fl fi g p w a J s I n n : . . a m m u n fl fl n u r fi m H M R I ! R o n - “ 4 6 . 4 . ! 3 3 3 “ . . . ” u n fi m fl x . » fl u u . : i n " ; I m l ; . \ I s 3 1 . 3 . x . 1 : 3 . I . . I . 1 . 3 ! . . . 4 5 . . . ) . 1 . C I J . . 2 5 u : D x n - I u { x i i i } ? i } . 1 ‘ C l 1 i i ! L fi n v i “ : l x \ ) . \ M i c U h n i i g v a e n r s S i t t a y t e T h e m e o ‘ . | L I B R A R Y T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d P R O T O N M O V E M E N T I N C Y T O C H R O M E C O X I D A S E O F R H O D O B A C T E R S P H A E R O I D E S p r e s e n t e d b y N A M J O O N K I M h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e P h D . d e g r e e i n B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y M a j r o f e s s o r ’ s S i g n a t u r e r 7 4 1 / 1 7 7 fl } . 3 2 0 0 ? y I / D a t e M S U i s a n A f f i r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y E m p l o y e r P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 5 / 0 8 K : I P r o j / A c c & P r e l e l R C / D a l e D u e . i n d d P R O T O N M O V E M E N T I N C Y T O C H R O M E C O X I D A S E O F R H O D O B A C T E R S P H A E R O I D E S V O L U M E I B y N A M J O O N K I M A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y B i o c h e m i s t r y & M o l e c u l a r B i o l o g y 2 0 0 9 A B S T R A C T P R O T O N M O V E M E N T I N C Y T O C H R O M E C O X I D A S E O F R H O D O B A C T E R S P H A E R O I D E S B y N a m j o o n K i m M e m b r a n e b o u n d c y t o c h r o m e c o x i d a s e c o u p l e s t h e m o v e m e n t o f e l e c t r o n s a n d p r o t o n s i n o r d e r t o a c h i e v e b o t h o x y g e n r e d u c t i o n a n d p r o t o n t r a n s l o c a t i o n a c r o s s t h e m e m b r a n e , r e s u l t i n g i n t h e g e n e r a t i o n o f a n e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t t o s u p p o r t A T P s y n t h e s i s . P r o t o n m o v e m e n t f r o m t h e i n n e r s u r f a c e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e t o t h e a c t i v e s i t e t h r o u g h t h e “ D ” a n d “ K ” p r o t o n u p t a k e p a t h w a y s h a s b e e n i d e n t i fi e d . H o w e v e r , t h e p r o t o n r e l e a s e p a t h w a y t o t h e e x t e r i o r o f t h e p r o t e i n i s n o t w e l l e s t a b l i s h e d . A h y d r o g e n b o n d e d n e t w o r k i n v o l v i n g a n u m b e r o f w a t e r m o l e c u l e s a b o v e t h e h e m e s h a s b e e n p o s t u l a t e d t o b e i n v o l v e d i n p r o t o n r e l e a s e a n d t o p o s s i b l y h a v e r e v e r s i b i l i t y f o r t h e b a c k fl o w o f p r o t o n s . I t i s a l s o p r o p o s e d t h a t p r o t o n b a c k fl o w m a y b e a n i m p o r t a n t p r o c e s s i n p h y s i o l o g i c a l r e g u l a t i o n o f e n e r g y e f fi c i e n c y . T o o b s e r v e a n d q u a n t i f y p r o t o n p u m p i n g a n d p r o t o n b a c k f l o w i n r e c o n s t i t u t e d v e s i c l e s c o n t a i n i n g c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( C O V ) , c o n d i t i o n s w e r e e s t a b l i s h e d f o r t h e u s e o f p H s e n s i t i v e d y e s , p h e n o l r e d o n t h e o u t s i d e a n d fl u o r e s c e n t p y r a n i n e t r a p p e d o n t h e i n s i d e , t o a l l o w m e a s u r e m e n t o f p r o t o n m o v e m e n t o n b o t h s i d e s o f t h e m e m b r a n e u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s . S t o p p e d - fl o w t e c h n i q u e s w e r e u s e d t o f o l l o w t h e c a t a l y t i c r e a c t i o n i n t h e m i l l i s e c o n d t i m e s c a l e , b y fl u o r e s c e n c e o r r a p i d s c a n n i n g v i s i b l e s p e c t r o s c o p y . T h e c o n d i t i o n s f o r p r e p a r i n g C O V s w e r e o p t i m i z e d b y u s i n g B i o b e a d s f o r d e t e r g e n t r e m o v a l r a t h e r t h a n d i a l y s i s a n d b y p u r i f y i n g C O V s t h a t c o n t a i n e d h i s - t a g g e d o x i d a s e p u r i fi e d b y N i - N T A r e s i n . T h e s e p r o c e d u r e s i n c r e a s e d t h e s i z e a n d h o m o g e n e i t y o f C O V s r e s u l t i n g i n i m p r o v e d s i g n a l / n o i s e f o r t h e i n t e r n a l p H m e a s u r e m e n t s . T h e s i z e o f t h e v e s i c l e s w a s m e a s u r e d b y t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y a f t e r fi x a t i o n w i t h o s m i u m t e t r o x i d e b y a n e g a t i v e s t a i n i n g m e t h o d . S e v e r a l m u t a n t s i n v o l v e d i n t h e p r o t o n u p t a k e p a t h w a y a n d t h e p o s t u l a t e d p r o t o n r e l e a s e / b a c k fl o w p a t h w a y s w e r e e x a m i n e d t o q u a n t i f y t h e r a t e a n d e x t e n t o f p r o t o n m o v e m e n t a n d c l a r i f y t h e r o l e o f e a c h p r o t o n p a t h w a y i n c y t o c h r o m e o x i d a s e a c t i v i t y . M i c r o m o l a r l e v e l s o f z i n c , a n o x i d a s e i n h i b i t o r , c a u s e d s t r o n g i n h i b i t i o n o f p r o t o n b a c k fl o w , s u p p o r t i n g t h e i d e a t h a t p r o t o n b a c k fl o w i s i m p o r t a n t f o r o x i d a s e a c t i v i t y w h e n u p t a k e o f p r o t o n s f r o m t h e i n s i d e i s i n h i b i t e d , a s i n t h e p r e s e n c e o f a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l o r b y s i t e — d i r e c t e d m u t a t i o n s . I s s u e s s t i l l r e m a i n c o n c e r n i n g t h e q u a n t i t a t i v e c o n t r i b u t i o n s o f p r o t o n s f r o m t h e i n s i d e a n d t h e o u t s i d e t o s u p p o r t i n g o x i d a s e a c t i v i t y u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s . T h e r e g i o n o f H 9 3 h a s b e e n s u g g e s t e d t o b e i n v o l v e d i n p r o t o n p u m p i n g i n t h e b o v i n e o x i d a s e a n d i s a l s o a c a n d i d a t e f o r t h e i n h i b i t o r y z i n c s i t e . V a r i o u s m u t a n t f o r m s w e r e p r o d u c e d a n d t e s t e d i n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r H 9 3 h a s a r o l e i n p r o t o n p u m p i n g o r b a c k fl o w i n t h e b a c t e r i a l o x i d a s e a n d w h e t h e r H 9 3 i t s a l t e r a t i o n d i m i n i s h e d z i n c i n h i b i t i o n . V a r i o u s H 9 3 m u t a n t s s h o w c l o s e t o n o r m a l p r o t o n p u m p i n g s u g g e s t i n g H 9 3 i s n o t i m p o r t a n t i n t h e p r o t o n p u m p i n g o f R . s p h a e r o i d e s o x i d a s e . Z i n c i n h i b i t i o n w a s a l s o o b s e r v e d i n t h e s e m u t a n t s , r u l i n g o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t H 9 3 p l a y s a r o l e i n z i n c b i n d i n g . A d e c r e a s e d a c t i v i t y i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e , p a r t i c u l a r l y a t h i g h p H , c a u s e d a n i n c r e a s e d R C R f o r a l l t h e H 9 3 m u t a n t s . S i n c e t h e p r o t o n s u p p l y f r o m t h e o u t s i d e i s i m p o r t a n t i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e , t h e d a t a s u g g e s t s t h a t H 9 3 m a y b e i n v o l v e d i n p r o t o n b a c k fl o w . P r e l i m i n a r y r e s u l t s f r o m g l o b a l fi t t i n g a n d k i n e t i c m o d e l i n g o f t h e c o m p l e t e s p e c t r a f r o m t h e r a p i d - s c a n n i n g d a t a , o b t a i n e d f r o m t h e s t o p p e d - fl o w k i n e t i c a n a l y s i s o f p r o t o n m o v e m e n t s , s u g g e s t s t h a t t h i s m e t h o d w i l l p r o v i d e a m o r e p o w e r f u l a p p r o a c h t o q u a n t i t a t i v e m o d e l i n g o f p r o t o n p u m p i n g k i n e t i c s . T h i s a p p r o a c h m a y p r o v i d e a m o r e d e fi n i t i v e a n s w e r t o t h e r o l e o f p r o t o n b a c k fl o w i n o x i d a s e a c t i v i t y a n d a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e p h y s i o l o g i c a l c o n t r o l o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . D e d i c a t e d t o m y w i f e H y u n j o o J u n i v A C K N O W L E D G E M E N T S I w o u l d l i k e t o e x p r e s s m y s i n c e r e a p p r e c i a t i o n t o D r . S h e l a g h M F e r g u s o n - M i l l e r , a t r u l y i n s p i r i n g t e a c h e r a n d c o u n s e l o r ; f o r h e r g u i d a n c e , t e a c h i n g a n d f r i e n d s h i p d u r i n g t h e c o u r s e o f t h i s i n v e s t i g a t i o n . G r a t e f u l a p p r e c i a t i o n i s a l s o e x t e n d e d t o D r . J . G r e g o r y Z e i k u s , D r . H o n g g a o Y a n , D r . L e e R . K r o o s a n d D r . R o b e r t I . C u k i e r f o r s e r v i n g o n m y g u i d a n c e c o m m i t t e e . S p e c i a l t h a n k s g o t o o u r r e s e a r c h t e a m m e m b e r s t h a t I h a v e h a d g r e a t o p p o r t u n i t y t o w o r k w i t h d u r i n g m y g r a d u a t e t r a i n i n g . T h a n k s t o D r . D e n i s e M i l l s f o r t h e t r a i n i n g o f t h e k i n e t i c a n d m e c h a n i s m s t u d y a n d t o D r . C a r r i e H i s e r f o r ’ h e r h e l p o f m a k i n g o x i d a s e m u t a n t s . I a l s o g r e a t l y a p p r e c i a t e t o D r . L i n g Q i n f o r h i s c r y s t a l s t r u c t u r e s . I a l s o t h a n k t o m y f e l l o w g r a d u a t e s t u d e n t J i a n L i u a n d f o r m e r g r a d u a t e s o f t h e l a b . I a m g r a t e f u l t o a c a d e m i c s p e c i a l i s t , A l i c i a P a s t o r , f o r t h e h e l p o f T E M t e c h n i q u e . I a l s o a p p r e c i a t e m y f r i e n d s a n d f e l l o w K o r e a n g r a d u a t e s t u d e n t s i n M S U w h o a l w a y s e n c o u r a g e d i n t h e p a s t a n d p r e s e n t . F i n a l l y , I a m e s p e c i a l l y g r a t e f u l t o m y f a m i l y f o r t h e i r p r a y e r a n d s u p p o r t . M o s t o f a l l I w o u l d l i k e t o t h a n k t o m y m o t h e r f o r b e i n g a c o n s t a n t s u p p o r t a n d f r i e n d . V e r y s p e c i a l t h a n k s g o t o m y l o v i n g w i f e f o r h e r p a t i e n c e a n d l o v e w h i l e I w o r k e d o n t h i s t h e s i s . E s p e c i a l l y , I w o u l d l i k e t o t h a n k t o b r o t h e r s a n d s i s t e r s o f t h e c h u r c h ( N e w H o p e B a p t i s t c h u r c h a n d T M S ) . I s i n c e r e l y t h a n k G o d f o r H i s l o v i n g - k i n d n e s s a n d g r a c e f o r e v e r y m o m e n t i n m y l i f e . T A B L E O F C O N T E N T S v i L I S T O F T A B L E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x L I S T O F F I G U R E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i A B B R E V I A T I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v i C h a p t e r 1 B a c k g r o u n d o n c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( L i t e r a t u r e R e v i e w ) . . . . . . . . . . . . 1 1 . 1 . E n e r g y T r a n s d u c t i o n a n d C y t o c h r o m e c O x i d a s e 1 1 . 1 . 1 . O v e r a l l S t u c t u r e o f t h e C y t o c h r o m e c O x i d a s e 3 1 . 1 . 1 . 1 . X - r a y C r y s t a l S t r u c t u r e o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e 3 1 . 1 . 1 . 2 . C a t a l y t i c C o r e S u b u n i t s a n d F u n c t i o n 3 1 . 1 . 1 . 3 . S t r u c t u r e o f t h e H e m e a 3 - C u 3 S i t e 7 1 . 1 . 1 . 4 . N o n - R e d o x M e t a l B i n d i n g S i t e s 8 1 . 1 . 2 . T h e R o l e o f t h e C y t o c h r o m e c O x i d a s e 1 1 1 . 1 . 3 . I n t r i n s i c U n c o u p l i n g o f O x i d a s e a n d E n e r g y E f f i c i e n c y 1 6 1 . 2 . S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e 2 0 1 . 2 . 1 . C o m p a r i s o n o f M i t o c h o n d r i a l a n d P r o k a r y o t i c E n z y m e s 2 0 1 . 2 . 1 . 1 . B o v i n e H e a r t C y t o c h r o m e c O x i d a s e 2 0 1 . 2 . 1 . 2 . P r o k a r y o t i c C y t o c h r o m e c O x i d a s e 2 2 1 . 2 . 2 . E l e c t r o n T r a n s f e r i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e 2 6 1 . 2 . 3 . P r o t o n M o v e m e n t i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e 2 8 1 . 2 . 4 . T h e C a t a l y t i c R e a c t i o n C y c l e f o r O x y g e n R e d u c t i o n 3 0 1 . 2 . 4 . 1 . O x y g e n P a t h w a y 3 0 1 . 2 . 4 . 2 . C a t a l y t i c C y c l e o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e 3 1 1 . 2 . 4 . 3 . M i s s i n g E l e c t r o n d u r i n g 0 2 C l e a v a g e 3 5 1 . 2 . 5 . C o n t r o l o f A c t i v i t y i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e 3 8 1 . 2 . 5 . 1 . E f f e c t o f M e m b r a n e P o t e n t i a l a n d p H G r a d i e n t 3 8 1 . 2 . 5 . 2 . C y t o c h r o m e c B i n d i n g t o t h e C o m p l e x 4 0 1 . 2 . 5 . 3 . R o l e o f S u b u n i t I I I 4 3 1 . 3 . P r o t o n P u m p i n g M e c h a n i s m o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e 4 6 1 . 3 . 1 . A p p r o a c h e s t o U n d e r s t a n d i n g t h e C a t a l y t i c M e c h a n i s m 4 6 1 . 3 . 1 . 1 . E l e c t r o m e t r i c M e a s u r e m e n t 4 6 1 . 3 . 1 . 2 . E l e c t r o s t a t i c C a l c u l a t i o n s 4 8 1 . 3 . 1 . 3 . M o l e c u l a r D y n a m i e s S i m u l a t i o n s 4 9 1 . 3 . 1 . 4 . S i n g l e - T b m o v e r E x p e r i m e n t s 5 3 1 . 3 . 1 . 5 . E P R S p e c t r o s c o p y A n a l y s i s 5 5 1 . 3 . 1 . 6 . F T I R S p e c t r o s c o p y A n a l y s i s 5 8 1 . 3 . 1 . 7 . X - R a y C r y s t a l l o g r a p h y 6 0 1 . 3 . 1 . 8 . A m i d e H I D E x c h a n g e M a s s S p e c t r o m e t r y 6 3 1 . 3 . 1 . 9 . B i o m i m e t i c M o d e l S t u d y 6 4 1 . 3 . 2 . S t u d y o f R e c o n s t i t u t e d S y s t e m s 6 5 1 . 3 . 2 . 1 . O r g a n i c s o l v e n t - m e d i a t e d r e c o n s t i t u t i o n s 6 8 1 . 3 . 2 . 2 . M e c h a n i c a l m e a n s - 6 8 1 . 3 . 2 . 3 . D e t e r g e n t - m e d i a t e d r e c o n s t i t u t i o n s 7 0 1 . 3 . 3 . P r o t o n P u m p i n g M e c h a n i s m 7 4 1 . 3 . 3 . 1 . E l e c t r o n e u t r a l i t y M o d e l 7 4 1 . 3 . 3 . 2 . P r o t o n P u m p i n g E l e m e n t 7 5 1 . 3 . 3 . 3 . P r o t o n P u m p i n g M e d i a t e d b y C u A o r H e m e a 7 6 1 . 3 . 3 . 4 . P r o t o n P u m p i n g M e d i a t e d b y t h e H e m e a 3 / C u ; A c t i v e S i t e . . . . . . . . . . . 7 7 1 . 3 . 3 . 5 . C o n f o r m a t i o n a l C h a n g e s i n C c O 7 9 1 . 3 . 4 . M u t a t i o n a l A n a l y s i s o f P r o t o n P a t h w a y s 8 1 1 . 3 . 4 . 1 . D - P a t h w a y f o r P r o t o n U p t a k e 8 1 1 . 3 . 4 . 2 . K - P a t h w a y f o r P r o t o n U p t a k e 8 6 1 . 3 . 4 . 3 . H - P a t h w a y i n B o v i n e H e a r t M i t o c h o n d r i a l C y t o c h r o m e c O x i d a s e 9 1 1 . 3 . 4 . 4 . E x i t P a t h w a y s f o r P r o t o n s a n d W a t e r 9 3 1 . 3 . 4 . 5 . P r o t o n B a c k fl o w P a t h w a y 9 5 1 . 4 . S t a t e m e n t o f p u r p o s e 9 6 C h a p t e r 2 O p t i m i z a t i o n / C h a r a c t e r i z a t i o n o f P r o t e o l i p o s o m e s a n d p H S e n s i t i v e D y e s t o A c h i e v e I n t e r n a l a n d E x t e r n a l p H M e a s u r e m e n t 9 9 2 . 1 . I n t r o d u c t i o n 9 9 2 . 2 . E x p e r i m e n t a l P r o c e d u r e s 1 0 2 2 . 2 . 1 . P r o d u c t i o n a n d I s o l a t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e 1 O 2 v i i B a c t e r i a l G r o w t h P r e p a r a t i o n o f C y t o p l a s m i c M e m b r a n e s P u r i f i c a t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e 2 . 2 . 2 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e U V - V i s i b l e S p e c t r o s c o p y S t e a d y S t a t e A c t i v i t y M e a s u r e m e n t b y O x y g r a p h R a p i d S c a n n i n g S t o p p e d - F l o w M e m b r a n e P o t e n t i a l M e a s u r e m e n t i n C O V s 2 . 2 . 3 . R e c o n s t i t u t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e C h o l a t e - D i a l y s i s C O V s B i o - B e a d C O V s p u r i fi e d b y N i h - N T A c o l u m n 2 . 2 . 4 . M e a s u r e m e n t o f C O V S i z e b y E l e c t r o n M i c r o s c o p y 2 . 3 . R e s u l t s - 2 . 3 . 1 . D y e C h a r a c t e r i z a t i o n 2 . 3 . 2 . I n i t i a l M e a s u r e m e n t o f C O V s w i t h F l u o r e s c e n c e M o d e M e m b r a n e P o t e n t i a l M e a s u r e m e n t o f C O V s F l u o r e s c e n c e M o n i t o r i n g o f p H c h a n g e s o n t h e i n s i d e o f C O V s 2 . 3 . 3 . I n i t i a l M e a s u r e m e n t o f C O V s w i t h A b s o r b a n c e M o d e 2 . 3 . 4 . M o d i fi c a t i o n o f p r e p a r a t i o n m e t h o d a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f C O V s . . . . . . B i o - b e a d s C O V s w i t h p u r i f i c a t i o n s t e p s b y N i - N T A a n d h i s - t a g g e d C c O . . . . . . . . . . S i z e M e a s u r e m e n t b y T r a n s m i s s i o n E l e c t r o n M i c r o s c o p y P e r m e a b i l i t y o f C O V s a n d C a l i b r a t i o n o f A b s o r b a n c e C h a n g e - 1 0 2 1 0 2 1 0 3 1 0 4 1 0 4 1 0 5 1 0 6 1 1 0 1 1 2 1 1 2 1 1 4 1 2 1 1 2 2 1 2 2 1 2 9 1 2 9 1 3 3 1 3 7 1 4 3 1 4 3 1 4 4 1 4 9 2 . 3 . 5 . O p t i m i z i n g C o n d i t i o n s f o r A n a l y s i s o f t h e A c t i v i t y a n d F u n c t i o n o f C O V s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 4 I n t e r n a l B u f f e r S e l e c t i o n M o n i t o r i n g i n s i d e p H c h a n g e s w i t h v a r i o u s c o n d i t i o n s T h e e f f e c t o f p H o n a c t i v i t y o f C O V s p r e p a r e d b y d i f f e r e n t m e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . 2 . 4 . D i s c u s s i o n D i f f i c u l t i e s i n p H m e a s u r e m e n t o n t h e i n s i d e o f C O V s I n t e r n a l V o l u m e E s t i m a t i o n o f C O V s 1 5 4 1 5 9 1 6 3 1 6 3 1 6 3 1 6 4 T h e u s e o f p H p r o b e , p y r a n i n e , a n d i t s a d v a n t a g e s i n a b s o r b e n c e m e a s u r e m e n t o v e r fl u o r e s c e n c e v i i i 1 6 5 C h a p t e r 3 A p p l i c a t i o n a n d A n a l y s i s o f I n t e r n a l a n d E x t e r n a l p H C h a n g e s i n R e c o n s t i t u t e d C c O V e s i c l e s t o U n d e r s t a n d P r o t o n P a t h w a y s 1 6 7 3 . 1 . I n t r o d u c t i o n 1 6 7 3 . 2 . R e s u l t s 1 6 8 3 . 2 . 1 . R a w D a t a A n a l y s i s o f T h e W i l d T y p e C O V M e a s u r e m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 8 3 . 2 . 2 . Q u a n t i t a t i v e A n a l y s i s o f D a t a f r o m S t o p p e d - F l o w 1 7 4 3 . 2 . 3 . E x i t ! B a c k fl o w S t u d y o f C c O w i t h Z i n c 1 8 1 3 . 2 . 4 . F u r t h e r S t u d y o f B a c k f l o w w i t h D 1 3 2 A M u t a n t . 1 8 7 3 . 3 . D i s c u s s i o n 1 9 1 3 . 3 . 1 . P r o b l e m s i n C u r r e n t A n a l y s i s 1 9 1 3 . 3 . 2 . F u r t h e r A n a l y s i s o f P o s s i b i l i t i e s b y G l o b a l F i t t i n g a n d M o d e l S t u d i e s 1 9 2 C h a p t e r 4 H 9 3 M u t a t i o n a n d I t s P u t a t i v e R o l e i n P r o t o n B a c k fl o w S t u d y 1 9 5 4 . 1 . I n t r o d u c t i o n 1 9 5 4 . 2 . M e t h o d s o f S i t e - D i r e c t e d M u t a g e n e s i s o f R c h O t o P r o d u c e H 9 3 K . . . . . . . 2 0 0 4 . 3 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f H 9 3 K m u t a n t s 2 0 2 4 . 3 . 1 . S u b u n i t A n a l y s i s b y S D S - P A G E o f P u r i f i e d C c O 2 0 2 4 . 3 . 2 . S p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r i z a t i o n 2 0 5 U V - V i s i b l e s p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r i z a t i o n 2 0 5 E P R s p e c t r a o f H 9 3 K 2 0 5 4 . 3 . 3 . p H a n d L i p i d D e p e n d e n c e o f M u t a n t s 2 0 8 4 . 3 . 4 . C y t o c h r o m e c B i n d i n g S t u d y 2 1 0 4 . 3 . 5 . P r o t o n p u m p i n g i n C O V s 2 1 7 4 . 3 . 6 . Z i n c I n h i b i t i o n S t u d y i n P u t a t i v e B a c k fl o w P a t h w a y 2 2 1 4 . 4 . D i s c u s s i o n - - _ 2 2 6 C h a p t e r 5 S u m m a r y a n d P e r s p e c t i v e s 2 2 9 T h e i m p o r t a n c e o f r e g u l a t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e a n d e n e r g y m e t a b o l i s m . . . . . 2 2 9 B i b l i o g r a p h y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 6 i x L I S T O F T A B L E S T a b l e 2 . 1 T h e p r o t o c o l f o r d e t e r g e n t r e m o v a l b y B i o - b e a d s . 1 1 7 T a b l e 2 . 2 V a r y i n g t h e i n t e r n a l c o n d i t i o n s t o o p t i m i z e t h e C O V s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 6 T a b l e 3 . 1 M e a s u r e m e n t o f C c O a c t i v i t y i n C O V s p r e p a r e d b y t h e B i o - b e a d m e t h o d . 1 7 3 T a b l e 3 . 2 T h e s t o i c h i o m e t r y t a b l e o f H ‘ V e ' d u r i n g t u r n o v e r s h o w i n g p r o t o n u p t a k e , p r o t o n b a c k fl o w a n d p r o t o n p u m p i n g w i t h o r w i t h o u t z i n c - 1 7 7 T a b l e 4 . 1 E q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s , K n , f o r t h e b i n d i n g o f h o r s e C c t o t h e h i g h a f f i n i t y s i t e o n R . s p h a e r o i d e s c y t o c h r o m e c o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 8 T a b l e 4 . 2 E f f e c t o f z i n c o n t h e t u r n o v e r a c t i v i t y o f C O V s p r e p a r e d b y t h e B i o - b e a d m e t h o d . 2 2 5 L I S T O F F I G U R E S F i g u r e 1 . 1 T h e r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x 2 F i g u r e 1 . 2 C o m p a r i s o n b e t w e e n b o v i n e h e a r t 0 : 0 a n d R . s p h a e r o i d e s ( R s ) 0 . 0 b a s e d o n t h e X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e s . 5 F i g u r e 1 . 3 B u i l d i n g - u p a p o t e n t i a l g r a d i e n t a c r o s s t h e m e m b r a n e i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e 1 2 F i g u r e 1 . 4 C y t o c h r o m e c o x i d a t i o n a n d p r o t o n p u m p i n g w i t h C 0 0 v e s i c l e s . 1 5 F i g u r e l . 5 S u p e r p o s i t i o n o f c r y s t a l s t r u c t u r e s h o w i n g c o n s e r v e d d e t e r g e n t / l i p i d b i n d i n g s i t e f o u n d i n o x i d a s e . 2 5 F i g u r e 1 . 6 T h e e l e c t r o n t r a n s f e r p a t h w a y w i t h i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e . . . . . . . . . 2 7 F i g u r e 1 . 7 T h e c a t a l y t i c c y c l e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e d u r i n g t u r n o v e r . . . . . . . . . . 3 3 F i g u r e 1 . 8 T h e a c t i v e b i n u c l e a r s i t e s t r u c t u r e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . . . . . . . . . . . . 3 7 F i g u r e 1 . 9 I n t r a c o m p l e x e l e c t r o n t r a n s f e r i n C c O u s i n g a R u - 3 9 d e r i v a t i v e o f c y t o c h r o m e c . 4 1 F i g u r e 1 . 1 0 T h e D a n d K p r o t o n u p t a k e p a t h w a y s i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e . 6 2 F i g u r e 1 . 1 1 S c h e m a t i c d i a g r a m f o r t h e f u n c t i o n a l r e a s s e m b l y o f m e m b r a n e p r o t e i n i n t o l i p o s o m e s w i t h d i f f e r e n t s t r a t e g i e s . 6 7 F i g u r e 1 . 1 2 T h e r e s o l v e d w a t e r s i n t h e o x i d a s e D - p a t h s t r u c t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 2 F i g u r e 1 . 1 3 T h e K - p a t h w a y a n d i m p o r t a n t r e s i d u e s 8 8 F i g u r e 2 . 1 M o d e l o f l i p o s o m e f o r m a t i o n a n d r e c o n s t i t u t i o n w i t h m e m b r a n e p r o t e i n s . 1 0 1 F i g u r e 2 . 2 C y t o c h r o m e c d e p e n d e n c e o f a c t i v i t y a n d R C R ( R e s p i r a t o r y C o n t r o l R a t i o ) i n t h e s t e a d y - s t a t e c o n d i t i o n . 1 0 7 x i F i g u r e 2 . 3 A n e w m e t h o d f o r r e c o n s t i t u t i o n o f C c O i n t o v e s i c l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 8 F i g u r e 2 . 4 S t r u c t u r e s a n d a b s o r p t i o n s p e c t r a o f p H p r o b e s , p h e n o l r e d a n d p y r a n i n e . 1 2 3 F i g u r e 2 . 5 M e a s u r e m e n t o f t h e r e s i d u a l p y r a n i n e o n t h e o u t s i d e s u r f a c e o f t h e C O V s . 1 2 6 F i g u r e 2 . 6 T h e u s e o f p H p r o b e s a n d i s o s b e s t i c p o i n t s o f c y t o c h r o m e c . . . . . . . . 1 2 7 F i g u r e 2 . 7 M e m b r a n e p o t e n t i a l m e a s u r e m e n t s w i t h t h e w i l d t y p e C O V s . . . . . 1 3 1 F i g u r e 2 . 8 S c h e m e o f A p p l i e d P h o t o p h y s i c s s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t . . . . . . . . . . 1 3 5 F i g u r e 2 . 9 I n i t i a l m e a s u r e m e n t s o f C O V s m a d e u s i n g t h e c h o l a t e - d i a l y s i s m e t h o d . 1 3 6 F i g u r e 2 . 1 0 S c h e m e o f O l i s s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t . 1 3 9 F i g u r e 2 . 1 1 I n i t i a l m e a s u r e m e n t s o f C O V s m a d e w i t h t h e c h o l a t e - d i a l y s i s m e t h o d i n t h e a b s o r b a n c e m o d e o f t h e O l i s s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 F i g u r e 2 . 1 2 S i z e e s t i m a t i o n o f C o v e 1 4 1 F i g u r e 2 . 1 3 T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M ) o f r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e v e s i c l e s ( C O V s ) b y a c h o l a t e - d i a l y s i s m e t h o d . . . . . . 1 4 6 F i g u r e 2 . 1 4 T E M o f r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e v e s i c l e s ( C O V s ) b y t h e B i o - b e a d m e t h o d . 1 4 7 F i g u r e 2 . 1 5 S i z e d i s t r i b u t i o n h i s t o g r a m o b t a i n e d f r o m T E M o f C O V s . . . . . . . . . 1 4 8 F i g u r e 2 . 1 6 F r e e z e - f r a c t u r e e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e o x i d a s e v e s i c l e s w h i c h a r e m a d e b y t h e c h o l a t e d i a l y s i s m e t h o d . . . . . . . . . . . . . 1 5 0 F i g u r e 2 . 1 7 A m e a s u r e m e n t o f t h e p e r m e a b i l i t y o f C O V s a n d c a l i b r a t i o n o f a b s o r b a n c e c h a n g e s . 1 5 2 F i g u r e 2 . 1 8 P r o t o n p u m p i n g o n t h e o u t s i d e o f C O V s . 1 5 7 x i i F i g u r e 2 . 1 9 A c o m p a r i s o n o f p r o t o n u p t a k e i n C O V s e i t h e r m a d e b y t h e c h o l a t e - d i a l y s i s m e t h o d ( A ) , o r b y t h e B i o - b e a d m e t h o d , ( B ) . 1 5 8 F i g u r e 2 . 2 0 C o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t a b s o r b a n c e c h a n g e s o f p y r a n i n e m e a s u r e d f r o m t h e i n s i d e o f B i o - b e a d C O V s w i t h e n t r a p p e d p y r a n i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 0 F i g u r e 2 . 2 1 C o n d u c t i v i t y m e a s u r e m e n t s w i t h a t h r e e - b u f f e r s y s t e m ; M E S , H E P E S a n d C H E S b u f f e r f o r u s e w i t h C O V s o v e r a r a n g e o f p H . . . . . . . . . . 1 6 1 F i g u r e 2 . 2 2 p H d e p e n d e n t a c t i v i t y a n d m e a s u r e m e n t o f t h e R C R w i t h B i o b e a d C O V s ( A , B ) o r c h o l a t e - d i a l y s i s C O V s ( C D ) . 1 6 2 F i g u r e 3 . 1 D a t a p r o c e s s i n g f o r z e r o t i m e s t a r i n g a b s o r b a n c e p o i n t s . . . . . . . . . . . . . . 1 7 0 F i g u r e 3 . 2 A p r o c e s s e d d a t a s e t w i t h t h e a r t i f a c t s e l i m i n a t e d f r o m t h e s i g n a l s b y u s i n g a c o r r e l a t i o n p l o t 1 7 2 F i g u r e 3 . 3 S e m i - q u a n t i t a t i v e a n a l y s e s o f d a t a f r o m t h e O l i s - r s m s t o p p e d - fl o w m e a s u r e m e n t s 1 7 6 F i g u r e 3 . 4 C o r r e l a t i o n o f t h e c o n t r o l l e d s t a t e p r o t o n m o v e m e n t s f r o m t h e i n s i d e a n d o u t s i d e o f C O V s w i t h p y r a n i n e ( t o p p a n e l ) o r p h e n o l r e d ( b o t t o m p a n e l ) . 1 8 0 F i g u r e 3 . 5 T h e e f f e c t o f z i n c b i n d i n g o n t h e o u t s i d e o f C O V s . 1 8 3 F i g u r e 3 . 6 T h e i n h i b i t i o n o f p r o t o n u p t a k e b y t h e D 1 3 2 A m u t a t i o n a l l o w s t h e b a c k fl o w o f p r o t o n s t o c o n t r i b u t e s i g n i f i c a n t l y t o t h e o b s e r v e d r a t e u n d e r c o n t r o l l e d c o n d i t i o n s . 1 8 5 F i g u r e 3 . 7 T h e r e s c u e d a c t i v i t y o f D 1 3 2 A b y a d d i t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d . . . 1 8 9 F i g u r e 3 . 8 Q u a n t i f i c a t i o n p r o c e s s 1 9 3 F i g u r e 3 . 9 K i n e t i c m o d e l f o r p r o t o n p u m p i n g i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e . 1 9 4 F i g u r e 4 . 1 . C o m p a r i s o n b e t w e e n t h e p r o p o s e d H - p a t h w a y r e s i d u e s c l o s e t o h e m e a i n t h e m a m m a l i a n C c O , v e r s u s R c h O 1 9 7 x i i i F i g u r e 4 . 2 . L o c a t i o n o f H 9 3 a n d i t s n e i g h b o r r e s i d u e s . 1 9 9 F i g u r e 4 . 3 . T h e b i n d i n g e f f e c t o f C c o n t o t h e C c O . 2 0 1 F i g u r e 4 . 4 . C o n s t r u c t i o n o f e x p r e s s i o n p l a s m i d o f H 9 3 K . 2 0 3 F i g u r e 4 . 5 . A n S D S - P A G E g e l o f a l l o f t h e s u b u n i t s o f C c O 2 0 4 F i g u r e 4 . 6 . U V - V i s i b l e s p e c t r a o f w i l d t y p e a n d H 9 3 K . 2 0 6 F i g u r e 4 . 7 . E P R s p e c t r a o f p u r i f i e d w i l d t y p e ( b l a c k l i n e ) , a n d H 9 3 K ( r e d l i n e ) R . s p h a e r o i d e s C c O . 2 0 7 fi g u r e 4 . 8 . E f f e c t o f p H a n d l i p i d a d d i t i o n o n t h e c a t a l y t i c a c t i v i t y o f t h e f r e e e n z y m e . 2 0 9 F i g u r e 4 . 9 . E f f e c t o f p H o n o x y g e n c o n s u m p t i o n a c t i v i t y a n d R C R o f C c O , r e c o n s t i t u t e d i n t h e v e s i c l e s u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s . 2 1 1 F i g u r e 4 . 1 0 . M o d e l f o r t h e h i g h a f f i n i t y c o m p l e x b e t w e e n h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c a n d b o v i n e 0 : 0 . 2 1 2 F i g u r e 4 . 1 1 . A n a l i t i c a l U l t r a c e n t r i f u g a t i o n m e a s u r e m e n t s o f t h e b i n d i n g a f f i n i t y o f h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c b i n d i n g t o w i l d t y p e 0 : 0 . 2 1 4 F i g u r e 4 . 1 2 T h e c a t a l y t i c a c t i v i t y a n d p r o t o n p u m p i n g o f C O V s o f w i l d t y p e a n d H 9 3 m u t a n t s . 2 1 9 F i g u r e 4 . 1 3 M o n i t o r i n g t h e p r o t o n m o v e m e n t i n H 9 3 K C O V s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 2 F i g u r e 4 . 1 4 M o n i t o r i n g t h e p r o t o n m o v e m e n t i n H 9 3 N / E 1 8 2 A C O V s . . . . . . . . . 2 2 4 F i g u r e 5 . 1 M a p o f t h e h u m a n m i t o c h o n d r i a l g e n o m e . 2 3 1 F i g u r e 5 . 2 E l e c t r o n t r a n s p o r t c h a i n c o m p l e x , a n d p r o t o n c o u p l i n g a n d u n c o u p l i n g . 2 3 2 " I m a g e s i n t h i s d i s s e r t a t i o n a r e p r e s e n t e d i n c o l o r " x i v A a B S A C C C P C d ) C M C C O V s D P X F P L C D i S C 3 ( 5 ) D E A E E P R F C C P F I ' I R H ” I e ' H E P E S H i s - t a g L U V M D L I S T O F A B B R E V I A T I O N S A r a c h i d o n l c a c i d b o v i n e s e r u m a l b u m i n C a r b o n y l c y a n i d e 3 - c h l o r o p h e n y l h y d r a z o n e C y t o c h r o m e c O x i d a s e c r i t i c a l m i c e l l e c o n c e n t r a t i o n C y t o c h r o m e O x i d a s e V e s i c l e s p - X y l e n e - b i s ( N - p y r i d i n i u m b r o m i d e ) f a s t p r o t e i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y 3 ’ , 3 ’ - d i p r o p h l t h i a d i c a r b o c y a n i n e d i e t h y l a m l n o e h t y l e l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e C a r b o n y l c y a n i d e 4 - ( t r i f l u o r o m e t h o x y ) - p h e n y l h y d r a z o n e F o u r i e r t r a n s f o r m i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y r a t i o o f p r o t o n s p u m p e d p e r e l e c t r o n t r a n s f e r r e d f r o m c y t o c h r o m e c i n t o c y t o c h r o m e o x i d a s e 4 - ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) - 1 - p i p e r a z i n e - e t h a n e s u l f o n i c a c i d h i s t i d i n e s t h a t a r e g e n e t i c a l l y a t t a c h e d t o a n e n z y m e t o a l l o w p u r i f i c a t i o n b y a n i c k e l a f f i n i t y c o l u m n e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t l a r g e u n i l a m e l l a r v e s i c l e s m o l e c u l a r d y n a m i c s X V P h e n o l R e d P y r a n i n e R C R R . s p ( o r R s ) R O S S D S S U V S V D T E M T r i s T M P D A p H A ‘ P p h e n o l s u l f o p h t h a l e i n 8 - H y d r o x y p y r e n e - 1 , 3 , 6 - t r i f u l f o n i c a c i d r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o R h o d o b a c f e r s p h a e r o i d e s r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e s m a l l u n i l a m e l l a r v e s i c l e s s i n g l u l a r v a l u e d e c o m p o s i t i o n t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y T r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e N , N , N ’ , N ’ - t e t r a m e t h y l - p - p h e n y l e n e d i a m i n e t r a n s m e m b r a n e p H g r a d i e n t t r a n s m e m b r a n e e l e c t r i c a l g r a d i e n t C h a p t e r 1 B a c k g r o u n d o n c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( L i t e r a t u r e R e v i e w ) 1 . 1 . E n e r g y T r a n s d u c t i o n a n d C y t o c h r o m e c O x i d a s e A e r o b i c o r g a n i s m s o b t a i n e n e r g y f r o m t h e i r e n v i r o n m e n t b y e x t r a c t i n g e l e c t r o n s d e r i v e d f r o m m a n y f o o d s o u r c e s b y t h e o x i d a t i o n o f p r o t e i n , c a r b o h y d r a t e a n d f a t . R e d u c e d s u b s t r a t e s , s u c h a s N A D H o r s u c c i n a t e , d o n a t e e l e c t r o n s t o t h e r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x e s w h i c h a r e m e t a l l o p r o t e i n s e m b e d d e d i n a m i t o c h o n d r i a l o r b a c t e r i a l m e m b r a n e . I n m o s t a e r o b i c s y s t e m s , t h e fi n a l a c c e p t o r o f e l e c t r o n s i n t h e r e s p i r a t o r y c h a i n i s a n o x y g e n m o l e c u l e , w h i c h i s r e d u c e d t o w a t e r b y t h e a d d i t i o n o f f o u r e l e c t r o n s a n d f o u r p r o t o n s , p r o v i d i n g a l a r g e r e d o x p o t e n t i a l d r o p a n d m a x i m i z i n g t h e f r e e e n e r g y . M u c h o f t h e f r e e e n e r g y r e l e a s e d i n t h e r e d u c t i o n o f 0 2 t o w a t e r i s c o n v e r t e d i n t o a n e l e c t r o c h e m i c a l p r o t o n g r a d i e n t a c r o s s t h e m e m b r a n e w h i c h i s u s e d f o r A T P s y n t h e s i s b y t h e A T P s y n t h a s e ( H o s l e r e r a l . , 2 0 0 6 ) ( F i g u r e l . 1 ) . C y t o c h r o m e c o x i d a s e ( C c O ) i s t h e t e r m i n a l e n z y m e o f t h e r e s p i r a t o r y c h a i n , w h i c h c a t a l y z e s t h e r e d u c t i o n o f o x y g e n t o w a t e r a n d p u m p s p r o t o n s a c r o s s t h e m e m b r a n e , c o n t r i b u t i n g t o t h e e l e c t r o c h e m i c a l p o t e n t i a l g r a d i e n t . T h e r e s p i r a t o r y s y s t e m c a n b e “ u n c o u p l e d ” ; t h a t i s , t h e e l e c t r o n t r a n s f e r p r o c e s s c a n p r o c e e d w i t h o u t r e s u l t i n g i n n e t p r o t o n p u m p i n g o r A T P s y n t h e s i s , e i t h e r b e c a u s e t h e p u m p e d p r o t o n s a r e l e a k e d b a c k a c r o s s t h e m e m b r a n e b y p r o t o n o p h o r e s o r b y u n c o u p l i n g p r o t e i n s t h a t d i s s i p a t e A u H + , l e a d i n g t o t h e p r o d u c t i o n o f h e a t . C y t o c h r o m e c o x i d a s e i t s e l f a l s o a p p e a r s t o h a v e a n i n t r i n s i c u n c o u p l i n g m e c h a n i s m t h a t m a y c o n t r i b u t e t o t h e c o n t r o l o f t h e e f fi c i e n c y o f i t s e n e r g y c o u p l i n g i n r e s p o n s e t o t h e b u i l d u p a m e m b r a n e p o t e n t i a l ( M i l l s e t a l . , 2 0 0 2 ) . C y t o c h r o m e c ‘ _ _ ‘ _ ‘ - _ l " _ | . * _ _ _ \ _ 2 H ” + H ’ S u c c i n a t e F u m a r a t e Z H I + 2 H + C g p i g ; I V m i l — l C m x I l l C y t o I Z h r o m e D e h N A D H Q M C y t o c h r o m e b c 1 c O x i d a s e y d r o g o n a s e S u c c i n a t e C o m p l e x A T P S y n t h a s e D e h y d r o g e n a s e F i g u r e 1 . 1 T h e r e s p i r a t o r y c h a i n c o m p l e x . C o m p l e x I o r N A D H d e h y d r o g e n a s e , ( P D B : 1 P P 9 ) ; c o m p l e x I I o r s u c c i n a t e d e h y d r o g e n a s e ( l N E N ) ; c o m p l e x I I I , c y t o c h r o m e b e ] ( 1 P P 9 ) a n d c o m p l e x I V , c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( 1 V 5 4 ) . S u c c i n a t e d e h y d r o g e n a s e m e d i a t e s e l e c t r o n t r a n s f e r t h r o u g h c o e n z y m e Q t o t h e c y t o c h r o m e b e ] c o m p l e x . A n e l e c t r o n i s t r a n s f e r r e d t o c y t o c h r o m e c ( l H R C ) a n d m o v e s t o t h e fi n a l e l e c t r o n a c c e p t o r , c y t o c h r o m e c o x i d a s e t o r e d u c e 0 2 t o w a t e r . M o s t o f t h e f r e e e n e r g y i n t h i s p r o c e s s i s c o n v e r t e d t o p r o d u c e a p r o t o n g r a d i e n t w h i c h i s u s e d b y A T P s y n t h a s e , c o m p l e x V ( l Q O l ) f o r t h e s y n t h e s i s o f A T P . T h e r e i s n o a v a i l a b l e c r y s t a l s t r u c t u r e a s y e t f o r c o m p l e x I ( N A D H d e h y d r o g e n a s e ) , a l t h o u g h t h e F e / S c e n t e r s h a v e b e e n d e fi n e d . T h e fi g u r e i s f r o m D r . H o s l e r e t a l . ( H o s l e r e t a l . , 2 0 0 6 ) . 1 . 1 . 1 . O v e r a l l S t u c t u r e o f t h e C y t o c h r o m e c O x i d a s e 1 . 1 . 1 . 1 . X - r a y C r y s t a l S t r u c t u r e o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e H i g h r e s o l u t i o n X - r a y c r y s t a l l o g r a p h i c s t r u c t u r e s o f C c O h a v e b e e n o b t a i n e d . T h e y r e v e a l d i s t i n c t p r o t o n c o n d u c t i n g p a t h w a y s ( I w a t a e t a l . , 1 9 9 5 ; S v e n s s o n - E k e t a l . , 2 0 0 2 ; T s u k i h a r a e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e D — a n d K — p a t h w a y s w e r e n a m e d a f t e r t w o w e l l - c o n s e r v e d k e y r e s i d u e s , D 1 3 2 a n d K 3 6 2 ( R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s n u m b e r i n g ) , r e s p e c t i v e l y , i n t h e p r o t o n u p t a k e p a t h w a y s . E v e n w i t h t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s , t h e r e a r e s t i l l u n s o l v e d q u e s t i o n s a b o u t t h e r o l e s o f t h e c h a n n e l s i n t e r m s o f t h e n u m b e r a n d d e s t i n a t i o n o f p r o t o n s a n d h o w t h e p r o t o n u p t a k e e v e n t s a r e c o u p l e d t o e l e c t r o n t r a n s f e r . T h e s t r u c t u r e d e t e r m i n a t i o n o f a m e c h a n i s t i c a l l y c o m p l e x e n z y m e l i k e C c O i s i m p o r t a n t f o r u n d e r s t a n d i n g i t s f u n c t i o n . H o w e v e r , o n l y t h e c o m b i n e d i n v e s t i g a t i o n o f t h e s t r u c t u r a l d a t a a n d m e c h a n i s t i c s t u d i e s , u s i n g t i m e - r e s o l v e d t e c h n i q u e s , c a n s o l v e t h e p r o t o n p u m p i n g m e c h a n i s m ( S v e n s s o n - E k e t a l . , 2 0 0 2 ) . 1 . 1 . 1 . 2 . C a t a l y t i c C o r e S u b u n i t s a n d F u n c t i o n T h e m i t o c h o n d r i a l C c O h a s 1 3 s u b u n i t s , w h e r e a s t h e b a c t e r i a l C c O h a s f o u r s u b u n i t s ( F i g u r e 1 . 2 ) . T h e 3 l a r g e s t c o r e s u b u n i t s ( I , I I , a n d I I I ) a r e e n c o d e d b y t h e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e a n d a r e h i g h l y h o m o l o g o u s t o t h e c o r e s u b u n i t s o f t h e b a c t e r i a l C c O w h i c h h a v e h i g h a m i n o a c i d s e q u e n c e a n d s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y t o t h e m a m m a l i a n 3 o x i d a s e . T h e s t r u c t u r e o f C c O h a s b e e n w e l l c h a r a c t e r i z e d s p e c t r o s c o p i c a l l y a n d c r y s t a l l o g r a p h i c a l l y i n c l u d i n g i t s f o u r r e d o x - a c t i v e c o f a c t o r s , w h i c h a r e l o c a t e d i n s u b u n i t I a n d I I : h e m e a a n d a 3 , a n d a t y p e I I c o p p e r ( C u B ) a r e p l a c e d i n s u b u n i t 1 , w h e r e a s a d i n u c l e a r c o p p e r c e n t e r ( C u A ) i s f o u n d i n s u b u n i t I I . A l o n g w i t h t h e s e r e d o x a c t i v e c o f a c t o r s , n o n - r e d o x a c t i v e m e t a l s , M g 2 + a n d C a 2 + / N a 2 + , a r e a l s o f o u n d i n t h e s t r u c t u r e ( F e r g u s o n — M i l l e r a n d B a b c o c k , 1 9 9 6 ; G e n n i s a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 9 5 ; H o s l e r e t a l . , 1 9 9 5 ; T s u k i h a r a e t a l . , 1 9 9 6 ) . S u b u n i t I I I i s a h i g h l y h y d r o p h o b i c m e m b r a n e p r o t e i n w i t h 7 h e l i c e s . U n l i k e t h e t w o o t h e r c o r e s u b u n i t s ( I & I I ) , i t d o e s n o t c o n t a i n a n y r e d o x c e n t e r s . T h e f u n c t i o n o f s u b u n i t I I I i s n o t e n t i r e l y c e r t a i n ; h o w e v e r , t h e r e i s e v i d e n c e t h a t s u b u n i t 1 1 1 m a y h a v e a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e p r o t o n p u m p i n g o f C c O ( P r o c h a s k a a n d F i n k , 1 9 8 7 ) . E v e n w i t h o u t s u b u n i t I I I , t h e t w o - s u b u n i t o x i d a s e i s a s a c t i v e a s w i l d t y p e , b u t w i t h a g e n e r a l l y l o w e r H i / e ' s t o i c h i o m e t r y ( H a l t i a e t a l . , 1 9 9 1 ) a n d w i t h s p o n t a n e o u s a n d i r r e v e r s i b l e s u i c i d e i n a c t i v a t i o n a f t e r m u l t i p l e c a t a l y t i c t u r n o v e r s d u r i n g O 2 r e d u c t i o n ( M i l l s a n d H o s l e r , 2 0 0 5 ) . T h i s s u i c i d e i n a c t i v a t i o n h a s b e e n a t t r i b u t e d t o o x y g e n r a d i c a l d a m a g e l e a d i n g t o l o s s o f a l i g a n d o f C u ] ; t h a t n o r m a l l y h e l p s t o m a i n t a i n t h e s t r u c t u r a l i n t e g r i t y o f t h e a c t i v e s i t e ( B r a t t o n e t a l . , 1 9 9 9 ) . . ‘ . . . a , ' . fl - e ' ‘ . 1 ‘ , \ \ D ‘ x / . - / % R . s p h a e r o i d e s C c O ( P D B : 1 M 5 6 ) B o v i n e h e a r t C c O ( P D B : 1 V 5 4 ) ‘ a o r . » t . « 2 ' W F i g u r e 1 . 2 C o m p a r i s o n b e t w e e n b o v i n e h e a r t 0 : 0 a n d R s p h a e r o i d e s ( R s ) C c O b a s e d o n t h e X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e s . B o v i n e h e a r t C c O c o n t a i n s a t o t a l o f 1 3 s u b u n i t s , i n c l u d i n g t h e m i t o c h o n d r i a l e n c o d e d c a t a l y t i c c o r e s u b u n i t s ( 1 , 1 1 , a n d I I I ) . B a c t e r i a l C c O f r o m R . s p h a e r 0 i d e s o n l y c o n t a i n s 4 s u b u n i t s . B o t h s t r u c t u r e s h a v e t h e s a m e r e d o x a c t i v e m e t a l c e n t e r s ( d i n u c l e a r C u A i n s u b u n i t I I , a n d h e m e a F e , a 3 F e a n d C u B i n s u b u n i t 1 ) , a s w e l l a s t h e n o n - r e d o x a c t i v e c e n t e r s o f M g 2 + , N a + ( b o v i n e ) o r C a 2 + ( R . s p ) . T h e t h r e e c a t a l y t i c c o r e s u b u n i t s a r e h i g h l y c o n s e r v e d b e t w e e n t h e b a c t e r i a l a n d m a m m a l i a n o x i d a s e s . ( T h e fi g u r e i s f r o m D r . L i n g Q i n , u n p u b l i s h e d ) T i m e r e s o l v e d s p e c t r o s c o p i c s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t e l e c t r o n s f r o m s o l u b l e c y t o c h r o m e c a r e d e l i v e r e d fi r s t t o t h e e l e c t r o n a c c e p t o r , C u A i n s u b u n i t H , w h i c h i s p l a c e d a t t h e i n t e r f a c e b e t w e e n t h e e x t e r n a l a q u e o u s P - s i d e a n d t h e m e m b r a n e . S u b s e q u e n t l y , e l e c t r o n s m o v e t o t h e s i x - c o o r d i n a t e h e m e a i r o n i n s u b u n i t 1 , w h i c h l i e s i n s i d e t h e m e m b r a n e , a t a d i s t a n c e c o r r e s p o n d i n g t o 1 / 3 o f t h e t o t a l m e m b r a n e d i e l e c t r i c , a n d t h e n t h e e l e c t r o n s m o v e l a t e r a l l y t o t h e h e m e a 3 / C u B a c t i v e s i t e , a l s o i n s u b u n i t 1 , w h e r e 0 2 i s r e d u c e d t o w a t e r . R h o d o b a c t e r ( R . ) s p h a e r o i d e s C c O i s a g o o d m o d e l f o r f u n c t i o n a l a n d m e c h a n i s t i c s t u d i e s o f t h e m a m m a l i a n C c O . T h e b a c t e r i a l C c O i s e x p e r i m e n t a l l y m o r e a m e n a b l e b e c a u s e i t c a n b e e a s i l y g r o w n a n d g e n e t i c a l l y a l t e r e d . R e m o v a l o f s u b u n i t s a n d t h e u s e o f s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s o f p r o t e i n r e s i d u e s h a v e b e e n p o w e r f u l i n s t u d y i n g t h e m e c h a n i s m o f p r o t o n p u m p i n g a n d s i t e s o f i n h i b i t i o n . U s i n g s u b s t i t u t i o n o f t h e c o r e m e t a l s , M g 2 + t o M n 2 + , h a s a l l o w e d E P R a n a l y s i s o f t h e s u b u n i t I / I I i n t e r f a c e . S e v e r a l m u t a t i o n s i n t h e c o r e s u b u n i t s i n t h e D a n d K - p a t h w a y s h a v e b e e n m a d e i n o r d e r t o c l a r i f y t h e r o l e o f t h e s e c h a n n e l s a n d t o p r o b e t h e p r o t o n m o v e m e n t a n d h o w i t i s c o u p l e d t o e l e c t r o n t r a n s f e r . 1 . 1 . 1 . 3 . S t r u c t u r e o f t h e H e m e a 3 - C u B S i t e T h e b i n u c l e a r c e n t e r h e m e a 3 / C u B i s w h e r e t h e o x y g e n r e d u c t i o n t a k e s p l a c e i n C c O . T h e 0 - 0 b o n d c l e a v a g e i n c y t o c h r o m e o x i d a s e i s a v e r y c o m p l i c a t e d r e a c t i o n , w h i c h i s c o u p l e d t o e l e c t r o n a n d p r o t o n m o v e m e n t . T h e m e c h a n i s m o f t h i s r e a c t i o n , O — O b o n d c l e a v a g e , i s n o t c o m p l e t e l y u n d e r s t o o d . T h e e l e c t r o n d e n s i t y a t t h e b i n u c l e a r c e n t e r i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f a c o v a l e n t b o n d b e t w e e n a h i s t i d i n e i m i d a z o l e g r o u p a n d a t y r o s i n e p h e n o l g r o u p i n t h e f u l l y r e d u c e d b o v i n e C c O c r y s t a l s t r u c t u r e a t 1 . 8 A r e s o l u t i o n ( T s u k i h a r a e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h e c o v a l e n t l i n k a g e h a s a l s o b e e n o b s e r v e d i n t h e f u l l y o x i d i z e d P a r a c o c c u s C c O a t 2 . 7 A r e s o l u t i o n ( O s t e r m e i e r e t a l . , 1 9 9 7 ) a n d t h e R . s p h a e r o i d e s ( R . s p ) C c O ( Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) a n d c o n fi r m e d b y m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s e s ( B u s e e t a l . , 1 9 9 9 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h i s u n i q u e l i n k a g e b e t w e e n H i s - T y r l o w e r s t h e p K a o f t h e t y r o s i n e p h e n o l g r o u p b e l o w t h a t o f f r e e T e r H a l l o w i n g t h e d e p r o t o n a t e d f o r m o f t y r o s i n e O H e v e n a t p h y s i o l o g i c a l p H . T h i s m a k e s t h e t y r o s i n e a p o t e n t i a l e l e c t r o n a n d p r o t o n d o n o r w h i c h h a s t h e p o s s i b i l i t y o f b e c o m i n g a r a d i c a l d u r i n g c a t a l y s i s . T h e i n v o l v e m e n t o f t y r o s i n e i n t h e o x y g e n r e d u c t i o n c h e m i s t r y i s s u p p o r t e d b y a n u m b e r o f fi n d i n g s ( O s t e r m e i e r e t a l . , 1 9 9 7 ; P r o s h l y a k o v e t a l . , 2 0 0 0 ) b u t i s n o t y e t e s t a b l i s h e d . C u B h a s a d i s t o r t e d t e t r a h e d r a l c o o r d i n a t i o n w i t h t h r e e h i s t i d i n e r e s i d u e s a n d e l e c t r o n d e n s i t y t h a t h a s b e e n i n t e r p r e t e d a s a h y d r o x y l i o n ( O H ' ) ( S v e n s s o n - E k e t a l . , 2 0 0 2 ) . I n t h e b o v i n e o x i d a s e , p e r o x i d e w a s m o d e l e d a s a b r i d g e b e t w e e n t h e C u B a n d t h e F e a t o m ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 8 ) i n t h e f u l l y o x i d i z e d f o r m . T h e p o s s i b i l i t y o f o n e 7 h y d r o x y l i o n a n d o n e w a t e r , a s t h e G U I ; l i g a n d , h a s b e e n p r o p o s e d f o r t h e l i g a n d s o f t h e h e m e a 3 - C u 3 s i t e i n t h e f u l l y o x i d i z e d P . d e n i t r i fi c a n s C c O a t 2 . 7 A r e s o l u t i o n ( O s t e r m e i e r e t a l . , 1 9 9 7 ) a n d f o r t h e o x i d i z e d R . s p h a e r o i d e s C c O ( Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) . H o w e v e r , t h e e x a c t n a t u r e o f t h e b r i d g i n g a t o m s i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e h e m e a 3 - C u B s i t e r e m a i n s c o n t r o v e r s i a l a s d o e s t h e i m m e d i a t e s o u r c e o f e l e c t r o n s a n d p r o t o n s d u r i n g c a t a l y s i s . 1 . 1 . 1 . 4 . N o n - R e d o x M e t a l B i n d i n g S i t e s I n a d d i t i o n t o fi v e r e d o x a c t i v e m e t a l i o n s ( C u A b i n u c l e a r c e n t e r , C u B , h e m e a a n d a 3 ) , m a m m a l i a n C c O c o n t a i n s t i g h t l y b o u n d n o n - r e d o x m e t a l i o n s i n c l u d i n g C a 2 + / N a + , M g 2 + a n d Z n 2 + ( F e r g u s o n - M i l l e r a n d B a b c o c k , 1 9 9 6 ) . T h e r e a r e s t r u c t u r a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e b o v i n e a n d t h e b a c t e r i a l e n z y m e s i n t h i s r e s p e c t ( K i r i c h e n k o e r a l . , 1 9 9 8 ) . F o r e x a m p l e , t h e o p t i c a l s p e c t r u m o f r e d u c e d h e m e a i s r e d - s h i f t e d b y C a 2 + i n b o v i n e h e a r t m i t o c h o n d r i a l C c O ( N i c h o l l s , 1 9 7 5 ; W i k s t r o m a n d S a a r i , 1 9 7 5 ) . H o w e v e r , t h e C a 2 + i n d u c e d s h i f t i s s p e c i fi c f o r t h e m a m m a l i a n e n z y m e a n d i s n o t o b s e r v e d w i t h t h e h i g h l y h o m o l o g o u s o x i d a s e f r o m b a c t e r i a , w h e r e C a 2 + i s t i g h t l y b o u n d u n l i k e t h e m a m m a l i a n C a 2 + w h i c h c a n b e r e m o v e d w i t h E G T A a n d s u b s t i t u t e d w i t h N a " . I t h a s b e e n s h o w n t h a t N a + a n d H I c o m p e t e w i t h C a 2 + f o r b i n d i n g i n b o v i n e C c O ( K i r i c h e n k o e t a l . , 1 9 9 8 ; S a a r i e t a l . , 1 9 8 0 ) . T h e N a + i o n s h a v e b e e n r e p o r t e d t o i n h i b i t p r o t o n p u m p i n g b y C c O i n m i t o c h o n d r i a ( L a m a n d T u , 1 9 8 0 ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e C a 2 + b i n d i n g s i t e m a y b e f u n c t i o n a l l y a s s o c i a t e d w i t h t h e p r o t o n m o v e m e n t i n s u b u n i t I o f t h e 8 m a m m a l i a n C c O , e s p e c i a l l y i n t h e p r o t o n e x i t p a t h w a y ( K i r i c h e n k o e t a l . , 1 9 9 8 ) . R e v e r s i b l e b i n d i n g o f C a 2 + t o t h e b o v i n e o x i d a s e m a y b e i n v o l v e d i n p h y s i o l o g i c a l r e g u l a t i o n o f r e s p i r a t i o n a n d e n e r g y t r a n s d u c t i o n . H o w e v e r , n e i t h e r t h e l i g a n d b i n d i n g n o r c h a n g e s i n t h e o x i d a t i o n s t a t e s i n d u c e d a n y d e t e c t a b l e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n t h e N a I / C a z ” i n b o v i n e C c O ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 8 ) . I t i s a l s o u n l i k e l y t h a t C c O u n d e r g o e s l a r g e s c a l e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s d u e t o C a 2 + b i n d i n g i n b a c t e r i a l C c O ( L e e e t a l . , 2 0 0 2 ) . A n o n - r e d o x a c t i v e M g 2 + i o n l i e s a t t h e b o t t o m o f a p r o p o s e d w a t e r c h a n n e l , 1 2 A f r o m t h e s u r f a c e , b r i d g i n g s u b u n i t I a n d I I o f C c O . T h e n a t u r a l M g 2 + s i t e c a n b e s u b s t i t u t e d f o r M n 2 + f o r E P R s t u d i e s a n d i s s i t u a t e d a b o v e t h e h e m e s w h e r e t h e r e i s a h y d r o g e n - b o n d e d n e t w o r k o f w a t e r . T i m e - r e s o l v e d w a t e r m o v e m e n t w a s m o n i t o r e d b y t h e i n t r o d u c t i o n o f D 2 0 , o r a n o x y g e n i s o t o p e ” O , w i t h t h e M n 2 + s u b s t i t u t e d e n z y m e i n s t o p p e d - fl o w , f r e e z e q u e n c h , a n d E P R e x p e r i m e n t s ( S c h m i d t e t a l . , 2 0 0 3 ) . U s i n g 1 7 0 2 f o r f o r m a t i o n o f H 2 1 7 0 a t t h e a c t i v e s i t e , i t w a s s e e n b o u n d t o t h e M g / M n s i t e d u r i n g t h e b r i e f t u r n o v e r b e f o r e f r e e z i n g , s u g g e s t i n g a s p e c i fi c e x i t p a t h w a y f o r p r o d u c t w a t e r c l o s e t o M g . U s i n g D 2 0 , a d d e d e x t e r n a l l y , t h e m a x i m a l p r o t o n / d e u t e r i u m e x c h a n g e a t t h e M n 2 + s i t e o c c u r e d i n l e s s t h a n 1 1 . 4 m s a t r o o m t e m p e r a t u r e s u g g e s t i n g r a p i d e q u i l i b r i u m b e t w e e n t h e M n s i t e a n d t h e b u l k s o l v e n t ( F l o r e n s e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t 2 . . . . . t h e a n I I M g + s r t e 1 S i n v o l v e d i n p r o t o n a n d / o r w a t e r m o v e m e n t d u r i n g t u r n o v e r . . 