e s a m e c e l l o r i n n u m e r o u s , d i f f e r e n t c e l l s . R e g a r d l e s s , 1 u n i q u e R A M m i g h t p r o v i d e a g r o w t h a d v a n t a g e t o a s i n g l e c e l l ; a c c u m u l a t i o n o f m u l t i p l e R A M s i n t h e s a m e c e l l c o u l d a d d i t i v e l y o r s y n e r g i s t i c a l l y e n h a n c e a b e r r a n t p r o l i f e r a t i o n . M o r e o v e r , t h e s e R A M s m i g h t o c c u r i n v a r i o u s l i v e r c e l l t y p e s : h e p a t o c y t e s , K u p f f e r m a c r o p h a g e s , a n d / o r s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a l c e l l s . H e p a t o c y t e s a r e n o t t h e o n l y c e l l s t h a t p l a y c r u c i a l r o l e s i n h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s ; l i v e r m a c r o p h a g e s s e c r e t e I L - 6 w h i c h c a n i n c r e a s e t u m o r c e l l g r o w t h a n d s u r v i v a l ( L a w r e n c e e t a l . , 2 0 0 7 ) . I n t e r a c t i o n s b e t w e e n d i f f e r e n t c e l l t y p e s a r e i m p o r t a n t d u r i n g t u m o r f o r m a t i o n , s o i t i s e s s e n t i a l t o u t i l i z e w h o l e a n i m a l s t u d i e s w h i c h p e r m i t c r i t i c a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n d i f f e r e n t c e l l t y p e s i n t h e t a r g e t t i s s u e t o b e o b s e r v e d , e . g . , t h e i r m a t e i m m u n e s y s t e m p l a y s a c r u c i a l r o l e i n D E N - i n d u c e d h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a i n m i c e ( N a u g l e r e t a l . , 2 0 0 7 ) . M a t u r e m a m m a l i a n c e l l s c a n b e s t i m u l a t e d t o d e d i f f e r e n t i a t e i n t o a n e m b r y o n i c s t e m c e l l - l i k e s t a t e ( O k i t a e t a l . , 2 0 0 7 ; W e r n i g e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h i s f a c t , c o u p l e d w i t h t h e c a p a b i l i t y o f h e p a t o c y t e s t o p r o l i f e r a t e e i t h e r i n a c o m p e n s a t o r y f a s h i o n , e . g . , f o l l o w i n g p a r t i a l h e p a t e c t o m y ( S t e e r , 1 9 9 5 ) , o r i n r e s p o n s e t o t r e a t m e n t w i t h m i t o g e n s s u c h a s P B ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ; K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 a ) , i n d i c a t e s t h a t i t i s p o s s i b l e t h a t m a t u r e h e p a t o c y t e s a r e l i v e r t u m o r c e l l p r o g e n i t o r s . T h i s n o t i o n i s n o t i n c o m p a t i b l e w i t h t h e s u g g e s t i o n t h a t t u m o r s o r i g i n a t e f r o m s t e m c e l l t r a n s f o r m a t i o n 8 3 ( R e y a e t a l . , 2 0 0 1 ) , a s b o t h s c e n a r i o s m i g h t b e o p e r a t i v e . T h u s , i t i s i m p o r t a n t t o e v a l u a t e m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n w h o l e t i s s u e . T r e a t m e n t w i t h a t u m o r - p r o m o t i n g d o s e o f P B f o r 2 o r 4 w e e k s s t i m u l a t e s h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n i n B 6 C 3 F 1 m a l e m i c e ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ; K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 a ) . U p o n f u r t h e r t r e a t m e n t , P B i n h i b i t s p r o l i f e r a t i o n i n t h e n o r m a l h e p a t o c y t e p o p u l a t i o n , w h i l e p r e n e o p l a s t i c c e l l s m a y c o n t i n u e t o d i v i d e ( r e v i e w e d i n C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e o b s e r v e d m e t h y l a t i o n c h a n g e s m i g h t g i v e c e r t a i n c e l l s t h e a b i l i t y t o “ e s c a p e ” t h e i n h i b i t i o n o f p r o l i f e r a t i o n b y P B , f a c i l i t a t i n g c l o n a l e x p a n s i o n o f p r e n e o p l a s t i c c e l l s . T h e r e f o r e , r e p l i c a t i o n - d e p e n d e n t p a s s i v e d e m e t h y l a t i o n c o u l d p r o d u c e h y p o m e t h y l a t e d R A M s . C o n v e r s e l y , a c t i v e d e m e t h y l a t i o n ( B h a t t a c h a r y a e t a l . , 1 9 9 9 ) o r c y t i d i n e d e a m i n a s e s ( M o r g a n e t a l . , 2 0 0 4 ) c o u l d a l s o g e n e r a t e h y p o m e t h y l a t e d R A M s . P B - i n d u c e d d i f f e r e n c e s i n a c t i v i t y a n d / o r l o c a l i z a t i o n o f d e m e t h y l a s e s , D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s ( D N M T l , D N M T 3 a a n d D N M T 3 b ) , m e t h y l - b i n d i n g p r o t e i n s a n d / o r e n z y m e s i n v o l v e d i n l - c a r b o n m e t a b o l i s m ( U l r e y e t a l . , 2 0 0 5 ) c o u l d b e r e s p o n s i b l e f o r t h e d e t e c t e d m e t h y l a t i o n c h a n g e s . W h i l e t h e d e t a i l e d m e c h a n i s m ( s ) i n v o l v e d i n P B - i n d u c e d a l t e r a t i o n o f m e t h y l a t i o n r e m a i n t o b e d i s c e r n e d , i t i s i m p o r t a n t t o r e c o g n i z e t h a t t h e s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 , a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 , m i c e a p p e a r t o b e “ d e f e c t i v e ” w i t h r e g a r d t o t h e a b i l i t y t o p r e s e r v e n o r m a l m e t h y l a t i o n p a t t e r n s ( W a t s o n a n d G o o d m a n , 2 0 0 2 ) M e t h y l a t i o n c h a n g e s i n 5 7 % ( 2 9 / 5 1 ) o f t h e g e n e s r e p r e s e n t i n g u n i q u e B 6 C 3 F 1 R A M s o c c u r w i t h i n i n t r o n s ( T a b l e 1 . 1 ) . A l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n w i t h i n i m m e d i a t e 5 ’ p r o m o t e r r e g i o n s m i g h t r e s u l t i n g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s ( E s t e l l e r , 2 0 0 7 ) . H o w e v e r , c u r r e n t s t u d i e s i n d i c a t e t h a t m o s t m a m m a l i a n g e n e s p o s s e s s m u l t i p l e p r o m o t e r s a n d a 8 4 l a r g e n u m b e r o f n o v e l i n t e r g e n i c p r o m o t e r s h a v e b e e n d i s c o v e r e d , a n d t h e s e m i g h t r e s u l t i n t h e t r a n s c r i p t i o n o f n o n - c o d i n g R N A p r o d u c t s ( s a n d e l i n e t a l . , 2 0 0 7 ) . A d d i t i o n a l l y , a P B - r e s p o n s i v e g e n e ( U g t I a 1 ) c o n t a i n s a n i m p o r t a n t c i s r e g u l a t o r y e l e m e n t l o c a t e d 3 k i l o b a s e s u p s t r e a m f r o m t h e t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e ( S u g a t a n i e t a l . , 2 0 0 1 ) , a n d r e g u l a t o r y e l e m e n t s c a n a l s o b e f o u n d w i t h i n i n t r o n s ( F e d o r o v a a n d F e d o r o v , 2 0 0 3 ) a n d n e a r t h e 3 ’ r e g i o n ( C a w l e y e t a l . , 2 0 0 4 ) . H e n c e , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e R A M s a s s o c i a t e d w i t h g e n o m i c r e g i o n s o t h e r t h a n i m m e d i a t e 5 ’ p r o m o t e r s e q u e n c e s c a n f a c i l i t a t e c h a n g e s i n g e n e e x p r e s s i o n . T h e u n i q u e B 6 C 3 F l R A M s o c c u r r e d v e r y e a r l y , a t 2 a n d 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t , a n d a s u b s e t o f t h e d i s c e r n e d g e n e s t h a t r e p r e s e n t t h e R A M s o f i n t e r e s t c a n p o t e n t i a l l y i n fl u e n c e p r o c e s s e s t h a t a r e a s s o c i a t e d w i t h l a t e s t a g e s o f t u m o r i g e n e s i s , i n c l u d i n g a n g i o g e n e s i s , i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s . T h e s e d a t a s u p p o r t t h e i d e a t h a t c a n c e r e v o l v e s i n a s t e p w i s e s e r i e s o f c l o n a l e x p a n s i o n s , a c c u m u l a t i n g h e r i t a b l e a l t e r a t i o n s i n t h e i r g e n o m e s ( m u t a t i o n s a n d / o r e p i g e n e t i c c h a n g e s ) w h i c h , i n a p r o g r e s s i v e f a s h i o n , p r o v i d e a g r o w t h a d v a n t a g e o v e r n e i g h b o r i n g c e l l s ( N o w e l l , 1 9 7 6 ) . I t i s o u r c o n t e n t i o n t h a t a l t e r e d m e t h y l a t i o n p l a y s c r i t i c a l r o l e s d u r i n g P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r f o r m a t i o n i n r o d e n t s . W e b e l i e v e t h a t t h e g e n e s i n v o l v e d i n r o d e n t l i v e r t u m o r i g e n e s i s a r e fi m d a m e n t a l l y t h e s a m e a s t h o s e u n d e r l y i n g t t m r o r i g e n e s i s i n h u m a n t i s s u e s a n d h y p o t h e s i z e t h a t t h e r e a r e k e y d i f f e r e n c e s i n t h e c a p a c i t y t o m a i n t a i n o v e r a l l s t a b i l i t y o f t h e g e n o m e ( e . g . , D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s i s m o r e s t a b l e i n h u m a n c e l l s a s c o m p a r e d t o r o d e n t c e l l s ) ( r e v i e w e d i n G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) . T h i s c o u l d a c c o u n t , i n p a r t , f o r t h e i n c r e a s e d s u s c e p t i b i l i t y t o t u m o r i g e n e s i s e x h i b i t e d b y r o d e n t s a s c o m p a r e d t o h u m a n s ( R a n g a r a j a n a n d W e i n b e r g , 2 0 0 3 ) . T h i s s t u d y h a s d i s c e r n e d g e n e s t h a t d i s p l a y u n i q u e 8 5 m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n P B - t r e a t e d l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e a n d w h i c h c a n n o w b e l i n k e d t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s b a s e d o n t h e p r o c e s s e s i n w h i c h t h e y a r e i n v o l v e d . W e a r e n o w t u r n i n g o u r a t t e n t i o n t o w a r d s r e a l - t i m e P C R a n d m i c r o a r r a y a n a l y s i s o f t h e k e y g e n e s i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e e x t e n t t o w h i c h e x p r e s s i o n c h a n g e s a r e a s s o c i a t e d w i t h t h e o b s e r v e d P B - i n d u c e d a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n d u r i n g e a r l y p h a s e s o f t u m o r i g e n e s i s . 8 6 A C K N O W L E D G E M E N T S J . M . P . i s a p r e d o c t o r a l f e l l o w s u p p o r t e d b y N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h — N a t i o n a l I n s t i t u t e o f E n v i r o n m e n t a l H e a l t h S c i e n c e s t r a i n i n g g r a n t N o . T 3 2 - E S - 7 2 5 5 . R e s e a r c h s u p p o r t , i n t h e f o r m o f a g i f t , f r o m t h e R . J . R e y n o l d s T o b a c c o C o m p a n y i s a c k n o w l e d g e d g r a t e f u l l y . R E F E R E N C E S A y d i n l i k , H . , N g u y e n , T . D . , M o e n n i k e s , O . , B u c h m a n n , A . , a n d S c h w a r z , M . ( 2 0 0 1 ) . S e l e c t i v e p r e s s u r e d u r i n g t u m o r p r o m o t i o n b y p h e n o b a r b i t a l l e a d s t o c l o n a l o u t g r o w t h o f B - c a t e n i n - m u t a t e d m o u s e l i v e r t u m o r s . O n c o g e n e 2 2 , 7 8 1 2 - 7 8 1 6 . B a c h m a n , A . N . , K a r n e n d u l i s , L . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 6 a ) . D i e t h a n o l a m i n e a n d p h e n o b a r b i t a l p r o d u c e a n a l t e r e d p a t t e r n o f m e t h y l a t i o n i n G C - r i c h r e g i o n s o f D N A i n B 6 C 3 F 1 m o u s e h e p a t o c y t e s s i m i l a r t o t h a t r e s u l t i n g f r o m c h o l i n e d e fi c i e n c y . T o x i c o l . S c i . 9 0 , 3 1 7 - 3 2 0 . B a c h m a n , A . N . , P h i l l i p s , J . M , a n d G o o d m a n J . I . ( 2 0 0 6 b ) . P h e n o b a r b i t a l i n d u c e s p r o g r e s s i v e p a t t e r n s o f G C - r i c h a n d g e n e - s p e c i fi c a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n i n t h e l i v e r o f t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e . T o x i c o l . S c i . 9 1 , 3 9 3 - 4 0 5 . B e c k e r , R F . ( 1 9 8 2 ) . M o r p h o l o g i c a l c l a s s i fi c a t i o n o f m o u s e l i v e r t u m o r s b a s e d o n b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . C a n c e r R e s . 4 2 , 3 9 1 8 - 3 9 2 3 . B h a t t a c h a r y a , S . K . , R a m c h a n d a n i , S . , C e r v o n i , N . , a n d S z y f , M . ( 1 9 9 9 ) . A m a m m a l i a n p r o t e i n w i t h s p e c i fi c d e m e t h y l a s e a c t i v i t y f o r m e G D N A . N a t u r e 3 9 7 , 5 7 9 - 5 8 3 . C a w l e y , S . , B e k i r a n o v , S . , N g , H . H . , K a p r a n o v , P . , S e k i n g e r , E . A . , K a m p a , D . , P i c c o l b o n i , A . , S e m e n t c h e n k o , V . , C h e n g , J . , W i l l i a m s , A . J . , W h e e l e r , R . , W o n g , B . , D r e n k o w , J . , Y a m a n a k a , M . , P a t e l , 8 . , B r u b a k e r , S . , T a m m a n a , H . , H e l t , G . , S t r u h l , K . , G i n g e r a s , T . R . ( 2 0 0 4 ) U n b i a s e d m a p p i n g o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r b i n d i n g s i t e s a l o n g h u m a n c h r o m o s o m e s 2 1 a n d 2 2 p o i n t s t o w i d e s p r e a d r e g u l a t i o n o f n o n c o d i n g R N A s . C e l l 1 1 6 , 4 9 9 - 5 0 9 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 ) . A l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n m a y p l a y a v a r i e t y o f r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s . C e l l 8 3 , 1 3 - 1 5 . C o u n t s , J . L . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 7 ) . C o m p a r i s o n o f e f f e c t o f t u m o r p r o m o t e r t r e a t m e n t s o n D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d g e n e e x p r e s s i o n i n B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m o u s e l i v e r a n d i n B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . M a l . C a r c i n o g . 1 8 , 9 7 - 1 0 6 . C o u n t s , J . L . , S a r m i e n t o , J . I . , H a r b i s o n , M . L . , D o w n i n g , J . C . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 6 ) . C e l l p r o l i f e r a t i o n a n d g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s c h a n g e s i n m o u s e 8 7 l i v e r a fi e r p h e n o b a r b i t a l a n d / o r c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e fi c i e n t d i e t a d m i n i s t r a t i o n . C a r c i n o g e n e s i s 1 7 , 1 2 5 1 - 1 2 5 7 . E s t e l l e r , M . ( 2 0 0 7 ) . C a n c e r e p i g e n o m i c s : D N A m e t h y l o m e s a n d h i s t o n e - m o d i fi c a t i o n m a p s . N a t . R e v . G e n e t . 8 , 2 8 6 - 2 9 8 . F e d o r o v a , L . , a n d F e d o r o v , A . ( 2 0 0 3 ) . I n t r o n s i n g e n e e v o l u t i o n . G e n e t i c a 1 1 8 , 1 2 3 - 3 1 . F e i n b e r g , A . P . , O h l s s o n , R . , a n d H e n i k o f f , S . ( 2 0 0 6 ) . T h e e p i g e n e t i c p r o g e n i t o r o r i g i n o f h u m a n c a n c e r . N a t . R e v . G e n e t . 7 , 2 1 - 3 3 . G a l e , N . W . , H o l l a n d , S . J . , V a l e n z u e l a , D . M . , F l e n n i k e n , A . , P a n , L . , R y a n , T . E . , H e n k e m e y e r , M . , S t r e b h a r d t , K . , H i r a i , H . , W i l k i n s o n , D . G . , P a w s o n , T . , D a v i s , 8 . , a n d Y a n c o p o u l o s , G . D . ( 1 9 9 6 ) E p h r e c e p t o r s a n d l i g a n d s c o m p r i s e t v m m a j o r s p e c i fi c i t y s u b c l a s s e s a n d a r e r e c i p r o c a l l y c o m p a r t m e n t a l i z e d d u r i n g e m b r y o g e n e s i s . N e u r o n 1 7 , 9 - 1 9 . G o n z a l g o , M . L . , L i a n g , G . , S p r u c k , C . H . , 1 1 1 , Z i n g g , J . M . , R i d e o u t , W . M . , I I I , a n d J o n e s , P . A . ( 1 9 9 7 ) . I d e n t i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f d i f f e r e n t i a l l y m e t h y l a t e d r e g i o n s o f g e n o m i c D N A b y m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e a r b i t r a r i l y p r i m e d P C R . C a n c e r R e s . 5 7 , 5 9 4 - 5 9 9 . G o n z a l e z - G a r c i a , A . , P r i t c h a r d , C . A . , P a t e r s o n , H . F . , M a v r i a , G . , S t a m p , G . , a n d M a r s h a l l , C . J . ( 2 0 0 5 ) R a l G D S i s r e q u i r e d f o r t u m o r f o r m a t i o n i n a m o d e l o f s k i n c a r c i n o g e n e s i s . C a n c e r C e l l . 7 , 2 1 9 - 2 2 6 . G o o d m a n , J . I . a n d W a t s o n , R E . ( 2 0 0 2 ) . A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n : A s e c o n d a r y m e c h a n i s m i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s . A n n u . R e v . P h a r m a c o l . T o x i c o l . 4 2 , 5 0 1 - 5 2 5 . H a n a h a n D . a n d W e i n b e r g , G . F . ( 2 0 0 0 ) . T h e h a l l m a r k s o f c a n c e r . C e l l 1 0 0 , 5 7 - 7 0 . H o b e r g , J . E . , Y e u n g , F . , a n d M a y o , M . W . ( 2 0 0 4 ) . S M R T d e r e p r e s s i o n b y t h e I K B k i n a s e 0 1 : a p r e r e q u i s i t e t o N F - K B t r a n s c r i p t i o n a n d s u r v i v a l . M o l . C e l l 1 6 , 2 4 5 - 2 5 5 . H u , M . C . , T a n g - O x l e y , Q . , Q i u , W . R . , W a n g , Y . P . , M i h i n d u k u l a s u r i y a , K . A . , A f s h a r , R . , a n d T a n , T . H . ( 1 9 9 8 ) . P r o t e i n p h o s p h a t a s e X i n t e r a c t s w i t h c - R e l a n d s t i m u l a t e s c - R e l / n u c l e a r f a c t o r K B a c t i v i t y . J . B i o l . C h e m . 5 0 , 3 3 5 6 1 - 3 3 5 6 5 . K a r a s h i m a , T . , S w e e n e y , P . , K a m a t , A . , H u a n g , 8 . , K i m , S . J . , B a r - E l i , M . , M c C o n k e y , D . J . , a n d D i n n e y , C . P . ( 2 0 0 3 ) N u c l e a r f a c t o r - K B m e d i a t e s a n g i o g e n e s i s a n d m e t a s t a s i s o f h u m a n b l a d d e r c a n c e r t h r o u g h t h e r e g u l a t i o n o f i n t e r l e u k i n - 8 . C l i n . C a n c e r R e s . 9 , 2 7 8 6 - 2 7 9 7 . K a t a d a , J . , M u r a r n a t s u , M . , H a y a s h i , 1 . , T s u t s u m i , M . , K o n i s h i , Y . , a n d M a j i r n a , M . ( 2 0 0 2 ) . S i g n i fi c a n c e o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l g r o w t h f a c t o r u p - r e g u l a t i o n m e d i a t e d v i a 8 8 a c h y m a s e - a n g i o t e n s i n - d e p e n d e n t p a t h w a y d u r i n g a n g i o g e n e s i s i n h a m s t e r s p o n g e g r a n u l o m a s . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 3 0 2 , 9 4 9 - 9 5 6 . K o l a j a , K . L . , S t e v e n s o n , D . E . , J o h n s o n J . T . , W a l b o r g , J r . , E . F . , a n d K l a u n i g , J . E . ( 1 9 9 6 a ) S u b c h r o n i c e f f e c t s o f d i e l d r i n a n d p h e n o b a r b i t a l o n h e p a t i c D N A s y n t h e s i s i n m i c e a n d r a t s . F u n d a m . A p p l . T o x i c o l . 2 9 , 2 1 9 - 2 2 8 . K o l a j a , K . L . , S t e v e n s o n , D . E . , W a l b o r g J r . , E . F . , a n d K l a u n i g J . E . ( 1 9 9 6 b ) . D o s e d e p e n d e n c e o f p h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n o f p r e n e o p l a s t i c h e p a t i c l e s i o n s i n F 3 4 4 r a t s a n d B 6 C 3 F 1 m i c e : e f f e c t s o n D N A s y n t h e s i s a n d a p o p t o s i s . C a r c i n o g e n e s i s 1 7 , 9 4 7 - 9 5 4 . L a w r e n c e , T . , H a g e m a n , T . , a n d B a l k w i l l , F . ( 2 0 0 7 ) . S e x , c y t o k i n e s , a n d c a n c e r . S c i e n c e 3 1 7 , 5 1 - 5 2 . L e e , S . K . , K i m , J . H . , L e e , Y . C . , C h e o n g , J . , a n d L e e , J . W . ( 2 0 0 0 ) . S i l e n c i n g m e d i a t o r o f r e t i n o i c a c i d a n d t h y r o i d h o r m o n e r e c e p t o r s , a s a n o v e l t r a n s c r i p t i o n a l c o r e p r e s s o r m o l e c u l e o f a c t i v a t i n g p r o t e i n - l , n u c l e a r f a c t o r - K B , a n d s e r u m r e s p o n s e f a c t o r . J . B i o l . C h e m . 2 7 5 , 1 2 4 7 0 - 1 2 4 7 4 . L e v y , L . , N e u v e u t , C . , R e n a r d , C . A . , C h a m e a u , P . , B r a n c h e r e a u , S . , G a u t h i e r , F . , V a n N h i e u , J . T . , C h e r q u i , D . , P e t i t - B e r t r o n , A . F . , M a t h i e u , D . , a n d B u e n d i a , M . A . ( 2 0 0 2 ) . T r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n o f i n t e r l e u k i n - 8 b y B - c a t e n i n - c h 4 . J . B i o l . C h e m . 2 7 7 , 4 2 3 8 6 - 4 2 3 9 3 . M a e k a w a , H . , O i k e , Y . , K a n d a , S . , I t o , Y . , Y a m a d a , Y . , K u r i h a r a , H . , N a g a i , R . , a n d S u d a , T . ( 2 0 0 3 ) . E p h r i n - 3 2 i n d u c e s m i g r a t i o n o f e n d o t h e l i a l c e l l s t h r o u g h t h e p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 3 k i n a s e p a t h w a y a n d p r o m o t e s a n g i o g e n e s i s i n a d u l t v a s c u l a t u r e . A r t e r i o s c l e r T h r o m b . V a s c . B i o l . 2 3 , 2 0 0 8 - 2 0 1 4 . M a s o o d , R . , X i a , G . , S m i t h , D . L . , S c a l i a , P . , S t i l l , J . G . , T u l p u l e , A . , a n d G i l l , P . S . ( 2 0 0 5 ) . E p h r i n B 2 e x p r e s s i o n i n K a p o s i s a r c o m a i s i n d u c e d b y h u m a n h e r p e s v i r u s t y p e 8 : p h e n o t y p e s w i t c h fi o m v e n o u s t o a r t e r i a l e n d o t h e l i u m . B l o o d 1 0 5 , 1 3 1 0 - 1 3 1 8 . M o e n n i k e s , O . , B u c h m a n n , A . , R o m u a l d i , A . , O t t , T . , W e r r i n g l o e r , J . , W i l l e c k e , K . , a n d S c h w a r z , M . ( 2 0 0 0 ) . L a c k o f p h e n o b a r b i t a l - m e d i a t e d p r o m o t i o n o f h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n c o n n e x i n 3 2 - n u l l m i c e . C a n c e r R e s . 1 5 , 5 0 8 7 - 5 0 9 1 . N a k a d a , M . , N i s k a , J . A . , M i y a r n o r i , H . , M c D o n o u g h , W . 8 . , W u , J . , S a t o , H . , a n d B e r e n s , M . E . ( 2 0 0 4 ) . T h e p h o s p h o r y l a t i o n o f E p h B 2 r e c e p t o r r e g u l a t e s m i g r a t i o n a n d i n v a s i o n o f h u m a n g l i o m a c e l l s . C a n c e r R e s . 6 4 , 3 1 7 9 - 3 1 8 5 . N a u g l e r , W . E . , S a k u r a i , T . , K i m , S . , M a e d a , S . , K i m , K . , E l s h a r k a w y , A . M . , a n d K a r i n , M . ( 2 0 0 7 ) . G e n d e r d i s p a r i t y i n l i v e r c a n c e r d u e t o s e x d i f f e r e n c e s i n M y D 8 8 - d e p e n d e n t I L - 6 p r o d u c t i o n . S c i e n c e 3 1 7 , 1 2 1 - 1 2 4 . 8 9 N a v e h - M a n y , T . , a n d C e d a r , H . ( 1 9 8 1 ) . A c t i v e g e n e s e q u e n c e s a r e u n d e r r n e t h y l a t e d . P r o c . N a t l . A c a d S c i . U S A , 7 8 , 4 2 4 6 - 4 2 5 0 . N o w e l l , P . C . ( 1 9 7 6 ) . T h e c l o n a l e v o l u t i o n o f t u m o r c e l l p o p u l a t i o n s . S c i e n c e 1 9 4 , 2 4 - 2 8 . O k i t a , K . , I c h i s a k a , T . , a n d Y a m a n a k a , S . ( 2 0 0 7 ) . G e n e r a t i o n o f g e r m l i n e - c o m p e t e n t i n d u c e d p l u r i p o t e n t s t e m c e l l s . N a t u r e 4 4 8 , 3 1 3 - 3 1 7 . P h i l l i p s , J . M . , Y a m a m o t o . Y , , N e g i s h i , M . , M a r o n p o t , R . R . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 7 ) . O r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n d u r i n g p h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n o f l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T o x i c o l . S c i . 9 6 , 7 2 - 8 2 . R a m s a h o y e , B . H . , B i n i s z k i e w i c z , D . , L y k o , F . , C l a r k , V . , B i r d , A . P . , a n d J a e n i s c h , R . ( 2 0 0 0 ) N o n - C p G m e t h y l a t i o n i s p r e v a l e n t i n e m b r y o n i c s t e m c e l l s a n d m a y b e m e d i a t e d b y D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e 3 a . C e l l B i o l o g y 9 7 , 5 2 3 7 - 5 2 4 2 . R a n g a r a j a n , A . a n d W e i n b e r g , R A . ( 2 0 0 3 ) . C o m p a r a t i v e b i o l o g y o f m o u s e v e r s u s h u m a n c e l l s : M o d e l i n g h u m a n c a n c e r i n m i c e . N a t u r e R e v . C a n c e r 3 , 9 5 2 - 9 5 9 . R a y , J . S . , H a r b i s o n , M . L . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 4 ) A l t e r a t i o n s i n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d e x p r e s s i o n o f t h e r a f o n c o g e n e i n p h e n o b a r b i t a l - i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B 6 C 3 F ] m o u s e l i v e t u m o r s . M o l . C a r c i n o g . 9 , 1 5 5 - 1 6 6 . R e i k , W . ( 2 0 0 7 ) . S t a b i l i t y a n d fl e x i b i l i t y o f e p i g e n e t i c g e n e r e g u l a t i o n i n m a m m a l i a n d e v e l o p m e n t . N a t u r e 4 4 7 , 4 2 5 - 4 3 2 . R e y a , T . , M o r r i s o n , S . J . , C l a r k e M . F . , a n d W e i s s m a n , I . L . ( 2 0 0 1 ) S t e m c e l l s , c a n c e r , a n d c a n c e r s t e m c e l l s . N a t u r e 4 1 4 , 1 0 5 - 1 1 1 . S a n d e l i n , A . , C a r n i n c i , P . , L e n h a r d , B . , P o n j a v i c , J . , H a y a s h i z a k i , Y . , a n d H u m e , D . A . ( 2 0 0 7 ) . M a m m a l i a n R N A p o l y m e r a s e I I c o r e p r o m o t e r s : i n s i g h t s f r o m g e n o m e - w i d e s t u d i e s . N a t . R e v . G e n e t . 8 , 4 2 4 - 4 3 6 . S e n g a , T . , I w a m o t o , T . , K i t a m u r a , T . , M i y a k e , Y . , a n d H a m a g u c h i , M . ( 2 0 0 1 ) . J A K / S T A T 3 - d e p e n d e n t a c t i v a t i o n o f t h e R a l G D S / R a ] p a t h w a y i n M 1 m o u s e m y e l o i d l e u k e m i a c e l l s . J . B i o l . C h e m . 3 5 , 3 2 6 7 8 - 3 2 6 8 1 . S h i r a i s h i , M . , L e r m a n L . S . , a n d S e k i y a T . ( 1 9 9 5 ) . P r e f e r e n t i a l i s o l a t i o n o f D N A f r a g m e n t s a s s o c i a t e d w i t h C p G i s l a n d s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 9 2 , 4 2 2 9 - 4 2 3 3 . S o n g , L . , Z l o b i n , A . , G h o s h a l , P . , Z h a n g , Q . , H o u d e , C . , W e i j z e n , S . , J i a n g , Q . , N a c h e v a , E . , Y a g a n , D . , D a v i s , E . , G a l i e g u e - Z o u i t i n a , S . , C a t o v s k y , D . , G r o g a n , T . , F i s h e r , R . I . , M i e l e , L . , a n d C o i g n e t , L . J . ( 2 0 0 5 ) . A l t e r a t i o n o f S M R T t u m o r s u p p r e s s o r f u n c t i o n i n t r a n s f o r m e d n o n - H o d g k i n l y m p h o m a s . C a n c e r R e s . 6 5 , 4 5 5 4 - 4 5 6 1 . 9 0 S t e e r , C . J . ( 1 9 9 5 ) . L i v e r r e g e n e r a t i o n . F A S E B J . 9 , 1 3 9 6 - 1 4 0 0 . S t r a t h m a n n , J . , S c h w a r z , M . , T h a r a p p e l , J . C . , G l a u e r t , H . P . , S p e a r , B . T . , R o b e r t s o n , L . W . , A p p e l , K . E . , a n d B u c h m a n n , A . ( 2 0 0 6 ) . P C B 1 5 3 , a n o n - d i o x i n - l i k e t u m o r p r o m o t e r , s e l e c t s f o r B - c a t e n i n ( C a t n b ) - m u t a t e d m o u s e l i v e r t u m o r s . T o x i c o l . S c i . 9 3 , 3 4 - 4 0 . S u g a t a n i , J . , K o j i m a , H . , U e d a , A . , K a k i z a k i , S . , Y o s h i n a r i , K . , G o n g , Q . H . , O w e n s , 1 . S . , N e g i s h i , M . , a n d S u e y o s h i , T . ( 2 0 0 1 ) . T h e p h e n o b a r b i t a l r e s p o n s e e n h a n c e r m o d u l e i n t h e h u m a n b i l i r u b i n U D P - g l u c u r o n o s y l t r a n s f e r a s e U G T I A I g e n e a n d r e g u l a t i o n b y t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R . H e p a t o l o g y 3 3 , 1 2 3 2 - 1 2 3 8 . T e r a k a w a , M . , T o m i m o r i , Y . , G o t o , M . , a n d F u k u d a , Y . ( 2 0 0 6 ) . M a s t c e l l c h y m a s e i n d u c e s e x p r e s s i o n o f c h e m o k i n e s f o r n e u t r o p h i l s i n e o s i n o p h i l i c E o L - l c e l l s a n d m o u s e p e r i t o n i t i s e o s i n o p h i l s . E u r . J . P h a r m a c o l . 5 3 8 , 1 7 5 - 1 8 1 . T h i e r y , J . P . ( 2 0 0 2 ) . E p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n s i n t u m o u r p r o g r e s s i o n . N a t . R e v . C a n c e r 2 , 4 4 2 - 4 5 4 . T r o s k o , J . E . , a n d C h a n g C . , C . ( 2 0 0 1 ) . R o l e o f s t e m c e l l s a n d g a p j u n c t i o n a l i n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n i n h u m a n c a r c i n o g e n e s i s . R a d i a t . R e s . 1 5 5 , 1 7 5 - 1 8 0 . U l r e y , C . L . , L i u , L . , A n d r e w s , L . G . , a n d T o l l e f s b o l , T . O . ( 2 0 0 5 ) T h e i m p a c t o f m e t a b o l i s m o n D N A m e t h y l a t i o n . H u m . M o l . G e n e t . 1 4 S p e c N o 1 : R l 3 9 - 1 4 7 . v a n d e r H o r s t , E . H . , D e g e n h a r d t , Y . Y . , S t r e l o w , A . , S l a v i n , A . , C h i n o , L . , O r f , J . , R o n g , M . , L i , 8 . , S e e , L . H . , N g u y e n , K . Q . , H o e y , T . , W e s c h e , H . , a n d P o w e r s , S . ( 2 0 0 5 ) M e t a s t a t i c p r o p e r t i e s a n d g e n o m i c a m p l i fi c a t i o n o f t h e t y r o s i n e k i n a s e g e n e A C K I . P r o c . N a t l . A c a d S c i . U S A 1 0 2 , 1 5 9 0 1 - 1 5 9 0 6 . V o r c e , R . L . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 1 ) . H y p o m e t h y l a t i o n o f r a s o n c o g e n e s i n c h e m i c a l l y i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B 6 C 3 F ] m o u s e l i v e r t u m o r s . T o x i c o l . E n v i r o n . H e a l t h . 3 4 , 3 6 7 - 3 8 4 . W a r d , Y . , W a n g , W . , W o o d h o u s e , E . , L i n n o i l a , I . , L i o t t a , L . , a n d K e l l y , K . ( 2 0 0 1 ) S i g n a l p a t h w a y s w h i c h p r o m o t e i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s : c r i t i c a l a n d d i s t i n c t c o n t r i b u t i o n s o f e x t r a c e l l u l a r s i g n a l - r e g u l a t e d k i n a s e a n d R a l - s p e c i fi c g u a n i n e e x c h a n g e f a c t o r p a t h w a y s . M o l . C e l l B i o l . 2 1 , 5 9 5 8 - 5 9 6 9 . W a t s o n , R . E . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 2 ) E f f e c t s o f p h e n o b a r b i t a l o n D N A m e t h y l a t i o n i n G C - r i c h r e g i o n s o f h e p a t i c D N A f r o m m i c e t h a t e x h i b i t d i f f e r e n t l e v e l s o f s u s c e p t i b i l i t y t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T o x i c o l S c i . 6 8 , 5 1 - 5 8 . W e i , P . , Z h a n g , J . , E g a n - H a fl e y , M . , L i a n g , S . , a n d M o o r e , D . D . ( 2 0 0 0 ) . T h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R m e d i a t e s s p e c i fi c x e n o b i o t i c i n d u c t i o n o f d r u g m e t a b o l i s m . N a t u r e 4 0 7 , 9 2 0 - 9 2 3 . 9 1 W e r n i g , M . , M e i s s n e r , A . , F o r e m a n , R . , B r a m b r i n k , T . , K u , M . , H o c h e d l i n g e r , K . , B e r n s t e i n , B . E . , a n d J a e n i s c h , R . ( 2 0 0 7 ) . I n v i t r o r e p r o g r a m m i n g o f fi b r o b l a s t s i n t o a p l u r i p o t e n t E S - c e l l - l i k e s t a t e . N a t u r e 4 4 8 , 3 1 8 - 3 2 4 . W h y s n e r , J . , R o s s , P . M . , a n d W i l l i a m s , G . M . ( 1 9 9 6 ) . P h e n o b a r b i t a l m e c h a n i s t i c d a t a a n d r i s k a s s e s s m e n t : e n z y m e i n d u c t i o n , e n h a n c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n d t u m o r p r o m o t i o n . P h a r m a c o l . T h e r . 7 1 , 5 3 - 9 1 . W i s e m a n , R . W . , S t o w e r s , S . J . , M i l l e r , E . C . , A n d e r s o n , M . W . , a n d M i l l e r , J . A . ( 1 9 8 6 ) . A c t i v a t i n g m u t a t i o n s o f t h e c - H a - r a s p r o t o o n c o g e n e i n c h e m i c a l l y i n d u c e d h e p a t o m a s o f t h e m a l e B 6 C 3 F l m o u s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 3 , 5 8 2 5 - 5 8 2 9 . Y a m a m o t o , Y . , M o o r e , R . , G o l d s w o r t h y , T . L . , N e g i s h i , M . , a n d M a r o n p o t , R . R . ( 2 0 0 4 ) . T h e o r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r i s e s s e n t i a l f o r l i v e r t u m o r p r o m o t i o n b y p h e n o b a r b i t a l i n m i c e . C a n c e r R e s . 6 4 , 7 1 9 7 - 7 2 0 0 . Y o s h i z u k a , N . , M o r i u c h i , R . , M o r i , T . , Y a m a d a , K . , H a s e g a w a , S . , M a e d a , T . , S h i m a d a , T . , Y a m a d a , Y . , K a m i h i r a , S . , T o m o n a g a , M . , a n d K a t a m i n e , S . ( 2 0 0 4 ) A n a l t e r n a t i v e t r a n s c r i p t d e r i v e d f r o m t h e T r i o l o c u s e n c o d e s a g u a n o s i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e f a c t o r w i t h m o u s e c e l l - t r a n s f o r m i n g p o t e n t i a l . J . B i o l . C h e m . 2 7 9 , 4 3 9 9 8 - 4 4 0 0 4 . Z h a n g , X . , G a s p a r d , J . P . , a n d C h u n g , D . C . ( 2 0 0 1 ) . R e g u l a t i o n o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r b y t h e W n t a n d K - r a s p a t h w a y s i n c o l o n i c n e o p l a s i a . C a n c e r R e s . 1 5 , 6 0 5 0 - 6 0 5 4 . 9 2 C H A P T E R 1 A P P E N D I X D a t a w i t h i n t h e a p p e n d i x c o n s i s t o f : l ) A s e r i e s o f fi g u r e s w h i c h p r o v i d e a b r e a k d o w n o f t h e g e n o m i c l o c a t i o n s ( F i g . 1 . 1 1 ) , c h r o m o s o m a l a l i g n m e n t s ( F i g . 1 . 1 2 ) a n d f u n c t i o n s ( F i g . 1 . 1 3 ) o f a l l t h e u n i q u e B 6 C 3 F 1 R A M s p l u s 2 e x a m p l e s o f i n f o r m a t i c s p a t h w a y s o f u n i q u e B 6 C 3 F 1 R A M s ( F i g s . 1 . 1 4 a n d 1 . 1 5 ) , t h e c o m m o n c e l l u l a r r e g u l a t o r s o f u n i q u e B 6 C 3 F ] R A M s a t 4 w e e k s ( F i g . 1 . 1 6 ) a n d a p p r o p r i a t e l i t e r a t u r e r e f e r e n c e s f o r b o t h T a b l e 1 . 1 ( A p p e n d i x R e f e r e n c e s 1 ) a n d F i g u r e 1 . 1 0 ( F i g . 1 . 1 7 p l u s A p p e n d i x R e f e r e n c e s 2 ) . N o t e t h a t t h e s e d a t a a r e a s u b s e t o f t h e t o t a l S u p p l e m e n t a r y I n f o r m a t i o n t h a t c a n b e f o u n d i n t h e v e r s i o n o f t h i s m a n u s c r i p t t h a t w a s p u b l i s h e d i n T o x i c o l o g i c a l S c i e n c e s i n 2 0 0 8 . 9 3 4 : R e p e a t e l e m e n t : m u l t i p l e " t o p " h i t s a n d n o h i t s a r e a s s o c i a t e d w i t h a g e n e ( s ) E 1 . A . i : S p a n s T S S a n d / o r 1 % ' o 3 : R e p e a t e l e m e n t : m u l t i p l e 5 A " t o p " h i t s a n d o n e / s e v e r a l a r e a s s o c i a t e d w i t h a g e n e ( s ) 0 1 . A . i i : E x o n i c 7 % 2 : U n c h a r a c t e r i z e d : > 1 0 k b a w a y f r o m a n a n n o t a t e d g e n e 0 3 4 1 . A . i i i : I n t r o n i c 3 5 % 1 . C . i i : > 2 a n d 5 1 0 k b d o w n s t r e a m f r o m l a s t e x o n / t n t r o n 5 % 1 . B . i : 5 2 k b u p s t r e a m o f T S S 2 % 1 . C . i . : 5 2 k b d o w n s t r e a m f r o m l a s t e x o n fi n t r o n 1 . B . i i : > 2 a n d 5 1 0 k b 2 % u p s t r e a m o f T S S 5 % F r g g ' r e 1 . 1 1 T h e D i s t r i b u t i o n o f G e n o m i c L o c a t i o n s t o W h i c h t h e P C R P r o d u c t s R e p r e s e n t i n g P B - i n d u c e d U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n B 6 C 3 F 1 M i c e A l i g n e d . P C R p r o d u c t s r e p r e s e n t i n g u n i q u e B 6 C 3 F l R A M s w e r e a s s i g n e d a g e n o m i c l o c a t i o n r e l a t i v e t o a n a n n o t a t e d g e n e , b a s e d o n t h e c l a s s i fi c a t i o n s c h e m e i n F i g u r e 1 . 8 . A b b r e v i a t i o n s : T S S , t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e ; U T R , u n t r a n s l a t e d r e g r o n . 9 4 1 9 X 1 1 8 2 % 1 % 4 % 2 5 1 0 % 1 3 1 % 1 2 1 6 % F m r e 1 . 1 2 T h e D i s t r i b u t i o n o f C h r o m o s o m e s W i t h i n t h e M o u s e G e n o m e t o W h i c h t h e P C R P r o d u c t s R e p r e s e n t i n g P B - i n d u c e d U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n B 6 C 3 F 1 M i c e A l i g n e d . T h e c h r o m o s o m e s p r o c e e d fl o u r 1 t o 1 9 , i n c l u d i n g X , i n a c l o c k w i s e f a s h i o n . 9 5 C e l l u l a r a d h e s i o n a n d m o t i l i t y 1 % S i g n a l t r a n s d u c t i o n 9 % U n c h a r a c t e r i z e d T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n 3 2 % 1 2 % T r a n s p o r t 6 % C e l l u l a r m e t a b o l i s m 8 % I n t r a c e l l u l a r t r a f fi c k i n g U n k n o w n 1 % 1 4 % R N A m e t a b o l i s m a n d f u n c t i o n ' ~ 3 % 0 5 2 ’ ? A p o p t o s i s 2 % U b i q u i t i n c y c l e 3 % F ' g r _ r r e 1 . 1 3 F u n c t i o n a l B r e a k d o w n o f t h e G e n o m i c R e g i o n s t h a t R e p r e s e n t U n i q u e P B - i n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n B 6 C 3 F 1 M i c e . T h e g e n o m i c r e g i o n s , i n c l u d i n g g e n e s , r e p r e s e n t i n g u n i q u e R A M s w e r e b r o k e n d o w n i n t o 1 2 c a t e g o r i e s , 1 0 o f w h i c h a r e b a s e d o n G e n e O n t o l o g y ( G O ) f u n c t i o n a l i n f o r m a t i o n . F o r g e n e s i n t h e “ I m k n o w n ” c a t e g o r y , n o i n f o r m a t i o n a b o u t t h e m e x i s t s i n t h e l i t e r a t u r e . R e g i o n s i n t h e ‘ fi m c h a r a c t e r i z e d ” c a t e g o r y a l i g n t o t h e m o u s e g e n o m e g r e a t e r t h a n 1 0 k i l o b a s e s a w a y f r o m a n a n n o t a t e d g e n e . 9 6 V ‘ Q “ h r . 0 5 ' ; o T M J ; . g m - 4 ‘ - l F l a r e 1 , 1 4 I n f o r m a t i c A n a l y s i s o f R a l G u a n i n e N u c l e o t i d e D i s s o c i a t i o n S t i m u l a t o r ( R a l g d s ) , a P o t e n t i a l O n c o g e n e t h a t i s U n i q u e l y H y p o m e t h y l a t e d i n B 6 C 3 F 1 M i c e a t 4 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t . R A L G D S p l a y s a c r i t i c a l r o l e i n t h e o n c o g e n i c R a s p a t h w a y . S o l i d a r r o w s i n d i c a t e p o s i t i v e ( — o - > ) o r n e g a t i v e ( - — - l ) i n t e r a c t i o n s . D o t t e d a r r o w s ( . . . . - - - - > ) i n d i c a t e i n v o l v e m e n t i n d i s e a s e s t a t e s , a n d l i n e s w i t h n o a r r o w h e a d s ( — ) i n d i c a t e a d i r e c t i n t e r a c t i o n . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t a s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h e a c h g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s ( 0 ) a n d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( 1 2 ) . 9 7 F I E . g e 1 . 1 5 I n f o r m a t i c A n a l y s i s o f T r a n s f o r m i n g G r o w t h F a c t o r B e t a R e c e p t o r 1 ] ( T g / e r ) , w h i c h i s U n i q u e l y H y p o m e t h y l a t e d i n B 6 C 3 F 1 M i c e a t 4 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t . T G F B R 2 p l a y s a c e n t r a l r o l e i n T g f - B s i g n a l i n g . S o l i d a r r o w s i n d i c a t e p o s i t i v e ( — O > ) o r n e g a t i v e ( — l ) . D o t t e d a r r o w s ( - - - - - - - - s » ) i n d i c a t e i n v o l v e m e n t i n d i s e a s e s t a t e s . L i n e d w i t h n o a r r o w h e a d s ( — ) i n d i c a t e a d i r e c t i n t e r a c t i o n . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t a s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h e a c h g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s ( O ) , k i n a s e s ( C ‘ ) , t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( i 2 ) , a n d m e m b r a n e r e c e p t o r s ( ' . . ‘ ) . 9 8 F m r e 1 , 1 6 C o m m o n C e l l u l a r R e g u l a t o r s o f G e n e s t h a t R e p r e s e n t U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n L i v e r T u m o r - S u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] M i c e a t 4 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t . A n i n f o r m a t i c s a p p r o a c h w a s u t i l i z e d t o u n c o v e r c e l l u l a r r e g u l a t o r s t h a t a f f e c t 2 o r m o r e g e n e s r e p r e s e n t i n g u n i q u e P B - i n d u c e d B 6 C 3 F l R A M s a t 4 w e e k s . E n t i t i e s t h a t l a c k a H , Y , o r N a r e c o m m o n r e g u l a t o r s . T h e a r r o w s p o i n t a w a y f r o m t h e c o m m o n r e g u l a t o r : p o s i t i v e ( m e - b ) a n d n e g a t i v e ( - - - - - - - l ) i n t e r a c t i o n s a r e s h o w n . T h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f a u n i q u e R A M i s i n d i c a t e d b y H ( h y p o m e t h y l a t i o n ) , Y ( h y p e r m e t h y l a t i o n ) o r N ( n e w m e t h y l a t i o n ) . A c o m b i n a t i o n o f l e t t e r s ( e . g . , H a n d Y ) d e n o t e s a R A M w i t h a n a m b i g u o u s m e t h y l a t i o n s t a t u s a t 4 w e e k s . A n a s t e r i s k ( * ) r e p r e s e n t s a R A M t h a t c a r r i e d f o r w a r d ( i . e . i t w a s o b s e r v e d a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s ) . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t a s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h e a c h g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s o r n u c l e a r r e c e p t o r s ( 0 ) , l i g a n d s ( ‘ 3 ’ ) , k i n a s e s ( O ) , t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( S 2 ) , a n d m e m b r a n e r e c e p t o r ( r ‘ ) . 9 9 0 . 0 5 % P B f o r 2 o r 4 w e e k s B 6 C 3 F ] v s . C 5 7 B L / 6 i ” 4 - H , 4 W k l I d e n t i fi e d a n d a n n o t a t e d u n i q u e R A M s i n s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 m i c e H . 4 C m a l . H . 4 w k " ' . l g d s \ l T A n g i o g e n e s ' ~ N f — k fl a c t i v a t i o n E p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l , . : - I n v a s i o n a n d T u m o r c e l l m e t s t a s i s s u r v i v a l / p r o l i f e r a t i o 1 O B Q / F r g g ' r e 1 . 1 7 T h e P o s s i b l e F u n c t i o n a l S i g n i fi c a n c e , R e g a r d i n g T u m o r i g e n e s i s , o f S e l e c t e d G e n e s w h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n t h e B 6 C 3 F l M o u s e F o l l o w i n g T r e a t m e n t w i t h P h e n o b a r b i t a l ( P B ) . T h e c u r r e n t s t u d y i d e n t i fi e d r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M s ) a t 2 o r 4 w e e k s o f 0 . 0 5 % P B t r e a t m e n t a n d a n n o t a t e d 5 1 g e n e s t h a t r e p r e s e n t t h e s e r e g i o n s . S e v e r a l o f t h e s e g e n e s a r e w e l l - d o c u m e n t e d a s p l a y i n g c r i t i c a l r o l e s i n t u m o r i g e n e s i s ( d a r k g r a y o v a l s ) . U n i q u e P B - i n d u c e d h y p o m e t h y l a t i o n a n d d e c r e a s e d e x p r e s s i o n o f H a - r a s ( l i g h t g r a y o v a l ) i n B 6 C 3 F 1 m i c e h a s b e e n d e m o n s t r a t e d ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . T h e a p p r o p r i a t e t i m e p o i n t o f P B t r e a t m e n t i s d e n o t e d ( 2 o r 4 w k ) , a n d t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f t h e R A M s a r e i n d i c a t e d b y H ( h y p o m e t h y l a t i o n ) , Y ( h y p e r m e t h y l a t i o n ) o r N ( n e w m e t h y l a t i o n ) . R A M s w i t h a n a m b i g u o u s m e t h y l a t i o n s t a t u s a r e i n d i c a t e d b y t h e p r e s e n c e o f 2 l e t t e r s ( i . e . H o r Y ) . I n t e r l e u k i n 6 ( I L - 6 ) i s a c o m m o n 4 w e e k r e g u l a t o r , a n d i n t e r l e u k i n 8 ( I L - 8 ) a n d v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ( V E G F ) a r e c o m m o n 4 w e e k t a r g e t s , o f m u l t i p l e g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n t h e l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e ( w h i t e o v a l s ) . R A L G D S i s a k e y d o w n s t r e a m e f f e c t o r o f H R A S . T h e n u m b e r s c o r r e s p o n d t o s e l e c t e d l i t e r a t u r e r e f e r e n c e s , l i s t e d i n A p p e n d i x R e f e r e n c e s 2 , f o r t h e r e l a t i o n s h i p s d e p i c t e d i n t h i s fi g u r e . 1 0 0 R E F E R E N C E S 1 : L i t e r a t u r e R e f e r e n c e s f o r t h e G e n e s R e p r e s e n t i n g U n i q u e B 6 C 3 F 1 R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) , f o r N o r m a l F u n c t i o n s a n d P o s s i b l e R o l e s i n T u m o r i g e n e s i s . T h e n u m b e r o f t h e r e f e r e n c e c o r r e s p o n d s t o t h e n u m b e r i n p a r e n t h e s e s p r o c e e d i n g t h e n o r m a l fi m c t i o n o r p o s s i b l e r o l e i n t u m o r i g e n e s i s a s n o t e d i n T a b l e l . 1 ) C o h e n , P . T . , P h i l p , A . , a n d V a z q u e z - M a r t i n , C . ( 2 0 0 5 ) P r o t e i n p h o s p h a t a s e 4 - - f r o m o b s c u r i t y t o v i t a l f u n c t i o n s . F E B S L e t t . 5 7 9 , 3 2 7 8 - 3 2 8 6 . 2 ) S z a s z i , K . , P a u l s e n , A . , S z a b o , E . Z . , N u m a t a , M . , G r i n s t e i n , S . , a n d O r l o w s k i , J . ( 2 0 0 2 ) C l a t h r i n - m e d i a t e d e n d o c y t o s i s a n d r e c y c l i n g o f t h e n e u r o n - s p e c i fi c N a + / H + e x c h a n g e r N H E S i s o f o r m : r e g u l a t i o n b y p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 3 ' - k i n a s e a n d t h e a c t i n c y t o s k e l e t o n . J . B i o l . C h e m . 2 7 7 , 4 2 6 2 3 - 4 2 6 3 2 . 3 ) R a j e n d r a n , R . R . , N y e , A . c . , F r a s o r , J . , B a l s a r a , R . 1 ) . , M a r t i n i , P . G . , a n d K a t z e n e l l e n b o g e n , B . S . ( 2 0 0 3 ) R e g u l a t i o n o f n u c l e a r r e c e p t o r t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y b y a n o v e l D E A D b o x R N A h e l i c a s e ( D P 9 7 ) . J . B i o l . C h e m . 2 7 8 , 4 6 2 8 - 4 6 3 8 . 4 ) D a v i s , D . B . , D o h e r t y , K . R . , D e l m o n t e , A . J . , a n d M c N a l l y , E . M . ( 2 0 0 2 ) C a l c i u m - s e n s i t i v e p h o s p h o l i p i d b i n d i n g p r o p e r t i e s o f n o r m a l a n d m u t a n t f e r l i n C 2 d o m a i n s . J . B i o l . C h e m . 2 7 7 , 2 2 8 8 3 - 2 2 8 8 8 . 5 ) S w a n s o n , D . J . , Z e l l m e r , E . , a n d L e w i s , B . J . ( 1 9 9 8 ) A P 1 p r o t e i n s m e d i a t e t h e C A M P r e s p o n s e o f t h e d o p a m i n e B - h y d r o x y l a s e g e n e . J . B i o l . C h e m . 2 7 3 , 2 4 0 6 5 - 2 4 0 7 4 . 6 ) N a k a m u r a , N . , T o b a , S . , H i r a i , M . , M o r i s h i t a , S . , M i k a r n i , T . , K o n i s h i , M . , I t o h , N . , a n d K u r o s a k a , A . ( 2 0 0 5 ) C l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o f a b r a i n - s p e c i fi c p u t a t i v e U D P - G a l N A c : p o l y p e p t i d e N - a c e t y l g a l a c t o s a r n i n y l t r a n s f e r a s e g e n e . B i o l . P h a r m . B u l l . 2 8 , 4 2 9 - 4 3 3 . 7 ) L e s a g e , F . , T e r r e n o i r e , C . , R o m e y , G . , a n d L a z d u n s k i , M . J . ( 2 0 0 0 ) H u m a n T R E K Z , a 2 P d o m a i n m e c h a n o - s e n s i t i v e K + c h a n n e l w i t h m u l t i p l e r e g u l a t i o n s b y p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s , l y s o p h o s p h o l i p i d s , a n d G s , G i , a n d G q p r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o r s . J . B i o l . C h e m . 2 7 5 , 2 8 3 9 8 - 2 8 4 0 5 . 8 ) W i l l i g e r , B . T . , P r o v o s t , J . J . , H o , W . T . , M i l s t i n e , J . , a n d E x t o n , J . H . ( 1 9 9 9 ) A r f a p t i n 1 f o r m s a c o m p l e x w i t h A D P - r i b o s y l a t i o n f a c t o r a n d i n h i b i t s p h o s p h o l i p a s e D . F E B S L e t t . 4 5 4 , 8 5 - 8 9 . 9 ) P a r k K H , C h o i S E , E o m M , K a n g Y . ( 2 0 0 5 ) D o w n r e g u l a t i o n o f t h e a n a p h a s e - p r o m o t i n g c o m p l e x ( A P C ) 7 i n i n v a s i v e d u c t a l c a r c i n o m a s o f t h e b r e a s t a n d i t s c l i n i c o p a t h o l o g i c r e l a t i o n s h i p s . B r e a s t C a n c e r R e s . 7 , R 2 3 8 - 2 4 7 . 1 0 ) Y o k o y a r n a , K . , S u , 1 . H . , T e z u k a , T . , Y a s u d a , T . , M i k o s h i b a , K . , T a r a k h o v s k y , A . , a n d Y a m a m o t o , T . ( 2 0 0 2 ) B A N K r e g u l a t e s B C R - i n d u c e d c a l c i u m m o b i l i z a t i o n b y p r o m o t i n g t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f 1 P 3 r e c e p t o r . E M B O J . 2 1 , 8 3 - 9 2 . 1 0 1 l l ) S h i o t a , N . , J i n , D . , T a k a i , S . , K a w a m u r a , T . , K o y a m a , M . , N a k a m u r a , N . , a n d M i y a z a k i , M . ( 1 9 9 7 ) C h y m a s e i s a c t i v a t e d i n t h e h a m s t e r h e a r t f o l l o w i n g v e n t r i c u l a r fi b r o s i s d u r i n g t h e c h r o n i c s t a g e o f h y p e r t e n s i o n . F E B S L e t t . 4 0 6 , 3 0 1 - 3 0 4 . 1 2 ) S i g n i fi c a n c e o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l g r o w t h f a c t o r u p - r e g u l a t i o n m e d i a t e d v i a a c h y m a s e - a n g i o t e n s i n — d e p e n d e n t p a t h w a y d u r i n g a n g i o g e n e s i s i n h a m s t e r s p o n g e g r a n u l o m a s . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 3 0 2 , 9 4 9 - 5 6 . 1 3 ) G i n g r a s , H . , C a s e s , 0 . , K r a s i l n i k o v a , M . , B é r u b é , G . , a n d N e p v e u , A . ( 2 0 0 5 ) B i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e m a m m a l i a n C u x 2 p r o t e i n . G e n e . 3 4 4 , 2 7 3 - 2 8 5 . 1 4 ) W u , G . , L y a p i n a , 8 . , D a s , 1 . , L i , J . , G u r n e y , M . , P a u l e y , A . , C h u i , 1 . , D e s h a i e s R . J . , a n d K i t a j e w s k i , J . ( 2 0 0 1 ) S E L - l O i s a n i n h i b i t o r o f n o t c h s i g n a l i n g t h a t t a r g e t s n o t c h f o r u b i q u i t i n - m e d i a t e d p r o t e i n d e g r a d a t i o n . M o l C e l l B i o l . 2 1 , 7 4 0 3 - 7 4 1 5 . 1 5 ) A k h o o n d i , 8 . , S u n , D . , v o n d e r L e h r , N . , A p o s t o l i d o u , S . , K l o t z , K . , M a l j u k o v a , A . , C e p e d a , D . , F i e g l , H . , D o f o u , D . , M a r t h , C . , M u e l l e r - H o l m e r , E . , C o r c o r a n , M . , D a g n e l l , M . , N e j a d , S . 2 . , N a y e r , B . N . , Z a l i , M . R . , H a n s s o n , J . , E g y h a z i , S . , P e t e r s s o n , F . , S a n g f e l t , P . , N o r d g r e n , H . , G r a n d e r , D . , R e e d , S . I . , W i d s c h w e n d t e r , M . , S a n g f e l t , O . , a n d S p r u c k , C . ( 2 0 0 7 ) F B X W 7 / h C D C 4 i s a g e n e r a l t u m o r s u p p r e s s o r i n h u m a n c a n c e r . C a n c e r R e s . 6 7 , 9 0 0 6 - 9 0 1 2 . 1 6 ) N i s h i n o , J . , Y a m a s h i t a , K . , H a s h i g u c h i , H . , F u j i i , H . , S h i m a z a k i , T . , a n d H a m a d a , H . ( 2 0 0 4 ) M e t e o r i n : a s e c r e t e d p r o t e i n t h a t r e g u l a t e s g l i a l c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a n d p r o m o t e s a x o n a l e x t e n s i o n . E M B O J . 5 , 1 9 9 8 - 2 0 0 8 . 1 7 ) B a g u t t i , C . , F o r r o , G . , F e r r a l l i , J . , R u b i n , B . , a n d C h i q u e t - E h r i s m a n n , R . ( 2 0 0 3 ) T h e i n t r a c e l l u l a r d o m a i n o f t e n e u r i n - 2 h a s a n u c l e a r f l m c t i o n a n d r e p r e s s e s z i c - 1 - m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n J . C e l l S c i . 1 1 6 ( P t 1 4 ) , 2 9 5 7 - 2 9 6 6 . 1 8 ) W a r d , Y . , W a n g , W . , W o o d h o u s e , E . , L i n n o i l a , I . , L i o t t a , L . , a n d K e l l y , K . ( 2 0 0 1 ) S i g n a l p a t h w a y s w h i c h p r o m o t e i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s : c r i t i c a l a n d d i s t i n c t c o n t r i b u t i o n s o f e x t r a c e l l u l a r s i g n a l - r e g u l a t e d k i n a s e a n d R a l - s p e c i fi c g u a n i n e e x c h a n g e f a c t o r p a t h w a y s . M o l . C e l l B i o l . 2 1 , 5 9 5 8 - 5 9 6 9 . 1 9 ) T a n i g u c h i , M . , M a s u d a , T . , F u k a y a , M . , K a t a o k a , H . , M i s h i n a , M . , Y a g i n u m a , H . , W a t a n a b e , M . , a n d S h i m i z u , T . ( 2 0 0 5 ) I d e n t i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n o v e l m e m b e r o f m u r i n e s e m a p h o r i n f a m i l y . G e n e s C e l l s . 1 0 , 7 8 5 - 7 9 2 . 2 0 ) H u a n g , G . N . , Z e n g , W . , K i m , J . Y . , Y u a n , J . P . , H a n , L . , M u a l l e m , S . , a n d W o r l e y , P . F . ( 2 0 0 6 ) S T I M l c a r b o x y l - t e r m i n u s a c t i v a t e s n a t i v e S O C , [ c m a n d T R P C l c h a n n e l s . N a t . C e l l B i o l . 8 , 1 0 0 3 - 1 0 1 0 . 1 0 2 2 1 ) M a n j i , S . S . , P a r k e r , N . J . , W i l l i a m s , R . T . , v a n S t e k e l e n b u r g , L . , P e a r s o n , R . B . , D z i a d e k , M . , a n d S m i t h , P . J . ( 2 0 0 0 ) S T I M l : a n o v e l p h o s p h o p r o t e i n l o c a t e d a t t h e c e l l s u r f a c e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a . 1 4 8 1 , 1 4 7 - 1 5 5 . 2 2 ) C h e n , Z . , F r i e d r i c h , G . A . , a n d S o r i a n o , P . ( 1 9 9 4 ) T r a n s c r i p t i o n a l e n h a n c e r f a c t o r 1 d i s r u p t i o n b y a r e t r o v i r a l g e n e t r a p l e a d s t o h e a r t d e f e c t s a n d e m b r y o n i c l e t h a l i t y i n m i c e . G e n e s D e v . 8 , 2 2 9 3 - 2 3 0 1 . 2 3 ) M a t h e w , S . , M u r t y , V . V . , C h e i f e t z , 8 . , G e o r g e , D . , M a s s a g u é , J . , a n d C h a g a n t i , R . S . ( 1 9 9 4 ) T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r g e n e T G F B R 2 m a p s t o h u m a n c h r o m o s o m e b a n d 3 p 2 2 . G e n o m i c s . 2 0 , 1 1 4 - 1 1 5 . 2 4 ) R o b e r t s , A . B . , a n d L a l a g e , M . W a k e fi e l d . ( 2 0 0 3 ) . T h e t w o f a c e s o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r B i n c a r c i n o g e n e s i s . P N A S 1 0 0 , 8 6 2 1 - 8 6 2 3 2 5 ) E d g a r A . J . ( 2 0 0 5 ) M i c e h a v e a t r a n s c r i b e d L - t h r e o n i n e a l d o l a s e / G L Y I g e n e , b u t t h e h u m a n G L Y l g e n e i s a n o n - p r o c e s s e d p s e u d o g e n e . B M C G e n o m i c s . 6 , 3 2 . 2 6 ) A h m e d , I . , C a l l e , Y . , S a y e d , M . A . , K a m a l , J . M . , R e n g a s w a m y , P . , M a n s e r , E . , M e i n e r s , S . , a n d N u r - E - K a r n a l , A . ( 2 0 0 4 ) C d c 4 2 - d e p e n d e n t n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f n o n - r e c e p t o r t y r o s i n e k i n a s e , A C K . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 3 1 4 , 5 7 1 - 9 . 2 7 ) v a n d e r H o r s t , E . H . , D e g e n h a r d t , Y . Y . , S t r e l o w , A . , S l a v i n , A . , C h i n n , L . , O r f , J . , R o n g , M . , L i , 8 . , S e e , L . H . , N g u y e n , K . Q . , H o e y , T . , W e s c h e , H . , a n d P o w e r s , S . ( 2 0 0 5 ) M e t a s t a t i c p r o p e r t i e s a n d g e n o m i c a m p l i fi c a t i o n o f t h e t y r o s i n e k i n a s e g e n e A C K I . P r o c . N a t l . A c a d S c i . U S A . 1 0 2 , 1 5 9 0 1 - 1 5 9 0 6 . 2 8 ) G r i m m , C . , K r a f t , R . , S a u e r b r u c h , S . , S c h u l t z , G . , a n d H a r t e n e c k , C . ( 2 0 0 3 ) M o l e c u l a r a n d f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e m e l a s t a t i n - r e l a t e d c a t i o n c h a n n e l T R P M 3 . J . B i o l . C h e m . 2 7 8 , 2 1 4 9 3 - 2 1 5 0 1 . 2 9 ) K e e , H . J . , A h n , K . Y . , C h o i , K . C . , W o n S o n g , J . , H e o , T . , J u n g , 8 . , K i m , J . K . , B a e , C . S . , a n d K i m , K . K . ( 2 0 0 4 ) E x p r e s s i o n o f b r a i n - s p e c i fi c a n g i o g e n e s i s i n h i b i t o r 3 ( B A I 3 ) i n n o r m a l b r a i n a n d i m p l i c a t i o n s f o r B A 1 3 i n i s c h e m i a - i n d u c e d b r a i n a n g i o g e n e s i s a n d m a l i g n a n t g l i o m a . F E B S L e t t . 5 6 9 , 3 0 7 - 3 1 6 . 3 0 ) C o w e l l , J . K . , L a D u c a , J . , R o s s i , M . R . , B u r k h a r d t , T . , N o w a k , N . J . , a n d M a t s u i , S . ( 2 0 0 5 ) M o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e t ( 3 ; 9 ) a s s o c i a t e d w i t h i m m o r t a l i z a t i o n i n t h e M C F I O A c e l l l i n e . C a n c e r G e n e t . C y t o g e n e t . 1 6 3 , 2 3 - 2 9 . 3 1 ) S h e , P . , R e i d , T . M . , B r o n s o n , S . K . , V a r y , T . C . , H a j n a l , A . , L y n c h , C . J . , a n d H u t s o n , S . M . ( 2 0 0 7 ) D i s r u p t i o n o f B C A T m i n m i c e l e a d s t o i n c r e a s e d e n e r g y e x p e n d i t u r e a s s o c i a t e d w i t h t h e a c t i v a t i o n o f a f u t i l e p r o t e i n t u r n o v e r c y c l e . C e l l M e t a b . 6 , 1 8 1 - 1 9 4 . 1 0 3 3 2 ) K a t a o k a , T . , H o l l e r , N . , M i c h e a u , O . , M a r t i n o n , F . , T i n e l , A . , H o f m a n n , K . , a n d T s c h o p p , J . ( 2 0 0 1 ) B c l - r a m b o , a n o v e l B e l - 2 h o m o l o g u e t h a t i n d u c e s a p o p t o s i s v i a i t s u n i q u e C - t e r m i n a l e x t e n s i o n J . B i o l . C h e m . 2 7 6 , 1 9 5 4 8 - 1 9 5 5 4 . 3 3 ) H o l l e m a n , A . , d e n B o e r , M . L . , d e M e n e z e s , R . X . , C h e c k , M . H . , C h e n g , C . , K a z e m i e r , K . M . , J a n k a - S c h a u b , G . E . , G o b e l , U . , G r a u b n e r , U . B . , E v a n s , W . E . , a n d P i e t e r s , R . ( 2 0 0 6 ) T h e e x p r e s s i o n o f 7 0 a p o p t o s i s g e n e s i n r e l a t i o n t o l i n e a g e , g e n e t i c s u b t y p e , c e l l u l a r d r u g r e s i s t a n c e , a n d o u t c o m e i n c h i l d h o o d a c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a . B l o o d 1 0 7 , 7 6 9 - 7 7 6 3 4 ) T a k e u c h i , M . , H a t a , Y . , H i r a o , K . , T o y o d a , A . , I r i e , M . , a n d T a k a i , Y . ( 1 9 9 7 ) S A P A P s : a f a m i l y o f P S D - 9 5 / S A P 9 0 - a s s o c i a t e d p r o t e i n s l o c a l i z e d a t p o s t s y n a p t i c d e n s i t y . J . B i o l . C h e m . 2 7 2 , 1 1 9 4 3 - 1 1 9 5 1 . 3 5 ) H u , X . , a n d L a z a r , M . A . ( 2 0 0 0 ) T r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s i o n b y n u c l e a r h o r m o n e r e c e p t o r s . T r e n d s E n d o c r i n o l . M e t a b . 1 1 , 6 - 1 0 . 3 6 ) M a n g e l s d o r f , D . J . , a n d E v a n s R . M . ( 1 9 9 5 ) T h e R X R h e t e r o d i r n e r s a n d o r p h a n r e c e p t o r s . C e l l 8 3 , 8 4 1 - 8 5 0 . 3 7 a ) A l f a r o , J . M . , F r a i l e , B . , L o b o , M . V . , R o y u e l a , M . , P a n i a g u a , R . , a n d A r e n a s , M . I . ( 2 0 0 3 ) I m m u n o h i s t o c h e m i c a l d e t e c t i o n o f t h e r e t i n o i d X r e c e p t o r s ( 1 , B , a n d y i n h u m a n p r o s t a t e . J . A n d r o l . 2 4 , 1 1 3 - 1 1 9 . 3 7 b ) B r a b e n d e r , J . , D a n e n b e r g , K . D . , M e t z g e r , R . , S c h n e i d e r , P . M . , L o r d , R . V . , G r o s h e n , S . , T s a o - W e i , D . D . , P a r k , J . , S a l o n g a , D . , H o l s c h e r , A . H . , a n d D a n e n b e r g , P . V . ( 2 0 0 2 ) T h e r o l e o f r e t i n o i d X r e c e p t o r m e s s e n g e r R N A e x p r e s s i o n i n c u r a t i v e l y r e s e c t e d n o n - s m a l l c e l l l u n g c a n c e r . C l i n . C a n c e r R e s . 8 , 4 3 8 - 4 4 3 . 3 8 ) S j o b e r g , E . R . , K i t a g a w a , H . , G l u s h k a , J . , v a n H a l b e e k , H . , a n d P a u l s o n , J . C . ( 1 9 9 6 ) M o l e c u l a r c l o n i n g o f a d e v e l o p m e n t a l l y r e g u l a t e d N - a c e t y l g a l a c t o s a m i n e a l p h a 2 , 6 - s i a l y l t r a n s f e r a s e s p e c i fi c f o r s i a l y l a t e d g l y c o c o n j u g a t e s . J . B i o l . C h e m . 2 7 1 , 7 4 5 0 - 7 4 5 9 . 3 9 ) E n t r e z G e n e ; s e a r c h t e r m “ T m e m 1 0 4 . ” 4 0 ) C h e n , W . , L i , N . , C h e n , T . , H a n , Y . , L i , C . , W a n g , Y . , H e , W . , Z h a n g , L . , W a n , T . , a n d C a o , X . ( 2 0 0 5 ) T h e l y s o s o m e - a s s o c i a t e d a p o p t o s i s - i n d u c i n g p r o t e i n c o n t a i n i n g t h e p l e c k s t r i n h o m o l o g y ( P H ) a n d F Y V E d o m a i n s ( L A P F ) , r e p r e s e n t a t i v e o f a n o v e l f a m i l y o f P H a n d F Y V E d o m a i n - c o n t a i n i n g p r o t e i n s , i n d u c e s c a s p a s e - i n d e p e n d e n t a p o p t o s i s v i a t h e l y s o s o m a l - m i t o c h o n d r i a l p a t h w a y . J . B i o l . C h e m . 2 8 0 , 4 0 9 8 5 - 4 0 9 9 5 . 4 1 ) T i s s i r , F . , a n d G o f fi n e t , A . M . ( 2 0 0 6 ) E x p r e s s i o n o f p l a n a r c e l l p o l a r i t y g e n e s d u r i n g d e v e l o p m e n t o f t h e m o u s e C N S . E u r . J . N e u r o s c i . 2 3 , 5 9 7 - 6 0 7 . 1 0 4 4 2 ) K a t o h , M . , a n d K a t o h , M . ( 2 0 0 3 ) I d e n t i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f h u m a n P R I C K L E I a n d P R I C K L E Z g e n e s a s w e l l a s m o u s e P r i c k l e I a n d P r i c k l e Z g e n e s h o m o l o g o u s t o D r o s o p h i l a t i s s u e p o l a r i t y g e n e p r i c k l e . I n t . J . M o l . M e d . 1 1 , 2 4 9 - 2 5 6 . 4 3 ) S e i d e n s t i c k e r , M . J . , a n d B e h r e n s . J . ( 2 0 0 0 ) B i o c h e m i c a l i n t e r a c t i o n s i n t h e w n t p a t h w a y . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 1 4 9 5 , 1 6 8 - 1 8 2 . 4 4 a ) Z h a o , D . H . , H o n g , J . J . , G u o , S . Y . , Y a n g , R . L . , Y u a n , J . , W e n , C . Y . , Z h o u , K . Y . , a n d L i , C . J . ( 2 0 0 4 ) A b e r r a n t e x p r e s s i o n a n d f u n c t i o n o f T C F 4 i n t h e p r o l i f e r a t i o n o f h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a c e l l l i n e B E L - 7 4 0 2 . C e l l R e s . 1 4 , 7 4 - 8 0 . 4 4 b ) L i , C . Y . , W a n g , Y . , C u i , Z . S . , a n d W a n g , E . H . ( 2 0 0 5 ) E x p r e s s i o n o f T c e l l f a c t o r - 4 i n n o n - s m a l l - c e l l l u n g c a n c e r . C h i n . M e d . J ( E n g l ) . 1 1 8 , 1 3 6 - 1 4 0 . 4 5 ) S c h e f f n e r , M . , H u i b r e g t s e , J . M . , a n d H o w l e y , P . M . ( 1 9 9 4 ) I d e n t i fi c a t i o n o f a h u m a n u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n g e n z y m e t h a t m e d i a t e s t h e E 6 - A P - d e p e n d e n t u b i q u i t i n a t i o n o f p 5 3 . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 9 1 , 8 7 9 7 - 8 8 0 1 . 4 6 ) S c h e f f n e r , M . , H u i b r e g t s e , J . M . , a n d H o w l e y , P . M . ( 1 9 9 4 ) I d e n t i fi c a t i o n o f a h u m a n u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n g e n z y m e t h a t m e d i a t e s t h e E 6 - A P - d e p e n d e n t u b i q u i t i n a t i o n o f p 5 3 . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 9 1 , 8 7 9 7 - 8 8 0 1 . 4 7 ) K o h l e , C . , a n d B o c k , K . W . ( 2 0 0 7 ) C o o r d i n a t e r e g u l a t i o n o f P h a s e I a n d I I x e n o b i o t i c m e t a b o l i s m s b y t h e A h r e c e p t o r a n d N r f 2 . B i o c h e m P h a r m a c o l . 7 3 , 1 8 5 3 - 1 8 6 2 . 4 8 ) T a n a k a , M . , Y a r n a s a k i , N . , a n d I z u m o , S . ( 2 0 0 0 ) P h e n o t y p i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e m u r i n e k a 2 . 6 h o m e o b o x g e n e b y g e n e t a r g e t i n g . M o l . C e l l B i o l . 2 0 , 2 8 7 4 - 2 8 7 9 . 4 9 ) E n t r e z G e n e ; s e a r c h t e r m “ Z s c a n 2 2 . ” 5 0 ) M i t c h e l l , C . A . , S p e e d , C . J . , N i c h o l l , J . , a n d S u t h e r l a n d , G . R . ( 1 9 9 6 ) C h r o m o s o m a l m a p p i n g o f t h e g e n e ( I N P P S A ) e n c o d i n g t h e 4 3 - k D a m e m b r a n e - a s s o c i a t e d i n o s i t o l p o l y p h o s p h a t e 5 - p h o s p h a t a s e t o 1 0 q 2 6 . 3 b y fl u o r e s c e n c e i n s i t u h y b r i d i z a t i o n . G e n o m i c s 3 1 , 1 3 9 - 1 4 0 . 5 1 ) S p e e d , C . J . , L i t t l e , P . J . , H a y m a n , J . A . , a n d M i t c h e l l , C . A . ( 1 9 9 6 ) U n d e r e x p r e s s i o n o f t h e 4 3 k D a i n o s i t o l p o l y p h o s p h a t e 5 - p h o s p h a t a s e i s a s s o c i a t e d w i t h c e l l u l a r t r a n s f o r m a t i o n . E M B O J . 1 5 , 4 8 5 2 - 4 8 6 1 . 5 2 ) M o t i w a l a , T . , K u t a y , H . , G h o s h a l , K . , B a i , S . , S e i m i y a , H . , T s u r u o , T . , S u s t e r , S . , M o r r i s o n , C . , a n d J a c o b , S . T . ( 2 0 0 4 ) P r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e r e c e p t o r - t y p e O ( P T P R O ) e x h i b i t s c h a r a c t e r i s t i c s o f a c a n d i d a t e t u m o r s u p p r e s s o r i n h u m a n l u n g c a n c e r . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 1 0 1 , 1 3 8 4 4 - 1 3 8 4 9 . 5 3 a ) M a e k a w a , H . , O i k e , Y . , K a n d a , S . , I t o , Y . , Y a m a d a , Y . , K u r i h a r a , H . , N a g a i , R . , a n d S u d a , T . ( 2 0 0 3 ) E p h r i n - B 2 i n d u c e s m i g r a t i o n o f e n d o t h e l i a l c e l l s t h r o u g h t h e 1 0 5 p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 3 k i n a s e p a t h w a y a n d p r o m o t e s a n g i o g e n e s i s i n a d u l t v a s c u l a t u r e . A r t e r i o s c l e r . T h r o m b . V a s c . B i o l . 2 3 , 2 0 0 8 - 2 0 1 4 . 5 3 b ) G a l e , N . W . , H o l l a n d , S . J . , V a l e n z u e l a , D . M . , F l e n n i k e n , A . , P a n , L . , R y a n , T . E . , H e n k e m e y e r , M . , S t r e b h a r d t , K . , H i r a i , H . , W i l k i n s o n , D . G . , P a w s o n , T . , D a v i s , 8 . , a n d Y a n c o p o u l o s , G . D . ( 1 9 9 6 ) E p h r e c e p t o r s a n d l i g a n d s c o m p r i s e t w o m a j o r s p e c i fi c i t y s u b c l a s s e s a n d a r e r e c i p r o c a l l y c o m p a r t m e n t a l i z e d d u r i n g e m b r y o g e n e s i s . N e u r o n 1 7 , 9 - 1 9 . 5 3 c ) N a k a d a , M . , N i s k a , J . A . , M i y a m o r i , H . , M c D o n o u g h , W . 8 . , W u , J . , S a t o , H . , a n d B e r e n s , M . E . ( 2 0 0 4 ) T h e p h o s p h o r y l a t i o n o f E p h B 2 r e c e p t o r r e g u l a t e s m i g r a t i o n a n d i n v a s i o n o f h u m a n g l i o m a c e l l s . C a n c e r R e s . 9 , 3 1 7 9 - 3 1 8 5 . 5 4 ) S e i p e l , K . , M e d l e y , Q . G . , K e d e r s h a , N . L . , Z h a n g , X . A . , O ' B r i e n , S . P . , S e r r a - P a g e s , C . , H e m l e r , M . E . , a n d S t r e u l i , M . ( 1 9 9 9 ) T r i o a m i n o - t e r m i n a l g u a n i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e f a c t o r d o m a i n e x p r e s s i o n p r o m o t e s a c t i n c y t o s k e l e t o n r e o r g a n i z a t i o n , c e l l m i g r a t i o n a n d a n c h o r a g e - i n d e p e n d e n t c e l l g r o w t h . J . C e l l S c i . 1 1 2 ( P t 1 2 ) : 1 8 2 5 - 1 8 3 4 . 5 5 ) Y o s h i z u k a , N . , M o r i u c h i , R . , M o r i , T . , Y a m a d a , K . , H a s e g a w a , S . , M a e d a , T . , S h i m a d a , T . , Y a m a d a , Y . , K a m i h i r a , S . , T o m o n a g a , M . , a n d K a t a m i n e , S . ( 2 0 0 4 ) A n a l t e r n a t i v e t r a n s c r i p t d e r i v e d fi o m t h e T r i o l o c u s e n c o d e s a g u a n o s i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e f a c t o r w i t h m o u s e c e l l - t r a n s f o r m i n g p o t e n t i a l . J . B i o l . C h e m . 2 7 9 , 4 3 9 9 8 - 4 4 0 0 4 . 1 0 6 R E F E R E N C E S 2 : S e l e c t e d L i t e r a t u r e R e f e r e n c e s f o r t h e R e l a t i o n s h i p s D e p i c t e d i n F i g u r e 4 . T h e n u m b e r e d r e f e r e n c e s c o r r e s p o n d t o t h e r e d n u m b e r e d r e l a t i o n s h i p s n o t e d i n A p p e n d i x F i g u r e 1 0 . l ) R o b e r t s , A . B . , a n d W a k e fi e l d , L . M . ( 2 0 0 3 ) T h e t w o f a c e s o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r B i n c a r c i n o g e n e s i s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i U S A 1 0 0 , 8 6 2 1 - 8 6 2 3 . 2 ) O f t , M . , P e l i , J . , R u d a z , C . , S c h w a r z , H . , B e u g , H . , a n d R e i c h m a n n , B . ( 1 9 9 6 ) T G F - b e t a l a n d H a - R a s c o l l a b o r a t e i n m o d u l a t i n g t h e p h e n o t y p i c p l a s t i c i t y a n d i n v a s i v e n e s s o f e p i t h e l i a l t u m o r c e l l s . G e n e s D e v . 1 0 , 2 4 6 2 - 2 4 7 7 . 3 ) K a n g , Y . , a n d M a s s a g u é , J . ( 2 0 0 4 ) E p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n s : T w i s t i n d e v e l o p m e n t a n d m e t a s t a s i s . C e l l 1 1 8 , 2 7 7 - 2 7 9 . 4 ) W o l t h u i s , R . M . , a n d B o s , J . L . ( 1 9 9 9 ) R a s c a u g h t i n a n o t h e r a f f a i r : t h e e x c h a n g e f a c t o r s f o r R a l . C u r r . O p i n . G e n e t . D e v . 9 , 1 1 2 - 1 1 7 . 5 ) T h i e r y , J . P . ( 2 0 0 2 ) . E p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n s i n t u m o u r p r o g r e s s i o n . N a t . R e v . C a n c e r 2 , 4 4 2 - 4 5 4 . 6 ) G i l l e s , C . , P o l e t t e , M . , M e s t d a g t , M . , N a w r o c k i - R a b y , B . , R u g g e r i , P . , B i r e m b a u t , P . , a n d F o i d a r t , J . M . ( 2 0 0 3 ) T r a n s a c t i v a t i o n o f v i m e n t i n b y B - c a t e n i n i n h u m a n b r e a s t c a n c e r c e l l s . C a n c e r R e s . 6 3 , 2 6 5 8 - 2 6 6 4 . 7 ) Z h a n g , X . , G a s p a r d , J . P . , a n d C h u n g , D . C . ( 2 0 0 1 ) R e g u l a t i o n o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r b y t h e W n t a n d K - r a s p a t h w a y s i n c o l o n i c n e o p l a s i a . C a n c e r R e s . 6 1 , 6 0 5 0 - 4 . 8 ) S a a d e h , P . B . , M e h r a r a B . J . , S t e i n b r e c h D . S . , S p e c t o r J . A . , G r e e n w a l d , J . A . , C h i n , G . S . , U e n o , H . , G i t t e s , G . K . , a n d L o n g a k e r M . T . ( 2 0 0 0 ) M e c h a n i s m s o f fi b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r - 2 m o d u l a t i o n o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r e x p r e s s i o n b y o s t e o b l a s t i c c e l l s . E n d o c r i n o l o g y 1 4 1 , 2 0 7 5 - 2 0 8 3 . 9 ) K a t a d a , J . , M u r a r n a t s u , M . , H a y a s h i , I . , T s u t s u m i , M . , K o n i s h i , Y . , a n d M a j i m a , M . _ ( 2 0 0 2 ) S i g n i fi c a n c e o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l g r o w t h f a c t o r u p - r e g u l a t i o n m e d i a t e d v i a a c h y m a s e - a n g i o t e n s i n - d e p e n d e n t p a t h w a y d u r i n g a n g i o g e n e s i s i n h a m s t e r s p o n g e g r a n u l o m a s . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 3 0 2 , 9 4 9 - 9 5 6 . 1 0 ) M u r a r n a t s u , M . , K a t a d a , J . , H a y a s h i , I . , a n d M a j i m a , M . ( 2 0 0 0 ) C h y m a s e a s a p r o a n g i o g e n i c f a c t o r : a p o s s i b l e i n v o l v e m e n t o f c h y m a s e - a n g i o t e n s i n - d e p e n d e n t p a t h w a y i n t h e h a m s t e r s p o n g e a n g i o g e n e s i s m o d e l . J . B i o l . C h e m . 8 , 5 5 4 5 - 5 5 5 2 . 1 1 ) F e r r a r a , N . ( 2 0 0 2 ) V E G F a n d t h e q u e s t f o r t u m o u r a n g i o g e n e s i s f a c t o r s . N a t . R e v . C a n c e r . 2 , 7 9 5 - 8 0 3 . 1 0 7 1 2 ) M a e k a w a , H . , O i k e , Y . , K a n d a , S . , I t o , Y . , Y a m a d a , Y . , K u r i h a r a , H . , N a g a i , R . , a n d S u d a , T . ( 2 0 0 3 ) E p h r i n - B 2 i n d u c e s m i g r a t i o n o f e n d o t h e l i a l c e l l s t h r o u g h t h e p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 3 k i n a s e p a t h w a y a n d p r o m o t e s a n g i o g e n e s i s i n a d u l t v a s c u l a t u r e . A r t e r i o s c l e r . T h r o m b . V a s c . B i o l . 2 3 , 2 0 0 8 - 2 0 1 4 . 1 3 ) G a l e , N . W . , H o l l a n d , S . J . , V a l e n z u e l a , D . M . , F l e n n i k e n , A . , P a n , L . , R y a n , T . E . , H e n k e m e y e r , M . , S t r e b h a r d t , K . , H i r a i , H . , W i l k i n s o n , D . G . , P a w s o n , T . , D a v i s , 8 . , a n d Y a n c o p o u l o s , G . D . ( 1 9 9 6 ) E p h r e c e p t o r s a n d l i g a n d s c o m p r i s e t w o m a j o r s p e c i fi c i t y s u b c l a s s e s a n d a r e r e c i p r o c a l l y c o m p a r t m e n t a l i z e d d u r i n g e m b r y o g e n e s i s . N e u r o n 1 7 , 9 - l 9 . l 4 ) N a k a d a , M . , N i s k a , J . A . , M i y a m o r i , H . , M c D o n o u g h , W . 8 . , W u , J . , S a t o , H . , a n d B e r e n s , M . E . ( 2 0 0 4 ) T h e p h o s p h o r y l a t i o n o f E p h B 2 r e c e p t o r r e g u l a t e s m i g r a t i o n a n d i n v a s i o n o f h u m a n g l i o m a c e l l s . C a n c e r R e s . 9 , 3 1 7 9 - 3 1 8 5 . 1 5 ) Y o s h i z u k a , N . , M o r i u c h i , R . , M o r i , T . , Y a m a d a , K . , H a s e g a w a , S . , M a e d a , T . , S h i m a d a , T . , Y a m a d a , Y . , K a m i h i r a , S . , T o m o n a g a , M . , a n d K a t a m i n e , S . ( 2 0 0 4 ) A n a l t e r n a t i v e t r a n s c r i p t d e r i v e d f r o m t h e T r i o l o c u s e n c o d e s a g u a n o s i n e n u c l e o t i d e e x c h a n g e f a c t o r w i t h m o u s e c e l l - t r a n s f o r m i n g p o t e n t i a l . J . B i o l . C h e m . 2 7 9 , 4 3 9 9 8 - 4 4 0 0 4 . 7 1 6 ) v a n d e r H o r s t , E . H . , D e g e n h a r d t , Y . Y . , S t r e l o w , A . , S l a v i n , A . , C h i n n , L . , O r f , J . , R o n g , M . , L i , 8 . , S e e , L . H . , N g u y e n , K . Q . , H o e y , T . , W e s c h e , H . , a n d P o w e r s , S . ( 2 0 0 5 ) M e t a s t a t i c p r o p e r t i e s a n d g e n o m i c a m p l i fi c a t i o n o f t h e t y r o s i n e k i n a s e g e n e A C K I . P r o c . N a t l . A c a d S c i . U S A . 1 0 2 , 1 5 9 0 1 - 1 5 9 0 6 . 1 7 ) W a r d , Y . , W a n g , W . , W o o d h o u s e , E . , L i n n o i l a , 1 . , L i o t t a , L . , a n d K e l l y , K . ( 2 0 0 1 ) S i g n a l p a t h w a y s w h i c h p r o m o t e i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s : c r i t i c a l a n d d i s t i n c t c o n t r i b u t i o n s o f e x t r a c e l l u l a r s i g n a l - r e g u l a t e d k i n a s e a n d R a l - s p e c i fi c g u a n i n e e x c h a n g e f a c t o r p a t h w a y s . M o l . C e l l B i o l . 2 1 , 5 9 5 8 - 5 9 6 9 . 1 8 ) G o n z a l e z - G a r c i a , A . , P r i t c h a r d , C . A . , P a t e r s o n , H . F . , M a v r i a , G . , S t a m p , G . , a n d M a r s h a l l , C . J . ( 2 0 0 5 ) R a l G D S i s r e q u i r e d f o r t u m o r f o r m a t i o n i n a m o d e l o f s k i n c a r c i n o g e n e s i s . C a n c e r C e l l . 7 , 2 1 9 - 2 2 6 . 1 9 ) H u , C . - T . M . , T a n g - O x l e y , Q . , Q i u , W . R . , W a n g , Y . - P . , M i h i n d u k u l a s u r i y a , K . A . , A f s h a r , R . , a n d T a n , T . - H . ( 1 9 9 8 ) P r o t e i n p h o s p h a t a s e X i n t e r a c t s w i t h c - r e l a n d s t i m u l a t e s c - r e l / n u c l e a r f a c t o r K B a c t i v i t y . J . B i o l . C h e m . 2 7 3 , 3 3 5 6 1 - 3 3 5 6 5 . 2 0 ) L e e , S . K . , K i m , J . H . , L e e , Y . C . , C h e o n g , J . , a n d L e e , J . W . ( 2 0 0 0 ) S i l e n c i n g m e d i a t o r o f r e t i n o i c a c i d a n d t h y r o i d h o r m o n e r e c e p t o r s , a s a n o v e l t r a n s c r i p t i o n a l c o r e p r e s s o r m o l e c u l e o f a c t i v a t i n g p r o t e i n - 1 , n u c l e a r f a c t o r - K B , a n d s e r u m r e s p o n s e f a c t o r . J . B i o l . C h e m . 2 7 5 , 1 2 4 7 0 - 1 2 4 7 4 . 2 1 ) K a r a s h i m a , T . , S w e e n e y , P . , K a m a t , A . , H u a n g , 8 . , K i m , S . J . , B a r - E l i , M . , M c C o n k e y , D . J . , a n d D i n n e y , C . P . ( 2 0 0 3 ) N u c l e a r f a c t o r - K B m e d i a t e s a n g i o g e n e s i s 1 0 8 a n d m e t a s t a s i s o f h u m a n b l a d d e r c a n c e r t h r o u g h t h e r e g u l a t i o n o f i n t e r l e u k i n - 8 . C l i n . C a n c e r R e s . 9 , 2 7 8 6 - 2 7 9 7 . 2 2 ) L a w r e n c e , T . , H a g e m a n , T . , a n d B a l k w i l l , F . ( 2 0 0 7 ) S e x , c y t o k i n e s , a n d c a n c e r . S c i e n c e 3 1 7 , 5 1 - 5 2 . 1 0 9 C H A P T E R 2 P H E N O B A R B I T A L ( P B ) E L I C I T S U N I Q U E , E A R L Y C H A N G E S I N T H E E X P R E S S I O N O F H E P A T I C G E N E S T H A T A F F E C T C R I T I C A L P A T H W A Y S I N T U M O R - P R O N E B 6 C 3 F ] M I C E T h i s c h a p t e r r e p r e s e n t s a m a n u s c r i p t t h a t i s i n p r e s s f o r p u b l i c a t i o n ( a s o f M a r c h 2 0 0 9 ) i n T o x i c o l o g i c a l S c i e n c e s . T h e a u t h o r s a r e J e n n i f e r M . P h i l l i p s , L y l e D . B u r g o o n , a n d J a y I . G o o d m a n . 1 1 0 A B S T R A C T A t 2 a n d 4 w e e k s f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h P h e n o b a r b i t a l ( P B ) , t h e c l a s s i c a l n o n g e n o t o x i c r o d e n t l i v e r c a r c i n o g e n , w e e l u c i d a t e d u n i q u e g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s ( b o t h i n d u c t i o n a n d r e p r e s s i o n ) i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 . B a s e d o n t h e i r c a n c e r - r e l a t e d r o l e s , w e b e l i e v e t h a t a l t e r e d e x p r e s s i o n o f a t l e a s t s o m e o f t h e s e g e n e s m i g h t u n d e r l i e P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s . P u t a t i v e c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e ( C A R ) r e s p o n s e e l e m e n t s ( C A R E S ) , a s u b s e t o f P B r e s p o n s e e l e m e n t s , w e r e p r e s e n t w i t h i n m u l t i p l e g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n w a s u n i q u e l y a l t e r e d i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , s u g g e s t i n g a r o l e f o r C A R i n t h e i r r e g u l a t i o n . A d d i t i o n a l l y , 3 D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e g e n e s ( D n m t l , D n m t 3 a , a n d D n m t 3 b ) w e r e r e p r e s s e d u n i q u e l y i n t h e t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e , a n d a l l p o s s e s s p u t a t i v e C A R E S , p r o v i d i n g a p o t e n t i a l d i r e c t l i n k b e t w e e n P B a n d e x p r e s s i o n o f k e y g e n e s t h a t r e g u l a t e D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s . P r e v i o u s l y , w e d e m o n s t r a t e d t h a t P B e l i c i t e d u n i q u e r e g i o n s o f a l t e r e d m e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , a t 2 a n d 4 w e e k s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) , a n d a n n o t a t i o n o f t h e r e g i o n s h a r b o r i n g t h e s e c h a n g e s r e v e a l e d 5 1 g e n e s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) . T h i s i s e x t e n d e d b y t h e c u r r e n t s t u d y , w h i c h e m p l o y e d R N A i s o l a t e d f r o m t h e s a m e l i v e r t i s s u e u s e d i n t h e e a r l i e r i n v e s t i g a t i o n s . G e n e s e l u c i d a t e d f r o m b o t h t h e m e t h y l a t i o n a n d e x p r e s s i o n a n a l y s e s a r e i n v o l v e d i n i d e n t i c a l p r o c e s s e s / p a t h w a y s ( e . g . , c e l l c y c l e , a p o p t o s i s , a n g i o g e n e s i s , e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n ( E M T ) , i n v a s i o n / m e t a s t a s i s , a n d m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ( M A P K ) , t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - b e t a ( T G F - B ) , a n d W n t s i g n a l i n g ) . T h e r e f o r e , t h e s e c h a n g e s m i g h t r e p r e s e n t v e r y e a r l y e v e n t s t h a t d i r e c t l y 1 1 1 c o n t r i b u t e t o P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s . I t i s i n s t r u c t i v e t o c o n s i d e r t h e p o s s i b i l i t y t h a t , i n a h y p o t h e s i s - d r i v e n f a s h i o n , t h e s e g e n e s a r e i n i t i a l c a n d i d a t e s t h a t c o u l d b e u t i l i z e d t o d e v e l o p a b i o m a r k e r “ fi n g e r p r i n t ” o f e a r l y e x p o s u r e t o P B a n d P B - l i k e c o m p o u n d s . 1 1 2 I N T R O D U C T I O N T h e a c c u m u l a t i o n o f k e y h e r i t a b l e m o d i fi c a t i o n s , i n c l u d i n g e p i g e n e t i c a l t e r a t i o n s , e . g . , c h a n g e s i n D N A m e t h y l a t i o n ( E s t e l l e r , 2 0 0 7 ) w h i c h c a n p l a y a v a r i e t y o f r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 ) a n d b e i n v o l v e d i n t h e i n i t i a t i o n a s w e l l a s p r o m o t i o n s t a g e s ( G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) , a s w e l l a s m u t a t i o n s ( L o e b a n d H a r r i s , 2 0 0 8 ) , d r i v e s t h e p r o g r e s s i v e c l o n a l e x p a n s i o n s o f c e l l s d u r i n g t u m o r i g e n e s i s ( F e i n b e r g , 2 0 0 6 ; H a n a h a n a n d W e i n b e r g , 2 0 0 0 ) . W h i l e g e n o t o x i c c a r c i n o g e n s c a n i n t e r a c t d i r e c t l y w i t h D N A t o f o r m p r o m u t a g e n i c a d d u c t s , n o n g e n o t o x i c c o m p o u n d s c a u s e t u m o r i g e n e s i s b y o t h e r m e c h a n i s m s , i n c l u d i n g i n fl a m m a t i o n , i m m u n o s u p p r e s s i o n , r e c e p t o r a c t i v a t i o n , a n d e p i g e n e t i c c h a n g e s ( L u c h , 2 0 0 5 ) . P h e n o b a r b i t a l ( P B ) i s t h e c l a s s i c a l n o n g e n o t o x i c r o d e n t l i v e r c a r c i n o g e n ( W h y s n e r e t a l . , 1 9 9 6 ) , a n d u p o n t r e a t m e n t w i t h a p r o m o t i n g d o s e i n d r i n k i n g w a t e r ( 0 . 0 5 % , ( w / w ) ) f o r 1 2 m o n t h s , 1 0 0 % o f s u s c e p t i b l e C 3 H / H e a n d B 6 C 3 F 1 ( C 3 H / H e x C 5 7 B L / 6 ) m i c e d e v e l o p l i v e r t u m o r s , w h i l e t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e d e v e l o p n o n e a f t e r 1 8 m o n t h s ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) . T h e m e c h a n i s m ( s ) o f a c t i o n o f P B r e m a i n t o b e c o m p l e t e l y e l u c i d a t e d ; h o w e v e r , s o m e d e t a i l s h a v e e m e r g e d . C o n n e x i n 3 2 , t h e m a j o r h e p a t i c g a p j u n c t i o n - f o r m i n g p r o t e i n , i s e s s e n t i a l f o r P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s ( M o e n n i k e s e t a l . , 2 0 0 0 ) , a n d m o r e o v e r , P B i n h i b i t s g a p j u n c t i o n i n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n i n h e p a t o c y t e s fi ' o m s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 m i c e b u t n o t t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 ( W a r n e r e t a l . , 2 0 0 3 ) . F u r t h e r m o r e , m u l t i p l e e v e n t s a p p e a r t o b e l i n k e d t o P B - a s s o c i a t e d m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s : m u t a t i o n s i n B - c a t e n i n ( A y d i n l i k e t a l . , 2 0 0 1 ) , H a - r a s h y p o m e t h y l a t i o n ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) , i n c r e a s e d H a - r a s e x p r e s s i o n ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 7 ) , K i - r a s h y p o m e t h y l a t i o n ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) , h y p o m e t h y l a t i o n a n d i n c r e a s e d 1 1 3 e x p r e s s i o n o f r a f ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) , a n d a m p l i fi c a t i o n o f c - m y c ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) C h a n g e s i n D N A m e t h y l a t i o n h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n t h e a b i l i t y o f P B t o p r o m o t e t u m o r i g e n e s i s . P B t r e a t m e n t r e s u l t e d i n h i g h e r l e v e l s o f r e g i o n a l h y p e r m e t h y l a t i o n i n 2 t u m o r - p r o n e g r o u p s ( C 3 H / H e > > B 6 C 3 F l ) v . t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 ( W a t s o n a n d G o o d m a n , 2 0 0 2 ) , a s w e l l a s a g r e a t e r d e c r e a s e i n g l o b a l m e t h y l a t i o n l e v e l s i n B 6 C 3 F 1 v . C 5 7 B L / 6 m i c e ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ) . F u r t h e r m o r e , P B - e l i c i t e d u n i q u e r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M S ) , r e p r e s e n t i n g b o t h i n c r e a s e s a n d d e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n l e v e l s , w e r e d i s c e r n e d i n B 6 C 3 F 1 v . C 5 7 B L / 6 m i c e a t 2 - a n d 4 - w e e k s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . C l o n i n g a n d a n n o t a t i o n o f t h e s e R A M s r e s u l t e d i n t h e i d e n t i fi c a t i o n o f 5 1 g e n e s , m a n y o f w h i c h p a r t i c i p a t e i n c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s , w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n t h e s u s c e p t i b l e m i c e ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) . T h e s e d a t a s u p p o r t t h e n o t i o n t h a t t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f P B i n v o l v e s a l t e r a t i o n o f D N A m e t h y l a t i o n i n k e y g e n e s w h i c h c a n f a c i l i t a t e t u m o r f o r m a t i o n . T h e c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) m e d i a t e s t h e a c t i o n s o f P B , i n c l u d i n g i n d u c t i o n o f x e n o b i o t i c - m e t a b o l i z i n g e n z y m e s a n d h e p a t o m e g a l y ( W e i e t a l . , 2 0 0 0 ) . M i c r o a r r a y a n a l y s i s o f C A R w i l d t y p e ( W T ) a n d k n o c k o u t ( K O ) m i c e r e v e a l e d C A R - d e p e n d e n t r e g u l a t i o n o f a p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e 1 3 8 g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s ( o u t o f 8 , 7 3 6 t o t a l g e n e s / E S T s ) t h a t P B e l i c i t e d ( U e d a e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h e r e f o r e , n o t a l l o f t h e e f f e c t s o f P B a r e C A R - d e p e n d e n t . C h r o n i c P B t r e a t m e n t c u l m i n a t e s i n l i v e r t u m o r d e v e l o p m e n t ( H u a n g e t a l . , 2 0 0 5 ) a n d i m p o r t a n t l y , C A R i s n e c e s s a r y f o r t u m o r p r o m o t i o n b y P B i n d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) - i n i t i a t e d C 3 H / H e m i c e ( Y a m a m o t o e t a l . , 1 1 4 2 0 0 4 ) . P h i l l i p s e t a l . ( 2 0 0 7 ) d i s c e r n e d P B - i n d u c e d u n i q u e D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e C A R W T ( b o t h p r e c a n c e r o u s a n d l i v e r t u m o r t i s s u e ) , a s c o m p a r e d t o P B - t r e a t e d r e s i s t a n t C A R K O m i c e . A n n o t a t i o n o f t h e s e u n i q u e R A M s u n c o v e r e d m u l t i p l e g e n e s t h a t c o n c e i v a b l y fi m c t i o n i n c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s , r a i s i n g t h e p o s s i b i l i t y t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e C A R - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n c o n t r i b u t e t o P B - i n d u c e d h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 ) . W e h y p o t h e s i z e d t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e c h a n g e s i n h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n t h a t o c c u r u n i q u e l y i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e v . t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , f o l l o w i n g b o t h 2 a n d 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t , c o n t r i b u t e d i r e c t l y t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . I n t h e c u r r e n t s t u d y , b o t h m i c r o a r r a y a n d q u a n t i t a t i v e r e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) a n a l y s e s w e r e u t i l i z e d t o d i s c e r n t h e a f o r e m e n t i o n e d u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e s , i n c l u d i n g t h o s e o f a s u b s e t o f g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s i n t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) , p l u s 3 D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) g e n e s , a t v e r y e a r l y t i m e p o i n t s ( i . e . 2 a n d 4 w e e k s ) . A d d i t i o n a l l y , C A R r e s p o n s e e l e m e n t s ( C A R E s ) , w h i c h a r e a s u b s e t o f P B r e s p o n s e e l e m e n t s , w e r e l o c a t e d w i t h i n m u l t i p l e g e n e s t h a t e x h i b i t e d u n i q u e B 6 C 3 F ] e x p r e s s i o n a n d / o r m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n r e s p o n s e t o P B . F u r t h e r m o r e , w e a s c e r t a i n e d s i g n a l i n g p a t h w a y s a n d p r o c e s s e s t h a t t h e d i s t i n c t i v e l y a f f e c t e d g e n e s m i g h t i n fl u e n c e . O v e r a l l , t h e s e r e s u l t s p r o v i d e s u p p o r t f o r t h e n o t i o n t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n w a s u n i q u e l y a l t e r e d i n s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , m i g h t b e m e c h a n i s t i c a l l y c r u c i a l f o r t u m o r d e v e l o p m e n t , t h u s e n h a n c i n g o u r u n d e r s t a n d i n g o f h o w P B p r o m o t e s h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . 1 1 5 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S A n i m a l s , T r e a t m e n t s a n d T i s s u e S a m p l e s A s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , a n i m a l s w e r e t r e a t e d , l i v e r t i s s u e w a s h a r v e s t e d , a n d R N A w a s i s o l a t e d ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . B r i e fl y , B 6 C 3 F ] ( C 5 7 B L / 6 x C 3 H / H e ) a n d C 5 7 B L / 6 m i c e ( a g e s 2 9 - 3 2 d a y s ) w e r e a d m i n i s t e r e d P B i n d r i n k i n g w a t e r a t a c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 0 5 % ( w / w ) , a d o s e w h i c h w i l l c a u s e l i v e r t u m o r s i n 1 0 0 % o f t h e t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e w i t h i n 1 2 m o n t h s , w h i l e n o l i v e r t u m o r s a r e o b s e r v e d i n t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e a f t e r 1 8 m o n t h s o f t r e a t m e n t ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) , f o r 2 o r 4 w e e k s . L i v e r t i s s u e w a s h a r v e s t e d f r o m a t o t a l o f 8 g r o u p s ( n = 6 p e r g r o u p ) : B 6 C 3 F 1 , 2 - a n d 4 - w e e k , c o n t r o l a n d P B - t r e a t e d , a n d C 5 7 B L / 6 , 2 - a n d 4 - w e e k , c o n t r o l a n d P B - t r e a t e d . R N A w a s i s o l a t e d f r o m s a m p l e s o f t h e s a m e l i v e r s e m p l o y e d i n o u r e a r l i e r s t u d y a i m e d a t i d e n t i f y i n g P B - i n d u c e d R A M S ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) , a n d s t o r e d a t - 8 0 ° C u n t i l i t s u s e i n t h e c u r r e n t s t u d y . R N A P r e p a r a t i o n U p o n r e m o v a l f r o m - 8 0 ° C , R N A s a m p l e s w e r e p u r i fi e d w i t h t h e Q i a g e n R N e a s y M i n i K i t ( Q i a g e n , V a l e n c i a , C A ) a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l . S a m p l e s w e r e e l u t e d i n d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e ( D E P C ) - t r e a t e d w a t e r , a n d R N A i n t e g r i t y w a s e v a l u a t e d o n t h e A g i l e n t 2 1 0 0 B i o a n a l y z e r u s i n g 5 n g s a m p l e a l i q u o t s a n d t h e R N A 6 0 0 0 P i c o L a b - o n - a - C h i p ( A g i l e n t T e c h n o l o g i e s , S a n t a C l a r a , C A ) . T h e p r e s e n c e o f 2 d i s t i n c t p e a k s , r e p r e s e n t i n g 1 8 8 a n d 2 8 S r R N A l e v e l s , w e r e i n d i c a t i v e o f h i g h q u a l i t y s a m p l e s . T h e p u r i t y ( A 2 6 0 / A 2 8 O r a t i o s ) a n d c o n c e n t r a t i o n s o f t h e R N A s a m p l e s w e r e d e t e r m i n e d v i a t h e N a n o D r O p T M 8 0 0 0 s p e c t r o p h o t o m e t e r ( T h e n n o S c i e n t i fi c , W i l m i n g t o n , D E ) . 1 1 6 M i c r o a r r a y A n a l y s i s A l l p r o c e d u r e s w e r e p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o s t a n d a r d p r o t o c o l s f o u n d w i t h i n t h e A f f y m e t r i x G e n e c h i p ® E x p r e s s i o n A n a l y s i s T e c h n i c a l M a n u a l ( A f f y m e t r i x , S a n t a C l a r a , C A ) . R N A L a b e l i n g a n d F r a g m e n t a t i o n T h e O n e - C y c l e T a r g e t L a b e l i n g a n d C o n t r o l R e a g e n t k i t ( A f f y m e t r i x , S a n t a C l a r a , C A ) w a s u t i l i z e d f o r fi r s t - a n d s e c o n d - s t r a n d c D N A s y n t h e s i s p l u s d o u b l e - s t r a n d e d c D N A s a m p l e c l e a n u p , a n d s y n t h e s i s p l u s c l e a n u p o f b i o t i n - l a b e l e d c R N A , o f 4 8 s a m p l e s ( n = 6 , f o r 8 g r o u p s ) . T o s t a r t , 1 u g o f t o t a l R N A w a s u s e d f o r t h e g e n e r a t i o n o f d o u b l e - s t r a n d e d c D N A , w h i c h w a s t h e n u s e d a s a t e m p l a t e f o r t h e s y n t h e s i s o f b i o t i n y l a t e d c R N A . T h e s i z e d i s t r i b u t i o n a n d y i e l d o f t h e l a b e l e d c R N A p r o d u c t s w e r e e v a l u a t e d o n t h e A g i l e n t 2 1 0 0 B i o a n a l y z e r u s i n g 5 n g s a m p l e a l i q u o t s a n d t h e R N A 6 0 0 0 P i c o L a b - o n - a - C h i p ( A g i l e n t T e c h n o l o g i e s , S a n t a C l a r a , C A ) . S u b s e q u e n t l y , 1 5 p g o f l a b e l e d c R N A w a s fi ' a g m e n t e d t o a r a n g e o f 3 5 - 2 0 0 b p i n a 4 0 u l v o l u m e r e a c t i o n ( 4 0 m M T r i s - a c e t a t e a t p H 8 . 1 , l O O m M p o t a s s i u m a c e t a t e , a n d 3 0 m M m a g n e s i u m a c e t a t e ) a t 9 4 ° C f o r 3 5 m i n . T h e s i z e d i s t r i b u t i o n o f t h e f r a g m e n t e d c R N A w a s a s s e s s e d o n t h e A g i l e n t 2 1 0 0 B i o a n a l y z e r u s i n g 5 n g s a m p l e a l i q u o t s a n d t h e R N A 6 0 0 0 P i c o L a b - o n - a - C h i p ( A g i l e n t T e c h n o l o g i e s , S a n t a C l a r a , C A ) . H y b r i d i z a t i o n , W a s h i n g , S t a i n i n g , a n d S c a n n i n g 1 1 7 F i f t e e n u g o f f r a g m e n t e d c R N A w a s h y b r i d i z e d t o a G e n e C h i p ® M o u s e G e n o m e 4 3 0 2 . 0 A r r a y ( A f f y m e t r i x , S a n t a C l a r a , C A ) , c o n t a i n i n g m o r e t h a n 4 5 , 0 0 0 p r o b e s e t s r e p r e s e n t i n g o v e r 3 4 , 0 0 0 g e n e s . T h e i n s t r u m e n t a t i o n u t i l i z e d f o r t h e w a s h i n g a n d s c a n n i n g o f t h e c h i p s i s o p e r a t e d b y t h e G e n e C h i p ® O p e r a t i n g S o f t w a r e ( G C O S , A f f y m e t r i x , S a n t a C l a r a , C A ) , v e r s i o n 3 . 1 . A f t e r h y b r i d i z a t i o n c o c k t a i l s w e r e r e m o v e d , a r r a y s w e r e w a s h e d a n d s t a i n e d o n a n A f f y m e t r i x F l u i d i c s 4 5 0 s t a t i o n , a n d s u b s e q u e n t l y s c a n n e d u s i n g t h e A f f y m e t r i x G e n e C h i p ® S c a n n e r 3 0 0 0 7 G , i n o r d e r t o d e t e c t h y b r i d i z a t i o n s i g n a l s . F r o m t h e r e s u l t i n g i m a g e fi l e s ( D A T fi l e ) , G C O S c o m p u t e s c e l l i n t e n s i t y d a t a ( C E L fi l e ) , w h i c h i s f u r t h e r a n a l y z e d t o d e t e r m i n e d i f f e r e n t i a l g e n e e x p r e s s i o n p a t t e r n s . D a t a A n a l y s i s D a t a f r o m A f f y m e t r i x G e n e C h i p C E L fi l e s w e r e n o r m a l i z e d u s i n g G C R o b u s t M u l t i - a r r a y A v e r a g e ( G C R M A ) ( W u e t a l . , 2 0 0 4 ) . B o x p l o t s a n d P r i n c i p a l C o m p o n e n t s A n a l y s i s ( P C A ) w e r e e m p l o y e d t o a s s e s s d a t a q u a l i t y . L i n e a r m o d e l s w e r e b u i l t a n d c o n t r a s t e s t i m a t e s w e r e p e r f o r m e d , c o m p a r i n g t r e a t m e n t t o t i m e - m a t c h e d c o n t r o l s a m p l e s , u s i n g L i m m a . A n e m p i r i c a l B a y e s m e t h o d w a s u s e d t o c a l c u l a t e f a l s e d i s c o v e r y r a t e c o n t r o l l e d p - v a l u e s o n t h e c o n t r a s t e s t i m a t e s f r o m L i r n m a . A C D F fi l e e s t a b l i s h e d b y D a i e t a l . ( 2 0 0 5 ) , c o n t a i n i n g m o r e a c c u r a t e g e n e / t r a n s c r i p t d e fi n i t i o n s ( a s c o m p a r e d t o t h o s e f r o m A fi y m e t r i x ) b a s e d o n u p - t o - d a t e E n t r e z G e n e i n f o r m a t i o n , w a s u t i l i z e d ( M o u s e 4 3 0 , v e r s i o n 9 . 0 , f r o m ( h t t p : / / b r a i n a r r a y . m b n i . m e d . u m i c h . e d u / B r a i n a r r a y / D a t a b a s e / C u s t o m C D F / C D F _ d o w n l o a d _ v 9 . a s p ) . B a s e d u p o n t h e s e n e w p r o b e s e t d e fi n i t i o n s , d a t a w a s g e n e r a t e d f o r 1 6 , 4 7 5 1 1 8 g e n e s ( a s c o m p a r e d t o m o r e t h a n 4 5 , 0 0 0 f e a t u r e s r e p r e s e n t i n g o v e r 3 4 , 0 0 0 g e n e s , a s i n d i c a t e d b y A fi y m e t r i x ) . A l l s t a t i s t i c a l a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d i n R ( v 2 . 6 . 1 ) u s i n g B i o c o n d u c t o r ( 2 . 1 ) . I d e n t i fi c a t i o n o f U n i q u e l y A c t i v e G e n e s i n L i v e r T u m o r - P r o n e B 6 C 3 F ] M i c e , a s C o m p a r e d t o t h e R e l a t i v e l y R e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 D i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d , i . e . a c t i v e , g e n e s i n P B - t r e a t e d v . c o n t r o l g r o u p s w e r e i d e n t i fi e d b a s e d o n m e e t i n g t w o c r i t e r i a : 1 ) s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e , p < 0 . 0 1 , a n d 2 ) a _ > _ 2 - f o l d c h a n g e i n e x p r e s s i o n ( u p - o r d o w n - r e g u l a t e d ) . U n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] g r o u p s , a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 , w e r e t h e n d i s c e r n e d . A t 2 w e e k s , a n d s e p a r a t e l y , a t 4 w e e k s , a c t i v e g e n e s i n t h e B 6 C 3 F l a n d C 5 7 B L / 6 g r o u p s w e r e c o m p a r e d t o o n e a n o t h e r . C o m m o n g e n e s o b s e r v e d i n b o t h t h e B 6 C 3 F ] a n d C 5 7 B L / 6 g r o u p s , a t 2 o r 4 w e e k s , w h i c h e x h i b i t e d e x p r e s s i o n c h a n g e s i n t h e s a m e d i r e c t i o n ( i . e . i n d u c e d o r r e p r e s s e d i n b o t h ) w e r e n o t g i v e n f u r t h e r c o n s i d e r a t i o n . T h u s , u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o C 5 7 B L / 6 , a t 2 o r 4 w e e k s , i n c l u d e d : 1 ) c o m m o n a c t i v e g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n c h a n g e s w e r e o p p o s i t e ( e . g . , i n d u c t i o n i n t h e B 6 C 3 F l a n d r e p r e s s i o n i n t h e C 5 7 B L / 6 ) , a n d 2 ) g e n e s w h i c h w e r e a c t i v e o n l y i n t h e B 6 C 3 F 1 . I n a n a n a l o g o u s m a n n e r , u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n t h e C 5 7 B L / 6 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e B 6 C 3 F l , a t 2 a n d 4 w e e k s , w e r e e l u c i d a t e d . U n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s w e r e c o m p a r e d , i n o r d e r t o a s c e r t a i n g e n e s t h a t w e r e a c t i v e o n l y a t 2 w e e k s , o n l y a t 4 w e e k s , a n d t h o s e w h i c h “ c a r r i e d f o r w a r , ” i . e . , e x p r e s s i o n c h a n g e d i n t h e s a m e d i r e c t i o n a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s . 1 1 9 Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( g R T - P C R ) A n g y s i s E x p r e s s i o n l e v e l s o f 3 g r o u p s o f g e n e s w e r e e v a l u a t e d b y q R T - P C R : 1 ) a s u b s e t o f g e n e s w h i c h w e r e u n i q u e l y a c t i v e , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s , i n t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 ( a l l 1 8 g e n e s l i s t e d i n T a b l e 2 . 4 ) a n d / o r 4 ( a l l 1 1 g e n e s l i s t e d i n T a b l e 2 . 5 ) w e e k s o f P B t r e a t m e n t ; 2 ) a s u b s e t o f g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 ( 2 g e n e s l i s t e d i n T a b l e 2 . 9 ) a n d / o r 4 ( 1 7 g e n e s l i s t e d i n T a b l e 2 . 9 ) w e e k s , a s d i s c e r n e d b y P h i l l i p s a n d G o o d m a n ( 2 0 0 8 ) ; a n d 3 ) 3 D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D m n t ) g e n e s ( D n m t I , D n m t 3 a , D n m t 3 b ) a t 2 a n d 4 w e e k s . T h e g e n e s i n g r o u p 1 a n d 3 , a b o v e , w e r e c h o s e n f o r a n a l y s i s b a s e d o n t h e i r i n t e r e s t i n g , p o t e n t i a l l y c a n c e r - r e l a t e d , d o c u m e n t e d f u n c t i o n s , a n d t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e y a f f e c t p e r t i n e n t s i g n a l i n g p a t h w a y s ( e . g . , t h e 3 g e n e s f r o m G r o u p 3 a r e i n v o l v e d i n m a i n t a i n i n g D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s ) . T h e g e n e s i n G r o u p 2 a l s o c a n i n fl u e n c e k e y p a t h w a y s , a n d m a n y w e r e s e l e c t e d b e c a u s e t h e y e x h i b i t e d u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s i n b o t h t h e l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] a n d C A R W T m i c e ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 ) . R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n o f R N A R N A , f r o m t h e s a m e s a m p l e s u s e d f o r m i c r o a r r a y a n a l y s i s , w a s t r e a t e d w i t h a m p l i fi c a t i o n g r a d e D N A s e I e n z y m e ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A ) t o e l i m i n a t e c o n t a m i n a t i n g g e n o m i c D N A . E a c h r e a c t i o n , c o n t a i n i n g 1 u g o f R N A , 1 0 X D N a s e I R e a c t i o n B u f f e r , 2 U D N a s e I , a n d D E P C - t r e a t e d w a t e r ( A m b i o n I n c . , A u s t i n , T X ) u p t o 1 0 p l , w a s i n c u b a t e d f o r 1 5 m i n . a t r o o m t e m p e r a t u r e . D N A s e I w a s i n a c t i v a t e d b y a d d i n g 1 u l o f 2 5 m M E D T A s o l u t i o n a n d s u b s e q u e n t l y h e a t i n g t h e r e a c t i o n s f o r 1 0 m i n . 1 2 0 a t 6 5 ° C . R e v e r s e t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n s c o n t a i n i n g D N A s e I - t r e a t e d R N A w e r e p r e p a r e d w i t h r e a g e n t s f r o m t h e H i g h C a p a c i t y c D N A R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n K i t ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A ) . E a c h r e a c t i o n c o n t a i n e d 1 u g R N A , 1 0 X r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n b u f f e r , 2 5 X d N T P m i x ( 1 0 0 m M ) , 1 0 X r a n d o m p r i m e r s , 5 0 U M u l t i S c r i b e T M r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e , a n d R N A s e - f r e e w a t e r , u p t o 2 0 t o t a l u l . R e a c t i o n s w e r e i n c u b a t e d a t 2 5 ° C f o r 1 0 m i n . , 3 7 ° C f o r 1 2 0 m i n . , a n d 8 5 ° C f o r 5 3 . A l l s a m p l e s w e r e s t o r e d a t 4 ° C u n t i l n e e d e d . P r i m e r s f o r q R T - P C R P r i m e r s w e r e d e s i g n e d u s i n g t h e w e b - b a s e d P r i m e r 3 p r o g r a m , v . 0 . 4 . 0 ( h t t p : / / fi ’ o d o . w i . m i t . e d u / p r i m e r 3 / i n p u t . h t m ) a n d s y n t h e s i z e d b y t h e M a c r o m o l e c u l a r S t r u c t u r e F a c i l i t y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . T h e s i z e s o f t h e a m p l i c o n s r a n g e d f r o m 1 0 0 - 1 4 0 b p a n d t h e p r i m e r s w e r e 2 0 m e r s ; a l l o t h e r p a r a m e t e r s ( e . g . , m e l t i n g t e m p e r a t u r e ) r e m a i n e d o n t h e d e f a u l t s e t t i n g s . T h e m a j o r i t y o f p r i m e r s w e r e d e s i g n e d s u c h t h a t t h e a m p l i c o n s p a n n e d a n i n t r o n - e x o n j u n c t i o n n e a r t h e 3 ’ e n d o f t h e g e n e o f i n t e r e s t . T h i s w a s c o n fi r m e d u s i n g G e n B a n k s e q u e n c e i n f o r m a t i o n , a n d a l s o , i n m o s t i n s t a n c e s , t h e U C S C I n - S i l i c o P C R w e b - b a s e d t o o l ( J u l y 2 0 0 7 b u i l d , h t t p : / / g e n o m e . u c s c . e d u / c g i - b i n / t h c r ? c o m m a n d = s t a r t ) . T h i s w a s d o n e s o a s t o p r e c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e e x p r e s s i o n d a t a c o u l d b e a t t r i b u t e d t o c o n t a m i n a t i o n w i t h g e n o m i c D N A . F u r t h e r m o r e , w e a r e a t t e m p t i n g t o n o t s i m p l y c o n fi r m t h e m i c r o a r r a y d a t a b u t a r e e x t e n d i n g t h i s t o e v a l u a t e p r o p e r s p l i c i n g , i . e . t h i s r e p r e s e n t s a s t r i n g e n t a t t e m p t t o e v a l u a t e c h a n g e s i n e x p r e s s i o n o f f u n c t i o n a l m R N A s . N a m e s a n d s y m b o l s , a c c e s s i o n n u m b e r s , a n d f o r w a r d a n d r e v e r s e p r i m e r s e q u e n c e s o f g e n e s c h o s e n f o r q R T - P C R a n a l y s i s , p l u s a m p l i c o n 1 2 1 s i z e s , a r e l i s t e d i n S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S l A ( s e l e c t e d g e n e s t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n B 6 C 3 F 1 m i c e , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s ) a n d 8 1 B ( s e l e c t e d g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s , p l u s 3 D n m t s ) i n t h e a c c e p t e d m a n u s c r i p t . q R T - P C R A s s a y s R e a c t i o n s w e r e p r e p a r e d w i t h P o w e r S Y B R ® G r e e n P C R M a s t e r M i x ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A ) , a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l , w i t h e a c h r e a c t i o n c o n t a i n i n g 1 u l o f c D N A f r o m t h e a f o r e m e n t i o n e d r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n ( w i t h t h e e x c e p t i o n o f 1 8 8 r e a c t i o n s , w h i c h c o n t a i n e d 1 u l o f 1 : 1 0 0 d i l u t e d c D N A ) , 1 X P o w e r S Y B R ® G r e e n P C R M a s t e r M i x , 0 . 3 u M o f b o t h t h e f o r w a r d a n d r e v e r s e p r i m e r s ( w i t h t h e e x c e p t i o n o f D n m t 3 b , 0 . 1 u M ) , a n d D E P C - t r e a t e d w a t e r ( A m b i o n I n c . , A u s t i n , T X ) u p t o 5 0 u l . P C R a m p l i fi c a t i o n o f d u p l i c a t e r e a c t i o n s w a s c o n d u c t e d i n M i c r o A m p T M 9 6 - w e l l O p t i c a l P l a t e s ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A ) u s i n g t h e A p p l i e d B i o s y s t e m s 7 5 0 0 R e a l - T i m e P C R S y s t e m , w i t h t h e f o l l o w i n g t h e r m a l c y c l i n g c o n d i t i o n s : 5 0 ° C f o r 2 m i n . , 9 5 ° C f o r 1 0 m i n . , a n d 4 0 c y c l e s o f 9 5 ° C f o r 1 5 5 p l u s 6 0 ° C f o r l m i n . A d i s s o c i a t i o n p r o t o c o l w a s r u n f o r e a c h p r i m e r p a i r t o e n s u r e t h a t a s i n g l e p r o d u c t f o r m e d , a n d a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f a m p l i fi e d p r o d u c t s w a s p e r f o r m e d t o v e r i f y a m p l i c o n s i z e . B e f o r e s a m p l e s w e r e a n a l y z e d , s t a n d a r d c u r v e s f o r e a c h g e n e w e r e g e n e r a t e d f r o m p u r i fi e d a m p l i c o n s . S t a n d a r d c u r v e s a m p l e s ( s p a n n i n g 1 0 2 t o 1 0 8 c o p i e s ) f o r a p a r t i c u l a r g e n e w e r e i n c l u d e d o n t h e a p p r o p r i a t e s a m p l e p l a t e s o t h a t t h e a b s o l u t e q u a n t i t a t i o n m e t h o d , w h i c h c o m p a r e s t h e t h r e s h o l d c y c l e o f a n u n k n o w n s a m p l e a g a i n s t a s t a n d a r d c u r v e w i t h k n o w n c o p y n u m b e r s , c o u l d b e u s e d t o d e t e r m i n e m R N A e x p r e s s i o n 1 2 2 l e v e l s . T h e c o p y n u m b e r o f t h e g e n e o f i n t e r e s t f o r e a c h s a m p l e w a s s t a n d a r d i z e d t o t h a t o f t h e 1 8 S r R N A g e n e t o c o n t r o l f o r d i f f e r e n c e s i n R N A q u a n t i t y , q u a l i t y , a n d r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n e f fi c i e n c y . F i n a l l y , f o l d c h a n g e s i n t h e t r e a t m e n t g r o u p s ( v . t h e i r t i m e - m a t c h e d c o n t r o l s ) w e r e c a l c u l a t e d . S t a t i s t i c a l o u t l i e r s w e r e e x c l u d e d fi o m t h e fi n a l c a l c u l a t i o n s f o l l o w i n g t h e i r i d e n t i fi c a t i o n b y t h e G r u b b s ’ t e s t ( p < 0 . 0 5 , h t t p : / / w w w . g r a p h p a d . c o m / q u i c k c a l c s / G r u b b s 1 . c f r n ) . S i g n i fi c a n c e w a s d e t e r m i n e d b y a S t u d e n t ’ s t - t e s t ( p < 0 . 0 5 ) . C h a n g e s i n G e n e E x p r e s s i o n i n t h e B 6 C 3 F ] v . C 5 7 B L / 6 U n i q u e : B a s e d o n q R T - P C R a n a l y s i s , w h e r e t h e r e i s a s t a t i s t i c a l d i f f e r e n c e ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) o r t h e c h a n g e i s i n a n o p p o s i t e d i r e c t i o n . C o n fi r m e d : M i c r o a r r a y d a t a w h i c h a r e c o n fi r m e d b a s e d o n q R T - P C R , w h e r e t h e c h a n g e i s u n i q u e . A p p a r e n t l y C o n fi r m e d : C i r c u m s t a n c e s , b a s e d o n q R T - P C R a n a l y s i s , w h e r e d a t a f r o m a t l e a s t 3 o f t h e 6 s a m p l e s f e l l o u t s i d e t h e 9 5 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l ( C I ) o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a w e r e c o n s i d e r e d a n ‘ i n d i c a t i o n o f a c h a n g e ’ a n d t h u s , a p p a r e n t l y c o n fi r m i n g t h e r r r i c r o a r r a y d a t a . F u n c t i o n a l A n m s i s o f U n i g u e l y A c t i v e B 6 C 3 F ] G e n e s a t 2 a n d 4 W e e k s o f P B T r e a t m e n t T h e P a t h w a y S t u d i o ® 5 . 0 ( A r i a d n e G e n o m i c s , R o c k v i l l e , 1 W D ) i n f o r m a t i c s p r o g r a m w a s u t i l i z e d t o e l u c i d a t e f u n c t i o n s o f u n i q u e l y a c t i v e g e n e s . A d d i t i o n a l l y , t h e p r o g r a m d i s c e r n e d c o n n e c t i o n s b e t w e e n m u l t i p l e g e n e s , a n d l i n k e d t h e m t o k e y c e l l u l a r 1 2 3 p r o c e s s e s a n d p a t h w a y s . T h e D a t a b a s e f o r A n n o t a t i o n , V i s u a l i z a t i o n a n d I n t e g r a t e d D i s c o v e r y ( D A V I D ) , v e r s i o n 6 ( D e n n i s e t a l . , 2 0 0 3 ; h t t p : / / d a v i d . a b c c . n c i f c r f . g o v / ) w a s u t i l i z e d t o o v e r l a y u n i q u e l y a c t i v e g e n e s o n p a t h w a y s f r o m t h e K y o t o E n c y c l o p e d i a o f G e n e s a n d G e n o m e s ( K E G G ) d a t a b a s e . I d e n t i fi c a t i o n o f C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r R e s p o n s e E l e m e n t s ( C A R E S ) C A R E S a r e a s u b s e t o f P B - r e s p o n s i v e e l e m e n t s ( P B R E M S ) s i n c e 1 ) C A R - i n d e p e n d e n t e f f e c t s o f P B h a v e b e e n o b s e r v e d ( U e d a e t a l . , 2 0 0 2 ) , a n d t h u s i t i s p r e s u m e d t h a t o t h e r c l a s s e s o f c i s e l e m e n t s m o d u l a t e t h o s e e f f e c t s , a n d 2 ) t h e r e m i g h t e x i s t e l e m e n t s w h i c h a r e n e c e s s a r y , b u t n o t s u f fi c i e n t , f o r t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n b y C A R . S e v e n b o n a fi d e C A R E S w e r e i d e n t i fi e d f r o m t h e l i t e r a t u r e ( C h e n e t a l . , 2 0 0 3 ; G e r b a l - C h a l o i n e t a l . , 2 0 0 2 ; G o o d w i n e t a l . , 2 0 0 2 ; H o n k a k o s k i e t a l . , 1 9 9 8 ; S u e y o s h i e t a l . , 1 9 9 9 ; S u g a t a n i e t a l . , 2 0 0 1 ) a n d u s e d t o c o n s t r u c t a p o s i t i o n w e i g h t m a t r i x ( P W M ) . T h e c r i t e r i a f o r b o n a f i d e C A R E S a r e t h a t t h e e l e m e n t s a r e f u n c t i o n a l i n a r e p o r t e r g e n e a s s a y a n d h a v e b e e n s h o w n t o b i n d t o C A R b y e i t h e r g e l s h i f t o r c h r o m a t i n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y s . A d d i t i o n a l l y , t h e r e h a d t o b e a m a t c h b e t w e e n t h e s e q u e n c e s o f t h e e l e m e n t s r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e a n d t h e m o s t r e c e n t b u i l d , i . e . c o m p i l a t i o n o f g e n o m e s e q u e n c e a n d a n n o t a t i o n d a t a a t a p a r t i c u l a r p o i n t i n t i m e , o f t h e h u m a n , m o u s e , o r r a t g e n o m e . T h e m a t r i x s i m i l a r i t y s c o r e t h r e s h o l d u s e d w a s 0 . 8 0 , i . e . t h e i d e n t i fi e d C A R E S w e r e a t l e a s t 8 0 % s i m i l a r t o t h e c o n s e n s u s c i s e l e m e n t . T h e s e a r c h f o r p u t a t i v e C A R E S w a s p e r f o r m e d o n g e n e s f r o m t h e 3 g r o u p s d e s c r i b e d a b o v e , u n d e r Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s . 1 2 4 P o t e n t i a l / p o s s i b l e r e g u l a t o r y r e g i o n s ( - l 0 , 0 0 0 b p r e l a t i v e t o t h e t r a n s c r i p t i o n s t a r t S i t e t h r o u g h t h e 5 ’ - u n t r a n s l a t e d r e g i o n ) , f o r t h e g e n e s s e l e c t e d f o r a n a l y s i s , w e r e o b t a i n e d f r o m t h e U C S C g e n o m e d a t a b a s e ( h t t p : / / g e n o m e . u c s c . e d u ) . T h e s e r e g u l a t o r y r e g i o n s w e r e a n a l y z e d u s i n g p r e v i o u s l y d e s c r i b e d m e t h o d s ( S u n e t a l . , 2 0 0 4 ) . 1 2 5 R E S U L T S T h e c o m p l e t e m i c r o a r r a y d a t a s e t i s p r o v i d e d a s S u p p l e m e n t a r y T a b l e 8 2 i n t h e a c c e p t e d m a n u s c r i p t . P C A r e v e a l e d d i s t i n c t d i f f e r e n c e s i n g e n e e x p r e s s i o n p a t t e r n s b a s e d o n t r e a t m e n t a n d m o u s e s t r a i n ( F i g . 2 . 6 ) . O n e a n i m a l ( f r o m t h e B 6 C 3 F 1 , 4 - w e e k P B g r o u p ) w a s o m i t t e d fi o m s u b s e q u e n t d a t a a n a l y s i s a f t e r i t w a s d e e m e d t o b e a n o u t l i e r b y P C A ( d a t a p o i n t n o t s h o w n ) . A d d i t i o n a l l y , a n i m a l s w i t h i n a p a r t i c u l a r g r o u p ( e . g . , C 5 7 B L / 6 , 4 - w e e k P B - t r e a t e d ) t y p i c a l l y e x h i b i t e d s i m i l a r e x p r e s s i o n p a t t e r n s ( A p p e n d i x F i g . 1 ) . T h e m i c r o a r r a y s ( w i t h t h e e x c e p t i o n o f 1 o u t l i e r ) s h o w e d c o n s i s t e n t d i s t r i b u t i o n s , b a s e d o n b o x p l o t s , w h i c h i s a n i n d i c a t i o n t h a t t h e e x p e r i m e n t s a r e r e p r o d u c i b l e , w h i l e s o m e o u t l y i n g d a t a p o i n t s f o r e a c h i n d i v i d u a l m o u s e w e r e o b s e r v e d ( F i g . 2 . 7 ) . T h e a f o r e m e n t i o n e d o u t l i e r ( o n e B 6 C 3 F ] , 4 - w e e k P B - t r e a t e d a n i m a l ) i s d e p i c t e d i n F i g . 2 . 7 b u t w a s n o t u t i l i z e d f o r d a t a a n a l y s i s . A c t i v e g e n e s i n t h e 4 P B - t r e a t e d g r o u p s , a s c o m p a r e d t o t h e i r t i m e - m a t c h e d c o n t r o l s , w e r e i d e n t i fi e d ( F i g . 1 ) . L i s t s o f t h e a c t i v e g e n e s r e p r e s e n t e d i n t h e V e n n d i a g r a m s ( F i g . 1 ) c a n b e f o u n d i n S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S 3 A - I i n t h e a c c e p t e d m a n u s c r i p t . A t 2 w e e k s , P B a l t e r e d t h e e x p r e s s i o n o f 4 0 5 a n d 1 6 4 g e n e s i n t h e B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m i c e , r e s p e c t i v e l y ( F i g . 1 ) . C o m p a r i s o n o f t h e s e r e v e a l e d 1 2 4 o v e r l a p p i n g a c t i v e g e n e s a n d f o r a l l o f t h e m , t h e c h a n g e s o c c u r r e d i n t h e s a m e d i r e c t i o n ( i . e . 9 4 w e r e i n d u c e d a n d 3 0 w e r e r e p r e s s e d ) i n b o t h g r o u p s . T h e s e g e n e s w e r e n o t c o n s i d e r e d f u r t h e r . T h e r e f o r e , 2 8 1 g e n e s ( 1 9 0 i n d u c e d a n d 9 1 r e p r e s s e d ) w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 , a t 2 w e e k s o f P B t r e a t m e n t . C o n v e r s e l y , 4 0 g e n e s ( 2 0 i n d u c e d a n d 2 0 r e p r e s s e d ) w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n t h e C 5 7 B L / 6 m i c e v . t h e B 6 C 3 F l . 1 2 6 F fl r e 2 . 1 I d e n t i f i c a t i o n o f u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 , a s c o m p a r e d t o r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e , i n r e s p o n s e t o 2 o r 4 w e e k s o f p h e n o b a r b i t a l ( P B ) t r e a t m e n t . M i c r o a r r a y a n a l y s i s w a s u t i l i z e d t o a s c e r t a i n g e n e s w h o s e h e p a t i c e x p r e s s i o n w a s a l t e r e d ( T , i n d u c e d o r 1 , r e p r e s s e d ) i n 4 g r o u p s o f P B - t r e a t e d m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e i r t i m e - m a t c h e d c o n t r o l s . G e n e s w e r e c o n s i d e r e d t o b e d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d ( i . e . a c t i v e ) b a s e d o n m e e t i n g t w o c r i t e r i a : 1 ) s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e , p < 0 . 0 1 , a n d 2 ) a 3 2 - f o l d c h a n g e i n e x p r e s s i o n ( u p - o r d o w n - r e g u l a t e d ) . F i r s t , a c t i v e g e n e s i n t h e B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 g r o u p s w e r e c o m p a r e d , a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s . G e n e s t h a t e x h i b i t e d o p p o s i t e c h a n g e s ( e . g . , i n d u c e d i n t h e B 6 C 3 F ] a n d r e p r e s s e d i n t h e C 5 7 B L / 6 ) a t a p a r t i c u l a r t i m e p o i n t , d e p i c t e d b y a s t e r i s k s C “ ) , w e r e c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e l y a c t i v e i n e a c h o f t h e g r o u p s , a n d t h u s , s e g r e g a t e d . U n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n t h e B 6 C 3 F 1 a t 2 a n d 4 w e e k s ( A ) w e r e d i s c e r n e d b y e x c l u d i n g t h o s e g e n e s a t e a c h t i m e p o i n t w h i c h o v e r l a p p e d i n t h e B 6 C 3 F l a n d C 5 7 B L / 6 m i c e ( o v e r l a p p i n g p o r t i o n s o f V e n n d i a g r a m s ) , a n d w h o s e f o l d c h a n g e s o c c u r r e d i n t h e s a m e d i r e c t i o n ( i . e . i n d u c e d o r r e p r e s s e d i n b o t h g r o u p s , + ) . O f t h e 3 6 7 t o t a l u n i q u e l y a c t i v e g e n e s e l i c i t e d b y P B i n t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , 2 3 4 w e r e o b s e r v e d o n l y a t 2 w e e k s , 8 6 w e r e o b s e r v e d o n l y a t 4 w e e k s , a n d 4 7 w e r e o b s e r v e d a t b o t h t i m e p o i n t s o f t r e a t m e n t . 1 2 7 2 w e e k s P B 4 w e e k s P B B 6 C 3 F l C 5 7 B L / 6 B 6 C 3 F 1 C 5 7 B L / 6 ( 4 0 5 ( 1 6 4 ) C o m p a r e d u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s 2 w e e k s 4 w e e k s 1 2 8 A t 4 w e e k s , P B a l t e r e d t h e e x p r e s s i o n o f 2 2 4 a n d 3 0 7 g e n e s i n t h e B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m i c e , r e s p e c t i v e l y ( F i g . 1 ) . C o m p a r i s o n o f t h e s e r e v e a l e d 1 0 5 o v e r l a p p i n g a c t i v e g e n e s , o f w h i c h 9 1 e x h i b i t e d f o l d c h a n g e s i n t h e s a m e d i r e c t i o n ( i . e . 8 2 i n d u c e d a n d 9 r e p r e s s e d ) i n b o t h g r o u p s , a n d t h u s w e r e n o t c o n s i d e r e d f u r t h e r . A d d i t i o n a l l y , 1 4 a c t i v e g e n e s e x h i b i t e d o p p o s i t e c h a n g e s : 1 1 w e r e i n d u c e d i n t h e B 6 C 3 F 1 a n d r e p r e s s e d i n t h e C 5 7 B L / 6 , w h i l e 3 w e r e r e p r e s s e d i n t h e B 6 C 3 F ] a n d i n d u c e d i n t h e C 5 7 B L / 6 . D u e t o t h e i r o p p o s i n g e x p r e s s i o n c h a n g e s , t h e s e 1 4 g e n e s w e r e c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e l y a c t i v e i n t h e B 6 C 3 F l , a s w e l l a s i n t h e C 5 7 B L / 6 . I n t o t a l , 1 3 3 g e n e s ( 9 8 i n d u c e d a n d 3 5 r e p r e s s e d ) w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 , a t 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t . I n c o n t r a s t , 2 1 6 g e n e s ( 1 2 8 i n d u c e d a n d 8 8 r e p r e s s e d ) , i n c l u d i n g t h e 1 4 t h a t e x h i b i t e d o p p o s i t e c h a n g e s , w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n t h e C 5 7 B L / 6 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e B 6 C 3 F l . T h e v a l i d i t y o f t h e m i c r o a r r a y d a t a i s s u p p o r t e d b y t h e o b s e r v a t i o n s t h a t , a s e x p e c t e d , i n d u c t i o n o f c l a s s i c a l P B - i n d u c e d g e n e s ( e . g . , C y p 2 b 9 , C y p 2 b 1 0 , C y p r 1 3 , G s t a 2 , G s t t 3 ) i n b o t h t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 a n d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 g r o u p s a t 2 a n d 4 w e e k s w a s o b s e r v e d ( T a b l e 2 . 3 ) . T h e s e g e n e s a r e i n c l u d e d a m o n g t h e 1 2 4 c o m m o n a c t i v e 2 - w e e k g e n e s a n d 9 1 a c t i v e c o m m o n 4 - w e e k g e n e s ( F i g . 1 ; S u p p l e m e n t a r y T a b l e s 8 3 B a n d S B E , r e s p e c t i v e l y , i n t h e a c c e p t e d m a n u s c r i p t ) . N e x t , u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 ( 2 8 1 g e n e s ) a n d 4 ( 1 3 3 g e n e s ) w e e k s w e r e c o m p a r e d ( F i g . 1 ; S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S 3 G - I i n t h e a c c e p t e d m a n u s c r i p t ) : 4 7 w e r e a l t e r e d i n t h e s a m e d i r e c t i o n ( 3 5 i n d u c e d a n d 1 2 r e p r e s s e d ) a t b o t h t i m e p o i n t s , 2 3 4 ( 1 5 5 i n d u c e d a n d 7 9 r e p r e s s e d ) w e r e o b s e r v e d o n l y a t 2 w e e k s , a n d 8 6 ( 6 3 i n d u c e d a n d 2 3 r e p r e s s e d ) w e r e o b s e r v e d o n l y a t 4 w e e k s . I n t o t a l , P B t r e a t m e n t 1 2 9 r e s u l t e d i n 3 6 7 t o t a l u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d / o r 4 w e e k s . T w e n t y - e i g h t o f t h e s e w e r e s e l e c t e d , a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s , f o r c o n fi r m a t i o n o f t h e i r e x p r e s s i o n s t a t u s e s b y q R T - P C R a n a l y s i s . O f t h e 1 7 g e n e s c h o s e n t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e o n l y a t 2 w e e k s , e x p r e s s i o n c h a n g e s o f 1 1 w e r e c o n fi r m e d ( T a b l e 2 . 4 ) . T h e e x p r e s s i o n c h a n g e o f t h e s i n g l e u n i q u e l y a c t i v e c a r r y f o r w a r d g e n e ( i . e . i t s e x p r e s s i o n w a s i n d u c e d a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s ) t h a t w a s t e s t e d , S l c o I a 4 , w a s c o n fi r m e d a t 2 , b u t n o t 4 , w e e k s ( T a b l e s 2 . 4 a n d 2 . 5 , r e s p e c t i v e l y ) . F i n a l l y , o f t h e 1 0 g e n e s c h o s e n t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e o n l y a t 4 w e e k s , e x p r e s s i o n c h a n g e s o f 8 w e r e c o n fi r m e d ( T a b l e 2 . 5 ) . M a n y o f t h e 3 6 7 t o t a l u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d / o r 4 w e e k s w e r e f o u n d t o b e i n v o l v e d i n m u l t i p l e k e y s i g n a l i n g p a t h w a y s ( F i g s . 2 - 5 ; A p p e n d i x T a b l e s 4 - 5 ) , a n d e m p h a s i s w i l l b e p l a c e d o n t h o s e w h o s e e x p r e s s i o n c h a n g e s w e r e c o n fi r m e d b y q R T - P C R , p l u s t h o s e g e n e s t h a t w e r e n o t s e l e c t e d f o r c o n fi r m a t i o n . G e n e s w h i c h c a n a f f e c t m i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ( M A P K ) s i g n a l i n g w e r e i n d u c e d ( M a p 3 k 5 , M a p 2 k 6 , M k n k Z , a n d T n j f s fl 0 ) o r r e p r e s s e d ( P r d m 2 a n d T fi 3 ) b y P B a t 2 o r 4 w e e k s ( F i g . 2 ) . M A P K p a t h w a y s t h a t i n v o l v e p 3 8 a n d M a k a / 3 c a n e v e n t u a l l y r e s u l t i n t h e a c t i v a t i o n o f k e y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s , i n c l u d i n g M y c , J u n , a n d F a s ( F i g . 2 ) . P B a l t e r e d t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s t h a t c a n i n fl u e n c e c e l l c y c l e p r o g r e s s i o n ( C c n e 2 , G a b p a , G a d d 4 5 a , G a d d 4 5 b , G m n n , P e r ] , P l k 3 , a n d W e e ! ) a t 2 a n d / o r 4 w e e k s ( F i g . 2 ) . F o r G a d d 4 5 b , t h e B 6 C 3 F 1 P B - t r e a t e d a n i m a l s d e m o n s t r a t e d a s t a t i s t i c a l l y S i g n i fi c a n t i n c r e a s e i n e x p r e s s i o n o v e r t h e i r c o n t r o l s a t 2 w e e k s , a s d e t e r m i n e d b y q R T - P C R ( T a b l e 2 . 4 ) . T h e l e v e l o f e x p r e s s i o n i n t h e B 6 C 3 F 1 a p p e a r s t o b e h i g h e r t h a n t h a t s e e n i n t h e C 5 7 B L / 6 ; h o w e v e r , t h i s d o e s n o t r e a c h s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e d u e t o a p a r t i c u l a r l y l o w l e v e l o f e x p r e s s i o n i n o n e o f t h e B 6 C 3 F 1 m i c e ( T a b l e 2 . 4 ) . A c o m p l e t e 1 3 0 F ' g p r e 2 . 2 T h e e x p r e s s i o n a n d / o r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f g e n e s i n v o l v e d i n t h e c e l l c y c l e , a p o p t o s i s , a n d m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ( M A P K ) s i g n a l i n g w e r e a l t e r e d b y p h e n o b a r b i t a l ( P B ) a t 2 a n d 4 w e e k s . M i c r o a r r a y a n a l y s i s w a s u s e d t o i d e n t i f y u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n l i v e r s o f t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d / o r 4 w e e k s , a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s . F u n c t i o n a l a n n o t a t i o n o f 3 6 7 u n i q u e l y a c t i v e g e n e s ( F i g . 1 ; S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S 3 G - I i n t h e p u b l i s h e d m a n u s c r i p t ) w a s p e r f o r m e d . E x p r e s s i o n i s d e n o t e d a s u p - r e g u l a t e d ( T ) o r d o w n - r e g u l a t e d ( 1 ) . R e g a r d i n g q R T - P C R a n a l y s i s , a c h a n g e w a s c o n fi r m e d i f t h e t i m e p o i n t i s u n d e r l i n e d ( d a t a i n A p p e n d i x T a b l e s 2 - 3 ) ; t h e w o r d ‘ g r a y ’ i n d i c a t e s e i t h e r ‘ n o t c o n fi r m e d ’ ( g e n e s i d e n t i fi e d b y m i c r o a r r a y a n a l y s i s ) o r ‘ n o e x p r e s s i o n c h a n g e ’ ( g e n e s i d e n t i fi e d f r o m r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n , R A M S ) . G e n e s t h a t l a c k u n d e r l i n i n g , s y m b o l s , a n d t h e w o r d ‘ g r a y ’ w e r e n o t s e l e c t e d f o r c o n fi r m a t i o n . G e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e P B - i n d u c e d R A M S i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d / o r 4 w e e k s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) a r e d e n o t e d b y a s t e r i s k s ( * ) , a n d t h e i r e x p r e s s i o n w a s e v a l u a t e d a t t h e t i m e p o i n t d i r e c t l y p r e c e d i n g t h e a s t e r i s k ( A p p e n d i x T a b l e 7 ) . H a - r a s ( A ) w a s h y p o m e t h y l a t e d a n d u p - r e g u l a t e d u n i q u e l y i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 4 w e e k s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . W h i t e s y m b o l s r e p r e s e n t “ b r i d g i n g ” g e n e s t h a t w e r e n o t a l t e r e d i n r e s p o n s e t o P B . P o s i t i v e ( . . . . . . . . a n ) o r n e g a t i v e ( — — I ) r e g u l a t i o n i s i l l u s t r a t e d , a n d t h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t t h e s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h t h e g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s ( 0 ) , l i g a n d s ( 0 ) , k i n a s e s ( 0 ) , t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( C l ) , p h o s p h a t a s e s ( l 1 ) , a n d m e m b r a n e r e c e p t o r s ( ( 1 ‘ ) . l i s t o f t h e g e n e s t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , w h i c h h a v e d i s c e m a b l e c o n n e c t i o n s t o g r o w t h / s u r v i v a l , a t 2 a n d / o r 4 w e e k s a r e l i s t e d i n T a b l e s 2 . 6 a n d 2 . 7 , r e s p e c t i v e l y . T h e i n d u c t i o n o f g e n e s t h a t c a n a f f e c t a p o p t o s i s ( B a x , F h i t , G a d d 4 5 a , G a d d 4 5 b , K l fl 0 , S h p , T n fi s fl 0 ) w a s o b s e r v e d a t 2 a n d / o r 4 w e e k s ( F i g . 2 ) . A d d i t i o n a l g e n e s t h a t a r e p o s i t i v e l y o r n e g a t i v e l y a s s o c i a t e d w i t h d e c r e a s e d g r o w t h / s u r v i v a l ( i . e . a p o p t o s i s a n d c e l l d e a t h ) , a n d w h i c h w e r e a l t e r e d a t 2 o r 4 w e e k s , a r e l i s t e d i n T a b l e 2 . 6 a n d 2 . 7 , r e s p e c t i v e l y . F i g . 3 d e p i c t s a s u b s e t o f t h e u n i q u e l y a c t i v e g e n e s a t 2 a n d / o r 4 w e e k s w h i c h a r e l i n k e d t o a n g i o g e n e s i s ( A n g p t l 4 , C x c r 7 , D d a h I , M a p 3 k 5 , M m e , T n fi s fl 0 ) a n d E M T ( C l d n l ) . C o m p l e t e l i s t s o f u n i q u e l y a c t i v e 2 - ( T a b l e 2 . 6 ) a n d 4 - ( T a b l e 2 . 7 ) w e e k g e n e s , i n c l u d i n g c a r r y f o r w a r d g e n e s , w h i c h a r e p o s i t i v e l y o r n e g a t i v e l y a s s o c i a t e d w i t h a n g i o g e n e s i s , i n v a s i o n , a n d m e t a s t a s i s a r e i n c l u d e d i n t h e A p p e n d i x . T h e p r e g n a n e X n u c l e a r r e c e p t o r ( P X R ) , a x e n o b i o t i c s e n s o r , w a s i n d u c e d a t 2 w e e k s ( F i g . 4 ) . A t 2 o r 4 w e e k s , P B a l t e r e d t h e e x p r e s s i o n o f s e v e r a l g e n e s w h i c h a r e d o c u m e n t e d d o w n s t r e a m t a r g e t s o f C A R a n d / o r P X R ( e . g . , A l a s ] , A b c c 3 , G a d d 4 5 b , S l c o I a 4 : 2 w e e k s ) . A d d i t i o n a l l y , u n i q u e l y a c t i v e k i n a s e , p h o s p h a t a s e , p h o s p h a t a s e a c t i v a t o r ( r e g u l a t o r y s u b u n i t ) , a n d p h o s p h a t a s e r e g u l a t o r y ( i n h i b i t o r ) g e n e s a r e p r e s e n t e d i n A p p e n d i x 6 . T h e e x p r e s s i o n o f g e n e s i n v o l v e d i n e p i g e n e t i c p r o c e s s e s ( D N A m e t h y l a t i o n : D n m t 3 b , o n e - c a r b o n m e t a b o l i s m : C b s , M t r r , S h m t l , a n d h i s t o n e m e t h y l a t i o n : P r d m 2 ) w a s a f f e c t e d b y P B a t 2 o r 4 w e e k s ( F i g . 4 ) . A d d i t i o n a l l y , u n i q u e r e p r e s s i o n o f 3 D n m t g e n e s ( D n m t l , D n m t 3 a , D n m t 3 b ) w a s d e m o n s t r a t e d i n t h e B 6 C 3 F ] g r o u p s a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s , a n d t h e s e c h a n g e s w e r e s t r i k i n g l y d i f f e r e n t fi o m w h a t w a s o b s e r v e d i n t h e 1 3 3 1 3 4 F i g p r e 2 . 3 T h e e x p r e s s i o n a n d / o r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f g e n e s i n v o l v e d i n a n g i o g e n e s i s a n d t h e e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n ( E M T ) w e r e a l t e r e d b y p h e n o b a r b i t a l ( P B ) a t 2 a n d 4 w e e k s . M i c r o a r r a y a n a l y s i s w a s u s e d t o i d e n t i f y u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n l i v e r s o f n u n o r - S u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d / o r 4 w e e k s , a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s . F u n c t i o n a l a n n o t a t i o n o f 3 6 7 u n i q u e l y a c t i v e g e n e s ( F i g . 1 ; S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S 3 G - I i n t h e p u b l i s h e d m a n u s c r i p t ) w a s p e r f o r m e d . E x p r e s s i o n i s d e n o t e d a s u p - r e g u l a t e d ( T ) o r d o w n - r e g u l a t e d ( 1 ) . R e g a r d i n g q R T - P C R a n a l y s i s , a c h a n g e w a s c o n fi r m e d i f t h e t i m e p o i n t i s u n d e r l i n e d ( d a t a i n A p p e n d i x T a b l e s 2 - 3 ) ; t h e w o r d ‘ g r a y ’ i n d i c a t e s e i t h e r ‘ n o t c o n fi r m e d ’ ( g e n e s i d e n t i fi e d b y m i c r o a r r a y a n a l y s i s ) o r ‘ n o e x p r e s s i o n c h a n g e ’ ( g e n e s i d e n t i fi e d f r o m r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n , R A M S ) . G e n e s d e n o t e d b y a n a r r o w t h a t l a c k s u n d e r l i n i n g a n d s y m b o l s w e r e n o t s e l e c t e d f o r c o n fi r m a t i o n . G e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e P B - i n d u c e d R A M S i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d / o r 4 w e e k s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) a r e d e n o t e d b y a s t e r i s k s C “ ) , a n d t h e i r e x p r e s s i o n w a s e v a l u a t e d a t t h e t i m e p o i n t d i r e c t l y p r e c e d i n g t h e a s t e r i s k ( A p p e n d i x T a b l e 7 ) . H a - r a s ( A ) w a s h y p o m e t h y l a t e d a n d u p - r e g u l a t e d u n i q u e l y i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 4 w e e k s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . W h i t e s y m b o l s r e p r e s e n t “ b r i d g i n g ” g e n e s t h a t w e r e n o t a l t e r e d i n r e s p o n s e t o P B . P o s i t i v e ( . . . . . . . . a . ) o r n e g a t i v e ( — — l ) r e g u l a t i o n i s i l l u s t r a t e d , a n d t h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t t h e S p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h t h e g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s ( 0 ) , l i g a n d s ( O ) , k i n a s e s ( C “ ) , t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( £ 1 ) , a n d m e m b r a n e r e c e p t o r s ( ' 1 ‘ 3 ' ) . - ? ? " 1 : l l i w - , - . : i , ' » - ‘ - . r e x fi M , m . i 1 3 5 2 , 4 * , g r a y _ _ 1 i _ B e r g / 1 . 1 % 1 3 6 F i g u r e 2 . 4 T h e e x p r e s s i o n o f g e n e s i n v o l v e d i n e p i g e n e t i c - r e l a t e d p r o c e s s e s , a n d t h o s e t h a t a r e i n d i c a t i v e o f n u c l e a r r e c e p t o r a c t i v a t i o n , w a s a l t e r e d b y p h e n o b a r b i t a l ( P B ) a t 2 a n d 4 w e e k s . M i c r o a r r a y a n a l y s i s w a s u s e d t o i d e n t i f y u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n l i v e r s o f t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s . F u n c t i o n a l a n n o t a t i o n o f 3 6 7 u n i q u e l y a c t i v e g e n e s ( F i g . 1 ; S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S 3 G - I i n t h e p u b l i s h e d m a n u s c r i p t ) w a s p e r f o r m e d . E x p r e s s i o n i s d e n o t e d a s u p - r e g u l a t e d ( T ) o r d o w n - r e g u l a t e d ( 1 ) . R e g a r d i n g q R T - P C R a n a l y s i s , a c h a n g e w a s c o n fi r m e d i f t h e t i m e p o i n t i s u n d e r l i n e d ( d a t a i n A p p e n d i x T a b l e s 2 - 3 ) ; t h e w o r d ‘ g r a y ’ i n d i c a t e s ‘ n o t c o n fi r m e d ’ . E x p r e s s i o n o f S 1 0 0 ] a 4 w a s c o n fi r m e d a t 2 , b u t n o t 4 ( § ) w e e k s . G e n e s d e n o t e d b y a r r o w t h a t l a c k s b o t h u n d e r l i n i n g a n d p a r t i c u l a r s y m b o l s ( + a n d § ) w e r e n o t s e l e c t e d f o r c o n fi r m a t i o n . A p l u s S i g n ( + ) d e n o t e s a g e n e w h o s e e x p r e s s i o n w a s e v a l u a t e d o n l y b y q R T - P C R . W h i t e s y m b o l s r e p r e s e n t “ b r i d g i n g ” g e n e s t h a t w e r e n o t a l t e r e d i n r e s p o n s e t o P B . P o s i t i v e ( . . . . . . . . > ) o r n e g a t i v e ( — — l ) r e g u l a t i o n i s i l l u s t r a t e d , a n d t h e S h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t t h e s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h t h e g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s ( 0 ) , a n d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( 0 ) . A c c o r d i n g t o U e d a e t a l . ( 2 0 0 2 ) , 2 g e n e s ( K m ! a n d P c k l ) e x h i b i t e d c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) - d e p e n d e n t d o w n - r e g u l a t i o n i n r e s p o n s e t o P B ( w h i l e w e d e t e c t e d u p - r e g u l a t i o n ) , a n d 3 g e n e s ( ¥ ) w e r e u n d e r C A R - d e p e n d e n t “ b l o c k i n g ” , i . e . t h e y w e r e i n d u c e d o r r e p r e s s e d o n l y i n C A R k n o c k o u t m i c e ( v . t h e w i l d t y p e ) . 1 3 7 C 5 7 B L / 6 a t t h e c o r r e s p o n d i n g t i m e p o i n t s ( T a b l e 1 ) . A t 2 w e e k s , e x p r e s s i o n o f D n m t 3 b d e c r e a s e d t o a s t a t i s t i c a l l y g r e a t e r e x t e n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 , a n d t h u s , t h e c h a n g e i s c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e i n t h e B 6 C 3 F 1 . I n a d d i t i o n t o a s s e s s i n g t h e e f f e c t s o f P B o n g l o b a l g e n e e x p r e s s i o n , w e w e r e i n t e r e s t e d i n e v a l u a t i n g t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s t h a t w e r e p r e v i o u s l y s h o w n t o e x h i b i t u n i q u e R A M S i n D N A i s o l a t e d f r o m t h e s a m e l i v e r s o f t h e s e t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e i r r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 c o u n t e r p a r t s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) . T h e e x p r e s s i o n o f a s u b s e t o f t h e s e ( 1 9 t o t a l : 2 a t 2 w e e k s a n d 1 7 a t 4 w e e k s ) w a s i n i t i a l l y e v a l u a t e d i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e ( T a b l e 2 . 9 ) . I f t h e m e t h y l a t i o n a n d e x p r e s s i o n s t a t u s e s a p p e a r e d t o b e i n v e r s e l y c o r r e l a t e d ( a s d e s c r i b e d T a b l e 2 . 9 ) , e x p r e s s i o n i n t h e t i m e - m a t c h e d C 5 7 B L / 6 g r o u p w a s e v a l u a t e d . A t 4 w e e k s , 3 g e n e s ( B c a t 2 , B c 1 2 1 1 3 , U b e 2 d 1 ) e x h i b i t e d u n i q u e d e c r e a s e s i n e x p r e s s i o n a n d u n i q u e i n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 . T w o g e n e s e x h i b i t e d d e c r e a s e s i n e x p r e s s i o n t h a t w e r e n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) i n t h e B 6 C 3 F l a n d C 5 7 B L / 6 m i c e a t 2 ( S r m s ) o r 4 ( T r i o ) w e e k s , a n d t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s w e r e a m b i g u o u s ( e i t h e r i n c r e a s e d a n d / o r d e c r e a s e d ) . A t 4 w e e k s , N c o r 2 e x h i b i t e d i n c r e a s e d m e t h y l a t i o n l e v e l s a n d d e c r e a s e d e x p r e s s i o n i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , a n d t h e e x t e n t o f t h e f o l d c h a n g e w a s s t a t i s t i c a l l y l e s s ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) t h a n t h a t o b s e r v e d i n t h e C 5 7 B L / 6 . T h e e x p r e s s i o n o f 1 3 g e n e s w a s o n l y e v a l u a t e d i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e : 7 w e r e d o w n - r e g u l a t e d a n d h y p o m e t h y l a t e d , w h i l e e x p r e s s i o n o f t h e o t h e r 6 d i d n o t c h a n g e . G e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M S ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) w e r e a d d e d t o 1 3 8 3 1 _ - _ ° 7 3 4 . o 0 n 4 . 1 l 1 - _ — - _ f ‘ ° d ° d 7 ’ 0 9 4 0 ° . . 4 0 . 6 1 2 1 . - _ - 6 - l l 1 l k k k k w w w W 2 4 2 4 1 e s a r e f s b 3 e s a r e f : n l a : s b n r 3 a t r t m l n y D h t t m l n y t D e m A N D h t e m A N D 1 3 9 T a b l e 2 . 1 Q u a n t i t a t i v e r e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) a n a l y s i s o f e x p r e s s i o n o f 3 D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) g e n e s . B 6 C 3 F ] C 5 7 B L / 6 N o . o f M i c e N o . o f M i c e G e n e T i m e P o i n t ‘ t h a t E x h i b i t e d t h a t E x h i b i t e d F o l d a C h a n g e F o l d a C h a n g e ( 3 . , “ n g O u t s i d e 9 5 % C h a n g e b O u t s i d e 9 5 % C I o f C o n t r o l C I o f C o n t r o l G r o u p c G r o u p c - n . c . - D n m t 3 a : 2 w k 1 - 1 . 6 0 ° - 1 1 . 3 3 - — D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e 3 a 4 w k 1 _ l e d _ _ n . c . l 3 " P h e n o b a r b i t a l ( P B ) w a s a d m i n i s t e r e d t o B 6 C 3 F ] a n d C 5 7 B L / 6 m i c e f o r 2 o r 4 w e e k s . b A f o l d c h a n g e o f g e n e e x p r e s s i o n ( T , u p - r e g u l a t i o n o r 1 , d o w n - r e g u l a t i o n ) i s l i s t e d i f i t w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) i n a t r e a t m e n t g r o u p v . i t s t i m e - m a t c h e d c o n t r o l . I f i t w a s n o t s i g n i fi c a n t , n o c h a n g e ( n . c . ) i s l i s t e d . c I f a f o l d c h a n g e w a s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t , a g e n e w a s c o n s i d e r e d t o s h o w a n ‘ i n d i c a t i o n o f a c h a n g e ’ i f d a t a f r o m a t l e a s t 3 o f t h e 6 s a m p l e s i n t h e P B - t r e a t e d g r o u p f e l l o u t s i d e ( a b o v e , T o r b e l o w , 1 ) t h e 9 5 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l ( C I ) o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a . I f t h e r e w a s n o i n d i c a t i o n o f a c h a n g e , o r i f a f o l d c h a n g e w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t , t h e s e d a t a a r e n o t S h o w n ( - ) . “ T h e e x p r e s s i o n c h a n g e w a s c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 . e A t 2 w e e k s , e x p r e s s i o n o f D n m t 3 b d e c r e a s e d t o a s t a t i s t i c a l l y g r e a t e r e x t e n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) i n t h e B 6 C 3 F l , a s c o m p a r e d t o t h e C S 7 B L / 6 , a n d t h u s , t h e c h a n g e w a s c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e i n t h e B 6 C 3 F l . I A t 2 w e e k s , D n m t 3 b w a s u n i q u e l y a c t i v e , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s , i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e . F i g u r e s 2 - 5 i n o r d e r t o d e p i c t c o m p l e m e n t a r y d a t a f r o m t h e g e n e e x p r e s s i o n a n d D N A m e t h y l a t i o n a n a l y s e s . A l s o i n c l u d e d i n F i g u r e s 2 a n d 3 i s H a — r a s , w h i c h w e p r e v i o u s l y d e m o n s t r a t e d t o b e h y p o m e t h y l a t e d a n d i n d u c e d u n i q u e l y i n B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 , a t 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h i r t y g e n e s o f i n t e r e s t ( 1 8 u n i q u e l y a c t i v e g e n e s b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s , 3 D n m t s , a n d 9 g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M S ) h a r b o r e d a t l e a s t 1 p u t a t i v e C A R E w i t h i n 1 0 k b u p s t r e a m o f t h e i r t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e s ( T a b l e 2 ; b a s e s e q u e n c e s o f t h e p u t a t i v e C A R E S a r e l i s t e d i n S u p p l e m e n t a r y T a b l e 8 1 0 i n t h e a c c e p t e d m a n u s c r i p t ) . A l l 3 0 g e n e s w e r e s u b j e c t e d t o q R T - P C R a n a l y s i s ( T a b l e 1 , T a b l e s 2 . 4 , 2 . 5 a n d 2 . 9 ) . O f t h e 1 8 w h i c h w e r e i d e n t i fi e d a s u n i q u e l y a c t i v e b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s , t h e e x p r e s s i o n s t a t u s e s o f 1 3 w e r e c o n fi r m e d b y q R T - P C R ( T a b l e s 2 . 4 a n d 2 . 5 ) . 1 4 0 B ’ ° ) S E R A C ( s t n e m e l E e s e s f v 0 i t ° a ° t N u c P n o E i n t e o g a p n l s y a e h h R t C r e o M t ) R e . m C R y P e l " “ . . - C n a a T t R n A s o r d n A / e q y D a r , s v r i a t o c r ' s y l a A c n e i A v M i t u t i t t . n 1 s r ) F n o 3 s o k P C C e e e 6 e v w B m i i n . ( T i t a t u P n i a . A C . A x 3 t b l 4 t a 1 ( [ m h B h p S E n o C t a h t s e n e C e n e G f o n o i s s e r p x o s y d l e a s n a A s e r p x E y B d s e e t g i n b a a r r a o i r E h h C c x i E M 2 . 2 e # l b a T — G s n F o s n i J s e s i a a l c g r a p P r e f s n a r t l y h t e m A N D 1 4 1 A b c c 3 { — C O V ) A C . " C a s p 3 I [ 1 . 0 . C b s C G C e b p b C G G a d d 4 5 b I 1 1 . 0 . L a n I 1 1 . 0 . P r d m 2 A . C . “ A . C . " T n fl fl 0 C G I 1 1 . 0 . G a d d 4 5 a C G M a p 3 k 5 M t r r P l k 3 < — 4 — — > 4 — < — — > < — — > 4 — 4 — < — 4 — < — 4 — + — 4 — W e e ] \ O N M N V fi H — ‘ N I — ‘ W N V H — ‘ fi m D n m t ] M D n m t 3 a D n m t 3 b N N N N N N N N N N N V ‘ I ’ V V V V V N V N V N V 7 3 l c I 2 4 2 f t 5 r h I p a a Z x o k c I d c n B c A B D N e l P A M N ) e u D S q d M i e A n R r e U ( t d n l e o A t i f i t o b a i l s h y n x h o E i t g e e m R 1 4 2 T a b l e 2 . 2 c o n t i n u e d E x p r e s s i o n o f G e n e s t h a t C o n t a i n P u t a t i v e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r R e s p o n s e E l e m e n t s N I T . k L H y p o M 2 N . D . k l l ‘ N e w M 2 N . D . k 1 ’ “ N e w M 2 N . D . k n . a . N H y p o M N D . k 1 L H y p o M N D . k 1 L N e w M 2 N . D . k n . a . N N e w M N D . “ 1 L H y p o M N . D . k n . a . N H y p o M a n d / o r N e w M " N . D . k n . S . o H y p o M T g e r 4 N D . " a s ? H y p o M 1 A B a s e s e q u e n c e s o f p u t a t i v e C A R E S , l o c a t e d 1 0 k b u p s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e , a r e l i s t e d i n S u p p l e m e n t a r y T a b l e 3 1 0 i n t h e p u b l i s h e d m a n u s c r i p t ; B W e u s e d t h e s a m e p o s i t i o n w e i g h t m a t r i x a n d 8 0 % s t r i n g e n c y c u t - o f f o n 2 5 , 0 0 0 r a n d o m l y c o n s t r u c t e d s e q u e n c e s o f 1 0 k b i n l e n g t h a n d f o u n d t h a t , o n a v e r a g e , t h e r e w e r e o n l y 0 . 5 6 1 C A R E S f o u n d p e r s e q u e n c e ( a c r o s s a l l 2 5 , 0 0 0 s e q u e n c e s ) . T h e p r o b a b i l i t y o f a g e n e h a v i n g m o r e t h a n I C A R E i s 1 0 . 8 % , w h i l e t h e p r o b a b i l i t y o f h a v i n g m o r e t h a n 2 , 3 , o r 4 C A R E S i s 2 . 2 % , 0 . 3 8 % , a n d 0 . 0 4 4 % , r e s p e c t i v e l y . T h e p r o b a b i l i t y o f n o t h a v i n g a n y C A R E S i s 5 7 . 4 % ; C G e n e s t h a t e x h i b i t e d u n i q u e P B - e l i c i t e d e x p r e s s i o n c h a n g e s ( T a b l e 1 , S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S 3 G - I i n t h e p u b l i s h e d m a n u s c r i p t a n d A p p e n d i x T a b l e s 2 - 3 ) a n d / o r m e t h y l a t i o n ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 a ) i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d / o r 4 w e e k s o f p h e n o b a r b i t a l ( P B ) t r e a t m e n t ; D E x p r e s s i o n c h a n g e s ( T , u p — r e g u l a t i o n a n d l , d o w n - r e g u l a t i o n ) o f u n i q u e l y a c t i v e g e n e s t h a t w e r e i d e n t i fi e d b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s ( a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s ) . F o r g e n e s a n d t i m e p o i n t s l i s t e d i n b o l d e d t o u t , t h e e x p r e s s i o n c h a n g e w a s c o n fi r m e d , o r a p p e a r e d t o b e c o n fi r m e d , b y q u a n t i t a t i v e r e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) a n a l y s i s . T h e e x p r e s s i o n o f g e n e s l i s t e d i n n o r m a l b l a c k f o n t w a s e v a l u a t e d b u t w a s n o t c o n fi r m e d ; E P B - i n d u c e d d e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( H y p o m e t h y l a t i o n , H y p o M ) a n d i n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( H y p e r m e t h y l a t i o n , H y p e r M a n d n e w m e t h y l a t i o n s , N e w M ) , a s d e t e r m i n e d b y P h i l l i p s a n d G o o d m a n ( 2 0 0 8 a ) . F o r c e r t a i n g e n e s ( A ) , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s w e r e a m b i g u o u s ( i . e . n o t d e fi n i t i v e l y d e t e r m i n e d ) ; F D e t a i l e d c o n fi r m a t o r y q R T - P C R d a t a a r e f o u n d i n A p p e n d i x T a b l e s 2 ( 2 w e e k s ) a n d 3 ( 4 w e e k s ) ; G T h e f x p r e s s i o n c h a n g e , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s , w a s c o n fi r m e d ( C ) ; H T h e e x p r e s s i o n c h a n g e , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s , w a s a p p a r e n t l y c o n fi r m e d ( A . C . ) ; T h e e x p r e s s i o n c h a n g e , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s , w a s n o t c o n fi r m e d ( n . c . ) ; J D e t a i l e d q R T - P C R d a t a a r e f o u n d i n T a b l e 1 ; K N . D . ( n o t d e t e c t e d ) i n d i c a t e s t h a t t h e g e n e w a s n o t a c t i v e ; I ’ D i r e c t i o n ( T , u p - r e g u l a t i o n a n d l , d o w n - r e g u l a t i o n ) o f t h e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p 5 0 . 0 5 ) f o l d c h a n g e ; ” D e t a i l e d q R T - P C R d a t a a r e f o u n d i n A p p e n d i x T a b l e 7 ; N E x p r e s s i o n w a s n o t e v a l u a t e d ; o F o l d c h a n g e w a s n o t s i g n i fi c a n t , n . s . ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) . V P r i c k l e 2 V V N V I ‘ V ’ N V N V ‘ N S r m s D I S C U S S I O N U n i q u e h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s i n t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 , a s c o m p a r e d t o r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e , w e r e d i s c e r n e d a t v e r y e a r l y t i m e p o i n t s f o l l o w i n g P B t r e a t m e n t . W e h y p o t h e s i z e t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e s e c o n t r i b u t e d i r e c t l y t o t h e d e v e l o p m e n t o f l i v e r t u m o r s w h i c h a r e d e s t i n e d t o b e c o m e e v i d e n t a t l a t e r t i m e p o i n t s , e . g . , 1 2 m o n t h s ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) . S t r i k i n g l y , a s e a r l y a s 2 a n d 4 w e e k s , t h e e x p r e s s i o n o f i n g e n e s t h a t r e g u l a t e k e y c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s i s a l t e r e d u n i q u e l y i n t u m o r - s u s c e p t i b l e : : m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e i r r e l a t i v e l y r e s i s t a n t c o u n t e r p a r t s ( F i g s . 2 - 5 ) . T h e s e d a t a b o t h c o m p l e m e n t a n d e x t e n d o u r p r e v i o u s r e s e a r c h , w h i c h i d e n t i fi e d m u l t i p l e g e n e s t h a t e x h i b i t e d u n i q u e m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n h e p a t i c D N A f r o m t h e s a m e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 E l a n d 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) . I m p o r t a n t l y , g e n e s e l u c i d a t e d f r o m b o t h t h e m e t h y l a t i o n a n d e x p r e s s i o n a n a l y s e s p a r t i c i p a t e i n s e v e r a l o f t h e s a m e o v e r a r c h i n g p a t h w a y s a n d s i g n a l i n g p r o c e s s e s ( e . g . , c e l l c y c l e , a p o p t o s i s , a n g i o g e n e s i s , E M T , i n v a s i o n / m e t a s t a s i s , a n d M A P K , T g f - B a n d W n t s i g n a l i n g ) ( F i g . 5 ) . A d d i t i o n a l l y , s e v e r a l p a t h w a y s a r e r e p r e s e n t e d b y g e n e s t h a t e x h i b i t e d c h a n g e s o n l y i n m e t h y l a t i o n ( N o t c h s i g n a l i n g ) o r e x p r e s s i o n ( D N A m e t h y l a t i o n , l - c a r b o n m e t a b o l i s m ) ( F i g . 5 ) . O v e r a l l , t h e s e d a t a i l l u m i n a t e v e r y e a r l y e v e n t s ( a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n ) w h i c h m i g h t f a c i l i t a t e s e l e c t i v e c l o n a l e x p a n s i o n , a n d u l t i m a t e l y , t u m o r f o r m a t i o n , i n r e s p o n s e t o P B . A s u b s e t o f t h e u n i q u e l y a c t i v e B 6 C 3 F 1 g e n e s a t 2 a n d / o r 4 w e e k s a r e i n v o l v e d i n g r o w t h ( e . g . , c e l l c y c l e ) , s u r v i v a l , a n d a p o p t o s i s ( F i g s . 2 a n d 5 ; A p p e n d i x T a b l e s 2 . 6 a n d 2 . 7 ) . M u l t i p l e g e n e s i d e n t i fi e d fi o m u n i q u e B 6 C 3 F ] R A M s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) p a r t i c i p a t e i n t h e s e s a m e p r o c e s s e s ( F i g . 5 ) , a n d s e v e r a l o f t h e m ( A n a p c 7 , B c 1 2 1 1 3 , 1 4 3 1 4 4 F i g p r e 2 . 5 S u m m a r y o f p a t h w a y s a n d p r o c e s s e s i n v o l v i n g g e n e s t h a t e x h i b i t e d u n i q u e p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - e l i c i t e d e x p r e s s i o n a n d / o r m e t h y l a t i o n c h a n g e s a t 2 a n d / o r 4 w e e k s . P B i n d u c e d u n i q u e h e p a t i c r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M S ) , i n c l u d i n g h y p o m e t h y l a t i o n s ( H y p o M ) , h y p e r m e t h y l a t i o n s ( H y p e r M ) , a n d n e w m e t h y l a t i o n s ( N e w M ) i n t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 ( i n A ) a n d / o r 4 ( i n B ) w e e k s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . G e n e s , i d e n t i fi e d fi o m u n i q u e R A M S ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 a ) , a r e d e p i c t e d b y a n a s t e r i s k ( * ) . R e g a r d i n g a n a l y s i s o f t h e i r e x p r e s s i o n i n B 6 C 3 F 1 m i c e b y q R T - P C R ( A p p e n d i x T a b l e 7 ) : g e n e s t h a t e x h i b i t e d a n e x p r e s s i o n c h a n g e ( i n d u c t i o n , T o r r e p r e s s i o n , l ) a r e b o l d e d , t h o s e t h a t d i d n o t a r e i n i t a l i c s , a n d t h o s e t h a t w e r e n o t e v a l u a t e d a r e i n n o r m a l f o n t . B a c h m a n e t a l . ( 2 0 0 6 ) d e m o n s t r a t e d u n i q u e h y p o m e t h y l a t i o n a n d u p - r e g u l a t i o n o f H a - r a s ( A ) i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 4 w e e k s . A S d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s , m i c r o a r r a y a n a l y s i s w a s e m p l o y e d t o i d e n t i f y u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d / o r 4 w e e k s . E x p r e s s i o n o f u n i q u e l y a c t i v e g e n e s w a s c o n fi r m e d ( b o l d e d ) , o r e v a l u a t e d a n d n o t c o n fi r m e d ( i t a l i c s ) b y q R T - P C R ( A p p e n d i x T a b l e s 2 - 3 ) . U n i q u e l y a c t i v e g e n e s t h a t w e r e n o t s e l e c t e d f o r c o n fi r m a t i o n a r e l i s t e d i n n o r m a l f o n t . A p l u s S i g n ( + ) d e n o t e s a D n m t g e n e w h o s e u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e w a s r e v e a l e d o n l y b y q R T - P C R . A l i n e u n d e r n e a t h a g e n e i n d i c a t e s t h a t a t l e a s t 1 p u t a t i v e C A R E w a s f o u n d w i t h i n 1 0 k b o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e . A b b r e v i a t i o n s : E M T , e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n ; M A P K , m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ; T G F B , t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - b e t a . n ) M O P Y ) M “ o p ) H m ( ‘ " y M “ r H e ( ( Z p r y é H " " g T 2 m r o T o “ i t a l y h l ” ) M t ) e M ) A N D M w e N ( “ 2 r o m c N r ) o l ) M / M d w e o n p a y N M H ( o ( m “ I p S " 1 y I H l I Z f 1 r ( l I k " c e o B l l r P p l t P o M p o y p H y ( H ( “ * 4 f W h c 1 ) M o p y H ( ? m a T i ) ) M ) M M o ) M o o p w p M M r e e y w 3 p y H p y N H ( ( H e ( N L y h H ( ' c " " * r r o l c ‘ o f O 4 / h r p d k p m — 4 / h d n ) c n a e t p a l P P P l , M M r . e : . . p y H m p o 5 r “ r e / 4 L h d i 1 n c a . W . M K . o . p . y ) H . 1 ) M ( w e N r M w e N 2 r b p 5 i f g 4 7 t d k C 3 d a p l o M o 3 1 M o 1 p T o y l i H p y a H G M 1 l ( “ 2 b r fi E 4 ( o i r T 1 4 5 1 W 1 3 . 1 E f n b 2 " ( H y p o M o r N e w M ) 1 n 3 . T S h c ] T T n f s f l 0 T C c n e 2 T F h i t T G a d d 4 5 a T K l f l O H y p e r M ) l T 1 1 4 " ( H y p o M ) 1 G a d d 4 5 a 1 M a p 2 k 6 E fi z b 2 " I ( H y p o M o r H y p e r M ) P p p 4 c , P l e k h fl ) e x h i b i t e d a n e x p r e s s i o n c h a n g e ( T a b l e 2 . 9 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e k n o w n a b i l i t y o f P B t o e n h a n c e h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n b e t w e e n 1 - 4 w e e k s o f t r e a t m e n t ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ; K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 a ) a n d d e c r e a s e a p o p t o s i s w i t h i n f o c a l l e s i o n s t h a t b e c o m e e v i d e n t a f t e r p r o l o n g e d t r e a t m e n t ( i . e . 3 0 - 6 0 d a y s ) ( K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 b ) . I n t h i s c o n t e x t , i t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t P B t r e a t m e n t f o r 1 - 2 w e e k s a l s o i n c r e a s e s h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n i n t h e r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 s t r a i n ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ) . C h r o n i c P B a d m i n i s t r a t i o n i n h i b i t s n o r m a l h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n , w h i l e a s u b p o p u l a t i o n o f c e l l s e s c a p e s t h e m i t o i n h i b i t o r y e f f e c t s a n d m a y s e r v e a s t h e p r o g e n i t o r s f o r t u m o r f o r m a t i o n ( r e v i e w e d i n C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ) . A n o v e l a s p e c t o f t h i s r e s e a r c h i s t h e i d e n t i fi c a t i o n o f s e v e r a l g r o w t h r e g u l a t o r y g e n e s w h i c h a r e u n i q u e l y a c t i v e i n t h e t m n o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e . I m p o r t a n t l y , P B e l i c i t e d u n i q u e c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n 2 0 0 8 ) a n d e x p r e s s i o n o f a n g i o g e n e s i s - a s s o c i a t e d g e n e s a t 2 a n d / o r 4 w e e k s i n t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e ( F i g s . 3 a n d 5 ; T a b l e s 2 . 6 a n d 2 . 7 ) . A n g i o g e n e s i s i s r e q u i r e d f o r b o t h n o r m a l d e v e l o p m e n t a n d t u m o r g r o w t h a n d m e t a s t a s i s ( F o l k m a n , 2 0 0 2 ; P a p e t t i a n d H e r m a n , 2 0 0 2 ) . I t i s r e m a r k a b l e t o s e e a l t e r e d e x p r e s s i o n o f g e n e s i n v o l v e d i n t h i s p r o c e s s s o s o o n a f t e r c o m m e n c i n g P B t r e a t m e n t . F u r t h e r m o r e , g e n e s i n v o l v e d i n i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s , p l u s E M T , a d e v e l o p m e n t a l p r o g r a m w h i c h a p p e a r s t o f a c i l i t a t e t h e t w o f o r m e r p r o c e s s e s ( T h i e r y , 2 0 0 2 ; Y a n g e t a l . , 2 0 0 6 ) , w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d / o r 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t ( F i g s . 3 a n d 5 ; T a b l e s 2 . 6 a n d 2 . 7 ) . G e n e s i n w h i c h u n i q u e P B - i n d u c e d B 6 C 3 F l R A M S o c c u r r e d ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) a r e a l s o i n v o l v e d i n t h e s e p r o c e s s e s ( F i g . 5 ) , a n d n o t a b l y , P B a l t e r e d t h e e x p r e s s i o n o f T c f 4 i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e ( F i g . 3 ) . W h i l e i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s a r e 1 4 6 t y p i c a l l y r e g a r d e d a s l a t e e v e n t s i n t u m o r i g e n e s i s , u n t r a n s f o r m e d c e l l s c a n t r a v e l t h r o u g h t h e b l o o d s t r e a m t o a s e c o n d a r y s i t e , w h e r e a d d i t i o n a l m o l e c u l a r a l t e r a t i o n s l e a d i n g t o m a l i g n a n t g r o w t h m a y o c c u r ( P o d s y p a n i n a e t a l . , 2 0 0 8 ) . T h e c u r r e n t r e p o r t i s t h e fi r s t t o i n d i c a t e t h a t P B c a n s t a r t t o f a c i l i t a t e E M T , i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s a t a v e r y e a r l y s t a g e o f t u m o r d e v e l o p m e n t . T h e f u n d a m e n t a l g e n e s i n v o l v e d i n h u m a n a n d m o u s e t u m o r i g e n e s i s a r e l i k e l y i d e n t i c a l , h o w e v e r , m i c e a r e m o r e s u s c e p t i b l e t h a n h u m a n s ( R a n g a r a j a n a n d W e i n b e r g , 2 0 0 3 ) . T h e r e g u l a t i o n o f t h e s e g e n e s , o f w h i c h e p i g e n e t i c c o n t r o l ( e . g . , a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ) i s a c o m p o n e n t , m i g h t b e a k e y s p e c i e s - s p e c i fi c d i f f e r e n c e t h a t c o n t r i b u t e s t o t h e i r d i s p a r a t e s e n s i t i v i t i e s . F o r i n s t a n c e , m e t h y l a t i o n p a t t e r n s a r e l e s s s t a b l e i n r o d e n t , E , a s c o m p a r e d t o h u m a n , c e l l s ( r e v i e w e d i n G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) . I n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , P B u n i q u e l y a l t e r e d t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s w h i c h i n fl u e n c e m e t h y l a t i o n s t a t u s . C h a n g e s i n g e n e s t h a t f u n c t i o n i n l - c a r b o n m e t a b o l i s m ( C b s , M t r r , a n d S h m t I ; F i g . 4 ) , w h i c h g e n e r a t e s t h e D n m t m e t h y l d o n o r S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e , o c c u r r e d . R e m a r k a b l y , t h e e x p r e s s i o n o f 3 D n m t g e n e s ( 1 , 3 a , a n d 3 b ) w a s u n i q u e l y r e p r e s s e d i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s ( T a b l e 1 ) , t h u s l i n k i n g P B t o e a r l y e x p r e s s i o n c h a n g e s o f k e y g e n e s i n v o l v e d i n r e g u l a t i n g D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s . I n t e r e s t i n g l y , a l l 6 o f t h e s e g e n e s h a r b o r C A R E S , i n d i c a t i n g t h a t C A R m i g h t m o d u l a t e t h e i r t r a n s c r i p t i o n . A d d i t i o n a l g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n a n d / o r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y a t t h e s e e x t r e m e l y e a r l y t i m e p o i n t s i n t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e c a n p a r t i c i p a t e i n m u l t i p l e S i g n a l i n g p a t h w a y s o f d e v e l o p m e n t a n d d i f f e r e n t i a t i o n t h a t h a v e p r e v i o u s l y b e e n l i n k e d t o t u m o r i g e n e s i s : t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - b e t a ( T g f - B ) , W n t , a n d N o t c h ( F i g . 5 ) . T g f - B S i g n a l i n g f u n c t i o n s i n a t u m o r s u p p r e s s i v e m a n n e r i n n o r m a l 1 4 7 c e l l s a n d i n a n o n c o g e n i c f a s h i o n d u r i n g l a t e r s t a g e s o f t u m o r i g e n e s i s ( M a s s a g u é , 2 0 0 8 ) . A b e r r a n t W n t S i g n a l i n g i s k n o w n f o r i t s p r o m i n e n t r o l e i n c o l o r e c t a l c a n c e r ( K l a u s a n d B i r c h m e i e r , 2 0 0 8 ) , a s e p i g e n e t i c S i l e n c i n g o f W n t a n t a g o n i s t s ( e . g . , s e c r e t e d fi i z z l e d - r e l a t e d p r o t e i n s ) a n d a c t i v a t i n g m u t a t i o n s i n B - c a t e n i n o c c u r ( B a y l i n a n d O h m , 2 0 0 6 ) . B - c a t e n i n m u t a t i o n s a r e a l s o p r e v a l e n t i n D E N - i n i t i a t e d , P B - p r o m o t e d m o u s e l i v e r t u m o r s ( S c h w a r z e t a l . , 2 0 0 3 ) . F i n a l l y , a b n o r m a l N o t c h S i g n a l i n g c a n c o n t r i b u t e t o a v a r i e t y o f h u m a n m a l i g n a n c i e s i n a n o n c o g e n i c o r t u m o r s u p p r e s s i v e m a n n e r ( 8 0 1 6 3 e t a l . , 2 0 0 7 ) . W e a r e i n t e r e s t e d i n d e v e l o p i n g a p a t t e r n o f g e n e e x p r e s s i o n a n d D N A m e t h y l a t i o n t h a t c o u l d b e u s e d a s a n e a r l y b i o m a r k e r o f P B t r e a t m e n t . T h e c u r r e n t s t u d y t a k e s u s a s t e p i n t h a t d i r e c t i o n b y f o c u s i n g o n a s u b s e t o f t h e u n i q u e l y a c t i v e B 6 C 3 F ] g e n e s a t 2 a n d / o r 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t . C a n d i d a t e g e n e s i n c l u d e t h o s e w i t h d o c u m e n t e d r o l e s i n c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s ( C c n e 2 , C x c r 7 , G a d d 4 5 a , G a d d 4 5 b , I n h b a , L r p 5 , M l m e , W e e ] ) . O t h e r p o t e n t i a l c a n d i d a t e s i n c l u d e t h o s e g e n e s , p o s s e s s i n g t u m o r i g e n e s i s - r e l a t e d f u n c t i o n s , t h a t e x h i b i t e d u n i q u e R A M S s o l e l y i n t h e B 6 C 3 F ] g r o u p ( C m a l , R a l g d s , T g f b r z ; f r o m P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) , a n d c o m m o n R A M S w i t h t h e s a m e m e t h y l a t i o n s t a t u s i n b o t h l i v e r t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 a n d C A R W T m i c e ( B c a t 2 , D d x 5 4 , S r m s , W s c d ] , Z s c a n 2 2 ; fi o m P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 ) . E f f o r t s h a v e b e e n m a d e t o i d e n t i f y e x p r e s s i o n s i g n a t u r e s o f n o n g e n o t o x i c r o d e n t h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . I i d a e t a l . ( 2 0 0 5 ) e v a l u a t e d h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n i n B 6 C 3 F 1 m i c e t r e a t e d f o r 2 w e e k s w i t h o x a z e p a m . T w o o f t h e 6 g e n e s w h i c h w e r e u p - r e g u l a t e d , e x c l u d i n g t h o s e i n v o l v e d i n d r u g m e t a b o l i s m , ( G a d d 4 5 b a n d M a fi ) , a n d 1 o f t h e 3 w h i c h w e r e d o w n - r e g u l a t e d ( T s c - 2 2 ) m a t c h e d o u r r e s u l t s . F i e l d e n e t a l . ( 2 0 0 7 ) r e p o r t e d a 3 7 g e n e s i g n a t u r e b a s e d o n e x p r e s s i o n d a t a fi ' o m r a t s ( w h i c h a r e n o t a s r e s p o n s i v e t o P B - 1 4 8 i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s a s t h e s u s c e p t i b l e s t r a i n s / s t o c k s o f m i c e ) t r e a t e d f o r 5 d a y s w i t h o n e o f a v a r i e t y o f n o n g e n o t o x i c c o m p o u n d s . O n l y o n e o f t h e s e ( U s p 2 ) w a s a c t i v e i n o u r s t u d y . H o w e v e r , t h e d i r e c t i o n o f c h a n g e w a s o p p o s i t e a n d , t h u s , t h e r e w e r e n o r e a l m a t c h e s . O u r a p p r o a c h f o r e l u c i d a t i n g P B - i n d u c e d g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s t h a t m i g h t b e u s e f u l b i o m a r k e r c a n d i d a t e s i s m o r e a p p r o p r i a t e t h a n w h a t i s i n t h e l i t e r a t u r e c u r r e n t l y b e c a u s e w e a r e “ s u b t r a c t i n g o u t ” t h o s e a l t e r a t i o n s t h a t o c c u r r e d i n t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e , a n d t h u s , a r e f o c u s i n g u p o n c h a n g e s i n t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 t h a t m i g h t t r u l y b e r e l a t e d d i r e c t l y t o t u m o r i g e n e s i s . T h e R N A u t i l i z e d f o r g e n e e x p r e s s i o n a n a l y s i s w a s i s o l a t e d fi ' o m w h o l e l i v e r . T h u s , t h e e x p r e s s i o n p a t t e r n s a r e p r e s u m a b l y d e r i v e d f r o m m u l t i p l e c e l l t y p e s ( e . g . , h e p a t o c y t e s , s i n u s o i d a l e p i t h e l i a l c e l l s , K u p f f e r c e l l s ) , w h i c h c o u l d p a r t i a l l y e x p l a i n c h a n g e s t h a t d o n o t a p p e a r t o o b v i o u s l y c o r r e l a t e w i t h o v e r a l l e n h a n c e m e n t o r i n h i b i t i o n o f a p r o c e s s ( e . g . , g e n e s t h a t p o s i t i v e l y r e g u l a t e a n g i o g e n e s i s a r e b o t h i n d u c e d a n d r e p r e s s e d , F i g . 3 a n d T a b l e s 2 . 6 a n d 2 . 7 ) . T h i s a p p r o a c h i s b e n e fi c i a l f o r a s c e r t a i n i n g e a r l y c h a n g e s t h a t a c c u m u l a t e i n m u l t i p l e c e l l s , i n c l u d i n g p o t e n t i a l t u m o r p r o g e n i t o r s , s u c h a s s t e m c e l l s ( R e y a e t a l . , 2 0 0 1 ) , o r m a t u r e c e l l s ( e . g . , h e p a t o c y t e s ) t h a t h a v e d e - d i f f e r e n t i a t e d . I n d e e d , S i n c e h e p a t o c y t e s c a n p r o l i f e r a t e ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ; K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 a ; M i c h a l o p o l o u s , 2 0 0 7 ) a n d c a n b e r e p r o g r a m m e d t o a s t e m - l i k e p h e n o t y p e ( A o i e t a l . , 2 0 0 8 ) , i t i s p o s s i b l e t h a t a d u l t l i v e r c e l l s c a n r e v e r t i n t o a d e - d i f f e r e n t i a t e d s t a t e a n d s e r v e a s t h e t u m o r p r o g e n i t o r . I m p o r t a n t l y , t h i s n o t i o n i s n o t i n c o m p a t i b l e w i t h t h e a f o r e m e n t i o n e d s t e m c e l l t h e o r y . K i n a s e , p h o s p h a t a s e , p h o s p h a t a s e a c t i v a t o r ( r e g u l a t o r y s u b u n i t ) , a n d p h o s p h a t a s e r e g u l a t o r y ( i n h i b i t o r ) g e n e s , w h i c h w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n t h e t u m o r - s u s c e p t i b l e 1 4 9 B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s , a r e l i s t e d i n T a b l e 2 . 8 . I n t h i s c o n t e x t i t i s i n s t r u c t i v e t o n o t e t h a t p h o s p h o r y l a t i o n a n d d e p h o s p h o r y l a t i o n e v e n t s ( K a w a m o t o e t a l . , 1 9 9 9 ; S u e y o s h i e t a l . , 2 0 0 8 ; Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 3 ) a r e n e c e s s a r y f o r C A R a c t i v a t i o n , a n d w e s p e c u l a t e t h a t P B m i g h t a f f e c t e x p r e s s i o n l e v e l s o f g e n e s i n v o l v e d . I n d u c t i o n o f k n o w n C A R t a r g e t g e n e s w a s o b s e r v e d ( F i g . 4 ) . F u r t h e r m o r e , i n a h y p o t h e s i s g e n e r a t i n g f a s h i o n , p u t a t i v e C A R E S w e r e d i s c e r n e d w i t h i n a s u b s e t o f u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , p l u s m u l t i p l e g e n e s t h a t h a r b o r e d u n i q u e P B - e l i c i t e d B 6 C 3 F ] R A M S ( S u p p l e m e n t a r y T a b l e S 1 0 i n t h e a c c e p t e d m a n u s c r i p t ) . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t C A R m i g h t r e g u l a t e g e n e t r a n s c r i p t i o n a t 2 a n d 4 w e e k s . E x p r e s s i o n a n a l y s i s o f a s u b s e t o f g e n e s t h a t e x h i b i t e d u n i q u e R A M S i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e ( T a b l e 2 . 9 ) r e v e a l e d s e v e r a l ( B c a t 2 , B c 1 2 1 1 3 , U b e Z d I ) w h o s e l e v e l s w e r e u n i q u e a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 g r o u p , s u g g e s t i n g t h a t t h e y m i g h t b e i m p o r t a n t f o r t u m o r f o r m a t i o n , p a r t i c u l a r l y t h e a p o p t o s i s - i n d u c e r B c 1 2 1 1 3 . F o r o t h e r s ( S r m s a n d T r i o ) , t h e e x p r e s s i o n p a t t e r n s w e r e n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t i n t h e B 6 C 3 F l a n d C 5 7 B L / 6 m i c e , a n d t h e r e f o r e , i n t h e c a s e o f T r i o , w h i c h h a s b e e n l i n k e d t o c a n c e r , t h e e x p r e s s i o n c h a n g e m i g h t b e n e c e s s a r y , b u t n o t s u f fi c i e n t , f o r t u m o r f o r m a t i o n . F o r n u m e r o u s g e n e s , d e c r e a s e d m e t h y l a t i o n w a s a s s o c i a t e d w i t h d e c r e a s e d e x p r e s s i o n . T h i s r e s e m b l e s t h e s i t u a t i o n f o r t h e i m p r i n t e d i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r t y p e - 2 ( I n g r ) g e n e , i n w h i c h h y p o m e t h y l a t i o n o f a n i n t r o n i c C p G i s l a n d i s a s s o c i a t e d w i t h p a t e r n a l s i l e n c i n g , w h i l e m e t h y l a t i o n a p p e a r s t o f a c i l i t a t e m a t e r n a l e x p r e s s i o n ( W u t z e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e r e o fi e n i s n o t a n a s s o c i a t i o n b e t w e e n e x p r e s s i o n a n d t h e g e n o m i c l o c a t i o n o f t h e D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e ( T a b l e 2 . 9 ) . T h e a p p r o a c h t a k e n t o d i s c e r n u n i q u e B 6 C 3 F l R A M S i s u n b i a s e d , i n t h e s e n s e t h a t r e g i o n s t o b e a s s a y e d a r e n o t p r e - d e t e n n i n e d 1 5 0 ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h u s , m e t h y l a t i o n c h a n g e s w e r e a s c e r t a i n e d i n v a r i o u s g e n o m i c l o c a t i o n s ( n o t o n l y p r o m o t e r s ) t h a t c o u l d p o t e n t i a l l y i n fl u e n c e e x p r e s s i o n . I t i s p o s s i b l e t h a t n u m e r o u s r e g u l a t o r y e l e m e n t s , i n c l u d i n g r e g i o n s i n w h i c h R A M S o c c u r r e d , f u n c t i o n i n c o n c e r t t o c o n t r o l e x p r e s s i o n . A d d i t i o n a l l y , m u l t i p l e m e t h y l a t i o n c h a n g e s m a y b e r e q u i r e d t o a f f e c t e x p r e s s i o n o f a g e n e a n d n o t a l l m i g h t h a v e a c c u m u l a t e d w i t h i n 4 w e e k s . I n t h e s e i n s t a n c e s , a n o b v i o u s l i n k b e t w e e n e x p r e s s i o n s t a t u s a n d t h e l o c a t i o n o f a R A M m i g h t n o t b e a p p a r e n t . I n g e n e r a l , t h e r e w a s g o o d a g r e e m e n t b e t w e e n t h e m i c r o a r r a y a n d q R T - P C R d a t a ( T a b l e s 2 . 4 a n d 2 . 5 ) . H o w e v e r , d i s c r e p a n c i e s b e t w e e n t h e s e 2 t e c h n i q u e s a r e o f t e n e n c o u n t e r e d ( E t i e n n e e t a l . , 2 0 0 4 ; M o r e y e t a l . , 2 0 0 6 ) , a n d t h e r e w e r e a f e w i n s t a n c e s w h e n t h e e x p r e s s i o n s t a t u s e s o f g e n e s , i d e n t i fi e d a s u n i q u e l y a c t i v e i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e b y m i c r o a r r a y a n a l y s i s , w e r e n o t c o n fi r m e d b y q R T - P C R ( T a b l e s 2 . 4 a n d 2 . 5 ) . N o n e t h e l e s s , t h e o v e r a l l v a l i d i t y o f t h e m i c r o a r r a y d a t a i s s u p p o r t e d b y t h e o b s e r v e d i n d u c t i o n o f t y p i c a l P B - r e s p o n s i v e g e n e s i n b o t h t h e B 6 C 3 F l a n d C 5 7 B L / 6 g r o u p s a t 2 a n d 4 w e e k s ( T a b l e 2 . 3 ) . F u r t h e r m o r e , o u r d a t a r e i n f o r c e p u b l i s h e d r e s u l t s t h a t d e m o n s t r a t e P B - e l i c i t e d i n d u c t i o n o f G a d d 4 5 , 8 ( P e f f e r e t a l . , 2 0 0 7 ) , q u I a n d A l a s ] ( U e d a e t a l . , 2 0 0 2 ) , a n d A b c c 3 , D i o ] , G n a 1 4 , L c n 2 , P a r , a n d T h r s p , p l u s r e p r e s s i o n o f A r n t l ( S t a h l e t a l . , 2 0 0 5 ) . A l l o f t h e s e w e r e a l t e r e d i n t h e s a m e d i r e c t i o n s i n t h e B 6 C 3 F l a t 2 o r 4 w e e k s ( S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S 3 G a n d S 3 1 , i n t h e a c c e p t e d m a n u s c r i p t ) . C o n t r a s t i n g l y , d i f f e r e n t e x p r e s s i o n p a t t e r n s o f s e v e r a l u n i q u e l y a c t i v e B 6 C 3 F 1 g e n e s ( C y p 4 a 1 0 , a n n a t ] , K r t 4 , P c k ] , a n d P k l r ) , a s c o m p a r e d t o U e d a e t a l . ( 2 0 0 2 ) , w e r e r e p o r t e d ( F i g . 4 ) . R e a s o n s f o r t h e s e i n c o n s i s t e n c i e s m i g h t b e d i f f e r e n c e s i n o u r m i c r o a r r a y p l a t f o r m s , t h e n u m b e r o f g e n e s / E S T S o n t h e a r r a y p l u s m o r e r e c e n t a n d 1 5 1 a c c u r a t e a n n o t a t i o n i n f o r m a t i o n , m o u s e s t r a i n / s t o c k , a n d / o r t h e m e t h o d / d u r a t i o n o f P B a d m i n i s t r a t i o n . I n s u m m a r y , t h i s e x t e n s i v e a n a l y s i s o f P B - e l i c i t e d e x p r e s s i o n a t v e r y e a r l y t i m e p o i n t s h a s r e v e a l e d n u m e r o u s u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 , a s c o m p a r e d t o r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e , m a n y o f w h i c h a r e i n v o l v e d i n k e y c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s ( F i g s . 2 - 5 ; T a b l e s 2 . 6 a n d 2 . 7 ) . S i g n i fi c a n t l y , g e n e s w h i c h d e m o n s t r a t e d u n i q u e R A M S i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) a l s o p a r t i c i p a t e i n s e v e r a l o f t h e s e p a t h w a y s ( F i g s . 2 - 5 ) , a n d f o r a s u b s e t , t h e i r e x p r e s s i o n l e v e l s i n t h e B 6 C 3 F 1 g r o u p s w e r e a f f e c t e d b y P B t r e a t m e n t . T h e u n i q u e r e p r e s s i o n o f 3 m a j o r D n m t g e n e s i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s p r o v i d e s a p o t e n t i a l d i r e c t l i n k b e t w e e n P B a n d t h e e x p r e s s i o n o f k e y g e n e s t h a t r e g u l a t e D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s . F u r t h e r m o r e , w e l o c a t e d p u t a t i v e C A R E S w i t h i n n u m e r o u s g e n e s t h a t w e r e a l t e r e d b y P B , i n c l u d i n g a l l 3 D n m t s , s u g g e s t i n g t h a t t h e s e m i g h t b e r e g u l a t e d b y C A R . W e p r o p o s e t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e g e n e s t h a t e x h i b i t e d u n i q u e c h a n g e s i n e x p r e s s i o n a n d / o r D N A m e t h y l a t i o n r e p r e s e n t i n i t i a l k e y , h e r i t a b l e c h a n g e s t h a t c o n f e r p r o l i f e r a t i v e a d v a n t a g e s t o c e l l s , r e s u l t i n g i n t h e p r o g r e s s i v e a c c u m u l a t i o n o f m o d i fi c a t i o n s a n d t h e p e r t u r b a t i o n o f S i g n a l i n g p a t h w a y s t h a t f a c i l i t a t e P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s . I t i s i n s t r u c t i v e t o r e fl e c t o n t h e p o s s i b i l i t y t h a t , i n a h y p o t h e s i s - d r i v e n f a s h i o n , t h e s e g e n e s r e p r e s e n t a p p r o p r i a t e c a n d i d a t e s t h a t c o u l d b e u t i l i z e d t o d e v e l o p a b i o m a r k e r “ fi n g e r p r i n t ” o f e a r l y e x p o s u r e t o P B a n d P B - l i k e c o m p o u n d s . 1 5 2 A C K N O W L E D G E M E N T S P r e d o c t o r a l f e l l o w s h i p s u p p o r t f o r J . M . P w a s r e c e i v e d f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h / N a t i o n a l I n s t i t u t e o f E n v i r o n m e n t a l H e a l t h S c i e n c e s t r a i n i n g g r a n t N o . T 3 2 - E S - 7 2 5 5 . R e s e a r c h s u p p o r t , i n t h e f o r m o f a n u n r e s t r i c t e d g i f t , f r o m t h e R . J . R e y n o l d s T o b a c c o C o m p a n y i s a c k n o w l e d g e d g r a t e f u l l y . W e t h a n k t h e M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y R e s e a r c h T e c h n o l o g y a n d S u p p o r t F a c i l i t y f o r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e w i t h t h e m i c r o a r r a y a n a l y s e s . R E F E R E N C E S A o i , T . , Y a e , K . , N a k a g a w a , M . , I c h i s a k a , T . , O k i t a , K . , T a k a h a s h i , K . , C h i b a , T . , a n d [ a Y a m a n a k a , S . ( 2 0 0 8 ) G e n e r a t i o n o f p l u r i p o t e n t s t e m c e l l s fi o m a d u l t m o u s e l i v e r a n d f ; ' s t o m a c h c e l l s . S c i e n c e 3 2 1 , 6 9 9 - 7 0 2 . " A y d i n l i k , H . , N g u y e n , T . D . , M o e m r i k e s , O . , B u c h m a n n , A . , a n d S c h w a r z , M . ( 2 0 0 1 ) . . S e l e c t i v e p r e s s u r e d u r i n g t u m o r p r o m o t i o n b y p h e n o b a r b i t a l l e a d s t o c l o n a l o u t g r o w t h o f I } B - c a t e n i n - m u t a t e d m o u s e l i v e r t u m o r s . O n c o g e n e 2 2 , 7 8 1 2 - 7 8 1 6 . B a c h m a n , A . N . , P h i l l i p s , J . M , a n d G o o d m a n J . I . ( 2 0 0 6 ) . P h e n o b a r b i t a l i n d u c e s p r o g r e s s i v e p a t t e r n s o f G C - r i c h a n d g e n e - s p e c i fi c a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n i n t h e l i v e r o f t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e . T o x i c o l . S c i . 9 1 , 3 9 3 - 4 0 5 . B a y l i n , S . B . , O h m , J . E . ( 2 0 0 6 ) E p i g e n e t i c g e n e s i l e n c i n g i n c a n c e r - a m e c h a n i s m f o r e a r l y o n c o g e n i c p a t h w a y a d d i c t i o n ? N a t . R e v . C a n c e r . 6 , 1 0 7 - 1 1 6 . B e c k e r , R F . ( 1 9 8 2 ) . M o r p h o l o g i c a l c l a s s i fi c a t i o n o f m o u s e l i v e r t u m o r s b a s e d o n b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . C a n c e r R e s . 4 2 , 3 9 1 8 - 3 9 2 3 . B o l o s , V . , G r e g o - B e s s a , J . , a n d d e l a P o m p a , J . L . ( 2 0 0 7 ) N o t c h s i g n a l i n g i n d e v e l o p m e n t a n d c a n c e r . E n d o c r . R e v . 2 8 , 3 3 9 - 3 6 3 . C h e n , Y . , F e r g u s o n , S . S . , N e g i s h i , M . , a n d G o l d s t e i n , J . A . ( 2 0 0 3 ) I d e n t i fi c a t i o n o f c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r a n d g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r b i n d i n g s i t e s i n t h e C Y P 2 C 1 9 p r o m o t e r . M o l . P h a r m a c o l . 6 4 , 3 1 6 - 3 2 4 . C o u n t s , J . L . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 ) A l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n m a y p l a y a v a r i e t y o f r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s . C e l l 8 3 , 1 3 - 1 5 . C o u n t s , J . L . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 7 ) . C o m p a r i s o n o f e f f e c t o f t u m o r p r o m o t e r t r e a t m e n t s o n D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d g e n e e x p r e s s i o n i n B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m o u s e l i v e r a n d i n B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . M 0 ] . C a r c i n o g . 1 8 , 9 7 - 1 0 6 . C o u n t s , J . L . , S a r m i e n t o , J . I . , H a r b i s o n , M . L . , D o w n i n g , J . C . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 6 ) . C e l l p r o l i f e r a t i o n a n d g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s c h a n g e s i n m o u s e 1 5 3 l i v e r a f t e r p h e n o b a r b i t a l a n d / o r c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e fi c i e n t d i e t a d m i n i s t r a t i o n . C a r c i n o g e n e s i s 1 7 , 1 2 5 1 - 1 2 5 7 . D a i , M . , W a n g , P . , B o y d , A . D . , K o s t o v , G . , A t h e y , B . , J o n e s , E . G . , B u n n e y , W . E . , M y e r s , R . M . , S p e e d , T . P . , A k i l , H . , W a t s o n , S . J . , a n d M e n g , F . ( 2 0 0 5 ) E v o l v i n g g e n e / t r a n s c r i p t d e fi n i t i o n s s i g n i fi c a n t l y a l t e r t h e i n t e r p r e t a t i o n o f G e n e C h i p d a t a . N u c l e i c A c i d s R e s . 3 3 , 1 7 5 . D e n n i s , G . J r . , S h e r m a n , B . T . , H o s a c k , D . A . , Y a n g , J . , G a o , W . , L a n e , H . C . , L e m p i c k i , R . A . ( 2 0 0 3 ) D A V I D : D a t a b a s e f o r A n n o t a t i o n , V i s u a l i z a t i o n , a n d I n t e g r a t e d D i s c o v e r y . G e n o m e B i o l . 4 , P 3 . E s t e l l e r , M . ( 2 0 0 7 ) C a n c e r e p i g e n o m i c s : D N A m e t h y l o m e s a n d h i s t o n e - m o d i fi c a t i o n I ] m a p s . N a t . R e v . G e n e t . 8 , 2 8 6 - 2 9 8 . ' E t i e n n e , W . , M e y e r , M . H . , P e p p e r s , J . , a n d M e y e r , R . A . J r . ( 2 0 0 4 ) C o m p a r i s o n o f - m R N A g e n e e x p r e s s i o n b y R T - P C R a n d D N A m i c r o a r r a y . B i o t e c h n i q u e s 3 6 , 6 1 8 - 2 0 , 6 2 2 , 6 2 4 - 6 2 6 . B F e i n b e r g A P , O h l s s o n R , H e n i k o f f S . ( 2 0 0 6 ) T h e e p i g e n e t i c p r o g e n i t o r o r i g i n o f h u m a n c a n c e r . N a t . R e v . G e n e t . 7 , 2 1 - 3 3 . F i e l d e n , M . R . , B r e n n a n , R . , a n d G o l l u b , J . ( 2 0 0 7 ) A g e n e e x p r e s s i o n b i o m a r k e r p r o v i d e s e a r l y p r e d i c t i o n a n d m e c h a n i s t i c a s s e s s m e n t o f h e p a t i c t u m o r i n d u c t i o n b y n o n g e n o t o x i c c h e r r r i c a l s . T o x i c o l . S c i . 9 9 , 9 0 - 1 0 0 . F o l k m a n , J . ( 2 0 0 2 ) R o l e o f a n g i o g e n e s i s i n t u m o r g r o w t h a n d m e t a s t a s i s . S e m i n . O n c o l . 2 9 , 1 5 - 1 8 . G e r b a l - C h a l o i n , S . , D a u j a t , M . , P a s c u s s i , J . M . , P i c h a r d - G a r c i a , L . , V i l a r e m , M . J . , a n d M a u r e l , P . ( 2 0 0 2 ) T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f C Y P 2 C 9 g e n e . R o l e o f g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r a n d c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r . J B i o l . C h e m . 2 7 7 , 2 0 9 - 2 1 7 . G o o d m a n , J . I . a n d W a t s o n , R E . ( 2 0 0 2 ) . A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n : A s e c o n d a r y m e c h a n i s m i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s . A n n u . R e v . P h a r m a c o l . T o x i c o l . 4 2 , 5 0 1 - 5 2 5 . G o o d w i n , B . , H o d g s o n , E . , D ' C o s t a , D . J . , R o b e r t s o n , G . R . , a n d L i d d l e , C . ( 2 0 0 2 ) T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f t h e h u m a n C Y P 3 A 4 g e n e b y t h e c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r . M o l . P h a r m a c o l . 6 2 , 3 5 9 - 6 5 . H a n a h a n D . a n d W e i n b e r g , G . F . ( 2 0 0 0 ) . T h e h a l l m a r k s o f c a n c e r . C e l l 1 0 0 , 5 7 - 7 0 . H o n k a k o s k i , P . , Z e l k o , I . , S u e y o s h i , T . , a n d N e g i s h i , M . ( 1 9 9 8 ) T h e n u c l e a r o r p h a n r e c e p t o r C A R - r e t i n o i d X r e c e p t o r h e t e r o d i m e r a c t i v a t e s t h e p h e n o b a r b i t a l - r e s p o n s i v e e n h a n c e r m o d u l e o f t h e C Y P Z B g e n e . M o l . C e l l . B i o l . 1 8 , 5 6 5 2 - 5 6 5 8 . 1 5 4 H u a n g , W . , Z h a n g , J . , W a s h i n g t o n , M . , L i u , J . , P a r a n t , J . M . , L o z a n o , G . , a n d M o o r e , D . D . ( 2 0 0 5 ) X e n o b i o t i c s t r e s s i n d u c e s h e p a t o m e g a l y a n d l i v e r t u m o r s v i a t h e n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r . M o l . E n d o c r i n o l . 1 9 , 1 6 4 6 - 1 6 5 3 . I i d a , M . , A n n a , C . H . , H o l l i d a y , W . M . , C o l l i n s , J . B . , C u n n i n g h a m , M . L . , S i l l s , R . C . , D e v e r e u x , T . R . ( 2 0 0 5 ) U n i q u e p a t t e r n s o f g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s i n l i v e r a fi e r t r e a t m e n t o f m i c e f o r 2 w e e k s w i t h d i f f e r e n t k n o w n c a r c i n o g e n s a n d n o n - c a r c i n o g e n s . C a r c i n o g e n e s i s 2 6 , 6 8 9 - 9 9 . K a w a r n o t o , T . , S u e y o s h i , T . , Z e l k o , 1 . , M o o r e , R . , W a s h b u r n , K . , a n d N e g i s h i , M . ( 1 9 9 9 ) _ P h e n o b a r b i t a l - r e s p o n s i v e n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f t h e r e c e p t o r C A R i n i n d u c t i o n o f t h e F “ C Y P Z B g e n e . M o l . C e l l . B i o l . 1 9 , 6 3 1 8 - 6 3 2 2 . K l a u s , A . , a n d B i r c h m e i e r , W . ( 2 0 0 8 ) W n t S i g n a l l i n g a n d i t s i m p a c t o n d e v e l o p m e n t a n d c a n c e r . N a t . R e v . C a n c e r 8 , 3 8 7 - 3 9 8 . K o l a j a , K . L . , S t e v e n s o n , D . E . , J o h n s o n J . T . , W a l b o r g , J r . , E . F . , a n d K l a u n i g , J . E . ( 1 9 9 6 a ) S u b c h r o n i c e f f e c t s o f d i e l d r i n a n d p h e n o b a r b i t a l o n h e p a t i c D N A s y n t h e s i s i n . . . . m i c e a n d r a t s . F u n d a m . A p p l . T o x i c o l . 2 9 , 2 1 9 - 2 2 8 . K o l a j a , K . L . , S t e v e n s o n , D . E . , W a l b o r g J r . , E . F . , a n d K l a u n i g J . E . ( 1 9 9 6 b ) . D o s e d e p e n d e n c e o f p h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n o f p r e n e o p l a s t i c h e p a t i c l e s i o n s i n F 3 4 4 r a t s a n d B 6 C 3 F 1 m i c e : e f f e c t s o n D N A s y n t h e s i s a n d a p o p t o s i s . C a r c i n o g e n e s i s 1 7 , 9 4 7 - 9 5 4 . L o e b , L . A . , a n d H a r r i s , C . C . ( 2 0 0 8 ) A d v a n c e s i n c h e m i c a l c a r c i n o g e n e s i s : a h i s t o r i c a l r e v i e w a n d p r o s p e c t i v e . C a n c e r R e s . 6 8 , 6 8 6 3 - 6 8 7 2 . L u c h , A . ( 2 0 0 5 ) N a t u r e a n d n u r t u r e - l e s s o n s f r o m c h e m i c a l c a r c i n o g e n e s i s . N a t . R e v . C a n c e r 5 , 1 1 3 - 1 2 5 . M a s s a g u é , J . ( 2 0 0 8 ) T G F B i n C a n c e r . C e l l 1 3 4 , 2 1 5 - 2 3 0 . M i c h a l o p o u l o s , G . K . ( 2 0 0 7 ) L i v e r r e g e n e r a t i o n . J . C e l l . P h y s i o l . 2 1 3 , 2 8 6 - 3 0 0 . M o e n n i k e s , O . , B u c h m a n n , A . , R o m u a l d i , A . , O t t , T . , W e r r i n g l o e r , J . , W i l l e c k e , K . , a n d S c h w a r z , M . ( 2 0 0 0 ) . L a c k o f p h e n o b a r b i t a l - m e d i a t e d p r o m o t i o n o f h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n c o n n e x i n 3 2 - n u l l m i c e . C a n c e r R e s . 1 5 , 5 0 8 7 - 5 0 9 1 . M o r e y , J . 8 . , R y a n , J . C . , a n d V a n D o l a h , F . M . ( 2 0 0 6 ) M i c r o a r r a y v a l i d a t i o n : f a c t o r s i n fl u e n c i n g c o r r e l a t i o n b e t w e e n o l i g o n u c l e o t i d e m i c r o a r r a y s a n d r e a l - t i m e P C R . B i o l . . P r o c e d . O n l i n e . 8 , 1 7 5 - 1 9 3 . P a p e t t i , M . , a n d H e r m a n , I . M . ( 2 0 0 2 ) M e c h a n i s m s o f n o r m a l a n d t u m o r - d e r i v e d a n g i o g e n e s i s . A m . J . P h y s i o l . C e l l . P h y s i o l . 2 8 2 , C 9 4 7 - 9 7 0 . 1 5 5 P e f f e r , R . C . , M o g g s , J . G . , P a s t o o r , T . , C u r r i e , R . A . , W r i g h t , J . , M i l b u r n , G . , W a e c h t e r , F . , a n d R u s y n , I . ( 2 0 0 7 ) M o u s e l i v e r e f f e c t s o f c y p r o c o n a z o l e , a t r i a z o l e f u n g i c i d e : r o l e o f t h e c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r . T o x i c o l . S c i . 9 9 , 3 1 5 - 3 2 5 . P h i l l i p s , J . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 8 ) I d e n t i fi c a t i o n o f g e n e s t h a t m a y p l a y c r i t i c a l r o l e s i n p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s d u e t o a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n . T o x i c o l . S c i . 1 0 4 , 8 6 - 9 9 . P h i l l i p s , J . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 9 ) M u l t i p l e g e n e s e x h i b i t p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) - m e d i a t e d D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s d u r i n g l i v e r t u m o r i g e n e s i s a n d i n l i v e r t u m o r s . T o x i c o l . S c i , i n p r e s s . P h i l l i p s , J . M . , Y a m a m o t o . Y , , N e g i s h i , M . , M a r o n p o t , K R . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 7 ) . O r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n d u r i n g p h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n o f l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T o x i c o l . S c i . 9 6 , 7 2 - 8 2 . P o d s y p a n i n a , K . , D u , Y . C . , J e c h l i n g e r , M . , B e v e r l y , L . J . , H a r n b a r d z u m y a n , D . , a n d V a r m u s , H . ( 2 0 0 8 ) S e e d i n g a n d p r o p a g a t i o n o f u n t r a n s f o r m e d m o u s e m a m m a r y c e l l s i n t h e l u n g . S c i e n c e 2 6 , 1 8 4 1 - 1 8 4 4 . R a n g a r a j a n , A . , a n d W e i n b e r g , R . A . ( 2 0 0 3 ) O p i n i o n : C o m p a r a t i v e b i o l o g y o f m o u s e v e r s u s h u m a n c e l l s : m o d e l l i n g h u m a n c a n c e r i n m i c e . N a t . R e v . C a n c e r 3 , 9 5 2 - 9 5 9 . R a y , J . S . , H a r b i s o n , M . L . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 4 ) A l t e r a t i o n s i n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d e x p r e s s i o n o f t h e r a f o n c o g e n e i n p h e n o b a r b i t a l - i n d u c e d a n d S p o n t a n e o u s B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . M o l . C a r c i n o g . 9 , 1 5 5 - 1 6 6 . R e y a , T . , M o r r i s o n , S . J . , C l a r k e , M . F . , a n d W e i s s m a n , I . L . ( 2 0 0 1 ) S t e m c e l l s , c a n c e r , a n d c a n c e r s t e m c e l l s . N a t u r e 4 1 4 , 1 0 5 - 1 1 1 . S c h w a r z , M . , W a n k e , 1 . , W u l b r a n d , U . , M o e n n i k e s , O . , a n d B u c h m a n n , A . ( 2 0 0 3 ) R o l e o f c o n n e x i n 3 2 a n d B - c a t e n i n i n t u m o r p r o m o t i o n i n m o u s e l i v e r . T o x i c o l . P a t h o l . 3 1 , 9 9 - 1 0 2 . S t a h l , S . , I t t r i c h , C . , M a r x - S t o e l t i n g , P . , K o h l e , C . , O t t , T . , B u c h m a n n , A . , a n d S c h w a r z , M . ( 2 0 0 5 ) E f f e c t o f t h e t u m o r p r o m o t e r p h e n o b a r b i t a l o n t h e p a t t e r n o f g l o b a l g e n e e x p r e s s i o n i n l i v e r o f c o n n e x i n 3 2 - w i l d - t y p e a n d c o n n e x i n 3 2 - d e fi c i e n t m i c e . I n t . J . C a n c e r 1 1 5 , 8 6 1 - 8 6 9 . S u e y o s h i , T . , K a w a r n o t o , T . , Z e l k o , 1 . , H o n k a k o s k i , P . , a n d N e g i s h i , M . ( 1 9 9 9 ) T h e r e p r e s s e d n u c l e a r r e c e p t o r C A R r e s p o n d s t o p h e n o b a r b i t a l i n a c t i v a t i n g t h e h u m a n C Y P Z B 6 g e n e . J . B i o l . C h e m . 2 7 4 , 6 0 4 3 - 6 0 4 6 . S u e y o s h i , T . , M o o r e , R . , S u g a t a n i , J . , M a t s u m u r a , Y . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 8 ) P P P 1 R 1 6 A , t h e m e m b r a n e s u b u n i t o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e 1 B , s i g n a l s n u c l e a r 1 5 6 t r a n s l o c a t i o n o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r . M o l . P h a r m a c o l . 7 3 , 1 1 1 3 - 1 1 2 1 . S u g a t a n i , J . , K o j i m a , H . , U e d a , A . , K a k i z a k i , S . , Y o s h i n a r i , K . , G o n g , Q . H . , O w e n s , 1 . S . , N e g i s h i , M . , a n d S u e y o s h i , T . ( 2 0 0 1 ) T h e p h e n o b a r b i t a l r e s p o n s e e n h a n c e r m o d u l e i n t h e h u m a n b i l i r u b i n U D P - g l u c u r o n o s y l t r a n s f e r a s e U G T 1 A ] g e n e a n d r e g u l a t i o n b y t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R . H e p a t o l o g y 3 3 , 1 2 3 2 - 1 2 3 8 . S u n , Y . V . , B o v e r h o f , D . R . , B u r g o o n , L . D . , F i e l d e n , M . R . , a n d Z a c h a r e w s k i , T . R . ( 2 0 0 4 ) C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f d i o x i n r e s p o n s e e l e m e n t s i n h u m a n , m o u s e a n d r a t g e n o m i c s e q u e n c e s . N u c l e i c A c i d s R e s . 3 2 , 4 5 1 2 - 4 5 2 3 . ' f ‘ T h i e r y , J . P . ( 2 0 0 2 ) E p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n s i n t u m o u r p r o g r e s s i o n . N a t . R e v . - - C a n c e r 2 , 4 4 2 - 4 5 4 . U e d a , A . , H a r n a d e h , H . K . , W e b b , H . K . , Y a m a m o t o , Y . , S u e y o s h i , T . , A f s h a r i , C . A . , L e h m a n n , J . M . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 2 ) D i v e r s e r o l e s o f t h e n u c l e a r o r p h a n r e c e p t o r C A R i n r e g u l a t i n g h e p a t i c g e n e s i n r e s p o n s e t o p h e n o b a r b i t a l . M o l . P h a r m a c o l . 6 1 , 1 - 6 . , . a ) " V o r c e , R . L . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 1 ) . H y p o m e t h y l a t i o n o f r a s o n c o g e n e s i n c h e m i c a l l y i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . T o x i c o l . E n v i r o n . H e a l t h . 3 4 , 3 6 7 - 3 8 4 . W a r n e r , K . A . , F e m s t r o m , M . J . , a n d R u c h , R . J . ( 2 0 0 3 ) I n h i b i t i o n o f m o u s e h e p a t o c y t e g a p j u n c t i o n a l i n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n b y p h e n o b a r b i t a l c o r r e l a t e s w i t h s t r a i n - S p e c i fi c h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . T o x i c o l . S c i . 7 1 , 1 9 0 - 1 9 7 . W a t s o n , R . E . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 2 ) E f f e c t s o f p h e n o b a r b i t a l o n D N A m e t h y l a t i o n i n G C - r i c h r e g i o n s o f h e p a t i c D N A f r o m m i c e t h a t e x h i b i t d i f f e r e n t l e v e l s o f s u s c e p t i b i l i t y t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T o x i c o l . S c i . 6 8 , 5 1 - 5 8 . W e i , P . , Z h a n g , J . , E g a n - H a fl e y , M . , L i a n g , S . , a n d M o o r e , D . D . ( 2 0 0 0 ) . T h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R m e d i a t e s s p e c i fi c x e n o b i o t i c i n d u c t i o n o f d r u g m e t a b o l i s m . N a t u r e 4 0 7 , 9 2 0 - 9 2 3 . W h y s n e r , J . , R o s s , P . M . , a n d W i l l i a m s , G . M . ( 1 9 9 6 ) . P h e n o b a r b i t a l m e c h a n i s t i c d a t a a n d r i s k a s s e s s m e n t : e n z y m e i n d u c t i o n , e n h a n c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n d t u m o r p r o m o t i o n . P h a r m a c o l . T h e r . 7 1 , 5 3 - 9 1 . W u , Z . , I r i z a r r y , R . A . , G e n t l e m a n , R . , M a r t i n e z - M u r i l l o , F . , a n d S p e n c e r , F . ( 2 0 0 4 ) A m o d e l b a s e d b a c k g r o u n d a d j u s t m e n t f o r o l i g o n u c l e o t i d e e x p r e s s i o n a r r a y s . J . A m . S t a t . A s s o c . 9 9 , 9 0 9 - 9 1 7 . W u t z , A . , S m r ' z k a , O . W . , S c h w e i f e r , N . , S c h e l l a n d e r , K . , W a g n e r , E . F . , B a r l o w , D . P . ( 1 9 9 7 ) I m p r i n t e d e x p r e s s i o n o f t h e I n g r g e n e d e p e n d s o n a n i n t r o n i c C p G i s l a n d . N a t u r e 3 8 9 , 7 4 5 - 7 4 9 . 1 5 7 Y a m a m o t o , Y . , K a w a r n o t o , T . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 3 ) T h e r o l e o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R a s a c o o r d i n a t e r e g u l a t o r o f h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n i n d e f e n s e a g a i n s t c h e m i c a l t o x i c i t y . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 4 0 9 , 2 0 7 - 2 1 1 . Y a m a m o t o , Y . , M o o r e , R . , G o l d s w o r t h y , T . L . , N e g i s h i , M . , a n d M a r o n p o t , R . R . ( 2 0 0 4 ) T h e o r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r i s e s s e n t i a l f o r l i v e r t u m o r p r o m o t i o n b y p h e n o b a r b i t a l i n m i c e . C a n c e r R e s . 6 4 , 7 1 9 7 - 7 2 0 0 . Y a n g , J . , M a n i , S . A . , a n d W e i n b e r g , R . A . ( 2 0 0 6 ) E x p l o r i n g a n e w t w i s t o n t u m o r m e t a s t a s i s . C a n c e r R e s . 6 6 , 4 5 4 9 - 4 5 5 2 . 1 5 8 C H A P T E R 2 A P P E N D I X D a t a w i t h i n t h e a p p e n d i x c o n s i s t o f : P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s o f t h e m i c r o a r r a y d a t a ( F i g . 2 . 6 ) , b o x p l o t d e p i c t i n g t h e d i s t r i b u t i o n o f m i c r o a r r a y d a t a ( F i g . 2 . 7 ) , m i c r o a r r a y d a t a o f c l a s s i c a l P B - i n d u c e d g e n e s ( T a b l e 2 . 3 ) , d a t a f r o m q R T - P C R a s s a y s o f u n i q u e l y a c t i v e B 6 C 3 F l g e n e s ( i d e n t i fi e d b y m i c r o a r r a y a n a l y s i s ) a t 2 ( T a b l e 2 . 3 ) a n d 4 ( T a b l e 2 . 4 ) w e e k s , u n i q u e l y a c t i v e B 6 C 3 F ] g e n e s t h a t S h o w d o c u m e n t e d c o n n e c t i o n s t o 5 c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s a t 2 ( T a b l e 2 . 6 ) a n d 4 ( T a b l e 2 . 7 ) w e e k s , u n i q u e l y a c t i v e k i n a s e , p h o s p h a t a s e , p h o s p h a t a s e a c t i v a t o r ( r e g u l a t o r y s u b u n i t ) , a n d p h o s p h a t a s e r e g u l a t o r y ( i n h i b i t o r ) g e n e s t h a t a r e c a n d i d a t e s f o r i n v o l v e m e n t i n P B - i n d u c e d C A R a c t i v a t i o n ( T a b l e 2 . 8 ) , a n d q R T - P C R d a t a f r o m g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e B 6 C 3 F 1 R A M s a t 2 a n d / o r 4 w e e k s ( T a b l e 2 . 9 ) . A s c h e m e t o c l a s s i f y P B - i n d u c e d R A M S i s f o u n d i n F i g . 2 . 8 . N o t e t h a t t h e s e d a t a a r e a s u b s e t o f t h e t o t a l S u p p l e m e n t a r y I n f o r m a t i o n t h a t c a n b e f o u n d i n t h e v e r s i o n o f t h i s m a n u s c r i p t t h a t i s i n p r e s s f o r p u b l i c a t i o n i n T o x i c o l o g i c a l S c i e n c e s i n 2 0 0 9 . 1 5 9 o u > 0 l 4 > t o o J < 1 < 0 r 2 2 C P 1 > < l C 5 7 B L / 6 C o n t r o l 2 w k s C 5 7 B L / 6 T r e a t e d 2 w k s C 5 7 B L / 6 C o n t r o l 4 w k s C 5 7 B L / 6 T r e a t e d 4 w k s B 6 C 3 F 1 C o n t r o l 2 w k s B 6 C 3 F 1 T r e a t e d 2 w k s ° B 6 C 3 F l C o n t r o l 4 w k s B 6 C 3 F l T r e a t e d 4 w k s A - 2 0 l o D - 4 0 - 2 0 0 2 0 4 O P C 1 F r g p ' r e 2 . 6 P r i n c i p l e C o m p o n e n t A n a l y s i s ( P C A ) o f G e n e E x p r e s s i o n P a t t e r n s o f I n d i v i d u a l B 6 C 3 F ] a n d C 5 7 B L / 6 M i c e W i t h i n C o n t r o l a n d P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - t r e a t e d G r o u p s a t 2 a n d 4 W e e k s . M i c r o a r r a y a n a l y s i s o f R N A i s o l a t e d f r o m l i v e r s o f t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] a n d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e l e f t u n t r e a t e d ( c o n t r o l ) , o r a d m i n i s t e r e d 0 . 0 5 % ( w / w ) P B i n d r i n k i n g w a t e r f o r 2 o r 4 w e e k s , w a s p e r f o r m e d . P C A o f d a t a f r o m i n d i v i d u a l B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m i c e d e p i c t s i m i l a r i t i e s a n d d i f f e r e n c e s o f t h e i r o v e r a l l g e n e e x p r e s s i o n p a t t e r n s . P C A i s a d i m e n s i o n r e d u c t i o n t e c h n i q u e t h a t c r e a t e s a x e s t h r o u g h t h e d a t a ( P r i n c i p a l C o m p o n e n t s ; P C ) t h a t a c c o u n t f o r v a r i a b i l i t y w i t h i n t h e d a t a s e t . P C l a c c o u n t s f o r t h e l a r g e s t v a r i a n c e , P C 2 i s o r t h o g o n a l t o P C I a n d a c c o u n t s f o r t h e n e x t l a r g e s t v a r i a n c e , a n d s o f o r t h , u n t i l a l l o f t h e v a r i a n c e i s e x p l a i n e d . D a t a f r o m 8 g r o u p s o f m i c e ( n = 6 , w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e B 6 C 3 F ] , 4 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p , n = 5 ) a r e s h o w n . D a t a f r o m 1 m o u s e i n t h e B 6 C 3 F ] , 4 - w e e k P B g r o u p w a s e x c l u d e d b e c a u s e i t d o e s n o t f a l l w i t h i n t h e b o u n d a r i e s o f t h i s c h a r t , a n d a s s u c h , i t w a s d e e m e d a n o u t l i e r a n d n o t u t i l i z e d f o r s u b s e q u e n t a n a l y s i s . T h e b l a c k b o x c o n t a i n s d a t a p o i n t s f o r 2 s e p a r a t e B 6 C 3 F 1 , 2 - w e e k c o n t r o l m i c e ; t h e y f a l l d i r e c t l y o n t o p o f o n e a n o t h e r . T h i s i m a g e i s p r e s e n t e d i n c o l o r . 1 6 0 5 1 0 1 . 0 0 > 0 0 0 0 0 ° ° ° a : o n o ° ° ° ° o L l l l l ' w i ' v ' ' I ‘ T ' F ' " l e . . . J — ~ _ _ _ T l l . l l l l t l l l l l l l l l ' l l l l l l . 1 . . . I l l l l l l l l l l l l l l l I l l l l l l l l l l I l l | l l l l l l l l l l l . l l l ‘ l l l l l l l l l l l l l l l l l I l l l l l l l l l ' l l l l l l l l l l l l l l l g l I l l l l l l l l l l l l ' l l l l l l I I . I I I I I I I , I i i l i i i l l l l r l l | , | . . . l l l l r l l l l l l r l l i l l L L L J J L L L L L L i l l g L L L L L A A A L L I L L * * * L L L L L L 4 4 L 1 * L L L J $ L I l l I l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l 1 2 3 4 2 4 5 6 1 3 0 1 2 3 1 4 5 6 2 4 5 6 7 ‘ 1 6 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6 5 5 1 1 2 3 3 1 1 3 3 4 1 * * - - . = - - - , = = = = - - { { { H I - ‘ l - l l l l n l F i g p r e 2 . 7 D i s t r i b u t i o n o f G e n e E x p r e s s i o n D a t a G e n e r a t e d f r o m I n d i v i d u a l B 6 C 3 F ] a n d C 5 7 B L / 6 M i c e W i t h i n C o n t r o l a n d P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - t r e a t e d G r o u p s a t 2 a n d 4 W e e k s . M i c r o a r r a y a n a l y s i s o f R N A i s o l a t e d f r o m l i v e r s o f t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 a n d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e l e f t u n t r e a t e d ( c o n t r o l ) , o r a d m i n i s t e r e d 0 . 