2 . . B e c a u s e o f t h e c o m p l e x h y d r o g e n - b o n d i n g n e t w o r k o f w a t e r s a r o u n d M n + , i t i s u n c l e a r w h e r e e x a c t l y w a t e r o r p r o t o n s a r e m o v i n g . T h e b i n d i n g o f m e t a l s , s u c h a s a n , t o C c O i s i n t e r e s t i n g b e c a u s e t h e y i n h i b i t p r o t o n m o v e m e n t i n m a n y p r o t o n - d e p e n d e n t s y s t e m s ( C h e m y a n d D e C o u r s e y , 1 9 9 9 ) . M e t a l i n h i b i t i o n w a s r i g o r o u s l y s t u d i e d i n v o l t a g e - g a t e d p r o t o n c h a n n e l s ( C h e m y a n d D e C o u r s e y , 1 9 9 9 ; D e C o u r s e y , 2 0 0 3 ) . I n C c O , p r o t o n u p t a k e i s i n h i b i t e d b y m i c r o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f Z n 2 + o r C d 2 + ( A a g a a r d e t a l . , 2 0 0 2 ; M i l l s e t a l . , 2 0 0 2 ) . H i s t i d i n e a n d c a r b o x y l a t e r e s i d u e s o r w a t e r s a c t a s m e t a l c o o r d i n a t i n g g r o u p s i n m o s t c a s e s , w h e r e s i t e s h a v e b e e n d e fi n e d f r o m Z n 2 + i n h i b i t i o n . T h e s p e c i fi c m e t a l b i n d i n g s i t e i s n o t e a s i l y d e t e r m i n e d u n l e s s m u l t i - w a v e l e n g t h a n o m a l o u s d i f f r a c t i o n ( M A D ) i s u s e d i n X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y . H e a v i e r a t o m s s u c h a s C d 2 + c a n g i v e s i g n i fi c a n t a n o m a l o u s s c a t t e r i n g . . . . . . 2 f r o m i n c o m i n g X - r a y s a t t h e p a r t i c u l a r w a v e l e n g t h u s e d f o r t h e d i f f r a c t i o n . S i n c e Z n + o r C d 2 + i n h i b i t s C c O a c t i v i t y b o t h i n t h e p u r i fi e d d e t e r g e n t s o l u b i l i z e d s t a t e a n d i n r e c o n s t i t u t e d v e s i c l e s u n d e r s t e a d y s t a t e t u r n o v e r ( M i l l s e t a l . , 2 0 0 2 ) , t h r e e p o s s i b l e i n h i b i t o r y m e t a l b i n d i n g s i t e s i n R . s p h a e r o i d e s C c O n e e d t o b e c o n s i d e r e d : t w o s i t e s a r e o n t h e i n n e r s u r f a c e f o r p r o t o n u p t a k e ( D a n d K p a t h s ) a s w e l l a s o n e o n t h e o u t e r s u r f a c e ( t h e e x i t / b a c k fl o w p a t h ) ( H o s l e r e t a l . , 2 0 0 6 ) . Z i n c b i n d i n g a t t h e e n t r a n c e t o t h e D - p a t h w a y h a s b e e n s u g g e s t e d , b a s e d o n a k i n e t i c s t u d y ( A a g a a r d e t a l . , 2 0 0 2 ) a s w e l l a s E X A F S ( E x t e n d e d X - r a y a b s o r p t i o n fi n e s t r u c t u r e ) a n a l y s i s ( F r a n c i a e t a l . , 2 0 0 7 ) . A c a d m i u m b i n d i n g s i t e w a s c l e a r l y i d e n t i fi e d a t t h e e n t r a n c e o f t h e K - p a t h w a y i n v o l v i n g s i d e c h a i n a t o m s o f E 1 0 1 1 1 a n d H 9 6 1 1 i n s u b u n i t I I , w h i c h w a s o b s e r v e d i n t w o s u b u n i t 1 0 i s o t r o p i c c r y s t a l s ( 2 . 0 A ) o f R . s p h a r 0 i d e s C c O ( Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h i s p o s i t i o n a t t h e b o t t o m o f s u b u n i t H h a s b e e n p r e v i o u s l y s u g g e s t e d a s t h e e n t r y p o i n t f o r t h e K - p a t h w a y ( B r a n d e n e t a l . , 2 0 0 2 ) . O t h e r s t r u c t u r e s o f t h e b o v i n e C c O ( F r a n c i a e t a l . , 2 0 0 7 ) s h o w Z n 2 + b i n d i n g a t t h e e n t r a n c e o f t h e D - p a t h w a y , a s p r e d i c t e d . H o w e v e r , s o f a r t h e r e h a s n o t b e e n a s i t e d e fi n e d o n t h e o u t s i d e s u r f a c e t h a t i s a l i k e l y c a n d i d a t e f o r t h e e x i t / b a c k fl o w p a t h w a y . 1 . 1 . 2 . T h e R o l e o f t h e C y t o c h r o m e c O x i d a s e C y t o c h r o m e c o x i d a s e ( C 0 0 ) i s t h e t e r m i n a l e n z y m e o f t h e r e s p i r a t o r y c h a i n i n m i t o c h o n d r i a l a n d m a n y b a c t e r i a l c e l l m e m b r a n e s . I t u s e s t h e e n e r g y f r o m t h e e x e r g o n i c r e d u c t i o n o f o x y g e n t o p u m p p r o t o n s a c r o s s t h e c y t o p l a s m i c o r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e . E l e c t r o n s a r e d e l i v e r e d f r o m t h e P - s i d e ( p e r i p l a s m i c o r p o s i t i v e ) o f t h e m e m b r a n e v i a t h e c y t o c h r o m e c , w i t h c o u p l e d p r o t o n u p t a k e f r o m t h e N - s i d e ( c y t o p l a s m i c o r n e g a t i v e s i d e ) o f t h e m e m b r a n e , p r o d u c i n g a c h a r g e s e p a r a t i o n a c r o s s t h e m e m b r a n e ( F i g u r e 1 . 3 ) . T h e a d d i t i o n a l t r a n s l o c a t i o n o f p r o t o n s a c r o s s t h e m e m b r a n e , a g a i n s t t h e e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t , a u g m e n t s t h e t r a n s m e m b r a n e p r o t o n g r a d i e n t , w h i c h i s u s e d f o r t h e s y n t h e s i s o f A T P b y t h e m e m b r a n e p r o t e i n A T P s y n t h a s e ( G a r c i a - H o r s m a n e t a l . , 1 9 9 4 ) . l l C y t o c h r o m e C 4 9 ' 4 H 2 . . . 4 R e l a t i v e l y P o s i t i v e 4 e ‘ + 4 H + ( i n ) + 0 2 + 4 H + — + 2 H 2 0 + 4 H + ( i n ) ( o u t ) 4 R e l a t i v e l y N e g a t i v e 8 H + ( i n ) C y t o c h r o m e c o x i d a s e F i g u r e 1 . 3 B u i l d i n g - u p a p o t e n t i a l g r a d i e n t a c r o s s t h e m e m b r a n e i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e A p o t e n t i a l g r a d i e n t w i l l b e m a d e i n t h r e e w a y s d u r i n g t h e o x y g e n c h e m i s t r y . E l e c t r o n s a r e c o n s u m e d f r o m t h e o u t s i d e ( P - s i d e ) o f t h e m e m b r a n e v i a c y t o c h r o m e c , w i t h p r o t o n c o n s u m p t i o n f r o m t h e i n s i d e ( N - s i d e ) o f t h e m e m b r a n e . T h e a d d i t i o n a l p r r o t o n p u m p i n g a c r o s s t h e m e m b r a n e i n c r e a s e s t h e t r a n s m e m b r a n e e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t . T h e s e r e a c t i o n s r e s u l t i n a r e l a t i v e l y p o s i t i v e o u t s i d e a n d n e g a t i v e i n s i d e d u r i n g t u r n o v e r s . 1 2 T h e i n c o r p o r a t i o n o f C c O i n t o s m a l l u n i l a m e l l a r p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s h a s p r o v e n t o b e a v e r y u s e f u l t o o l i n q u a n t i t a t i v e i n v e s t i g a t i o n s o f r e s p i r a t i o n ( H i n k l e e t a l . , 1 9 7 2 ; N i c h o l l s , 1 9 7 4 ) . T h e c y t o c h r o m e o x i d a s e v e s i c l e s ( C O V s ) r e p r e s e n t t h e s i m p l e s t b i o l o g i c a l m o d e l s y s t e m , a n d t h e y s h o w a n i n c r e a s e i n o x y g e n c o n s u m p t i o n i n d u c e d b y t h e a d d i t i o n o f i o n o p h o r e s s u c h a s v a l i n o m y c i n a n d F C C P , w h i c h a r e c l a s s i c u n c o u p l e r s o f m i t o c h o n d r i a l r e s p i r a t i o n ( B r u n o r i e t a l . , 1 9 8 5 ) , e x h i b i t i n g “ r e s p i r a t o r y c o n t r o l ” ; t h a t i s , t h e s l o w r a t e o f o x y g e n c o n s u m p t i o n i n t h e p r e s e n c e o f a m e m b r a n e p o t e n t i a l t h a t c a n b e s t i m u l a t e d w h e n t h e p o t e n t i a l i s b r o k e n d o w n . A m e a s u r e o f t h i s r e s p i r a t o r y c o n t r o l i s t h e R e s p i r a t o r y C o n t r o l R a t i o , R C R . T h e R C R o f C O V s i s o b t a i n e d f r o m t h e u n c o n t r o l l e d r a t e , i n t h e p r e s e n c e o f i o n o p h o r e s , d i v i d e d b y t h e c o n t r o l l e d r a t e i n t h e a b s e n c e o f i o n o p h o r e s . M e a s u r e m e n t o f t h e R C R i s o f t e n u s e d a s a n i n d i c a t i o n o f h o w w e l l C c O i s r e c o n s t i t u t e d i n t o v e s i c l e s . T h e R C R c a n b e a s h i g h a s 1 0 o r m o r e f o r C O V s p r e p a r e d u s i n g t h e b o v i n e o r R h o d o b a c t e r e n z y m e s . C O V s h a v e a l s o b e e n s h o w n t o p u m p p r o t o n s f r o m t h e i n t e r i o r t o t h e e x t e r i o r m e d i u m d u r i n g t u r n o v e r , a s i n m i t o c h o n d r i a ( S i g e l a n d C a r a f o l i , 1 9 7 8 ) . H o w e v e r , i n t h e s m a l l a r t i fi c i a l v e s i c l e s p r o t o n a v a i l a b i l i t y m a y b e o n e o f t h e r a t e l i m i t i n g f a c t o r s t o o b s e r v a t i o n o f p r o t o n e x t r u s i o n . T h e p r e s e n c e o f t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l , N P , a n d p H g r a d i e n t a r e a l s o l i m i t i n g f a c t o r s i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e . T h e a d d i t i o n o f i o n o p h o r e s s u c h a s v a l i n o m y c i n , a p o t a s s i u m i o n o p h o r e , i n c r e a s e s t h e r a t e o f t h e r e a c t i o n b y d i s s i p a t i n g t h e N P a n d a l l o w i n g t h e p u m p i n g o f p r o t o n s t o b e o b s e r v e d w i t h a b o u t 1 H 7 6 s t o i c h i o m e t r y . W h e n F C C P i s a d d e d , a p r o t o n c o n d u c t i n g i o n o p h o r e , t h e p r o t o n s a r e 1 3 l e a k e d b a c k a s f a s t a s t h e y a r e p u m p e d , s o t h a t o n l y n e t c o n s u m p t i o n i s o b s e r v e d ( F i g u r e 1 . 4 ) . E l e c t r o n s a r e t a k e n u p f r o m t h e o p p o s i t e s i d e o f t h e m e m b r a n e ( P - s i d e ) . T h e p r o x i m i t y o f h e m e a t o h e m e a 3 , s h o w n i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s , s u g g e s t t h a t t h e s i x - c o o r d i n a t e d h e m e a s e r v e s a s a n e f f e c t i v e e l e c t r o n d o n o r t o h e m e a 3 , c o n s i s t e n t w i t h r e s o n a n c e R a m a n r e s u l t s ( H a n e t a l . , 1 9 9 0 ) a n d c o n fi r m e d b y t h e a b s o r p t i o n s p e c t r a l c h a n g e ( V e r k h o v s k y e t a l . , 1 9 9 4 ) . H e m e a l i e s c l o s e t o h e m e a 3 , a t a l m o s t v a n d e r W a a l s c o n t a c t , d o n a t i n g o n e e l e c t r o n a t a t i m e t o t h e h e m e a 3 / C u 3 a c t i v e s i t e ( F e r g u s o n - M i l l e r a n d B a b c o c k , 1 9 9 6 ) . T h e d i r e c t i o n a l i t y o f p r o t o n u p t a k e f r o m t h e i n s i d e a n d e l e c t r o n m o v e m e n t f r o m t h e o u t s i d e c o n t r i b u t e s t o t h e g e n e r a t i o n o f e l e c t r o - c h e m i c a l g r a d i e n t a c r o s s t h e m e m b r a n e d u r i n g t h e 0 2 r e d u c t i o n t o w a t e r ( B a b c o c k a n d W i k s t r o m , 1 9 9 2 ; F e r g u s o n - M i l l e r a n d B a b c o c k , 1 9 9 6 ) . E v e n t h o u g h t h e r e i s n o c o n s e n s u s r e g a r d i n g t h e d e t a i l s o f t h e p r o t o n p u m p i n g p r o c e s s , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e i n t r o d u c t i o n o f n e g a t i v e c h a r g e ( e l e c t r o n s ) i n t o t h e b u r i e d h e m e a / h e m e a 3 / C u B c e n t e r s i s t h e d r i v i n g f o r c e f o r a l l o f t h e p r o t o n s t a k e n u p b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P u m p p r o t o n s a r e d i r e c t e d t o a s i t e ( p u m p s i t e ) s e p a r a t e f r o m t h e i n t e r m e d i a t e s o f t h e O z c h e m i s t r y . S u b s e q u e n t s u b s t r a t e p r o t o n u p t a k e s u p p l i e s t h e p r o t o n s n e e d e d f o r o x y g e n r e d u c t i o n a n d p r o v i d e s t h e c h a r g e r e p u l s i o n t h a t e x p e l s t h e p u m p p r o t o n s t o t h e o u t s i d e . B e c a u s e o f t h e c o m p l e x i t y o f t h e m e c h a n i s m o f C c O , s t r u c t u r a l d e t e r m i n a t i o n s a r e e s s e n t i a l f o r u n d e r s t a n d i n g t h e f u n c t i o n . 1 4 H + P u m p i n g ( V a l i n o m y c i n ) T u r n o v e r ( A ) E ( e ' / s e c / a a g ) 5 I n £ 1 < 1 < 1 U P r o t o n P u m p i n g E U C I N L O E 2 . C < < ‘ V ( 3 ) T i m e ( s e c ) ~ , 1 V ‘ s , " ~ - ' H + U n c o n t r o l l e d ( F C C P ) F i g u r e 1 . 4 C y t o c h r o m e c o x i d a t i o n a n d p r o t o n p u m p i n g w i t h C c O v e s i c l e s . A s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t ( O L I S - r s m — r a p i d s c a n n i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r ) i s u s e d t o m o n i t o r k i n e t i c r a t e s o f t h e o x i d a t i o n o f c y t o c h r o m e c , t h e e l e c t r o n d o n o r t o C c O , a t 5 5 0 n m ( t o p p a n e l , A ) . I n o r d e r t o m o n i t o r p r o t o n m o v e m e n t , s p e c i fi c p H - s e n s i t i v e d y e s a r e p l a c e d o n t h e o u t s i d e ( p h e n o l r e d ) o r i n s i d e ( p y r a n i n e ) o f C O V s . D u r i n g t u r n o v e r a m e m b r a n e p o t e n t i a l ( A ‘ I ’ ) i s f o r m e d f r o m t h e m o v e m e n t o f p r o t o n s a n d e l e c t r o n s . T h i s i n h i b i t s a c t i v i t y ( c o n t r o l l e d s t a t e ) b u t t h e a d d i t i o n o f t h e i o n o p h o r e , v a l i n o m y c i n , d i s s i p a t e s t h e A W , w h i c h i n c r e a s e s t h e r a t e o f t h e r e a c t i o n a n d r e s u l t s i n p r o t o n p u m p i n g t o t h e o u t s i d e o f t h e C O V s . I n t h e p r e s e n c e o f F C C P , t o g e t h e r w i t h v a l i n o m y c i n , C O V s a r e n o t l i m i t e d b y A ‘ P / A p H a n d g i v e t h e f a s t e s t t u r n o v e r , a s F C C P f r e e l y t r a n s p o r t s p r o t o n s a c r o s s t h e m e m b r a n e a l l o w i n g p r o t o n s t o l e a k b a c k a s f a s t a s t h e y a r e p u m p e d . C : c o n t r o l l e d s t a t e . V : w i t h v a l i n o m y c i n a d d i t i o n , p r o t o n p u m p i n g i s o b s e r v e d . U : u n c o n t r o l l e d c o n d i t i o n . 1 5 V a r i o u s b i o c h e m i c a l m e t h o d s , a s w e l l a s s p e c t r o s c o p i c , X - r a y c r y s t a l l o g r a p h i c , a n d b i o m i m e t i c m o d e l i n g s t u d i e s , h a v e b e e n u s e d t o u n d e r s t a n d t h e f u n c t i o n a l a n d s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h i s e n z y m e . T h e f u l l u n d e r s t a n d i n g o f p r o t o n p u m p i n g n e e d s a c o m b i n e d i n v e s t i g a t i o n o f t h e s t r u c t u r a l d a t a a n d m e c h a n i s t i c s t u d i e s , u s i n g t e c h n i q u e s s u c h a s s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s a n d t i m e r e s o l v e d s p e c t r o s c o p y t o d e fi n e t h e s p e c i fi c s t e p s o f e l e c t r o n a n d p r o t o n t r a n s f e r a n d h o w t h e y a r e c o u p l e d ( B r z e z i n s k i a n d A d e l r o t h , 1 9 9 8 ) . 1 . 1 . 3 . I n t r i n s i c U n c o u p l i n g o f O x i d a s e a n d E n e r g y E f f i c i e n c y D u r i n g o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n b y m i t o c h o n d r i a , p a r t o f t h e f r e e e n e r g y i s s t o r e d a s c h e m i c a l e n e r g y , A T P , o r i s d i s s i p a t e d a s h e a t . T h e m e c h a n i s m o f t h e p h y s i o l o g i c a l c o n t r o l o f e f fi c i e n c y i n e n e r g y t r a n s d u c t i o n s t i l l r e m a i n s e l u s i v e . W h i l e e n e r g y t r a n s d u c t i o n b y s u b s t r a t e l e v e l p h o s p h o r y l a t i o n r e s u l t s i n a d e fi n e d s t o i c h i o m e t r y , o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n b y t h e r e s p i r a t o r y e n z y m e s e x h i b i t s v a r i a b l e e f fi c i e n c i e s o f p r o t o n p u m p i n g . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e r e a r e t w o t y p e s o f p a r t i a l c o u p l i n g , w h i c h r e s u l t i n a l o w y i e l d o f o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n : s l i p a n d l e a k ( M u r p h y , 1 9 8 9 ) . S o m e p r o t o n s u n d e r t h e c o n t r o l o f a p r o t o n g r a d i e n t m a y b y p a s s t h e A T P s y n t h a s e a n d g o d i r e c t l y t h r o u g h t h e m i t o c h o n d r i a l i n n e r m e m b r a n e w i t h o u t s y n t h e s i z i n g A T P . T h i s A u H I d e p e n d e n t p r o t o n m o v e m e n t i s c a l l e d “ l e a k ” ( B r o w n a n d B r a n d , 1 9 9 1 ; N i c h o l l s , 1 9 7 4 ) a n d w i l l r e s u l t i n t h e d i s s i p a t i o n o f s o m e o f t h e f r e e e n e r g y s t o r e d d u r i n g t h e r e s p i r a t o r y r e a c t i o n . T h i s l e a k i s h i g h l y s p e c i fi c f o r p r o t o n s r e l a t i v e t o o t h e r i o n s . T h e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y t o p r o t o n s , a l t h o u g h v e r y l o w , w a s 6 t o 8 o r d e r s o f m a g n i t u d e h i g h e r t h a n o t h e r c a t i o n s ( B r o w n a n d B r a n d , 1 9 9 1 ) . T h e 1 6 r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e r e s p i r a t i o n r a t e a n d t h e p r o t o n - e l e c t r o c h e m c i a l g r a d i e n t ( i n r a t - l i v e r m i t o c h o n d r i a r e s p i r i n g o n s u c c i n a t e ) w a s n o n l i n e a r w h e n t h e r e s p i r a t i o n r a t e w a s g r a d u a l l y d e c r e a s e d b y t h e i n h i b i t o r , m a l o n a t e ( N i c h o l l s , 1 9 7 4 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e n o n - l i n e a r r e l a t i o n s h i p m a y b e c a u s e d b y a n i n c r e a s e i n t h e p r o t o n c o n d u c t a n c e o f t h e m i t o c h o n d r i a l i n n e r m e m b r a n e a t a h i g h v a l u e o f t h e p r o t o n g r a d i e n t o r m e m b r a n e p o t e n t i a l ( A ‘ I ’ ) , c a u s i n g l e a k t h r o u g h t h e m e m b r a n e ( K r i s h n a m o o r t h y a n d H i n k l e , 1 9 8 4 ) . T h e i n n e r m e m b r a n e w o u l d a l l o w p r o t o n s p u m p e d o u t t o l e a k b a c k t h r o u g h t h e m e m b r a n e w h e n a h i g h p r o t o n g r a d i e n t i s c r e a t e d . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e m i t o c h o n d r i a l l e a k i s t h r o u g h t h e p h o s p h o l i p i d b i l a y e r s r a t h e r t h a n t h e r e s p i r a t o r y p r o t e i n s . A n o l o g o u s n o n l i n e a r r e l a t i o n s h i p s h a v e b e e n r e p o r t e d i n r e l a t e d s y s t e m s s u c h a s t h y l a k o i d c h l o r o p l a s t m e m b r a n e s ( S c h o n f e l d a n d N e u m a n n , 1 9 7 7 ) a n d m e m b r a n e v e s i c l e s p r e p a r e d f r o m P a r a c o c c u s ( P . ) d e n i t r i fi c a n s ( K e l l e t a l . , 1 9 7 8 ) . I f t h e n u m b e r o f p r o t o n s t r a n s l o c a t e d a c r o s s t h e m e m b r a n e c o m p a r e d t o t h e n u m b e r o f e l e c t r o n s c o n s u m e d i s d e c r e a s e d d u r i n g r e s p i r a t i o n , t h e n a l e s s e r b u i l d u p o f t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l o c c u r s d u e t o a d e c r e a s e d A I L H + ( p r o t o n - e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t ) . T h i s i s c a l l e d “ s l i p ” ( S t e v e r d i n g e t a l . , 1 9 9 3 ) a n d w i l l r e s u l t i n t h e d i s s i p a t i o n o f t h e s t o r e d f r e e e n e r g y a s h e a t . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e s t o i c h i o m e t r y o f H I / e ' i n m i t o c h o n d r i a i s i n t r i n s i c a l l y d e c r e a s e d d u e t o t h e s l i p p a g e i n t h e p u m p ( M u r p h y a n d B r a n d , 1 9 8 7 ) a s t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l ( A ‘ I ’ ) i s r a i s e d . H o w e v e r , t h e e v i d e n c e f o r a c h a n g e i n t h e s t o i c h i o m e t r y o f p r o t o n p u m p i n g b y s l i p p a g e i s n o t c o n c l u s i v e . S l i p s e e m s t o o c c u r i n c y t o c h r o m e o x i d a s e , b u t n o t i n t h e c y t o c h r o m e b e ] c o m p l e x ( M u r p h y , 1 9 8 9 ) . T h e s t o i c h i o m e t r y ( H I / e ' ) c h a n g e s c a n b e c a u s e d b y v a r i o u s c o n d i t i o n s , i n c l u d i n g 1 7 m o d i fi c a t i o n o f C c O b y r e m o v i n g s u b u n i t I I I ( C a s e y e t a l . , 1 9 8 4 ; S a r t i e t a l . , 1 9 8 5 ) . A n o t h e r w a y o f c o n s i d e r i n g s l i p i n c y t o c h r o m e o x i d a s e h a s b e e n p r o p o s e d ( B l a i r e t a l . , 1 9 8 6 ) , w h e r e e l e c t r o n s p a s s t h r o u g h t h e c o m p l e x w i t h o u t p u m p i n g p r o t o n s b y a “ r e d o x s l i p ” p r o c e s s . T h e r e a r e t e c h n i c a l d i f fi c u l t i e s t o d i s t i n g u i s h i n g b e t w e e n a n y o f t h e s e “ s l i p ” a n d “ l e a k ” p r o c e s s e s . A n a l t e r n a t i v e e x p l a n a t i o n f o r a n i n t r i n s i c u n c o u p l i n g m e c h a n i s m h a s b e e n p r o p o s e d w i t h r e c e n t C O V s m e a s u r e m e n t s b y s t o p p e d fl o w t e c h n i q u e s . T h e r e i s e v i d e n c e t h a t C c O h a s t h e a b i l i t y t o c o n t r o l i t s o w n p u m p i n g e f fi c i e n c y v i a p r o t o n b a c k fl o w t h r o u g h t h e p r o t e i n i t s e l f u n d e r a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l , p r o v i d i n g p r o t o n s f r o m t h e o u t s i d e o f t h e m e m b r a n e i n s t e a d o f o n l y f r o m t h e i n s i d e t o s u p p o r t o x y g e n r e d u c t i o n . I t s u g g e s t s t h a t t h e e f fi c i e n c y o f e n e r g y t r a n s d u c t i o n c o u l d b e r e g u l a t e d b y p h y s i o l o g i c a l e f f e c t o r s o f p r o t o n b a c k fl o w , i n c l u d i n g a m e m b r a n e p o t e n t i a l ( M i l l s e t a l . , 2 0 0 2 ) o r b y r e g u l a t o r y s i g n a l s s u c h a s a d e n i n e n u c l e o t i d e s a n d p h o s p h o r y l a t i o n ( K a d e n b a c h , 2 0 0 3 ) . P r o t o n b a c k fl o w m a y b e o n e o f t h e m e c h a n i s m s u s e d t o p r e v e n t t h e b u i l d u p o f a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l , w h i c h c a n i n h i b i t e l e c t r o n t r a n s f e r a n d a l l o w r e d u c e d i n t e r m e d i a t e s t o p e r s i s t u p s t r e a m o f c y t o c h r o m e o x i d a s e . T h e p r o l o n g e d l i f e t i m e o f s o m e o f t h e s e r e d u c e d i n t e r m e d i a t e s l e a d s t o t h e p r o d u c t i o n o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s ( R O S ) ( B r a n d e r a l . , 2 0 0 4 ) s u c h a s s u p e r o x i d e o r a h y d r o x y l r a d i c a l , b o t h o f w h i c h a r e h i g h l y r e a c t i v e t o x i c c h e m i c a l s t o t h e c e l l ( H o s l e r e t a l . , 2 0 0 6 ) . E v e n t h o u g h t h e m i t o c h o n d r i a h a v e s o p h i s t i c a t e d s y s t e m s t o a n n i h i l a t e R O S , i n c l u d i n g p r o t e i n s s u c h a s s u p e r o x i d e d i s m u t a s e , l o w l e v e l s o f R O S c a n s e r i o u s l y d a m a g e t h e c e l l . T h e e x t r a n u c l e a r - e n c o d e 1 8 s u b u n i t s i n t h e m i t o c h o n d r i a l o x i d a s e m a y p r o v i d e s o m e p r o t e c t i o n a n d s t a b i l i t y u n d e r t o x i c c o n d i t i o n s , b u t t h e b a c t e r i a l f o r m s h a v e f e w e r s u b u n i t s , w h i c h m a y c a u s e m o r e d e l e t e r i o u s c o n d i t i o n s . I t i s u n c l e a r w h e t h e r b a c k fl o w m a y a l s o b e r e g u l a t e d b y t h e n u c l e a r e n c o d e d e x t r a s u b u n i t s w h i c h a r e a b s e n t i n b a c t e r i a l C c O . S o m e b a c t e r i a l c y t o c h r o m e o x i d a s e s i n c l u d i n g t h a t f r o m T h e r m u s t h e r m o p h i l u s , h a v e a H + / e ' r a t i o t h a t i s c l o s e t o 0 . 5 i n s t e a d o f 1 . 0 u n d e r s t a n d a r d c o n d i t i o n s ( K a n n t e t a l . , 1 9 9 8 b ) . M a m m a l i a n c y t o c h r o m e c o x i d a s e s h o w s d e c r e a s e d H + / e ’ r a t i o w h e n s u b u n i t H 1 i s r e m o v e d o r c h e m i c a l l y m o d i fi e d ( P r o c h a s k a a n d F i n k , 1 9 8 7 ) . H o w e v e r , t h e r e g u l a t i o n o f e n e r g y m e t a b o l i s m i s n o t f u l l y u n d e r s t o o d . H e m e - c 0 p p e r ( a 3 / C u B ) o x i d a s e c a t a l y z e s 9 0 % o f t h e m o l e c u l a r o x y g e n r e d u c t i o n i n t h e b i o s p h e r e w i t h o u t b e i n g d i r e c t l y i n v o l v e d i n t h e f o r m a t i o n o f m e a s u r a b l e r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s ( R O S ) , w h i c h a r e k n o w n t o a c c e l e r a t e a g i n g a n d t o c a u s e d e g e n e r a t i v e d i s e a s e s . H o w e v e r , h e m e c o p p e r o x i d a s e d e fi c i e n c i e s , o r n a t u r a l l y o c c u r r i n g m u t a t i o n s t h a t i n h i b i t o x i d a s e a c t i v i t y c a n c o n t r i b u t e t o r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s a s w e l l a s s t r o n g i n h i b i t i o n o f A T P p r o d u c t i o n . S u c h d e f e c t s h a v e b e e n l i n k e d t o A l z h e i m e r ’ s d i s e a s e ( D a v i s e t a l . , 1 9 9 7 ) , L e i g h s y n d r o m e ( Z h u e t a l . , 1 9 9 8 ) , a n d a g i n g ( P a r a d i e s e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e r e f o r e , c y t o c h r o m e c o x i d a s e e x e r t s a m a j o r c o n t r o l o f e n e r g y m e t a b o l i s m a n d R O S f o r m a t i o n ( L u d w i g e t a l . , 2 0 0 1 ) . 1 9 1 . 2 . S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e 1 . 2 . 1 . C o m p a r i s o n o f M i t o c h o n d r i a l a n d P r o k a r y o t i c E n z y m e s T h e r e a r e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n s t r u c t u r e ( n u m b e r o f s u b u n i t s a n d m e t a l b i n d i n g s i t e s ) , c a t a l y t i c f u n c t i o n a n d s p e c i fi c a l l y b o u n d l i p i d s i n m i t o c h o n d r i a l a n d p r o k a r y o t i c o x i d a s e s . H o w e v e r , t h e r e a r e m a n y c o m m o n f e a t u r e s s u c h a s t h e r e d o x a c t i v e m e t a l c e n t e r s a n d t h e s t r o n g c o u p l i n g b e t w e e n p r o t o n s a n d e l e c t r o n s d u r i n g t h e r e s p i r a t o r y r e a c t i o n . X - r a y c r y s t a l d a t a i s n o w a v a i l a b l e f o r 4 o f t h e 5 e n e r g y - t r a n s d u c i n g e l e c t r o n t r a n s f e r c o m p l e x e s o f o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n , s u c c i n a t e d e h y d r o g e n a s e , t h e b c l c o m p l e x , c y t o c h r o m e c o x i d a s e a n d A T P s y n t h a s e . S t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n , m u t a t i o n a l a n d k i n e t i c i n f o r m a t i o n i s a l s o a v a i l a b l e c o n c e r n i n g p r o t o n t r a n s f e r c o u p l e d t o e l e c t r o n t r a n s f e r i n t h e s e p r o t e i n s . S i n c e e v i d e n c e i s a c c u m u l a t i n g t h a t t h e s e r e s p i r a t o r y c o m p l e x e s i n b o t h e u k a r y o t e s a n d p r o k a r y o t e s m a y a c t a s s u p r a m o l e c u l a r s t r u c t u r e s , t h e f u n c t i o n o f o x i d a s e m a y t u r n o u t t o b e m o d i fi e d a n d r e g u l a t e d b y i n t e r a c t i o n s w i t h i t s r e s p i r a t o r y c h a i n n e i g h b o r s . 1 . 2 . 1 . 1 . B o v i n e H e a r t C y t o c h r o m e c O x i d a s e B o v i n e h e a r t C c O e x i s t s a s a d i m e r w h e n i t i s i n d e t e r g e n t o r i n t h e c r y s t a l l i n e s t a t e . T h e w h o l e s t r u c t u r e o f t h e 1 3 - s u b u n i t C c O w a s fi r s t r e v e a l e d b y X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y i n i t s o x i d i z e d f o r m a t 2 . 8 A r e s o l u t i o n ( T s u k i h a r a e t a l . , 1 9 9 6 ) ( F i g u r e 1 . 2 ) . I t i s c o m p o s e d o f t h e m i t o c h o n d r i a l - e n c o d e d t h r e e c o r e s u b u n i t s w h i c h a r e e s s e n t i a l f o r t h e c a t a l y t i c c y c l e , a n d t e n n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s ( K a d e n b a c h e t a l . , 1 9 8 7 ) . S u b s e q u e n t l y , c r y s t a l s t r u c t u r e s o f b o v i n e h e a r t C c O i n t h e f u l l y o x i d i z e d , f u l l y r e d u c e d , 2 0 a z i d e - b o u n d , a n d c a r b o n m o n o x i d e - b o u n d s t a t e s w e r e d e t e r m i n e d a t 2 . 3 0 , 2 . 3 5 , 2 . 9 , a n d 2 . 8 A r e s o l u t i o n , r e s p e c t i v e l y ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 8 ) . C o m p a r i s o n o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s i n v a r i o u s o x i d a t i o n a n d l i g a n d - b i n d i n g s t a t e s , a t h i g h r e s o l u t i o n , h a s i l l u m i n a t e d s o m e a s p e c t s o f t h e m e c h a n i s m o f C c O . W i t h t h e h e l p o f a h i g h e r r e s o l u t i o n c r y s t a l ( 1 . 8 A ) , a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f w a t e r w a s d e fi n e d w i t h i n t h e p r o t e i n , w h i c h c o u l d b e i n v o l v e d i n t h e p r o t o n p u m p i n g m e c h a n i s m , p a r t i c u l a r l y i n t h e D - p a t h w a y ( T s u k i h a r a e t a l . , 2 0 0 3 ) . A c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e o f A s p - 5 1 ( B o v i n e n u m b e r i n g ) i n s u b u n i t 1 , b e t w e e n t h e f u l l y r e d u c e d a n d o x i d i z e d s t a t e s , i s s u g g e s t e d t o b e a n i m p o r t a n t f a c t o r i n t h e p u m p i n g m e c h a n i s m . A s i g n i fi c a n t r e a r r a n g e m e n t o f t h e h y d r o g e n - b o n d i n g n e t w o r k a b o v e h e m e a i s p r o p o s e d t o d r i v e t h e p r o t o n u p t a k e a n d r e l e a s e . T h e p K a o f t h e c a r b o x y l g r o u p i s s t r o n g l y i n fl u e n c e d b y i t s r e d o x e n v i r o n m e n t . I n t h e o x i d i z e d s t a t e , A s p - 5 1 i s m o s t l i k e l y p r o t o n a t e d a n d o r i e n t e d i n t o t h e p r o t e i n , w h e r e a s i n t h e r e d u c e d s t a t e i t s e e m s t o b e o r i e n t e d t o t h e o u t s i d e . T h e H - p a t h w a y , i n c l u d i n g A s p - 5 1 , a n d a n u m b e r o f r e s i d u e s a n d w a t e r c a v i t i e s , i s d e fi n e d a s t h e p r o t o n p u m p p a t h w a y i n t h e b o v i n e e n z y m e . H o w e v e r , i n t h e b a c t e r i a l e n z y m e t h e s e r e s i d u e s a r e n o t c o n s e r v e d a n d m u t a t i o n s o f r e s i d u e s w i t h i n t h i s p a t h w a y h a v e l i t t l e o r n o e f f e c t o n t h e a c t i v i t y o f t h e C c O f r o m R . s p h a e r o i d e s ( L e e e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h e X - r a y s t r u c t u r e o f b o v i n e h e a r t C c O s h o w s t h a t t h e l i p i d s c o n t r i b u t e t o t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e d i m e r s t a t e a n d t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e t h r e e c o r e s u b u n i t s a n d t h e 1 0 n u c l e a r - e n c o d e d s u b u n i t s . T h i r t e e n l i p i d s , i n c l u d i n g t w o c a r d i o l i p i n s , o n e p h o s p h a t i d y l c h o l i n e , t h r e e p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e s , f o u r p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l s a n d t h r e e t r i g l y c e r i d e s , a r e i d e n t i fi e d i n a c r y s t a l l i n e b o v i n e h e a r t C c O p r e p a r a t i o n 2 1 ( S h i n z a w a - I t o h e t a l . , 2 0 0 7 ) . M a s s s p e c t r o m e t r y ( M S ) a n d t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ( M S - M S ) t e c h n i q u e s w e r e a p p l i e d t o d e t e r m i n e t h e i d e n t i t y o f t h e l i p i d s t r u c t u r e s , e s p e c i a l l y t h e u n s a t u r a t e d b o n d p o s i t i o n a n d c h a i n l e n g t h o f t h e h y d r o p h o b i c t a i l s , w h i c h a r e w e l l r e s o l v e d i n t h e X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e . T h e c i s - v a c c i n a t e ( c i s - A H - o c t a d e c e n o a t e ) o f t h e p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l f o u n d b o t h i n C 0 0 o f b o v i n e a n d P . d e n i t r i fi c a n s , w e r e d e t e r m i n e d b y m a s s s p e c t r o m e t r y a n d X - r a y s t r u c t u r a l a n a l y s i s , a n d a r e s u g g e s t e d t o b e a k e y s t r u c t u r a l f e a t u r e , i m p o r t a n t i n O z t r a n s f e r t o t h e a c t i v e s i t e . 1 . 2 . 1 . 2 . P r o k a r y o t i c C y t o c h r o m e c O x i d a s e T h e p r o k a r y o t i c e n z y m e i s a g o o d m o d e l s y s t e m f o r m e c h a n i s t i c s t u d i e s b e c a u s e t h e c a t a l y t i c c o r e i s h i g h l y h o m o l o g o u s t o t h a t o f t h e m a m m a l i a n o x i d a s e ( F i g u r e 1 . 2 ) . M o r e o v e r , i t i s e a s i l y a m e n a b l e t o s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s , a l l o w i n g t h e p r o d u c t i o n o f n u m e r o u s m u t a n t s b a s e d o n w e l l — s t u d i e d g e n o m e s e q u e n c e s . S i n c e t h e fi r s t c r y s t a l s t r u c t u r e o f P . d e n i t r i fi c a n s o x i d a s e a t 2 . 8 A r e s o l u t i o n ( I w a t a e t a l . , 1 9 9 5 ) , a l o t m o r e s t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n , b a s e d o n c r y s t a l s w i t h i m p r o v e d r e s o l u t i o n , h a s e n r i c h e d t h e u n d e r s t a n d i n g o f t h e p r o t o n p u m p i n g m e c h a n i s m o f C c O . A s i n t h e b o v i n e o x i d a s e , t h e c o v a l e n t b o n d b e t w e e n t h e h i s t i d i n e i m i d a z o l e g r o u p t h a t i s o n e o f t h e G u n l i g a n d s ( H 2 8 4 ) a n d t h e t y r o s i n e p h e n o l g r o u p ( Y 2 8 8 ) h a s b e e n o b s e r v e d i n a o x i d i z e d P a r a c o c c u s c y t o c h r o m e c o x i d a s e a t 2 . 7 A r e s o l u t i o n ( O s t e r m e i e r e t a l . , 1 9 9 7 ) a n d R . s p h a e r o i d e s a t 2 . 0 A r e s o l u t i o n ( Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e H i s - T y r c r o s s l i n k h a s b e e n s u g g e s t e d t o h a v e a r o l e i n t h e c a t a l y t i c m e c h a n i s m o f t h e b a c t e r i a l f o r m o f C c O 2 2 ( O s t e r m e i e r e t a l . , 1 9 9 7 ; Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) a s o b s e r v e d i n t h e b o v i n e f o r m s . T h e h e m e a 3 - C u B b r i d g i n g l i g a n d s a t t h e a c t i v e s i t e a r e s t i l l c o n t r o v e r s i a l . A h y d r o x i d e i o n a n d a w a t e r m o l e c u l e a r e p r o p o s e d ( O s t e r m e i e r e t a l . , 1 9 9 7 ; Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) a s l i g a n d s o f t h e h e m e a 3 - C u B s i t e i n t h e o x i d i z e d b a c t e r i a l C c O , i n s t e a d o f t h e b r i d g i n g p e r o x i d e p r o p o s e d f o r t h e b o v i n e C c O ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 8 ; Y o s h i k a w a e t a l . , 2 0 0 0 ) . I t i s h o w e v e r d i f fi c u l t t o a s s i g n t h e p o s i t i o n a n d i d e n t i t y o f t h e l i g a n d s a t t h e a c t i v e s i t e b e c a u s e o f t h e d e n s i t y o f t h e m e t a l s a n d t h e q u e s t i o n s a b o u t t h e a c t u a l r e d o x s t a t e o f t h e p r o t e i n w h e n i t h a s b e e n e x p o s e d t o t h e X - r a y b e a m . T h e o v e r a l l s t r u c t u r e o f s u b u n i t s ( I , H , I I I , a n d I V ) o f R . s p h a e r o i d e s C c O a r e v e r y s i m i l a r t o t h o s e o f t h e P . d e n i t r i fi c a n s , a n d t h e c o r e s u b u n i t s ( I , H , a n d H I ) a r e s i m i l a r t o t h e c o r r e s p o n d i n g s u b u n i t s o f t h e b o v i n e h e a r t e n z y m e . T h e r e i s a h i g h s e q u e n c e i d e n t i t y b e t w e e n t h e P . d e n i t r i fi c a n s a n d R . s p h a e r 0 i d e s C c O ( 8 1 % i n s u b u n i t I , 4 9 % i n s u b u n i t H , 6 9 % i n s u b u n i t H I , a n d 4 8 % i n s u b u n i t I V ) . S u b u n i t I V , w h o s e r o l e i s n o t y e t k n o w n , h a s n o d i r e c t i n t e r a c t i o n s w i t h t h e o t h e r s u b u n i t s i n t h e r e g i o n s w h e r e i t i s r e s o l v e d . I t m a i n t a i n s i t s p o s i t i o n m a i n l y b y i n d i r e c t c o n t a c t s v i a l i p i d m o l e c u l e s . A t o t a l o f s i x p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e s w e r e i d e n t i fi e d i n t h e f o u r s u b u n i t C c O c r y s t a l s t r u c t u r e f r o m R . s p h a e r o i d e s ( S v e n s s o n - E k e t a l . , 2 0 0 2 ) , w i t h f o u r p o s i t i o n e d o n t h e i n t e r f a c e b e t w e e n s u b u n i t I V a n d I / I H , a n d t w o a s s o c i a t e d w i t h s u b u n i t H I a n d s u b u n i t 1 . S u b u n i t I V i s n o t c o m p l e t e l y r e s o l v e d a n d c a n b e i n c o m p l e t e l y p r o t e o l y z e d w h i c h m a y b e a p r o b l e m i n m a k i n g g o o d r e s o l u t i o n c r y s t a l s f o r X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y . T w o - s u b u n i t c r y s t a l s o f R . s p h a e r 0 i d e s C c O a t 2 . 0 A r e s o l u t i o n r e v e a l e d t h a t t h e p o s i t i o n s o f l i p i d a n d d e t e r g e n t s u b s t i t u t e s a r e a l s o h i g h l y c o n s e r v e d , c o m p a r e d w i t h b o v i n e , w i t h a m i n o a c i d 2 3 r e s i d u e s i n t h e i r v i c i n i t y , s u g g e s t i n g a s p e c i fi c r o l e o f l i p i d i n m e m b r a n e p r o t e i n s ( Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) ( F i g u r e 1 . 5 ) . A s m a n y a s 1 7 8 w a t e r m o l e c u l e s f o r m a h y d r o g e n b o n d e d n e t w o r k i n s i d e t h e R c h O p r o t e i n . T h e r e i s a h i g h d e g r e e o f c o n s e r v a t i o n o f o r d e r e d h y d r o g e n - b o n d e d w a t e r s i n t h e p r o t o n p a t h w a y s , s u g g e s t i n g a c r i t i c a l r o l e o f w a t e r i n p r o t o n t r a n s f e r ( S h a r p e e t a l . , 2 0 0 5 ) . 2 4 F i g u r e 1 . 5 S u p e r p o s i t i o n o f c r y s t a l s t r u c t u r e s h o w i n g c o n s e r v e d d e t e r g e n t / l i p i d b i n d i n g s i t e f o u n d i n o x i d a s e . C o n s e r v e d d e t e r g e n t / l i p i d s i t e s w e r e f o u n d i n R . s p h a e r o i d e s ( R s ) , R d e n i t r i fi c a n s ( P d ) , a n d b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e c r y s t a l s t r u c t u r e s ( Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) . ( A ) M o l e c u l a r s u r f a c e c o l o r e d b y r e l a t i v e e l e c t r o s t a t i c p o t e n t i a l ( b l u e , p o s i t i v e ; r e d , n e g a t i v e ) a n d t h e d e t e r g e n t m o l e c u l e s . T h e a l k y l c h a i n s r e s o l v e d i n t h e R s C c O ( C , d a r k b l u e ; O , r e d ) , P d C c O ( C , g r e e n ; O , r e d ; N , b l u e ) s u p e r i m p o s e d t o g e t h e r . ( B ) L i p i d m o l e c u l e s i n t h e b o v i n e C c O o c c u p y t h e s a m e s i t e s a s i n R s / P d C c O s t r u c t u r e . P C , p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ; P G ; p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ; C D L , c a r d i o l i p i n ; T G L , t r i a c y l g l y c e r o l . ( C ) D e t a i l e d v i e w o f o n e o f t h e c o n s e r v e d l i p i d - b i n d i n g s i t e s , w h e r e a n a l k y l c h a i n o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e r e s o l v e d i n b o v i n e C c O o c c u p i e s t h e s a m e s i t e a s d e t e r g e n t s r e s o l v e d i n R s C 6 0 a n d P d C c O ( Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) . 2 5 N o c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i s o b s e r v e d i n t h e p r o t e i n s t r u c t u r e i n c l u d i n g C u B a n d 2 2 . . . h e m e a a s w e l l a s o t h e r m e t a l c e n t e r s ( C u A , h e m e a , M g + a n I b i n d i n g S i t e ) , u p o n r e d u c t i o n i n t h e P a r a c o c c u s C c O ( H a r r e n g a a n d M i c h e l , 1 9 9 9 ) w h e r e a s a s m a l l c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e h a s b e e n d e s c r i b e d f o r t h e b o v i n e h e a r t C c O , a f f e c t i n g a l o o p i n s u b u n i t I a r o u n d t h e r e s i d u e A s p 5 1 ( b o v i n e n u m b e r i n g ) a n d t h e t a i l o f h e m e a ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 8 ) . R e c e n t l y , a h i g h r e s o l u t i o n s t r u c t u r e o f t h e f u l l y r e d u c e d f o r m o f R . s p h a e r o i d e s C c O s h o w s a s i g n i fi c a n t c h a n g e i n t h e o r i e n t a t i o n o f h e m e a 3 , w h i c h s u g g e s t s a n o p e n i n g o f t h e K - p a t h w a y . 1 . 2 . 2 . E l e c t r o n T r a n s f e r i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e T h e r e d u c t i o n o f d i o x y g e n t o t w o m o l e c u l e s o f w a t e r i s a c o m p l i c a t e d p r o c e s s t h a t i n v o l v e s c o u p l i n g b e t w e e n e l e c t r o n a n d p r o t o n t r a n s f e r . A n e l e c t r o n t r a n s f e r p a t h w a y h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t a l l o w s t h e r a p i d t r a n s f e r o f e l e c t r o n s f r o m C u A t o h e m e a , 1 9 A i n t o t h e m e m b r a n e , b u t t h e n e e d f o r a s p e c i fi c p a t h w a y h a s b e e n c h a l l e n g e d ( M o s e r e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e n e x t s t e p , t o h e m e a 3 / C u B , i n v o l v e s a s h o r t e r ( ~ 4 A ) t r a n s f e r . B o t h t h e s e s t e p s a p p e a r t o b e c o u p l e d t o s p e c i fi c p r o t o n m o v e m e n t s ( F i g u r e 1 . 6 ) . 2 6 « r ' - . - ' ~ - - _ ; - ‘ C y t o c h r o m e c 1 1 1 7 ‘ ‘ ‘ i f “ ) , R 4 8 2 1 F i g u r e l . 6 T h e e l e c t r o n t r a n s f e r p a t h w a y w i t h i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e . E a c h m o l e c u l e o f c y t o c h r o m e c d e l i v e r s o n e e l e c t r o n a t a t i m e ( C u A 9 h e m e a - ) h e m e : 1 3 ) . E a c h e l e c t r o n t r a n s f e r a p p e a r s t o b e c o u p l e d t o u p t a k e o f o n e p r o t o n f r o m t h e i n t e r i o r . ( T h e fi g u r e i s f r o m D r . F r a n k M i l l e t t , u n p u b l i s h e d ) 2 7 1 . 2 . 3 . P r o t o n M o v e m e n t i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e B i o c h e m i c a l s t u d i e s a n d a n a l y s i s o f c r y s t a l l o g r a p h i c w a t e r s h a v e l e d t o t h e p r o p o s a l t h a t c e r t a i n a m i n o a c i d s , a l o n g w i t h r e s o l v e d w a t e r s , a r e i n v o l v e d i n t h e m o v e m e n t o f p r o t o n s i n t o a n d t h r o u g h t h e i n t e r i o r o f t h e C c O . T h e s e r e s i d u e s a n d w a t e r s d e fi n e a t l e a s t t w o d i s t i n c t p r o t o n u p t a k e p a t h w a y s c a l l e d t h e D - a n d K - p a t h w a y s f o r k e y r e s i d u e s D 1 3 2 a n d K 3 6 2 ( R . s p h a e r o i d e s n u m b e r i n g ) , r e s p e c t i v e l y . B o t h p r o t o n u p t a k e p a t h w a y s w e r e i d e n t i fi e d w i t h t h e h e l p o f s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s e x p e r i m e n t s ( F e t t e r e t a l . , 1 9 9 5 ; G e n n i s , 1 9 9 8 ; H o s l e r e t a l . , 1 9 9 3 ) i n b a c t e r i a l f o r m s o f t h e e n z y m e . P r o t o n s m o v e r a p i d l y t h r o u g h h y d r o g e n b o n d e d c h a i n s o f w a t e r a n d a m i n o a c i d r e s i d u e s , p r e s u m a b l y v i a a G r o t t h u s p r o t o n h o p p i n g m e c h a n i s m ( d e G r o t t h u s s , 1 8 0 6 ) , w h i c h a l l o w s p r o t o n t r a n s f e r b e t w e e n h y d r o g e n - b o n d e d w a t e r s a n d a m i n o a c i d s ( A g m o n , 1 9 9 5 ; X u a n d V o t h , 2 0 0 5 ) . T h u s , o n e p r o t o n i s a d d e d t o o n e e n d o f a c h a i n o f w a t e r s , w h i l e a n o t h e r p r o t o n i s r e l e a s e d f r o m t h e o t h e r e n d . P r o t o n t r a n s f e r t h r o u g h p r o t e i n s m a y b e r a p i d b e c a u s e t h e p r o t o n m o b i l i t y a l o n g a h y d r o g e n - b o n d e d w a t e r c h a i n e x c e e d s t h a t o f p r o t o n t r a n s f e r i n b u l k w a t e r b y a f a c t o r o f 4 0 ( D e l l a g o e t a l . , 2 0 0 3 ) . I n t h i s p r o t o n p a t h w a y , r e s i d u e s w i t h e x c h a n g e a b l e p r o t o n s s u c h a s c a r b o x y l a t e , h i s t i d i n e a n d a r g i n i n e , s t a r t o r t e r m i n a t e t h e p a t h w a y a t t h e p r o t e i n s u r f a c e ( H o s l e r e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e fl o w o f p r o t o n s c a n b e i n t e r r u p t e d b y a p r o t o n a t a b l e g r o u p i n t h e m i d d l e o f a p a t h w a y t h a t c a n s t o r e a p r o t o n a n d t h e n r e l e a s e i t , a s n e e d e d t o s a t i s f y t h e d e m a n d s o f t h e n e x t p r o t o n a c c e p t o r . 2 8 D e fi n i n g t h e s i t e o f w a t e r m o l e c u l e s i n C c O i s i m p o r t a n t f o r u n d e r s t a n d i n g l o n g - r a n g e p r o t o n m o v e m e n t t h o u g h p r o t e i n s . W a t e r m o l e c u l e s a r e g e n e r a l l y c o o r d i n a t e d w i t h p o l a r s i d e c h a i n s o f p r o t e i n s , b u t a r e e x p e c t e d t o b e f o u n d i n h y d r o p h o b i c r e g i o n s a s w e l l ( W u a n d V o t h , 2 0 0 3 ) . B o t h w a t e r s t h a t a r e r e s o l v e d i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f C c O , a n d a d d e d w a t e r s , w h i c h c a n b e s i m u l a t e d b y m o l e c u l a r d y n a m i c c a l c u l a t i o n s , a r e u s e d t o p r e d i c t c h a n n e l s i n t h e C c O s t r u c t u r e , b a s e d o n x - r a y c r y s t a l i n f o r m a t i o n ( C u k i e r , 2 0 0 5 ) . B e c a u s e n o t a l l o f t h e w a t e r s t h a t p l a y a r o l e i n p r o t o n t r a n s f e r a r e r e s o l v e d i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e , e v e n a t h i g h r e s o l u t i o n , t h e m o d e l i n g e f f o r t i s v e r y c r u c i a l . F o r e x a m p l e , w a t e r s t h a t c o u l d m e d i a t e s u b s t r a t e p r o t o n fl o w f r o m E 2 8 6 t o C u B ( 1 0 - 1 2 A d i s t a n c e ) a r e n o t r e v e a l e d i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e , b u t c a n b e m o d e l e d t h r o u g h a h y d r o p h o b i c c a v i t y b e t w e e n E 2 8 6 a n d t h e a c t i v e s i t e v i a w a t e r m o l e c u l e s ( C u k i e r , 2 0 0 4 ; S h a r p e e t a l . , 2 0 0 5 ; T a s h i r o a n d S t u c h e b r u k h o v , 2 0 0 5 ; W i k s t r o m e t a l . , 2 0 0 3 ) . N e i t h e r t h e p r o t o n e x i t p a t h w a y n o r t h e p r o t o n b a c k fl o w p a t h w a y i s o b v i o u s f r o m e i t h e r t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s , o r b i o c h e m i c a l m u t a t i o n a l s t u d i e s . T h i s m a y r e l a t e t o t h e a b i l i t y o f p r o t o n p a t h w a y s t o f o r m a n d d i s s i p a t e d u r i n g t h e c a t a l y t i c c y c l e . I n b a c t e r i o r h o d o p s i n , t h e e n e r g y d e p e n d e n t c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s e n a b l e t h e a c c e s s o f p r o t o n s o n o n e m e m b r a n e s i d e w h i l e t h e o t h e r s i d e i s c l o s e d ( L a n y i , 1 9 9 7 ) , a n d t h e n t h e o u t e r s i d e i s o p e n e d f o r w a t e r a c c e s s , a l l o w i n g t h e t r a n s f e r o f a p r o t o n a c r o s s t h e . m e m b r a n e . T r a n s i e n t p r o t o n t r a n s f e r p a t h w a y s m a y b e u s e d b y p r o t e i n s t o “ g a t e ” t h e fl o w o f p r o t o n s , i n o r d e r t o p r o v i d e d i r e c t i o n a l i t y o r t o c o n t r o l t h e t i m i n g o f p r o t o n d e l i v e r y . 2 9 x e n o n , t o d e t e c t l i k e l y o x y g e n b i n d i n g s i t e s ( S v e n s s o n - E k e t a l . , 2 0 0 2 ) . O x y g e n i s v e r y 1 . 2 . 4 . T h e C a t a l y t i c R e a c t i o n C y c l e f o r O x y g e n R e d u c t i o n T h e c a t a l y t i c c y c l e o f C c O c a n b e d i v i d e d i n t o t h r e e t y p e s o f r e a c t i o n s . O x y g e n b i n d s t o t h e r e d u c e d c a t a l y t i c s i t e fi r s t , t h e n i t s O - O b o n d i s s p l i t b y a f o u r e l e c t r o n t r a n s f e r e v e n t a n d c o n c o m i t t a n t p r o t o n t r a n s f e r ( G o r b i k o v a e t a l . , 2 0 0 8 ) . T h e c r o s s - l i n k e d t y r o s i n e ( Y 2 8 8 i n R . s p h a e r o i d e s n u m b e r i n g ) h a s b e e n s u g g e s t e d t o b e a n e l e c t r o n a n d p r o t o n d o n o r r e q u i r e d f o r O - O b o n d c l e a v a g e . F o u r s e p a r a t e o n e - e l e c t r o n t r a n s f e r r e a c t i o n s m u s t o c c u r f o r t h e c o m p l e t e r e a c t i o n o f C c O . E a c h e l e c t r o n t r a n s f e r r e a c t i o n i s c o u p l e d t o t h e u p t a k e o f t w o p r o t o n s , a s u b s t r a t e p r o t o n i n t o t h e a c t i v e s i t e a n d a n o t h e r p r o t o n d e s t i n e d t o m o v e a c r o s s t h e m e m b r a n e ( B l o c h e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e o v e r a l l d r i v i n g f o r c e f o r t h e s e r e a c t i o n s i s o b t a i n e d f r o m t h e r e d o x p o t e n t i a l d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e e l e c t r o n d o n o r ( c y t c , E m 2 7 0 m V ) a n d t h e a c c e p t o r ( 0 2 fl 1 2 0 ; E m 8 1 5 m V ) ( W i k s t r o m a n d V e r k h o v s k y , 2 0 0 7 ) . T h e r e a c t i o n c a t a l y z e d b y C c O i s : 4 e ' + 8 H i n + + 0 2 ' 9 4 l ' l o m + + 2 H 2 0 w h e r e t h e s u b s c r i p t s i n a n d o u t r e f e r t o t h e i n s i d e a n d o u t s i d e o f t h e m e m b r a n e , r e s p e c t i v e l y . 1 . 2 . 4 . 1 . O x y g e n P a t h w a y A p o s s i b l e o x y g e n p a t h w a y h a s b e e n s u g g e s t e d i n a c r y s t a l s t r u c t u r e o f b o v i n e C C O ( T s u k i h a r a e t a l . , 1 9 9 6 ) a n d i n R . s p h a e r o i d e s C c O w h e r e t h e y u s e d a n 0 2 a n a l o g , 3 0 s o l u b l e i n t h e m e m b r a n e a n d c a n e a s i l y d i f f u s e i n t o t h e t r a n s m e m b r a n e p o r t i o n o f C c O , g i v i n g a c c e s s t o t h e a c t i v e s i t e . T h e x e n o n m o l e c u l e c a n b e m o r e e a s i l y i d e n t i fi e d i n t h e e l e c t r o n d e n s i t y m a p b e c a u s e x e n o n h a s m o r e e l e c t r o n s t h a n o x y g e n ( S v e n s s o n - E k e t a l . , 2 0 0 2 ) . T w o x e n o n m o l e c u l e s a r e r e s o l v e d i n t h e h y d r o p h o b i c c a v i t y s u g g e s t i n g a p o s s i b l e o x y g e n c h a n n e l l e a d i n g t o t h e b i n u c l e a r c e n t e r . T h e p r o p o s e d e n t r a n c e o f t h e o x y g e n i n t o t h e p r o t e i n i s i n t h e m e m b r a n e s p a n n i n g r e g i o n , a b o u t 3 0 A f r o m t h e t o p s u r f a c e o f t h e p r o t e i n , b e t w e e n h e l i c e s H a n d H 1 i n s u b u n i t H I . O x y g e n p a t h w a y s h a v e b e e n i d e n t i fi e d i n o t h e r o x i d a s e s t r u c t u r e s ( S o u l i m a n e e t a l . , 2 0 0 0 ) a n d b y c o m p u t a t i o n a l m e t h o d s ( H o f a c k e r a n d S c h u l t e n , 1 9 9 8 ) , a n d a l s o t e s t e d b y m u t a g e n e s i s ( R i i s t a m a e t a l . , 2 0 0 0 ) . 1 . 2 . 4 . 2 . C a t a l y t i c C y c l e o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e A t t h e p r e s e n t r e s o l u t i o n ( 1 . 8 A b o v i n e h e a r t C c O ) , C c O a p p e a r s a s a f a i r l y r i g i d p r o t e i n , s h o w i n g o n l y s u b t l e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s u p o n r e d u c t i o n s u g g e s t i n g t h a t t h e m e c h a n i s m o f o x y g e n r e d u c t i o n a n d e n e r g y c o u p l i n g i s n o t d e p e n d e n t o n c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e . E x t e n s i v e s t u d i e s u s i n g s p e c t r o s c o p i c a n d k i n e t i c m e t h o d s s u c h a s 1 3 T H ? a n d f a s t e l e c t r o n t r a n s f e r t e c h n i q u e s ( M i l l e t t a n d D u r h a m , 2 0 0 2 ; N a m s l a u e r e t a l . , 2 0 0 2 ; V e r k h o v s k y e t a l . , 1 9 9 2 ) , w h i c h m e a s u r e t h e a b s o r p t i o n s p e c t r a l c h a n g e s , h a v e r e v e a l e d a n u m b e r o f c h e m i c a l i n t e r m e d i a t e s t h a t l i k e l y i m p o r t a n t i n t h e c a t a l y t i c m e c h a n i s m a n d a r e s p e c t r a l l y a n d f u n c t i o n a l l y d i s t i n c t u p o n r e d u c t i o n o r u p o n l i g a n d b i n d i n g . D u r i n g o n e t u r n o v e r o f C c O , s e v e r a l i n t e r m e d i a t e s a r e f o r m e d t h a t r e p r e s e n t d i f f e r e n t r e d o x s t a t e s o f m e t a l c e n t e r s s u c h a s C u A , h e m e a / a 3 , a n d C u B . V a r i o u s f o r m s 0 f i n t e r m e d i a t e s h a v e b e e n p r o p o s e d w i t h d i f f e r e n t c a t a l y t i c c y c l e s , i n w h i c h t h e 3 1 m e c h a n i s m i s c o u p l e d t o e l e c t r o n a n d p r o t o n t r a n s f e r ( A n t o n i n i e t a l . , 1 9 7 7 ; B r u n o r i e r a l . , 2 0 0 5 ) . S i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s a n d t i m e - r e s o l v e d s p e c t r o s c o p i c s t u d i e s h a v e b e e n u s e d t o s t u d y t h e c a t a l y t i c r e a c t i o n a t t h e a c t i v e s i t e a t s p e c i fi c r e a c t i o n s t e p s . D u r i n g C c O t u r n o v e r ( F i g u r e 1 . 