0 5 % ( w / w ) P B i n d r i n k i n g w a t e r f o r 2 o r 4 w e e k s , w a s p e r f o r m e d . A “ b o x - a n d - w h i s k e r ” p l o t w a s u t i l i z e d t o e x p r e s s t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e d a t a . T h e i n d i v i d u a l a n i m a l s a r e l i s t e d b y g r o u p , a l o n g t h e b o t t o m o f t h e c h a r t , a n d t h e n o r m a l i z e d i n t e n s i t y v a l u e s ( i n 1 0 g 2 f o r m ) , f r o m t h e m i c r o a r r a y d a t a , a r e l i s t e d a l o n g t h e l e f t - h a n d s i d e . T h e w h i t e b a r s r e p r e s e n t t h e i n t e r q u a r t i l e r a n g e ( I Q R ) , w h i c h e x t e n d s f r o m t h e 2 5 t h t o t h e 7 5 t h p e r c e n t i l e s , a n d t h e h o r i z o n t a l b l a c k b a r s w i t h i n t h e I Q R r e p r e s e n t t h e m e d i a n v a l u e . T h e “ w h i s k e r s ” e n d a t + 1 . 5 * I Q R u n i t s . E v e r y d o t ( 0 ) b e y o n d t h e “ w h i s k e r s ” r e fl e c t s a n o u t l y i n g d a t a p o i n t . T h e 8 g r o u p s o f m i c e ( n = 6 ) i n c l u d e : B 6 C 3 F l c o n t r o l s a t 2 ( ‘ ) a n d 4 ( + ) w e e k s ; B 6 C 3 F l P B - t r e a t e d a t 2 ( I ) a n d 4 ( \ ) w e e k s ; C S 7 B L / 6 c o n t r o l s a t 2 ( l ) a n d 4 ( = ) w e e k s ; a n d C 5 7 B L / 6 P B - t r e a t e d a t 2 ( - ) a n d 4 ( { ) w e e k s . O n e B 6 C 3 F 1 4 - w e e k P B - t r e a t e d a n i m a l w h i c h w a s d e e m e d a n o u t l i e r , a n d o m i t t e d f r o m f u r t h e r a n a l y s i s , b e c a u s e i t f e l l o u t s i d e t h e b o u n d a r i e s o f t h e P r i n c i p l e C o m p o n e n t A n a l y s i s ( d i s c u s s e d i n t h e l e g e n d t o A p p e n d i x F i g u r e 2 ) , a l s o a p p e a r s d i f f e r e n t i n t h i s “ b o x a n d w h i s k e r ” p l o t ( A ) . 1 6 1 l 0 k b 2 k b 5 ’ T S S 3 ’ 2 k b l 0 k b 4 1 1 H I I I 1 H P 1 ) A s s o c i a t e d w i t h a g e n e A . W i t h i n a g e n e 1 . S p a n s t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e ( T S S ) a n d / o r 5 ’ u n t r a n s l a t e d r e g i o n I ' i i . E x o n " i i i . I n t r o n ‘ B . U p s t r e a m f r o m t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t S i t e i . 5 2 k b i i . § 1 0 k b a n d > 2 k b . C . D o w n s t r e a m f r o m l a s t e x o n / i n t r o n 1 7 " i . 5 2 k b i i . 5 1 0 k b a n d > 2 k b 2 ) > 1 0 k b a w a y f r o m e i t h e r t h e t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t S i t e o r t h e l a s t e x o n / i n t r o n 3 ) R e p e a t e l e m e n t : m u l t i p l e “ t o p ” h i t s a n d o n e / s e v e r a l a r e a s s o c i a t e d w i t h a g e n e ( s ) 4 ) R e p e a t e l e m e n t : m u l t i p l e “ t o p ” h i t s a n d n o h i t s a r e a s s o c i a t e d w i t h a g e n e ( s ) F ' g p r e 2 . 8 A S c h e m e t o C l a s s i n C l o n e d P C R P r o d u c t s t h a t R e p r e s e n t U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d B 6 C 3 F l R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) B a s e d o n t h e i r L o c a t i o n s W i t h i n t h e M o u s e G e n o m e a s D e t e r m i n e d b y B L A S T - l i k e S e q u e n c e A l i g n m e n t T o o l ( B L A T ) S e a r c h e s ( U C S C G e n o m e B r o w s e r ) . P C R p r o d u c t s r e p r e s e n t i n g u n i q u e B 6 C 3 F 1 R A M S w e r e c l o n e d a n d s u b j e c t e d t o B L A T s e a r c h e s . D e p e n d i n g o n w h e r e , i n r e l a t i o n t o a g e n e , t h e P C R p r o d u c t a l i g n e d , i t w a s a s s i g n e d a p a r t i c u l a r g e n o m i c c l a s s i fi c a t i o n . F o r e x a m p l e , a n y P C R p r o d u c t s d e s i g n a t e d a s l . B . i . a r e l o c a t e d l e s s t h a n o r e q u a l t o 2 k i l o b a s e s u p s t r e a m f r o m a n a n n o t a t e d g e n e . 1 6 2 T a b l e 2 . 3 G e n e s E n c o d i n g D r u g - M e t a b o l i z i n g E n z y m e s t h a t w e r e I d e n t i fi e d a s U n i q u e l y A c t i v e i n B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 M i c e F o l d C h a n g e ° G e n e a 2 W e e k s ° 4 W e e k s ° B 6 C 3 F l C 5 7 B L / 6 B 6 C 3 F ] C 5 7 B L / 6 C y p 2 b 1 0 1 8 9 9 . 1 T 4 6 2 4 1 1 0 7 6 . 8 T 5 8 4 1 C y p 2 b 9 1 2 7 . 0 1 8 2 . 2 T 2 7 . 4 1 1 0 3 . 0 C y p 2 b 1 3 1 1 8 . 3 3 7 . 1 1 1 2 . 5 1 7 6 . 6 G s t t 3 1 1 3 . 6 T 8 . 0 1 1 2 . 0 1 1 0 . 4 G s t a 2 1 4 . 7 T 2 . 8 1 3 . 8 1 2 . 5 “ R e p r e s e n t a t i v e g e n e s e n c o d i n g c l a s s i c a l P B - i n d u c e d d r u g - m e t a b o l i z i n g e n z y m e s t h a t w e r e i d e n t i fi e d a s b e i n g u n i q u e l y a c t i v e , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s ( a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s ) , i n l i v e r - t u m o r s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 a n d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s . F o l d c h a n g e o f g e n e e x p r e s s i o n ( T , i n d u c t i o n o r 1 , r e p r e s s i o n ) b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s . c T i m e p o i n t a t w h i c h t h e u n i q u e l y a c t i v e g e n e w a s d e t e c t e d . 1 6 3 . 0 . 1 1 6 8 0 0 0 . . 6 2 4 . - - 2 l l 1 . 6 . 1 1 6 1 7 5 . . 1 2 1 t c 2 c c b A 1 6 4 T a b l e 2 . 4 Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f t h e E x p r e s s i o n o f 1 8 G e n e s t h a t w e r e U n i q u e l y A c t i v e i n L i v e r s o f B 6 C 3 F ] M i c e a t 2 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t U n i q u e l y A c t i v e G e n e a t 2 W e e k s a F o l d C h a n g e B a s e d o n M i c r o a r r a y A n a l y s i s b q R T - P C R D a t a M e a n F o l d C h a n g e i n P B - t r e a t e d G r o u p c N o . o f a n i m a l s a b o v e u p p e r l i m i t o f 9 5 % C I o f c o n t r o l g r o u p d N o . o f a n i m a l s b e l o w l o w e r l i m i t o f 9 5 % C I o f c o n t r o l g r o u p d B 6 C 5 7 \ 0 m [ \ V ) O \ O m l \ I n C . ) 2 . 0 1 - 2 . 3 3 1 1 . 5 7 1 1 . 5 3 T L C . [ l . C . 1 - 1 3 1 1 1 . 0 . 1 2 . 2 6 l - 1 . 5 6 5 . 9 1 1 1 . 5 8 O O O O V O O O O W O W O 1 1 . 0 . O O N N W O V O O © O © C N l I L C . \ O V O I V O O O O O Q O N O W O 1 1 . 0 . 1 1 . 3 3 6 1 1 . 0 . § O \ O ~ M O v — O \ O O \ O O V ~ O O O W O O M O O O G o v - 4 0 ° s i h t , r e v e w o h ; 6 / L B 7 5 C e h t n i n e e s . t a e h c t i m n a 1 h t F 3 r e C h 6 g B i h e h e t b f o o t e s n r o a e n p i p n a o i ] s F s 3 e r C p 6 x B e e f h o t l n e i v e n l o i w s o s l e r y l p r x a e l f u c o i l t e r v a e p l a e o h t T e u . d d e e c m n r a fi c n fi o i c n g y i l s t n l e a c r i a t p s p i t a a t s s a h w c n a o e i r s t s o e n r p s x e E o h d 1 6 5 T a b l e 2 . 4 c o n t i n u e d Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f t h e E x p r e s s i o n o f 1 8 G e n e s t h a t w e r e U n i q u e l y A c t i v e i n L i v e r s o f B 6 C 3 F l M i c e a t 2 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t “ S e v e n t e e n u n i q u e l y a c t i v e g e n e s o b s e r v e d i n l i v e r s o f B G C 3 F 1 m i c e o n l y a t 2 w e e k s , a s u b s e t o f t h e 2 3 4 i d e n t i fi e d b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s ( a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s ) , w e r e c h o s e n f o r c o n fi r m a t i o n o f t h e i r e x p r e s s i o n s t a t u s e s b y q R T — P C R . A d d i t i o n a l l y , I ( o f t h e 4 7 t o t a l ) u n i q u e l y a c t i v e c a r r y f o r w a r d g e n e s ( i . e . i t s i n d u c t i o n o r r e p r e s s i o n w a s o b s e r v e d i n t h e B 6 C 3 F ] a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s ) , i n d i c a t e d b y t h e p l u s s i g n ( + ) , w a s a s s a y e d a t 2 w e e k s . b F o l d c h a n g e s o f g e n e e x p r e s s i o n a r e e x p r e s s e d a s a c h a n g e i n a p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - t r e a t e d g r o u p v . i t s t i m e - m a t c h e d c o n t r o l ( u p - r e g u l a t i o n , T o r d o w n - r e g u l a t i o n , 1 ) . T h o s e t h a t a r e h i g h l i g h t e d i n g r a y w e r e c o n fi r m e d , o r a p p a r e n t l y c o n fi r m e d , b y q R T - P C R ( a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s ) . ( - ) i n d i c a t e s t h a t a g e n e w a s n o t a c t i v e . c A l l f o l d c h a n g e s l i s t e d a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t i n a P B - t r e a t e d g r o u p v . i t s t i m e - m a t c h e d c o n t r o l ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) . N o c h a n g e ( n . c . ) i n d i c a t e s t h a t t h e f o l d c h a n g e w a s n o t s i g n i fi c a n t . d T h e 9 5 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l ( C I ) o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a w a s c a l c u l a t e d , a n d t h e n u m b e r o f s a m p l e s ( o u t o f 6 t o t a l ) f r o m a P B - t r e a t e d g r o u p t h a t f e l l o u t s i d e t h e 9 5 % C I a r e l i s t e d . H i g h l i g h t e d i n g r a y a r e t h o s e c i r c u m s t a n c e s w h e r e d a t a f r o m a t l e a s t 3 o f t h e s a m p l e s t h a t f e l l o u t s i d e t h e 9 5 % C I o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a w e r e c o n s i d e r e d a n ‘ i n d i c a t i o n o f a c h a n g e ’ , t h u s a p p a r e n t l y c o n fi r m i n g t h e m i c r o a r r a y d a t a ( s e e f o o t n o t e ‘ g ’ ) . e E x p r e s s i o n w a s n o t c o n fi r m e d , s i n c e t h e f o l d c h a n g e s i n t h e B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m i c e w e r e n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) . f E x p r e s s i o n w a s c o n fi r m e d , s i n c e t h e f o l d c h a n g e s i n t h e B 6 C 3 F l a n d C 5 7 B L / 6 m i c e w e r e s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) . g E x p r e s s i o n w a s a p p a r e n t l y c o n fi r m e d . d p u o r g l o r t n o c d p u o r g b s i s y l a n A . c . n 2 3 . 2 T 1 6 6 T a b l e 2 . 5 Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f t h e E x p r e s s i o n o f 1 1 G e n e s t h a t w e r e U n i q u e l y A c t i v e i n L i v e r s o f B 6 C 3 F ] M i c e a t 4 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t g y r - P C R D a t a F o l d C h a n g e - . . N o . o f a n i m a l s a b o v e u p p e r N o . o f a n i m a l s b e l o w U m q u e l y A c t i v e B a s e d o n M e a n F o l d C h a n g e I n . . . . G e n e a t 4 W e e k s “ M i c r o a r r a y P B - t r e a t e d G r o u p “ l i m i t o f 9 5 % C I o f c o n t r o l l o w e r h m r t o f 9 5 % C I o f B 6 C 5 7 B 6 l \ W O \ O m l \ W U 1 4 . 5 7 l — 3 . 1 4 E h b 4 2 . 2 4 1 , - 1 . 2 5 n . c . V O O O V { 1 . 7 0 n o n . c . l - 1 . 2 0 1 1 . 4 3 1 - 1 . 3 6 n . c . l - 4 . 9 9 P p a r g c l a 2 . 3 4 n . c . n . c . S h - 2 . 5 1 l - 1 . 9 4 n c T 1 . 6 4 T 1 : 5 6 o ~ o o < r x o x o m o o ~ o v o o o o m — l m o o m o o — o o o — ‘ N m o \ O “ O V I O T 3 . 7 2 n . c . 1 6 7 T a b l e 2 . 5 c o n t i n u e d Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f t h e E x p r e s s i o n o f 1 1 G e n e s t h a t w e r e U n i q u e l y A c t i v e i n L i v e r s o f B 6 C 3 F l M i c e a t 4 W e e k s o f P h e n o b a r b i t a l ( P B ) T r e a t m e n t “ T e n u n i q u e l y a c t i v e g e n e s o b s e r v e d i n l i v e r s o f B 6 C 3 F 1 m i c e o n l y a t 4 w e e k s , a s u b s e t o f t h e 8 6 i d e n t i fi e d b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s ( a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s ) , w e r e c h o s e n f o r c o n fi r m a t i o n o f t h e i r e x p r e s s i o n s t a t u s e s b y q R T - P C R . A d d i t i o n a l l y , I ( o f t h e 4 7 t o t a l ) u n i q u e l y a c t i v e c a n ' y f o r w a r d g e n e s ( i . e . i t s i n d u c t i o n o r r e p r e s s i o n w a s o b s e r v e d i n t h e B 6 C 3 F ] a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s ) , i n d i c a t e d b y t h e p l u s s i g n ( + ) , w a s a s s a y e d a t 4 w e e k s . b F o l d c h a n g e s o f g e n e e x p r e s s i o n a r e e x p r e s s e d a s a c h a n g e m a p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - t r e a t e d g r o u p v . i t s t i m e - m a t c h e d c o n t r o l ( u p - r e g u l a t i o n , T o r d o w n - r e g u l a t i o n , 1 ) . T h o s e t h a t a r e h i g h l i g h t e d 1 n g l a y w e r e c o n f u m e d , o r a p p a r e n t l y c o n fi r m e d , b y q R T — P C R . ( - ) i n d i c a t e s t h a t a g e n e w a s n o t a c t i v e . c A l l f o l d c h a n g e s l i s t e d a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t i n a P B - t r e a t e d g r o u p v . i t s t i m e - m a t c h e d c o n t r o l ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) . N o c h a n g e ( n . c . ) i n d i c a t e s t h a t t h e f o l d c h a n g e w a s n o t s i g n i fi c a n t . d T h e 9 5 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l ( C I ) o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a w a s c a l c u l a t e d , a n d t h e n u m b e r o f s a m p l e s ( o u t o f 6 t o t a l ) f r o m a P B - t r e a t e d g r o u p t h a t f e l l o u t s i d e t h e 9 5 % C 1 a r e l i s t e d . H i g h l i g h t e d 1 n g r a y a r e t h o s e c i r c u m s t a n c e s w h e r e d a t a f r o m a t l e a s t 3 o f t h e s a m p l e s t h a t f e l l o u t s i d e t h e 9 5 % C I o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a w e r e c o n s i d e r e d a n ‘ i n d i c a t i o n o f a c h a n g e ’ , t h u s a p p a r e n t l y c o n f i r m i n g t h e m i c r o a r r a y d a t a ( s e e f o o t n o t e ‘ e ’ ) . e E x p r e s s i o n w a s a p p a r e n t l y c o n fi r m e d . f E x p r e s s i o n w a s n o t c o n fi r m e d , s i n c e t h e f o l d c h a n g e s i n t h e B 6 C 3 F l a n d C 5 7 B L / 6 m i c e w e r e n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) . y l e u q ) ) a s ) ) , , ) ) ) g ) s ) s ) g s g g ( i , s ( ( ( g ) , ( i ( ( ) ) g n ) ( s ( l ( 3 s ( o ( 4 s g n p l 2 ( s g ( ) s U p e k s r a p k n m x r k i c r f n r h S P b p i a C r G A B e F D T n l E P S l 2 d ( l 3 a l 3 r l n a f fi m o 3 a l 8 s c i a w t a h T B ) m ) . s i ) ) , . ) t g m s ) , , g ) a s ) m , i , ) a s ) ( , s g , ) _ s s s , g s ( ) ( ) s ) ) ) , i ( g l , ( d s ( ) , a l 4 r ( d ( g g ( g 5 ( s g l b l ( ( t , ( s g 3 g , , g ( , ( l a w 2 ( ( 5 d 4 4 3 p e l t a d 2 2 f b k p t k l r l p n c r g n b i l t a a g b 2 n x d a r c e e a k n c s t a d c a c y n G o A c L T K C A D C C a H D P S B R F d e i r r a C h c i h w ) a } , ) ) ) s ) s ) s s g 3 ( S ( g , , ) ) ( e { ( g g g s o h t a P b 3 h 1 7 ) s ) ( l 4 2 g 1 h a a r ( l 2 4 m ( ( a l 6 c 2 c h d b 3 r c d d n d ) ( ( ( g r a P a d a n a e r h p M P P c I B I W C N t g s n k i e d u e l W c n 2 I r o , f s e ) n B e P G ( d l n a a t i s b e r s a s b e o c n o e r h P P d h e t t i a w l e t r n - e r m e t c a n e a C r T 5 g n n e i e w o w l t l e o B s n o F s e n e e ) c i u e q g i i t M c e 1 d s n k u e e l 4 n w F n o 3 a 3 t 2 - 2 C o C f T , 6 o 6 B . n 2 i e e l v b i a t T c A ] F t u o 3 ( C 6 B 1 6 8 G e n e s t h a t E N H A N C E g r o w t h , s u r v i v a l , a n g i o g e n e s i s , i n v a s i o n , m e t a s t a s i s b G e n e s t h a t S U P P R E S S g r o w t h , s u r v i v a l , a n g i o g e n e s i s , i n v a s i o n , m e t a s t a s i s b T C l 0 C T 3 2 g = 2 3 , a = 7 , m = 4 , s = l 8 , i = 6 3 3 g = 2 1 , a = 3 , m = 3 , s = 2 2 , i = 5 D d i t 4 ( s ) K c n k 5 ( s ) G p r l 8 2 ( g , i ) C c n e 2 ( g ) C e b p b ( g , s l T k l ( g ) P s c d l ( g ) N g e f ( g ) C x c r 7 ( g , s , a , i , m ) C t g f ( s , a , m ) q u 1 ( g , a , i , m ) S l c 3 7 a 4 ( s , i ) G a b p a ( g ) a n n a t l ( g ) S h m t l ( g ) H y a l ] ( g , a ) B r a p ( s ) T n f s f l 0 1 § , t n , i ) P c t p ( s ) A n g p t l 4 ( s , a , m ) F k b p S ( g , s ) c G a d d 4 5 b ( g , s ) M k n k 2 ( g , s ) D c l r e 1 a ( s ) S t 3 g a 1 5 ( g ) P e x 1 1 b ( s ) P i k 3 a p l ( g , s ) B l n k ( g , s ) S P 3 ( g ) H m o x l ( g , s ) S h e l ( 2 , 5 , 8 ) a n l ( g ) M a p 3 k 7 i p 2 ( s ) “ 3 ( s , a , m ) D n m t 3 b 1 g ) t h d l ( g , s ) C l d n l ( g , i , m ) I n h b a ( g ) P d g f c ( g ) C l o c k ( g ) I n s i g 2 ( g , s , i ) P n k d ( g ) , 3 = a , 6 2 = g 8 3 : ) s e n e g l F 3 C 6 B 1 6 9 T a b l e 2 . 6 c o n t i n u e d C o n n e c t i o n s B e t w e e n 5 C a n c e r - r e l a t e d P r o c e s s e s a n d G e n e s , I n c l u d i n g t h o s e w h i c h C a r r i e d F o r w a r d , t h a t w e r e U n i q u e l y A c t i v e i n B 6 C 3 F 1 M i c e F o l l o w i n g T r e a t m e n t w i t h P h e n o b a r b i t a l ( P B ) f o r 2 W e e k s 3 d T o t a l s 9 g = 7 , a = 0 , 2 g = 1 , a = 1 , l g = 1 , a = “ “ “ m m r y m m a r d m = 0 , s = 5 , i = 0 m = 0 , s = 1 , i = l m = 0 , s i D O H 4 S ] 1 4 ( g ) P fl d b 3 ( g ) D d a h l ( g , a ) T f f 3 ( g ) A r 1 6 i p 5 ( g , s ) D n a j a l ( s ) P i m 3 ( g , s ) T f B ( s , i ) F h i t ( g , s ) H s p a l b ( s ) P p a t ( g ) M o r c 3 ( g ) N r g 4 ( g ) S h 3 b p 2 ( g , s ) P e r l ( g , s ) P b e f l ( g , s ) P e r 2 ( g , s ) d T o t a l s 4 1 g = 3 0 , a = 7 , 1 7 g : 1 4 , 2 1 : g 1 5 1 0 , s = 7 , ' = 0 m = 3 , s = 2 6 , i = 5 2 ( o u t O f 2 8 1 u n i q u e = 4 = 2 3 ' = 6 = 2 = ' = 4 B 6 C 3 F ] , 2 - w e e k g e m ) m ’ S ’ 1 m ’ S ’ " U n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n l i v e r s o f B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 w e e k s , i n c l u d i n g t h o s e t h a t c a r r i e d f o r w a r d ( i . e . e x h i b i t e d s i m i l a r e x p r e s s i o n c h a n g e s , e i t h e r i n d u c t i o n o f r e p r e s s i o n , a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s ) , w e r e i d e n t i fi e d a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s . Q u a n t i t a t i v e r e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) w a s p e r f o r m e d o n a s u b s e t o f t h e s e ( s e e A p p e n d i x T a b l e 2 f o r t h e c o m p l e t e d a t a s e t ) , d e n o t e d h e r e i n b o l d e d f o n t , a n d g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n c h a n g e s w e r e c o n fi r m e d a r e u n d e r l i n e d . b F u n c t i o n a l a n n o t a t i o n r e v e a l e d a s s o c i a t i o n s b e t w e e n k e y c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s ( g r o w t h : g , s u r v i v a l : s , a n g i o g e n e s i s : a , i n v a s i o n : i , a n d m e t a s t a s i s : m ) a n d m a n y o f t h e 2 8 1 t o t a l u n i q u e l y a c t i v e g e n e s a t 2 w e e k s , w h i c h i n c l u d e g e n e s o b s e r v e d o n l y a t 2 w e e k s , p l u s c a r r y f o r w a r d g e n e s . c G e n e s y m b o l s a r e l i s t e d i n a p a r t i c u l a r c o l u m n b a s e d o n w h e t h e r t h e l i t e r a t u r e i n d i c a t e s t h a t t h e g e n e e n h a n c e s o r s u p p r e s s e s a p a r t i c u l a r p r o c e s s , a n d g e n e s a r e f u r t h e r c l a s s i fi e d d e p e n d i n g o n w h e t h e r t h e i r e x p r e s s i o n i s i n d u c e d ( T ) o r r e p r e s s e d ( l ) b y P B t r e a t m e n t . N o t e t h a t a g e n e w h i c h s u p p r e s s e s g r o w t h o r s u r v i v a l c a n d o s o b y p r o m o t i n g a p o p t o s i s a n d / o r c e l l d e a t h . d T h e t o t a l n u m b e r o f g e n e s i n e a c h o f t h e s p e c i fi c c a t e g o r i e s i s d e p i c t e d i n b o l d . T h o s e t o t a l s n o t l i s t e d i n b o l d r e p r e s e n t t h e g e n e s , w i t h i n a c a t e g o r y , t h a t c a n p a r t i c i p a t e i n o n e o r m o r e c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s . y l e u q i , l , n a 1 U v b = i s e v a r r i e u w ’ s a 0 s , t , t s 1 1 a a = h h t t g t w e m , o d r , r g n a o w S i r s o F S a E v n R d i e P i r , P s i 5 1 r U 1 a C s S e = ' t n a h e a c g ) s i t o i f g ( h , h w e s s g n a e n o e h G = ) g ( n g u s l / d n 2 2 t 6 r a c m o s m T g s n k i d e u e l W c n 4 , I r o l a v , b f s s i e i ) v r n B s u “ e P a s i G ( t d a l h n t a , s a t i t w o e m s n b 3 e r r , I s a g n s b e o E c n o e C o i s a v r h P P N n i ) a ( ) i , a , d h a s A ) ) , ) e t , 3 s 3 s g , ( ) l ( , t ( i s = c g S = ( 9 ( H g a N w i g ] l b 3 s r a h e , t E b c e a , a t d j i b 4 r n n p h a t 8 n 9 a n - e e ° a M D P R p B r m 1 = g = E h ) e o t m t s c a i , g n g e s a n , ) s ) i , s , ) s s r e l g ( , ) C a ( ( g ) s T n 5 g e n n G e i e w w o l t l e o B F s 6 = 2 ( g ( 1 m 8 l l b p ( 1 h h s 3 4 p l r k p e s h h l t e H T B P P W ) s e e n n c e o g i i t M c e 1 n F n 3 o C C 6 7 B . n 2 i e e l v b i a t T c A k e e w - 4 , ] F 3 C 6 B T o t a l s d ( o u t o f 8 6 u n i q u e m = l , s = 1 1 , i = 3 F d fi l ( g , s ) F g l l ( g ) A m t ] ( g ) P p a p 2 c ( s ) G r k 5 ( g ) F a l l ( 3 ) E fl 1 d 2 ( s ) E p h b 4 ( g , s , i ) P l k 3 1 g , § l M a n S ( S T G a d d 4 5 a ( g , s ) H s p h l ( s ) 1 7 0 M a g k s ( a ) M a 2 2 k 6 ( i ) T e s l a ( s ) A t p 6 v 0 a 2 ( g ) O s g i n l ( 2 . 8 ) R n d 3 ( a 5 ) M a t h ( 1 ; ) B h l h b 2 ( s ) M a 2 2 k 6 ( g , s , i p ) W e e l M m e ( g , a , i ) P p a r g c l a ( s ) A t p 6 v 0 a 2 ( g ) K l fl o ( g , s ) T o t a l s d ( o u t o f 4 7 c a r r y f o r w a r d B 6 C 3 F l g e n e s ) 9 g = 7 , a = 0 , m = 0 , s = 5 , i = 0 D O H 4 S l l 4 ( g ) P fl r f b 3 ( g ) D n a j a l ( s ) P i m 3 ( g , s ) H s p a l b ( S ) P p a t ( g ) N r g 4 ( g ) S h 3 b p 2 ( g , s ) P b e f l ( g , s ) A r l 6 i p 5 ( g , s ) F h i t ( g , s ) M o r c 3 ( g ) P e r l ( g , s ) P e r 2 ( g , s ) ( 1 T o t a l s ( o u t o f 1 3 3 u n i q u e B 6 C 3 F l , 4 — w e e k g e n e s ) 2 5 g = 1 5 , a = 3 , m = l , s = 1 4 , i = 3 2 0 g = 1 5 , a = l , m = l , s = 1 5 , i = 3 1 7 1 T a b l e 2 . 7 c o n t i n u e d C o n n e c t i o n s B e t w e e n 5 C a n c e r - r e l a t e d P r o c e s s e s a n d G e n e s , I n c l u d i n g t h o s e w h i c h C a r r i e d F o r w a r d , t h a t w e r e U n i q u e l y A c t i v e i n B 6 C 3 F 1 M i c e F o l l o w i n g T r e a t m e n t w i t h P h e n o b a r b i t a l ( P B ) f o r 4 W e e k s a “ U n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n l i v e r s o f B 6 C 3 F 1 m i c e a t 4 w e e k s , i n c l u d i n g t h o s e t h a t c a r r i e d f o r w a r d ( i . e . e x h i b i t e d s i m i l a r e x p r e s s i o n c h a n g e s , e i t h e r i n d u c t i o n o f r e p r e s s i o n , a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s ) , w e r e i d e n t i fi e d a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s . Q u a n t i t a t i v e r e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) w a s p e r f o r m e d o n a s u b s e t o f t h e s e ( s e e A p p e n d i x T a b l e 3 f o r t h e c o m p l e t e d a t a s e t ) , d e n o t e d h e r e i n b o l d e d f o n t , a n d g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n c h a n g e s w e r e c o n fi r m e d a r e u n d e r l i n e d . b F u n c t i o n a l a n n o t a t i o n r e v e a l e d a s s o c i a t i o n s b e t w e e n k e y c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s ( g r o w t h : g , s u r v i v a l : s , a n g i o g e n e s i s : a , i n v a s i o n : i , a n d m e t a s t a s i s : m ) a n d m a n y o f t h e 1 3 3 t o t a l u n i q u e l y a c t i v e g e n e s a t 4 w e e k s , w h i c h i n c l u d e g e n e s o b s e r v e d o n l y a t 4 w e e k s , p l u s c a r r y f o r w a r d g e n e s . c G e n e s y m b o l s a r e l i s t e d i n a p a r t i c u l a r c o l u m n b a s e d o n w h e t h e r t h e l i t e r a t u r e i n d i c a t e s t h a t t h e g e n e e n h a n c e s o r s u p p r e s s e s a p a r t i c u l a r p r o c e s s , a n d g e n e s a r e f u r t h e r c l a s s i fi e d d e p e n d i n g o n w h e t h e r t h e i r e x p r e s s i o n i s i n d u c e d ( T ) o r r e p r e s s e d ( l ) b y P B t r e a t m e n t . N o t e t h a t a g e n e w h i c h s u p p r e s s e s g r o w t h o r s u r v i v a l c a n d o s o b y p r o m o t i n g a p o p t o s i s a n d / o r c e l l d e a t h . “ T h e t o t a l n u m b e r o f g e n e s i n e a c h o f t h e s p e c i fi c c a t e g o r i e s i s d e p i c t e d i n b o l d . T h o s e t o t a l s n o t l i s t e d i n b o l d r e p r e s e n t t h e g e n e s , w i t h i n a c a t e g o r y , t h a t c a n p a r t i c i p a t e i n o n e o r m o r e c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s . T a b l e 2 . 8 K i n a s e , P h o s p h a t a s e , P h o s p h a t a s e A c t i v a t o r ( R e g u l a t o r y S u b u n i t ) , a n d P h o s p h a t a s e R e g u l a t o r y ( I n h i b i t o r ) G e n e s I d e n t i fi e d a s U n i q u e l y A c t i v e i n L i v e r T u m o r - S u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 M i c e G e n e a F o l d c C h a n g e T c 2 w e e k s 4 w e e k s A k 2 1 2 . 9 0 A k 3 1 1 1 2 . 1 8 C 1 k 4 1 2 . 4 8 M k n k 2 1 2 . 8 7 P c k l 1 2 . 6 8 P c t k 3 1 2 . 9 9 P i 4 k b 1 2 . 0 4 P k l r 1 2 . 0 4 K i n a s e s “ ‘ 1 T 3 - 0 2 C a m k l d 1 2 . 5 0 P fl d b 3 1 3 . 2 6 1 2 . 1 0 S b k l 1 3 . 7 5 1 2 . 1 6 A d c k 5 1 - 2 . 1 1 1 - 2 . 5 4 M g ) 2 k 6 * 1 2 1 6 M a p 3 k 5 " ‘ 1 2 7 9 P 1 k 3 * 1 5 8 5 T e s k 2 T 2 2 5 T a o k 3 1 - 2 2 0 G r k 5 1 - 2 2 7 P d k 4 1 - 2 4 7 P t p n 9 1 - 2 . 1 2 P fl d b 3 1 3 . 2 6 1 2 . 1 0 P h o s p h a t a s e s W a l T 3 . 4 6 P p a p 2 c 1 1 - 2 . 1 9 P h o s p h a t a s e A c t l v a t o r P p p m l - 2 . 1 7 ( R e g u l a t o r y S u b u n i t ) P h o s p h a t a s e P P P 1 r 3 g T 9 - 0 7 R e g u l a t o r y P p p 1 r 3 b 1 - 2 . 1 7 ( I n h 1 b 1 t o r ) S u b u n i t ‘ U n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d / o r 4 w e e k s , w e r e i d e n t i fi e d b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s , a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s . T h e e x p r e s s i o n c h a n g e s o f g e n e s d e s i g n a t e d b y a s t e r i s k s ( * ) w e r e c o n fi r m e d b y q u a n t i t a t i v e r e a l - t i m e P C R ( A p p e n d i x T a b l e 3 ) . b F o l d c h a n g e o f g e n e e x p r e s s i o n ( T , i n d u c t i o n o r 1 , r e p r e s s i o n ) b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s . 1 : . . . . . T r m e p o m t a t w h 1 c h t h e u n r q u e l y a c t 1 v e g e n e w a s d e t e c t e d . 1 7 2 s s n e e g ; n n o e n n a n n e r 1 e r 1 g n o i d s a / o i n o o i n n h i t o 6 n 6 i w o d n a o h n ; o i s n u h t n 6 i o c i t s L t i a f c t o e t i a s / t a s g a ; t / s B a o g s a s n L e a l a 1 L t a i l l e ‘ e R n t o 5 B c e i c p F c s e 7 h y h o S i C o s e a e h o h t i 7 r r o s 5 t v s x o 3 s s e s t e s s l r e p n 7 i l o r B i i s n s l y y n n y d r i . e s s e p e n C c C 5 e s l a e f s e m s x s m a t e a v x n e e n e o i c 6 r m a 1 l t 1 x 1 T e o T h d d t o r t d e p T u i l B n n n n i p n i p t d e n e a a m s s e t x y e 3 e s a i e r f 3 o e d e x F n F n t 1 e n v w 1 m C a f a r n d s n r i u h S t e i — r ) p e e n 1 t a C a e e l a o C u 6 p w q B p t a e a e 6 a r y p w p p t h p s F t p t h v x 3 l t a e t a e e n B a e s w l r n n e B b x M i n b C E b n l e e e n i m i v t P E U 6 e B l x E ( l a t i b e a o l % c i d e 5 r 9 t r e a t M t g n b f i a n e o o o h d C b a t i i h f n e . h o s o x C t h u I N E P O C e u q i n U d e t i b i e o c 5 r d l % h e e e t i 9 x E c M t t i g n a n e o i b f h d C a h o i M t i l f h h c s F t . o x C i ] o E h F 3 N u I O C w 3 C s C 6 e 6 B n B e e G l b f i o t s i e 1 3 . 3 - “ + 1 1 2 0 . 2 - 1 * 0 " & 1 1 6 . l — 1 s e - c t R k y s n m T f l u i o C i R o T P q P a S n - A r ) o w 4 R m n M M M a M r M u o , 4 M M C t T i a ° r w w a M e w o o w a o o P p p r p p e e w e - r t a s y e y y y o s M e w e e / k w T u v l N e p N N e H H H H p N y R y : N : : : N i : : q h L ( t a n e t a W N k k k r / r k k k H o H w r w r w o w o d w w t e d e y r n i S o o n e 2 4 4 2 a 2 2 4 : k w 4 R M C ) P s M 0 e m e 1 c a n A u S m o c ) e ) i ’ i ) c i c ) i i i R i 5 r i i S i i i i i n t ( i t . . m q i T n - o M r A n n m . t o d . s B t . p n l u a o 1 I ( 2 r ( b f > k n A o . x l E ( i o . r A t . n l I ( r o n a l o U c n A e R o G L f o a i e t R a l e y v i h t t a e t i t a u Q D 9 d . e m e c l t e k a a y t i 5 s z a a i i i t t / s l o F i R c 2 t ) e n A d a l i l u n l 4 e t a y P c g r r o N h i e e r i r q e n n T - e y C r s s c r u e i n l n 3 i r , e - ) l o t a a 2 h o n i p e e t ) t n m d c n f f b g r e L a ( c d 2 a B - s f t ( i s P a s e e n o n g s u U y t e a l r a h n C s i l , o s n c r p i s r n 1 i r c a i t 1 p e B : n l k i . i b o r 1 s t a : : o . r a n u e n r t o t d s g — 2 3 r g D t : i 2 u o t m m n m i : o e l 2 m e i 2 n p _ 2 j o : o c e t i o r o l l l t a m p 2 b r n k d E h o c S i a a c l U a r o b c T c ( l A c B B N a f T o 1 7 3 ' a G e n e C 5 7 B L / 6 F o l d C h a n e d g G r o u p 6 F o l d C h a n e d g G r o u p c E x o n i c ( 1 . 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I n t r o n i c ( l . A . i i i ) 4 w s z M 1 1 . 3 . 1 1 . 3 . . I n t r o n i c ( 1 . A . i i i ) 4 w k : H y p o M 1 1 . 3 . . - ) B P ( l a t i b r a b o n e h P e u q i n U d e e t c i i b M i h l x F E 3 h C c 6 i h B w e l s b e i n t e p G e f o c s u s S i - s r y o l m a u n T A r ) e R v C i L P — n i T R ) q s ( M A R R C ( P n e o m i i t t a - l l y a h e t R e m e v i A t . c . n M o p y H : k w M f o M p y w H e : N k r w o 2 4 m ) ) ) N o b n i i i a i i i t r D f 0 t k r o i i i . . . i A A A t d m i 1 . . . n ) n e a i / i 1 1 1 5 . ( ( ( a r e n C u e d r o . c c c Q n t x l i i i t l d A e f a s e ( n t 2 s w a > o l n n n o o o r r r t t t n n n I I I u o d n i s t n n e o o i s g a l c l e m e 9 R . 2 d y c h t c s e a : e c l m l u , b d a n T i a 1 m C 1 7 5 4 w k : H y p o M n . c . E m b 2 : e p h r i n B Z 4 w k : H y p o M o r H y p e e r n . c . m : p r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e , r e c e p t o r t y p e , 0 I n t r o n i c ( 1 . A . i i i ) 2 w k : H y p o M f a n d / o r N e w M 4 w k : H y p o M a n d / o r H y p e e r [ l . C . n / a R a l g d s : r a l g u a n i n e n u c l e o t i d e d i s s o c i a t i o n s t i m u l a t o r 4 w k : H y p o M 4 w k n . c . n / a n / a e r b : r e t i n o i d X r e c e p t o r b e t a 4 w k : N e w M 4 w k n / a n / a T g Q r Z : t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r , b e t a r e c e p t o r H I n t r o n i c ( l . A . i i i ) 4 w k n . c . E x p r e s s i o n l e v e l s w e r e o n l y e v a l u a t e d i n t h e B 6 C 3 F l " : n o i n d i c a t i o n o f a n e x p r e s s i o n c h a n g e w a s o b s e r v e d 1 7 6 T a b l e 2 . 9 c o n t i n u e d Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f G e n e s w h i c h E x h i b i t e d U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n L i v e r T u m o r - S u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] M i c e “ G e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , a t 2 a n d / o r 4 w e e k s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) . b G e n o m i c l o c a t i o n o f t h e R A M , b a s e d o n a c l a s s i fi c a t i o n s c h e m e i n A p p e n d i x F i g u r e 3 . A b b r e v i a t i o n s : T S S , t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e ; U T R , u n t r a n s l a t e d r e g i o n . c P B - i n d u c e d d e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( H y p o m e t h y l a t i o n , H y p o M ) a n d i n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( H y p e r m e t h y l a t i o n , H y p e r M a n d n e w m e t h y l a t i o n , N e w M ) , a s d e t e r m i n e d b y P h i l l i p s a n d G o o d m a n ( 2 0 0 8 ) . d A f o l d c h a n g e o f g e n e e x p r e s s i o n ( T , u p - r e g u l a t i o n o r 1 , d o w n - r e g u l a t i o n ) i s l i s t e d i f i t w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) i n a t r e a t m e n t g r o u p ( v . i t s t i m e - m a t c h e d c o n t r o l ) . I f i t w a s n o t s i g n i fi c a n t , n o c h a n g e ( n . c . ) i s l i s t e d . F o r B c 1 2 1 1 3 a n d U b e Z d I ( * ) , t h e f o l d c h a n g e i n t h e B 6 C 3 F 1 w a s s t a t i s t i c a l l y g r e a t e r t h a n t h a t i n t h e C 5 7 B L / 6 ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) . S r m s a n d T r i o ( A ) e x h i b i t e d f o l d c h a n g e s i n t h e B 6 C 3 F l a n d C 5 7 B L / 6 t h a t w e r e n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) . F o r N c o r 2 ( § ) , t h e e x t e n t o f t h e c h a n g e i n t h e B 6 C 3 F l w a s s t a t i s t i c a l l y l e s s t h a n ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p 5 0 . 0 5 ) t h a t i n t h e C 5 7 B L / 6 . e l f a f o l d c h a n g e w a s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t , a g e n e w a s c o n s i d e r e d t o s h o w a n ‘ i n d i c a t i o n o f a c h a n g e ’ i f d a t a f r o m a t l e a s t 3 o f t h e 6 s a m p l e s i n t h e P B - t r e a t e d g r o u p f e l l o u t s i d e ( a b o v e , T o r b e l o w , 1 ) t h e 9 5 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l ( C I ) o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a . I f t h e r e w a s n o i n d i c a t i o n o f a c h a n g e , o r i f a f o l d c h a n g e w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t , t h e s e d a t a a r e n o t s h o w n ( - - ) . f M e t h y l a t i o n s t a t u s w a s a m b i g u o u s ( i . e . c o u l d n o t b e d e fi n i t i v e l y d e t e r m i n e d ) , a s d e s c r i b e d i n d e t a i l i n P h i l l i p s a n d G o o d m a n ( 2 0 0 8 ) . g T h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f S r m s ( a t 2 w e e k s ) a n d T r i o ( a t 4 w e e k s ) w e r e a m b i g u o u s , s o i t w a s n o t p o s s i b l e t o c o n c l u s i v e l y e s t a b l i s h a n a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e m e t h y l a t i o n a n d e x p r e s s i o n s t a t u s e s . h n . a . i n d i c a t e s t h a t q R T - P C R w a s n o t p e r f o r m e d . B 6 C 3 F ] e x p r e s s i o n d a t a w e r e g e n e r a t e d f o r a l l o f t h e g e n e s a t t h e i n d i c a t e d t i m e p o i n t s . H o w e v e r , C 5 7 B L / 6 e x p r e s s i o n d a t a w e r e g e n e r a t e d o n l y i f t h e B 6 C 3 F ] m e t h y l a t i o n a n d e x p r e s s i o n s t a t u s e s a p p e a r e d t o b e i n v e r s e l y c o m e l a t e d ( i . e . d e c r e a s e d m e t h y l a t i o n l e v e l s w e r e a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d e x p r e s s i o n , o r i n c r e a s e d m e t h y l a t i o n l e v e l s w e r e a s s o c i a t e d w i t h d e c r e a s e d e x p r e s s i o n ) , a s s u m i n g t h a t D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n k e y r e g i o n s ( e . g . , r e g u l a t o r y e l e m e n t s ) c a n c o n t r o l g e n e e x p r e s s i o n . . u n . { i I l i w u a v . . c t r v n , . J r . . s u I a I i I s t i J . h Z i " : L x . . . . V . . _ . . . ‘ . . . . . . . . . . . . V . . . ‘ 3 0 z i . 1 6 t 5 ~ . 5 \ . . v . . . 1 v I ! . 1 v n : : . 5 . . . 5 0 0 s 7 § ‘ . y ‘ ; . 3 . 1 : . v f . l . 3 ‘ . f . a » . “ e 4 . 3 6 . . ' . . : n . “ a I l : \ f 2 4 . $ : , » . . 1 . ' . . . l . a . w x \ . a z ? C : y a 3 « . . n 1 . . ; . . fi . , . : fi . v k m g . £ v n n I , 3 ~ c . . : u . 5 d s . ‘ ” . fl . £ y fi x . ‘ . . . p . m i h . m t h fi a W 1 w u . ‘ " : V t 3 . . ? a _ fi f ‘ 9 r fi ‘ s u . v . . . . . ‘ . 1 . . h 3 r 8 . d : u 2 i - . I . s . . 3 . . . . . . “ 5 . c ! c . u . l A \ U . ( h J . . . s . . . . h . u m . . . fi . . t . . k . . ” . . . 1 » , l ~ H . u W ‘ 8 . M « . H _ . 4 a . ‘ g % m a . u n . . , . “ . . . . , V m u ‘ c 1 1 r % ‘ w x . . . , . . . 4 . » 6 n h . . i i 1 h w . { r V h . s . . 4 I V 5 y , . . v . / , 1 { 3 . a , I ” t , n . : . . fi w ‘ I . t Q 1 , r . . / 3 9 % Jr" J 5 , J M i c U U B i i h n R g v a e A r n s R i S Y t t a y t e m e a n s : , a o W P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 5 / 0 8 K : I P r o j / A o c & P r e s / C I R C I D a t e D u e . i n d d I D E N T I F I C A T I O N O F G E N E S I N V O L V E D I N T U M O R I G E N E S I S T H A T A R E D E R E G U L A T E D , W I T H A N E M P H A S I S O N A L T E R E D D N A M E T H Y L A T I O N V O L U M E 1 1 B y J e n n i f e r M a r i e P h i l l i p s A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y I n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y 2 0 0 9 C H A P T E R 3 O R P H A N N U C L E A R R E C E P T O R C O N S T I T U T I V E A C T I V E / A N D R O S T A N E R E C E P T O R ( C A R ) — M E D I A T E D A L T E R A T I O N S I N D N A M E T H Y L A T I O N D U R I N G P H E N O B A R B I T A L ( P B ) P R O M O T I O N O F L I V E R T U M O R I G E N E S I S T h i s c h a p t e r r e p r e s e n t s a m a n u s c r i p t t h a t w a s p u b l i s h e d i n T o x i c o l o g i c a l S c i e n c e s 9 6 , p . 7 2 — 8 2 , 2 0 0 7 . T h e a u t h o r s a r e J e n n i f e r M . P h i l l i p s , Y u k i o Y a m a m o t o , M a s a h i k o N e g i s h i , R o b e r t R . M a r o n p o t , a n d J a y I . G o o d m a n . 1 7 7 A B S T R A C T A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n i s a n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m t h a t p l a y s a k e y r o l e i n t h e c a r c i n o g e n e s i s p r o c e s s , a n d t h e n o n g e n o t o x i c r o d e n t h e p a t o c a r c i n o g e n p h e n o b a r b i t a l ( P B ) a l t e r s t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A i n m o u s e l i v e r . T h e c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e n u c l e a r r e c e p t o r ( C A R ) m e d i a t e s h a l f o f t h e P B - i n d u c e d h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s a n d i t i s e s s e n t i a l f o r l i v e r t u m o r p r o m o t i o n i n P B - t r e a t e d m i c e . H e r e , a t e c h n i q u e i n v o l v i n g m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n , a r b i t r a r i l y p r i m e d P C R , a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s w a s u t i l i z e d t o d e t e c t P B - i n d u c e d r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M S ) i n C A R v v i l d t y p e ( W T ) m i c e t h a t a r e s e n s i t i v e t o p r o m o t i o n b y P B a n d r e s i s t a n t C A R k n o c k o u t ( K O ) m i c e . T h e C A R W T m i c e d e v e l o p e d p r e n e o p l a s t i c l e s i o n s a f t e r 2 3 w k o f P B t r e a t m e n t ( p r e c a n c e r o u s ) a n d l i v e r t u m o r s a f t e r 3 2 w k , w h i l e t h e C A R K O m i c e d i d n o t d e v e l o p t u m o r s ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . O u r g o a l w a s t o d i s c e r n t h o s e R A M s w h i c h a r e p l a y i n g i m p o r t a n t r o l e s i n t u m o r f o r m a t i o n b y c o m p a r i n g t h e R A M s t h a t f o r m i n s e n s i t i v e a n d r e s i s t a n t g r o u p s o f m i c e . U s i n g t h i s n o v e l a p p r o a c h , 4 2 u n i q u e R A M s w e r e i d e n t i fi e d i n t h e p r e c a n c e r o u s a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e . O f t h e s e 4 2 R A M s , 1 4 c a r r i e d f o r w a r d t o t h e t u m o r t i s s u e , a n d a d d i t i o n a l l y , 1 0 4 t o t a l u n i q u e R A M s w e r e o b s e r v e d i n t h e t u m o r t i s s u e . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t u n i q u e R A M s o c c u r r e d i n t h e s e n s i t i v e C A R W T m i c e a n d t h a t a p o r t i o n o f t h e s e w e r e s e e n i n b o t h t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e . W e h y p o t h e s i z e t h a t t h e s e u n i q u e R A M s m a y b e f a c i l i t a t i n g t h e t u m o r i g e n e s i s p r o c e s s , a n d t h e s e d a t a s u p p o r t t h e v i e w t h a t D N A m e t h y l a t i o n p l a y s a c a u s a t i v e r o l e i n P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s . 1 7 8 I N T R O D U C T I O N T h e c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) i s a m e m b e r o f t h e o r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r s u b f a m i l y , w h i c h l a c k s k n o w n p h y s i o l o g i c a l l i g a n d s ( M o h a n a n d H e y m a n , 2 0 0 3 ) . C A R i s e x p r e s s e d p r i m a r i l y i n t h e l i v e r a n d t h e s m a l l i n t e s t i n e , a n d a t l o w e r l e v e l s i n h e a r t , m u s c l e , k i d n e y , a n d l u n g t i s s u e ( B a e s e t a l . , 1 9 9 4 ) . T h e r o l e o f C A R i n d e t o x i fi c a t i o n i s s u p p o r t e d b y t h e o b s e r v a t i o n s t h a t i t i s a c t i v a t e d b y a v a r i e t y o f x e n o b i o t i c s a n d m e d i a t e s t h e u p r e g u l a t i o n o f s e v e r a l p h a s e I a n d I I d r u g - m e t a b o l i z i n g e n z y m e s , e . g . , C Y P 4 5 0 s , g l u t a t h i o n e S - t r a n s f e r a s e s a n d U D P - g l u c u r o n o s y l t r a n s f e r a s e s ( U e d a e t a l . , 2 0 0 2 a ) i n a d d i t i o n t o d r u g t r a n s p o r t e r s ( K a s t e t a l . , 2 0 0 2 ; A s s e m e t a l . , 2 0 0 4 ) . C A R a l s o c o n t r i b u t e s t o t h e m e t a b o l i s m o f e n d o g e n o u s c o m p o u n d s s u c h a s b i l i r u b i n , a n d s t e r o i d a n d t h y r o i d h o r m o n e s i n r e s p o n s e t o e x o g e n o u s a g e n t s ( K o d a m a a n d N e g i s h i , 2 0 0 6 ) , a n d i t s r e g u l a t i o n o f e n z y m e s i n v o l v e d i n e n e r g y m e t a b o l i s m i s a c o m p o n e n t o f t h e r e s p o n s e t o x e n o b i o t i c s t r e s s ( S w a l e s a n d N e g i s h i , 2 0 0 4 ) . F i n a l l y , i n a d d i t i o n t o a c t i n g a s a c o m p o n e n t o f a t r a n s c r i p t i o n f a c t o r , C A R m a y i n t e r a c t w i t h p r o t e i n s l e a d i n g t o a l t e r a t i o n o f t h e i r fi m c t i o n , e . g . , C A R b i n d i n g t o t h e F o x O l p r o t e i n i n h i b i t s t h e a b i l i t y o f t h e l a t t e r t o i n c r e a s e g l u c o n e o g e n e s i s ( K o d a m a a n d N e g i s h i , 2 0 0 6 ) . P h e n o b a r b i t a l ( P B ) i s a p r o t o t y p i c a l n o n g e n o t o x i c r o d e n t l i v e r t u m o r p r o m o t e r t h a t s t i m u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f d r u g - m e t a b o l i z i n g e n z y m e s , i n a d d i t i o n t o c a u s i n g h e p a t i c h y p e r t r o p h y a n d h y p e r p l a s i a ( W h y s n e r , 1 9 9 6 ) . P B f a c i l i t a t e s t h e t r a n s l o c a t i o n o f C A R f r o m t h e c y t o p l a s m t o t h e n u c l e u s w h e r e i t f o r m s a h e t e r o d i m e r w i t h t h e r e t i n o i d X r e c e p t o r ( R X R ) w h i c h c a n b i n d t o t h e P B - r e s p o n s i v e e l e m e n t l o c a t e d w i t h i n t h e p r o m o t e r r e g i o n o f p a r t i c u l a r g e n e s , e . g . , C y p 2 b 1 0 , l e a d i n g t o u p r e g u l a t i o n o f t h e i r e x p r e s s i o n ( H o n k a k o s k i e t a l . , 1 9 9 8 ) . F u r t h e r m o r e , m i c r o a r r a y d a t a f r o m U e d a e t a l . ( 2 0 0 2 a ) 1 7 9 i n d i c a t e t h a t P B a l t e r s t h e e x p r e s s i o n o f 1 3 8 h e p a t i c g e n e s , i n c r e a s i n g t h e e x p r e s s i o n o f s o m e w h i l e d e c r e a s i n g t h e e x p r e s s i o n o f o t h e r s , a n d a p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e s e c h a n g e s a r e C A R - d e p e n d e n t . T h u s , n o t a l l o f t h e h e p a t i c e f f e c t s o f P B a r e C A R - d e p e n d e n t . C A R a l s o m e d i a t e s P B - i n d u c e d h e p a t o m e g a l y ( W e i e t a l . , 2 0 0 0 ) , a n d i s e s s e n t i a l f o r l i v e r t u m o r p r o m o t i o n b y P B i n C 3 H / H e m i c e f o l l o w i n g i n i t i a t i o n w i t h d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . A d d i t i o n a l l y , c h r o n i c a c t i v a t i o n o f C A R b y t h e p o t e n t P B - l i k e i n d u c e r l , 4 - B i s [ 2 - ( 3 , S - d i c h l o r o p y r i d y l o x y ) ] b e n z e n e ( T C P O B O P ) r e s u l t s i n m o u s e l i v e r t u m o r f o r m a t i o n ( H u a n g e t a l . , 2 0 0 5 ) . A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n , a n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m w h i c h p l a y s a k e y r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n , m a y p l a y m u l t i p l e r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 ) . T h e e p i g e n e t i c D N A m o d i fi c a t i o n S - m e t h y l c y t o s i n e a c c o u n t s f o r a p p r o x i m a t e l y 3 - 5 % o f a l l D N A b a s e s a n d i s f o u n d a t 7 0 - 8 0 % o f a l l C p G d i n u c l e o t i d e s i n t h e g e n o m e ( E h r l i c h e t a l . , 1 9 8 2 ) . M e t h y l a t i o n a t C p r G s i t e s a l s o o c c u r s i n t h e m a m m a l i a n g e n o m e ( C l a r k e t a l . , 1 9 9 5 ) . A b e r r a n t p a t t e r n s o f D N A m e t h y l a t i o n h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n c a r c i n o g e n e s i s . F o r e x a m p l e , t h e g e n o m e s o f c a n c e r c e l l s a r e g l o b a l l y h y p o m e t h y l a t e d a s c o m p a r e d t o t h e i r n o r m a l c o u n t e r p a r t s ( G a m a - S o s a e t a l . , 1 9 8 3 ) a n d d e c r e a s e d l e v e l s o f m e t h y l a t i o n h a v e b e e n s h o w n t o c a u s e a c t i v a t i o n o f o n c o g e n e s s u c h a s R - r a s a n d c y c l i n D 2 ( N i s h i g a k i e t a l . , 2 0 0 5 ; O s h i m o e t a l . , 2 0 0 3 ) , i n a d d i t i o n t o c h r o m o s o m a l i n s t a b i l i t y a n d i n c r e a s e d t u m o r f o r m a t i o n ( E d e n e t a l . , 2 0 0 3 ; G a u d e t e t a l . , 2 0 0 3 ) . C o n c u r r e n t l y , G C - r i c h r e g i o n s i n t h e p r o m o t e r s o f t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s i n c a n c e r c e l l s b e c o m e h y p e r m e t h y l a t e d , r e s u l t i n g i n g e n e s i l e n c i n g ( J o n e s a n d L a i r d , 1 9 9 9 ) . B o t h m u t a t i o n a n d e p i g e n e t i c a l t e r a t i o n s a r e t h o u g h t t o p l a y c r i t i c a l r o l e s a t a l l s t a g e s o f t h e m u l t i s t e p / m u l t i s t a g e m o d e l o f t h e c a r c i n o g e n e s i s p r o c e s s ( G o o d m a n a n d 1 8 0 W a t s o n , 2 0 0 2 ) , w h i c h c a n b e d i v i d e d i n t o e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d s t a g e s , i . e . , i n i t i a t i o n , p r o m o t i o n , a n d p r o g r e s s i o n ( D r a g a n e t a l . , 1 9 9 3 ) . T u m o r p r o m o t e r s i n c r e a s e c e l l p r o l i f e r a t i o n i n t a r g e t t i s s u e a n d s u p p r e s s a p o p t o s i s , t h u s f a c i l i t a t i n g t h e c l o n a l e x p a n s i o n o f i n i t i a t e d c e l l s ( S c h u l t e - H e r m a n n e t a l . , 1 9 9 0 ) . P B t r e a t m e n t a l t e r s h e p a t i c D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s , a n d t h e e f f e c t s , s p e c i fi c a l l y h y p e r m e t h y l a t i o n o f i n t e r n a l a n d e x t e r n a l c y t o s i n e s o f 5 ’ C C G G 3 ’ s e q u e n c e s , a r e g r e a t e r i n l i v e r t u m o r - p r o n e a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t s t r a i n s o f m i c e ( W a t s o n a n d G o o d m a n , 2 0 0 2 ) . I n a d d i t i o n , u n i q u e P B - i n d u c e d r e g i o n s o f a l t e r e d m e t h y l a t i o n ( R A M s ) w e r e i d e n t i fi e d i n s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 m i c e a s c o m p a r e d t o r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . T h e c o m p a r i s o n o f R A M s t h a t f o r m i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e a s c o m p a r e d t o t h o s e t h a t a r e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t r e s u l t s i n t h e i d e n t i fi c a t i o n o f R A M s t h a t o c c u r u n i q u e l y i n t h e s e n s i t i v e g r o u p a n d p r o v i d e s t h e o p p o r t u n i t y t o d i s c e r n P B - i n d u c e d m e t h y l a t i o n c h a n g e s w h i c h m a y b e c r u c i a l t o t h e t u m o r i g e n e s i s p r o c e s s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . I n t h e c u r r e n t s t u d y , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A w a s e v a l u a t e d i n m o u s e l i v e r s a m p l e s u s e d b y Y a m a m o t o e t a l . ( 2 0 0 4 ) w h e r e C A R w i l d t y p e ( W T ) a n d C A R k n o c k o u t ( K O ) a n i m a l s r e c e i v e d o n e i n i t i a t i n g d o s e o f D E N f o l l o w e d b y t r e a t m e n t w i t h P B . C A R W T m i c e d e v e l o p e d p r e n e o p l a s t i c h e p a t i c l e s i o n s a f t e r 2 3 w k a n d t u m o r s a f t e r 3 2 w k o f P B t r e a t m e n t , w h i l e t h e C A R K O m i c e d i d n o t f o r m p r e n e o p l a s t i c h e p a t i c l e s i o n s a f t e r 2 3 w k o f P B t r e a t m e n t a n d l i v e r t u m o r s w e r e n o t o b s e r v e d a f t e r 3 2 w k o f P B t r e a t m e n t ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e P B - i n d u c e d R A M s t h a t o c c u r r e d i n t h e s e n s i t i v e C A R W T m i c e w e r e c o m p a r e d t o t h o s e i n t h e r e s i s t a n t C A R K O m i c e i n o r d e r t o e v a l u a t e t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e R A M s t h a t f o r m e d u n i q u e l y i n t h e s e n s i t i v e m i c e m a y p l a y a r o l e i n 1 8 1 k e y e v e n t s t h a t o c c u r d u r i n g l i v e r t u m o r f o r m a t i o n . O u r g o a l i s t o i d e n t i f y R A M s t h a t p l a y a r o l e i n m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s b y a s c e r t a i n i n g t h o s e t h a t o c c u r u n i q u e l y i n t h e s e n s i t i v e C A R W T m i c e a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t C A R K O m i c e . 1 8 2 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S A n i m a l s , T r e a t m e n t s a n d T i s s u e S a m p l e s C A R K O ( h o m o z y g o u s n u l l ) m i c e o n a C 5 7 B L / 6 b a c k g r o u n d w e r e b a c k c r o s s e d t o C 3 H / H e N C r l B R m i c e ( C h a r l e s R i v e r L a b o r a t o r i e s , W i l m i n g t o n , M A ) ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e C 3 H / H e m o u s e i s a s t r a i n t h a t i s h i g h l y s u s c e p t i b l e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s ( B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e m a l e m i c e u s e d f o r t h e s e s t u d i e s w e r e h o u s e d i n a s p e c i fi c p a t h o g e n - fl e e f a c i l i t y a n d c a r e d f o r i n a c c o r d a n c e w i t h t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e o f H e a l t h g u i d e l i n e s f o r t h e c a r e a n d u s e o f l a b o r a t o r y a n i m a l s . C A R W T o r C A R K O m i c e w e r e i n j e c t e d w i t h a s i n g l e i n t r a p e r i t o n e a l d o s e o f d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) , 9 0 m g / k g , a t 5 w k o f a g e a n d t h e n a d m i n i s t e r e d d r i n k i n g w a t e r ( c o n t r o l ) o r 0 . 0 5 % P B ( w / w ) i n d r i n k i n g w a t e r s t a r t i n g a t 7 w k o f a g e a n d c o n t i n u i n g f o r 2 3 o r 3 2 w k , r e s u l t i n g i n t h e f o l l o w i n g g r o u p s o f m i c e : C A R K O , 2 3 w k c o n t r o l , C A R K O , 2 3 w k P B , C A R W T , 2 3 w k c o n t r o l , C A R W T , 2 3 w k P B ( p r e c a n c e r o u s t i s s u e ) , a n d C A R W T , 3 2 w k P B ( t u m o r t i s s u e ) ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . A n i m a l s w e r e s a c r i fi c e d a t t h e e n d o f t h e i n d i c a t e d t i m e p o i n t s , a n d t h e i r l i v e r s w e r e q u i c k l y r e m o v e d a n d f r o z e n i n l i q u i d n i t r o g e n . L i v e r s a m p l e s w e r e o b t a i n e d f r o m 6 m i c e i n e a c h e x p e r i m e n t a l g r o u p . T i s s u e s a m p l e s f r o m t h e C A R W T , 2 3 w k P B g r o u p w e r e t a k e n f r o m n o n - l e s i o n a r e a s o f t h e l i v e r , a n d 6 s a m p l e s o f t u m o r t i s s u e w e r e o b t a i n e d . H i s t o p a t h o l o g y w a s p e r f o r m e d . T u m o r s w e r e s e l e c t e d b a s e d u p o n a l i m i t e d a v a i l a b i l i t y f o r m e t h y l a t i o n s t u d i e s , f o u r a d e n o m a s a n d t w o c a r c i n o m a s w e r e s e l e c t e d . T h u s , w e w e r e a b l e t o e v a l u a t e c o n t r o l t i s s u e v e r s u s p r e c a n c e r o u s ( C A R W T , 2 3 w e e k s P B ) a n d p r e c a n c e r o u s t i s s u e v e r s u s t u m o r t i s s u e . H o w e v e r , d u e t o t h e l i m i t e d a v a i l a b i l i t y o f s a m p l e s , w e w e r e n o t a b l e t o e v a l u a t e s p e c i fi c a l l y a d e n o m a s v e r s u s c a r c i n o m a s . 1 8 3 R e g a r d i n g t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e ( C A R W T , 2 3 w e e k s P B ) , t h e r e w e r e n o v i s i b l e a l t e r a t i o n s , t h a t i s , n o n o d u l e s a n d n o a d e n o m a s ( b a s e d u p o n h i s t o l o g y o f a d j a c e n t t i s s u e ) . H o w e v e r , t h e r e c o u l d h a v e b e e n m i c r o s c o p i c f o c i o f c e l l u l a r a l t e r a t i o n i n t h e f r o z e n s a m p l e s . O v e r a l l , t h e a d j a c e n t fi x e d s p e c i m e n s d i d o c c a s i o n a l l y h a v e o n e o r t w o s m a l l f o c i . D N A i s o l a t i o n L i v e r t i s s u e w a s h o m o g e n i z e d i n l m l o f T R I z o l ® R e a g e n t ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A ) . D N A w a s i s o l a t e d v i a t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l . E v a l u a t i o n o f D N A M e t h y l a t i o n S t a t u s b y A r b i t r a g l y ’ P r i m e d P C R a n d C a p i l l a g y E l e c t r o p h o r e s i s D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s w a s e v a l u a t e d b y a n a r b i t r a r i l y p r i m e d P C R a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s p r o c e d u r e ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . T h i s t e c h n i q u e p e r m i t s t h e s i m u l t a n e o u s e v a l u a t i o n o f t r e a t m e n t - r e l a t e d h y p o m e t h y l a t i o n s ( l e s s m e t h y l a t i o n i n a r e g i o n t h a t w a s m e t h y l a t e d i n c o n t r o l ) , h y p e r m e t h y l a t i o n s ( m o r e m e t h y l a t i o n i n a r e g i o n t h a t w a s m e t h y l a t e d i n c o n t r o l ) a n d n e w m e t h y l a t i o n s ( m e t h y l a t i o n i n a r e g i o n t h a t w a s n o t m e t h y l a t e d i n c o n t r o l ) i n n u m e r o u s r e g i o n s o f t h e g e n o m e . R e s t r i c t i o n D i g e s t s E a c h D N A s a m p l e w a s s u b j e c t e d t o 3 s e p a r a t e d o u b l e r e s t r i c t i o n d i g e s t s t h a t w e r e p e r f o r m e d i n d u p l i c a t e w i t h a ) a m e t h y l a t i o n - i n s e n s i t i v e e n z y m e a n d b ) a m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e e n z y m e . D i g e s t i o n w i t h a m e t h y l a t i o n - i n s e n s i t i v e e n z y m e , R s a I o r B f a I , e n s u r e s c o m p l e t e d i g e s t i o n b y t h e m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e e n z y m e , M s p I , H p a I I , o r B s s H I I . 1 8 4 R e s t r i c t i o n d i g e s t i o n w i t h R s a I / M s p l a n d R s a I / H p a l l w a s c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . M s p I a n d H p a I I r e c o g n i z e 5 ’ C C G G 3 ’ s i t e s a n d c u t b e t w e e n t h e i n t e r n a l c y t o s i n e a n d g u a n i n e . M s p I w i l l n o t r e s t r i c t D N A i f t h e e x t e r n a l c y t o s i n e i s m e t h y l a t e d , w h i l e H p a I I w i l l n o t r e s t r i c t D N A i f t h e i n t e r n a l c y t o s i n e i s m e t h y l a t e d . R e s t r i c t i o n d i g e s t i o n w i t h B f a I / B s s H I I w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n a p r e v i o u s s t u d y ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . B s s H I I r e c o g n i z e s 5 ’ G C G C G C 3 ’ s i t e s a n d c u t s b e t w e e n t h e fi r s t g u a n i n e a n d c y t o s i n e r e s i d u e s a n d w i l l n o t r e s t r i c t D N A i f s e v e r a l c o m b i n a t i o n s o f c y t o s i n e s i n t h e s e q u e n c e a r e m e t h y l a t e d ' . B f a I s i t e s a p p e a r l e s s f r e q u e n t l y i n C p G i s l a n d s t h a n R s a I s i t e s a n d , t h u s , C p G i s l a n d s a r e m o r e i n t a c t f o l l o w i n g d i g e s t i o n o f D N A w i t h t h e f o r m e r e n z y m e a s c o m p a r e d t o t h e l a t t e r ( S h i r a i s h i e t a 1 . , 1 9 9 5 ) . T h e r e f o r e , t h e u s e o f B f a I i n c o m b i n a t i o n w i t h B s s H I I , a 6 - b a s e r a r e c u t t e r w i t h a G C - r i c h r e c o g n i t i o n s e q u e n c e , p r o v i d e s a n a d d i t i o n a l , i m p o r t a n t “ w i n d o w ” i n t o o u r D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s a n a l y s i s w h i c h c o m p l e m e n t s t h e d a t a o b t a i n e d f r o m t h e R s a I / M s p l a n d R s a I / H p a I I d i g e s t s . A r b i t r a r i l y P r i m e d P C R ( A P - P C R ) a n d C a p i l l a r y E l e c t r o p h o r e t i c S e p a r a t i o n o f P r o d u c t s A P - P C R a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) , h o w e v e r t w o c o r r e c t i o n s w e r e m a d e : T h e 5 c y c l e s t a g e o f t h e A P - P C R r e a c t i o n w a s f o l l o w e d b y 3 0 c y c l e s ( n o t 4 0 c y c l e s s t a t e d o r i g i n a l l y , a s t h i s w a s a n e r r o r ) o f 9 4 ° C f o r 3 0 s ( n o t 1 5 3 s t a t e d o r i g i n a l l y , a s t h i s w a s a n e r r o r ) , 5 5 ° C f o r 1 5 s , a n d 7 2 ° C f o r l m i n . T h e d i g e s t e d D N A w a s s u b j e c t e d t o A P - P C R u s i n g a s i n g l e a r b i t r a r y p r i m e r , l h t t p : / / r e b a s e . n e b . c o m / c g i - b i n / m s g e t ? B s s H I I 1 8 5 5 ’ A A C C C T C A C C C T A A C C C C G G 3 ’ ( G o n z a l g o e t a l . , 1 9 9 7 ) w h i c h w a s fl u o r e s c e n t l y l a b e l e d a t t h e 5 ’ e n d w i t h H E X T M ( I n t e g r a t e d D N A T e c h n o l o g i e s , C o r a l v i l l e , I A ) . T h i s p r i m e r b i n d s w e l l t o G C - r i c h r e g i o n s a n d t h e 5 ’ C C G G 3 ’ s e q u e n c e a t i t s 3 ’ e n d i n c r e a s e s t h e p r o b a b i l i t y o f b i n d i n g t o t h e M s p I a n d H p a I I r e s t r i c t i o n s i t e s , p e r m i t t i n g t h e d e t e c t i o n o f m e t h y l a t i o n a t t h e s i t e o f p r i m e r a n n e a l i n g a n d b e t w e e n s i t e s o f p r i m e r a n n e a l i n g . A P - P C R p r o d u c t s w e r e q u a n t i fi e d u s i n g t h e N D - 1 0 0 0 U V - V i s S p e c t r o p h o t o m e t e r ( N a n o d r o p T e c h n o l o g i e s , W i l m i n g t o n , D E ) . D a t a A n a l y s i s T h e r e s u l t s a s s i z e o f P C R p r o d u c t s , i n b a s e p a i r s , a n d t h e i r c o r r e s p o n d i n g p e a k a r e a s a r e a n a l y z e d u s i n g t h e E x c e l ® p r o g r a m . A c o n s e n s u s , a v e r a g e p e a k a r e a i s c a l c u l a t e d f o r e a c h e x p e r i m e n t a l g r o u p . T h i s p e r m i t s t h e c o n s e n s u s p e a k a r e a s o f o n e g r o u p t o b e c o m p a r e d w i t h a n o t h e r t o d e t e r m i n e i f t h e r e a r e d i f f e r e n c e s i n m e t h y l a t i o n a t a p a r t i c u l a r P C R p r o d u c t s i z e , a n d i f s o , t h e s e P C R p r o d u c t s a r e c o n s i d e r e d t o b e r e g i o n s o f a l t e r e d m e t h y l a t i o n ( R A M s ) . I n t h i s s t u d y , 1 ) t h e C A R K C , 2 3 w k P B d a t a w e r e c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k c o n t r o l d a t a , a n d 2 ) b o t h t h e C A R W T , 2 3 w k P B ( p r e c a n c e r o u s t i s s u e ) a n d C A R W T , 3 2 w k P B ( t u m o r t i s s u e ) d a t a w e r e c o m p a r e d t o t h e C A R W T , 2 3 w k c o n t r o l d a t a . T r e a t m e n t - r e l a t e d R A M s i n c l u d e : a ) h y p o m e t h y l a t i o n s , b o t h 1 0 0 % d e c r e a s e s a n d d e c r e a s e s w h i c h a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t w h e n c o m p a r e d t o c o n t r o l , b ) h y p e r m e t h y l a t i o n s w h i c h a r e i n c r e a s e s t h a t a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t w h e n c o m p a r e d t o c o n t r o l a n d c ) n e w m e t h y l a t i o n s i n w h i c h P C R p r o d u c t f o r m e d f o l l o w i n g t r e a t m e n t b u t d i d n o t f o r m u n d e r c o n t r o l c o n d i t i o n s . F o r e a c h P C R p r o d u c t s i z e , t h e c o n s e n s u s t r e a t e d p e a k a r e a w a s c o m p a r e d t o t h e c o n s e n s u s c o n t r o l p e a k a r e a u s i n g a S t u d e n t ’ s t - t e s t 1 8 6 ( p < 0 . 0 5 ) . E a c h s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e w a s c o u n t e d a s a c h a n g e i n m e t h y l a t i o n ( c a t e g o r i z e d a s h y p o - o r h y p e r m e t h y l a t i o n s ) a n d o n l y t h o s e m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t w e r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t a r e r e p o r t e d . A l l 1 0 0 % h y p o m e t h y l a t i o n s w e r e c o n s i d e r e d s i g n i fi c a n t . A d d i t i o n a l l y , a l l n e w m e t h y l a t i o n s , i n d i c a t e d b y t h e f o r m a t i o n o f P C R p r o d u c t i n t h e t r e a t e d g r o u p a n d n o p r o d u c t f o r m a t i o n i n t h e c o n t r o l g r o u p a t a p a r t i c u l a r P C R p r o d u c t s i z e , w e r e c o n s i d e r e d s i g n i fi c a n t . A d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f t h e d a t a a n a l y s i s p r o c e d u r e w a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 a ; B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) A s s u m p t i o n s T h e f o l l o w i n g a s s u m p t i o n s a r e m a d e d u r i n g t h e d a t a a n a l y s i s p r o c e d u r e : 1 ) e a c h s e p a r a t e P C R p r o d u c t o f a d e fi n e d s i z e r e p r e s e n t s a d i s t i n c t r e g i o n o f t h e g e n o m e , 2 ) a r e g i o n c a n i n c l u d e o n e o r m o r e r e c o g n i t i o n s e q u e n c e s f o r t h e s p e c i fi c m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n z y m e e m p l o y e d l o c a t e d b e t w e e n t h e a n n e a l i n g s i t e s o f t h e u p - a n d d o w n - s t r e a m p r i m e r s ; t h u s , t h e a m o u n t o f e a c h P C R p r o d u c t f o r m e d c a n b e v i e w e d a s r e p r e s e n t i n g a n “ a v e r a g e ” o f t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h e p a r t i c u l a r r e c o g n i t i o n s e q u e n c e s l o c a t e d b e t w e e n t h e u p - a n d d o w n - s t r e a m p r i m e r s a n d 3 ) d i f f e r e n c e s i n t h e a m o u n t o f e a c h P C R p r o d u c t b e t w e e n t h e g r o u p s b e i n g c o m p a r e d r e p r e s e n t t h e a l t e r e d m e t h y l a t i o n s t a t u s o f a p a r t i c u l a r G C - r i c h r e g i o n o f D N A . s n m a m a u u u 4 n a b m a : I n o r d e r t o d e t e r m i n e i f t h e R A M s t h a t o c c u r r e d a t t h e s a m e P C R p r o d u c t s i z e i n 2 e x p e r i m e n t a l g r o u p s a r e e q u i v a l e n t ( c o m m o n R A M s ) o r d i f f e r e n t ( u n i q u e R A M s ) , 1 8 7 a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( A N O V A ) t e s t s ( p < 0 . 0 5 ) w e r e p e r f o r m e d . A N O V A t e s t s a n a l y z e t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e m e a n s o f 2 o r m o r e g r o u p s a n d a n a d v a n t a g e o v e r t h e u s e o f m u l t i p l e t - t e s t s i s t h e d e c r e a s e d p r o b a b i l i t y o f fi n d i n g s i g n i fi c a n c e b y c h a n c e . O n e - w a y A N O V A a n a l y s i s w a s u t i l i z e d t o c o m p a r e t h e m a g n i t u d e s o f t h e m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t o c c u r r e d a t t h e s a m e P C R p r o d u c t s i z e i n t h e C A R W T , 2 3 w k P B - ( p r e c a n c e r o u s ) a n d t h e C A R W T , 3 2 w k P B - t r e a t e d ( t u m o r ) t i s s u e b e c a u s e o n l y o n e i n d e p e n d e n t v a r i a b l e ( i . e . d u r a t i o n o f P B t r e a t m e n t ) e x i s t s . T w o - w a y A N O V A t e s t s w e r e e x e c u t e d t o d e t e r m i n e i f t h e m a g n i t u d e s o f t h e R A M s t h a t o c c u r r e d a t t h e s a m e P C R p r o d u c t s i z e a s a r e s u l t o f P B t r e a t m e n t i n t h e C A R W T , 2 3 w k a n d t h e C A R K O , 2 3 w k g r o u p s w e r e e q u i v a l e n t o r d i f f e r e n t b e c a u s e t h e r e a r e 2 i n d e p e n d e n t v a r i a b l e s ( i . e . d u r a t i o n o f P B t r e a t m e n t a n d m o u s e s t r a i n ) . C o m m o n a n d U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d M e t h y l a t i o n ( R A M s ) P C R p r o d u c t s o f i d e n t i c a l s i z e t h a t e x h i b i t m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n 2 e x p e r i m e n t a l g r o u p s ( e . g . , p r e c a n c e r o u s a n d C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e o r t u m o r a n d p r e c a n c e r o u s t i s s u e ) a r e c o n s i d e r e d t o b e c o m m o n R A M s . A r e g i o n i s c o n s i d e r e d t o b e a c a r r y f o r w a r d R A M i f t h e m e t h y l a t i o n c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h t h e c o m m o n R A M i n t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e o c c u r i n t h e s a m e d i r e c t i o n a n d a r e e q u i v a l e n t a s d e t e r m i n e d b y o n e - w a y A N O V A ( p < 0 . 0 5 ) . R A M s i n c o m m o n b e t w e e n 2 e x p e r i m e n t a l g r o u p s a r e c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e R A M s i f : 1 ) t h e m e t h y l a t i o n c h a n g e s a r e o p p o s i t e i n d i r e c t i o n ( i . e . i n t h e s a m e r e g i o n , a h y p o m e t h y l a t i o n i s e l i c i t e d b y o n e t r e a t m e n t a n d a h y p e r m e t h y l a t i o n o c c u r s a s a r e s u l t o f a s e c o n d t r e a t m e n t ) , o r 2 ) t h e c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n o c c u r i n t h e s a m e d i r e c t i o n ( i . e . b o t h c h a n g e s a r e h y p e r m e t h y l a t i o n s ) b u t t h e 1 8 8 e x t e n t s o f c h a n g e a r e s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t a s d e t e r m i n e d b y t w o - w a y , p < 0 . 0 5 ( f o r p r e c a n c e r o u s v s . C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e ) o r o n e - w a y A N O V A , p < 0 . 0 5 ( f o r t u m o r v s . p r e c a n c e r o u s t i s s u e ) . I n a d d i t i o n , R A M s a r e c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e i f t h e y a r e o b s e r v e d o n l y i n a p a r t i c u l a r t r e a t m e n t g r o u p . F o r i n s t a n c e , a R A M m a y b e o b s e r v e d o n l y i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e ( v s . C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e ) o r o n l y i n t h e t u m o r t i s s u e ( v s . p r e c a n c e r o u s t i s s u e ) . P e r c e n t D i s s i m i l a r i t y C a l c u l a t i o n s T r e a t m e n t G r o u p v s . C o n t r o l G r o u p T h e d i s s i m i l a r i t y b e t w e e n c o n t r o l p a t t e r n s o f m e t h y l a t i o n a n d P B - i n d u c e d p a t t e r n s w a s c a l c u l a t e d f o r 3 t r e a t m e n t v s . c o n t r o l g r o u p s ( C A R K O , 2 3 w k P B v s . C A R K O , 2 3 w k c o n t r o l t i s s u e , p r e c a n c e r o u s v s . C A R W T , 2 3 w k c o n t r o l t i s s u e , a n d t u m o r v s . C A R W T , 2 3 w k c o n t r o l t i s s u e ) . T h e t o t a l n u m b e r o f P C R p r o d u c t s r e p o r t i n g i n t h e c o n t r o l w a s a d d e d t o t h e t o t a l n u m b e r o f u n i q u e P C R p r o d u c t s ( i . e . t h o s e P C R p r o d u c t s i z e s t h a t w e r e n o t f o r m e d u n d e r c o n t r o l c o n d i t i o n s ) r e p o r t i n g fi ' o m t r e a t m e n t t o o b t a i n t h e t o t a l n u m b e r o f d i f f e r e n t s i z e d P C R p r o d u c t s r e p o r t i n g i n t h e c o n t r o l a n d t r e a t m e n t g r o u p s . T h e t o t a l n u m b e r o f R A M s ( h y p o m e t h y l a t i o n s , h y p e r m e t h y l a t i o n s , a n d n e w m e t h y l a t i o n s ) i n t h e t r e a t m e n t g r o u p d i v i d e d b y t h e t o t a l n u m b e r o f d i f f e r e n t s i z e d P C R p r o d u c t s t h a t r e p o r t e d i n t h e c o n t r o l a n d t r e a t m e n t g r o u p , e x p r e s s e d a s a p e r c e n t , e q u a l s t h e p e r c e n t d i s s i m i l a r i t y o f t h e t r e a t m e n t a s c o m p a r e d t o t h e c o n t r o l p a t t e r n o f m e t h y l a t i o n . 1 8 9 R E S U L T S T h e p r o c e d u r e e m p l o y e d , w h i c h i n v o l v e s m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n , a r b i t r a r i l y p r i m e d P C R , a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s , p e r m i t s t h e s i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n o f t r e a t m e n t - r e l a t e d h y p e r m e t h y l a t i o n s , h y p o m e t h y l a t i o n s , a n d “ n e w ” m e t h y l a t i o n s t h r o u g h o u t G C - r i c h r e g i o n s o f t h e g e n o m e . A d m i n i s t r a t i o n o f P B r e s u l t e d i n n u m e r o u s R A M s i n t h e l i v e r s o f C A R W T m i c e t r e a t e d f o r 2 3 w k , C A R K O m i c e t r e a t e d f o r 2 3 w k a n d i n l i v e r t u m o r s o b s e r v e d f o l l o w i n g t r e a t m e n t o f C A R W T m i c e f o r 3 2 w k ( T a b l e 3 . 1 a n d F i g u r e s 3 . 1 - 3 . 3 ) . T h e a c t u a l b a s i c , u n d e r l y i n g d a t a f o r T a b l e 3 . 1 a n d F i g u r e s 3 . 1 - 3 . 3 a r e l o c a t e d i n t h e A p p e n d i x ( F i g u r e s 3 . 1 - 3 . 3 ) . T r e a t m e n t o f W T m i c e w i t h P B f o r 2 3 w k ( p r e c a n c e r o u s t i s s u e ) a n d 3 2 w k ( t u m o r t i s s u e ) r e s u l t e d i n t h e d e t e c t i o n 4 7 a n d 1 2 9 R A M s , r e s p e c t i v e l y ( T a b l e 3 . 1 ) . C o n s i d e r a b l e i n c r e a s e s o f b o t h h y p o m e t h y l a t i o n s a n d “ n e w ” m e t h y l a t i o n s o c c u r r e d , d i s p l a y i n g g r e a t e r t h e n 2 . 6 - a n d 4 3 - f o l d i n c r e a s e s , r e s p e c t i v e l y , f r o m p r e c a n c e r o u s t o t u m o r t i s s u e ( T a b l e 3 . 1 ) . W h i l e t h e t o t a l n u m b e r o f R A M s d e t e c t e d i n t h e p r e c a n c e r o u s a n d t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e w e r e a p p r o x i m a t e l y e q u a l , t h e s p e c i fi c a l t e r a t i o n s d i f f e r e d . T h e r e w e r e n o h y p e r m e t h y l a t i o n s o b s e r v e d i n t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e , w h i l e 1 0 o c c u r r e d i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e . F u r t h e r m o r e , a p p r o x i m a t e l y t w i c e t h e n u m b e r o f h y p o m e t h y l a t i o n s o c c u r r e d i n t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e a s i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e ( T a b l e 3 . 1 ) . I n o r d e r t o a s c e r t a i n m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t m a y p l a y k e y r o l e s i n l i v e r t u m o r f o r m a t i o n i n t h e C A R W T C 3 H / H e m i c e , u n i q u e R A M s i n t h e p r e c a n c e r o u s a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e w e r e fi r s t i d e n t i fi e d ( F i g u r e 3 . 1 A ) . T h e r e w e r e 1 9 0 7 1 c n o i t a l s y M 2 h t 1 A e R M ” w e N “ b n o l t a s l y M h 0 A t R e m r e p y H a n o i t a s l M y 5 A h t R e m o p y H 1 9 3 M — k w 3 — 2 “ , l a O t K R A C o T 1 9 1 T a b l e 3 . 1 G C - r i c h R e g i o n s o f A l t e r e d M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n t h e L i v e r s o f C 3 H / H e C A R W T a n d K O M i c e T r e a t e d w i t h 0 . 0 5 % P h e n o b a r b i t a l f o r 2 3 o r 3 2 W e e k s 0 . 0 5 % P B H P ’ " 1 3 ° 3 1 6 B s s H I I 2 1 0 0 2 1 T r e a t m e n t G r o u p D i g e s t T O T A L T o t a l d C A R W T , 2 3 w k M s p I 1 4 1 0 1 5 0 . 0 5 % P B H 1 1 1 1 6 6 2 1 4 ( P m n c e m m ) B s s H I I 1 3 o 5 1 8 T o t a l ° C A R W T , 3 2 w k M s p I 2 3 4 2 0 4 7 0 . 0 5 % P B H p a I I 1 1 r 2 8 4 0 ( T u m o r ) B s s I - I I I l 7 0 2 5 4 2 " H y p o m e t h y l a t e d R A M s i n c l u d e b o t h s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d e c r e a s e s a n d 1 0 0 % d e c r e a s e s . b H y p e r m e t h y l a t e d R A M s a r e o n l y t h o s e i n c r e a s e s w h i c h a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( p < 0 . 0 5 ) . ” N e w m e t h y l a t i o n s i n d i c a t e t h e f o r m a t i o n o f a P C R p r o d u c t f o l l o w i n g t r e a t m e n t d u e t o a g a i n o f m e t h y l a t i o n e i t h e r a t t h e s i t e o f p r i m e r a n n e a l i n g o r b e t w e e n s i t e s o f p r i m e r a n n e a l i n g w h i c h w a s n o t p r e s e n t u n d e r c o n t r o l c o n d i t i o n s . d T o t a l R A M s i n c l u d i n g h y p o m e t h y l a t i o n s , h y p e r m e t h y l a t i o n s , a n d n e w m e t h y l a t i o n s f o r a l l t h r e e m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n d i g e s t s a r e r e p o r t e d f o r e a c h t r e a t m e n t . a ] I . " F g g g ' r e 3 . 1 I d e n t i fi c a t i o n o f P B - I n d u c e d U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n t h e P r e c a n c e r o u s a s C o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k P B - T r e a t e d T i s s u e . T h e fl o w c h a r t i n ( A ) d e p i c t s t h e s t e p s t h a t a r e t a k e n t h a t a l l o w f o r t h e i d e n t i fi c a t i o n o f u n i q u e R A M s i n p r e c a n c e r o u s ( C A R W T , 2 3 w k P B ) a s c o m p a r e d t o C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e . S t e p s t h a t a r e r e l e v a n t t o d i s c e r n i n g t h e s e R A M s a r e s h o w n i n n o r m a l f o n t , w h i l e t h o s e t h a t a r e n o t a r e s h o w n i n i t a l i c s . R A M s a r e c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e i f a r e g i o n i s i n c o m m o n b e t w e e n t h e t w o t r e a t m e n t g r o u p s a n d t h e m a g n i t u d e o f t h e m e t h y l a t i o n c h a n g e i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e i s g r e a t e r t h a n t h e c h a n g e i n t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e a s d e t e r m i n e d b y t w o - w a y A N O V A a n a l y s i s ( p < 0 . 0 5 ) o r i f t h e m e t h y l a t i o n c h a n g e s a t a c o m m o n R A M o c c u r i n o p p o s i t e d i r e c t i o n s ( i . e . , a t a c o m m o n R A M , a h y p e r m e t h y l a t i o n o c c u r s i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e a n d a h y p o m e t h y l a t i o n i s o b s e r v e d i n t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e ) . A d d i t i o n a l l y , R A M s t h a t a r e s e e n o n l y i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e a r e c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e . T h e u n i q u e R A M s i n t h e p r e c a n c e r o u s a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e ( I ) a r e d e p i c t e d i n ( B ) . H y p o m e t h y l a t i o n s ( B ) , h y p e r m e t h y l a t i o n s ( I ) , n e w m e t h y l a t i o n s ( I ) , a n d t h o s e R A M s i n c o m m o n b e t w e e n p r e c a n c e r o u s a n d C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e a n d w h i c h e x h i b i t m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t o c c u r i n o p p o s i t e d i r e c t i o n s a r e r e p r e s e n t e d ( E ) . 1 9 2 s ) n 0 0 o i g e 1 R N 0 f o r N C e b m u A ( I I N l - 0 A . ” P r e c a n c e r o u s v s . C A R K O , 2 3 w k P B / \ C R a I “ U n i q u e R A M s r n o n o b s e r v e d o n l y i n / \ p r e c a n c e r o u s _ t i o n c h a a r e d i f f e r e n t M e t h y l a t i o n c h a n g e s a r e 1 . G r e a t e r e x t e n t o f c h a n g e i n p r e c a n c e r o u s e q u i v a l e n t 2 . G r e a t e r e x t e n t o f c h a n g e i n C A R K O , 2 3 w k P B 3 . O p p o s i t e d i r e c t i o n a l c h a n g e i n p r e m n c e r o u s g m 9 ; M i n P r e c a n c e r o u s : 1 . R A M : i t c o m m o n w i t h C A R K 0 . 2 3 w k P B . g r e a t e r e x t e n t o f c h a n g e i n p r e c e n c e r o m 2 . R A M s i n c o m m o n M fl r c A R K O , 2 3 k a B . o p p o e i t e d l r e c t I o n a l c h a n g e 3 . U a n u e R A M e o b s e r v e d o n l y i n p r e c a n c e m u s 4 5 4 0 0 | U n i q u e R A M s i n P r e c a n c e r o u s a s c o m p a r e d t o K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d T i s s u e 1 9 3 4 2 u n i q u e c h a n g e s t h a t o c c u r r e d i n t h e p r e c a n c e r o u s a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e ( F i g u r e 3 . 1 B ) . F r o m t h i s p o o l o f u n i q u e r e g i o n s i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e , c a r r y f o r w a r d R A M s w e r e d i s c e r n e d . C a r r y f o r w a r d R A M s a r e t h o s e r e g i o n s t h a t w e r e c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e i n t h e p r e c a n c e r o u s a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e , w e r e a l s o o b s e r v e d i n t h e t u m o r t i s s u e , a n d w h o s e m e t h y l a t i o n c h a n g e s a t a c o m m o n R A M i n t h e t u m o r a n d p r e c a n c e r o u s w e r e e q u i v a l e n t a s d e t e r m i n e d b y o n e - w a y A N O V A , p < 0 . 0 5 ( F i g u r e 3 . 2 A ) . O f t h e 4 2 u n i q u e R A M s i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e , 1 4 ( 3 3 % ) c a r r i e d f o r w a r d t o t h e t u m o r t i s s u e ( F i g u r e 3 . 2 3 ) . T h e s e c a r r y f o r w a r d c h a n g e s w e r e p r i m a r i l y h y p o m e t h y l a t i o n s ( 7 1 % ) , b u t 2 h y p e r m e t h y l a t i o n s a n d 2 n e w m e t h y l a t i o n s a l s o w e r e o b s e r v e d ( F i g u r e 3 . 2 B ) . A d d i t i o n a l l y , t h e t o t a l u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r t i s s u e w e r e d e t e c t e d ( F i g u r e 3 . 3 A ) . U n i q u e R A M s i n t h e t u m o r t i s s u e a s c o m p a r e d t o t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e c o n s i s t o f c o m m o n R A M s a t w h i c h t h e m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n t h e t u m o r t i s s u e o c c u r t o a g r e a t e r e x t e n t a s d e t e r m i n e d b y o n e - w a y A N O V A a n a l y s i s ( p < 0 . 0 5 ) , c o m m o n R A M s w i t h o p p o s i t e d i r e c t i o n a l c h a n g e s i n t h e t u m o r t i s s u e ( i . e . a t a c o m m o n R A M , P B i n d u c e s a h y p o m e t h y l a t i o n i n t h e t u m o r t i s s u e a n d a h y p e r m e t h y l a t i o n i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e ) , a n d u n i q u e R A M s o b s e r v e d o n l y i n t h e t u m o r t i s s u e . F i n a l l y , t o o b t a i n t h e t o t a l u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r t i s s u e , c o m m o n R A M s i n t h e t u m o r a n d C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e t h a t e x h i b i t e d e q u i v a l e n t m e t h y l a t i o n c h a n g e s a s d e t e r m i n e d b y t w o - w a y A N O V A ( p < 0 . 0 5 ) w e r e s u b t r a c t e d o u t , a s m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t o c c u r i n t h e C A R K O a n i m a l s a r e m o s t l i k e l y n o t c r i t i c a l f o r l i v e r t u m o r i g e n e s i s . 1 9 4 . 1 1 1 . F g g ' r e 3 . 2 P r o g r e s s i v e C h a n g e s i n M e t h y l a t i o n : P B - I n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d M e t h y l a t i o n ( R A M s ) w h i c h C a r r y F o r w a r d f r o m P r e c a n c e r o u s t o T u m o r T i s s u e i n C 3 H / H e C A R W T M i c e . T h e fl o w c h a r t i n ( a ) d e m o n s t r a t e s h o w c a r r y f o r w a r d R A M s f r o m p r e c a n c e r o u s ( C A R W T , 2 3 w k P B ) t o t u m o r ( C A R W T , 3 2 w k P B ) t i s s u e a r e o b t a i n e d . T h e s t e p s t h a t a r e r e l e v a n t t o t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e s e R A M s a r e s h o w n i n n o r m a l f o n t , w h i l e t h o s e t h a t a r e n o t a r e s h o w n i n i t a l i c s . C a r r y f o r w a r d R A M s a r e t h o s e r e g i o n s w h i c h a r e u n i q u e i n t h e p r e c a n c e r o u s a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e , a r e a l s o p r e s e n t i n t h e t u m o r t i s s u e , a n d w h o s e m e t h y l a t i o n c h a n g e s a t t h i s c o m m o n R A M i n t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e a r e e q u i v a l e n t i n m a g n i t u d e a s d e t e r m i n e d b y t w o - w a y A N O V A a n a l y s i s ( p < 0 . 0 5 ) . T o t a l c a r r y f o r w a r d R A M s ( I ) f r o m p r e c a n c e r o u s t o t u m o r t i s s u e a r e d e p i c t e d i n ( b ) . T h e s e R A M s a r e d i v i d e d i n t o h y p o m e t h y l a t i o n s ( B ) , h y p e r m e t h y l a t i o n s ( E ) , a n d n e w m e t h y l a t i o n s ( S ) . 1 9 5 s n o i g e R f o r e b m u N A . l P r e c a n c e n o u s v s . C A R K 0 , 2 3 w k P B ] ‘ T u m o r v s . P r e c a n c e r o u s I U n i r p e R A M a C o m m o n R A M s m ” H I I . 1 . G r e a t e r o n e n t o t c h a n g e h W 2 3 $ 2 . G r e a t e r e x t e n t o f c h a n t h A R K O , 2 3 k a B 3 . 0 p p o e l e d i e c t i o n a l d r a n g e h p r m u n w e 1 0 ° $ 0 9 0 . . U n ‘ n g A M s i n E m : 1 . R A M s i n e o r n m o t h h C A R K O . 2 3 k a B . g r e a t e r e x t e n t o f c h a n g e i n p r e c a n c e r o u e 2 . R A M s i n c o m m o n w i t h C A R K O , 2 3 k a B . o p p o e i t e d i r e c t i o n a l c h a n g e 3 . U n i q u e R A M s o b s e r v e d o n l y I n p r e c a n c e r o u s 1 9 6 F g g g ' r e 3 . 3 T o t a l U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d M e t h y l a t i o n ( R A M s ) T h a t O c c u r r e d a s a R e s u l t o f P B T r e a t m e n t i n t h e T u m o r a s C o m p a r e d t o t h e P r e c a n c e r o u s T i s s u e . T h e d i a g r a m u s e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t o t a l u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r ( C A R W T , 3 2 w k P B ) t i s s u e i s i l l u s t r a t e d i n ( A ) . S t e p s t h a t a r e r e l e v a n t f o r d e t e r m i n i n g t h e s e R A M s a r e s h o w n i n n o r m a l f o n t , w h i l e t h o s e t h a t a r e n o t a r e s h o w n i n i t a l i c s . F i r s t , u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r a s c o m p a r e d t o t h e p r e c a n c e r o u s ( C A R W T , 2 3 w k P B ) t i s s u e w e r e a s c e r t a i n e d . T h e s e i n c l u d e c o m m o n R A M s w i t h a g r e a t e r e x t e n t o f m e t h y l a t i o n c h a n g e i n t h e t u m o r t i s s u e a s d e t e r m i n e d b y o n e - w a y A N O V A a n a l y s i s ( p < 0 . 0 5 ) , c o m m o n R A M s i n w h i c h t h e m e t h y l a t i o n c h a n g e s o c c u r i n o p p o s i t e d i r e c t i o n s , a n d t h o s e R A M s w h i c h a r e o b s e r v e d o n l y i n t h e t u m o r t i s s u e . T h e n m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t o c c u r r e d a t c o m m o n R A M s i n t h e t u m o r a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e a n d w e r e d e t e r m i n e d t o b e e q u i v a l e n t b y t w o - w a y A N O V A a n a l y s i s ( p < 0 . 0 5 ) w e r e s u b t r a c t e d o u t t o e s t a b l i s h t h e t o t a l u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r t i s s u e . T h e s e R A M s ( [ 1 ] ) , r e p r e s e n t e d i n ( B ) , a r e s e g r e g a t e d i n t o h y p o m e t h y l a t i o n s ( fl ) , h y p e r m e t h y l a t i o n s ( a ) , n e w m e t h y l a t i o n s ( I ) , a n d t h o s e R A M s i n c o m m o n b e t w e e n t h e t u m o r a n d p r e c a n c e r o u s t i s s u e w i t h m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t o c c u r r e d i n o p p o s i t e d i r e c t i o n s ( E ) . 1 9 7 s n n o o O i g e R f o ) 0 O r e b m u N A . P r e c a n c e r o u s v s . C A R K C , 2 3 w k P B ‘ I ‘ T u m o r v s . P r e c a n c e r o u s / \ / \ , . C o m m o n R A M s U m q u e R A M s C o n u n o n R A M s m a m o b w v e d o n l y h t u m o r / J n r ’ W m W M M e M y I a fi o n W ” 1 . 6 M a x t a i o f c l u r y e ' n p r o c a m a o u s c h a n g e s l a r t e 1 . G r e - t e r o n e n t o f d w r o e h t u m o r " u m “ . z m m u m h m x o g a w k m e q 2 . 6 m t e r e x t e n t o f c h a n g e h p r e c e n c e r o u s 3 0 ” ) “ d e t h 3 . 0 p p o e i t e d i r e c t i o n a l c h a n g e h u m o r W e ‘ d 5 u 0 0 ‘ ” a “ ? 1 . M h m r o n w i h G A R K O , 2 3 k a B , 1 . R A M s i n c o n u r I o n w i t h p r e c a n c e m u s . g r e a b r e x t e n t o f ” W a t c h m a n M i r t u m o r h l R A M e i n c o r r m o n w i t h p m c a n c e r w s . o p p o e i t e W p a c e r - c u m Z R A M s t h C A R K O . 2 3 k a B , I . 1 I — , r 4 : 1 ‘ u n m t l ' d m c o r m n o n a r r d a q u i v a l e r l b C A R K O . 2 3 I k P B 3 . l i n k - n . 5 “ “ ‘ * 1 2 0 1 0 0 A o N O 1 9 8 I n t o t a l , 1 0 4 u n i q u e R A M s w e r e o b s e r v e d i n t h e t u m o r t i s s u e ( F i g u r e 3 . 3 B ) . N e w m e t h y l a t i o n s a c c o u n t e d f o r 6 3 % ( 6 6 / 1 0 4 ) o f t h e s e c h a n g e s , w h i l e h y p o m e t h y l a t i o n s r e p r e s e n t e d 3 4 % ( 3 5 / 1 0 4 ) a n d h y p e r m e t h y l a t i o n s o n l y 3 % ( 3 / 1 0 4 ) o f t h e t o t a l u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r ( F i g u r e 3 . 3 3 ) . B o t h t h e c a r r y f o r w a r d R A M s a n d t h e t o t a l u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r t i s s u e m a y p l a y c r i t i c a l m e c h a n i s t i c r o l e s d u r i n g t h e f o r m a t i o n o f l i v e r t u m o r s i n t h e C A R W T C 3 H / H e m i c e . A d i a g r a m i l l u s t r a t i n g a l l o f t h e d a t a p r e v i o u s l y d e s c r i b e d i s s h o w n ( F i g u r e 3 . 4 ) . U n i q u e R A M s i n t h e p r e c a n c e r o u s a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e a r e d e p i c t e d , a n d fi ' o m t h e s e r e g i o n s , c a r r y f o r w a r d c h a n g e s f r o m t h e p r e c a n c e r o u s t o t u m o r t i s s u e w e r e d e t e r m i n e d . F i n a l l y , t o o b t a i n t h e t o t a l u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r t i s s u e , 3 h y p o m e t h y l a t i o n s a n d 2 n e w m e t h y l a t i o n s w e r e s u b t r a c t e d o u t f r o m t h e t a l l i e d u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r a s c o m p a r e d t o t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e ( F i g u r e 3 . 4 ) . T h e s e 5 R A M s w e r e u n i q u e i n t h e t u m o r a s c o m p a r e d t o t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e a n d a l s o w e r e c o m m o n R A M s b e t w e e n t h e t u m o r a n d C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e , w i t h t h e i r a s s o c i a t e d m e t h y l a t i o n c h a n g e s d e e m e d t o b e e q u i v a l e n t b y t w o - w a y A N O V A , p < 0 . 0 5 ( F i g u r e 3 . 4 ) . T h e s e R A M s h a v e b e e n e x c l u d e d f r o m t h e t o t a l u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r t i s s u e b e c a u s e t h e y a r e i n c o m m o n a n d e q u i v a l e n t b e t w e e n t h e p r e c a n c e r o u s m i c e a n d t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d m i c e t h a t d o n o t d e v e l o p l i v e r t u m o r s , a n d t h u s a r e p r o b a b l y n o t r e l e v a n t t o t h e t u m o r i g e n e s i s p r o c e s s . W e u n d e r s t a n d t h a t t h i s a c o n s e r v a t i v e a p p r o a c h a n d w e r e c o g n i z e t h a t t h e m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t a r e e q u i v a l e n t i n t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d a n d t u m o r t i s s u e m a y b e n e c e s s a r y b u t n o t s u f fi c i e n t f o r t u m o r d e v e l o p m e n t . I t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t a l l 4 o f t h e u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r a s c o m p a r e d t o t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e i n w h i c h t h e m e t h y l a t i o n c h a n g e s o c c u r r e d i n 1 9 9 U n i q u e R A M s i n F o r w a r d T o t a l U n i q u e R A M S i n P r e c a n c e r o u s R A M S T u m o r s 1 6 . t “ ) r “ ( : 3 o 3 5 e e e e o r . z - 1 ‘ ° e ° e ° e H Y P O M 9 % “ ) ? r ' t : § “ 1 a “ o ° e % 9 G 9 2 . 5 9 - 0 G ' t r ' t ’ e i ‘ f e m e ‘ a e a e a n ® ® ® U s ” ; a c c e n t s I n 3 9 9 3 6 3 0 H Y P E R M ® ® 5 ’ 0 0 9 9 r a j ) 5 0 O 6 6 1 6 : O . o z o z o z o z o . Q 0 G 0 E 0 9 8 8 8 8 0 N E W M 9 0 g 0 o ° o ° o ° o ° o ° o 0 e 0 . o o o o o o o 8 9 Q o o o o o o o o 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ° 0 0 o o o o F ' g g r e 3 . 4 A S u m m a r y o f R e g i o n s o f A l t e r e d M e t h y l a t i o n ( R A M s ) t h a t C a r r y F o r w a r d f r o m t h e P r e c a n c e r o u s t o t h e T u m o r T i s s u e a n d T o t a l U n i q u e R A M s i n t h e T u m o r T i s s u e . T h e u n i q u e R A M s i n t h e p r e c a n c e r o u s ( C A R W T , 2 3 w k P B ) a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e a r e s h o w n o n t h e l e f t ( 0 ) . R A M s t h a t c a r r i e d f o r w a r d i n t h e C A R W T m i c e f r o m p r e c a n c e r o u s t o t u m o r ( C A R W T , 3 2 w k P B ) t i s s u e a r e d e p i c t e d ( O ) o n t h e r i g h t . T o t a l u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r t i s s u e a r e r e p r e s e n t e d o n t h e f a r r i g h t ( 0 ) . T o o b t a i n t h e t o t a l u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r t i s s u e , c o m m o n R A M s i n t h e t u m o r a s c o m p a r e d t o t h e C A R K C , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e w h i c h w e r e e q u i v a l e n t a s d e t e r m i n e d b y t w o - w a y A N O V A a n a l y s i s w e r e s u b t r a c t e d fi o m t h e u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r a s c o m p a r e d t o t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e a n d a r e n o t s h o w n h e r e . A l l R A M s a r e d i v i d e d i n t o h y p o m e t h y l a t i o n s ( H Y P O M ) , h y p e r m e t h y l a t i o n s ( H Y P E R M ) , a n d n e w m e t h y l a t i o n s ( N E W M ) . I t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t t h e 4 R A M s i n c o m m o n b e t w e e n t h e t u m o r a n d t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e w h i c h h a v e m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t a r e o p p o s i t e i n d i r e c t i o n i n t h e t u m o r a n d p r e c a n c e r o u s t i s s u e ( F i g u r e 3 . 3 3 ) w e r e a l l h y p o m e t h y l a t i o n s i n t h e t u m o r . T h u s t h e 3 5 h y p o m e t h y l a t i o n s t h a t a r e u n i q u e i n t h e t u m o r t i s s u e ( F i g u r e 3 . 4 ) i n c l u d e t h e 3 1 r e g i o n s o f h y p o m e t h y l a t i o n ( F i g u r e 3 . 3 B ) a d d e d t o t h e 4 R A M s i n w h i c h m e t h y l a t i o n c h a n g e s o c c u r r e d i n o p p o s i t e d i r e c t i o n s i n t h e t u m o r a s c o m p a r e d t o t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e ( F i g u r e 3 . 3 B ) . A l l 4 w e r e h y p o m e t h y l a t e d i n t h e t u m o r t i s s u e a n d a r e t a l l i e d a s s u c h . 2 0 0 o p p o s i t e d i r e c t i o n s ( F i g u r e 3 . 3 B ) w e r e P B - e l i c i t e d h y p o m e t h y l a t i o n s i n t h e t u m o r t i s s u e ( a s c o m p a r e d t o a n i n c r e a s e i n m e t h y l a t i o n a t t h e c o m m o n r e g i o n i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e ) a n d a r e c a t e g o r i z e d a s s u c h ( F i g u r e 3 . 4 ) . T h e c a l c u l a t i o n o f p e r c e n t d i s s i m i l a r i t y a l l o w s f o r t h e e v a l u a t i o n o f P B - i n d u c e d p a t t e r n s o f a l t e r e d m e t h y l a t i o n i n a t r e a t m e n t g r o u p a s c o m p a r e d t o a c o n t r o l g r o u p . D i s s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e p r e c a n c e r o u s a n d t h e C A R W T , 2 3 w k c o n t r o l t i s s u e w a s 4 7 % b u t i n c r e a s e d t o 8 3 % i n t h e t u m o r t i s s u e ( F i g u r e 3 . 5 ) . T h i s o b s e r v a t i o n i n d i c a t e s t h a t t h e m e t h y l a t i o n p a t t e r n b e c a m e p r o g r e s s i v e l y a b e r r a n t w i t h p r o l o n g e d P B t r e a t m e n t . F u r t h e r m o r e , t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e d e m o n s t r a t e d 5 3 % d i s s i m i l a r i t y i n i t s m e t h y l a t i o n p a t t e r n a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k c o n t r o l t i s s u e ( F i g u r e 3 . 5 ) . 2 0 1 y t i r a l i m i s s i D % K O , 2 3 w k P B W T , 2 3 w k P B W T , 3 2 w k P B v s . ( P r e c a n c e r o u S ) ( T u m o r ) K O , C o n t r o l V S - v s . W T , C o n t r o l W T . C o n t r o l F m r e 3 . 5 D e t e r m i n a t i o n o f P e r c e n t D i s s i m i l a r i t y B e t w e e n P r e c a n c e r o u s v s . C A R W T , 2 3 w k C o n t r o l , T u m o r v s . C A R W T , 2 3 w k C o n t r o l , a n d C A R K O , 2 3 w k P B v s . C A R K O , 2 3 w k C o n t r o l T i s s u e . D i s s i n r i l a r i t y b e t w e e n p a t t e r n s o f m e t h y l a t i o n i n a t r e a t m e n t g r o u p a n d i t s r e s p e c t i v e c o n t r o l g r o u p w a s c a l c u l a t e d . F o r e x a m p l e , t o d e t e r m i n e h o w d i s s i m i l a r t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e i s a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k c o n t r o l t i s s u e , t h e n u m b e r o f r e g i o n s o f a l t e r e d m e t h y l a t i o n ( i n c l u d i n g h y p o m e t h y l a t i o n s , h y p e r m e t h y l a t i o n s , a n d n e w m e t h y l a t i o n s ) p r e s e n t i n t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e w a s d i v i d e d b y t h e t o t a l n u m b e r o f d i f f e r e n t s i z e d P C R p r o d u c t s r e p o r t i n g i n t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d a n d C A R K O , 2 3 w k c o n t r o l g r o u p s a n d e x p r e s s e d a s a p e r c e n t . T h e s a m e f u n d a m e n t a l c a l c u l a t i o n w a s p e r f o r m e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f p e r c e n t d i s s i m i l a r i t y i n t h e p r e c a n c e r o u s ( C A R W T , 2 3 w k P B ) v s . C A R W T , 2 3 w k c o n t r o l t i s s u e a n d i n t h e t u m o r ( C A R W T , 3 2 w k P B ) v s . C A R W T , 2 3 w k c o n t r o l t i s s u e . 2 0 2 D I S C U S S I O N W e h a v e d e v e l o p e d a n a p p r o a c h t h a t i n v o l v e s m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n , a r b i t r a r i l y p r i m e d P C R , a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n o f t h e r e s u l t i n g P C R p r o d u c t s w h i c h p e r m i t s t h e d e t e c t i o n o f t r e a t m e n t - r e l a t e d c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n , i . e . s i t e s o f h y p o - , h y p e r - , a n d “ n e w ” m e t h y l a t i o n , t h a t o c c u r s i m u l t a n e o u s l y t h r o u g h o u t m u l t i p l e r e g i o n s o f t h e g e n o m e ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . D N A i s s u b j e c t e d t o a d o u b l e d i g e s t w i t h a n o n - m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e e n z y m e p l u s o n e t h a t i s m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e : R s a I / M s p l , R s a I / H p a I I o r B f a I / B s s H I I . B y e v a l u a t i n g C C G G s i t e s , w e a r e a s s e s s i n g t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f a p p r o x i m a t e l y 7 . 4 5 % o f t h e C p G d i n u c l e o t i d e s w i t h i n t h e m o u s e g e n o m e , 4 . 3 7 % o f w h i c h a r e l o c a t e d w i t h i n u n i q u e s e q u e n c e s a n d 3 . 0 8 % o f w h i c h a r e f o u n d i n t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s ( F a z z a r i a n d G r e a l l y , 2 0 0 4 ) . A s i g n i fi c a n t a d v a n t a g e o f u s i n g M s p I a n d H p a I I i s t h a t t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s a t C p C p G s i t e s a s w e l l a s C p G s i t e s a r e e v a l u a t e d , r e s p e c t i v e l y , a f f o r d i n g t h e o p p o r t u n i t y t o c o m p l e m e n t a r i l y a s s e s s a w i d e r s p e c t r u m o f m e t h y l a t i o n a l t e r a t i o n s . R e s t r i c t i o n w i t h B f a I l e a v e s C p G i s l a n d s m o r e i n t a c t t h a n R s a I ( S h i r a i s h i e t a l . , 1 9 9 5 ) t h u s i n c r e a s i n g t h e p r o b a b i l i t y t h a t s u b s e q u e n t d i g e s t i o n w i t h t h e 6 - b a s e c u t t e r B s s H I I w i l l a l l o w f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s a t s i t e s w i t h i n C p G i s l a n d s . T h e c o m b i n a t i o n o f r e s t r i c t i o n d i g e s t s e m p l o y e d p e r m i t s a r o b u s t e v a l u a t i o n o f m e t h y l a t i o n s t a t u s a l o n g m u l t i p l e r e g i o n s o f t h e g e n o m e . T h e n o n g e n o t o x i c r o d e n t t u m o r p r o m o t e r P B d e c r e a s e s g l o b a l m e t h y l a t i o n l e v e l s t o a g r e a t e r e x t e n t i n l i v e r t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 6 ) . F u r t h e r m o r e , h i g h e r l e v e l s o f h y p e r m e t h y l a t i o n o c c u r r e d a t t h e i n t e r n a l a n d e x t e r n a l c y t o s i n e s o f t h e r e c o g n i t i o n s e q u e n c e 5 ’ C C G G 3 ’ i n m i c e 2 0 3 t h a t a r e m o r e s u s c e p t i b l e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s a s c o m p a r e d t o m i c e t h a t a r e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t ( C 3 H / H e > > B 6 C 3 F 1 > C 5 7 B L / 6 ) ( W a t s o n a n d G o o d m a n , 2 0 0 2 ) . U s i n g t h e a f o r e m e n t i o n e d a p p r o a c h , w e r e c e n t l y e v a l u a t e d t h e e f f e c t o f P B o n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f D N A fi ' o m B 6 C 3 F l a n d C 5 7 B L / 6 m i c e ( B a c l u n a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . T h i s m e t h o d i s a n i m p r o v e m e n t o v e r t h e p o l y a c r y l a m i d e g e l - b a s e d p r o c e d u r e u s e d b y W a t s o n a n d G o o d m a n ( 2 0 0 2 ) b e c a u s e t h e c u r r e n t c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s - b a s e d t e c h n i q u e p e r m i t s a m u c h m o r e p r e c i s e s e p a r a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f t h e P C R p r o d u c t s . U n i q u e R A M s i n t h e s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 m i c e w e r e i d e n t i fi e d ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . T h e p r i m a r y a d v a n t a g e o f c o m p a r i n g m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t o c c u r i n s e n s i t i v e v s . r e s i s t a n t m i c e i s t h a t t h e R A M s w h i c h m a y b e m o s t i m p o r t a n t f o r t u m o r i g e n e s i s ( i . e . u n i q u e i n t h e s e n s i t i v e m i c e ) a r e s e g r e g a t e d o u t f r o m t h o s e w h i c h a r i s e o n l y i n t h e r e s i s t a n t g r o u p . T h i s a p p r o a c h i s c o n s e r v a t i v e i n t h e s e n s e t h a t w e m a y b e e x c l u d i n g s o m e R A M s t h a t a r e n e c e s s a r y b u t n o t s u f fi c i e n t f o r t u m o r d e v e l o p m e n t b y “ d i s c a r d i n g ” t h o s e t h a t a r e i n c o m m o n a n d e q u i v a l e n t b e t w e e n B 6 C 3 F l a n d C 5 7 B L / 6 m i c e . I n t h e c u r r e n t s t u d y , a n o t h e r s e n s i t i v e v s . r e s i s t a n t c o m p a r i s o n w a s m a d e b e t w e e n P B - i n d u c e d R A M s t h a t f o r m e d i n t h e l i v e r s o f s e n s i t i v e C A R W T m i c e , w h i c h d e v e l o p p r e n e o p l a s t i c l e s i o n s a f t e r 2 3 w k a n d l i v e r t u m o r s a f t e r 3 2 w k o f P B t r e a t m e n t , a n d t h e r e s i s t a n t C A R K O m i c e w h i c h d o n o t d e v e l o p l i v e r l e s i o n s a f t e r 2 3 w k o f p r o m o t i o n o r t u m o r s a f t e r 3 2 w k . R A M s w e r e e l i c i t e d i n a l l 3 g r o u p s , i n d i c a t i n g t h a t P B i n d u c e s m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n t h e s e m i c e i n b o t h a C A R - d e p e n d e n t a n d C A R - i n d e p e n d e n t m a n n e r ( T a b l e 3 . 1 ) . T h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h m i c r o a r r a y d a t a t h a t s h o w s t h a t a p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e P B - i n d u c e d g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s t h a t o c c u r i n m o u s e l i v e r a r e C A R - d e p e n d e n t w h i l e t h e o t h e r h a l f a r e C A R - i n d e p e n d e n t ( U e d a e t a l . , 2 0 0 2 a ) . 2 0 4 F u r t h e r m o r e , c h r o n i c a c t i v a t i o n o f C A R c a u s e s t u m o r f o r m a t i o n i n m i c e ( H u a n g e t a l . , 2 0 0 5 ; Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . A l l o f t h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e c o n c e p t t h a t P B i n d u c e s C A R - d e p e n d e n t a n d C A R - i n d e p e n d e n t a l t e r a t i o n s , i n c l u d i n g m e t h y l a t i o n c h a n g e s , i n m o u s e l i v e r . W e h y p o t h e s i z e t h a t P B - i n d u c e d R A M s t h a t o c c u r u n i q u e l y i n t h e C A R W T m i c e , e s p e c i a l l y t h o s e w h i c h c a r r y f o r w a r d f r o m t h e 2 3 w k t o 3 2 w k t i m e p o i n t s , m a y p l a y k e y r o l e s u n d e r l y i n g p r o m o t i o n o f l i v e r t u m o r i g e n e s i s b y P B . M o r e R A M s f o r m e d i n t h e t u m o r a s c o m p a r e d t o t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e , s u g g e s t i v e o f a t i m e - d e p e n d e n t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n d u r a t i o n o f P B t r e a t m e n t a n d n u m b e r o f R A M s ( T a b l e 3 . 1 ) . T h e u n i q u e R A M s o b s e r v e d i n t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e ( F i g . 3 . 4 ) m i g h t f a c i l i t a t e t u m o r i g e n e s i s , e s p e c i a l l y t h o s e t h a t c a r r y f o r w a r d f r o m a n e a r l y ( p r e c a n c e r o u s ) t o a l a t e r ( t u m o r ) s t a g e o f t u m o r i g e n e s i s . I t i s i m p o r t a n t t o r e c o g n i z e t h a t t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e i s h e t e r o g e n e o u s , c o m p r i s e d o f b o t h n o n - f o c a l t i s s u e a n d p r e n e o p l a s t i c f o c i . B y i d e n t i f y i n g m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t c a r r y f o r w a r d f r o m t h e p r e c a n c e r o u s t o t h e t u m o r t i s s u e , w e a r e a b l e t o f o c u s u p o n t h e c r u c i a l c h a n g e s t h a t m o s t l i k e l y o c c u r i n b o t h t h e p r e n e o p l a s t i c a n _ d n e o p l a s t i c l e s i o n s . M o r e o v e r , t h e r e w e r e 1 0 4 t o t a l u n i q u e R A M s t h a t f o r m e d i n t h e t u m o r t i s s u e , a n d t h i s n u m b e r d o e s n o t i n c l u d e t h e 5 R A M s t h a t w e r e i n c o m m o n a n d e q u i v a l e n t b e t w e e n t h e K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d t i s s u e a n d t h e t u m o r t i s s u e , w h i c h w e r e e x c l u d e d i n a n e f f o r t t o b e t t e r f o c u s u p o n t h e R A M s t h a t w e r e c o m p l e t e l y u n i q u e t o t h e s e n s i t i v e C A R W T m i c e ( F i g . 3 . 3 B ) . T h i s o b s e r v a t i o n s u p p o r t s t h e m u l t i s t e p / m u l t i s t a g e m o d e l o f t u m o r i g e n e s i s ( D r a g a n e r a l . , 1 9 9 3 ) , d u r i n g w h i c h t h e r e i s a p r o g r e s s i v e a c c u m u l a t i o n o f c e l l s t h a t h a v e o b t a i n e d h e r i t a b l e c h a n g e s ( i . e . g e n e t i c o r e p i g e n e t i c ) , w h i c h a r e c r i t i c a l f o r t h e s e l e c t i o n a n d c l o n a l e x p a n s i o n o f i n i t i a t e d c e l l s . 2 0 5 I n a d d i t i o n t o t h e p o s s i b l e i n v o l v e m e n t o f m u t a t i o n s i n k e y g e n e s , e p i g e n e t i c e v e n t s h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n t h e t u m o r i g e n e s i s p r o c e s s ( F e i n b e r g e t a l . , 2 0 0 6 ; G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) . H y p e r m e t h y l a t i o n c a n d o w n r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s s u c h a s M L H I , V H L , a n d R B ] ( J o n e s a n d L a i r d , 1 9 9 9 ) a n d h y p o m e t h y l a t i o n c a n a c t i v a t e o n c o g e n e s ( N i s h i g a k i e t a l . , 2 0 0 5 ; O s h i m o e t a l . , 2 0 0 3 ) p l u s i n c r e a s e g e n e t i c i n s t a b i l i t y ( E d e n e t a l . , 2 0 0 3 ) a n d t u m o r b u r d e n ( G a u d e t e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h u s , t h e p r e s e n c e o f u n i q u e R A M s i n t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w k - P B t r e a t e d t i s s u e , i n d i c a t e s t h a t e p i g e n e t i c a l t e r a t i o n s a r e i n v o l v e d i n p r o m o t i o n o f m o u s e l i v e r t u m o r s b y P B . C A R m a y m e d i a t e h y p o m e t h y l a t i o n b y b l o c k i n g t h e m e t h y l t r a n s f e r a s e e n z y m e s f r o m a c t i n g o n D N A o r r e c r u i t i n g p r o t e i n s r e s p o n s i b l e f o r a c t i v e d e m e t h y l a t i o n ( B h a t t a c h a r y a e t a l . , 1 9 9 9 ; J o s t e t a l . , 2 0 0 1 ; Z h u e t a l . , 2 0 0 0 ) . C A R c o u l d a l s o i n d u c e h y p o m e t h y l a t i o n b y e n g a g i n g c y t i d i n e d e a m i n a s e s , s u c h a s t h o s e f r o m t h e A i d / A p o b e c f a m i l y ( M o r g a n e t a l . , 2 0 0 4 ) . C o n v e r s e l y , C A R m a y f a c i l i t a t e h y p e r m e t h y l a t i o n b y r e c r u i t i n g m e t h y l t r a n s f e r a s e s , a s i n t h e c a s e o f G C N F a n d t h e r e s u l t i n g d o w n r e g u l a t i o n o f 0 c t - 3 / 4 e x p r e s s i o n d u r i n g g a s t r u l a t i o n ( S a t o e t a l . , 2 0 0 6 ) . A d d i t i o n a l l y , C A R c o u l d m e d i a t e g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s t h a t a f f e c t e n z y m e s i n v o l v e d i n l - c a r b o n m e t a b o l i s m , t h e r e b y a l t e r i n g l e v e l s o f m e t h y l g r o u p s a v a i l a b l e f o r S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e f o r m a t i o n . F o r e x a m p l e , d i e t s d e v o i d o f c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e , c o m p o u n d s w h i c h s e r v e a s m e t h y l - g r o u p d o n o r s f o r t h e D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e r e a c t i o n , c a u s e l i v e r c a n c e r i n r o d e n t s ( G h o s h a l a n d F a r b e r , 1 9 8 4 ) . C A R m a y a l s o a f f e c t e x p r e s s i o n a n d / o r a c t i v i t y o f t h e D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s ( D n m t l , D n m t 3 a , D n m t 3 b ) . 2 0 6 T h e h u m a n i s o f o r m o f C A R ( h C A R ) ( B a e s e t a l . , 1 9 9 4 ) d i f f e r s f r o m i t s m u r i n e c o u n t e r p a r t ( m C A R ) ( C h o i e t a l . , 1 9 9 7 ) a n d s t r u c t u r a l v a r i a t i o n s s e e m t o b e r e s p o n s i b l e f o r s o m e o f t h e d i f f e r e n t r e s p o n s e s o f h C A R a s c o m p a r e d t o m C A R ( U e d a e t a l . , 2 0 0 2 b ) . F o r i n s t a n c e , K a w a m o t o e t a l . ( 2 0 0 0 ) f o u n d t h a t e s t r a d i o l a n d e s t r o n e a c t i v a t e d m C A R b u t n o t h C A R . A d d i t i o n a l l y , m C A R a n d h C A R a r e b o t h a c t i v a t e d b y P B ( M o o r e e t a l . , 2 0 0 0 ) , b u t t h e P B - l i k e i n d u c e r T C P O B O P i s a n a g o n i s t f o r m C A R a n d n o t h C A R ( M o o r e e t a l . , 2 0 0 0 ; T z a m e l i e t a l . , 2 0 0 0 ) . C o n v e r s e l y , t h e x e n o b i o t i c 6 - ( 4 - c h l o r o p h e n y l - i m i d a z o [ 2 , l - b ] [ 1 , 3 ] t h i a z o l e - 5 - c a r b a l d e h y d e 0 - ( 3 , 4 - d i c h l o r o b e n z y l ) o x i m e i s a n a g o n i s t f o r h C A R b u t d o e s n o t a f f e c t m C A R ( M a g l i c h e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h e r e a l s o a r e i m p o r t a n t s p e c i e s d i f f e r e n c e s i n t e r m s o f c r o s s t a l k b e t w e e n C A R a n d t h e x e n o b i o t i c - s e n s i n g p r e g n a n e X r e c e p t o r ( P X R ) . F o r e x a m p l e , T C P O B O P a c t i v a t e s m C A R a n d h P X R b u t n o t h C A R o r m P X R ( M o o r e e t a l . , 2 0 0 0 ) . S i m i l a r l y , c l o t r i m a z o l e c a n i n d u c e h P X R a n d i n h i b i t h C A R b u t i t d o e s n o t a f f e c t m C A R ( M o o r e e t a l . , 2 0 0 0 ) . F i n a l l y , a n d r o s t a n o l s e r v e s a s a n i n v e r s e a g o n i s t f o r C A R , w i t h i t s e f f e c t s b e i n g g r e a t e r i n m C A R a s c o m p a r e d t o h C A R , w h i l e i t a c t i v a t e s b o t h m P X R a n d h P X R ( M o o r e e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h u s , t h e r e a r e i m p o r t a n t s t r u c t u r a l a n d r e g u l a t o r y d i f f e r e n c e s b e t w e e n m C A R a n d h C A R . T h e s e d i s t i n c t i o n s m i g h t , i n p a r t , p r o v i d e a m e c h a n i s t i c b a s i s , p o s s i b l y i n c l u d i n g d i f f e r e n c e s i n c a p a c i t y t o m a i n t a i n n o r m a l p a t t e r n s o f D N A m e t h y l a t i o n , f o r t h e o b s e r v a t i o n t h a t P B , w h i l e b e i n g a b l e t o p r o m o t e r o d e n t l i v e r t u m o r s , i s n o t a h u m a n c a r c i n o g e n ( L a m m i n p a a e t a l . , 2 0 0 2 ; W h y s n e r e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e q u e s t i o n r e m a i n s , “ W h y a r e h u m a n s m o r e r e s i s t a n t t o t h e e f f e c t s o f P B ? ” P a r t o f t h e a n s w e r m a y l i e d o w n s t r e a m o f C A R , i n t e r m s o f t h e g e n e s t h a t a r e i n d u c e d / r e p r e s s e d , s o m e o f w h i c h m a y b e d e r e g u l a t e d b y m e t h y l a t i o n c h a n g e s . M a n y o f 2 0 7 t h e s a m e t u m o r s u p p r e s s o r s a n d o n c o g e n e s , s u c h a s p R B , p 5 3 , P T E N , a n d M L H l ( H e r z i g a n d C h r i s t o f o r i , 2 0 0 2 ) , t h a t a r e i n v o l v e d i n a v a r i e t y o f h u m a n c a n c e r s a r e i d e n t i c a l t o t h o s e i m p l i c a t e d i n m o u s e t u m o r i g e n e s i s , a n d s o w h i l e t h e s a m e g e n e s m a y b e a f f e c t e d d u r i n g h u m a n a n d m o u s e t u m o r i g e n e s i s , l e s i o n s m a y f o r m o n l y i n m i c e d u e t o d i f f e r e n c e s i n r e g u l a t i o n o f t h e s e g e n e s , a n d a l t e r e d m e t h y l a t i o n m a y b e a c o m p o n e n t o f t h i s p r o c e s s . I n g e n e r a l , h u m a n s a r e l e s s s u s c e p t i b l e t o c a r c i n o g e n e s i s a s c o m p a r e d t o r o d e n t s ( R a n g a r a j a n a n d W e i n b e r g , 2 0 0 3 ) . I n t h i s c o n t e x t , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s a r e b e t t e r p r e s e r v e d i n h u m a n a s c o m p a r e d t o r o d e n t c e l l s i n c u l t u r e ( r e v i e w e d i n G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) . T h e r e f o r e , h u m a n s m i g h t b e m o r e c o m p a r a b l e t o t h e r e s i s t a n t K O m i c e i n t h e s e n s e t h a t t h e m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t o c c u r i n t h e C A R K O m i c e a n d a n y a l t e r a t i o n s i n h u m a n s m a y n o t b e a s d e t r i m e n t a l a s t h o s e t h a t a r i s e i n t h e C A R W T m i c e , a n d t h i s c o u l d b e a r e s u l t o f d o w n s t r e a m d i f f e r e n c e s i n t h e R A M s c a u s e d b y m C A R v s . h C A R . T h e a p p r o a c h t h a t o u r l a b o r a t o r y r e c e n t l y d e v e l o p e d a f f o r d s u s t h e o p p o r t u n i t y t o d e t e c t t r e a t m e n t - r e l a t e d a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n , i n c l u d i n g s i t e s o f h y p e r - , h y p o - , a n d “ n e w ” m e t h y l a t i o n s . P B - e l i c i t e d u n i q u e R A M s w e r e i d e n t i fi e d i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e C A R W T m i c e a s c o m p a r e d t o t h e r e s i s t a n t C A R K O m i c e , a n d t h e s e c h a n g e s , i n c l u d i n g u n i q u e R A M s i n t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e a n d e s p e c i a l l y t h o s e t h a t c a r r y f o r w a r d fi o m t h e e a r l y t o t h e l a t e r t i m e p o i n t , m a y p l a y k e y r o l e s i n t u m o r f o r m a t i o n i n t h e s e m i c e . C u r r e n t l y , t h e P C R p r o d u c t s t h a t r e p r e s e n t t h e s e k e y R A M s a r e b e i n g c l o n e d , s e q u e n c e d , a n d a n n o t a t e d i n a n a t t e m p t t o i d e n t i f y s p e c i fi c , n o v e l g e n e s t h a t a r e i n v o l v e d i n t h e t u m o r i g e n e s i s p r o c e s s d u e t o a l t e r e d m e t h y l a t i o n . 2 0 8 A C K N O W L E D G E M E N T S J . M . P . i s a p r e d o c t o r a l f e l l o w s u p p o r t e d b y N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h - N a t i o n a l I n s t i t u t e o f E n v i r o n m e n t a l H e a l t h S c i e n c e s t r a i n i n g g r a n t N o . T 3 2 - E S - 7 2 5 5 . R e s e a r c h s u p p o r t , i n t h e f o r m o f a g i f t , f r o m t h e R ] . R e y n o l d s T o b a c c o C o m p a n y i s a c k n o w l e d g e d g r a t e f u l l y . R E F E R E N C E S A s s e m , M . , S c h u e t z , E . G . , L e g g a s , M . , S u n , D . , Y a s u d a , K . , R e i d , G . , Z e l c e r , N . , A d a c h i , M . , S t r o m , S . , E v a n s , R . M . , M o o r e , D . D . , B o r s t , P . , a n d S c h u e t z , J . D . ( 2 0 0 4 ) I n t e r a c t i o n s b e t w e e n h e p a t i c M r p 4 a n d S u l t 2 a a s r e v e a l e d b y t h e c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r a n d M r p 4 k n o c k o u t m i c e . J . B i o l . C h e m . 2 1 , 2 2 2 5 0 - 2 2 2 5 7 . B a c h m a n , A . N . , C u r t i n , G . M . , D o o l i t t l e , D . J . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 6 a ) A l t e r e d m e t h y l a t i o n i n g e n e - s p e c i fi c a n d G C - r i c h r e g i o n s o f D N A i s p r o g r e s s i v e a n d n o n r a n d o m d u r i n g p r o m o t i o n o f s k i n t u m o r i g e n e s i s . T o x i c o l . S c i . 9 1 , 4 0 6 — 4 1 8 . . B a c h m a n , A . N . , P h i l l i p s , J . M , a n d G o o d m a n J . I . ( 2 0 0 6 b ) P h e n o b a r b i t a l i n d u c e s p r o g r e s s i v e p a t t e r n s o f G C - r i c h a n d g e n e - s p e c i fi c a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n i n t h e l i v e r o f t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 M i c e . T o x i c o l . S c i . 9 1 , 3 9 3 - 4 0 5 . B a e s , M . , G u l i c k , T . , C h o i , H . S . , M a r t i n o l i , M . G . , S i r n h a , D . , a n d M o o r e , D . D . ( 1 9 9 4 ) A n e w o r p h a n m e m b e r o f t h e n u c l e a r h o r m o n e r e c e p t o r s u p e r f a m i l y t h a t i n t e r a c t s w i t h a s u b s e t o f r e t i n o i c a c i d r e s p o n s e e l e m e n t s . M o l . C e l l . B i o l . 1 4 , 1 5 4 4 - 1 1 5 2 . B h a t t a c h a r y a , S . K . , R a m c h a n d a n i , S . , C e r v o n i , N . , a n d S z y f , M . ( 1 9 9 9 ) A m a m m a l i a n p r o t e i n w i t h s p e c i fi c d e m e t h y l a s e a c t i v i t y f o r m e G D N A . N a t u r e 3 9 7 , 5 7 9 - 5 8 3 . B u c h m a n n , A . , B a u e r - H o f r n a n n , R . , M a h r , J . , D r i n k w a t e r , N . R . , L u z , A . , a n d S c h w a r z , M . ( 1 9 9 1 ) M u t a t i o n a l a c t i v a t i o n o f t h e c - H a - r a s g e n e i n l i v e r t u m o r s o f d i f f e r e n t r o d e n t s t r a i n s : c o r r e l a t i o n w i t h s u s c e p t i b i l i t y t o h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 8 , 9 1 1 - 9 1 5 . C h o i , H . S . , C h u n g , M . , T z a m e l i , I . , S i r n h a , D . , L e e , Y . K . , S e o l , W . , a n d M o o r e , D . D . ( 1 9 9 7 ) D i f f e r e n t i a l t r a n s a c t i v a t i o n b y t w o i s o f o r m s o f t h e o r p h a n n u c l e a r h o r m o n e r e c e p t o r C A R . . 1 B i o l . C h e m . 2 7 2 , 2 3 5 6 5 - 2 3 5 7 1 . C l a r k , S . J . , H a r r i s o n , J . , a n d F r o m m e r , M . ( 1 9 9 5 ) C p r G m e t h y l a t i o n i n m a m m a l i a n c e l l s . N a t . G e n e t . 1 0 , 2 0 - 2 7 . C o u n t s , J . L . a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 ) A l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n m a y p l a y a v a r i e t y o f r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s . C e l l 8 3 , 1 3 - 1 5 . C o u n t s , J . L . , S a r m i e n t o , J . 1 . , H a r b i s o n , M . L . , D o w n i n g , J . C . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 6 ) C e l l p r o l i f e r a t i o n a n d g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s c h a n g e s i n m o u s e l i v e r a f t e r p h e n o b a r b i t a l a n d / o r c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e fi c i e n t d i e t a d m i n i s t r a t i o n . 2 0 9 C a r c i n o g e n e s i s 1 7 , 1 2 5 1 - 1 2 5 7 . D r a g a n , Y . P , S a r g e n t , L . , X u , Y . D . , X u , Y . H . , a n d P i t o t , H . C . ( 1 9 9 3 ) T h e i n i t i a t i o n p r o m o t i o n - p r o g r e s s i o n m o d e l o f r a t h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 2 0 2 , 1 6 - 2 4 . E d e n , A . , G a u d e t , F . , W a g l r r n a r e , A . , a n d J a e n i s c h , R . ( 2 0 0 3 ) C h r o m o s o m a l i n s t a b i l i t y a n d t u m o r s p r o m o t e d b y D N A h y p o m e t h y l a t i o n . S c i e n c e 3 0 0 , 4 5 5 . E h r l i c h , M . , G a m a - S o s a , M . A . , H u a n g , L . H . , M i d g e t t , R . M . , K u o , K . C . , M c C u n e , R . A . , a n d G e h r k e , C . ( 1 9 8 2 ) A m o u n t a n d d i s t r i b u t i o n o f 5 - m e t h y l c y t o s i n e i n h u m a n D N A f r o m d i f f e r e n t t y p e s o f t i s s u e s o f c e l l s . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 0 , 2 7 0 9 - 2 7 2 1 . F a z z a r i , M . J . , a n d G r e a l l y , J . M . ( 2 0 0 4 ) E p i g e n o m i c s : B e y o n d C p G i s l a n d s . N a t . R e v . G e n e t . 5 , 4 4 6 - 4 5 5 . F e i n b e r g A P , O h l s s o n R , H e n i k o f f S . ( 2 0 0 6 ) T h e e p i g e n e t i c p r o g e n i t o r o r i g i n o f h u m a n c a n c e r . N a t . R e v . G e n e t . 7 , 2 1 - 3 3 . G a m a - S o s a , M . A . , S l a g e l , V . A . , T r e w y n , R . W . , O x e n h a n d l e r , R . , K u o , K . C . , G e h r k e , C . W . , a n d E h r l i c h , M . ( 1 9 8 3 ) T h e S - m e t h y l c y t o s i n e c o n t e n t o f D N A f r o m h u m a n t u m o r s . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 1 , 6 8 8 3 - 6 8 9 4 . G a u d e t , F . , H o d g s o n , J . G . , E d e n , A . , J a c k s o n - G r u s b y , L . , D a u s m a n , J . , G r a y , J . W . , L e o n h a r d t , H . , a n d J a e n i s c h , R . ( 2 0 0 3 ) I n d u c t i o n o f t u m o r s i n m i c e b y g e n o m i c h y p o m e t h y l a t i o n . S c i e n c e 3 0 0 , 4 8 9 - 4 9 2 . G h o s h a l , A . K . a n d F a r b e r , E . ( 1 9 8 4 ) T h e i n d u c t i o n o f l i v e r c a n c e r b y d i e t a r y d e fi c i e n c y o f c h o l i n e a n d m e t h i o n i n e w i t h o u t a d d e d c a r c i n o g e n s . C a r c i n o g e n e s i s 5 , 1 3 6 7 - 1 3 7 0 . G o n z a l g o , M . L . , L i a n g , G . , S p r u c k , C . H . , 1 1 1 , Z i n g g , J . M . , R i d e o u t , W . M . , 1 1 1 , a n d J o n e s , P . A . ( 1 9 9 7 ) I d e n t i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f d i f f e r e n t i a l l y m e t h y l a t e d r e g i o n s o f g e n o m i c D N A b y m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e a r b i t r a r i l y p r i m e d P C R . C a n c e r R e s . 5 7 , 5 9 4 - 5 9 9 . G o o d m a n , J . I . , a n d W a t s o n , R E . ( 2 0 0 2 ) A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n : a s e c o n d a r y m e c h a n i s m i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s . A n n u . R e v . P h a r m a c o l . T o x i c o l . 4 2 , 5 0 1 - 5 2 5 . H e r z i g , M . a n d C h r i s t o f o r i , G . ( 2 0 0 2 ) R e c e n t a d v a n c e s i n c a n c e r r e s e a r c h : m o u s e m o d e l s o f t u m o r i g e n e s i s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 1 6 0 2 , 9 7 - 1 1 3 . H o n k a k o s k i , P . , Z e l k o , I . , S u e y o s h i , T . , a n d N e g i s h i , M . ( 1 9 9 8 ) T h e n u c l e a r o r p h a n r e c e p t o r C A R - r e t i n o i d X r e c e p t o r h e t e r o d i m e r a c t i v a t e s t h e p h e n o b a r b i t a l - r e s p o n s i v e e n h a n c e r m o d u l e o f t h e C Y P 2 B g e n e . M o l . C e l l . B i o l . 1 8 , 5 6 5 2 - 5 6 5 8 . H u a n g , W . , Z h a n g , J . , W a s h i n g t o n , M . , L i u , J . , P a r a n t , J . M . , L o z a n o , G . , M o o r e , D . D . ( 2 0 0 5 ) X e n o b i o t i c s t r e s s i n d u c e s h e p a t o m e g a l y a n d l i v e r t r u n o r s v i a t h e n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r . M o l . E n d o c r i n o l . 1 9 , 1 6 4 6 - 1 6 5 3 . 2 1 0 J o n e s , R A , a n d L a i r d , P . W . ( 1 9 9 9 ) C a n c e r e p i g e n e t i c s c o m e s o f a g e . N a t . G e n e t . 2 1 , 1 6 3 - 1 6 7 . J o s t , J . P , O a k e l e y , E . J . , Z h u , 3 . , B e n j a m i n , D . , T h i r y , S . , S i e g r n a n n , M . , a n d J o s t , Y . C . ( 2 0 0 1 ) S - M e t h y l c y t o s i n e D N A g l y c o s y l a s e p a r t i c i p a t e s i n t h e g e n o m e - w i d e l o s s o f D N A m e t h y l a t i o n o c c u r r i n g d u r i n g m o u s e m y o b l a s t d i f f e r e n t i a t i o n . N u c l e i c A c i d s R e s . 2 9 , 4 4 5 2 - 4 4 6 1 . K a s t , H . R . , G o o d w i n , B . , T a r r , P . T . , J o n e s , S . A . , A n i s f e l d , A . M . , S t o l t z , C . M . , T o n t o n o z , P . , K l i e w e r , S . , W i l l s o n , T . M . , a n d E d w a r d s , P . A . ( 2 0 0 2 ) R e g u l a t i o n o f m u l t i d r u g r e s i s t a n c e - a s s o c i a t e d p r o t e i n 2 ( A B C C 2 ) b y t h e n u c l e a r r e c e p t o r s p r e g n a n e X r e c e p t o r , f a m e s o i d X - a c t i v a t e d r e c e p t o r , a n d c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r . J . B i o l . C h e m . 2 5 , 2 9 0 8 - 2 9 1 5 . K a w a m o t o , T . , K a k i z a k i , S . , Y o s h i n a r i , K . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 0 ) E s t r o g e n a c t i v a t i o n o f t h e n u c l e a r o r p h a n r e c e p t o r C A R ( c o n s t i t u t i v e a c t i v e r e c e p t o r ) i n i n d u c t i o n o f t h e m o u s e C y p 2 b 1 0 g e n e . M o l . E n d o c r i n o l . 1 4 , 1 8 9 7 - 1 9 0 5 . K o d a m a , S . a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 6 ) P h e n o b a r b i t a l c o n f e r s i t s d i v e r s e e f f e c t s b y a c t i v a t i n g t h e o r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r C A R . D r u g M e t a b . R e v . 3 8 , 7 5 - 8 7 . L a m m i n p a t i , A . , P u k k a l a , E . , T e p p o , L . , a n d N e u v o n e n , P . J . ( 2 0 0 2 ) C a n c e r i n c i d e n c e a m o n g p a t i e n t s u s i n g a n t i e p i l e p t i c d r u g s : a l o n g - t e r m f o l l o w - u p o f 2 8 , 0 0 0 p a t i e n t s . E u r . J C l i n . P h a r m a c o l . 5 8 , 1 3 7 — 1 4 1 . M a g l i c h , J . M . , P a r k s , D . J . , M o o r e , L . B . , C o l l i n s , J . L . , G o o d w i n , B . , B i l l i n , A . N . , S t o l t z , C . A . , K l i e w e r , S . A . , L a m b e r t , M . H . , W i l l s o n , T . M . , a n d M o o r e , J . T . ( 2 0 0 3 ) I d e n t i fi c a t i o n o f a n o v e l h u m a n c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) a g o n i s t a n d i t s u s e i n t h e i d e n t i fi c a t i o n o f C A R t a r g e t g e n e s . J . B i o l . C h e m . 2 7 8 , 1 7 2 7 7 - 8 3 . M o h a n , R . a n d H e y m a n , R . A . ( 2 0 0 3 ) O r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r m o d u l a t o r s . C u r r . T o p . M e d . C h e m . 3 , 1 6 3 7 - 1 6 4 7 . M o o r e , L . B . , P a r k s , D . J . , J o n e s , S . A . , B l e d s o e , R . K . , C o n s l e r , T . G . , S t i m m e l , J . B . , G o o d w i n , B . , L i d d l e , C . , B l a n c h a r d , S . G . , W i l l s o n , T . M . , C o l l i n s , J . L . , a n d K l i e w e r , S . A . ( 2 0 0 0 ) O r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r s c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r a n d p r e g n a n e X r e c e p t o r s h a r e x e n o b i o t i c a n d s t e r o i d l i g a n d s . J . B i o l . C h e m . 2 7 5 , 1 5 1 2 2 - 1 5 1 2 7 . M o r g a n , H . D . , D e a n , W . , C o k e r , H . A . , R e i k , W . , a n d P e t e r s e n - M a h r t , S . K . ( 2 0 0 4 ) A c t i v a t i o n - i n d u c e d c y t i d i n e d e a m i n a s e d e a r n i n a t e s 5 - m e t h y l c y t o s i n e i n D N A a n d i s e x p r e s s e d i n p l u r i p o t e n t t i s s u e s : i m p l i c a t i o n s f o r e p i g e n e t i c r e p r o g r a m m i n g . J . B i o l . C h e m . 2 7 9 , 5 2 3 5 3 - 6 0 . N i s h i g a k i , M . , A o y a g i , K . , D a n j o h , I . , F u k a y a , M . , Y a n a g i h a r a , K . , S a k a m o t o , H . , Y o s h i d a , T . , a n d S a s a k i , H . ( 2 0 0 5 ) D i s c o v e r y o f a b e r r a n t e x p r e s s i o n o f R - R A S b y c a n c e r - l i n k e d D N A h y p o m e t h y l a t i o n i n g a s t r i c c a n c e r u s i n g m i c r o a r r a y s . C a n c e r R e s . 6 5 , 2 1 1 5 - 2 1 2 4 . O s h i m o , Y . , N a k a y a m a , H . , I t o , R . , K i t a d a i , Y . , Y o s h i d a , K . , C h a y a m a , K . , a n d Y a s u i , 2 1 1 W . ( 2 0 0 3 ) P r o m o t e r m e t h y l a t i o n o f c y c l i n D 2 g e n e i n g a s t r i c c a r c i n o m a . I n t . J . O n c o l . 2 3 , 1 6 6 3 - 1 6 7 0 . R a n g a r a j a n , A . a n d W e i n b e r g , R . A . ( 2 0 0 3 ) O p i n i o n : C o m p a r a t i v e b i o l o g y o f m o u s e v e r s u s h u m a n c e l l s : m o d e l l i n g h u m a n c a n c e r i n m i c e . N a t . R e v . C a n c e r 3 , 9 5 2 - 9 5 9 . S a t o , N . , K o n d o , M . , a n d A r a i , K . ( 2 0 0 6 ) T h e o r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r G C N F r e c r u i t s D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e f o r 0 c t - 3 / 4 s i l e n c i n g . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 3 4 4 , 8 4 5 - 8 5 1 . S c h u l t e - H e r m a n n , R . , T i r n m e r r n a n n - T r o s i e n e r , l . , B a r t h e l , G . , a n d B u r s c h , W . ( 1 9 9 0 ) D N A s y n t h e s i s , a p o p t o s i s , a n d p h e n o t y p i c e x p r e s s i o n a s d e t e r m i n a n t s o f g r t h o f a l t e r e d f o c i i n r a t l i v e r d u r i n g p h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n . C a n c e r R e s . 5 0 , 5 1 2 7 - 5 1 3 5 . S h i r a i s h i , M . , L e r m a n L . S . , a n d S e k i y a T . ( 1 9 9 5 ) P r e f e r e n t i a l i s o l a t i o n o f D N A f r a g m e n t s a s s o c i a t e d w i t h C p G i s l a n d s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 9 2 , 4 2 2 9 - 4 2 3 3 . S w a l e s , K . a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 4 ) C A R , d r i v i n g i n t o t h e f u t u r e . M o l . E n d o c r i n o l . 1 8 , 1 5 8 9 - 1 5 9 8 . T z a m e l i , 1 . , P i s s i o s , P . , S c h u e t z , E . G . , a n d M o o r e , D . D . ( 2 0 0 0 ) T h e x e n o b i o t i c c o m p o u n d 1 , 4 - b i s [ 2 - ( 3 , 5 - d i c h l o r o p y r i d y l o x y ) ] b e n z e n e i s a n a g o n i s t l i g a n d f o r t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R . M o l . C e l l . B i o l . 2 0 , 2 9 5 1 - 2 9 5 8 . U e d a , A . , H a m a d e h , H . K . , W e b b , H . K . , Y a m a m o t o , Y . , S u e y o s h i , T . , A f s h a r i , C . A . , L e h m a n n , J . M . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 2 a ) D i v e r s e r o l e s o f t h e n u c l e a r o r p h a n r e c e p t o r C A R i n r e g u l a t i n g h e p a t i c g e n e s i n r e s p o n s e t o p h e n o b a r b i t a l . M o l . P h a r m a c o l . 6 1 , 1 - 6 . U e d a , A . , K a k i z a k i , S . , N e g i s h i , M . , a n d S u e y o s h i , T . ( 2 0 0 2 b ) R e s i d u e t l r r e o n i n e 3 5 0 c o n f e r s s t e r o i d h o r m o n e r e s p o n s i v e n e s s t o t h e m o u s e n u c l e a r o r p h a n r e c e p t o r C A R . M o l . P h a r m a c o l . 6 1 , 1 2 8 4 - 1 2 8 8 . W a t s o n , R E . a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 2 ) E f f e c t s o f p h e n o b a r b i t a l o n D N A m e t h y l a t i o n i n G C - r i c h r e g i o n s o f h e p a t i c D N A f r o m m i c e t h a t e x h i b i t d i f f e r e n t l e v e l s o f s u s c e p t i b i l i t y t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T o x i c o l . S c i . 6 8 , 5 1 - 5 8 . W h y s n e r , J . , R o s s , P . M . , a n d W i l l i a m s , G . M . ( 1 9 9 6 ) P h e n o b a r b i t a l m e c h a n i s t i c d a t a a n d r i s k a s s e s s m e n t : e n z y m e i n d u c t i o n , e n h a n c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n d t u m o r p r o m o t i o n . P h a r m a c o l . T h e r . 7 1 , 5 3 - 9 1 . Y a m a m o t o , Y . , M o o r e , R . , G o l d s w o r t h y , T . L . , N e g i s h i , M . , a n d M a r o n p o t , R . R . ( 2 0 0 4 ) T h e o r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r i s e s s e n t i a l f o r l i v e r t u m o r p r o m o t i o n b y p h e n o b a r b i t a l i n m i c e . C a n c e r R e s . 6 4 , 7 1 9 7 - 7 2 0 0 . Z h u , B . , Z h e n g , Y . , A n g l i k e r , H . , S c h w a r z , S . , T h i r y , S . , S i e g m a n n , M . , a n d J o s t , J . P . ( 2 0 0 0 ) S - M e t h y l c y t o s i n e D N A g l y c o s y l a s e a c t i v i t y i s a l s o p r e s e n t i n t h e h u m a n M B D 4 ( G / T m i s m a t c h g l y c o s y l a s e ) a n d i n a r e l a t e d a v i a n s e q u e n c e . N u c l e i c A c i d s R e s . 2 8 , 4 1 5 7 - 4 1 6 5 . ' 2 1 2 C H A P T E R 3 A P P E N D I X T h e a p p e n d i x c o n t a i n s a s e r i e s o f fi g u r e s w h i c h p r o v i d e t h e a c t u a l , b a s i c u n d e r l y i n g d a t a f o r T a b l e 3 . 1 a n d F i g u r e s 3 . 1 — 3 . 3 . T h e s e fi g u r e s p r o v i d e t h e d a t a f o r R A M s w h o s e m e t h y l a t i o n c h a n g e s w e r e ( 1 ) s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( h y p o m e t h y l a t i o n s , h y p e r m e t h y l a t i o n s ) , ( 2 ) c o m p l e t e 1 0 0 % h y p o m e t h y l a t i o n s a n d ( 3 ) n e w m e t h y l a t i o n s . D a t a a r e d e p i c t e d f o r t h e C A R K O , 2 3 w k P B - t r e a t e d , p r e c a n c e r o u s ( C A R W T , 2 3 w k P B - t r e a t e d ) , a n d t u m o r ( C A R W T , 3 2 w k P B - t r e a t e d ) t i s s u e . 2 1 3 F g g g ' r e 3 . 6 G C - R i c h R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n : C o m p a r i s o n o f D i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E M - I n i t i a t e d , 0 . 0 5 % p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - p r 0 m o t e d P r e c a n c e r o u s T i s s u e ( C A R W i l d t y p e , 2 3 w k D E N / P B ) t o C o n t r o l ( C A R W i l d t y p e , 2 3 w k D E N ) . R s a I / M s p l ( t r i a n g l e s ) , R s a I / H p a I I ( c i r c l e s ) , a n d B f a I / B s s H I I ( s q u a r e s ) r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n a n d A P - P C R w a s p e r f o r m e d o n D N A i s o l a t e d f r o m C 3 H / H e C A R W T m o u s e l i v e r i n i t i a t e d w i t h a s i n g l e d o s e o f D E N , a n d t h e n a d m i n i s t e r e d w a t e r o r 0 . 0 5 % P B ( w / w ) f o r 2 3 w k . R e g i o n s o f h y p o m e t h y l a t i o n a n d h y p e r m e t h y l a t i o n a r e e v i d e n t ( A ) . R e g i o n s o f n e w m e t h y l a t i o n r e s u l t i n g f r o m P B t r e a t m e n t a r e s h o w n i n t e r m s o f p e a k a r e a f o r e a c h P C R p r o d u c t s i z e ( B ) . T h e y - a x i s s c a l e w a s e x p a n d e d i n o r d e r t o f a c i l i t a t e v i s u a l i z a t i o n o f a l l d a t a p o i n t s . S u b s e q u e n t l y , 2 r e g i o n s o f n e w m e t h y l a t i o n w h o s e p e a k a r e a s e x c e e d e d t h e s c a l e o f t h e c h a r t w e r e l a b e l e d w i t h t h e i r c o r r e s p o n d i n g p e a k a r e a s ( C ) . A t a b l e t a l l y i n g t h e r e g i o n s o f a l t e r e d m e t h y l a t i o n f o r e a c h t r e a t m e n t i s s h o w n a s a n i n s e t i n e a c h fi g u r e . R e g i o n s o f h y p o m e t h y l a t i o n a n d h y p e r m e t h y l a t i o n a r e e x p r e s s e d i n t e r m s o f t h e t r e a t e d m e a n f o r e a c h P C R p r o d u c t s i z e a s a p e r c e n t o f t h e c o n t r o l m e a n f o r e a c h P C R p r o d u c t s i z e . A l l c h a n g e s p r o j e c t i n g b e l o w t h e x - a x i s r e p r e s e n t d e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( h y p o m e t h y l a t i o n ) w h i l e a l l o f t h o s e a b o v e t h e x - a x i s r e p r e s e n t i n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( h y p e r m e t h y l a t i o n ) . A l l 1 0 0 % h y p o m e t h y l a t i o n s a r e c o n s i d e r e d t o b e s i g n i fi c a n t , a n d o n l y t h e h y p e r m e t h y l a t i o n s a n d p a r t i a l h y p o m e t h y l a t i o n s t h a t w e r e s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e s ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) a r e s h o w n . D i g e s t H y m w ‘ y ' a ‘ “ H y p e r m e t h y l a t e d R A M s T O T A L R A M s A . R A M s M s p l A 1 4 5 H p a l l o 6 6 1 2 B s s H l l I 1 3 0 1 3 2 0 0 . 0 T . a 1 5 0 . 0 # 5 1 0 0 . 0 2 l g A 5 0 . 0 i 8 3 E 0 O 2 0 0 3 0 0 _ _ 4 0 0 _ 5 0 0 6 0 0 7 0 0 . ' 1 0 0 1 1 l . \ - 5 0 0 i . . - 1 0 0 . 0 c o — o — l — F — L — A a i t P C R P r o d u c t S i z e ( b p ) 2 1 4 i I I I l l i “ I l l l l t h w fl i ‘ I I . < I d a ‘ s . A ‘ 2 R a n a - u s . fi s h - ‘ ‘ l 1 1 l ‘ I l i a d . \ v I d S F t I e N a s < l i n e n s 5 F ' g g r e 3 . 6 c o n t i n u e d G C - R i c h R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n : C o m p a r i s o n o f D i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E M - I n i t i a t e d , 0 . 0 5 % p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - p r 0 m 0 t e d P r e c a n c e r o u s T i s s u e ( C A R W i l d t y p e , 2 3 w k D E N / P B ) t o C o n t r o l ( C A R W i l d t y p e , 2 3 w k D E N ) . B . 1 2 0 0 0 0 D i g e s t 1 0 0 0 0 0 A A g c O 3 8 0 0 0 0 8 B s s H l l I 4 2 x 8 6 0 0 0 0 9 ; 8 2 4 0 0 0 0 x ( B 0 a . 2 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 P C R P r o d u c t S i z e ( b p ) C . 1 1 4 . 8 4 9 0 1 0 3 , 7 4 3 2 5 0 0 0 D i g e s t A 2 0 0 0 0 A s . D g B s s H l l I < 1 5 0 0 0 x N 0 E , § 1 0 0 0 0 x 8 “ - 5 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 P C R P r o d u c t S i z e ( b p ) 2 1 5 F i g g ' r e 3 . 7 G C - R i c h R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n : C o m p a r i s o n o f D i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E M - I n i t i a t e d , 0 . 0 5 % P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - p r 0 m 0 t e d T u m o r T i s s u e ( C A R W i l d t y p e , 3 2 w k D E N / P B ) t o C o n t r o l ( C A R W i l d t y p e , 2 3 w k D E N ) . R s a I / M s p l ( t r i a n g l e s ) , R s a I / H p a I I ( c i r c l e s ) , a n d B f a I / B s s H I I ( s q u a r e s ) r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n a n d A P - P C R w a s p e r f o r m e d o n D N A i s o l a t e d f r o m C 3 H / H e C A R W T m o u s e l i v e r i n i t i a t e d w i t h a s i n g l e d o s e o f D E N , a n d t h e n a d m i n i s t e r e d w a t e r o r 0 . 0 5 % P B ( w / w ) f o r 3 2 w k . R e g i o n s o f h y p o m e t h y l a t i o n a n d h y p e r m e t h y l a t i o n a r e e v i d e n t ( A ) . T h e y - a x i s s c a l e w a s e x p a n d e d i n o r d e r t o f a c i l i t a t e v i s u a l i z a t i o n o f a l l d a t a p o i n t s . S u b s e q u e n t l y , 1 r e g i o n o f h y p e r m e t h y l a t i o n w h o s e p e r c e n t c o n s e n s u s c o n t r o l e x c e e d e d t h e s c a l e o f t h e c h a r t w a s l a b e l e d w i t h i t s c o r r e s p o n d i n g v a l u e ( B ) . R e g i o n s o f n e w m e t h y l a t i o n r e s u l t i n g f r o m P B t r e a t m e n t a r e s h o w n i n t e r m s o f p e a k a r e a f o r e a c h P C R p r o d u c t s i z e ( C ) . A t a b l e t a l l y i n g t h e r e g i o n s o f a l t e r e d m e t h y l a t i o n f o r e a c h t r e a t m e n t i s s h o w n a s a n i n s e t i n e a c h fi g u r e . R e g i o n s o f h y p o m e t h y l a t i o n a n d h y p e r m e t h y l a t i o n a r e e x p r e s s e d i n t e r m s o f t h e t r e a t e d m e a n f o r e a c h P C R p r o d u c t s i z e a s a p e r c e n t o f t h e c o n t r o l m e a n f o r e a c h P C R p r o d u c t s i z e . A l l c h a n g e s p r o j e c t i n g b e l o w t h e x - a x i s r e p r e s e n t d e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( h y p o m e t h y l a t i o n ) w h i l e a l l o f t h o s e a b o v e t h e x - a x i s r e p r e s e n t i n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( h y p e r m e t h y l a t i o n ) . A l l 1 0 0 % h y p o m e t h y l a t i o n s a r e c o n s i d e r e d t o b e s i g n i fi c a n t , a n d o n l y t h e h y p e r m e t h y l a t i o n s a n d p a r t i a l h y p o m e t h y l a t i o n s t h a t w e r e s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e s ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) a r e s h o w n . A ' . H y p o m e t h y l a t e d H y p e r r n e t h y l a t e d D i g e s t R A M 3 R A M s T O T A L R A M s M s p l A 2 3 4 2 7 H p a l l 0 1 1 1 1 2 B s s H l l I 1 7 0 1 7 7 0 0 . 0 T 6 0 0 . 0 3 5 0 0 . 0 8 0 4 0 0 . 0 2 B i m o o ( ' 0 N 5 2 0 0 . 0 s 1 ‘ 1 0 0 . 0 0 0 1 0 0 2 0 0 _ 3 0 0 4 0 0 7 5 0 0 1 _ 6 0 0 7 0 0 - 1 0 0 . 0 - i l 1 P C R P r o d u c t S i z e ( b p ) 2 1 6 F g g ’ r e 3 . 7 c o n t i n u e d G C - R i c h R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n : C o m p a r i s o n o f D i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) - I n i t i a t e d , 0 . 0 5 % P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - p r 0 m 0 t e d T u m o r T i s s u e ( C A R W i l d t y p e , 3 2 w k D E N / P B ) t o C o n t r o l ( C A R W i l d t y p e , 2 3 w k D E N ) . . H y p o m e t h y l a t e d H y p e r r n e t h y l a t e d B . D i g e s t R A M S R A M S T O T A L R A M s M s p l A 2 3 4 2 7 H p a l l 9 1 1 1 1 2 B s s H l l I 1 7 0 1 7 a 6 9 7 . 5 2 0 0 . 0 . / / 1 5 0 . 0 " e § 1 o o . o o z B 5 0 0 i 8 E “ 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 _ _ _ 4 0 _ 0 _ 5 0 0 _ _ 6 0 0 7 0 0 a s b l I ” . 1 - 5 0 0 a l n L - 1 0 0 1 ) - — U i * - P C R P r o d u c t S i z e ( b p ) C . N e w M e t h y l a t i o n s 2 0 2 8 2 5 2 0 0 3 0 0 4 0 0 P C R P r o d u c t S i z e ( b p ) 5 0 0 6 0 0 7 0 0 2 1 7 l o r t n o C N E D k w 3 2 , 0 K 6 9 F g g ’ r e 3 . 8 G C - R i c h R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n : C o m p a r i s o n o f D i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E M - I n i t i a t e d , 0 . 0 5 % P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - p r o m 0 t e d C A R K n o c k o u t ( K O ) T i s s u e ( C A R K O , 2 3 w k D E N / P B ) t o C o n t r o l ( C A R K O , 2 3 w k D E N ) . R s a I / M s p I ( t r i a n g l e s ) , R s a I / H p a I I ( c i r c l e s ) , a n d B f a I / B s s H I I ( s q u a r e s ) r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n a n d A P - P C R w a s p e r f o r m e d o n D N A i s o l a t e d f r o m C 3 H / H e C A R K O m o u s e l i v e r i n i t i a t e d w i t h a s i n g l e d o s e o f D E N a n d t h e n a d m i n i s t e r e d w a t e r o r 0 . 0 5 % P B ( w / w ) f o r 2 3 w k . R e g i o n s o f h y p o m e t h y l a t i o n a n d h y p e r m e t h y l a t i o n a r e e v i d e n t ( A ) . R e g i o n s o f n e w m e t h y l a t i o n r e s u l t i n g f r o m P B t r e a t m e n t a r e s h o w n i n t e r m s o f p e a k a r e a f o r e a c h P C R p r o d u c t s i z e ( B ) . T h e y - a x i s s c a l e w a s e x p a n d e d i n o r d e r t o f a c i l i t a t e v i s u a l i z a t i o n o f a l l d a t a p o i n t s . S u b s e q u e n t l y , 1 r e g i o n o f n e w m e t h y l a t i o n w h o s e p e a k a r e a e x c e e d e d t h e s c a l e o f t h e c h a r t w e r e l a b e l e d w i t h i t s c o r r e s p o n d i n g p e a k a r e a ( C ) . A t a b l e t a l l y i n g t h e r e g i o n s o f a l t e r e d m e t h y l a t i o n f o r e a c h t r e a t m e n t i s s h o w n a s a n i n s e t i n e a c h fi g u r e . R e g i o n s o f h y p o m e t h y l a t i o n a n d h y p e r m e t h y l a t i o n a r e e x p r e s s e d i n t e r m s o f t h e t r e a t e d m e a n f o r e a c h P C R p r o d u c t s i z e a s a p e r c e n t o f t h e c o n t r o l m e a n f o r e a c h P C R p r o d u c t s i z e . A l l c h a n g e s p r o j e c t i n g b e l o w t h e x - a x i s r e p r e s e n t d e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( h y p o m e t h y l a t i o n ) w h i l e a l l o f t h o s e a b o v e t h e x - a x i s r e p r e s e n t i n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( h y p e r m e t h y l a t i o n ) . A l l 1 0 0 % h y p o m e t h y l a t i o n s a r e c o n s i d e r e d t o b e s i g n i fi c a n t , a n d o n l y t h e h y p e r m e t h y l a t i o n s a n d p a r t i a l h y p o m e t h y l a t i o n s t h a t w e r e s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e s ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) a r e s h o w n . 1 0 0 . 0 H y p o m e t h y l a t e d H y p e n ' n e t h y l a t e d R A M s R A M s 6 0 - 0 M s p i A 5 0 5 8 0 - 0 D i g e s t T O T A L R A M s 4 & 0 H p a l l I 1 0 0 1 0 B s s H l l I 2 1 0 2 1 2 0 . 0 0 . 0 - 2 0 . 0 - 4 0 . 0 - 6 0 . 0 - 8 0 . 0 - 1 0 0 . 0 P C R P r o d u c t ( b p ) 2 1 8 § § § § § § . F r g g ' r e 3 . 8 c o n t i n u e d G C - R i c h R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n : C o m p a r i s o n o f D i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) - I n i t i a t e d , 0 . 0 5 % P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - p r o m 0 t e d C A R K n o c k o u t ( K O ) T i s s u e ( C A R K O , 2 3 w k D E N / P B ) t o C o n t r o l ( C A R K O , 2 3 w k I ) E H V ) . E L 1 3 0 0 0 0 1 6 0 0 0 0 1 ; 1 4 0 0 0 0 A N O O O O 1 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 6 0 0 0 0 P e a k A r e a ( P e a k A r e a U n i t 4 0 0 0 0 2 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 i D i g e s t M s p l A H p a l l O B s s H l l I 1 0 0 2 0 0 N e w M e t h y l a t i o n s M s p l A 1 2 H p a l l O 3 B s s H l I I 0 D i g e s t 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 P C R P r o d u c t ( b p ) 1 6 8 , 1 4 8 N e w M e t h y l a t i o n s 1 2 3 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 P C R P r o d u c t ( b p ) 2 1 9 C H A P T E R 4 M U L T I P L E G E N E S E X H I B I T P H E N O B A R B I T A L ( P B ) - I N D U C E D C O N S T I T U T I V E A C T I V E / A N D R O S T A N E R E C E P T O R ( C A R ) - M E D I A T E D D N A M E T H Y L A T I O N C H A N G E S D U R I N G L I V E R T U M O R I G E N E S I S A N D I N L I V E R T U M O R S T h i s c h a p t e r r e p r e s e n t s a m a n u s c r i p t t h a t i s i n p r e s s f o r p u b l i c a t i o n ( a s o f M a r c h 2 0 0 9 ) i n T o x i c o l o g i c a l S c i e n c e s . T h e a u t h o r s a r e J e n n i f e r M . P h i l l i p s a n d J a y I . G o o d m a n . 2 2 0 A B S T R A C T T h e c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) m e d i a t e s r e s p o n s e s t o t h e n o n g e n o t o x i c r o d e n t l i v e r t u m o r p r o m o t e r p h e n o b a r b i t a l ( P B ) , i n c l u d i n g c e r t a i n g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s , h e p a t o m e g a l y , a n d t u m o r f o r m a t i o n . A b e r r a n t D N A m e t h y l a t i o n r e p r e s e n t s e p i g e n e t i c e v e n t s t h a t c a n p l a y m u l t i p l e r o l e s i n t u m o r i g e n e s i s . P r e v i o u s l y , 1 4 6 u n i q u e P B - i n d u c e d r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M s ) w e r e o b s e r v e d i n l i v e r - t u m o r s u s c e p t i b l e C A R w i l d t y p e ( W T ) m i c e ( i n 2 3 w e e k s , p r e c a n c e r o u s t i s s u e a n d 3 2 w e e k s , t u m o r t i s s u e ) , a s c o m p a r e d t o t h e r e s i s t a n t k n o c k o u t ( K O ) . W e b e l i e v e t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e s e m i g h t b e k e y f o r t u m o r i g e n e s i s ( P h i l l i p s e t a l . , 2 0 0 7 ) . I n t h e c u r r e n t s t u d y , c l o n i n g a n d a n n o t a t i o n o f a s u b s e t ( 8 2 % ) o f t h e u n i q u e R A M s r e v e a l e d 4 7 g e n e s e x h i b i t i n g a l t e r e d m e t h y l a t i o n ; 1 7 a r e a l r e a d y i m p l i c a t e d i n c a n c e r o r r e l a t e d p r o c e s s e s a n d , t h u s , w e h a v e i d e n t i fi e d 3 0 “ n e w ” c a n d i d a t e g e n e s t h a t m i g h t b e i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s d u e t o a n e p i g e n e t i c a l t e r a t i o n . T h e s e m a y c o n t r i b u t e t o t u m o r d e v e l o p m e n t t h r o u g h t h e i r i n v o l v e m e n t i n a n g i o g e n e s i s , a p o p t o s i s , e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n , g r o w t h / s u r v i v a l , a n d i n v a s i o n / m i g r a t i o n / m e t a s t a s i s . W e h a v e a l s o , p r e v i o u s l y , d i s c e r n e d u n i q u e P B - e l i c i t e d R A M s i n l i v e r t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 s t r a i n , a t 2 o r 4 w e e k s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) , a n d i d e n t i fi e d 5 1 g e n e s e x h i b i t i n g a l t e r e d m e t h y l a t i o n ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) . I r n p o r t a n t l y , 1 1 o f t h e s e g e n e s w e r e i d e n t i fi e d f r o m i d e n t i c a l , u n i q u e R A M s d i s c e r n e d i n b o t h t h e s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 a n d C A R W T m i c e , t h u s r e p r e s e n t i n g a n i n i t i a l , p o t e n t i a l c a n d i d a t e “ fi n g e r p r i n t ” w h i c h m i g h t s e r v e a s a b i o m a r k e r f o r P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s . T h e s e 2 s t u d i e s r e v e a l “ n e w ” g e n e s w h o s e e p i g e n e t i c s t a t u s e s c h a n g e d u n i q u e l y i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e ( B 6 C 3 F l a n d C A R W T ) , a s c o m p a r e d t o t h e i r 2 2 1 r e s i s t a n t c o u n t e r p a r t s ( C 5 7 B L / 6 a n d C A R K O , r e s p e c t i v e l y ) , w i t h i n a c o n t i n u u m o f P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s . 2 2 2 I N T R O D U C T I O N T h e c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e n u c l e a r r e c e p t o r ( C A R ) i s e x p r e s s e d p r i m a r i l y i n t h e l i v e r a n d m e d i a t e s t r a n s c r i p t i o n o f d r u g - m e t a b o l i z i n g e n z y m e s , e . g . , c y t o c h r o m e P 4 5 0 ( C Y P ) 2 B 1 0 a n d C Y P 3 A 1 1 , p l u s N A D P H - c y t o c h r o m e r e d u c t a s e ( U e d a e t a l . , 2 0 0 2 ) , t h e U D P - g l u c u r o n o s y l t r a n s f e r a s e U G T l A l ( S u g a t a n i e t a l . , 2 0 0 1 ) a n d g l u t a t h i o n e S - t r a n s f e r a s e s ( H u a n g e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h u s , C A R p l a y s a k e y r o l e i n t h e m e t a b o l i s m a n d e x c r e t i o n o f x e n o b i o t i c s a n d e n d o b i o t i c s ( e . g . , b i l i r u b i n a n d b i l e a c i d s ) , i n a d d i t i o n t o x e n o b i o t i c - i n d u c e d c h a n g e s i n e n e r g y m e t a b o l i s m ( r e v i e w e d i n K o n n o e t a l . , 2 0 0 8 ) . P h e n o b a r b i t a l ( P B ) , t h e p r o t o t y p i c a l n o n g e n o t o x i c r o d e n t l i v e r t u m o r p r o m o t e r , c a u s e s l i v e r h y p e r p l a s i a a n d h y p e r t r o p h y , a n d i n d u c e s x e n o b i o t i c - m e t a b o l i z i n g e n z y m e s ( W h y s n e r e t a l . , 1 9 9 6 ) . A p r o m o t i n g d o s e o f P B i n c r e a s e s D N A s y n t h e s i s a n d d e c r e a s e s a p o p t o s i s i n m u r i n e h e p a t o c y t e s ( K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 b ) , a n d i n i t i a l l y s t i m u l a t e s h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ; K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 a ) . H a - r a s m u t a t i o n s a r e i n f r e q u e n t i n P B - i n d u c e d m o u s e l i v e r t u m o r s ( F o x e t a l . , 1 9 9 0 ; R u m s b y e t a l . , 1 9 9 1 ) , h o w e v e r , h y p o m e t h y l a t i o n o f H a - r a s ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) a n d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o c c u r s ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 7 ) . A d d i t i o n a l l y , c o n n e x i n 3 2 ( t h e m a j o r g a p j u n c t i o n - f o r m i n g p r o t e i n i n l i v e r ) i s r e q u i r e d f o r p r o m o t i o n b y P B ( M o e n n i k e s e t a l . , 2 0 0 0 ) . P B a n d P B - l i k e c o m p o u n d s ( e . g . , 1 , 4 - b i s [ 2 - ( 3 , 5 - d i c h l o r o p y r i d y l o x y ) ] b e n z e n e , T C P O B O P ) a c t i v a t e C A R ( r e v i e w e d i n S w a l e s a n d N e g i s h i , 2 0 0 4 ) . C A R i s r e q u i r e d f o r P B - i n d u c e d h e p a t o m e g a l y a n d C y p 2 b 1 0 g e n e e x p r e s s i o n i n m o u s e l i v e r ( W e i e t a l . , 2 0 0 0 ) , a n d c h r o n i c C A R a c t i v a t i o n i n r e s p o n s e t o P B o r T C P O B O P r e s u l t s i n h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s ( H u a n g e t a l . , 2 0 0 5 ) . I r n p o r t a n t l y , C A R i s e s s e n t i a l f o r t u m o r P r o m o t i o n b y P B i n d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) - i n i t i a t e d C 3 H / H e m i c e ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 2 3 2 0 0 4 ) . M i c r o a r r a y d a t a a n a l y s i s o f P B - t r e a t e d C A R w i l d t y p e ( W T ) a n d k n o c k o u t ( K O ) m i c e i n d i c a t e d t h a t o f 1 3 8 g e n e s ( o u t o f 8 , 7 3 6 t o t a l g e n e s / e x p r e s s e d s e q u e n c e t a g s , E S T s ) w h o s e e x p r e s s i o n w a s a l t e r e d , o n l y a p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e s e c h a n g e s w e r e C A R - d e p e n d e n t ( U e d a e t a l . , 2 0 0 2 ) . I n r e s p o n s e t o P B t r e a t m e n t , C A R t r a n s l o c a t e s f r o m t h e c y t o p l a s m t o t h e n u c l e u s , h e t e r o d i r n e r i z e s w i t h r e t i n o i d X r e c e p t o r ( R X R ) , a n d b i n d s t o a n d a c t i v a t e s t r a n s c r i p t i o n a l e l e m e n t s ( e . g . , P B - r e s p o n s i v e e n h a n c e r m o d u l e s ) t o a f f e c t g e n e e x p r e s s i o n ( H o n k a k o s k i e t a l . , 1 9 9 8 ; K a w a m o t o e t a l . , 1 9 9 9 ; S u e y o s h i e t a l . , 1 9 9 9 ) . N u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f C A R c a n b e b l o c k e d b y a n i n h i b i t o r o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e 2 A ( P P 2 A ) ( K a w a m o t o e t a l . , 1 9 9 9 ) , w h i l e a s u b u n i t o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e 1 , P P P 1 R 1 6 A , c a n i n h i b i t p r o t e i n p h o s p h a t a s e 1 - b e t a ( P P I B ) , r e s u l t i n g i n C A R t r a n s l o c a t i o n ( S u e y o s h i e t a l . , 2 0 0 8 ) . A d d i t i o n a l l y , C A R - m e d i a t e d i n d u c t i o n o f t h e C y p 2 b 1 0 g e n e c a n b e b l o c k e d b y a C a 2 + / c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r , w i t h o u t a f f e c t i n g n u c l e a r a c c u m u l a t i o n ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t b o t h p h o s p h o r y l a t i o n a n d d e p h o s p h o r y l a t i o n e v e n t s c o n t r i b u t e t o C A R a c t i v a t i o n . W e s p e c u l a t e t h a t e n h a n c e m e n t o f P P 2 A a n d / o r i n h i b i t i o n o f P F ] 8 p l a y s a r o l e i n t h e m e c h a n i s m b y w h i c h P B s t i m u l a t e s n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f C A R . D N A m e t h y l a t i o n i s a n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m r e g u l a t i n g t r a n s c r i p t i o n w h i c h , w h e n a l t e r e d , m a y l e a d t o t u m o r i g e n e s i s . F o r i n s t a n c e , h y p o m e t h y l a t i o n c a n a c t i v a t e o n c o g e n e s , w h i l e h y p e r m e t h y l a t i o n c a n s i l e n c e t u m o r s u p p r e s s o r s ( E s t e l l e r , 2 0 0 8 ; G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) . T h e r e f o r e , a b e r r a n t m e t h y l a t i o n , i n a d d i t i o n t o m u t a t i o n , c a n p l a y c r i t i c a l r o l e s d u r i n g a l l s t a g e s o f t u m o r f o r m a t i o n , e . g . , b y f a c i l i t a t i n g t h e p r o g r e s s i v e c l o n a l e x p a n s i o n o f s u b p o p u l a t i o n s w h i c h p o s s e s s g r o w t h a d v a n t a g e s o v e r n e i g h b o r i n g c e l l s ( G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) . W h i l e t h e d e t a i l e d m e c h a n i s m s o f P B - 2 2 4 i n d u c e d a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n r e m a i n t o b e e l u c i d a t e d , l i v e r t u r n o r - s e n s i t i v e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , a p p e a r t o b e " d e f e c t i v e " w i t h r e g a r d t o t h e a b i l i t y t o p r e s e r v e n o r m a l m e t h y l a t i o n p a t t e r n s ( W a t s o n a n d G o o d m a n , 2 0 0 2 ) . I n d e e d , P B c a u s e s t h e f o r m a t i o n o f u n i q u e r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n B 6 C 3 F 1 , c o m p a r e d t o C 5 7 B L / 6 , m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s o f t r e a t m e n t ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) . C l o n i n g a n d a n n o t a t i o n o f t h e s e u n i q u e R A M s r e v e a l e d c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n w h i c h o c c u r r e d w i t h i n g e n e s t h a t a r e k n o w n t o p l a y i m p o r t a n t r o l e s i n t u m o r i g e n e s i s ( e . g . , a n g i o g e n e s i s , i n v a s i o n , m e t a s t a s i s , a n d e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n ) , p l u s g e n e s w h i c h h a d n o t p r e v i o u s l y b e e n l i n k e d t o c a n c e r , t h u s p r o v i d i n g i n s i g h t r e g a r d i n g s p e c i fi c g e n e s w h i c h m a y p l a y a r o l e i n P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s d u e t o a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) . I n a n a n a l o g o u s f a s h i o n t o B a c h m a n e t a l . ( 2 0 0 6 b ) , P h i l l i p s e t a l . ( 2 0 0 7 ) c o m p a r e d D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e C 3 H / H e C A R W T m i c e a n d r e s i s t a n t C A R K O m i c e . U n i q u e R A M s i n t h e l i v e r s o f C A R W T m i c e i n i t i a t e d w i t h D E N a n d t r e a t e d w i t h P B f o r 2 3 ( p r e c a n c e r o u s t i s s u e ) o r 3 2 ( t u m o r t i s s u e ) w e e k s , c o m p a r e d t o C A R K O m i c e i n i t i a t e d w i t h D E N a n d t r e a t e d w i t h P B f o r 2 3 w e e k s , w e r e i d e n t i fi e d . M e t h y l a t i o n c h a n g e s a l s o o c c u r r e d i n t h e C A R K O , P B - t r e a t e d r r r i c e , s u g g e s t i n g , a n a l o g o u s t o g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s o b s e r v e d i n U e d a e t a l . ( 2 0 0 2 ) , t h a t D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s a r e b o t h C A R — d e p e n d e n t a n d — i n d e p e n d e n t . W e h y p o t h e s i z e t h a t a s u b s e t o f t h e u n i q u e R A M s i n t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e a r e i m p o r t a n t f o r f a c i l i t a t i n g t u m o r i g e n e s i s . I n t h i s s t u d y , u n i q u e R A M s d e t e c t e d i n t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e ( P h i l l i p s e t a l . , 2 0 0 7 ) w e r e c l o n e d a n d a n n o t a t e d t o d i s c e r n t h e p a r t i c u l a r g e n e s i n v o l v e d a n d h o w t h e y m i g h t c o n t r i b u t e t o t u m o r i g e n e s i s , e . g . , c o m m o n c e l l u l a r 2 2 5 t a r g e t s o f t h e g e n e s o f i n t e r e s t w e r e i d e n t i fi e d i n o r d e r t o p i c t u r e h o w t h e y m i g h t i n t e r a c t t o a f f e c t c r i t i c a l s i g n a l i n g p a t h w a y s , l e a d i n g t o k e y a l t e r a t i o n s . i n p h e n o t y p e . W h i l e P h i l l i p s a n d G o o d m a n ( 2 0 0 8 ) f o c u s e d u p o n g e n e s i n v o l v e d i n P B - i n d u c e d t u m o r f o r m a t i o n a t v e r y e a r l y t r e a t m e n t t i m e s ( i . e . 2 a n d 4 w e e k s ) , t h e c u r r e n t s t u d y e l u c i d a t e d g e n e s i n v o l v e d a t l a t e r t i m e s , w h e n f o c i ( 2 3 w e e k , P B - t r e a t e d C A R W T ) a n d t u m o r s ( 3 2 w e e k , P B - t r e a t e d C A R W T ) a r e a p p a r e n t . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e 2 s t u d i e s ( t h e a f o r e m e n t i o n e d B 6 C 3 F 1 - C 5 7 B L / 6 s t u d y , a n d t h e c u r r e n t C A R s t u d y ) l e a d t o t h e i d e n t i fi c a t i o n o f g e n e s w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s c h a n g e d u n i q u e l y i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e ( B 6 C 3 F 1 a n d C A R W T ) , a s c o m p a r e d t o t h e i r r e s i s t a n t c o u n t e r p a r t s ( C 5 7 B L / 6 a n d C A R K O , r e s p e c t i v e l y ) , w i t h i n a c o n t i n u u m o f P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s . 2 2 6 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S A n i m a l s , T r e a t m e n t s a n d T i s s u e S a m p l e s T h e D N A e m p l o y e d f o r t h e s e s t u d i e s w a s i s o l a t e d fi o m t h e s a m e l i v e r s a m p l e s u s e d b y P h i l l i p s e t a l . ( 2 0 0 7 ) , a n d t h e s e s a m p l e s w e r e p r o v i d e d b y Y a m a m o t o e t a l . ( 2 0 0 4 ) . C A R W T o r C A R K O m i c e , o n a C 3 H / H e b a c k g r o u n d ( w h i c h i s h i g h l y s u s c e p t i b l e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s ( B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ) ) , w e r e i n j e c t e d w i t h a s i n g l e i n t r a p e r i t o n e a l d o s e o f d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) , 9 0 m g / k g , a t 5 w e e k s o f a g e a n d t h e n a d m i n i s t e r e d d r i n k i n g w a t e r ( c o n t r o l ) o r 0 . 0 5 % P B ( w / w ) i n d r i n k i n g w a t e r s t a r t i n g a t 7 w e e k s o f a g e a n d c o n t i n u i n g f o r 2 3 o r 3 2 w e e k s , r e s u l t i n g i n t h e f o l l o w i n g g r o u p s : C A R K O , 2 3 w e e k c o n t r o l , C A R K O , 2 3 w e e k P B , C A R W T , 2 3 w e e k c o n t r o l , C A R W T , 2 3 w e e k s P B ( p r e c a n c e r o u s t i s s u e ) , a n d C A R W T , 3 2 w e e k P B ( t u m o r t i s s u e ) ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) P r o t o c o l E m p l o y e d f o r t h e A n n o t a t i o n o f P B - i n d u c e d U n i g u e R A M s i n P r e c a n c e r o u s a n d T u m o r T i s s u e T h e R A M s c l o n e d a n d a n n o t a t e d i n t h e c m r e n t s t u d y w e r e p r e v i o u s l y d e t e c t e d v i a a n a p p r o a c h i n v o l v i n g m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n , a r b i t r a r i l y p r i m e d P C R ( A P - P C R ) , a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ( C E ) ( p . 1 8 4 o f t h i s d i s s e r t a t i o n ) , a t e c h n i q u e d e s c r i b e d i n d e t a i l b y B a c h m a n e t a l . ( 2 0 0 6 a ) . T h e f o l l o w i n g c o m p a r i s o n s w e r e p r e v i o u s l y m a d e b e t w e e n e x p e r i m e n t a l g r o u p s : 1 ) t h e C A R K O , 2 3 w e e k P B d a t a w e r e c o m p a r e d t o t h e C A R K O , 2 3 w e e k c o n t r o l d a t a , a n d 2 ) b o t h t h e C A R W T , 2 3 w e e k P B ( p r e c a n c e r o u s t i s s u e ) a n d C A R W T , 3 2 w e e k P B ( t u m o r t i s s u e ) d a t a w e r e c o m p a r e d t o t h e C A R W T , 2 3 w e e k c o n t r o l d a t a . F o r e a c h s p e c i fi c P C R p r o d u c t s i z e t h a t w a s O b s e r v e d i n c o n t r o l v . P B - t r e a t e d a n i n d i v i d u a l S t u d e n t ’ s t - t e s t w a s p e r f o r m e d t o e v a l u a t e 2 2 7 w h e t h e r o r n o t t h e r e w a s a s t a t i s t i c a l ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e i n t h e p e a k a r e a . A d d i t i o n a l l y , n e w m e t h y l a t i o n s ( P C R p r o d u c t s w h i c h w e r e o b s e r v e d i n t h e P B - t r e a t e d a n d n o t i n c o n u o l ) , a s w e l l a s 1 0 0 % h y p o m e t h y l a t i o n s ( P C R p r o d u c t s w h i c h w e r e o b s e r v e d i n c o n t r o l b u t n o t s e e n a t a l l i n P B - t r e a t e d ) , w e r e v i e w e d a s b e i n g “ s i g n i fi c a n t ” ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 a ) . F o r t h e m e t h y l a t i o n a n a l y s i s p e r f o r m e d b y P h i l l i p s e t a l . ( 2 0 0 7 ) , w h o l e l i v e r f r o m 4 o f t h e 5 ( n o t i n c l u d i n g t h e W T , 3 2 - w e e k P B ) g r o u p s w a s u t i l i z e d ; t h e p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( W T , 2 3 - w e e k P B ) c o n t a i n e d n o t u m o r s , h o w e v e r , b a s e d u p o n h i s t o l o g y o f a d j a c e n t t i s s u e , t h e r e a r e e x p e c t e d t o b e v e r y n u m e r o u s m i c r o s c o p i c f o c i o f c e l l u l a r a l t e r a t i o n d i f f u s e d t h r o u g h o u t t h e t i s s u e . I m p o r t a n t l y , D N A w a s i s o l a t e d f r o m i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s t h a t d e v e l o p e d i n t h e W T , 3 2 — w e e k P B g r o u p . T h e 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e a r e 3 0 w e e k s o f a g e ( P B t r e a t m e n t s t a r t e d w h e n t h e a n i m a l s w e r e 7 w e e k s o l d ) , a n d t h e 3 2 - w e e k m i c e a r e 3 9 w e e k s o f a g e . T h u s , t h e m i c e w e r e p a s t t h e j u v e n i l e d e v e l o p m e n t s t a g e a n d n o t i n t o o l d a g e , a n d a t a n a g e w h e r e a r e a s o n a b l e d e g r e e o f s t a b i l i t y o f m e t h y l a t i o n m i g h t b e a n t i c i p a t e d o v e r a 9 - w e e k p e r i o d . C l o n i n g a n d S e q u e n c i n g o f A P - P C R P r o d u c t s A P - P C R p r o d u c t s w e r e fi r s t c l o n e d u s i n g a n i n - g e l a p p r o a c h t o i d e n t i f y i n w h a t r e g i o n s o f t h e g e n o m e t h e P B - i n d u c e d u n i q u e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r R A M s o c c u r r e d . T h e A P - P C R p r o d u c t s a n d a 1 0 0 b a s e p a i r D N A l a d d e r ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A ) w e r e e l e c t r o p h o r e s e d t h r o u g h a 3 % N u S i e v e ® G T G ® l o w m e l t i n g t e m p e r a t u r e a g a r o s e g e l ( L o n z a B i o s c i e n c e s , B a s e l , S w i t z e r l a n d ) . P o r t i o n s o f t h e g e l t h a t c o n t a i n e d P C R p r o d u c t s w i t h i n 1 0 0 b a s e p a i r s i z e r a n g e s w e r e e x c i s e d , m e l t e d a n d u s e d f o r i n - g e l 2 2 8 c l o n i n g r e a c t i o n s p r e p a r e d w i t h t h e p G E M ® - T E a s y V e c t o r K i t ( P r o m e g a , M a d i s o n , W I ) . C l o n e s t h a t c o n t a i n e d P C R p r o d u c t i n s e r t s w e r e p u r i fi e d a n d s e q u e n c e d a t t h e R e s e a r c h T e c h n o l o g y a n d S u p p o r t F a c i l i t y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . S e q u e n c i n g r e a c t i o n s w e r e p r e p a r e d u s i n g e i t h e r S P 6 o r T 7 s e q u e n c i n g p r i m e r s ( a s d e s c r i b e d i n t h e p G E M ® - T E a s y V e c t o r T e c h n i c a l M a n u a l ; P r o m e g a , M a d i s o n , W I ) a n d s u b s e q u e n t l y r u n o n a n A B I 3 7 3 0 x 1 G e n e t i c A n a l y z e r . C o m p a r i s o n o f t h e S i z e s o f C l o n e d a n d S e q u e n c e d A P — P C R P r o d u c t s t o t h e S i z e s o f U n i q u e R A M s A f t e r t h e s e q u e n c e s w e r e o b t a i n e d , t h e s i z e s o f t h e c l o n e d p r o d u c t s w e r e c o m p a r e d t o t h e s i z e s o f t h e u n i q u e R A M s i n o r d e r t o d e t e r m i n e w h i c h c l o n e d p r o d u c t s r e p r e s e n t e d u n i q u e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r R A M s . I n m a n y i n s t a n c e s , i t c a n b e c o n fi d e n t l y s t a t e d t h a t a p a r t i c u l a r c l o n e d p r o d u c t r e p r e s e n t s a s i n g l e R A M a n d a s s u c h , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f t h a t R A M i s u n a m b i g u o u s . H o w e v e r , t h e r a w d a t a a n a l y s i s p e r f o r m e d t o e s t a b l i s h i f a R A M o c c u r r e d i n a t r e a t m e n t g r o u p a s c o m p a r e d t o i t s r e s p e c t i v e c o n t r o l g r o u p ( P h i l l i p s e t a l . , 2 0 0 7 ) i s b a s e d u p o n t h e u n d e r s t a n d i n g t h a t t h e A 3 1 3 1 3 0 G e n e t i c A n a l y z e r c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s i n s t r u m e n t d o e s n o t d e t e c t P C R p r o d u c t s i z e s w i t h 1 0 0 % a c c u r a c y . T h e r e f o r e , i n c e r t a i n i n s t a n c e s d u r i n g t h e a n a l y s i s o f t h e r a w d a t a , P C R p r o d u c t s i z e s w e r e c o m b i n e d . S i x a n i m a l s p e r e x p e r i m e n t a l g r o u p w e r e u s e d a n d r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n s w e r e p e r f o r m e d i n d u p l i c a t e , f o l l o w e d b y A P - P C R , f o r a t o t a l o f 1 2 r e a c t i o n s . I f m u l t i p l e P C R p r o d u c t s i z e s w i t h i n 2 b a s e p a i r s o f o n e a n o t h e r d i s p l a y e d p r o d u c t i n l e s s t h a n h a l f o f t h e 1 2 A P - P C R r e a c t i o n s , t h e s e p r o d u c t s w e r e c o n s i d e r e d t o b e “ i d e n t i c a l ” a n d w e r e s u b s e q u e n t l y c o m b i n e d . T h i s p r o c e d u r e h a s i m p l i c a t i o n s f o r a n a l y s i s o f t h e c l o n i n g d a t a . F o r e x a m p l e , 2 R A M s o c c u r r e d u n i q u e l y i n t h e t u m o r t i s s u e 2 2 9 a s a r e s u l t o f R s a I / H p a I I d i g e s t i o n : a h y p o m e t h y l a t i o n a t 4 0 2 b p a n d a c a r r y f o r w a r d n e w m e t h y l a t i o n a t 4 0 4 b p ( p . 2 0 0 o f t h i s d i s s e r t a t i o n ) . A c a r r y f o r w a r d m e t h y l a t i o n c h a n g e i s a u n i q u e R A M t h a t w a s o b s e r v e d i n b o t h p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e . A P C R p r o d u c t o f 4 0 4 b p w a s c l o n e d , a n d a B L A T s e a r c h s h o w e d t h a t t h e p r o d u c t s p a n s a n i n t r o n i c r e g i o n w i t h i n t h e t r a n s m e m b r a n e p r o t e i n 1 3 2 d ( T m e m 1 3 2 d ) g e n e ( T a b l e 4 . 1 ) . D u e t o o u r b a s i c d a t a a n a l y s i s 1 2 b p a s s u m p t i o n , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f T m e m 1 3 2 d i s a m b i g u o u s ; i t c o u l d r e p r e s e n t t h e h y p o m e t h y l a t e d R A M a t 4 0 2 b p o r t h e n e w l y m e t h y l a t e d c a r r y f o r w a r d R A M a t 4 0 4 b p . A d d i t i o n a l l y , t h e u s e o f 3 d i f f e r e n t m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e e n z y m e p a i r s c o u l d a l s o r e v e a l m u l t i p l e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f a p a r t i c u l a r g e n e . I n t h e c a s e o f d i p e p t i d y l p e p t i d a s e 1 0 ( D p p l 0 ) , R s a I / H p a I I d i g e s t i o n r e v e a l e d a h y p o m e t h y l a t e d R A M w h i l e R s a I / M s p l d i g e s t i o n d e m o n s t r a t e d a c a r r y f o r w a r d h y p e r m e t h y l a t e d R A M i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e ( T a b l e 4 . 1 ) . T h u s , D p p l 0 c o u l d r e p r e s e n t o n e o r b o t h o f t h e s e R A M s s i n c e d i f f e r e n t r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n s w e r e u t i l i z e d , e a c h o f w h i c h r e v e a l s i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e m e t h y l a t i o n p a t t e r n s o f d i f f e r e n t c y t o s i n e s a t a n d w i t h i n t h e s i t e s o f p r i m e r a n n e a l i n g . T h e “ m e t h y l a t i o n s t a t u s ” d a t a c o l u m n i n T a b l e 4 . 1 r e fl e c t s t h e s e 2 s i t u a t i o n s , ( e . g . , H y p o / N e w f o r a s i n g l e g e n e , i n a p a r t i c u l a r t i s s u e ) . A n a l y s i s o f S e q u e n c e d A P - P C R P r o d u c t s T h e s e q u e n c e s w e r e s u b j e c t e d t o B L A T d a t a b a s e s e a r c h e s o f t h e m o u s e g e n o m e ( U C S C G e n o m e B r o w s e r , J u l y 2 0 0 7 m o u s e a s s e m b l y , h t t p : / / g e n o m e . u c s c . e d u / c g i - b i n / t h l a t ? c o m m a n d = s t a r t & o r g = m o u s e ) i n o r d e r t o a s c e r t a i n i n w h i c h r e g i o n s o f t h e g e n o m e t h e u n i q u e P B - i n d u c e d p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r R A M s o c c r u r e d . T h e B L A T 2 3 0 p r o g r a m a l i g n s a n u c l e o t i d e 0 r a m i n o a c i d s e q u e n c e t o a n i n d e x o f a n e n t i r e a n i m a l g e n o m e . F o r D N A s e q u e n c e q u e r i e s , B L A T c a n d e t e c t s e q u e n c e a l i g n m e n t s o f 9 5 % o r g r e a t e r s i m i l a r i t y o f r e g i o n s w i t h l e n g t h s o f 2 5 o r m o r e b a s e p a i r s . A d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n a b o u t t h e g e n o m i c r e g i o n ! g e n e i s l i s t e d , i n c l u d i n g , b u t n o t l i m i t e d t o : g e n e i n f o r m a t i o n , s e q u e n c e c o n s e r v a t i o n b e t w e e n s p e c i e s , G C p e r c e n t a g e , a n d t h e l o c a t i o n o f s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s a n d r e p e a t e l e m e n t s . T h e u n i q u e R A M s w e r e c l a s s i fi e d a c c o r d i n g t o a s c h e m e t h a t i n d i c a t e s w h e r e , i n r e l a t i o n t o a g e n e ( e . g . , w i t h i n a n i n t r o n , w i t h i n a n e x o n , u p s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e ) , t h e y a r e l o c a t e d . R A M s w e r e a l s o c a t e g o r i z e d b y c h r o m o s o m a l l o c a t i o n a n d g e n e f u n c t i o n . G e n e O n t o l o g y i n f o r m a t i o n f o r F i g u r e 4 . 1 0 w a s o b t a i n e d f r o m h t t p : / / w w w . g e n e o n t o l o g y . o r g / . T h e f u n c t i o n s o f t h e g e n e s i d e n t i fi e d u s i n g B L A T s e a r c h e s w e r e i n v e s t i g a t e d v i a P a t h w a y S t u d i o ® 5 . 0 ( A r i a d n e G e n o m i c s , R o c k v i l l e , M D ) . I n t h i s f a s h i o n , c o n n e c t i o n s b e t w e e n e a c h i n d i v i d u a l g e n e a n d o t h e r g e n e s , c e l l u l a r p r o c e s s e s , o r d i s e a s e s t a t e s w e r e e l u c i d a t e d . A n e x a m p l e o f t h i s t y p e o f a n a l y s i s i s l o c a t e d i n F i g u r e 4 . 1 1 . I n a d d i t i o n , c o m m o n t a r g e t s a n d c o m m o n r e g u l a t o r s o f g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n b o t h t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e w e r e d i s c e r n e d . P a t h w a y S t u d i o ® 5 . 0 w a s a l s o u t i l i z e d t o u n c o v e r d o c u m e n t e d l i n k s b e t w e e n u n i q u e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r R A M s a n d c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s , i n c l u d i n g a n g i o g e n e s i s , a p o p t o s i s , e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n ( E M T ) , m i g r a t i o n / i n v a s i o n / m e t a s t a s i s a n d g r o w t h a n d s u r v i v a l . C o m p a r i s o n o f G e n e s / G e n o m i c R g g i o n s I d e n t i fi e d F r o m U n i q u e P B - I n d u c e d R A M s t h a t F o r m e d i n B o t h C A R W T ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r ) t 0 G e n e s / G e n o m i c R g fi o n s I d e n t i fi e d F r o m U n i q u e P B - i n d u c e d R A M s i n L i v e r T u m o r - S u s c e p t i b l e B 6 C 3 F l M i c e ( 2 a n d / o r 4 W e e k s ) 2 3 1 W e p r e v i o u s l y i d e n t i fi e d 1 7 0 t o t a l u n i q u e R A M s i n l i v e r s o f t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e t r e a t e d w i t h 0 . 0 5 % ( w / w ) P B f o r 2 o r 4 w e e k s , a s c o m p a r e d t o t h e r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 s t o c k ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) , a n d P C R p r o d u c t s r e p r e s e n t i n g 9 0 o f t h e s e 1 7 0 ( 5 3 % ) R A M s w e r e c l o n e d a n d s u b j e c t e d t o B L A T s e a r c h e s t h a t r e s u l t e d i n 5 1 a n n o t a t e d g e n e s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) . U n i q u e B 6 C 3 F 1 R A M s a t 2 a n d 4 w e e k s , w h i c h c o r r e s p o n d e d t o i d e n t i c a l g e n e s a n d u n c h a r a c t e r i z e d r e g i o n s ( i . e . r e g i o n s o f D N A g r e a t e r t h a n 1 0 k b a w a y f r o m a n a n n o t a t e d g e n e ) o b s e r v e d i n t h e c u r r e n t s t u d y , w e r e c o m p a r e d t o t h e u n i q u e C A R p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r R A M s , i n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e m e t h y l a t i o n p a t t e r n s o f c o m m o n g e n e s / u n c h a r a c t e r i z e d r e g i o n s o b s e r v e d i n b o t h s t u d i e s w e r e a l t e r e d s i m i l a r l y o r d i f f e r e n t l y b y P B t r e a t m e n t . S i n c e 3 d i f f e r e n t r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n s w e r e u t i l i z e d , m u l t i p l e R A M s m i g h t r e p r e s e n t t h e s a m e g e n e / u n c h a r a c t e r i z e d r e g i o n . T h e f o l l o w i n g c r i t e r i a n e e d e d t o b e m e t i n o r d e r f o r a g e n e / u n c h a r a c t e r i z e d g e n o m i c r e g i o n i d e n t i fi e d f r o m a P B - i n d u c e d R A M t o b e v i e w e d a s b e i n g i n c o m m o n b e t w e e n t h e s t u d i e s : 1 ) t h e R A M m u s t h a v e b e e n c l o n e d i n b o t h t h e B 6 C 3 F 1 ( 2 a n d / o r 4 w e e k s P B ) a n d C A R W T ( p r e c a n c e r o u s a n d / o r t u m o r ) m i c e , a n d 2 ) t h e u n i q u e R A M s i n t h e B 6 C 3 F 1 a n d C A R W T m i c e m u s t h a v e a l i g n e d t o t h e s a m e r e g i o n o f t h e g e n o m e . H y p e r m e t h y l a t e d R A M s ( s i g n i fi c a n t i n c r e a s e s , S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) a n d n e w l y m e t h y l a t e d R A M s a r e c o n s i d e r e d t o b e i n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n , w h i l e h y p o m e t h y l a t e d R A M s ( b o t h 1 0 0 % d e c r e a s e s , a n d t h o s e w h i c h a r e s i g n i fi c a n t , S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) a r e c o n s i d e r e d t o b e d e c r e a s e s . G e n e s a n d u n c h a r a c t e r i z e d g e n o m i c r e g i o n s , i d e n t i fi e d fi ' o m i d e n t i c a l , u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s t h a t f o r m e d i n b o t h C A R W T ( p r e c a n c e r o u s 2 3 2 l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r ) a n d B 6 C 3 F 1 ( 2 a n d / o r 4 w e e k t r e a t e d ) , a r e l i s t e d i n T a b l e 4 . 3 a n d T a b l e 4 . 4 , r e s p e c t i v e l y . C l o n i n g a n d s e q u e n c i n g r e v e a l e d 2 o b s e r v a t i o n s r e g a r d i n g c r i t e r i o n n u m b e r 2 ( a b o v e ) . F i r s t , f o l l o w i n g d i g e s t i o n w i t h t h e s a m e m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n z y m e , P C R p r o d u c t s o c c a s i o n a l l y f o r m e d w h i c h : a ) r e p r e s e n t e d d i s t i n c t R A M s t h a t d i f f e r e d b y m o r e t h a n 2 b p i n m u l t i p l e g r o u p s ( B 6 C 3 F 1 , 2 - a n d / o r 4 - w e e k , a n d C A R W T , p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r ) ; a n d b ) a l i g n e d t o t h e s a m e r e g i o n o f t h e g e n o m e . S e c o n d l y , f o l l o w i n g d i g e s t i o n w i t h t h e s a m e m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n z y m e , P C R p r o d u c t s o c c a s i o n a l l y f o r m e d w h i c h : a ) r e p r e s e n t e d d i s t i n c t R A M s t h a t w e r e w i t h i n 2 b p o f o n e a n o t h e r ( e . g . , u n i q u e R A M s a t 3 1 5 a n d 3 1 7 b p ) i n m u l t i p l e g r o u p s ( B 6 C 3 F 1 , 2 - a n d / o r 4 - w e e k , a n d C A R W T , p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r ) ; a n d b ) a l i g n e d t o t h e s a m e r e g i o n o f t h e g e n o m e . T h u s , f o r a p a r t i c u l a r r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n , u n i q u e R A M s i n t h e B 6 C 3 F l a n d C A R W T m i c e t h a t w e r e w i t h i n 2 b p o f o n e a n o t h e r o r m o r e t h a n 2 b p a p a r t , w h i c h w e r e r e p r e s e n t e d b y P C R p r o d u c t s t h a t a l i g n e d t o t h e s a m e r e g i o n o f t h e g e n o m e , w e r e c o n s i d e r e d t o b e o n e R A M . T h i s i s e v i d e n t i n T a b l e 4 . 3 a n d T a b l e 4 . 4 . T h e f o l l o w i n g i s a n e x a m p l e o f s i t u a t i o n n u m b e r o n e , a b o v e . A P C R p r o d u c t , r e p r e s e n t i n g a 4 6 4 b p R A M t h a t w a s i d e n t i fi e d a f t e r R s a I / M s p l d i g e s t i o n a n d A P - P C R , w a s c l o n e d i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 4 w e e k s , a n d a l i g n e d t o B c a t 2 ( T a b l e 4 . 3 ) . S i m i l a r l y , i n t h e C A R p r e c a n c e r o u s t i s s u e , a P C R p r o d u c t , r e p r e s e n t i n g a 4 6 8 b p R A M t h a t w a s i d e n t i fi e d a f t e r R s a I / M s p l d i g e s t i o n a n d A P - P C R , w a s c l o n e d i n t h e C A R p r e c a n c e r o u s t i s s u e , a n d a l i g n e d t o t h e s a m e r e g i o n o f B c a t 2 ( T a b l e 4 . 3 ) . W h i l e t h e 2 R A M s w e r e n o t W i t h i n 2 b p o f o n e a n o t h e r , t h e s e q u e n c i n g r e s u l t s c l e a r l y d e m o n s t r a t e d t h a t t h e P C R p r o d u c t s a l i g n e d t o t h e s a m e r e g i o n o f t h e g e n o m e . T h e r e f o r e , t h e s e R A M s w e r e 2 3 3 c o n s i d e r e d t o b e o n e R A M . T h e f o l l o w i n g i s a n e x a m p l e o f s i t u a t i o n n u m b e r t w o , a b o v e . F o r D d x 5 4 ( T a b l e 4 . 3 ) , 2 d i s t i n c t R A M s ( M 3 1 5 i n p r e c a n c e r o u s t i s s u e , a n d M 3 1 7 i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 4 w e e k s ) t h a t t h e c l o n e d P C R p r o d u c t s r e p r e s e n t w e r e w i t h i n 2 b p o f o n e a n o t h e r . T h e r e f o r e , t h e s e R A M s w e r e c o n s i d e r e d t o b e o n e R A M . 2 3 4 R E S U L T S P C R p r o d u c t s w e r e c l o n e d t h a t r e p r e s e n t 1 1 9 ( 8 2 % ) o f t h e 1 4 6 t o t a l u n i q u e R A M s p r e v i o u s l y d e t e c t e d i n t h e l i v e r s o f m a l e C 3 H / H e C A R W T m i c e t r e a t e d w i t h a t u m o r - p r o m o t i n g d o s e o f P B f o r 2 3 ( p r e c a n c e r o u s t i s s u e ) o r 3 2 ( t u m o r t i s s u e ) w e e k s , a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t C A R K O m i c e , i n c l u d i n g 1 4 c a r r y f o r w a r d R A M s ( i . e . t h o s e w h i c h w e r e o b s e r v e d i n b o t h t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e ) ( p . 2 0 0 o f t h i s d i s s e r t a t i o n ) ( P h i l l i p s e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h e s e R A M s w e r e a n n o t a t e d v i a t h e B L A T s e q u e n c e a l i g n m e n t t o o l , a n d 4 7 g e n e s w e r e d i s c e r n e d ( T a b l e 4 . 1 ) . T w o g e n e s ( T t l l 9 a n d W s c d l ) a r e l i s t e d t w i c e b e c a u s e i n e a c h s i t u a t i o n , 2 P C R p r o d u c t s o f d i f f e r e n t s i z e s a l i g n e d t o 2 d i s t i n c t , s e p a r a t e r e g i o n s o f t h e s a m e g e n e . R A M s w e r e a l s o c l a s s i fi e d b a s e d o n t h e i r l o c a t i o n r e l a t i v e t o a n a n n o t a t e d g e n e ( T a b l e 4 . 1 a n d F i g . 4 . 8 ) a n d c h r o m o s o m a l d i s t r i b u t i o n ( F i g . 4 . 9 ) . A l l o f t h e a n n o t a t e d g e n e s w e r e s u b s e q u e n t l y i n v e s t i g a t e d v i a a n i n f o r r n a t i c a p p r o a c h i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e f u n c t i o n o f t h e g e n e , i n a d d i t i o n t o a n y g e n e s w h i c h a r e c o m m o n t a r g e t s a n d / o r r e g u l a t o r s o f t h e u n i q u e R A M s o f i n t e r e s t i n t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e . A f u n c t i o n a l s u m m a r y o f t h e s e R A M s ( F i g . 4 . 1 0 ) , p l u s 1 r e p r e s e n t a t i v e p a t h w a y o f a u n i q u e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r R A M , i s p r e s e n t e d i n F i g . 4 . 1 1 . M a n y ( 5 9 o f t h e 7 5 t o t a l g e n e s a n d g e n o m i c r e g i o n s ) a n n o t a t e d R A M s c o u l d u n a m b i g u o u s l y b e a s s i g n e d a s p e c i fi c m e t h y l a t i o n s t a t u s ( T a b l e 4 . 1 ) . U n a m b i g u o u s c a r r y f o r w a r d h y p o m e t h y l a t i o n s w e r e o b s e r v e d i n b o t h t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e : a n n e x i n A 4 ( A n x a 4 ) , c o i l e d - c o i l d o m a i n c o n t a i n i n g 1 3 4 ( C c c h 3 4 ) , e x o s o m e c o m p o n e n t 2 ( E x o s c 2 ) , R I K E N c D N A 1 7 0 0 0 2 7 D 2 1 g e n e ( 1 7 0 0 0 2 7 D 2 1 R i k ) , a n d c - a b l o n c o g e n e 1 , r e c e p t o r t y r o s i n e k i n a s e ( A b l I ) . H y p o m e t h y l a t e d R A M s t h a t o c c u r r e d o n l y i n t h e t u m o r t i s s u e i n c l u d e d c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n 1 ( C r a b p l ) , n u d C 2 3 5 - g n l - r - i 2 e ) n d e 4 a e l v , n h a o u r c m n 2 c e l d ( i . n l a ) a t e e ( m a m h e i i ) s m 7 g f c g d s a ( n o d a o o 5 e ) e i r i n h 1 n 0 s c a d n n n p i i y ( r a l t i o c o 2 ( _ e t . o ) c i u d s n e s r s a e o i l R i r n e i r t u 6 a e - c e a ( d c n s a f a b a . o n c l g c r o - s s l c o a p i s a i s n t s v e - a l i r a t a g c a i a r t - - r e t fl c o r i i e n r i fi g n w n o j n a n p s g a r o m n l s f d m o x s f e h n m o u o i p l e e e o e u s t - t e t r o T a c - . s c s g o P l . r n e v o e m t o r t f m y h n a p O o s , , . 1 t i r e T M r y P s s e r p x E o c m o r s u o i r a V d e c u d n ) d I n d n 1 o ( i n a e a h t , w ) ) o 1 2 c ( i n i e o m n m i 9 ( g a d a R ) 1 r s i n K 8 - ( r g e i E n v s r s a a M o n l o i t I p b i a t p l s ) r m s h e o l o ) t 5 o e e o i c d c t 1 p v y 3 b m t a ( ) s m m l n i e n r i d 8 n a 1 h n ( t a n o n r p n c n W i d n o 9 ) 3 a n p 1 i w a i r h a t r u i w n a s w a ( e i h 2 l i t e o c ( t o o t e g n ) l a , s a r t a n n c l n n m l g s v r d ) p o ) e d e l e o 2 t h g n l i 7 o k u o i o t k k o r o d t n i 1 1 t i n G b c i t ( r u n t n n s i n c ( i c a p — e l c d t e o v l a r i a U U s a U f f c a r e t s c e t s u r d e i f o n o h e c t e c K t e m n f - c m e , e r a r a N h w s m l n f r t o r u s e l r t n 1 t p I a i t u a p u c g u y e y s o t i a v — t c r s l a r c i n d o e S A L - t D t a - y A e i n i l - o e n c ‘ t l u " c r N i c b l a c m l D a C F - a e S e C I r e t M 1 i i i _ A . 1 0 0 T t n e i i . C . l i i . A . l i i i . A . 1 6 8 1 4 6 4 5 3 m s l fl a c o n b e i y t r 9 4 7 e 3 4 b 3 7 I 1 m O u _ N M 6 7 8 9 0 3 0 4 8 5 9 3 4 9 2 1 4 0 6 8 7 I 9 5 2 0 0 0 _ 1 0 _ _ _ _ _ _ M M M M M M M N N N N N N N N r a 4 2 k a c 2 h 9 7 p 1 8 a 3 x a r h c n 0 0 : 0 5 0 t R 1 2 C $ S 1 c l A 1 7 0 a fl i Y n i e t o I d - , y l i 9 4 a 3 i e t c A n A r S 1 g n s s 2 e e t , 2 r e e o n n o m p g w g e o 1 a b g r r c l a t 2 n y n f f e l o i t m o 1 s y n b c n e m u r l 2 i d 3 k r a g m p n e l ( o a i i a D o W e e 4 h d m o n n g i n , t 7 s n a r i o I 2 . 5 r m t r - t i e 2 8 n 2 s b n 1 l l 3 o p 3 o o d i m g y 0 c ' r a m e s 0 e , 1 ‘ t a r y c t e i p y t e o g l n m p r a a l e i ) n l 0 n i n c e n b x f i e n i m p i m l i m u 7 , h a c i m , a b a 1 C a g m m n l e a e t e ' a o n , f n i f 7 ) 1 p m m d n n C m f i e . i n r l s c 8 r m e i ' o A n t n t a 7 c o n s A d n e 1 i e a o o ‘ e 3 N i i a ( i 4 i v r t N a e n r i y m i r r 9 r l c D g e a o m y A i m e i d d c g t x r o t n D t d c o k a a c n c c o v e n e o e i o n r n d d d n i - N i s b r h o r a c c r m s h d l u i E n e e d x e i e o c e d l n c c C a t b e c s s l c A v o l l t e l l d i n . t m u o m p t l x n S o l I l i i e r i 3 u b l i a N p u l u G a K b a e - n o e r u o 5 o o u C N P p 1 S c T " m S A C E R c k D U H D Y ( B m ) ) M M ( ( ) M ( O O o P P p Y Y y H H H ) ) ) ) ) B B M B M ( ( ( ( ( o o o o “ p p p p P y y y y V H H H “ H 3 1 B ( o p y H ) ) ) ) ) ) ) M H B M B ( ( ( o o o p p p B ( o p y ! ( ( l r r i e e m p p y y y y y H H H H E H H c a h a i c r s l a i r 2 3 6 T a b l e 4 . 1 G e n e s a n d G e n o m i c R e g i o n s I d e n t i fi e d fi ' o m U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s i n C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / 0 r L i v e r T u m o r s ) , a s C o m p a r e d t o R e s i s t a n t P B - T r e a t e d K n o c k o u t M i c e , w e r e C l o n e d a n d S u b e c t e d t o B L A S T - l i k e A l i P r e e a n . b T u m o r c A . N a m e S y m b o l L o c a t i o n ‘ l ' ' 0 1 ' a n F u n c t i o n c H Y P O M l . A . i i R e t i n o i c a c i d ( R A ) m e t a b o l i s m ( l ) f H y p o ( M ) N u d c d 3 H p r M ) P r k c e 1 . A _ i i D y n e i n ' a n d c e l l v i a b i l i t y p l N M _ O I I I O 4 I n h i b i t i o n o f a p o p t o s i s ( 4 ) a n d c e l l p r o l i f e r a t i o n ( 5 ) P d r g l N M _ I 7 8 9 3 9 N M _ _ 0 0 8 7 3 2 l . A i i i H y p o 0 ' 9 S p a t a 2 1 N M 1 7 7 8 6 7 T 1 1 1 9 l . B . i U n k n o w n ( 1 0 ) N M 1 7 8 7 4 6 U n k n o w n H y p o ( B ) C c d c 1 3 4 N M _ 1 7 2 4 2 8 P u t a t i v e e x o m m c c o m p o n e n t ( 1 6 ) N M _ 0 2 9 6 6 1 A b l l H y p o ( H ) B r o o d ! ) o r D I 3 W r u l 7 7 c H t g d Z o D d x 5 4 N M 0 2 8 0 4 1 N M _ 0 2 6 5 5 3 N e w ( M ) B c a t 2 N M _ 0 0 9 7 3 7 o 6 i 2 t ( a r s e l f l o r r p e n i s l l e c r ) n 7 o s a r e 3 i c ( m g n n ) ) ! r e c 2 n 3 4 o 3 s l n g e o a r i c a ( a n i ( s c i e i c n o y r t n e t p i t i r e d e s ) e i i c a t p u c m a 5 l n 2 c m r i o i f n o a p m i n s m u n t c i r o t i o n b t l w e i l s t a i e o i d a m d i h u i e s i 4 ( d h e t t i e t a s r u s n a 1 o g m r n e 4 r , c 4 n 4 i ( n o i s s b s T t t n e i r i b h n I i r n a t e p t o P c a o h x t E L s e r p x E s a , i ) t s s n u 4 fi e ) i r q ( i c o 0 t s i u ( g i I ) 7 2 ( n ) ) ) 5 t g 1 l ) 3 n n 3 a 1 ( ( l e ( o n 3 g ( n i n i ) i o i t m r 2 e s s e n i t t ) 4 a a r y 9 a i s 4 m o i b 2 r s e h c r n i d e v ( e ) 3 / s f s 3 ( n d n . i u n a o l o 3 ( b l d t a ) u o n y n 3 m e m i 4 y k ( a i r c e z l w p ( a g i l w e l t i e n i o ) r g s o t o e l o d t n g u i S v 8 n n l n m p n e a r n v o n r m g ) ( n e ) y r l U n n a s T n i 3 r o U l s t r o i o e e n r r n s 0 U i e n e n _ n l p k a m a I k y a e i g n i r e n s l t d i i n 2 k e u i n g w o n r t y 3 n d e o n n u i b o t t p e g t n v i y m a r a 9 n a e l m ( s i t e a f r a n i A l n i r t L i d c r x i o o t ' l o l p n s - , c B o s n n t l ) N e d b a a r i e i 3 n a 9 r a ( r n l o l n l g u c o l a e n e a W b r l o o a b a t t t t ( o n o e o i i P e N t s s m t e o e P n s P t t o n d o u b r h - a o O H i o P B T t p n e i i i i i i . . A A . . 1 1 i i . A . 1 r c 7 ] a n i i i i i i i i i i i i . A . 1 l i i i i . . A A . . i . A . 1 i i . . A A . . 1 1 1 1 . A . 1 8 1 6 1 l 8 5 1 4 0 8 0 6 2 2 5 4 6 0 0 0 8 6 4 l _ M N 5 1 B 3 9 7 1 7 1 ( 1 Z 0 4 l 0 0 U 0 4 _ _ _ _ _ M M M M M M N N N N N N 2 2 Z n 4 t a e r W a d c l F a c q m U C A 3 Z a C 1 r d A b u S n n o x p y t n i n 3 g e 1 e k d 3 i d n a n - i C e a g m k ) i 0 b i s n i I g i p n a “ i l o a n l h A o e y — a m o d M o 0 m 2 1 e l d o n t n 3 - i e s d d k e 8 s a n s a N 0 7 r D o r 4 d e ) o 4 p d l a c a a a 2 A l n p l L r g e l r g s T r d i ( ‘ o i " e o t t S 9 i i a R l 2 a B n o s n “ n e n 0 h f t 2 l ( i C n 5 e b e c s ' e h a b d r e d a o i ‘ a m o a n m r n M e B k e 1 t m a r e f n n s e n i p “ a a n r l r n e “ a i A - - l d d w 2 b t i s m n a i l k ‘ o d m n l o a a r C a h n h r n d n y r m h o r d 8 c i t l e ( D s e e - ) M d t ” r p 7 i i i s y a t e N c t n i r g i l n g e h 4 n n “ n p t m ( r t Z o a g e e t c n n c l p t e e r i O a n i i e n r o i u i g i t l , t P o l i p fi n l n r , g a m y e e i o i l fi p y i r i c a ' l s l e c n n n c y N c d f t r l g w ( n i e o n u m r e E s l i u - a l w e c t K e o m e i a l u m c a e e c m b m a o 3 e s ) t t - r n n i n n i o h I e i y o e i n n p m m d t 1 e l k t l D i 1 o e a l - i w o u a r r F G H L b d N S T T f W Z , 1 r C 8 Z c C R g S h A m t e c i M d ) ) i ) I ) - H ) 3 [ B I t H ( ( , B ( n ( u w ( a w e N w w w e e e N N w e e N N N o k c o n K d ) B e ( t a e r T w e N 2 3 7 T a b l e 4 . 1 c o n t i n u e d G e n e s a n d G e n o m i c R e g i o n s I d e n t i fi e d f r o m U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s i n C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r s ) , a s C o m p a r e d t o R e s i s t a n t P B - V e s t e d t o B L A S T - l i k e A l i g n m e n N e w ( M ) U b i q u i n o l - c y t o e h r o m e 0 r e d u c t a s e ( 6 . 4 k I _ ) ) § r b t m i t N M _ 0 2 5 6 5 0 1 . A . i U n k n o w n N e w ( M ) t h b 8 0 5 N M _ 0 2 5 9 7 0 U n k n o w n N e w ( B ) N e w ( B ) N e w ( 3 ) C W N M _ 0 2 3 S 4 3 R e g u l a t i o n o f s m o o t h m u s c l e c e l l p r o l i f e r a t i o n / m i g r a t i o n ( 2 4 ) a n d T - c e l l r e s p o n s e s ( 2 _ 5 ) 1 5 2 0 4 0 1 A 0 3 R r ‘ k N M _ 1 7 7 1 3 2 1 . A i i i U n k n o w n N e w ( M ) N e w ( M ) S i x 3 N M _ 0 1 1 3 8 1 N e w ( B ) N M _ 0 0 1 0 3 3 8 7 7 1 . A . i i i A n n e x i n A 2 N M _ 0 0 7 5 8 5 1 . A . i i i N e w ( H ) N M _ 0 2 8 7 0 9 N e w ( H ) l l C h e m o k i n e ( C - C - m o t i f ) N M _ 0 0 9 9 1 6 1 . A . i i i N M _ o r z 2 3 1 9 1 . A . i i i N e w ( B m ' N e w ( M ) G a d l l X M 1 3 5 2 1 1 H e r c 3 N M 0 2 8 7 0 5 N M _ 0 1 0 6 8 7 N e w ( B ) L i n g a 2 U n k n o w n N e w ( H M ) i S n n s T c } ? 1 . A . i i i N e w ( B ) T t l l 9 N e w ( M ) W d r l 7 l . A . i i i m m t n i n i r w 2 2 P a w n i a l m l e i n q t ' ' 4 ) 7 4 ( n r o t ) c i ) 0 5 ( i s s a i v s n s 5 a g n 5 ) ( 7 , n 5 i ( s o r i r i a o s s t d e s y s d e c t a a ) n 3 t n i v t c a c n e a 5 r - e e c i i p p u s m t n d 5 s l i e e e , d g n h n a s e ( i n r n e o t i w r o o r t n i e o m u T e n i s o r y o g s u r m i o s i a g v n n A I s d t G u e n r a p x E e g a t l o v ) 1 e 5 h ) 4 5 ( ( t y , a a e t i w n v c t h ) n 7 d s 4 i e ) 8 e 4 t n e ( t h w o e a g ( c p a r s o - s r e a t n ’ l K e e i m m y t t a p t i p o r l l u a g e d v a e n l n o i p l a d i r k n a h n f m r n r s e a p r s U o a n h S b o a i l s l a n a g i s m h i / n u P o c e p e t e e C p c ) m T s A n a r a l u g e m g u V o s P i / s g i n T T a N L R T W B ( l o o i i i T B . . i . A 1 . t 1 n e m n g 6 4 8 i 1 9 7 9 4 l 7 i i i . A . 1 A e k i l - T S A L B o t d e t c e ' 3 4 0 1 1 0 0 _ M N 0 0 _ M X 2 A A m R R 3 9 s s M M b 8 ) 1 1 u g p e c 0 a l n 4 n S i i i 1 g n d - n i n e r 2 i 2 6 h e a p m t n i o o a ) o r o t d 2 3 n a i a t n o c n 6 o n e s 3 p n s d g r t n m ’ 1 l i d o D e d , ( n e a d c e n n z d a e z e n n i a e ) n 2 i o n i i r n t i p e r e b t i g e n a b k c n r e t o o m l u 1 s e o ) e 3 e - f a F e 6 a a k 2 i n i m t d r l e m r 3 r n t R d d p b i c P e n l s - a a C s l i i ' k C h n 9 h e S 7 h e i i ' S r y p r r r P r 3 n n W ( U U ' & T P P T ( T 2 E C o c r d p I a 5 e c r W 4 e w , e . M W u r r ' r I . ) i g l o o l o / / / / ' i H r r l d l ) o / c ) n ) i d n i o i a fi M ) ( M w ) ( . D r ( r m ‘ l . m M a M E n - ) . l i r ; O u t o N r p m e r u p o o y / k H d r u c o n K d B o ( 3 w o E ' n ( ( e p N M m w a n r r a m o o y o e p H o m o ‘ . H p H N p / I n c y " a y d H a r H c e y n ' H e o r n P r a n P c i _ ‘ e w w ) n ) r B e e H e ) ) r r M M ( o < N 1 ( P t N p ( n / r y r w r e o t t a e r T d r p n e y a p e d d y / p / H y N n n w o e o H o p y e H a H a H N 2 3 8 T a b l e 4 . 1 c o n t i n u e d G e n e s a n d G e n o m i c R e g i o n s I d e n t i fi e d fi ' o m U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s i n C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r s ) , a s C o m p a r e d t o R e s i s t a n t P B - N e w ( H ) R I K E N c D N A A 4 3 0 0 7 8 C 1 2 3 A 4 3 0 0 7 8 6 2 3 1 ? 1 ! : N M _ 0 0 1 0 3 3 3 7 8 U n k n o w n P t p r o N M _ 0 1 1 2 1 6 W s c d l N M _ 1 7 7 6 1 8 H y p e r ( M ) D i p e p fi d y l p e p fi d a s e 1 0 D p p l 0 N M _ 1 9 9 0 2 1 l . A . i i i H y p e r ( M ) T n k 2 N M _ 0 1 6 7 8 8 1 . A . i i i I n t r a c e l l u l a r a m . - t h a t m i g h t b e i n v o l v e d i n g r o w t h / m o v e m e n t ( 4 9 ) H y p e r < M > i N M _ 0 1 0 1 1 1 1 . A . i i i N e w ( H ) N e w ( q u r H y p o L E G 6 2 2 4 0 8 U n k n o w n H y ? ! 0 1 ' ( H ) H y p o ( B , H ) a n d / o r N e w ( M ) ' P r i c k l e Z N M _ 0 0 1 0 8 1 1 4 6 l . B . i i T r i o 1 . A . i i C o o r d i n a t i o n o f c y t o s k e l e t o n r e m o d e l i n g ( 5 6 ) ( H ) T n m n l 3 2 d N M _ 1 7 2 8 8 5 U n k n o w n ( B ) I N M _ 1 7 7 6 1 8 U n k n o w n S R A M S - b h t s i u e y B P t n a t s s e t s n a e r c n i e o m / t t d r d e e a n l e a c r e t n ) “ u I t t n ” i r o a t C d e n r i I r s e p h s i H o i u o : e a s , e _ i u s t H R r a o n n M / V o r i h t s r s T r B o d o H t g i A r f n t d o l a R 3 a e n / o r 2 e l m o d i f f a c e m s o p e e s r n f t s h h m o e c t t M o M o A C p u i o y d t r n d t a o o h o n r a c / i R d s d t , fi p a d s R r o a e e t e i s n n p t r y n h o o t h t s n a a b n e r I f p E e , e e ) h a s n i c a C e t l x p e P d i s l e . t n e u m r s e c a m d g o . e c r r c e c fi e p e i h e n l o a d h H d n t i - m e u S ) T s t i e a % c n . h g t , e s o u 0 t a e o g t o p p . i i e d B s d . 0 t e ) — i u _ . c ( W e p P r r e o 1 t i e ( V e r r s a . r T a h l v A l i L g e c ) e t t n t i s o c o a r L n p o t B l w t e s n s i M e r ( m n e e p . t i l m e e h n fi n i a c e p t n i m g m s a a r i o s g e c , o d r e e s e . a s b o r / l o s a d b n o r p h m a s e l u n t t s ) o o e u s n l h s h o l i f a T t i a r n o h t s c i e t a i t t p e n f r t e e n h v t i a r e p ) m c i w n 5 t n H i y n r r t v o t s a P i s e e 0 i a , o a i i w e L m . e I h ) m d e g t , e 0 r I t t r a u e e a u 7 < e s b t m t t r i s g 3 4 e 2 2 c n ) r t H n q u i 0 p n r w e o B m k s 0 p i d o e t B i o 2 P r m l s f r 0 n r A , e a ( n ( a t n f e c 1 a f t s o o r e s s U e a e . f s s a c e m n k o a i c l i t u m s i t h a - t s n d y u t t a e h n e a c h n t . k B a z o t e l s e P n m r s e t n e s o o r u r ’ y e e u p t h w f e t M u e i e q l s e s f h t c r - d P T e S ( — o s 3 e e - l i e — e t n c a o n i n A d c t e t o a r a V l d m i n e e s a R 2 n r i t k c i r e u b i ( g fi t d e e h w c g h 2 A e P i S e t d i i e e e r f M e l L u e r ( t p w t y n s t s p a o t r d n y i i n b 1 t t s B s a A e t o d t d p d a n t 3 r h n l d i 2 e e y n h o R t a s a s e p e c 1 a t t p e s b r b ( e t I M l 5 v p n fi c b s h e d M , a s u i e A ) o t t A u i i d 4 i n u o e s 4 1 m n s t e a d r n 0 r p W - 9 r o c n R 5 h t s R h g o i t o 4 c t i d c e i s t n r l i 2 4 b e c u i 2 e . ) e 4 t n s s n 0 e r e p i t e n o h e R j e r y i s r e g e A l d r o b - d l c p o s g s R < e r a i s w R C a e c u r o r e e m R a u s p a t p M e n m C s n S , v A P ( y C i a c i h t r p t , s t t t n r c R r c s s n b d n e k e e a a P e r i s t i e i i n o t m - t d i a t a y b e l e y e s u l b l s e r d l m d a t e h t t e n h o e c f t t t b e o t o n p m e z e h n e n s s m e i m o t h i t d ’ b r d e e t i i n i o o s g e r e t t 1 e e r r m e e g m e e r n p a t h n o i n s t a e g c n t e r t m e a p t e e e e i h n x w h t e G e c e r o g c d c r h d g e e R l “ a l r w t u s c ) e p r p r i n h d r t a h i e e d m s e o s e s t n h e 1 h C t S l o r n s l t t c ( o p o M w r o a c p a u n n n i e o r s n a n f h h h r a [ U t h e b e A f M U n f t s e f h e i s t w g n r n r o o e o r g i t e t R s e a r i s a e s h s r t e n o w n e d e fi h g s h i e o o i c M c g s c o e e i h s n t n c e r r s i o t i e i d i t i t p , s d G e e t n i ) g a g n f s a n m A h “ e e e o R i i e g e t m o o t f s r i v l e c s 0 r r f A o o c s i n e s e ( n s m e o d i p o e f f h t e / o l e . d s y o l e M p r p d o o a t s p i p e u l M o 2 g p o o y i t i l u g l n e n u s v e e s h t a o H a e e t e m h e t d t n i r u l t c t r e r l r s g r e r e A t s i t t c u o a s a a T n s z a n e u i s e . t g u R u u e s s t t M l m o e p e m i e k n f v n s i a a d i r h r s l n h n A o t o e u t o i r t a t t t t e d o t a n s i a f e c a a i r h t o a s s p t e t t t t c c s , t n w o o a s t i i a c n t a o n n w n v s n h e s l r t a o o o l o i r h a n o a i e u n ) i n i h r 1 t l i c i r e e t K o r a s y B t h o o t . u ( y t d t i P h a s r c e b u t s e t e f i a s h o e i 4 t s d t a u o t e t h a a m e h t g c c i g . e . l p e y y o l i e i m u y n i y n r a r e t h n A l b H r t a h m h h t n a i c e e u y fi n t e T a t t w l l n m s t a c e m e e l e o e d t t n i L c i e e b e n e M a o r T T C r a h B h e e i p t G d p e h h a n h P h M M ( l T y o T x C T d n T T “ h f w n J b c ” e g h e [ i i k 2 3 9 T u m o r s t a t u s i s ‘ . h , i U n c h a r a c t e m e d 3 R A M s — 2 — - . a m b i g u o u s “ W ( M ) M u l t i p l e g e n e h i t s " 4 6 2 b p V a r i o u s 3 V a r i o u s V a r i o u s N e w ( M ) c o n t a i n i n g 3 ( N u d c d 3 ) , p r o t e i n k i n a s e C , e p s i l o n ( P r k c e ) , p 5 3 a n d D N A d a m a g e r e g u l a t e d l ( P d r g l ) , s o l u t e c a r r i e r f a m i l y 1 1 ( p r o t o n - c o u p l e d d i v a l e n t m e t a l i o n t r a n s p o r t e r s ) , m e m b e r 2 ( $ c h 1 a 2 ) , s p e r m a t o g e n e s i s a s s o c i a t e d 2 1 ( S p a t a Z I ) , t u b u l i n t y r o s i n e l i g a s e - l i k e f a m i l y , m e m b e r 9 , 3 8 1 b p ( T t l l 9 ) , s o l u t e c a r r i e r f a m i l y 3 8 , m e m b e r 9 ( S l c 3 8 a 9 ) , d e a d b o x p o l y p e p t i d e 5 4 ( D d x 5 4 ) , a n d W S C d o m a i n c o n t a i n i n g 1 , 4 0 7 b p ( W s c h ) . R A M s t h a t w e r e u n a m b i g u o u s l y a s s i g n e d a h y p e r m e t h y l a t e d s t a t u s i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e i n c l u d e d d e a d b o x p o l y p e p t i d e 5 4 ( D d x 5 4 ) a n d Y i p l i n t e r a c t i n g f a c t o r h o m o l o g A ( S . c e r e v i s i a e ) ( Y i f ] a ) . I n t h e t u m o r t i s s u e , Y i p l i n t e r a c t i n g f a c t o r h o m o l o g A ( S . c e r e v i s i a e ) ( Y i fl a ) w a s h y p e r m e t h y l a t e d . F u r t h e r m o r e , u n a m b i g u o u s n e w m e t h y l a t i o n s i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e w e r e b r a n c h e d c h a i n a m i n o t r a n s f e r a s e 2 , m i t o c h o n d r i a l ( B c a t Z ) , u b i q u i n o l - c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e ( 6 . 4 k D ) s u b u n i t ( U q c r ) , z i n c fi n g e r a n d B T B d o m a i n c o n t a i n i n g 8 o p p o s i t e s t r a n d ( t h b 8 o s ) , c h i m e r i n ( c h i m a e r i n ) 2 ( C h n 2 ) , R I K E N c D N A 1 5 2 0 4 0 1 A 0 3 g e n e ( 1 5 2 0 4 0 1 A 0 3 R i k ) , s i n e o c u l i s - r e l a t e d h o m e o b o x 3 h o m o l o g ( D r o s o p h i l a ) ( S i x 3 ) , a n d W S C d o m a i n c o n t a i n i n g 1 , 4 0 7 b p ( W s c d l ) . N e w l y m e t h y l a t e d R A M s i n t h e t u m o r t i s s u e i n c l u d e d c h i m e r i n ( c h i m a e r i n ) 2 ( C h n 2 ) , R I K E N c D N A 1 5 2 0 4 0 1 A O 3 g e n e ( 1 5 2 0 4 0 1 A 0 3 R i k ) , s i n e o c u l i s - r e l a t e d h o m e o b o x 3 h o m o l o g ( D r o s o p h i l a ) ( S i x 3 ) , A d i s i n t e g r i n - l i k e a n d m e t a l l o p e p t i d a s e ( r e p r o l y s i n t y p e ) w i t h t h r o m b o s p o n d i n t y p e 1 m o t i f , 1 7 ( A d a m t s I 7 ) , a n n e x i n A 2 ( A n x a 2 ) , B T B ( P O Z ) d o m a i n c o n t a i n i n g 1 1 ( B t b d l I ) , c h e m o k i n e ( C - C - m o t i f ) r e c e p t o r 4 ( C c r 4 ) , c a l s y n t e n i n 2 ( C l s t n 2 ) , f o l l i c u l i n ( F l c n ) , g l u t a m a t e d e c a r b o x y l a s e — l i k e 1 ( G a d I I ) , H e c t d o m a i n a n d R L D 3 ( H e r c 3 ) , l i k e - g l y c o s y l t r a n s f e r a s e ( L a r g e ) , l e u c i n e r i c h r e p e a t a n d l g d o m a i n c o n t a i n i n g 2 ( L i n g 0 2 ) , s r c - r e l a t e d k i n a s e l a c k i n g C - a n d N - t e r m i n a l m y r i s t y l a t i o n 2 4 0 s i t e s ( S r m s ) , t r a n s c r i p t i o n f a c t o r 4 ( T c f 4 ) , t u b u l i n t y r o s i n e l i g a s e - l i k e f a m i l y , m e m b e r 9 , 2 0 8 b p ( T 1 1 1 9 ) , W D r e p e a t d o m a i n 1 7 ( W d r I 7 ) , z i n c fi n g e r a n d S C A N d o m a i n c o n t a i n i n g 2 2 ( Z s c a n 2 2 ) a n d R I K E N c D N A A 4 3 0 0 7 8 G 2 3 g e n e ( A 4 3 0 0 7 8 G 2 3 R i k ) . T h e r e w e r e n o u n a m b i g u o u s h y p e r m e t h y l a t e d o r n e w l y m e t h y l a t e d R A M s t h a t c a r r i e d f o r w a r d f r o m t h e p r e c a n c e r o u s t o t h e t u m o r t i s s u e . A s d e s c r i b e d i n t h e m e t h o d s , s o m e g e n e s a n d g e n o m i c r e g i o n s , w h i c h a r e g r e a t e r t h a n 1 0 k b a w a y f r o m a k n o w n g e n e , a r e t e n t a t i v e l y c l a s s i fi e d a s h a v i n g m u l t i p l e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s i n t h e p r e c a n c e r o u s a n d / o r t u m o r t i s s u e ( 2 1 % , 1 6 o f t h e 7 5 t o t a l g e n e s a n d g e n o m i c r e g i o n s ) . T a b l e 4 . 1 i n d i c a t e s t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s a n d p a r t i c u l a r t r e a t m e n t p e r i o d s a t w h i c h t h e s e g e n e s d i s p l a y e d a l t e r e d m e t h y l a t i o n . T h e g e n e s w e r e : D N A s e g m e n t , C h r 1 3 , W a y n e S t a t e U n i v e r s i t y 1 7 7 , e x p r e s s e d ( D 1 3 W s u 1 7 7 e ) , H I G l d o m a i n f a m i l y , m e m b e r 2 A ( H i g d Z a ) , p r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e , r e c e p t o r t y p e 0 ( P z p r o ) , d i p e p t i d y l p e p t i d a s e 1 0 ( D p p l 0 ) , t y r o s i n e k i n a s e n o n r e c e p t o r 2 ( T n k 2 ) , e p h r i n B 2 ( E fi z b Z ) , p r e d i c t e d g e n e , E G 6 2 2 4 0 8 ( E G 6 2 2 4 0 8 ) , p r i c k l e - l i k e 2 ( D r o s o p h i l a ) ( P r i c k I e Z ) , t r i p l e f u n c t i o n a l d o m a i n , P T P R F i n t e r a c t i n g ( T r i o ) , t r a n s m e m b r a n e p r o t e i n 1 3 2 d ( T m e m 1 3 2 d ) , a n d W S C d o m a i n c o n t a i n i n g 1 , 3 5 9 - 3 6 1 b p ( W s c d 1 ) . T h e r e w e r e 3 P C R p r o d u c t s w h i c h e a c h a s s o c i a t e d w i t h m u l t i p l e “ h i t s ” t h a t d i s p l a y e d t h e h i g h e s t B L A T s c o r e s ( i . e . n u m e r o u s g e n o m i c r e g i o n s s h o w e d t h e f e w e s t m i s m a t c h e s a s c o m p a r e d t o t h e s e q u e n c e o f i n t e r e s t ) , i n d i c a t i n g t h a t a n y o f o n e o f t h e v a r i o u s r e g i o n s c o u l d c o r r e s p o n d t o t h e P C R p r o d u c t s e q u e n c e . W h i l e a l l o f t h e t o p h i t s f o r a p a r t i c u l a r P C R p r o d u c t r e p r e s e n t e d r e g i o n s o n d i f f e r e n t c h r o m o s o m e s , t h e p r o d u c t a l i g n e d t o t h e i d e n t i c a l r e p e t i t i v e e l e m e n t . T h e r e f o r e , t h e s e 3 R A M s ( 4 4 2 - 4 4 5 , 4 6 2 a n d 4 9 1 b p ) a p p e a r t o b e l i n k e d t o a d i f f e r e n t , s p e c i fi c r e p e t i t i v e e l e m e n t , a n d w e a r e u n a b l e 2 4 1 t o d e t e r m i n e w i t h c e r t a i n t y w h i c h g e n o m i c r e g i o n t h e u n i q u e R A M r e p r e s e n t s . B L A T s e a r c h e s r e v e a l e d t h a t r e g i o n s o f t h e g e n o m e ( i n c l u d i n g t h e a f o r e m e n t i o n e d 4 9 1 b p r e g i o n ) , r e p r e s e n t e d b y 2 4 R A M s , a r e u n c h a r a c t e r i z e d ( i . e . l o c a t e d m o r e t h a n 1 0 k b a w a y fi o m a n a n n o t a t e d g e n e ) . O f t h e s e 2 4 R A M s , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f 1 8 w e r e u n a m b i g u o u s a n d t h e r e f o r e c o u l d b e c l a s s i fi e d a s e i t h e r h y p o - ( 5 R A M s ) , h y p e r - ( 3 R A M s ) o r n e w - ( 1 0 R A M s ) m e t h y l a t i o n s a t a p a r t i c u l a r t i m e p o i n t . O n e o f t h e 2 4 u n c h a r a c t e r i z e d R A M s c o u l d b e a s s i g n e d a s p e c i fi c m e t h y l a t i o n i n b o t h t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e ; t h e c h a n g e s w e r e o p p o s i t e i n d i r e c t i o n ( i . e . t h e p r e c a n c e r o u s R A M w a s h y p o m e t h y l a t e d a n d t h e t u m o r R A M w a s n e w l y m e t h y l a t e d ) . F i n a l l y , f o r 5 o u t o f t h e 2 4 u n c h a r a c t e r i z e d R A M s , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e ( 2 R A M s ) o r t h e t u m o r t i s s u e ( 3 R A M s ) w a s a m b i g u o u s . T h e P a t h w a y S t u d i o ® 5 . 