7 ) , c y t o c h r o m e c b i n d s t o C c O a t t h e e l e c t r i c a l l y p o s i t i v e s i d e o f t h e m e m b r a n e ( P - s i d e ) a n d d o n a t e s o n e e l e c t r o n a t a t i m e t o t h e p r i m a r y e l e c t r o n a c c e p t o r , C u A . C o n s e c u t i v e l y , a n e l e c t r o n i s t r a n s f e r e d t o h e m e a a n d t o t h e c a t a l y t i c s i t e , h e m e a 3 / C u B ( F a x e n e t a l . , 2 0 0 5 ) . T h e t r a n s f e r o f t w o e l e c t r o n s t o t h e o x i d i z e d C c O r e s u l t s i n r e d u c t i o n o f C u B ( s t a t e E ) , a n d a l s o t o h e m e ( 1 3 ( s t a t e R ) . T h e 0 2 b i n d s t o h e m e 5 2 3 w h e n C c O h a s t w o e l e c t r o n s d e l i v e r e d t o t h e a c t i v e s i t e , f o r m i n g t h e i n t e r m e d i a t e A . C c O i s m o r e l i k e l y i n a “ m i x e d v a l e n c e ” f o r m u n d e r p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s , i n w h i c h h e m e a 3 a n d C u ] ; a r e r e d u c e d a n d h e m e a a n d C u A a r e o x i d i z e d . C c O i s l e s s l i k e l y t o b e f u l l y r e d u c e d u n d e r i n v i v o c o n d i t i o n s b e c a u s e e l e c t r o n d e l i v e r y b y c y t o c h r o m e c i s s l o w e r t h a n t h e r a t e a t w h i c h i n t e r n a l e l e c t r o n s a r e d e l i v e r e d t o o x y g e n b o u n d a t t h e a c t i v e s i t e , u n l e s s o x y g e n a v a i l a b i l i t y i s l i m i t e d . B i n d i n g o f 0 2 t o h e m e a 3 o f m i x e d v a l e n c e C c O i s f o l l o w e d b y t h e c l e a v a g e o f t h e O - O b o n d a n d t h e f o r m a t i o n o f a s t a t e c a l l e d P M w i t h a t i m e c o n s t a n t o f ~ 3 0 0 i t s ( K a r p e f o r s e t a l . , 2 0 0 0 b ) . 3 2 ® ® G D I H O - t y r 0 2 I H O - t y r | ' O - t y r F e l l C u ' ’ F e l l - “ 0 2 C u ' ‘ F e W = O c u l l H I I H O - t y r ® F l e m O H C u ' I ' O - t y r F e ' V = O C u " I ' O - t y r F e ' " 0 H C U " I H O H F i g u r e 1 . 7 T h e c a t a l y t i c c y c l e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e d u r i n g t u r n o v e r . T h e p r o p o s e d m o d e l w a s o b t a i n e d f r o m W i k s t r o m e t a 1 . ( W i k s t r o m a n d V e r k h o v s k y , 2 0 0 7 ) . R e d a r r o w s i n d i c a t e t r a n s l o c a t i o n o f o n e p r o t o n a c r o s s t h e m e m b r a n e . T h e g r e e n a r r o w i n d i c a t e s b i n d i n g o f 0 2 i n t o t h e r e d u c e d b i n u c l e a r s i t e . T h e b l u e a r r o w i n d i c a t e s t h e r e d u c t i o n o f b o u n d o x y g e n i n t h e s i t e . T h e 0 2 b i n d s t o a t w o - e l e c t r o n r e d u c e d R i n t e r m e d i a t e w h e r e h e m e a 3 a n d C u B a r e r e d u c e d w h i l e h e m e a a n d C u t , a r e o x i d i z e d . B i n d i n g o f 0 2 t o h e m e a 3 o f m i x e d v a l e n c e C c O i s f o l l o w e d b y t h e c l e a v a g e o f t h e 0 - 0 b o n d , r e s u l t i n g i n a n i n t e r m e d i a t e , P M . A s t h e e l e c t r o n m o v e s f r o m C u A t o h e m e a , a p r o t o n i s t a k e n u p t h r o u g h D - p a t h w a y r e s u l t i n g i n f o r m a t i o n o f t h e F s t a t e . A n o t h e r p r o t o n a n d e l e c t r o n a r e t r a n s f e r r e d , f o r m i n g t h e o x i d i z e d C c O ( O H ) . T r a n s f e r o f t w o e l e c t r o n s t o O H c o m p l e t e s t h e c a t a l y t i c c y c l e t h r o u g h E H . 3 3 i r s o T h T c h o s i e u l c d a f o u r - e l e c t r s s - l i a l s o n b k e e d h a i p s t r o o i n t r e q e — d i o n n u t d i o y r r n i o n s g i n o r r e f e a m c t a i y o n , a n d p r o v b i d e o n o r O - O C d u t B h e c l a e n f o d u r h t e h m e e l a v a g e , c o a n a 3 e w c h t e r n n h o n 0 m e i n e l y p r o 2 e d r a v s u i i d c t e o x i o t , n i h r e e a d i z n e . d d a n d V e r k h o v s k y , 2 0 0 7 ) - 3 4 ( G o r b i k o v a e t a l . , 2 0 0 8 ; P r o s h l y a k o v e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h e i n i t i a l a s s i g n m e n t s o f P M p o s t u l a t e d t h a t i t c o n t a i n e d a n i n t a c t b o n d , a 3 3 * - O - 0 2 ' s p e c i e s , h e n c e i t s d e s i g n a t i o n a s P f o r “ p e r o x y ” ( B a b c o c k a n d W i k s t r o m , 1 9 9 2 ; W i k s t r o m , 1 9 8 9 ) b u t t h i s f o r m w a s u n d e t e c t a b l e b y t i m e - r e s o l v e d R a r n a n m e a s u r e m e n t s . R e c e n t d a t a s u g g e s t s t h a t t h e O - O b o n d i s a l r e a d y b r o k e n i n t h e P M s t a t e ( F a b i a n e t a l . , 1 9 9 9 ) a n d f o r m s a f e r r y l s t a t e , F e a 3 4 + = 0 2 ' , a n d C u A Z I - O H ' i n s t e a d o f t h e p r e v i o u s l y p r o p o s e d p e r o x y f o r m ( K i t a g a w a a n d O g u r a , 1 9 9 8 ) . I n t h e n e x t s t e p , a s a n e l e c t r o n m o v e s f r o m C u A t o h e m e a , a p r o t o n i s t a k e n u p f r o m t h e s o l u t i o n t h r o u g h t h e D - p a t h w a y t o t h e c a t a l y t i c s i t e , r e s u l t i n g i n f o r m a t i o n o f t h e f e r r y ] i n t e r m e d i a t e , F . F i n a l l y , a n o t h e r p r o t o n a n d e l e c t r o n a r e t r a n s f e r r e d t o t h e c a t a l y t i c s i t e , r e s u l t i n g i n f o r m a t i o n o f t h e o x i d i z e d C C O ( 0 i n t e r m e d i a t e ) , w h i c h c o m p l e t e s t h e c a t a l y t i c c y c l e . I n t h e p a r a l l e l r e a c t i o n o f t h e f u l l y r e d u c e d C c O , a p e r o x y i n t e r m e d i a t e ( P R ) i s f o r m e d t h a t a l s o h a s a s p l i t o x y g e n b o n d , b u t t h e f o u r t h e l e c t r o n c a n b e d o n a t e d m o r e r a p i d l y f r o m t h e r e d u c e d h e m e a . T h e s t r u c t u r e s o f P M a n d P R a r e p r e s u m a b l y t h e s a m e ( G o r b i k o v a e t a l . , 2 0 0 8 ; M o r g a n e t a l . , 2 0 0 1 ) . E a c h o f t h e e l e c t r o n t r a n s f e r s d u r i n g t h e 0 9 E , E - ) R , P - > F a n d F 9 0 t r a n s i t i o n s i s c o u p l e d t o p r o t o n u p t a k e f r o m t h e m e m b r a n e n e g a t i v e s i d e , a n d h a s b e e n s u g g e s t e d t o b e a s s o c i a t e d w i t h p r o t o n p u m p i n g ( W i k s t r o m 1 . 2 . 4 . 3 . M i s s i n g E l e c t r o n d u r i n g 0 2 C l e a v a g e A s i n d i c a t e d a b o v e , d u r i n g t h e r e d u c t i v e c l e a v a g e o f t h e d i o x y g e n a t t h e a c t i v e s i t e o f C c O , t h e i n t e r m e d i a t e ( P ) i s f o r m e d , w i t h t h e O - O b o n d b r o k e n ( F e 4 + = O z ' , C u s h - O H ' ) . I n o r d e r t o b r e a k t h e O — O b o n d , f o u r e l e c t r o n s a n d o n e p r o t o n a r e r e q u i r e d . B u t o n l y t h r e e o f t h e f o u r e l e c t r o n s t h a t a r e r e q u i r e d f o r t h i s p r o c e s s c a n b e p r o v i d e d b y t h e m e t a l c e n t e r s ( t w o f r o m h e m e a 3 a n d o n e f r o m C u B ) . T h e m i s s i n g e l e c t r o n i s l i k e l y t o b e d o n a t e d b y a n a m i n o a c i d r e s i d u e c l o s e t o t h e b i n u c l e a r c e n t e r ( S v e n s s o n - E k e t a l . , 2 0 0 2 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e f o u r t h e l e c t r o n c o m e s f r o m t h e c r o s s - l i n k e d t y r o s i n e ( Y 2 8 8 - H 2 8 4 ) t h a t i s o x i d i z e d t o a n e u t r a l t y r o s y l r a d i c a l w h e n t h e P M i s f o r m e d ( P r o s h l y a k o v e t a l . , 2 0 0 0 ) ( F i g u r e 1 . 8 ) . A t y r o s i n e r a d i c a l h a s b e e n f o u n d i n t h e P M a n d F i n t e r m e d i a t e s o f P a r a c c o c u s C c O u s i n g E P R s p e c t r o s c o p y b y a d d i t i o n o f H 2 0 2 ( M a c M i l l a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . F r o m t h e m u t a n t s t u d y o f c o n s e r v e d r e s i d u e s , t h e o r i g i n o f t h e r a d i c a l f o u n d i n C c O h a s b e e n a s s i g n e d t o t y r o s i n e 1 7 5 ( R h o d o b a c t e r n u m b e r i n g ) fi r s t . H o w e v e r , t h i s r e s i d u e i s n o t e s s e n t i a l f o r t h e f u n c t i o n o f t h e e n z y m e , b e c a u s e a n e q u i v a l e n t m u t a t i o n i n P . d e n i t r i fi c a n s C c O ( Y 1 6 7 F ) w a s s t i l l a b l e t o f o r m t h e P M i n t e r m e d i a t e a n d m a i n t a i n a h i g h t u r n o v e r r a t e w h i l e r e t a i n i n g f u l l p r o t o n p u m p i n g a c t i v i t y . R e c e n t p r e - s t e a d y s t a t e r e a c t i o n k i n e t i c s o f C c O s u g g e s t s t h a t W 2 8 0 ( R . s p h a e r o i d e s n u m b e r i n g ) c o u l d b e t h e a c t u a l d o n o r o f t h e m i s s i n g e l e c t r o n i n t h e o x y g e n b o n d c l e a v a g e r e a c t i o n ( W i e r t z e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e r e s u l t s m e a s u r e d w i t h C c O f r o m P . d e n i t n fi c a n s s u g g e s t t h a t a t r y p t o p h a n r e s i d u e ( W 2 7 2 i n P a r a c o c c u s n u m b e r i n g , W 2 8 0 i n R . s p n u m b e r i n g ) m i g h t f o r m a n 3 5 i n t e r m e d i a t e r a d i c a l s t a t e b e t w e e n t h e o r i g i n a l d o n o r Y 1 6 7 ( Y 1 7 5 i n R . s p ) , a n d t h e c r o s s - l i n k e d Y 2 8 0 ( Y 2 8 8 i n R . s p ) . M u t a t i o n s o f t h e t r y p t o p h a n , W 2 7 2 M ( W 2 8 0 i n R . s p ) , W 2 7 2 F , l e a d t o t h e c o m p l e t e l o s s o f c a t a l y t i c a c t i v i t y a n d t h e a b i l i t y t o f o r m t h e o x o f e r r y l i n t e r m e d i a t e s ( P M , F ) i n t h e r e a c t i o n w i t h h y d r o g e n p e r o x i d e , i n d i c a t i n g t h a t t h e c l e a v a g e o f t h e o x y g e n b o n d m i g h t n o t b e p o s s i b l e i n e i t h e r o f t h e W 2 7 2 m u t a n t s . M o r e o v e r , t h e E P R s i g n a l d i d n o t s h o w t h e p r e s e n c e o f r a d i c a l s p e c i e s i n t h e s e m u t a n t s . T h e W 2 7 2 m a y b e t h e o r i g i n a l d o n o r o f t h e m i s s i n g e l e c t r o n , w h i c h i s t h e n r e p l e n i s h e d b y a n e a r b y t y r o s i n e r e s i d u e , e i t h e r t y r o s i n e 1 6 7 ( 3 A a w a y ) o r t h e c r o s s l i n k e d t y r o s i n e 2 8 0 ( M a c M i l l a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . 3 6 H i s 2 8 - 1 ‘ T v r 2 8 8 2 + ' 4 + H e m e 3 3 H e m e 3 3 F i g u r e 1 . 8 T h e a c t i v e b i n u c l e a r s i t e s t r u c t u r e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . T h e r a p i d , c o n c e r t e d s u p p l y o f 4 e l e c t r o n s f r o m c y t o c h r o m e c i s r e q u i r e d f o r t h e r e d u c t i o n o f 0 2 t o H 2 0 . T h e m e c h a n i s m i s d e s i g n e d t o p r e v e n t t h e p r o d u c t i o n o f h a r m f u l i n t e r m e d i a t e s s u c h a s r a d i c a l s p e c i e s . W h e n t h e a c t i v e s i t e i s r e d u c e d w i t h t w o e l e c t r o n s , o x y g e n i s b o u n d . T h e o t h e r e l e c t r o n s c o m e f r o m h e m e a 3 i r o n ( F e 2 + - > F e 4 + ) a n d C u B . T h e l a s t e l e c t r o n i s o b t a i n e d f r o m a C c O t y r o s i n e c r o s s - l i n k e d t o a h i s t i d i n e , p r o d u c i n g a n e u t r a l t y r o s i n e r a d i c a l . 3 7 1 . 2 . 5 . C o n t r o l o f A c t i v i t y i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e 1 . 2 . 5 . 1 . E f f e c t o f M e m b r a n e P o t e n t i a l a n d p H G r a d i e n t T h e m e c h a n i s m o f e n e r g y c o u p l i n g i n C c O c a n b e s t u d i e d b y m e a s u r i n g t h e e f f e c t o f a n e l e c t r o c h e m i c a l p r o t o n g r a d i e n t o n t h e s t e a d y s t a t e s p e c t r a w i t h t i g h t l y c o u p l e d C c O v e s i c l e s u s i n g e i t h e r c y t o c h r o m e c ( G r e g o r y a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 8 9 ) o r h e x a a m i n e r u t h e n i u m ( I I ) a s a r e d u c t a n t t o r a p i d l y r e d u c e c y t o c h r o m e c . I t w a s o b s e r v e d t h a t t h e e l e c t r o n t r a n s f e r b e t w e e n h e m e a a n d h e m e a 3 w a s i n h i b i t e d b y t h e b u i l d u p o f a n e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t ( M o r o n e y e t a l . , 1 9 8 4 ) . H e m e a w a s r e d u c e d u p t o 8 0 % i n t h e s t e a d y s t a t e i n t h e c o u p l e d v e s i c l e s , a s m e a s u r e d b y t h e a b s o r b a n c e a t 4 4 6 n m . W i t h t h e a d d i t i o n o f n i g e r i c i n , a n i o n o p h o r e t h a t a l l o w s t h e o v e r a l l n e u t r a l e x c h a n g e o f K " f o r H + , w h i c h c a u s e s a d e c r e a s e s i n t h e A p H w h i l e i n c r e a s i n g t h e N P , h e m e a b e c a m e m o r e o x i d i z e d , w i t h o u t a c h a n g e i n t h e r a t e o f r e s p i r a t i o n , i n t h e s t e a d y s t a t e c o n d i t i o n . O n t h e o t h e r h a n d , u n c o u p l e r s , s u c h a s C C C P , t r a n s p o r t H + a c r o s s t h e m e m b r a n e a n d l o w e r b o t h t h e E l [ : 1 a n d E l p H , w h i c h c a u s e s a 2 - t o 8 - f o l d s t i m u l a t i o n o f t h e r e s p i r a t i o n , a n d l o w e r s t h e s t e a d y s t a t e l e v e l o f t h e r e d u c t i o n o f h e m e a . S o l u b i l i z e d C c O a l s o s h o w e d a p H d e p e n d e n c y o n t h e r e d u c t i o n k i n e t i c s o f h e m e a . T h i s r e s u l t i n d i c a t e s t h a t t h e e l e c t r o n t r a n s f e r b e t w e e n h e m e a a n d a 3 i s s e n s i t i v e t o t h e p H g r a d i e n t . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h a n a l y s i s o f t h e s t e a d y - s t a t e b y G r e g o r y e t a l . ( G r e g o r y a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 8 9 ) , w h i c h s h o w e d t h a t t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l h a d g r e a t e r c o n t r o l o f t h e C u A t o h e m e a r a t e , w h i l e t h e p H g r a d i e n t a f f e c t e d t h e h e m e a 9 a 3 e l e c t r o n t r a n s f e r m o r e s t r o n g l y . I t i s a l s o p r O p o s e d t h a t t h e p H o n t h e i n s i d e o f t h e m e m b r a n e f u l l y d e t e r m i n e s t h e k i n e t i c s o f 3 8 i n t e r n a l e l e c t r o n t r a n s f e r s t h a t a r e l i n k e d t o p r o t o n p u m p i n g ( F a x e n a n d B r z e z i n s k i , 2 0 0 7 ) . I n t h e m i t o c h o n d r i a , t h e m i d p o i n t p o t e n t i a l o f C c O h e m e a w a s s e n s i t i v e t o t h e p H i n s i d e ( W i l s o n e t a l . , 1 9 7 6 ) i n d i c a t i n g t h a t t h e m a t r i x s i d e o f t h e m e m b r a n e c o n t r o l s t h e s t e a d y - s t a t e l e v e l o f r e d u c t i o n o f h e m e a . T i m e r e s o l v e d o p t i c a l a b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p y , u s i n g r e d o x d e p e n d e n t a b s o r p t i o n c h a n g e s o f t h e t w o h e m e s a n d C u , i n t h e v i s i b l e - n e a r i n f r a r e d , w a s u s e d t o s t u d y e l e c t r o n t r a n s f e r t h r o u g h C c O d u r i n g t h e c a t a l y t i c c y c l e . B o t h t h e s t e a d y - s t a t e t u r n o v e r r a t e o f C c O , a n d t h e r a t e o f t h e s p e c i fi c r e a c t i o n s t e p s w h i c h a r e a s s o c i a t e d w i t h p r o t o n u p t a k e a n d p u m p i n g d i s p l a y e d p H - d e p e n d e n t k i n e t i c s w h e n s t u d i e d i n d e t e r g e n t s o l u t i o n ( O l i v e b e r g e t a l . , 1 9 8 9 ; T h o m s t r o m e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e e f f e c t o f p H g r a d i e n t s o n t h e r e a c t i o n c a t a l y z e d b y C c O , s h o w e d t h a t t h e c a t a l y t i c s i t e i s i n p r o t o n e q u i l i b r i u m w i t h t h e i n s i d e o f t h e v e s i c l e s ( S h a r p e e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e r a t e s o f t h e i n d i v i d u a l r e a c t i o n s t e p s d e p e n d o n p H . T h e m e a s u r e d k i n e t i c s o f a n i n t e r n a l e l e c t r o n t r a n s f e r s u g g e s t e d t h a t t h e p H o n t h e i n s i d e o f t h e v e s i c l e s f u l l y d e t e r m i n e s t h e r a t e s o f t h e r e a c t i o n s t e p s t h a t a r e l i n k e d t o p r o t o n p u m p i n g ( F a x e n a n d B r z e z i n s k i , 2 0 0 7 ) . T h e t r a n s i t i o n k i n e t i c s w e r e i n s e n s i t i v e t o t h e p H o n t h e o u t s i d e o f t h e v e s i c l e s . T h e s t o p p e d - fl o w k i n e t i c s o f t h e c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n r a t e s s u g g e s t e d t h a t t h e e l e c t r o c h e m i c a l p o t e n t i a l c o n t r o l l e d t h e a c t i v i t y o f C c O ( B r u n o r i e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e t i m e c o u r s e o f t h e o x i d a t i o n o f r e d u c e d c y t o c h r o m e c b i n d i n g t o C O V s w a s m e a s u r e d b y a r a p i d m i x i n g s t o p p e d - fl o w e x p e r i m e n t i n t h e p r e s e n c e o f v a r i o u s i o n o p h o r e s . I n t h e p r e s e n c e o f v a l i n o m y c i n a n d C C C P , w h e r e t h e e l e c t r o c h e m i c a l p o t e n t i a l a n d p H g r a d i e n t s a r e t o t a l l y c o l l a p s e d , t h e t i m e c o u r s e o f t h e r e a c t i o n i s v e r y c l o s e t o b e i n g 3 9 e x p o n e n t i a l . T h e i o n o p h o r e , v a l i n o m y c i n a l o n e , c o l l a p s e s t h e e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t a n d a l s o a l l o w s i n c r e a s e d a c t i v i t y . T h e s e r e s u l t s l e a d t o a p r 0 p o s a l t h a t t h e a c t i v i t y o f C c O i s c o n t r o l l e d b y t h e e l e c t r o c h e m i c a l p o t e n t i a l g r a d i e n t . A s t h e r e d u c e d c y t o c h r o m e c i s o x i d i z e d , t h e r e i s a b u i l d u p i n t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l d u e t o t h e t r a n s l o c a t i o n o f p r o t o n s a n d c o n s u m p t i o n o f e l e c t r o n s . T h e c o m p l e x i t y o f t h e e l e c t r o n a n d p r o t o n t r a n s f e r r e a c t i o n s i n C 0 0 , a n d t h e d i f f e r e n c e i n s i z e a n d b u f f e r i n g i n a r t i fi c i a l r e c o n s t i t u t e d s y s t e m s m a y a c c o u n t f o r t h e c o n fl i c t i n g d a t a o b t a i n e d b y v a r i o u s i n v e s t i g a t i o n s . S t u d i e s r e p o r t e d i n t h i s t h e s i s w e r e a i m e d a t c l a r i f y i n g s o m e o f t h e s e i s s u e s . 1 . 2 . 5 . 2 . C y t o c h r o m e c B i n d i n g t o t h e C o m p l e x T h e e l e c t r o n t r a n s f e r r e a c t i o n b e t w e e n c y t o c h r o m e c a n d R . s p h a e r o i d e s C c O w a s s t u d i e d u s i n g a c y t o c h r o m e c d e r i v a t i v e l a b e l e d w i t h r u t h e n i u m t r i s b i p y r i d i n e a t l y s i n e 5 5 ( R u - S S - C c ) ( W a n g e t a l . , 1 9 9 9 ) . F l a s h p h o t o l y s i s o f a 1 : 1 c o m p l e x b e t w e e n R u - 5 5 — C c a n d C c O a t l o w i o n i c s t r e n g t h r e s u l t s i n r a p i d e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m t h e p h o t o - r e d u c e d h e m e c t o C u A f o l l o w e d b y e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m C u p , t o h e m e a . A h i g h l y c o n s e r v e d t r y p t o p h a n w a s m u t a t e d t o a n a l a n i n e ( W 1 4 3 A ) w h i c h d e c r e a s e d t h e i n t r a c o m p l e x e l e c t r o n t r a n s f e r , s u g g e s t i n g a n i m p o r t a n t r o l e o f W 1 4 3 , t o m e d i a t e e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m t h e h e m e g r o u p o f C c t o C u ( F i g u r e 1 . 9 ) . 4 0 h v R u _ 3 9 _ C c C y t o c h r o m e O x i d a s e . i ‘ 7 " . ' / P L : s ‘ s . \ H e m L A Y “ _ . . y , , I ; e . a s , . r " i A . - . 3 ' - s 7 / \ ~ . . . \ K i s s , F i g u r e 1 . 9 I n t r a c o m p l e x e l e c t r o n t r a n s f e r i n C c O u s i n g a R u - 3 9 d e r i v a t i v e o f c y t o c h r o m e c . L a s e r i n d u c e d e l e c t r o n t r a n s f e r o c c u r s f r o m a n a c t i v a t e d R u ( I I * ) t o t h e h e m e o f C c a n d t h e n t o C u A a n d h e m e a . E a c h i n d i v i d u a l r e a c t i o n r a t e i s m e a s u r e d b y m o n i t o r i n g a b s o r b a n c e c h a n g e s a t 5 8 0 n m ( F i n t e r m e d i a t e ) , 6 0 5 n m ( h e m e a ) , a n d 8 3 0 n m ( C u A ) . T r y p t o p h a n 1 4 3 i s s h o w n i n p u r p l e . T h e fi g u r e i s f r o m D r . F r a n k M i l l e t t , u n p u b l i s h e d . \ t 4 1 T h e e l e c t r o n t r a n s f e r m a y b e c o n t r o l l e d b y t h e r a t e o f c y t o c h r o m e c d i s s o c i a t i o n f r o m t h e C c O ( E r r e d e a n d K a m e n , 1 9 7 8 ) . T h e k i n e t i c c o n s t a n t s o b t a i n e d s u p p o r t t h e i d e a t h a t t h e b i n d i n g o f c y t o c h r o m e c i s t h e d o m i n a n t p a r a m e t e r i n r e a c t i v i t y . E f fi c i e n t e l e c t r o n t r a n s f e r b e t w e e n c y t o c h r o m e c ( C c ) a n d c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( C c O ) d e p e n d s o n t h e b i n d i n g i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e m ( W a n g e t a l . , 1 9 9 9 ) . F a c i l i t a t i o n o f t h e r a p i d f o r m a t i o n o f a c o m p l e x a n d a n o p t i m a l o r i e n t a t i o n o f t h e c o m p l e x i s r e q u i r e d f o r r a p i d e l e c t r o n t r a n s f e r t o t h e e l e c t r o n a c c e p t o r , C u A . R a p i d d i s s o c i a t i o n , t o r e l e a s e f e r r i c y t o c h r o m e c , a s w e l l a s r a p i d b i n d i n g , i s a l s o i m p o r t a n t i n m a i n t a i n i n g a c t i v i t y . S t e a d y s t a t e k i n e t i c s s h o w e d t h a t t h e r e a c t i o n r a t e w a s l i m i t e d b y c y t o c h r o m e c d i s s o c i a t i o n a t l o w i o n i c s t r e n g t h , a n d b y c y t o c h r o m e c a s s o c i a t i o n a t h i g h i o n i c s t r e n g t h , i n d i c a t i n g a s i g n i fi c a n t e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e c y t o c h r o m e c a n d C c O . C h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t t h e h i g h l y c o n s e r v e d l y s i n e a m i n o g r o u p s i n c y t o c h r o m e c a r e i n v o l v e d i n t h e e l e c t r o s t a t i c c o m p l e x w i t h c y t o c h r o m e o x i d a s e ( F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . , 1 9 7 8 ) . T h e r e i s e v i d e n c e t h a t a t l e a s t f o u r c a r b o x y l a t e g r o u p s o n s u b u n i t H o f C c O m i g h t b e i n v o l v e d i n t h e e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n w i t h c y t o c h r o m e c ( F e r g u s o n — M i l l e r e t a l . , 1 9 7 8 ; M i l l e t t e t a l . , 1 9 8 3 ) . S t o p p e d - fl o w s p e c t r o s c o p y h a s b e e n u s e d t o m e a s u r e t h e r a t e o f c o m p l e x f o r m a t i o n , b u t t h i s m e t h o d h a s i n s u f fi c i e n t t i m e r e s o l u t i o n t o m e a s u r e t h e i n t r a c o m p l e x e l e c t r o n t r a n s f e r . A p h o t o r e d u c t i o n t e c h n i q u e u s i n g r u t h e n i u m d e r i v a t i v e s h a s a l l o w e d t h e s t u d y o f i n d i v i d u a l s t e p s i n t h e m e c h a n i s m , d u r i n g i n t r a c o m p l e x e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m C c t o t h e i n i t i a l a c c e p t o r i n C c O ( S i l e t s k y e t a l . , 2 0 0 6 ) . F o r e x a m p l e , t i m e - r e s o l v e d e l e c t r o n t r a n s f e r a n d v e c t o r i a l c h a r g e t r a n s l o c a t i o n i n t h e F - ) 0 t r a n s i t i o n h a s b e e n s t u d i e d w i t h 4 2 t h e N 1 3 9 D m u t a n t u s i n g t h e r u t h e n i u m ( H ) - t r i s - b i p y r i d y l c o m p l e x a s a p h o t o a c t i v e s i n g l e e l e c t r o n d o n o r ( S i l e t s k y e t a l . , 2 0 0 4 ) . 1 . 2 . 5 . 3 . R o l e o f S u b u n i t [ 1 1 W h i l e m a m m a l i a n o x i d a s e i s c o m p o s e d o f 1 3 d i f f e r e n t s u b u n i t s , o n l y t h r e e o f t h e l a r g e s t s u b u n i t s f o r m t h e c a t a l y t i c c o r e o f t h e e n z y m e . S u b u n i t H I o f C c O i s a h i g h l y c o n s e r v e d h y d r o p h o b i c p r o t e i n t h a t c o n t a i n s n o m e t a l r e d o x c e n t e r s . S u b u n i t H 1 i s p a r t o f t h e c a t a l y t i c c o r e o f C c O a l o n g w i t h s u b u n i t I a n d H a n d i s e n c o d e d b y t h e m i t o c h o n d r i a l g e n o m e . S u b u n i t I H i s c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h s u b u n i t I b u t i s e a s i l y r e m o v e d f r o m C c O b y u s i n g h i g h p H a n d a d e t e r g e n t s u c h a s T r i t o n X - 1 0 0 . S u b u n i t H I - d e p l e t e d o x i d a s e g e n e r a l l y e x h i b i t s a d e c r e a s e d p r o t o n p u m p i n g e f fi c i e n c y w i t h o u t i n h i b i t i n g t h e i n i t i a l a c t i v i t y o f t h e e n z y m e ( B r a t t o n e t a l . , 1 9 9 9 ; G i l d e r s o n e t a l . , 2 0 0 3 ; G r e g o r y a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 8 8 ) . S u b u n i t H I h a s b e e n s u g g e s t e d t o p l a y a r o l e i n t h e p r o t o n p u m p i n g e f fi c i e n c y o f C c O ( W i l s o n a n d P r o c h a s k a , 1 9 9 0 ) , p r o t o n c h a n n e l i n g ( T h o m p s o n e t a l . , 1 9 8 5 ) , o x i d a s e a s s e m b l y ( H a l t i a e t a l . , 1 9 8 9 ) , a n d O z c h a n n e l i n g ( R i i s t a m a e t a l . , 1 9 9 6 ) . R e c e n t w o r k s h o w s t h a t s u b u n i t H I h a s a n e f f e c t o n t h e t r a n s f e r o f p r o t o n s t h r o u g h s u b u n i t I ( H o s l e r , 2 0 0 4 ) . T h e D a n d K - p a t h w a y s l e a d p r o t o n s f r o m t h e i n n e r s u r f a c e i n t o t h e h e m e r e g i o n o f C c O , b u t o n l y t h e D - p a t h w a y i s c l o s e t o s u b u n i t H I . I n f a c t , t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f C c O s h o w t h a t D 1 3 2 i s l o c a t e d a t a j u n c t i o n o f s u b u n i t I a n d H I , s u c h t h a t h a l f o f t h e r e s i d u e s s u r r o u n d i n g D 1 3 2 c o m e f r o m s u b u n i t H I . W h e n s u b u n i t H 1 i s d e p l e t e d , D 1 3 2 i s m o r e l i k e l y t o b e e x p o s e d t o t h e b u l k s o l v e n t . S i n g l e t u r n o v e r e x p e r i m e n t s s h o w l a r g e d i f f e r e n c e s i n t h e r a t e o f D - p a t h w a y p r o t o n u p t a k e i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f s u b u n i t H I , f r o m > 1 0 0 0 t o ~ 3 5 0 5 ' ] , r e s p e c t i v e l y , a t 4 3 p H 8 ( G i l d e r s o n e t a l . , 2 0 0 3 ) . H o w e v e r , r a p i d p r o t o n u p t a k e i s r e s t o r e d a t l o w p H ( < 6 ) t o s u b u n i t H I — d e p l e t e d C c O . I n t h e s t e a d y s t a t e t u r n o v e r , t h e o v e r a l l a c t i v i t y o f s u b u n i t H I - d e p l e t e d C c O i s l i m i t e d b y t h e r a t e o f p r o t o n u p t a k e t h r o u g h t h e D - p a t h w a y a t p H 7 a n d a b o v e . S l o w p r o t o n u p t a k e i n t h e a b s e n c e o f s u b u n i t H 1 i s a t t r i b u t e d t o c h a n g e s i n t h e p K a o f D 1 3 2 o r t h e l o s s o f p r o t o n - c o l l e c t i n g g r o u p s o n t h e i n n e r s u r f a c e ( M a r a n t z e t a l . , 2 0 0 1 ; M a r a n t z e t a l . , 1 9 9 8 ) . A p r o t o n a n t e n n a h a s b e e n p r o p o s e d t o a i d p r o t o n u p t a k e i n b a c t e r i o r h o d o p s i n ( C h e c o v e r e t a l . , 2 0 0 1 ; G u t m a n a n d N a c h l i e l , 1 9 9 0 ) a n d t h e p h o t o s y n t h e t i c r e a c t i o n c e n t e r , a s w e l l a s i n C c O ( A d e l r o t h a n d B r z e z i n s k i , 2 0 0 4 ) . S u r f a c e e x p o s e d p r o t o n a t a b l e g r o u p s , e . g . , c a r b o x y l a t e r e s i d u e s a n d h i s t i d i n e s , w h i c h c a p t u r e p r o t o n s f r o m t h e b u l k s o l v e n t a n d t r a n s f e r t h e m a l o n g t h e s u r f a c e o f t h e p r o t e i n b y a p r o c e s s o f r e l e a s e a n d r e c a p t u r e , e f f e c t i v e l y i n c r e a s i n g t h e l o c a l p r o t o n c o n c e n t r a t i o n n e a r t h e e n t r y p o i n t o f a p a t h w a y . T h e s i n g l e t u r n o v e r e x p e r i m e n t s s h o w t h a t t h e r e p r o t o n a t i o n r a t e o f E 2 8 6 f r o m t h e b u l k s o l v e n t , v i a D 1 3 2 a n d t h e D - p a t h w a y w a t e r c h a i n , i s 1 , 0 0 0 - f o l d g r e a t e r t h a n t h e b i m o l e c u l a r r a t e c o n s t a n t f o r t h e d i f f u s i o n l i m i t e d t r a n s f e r o f a b u f f e r p r o t o n t o D 1 3 2 ( N a m s l a u e r e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h i s i s i n t e r p r e t e d a s e v i d e n c e f o r a p r o t o n a n t e n n a f o r t h e D - p a t h w a y . W i t h o u t s u b u n i t I H , t h e n u m b e r o f a n t e n n a r e s i d u e s o n t h e i n n e r s u r f a c e o f C 0 0 m a y f a l l b e l o w t h e t h r e s h o l d r e q u i r e d f o r i t s o p e r a t i o n ( G e o r g i e v s k i i e t a l . , 2 0 0 2 ) I n t h e r e c o n s t i t u t e d C c O , t h e r a t e o f 0 2 r e d u c t i o n i s s l o w d u e t o t h e i n h i b i t i o n o f p r o t o n u p t a k e a g a i n s t a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l . H o w e v e r , a s l o w r a t e o f “ c o n t r o l l e d ” t u r n o v e r i s m a i n t a i n e d b y p r o t o n b a c k fl o w f r o m t h e o u t e r s u r f a c e o f t h e e n z y m e ( M i l l s e t 4 4 a l . , 2 0 0 3 ) t o t h e a c t i v e s i t e . T h e r e m o v a l o f s u b u n i t H I i n h i b i t s t h i s b a c k fl o w o f p r o t o n s , a s e v i d e n c e d b y a m u c h s l o w e r r a t e o f c o n t r o l l e d t u r n o v e r ( M i l l s a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 2 0 0 3 ) . T h e e f f e c t o f i n h i b i t i o n b y r e m o v i n g s u b u n i t 1 ] ] i s s i m i l a r , b u t a d d i t i v e , t o t h e i n h i b i t i o n e f f e c t b y z i n c . I t s e e m s t h a t s u b u n i t H I f a c i l i t a t e s b o t h t h e u p t a k e a n d e x i t o f p u m p p r o t o n s , s u g g e s t i n g t h a t t h e b a c k fl o w p r o t o n p a t h w a y o p e r a t e s v i a t h e r e v e r s a l o f t h e e x i t p a t h . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e l o n g — k n o w n o b s e r v a t i o n t h a t t h e r e m o v a l o f s u b u n i t H I d e c r e a s e s t h e e f fi c i e n c y o f p r o t o n p u m p i n g t o a p p r o x i m a t e l y h a l f t h a t o f s u b u n i t H I - c o n t a i n i n g C c O ( G r e g o r y a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 8 8 ; W i l s o n a n d P r o c h a s k a , 1 9 9 0 ) . P a r t i c u l a r l y , s u b u n i t H I - l e s s C c O h a s b e e n r e p o r t e d t o e x h i b i t s u i c i d e i n a c t i v a t i o n w i t h a d e c r e a s e d c a t a l y t i c l i f e s p a n , d e p e n d e n t o n t h e n u m b e r o f t u r n o v e r s . M u l t i p l e t u r n o v e r s r e s u l t i n t h e i r r e v e r s i b l e l o s s o f a c t i v i t y ( H a l t i a e t a l . , 1 9 9 1 ) a p p a r e n t l y d u e t o s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n o f t h e C u B c e n t e r d u r i n g t h e c a t a l y t i c c y c l e ( B r a t t o n e t a l . , 1 9 9 9 ; H o s l e r , 2 0 0 4 ) . S u i c i d e i n a c t i v a t i o n i s t i g h t l y l i n k e d t o p r o t o n t r a n s f e r ( M i l l s a n d H o s l e r , 2 0 0 5 ) . M u t a t i o n s t h a t i n h i b i t t h e D - p a t h w a y b u t n o t t h e K - p a t h w a y i n d u c e s u i c i d e i n a c t i v a t i o n . L i k e w i s e , t h e i n h i b i t e d p r o t o n u p t a k e a t h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l i n c r e a s e s t h e p o s s i b i l i t y o f s u i c i d e i n a c t i v a t i o n . I t i s a r g u e d t h a t d e l a y i n p r o t o n t r a n s f e r i n c r e a s e s t h e l i f e t i m e o f a r e a c t i v e 0 2 i n t e r m e d i a t e s u c h a s a n o x o f e r r y l f o r m o r a t y r o s y l r a d i c a l . T h e D 1 3 2 A / R 4 8 1 K d o u b l e m u t a n t i n c r e a s e s t h e p r o b a b i l i t y o f s u i c i d e i n a c t i v a t i o n e v e n w i t h s u b u n i t H I p r e s e n t b e c a u s e o f s i m u l t a n e o u s i n h i b i t i o n o f p r o t o n u p t a k e b o t h f r o m b a c k fl o w a n d f r o m i n n e r s u r f a c e . T h i s r e s u l t s u g g e s t s a p h y s i o l o g i c a l r o l e o f p r o t o n b a c k fl o w . U n d e r c o n d i t i o n s o f a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l , w h e r e p r o t o n u p t a k e b y t h e 4 5 D - p a t h w a y i s s t r o n g l y i n h i b i t e d , p r o t o n fl o w t o t h e a c t i v e s i t e , v i a t h e b a c k fl o w p a t h w a y , h e l p s t o p r e v e n t i n a c t i v a t i o n o f C c O . 1 . 3 . P r o t o n P u m p i n g M e c h a n i s m o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e P r o t o n s a r e k n o w n t o m o v e r a p i d l y t h r o u g h o r d e r e d c h a i n s o f w a t e r , b u t h o w t h e r a t e a n d t h e d i r e c t i o n o f t h e p r o t o n m o v e m e n t a r e c o n t r o l l e d , a n d h o w i t i s c o u p l e d t o e l e c t r o n t r a n s f e r , i s c o n t r o v e r s i a l . M e c h a n i s t i c q u e s t i o n s a l s o a r i s e f r o m t h e f a c t t h a t p r o t o n s a r e m o v e d a g a i n s t a n e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t , r e q u i r i n g a g a t i n g p r o c e s s t o p r e v e n t t h e b a c k fl o w o f p r o t o n s . C o m p r e h e n s i v e k n o w l e d g e o f C c O s t r u c t u r e , f u n c t i o n , a n d k i n e t i c / s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s h a s a l l o w e d t h e c r e a t i o n o f v a r i o u s m o d e l s t o e x p l a i n h o w t h e p r o t o n p u m p f u n c t i o n s . A c l u s t e r o f h e m e p r o p i o n a t e s , t w o a r g i n i n e s , a n d a n a s s o c i a t e d w a t e r n e t w o r k a b o v e t h e h e m e s i s l i k e l y t o b e a n a c c e p t o r s i t e f o r p r o t o n s , r e g a r d l e s s o f t h e m e c h a n i s m o f t h e p u m p . P r o t o n t r a n s f e r i n C c O i n v o l v e s h y d r o g e n - b o n d e d w a t e r c h a i n s , b u t e x p e r i m e n t a l r e s u l t s a n d c o m p u t a t i o n a l a n a l y s e s r e v e a l c o m p l e x i t i e s w h i c h a r e y e t t o b e s o l v e d , s u c h a s t h e a p p a r e n t d i s c o n t i n u i t i e s i n t h e w a t e r c h a i n s i n t h e h y d r o p h o b i c r e g i o n s . 1 . 3 . 1 . A p p r o a c h e s t o U n d e r s t a n d i n g t h e C a t a l y t i c M e c h a n i s m 1 . 3 . 1 . 1 . E l e c t r o m e t r i c M e a s u r e m e n t T h e e l e c t r o m e t r i c t e c h n i q u e m a y b e u s e d t o m o n i t o r c h a r g e t r a n s l o c a t i o n d u e t o b o t h e l e c t r o n a n d p r o t o n t r a n s f e r p e r p e n d i c u l a r t o t h e m e m b r a n e d u r i n g d i f f e r e n t r e a c t i o n s t e p s i n t h e c a t a l y t i c c y c l e . T i m e - r e s o l v e d p o t e n t i a l m e a s u r e m e n t s a r e a p o w e r f u l m e t h o d 4 6 t o t e s t w h e t h e r c a t a l y t i c s t e p s a r e c o u p l e d t o p r o t o n u p t a k e a n d p u m p i n g ( W i k s t r o m a n d V e r k h o v s k y , 2 0 0 2 ) . M e m b r a n e p o t e n t i a l s a c r o s s t h e m e m b r a n e c a n b e g e n e r a t e d b y t h e f a s t i n j e c t i o n o f s i n g l e e l e c t r o n s f r o m l a s e r - fl a s h - e x c i t e d , R u I I ( 2 , 2 ’ - b i p y r i d y l ) 3 , 2 + a s a p h o t o r e d u c t a n t ( R u i t e n b e r g e t a l . , 2 0 0 0 ; Z a s l a v s k y e t a l . , 1 9 9 3 ; Z a s l a v s k y e t a l . , 1 9 9 5 ) . G e n e r a t i o n o f m e m b r a n e p o t e n t i a l r e s u l t s m a i n l y f r o m t h r e e e v e n t s : v e c t o r i a l e l e c t r o n t r a n s f e r i n t o h e m e a , u p t a k e o f a c h a r g e c o m p e n s a t i n g p r o t o n f r o m t h e o p p o s i t e s i d e o f t h e m e m b r a n e , a n d p u m p i n g o f p r o t o n s a c r o s s t h e m e m b r a n e . E l e c t r o m e t r i c m e a s u r e m e n t s t h a t f o l l o w t h e m o v e m e n t o f c h a r g e i n t h e p r o t e i n h a v e b e e n u s e d t o d e d u c e t h e r a t e o f p r o t o n t r a n s f e r d u r i n g t h e m e t a l r e d u c t i o n p h a s e ( R u i t e n b e r g e t a l . , 2 0 0 2 ; V e r k h o v s k y e t a l . , 1 9 9 9 ; W i k s t r o m a n d V e r k h o v s k y , 2 0 0 2 ) a n d d u r i n g t h e F t o 0 t r a n s i t i o n ( K o n s t a n t i n o v e t a l . , 1 9 9 7 ; S i l e t s k y e t a l . , 2 0 0 4 ) . P r o t o n p u m p i n g w a s t h o u g h t t o b e l i n k e d e x c l u s i v e l y t o t h e o x i d a t i v e p h a s e w h e n o x y g e n i s r e d u c e d t o w a t e r a n d t h e e l e c t r o n s u s e d u p a r e r e p l a c e d ( W i k s t r o m , 1 9 8 9 ) . H o w e v e r , i t i s a r g u e d t h a t p r o t o n p u m p i n g a l s o c a n o c c u r d u r i n g t h e r e d u c t i v e p h a s e w h e n e l e c t r o n s a r e s u p p l i e d t o t h e b i n u c l e a r c e n t e r b e f o r e 0 2 b i n d i n g , w i t h f u l l e f fi c i e n c y b u t o n l y w h e n i t i s i m m e d i a t e l y p r e c e d e d b y a n o x i d a t i v e p h a s e ( V e r k h o v s k y e t a l . , 1 9 9 9 ) . S t a r t i n g f r o m t h e o x i d i z e d s t a t e , a fi r s t e l e c t r o n l e a d s t o p u m p i n g o f o n e p r o t o n w h e n t h e r e i s a p r e c e e d i n g t u r n o v e r . T h e e n e r g y r e q u i r e d f o r p u m p i n g i n t h e m e t a l r e d u c t i o n p h a s e m a y b e c o n s e r v e d f r o m t h e 0 2 r e d u c t i o n p h a s e b y t h e r e t e n t i o n o f h y d r o x y l l i g a n d s w i t h a h i g h p K a o r b y a h i g h r e d o x p o t e n t i a l f o r h e m e a 3 / C u 3 d u r i n g s t e a d y s t a t e t u r n o v e r . T h e p r o t o n p a t h w a y m a y b e p a r t i a l l y d i f f e r e n t a t e a c h p h a s e . T h e s u b s t r a t e p r o t o n s 4 7 a p p e a r t o b e t a k e n u p b y t h e K - p a t h w a y i n t h e 0 9 E a n d E 9 R t r a n s i t i o n ( r e d u c t i v e p h a s e ) , b u t s u b s t r a t e p r o t o n s a r e t a k e n u p t h r o u g h t h e D - p a t h w a y i n P 9 F a n d t h e F 9 0 t r a n s i t i o n ( o x i d a t i v e p h a s e ) . H o w e v e r , t h e D - p a t h w a y i s r e q u i r e d f o r p r o t o n p u m p i n g i n b o t h c a s e s . 1 . 3 . 1 . 2 . E l e c t r o s t a t i c C a l c u l a t i o n s E l e c t r o s t a t i c c a l c u l a t i o n s a r e i m p o r t a n t f o r e s t i m a t i n g t h e p K a o f i m p o r t a n t a m i n o a c i d r e s i d u e s t h a t m a y b e d e p e n d e n t u p o n t h e r e d o x s t a t e s o f h e m e a , a 3 , a n d C u B , a n d t h u s a i d i n p r e d i c t i o n s o f p r o t o n m o v e m e n t . U s i n g a c o n t i n u u m d i e l e c t r i c m o d e l a n d P o i s s o n - B o l t z m a n n s o l u t i o n ( T i e d e e t a l . , 1 9 9 3 ) , a c l u s t e r o f 1 8 r e s i d u e s i n C c O w e r e c a l c u l a t e d t o f o r m a n e l e c t r o s t a t i c n e t w o r k ( K a n n t e t a l . , 1 9 9 8 a ) . T h e e f f e c t o f t h e r e d o x s t a t u s o f t h e m e t a l c e n t e r s , i n s u b u n i t 1 , o n t h e p K a v a l u e s o f t h e s e r e s i d u e s w a s e x a m i n e d . I n t h e K - p a t h w a y , t h e K 3 6 2 d i d n o t a l t e r i t s p r o t o n a t i o n s t a t e u p o n r e d o x s t a t e c h a n g e s , b u t E 1 0 1 a t t h e e n t r a n c e t o t h e K - p a t h w a y d i d , e v e n t h o u g h i t i s 2 5 A a w a y f r o m t h e a c t i v e s i t e . T h e r e d o x s t a t u s o f h e m e a w a s l i n k e d t o c h a n g e s i n t h e a r g i n i n e p a i r ( R 4 8 1 / R 4 8 2 i n R . s p h a e r o i d e s n u m b e r i n g ) a b o v e t h e p r o p i o n a t e s o f h e m e a a n d a 3 a n d w a s a l s o l i n k e d w i t h R 5 2 , w h i c h c l o s e l y i n t e r a c t s w i t h t h e f o r m y l g r o u p o f h e m e a ( K a n n t e t a l . , 1 9 9 8 a ; L a n c a s t e r , 2 0 0 3 ) . T h e r e s u l t w a s i n t e r e s t i n g b e c a u s e t h e s a l t b r i d g e s b e t w e e n t h e a r g i n i n e p a i r a n d t h e D - p r o p i o n a t e s o f t h e h e m e s w e r e p r e d i c t e d t o n o t b e a p a r t o f t h e p r o t o n p u m p ( P o p o v i c a n d S t u c h e b r u k h o v , 2 0 0 4 ) . I n t h i s r e g a r d , t h e r e w a s a c o n s e n s u s a m o n g d i f f e r e n t a n a l y s e s o n d i f f e r e n t C c O s t r u c t u r e s . T h e m u t a g e n e s i s ( B r a n d e n e t a l . , 2 0 0 5 ; M i l l s e t a l . , 2 0 0 5 ) , c o m p u t a t i o n a l p r e d i c t i o n ( S e i b o l d e t a l . , 2 0 0 5 ) , 4 8 a n d F T I R s p e c t r o s c o p y e x p e r i m e n t s ( B e h r e t a l . , 2 0 0 0 ) i m p l i c a t e t h a t t h e a r g i n i n e / p r o p i o n a t e c l u s t e r i s p a r t o f t h e e x i t r o u t e f o r p r o t o n s . I n t h e D - p a t h w a y , E 2 8 6 r e m a i n e d p r o t o n a t e d i n a l l r e d o x s t a t e s . H o w e v e r , l a t e r e l e c t r o s t a t i c a n a l y s i s o f P . d e n i t r i fi c a n s C c O s u g g e s t e d t h a t t h e p r o t o n a t i o n o f E 2 8 6 w a s s e n s i t i v e t o r e d o x c h a n g e s ( S c a r e s e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e q u a n t u m m e c h a n i c a l a n a l y s i s b y O l s s o n ( O l s s o n e t a l . , 2 0 0 5 ) p r o p o s e d t h a t t h e r e w a s a m o v e m e n t o f a p r o t o n f r o m t h e D - p a t h w a y t o E 2 8 6 i n c o n c e r t w i t h t h e m o v e m e n t o f a p r o t o n f r o m E 2 8 6 t o a n a c c e p t o r t o w a r d t h e o u t e r s u r f a c e . T h e p r o t o n a t i o n o f t h e D - p r o p i o n a t e o f h e m e a 3 i s f o l l o w e d b y p r o t o n a t i o n o f a h y d r o x y l b o u n d a t t h e h e m e a 3 / C u B c e n t e r . N e u t r a l i z a t i o n o f t h i s h y d r o x y l m a y r e p u l s e t h e p r o t o n f r o m t h e p r o p i o n a t e t o t h e o u t s i d e a n d c a u s e a h i g h e n e r g y b a r r i e r f o r t h e b a c k fl o w o f p r o t o n s . 1 . 3 . 1 . 3 . M o l e c u l a r D y n a m i c s S i m u l a t i o n s T h e a c q u i s i t i o n o f h i g h r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e s o f C 0 0 , a l o n g w i t h i n c r e a s e d c o m p u t i n g p o w e r , h a s a l l o w e d t h e p r e d i c t i o n o f p r o t o n m o v e m e n t b y c o m p u t a t i o n a l m e t h o d s ( C u k i e r , 2 0 0 4 ; P o m e s e t a l . , 1 9 9 8 ; P o p o v i c a n d S t u c h e b r u k h o v , 2 0 0 5 ; X u a n d V o t h , 2 0 0 5 ) . T h e m o v e m e n t o f p r o t e i n r e s i d u e s a n d t h e f o r m a t i o n o f w a t e r c h a i n s c a n b e s i m u l a t e d b y m o l e c u l a r d y n a m i c s m e t h o d s , w h i c h a l o n g w i t h e l e c t r o s t a t i c c a l c u l a t i o n s s u g g e s t a n e w m e c h a n i s t i c v i e w o f C c O . A l t h o u g h c r y s t a l s t r u c t u r e s c a n r e v e a l i n f o r m a t i o n o n s i d e c h a i n p o s i t i o n s a n d s t a b l e w a t e r s i n C c O , m o b i l e r e s i d u e s a n d w a t e r s a r e n o t c l e a r l y o b s e r v e d i n a c r y s t a l s t r u c t u r e . F o r e x a m p l e , e v e n w i t h a h i g h r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e s u c h a s t h e r e c e n t l y 4 9 r e s o l v e d t w o s u b u n i t R . s p h a e r o i d e s C c O a t 2 . 0 A r e s o l u t i o n ( Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) , f e w e r w a t e r s ( 1 7 8 w a t e r s ) w e r e o b s e r v e d t h a n t h e c a l c u l a t e d p o s s i b l e n u m b e r . A n i m p o r t a n t p a r t o f p r o t o n c o n d u c t i o n i n t h e C c O i n v o l v e s c h a n g e s i n t h e f o r m a t i o n o f w a t e r c h a i n s d u r i n g t h e r e a c t i o n c y c l e . T h e p o s i t i o n o f w a t e r s m a y a i d i n t h e u n d e r s t a n d i n g o f p r o t o n t r a n s f e r a n d t h e p u m p i n g m e c h a n i s m . T h e r e f o r e , p r e d i c t i o n o f t h e l o c a t i o n o f w a t e r a n d s t u d y o f i t s m o b i l i t y u s i n g c o m p u t a t i o n a l m e t h o d s i s i n c r e a s i n g l y v a l u a b l e f o r d e v e l o p i n g a m e c h a n i s t i c m o d e l . P r o g r a m s s u c h a s D O W S E R ( H o f a c k e r a n d S c h u l t e n , 1 9 9 8 ; Z h a n g a n d H e r r n a n s , 1 9 9 6 ) o r G R I D ( O l k h o v a e t a l . , 2 0 0 4 ) c a n b e u s e d t o fi l l p o t e n t i a l w a t e r s i t e s i n a s t r u c t u r e w i t h n o v a n d e r W a a l s o v e r l a p s ( H o s l e r e t a l . , 2 0 0 6 ) . F o r e x a m p l e , t h e D O W S E R p r o g r a m p l a c e s w a t e r m o l e c u l e s b y s e a r c h i n g f o r h y d r o p h i l i c c a v i t i e s , w h e r e h y d r o p h i l i c i t y i s m e a s u r e d a s t h e i n t e r a c t i o n e n e r g y b e t w e e n a w a t e r m o l e c u l e i n t h e c a v i t y a n d t h e s u r r o u n d i n g p r o t e i n . T h e n u m b e r o f w a t e r s t h a t h a v e b e e n p l a c e d w i t h i n t h e t w o - s u b u n i t s t r u c t u r e s o f C c O v a r i e s f r o m 1 3 0 t o 7 5 5 d e p e n d i n g u p o n s e l e c t i o n c r i t e r i a , s u c h a s i n t e r a c t i o n e n e r g i e s ( C u k i e r , 2 0 0 5 ; H o f a c k e r a n d S c h u l t e n , 1 9 9 8 ; O l k h o v a e t a l . , 2 0 0 4 ; Z h e n g e t a l . , 2 0 0 3 ) . U s i n g M D s i m u l a t i o n s , m e t h o d s h a v e b e e n d e v e l o p e d t o m o n i t o r t h e f o r m a t i o n , n a t u r e , a n d p e r s i s t e n c e o f h y d r o g e n b o n d e d w a t e r c h a i n s ( C u k i e r , 2 0 0 4 , 2 0 0 5 ; S e i b o l d e t a l . , 2 0 0 5 ) . S e i b o l d e t a l . s h o w s r e g u l a t i o n o f f o r m a t i o n o f w a t e r c h a i n s b y m u t a t g e n e s i s ( S e i b o l d e t a l . , 2 0 0 5 ) . U s u a l l y M D s i m u l a t i o n s a r e c a r r i e d o u t w i t h v a r y i n g r e s t r a i n t s o n p r o t e i n m o v e m e n t ; e i t h e r b y fi x i n g t h e c o m p l e t e p r o t e i n b a c k b o n e , o r fi x i n g e v e r y t h i n g o u t s i d e t h e a r e a o f i n t e r e s t . T h e s e c o n s t r a i n t s a r e n e e d e d t o m i n i m i z e t h e c o m p u t a t i o n a l c o s t . I n o r d e r t o p r e d i c t t h e m o v e m e n t o f p r o t o n s t h e m s e l v e s t h r o u g h w a t e r c h a i n s , 5 0 q u a n t u m m e c h a n i c a l c a l c u l a t i o n s h a v e b e e n c o m b i n e d w i t h M D ( C u k i e r , 2 0 0 4 ; O l s s o n e t a l . , 2 0 0 5 ; X u a n d V o t h , 2 0 0 5 ) . I n t h i s w a y , w a t e r c h a i n f o r m a t i o n c a n b e o b s e r v e d i n w e l l s o l v a t e d f u l l y r e d u c e d w i l d t y p e R . s p h a e r o i d e s C c O , w i t h o u t a n y e n z y m e o r w a t e r c o n s t r a i n t s . W a t e r s w e r e i n i t i a l l y p l a c e d i n t h e C c O b y a n a l g o r i t h m d e s i g n e d t o fi n d p o s s i b l e s t a b l e w a t e r l o c a t i o n s . T h e s i m u l a t i o n r e s u l t s i n n u m e r o u s t r a n s i e n t w a t e r c h a i n s i n v a r i o u s r e g i o n o f t h e C c O . T h e s e w a t e r c h a i n s h a v e a l i m i t e d l i f e t i m e , b u t a r e c o n s t a n t l y f o r m i n g , b r e a k i n g a n d r e - f o r m i n g q u i t e p e r s i s t e n t l y . F o r e x a m p l e , a s n a p s h o t f r o m t h e M D s i m u l a t i o n s h o w s a c o n t i n u o u s h y d r o g e n - b o n d e d n e t w o r k o f 1 3 w a t e r s w h i c h s p a n s t h e r e g i o n s f r o m E 2 8 6 t o M g 2 + w h e r e o n l y o n e w a t e r m o l e c u l e h a s b e e n f o u n d i n t h e X - r a y s t r u c t u r e ( Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) . O n l y t w o c o n s e r v e d w a t e r s h a v e b e e n f o u n d i n t h e K - p a t h w a y i n a l l o f t h e C c O c r y s t a l s t r u c t u r e s . H o w e v e r , w a t e r c h a i n s c a n b e f o r m e d d u r i n g a n M D s i m u l a t i o n a f t e r t h e a d d i t i o n o f e x t r a w a t e r s ( C u k i e r , 2 0 0 5 ) . A n i n t e r e s t i n g fi n d i n g w a s t h a t t h e T 3 5 9 s i d e c h a i n h a s t o r o t a t e f o r t h e f o r m a t i o n o f a h y d r o g e n b o n d e d w a t e r c h a i n t h a t s p a n s f r o m S 2 9 9 t o t h e h y d r o x y l o f t h e h e m e a 3 f a m e s y l c h a i n . A n o t h e r w a t e r c h a i n w a s f o r m e d f r o m t h i s f a m e s y l h y d r o x y l t o t h e a c t i v e s i t e v i a Y 2 8 8 i n a h y d r o p h o b i c r e g i o n . W h e n t h e h e m e a i s r e d u c e d w i t h o x i d i z e d h e m e a 3 , a w a t e r c h a i n w a s f o r m e d c o n s i s t i n g o f t w o w a t e r s e x t e n d i n g f r o m E 2 8 6 t o a n e a r b y w a t e r m o l e c u l e o r t o t h e D - p r o p i o n a t e o f h e m e a 3 . I n c o n t r a s t , w h e n t h e h e m e a w a s o x i d i z e d w i t h a r e d u c e d h e m e a 3 - C u B b i n u c l e a r c e n t e r , a w a t e r c h a i n c o n s i s t i n g o f t h r e e w a t e r s , c o n n e c t e d E 2 8 6 t o t h e h y d r o x y l g r o u p o n C u B ( S e i b o l d e t a l . , 2 0 0 5 ) . M D s h o w e d n o c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n K 3 6 2 , w h i c h h a s b e e n s u g g e s t e d t o u n d e r g o a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e ( A d e l r o t h e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h i s i s n o t s u r p r i s i n g b e c a u s e t h e r e a r e 5 1 l i m i t a t i o n s t o t h i s m e t h o d : a M D s i m u l a t i o n i s n o r m a l l y p e r f o r m e d u p t o 2 n s , w h e r e a s a f u l l t u r n o v e r o c c u r s i n t h e m i l l i s e c o n d t i m e s c a l e . M D s i m u l a t i o n s c o u l d p o s s i b l y b e a p p l i e d t o t r a c e t h e e x i t p a t h w a y f o r p u m p p r o t o n s . T h e c o n t i n u o u s h y d r o g e n - b o n d e d w a t e r c h a i n e x t e n d i n g f r o m E 2 8 6 t o t h e M g 2 + c e n t e r i s o b s e r v e d , b u t n o d o m i n a n t w a t e r c h a i n s a r e o b s e r v e d i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e t o t h e o u t s i d e a l t h o u g h t h e r e g i o n a b o v e t h e h e m e s s h o w s a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f H 2 0 . T h e R 4 8 1 K m u t a t i o n c a u s e s a l o o p m o v e m e n t d u r i n g t h e M D s i m u l a t i o n c o n t a i n i n g t h e c o n s e r v e d r e s i d u e s W 1 7 2 a n d Y 1 7 5 , l e a d i n g t o t h e c o l l a p s e o f a w a t e r c h a i n ( S e i b o l d e t a l . , 2 0 0 5 ) , c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v e d p h e n o t y p e o f i n h i b i t e d b a c k fl o w i n R 4 8 1 K ( M i l l s e r a l . , 2 0 0 5 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t s i g n i fi c a n t c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s m a y o c c u r i n r e s p o n s e t o a s i n g l e m u t a t i o n i n a n e x i t p a t h w a y r e s i d u e . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t E 2 8 6 m a y u n d e r g o s o m e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e d u r i n g t h e O z r e d u c t i o n p h a s e , b a s e d o n e x p e r i m e n t a l , c r y s t a l l o g r a p h i c , a n d c o m p u t a t i o n a l m e t h o d s ( C u k i e r , 2 0 0 4 ; V a k k a s o g l u e t a l . , 2 0 0 6 ) . A l t e r n a t i v e l y , W 1 7 2 ( S e i b o l d e t a l . , 2 0 0 5 ) m a y b e a r e s i d u e w h i c h u n d e r g o e s c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e a s w e l l a s E 2 8 6 . A l o o p m o v e m e n t i n d u c e d b y t h e r o t a t i o n o f W 1 7 2 c o u l d d e l i v e r a p r o t o n f r o m E 2 8 6 t o t h e a r e a a b o v e t h e h e m e s . T h i s l o o p c o n t a i n i n g t w o h i g h l y c o n s e r v e d r e s i d u e s , W 1 7 2 a n d Y 1 7 5 , h a s m o s t l y h y d r o p h o b i c r e s i d u e s ( ~ 7 0 % ) a n d m a k e s h y d r o p h o b i c c o n t a c t s w i t h h e l i c e s H , V I , a n d V H o f s u b u n i t 1 . D u r i n g t h e M D s i m u l a t i o n o f b o t h t h e w i l d t y p e a n d t h e R 4 8 1 K m u t a n t , t h i s l o o p c h a n g e s i t s c o n f o r m a t i o n a n d s h i f t s s o m e o f i t s a m i n o a c i d s a n d t h e i r h y d r o g e n b o n d i n g a w a y f r o m t h e p o s i t i o n s s h o w n i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e . 5 2 1 . 3 . 1 . 