0 i n f o r m a t i c p r o g r a m w a s u s e d t o i d e n t i f y c o m m o n t a r g e t s a n d r e g u l a t o r s o f t h e s e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e . F i g u r e 4 . 1 d e p i c t s t h e c o m m o n t a r g e t s o f s e v e r a l o f t h e g e n e s o f i n t e r e s t i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e . G e n e s i d e n t i fi e d f r o m P B - i n d u c e d R A M s d i s c e r n e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r ( T a b l e 4 . 1 ) w h i c h d o n o t p o s s e s s t a r g e t s t h a t a r e i n c o m m o n w i t h a n y o f t h e o t h e r p r e c a n c e r o u s g e n e s a r e n o t r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 4 . 1 . C o m m o n t a r g e t s o f t h e g e n e s i d e n t i fi e d f r o m P B - i n d u c e d R A M s d i s c e r n e d i n t u m o r t i s s u e a r e d e p i c t e d i n F i g u r e 4 . 2 . F o r e x a m p l e , c y c l i n D 1 ( C C N D I ) i s a c o m m o n t a r g e t o f A B L l , C R A B P I , P R K C E , a n d T C F 4 , a n d s i m i l a r l y , V - a k t m u r i n e t h y m o m a v i r a l o n c o g e n e h o m o l o g l ( A K T l ) i s a c o m m o n t a r g e t o f A B L l , E F N B 2 , P R K C E , a n d T C F 4 . I n t h i s w a y , p o t e n t i a l t a r g e t s o f m u l t i p l e g e n e s o f i n t e r e s t w e r e a s c e r t a i n e d i n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r c o m m o n c e l l u l a r p r o c e s s e s m i g h t b e a f f e c t e d w h i c h c o u l d m o r e e f fi c i e n t l y f a c i l i t a t e t u m o r i g e n e s i s . A d d i t i o n a l l y , c o m m o n 2 4 2 H a n d / o r Y H a n d / o r Y F m r e 4 . 1 C o m m o n T a r g e t s o f G e n e s I d e n t i fi e d f r o m U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d P r e c a n c e r o u s L i v e r T i s s u e f r o m C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e M i c e . A n i n f o r m a t i c s a p p r o a c h w a s u t i l i z e d t o d i s c e r n t a r g e t s o f 2 o r m o r e g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s i n p r e c a n c e r o u s t i s s u e ( 2 3 w e e k s ) . U n i q u e R A M s a r e h y p o m e t h y l a t e d ( H ) o r h y p e r m e t h y l a t e d ( Y ) . A c o m b i n a t i o n o f l e t t e r s ( e . g . , H a n d / o r Y ) i n d i c a t e s a n a m b i g u o u s m e t h y l a t i o n s t a t u s . R A M s t h a t c a r r i e d f o r w a r d ( c . f . ) , i . e . w e r e o b s e r v e d i n b o t h p r e c a n c e r o u s a n d t l m r o r t i s s u e , a r e d e n o t e d . T h e a r r o w s p o i n t t o w a r d s t h e c o m m o n t a r g e t s , w h i c h a r e u n l a b e l e d . P o s i t i v e ( + ) e f f e c t s a r e s h o w n . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t t h e s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h a g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s o r n u c l e a r r e c e p t o r s ( 0 ) , l i g a n d s ( ‘ 3 ’ ) , k i n a s e s ( O ) , a n d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( t 3 ) . 2 4 3 c . f . H a n d / o r H c . f . H a n d / o r H F ' g g g e 4 . 2 C o m m o n T a r g e t s o f G e n e s I d e n t i fi e d f r o m U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d L i v e r T u m o r T i s s u e f r o m C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e M i c e . A n i n f o r m a t i c s a p p r o a c h w a s u t i l i z e d t o d i s c e r n t a r g e t s o f 2 o r m o r e g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s i n t u m o r t i s s u e ( 3 2 w e e k s ) . U n i q u e R A M s a r e h y p o m e t h y l a t e d ( H ) , h y p e r m e t h y l a t e d ( Y ) o r n e w l y m e t h y l a t e d ( N ) . A c o m b i n a t i o n o f l e t t e r s ( e . g . , c . f . H a n d / o r H ) i n d i c a t e s a n a m b i g u o u s m e t h y l a t i o n s t a t u s . R A M s t h a t c a r r i e d f o r w a r d ( c . f . ) , i . e . w e r e o b s e r v e d i n b o t h p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e a r e d e n o t e d . T h e a r r o w s p o i n t t o w a r d s t h e c o m m o n t a r g e t s , w h i c h a r e u n l a b e l e d . P o s i t i v e ( — ° > ) a n d n e g a t i v e ( — — 1 ) e f f e c t s a r e s h o w n . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t t h e s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h a g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s o r n u c l e a r r e c e p t o r s ( 0 ) , l i g a n d s ( ‘ 3 ’ ) , k i n a s e s ( O ) a n d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( t 1 2 ) . 2 4 4 r e g u l a t o r s o f g e n e s o f i n t e r e s t i n t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e w e r e i d e n t i fi e d ( F i g . 4 . 1 2 ) . I n o r d e r t o e l u c i d a t e h o w t h e s e g e n e s m i g h t b e c o n t r i b u t i n g t o t u m o r i g e n e s i s , i n t e r c o n n e c t i o n s b e t w e e n t h e m a n d 5 k e y c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s ( a n g i o g e n e s i s , a p o p t o s i s , e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n , m i g r a t i o n / i n v a s i o n / m e t a s t a s i s a n d g r o w t h / s u r v i v a l ) w e r e d i s c e r n e d ( F i g s . 4 . 3 - 4 . 7 ) . T h e g e n e s o f i n t e r e s t t h a t w e r e i d e n t i fi e d i n t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e w h i c h a r e l i n k e d t o a p a r t i c u l a r p r o c e s s a r e d e p i c t e d s e p a r a t e l y w i t h i n e a c h fi g u r e . T a b l e 4 . 2 s u m m a r i z e s t h e p o t e n t i a l e f f e c t s o f t h e s e g e n e s o n t u m o r i g e n e s i s , b a s e d o n t h e i r c o n n e c t i o n s t o t h e a f o r e m e n t i o n e d p r o c e s s e s a n d t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s , a s s u m i n g t h a t m e t h y l a t i o n c h a n g e s a f f e c t g e n e e x p r e s s i o n ( e . g . , i n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n s i l e n c e e x p r e s s i o n a n d d e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n f a c i l i t a t e e x p r e s s i o n ) . A s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s , u n i q u e B 6 C 3 F 1 R A M s a t 2 a n d 4 w e e k s ( i d e n t i fi e d i n B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ; a n n o t a t e d i n P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) , w h i c h c o r r e s p o n d e d t o i d e n t i c a l g e n e s a n d u n c h a r a c t e r i z e d g e n o m i c r e g i o n s ( i . e . r e g i o n s o f D N A g r e a t e r t h a n 1 0 k b a w a y fi ' o m a n a n n o t a t e d g e n e o b s e r v e d i n t h e c u r r e n t s t u d y , w e r e c o m p a r e d t o t h e u n i q u e C A R p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r R A M s , i n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e m e t h y l a t i o n p a t t e r n s o f c o m m o n g e n e s / g e n o m i c r e g i o n s s e e n i n b o t h s t u d i e s w e r e a l t e r e d s i m i l a r l y o r d i f f e r e n t l y b y P B t r e a t m e n t . E l e v e n g e n e s ( B c a t 2 , D d x 5 4 , E fi r b Z , P r i c k l e Z , P t p r o , S r m s , T c f 4 , T n k 2 , T r i o , W s c d l a n d Z s c a n 2 2 ) , i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s , w e r e o b s e r v e d i n b o t h g r o u p s o f m i c e ( T a b l e 4 . 3 ) . F i v e g e n e s w e r e i d e n t i fi e d f r o m R A M s w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s e i t h e r c l e a r l y i n c r e a s e ( B c a t 2 : M 4 6 4 - 4 6 8 a n d Z s c a n 2 2 : H 2 3 8 - 2 3 9 ) o r c l e a r l y d e c r e a s e ( D d x 5 4 : B 3 1 2 - 3 1 5 , P t p r o : B 3 4 1 - 3 4 2 , a n d W s c d l : M 3 5 8 - 3 5 9 ) i n b o t h t h e B 6 C 3 F 1 a n d C A R W T m i c e . T h r e e g e n e s w e r e 2 4 5 . g . V E T ' G F . . i f ? ? ? “ a r i s e a . 5 . 1 m : H a n d / o r Y B . a ; V E T G F 1 ’ / . . , , c . f . H _ F N B Z » a n d / o r H F m r e 4 . 3 G e n e s w h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e a n d w h i c h a r e P o t e n t i a l l y I n v o l v e d i n t h e R e g u l a t i o n o f A n g i o g e n e s i s . A n i n f o r m a t i c s a p p r o a c h w a s u t i l i z e d t o d i s c e r n r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n a n g i o g e n e s i s a n d g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n p r e c a n c e r o u s ( A ) a n d t u m o r ( B ) t i s s u e . U n i q u e R A M s a r e d e n o t e d b y t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s : h y p o m e t h y l a t i o n ( H ) o r h y p e r m e t h y l a t i o n ( Y ) . A c o m b i n a t i o n o f l e t t e r s ( e . g . , H a n d / o r Y ) i n d i c a t e s a n a m b i g u o u s m e t h y l a t i o n s t a t u s , a n d c a r r y f o r w a r d ( c . f . ) R A M s a r e n o t e d . P o s i t i v e ( — ° > ) r e g u l a t i o n i s s h o w n . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t t h e s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h a g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s o r n u c l e a r r e c e p t o r s ( 0 ) , l i g a n d s ( < ‘ ) a n d k i n a s e s ( C ‘ ) . 2 4 6 B . e G E E F N B Z r c . f . H a n d / o r H F \ T M K ] ? ¥ \ l \ ( " s r A T 5 . A ' « E F u a z » H a n d / o r Y A K T : / / / “ \ \ \ c f H A B L 1 A p o p t o s i s : g ’ E G F \ ] . _ S T A T 5 , T N K 2 ~ H a n d / o r c . f . Y { P R K C E fl * « \ \ c f H ( l \ / K \ / W A B L 1 A p o p t o s i s / c f . Y , . P T P R O L H a n d / o r N F g g ’ r g 4 . 4 G e n e s w h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e a n d w h i c h a r e P o t e n t i a l l y I n v o l v e d i n t h e R e g u l a t i o n o f A p o p t o s i s . A n i n f o r m a t i c s a p p r o a c h w a s u t i l i z e d t o d i s c e r n r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n a p o p t o s i s a n d g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n p r e c a n c e r o u s ( A ) a n d t u m o r ( B ) t i s s u e . U n i q u e R A M s a r e d e n o t e d b y t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s : h y p o m e t h y l a t i o n ( H ) , h y p e r m e t h y l a t i o n ( Y ) , o r n e w m e t h y l a t i o n ( N ) . A c o m b i n a t i o n o f l e t t e r s ( e . g . , H a n d / o r N ) i n d i c a t e s a n a m b i g u o u s m e t h y l a t i o n s t a t u s , a n d c a r r y f o r w a r d ( c . f . ) R A M s a r e n o t e d . P o s i t i v e ( — ° > ) a n d n e g a t i v e ( - - l ) r e g u l a t i o n i s s h o w n . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t t h e s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h a g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s o r n u c l e a r r e c e p t o r s ( 0 ) , l i g a n d s ( 0 ) , k i n a s e s ( C ‘ ) a n d p h o s p h a t a s e s ( L A ) . 2 4 7 F G F ; @ a ” . C 2 4 8 B . c . f . H C . . f H a n d / o r H ” m m , C A B L 1 ‘ H a n d / o r Y 1 T G F | 3 S T A T 3 R A S E R 1 N F - K B L I V 1 M A P K - Z M T A 3 S m a d \ / E M T P r o g r a m ‘ E M T P r o g r a m 1 E - c a d h e r i n V i m e n t i n \ l E - c a d h e r i n V i m e n t i n a - c a t e n i n F i b r o n e c t i n a m t e n i n F i b r o n e c t i n B - c a t e n i n N - c a d h e r i n B - c a t e n i n N - c a d h e r i n E p i t h e l i a l m a r k e r s M e s e n c h y m a l m a r k e r s E p i t h e l i a l m a r k e r s M e s e n c h y m a l m a r k e r s r e p r e s s e d i n d u c e d r e p r e s s e d i n d u c e d F i g u r e 5 . G e n e s w h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e a n d w h i c h a r e P o t e n t i a l l y I n v o l v e d I n t h e R e g u l a t i o n o f ' 7 _ ‘ L ' ‘ " . . . . . . ' C e l l T r a n s i t i o n ( E M T ) . A n i n f o r m a t i c s a p p r o a c h w a s u t i l i z e d t o d i s c e r n r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n E M T a n d g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s 1 n p r e c a n c e r o u s ( A ) a n d t u m o r ( B ) t i s s u e . U n i q u e R A M s a r e d e n o t e d b y t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s : h y p o m e t h y l a t i o n ( H ) a n d h y p e r m e t h y l a t i o n ( Y ) . A c o m b i n a t i o n o f l e t t e r s ( e . g . , H a n d / o r Y ) i n d i c a t e s a n a m b i g u o u s m e t h y l a t i o n s t a t u s , a n d c a r r y f o r w a r d ( c . f . ) R A M s a r e n o t e d . P o s i t i v e ( — * ) a n d n e g a t i v e ( — 1 ) r e g u l a t i o n i s s h o w n . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t t h e s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h a g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s o r n u c l e a r r e c e p t o r s ( 0 ) , l i g a n d s ( O ) , a n d k i n a s e s ( C ‘ ) . 1 T h e a n n o t a t e d R A M s d e p i c t e d h a v e b e e n s u p e r i m p o s e d o n a m o d i fi c a t i o n o f a s c h e m a t i c o f t h e E M T p r o g r a m ( Z v a i fl e r , 2 0 0 6 ) . H a n d / o r Y H ya n d / o r Y N If 7 A é ’ m A A c ., X - N ' l I M H I ' 8 / m H m \ 2 4 c ' d O 4 T B \ H ' a ' c . d n . f / o H r E F N B z c . d . f / o H r a n H / \ N H a n d / o r F i g u r e 4 . 6 G e n e s w h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e a n d w h i c h a r e P o t e n t i a l l y I n v o l v e d ' 1 n t h e R e g u l a t i o n o f M i g r a t i o n , I n v a s i o n a n d M e t a s t a s i s . A n i n f o r m a t i c s a p p r o a c h w a s u t i l i z e d t o d i s c e r n r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n ' 7 t ’ a n d g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s 1 n p r e c a n c e r o u s ( A ) a n d t u m o r ( B ) t i s s u e . U n i q u e R A M s a r e d e n o t e d b y t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s : h y p o m e t h y l a t i o n ( H ) , h y p e r m e t h y l a t i o n ( Y ) , o r n e w m e t h y l a t i o n ( N ) . A c o m b i n a t i o n o f l e t t e r s ( e . g . , H a n d / o r Y ) i n d i c a t e s a n a m b i g u o u s m e t h y l a t i o n s t a t u s , a n d c a r r y f o r w a r d ( c . f . ) R A M s a r e d e n o t e d . P o s i t i v e ( — ° ' > ) a n d n e g a t i v e ( — — l ) r e g u l a t i o n i s s h o w n . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t t h e s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h a g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s o r n u c l e a r r e c e p t o r s ( 0 ) , l i g a n d s ( 0 ) , t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( S 3 . ) , a n d k i n a s e s ( C ‘ ) . 2 4 9 2 5 0 F ' g r e 4 . 7 G e n e s w h i c h E x h i b i t e d A l t e r e d M e t h y l a t i o n U n i q u e l y i n P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e a n d w h i c h a r e P o t e n t i a l l y I n v o l v e d i n t h e R e g u l a t i o n o f G r o w t h a n d S u r v i v a l . A n i n f o r m a t i c s a p p r o a c h w a s u t i l i z e d t o d i s c e r n r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n g r o w t h / s u r v i v a l a n d g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n p r e c a n c e r o u s ( A ) a n d t u m o r ( B ) t i s s u e . U n i q u e R A M s a r e d e n o t e d b y t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s : h y p o m e t h y l a t i o n ( H ) , h y p e r m e t h y l a t i o n ( Y ) , o r n e w m e t h y l a t i o n ( N ) . A c o m b i n a t i o n o f l e t t e r s ( e . g . , H a n d / o r Y ) i n d i c a t e s a n a m b i g u o u s m e t h y l a t i o n s t a t u s , a n d c a r r y f o r w a r d ( c . f . ) R A M s a r e d e n o t e d . P o s i t i v e ( 4 * ) a n d n e g a t i v e ( — - l ) r e g u l a t i o n i s s h o w n . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t t h e s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h a g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s o r n u c l e a r r e c e p t o r s ( 0 ) , l i g a n d s ( O ) , k i n a s e s ( O ) , p h o s p h a t a s e s ( i L ) a n d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( T 2 ) . r o t p e n o r c o e m r r M R A u l ‘ T e R n s e s a e t s o r d n A h t c o f r o P t d c e e t / c f u e o E i f a s v r d ‘ l n 1 i a e t c A i c ' I t n 1 r n a o e t c T e e v r P o i P t u t i t s n c o s r r r o o o C e l r / / / o m M o d d d n n n a a a - u I T p / H 3 n y i s H M M M o o o p p p C M M M u y y y d n t r o o H H H i a a p p t w d d d S y y r r r r s M n o i o a H H a a f w w w r r r o p y H A y o o o R a t d e c l y h t u e d M r r a C f f f y y y r r r r r r a a a C C C [ n i - ) B P ( l a t i b M M M o o o p p p r y y y a b o n e H H H d d d r r r a a a r o / d n a M o p M y r H e p h d w w w r r r r y o o f f o a H f w y y y r r r r r r r o f a a a y C C C r r a C 2 2 4 a 1 Z b b 5 l n r x l l b f fi E E d D c l A S P e u q i n U m o r f d e fi i t n e d I s e n e G 2 . 4 e l b a T 2 5 1 ( C A R ) W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r s ) , a s C o m p a r e d t o R e s i s t a n t C A R K n o c k o u t M i c e , a n d t h e i r P o t e n t i a l F u n c t i o n a l S i g n i fi c a n c e i n T u m o r i g e n e s i s M e t h y l a t i o n S t a t u s i n b P r e c a n c e r o u s I C e l l P r o c e s s o r G e n e a I A b l l ‘ C a r r y f o r w a r d H y p o M C a r r y f o r w a r d H y p o M a n d / o r H y p e r M P r k c e H y p e } ! T A b l l C a r r y F o r w a r d H y p o M C a r r y f o r w a r d H y p o M a n d / o r H y p e r M 1 M I T l T n k 2 H y p o M a n d / o r c a r r y f o r w a r d H y p e r M C a r r y f o r w a r d H y p e r M l o r t T P r k c e H y p o M 1 ' 0 H y p o M a n d / o r N e w M A h ] 1 C a r r y F o r w a r d H y p o M H y p e r M H y p o M E f n b 2 C a r r y f o r w a r d H y p o M a n d / o r H y p e r M P r k c e H y p o M H y p o M < — < — — < — — < — < - — — > I — O ‘ — C a r - 1 y F o r w a r d H y p o M C h n 2 N e w M N e w M E f n b 2 C a r r y f o r w a r d H y p o M a n d / o r H y p o M + — « — 4 — { — W H U F I I I - d l l fl i l - I I I < \ I I I I “ I I \ 1 ‘ l l l u l e n a t r s i o e r h d t n d A n , ) n . o s ; s s e s g i s e s u n s i c F o o n e e r p g i r . p s r e x a s d r e c h e l e e n t c t u a l c o e c r a i f t l / o a e v , e t p r i ) e e p c r p s l e i d a a l i c e t c c i A n i ( e a n u s r f l o u a l s t e n e M a s e t v u o M c n s t s i e e A a g c n a t R n i o t o u k t c f o l r o o i y e t h h p s t M a t r i i l e l e a f o s A t r s n n K o C R e A H C / t H n 3 a t C s n i i s e R o T M M r o / d n r u u o y m l o ) a t i l t R n l h l e t e n e o h s m c s e i t n n d t s f o i o n a a l o e a u t d r ) g a e n e c l s e n y a d e e r o i e t h B g t d d v e n a i a l M a ; t u n g b ) a t g n e e r ; o n e e e e i w n e u m s v s r o M e R e H d r d e a r c a p u w t i p p M i t r n e b A y r d y o o a s t f t s i s e a e o t H p d M r o c n i y e u o P s b H t a p w d d f n h o n o o i e n l i t i p s o s r t o x p i o i t e p m f B h i m y r r d r o o o a H n i - C f F w r n i s t a a s d l i k s e n e n b r i a u h e o s y y o i c n o , w ) a r r f r t fi n i B r r e 2 a i o 3 i d P c a a , y l c C C r e n ( y t n r a p e h a a l c u S t a u , C e e g n s e r o e s m i ; r i p n t ) n 7 e i t a i v r . s l o i 4 e u d - t m g s e 3 i e n s u a . t 4 e r r r o r o e p e / d n c . c i v n s g s g i i n r n M M M t i i s i y y q n a s i e n r o / / y f , e g n A c n i H d n o H p d M H n n R s o o i ( n r a d M y d r d i t U e e r a w e r H a d r e v a u m p g M a M e s s p c u s e l u r e f c w e d w q a t o o ( a r . d n g g u p r p M r s . e s l e e o M p o g e n s c d e F a , i p h y g t i d S l l i a W n o d m n n e e t c e t e fi a t n e a i o e o w c t r p i n d t t i e n e t a d B b i s l a i e P y s l t f h p ) e a i 2 2 o r o c h b t i o k i e i n r e s m s m d w n y n T k T h a e i t o s i c e T h t i w t a l l o h g e A b 4 o f a 3 t i e t p l e b c n e t a e o T R P w r n 2 ; i m y s 7 ( e m e e u h . s n l s u t 4 , s - e d s s 3 G a n A i . " t 4 ( a g ( ) s l r a o t m i b u T r a r b e o v n i e L h P o e / u d s i o L i r - fi s o u m d o u e r T fi e i c n t n n a e e c c d e I r n a P c s ( fi e i n e n e G d e u n i t R t k n c A n o n C T c u ( F 2 . r l i r c C C r r r y o r w r N r e o a H p o ( f w p f o u y y o r y e e c i c t e y f n e r H r f r o H y r r r a a y a r n i i f a o e f t s m a g o d e l n p t e i a l n t u p e i r f n s x l e e l v t r a C o y h c a l v e a i e t t f s i n a e t e f o M n a n c e e s t g e m g n ; o e o ) g p e l r t n h a a f n a t i e s t 2 5 2 H y p o M a n d / o r c a r r y f o r w a r d H y p e r M C r a b p l H y p o M N u d c d 3 H M P r k c e H y p o M P t p r o H y p o M a n d / o r N e w M S l c l l a Z H y p o M c h 4 A b l l N e w M — > + — < — 1 ( — ‘ 5 4 — 4 — C a r r y f o r w a r d H y p o M C a r r y F o r w a r d H y p o M A n x a 4 C h n 2 N e w M < — < — 4 — E f n b 2 — > H O ( — < — < — < — 4 — C a r r y f o r w a r d H y p e r M T o r i — + H y p o M a n d / o r C a r r y f o r w a r d H y p o M A n x a 2 N e w M P r k c e H y p o M S l c l l a 2 H y p o M c h 4 N e w M ( — 4 — ( — 1 ( — 4 — ) ) ) ) ) ) ) 0 5 0 4 8 4 6 4 9 2 2 ) 0 0 r g o ) ) ) ) 8 3 6 5 1 1 2 H 2 2 3 2 7 6 5 5 4 I 2 5 3 3 1 3 3 H M M H 3 - ( 3 ( ( B 0 M M M ( I ( ( 0 ( ( ( 1 ’ l 1 T 1 1 S “ “ l N T l T r 1 b e p y t d l i W R s u ) A ) ) o 8 C 6 r 5 4 s 4 e 6 1 ) ) ) 7 6 4 5 7 6 3 3 1 c 2 5 3 5 u M n t ( a M a c ( M ( M M ( ( ( t T T e “ S r r P T T ” 1 n o i t a l y h t e M d ) ) 4 0 6 1 4 3 M H ( ( ) 0 ) ) ) 5 3 7 8 0 7 5 5 3 h ) 9 2 2 3 2 3 3 B M M H 3 2 r o ( ( ( ( 1 l T " 1 ( , J ” 1 l 1 r k ) 5 3 1 ) 0 0 ) 0 ) ) ) ) ) ) a ) r g r g o ) o r o g d n g e e w 2 ) 1 s ) 5 0 6 6 6 5 1 1 3 o 2 6 6 4 0 4 2 3 4 B z 1 6 3 3 0 2 5 M H B 3 5 2 1 5 H 3 ( M T ( ( ( ( M ( H M ( 2 S N ' 1 T 1 l T 1 ( % l T l T T 1 1 o t c d 2 3 2 2 9 8 M 7 8 6 e 4 A 1 6 1 1 6 7 4 c 5 5 3 2 c e ° c 6 9 ° c r 3 4 3 5 3 0 2 3 3 3 3 - e - - — — - - 8 R - - — 0 - d 4 4 e 8 0 0 1 3 5 3 1 4 5 1 0 5 2 7 i s n 6 6 1 1 3 4 5 7 o 5 4 3 3 3 3 3 3 3 2 3 3 2 n H M 1 1 M H H M M 1 o e M C b l a i r d n 0 e p y r o ) g t n ) a i p 2 2 g n i o l t b h u y s n c c g 1 ) i a t e t r a o r i 2 S e 6 ) e t t S o r s a r t t 3 - T n ) i m , 2 4 l n l p 5 i f a R o e h o n i c T 4 o t p i 9 R 5 c T F 3 n ) o e n p e i t e d a U r m R o m r c ( U i e i s t a p r e ) 2 ) r r e t g ) ) ) ) - s r a P ) c o r s a r o e e , l o y t ’ e P 1 a ’ 5 t c 5 r T m ) c c D s - c c n t c n f o e i B d p o i c i i ( a i C i i ( c s o f r i n i n p y / n n n n n i t n n n s n l 2 d o o a o o g y o o n o N n i n i u o r r h r n e i i n r r m r / d n a t t o e r p t t p t a s t i o a t A a r x n h n k n k b l a x n n t n s p C a t I p E I x I c i k a m E I I I n S l n o S i n o E a : : : - o 0 h r i : : : i S o o S : : S n l d i i c i b i i e 1 p i c i k i m i i d T i i i T - i i i i : l s m . i d k n A s . i r i e l e n i e i n . i a A . . A a 2 . . 5 s s . . a A c A a n e n . i A a a n . A A n n n e 1 . d n a r r . 1 . i a o a b . i i . t ( 1 m 1 n i r - s 1 T 1 s ( m 1 1 i i D N ( P o ( ( e ( ( ( a r k E a S r d c : g o o t p S h : : y d d y m : l n c n : t z 2 t 4 e fi . T r d l . 5 > e C n t f i a c i e A x e k h d i e 1 l W c D i i t o r p i k i 1 Z ( r - n . s c n . : l e n e . 2 n r P B c o T r i : i : A S a c T . a r . P l : r r T 1 ( s y d 2 B : t c 2 : 2 t a c B : m m : s m r S o s n i r T W a c s Z 2 5 3 T a b . E 1 3 \ G e n e s I d e n t i fi e d f r o m I d e n t i c a l , U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s t h a t F o r m e d i n B o t h C A R W i l d t y p e “ 5 L i V e r a n d / o r L i v e r T u m o r s ) a n d B 6 C 3 F ] ( 2 a n d / o r 4 W e e k T r e a t e d ) M i c e G e n e ( G e n o m i c C l a s s i fi c a t i o n ) B 6 C 3 F 1 a 4 w e e k T u m o r l ( M 3 1 7 ) t 1 3 3 1 2 - 3 1 5 c l ( B 3 1 5 ) 1 ( B 3 1 2 ) 1 ( H 3 1 0 ) o r 1 ( H 3 1 2 ) g 1 ( B 3 1 0 ) C 1 0 3 3 4 1 ) 1 ( B 3 4 2 ) M 2 0 2 — 2 0 6 H 2 0 0 ° T N ( 1 3 2 0 0 ) M 5 6 4 - 5 6 6 2 5 4 T a b l e 4 . 3 c o n t i n u e d G e n e s I d e n t i fi e d f r o m I d e n t i c a l , U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) — i n d u c e d R A M s t h a t F o r m e d i n B o t h C A R W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r s ) a n d B 6 C 3 F ] ( 2 a n d / o r 4 W e e k T r e a t e d ) M i c e “ U n i q u e R A M s t h a t f o r m e d i n l i v e r s o f B 6 C 3 F 1 m i c e u p o n 2 o r 4 w e e k s o f 0 . 0 5 % ( w / w ) P B t r e a t m e n t . ” U n i q u e R A M s t h a t f o r m e d i n C 3 H / H e C A R W T m i c e ( p r e c a n c e r o u s o r t u m o r t i s s u e ) . ‘ A u n i q u e R A M ( e . g . , H 2 0 0 ) i s l i s t e d a s a s i n g l e l e t t e r , w h i c h i n d i c a t e s t h e m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n z y m e ( fl s s H I I , H p a l l o r M s p l ) w h i c h l e d t o t h e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e R A M , p l u s t h e s i z e ( s ) , i n b a s e p a i r s , o f t h e u n i q u e R A M s d e t e c t e d . I f m o r e t h a n 1 s i z e i s l i s t e d ( e . g . , M 5 6 4 - 5 6 6 ) , t h e s e r e p r e s e n t t h e s p a n o f t h e R A M s i z e s i n t h e B 6 C 3 F ] a n d C A R W T g r o u p s , a s n o t e d i n p a r e n t h e s e s i n t h e “ m e t h y l a t i o n s t a t u s ” c o l u m n . T h e r a t i o n a l e f o r c o n s i d e r i n g m u l t i p l e R A M s o f s i m i l a r s i z e s t o b e o n e R A M i s d e t a i l e d w i t h i n t h e M a t e r i a l s / M e t h o d s . ” T h e p r e s e n c e o f a n a r r o w , p l u s t h e R A M s i z e , i n d i c a t e s t h a t t h e u n i q u e R A M w a s d i s c e r n e d i n a s p e c i fi c g r o u p o f m i c e . I n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( h y p e r m e t h y l a t e d R A M s : t h o s e w h i c h a r e s i g n i fi c a n t , S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 , a n d n e w l y m e t h y l a t e d R A M s , w h e r e P C R p r o d u c t f o r m e d i n t h e t r e a t m e n t b u t n o t t h e c o n t r o l g r o u p ) a r e c o l l e c t i v e l y r e p r e s e n t e d b y a n u p w a r d s a r r o w ( T ) ; A N d e p i c t s a n e w m e t h y l a t i o n , w h i l e h y p e r m e t h y l a t i o n s r e m a i n a s u n l a b e l e d u p w a r d s a r r o w s . ‘ S i n c e 3 d i f f e r e n t r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n s w e r e u t i l i z e d , m o r e t h a n 1 R A M m i g h t r e p r e s e n t a s i n g l e g e n e . f D e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( h y p o m e t h y l a t e d R A M s , b o t h 1 0 0 % d e c r e a s e s , a n d t h o s e w h i c h a r e s i g n i fi c a n t , S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) a r e c o l l e c t i v e l y r e p r e s e n t e d b y a d o w n w a r d s a r r o w ( 1 ) . g T h e m e t h y l a t i o n s t a t u s i s a m b i g u o u s ( e . g . , n e w l y m e t h y l a t e d M 5 6 5 o r h y p o m e t h y l a t e d M 5 6 6 m i g h t r e p r e s e n t E fi r b 2 ) . ” T h e g e n e m i g h t b e r e p r e s e n t e d b y l o f 2 R A M s w h i c h e x h i b i t e d t h e s a m e d i r e c t i o n o f c h a n g e ( e . g . , b o t h a r e n e w m e t h y l a t i o n s ) . . _ . m . _ _ . . _ w , _ a . . . 3 t r . g m i d e n t i fi e d fi ' o m R A M s w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s a r e c l e a r l y o p p o s i t e ( e . g . , i n c r e a s e s i n 1 g r o u p a n d d e c r e a s e s i n a n o t h e r ) i n a t l e a s t 1 B 6 C 3 F 1 g r o u p a n d 1 C A R W T g r o u p : D d x 5 4 ( M 3 1 5 - 3 1 7 ) , T c f 4 ( 1 1 2 0 0 ) a n d T n k 2 ( M 2 7 5 - 2 7 6 ) . P r i c k l e 2 ( B 3 1 0 - 3 1 2 ) a n d T c f 4 ( B 2 0 0 ) w e r e i d e n t i fi e d f r o m R A M s i n t h e B 6 C 3 F 1 w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s i n c r e a s e a t 2 w e e k s , d e c r e a s e a t 4 w e e k s , a n d e i t h e r i n c r e a s e ( c h 4 ) o r d e c r e a s e ( P r i c k 1 e 2 ) i n t h e C A R t u m o r t i s s u e . W s c h ( B 3 5 7 - 3 5 8 ) w a s i d e n t i fi e d f r o m R A M s i n t h e C A R p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s i n c r e a s e a n d d e c r e a s e , r e s p e c t i v e l y , a n d a l s o i n c r e a s e i n t h e B 6 C 3 F 1 a t 4 w e e k s . F i n a l l y , E fi r b 2 ( M 5 6 4 - 5 6 6 ) , P r i c k l e 2 ( 1 - 1 3 1 0 - 3 1 2 ) , P t p r o ( H 3 4 0 - 3 4 3 ) , S r m s ( M 2 0 2 - 2 0 6 ) a n d T r i o ( M 5 6 4 - 5 6 6 ) w e r e i d e n t i fi e d f r o m a R A M i n a t l e a s t 1 g r o u p w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s i s u n c l e a r ( i . e . 2 R A M s f o r m e d i n t h e s a m e g r o u p a n d t h e m e t h y l a t i o n c h a n g e s a r e o p p o s i t e i n d i r e c t i o n ) , a n d t h u s , i t i s u n c e r t a i n w h e t h e r t h e a l t e r e d m e t h y l a t i o n p a t t e r n s i n t h e s e 5 g e n e s , i d e n t i fi e d f r o m 5 R A M s , a r e s i m i l a r a c r o s s g r o u p s o f B 6 C 3 F ] a n d C A R W T m i c e . S i x u n c h a r a c t e r i z e d g e n o m i c r e g i o n s o n 6 d i f f e r e n t c h r o m o s o m e s ( 2 7 1 - 2 7 2 , 2 8 8 , 3 2 4 , 3 7 0 , 3 7 8 - 3 7 9 a n d 5 7 5 - 5 7 6 b p ) , i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s , w e r e o b s e r v e d i n b o t h g r o u p s o f m i c e ( T a b l e 4 . 4 ) . T w o r e g i o n s w e r e i d e n t i fi e d f r o m R A M s w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s c l e a r l y d e c r e a s e ( 2 7 1 - 2 7 2 b p : M 2 7 0 - 2 7 2 a n d 3 7 8 - 3 7 9 b p : M 3 7 8 - 3 8 0 ) i n b o t h t h e B 6 C 3 F l a n d C A R W T m i c e . T w o r e g i o n s w e r e i d e n t i fi e d fi ' o m R A M s w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s a r e c l e a r l y o p p o s i t e ( i . e . i n c r e a s e s i n 1 g r o u p a n d d e c r e a s e s i n a n o t h e r ) i n a t l e a s t 1 B 6 C 3 F 1 g r o u p a n d 1 C A R W T g r o u p : 2 8 8 b p ( M 2 8 6 ) a n d 3 2 4 b p ( M 3 2 3 - 3 2 6 ) . R e g i o n s 2 7 1 - 2 7 2 b p ( B 2 6 9 - 2 7 2 ) a n d 5 7 5 - 5 7 6 b p ( M S 7 7 - 5 7 9 ) w e r e i d e n t i fi e d f r o m R A M s i n t h e B 6 C 3 F ] w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s a r e o p p o s i t e a t 2 a n d 4 w e e k s , a n d e i t h e r i n c r e a s e ( 2 7 1 - 2 7 2 b p ) o r d e c r e a s e ( 5 7 5 - 5 7 6 b p ) i n t h e C A R t u m o r 2 5 5 t i s s u e . F i n a l l y , r e g i o n s 2 7 1 - 2 7 2 b p ( 1 1 2 6 9 - 2 7 2 ) a n d 3 7 0 b p ( 8 3 6 8 - 3 7 0 ) w e r e i d e n t i fi e d f r o m a R A M i n 1 g r o u p w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s i s u n c l e a r ( e . g . , 2 R A M s f o r m e d i n t h e s a m e g r o u p a n d t h e m e t h y l a t i o n c h a n g e s a r e o p p o s i t e i n d i r e c t i o n ) , a n d t h u s , i t i s u n c e r t a i n w h e t h e r t h e a l t e r e d m e t h y l a t i o n i n t h e s e 2 c a s e s i s s i m i l a r a c r o s s g r o u p s o f B 6 C 3 F l a n d C A R W T m i c e . 2 5 6 D I S C U S S I O N T h e m e t h o d o l o g y e m p l o y e d i n t h i s s t u d y t o e v a l u a t e P B - i n d u c e d a l t e r e d m e t h y l a t i o n r e p r e s e n t s a n u n b i a s e d a p p r o a c h i n t h e s e n s e t h a t t h e g e n e s / g e n o m i c r e g i o n s e v a l u a t e d a r e n o t p r e d e t e r m i n e d , i . e . m e t h y l a t i o n c h a n g e s a r e d e t e c t e d fi r s t , f o l l o w e d b y t h e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e g e n e s / g e n o m i c r e g i o n s e x h i b i t i n g t h e c h a n g e s . R A M s w e r e d e t e c t e d u s i n g D N A i s o l a t e d f r o m w h o l e l i v e r t i s s u e f o r 4 o f t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p s ( C A R W T 2 3 - w e e k c o n t r o l , C A R K O 2 3 - w e e k c o n t r o l , C A R W T 2 3 - w e e k P B / p r e c a n c e r o u s a n d C A R K O 2 3 - w e e k P B ) . D N A f r o m i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s w a s a n a l y z e d f o r t h e 5 t h g r o u p , C A R W T 3 2 - w e e k P B . I t i s v i t a l t o f o c u s u p o n w h o l e a n i m a l s t u d i e s , a s c o m p a r e d t o i n v i t r o m o d e l s o n l y . F i r s t l y , i n t e r a c t i o n s b e t w e e n v a r i o u s c e l l t y p e s a r e l i k e l y t o b e e s s e n t i a l f o r t u m o r i g e n e s i s , a n d w h o l e a n i m a l s a l s o p o s s e s s a n i n t a c t i m m u n e s y s t e m , e . g . , s e c r e t i o n o f I L - 6 b y m a c r o p h a g e s f a c i l i t a t e s D E N - i n d u c e d h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s ( N a u g l e r e t a l . , 2 0 0 7 ) a n d s t r o m a l fi b r o b l a s t s c a n p r o m o t e t u m o r g r o w t h ( O r i m o e t a l . , 2 0 0 5 ) . S e c o n d l y , t h e o r i g i n o f l i v e r t u m o r c e l l s i s u n c l e a r . C a n c e r c e l l p r e c u r s o r s a r e l i k e l y h e p a t o c y t e s , w h i c h c a n p r o l i f e r a t e i n r e s p o n s e t o t r e a t m e n t w i t h m i t o g e n s s u c h a s P B ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ; K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 a ) , o r p a r t i a l h e p a t e c t o m y ( S t e e r , 1 9 9 5 ) , a n d a d u l t h u m a n ( T a k a h a s h i e t a l . , 2 0 0 7 ) a n d m u r i n e e m b r y o n i c ( W e r n i g e t a l . , 2 0 0 7 ) fi b r o b l a s t s c a n b e r e p r o g r a m m e d , p r o d u c i n g i n d u c e d p l u r i p o t e n t s t e m ( i P S ) c e l l s . I m p o r t a n t l y , i P S c e l l s w e r e g e n e r a t e d fi ' o m a d u l t m u r i n e h e p a t o c y t e s f o l l o w i n g t r a n s d u c t i o n w i t h o n l y f o u r g e n e s , O c t 3 / 4 , S o x 2 , K l f 4 , a n d c - M y c ( A o i e t a l . , 2 0 0 8 ) . T h e r e p r o g r a m m i n g o f a d u l t p a n c r e a t i c e x o c r i n e c e l l s i n t o i n d u c e d B - c e l l s v i a e x p r e s s i o n o f 3 t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s : N g n 3 , d e l a n d M a f a ( Z h o u e t a l . , 2 0 0 8 ) p r o v i d e s a b a s i s f o r s p e c u l a t i n g t h a t l i v e r c a n c e r p r o g e n i t o r c e l l s c o u l d a r i s e d i r e c t l y f r o m n o r m a l l i v e r c e l l s 2 5 7 w i t h o u t r e v e r t i n g t o a s t e m c e l l s t a t e . A d d i t i o n a l l y , P B t r e a t m e n t c a n i n h i b i t h e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i o n , p r o v i d i n g a n o p p o r t u n i t y f o r t h o s e c e l l s w h i c h “ l o s e ” r e s p o n s i v e n e s s t o t h i s i n h i b i t i o n t o , p o s s i b l y , f o r m t h e i n i t i a l c l o n e s o f p r e c a n c e r o u s c e l l s ( r e v i e w e d i n C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e s u g g e s t i o n t h a t h e p a t o c y t e s a r e l i v e r t u m o r c e l l p r e c u r s o r s i s n o t i n c o m p a t i b l e w i t h t h e n o t i o n t h a t t u m o r c e l l s m i g h t o r i g i n a t e f r o m s t e m c e l l t r a n s f o r m a t i o n ( R e y a e t a l . , 2 0 0 1 ) . A l i m i t e d n u m b e r o f g e n e s h a v e b e e n a s s o c i a t e d w i t h m o u s e l i v e r t u m o r i g e n e s i s , i . e . C A R ( H u a n g e t a l . , 2 0 0 5 ; Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) , B - c a t e n i n ( A y d i n l i k e t a l . , 2 0 0 1 ; S t r a t h m a n n e t a l . , 2 0 0 6 ) , c - M j / c ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) , H a - r a s ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 7 ; V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ; W i s e m a n e t a l . , 1 9 8 6 ) , K i - r a s ( V o r c e a n d G o o d m a n , 1 9 9 1 ) , a n d R a f ( R a y e t a l . , 1 9 9 4 ) . P r e v i o u s l y , 1 4 6 t o t a l u n i q u e R A M s w e r e o b s e r v e d i n l i v e r - t u m o r s u s c e p t i b l e P B - t r e a t e d C A R W T m i c e ( p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e ) , a s c o m p a r e d t o t h e i r r e s i s t a n t K O c o u n t e r p a r t a n d w e s u g g e s t e d t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e s e c h a n g e s m i g h t b e p l a y i n g c r i t i c a l r o l e s i n t h e c a r c i n o g e n e s i s p r o c e s s ( P h i l l i p s e t a l . , 2 0 0 7 ) . I n t h i s s t u d y , c l o n i n g a n d a n n o t a t i o n o f a s u b s e t ( 8 2 % ) o f t h e s e u n i q u e R A M s r e v e a l e d 4 7 g e n e s w h i c h m i g h t c o n t r i b u t e t o t u m o r i g e n e s i s d u e t o t h e i r a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s e s ; 1 7 h a v e p r e v i o u s l y b e e n i m p l i c a t e d i n c a n c e r o r r e l a t e d p r o c e s s e s ( T a b l e 4 . 1 ) . T h u s , w e h a v e i d e n t i fi e d 3 0 “ n e w ” c a n d i d a t e g e n e s w h i c h m i g h t b e i n v o l v e d i n P B - i n d u c e d c a r c i n o g e n e s i s . W e r e c e n t l y i d e n t i fi e d 1 7 0 u n i q u e R A M s i n l i v e r t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 , a s c o m p a r e d t o r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , m i c e u p o n t r e a t m e n t w i t h 0 . 0 5 % P B ( w / w ) f o r 2 o r 4 w e e k s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) ; s u b s e q u e n t c l o n i n g a n d a n n o t a t i o n o f t h e s e R A M s u n c o v e r e d 5 1 g e n e s t h a t e x h i b i t e d a l t e r e d m e t h y l a t i o n ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) . 2 5 8 T h e c o m b i n e d d a t a fi o m t h e s e 2 m o d e l s y s t e m s h a v e r e v e a l e d t h e f o r m a t i o n o f u n i q u e R A M s i n l i v e r t u m o r - s e n s i t i v e m i c e a t e a r l y ( i . e . 2 a n d 4 w e e k s ) a s w e l l a s l a t e r ( i . e . 2 3 w e e k s , p r e c a n c e r o u s a n d 3 2 w e e k s , t u m o r t i s s u e ) t r e a t m e n t t i m e p o i n t s , a n d t h u s , w e h a v e : 1 ) e v a l u a t e d m e t h y l a t i o n c h a n g e s w h i c h o c c u r w i t h i n a c o n t i n u u m o f P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s , a n d 2 ) i d e n t i fi e d t h e g e n e s / g e n o m i c r e g i o n s t h a t h a r b o r t h e s e m o d i fi c a t i o n s . S t r i k i n g l y , t h e r e w e r e m u l t i p l e R A M s c l o n e d i n b o t h t h e C A R W T a n d B 6 C 3 F 1 m i c e w h i c h a l i g n e d t o t h e e x a c t s a m e g e n o m i c r e g i o n s a n d e x h i b i t e d u n i q u e a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n i n l i v e r s o f b o t h g r o u p s o f t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e , i . e . B 6 C 3 F l a n d C A R W T . S p e c i fi c a l l y , 1 1 g e n e s w e r e i d e n t i fi e d f r o m i d e n t i c a l , u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s t h a t f o r m e d i n b o t h C 3 H / H e C A R W T ( p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r ) a n d B 6 C 3 F ] ( 2 a n d / o r 4 w e e k t r e a t e d ) m i c e ( T a b l e 4 . 3 ) . I m p o r t a n t l y , t h e s e s i m i l a r i t i e s w e r e o b s e r v e d r e g a r d l e s s o f t h e s t o c k / s t r a i n o f m i c e . W h i l e 6 o f t h e s e g e n e s ( E fi r b 2 , P r i c k l e 2 , P t p r o , c h 4 , T n k 2 a n d T r i o ) h a v e p r e v i o u s l y b e e n s h o w n t o b e i n v o l v e d i n c a n c e r o r c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s ( T a b l e 4 . 1 ; e x a m p l e p a t h w a y i n F i g . 4 . 1 3 ) , t h e r e m a i n i n g 5 ( B c a t 2 , D d x 5 4 , S r m s , W s c h a n d Z s c a n 2 2 ) a r e o f p a r t i c u l a r i n t e r e s t b e c a u s e t h e y r e p r e s e n t “ n e w ” c a n d i d a t e g e n e s p o t e n t i a l l y i n v o l v e d i n b o t h r e l a t i v e l y e a r l y a n d l a t e s t a g e s o f t u m o r i g e n e s i s . T h e a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) a n d A k t I a r e c o m m o n t a r g e t s ( F i g . 4 . 1 4 ) , w h i l e n g i s a c o m m o n r e g u l a t o r ( F i g . 4 . 1 5 ) , o f a s u b s e t o f t h e 6 c a n c e r - r e l a t e d g e n e s . F o r s o m e o f t h e s e c o m m o n g e n e s ( D d x 5 4 : M 3 1 5 - 3 1 7 , c h 4 : H 2 0 0 , a n d T n k 2 : M 2 7 5 - 7 6 ) , t h e c h a n g e i n m e t h y l a t i o n s t a t u s a t t h e 2 / 4 w e e k t i m e p o i n t ( s ) d o e s n o t o c c u r i n t h e s a m e d i r e c t i o n ( e . g . , h y p o m e t h y l a t i o n v . h y p e r m e t h y l a t i o n ) a s t h a t s e e n i n t h e 2 5 9 p r e c a n c e r o u s / t u m o r t i s s u e , i n d i c a t i n g t h e p o s s i b i l i t y f o r t h e m t o h a v e a d i f f e r e n t r o l e d u r i n g e a r l y , a s c o m p a r e d t o l a t e , s t a g e s o f t u m o r i g e n e s i s . B a s e d o n t h e s e d a t a , i t i s c o n c e i v a b l e t h a t a n “ a l t e r e d m e t h y l a t i o n fi n g e r p r i n t , ” c o n s i s t i n g o f a s u b s e t o f t h e g e n e s w h i c h e x h i b i t e d P B - i n d u c e d a l t e r e d m e t h y l a t i o n u n i q u e l y i n t h e l i v e r t u m o r - s e n s i t i v e m i c e , c o u l d b e d e v e l o p e d a n d u t i l i z e d a s a b i o m a r k e r t o i d e n t i f y P B - l i k e n o n g e n o t o x i c l i v e r t u m o r p r o m o t e r s a t r e l a t i v e l y e a r l y t i m e s f o l l o w i n g t r e a t m e n t . P r e l i m i n a r y c a n d i d a t e s f o r t h e “ a l t e r e d m e t h y l a t i o n fi n g e r p r i n t ” a r e t h o s e g e n e s , p r e s e n t e d i n T a b l e 4 . 3 , w h i c h r e v e a l e d i d e n t i c a l m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n b o t h t h e B 6 C 3 F ] a n d C A R W T m i c e : B c a t Z : M 4 6 4 - 4 6 8 , D d x 5 4 : B 3 1 2 - 3 1 5 , P t p r o : B 3 4 1 - 3 4 2 , W s c h : M 3 5 8 - 3 5 9 , a n d Z s c a n 2 2 : 2 3 8 - 2 3 9 . A s e c o n d t i e r o f p o t e n t i a l g e n e s t h a t m i g h t c o n t r i b u t e t o a n “ a l t e r e d m e t h y l a t i o n fi n g e r p r i n t ” i n c l u d e s 3 g e n e s ( i d e n t i fi e d fi ' o m 4 R A M s ) w h i c h o c c u r r e d i n b o t h t h e B 6 C 3 F 1 a n d C A R W T m i c e ; R A M s fi ' o m a t l e a s t 1 t i m e p o i n t i n e a c h g r o u p e x h i b i t e d s i m i l a r m e t h y l a t i o n c h a n g e s , h o w e v e r , a n a d d i t i o n a l g r o u p s h o w e d a n o p p o s i t e o r a m b i g u o u s c h a n g e ( e . g . , f r o m T a b l e 4 . 3 : P r i c k I e Z : H 3 1 0 / 3 1 2 , e x c l u d i n g t h e a m b i g u o u s p r e c a n c e r o u s R A M , P r i c k I e Z : B 3 1 0 - 3 1 2 , e x c l u d i n g t h e B 6 C 3 F l , 2 w e e k R A M , T c f 4 : B 2 0 0 , e x c l u d i n g t h e B 6 C 3 F ] , 4 w e e k R A M , a n d W s c h : B 3 5 7 - 3 5 8 , e x c l u d i n g t h e t u m o r R A M ) . W h i l e t h e g e n e s e x h i b i t i n g u n i q u e P B - i n d u c e d a l t e r e d m e t h y l a t i o n p a t t e r n s i n t h e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e m a y i n d i v i d u a l l y b e p l a y i n g c r u c i a l r o l e s d u r i n g t u m o r i g e n e s i s ( e . g . , h y p e r m e t h y l a t i o n o f a g r o w t h s u p p r e s s o r o r h y p o m e t h y l a t i o n o f a n o n c o g e n e ) , a n a l y s i s o f t o t a l h e p a t i c D N A , o r D N A i s o l a t e d f r o m i n d i v i d u a l t u m o r s , d o e s n o t a l l o w u s t o c o n c l u d e w h e t h e r t h e c h a n g e s o c c u r r e d i n o n e , o r m u l t i p l e , c e l l p e p u l a t i o n s . S i n c e i t i s p o s s i b l e t h a t t h e s e m o d i fi c a t i o n s a r o s e i n d i f f e r e n t p o p u l a t i o n s , i t 2 6 0 i s c o n s t r u c t i v e t o c o n s i d e r t h e o v e r a r c h i n g p a t h w a y s ( e . g . , a n g i o g e n e s i s ) i n w h i c h t h e s e g e n e s p a r t i c i p a t e ( T a b l e 4 . 2 ; F i g s . 4 . 3 - 4 . 7 ) . S i m i l a r o b s e r v a t i o n s w e r e m a d e b y J o n e s e t a l . ( 2 0 0 8 ) a n d P a r s o n s e t a l . ( 2 0 0 8 ) , w h o s h o w e d t h a t c o r e s i g n a l i n g p a t h w a y s w e r e g e n e t i c a l l y a l t e r e d i n p a n c r e a t i c c a n c e r a n d g l i o b l a s t o m a , r e s p e c t i v e l y . I m p o r t a n t l y , w h i l e t h e p a r t i c u l a r m u t a t i o n s v a r i e d a m o n g t u m o r s a m p l e s o f a s p e c i fi c c a n c e r t y p e ( i . e . d i f f e r e n t g e n e s w e r e a f f e c t e d , d e p e n d i n g o n t h e s a m p l e ) , t h e a l t e r e d g e n e s p a r t i c i p a t e i n t h e s a m e p a t h w a y s . L i k e w i s e , e p i g e n e t i c d e r e g u l a t i o n o f c e r t a i n p a t h w a y s b y n u m e r o u s g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s m i g h t m o r e e f f i c i e n t l y f a c i l i t a t e t u m o r f o r m a t i o n . I m p o r t a n t l y , s e v e r a l u n i q u e p r e c a n c e r o u s R A M s a r e i n v o l v e d i n 5 d i s t i n c t p r o c e s s e s , h o w e v e r , m o r e u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r t i s s u e p o t e n t i a l l y a f f e c t t h e s e s a m e p a t h w a y s ( F i g s . 4 . 3 - 4 . 7 ) , s u g g e s t i n g t h a t a l t e r e d m e t h y l a t i o n p l a y s p r o g r e s s i v e l y c r i t i c a l r o l e s d u r i n g t u m o r d e v e l o p m e n t . A d d i t i o n a l l y , c o m m o n t a r g e t s o f m u l t i p l e g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n t h e p r e c a n c e r o u s ( F i g . 4 . 1 ) a n d t u m o r ( F i g . 4 . 2 ) t i s s u e s u g g e s t t h a t c o m m o n p r o c e s s e s m i g h t b e i n fl u e n c e d , e . g . , A K T ] i s a c o m m o n t a r g e t o f 4 g e n e s i d e n t i fi e d fi ' o m u n i q u e R A M s i n t h e t u m o r t i s s u e ( F i g . 4 . 2 : A b l l , E fi r b Z , P r k c e a n d c h 4 ) . O f t h e 5 t h e p r o c e s s e s i n w h i c h m u l t i p l e g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r R A M s a r e i n v o l v e d ( F i g s . 4 . 3 - 4 . 7 ) , 4 o f t h e m ( a n g i o g e n e s i s , E M T , g r o w t h / s u r v i v a l , a n d i n v a s i o n / m e t a s t a s i s ) a r e a l s o c o n v e r g e d u p o n b y u n i q u e B 6 C 3 F ] R A M s a t 2 o r 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t ( F i g . 4 i n P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) . F u r t h e r m o r e , c o m m o n t a r g e t s ( A K T l , C C N D l , F O S , J U N , P T K 2 , a n d V E G F ) o f u n i q u e p r e c a n c e r o u s a n d / o r t u m o r R A M s ( F i g s . 4 . 1 a n d 4 . 2 ) a r e a l s o t a r g e t s o f u n i q u e B 6 C 3 F 1 , 4 w e e k R A M s ( F i g . 3 i n P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) . T h e s e d a t a , c o m b i n e d w i t h t h e fi n d i n g t h a t s e v e r a l c o m m o n g e n e s i n t h e B 6 C 3 F l ( 2 a n d 4 w e e k s ) a n d C A R W T ( 2 3 a n d 2 6 1 3 2 w e e k s ) m i c e e x h i b i t e d P B - i n d u c e d a l t e r e d m e t h y l a t i o n ( T a b l e 4 . 3 ) , i n d i c a t e t h e i m p o r t a n c e o f e a r l y m o d i fi c a t i o n s w h i c h m i g h t u l t i m a t e l y i n fl u e n c e e x p r e s s i o n a n d d r i v e t u m o r i g e n e s i s . M a n y g e n e s e x h i b i t p o i n t m u t a t i o n s , d e l e t i o n s o r a m p l i fi c a t i o n s i n v a r i o u s c a n c e r s ( J o n e s e t a l . , 2 0 0 8 ; P a r s o n s e t a l . , 2 0 0 8 ) . H o w e v e r , t h e i n t e g r a t i o n o f g e n e t i c a n d e p i g e n e t i c d a t a i s c r u c i a l t o u n d e r s t a n d i n g t h e m o l e c u l a r b a s i s o f t h e d i s e a s e ( M c L e n d o n e t a l . , 2 0 0 8 ) , a n d o u r d a t a h i g h l i g h t t h e s i g n i fi c a n c e o f D N A m e t h y l a t i o n a s a n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m u n d e r l y i n g t u m o r i g e n e s i s . I t i s k n o w n t h a t C 3 H / H e a n d B 6 C 3 F 1 m i c e a r e m o r e s u s c e p t i b l e t o l i v e r t u m o r s a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 s t r a i n ( B e c k e r e t a l . , 1 9 8 2 ) . I n r e s p o n s e t o P B t r e a t m e n t , m e t h y l a t i o n p a t t e r n s a r e a l t e r e d t o a g r e a t e r e x t e n t i n t h e s e n s i t i v e g r o u p s , i n c l u d i n g h i g h e r l e v e l s o f h y p e r m e t h y l a t i o n ( C 3 H / H e > > B 6 C 3 F 1 > C 5 7 B L / 6 ) , a n d t h u s , i t i s h y p o t h e s i z e d t h a t t h e i n a b i l i t y o f t h e s e a n i m a l s t o m a i n t a i n n o r m a l m e t h y l a t i o n p a t t e r n s i s r e s p o n s i b l e , a t l e a s t i n p a r t , f o r t h e i r d i f f e r e n t i a l l i v e r t u m o r s u s c e p t i b i l i t i e s ( W a t s o n a n d G o o d m a n , 2 0 0 2 ) . W h i l e t h e f u n d a m e n t a l g e n e s u n d e r l y i n g l i v e r c a n c e r i n m i c e a n d h u m a n s a r e l i k e l y t h e s a m e , r o d e n t s e x h i b i t a n i n c r e a s e d s u s c e p t i b i l i t y t o t u m o r i g e n e s i s ( R a n g a r a j a n a n d W e i n b e r g , 2 0 0 3 ) . A l s o , i t h a s b e e n o b s e r v e d t h a t m e t h y l a t i o n p a t t e r n s i n r o d e n t c e l l s a r e l e s s s t a b l e t h a n i n h u m a n c e l l s ( r e v i e w e d i n G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) . T h e r e f o r e , a d i f f e r e n c e b e t w e e n h u m a n s a n d r o d e n t s m i g h t e x i s t w i t h r e g a r d t o t h e r e g u l a t i o n o f e p i g e n e t i c c o n t r o l , i n c l u d i n g D N A m e t h y l a t i o n , r e s u l t i n g i n e n h a n c e d s e n s i t i v i t y t o t u m o r f o r m a t i o n i n t h e l a t t e r . P B c a u s e s h e p a t i c h y p e r t r o p h y a n d h y p e r p l a s i a ( W h y s n e r e t a l . , 1 9 9 6 ) , a n d P B - t r e a t e d C A R W T , b u t n o t C A R K O , m i c e e x h i b i t a n i n c r e a s e i n l i v e r m a s s d u e t o m i t o g e n e s i s a n d c e l l u l a r h y p e r t r o p h y ( W e i e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h u s , h y p o m e t h y l a t i o n c o u l d 2 6 2 r e s u l t f r o m r e p l i c a t i o n - d e p e n d e n t , p a s s i v e d e m e t h y l a t i o n ( H o w l e t t a n d R e i k , 1 9 9 1 ) . H y p o m e t h y l a t e d R A M s m i g h t o c c u r v i a p h y s i c a l b l o c k i n g o f c i s e l e m e n t s a n d / o r t r a n s - a c t i n g f a c t o r s ( e . g . , D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s , D N M T s , o r m e t h y l - b i n d i n g p r o t e i n s ) b y C A R i t s e l f , e . g . , t h e p r e s e n c e o f C A R o n D N A c o u l d s t e r i c a l l y h i n d e r t h e b i n d i n g o f D N M T ] . A c t i v e d e m e t h y l a t i o n ( r e v i e w e d i n O o i a n d B e s t o r , 2 0 0 8 ) m i g h t a l s o d e c r e a s e 5 - m e t h y l c y t o s i n e l e v e l s . I n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( i . e . h y p e r - a n d n e w - m e t h y l a t i o n s ) c o u l d b e m e d i a t e d b y t h e r e c r u i t m e n t o f d e n o v o D N M T s ( i . e . 3 A a n d 3 8 ) a n d / o r m e t h y l - b i n d i n g p r o t e i n s t o D N A b y C A R , s i m i l a r t o t h e o r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r G C N F r e c r u i t m e n t o f d e n o v o m e t h y l t r a n s f e r a s e s , r e s u l t i n g i n 0 c t - 3 / 4 s i l e n c i n g ( S a t o e t a l . , 2 0 0 6 ) . M o r e o v e r , C A R m i g h t m e d i a t e P B - i n d u c e d e x p r e s s i o n c h a n g e s i n p r o t e i n s t h a t c o u l d a l t e r m e t h y l a t i o n s t a t u s : D N M T s ( G 0 1 1 a n d B e s t o r , 2 0 0 5 ) , p r o t e i n s i n v o l v e d i n d e m e t h y l a t i o n ( O o i a n d B e s t o r , 2 0 0 8 ) , m e t h y l - b i n d i n g p r o t e i n s ( L o p e z - S e r r a a n d E s t e l l e r , 2 0 0 8 ) a n d / o r e n z y m e s i n v o l v e d i n r e g u l a t i n g l e v e l s o f S - a d e n o s y l m e t h i o n i n e ( S A M ) , t h e p r i m a r y m e t h y l - d o n o r f o r D N M T r e a c t i o n s ( U l r e y e t a l . , 2 0 0 5 ) . T h e c u r r e n t s t u d y f o c u s e d u p o n P B - i n d u c e d R A M s t h a t f o r m e d u n i q u e l y i n l i v e r t u m o r - s e n s i t i v e C A R W T ( p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r t i s s u e ) , a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t C A R K O , m i c e , a n d t h e g e n e s i d e n t i fi e d f r o m t h e s e R A M s c a n f u n c t i o n i n p r o c e s s e s t h a t a r e i m p o r t a n t f o r t u m o r d e v e l o p m e n t , i n c l u d i n g a n g i o g e n e s i s , a p o p t o s i s , E M T , g r o w t h / s u r v i v a l , a n d m i g r a t i o n / i n v a s i o n / m e t a s t a s i s . T h e s e d a t a , p l u s t h e r e s u l t s f r o m a n a l o g o u s w o r k i n w h i c h P B - e l i c i t e d u n i q u e R A M s a t 2 a n d 4 w e e k s i n s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] , a s c o m p a r e d t o r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , m i c e w e r e d i s c e r n e d ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 b ) a n d a n n o t a t e d ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) , a l l o w e d u s t o i d e n t i f y g e n e s w h o s e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n s e n s i t i v e a n i m a l s w i t h i n a 2 6 3 c o n t i n u u m o f P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s . A s u b s e t o f t h e s e , a s d i s c u s s e d a b o v e , r e p r e s e n t o u r i n i t i a l , p r e l i m i n a r y c a n d i d a t e “ a l t e r e d m e t h y l a t i o n fi n g e r p r i n t ” w h i c h m i g h t b e e m p l o y e d a s a b i o m a r k e r t o i d e n t i f y P B - l i k e n o n g e n o t o x i c l i v e r t u m o r p r o m o t e r s a t r e l a t i v e l y e a r l y t i m e s f o l l o w i n g t r e a t m e n t . C o m m o n g e n e s o b s e r v e d a t b o t h e a r l y ( B 6 C 3 F 1 ) a n d l a t e r ( C A R W T ) t i m e p o i n t s o f t r e a t m e n t ( T a b l e 4 . 3 ) , w h i c h e x h i b i t e d u n i q u e P B - i n d u c e d a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n , p a r t i c i p a t e i n t h e s a m e k e y p r o c e s s e s , i n d i c a t i n g t h a t m e t h y l a t i o n c h a n g e s a t e a r l y t i m e s a r e c r i t i c a l f o r t u m o r f o r m a t i o n . T h u s , t h e c u r r e n t s t u d y r e p r e s e n t s a n i m p o r t a n t s t e p f o r w a r d t o w a r d s o u r g o a l o f e n h a n c i n g o u r u n d e r s t a n d i n g o f g e n e s a n d p a t h w a y s i n v o l v e d i n P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s . E x p r e s s i o n a n a l y s i s ( b o t h q u a n t i t a t i v e r e a l - t i m e P C R a n d m i c r o a r r a y s ) i s c u r r e n t l y b e i n g p e r f o r m e d o n R N A i s o l a t e d f r o m t h e s a m e l i v e r t i s s u e u s e d i n t h e c u r r e n t s t u d y a n d o u r s t u d y i n v o l v i n g a c o m p a r i s o n o f t h e e f f e c t s o f P B ( f o l l o w i n g 2 o r 4 w k o f t r e a t m e n t ) o n l i v e r t u m o r s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) . 2 6 4 A C K N O W L E D G E M E N T S C 3 H / H e C A R w i l d t y p e a n d k n o c k o u t m o u s e l i v e r t i s s u e w a s g r a c i o u s l y p r o v i d e d b y D r s . M a s a h i k o N e g i s h i a n d R o b e r t M a r o n p o t ( N a t i o n a l I n s t i t u t e o f E n v i r o n m e n t a l H e a l t h S c i e n c e s ) . P r e d o c t o r a l f e l l o w s h i p s u p p o r t f o r J . M . P w a s r e c e i v e d f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h / N a t i o n a l I n s t i t u t e o f E n v i r o n m e n t a l H e a l t h S c i e n c e s t r a i n i n g g r a n t N o . T 3 2 - E S - 7 2 5 5 . R e s e a r c h s u p p o r t , i n t h e f o r m o f a g i f t , f r o m t h e R ] . R e y n o l d s T o b a c c o C o m p a n y i s a c k n o w l e d g e d g r a t e f u l l y . R E F E R E N C E S A o i , T . , Y a e , K . , N a k a g a w a , M . , I c h i s a k a , T . , O k i t a , K . , T a k a h a s h i , K . , C h i b a , T . , a n d Y a m a n a k a , S . ( 2 0 0 8 ) G e n e r a t i o n o f p l u r i p o t e n t s t e m c e l l s fi ' o m a d u l t m o u s e l i v e r a n d s t o m a c h c e l l s . S c i e n c e 3 2 1 , 6 9 9 - 7 0 2 . A y d i n l i k , H . , N g u y e n , T . D . , M o e n n i k e s , O . , B u c h m a n n , A , a n d S c h w a r z , M . ( 2 0 0 1 ) S e l e c t i v e p r e s s u r e d u r i n g t u m o r p r o m o t i o n b y p h e n o b a r b i t a l l e a d s t o c l o n a l o u t g r o w t h o f B - c a t e n i n - m u t a t e d m o u s e l i v e r t u m o r s . O n c o g e n e 2 2 , 7 8 1 2 — 7 8 1 6 . B a c h m a n , A . N . , K a m e n d u l i s , L . M . , a n d G o o d m a n , J . I , ( 2 0 0 6 a ) D i e t h a n o l a m i n e a n d p h e n o b a r b i t a l p r o d u c e a n a l t e r e d p a t t e r n o f m e t h y l a t i o n i n G C - r i c h r e g i o n s o f D N A i n B 6 C 3 F 1 m o u s e h e p a t o c y t e s s i m i l a r t o t h a t r e s u l t i n g f r o m c h o l i n e d e fi c i e n c y . T o x i c o l . S c i . 9 0 , 3 1 7 — 3 2 5 . B a c h m a n , A . N . , P h i l l i p s , J . M , a n d G o o d m a n J . I . ( 2 0 0 6 b ) P h e n o b a r b i t a l i n d u c e s p r o g r e s s i v e p a t t e r n s o f G C - r i c h a n d g e n e - s p e c i fi c a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n i n t h e l i v e r o f t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e . T o x i c o l . S c i . 9 1 , 3 9 3 - 4 0 5 . B e c k e r , F . F . ( 1 9 8 2 ) M o r p h o l o g i c a l c l a s s i fi c a t i o n o f m o u s e l i v e r t u m o r s b a s e d o n b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . C a n c e r R e s . 4 2 , 3 9 1 8 — 3 9 2 3 . B u c h m a n n , A . , B a u e r - H o f r n a n n , R . , M a h r , J . , D r i n k w a t e r , N . R . , L u z , A . , a n d S c h w a r z , M . ( 1 9 9 1 ) M u t a t i o n a l a c t i v a t i o n o f t h e c - H a - r a s g e n e i n l i v e r t u m o r s o f d i f f e r e n t r o d e n t s t r a i n s : C o r r e l a t i o n w i t h s u s c e p t i b i l i t y t o h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 8 8 , 9 1 1 — 9 1 5 . C o u n t s , J . L . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 7 ) . C o m p a r i s o n o f e f f e c t o f t u m o r p r o m o t e r t r e a t m e n t s o n D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d g e n e e x p r e s s i o n i n B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m o u s e l i v e r a n d i n B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . M o l . C a r c i n o g . 1 8 , 9 7 - 1 0 6 . C o u n t s , J . L . , S a r m i e n t o , J . I . , H a r b i s o n , M . L . , D o w n i n g , J . C . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 6 ) . C e l l p r o l i f e r a t i o n a n d g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s c h a n g e s i n m o u s e l i v e r a f t e r p h e n o b a r b i t a l a n d / o r c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e fi c i e n t d i e t a d m i n i s t r a t i o n . C a r c i n o g e n e s i s 1 7 , 1 2 5 1 - 1 2 5 7 . 2 6 5 E s t e l l e r , M . ( 2 0 0 8 ) E p i g e n e t i c s i n c a n c e r . N . E n g ] . J . M e d . 3 5 8 , 1 1 4 8 - 1 1 5 9 . F o x , T . R . , S c h u m a n n , A . M . , W a t a n a b e , P . G . , Y a n o , B . L . , M a h e r , V . M . , M c C o m r i c k , J . J . ( 1 9 9 0 ) M u t a t i o n a l a n a l y s i s o f t h e H - r a s o n c o g e n e i n s p o n t a n e o u s C 5 7 B L / 6 x C 3 H / H e m o u s e l i v e r t u m o r s a n d t u m o r s i n d u c e d w i t h g e n o t o x i c a n d n o n g e n o t o x i c h e p a t o c a r c i n o g e n s . C a n c e r R e s . 5 0 , 4 0 1 4 - 4 0 1 9 . G o l l , M . G . , a n d B e s t o r , T . H . ( 2 0 0 5 ) E u k a r y o t i c c y t o s i n e m e t h y l t r a n s f e r a s e s . A n n u . R e v . B i o c h e m . 7 4 , 4 8 1 - 5 1 4 . G o o d m a n , J . I . , a n d W a t s o n , R E . ( 2 0 0 2 ) . A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n : A s e c o n d a r y m e c h a n i s m i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s . A n n u . R e v . P h a r m a c o l . T o x i c o l . 4 2 , 5 0 1 - 5 2 5 . H o n k a k o s k i , P . , Z e l k o , I . , S u e y o s h i , T . , a n d N e g i s h i , M . ( 1 9 9 8 ) T h e n u c l e a r o r p h a n r e c e p t o r C A R - r e t i n o i d X r e c e p t o r h e t e r o d i m e r a c t i v a t e s t h e p h e n o b a r b i t a l - r e s p o n s i v e e n h a n c e r m o d u l e o f t h e C Y P Z B g e n e . M o ] . C e l l . B i o l . 1 8 , 5 6 5 2 - 5 6 5 8 . H o w l e t t , S . K . , a n d R e i k , W . ( 1 9 9 1 ) M e t h y l a t i o n l e v e l s o f m a t e r n a l a n d p a t e r n a l g e n o m e s d u r i n g p r e i m p l a n t a t i o n d e v e l o p m e n t . D e v e l o p m e n t 1 1 3 , 1 1 9 - 1 2 7 . H u a n g , W . , Z h a n g , J . , C h u a , S . S . , Q a t a n a n i , M . , H a n , Y . , G r a n a t a , R . , a n d M o o r e , D . D . ( 2 0 0 3 ) I n d u c t i o n o f b i l i r u b i n c l e a r a n c e b y t h e c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 1 0 0 , 4 1 5 6 - 4 1 6 1 . H u a n g , W . , Z h a n g , J . , W a s h i n g t o n , M . , L i u , J . , P a r a n t , J . M . , L o z a n o , G . , M o o r e , D . D . ( 2 0 0 5 ) X e n o b i o t i c s t r e s s i n d u c e s h e p a t o m e g a l y a n d l i v e r t u m o r s v i a t h e n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r . M o l . E n d o c r i n o l . 1 9 , 1 6 4 6 - 1 6 5 3 . J o n e s , 8 . , Z h a n g , X . , P a r s o n s , D . W . , L i n , J . C . , L e a r y , R . J . , A n g e n e n d t , P . , M a n k o o , P . , C a r t e r , H . , K a m i y a m a , H . , J i m e n o , A . , H o n g , S . M . , F u , B . , L i n , M . T . , C a l h o u n , E . S . , K a m i y a m a , M . , W a l t e r , K . , N i k o l s k a y a , T . , N i k o l s k y , Y . , H a r t i g a n , J . , S m i t h , D . R . , H i d a l g o , M . , L e a c h , S . D . , K l e i n , A . P . , J a f f e e , E . M . , G o g g i n s , M . , M a i t r a , A . , I a c o b u z i o - D o n a h u e , C . , E s h l e m a n , J . R . , K e r n , S . E . , H r u b a n , R . H . , K a r c h i n , R . , P a p a d o p o u l o s , N . , P a r r n i g i a n i , G . , V o g e l s t e i n , B . , V e l c u l e s c u , V . E . , a n d K i n z l e r , K . W . ( 2 0 0 8 ) C o r e s i g n a l i n g p a t h w a y s i n h u m a n p a n c r e a t i c c a n c e r s r e v e a l e d b y g l o b a l g e n o m i c a n a l y s e s . S c i e n c e 3 2 1 , 1 8 0 1 - 1 8 0 6 . K a w a m o t o , T . , S u e y o s h i , T . , Z e l k o , 1 . , M o o r e , R . , W a s h b u r n , K . , a n d N e g i s h i , M . ( 1 9 9 9 ) P h e n o b a r b i t a l - r e s p o n s i v e n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f t h e r e c e p t o r C A R i n i n d u c t i o n o f t h e C Y P Z B g e n e . M o l . C e l l . B i o l . 1 9 , 6 3 1 8 - 6 3 2 2 . K o l a j a , K . L . , S t e v e n s o n , D . E . , J o h n s o n , J . T . , W a l b o r g , E . F . , J r . , a n d K l a u n i g , J . E . ( 1 9 9 6 a ) S u b c h r o n i c e f f e c t s o f d i e l d r i n a n d p h e n o b a r b i t a l o n h e p a t i c D N A s y n t h e s i s i n m i c e a n d r a t s . F u n d a m . A p p ] . T o x i c o l . 2 9 , 2 1 9 - 2 2 8 . 2 6 6 K o l a j a , K . L . , S t e v e n s o n , D . E . , W a l b o r g J r . , E . F . , a n d K l a u n i g J . E . ( 1 9 9 6 b ) . D o s e d e p e n d e n c e o f p h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n o f p r e n e o p l a s t i c h e p a t i c l e s i o n s i n F 3 4 4 r a t s a n d B 6 C 3 F 1 m i c e : e f f e c t s o n D N A s y n t h e s i s a n d a p o p t o s i s . C a r c i n o g e n e s i s 1 7 , 9 4 7 - 9 5 4 . K o n n o , Y . , N e g i s h i , M . , a n d K o d a m a , S . ( 2 0 0 8 ) T h e r o l e s o f n u c l e a r r e c e p t o r s C A R a n d P X R i n h e p a t i c e n e r g y m e t a b o l i s m . D r u g M e t a b . P h a r m a c o k i n e t . 2 3 , 8 - 1 3 . L o p e z - S e r r a , L . , a n d E s t e l l e r , M . ( 2 0 0 8 ) P r o t e i n s t h a t b i n d m e t h y l a t e d D N A a n d h u m a n c a n c e r : r e a d i n g t h e w r o n g w o r d s . B r . J . C a n c e r 9 8 , 1 8 8 1 - 1 8 8 5 . M c L e n d o n , R . , F r i e d m a n , A . , B i g n e r , D . , V a n M e i r , E . G . , B r a t , D . J . , M a s t r o g i a n a k i s , G . M . , O l s o n , J . J . , M i k k e l s e n , T . , L e h m a n , N . , A l d a p e , K . , e t a ] . ( 2 0 0 8 ) C o m p r e h e n s i v e g e n o m i c c h a r a c t e r i z a t i o n d e fi n e s h u m a n g l i o b l a s t o m a g e n e s a n d c o r e p a t h w a y s . N a t u r e 4 5 5 , 1 0 6 1 - 1 0 6 8 . M o e n n i k e s , O . , B u c h m a n n , A . , R o m u a l d i , A . , O t t , T . , W e r r i n g l o e r , J . , W i l l e c k e , K . , a n d S c h w a r z , M . ( 2 0 0 0 ) . L a c k o f p h e n o b a r b i t a l - m e d i a t e d p r o m o t i o n o f h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n c o n n e x i n 3 2 - n u l l m i c e . C a n c e r R e s . 1 5 , 5 0 8 7 - 5 0 9 1 . N a u g l e r , W . E , S a k u r a i , T . , K i m , S . , M a e d a , S . , K i m , K . , E l s h a r k a w y , A . M . , a n d K a r i n , M . ( 2 0 0 7 ) G e n d e r d i s p a r i t y i n l i v e r c a n c e r d u e t o s e x d i f f e r e n c e s i n M y D 8 8 - d e p e n d e n t I L - 6 p r o d u c t i o n . S c i e n c e 3 1 7 , 1 2 1 - 1 2 4 . O o i , S . K . , a n d B e s t o r , T . H . ( 2 0 0 8 ) T h e c o l o r f u l h i s t o r y o f a c t i v e D N A d e m e t h y l a t i o n . C e l l 1 3 3 , 1 1 4 5 - 1 1 4 8 . O r i m o , A . , G u p t a , P . B . , S g r o i , D . C . , A r e n z a n a - S e i s d e d o s , F . , D e l a u n a y , T . , N a e e m , R . , C a r e y , V . J . , R i c h a r d s o n , A . L . , a n d W e i n b e r g , R . A . ( 2 0 0 5 ) S t r o m a l fi b r o b l a s t s p r e s e n t i n i n v a s i v e h u m a n b r e a s t c a r c i n o m a s p r o m o t e t u m o r g r o w t h a n d a n g i o g e n e s i s t h r o u g h e l e v a t e d S D F - l / C X C L 1 2 s e c r e t i o n . C e l l 1 2 1 , 3 3 5 - 3 4 8 . P a r s o n s , D . W . , J o n e s , 8 . , Z h a n g , X . , L i n , J . C . , L e a r y , R . J . , A n g e n e n d t , P . , M a n k o o , P . , C a r t e r , H . , S i n , 1 . M . , G a l l i a , G . L . , O l i v i , A . , M c L e n d o n , R . , R a s h e e d , B . A . , K e i r , S . , N i k o l s k a y a , T . , N i k o l s k y , Y . , B u s a m , D . A . , T e k l e a b , H . , D i a z , L . A . J r . , H a r t i g a n , J . , S m i t h , D . R . , S t r a u s b e r g , R . L . , M a r i e , S . K . , S h i n j o , S . M . , Y a n , H . , R i g g i n s , G . J . , B i g n e r , D . D . , K a r c h i n , R . , P a p a d o p o u l o s , N . , P a r m i g i a n i , G . , V o g e l s t e i n , B . , V e l c u l e s c u , V . E . , a n d K i n z l e r , K . W . ( 2 0 0 8 ) A n i n t e g r a t e d g e n o m i c a n a l y s i s o f h u m a n g l i o b l a s t o m a m u l t i f o r m e . S c i e n c e 3 2 1 , 1 8 0 7 - 1 8 1 2 . P h i l l i p s , J . M . , a n d G o o d m a n , J . l . ( 2 0 0 8 ) I d e n t i fi c a t i o n o f g e n e s t h a t m a y p l a y c r i t i c a l r o l e s i n p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s d u e t o a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n . T o x i c o l . S c i . 1 0 4 , 8 6 - 9 9 . P h i l l i p s , J . M . , Y a m a m o t o , Y . , N e g i s h i , M . , M a r o n p o t , R . R . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 7 ) O r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s i n 2 6 7 D N A m e t h y l a t i o n d u r i n g p h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n o f l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T o x i c o l . S c i . 9 6 , 7 2 - 8 2 . R a n g a r a j a n , A . , a n d W e i n b e r g , R . A . ( 2 0 0 3 ) C o m p a r a t i v e b i o l o g y o f m o u s e v e r s u s h u m a n c e l l s : M o d e l i n g h u m a n c a n c e r i n m i c e . N a t . R e v . C a n c e r 3 , 9 5 2 — 9 5 9 . R a y , J . S . , H a r b i s o n , M . L . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 4 ) A l t e r a t i o n s i n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d e x p r e s s i o n o f t h e r a f o n c o g e n e i n p h e n o b a r b i t a l - i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e t u m o r s . M o ] . C a r c i n o g . 9 , 1 5 5 — 1 6 6 . R e y a , T . , M o r r i s o n , S . J . , C l a r k e , M . F . , a n d W e i s s m a n , I . L . ( 2 0 0 1 ) S t e m c e l l s , c a n c e r , a n d c a n c e r s t e m c e l l s . N a t u r e 4 1 4 , 1 0 5 — 1 1 1 . R u m s b y , P . C . , B a r r a s s , N . C . , P h i l l i m o r e , H . E . , a n d E v a n s , J . G . ( 1 9 9 1 ) A n a l y s i s o f t h e H a - r a s o n c o g e n e i n C 3 H / H e m o u s e l i v e r t u m o u r s d e r i v e d s p o n t a n e o u s l y o r i n d u c e d w i t h d i e t h y l n i t r o s a m i n e o r p h e n o b a r b i t o n e . C a r c i n o g e n e s i s 1 2 , 2 3 3 1 - 2 3 3 6 . S a t o , N . , K o n d o , M . , a n d A r a i , K . ( 2 0 0 6 ) T h e o r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r G C N F r e c r u i t s D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e f o r 0 c t - 3 / 4 s i l e n c i n g . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 3 4 4 , 8 4 5 - 8 5 1 . S t e e r , C ] . ( 1 9 9 5 ) L i v e r r e g e n e r a t i o n . F A S E B J . 9 , 1 3 9 6 - 1 4 0 0 . S t r a t h m a n n , J . , S c h w a r z , M . , T h a r a p p e l , J . C . , G l a u e r t , H . P . , S p e a r , B . T . , R o b e r t s o n , L . W . , A p p e l , K . E . , a n d B u c h m a n n , A . ( 2 0 0 6 ) P C B 1 5 3 , a n o n - d i o x i n - l i k e t u m o r p r o m o t e r , s e l e c t s f o r B - c a t e n i n ( C a t n b ) - m u t a t e d m o u s e l i v e r t u m o r s . T o x i c o l . S c i . 9 3 , 3 4 - 4 0 . S u e y o s h i , T . , K a w a m o t o , T . , Z e l k o , 1 . , H o n k a k o s k i , P . , a n d N e g i s h i , M . ( 1 9 9 9 ) T h e r e p r e s s e d n u c l e a r r e c e p t o r C A R r e s p o n d s t o p h e n o b a r b i t a l i n a c t i v a t i n g t h e h u m a n C Y P 2 B 6 g e n e . J . B i o l . C h e m . 2 7 4 , 6 0 4 3 - 6 0 4 6 . S u e y o s h i , T . , M o o r e , R . , S u g a t a n i , J . , M a t s u r n u r a , Y . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 8 ) P P P 1 R 1 6 A , t h e m e m b r a n e s u b u n i t o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e 1 B , s i g n a l s n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r . M 0 ] . P h a r m a c o l . 7 3 , 1 1 1 3 - 1 1 2 1 . S u g a t a n i , J . , K o j i m a , H . , U e d a , A . , K a k i z a k i , S . , Y o s h i n a r i , K . , G o n g , Q . H . , O w e n s , 1 . S . , N e g i s h i , M . , a n d S u e y o s h i , T . ( 2 0 0 1 ) T h e p h e n o b a r b i t a l r e s p o n s e e n h a n c e r m o d u l e i n t h e h u m a n b i l i r u b i n U D P - g l u c u r o n o s y l t r a n s f e r a s e U G T 1 A 1 g e n e a n d r e g u l a t i o n b y t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R . H e p a t o l o g y 3 3 , 1 2 3 2 - 1 2 3 8 . S w a l e s , K . a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 4 ) C A R , d r i v i n g i n t o t h e f u t u r e . M o l . E n d o c r i n o l . 1 8 , 1 5 8 9 - 1 5 9 8 . T a k a h a s h i , K . , T a n a b e , K . , O h n u k i , M . , N a r i t a , M . , I c h i s a k a , T . , T o m o d a , K . , a n d Y a m a n a k a , S . ( 2 0 0 7 ) I n d u c t i o n o f p l u r i p o t e n t s t e m c e l l s f r o m a d u l t h u m a n fi b r o b l a s t s b y 2 6 8 d e fi n e d f a c t o r s . C e l l 1 3 1 , 8 6 1 - 8 7 2 . U e d a , A . , H a m a d e h , H . K . , W e b b , H . K . , Y a m a m o t o , Y . , S u e y o s h i , T . , A f s h a r i , C . A . , L e h m a n n , J . M . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 2 ) D i v e r s e r o l e s o f t h e n u c l e a r o r p h a n r e c e p t o r C A R i n r e g u l a t i n g h e p a t i c g e n e s i n r e s p o n s e t o p h e n o b a r b i t a l . M o l . P h a r m a c o l . 6 1 , 1 - 6 . U l r e y , C . L . , L i u , L . , A n d r e w s , L . G . , a n d T o l l e f s b o l , T . O . ( 2 0 0 5 ) T h e i m p a c t o f m e t a b o l i s m o n D N A m e t h y l a t i o n . H u m . M o l . G e n e t . 1 4 S p e c N o 1 : R l 3 9 - 1 4 7 . V o r c e , R . L . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 1 ) . H y p o m e t h y l a t i o n o f r a s o n c o g e n e s i n c h e m i c a l l y i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . T o x i c o l . E n v i r o n . H e a l t h . 3 4 , 3 6 7 - 3 8 4 . W a t s o n , R . E . a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 2 ) . E f f e c t s o f p h e n o b a r b i t a l o n D N A m e t h y l a t i o n i n G C - r i c h r e g i o n s o f h e p a t i c D N A f r o m m i c e t h a t e x h i b i t d i f f e r e n t l e v e l s o f s u s c e p t i b i l i t y t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T o x i c o l . S c i . 6 8 , 5 1 - 5 8 . W e i , P . , Z h a n g , J . , E g a n - H a fl e y , M . , L i a n g , S . , a n d M o o r e , D . D . ( 2 0 0 0 ) . T h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R m e d i a t e s s p e c i fi c x e n o b i o t i c i n d u c t i o n o f d r u g m e t a b o l i s m . N a t u r e 4 0 7 , 9 2 0 - 9 2 3 . W e r n i g , M . , M e i s s n e r , A . , F o r e m a n , R . , B r a m b r i n k , T . , K u , M . , H o c h e d l i n g e r , K . , B e r n s t e i n , B . E . , a n d J a e n i s c h , R . ( 2 0 0 7 ) I n v i t r o r e p r o g r a m m i n g o f fi b r o b l a s t s i n t o a p l u r i p o t e n t E S - c e l l - l i k e s t a t e . N a t u r e 4 4 8 , 3 1 8 — 3 2 4 . W h y s n e r , J . , R o s s , P . M . , a n d W i l l i a m s , G . M . ( 1 9 9 6 ) P h e n o b a r b i t a l m e c h a n i s t i c d a t a a n d r i s k a s s e s s m e n t : e n z y m e i n d u c t i o n , e n h a n c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n d t u m o r p r o m o t i o n . P h a r m a c o l . T h e r . 7 1 , 5 3 - 9 1 . W i s e m a n , R . W . , S t o w e r s , S . J . , M i l l e r , E . C . , A n d e r s o n , M . W . , a n d M i l l e r , J . A . ( 1 9 8 6 ) A c t i v a t i n g m u t a t i o n s o f t h e c - H a - r a s p r o t o o n c o g e n e i n c h e m i c a l l y i n d u c e d h e p a t o m a s o f t h e m a l e B 6 C 3 F 1 m o u s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 8 3 , 5 8 2 5 — 5 8 2 9 . Y a m a m o t o , Y . , K a w a m o t o , T . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 3 ) T h e r o l e o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R a s a c o o r d i n a t e r e g u l a t o r o f h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n i n d e f e n s e a g a i n s t c h e m i c a l t o x i c i t y . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 4 0 9 , 2 0 7 - 2 1 1 . Y a m a m o t o , Y . , M o o r e , R . , G o l d s w o r t h y , T . L . , N e g i s h i , M . , a n d M a r o n p o t , R . R . ( 2 0 0 4 ) T h e o r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r i s e s s e n t i a l f o r l i v e r t u m o r p r o m o t i o n b y p h e n o b a r b i t a l i n m i c e . C a n c e r R e s . 6 4 , 7 1 9 7 - 7 2 0 0 . Z h o u , Q . , B r o w n , J . , K a n a r e k , A . , R a j a g o p a l , J . , a n d M e l t o n , D . A . I n v i v o r e p r o g r a m m i n g o f a d u l t p a n c r e a t i c e x o c r i n e c e l l s t o B - c e l l s . N a t u r e 4 5 5 , 6 2 7 - 6 3 2 . Z v a i fl e r , N . J . ( 2 0 0 6 ) R e l e v a n c e o f t h e s t r o m a a n d e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n ( E M T ) f o r t h e r h e u m a t i c d i s e a s e s . A r t h r i t i s R e s . T h e r . 8 , 2 1 0 - 2 2 0 . 2 6 9 C H A P T E R 4 A P P E N D I X T h e a p p e n d i x c o n s i s t s o f a s e r i e s o f fi g u r e s w h i c h p r o v i d e a s u m m a r y o f t h e g e n o m i c l o c a t i o n s ( F i g . 4 . 8 ) , c h r o m o s o m a l a l i g n m e n t s ( F i g . 4 . 9 ) a n d fi m c t i o n s ( F i g . 4 . 1 0 ) o f t h e g e n e s / g e n o m i c r e g i o n s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n C A R W T m i c e . A d d i t i o n a l l y , t h e r e i s 1 e x a m p l e o f a n i n f o n n a t i c p a t h w a y s o f a u n i q u e C A R W T R A M ( F i g . 4 . 1 1 ) , a n d c o m m o n c e l l u l a r r e g u l a t o r s o f g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e ( F i g . 4 . 1 2 ) . A n e x a m p l e o f a p a t h w a y d i a g r a m o f g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s o b s e r v e d i n C A R W T a n d B 6 C 3 F 1 m i c e i s d e p i c t e d i n F i g . 4 . 1 3 . C o m m o n t a r g e t s a n d r e g u l a t o r s o f g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s o b s e r v e d i n C A R W T a n d B 6 C 3 F 1 m i c e a r e f o u n d i n F i g s . 4 . 1 4 a n d 4 . 1 5 , r e s p e c t i v e l y . I d e n t i c a l g e n o m i c r e g i o n s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s o b s e r v e d i n C A R W T a n d B 6 C 3 F 1 m i c e a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 4 . 1 . N o t e t h a t t h e s e d a t a a r e a s u b s e t o f t h e t o t a l S u p p l e m e n t a r y I n f o r m a t i o n t h a t c a n b e f o u n d i n t h e v e r s i o n o f t h i s m a n u s c r i p t t h a t i s i n p r e s s f o r p u b l i c a t i o n t o T o x i c o l o g i c a l S c i e n c e s ( a s o f M a r c h 2 0 0 9 ) . 2 7 0 4 : R e p e a t e l e m e n t : m u l t i p l e " t o p " h i t s a n d n o n e a r e a s s o c i a t e d w i t h a g e n e 1 % 3 : R e p e a t e l e m e n t : m u l t i p l e " t o p " h i t s a n d o n e / s e v e r a l a r e a s s o c i a t e d w i t h a g e n e ( s ) 3 A 1 . A . i : S p a n s T S S a n d / o r 5 ' U T R 8 % 1 . A . i i : E x o n i c 1 1 % 2 : U n c h a r a c t e r i z e d : > 1 0 k b a w a y f r o m a n a n n o t a t e d g e n e 1 % 1 . C . i i : > 2 a n d 5 1 0 k b d o w n s t r e a m f r o m l a s t e x o n fi n t r o n 1 % 1 . A . i i i : l n t r o n i c 3 4 % 1 . C . i : 5 2 k b d o w n s t r e a m f r o m l a s t e x o n fi n t r o n 4 o 1 . B . i i : > 2 a n d _ < _ 1 0 k b u p s t r e z r z l r s o f T S S 1 . B . i : 5 2 k b u p s t r e a m o f T S S 0 4 A : F i g r _ r r e 4 . 8 T h e D i s t r i b u t i o n o f G e n o m i c L o c a t i o n s o f t h e A n n o t a t e d ( I n c l u d i n g U n c h a r a c t e r i z e d R e g i o n s ) P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e . T h e g e n o m i c l o c a t i o n s o f t h e a n n o t a t e d ( i n c l u d i n g u n c h a r a c t e r i z e d r e g i o n s ) R A M s a r e p r e s e n t e d b a s e d o n t h e c l a s s i fi c a t i o n s c h e m e o n p a g e 7 1 o f t h i s d i s s e r t a t i o n . 2 7 1 1 8 1 9 1 1 7 1 % 1 % 4 % 2 1 3 6 % 5 6 % 1 2 3 % 6 7 % 1 1 9 % 9 % 4 % F i g g r e 4 . 9 T h e C h r o m o s o m a l D i s t r i b u t i o n o f t h e A n n o t a t e d ( I n c l u d i n g U n c h a r a c t e r i z e d R e g i o n s ) P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d U n i q u e R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e . T h e c h r o m o s o m e s p r o c e e d f r o m 1 t o 1 9 , i n a c l o c k w i s e f a s h i o n . N o n e o f t h e R A M s a l i g n e d t o t h e X o r Y c h r o m o s o m e s . 2 7 2 S i g n a l t r a n s d u c t i o n 1 5 ° / 0 U n c h a r a c t e r i z e d 3 4 % T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n 4 % T r a n s p o r t 4 % C e l l u l a r m e t a b o l i s m 4 % I n t r a c e l l u l a r t r a f fi c k i n g 1 % R N A m e t a b o l i s m a n d f u n c t i o n 1 % U n k n o w n 3 0 % F ' g g r e 4 . 1 0 F u n c t i o n a l B r e a k d o w n o f t h e G e n o m i c R e g i o n s t h a t R e p r e s e n t U n i q u e P B - i n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e M i c e ( P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e ) . T h e g e n o m i c r e g i o n s , i n c l u d i n g g e n e s , r e p r e s e n t i n g u n i q u e R A M s w e r e b r o k e n d o w n i n t o 1 2 c a t e g o r i e s , 1 0 o f w h i c h a r e b a s e d o n G e n e O n t o l o g y ( G O ) f u n c t i o n a l i n f o r m a t i o n . F o r g e n e s i n t h e “ u n k n o w n ” c a t e g o r y , n o i n f o r m a t i o n a b o u t t h e m e x i s t s i n t h e l i t e r a t u r e . R e g i o n s i n t h e “ u n c h a r a c t e r i z e d ” c a t e g o r y a l i g n t o t h e m o u s e g e n o m e g r e a t e r t h a n 1 0 k i l o b a s e s a w a y f r o m a n a n n o t a t e d g e n e . 2 7 3 1 : 1 1 : 5 1 ] ? ? ? 1 7 4 ? ? ! F r g L r ' r e 4 . 1 1 I n f o r m a t i c s A n a l y s i s o f c - A b l O n c o g e n e 1 , R e c e p t o r T y r o s i n e K i n a s e ( A b l l ) W h i c h R e p r e s e n t s a U n i q u e C a r r y F o r w a r d H y p o m e t h y l a t e d R A M i n b o t h t h e P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e . T h e p r o t o o n c o g e n e A b l l e n c o d e s a c y t o p l a s m i c a n d n u c l e a r p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e t h a t h a s b e e n i m p l i c a t e d i n a v a r i e t y o f c e l l u l a r p r o c e s s e s , i n c l u d i n g o n c o g e n e s i s . S o l i d a r r o w s i n d i c a t e p o s i t i v e ( — 0 > ) o r n e g a t i v e ( — - 1 ) r e g u l a t i o n , w h i l e d o t t e d a r r o w s ( - » - - > ) i n d i c a t e i n v o l v e m e n t i n d i s e a s e s t a t e s . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t a s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h a g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s o r n u c l e a r r e c e p t o r s ( 0 ) , l i g a n d s ( 0 ) , k i n a s e s ( O ) a n d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( S , 2 ) . 2 7 4 H a n d / o r c . f . Y . ‘ . ' c . f . H N a n d / o r H F i g g r _ e 4 . 1 2 C o m m o n R e g u l a t o r s o f G e n e s t h a t w e r e I d e n t i f i e d f r o m U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n C 3 H / H e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e P r e c a n c e r o u s a n d L i v e r T u m o r T i s s u e . A n i n f o r m a t i c a p p r o a c h w a s u t i l i z e d t o d i s c e r n r e g u l a t o r s t h a t a f f e c t 2 o r m o r e g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s i n p r e c a n c e r o u s t i s s u e ( 2 3 w e e k s , i n A ) a n d l i v e r t u m o r t i s s u e ( 3 2 w e e k s , i n B ) . U n i q u e R A M s a r e h y p o m e t h y l a t e d ( H ) , h y p e r m e t h y l a t e d ( Y ) , o r n e w l y m e t h y l a t e d ( N ) . A c o m b i n a t i o n o f l e t t e r s ( e . g . , H a n d / o r Y ) r e p r e s e n t s a R A M w i t h a n a m b i g u o u s m e t h y l a t i o n s t a t u s i n t h e t u m o r t i s s u e , a n d c a r r y f o r w a r d ( c . f . ) R A M s a r e n o t t e d . T h e a r r o w s p o i n t a w a y f r o m t h e c o m m o n r e g u l a t o r ( u n l a b e l e d ) a n d t o w a r d s t h e u n i q u e R A M ; p o s i t i v e ( 4 9 ) a n d n e g a t i v e ( — l ) r e g u l a t i o n i s s h o w n . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t a s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h a g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s o r n u c l e a r r e c e p t o r s ( 0 ) , l i g a n d s ( 0 ) , k i n a s e s ( O ) , a n d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( 3 . 2 ) . 2 7 5 F r g g ' r _ e 4 . 1 3 I n f o r m a t i c A n a l y s i s o f E p h r i n B 2 ( E f n b 2 ) , a G e n e I d e n t i fi e d f r o m I d e n t i c a l , U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s t h a t F a m e d i n B o t h C 3 H / H e C A R W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r s ) a n d B 6 C 3 F l ( 2 a n d / o r 4 W e e k s ) M i c e . E f n b 2 e n c o d e s a l i g a n d t h a t i s i n v o l v e d i n a n g i o g e n e s i s . T h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f t h i s g e n e i n C A R W T a n d B 6 C 3 F 1 m i c e a r e l i s t e d i n T a b l e 3 . S o l i d a r r o w s i n d i c a t e p o s i t i v e ( - O > ) r e g u l a t i o n , w h i l e l i n e s l a c k i n g a r r o w h e a d s ( - — — — ~ ) i n d i c a t e d i r e c t i n t e r a c t i o n s . T h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t a s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h a g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s ( 0 ) , l i g a n d s ( C ’ ) , a n d m e m b r a n e r e c e p t o r s ( ' 1 ' ) . 2 7 6 F g g g ' r e 4 . 1 4 C o m m o n T a r g e t s o f G e n e s I d e n t i f i e d f r o m I d e n t i c a l , U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s t h a t F o r m e d i n B o t h C 3 H / H e C A R W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r s ) a n d B 6 C 3 F l ( 2 a n d / o r 4 W e e k s ) M i c e . A n i n f o r m a t i c s a p p r o a c h w a s u t i l i z e d t o d i s c e r n t a r g e t s o f 2 o r m o r e g e n e s i d e n t i fi e d fi o m i d e n t i c a l , u n i q u e P B - i n d u c e d r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( * ) i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e C A R W T a n d B 6 C 3 F 1 m i c e . T h e a r r o w s p o i n t t o w a r d s t h e c o m m o n t a r g e t s ( n o a s t e r i s k s ) ; p o s i t i v e { — 9 ) a n d n e g a t i v e ( - - - 1 ) r e g u l a t i o n i s s h o w n . T h e s h a p e s r e p r e s e n t t h e s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h a g e n e b e l o n g s : l i g a n d s ( O ) , k i n a s e s ( C ‘ ) , a n d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( ’ . . ' ) . T a b l e 3 c o n t a i n s t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f E f n b 2 , T c f 4 , a n d T n k 2 i n C A R W T a n d B 6 C 3 F 1 m i c e . 2 7 7 F m r e 4 . 1 5 C o m m o n R e g u l a t o r o f G e n e s I d e n t i fi e d f r o m I d e n t i c a l , U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R A M s t h a t F o r m e d i n B o t h C 3 H / H e C A R W i l d t y p e ( P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r L i v e r T u m o r s ) a n d B 6 C 3 F ] ( 2 a n d / o r 4 W e e k s ) M i c e . A n i n f o r m a t i c s a p p r o a c h w a s u t i l i z e d t o d i s c e r n r e g u l a t o r s t h a t a f f e c t 2 o r m o r e g e n e s i d e n t i fi e d fi ' o m i d e n t i c a l , u n i q u e P B - i n d u c e d r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( * ) i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e C A R W T a n d B 6 C 3 F 1 m i c e . T h e a r r o w s p o i n t a w a y f r o m t h e c o m m o n r e g u l a t o r ( n o a s t e r i s k ) ; p o s i t i v e ( — ° - > ) r e g u l a t i o n i s s h o w n . T h e s h a p e s r e p r e s e n t a s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h a g e n e b e l o n g s : l i g a n d s ( ‘ 5 ’ ) , k i n a s e s ( C ‘ ) , a n d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( 5 . ‘ ) . T a b l e 3 c o n t a i n s t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f c h 4 a n d T n k 2 i n C A R W T a n d B 6 C 3 F 1 m i c e . 2 7 8 2 n ( i ] d F e 3 m r C o 6 F B t d a n h t a ) s T s M r o A m R u W R d T A C e r c e u v d i n L i - r ) o B / P ( d n a l r a e t v i i b L r a s b u o o n r e e h c P n e a c u e q r i P n ( U e , p l y a c t i d t l n i e d W I ) m R ) 6 8 2 M ( N T k 6 8 ) ) 9 6 2 2 3 M ( ( w 4 r o ° ) 9 ) 8 6 3 8 ( l ) 9 6 3 8 ( L , l l ) 7 7 5 M ( l o ) A k 6 r 2 0 C f w 2 7 H ( ( d e r fi o i t t p n e e c d e I R s e n n o a 2 N H ( i T o t ° i t M g s e o R r d e A r R 0 9 7 7 3 5 d - e — c n i A d e i n m 3 e s o 8 n e o C b o v n i e t G c A d e e z v i i t r ' u e t e 8 7 6 7 5 M t p p p i c c t i a s M r n a o ) h C c n e U H s k e e / 4 W H . 4 3 4 C r e l h o / b t d a o n T B a b b b 2 9 6 7 ) 7 7 ) ) 3 7 2 2 ( 3 5 ( ( - - - 1 8 5 7 7 7 2 3 5 2 7 9 C l o n e d s i z e o f u n c h a r a c t e r i z e d r e g i o n ( C h r o m o s o m e ) M e t h y l a t i o n S t a t u s b B G C 3 F 1 P r e c a n . T u m o r H 2 6 9 — 2 7 2 d T N ( H 2 7 2 ) M 2 7 0 — 2 7 2 d J , ( M 2 7 1 ) J , ( M 2 7 0 o r M 2 7 2 ) f 3 2 6 9 - 2 7 2 d T N ( 3 2 7 2 ) T N ( 3 2 7 2 ) 2 8 8 b p ( 9 ) M 2 8 6 3 2 4 b p ( 1 ) M 3 2 3 — 3 2 6 T N ( M 3 2 6 ) J , ( M 3 2 3 o r M 3 2 4 ) f 3 7 0 b p ( 5 ) 1 ( 8 3 6 8 , 3 3 6 9 ) o r T N ( 3 3 7 0 ) ° M 3 7 8 — 3 8 0 J , ( M 3 7 8 ) J , ( M 3 8 0 ) T ( M 5 7 7 ) 1 ( M 5 7 9 ) 2 n ( i l d F e 3 m r C o 6 F B t d a n h t a ) s s M r o A m R u d T e r c e u v d i n L i - r ) o B / P d n ( a l r a e t v i i b r L a s b u o o n r e e h c P n e a c u e q r i P n ( U e , p l y a c t i d t l n i e d W I ) m R o A r f C ( d e r fi o i t t p n e e c d e I R s e n n o a i t g s e o R r d c n i A m e o v n i e t G c A d e e z v i i t r l u e l t t i c t a s e c i M r n a o ) h C s c n e k U H e / e 4 W H . 4 3 4 C r e l h b t o / d a o n T B a 2 8 0 “ I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e m e t h y l a t i o n p a t t e r n s o f i d e n t i c a l u n c h a r a c t e r i z e d g e n o m i c r e g i o n s o b s e r v e d i n b o t h s t u d i e s w e r e a l t e r e d s i m i l a r l y o r d i f f e r e n t l y b y P B t r e a t m e n t , t m i q u e B 6 C 3 F ] R A M s i n d u c e d b y 2 a n d 4 w e e k s P B ( 0 . 0 5 % ( w / w ) ) , a n d u n i q u e R A M s i n C A R p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e r e p r e s e n t i n g t h e s e i d e n t i c a l r e g i o n s , w e r e c o m p a r e d . b l n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( h y p e r m e t h y l a t e d R A M s : t h o s e w h i c h a r e s i g n i fi c a n t , S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 , a n d n e w l y m e t h y l a t e d R A M s ) a r e c o l l e c t i v e l y r e p r e s e n t e d b y a n u p w a r d s a r r o w ( T ) . A s u p e r s c r i p t “ N ” d e p i c t s a n e w m e t h y l a t i o n ; h y p e r m e t h y l a t i o n s a r e u p w a r d s a r r o w s w h i c h r e m a i n u n l a b e l e d . D e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( h y p o m e t h y l a t e d R A M s , b o t h 1 0 0 % d e c r e a s e s , a n d t h o s e w h i c h a r e s i g n i fi c a n t , S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) a r e c o l l e c t i v e l y r e p r e s e n t e d b y a d o w n w a r d s a r r o w ( 1 ) . “ A u n i q u e R A M ( e . g . , M 2 8 6 ) i s l i s t e d a s a s i n g l e l e t t e r , w h i c h i n d i c a t e s t h e m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n z y m e ( B s s H I I , H p a l l o r M s p I ) u s e d , p l u s t h e s i z e ( s ) , i n b a s e p a i r s , o f t h e u n i q u e R A M s d e t e c t e d . I f m o r e t h a n 1 s i z e ( e . g . , H 2 6 9 - 2 7 2 ) i s l i s t e d , t h e s e r e p r e s e n t t h e s p a n o f t h e R A M s i z e s i n t h e B 6 C 3 F ] a n d C A R W T g r o u p s , a s n o t e d i n p a r e n t h e s e s i n t h e “ m e t h y l a t i o n s t a t u s ” c o l u m n . A d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f t h e r a t i o n a l e f o r c o n s i d e r i n g m u l t i p l e R A M s o f s i m i l a r s i z e s t o b e o n e R A M i s d e t a i l e d w i t h i n t h e M a t e r i a l s / M e t h o d s . “ S i n c e 3 d i f f e r e n t r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n s w e r e u t i l i z e d , m o r e t h a n 1 R A M m i g h t r e p r e s e n t a n u n c h a r a c t e r i z e d r e g i o n . T h e m e t h y l a t i o n s t a t u s i s a m b i g u o u s ( e . g . , i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 w e e k s , n e w l y m e t h y l a t e d H 2 6 9 o r h y p o m e t h y l a t e d H 2 7 0 c o u l d r e p r e s e n t t h e 2 7 1 - 2 7 2 b p u n c h a r a c t e r i z e d r e g i o n ) . f T h e u n c h a r a c t e r i z e d r e g i o n m i g h t b e r e p r e s e n t e d b y l o f 2 R A M s , w h i c h e x h i b i t t h e s a m e m e t h y l a t i o n s t a t u s ( e . g . , b o t h a r e d e c r e a s e s ) . C H A P T E R 5 T H E C O N S T I T U T I V E A C T I V E / A N D R O S T A N E R E C E P T O R ( C A R ) F A C I L I T A T E S U N I Q U E P H E N O B A R B I T A L ( P B ) - I N D U C E D E X P R E S S I O N C H A N G E S O F G E N E S I N V O L V E D I N K E Y P A T H W A Y S I N P R E C A N C E R O U S L I V E R A N D L I V E R T U M O R S T h i s c h a p t e r r e p r e s e n t s a m a n u s c r i p t t h a t w a s s u b m i t t e d i n M a r c h 2 0 0 9 t o T o x i c o l o g i c a l S c i e n c e s . T h e a u t h o r s a r e J e n n i f e r M . P h i l l i p s , L y l e D . B u r g o o n , a n d J a y I . G o o d m a n . 2 8 1 A B S T R A C T O u r o v e r a l l g o a l i s t o e l u c i d a t e p r o g r e s s i v e c h a n g e s , i n e x p r e s s i o n a n d m e t h y l a t i o n s t a t u s , o f g e n e s w h i c h p l a y k e y r o l e s i n p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s , w i t h a n e m p h a s i s o n t h e i r p o t e n t i a l t o a f f e c t s i g n a l i n g t h r o u g h c r i t i c a l p a t h w a y s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f c e l l g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n . P B - e l i c i t e d u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e s o f g e n e s , i n c l u d i n g s o m e o f t h o s e i d e n t i fi e d p r e v i o u s l y a s e x h i b i t i n g r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 3 ) , w e r e d i s c e r n e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s f r o m s u s c e p t i b l e c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) w i l d t y p e ( W T ) v . r e s i s t a n t C A R k n o c k o u t ( K O ) m i c e . M a n y o f t h e s e f u n c t i o n i n c r u c i a l c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s , e . g . , a n g i o g e n e s i s , a p o p t o s i s , c e l l c y c l e , D N A m e t h y l a t i o n , H e d g e h o g s i g n a l i n g , i n v a s i o n / m e t a s t a s i s , N o t c h s i g n a l i n g , a n d W n t s i g n a l i n g . F u r t h e r m o r e , a s u b s e t o f t h e u n i q u e l y a l t e r e d g e n e s c o n t a i n e d C A R r e s p o n s e e l e m e n t s ( C A R E S ) . T h i s i n c l u d e d G a d d 4 5 b , a c o a c t i v a t o r o f C A R a n d a p o p t o s i s i n h i b i t o r , a n d 2 D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s ( D n m t l , D n m t 3 a ) . T h e p r e s e n c e o f C A R E S i n D n m t s s u g g e s t s a p o t e n t i a l d i r e c t l i n k b e t w e e n P B a n d a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n . T h e c u r r e n t d a t a a r e j u x t a p o s e d w i t h t h e e f f e c t s o f P B o n D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n t h a t o c c u r r e d u n i q u e l y i n l i v e r t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , f o l l o w i n g 2 - o r 4 - w k o f t r e a t m e n t ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 a n d 2 0 0 9 b ) . C o l l e c t i v e l y , t h e s e d a t a r e v e a l a c o m p r e h e n s i v e v i e w o f P B - e l i c i t e d m o l e c u l a r a l t e r a t i o n s ( i . e . c h a n g e s i n g e n e e x p r e s s i o n a n d D N A m e t h y l a t i o n ) t h a t c a n f a c i l i t a t e h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . N o t a b l y , c a n d i d a t e g e n e s f o r i n i t i a l “ fi n g e r p r i n t s ” o f e a r l y a n d l a t e s t a g e s o f P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s a r e p r o p o s e d . 2 8 2 W E p i g e n e t i c a l t e r a t i o n s ( e . g . , D N A m e t h y l a t i o n ) , i n a d d i t i o n t o m u t a t i o n , p l a y c r u c i a l r o l e s d u r i n g t h e m u l t i s t e p / m u l t i s t a g e p r o c e s s o f t u m o r i g e n e s i s ( E s t e l l e r , 2 0 0 7 ; L o e b a n d H a r r i s , 2 0 0 8 ) . I n d e e d , b o t h h y p e r m e t h y l a t i o n a n d h y p o m e t h y l a t i o n a r e c r i t i c a l m e c h a n i s m s t h a t f a c i l i t a t e t u m o r d e v e l o p m e n t ( C o u n t s a n d G o o d m a n , 1 9 9 5 ; G r c n b a e k e t a l . , 2 0 0 7 ) . F u r t h e r m o r e , g e n e s w i t h d i v e r s e f u n c t i o n s ( e . g . , c e l l c y c l e c o n t r o l , d i f f e r e n t i a t i o n ) p a r t i c i p a t e i n s i g n a l i n g t h a t v a r i e s d r a m a t i c a l l y i n c a n c e r c e l l s , a s c o m p a r e d t o n o r m a l c e l l s ( W e i n s t e i n , 2 0 0 0 ) . F o r e x a m p l e , p h y s i o l o g i c a l d e p e n d e n c e u p o n ( i . e . a d d i c t i o n t o ) i n c r e a s e d l e v e l s a n d / o r a c t i v i t y o f S p e c i fi c g e n e s c a n b e e s s e n t i a l f o r l e a d i n g t o a n d m a i n t a i n i n g t h e t r a n s f o r m e d p h e n o t y p e ( W e i n s t e i n , 2 0 0 2 ) . U l t i m a t e l y , t h e p r o g r e s s i v e a c c u m u l a t i o n o f c h a n g e s r e s u l t s i n t h e a c q u i s i t i o n o f 6 m a j o r f e a t u r e s o f a t u m o r t h a t c o n t r o l i t s m a l i g n a n t g r o w t h ( H a n a h a n a n d W e i n b e r g , 2 0 0 0 ) . O u r o v e r a l l g o a l i s t o e l u c i d a t e p r o g r e s s i v e c h a n g e s , i n e x p r e s s i o n a n d m e t h y l a t i o n s t a t u s , o f g e n e s t h a t p l a y k e y r o l e s i n p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s , w i t h a n e m p h a s i s o n t h e i r p o t e n t i a l t o a f f e c t s i g n a l i n g t h r o u g h c r i t i c a l p a t h w a y s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f c e l l g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n . T r e a t m e n t w i t h a 0 . 0 5 % ( w / w ) p r o m o t i n g d o s e o f P B , a n o n g e n o t o x i c r o d e n t h e p a t o c a r c i n o g e n ( W h y s n e r e t a l . , 1 9 9 6 ) , c a u s e s l i v e r t u m o r s i n 1 0 0 % o f s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 a n d C 3 H / H e m i c e a fi e r 1 2 m o n t h s , b u t n o n e i n t h e r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e a f t e r 1 8 m o n t h s ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) . I n o r d e r t o s h e d l i g h t u p o n p o t e n t i a l m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s a t v e r y e a r l y t i m e s , w e p e r f o r m e d a n e x t e n s i v e m i c r o a r r a y a n a l y s i s o f R N A f r o m t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 a n d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e , t r e a t e d f o r 2 a n d 4 w e e k s w i t h P B , f o c u s i n g u p o n g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n w a s a l t e r e d u n i q u e l y i n t h e 2 8 3 s u s c e p t i b l e g r o u p ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 b ) . A s u b s e t o f t h e g e n e s c a n a f f e c t a n g i o g e n e s i s , t h e e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n , a n d i n v a s i o n / m e t a s t a s i s , p l u s t h e c e l l c y c l e a n d a p o p t o s i s , w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v a t i o n s t h a t P B s t i m u l a t e s p r o l i f e r a t i o n ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ; K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 a ) , a n d s u p p r e s s e s a p o p t o s i s ( K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 b ) . W e h y p o t h e s i z e t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e s e i n i t i a l c h a n g e s c o u l d i m p a r t s e l e c t i v e c l o n a l a d v a n t a g e s t o c e l l s . P B c a u s e s t h e f o r m a t i o n o f u n i q u e r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M S ) i n t h e s a m e l i v e r s o f t h e s e t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e v . t h e r e l a t i v e l y C 5 7 B L / 6 , a t 2 a n d 4 w e e k s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . A n n o t a t i o n o f t h e s e r e g i o n s u n c o v e r e d 5 1 g e n e s , m a n y o f w h i c h a r e i n v o l v e d i n c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) . T a k e n t o g e t h e r , o u r e x p r e s s i o n a n d m e t h y l a t i o n a n a l y s e s h a v e p r o v i d e d a m o r e c o m p r e h e n s i v e p i c t u r e o f u n i q u e P B - e l i c i t e d m o l e c u l a r a l t e r a t i o n s i n s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e w h i c h m i g h t f a c i l i t a t e h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s a s e a r l y a s 2 a n d 4 w e e k s . T h e c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) m e d i a t e s m a n y o f t h e e f f e c t s o f P B . H o w e v e r , m i c r o a r r a y a n a l y s i s o f C 3 H / H e C A R w i l d t y p e ( W T ) a n d k n o c k o u t ( K O ) m i c e r e v e a l e d t h a t o n l y a p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e P B - e l i c i t e d a l t e r a t i o n s i n g e n e e x p r e s s i o n o b s e r v e d w e r e d e p e n d e n t u p o n C A R , i n d i c a t i n g t h a t P B a l s o f u n c t i o n s t h r o u g h C A R - i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s ( U e d a e t a l . , 2 0 0 2 ) . I m p o r t a n t l y , C A R u p - r e g u l a t e s g r o w t h a r r e s t a n d D N A - d a m a g e - i n d u c i b l e 4 5 b e t a ( G A D D 4 5 B ) ( Y a m a m o t o a n d N e g i s h i , 2 0 0 8 ) , a g e n e w h i c h c a n i n h i b i t T N F - u / J N K - i n d u c e d a p o p t o s i s ( P a p a e t a l . , 2 0 0 4 ) . C A R i s r e q u i r e d f o r l i v e r t u m o r f o r m a t i o n e l i c i t e d b y P B ( H u a n g e t a l . , 2 0 0 5 ; Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . C 3 H / H e C A R W T m i c e , i n i t i a t e d w i t h d i e t h y l n i t r o s a m i n e 2 8 4 ( D E N ) , d e v e l o p p r e c a n c e r o u s l e s i o n s a f t e r 2 3 w e e k s o f P B p r o m o t i o n a n d t u m o r s a f t e r 3 2 w e e k s , w h i l e C A R K O m i c e d o n o t ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . P B a l s o i n d u c e s u n i q u e ' R A M S i n C A R W T m i c e ( p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ) , a s c o m p a r e d t o t h e C A R K O ( P h i l l i p s e t a l . , 2 0 0 7 ) . A n n o t a t i o n o f t h e r e g i o n s t h a t e x h i b i t e d t h e s e u n i q u e m e t h y l a t i o n c h a n g e s r e v e a l e d 4 7 g e n e s , m a n y o f w h i c h p a r t i c i p a t e i n c r u c i a l c a n c e r - a s s o c i a t e d p a t h w a y s ( e . g . , g r o w t h , a n g i o g e n e s i s , e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n ) ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 a ) . H e r e , w e h a v e e x p a n d e d u p o n o u r a s s e s s m e n t o f u n i q u e m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n C A R p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s b y e v a l u a t i n g t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s i d e n t i fi e d f r o m t h e s e R A M S , p l u s 3 D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s ( D n m t s ) . A d d i t i o n a l l y , a n e x t e n s i v e m i c r o a r r a y a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d u s i n g R N A i s o l a t e d f r o m t h e s a m e t i s s u e s o f t h e s u s c e p t i b l e C A R W T a n d r e s i s t a n t C A R K O m i c e , i n o r d e r t o d i s c e r n g e n e s , a s w e l l a s o v e r a r c h i n g c e l l u l a r p r o c e s s e s a n d s i g n a l i n g p a t h w a y s , t h a t w e r e p e r t u r b e d u n i q u e l y d u r i n g l a t e r s t a g e s o f P B - i n d u c e d t u m o r d e v e l o p m e n t . F i n a l l y , a s e a r c h f o r p u t a t i v e C A R r e s p o n s e e l e m e n t s ( C A R E S ) , a s u b s e t o f P B r e s p o n s e e l e m e n t s , w i t h i n g e n e s w h o s e m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n p a t t e r n s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n t h e C A R W T m i c e , i n c l u d i n g 3 D n m t g e n e s , w a s c a r r i e d o u t . T h e g e n e e x p r e s s i o n r e s u l t s p r e s e n t e d h e r e c o m p l e m e n t d a t a o b t a i n e d f r o m t h e a n n o t a t i o n o f g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M S i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s f r o m P B - t r e a t e d C A R W T m i c e ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 a ) , a s w e l l a s t h e e l u c i d a t i o n o f g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n a n d / o r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n P B - t r e a t e d s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e , a t 2 a n d / o r 4 w e e k s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ; P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 b ) . C o m b i n e d , t h e s e d a t a s e t s p r o v i d e i n s i g h t i n t o 2 8 5 p r o g r e s s i v e a l t e r a t i o n s o f g e n e s t h a t a r e i n v o l v e d i n S i g n a l i n g p a t h w a y s a n d c e l l u l a r p r o c e s s e s t h a t m i g h t f u n c t i o n t h r o u g h o u t a c o n t i n u u m o f P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s . S i g n i fi c a n t l y , c a n d i d a t e g e n e s f o r i n i t i a l “ fi n g e r p r i n t s ” o f e a r l y , a s w e l l a s l a t e , s t a g e s o f P B - i n d u c e d t u m o r f o r m a t i o n a r e p r o p o s e d , b a s e d u p o n t h e e x p r e s s i o n a n d m e t h y l a t i o n c h a n g e s o f g e n e s a s c e r t a i n e d i n t h e s e s t u d i e s . 2 8 6 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S A n i m a l s , T r e a t m e n t s a n d T i s s u e S a m p l e s T h e R N A e m p l o y e d f o r t h e s e s t u d i e s w a s i s o l a t e d f r o m t h e s a m e l i v e r s a m p l e s u s e d b y P h i l l i p s e t a l . ( 2 0 0 7 ) f o r a n a l y s i s o f D N A m e t h y l a t i o n . T h e s e l i v e r s w e r e o r i g i n a l l y p r o v i d e d b y Y a m a m o t o e t a l . ( 2 0 0 4 ) . C A R W T o r C A R K O m i c e , o n a C 3 H / H e b a c k g r o u n d ( w h i c h i s h i g h l y s u s c e p t i b l e t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s ( B u c h m a n n e t a l . , 1 9 9 1 ) ) , w e r e i n j e c t e d w i t h a s i n g l e i n t r a p e r i t o n e a l d o s e o f d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) , 9 0 m g / k g , a t 5 w e e k s o f a g e a n d t h e n a d m i n i s t e r e d d r i n k i n g w a t e r ( c o n t r o l ) o r 0 . 0 5 % P B ( w / w ) , a l i v e r t u m o r - p r o m o t i n g d o s e , i n d r i n k i n g w a t e r s t a r t i n g a t 7 w e e k s o f a g e a n d c o n t i n u i n g f o r 2 3 o r 3 2 w e e k s , r e s u l t i n g i n t h e f o l l o w i n g g r o u p s : C A R K O , 2 3 - w e e k c o n t r o l , C A R K O , 2 3 - w e e k P B , C A R W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l , C A R W T , 2 3 - w e e k P B ( p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ) , a n d C A R W T , 3 2 - w e e k P B ( i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ) ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . W h o l e l i v e r f r o m 4 o f t h e 5 ( n o t i n c l u d i n g t h e C A R W T , 3 2 - w e e k P B ) g r o u p s w a s u t i l i z e d ; t h e p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( C A R W T , 2 3 - w e e k P B ) c o n t a i n e d n o t u m o r s , h o w e v e r , b a s e d u p o n h i s t o l o g y o f a d j a c e n t t i s s u e , t h e r e a r e e x p e c t e d t o b e n u m e r o u s m i c r o s c o p i c f o c i o f c e l l u l a r a l t e r a t i o n d i f f u s e d t h r o u g h o u t t h e t i s s u e . I m p o r t a n t l y , R N A w a s i s o l a t e d fi o m i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s t h a t d e v e l o p e d i n t h e C A R W T , 3 2 - w e e k P B g r o u p . R N A I s o l a t i o n a n d P r e p a r a t i o n I n a d o u n c e h o m o g e n i z e r , f r o z e n l i v e r s a m p l e s w e r e h o m o g e n i z e d i n 1 m l T R I z o l ® R e a g e n t ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A ) p e r 1 0 0 m g t i s s u e . T o t a l R N A f r o m e a c h g r o u p ( N = 6 ) w a s i s o l a t e d v i a t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l a n d s t o r e d a t - 8 0 ° C u n t i l u s e . 2 8 7 U p o n r e m o v a l f r o m - 8 0 ° C , t h e R N A s a m p l e s w e r e p u r i fi e d w i t h t h e Q i a g e n R N e a s y M i n i K i t ( Q i a g e n , V a l e n c i a , C A ) a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l . S a m p l e s w e r e e l u t e d i n d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e ( D E P C ) - t r e a t e d w a t e r , a n d R N A i n t e g r i t y w a s e v a l u a t e d o n t h e A g i l e n t 2 1 0 0 B i o a n a l y z e r u s i n g 5 n g s a m p l e a l i q u o t s a n d t h e R N A 6 0 0 0 P i c o L a b - o n - a - C h i p ( A g i l e n t T e c h n o l o g i e s , S a n t a C l a r a , C A ) . T h e p r e s e n c e o f 2 d i s t i n c t p e a k s , r e p r e s e n t i n g 1 8 8 a n d 2 8 S r R N A l e v e l s , w e r e i n d i c a t i v e o f h i g h q u a l i t y s a m p l e s . D a t a f r o m t h e A g i l e n t B i o a n a l y z e r q u a l i t y c o n t r o l m e a s u r e r e v e a l e d t h a t 3 R N A s a m p l e s ( 1 C A R W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l m o u s e , 1 C A R K O 2 3 - w e e k c o n t r o l m o u s e , a n d 1 C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m o u s e ) w e r e d e g r a d e d , a n d t h e s e 3 s a m p l e s w e r e e x c l u d e d f r o m f u r t h e r a n a l y s i s . T h e p u r i t y ( A 2 6 0 / A 2 8 0 r a t i o s ) a n d c o n c e n t r a t i o n s o f t h e R N A s a m p l e s w e r e d e t e r m i n e d v i a t h e N a n o D r o p T M 8 0 0 0 s p e c t r o p h o t o m e t e r ( T h e r m o S c i e n t i fi c , W i l m i n g t o n , D E ) . M i c r o a r r a y A n a l y s i s A l l p r o c e d u r e s w e r e p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o s t a n d a r d p r o t o c o l s f o u n d w i t h i n t h e A f f y m e t r i x G e n e c h i p ® E x p r e s s i o n A n a l y s i s T e c h n i c a l M a n u a l ( A f f y m e t r i x , S a n t a C l a r a , C A ) . R N A L a b e l i n g a n d F r a g m e n t a t i o n T h e O n e - C y c l e T a r g e t L a b e l i n g a n d C o n t r o l R e a g e n t k i t ( A f f y m e t r i x , S a n t a C l a r a , C A ) w a s u t i l i z e d f o r fi r s t - a n d s e c o n d - s t r a n d c D N A s y n t h e s i s p l u s d o u b l e - s t r a n d e d c D N A s a m p l e c l e a n u p , a n d s y n t h e s i s p l u s c l e a n u p o f b i o t i n - l a b e l e d c R N A , o f 2 7 s a m p l e s ( N = 6 , f o r t h e W T , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d ( p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ) , a n d C A R 2 8 8 W T , 3 2 - w e e k P B - t r e a t e d ( i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ) g r o u p s , p l u s N = 5 f o r t h e W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l , K O , 2 3 - w e e k c o n t r o l , a n d K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p s ) . T o s t a r t , 1 u g o f t o t a l R N A w a s u s e d f o r t h e g e n e r a t i o n o f d o u b l e - s t r a n d e d c D N A . T h e c D N A w a s t h e n u s e d a s a t e m p l a t e f o r t h e s y n t h e s i s o f b i o t i n y l a t e d c R N A . T h e s i z e d i s t r i b u t i o n a n d y i e l d o f t h e l a b e l e d c R N A p r o d u c t s w e r e e v a l u a t e d o n t h e A g i l e n t 2 1 0 0 B i o a n a l y z e r u s i n g 5 n g s a m p l e a l i q u o t s a n d t h e R N A 6 0 0 0 P i c o L a b - o n - a — C h i p ( A g i l e n t T e c h n o l o g i e s , S a n t a C l a r a , C A ) . S u b s e q u e n t l y , 1 5 u g o f l a b e l e d c R N A w a s f r a g m e n t e d t o a r a n g e o f 3 5 - 2 0 0 b p i n a 4 0 u l v o l u m e r e a c t i o n ( 4 0 m M T r i s - a c e t a t e a t p H 8 . 1 , l O O m M p o t a s s i u m a c e t a t e , a n d 3 0 m M m a g n e s i u m a c e t a t e ) a t 9 4 ° C f o r 3 5 m i n . T h e s i z e d i s t r i b u t i o n o f t h e f r a g m e n t e d c R N A w a s a s s e s s e d o n t h e A g i l e n t 2 1 0 0 B i o a n a l y z e r u s i n g 5 n g s a m p l e a l i q u o t s a n d t h e R N A 6 0 0 0 P i c o L a b - o n - a - C h i p ( A g i l e n t T e c h n o l o g i e s , S a n t a C l a r a , C A ) . H y b r i d i z a t i o n , W a s h i n g , S t a i n i n g , a n d S c a n n i n g F i f t e e n p g o f f r a g m e n t e d c R N A w a s h y b r i d i z e d t o a G e n e C h i p ® M o u s e G e n o m e 4 3 0 2 . 0 A r r a y ( A f f y m e t r i x , S a n t a C l a r a , C A ) , c o n t a i n i n g m o r e t h a n 4 5 , 0 0 0 p r o b e s e t s r e p r e s e n t i n g o v e r 3 4 , 0 0 0 g e n e s . T h e i n s t r u m e n t a t i o n u t i l i z e d f o r t h e w a s h i n g a n d s c a n n i n g o f t h e c h i p s i s o p e r a t e d b y t h e G e n e C h i p ® O p e r a t i n g S o f t w a r e ( G C O S , A fi y m e u i x , S a n t a C l a r a , C A ) , v e r s i o n 3 . 1 . A f t e r h y b r i d i z a t i o n c o c k t a i l s w e r e r e m o v e d , a r r a y s w e r e w a s h e d a n d s t a i n e d o n a n A f f y m e t r i x F l u i d i c s 4 5 0 s t a t i o n , a n d s u b s e q u e n t l y s c a n n e d u s i n g t h e A f f y m e t r i x G e n e C h i p ® S c a n n e r 3 0 0 0 7 G , i n o r d e r t o d e t e c t h y b r i d i z a t i o n s i g n a l s . F r o m t h e r e s u l t i n g i m a g e fi l e s ( D A T fi l e ) , G C O S c o m p u t e s c e l l 2 8 9 i n t e n s i t y d a t a ( C E L fi l e ) , w h i c h i s f u r t h e r a n a l y z e d t o d e t e r m i n e d i f f e r e n t i a l g e n e e x p r e s s i o n p a t t e r n s . D a t a A n a l y s i s D a t a fi ' o m A f f y m e t r i x G e n e C h i p C E L fi l e s w e r e n o r m a l i z e d u s i n g G C R o b u s t M u l t i - a r r a y A v e r a g e ( G C R M A ) ( W u e t a l . , 2 0 0 4 ) . B o x p l o t s a n d P r i n c i p a l C o m p o n e n t s A n a l y s i s ( P C A ) w e r e e m p l o y e d t o a s s e s s d a t a q u a l i t y . A C D F fi l e e s t a b l i s h e d b y D a i e t a l . ( 2 0 0 5 ) , c o n t a i n i n g m o r e a c c u r a t e g e n e / t r a n s c r i p t d e fi n i t i o n s ( a s c o m p a r e d t o t h o s e f r o m A fi y m e t r i x ) b a s e d o n u p - t o - d a t e E n t r e z G e n e i n f o r m a t i o n , w a s u t i l i z e d ( M o u s e 4 3 0 , v e r s i o n 9 . 0 , f r o m ( h t t p : / / b r a i n a r r a y . m b n i . m e d . u m i c h . e d u / B r a i n a r r a y / D a t a b a s e / C u s t o m C D F / C D F _ d o w n l o a d _ v 9 . a s p ) . B a s e d u p o n t h e s e n e w p r o b e s e t d e fi n i t i o n s , d a t a w a s g e n e r a t e d f o r 1 6 , 4 7 5 g e n e s ( a s c o m p a r e d t o m o r e t h a n 4 5 , 0 0 0 f e a t u r e s r e p r e s e n t i n g o v e r 3 4 , 0 0 0 g e n e s , a s i n d i c a t e d b y A f f y r n e t n ' x ) . A l l s t a t i s t i c a l a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d i n R ( v 2 . 6 . 1 ) u s i n g B i o c o n d u c t o r ( 2 . 1 ) . I d e n t i f i c a t i o n o f U n i q u e l y A c t i v e G e n e s i n L i v e r T u m o r - S u s c e p t i b l e C A R W T M i c e , a s C o m p a r e d t o t h e R e s i s t a n t C A R K 0 A “ c o n s e n s u s ” l i s t o f C A R W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l g e n e s w a s c r e a t e d i n o r d e r t o f o c u s u p o n t h o s e t h a t d e m o n s t r a t e d a h i g h d e g r e e o f i n t e r n a l c o n s i s t e n c y o f e x p r e s s i o n w i t h i n t h e g r o u p . F o r e a c h g e n e , t h e 9 9 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l ( C I ) o f n o r m a l i z e d i n t e n s i t y v a l u e s o f t h e 5 s a m p l e s f r o m t h e C A R W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l g r o u p w a s c a l c u l a t e d . l f a t l e a s t 4 o u t o f t h e 5 s a m p l e s i n t h e c o n t r o l g r o u p e x h i b i t e d e x p r e s s i o n l e v e l s t h a t f e l l w i t h i n t h e 9 9 % C I , t h e s e g e n e s w e r e d e e m e d t o h a v e t h e p o t e n t i a l t o b e 2 9 0 d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d ( i . e . a c t i v e ) i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( v . W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l ) . I n t h i s f a s h i o n , t h e o r i g i n a l 1 6 , 4 7 5 g e n e s d e r i v e d f r o m t h e C D F fi l e ( f o r w h i c h e x p r e s s i o n d a t a w a s i n i t i a l l y g e n e r a t e d , s e e a b o v e ) , w a s r e d u c e d t o a p o o l o f 1 3 , 7 3 3 . F o r e a c h g e n e ( o u t o f t h e 1 3 , 7 3 3 ) , t h e a v e r a g e e x p r e s s i o n l e v e l i n t h e C A R W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l g r o u p w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e n o r m a l i z e d e x p r e s s i o n v a l u e s f r o m a l l 5 c o n t r o l s a m p l e s , a n d t h i s v a l u e w a s c o m p a r e d t o i t s e x p r e s s i o n l e v e l i n e a c h i n d i v i d u a l p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e s a m p l e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r . A g e n e w a s c o n s i d e r e d t o b e a c t i v e i n t h e p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( v . C A R W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l ) b a s e d u p o n m e e t i n g 2 c r i t e r i a : 1 ) a t l e a s t 3 , o f t h e 6 t o t a l , s a m p l e s i n e a c h P B - t r e a t e d g r o u p e x h i b i t e d e x p r e s s i o n l e v e l s t h a t f e l l o u t s i d e ( a l l a b o v e o r a l l b e l o w ) t h e 9 9 % C I o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a , a n d 2 ) i t e x h i b i t e d a 2 2 - f o l d c h a n g e i n e x p r e s s i o n ( u p - o r d o w n - r e g u l a t e d ) a s c o m p a r e d t o t h e a v e r a g e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e c o n t r o l g r o u p . T h e a v e r a g e e x p r e s s i o n l e v e l i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s w a s c a l c u l a t e d f o r e a c h a c t i v e g e n e . I n a n a n a l o g o u s f a s h i o n , a “ c o n s e n s u s ” l i s t o f C A R K O , 2 3 - w e e k c o n t r o l g r o u p g e n e s w a s c r e a t e d . F i r s t , f o r e a c h g e n e , t h e 9 9 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l ( C I ) o f n o r m a l i z e d i n t e n s i t y v a l u e s o f t h e 5 s a m p l e s f r o m t h e C A R K O , 2 3 - w e e k c o n t r o l g r o u p w a s c a l c u l a t e d . I f a t l e a s t 4 o u t o f t h e 5 s a m p l e s i n t h e c o n t r o l g r o u p e x h i b i t e d e x p r e s s i o n l e v e l s t h a t f e l l w i t h i n t h e 9 9 % C I , t h e s e g e n e s w e r e d e e m e d t o h a v e t h e p o t e n t i a l t o b e a c t i v e i n l i v e r t i s s u e f r o m t h e K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e ( v . K O , 2 3 - w e e k c o n t r o l ) . I n t h i s f a s h i o n , t h e o r i g i n a l 1 6 , 4 7 5 g e n e s d e r i v e d f r o m t h e C D F fi l e ( f o r w h i c h e x p r e s s i o n d a t a w a s i n i t i a l l y g e n e r a t e d , s e e a b o v e ) , w a s r e d u c e d t o a p o o l o f 1 2 , 2 6 4 . F o r e a c h g e n e ( o u t o f t h e 1 2 , 2 6 4 ) , t h e a v e r a g e e x p r e s s i o n l e v e l i n t h e C A R K O , 2 3 - w e e k c o n t r o l g r o u p 2 9 1 w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e n o r m a l i z e d e x p r e s s i o n v a l u e s f r o m a l l 5 c o n t r o l s a m p l e s , a n d t h i s v a l u e w a s c o m p a r e d t o i t s e x p r e s s i o n l e v e l i n e a c h l i v e r s a m p l e f r o m t h e K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p . A g e n e w a s c o n s i d e r e d t o b e a c t i v e i n t h e C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p b a s e d u p o n m e e t i n g 2 c r i t e r i a : 1 ) a t l e a s t 3 , o f t h e 5 t o t a l , s a m p l e s i n t h e P B - t r e a t e d g r o u p e x h i b i t e d e x p r e s s i o n l e v e l s t h a t f e l l o u t s i d e ( a l l a b o v e o r a l l b e l o w ) t h e 9 9 % C I o f t h e c o n t r o l g r o u p , a n d 2 ) i t e x h i b i t e d a 3 2 - f o l d c h a n g e i n e x p r e s s i o n ( u p - o r d o w n - r e g u l a t e d ) a s c o m p a r e d t o t h e a v e r a g e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e c o n t r o l g r o u p . T h e a v e r a g e e x p r e s s i o n l e v e l i n t h e C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p w a s c a l c u l a t e d f o r e a c h a c t i v e g e n e . O n c e t h e a c t i v e g e n e s i n t h e p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( v . C A R W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l ) , i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( v . C A R W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l ) , a n d C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d ( v . K O , 2 3 - w e e k c o n t r o l ) g r o u p s w e r e a s c e r t a i n e d , u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s a n d t u m o r t i s s u e , a s c o m p a r e d t o l i v e r t i s s u e f r o m t h e C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p , w e r e d i s c e r n e d . T h e a c t i v e g e n e s i n t h e p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d l i v e r t i s s u e f r o m t h e C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p w e r e c o m p a r e d t o o n e a n o t h e r , a n d s i m i l a r l y , a c t i v e g e n e s i n t h e i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s a n d C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p w e r e c o m p a r e d t o o n e a n o t h e r . I n o r d e r t o f o c u s o n m a j o r d i f f e r e n c e s , c o m m o n g e n e s o b s e r v e d i n b o t h t h e P B - t r e a t e d C A R W T ( p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ) a n d C A R K O g r o u p s t h a t e x h i b i t e d e x p r e s s i o n c h a n g e s i n t h e s a m e d i r e c t i o n ( i . e . i n d u c e d o r r e p r e s s e d i n b o t h ) w e r e n o t g i v e n f u r t h e r c o n s i d e r a t i o n . T h u s , t h e g e n e s c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e l y a c t i v e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , a s c o m p a r e d t o l i v e r t i s s u e f r o m C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d , i n c l u d e d : 1 ) c o m m o n a c t i v e g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n c h a n g e s w e r e o p p o s i t e ( e . g . , i n d u c t i o n i n t h e 2 9 2 p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , a n d r e p r e s s i o n i n l i v e r f r o m t h e C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p ) , a n d 2 ) g e n e s w h i c h w e r e a c t i v e o n l y i n t h e p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . I n a n a n a l o g o u s m a n n e r , u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n l i v e r t i s s u e f r o m t h e C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p , a s c o m p a r e d t o t h e p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , w e r e e l u c i d a t e d . F i n a l l y , t h e u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e w e r e c o m p a r e d t o t h o s e i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . G e n e s w h o s e e x p r e s s i o n w a s a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e , a s c o m p a r e d t o i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , i n c l u d e d : 1 ) t h o s e w h o s e e x p r e s s i o n c h a n g e s w e r e o p p o s i t e ( e . g . , i n d u c t i o n i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e , a n d r e p r e s s i o n i n t h e t u m o r s ) , a n d 2 ) t h o s e t h a t w e r e a c t i v e o n l y i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e . S i m i l a r l y , g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n w a s a l t e r e d u n i q u e l y i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , a s c o m p a r e d t o p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e , i n c l u d e d : 1 ) t h o s e w h o s e e x p r e s s i o n c h a n g e s w e r e o p p o s i t e ( e . g . , i n d u c t i o n i n t h e t u m o r s , a n d r e p r e s s i o n i n t h e p r e c a n c e r o u s t i s s u e ) , a n d 2 ) t h o s e t h a t w e r e a c t i v e o n l y i n t h e i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . F i n a l l y , u n i q u e l y a c t i v e “ c a r r y f o r w a r d ” g e n e s w e r e t h o s e w h o s e e x p r e s s i o n c h a n g e d i n t h e s a m e d i r e c t i o n i n b o t h p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . A d d i t i o n a l l y , i n o r d e r t o b e p r o g r e s s i v e l y m o r e s t r i n g e n t , c o r e g r o u p s o f u n i q u e l y a c t i v e g e n e s w e r e i d e n t i fi e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s b a s e d o n a t l e a s t 5 / 6 a n d 6 / 6 s a m p l e s e x h i b i t i n g e x p r e s s i o n l e v e l s o u t s i d e o f t h e 9 9 % C I o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a , i n a d d i t i o n t o b e i n g 2 2 - f o l d u p - o r d o w n - r e g u l a t e d . Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( g R T - P C R ) A n a fl s i s 2 9 3 E x p r e s s i o n l e v e l s o f 3 g r o u p s o f g e n e s w e r e i n v e s t i g a t e d v i a q R T - P C R : l ) a s u b s e t o f 2 2 g e n e s ( l i s t e d i n T a b l e 5 . 4 ) t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , i n c l u d i n g 4 u n i q u e l y a c t i v e c a r r y f o r w a r d g e n e s , 2 g e n e s t h a t w e r e a c t i v e i n b o t h p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s t h a t e x h i b i t e d o p p o s i t e e x p r e s s i o n c h a n g e s , a n d 1 6 g e n e s t h a t w e r e a c t i v e o n l y i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ; 2 ) a s u b s e t o f 1 6 g e n e s ( l i s t e d i n T a b l e 5 . 6 ) i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M S i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , a s c o m p a r e d t o 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d C A R K O m i c e , a s d i s c e r n e d b y P h i l l i p s a n d G o o d m a n ( 2 0 0 9 a ) ; a n d 3 ) 3 D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) g e n e s ( D n m t l , D n m t 3 a , D n m t 3 b ) . T h e g e n e s i n G r o u p s 1 a n d 3 , a b o v e , w e r e c h o s e n f o r a n a l y s i s b a s e d o n t h e i r i n t e r e s t i n g , p o t e n t i a l l y c a n c e r - r e l a t e d , d o c u m e n t e d f u n c t i o n s , a n d t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e y a f f e c t p e r t i n e n t s i g n a l i n g p a t h w a y s ( e . g . , t h e 3 g e n e s fi o m G r o u p 3 a r e i n v o l v e d i n e s t a b l i s h i n g D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s ) . T h e g e n e s i n G r o u p 2 c a n a l s o i n fl u e n c e k e y p a t h w a y s , a n d m a n y w e r e s e l e c t e d b e c a u s e t h e y e x h i b i t e d i d e n t i c a l P B - i n d u c e d R A M s i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e C A R W T a n d B 6 C 3 F 1 m i c e ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 a ) . R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n o f R N A R N A , f r o m t h e s a m e s a m p l e s u s e d f o r m i c r o a r r a y a n a l y s i s ( w i t h t h e e x c e p t i o n o f 1 t u m o r s a m p l e , f o r w h i c h t h e R N A w a s e n t i r e l y d e p l e t e d d u r i n g m i c r o a r r a y a n a l y s i s , a n d c o u l d n o t b e u t i l i z e d f o r q R T - P C R , t h u s t h e N o f t h e t u m o r s a m p l e s d e c r e a s e d fi ' o m 6 t o 5 ) , w e r e t r e a t e d w i t h a m p l i fi c a t i o n g r a d e D N A s e I e n z y m e ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A ) t o e l i m i n a t e c o n t a m i n a t i n g g e n o m i c D N A . E a c h r e a c t i o n , c o n t a i n i n g 1 u g o f R N A , 1 0 X D N a s e I R e a c t i o n B u f f e r , 2 U D N a s e I , a n d D E P C - t r e a t e d w a t e r ( A m b i o n I n c . , A u s t i n , 2 9 4 T X ) u p t o 1 0 u l , w a s i n c u b a t e d f o r 1 5 m i n . a t r o o m t e m p e r a t u r e . D N A s e I w a s i n a c t i v a t e d b y a d d i n g 1 u l o f 2 5 m M E D T A s o l u t i o n a n d s u b s e q u e n t l y h e a t i n g t h e r e a c t i o n s f o r 1 0 m i n . a t 6 5 ° C . R e v e r s e t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n s c o n t a i n i n g D N A s e I - t r e a t e d R N A w e r e p r e p a r e d w i t h r e a g e n t s f r o m t h e H i g h C a p a c i t y c D N A R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n K i t ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A ) . E a c h r e a c t i o n c o n t a i n e d 1 u g R N A , 1 0 X r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n b u f f e r , 2 5 X d N T P m i x ( 1 0 0 m M ) , 1 0 X r a n d o m p r i m e r s , 5 0 U M u l t i S c r i b e T M r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e , a n d R N A s e - fi ' e e w a t e r , u p t o 2 0 t o t a l u l . R e a c t i o n s w e r e i n c u b a t e d a t 2 5 ° C f o r 1 0 m i n . , 3 7 ° C f o r 1 2 0 m i n . , a n d 8 5 ° C f o r 5 3 . A l l s a m p l e s w e r e s t o r e d a t 4 ° C u n t i l n e e d e d . P r i m e r s f o r q R T - P C R P r i m e r s w e r e d e s i g n e d u s i n g t h e w e b - b a s e d P r i m e r 3 p r o g r a m , v . 0 . 4 . 0 ( h t t p : / / f r o d o . w i . m i t . e d u / p r i m e r 3 / i n p u t . h t m ) a n d s y n t h e s i z e d b y t h e M a c r o m o l e c u l a r S t r u c t u r e F a c i l i t y a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . T h e s i z e s o f t h e a m p l i c o n s r a n g e d fi ' o m 1 0 0 - 1 4 0 b p a n d t h e p r i m e r s w e r e 2 0 m e r s ; a l l o t h e r p a r a m e t e r s ( e . g . , m e l t i n g t e m p e r a t u r e ) r e m a i n e d o n t h e d e f a u l t s e t t i n g s . T h e m a j o r i t y o f p r i m e r s w e r e d e s i g n e d s u c h t h a t t h e a m p l i c o n s p a n n e d a n i n t r o n - e x o n j u n c t i o n n e a r t h e 3 ’ e n d o f t h e g e n e o f i n t e r e s t . T h i s w a s c o n fi r m e d u s i n g G e n B a n k s e q u e n c e i n f o r m a t i o n , a n d a l s o , i n m o s t i n s t a n c e s , t h e U C S C I n - S i l i c o P C R w e b - b a s e d t o o l ( J u l y 2 0 0 7 b u i l d , h t t p : / / g e n o m e . u c s c . e d u / c g i - b i n / t h c r ? c o m m a n d = s t a r t ) . T h i s w a s d o n e s o a s t o p r e c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e e x p r e s s i o n d a t a c o u l d b e a t t r i b u t e d t o c o n t a m i n a t i o n w i t h g e n o m i c D N A . F u r t h e r m o r e , w e a r e a t t e m p t i n g t o n o t s i m p l y c o n fi r m t h e m i c r o a r r a y d a t a b u t a r e e x t e n d i n g t h i s t o e v a l u a t e p r o p e r S p l i c i n g , i . e . t h i s r e p r e s e n t s a s t r i n g e n t a t t e m p t t o e v a l u a t e c h a n g e s i n 2 9 5 e x p r e s s i o n o f fi m c t i o n a l m R N A s . N a m e s a n d s y m b o l s , a c c e s s i o n n u m b e r s , f o r w a r d a n d r e v e r s e p r i m e r s e q u e n c e s o f g e n e s c h o s e n f o r q R T - P C R a n a l y s i s , p l u s a m p l i c o n s i z e s , a r e l i s t e d i n S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S l A ( s e l e c t e d g e n e s t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s ) a n d S I B ( s e l e c t e d g e n e s i d e n t i fi e d fi o m u n i q u e R A M s , p l u s 3 D n m t g e n e s ) i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t . q R T - P C R A s s a y s R e a c t i o n s w e r e p r e p a r e d w i t h P o w e r S Y B R ® G r e e n P C R M a s t e r M i x ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A ) , a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ’ s p r o t o c o l , w i t h e a c h r e a c t i o n c o n t a i n i n g 1 u l o f c D N A f r o m t h e a f o r e m e n t i o n e d r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n ( w i t h t h e e x c e p t i o n o f 1 8 8 r e a c t i o n s , w h i c h c o n t a i n e d 1 u l o f 1 : 1 0 0 d i l u t e d c D N A ) , 1 X P o w e r S Y B R ® G r e e n P C R M a s t e r M i x , 0 . 3 u M o f b o t h t h e f o r w a r d a n d r e v e r s e p r i m e r s ( w i t h t h e e x c e p t i o n o f D n m t 3 b , 0 . 1 u M ) , a n d D E P C - t r e a t e d w a t e r ( A m b i o n I n c . , A u s t i n , T X ) u p t o 5 0 [ . 1 1 . P C R a m p l i fi c a t i o n o f d u p l i c a t e r e a c t i o n s w a s c o n d u c t e d i n M i c r o A m p T M 9 6 - w e l l O p t i c a l P l a t e s ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A ) u s i n g t h e A p p l i e d B i o s y s t e m s 7 5 0 0 R e a l - T i m e P C R S y s t e m , w i t h t h e f o l l o w i n g t h e r m a l c y c l i n g ' c o n d i t i o n s : 5 0 ° C f o r 2 m i n . , 9 5 ° C f o r 1 0 m i n . , a n d 4 0 c y c l e s o f 9 5 ° C f o r 1 5 S p l u s 6 0 ° C f o r l m i n . A d i s s o c i a t i o n p r o t o c o l w a s r u n f o r e a c h p r i m e r p a i r t o e n s u r e t h a t a s i n g l e p r o d u c t f o r m e d , a n d a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f a m p l i fi e d p r o d u c t s w a s p e r f o r m e d t o v e r i f y a m p l i c o n s i z e . B e f o r e s a m p l e s w e r e a n a l y z e d , s t a n d a r d c u r v e s f o r e a c h g e n e w e r e g e n e r a t e d fi o m p u r i fi e d a m p l i c o n s . S t a n d e c u r v e s a m p l e s ( s p a n n i n g 1 0 2 t o 1 0 8 c o p i e s ) f o r a 2 9 6 p a r t i c u l a r g e n e w e r e i n c l u d e d o n t h e a p p r o p r i a t e s a m p l e p l a t e s o t h a t t h e a b s o l u t e q u a n t i t a t i o n m e t h o d , w h i c h c o m p a r e s t h e t h r e s h o l d c y c l e o f a n u n k n o w n s a m p l e a g a i n s t a s t a n d a r d c u r v e w i t h k n o w n c o p y n u m b e r s , c o u l d b e u s e d t o d e t e r m i n e m R N A e x p r e s s i o n l e v e l s . T h e c o p y n u m b e r o f t h e g e n e o f i n t e r e s t f o r e a c h s a m p l e w a s s t a n d a r d i z e d t o t h a t o f t h e 1 8 8 r R N A g e n e t o c o n t r o l f o r d i f f e r e n c e s i n R N A q u a n t i t y , q u a l i t y , a n d r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n e f fi c i e n c y . F i n a l l y , f o l d c h a n g e s i n t h e t r e a t m e n t g r o u p s ( v . c o n t r o l s ) , w e r e c a l c u l a t e d . T h e f o l l o w i n g c o m p a r i s o n s w e r e m a d e : 1 ) p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( N = 6 ) v . C A R W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l g r o u p ( N = 5 ) , 2 ) i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( N = 5 ) v . C A R W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l g r o u p , a n d 3 ) C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p ( N = 5 ) v . C A R K O , 2 3 - w e e k c o n t r o l g r o u p ( N = 5 ) . S t a t i s t i c a l o u t l i e r s w e r e e x c l u d e d f r o m t h e fi n a l f o l d c h a n g e c a l c u l a t i o n s f o l l o w i n g t h e i r i d e n t i fi c a t i o n b y t h e G r u b b s ’ t e s t ( p < 0 . 0 5 , h t t p : / / w w w . g r a p h p a d . c o m / q u i c k c a l c s / G r u b b s 1 . c fi n ) . S i g n i fi c a n c e w a s d e t e r m i n e d v i a a S t u d e n t ’ s t - t e s t ( p < 0 . 0 5 ) . A c h a n g e w a s c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( a s c o m p a r e d t o l i v e r t i s s u e f r o m t h e C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p ) i f : 1 ) i t w a s i n a n o p p o s i t e d i r e c t i o n , o r 2 ) i t c h a n g e d t o a g r e a t e r e x t e n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) . H o w e v e r , i n t h o s e c a s e s w h e r e t h e r e w a s n o t a s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t c h a n g e i n e x p r e s s i o n i n t h e t r e a t e d g r o u p , i f t h e e x p r e s s i o n ( e i t h e r u p o r d o w n ) o f t h e g e n e i n a t l e a s t 3 s a m p l e s w a s o u t s i d e o f t h e 9 5 % C I o f t h e c o n t r o l g r o u p , i t w a s c o n s i d e r e d t o S h o w a n ‘ i n d i c a t i o n o f a c h a n g e ’ i n e x p r e s s i o n . F u n c t i o n a l A n a l y s i s o f U n i g u e u A c t i v e G e n e s i n P r e c a n c e r o u s L i v e r T i s s u e a n d / o r I n d i v i d u a l L i v e r T u m o r s 2 9 7 T h e D a t a b a s e f o r A n n o t a t i o n , V i s u a l i z a t i o n a n d I n t e g r a t e d D i s c o v e r y ( D A V I D ) , v e r s i o n 6 ( D e n n i s e t a l . , 2 0 0 3 ; h t t p : / / d a v i d . a b c c . n c i f c r f . g o v / ) , w a s u t i l i z e d t o o b t a i n f u n c t i o n a l i n f o r m a t i o n a b o u t t h e u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . F u n c t i o n a l a n n o t a t i o n c l u s t e r i n g ( f o c u s e d o n G e n e O n t o l o g y t e r m s ) , o n e o f s e v e r a l D A V I D t o o l s a v a i l a b l e , g r o u p e d g e n e s i n t h e p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , s e p a r a t e l y , i n t o d i s t i n c t c a t e g o r i e s w h i c h w e r e b a s e d u p o n c e l l u l a r p r o c e s s e s ( e . g . , a n g i o g e n e s i s ) o r a c t i v i t y ( e . g . , o x i d o r e d u c t a s e a c t i v i t y ) . F u r t h e r m o r e , D A V I D w a s u s e d t o o v e r l a y t h e s e g e n e s o n t o p a t h w a y s f r o m t h e K y o t o E n c y c l o p e d i a o f G e n e s a n d G e n o m e s ( K E G G ) d a t a b a s e , t h u s e n h a n c i n g o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e s e d a t a . T h e P a t h w a y S t u d i o ® 6 . 0 i n f o r m a t i c s p r o g r a m ( A r i a d n e G e n o m i c s , R o c k v i l l e , M D ) w a s u s e d t o c o n fi r m s e l e c t e d i n f o r m a t i o n o b t a i n e d f r o m D A V I D ( e . g . , m u l t i p l e r e l a t i o n s h i p s d e p i c t e d i n F i g s . 5 . 2 - 5 . 5 a n d S u p p l e m e n t a r y F i g s . S 4 - S 1 4 ) , a n d t o d i s c e r n a d d i t i o n a l c o n n e c t i o n s b e t w e e n g e n e s a n d p a t h w a y s / p r o c e s s e s o f i n t e r e s t . I d e n t i fi c a t i o n o f C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r R e s p o n s e E l e m e n t s ( C A R E S ) C A R E S a r e a s u b s e t o f P B - r e s p o n s i v e e l e m e n t s ( P B R E M S ) s i n c e 1 ) C A R - i n d e p e n d e n t e f f e c t s o f P B h a v e b e e n o b s e r v e d ( U e d a e t a l . , 2 0 0 2 ) , a n d t h u s i t i s p r e s u m e d t h a t o t h e r c l a s s e s o f c i s e l e m e n t s m o d u l a t e t h o s e e f f e c t s , a n d 2 ) t h e r e m i g h t e x i s t e l e m e n t s w h i c h a r e n e c e s s a r y , b u t n o t s u f fi c i e n t , f o r t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n b y C A R . S e v e n b o n a fi d e c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r r e s p o n s e e l e m e n t s ( C A R E S ) w e r e i d e n t i fi e d f r o m t h e l i t e r a t u r e ( C h e n e t a l . , 2 0 0 3 ; G e r b a l - C h a l o i n e t a l . , 2 0 0 2 ; G o o d w i n e t 2 9 8 a l . , 2 0 0 2 ; H o n k a k o s k i e t a l . , 1 9 9 8 ; S u e y o s h i e t a l . , 1 9 9 9 ; S u g a t a n i e t a l . , 2 0 0 1 ) a n d u s e d t o c o n s t r u c t a p o s i t i o n w e i g h t m a t r i x ( P W M ) . T h e c r i t e r i a f o r b o n a fi d e C A R E S a r e t h a t t h e e l e m e n t s a r e f u n c t i o n a l i n a r e p o r t e r g e n e a s s a y a n d h a v e b e e n s h o w n t o b i n d t o C A R b y e i t h e r g e l s h i f t o r c h r o m a t i n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y s . A d d i t i o n a l l y , t h e r e h a d t o b e a m a t c h b e t w e e n t h e s e q u e n c e s o f t h e e l e m e n t s r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e a n d t h e m o s t r e c e n t b u i l d , i . e . c o m p i l a t i o n o f g e n o m e s e q u e n c e a n d a n n o t a t i o n d a t a a t a p a r t i c u l a r p o i n t i n t i m e , o f t h e h u m a n , m o u s e , o r r a t g e n o m e . T h e m a t r i x S i m i l a r i t y s c o r e t h r e s h o l d u s e d w a s 0 . 8 0 , i . e . t h e i d e n t i fi e d C A R E S w e r e a t l e a s t 8 0 % s i m i l a r t o t h e c o n s e n s u s c i s e l e m e n t . T h e s e a r c h f o r C A R E S w a s p e r f o r m e d w i t h i n g e n e s f r o m t h e 3 g r o u p s d e s c r i b e d a b o v e ( a s u b s e t o f u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s t h a t w e r e s e l e c t e d f o r c o n fi r m a t i o n b y q R T - P C R , a s u b s e t o f g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M S i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s w h o s e e x p r e s s i o n l e v e l s w e r e e v a l u a t e d b y q R T - P C R , a n d 3 D n m t g e n e s ) . P o t e n t i a l / p o s s i b l e r e g u l a t o r y r e g i o n s ( - 1 0 , 0 0 0 b p r e l a t i v e t o t h e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e t h r o u g h t h e 5 ’ - u n t r a n s l a t e d r e g i o n ) f o r t h e g e n e s s e l e c t e d f o r a n a l y s i s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e U C S C g e n o m e d a t a b a s e ( h t t p : / / g e n o m e . u c s c . e d u ) . T h e s e r e g u l a t o r y r e g i o n s w e r e a n a l y z e d u s i n g p r e v i o u s l y d e s c r i b e d m e t h o d s ( S u n e t a l . , 2 0 0 4 ) . 2 9 9 R E S U L T S T h e c o m p l e t e m i c r o a r r a y d a t a s e t i s p r e s e n t e d a s S u p p l e m e n t a r y T a b l e 8 2 A . G e n e r a l l y , m i c e w i t h i n a p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t a l g r o u p ( e . g . , p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ) e x h i b i t e d s i m i l a r e x p r e s s i o n p a t t e r n s ( F i g . 5 . 6 ) . T h e d i s t r i b u t i o n o f t h e s e d a t a a r e p o s i t i v e l y s k e w e d ( i . e . t o w a r d s z e r o ) , i n d i c a t i v e o f a g o o d m i c r o a r r a y e x p e r i m e n t , w h i l e s o m e o u t l y i n g d a t a p o i n t s f o r e a c h i n d i v i d u a l m o u s e w e r e o b s e r v e d ( F i g . 5 . 7 ) . F o r t h e C A R W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l a n d C A R K O , 2 3 - w e e k c o n t r o l m i c e , “ c o n s e n s u s ” g e n e l i s t s w e r e m a d e ( S u p p l e m e n t a r y T a b l e s 8 2 B a n d 8 2 C , r e s p e c t i v e l y , i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t ) a n d a c t i v e g e n e s i n t h e P B - t r e a t e d m i c e w e r e i d e n t i fi e d f r o m t h e m . P C A r e v e a l e d d i s t i n c t d i f f e r e n c e s i n g e n e e x p r e s s i o n p a t t e r n s , b a s e d u p o n t r e a t m e n t a n d s t r a i n ( F i g . 5 . 6 ) . I d e n t i fi c a t i o n o f U n i q u e l y A c t i v e G e n e s A c t i v e g e n e s i n t h e 3 P B - t r e a t e d g r o u p s , a s c o m p a r e d t o t h e i r r e s p e c t i v e c o n t r o l s ( p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e v . W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l ; i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s v . W T , 2 3 - w e e k c o n t r o l ; a n d K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d v . K O , 2 3 - w e e k c o n t r o l ) , w e r e d i s c e r n e d ( F i g . 5 . 1 ) . L i s t s o f t h e a c t i v e g e n e s r e p r e s e n t e d i n t h e V e n n d i a g r a m s ( F i g . 5 . 1 ) c a n b e f o u n d i n S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S 3 A - I i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t . P B t r e a t m e n t a l t e r e d t h e e x p r e s s i o n o f 1 1 6 a n d 1 9 g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d l i v e r t i s s u e f r o m C A R K O 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e , r e s p e c t i v e l y ( F i g . 5 . 1 ) . C o m p a r i s o n o f t h e s e a c t i v e g e n e s r e v e a l e d 3 t h a t e x h i b i t e d t h e s a m e d i r e c t i o n o f f o l d c h a n g e ( 2 i n d u c e d a n d l r e p r e s s e d ) i n b o t h g r o u p s , a n d t h e r e f o r e , t h e s e w e r e n o t c o n s i d e r e d f u r t h e r . T h u s , 1 1 3 g e n e s ( 8 8 i n d u c e d a n d 2 5 r e p r e s s e d ) w e r e u n i q u e l y a c t i v e 3 0 0 F r g p ’ [ e 5 . 1 I d e n t i fi c a t i o n o f U n i q u e l y A c t i v e G e n e s i n P r e c a n c e r o u s L i v e r T i s s u e a n d / o r I n d i v i d u a l L i v e r T u m o r s , a s C o m p a r e d t o L i v e r T i s s u e f r o m T u m o r - R e s i s t a n t C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) K n o c k o u t ( K O ) M i c e . M i c r o a r r a y a n a l y s i s w a s u t i l i z e d t o d i s c e r n g e n e s w h i c h w e r e d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d , i . e . , a c t i v e ( T , u p - r e g u l a t e d o r 1 , d o w n - r e g u l a t e d ) . A g e n e w a s c o n s i d e r e d t o b e a c t i v e b a s e d o n m e e t i n g 2 c r i t e r i a : 1 ) a t l e a s t 3 , o f t h e 5 o r 6 t o t a l , s a m p l e s i n e a c h P B - t r e a t e d g r o u p e x h i b i t e d e x p r e s s i o n l e v e l s t h a t f e l l o u t s i d e t h e 9 9 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l ( C I ) o f t h e n o r m a l i z e d i n t e n s i t y v a l u e s o f t h e r e s p e c t i v e c o n t r o l g r o u p , a n d 2 ) i t e x h i b i t e d a 2 2 — f o l d c h a n g e i n e x p r e s s i o n ( u p - o r d o w n - r e g u l a t e d ) a s c o m p a r e d t o t h e a v e r a g e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e c o n t r o l g r o u p . U n i q u e l y a c t i v e g e n e s ( A ) i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( P ) a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( T ) , a s c o m p a r e d t o l i v e r t i s s u e f r o m C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e , w e r e d i s c e r n e d b y e x c l u d i n g g e n e s t h a t e x h i b i t e d c h a n g e s w h i c h o c c u r r e d i n t h e s a m e d i r e c t i o n ( + ) . G e n e s t h a t e x h i b i t e d c h a n g e s i n o p p o s i t e d i r e c t i o n s , d e p i c t e d b y a s t e r i s k s ( * ) , w e r e c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e l y a c t i v e i n e a c h g r o u p . O f t h e 9 3 3 t o t a l u n i q u e l y a c t i v e g e n e s , 4 4 w e r e a l t e r e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e , 8 2 0 w e r e a l t e r e d i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , a n d 6 9 w e r e a l t e r e d i n t h e s a m e d i r e c t i o n i n b o t h t i s s u e s . G e n e l i s t s a r e f o u n d i n S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S 3 A - I i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t . A d d i t i o n a l l y , i n o r d e r t o b e p r o g r e s s i v e l y m o r e s t r i n g e n t , c o r e g r o u p s o f u n i q u e l y a c t i v e g e n e s w e r e i d e n t i fi e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s b a s e d o n a t l e a s t 5 / 6 a n d 6 / 6 s a m p l e s . 3 0 1 P r e c a n c e r o u s K O , 2 3 - w k P B T u m o r s K O , 2 3 - w k P B ( 1 9 ) C o m p a r e d u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d t u m m y 3 0 2 i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e . C o n v e r s e l y , 1 6 g e n e s ( 7 i n d u c e d a n d 9 r e p r e s s e d ) w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n l i v e r t i s s u e fi o m C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e , a s c o m p a r e d t o p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e . P B a l t e r e d t h e e x p r e s s i o n o f 8 9 1 g e n e s i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( F i g . 5 . 1 ) . W h e n t h e s e w e r e c o m p a r e d t o t h e 1 9 a c t i v e g e n e s i n C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e , 3 g e n e s w e r e i n c o m m o n ( F i g . 5 . 1 ) . T w o e x h i b i t e d f o l d c h a n g e s t h a t o c c u r r e d i n t h e s a m e d i r e c t i o n ( 1 i n d u c e d a n d 1 r e p r e s s e d ) i n b o t h g r o u p s , a n d t h e r e f o r e , w e r e n o t c o n s i d e r e d f u r t h e r . T h e t h i r d g e n e e x h i b i t e d o p p o s i t e c h a n g e s , a n d h e n c e , w a s c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e l y a c t i v e i n e a c h g r o u p . F u r t h e r m o r e , t h e e x p r e s s i o n o f 8 8 8 a n d 1 6 g e n e s w a s a l t e r e d i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , a n d l i v e r t i s s u e fi o m C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e , r e s p e c t i v e l y . T h u s , 8 8 9 u n i q u e l y a c t i v e g e n e s ( 5 8 9 i n d u c e d a n d 3 0 0 r e p r e s s e d ) w e r e d i s c e r n e d i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , w h i l e 1 7 ( 8 i n d u c e d a n d 9 r e p r e s s e d ) w e r e i d e n t i fi e d i n l i v e r t i s s u e f r o m C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e ( F i g . 5 . 1 ) . C o m p a r i s o n o f t h e 1 1 3 ( p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ) a n d 8 8 9 ( i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ) u n i q u e l y a c t i v e g e n e s r e v e a l e d 7 7 t h a t o v e r l a p p e d ( F i g . 5 . 1 ) . S i x t y g e n e s w e r e u p - r e g u l a t e d i n b o t h g r o u p s a n d 9 w e r e d o w n - r e g u l a t e d i n b o t h g r o u p s ( S u p p l e m e n t a r y T a b l e S 3 G ) , w h i l e 8 e x h i b i t e d o p p o s i t e e x p r e s s i o n c h a n g e s : 4 w e r e i n d u c e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d r e p r e s s e d i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , a n d 4 w e r e r e p r e s s e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d u c e d i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . T h e s e 8 g e n e s w e r e c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e l y a c t i v e i n e a c h g r o u p . I n s u m m a r y , 6 9 u n i q u e l y a c t i v e g e n e s c a r r i e d f o r w a r d ( i . e . w e r e i n d u c e d o r r e p r e s s e d i n b o t h g r o u p s ) , w h i l e 4 4 g e n e s w e r e 3 0 3 a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d 8 2 0 w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( F i g . 5 . 1 ) . I n t o t a l , P B e l i c i t e d u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e s o f 9 3 3 g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( F i g . 5 . 1 ) . T h e v a l i d i t y o f t h e s e m i c r o a r r a y d a t a i s s u b s t a n t i a t e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e e x p r e s s i o n o f P B - i n d u c e d g e n e s , e n c o d i n g d r u g - m e t a b o l i z i n g e n z y m e s a n d d r u g t r a n s p o r t e r s , w h o s e t r a n s c r i p t i o n i s m e d i a t e d b y C A R , e . g . , C y p 2 b 1 0 , P o r , A b c c 4 ( A s s e m e t a l . , 2 0 0 4 ; U e d a e t a l . , 2 0 0 2 ) , w a s u p - r e g u l a t e d i n t r e a t e d C A R W T , b u t n o t K O m i c e . A d d i t i o n a l P B - i n d u c i b l e d r u g - m e t a b o l i z i n g e n z y m e s , e . g . , C y p 2 b 9 a n d C y p 2 b 1 3 ( N e m o t o a n d S a k u r a i , 1 9 9 5 ; S t u p a n s e t a l . , 1 9 8 4 ) w e r e a l s o u p - r e g u l a t e d o n l y i n C A R W T m i c e . I m p o r t a n t l y , a s w o u l d b e e x p e c t e d , a l l o f t h e s e g e n e s c o m p r i s e d a s u b s e t o f t h e 6 9 u n i q u e l y a c t i v e c a r r y f o r w a r d g e n e s . V e n n d i a g r a m s , s h o w i n g t h e n u m b e r s o f g e n e s t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , b a s e d o n a t l e a s t 5 / 6 a n d 6 / 6 s a m p l e s e x h i b i t i n g e x p r e s s i o n l e v e l s o u t s i d e o f t h e 9 9 % C I o f t h e n o r m a l i z e d i n t e n s i t y v a l u e s o f t h e c o n t r o l g r o u p , i n a d d i t i o n t o b e i n g 2 2 - f o l d u p - o r d o w n - r e g u l a t e d , a r e l o c a t e d i n F i g u r e 5 . 8 , a n d g e n e s a r e l i s t e d i n S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S 4 A - J i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t . G e n e s t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n a t l e a s t 5 / 6 p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e s a m p l e s a n d 5 / 6 i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , 5 1 a n d 3 8 5 , r e s p e c t i v e l y , w e r e i d e n t i fi e d ( F i g . 5 . 8 ) a n d a r e l i s t e d i n S u p p l e m e n t a r y T a b l e s 8 4 A a n d S 4 3 . C o m p a r i s o n o f t h e s e g e n e s r e v e a l e d 4 0 2 t o t a l a c t i v e g e n e s : 3 4 c a r r i e d f o r w a r d , w h i l e 1 7 w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d 3 5 1 w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . G e n e s t h a t w e r e a c t i v e i n a l l 6 o f t h e p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e s a m p l e s a n d a l l 6 o f i n d i v i d u a l t u m o r s , 3 5 a n d 9 4 , r e s p e c t i v e l y , w e r e i d e n t i fi e d ( F i g . 5 . 8 ) a n d a r e l i s t e d i n 3 0 4 S u p p l e m e n t a r y T a b l e s 3 4 F a n d S 4 G . C o m p a r i s o n o f t h e s e g e n e s r e v e a l e d 1 0 6 t o t a l a c t i v e g e n e s : 2 3 c a r r i e d f o r w a r d , w h i l e 1 2 w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e , a n d 7 1 w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . F u n c t i o n a l a n n o t a t i o n a n d p a t h w a y a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d o n a l l 9 3 3 a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , b a s e d o n a t l e a s t 3 / 6 t o t a l s a m p l e s f r o m P B - t r e a t e d m i c e e x h i b i t i n g a c h a n g e . A d d i t i o n a l l y , g e n e s t h a t w e r e a c t i v e i n 5 / 6 t o t a l s a m p l e s a r e n o t e d i n t h e p a t h w a y s ( F i g s . 5 . 2 - 5 . 5 a n d S u p p l e m e n t a r y F i g s . S 4 - S l 4 i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t ) . T w e n t y - t w o o f t h e 9 3 3 u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i d e n t i fi e d b y m i c r o a r r a y a n a l y s i s i n t h e p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s w e r e s e l e c t e d f o r c o n fi r m a t i o n o f t h e i r e x p r e s s i o n s t a t u s e s b y q R T - P C R ( T a b l e 5 . 4 ) . T h e e x p r e s s i o n s t a t u s e s o f 4 c a r r y f o r w a r d g e n e s w e r e c o n fi r m e d . T w o g e n e s t h a t e x h i b i t e d c h a n g e s i n o p p o s i t e d i r e c t i o n s i n t h e p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s w e r e e v a l u a t e d . T h e e x p r e s s i o n o f t h I w a s c o n fi r m e d o n l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e , a n d t h a t o f F g f 2 1 w a s c o n fi r m e d o n l y i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . H o w e v e r , F 3 1 2 1 e x h i b i t e d a s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( v . i t s c o n t r o l ) . O f 1 6 g e n e s t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e o n l y i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , a l l o f t h e i r e x p r e s s i o n s t a t u s e s w e r e c o n fi r m e d . W h i l e n o n e o f t h e s e w a s i d e n t i fi e d a s b e i n g u n i q u e l y a c t i v e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s , u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e s w e r e d e t e c t e d b y q R T - P C R f o r 4 o f t h e m ( B m p 8 b , G a d d 4 5 b , M d m 2 , T g b r 2 ) , a n d 2 g e n e s ( M a p k 3 a n d P d g f a ) e x h i b i t e d i n d i c a t i o n s o f u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e s ( T a b l e 5 . 4 ) . F u n c t i o n a l A n a l y s i s o f U n i q u e l y A c t i v e G e n e s 3 0 5 F u n c t i o n a l a n n o t a t i o n c l u s t e r i n g b y D A V I D s e g r e g a t e d t h e 9 3 3 t o t a l u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s i n t o g r o u p s b a s e d o n c o m m o n b i o l o g i c a l p r o c e s s e s a n d m o l e c u l a r f u n c t i o n s ( s e l e c t e d e x a m p l e s i n S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S 6 A - S i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t ) . N u m e r o u s u n i q u e l y a c t i v e g e n e s p a r t i c i p a t e i n k e y c e l l u l a r p r o c e s s e s a n d s i g n a l i n g p a t h w a y s t h a t c a n i n fl u e n c e t u m o r d e v e l o p m e n t . T h e g e n e s a r e d e p i c t e d i n p a t h w a y s / p r o c e s s e s i n F i g u r e s 5 . 2 - 5 . 5 a n d i n S u p p l e m e n t a r y I n f o r m a t i o n ( F i g s . S 4 - S l 4 i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t ) . P B a l t e r e d t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s t h a t c a n p o s i t i v e l y o r n e g a t i v e l y r e g u l a t e c e l l c y c l e p r o g r e s s i o n ( e . g . , C d c 2 a , C c n d I , G a d d 4 5 a , G a d d 4 5 b , G m n n , M d m 2 , W e e I ) ( F i g . 5 . 2 ) . A d d i t i o n a l g e n e s d e m o n s t r a t e c o n n e c t i o n s t o t h e c e l l c y c l e a n d g r o w t h ( S u p p l e m e n t a r y F i g . S 4 ) . T h e i n d u c t i o n a n d r e p r e s s i o n o f g e n e s i n v o l v e d i n a p o p t o s i s ( e . g . , C a s p I , G a d d 4 5 a , G a d d 4 5 b , G a s ] , M y c , a n d p 2 1 ) w a s o b s e r v e d ( F i g . 5 . 2 ; S u p p l e m e n t a r y F i g . S S ) F u r t h e r m o r e , g e n e s l i n k e d t o M A P K s i g n a l i n g w e r e a l t e r e d ( F i g . 5 . 2 ; S u p p l e m e n t a r y F i g . S 6 ) . N o t a b l y , M a p k 3 ( a l s o k n o w n a s E r k l ) w a s i n d u c e d . G r o w t h f a c t o r s w h i c h a r e k n o w n t o s t i m u l a t e M A P K c a s c a d e s ( e . g . , F g f 2 1 a n d P d g f a ) , a s w e l l a s d o w n s t r e a m t a r g e t s o f M A P K a c t i v a t i o n ( e . g . , D d i t 3 , J u n , M k n k Z , M y c ) , w e r e a l s o a f f e c t e d . F i g u r e 5 . 3 d e p i c t s u n i q u e l y a c t i v e g e n e s t h a t a r e i n v o l v e d i n m u l t i p l e c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s : a n g i o g e n e s i s ( e . g . , A n g p t l 6 , C x c r 7 , C y r 6 1 , E s a m I , P d g f a ) , c y t o s k e l e t o n o r g a n i z a t i o n / d y n a m i c s ( e . g . , D i a p 2 , F 2 r , G n a 1 2 , R r a s , R o c k 2 ) , a n d c e l l - t o - c e l l o r c e l l - t o - m a t r i x a d h e s i o n ( C d 3 6 , C d 4 4 , t h l , [ c a m ] , L m o 7 ) . A d d i t i o n a l g e n e s t h a t c o n t r i b u t e t o t h e s e 3 p r o c e s s e s a r e i l l u s t r a t e d i n S u p p l e m e n t a r y F i g u r e s 8 7 - 8 9 . 3 0 6 d t . e f e d l n , o t e i a e d f a m h v n r e o n o v w r i s l g c v l r o e e t e l i o i e e t i o e e e t r t f a t n , s h a l c c e r a d . e d - I ' e f l i l f l ) e a e ) y t c n . - e s p h o i a d n h - a g - 3 - t b t n - n i t u n y e a . d d i l - - ' - e e o m o o s i ( y n ( s m o e d h ' g l s i R h a t s k t v n n o p t h C i t t s e v d w a a i a s e s r t x a r e e m e s r ) P n i c e o i e t e t t w c i i l e i - n t M t e M n p e i n i e s h p h o h T r s d n s i h d a ) w r c o o h e e w a § w g t c d R c i e ( e ( t / P d o w n q n d , a n h s n r d t s u a i ) d ] e . a n i w c a r * s , i e . t e d l n T ( s t s p ) e a r n e K n i k l e t i o s y i b m e g u s n i A d l d s r n a i a d g n c r s c o r e n o a r t c h d u e . n i i e i e y s b p s m s t t l a l t h s t u l n s i u l a fi g e e o y e i e e t e n e y r s n o s c r p a d n M u i r e o e m l a a m m i v a l d m A r a n n f s t i b e ) q o r s d o a a c u l c d T i i , u e s i n a r e e n e s , s k u s s t r s o o r o ( s y t a s l ) c i e u c a d T , n a r m e i b t h i P e t r o c l ( u ) y C i e t t g ( m c l p a r d l e x e e t e M s n e R s t n b : r e w c t c f l i u i a r u e l h o s s s ( . v e a o C t n fi e m i c e u I o P s n a e i i c s c e b e s C — u u l p q - p d n e a t h r e s t G e p o r l T i s t o w o t s 3 s a e n n h S i p r R i n c t s i i S u n e u o h e T v d i r s i q n e T s a f n i i h i s a i e e t 6 l d y i v r e d S r h n c h t o l e p e - t l i e ) . t t b o d s b d g e m a n n a M n i , e 4 x n l n i t v T u d a u n e i l s a e o A R S p o e i o s i i l R i e C T t r 6 h t v c e . y h o v v i / p ( P e s c u r a c r w l d s r 5 q o g p m - n n p i e i n , r I R a n t o r o F T n a r d r n a a n s i a o i o n i R r s e / t t i y , u r o C f s s t n r o ) q d P t r l a a e m u n ( o m o e i e - , l t n i a n 2 c / u f o a e d t d T o l y o d i t d t ) r B r n h n p s e n G R o r d A e n t e O a p e N e t e f ( u v c m q ) i s l a F m . e e o n f i d S p l P ) t a h s E i l e l o e f e a s ( a m u * t ; b e c * 1 a ’ g s c l t A p e c e ( p f s e s i s e e a e e N a s u u s r . r g m l s n k o d u u P i - k s e n i s d S D g n r n t e i i i i a F d n i n l t k s s v e a t ( i p n h e n v i t ‘ i w i i t r l o S a c r , o r t a d e d h s i d w e s n t d e o n t s e i s S v e t n n e ) i t l o n u e , o a r O ) a s i e r u w e l o s e , T n i a c e g ( R f i i h s 2 ( t s t e a n p t s a C u n e o l e c d s c y e r e e l e v n A e P d o o e G n r b i y a t b r i - h o p d d n n h t i x e e t c a t e d a a t f ) e g r e l c g d e c T . a r e e u d r i e A n u a e R t i l a , M w g a g q e y p e r g d ( n l c e u s e u t n , e d 6 r l y e l e e q i s ) a r g e o u n r / e r — m c b l s i e 5 n r p i a - t r u / q p i p s c n 0 s u i d t i p n d n i u l t u u u s e l t g e n s r s i l a a a s ( i d n e n i m u n e t s a e s i s g s r r i l i u d a s n o e i 3 h e w n t t d K B fi - i i o S 3 r e t n n B e a P i r P o 9 e g t o P e e i n , i n s ) n m g b o o o c o n s i f c i i t r n e a A r i s e K s o , h t p a u e s v fi e s h e a s M x P r s a e i n c l i v e n c q r p n o w A t o i e i d a r s u c n i t l y n r , n g x M p o E ( a a i a l a ) t c o u c x e p l p u 4 a e y s g E t s , n a e l n r o r e e n e h e l ) e a o s s h n e s i e t m c r a . r i e T a n q T a s p r u ) o n e n r 1 h s y a s t a i c p w i r o n t r — e a i t 2 i h r t d n n r n l p r f x x o e ( e . a p K a u e C o a o o d 5 r x h n P o e i i ( p e e : n y e t o ( r fi s s e a u s v e i f t s i i s s c r e i l s q , i g e r t t e e I i t n p t t e u a i e o n g l s n c n r r m a o g n o m n p p e t g l e c s ' y e r u x x d u o d y e e i n u F i F G i P e e a c t n b n b F t 3 0 7 3 0 8 3 0 9 F i g p r e 5 . 3 T h e E x p r e s s i o n a n d / o r M e t h y l a t i o n S t a t u s e s o f G e n e s I n v o l v e d i n A n g i o g e n e s i s , C y t o s k e l e t o n O r g a n i z a t i o n / D y n a m i c s , a n d A d h e s i o n w e r e A l t e r e d i n P r e c a n c e r o u s a n d T u m o r T i s s u e . M i c r o a r r a y a n a l y s i s w a s e m p l o y e d t o i d e n t i f y u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( P ) a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( T ) , a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s . F u n c t i o n a l a n n o t a t i o n o f 9 3 3 u n i q u e l y a c t i v e g e n e s ( F i g . 1 ; S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S B G - I i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t ) w a s p e r f o r m e d . G e n e s t h a t w e r e a c t i v e i n a t l e a s t 5 / 6 p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e s a m p l e s a n d / o r 5 / 6 i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s a r e d e n o t e d ( § ) n e x t t o t h e r e l e v a n t t i s s u e ( P o r T ) . E x p r e s s i o n w a s u p - r e g u l a t e d ( T ) , d o w n - r e g u l a t e d ( l ) , o r c h a n g e d i n o p p o s i t e d i r e c t i o n s . T h e t i s s u e ( P o r T ) i s u n d e r l i n e d o n e t i m e i f t h e e x p r e s s i o n c h a n g e w a s c o n fi r m e d b y q R T - P C R o r t h r e e t i m e s i f t h e r e w a s a n i n d i c a t i o n o f a u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e ( s e e M e t h o d s ) . q R T - P C R a n a l y s i s o f t h 1 c o n fi r m e d i t s u p - r e g u l a t i o n i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e , b u t n o t i t s d o w n - r e g u l a t i o n i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( 7 5 ) . G e n e s n o t s e l e c t e d f o r c o n fi r m a t i o n b y q R T - P C R l a c k u n d e r l i n i n g a n d a s t e r i s k s . I f a g e n e , i d e n t i fi e d f r o m a u n i q u e P B - i n d u c e d r e g i o n o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M ) i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( C h a p t e r 4 ) , e x h i b i t e d a u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e b a s e d o n q R T - P C R , t h i s i s d e n o t e d b y a n a s t e r i s k ( * ) , w h i l e a n i n d i c a t i o n o f a u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e i s r e p r e s e n t e d b y 2 a s t e r i s k s C ” ) . A n v a ( 0 0 ) w a s u n i q u e l y a c t i v e i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( S u p p l e m e n t a r y T a b l e S 3 1 i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t ) a n d e x h i b i t e d a u n i q u e R A M . A d d i t i o n a l c o n n e c t i o n s b e t w e e n u n i q u e l y a l t e r e d g e n e s a n d a n g i o g e n e s i s , c y t o s k e l e t o n o r g a n i z a t i o n / d y n a m i c s , a n d a d h e s i o n a r e d e p i c t e d i n S u p p l e m e n t a r y F i g s . 8 7 - 8 9 i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t . P o s i t i v e ( - - - - - - - - a » ) o r n e g a t i v e ( — 1 ) r e g u l a t i o n i s i l l u s t r a t e d , a n d t h e s h a p e s o f t h e e n t i t i e s r e p r e s e n t t h e s p e c i fi c c l a s s o f m o l e c u l e s t o w h i c h t h e g e n e b e l o n g s : e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s ( 0 ) , l i g a n d s ( O ) , k i n a s e s ( C “ ) , a n d m e m b r a n e r e c e p t o r s ( ( 3 ) 3 1 0 S i g n i fi c a n t l y , g e n e s i n v o l v e d i n 5 m a j o r d e v e l o p m e n t a l p a t h w a y s ( e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n , E M T ; H e d g e h o g ; N o t c h ; t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - b e t a , T G F - B , a n d W n t ) w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( F i g . 5 . 4 ; S u p p l e m e n t a r y F i g s . S l O - S l 4 ) . A d d i t i o n a l l y , u n i q u e l y a c t i v e k i n a s e , p h o s p h a t a s e a n d p h o s p h a t a s e r e g u l a t o r y ( i n h i b i t o r ) s u b u n i t g e n e s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 5 . 5 . E x p r e s s i o n o f D N A M e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) G e n e s E x p r e s s i o n d a t a o f D n m t ] , D n m t 3 a a n d D n m t 3 b a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 5 . 1 . T h e r e w a s a 2 - f o l d i n c r e a s e i n t h e e x p r e s s i o n o f D n m t ] i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . T h o u g h n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t , t h e r e w a s a n i n d i c a t i o n o f u p - r e g u l a t i o n o f D n m t ] e x p r e s s i o n i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n l i v e r t i s s u e f r o m C A R K O , 2 3 - w k P B - t r e a t e d m i c e , a s e v i d e n c e d b y 3 / 6 t o t a l s a m p l e s i n t h e p r e c a n c e r o u s g r o u p , a n d 3 / 5 t o t a l s a m p l e s i n t h e C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p e x h i b i t i n g e x p r e s s i o n l e v e l s t h a t f e l l a b o v e t h e 9 5 % C I o f t h e i r r e s p e c t i v e c o n t r o l g r o u p d a t a . T h e e x p r e s s i o n o f D n m t 3 a w a s i n c r e a s e d i n b o t h p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( 1 . 2 7 - f o l d ) a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( 2 2 9 - f o l d ) , w h i l e t h e r e w a s n o e x p r e s s i o n c h a n g e i n t h e C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d g r o u p . T h e e x p r e s s i o n o f D n m t 3 b w a s n o t a l t e r e d . E x p r e s s i o n o f G e n e s I d e n t i f i e d f r o m U n i q u e P B - I n d u c e d R A M s I n a d d i t i o n t o e v a l u a t i n g t h e e f f e c t s o f P B o n g l o b a l g e n e e x p r e s s i o n , w e w e r e a l s o i n t e r e s t e d i n a s s e s s i n g t h e e x p r e s s i o n o f a s u b s e t o f g e n e s p r e v i o u s l y s h o w n t o e x h i b i t u n i q u e P B - i n d u c e d R A M S i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r 3 1 1 , ) “ C ( s e s a n i k , ) 0 ( s d n a g i l , ) 0 ( s n i e t o r p r a l u l l e c a r t x e : s g n o l e b e n e g e h t . ) h c 3 i ( h ( w s o r t o t s p e e l c u e c r e l e o n m a f r o b s m s e a m l c d c n fi a i , c ) e 1 p £ s ( e h s t r o t t n c e a s f e n r o p i e t r p s e i r i c t s i n t a n r e t 3 1 2 F ' g p r e 5 . 4 T h e E x p r e s s i o n a n d / o r M e t h y l a t i o n S t a t u s e s o f G e n e s I n v o l v e d i n P a t h w a y s A s s o c i a t e d w i t h D e v e l o p m e n t a n d D i f f e r e n t i a t i o n w e r e A l t e r e d i n P r e c a n c e r o u s a n d T u m o r T i s s u e . M i c r o a r r a y a n a l y s i s w a s e m p l o y e d t o i d e n t i f y u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( P ) a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( T ) , a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s . F u n c t i o n a l a n n o t a t i o n o f 9 3 3 u n i q u e l y a c t i v e g e n e s ( F i g . 1 ; S u p p l e m e n t a r y T a b l e s S 3 G - l i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t ) w a s p e r f o r m e d . G e n e s t h a t w e r e a c t i v e i n a t l e a s t 5 / 6 p r e c a n c e r o u s l i v e r s a m p l e s a n d / o r 5 / 6 i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s a r e d e n o t e d ( § ) n e x t t o t h e r e l e v a n t t i s s u e ( P o r T ) . E x p r e s s i o n w a s u p - r e g u l a t e d ( T ) , d o w n - r e g u l a t e d ( l ) , o r c h a n g e d i n o p p o s i t e d i r e c t i o n s . T h e t i s s u e ( P o r T ) i s u n d e r l i n e d o n e t i m e i f t h e e x p r e s s i o n c h a n g e w a s c o n fi r m e d b y q R T - P C R , t w o t i m e s i f q R T - P C R r e v e a l e d a u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e w h i c h w a s n o t d e t e c t e d b y m i c r o a r r a y a n a l y s i s , o r t h r e e t i m e s i f t h e r e w a s a n i n d i c a t i o n o f a u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e ( s e e M e t h o d s ) . T h e r e w a s a n i n d i c a t i o n o f u p - r e g u l a t i o n o f W n t 5 a e x p r e s s i o n i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( A ) . G e n e s n o t s e l e c t e d f o r c o n fi r m a t i o n b y q R T - P C R l a c k u n d e r l i n i n g a n d a s t e r i s k s . I f a g e n e , i d e n t i fi e d fi ' o m a u n i q u e P B - i n d u c e d u n i q u e r e g i o n o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M ) i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( C h a p t e r 4 ) , e x h i b i t e d a u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e b a s e d o n q R T - P C R , t h i s i s d e n o t e d b y a n a s t e r i s k ( * ) , w h i l e a n i n d i c a t i o n o f a u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e i s r e p r e s e n t e d b y 2 a s t e r i s k s ( * * ) . A d d i t i o n a l c o n n e c t i o n s b e t w e e n u n i q u e l y a l t e r e d g e n e s a n d p a t h w a y s t h a t a r e i n s t r u m e n t a l i n d e v e l o p m e n t a n d d i f f e r e n t i a t i o n ( e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n , E M T ; H e d g e h o g ; N o t c h ; t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - b e t a , T G F - b e t a ) a r e d e p i c t e d i n S u p p l e m e n t a r y F i g u r e s 8 1 0 - 8 1 4 i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t . P o s i t i v e ( - - - - - - - - a » ) o r n e g a t i v e ( — - I ) r e g u l a t i o n i s i l l u s t r a t e d , a n d t h e s h a p e s o f t h e 3 1 3 1 l 3 , - _ _ - 3 - - _ _ _ - - T T ' . 4 ' 0 9 7 . . . . - . 0 2 2 c c c c 0 c . . . . . . . . - 1 2 2 n n n n n “ T T T B B B s s s P P P u u u o o o k r r r k k s s s w w w e e e r r r c c o o c o 3 3 3 m m m n n n 2 2 2 u u u a a a c c c T T T , , , e e e O O O r r r P P P K K K l e s a r e f s a 3 e s a r e f : n ] a : s 0 n a r 3 t r t t m l n y D h t m l n y t D e m A N D h t e m A N D 3 1 4 T a b l e 5 . 1 Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f t h e E x p r e s s i o n o f 3 D N A M e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) G e n e s . a b N o . o f M i c e t h a t E x h i b i t e d a C h a n g e G e n e E x p e r i m e n t a l G r o u p F o l d C h a n g e O u t s i d e 9 5 % C I o f C o n t r o l G r o u p c D n m t 3 b : D N A m e t h y l u ‘ a n s f e r a s e 3 b “ P h e n o b a r b i t a l ( P B ) w a s a d m i n i s t e r e d t o c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) w i l d t y p e ( W T ) m i c e f o r 2 3 w e e k s ( p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ) o r 3 2 w e e k s ( i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ) , a n d t o C A R k n o c k o u t ( K O ) m i c e f o r 2 3 w e e k s . A f o l d c h a n g e o f g e n e e x p r e s s i o n ( T , u p — r e g u l a t i o n ) i s l i s t e d i f i t w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) i n a t r e a t m e n t g r o u p ( v . i t s c o n t r o l ) . I f i t w a s n o t s i g n i fi c a n t , n o c h a n g e ( n . c . ) i s l i s t e d . C o m p a r i s o n s w e r e m a d e a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s . c I f a f o l d c h a n g e w a s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t , a g e n e w a s c o n s i d e r e d t o S h o w a n i n d i c a t i o n o f a c h a n g e i f a t l e a s t 3 s a m p l e s f r o m t h e P B - t r e a t e d g r o u p e x h i b i t e d e x p r e s s i o n t h a t w a s o u t s i d e ( a b o v e , T o r b e l o w , 1 ) t h e 9 5 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l ( C I ) o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a . I f t h e r e w a s n o i n d i c a t i o n o f a c h a n g e , o r i f a f o l d c h a n g e w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t , t h e s e d a t a a r e n o t s h o w n ( - ) . t u m o r s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 a ) . q R T - P C R w a s e m p l o y e d t o e v a l u a t e e x p r e s s i o n o f 1 6 o f t h e s e g e n e s , u s i n g R N A i s o l a t e d f r o m t h e s a m e t i s s u e s i n w h i c h t h e u n i q u e R A M s w e r e a s c e r t a i n e d ( T a b l e 5 . 6 ) . I n t h i s m a n n e r , c o m p l e m e n t a r y d a t a f r o m o u r g e n e e x p r e s s i o n a n d D N A m e t h y l a t i o n s t u d i e s w e r e d e p i c t e d ( F i g s . 5 . 2 - 5 . 5 ) . G e n e s t h a t e x h i b i t e d o n l y a P B - i n d u c e d c h a n g e i n m e t h y l a t i o n a r e s h o w n i n S u p p l e m e n t a r y F i g s . S 4 - S S , S 7 , a n d S 9 . P r e s e n c e o f C A R E S T h i r t y g e n e s , w h o s e e x p r e s s i o n a n d / o r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y ( w i t h t h e e x c e p t i o n o f D n m t 3 b ) i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , c o n t a i n e d a t l e a s t 1 p u t a t i v e C A R E w i t h i n 1 0 k b u p s t r e a m o f t h e i r t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e s ( T a b l e 5 . 2 ; b a s e s e q u e n c e s o f t h e p u t a t i v e C A R E S a r e l i s t e d i n S u p p l e m e n t a r y T a b l e S 9 i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t ) . O f t h e s e , 2 6 ( i n c l u d i n g G a d d 4 5 a , G a d d 4 5 b , T g f b r 2 , D n m t ] , D n m t 3 a , a n d D n m t 3 b ) w e r e s u b j e c t e d t o q R T - P C R a n a l y s i s ( T a b l e 5 . 1 ; A p p e n d i x T a b l e s 5 . 4 a n d 5 . 6 ) . C o m p a r i s o n o f C u r r e n t D a t a w i t h A n a l o g o u s D a t a O b t a i n e d fi o m B 6 C 3 F ] M i c e I n a p r e v i o u s s e r i e s o f s t u d i e s , w e e v a l u a t e d u n i q u e g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s a n d t h e p r e s e n c e o f C A R E S , a n d p e r f o r m e d f u n c t i o n a l a n n o t a t i o n o f g e n e s o f i n t e r e s t i n l i v e r t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h a t u m o r - p r o m o t i n g d o s e o f P B f o r 2 a n d 4 w e e k s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 b ) . I t i s i n s t r u c t i v e t o n o w c o m p a r e t h e s e d a t a w i t h t h e a n a l o g o u s d a t a r e p o r t e d i n t h e c u r r e n t m a n u s c r i p t : t h e e x p r e s s i o n o f 3 D n m t g e n e s ( T a b l e 5 . 3 ) , g e n e s i d e n t i fi e d f r o m 3 1 5 B ' A ) e S S f v E o i E R t A a . R C A o t ( N u P C s t n e m e l E e s n o p s e R r o t p e c e R e n a t s o y r a D d r s n r i A s a / y e l o v r a i c n t i A c M A e v i t u S t r i o s t s s r U O s s u u n R u o o o S S S o s s s C o m r u e e v c T i n r R E R R r r r r r e e O C O o c c o O o M N M M m m m n n u u u a a t c c a a e U A t T c v C U U T T T e e T r r T u e i P r L E P P n P R i P 3 k p a M H s b C a t n o C t a h t s e I h n t e G f o n o i s s e r p x E 2 . 5 e l b a T 3 1 6 _ — G e n e C q R T - P C R A n a l y s i s E M e t h y l a t i o n C h a n g e F E x h i b i t e d E x p r e s s i o n C h a n g e s B a s e d o n i M k n m n u y A n a l y s i s G B m p 8 b P r e c a n c e r o u s - s T T T u m o r s 4 — ‘ 0 1 S : F g f 2 1 P R E C A N C E R O U S u — l - — - ) T U M O R S G a d d 4 5 a “ P r e c a n c e r o u s T u m o r s G a d d 4 5 b “ P r e c a n c e r o u s H T U M O R S I d 3 P r e c a n c e r o u s - | c : t : M d m 2 H M y c T u m o r s T g / b r 2 ‘ P r e c a n c e r o u s H T U M O R S W i s p ] P R E C A N C E R O U S C a s p I T u m o r s G C c n d ] T u m o r s l s t n e m e l E e s n o p s e R M o M p r M y e w r H p y e o t p e c e R e n a t s o r d n A / e v i t c A e v i t u t i t s n o C e v i t a t u P n i . N f H . c S S R R s s s u u u o o o r r r e e e s r O O c c c o M M a a a n n n a U U c c c e e e T T r r r P P P m u T ] t m n a 3 t m n D I Z t a c B t n o C t a h t s e n e G f o a 2 c n d C D o i s s e r p x E d e u n i t n o c 2 . 5 e l b a T 3 1 7 ( C A R E S W ’ T U M O R S D d i t 3 T U M O R S J u n N l r d I W e e ] H T U M O R S 4 — < — < — < - — 4 — N v - ‘ N v — r l n D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s N P r e c a n c e r o u s T u m o r s P r e c a n c e r o u s T u m o r s D n m t 3 b T u m o r s M A b l l c . f . H y p o M T u m o r s A n v a * T u m o r s N e w M N e w M D d x 5 4 ' P r e c a n c e r o u s T u m o r s H y p o M N u d c d 3 T u m o r s H y p o M P r r ' c l r l e 2 I P r e c a n c e r o u s H y p o M o r H fl c h A H y p o M a n d / o r N e w M " S I c I I a 2 T u m o r s H y p o M S r m s l T u m o r s 3 1 8 T a b l e 5 . 2 c o n t i n u e d E x p r e s s i o n o f G e n e s t h a t C o n t a i n P u t a t i v e C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r R e s p o n s e E l e m e n t s ( C A R E S ) A ’ B A P u t a t i v e C A R E S a r e l o c a t e d 1 0 k b u p s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t S i t e . B W e u s e d t h e s a m e p o s i t i o n w e i g h t m a t r i x a n d 8 0 % s t r i n g e n c y c u t - o f f ( a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s ) o n 2 5 , 0 0 0 r a n d o m l y c o n s t r u c t e d s e q u e n c e s o f 1 0 k b i n l e n g t h a n d f o u n d t h a t , o n a v e r a g e , t h e r e w e r e o n l y 0 . 5 6 1 C A R E S f o u n d p e r s e q u e n c e ( a c r o s s a l l 2 5 , 0 0 0 s e q u e n c e s ) . T h e p r o b a b i l i t y o f a g e n e h a v i n g m o r e t h a n 1 C A R E i s 1 0 . 8 % , w h i l e t h e p r o b a b i l i t y o f h a v i n g m o r e t h a n 2 , 3 , o r 4 C A R E S i s 2 . 2 % , 0 . 3 8 % , a n d 0 . 0 4 4 % , r e s p e c t i v e l y . T h e p r o b a b i l i t y o f n o t h a v i n g a n y C A R E S i s 5 7 . 4 % . W e v i e w t h e i n f o r m a t i c a p p r o a c h f o r i d e n t i fi c a t i o n o f C A R E S a s h y p o t h e s i s g e n e r a t i n g . C G e n e s t h a t e x h i b i t e d u n i q u e p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - e l i c i t e d e x p r e s s i o n ( c u r r e n t c h a p t e r ) a n d / o r m e t h y l a t i o n ( C h a p t e r 4 ) c h a n g e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . A n x a 2 ( * ) w a s u n i q u e l y a c t i v e a n d n e w l y m e t h y l a t e d . D E x p r e s s i o n c h a n g e s ( T , u p - r e g u l a t i o n a n d 1 , d o w n - r e g u l a t i o n ) o f u n i q u e l y a c t i v e g e n e s t h a t w e r e i d e n t i fi e d b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s ( a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s ) . A t i s s u e i n C A P I T A L , B O L D E D F O N T i n d i c a t e s t h a t t h e g e n e w a s a c t i v e i n a t l e a s t 5 / 6 t o t a l p r e c a n c e r o u s l i v e r s a m p l e s o r 5 / 6 t o t a l i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . E E x p r e s s i o n c h a n g e s ( T , u p - r e g u l a t i o n a n d l , d o w n - r e g u l a t i o n ) b a s e d o n q R T - P C R . A n a r r o w i n d i c a t e s t h a t a c h a n g e i n t h e P B - t r e a t e d g r o u p ( v . i t s c o n t r o l ) w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) , a n d a l s o u n i q u e a s c o m p a r e d t o e x p r e s s i o n i n l i v e r t i s s u e f r o m C A R k n o c k o u t ( K O ) , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e ( a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s ) . P B - i n d u c e d d e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( H y p o m e t h y l a t i o n , H y p o M ) a n d i n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n ( H y p e r m e t h y l a t i o n , H y p e r M a n d n e w m e t h y l a t i o n , N e w M ) , a s d e t e r m i n e d i n C h a p t e r 4 . C a r r y f o r w a r d ( c . f . ) c h a n g e s w e r e o b s e r v e d i n b o t h p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . I n 2 i n s t a n c e s ( A ) , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s w a s a m b i g u o u s ( i . e . c o u l d n o t b e d e fi n i t i v e l y d e t e r m i n e d ) . G D e t a i l e d c o n fi r m a t o r y q R T - P C R d a t a a r e f o u n d i n A p p e n d i x T a b l e 1 . ” A l s o e x h i b i t e d u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e i n l i v e r s o f t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e v . t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , t r e a t e d w i t h P B f o r 2 o r 4 w e e k s ( C h a p t e r 2 ) . [ A l s o e x h i b i t e d u n i q u e R A M i n l i v e r s o f t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e v . t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , t r e a t e d w i t h P B f o r 2 o r 4 w e e k s ( C h a p t e r 2 ) . N D ( n o t d e t e c t e d ) i n d i c a t e s t h a t t h e g e n e w a s n o t a c t i v e . T h e f o l d c h a n g e i n t h e P B - t r e a t e d g r o u p i s n o t S i g n i fi c a n t ( n . s . ) v . i t s c o n t r o l ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) . T h e f o l d c h a n g e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d l i v e r t i s s u e f r o m C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e w e r e n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < . 0 5 ) . q R T - P C R w a s n o t p e r f o r m e d ( n . p . ) . D e t a i l e d q R T - P C R d a t a a r e f o u n d i n T a b l e 1 . D e t a i l e d q R T - P C R d a t a a r e f o u n d i n A p p e n d i x T a b l e 3 . 5 3 4 - 4 9 : 2 0 T a b l e 5 . 3 Q u a n t i t a t i v e R e a l - T i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f E x p r e s s i o n o f 3 D N A M e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) G e n e s i n 2 T y p e s o f L i v e r T u m o r - S u s c e p t i b l e M i c e B 6 C 3 F ] C A R W T G e n e f o l d c h a g g e ’ l f o l d c h a n g e b , 2 w e e k s P B 4 w e e k s P B P r e c a n c e r o u s T u m o r s D n m t ] : D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e 1 l ' 1 ' 4 7 l ” 1 ' 4 9 “ ' 0 " : l 2 - 0 0 D m t 3 : D N A m e t h ’ ; l t r a : s f e r a s e 3 a 1 ' ' 1 ' 6 0 l " 1 ' 8 1 T 1 - 2 7 l 2 - 2 9 D n m t 3 b : D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e 3 b l ' 6 - 6 0 l ' 2 - 0 0 n . c . c n . c . ° “ F o l d c h a n g e s o f g e n e e x p r e s s i o n i n l i v e r s o f p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - t r e a t e d B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s ( v . t h e i r r e s p e c t i v e c o n t r o l s ) . A l l c h a n g e s ( T , u p - r e g u l a t i o n a n d 1 , d o w n - r e g u l a t i o n ) a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) , a n d a r e c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e a s c o m p a r e d t o e x p r e s s i o n i n l i v e r s o f P B - t r e a t e d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e ( C h a p t e r 4 ) . b F o l d c h a n g e s o f g e n e e x p r e s s i o n i n P B - t r e a t e d C A R w i l d t y p e ( W T ) m i c e ( p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ) v . t h e i r c o n t r o l . T h e c h a n g e s a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) , a n d a r e c o n s i d e r e d t o b e u n i q u e a s c o m p a r e d t o e x p r e s s i o n i n l i v e r t i s s u e f r o m C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e ( T a b l e 1 ) . “ N o c h a n g e ( n . c . ) i n d i c a t e s t h a t a f o l d c h a n g e w a s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t . 3 1 9 i d e s u l l l l E i d e n t i c a l R A M S ( T a b l e 5 . 7 ) , u n i q u e l y a c t i v e g e n e s , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s ( a s u b s e t i s l i s t e d i n T a b l e 6 . 2 o n p . 3 5 8 ; S u p p l e m e n t a r y T a b l e s 8 1 l A - C i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t ) , t h e p r e s e n c e o f C A R E S ( T a b l e 5 . 2 ) , a n d p a t h w a y s a n d p r o c e s s e s ( T a b l e 6 . 3 , p . 3 5 9 ) 3 2 0 \ b — u - n ‘ ( I ) A a i l 1 6 5 o r ; a ) D I S C U S S I O N O u r o v e r a l l g o a l i s t o e l u c i d a t e p r o g r e s s i v e c h a n g e s , i n e x p r e s s i o n a n d m e t h y l a t i o n s t a t u s , o f g e n e s w h i c h p l a y k e y r o l e s d u r i n g P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s , w i t h a n e m p h a s i s o n t h e i r p o t e n t i a l t o a f f e c t s i g n a l i n g t h r o u g h c r i t i c a l p a t h w a y s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f c e l l g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n . I n a s e r i e s o f k e y s t u d i e s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ; P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 a ; P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 b ) p l u s t h e c u r r e n t o n e , w e h a v e d i s c e r n e d u n i q u e P B - e l i c i t e d a l t e r a t i o n s , i n D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n , t h a t o c c u r r e d i n 2 t y p e s o f l i v e r t u m o r - p r o n e m i c e . T h i s w a s a c c o m p l i s h e d b y “ s u b t r a c t i n g ” o u t t h o s e w h i c h w e r e a l s o o b s e r v e d i n t h e i r t u m o r - r e s i s t a n t c o u n t e r p a r t s . I n d e e d , P B i n d u c e d R A M S i n t i s s u e f r o m k i d n e y ( a n o n - t a r g e t o r g a n ) a s w e l l a s l i v e r t i s s u e f r o m r e l a t i v e l y t u m o r - r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) a n d t u m o r - r e s i s t a n t C A R K O m i c e ( P h i l l i p s e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h e r e f o r e , t h e u s e o f t h i s “ s u b t r a c t i o n a p p r o a c h ” w a s n e c e s s a r y i n o r d e r t o p r o v i d e n o v e l i n s i g h t r e g a r d i n g k e y m o l e c u l a r e v e n t s t h a t t r a n s p i r e d d u r i n g t u m o r i g e n e s i s a c r o s s a b r o a d t i m e - l i n e o f P B t r e a t m e n t ( i . e . 2 a n d 4 w e e k s , t o p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d , fi n a l l y , i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ) . T h i s p e m r i t t e d u s t o f o c u s o n c r i t i c a l g e n e s a n d h o w t h e y m i g h t i n t e r a c t t o c o n t r i b u t e t o t u m o r i g e n e s i s . T h e p r e s e n t r e p o r t e x p a n d s u p o n o u r p r e v i o u s w o r k i n v o l v i n g C A R W T a n d K O m i c e , i n w h i c h g e n e s t h a t e x h i b i t e d u n i q u e P B - i n d u c e d R A M S i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s w e r e i d e n t i fi e d ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 a ) . A n e x t e n s i v e a n a l y s i s o f e x p r e s s i o n c u l m i n a t e d i n t h e e l u c i d a t i o n o f g e n e s ( i n c l u d i n g s e v e r a l i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M S ) w h o s e t r a n s c r i p t i o n w a s a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s v . l i v e r t i s s u e f r o m r e s i s t a n t C A R K O , 2 3 - w e e k 3 2 1 P B - t r e a t e d m i c e . R e m a r k a b l y , t h e s e d a t a s e t s a r e c o m p l e m e n t a r y , a s g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n a n d / o r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s c h a n g e d u n i q u e l y i n r e s p o n s e t o P B a r e i n v o l v e d i n m a n y o f t h e s a m e c a n c e r - a s s o c i a t e d s i g n a l i n g p a t h w a y s a n d c e l l u l a r p r o c e s s e s ( F i g . 5 . 5 ; S u p p l e m e n t a r y F i g s . S 4 - S 1 4 i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t ) . I n a n a n a l o g o u s f a s h i o n , w e h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t u n i q u e m e t h y l a t i o n ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ) a n d g e n e e x p r e s s i o n ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 b ) c h a n g e s o c c u r r e d i n t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e v . t h e i r r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 c o u n t e r p a r t , a t 2 a n d / o r 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t . I m p o r t a n t l y , g e n e s e x h i b i t i n g u n i q u e a l t e r a t i o n s i n b o t h t y p e s o f s u s c e p t i b l e m i c e a r e i n v o l v e d i n m a n y o f t h e s a m e f u n d a m e n t a l s i g n a l i n g p a t h w a y s a n d c e l l u l a r p r o c e s s e s a t b o t h e a r l y ( i . e . 2 a n d 4 w e e k s ) a n d l a t e r ( 2 3 w e e k s , p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d 3 2 w e e k s , i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ) t i m e s ( T a b l e 6 . 3 , p . 3 5 9 ) . E a r l y e v e n t s , i n c l u d i n g D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s , m i g h t c a u s e a c e l l t o b e c o m e a d d i c t e d t o ( i . e . , d e p e n d e n t o n ) o n c o g e n i c s i g n a l i n g p a t h w a y s t h a t a r e n e c e s s a r y f o r t r a n s f o r m a t i o n ( B a y l i n a n d O h m , 2 0 0 6 ) , a n d t h i s s t r e n g t h e n s s u p p o r t f o r o u r a s s e r t i o n t h a t c h a n g e s o b s e r v e d a t 2 a n d 4 w e e k s c o u l d f a c i l i t a t e s e l e c t i v e c l o n a l e x p a n s i o n , w h i c h i s c h a r a c t e r i s t i c o f t u m o r f o r m a t i o n ( F e i n b e r g e t a l . , 2 0 0 6 ) . W e h a v e p r o v i d e d a v i e w o f t h e p r o g r e s s i v e n a t u r e o f t h e m u l t i s t a g e m o d e l o f c a r c i n o g e n e s i s , a s g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n ( e . g . , G a d d 4 5 b , C x c r 7 , K c n k I ) o r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s ( e . g . , P r i c k l e 2 , P t p r o , Z s c a n 2 2 ) c h a n g e d a t 2 a n d / o r 4 w e e k s r e m a i n e d d e r e g u l a t e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( T a b l e s 6 . 1 a n d 6 . 2 , p p . 3 5 7 - 3 5 8 ) . T h o s e g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n c h a n g e d o n l y i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s a r e l i s t e d i n S u p p l e m e n t a r y T a b l e S 3 1 i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t I n d e e d , g e n e s t h a t w e r e a l t e r e d a t 3 2 2 3 2 3 F g g p ° r e 5 . 5 S u m m a r y o f S i g n a l i n g P a t h w a y s a n d P r o c e s s e s I n v o l v i n g G e n e s t h a t E x h i b i t e d U n i q u e E x p r e s s i o n a n d / o r M e t h y l a t i o n C h a n g e s i n P r e c a n c e r o u s a n d T u m o r T i s s u e . P B i n d u c e d u n i q u e r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M S ) , i n c l u d i n g h y p o m e t h y l a t i o n s ( H y p o M ) , h y p e r m e t h y l a t i o n s ( H y p e r M ) , a n d n e w m e t h y l a t i o n s ( N e w M ) , i n t u m o r - s u s c e p t i b l e c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) w i l d t y p e ( W T ) m i c e a t 2 3 ( p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e , i n A ) a n d / o r 3 2 ( i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , i n B ) w e e k s ( C h a p t e r 3 ) . C a r r y f o r w a r d ( c . f . ) R A M S w e r e o b s e r v e d i n b o t h t i s s u e s . I f a g e n e , i d e n t i fi e d f r o m a u n i q u e R A M ( C h a p t e r 4 ) , e x h i b i t e d a u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e ( i n d u c t i o n , T o r r e p r e s s i o n , 1 ) b a s e d o n q R T - P C R , t h i s i s d e n o t e d b y b o l d e d f o n t a n d 2 a s t e r i s k s C ” ) , w h i l e a n i n d i c a t i o n o f a u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e i s r e p r e s e n t e d b y b o l d e d f o n t a n d l a s t e r i s k ( * ) . A S d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s , m i c r o a r r a y a n a l y s i s w a s e m p l o y e d t o i d e n t i f y u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . I n d i c a t e d g e n e s ( D ) w e r e a c t i v e i n a t l e a s t 5 / 6 p r e c a n c e r o u s l i v e r s a m p l e s o r a t l e a s t 5 / 6 i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . E x p r e s s i o n o f u n i q u e l y a c t i v e g e n e s w a s c o n fi r m e d ( b o l d e d ) b y q R T - P C R . I n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e , q R T - P C R r e v e a l e d a s t a t i s t i c a l l y S i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n F g f 2 1 e x p r e s s i o n ( § ) a n d a n i n d i c a t i o n o f u p - r e g u l a t i o n o f W n t 5 a a n d D n m t ] e x p r e s s i o n ( 0 0 ) . G e n e s n o t s e l e c t e d f o r c o n fi r m a t i o n b y q R T - P C R a r e l i s t e d i n u n b o l d e d f o n t a n d l a c k s y m b o l s . A n v a ( ‘ 1 ' ) e x h i b i t e d a u n i q u e R A M a n d w a s u n i q u e l y a c t i v e i n t h e i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . A g e n e w h o s e u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e w a s r e v e a l e d o n l y b y q R T - P C R i s d e n o t e d b y b o l d e d f o n t a n d 2 c a r r o t s ( M ) , w h i l e a g e n e t h a t e x h i b i t e d a n i n d i c a t i o n o f a u n i q u e c h a n g e i s d e n o t e d b y b o l d e d f o n t a n d l c a r r o t ( A ) . A l i n e u n d e r n e a t h a g e n e i n d i c a t e s t h a t a t l e a s t 1 p u t a t i v e C A R r e s p o n s e e l e m e n t ( C A R E ) w a s f o u n d w i t h i n 1 0 k b u p s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e ( T a b l e 2 ) . A b b r e v i a t i o n s : m e t a b . , m e t a b o l i s m ; E M T , e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n ; M A P K , m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ; T G F - b e t a , t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - b e t a . r a n - . 1 1 “ — — 2 . 1 1 1 1 “ ‘ I ‘ I _ 0 : ; g 1 r t ) M M o M ) ) M M a o w r " : H " p y e ) p 1 M l y 1 o l H g . Z ” . p 2 n f l f . p ! r f . y i 1 ( i . c a 2 l c H . c F c ( ” “ D 1 R o ( r * o T * / T " l Z l i o d K n b I a I r T A T ) M o p “ T y T T I B o p p y y H o ) ) p M M y - o H o H . “ i . f g . f c . y y c n ( c H H ( H r o ) M ) w M e n f p . p . M “ l o * w m p I N D ( ! 2 e T " r r a 2 o o “ t / / o “ b d d n n i n f M E t T a r a T T ) ) M o p M r e a p y l " H fl n y ] H k . 4 f p d . . f d a ” Y c ' N y “ r e C I L r ( H e l o T T f n l k / e c d c ( * * o ) i M r T - o p T y u . . H b k i M * n s r T d a * C 1 P T 4 M T h o p c ) y 1 H ( ) M w . - " a f 4 n ' 5 N 5 n 3 e c u . ( / c d t c m d k 1 ( C d ( . ( _ 9 1 2 t C . - : S y w “ l l T b A T ) M M r r . o e f * o / . c 1 p T H a 1 “ 1 2 G * l p 1 2 l 1 k b n A T 1 1 ) M o p M H r o / d n a ) M o p y H p y H . ( * 2 b . f f . c ( “ l _ A E 1 T l n b _ f “ . G r M “ n “ l 7 G t W . C , l T l m b A t . ) M o p A e y a " M 1 ‘ W T 4 T 1 h c l H S h A A . 4 5 f 2 . d 4 c m ( d d a d d “ ' G a M T T G . I c d ) “ ( n M a r B ° p 2 l e y l ° l H l a m “ k p 5 a M o c s t e r i i i n p o c o M r y r W W M P o T T T T y m H p y 1 H ( M r M e o ) ) p p M M y y r o H H e p . p . f y f . . y c H c H ( ( r o r " “ o / o / 2 d i d k n n n a a r T T T T 3 2 4 A . T D n m t 3 a A A 1 F g fl l m ' “ - T ' I ‘ n k 2 * ( c . f . H y p e r M T G a d d 4 5 a T G a d d 4 5 b " " T D t x 4 1 G n a l 2 T M a p k 3 A 1 A b l l “ ( c . r . H y p o M ) 1 G a d d 4 5 M _ T C x c r 7 l l T E f n b 2 * ( c . f . H y p o M 0 " H y p e r M ) 1 P d g f a " D E T M a k S " 1 . 2 1 r g p r z M T W n t 5 a ° ° 1 T E f a n ’ “ ( c . f . H y p o a n d / o r H y p o M ) 1 P d g f a " E m T W i s l ' 1 T W n t S a b o t h t h e e a r l y a n d l a t e t i m e p o i n t s a r e p a r t i c u l a r l y c o m p e l l i n g c a n d i d a t e s f o r d i r e c t i n v o l v e m e n t i n t u m o r i g e n e s i s . F u r t h e r m o r e , i n a h y p o t h e s i s d r i v e n f a s h i o n , t h e s e g e n e s c a n s e r v e a s t h e s u b s t r a t e f o r d e v e l o p i n g a “ fi n g e r p r i n t ” f o r P B - l i k e , n o n g e n o t o x i c r o d e n t h e p a t o c a r c i n o g e n s . E fi o r t s h a v e b e e n m a d e t o i d e n t i f y g e n e e x p r e s s i o n S i g n a t u r e s o f n o n g e n o t o x i c r o d e n t h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n m i c e ( I i d a e t a l . , 2 0 0 5 ) , a n d r a t s ( F i e l d e n e t a l . , 2 0 0 7 ) , w h i c h a r e n o t a s r e s p o n s i v e t o P B - i n d u c e d t m n o r i g e n e s i s a s t h e s u s c e p t i b l e m o u s e s t r a i n s . O u r a p p r o a c h f o r e l u c i d a t i n g g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s t h a t m i g h t b e u s e f u l b i o m a r k e r c a n d i d a t e s i s m o r e a p p r o p r i a t e t h a n w h a t i s i n t h e l i t e r a t u r e c u r r e n t l y b e c a u s e w e “ s u b t r a c t e d o u t ” a l t e r a t i o n s t h a t o c c u r r e d i n t h e P B - t r e a t e d r e s i s t a n t C A R K O m i c e , a n d t h u s , a r e f o c u s i n g o n c h a n g e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s t h a t a r e l i k e l y t o b e r e l a t e d d i r e c t l y t o t u m o r i g e n e s i s . T h e p h o s p h o r y l a t i o n a n d d e - p h o s p h o r y l a t i o n o f p r o t e i n s i s i n t i m a t e l y i n v o l v e d i n n u m e r o u s s i g n a l i n g p a t h w a y s . T h u s , i t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t g e n e s w h i c h e n c o d e k i n a s e s , p h o s p h a t a s e s , p r o t e i n p h o s p h a t a s e r e g u l a t o r y ( i n h i b i t o r ) s u b u n i t s a n d / o r p r o t e i n p h o s p h a t a s e a c t i v a t o r s ( r e g u l a t o r y s u b u n i t ) w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( T a b l e 5 . 5 ) a n d i n B 6 C 3 F 1 m i c e f o l l o w i n g 2 - o r 4 - w e e k s o f t r e a t m e n t w i t h P B ( S u p p l e m e n t a r y T a b l e S 8 i n P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 b ) . I n t h i s c o n t e x t , i t i s i m p o r t a n t t o r e fl e c t o n h o w t h e a c t i v a t i o n o f C A R i s d e p e n d e n t o n k i n a s e s a n d p h o s p h a t a s e s . C A R i s s e q u e s t e r e d i n t h e c y t o p l a s m b y H S P 9 0 i n m o u s e h e p a t o c y t e s ( Y o s h i n a r i e t a l . , 2 0 0 3 ) a n d H S P 9 0 p l u s t h e c o c h a p e r o n e c y t o p l a s m i c C A R r e t e n t i o n p r o t e i n ( C C R P ) i n h u m a n h e p a t o c y t e s ( K o b a y a s h i e t a l . , 2 0 0 3 ) . I n r e s p o n s e t o P B t r e a t m e n t , C A R t r a n s l o c a t e s fi o m t h e c y t o p l a s m t o t h e n u c l e u s , h e t e r o d i m e r i z e s w i t h r e t i n o i d X r e c e p t o r ( R X R ) , a n d b i n d s t o t r a n s c r i p t i o n a l e l e m e n t s ( e . g . , P B - r e s p o n s i v e 3 2 5 e n h a n c e r m o d u l e s ) t o a f f e c t g e n e e x p r e s s i o n ( H o n k a k o s k i e t a l . , 1 9 9 8 ; K a w a m o t o e t a l . , 1 9 9 9 ; S u e y o s h i e t a l . , 1 9 9 9 ) . S p e c i fi c a l l y , P B c a u s e s r e c r u i t m e n t o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e 2 A ( P P 2 A ) t o t h e C A R z H S P 9 0 c y t o p l a s m i c c o m p l e x ( Y o s h i n a r i e t a l . , 2 0 0 3 ) . O k a d a i c a c i d , a p h o s p h a t a s e i n h i b i t o r w h i c h c a n i n h i b i t P P 2 A , b l o c k s t h e P B - i n d u c e d n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f C A R ( K a w a m o t o e t a l . , 1 9 9 9 ) . C A R - m e d i a t e d i n d u c t i o n o f t h e C y p 2 b 1 0 g e n e c a n b e b l o c k e d b y K N - 6 2 ( a C a 2 + / c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r ) w i t h o u t a fi e c fi n g n u c l e a r a c c u m u l a t i o n ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 3 ) , w h i c h s u g g e s t s t h a t C A R i s a c t i v a t e d i n t h e n u c l e u s b y a p h o s p h o r y l a t i o n e v e n t . T h e m e c h a n i s m u n d e r l y i n g P B - i n d u c e d t r a n s l o c a t i o n o f C A R f r o m t h e c y t o p l a s m t o t h e n u c l e u s a p p e a r s t o e n t a i l i n t e r a c t i o n o f C A R w i t h a h o m o d i m e r o f t h e m e m b r a n e - a s s o c i a t e d s u b u n i t o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e 1 , P P P 1 R 1 6 A ( R 1 6 A ) . T h e R 1 6 A r e s i d u e s d i r n e r i z e a t a r e g i o n c o n t a i n i n g p r o t e i n k i n a s e A p h o s p h o r y l a t i o n S i t e s . A d d i t i o n a l l y , R 1 6 A c a n i n h i b i t p r o t e i n p h o s p h a t a s e l - b e t a ( P P l B ) , w h i c h c a n i n h i b i t C A R t r a n s l o c a t i o n ( S u e y o s h i e t a l . , 2 0 0 8 ) . W e s p e c u l a t e t h a t e n h a n c e m e n t o f P P 2 A a n d / o r i n h i b i t i o n o f P M [ 3 p l a y s a r o l e i n t h e m e c h a n i s m b y w h i c h P B s t i m u l a t e s n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f C A R . R o d e n t s a r e m o r e p r o n e t o t u m o r d e v e l o p m e n t t h a n h u m a n s ( R a n g a r a j a n a n d W e i n b e r g , 2 0 0 3 ) . H o w e v e r , i n o u r o p i n i o n , t h e b a s i c g e n e s i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s a r e l i k e l y t o b e l a r g e l y t h e s a m e i n b o t h s p e c i e s . T h e r e f o r e , i t i s r e a s o n a b l e t o h y p o t h e s i z e t h a t d i f f e r e n c e s i n r e g u l a t i o n o f g e n e a c t i v i t y c a n c o n t r i b u t e t o t h i s s p e c i e s d i s p a r i t y i n s u s c e p t i b i l i t y . A f u n d a m e n t a l d i f f e r e n c e b e t w e e n m u r i n e a n d h u m a n C A R i s t h e i r r e s p o n s i v e n e s s t o a r a n g e o f a g o n i s t s a n d i n v e r s e a g o n i s t s , w h i c h m i g h t b e a t t r i b u t a b l e t o s t r u c t u r a l v a r i a t i o n s ( S t a n l e y e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h u s , t h e r e l a t i v e s e n s i t i v i t y o f m i c e t o c a r c i n o g e n e s i s m i g h t , i n p a r t , b e d u e t o d i s t i n c t r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s a n d / o r 3 2 6 s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f m C A R . M o r e o v e r , i t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t m e t h y l a t i o n p a t t e r n s i n r o d e n t c e l l s a r e l e s s s t a b l e t h a n t h o s e i n h u m a n c e l l s ( r e v i e w e d i n G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ) , s o d i f f e r e n c e s i n e p i g e n e t i c c o n t r o l ( e . g . , D N A m e t h y l a t i o n ) b e t w e e n t h e s p e c i e s c o u l d , i n p a r t , u n d e r l i e t h e e n h a n c e d p r o p e n s i t y o f r o d e n t s , a s c o m p a r e d t o h u m a n s , t o d e v e l o p c a n c e r . A k e y q u e s t i o n i s , w h a t i s r e s p o n s i b l e f o r t h e d i f f e r e n c e i n s u s c e p t i b i l i t y b e t w e e n t h e t u m o r - p r o n e a n d t u m o r - r e s i s t a n t m i c e ? P r o l i f e r a t i o n a l o n e i s n o t t h e a n s w e r , a s P B t r e a t m e n t f o r 1 a n d 2 w e e k s i n c r e a s e s l e v e l s i n b o t h t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 a n d r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ) . C A R i s c l e a r l y i n v o l v e d , s i n c e P B - t r e a t e d C A R K O m i c e d o n o t d e v e l o p l i v e r t u m o r s ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . H o w e v e r , t h e r e a p p e a r s t o b e o t h e r d o w n s t r e a m e v e n t s t h a t a r e r e q u i s i t e f o r t r a n s f o r m a t i o n b e c a u s e t h e i n d u c t i o n o f g e n e s e n c o d i n g d r u g - m e t a b o l i z i n g e n z y m e s , i n d i c a t i v e o f a f u n c t i o n a l C A R p r o t e i n , o c c u r r e d i n b o t h t h e B 6 C 3 F ] a n d C 5 7 B L / 6 m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 b ) . G a d d 4 5 b i s a l i k e l y c a n d i d a t e g e n e , a s i t s o v e r e x p r e s s i o n c a n e n h a n c e C A R - m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n ( Y a m a m o t o a n d N e g i s h i , 2 0 0 8 ) . A t 2 w e e k s o f P B t r e a t m e n t , G a d d 4 5 b a p p e a r s t o b e u p - r e g u l a t e d t o a g r e a t e r e x t e n t i n B 6 C 3 F 1 m i c e v . t h e C 5 7 B L / 6 ( P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 b ) , a n d i t i s a l s o u n i q u e l y u p - r e g u l a t e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( T a b l e 5 . 