4 . S i n g l e - T u r n o v e r E x p e r i m e n t s I t i s n o t a l w a y s p o s s i b l e t o d i v i d e a c a t a l y t i c c y c l e i n t o p a r t i a l r e a c t i o n s . I f a l l s u b s t r a t e s m u s t b e p r e s e n t b e f o r e a r e a c t i o n o c c u r s , o r i f t h e r e i s o n l y o n e s u b s t r a t e , t h e n i s o l a t e d p a r t i a l r e a c t i o n s a r e n o t p o s s i b l e . H o w e v e r , t h e k i n e t i c s o f t h e s y s t e m c a n b e o b s e r v e d u s i n g a s i n g l e - t u m o v e r o f t h e f u l l y r e d u c e d o r m i x e d v a l e n c e C c O . M e t h o d s u s e d f o r s t u d y i n g C c O i n o r d e r t o u n d e r s t a n d e a c h i n d i v i d u a l s t e p d u r i n g t h e c a t a l y t i c t u r n o v e r a r e d e s c r i b e d b e l o w . F l o w - F l a s h T e c h n i q u e I n o r d e r t o t r y t o u n d e r s t a n d t h e r a p i d m o v e m e n t o f p r o t o n s a n d e l e c t r o n s i n C c O , v a r i o u s f a s t k i n e t i c m e t h o d s h a v e b e e n u s e d t h a t a l l o w o b s e r v a t i o n i n t h e [ I ] s t i m e f r a m e . O n e o f t h e s e i s t h e fl o w - fl a s h t e c h n i q u e w h i c h c a n g i v e d e t a i l e d i n f o r m a t i o n a b o u t t h e i n d i v i d u a l r e a c t i o n s t e p s t h a t C c O u n d e r g o e s u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s . C c O i s i n i t i a l l y r e d u c e d e i t h e r i n t h e t w o e l e c t r o n ( m i x e d v a l e n c e ) o r f o u r e l e c t r o n ( f u l l y r e d u c e d ) s t a t e i n t h e p r e s e n c e o f c a r b o n m o n o x i d e ( C O ) , w h i c h b i n d s t o t h e r e d u c e d h e m e a 3 / C u B s i t e a n d b l o c k s t h e s i t e f r o m b i n d i n g 0 2 . T h e f u l l y r e d u c e d C c O - C O c o m p l e x i s r a p i d l y m i x e d w i t h a n O z - c o n t a i n i n g s o l u t i o n a n d t h e r e a c t i o n w i t h 0 2 i s t h e n i n i t i a t e d b y a fl a s h o f l i g h t w h i c h i n d u c e s t h e d i s s o c i a t i o n o f t h e C O l i g a n d f r o m C c O . T h e r a p i d b i n d i n g o f 0 2 i s f o l l o w e d b y 0 2 r e d u c t i o n a n d b o n d - c l e a v a g e u t i l i z i n g t h e e l e c t r o n s a v a i l a b l e a t t h e a 3 / C u B s i t e . T h e fl o w - fl a s h m e t h o d c a n p r o v i d e i n f o r m a t i o n o n t h e t i m i n g a n d o r d e r o f t h e p r o t o n a n d e l e c t r o n t r a n s f e r r e a c t i o n s i n a t i m e - r e s o l v e d m a n n e r ( S a l o m o n s s o n e t a l . , 5 3 2 0 0 5 ) i n c l u d i n g p r o t o n u p t a k e ( A d e l r o t h e t a l . , 1 9 9 7 ; O l i v e b e r g e r a l . , 1 9 9 1 ) a n d p r o t o n p u m p i n g ( F a x e n e t a l . , 2 0 0 5 ; N i l s s o n e t a l . , 1 9 9 0 ) o b s e r v e d o n t h e o u t s i d e u s i n g p H s e n s i t i v e d y e s d u r i n g t h e c a t a l y t i c t r a n s i t i o n s i n t h e s e s i n g l e t u r n o v e r e x p e r i m e n t s . I n o r d e r t o t h o r o u g h l y s t u d y t h e p r o t o n p u m p i n g , t h e C c O i s r e c o n s t i t u t e d i n t o l i p i d v e s i c l e s t o s e p a r a t e t h e i n t e r i o r f r o m t h e e x t e r i o r c h a n g e s . T h e p H c h a n g e s c a n b e m o n i t o r e d u s i n g t h e p H i n d i c a t o r p h e n o l r e d ( O l i v e b e r g e t a l . , 1 9 9 1 ) . A f t e r c o m p l e t e c o n s u m p t i o n o f 0 2 , t h e C O r e - b i n d s t o C c O p r o v i d i n g l i g a n d a s s o c i a t i o n k i n e t i c s . T h i s m e t h o d c a n a l s o b e u s e d i n t h e a b s e n c e o f o x y g e n , i n w h i c h c a s e t h e l o s s o f C O i n t h e 2 - e l e c t r o n r e d u c e d e n z y m e i s f o l l o w e d b y fl o w o f e l e c t r o n s f r o m h e m e a 3 b a c k t o h e m e a . L a s e r - I n d u c e d E l e c t r o n I n j e c t i o n A m e t h o d f o r s t u d y i n g i n t r a c o m p l e x e l e c t r o n t r a n s f e r h a s b e e n d e v e l o p e d t h a t u t i l i z e s a p h o t o a c t i v e t r i s ( b i p y r i d i n e ) r u t h e n i u m g r o u p [ R u ( H ) ] w h i c h i s c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o t h e p r o t e i n s u b s t r a t e c y t o c h r o m e c ( D u r h a m e t a l . , 1 9 8 9 ) . R a p i d e l e c t r o n t r a n s f e r i s i n i t i a t e d b y a fl a s h o f l i g h t . P h o t o e x c i t a t i o n o f R u ( H ) t o R u ( H * ) , w h i c h i s a s t r o n g r e d u c i n g a g e n t , i s f o l l o w e d b y r a p i d e l e c t r o n t r a n s f e r t o t h e f e r r i c h e m e g r o u p i n c y t o c h r o m e c . S u b s e q u e n t e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m p h o t o r e d u c e d h e m e c t o t h e r e d o x c e n t e r s i n C c O o c c u r s o n a f a s t t i m e s c a l e o f < 5 0 n s ( M i l l e t t a n d D u r h a m , 2 0 0 2 ) . T h e R u - 3 9 - C c d e r i v a t i v e w a s d e s i g n e d t o m e a s u r e i n t r a c o m p l e x e l e c t r o n t r a n s f e r t o t h e i n i t i a l a c c e p t o r i n C c O ( G e r e n e t a l . , 1 9 9 5 ) ( F i g u r e 1 . 9 ) . T h e s e i n v e s t i g a t i o n s d e t e r m i n e d w h a t p o s i t i o n c o u l d b e m o d i fi e d o n c y t o c h r o m e c w i t h o u t i n t e r f e r i n g w i t h i t s e f fi c i e n t b i n d i n g t o C c O . T h e e l e c t r o n t r a n s f e r i s i n i t i a t e d f r o m R u ( H * ) t o h e m e c a n d c o n t i n u e s t o C u , 5 4 a n d h e m e a l e a d i n g t o t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e r a t e c o n s t a n t s f o r e a c h i n d i v i d u a l s t e p i n t h e r e a c t i o n . M i l l e t t a n d c o l l e a g u e s h a v e a l s o d e v e l o p e d v e r y e f fi c i e n t r u t h e n i u m d i m e r s t h a t c a n r e a c t a t t h e s a m e s i t e a s c y t o c h r o m e c a n d e l i m i n a t e t h e s o m e t i m e s r a t e - l i m i t i n g c y t o c h r o m e c t o C c O r e a c t i o n . P o s s i b l e i n t e r m e d i a t e s a s s o c i a t e d w i t h i n d i v i d u a l s t e p s c a n b e i s o l a t e d a n d i d e n t i fi e d . F o r e x a m p l e , C c O w a s c o n v e r t e d t o s t a t e F b y r e a c t i o n w i t h H 2 0 2 . W h e n f o r m e d u n d e r a l k a l i n e c o n d i t i o n s , t h e H Z O Z - g e n e r a t e d F i n t e r m e d i a t e h a s a v i s i b l e a b s o r b a n c e b a n d a t 5 8 0 n m ( J u n e m a n n e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h e s e q u e n c e o f t h e e l e c t r o n r e d u c t i o n s a n d t h e r a t e c o n s t a n t f o r e l e c t r o n t r a n s f e r b e t w e e n C u A a n d h e m e a w e r e m o n i t o r e d a t 8 3 0 n m a n d 6 0 5 n m ( Z a s l a v s k y e t a l . , 1 9 9 8 ) a n d t h e r e d u c t i o n o f t h e o x y f e r r y l h e m e a 3 w a s f o l l o w e d a t 5 8 0 n m ( S i l e t s k y e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e s e i n t e r m e d i a t e s t a t e s c a n b e c o m p a r e d w i t h t h e s t a t e s o b s e r v e d i n t h e f a s t e l e c t r o n t r a n s f e r m e a s u r e m e n t . P r o t o n r e l e a s e a n d u p t a k e e v e n t s d u r i n g a s i n g l e e l e c t r o n t r a n s f e r a r e m o n i t o r e d w i t h p H s e n s i t i v e d y e s ( Z a s l a v s k y e t a l . , 2 0 0 4 ) i n o r d e r t o o b s e r v e t h e p r o t o n m o v e m e n t s c o n c u r r e n t l y w i t h t h e e l e c t r o n t r a n s f e r . A l l o f t h e s e r e a c t i o n s d e p e n d o n a n i n i t i a l f a s t e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m t h e p h o t o r e d u c t a n t i n t o C u A i n C c O . 1 . 3 . 1 . 5 . E P R S p e c t r o s c o p y A n a l y s i s T h e p a r a m a g n e t i c s p i n 5 / 2 o f t h e h i g h - s p i n h e m e a 3 a n d t h e s p i n 1 / 2 o f C u } ; i n t h e o x i d i z e d e n z y m e s h o u l d m a k e t h e m i d e a l f o r s t u d y b y E P R . H o w e v e r , a c o m b i n a t i o n o f 5 5 m a g n e t i c d i p o l e a n d e l e c t r o n i c e x c h a n g e c o u p l i n g b e t w e e n t h e s e t w o s i t e s m a k e s t h e m b o t h u n d e t e c t a b l e b y E P R . T h e h e m e a 3 s i g n a l i s E P R - v i s i b l e w h e n t h e r e i s a n a d d i t i o n o f a s i n g l e e l e c t r o n t h a t c a n r e d u c e C u B a n d t h i s b r e a k s t h e c o u p l i n g b e t w e e n h e m e a 3 a n d C u B . T h i s h i g h - s p i n a 3 s p e c t r u m c o u l d b e p r o d u c e d w i t h h i g h y i e l d ( n e a r l y 1 0 0 % ) b y a d d i n g h i g h l e v e l s o f r e d u c t a n t ( S c h m i d t e t a l . , 2 0 0 4 ) . B e s i d e s t h e r e d o x - a c t i v e m e t a l s , a d d i t i o n a l n o n - r e d o x - a c t i v e m e t a l c e n t e r s a r e p r e s e n t i n C c O o f d i f f e r e n t s p e c i e s ( E s p e e t a l . , 1 9 9 5 ) . B e e f h e a r t o x i d a s e c o n t a i n s o n e z i n c ( Z n Z I ) a n d o n e m a g n e s i u m ( M g Z I ) a t o m p e r m o n o m e r a s w e l l a s C a 2 + o r N a h P . d e n i t r i fi c a n s a n d R . s p h a e r o i d e s C c O h a v e m a g n e s i u m ( M g 2 + ) a n d c a l c i u m ( C a 2 + ) . T h e s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l r o l e s o f t h e s e m e t a l s a r e n o t c l e a r . E v e n t h o u g h t h e M g 2 + s i t e i s n o t c o n s e r v e d i n a l l s p e c i e s , i t i s w e l l c o n s e r v e d i n a l l o f t h e e u k a r y o t i c C c O a n d s e v e r a l b a c t e r i a l C c O , s u g g e s t i n g a n i m p o r t a n t r o l e o f t h i s s i t e . U n l i k e M g z “ , M n 2 + i s v i s i b l e b y E P R s p e c t r o s c o p y . M n 2 + c a n b e i n c o r p o r a t e d i n t o t h e n o n r e d o x a c t i v e M g 2 + s i t e d u r i n g g r o w t h w i t h o u t a n y c h a n g e s i n C c O a c t i v i t y ( H o s l e r e t a l . , 1 9 9 5 ) t o p r o v i d e a p r o b e t h a t c a n m o n i t o r t h e m o v e m e n t o f w a t e r a n d p r o t o n s c l o s e t o t h e M n 2 + s i t e . M n 2 + g i v e s a s t r o n g E P R s i g n a l i n t h e g = 2 . 0 r e g i o n o f t h e E P R s p e c t r u m . E P R s p e c t r o s c o p y s h o w s t h a t t h e M n 2 + a t o m i s t i g h t l y b o u n d a n d t h e c o o r d i n a t i o n g e o m e t r y o f t h e m e t a l c h a n g e s u p o n t h e r e d u c t i o n o f t h e r e d o x a c t i v e m e t a l c e n t e r s . W h e n M g Z I i s r e p l a c e d w i t h M n 2 + t h i s c r e a t e s a s e n s i t i v e p r o b e f o r w a t e r a n d p r o t o n m o v e m e n t a b o v e t h e h e m e s ( F l o r e n s e t a l . , 2 0 0 1 ; S c h m i d t e t a l . , 2 0 0 4 ; S c h m i d t e t 5 6 a l . , 2 0 0 3 ) . M g 2 + a n d M n 2 + h a v e s i m i l a r c o o r d i n a t i o n s o t h a t t h e r e p l a c e m e n t o f M g 2 + b y M n 2 + r e s u l t s i n a n a t i v e p r o t o n s t r u c t u r e . A r a p i d f r e e z e - q u e n c h , e l e c t r o n s p i n e c h o e n v e l o p m o d u l a t i o n ( E S E E M ) t e c h n i q u e w a s a p p l i e d t o m o n i t o r w a t e r m o v e m e n t i n t h e m i l l i s e c o n d t i m e s c a l e u s i n g t h e m a g n e t i c i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e o x y g e n i s o t o p e 1 7 0 a n d t h e M n 2 + . T h e 1 7 O w a s d e t e c t e d , i n t h e f o r m o f i s o t o p i c a l l y l a b e l e d w a t e r , H 2 1 7 0 , a t t h e M n g ' a n z ” s i t e w i t h a s i g n i fi c a n t l i n e b r o a d e n i n g o f t h e M n 2 + E P R s p e c t r u m a f t e r a l i m i t e d n u m b e r o f t u r n o v e r s . I n p a r a l l e l e x p e r i m e n t s , D 2 0 w a s m i x e d w i t h C c O o n a f a s t t i m e s c a l e a n d t h e d e u t e r i u m o b s e r v e d a t t h e M n s i t e i n < 1 0 m s . T h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e e x c h a n g e o f b u l k w a t e r a t t h e M g z ‘ V M n 2 + s i t e i s o n a c a t a l y t i c a l l y r e l e v a n t t i m e s c a l e b o t h f r o m t h e o u t s i d e a n d f r o m t h e a c t i v e s i t e . T h i s E P R s i g n a l b r o a d e n i n g w i t h 1 7 O w a s n o l o n g e r s e e n w h e n t h e s a m p l e s w e r e a l l o w e d t o t u r n o v e r f o r 3 0 8 c c , i n d i c a t i n g t h a t t h e p r o d u c t w a t e r a t t h e a c t i v e s i t e h a d e s c a p e d w h e n t u r n o v e r w a s c o m p l e t e d . A w a t e r e x i t p a t h w a y w a s p r o p o s e d b a s e d o n t h e s e r e s u l t s t h a t r e a c h t h e M g z + a n 2 + f r o m t h e h e m e a 3 — C u g s i t e . H o w e v e r , t h e e x a c t w a t e r p a t h w a y f r o m t h e M g z ‘ V M n 2 + s i t e t o t h e o u t s i d e h a s n o t b e e n d e fi n e d . T h e w a t e r p a t h w a y m a y b e i n v o l v e d i n p r o t o n t r a n s f e r a s w e l l . M o r e o v e r , t h e M n g ' a n 2 + s i t e c o u l d p r o v i d e a m e c h a n i s m f o r p r e v e n t i n g t h e b a c k fl o w o f p r o t o n s b y e l e c t r o s t a t i c r e p u l s i o n , i f t h e w a t e r e x i t / b a c k fl o w p a t h w a y s h a r e s t h e s a m e w a t e r c h a n n e l . 5 7 1 . 3 . 1 . 6 . F I ‘ I R S p e c t r o s c o p y A n a l y s i s F o u r i e r t r a n s f o r m i n f r a r e d ( F T I R ) s p e c t r o s c o p y h a s b e e n u s e d e x t e n s i v e l y t o p r o b e s t r u c t u r a l c h a n g e s i n t h e i n t e r n a l s t r u c t u r e a n d a m i n o a c i d p r o t o n a t i o n s t a t e s o f C c O ( I w a k i e t a l . , 2 0 0 3 ; M o o d y e t a l . , 1 9 9 5 ; N y q u i s t e t a l . , 2 0 0 3 ; R i c h a n d B r e t o n , 2 0 0 1 ) . I t i s a t e c h n i q u e w h e r e b y s p e c t r a a r e c o l l e c t e d b a s e d o n I R u s i n g a t i m e - d o m a i n m e a s u r e m e n t o f t h e e l e c t r o m a g n e t i c r a d i a t i o n . I n o r d e r t o u n d e r s t a n d p r o t e i n d y n a m i c s , m o n i t o r i n g t h e m i n u t e c h a n g e s i n s t r u c t u r e d u r i n g c a t a l y t i c t u r n o v e r i s u s e f u l i n a l a r g e c o m p l e x p r o t e i n s u c h a s C c O . T h e i d e n t i fi c a t i o n o f t h e i m p o r t a n t a m i n o a c i d s t h a t c a n b e p r o t o n a t e d d u r i n g t h e c a t a l y t i c - c y c l e c a n s h o w p r o t o n - a c c e p t i n g s i t e c h a n g e s d u r i n g t h e c a t a l y t i c c y c l e , a s a fi r s t s t e p t o u n d e r s t a n d t h e p u m p i n g m e c h a n i s m . F I R s p e c t r o s c o p y c a n p o t e n t i a l l y r e s o l v e s i n g l e p r o t o n t r a n s f e r e v e n t s b e t w e e n c o f a c t o r s a n d a m i n o a c i d s i d e c h a i n s i f t h e r e s i d u e s c a n b e i n d i v i d u a l l y d e t e c t e d . F I R t e c h n i q u e s b a s e d o n t h e v i b r a t i o n a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n t w o s a m p l e s c a n b e u s e d t o a n a l y z e a n y c h a n g e s i n t h e c a t a l y t i c i n t e r m e d i a t e s o f C c O . D r a w b a c k s o f t h e m e t h o d i n c l u d e t h e l a r g e s i g n a l o f w a t e r , s o t h a t C c O i s n e e d e d t o b e p r e p a r e d a t a v e r y h i g h c o n c e n t r a t i o n a s w e l l a s t h e d i f fi c u l t y o f d e a l i n g w i t h t h e v e r y c o m p l e x s p e c t r u m o f a l a r g e p r o t e i n . T h e h e m e p r o p i o n a t e s a r e p o s s i b l e c a n d i d a t e s f o r a p r o t o n a t i o n s i t e u p o n r e d u c t i o n o f C c O , a s w e l l a s g l u t a m a t e ( E 2 8 6 ) ( R i c h e t a l . , 1 9 9 8 ) a n d t h e “ p r o p i o n a t e / a r g i n i n e / w a t e r c l u s t e r ” s i t e ( W i k s t r o m e t a l . , 2 0 0 3 ) . I n t h e c a s e o f t h e p r o p i o n a t e s , d i f f e r e n t a p p r o a c h e s a r e r e q u i r e d i n o r d e r t o o b s e r v e c h a n g e s . T h e c o m b i n a t i o n o f i s o t o p i c l a b e l i n g a n d r e d o x - F T I R d i f f e r e n c e s p e c t r o s c o p y w a s a p p l i e d t o s t u d y t h e p o s s i b l e r o l e o f h e m e p r o p i o n a t e s i n p r o t o n a t i o n / d e p r o t o n a t i o n ( B e h r e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h e 5 8 c a r b o x y l g r o u p s o f t h e h e m e p r o p i o n a t e s w e r e 1 3 C — l a b e l l e d a f t e r s u p p l e m e n t a t i o n w i t h a 1 3 C l a b e l e d h e m e p r e c u r s o r , [ 1 - I 3 C ] - 5 - a m i n o l e v u l i n a t e . T h e r e d u c e d - m i n u s - o x i d i z e d F T I R d i f f e r e n c e s p e c t r a o f l 3 C - l a b e l e d C c O w a s c o m p a r e d t o t h o s e o f u n l a b e l e d C c O , a l l o w i n g t h e a s s i g n m e n t o f t h e s i g n a l t o a C = O s t r e t c h i n g m o d e o f a c a r b o x y l g r o u p ( ” C O O H ) o f a t l e a s t o n e o f t h e f o u r h e m e p r o p i o n a t e s a t 1 5 3 8 c m ] , w h i c h w a s s h i f t e d t o 1 5 0 0 c m ' ] u p o n r e d o x c h a n g e , s u g g e s t i n g t h a t i t w a s u n d e r g o i n g a c h a n g e i n p r o t o n a t i o n o r a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e . B e s i d e s t h e c a r b o x y l g r o u p o f t h e h e m e p r o p i o n a t e , F T I R s p e c t r o s c o p y c a n b e a p p l i e d t o i n v e s t i g a t e p r o t o n a t i o n / d e p r o t o n a t i o n s t a t e o f c a r b o x y l g r o u p s a n d h a s b e e n e x t e n s i v e l y a p p l i e d t o t h e C c O ( O k u n o e t a l . , 2 0 0 3 ; P u u s t i n e n e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e f u l l y r e d u c e d - m i n u s - o x i d i z e d d i f f e r e n c e s p e c t r u m i n t h e c a r b o x y l s t r e t c h i n g r e g i o n p r o v i d e d t w o n e g a t i v e b a n d s a t 1 7 4 9 a n d 1 7 3 7 c m ' l . T h e s e b a n d s w e r e a s s i g n e d t o E 2 4 2 a n d D 5 1 , r e s p e c t i v e l y , i n b o v i n e C c O . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e o r i e n t a t i o n o f t h e c a r b o x y l s i d e c h a i n s a r e d i f f e r e n t i n t h e f u l l y r e d u c e d a n d o x i d i z e d s t a t e , s u g g e s t i n g t h a t t h e s e s i t e s m a y p l a y a k e y r o l e i n p r o t o n p u m p i n g t h r o u g h t h e H p a t h w a y ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 8 ) . C o m p a r i s o n b e t w e e n s p e c i fi c 1 5 N l a b e l e d h i s t i d i n e s a n d u n l a b e l e d C c O , s h o w e d t h a t h i s t i d i n e l i g a n d s o f h e m e s a n d G u s c o u l d b e p r o t o n a t e d u p o n C c O r e d u c t i o n ( S c h m i d t e t a l . , 2 0 0 4 ) . A h i g h d e g r e e o f c o n s e r v a t i o n a n d f a v o r a b l e p K a f o r p r o t o n a t i o n / d e p r o t o n a t i o n s u g g e s t e d t h a t h e m e a n d c 0 p p e r - b i n d i n g h i s t i d i n e s a r e e s s e n t i a l t o t h e p r o t o n p u m p i n g m e c h a n i s m ( W i k s t r o m e t a l . , 1 9 9 4 ) . M o r e o v e r , h i s t i d i n e h a s b e e n s u g g e s t e d t o p l a y a n e s s e n t i a l r o l e i n t h e p r o t o n a n t e n n a a s s o c i a t e d w i t h D - 5 9 p a t h w a y p r o t o n u p t a k e . M e a s u r i n g h i s t i d i n e t h a t h a s b e e n s p e c i fi c a l l y l a b e l e d w i t h 1 5 N s h o w s l o c a l c h a n g e s w i t h i n t h e C c O t h a t d e p e n d o n t h e r e d o x s t a t e o f t h e m e t a l s . T h i s c o u l d b e i m p o r t a n t i n t h e p r o t o n p u m p i n g m e c h a n i s m . 1 . 3 . 1 . 7 . X - R a y C r y s t a l l o g r a p h y T h e fi r s t a t o m i c r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e s o f m a m m a l i a n ( T s u k i h a r a e t a l . , 1 9 9 5 ) a n d b a c t e r i a l C c O ( I w a t a e t a l . , 1 9 9 5 ) i m m e d i a t e l y p r o v i d e d a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f C c O f u n c t i o n a n d i t s m e c h a n i s m . B u t , d e fi n e d w a t e r s t r u c t u r e s , w h i c h h a v e a n i m p o r t a n t r o l e i n p r o t o n m o v e m e n t , i n t h e C c O c a n o n l y b e a c q u i r e d i n a v e r y h i g h r e s o l u t i o n c r y s t a l . E v e n w i t h a l l t h e d i f fi c u l t i e s i n m a k i n g m e m b r a n e p r o t e i n c r y s t a l s t h a t d i f f r a c t t o h i g h r e s o l u t i o n , p r o g r e s s h a s b e e n m a d e t o p r o d u c e c r y s t a l s o f C c O u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s ( Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ; Q i n e t a l . , 2 0 0 7 ; Y o s h i k a w a e r a l . , 1 9 9 8 ) . M a n y d e t e r g e n t / l i p i d a l k y l c h a i n s o c c u p y e s s e n t i a l l y i d e n t i c a l p o s i t i o n s o n t h e s u r f a c e o f C c O i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f o x i d a s e s f r o m R . s p h a e r o i d e s a n d P . d e n i t r z fi c a n s a n d a r e a l s o f o u n d i n b o v i n e h e a r t C c O . T h e s e s i t e s m a y h a v e a c r i t i c a l r o l e i n s t r u c t u r e a n d a c t i v i t y ( Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) . C o n s e r v e d w a t e r s i n C c O h a v e h e l p e d i d e n t i f y t w o d i s t i n c t p r o t o n u p t a k e p a t h w a y s o n t h e b a s i s o f t h e X - r a y c r y s t a l l o g r a p h i c w a t e r s a t h i g h r e s o l u t i o n ( F i g u r e 1 . 1 0 ) . H o w e v e r , n o t a l l o f t h e p r o t o n p a t h w a y s a r e r e s o l v e d w i t h i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s a n d t h e r e a r e s t i l l t o o f e w w a t e r s r e s o l v e d t o a l l o w w a t e r c h a i n f o r m a t i o n . F l e x i b l e r e g i o n s i n t h e s t r u c t u r e s a r e a l s o r a r e l y r e s o l v e d . E v e n w i t h t h e s e l i m i t a t i o n s , v a r i o u s 6 0 i n f o r m s o f X - r a y c r y s t a l s ( r e d u c e d ! o x i d i z e d / w i t h i n h i b i t o r / m u t a n t s ) g i v e i n f o r m a t i o n o n t h e d i f f e r e n t f o r m s o f C c O , a n d a r e e x p e c t e d t o p r o v i d e i m p o r t a n t i n s i g h t s i n t o s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n , i n c l u d i n g s p e c i fi c a s s o c i a t i o n w i t h l i p i d s , d e t e r g e n t s , s t e r o i d s , m e t a l s a n d w a t e r . C a d m i u m / z i n c b i n d i n g s i t e s a r e i d e n t i fi e d a t t h e c r y s t a l l o g r a p h i c s u r f a c e a n d a t t h e e n t r a n c e o f t h e p r o t o n p a t h w a y s e i t h e r o n t h e D - o r K - p a t h w a y s i n t h e s o l u b i l i z e d C c O ( M u r a r n o t o e t a l . , 2 0 0 7 ; Q i n e t a l . , 2 0 0 7 ) . I t i s p r o p o s e d t h a t a t l e a s t t h r e e i n h i b i t o r y m e t a l b i n d i n g s i t e s o n C c O b l o c k t h e p r o t o n m o v e m e n t t h r o u g h t h e s e p a t h w a y s . O n l y t w o h a v e s o f a r b e e n i d e n t i fi e d b y m u t a t i o n a n d c r y s t a l l o g r a p h y . 6 1 < 7 3 “ ' « fl , a N 1 2 1 } ~ 7 ‘ ? “ p . . N 1 3 9 I & ' . - . = ~ < : N 2 0 7 ; 5 2 9 9 , l D P a t h w a y P : L K P a t h w a y \ \ t N A R \ D 1 3 2 1 F i g u r e 1 . 1 0 T h e D a n d K p r o t o n u p t a k e p a t h w a y s i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e . T w o p r o t o n u p t a k e p a t h w a y s ( b l u e a r r o w ) a r e w e l l d e fi n e d i n t h e X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e . T h e s e p a t h w a y s a r e d e fi n e d b y w a t e r m o l e c u l e s ( y e l l o w b a l l ) i n s u b u n i t I f r o m t h e s t r u c t u r e o f R . s p h a e r o i d e s c y t o c h r o m e c o x i d a s e . W a t e r c h a i n s a r e f o r m e d b y a h y d r o g e n b o n d i n g n e t w o r k w i t h p o l a r r e s i d u e s a n d w a t e r m o l e c u l e s . T h e i m p o r t a n t r e s i d u e s a r e l a b e l e d b y r e s i d u e n u m b e r a n d s h o w i n g t h e p r o t o n p u m p i n g p a t h s . ( T h e fi g u r e i s f r o m D r . L i n g Q i n ) 6 2 1 . 3 . 1 . 8 . A m i d e H / D E x c h a n g e M a s s S p e c t r o m e t r y T h e t r a n s i t i o n s b e t w e e n c a t a l y t i c i n t e r m e d i a t e s i n C c O a r e m o d u l a t e d b y t h e o p e n i n g a n d c l o s i n g o f s p e c i fi c p r o t o n p a t h w a y s , p r o v i d i n g a l t e r n a t i n g a c c e s s f o r p r o t o n s , a n d u l t i m a t e l y t r a n s p o r t i n g p r o t o n s a c r o s s t h e m e m b r a n e . I t i s b y n o m e a n s c l e a r w h e t h e r c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s o c c u r t h a t a r e s i g n i fi c a n t i n s i z e , o r o n l y h i g h l y l o c a l i z e d a n d s m a l l . T h e p e p t i d e b a c k b o n e s o f C c O t h a t c o u l d u n d e r g o r e d o x d e p e n d e n t c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s w e r e t r a c e d b y H / D e x c h a n g e k i n e t i c s c o m b i n e d w i t h s e q u e n c e b a s e d M a s s s p e c t r o m e t r y ( B u s e n l e h n e r a n d A r m s t r o n g , 2 0 0 5 ; B u s e n l e h n e r e t a l . , 2 0 0 8 ) . T h e c h e m i c a l e x c h a n g e r e a c t i o n s c a n b e m o n i t o r e d w i t h e i t h e r c o n t i n u o u s fl o w M S m e t h o d s o r c h e m i c a l q u e n c h i n g f o l l o w e d b y s a m p l e c o l l e c t i o n a n d d i r e c t fl o w i n j e c t i o n i n t o a m a s s s p e c t r o m e t e r . T h e c o n t i n u o u s fl o w m e t h o d h a s b e e n u s e d t o s t u d y H / D e x c h a n g e i n l o n g - l i v e d e n z y m e i n t e r m e d i a t e s w h i l e c h e m i c a l q u e n c h i n g i s w e l l - s u i t e d f o r t h e d e t e c t i o n o f s h o r t l i v e d c h e m i c a l s p e c i e s a s i n t h e c a s e o f C c O . H / D e x c h a n g e w a s p e r f o r m e d o n C c O f o r e a c h i n t e r m e d i a t e s t a t e ( 0 , R , P M , a n d F ) ( B u s e n l e h n e r e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e t o t a l p e r c e n t a g e o f d e u t r e r i u m i n c o r p o r a t e d i n t o t h e p e p t i d e b a c k b o n e o f t h o s e p e p t i d e s t h a t c o u l d b e r e c o v e r e d , w a s m e a s u r e d a s a f u n c t i o n o f t i m e a n d fi t t e d t o e x p o n e n t i a l e q u a t i o n s . F o r e x a m p l e , p e p t i d e r e s i d u e n u m b e r s 3 5 2 - 3 6 6 c o n t a i n r e s i d u e s i n v o l v e d i n t h e K — p a t h w a y ( R . s p h a e r o i d e s n u m b e r i n g ) , w h i l e p e p t i d e 2 8 2 - 2 9 2 c o n t a i n s r e s i d u e s i m p o r t a n t i n t h e D - p a t h w a y , i n c l u d i n g E 2 8 6 a n d t h e Y 2 8 8 - H 2 8 4 c o v a l e n t c r o s s - l i n k . P e p t i d e 1 2 3 - 1 3 5 c o n t a i n s D 1 3 2 a t t h e e n t r a n c e o f t h e D - p a t h w a y . P e p t i d e 3 2 0 - 3 4 0 ( s u b u n i t 1 ) a n d 2 2 5 - 2 2 9 o f s u b u n i t H w e r e c o n s i d e r e d a s b e i n g p a r t o f a p o s s i b l e p r o t o n e x i t p a t h w a y t o g a i n i n f o r m a t i o n a t t h e s u b u n i t I — H i n t e r f a c e . 6 3 T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e w a s a r e d o x - d e p e n d e n t s t r u c t u r a l a n d d y n a m i c p e r t u r b a t i o n i n C c O . A m i d e H I D e x c h a n g e k i n e t i c s s u g g e s t e d t h a t t h e t r a n s i t i o n f r o m O 9 R t h a t c o n t r o l s p r o t o n u p t a k e b y t h e K - p a t h w a y i s c o n n e c t e d t o s t r u c t u r a l c h a n g e s t h a t m a y b l o c k p r o t o n a c c e s s t h r o u g h t h e D - p a t h w a y . U p o n o x y g e n b i n d i n g ( R 9 P M ) t h e K - p a t h w a y p e p t i d e r e p o r t e r w a s w e a k l y l a b e l e d . T h e r e s u l t s w e r e i n t e r p r e t e d t o i n d i c a t e t h e s p a t i a l l o c a t i o n o f a g a t e , w h i c h c o n t r o l s t h e u n i d i r e c t i o n a l p r o t o n fl u x t h r o u g h t h e e n z y m e , a n d t o i n d i c a t e t h a t s o m e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s a r e l i k e l y t o b e i n v o l v e d i n t h e p u m p i n g p r o c e s s . 1 . 3 . 1 . 9 . B i o m i m e t i c M o d e l S t u d y T h e b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i z a t i o n o f C c O a n d i t s v a r i o u s m u t a n t s h a s s h o w n t h a t p r o t o n m o v e m e n t i s c o u p l e d t o 0 2 r e d u c t i o n a t t h e a c t i v e s i t e a n d t h e e l e c t r o n t r a n s f e r i s c o o r d i n a t e d w i t h p r o t o n p u m p i n g a c t i v i t y . H o w e v e r , b e c a u s e o f t h e i n h e r e n t c o m p l e x i t y o f C c O , i t i s v e r y d i f fi c u l t t o m a n i p u l a t e t h e n a t i v e e n z y m e . S i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s i s a g o o d m o l e c u l a r b i o l o g i c a l t o o l t o u n d e r s t a n d t h e m e c h a n i s m b y s t u d y i n g t h e e f f e c t s b y m a k i n g d i f f e r e n t m u t a t i o n s . H o w e v e r , i t i s n o t u s e f u l i f t h e m u t a t i o n s e v e r e l y i n h i b i t s t h e a c t i v i t y o r c a u s e s i n a c t i v a t i o n o f C c O ( P fi t z n e r e t a l . , 1 9 9 8 ) . A n o t h e r a p p r o a c h i s t o t r y t o s i m p l i f y t h e s y s t e m b y c r e a t i n g a m o d e l o f t h e a c t i v e s i t e . A r e c e n t m o d e l o f C c O w a s e s t a b l i s h e d b y u s i n g a m i m e t i c s y s t e m w i t h s i m i l a r s t r u c t u r a l c o o r d i n a t i o n i n c l u d i n g F e a 3 , C u p a n d t y r o s i n e d e s i g n e d o n t h e b a s i s o f t h e n a t i v e e n z y m e p l a c e d o n t o a s e l f - a s s e m b e l e d m o n o l a y e r o f g o l d c o a t e d e l e c t r o d e s 6 4 ( C o l l m a n e r a l . , 2 0 0 7 ) . I n t h i s m o d e l , t h e s t e a d y s t a t e c a t a l y t i c r e d u c t i o n o f 0 2 w a s s t u d i e d u s i n g t h i s s y n t h e t i c C c O w i t h a m i m i c k e d s t r u c t u r e o f t y r o s i n e 2 4 4 , w h i c h d e l i v e r s a n e l e c t r o n t o b o u n d o x y g e n i n t h e a c t i v e s i t e . T h e a c t i v e s i t e m o d e l s u p p o r t s t h e p r i m a r y r o l e o f t h e r e d o x c e n t e r t o p r o v i d e f o u r e l e c t r o n s r a p i d l y t o r e d u c e d i o x y g e n w h i l s t p r e v e n t i n g t h e r e l e a s e o f t o x i c r a d i c a l o x y g e n s p e c i e s ( R O S ) . A k i n e t i c s t u d y o f t h e e n g i n e e r e d a c t i v e c e n t e r m a y g i v e i n f o r m a t i o n t o W a r d t h e u n d e r s t a n d i n g o f t h e f u n c t i o n a l m e c h a n i s m o f n a t i v e e n z y m e . 1 . 3 . 2 . S t u d y o f R e c o n s t i t u t e d S y s t e m s P h o s p h o l i p i d v e s i c l e s c a n b e f o r m e d t o i n c o r p o r a t e p u r i fi e d m e m b r a n e p r o t e i n s ( p r o t e o l i p o s o m e s ) a n d a r e a p o w e r f u l t o o l f o r f u n c t i o n a l a n d s t r u c t u r a l s t u d i e s o f C c O . R e c o n s t i t u t i o n a l l o w s a n a l y s i s o f i m p o r t a n t p r o p e r t i e s o f m e m b r a n e p r o t e i n s , s u c h a s l i p i d - p r o t e i n a n d p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s , t o p o l o g y o f t h e c o n s t i t u e n t s u b u n i t s a n d r e d o x c e n t e r s , a n d i n v o l v e m e n t o f s u b u n i t s i n t h e e n e r g y t r a n s f e r p r o c e s s e s ( R i g a u d e t a l . , 1 9 9 5 ) . P a r t i c u l a r l y , t h e r e c o n s t i t u t i o n i n l i p o s o m e s o f e n e r g y t r a n s d u c i n g e n z y m e s o f o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n h a s c o n t r i b u t e d e v i d e n c e f o r t h e c o n c e p t o f c h e m i o s m o t i c c o u p l i n g b e t w e e n r e d o x p r o c e s s e s a n d A T P s y n t h e s i s i n m i t o c h o n d r i a l a s w e l l a s b a c t e r i a l s y s t e m s . I n e n e r g y t r a n s d u c i n g e n z y m e s s u c h a s C c O , r e c o n s t i t u t e d v e s i c l e s a r e a n e s s e n t i a l t o o l f o r u n d e r s t a n d i n g t h e p r o t o n t r a n s l o c a t i o n m e c h a n i s m a c r o s s t h e m e m b r a n e . U s u a l l y m e m b r a n e p r o t e i n s c a n b e i s o l a t e d e i t h e r i n a m i x e d m i c e l l e w i t h d e t e r g e n t , d i s s o l v e d i n a n o r g a n i c s o l v e n t , o r i n a n a q u e o u s e n v i r o n m e n t a s a n a g g r e g a t e o r m e m b r a n e f r a g m e n t . A f t e r i s o l a t i o n a n d p u r i fi c a t i o n , m e m b r a n e p r o t e i n s c a n b e r e c o n s t i t u t e d i n t o l i p o s o m e s f o l l o w i n g t h r e e m a i n s t r a t e g i e s : o r g a n i c s o l v e n t m e d i a t e d 6 5 r e c o n s t i t u t i o n ( r e v e r s e — p h a s e e v a p o r a t i o n , r e h y d r a t i o n o f l i p i d - p r o t e i n fi l m s ) , m e c h a n i c a l m e a n s ( s o n i c a t i o n , F r e n c h p r e s s , f r e e z e - t h a w ) , d e t e r g e n t - m e d i a t e d r e c o n s t i t u t i o n s ( d e t e r g e n t r e m o v a l , d i l u t i o n o r d i r e c t i n c o r p o r a t i o n ) ( F i g u r e 1 . 1 1 ) . N o s i n g l e r e c o n s t i t u t i o n p r o c e d u r e w o r k s f o r a l l m e m b r a n e p r o t e i n s . I t h a s b e e n p o s s i b l e t o d e fi n e a n u m b e r o f e x p e r i m e n t a l v a r i a b l e s t h a t a r e c r i t i c a l t o o b t a i n i n g p r o p e r r e c o n s t i t u t i o n s y s t e m s f o r m a n y p r o t e i n s . I n s o m e c a s e s , s e v e r a l m e t h o d s a r e a p p l i e d t o g e t h e r . M a n y o f t h e s t u d i e s o n r e c o n s t i t u t e d s y s t e m s h a v e e m p l o y e d d e fi n e d p h o s p h o l i p i d m i x t u r e s o r p h o s p h o l i p i d s e x t r a c t e d f r o m s o y b e a n s , k n o w n a s ‘ a s o l e c t i n ’ , w h i c h i s a m i x t u r e d o m i n a t e d b y p h o s p h a t i d y l c h o l i n e a n d i s s i m i l a r t o t h a t p r e s e n t i n t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e w i t h r e g a r d t o t h e k i n d s o f p h o s p h o l i p i d s a n d u n s a t u r a t e d f a t t y a c y l c h a i n s . A s o l e c t i n l i p i d ( A v a n t i P o l a r L i p i d s , I n c . ) c o n t a i n s p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( 4 5 . 7 % ) , p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( 2 2 . 1 % ) , p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( 1 8 . 4 % ) a n d s o m e p h o s t a t i d i c a c i d ( 6 . 9 % ) i n c l u d i n g s o m e i m p u r i t i e s ( ~ 6 % ) . 6 6 C E L L U L A R M E M B R A N E 6 ' : i 3 : " + O r g a n i c s o l v e n t i f ; + D e t e r g e n t “ o r F r a g m e n t a t i o n l = W " ’ , ¢ t g g . i f 0 ” ‘ l . I + L l p l d s 0 ‘ 5 : 4 ‘ , » — + L i p o s o m e + D e t e r g e n t a . E v a p o r a t l o H y d r a t i o n ( \ l + L l p l d s 9 \ , . - ’ I , ‘ ‘ ' i S o n l c a t i o n F r e n c h p r e s s I R e h y d r a t l o n E v a p o r a t i o n D i r e c t D e t e r g e n t F r e e z e - t h a w I n c o r p o r a t i o n r e m o v a l I I l I I I f v v O R G A N I C S O L V E N T M E C H N I C A L D E T E R G E N T F i g u r e 1 . 1 1 S c h e m a t i c d i a g r a m f o r t h e f u n c t i o n a l r e a s s e m b l y o f m e m b r a n e p r o t e i n i n t o l i p o s o m e s w i t h d i f f e r e n t s t r a t e g i e s . M e m b r a n e p r o t e i n s c a n b e i s o l a t e d , e i t h e r i n m i x e d m i c e l l e s w i t h d e t e r g e n t , b y d i s s o l v i n g p r o t e i n s i n o r g a n i c s o l v e n t , o r i n a n a q u e o u s e n v i r o n m e n t a s a g g r e g a t e s . I s o l a t e d p r o t e i n c a n b e r e c o n s t i t u t e d f o l l o w i n g t h r e e m a i n s t r a t e g i e s : o r g a n i c s o l v e n t - m e d i a t e d r e c o n s t i t u t i o n s ( r e v e r s e - p h a s e e v a p o r a t i o n , r e h y d r a t i o n o f l i p i d - p r o t e i n fi l m s ) ; m e c h a n i c a l m e a n s ( s o n i c a t i o n , F r e n c h p r e s s , f r e e z e - t h a w ) ; d e t e r g e n t - m e d i a t e d r e c o n s t i t u t i o n ( d e t e r g e n t r e m o v a l , d i l u t i o n o r d i r e c t i n c o r p o r a t i o n ) . T h e fi g u r e i s f r o m R i g a u d e t a l . ( R i g a u d e t a l . , 1 9 9 5 ) 6 7 1 . 3 . 2 . 1 . O r g a n i c s o l v e n t - m e d i a t e d r e c o n s t i t u t i o n s O r g a n i c s o l v e n t s h a v e b e e n w i d e l y u s e d t o p r e p a r e l i p o s o m e s . R e c o n s t i t u t e d v e s i c l e s w h i c h a r e p r e p a r e d i n t h i s m e t h o d h a v e a l a r g e i n t e r n a l a q u e o u s s p a c e a n d e n t r a p d y e e f fi c i e n t l y . A r a n g e o f b u f f e r c o m p o s i t i o n s w i t h h i g h i o n i c s t r e n g t h a r e p r e p a r e d . L a r g e l i p o s o m e s o f C c O c o u l d b e f o r m e d b y a n e v a p o r a t i o n p r o c e d u r e w h e r e a p r o t e i n - l i p i d c o m p l e x i s d i s s o l v e d i n o r g a n i c s o l v e n t f o l l o w e d b y r e h y d r a t i o n w i t h a q u e o u s b u f f e r ( B u t k o a n d N i c h o l l s , 1 9 9 3 ) . H o w e v e r , t h i s m e t h o d p r o d u c e s a v e r y h e t e r o g e n e o u s p o p u l a t i o n o f p r o t e o l i p o s o m e s , w i t h a l a r g e p r o p o r t i o n o f m u l t i l a m e l l a r v e s i c l e s , w h i c h h a v e m u l t i l a y e r s o f t h e l i p i d b i l a y e r . T h e r e v e r s e p h a s e e v a p o r a t i o n m e t h o d ( S z o k a a n d P a p a h a d j o p o u l o s , 1 9 7 8 ) a l l o w e d e f fi c i e n t i n c o r p o r a t i o n o f r h o d o p s i n ( D a r s z o n e t a l . , 1 9 7 9 ) a n d b a c t e r i o r h o d o p s i n ( R i g a u d e t a l . , 1 9 8 3 ) . L a r g e u n i l a m e l l a r p r o t e o l i p o s o m e s ( 0 . 2 t o 5 p m ) a r e f o r m e d f r o m w a t e r - i n - o i l e m u l s i o n o f p h o s p h o l i p i d - p r o t e i n - a q u e o u s b u f f e r i n a n e x c e s s o f o r g a n i c s o l v e n t , f o l l o w e d b y r e m o v a l o f t h e o r g a n i c p h a s e u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . P e n t a n e , h e x a n e , d i - i s o p r o p y l e t h e r a n d d i e t h y l e t h e r h a v e b e e n c o m m o n l y u s e d a s o r g a n i c s o l v e n t s f o r t h e s e s y s t e m s . H o w e v e r , o r g a n i c s o l v e n t s d e n a t u r e s o m e a m p h i p h i l i c m e m b r a n e p r o t e i n s . T h e o r g a n i c s o l v e n t - m e d i a t e d r e c o n s t i t u t i o n m e t h o d i s p r e c l u d e d f o r f u n c t i o n a l s t u d i e s o f t h e r e c o n s t i t u t e d C c O . 1 . 3 . 2 . 2 . M e c h a n i c a l m e a n s D r i e d p h o s p h o l i p i d fi l m s , w h i c h a r e o b t a i n e d b y e v a p o r a t i o n o f s o l v e n t , a r e f o l l o w e d b y a s w e l l i n g p r o c e d u r e w i t h a n e x c e s s a m o u n t o f a q u e o u s b u f f e r . M u l i t l a m e l l a r l i p i d v e s i c l e s f o r m s p o n t a n e o u l y . I n o r d e r t o p r o d u c e l a r g e u n i l a m e l l a r 6 8 v e s i c l e s ( L U V ) o r s m a l l u n i l a m e l l a r v e s i c l e s ( S U V ) , w h i c h h a v e h i g h e r f r e e e n e r g i e s , s o m e e n e r g y m u s t b e a p p l i e d i n t o t h e m u l t i l a m e l l a r s y s t e m . T h e m o s t c o m m o n l y u s e d t e c h n i q u e t o p r e p a r e S U V i s t h e s o n i c a t i o n o f m i l t i l a m e l l a r v e s i c l e s ( M L V ) . F r e n c h p r e s s i n g ( B a r e n h o l z t e t a l . , 1 9 7 9 ) i s a l s o p e r f o r m e d f o r t h e s a m e r e a s o n , o r f o r c o n v e r s i o n o f S U V i n t o L U V i n a r e v e r s e w a y , f e e z e - t h a w i n g ( P i c k , 1 9 8 1 ) c a n b e a p p l i e d . S o n i c a t i o n o f a m i x e d s u s p e n s i o n o f l i p i d d e t e r g e n t a n d i s o l a t e d p r o t e i n s h a s b e e n w i d e l y u s e d w h e n d e t e r g e n t d i a l y s i s w a s i n e f fi c i e n t . T h e a d v a n t a g e o f t h i s s o n i c a t i o n p r o c e d u r e i s t h a t i t i s r a p i d a n d r e q u i r e s n o e x t r a d e t e r g e n t , b u t m a j o r c r u c i a l d r a w b a c k s c a n b e i r r e p r o d u c i b i l i t y , i n a c t i v a t i o n o f m a n y p r o t e i n s b y l o n g s o n i c a t i o n , a n d t h e s m a l l s i z e o f t h e r e s u l t i n g p r o t e o l i p o s o m e s ( 2 0 - 4 0 n m ) . A m a j o r d i s a d v a n t a g e i s t h a t i t i s d i f fi c u l t t o r e p r o d u c e t h e p o w e r o u t p u t o f t h e s o n i c a t o r , p a r t i c u l a r l y w h e n s m a l l v o l u m e s a r e t o b e s o n i c a t e d . L o c a l h e a t i n g i s d i f fi c u l t t o c o n t r o l w i t h a p r o b e - t y p e s o n i c a t o r . T h e l e n g t h o f t i m e o f s o n i c a t i o n i s , o f c o u r s e , t h e m o s t c r i t i c a l f e a t u r e a n d m u s t b e d e t e r m i n e d w i t h e a c h p r o t e i n t h a t i s b e i n g r e c o n s t i t u t e d . F r e e z e - t h a w i n g m e t h o d s c a n b e u s e d , w i t h o r w i t h o u t s o n i c a t i o n , t o g e t b e t t e r r e c o n s t i t u t i o n ( K a s a h a r a a n d H i n k l e , 1 9 7 7 ) . S o n i c a t i o n w i t h f r e e z e - t h a w i s f o l l o w e d b y a m i x i n g o f s o n i c a t e d S U V a n d p r o t e i n w i t h a r a p i d f r e e z e t e c h n i q u e i n l i q u i d n i t r o g e n . T h i s m e t h o d w a s fi r s t u s e d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f p r o t e o l i p o s o m e s w i t h t h e g l u c o s e c a r r i e r f r o m r e d b l o o d c e l l s ( K a s a h a r a a n d H i n k l e , 1 9 7 6 ) . A f t e r t h a w i n g a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h e m i x t u r e i s e x p o s e d t o b r i e f p e r i o d s o f s o n i c a t i o n ( l e s s t h a n 2 m i n ) . T h i s m e t h o d i s v e r y s u i t a b l e f o r p r o t e i n s t h a t a r e s e n s i t i v e t o s o n i c a t i o n , s u c h a s c y t o c h r o m e o x i d a s e , w i t h o u t m u c h l o s s o f e n z y m a t i c a c t i v i t y . V e r y l a r g e p r o t e o l i p o s o m e s a r e 6 9 f o r m e d w h i c h c a n b e b r o k e n b y a s h o r t s o n i c a t i o n l e a d i n g t o a p r e p a r a t i o n o f u n i l a m e l l a r p r o t e o l i p o s o m e s w i t h d i a m e t e r s r a n g i n g f r o m 2 0 - 2 0 0 n m . T h e l i p i d b i l a y e r i s e a s i l y f r a c t u r e d a n d t h e e x p o s e d h y d r o p h o b i c c o r e s ‘ a l l o w t h e f o r m a t i o n o f l a r g e l i p o s o m e s b y f u s i o n d u r i n g t h e s l o w t h a w i n g . T h i s m e t h o d i s r a p i d a n d c a n b e a p p l i e d t o p r o t e i n s t h a t a r e s e n s i t i v e t o d e t e r g e n t . H o w e v e r , p r o t e o l i p o s o m e s h a v e a r e l a t i v e l y w i d e r a n g e o f s i z e a n d h a v e r a n d o m o r i e n t a t i o n o f t h e p r o t e i n i n t h e m e m b r a n e . P o s s i b l e a g g r e g a t i o n i s a n o t h e r l i m i t a t i o n w i t h t h i s m e t h o d . L i p o s o m e s t h a t c o n t a i n p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e a n d a b o u t 3 0 % o f e i t h e r p h o s p h a t i d y l s e r i n e o r c a r d i o l i p i n f u s e r a p i d l y o n a d d i t i o n o f C a 2 + o r b y m a n i p u l a t i o n o f t h e p H o f t h e m i x t u r e ( S c h n e i d e r e t a l . , 1 9 8 0 ) . F u s i o n c a n b e m e a s u r e d k i n e t i c a l l y b y m e a s u r i n g t h e i n c r e a s e i n r e s p i r a t i o n ( l o s s o f r e s p i r a t o r y c o n t r o l ) w h e n A T P a s e i s i n c o r p o r a t e d b y f u s i o n i n t o t h e s a m e v e s i c l e t h a t c o n t a i n s c y t o c h r o m e o x i d a s e . T h i s m e t h o d y i e l d s l a r g e r l i p o s o m e s t h a n t h e o t h e r r e c o n s t i t u t i o n p r o c e d u r e s . 1 . 3 . 2 . 3 . D e t e r g e n t - m e d i a t e d r e c o n s t i t u t i o n s T h e m o s t s u c c e s s f u l a n d f r e q u e n t l y u s e d s t r a t e g y f o r t h e p r e p a r a t i o n o f p r o t e o l i p o s o m e s f o r f u n c t i o n a l a n d m e c h a n i s t i c a l s t u d i e s i s a d e t e r g e n t - m e d i a t e d r e c o n s t i t u t i o n m e t h o d , b e c a u s e m o s t m e m b r a n e p r o t e i n s a r e i s o l a t e d a n d p u r i fi e d i n t h e p r e s e n c e o f d e t e r g e n t s . P r o t e i n s a r e fi r s t c o - s o l u b i l i z e d w i t h p h o s p h o l i p i d s i n t h e a p p r o p r i a t e d e t e r g e n t i n o r d e r t o f o r m a n i s o t r o p i c s o l u t i o n o f l i p i d - p r o t e i n - d e t e r g e n t a n d 7 0 l i p i d - d e t e r g e n t m i c e l l e s . T h e d e t e r g e n t r e m o v a l r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f b i l a y e r v e s i c l e s w i t h i n c o r p o r a t e d p r o t e i n . T h e r e a r e v a r i o u s m e t h o d s o f d e t e r g e n t r e m o v a l b a s e d o n t h e p h y s i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f d e t e r g e n t s s u c h a s t h e c r i t i c a l m i c e l l e c o n c e n t r a t i o n ( C M C ) . T h e ‘ C M C ’ i s d e fi n e d a s t h e c o n c e n t r a t i o n a t w h i c h t h e d e t e r g e n t m o n o m e r s s t a r t f o r m i n g m i c e l l a r a g g r e g a t e s , w h i c h i s r e l a t e d t o t h e b a l a n c e b e t w e e n h y d r o p h o b i c a n d h y d r o p h i l i c c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e d e t e r g e n t . C h o l a t e , d e o x y c h o l a t e , a n d o c t y l — g l u c o s i d e , w h i c h e x h i b i t a h i g h C M C , a r e m o s t s u i t a b l e f o r a d i a l y s i s - b a s e d p r o c e d u r e ( A l l e n e t a l . , 1 9 8 0 ) . T h e c h o l a t e - d i a l y i s p r o c e d u r e w a s t h e fi r s t m e t h o d u s e d f o r t h e r e c o n s t i t u t i o n o f e n z y m e s i n v o l v e d i n o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n ( K a g a w a a n d R a c k e r , 1 9 7 1 ) . T h e b a s i c p r o c e d u r e i s t o m i x a s u s p e n s i o n o f p h o s p h o l i p i d s t h a t w e r e e x p o s e d t o s o n i c a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f s o d i u m c h o l a t e , w i t h t h e i s o l a t e d p r o t e i n a l s o a t a p p r o p r i a t e c h o l a t e c o n c e n t r a t i o n s . T h i s i s f o l l o w e d b y t h e s l o w r e m o v a l o f t h e d e t e r g e n t b y d i a l y s i s f o r a b o u t 2 0 h o u r s . T h e c h o l a t e - d i a l y s i s m e t h o d i s s i m p l e a n d h a s b e e n i n t e n s i v e l y u s e d f o r a v a r i e t y o f m e m b r a n e s y s t e m s i n c l u d i n g c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( B r u n o r i e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o w a s m e a s u r e d a s a c r i t e r i o n o f s u c c e s s f u l r e c o n s t i t u t i o n , s i n c e i t i n d i c a t e s a r e s p o n s e o f t h e e n z y m e t o b u i l d u p a m e m b r a n e p o t e n t i a l . W e l l r e c o n s t i t u t e d C O V s a l l o w e d m o n i t o r i n g o f t h e p r o t o n p u m p i n g o f C c O i n t h e v e s i c l e s b y s t o p p e d fl o w t e c h n i q u e s . T h e o r i e n t a t i o n o f t h e p r o t e i n i n t h e l i p o s o m e s i s d e p e n d e n t o f t h e m e t h o d o f r e c o n s t i t u t i o n u s e d . V e s i c l e s p r e p a r e d b y t h e c h o l a t e d i a l y s i s m e t h o d p r e s e n t o v e r 8 0 % o f t h e r e c o n s t i t u t e d C c O o r i e n t e d r i g h t - s i d e - o u t ( C a s e y e t a l . , 1 9 8 4 ; G r e g o r y a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 8 9 ) . T h e c h o l a t e d i a l y s i s m e t h o d c o m b i n e d w i t h a h i s - t a g 7 1 p u r i fi c a t i o n m e t h o d u s i n g N i - N T A r e s i n t h a t b o u n d t o a h i s - t a g g e d C c O , i m p r o v e d t h e s i g n a l ] n o i s e r a t i o b y g i v i n g m o r e h o m o g e n i o u s l y o r i e n t e d C O V s w i t h o u t b a c k g r o u n d s i g n a l i n t e r f e r e n c e ( H i s e r e t a l . , 2 0 0 1 ) . G e l fi l t r a t i o n a l s o c a n b e a p p l i e d t o e l i m i n a t e t h e d e t e r g e n t ( A b e y w a r d e n a e t a l . , 1 9 8 3 ; K a g a w a e t a l . , 1 9 7 3 ) . T h e r e c o n s t i t u t e d m i x t u r e o f p r o t e i n , d e t e r g e n t a n d l i p i d w a s a p p l i e d t o a g e l - e x c l u s i o n c o l u m n . T h e p r o t e i n i n t e g r a t e d i n t o t h e l i p o s o m e s m o v e s m o s t r a p i d l y t h r o u g h t h e c o l u m n , w h i l e d e t e r g e n t m i c e l l e s a r e i n c l u d e d i n t h e r e s i n a n d e l u t e d l a t e r . D e p e n d i n g u p o n t h e s i z e o f t h e m i c e l l e s , d i f f e r e n t r e s i n t y p e / s i z e c a n b e s e l e c t e d f o r f r a c t i o n i z a t i o n s u c h a s S e p h a d e x G 2 5 / 2 0 0 a n d S e p h a r o s e 4 B ( W r i g g l e s w o r t h e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e m o s t s i g n i fi c a n t a d v a n t a g e o f t h i s t e c h n i q u e i s i t s r a p i d i t y , a v o i d i n g l o n g p e r i o d s o f e x p o s u r e t o d e t e r g e n t w h i c h i s c o m m o n i n d i a l y s i s . H o w e v e r , i t t u r n s i n t o a d i s a d v a n t a g e i n t e r m s o f i n c o m p l e t e p r o t e i n i n c o r p o r a t i o n , a n d a l s o i n t e r m s o f a b r o a d e r s i z e d i s t r i b u t i o n o f p r o t e o l i p o s o m e s t h a n f o u n d b y d i a l y s i s ( A b e y w a r d e n a e t a l . , 1 9 8 3 ) . T o o r a p i d a r e m o v a l t h r o u g h a d e t e r g e n t f r e e S e p h a d e x c o l u m n h a s y i e l d e d p o o r r e c o n s t i t u t i o n . D e t e r g e n t s w i t h l o w C M C ( e . g . , T r i t o n X - 1 0 0 ) a r e p o o r l y r e m o v e d b y g e l c h r o m a t o g r a p h y , o r b y d i a l y s i s . M o r e o v e r , t h e d i a l y s i s r e q u i r e s a l o n g t i m e t o r e a c h a n e q u i l i b r i u m c o n d i t i o n . T h e s e d e t e r g e n t s c a n b e e f fi c i e n t l y r e m o v e d b y t h e a d d i t i o n o f d e t e r g e n t — a b s o r b i n g h y d r o p h o b i c p o l y s t y r e n e r e s i n s s u c h a s B i o - B e a d s S M - 2 a d s o r b e n t ( B i o - R a d l a b o r a t o r i e s ) ( R i g a u d e r a l . , 1 9 9 7 ) . T h e h y d r o p h o b i c a b s o r p t i o n h a s b e e n s h o w n t o b e e f fi c i e n t f o r a l l k i n d s o f d e t e r g e n t s i n c l u d i n g t h o s e w i t h a h i g h C M C . T h e B i o - b e a d m e t h o d s a l l o w a c h i e v e m e n t o f r e l a t i v e l y l a r g e , m o r e h o m o g e n o u s , a n d 7 2 i m p e r m e a n t p r o t e o l i p o s o m e s ( L e v y e t a l . , 1 9 9 0 ; R i c h a r d e t a l . , 1 9 9 5 ; R i g a u d e t a l . , 1 9 8 8 ) . C c O c a n b e s u c c e s s f u l l y r e c o n s t i t u t e d i n t h e v e s i c l e s u s i n g a B i o - B e a d s t r e a t m e n t , a l l o w i n g t h e m e a s u r e m e n t o f p r o t o n p u m p i n g ( H a n e t a l . , 2 0 0 5 ) a n d m e a s u r e m e n t o f t h e e l e c t r i c a l m e m b r a n e p o t e n t i a l ( J a s a i t i s e t a l . , 1 9 9 9 ) . A n o t h e r p r o c e d u r e f o r o b t a i n i n g p r o t e o l i p o s o m e s f r o m l i p i d - d e t e r g e n t - m i c e l l a r s o l u t i o n s c o n s i s t s o f d i l u t i n g t h e r e c o n s t i t u t i o n m i x t u r e ( R a c k e r e t a l . , 1 9 7 9 ) . D i l u t i o n l o w e r s t h e d e t e r g e n t c o n c e n t r a t i o n t o b e l o w i t s C M C a n d p r o t e o l i p o s o m e s a r e f o r m e d s p o n t a n e o u s l y ( D o l d e r e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e s i m p l e d i l u t i o n o f a r e c o n s t i t u t i o n m i x t u r e c o n t a i n i n g a b o u t 0 . 8 % c h o l a t e l o w e r e d t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e d e t e r g e n t s u f fi c i e n t l y t o a l l o w t h e a s s a y t o b e p e r f o r m e d . T h e p r o c e d u r e i s r a p i d s i n c e i t u s u a l l y r e q u i r e s o n l y a s h o r t p e r i o d o f i n c u b a t i o n ( 1 0 - 2 0 m i n ) b e f o r e d i l u t i o n . D e t e r g e n t s w i t h h i g h C M C s s u c h a s c h o l a t e o r o c t y l g l u c o s i d e h a v e b e e n u s e d . G e n e r a l l y , t h e d i l u t i o n i s f o l l o w e d b y c e n t r i f u g a t i o n o f t h e d i l u t e d p r o t e o l i p o s o m e s t o i n c r e a s e t h e c o n c e n t r a t i o n . A l t h o u g h e m p l o y e d w i t h s o m e s u c c e s s f o r r e c o n s t i t u t i o n o f d i f f e r e n t c l a s s e s o f p r o t e i n s ( e . g . , A T P a s e c o m p l e x o f s p i n a c h c h l o r o p l a s t ) , t h e d i l u t i o n t e c h n i q u e s h a v e f a i l e d i n s e v e r a l s y s t e m s t h a t h a v e b e e n s u c c e s s f u l l y r e c o n s t i t u t e d b y t h e c h o l a t e - d i a l y s i s p r o c e d u r e ( e . g . , b a c t e r i o r h o d o p s i n ) . T h i s f a i l u r e m a y b e m a i n l y r e l a t e d t o i n c o m p l e t e r e m o v a l o f d e t e r g e n t s . 7 3 1 . 3 . 3 . P r o t o n P u m p i n g M e c h a n i s m T o b e t t e r d e fi n e t h e p r o c e s s e s o f p r o t o n e x i t a n d b a c k fl o w , a n d t o d e t e r m i n e w h e t h e r p r o t o n b a c k fl o w c a n o n l y s u p p l y t h e a c t i v e s i t e , o r w h e t h e r t h e p r o t o n c a n m o v e a l l t h e w a y t h r o u g h t h e p r o t e i n , i t w a s i m p o r t a n t t o q u a n t i f y t h e a m o u n t o f p r o t o n s t h a t a r e t r a n s l o c a t e d t h r o u g h t h e m e m b r a n e d u r i n g t h e c a t a l y t i c c y c l e . M e a s u r e m e n t o f p r o t o n s b o t h i n t h e i n t e r i o r a n d t h e o u t s i d e o f C c O r e c o n s t i t u t e d i n t o v e s i c l e s w o u l d b e n e c e s s a r y t o a c h i e v e t h i s a i m . T h e r e i s l i t t l e r e s e a r c h o n t h e a c c u r a t e m e a s u r e m e n t o f p r o t o n m o v e m e n t t h r o u g h C c O d u e t o t e c h n i c a l p r o b l e m s . T h e w o r k r e p o r t e d i n t h i s t h e s i s w a s d i r e c t e d a t s o l v i n g a n u m b e r o f t h e s e p r o b l e m s i n o r d e r t o b e t t e r d e fi n e t h e p r o t o n p u m p i n g / b a c k fl o w r e a c t i o n s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . 1 . 3 . 3 . 