4 ) . T h e r e f o r e , i n c r e a s e d G a d d 4 5 b e x p r e s s i o n m i g h t b e a c r u c i a l f a c t o r i n v o l v e d i n t h e a b i l i t y o f P B t o p r o m o t e t u m o r i g e n e s i s , e s p e c i a l l y s i n c e i t c a n fi m c t i o n a s a n i n h i b i t o r o f a p o p t o s i s ( P a p a e t a l . , 2 0 0 4 ) w h i c h i s o n e o f t h e h a l l m a r k e f f e c t s o f P B ( K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 b ; W h y s n e r e t a l . , 1 9 9 6 ) . A d d i t i o n a l g e n e s o f i n t e r e s t i n t h i s r e g a r d a r e t h o s e t h a t h a r b o r C A R E S a n d e x h i b i t P B - 3 2 7 e l i c i t e d a l t e r e d m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n s t a t u s e s ( T a b l e 5 . 2 ; T a b l e 2 i n P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 b ) . D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f D n m t s ( T a b l e 5 . 3 : d e c r e a s e s i n D n m t ] , 3 a a n d 3 b a t 2 a n d 4 w e e k s ; i n c r e a s e i n D n m t 3 a i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ; a n d i n c r e a s e s i n D n m t ] a n d 3 a i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ) i s s u g g e s t i v e o f d i s t i n c t r o l e s t h a t s e e m t o b e d e p e n d e n t o n t h e s t a g e o f t u m o r i g e n e s i s . F u r t h e r m o r e , a l l 3 D n m t s c o n t a i n a t l e a s t 1 C A R E ( T a b l e 5 . 2 ) , w h i c h i m p l i e s t h a t C A R p o t e n t i a l l y r e g u l a t e s t h e i r t r a n s c r i p t i o n , t h u s s u g g e s t i n g a d i r e c t l i n k b e t w e e n P B a n d a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n . H o w e v e r , D n m t s i n a l l m i c e a r e e x p e c t e d t o c o n t a i n C A R E S . T h e r e f o r e , o t h e r f a c t o r s ( e . g . , S i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s i n t h e C A R E S , p r o t e i n s t h a t t a r g e t C A R , c o - a c t i v a t o r s . a n d c o - r e p r e s s o r s o f C A R ) m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e d i f f e r e n c e s i n e x p r e s s i o n . N e v e r t h e l e s s , t h e u n i q u e P B - e l i c i t e d e x p r e s s i o n c h a n g e s o f D n m t s i n s u s c e p t i b l e m i c e m i g h t i n fl u e n c e t h e f o r m a t i o n o f R A M s , a s u b s e t o f w h i c h c o u l d f o s t e r t u m o r d e v e l o p m e n t . I n v i v o s t u d i e s a r e e s s e n t i a l f o r a d v a n c i n g o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e c o m p l e x c a r c i n o g e n e s i s p r o c e s s . N u m e r o u s s t r o m a l c o m p o n e n t s , s u c h a s m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s , c a n i n fl u e n c e m a l i g n a n t b e h a v i o r ( M a r x , 2 0 0 8 ) . M o r e o v e r , i n fl a m m a t i o n - r e l a t e d s i g n a l i n g c a n c o n t r i b u t e t o t u m o r i g e n e s i s , e . g . , I L - 6 p r o d u c t i o n b y m a c r o p h a g e s f a c i l i t a t e s D E N - i n i t i a t e d l i v e r t u m o r f o r m a t i o n ( N a u g l e r e t a l . , 2 0 0 7 ) . S i g n i fi c a n t l y , o u r u s e o f w h o l e l i v e r t i s s u e ( i n c l u d i n g p r e c a n c e r o u s l i v e r ) a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s d e r i v e d f r o m P B - t r e a t e d m i c e e n a b l e d t h e d e t e c t i o n o f c h a n g e s t h a t o c c u r r e d w i t h i n t h e c o n t e x t o f t h e r r r i c r o e n v i r o n m e n t , a n d p o t e n t i a l l y , w i t h i n m u l t i p l e c e l l t y p e s . I n s u m m a r y , w e h a v e p e r f o r m e d e x t e n s i v e i n v e s t i g a t i o n s ( s p a n n i n g 4 s t u d i e s : P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 8 ; P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 2 0 0 9 a ; P h i l l i p s a n d G o o d m a n , 3 2 8 2 0 0 9 b ; t h e c u r r e n t r e p o r t ) o f P B - e l i c i t e d m o l e c u l a r a l t e r a t i o n s , i . e . D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s , t h a t o c c u r r e d u n i q u e l y i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e i r t u m o r - r e s i s t a n t c o u n t e r p a r t s . T h i s a p p r o a c h , i n v o l v i n g 2 d i s t i n c t m o d e l s y s t e m s c o m p r i s e d o f P B - t r e a t e d m i c e w h o s e e x p o s u r e p e r i o d s s p a n n e d a c o n t i n u u m o f P B - i n d u c e d h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s , h a s p r o v e n t o b e e f f e c t i v e f o r i d e n t i f y i n g g e n e s t h a t m i g h t b e m e c h a n i s t i c a l l y c r i t i c a l f o r t u m o r d e v e l o p m e n t . A s a d i r e c t r e s u l t o f t h e s e a n a l y s e s , n u m e r o u s g e n e s a r e p r e s e n t e d t h a t c o u l d c o n t r i b u t e t o t u m o r i g e n e s i s b y v i r t u e o f t h e i r d e r e g u l a t i o n i n r e s p o n s e t o P B . M a n y o f t h e s e g e n e s p a r t i c i p a t e i n p r o c e s s e s ( T a b l e 6 . 3 , p . 3 5 9 , a n d l i s t e d i n p a r e n t h e s e s b e l o w ) t h a t a r e c a p a b l e o f c o n t r i b u t i n g t o t h e a c q u i s i t i o n o f t h e 6 b a s i c f e a t u r e s o f a t u m o r ( H a n a h a n a n d W e i n b e r g , 2 0 0 0 ) : 1 ) s e l f - s u f f i c i e n c y i n g r o w t h S i g n a l s ( c e l l c y c l e , g r o w t h , s u r v i v a l , a n d M A P K s i g n a l i n g ) , 2 ) i n s e n s i t i v i t y t o a n t i - g r o w t h s i g n a l s ( c e l l c y c l e , g r o w t h , s u r v i v a l , T G F - B s i g n a l i n g , a n d d i f f e r e n t i a t i o n - r e l a t e d p a t h w a y s , i . e . H e d g e h o g , N o t c h , W n t ) , 3 ) e v a s i o n o f a p o p t o s i s ( a p o p t o s i s a n d s u r v i v a l ) , 4 ) s u s t a i n e d a n g i o g e n e s i s ( a n g i o g e n e s i s ) , 5 ) t i s s u e i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s ( i n v a s i o n , m e t a s t a s i s , E M T , a d h e s i o n a n d c y t o s k e l e t o n o r g a n i z a t i o n / d y n a m i c s ) , a n d 6 ) l i m i t l e s s r e p l i c a t i v e p o t e n t i a l ( c e l l c y c l e , g r o w t h , s u r v i v a l ) , p l u s a n i n fl a m m a t o r y m i c r o e n v i r o n m e n t ( a c u t e i n fl a m m a t o r y r e s p o n s e , i n S u p p l e m e n t a r y T a b l e S 6 0 ) , a s e m p h a s i z e d b y M a n t o v a n i ( 2 0 0 9 ) . S i g n i fi c a n t l y , D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s t h a t c o u l d b e u t i l i z e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f a “ fi n g e r p r i n t ” o f P B e x p o s u r e a r e p r e s e n t e d ( S u p p l e m e n t a r y T a b l e 8 1 4 ; a s u b s e t o f t h e s e a r e l i s t e d i n T a b l e 6 . 2 , p . 3 5 8 ) . C o l l e c t i v e l y , t h e s e d a t a p r o v i d e n o v e l i n s i g h t r e g a r d i n g t h e d e t a i l e d p i c t u r e o f g e n e e x p r e s s i o n a n d D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s t h a t u n d e r l i e P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s . 3 2 9 A C K N O W L E D G E M E N T S P r e d o c t o r a l f e l l o w s h i p s u p p o r t f o r J . M . P w a s r e c e i v e d f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h / N a t i o n a l I n s t i t u t e o f E n v i r o n m e n t a l H e a l t h S c i e n c e s t r a i n i n g g r a n t N o . T 3 2 - E S - 7 2 5 5 . R e s e a r c h s u p p o r t , i n t h e f o r m o f a n u n r e s t r i c t e d g i f t , f r o m t h e R ] . R e y n o l d s T o b a c c o C o m p a n y i s a c k n o w l e d g e d g r a t e f u l l y . W e t h a n k t h e M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y R e s e a r c h T e c h n o l o g y a n d S u p p o r t F a c i l i t y f o r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e w i t h t h e m i c r o a r r a y e x p e r i m e n t s . R E F E R E N C E S A s s e m , M . , S c h u e t z , E . G . , L e g g a s , M . , S u n , D . , Y a s u d a , K . , R e i d , G . , Z e l c e r , N . , A d a c h i , M . , S t r o m , S . , E v a n s , R . M . , M o o r e , D . D . , B o r s t , P . , a n d S c h u e t z , J . D . ( 2 0 0 4 ) I n t e r a c t i o n s b e t w e e n h e p a t i c M r p 4 a n d S u l t 2 a a s r e v e a l e d b y t h e c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r a n d M r p 4 k n o c k o u t m i c e . J . B i o l . C h e m . 2 7 9 , 2 2 2 5 0 - 2 2 2 5 7 . B a c h m a n , A . N . , P h i l l i p s , J . M , a n d G o o d m a n J . I . ( 2 0 0 6 ) . P h e n o b a r b i t a l i n d u c e s p r o g r e s s i v e p a t t e r n s o f G C - r i c h a n d g e n e - s p e c i fi c a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n i n t h e l i v e r o f t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e . T o x i c o l . S c i . 9 1 , 3 9 3 - 4 0 5 . B a y l i n , S . B . , a n d O h m , J . E . ( 2 0 0 6 ) E p i g e n e t i c g e n e s i l e n c i n g i n c a n c e r - a m e c h a n i s m f o r e a r l y o n c o g e n i c p a t h w a y a d d i c t i o n ? N a t . R e v . C a n c e r 6 , 1 0 7 - l 1 6 . B e c k e r , R F . ( 1 9 8 2 ) . M o r p h o l o g i c a l c l a s s i fi c a t i o n o f m o u s e l i v e r t u m o r s b a s e d o n b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . C a n c e r R e s . 4 2 , 3 9 1 8 - 3 9 2 3 . B u c h m a n n , A . , B a u e r - H o f r n a n n , R . , M a h r , J . , D r i n k w a t e r , N . R . , L u z , A . , a n d S c h w a r z , M . ( 1 9 9 1 ) M u t a t i o n a l a c t i v a t i o n o f t h e c - H a - r a s g e n e i n l i v e r t u m o r s o f d i f f e r e n t r o d e n t s t r a i n s : C o r r e l a t i o n w i t h s u s c e p t i b i l i t y t o h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 8 8 , 9 1 1 — 9 1 5 . C h e n , Y . , F e r g u s o n , S . S . , N e g i s h i , M . , a n d G o l d s t e i n , J . A . ( 2 0 0 3 ) I d e n t i fi c a t i o n o f c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r a n d g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r b i n d i n g s i t e s i n t h e C Y P 2 C I 9 p r o m o t e r . M o l . P h a r m a c o l . 6 4 , 3 1 6 - 3 2 4 . C o u n t s , J . L . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 5 ) A l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n m a y p l a y a v a r i e t y o f r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s . C e l l 8 3 , 1 3 - 1 5 . C o u n t s , J . L . , S a r m i e n t o , J . I . , H a r b i s o n , M . L . , D o w n i n g , J . C . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 6 ) . C e l l p r o l i f e r a t i o n a n d g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s c h a n g e s i n m o u s e l i v e r a f t e r p h e n o b a r b i t a l a n d / o r c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e fi c i e n t d i e t a d m i n i s t r a t i o n . C a r c i n o g e n e s i s 1 7 , 1 2 5 1 - 1 2 5 7 . D a i , M . , W a n g , P . , B o y d , A . D . , K o s t o v , G . , A t h e y , B . , J o n e s , E . G . , B u n n e y , W . E . , M y e r s , R . M . , S p e e d , T . P . , A k i l , H . , W a t s o n , S . J . , a n d M e n g , F . ( 2 0 0 5 ) E v o l v i n g 3 3 0 g e n e / t r a n s c r i p t d e fi n i t i o n s s i g n i fi c a n t l y a l t e r t h e i n t e r p r e t a t i o n o f G e n e C h i p d a t a . N u c l e i c A c i d s R e s . 3 3 , e 1 7 5 . D e n n i s , G . J r . , S h e r m a n , B . T . , H o s a c k , D . A . , Y a n g , J . , G a o , W . , L a n e , H . C . , L e m p i c k i , R . A . ( 2 0 0 3 ) D A V I D : D a t a b a s e f o r A n n o t a t i o n , V i s u a l i z a t i o n , a n d I n t e g r a t e d D i s c o v e r y . G e n o m e B i o l . 4 , P 3 . E s t e l l e r , M . ( 2 0 0 7 ) E p i g e n e t i c g e n e s i l e n c i n g i n c a n c e r : t h e D N A h y p e r m e t h y l o m e . H u m . M o l . G e n e t . 1 6 S p e c N o 1 , R 5 0 - 5 9 . F e i n b e r g , A . P . , O h l s s o n , R . , a n d H e n i k o f f , S . ( 2 0 0 6 ) T h e e p i g e n e t i c p r o g e n i t o r o r i g i n o f h u m a n c a n c e r . N a t . R e v . G e n e t . 7 , 2 1 - 3 3 . “ 1 F i e l d e n , M . R . , B r e n n a n , R . , a n d G o l l u b , J . ( 2 0 0 7 ) A g e n e e x p r e s s i o n b i o m a r k e r p r o v i d e s e a r l y p r e d i c t i o n a n d m e c h a n i s t i c a s s e s s m e n t o f h e p a t i c t u m o r i n d u c t i o n b y n o n - g e n o t o x i c c h e m i c a l s . T o x i c o l . S c i . 9 9 , 9 0 - 1 0 0 . G e r b a l - C h a l o i n , S . , D a u j a t , M . , P a s c u s s i , J . M . , P i c h a r d - G a r c i a , L . , V i l a r e m , M . J . , a n d v M a u r e l , P . ( 2 0 0 2 ) T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f C Y P 2 C 9 g e n e . R o l e o f g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r a n d c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r . J . B i o l . C h e m . 2 7 7 , 2 0 9 - 2 1 7 . G o o d m a n , J . 1 . , a n d W a t s o n , R . E . ( 2 0 0 2 ) A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n : a s e c o n d a r y m e c h a n i s m i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s . A n n u . R e v . P h a r m a c o l . T o x i c o l . 4 2 , 5 0 1 - 5 2 5 . G o o d w i n , B . , H o d g s o n , E . , D ’ C o s t a , D . J . , R o b e r t s o n , G . R . , a n d L i d d l e , C . ( 2 0 0 2 ) T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f t h e h u m a n C Y P 3 A 4 g e n e b y t h e c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r . M o l . P h a r m a c o l . 6 2 , 3 5 9 - 3 6 5 . G r c n b a e k , K . , H o t h e r , C . , a n d J o n e s , P . A . ( 2 0 0 7 ) E p i g e n e t i c c h a n g e s i n c a n c e r . A P M S ( A c t a P a t h o l o g i c a , M i c r o b i o l o g i c a e t I m m u n o l o g i c a S c a n d i n a v i c a ) 1 1 5 , 1 0 3 9 - 1 0 5 9 . H a n a h a n , D . , a n d W e i n b e r g , R . A . ( 2 0 0 0 ) T h e h a l l m a r k s o f c a n c e r . C e l l 1 0 0 , 5 7 - 7 0 . H o n k a k o s k i , P . , Z e l k o , 1 . , S u e y o s h i , T . , a n d N e g i s h i , M . ( 1 9 9 8 ) T h e n u c l e a r o r p h a n r e c e p t o r C A R - r e t i n o i d X r e c e p t o r h e t e r o d i m e r a c t i v a t e s t h e p h e n o b a r b i t a l - r e s p o n s i v e e n h a n c e r m o d u l e o f t h e C Y P Z B g e n e . M o l . C e l l . B i o l . 1 8 , 5 6 5 2 - 5 6 5 8 . H u a n g , W . , Z h a n g , J . , W a s h i n g t o n , M . , L i u , J . , P a r a n t , J . M . , L o z a n o , G . , M o o r e , D . D . ( 2 0 0 5 ) X e n o b i o t i c s t r e s s i n d u c e s h e p a t o m e g a l y a n d l i v e r t u m o r s v i a t h e n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r . M o l . E n d o c r i n o l . 1 9 , 1 6 4 6 - 1 6 5 3 . I i d a , M . , A n n a , C . H . , H o l l i d a y , W . M . , C o l l i n s , J . B . , C u n n i n g h a m , M . L . , S i l l s , R . C . , D e v e r e u x , T . R . ( 2 0 0 5 ) U n i q u e p a t t e r n s o f g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s i n l i v e r a f t e r t r e a t m e n t o f m i c e f o r 2 w e e k s w i t h d i f f e r e n t k n o w n c a r c i n o g e n s a n d n o n - c a r c i n o g e n s . C a r c i n o g e n e s i s 2 6 , 6 8 9 - 6 9 9 . 3 3 1 K a w a m o t o , T . , S u e y o s h i , T . , Z e l k o , 1 . , M o o r e , R . , W a s h b u r n , K . , a n d N e g i s h i M . ( 1 9 9 9 ) P h e n o b a r b i t a l - r e s p o n s i v e n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f t h e r e c e p t o r C A R i n i n d u c t i o n o f t h e C Y P 2 B g e n e . M o l . C e l l . B i o l . 1 9 , 6 3 1 8 - 6 3 2 2 . K o b a y a s h i , K . , S u e y o s h i , T . , I n o u e , K . , M o o r e , R . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 3 ) C y t o p l a s m i c a c c u m u l a t i o n o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R b y a t e t r a t r i c o p e p t i d e r e p e a t p r o t e i n i n H e p G 2 c e l l s . M o l . P h a r m a c o l . 6 4 , 1 0 6 9 - 1 0 7 5 . K o l a j a , K . L . , S t e v e n s o n , D . E . , J o h n s o n J . T . , W a l b o r g , J r . , E . F . , a n d K l a u n i g , J . E . ( 1 9 9 6 a ) S u b c h r o n i c e f f e c t s o f d i e l d r i n a n d p h e n o b a r b i t a l o n h e p a t i c D N A s y n t h e s i s i n m i c e a n d r a t s . F u n d a m . A p p l . T o x i c o l . 2 9 , 2 1 9 - 2 2 8 . K o l a j a , K . L . , S t e v e n s o n , D . E . , W a l b o r g J r . , E . F . , a n d K l a u n i g J . E . ( 1 9 9 6 b ) . D o s e d e p e n d e n c e o f p h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n o f p r e n e o p l a s t i c h e p a t i c l e s i o n s i n F 3 4 4 r a t s a n d B 6 C 3 F 1 m i c e : e f f e c t s o n D N A s y n t h e s i s a n d a p o p t o s i s . C a r c i n o g e n e s i s 1 7 , 9 4 7 - 9 5 4 . L o e b , L . A . , a n d H a r r i s , C . C . ( 2 0 0 8 ) A d v a n c e s i n c h e m i c a l c a r c i n o g e n e s i s : a h i s t o r i c a l r e v i e w a n d p r o s p e c t i v e . C a n c e r R e s . 6 8 , 6 8 6 3 - 6 8 7 2 . M a n t o v a n i , A . ( 2 0 0 9 ) C a n c e r : I n fl a m i n g m e t a s t a s i s . N a t u r e 4 5 7 , 3 6 - 3 7 . M a r x , J . ( 2 0 0 8 ) C a n c e r b i o l o g y . A l l i n t h e s t r o m a : c a n c e r ' s C o s a N o s t r a . S c i e n c e 3 2 0 , 3 8 4 1 . N a u g l e r , W . E , S a k u r a i , T . , K i m , S . , M a e d a , S . , K i m , K . , E l s h a r k a w y , A . M . , a n d K a r i n , M . ( 2 0 0 7 ) G e n d e r d i s p a r i t y i n l i v e r c a n c e r d u e t o s e x d i f f e r e n c e s i n M y D 8 8 - d e p e n d e n t I L - 6 p r o d u c t i o n . S c i e n c e 3 1 7 , 1 2 1 — 1 2 4 . N e m o t o , N . , a n d S a k u r a i , J . ( 1 9 9 5 ) G l u c o c o r t i c o i d a n d s e x h o r m o n e s a s a c t i v a t i n g o r m o d u l a t i n g f a c t o r s f o r e x p r e s s i o n o f C y p 2 b - 9 a n d C y p 2 b - 1 0 i n t h e m o u s e l i v e r a n d h e p a t o c y t e s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 3 1 9 , 2 8 6 - 2 9 2 . P a p a , S . , Z a z z e r o n i , F . , B u b i c i , C . , J a y a w a r d e n a , S . , A l v a r e z , K . , M a t s u d a , S . , N g u y e n , D . U . , P h a m , C . G . , N e l s b a c h , A . H . , M e l i s , T . , D e S m a e l e , E . , T a n g , W . J . , D ' A d a m i o , L . , a n d F r a n z o s o , G . ( 2 0 0 4 ) G a d d 4 5 0 m e d i a t e s t h e N F - K B s u p p r e s s i o n o f J N K s i g n a l l i n g b y t a r g e t i n g M K K 7 / J N K K 2 . N a t . C e l l . B i o l . 6 , 1 4 6 - 1 5 3 . P h i l l i p s , J . M . , Y a m a m o t o . Y , , N e g i s h i , M . , M a r o n p o t , R . R . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 7 ) . O r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r - m e d i a t e d a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n d u r i n g p h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n o f l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T o x i c o l . S c i . 9 6 , 7 2 — 8 2 . P h i l l i p s , J . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 8 ) I d e n t i fi c a t i o n o f g e n e s t h a t m a y p l a y c r i t i c a l r o l e s i n p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d l i v e r t u m o r i g e n e s i s d u e t o a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n . T o x i c o l . S c i . 1 0 4 , 8 6 - 9 9 . 3 3 2 P h i l l i p s , J . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 9 a ) M u l t i p l e g e n e s e x h i b i t p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) - m e d i a t e d D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s d u r i n g l i v e r t u m o r i g e n e s i s a n d i n l i v e r t u m o r s . T o x i c o l . S c i . , a c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n . P h i l l i p s , J . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 9 b ) P h e n o b a r b i t a l ( P B ) e l i c i t s u n i q u e , e a r l y c h a n g e s i n t h e e x p r e s s i o n o f h e p a t i c g e n e s t h a t a f f e c t c r i t i c a l p a t h w a y s i n t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e . T o x i c o l . S c i . , s u b m i t t e d f o r p u b l i c a t i o n . R a n g a r a j a n , A . , a n d W e i n b e r g , R . A . ( 2 0 0 3 ) O p i n i o n : C o m p a r a t i v e b i o l o g y o f m o u s e . _ v e r s u s h u m a n c e l l s : m o d e l l i n g h u m a n c a n c e r i n m i c e . N a t . R e v . C a n c e r 3 , 9 5 2 - 9 5 9 . F S t a n l e y , L . A . , H o r s b u r g h , B . C . , R o s s , J . , S c h e e r , N . , a n d W o l f , C . R . ( 2 0 0 6 ) D r u g M e t a b . R e v . P X R a n d C A R : n u c l e a r r e c e p t o r s w h i c h p l a y a p i v o t a l r o l e i n d r u g d i s p o s i t i o n a n d c h e m i c a l t o x i c i t y . 3 8 , 5 1 5 - 5 9 7 . S t u p a n s , I . , I k e d a , T . , K e s s l e r , D . J . , a n d N e b e r t , D . W . ( 1 9 8 4 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f a ' c D N A c l o n e f o r m o u s e p h e n o b a r b i t a l - i n d u c i b l e c y t o c h r o m e P - 4 5 0 b . D N A 3 , 1 2 9 - 1 3 7 . S u e y o s h i , T . , K a w a m o t o , T . , Z e l k o , I . , H o n k a k o s k i , P . , a n d N e g i s h i , M . ( 1 9 9 9 ) T h e r e p r e s s e d n u c l e a r r e c e p t o r C A R r e s p o n d s t o p h e n o b a r b i t a l i n a c t i v a t i n g t h e h u m a n C Y P 2 B 6 g e n e . . 1 B i o l . C h e m . 2 7 4 , 6 0 4 3 - 6 0 4 6 . S u e y o s h i , T . , M o o r e , R . , S u g a t a n i , J . , M a t s u m u r a , Y . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 8 ) P P P 1 R 1 6 A , t h e m e m b r a n e s u b u n i t o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e I B , s i g n a l s n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r . M o l . P h a r m a c o l . 7 3 , 1 1 1 3 - 1 1 2 1 . S u g a t a n i , J . , K o j i m a , H . , U e d a , A . , K a k i z a k i , S . , Y o s h i n a r i , K . , G o n g , Q . R , O w e n s , 1 . S . , N e g i s h i , M . , a n d S u e y o s h i , T . ( 2 0 0 1 ) T h e p h e n o b a r b i t a l r e s p o n s e e n h a n c e r m o d u l e i n t h e h u m a n b i l i r u b i n U D P - g l u c u r o n o s y l t r a n s f e r a s e U G T [ A ] g e n e a n d r e g u l a t i o n b y t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R . H e p a t o l o g y 3 3 , 1 2 3 2 - 1 2 3 8 . S u n , Y . V . , B o v e r h o f , D . R . , B u r g o o n , L . D . , F i e l d e n , M . R . , a n d Z a c h a r e w s k i , T . R . ( 2 0 0 4 ) C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f d i o x i n r e s p o n s e e l e m e n t s i n h u m a n , m o u s e a n d r a t g e n o m i c s e q u e n c e s . N u c l e i c A c i d s R e s . 3 2 , 4 5 1 2 - 4 5 2 3 . T o m i d a , S . , Y a n a g i s a w a , K . , K o s h i k a w a , K . , Y a t a b e , Y . , M i t s u d o m i , T . , O s a d a , H . , a n d T a k a h a s h i , T . ( 2 0 0 7 ) I d e n t i fi c a t i o n o f a m e t a s t a s i s s i g n a t u r e a n d t h e D L X 4 h o m e o b o x p r o t e i n a s a r e g u l a t o r o f m e t a s t a s i s b y c o m b i n e d t r a n s c r i p t o m e a p p r o a c h . O n c o g e n e 2 6 , 4 6 0 0 - 4 6 0 8 . 3 3 3 U e d a , A . , H a m a d e h , H . K . , W e b b , H . K . , Y a m a m o t o , Y . , S u e y o s h i , T . , A f s h a r i , C . A . , L e h m a n n , J . M . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 2 ) D i v e r s e r o l e s o f t h e n u c l e a r o r p h a n r e c e p t o r C A R i n r e g u l a t i n g h e p a t i c g e n e s i n r e s p o n s e t o p h e n o b a r b i t a l . M o l . P h a r m a c o l . 6 1 , 1 - 6 . W e i n s t e i n , I . B . ( 2 0 0 0 ) D i s o r d e r s i n c e l l c i r c u i t r y d u r i n g m u l t i s t a g e c a r c i n o g e n e s i s : t h e r o l e o f h o m e o s t a s i s . C a r c i n o g e n e s i s 4 , 8 5 7 - 8 6 4 . W e i n s t e i n , I . B . ( 2 0 0 2 ) A d d i c t i o n t o o n c o g e n e s - - t h e A c h i l l e s h e a l o f c a n c e r . S c i e n c e 2 9 7 , 6 3 - 6 4 . W h y s n e r , J . , R o s s , P . M . , a n d W i l l i a m s , G . M . ( 1 9 9 6 ) . P h e n o b a r b i t a l m e c h a n i s t i c d a t a a n d r i s k a s s e s s m e n t : e n z y m e i n d u c t i o n , e n h a n c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n d t u m o r p r o m o t i o n . P h a r m a c o l . T h e r . 7 1 , 5 3 - 9 1 . W u , Z . , I r i z a r r y , R . A . , G e n t l e m a n , R . , M a r t i n e z - M u r i l l o , F . , a n d S p e n c e r , F . ( 2 0 0 4 ) A m o d e l b a s e d b a c k g r o u n d a d j u s t m e n t f o r o l i g o n u c l e o t i d e e x p r e s s i o n a r r a y s . J . A m . S t a t . A s s o c . 9 9 , 9 0 9 - 9 1 7 . Y a m a m o t o , Y . , K a w a m o t o , T . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 3 ) T h e r o l e o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R a s a c o o r d i n a t e r e g u l a t o r o f h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n i n d e f e n s e a g a i n s t c h e m i c a l t o x i c i t y . A r c h B i o c h e m . B i o p h y s . 4 0 9 , 2 0 7 - 2 1 1 . Y a m a m o t o , Y . , M o o r e , R . , G o l d s w o r t h y , T . L . , N e g i s h i , M . , a n d M a r o n p o t , R . R . ( 2 0 0 4 ) T h e o r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r i s e s s e n t i a l f o r l i v e r t u m o r p r o m o t i o n b y p h e n o b a r b i t a l i n m i c e . C a n c e r R e s . 6 4 , 7 1 9 7 - 7 2 0 0 . Y a m a m o t o , Y . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 8 ) T h e a n t i a p o p t o t i c f a c t o r g r o w t h a r r e s t a n d D N A - d a m a g e - i n d u c i b l e 4 5 B r e g u l a t e s t h e n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r - m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n . D r u g M e t a b . D i s p o s . 3 6 , 1 1 8 9 - 1 1 9 3 . Y o s h i n a r i , K . , K o b a y a s h i , K . , M o o r e , R . , K a w a m o t o , T . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 3 ) I d e n t i fi c a t i o n o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R : H S P 9 0 c o m p l e x i n m o u s e l i v e r a n d r e c r u i t m e n t o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e 2 A i n r e s p o n s e t o p h e n o b a r b i t a l . F E B S L e t t . 5 4 8 , 1 7 - 2 0 . 3 3 4 C H A P T E R 5 A P P E N D I X D a t a w i t h i n t h e a p p e n d i x c o n s i s t o f : P r i n c i p a l C o m p o n e n t A n a l y s i s o f t h e m i c r o a r r a y d a t a ( F i g . 5 . 6 ) , b o x p l o t d e p i c t i n g t h e d i s t r i b u t i o n o f m i c r o a r r a y d a t a ( F i g . 5 . 7 ) , V e n n d i a g r a m s d e p i c t i n g n u m b e r s o f g e n e s t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s i n a t l e a s t 5 / 6 o r 6 / 6 t o t a l m i c e p e r g r o u p ( F i g . 5 . 8 ) , d a t a f r o m q R T - P C R a s s a y s o f u n i q u e l y a c t i v e g e n e s ( i d e n t i fi e d b y m i c r o a r r a y a n a l y s i s ) i n p r e c a n c e r o u s a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( T a b l e 5 . 4 ) , u n i q u e l y a c t i v e k i n a s e , p h o s p h a t a s e , a n d p h o s p h a t a s e r e g u l a t o r y ( i n h i b i t o r ) g e n e s t h a t a r e c a n d i d a t e s f o r i n v o l v e m e n t i n P B - i n d u c e d C A R a c t i v a t i o n ( T a b l e 5 . 5 ) , q R T - P C R e x p r e s s i o n d a t a o f g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( T a b l e 5 . 6 ) , a n d q R T - P C R e x p r e s s i o n d a t a o f g e n e s i d e n t i fi e d f r o m i d e n t i c a l , u n i q u e R A M S i n B 6 C 3 F 1 ( 2 a n d / o r 4 w e e k s ) a n d C A R W T ( p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ) m i c e ( T a b l e 5 . 7 ) . N o t e t h a t t h e s e d a t a a r e a s u b s e t o f t h e t o t a l S u p p l e m e n t a r y I n f o r m a t i o n t h a t c a n b e f o u n d i n t h e v e r s i o n o f t h i s m a n u s c r i p t t h a t w a s s u b m i t t e d t o T o x i c o l o g i c a l S c i e n c e s i n M a r c h 2 0 0 9 . 3 3 5 A 0 W T , 2 3 w k c o n t r o l a A P r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( W T , 2 3 w k P B ) 0 9 v V I n d i v i d u a l l i v e r t u m o r ( W T , 3 2 w k P B ) N T a ° K O , 2 3 w k c o n t r o l A V K O . 2 3 w k P B 9 , — 1 N O 0 ' v O - 0 ° v V 8 V 9 — 0 ° ° V c - 0 ° v r r I r l - 2 0 0 2 0 4 O 6 0 P C 1 F ' g p r e 5 . 6 P r i n c i p l e C o m p o n e n t A n a l y s i s ( P C A ) o f G e n e E x p r e s s i o n P a t t e r n s E x h i b i t e d i n T i s s u e S a m p l e s f r o m C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e ( W T ) a n d K n o c k o u t ( K O ) M i c e . M i c r o a r r a y a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d o n R N A i s o l a t e d f r o m 5 g r o u p s o f t i s s u e s w h i c h w e r e o b t a i n e d f r o m l i v e r s o f c o n t r o l a n d p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - t r e a t e d m i c e : W T , 2 3 w k c o n t r o l , N = 5 ; p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( W T , 2 3 w k P B ) , N = 6 ; i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( W T , 3 2 w k P B ) , N = 6 ; K O , 2 3 w k c o n t r o l , N = 5 ; a n d K O , 2 3 w k P B , N = 5 . P C A i s a d i m e n s i o n r e d u c t i o n t e c h n i q u e t h a t c r e a t e s a x e s t h r o u g h t h e d a t a ( P r i n c i p a l C o m p o n e n t s ; P C ) t h a t a c c o u n t f o r v a r i a b i l i t y w i t h i n t h e d a t a s e t . P C 1 a c c o u n t s f o r t h e l a r g e s t v a r i a n c e , P C 2 i s o r t h o g o n a l t o P C 1 a n d a c c o u n t s f o r t h e n e x t l a r g e s t v a r i a n c e , a n d s o f o r t h , u n t i l a l l o f t h e v a r i a n c e i s e x p l a i n e d . S i m i l a r i t i e s a n d d i f f e r e n c e s o f o v e r a l l g e n e e x p r e s s i o n p a t t e r n s a r e e v i d e n t . T h i s i m a g e i s p r e s e n t e d i n c o l o r . 3 3 6 o o - - » » . 9 0 0 o | o . . 1 n — . 4 0 . - . o n 0 o . w - o 0 — 4 m 0 . = . . p n - - m - i _ n a p n 4 4 n . _ . a - - - — - - m - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 - - - - - - - - - l - - - - - - - ) - - - l J J J J J - l l - - - - l } l J 4 J J | I l | - - - - - - - " - - — - - - - - - { [ - - - - - - - - - — — — — - - — - - — - " - - - - - - - - - - - - ’ — - - - - - - - - - - - - — - — - - - - - — - - - r 1 l r r r r r r l r r r r r r r r r 1 r r r r r * w h i c h e x t e n d s f r o m 1 1 1 2 2 2 1 1 3 2 / l \ * / A { t h e 2 5 t h t o t h e 7 5 t h l i s t e d a l o n g t h e l e f t - h a n d s i d e . T h e w h i t e b a r s r e p r e s e n t t h e i n t e r q u a r t i l e r a n g e ( I Q R ) , 3 3 3 7 | / | * / { " { ( 0 ) b e y o n d t h e “ w h i s k e r s ” r e fl e c t s a n o u t l y i n g d a t a p o i n t . t h e I Q R r e p r e s e n t t h e m e d i a n v a l u e . T h e “ w h i s k e r s ” e n d a t + 1 . 5 * I Q R u n i t s . E v e r y d o t 4 2 3 3 4 3 5 * I * A / { | 4 5 4 4 5 6 5 5 6 F i g p r e 5 . 7 D i s t r i b u t i o n o f M i c r o a r r a y D a t a t h a t w e r e G e n e r a t e d u s i n g R N A | * { " / ( P B ) - t r e a t e d m i c e : W T , 2 3 w k c o n t r o l , N = 5 ( A ) ; p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( W T , 2 3 w k P B ) , N = 6 ( * ) ; i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( W T , 3 2 w k P B ) , N = 6 ( / ) ; K O , 2 3 w k c o n t r o l , N ( I ) ; a n d K O , 2 3 w k P B , N = 5 ( { ) . A “ b o x - a n d - w h i s k e r ” p l o t w a s u t i l i z e d t o e x p r e s s t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e d a t a . T h e i n d i v i d u a l s a m p l e s a r e l i s t e d a l o n g t h e b o t t o m o f t h e fi g u r e , a n d t h e n o r m a l i z e d i n t e n s i t y v a l u e s ( i n l o g 2 f o r m ) , r e p r e s e n t i n g e x p r e s s i o n l e v e l s , a r e I s o l a t e d f r o m C o n s t i t u t i v e A c t i v e / A n d r o s t a n e R e c e p t o r ( C A R ) W i l d t y p e ( W T ) a n d K n o c k o u t ( K O ) M o u s e T i s s u e s . M i c r o a r r a y a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d o n R N A i s o l a t e d f r o m 5 g r o u p s o f t i s s u e s w h i c h w e r e o b t a i n e d f r o m l i v e r s o f c o n t r o l a n d p h e n o b a r b i t a l p e r c e n t i l e s , a n d t h e h o r i z o n t a l b l a c k b a r s w i t h i n F _ _ - _ F - - - - 5 P r e c a n c e r o u s ( 1 1 3 ) T u m o r ( 8 8 9 ) G e n e s a c t i v e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s i n a t l e a s t 3 / 6 t o t a l m i c e / g r o u p : 9 3 3 _ _ m T 2 8 T 6 0 T 5 2 8 P r e c a n c e r o u s ( 5 1 ) T u m o r ( 3 8 5 ) G e n e s a c t i v e i n p r e c a n c e r o u s _ 3 _ 5 _ l _ l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l T 2 4 3 l i v e r t u m o r s i n l 1 0 8 a t l e a s t 5 / 6 t o t a l m i c e / g r o u p : 4 0 2 P r e c a n c e r o u s 3 5 ) T u m o r ( 9 4 ) G e n e s a c t i v e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s i n a l l 6 m i c e / g r o u p : 1 0 6 F i g u r e 5 . 8 I d e n t i fi c a t i o n o f U n i q u e l y A c t i v e G e n e s i n P r e c a n c e r o u s L i v e r a n d / o r I n d i v i d u a l L i v e r T u m o r s . M i c r o a r r a y a n a l y s i s w a s e m p l o y e d t o i d e n t i f y u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s b a s e d o n a t l e a s t 3 / 6 s a m p l e s e x h i b i t i n g e x p r e s s i o n l e v e l s o u t s i d e o f t h e 9 9 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l ( C I ) o f t h e n o r m a l i z e d i n t e n s i t y v a l u e s o f t h e c o n t r o l g r o u p , i n a d d i t i o n t o b e i n g 2 2 - f o l d u p - o r d o w n - r e g u l a t e d . C o m p a r i s o n o f 1 1 3 u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d 8 8 9 u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s r e v e a l e d a t o t a l o f 9 3 3 : 6 9 c a r r i e d f o r w a r d ( i . e . w e r e u n i q u e l y i n d u c e d o r r e p r e s s e d i n b o t h g r o u p s ) , w h i l e 4 4 w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d 8 2 0 w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( F i g . 1 ) . I n o r d e r t o b e p r o g r e s s i v e l y m o r e s t r i n g e n t , c o r e g r o u p s o f u n i q u e l y a c t i v e g e n e s w e r e i d e n t i fi e d b a s e d o n a t l e a s t 5 / 6 a n d 6 / 6 s a m p l e s e x h i b i t i n g e x p r e s s i o n l e v e l s o u t s i d e o f t h e 9 9 % C I o f t h e n o r m a l i z e d i n t e n s i t y v a l u e s o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a , i n a d d i t i o n t o b e i n g 2 2 - f o l d u p - o r d o w n - r e g u l a t e d . C o m p a r i s o n o f 5 1 g e n e s t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n a t l e a s t 5 / 6 p r e c a n c e r o u s l i v e r s a m p l e s a n d 3 8 5 g e n e s t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n a t l e a s t 5 / 6 i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s r e v e a l e d a t o t a l o f 4 0 2 : 3 4 g e n e s c a r r i e d f o r w a r d , w h i l e 1 7 g e n e s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d 3 5 1 g e n e s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . F i n a l l y , c o m p a r i s o n o f 3 5 g e n e s t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n a l l 6 p r e c a n c e r o u s l i v e r s a m p l e s a n d 9 4 g e n e s t h a t w e r e u n i q u e l y a c t i v e i n a t a l l 6 i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s r e v e a l e d a t o t a l o f 1 0 6 : 2 3 g e n e s c a r r i e d f o r w a r d , w h i l e 1 2 g e n e s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d 7 1 g e n e s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s . G e n e l i s t s a r e f o u n d w i t h i n S u p p l e m e n t a r y I n f o r m a t i o n i n t h e s u b m i t t e d m a n u s c r i p t . 3 3 8 n i e v i t c A y l e u q i n U e r e w t a a h t s t a D e R C P - T R l n e G 2 2 f o n o i s s e r p x E e h t f o s i s s y r l a o n m A u ) R C T r e v P i - L T l R a q u ( d R i v i C d n P I e r m o i - 6 1 9 . . 8 . c c c 5 8 2 L . . . - - n n n 1 1 L 3 8 1 5 4 5 3 7 6 2 9 1 4 2 5 4 1 2 T 1 1 1 1 2 7 1 3 1 1 — - 9 1 1 3 / 2 3 1 2 t d - n l a a e e R u s e s v i i T t a r t e i v t i n L a u s Q u o r e c l u " 6 9 3 4 1 1 1 1 1 0 0 5 5 1 4 3 2 2 7 3 . 3 1 1 T - 1 + a + 5 a F 4 d d c a e r W G T a U n i q u e l y A c t i v e G e n e a F o l d C h a n g e B a s e d o n M i c r o a r r a y A n a l y s i s b M e a n F o l d C h a n g e i n P B - t r e a t e d G r o u p c N o . o f a n i m a l s a b o v e u p p e r l i m i t o f 9 5 % C I o f c o n t r o l g r o u p ‘ 1 N o . o f a n i m a l s b e l o w l o w e r l i m i t o f 9 5 % C I o f c o n t r o l g r o u p d P T 1 0 6 6 C a s p l I - 1 4 3 1 1 1 . 0 T K M [ - P I # 4 T 2 2 9 A n . c . n . c . C c n d l - 1 1 . 0 1 - L 9 4 n . c . n . c . 1 - 5 0 2 1 n . c . n . c . T 6 6 7 1 - 7 0 8 § T 3 0 6 1 . 3 . 9 4 § T 5 . 4 9 1 2 5 0 1 5 2 1 n . c . 1 3 8 3 n . c . 1 2 9 0 1 1 1 5 1 7 3 4 I h h . . n . c . T 2 6 8 n . c . n . c . 1 4 4 0 T 5 3 6 n . c . 1 3 5 0 n . c . 1 2 2 5 n . c . 1 2 4 4 T 1 J 8 T 2 6 1 Q W O N v — W C O — ‘ V N O — ‘ O 5 T 4 8 8 1 - 1 2 2 6 1 7 9 0 n . c . T 3 6 8 9 n . c . 1 5 2 5 n . c . 1 5 1 9 T 3 8 7 n . c . 1 3 0 5 2 O O O O ~ O O ~ O O N N O ~ C ~ O O W V V m fi V W V W W W V ’ V W W W W W Q O O O O O O O N O O V — O O O O — ‘ N — t C O C O — ‘ H O — ‘ O O O O O O O O O O M N W — ‘ fi ‘ n V — N M C N W O V M V N n i e v i t c A y l e u q i n U e r e w t a h t s e n e G 2 2 f o n o i s s e r p x E e h t f o s i s y l a n A ) R C P s - r T o R m q u ( T R r e C v P i L e m l i a u t d - i l v a i e d R n I e v r i o t / a d t n i a t n e a u u s Q s i d T e r u e n v i i t L n o s c u o 4 r . e 5 c n e a l c b e a r T P 3 4 0 1 3 . 0 3 . - n . c . 1 2 . 7 9 1 - 3 . 2 2 ] 2 1 4 . 4 0 - - ' 1 1 , 7 9 1 . 1 5 . 5 9 n . c . | T 3 7 . 8 0 . - 1 1 2 . 9 2 1 3 4 . 9 3 1 2 . 5 7 | 6 T 3 . 1 7 - n . c . l T 3 . 2 9 n . c . I 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 M # 1 0 t h V 3 W M M 6 “ T w e n t y - t w o u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , a s u b s e t o f t h e 9 3 3 i d e n t i fi e d b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s ( a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s ) , w e r e c h o s e n f o r c o n f i r m a t i o n o f t h e i r e x p r e s s i o n s t a t u s e s b y q R T - P C R . G e n e s h i g h l i g h t e d i n g r a y w e r e a c t i v e i n a t l e a s t 5 / 6 t o t a l p r e c a n c e r o u s l i v e r s a m p l e s u n b o l d e d a n d u n d e r l i n e d , a t l e a s t 5 / 6 i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( u n b o l d e d ) , o r a t l e a s t 5 / 6 p r e c a n c e r o u s l i v e r Q 4 5 / 6 t u m o r s a m p l e s ( b o l d e d ) . U n i q u e l y a c t i v e c a r r y f o r w a r d g e n e s ( i . e . t h o s e u p - o r d o w n - r e g u l a t e d i n b o t h p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ) a r e d e n o t e d b y a p l u s S i g n ( + ) . b F o l d c h a n g e s o f g e n e e x p r e s s i o n ( b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s ) a r e e x p r e s s e d a s a c h a n g e i n a p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - t r e a t e d g r o u p v . i t s c o n t r o l ( c o m p a r i s o n s w e r e m a d e a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s ) . A l l c h a n g e s , w i t h t h e e x c e p t i o n o f 2 ( ' 1 ) , w e r e c o n fi r m e d b y q R T - P C R . F o l d c h a n g e s ( u p - r e g u l a t i o n , T a n d d o w n - r e g u l a t i o n , 1 ) i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e ( P ) , i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s ( T ) , a n d l i v e r t i s s u e f r o m c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) k n o c k o u t , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e ( K ) a r e l i s t e d . ( - ) i n d i c a t e s t h a t a g e n e w a s n o t a c t i v e . c A l l f o l d c h a n g e s l i s t e d a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t i n a P B - t r e a t e d g r o u p v . i t s c o n t r o l ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) . N o c h a n g e ( n . c . ) i n d i c a t e s t h a t t h e f o l d c h a n g e w a s n o t S i g n i fi c a n t . q R T - P C R r e v e a l e d u n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e s t h a t w e r e n o t d e t e c t e d b y m i c r o a r r a y a n a l y s i s ( h i g h l i g h t e d i n g r a y ) . F o r F g f 2 1 , t h e f o l d c h a n g e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e w a s n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t fi ' o m t h e f o l d c h a n g e i n l i v e r t i s s u e fi o m C A R K O , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e , S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ( * ) . “ T h e 9 5 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l ( C I ) o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a w a s c a l c u l a t e d , a n d t h e n u m b e r o f s a m p l e s ( o u t o f 6 t o t a l f o r p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d i n d i v i d u a l l i v e r t u m o r s , a n d 5 t o t a l f o r C A R K O ) f r o m a P B - t r e a t e d g r o u p t h a t f e l l o u t s i d e t h e 9 5 % C 1 a r e l i s t e d . H i g h l i g h t e d i n g r a y a r e t h o s e c i r c u m s t a n c e s w h e r e d a t a f r o m a t l e a s t 3 o f t h e p r e c a n c e r o u s s a m p l e s t h a t f e l l o u t s i d e t h e 9 5 % C I o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a w e r e c o n s i d e r e d a n ‘ i n d i c a t i o n ’ o f a n e x p r e s s i o n c h a n g e . A n a s t e r i s k ( * ) d e n o t e s a n i n d i c a t i o n o f a u n i q u e c h a n g e . s u o r e c n a c e r P n i e v i t c A y l e u q i n U l ‘ s r o m s u a T d e c fi e i t n g n e a d I s h C e d n l d e G t i n o s F u o r e u c b n u a S c ) r e r o P t i b i h n I ( y r o t a l u g e R e s a t l a ' h s p r s o o m h u P T d r n e a v i , L e s l a a t u d a i h v p i s d o n h I P r , o e / s d a n n a i K e u s 5 . s 5 i T e r l e b v a i T L 3 4 1 T i e l 1 3 . 5 6 D k 3 1 1 3 . 2 1 1 1 1 . 9 7 N e k 2 1 1 0 . 3 3 A u r k a 1 7 . 0 0 H u n k 1 5 . 7 9 P r n g 1 5 . 4 0 R o c k 2 T 3 . 8 7 C s n k l e 1 3 . 7 2 . F r k 1 3 . 5 9 K l n a s e s T 3 . 3 4 d e k 1 3 . 1 4 L i m k l 1 2 . 8 4 1 2 . 7 4 N a g k 1 2 . 4 1 P i 4 k 2 b 1 2 . 2 8 M a p k 3 T 2 . 2 5 F l t 4 1 - 3 . 0 0 S 1 1 - 3 2 0 1 - 3 . 2 1 C a m k k 2 1 - 3 . 6 l n i e v i t c A y l e u q i n s U s a d e fi i 8 8 t . n 3 d e t u r e o e n n i r t i b e p i e c a h g d e e n f h x r t a e o s C e c ( i 7 l d w e e 0 e n r g t . p n a a g d 3 a h n n n t a s a e - - i h d I s 1 1 s e a c e c s y h k e e d n r f n l e g o w e o g F n e 4 n e G t i r m b u S ) r o t i b i h g n c f i o r e o i v ; d o e t i s s c t d e e t 2 c h o g r t a g i a h n i d y t l a l h e e h e M c g t e c i u q i n e h s d m i i h l o t s o 1 p U n F e p F b 3 i n o . e d d G n C e e e a 6 ; s 4 5 h t k d B . n c ; e e e e d 2 c t e t e l n t - s w e i b b I ( 1 3 d t s h n 2 e d o i i y r s a e x p d e a e r o t o w c f , d e s s u e r a n B a i s n s e - a ) l l P y g y , r u g e I h a s a e t n r k v i e i a g o m u t w t e y n c n w R i e s a a s t r a h p s o 0 3 m 7 k u l d a a i e r d 4 t e r y e a r v a l t e o i o e h r t a r u g 4 l t 2 c c q i a e i i l t c m n o h a r s u g l i m n l i e T o c o p e h c a h ( i h r D P e v d i n L a l , a | e u d p m O d t e e r s P h K e s e c l 1 a w R b i p F h m 3 t A d a w C n C e s o fi f n 6 e i i 6 B h t e / d n u l 6 e e s t a e d i t v a i n s r b i d l s o i i i o t e ) h v e t p d T b p n s I o r h o i d e r n n t c e . ; o i c s ) f ) a u w d n 2 e r i e - s t o d s e P s / r e s r d i r d o , n e a e l s o t l w o m e m p u d r u a b s p a e n u s t t n h e r a C r n e ( n e ( s i y e v , i e s K s i d T e r u e n v i g l i e e 1 a l r v g e i g r p s t l o m n a a a c a n u h n i t d o s a a i i o 6 h t v s / p i c l 5 d c e f t o i h t L n o c s u o 5 r . e s d u a o h n d n g n o i n i e i i r l i p e t d h r n , g o a ( t r T i w e i v c e e e n n a d s u s o o c i t h 5 c s n p a l a i e y f e n s i l i s l n m t s e e a k a e u c G b e a r r s m r q f o e N v p i ; r e i x n ) o h T P l e u n 2 t “ 3 4 2 1 - 5 . 8 9 1 - 1 2 . 4 9 1 4 . 7 6 A l p l 1 3 . 3 5 D u s p l 4 1 3 . 1 7 D u s p 3 ’ 1 2 . 4 1 P h o s p h a t a s e s P p m 1 1 l _ 2 2 0 P t p r b 1 - 2 . 8 0 P p m l m 1 - 3 . 8 8 G 6 p c 1 - 6 . 2 6 P h o s p h a t a s e R e g u l a t o r y ( I n h i b i t o r ) S u b u n i t - ) B s u o r e c P n a c e r p m ( l a t i b r a b o n e h P e B u P q i k n U d e t i w 3 2 , b O 7 i h x E t a h T s e K 4 . 1 — 1 t a h t e c d p a i f u s o n o e d t e u I e r G C i i c t O G f M b e l o f g i % o h 5 r o n x t . E n a 9 o h o N C C n o i s s e r p x E f o s i s y l s n a u c ) ) o n n o e s A i r s i M P t ) a ( A c s o e s r r : r M : o s r p R l R t n r y u o m m H u y m o C P ( u a a e u h T . r - n t S e i r o e T r L o i M R P t c v T t q a ( l T f . c o m u T y S R " h S ) ) i i C t e c P M f o M A T m i i . A . i n o e r 1 i i . A . 1 m o R o i t e n f m ( ( c c i i a u a n n e e o o r r r 1 1 , 3 1 2 4 M o p y H : s 4 5 . 2 1 m A i t N - D l a d e e c q G o i L n R r U e e t v l i A t a f t o i t s n n a o u i Q g e 6 . 5 d e e c u b d a n T i t s p u e - t t n n I I r l e i r a - t e p x n e n , i o s r ) n e A 4 o g s o o ( 5 b c r ) y D p e n t e o s A s d a m s c t r o t e 2 e n r t t e p r r u l ( o l a e r a i A p l E o — n o 1 v s b b t s a D t i a p k l m 1 i n m d a : e y r e c A l 2 d : t l m c : e l r l , 4 - o 5 u p x l a e i I l m n o h i a p R - l 1 d G f b c u o A D S c 3 4 3 G e n e “ P r e c a n c e r o u s o r T u m o r s F o l d C h a n g e d F o l d c h a n g e d N o . o f M i c e t h a t E x h i b i t e d a C h a n g e O u t s i d e 9 5 % C I o f C o n t r o l G r o u p e S u m m a r y o f M e t h y l a t i o n a n d G e n e E x p r e s s i o n S t a t u s e s A n x a 4 : a n n e x i n A 4 S p a n s T S S a n d / o r 5 ’ U T R ( 1 . A . i ) c . f . H M n . c . 1 3 > 2 a n d 5 1 0 k b ( 1 . 1 3 . 1 1 ) P r e : c . f . H y p o M 1 1 . 3 3 T u m o r s : c . f . H y p o M 1 2 . 0 9 n . c . I n t r o n i c ( 1 . A . i i i ) T u m o r s : H y p o M 1 1 . 3 3 1 4 . 5 4 E Q b Z : e p h r i n B 2 a n d / o r H y p o M f 1 3 . 3 0 1 4 . 4 0 N u d c d 3 : N u d C d o m a i n c o n t a i n i n g 3 E x o n i c ( 1 . A . i i ) n . c . n . c . 1 3 T u m o r s : H y p o M 1 1 . 4 6 n . c . 5 : 1 1 , 1 4 m : t r i p l e f u n c t i o n a l d o m a i n ( P T P R F i n t e r a c t i n g ) E x o n i c ( 1 . A . i i ) T u m o r s : c . f . H y p o M a n d / o r H y p o M f n . c . 5 : 1 1 , 1 4 U n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e ( o r a n i n d i c a t i o n o f ) l i v e r a n d / o r t u m o r s : a p p a r e n t a s s o c i a t i o n b e t w e e n 1 m e t h y l a t i o n a n d T e x p r e s s i o n l a t i n f o ) n n r s e u b d o o o i r n u i n s a s a n n i t a t i : s : v a o o r a f l s s s t b c i r o e i u i i s o n e s i T o o o s s n r o r e e m t o n g s c u a o n r n m o u s s n c i p p o e s s e o u u o d e h x n n t s e e g i i e t x r t g n i e a d r a a w a e t e r i a r t r n h c p p a n a o t t l c a o b P e x x e c c i n y e u r r e e h e e u c a y e h n l i m / e n b d d p a q q v r t c h a T n n T u i n a e e t i i I a n r m r e p n i l q i n U d e t i b i h x E t a h T s e n e G f o n o i s s e U o p u p m ( a 4 1 , 1 1 : 5 . c . n 1 r 1 p , 4 4 x 3 — - - - T T E f o s i s y l a n A ) R C T : 4 4 2 2 . . . 4 c c . 1 . . 4 n n . c . n ) T 1 s P M - T A R R q ( ( n o R i C t M M ? o a r f ] M p w p p p e e o o r y H e y y y p N H H H y : r . . H a r f P l y s f o . r o . / c r c o / d e o / m h i t t e - M l a A e R N e D v d : : n m n e d e a u a r T P r n P a ) i i . ) ) i i b m i k i i i i o ) . . 0 ' i A A A 1 fi . . . . i 1 1 1 d B t e r ( 5 ( ( m . a 1 ( a c c d e t e i t l c i n i i n r n n S o o a t s S t o r r n x t t A 2 p T a E n n u f > I I u Q o s d n e o u i n g i e t R n d n o i t p i 2 e k i l - e , e s a n 2 ) i , ) a k r r 4 e o k i c n t l l g n i t o r c h e s i p o p c i c n c t 6 u . d 5 n i e - l ) b B a P T ( a r t : 4 t c T r o p s e o c a c r s r e a e f t : y r o 2 t - r n e n i D l o ( : k 2 n c k i n r P T 3 4 4 B c a t Z : b r a n c h e d c h a i n a m i n o t r a n s f e r a s e 2 , m i t o c h o n d r i a l P r e : N e w M n . c . 0 1 x 5 4 : D E A D ( A s p - G l u - A l a - A s p ) b o x p o l y p e p t i d e 5 4 I n t r o n i c ( 1 . A . i i i ) P r e : H y p e r M 1 1 5 4 I n t r o n i c ( 1 . A . i i i ) T u m o r s : N e w M n . c . T h k 2 : t y r o s i n e k i n a s e , n o n - r e c e p t o r , 2 I n t r o n i c ( 1 . A . i i i ) T u m o r s : 1 1 . 0 . E t n b z : e p h r i n B 2 c . f . H fl e r M P r e : c . f . H y p o M a n d / o r H y p e e r 1 — 1 . 4 0 P r e : H y p o M o r H y p e e r n . c . T 3 n . c . 5 : T 3 , 1 2 n . c . _ 1 _ ‘ r _ i _ o _ : t r i p l e f u n c t i o n a l d o m a i n ( P T P R F E x o n i c ( 1 . A . i i ) n . c . T 3 n . c . , n o f n I i o t t d n . e a i a t ) l g o t y a n e 5 3 , s i s e r 0 s h e . s r d 0 t r e e t a o m r u a B t w m - < - t r o l p w P e r s r e n , e e m n h h t a s e v u t t i r e t d t f l t n n i n — I m l t u a o r f s u . s s . a , M e ’ e a r d R o r i l t t g n a n p v e e m d T e u m i a s U a p d h p d u 1 t u 1 i i e r H o S d , t t e 3 i v ( e r r s y n c ; t s u 4 i t g h a r , s e n t l t s 1 v t w o n a l : i l a e o i r n r 3 l a t t a c r l o i . fi a s t u f t o v n d l i a l a y r f r i o n i y s v g i c n r h T r i o t d i e a o m i e c h n s e d t g m t n i y u p a r l a n t l i e d a f r p h n ) c c r o a s d 2 e e y d b a i t c ) v 4 s ) i e s a C — r a ( h - fi e n n H o t I r l u i e r f s E ( ( t n s t t l t e s a o e l a p t r i a o n r u t a v w o p , M i s n d S t o h e r o F e i S e r a s i r C h e h v l t a t ( T v t . i y i w a s n n ) d e : h l n i c 4 o n s t i i i s c o d r e n e t t i i t i e f d n n o m i a u c r e i m t i o n e l o b / i d e i a e a a t r r n p d n y e d e t r a h d h n t c fi t a C i c s s v n e i w a n t a s e e l s a ( e o e o a m e a c r r s d u b e e i t h o d ) c s b r s e s - r d p e y s i B o p A a % c ) s t P t 5 . i h o e n n e n h h i . h r i t t d k d 1 c v , n e e t a e . b r a e d r 7 o e t n a r l e i e . m h t t 9 m e l t w n p n i e a u d e e s h g i - ) ) d n c u 3 o M d fi y t e s e r 1 o e i 2 r n l e r e n v o , - o w w e h e m r , p n c g s o v w c y ) w i M M e i o o a O s s e n l w p w n t s h H s o e a i K d a b y a ( c b s e c , o , w w l n y e r fi e n 1 s i l H e t a r t r i a m w , n g o k n s e o i u o m o t d a g c a l o o e / b o c s y i a v t u n e t h , o o t m C n s fi i T T u a 4 A M k g a t t b n i s b s . e d n a l n m A s s d ) u a e ( a a m a g c a l t R R h o l s e u s w fi e d o l a A c p i c r i d e a C ) n - e y i c w H . s s g p g c ( f i n u . n e t ( t i . u r s u c ) . d , o ( i o . o n a a o h ( T y n c t d ( l i p - e e l t r n s n a a s ( d i d . c s h w B a w l c o a a c u ; e l w i d o i e o P b t r r y t e u s g s f a r e s g i h o e , n h r u f e t t a n a t q a M r e a i u f b m p n y i h t c i t A c s m c r x o n s n r o a u o i o o R t i e r r a o s s n a n e s C n s m d , o o , n f e i e e n a a o . t g t s e r w s r f / g a n a p ) n a s n 4 e x n e a o f w a l u i v c r e d h y t i o r x i c fi e t e n c d fi g t a t e n a s e n a i c p n e g t g e t e e a c h i t d a : 4 a x t o a d i n a f m i n n l e h o h b o e n a s e v d i c c h C i c n i i ( t h t i t o d i x u c o i a e u d l m d ) l t n e s s t o n o a y l a n i f A t n e M p i s o c h e n f - a u s t w i a r e n e R o w d c f e G o t l M P r n e G A e c C d e d N b g i i f N : s N r : s r o n c s e o e r p i r o i u u r a n d o o i t e p e t T 3 4 5 T a b l e 5 . 6 c o n t i n u e d Q u a n t i t a t i v e R e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) A n a l y s i s o f E x p r e s s i o n o f G e n e s T h a t E x h i b i t e d U n i q u e P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) S p a n s T S S a n d / o r 5 ’ U T R ( 1 . A . i ) P r e : c . f . H y p o M n . c . 1 - 1 . 4 7 C h n 2 : c h i m e r i n ( c h i m a e r i n ) 2 I n t r o n i c ( 1 . A . i i i ) P r e : N e w M n . c . n . c . n . c . C r a b g ] : c e l l u l a r r e t i n o i c a c i d b i n d i n g p r o t e i n I E x o n i c ( 1 . A . i i ) T u m o r s : H y p o M n . c . 1 - 3 . 8 1 m : p r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e , r e c e p t o r t y p e , 0 I n t r o n i c ( 1 . A . i i i ) n . c . n . c . P r k c e : p r o t e i n k i n a s e C , e p s i l o n I n t r o n i c ( 1 . A . i i i ) T u m o r s : H y p o M n . c . S r m s : s r c - r e l a t e d k i n a s e l a c k i n g C - t e r m i n a l r e g u l a t o r y t y r o s i n e a n d N - t e r m i n a l m y r i s t y l a t i o n s i t e s S p a n s T S S a n d / o r 5 ’ U T R ( 1 . A . i ) T u m o r s : N e w M n . c . N o i n d i c a t i o n o f a n e x p r e s s i o n c h a n g e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r o r t u m o r s l a t i b r a b o n e h P e u q i n U , l a c i t n e d I m o r f d e fi 4 2 . 1 1 r o f ) ) 2 0 1 1 3 3 i H H t ( ( n 1 e 1 d I s e n e c . 8 7 s s e r 3 1 . . 1 1 G p - - f E x 1 1 o n o d n ) o 4 ) ) i 5 0 e a t 6 4 l M y h ( t N e 1 M 1 1 3 3 B H ( ( 1 1 ) 6 7 Z M ( 1 . c . n - 2 6 0 0 2 2 M y r ’ - o n 5 e t l s a a a l n r o s / o n i s s r p x E f o ) R C P - T R q ( s i s y l a n A R C P e m i T - l a e R t n a l b a T n 2 b i k , e ) e a 2 k n S i e u e ) v 0 h ) g s c i i d S n t i l c e l n k i e i a s - T ) n c 1 t a i r n s a n a i d a a 5 e d e 2 o t r e r n l m l e t n l S i k h e d o r t k d i o a - o r t i ) x c h n a S N i o n c n f s E i t l p T a t I R r n e n o e f i n r o d a p u r Q B a c i r i o t . t a : h P n s m 2 : e o a a c i o e r r a i > t Z e t e s r r . r m i T n l s e : - r i s y n U c 7 n l i ( . k i 1 t . : ( s s y Z m 1 t . C i r T i : i S : . i o e r : - n y A A s D p 5 m c a c a i B p . u e y r 1 r B . k P t ( S c 1 s g ( o : m i m n r . i A 2 k n a ( T l 3 4 6 ' P B i i n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n M S ) i n 2 T y p e s o f L i v e r T u m o r - P r o n e M i c e B 6 C 3 F 1 M i c e C A R W T M i c e G e n e a ( L o c a t i o n o f R A M ) b R A M S i z e s c 2 w e e k s P B 4 w e e k s P B P r e c a n c e r o u s L i v e r L i v e r T u m o r s M e t h y l a t i o n d E x p r e s s . e M e t h y l a t i o n T d E x p r e s s . c M e t h y l a t i o n e E x p r e s s . M 4 6 4 - 4 6 8 1 N ( M 4 6 8 ) D d x 5 4 : D e a d b o x p o l y p e p t i d e 5 4 ( 1 . A . i i i : I n t r o n i c ) M 3 1 5 - 3 1 7 B 3 1 2 - 3 1 5 1 ( M 3 1 7 ) T ( M 3 1 5 ) n . c . 1 ( B 3 1 2 ) 1 1 . 3 3 H 3 1 0 - 3 1 2 B 3 1 0 - 3 1 2 n . c . 1 0 3 3 1 0 ) 1 ( H 3 1 2 ) n . c . 1 ( B 3 1 2 ) n . c . L i a m : p r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e , r e c e p t o r t y p e , 0 ( 1 . A . i i i : I n t r o n i c ) B 3 4 1 - 3 4 2 1 ( B 3 4 1 ) n . c . 1 ( B 3 4 2 ) n . c . 1 ( M 2 0 2 ) o r i ( M 2 0 6 ) f l - 8 . 6 5 1 N ( M 2 0 5 ) n . c . T c t 4 : T r a n s c r i p t i o n f a c t o r 4 1 . A . i i i : I n t r o n i c B 2 0 0 1 ( 1 3 2 0 0 ) 1 - 1 . 5 1 1 N ( 1 3 2 0 0 ) 1 4 . 4 2 M 2 7 5 - 2 7 6 1 ( M 2 7 5 ) 1 - 1 . 4 9 T ( M 2 7 6 ) n . c . n o i s n e i s ) e n . a 5 g i 0 e e u e r q r , n , r . e I d e I c 0 v i I e g I d e i n D e H < l t H t s l c s e U a s g . e s p l , n , l fi t B ) l s i N N t e a u d a : : e i n s T d s c e t a ( i v r - M a M e v r s t i t i t n e d n A A d n t e u w u R e R o s n t i ’ i d t I i , t e s n e t e ) e e h n h d c t a m i s l 4 z s R t t e n n T f f y r i e d a o s M o r e U o o h u t e r c p f M e n ; e n t S t u d ( p e o r o e s d e n s t m o t n i a i i A t i a t h t s t a n w r C R a a fi h t a r i c f e P r t ) ( c c e t ) - fi o k i t i ) i n r s s t 2 t d l i e n s a fi fi n v e o r n 1 n n e l a n g d o e e s m a p 3 a w i d u d I u m n 4 u o i ) — i s s o s t i e y r T 0 T r 1 l e t h e e ( e r h r h n e / i a n e i d o v o r s i n l t d t c c e t o i a v B n c o p t 3 c l e t s t G f o L a l i n t d a d n e s t i s f 2 a a e c a e r a t ( u l r l i l a p o n t t n m s d t d 2 t y . o s , i c v h t 3 h o 2 4 s e i 1 . ) a a h i e S i e - r t t i r ) r s p d S a f s y e T m e m 2 e 0 n T e e w i 4 a 1 t r t 1 p : t 3 3 i p m m t e r y r y p F s a - H f a a p z 2 o y 3 1 n z i h D h x n o n n C C / , h C d 4 . d E i i e g e e e 6 t n 3 . n n . d t d 1 i f a n a s e n B e o i o ( o i t ) B u d d e , l i i e l s n s e u v . t i t c g b ) l s u s e M c n c s l R i o e M b s i r i i . i A i i r b r ( s r i C ) f R t t t t b A n c P n p A o r e s s s n ) - T ( e R e o . e e e i r e r c r n 2 . h c v t i . a d s i t 1 1 e e a R u n h 7 h ( l a e s o l p 1 q s d i y s t t c y 1 a l t - u e . h ( ( a r u f p e f h i o a m d o t o t g g s e r n l e o e n i y e o 1 n h c v b u v - u h i s s F n t i i n m r e y m e a l y t t e n w t 1 n e c 3 m n a m s l r o a e r a a M n i c e c c e C o o e y i s i 6 h t i d n e t s d r l , d a c a , B e A A n 1 p n l e N ( a n ( d r m n R A y n a c o p M s ( i a i r d t C R D e n o r o r c l e n r c a e i e i fi e i t i v t t s S I f P d d t t n e e o m e e e a n a i e s l c g l t . . c r c s s i m r r t ) o fi i i c e u a o a i s n i t d s fi a a T l p p e n W s y s y t l t T a i i h - A i ( ) g l d e d f s s e c t a o B r e e s o p a a y ( i - m 1 l l e n e a b e e d b u o e y b b s P a t z t — h a n w R s e n e n e n u t n w . n d o e u o s s i i t , e 3 . n n n p e , i l i i o q e e e v i d , , T t f e i i l r r e e ( i , g n w I e a l p z p z p t s s i i l n e i e b a s s u a t r r a y . o e ) u t l R R b s s T l h i ) o s s i s t t A r u i t u a l t d n e a c c i o i i C r , ) m ) g e s x t t y f 0 y ( M 0 r m i i e u u 0 e r A p o n m b o b 0 p n d o n b Q d d o e 2 y d d 2 i R x c e e a n t s e e h s d i p a w w u s t m i e e , , e p o o a B p B e o . . d c e A - f n u r e ) o g u e v . n l l . h l l . g w n e n i e o o T B l g ( f r s P ( u ( c i f f d e n t p o f d t e . i u a n n o ( i n o fi s u t l a M , M t , i ) p t n s a ) e o a c r A A o l g t u s o c t o n p i f n o g 1 i o p e r t a t r s n o l R R 7 . r b d M M d g e a h n c e e i r 5 a n t i u c l e i a u r r a e / d m l q o o q y m a l e i i b s h t s o e t a e p I l o e y l I v i n o n r n n n e d e i t a u f u o h t b r e e ! e m t l p m t e a h A G ; G A c u u H n T P i “ a b A 1 e m d a _ t M f 3 4 7 S U M M A R Y S p e c i fi c A i m s E a c h o f t h e f o l l o w i n g s p e c i fi c a i m s , c o n s t i t u t i n g 3 s e p a r a t e b u t r e l a t e d p r o j e c t s , w a s e x p e r i m e n t a l l y a s s e s s e d , a n d t h e o v e r a l l r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n i t a l i c s . P R O J E C T 1 ( C h a p t e r s 1 a n d 2 ) : I d e n t i fi c a t i o n o f g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e p h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d h e p a t i c m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n c h a n g e s i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e B G C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 m i c e , a t 2 a n d 4 w e e k s o f t r e a t m e n t . a ) T o a s c e r t a i n k e y g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s : C h a p t e r 1 0 f t h e 1 7 0 u n i q u e P B - i n d u c e d r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n ( R A M S ) t h a t w e r e d i s c e r n e d i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e i r r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 c o u n t e r p a r t s , a t 2 a n d 4 w e e k s ( B a c h m a n e t a 1 , 2 0 0 6 ) , c l o n i n g a n d a n n o t a t i o n o f 9 0 o f t h e m ( 5 3 % ) r e v e a l e d 5 1 g e n e s t h a t h a r b o r e d m e t h y l a t i o n c h a n g e s . F u n c t i o n a l a n a l y s i s o f t h e g e n e s d e m o n s t r a t e d c o n n e c t i o n s t o c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s , i n c l u d i n g g r o w t h a n d s u r v i v a l , a n g i o g e n e s i s , e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n , i n v a s i o n , a n d m e t a s t a s i s , s u g g e s t i n g t h a t t h e y a r e c a p a b l e o f a fl e c t i n g t u m o r i g e n e s i s , w h i l e o t h e r s r e p r e s e n t “ n e w ” c a n d i d a t e g e n e s w h i c h h a v e b e e n n o t p r e v i o u s l y a s s o c i a t e d w i t h t h e d i s e a s e . I t i s p o s s i b l e t h a t , i n r e s p o n s e t o P B t r e a t m e n t , c h a n g e s i n s o m e o f t h e s e g e n e s a r e e a r l y e v e n t s t h a t c o n t r i b u t e t o t h e f o r m a t i o n o f t u m o r s t h a t a r e d e s t i n e d t o b e c o m e e v i d e n t a t l a t e r t i m e p o i n t s . 3 4 8 b ) T o d e t e r m i n e h o w e x p r e s s i o n o f k e y g e n e s ( i d e n t i fi e d fi o m u n i q u e R A M s i n B 6 C 3 F 1 m i c e , a s d i s c e r n e d i n A i m 1 a ) r e l a t e s t o t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s , a n d i f t r a n s c r i p t l e v e l s a r e a l t e r e d u n i q u e l y i n B 6 C 3 F 1 m i c e : C h a p t e r 2 0 f t h e 1 9 g e n e s t e s t e d ( o u t o f 5 1 t o t a l g e n e s i d e n t i fi e d ) , 3 o f t h e m ( B c a t 2 , B c 1 2 1 1 3 , U b e Z d 1 ) w e r e n e w l y m e t h y l a t e d a n d r e p r e s s e d a t 4 w e e k s , a n d t h e s e e x p r e s s i o n p a t t e r n s w e r e u n i q u e a s c o m p a r e d t o t h e c h a n g e s o b s e r v e d i n t h e C 5 7 B L / 6 m i c e . T w o g e n e s , S r m s ( 2 w e e k s ) a n d T r i o ( 4 w e e k s ) p o s s e s s e d a m b i g u o u s ( i . e . n o t a b l e t o b e d e fi n i t i v e l y d e t e r m i n e d ) m e t h y l a t i o n s t a t u s e s a n d t h e e x t e n t o f t h e i r r e p r e s s i o n w a s n o t s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t fi ' o m t h a t o b s e r v e d i n t h e C 5 7 B L / 6 g r o u p s . N c o r 2 w a s n e w l y m e t h y l a t e d a n d r e p r e s s e d i n t h e B 6 C 3 F ] , b u t t h e e x t e n t o f t h e r e p r e s s i o n w a s s i g n i f i c a n t l y l e s s t h a n t h a t i n t h e C 5 7 B I / 6 . F o r 1 3 g e n e s a s s a y e d o n l y i n t h e B 6 C 3 F 1 m i c e , 7 g e n e s w e r e h y p o m e t h y l a t e d a n d r e p r e s s e d ( o r s h o w e d a n i n d i c a t i o n o f r e p r e s s i o n ) , w h i l e e x p r e s s i o n l e v e l s o f t h e r e m a i n i n g 6 d i d n o t c h a n g e . S i n c e m a n y o f t h e s e g e n e s a r e a s s o c i a t e d w i t h c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s , P B t r e a t m e n t c o u l d a l t e r t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s , s u b s e q u e n t l y i n fl u e n c e e x p r e s s i o n l e v e l s , a n d p o s s i b l y f a c i l i t a t e c l o n a l e x p a n s i o n t h a t c o n t r i b u t e s t o t u m o r i g e n e s i s . c ) T o d e t e r m i n e i f e x p r e s s i o n l e v e l s o f 3 D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) g e n e s c h a n g e u n i q u e l y i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t : C h a p t e r 2 A t b o t h 2 a n d 4 w e e k s , D n m t ] , D n m t 3 a , a n d D n m t 3 b w e r e r e p r e s s e d u n i q u e l y i n B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B L / 6 , i n d i c a t i n g t h a t P B - e l i c i t e d e x p r e s s i o n c h a n g e s o f D n m t g e n e s m i g h t r e p r e s e n t o n e m e c h a n i s m b y w h i c h t h e u n i q u e B 6 C 3 F ] R A M s f o r m e d . 3 4 9 d ) T o p e r f o r m m i c r o a r r a y a n a l y s i s a n d s u b s e q u e n t l y e l u c i d a t e u n i q u e g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s i n B 6 C 3 F 1 m i c e , a t 2 a n d 4 w e e k s : C h a p t e r 2 U n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e s w e r e s e e n i n t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e C 5 7 B l / 6 , a t 2 ( 2 8 1 ) a n d 4 ( 1 3 3 ) w e e k s , i n c l u d i n g 4 7 w h o s e e x p r e s s i o n w a s a l t e r e d i n t h e s a m e d i r e c t i o n a t b o t h t i m e p o i n t s . S u b s e t s o f t h e s e c a n p a r t i c i p a t e i n c e l l u l a r p r o c e s s e s a n d s i g n a l i n g p a t h w a y s t h a t h a v e p r e v i o u s l y b e e n i m p l i c a t e d i n t u m o r i g e n e s i s , s u g g e s t i n g t h a t P B - e l i c i t e d g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s w h i c h o c c u r r e d u n i q u e l y i n t h e s u s c e p t i b l e m i c e c o u l d d i r e c t l y c o n t r i b u t e t o c a r c i n o g e n e s i s . F u r t h e r m o r e , g e n e s i n v o l v e d i n I - c a r b o n m e t a b o l i s m , w h i c h c a n i m p a c t D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s , w e r e d i s r u p t e d u n i q u e l y i n t h e B 6 C 3 F ] , p r o v i d i n g e v i d e n c e o f a m e c h a n i s m o f P B - i n d u c e d a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n i n t h e s u s c e p t i b l e m i c e . e ) T o i d e n t i f y p u t a t i v e C A R r e s p o n s e c i s e l e m e n t s ( C A R E S ) w i t h i n s e l e c t e d g e n e s , i n c l u d i n g 3 D n m t ’ s , w h o s e m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n s t a t u s e s a r e a l t e r e d u n i q u e l y i n B 6 C 3 F 1 m i c e d u e t o 2 a n d / o r 4 w e e k s o f P B t r e a t m e n t : C h a p t e r 2 C A R E S w e r e l o c a t e d w i t h i n 3 0 g e n e s t h a t w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n r e s p o n s e t o P B t r e a t m e n t : 9 g e n e s i d e n t i fi e d fi o m R A M s ( f o r 8 / 9 , t h e r e w a s a n e x p r e s s i o n c h a n g e ( o r i n d i c a t i o n o f ) i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 o r 4 w e e k s ; o f t h e 8 , 3 c h a n g e s w e r e u n i q u e i n t h e B 6 C 3 F 1 ) ; 1 8 u n i q u e l y a c t i v e ( i . e . d i fl e r e n t i a l l y e x p r e s s e d ) g e n e s a t 2 o r 4 w e e k s , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s ( f o r 1 3 , e x p r e s s i o n c h a n g e s w e r e c o n fi r m e d b y q R T - P C R ) ; a n d 3 D n m t ’ s ( f o r a l l 3 , e x p r e s s i o n w a s a l t e r e d u n i q u e l y i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s ) . T h e s e d a t a s u p p o r t t h e n o t i o n t h a t C A R m e d i a t e s e a r l y P B - e l i c i t e d e x p r e s s i o n c h a n g e s , i n c l u d i n g t h o s e o f g e n e s t h a t a r e i n v o l v e d i n c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s , a n d t h o s e t h a t a r e c a p a b l e o f r e g u l a t i n g m e t h y l a t i o n p a t t e r n s . 3 5 0 P R O J E C T 2 ( C h a p t e r s 3 , 4 , a n d § ) : I d e n t i fi c a t i o n o f g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e P B - i n d u c e d m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n c h a n g e s i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e C A R w i l d t y p e ( W T ) m i c e a t 2 3 ( p r e c a n c e r o u s l i v e r ) a n d 3 2 ( l i v e r t u m o r s ) w e e k s o f t r e a t m e n t , a s c o m p a r e d t o t u m o r - r e s i s t a n t C A R k n o c k o u t ( K O ) m i c e a t 2 3 w e e k s . a ) T o c o m p a r e c h a n g e s i n G C - r i c h m e t h y l a t i o n p a t t e r n s i n t u m o r - s u s c e p t i b l e C A R W T a n d r e s i s t a n t K O m i c e , a n d t o d i s c e r n u n i q u e R A M s i n t h e C A R W T g r o u p s ( b o t h p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d l i v e r t u m o r s ) : C h a p t e r 3 P B e l i c i t e d 1 4 6 u n i q u e R A M s i n C A R W T m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e C A R K 0 , i n c l u d i n g 1 4 c h a n g e s w h i c h “ c a r r i e d f o r w a r d , ” i . e . w e r e o b s e r v e d i n b o t h p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d l i v e r t u m o r s . S o m e o f t h e s e C A R - d e p e n d e n t a l t e r a t i o n s m i g h t c o n t r i b u t e t o t u m o r d e v e l o p m e n t i n t h e s u s c e p t i b l e W T m i c e . b ) T o a s c e r t a i n k e y g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e R A M s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s : C h a p t e r 4 C l o n i n g a n d a n n o t a t i o n o f 1 1 9 o f t h e 1 4 6 ( 8 2 % ) t o t a l u n i q u e R A M s u n c o v e r e d 4 7 g e n e s t h a t h a r b o r e d m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n p r e c a n c e r o u s a n d / o r t u m o r t i s s u e . F u n c t i o n a l i n v e s t i g a t i o n o f t h e s e g e n e s r e v e a l e d t h a t m a n y p a r t i c i p a t e i n c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s , i n c l u d i n g g r o w t h a n d s u r v i v a l , a p o p t o s i s , a n g i o g e n e s i s , e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n , c y t o s k e l e t o n d y n a m i c s , a n d a d h e s i o n , i n d i c a t i n g t h a t t h e y a r e c a p a b l e o f i n fl u e n c i n g t u m o r d e v e l o p m e n t . F o r o t h e r s , t h e r e i s n o e v i d e n c e l i n k i n g t h e g e n e s t o t h e d i s e a s e , a n d t h u s , t h e y c o u l d b e c o n s i d e r e d “ n e w ” c a n d i d a t e g e n e s o f P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s , b a s e d u p o n t h e i r a l t e r e d m e t h y l a t i o n s t a t u s e s . c ) T o d e t e r m i n e h o w e x p r e s s i o n o f k e y g e n e s ( i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n C A R W T m i c e , a s d i s c e r n e d i n A i m 2 b ) r e l a t e s t o t h e i r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s , a n d i f 3 5 1 t r a n s c r i p t l e v e l s a r e a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s : C h a p t e r 5 0 f t h e I 6 g e n e s t e s t e d ( o u t o f 4 7 t o t a l g e n e s i d e n t i f i e d ) t h a t e x h i b i t e d u n i q u e R A M s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s , 7 o f t h e m ( A b l l , A n x a 4 , D d x 5 4 , E f n b 2 , N u d c d 3 , S l c l l a 2 , T r i o ) w e r e h y p o m e t h y l a t e d a n d d e m o n s t r a t e d i n c r e a s e d e x p r e s s i o n l e v e l s ( o r a n i n d i c a t i o n o f ) i n t h e s a m e t i s s u e , a n d t h e s e w e r e u n i q u e a s c o m p a r e d t o e x p r e s s i o n i n l i v e r t i s s u e fi o m P B - t r e a t e d C A R K O m i c e . F o u r o f t h e g e n e s ( B c a t 2 , D d x 5 4 , c h 4 , T n k 2 ) , e x h i b i t e d i n c r e a s e d m e t h y l a t i o n a n d e l e v a t e d e x p r e s s i o n l e v e l s ( o r a n i n d i c a t i o n o f ) i n t h e s a m e t i s s u e , a n d t h e s e l e v e l s w e r e u n i q u e a s c o m p a r e d t o t h o s e i n l i v e r t i s s u e f r o m P B - t r e a t e d C A R K O m i c e . T h e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f 4 g e n e s ( E f n b 2 , P r i c k l e 2 , T n k 2 , T r i o ) w e r e a m b i g u o u s ( i . e . n o t d e fi n i t i v e l y d e t e r m i n e d ) i n e i t h e r p r e c a n c e r o u s l i v e r o r l i v e r t u m o r s , a n d t h e r e w a s a n i n d i c a t i o n o f u n i q u e i n d u c t i o n o f e x p r e s s i o n . T h e r e w e r e s e v e r a l t h a t d i d n o t e x h i b i t a n e x p r e s s i o n c h a n g e . O v e r a l l , t h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t a l t e r e d m e t h y l a t i o n m i g h t r e g u l a t e t h e o b s e r v e d e x p r e s s i o n c h a n g e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s , a n d b a s e d u p o n t h e d o c u m e n t e d r o l e s o f m a n y o f t h e s e g e n e s i n c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s , c o u l d p o s s i b l y f a c i l i t a t e t u m o r i g e n e s i s . d ) T o d e t e r m i n e i f e x p r e s s i o n l e v e l s o f 3 D n m t g e n e s c h a n g e u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s : C h a p t e r 5 D n m t l ( i n p r e c a n c e r o u s l i v e r ) a n d D n m t 3 a ( i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d l i v e r t u m o r s ) w e r e i n d u c e d u n i q u e l y , a s c o m p a r e d t o l i v e r f r o m P B - t r e a t e d C A R K O m i c e . T h i s s u g g e s t s t h a t e x p r e s s i o n c h a n g e s o f c e r t a i n D n m t g e n e s m i g h t b e a m e c h a n i s m b y w h i c h P B u n i q u e l y a fi ' e c t s m e t h y l a t i o n s t a t u s e s i n s u s c e p t i b l e C A R W T m i c e . 3 5 2 e ) T o p e r f o r m m i c r o a r r a y a n a l y s i s a n d s u b s e q u e n t l y e l u c i d a t e u n i q u e g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s : C h a p t e r 5 U n i q u e e x p r e s s i o n c h a n g e s w e r e a s c e r t a i n e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r ( 1 1 3 ) a n d l i v e r t u m o r s ( 8 8 9 ) , a s c o m p a r e d t o l i v e r s fi o m C A R K 0 , 2 3 - w e e k P B - t r e a t e d m i c e , w h i c h i n c l u d e d 8 w h o s e d i r e c t i o n s o f c h a n g e w e r e o p p o s i t e . A d d i t i o n a l l y , e x p r e s s i o n o f 6 9 g e n e s w a s a l t e r e d i n t h e s a m e d i r e c t i o n i n b o t h t i s s u e s . F u n c t i o n a l a n n o t a t i o n o f t h e s e b g e n e s r e v e a l e d t h a t m a n y a r e i n v o l v e d i n c e l l u l a r p r o c e s s e s a n d s i g n a l i n g p a t h w a y s t h a t 1 a r e a s s o c i a t e d w i t h t u m o r i g e n e s i s . T h e r e f o r e , a t l e a s t s o m e o f t h e m m i g h t b e c r i t i c a l f o r P B - i n d u c e d t u m o r d e v e l o p m e n t . I f ) T o i d e n t i f y p u t a t i v e C A R E S w i t h i n s e l e c t e d g e n e s , i n c l u d i n g 3 D n m t ’ s , w h o s e m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n s t a t u s e s a r e a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s : C h a p t e r 5 C A R E S w e r e l o c a t e d w i t h i n 3 0 g e n e s t h a t w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n r e s p o n s e t o P B : 8 g e n e s i d e n t i f i e d fi o m R A M s ( f o r 7 / 8 , t h e r e w a s a u n i q u e c h a n g e i n e x p r e s s i o n ( o r a n i n d i c a t i o n o f ) i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s v . l i v e r t i s s u e fi o m P B - t r e a t e d C A R K O m i c e ) ; 1 9 u n i q u e l y a c t i v e g e n e s i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s ( f o r 1 6 , e x p r e s s i o n c h a n g e s w e r e c o n fi r m e d b y q R T - P C R , ‘ 3 w e r e n o t s e l e c t e d f o r c o n fi r m a t i o n ) , a n d 3 D n m t g e n e s ( f o r D n m t l a n d D n m t 3 a , e x p r e s s i o n w a s a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s ) . T h e s e r e s u l t s s u p p o r t t h e n o t i o n t h a t , i n t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e , C A R m e d i a t e s P B - e l i c i t e d e x p r e s s i o n c h a n g e s o f g e n e s t h a t a r e c a p a b l e o f d r i v i n g t u m o r i g e n e s i s ( b a s e d o n t h e i r c a n c e r - r e l a t e d fi m c t i o n s ) , i n a d d i t i o n t o t h o s e t h a t r e g u l a t e D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s . 3 5 3 P R O J E C T 3 ( C h a p t e r s 4 a n d 5 ) : C o m p a r i s o n o f g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e P B - e l i c i t e d a l t e r e d m e t h y l a t i o n a n d / o r g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s i n b o t h t y p e s o f l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e , a t e a r l y ( i . e . 2 a n d 4 w e e k s ) a n d l a t e ( i . e . 2 3 w e e k s , p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d 3 2 w e e k s , l i v e r t u m o r s ) t i m e p o i n t s . a ) T o c o m p a r e g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e R A M s i n b o t h t h e P B - t r e a t e d s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] a n d C A R W T m i c e : C h a p t e r 4 P B t r e a t m e n t i n d u c e d R A M s i n 1 1 c o m m o n g e n e s ( B c a t 2 , D d x 5 4 , E f n b 2 , P r i c k l e 2 , P t p r o , S r m s , c h 4 , T n k 2 , T r i o , W s c d l , Z s c a n 2 2 ) i n b o t h t y p e s o f s u s c e p t i b l e m i c e , i n c l u d i n g 5 ( B c a t 2 , D d x 5 4 , P t p r o , W s c d l , Z s c a n 2 2 ) w h o s e m e t h y l a t i o n l e v e l s e i t h e r i n c r e a s e d o r d e c r e a s e d a t b o t h e a r l y a n d l a t e r t i m e s . T h e r e f o r e , t h e s e r e p r e s e n t p r e l i m i n a r y c a n d i d a t e g e n e s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a n “ a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n fi n g e r p r i n t ” o f P B p r o m o t i o n ( T a b l e 6 . 1 ) . b ) T o c o m p a r e t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s t h a t e x h i b i t u n i q u e R A M s , p l u s 3 D n m t ’ s , i n b o t h P B - t r e a t e d s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] a n d C A R W T m i c e : C h a p t e r 5 C o n s i d e r i n g a s u b s e t o f t h e 1 1 a f o r e m e n t i o n e d g e n e s i n w h i c h a n e x p r e s s i o n c h a n g e ( o r i n d i c a t i o n o f a c h a n g e ) w a s o b s e r v e d i n b o t h t y p e s o f m i c e , 5 ( B c a t 2 , D d x 5 4 , P r i c k l e 2 , c h 4 , T n k 2 ) e x h i b i t e d a d e c r e a s e i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 4 w e e k s , w h i l e t h e y e x h i b i t e d a n i n c r e a s e i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s ( T a b l e 6 . 1 ) . R A M s i n d u c e d b y P B w i t h i n B c a t 2 , D d x 5 4 , a n d P r i c k l e 2 m i g h t h a v e i n fl u e n c e d e x p r e s s i o n l e v e l s t h a t w e r e e v i d e n t s u b s e q u e n t t o 4 w e e k s a n d w e r e e v i d e n t i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r t u m o r s , s i n c e t h e i r t r a n s c r i p t i o n ( b u t n o t m e t h y l a t i o n s t a t u s e s ) c h a n g e d b e t w e e n e a r l y a n d l a t e r t i m e s . F o r c h 4 a n d T n k 2 , d e c r e a s e d m e t h y l a t i o n l e v e l s a t 4 w e e k s m i g h t s u p p r e s s e x p r e s s i o n , w h i l e i n c r e a s e d l e v e l s m i g h t i n d u c e e x p r e s s i o n i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r 3 5 4 l i v e r t u m o r s . A s s u m i n g t h e s e m e t h y l a t i o n c h a n g e s c o n t r o l t r a n s c r i p t i o n , a n d t h e o b s e r v e d e x p r e s s i o n c h a n g e s a fl e c t t u m o r i g e n e s i s ( b a s e d u p o n d o c u m e n t e d , c a n c e r - r e l a t e d fi m c t i o n s ) , t h e r o l e s o f t h e s e g e n e s i n t u m o r f o r m a t i o n l i k e l y v a r y d u r i n g i n i t i a l , a s c o m p a r e d t o l a t e r s t a g e s . F u r t h e r m o r e , D n m t l , D n m t 3 a a n d D n m t 3 b w e r e u n i q u e l y r e p r e s s e d i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s , w h i l e D n m t 3 a ( p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d l i v e r t u m o r s ) a n d D n m t l ( l i v e r t u m o r s ) w e r e i n d u c e d u n i q u e l y ( T a b l e 6 . 2 ) . T h e r e f o r e , D N M T e n z y m e s m i g h t e s t a b l i s h m e t h y l a t i o n p a t t e r n s d i j fi z r e n t l y d u r i n g e a r l y v . l a t e r s t a g e s o f t u m o r i g e n e s i s . c ) T o c o m p a r e g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n i s a l t e r e d u n i q u e l y , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s , i n b o t h t h e P B - t r e a t e d s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F ] a n d C A R W T m i c e : C h a p t e r 5 T h e u n i q u e l y a l t e r e d g e n e s i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d / o r 4 w e e k s ( 3 6 7 ) a n d C A R W T m i c e , i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s ( 9 3 3 ) , w e r e c o m p a r e d . E x p r e s s i o n l e v e l s o f 6 9 g e n e s w e r e a l t e r e d i n t h e s a m e d i r e c t i o n a n d 2 6 i n o p p o s i t e d i r e c t i o n s , i n a t l e a s t 1 g r o u p o f B 6 C 3 F I a n d a t l e a s t 1 g r o u p o f C A R W T m i c e . A d d i t i o n a l l y , 5 g e n e s e x h i b i t e d t h e s a m e d i r e c t i o n o f c h a n g e i n 2 g r o u p s o f m i c e , b u t s h o w e d a d i v e r g e n t a l t e r a t i o n i n a t h i r d g r o u p . F u n c t i o n a l a n n o t a t i o n d e m o n s t r a t e d t h a t g e n e s s u c h a s C x c r 7 , G a d d 4 5 a , a n d G a d d 4 5 b ( i n d u c e d i n b o t h s u s c e p t i b l e g r o u p s , T a b l e 6 . 2 ) , p o s s e s s c r i t i c a l , t u m o r i g e n e s i s - r e l a t e d fi m c t i o n s . T h e r e f o r e , g e n e s a l t e r e d i n b o t h t y p e s o f s u s c e p t i b l e m i c e m i g h t f a c i l i t a t e t h e s e l e c t i v e c l o n a l e x p a n s i o n o f c e l l s d u r i n g v e r y e a r l y p h a s e s o f P B p r o m o t i o n ( i . e . 2 a n d 4 w e e k s ) , u l t i m a t e l y r e s u l t i n g i n t h e p r e c a n c e r o u s l e s i o n s a n d fl a n k t u m o r s t h a t a r i s e a t l a t e r t i m e p o i n t s ( i . e . 2 3 a n d 3 2 w e e k s ) . S i g n i fi c a n t l y , m u l t i p l e c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s a n d s i g n a l i n g p a t h w a y s i n v o l v e g e n e s w h o s e m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n s t a t u s e s w e r e p e r t u r b e d b y P B i n b o t h t y p e s o f t u m o r - p r o n e m i c e . 3 5 5 T a b l e 6 . 1 E x p r e s s i o n o f G e n e s I d e n t i fi e d f r o m I d e n t i c a l P h e n o b a r b i t a l ( P B ) - i n d u c e d R e g i o n s o f A l t e r e d D N A M e t h y l a t i o n ( R A M s ) i n 2 T y p e s o f L i v e r T u m o r - P r o n e M i c e G e n e a ( L o c a t i o n o f R A M ) b B 6 C 3 F ] M i c e C A R W T M i c e 4 w e e k s P B P r e c a n c e r o u s L i v e r L i v e r T u m o r s M e t h y l . c E x p r e s s . d M e t h y l . c E x p r e s s . d 1 . M e t h y l . c E x p r e s s . d B c a t 2 : B r a n c h e d c h a i n a m i n o t r a n s f e r a s e 2 , m i t o c h o n d r i a l ( E x o n i c ) 1 " ( . M ) 1 - 1 . 3 8 * W M ) 1 1 . 2 4 D d x 5 4 . D e a d b o x p o l y p e p t i d e 5 4 ( I n t r o n i c 1 l ( M ) 1 ( 8 ) 1 - l . l 7 * T ( M ) T 3 , l l 1 ( 5 ) T 1 . 3 3 * P M P r i c k l e - l i k e 2 ( D r o s o p h i l a ) ( > 2 a n d 5 1 0 k b u p s t r e a m f r o m T S S ) N H ) 1 ( 3 ) 1 4 , “ N H ) 1 ( 3 ) T 3 , l 2 £ 1 2 7 0 : P r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e , r e c e p t o r t y p e , 0 I n t r o n i c M B ) n . c . 1 ( 3 ) n . c . T c t 4 : T r a n s c r i p t i o n f a c t o r 4 ‘ ( I n t r o n i c ) l ( B ) 1 - 1 . 5 1 * 1 “ ( B ) 1 4 4 2 * T n k 2 : T y r o s i n e k i n a s e n o n - r e c e p t o r 2 ( I n t r o n i c ) M M ) 1 - 1 4 9 1 - T N ) 1 4 T N ) 1 4 ‘ W s c h : W S C d o m a i n - c o n t a i n i n g l I n t r o n i c N M ) N M ) ‘ Z s c a n 2 2 : Z i n c fi n g e r a n d S C A N d o m a i n c o n t a i n i n g 2 2 ( S p a i s T S S ) t " ( H ) t " ( H ) ' G e n e s i d e n t i fi e d f r o m i d e n t i c a l P B - i n d u c e d R A M s t h a t o c c u r r e d u n i q u e l y i n t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e ( 4 w e e k s ) a n d c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) w i l d t y p e ( W T ) m i c e ( p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s ) v . t h e i r r e s i s t a n t c o u n t e r p a r t s ( C h a p t e r 4 ) . G e n o m i c l o c a t i o n o f a R A M . T S S , t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t s i t e . c l n c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n i n c l u d e h y p e r m e t h y l a t i o n s ( T ) a n d n e w m e t h y l a t i o n s ( T N ) . D e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n a r e h y p o m e t h y l a t i o n s ( 1 ) . R A M s i n g r a y e x h i b i t e d t h e s a m e d i r e c t i o n o f c h a n g e i n b o t h t y p e s o f m i c e . A l e t t e r i n d i c a t e s t h e r e s t r i c t i o n e n z y m e ( fi s s H I I , _ i j a I I , M s p l ) u s e d t o d e t e c t t h e R A M . d A f o l d c h a n g e o f g e n e e x p r e s s i o n ( T , u p - r e g u l a t i o n a n d 1 , d o w n - r e g u l a t i o n ) , b a s e d o n q u a n t i t a t i v e r e a l - t i m e P C R , i s s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( S t u d e n t ’ s t - t e s t , p < 0 . 0 5 ) i f d e n o t e d b y a n a s t e r i s k ( * ) . l f a f o l d c h a n g e w a s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t , i t i s n o t l i s t e d , h o w e v e r , a g e n e w a s c o n s i d e r e d t o s h o w a n i n d i c a t i o n o f a c h a n g e i f a t l e a s t 3 , o u t o f 6 t o t a l , s a m p l e s f r o m t h e P B - t r e a t e d g r o u p f e l l o u t s i d e ( e i t h e r a b o v e , T o r b e l o w , 1 ) t h e 9 5 % c o n fi d e n c e i n t e r v a l o f t h e c o n t r o l g r o u p d a t a . N o c h a n g e ( n . c . ) d e n o t e s t h a t t h e r e w a s n o i n d i c a t i o n o f a c h a n g e ; 3 5 6 e E x p r e s s i o n w a s n o t e v a l u a t e d . T a b l e 6 . 2 G e n e s E x h i b i t i n g P h e n o b a r b i t a l ( P B ) « e l i c i t e d A l t e r e d E x p r e s s i o n i n 2 T y p e s o f L i v e r T u m o r - P r o n e M i c e a E a r l y b L a t e " G e n e B 6 C 3 F ] C A R W T 2 w e e k s P B 4 w e e k s P B P r e c a n c e r o u s T u m o r s D d a h l $ 1 0 4 1 a 2 M a f f S l c 1 6 a 7 B C O 1 6 4 9 5 T s k u T a r s N D O H 4 S l 1 4 S d s A l a D n m t l K c n k l 1 2 D n m t 3 a G a d d 4 5 a P o r e r n l T 1 B C O 8 9 5 9 7 C x c r 7 G a d d 4 5 b G n a 1 4 R a r b C i b 3 S l c o 1 a 4 6 4 3 O 7 0 6 D 2 2 R i k 1 8 1 0 1 3 3 1 2 M f s d l l C e s 6 E G 6 2 4 2 l 9 “ U p - r e g u l a t e d ( T ) o r d o w n - r e g u l a t e d ( 1 ) g e n e e x p r e s s i o n , b a s e d o n m i c r o a r r a y a n d / o r q u a n t i t a t i v e r e a l - t i m e P C R ( q R T - P C R ) a n a l y s i s ; b U n i q u e g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s i n P B - t r e a t e d l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e v . t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , a t 2 a n d 4 w e e k s , w e r e d i s c e r n e d ( C h a p t e r 2 ) ; c U n i q u e g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s i n P B - t r e a t e d l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) w i l d t y p e ( W T ) m i c e ( 2 3 w e e k s , p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d 3 2 w e e k s , l i v e r t u m o r s ) v . t h e r e s i s t a n t C A R k n o c k o u t ( K O ) a t 2 3 w e e k s , w e r e d i s c e r n e d ( C h a p t e r 5 ) . 3 5 7 T a b l e 6 . 3 C o m m o n S i g n a l i n g P a t h w a y s a n d C e l l u l a r P r o c e s s e s I n v o l v i n g G e n e s t h a t E x h i b i t e d M e t h y l a t i o n a n d / o r E x p r e s s i o n C h a n g e s i n 2 T y p e s o f L i v e r - T u m o r P r o n e M i c e G e n e s A l t e r e d i n G e n e s A l t e r e d i r b i . a . P a t h w a y o r P r o c e s s B 6 C 3 F ] M i c e C A R W T M i c e 2 w e e k s 4 w e e k s P T P B P B r e c a n c e r o u s u m o r s A d h e s i o n \ l ‘ l \ l \ l A n g i o g e n e s i s \ l « l « I \ ] A p o p t o s i s \ l x ] \ ] x ] I n - l - C a r b o n M e t a b o l i s m \ / « 1 - - ° x ] C e l l C y c l e / G r o w t h / S u r v i v a l ‘ 1 « I \ I « J C y t o s k e l e t o n O r g a n i z a t i o n / ‘ 1 \ j \ j ‘ 1 D y n a m i c s D N A m e t h y l a t i o n \ l \ l \ ] s f . . 1 _ , E p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l \ / \ / ‘ 1 \ l c e l l t r a n s i t i o n H e d g e h o g s i g n a l i n g - - ° J x ] « j I n v a s i o n / M e t a s t a s i s 1 ] \ l \ I \ 7 M A P K s i g n a l i r g « J « J x ] « J N o t c h s i g n a l i g s ] x ] x ] x ] T G F - B s i g n a l i p g \ l \ l \ I « 1 W m s i g a l i n g \ l \ l \ l 3 ] “ A ( ‘ 1 ) i n d i c a t e s t h e i n v o l v e m e n t o f g e n e s t h a t e x h i b i t e d u n i q u e r e g i o n s o f a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n , R A M s ( C h a p t e r 1 ) , a n d / o r e x p r e s s i o n c h a n g e s ( C h a p t e r 2 ) i n l i v e r s o f t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e v . t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , t r e a t e d w i t h p h e n o b a r b i t a l ( P B ) f o r 2 a n d 4 w e e k s . b A ( ‘ 1 ) i n d i c a t e s t h e i n v o l v e m e n t o f g e n e s t h a t e x h i b i t e d u n i q u e R A M s ( C h a p t e r 4 ) a n d / o r e x p r e s s i o n c h a n g e s ( C h a p t e r 5 ) i n l i v e r s o f P B - t r e a t e d c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) w i l d t y p e ( W T ) m i c e ( p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s ) v . t h e t u m o r - r e s i s t a n t C A R k n o c k o u t ( K O ) m i c e ( 2 3 w e e k s ) . c ( - ) i n d i c a t e s t h a t n o n e o f t h e g e n e s o f i n t e r e s t p a r t i c i p a t e i n a p a t h w a y / p r o c e s s . 3 5 8 D I S C U S S I O N T h r e e c o m p l e m e n t a r y p r o j e c t s , c o m p r i s i n g 5 d i s t i n c t c h a p t e r s o f t h i s d i s s e r t a t i o n , w e r e d e s i g n e d t o t e s t t h e o v e r a l l h y p o t h e s i s : g g i e s t h a t a r e d e r e g u l a t e d u n i q u e l y i n l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e . a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t m i c e . a r e a m o n g fl o s e t h _ a t a r e m e c h a n i s t i c a l l y i m p _ o r t a n t f o r t u m o r i g e n e s i _ s . T w o s e p a r a t e m o d e l s y s t e m s w e r e u t i l i z e d t o d i s c e r n m o l e c u l a r a l t e r a t i o n s ( i . e . D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s ) t h a t o c c u r r e d u n i q u e l y i n 2 d i f f e r e n t t y p e s o f t u m o r - p r o n e m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e i r r e s i s t a n t c o u n t e r p a r t s . M a n y o f t h e g e n e s t h a t e x h i b i t e d P B - e l i c i t e d c h a n g e s p l a y d o c u m e n t e d r o l e s i n c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s , a n d t h u s , t h e p r e v i o u s l y p r e s e n t e d r e s u l t s s t r o n g l y s u p p o r t t h e o v e r a l l h y p o t h e s i s . T h e f o l l o w i n g 5 a s p e c t s o f t h i s r e s e a r c h a r e t h o s e t h a t I b e l i e v e t o b e t h e m o s t s i g n i fi c a n t c o n t r i b u t i o n s t o t h e fi e l d s o f e p i g e n e t i c s a n d t u m o r i g e n e s i s : l ) T h e u s e o f t w o m o d e l s y s t e m s ( e a c h c o n s i s t i n g o f a g r o u p o f l i v e r t u m o r - p r o n e a n d t u m o r - r e s i s t a n t m i c e ) t o e l u c i d a t e u n i q u e m o l e c u l a r a l t e r a t i o n s i n t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e , a c r o s s a c o n t i n u u m o f P B t r e a t m e n t , i s a n e x t r e m e l y e f f e c t i v e a p p r o a c h f o r a s s e s s i n g c h a n g e s w h i c h a r e c r i t i c a l f o r t u m o r d e v e l o p m e n t . A p o w e r f u l a s p e c t o f t h i s r e s e a r c h w a s t h e a b i l i t y t o c o m p a r e a l t e r a t i o n s t h a t o c c u r r e d i n t u m o r - s u s c e p t i b l e , a s c o m p a r e d t o t u m o r - r e s i s t a n t m i c e . I n t h i s f a s h i o n , o n e c a n f o c u s u p o n k e y c h a n g e s i n g e n e s t h a t m i g h t d i r e c t l y c o n t r i b u t e t o c a r c i n o g e n e s i s . B 6 C 3 F 1 m i c e a r e s u s c e p t i b l e t o P B - i n d u c e d l i v e r t u m o r f o r m a t i o n , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) , a n d s i m i l a r l y , C A R W T m i c e d e v e l o p t u m o r s i n r e s p o n s e t o a D E N - i n i t i a t i o n / P B - p r o m o t i o n r e g i m e n , w h i l e C A R K O m i c e d o n o t ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . U n i q u e c h a n g e s i n D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n 3 5 9 w e r e d i s c e r n e d i n e a c h s e n s i t i v e g r o u p , a s c o m p a r e d t o t h e i r r e s i s t a n t c o u n t e r p a r t , i n o r d e r t o i d e n t i f y g e n e s t h a t , b y v i r t u e o f t h e i r d e r e g u l a t i o n , m i g h t e n h a n c e t h e a b e r r a n t c l o n a l e x p a n s i o n o f c e l l s t h a t u l t i m a t e l y c o n t r i b u t e s t o t u m o r f o r m a t i o n . I t i s c o m m o n t o e n c o u n t e r s t u d i e s t h a t f o c u s u p o n m o l e c u l a r c h a n g e s t h a t a r i s e t o w a r d s t h e e n d s t a g e s o f c a r c i n o g e n e s i s ( e . g . , f r a n k t u m o r s ) . W h i l e t h i s i s u n d o u b t e d l y a n i m p o r t a n t a v e n u e t o p u r s u e , i t i s n e c e s s a r y t o e x p l o r e e a r l i e r s t a g e s o f t h e d i s e a s e i n o r d e r t o d e v e l o p a m o r e c o m p r e h e n s i v e u n d e r s t a n d i n g o f t h e t u m o r i g e n e s i s p r o c e s s . O n e t r u l y n o v e l c o m p o n e n t o f m y r e s e a r c h i n v o l v e d a s c e r t a i n i n g e a r l y e v e n t s t h a t t r a n s p i r e d d u r i n g p e r i o d s o f P B t r e a t m e n t w h i c h a r e n o t c h a r a c t e r i z e d b y t h e p r e s e n c e o f t u m o r s . F o r e x a m p l e , i n a d d i t i o n t o l i v e r t u m o r s ( C A R W T , 3 2 w e e k s P B ) , p r e c a n c e r o u s l i v e r ( C A R W T , 2 3 w e e k s P B ) , c o n t a i n i n g n u m e r o u s m i c r o s c o p i c f o c i o f c e l l u l a r a l t e r a t i o n d i f f u s e d t h r o u g h o u t t h e t i s s u e , w a s e x a m i n e d . T u m o r s e v o l v e f r o m t h e s t e p - w i s e c l o n a l e x p a n s i o n o f i n i t i a t e d c e l l s ( F e i n b e r g , 2 0 0 6 ) , a n d t h u s , e a r l y c h a n g e s a r e c r i t i c a l . A s s u c h , t h e u s e o f p r e c a n c e r o u s l i v e r w a s a v a l u a b l e a s s e t f o r t h e e v a l u a t i o n o f s u c h a l t e r a t i o n s . F u r t h e r m o r e , l i v e r t i s s u e w a s a n a l y z e d f r o m m i c e t r e a t e d w i t h P B f o r e v e n s h o r t e r p e r i o d s ( i . e . 2 a n d 4 w e e k s ) , a t t i m e s w h e n c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n i s i n c r e a s e d ( C o u n t s e t a l . , 1 9 9 6 ; K o l a j a e t a l . , 1 9 9 6 a ) , b u t f a r e a r l i e r t h a n w h e n t u m o r s a r e p r e s e n t . T h e r e f o r e , a n o t h e r i n n o v a t i v e a s p e c t o f m y r e s e a r c h w a s t h e i n c l u s i o n o f t h e s e v e r y e a r l y t i m e s t o i d e n t i f y u n i q u e c h a n g e s i n t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e t h a t m i g h t b e i m p o r t a n t f o r t h e g r o w t h o f t u m o r s t h a t a r e d e s t i n e d t o b e c o m e e v i d e n t a t l a t e r t i m e s o f P B e x p o s u r e : 8 m o n t h s , w i t h D E N t r e a t m e n t ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) a n d 1 2 m o n t h s , w i t h o u t ( B e c k e r , 1 9 8 2 ) . I n t h i s m a n n e r , t w o d i s t i n c t m o d e l s y s t e m s w e r e u t i l i z e d t o e v a l u a t e u n i q u e m o l e c u l a r 3 6 0 e v e n t s ( a l t e r a t i o n s i n D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n ) i n t u m o r - p r o n e , a s c o m p a r e d t o t u m o r - r e s i s t a n t m i c e , w i t h i n a c o n t i n u u m o f P B t r e a t m e n t . T h i s a p p r o a c h p r o v i d e d a n e f f e c t i v e m e a n s o f e x p l o r i n g g e n e s a n d s i g n a l i n g p a t h w a y s t h a t m i g h t b e i n v o l v e d i n t u m o r i g e n e s i s . 2 ) B o t h i n c r e a s e s a n d d e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n r e p r e s e n t k e y e v e n t s t h a t o c c u r d u r i n g t u m o r d e v e l o p m e n t . T y p i c a l l y , c h a n g e s i n m e t h y l a t i o n s t a t u s a r e e l u c i d a t e d o n a g e n e - b y - g e n e b a s i s w i t h i n p r e - d e t e r m i n e d g e n o m i c r e g i o n s ( e . g . , b i s u l fi t e s e q u e n c i n g ) . L e s s f r e q u e n t l y , g e n o m e - w i d e t e c h n i q u e s , p r i m a r i l y l i m i t e d t o C p G i s l a n d s ( e . g . , r e s t r i c t i o n l a n d m a r k g e n o m e s c a n n i n g , R L G S a n d a m p l i fi c a t i o n o f i n t e r - m e t h y l a t e d s i t e s , A I M S ) , a r e a l s o u t i l i z e d t o d e t e c t m e t h y l a t i o n c h a n g e s . I u s e d a n o v e l m e t h o d o l o g y i n v o l v i n g m e t h y l a t i o n - s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n , a r b i t r a r i l y p r i m e d P C R ( A P - P C R ) , a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s , t o e v a l u a t e P B - i n d u c e d m e t h y l a t i o n p a t t e r n s w i t h i n C p G i s l a n d s ( m a i n l y u s i n g t h e r e s t r i c t i o n e n z y m e B s s H I I ) , a s w e l l a s a t n o n - i s l a n d C p G ( H p a l l ) a n d C p C p G ( M s p l ) s i t e s . T h i s t e c h n i q u e , w h i c h i s “ u n b i a s e d ” i n t h e s e n s e t h a t r e g i o n s t o b e a s s a y e d w e r e n o t p r e - s e l e c t e d , e n a b l e s t h e s i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n o f a n a r r a y o f c h a n g e s , i n c l u d i n g b o t h i n c r e a s e s ( h y p e r m e t h y l a t i o n a n d “ n e w ” m e t h y l a t i o n s ) , a s w e l l a s d e c r e a s e s ( h y p o m e t h y l a t i o n s ) , w i t h i n G C - r i c h r e g i o n s t h r o u g h o u t t h e g e n o m e . T h i s a p p r o a c h i s q u a n t i t a t i v e ( i . e . t h e e x t e n t s o f m e t h y l a t i o n c h a n g e s w e r e d e t e r m i n e d ) , a s w e l l a s h i g h l y a c c u r a t e a n d s e n s i t i v e . U s i n g t h i s m e t h o d , o u r l a b o r a t o r y p r e v i o u s l y e l u c i d a t e d u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s i n s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 , a t 2 a n d 4 w e e k s ( B a c h m a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h i s w o r k i s a n a l o g o u s t o t h e s t u d y d e s c r i b e d i n 3 6 1 C h a p t e r 3 , i n w h i c h u n i q u e R A M s w e r e d i s c e r n e d i n P B - t r e a t e d t u m o r - p r o n e C A R W T m i c e ( p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d l i v e r t u m o r s ) , a s c o m p a r e d t o t h e t u m o r - r e s i s t a n t C A R K O . T h e e l u c i d a t i o n o f “ c a r r y f o r w a r d ” R A M s ( i . e . c h a n g e s o b s e r v e d i n b o t h t i s s u e s ) i s c o n s i s t e n t w i t h a fi m d a m e n t a l p r i n c i p l e o f c a r c i n o g e n e s i s , t h a t i s , t h e a c c u m u l a t i o n o f h e r i t a b l e c h a n g e s w h i c h r e s u l t i n p r o l i f e r a t i v e g r o w t h a d v a n t a g e s , a n d t h e s u b s e q u e n t s e l e c t i v e c l o n a l e x p a n s i o n o f i n i t i a t e d c e l l s . I m p o r t a n t l y , P B c a u s e d b o t h i n c r e a s e s a n d d e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n l e v e l s , a n d c o n s i d e r e d t o g e t h e r w i t h d a t a t h a t d e m o n s t r a t e r o l e s f o r b o t h t y p e s o f a l t e r a t i o n s i n c a n c e r ( E s t e l l e r , 2 0 0 8 ) , m y r e s u l t s i n d i c a t e t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e o b s e r v e d R A M s m i g h t b e c r u c i a l f o r t u m o r f o r m a t i o n . T h u s , i t w a s o f p a r a m o u n t i m p o r t a n c e t o d i s c e r n t h e g e n e s i n w h i c h t h e s e m e t h y l a t i o n c h a n g e s o c c u r r e d . C h a p t e r s 1 a n d 4 d e s c r i b e t h e c l o n i n g a n d a n n o t a t i o n o f g e n e s t h a t h a r b o r e d t h e u n i q u e R A M s d i s c e r n e d i n t h e t u m o r - s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F l ( 5 1 g e n e s ) a n d C A R W T ( 4 7 g e n e s ) m i c e , r e s p e c t i v e l y . A l a r g e b o d y o f l i t e r a t u r e d e s c r i b e s t h e i d e n t i fi c a t i o n o f g e n e s d i s r u p t e d b y h y p e r m e t h y l a t i o n , i n c l u d i n g t h o s e i n v o l v e d i n a v a r i e t y o f c e l l u l a r p r o c e s s e s w h i c h a r e r e l e v a n t t o t u m o r i g e n e s i s : c e l l c y c l e , a p o p t o s i s , i n v a s i o n , t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n , t y r o s i n e k i n a s e s i g n a l i n g , a n d W n t s i g n a l i n g , a m o n g o t h e r s ( E s t e l l e r , 2 0 0 7 b ) . M a n y o f t h e g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n t h e B 6 C 3 F ] a n d C A R W T m i c e h a v e d o c u m e n t e d r o l e s i n c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s , i n c l u d i n g t h e c e l l c y c l e , a p o p t o s i s , a n g i o g e n e s i s , e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n , i n v a s i o n , m e t a s t a s i s , a n d m u l t i p l e s i g n a l i n g p a t h w a y s ( i . e . W n t , N o t c h , a n d T G F - B ) . T h u s , m y d a t a b o t h r e i n f o r c e a n d b u i l d u p o n p r e v i o u s o b s e r v a t i o n s , w i t h r e g a r d t o t u m o r i g e n e s i s - a s s o c i a t e d p a t h w a y s t h a t a r e a f f e c t e d b y a l t e r e d m e t h y l a t i o n , a n d s i g n i fi c a n t l y , 3 6 2 d e m o n s t r a t e t h a t c h a n g e s i n s p e c i fi c g e n e s w i t h i n t h e s e p a t h w a y s o c c u r a t v e r y e a r l y t i m e p o i n t s o f P B t r e a t m e n t . T h e l i t e r a t u r e i s m o r e l i m i t e d w i t h r e s p e c t t o t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f h y p o m e t h y l a t e d o n c o g e n e s , w h o s e i n d u c t i o n c a n f a c i l i t a t e t u m o r d e v e l o p m e n t ( W i l s o n e t a l . , 2 0 0 7 ) . M a n y g e n e s i n b o t h s u s c e p t i b l e t y p e s o f m i c e ( B 6 C 3 F l a n d C A R W T ) e x h i b i t e d P B - e l i c i t e d d e c r e a s e s i n m e t h y l a t i o n , a n d t h u s , m y r e s e a r c h h a s m a r k e d l y a d d e d t o a l i s t o f g e n e s t h a t , d u e t o t h e i r h y p o m e t h y l a t e d s t a t e s a n d d o c u m e n t e d fi m c t i o n s i n c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s , c o u l d p o t e n t i a l l y c o n t r i b u t e t o t u m o r i g e n e s i s . N o t a b l y , I h a v e a l s o s h o w n t h a t g e n e s n o t p r e v i o u s l y l i n k e d t o a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n a n d / o r t u m o r i g e n e s i s e x h i b i t e d u n i q u e m e t h y l a t i o n s t a t u s e s i n t h e t u m o r - p r o n e m i c e , r e s u l t i n g i n m a n y “ n e w ” c a n d i d a t e g e n e s t h a t m i g h t b e i n v o l v e d i n P B - i n d u c e d c a r c i n o g e n e s i s . 