1 . E l e c t r o n e u t r a l i t y M o d e l T h e a b i l i t y o f C c O t o p u m p p r o t o n s w a s fi r s t e s t a b l i s h e d b y M a r t e n W i k s t r o m ( W i k s t r o m , 1 9 7 7 ) . T h e m e c h a n i s m s o f r e d o x - d r i v e n p r o t o n p u m p s h a s b e e n d i s c u s s e d i n d e t a i l a n d t h e r e i s a n e x t e n s i v e b o d y o f k n o w l e d g e o n t h e m e c h a n i s m o f C c O ( M a l m s t r o m , 1 9 8 5 ; P o p o v i c a n d S t u c h e b r u k h o v , 2 0 0 4 ; W i k s t r o m e t a l . , 1 9 8 1 b ) . H o w e v e r , t h e m o l e c u l a r b a s i s o f c o u p l i n g b e t w e e n e l e c t r o n t r a n s f e r a n d p r o t o n t r a n s l o c a t i o n i n C c O i s n o t e s t a b l i s h e d . O n e g e n e r a l c o n c e p t i s t h a t p r e s e r v a t i o n o f e l e c t r o n e u t r a l i t y i s t h e m a j o r d r i v i n g f o r c e f o r p r o t o n m o v e m e n t ( M i t c h e l l a n d R i c h , 1 9 9 4 ) . E a c h e l e c t r o n t h a t i s t r a n s f e r r e d i n t o t h e b u r i e d h e m e a a n d h e m e a 3 / C u B s i t e s s h o u l d i n d u c e u p t a k e o f a c o m p e n s a t i n g p o s i t i v e l y c h a r g e d p r o t o n . T h e p r o t o n s t h a t a r e t o b e p u m p e d a r e l o a d e d t o t h e v i c i n i t y o f 7 4 t h e h e m e a 3 p r o p i o n a t e ( p u m p s i t e ) , a n d m o v e d t o w a r d t h e e x t e r i o r b y e l e c t r o s t a t i c r e p u l s i o n d u e t o t h e c h e m i c a l p r o t o n u p t a k e ( M o r g a n e t a l . , 1 9 9 4 ; R i c h , 1 9 9 5 ) . T h e p r o t o n t r a n s l o c a t i o n , w h i c h o c c u r s a g a i n s t a A u H ” a n d N Y i n a n e n d e r g o n i c p r o c e s s , r e q u i r e s t h a t t h e r e b e a p p r o p r i a t e s i t e s f o r l o a d i n g t h e p r o t o n s a n d g a t e s t o p r e v e n t t h e i r b a c k l e a k . 1 . 3 . 3 . 2 . P r o t o n P u m p i n g E l e m e n t T h e p r o p i o n a t e s o f t h e h e m e s ( I w a t a e t a l . , 1 9 9 5 ) , t h e [ I n i t r o g e n o f h i s t i d i n e 2 9 1 ( b o v i n e n u m b e r i n g ) ( P o p o v i c a n d S t u c h e b r u k h o v , 2 0 0 4 ) , a n d t h e w a t e r c l u s t e r a b o v e t h e h e m e g r o u p s h a v e a l l b e e n p r o p o s e d a s p o s s i b l e p u m p s i t e s . T h e p r o t o n a f fi n i t y i n d u c e d b y a p K a c h a n g e o f a p r o t o n p u m p i n g s i t e m a y b e m o d u l a t e d b y c h a n g e s t h a t o c c u r d u r i n g r e a c t i o n . T h e p u m p i n g e l e m e n t m u s t b e a c c e s s i b l e t o p r o t o n s f r o m t h e i n n e r s u r f a c e o f t h e o x i d a s e ( N - s i d e ) a n d a t a l a t e r p o i n t b e a c c e s s i b l e t o t h e o u t e r s u r f a c e ( P — s i d e ) t o r e l e a s e t h e p r o t o n . A s d i s c u s s e d ( S e c t i o n 1 . 3 . 2 . 4 ) , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e o f E 2 8 6 ( R . s p h a e r o i d e s n u m b e r i n g ) m a y o c c u r , d e p e n d e n t o n i t s p r o t o n a t i o n s t a t e . T h e l i k e l y c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e o f E 2 8 6 i s s u p p o r t e d b y F T I R s p e c t r o s c o p y ( N y q u i s t e t a l . , 2 0 0 3 ) , c o m p u t a t i o n a l a n a l y s i s ( C u k i e r , 2 0 0 4 ; P o m e s e t a l . , 1 9 9 8 ) , a n d s t r u c t u r a l d a t a ( S v e n s s o n - E k e t a l . , 2 0 0 2 ) . 7 5 1 . 3 . 3 . 3 . P r o t o n P u m p i n g M e d i a t e d b y C u A o r H e m e a I n i t i a l m o d e l s o f p r o t o n p u m p i n g i n C c O s u g g e s t e d a r o l e f o r t h e d i n u c l e a r C u A i n c o n t r o l l i n g p r o t o n m o v e m e n t ( B l a i r e t a l . , 1 9 8 6 ) . A s e c o n d p r o p o s a l w a s b a s e d o n t h e h e m e a r e d o x c e n t e r ( B a b c o c k a n d C a l l a h a n , 1 9 8 3 ) . T h e r e i s e v i d e n c e t h a t t h e h e m e a r e d o x p o t e n t i a l d o e s v a r y a s t h e C c O i s t u r n i n g o v e r ( W i k s t r o m , 1 9 8 1 ) . T h e s t e a d y s t a t e r e d u c t i o n l e v e l o f h e m e a i s d e p e n d e n t o n b o t h t h e p H a n d t h e t r a n s m e m b r a n e p o t e n t i a l . I t w a s s u g g e s t e d t h a t a r e d o x - d r i v e n c h a n g e o f t h e h y d r o g e n b o n d s t r e n g t h b e t w e e n t h e f o r m y l s u b s t i t u e n t o f t h e p o r p h y r i n r i n g o f h e m e a c o u l d b e u s e d t o t r a n s l o c a t e a p r o t o n ( B a b c o c k a n d C a l l a h a n , 1 9 8 3 ) . T h e f o r m y l g r o u p i s i n v o l v e d i n a h y d r o g e n b o n d w i t h a n e a r b y p r o t o n d o n o r f r o m t h e p r o t e i n , a n d i s o b s e r v e d t o c h a n g e i t s s t r e t c h i n g f r e q u e n c y ( m e a s u r e d b y R a m a n s p e c t r o s c o p y ) u p o n r e d u c t i o n o f h e m e a . T h e h y d r o g e n b o n d a p p e a r s t o b e s t r e n g t h e n e d u p o n r e d u c t i o n b y 2 - 2 . 5 k c a l / m o l ( B a b c o c k a n d C a l l a h a n , 1 9 8 3 ) . T h i s e n e r g y m a y c o n t r i b u t e t o d r i v i n g a p r o t o n a g a i n s t t h e e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t a c r o s s t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e . A n a l t e r n a t e m o d e l w a s p r o p o s e d b a s e d o n a n i m p o r t a n t r o l e f o r C u A a s t h e s i t e o f r e d o x c o u p l i n g t o p r o t o n t r a n s l o c a t i o n . T h i s m o d e l s u g g e s t e d l i g a n d s w i t c h i n g a t t h e C u A s i t e , d r i v e n b y c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n t h e c o o r d i n a t i o n g e o m e t r y o f C u A u p o n r e d u c t i o n a n d r e o x i d a t i o n o f t h e C u p , ( C h a n a n d L i , 1 9 9 0 ; G e l l e s e t a l . , 1 9 8 6 ) . R e d o x e n e r g y f r o m t h e r e d u c t i o n o f t h e C u A s i t e i s p r o p o s e d t o m o v e t h e p r o t o n f r o m t h e m a t r i x s i d e o f t h e p u m p s i t e t o t h e c y t o s o l i c s i d e t h r o u g h l i g a n d e x c h a n g e a n d p r o t o n t r a n s f e r . C h e m i c a l m o d i fi c a t i o n o f t h e C u s i t e i n h i b i t e d p r o t o n p u m p i n g , s u p p o r t i n g t h i s i d e a . 7 6 H o w e v e r , t h e s e m e c h a n i s m s l o s t s u p p o r t w i t h t h e fi n d i n g t h a t t h e h e m e - C u o x i d a s e o f E . c o l i , a b 0 3 t y p e q u i n o l o x i d a s e , p u m p s p r o t o n s w i t h o u t t h e b e n e fi t o f C u o r a f o r m y l g r o u p o n i t s l o w s p i n h e m e a ( P u u s t i n e n e t a l . , 1 9 8 9 ) a n d t h e fi n d i n g t h a t m u t a t i o n a l m o d i fi c a t i o n s t o t h e s i t e d i d n o t i n h i b i t p r o t o n p u m p i n g ( Z h e n e t a l . , 2 0 0 2 ) . A m o r e r e c e n t l y p r o p o s e d m e c h a n i s m , b a s e d o n t h e h i g h r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e s o f b o v i n e C c O ( T s u k i h a r a e t a l . , 1 9 9 5 ) , i n v o l v e s a n a s p a r t a t e r e s i d u e ( D 5 1 i n b o v i n e n u m b e r i n g ) n e a r t h e o u t e r s u r f a c e o f s u b u n i t I w h i c h c h a n g e s i t s p o s i t i o n b a s e d o n a c h a n g e i n t h e r e d o x s t a t e o f h e m e a . I n t h e X - r a y s t r u c t u r e o f t h e o x i d i z e d s t a t e , t h e a s p a r t a t e i s b u r i e d i n t h e h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t w i t h a h i g h a f fi n i t y f o r p r o t o n s , a n d i s p r o p o s e d t o b e c o n n e c t e d t o a c h a n n e l i n v o l v i n g a w a t e r c l u s t e r a n d t h e f o r m y l g r o u p o f h e m e a . I n t h e r e d u c e d f o r m , t h e a s p a r t a t e i s e x p o s e d t o t h e o u t e r s u r f a c e w i t h a l o w a f fi n i t y f o r p r o t o n s a n d i s d i s c o n n e c t e d f r o m i t s p r o t o n s o u r c e b a s e d o n t h e a l t e r e d w a t e r c h a i n i n t h e o x i d i z e d v e r s u s r e d u c e d e n z y m e s t r u c t u r e . 1 . 3 . 3 . 4 . P r o t o n P u m p i n g M e d i a t e d b y t h e H e m e a 3 ! C u B A c t i v e S i t e T h e r e i s c o n s i d e r a b l e c o n t r o v e r s y a b o u t t h e m e c h a n i s m o f h o w p r o t o n p u m p i n g i s l i n k e d t o t h e 0 2 c h e m i s t r y a t t h e a c t i v e s i t e . T h e h i s t i d i n e c y c l e i s a n e x a m p l e o f a p r o t o n p u m p d i r e c t l y c o u p l e d t o t h e r e d o x c h e m i s t r y a t t h e a c t i v e s i t e ( M o r g a n e t a l . , 1 9 9 4 ) . I n t h i s p r o p o s a l , p r o t o n s t r a n s f e r r e d f r o m t h e n e g a t i v e l y c h a r g e d a q u e o u s N - s i d e o f t h e m e m b r a n e a r e m o v e d t o a p u m p s i t e b e c a u s e o f t h e n e g a t i v e c h a r g e i n t h e b u r i e d h e m e c e n t e r i n t r o d u c e d b y e l e c t r o n t r a n s f e r . 7 7 A h i s t i d i n e l i g a n d o f G u n h a s b e e n s u g g e s t e d a s t h e p r o t o n l o a d i n g / p u m p s i t e . I n t h i s m e c h a n i s m , t h e h i s t i d i n e s e r v e s a s t h e p r o t o n t r a n s f e r v e h i c l e b y c y c l i n g b e t w e e n i m i d a z o l a t e ( I m ' ) , i m i d a z o l e ( I r n H ) , a n d i m i d a z o l i u m ( I m H Z I ) s t a t e s . T h i s i d e a i n i t s o r i g i n a l f o r m , i n v o l v i n g t h e c h a n g e s d u e t o o x y g e n c h e m i s t r y s e e m e d l e s s l i k e l y w h e n k i n e t i c d a t a r e v e a l e d t h a t p r o t o n p u m p i n g o c c u r r e d d u r i n g t h e r e d u c t i v e p h a s e o f t h e c a t a l y t i c c y c l e ( B l o c h e t a l . , 2 0 0 4 ; V e r k h o v s k y e t a l . , 1 9 9 9 ) a s w e l l a s o x i d a t i v e s t e p s . T h e f r e e e n e r g y a v a i l a b l e d u r i n g t h e 0 2 r e d u c t i o n p h a s e i s l a r g e r t h a n t h a t a v a i l a b l e d u r i n g t h e i n i t i a l m e t a l r e d u c t i o n p h a s e , d u e t o h i g h l y e x e r g o n i c n a t u r e o f t h e o x y g e n r e a c t i o n . H o w e v e r , t h e p a r a d i g m t h a t a l l p r o t o n t r a n s l o c a t i o n b y t h e C c O t a k e s p l a c e d u r i n g a n d a f t e r t h e b r e a k i n g o f t h e O — O b o n d h a s b e e n c h a l l e n g e d b y r e c e n t t i m e - r e s o l v e d s p e c t r o s c o p y a n d a l s o t i m e - r e s o l v e d e l e c t r o m e t r y , w h i c h d e t e c t s c h a r g e m o v e m e n t s w i t h i n t h e d i e l e c t r i c o f t h e e n z y m e a f t e r l a s e r - a c t i v a t e d e l e c t r o n i n j e c t i o n . T h e d a t a s h o w t h a t t h e r e i s p r o t o n t r a n s l o c a t i o n d u r i n g t h e r e d u c t i o n p h a s e b e f o r e o x y g e n b i n d s ( V e r k h o v s k y e t a l . , 1 9 9 9 ) . S o m e e v i d e n c e s u p p o r t s t h a t t h e fi r s t e l e c t r o n r e d u c t i o n o f t h e C c O d o e s n o t l e a d t o p r o t o n p u m p i n g u n l e s s a p r e c e d i n g o x i d a t i v e p h a s e ( R 9 0 ) h a s j u s t o c c u r r e d . C c O m a y c o n s e r v e p a r t o f t h e e n e r g y o f t h e o x y g e n c h e m i s t r y s o t h a t p r o t o n t r a n s l o c a t i o n i s d r i v e n i n t h e l a t e r r e d u c t i v e p h a s e o f t h e c a t a l y t i c c y c l e ( V e r k h o v s k y e t a l . , 1 9 9 9 ) . 7 8 1 . 3 . 3 . 5 . C o n f o r m a t i o n a l C h a n g e s i n C c O V a r i o u s m o d e l s o f p r o t o n p u m p i n g i n C 0 0 h a v e b e e n p r o p o s e d t h a t s u g g e s t c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s o f c e r t a i n i m p o r t a n t a m i n o a c i d s d u e t o t h e i r p r o t o n a t i o n s t a t e s . E 2 8 6 i s c o n s i d e r e d t o b e a n i m p o r t a n t p u m p i n g e l e m e n t t h a t i s n o t a m e t a l l i g a n d b u t i s c l o s e t o t h e a c t i v e s i t e . I t i s p r o p o s e d t h a t E 2 8 6 s e r v e s a s a b r a n c h p o i n t t h a t a l t e r n a t e l y d i r e c t s p r o t o n s t o t h e p u m p s i t e o r t o t h e a c t i v e s i t e . A d e t a i l e d m e c h a n i s m , b a s e d o n a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e o f E 2 8 6 , a n d d e p e n d e n t o n i t s p r o t o n a t i o n s t a t e , w a s p o s t u l a t e d ( B r z e z i n s k i a n d L a r s s o n , 2 0 0 3 ) . T h e m o v e m e n t o f E 2 8 6 i s s u p p o r t e d b y F I R s p e c t r o s c o p y e v i d e n c e ( L u b b e n e t a l . , 1 9 9 9 ; N y q u i s t e t a l . , 2 0 0 3 ) a n d c o m p u t a t i o n a l a n a l y s e s ( C u k i e r , 2 0 0 4 ; H o f a c k e r a n d S c h u l t e n , 1 9 9 8 ; P o m e s e t a l . , 1 9 9 8 ) i n a d d i t i o n t o t h e s t r u c t u r a l d a t a ( S v e n s s o n - E k e t a l . , 2 0 0 2 ) . A m o d i fi e d m e c h a n i s m h a s b e e n p r o p o s e d ( B r a n d e n e t a l . , 2 0 0 6 ) w h e r e t h e p u m p e d p r o t o n c o n t r o l s t h e e l e c t r o n t r a n s f e r . A c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e o f t h e D 5 1 r e s i d u e ( b o v i n e n u m b e r i n g ) h a s b e e n p r o p o s e d ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 8 ) a s a k e y e l e m e n t i n t h e H - p a t h w a y p r o p o s e d f o r t h e b o v i n e C c O ( s e e S e c t i o n 1 . 3 . 3 . 7 . H - P a t h w a y ) . M u t a t i o n s o f a h i s t i d i n e ( H 9 3 i n R . s p h a e r o i d e s n u m b e r i n g ) , w h i c h h a s t h e c l o s e s t s p a t i a l a l i g n m e n t w i t h D 5 1 i n b o v i n e C c O , w e r e m a d e i n o r d e r t o p r o b e t h e c o n f o r m a t i o n a l m o v e m e n t i n t h i s r e g i o n , b e c a u s e D 5 1 i s n o t c o n s e r v e d i n b a c t e r i a l C c O . A c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e w a s o b s e r v e d u p o n b i n d i n g o f c y t o c h r o m e c b y u s i n g fl u o r e s c e n t l a b e l i n g t e c h n i q u e s w i t h t h e H 9 3 C m u t a n t C c O . A d d i t i o n a l l y , s u b s t a n t i a l m o v e m e n t o f H 9 3 w a s a l s o o b s e r v e d i n a m o l e c u l a r 7 9 d y n a m i c s s t u d y o f t h e R 4 8 1 K m u t a t i o n ( S e i b o l d e t a l . , 2 0 0 5 ) a l o n g w i t h t h e n e a r b y E 1 8 2 r e s i d u e . A n M D s i m u l a t i o n s t u d y a l s o s u g g e s t e d a p o s s i b l e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e a t a d i f f e r e n t l o o p a r e a i n d u c e d b y m u t a t i o n o f R 4 8 1 t o K 4 8 1 ( R . s p h a e r o i d e s n u m b e r i n g ) , r e s u l t e d i n b l o c k i n g t h e w a t e r c h a i n f o r m a t i o n i n C c O ( S e i b o l d e t a l . , 2 0 0 5 ) . I n t h e R 4 8 1 K m u t a n t , t h e W 1 7 2 w a s s h i f t e d 4 . 4 A a w a y f r o m t h e o r i g i n a l p o s i t i o n o f t h e w i l d t y p e C c O . A r e c e n t c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e r e d u c e d f o r m o f R . s p h a e r o i d e s C c O ( Q i n e t a l . u n p u b l i s h e d ) s h o w s a s i g n i fi c a n t c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n t h e h e m e a 3 p o r p h y r i n r i n g a n d f a m e s y l t a i l , a s w e l l a s r e s i d u e s i n t h e K - p a t h w a y . S e v e r a l h i g h r e s o l u t i o n s t r u c t u r e s o f b o v i n e C c O ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 8 ) , h a v e l e d t o t h e p r o p o s a l o f a u n i q u e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n s u b u n i t I t h a t m a y b e i n v o l v e d i n p r o t o n p u m p i n g . A s i g n i fi c a n t c h a n g e i n t h e p K a o f a n a c i d i c g r o u p c a n b e i n t r o d u c e d b y a v e r y s m a l l c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n C c O . C a r e f u l c o m p a r i s o n s o f c r y s t a l s t r u c t u r e s i n v a r i o u s o x i d a t i o n s t a t e s a t h i g h r e s o l u t i o n s u g g e s t a r e d o x d r i v e n c h a n g e i n t h e c o n f o r m a t i o n o f D 5 1 ( b o v i n e n u m b e r i n g ) , p r o p o s e d t o r e l e a s e p r o t o n s f r o m t h e n e g a t i v e s i d e s u r f a c e t o t h e m i t o c h o n d r i a l e x t e r i o r v i a t h e h y d r o g e n - b o n d w a t e r n e t w o r k . ( a s d i s c u s s e d i n 1 . 3 . 3 . 3 ) 8 0 1 . 3 . 4 . M u t a t i o n a l A n a l y s i s o f P r o t o n P a t h w a y s 1 . 3 . 4 . 1 . D - P a t h w a y f o r P r o t o n U p t a k e T h e D - p a t h w a y i s c o n s i d e r e d t o s t a r t a t a n a s p a r t a t e ( D 1 3 2 i n t h e R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s o x i d a s e ) l o c a t e d a t t h e n e g a t i v e s i d e ( N - s i d e ) a n d t o c o n t i n u e t o a g l u t a m a t e ( E 2 8 6 ) a b o u t 2 5 A d i s t a n t f r o m D 1 3 2 a n d 1 2 A f r o m t h e h e m e s ( l o w s p i n h e m e a a n d h i g h s p i n h e m e ( 1 3 ) v i a a h y d r o g e n b o n d e d n e t w o r k i n v o l v i n g a c h a i n o f w a t e r m o l e c u l e s a n d p r o t o n a t a b l e r e s i d u e s ( F i g u r e 1 . 1 2 ) . T h e D - p a t h w a y i s l i k e l y t o b e i n v o l v e d i n t h e m a j o r p r o t o n u p t a k e o f b o t h s u b s t r a t e p r o t o n s u s e d a t t h e a c t i v e s i t e f o r o x y g e n r e d u c t i o n t o f o r m w a t e r m o l e c u l e s , a n d o f p r o t o n s t o b e p u m p e d a c r o s s t h e l i p i d m e m b r a n e ( A d e l r o t h e t a l . , 1 9 9 7 ; K o n s t a n t i n o v e t a l . , 1 9 9 7 ) . I t a p p e a r s t h a t a l l f o u r p u m p e d p r o t o n s a n d t w o s u b s t r a t e p r o t o n s c o n s u m e d d u r i n g t h e o x i d a t i v e p h a s e ( P 9 F a n d F 9 0 t r a n s i t i o n ) a r e t a k e n u p v i a t h e D - p a t h w a y . T h e r e a r e t w e l v e c r y s t a l l o g r a p h i c a l l y r e s o l v e d w a t e r m o l e c u l e s t h a t f o r m a p a t h w a y b e t w e e n D 1 3 2 a n d E 2 8 6 t h a t f a c i l i t a t e s r a p i d p r o t o n t r a n s f e r f r o m t h e b u l k a q u e o u s p h a s e t o t h e e n z y m e i n t e r i o r . H o w e v e r , n o o b v i o u s p r o t o n c o n n e c t i v i t y i s f o u n d b e y o n d E 2 8 6 i n X - r a y s t r u c t u r e s . T h e a r e a b e t w e e n t h e E 2 8 6 a n d t h e b i n u c l e a r c e n t e r / h e m e a 3 p r o p i o n a t e g r o u p i s p r e d i c t e d b y s t a t i s t i c a l - ‘ m e c h a n i c a l c a l c u l a t i o n s ( R i i s t a m a e t a l . , 1 9 9 7 ) t o b e i n v o l v e d i n a w a t e r - m e d i a t e d p r o t o n t r a n s f e r t h r o u g h t h i s h y d r o p h o b i c c a v i t y . T h e a r e a m u s t c o n t a i n w a t e r d u r i n g t h e c a t a l y t i c r e a t i o n i n o r d e r t o f u l fi l l t h e c o m p l e t e p r o t o n t r a n s f e r f o r o x y g e n r e d u c t i o n . A p o s s i b l e t r a n s i e n t w a t e r p a t h w a y w i t h i n t h i s h y d r o p h o b i c c a v i t y w a s a l s o p r e d i c t e d b y o t h e r m o d e l i n g a p p r o a c h e s ( C u k i e r , 2 0 0 4 ; T a s h i r o a n d S t u c h e b r u k h o v , 2 0 0 5 ; W i k s t r o m e t a l . , 2 0 0 3 ) . M o v e m e n t o f w a t e r m o l e c u l e s d u r i n g t h e c a t a l y t i c c y c l e c o u l d l i m i t e l e c t r o n 8 1 V O 9 ‘ " \ r ‘ , 0 4 " l . A . 3 : 9 : 2 1 ; } , , F i g u r e 1 . 1 2 T h e r e s o l v e d w a t e r s i n t h e o x i d a s e D - p a t h s t r u c t u r e . T h e r e s o l v e d w a t e r s i n t h e D - p a t h w a y o f p r o t o n u p t a k e i n t h e t w o - s u b u n i t c r y s t a l s t r u c t u r e s o f R s C c O ( C , g r e e n ; O , r e d ; N , b l u e ) f r o m Q i n e t a l . ( Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) . F o u r - s u b u n i t R s C c O ( 1 M S 6 ) i s s u p e r i m p o s e d o n t h e t w o - s u b u n i t c r y s t a l ( g r a y c o l o r ) . T h e d o t t e d b l a c k b o x i n d i c a t e s t w o a d d i t i o n a l w a t e r s w h i c h w e r e r e s o l v e d i n t h e t w o - s u b u n i t R c h 0 . T h e ( 2 F o - F c ) d i f f e r e n c e e l e c t r o n d e n s i t y m a p c o n t o u r e d a t 1 . 0 0 i s s h o w n i n b l u e a n d m a g e n t a . 8 2 t r a n s f e r ( K o m b l a t t , 1 9 9 8 ) . W a t e r m o l e c u l e s m i g h t p r o v i d e p r o t o n c o n d u c t i v i t y f r o m E 2 8 6 t o t h e p r o p i o n a t e a s w e l l a s t h e b i n u c l e a r s i t e v i a w a t e r d i p o l e r e o r i e n t a t i o n ( W i k s t r o m e t a l . , 2 0 0 3 ) i n w h i c h t h e G r o t t h u s s a r r a y O i l / r a i g h t , 2 0 0 6 ) f o r p r o t o n t r a n s f e r s w i t c h e s a s r e d o x s t a t e s o f t h e m e t a l c e n t e r s ( h e m e a o r h e m e a 3 / C u B ) c h a n g e . O n e o f t h e p r o t o n a t a b l e a m i n o a c i d r e s i d u e s t h a t h a s a c e n t r a l r o l e i n t h e D - p a t h w a y i s E 2 8 6 i n s u b u n i t I o f C c O . T h e r o l e o f E 2 8 6 i n r e g u l a t i n g t h e p r o t o n t r a n s f e r t h r o u g h t h e D - p a t h w a y h a s b e e n e x t e n s i v e l y e x a m i n e d b y m u t a g e n e s i s ( A a g a a r d e t a l . , 2 0 0 0 ; A d e l r o t h e t a l . , 2 0 0 0 ; N a m s l a u e r e t a l . , 2 0 0 3 ; N a m s l a u e r e t a l . , 2 0 0 7 ) . E 2 8 6 h a s b e e n p r o p o s e d t o b e a p a r t o f t h e p r o t o n p u m p i n g p a t h w a y , b a s e d o n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f C c O f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s ( I w a t a e t a l . , 1 9 9 5 ) . E 2 8 6 i s b u r i e d a t t h e e n d o f t h e D - p a t h w a y b e t w e e n t h e t w o h e m e s . I t i s p r o b a b l y a b r a n c h i n g p o i n t f r o m w h i c h p r o t o n s m a y b e t r a n s f e r r e d , e i t h e r t o t h e c a t a l y t i c s i t e o r t o w a r d t h e h e m e p r o p i o n a t e s , d e p e n d i n g o n a r e d o x - l i n k e d t r a n s i e n t c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e . E 2 8 6 h a s b e e n p r o p o s e d t o a c c e p t t h e p u m p e d p r o t o n s a n d s h u t t l e t h e s e p r o t o n s t o a n a c c e p t o r l o c a t e d f u r t h e r a w a y ( N y q u i s t e t a l . , 2 0 0 3 ; P o p o v i c a n d S t u c h e b r u k h o v , 2 0 0 4 ) . I n t h e n a t i v e s t a t e , E 2 8 6 i s p o s t u l a t e d t o b e i n i t s p r o t o n a t e d f o r m b e c a u s e o f i t s p r o p o s e d h i g h p K a , w h i c h a l l o w s r a p i d r e p r o t o n a t i o n f r o m t h e b u l k s o l v e n t t h r o u g h D 1 3 2 ( N a m s l a u e r a n d B r z e z i n s k i , 2 0 0 4 ) . W h e n i t w a s m u t a t e d t o a n o n - c a r b o x y l i c a m i n o a c i d ( E 2 8 6 Q , R h o d o b a c t e r n u m b e r i n g ) , t h e m u t a n t s h o w e d a n o v e r a l l t u r n o v e r t h a t w a s s t r o n g l y i n h i b i t e d ( 0 . 0 2 % o f w i l d t y p e ) , b u t w i t h t h e s a m e r a t e a n d a b s o r b a n c e c h a n g e s f o r t h e s i n g l e e l e c t r o n t r a n s f e r f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e p e r o x y i n t e r m e d i a t e . H o w e v e r , e l e c t r o n t r a n s f e r a f t e r f o r m a t i o n o f t h e p e r o x y i n t e r m e d i a t e ( P ) i s i m p a i r e d ( 0 . 2 % o f t h a t o f t h e w i l d t y p e ) . C u A r e m a i n s 8 3 r e d u c e d , a n d n o p r o t o n s a r e t a k e n u p f r o m t h e m e d i u m d u r i n g t h e r e a c t i o n w i t h o x y g e n ( A d e l r o t h e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h i s i s d i f f e r e n t f r o m t h e D 1 3 2 A m u t a n t , w h i c h i s a t t h e b e g i n n i n g o f t h e D p a t h a n d i s c h e m i c a l l y r e s c u e d b y a r a c h i d o n i c a c i d . R e s c u e b y a r a c h i d o n i c a c i d i s n o t o b s e r v e d f o r E 2 8 6 Q . W h e n E 2 8 6 Q i s r e c o n s t i t u t e d i n t o v e s i c l e s , t h e v e r y l o w a c t i v i t y i s h i g h e s t u n d e r t h e c o n t r o l l e d c o n d i t i o n , a s o b s e r v e d w i t h t h e D 1 3 2 A m u t a n t . P r o t o n s f r o m t h e e x t e r n a l s i d e o f t h e m e m b r a n e c a n s u p p l e m e n t t h o s e f r o m t h e i m p a i r e d D p a t h w a y t o s t i m u l a t e t h e a c t i v i t y a n d a l l o w s o m e s l o w e l e c t r o n t r a n s f e r t o p r o c e e d . E v e n t h e c o n s e r v a t i v e m u t a t i o n t o a n a s p a r t a t e ( E 2 8 6 D ) r e s u l t s i n d e c r e a s e d a c t i v i t y ( 5 0 % o f t h a t o f t h e w i l d t y p e ) a s w e l l a s a l o w e r e d d e u t e r i u m i s o t o p e e f f e c t ( ~ 2 . 5 a s c o m p a r e d w i t h ~ 7 i n t h e w i l d t y p e C c O ) ( A d e l r o t h e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h e s m a l l e r d e u t e r i u m i s o t o p e e f f e c t i n E 2 8 6 D i n d i c a t e s t h a t p r o t o n t r a n s f e r f r o m E 2 8 6 d e t e r m i n e s t h e r a t e . I t w a s p r o p o s e d t h a t t h e p r o t o n t r a n s f e r f r o m E 2 8 6 t o t h e b i n u c l e a r c e n t e r d e t e r m i n e s t h e t r a n s i t i o n r a t e o f o f b o t h P R 9 F a n d F 9 0 t r a n s i t i o n s ( M i l l s e t a l . , 2 0 0 0 ; V e r k h o v s k a y a e t a l . , 1 9 9 7 ) . W h e n t h e a m i n o a c i d D 1 3 2 i s m u t a t e d t o a n y n o n - c a r b o x y l a t e r e s i d u e , t h e r e s i d u a l a c t i v i t y i s o n l y 5 % o f w i l d - t y p e i n t h e R . s p h a e r o i d e s a a 3 o x i d a s e ( F e t t e r e t a l . , 1 9 9 5 ; M i l l s e r a l . , 2 0 0 0 ) a n d p r o t o n p u m p i n g i s l o s t b y b l o c k i n g t h e e n t r a n c e o f t h e D - p a t h w a y . T h i s r e s u l t p r o v i d e d t h e fi r s t e v i d e n c e f o r t h e c r i t i c a l r o l e o f t h e D - p a t h w a y i n t r a n s f e r r i n g t h e p u m p e d p r o t o n s . A s i m i l a r m u t a t i o n e f f e c t w a s f o u n d i n a n o t h e r t y p e o f e n z y m e s s u c h a s t h e E c o l i b 0 3 o x i d a s e ( T h o m a s e t a l . , 1 9 9 3 ) . B l o c k i n g p r o t o n u p t a k e 8 4 f r o m t h e D - p a t h w a y i n E . c o l i b 0 3 o x i d a s e b y t h e e q u i v a l e n t m u t a t i o n o f D 1 3 5 ( i n E . c o l i n u m b e r i n g ) t o a s p a r a g i n e s , r e s u l t s i n t h e d e c o u p l i n g o f t h e p r o t o n p u m p i n g w i t h d i m i n i s h e d t u r n o v e r a c t i v i t y . W h e n t h e D 1 3 2 A i s r e c o n s t i t u t e d i n t o t h e l i p i d v e s i c l e s , p r o t o n s f r o m t h e o u t s i d e , i n t h e p r e s e n c e o f a m e m b r a n e p o t e n t i a l , s t i m u l a t e d t h e a c t i v i t y , r e s u l t i n g i n a r e v e r s e r e s p i r a t o r y c o n t r o l ( R C R < 1 ) . T h e r e s u l t i n d i c a t e s t h a t c o n t r i b u t i o n o f p r o t o n s s u p p l i e d f r o m t h e o u t s i d e c a n c o n t r o l t h e a c t i v i t y o f C c O w h e n i t i s i n h i b i t e d f r o m t a k i n g p r o t o n s f r o m t h e i n s i d e a s w e l l a s i n h i b i t e d b y t h e p r e s e n c e o f a m e m b r a n e p o t e n t i a l . E v e n m o r e c l e a r e v i d e n c e f o r t h e i m p o r t a n c e o f t h e D - p a t h w a y w a s f o u n d w h e n c o n s e r v e d a s p a r g i n e s i n t h e D - p a t h w a y ( H a n e t a l . , 2 0 0 6 ; P a w a t e e t a l . , 2 0 0 2 ; P fi t z n e r e t a l . , 2 0 0 0 ) w e r e m u t a t e d t o a s p a r t a t e ( N 1 3 9 D a n d N 2 0 7 D i n R . s p h a e r o i d e s n u m b e r i n g ) . T h e s e m u t a t i o n s l e a d t o d e c o u p l i n g o f t h e p r o t o n p u m p , e i t h e r w i t h o u t a l t e r i n g t h e a c t i v i t y , o r b y i n c r e a s i n g t h e a c t i v i t y . S e v e r a l p o s s i b l e e x p l a n a t i o n s w e r e p r o p o s e d . F i r s t , b a s e d o n k i n e t i c e x p e r i m e n t s , t h e r e a s o n f o r t h i s s h o r t - c i r c u i t w a s a t t r i b u t e d t o a n e l e c t r o s t a t i c e f f e c t w h i c h r a i s e d t h e p K a o f E 2 8 6 ( B r a n d e n e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h i s c o u l d a f f e c t t h e p r o t o n m o v e m e n t i n t h e p a t h w a y f r o m E 2 8 6 t o t h e o u t s i d e v e r s u s t o t h e a c t i v e s i t e . T h e h i g h e r p K a o f E 2 8 6 c o u l d m a k e i t m o r e d i f fi c u l t t o p r o t o n a t e a n e x t e r n a l p u m p s i t e , s o t h e p r o t o n w i l l g o t o t h e a c t i v e s i t e i n s t e a d . I n t e r e s t i n g l y , r e p l a c e m e n t o f t h e a c i d i c r e s i d u e , D 1 3 2 , b y A s n i n t h e N 1 3 9 D m u t a n t g i v i n g t h e D 1 3 2 N / N 1 3 9 D d o u b l e m u t a n t , r e s u l t s i n r e s t o r a t i o n o f t h e E 2 8 6 p K a t o t h e o r i g i n a l v a l u e a n d r e c o u p l i n g o f t h e p r o t o n p u m p d u r i n g s t e a d y s t a t e t u r n o v e r ( B r a n d e n e t a l . , 2 0 0 6 ) e v e n w i t h a d e c r e a s e d t u r n o v e r o f a b o u t 2 0 % o f w i l d — t y p e C c O . 8 5 T h e p r e c i s e c o n s e r v e d l o c a t i o n o f t h e c a r b o x y l r e s i d u e a t t h e 2 8 6 p o s i t i o n s e e m s t o b e s o m e w h a t fl e x i b l e . T h e d o u b l e m u t a n t E 2 8 6 A / 1 1 1 2 E , w h i c h h a s a g l u t a m a t e r e l o c a t e d t o t h e o p p o s i t e s i d e o f t h e p r o t o n t r a n s f e r p a t h w a y , s h o w e d h i g h e r t u r n o v e r a c t i v i t y t h a n t h e E 2 8 6 A s i n g l e m u t a n t a n d i s s t i l l a b l e t o p u m p p r o t o n s w i t h a b o u t a 0 . 4 H + / e ' s t o i c h i o m e t r y ( a s c o m p a r e d t o ~ 1 H + / e ' f o r t h e w i l d t y p e e n z y m e ) ( A a g a a r d e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h e D 1 3 2 m u t a n t C c O a c t i v i t y ( e . g . D 1 3 2 A o r D 1 3 2 N ) w a s r e s c u e d b y t h e a d d i t i o n o f l o n g c h a i n f a t t y a c i d s ( F e t t e r e t a l . , 1 9 9 6 ) . H o w e v e r , f a t t y a c i d s d o n o t r e s t o r e t h e p r o t o n p u m p i n g , p r e s u m a b l y b e c a u s e o f c o m p e t i t i v e k i n e t i c s b e t w e e n t h e b a c k w a r d a n d f o r w a r d d i r e c t i o n s o f t h e p r o t o n s i n t h e p a t h w a y . 1 . 3 . 4 . 2 . K - P a t h w a y f o r P r o t o n U p t a k e T h e K - p a t h w a y a p p e a r s t o s t a r t w i t h a g l u t a m a t e r e s i d u e ( E 1 0 1 ) a n d a h i s t i d i n e ( H 9 6 ) i n s u b u n i t I I o n t h e c y t o p l a s m i c s u r f a c e o f t h e e n z y m e , b a s e d o n m u t a g e n e s i s r e s u l t s a n d X - r a y s t r u c t u r e a n a l y s i s ( Q i n e t a l . , 2 0 0 8 ; Q i n e t a l . , 2 0 0 7 ) ( F i g u r e 1 . 1 3 ) . A n i m p o r t a n t c o n s e r v e d a m i n o a c i d , l y s i n e 3 6 2 , w a s m u t a t e d t o m e t h i o n i n e i n t h e K - p a t h w a y , r e s u l t i n g i n e x t r e m e l y l o w a c t i v i t y ( l e s s t h a n 0 . 2 % o f w i l d t y p e ) a n d h e m e a 3 b e c o m i n g v e r y d i f fi c u l t t o r e d u c e , w h e r e a s h e m e a i s r e a d i l y r e d u c e d . I n t e r e s t i n g l y , t h e K 3 6 2 M i s s l o w t o r e d u c e e x c e p t i n t h e fi r s t m e a s u r e m e n t o f r e d u c t i o n , a s i t e l u t e s f r o m t h e c o l u m n . H o w e v e r , t h e f u l l y r e d u c e d K 3 6 2 M m u t a n t b e c o m e s f u l l y o x i d i z e d i n a b o u t t h e s a m e t i m e p e r i o d a s t h e w i l d t y p e a n d d i s p l a y e d s i m i l a r p r o t o n u p t a k e a s t h e w i l d t y p e ( A d e l r o t h e t a l . , 1 9 9 8 ) . I t h a s b e e n p o s t u l a t e d t h a t K 3 6 2 c o u l d b e r e q u i r e d a s a p r o t o n t r a p , r a t h e r t h a n b e i n g u s e d f o r p r o t o n u p t a k e f o r n e u t r a l i z a t i o n o f t h e c h a r g e a t h e m e a 3 8 6 / C u B ( J u n e m a n n e t a l . , 1 9 9 7 ) . H o w e v e r , t h i s r e s u l t i n d i c a t e s t h a t t h e K 3 6 2 i s i m p o r t a n t i n p r o t o n u p t a k e d u r i n g t h e r e d u c t i v e p h a s e o f t h e c a t a l y t i c c y c l e . U n l i k e t h e i n i t i a l p r o p o s a l t h a t t h e D - a n d K - p a t h w a y s c o r r e s p o n d t o t h e u p t a k e o f p u m p e d a n d s u b s t r a t e p r o t o n s , r e s p e c t i v e l y ( I w a t a e t a l . , 1 9 9 5 ) , i t a p p e a r s t h a t a l l f o u r p u m p e d p r o t o n s a r e t a k e n u p v i a t h e D — p a t h w a y a n d t w o s u b s t r a t e p r o t o n s a s w e l l , t a k e n u p d u r i n g t h e o x i d a t i v e p h a s e ( P M 9 F a n d F 9 0 t r a n s i t i o n ) v i a t h e D - p a t h w a y t h r o u g h E 2 8 6 ( A d e l r o t h e t a l . , 1 9 9 7 ) . T h e K - p a t h w a y i s n o t i n v o l v e d i n p r o t o n u p t a k e d u r i n g o x i d a t i o n o f t h e e n z y m e b y 0 2 ( o x i d a t i v e p h a s e ) . T h e K - p a t h w a y i s e x c l u s i v e l y u s e d f o r p r o t o n u p t a k e d u r i n g t h e r e d u c t i v e p h a s e ( 0 t o R t r a n s i t i o n ) ( A d e l r o t h e t a l . , 1 9 9 8 ; B r a n d e n e t a l . , 2 0 0 1 ) . B o t h o f t h e s u b s t r a t e p r o t o n s f o r h e m e a 3 / C u 3 r e d u c t i o n a r e l i k e l y t a k e n u p b y t h e K - p a t h w a y ( F o r t e e t a l . , 2 0 0 4 ; V y g o d i n a e t a l . , 1 9 9 8 ) . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e fi r s t p r o t o n i s t a k e n u p b y t h e K - p a t h w a y a n d t h e s e c o n d b y t h e D - p a t h w a y ( R u i t e n b e r g e t a l . , 2 0 0 0 ; S h a r p e a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 2 0 0 8 ; W i k s t r o m e t a l . , 2 0 0 0 ) o r , t h a t t h e K - p a t h w a y i s u s e d f o r p r o t o n u p t a k e o n l y i m m e d i a t e l y a f t e r o x i d a t i o n o f t h e f u l l y r e d u c e d C c 0 ( B r a n d e n e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e p r e c i s e n u m b e r a n d t i m i n g a r e s t i l l a n i s s u e . T h e K - p a t h w a y a p p e a r s t o s e q u e n t i a l l y i n v o l v e E 1 0 1 , 8 2 9 9 , K 3 6 2 , T 3 5 9 , t h e h y d r o x y l f a m e s y l o f h e m e a 3 a n d Y 2 8 8 o f s u b u n i t I . T h e T 3 5 9 i s s u g g e s t e d a s a p o t e n t i a l p o l a r g r o u p f o r h y d r o g e n b o n d i n g w i t h w a t e r t o a i d i n p r o t o n t r a n s l o c a t i o n . Y 2 8 8 , w h i c h i s p l a c e d c l o s e t o t h e b i n u c l e a r c e n t e r a n d f o r m s a c r o s s - l i n k w i t h H 2 8 4 ( O s t e r m e i e r e t a l . , 1 9 9 7 ; Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 8 ) , a p p e a r s t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e c a t a l y s i s o f 0 - 0 8 7 - . ‘ : ‘ 9 P » J S u b u n i t l l l “ " ' , . h e m e I a 3 F i g u r e 1 . 1 3 T h e K - p a t h w a y a n d i m p o r t a n t r e s i d u e s . T h e c o r e s u b u n i t I ( g r e e n ) a n d I I ( c y a n ) i s s h o w n w i t h d e o x y c h o l a t e ( r e d s t i c k s ) r e s o l v e d n e a r t h e K p a t h e n t r a n c e i n t h e s t r u c t u r e o f R c h O ( Q i n e t a l . , 2 0 0 8 ) . D e c y l m a l t o s i d e ( D M ) i s a l s o r e s o l v e d n e a r b y . T h e m e t a l c e n t e r s a r e s h o w n a s s p h e r e s ( C u , o r a n g e ; F e , r e d ; M g , b l u e ; C a , y e l l o w ; C d , w h e a t ) . T h e h e m e g r o u p s a r e c o l o r e d b y a t o m t y p e . T h e b l a c k d o t t e d l i n e s i n d i c a t e t h e p r o t o n u p t a k e c h a n n e l w h i c h i s m e d i a t e d b y w a t e r m o l e c u l e s w i t h i n t h e p a t h w a y , s h o w n a s r e d s p h e r e s . 8 8 b r e a k a g e b y d o n a t i n g b o t h a n e l e c t r o n a n d a p r o t o n ( G o r b i k o v a e t a l . , 2 0 0 8 ; S h a r p e a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 2 0 0 8 ) . C o m p u t a t i o n a l m e t h o d s h a v e b e e n a p p l i e d ( C u k i e r , 2 0 0 5 ) t o s t u d y t h e f o r m a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f w a t e r c h a i n s b e c a u s e t h e r e a r e o n l y t w o c r y s t a l l o g r a p h i c a l l y r e s o l v e d w a t e r m o l e c u l e s i n t h e K - p a t h w a y o f C c O . T h e h y d r o g e n b o n d e d w a t e r c h a i n s a r e l i k e l y f o r m e d o n t h e M D t i m e ( n s ) s c a l e . W a t e r c h a i n s a r e r e a d i l y f o r m e d i n t h e r e g i o n o f t h e K - p a t h w a y s u g g e s t i n g t h e p o s s i b i l i t y o f s i d e - c h a i n m o v e m e n t s o f t h e r e s i d u e s K 3 6 2 ( B r a n d e n e t a l . , 2 0 0 1 ) , T 3 5 9 ( C u k i e r , 2 0 0 5 ) , a n d Y 2 8 8 ( S h a r p e e t a l . , 2 0 0 5 ) w h i c h h a v e b e e n p r o p o s e d . T h e r e s u l t s f r o m m o l e c u l a r d y n a m i c s c a l c u l a t i o n s s u g g e s t t h a t a s t r u c t u r a l c h a n g e o f t h e K 3 6 2 s i d e c h a i n , v i a t h e w a t e r r e a r r a n g e m e n t f a c i l i t a t e s p r o t o n t r a n s f e r t o t h e c a t a l y t i c s i t e ( H o f a c k e r a n d S c h u l t e n , 1 9 9 8 ) . T h e K 3 6 2 s i d e c h a i n m a y b e fl e x i b l e a n d s h u t t l e p r o t o n s f r o m 8 2 9 9 t o T 3 5 9 ( C u k i e r , 2 0 0 5 ) . A c c o r d i n g t o e l e c t r o s t a t i c c a l c u l a t i o n s , K 3 6 2 i s i n a n e u t r a l s t a t e o v e r a w i d e r a n g e o f p H d u e t o t h e l a c k o f c o m p e n s a t i n g d i p o l a r o r c h a r g e - c h a r g e i n t e r a c t i o n s . M o r e r e c e n t d a t a i n d i c a t e t h a t t h e K 3 6 2 i s p r o t o n a t e d a t p H 7 a n d m o v e s t r a n s i e n t l y t o a n u p w a r d p o s i t i o n d u r i n g f o r m a t i o n o f t h e P R i n t e r m e d i a t e t o c o m p e n s a t e f o r t h e c h a n g e i n t h e c h a r g e s t a t e a t t h e b i n u c l e a r c e n t e r ( B r a n d e n e t a l . , 2 0 0 1 ) . O t h e r a n a l y s e s ( S h a r p e a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 2 0 0 8 ) s u g g e s t t h a t [ ( 3 6 2 m a y b e a s s o c i a t e d w i t h a h y d r o x y l r a t h e r t h a n a w a t e r , s t a b i l i z i n g i t s p o s i t i v e l y c h a r g e d f o r m . P r o t o n t r a n s f e r v i a t h e K - p a t h w a y c a n b e v e r y f a s t ( B e l e v i c h e t a l . , 2 0 0 6 ) b a s e d o n a k i n e t i c s t u d y o f r e v e r s a l o f e l e c t r o n fl o w f r o m h e m e a 3 t o a i n t h e t w o e l e c t r o n r e d u c e d , m i x e d v a l e n c e C c O . F a s t ( n a n o s e c o n d t o m i c r o s e c o n d ) e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m 8 9 h e m e a 3 t o h e m e a i s f o l l o w e d b y p r o t o n r e l e a s e f r o m t h e C c O t h r o u g h t h e K - p a t h w a y t o t h e b u l k m e d i u m . E v e n t h o u g h t h e f a s t r a t e o f p r o t o n t r a n s f e r i n t h e r e v e r s e d i r e c t i o n f r o m t h e b i n u c l e a r c e n t e r t o t h e i n n e r , N - s i d e o f t h e m e m b r a n e w a s m e a s u r e d ( B e l e v i c h e t a l . , 2 0 0 6 ) , t h e r a t e o f p r o t o n t r a n s f e r i n t h e f o r w a r d d i r e c t i o n m a y b e m u c h s l o w e r a s i t m a y b e l i m i t e d b y t h e r a t e b y w h i c h p r o t o n s f r o m t h e a q u e o u s p h a s e e n t e r t h e p a t h w a y . P r o t o n u p t a k e m a y b e s t r o n g l y e n h a n c e d i n t h e c a s e o f t h e D - p a t h w a y d u e t o t h e p r o t o n c o l l e c t i n g a n t e n n a g r o u p s a r o u n d t h e e n t r a n c e ( K a r p e f o r s e t a l . , 1 9 9 8 ) . H o w e v e r , t h e p r o t o n u p t a k e t h r o u g h t h e K - p a t h w a y m i g h t b e m u c h s l o w e r b e c a u s e t h e r e i s n o s u c h a n t e n n a a r o u n d i t s e n t r y p o i n t . T h e K - p a t h w a y a p p e a r s n o t t o b e c a p a b l e o f t r a n s f e r r i n g a p r o t o n t o t h e p r o t o n l o a d i n g s i t e f o r t h e p u m p , w h e r e a s t h e D - p a t h w a y i s c a p a b l e o f t r a n s f e r r i n g b o t h s u b s t r a t e a n d p u m p p r o t o n s . E l e c t r o n t r a n s f e r f r o m h e m e a t o t h e b i n u c l e a r s i t e w i t h o u t a p r o t o n i n t h e p u m p s i t e m a y b e v e r y u n f a v o r a b l e e n e r g e t i c a l l y , a n d p r o t o n t r a n s f e r t o t h e b i n u c l e a r s i t e w i t h o u t a n a c c o m p a n y i n g e l e c t r o n i s a l s o t h e r m o d y n a m i c a l l y u n f a v o r a b l e . T h e r e f o r e , i f p r o t o n a t i o n o f t h e p u m p s i t e i s i m p a i r e d , t u r n o v e r w i l l b e s l o w d e s p i t e a n a c t i v e K - p a t h w a y . T h i s i s a p l a u s i b l e e x p l a n a t i o n f o r w h y t h e K - p a t h w a y c a n n o t s u b s t i t u t e f o r t h e D - p a t h w a y m u t a t i o n s ( M i l l s a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 9 8 ; W i k s t r o m a n d V e r k h o v s k y , 2 0 0 7 ) . H o w e v e r , a d i f f e r e n t e x p l a n a t i o n f o r t h e r e c i p r o c a l c a s e i s n e e d e d : w h y t h e D - p a t h w a y c a n n o t s u b s t i t u t e f o r a b l o c k a g e o f t h e K - p a t h w a y . I t i s s u g g e s t e d t h a t t h e b i n u c l e a r s i t e m i g h t h a v e a d i s c r e t e p r o t o n a t i o n s t a t e w h i c h s h o w s d i f f e r e n t c h e m i s t r y i n t h e r e d u c t i v e p h a s e ( 0 9 E 9 R ) , s o a s t o p r e v e n t i t s p r o t o n a t i o n b y E 2 8 6 v i a t h e D - p a t h w a y . S u c h a p r e f e r e n c e c o u l d b e a c h i e v e d i f Y 2 8 8 i s t h e p r o t o n a c c e p t o r a n d 9 0 i s r e p r o t o n a t e d o n l y v i a t h e K - p a t h w a y d u r i n g t h e r e d u c t i v e p h a s e ( 0 9 R ) b u t n o t t h e o x i d a t i v e p h a s e ( P 9 F 9 0 ) . I n t h i s c o n d i t i o n , t h e s u b s t r a t e p r o t o n u p t a k e v i a t h e D - p a t h w a y c a n n o t s u b s t i t u t e f o r t h e K - p a t h w a y m u t a t i o n s ( W i k s t r o m a n d V e r k h o v s k y , 2 0 0 7 ) . T h e r e v e r s e s c e n a r i o h a s a l s o b e e n p r o p o s e d ( S h a r p e a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 2 0 0 8 ) : t h a t t h e C u B - O H g r o u p i s t h e p r o t o n a c c e p t o r f r o m t h e K - p a t h w a y d u r i n g t h e 0 9 R ( m e t a l r e d u c t i o n ) p h a s e , w h e r e a s t h e H i s - T y r g r o u p i s t h e p r o t o n d o n o r i n t h e P 9 F 9 0 p h a s e , a n d c a n o n l y b e r e p r o t o n a t e d b y t h e D - p a t h w a y . 1 . 3 . 4 . 3 . H - P a t h w a y i n B o v i n e H e a r t M i t o c h o n d r i a l C y t o c h r o m e c O x i d a s e R e d o x - c o u p l e d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s w e r e o b s e r v e d i n a s e g m e n t f r o m G 4 9 t o N 5 5 i n b o v i n e h e a r t m i t o c h o n d r i a l C c O ( b o v i n e n u m b e r i n g ) i n t h e 2 . 3 A r e s o l u t i o n c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e r e d u c e d e n z y m e ( 2 0 C C ) ( Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 8 ) . B a s e d o n t h i s o b s e r v a t i o n , t h e H - p a t h w a y h a s b e e n p r o p o s e d , i n b o v i n e C c O , t o p u m p p r o t o n s . D 5 1 i n t h e o x i d i z e d s t a t e i s c o m p l e t e l y b u r i e d i n s i d e t h e p r o t e i n a t t h e o u t e r e n d o f t h e p r 0 p o s e d H - p a t h w a y ( Y o s h i k a w a e r a l . , 1 9 9 8 ) a n d i s c o n n e c t e d w i t h t h e m a t r i x s u r f a c e b y a h y d r o g e n - b o n d e d n e t w o r k i n v o l v i n g w a t e r a n d a p e p t i d e b a c k b o n e . I n t h i s c o n fi g u r a t i o n , t h e r e s i d u e D 5 1 c a n o n l y t a k e u p p r o t o n s f r o m t h e m a t r i x s i d e , a n d i s i n a c c e s s i b l e f r o m t h e c y t o s o l i c s i d e . W a t e r c h a n n e l s o n t h e b o t t o m o f t h e H - p a t h w a y a r e p r o p o s e d t o b e c a p a b l e o f a c c e s s i n g w a t e r m o l e c u l e s i n t h e m a t r i x . T h i s c h a n n e l e x t e n d s t o t h e f o r m y l g r o u p o f h e m e a , c o n n e c t i n g w i t h D 5 1 v i a t h e p r o p i o n a t e o f h e m e a ( Y o s h i k a w a e t a l . , 2 0 0 6 a ) . I t i s s u g g e s t e d t h a t r e d u c t i o n f o l l o w e d b y o x i d a t i o n o f t h e l o w 9 1 s p i n h e m e a d r i v e s t h e a c t i v e p r o t o n t r a n s f e r f r o m t h e i n t e r i o r t o D 5 1 a c r o s s t h e e n z y m e v i a a w a t e r c h a n n e l a n d h y d r o g e n - b o n d e d n e t w o r k . T h e m e c h a n i s t i c p r o p o s a l s u g g e s t s t h a t u p o n r e d u c t i o n o f t h e f u l l y o x i d i z e d C c O , t h e h y d r o g e n b o n d b e t w e e n t h e k e y p e p t i d e a m i d e a n d a c a r b o x y l g r o u p o f D 5 1 i s b r o k e n . C o n s e q u e n t l y , D 5 1 l o s e s i t s a c c e s s i b i l i t y t o t h e m a t r i x s i d e a n d m o v e s t o w a r d t h e c y t o s o l i c s u r f a c e v i a a r e a r r a n g e d h y d r o g e n - b o n d e d n e t W o r k w h i c h n o w c o n n e c t s D 5 1 t o t h e o u t e r s u r f a c e t o r e l e a s e p r o t o n s t o t h e m i t o c h o n d r i a l e x t e r i o r . A p e p t i d e b o n d i n t h e h y d r o g e n b o n d e d n e t w o r k g i v e s d i r e c t i o n a l i t y , w h i c h i n h i b i t s r e v e r s e p r o t o n t r a n s f e r . I n a d d i t i o n , u p o n r e d u c t i o n , t h e p K a o f t h e D 5 1 c a r b o x y l g r o u p i s e x p e c t e d t o b e d e c r e a s e d b y a b o u t 5 p H u n i t s , c a u s i n g t h e c a r b o x y l g r o u p t o b e d e p r o t o n a t e d i n t h e r e d u c e d s t a t e ( Y o s h i k a w a e t a l . , 2 0 0 6 b ) . A l l o f t h e a m i n o a c i d s i n t h e n e t w o r k c o n n e c t e d t o D 5 1 i n b o v i n e h e a r t C c O a r e c o n s e r v e d i n m a m m a l i a n s y s t e m s . H o w e v e r , t h e H — p a t h w a y p r o p o s a l i s n o t y e t g e n e r a l l y a c c e p t e d b e c a u s e o f t h e l a c k o f c o n s e r v e d r e s i d u e s , i n c l u d i n g D 5 1 , i n t h e b a c t e r i a l e n z y m e ( L e e e t a l . , 2 0 0 0 ) a n d t h e l a c k o f e f f e c t o f m u t a t i o n s i n t h a t r e g i o n . M u t a t i o n a l e v i d e n c e f o r t h e i n v o l v e m e n t o f t h e k e y r e s i d u e , D 5 ] , i n p r o t o n p u m p i n g h a s b e e n r e p o r t e d i n s t u d i e s w i t h t h e m a m m a l i a n e n z y m e . A s p 5 1 o f s u b u n i t 1 w a s r e p l a c e d w i t h A s n , a n o n p r o t o n a t a b l e a n d i s o s t e r i c a m i n o a c i d , b y a h y b r i d e n z y m e f o r m a t i o n m e t h o d i n w h i c h m u t a n t b o v i n e s u b u n i t I w a s i n t r o d u c e d i n t o H e L a c e l l s a n d i m p o r t e d i n t o t h e m i t o c h o n d r i a t o f o r m e d a h y b r i d e n z y m e w i t h t h e r e m a i n i n g 1 2 h u m a n s u b u n i t s ( T s u k i h a r a e r a l . , 2 0 0 3 ) . T h e D 5 1 N m u t a t i o n a b o l i s h e d p r o t o n p u m p i n g a c t i v i t y 9 2 w h i l e m a i n t a i n i n g f u l l e l e c t r o n t r a n s f e r a c t i v i t y ( S h i m o k a t a e t a l . , 2 0 0 7 ) . M u t a t i o n s w h i c h b l o c k e i t h e r t h e w a t e r c h a n n e l o r p r o t o n t r a n s f e r a b o l i s h t h e p u m p i n g a c t i v i t y a s s e e n i n t h e D 5 1 N m u t a n t . T h e s e r e s u l t s s i g n i fi c a n t l y s t r e n g t h e n t h e p r o p o s a l t h a t t h e H - p a t h w a y i s i n v o l v e d i n p r o t o n p u m p i n g i n t h e m a m m a l i a n C c O . 1 . 3 . 4 . 4 . E x i t P a t h w a y s f o r P r o t o n s a n d W a t e r A l t h o u g h t h e t w o p r o t o n u p t a k e p a t h w a y s ( D a n d K - p a t h w a y ) a r e w e l l s t u d i e d b y b i o c h e m i c a l a n d c r y s t a l l o g r a p h i c a p p r o a c h e s , t h e p a t h w a y f o r p r o t o n s b e y o n d E 2 8 6 i s n o t r e s o l v e d f r o m s t r u c t u r a l o r f u n c t i o n a l s t u d i e s . I t i s p r o p o s e d t h a t p r o t o n s a r e m o v e d t o p r o t o n a t i o n s i t e s , i n t h e v i c i n i t y o f t h e h e m e p r o p i o n a t e s ( h e m e a a n d a 3 ) . t h r o u g h a w a t e r - m e d i a t e d n e t w o r k t h a t m a y i n v o l v e s p e c i fi c a m i n o a c i d s a n d w a t e r c h a i n s ( B e h r e t a l . , 2 0 0 0 ; P u u s t i n e n a n d W i k s t r o m , 1 9 9 9 a ; X u e t a l . , 2 0 0 7 ) . M a n y w a t e r s f o r m i n g a h y d r o g e n - b o n d e d n e t w o r k a n d c o n n e c t i n g t h e p r o p i o n a t e s o f t h e h e m e s t o t h e o u t s i d e a r e l o c a t e d a t t h e i n t e r f a c e b e t w e e n s u b u n i t I a n d H ( S c h m i d t e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h i s n e t w o r k , c o n t a i n i n g t h e p r o p i o n a t e s , c o u l d b e a p a r t o f a n e x i t p a t h w a y . I n a l l e u k a r y o t i c C c O , t h e r e g i o n a b o v e t h e h e m e s c o n t a i n s a n o n - r e d o x - a c t i v e m e t a l s i t e c o n t a i n i n g a M g z " . T h e r o l e o f t h e m e t a l s i t e i n t h e e x i t p a t h w a y i s n o t c l e a r . T h e M g 2 + c a n b e r e p l a c e d w i t h a n E P R a c t i v e p r o b e , M n 2 + , r e t a i n i n g f u l l a c t i v i t y ( H o s l e r e t a l . , 1 9 9 5 ) a n d m a i n t a i n i n g t h e s t r u c t u r a l c h a r a c t e r o f t h i s e n z y m e . P r o t o n s o r w a t e r m o l e c u l e s t h a t c o o r d i n a t e t h e m e t a l c a n b e e x c h a n g e d w i t h 2 H 2 0 o n a c a t a l y t i c a l l y r e l e v a n t t i m e s c a l e . T h e d e u t e r i u m e x c h a n g e , u s i n g a c o m b i n a t i o n o f r a p i d f r e e z e - q u e n c h a n d e l e c t r o n s p i n e c h o e n v e l o p e m o d u l a t i o n ( E S E E M ) a n a l y s i s o f M n 2 + 9 3 s u b s t i t u t e d C c O , s h o w e d t h a t t h r e e i n n e r s p h e r e 2 H 2 0 e x c h a n g e d p e r M n 2 + . I t i s p r o s p o s e d t h a t t h e M g 2 + l M n 2 + c o u l d p r o v i d e a m e c h a n i s m f o r p r e v e n t i n g b a c k fl o w o f p r o t o n s b y e l e c t r o s t a t i c r e p u l s i o n , i f t h e w a t e r / p r o t o n e x i t c h a n n e l i n v o l v e s w a t e r s l i g a t e d t o t h e m e t a l ( S c h m i d t e t a l . , 2 0 0 3 ) . ( s e e S e c t i o n 1 . 3 . 2 . 5 f o r d e t a i l s ) I n m e c h a n i s t i c a l l y s i m p l e r s y s t e m s , s u c h a s b a c t e r i o r h o d o p s i n , e a c h p r o t o n p u m p i n g e v e n t i s d r i v e n b y a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e b y p h o t o i s o m e r i z a t i o n o f t h e r e t i n a l ( L a n y i , 1 9 9 7 ; L a n y i a n d L u e c k e , 2 0 0 1 ) . T h i s p r o c e s s i n v o l v e s a s h i f t o f t h e p r o t o n p a t h s s o t h a t o n e i s c l o s e d a n d t h e o t h e r o p e n . A c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e o f E 2 8 6 i s s u g g e s t e d a s o n e p o s s i b l e w a y t o t r a n s i e n t l y c o n n e c t t h e D - p a t h w a y w i t h t h e e x i t p a t h w a y . A s i d e c h a i n s h i f t o f E 2 8 6 u p o n d e p r o t o n a t i o n t o a n “ u p ” - p o s i t i o n m a y r e s u l t i n a c h a n g e i n t h e w a t e r a r r a n g e m e n t i n s i d e t h e h y d r o p h o b i c c a v i t y a b o v e i t , t h e r e b y f o r m i n g a p r o t o n t r a n s f e r p a t h w a y . T h i s i s s u p p o r t e d b y e x p e r i m e n t a l ( B a i l e y e t a l . , 2 0 0 2 ; K a r p e f o r s e t a l . , 2 0 0 0 a ) a n d t h e o r e t i c a l s t u d i e s ( H o f a c k e r a n d S c h u l t e n , 1 9 9 8 ; S e i b o l d e t a l . , 2 0 0 5 ) . T h e c o n f o r f m a t i o n a l c h a n g e s a r e p o s t u l a t e d t o e x i s t t r a n s i e n t l y o n l y i n s p e c i fi c s t e p s o f t h e c a t a l y t i c c y c l e a n d t h e r e f o r e a r e n o t e a s y t o c a p t u r e i n t h e s t a t i c c r y s t a l s t r u c t u r e . S i n c e E 2 8 6 h a s a h i g h p K a , t h e d e p r o t o n a t e d s t a t e o f E 2 8 6 i s u n f a v o r a b l e ; r a p i d r e l o c a t i o n t o a ‘ d o w n ’ p o s i t i o n w o u l d d i s r u p t t h e w a t e r c h a i n a b o v e i t , p r e v e n t i n g t h e b a c k fl o w o f p r o t o n s f r o m t h e e x i t p a t h w a y . T h e E 2 8 6 i s a s s u m e d t o b e r e p r o t o n a t e d t h r o u g h t h e D - p a t h w a y a f t e r r e t u r n i n g t o i t s o r i g i n a l c o n f o r m a t i o n . T h e t u r n o v e r a c t i v i t y a n d p r o t o n p u m p i n g e f fi c i e n c y o f t h e E 2 8 6 A m u t a n t C c O w a s r e s t o r e d b y p l a c i n g a S e r a n d a T y r n e a r t h e 2 8 6 p o s i t i o n o f t h e P . d e n i t r i fi c a n s C c O ( E 2 7 8 A / G 2 7 5 S i n t h e P a r a c o c c u s C c O ) ( B a c k g r e n e t a l . , 2 0 0 0 ) , w h i c h i n d i c a t e s t h a t p r o t o n t r a n s l o c a t i o n c a n t a k e p l a c e w i t h o u t 9 4 t h e c o n s e r v e d g l u t a m i c a c i d r e s i d u e . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e e f f e c t o f d e p r o t o n a t i o n o f E 2 8 6 o n w a t e r c h a i n f o r m a t i o n i s n o t d i r e c t , b u t r a t h e r i n v o l v e s m o d u l a t i o n o f t h e e l e c t r o s t a t i c fi e l d a r o u n d t h i s r e s i d u e . 1 . 3 . 4 . 