3 ) U n i q u e l y a l t e r e d g e n e s , a n d c a n c e r - r e l a t e d p a t h w a y s / p r o c e s s e s i n w h i c h t h e y a r e i n v o l v e d , w e r e d i s c e r n e d i n P B - t r e a t e d l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e . T h e m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s , a s i n d i c a t e d i n t h e i n t r o d u c t i o n , h a v e b e e n e x p l o r e d b u t n o t c o m p l e t e l y e l u c i d a t e d . P B a l t e r s m e t h y l a t i o n p a t t e r n s t o a g r e a t e r e x t e n t i n l i v e r t u m o r - p r o n e , a s c o m p a r e d t o r e l a t i v e l y r e s i s t a n t m i c e , a n d t h u s , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t D N A m e t h y l a t i o n p l a y s a r o l e i n t h e i r d i f f e r e n t i a l s u s c e p t i b i l i t i e s ( r e v i e w e d i n G o o d m a n a n d W a t s o n , 2 0 0 2 ; W a t s o n a n d G o o d m a n , 2 0 0 2 ) . R e m a r k a b l y , e l u c i d a t i o n o f P B - e l i c i t e d m e t h y l a t i o n c h a n g e s a t e a r l y ( i . e . 2 a n d 4 w e e k s , n o l e s i o n s e v i d e n t ) a n d l a t e r ( 2 3 w e e k s , p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d 3 2 w e e k s , l i v e r t u m o r s ) t i m e p o i n t s , r e s u l t e d i n 1 1 i d e n t i c a l r e g i o n s t h a t e x h i b i t e d m e t h y l a t i o n c h a n g e s i n b o t h t y p e s o f s u s c e p t i b l e m i c e . S i g n i fi c a n t l y , 6 g e n e s e x h i b i t e d R A M s t h a t d e m o n s t r a t e d t h e 3 6 3 s a m e d i r e c t i o n o f m e t h y l a t i o n c h a n g e ( T a b l e 6 . 1 ) , a n d o n l y 2 o f t h e m ( P r i c k l e 2 a n d P t p r o ) a r e l i n k e d t o c a r c i n o g e n e s i s . T h u s , i t i s o f i n t e r e s t t o f u l l y i n v e s t i g a t e t h e f u n c t i o n s o f t h e s e 6 g e n e s . R e l a t i o n s h i p s b e t w e e n g e n e e x p r e s s i o n a n d m e t h y l a t i o n s t a t u s a t l a t e t i m e p o i n t s ( e . g . i n t u m o r s ) a r e o f t e n d i s c e r n e d ( E s t e l l e r , 2 0 0 1 ; E s t e l l e r , 2 0 0 7 b ) . M y d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h p r o v i d e d t h e e x t r a o r d i n a r y o p p o r t u n i t y t o e x p l o r e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n m e t h y l a t i o n a n d e x p r e s s i o n n o t o n l y w i t h i n t u m o r t i s s u e , b u t a l s o i n l i v e r t i s s u e t h a t l a c k s f r a n k t u m o r s ( i . e . 2 , 4 , a n d 2 3 w e e k s / p r e c a n c e r o u s l i v e r ) . A s u b s e t o f t h e g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s a l s o e x h i b i t e d e x p r e s s i o n c h a n g e s i n t h e s u s c e p t i b l e g r o u p s ( T a b l e 6 . 1 ) . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t i n r e s p o n s e t o P B , D N A m e t h y l a t i o n m i g h t r e g u l a t e g e n e e x p r e s s i o n , s p e c i fi c a l l y w i t h i n t h e c o n t e x t o f t u m o r i g e n e s i s , s i n c e m a n y o f t h e g e n e s p l a y k n o w n r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s - r e l a t e d p r o c e s s e s . T h e d i v e r g e n t e x p r e s s i o n p a t t e r n s o f B c a t 2 ( r e p r e s s e d a t 4 w e e k s a n d i n d u c e d a t 2 3 w e e k s , p r e c a n c e r o u s l i v e r ) c o u l d b e t h e r e s u l t o f a n i m p o r t a n t m e t h y l a t i o n c h a n g e t h a t a r i s e s e a r l y ( e . g . , n e w m e t h y l a t i o n a t 4 w e e k s ) b u t h a s n o t y e t m e t a c e r t a i n t h r e s h o l d w h i c h i s n e c e s s a r y f o r i n c r e a s i n g e x p r e s s i o n t o l e v e l s t h a t a r e o b s e r v e d a t l a t e r t i m e p o i n t s ( e . g . 2 3 w e e k s , p r e c a n c e r o u s l i v e r ) ( T a b l e 6 . 1 ) . T 3 1 e r ( a m a i n c o m p o n e n t o f T G F - B s i g n a l i n g ) i s h y p o m e t h y l a t e d a t 4 w e e k s i n l i v e r s o f B 6 C 3 F 1 m i c e ( C h a p t e r 1 ) a n d i n d u c e d i n l i v e r t u m o r s ( C h a p t e r 5 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e o b s e r v a t i o n s l e a d m e t o h y p o t h e s i z e t h a t e a r l y a l t e r a t i o n s i n m e t h y l a t i o n c h a n g e s m i g h t n o t a l w a y s r e s u l t i n i m m e d i a t e t r a n s c r i p t i o n a l c o n s e q u e n c e s . A d d i t i o n a l f a c t o r s m u s t b e r e c r u i t e d , s u c h a s m e t h y l - b i n d i n g p r o t e i n s a n d o t h e r r e p r e s s i v e p r o t e i n s t o s i l e n c e e x p r e s s i o n a t h y p e r m e t h y l a t e d C p G s i t e s , a n d c o m p o n e n t s o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l m a c h i n e r y ( R N A 3 6 4 p o l y m e r a s e , c o a c t i v a t o r s , e n h a n c e r s ) t o a c t i v a t e t r a n s c r i p t i o n f r o m h y p o m e t h y l a t e d s i t e s . T h u s , w h i l e m e t h y l a t i o n c h a n g e s a t 2 o r 4 w e e k s m i g h t h a v e b e e n e s s e n t i a l f o r a f f e c t i n g t r a n s c r i p t i o n , t h e s e m i g h t n o t h a v e i n s t a n t a n e o u s l y m a n i f e s t e d a s e x p r e s s i o n c h a n g e s . T h e r e h a v e b e e n l i m i t e d l a r g e - s c a l e P B e x p r e s s i o n s t u d i e s ( S t a h l e t a l . , 2 0 0 5 ; U e d a e t a l . , 2 0 0 2 ) p r o b i n g a p p r o x i m a t e l y 1 2 , 0 0 0 a n d 8 , 7 3 6 t r a n s c r i p t s , r e s p e c t i v e l y . I n o r d e r t o b e t t e r p i c t u r e h o w P B m i g h t b e p r o m o t i n g l i v e r t u m o r f o r m a t i o n , I p e r f o r m e d a n F 5 " e x t e n s i v e ( i . e . 1 6 , 4 7 5 t r a n s c r i p t s ) m i c r o a r r a y a n a l y s i s . U l t i m a t e l y , u n i q u e e x p r e s s i o n ' c h a n g e s w e r e a s c e r t a i n e d i n s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 a n d 4 w e e k s , a s w e l l a s t h e C A R W T m i c e a t 2 3 ( p r e c a n c e r o u s l i v e r ) a n d 3 2 ( l i v e r t u m o r s ) w e e k s , a s c o m p a r e d t o 5 ' . . - 4 ; t h e i r r e s i s t a n t c o u n t e r p a r t s . I fi r s t f o c u s e d u p o n g e n e s t h a t w e r e i n c o m m o n b e t w e e n ' b o t h t y p e s o f s u s c e p t i b l e m i c e ( e . g . , G a d d 4 5 a , G a d d 4 5 b , C x c r 7 ) , a s t h e s e m a y b e e s p e c i a l l y i m p o r t a n t , p o t e n t i a l l y r e p r e s e n t i n g c h a n g e s w h i c h o c c u r r e d a t 2 a n d / o r 4 w e e k s , c o n f e r r e d a p r o l i f e r a t i v e a d v a n t a g e o v e r n e i g h b o r i n g c e l l s , a n d a s a r e s u l t o f c l o n a l e x p a n s i o n , w e r e s t i l l a l t e r e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s ( T a b l e 6 . 2 ) . D i s t u r b a n c e o f o v e r a l l s i g n a l i n g n e t w o r k s i s c r i t i c a l f o r t u m o r d e v e l o p m e n t . F o r e x a m p l e , i n p a n c r e a t i c c a n c e r a n d g l i o b l a s t o m a , c o r e s i g n a l i n g p a t h w a y s a r e g e n e t i c a l l y a l t e r e d , i . e . d i f f e r e n t t u m o r s o f t h e s a m e t y p e e x h i b i t e d m u t a t i o n s i n v a r i o u s g e n e s i n v o l v e d i n t h e s a m e p a t h w a y , a n d n o t e v e r y t u m o r h a r b o r e d a l l o f t h e m u t a t i o n s ( J o n e s e t a l . , 2 0 0 8 ; P a r s o n s e t a l . , 2 0 0 8 ) . T h e r e f o r e , I t h e n c o n s i d e r e d t h e o v e r a r c h i n g p a t h w a y s a n d p r o c e s s e s i n w h i c h t h e g e n e s o f i n t e r e s t p a r t i c i p a t e . I n d e e d , i n e a c h t y p e o f s u s c e p t i b l e m i c e , m a n y o f t h e u n i q u e l y a c t i v e g e n e s ( b a s e d o n m i c r o a r r a y a n a l y s i s ) , a n d s e p a r a t e l y , g e n e s t h a t e x h i b i t e d u n i q u e R A M s ( a n d s o m e t i m e s , a l t e r e d e x p r e s s i o n ) , p l a y d o c u m e n t e d r o l e s i n c a n c e r - r e l a t e d s i g n a l i n g p a t h w a y s a n d p r o c e s s e s . I m p o r t a n t l y , 3 6 5 h o w e v e r , w h e n b o t h g r o u p s o f g e n e s a r e c o n s i d e r e d t o g e t h e r w i t h i n t h e c o n t e x t o f a p a r t i c u l a r m o d e l s y s t e m , t h e c r u c i a l p a t h w a y s a n d p r o c e s s e s t h a t t h e y a f f e c t a r e c o m p l e m e n t a r y ( T a b l e 6 . 3 ) . F o r e x a m p l e , g e n e s w h o s e m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n s t a t u s e s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n B 6 C 3 F 1 m i c e p a r t i c i p a t e i n t h e c e l l c y c l e , a p o p t o s i s , a n g i o g e n e s i s , e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n , i n v a s i o n , m e t a s t a s i s , a n d W n t , N o t c h , a n d T G F - B s i g n a l i n g ) . S i m i l a r l y , g e n e s w h o s e m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n l e v e l s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n C A R W T m i c e p a r t i c i p a t e i n t h e c e l l c y c l e , a n g i o g e n e s i s , e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c e l l t r a n s i t i o n , a n d a d h e s i o n , p l u s W n t , T G F - B , a n d H e d g e h o g s i g n a l i n g . I m p o r t a n t l y , t h e r e a r e p a t h w a y s a n d p r o c e s s e s t h a t a r e i n c o m m o n b e t w e e n b o t h t y p e s o f s u s c e p t i b l e m i c e ( T a b l e 6 . 3 ) , s u g g e s t i n g t h a t s e v e r a l o f t h e s e p a t h w a y s c o u l d f u n c t i o n a t e a r l y , a s w e l l a s l a t e t i m e p o i n t s , t o d r i v e t u m o r d e v e l o p m e n t . M a n y o f t h e s e p a t h w a y s a r e c a p a b l e o f f a c i l i t a t i n g t h e a c q u i s i t i o n o f t h e 6 f u n d a m e n t a l c h a r a c t e r i s t i c s o f a t u m o r t h a t c o n t r o l i t s m a l i g n a n t g r o w t h ( H a h a n h a n a n d W e i n b e r g , 2 0 0 0 ) I t i s r e a s o n a b l e t o p r o p o s e , b a s e d o n t h e a f o r e m e n t i o n e d d a t a , i n c o m b i n a t i o n w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e e x p r e s s i o n o f k e y g e n e s w h i c h e x h i b i t e d u n i q u e R A M s w a s a l t e r e d ( i . e . D N A m e t h y l a t i o n c o u l d b e f u n c t i o n i n g a s a r e g u l a t o r y m e c h a n i s m ) , t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e a b e r r a n t m e t h y l a t i o n a n d t r a n s c r i p t i o n a l c h a n g e s o b s e r v e d u n d e r l i e P B - i n d u c e d t m n o r i g e n e s i s . A c c o r d i n g l y , I h a v e s u g g e s t e d n u m e r o u s g e n e s t h a t c o u l d b e u t i l i z e d f o r t h e d e v e l o p m e n t o f “ fi n g e r p r i n t s ” o f P B e x p o s u r e ( T a b l e 6 . 1 : m e t h y l a t i o n / e x p r e s s i o n , a n d T a b l e 6 . 2 : e x p r e s s i o n o n l y ) . T h e s e t a b l e s c o n t a i n s u b s e t s o f t h e g e n e s p r o p o s e d i n C h a p t e r 5 . T h e y w e r e i n c l u d e d b e c a u s e t h e y e x h i b i t e d c h a n g e s a t 3 6 6 b o t h e a r l y a n d l a t e r t i m e s , a n d a d d i t i o n a l l y , t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s o f a p a r t i c u l a r R A M w a s u n a m b i g u o u s a t t h e i n d i c a t e d t i m e p o i n t . B i o m a r k e r d e v e l o p m e n t i s a n i m p o r t a n t f o c a l p o i n t i n c a n c e r b i o l o g y r e s e a r c h . F u r t h e r m o r e , s h o r t - t e r m a n d m o r e c o s t - e f f e c t i v e a s s a y s a r e c u r r e n t l y b e i n g p u r s u e d f o r t h e d e t e c t i o n o f p o t e n t i a l n o n g e n o t o x i c c a r c i n o g e n s , s u c h t h a t c o m p o u n d s w h i c h m i g h t p o s e a r i s k c a n b e i d e n t i fi e d e a r l i e r t h a n 2 y e a r s ( t h e l e n g t h o f t h e s t a n d a r d r o d e n t b i o a s s a y ) . O n e g r o u p , u s i n g d a t a fi o m r a t s t r e a t e d f o r 5 d a y s w i t h l o f a v a r i e t y o f c o m p o u n d s , d e v e l o p e d a 3 7 - g e n e e x p r e s s i o n s i g n a t u r e t h a t w a s h i g h l y p r e d i c t i v e o f n o n g e n o t o x i c h e p a t i c t u m o r i g e n i c i t y ( F i e l d e n e t a l . , 2 0 0 7 ) . A n o t h e r g r o u p , u s i n g r a t s t r e a t e d f o r 2 4 h o u r s w i t h o n e o f n u m e r o u s c h e m i c a l s , e l u c i d a t e d a p a n e l o f 6 g e n e s t h a t w e r e s u c c e s s f u l i n i d e n t i f y i n g n o n g e n o t o x i c c a r c i n o g e n s ( N i e e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e a p p r o a c h t a k e n t o d i s c e r n k e y g e n e s i s m o r e a p p r o p r i a t e t h a n w h a t i s c u r r e n t l y i n t h e l i t e r a t u r e b e c a u s e c h a n g e s t h a t o c c u r r e d i n t h e r e s i s t a n t g r o u p s w e r e “ s u b t r a c t e d o u t ” , a l l o w i n g m e t o f o c u s o n t h o s e i n t h e s u s c e p t i b l e m i c e t h a t p o t e n t i a l l y d i r e c t l y c o n t r i b u t e t o t u m o r i g e n e s i s . T h e g e n e s t h a t w e r e d i s c e r n e d , p a r t i c u l a r l y t h o s e t h a t w e r e a l t e r e d a t b o t h e a r l y a n d l a t e r t i m e p o i n t s o f P B t r e a t m e n t , m i g h t b e e x t r e m e l y b e n e fi c i a l i n t h e o n g o i n g e f f o r t s t o c l a s s i f y n o n g e n o t o x i c h e p a t o c a r c i n o g e n s . 4 ) A l t e r e d e x p r e s s i o n o f D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e ( D n m t ) g e n e s , i n a d d i t i o n t o g e n e s i n v o l v e d i n l - c a r b o n m e t a b o l i s m , c o u l d r e p r e s e n t m e c h a n i s m s b y w h i c h u n i q u e P B - i n d u c e d R A M s f o r m e d i n l i v e r - t u m o r s u s c e p t i b l e m i c e . T h e e x p r e s s i o n o f D n m t g e n e s h a s b e e n e v a l u a t e d i n t h e c o n t e x t o f t u m o r i g e n e s i s , i n c l u d i n g h u m a n h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a ( L i n e t a l . , 2 0 0 1 ; R o b e r t s o n e t a l . , 1 9 9 9 ) , 3 6 7 m a i n l y b e c a u s e o f t h e c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t i n e l u c i d a t i n g m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g a b e r r a n t m e t h y l a t i o n c h a n g e s . A n o v e l f a c e t o f m y r e s e a r c h w a s t h e a s s e s s m e n t o f P B - e l i c i t e d t r a n s c r i p t i o n a l c h a n g e s o f 3 m a j o r D n m t g e n e s ( D n m t l , 3 a , a n d 3 b ) a t v e r y e a r l y t i m e p o i n t s ( i . e . 2 a n d 4 w e e k s ) , i n a d d i t i o n t o p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d l i v e r t u m o r s , t h e r e b y p r o v i d i n g t h e i r e x p r e s s i o n s t a t u s e s a c r o s s a c o n t i n u u m o f t r e a t m e n t . I t w a s r e m a r k a b l e t o o b s e r v e t h a t t h e e x p r e s s i o n o f a l l 3 g e n e s w a s u n i q u e l y r e p r e s s e d i n s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e ( v . t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t C 5 7 B L / 6 ) a t b o t h 2 a n d 4 w e e k s , w h i l e 2 o f t h e m w e r e u n i q u e l y i n d u c e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r ( D n m t 3 a ) a n d l i v e r t u m o r s ( D n m t l a n d D n m t 3 a ) ( v . l i v e r t i s s u e f r o m C A R K O , P B - t r e a t e d m i c e ) . B a s e d o n t h e d i v e r g e n t e x p r e s s i o n s t a t u s e s a t e a r l y a n d l a t e r t i m e p o i n t s , i t i s l i k e l y t h a t t h e s p e c i fi c f u n c t i o n s o f t h e D N M T s a r e d i f f e r e n t , d e p e n d i n g o n t h e s t a g e o f P B t r e a t m e n t . M o r e o v e r , t h e e x p r e s s i o n o f 3 g e n e s i n v o l v e d i n l - c a r b o n m e t a b o l i s m ( C b s , M t r r , S h m t l ) , w h i c h c a n i n fl u e n c e m e t h y l a t i o n l e v e l s ( U l r e y e t a l . , 2 0 0 5 ) , w a s u n i q u e l y a l t e r e d i n B 6 C 3 F 1 m i c e a t 2 o r 4 w e e k s . I n t e r e s t i n g l y , C b s w a s r e p r e s s e d u n i q u e l y a t b o t h 2 w e e k s a n d i n l i v e r t u m o r s . P u t a t i v e C A R r e s p o n s e e l e m e n t s ( C A R E S ) w e r e l o c a t e d w i t h i n a l l 3 D n m t g e n e s , t h u s p r o v i d i n g a p o t e n t i a l d i r e c t l i n k b e t w e e n P B a n d a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n . O v e r a l l , P B - e l i c i t e d t r a n s c r i p t i o n a l c h a n g e s o f t h e s e g e n e s c o u l d , i n p a r t , b e r e s p o n s i b l e f o r t h e a b e r r a n t m e t h y l a t i o n c h a n g e s o b s e r v e d m r i q u e l y i n t h e l i v e r t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e . 5 ) E v i d e n c e s u p p o r t s t h e r o l e o f C A R i n m e d i a t i n g g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s t h a t o c c u r r e d i n r e s p o n s e t o P B t r e a t m e n t , a t b o t h e a r l y a n d l a t e r t i m e p o i n t s , w h i c h m i g h t c o n t r i b u t e t o c a r c i n o g e n e s i s . 3 6 8 C A R i s e s s e n t i a l f o r P B - i n d u c e d t u m o r i g e n e s i s ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 4 ) . P r i o r t o m y r e s e a r c h , a r a t h e r l i m i t e d ( i . e . 8 , 7 3 6 g e n e s / E S T S ) g e n e e x p r e s s i o n s t u d y h a d b e e n p e r f o r m e d , u s i n g C A R W T a n d K O m i c e , w h i c h r e s u l t e d i n t h e i d e n t i fi c a t i o n o f b o t h C A R - d e p e n d e n t a n d - i n d e p e n d e n t c h a n g e s ( U e d a e t a l . , 2 0 0 2 ) . I n o r d e r t o o b t a i n a m o r e i n - d e p t h v i e w o f h o w C A R m i g h t f a c i l i t a t e t u m o r p r o m o t i o n i n r e s p o n s e t o P B t r e a t m e n t , I p e r f o r m e d a m o r e c o m p r e h e n s i v e ( 1 6 , 4 7 5 t r a n s c r i p t s ) m i c r o a r r a y a n a l y s i s t h a t r e s u l t e d i n t h e e l u c i d a t i o n o f u n i q u e c h a n g e s i n C A R W T m i c e ( p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d l i v e r t u m o r s ) . I n d e e d , h u n d r e d s o f g e n e s a p p e a r t o b e u n d e r C A R - d e p e n d e n t r e g u l a t i o n . A d d i t i o n a l l y , P B a l t e r e d t h e e x p r e s s i o n s t a t u s e s o f m u l t i p l e g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M S i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d l i v e r t u m o r s , a n d t h e e x p r e s s i o n l e v e l s w e r e d i f f e r e n t a s c o m p a r e d t o t h o s e o b s e r v e d i n l i v e r t i s s u e f r o m P B - t r e a t e d C A R K O m i c e . T h e s e d a t a r e i n f o r c e t h e r o l e o f C A R i n P B - e l i c i t e d g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s , a n d a l s o , i n a n o v e l f a s h i o n , i n t r o d u c e a v a s t a r r a y o f g e n e s a f f e c t e d u n i q u e l y b y P B i n t u m o r - p r o n e m i c e . B a s e d u p o n t h e i r k n o w n f u n c t i o n s i n c a n c e r , a t l e a s t s o m e o f t h e s e g e n e s m i g h t b e m e c h a n i s t i c a l l y c r i t i c a l f o r t u m o r f o r m a t i o n . M o r e o v e r , n u m e r o u s g e n e s w h o s e m e t h y l a t i o n a n d / o r e x p r e s s i o n s t a t u s e s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y i n p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d / o r l i v e r t u m o r s c o n t a i n e d p u t a t i v e C A R E S , p r o v i d i n g f u r t h e r s u p p o r t f o r t h e c o n c e p t t h a t t h e i r e x p r e s s i o n i s r e g u l a t e d b y C A R . N o t a b l y , a s e a r l y a s 2 o r 4 w e e k s , g e n e s k n o w n t o b e i n d u c e d b y C A R w e r e i n d e e d u n i q u e l y u p - r e g u l a t e d i n B 6 C 3 F 1 m i c e , i n d i c a t i n g t h e p o t e n t i a l f o r t h e i r m o d u l a t i o n b y t h e n u c l e a r r e c e p t o r . F u r t h e r m o r e , C A R E S w e r e p r e s e n t w i t h i n g e n e s i d e n t i fi e d f r o m u n i q u e R A M s i n t h e s u s c e p t i b l e B 6 C 3 F 1 m i c e , a n d t h e e x p r e s s i o n o f a s u b s e t w a s a l t e r e d , u n i q u e l y i n s o m e i n s t a n c e s , a s c o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y r e s i s t a n t 3 6 9 C 5 7 B L / 6 m i c e . T h u s , C A R m i g h t c o n t r o l k e y t r a n s c r i p t i o n a l c h a n g e s d u r i n g t h e i n i t i a l s t a g e s o f p r o m o t i o n b y P B . S i n c e a s u b s e t o f t h e a f o r e m e n t i o n e d g e n e s a r e k n o w n t o p a r t i c i p a t e i n t u m o r i g e n e s i s - r e l a t e d p r o c e s s e s , i t i s p o s s i b l e t h a t C A R e n h a n c e s t h e s e l e c t i v e c l o n a l e x p a n s i o n o f c e l l s a s e a r l y a s 2 a n d / o r 4 w e e k s . A S d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , p u t a t i v e C A R E S w e r e p r e s e n t i n a l l 3 D n m t g e n e s , w h o s e e x p r e s s i o n w a s a l t e r e d u n i q u e l y i n b o t h t h e B 6 C 3 F 1 a n d C A R W T m i c e , t h u s p r o v i d i n g a p o t e n t i a l d i r e c t l i n k t o P B a n d t h e t r a n s c r i p t i o n o f g e n e s t h a t c a n i m p a c t m e t h y l a t i o n p a t t e r n s . I m p o r t a n t l y , C A R m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e i r r e g u l a t i o n , t h u s p o t e n t i a l l y a f f e c t i n g t h e D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s e s o f g e n e s t h a t c o u l d f a c i l i t a t e t u m o r i g e n e s i s . T a k e n t o g e t h e r , d a t a f r o m t h e B 6 C 3 F 1 - C 5 7 B L / 6 a n d C A R m o d e l s y s t e m s i m p l i c a t e C A R i n t h e m e d i a t i o n o f k e y P B - e l i c i t e d g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s a t e a r l y , i n a d d i t i o n t o l a t e t i m e p o i n t s o f t r e a t m e n t , i n t u m o r - s u s c e p t i b l e m i c e . S i n c e m a n y o f t h e a f f e c t e d g e n e s p l a y d o c u m e n t e d r o l e s i n c a r c i n o g e n e s i s , C A R m i g h t e n h a n c e t h e a b e r r a n t e x p a n s i o n o f c e l l s h a r b o r i n g t h e s e c h a n g e s , u l t i m a t e l y r e s u l t i n g i n t u m o r f o r m a t i o n . 3 7 0 C o n c l u s i o n s T h e o v e r a l l g o a l o f t h e s e s t u d i e s w a s t o e l u c i d a t e p r o g r e s s i v e c h a n g e s , i n m e t h y l a t i o n a n d e x p r e s s i o n s t a t u s , o f g e n e s w h i c h p l a y k e y r o l e s i n l i v e r t u m o r i g e n e s i s i n d u c e d b y P B , w i t h a n e m p h a s i s o n t h e i r p o t e n t i a l t o a f f e c t S i g n a l i n g t h r o u g h c r i t i c a l p a t h w a y s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f c e l l g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n . T w o d i s t i n c t m o d e l s y s t e m s , r e p r e s e n t i n g e a r l y a n d l a t e t i m e s , w e r e e a c h c o m p r i s e d o f a g r o u p o f l i v e r t u m o r - p r o n e a n d t u m o r - r e s i s t a n t m i c e a n d w e r e u t i l i z e d i n c o m b i n a t i o n t o e v a l u a t e P B - e l i c i t e d a l t e r a t i o n s t h a t a r o s e u n i q u e l y i n t h e s u s c e p t i b l e m i c e . T h e o b s e r v a n c e o f e a r l y P B - i n d u c e d D N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s a n d c o n c u r r e n t e x p r e s s i o n c h a n g e s , o f g e n e s w h i c h c o n c e i v a b l y f u n c t i o n i n c a n c e r - r e l a t e d p r o c e s s e s , s u p p o r t t h e a s s e r t i o n t h a t a b e r r a n t m e t h y l a t i o n i s a m e c h a n i s m u n d e r l y i n g t u m o r i g e n e s i s . F u r t h e r m o r e , a v i e w o f t h e p r o g r e s s i v e n a t u r e o f t h e m u l t i s t a g e m o d e l o f c a r c i n o g e n e s i s w a s p r o v i d e d , a s g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n o r m e t h y l a t i o n s t a t u s e s w e r e d i s r u p t e d a t 2 a n d / o r 4 w e e k s r e m a i n e d d e r e g u l a t e d i n p r e c a n c e r o u s l i v e r t i s s u e a n d / o r l i v e r t u m o r s . I m p o r t a n t l y , m a n y o f t h e g e n e s a f f e c t e d i n t h e s u s c e p t i b l e m i c e p l a y d o c u m e n t e d r o l e s i n c a n c e r , i n d i c a t i v e o f t h e i r p o s s i b l e i n v o l v e m e n t i n t u m o r f o r m a t i o n , a n d a l s o c o n t a i n C A R E S , w h i c h l i n k t h e s e c h a n g e s t o C A R . M o r e o v e r , 3 D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e g e n e s a l s o h a r b o r C A R E S , a n d t h e i r e x p r e s s i o n l e v e l s w e r e a l t e r e d u n i q u e l y a t e a r l y ( D n m t l , D n m t 3 a , a n d D n m t 3 b ) a n d / o r l a t e ( D n m t l a n d D n m t 3 a ) t i m e p o i n t s , s u g g e s t i v e o f a p o t e n t i a l d i r e c t a s s o c i a t i o n b e t w e e n P B a n d a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s . A c r i t i c a l a s p e c t o f t h i s r e s e a r c h w a s t h e a n a l y s i s o f l i v e r t i s s u e a t e x t r e m e l y e a r l y t i m e p o i n t s , a s w e l l a s p r e c a n c e r o u s l i v e r a n d i n d i v i d u a l t u m o r s , t o e l u c i d a t e u n i q u e m o l e c u l a r c h a n g e s i n t h e s u s c e p t i b l e g r o u p s . T h i s p r o v e d t o b e a n e f f e c t i v e s t r a t e g y f o r 3 7 1 a s c e r t a i n i n g c r i t i c a l c h a n g e s t h a t o c c u r r e d a c r o s s a c o n t i n u u m o f P B e x p o s u r e . M y d i s s e r t a t i o n r e s e a r c h c u l m i n a t e d i n t h e i d e n t i fi c a t i o n o f g e n e s ( a n d t h e s i g n a l i n g p a t h w a y s a n d c e l l u l a r p r o c e s s e s i n w h i c h t h e y p a r t i c i p a t e ) t h a t , b y v i r t u e o f t h e i r u n i q u e d e r e g u l a t i o n i n t u m o r - p r o n e , a s c o m p a r e d t o r e s i s t a n t m i c e , c o u l d c o n t r i b u t e t o t u m o r i g e n e s i s . C o l l e c t i v e l y , t h e s e d a t a p r o v i d e n o v e l i n s i g h t w i t h r e g a r d t o a d e t a i l e d p i c t u r e o f D N A m e t h y l a t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n c h a n g e s t h a t f a c i l i t a t e P B - i n d u c e d h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . a ! R E F E R E N C E S F O R I N T R O D U C T I O N , S U N I I V I A R Y , A N D D I S C U S S I O N S E C T I O N S A R E L I S T E D O N P A G E S 3 7 3 - 3 9 1 . 3 7 2 R E F E R E N C E S A a r o n s o n , S . A . ( 1 9 9 1 ) S c i e n c e . G r o w t h f a c t o r s a n d c a n c e r . S c i e n c e 2 5 4 , 1 1 4 6 - 1 1 5 3 . A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y . ( 2 0 0 5 ) C a n c e r F a c t s a n d F I G S 2 0 0 5 . A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y [ o n l i n e ] , h t t p : / / w w w . c a n c e r . o r g / d o c r o o t / h o m e / i n d e x . a s p A n t e q u e r a , F . ( 2 0 0 3 ) S t r u c t u r e , f u n c t i o n a n d e v o l u t i o n o f C p G i s l a n d p r o m o t e r s . C e l l . M o l . L i f e S c i . 6 0 , 1 6 4 7 — 1 6 5 8 A n t e q u e r a , F . , a n d B i r d , A . ( 1 9 9 3 ) N u m b e r o f C p G i s l a n d s a n d g e n e s i n h u m a n a n d m o u s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 9 0 , 1 1 9 9 5 - 1 1 9 9 9 . A n t h o n y , P . , B u r t , A . , I s h a k K . , M a c S w e e n R . , P o r t m a n 3 . , a n d S c h e u e r P . , E d s . ( 2 0 0 2 ) P a t h o l o g y o f t h e L i v e r . C h u r c h i l l L i v i n g s t o n e : L o n d o n , N e w Y o r k , S y d n e y , T o r o n t o , p . 7 1 1 - 7 7 5 . A o i , T . , Y a e , K . , N a k a g a w a , M . , I c h i s a k a , T . , O k i t a , K . , T a k a h a s h i , K . , C h i b a , T . , a n d Y a m a n a k a , S . ( 2 0 0 8 ) G e n e r a t i o n o f p l u r i p o t e n t s t e m c e l l s f r o m a d u l t m o u s e l i v e r a n d s t o m a c h c e l l s . S c i e n c e 3 2 1 , 6 9 9 - 7 0 2 . A y d i n l i k , H . , N g u y e n , T . D . , M o e n n i k e s , 0 . , B u c h m a n n , A . , a n d S c h w a r z , M . ( 2 0 0 1 ) . S e l e c t i v e p r e s s u r e d u r i n g t u m o r p r o m o t i o n b y p h e n o b a r b i t a l l e a d s t o c l o n a l o u t g r o w t h o f B - c a t e n i n - m u t a t e d m o u s e l i v e r t u m o r s . O n c o g e n e 2 2 , 7 8 1 2 - 7 8 1 6 . B a c h m a n , A . N . , P h i l l i p s , J . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 6 ) P h e n o b a r b i t a l i n d u c e s p r o g r e s s i v e p a t t e r n s o f G C - r i c h a n d g e n e - s p e c i fi c a l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n i n t h e l i v e r o f t u m o r - p r o n e B 6 C 3 F 1 m i c e . T o x i c o l . S c i . 9 1 , 3 9 3 - 4 0 5 . B a c h m a n , K . E . , P a r k , B . H . , R h e e , I . , R a j a g o p a l a n , H . , H e r m a n , J . G . , B a y l i n , S . B . , K i n z l e r , K . W . , a n d V o g e l s t e i n , B . ( 2 0 0 3 ) H i s t o n e m o d i fi c a t i o n s a n d S i l e n c i n g p r i o r t o D N A m e t h y l a t i o n o f a t u m o r s u p p r e s s o r g e n e . C a n c e r C e l l . 3 , 8 9 - 9 5 . B a c h m a n , K . E . , R o u n t r e e , M . R . , a n d B a y l i n , S . B . ( 2 0 0 1 ) D n m t 3 a a n d D n m t 3 b a r e t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s o r s t h a t e x h i b i t u n i q u e l o c a l i z a t i o n p r 0 p e r t i e s t o h e t e r o c h r o m a t i n . J . B i o l . C h e m . 2 7 6 , 3 2 2 8 2 — 3 2 2 8 7 B a d a l , V . , C h u a n g , L . S . , T a n , E . H . , B a d a l , S . , V i l l a , L . L . , W h e e l e r , C . M . , L i , B . F . , a n d B e r n a r d , H . U . ( 2 0 0 3 ) C p G m e t h y l a t i o n o f h u m a n p a p i l l o m a v i r u s t y p e 1 6 D N A i n c e r v i c a l c a n c e r c e l l l i n e s a n d i n c l i n i c a l s p e c i m e n s : g e n o m i c h y p o m e t h y l a t i o n c o r r e l a t e s w i t h c a r c i n o g e n i c p r o g r e s s i o n . J . V i r o l . 7 7 , 6 2 2 7 - 6 2 3 4 . B a e s , M . , G u l i c k , T . , C h o i , H . S . , M a r t i n o l i , M . G . , S i m h a , D . , a n d M o o r e , D . D . ( 1 9 9 4 ) A n e w o r p h a n m e m b e r o f t h e n u c l e a r h o r m o n e r e c e p t o r s u p e r f a m i l y t h a t i n t e r a c t s w i t h a s u b s e t o f r e t i n o i c a c i d r e s p o n s e e l e m e n t s . M o l . C e l l . B i o l . 1 4 , 1 5 4 4 - 1 5 5 2 . 3 7 3 B a n i n e , F . , B a r t l e t t , C . , G u n a w a r d e n a , R . , M u c h a r d t , C . , Y a n i v , M . , K n u d s e n , E . S . , W e i s s m a n , B . E . , a n d S h e r m a n , L . S . ( 2 0 0 5 ) S W I / S N F c h r o m a t i n - r e m o d e l i n g f a c t o r s i n d u c e c h a n g e s i n D N A m e t h y l a t i o n t o p r o m o t e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n . C a n c e r R e s . 6 5 , 3 5 4 2 - 3 5 4 7 . B a y l i n , S . B . , O h m , J . E . ( 2 0 0 6 ) E p i g e n e t i c g e n e S i l e n c i n g i n c a n c e r - a m e c h a n i s m f o r e a r l y o n c o g e n i c p a t h w a y a d d i c t i o n ? N a t . R e v . C a n c e r . 6 , 1 0 7 - 1 1 6 . B e c k e r , F . F . ( 1 9 8 2 ) . M o r p h o l o g i c a l c l a s s i fi c a t i o n o f m o u s e l i v e r t u m o r s b a s e d o n b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . C a n c e r R e s . 4 2 , 3 9 1 8 - 3 9 2 3 . B e l l , A . C . , a n d F e l s e n f e l d , G . ( 2 0 0 0 ) M e t h y l a t i o n o f a C T C F - d e p e n d e n t b o u n d a r y c o n t r o l s i m p r i n t e d e x p r e s s i o n o f t h e 1 n g g e n e . N a t u r e 4 0 5 , 4 8 2 - 4 8 5 . B e l l a c o s a , A . , d e F e o , D . , G o d w i n , A . K . , B e l l , D . W . , C h e n g , J . Q . , A l t o m a r e , D . A . , W a n , M . , D u b e a u , L . , S c a m b i a , G . , M a s c i u l l o , V . , F e r r a n d i n a , G . , B e n e d e t t i P a n i c i , P . , M a n c u s o , S . , N e r i , G . , a n d T e s t a , J . R . ( 1 9 9 5 ) M o l e c u l a r a l t e r a t i o n s o f t h e A K T 2 o n c o g e n e i n o v a r i a n a n d b r e a s t c a r c i n o m a s . I n t . J . C a n c e r . 6 4 , 2 8 0 - 2 8 5 . B e r a s a i n , C . , C a s t i l l o , J . , P r i e t o , J . , a n d A v i l a , M . A . ( 2 0 0 7 ) N e w m o l e c u l a r t a r g e t s f o r h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a : t h e E r b B l S i g n a l i n g s y s t e m . L i v e r I n t . 2 7 , 1 7 4 - 1 8 5 . B e r g e r s , G . , a n d B e n j a m i n , L . E . ( 2 0 0 3 ) T u m o r i g e n e s i s a n d t h e a n g i o g e n i c s w i t c h . N a t . R e v . C a n c e r . 3 , 4 0 1 - 4 1 0 . B h a t t a c h a r y a , S . K . , R a m c h a n d a n i , S . , C e r v o n i , N . , a n d S z y f , M . ( 1 9 9 9 ) A m a m m a l i a n p r o t e i n w i t h s p e c i fi c d e m e t h y l a s e a c t i v i t y f o r m e G D N A . N a t u r e 3 9 7 , 5 7 9 - 5 8 3 . B i a n c h i , A . , a n d S h o r e , D . ( 2 0 0 8 ) H o w t e l o m e r a s e r e a c h e s i t s e n d : m e c h a n i s m o f t e l o m e r a s e r e g u l a t i o n b y t h e t e l o m e r i c c o m p l e x . M o l . C e l l . 3 1 , 1 5 3 - 1 6 5 . B i n i s z k i e w i c z , D . , G r i b n a u , J . , R a m s a h o y e , B . , G a u d e t , F . , E g g a n , K . , H u m p h e r y s , D . , M a s t r a n g e l o , M . A . , J u n , Z , W a l t e r , J . , a n d J a e n i s c h , R . ( 2 0 0 2 ) D n m t 1 o v e r e x p r e s s i o n c a u s e s g e n o m i c h y p e r m e t h y l a t i o n , l o s s o f i m p r i n t i n g , a n d e m b r y o n i c l e t h a l i t y . M o l . C e l l . B i o l . 2 2 , 2 1 2 4 - 2 1 3 5 . B j e r k v i g , R . , T y s n e s , B . B . , A b o o d y , K . S . , N a j b a u e r , J . , a n d T e r z i s , A . J . ( 2 0 0 5 ) T h e o r i g i n o f t h e c a n c e r s t e m c e l l : c u r r e n t c o n t r o v e r s i e s a n d n e w i n s i g h t s . N a t . R e v . C a n c e r . 5 , 8 9 9 - 9 0 4 . B j o m s s o n , H . T . , B r o w n , L . J . , F a l l i n , M . D . , R o n g i o n e , M . A . , B i b i k o v a , M . , W i c k h a m , E . , F a n , J . B . , F e i n b e r g , A . P . ( 2 0 0 7 ) E p i g e n e t i c S p e c i fi c i t y o f l o s s o f i m p r i n t i n g o f t h e I G F 2 g e n e i n W i l m s t u m o r s . J . N a t l . C a n c e r I n s t . 9 9 , 1 2 7 0 - 1 2 7 3 . B o u r c ' h i s , D . , a n d B e s t o r , T . H . ( 2 0 0 4 ) M e i o t i c c a t a s t r o p h e a n d r e t r o t r a n s p o s o n r e a c t i v a t i o n i n m a l e g e r m c e l l s l a c k i n g D n m t 3 L . N a t u r e 4 3 1 , 9 6 - 9 9 . 3 7 4 B c u o r n g n e e r c s t , e W d - t o A c » h F o r u m k a s t , i . , F . n T a r n e d n o K s d u G z e a n r e i t d . e s 1 , 8 , T . 2 7 ( 5 2 - 0 2 0 7 2 7 ) . D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s g e t I " L 1 B o u r c ' h i s , D . , X u , G . L . , L i n , C . S . , B o l l r n a n , B . , a n d B e s t o r , T . H . ( 2 0 0 1 ) D n m t 3 L a n d t h e e s t a b l i s h m e n t o f m a t e r n a l g e n o m i c i m p r i n t s . S c i e n c e 2 9 4 , 2 5 3 6 - 2 5 3 9 . B r o w n , S . E . , S u d e r m a n , M . J . , H a l l e t t , M . , a n d S z y f , M . ( 2 0 0 8 ) D N A d e m e t h y l a t i o n i n d u c e d b y t h e m e t h y l - C p G - b i n d i n g d o m a i n p r o t e i n M B D 3 . G e n e 4 2 0 , 9 9 - 1 0 6 . B r y a n , T . M . , E n g l e z o u , A . , G u p t a , J . , B a c c h e t t i , S . , a n d R e d d e l , R . R . ( 1 9 9 5 ) T e l o m e r e e l o n g a t i o n i n i m m o r t a l h u m a n c e l l s w i t h o u t d e t e c t a b l e t e l o m e r a s e a c t i v i t y . E M B O J . 1 4 , 4 2 4 0 - 4 2 4 8 . B r u i x , J . , B o i x , L . , S a l a , M . , a n d L l o v e t , J . M . ( 2 0 0 4 ) F o c u s o n h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a . ‘ . C a n c e r C e l l 5 , 2 1 5 - 2 1 9 . F , B r u n i q u e l , D . , a n d S c h w a r t z , R . H . ( 2 0 0 3 ) S e l e c t i v e , s t a b l e d e m e t h y l a t i o n o f t h e i n t e r l e u k i n - 2 g e n e e n h a n c e s t r a n s c r i p t i o n b y a n a c t i v e p r o c e s s . N a t . I m m u n o l . 4 , 2 3 5 - 2 4 0 . B u r s c h , W . , C h a b i c o v s k y , M . , W a s t l , U . , G r a s l - K r a u p p , B . , B u k o w s k a , K . , T a p e r , H . , a n d S c h u l t e - H e r m a n n , R . ( 2 0 0 5 a ) A p o p t o s i s i n s t a g e s o f m o u s e h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s : f a i l u r e t o c o u n t e r b a l a n c e c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d t o a c c o u n t f o r s t r a i n d i f f e r e n c e s i n t u m o r s u s c e p t i b i l i t y . T o x i c o l . S c i . 8 5 , 5 1 5 - 5 2 9 . B u r s c h , W . , W a s t l , U . , H u f n a g l , K . , a n d S c h u l t e - H e r m a n n , R . ( 2 0 0 5 b ) N o i n c r e a s e o f a p o p t o s i s i n r e g r e s s i n g m o u s e l i v e r a f t e r w i t h d r a w a l o f g r o w t h s t i m u l i o r f o o d r e s t r i c t i o n . T o x i c o l . S c i . 8 5 , 5 0 7 - 5 1 4 . C a m e r o n , E . E . , B a c h m a n , K . E . , M y b h a n e n , S . , H e r m a n , J . G . , a n d B a y l i n , S . B . ( 1 9 9 9 ) S y n e r g y o f d e m e t h y l a t i o n a n d h i s t o n e d e a c e t y l a s e i n h i b i t i o n i n t h e r e - e x p r e s s i o n o f g e n e s s i l e n c e d i n c a n c e r . N a t . G e n e t . 2 1 , 1 0 3 - 1 0 7 . C a n t l e y , L . C . , a n d N e e l , B . G . ( 1 9 9 9 ) N e w i n s i g h t s i n t o t u m o r s u p p r e s s i o n : P T E N s u p p r e s s e s t u m o r f o r m a t i o n b y r e s t r a i n i n g t h e p h o s p h o i n o s i t i d e 3 - k i n a s e / A K T p a t h w a y . P r o c . N a t l . A c a d S c i . U S A . 9 6 , 4 2 4 0 - 4 2 4 5 . C h e d i n , F . , L i e b e r , M . R . , H s i e h , C . L . ( 2 0 0 2 ) T h e D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e - l i k e p r o t e i n D N M T 3 L s t i m u l a t e s d e n o v o m e t h y l a t i o n b y D n m t 3 a . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 9 9 , 1 6 9 1 6 - 1 6 9 2 1 . C h e n , Y . , F e r g u s o n , S . S . , N e g i s h i , M . , a n d G o l d s t e i n , J . A . ( 2 0 0 3 ) I d e n t i fi c a t i o n o f c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r a n d g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r b i n d i n g S i t e s i n t h e C Y P 2 C 1 9 p r o m o t e r . M o l . P h a r m a c o l . 6 4 , 3 1 6 - 3 2 4 . C h e n , R . Z . , P e t t e r s s o n , U . , B e a r d , C . , J a c k s o n - G r u s b y , L . , a n d J a e n i s c h , R . ( 1 9 9 8 ) D N A h y p o m e t h y l a t i o n l e a d s t o e l e v a t e d m u t a t i o n r a t e s . N a t u r e 3 9 5 , 8 9 - 9 3 . 3 7 5 C h e n , T . , U e d a , Y . , D o d g e , J . B , W a n g , Z . , a n d L i , B . ( 2 0 0 3 ) E s t a b l i s h m e n t a n d m a i n t e n a n c e o f g e n o m i c m e t h y l a t i o n p a t t e r n s i n m o u s e e m b r y o n i c s t e m c e l l s b y D n m t 3 a a n d D n m t 3 b . M o l . C e l l . B i o l . 2 3 , 5 5 9 4 - 5 6 0 5 . C h o i , H . S . , C h u n g , M , T z a m e l i , I . , S i m h a , D . , L e e , Y . K . , S e o l , W . , a n d M o o r e , D . D . ( 1 9 9 7 ) D i f f e r e n t i a l t r a n s a c t i v a t i o n b y t w o i s o f o r m s o f t h e o r p h a n n u c l e a r h o r m o n e r e c e p t o r C A R . J . B i o l . C h e m . 2 7 2 , 2 3 5 6 5 - 2 3 5 7 1 . C l a r k , S . J . , H a r r i s o n , J . , a n d F r o m m e r , M . ( 1 9 9 5 ) C p r G m e t h y l a t i o n i n m a m m a l i a n c e l l s . N a t . G e n e t . 1 0 , 2 0 - 2 7 . C o l l i e r , L . S . , a n d L a r g a e s p a d a , D . A . ( 2 0 0 7 ) T r a n s p o s a b l e e l e m e n t s a n d t h e d y n a m i c s o m a t i c g e n o m e . G e n o m e B i o l . 8 S u p p l 1 : 8 5 . C o r t a z a r , D . , K u n z , C . , S a i t o , Y . , S t e i n a c h e r , R . , a n d S c h a r , P . ( 2 0 0 7 ) T h e e n i g m a t i c t h y m i n e D N A g l y c o s y l a s e . D N A R e p a i r ( A m s t ) . 6 , 4 8 9 - 5 0 4 . C o u n t s , J . L . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 7 ) C o m p a r i s o n o f e f f e c t o f t u m o r p r o m o t e r t r e a t m e n t s o n D N A m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d g e n e e x p r e s s i o n i n B 6 C 3 F 1 a n d C 5 7 B L / 6 m o u s e l i v e r a n d i n B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . M o l . C a r c i n o g . 1 8 , 9 7 - 1 0 6 . C o u n t s , J . L . , S a r m i e n t o , J . I . , H a r b i s o n , M . L . , D o w n i n g , J . C . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 6 ) . C e l l p r o l i f e r a t i o n a n d g l o b a l m e t h y l a t i o n s t a t u s c h a n g e s i n m o u s e l i v e r a fi e r p h e n o b a r b i t a l a n d / o r c h o l i n e - d e v o i d , m e t h i o n i n e - d e fi c i e n t d i e t a d m i n i s t r a t i o n . C a r c i n o g e n e s i s 1 7 , 1 2 5 1 - 1 2 5 7 . C r a v o , M . , F i d a l g o , P . , P e r e i r a , A . D . , G o u v e i a - O l i v e i r a , A . , C h a v e s , P . , S e l h u b , J . , M a s o n , J . B . , M i r a , F . C . , L e i t a o , C . N . ( 1 9 9 4 ) D N A m e t h y l a t i o n a s a n i n t e r m e d i a t e b i o m a r k e r i n c o l o r e c t a l c a n c e r : m o d u l a t i o n b y f o l i c a c i d s u p p l e m e n t a t i o n . E u r . J . C a n c e r . P r e v . 3 , 4 7 3 - 4 7 9 . C r o s s , S . H . , a n d B i r d , A . P . ( 1 9 9 5 ) C p G i s l a n d s a n d g e n e s . C u r r . O p i n . i n G e n e t . a n d D e v e l o p . 5 , 3 0 9 - 3 1 4 C u i , H . , C r u z - C o r r e a , M . , G i a r d i e l l o , F . M . , H u t c h e o n , D . F , K a f o n e k , D . R . , B r a n d e n b u r g , S . , W u , Y . , H e , X . , P o w e , N . R . , a n d F e i n b e r g , A . P . ( 2 0 0 3 ) L o s s o f I G F 2 i m p r i n t i n g : a p o t e n t i a l m a r k e r o f c o l o r e c t a l c a n c e r r i s k . S c i e n c e 1 4 , 1 7 5 3 - 1 7 5 5 . D a b e v a , M . D . , a n d S h a f r i t z , D . A . ( 2 0 0 3 ) H e p a t i c s t e m c e l l s a n d l i v e r r e p o p u l a t i o n . S e m i n L i v e r D i s . 4 , 3 4 9 - 3 6 2 . D a n , Y . Y . , R i e h l e , K . J . , L a z a r o , C . , T e c h , N . , H a q u e , J . , C a m p b e l l , J . S . , a n d F a u s t o , N . ( 2 0 0 6 ) I s o l a t i o n o f m u l t i p o t e n t p r o g e n i t o r c e l l s f r o m h u m a n f e t a l l i v e r c a p a b l e o f d i f f e r e n t i a t i n g i n t o l i v e r a n d m e s e n c h y m a l l i n e a g e s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 1 0 3 , 9 9 1 2 - 9 9 1 7 . 3 7 6 D e L a F u e n t e , R . , B a u m a n n , C . , F a n , T . , S c h m i d t r n a n n , A . , D o b r i n s k i I , a n d M u e g g e K . ( 2 0 0 6 ) L s h i s r e q u i r e d f o r m e i o t i c c h r o m o s o m e s y n a p s i s a n d r e t r o t r a n s p o s o n s i l e n c i n g i n f e m a l e g e r m c e l l s . N a t . C e l l . B i o l . 8 , 1 4 4 8 - 1 4 5 4 . d e V o s , D . , a n d v a n O v e r v e l d , W . ( 2 0 0 5 ) D e c i t a b i n e : a h i s t o r i c a l r e v i e w o f t h e d e v e l o p m e n t o f a n e p i g e n e t i c d r u g . A n n . H e m a t o l . 8 4 , 3 - 8 . D e C l e r c k , Y . A . , M e r c u r i o , A . M . , S t a c k , M . S . , C h a p m a n , H . A . , Z u t t e r , M . M . , M u s c h e l , R . J . , R a z , A . , M a t r i s i a n , L . M . , S l o a n e , B . F . , N o e l , A . , H e n d r i x , M . J . , C o u s s e n s , L . , a n d P a d a r a t h s i n g h , M . ( 2 0 0 4 ) P r o t e a s e s , e x t r a c e l l u l a r m a t r i x , a n d c a n c e r : a w o r k s h o p o f t h e p a t h B s t u d y s e c t i o n . A m . J . P a t h o l . 1 6 4 , 1 1 3 1 - 1 1 9 . D e n n i s , K . , F a n , T . , G e i m a n , T . , Y a n , Q . , a n d M u e g g e , K . ( 2 0 0 1 ) L s h , a m e m b e r o f t h e S N F 2 f a m i l y , i s r e q u i r e d f o r g e n o m e - w i d e m e t h y l a t i o n . G e n e s D e v . 1 5 , 2 9 4 0 - 2 9 4 4 . D o d g e , J . E . , O k a n o , M . , D i c k , F . , T s u j i m o t o , N . , C h e n , T . , W a n g , S . , U e d a , Y . , D y s o n , N . , a n d L i , B . ( 2 0 0 5 ) I n a c t i v a t i o n o f D n m t 3 b i n m o u s e e m b r y o n i c fi b r o b l a s t s r e s u l t s i n D N A h y p o m e t h y l a t i o n , c h r o m o s o m a l i n s t a b i l i t y , a n d s p o n t a n e o u s i m m o r t a l i z a t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 8 0 , 1 7 9 8 6 - 1 7 9 9 1 . D o d g e , J . E . , R a m s a h o y e , B . H . , W o , Z . G . , O k a n o , M . , a n d L i , B . ( 2 0 0 2 ) D e n o v o m e t h y l a t i o n o f M M L V p r o v i r u s i n e m b r y o n i c s t e m c e l l s : C p G v e r s u s n o n - C p G m e t h y l a t i o n . G e n e 2 8 9 , 4 1 — 4 8 . D o w n w a r d , J . ( 1 9 9 8 ) M e c h a n i s m s a n d c o n s e q u e n c e s o f a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e B / A k t . C u r r . O p i n . C e l l . B i o l . 1 0 , 2 6 2 - 2 6 7 . D r i n k w a t e r , N . R . , a n d G i n s l e r , J . J . ( 1 9 8 6 ) G e n e t i c c o n t r o l o f h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n C 5 7 B L / 6 J a n d C 3 H / H e J i n b r e d m i c e . C a r c i n o g e n e s i s 7 , 1 7 0 1 - 1 7 0 7 . D r i n k w a t e r , N . R . , H a n i g a n , M . H . , a n d K e m p , C . J . ( 1 9 8 9 ) G e n e t i c d e t e r m i n a n t s o f h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n t h e B 6 C 3 F 1 m o u s e . T o x i c o l . L e t t . 4 9 , 2 5 5 - 2 6 5 . D r u c k e r , C . , P a r z e f a l l , W . , T e u f e l h o f e r , 0 . , G r u s c h , M . , E l l i n g e r , A . , S c h u l t e - H e r m a n n , R . , a n d G r a S l - K r a u p p , B . ( 2 0 0 6 ) N o n - p a r e n c h y m a l l i v e r c e l l s s u p p o r t t h e g r o w t h a d v a n t a g e i n t h e fi r s t s t a g e s o f h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . C a r c i n o g e n e s i s 2 7 , 1 5 2 - 1 6 1 . E d e n , A . , G a u d e t , F . , W a g h m a r e , A . , a n d J a e n i s c h , R . ( 2 0 0 3 ) C h r o m o s o m a l i n s t a b i l i t y a n d t u m o r s p r o m o t e d b y D N A h y p o m e t h y l a t i o n . S c i e n c e 3 0 0 , 4 5 5 . E h r l i c h , M . ( 2 0 0 2 ) D N A m e t h y l a t i o n i n c a n c e r : t o o m u c h , b u t a l s o t o o l i t t l e . O n c o g e n e 2 1 , 5 4 0 0 - 5 4 1 3 . E h r l i c h , M . ( 2 0 0 3 ) E x p r e s s i o n o f v a r i o u s g e n e s i s c o n t r o l l e d b y D N A m e t h y l a t i o n d u r i n g m a m m a l i a n d e v e l o p m e n t J . C e l l . B i o c h e m . 8 8 , 8 9 9 - 9 1 0 . 3 7 7 E h r l i c h , M . , G a m a - S o s a , M . A . , H u a n g , L . H . , M i d g e t t , R . M . , K u o , K . C . , M c C u n e , R . A . , a n d G e h r k e , C . ( 1 9 8 2 ) A m o u n t a n d d i s t r i b u t i o n o f S - m e t h y l c y t o s i n e i n h u m a n D N A fi o m d i f f e r e n t t y p e s o f t i s s u e s o f c e l l s . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 0 , 2 7 0 9 - 2 7 2 1 . E s t e l l e r , M . ( 2 0 0 7 a ) C a n c e r e p i g e n o m i c s : D N A m e t h y l o m e s a n d h i s t o n e - m o d i fi c a t i o n m a p s . N a t . R e v . G e n e t . 8 , 2 8 6 - 2 9 8 . E s t e l l e r , M . ( 2 0 0 7 b ) E p i g e n e t i c g e n e s i l e n c i n g i n c a n c e r : t h e D N A h y p e r m e t h y l o m e . H u m . M o l . G e n e t . 1 6 S p e c N o l , R 5 0 - 5 9 . E s t e l l e r , M . ( 2 0 0 8 ) E p i g e n e t i c s i n c a n c e r . N . E n g l . J . M e d . 3 5 8 , 1 1 4 8 - 1 1 5 9 . E s t e l l e r , M . , C o r n , P . G . , B a y l i n , S . B . , a n d H e r m a n , J . G . ( 2 0 0 1 ) A g e n e h y p e r m e t h y l a t i o n p r o fi l e o f h u m a n c a n c e r . C a n c e r R e s . 6 1 , 3 2 2 5 - 3 2 2 9 . F a r a z i , P . A . , a n d D e P i n h o , R . A . ( 2 0 0 6 ) H e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a p a t h o g e n e s i s : f r o m g e n e s t o e n v i r o n m e n t . N a t . R e v . C a n c e r 6 , 6 7 4 - 6 8 7 . F e i n b e r g , A . P . ( 2 0 0 1 ) C a n c e r e p i g e n e t i c s t a k e s c e n t e r s t a g e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 9 8 , 3 9 2 - 3 9 4 . F e i n b e r g , A . P . , O h l s s o n , R . , a n d H e n i k o f f , S . ( 2 0 0 6 ) . T h e e p i g e n e t i c p r o g e n i t o r o r i g i n o f h u m a n c a n c e r . N a t . R e v . G e n e t . 7 , 2 1 - 3 3 . F e i n b e r g , A . P . , a n d T y c k o , B . ( 2 0 0 4 ) T h e h i s t o r y o f c a n c e r e p i g e n e t i c s . N a t . R e v . C a n c e r . 4 , 1 4 3 - 1 5 3 . F e i n b e r g , A . P . , a n d V o g e l s t e i n , B . ( 1 9 8 3 a ) H y p o m e t h y l a t i o n d i s t i n g u i s h e s g e n e s o f s o m e h u m a n c a n c e r s f r o m t h e i r n o r m a l c o u n t e r p a r t s . N a t u r e 3 0 1 , 8 9 - 9 2 . F e i n b e r g , A . P . , a n d V o g e l s t e i n , B . ( 1 9 8 3 b ) H y p o m e t h y l a t i o n o f r a s o n c o g e n e s i n p r i m a r y h u m a n c a n c e r s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 1 1 , 4 7 - 5 4 . F i e l d e n , M . R . , B r e n n a n , R . , a n d G o l l u b , J . ( 2 0 0 7 ) A g e n e e x p r e s s i o n b i o m a r k e r p r o v i d e s e a r l y p r e d i c t i o n a n d m e c h a n i s t i c a s s e s s m e n t o f h e p a t i c t u m o r i n d u c t i o n b y n o n - g e n o t o x i c c h e m i c a l s . T o x i c o l . S c i . 9 9 , 9 0 - 1 0 0 . F i l i o n , G . J . , Z h e n i l o , S . , S a l o z h i n , S . , Y a m a d a , D . , P r o k h o r t c h o u k , E . , a n d D e f o s s e z , P . A . ( 2 0 0 6 ) A f a m i l y o f h u m a n z i n c fi n g e r p r o t e i n s t h a t b i n d m e t h y l a t e d D N A a n d r e p r e s s t r a n s c r i p t i o n . M o l . C e l l . B i o l . 2 6 , 1 6 9 - 8 1 . F o l e y , K . P . , a n d E i s e n m a n , R . N . ( 1 9 9 9 ) T w o M A D t a i l s : w h a t t h e r e c e n t k n o c k o u t s o f M a d ] a n d M x i l t e l l u s a b o u t t h e M Y C / M A X / M A D n e t w o r k . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 2 3 , M 3 7 - 4 7 . 3 7 8 F o r m a n , B . M . , T z a m e l i , 1 . , C h o i , H . S . , C h e n , J . , S i m h a , D . , S e o l , W . , E v a n s , R . M . , a n d M o o r e , D . D . ( 1 9 9 8 ) A n d r o s t a n e m e t a b o l i t e s b i n d t o a n d d e a c t i v a t e t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R - B . N a t u r e 3 9 5 , 6 1 2 - 6 1 5 . F r i g o l a , J . , S o n g , J . , S t i r z a k e r , C . , H i n s h e l w o o d , R . A . , P e i n a d o , M . A . , a n d C l a r k , S . J . ( 2 0 0 6 ) E p i g e n e t i c r e m o d e l i n g i n c o l o r e c t a l c a n c e r r e s u l t s i n c o o r d i n a t e g e n e s u p p r e s s i o n a c r o s s a n e n t i r e c h r o m o s o m e b a n d . N a t . G e n e t . 3 8 , 5 4 0 - 5 4 9 . F u k s , F . ( 2 0 0 5 ) D N A m e t h y l a t i o n a n d h i s t o n e m o d i fi c a t i o n s : t e a m i n g u p t o s i l e n c e g e n e s . C u r r . O p i n . G e n e t . D e v . 1 5 , 4 9 0 - 4 9 5 . F u k s , F . , H u r d , P . J . , D e p l u s , R . , a n d K o u z a r i d e s , T . ( 2 0 0 3 ) T h e D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s a s s o c i a t e w i t h I - I P l a n d t h e S U V 3 9 H 1 h i s t o n e m e t h y l t r a n s f e r a s e . N u c l e i c A c i d s R e s . 3 1 , 2 3 0 5 - 2 3 1 2 F u t s c h e r , B . W . , O s h i r o , M . M . , W o z n i a k , R . J . , H o l t a n , N . , H a n i g a n , C . L . , D u a n , H . , a n d D o m a n n , F . E . ( 2 0 0 2 ) R o l e f o r D N A m e t h y l a t i o n i n t h e c o n t r o l o f c e l l t y p e S p e c i fi c m a s p i n e x p r e s s i o n . N a t . G e n e t . 3 1 , 1 7 5 - 1 7 9 . G a m a - S o s a , M . A . , S l a g e l , V . A . , T r e w y n , R . W . , O x e n h a n d l e r , R . , K u o , K . C . , G e h r k e , C . W . , a n d E h r l i c h , M . ( 1 9 8 3 ) T h e 5 - m e t h y l c y t o s i n e c o n t e n t o f D N A f r o m h u m a n t u m o r s . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 1 , 6 8 8 3 - 6 8 9 4 . G a r d i n e r - G a r d e n M . , a n d F r o m m e r , M . ( 1 9 8 7 ) C p G i s l a n d s i n v e r t e b r a t e g e n o m e s . J . M o l . B i o l . 1 9 6 , 2 6 1 - 2 8 2 . G e r b a l - C h a l o i n , S . , D a u j a t , M . , P a s c u s s i , J . M . , P i c h a r d - G a r c i a , L . , V i l a r e m , M . J . , a n d M a u r e l , P . ( 2 0 0 2 ) T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f C Y P 2 C 9 g e n e . R o l e o f g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r a n d c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r . J . B i o l . C h e m . 2 7 7 , 2 0 9 - 2 1 7 . G i a n c o t t i , F . G . , a n d R u o s l a h t i , E . ( 1 9 9 9 ) I n t e g r i n s i g n a l i n g . S c i e n c e 2 8 5 , 1 0 2 8 - 1 0 3 2 . G j e r s e t , R . A . , a n d M a r t i n , D . W . , J r . ( 1 9 8 2 ) P r e s e n c e o f a D N A d e m e t h y l a t i n g a c t i v i t y i n t h e n u c l e u s o f m u r i n e e r y t h r o l e u k e m i c c e l l s . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 , 8 5 8 1 - 8 5 8 3 . G o e l z , S . E . , V o g e l s t e i n , B . , H a m i l t o n , S . R . , a n d F e i n b e r g , A . P . ( 1 9 8 5 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f D N A fi o m b e n i g n a n d m a l i g n a n t h u m a n c o l o n n e o p l a s m s . S c i e n c e 2 2 8 , 1 8 7 - 1 9 0 . G o n z a l o , S . , J a c o , I . , F r a g a , M . F . , C h e n , T . , L i , B , E s t e l l e r , M . , B l a s c o , M . A . ( 2 0 0 6 ) D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s c o n t r o l t e l o m e r e l e n g t h a n d t e l o m e r e r e c o m b i n a t i o n i n m a m m a l i a n c e l l s . N a t . C e l l . B i o l . 8 , 4 1 6 - 4 2 4 . G o o d m a n , J . 1 . , a n d W a t s o n , R . E . ( 2 0 0 2 ) A l t e r e d D N A m e t h y l a t i o n : a s e c o n d a r y m e c h a n i s m i n v o l v e d i n c a r c i n o g e n e s i s . A n n u . R e v . P h a r m a c o l . T o x i c o l . 4 2 , 5 0 1 - 5 2 5 . 3 7 9 G o o d w i n , B . , H o d g s o n , E . , D ' C o s t a , D . J . , R o b e r t s o n , G . R . , a n d L i d d l e , C . ( 2 0 0 2 ) T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f t h e h u m a n C Y P 3 A 4 g e n e b y t h e c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r . M o l . P h a r m a c o l . 6 2 , 3 5 9 - 3 6 5 . G o y a l , R . , R e i n h a r d t , R . , a n d J e l t s c h , A . ( 2 0 0 6 ) A c c u r a c y o f D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n p r e s e r v a t i o n b y t h e D n m t l m e t h y l t r a n s f e r a s e . N u c l e i c A c i d s R e s . 3 4 , 1 1 8 2 — 1 1 8 8 . H a n a h a n , D . , W e i n b e r g , R . A . ( 2 0 0 0 ) T h e h a l l m a r k s o f c a n c e r . C e l l 1 0 0 , 5 7 - 7 0 . H a n i g a n , M . H . , K e m p , C . J . , G i n s l e r , J . J . , a n d D r i n k w a t e r , N . R . ( 1 9 8 8 ) R a p i d g r o w t h o f p r e n e o p l a s t i c l e s i o n s i n h e p a t o c a r c i n o g e n - s e n s i t i v e C 3 H / H e J m a l e m i c e r e l a t i v e t o C 5 7 B L / 6 J m a l e m i c e . C a r c i n o g e n e s i s 9 , 8 8 5 - 8 9 0 . H a t a , K . , O k a n o , M . , L e i , H . , a n d L i , E . ( 2 0 0 2 ) D n m t 3 L c o o p e r a t e s w i t h t h e D n m t 3 f a m i l y o f d e n o v o D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s t o e s t a b l i s h m a t e r n a l i m p r i n t s i n m i c e . D e v e l o p m e n t 1 2 9 , 1 9 8 3 - 1 9 9 3 . H a y fl i c k , L . ( 1 9 9 7 ) M o r t a l i t y a n d i m m o r t a l i t y a t t h e c e l l u l a r l e v e l . A r e v i e w . B i o c h e m i s t r y ( M o s c ) l l , 1 1 8 0 - 1 1 9 0 . H e a r d , E . ( 2 0 0 4 ) R e c e n t a d v a n c e s i n X - c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n . C u r r . O p i n . C e l l . B i o l . 1 6 , 2 4 7 - 2 5 5 . H e n d r i c h , B . , a n d B i r d , A . ( 1 9 9 8 ) I d e n t i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a f a m i l y o f m a m m a l i a n m e t h y l - C p G b i n d i n g p r o t e i n s . M o l . C e l l . B i o l . 1 8 , 6 5 3 8 - 6 5 4 7 . H e r g e r s b e r g , M . ( 1 9 9 1 ) . B i o l o g i c a l a s p e c t s o f c y t o s i n e m e t h y l a t i o n i n e u k a r y o t i c c e l l s . E x p e r i e n t i a 4 7 , 1 1 7 1 - 1 1 8 5 . H e r z i g , M . , a n d C h r i s t o f o r i , G . ( 2 0 0 2 ) R e c e n t a d v a n c e s i n c a n c e r r e s e a r c h : m o u s e m o d e l s o f t u m o r i g e n e s i s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 1 6 0 2 , 9 7 - 1 1 3 . H o n k a k o s k i , P . , Z e l k o , I . , S u e y o s h i , T . , a n d N e g i s h i , M . ( 1 9 9 8 ) T h e n u c l e a r o r p h a n r e c e p t o r C A R - r e t i n o i d X r e c e p t o r h e t e r o d i m e r a c t i v a t e s t h e p h e n o b a r b i t a l - r e s p o n s i v e e n h a n c e r m o d u l e o f t h e C Y P Z B g e n e . M o l . C e l l . B i o l . 1 8 , 5 6 5 2 - 5 6 5 8 . H o w l e t t , S . K . , a n d R e i k , W . ( 1 9 9 1 ) M e t h y l a t i o n l e v e l s o f m a t e r n a l a n d p a t e r n a l g e n o m e s d u r i n g p r e i m p l a n t a t i o n d e v e l o p m e n t . D e v e l o p m e n t 1 1 3 , 1 1 9 - 1 2 7 . H o o d , J . D . , a n d C h e r e s h , D . A . ( 2 0 0 2 ) R o l e o f i n t e g r i n s i n c e l l i n v a s i o n a n d m i g r a t i o n . N a t . R e v . C a n c e r 2 , 9 1 - 1 0 0 . H u a n g , W . , Z h a n g , J . , C h u a , S . S . , Q a t a n a n i , M . , H a n , Y . , G r a n a t a , R . , a n d M o o r e , D . D . ( 2 0 0 3 ) I n d u c t i o n o f b i l i r u b i n c l e a r a n c e b y t h e c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 1 0 0 , 4 1 5 6 - 4 1 6 1 . 3 8 0 H u a n g , W . , Z h a n g , J . , W a s h i n g t o n , M . , L i u , J . , P a r a n t , J . M . , L o z a n o , G . , M o o r e , D . D . ( 2 0 0 5 ) X e n o b i o t i c s t r e s s i n d u c e s h e p a t o m e g a l y a n d l i v e r t u m o r s v i a t h e n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r . M o l . E n d o c r i n o l . 1 9 , 1 6 4 6 - 1 6 5 3 . H u n t e r , T . ( 1 9 9 7 ) O n c o p r o t e i n n e t w o r k s . C e l l 8 8 , 3 3 3 - 3 4 6 . I g u c h i - A r i g a , S . M . , a n d S c h a f f n e r , W . ( 1 9 8 9 ) C p G m e t h y l a t i o n o f t h e C A M P - r e s p o n s i v e e n h a n c e r / p r o m o t e r s e q u e n c e T G A C G T C A a b o l i s h e s S p e c i fi c f a c t o r b i n d i n g a s w e l l a s t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n . G e n e s D e v . 3 , 6 1 2 - 6 1 9 . I n o u e , S . , a n d O i s h i , M . ( 2 0 0 5 ) E f f e c t s o f m e t h y l a t i o n o f n o n - C p G s e q u e n c e i n t h e p r o m o t e r r e g i o n o n t h e e x p r e s s i o n o f h u m a n s y n a p t o t a g m i n X I ( s y t I 1 ) . G e n e 3 4 8 , 1 2 3 - 1 3 4 . J a c i n t o , F . V . , a n d E s t e l l e r . M . ( 2 0 0 7 ) M u t a t o r p a t h w a y s u n l e a s h e d b y e p i g e n e t i c s i l e n c i n g i n h u m a n c a n c e r . M u t a g e n e s i s 2 2 , 2 4 7 - 2 5 3 . J a h n e r , D . , a n d J a e n i s c h , R . ( 1 9 8 5 ) R e t r o v i r u s - i n d u c e d d e n o v o m e t h y l a t i o n o f fl a n k i n g h o s t s e q u e n c e s c o r r e l a t e s w i t h g e n e i n a c t i v i t y . N a t u r e 3 1 5 , 5 9 4 - 5 9 7 . J e a n e s , A . , G o t t a r d i , C . J . , a n d Y a p , A . S . ( 2 0 0 8 ) C a d h e r i n s a n d c a n c e r : h o w d o e s c a d h e r i n d y s f u n c t i o n p r o m o t e t u m o r p r o g r e s s i o n ? O n c o g e n e 2 7 , 6 9 2 0 - 6 9 2 9 . J e l t s c h , A . , N e l l e n , W . , a n d L y k o , F . ( 2 0 0 6 ) T w o s u b s t r a t e s a r e b e t t e r t h a n o n e : d u a l s p e c i fi c i t i e s f o r D n m t 2 m e t h y l t r a n s f e r a s e s . T r e n d s B i o c h e m S c i . 3 1 , 3 0 6 - 3 0 8 . J i a n g , W . G . ( 1 9 9 8 ) C e l l a d h e s i o n m o l e c u l e s i n t h e f o r m a t i o n o f l i v e r m e t a s t a s i s . J . H e p a t o b i l i a r y P a n c r e a t . S u r g . 5 , 3 7 5 - 3 8 2 . J o n e s , P . A . ( 1 9 9 9 ) T h e D N A m e t h y l a t i o n p a r a d o x . T r e n d s G e n e t . 1 5 , 3 4 - 3 7 . J o n e s , S . , Z h a n g , X . , P a r s o n s , D . W . , L i n , J . C . , L e a r y , R . J . , A n g e n e n d t , P . , M a n k o o , P . , C a r t e r , H . , K a m i y a m a , H . , J i m e n o , A . , H o n g , S . M . , F u , B . , L i n , M . T . , C a l h o u n , E . S . , K a m i y a m a , M . , W a l t e r , K . , N i k o l s k a y a , T . , N i k o l s k y , Y . , H a r t i g a n , J . , S m i t h , D . R . , H i d a l g o , M . , L e a c h , S . D . , K l e i n , A . P . , J a f f e e , E . M . , G o g g i n s , M . , M a i t r a , A . , I a c o b u z i o - D o n a h u e , C . , E s h l e m a n , J . R . , K e r n , S . E . , H r u b a n , R . H . , K a r c h i n , R . , P a p a d o p o u l o s , N . , P a r m i g i a n i , G . , V o g e l s t e i n , B . , V e l c u l e s c u , V . E . , a n d K i n z l e r , K . W . ( 2 0 0 8 ) C o r e s i g n a l i n g p a t h w a y s i n h u m a n p a n c r e a t i c c a n c e r s r e v e a l e d b y g l o b a l g e n o m i c a n a l y s e s . S c i e n c e 3 2 1 , 1 8 0 1 - 1 8 0 6 . J o s t , J . P . ( 1 9 9 3 ) N u c l e a r e x t r a c t s o f c h i c k e n e m b r y o s p r o m o t e a n a c t i v e d e m e t h y l a t i o n o f D N A b y e x c i s i o n r e p a i r o f S - m e t h y l d e o x y c y t i d i n e . P r o c . N a t l . A c a d S c i . U S A . 9 0 , 4 6 8 4 - 4 6 8 8 . K a n e d a , M . , O k a n o , M . , H a t a , K . , S a d o , T . , T s u j i m o t o , N . , L i , B , a n d S a s a k i , H . ( 2 0 0 4 ) E s s e n t i a l r o l e f o r d e n o v o D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e D n m t 3 a i n p a t e r n a l a n d m a t e r n a l i m p r i n t i n g . N a t u r e 4 2 9 , 9 0 0 - 9 0 3 . 3 8 1 K a r p f , A . R . , a n d M a t s u i , S . ( 2 0 0 5 ) G e n e t i c d i s r u p t i o n o f c y t o s i n e D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e e n z y m e s i n d u c e s c h r o m o s o m a l i n s t a b i l i t y i n h u m a n c a n c e r c e l l s . C a n c e r R e s . 6 5 , 8 6 3 5 - 8 6 3 9 . K a w a m o t o , T . , S u e y o s h i , T . , Z e l k o , 1 . , M o o r e , R . , W a s h b u r n , K . , a n d N e g i s h i , M . ( 1 9 9 9 ) P h e n o b a r b i t a l - r e s p o n s i v e n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f t h e r e c e p t o r C A R i n i n d u c t i o n o f t h e C Y P Z B g e n e . M o l . C e l l . B i o l . 1 9 , 6 3 1 8 - 6 3 2 2 . K a y e , F . J . ( 2 0 0 2 ) R B a n d c y c l i n d e p e n d e n t k i n a s e p a t h w a y s : d e fi n i n g a d i s t i n c t i o n b e t w e e n R B a n d p 1 6 l o s s i n l u n g c a n c e r . O n c o g e n e 2 1 , 6 9 0 8 - 6 9 1 4 . K e l l e h e r , F . C . , F e n n e l l y , D . , a n d R a f f e r t y , M . ( 2 0 0 6 ) C o m m o n c r i t i c a l p a t h w a y s i n e m b r y o g e n e s i s a n d c a n c e r . A c t a . O n c o l . 4 5 , 3 7 5 - 3 8 8 . K m i e é , Z . ( 2 0 0 1 ) C o o p e r a t i o n o f l i v e r c e l l s i n h e a l t h a n d d i s e a s e . A d v . A n a t . E m b r y o l . C e l l B i o l . 1 6 1 : I I I - X I I I , 1 - 1 5 1 . K o i k e , C . , M o o r e , R . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 7 ) E x t r a c e l l u l a r s i g n a l - r e g u l a t e d k i n a s e i s a n e n d o g e n o u s S i g n a l r e t a i n i n g t h e n u c l e a r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r ( C A R ) i n t h e c y t o p l a s m o f m o u s e p r i m a r y h e p a t o c y t e s . M o l . P h a r m a c o l . 7 1 , 1 2 1 7 - 1 2 2 1 . K o l a j a , K . L . , S t e v e n s o n , D . E . , J o h n s o n , J . T . , W a l b o r g , E . F . , J r . , a n d K l a u n i g , J . E . ( 1 9 9 6 a ) S u b c h r o n i c e f f e c t s o f d i e l d r i n a n d p h e n o b a r b i t a l o n h e p a t i c D N A s y n t h e s i s i n m i c e a n d r a t s . F u n d a m . A p p l . T o x i c o l . 2 9 , 2 1 9 - 2 2 8 . K o l a j a , K . L . , S t e v e n s o n , D . E . , W a l b o r g J r . , E . F . , a n d K l a u n i g J . E . ( 1 9 9 6 b ) . D o s e d e p e n d e n c e o f p h e n o b a r b i t a l p r o m o t i o n o f p r e n e o p l a s t i c h e p a t i c l e s i o n s i n F 3 4 4 r a t s a n d B 6 C 3 F 1 m i c e : e f f e c t s o n D N A s y n t h e s i s a n d a p o p t o s i s . C a r c i n o g e n e s i s 1 7 , 9 4 7 - 9 5 4 . K o u z a r i d e s , T . ( 2 0 0 7 ) C h r o m a t i n m o d i fi c a t i o n s a n d t h e i r f u n c t i o n . C e l l 1 2 8 , 6 9 3 - 7 0 5 . K u r m a s h e v a , R . T . , a n d H o u g h t o n , P . J . ( 2 0 0 6 ) I G F - I m e d i a t e d s u r v i v a l p a t h w a y s i n n o r m a l a n d m a l i g n a n t c e l l s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 1 7 6 6 , 1 - 2 2 . L e e , G . H . , N o m u r a , K . , K a n d a , H . , K u s a k a b e , M . , Y o s h i k i , A . , S a k a k u r a , T . , a n d K i t a g a w a , T . ( 1 9 9 1 ) S t r a i n S p e c i fi c s e n s i t i v i t y t o d i e t h y l n i t r o s a m i n e - i n d u c e d c a r c i n o g e n e s i s i s m a i n t a i n e d i n h e p a t o c y t e s o f C 3 H / H e N i n e q u i l i b r i u m w i t h C 5 7 B L / 6 N c h i m e r i c m i c e . C a n c e r R e s . 5 1 , 3 2 5 7 - 3 2 6 0 . L e h n e r t z , B . , U e d a , Y . , D e r i j c k , A . A . , B r a u n s c h w e i g , U . , P e r e z - B u r g o s , L . , K u b i c e k , S . , C h e n , T . , L i , R . , J e n u w e i n , T . , a n d P e t e r s , A . H . ( 2 0 0 3 ) S u v 3 9 h - m e d i a t e d h i s t o n e H 3 l y s i n e 9 m e t h y l a t i o n d i r e c t s D N A m e t h y l a t i o n t o m a j o r s a t e l l i t e r e p e a t s a t p e r i c e n t r i c h e t e r o c h r o m a t i n . C u r r . B i o l . 1 3 , 1 1 9 2 - 1 2 0 0 . 3 8 2 L e o n h a r d t , H . , P a g e , A . W . , W e i e r , H . U . , a n d B e s t o r , T . H . ( 1 9 9 2 ) A t a r g e t i n g s e q u e n c e d i r e c t s D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e t o S i t e s o f D N A r e p l i c a t i o n i n m a m m a l i a n n u c l e i . C e l l 7 1 , 8 6 5 - 8 7 3 . L i , R . , B e a r d , C . , a n d J a e n i s c h , R . ( 1 9 9 3 ) R o l e f o r D N A m e t h y l a t i o n i n g e n o m i c i m p r i n t i n g . N a t u r e 3 6 6 , 3 6 2 - 3 6 5 . L i , E . , B e s t o r , T . H . , J a e n i s c h , R . ( 1 9 9 2 ) T a r g e t e d m u t a t i o n o f t h e D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e g e n e r e s u l t s i n e m b r y o n i c l e t h a l i t y . C e l l 6 9 , 9 1 5 - 9 2 6 . L i , H . , F a n , X . , a n d H o u g h t o n , J . J . ( 2 0 0 7 ) T u m o r m i c r o e n v i r o n m e n t : t h e r o l e o f t h e t u m o r s t r o m a i n c a n c e r . C e l l . B i o c h e m . 1 0 1 , 8 0 5 - 8 1 5 . L i a n g , G . , C h a n , M . F . , T o m i g a h a r a , Y . , T s a i , Y . C . , G o n z a l e s , F . A . , L i , E . , L a i r d , P . W . , a n d J o n e s , P . A . ( 2 0 0 2 ) C o o p e r a t i v i t y b e t w e e n D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s i n t h e m a i n t e n a n c e m e t h y l a t i o n o f r e p e t i t i v e e l e m e n t s . M o l . C e l l . B i o l . 2 2 , 4 8 0 - 4 9 1 . L i n , C . H . , H s i e h , S . Y . , S h e e n , 1 . S . , L e e , W . C . , C h e n , T . C . , S h y u , W . C . , a n d L i a w , Y . F . ( 2 0 0 1 ) G e n o m e - w i d e h y p o m e t h y l a t i o n i n h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o g e n e s i s . C a n c e r R e s . 6 1 , 4 2 3 8 - 4 2 4 3 . L o e b , L . A . , H a r r i s , C . C . ( 2 0 0 8 ) A d v a n c e s i n c h e m i c a l c a r c i n o g e n e s i s : a h i s t o r i c a l r e v i e w a n d p r o s p e c t i v e . C a n c e r R e s . 6 8 , 6 8 6 3 - 6 8 7 2 . L o k k e r , N . A . , S u l l i v a n , C . M . , H o l l e n b a c h , S . J . , I s r a e l , M . A . , a n d G i e s e , N . A . ( 2 0 0 2 ) P l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r ( P D G F ) a u t o c r i n e S i g n a l i n g r e g u l a t e s s u r v i v a l a n d m i t o g e n i c p a t h w a y s i n g l i o b l a s t o m a c e l l s : e v i d e n c e t h a t t h e n o v e l P D G F - C a n d P D G F - D l i g a n d s m a y p l a y a r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f b r a i n t u m o r s . C a n c e r R e s . 6 2 , 3 7 2 9 - 3 7 3 5 . L o p e z - S e r r a , L . , B a l l e s t a r , E . , F r a g a , M . P . , A l a m i n o s , M . , S e t i e n , F . , a n d E s t e l l e r , M . ( 2 0 0 6 ) A p r o fi l e o f m e t h y l - C p G b i n d i n g d o m a i n p r o t e i n o c c u p a n c y o f h y p e r m e t h y l a t e d p r o m o t e r C p G i s l a n d s o f t u m o r s u p p r e s s o r g e n e s i n h u m a n c a n c e r . C a n c e r R e s . 6 6 , 8 3 4 2 - 8 3 4 6 . L o p e z - S e r r a , L . , a n d E s t e l l e r , M . ( 2 0 0 8 ) P r o t e i n s t h a t b i n d m e t h y l a t e d D N A a n d h u m a n c a n c e r : r e a d i n g t h e w r o n g w o r d s . B r . J . C a n c e r . 9 8 , 1 8 8 1 - 1 8 8 5 . L o r é a l , 0 . , L e v a v a s s e u r , F . , F r o m a g e t , C . , G r o s , D . , G u i l l o u z o , A . , C l e m e n t , B . ( 1 9 9 3 ) C o o p e r a t i o n o f I t o c e l l s a n d h e p a t o c y t e s i n t h e d e p o s i t i o n o f a n e x t r a c e l l u l a r m a t r i x i n v i t r o . A m . J . o f P a t h o l o g y 1 4 3 , 5 3 8 - 5 4 4 . L u c h , A . ( 2 0 0 5 ) N a t u r e a n d n u r t u r e - l e s s o n s f r o m c h e m i c a l c a r c i n o g e n e s i s . N a t . R e v . C a n c e r 5 , 1 1 3 - 1 2 5 . L u j a m b i o , A . , a n d E s t e l l e r , M . ( 2 0 0 7 ) C p G i s l a n d h y p e r m e t h y l a t i o n o f t u m o r s u p p r e s s o r m i c r o R N A s i n h u m a n c a n c e r . C e l l C y c l e 6 , 1 4 5 5 - 1 4 5 9 . 3 8 3 M a g l i c h , J . M . , S t o l t z , C . M . , G o o d w i n , B . , H a w k i n s - B r o w n , D . , M o o r e , J . T . , a n d K l i e w e r , S . A . ( 2 0 0 2 ) N u c l e a r p r e g n a n e x r e c e p t o r a n d c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r r e g u l a t e o v e r l a p p i n g b u t d i s t i n c t s e t s o f g e n e s i n v o l v e d i n x e n o b i o t i c d e t o x i fi c a t i o n . M o l . P h a r m a c o l . 6 2 , 6 3 8 - 6 4 6 . M a n d r i o t a , S . J . , a n d P e p p e r , M . S . ( 1 9 9 7 ) V a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r - i n d u c e d i n v i t r o a n g i o g e n e s i s a n d p l a s r n i n o g e n a c t i v a t o r e x p r e s s i o n a r e d e p e n d e n t o n e n d o g e n o u s b a s i c fi b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r . J . C e l l . S c i . 1 1 0 ( P t 1 8 ) , 2 2 9 3 - 2 3 0 2 . M a n e n t i , G . , B i n e l l i , G . , G a r i b a l d i , M . , C a n z i a n , F . , D e G r e g o r i o , L . , F a l v e l l a , F . S . , D r a g a n i , T . A . , a n d P i e r o t t i , M . A . ( 1 9 9 4 ) M u l t i p l e l o c i a f f e c t g e n e t i c p r e d i s p o s i t i o n t o h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n m i c e . G e n o m i c s 2 3 , 1 1 8 — 1 2 4 . M é t i v i e r , R . , G a l l a i s , R . , T i f f o c h e , C . , L e P é r o n , C . , J u r k o w s k a , R . Z . , C a r m o u c h e , R . P . , I b b e r s o n , D . , B a r a t h , P . , D e m a y , F . , R e i d , G . , B e n e s , V . , J e l t s c h , A . , G a n n o n , F . , a n d S a l b e r t , G . ( 2 0 0 8 ) C y c l i c a l D N A m e t h y l a t i o n o f a t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e p r o m o t e r . N a t u r e 4 5 2 , 4 5 - 5 0 . M o e n n i k e s , 0 . , B u c h m a n n , A . , R o m u a l d i , A . , O t t , T . , W e r r i n g l o e r , J . , W i l l e c k e , K . , a n d S c h w a r z , M . ( 2 0 0 0 ) . L a c k o f p h e n o b a r b i t a l - m e d i a t e d p r o m o t i o n o f h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n c o n n e x i n 3 2 - n u l l m i c e . C a n c e r R e s . 1 5 , 5 0 8 7 - 5 0 9 1 . M o r t u s e w i c z , 0 . , S c h e r m e l l e h , L . , W a l t e r , J . , C a r d o s o , M . C . , a n d L e o n h a r d t , H . ( 2 0 0 5 ) R e c r u i t m e n t o f D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e I t o D N A r e p a i r s i t e s . P r o c . N a t l . A c a d S c i . U S A . 1 0 2 , 8 9 0 5 - 8 9 0 9 . N a k a m u r a , N . , a n d T a k e n a g a , K . ( 1 9 9 8 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f t h e m e t a s t a s i s - a s s o c i a t e d S 1 0 0 A 4 g e n e c o r r e l a t e s w i t h g e n e a c t i v a t i o n i n h u m a n c o l o n a d e n o c a r c i n o m a c e l l l i n e s . C l i n . E x p . M e t a s t a s i s 1 6 , 4 7 1 - 4 7 9 . N a v e h - M a n y , T . , a n d C e d a r , H . ( 1 9 8 1 ) A c t i v e g e n e s e q u e n c e s a r e u n d e r m e t h y l a t e d . P r o c . N a t l . A c a d S c i . U S A . 7 8 , 4 2 4 6 - 4 2 5 0 . N i e , A . Y . , M c M i l l i a n , M . , P a r k e r , J . B . , L e o n e , A . , B r y a n t S . , Y i e h , L . , B i t t n e r , A . , N e l s o n , J . , C a r m e n , A . , W a n , J . , a n d L o r d , P . G . ( 2 0 0 6 ) P r e d i c t i v e t o x i c o g e n o m i c s a p p r o a c h e s r e v e a l u n d e r l y i n g m o l e c u l a r m e c h a n i s m s o f n o n g e n o t o x i c c a r c i n o g e n i c i t y . M o l . C a r c i n o g . 4 5 , 9 1 4 - 9 3 3 . N o w e l l , R C . ( 1 9 7 6 ) . T h e c l o n a l e v o l u t i o n o f t u m o r c e l l p o p u l a t i o n s . S c i e n c e 1 9 4 , 2 4 - 2 8 . O k a n o , M . , B e l l , D . W . , H a b e r , D . A . , a n d L i , B . ( 1 9 9 9 ) D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s D n m t 3 a a n d D n m t 3 b a r e e s s e n t i a l f o r d e n o v o m e t h y l a t i o n a n d m a m m a l i a n d e v e l o p m e n t . C e l l 9 9 , 2 4 7 - 2 5 7 . O k a n o , M . , X i e , S . , a n d L i , B . ( 1 9 9 8 ) C l o n i n g a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a f a m i l y o f n o v e l m a m m a l i a n D N A ( c y t o s i n e - 5 ) m e t h y l t r a n s f e r a s e s . N a t . G e n e t . 1 9 , 2 1 9 - 2 2 0 . 3 8 4 O o i , S . K . , a n d B e s t o r , T . H . ( 2 0 0 8 ) T h e c o l o r f u l h i s t o r y o f a c t i v e D N A d e m e t h y l a t i o n . C e l l 1 3 3 , 1 1 4 5 - 1 1 4 8 . O s h i m o , Y . , N a k a y a m a , H . , I t o , R . , K i t a d a i , Y . , Y o s h i d a , K . , C h a y a m a , K . , a n d Y a s u i , W . ( 2 0 0 3 ) P r o m o t e r m e t h y l a t i o n o f c y c l i n D 2 g e n e i n g a s t r i c c a r c i n o m a . I n t . J . O n c o l . 2 3 , 1 6 6 3 - 1 6 7 0 . O s w a l d , J . , E n g e m a n n , S . , L a n e , N . , M a y e r , W . , O l e k , A . , F u n d e l e , R . , D e a n , W . , R e i k , W . , a n d W a l t e r , J . ( 2 0 0 0 ) A c t i v e d e m e t h y l a t i o n o f t h e p a t e r n a l g e n o m e i n t h e m o u s e z y g o t e . C u r r . B i o l . 1 0 , 4 7 5 - 4 7 8 . P a r i k h , S . , a n d H y m a n , D . ( 2 0 0 7 ) H e p a t o c e l l u l a r c a n c e r : a g u i d e f o r t h e i n t e r n i s t . A m . J . M e d 1 2 0 , 1 9 4 - 2 0 2 . P a n n i n g , B . , a n d J a e n i s c h , R . ( 1 9 9 6 ) D N A h y p o m e t h y l a t i o n c a n a c t i v a t e X i s t e x p r e s s i o n a n d s i l e n c e X - l i n k e d g e n e s . G e n e s D e v . 1 0 , 1 9 9 1 - 2 0 0 2 . P a r s o n s , D . W . , J o n e s , S . , Z h a n g , X . , L i n , J . C . , L e a r y , R . J . , A n g e n e n d t , P . , M a n k o o , P . , C a r t e r , H . , S i n , 1 . M . , G a l l i a , G . L . , O l i v i , A . , M c L e n d o n , R . , R a s h e e d , B . A . , K e i r , S . , N i k o l s k a y a , T . , N i k o l s k y , Y . , B u s a m , D . A . , T e k l e a b , H . , D i a z , L . A . J r . , H a r t i g a n , J . , S m i t h , D . R . , S t r a u s b e r g , R . L . , M a r i e , S . K . , S h i n j o , S . M . , Y a n , H . , R i g g i n s , G . J . , B i g n e r , D . D . , K a r c h i n , R , P a p a d o p o u l o s , N . , P a r m i g i a n i , G . , V o g e l s t e i n , B . , V e l c u l e s c u , V . E . , a n d K i n z l e r , K . W . ( 2 0 0 8 ) A n i n t e g r a t e d g e n o m i c a n a l y s i s o f h u m a n g l i o b l a s t o m a m u l t i f o r m e . S c i e n c e 3 2 1 , 1 8 0 7 - 1 8 1 2 . P a s c u s s i , J . M . , G e r b a l - C h a l o i n , S . , D u r e t , C . , D a u j a t - C h a v a n i e u , M . , V i l a r e m , M . J . , a n d M a u r e l , P . ( 2 0 0 8 ) T h e t a n g l e o f n u c l e a r r e c e p t o r s t h a t c o n t r o l s x e n o b i o t i c m e t a b o l i s m a n d t r a n s p o r t : c r o s s t a l k a n d c o n s e q u e n c e s . A n n u . R e v . P h a r m a c o l . T o x i c o l . 4 8 , 1 - 3 2 . P h i l c h e n k o v , A . , Z a v e l e v i c h , M . , K r o c z a k , T . J . , a n d L o s , M . ( 2 0 0 4 ) C a s p a s e s a n d c a n c e r : m e c h a n i s m s o f i n a c t i v a t i o n a n d n e w t r e a t m e n t m o d a l i t i e s . E x p . O n c o l . 2 6 , 8 2 - 9 7 . P i t o t , H Q , a n d D r a g a n , Y . P . ( 1 9 9 1 ) F a c t s a n d t h e o r i e s c o n c e r n i n g t h e m e c h a n i s m s o f c a r c i n o g e n e s i s . F A S E B J 5 , 2 2 8 0 - 2 2 8 6 . P i t o t , H . C . , a n d D r a g a n , Y . P . ( 1 9 9 4 ) T h e m u l t i s t a g e n a t u r e o f c h e m i c a l l y i n d u c e d h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n t h e r a t . D r u g M e t a b . R e v . 2 6 , 2 0 9 - 2 2 0 . P i t o t , H . C . , D r a g a n , Y . , S a r g e n t , L . , a n d X u , Y . - H . ( 1 9 9 1 ) B i o c h e m i c a l m a r k e r s a s s o c i a t e d w i t h t h e s t a g e s o f p r o m o t i o n a n d p r o g r e s s i o n d u r i n g h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s i n t h e r a t . E n v i r o n . H e a l t h P e r s p e c t . 9 3 , 1 8 1 - 1 8 9 . Q a t a n a n i , M . , Z h a n g , J . , a n d M o o r e , D . D . ( 2 0 0 5 ) R o l e o f t h e c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r i n x e n o b i o t i c - i n d u c e d t h y r o i d h o r m o n e m e t a b o l i s m . E n d o c r i n o l o g y 1 4 6 , 9 9 5 - 1 0 0 2 . 3 8 5 R a m s a h o y e , B . H . , B i n i s z k i e w i c z , D . , L y k o , F . , C l a r k , V . , B i r d , A . P . , a n d J a e n i s c h , R . ( 2 0 0 0 ) N o n - C p G m e t h y l a t i o n i s p r e v a l e n t i n e m b r y o n i c s t e m c e l l s a n d m a y b e m e d i a t e d b y D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e 3 a . P r o c . N a t l . A c a d S c i . U S A 9 7 , 5 2 3 7 - 5 2 4 2 . R a n g a r a j a n , A . , a n d W e i n b e r g , R . A . ( 2 0 0 3 ) O p i n i o n : C o m p a r a t i v e b i o l o g y o f m o u s e v e r s u s h u m a n c e l l s : m o d e l l i n g h u m a n c a n c e r i n m i c e . N a t . R e v . C a n c e r 3 , 9 5 2 - 9 5 9 . R a y , J . S . , H a r b i s o n , M . L . , M c C l a i n , R . M . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 4 ) A l t e r a t i o n s i n t h e m e t h y l a t i o n s t a t u s a n d e x p r e s s i o n o f t h e r a f o n c o g e n e i n p h e n o b a r b i t a l - i n d u c e d a n d S p o n t a n e o u s B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . M o l . C a r c i n o g . 9 , 1 5 5 - 1 6 6 . R e i k , W . , D e a n , W . , a n d W a l t e r , J . ( 2 0 0 1 ) E p i g e n e t i c r e p r o g r a m m i n g i n m a m m a l i a n d e v e l o p m e n t . S c i e n c e 2 9 3 , 1 0 8 9 - 1 0 9 3 . R e i k , W . , a n d M u r r e l l , A . ( 2 0 0 0 ) G e n o m i c i m p r i n t i n g . S i l e n c e a c r o s s t h e b o r d e r . N a t u r e 4 0 5 , 4 0 8 - 4 0 9 . R e y a , T . , M o r r i s o n , S . J . , C l a r k e , M . F . , a n d W e i s s m a n , I . L . ( 2 0 0 1 ) S t e m c e l l s , c a n c e r , a n d c a n c e r s t e m c e l l s . N a t u r e 4 1 4 , 1 0 5 - 1 1 1 . R h i m , J . A . , S a n d g r e n , E . P . , D e g e n , J . L . , P a l r n i t e r , R . D . , a n d B r i n s t e r , R . L . ( 1 9 9 4 ) R e p l a c e m e n t o f d i s e a s e d m o u s e l i v e r b y h e p a t i c c e l l t r a n s p l a n t a t i o n . S c i e n c e 2 6 3 , 1 1 4 9 - 1 1 5 2 . R i b a t t i , D . , N i c o , B . , C r i v e l l a t o , E . , R o c c a r o , A . M . , a n d V a c c a , A . ( 2 0 0 7 ) T h e h i s t o r y o f t h e a n g i o g e n i c s w i t c h c o n c e p t . L e u k e m i a 2 1 , 4 4 - 5 2 . R o b e r t s o n , K . D . ( 2 0 0 5 ) D N A m e t h y l a t i o n a n d h u m a n d i s e a s e . N a t . R e v . G e n e t . 6 , 5 9 7 - 6 1 0 . R o b e r t s o n , K . D . , U z v o l g y i , E . , L i a n g , G . , T a l m a d g e , C . , S u m e g i , J . , G o n z a l e s , F . A . , a n d J o n e s , P . A . ( 1 9 9 9 ) T h e h u m a n D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e s ( D N M T S ) 1 , 3 a a n d 3 b : c o o r d i n a t e m R N A e x p r e s s i o n i n n o r m a l t i s s u e s a n d o v e r e x p r e s s i o n i n t u m o r s . N u c l e i c A c i d s R e s . 2 7 , 2 2 9 1 - 2 2 9 8 . R o m a n - G o m e z , J . , J i r n e n e z - V e l a s c o , A . , A g i r r e , X . , C e r v a n t e s , F . , S a n c h e z , J . , G a r a t e , L . , B a r r i o s , M . , C a s t i l l e j o , J . A . , N a v a r r o , G . , C o l o m e r , D . , P r o s p e r , F . , H e i n i g e r , A . , a n d T o r r e s , A . ( 2 0 0 5 ) P r o m o t e r h y p o m e t h y l a t i o n o f t h e L I N E - l r e t r o t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s a c t i v a t e s s e n s e / a n t i s e n s e t r a n s c r i p t i o n a n d m a r k s t h e p r o g r e s s i o n o f c h r o n i c m y e l o i d l e u k e m i a . O n c o g e n e 2 4 , 7 2 1 3 - 7 2 2 3 . R o u g i e r , N . , B o u r c ' h i s , D . , G o m e s , D . M . , N i v e l e a u , A . , P l a c h o t , M . , P a l d i , A . , a n d V i e g a S - P é q u i g n o t , E . ( 1 9 9 8 ) C h r o m o s o m e m e t h y l a t i o n p a t t e r n s d u r i n g m a m m a l i a n p r e i m p l a n t a t i o n d e v e l o p m e n t . G e n e s D e v . 1 2 , 2 1 0 8 - 2 1 1 3 . 3 8 6 R fi e g g , C . , a n d M a r i o t t i , A . ( 2 0 0 3 ) V a s c u l a r i n t e g r i n s : p l e i o t r o p i c a d h e s i o n a n d s i g n a l i n g m o l e c u l e s i n v a s c u l a r h o m e o s t a s i s a n d a n g i o g e n e s i s . C e l l . M o l . L i f e . S c i . 6 0 , 1 1 3 5 - 1 1 5 7 . S a d o , T . , O k a n o , M . , L i , B , a n d S a s a k i , H . ( 2 0 0 4 ) D e n o v o D N A m e t h y l a t i o n i s d i s p e n s a b l e f o r t h e i n i t i a t i o n a n d p r o p a g a t i o n o f X c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n . D e v e l o p m e n t 1 3 1 , 9 7 5 - 9 8 2 . S a i n i , S . P . , S o n o d a , J . , X u , L . , T o m a , D . , U p p a l , H . , M u , Y . , R e n , S . , M o o r e , D . D . , E v a n s , R . M . , a n d X i e , W . ( 2 0 0 4 ) A n o v e l c o n s t i t u t i v e a n d r o s t a n e r e c e p t o r - m e d i a t e d a n d C Y P 3 A - i n d e p e n d e n t p a t h w a y o f b i l e a c i d d e t o x i fi c a t i o n . M o l . P h a r m a c o l . 6 5 , 2 9 2 - 3 0 0 . S c h e r m e l l e h , L . , H a e m m e r , A . , S p a d a , F . , R b s i n g , N . , M e i l i n g e r , D . , R o t h b a u e r , U . , C a r d o s o , M . C . , a n d L e o n h a r d t , H . ( 2 0 0 7 ) D y n a m i c s o f D n m t l i n t e r a c t i o n w i t h t h e r e p l i c a t i o n m a c h i n e r y a n d i t s r o l e i n p o s t r e p l i c a t i v e m a i n t e n a n c e o f D N A m e t h y l a t i o n . N u c l e i c A c i d s R e s . 3 5 , 4 3 0 1 - 4 3 1 2 . S c h u b b e r t , S . , S h a n n o n , K . , a n d B o l l a g , G . ( 2 0 0 7 ) H y p e r a c t i v e R a s i n d e v e l o p m e n t a l d i s o r d e r s a n d c a n c e r . N a t . R e v . C a n c e r 7 , 2 9 5 - 3 0 8 . S c h u l z , W . A . , S t e i n h o f f , C . , a n d F l o r l , A . R . ( 2 0 0 6 ) M e t h y l a t i o n o f e n d o g e n o u s h u m a n r e t r o e l e m e n t s i n h e a l t h a n d d i s e a s e . C u r r . T o p . M i c r o b i o l . I m m u n o l . 3 1 0 , 2 1 1 - 2 5 0 . S h a y , J . W . , a n d B a c c h e t t i , S . ( 1 9 9 7 ) A s u r v e y o f t e l o m e r a s e a c t i v i t y i n h u m a n c a n c e r . E u r . J . C a n c e r 3 3 , 7 8 7 - 7 9 1 . S h i v a p u r k a r , N . , R e d d y , J . , C h a u d h a r y , P . M . , a n d G a z d a r , A . F . ( 2 0 0 3 ) A p o p t o s i s a n d l u n g c a n c e r : a r e v i e w . J . C e l l . B i o c h e m . 8 8 , 8 8 5 - 8 9 8 . S t a h l S , I t t r i c h C , M a r x - S t o e l t i n g P , t h l e C , O t t T , B u c h m a n n A , S c h w a r z M . ( 2 0 0 5 ) E f f e c t o f t h e t u m o r p r o m o t e r p h e n o b a r b i t a l o n t h e p a t t e r n o f g l o b a l g e n e e x p r e s s i o n i n l i v e r o f c o n n e x i n 3 2 - w i l d - t y p e a n d c o n n e x i n 3 2 - d e fi c i e n t m i c e . I n t . J . C a n c e r . 1 1 5 , 8 6 1 - 8 6 9 . S t e e n m a n , M . J . , R a i n i e r , S . , D o b r y , C . J . , G r u n d y , P . , H o r o n , I . L . , a n d F e i n b e r g , A . P . ( 1 9 9 4 ) L o s s o f i m p r i n t i n g o f I G F 2 i s l i n k e d t o r e d u c e d e x p r e s s i o n a n d a b n o r m a l m e t h y l a t i o n o f H 1 9 i n W i l m s ' t u m o u r . N a t . G e n e t . 7 , 4 3 3 - 4 3 9 . S t e e r , C . J . ( 1 9 9 5 ) L i v e r r e g e n e r a t i o n . F A S E B J . 9 , 1 3 9 6 - 1 4 0 0 . S t r a h l , B . D . , a n d A l l i s , C . D . ( 2 0 0 0 ) T h e l a n g u a g e o f c o v a l e n t h i s t o n e m o d i fi c a t i o n s . N a t u r e 4 0 3 , 4 1 - 4 5 . S u e y o s h i , T . , K a w a m o t o , T . , Z e l k o , I . , H o n k a k o s k i , P . , a n d N e g i s h i , M . ( 1 9 9 9 ) T h e r e p r e s s e d n u c l e a r r e c e p t o r C A R r e s p o n d s t o p h e n o b a r b i t a l i n a c t i v a t i n g t h e h u m a n C Y P Z B 6 g e n e . . 1 . B i o l . C h e m . 2 7 4 , 6 0 4 3 - 6 0 4 6 . 3 8 7 S u e y o s h i , T . , M o o r e , R . , S u g a t a n i , J . , M a t s u m u r a , Y . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 8 ) P P P 1 R 1 6 A , t h e m e m b r a n e s u b u n i t o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e 1 1 3 , s i g n a l s n u c l e a r t r a n s l o c a t i o n o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r . M o l . P h a r m a c o l . 7 3 , 1 1 1 3 - 1 1 2 1 . S u e y o s h i , T , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 1 ) P h e n o b a r b i t a l r e s p o n s e e l e m e n t s o f c y t o c h r o m e P 4 5 0 g e n e s a n d n u c l e a r r e c e p t o r s . A n n u . R e v . P h a r m a c o l . T o x i c o l . 4 1 , 1 2 3 - 1 4 3 . S u g a t a n i , J . , K o j i m a , H . , U e d a , A . , K a k i z a k i , S . , Y o s h i n a r i , K . , G o n g , Q . H . , O w e n s , I . S . , N e g i s h i , M . , a n d S u e y o s h i , T . ( 2 0 0 1 ) T h e p h e n o b a r b i t a l r e s p o n s e e n h a n c e r m o d u l e i n t h e h u m a n b i l i r u b i n U D P - g l u c u r o n o s y l t r a n s f e r a s e U G T [ A ] g e n e a n d r e g u l a t i o n b y t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R . H e p a t o l o g y 3 3 , 1 2 3 2 - 1 2 3 8 . S u l l i v a n , M . J . , T a n i g u c h i , T . , J h e e , A . , K e r r , N . , a n d R e e v e , A . E . ( 1 9 9 9 ) R e l a x a t i o n o f I G F 2 i m p r i n t i n g i n W i l m s t u m o u r s a s s o c i a t e d w i t h s p e c i fi c c h a n g e s i n I G F 2 m e t h y l a t i o n . O n c o g e n e 1 8 , 7 5 2 7 - 7 5 3 4 . S w a l e s K , N e g i s h i M . ( 2 0 0 4 ) C A R , d r i v i n g i n t o t h e f u t u r e . M o l . E n d o c r i n o l . 1 8 , 1 5 8 9 - 1 5 9 8 . T a k a h a s h i , K . , T a n a b e , K . , O h n u k i , M . , N a r i t a , M . , I c h i s a k a , T . , T o m o d a , K . , a n d Y a m a n a k a , S . ( 2 0 0 7 ) I n d u c t i o n o f p l u r i p o t e n t s t e m c e l l s fi o m a d u l t h u m a n fi b r o b l a s t s b y d e fi n e d f a c t o r s . C e l l 1 3 1 , 8 6 1 - 8 7 2 . T a k a i , D . , a n d J o n e s , P . A . ( 2 0 0 2 ) C o m p r e h e n s i v e a n a l y s i s o f C p G i s l a n d s i n h u m a n c h r o m o s o m e s 2 1 a n d 2 2 . P r o c . N a t l . A c a d S c i . U S A . 9 9 , 3 7 4 0 - 3 7 4 5 . T e i , K . , K a w a k a m i - K i m u r a , N . , T a g u c h i , 0 . , K u r n a m o t o , K . , H i g a s h i y a m a , S . , T a n i g u c h i , N . , T o d a , K . , K a w a t a , R . , H i s a , Y . , a n d K a n n a g i , R . ( 2 0 0 2 ) R o l e s o f c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e s i n t u m o r a n g i o g e n e s i s i n d u c e d b y c o t r a n s p l a n t a t i o n o f c a n c e r a n d e n d o t h e l i a l c e l l s t o n u d e r a t s . C a n c e r R e s . 6 2 , 6 2 8 9 - 6 2 9 6 . T h e i s e , N . D . , B a d v e , S . , S a x e n a , R , H e n e g a r i u , 0 . , S e l l , S . , C r a w f o r d , J . M . , K r a u s e , D . S . ( 2 0 0 0 ) D e r i v a t i o n o f h e p a t o c y t e s f r o m b o n e m a r r o w c e l l s i n m i c e a f t e r r a d i a t i o n - i n d u c e d m y e l o a b l a t i o n . H e p a t o l o g y 3 1 , 2 3 5 - 2 4 0 . T i m s i t , Y . E . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 7 ) C A R a n d P X R : t h e x e n o b i o t i c - s e n s i n g r e c e p t o r s . S t e r o i d s . 7 2 , 2 3 1 - 2 4 6 . T o r e t s k y , J . A . , T h a k a r , M . , E s k e n a z i , A . E . , a n d F r a n t z , C . N . ( 1 9 9 9 ) P h o s p h o i n o s i t i d e 3 - h y d r o x i d e k i n a s e b l o c k a d e e n h a n c e s a p o p t o s i s i n t h e E w i n g ' s s a r c o m a f a m i l y o f t u m o r s . C a n c e r R e s . 5 9 , 5 7 4 5 - 5 7 5 0 . T r o s k o , J . E . , a n d C h a n g , C . C . ( 2 0 0 1 ) M e c h a n i s m o f u p - r e g u l a t e d g a p j u n c t i o n a l i n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n d u r i n g c h e m o p r e v e n t i o n a n d c h e m o t h e r a p y o f c a n c e r . M u t a t . R e s . 4 8 0 - 8 1 , 2 1 9 - 2 2 9 . 3 8 8 T u r k e r , M . S . ( 1 9 9 9 ) T h e e s t a b l i s h m e n t a n d m a i n t e n a n c e o f D N A m e t h y l a t i o n p a t t e r n s i n m o u s e s o m a t i c c e l l s . S e m i n . C a n c e r B i o l . 9 , 3 2 9 - 3 3 7 . . U e d a , A . , H a m a d e h , H . K . , W e b b , H . K . , Y a m a m o t o , Y . , S u e y o s h i , T . , A f s h a r i , C . A . , L e h m a n n , J . M . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 2 ) D i v e r s e r o l e s o f t h e n u c l e a r o r p h a n r e c e p t o r C A R i n r e g u l a t i n g h e p a t i c g e n e s i n r e s p o n s e t o p h e n o b a r b i t a l . M o l . P h a r m a c o l . 6 1 , 1 - 6 . U l r e y , C . L . , L i u , L . , A n d r e w s , L . G . , a n d T o l l e f s b o l , T . O . ( 2 0 0 5 ) T h e i m p a c t o f m e t a b o l i s m o n D N A m e t h y l a t i o n . H u m . M o l . G e n e t . 1 4 S p e c N o 1 : R l 3 9 - 1 4 7 . V o g e l s t e i n , B . , L a n e , D . , a n d L e v i n e , A . J . ( 2 0 0 0 ) S u r fi n g t h e p 5 3 n e t w o r k . N a t u r e 4 0 8 , 3 0 7 - 3 1 0 . V o r c e , R . L . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 1 9 9 1 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f r a s o n c o g e n e s i n c h e m i c a l l y i n d u c e d a n d s p o n t a n e o u s B 6 C 3 F 1 m o u s e l i v e r t u m o r s . T o x i c o l . E n v i r o n . H e a l t h . 3 4 , 3 6 7 - 3 8 4 . W a l s h , C . P . , a n d B e s t o r , T . H . ( 1 9 9 9 ) C y t o s i n e m e t h y l a t i o n a n d m a m m a l i a n d e v e l o p m e n t . G e n e s D e v . 1 3 , 2 6 - 3 4 . W a l s h , C . P . , C h a i l l e t , J . R . , a n d B e s t o r , T . H . ( 1 9 9 8 ) T r a n s c r i p t i o n o f I A P e n d o g e n o u s r e t r o v i r u s e s i s c o n s t r a i n e d b y c y t o s i n e m e t h y l a t i o n . N a t . G e n e t . 2 0 , 1 1 6 - 1 1 7 . C h r o m a t i n r e m o d e l i n g a n d c a n c e r , P a r t I I : A T P - d e p e n d e n t c h r o m a t i n r e m o d e l i n g . W a n g , G . G . , A l l i s , C . D . , a n d C h i , P . ( 2 0 0 7 ) T r e n d s M o l . M e d . 1 3 , 3 7 3 - 3 8 0 . W a n g , X . , F o s t e r , M . , A l - D h a l i m y , M . , L a g a s s e , E . , F i n e g o l d , M . , G r o m p e , M . ( 2 0 0 3 ) T h e o r i g i n a n d l i v e r r e p o p u l a t i n g c a p a c i t y o f m u r i n e o v a l c e l l s . P r o c . N a t l . A c a d S c i . U S A 1 0 0 , S u p p l . 1 : 1 1 8 8 1 - 1 1 8 8 8 . W a r n e r , K . A . , F e m s t r o m , M . J . , R u c h , R . J . ( 2 0 0 3 ) I n h i b i t i o n o f m o u s e h e p a t o c y t e g a p j u n c t i o n a l i n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n b y p h e n o b a r b i t a l c o r r e l a t e s w i t h s t r a i n - s p e c i fi c h e p a t o c a r c i n o g e n e s i s . T o x i c o l . S c i . 7 1 , 1 9 0 - 1 9 7 . W a t s o n , R . E . , a n d G o o d m a n , J . I . ( 2 0 0 2 ) E f f e c t s o f p h e n o b a r b i t a l o n D N A m e t h y l a t i o n i n G C - r i c h r e g i o n s o f h e p a t i c D N A f r o m m i c e t h a t e x h i b i t d i f f e r e n t l e v e l s o f s u s c e p t i b i l i t y t o l i v e r t u m o r i g e n e s i s . T o x i c o l . S c i . 6 8 , 5 1 - 5 8 . W a t t , F . , a n d M o l l o y , P . L . ( 1 9 8 8 ) C y t o s i n e m e t h y l a t i o n p r e v e n t s b i n d i n g t o D N A o f a H e L a c e l l t r a n s c r i p t i o n f a c t o r r e q u i r e d f o r o p t i m a l e x p r e s s i o n o f t h e a d e n o v i r u s m a j o r l a t e p r o m o t e r . G e n e s D e v . 2 , 1 1 3 6 - 1 1 4 3 . W e i , P . , Z h a n g , J . , E g a n - H a fl e y , M . , L i a n g , S . , a n d M o o r e , D . D . ( 2 0 0 0 ) . T h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R m e d i a t e s S p e c i fi c x e n o b i o t i c i n d u c t i o n o f d r u g m e t a b o l i s m . N a t u r e 4 0 7 , 9 2 0 - 9 2 3 . 3 8 9 W e i s s , A . , K e s h e t , I . , R a z i n , A . , a n d C e d a r , H . ( 1 9 9 6 ) D N A d e m e t h y l a t i o n i n v i t r o : i n v o l v e m e n t o f R N A . C e l l 8 6 , 7 0 9 - 7 1 8 . W e r n i g , M . , M e i s s n e r , A . , F o r e m a n , R . , B r a r n b r i n k , T . , K u , M . , H o c h e d l i n g e r , K . , B e r n s t e i n , B . E . , a n d J a e n i s c h , R . ( 2 0 0 7 ) I n v i t r o r e p r o g r a m m i n g o f fi b r o b l a s t s i n t o a p l u r i p o t e n t E S - c e l l - l i k e s t a t e . N a t u r e 4 4 8 , 3 1 8 — 3 2 4 . W i l s o n , A . S . , P o w e r , B . E . , a n d M o l l o y , P . L . ( 2 0 0 7 ) D N A h y p o m e t h y l a t i o n a n d h u m a n d i s e a s e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 1 7 7 5 , 1 3 8 - 1 6 2 . W h i t e l a w , E . , a n d M a r t i n , D . I . ( 2 0 0 1 ) R e t r o t r a n s p o s o n s a s e p i g e n e t i c m e d i a t o r s o f p h e n o t y p i c v a r i a t i o n i n m a m m a l s . N a t . G e n e t . 2 7 , 3 6 1 - 3 6 5 . W h y s n e r , J . , R o s s , P . M . , a n d W i l l i a m s , G . M . ( 1 9 9 6 ) . P h e n o b a r b i t a l m e c h a n i s t i c d a t a a n d r i s k a s s e s s m e n t : e n z y m e i n d u c t i o n , e n h a n c e d c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n d t u m o r p r o m o t i o n . P h a r m a c o l . T h e r . 7 1 , 5 3 - 9 1 . W o n g , N . , L a m , W . C . , L a i , P . B . , P a n g , E . , L a u , W . Y . , a n d J o h n s o n , P . J . ( 2 0 0 1 ) H y p o m e t h y l a t i o n o f c h r o m o s o m e 1 h e t e r o c h r o m a t i n D N A c o r r e l a t e s w i t h q - a r m c o p y g a i n i n h u m a n h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a . A m . J . P a t h o l . 1 5 9 , 4 6 5 - 4 7 1 . W u t z , A . , S m r z k a , O . W . , S c h w e i f e r , N . , S c h e l l a n d e r , K . , W a g n e r , E . P . , B a r l o w , D . P . ( 1 9 9 7 ) I m p r i n t e d e x p r e s s i o n o f t h e I g f 2 r g e n e d e p e n d s o n a n i n t r o n i c C p G i s l a n d . N a t u r e 3 8 9 , 7 4 5 - 7 4 9 . X u , G . L . , B e s t o r , T . H . , B o u r c ' h i s , D . , H s i e h , C . L . , T o m m e r u p , N . , B u g g e , M . , H u l t e n , M . , Q u , X . , R u s s o , J . J . , a n d V i e g a S - P é q u i g n o t , E . ( 1 9 9 9 ) C h r o m o s o m e i n s t a b i l i t y a n d i m m u n o d e fi c i e n c y s y n d r o m e c a u s e d b y m u t a t i o n s i n a D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e g e n e . N a t u r e 4 0 2 , 1 8 7 - 1 9 1 . Y a m a m o t o , Y . , K a w a m o t o , T . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 3 ) T h e r o l e o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R a s a c o o r d i n a t e r e g u l a t o r o f h e p a t i c g e n e e x p r e s s i o n i n d e f e n s e a g a i n s t c h e m i c a l t o x i c i t y . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 4 0 9 , 2 0 7 - 2 1 1 . Y a m a m o t o , Y . , M o o r e , R . , G o l d s w o r t h y , T . L . , N e g i s h i , M . , a n d M a r o n p o t , R . R ( 2 0 0 4 ) T h e o r p h a n n u c l e a r r e c e p t o r c o n s t i t u t i v e a c t i v e / a n d r o s t a n e r e c e p t o r i s e s s e n t i a l f o r l i v e r t u m o r p r o m o t i o n b y p h e n o b a r b i t a l i n m i c e . C a n c e r R e s . 6 4 , 7 1 9 7 - 7 2 0 0 . Y o d e r , J . A . , W a l s h , C . P . , a n d B e s t o r , T . H . ( 1 9 9 7 ) C y t o s i n e m e t h y l a t i o n a n d t h e e c o l o g y o f i n t r a g e n o m i c p a r a s i t e s . T r e n d s G e n e t . 1 3 , 3 3 5 - 3 4 0 . Y o o , C . B . , a n d J o n e s , P . A . ( 2 0 0 6 ) E p i g e n e t i c t h e r a p y o f c a n c e r : p a s t , p r e s e n t a n d f u t u r e . N a t . R e v . D r u g . D i s c o v . 5 , 3 7 - 5 0 . 3 9 0 Y o o n , H . G . , C h a n , D . W . , R e y n o l d s , A . B . , Q i n , J . , a n d W o n g , J . ( 2 0 0 3 ) N - C o R m e d i a t e s D N A m e t h y l a t i o n - d e p e n d e n t r e p r e s s i o n t h r o u g h a m e t h y l C p G b i n d i n g p r o t e i n K a i s o . M o l . C e l l . 1 2 , 7 2 3 - 7 3 4 . Y o s h i n a r i , K . , K o b a y a s h i , K . , M o o r e , R . , K a w a m o t o , T . , a n d N e g i s h i , M . ( 2 0 0 3 ) I d e n t i fi c a t i o n o f t h e n u c l e a r r e c e p t o r C A R z H S P 9 0 c o m p l e x i n m o u s e l i v e r a n d r e c r u i t m e n t o f p r o t e i n p h o s p h a t a s e 2 A i n r e s p o n s e t o p h e n o b a r b i t a l . F E B S L e t t . 5 4 8 , 1 7 - 2 0 . Z h a n g , H . , B e r e z o v , A . , W a n g , Q . , Z h a n g , G . , D r e b i n , J . , M u r a l i , R . , a n d G r e e n e , M . I . ( 2 0 0 7 ) E r b B r e c e p t o r s : f r o m o n c o g e n e s t o t a r g e t e d c a n c e r t h e r a p i e s . J . C l i n . I n v e s t . 1 1 7 , 2 0 5 1 - 2 0 5 8 . Z h u , B . , Z h e n g , Y . , A n g l i k e r , H . , S c h w a r z , S . , T h i r y , S . , S i e g r n a n n , M . , a n d J o s t , J . P . ( 2 0 0 0 ) S - m e t h y l c y t o s i n e D N A g l y c o s y l a s e a c t i v i t y i s a l s o p r e s e n t i n t h e h u m a n M B D 4 ( G / T m i s m a t c h g l y c o s y l a s e ) a n d i n a r e l a t e d a v i a n s e q u e n c e . N u c l e i c A c i d s R e s . 2 8 , 4 1 5 7 - 4 1 6 5 . Z i l b e r m a n , D . , G e h r i n g , M . , T r a n , R . K . , B a l l i n g e r , T . , a n d H e n i k o f f , S . ( 2 0 0 7 ) G e n o m e - w i d e a n a l y s i s o f A r a b i d o p s i s t h a l i a n a D N A m e t h y l a t i o n u n c o v e r s a n i n t e r d e p e n d e n c e b e t w e e n m e t h y l a t i o n a n d t r a n s c r i p t i o n . N a t . G e n e t . 3 9 , 6 1 - 6 9 . 3 9 1 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 s