5 . P r o t o n B a c k fl o w P a t h w a y U n d e r s t a n d i n g t h e p r o t o n b a c k fl o w m e c h a n i s m i s i m p o r t a n t f o r s t u d y i n g t h e r o l e o f C c O i n e n e r g y t r a n s d u c t i o n e f fi c i e n c y . P r o t o n b a c k fl o w m a y b e i m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a l l y a n d m e c h a n i s t i c a l l y i n t e r m s o f r e g u l a t i o n o f t h e e n e r g y e f fi c i e n c y , h e a t v e r s u s A T P p r o d u c t i o n . P r o t o n b a c k fl o w m a y a l s o i n h i b i t f o r m a t i o n o f R O S ( r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s ) d u e t o a l o w e r i n g o f t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l b y a l l o w i n g e l e c t r o n t r a n s f e r t o t h e a c t i v e s i t e w i t h o u t p r o t o n p u m p i n g . A m u t a n t o f R . s p h a e r o i d e s C c O t h a t b l o c k s p r o t o n u p t a k e f r o m t h e D - p a t h w a y p r o v i d e d t h e fi r s t e v i d e n c e o f a p r o t o n b a c k fl o w r o u t e . W h e n D 1 3 2 i n R . s p h a e r o i d e s C c O i s m u t a t e d t o a n y n o n - c a r b o x y l r e s i d u e , t h e r e s i d u a l a c t i v i t y i s a b o u t 5 % o f w i l d - t y p e ( F e t t e r e t a l . , 1 9 9 5 ; M i l l s e t a l . , 2 0 0 0 ; V e r k h o v s k a y a e t a l . , 1 9 9 7 ) . W i t h a c o m p r o m i s e d D - p a t h w a y , b u t w i t h t h e p r e s e n c e o f a m e m b r a n e p o t e n t i a l , t h e a c t i v i t y o f t h e m u t a n t w a s s t i m u l a t e d . T h i s o b s e r v a t i o n l e d t o t h e s u g g e s t i o n t h a t p r o t o n b a c k fl o w c o u l d p a r t i a l l y r e p a i r t h e b l o c k a g e o f t h e D - p a t h w a y a n d t h a t t h i s b a c k fl o w c o u l d o c c u r b y r e v e r s a l o f t h e e x i t p a t h w a y . H o w e v e r , n e i t h e r a p r o t o n e x i t , n o r b a c k fl o w p a t h w a y s a b o v e t h e h e m e s h a v e b e e n i d e n t i fi e d i n t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s , s u g g e s t i n g t h a t w a t e r c h a i n 9 5 f o r m a t i o n i s t r a n s i e n t , a n d t h a t t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o b t a i n e d s o f a r a r e n o t i n t h e c o r r e c t s t a t e , w i t h t h e e x i t p a t h i n a n “ o p e n ” s t a t e . I n o r d e r t o s t u d y t h e p o s s i b l e i n v o l v e m e n t o f t h e r e g i o n a b o v e t h e h e m e s , t h e w e l l c o n s e r v e d a r g i n i n e ( R 4 8 1 ) , w h i c h i n t e r a c t s w i t h t h e h e m e p r o p i o n a t e s , h a s b e e n m u t a t e d ( M i l l s e t a l . , 2 0 0 5 ; P u u s t i n e n a n d W i k s t r o m , 1 9 9 9 b ; Q i a n e t a l . , 2 0 0 4 ) . M u t a t i o n o f R 4 8 1 s u g g e s t s t h a t e v e n a c o n s e r v a t i v e c h a n g e , R 4 8 1 K , a f f e c t s t h e p r o t o n m o v e m e n t a b o v e t h e h e m e s w i t h o u t p e r t u r b a t i o n o f t h e h e m e s o r t h e C u A s p e c t r u m . O x y g e n c o n s u m p t i o n i s m o s t s t r o n g l y i n h i b i t e d i n R 4 8 1 K C c O r e c o n s t i t u t e d i n t o v e s i c l e s i n t h e p r e s e n c e o f a m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d p H g r a d i e n t , s h o w i n g h i g h R C R ( r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o ) . T h i s s u g g e s t s t h e i n v o l v e m e n t o f t h e R 4 8 1 r e s i d u e i n a b a c k fl o w p a t h w a y f o r p r o t o n u p t a k e f r o m o u t s i d e i n t h e p r e s e n c e o f m e m b r a n e p o t e n t i a l . H o w e v e r , t h i s m u t a n t s h o w s n o r m a l p r o t o n p u m p i n g e f fi c i e n c y , s u g g e s t i n g t h a t i t d o e s n o t p r e v e n t p r o t o n e x i t . 1 . 4 . S t a t e m e n t o f p u r p o s e T r e m e n d o u s e f f o r t s h a v e b e e n m a d e u s i n g X - r a y c r y s t a l l o g r a p h y , k i n e t i c , a n d s p e c t r o s c o p i c s t u d i e s i n o r d e r t o o b t a i n a c o m p r e h e n s i v e k n o w l e d g e o f t h e s t r u c t u r e , f u n c t i o n a n d r e g u l a t i o n o f C c O . T h e s e t e c h n i q u e s h a v e p r o v i d e d t h e b a s i s f o r r a t i o n a l m o d e l s f o r m e c h a n i s m s o f p r o t o n p u m p i n g , w h i c h i s c o u p l e d t o e l e c t r o n t r a n s f e r , r e d u c i n g t h e o x y g e n i n t o w a t e r , u s i n g p r o t o n s f r o m w e l l d e fi n e d p r o t o n u p t a k e p a t h w a y s . H o w e v e r , d e s p i t e t h e r e m a r k a b l e a c h i e v e m e n t o f h i g h r e s o l u t i o n c r y s t a l s i n d i f f e r e n t s t a t e s a n d f r o m d i f f e r e n t s p e c i e s , a n d v a r i o u s k e y m u t a n t s w h i c h h a v e a l t e r e d 9 6 b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s a n d d i s t u r b e d p r o t o n p u m p i n g , t h e r e a r e s t i l l u n s o l v e d q u e s t i o n s . T h e p r o t o n r e l e a s e a n d p r o t o n b a c k fl o w p a t h w a y s a r e n o t y e t d e fi n e d . M o r e o v e r , c o n t r o l o f o x i d a s e a c t i v i t y a n d e f fi c i e n c y i s n o t u n d e r s t o o d . T h e c e n t r a l i s s u e o f t h e m e c h a n i s m o f p r o t o n p u m p i n g i n C c O i s t h e q u e s t i o n o f h o w p r o t o n s a r e m o v e d a g a i n s t a n e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t a n d h o w t h i s i s t i g h t l y c o u p l e d t o t h e e l e c t r o n t r a n s f e r . T h e r e f o r e , i n o r d e r t o u n d e r s t a n d t h e d e t a i l e d m e c h a n i s m , I h a v e b e e n t r y i n g t o d e v e l o p a s e n s i t i v e m e t h o d t o o b s e r v e p r o t o n m o v e m e n t b o t h i n s i d e a n d o u t s i d e o f t h e r e c o n s t i t u t e d v e s i c l e s o f R . s p h a e r o i d e s C c O . I n t h i s t h e s i s , I a d d r e s s t h e p r o g r e s s t h a t h a s b e e n m a d e i n t e r m s o f q u a n t i fi c a t i o n o f p r o t o n m o v e m e n t i n t h e s y s t e m . T h e m e a s u r e m e n t o f s i z e a n d i n t e r n a l c a p a c i t y o f t h e v e s i c l e s w i l l b e r e p o r t e d . M y g o a l w a s t o e n t r a p s u f fi c i e n t p H i n d i c a t o r o n t h e i n s i d e t o e n a b l e m e a s u r e m e n t o f i n t e r n a l p H c h a n g e s . T h i s w a s a c h i e v e d b y u s i n g B i o - b e a d s f o r r e m o v a l o f d e t e r g e n t , w h i c h a r e s h o w n b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y t o p r o d u c e l a r g e v e s i c l e s . A l t h o u g h a c o m p l e t e q u a n t i t a t i v e u n d e r s t a n d i n g o f p r o t o n / e l e c t r o n s t o i c h i o m e t r y w a s n o t o b t a i n e d , I w i l l d i s c u s s t h e r e s u l t s w i t h r e g a r d t o t h e s i g n a l a m p l i t u d e s a n d t h e r a t e o f H + / e ' c o n s u m p t i o n a t s t a n d a r d c o n d i t i o n s . I w i l l r e p o r t t h e e f f o r t s i n f u r t h e r a n a l y s i s o f t h e r e s u l t i n g d a t a c o n d u c t e d b y g l o b a l fi t t i n g o f f u l l s p e c t r a , i n o r d e r t o p r o d u c e a k i n e t i c m o d e l t h a t p r o v i d e s b e t t e r u n d e r s t a n d i n g a n d q u a n t i fi c a t i o n o f p r o t o n m o v e m e n t s . M o r e o v e r , t h e r e g u l a t i o n o f o x i d a s e a c t i v i t y w i l l b e d i s c u s s e d i n t e r m s o f t h e r o l e o f e x i t / b a c k fl o w o f p r o t o n s i n t h e p r e s e n c e / a b s e n c e o f i n h i b i t o r z i n c , u s i n g t h e w i l d - t y p e e n z y m e . I n a d d i t i o n t o t h e w i l d - t y p e C c O , I w i l l d i s c u s s s t u d i e s w i t h a s e t o f m u t a n t s o f t h e r e s i d u e 9 7 H 9 3 , w h i c h m a y h a v e a r o l e i n p r o t o n p u m p i n g a n d p r o t o n b a c k fl o w . T h e s e a p p r o a c h e s a d d t o o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e m e c h a n i s m a n d p a t h w a y s f o r p r o t o n p u m p i n g i n C c O . 9 8 C h a p t e r 2 O p t i m i z a t i o n l C h a r a c t e r i z a t i o n o f P r o t e o l i p o s o m e s a n d p H S e n s i t i v e D y e s t o A c h i e v e I n t e r n a l a n d E x t e r n a l p H M e a s u r e m e n t 2 . 1 . I n t r o d u c t i o n T h e c o u p l i n g o f p r o t o n s a n d e l e c t r o n s i n C c O w a s i n v e s t i g a t e d i n o r d e r t o c l a r i f y t h e r o l e o f p r o t o n p a t h w a y s a n d h o w p r o t o n m o v e m e n t i s l i n k e d w i t h e l e c t r o n t r a n s f e r . A l i p o s o m a l s y s t e m h a s b e e n u s e d a s a m o d e l f o r s t u d y i n g m e m b r a n e p r o t e i n s a n d t h e i r f u n c t i o n . A n u m b e r o f t e c h n i q u e s h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d f o r p r o d u c i n g m o d e l m e m b r a n e s f r o m l i p i d s f o r t h i s s t u d y . L i m i t a t i o n s t o m i m i c k i n g t h e b i l a y e r e n v i r o n m e n t a r e c a u s e d b y t h e p r e s e n c e o f d e t e r g e n t s u s e d t o s o l u b i l i z e a n d s t a b i l i z e t h e m e m b r a n e p r o t e i n w h e n i t i s p u r i fi e d . P u r i fi e d i n t e g r a l p r o t e i n s m a i n t a i n a f u n c t i o n a l c o n f o r m a t i o n w h e n s o l u b i l i z e d i n d e t e r g e n t s , b u t i n s e r t i o n o f a p u r i fi e d m e m b r a n e p r o t e i n i n t o a l i p i d m o d e l s y s t e m i s d e p e n d e n t o n d e t e r g e n t r e m o v a l s t e p s . R e c o n s t i t u t e d c y t o c h o r r n e c o x i d a s e v e s i c l e s ( C O V s ) e x h i b i t r e s p i r a t o r y c o n t r o l a n d p r o t o n p u m p i n g , s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d i n m i t o c h o n d r i a ( W i k s t r o m , 1 9 7 7 ) . S m a l l s i z e v e s i c l e s w i t h a d i a m e t e r r a n g e o f 2 0 - 3 0 m m , m e a s u r e d b y E M , m a y h a v e a l i m i t e d u s e i n m o d e l m e m b r a n e s t u d i e s . T h e a q u e o u s v o l u m e e n c l o s e d i n t h e v e s i c l e s i s t o o s m a l l t o m o n i t o r i n s i d e p H c h a n g e s d u e t o t h e s m a l l n u m b e r o f c a p t u r e d d y e m o l e c u l e s . T h e r e i s a l s o t h e p r o b l e m o f a p r o t o n s h o r t a g e f o r p u m p i n g , u n l e s s v e s i c l e s a r e p r e p a r e d u n d e r c o n d i t i o n s o f h i g h i n t e r n a l b u f f e r i n g . I n t h i s c h a p t e r , a t t e m p t s t o o p t i m i z e t h e c o n d i t i o n o f v e s i c l e s a r e d e s c r i b e d , a n d a r e d e s i g n e d t o m a x i m i z e s i g n a l a n d r e d u c e n o i s e b y i n c r e a s i n g t h e s i z e o f t h e v e s i c l e s , o r b y p u r i f y i n g 9 9 t h e C O V s t o m i n i m a l i z e t h e c o n t r i b u t i o n o f b a c k g r o u n d n o i s e a n d b u f f e r i n g i n t h e v e s i c l e s w i t h o u t C c O . C h a n g e s i n b u f f e r c a p a c i t y a n d d y e c o n c e n t r a t i o n o n t h e i n s i d e o f v e s i c l e s w e r e a l s o e x p l o r e d . T h e n e w B i o - b e a d m e t h o d d e v e l o p e d ( F i g u r e 2 . 1 ) i n c r e a s e d t h e s i z e o f t h e v e s i c l e s a l m o s t t h r e e - f o l d c o m p a r e d t o t h e p r e v i o u s c h o l a t e - d i a l y s i s m e t h o d . A s a r e s u l t o f t h e i n c r e a s e d s i z e , t h e a m o u n t o f d y e w a s i n c r e a s e d o n t h e i n t e r i o r o f t h e C O V s , l e a d i n g t o a n i n c r e a s e i n t h e s i g n a l - t o - n o i s e r a t i o a n d a l l o w i n g f o r t h e c o r r e s p o n d i n g o b s e r v a t i o n o f p H c h a n g e s a s p r o t o n p u m p i n g o c c u r s . T h e u n i l a m e l l a r s y s t e m ( s i n g l e l a y e r o f l i p i d b i l a y e r ) w i t h l a r g e r v e s i c l e s i z e s w a s m a d e b y a B i o - b e a d m e t h o d , w h i c h c o u l d b e t t e r m o n i t o r t h e p H c h a n g e s o n t h e i n s i d e w i t h a r e d u c e d b u f f e r i n g c a p a c i t y , a n d m a x i m i z e t h e a b i l i t y t o m o n i t o r t h e i n t e r n a l p H c h a n g e s . T h e o r i e n t a t i o n o f t h e C c O i s f o u n d t o b e p r e d o m i n a n t l y w i t h t h e l a r g e s o l u b l e “ h e a d ” r e g i o n o f s u b u n i t H p o i n t i n g o u t s i d e , a n d n o t r a n d o m l y o r i e n t e d i n t h e C O V s . H o w e v e r , m i s - o r i e n t e d C c O v e s i c l e s ( C O V s ) c a n b e r e m o v e d b y u s i n g a h i s - t a g g e d C c O p u r i fi c a t i o n t e c h n i q u e u s i n g a N i - N T A r e s i n a n d a h i s - t a g o n s u b u n i t H o n t h e o u t s i d e , s o t h a t o n l y t h o s e v e s i c l e s c o n t a i n i n g a h i s - t a g c a n b e p r e f e r e n t i a l l y s e l e c t e d . V o i d v e s i c l e s , w h i c h d o n o t h a v e C c O , w i l l a l s o n o t b e r e t a i n e d b y a N i - N T A c o l u m n a n d c a n b e s e p a r a t e d , e l i m i n a t i n g b a c k g r o u n d n o i s e . T h e u s e o f B i o - b e a d C O V s , c o m b i n e d w i t h t h e p u r i fi c a t i o n s t e p u s i n g h i s - t a g g e d C c O r e s u l t s i n r e l a t i v e l y p u r e h o m o g e n e o u s o u t w a r d f a c i n g C O V s . 1 0 0 b e a d s u r f a c e A B I l p l d I } d e t e r g e n t g p r o t e i n 0 F i g u r e 2 . 1 M o d e l o f l i p o s o m e f o r m a t i o n a n d r e c o n s t i t u t i o n w i t h m e m b r a n e p r o t e i n s . ( A ) S i z e t r a n s f o r m a t i o n p r o c e s s d u r i n g t h e r e m o v a l o f d e t e r g e n t . T h e c u r v a t u r e o f t h e l i p o s o m e s i s d e p e n d e n t u p o n t h e l e v e l o f r e s i d u a l d e t e r g e n t r e m a i n i n g i n t h e d e t e r g e n t a n d l i p i d m i x t u r e . M i c e l l e s u n d e r g o a s i z e t r a n s f o r m a t i o n t o l a r g e r v e s i c l e s t h r o u g h f u s i o n a n d l i p i d e x c h a n g e a s t h e d e t e r g e n t c o n c e n t r a t i o n i s d e c r e a s e d . D e t e r g e n t r e m o v a l f r o m l i p i d - d e t e r g e n t m i c e l l e s m a y c a u s e t h e t r a n s f o r m a t i o n o f s m a l l m i c e l l e s t o l a r g e r o n e s ( I ) , w h i c h b e n d u p o n f u r t h e r d e t e r g e n t r e m o v a l t o f o r m c u r v e d m i x e d m i c e l l e s . S u b s e q u e n t l y , d e t e r g e n t - s a t u r a t e d v e s i c l e s s h o u l d b e f o r m e d ( I D w h i c h u n d e r g o s i z e g r o w t h t h r o u g h f u s i o n a n d l i p i d e x c h a n g e ( H I ) t o l a r g e r u n i l a m e l l a r l i p o s o m e s . ( B ) P r o p o s e d m e c h a n i s m s o f d e t e r g e n t b i n d i n g o n t o B i o - B e a d s . A d s o r p t i o n o f d e t e r g e n t s , l i p i d s , a n d p r o t e i n s d e p e n d u p o n t h e a c c e s s i b i l i t y t h r o u g h t h e p o r e s o f t h e b e a d s . H y d r o p h o b i c d e t e r g e n t m o n o m e r s a n d s m a l l m i c e l l e s a r e i n c l u d e d ; l a r g e r m i x e d m i c e l l e s , p r o t e i n , a n d v e s i c l e s a r e e x c l u d e d . D e t a i l s o f t h e p r o t o c o l w e r e i n t r o d u c e d i n F i g u r e 2 . 3 . F i g u r e s a r e o b t a i n e d f r o m R i g a u d e t a l . ( E u r o p e a n B i o p h y s i c s J o u r n a l 1 9 9 8 2 7 : 3 0 5 - 3 0 9 ) w i t h m o d i fi c a t i o n . 1 0 1 T o o m u c h b u f f e r i n g o n t h e i n s i d e c a n r e s u l t i n s m a l l p H c h a n g e s . H o w e v e r , w i t h o u t s u f fi c i e n t b u f f e r i n g o n t h e i n s i d e o f v e s i c l e s , m e a s u r e m e n t o f p u m p i n g c a n a l s o b e d i f fi c u l t d u e t o a l a c k o f a v a i l a b l e p r o t o n s . V a r i o u s b u f f e r i n g c o n d i t i o n s a n d d i f f e r e n t d y e c o n c e n t r a t i o n s w e r e u s e d i n o r d e r t o g e t a b e t t e r s i g n a l o n b o t h t h e i n s i d e a n d t h e o u t s i d e o f t h e C O V S a t t h e s a m e t i m e . T h e s t o p p e d - fl o w m e a s u r e m e n t o f a c t i v i t y a l l o w s e l e c t r o n c o n s u m p t i o n , p r o t o n u p t a k e , a n d p r o t o n r e l e a s e t o b e m o n i t o r e d i n a m i l l i s e c o n d t i m e s c a l e . O s m o l a r i t y w a s m a i n t a i n e d w i t h s u c r o s e i n o r d e r t o p r e v e n t e x c e s s i v e s w e l l i n g o r s h r i n k a g e o f t h e C O V s . 2 . 2 . E x p e r i m e n t a l P r o c e d u r e s 2 . 2 . 1 . P r o d u c t i o n a n d I s o l a t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e B a c t e r i a l G r o w t h R h o d o b a c t e r ( R . ) s p h a e r o i d e s s t r a i n s w e r e g r o w n a e r o b i c a l l y i n t h e d a r k a t 3 0 ° C i n 2 . 8 L F e m b a c h fl a s k s c o n t a i n i n g 6 0 0 m L o f S i s t r o m ’ s m e d i a ( 1 9 6 2 S i s t r o m J . G e n . M i c r o b i a l . 2 8 , 6 0 7 ) w i t h 2 5 I i g / m L s t r e p t o m y c i n , 2 5 u g / m L s p e c t i n o m y c i n a n d l u g / m L t e t r a c y c l i n e a s d e s c r i b e d ( H i s e r e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d a f t e r 3 d a y s ' a t 3 0 ° C w h e n t h e c u l t u r e h a d a t t a i n e d a n o p t i c a l d e n s i t y a t 6 0 0 n m o f 1 . 5 - 1 . 8 a n d p H o f 8 . 5 - 9 . 0 , a n d c e l l s w e r e s t o r e d f r o z e n a t ~ 7 0 ° C . P r e p a r a t i o n o f C y t o p l a s m i c M e m b r a n e s R . s p h a e r o i d e s m e m b r a n e s w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d ( Z h e n e t a l . , 1 9 9 8 ) w i t h s o m e m o d i fi c a t i o n s . F r o z e n c e l l s w e r e r e s u s p e n d e d u s i n g a l a r g e p a i n t b r u s h i n t o 1 5 0 - 1 0 2 2 0 0 m l o f 5 0 m M K H 2 P 0 4 , p H 6 . 5 , l m M E D T A , 5 0 u g / m l D N a s e I , R N A s e ( f e w g r a i n s ) a n d w e r e h o m o g e n i z e d w i t h a h a n d h e l d g l a s s h o m o g e n i z e r a n d T e fl o n p e s t l e . T h e c e l l s w e r e b r o k e n b y p a s s i n g t h r o u g h a F r e n c h P r e s s a t 2 0 , 0 0 0 p s i . W h o l e c e l l s a n d d e b r i s w e r e r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 3 1 , 0 0 0 x g f o r 3 0 m i n u t e s . T h e m e m b r a n e s w e r e p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 0 0 , 0 0 0 x g f o r 1 . 5 h a n d w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 0 m M T r i s - H C l p H 8 . 0 , 4 0 m M K C l ( 2 0 0 m M K C l f o r s u b u n i t H h i s - t a g g e d C c O ) . P u r i f i c a t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e I s o l a t i o n a n d p u r i fi c a t i o n s t e p s w e r e d o n e a s d e s c r i b e d ( H o s l e r e t a l . , 1 9 9 2 ; Z h e n e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h e w i l d t y p e a n d m u t a n t o x i d a s e s w e r e i s o l a t e d u s i n g a h i s t i d i n e t a g e i t h e r o n t h e C - t e r m i n a l e n d o f s u b u n i t I o r C - t e r m i n a l e n d o f s u b u n i t H . C c O w a s s o l u b i l i z e d f r o m t h e m e m b r a n e w i t h a 1 0 m M T r i s - H C l p H 8 . 0 c o n t a i n i n g 4 0 m M K C ] ( 2 0 0 m m K C l f o r s u b u n i t H h i s - t a g ) , 3 % l a u r y l m a l t o s i d e ( 2 % f o r h i s - t a g H ) , a n d s t i r r e d i n t h e c o l d r o o m f o r 3 0 m i n u t e s . S a m p l e v o l u m e a t t h i s p o i n t w a s 9 0 — 1 0 0 m l . S o l u b i l i z e d o x i d a s e w a s c e n t r i f u g e d a t 2 0 0 , 0 0 0 x g f o r 3 0 m i n u t e s t o s p i n d o w n u n s o l u b i l i z e d m a t e r i a l . T h e e x p r e s s i o n y i e l d w a s c a l c u l a t e d i n a m i x t u r e o f 2 0 0 m o f s o l u b i l i z e d o x i d a s e i n 8 0 0 1 1 1 o f b u f f e r b y m e a s u r i n g t h e r e d u c e d m i n u s o x i d i z e d a b s o r b a n c e a t 5 0 0 - 7 0 0 n m a n d b y u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o f 2 8 , 9 0 0 M ' l c m ' l . A v o l u m e o f Q i a g e n N i Z I - N T A r e s i n w a s p r e p a r e d ( 1 m l / m g a a 3 ) b a s e d o n t h e s p e c t r a l a n a l y s i s . T h e s u p e r n a t a n t w a s m i x e d w i t h Q i a g e n N i z + - N T A r e s i n a n d s t i r r e d i n t h e c o l d r o o m o v e r n i g h t . T h i s s o l u t i o n w a s l o a d e d o n t o a g r a v i t y c o l u m n a n d w a s h e d fi r s t w i t h o n e c o l u m n v o l u m e o f i m i d a z o l e b u f f e r , 1 0 m M T r i s - H C l p H 8 . 0 + 4 0 m M K C l + 1 0 m M i m i d a z o l e + 0 . 1 % l a u r y l m a l t o s i d e ( 1 0 m M 1 0 3 T r i s - H C l p H 8 . 0 + 2 0 0 m M K C ] + 1 0 m M i m i d a z o l e + 0 . 1 % l a u r y l m a l t o s i d e f o r h i s - t a g 1 1 ) , t h e n w i t h t w o c o l u m n v o l u m e s o f t h e s a m e b u f f e r w i t h o u t i m i d a z o l e . T i g h t l y b o u n d C c O w a s e l u t e d w i t h 8 0 m M h i s t i d i n e + 1 0 m M T r i s - H C ] p H 8 . 0 + 4 0 m M K C ] ( 2 0 0 m M K C l f o r h i s - t a g H ) + 0 . 1 % l a u r y l m a l t o s i d e a n d c o n c e n t r a t e d i n a 1 0 0 K M W c u t - o f f M i l l i p o r e c e n t r i f u g a l fi l t e r t o r e m o v e t h e h i s t i d i n e - N i c o m p l e x . T h e e l u t e d C c O w a s w a s h e d w i t h 1 0 m M K H 2 P 0 4 ( p H 8 . 0 ) , 1 m M E D T A , 0 . 2 % l a u r y l m a l t o s i d e a n d a p p l i e d t o a f a s t p r o t e i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p y s y s t e m ( F P L C , A m e r s h a m B i o s c i e n c e , I n c . , A K T A - 5 1 9 ) w i t h a n a n i o n e x c h a n g e c o l u m n ( t a n d e m D E A E - 5 P W , T o s o h - H a a s ) , e q u i l i b r a t e d w i t h t h e s a m e b u f f e r ( H i s e r e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e s a m p l e w a s e l u t e d u s i n g a l i n e a r g r a d i e n t o f K C ] a n d c o n c e n t r a t e d b y u s i n g a n A m i c o n U l t r a c e n t r i f u g a l fi l t e r d e v i c e ( M i l l i p o r e ) . 2 . 2 . 2 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e U V - V i s i b l e S p e c t r o s c o p y U V - v i s i b l e s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a P e r k i n - E l m e r L a m b d a 4 0 P s p e c t r o p h o t o m e t e r a f t e r a p p r o p r i a t e d i l u t i o n o f C c O i n t o 1 0 0 m M K H 2 P O 4 , 0 . 1 % L M , p H 7 . 2 . T h e c o n c e n t r a t i o n o f C c O w a s d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e d i t h i o n i t e - r e d u c e d , 1 a b s o l u t e s p e c t r u m a t A 6 0 6 - 6 4 0 w i t h a n a b s o r p t i o n c o e f fi c i e n t o f 3 7 , 0 0 0 M ' l c m ' . T h e p u r i t y w a s d e t e r m i n e d f r o m t h e A 2 3 0 / A 4 2 0 r a t i o , w h i c h w a s f o u n d t o b e a b o u t 1 . 9 - 2 . 0 . B o t h h e m e g r o u p s m a k e a m a j o r c o n t r i b u t i o n i n t h e S o r e t r e g i o n , w i t h h e m e a b e i n g d o m i n a n t i n t h e a l p h a ( 0 t ) r e g i o n a r o u n d 6 0 5 n m ( b o v i n e ) ( V a n n e s t e , 1 9 6 6 ; W i k s t r o m e t a l . , 1 9 8 1 a ) a n d 6 0 6 n m ( R s ) ( H o s l e r e t a l . , 1 9 9 2 ) . 1 0 4 S t e a d y S t a t e A c t i v i t y M e a s u r e m e n t b y O x y g r a p h O x y g e n c o n s u m p t i o n a c t i v i t y o f C c O w a s m e a s u r e d , e i t h e r w i t h t h e s o l u b i l i z e d f o r m o f t h e e n z y m e , o r i n t h e r e c o n s t i t u t e d v e s i c l e s . T h e m e a s u r e m e n t s w e r e m a d e i n a G i l s o n O x y g r a p h w i t h a c l o s e d t h e r m o s t a t e d c h a m b e r c o n t a i n i n g a C l a r k - t y p e o x y g e n e l e c t r o d e ( F e r g u s o n - M i l l e r e t a l . , 1 9 7 6 ) . T h e V m a x i n t h e s t e a d y - s t a t e t u r n o v e r w a s m e a s u r e d i n K H 2 P 0 4 a t p H 6 . 5 w i t h 1 0 p m o l e s o f C c O , o r i n C O V s . H o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c ( 3 0 u M ) , a s c o r b a t e ( 5 . 6 m M ) a n d T M P D ( 0 . 2 8 m M ) w e r e a d d e d a s e l e c t r o n d o n o r s w i t h i s o l a t e d e n z y m e ( C c O ) i n t h e p r e s e n c e / a b s e n c e o f s o y b e a n p h o s p h o l i p i d s , a s o l e c t i n ( l m g / m l ) a t 2 5 ° C ( H o s l e r e t a l . , 1 9 9 2 ) . A 3 0 | . L M c y t o c h r o m e c c o n c e n t r a t i o n w a s s e l e c t e d a s a s t a n d a r d c o n d i t i o n f o r s t e a d y - s t a t e m e a s u r e m e n t , b a s e d o n a R C R c a l c u l a t i o n ( R C R = u n c o n t r o l l e d s t a t e a c t i v i t y / c o n t r o l l e d s t a t e a c t i v i t y ) . T h e R C R w a s i n d e p e n d e n t o f c y t o c h r o m e c c o n c e n t r a t i o n i n t h e r a n g e o f 3 . 5 ~ 5 6 I L M ( F i g u r e 2 . 2 ) . M e a s u r e m e n t o f t h e a c t i v i t y o f C O V s w e r e m a d e i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e ( a b s e n c e o f i o n o p h o r e s ) , a n d w i t h t h e a d d i t i o n o f v a l i n o m y c i n , w h i c h d i s s i p a t e s t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l b y e q u i l i b r a t i n g K + a c r o s s t h e m e m b r a n e t o r e m o v e t h e c h a r g e ( A ‘ I ’ = 0 ) . H o w e v e r , t h e p r o t o n g r a d i e n t , A p H , w i l l b e m a i n t a i n e d . T h e u n c o n t r o l l e d c o n d i t i o n o c c u r s w i t h t h e a d d i t i o n o f u n c o u p l e r s , F C C P ( o r C C C P ) , w h i c h t r a n s f e r s p r o t o n s a c r o s s t h e m e m b r a n e , a n d t h i s c a u s e s t h e p r o t o n g r a d i e n t t o b e d i s s i p a t e d ( A p H = 0 ) s h o w i n g t h e h i g h e s t r a t e o f a c t i v i t y . 1 0 5 [ i n R a p i d S c a n n i n g S t o p p e d - F l o w F o r s t o p p e d - fl o w , p r e - s t e a d y - s t a t e m e a s u r e m e n t s t h e e l e c t r o n d o n o r , h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c , w a s r e d u c e d b y s o d i u m d i t h o n i t e f o l l o w e d b y d e s a l t i n g a n d d e p o l y m e r i z i n g t h r o u g h a S e p h a d e x G - 7 5 ( A m e r s h a m B i o s c i e n c e s , I n c . ) g e l fi l t r a t i o n c o l u m n i n t o 0 . 5 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 , 4 5 m M K C ] . R e s p i r a t o r y c o n t r o l a n d a c t i v i t y o f C c O i n t h e r e c o n s t i t u t e d v e s i c l e s w a s m e a s u r e d i n 1 0 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 , 5 0 m M K C ] i n t h e a b s e n c e o r p r e s e n c e o f i o n o p h o r e s ( v a l i n o m y c i n a n d F C C P ) . S t o c k s o l u t i o n s o f 2 m M v a l i n o m y c i n a n d 1 0 m M F C C P ( S i g m a ) w e r e p r e p a r e d i n e t h a n o l . T h e t u r n o v e r n u m b e r s , i n e l e c t r o n s c o n s u m e d p e r s e c o n d p e r C c O ( e ' l s e c / a a 3 ) , w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e o x y g e n c o n s u m p t i o n t r a c e s . T h e r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o ( R C R ) w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e u n c o n t r o l l e d s t a t e t u r n o v e r s , w h e r e b o t h v a l i n o m y c i n a n d F C C P a r e p r e s e n t , d i v i d e d b y t h e c o n t r o l l e d t u r n o v e r s w h e r e n o i o n o p h o r e s a r e p r e s e n t . A c o n t r o l l e d s t a t e w i t h o u t i o n o p h o r e s s h o w s t h e s l o w e s t r e a c t i o n d u e t o t h e h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d p H g r a d i e n t , w h i c h i s b u i l t u p a c r o s s t h e m e m b r a n e d u r i n g t h e r e a c t i o n . 1 0 6 1 4 0 0 5 a q @ 1 2 0 0 - I c o n t r o l l e d s 4 E O u n c o n t r o l l e d 8 4 r R C R £ 1 0 0 0 - _ 3 I 0 $ 1 m V 4 . A ‘ 4 ‘ a . I O 9 8 0 0 — _ 2 D : d ) > 2 h 6 0 0 - _ 1 ' 2 { fl I 4 0 0 l r I r l ' l ' I ' l r r 0 C y t o c h r o m e c ( p M ) F i g u r e 2 . 2 C y t o c h r o m e c d e p e n d e n c e o f a c t i v i t y a n d R C R ( R e s p i r a t o r y C o n t r o l R a t i o ) i n t h e s t e a d y - s t a t e c o n d i t i o n . S t e a d y - s t a t e m e a s u r e m e n t s w e r e m a d e i n t h e p r e s e n c e o f a s c o r b a t e ( 5 . 6 m M ) a n d T M P D ( 0 . 2 8 m M ) a n d a n i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n o f c y t o c h r o m e c a s e l e c t r o n d o n o r s t o C c O , i n 5 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 , 2 5 m M K C ] . T h e R C R w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e u n c o n t r o l l e d a c t i v i t y d i v i d e d b y t h e c o n t r o l l e d a c t i v i t y . C y t o c h r o m e c a t 3 0 u M w a s s e l e c t e d a s a s t a n d a r d c o n d i t i o n f o r t h e s t e a d y - s t a t e m e a s u r e m e n t s . 1 0 7 M e a s u r e m e n t o f c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n w a s m a d e e i t h e r w i t h a n A p p l i e d P h o t o p h y s i c s S X . 1 8 M V — R S t o p p e d - F l o w r e a c t i o n a n a l y s e r ( A p p l i e d P h o t o p h y s i c s ) o r w i t h a r a p i d s c a n n i n g s t o p p e d - fl o w s p e c t r o p h o t o m e t e r O l i s R S M s y s t e m ( O l i s ) . T h e s t o p p e d - fl o w m e a s u r e m e n t a l l o w s a l i m i t e d t u r n o v e r n u m b e r a n d w a s m e a s u r e d b y u s i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f p r e - r e d u c e d h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c f o r t h e c a l c u l a t e d a m o u n t o f e l e c t r o n s . T h i s i s n o t p e r f o r m e d a t s a t u r a t i n g c o n d i t i o n s , n o r n e a r t h e V m a x , b u t i t a l l o w s f o r c o m p a r a b l e p r o t o n p u m p i n g m e a s u r e m e n t s t o b e m o n i t o r e d i n b o t h t h e i n s i d e a n d o u t s i d e o f t h e v e s i c l e s . A n e q u a l v o l u m e o f t h e t w o r e a c t a n t s o l u t i o n s , o n e c o n t a i n i n g r e d u c e d c y t o c h r o m e c ( i n o n e s y r i n g e ) , a n d t h e o t h e r c o n t a i n i n g a p H - s e n s i t i v e d y e a n d C O V s ( i n t h e o t h e r s y r i n g e ) w e r e r a p i d l y m i x e d ( 5 2 m s e c ) . T h e r e f o r e t h e c o n c e n t r a t i o n i n t h e o b s e r v a t i o n c e l l a f t e r m i x i n g i s h a l f o f t h a t i n t h e s y r i n g e s . A f t e r m i x i n g t w o s a m p l e s , i n e i t h e r t h e a b s e n c e o r t h e p r e s e n c e o f i o n o p h o r e s ( v a l i n o m y c i n a l o n e o r v a l i n o m y c i n p l u s F C C P ) w h i c h a r e p r e - e q u i l i b r a t e d w i t h C O V s i n t h e s y r i n g e , d a t a w e r e c o l l e c t e d a n d t h e r a t e s w e r e fi t t o t h e o x i d a t i o n o f c y t o c h r o m e c a t 5 5 0 n m , u s i n g s i n g l e e x p o n e n t i a l fi t t i n g t o t h e k i n e t i c t r a c e s w i t h M i c r o c a l O r i g n P r o s o f t w a r e . T h e c o n c e n t r a t i o n o f v a l i n o m y c i n m u s t b e h i g h e n o u g h t o m a k e t h e K + t r a n s p o r t b y v a l i n o m y c i n n o t r a t e l i m i t i n g , b u t e x c e s s i v e v a l i n o m y c i n c o n c e n t r a t i o n s , w h i c h m e d i a t e H I t r a n s p o r t , m u s t b e a v o i d e d . A s u i t a b l e v a l i n o m y c i n c o n c e n t r a t i o n h a s t o b e d e t e r m i n e d . T h e e n z y m e t u r n o v e r w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e e q u a t i o n b e l o w , b a s e d o n k o b s f r o m t h e k i n e t i c a n a l y s i s : T u r n o v e r ( a c t i v i t y , e ‘ / s e c / a a 3 ) = k o b s x [ r e d u c e d c y t o c h r o m e c ] / [ C c 0 ] 1 0 8 I n s i d e p H c h a n g e s , w h i c h a r e p r o b e d b y p y r a n i n e d y e , w e r e m e a s u r e d e i t h e r i n t h e fl u o r e s c e n c e m o d e ( P h o t o p h y s i c s ) o r t h e a b s o r b a n c e m o d e ( O l i s ) d e p e n d i n g o n t h e t y p e o f m e a s u r e m e n t . I n t h e fl u o r e s c e n c e m o d e , t h e e m i t t e d l i g h t i s u s u a l l y d e t e c t e d b y a p h o t o m u l t i p l i e r a f t e r i t h a s p a s s e d t h r o u g h a s u i t a b l e o p t i c a l fi l t e r . T h e c u t - o f f fi l t e r ( 4 9 0 n m ) w a s u s e d t o s e p a r a t e fl u o r e s c e n c e e m i s s i o n f r o m t h e e x c i t a t i o n l i g h t , w h i c h m a y b e s c a t t e r e d b y t h e s o l u t i o n a n d m a x i m i z e s t h e c o l l e c t i o n o f e m i s s i o n s i g n a l a t 5 1 0 n m w i t h a n e x c i t a t i o n A a t 4 6 5 n m a n d a 1 0 n m s l i t w i d t h . O t h e r w i s e , i n o r d e r t o r e s t r i c t t h e r a n g e o f t h e e m i s s i o n s i g n a l a n d t o r e j e c t a l l o t h e r u n w a n t e d r a d i a t i o n , a b a n d p a s s fi l t e r F B 5 0 0 - 4 0 ( C e n t r a l W a v e l e n g t h 5 0 0 n m , 4 0 n m b a n d p a s s r e g i o n s ) f r o m T h o r L a b s w a s a p p l i e d i n s t e a d o f a c u t - o f f fi l t e r . F o r t h e a b s o r b a n c e m e a s u r e m e n t o f p y r a n i n e , t h e i s o s b e s t i c p o i n t o f c y t o c h r o m e c , w h e r e a b s o r b a n c e d o e s n o t c h a n g e u p o n a r e d o x c h a n g e o f c y t o c h r o m e c w a s s e l e c t e d a t 4 3 5 n m , i n t h e a b s e n c e o f p h e n o l r e d . T h e i s o s b e s t i c p o i n t s w e r e m e a s u r e d b y a w a v e l e n g t h s c a n n i n g m e t h o d u s i n g t h e O l i s s t o p p e d fl o w i n s t r u m e n t . E x t e r n a l a c i d i fi c a t i o n o f t h e C O V s w a s m e a s u r e d b y u s i n g a p h e n o l r e d d y e . A b s o r b a n c e c h a n g e s a t 5 5 7 n m ( a n o t h e r i s o s b e s t i c p o i n t o f c y t o c h r o m e c ) w e r e m o n i t o r e d d u r i n g t h e c a t a l y t i c r e a c t i o n i n 5 0 1 1 M H E P E S - K O H p H 7 . 4 , 4 5 m M K C ] a n d W O W p h e n o l r e d p l a c e d o n t h e o u t s i d e . E v e n t h o u g h t h e s a m p l e c o n t a i n s p y r a n i n e a l r e a d y o n t h e i n s i d e o f t h e v e s i c l e s , t h e p h e n o l r e d s i g n a l i s n o t c o n t a m i n a t e d b y t h e p y r a n i n e b e c a u s e t h e i r a b s o r p t i o n r a n g e s d i f f e r . B o t h i n s i d e a n d o u t s i d e p H p r o b e s a n d c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n w e r e m e a s u r e d i n t h e a b s o r b a n c e m o d e b y r a p i d s c a n n i n g ( l m s ) f r o m 3 6 5 n m t o 5 9 5 n m ( G r o o v e D e n s i t y 4 0 0 , S p a n 2 3 0 n m , R e s o l u t i o n 1 n m ) . T h e s e s c a n s w e r e c o l l e c t e d b y t h e c o m p u t e r w h i c h 1 0 9 w a s l i n k e d t o t h e d e t e c t o r s y s t e m . T h e k i n e t i c t r a c e s f o r p h e n o l r e d a t 5 5 7 n m , p y r a n i n e a t 4 3 5 n m a n d c y t o c h r o m e c a t 5 5 0 n m w e r e e x t r a c t e d f r o m t h i s d a t a a f t e r a v e r a g i n g a t l e a s t t h r e e s e t s o f d a t a . T h e c y t o c h r o m e c c o n c e n t r a t i o n w a s c a l c u l a t e d u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t o f 1 7 , 0 0 0 M ' 1 c m ' 1 ( r e d u c e d - m i n u s - o x i d i z e d ) ( B r u n o r i e t a l . , 1 9 8 5 ) . U n l i k e t h e A p p l i e d p h t o p h y s i c s s t o p p e d - fl o w , w h i c h h a s o n l y a s i n g l e w a v e l e n g t h s e l e c t i o n d u r i n g t h e t u r n o v e r , t h e O l i s s t o p p e d - fl o w r a p i d s c a n n i n g i n s t r u m e n t a l l o w e d w a v e l e n g t h s c a n n i n g a c r o s s a w i d e r e g i o n ( 3 6 5 - 5 9 0 n m ) a n d 1 m s / s c a n . T h e r e f o r e , t h e c o m p l e t e s p e c t r u m o f t h e r e a c t i o n c a n b e m o n i t o r e d o v e r t i m e , a n d i s o s b e s t i c p o i n t s c a n b e c h o s e n t o m o n i t o r c h a n g e s i n t h e d i f f e r e n t p r o b e s , o r t h e c o m p l e t e s p e c t r u m c a n b e u s e d f o r S V D ( S i n g u l a r V a l u e D e c o m p o s i t i o n ) o r g l o b a l a n a l y s i s m e t h o d s . T h e r e l a t i o n s h i p o f A p H t o t h e a b s o r b a n c e c h a n g e s i n t h e d y e s w e r e e s t i m a t e d a s d e s c r i b e d i n r e s u l t s . M e m b r a n e P o t e n t i a l M e a s u r e m e n t i n C O V s P o s i t i v e l y c h a r g e d c y a n i n e d y e , D i S C 3 ( 5 ) ( 3 ’ , 3 ’ - d i p r o p y l t h i a d i c a r b o c y a n i n e i o d i d e ) i s a fl u o r o p h o r e t h a t r e s p o n d s t o a m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d i s u s e d t o m o n i t o r c h a n g e s i n t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l ( 1 3 ‘ ? ) o f C O V s ( S i m s e t a l . , 1 9 7 4 ; S i n g h e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e fl u o r e s c e n c e q u e n c h i n g o f t h e d y e r e s u l t s f r o m a p o t e n t i a l - d e p e n d e n t s t a c k i n g o f t h e d y e m o l e c u l e s i n t h e p o l a r i z e d m e m b r a n e s o f t h e v e s i c l e s ( S i n g h a n d N i c h o l l s , 1 9 8 5 a ) . B i o - b e a d C O V s ( fi n a l 0 . 1 u M a a 3 c o n c e n t r a t i o n ) w i t h a n i n t e r n a l b u f f e r o f 2 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 + 3 8 . 9 m M K C ] + 5 2 m M s u c r o s e a r e d i l u t e d i n t o h i g h s a l t b u f f e r ( 5 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 + 2 5 m M K C ] + 2 0 m M s u c r o s e + 8 0 0 m M N a C l ) . T h e 1 1 0 m e m b r a n e p o t e n t i a l f o r m e d a c r o s s t h e v e s i c l e s w a s o b s e r v e d b y m e a s u r i n g fl u o r e s c e n c e q u e n c h i n g ( e x 6 2 5 n m , e m 6 8 0 n m ) w i t h a F l u o r o M a x - 2 ( H O R I B A J o b i n Y v o n I n c ) fl u o r o m e t e r . T h i s i l l u s t r a t e s t h e r e s p o n s e o f t h e d y e t o a m e m b r a n e p o t e n t i a l . U n d e r e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s , t h e l a r g e s t p o l a r i z a t i o n o f C O V ’ s t h a t o c c u r s d u r i n g t h e t u r n o v e r i s ~ 1 4 0 m V , i n t e r i o r n e g a t i v e . T o m e a s u r e t h e d e v e l o p m e n t o f t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l C O V s w e r e m i x e d w i t h D i S C 3 ( 5 ) a t 2 . 5 ] . L M fi n a l c o n c e n t r a t i o n , a n d e q u i l i b r a t e d f o r a b o u t 5 m i n u t e s b e f o r e m e a s u r e m e n t . A s t e a d y - s t a t e c o n d i t i o n i s p r e p a r e d w i t h t h e p r e s e n c e o f a s c o r b a t e ( 1 2 m M ) , T M P D ( 5 7 M ) a n d h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c ( 2 u M ) i n 5 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 , 2 4 m M K C ] . T h e f o r m a t i o n o f . . . . T M m e m b r a n e p o t e n t i a l d u r i n g s t e a d y - s t a t e t u r n o v e r 1 S m e a s u r e d W i t h a Q u a n t a M a s t e r L u m i n e s c e n c e i n s t r u m e n t b y P h o t o n T e c h n o l o g y I n t e r n a t i o n a l ( P I I ) a n d a F e l i x 3 2 a n a l y s i s s o f t w a r e m o d u l e . G e n e r a t i o n o f t u r n o v e r s b y a d d i t i o n o f a s c o r b a t e a n d T M P D w i t h C O V s , w h i c h w e r e m a d e b y t h e B i o - b e a d m e t h o d , c a u s e s t h e l a r g e d e c r e a s e i n fl u o r e s c e n c e s i g n a l . S t a c k i n g o f t h e p r o b e i n t h e v e s i c l e m e m b r a n e u n d e r t h e i n fl u e n c e o f t h e p o t e n t i a l g r a d i e n t m a y c a u s e s e l f q u e n c h i n g o f t h e d y e a n d d e c r e a s e t h e i n t e n s i t y o f t h e s i g n a l ( S i n g h a n d N i c h o l l s , 1 9 8 5 a ) . T h e n i g e r i c i n r e l e a s e s t h e p H g r a d i e n t . T h e n , t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l i s r e l e a s e d b y a d d i t i o n o f v a l i n o m y c i n , c a u s i n g t h e i n c r e a s e i n fl u o r e s c e n t s i g n a l ( F e t t e r e t a l . , 1 9 9 6 ) . D e p o l a r i z a t i o n o f t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l p r o d u c e s a n i n c r e a s e i n t h e fl u o r e s c e n c e s i g n a l b y r e d u c i n g d y e a c c u m u l a t i o n i n t h e m e m b r a n e . 1 1 1 2 . 2 . 3 . R e c o n s t i t u t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e T h e s o y b e a n p o l a r l i p i d e x t r a c t , a s o l e c t i n , u s e d i n C c O r e c o n s t i t u t i o n , w a s o b t a i n e d f r o m A v a n t i P o l a r L i p i d , I n c . ( C a t N o 5 4 1 6 0 2 ) . I t i s c o m p o s e d o f p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( 2 2 . 1 % ) , p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( 1 8 . 4 % ) , p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( 4 5 . 7 % ) , p h o s p h a t i d i c a c i d ( 6 . 9 % ) , a n d o t h e r c o m p o n e n t s ( 6 . 9 % ) . P o l a r l i p i d e x t r a c t i s t h e t o t a l l i p i d e x t r a c t w h i c h i s p r e c i p i t a t e d w i t h a c e t o n e a n d t h e n e x t r a c t e d w i t h d i e t h y l e t h e r b y A v a n t i P o l a r L i p i d s , I n c . A n a g r a d e s o d i u m c h o l i c a c i d w a s o b t a i n e d f r o m A n a t r a c e . A l l g l a s s w a r e w a s r i n s e d w i t h e t h a n o l a n d M i l l i Q w a t e r b e f o r e u s e . C h o l a t e - D i a l y s i s C O V s V a r i o u s m e t h o d s o f r e c o n s t i t u t i o n o f C c O i n t o C O V s h a v e b e e n t r i e d , t o o b t a i n a g o o d s i g n a l - t o - n o i s e r a t i o a n d a g o o d m e a s u r e m e n t o f r e s p i r a t o r y c o n t r o l . T w o t y p e s o f C O V s w e r e m a i n l y p r e p a r e d ; e i t h e r b y u s i n g t h e c h o l a t e - d i a l y s i s m e t h o d , o r b y t h e B i o - b e a d m e t h o d i n o r d e r t o r e m o v e d e t e r g e n t . C h o l a t e , a d e t e r g e n t , i s a d d e d t o t h e e n z y m e t o d i s p l a c e t h e d o d e c y l m a l t o s i d e d e t e r g e n t f r o m t h e e n z y m e . C h o l a t e d e t e r g e n t i s s u b s e q u e n t l y e a s i l y e l i m i n a t e d b y d i a l y s i s d u e t o i t s l a r g e C M C , c r i t i c a l m i c e l l e c o n c e n t r a t i o n , o f 1 4 m M . A s t h e d e t e r g e n t c o n c e n t r a t i o n i s g r a d u a l l y d e c r e a s e d , i n t h e p r e s e n c e o f l i p i d a u n i l a m e l l a r v e s i c u l a r s t r u c t u r e i s f o r m e d . I n a t y p i c a l p r o t o c o l , t h e l i p i d , a s o l e c t i n , w a s s u s p e n d e d t o 4 0 m g / m l a n d s o n i c a t e d a t 0 ° C u n d e r a r g o n g a s u s i n g a m i c r o t i p s o n i c a t o r ( H e a t s y s t e m s - U l t r a s o n i c s 1 1 2 s o n i c a t o r M o d e ] W - 2 2 5 ) w i t h 2 % c h o l a t e i n 7 5 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 w i t h 1 4 m M K C ] u n t i l t h e s o l u t i o n r e a c h e d c l a r i t y . T h e s o n i c a t e d s u s p e n s i o n w a s c e n t r i f u g e d f o r 1 5 m i n a t 1 2 , 0 0 0 x g t o r e m o v e t i t a n i u m p a r t i c l e s . O n t h e o t h e r h a n d , C c O w a s p r e p a r e d a t 4 I L M fi n a l c o n c e n t r a t i o n a t p H 7 . 4 w i t h 4 % c h o l a t e i n t h e s a m e b u f f e r c o n d i t i o n ( 7 5 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 + 1 4 m M K C l ) , s e p a r a t e l y . T h e C c O s o l u t i o n w a s m i x e d ( 1 : 1 v / v ) w i t h t h e s o n i c a t e d a s o l e c t i n s u s p e n s i o n t o o b t a i n a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 2 | J . M o x i d a s e a n d 2 0 m g / m l l i p i d s w i t h 3 % fi n a l c h o l a t e c o n c e n t r a t i o n . ( H i s e r e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e c h o l a t e w a s r e m o v e d u s i n g fi v e s t e p s o f d i a l y s i s w i t h r a p i d s t i r r i n g a t 4 ° C i n S p e c t r a p o r d i a l y s i s t u b i n g ( # 2 5 2 2 5 / 2 0 4 , 1 2 - 1 4 , 0 0 0 M r c u t - o f f ) t o r e m o v e d e t e r g e n t a n d f o r m t h e C O V s . F o r e x a m p l e , 7 5 m M H E P E S - K O H b u f f e r e d C O V s w e r e m a d e b y f o l l o w i n g a b u f f e r e x c h a n g e p r o c e d u r e w h i c h w a s : 1 ) 6 h i n a 1 0 0 v o l u m e o f 7 5 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 , 1 4 m M K C ] w i t h , a n d t h e n 2 ) w i t h o u t 0 . 1 % c h o l a t e r e s p e c t i v e l y ; 3 ) 1 2 b i n 1 0 0 v o l u m e s o f 5 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 , 2 5 m M K C ] , 1 5 m M s u c r o s e ; 4 ) + 5 ) a 1 2 h d i a l y s i s t w o t i m e s i n a 5 0 0 v o l u m e o f S O u M H E P E S - K O H p H 7 . 4 , 4 5 m M K C ] , a n d 4 4 m M s u c r o s e a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( H o s l e r e t a l . , 1 9 9 2 ) . B e c a u s e o f t h e l o w e r e d b u f f e r i n g c o n d i t i o n o n t h e o u t s i d e o f t h e f o r m e d C O V s , s u c r o s e w a s a d d e d t o m a i n t a i n a f a i r l y c o n s t a n t o s m o t i c c o n d i t i o n . T h e s t e a d y s t a t e a c t i v i t i e s o f a s e t o f r e c o n s t i t u t e d C O V s , w i t h d i f f e r e n t i n t e r n a l b u f f e r i n g , w e r e m e a s u r e d p o l a r o g r a p h i c a l l y b y t h e G i l s o n o x y g r a p h u s i n g a C l a r k - t y p e e l e c t r o d e , i n o r d e r t o v e r i f y t h e s u c c e s s o f t h e C O V r e c o n s t i t u t i o n . A f t e r c h o l a t e d i a l y s i s , t h e v e s i c l e s w e r e s h o w n t o h a v e C c O i n t h e p r e d o m i n a n t l y m i t o c h o n d r i a ] c o n fi g u r a t i o n ( N i c h o l l s e t a l . , 1 9 8 0 ) w i t h t h e t h e c y t o c h r o m e c b i n d i n g s i t e o n t h e o u t s i d e a n d t o h a v e a h i g h r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o . 1 1 3 ‘ T T h e r e c o n s t i t u t i o n o f C c O i n t o p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s ( B r u n o r i e t a l . , 1 9 8 5 ) , w i t h v a r i o u s i n t e r i o r c o n c e n t r a t i o n s o f H E P E S - K O H b u f f e r w a s p e r f o r m e d u s i n g t h e c h o l a t e d i a l y s i s m e t h o d ( H i n k l e e t a l . , 1 9 7 2 ) t o d e t e r m i n e t h e b e s t o p t i m i z e d b u f f e r c o n d i t i o n s f o r C c O a c t i v i t y . I n t e r n a l b u f f e r c o n c e n t r a t i o n s w e r e v a r i e d b e t w e e n 5 m M t o 7 5 m M H E P E S - K O H , w h i l e t h e fi n a l e x t e r n a l b u f f e r w a s k e p t t o a m i n i m u m a t 5 0 p M H E P E S - K O H a t p H 7 . 4 i n o r d e r t o o b s e r v e t h e e x t e r n a l p H c h a n g e s o n t h e o u t s i d e o f t h e C O V S . B i o - B e a d C O V s p u r i fi e d b y N i 2 * - N T A c o l u m n A m e t h o d u s i n g B i o - B e a d s S M - 2 ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s ) , w h i c h a r e n e u t r a l , p o r o u s s t y r e n e d i v i n y l b e n z e n e b e a d s t o r e m o v e d e t e r g e n t , h a s b e e n i n t r o d u c e d a s a n a l t e r n a t i v e w a y t o f o r m l a r g e r u n i l a m e l l a r v e s i c l e s f o r p r o t o n p u m p i n g m e a s u r e m e n t s , r a t h e r t h a n u s i n g t h e d i a l y s i s - c h o l a t e m e t h o d w h i c h r e s u l t s i n r e l a t i v e l y s m a l l C O V s . T h e i n s i d e p H w a s a d j u s t e d t o 2 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 b u f f e r a s a fi n a l c o n c e n t r a t i o n , b a s e d o n t h e p r e l i m i n a r y o x y g e n c o n s u m p t i o n a c t i v i t y m e a s u r e m e n t i n t h e o x y g r a p h , i n t h e s t e a d y - s t a t e c o n d i t i o n , w i t h t h e d i a l y s i s - c h o l a t e C O V s . L i p i d m i x t u r e ( 2 m L ) w a s p r e p a r e d i n 2 0 m M H e p e s - K O H p H 7 . 4 , 3 8 . 9 m M K C ] , 5 2 m M s u c r o s e , l m M E D T A a n d 3 % c h o l a t e ( w / v ) w i t h 8 0 m g / m l a s o l e c t i n . T h e m i x t u r e w a s s o n i c a t e d f o r 3 0 s e c m o r e t h a n 3 t i m e s w i t h i n t e r n a l p H p r o b e p y r a n i n e ( 2 0 m M ) a n d c e n t r i f u g e d f o r 1 5 m i n a t 1 2 , 0 0 0 x g t o r e m o v e t i t a n i u m p a r t i c l e s . F P L C p u r i fi e d C c O ( 4 u M ) w h i c h c o n t a i n i n g n o c h o l a t e w a s d i l u t e d i n t h e s u p e r n a t a n t o f s o n i c a t e d l i p i d s , w h i c h i s p r e p a r e d i n p r e v i o u s s t e p , a t 4 ° C i n g l a s s s t i r r i n g b e a k e r ( 2 0 m L ) f o r 2 - 3 m i n . 1 1 4 C h o l a t e d e t e r g e n t w a s e f fi c i e n t l y r e m o v e d w i t h B i o - b e a d s S M - 2 b y c o n t i n u o u s a d d i t i o n f o r 7 h o u r s ( J a s a i t i s e t a l . , 1 9 9 9 ) i n a s t r r i n g b e a k e r ( T a b l e 2 . 1 ) . T h e l i p o s o m e s a n d t h e B i o - b e a d s w e r e s e p a r a t e d b y g e n t l e c e n t r i f u g e ( ~ 1 0 0 x g ) w i t h a fi l t e r c o l u m n m a d e o f a n i n e r t s t a b l e p o l y m e r , p o l y p r o p y l e n e ( F i s h e r S c i e n t i fi c # 1 1 - 3 8 7 - 5 0 ) i n s i d e a C o r n i n g t u b e ( l S m L ) . U n t r a p p e d f r e e p y r a n i n e a n d r e m a i n i n g c h o l a t e w e r e r e m o v e d f r o m s a m p l e s ( ~ 3 m L ) u s i n g a s i z e e x c l u s i o n s e p h a d e x G - 2 5 g e l - fi l t r a t i o n u s i n g a 2 c m i n t e r n a l d i a m e t e r , 4 5 c m l e n g t h c o l u m n w h i c h i s e q u i l i b r a t e d w i t h t h e s a m e b u f f e r a s i n s i d e ( 2 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 , 3 8 . 9 m M K C ] , 5 2 m M s u c r o s e , n o E D T A ) . T h e f o r m a t i o n o f C O V s w a s f o l l o w e d b y a N i z I - N T A b i n d i n g s t e p f o r f u r t h e r p u r i fi c a t i o n a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d b y H i s e r e t a l . ( H i s e r e t a l . , 2 0 0 1 ) . A l l o f t h e e x c l u d e d , g r e e n fl u o r e s c e n t C O V f r a c t i o n s ( F i g u r e 2 . 3 ) f r o m t h e s e p h a d e x G - 2 5 c o l u m n fi l t r a t i o n w e r e p o o l e d ( 1 0 - 1 2 m L v o l u m e ) a n d c a r e f u l l y a d j u s t e d t o p H 8 . 0 w i t h K O H a n d a fi n a l 2 0 0 m M K C ] c o n c e n t r a t i o n b e f o r e a d d i t i o n t o t h e N i Z I - N T A a g a r o s e i n o r d e r t o m a x i m i z e t h e s p e c i fi c b i n d i n g . A d d i t i o n a l l y , N i Z I - N T A r e s i n a l s o w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n d h i g h s a l t b u f f e r ( 2 0 0 m M K C l ) b e f o r e u s e t o i n c r e a s e t h e o x i d a s e b i n d i n g o n t o t h e N i h - N T A . A h i g h c o n c e n t r a t i o n o f s a l t s i n t h e b u f f e r s w a s n e c e s s a r y f o r t h e m e t a l a f fi n i t y c o l u m n t o b i n d t h e h i s t i d i n e - t a g g e d C c O , d u e t o a p p a r e n t l a c k o f a c c e s s i b i l i t y o f t h e h i s - t a g a t t h e l o w e r s a l t c o n c e n t r a t i o n . I n c r e a s i n g t h e s a l t c o n c e n t r a t i o n p r o v i d e d b e t t e r s c r e e n i n g o f t h e c h a r g e s , k e e p i n g t h e h i s - t a g a v a i l a b l e f o r t h e i n t e r a c t i o n w i t h t h e n i c k e l o n t h e r e s i n r a t h e r t h a n b i n d i n g t o t h e n e g a t i v e l y c h a r g e d c a r b o x y l a t e s o n s u b u n i t I I . T h e s a m p l e s a n d t h e p r e p a r e d N i - N T A r e s i n w e r e s t i r r e d f o r 2 0 m i n u t e s a t 4 ° C . C c O 1 1 5 w a s a r t i fi c i a l l y e n g i n e e r e d t o c r e a t e a h i s - t a g o n s u b u n i t H t o b e o u t w a r d - f a c i n g s o t h a t t h e C O V s w o u l d h a v e a h i s - t a g a c c e s s i b l e o n t h e o u t s i d e . T h i s h i s - t a g i s a b l e t o b i n d t o a N i - N T A a g a r o s e c o l u m n t o a l l o w t h e C O V S , w i t h t h e C c O c o r r e c t l y o r i e n t e d , t o h a v e t h e h i s - t a g o n t h e o u t s i d e , i n o r d e r t o s e p a r a t e t h e C O V s w i t h o x i d a s e p r e s e n t . A s a m p l e w a s l o a d e d o n t o t h e g r a v i t y c o l u m n w a s h e d w i t h t w o c o l u m n v o l u m e s o f h i g h s a l t b u f f e r ( 2 0 m M H E P E S - K O H p H 8 . 0 , 2 0 0 m M K C ] , w i t h n o i m i d a z o l e ) a n d e l u t e d w i t h h i s t i d i n e b u f f e r ( 8 0 m M h i s t i d i n e , 3 8 m M s u c r o s e , 2 0 m M H e p e s - K O H a t p H 7 . 4 w i t h n o i m i d a z o l e ) . R e s i n b o u n d C O V f r a c t i o n s , w h i c h c o n t a i n c o r r e c t l y o r i e n t e d o x i d a s e , w e r e s e p a r a t e d f r o m t h e fl o w - t h r o u g h p a r t , w h i c h i s n o t t i g h t l y b o u n d t o t h e r e s i n a n d i n c l u d e s t h e v e s i c l e s v o i d o f o x i d a s e . T h e e l u t e d C O V s ( ~ 1 5 m L ) w e r e t h e n c o n c e n t r a t e d t o 2 m L fi n a l v o l u m e i n a fi l t r a t i o n s y s t e m w i t h a C e n t r i c o n 1 0 0 ( A m i c o n Y M 1 0 0 ) m e m b r a n e u n d e r g e n t l e p r e s s u r e w i t h s t i r r i n g a n d d i a l y z e d a g a i n s t 1 0 0 0 m L b u f f e r ( 5 0 I i M H e p e s - K O H p H 7 . 4 w i t h 4 5 m M K C ] a n d 4 4 m M s u c r o s e ) f o r 1 2 h o u r s t o e x c h a n g e t h e o u t s i d e b u f f e r . A l l fl o w t h r o u g h p a r t ( 4 5 - 5 0 m L ) a l s o w a s c o l l e c t e d a n d f o l l o w e d t h e s a m e s t e p o f c o n c e n t r a t i o n a n d d i a l y s i s . T h e fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f o x i d a s e i n t h e v e s i c l e s w a s e s t i m a t e d b y m e a s u r i n g t h e V m a x i n t h e s t e a d y - s t a t e c o n d i t i o n w i t h u n c o u p l i n g a g e n t s ( v a l i n o m y c i n a n d F C C P ) , a n d t h e t o t a l v o l u m e o f s a m p l e p r e p a r e d . S o m e v o l u m e ( 1 0 0 m ) o f t h e s a m p l e w a s r e s e r v e d f o r f u r t h e r u s e i n t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M ) . T h e r e c o v e r e d y i e l d o f r e c o n s t i t u t e d C O V s w a s a b o u t 2 5 % f r o m t h e N i - N T A p u r i fi e d B i o - b e a d C O V p r e p a r a t i o n . 1 1 6 P r o t o c o l f o r D e t e r g e n t R e m o v a l T i m e ( m i n ) A n g g z g z l g ' g g z fi f d s T e m p . 0 3 3 . 2 4 ° C 3 0 3 3 . 2 4 ° C 6 0 3 3 . 2 4 ° C 9 0 3 3 . 2 4 ° C 1 2 0 6 6 . 5 4 ° C 1 8 0 6 6 . 5 4 ° C 2 4 0 1 3 3 R T 2 7 0 1 3 3 R T 2 6 6 3 0 0 a d d 1 m L o f R T 2 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 3 6 0 2 6 6 R T 4 2 0 R e a d y R T T a b l e 2 . 1 T h e p r o t o c o l f o r d e t e r g e n t r e m o v a l b y B i o - b e a d s . B i o - b e a d s a r e g r a d u a l l y a d d e d o v e r t i m e i n 3 0 m i n u t e i n t e r v a l s a t 4 ° C f o r u p t o 2 h r s a n d t h e n a t R T a c c o r d i n g t o t h e t a b l e , i n t o a 2 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 + 3 8 . 9 K C ] + 5 2 m M s u c r o s e b u f f e r w i t h s t i r r i n g i n a b e a k e r ( 2 m l o f s o n i c a t e d v e s i c l e s w i t h 4 I J . M M 3 ) a t r o o m t e m p e r a t u r e ( R T ) . 1 1 7 F i g u r e 2 . 3 A n e w m e t h o d f o r r e c o n s t i t u t i o n o f C 0 0 i n t o v e s i c l e s C c O w a s r e c o n s t i t u t e d i n t o l i p i d v e s i c l e s u s i n g t h e B i o - b e a d m e t h o d w i t h p y r a n i n e i n s i d e ( b r i g h t y e l l o w ) a n d a n e x t e r n a l h i s - t a g o n s u b u n i t H . L i p i d S o n i c a t i o n m i x t u r e ( A ) w a s p r e p a r e d i n 8 0 m g / m l A s o l e c t i n , 3 % c h o l a t e ( w / v ) , 2 0 m M H e p e s - K O H p H 7 . 4 , 3 8 . 0 9 m M K C ] , 5 2 m M s u c r o s e , 1 m M E D T A , 2 0 m M p y r a n i n e ( 0 . 0 1 g / 1 m l ) . S u p e r n a t a n t ( B ) v o i d o f m e t a l p r e c i p i t a n t w a s s e t a p a r t f o r m i x i n g w i t h C c O ( C ) . 4 u M o f F P L C p u r i fi e d C c O ( C ) ( n o c h o l a t e , w / L M ) w a s p r e i n c u b a t e d f o r 2 - 3 m i n a t 4 ° C a n d m i x e d w i t h ( B ) i n a g l a s s b e a k e r ( 2 0 m L ) w i t h 1 c m s t i r r i n g b a r . C o n t i n u o u s a d d i t i o n ( T a b l e 2 . 1 ) o f B i o b e a d s f o l l o w e d b y c e n t r i f u g a l fi l t e r i n g s t e p r e s u l t s i n ( D ) , 3 m L C O V s . F i l t e r c o l u m n u s e d f o r B i o - b e a d s s e p a r a t i o n u s i n g g e n t l e c e n t r i f u g e ( ~ 1 0 0 x g ) i n s i d e a 1 5 m L C o r n i n g p l a s t i c t u b e . U n t r a p p e d f r e e p y r a n i n e o n t h e o u t s i d e o f C O V s a n d t r a c e o f c h o l a t e r e m a i n d e r w e r e r e m o v e d b y S e p h a d e x G - 2 5 g e l fi l t r a t i o n ( 4 5 c m l e n g t h a n d 2 0 m i n t e r n a l d i a m e t e r s i z e d c o l u m n ) c o l u m n w h i c h i s e q u i l i b r a t e d w i t h t h e s a m e b u f f e r a s i n s i d e o f v e s i c l e s ; 2 0 m M H o p e s - K O H p H 7 . 4 , 3 8 . 9 m M K C ] , 5 2 m M S u c r o s e , n o c h o l a t e . A l l e x c l u d e d C O V s ( E , 1 0 - 1 2 m L ) w h i c h h a v e fl u o r e s c e n t c o l o r a n d p l a c e d l o w e r b a n d o f c o l u m n w e r e c o l l e c t e d . F u r t h e r p u r i fi c a t i o n o f t h e C O V s w a s a c h i e v e d u s i n g a N i - N T A r e s i n , w h i c h b o u n d t o t h e h i s - t a g o n t h e C O V s u n d e r h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n s . S a m p l e w a s a d j u s t e d t o fi n a l p H 8 . 0 w i t h 2 0 0 m M K C ] c o n c e n t r a t i o n a t t h i s s t e p b e f o r e b i n d i n g w i t h N i - N T A r e s i n s . N i - N T A r e s i n s w e r e p r e — w a s h e d w i t h t w o c o l u m n v o l u m e o f w a t e r a n d h i g h s a l t b u f f e r ( 2 0 m M H e p e s - K O H , 2 0 0 m M K C L a t p H 8 . 0 ) , r e s p e c t i v e l y . P r e p a r e d C O V s f r o m p r e v i o u s s t e p s a n d p r e w a s h e d N i - N T A w e r e m i x e d t o g e t h e r f o r 2 0 m i n . T h e fi r s t fl o w - t h r o u g h ( F , 1 0 - 1 5 m L ) a n d t h e s e c o n d fl o w - t h r o u g h ( G , 4 5 - 5 0 m L , t w o c o l u m n v o l u m e w a s h i n g w i t h 2 0 m M H e p e s - K O H p H 8 . 0 , 2 0 0 m L K C ] w i t h o u t i m i d a z o l e ) w a s c o m b i n d e d , c o n c e n t r a t e d , w a s h e d a s w i t h p u r i fi e d C O V s ( H , 1 5 - 2 0 m L , e l u t i o n w i t h 8 0 m M H i s t i d i n e , 3 8 m M s u c r o s e , 2 0 m M H e p e s - K O H a t p H 7 . 4 ) . A l l e l u t i o n s ( F + G & H ) w e r e s e p a r a t e l y c o n c e n t r a t e d w i t h C e n t r i c o n 1 0 0 ( a m i c o n Y M 1 0 0 m e m b r a n e ) u n d e r g e n t l e p r e s s u r e o f N 2 ( 5 p s i ) , w a s h e d ( x 1 0 v o l . o f b u f f e r ; 2 0 m M H e p e s - K O H p H 7 . 4 , 3 8 . 9 m M K C ] , 5 2 m M S u c r o s e ) a n d r e - c o n c e n t r a t e d t o r e a c h fi n a l v o l u m e ( I , ~ l . 8 - 2 . 0 m L ) . T h e e x t e r n a l b u f f e r w a s r e p l a c e d u s i n g d i a l y s i s f o r 1 2 h o u r s i n t o S O I L M H e p e s - K O H p H 7 . 4 ( 1 : 5 0 0 v / v ) , 4 5 m M K C ] , 4 4 m M S u c r o s e . F i n a l l y , C O V s s a m p l e s ( J ) w e r e p r e p a r e d f o r s t o p p e d - fl o w m e a s u r e m e n t . 1 1 8 ( A ) L i p i d S o n i c a t i o n m i x t u r e ( t o t a l 2 m L ) 8 0 m g / m l A s o l e c t i n ( B ) 3 % c h o l a t e ( w / v ) 2 0 m M H e p e s - K O H p H 7 . 4 L i p o s o m e 3 8 . 9 m M K C I 5 2 m M s u c r o s e 1 m M E D T A 2 0 m M P y r a n i n e ( 0 . 0 1 g / 1 m l ) S o n i c a t i o n f o r 3 0 $ e c o n / 3 0 s e c o f f m o r e t h a n 3 t i m e s C e n t r i f u g a t i o n ( C ) R e m o v e m e t a l ( 1 2 K , 1 5 m i n ) H i s - t a g g e d C c O \ a _ . ( C ) A d d 0 0 0 ( 4 u M , F P L C p u r i fi e d , n o c h o l a t e , w / L M ) \ m i x f o r 2 - 3 m i n a t 4 ° C i n g l a s s b e a k e r ( 2 0 m L ) w / 1 c m s t i r r i n g b a r B i o b e a d a d d i t i o n s t e p s 7 h o u r s c o n t i n u o u s a d d i t i o n o f B i o - b e a d s S M - 2 ( B i o - r a d ) A m o u n t o f B i o - b e a d s a d d e d B i o - b e a d s 3 3 . 2 3 3 . 2 C O V s 2 6 6 1 m L o f 2 0 m M E S - K O H . 4 r ‘ 2 6 6 U l , F i l t e r i n g S e p a r a t i o n o f B i o b e a d s b y fi l t e r c o l u m n b y g e n t l e c e n t r i f u g e ( ~ 1 0 0 x g ) i n s i d e a 1 5 m L C o r n i n g p l a s t i c t u b e 1 1 9 ' M ' A “ ‘ I ; “ l l i r G “ 1 . ( F i g u r e 2 . 3 c o n t i n u e d ) I ( D ) ~ 3 m L C O V s ) I , S e p h a d e x G - 2 5 2 c m i n t e r n a l d i a m e t e r , 4 5 c m l e n g t h E q . 2 0 m M H e p e s - K O H p H 7 . 4 , 3 8 . 9 m M K C l . 5 2 m M s u c r o s e W ) 1 0 4 2 m l e x c l u d e d C O V s C o l l e c t i o n o f l o w e r b a n d o f f l u o r e s c e n t c o l o r A d j u s t p H t o 8 . 0 & 2 0 0 m M K C I A d d N i - N T A r e s i n ( p r e w a s h e d ) u n e n t r a p p e d F r e e p y r a n i n e p y r a n i n e P r e - w a s h i n g o f r e s i n s w / t w o c o l u m n V o | . o f w a t e r w / t w o c o l u m n V o l . o f h i g h s a l t b u f f e r ( 2 0 m M H o p e s - K O H p H 8 . 0 . 2 0 0 m M K C I ) M i x 2 0 m i n a t 4 ° C ( i n 2 0 m L g l a s s b e a k e r w i t h s t i r r i n g ) ' P o u r i n t o c o l u m n a W 1 0 - 1 5 m L 1 s ' f l o w — t h r o u g L I \ I H i g h s a l t w a s h C o m b i n e d , c o n c e n t r a t e d , 2 0 m M H e p e s _ K O H p H 8 . o w a s h e d a s w i t h p u r i f i e d 2 0 0 m M K C I , w i t h o u t i m i d a z o l e C O V S R e ) ~ 4 5 - 5 0 m L 2 n d f l o w - t h r o u g h I E l u t i o n F l o w - t h r o u g h P u r i f i e d 8 0 m M H i s t i d i n e , 3 8 m M S u c r o s e . 2 0 m M H e p e s - K O H p H 7 . 4 ( F ) & ( G ) ( H ) W ) 1 5 - 2 0 m L P u r i fi e d C O V s I C o n c e n t r a t i o n | ( I ) 2 m L p u r i fi e d c o v i I I . F i n a l D i a l y s i s 5 0 p M H e p e s - K O H p H 7 . 4 , 4 5 m M K C l , 4 4 m M S u c r o s e f o r 1 2 h . C e n t r i c o n 1 0 0 I ? ) 2 . 0 - 2 . 1 m L c o v i l F i l t r a t i o n s y s t e m 1 2 0 2 . 2 . 4 . M e a s u r e m e n t o f C O V S i z e b y E l e c t r o n M i c r o s c o p y I n o r d e r t o e s t i m a t e t h e s i z e o f C O V s m a d e b y d i f f e r e n t m e t h o d s , t h e i r s i z e w a s m e a s u r e d d i r e c t l y b y t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M ) a t M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n t h e C e n t e r f o r A d v a n c e d M i c r o s c o p y f a c i l i t y . C O V s w e r e d i l u t e d 2 0 0 ~ 2 0 0 0 f o l d t o g e t w e l l s e p a r a t e d s a m p l e s o f t h e v e s i c l e p o p u l a t i o n f o r c o u n t i n g . I n ® o r d e r t o fi x C O V s o n t o a f r e s h p o l y v i n y l f o r m a l p o l y m e r , F o r r n v a r - c a r b o n c o a t e d g r i d s u p p o r t fi l m , o n e v o l u m e o f 2 % o s m i u m t e t r o x i d e ( 0 8 0 4 ) w a s u s e d i n 0 . 1 M c a c o d y l a t e b u f f e r ( p H 7 . 4 ) a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e p u r p o s e o f fi x a t i o n i s t o p r e s e r v e s t r u c t u r e w i t h m i n i m a l a l t e r a t i o n d u r i n g s t a i n i n g a n d v i e w i n g i n t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e . O s m i u m t e t r o x i d e a c t s a s a fi x a t i v e a s w e l l a s a n e l e c t r o n d e n s e s t a i n . I n t h e r e d u c e d s t a t e , t h i s fi x a t i v e r e n d e r s t h e s a m p l e b l a c k , p e r m i t t i n g i t t o b e m o r e e a s i l y s e e n d u r i n g p r o c e s s i n g . T h e p H o f t h e fi x a t i v e n e e d s t o b e c l o s e t o t h e s a m p l e p H ( p H 7 . 4 ) t o b e e f f e c t i v e ; o t h e r w i s e , t h e s t r u c t u r e a n d b e h a v i o r o f t h e p r o t e i n s m a y b e a l t e r e d . T h e e x c e s s m i x t u r e w a s e a s i l y r e m o v e d w i t h a W h a t m a n fi l t e r p a p e r a n d d r i e d a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e p r e p a r e d s p e c i m e n w a s s t a i n e d w i t h 1 % u r a n y l a c e t a t e i n d i s t i l l e d w a t e r f o r a f e w s e c o n d s f o r n e g a t i v e s t a i n i n g . C O V s c o n t a i n e d p y r a n i n e o n t h e i n s i d e t o i n c r e a s e t h e c o n t r a s t f o r b e t t e r o b s e r v a t i o n o f t h e C O V S . P h o t o g r a p h i c i m a g e s o f a n a r b i t r a r y n u m b e r o f t h e C O V s w e r e s a v e d o n t h e c o m p u t e r f o r s i z e a n a l y s i s . 1 2 1 2 . 3 . R e s u l t s 2 . 3 . 1 . D y e C h a r a c t e r i z a t i o n T w o p H p r o b e s , p y r a n i n e ( 8 - h y d r o x y p y r e n e - 1 , 3 , 6 — t r i s u l f o n i c a c i d ) a n d p h e n o l r e d , w e r e u s e d t o m o n i t o r t h e p r o t o n m o v e m e n t o n t h e i n s i d e a n d o u t s i d e o f C O V s , r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e 2 . 4 ) . P r o t o n p u m p i n g ( o r p r o t o n r e l e a s e ) w a s m e a s u r e d b y u s i n g p h e n o l r e d o n t h e o u t s i d e , b e c a u s e i t i s w a t e r s o l u b l e , h a s a n a m e n a b l e i s o s b e s t i c p o i n t a n d s h o w s a b s o r b a n c e c h a n g e s i n t h e r e q u i r e d r a n g e , 3 4 4 - 7 5 0 n m . H o w e v e r , a v e r y l o w e x t e r n a l c o n c e n t r a t i o n o f b u f f e r w a s r e q u i r e d i n o r d e r t o m o n i t o r t h e s m a l l c h a n g e s i n p H . P h e n o l r e d c h a n g e s c o l o r f r o m y e l l o w t o r e d o v e r t h e p H r a n g e 6 . 6 t o 8 . 0 ; i t s p K a i s c l o s e t o n e u t r a l p H ( p K a ~ 7 . 5 , M o l e c u l a r P r o b e s ) . P y r a n i n e i s a w a t e r - s o l u b l e , m e m b r a n e i m p e r m e a b l e fl u o r e s c e n t d y e w i t h a h i g h q u a n t u m y i e l d , w h i c h i s m e a s u r e d b y e i t h e r fl u o r e s c e n c e o r a b s o r b a n c e . B e c a u s e o f i t s p o l y a n i o n i c c h a r a c t e r , p y r a n i n e d o e s n o t b i n d s i g n i fi c a n t l y t o p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s , h a v i n g a n e t a n i o n i c s u r f a c e c h a r g e . C O V s w e r e p r e p a r e d w i t h e n t r a p p e d p y r a n i n e , w h i c h d o e s n o t r e a d i l y l e a k o u t o f t h e v e s i c l e s . I t i s o b s e r v e d t h a t i o n i z a t i o n o f t h e 8 - h y d r o x y l g r o u p o f p y r a n i n e a t a l k a l i n e p H i s a s s o c i a t e d w i t h a p r o n o u n c e d r e d s h i f t i n t h e fl u o r e s c e n c e e x c i t a t i o n m a x i m u m , f r o m 4 0 0 ( p H 4 ) t o 4 5 0 n m ( p H 1 0 ) , w h i l e t h e 5 1 0 n m e m i s s i o n m a x i m u m r e m a i n e d e s s e n t i a l l y u n c h a n g e d . T h e r e f o r e , a t m a x i m u m e x c i t a t i o n ( 4 6 5 n m ) a t p H 7 . 4 , t h e a m p l i t u d e fl u o r e s c e n c e e m i s s i o n a t 5 1 0 n m r e fl e c t s t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e u n p r o t o n a t e d p y r a n i n e . 1 2 2 P h e n o l r e d P y r a n i n e 0 . 7 - — p H 7 . 0 0 . 6 - 0 . 5 - 0 . 4 - 0 . 3 . 0 . 2 - A b s o r b a n c e A b s o r b a n c e 0 . 1 a d o « i n s é o s s o « t o a g o n o a i o s s o a l i o s o o d o s i o d o d o s o o s m W a v e l e n g t h ( n m ) W a v e l e n g t h ( n m ) F i g u r e 2 . 4 S t r u c t u r e s a n d a b s o r p t i o n s p e c t r a o f p H p r o b e s , p h e n o l r e d a n d p y r a n i n e . A h y d r o p h i l i c p H - s e n s i t i v e fl u o r e s c e n t d y e , p y r a n i n e ( t r i s o d i u m 8 - h y d r o x y p y r e n e - l , 2 , 6 t r i s u l f o n a t e ) , w a s e n t r a p p e d i n s i d e c y t o c h r o m e c o x i d a s e v e s i c l e s ( C O V s ) t o m o n i t o r i n s i d e p H c h a n g e s a t 4 3 5 n m d u r i n g e n z y m e t u r n o v e r . A n o t h e r p H p r o b e , p h e n o l r e d ( p h e n o l s u l f o p h t h a l e i n ) , w a s p l a c e d o n t h e o u t s i d e o f t h e C O V s t o m o n i t o r p r o t o n p u m p i n g , m e a s u r e d a t 5 5 7 n m . T h e d o t t e d l i n e s i n d i c a t e t h e a b s o r p t i o n w a v e l e n g t h u s e d t o m o n i t o r t h e p r o t o n c h a n g e s o n t h e o u t s i d e ( l e f t ) a n d i n s i d e ( r i g h t ) , s e p a r a t e l y . 1 2 3 A n y t r a c e a m o u n t o f u n - e n t r a p p e d p y r a n i n e , w h i c h i s a s s o c i a t e d p o s s i b l y w i t h o u t e r s u r f a c e l i p i d h e a d g r o u p s , c o u l d b e e s t i m a t e d b y q u e n c h i n g w i t h t h e a d d i t i o n o f D P X [ p - X y l e n e - b i s ( N - p y r i d i n i u m b r o m i d e ) ] , a w a t e r s o l u b l e c o l l i s i o n a l q u e n c h e r o f p y r a n i n e fl u o r e s c e n c e w h i c h d o e s n o t c r o s s t h e m e m b r a n e . N o s i g n i fi c a n t q u e n c h i n g e f f e c t w a s o b s e r v e d b y a d d i t i o n o f D P X t o t h e p u r i fi e d B i o b e a d C O V s ( F i g u r e 2 . 5 ) s u g g e s t i n g t h e a b s e n c e o f r e m a i n i n g p y r a n i n e o n t h e s u r f a c e o f C O V s a f t e r t h e p u r i fi c a t i o n . T h i s a l l o w s p y r a n i n e t o b e u s e d a s a r e l i a b l e r e p o r t e r o f a q u e o u s p H c h a n g e s i n s i d e o f t h e v e s i c l e s w i t h o u t D P X . B o t h p y r a n i n e a n d p h e n o l r e d w e r e s e l e c t e d f o r t h e p H m e a s u r e m e n t s b e c a u s e o f t h e i r h i g h a b s o r p t i o n c o e f fi c i e n t s a n d b e c a u s e t h e p K a s o f b o t h p r o b e s a r e v e r y c l o s e t o t h e i n i t i a l p H c o n d i t i o n s , w h i c h w e r e s e l e c t e d i n o r d e r t o f o l l o w t h e p H c h a n g e s d u r i n g t u r n o v e r . T h e p K a s o f t h e d y e s a r e , 7 . 2 ( p y r a n i n e ) ( C l e m e n t a n d G o u l d , 1 9 8 1 ) a n d 7 . 5 ( p h e n o l r e d ) ( F a x e n e t a l . , 2 0 0 5 ) . I n o r d e r t o e l i m i n a t e t h e c o n t a m i n a t i o n o f a b s o r p t i o n s i g n a l s f r o m c y t o c h r o m e c ( t h e e l e c t r o n d o n o r t o C c O ) , a n i s o s b e s t i c p o i n t i s u s e d . T h i s m e a n s t h a t a t t h e i s o s b e s t i c p o i n t t h e r e a r e n o c h a n g e s i n a b s o r p t i o n o f t h a t s p e c t r a ] s p e c i e s d u r i n g r e d u c t i o n o f c y t o c h r o m e c . I n t h e a b s o r b a n c e m o d e , p y r a n i n e a n d p h e n o l r e d s i g n a l c h a n g e s w e r e o b s e r v e d a t 4 3 5 n m a n d 5 5 7 n m , r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e 2 . 6 ) . T h e i n c r e a s e i n p y r a n i n e a b s o r b a n c e a t 4 3 5 n m i n d i c a t e s a l k a l i n i z a t i o n d u e t o p r o t o n c o n s u m p t i o n o n t h e i n s i d e ( F i g u r e 2 . 6 , B ) . T h e a b s o r b a n c e c h a n g e w a s m e a s u r e d a t 5 5 7 n m i n d i c a t i n g o u t s i d e p H c h a n g e s w i t h p h e n o l r e d ( F i g u r e 2 . 6 , C ) . A b s o r b a n c e w a s d e c r e a s e d c o r r e s p o n d i n g t o t h e d e c r e a s e i n p H b y p u m p e d p r o t o n , w h e r e a s t h e a b s o r b a n c e w a s i n c r e a s e d a s p r o t o n s m o v e t o i n s i d e o f C O V s d u e t o t h e b a c k fl o w . T h e 1 2 4 c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n r a t e w a s c a l c u l a t e d f r o m a S V D ( s i n g u l a r v a l u e d e c o m p o s i t i o n ) f i t t i n g m e t h o d u s i n g t h e w h o l e s p e c t r u m , o r b a s e d o n a b s o r b a n c e m e a s u r e d a t 5 5 0 n m ( F i g u r e 2 . 6 , A ) i n t h e O L I S s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t ( F i g u r e 2 . 1 1 ) . 1 2 5 s e o o - A / D P X l l v ‘ l l ‘ A } A l l 1 ‘ l A N " V i \ / ‘ W U V U A U I N V ' 5 0 0 0 — A - W I m a v m w / l l i r w s w 3 4 5 0 0 — : . 3 o s o o n . 3 “ - 3 5 0 0 . B 3 0 0 0 - V i / l ' fi ‘ v w ’ l h ‘ x l w W M “ N W A r / \ + + I \ l ' ‘ N M V ’ V N N - H H — N l I l l l l _ C 2 c 2 _ o 2 0 4 0 s o s o 1 0 0 1 2 0 D P X t i m e ( s e e ) F i g u r e 2 . 5 M e a s u r e m e n t o f t h e r e s i d u a l p y r a n i n e o n t h e o u t s i d e s u r f a c e o f t h e C O V s . S t r u c t u r e s o f p y r a n i n e a n d D P X a r e s h o w n o n t h e l e f t . T h e fl u o r e s c e n c e e m i s s i o n ( e x 4 6 5 n m , e m 5 1 0 n m ) o f p y r a n i n e w a s q u e n c h e d a b o u t 1 0 % b y a d d i t i o n o f D P X i n t h e a q u e o u s b u f f e r ( 2 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 + 3 8 . 9 m M K C ] + 5 2 m M s u c r o s e ) ( A ) m e a s u r e d i n a F l u o r o M a x - 2 fl u o r o m e t e r i n s t r u m e n t . P y r a n i n e fl u o r e s c e n c e e m i s s i o n d i d n o t c h a n g e w i t h t h e a d d i t i o n o f D P X i n t h e p u r i fi e d C O V s ( B ) . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e r e i s n o s i g n i fi c a n t a m o u n t o f a n y r e s i d u a l e x t e r n a l p y r a n i n e o n t h e s u r f a c e o f t h e p u r i fi e d C O V s . 1 2 6 F i g u r e 2 . 6 T h e u s e o f p H p r o b e s a n d i s o s b e s t i c p o i n t s o f c y t o c h r o m e c . T h e l e f t p a n e l s h o w s : a b s o r p t i o n s p e c t r a o f r e d u c e d ( b l u e l i n e ) a n d o x i d i z e d ( b l a c k l i n e ) c y t o c h r o m e c ( t o p l e f t p a n e l ) w i t h p y r a n i n e a b s o r b a n c e s p e c t r a i n g r e e n ( t o p l e f t p a n e l ) . P h e n o l r e d s p e c t r a a r e s h o w n i n r e d ( l o w e r l e f t p a n e l ) w i t h c y t o c h r o m e c r e d u c e d ( b l u e l i n e ) , a n d o x i d i z e d ( b l a c k l i n e ) . I n t h e r i g h t t o p p a n e l t h e r a t e o f o x i d a t i o n o f c y t o c h r o m e c w a s m e a s u r e d a t 5 5 0 n m . T h e a b s o r b a n c e w a s d e c r e a s e d a s c y t o c h r o m e c b e c a m e o x i d i z e d w i t h d i f f e r e n t r a t e a t t h r e e d i f f e r e n t c o n d i t i o n s , c o n t r o l l e d ( l a b e l e d a s C ) , v a l i n o m y c i n ( l a b e l e d a s V ) a n d u n c o n t r o l l e d c o n d i t i o n ( l a b e l e d a s U ) , r e s p e c t i v e l y . T h e i s o s b e s t i c p o i n t s , w h e r e c y t o c h r o m e c a b s o r b a n c e d o e s n o t c h a n g e d u r i n g c h a n g e s i n t h e r e d u c t i o n s t a t e , w e r e s e l e c t e d f o r a b s o r b a n c e m e a s u r e m e n t s ( l e f t p a n e l ) o f p y r a n i n e , 4 3 5 n m ( B , t o p ( l e f t p a n e l ) a n d p h e n o l r e d ( C , l o w e r l e f t p a n e l ) a t 5 5 7 n m . T h e r i g h t p a n e l s h o w s t h e c h a n g e s i n a b s o r b a n c e o v e r t i m e d u r i n g c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n . T h e c o n t r o l l e d s t a t e , C ( b l a c k l i n e ) , p u m p i n g s t a t e w i t h v a l i n o m y c i n ( b l u e l i n e ) a n d u n c o n t r o l l e d s t a t e ( r e d l i n e ) , a r e s h o w n w i t h ( A ) c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n ( B ) p y r a n i n e a b s o r b a n c e c h a n g e s o n t h e i n s i d e o f t h e C O V s a n d ( C ) p h e n o l r e d c h a n g e s o n t h e o u t s i d e . T h e i n c r e a s e i n p y r a n i n e a b s o r b a n c e a t 4 3 5 n m ( B ) i n d i c a t e s a l k a l i n i z a t i o n d u e t o p r o t o n c o n s u m p t i o n o n t h e i n s i d e i n a l l t h r e e c o n d i t i o n s w i t h d i f f e r e n t a m p l i t u d e . T h e a b s o r b a n c e c h a n g e w a s m e a s u r e d a t 5 5 7 n m i n d i c a t i n g o u t s i d e p H c h a n g e s w i t h p h e n o l r e d ( C ) . A b s o r b a n c e i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e w a s d e c r e a s e d f o r a s h o r t t i m e a n d t h e n i n c r e a s e d . I n t h e p r e s e n c e o f v a l i n o m y c i n , t h e a b s o r b a n c e w a s d e c r e a s e d c o r r e s p o n d i n g t o t h e d e c r e a s e i n p H d u e t o p u m p e d p r o t o n s , w h e r e a s a b s o r b a n c e w a s i n c r e a s e d a s p r o t o n s m o v e t o t h e i n s i d e o f C O V s i n t h e p r e s e n c e o f b o t h v a l i n o m y c i n a n d F C C P . D a t a fi t t i n g o f t h e a b s o r b a n c e c h a n g e s w a s p e r f o r m e d u s i n g M i c r o c a l O r i g i n P r o c o m p u t e r s o f t w a r e . 1 2 7 A b s o r b a n c e A b s o r b a n c e E 4 3 5 n m ( B ) ' 5 5 0 n m ( A ) 5 5 7 n m ( C ) 3 1 5 0 I 4 0 0 4 3 0 5 6 0 5 & 0 s i l o r i s e W a v e l e n g t h ( n m ) 1 2 8 7 1 T i m e ( s e c ) 2 . 3 . 2 . I n i t i a l M e a s u r e m e n t o f C O V s w i t h F l u o r e s c e n c e M o d e M e m b r a n e P o t e n t i a l M e a s u r e m e n t o f C O V s T h e fl u o r e s c e n c e d y e , D i S C 3 ( 5 ) w a s u s e d t o c h a r a c t e r i z e t h e v e s i c l e s t o d e t e r m i n e w h e t h e r a p o t e n t i a l w a s p r o p e r l y e s t a b l i s h e d . T h e e f f e c t o f m e m b r a n e p o t e n t i a l o n c h a n g e s i n t h e fl u o r e s c e n t s i g n a l o f D i S C 3 ( 5 ) c a n b e q u a n t i fi e d b y m e a s u r i n g t h e d i f f u s i o n p o t e n t i a l s ( S i n g h a n d N i c h o l l s , 1 9 8 5 b ) , w h i c h a r e b u i l t u p w i t h a k n o w n a m o u n t o f s a l t ( K I a n d N a ‘ “ ) o n t h e o u t s i d e i n t h e p r e s e n c e o f v a l i n o m y c i n . T h e c r e a t e d d i f f u s i o n p o t e n t i a l w i t h v a l i n o m y c i n , w h i c h e q u i l i b r a t e s [ K I ] a c r o s s t h e m e m b r a n e , c a n b e c a l c u l a t e d f r o m a k n o w n a m o u n t o f [ N a + ] b y u s i n g t h e N e m s t e q u a t i o n . W h e n t h e m e m b r a n e i s i n t h e r m o d y n a m i c e q u i l i b r i u m , i . e . n o n e t fl u x o f i o n s , t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l m u s t b e e q u a l t o t h e N e m s t p o t e n t i a l . E = R T / z F 1 n [ i o n o u t s i d e c e l l ] / [ i o n i n s i d e c e l l ] E , m e m b r a n e p o t e n t i a l ; R , g a s c o n s t a n t ( 8 . 3 1 J K ' l m o l ' l ) ; T , a b s o l u t e t e m p e r a t u r e i n k e l v i n s ; 2 , c h a r g e o f a i o n ; F , F a r a d a y c o n s t a n t ( 9 . 6 5 x 1 0 4 C o u l o m b m o l ' l ) D u r i n g t h e p r o t o n p u m p i n g o f C O V s , d u e t o t h e a c t i v e t r a n s p o r t o f p r o t o n s , a m e m b r a n e p o t e n t i a l i s d e v e l o p e d . I t c a n b e m e a s u r e d i n t h e s t e a d y - s t a t e c o n d i t i o n b y a d d i t i o n o f e l e c t r o n d o n o r s ( h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c , a s c o r b a t e , a n d T M P D ) w i t h D i S C 3 ( 5 ) , c a r b o c y a n i n e fl u o r e s c e n c e p r o b e s w i t h a Q u a n t a M a s t e r T M L u m i n e s c e n c e i n s t r u m e n t b y P h o t o n T e c h n o l o g y I n t e r n a t i o n a l ( P T I ) a n d a F e l i x 3 2 a n a l y s i s s o f t w a r e m o d u l e ( F i g u r e 2 . 7 ) . 1 2 9 A s t u r n o v e r s o c c u r , t h e fl u o r e s c e n c e w a s d e c r e a s e d , i n d i c a t i n g t h e f o r m a t i o n o f a m e m b r a n e p o t e n t i a l d u e t o c a t a l y t i c r e d u c t i o n o f 0 2 t o H 2 0 c o n s u m i n g t h e p r o t o n s a n d e l e c t r o n s . N i g e r i c i n ( 1 u M ) w a s a d d e d t o r e l e a s e t h e p H g r a d i e n t , a n d a l l o f t h e p r o t o n m o t i v e f o r c e i s n o w e x p r e s s e d i n a n i n c r e a s e d m e m b r a n e p o t e n t i a l . A d d i t i o n o f v a l i n o m y c i n ( 2 u M ) , w h i c h a l l o w s t h e e l e c t r o g e n i c m o v e m e n t o f K + t o a b o l i s h t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l , c a u s e d t h e fl u o r e s c e n c e r e c o v e r y ( i n c r e a s e i n fl u o r e s c e n c e ) ( F i g u r e 2 . 7 ) . A l a r g e r s i z e o f v e s i c l e i s c o n s i d e r e d t o f o r m l e s s m e m b r a n e p o t e n t i a l t h a n a s m a l l e r v e s i c l e . H o w e v e r , t h e fl o w - t h r o u g h v e s i c l e s ( l a r g e r s i z e ) t h a t d o n o t t i g h t l y b i n d t o t h e N i z I - N T A r e s i n s h o w e d t h e s a m e fl u o r e s c e n c e s i g n a l a s t h e p u r i fi e d v e s i c l e s u s i n g N i - N T A r e s i n . T h e i n c r e a s e d b u f f e r i n g o f fl o w - t h r o u g h v e s i c l e s c o n t a i n i n g m a n y e m p t y v e s i c l e s ( n o o x i d a s e ) m a y c a u s e t h e o b s e r v e d d i f f e r e n c e i n a m p l i t u d e f o r fl u o r e s c e n c e r e c o v e r y . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t b o t h v e s i c l e p o p u l a t i o n s a r e p e r f o r m i n g a g o o d t u r n o v e r , a s e x p e c t e d , w i t h a p r o p e r l y o r i e n t e d C c O i n t h e m e m b r a n e . T h e e l e c t r o n d o n o r , c y t o c h r o m e c , c a n p r o p e r l y b i n d t o t h e o x i d a s e w h i c h i s r e c o n s t i t u t e d i n t h e v e s i c l e s . A l t h o u g h t h e p o t e n t i a l w a s n o t c a l i b r a t e d f o r t h e s e v e s i c l e s a m e m b r a n e p o t e n t i a l o f 1 4 0 - 1 6 0 m V d u r i n g t u r n o v e r h a s b e e n m e a s u r e d w i t h s i m i l a r v e s i c l e s ( S i n g h a n d N i c h o l l s , 1 9 8 5 a ) . 1 3 0 . : . . } s . i 2 “ . 3 . . 9 . 5 n . 1 . i . . . . . r . . 5 1 $ : h 0 5 . $ f u l s H V R I » a W Q “ . 1 ‘ 3 ‘ 0 s t . S t . 1 5 . \ 1 “ o ! ! ! “ J “ : ‘ é ; i t s “ . 1 . - l u v - t i l : 1 9 h . . . ‘ . . a . u . 7 1 1 2 5 3 / . , , H Q 3 % ” W 5 L I B R A R Y M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . ' T o A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E S I D S K : I P r o j / A o c & P r e l e l R C / D a t e D u e . i n d d A d w fi p P R O T O N M O V E M E N T I N C Y T O C H R O M E C O X I D A S E O F R H O D O B A C T E R S P H A E R O I D E S V O L U M E I I B y N A M J O O N K I M A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y B i o c h e m i s t r y & M o l e c u l a r B i o l o g y 2 0 0 9 c y t o c h r o m e c F l o w - t h r o u g h C O V S 2 0 0 0 0 1 / P u r i fi e d C O V s ’ 0 ? , A a s c o r b a t e ! T M P D 3 1 6 0 0 0 - W W 4 ’ i g 1 2 0 0 0 i d ) ‘ I U U ) a 2 8 0 0 0 - i n i g e r i c i n o W E g v a l i n o m y c i n o . , , T 1 . . , T 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 t i m e ( s e c ) F i g u r e 2 . 7 M e m b r a n e p o t e n t i a l m e a s u r e m e n t s w i t h t h e w i l d t y p e C O V s C O V s w e r e m a d e b y t h e B i o - b e a d m e t h o d u s i n g a D i S C 3 ( 5 ) fl u o r e s c e n c e p r o b e a s a m o n i t o r o f e l e c t r o c h e m i c a l p o t e n t i a l d u r i n g t u r n o v e r s w i t h a Q u a n t a M a s t e r T M L u m i n e s c e n c e i n s t r u m e n t b y P h o t o n T e c h n o l o g y I n t e r n a t i o n a l ( P T I ) e q u i p p e d w i t h a F e l i x 3 2 a n a l y s i s s o f t w a r e m o d u l e . T h e s t e a d y - s t a t e c o n d i t i o n w a s p r e p a r e d i n t h e p r e s e n c e o f a s c o r b a t e ( 1 2 m M ) , T M P D ( 5 7 u M ) a n d h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c ( 2 . 1 u M ) i n S O m M H e p e s - K O H p H 7 . 4 , 2 4 m M K C l . Z O O u I o f p u r i fi e d C O V s o r 1 0 0 p l o f fl o w - t h r o u g h v e s i c l e s ( 0 . 2 u M fi n a l a a 3 c o n c e n t r a t i o n ) w e r e a d d e d i n t o a 2 m ] v o l u m e o f s a m p l e c e l l w i t h 2 . 5 8 u M o f D i S C 3 ( 5 ) w h i c h i s p r e - e q u i l i b r a t e d w i t h v e s i c l e s f o r 4 m i n b e f o r e m e a s u r e m e n t . T h e a d d i t i o n o f c y t o c h r o m e c i s r e q u i r e d a s a n e l e c t r o n d o n o r ; h o w e v e r , i t q u e n c h e s t h e fl u o r e s c e n c e s i g n a l t o s o m e e x t e n t . M a j o r q u e n c h i n g o f t h e fl u o r e s c e n c e s i g n a l w a s o b s e r v e d d u r i n g t h e t u r n o v e r s , w h i c h b u i l d u p a m e m b r a n e p o t e n t i a l . A d d i t i o n o f n i g e r i c i n ( l u M ) r e l e a s e s t h e p H g r a d i e n t , a n d t h e a d d i t i o n o f v a l i n o m y c i n ( Z u M ) , r e m o v e s t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d a l l o w s K + e q u i l i b r i u m , 1 3 1 ( F i g u r e 2 . 7 c o n t i n u e d ) r e c o v e r i n g t h e fl u o r e s c e n c e s i g n a l t o i t s o r i g i n a l l e v e l . B o t h p u r i fi e d ( t i g h t l y b o u n d t o N i - N T A r e s i n ) a n d fl o w - t h r o u g h C O V s ( l e s s t i g h t l y b o u n d ) s h o w g o o d d e v e l o p m e n t o f a m e m b r a n e p o t e n t i a l , i n d i c a t i n g a p r o p e r o r i e n t a t i o n o f C 0 0 i n t h e m e m b r a n e . B o t h fl u o r e s c e n c e s i g n a l s w e r e n o r m a l i z e d a t t h e s a m e s t a r t i n g p o i n t . T h e i n c r e a s e d b u f f e r i n g o f t h e fl o w — t h r o u g h v e s i c l e s , w h i c h c o n t a i n m a n y e m p t y v e s i c l e s w i t h n o C c O , m a y c a u s e t h e d i f f e r e n t r e s p o n s e t o D i S C 3 ( 5 ) fl u o r e s c e n c e c h a n g e s i n t h e p r e s e n c e o f n i g e r i c i n , r e s u l t i n g i n a n a p p a r e n t i n c r e a s e i n t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l . 1 3 2 D i S C 3 ( 5 ) , c a r b o c y a n i n e , fl u o r e s c e n c e c h a n g e s w e r e a l s o m e a s u r e d i n t h e s t o p p e d - fl o w s y s t e m a n d t o m e a s u r e t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l b u i l d u p v e r s u s t i m e b y r a p i d m i x i n g . H o w e v e r , t h i s w a s n o t s u c c e s s f u l i n a f a s t — t i m e s c a l e i n a p r e - s t e a d y s t a t e r a p i d - m i x i n g c o n d i t i o n w i t h t h e A p p l i e d P h o t o p h y s i c s s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t , p o s s i b l y b e c a u s e t h e r e s p o n s e o f D i S C 3 ( 5 ) i s s l o w e r t h a n t h e p H d y e r e s p o n s e s . F l u o r e s c e n c e M o n i t o r i n g o f p H c h a n g e s o n t h e i n s i d e o f C O V s I n o r d e r t o l o o k a t i n t e r n a l p H c h a n g e s , a n u m b e r o f s t u d i e s h a v e b e e n p e r f o r m e d u s i n g p h e n o l r e d , w h i c h i s e n t r a p p e d o n t h e i n s i d e o f C O V s ( F a x e n a n d B r z e z i n s k i , 2 0 0 7 ; F a x e n e t a l . , 2 0 0 5 ) . H o w e v e r , t h e a b s o r b a n c e o f p h e n o l r e d d i d n o t g i v e a g o o d s i g n a l t o n o i s e l e v e l b e c a u s e i t s p K a a p p e a r s t o s h i f t t o a s i g n i fi c a n t l y h i g h e r v a l u e w h e n i n c o r p o r a t e d i n t o t h e v e s i c l e s . W e t h e r e f o r e c h o s e p y r a n i n e f o r m o n i t o r i n g p H c h a n g e s o n t h e i n s i d e o f C O V s b e c a u s e o f i t s b e t t e r s e n s i t i v i t y t o p H a n d t h e f a c t t h a t i t c a n b e m e a s u r e d b y a b s o r p t i o n o r fl u o r e s c e n c e . T h e p y r a n i n e e m i s s i o n s i g n a l i s o b s e r v e d o n l y a t 5 1 0 n m n o m a t t e r w h a t e x c i t a t i o n w a v e l e n g t h i s a p p l i e d . T h e s i g n a l i n c r e a s e s i n fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y a t h i g h p H . P y r a n i n e i n t h e v e s i c l e s e x h i b i t s s i m i l a r fl u o r e s c e n t p r o p e r t i e s a s i n s o l u t i o n , w i t h a v e r y s l i g h t a l k a l i n e s h i f t i n t h e p K a , p o s s i b l y r e s u l t i n g f r o m t h e p r o x i m i t y o f n e g a t i v e l y c h a r g e d p h o s p h o l i p i d s o n t h e i n n e r s u r f a c e o f t h e b i l a y e r ( C l e m e n t a n d G o u l d , 1 9 8 1 ) . T h e s e u n i q u e c h a r a c t e r i s t i c s o f p y r a n i n e m a d e i t m o r e u s e f u l a s a m o n i t o r o f i n s i d e p H c h a n g e s i n t h e fl u o r e s c e n c e o r a b s o r p t i o n m o d e t h a n p h e n o l r e d . 1 3 3 D a t a c o l l e c t i o n w a s p e r f o r m e d i n i t i a l l y w i t h t h e A p p l i e d P h o t o p h y s i c s s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t ( F i g u r e 2 . 8 ) i n w h i c h t h e s o l u t i o n s a r e r a p i d l y m i x e d i n a m i l l i s e c o n d t i m e s c a l e . T h e o u t s i d e p H c h a n g e c o u l d b e e a s i l y m e a s u r e d w i t h p h e n o l r e d w h i c h w o u l d n o t i n t e r f e r e w i t h t h e i n t e r n a l p H p r o b e . T h e o x i d a t i o n r a t e o f c y t o c h r o m e c a n d t h e p h e n o l r e d a b s o r b a n c e c h a n g e s o n t h e o u t s i d e d u r i n g t u r n o v e r w e r e m e a s u r e d i n t h e a b s o r b a n c e m o d e , w h i l e i n s i d e p H c h a n g e s o f t h e p y r a n i n e d y e w e r e m e a s u r e d i n t h e fl u o r e s c e n c e m o d e u s i n g t h e A p p l i e d P h o t o p h y s i c s s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t w i t h a c u t - o f f fi l t e r ( F i g u r e 2 . 9 ) . E a c h r e a c t i o n i s r e p e a t e d a t l e a s t t h r e e t i m e s a n d a v e r a g e d f o r s i n g l e e x p o n e n t i a l fi t t i n g . 1 3 4 D R I V E S Y R I N G E C O V s & l o n o p h o r e s P H O T O M U L T I P L I E R M g O B S E R V I N G C E L L C y t o c h r o m e c “ E ] [ j L I G H T G R A T I N G M O N O C H R O M A T O R S D A T A P R O C E S S I N G S T O P S Y R I N G E F i g u r e 2 . 8 S c h e m e o f A p p l i e d P h o t o p h y s i c s s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t . A s i n g l e w a v e l e n g t h w a s u s e d f o r a b s o r b a n c e o r fl u o r e s c e n c e . T h e e m i s s i o n w a v e l e n g t h w a s s e l e c t e d f r o m t h e l i g h t s o u r c e , w h i c h i s g r a t e d b y m o n o c h r o m a t o r s . S a m p l e s a r e r a p i d l y m i x e d i n t h e o b s e r v a t i o n c e l l a n d c h a n g e s a r e m o n i t o r e d i n t h e m i l l i s e c o n d t o s e c o n d t i m e s c a l e , e i t h e r i n a fl u o r e s c e n c e o r a b s o r b a n c e m o d e . F l u o r e s c e n c e s i g n a l s w e r e fi l t e r e d b y u s i n g a c u t - o f f fi l t e r ( 4 9 0 n m ) b e f o r e c o l l e c t i o n o f t h e s i g n a l s a t t h e p h o t o m u l t i p l i e r , a n d w e r e t r a n s f e r r e d t o t h e c o m p u t e r a n d a n a l y z e d . e c n a b r o s b A _ — 0 . 0 5 ; A 0 0 0 4 " ' 0 ' O < 0 . 0 2 " , 4 0 . 0 1 ~ 0 . 0 0 - " 0 0 . 0 3 - ( A ) 0 . 0 4 4 R e d u c e d C C ( 0 ) O x i d i z e d C c A 0 ' 5 0 . 0 3 4 0 . 0 2 . 7 E m 5 1 0 £ 3 4 9 0 n m c u t o f f < - 0 . 0 1 ~ Q - 0 . 0 2 « - 0 . 0 3 3 0 . 0 1 % V I 2 . 0 . 0 0 « / C ( B ) 0 . 0 7 - 3 0 . 0 6 4 C ] B a n d p a s s f i l t e r M L 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 0 0 0 6 5 0 7 0 0 E 0 . 0 5 - 2 0 . 0 4 4 3 0 . 0 3 - < 0 . 0 2 . c < 0 . 0 1 . 0 . 0 0 0 ( C ) . 0 ' 0 : 5 1 : 0 1 1 5 2 . 0 T i m e ( s e e ) F i g u r e 2 . 9 I n i t i a l m e a s u r e m e n t s o f C O V s m a d e u s i n g t h e c h o l a t e — d i a l y s i s m e t h o d . T h e fl u o r e s c e n c e m o d e w a s u s e d i n a n A p p l i e d P h o t o p h y s i c s s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t f o r m e a s u r i n g i n t e r n a l p H . E a c h r e a c t i o n w a s r e p e a t e d a t l e a s t t h r e e t i m e s a n d a v e r a g e d f o r s i n g l e e x p o n e n t i a l fi t t i n g . ( A ) C y t o c h r o m e c o x i d a t i o n i n t h e c o n t r o l l e d , C , c o n d i t i o n , V , v a l i n o m y c i n ; a n d U , u n c o n t r o l l e d s t a t e s ( B ) p r o t o n p u m p i n g w a s m e a s u r e d e x t e r n a l l y u s i n g a n a b s o r b a n c e s i g n a l o f p h e n o l r e d . ( C ) I n t e r n a l p H c h a n g e s w e r e m o n i t o r e d b y u s i n g p y r a n i n e d y e e n t r a p p e d i n s i d e t h e C O V s w i t h t h e fl u o r e s c e n c e e m i s s i o n d e t e c t o r w i t h a c u t - o f f fi l t e r m e a s u r e d i n s e p a r a t e e x p e r i m e n t s f r o m ( A ) a n d ( B ) . T h e m a c h i n e c o n fi g u r a t i o n h a s t o b e c h a n g e d i n o r d e r t o c h a n g e t h e d e t e c t i o n m o d e f r o m a b s o r b a n c e t o fl u o r e s c e n c e . E v e n w i t h s t r o n g fl u o r e s c e n c e e m i s s i o n s i g n a l s , i t w a s h a r d t o d e t e r m i n e t h e i n i t i a l s t a r t i n g p o i n t a n d e n d p o i n t o f t h e r e a c t i o n . U s i n g a n e x t r a p o l a t i o n o f t h e d a t a , t h e s t a r t i n g a n d e n d p o i n t o f t h e r e a c t i o n w a s d e t e r m i n e d . H o w e v e r , t h e e m i s s i o n s i g n a l w a s s e v e r e l y c o n t a m i n a t e d b y t h e c y t o c h r o m e c i t s e l f e i t h e r w i t h c u t - o f f o r b a n d p a s s fi l t e r s b e c a u s e c y t o c h r o m e c a b s o r b e d e m i s s i o n s i g a n a l a n d w o r k e d l i k e a n i n n e r - fi l t e r i n t h e s y s t e m ( D ) , r e s u l t i n g i n d i f f e r e n t i a l fl u o r e s c e n c e q u e n c h i n g a s t u r n o v e r o c c u r s . 1 3 6 E v e n t h o u g h t h e fl u o r e s c e n c e m o d e e n a b l e d t h e m e a s u r e m e n t o f i n s i d e p H c h a n g e s w i t h a s t r o n g s i g n a l - t o - n o i s e r a t i o ( F i g u r e 2 . 9 C ) , s o m e l i m i t a t i o n s w e r e f o u n d i n t h i s m e a s u r e m e n t . T h e q u a n t i fi c a t i o n o f p r o t o n s w a s a m a j o r p r o b l e m b e c a u s e c y t o c h r o m e c h a d a n i n t e r n a l q u e n c h i n g e f f e c t o n t h e e m i s s i o n o f p y r a n i n e s i n c e i t a b s o r b s s t r o n g l y a n d v a r i a b l y i n t h e 5 0 0 - 5 5 0 r e g i o n . T h e v a r i a b l e r e d u c t i o n s t a t e o f c y t o c h r o m e c g a v e a v a r i a b l e r e - a b s o r p t i o n o f t h e e m i t t e d l i g h t w h i c h i s c a l l e d a n “ i n n e r - fi l t e r e f f e c t ” . I n i t i a l l y , a c u t - o f f fi t l e r t h a t a l l o w e d t r a n s m i s s i o n o f a l l fl u o r e s c e n c e s i g n a l s o v e r 4 9 0 n m w a s u s e d , b u t i n o r d e r t o r e d u c e t h e q u e n c h i n g e f f e c t , a n o t h e r b a n d - p a s s fi l t e r ( 4 8 0 - 5 2 0 n m ) w a s i n t r o d u c e d . H o w e v e r , u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s t h e fl u o r e s c e n c e e m i s s i o n w a s t o o s m a l l t o m e a s u r e a c c u r a t e l y . A n o t h e r d i f fi c u l t y i n t h e fl u o r e s c e n c e m e a s u r e m e n t w a s d e t e r m i n i n g t h e i n i t i a l z e r o t i m e p o i n t , a s i t s h i f t e d g r e a t l y b e t w e e n s a m p l e s . I n a d d i t i o n , t h e d e t e c t o r c o n fi g u r a t i o n h a d t o b e c h a n g e d i n o r d e r t o c h a n g e t h e d e t e c t i o n m o d e f r o m a b s o r b a n c e t o fl u o r e s c e n c e , s o w e c o u l d n o t g e t t h e t w o m e a s u r e m e n t s ( a b s o r b a n c e a n d fl u o r e s c e n c e ) a t o n c e o n t h e s a m e s a m p l e . T h e s e t e c h n i c a l a n d s y s t e m a t i c l i m i t a t i o n s t o t h e u s e o f t h e fl u o r e s c e n c e a s a t o o l , r e s u l t e d i n a c h a n g e t o u s e a b s o r b a n c e m e a s u r e m e n t s f o r t h e i n s i d e p H d e t e r m i n a t i o n , w i t h t h e O l i s r a p i d s c a n n i n g s t o p p e d - fl o w . 2 . 3 . 3 . I n i t i a l M e a s u r e m e n t o f C O V s w i t h A b s o r b a n c e M o d e P y r a n i n e i s a p a r t i c u l a r i l y v a l u a b l e p r o b e b e c a u s e i t h a s h i g h s e n s i t i v i t y i n b o t h t h e a b s o r p t i o n a n d fl u o r e s c e n c e m o d e s , m a k i n g d i f f e r e n t m e a s u r e m e n t m e t h o d s p o s s i b l e . I n t e r n a l a n d e x t e r n a l p r o t o n m o v e m e n t s i n v e s i c l e s c a n b e m e a s u r e d i n a n a b s o r b a n c e 1 3 7 m o d e a t t h e s a m e t i m e a s c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n , w i t h C O V s c o n t a i n i n g p y r a n i n e i n s i d e a n d p h e n o l r e d o n t h e o u t s i d e , b y u s i n g a r a p i d s c a n n i n g O l i s s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t ( F i g u r e 2 . 1 0 ) . T h e s i g n a l f r o m t h e p H p r o b e p y r a n i n e , i n t h e i n t e r i o r o f t h e C O V s , w a s w e a k u n d e r t h e c o n d i t i o n s e x a m i n e d i n i t i a l l y ( F i g u r e 2 . 1 1 C ) , c o m p a r e d t o t h e o u t s i d e p r o t o n c h a n g e s , w h i c h a r e p r o b e d b y p h e n o l r e d . T h e o n l y v i a b l e i s o s b e s t i c p o i n t o f c y t o c h r o m e c f o r p y r a n i n e m e a s u r e m e n t w a s 4 3 5 n m w h e r e r e l a t i v e l y s m a l l c h a n g e s a r e m o n i t o r e d i n t h i s r e g i o n d u r i n g t u r n o v e r ( F i g u r e 2 . 4 a n d 2 . 6 ) . A m a j o r p r o b l e m w a s i d e n t i fi e d a s b e i n g t h e s m a l l v o l u m e o f t h e v e s i c l e i n t e r i o r , g i v i n g l o w d y e e n t r a p m e n t . T h e v o l u m e o f t h e v e s i c l e c a n b e c a l c u l a t e d b a s e d o n t h e k n o w n w i d t h o f t h e b i l a y e r a n d t h e d i a m e t e r o f t h e C O V s ( F i g u r e 2 . 1 2 ) . I n a d d i t i o n t o t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e e n t r a p p e d d y e , a n o t h e r p r o b l e m w a s c o n s i d e r e d , t h a t p r o t o n p u m p i n g m i g h t b e i n h i b i t e d b y t h e l a c k o f s u f fi c i e n t p r o t o n s u p p l y f r o m t h e i n s i d e d u e t o t h e l o w b u f f e r i n g a n d t h e s m a l l c a p a c i t y o f t h e v e s i c l e i n t e r i o r . T h e r e f o r e , i t s e e m e d i m p o r t a n t t o i n c r e a s e t h e i n t e r n a l v o l u m e c a p a c i t y o f t h e C O V s a n d t o o p t i m i z e i n t e r n a l b u f f e r i n g c o n d i t i o n s . 1 3 8 T O P H O T O M U L T I P L I E R D R I V E S Y R I N G E o w 7 5 P S I ] A C I ' I ’ I U A T O R n S T O P S Y R I N G E O B S E R V A T I O N C H A M B E R F R O M R E S E R V I O R S Y R I N G E M O N O C H R O M A T O R F i g u r e 2 . 1 0 S c h e m e o f O l i s s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t . T h e b a s i c s e t u p i s s i m i l a r t o t h a t o f t h e A p p l i e d P h o t o p h y s i c s s t o p p e d - fl o w e x c e p t t h a t t h i s i n s t r u m e n t h a s t h e a b i l i t y t o s c a n m u l t i p l e w a v e l e n g t h s o v e r t i m e m o n i t o r i n g l i g h t a b s o r p t i o n . D a t a i s c o l l e c t e d o v e r a s e t w a v e l e n g t h r a n g e i n 1 m i l l i s e c o n d . T h i s i s f e a s i b l e b e c a u s e o f t h e u s e o f a p a t e n t e d “ D e S a ” s u b t r a c t i v e d o u b l e g r a t i n g m o n o c h r o m a t o r w i t h a m o v i n g i n t e r m e d i a t e s l i t . K i n e t i c a n a l y s i s o f c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n w a s p e r f o r m e d e i t h e r b y a S V D ( s i n g u l a r v a l u e d e c o n v o l u t i o n ) m e t h o d o r b y M i c r o c a l O r i g i n P r o s o f t w a r e . 1 3 9 0 . 0 o - 0 . _ e c n a b r o s b A 0 - 5 5 0 n m : : " I 0 1 1 , 1 ‘ . 0 0 A . 5 0 ‘ . 0 1 I . 5 1 2 . 0 0 3 0 ‘ ( A ) w 0 s e c 0 . 2 5 - 1 3 ° C . - ‘ . Z s e c 0 . 2 0 “ . “ g 3 s e c ‘ 4 3 5 n m 4 s e c 0 . 1 5 « 5 s e c 0 . 1 0 - 0 . 0 5 - l A b s o r b a n c e 0 . 1 . 0 . ” 0 . 8 . ( 3 1 ) 0 . 7 . I l I I I l l I l g 0 . 6 - . , l . . , ! I l I I I I I I 0 . 5 - 0 . 4 - 0 . 3 ~ 0 . 2 . 0 . 1 ~ 4 0 0 4 5 0 ' 5 0 0 V 5 5 0 6 0 0 T i m e ( s e c ) W a v e l e n g t h ( n m ) 5 5 7 n m - 0 . 0 0 0 5 « - ( E ) I j F i g u r e 2 . 1 1 I n i t i a l m e a s u r e m e n t s o f C O V s m a d e w i t h t h e c h o l a t e — d i a l y s i s m e t h o d i n t h e a b s o r b a n c e m o d e o f t h e O l i s s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t . A l l p r o b e s w e r e m o n i t o r e d u s i n g t h e i s o s b e s t i c w a v e l e n g t h o f c y t o c h r o m e c . T h e r i g h t p a n e l s h o w s c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n i n C , c o n t r o l l e d ; V , v a l i n o m y c i n ; U , u n c o n t r o l l e d s t a t e s ( C ) , p r o t o n p u m p i n g p r o b e d w i t h p h e n o l r e d ( D ) , a n d i n t e r n a l p H c h a n g e s p r o b e d w i t h p y r a n i n e ( E ) e n t r a p p e d i n s i d e t h e C O V s . M e a s u r e m e n t s w e r e m a d e o v e r t h e w a v e l e n g t h r a n g e ( r i g h t p a n e l ) a s i n ( A ) & ( B ) e v e r y l m s e c . A t y p i c a l w a v e l e n g t h s c a n o f c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n o v e r 5 s e c o n d s i n t h e p r e s e n c e o f p y r a n i n e i n s i d e t h e C O V s i s s h o w n i n ( A ) a t 5 5 0 n m . A n i n c r e a s e i n p y r a n i n e a b s o r p t i o n i s o b s e r v e d , d u e t o p r o t o n c o n s u m p t i o n o n t h e i n s i d e , d u r i n g t u r n o v e r a t t h e 4 3 5 n m i s o s b e s t i c p o i n t . T h e s e n s i t i v i t y o f c h a n g e s i n t h e p y r a n i n e a b s o r b a n c e w a s l i m i t e d . P h e n o l r e d a b s o r p t i o n c h a n g e s w e r e m o n i t o r e d i n t h e p r e s e n c e o f b o t h p y r a n i n e a n d c y t o c h r o m e c a t t h e 5 5 7 n m i s o s b e s t i c p o i n t o f c y t o c h r o m e c ( B ) . P y r a n i n e d o e s n o t c o n t a m i n a t e t h e p h e n o l r e d a b s o r p t i o n s i g n a l i n t h e w a v e l e n g t h r a n g e o b s e r v e d . 1 4 0 F i g u r e 2 . 1 2 S i z e e s t i m a t i o n o f C O V s . T h e t o t a l I n t e r n a l v o l u m e o f t h e C O V s w a s c a l c u l a t e d ( A ) b a s e d o n t h e m e a s u r e d m e a n d i a m e t e r o f C O V s b y E M a n d a n e s t i m a t e o f t h e t o t a l n u m b e r o f v e s i c l e s b a s e d o n t h e C c O c o n c e n t r a t i o n a s s u m i n g , m i n i m a l l y , 1 C c O / v e s i c l e ( B ) . T h e e q u a t i o n f o r a s p h e r e v o l u m e c a l c u l a t i o n ( V = 4 / 3 m 3 ) w a s a p p l i e d w i t h a S n m e s t i m a t e d b i l a y e r w i d t h . T h e a m o u n t o f e n t r a p p e d p y r a n i n e w a s c a l c u l a t e d b a s e d o n a n e s t i m a t e o f t h e v o l u m e o f t h e v e s i c l e s a s s u m i n g a n i n t e r n a l 2 0 m M fi n a l p y r a n i n e c o n c e n t r a t i o n i n 2 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 ( w i t h 3 8 . 9 m M K C l + 5 2 m M s u c r o s e ) . A s t h e m e a n d i a m e t e r i n c r e a s e d f r o m 2 0 n m t o 7 5 n m , t h e i n t e r n a l v o l u m e i n c r e a s e d t o a l a r g e e x t e n t , e n t r a p p i n g a l o t m o r e p y r a n i n e m o l e c u l e s i n s i d e o f a s i n g l e v e s i c l e f r o m 6 t o 1 , 7 3 0 m o l e c u l e s a s s h o w n i n r e d . T h e t o t a l i n t e r n a l v o l u m e i n t h e 8 0 1 1 1 c e l l i n t h e O l i s s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t w a s c a l c u l a t e d b a s e d o n a v a r i e d m e a n d i a m e t e r ( M D ) ( C ) . e . g . 0 . 6 9 1 1 1 o f t o t a l i n t e r n a l v o l u m e i s c a l c u l a t e d w i t h a 7 5 n m m e a n d i a m e t e r . A n o t h e r w a y o f c a l c u l a t i o n w a s m a d e f o r i n t e r n a l v o l u m e e s t i m a t i o n . D i r e c t a b s o r b a n c e o f p y r a n i n e m e a s u r e d f r o m t h e s t o p p e d - fl o w c o u l d b e u s e d t o c a l c u l a t e t h e p y r a n i n e c o n c e n t r a t i o n a n d t h e t o t a l i n t e r n a l v o l u m e ( D ) w i t h a 0 . 4 c m b a n d p a t h a n d 7 . 1 m M ' l c m " a s a n a b s o r p t i o n c o e f fi c i e n t m e a s u r e d f r o m a s t a n d a r d c u r v e a t 4 3 5 n m . T h e r e w a s a 7 - f o l d d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e c a l c u l a t e d ( 7 5 n m m e a n d i a m e t e r , 0 . 6 9 1 0 ) , a n d m e a s u r e d t o t a l i n t e r n a l v o l u m e ( 0 . 1 } . t l ) u s i n g t h e a b s o r b a n c e o f p y r a n i n e i n t h e c e l l . 1 4 1 % ® a ~ 5 n m E 6 7 2 3 2 . 2 x 1 0 ' 1 7 m L / v e s i c l e L I P O S O M E S P y r a n i n e M o l e c u l e s / v e s i c l e - _ _ _ - - - - - _ - _ . . _ . A L . 1 . 4 x 1 0 ' 1 5 m L / v e s i c y B . / 8 0 1 . 1 1 C e l l ( O I I S s t o p p e d - f l o w ) C C a l c u l a t e d T o t a l I n t e r n a l V o l u R a M D w . i i T o t a l # o f v e s i c l e s ' = t o t a l # o f C c O a s s u m i n g 1 C c O / v e s i c l e I n t e r n a l v o l u m e m e a s u r e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y u s i n g a m e a n d i a m e t e r M D T o t a l V o l u m e M e a n D i a m e t e r n m | 8 0 | c e l l 7 5 0 . 6 9 6 0 0 . 3 2 5 3 0 . 2 0 5 0 0 . 1 6 4 0 \ = 4 / 3 M 3 . [ M D — ( 2 x B i l a y e r w i d t h ) ] r a d i u s = — — — — j 2 L ) P y r a n i n e A b s o r b a n c e o f s t o p p e d - f l o w 4 3 5 0 ” “ = 7 . 1 m M ' 1 c m ' 0 . 0 7 I [ P y r a n i n e ] x 8 0 n l = 2 0 m M x t o t a l i n t e r n a l v o l u m e o f C O V s M e a s u r e d T o t a l I n t e r n a l V o l u m e = 0 . 1 ( 2 0 . 0 1 ) u l 1 4 2 2 . 3 . 4 . M o d i fi c a t i o n o f p r e p a r a t i o n m e t h o d a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f C O V s B i o - b e a d s C O V s w i t h p u r i fi c a t i o n s t e p s b y N i - N T A a n d h i s - t a g g e d C c O T h e s m a l l c a p a c i t y o f t h e i n t e r i o r o f t h e C O V s d i d n o t g i v e s u f fi c i e n t s i g n a l f o r g o o d a b s o r b a n c e m e a s u r e m e n t s e v e n w i t h e f fi c i e n t p r o b e s , s u c h a s p y r a n i n e . A n e w m e t h o d t o m a k e v e s i c l e s w a s a t t e m p t e d w i t h f u r t h e r p u r i fi c a t i o n s t e p s w i t h B i o - b e a d s , N i - N T A a n d a h i s t i d i n e - t a g g e d C c O , t o o b t a i n a b e t t e r s i g n a l t o n o i s e r a t i o b y i n c r e a s i n g t h e s i z e o f C O V s a n d b y e l i m i n a t i n g b a c k g r o u n d s i g n a l s f r o m v o i d v e s i c l e s , w h i c h d o n o t c o n t a i n C c O . B i o - b e a d s h a v e b e e n i n t r o d u c e d a s a s i m p l e a l t e r n a t i v e t o o t h e r c o n v e n t i o n a l d e t e r g e n t r e m o v a l s t r a t e g i e s s u c h a s d i a l y s i s , g e l c h r o m a t o g r a p h y a n d d i l u t i o n . A m e c h a n i s m u s i n g t h e a d s o r p t i o n o f d e t e r g e n t o n t o p o l y s t y r e n e b e a d s , a l l o w i n g t h e m o r e r a p i d f o r m a t i o n o f l i p o s o m e s h a s b e e n p r o p o s e d b y R i g a u d e t a l . ( R i g a u d e t a l . , 1 9 9 8 ) ( F i g u r e 2 . 1 ) . T h e u s e o f B i o - b e a d s h a s b e e n s h o w n t o b e a r e p r o d u c i b l e m e t h o d t o p r e p a r e u n i l a m e l l a r a n d h o m o g e n e o u s p r e p a r a t i o n s o f b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e p r o t e o l i p o s o m e s f r o m m i c e l l a r m i x t u r e s ( J a s a i t i s e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h i s m e t h o d w a s a d 0 p t e d f o r p r o d u c i n g v e s i c l e s o f R c h O a s d e s c r i b e d i n e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e ( S e c t i o n 2 . 2 ) a n d i n F i g u r e 2 . 3 . A b a t c h p r o c e d u r e , w i t h s u c c e s s i v e a d d i t i o n s o f b e a d s , a l l o w s c o n t r o l o f t h e d e t e r g e n t r e m o v a l r a t e , w h i c h i s e s s e n t i a l t o p r e v e n t a h e t e r o g e n e o u s p r e p a r a t i o n , i n t e r m s o f s i z e a n d m u l t i l a m e l l a r i t y . I n t h e e a r l y s t e p s o f r e c o n s t i t u t i o n , a l o w b e a d t o d e t e r g e n t r a t i o w a s a p p l i e d t o p r o m o t e t h e m i c e l l a r t o l a m e l l a r ( b i l a y e r ) t r a n s i t i o n . A f t e r s u c h a t r a n s i t i o n , t h e b e a d c o n c e n t r a t i o n w a s i n c r e a s e d u p t o t h e a d s o r p t i v e c a p a c i t y i n o r d e r t o r e m o v e r e s i d u a l d e t e r g e n t f r o m C O V s . U n t r a p p e d p y r a n i n e w a s r e m o v e d 1 4 3 s u c c e s s f u l l y b y s e p h a d e x G - 2 5 g e l fi l t r a t i o n w h e r e g o o d s e p a r a t i o n b e t w e e n t h e v e s i c l e s a n d t h e d y e w a s a c h i e v e d ( F i g u r e 2 . 3 , S e p h a d e x G - 2 5 c o l u m n ) . T h e N i 2 + - N T A p u r i fi c a t i o n w i t h s u b u n i t I I h i s - t a g g e d C c O , a l l o w e d c o r r e c t l y ( o u t w a r d f a c i n g ) o r i e n t e d C O V s t o b e i s o l a t e d w i t h 2 5 % r e c o v e r y y i e l d , a n d e l i m i n a t i n g b a c k g r o u n d m a i n l y a t t r i b u t e d t o e m p t y v e s i c l e s l a c k i n g i n C c O . S i z e M e a s u r e m e n t b y T r a n s m i s s i o n E l e c t r o n M i c r o s c o p y T h e s i z e o f C O V s r e c o n s t i t u t e d b y d e t e r g e n t r e m o v a l w i t h B i o — b e a d s u n d e r d i f f e r e n t v e s i c l e p r e p a r a t i o n c o n d i t i o n s w a s a n a l y z e d i n d e t a i l b y t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M ) b y n e g a t i v e s t a i n i n g a f t e r fi x a t i o n . I m a g e s f r o m m a n y d i f f e r e n t v e s i c l e s p r e p a r a t i o n ( 1 3 d i f f e r e n t C O V s e t s ) w e r e e x a m i n e d . I t w a s d i f fi c u l t t o g e t t h e r i g h t c o n c e n t r a t i o n o f s a m p l e t o g e t a g o o d v i s u a l i z a t i o n o f t h e v e s i c l e s . T h e b e s t c o n d i t i o n s w e r e o b t a i n e d w i t h a 5 0 0 f o l d d i l u t i o n ( u s i n g 2 0 m M H E P E S - K O H , 3 8 . 9 m M K C I , 5 2 m M s u c r o s e b u f f e r ) a n d s h o w e d r e p r o d u c i b l e d i f f e r e n c e s b e t w e e n C O V s p r e p a r e d b y d i f f e r e n t m e t h o d s . C h o l a t e - d i a l y s i s C O V s w e r e f o u n d t o h a v e a m e a n d i a m e t e r a b o u t 2 5 ~ 3 0 n m ( F i g u r e 2 . 1 5 A , B ) w i t h o r w i t h o u t C c O ( F i g u r e 2 . 1 3 ) . C h o l a t e - d i a l y s i s C O V s , c o m b i n e d w i t h p u r i fi c a t i o n b y N i L - N T A w e r e c o m p a r e d i n s i z e , a n d s h o w e d s i m i l a r m o r p h o l o g y ( s p h e r e ) a n d h o m o g e n e i t y i n s i z e d i s t r i b u t i o n . U n l i k e c h o l a t e - d i a l y s i s C O V s , B i o - b e a d s C O V s ( F i g u r e 2 . 1 4 ) s h o w e d a l m o s t t h r e e t i m e s l a r g e r a v e r a g e s i z e ( 7 0 ~ 8 0 n m i n m e a n d i a m e t e r ) ( F i g u r e 2 . 1 5 C D ) . 1 4 4 T o t a l i n t e r n a l v o l u m e o f t h e C O V s , w h i c h c o r r e s p o n d s t o 1 . 4 x 1 0 ' 1 6 m L p e r l i p o s o m e ( w i t h m e a n d i a m e t e r o f 7 5 n m ) w a s c a l c u l a t e d b a s e d o n a n e s t i m a t e d t o t a l n u m b e r o f v e s i c l e s a s s u m i n g , m i n i m a l l y , o n e o x i d a s e p e r v e s i c l e a f t e r t h e N i 2 + - N T A c o l u m n p u r i fi c a t i o n ( F i g u r e 2 . 1 2 ) . T h e a m o u n t o f e n t r a p p e d p y r a n i n e w a s a l s o c a l c u l a t e d b a s e d o n a n e s t i m a t e d v o l u m e o f v e s i c l e s a s s u m i n g t h e 2 0 m M i n t e r n a l p y r a n i n e c o n c e n t r a t i o n . A s t h e m e a n d i a m e t e r i n c r e a s e d , t h e v o l u m e c o n t r i b u t i o n w a s g r e a t l y i n c r e a s e d a s w e l l a s t h e a m o u n t o f p y r a n i n e d y e e n t r a p m e n t . T h i s i s a r e a l l y i m p o r t a n t f a c t , b e c a u s e l o w p y r a n i n e e n t r a p m e n t i n s i d e o f C O V s w a s a m a j o r l i m i t i n g f a c t o r i n m e a s u r i n g t h e p H c h a n g e s i n t h e a b s o r b a n c e m o d e . D i r e c t a b s o r b a n c e o f t h e s a m p l e w a s a l s o a p p l i e d t o c a l c u l a t e t h e t o t a l i n t e r n a l v o l u m e o f C O V s . T h e b a s e l i n e s c a t t e r i n g w a s c o r r e c t e d b y s u b t r a c t i n g t h e e n d s c a n a b s o r b a n c e p o i n t i n t h e O l i s - s t o p p e d fl o w s c a n . A k n o w n v a l u e o f b a n d p a t h ( 0 . 4 c m ) a n d m e a s u r e d a b s o r p t i o n c o e f fi c i e n t ( 7 . 1 m M ' l c m ' l ) f r o m a s t a n d a r d c u r v e w a s u s e d t o c a l c u l a t e p y r a n i n e c o n c e n t r a t i o n a t 4 3 5 n m . T h e t o t a l i n t e r n a l v o l u m e w a s c a l c u l a t e d f r o m t h i s m e a s u r e d p y r a n i n e c o n c e n t r a t i o n u s i n g t h e k n o w n o b s e r v i n g c e l l v o l u m e . T h e r e w a s a n a l m o s t 7 - f o l d d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e c a l c u l a t e d ( b a s e d o n E M m e a n d i a m e t e r ) a n d m e a s u r e d ( b a s e d o n a b s o r b a n c e ) t o t a l i n t e r n a l v o l u m e . I t i s p o s s i b l e t h a t w e m i g h t h a v e m a n y u n c o u n t e d s m a l l v e s i c l e s , w h i c h c o n t r i b u t e t o t h e r e d u c t i o n o f t h e r e a l m e a n 1 4 5 2 4 ' I . s . ‘ . , a n . . 1 1 " » . 1 ! ' . 9 I : I . f ‘ 1 ’ - 1 ' ; ‘ f - p ‘ T ' ” ‘ 1 ' , , ' ' v r a g - 5 « fi " 0 ‘ I f ? 2 J o ‘ " 3 ‘ 1 ' 8 ' 2 . C P , , g ’ 4 ' . . g . a . . . 4 . - 0 4 - h r a f t - M F R ? . c — t 1 0 m m F i g u r e 2 . 1 3 T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M ) o f r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e v e s i c l e s ( C O V s ) b y a c h o l a t e - d i a l y s i s m e t h o d . ( A ) C h o l a t e - d i a l y s i s C O V s w h o l e m i x t u r e w i t h e m p t y v e s i c l e s ( B ) N i - N T A p u r i fi e d C O V s f r o m a c h o l a t e - d i a l y s i s m e t h o d ; ( C ) & ( D ) P r o t e i n - f r e e v e s i c l e s m a d e b y t h e s a m e c h o l a t e - d i a l y s i s m e t h o d . V e s i c l e s w e r e fi x e d w i t h 2 % o s m i u m t e t r o x i d e i n 0 . 1 M c a c o d y l a t e b u f f e r p H 7 . 4 , a n d s t a i n e d w i t h 1 % u r a n y l a c e t a t e f o r n e g a t i v e s t a i n i n g . T h e s i z e b a r s r e p r e s e n t 1 0 0 n m ( A , B , C ) a n d 2 0 0 n m ( D ) i n t h e m i c r o g r a p h . 1 4 6 F i g u r e 2 . l 4 T E M o f r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e v e s i c l e s ( C O V s ) b y t h e B i o - b e a d m e t h o d . ( A ) B i o - b e a d C O V s p u r i fi e d b y N i - N T A ; ( B ) B i o - b e a d s f r o m t h e fl o w - t h r o u g h f r o m a N i - N T A c o l u m n ; ( C ) A s i n g l e C O V m a d e b y t h e B i o - b e a d m e t h o d w i t h N i - N T A p u r i fi c a t i o n ; ( D ) D i s r u p t e d v e s i c l e s i n t h e p r e s e n c e o f d e t e r g e n t ( 2 % l a u r y l m a l t o s i d e ) . V e s i c l e s w e r e fi x e d w i t h 2 % o s m i u m t e t r o x i d e i n 0 . 1 M c a c o d y l a t e b u f f e r p H 7 . 4 a n d s t a i n e d w i t h 1 % u r a n y l a c e t a t e f o r n e g a t i v e s t a i n i n g . T h e s i z e b a r s r e p r e s e n t 1 0 0 n m ( C ) , 2 0 0 n m ( A , B ) a n d 5 0 0 n m ( D ) i n t h e m i c r o g r a p h , r e s p e c t i v e l y . 1 4 7 5 0 ‘ 2 0 - _ r A 1 8 - c 1 6 - - ' 3 ? 7 : 1 ? 1 4 — 7 v V . — I : c 1 2 ' . 2 3 5 ~ g 1 0 ~ T 2 1 ! e ~ " 3 3 a . a . s . 0 F l 0 n . a 9 F 1 7 0 - _ B 6 0 - . A 3 5 5 s o - 2 . . r : r : . 2 ‘ 0 ‘ . 2 E 3 0 - E 3 3 3 ' 2 0 3 ' n . I n . 1 0 D i a m e t e r ( n m ) D i a m e t e r ( n m ) F i g u r e 2 . 1 5 S i z e d i s t r i b u t i o n h i s t o g r a m o b t a i n e d f r o m T E M o f C O V s . S i z e d i s t r i b u t i o n h i s t o g r a m o b t a i n e d f r o m T E M o f C O V s . S i z e p o p u l a t i o n ( % ) o f t o t a l c o u n t e d C O V s i s s h o w n w i t h t h e m e a s u r e d m e a n d i a m e t e r s i z e ( n m ) . ( A ) V o i d v e s i c l e s ( f r e e o f C c O ) m a d e b y t h e c h o l a t e d i a l y s i s m e t h o d . ( B ) C h o l a t e d i a l y s i s C O V s f o l l o w e d b y a N i - N T A p u r i fi c a t i o n s t e p . ( C ) B i o - b e a d C O V s w h i c h fl o w - t h r o u g h a n d d o n o t b i n d t o t h e N i - N T A c o l u m n . ( D ) P u r i fi e d B i o - b e a d C O V s u s i n g N i - N T A c o l u m n . 1 4 8 d i a m e t e r o f C O V s . A l t e r n a t i v e l y , t h e fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f p y r a n i n e e n t r a p p e d i n s i d e t h e v e s i c l e s m i g h t b e l o w e r b e c a u s e o f i t s b i n d i n g o n t o t h e B i o - b e a d s u r f a c e , o r d u e t o t h e e x c l u s i o n o f d y e f r o m t h e s m a l l i n t e r n a l v o l u m e . I f t h e v e s i c l e a v e r a g e d i a m e t e r i s a s s u m e d t o b e 5 3 n m , o r i f t h e a c t u a l i n t e r n a l d y e c o n c e n t r a t i o n i s a s s u m e d t o b e 1 0 m M , t h e n t h e t w o e s t i m a t e s w o u l d b e a c l o s e m a t c h ( 0 . 2 } , t I / 8 0 u l c e l l , F i g u r e 2 . 1 2 ) . A n a t t e m p t t o m e a s u r e v e s i c l e s i z e u s i n g a d y n a m i c l i g h t s c a t t e r i n g m e t h o d w a s n o t s u c c e s s f u l b e c a u s e o f t h e h e t e r o g e n e o u s c h a r a c t e r o f p r e p a r e d v e s i c l e s i n o u r m e t h o d . T h e n u m b e r o f o x i d a s e m o l e c u l e s p e r u n i t v e s i c l e c o u l d n o t b e m e a s u r e d b y t h e T E M t e c h n i q u e ; h o w e v e r , f r e e z e f r a c t u r e e l e c t r o n m i c r o s c o p y h a s r e p o r t e d t h a t 1 o r 2 C c O m o l e c u l e s c o u l d b e e m b e d d e d i n r e c o n s t i t u t e d v e s i c l e s o f t h i s s i z e r a n g e ( 6 0 - 7 0 n m ) s i m i l a r t o o u r C O V s ( M a d d e n e t a l . , 1 9 8 4 ) ( F i g u r e 2 . 1 6 ) . P e r m e a b i l i t y o f C O V s a n d C a l i b r a t i o n o f A b s o r b a n c e C h a n g e T h e p e r m e a b i l i t y o f t h e C O V s w a s m e a s u r e d b y u s i n g a p H g r a d i e n t i n t h e O l i s s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t . T h i s w a s p r o d u c e d b y m i x i n g v e s i c l e s a t p H 7 . 4 ( 2 0 m M H E P E S - K O H ) w i t h a b u f f e r ( 2 0 m M M E S - K O H ) a t p H 6 . 3 . V o i d v e s i c l e s , w i t h o u t C c O , w e r e m a d e b y t h e s a m e p r o c e d u r e a s u s e d f o r B i o - b e a d C O V s , a n d w e r e c o m p a r e d a s a c o n t r o l . B o t h t y p e s o f v e s i c l e s e x h i b i t e d s i m i l a r c h a n g e s i n i n t e r n a l p H i n d i c a t i n g l o w p e r m e a b i l i t y t o p r o t o n s u n d e r a p H g r a d i e n t 1 4 9 . w - . = ! 3 5 1 " - " : - s . « ; : ‘ e ~ ‘ . ” , . . 5 . < 1 2 5 . = . ' F i g u r e 2 . 1 6 F r e e z e - f r a c t u r e e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e o x i d a s e v e s i c l e s w h i c h a r e m a d e b y t h e c h o l a t e d i a l y s i s m e t h o d . T h e b a r s o n t h e b o t t o m r e p r e s e n t 1 0 0 n m i n e a c h m i c r o g r a p h . T h e f r e e z e f r a c t u r e m i c r o g r a p h s h o w s 1 - 2 C c O m o l e c u l e s ( 6 0 ~ 7 0 n m d i a m e t e r s i z e ) t h a t c o u l d b e e m b e d d e d i n t h e r e c o n s t i t u t e d v e s i c l e s . E l e c t r o n m i c r o g r a p h w a s o b t a i n e d f r o m M a d d e n e t a l . ( M a d d e n e t a l . , 1 9 8 4 ) . 1 5 0 w i t h o u t t u r n o v e r s . P y r a n i n e a b s o r b a n c e w a s m e a s u r e d a t t h e i s o s b e s t i c p o i n t o f c y t o c h r o m e c ( 4 3 5 n m ) a n d d i d n o t c h a n g e m u c h , u n l e s s t h e u n c o u p l i n g c h e m i c a l s , s u c h a s v a l i n o m y c i n a n d F C C P w e r e a d d e d t o t h e s y s t e m ( F i g u r e 2 . 1 7 A ) . W h e n t h e v e s i c l e s w e r e f u l l y e q u i l i b r a t e d , t h e p H w a s m e a s u r e d a s p H 6 . 3 1 , s h o w i n g l i t t l e c h a n g e d u e t o t h e m u c h g r e a t e r e x t e r n a l v o l u m e . T h e p H c h a n g e o n t h e i n s i d e w a s o b t a i n e d b y s u b t r a c t i n g t h e fi n a l p H ( p H 6 . 3 1 ) i n t h e p r e s e n c e o f i o n o p h o r e s ( v a l i n o m y c i n + F C C P ) f r o m t h e i n i t i a l s t a r t i n g p H ( p H 7 . 4 0 ) . A 1 . 0 9 p H u n i t c h a n g e c o r r e s p o n d s t o A A B S = 0 . 1 0 i n t h e O l i s s t o p p e d - fl o w a b s o r b a n c e m e a s u r e m e n t a t 4 3 5 n m ( F i g u r e 2 . 1 7 A ) . W e n o r m a l l y o b s e r v e d ~ 0 . 0 0 8 u n i t a b s o r b a n c e c h a n g e s d u r i n g t h e p u m p i n g m e a s u r e d a t 4 3 5 n m b y t h e s a m e s t o p p e d - fl o w m a c h i n e ( F i g u r e 2 . 1 9 , B : b 1 u e t r a c e ) . T h e p r o t o n c o n c e n t r a t i o n c a l c u l a t e d n e a r p H 7 . 4 ( F i g u r e 2 . 1 7 , B i n s e t ) s h o w e d a n a l m o s t l i n e a r r e l a t i o n s h i p w i t h t h e a b s o r b a n c e c h a n g e s o b s e r v e d a t 4 3 5 n m i n t h e P e r k i n - E l m e r s p e c t r o p h o t o m e t e r . T h e r e f o r e , w e e s t i m a t e d t h a t t h e 0 . 0 0 8 a b s o r b a n c e c h a n g e c o r r e s p o n d s t o a b o u t 0 . 1 p H u n i t c h a n g e ( p H 7 . 4 9 p H 7 . 5 ) d u r i n g t h e p u m p i n g m e a s u r e m e n t , o n t h e i n s i d e o f t h e C O V s , a r e a s o n a b l e n u m b e r a c c o r d i n g t o k n o w n e s t i m a t e s . I n o r d e r t o g e t t h e a c t u a l H + / e ' p u m p i n g s t o i c h i o m e t r y , t h e a m p l i t u d e o f t h e a b s o r b a n c e s i g n a l w a s u s e d t o e s t i m a t e h o w m a n y p r o t o n s a r e c o n s u m e d f r o m i n s i d e , . w i t h a n i n t e r n a l s t a n d a r d a s s u m i n g t h a t l H + / e ' i s c o n s u m e d u n d e r u n c o n t r o l l e d c o n d i t i o n . 1 5 1 F i g u r e 2 . 1 7 A m e a s u r e m e n t o f t h e p e r m e a b i l i t y o f C O V s a n d c a l i b r a t i o n o f a b s o r b a n c e c h a n g e s . V e s i c l e s w i t h o u t C c O w e r e p r e p a r e d a s a c o n t r o l a n d c o m p a r e d w i t h w i l d t y p e C O V s m a d e b y t h e B i o - b e a d m e t h o d i n 2 0 m M I - I E P E S - K O H p H 7 . 4 . ( A ) T h e p e r m e a b i l i t y o f t h e C O V s w a s m e a s u r e d b y u s i n g a p H j u m p , w h e r e a n a c i d i c 2 0 m M M E S - K O H b u f f e r ( p H 6 . 3 ) w a s p l a c e d o n t h e o u t s i d e w h i l e p H 7 . 4 m a i n t a i n e d o n t h e i n s i d e o f t h e C O V s . B o t h t y p e s o f v e s i c l e s s h o w e d p o o r p r o t o n p e r m e a b i l i t y u n d e r a p H g r a d i e n t ( 2 0 m M M E S b u f f e r , p H 6 . 3 o u t s i d e ) u n l e s s i o n o p h o r e s w e r e a d d e d . F u l l e q u i l i b r a t i o n w a s o n l y a c h i e v e d i n t h e u n c o u p l e d c o n d i t i o n w i t h b o t h v a l i n o m y c i n ( V ) a n d C C C P ( C ) . ( B ) p H d e p e n d e n t a b s o r b a n c e c h a n g e s o f a q u e o u s p y r a n i n e w e r e m e a s u r e d i n t h e P e r k i n - E l m e r s p e c t r o p h o t o m e t e r i n S O m M H E P E S - K O H , S O m M M E S - K O H a n d S O m M C H E S b u f f e r . P y r a n i n e a b s o r b a n c e a t t h e i s o s b e s t i c p o i n t ( 4 3 5 n m ) o f c y t o c h r o m e c s h o w e d a n a l m o s t l i n e a r r e l a t i o n s h i p w i t h a p K a n e a r 7 . 4 . A p p r o x i m a t e l y 0 . 1 p H u n i t c h a n g e s a r e e x p e c t e d d u r i n g t h e p u m p i n g r e a c t i o n i n t h e n o r m a l c o n d i t i o n w i t h v a l i n o m y c i n i n t h e C O V s . T h e p r o t o n c o n c e n t r a t i o n i n t h i s r e g i o n s h o w e d a l i n e a r r e l a t i o n s h i p w i t h a b s o r b a n c e s i g n a l , a s o b s e r v e d ( i n s e t ) . 1 5 2 A A ) m n 5 3 4 ( e c n a b r o s b A 0 . 1 2 - 0 . 1 0 - V 0 , 0 3 : - - - - - - - - p u r e v e s i c l e s ( n o C c O ) - - - - - - - - p u r e v e s i c l e s + V 0 . 0 6 - - - - - - - - - p u r e v e s i c l e s + V C ‘ - — — w i l d t y p e C O V s ° - ° 4 - — w i l d t y p e c o v 3 + v ' w i l d t C O V s + V C 0 . 0 2 - w e o . o o - . . - u m . . - o . o z . . , , I I 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 T i m e ( s e c ) 0 . 1 4 o ' M 0 1 - 7 7 - 7 7 F B 2 * , . 0 . 1 2 3 3 0 . 1 0 ‘ 2 i p H ” p H 7 . 2 i I . _ _ _ - W , ' l 0 ' 0 8 [ P r o t o n s ] 0 . 0 6 0 . 0 4 0 . 0 2 0 . 0 0 , , f . I I . . 1 5 3 2 . 3 . 5 . O p t i m i z i n g C o n d i t i o n s f o r A n a l y s i s o f t h e A c t i v i t y a n d F u n c t i o n o f C O V s I n t e r n a l B u f f e r S e l e c t i o n V a r i o u s l y b u f f e r e d C O V s w e r e p r e p a r e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f H E P E S - K O H p H 7 . 4 , i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e o p t i m a l b u f f e r i n g o n t h e i n s i d e ( T a b l e 2 . 2 ) . T h e r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o ( R C R ) , i n w h i c h t h e a c t i v i t y w i t h u n c o u p l e r s ( v a l i n o m y c i n a n d F C C P ) i s d i v i d e d b y t h e c o n t r o l l e d a c t i v i t y c o n t a i n i n g n o i o n o p h o r e s , w a s u s e d t o v e r i f y t h e c o n d i t i o n o f t h e v e s i c l e s . T h e o s m o l a r i t y o f C O V s w a s a d j u s t e d t o l 3 5 m O S M w i t h s u c r o s e . T h e c h a n g e s i n R C R , u n d e r t h e s a m e o s m o l a r i t y a n d i o n i c s t r e n g t h , c o u l d b e a t t r i b u t e d t o t h e e f f e c t o f b u f f e r c h a n g e s o n t h e i n s i d e . T h e m e a s u r e d R C R w a s v a r i a b l e , f r o m 6 . 5 t o 2 . 0 , a s t h e b u f f e r c h a n g e d f r o m h i g h e r t o l o w e r c o n c e n t r a t i o n , i n t h e s t e a d y - s t a t e c o n d i t i o n , w i t h t h e s a m e i o n i c s t r e n g t h . W h e n t h e i o n i c s t r e n g t h w a s l o w e r e d t o l O m M K ” , t h e R C R w a s l o w e r e d t o 2 - 4 , e v e n w i t h t h e s a m e o s m o l a r i t y , w h i c h w a s a d j u s t e d b y u s i n g a h i g h s u c r o s e c o n c e n t r a t i o n . T h e y i e l d o f p r o t o n r e l e a s e t o t h e o u t s i d e , m e a s u r e d b y p h e n o l r e d , w a s i n c r e a s e d a s t h e i n s i d e b u f f e r c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d i n t h e p r e - s t e a d y s t a t e s t o p p e d - fl o w c o n d i t i o n ( F i g u r e 2 . 1 8 ) . I n o r d e r t o m e a s u r e t h e i n s i d e p H c h a n g e s o f C O V s w i t h a p H p r o b e , l o w e r e d i n t e r i o r b u f f e r i n g w o u l d b e e x p e c t e d t o i n c r e a s e c h a n g e s i n t h e d y e s i g n a l ; h o w e v e r , C O V s w i t h l o w e r e d b u f f e r i n g d i d n o t s u p p o r t a g o o d R C R v a l u e , p r o b a b l y b e c a u s e o f a s h o r t a g e o f s u f fi c i e n t p r o t o n s t o m a i n t a i n e n o u g h t u r n o v e r s d u r i n g a c t i v i t y , w h i c h u s e s p r o t o n s f o r t h e r e d u c t i o n o f o x y g e n t o w a t e r , a s w e l l a s b e i n g p u m p e d t o t h e o u t s i d e . T h e 1 5 4 b u f f e r c o n d i t i o n , w i t h 2 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 , 4 5 m M [ 1 C ] o n t h e i n s i d e o f t h e C O V s w a s s e l e c t e d i n o r d e r t o s u p p l y s u f fi c i e n t p r o t o n s , w i t h r e d u c e d b u f f e r i n g o n t h e i n s i d e , i n o r d e r t o s t u d y p r o t o n m o v e m e n t b y m o n i t o r i n g t h e d y e a b s o r b a n c e c h a n g e s f r o m t h e i n s i d e a n d o u t s i d e t o g e t h e r d u r i n g t h e t u r n o v e r , i n t h e m i l l i s e c o n d t i m e s c a l e w i t h s t o p p e d - fl o w t e c h n i q u e s . 1 5 5 I N S I D E [ H e p e s - K O H ] 7 S m M 5 0 m M 2 5 m M 1 5 m M S m M 2 5 m M 2 5 m M [ K + ] 4 5 m M 4 5 m M 4 5 m M 4 5 m M 4 5 m M 1 0 m M 1 0 m M [ S u c r o s e ] N o n e N o n e 2 0 m M 3 0 m M 4 0 m M N o n e 9 0 m M c o n t m ' l e ‘ j 1 1 9 1 2 0 1 7 7 1 1 8 2 1 2 1 4 1 0 9 1 3 2 9 5 1 1 2 1 2 1 1 1 . 4 2 0 5 1 7 3 ( e ' l s e C / a a s ) U n c o n t r o l l e d ( e ' / s e c / a a a ) 7 6 3 1 1 1 0 9 7 5 1 7 5 1 1 0 1 1 1 8 0 4 7 0 1 2 7 0 2 7 4 1 3 7 5 1 4 1 8 0 4 0 7 1 8 6 R C R 5 , 5 1 0 . 9 5 , 8 1 0 . 6 5 , 2 1 0 . 6 4 , 3 1 1 . 3 2 , 7 1 0 . 4 4 , 2 1 0 . 6 2 , 0 1 0 . 7 T a b l e 2 . 2 V a r y i n g t h e i n t e r n a l c o n d i t i o n s t o o p t i m i z e t h e C O V s . C O V s w e r e p r e p a r e d w i t h d i f f e r e n t i n s i d e b u f f e r i n g c a p a c i t i e s u s i n g H E P E S - K O H p H 7 . 4 ( o u t s i d e , 5 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 4 5 m M [ K + ] ) . T h e R C R ( r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o = u n c o n t r o l l e d a c t i v i t y / c o n t r o l l e d a c t i v i t y ) w a s c a l c u l a t e d a n d u s e d a s a n i n d i c a t o r f o r t e s t i n g t h e “ l e a k i n e s s ” o f t h e v e s i c l e s . I o n i c s t r e n g t h w a s a d j u s t e d b y a d d i t i o n o f K C l , 4 5 m M o r 1 0 m M . O s m o l a r i t y w a s c o n t r o l l e d b y v a r y i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f s u c r o s e . 1 5 6 ' ° - ° 2 ‘ . 5 m M I n s i d e — — C z c o n t r o l l e d - — V : + v a l i n o m y c i n — — U : u n c o n t r o | l e d 4 1 ° 2 1 1 5 m M I n s i d e ' ° ' ° 2 ‘ 5 0 m M I n s i d e 0 ' 1 ' ' 2 T i m e ( s e e ) F i g u r e 2 . 1 8 P r o t o n p u m p i n g o n t h e o u t s i d e o f C O V s . P r o t o n p u m p i n g o n t h e o u t s i d e o f C O V s m e a s u r e d b y p h e n o l r e d a b s o r b a n c e c h a n g e s w i t h i n c r e a s i n g i n t e r i o r b u f f e r c o n c e n t r a t i o n s o f H E P E S - K O H p H 7 . 4 . T h e p r o t o n p u m p i n g ( b l u e l i n e ) s h o w s a l a r g e d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e a l m o s t e q u a l t o t h e i n c r e a s e i n a b s o r b a n c e i n t h e u n c o n t r o l l e d s t a t e w i t h 5 0 m M b u f f e r i n g i n s i d e , s h o w i n g t h a t t h e s t o i c h i o m e t r y o f p u m p i n g i s i n c r e a s e d w i t h a n i n c r e a s e i n t h e b u f f e r s t r e n g t h u n d e r a p r e - s t e a d y s t a t e c o n d i t i o n . M e a s u r e m e n t s w e r e m a d e w i t h t h e A p p l i e d P h o t o p h y s i c s s t o p p e d - fl o w i n t h e a b s o r b a n c e m o d e a t 5 5 7 n m , t h e i s o s b e s t i c p o i n t o f c y t o c h r o m e c . 1 5 7 0 . 0 0 3 . A 0 . 0 0 0 - A — — C z c o n t r o l l e d E 0 . 0 0 6 ‘ — V : + v a | i n o m y c i n 0 . 0 0 6 ~ s — — — ' U : u n c o n t r o | l e d 2 0 , 0 0 4 . 0 . 0 0 4 1 g 0 . 0 0 2 - 0 . 0 0 2 - 0 . 0 0 0 ~ 0 . 0 0 0 0 : 0 0 : 6 1 : 0 1 1 5 2 . 0 0 . 0 ' 0 : 5 ' { 0 1 : 5 ' 2 . 0 T i m e ( s e e ) T i m e ( s e e ) F i g u r e 2 . 1 9 A c o m p a r i s o n o f p r o t o n u p t a k e i n C O V s e i t h e r m a d e b y t h e c h o l a t e - d i a l y s i s m e t h o d ( A ) , o r b y t h e B i o - b e a d m e t h o d , ( B ) . T h e C O V s w h i c h w e r e m a d e w i t h t h e B i o - b e a d m e t h o d s h o w e d a n i n c r e a s e i n s i z e , a n d a l s o a n i n c r e a s e d p y r a n i n e a b s o r b a n c e . A l l t h r e e c o n d i t i o n s : c o n t r o l l e d ( b l a c k ) , w i t h v a l i n o m y c i n ( b l u e ) a n d u n c o n t r o l l e d , w i t h b o t h v a l i n o m y c i n a n d F C C P ( r e d ) , s h o w s i g n i fi c a n t s i g n a l c h a n g e s , w i t h t h e g r e a t e s t i n c r e a s e i n a b s o r b a n c e w i t h v a l i n o m y c i n a d d e d , d u e t o t h e i n c r e a s e i n p r o t o n u p t a k e f o r b o t h p r o t o n p u m p i n g a n d f o r p r o t o n s r e q u i r e d a t t h e a c t i v e s i t e f o r c h e m i s t r y . 1 5 8 M o n i t o r i n g i n s i d e p H c h a n g e s w i t h v a r i o u s c o n d i t i o n s L a r g e r C O V s p r e p a r e d b y t h e B i o - b e a d m e t h o d a l l o w e d t h e u s e o f a b s o r b a n c e s i g n a l s t o m o n i t o r i n s i d e p H c h a n g e s i n s t e a d o f u s i n g fl u o r e s c e n c e , w h i c h h a s l i m i t a t i o n s d u e t o a l a c k o f q u a n t i fi c a t i o n a n d t h e i n n e r - fi l t e r e f f e c t s o f c y t o c h r o m e c . C o m p a r e d t o t h e r e l a t i v e l y s m a l l C O V s m a d e b y t h e c h o l a t e - d i a l y s i s m e t h o d ( F i g u r e 2 . 1 9 A ) , C O V s m a d e w i t h B i o - b e a d s g a v e a b e t t e r s i g n a l t o n o i s e r a t i o ( F i g u r e 2 . 1 9 B ) . T h e a m p l i t u d e o f t h e p r o t o n p u m p i n g s i g n a l w a s a l m o s t t w i c e a s l a r g e a s t h a t o f t h e c o n t r o l l e d s t a t e , a s e x p e c t e d , s i n c e d u r i n g p r o t o n p u m p i n g t w i c e t h e a m o u n t o f p r o t o n s w i l l b e c o n s u m e d f r o m t h e i n s i d e . A n a l y s i s o f a b s o r b a n c e c h a n g e s o f i n t e r n a l p y r a n i n e i n d i c a t e d a m a x i m a l r e s p o n s e a t 2 0 m M p y r a n i n e ( F i g u r e 2 . 2 0 ) . H o w e v e r , t h e s i g n a l o b s e r v e d d u r i n g t h e t u r n o v e r s i n t h e s t o p p e d - fl o w w a s s t i l l n o t a s s t r o n g a s e x p e c t e d . T h i s m a y b e d u e t o t h e b u f f e r i n g o n t h e i n t e r i o r , o r a s e l f - q u e n c h i n g o f p y r a n i n e a t a h i g h e r i n t e r n a l c o n c e n t r a t i o n , o r e x c l u s i o n o f d y e d u e t o t h e s t i l l s m a l l i n t e r n a l v o l u m e ( F i g u r e 2 . 1 2 ) . 1 5 9 ‘ , . a ‘ 1 ' I ‘ I ' - , 1 . M I . i ’ I ‘ . N ‘ . V t ‘ i / i ‘ v ' i I i I i fi fl . I i ' i ' 0 . 0 1 0 . E 0 . 0 0 0 5 , 0 . 0 0 6 - ” . 3 ' 0 . 0 0 4 - 4 . < 1 0 . 0 0 2 . 0 . 0 0 0 N " ( A ) — C z c o n t r o l l e d — — V : + v a l i n o m y c i n — — - — — U : u n c o n t r o | l e d 0 . 0 1 0 - E 0 0 0 8 - C ‘ 9 0 . 0 0 6 - f ( B ) F i g u r e 2 . 2 0 C o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t a b s o r b a n c e c h a n g e s o f p y r a n i n e m e a s u r e d 0 . 0 0 . 5 1 1 0 1 . 5 t i m e ( s e c ) 2 . 0 f r o m t h e i n s i d e o f B i o - b e a d C O V s w i t h e n t r a p p e d p y r a n i n e . ( A ) 1 0 m M , ( B ) 2 0 m M , ( C ) 4 0 m M p y r a n i n e . T h e O l i s s t o p p e d - fl o w w a s u s e d t o m o n i t o r c h a n g e s i n p y r a n i n e a t 4 3 5 n m , t h e i s o s b e s t i c p o i n t o f c y t o c h r o m e c . B i o - b e a d s w e r e a d d e d s l o w l y o v e r 7 h o u r s . I n c r e a s e s i n t h e p y r a n i n e c o n c e n t r a t i o n c a u s e d a n i n c r e a s e i n t h e s i g n a l , m o s t l y u n d e r t h e p u m p i n g c o n d i t i o n w i t h v a l i n o m y c i n . T h e c o n t r o l l e d a n d u n c o n t r o l l e d c o n d i t i o n s s h o w e d t h e l e a s t c h a n g e i n a b s o r b a n c e . P y r a n i n e m a y c o n t r i b u t e t o t h e b u f f e r i n g c a p a c i t y o n t h e i n s i d e w h e n i t i s a t a h i g h c o n c e n t r a t i o n . 1 6 0 a 7 1 E 5 L v , ‘ \ o / . - \ . / ' a ; 5 ‘ \ , _ _ / ' C H E S ' 4 8 4 ‘ . M E S H E P E S 3 3 - ' 0 . C 2 - o . O 1 - 0 ‘ l T T l l I l 6 . 0 6 . 5 7 . 0 7 . 5 8 . 0 8 . 5 9 . 0 F i g u r e 2 . 2 1 C o n d u c t i v i t y m e a s u r e m e n t s w i t h a t h r e e - b u f f e r s y s t e m ; M E S , H E P E S a n d C H E S b u f f e r f o r u s e w i t h C O V s o v e r a r a n g e o f p H . T h e i o n i c s t r e n g t h o f t h e d i f f e r e n t b u f f e r s o l u t i o n s w a s m e a s u r e d f r o m t h e t o t a l o f a l l t h e i o n s p r e s e n t i n t h e s o l u t i o n . A c o n d u c t i v i t y m e t e r ( A c c u m e t ) w a s u s e d t o m e a s u r e t h e i o n i c s t r e n g t h o f e a c h b u f f e r . T h r e e d i f f e r e n t b u f f e r s y s t e m s , w h i c h h a v e s i m i l a r o s m o l a r i t i e s , w e r e u s e d . C o n d u c t i v i t y w a s e x p r e s s e d i n m i l l i s i e m e n s p e r c e n t i m e t e r ( m S / c m ) . T h e p r e p a r e d b u f f e r s w e r e d e s i g n e d t o h a v e a s i m i l a r i o n i c s t r e n g t h . O v e r m o s t r a n g e s , t h e a m o u n t o f m e a s u r e d c o n d u c t i v i t y i s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e a m o u n t o f s a l t s ( i o n i c s t r e n g t h ) i n t h e b u f f e r s o l u t i o n . 1 6 1 ( A ‘ N I F . ” A , - . - / » / ) / g / ’ / . . 4 » 4 \ . _ " g Q 1 O I 0 A c p u o u n r p n c m t o o i n t l n r l e d g o l l e d . . A , ' . \ \ \ \ , \ ~ ‘ \ \ \ . 9 7 , . . - ‘ , . ‘ . \ \ , l ‘ \ \ \ " \ m 0 m g m ) I . ( I . B I . 1 - - . _ _ ‘ " ‘ ‘ - . 1 , ‘ . . 7 6 s 4 3 2 7 6 5 4 3 2 A M E 3 V " a a 0 2 2 ° g E E z v . ‘ ; 0 g g 2 3 3 2 2 1 1 4 3 3 2 2 1 1 t ‘ ' 1 . . 5 0 5 0 5 0 5 5 0 5 0 5 0 5 0 0 0 0 0 0 . « j * - - 0 4 0 5 ‘ ‘ - ‘ - : : 0 0 0 0 0 0 ° ° . I I I I . I . - 1 - - I I u I I . . I I . - I ' 6 . 0 ' 6 1 5 ' 7 : 0 f 7 1 5 ' 8 : 0 f 8 i 5 ' 9 : 0 p H 6 . 0 T 6 1 5 ' 7 1 0 ' 7 : 5 ' 8 : 0 ' 0 : 5 ' 9 : 0 p H F i g u r e 2 . 2 2 p H d e p e n d e n t a c t i v i t y a n d m e a s u r e m e n t o f t h e R C R w i t h B i o b e a d C O V s ( A , B ) o r c h o l a t e - d i a l y s i s C O V s ( C , D ) . T h e s i z e o f t h e C O V s i n t h e B i o - b e a d m e t h o d w a s a l m o s t t h r e e t i m e s b i g g e r t h a n t h e c h o l a t e - d i a l y s i s C O V s . H o w e v e r , t h e r e w a s l i t t l e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s m a l l a n d l a r g e s i z e d C O V s i n t h e s t o p p e d fl o w m e a s u r e m e n t s , e x c e p t a t t h e h i g h p H r a n g e . 1 6 2 T h e e f f e c t o f p H o n a c t i v i t y o f C O V s p r e p a r e d b y d i f f e r e n t m e t h o d s T h r e e d i f f e r e n t b u f f e r s y s t e m s ( M E S , H E P E S , a n d C H E S ) w e r e p r e p a r e d f o r m e a s u r i n g t h e a c t i v i t y o f C O V s u n d e r d i f f e r e n t p H c o n d i t i o n s ( F i g u r e 2 . 2 1 ) . T h e p H d e p e n d e n t a c t i v i t y a n d R C R o f t h e B i o - b e a d C O V s ( F i g u r e 2 . 2 2 A , B ) w a s c o m p a r e d w i t h t h a t o f t h e c h o l a t e - d i a l y s i s C O V s ( F i g u r e 2 . 2 2 C D ) w i t h t h e s e b u f f e r s . I t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t C O V s m a d e b y t h e B i o - b e a d m e t h o d h a v e l o w e r e d R C R s ( a b o u t 3 ~ 4 ) w h e n t h e y a r e m e a s u r e d w i t h t h e G i l s o n O x y g r a p h u n d e r s t e a d y - s t a t e c o n d i t i o n s . H o w e v e r , t h e r e w a s l i t t l e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s m a l l v e s i c l e s ( c h o l a t e - d i a l y s i s C O V s ) a n d t h e l a r g e v e s i c l e s ( B i o - b e a d s C O V s ) i n s t o p p e d - fl o w m e a s u r e m e n t s , e x c e p t a t t h e h i g h p H r a n g e . 2 . 4 . D i s c u s s i o n D i f f i c u l t i e s i n p H m e a s u r e m e n t o n t h e i n s i d e o f C O V s H i g h b u f f e r i n g o f v e s i c l e s o n t h e i n s i d e m a k e s i t d i f fi c u l t t o o b s e r v e p H c h a n g e s ; h o w e v e r , i t c a n b e p r o b l e m a t i c a l t o h a v e v e r y l o w b u f f e r i n g o n t h e i n s i d e o f r e c o n s t i t u t e d v e s i c l e s s i n c e p r o t o n s m u s t b e a v a i l a b l e t o b e p u m p e d . F u r t h e r , i t h a s b e e n f o u n d t h a t t h e a p p a r e n t p K a o f a p H s e n s i t i v e d y e c a n b e s h i f t e d i n s i d e t h e v e s i c l e s . F o r e x a m p l e , p h e n o l r e d h a s a p K a o f 7 . 5 i n s o l u t i o n , h o w e v e r , w h e n l o a d e d i n t o l i p o s o m e s t h e p K a a p p e a r s t o i n c r e a s e b y a p p r o x i m a t e l y 1 p H u n i t ( F a x e n a n d B r z e z i n s k i , 2 0 0 7 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n o f a p H p r o b e e n t r a p p e d i n t h e v e s i c l e s i s u s u a l l y v e r y s m a l l d u e t o t h e s m a l l v o l u m e . M o r e o v e r , t h e p r o b e c a n b e d i l u t e d d u r i n g t h e p r e p a r a t i o n , e s p e c i a l l y w i t h s e v e r a l s t e p s o f d i a l y s i s . T h i s w i l l g i v e w e a k a b s o r b a n c e s i g n a l s u p o n p H c h a n g e s d u r i n g t h e r e a c t i o n . A n e w v e s i c l e p r e p a r a t i o n w a s u s e d t o i n c r e a s e t h e s i g n a l t o n o i s e l e v e l o f 1 6 3 C O V s b y i n c r e a s i n g t h e v e s i c l e s i z e a n d v o l u m e b y u s i n g B i o - b e a d s . T h e l a r g e r v o l u m e o f t h e C O V s m a d e f r o m u s i n g B i o - b e a d s i n c r e a s e d t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e e n t r a p p e d d y e . P u r i fi c a t i o n s t e p s w i t h N i L - N T A r e s i n , u s i n g a s u b u n i t I I h i s t i d i n e - t a g g e d C c O , r e d u c e d t h e p o p u l a t i o n o f m i s - o r i e n t e d C O V s i n w h i c h t h e c y t o c h r o m e c b i n d i n g s i t e f a c e s t h e i n w a r d d i r e c t i o n . F u r t h e r m o r e , i t r e d u c e s t h e n u m b e r o f v o i d v e s i c l e s , w h i c h d o n o t c o n t a i n o x i d a s e . T h e s e v e s i c l e s o t h e r w i s e i n t e r f e r e w i t h t h e a c c u r a t e m e a s u r e m e n t s , c o n t r i b u t i n g t o a b a c k g r o u n d s i g n a l b e c a u s e o f t h e l i g h t s c a t t e r i n g a n d a r t i f a c t u a l p H c h a n g e s a n d b u f f e r i n g I n t e r n a l V o l u m e E s t i m a t i o n o f C O V s A p r e v i o u s s t u d y o f N i - N T A p u r i fi e d , c h o l a t e - d i a l y s i s v e s i c l e s ( H i s e r e t a l . , 2 0 0 1 ) s h o w e d u p t o 5 0 % r e c o v e r y o f o x i d a s e , b u t a 1 0 - f o l d d e c r e a s e i n o x i d a s e t o l i p i d r a t i o , s u g g e s t i n g a 1 0 - f o l d d e c r e a s e i n t h e p r o p o r t i o n o f e m p t y v e s i c l e s a n d t h e r e f o r e r e s u l t i n g i n t h e b a c k g r o u n d e f f e c t . B i o - b e a d s i n c r e a s e t h e v e s i c l e d i a m e t e r b y a b o u t t h r e e f o l d . P u r i fi e d v e s i c l e s b y N i - N T A s h o w e d a 2 5 % r e c o v e r y y i e l d o f t h e o x i d a s e c o n t a i n i n g C O V s , w h i c h i s m e a s u r e d b y t h e V m a x o f b o t h p u r i fi e d a n d fl o w - t h r o u g h v e s i c l e s , w i t h e x p e c t e d r e d u c t i o n i n e m p t y v e s i c l e s . F r o m t h e T E M ( t r a n s m i s s t i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ) m e a s u r e m e n t s , a 7 5 n m a v e r a g e d i a m e t e r o f t h e v e s i c l e s w a s d e t e r m i n e d . T h e i n t e r n a l v o l u m e o f a s i n g l e v e s i c l e m a d e b y t h e B i o - b e a d m e t h o d w a s e s t i m a t e d a t 1 . 4 x 1 0 ' 1 6 m L , w h i c h c a n h o l d 1 , 7 3 0 m o l e c u l e s o f p y r a n i n e d y e ( a s s u m i n g 2 0 m M fi n a l c o n c e n t r a t i o n ) ( F i g u r e 2 . 1 2 ) . T h e t o t a l n u m b e r o f v e s i c l e s i n c e l l ( 8 0 0 1 , O l i s s t o p p e d - f l o w ) w a s e s t i m a t e d f r o m t h e c o n c e n t r a t i o n o f C c O i n t h e m e m b r a n e , b e c a u s e e a c h 1 6 4 v e s i c l e m a y c o n t a i n 1 o r 2 C 0 0 w h e n i t i s p u r i fi e d b y N i - N T A . F r e e z e f r a c t u r e e l e c t r o n m i c r o s c o p y s h o w s a r e a s o n a b l y c o m p a r a b l e d i a m e t e r s i z e t o o u r C O V s a n d s u p p o r t s t h i s e s t i m a t i o n ( M a d d e n e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e u s e o f p H p r o b e , p y r a n i n e , a n d i t s a d v a n t a g e s i n a b s o r b a n c e m e a s u r e m e n t o v e r fl u o r e s c e n c e U s i n g a b s o r b a n c e a s a n a s s a y m e t h o d h a s t h e a d v a n t a g e o f e a s i e r q u a n t i t a t i o n t h a n fl u o r e s c e n c e . P y r a n i n e h a s a h i g h m o l a r e x t i n c t i o n c o e f fi c i e n t a n d t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e c a n b e p r e d i c t e d f r o m B e e r ’ s L a w , w h i c h i s i n d e p e n d e n t o f t h e s p e c t r o m e t e r o n w h i c h t h e m e a s u r e m e n t i s m a d e . H o w e v e r , fl u o r e s c e n c e h a s t h e a d v a n t a g e o f m u c h g r e a t e r s e n s i t i v i t y , a l t h o u g h q u a n t i t a t i o n o f t h e s i g n a l i s m u c h m o r e d i f fi c u l t . T h e l i m i t a t i o n t o u s i n g fl u o r e s c e n c e u n d e r o u r c o n d i t i o n s i s a t t r i b u t e d t o c o m p l i c a t i o n s o f c y t o c h r o m e c a b s o r b a n c e i n t e r f e r i n g w i t h t h e fl u o r e s c e n c e s i g n a l i n a n o n - l i n e a r w a y . P y r a n i n e , a s a p H p r o b e , h a s t h e a d v a n t a g e o f h i g h p o l a r i t y d u e t o t h r e e s u l f o n a t e g r o u p s , w h i c h m a k e s i t s u i t a b l e f o r e n t r a p m e n t i n l i p i d v e s i c l e s . T h e u s e o f p y r a n i n e i n t h e s t u d y o f k i n e t i c s a n d t h e s t o i c h i o m e t r y o f p r o t o n s / e l e c t r o n h a s b e e n i n v e s t i g a t e d f o r l i g h t - i n d u c e d p r o t o n r e l e a s e a n d u p t a k e o f t h e b a c t e r i o r h o d o p s i n ( G r z e s i e k 1 9 8 6 F E B S l e t t e r s ) . T h e a b s o r p t i o n c h a n g e s o f p y r a n i n e h a v e a l s o b e e n u s e d f o r p r o t o n k i n e t i c s i n b a c t e r i o r h o d o p s i n ( D i o u m a e v e t a l . , 1 9 9 8 ) . T h e s t u d i e s r e p o r t e d i n t h i s c h a p t e r s h o w e d s o m e s u c c e s s i n t h e u t i l i z i n g p y r a n i n e f o r i n t e r n a l p H m e a s u r e m e n t s i n c y t o c h r o m e o x i d a s e v e s i c l e s . N e v e r t h e l e s s , t h e r e s u l t s o f t h e s e s t u d i e s , a i m e d a t O p t i m i z i n g c o n d i t i o n s f o r i t s u s e i n c y t o c h r o m e o x i d a s e p u m p i n g m e a s u r e m e n t s , r a i s e d m a n y i s s u e s 1 6 5 r e g a r d i n g t h e c h a l l e n g e f o r t h e a c h i e v e m e n t o f h i g h s i g n a l t o n o i s e w h i c h w i l l b e e x p l o r e d f u r t h e r i n C h a p t e r 3 . 1 6 6 C h a p t e r 3 A p p l i c a t i o n a n d A n a l y s i s o f I n t e r n a l a n d E x t e r n a l p H C h a n g e s i n R e c o n s t i t u t e d C c O V e s i c l e s t o U n d e r s t a n d P r o t o n P a t h w a y s 3 . 1 . I n t r o d u c t i o n T o u n d e r s t a n d t h e r o l e o f p r o t o n p a t h w a y s d u r i n g t u r n o v e r , p r o t o n m o v e m e n t f r o m b o t h t h e i n s i d e a n d t h e o u t s i d e h a s t o b e m e a s u r e d a n d q u a n t i fi e d i n o r d e r t o c a l c u l a t e t h e r a t e a n d e x t e n t o f p r o t o n t r a n s l o c a t i o n . P r e v i o u s a t t e m p t s t o q u a n t i f y i n t e r n a l a n d e x t e r n a l p r o t o n m o v e m e n t s h a v e b e e n m a d e u n d e r s i n g l e t u r n o v e r c o n d i t i o n s ( F a x e n a n d B r z e z i n s k i , 2 0 0 7 ; F a x e n e t a l . , 2 0 0 5 ) . H o w e v e r , a m o r e p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n i n v o l v e s m a n y t u r n o v e r s ( Z 1 0 T N ) , w h e r e t h e r e i s t h e b u i l d u p o f a m e m b r a n e p o t e n t i a l , w h i c h i s o n e o f t h e c o n t r o l l i n g f a c t o r s o f C c O a c t i v i t y , a s i s o b s e r v e d i n m i t o c h o n d r i a . N o r e s e a r c h h a s y e t b e e n d o n e t o m e a s u r e p r o t o n m o v e m e n t , f r o m t h e i n s i d e a n d t h e o u t s i d e , a n d e l e c t r o n t r a n s f e r a t t h e s a m e t i m e w i t h m u l t i p l e t u r n o v e r s , d u e t o t e c h n i c a l d i f fi c u l t i e s , s u c h a s s h i f t s i n t h e p K a o f e n t r a p p e d d y e s , o r s c a t t e r i n g c a u s e d b y t h e s m a l l v e s i c l e s . T h e s i n g l e t u r n o v e r e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d o n C O V s w i t h p h e n o l r e d e n t r a p p e d i n s i d e b y F a x e n e t a 1 . ( F a x e n a n d B r z e z i n s k i , 2 0 0 7 ) g a v e s o m e i n t e r e s t i n g d a t a , b u t d i f f e r e n t C O V s h a d t o b e p r e p a r e d t o m e a s u r e o u t s i d e p H c h a n g e s . I n t h i s c h a p t e r , I d e s c r i b e t h e r e s u l t s o f u s i n g t h e t w o d y e m e t h o d w i t h v e s i c l e s o f a l a r g e r s i z e p r e p a r e d b y t h e B i o - b e a d p r o c e d u r e , f o l l o w e d b y a p u r i fi c a t i o n s t e p u s i n g a N i 2 + - N T A c o l u m n . B y i m p r o v i n g t h e v e s i c l e p r e p a r a t i o n c o n d i t i o n s , w e o b t a i n e d l a r g e r v e s i c l e s , a l l o w i n g m o r e o f t h e p H d y e t o b e t r a p p e d o n t h e i n s i d e , r e d u c i n g t h e b a c k g r o u n d n o i s e a n d t h e 1 6 7 s c a t t e r i n g e f f e c t s , w h i c h m a y b e a k e y l i m i t a t i o n o f o b t a i n i n g g o o d s i g n a l - t o - n o i s e r a t i o s . W h i l e s o m e t e c h n i c a l p r o b l e m s r e m a i n , t h e r e s u l t s p r o v i d e n e w i n s i g h t c o n c e r n i n g p r o t o n p u m p i n g a n d i t s r e g u l a t i o n . 3 . 2 . R e s u l t s 3 . 2 . 1 . R a w D a t a A n a l y s i s o f T h e W i l d T y p e C O V M e a s u r e m e n t s T h e s t o p p e d - fl o w t e c h n i q u e a l l o w s c a t a l y t i c t u r n o v e r ( c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n ) , p r o t o n u p t a k e , a n d p r o t o n r e l e a s e t o b e m e a s u r e d i n a m i l l i s e c o n d t i m e s c a l e o n b o t h t h e i n s i d e a n d o u t s i d e o f C O V s , w i t h d i f f e r e n t o p t i c a l s i g n a l s f o r e a c h . U n d e r t h e c o n d i t i o n s u s e d , f u l l o x i d a t i o n o f c y t o c h r o m e c w a s a c c o m p l i s h e d i n a f e w s e c o n d s . I n t h e s t o p p e d - fl o w , t h e f u l l s p e c t r u m o f a b s o r b a n c e c h a n g e s o v e r 3 6 5 n m t o 5 9 5 n m a r e r e c o r d e d i n 1 m s , w h i c h i n c l u d e s t h e s i g n a l s f r o m p y r a n i n e , p h e n o l r e d a n d c y t o c h r o m e c . T h e s e a r e s t o r e d d i g i t a l l y , a n d p r o c e s s e d , i n o r d e r t o g e t p r e c i s e s t a r t i n g p o i n t s o f t h e r e a c t i o n s w h i c h c a n b e o b s c u r e d b y m i x i n g a r t i f a c t s . C y t o c h r o m e c c a n b e m o n i t o r e d a t i t s m a x i m u m a b s o r b a n c e a t 5 5 0 n m , s h o w i n g a d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e o v e r t i m e a s i t b e c o m e s o x i d i z e d . T h e O l i s s t o p p e d - fl o w i s u s e d t o m e a s u r e t u r n o v e r i n m i l l i s e c o n d s t o s e c o n d s . T h i s d a t a c a n b e e a s i l y c o n v e r t e d t o e l e c t r o n s c o n s u m e d p e r C c O / s e c . T h e a b s o r p t i o n c o e f fi c i e n t o f 1 7 , 0 0 0 M ' l c m ' l a t 5 5 0 n m w a s u s e d f o r C c w i t h a b a n d p a t h o f 0 . 4 c m f o r t h e O L I S - r s m , a n d a 1 c m b a n d p a t h f o r t h e A p p l i e d P h o t o p h y s i c s s t o p p e d - fl o w c e l l . T h e a b s o r p t i o n s i g n a l c h a n g e s t h a t o c c u r d u r i n g t h e fi r s t f e w m i l l i s e c o n d o f m i x i n g , b u t d o n o t c o r r e s p o n d t o a c t u a l e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m c y t o c h r o m e c , a r e c o n s i d e r e d t o b e m i x i n g 1 6 8 a r t i f a c t s ( F i g u r e 3 . 1 A , B , C ) . T o fi n d t h e s t a r t i n g p o i n t o f z e r o t i m e a b s o r p t i o n f o r e a c h o f t h e d y e s t h e s i g n a l s o f e i t h e r c y t o c h r o m e c a n d p y r a n i n e , o r c y t o c h r o m e c a n d p h e n o l r e d w e r e p l o t t e d a g a i n s t e a c h o t h e r a n d t h e n fi t t e d b y a l i n e a r r e g r e s s i o n m e t h o d i n t h e O r i g i n P r o d a t a p r o c e s s i n g p r o g r a m ( F i g u r e 3 . 1 D , E , F , G , H , a n d I ) . I s o s b e s t i c p o i n t s w e r e s e l e c t e d f o r e a c h d y e t o e l i m i n a t e i n t e r f e r e n c e b y c y t o c h r o m e c d u r i n g t h e c a t a l y t i c c y c l e . T h e w a v e l e n g t h s o f 4 3 5 n m , f o r t h e p y r a n i n e s i g n a l , 5 5 7 n m f o r t h e p h e n o l r e d c h a n g e s , a n d 5 5 0 n m f o r t h e c y t o c h r o m e c a r e u s e d . T h e d a t a w a s a l i g n e d a f t e r p r o c e s s i n g t h e a r t i f a c t s o f t h e z e r o t i m e s i g n a l b y t h i s m e t h o d ( F i g u r e 3 . 2 ) . T h e c o n d i t i o n s f o r m e a s u r e m e n t o f a c t i v i t y o f C O V s w e r e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( S e c t i o n 2 . 2 . 2 ) ( F i g u r e 2 . 6 i n C h a p t e r 2 ) . T h e d a t a s h o w n i n F i g u r e 3 . 2 A , B , C s u p p o r t s t h e i d e a t h a t p r o t o n b a c k fl o w t h r o u g h t h e C 0 0 i s a l a r g e c o n t r i b u t o r t o t h e c o n t r o l l e d a c t i v i t y a s w e l l a s p r o t o n u p t a k e f r o m t h e i n s i d e , a s i n d i c a t e d b y t h e i n c r e a s e d a b s o r b a n c e a t 5 5 7 n m ( a l k a l i n i z a t i o n o n t h e o u t s i d e , F i g u r e 3 . 2 B ) a n d i n c r e a s e d a b s o r b a n c e a t 4 3 5 n m ( a l k a l i n i z a t i o n o n t h e i n s i d e , F i g u r e 3 . 2 C ) . Z i n c i s a n i n h i b i t o r o f C 0 0 , b o t h i n t h e p u r i fi e d e n z y m e a n d t h e r e c o n s t i t u t e d C O V s ( F i g u r e 3 . 2 D , E , F ) , a n d e s p e c i a l l y i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e , w h e r e b o t h a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d p r o t o n g r a d i e n t a r e m a i n t a i n e d . Z i n c i n h i b i t e d t h e r a t e s o f p r o t o n b a c k fl o w ( a l k a l i n i z a t i o n o n t h e o u t s i d e , F i g u r e 3 . 2 E ) a s w e l l a s u p t a k e f r o m t h e i n s i d e ( F i g u r e 3 . 2 F ) a s e x p e c t e d f o r t h e i n h i b i t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n ( T a b l e 3 . 1 ) , p a r t i c u l a r l y i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e . W e w i l l d i s c u s s t h e p o s s i b l e r o l e o f z i n c i n t e r m s o f i t s a f f e c t o n t h e b a c k fl o w o f p r o t o n s i n C O V s , i n S e c t i o n 3 . 2 . 3 . 1 6 9 F i g u r e 3 . 1 D a t a p r o c e s s i n g f o r z e r o t i m e s t a r i n g a b s o r b a n c e p o i n t s T o o b t a i n a m o r e r e l i a b l e z e r o t i m e a b s o r b a n c e p o i n t , o r i g i n a l d a t a s e t s , f o r c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n ( A ) , a n d p h e n o l r e d ( B ) o r p y r a n i n e ( C ) f r o m t h e O l i s s t o p p e d - fl o w m e a s u r e m e n t s , w e r e p r o c e s s e d b y u s i n g a c o r r e l a t i o n c u r v e fi t t i n g m e t h o d w h i c h p l o t s t h e a b s o r b a n c e c h a n g e s o f c y t o c h r o m e c a g a i n s t p y r a n i n e ( D , E & F ) o r p h e n o l r e d ( G , H & I ) o v e r t h e s a m e r e a c t i o n p e r i o d . T h e a b s o r p t i o n s i g n a l s , w h i c h d i d n o t c o r r e l a t e w i t h t h e e l e c t r o n c o n s u m p t i o n m e a s u r e d a t 5 5 0 n m , w e r e c o n s i d e r e d t o b e m i x i n g a r t i f a c t s . C o r r e l a t i o n c u r v e s w e r e fi t t e d b y O r i g i n P r o , u s i n g a l i n e a r r e g r e s s i o n m e t h o d . T h e i s o s b e s t i c w a v e l e n g t h o f c y t o c h r o m e c a t 4 3 5 n m w a s s e l e c t e d i n o r d e r t o m o n i t o r c h a n g e s i n p y r a n i n e a b s o r b a n c e o n t h e i n s i d e o f t h e C O V s . A w a v e l e n g t h o f 5 5 7 n m , i s o s b e s t i c f o r c y t o c h r o m e c , w a s s e l e c t e d f o r p h e n o l r e d a b s o r b a n c e c h a n g e s o n t h e o u t s i d e . 1 7 0 f I J l ) . - I I I ‘ 2 v , ‘ _ ‘ , ) n ” ” ' 5 4 i ‘ c 3 d d e y “ , t e l . l \ R o r l o n t n o e c h n P U " 4 1 . ’ / , _ , , \ ' / V- 5 3 1 n i s e y D . s v m o n i c l C a \ ( g n i t t i f I { \ \ - 1 . - . 0 5 0 0 1 1 n 0 0 . o ' . 0 . 0 - o t - E c i 4 < n o l t a l e r r o c e c n a b r o d s e e b l g A l n i f o n r ‘ a t r n y o P C - 4 0 0 . 0 f i I - n 3 R a w d a t a s e t 8 ' . N o o q u O S S l V V 0 : c o n t r o l l e d V : + v a l i n o m y c l n . U : u n c o n t r o l l e d 1 7 1 M i m u o o m u s e » v v 0 = d i v ( u n s e t ) v o u u o o u n ( m u s c r l v T i m e ( o o c ) . 0 . 5 0 . 0 0 2 1 . 1 , « l ' - \ f 1 0 . 0 0 4 o c o o n 6 6 V P y r a n i n e V a l i n o m y c i n - 0 . 0 0 2 p . ' = 0 . 0 0 4 . N O O O P y r a n i n e U n c o n t r o l l e d 1 1 / 0 . 0 0 2 0 0 . 0 1 A A ( 5 5 0 n m ) - P h e n o l R e d C o n t r o l l e d 1 " . J . 1 1 ( G ) P h e n o l R e d ' O \ \ _ ( I ) 0 . 0 3 0 . 0 1 0 . 0 2 A A ( 5 5 0 n m ) ) N o Z i n c 1 0 0 M Z i n c 0 . 0 3 5 - C : c o n t r o l l e d I 0 . 0 3 0 - V : + v a l i n o m y c i n . ’ € 0 . 0 2 5 - U : u n c o n t r o l l e d o 0 . 0 2 0 . v 0 . 0 1 5 ~ < 0 . 0 1 0 A A ( 4 3 5 n m 0 . 0 - 0 : 5 ' 1 1 0 1 1 5 ' 0 . 0 0 3 1 . 0 1 . ' 5 2 . 0 T i m e ( s e e ) T i m e ( s e e ) F i g u r e 3 . 2 A p r o c e s s e d d a t a s e t w i t h t h e a r t i f a c t s e l i m i n a t e d f r o m t h e s i g n a l s b y u s i n g a c o r r e l a t i o n p l o t . C o n t r o l l e d s t a t e ( b l a c k l i n e ) , p u m p i n g s t a t e w i t h 2 1 1 M v a l i n o m y c i n ( b l u e ) , a n d u n c o n t r o l l e d s t a t e w i t h v a l i n o m y c i n + l u M F C C P ( r e d ) ( A , B & C ) w e r e c o m p a r e d t o t h e n o r m a l c o n d i t i o n w i t h o u t z i n c o n t h e o u t s i d e . T h e i n h i b i t i o n o f C O V a c t i v i t y w a s o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f l O O u M z i n c ( D , E & F ) . 1 7 2 C o n t r o l l e d E v e l i n o m y c i n U n c o n t r o l l e d R C R W T 7 6 1 0 . 4 2 1 7 1 2 . 8 3 1 3 1 5 . 5 4 . 1 W T + Z i n c 3 9 1 0 . 4 1 6 6 1 2 . 2 2 3 8 1 2 . 9 6 . 1 T a b l e 3 . 1 M e a s u r e m e n t o f C c O a c t i v i t y i n C O V s p r e p a r e d b y t h e B i o - b e a d m e t h o d . M e a s u r e m e n t o f C 0 0 a c t i v i t y i n C O V s p r e p a r e d b y t h e B i o - b e a d m e t h o d i n 2 0 m M H E P E S - K O H + 3 9 m M K C l + 5 2 m M s u c r o s e , p H 7 . 4 o n t h e i n s i d e . C O V s ( 0 . 1 u M a a 3 fi n a l c o n c e n t r a t i o n ) w e r e m i x e d i n t h e O l i s - r s m s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t w i t h 5 1 1 M c y t o c h r o m e c 2 + i n 5 0 1 1 M H E P E S - K O H + 4 5 m M K C l , p H 7 . 4 i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 0 0 0 M z i n c w i t h w i l d t y p e C O V s . R a t e s o f o x i d a t i o n w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e k i n e t i c t r a c e s a t 5 5 0 n m w i t h a n a v e r a g e o f t h r e e d a t a s e t s f o r e a c h c o n d i t i o n ( F i g u r e 3 . 2 ) . 1 7 3 3 . 2 . 2 . Q u a n t i t a t i v e A n a l y s i s o f D a t a f r o m S t o p p e d - F l o w P r o t o n p u m p i n g e f fi c i e n c y ( H + p u m p e d / e ' ) c a n b e c a l c u l a t e d f r o m t h e t u r n o v e r r a t e , w h i c h i s m e a s u r e d b y t h e c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n r a t e ( e l e c t r o n c o n s u m p t i o n r a t e ) a n d t h e r a t e o f p r o t o n r e l e a s e o n t h e o u t s i d e ( p u m p e d p r o t o n s ) i n o r d e r t o o b t a i n t h e s t o i c h i o m e t r y , o r b y t h e a m o u n t o f p r o t o n s r e l e a s e d c o m p a r e d t o t h e a m o u n t o f e l e c t r o n s c o n s u m e d . T h e r a t e o r a m o u n t o f p r o t o n r e l e a s e t o t h e o u t s i d e i s m e a s u r e d a t a n a b s o r b a n c e o f 5 5 7 n m w i t h t h e p h e n o l r e d d y e o n t h e o u t s i d e . A t t h i s i s o s b e s t i c w a v e l e n g t h , t h e a b s o r b a n c e o f c y t o c h r o m e c d o e s n o t c h a n g e d u r i n g t h e c a t a l y t i c r e a c t i o n . I n o r d e r t o c a l c u l a t e t h e H + / e ' s t o i c h i o m e t r y u s i n g p h e n o l r e d a s t h e p H p r o b e , t h e a m p l i t u d e o f a c i d i fi c a t i o n o f p h e n o l r e d o n t h e o u t s i d e w i t h v a l i n o m y c i n a d d e d , i s d i v i d e d b y t h e a m p l i t u d e o f t h e a l k a l i n i z a t i o n o b s e r v e d a t t h e s a m e w a v e l e n g t h w h e n F C C P ( c a r b o n y l c y a n i d e 4 - ( t r i fl u o r o m e t h o x y ) p h e n l y h y d r a z i n e ) i s a d d e d . F C C P a l l o w s t h e p r o t o n s t o e q u i l i b r a t e a c r o s s t h e m e m b r a n e s o t h a t n o p u m p i n g i s o b s e r v e d , o n l y t h e n e t c o n s u m p t i o n o f p r o t o n s , s e e n a s a n a l k a l i n i z a t i o n o f t h e o u t s i d e . T h e n u m b e r o f p r o t o n s c o n s u m e d o n t h e i n s i d e f o r t h e o x y g e n c h e m i s t r y c o r r e s p o n d s t o a 1 H + / e ’ s t o i c h i o m e t r y , p r o v i d i n g a n i n t e r n a l s t a n d a r d . T h e p h e n o l r e d a b s o r b a n c e a m p l i t u d e s w i t h w i l d - t y p e C c O o f t e n s h o w 1 , o r l e s s t h a n 1 H + / e ' , d u r i n g p r o t o n p u m p i n g ( F i g u r e 3 . 2 B / T a b l e 3 . 2 T o p ) . H o w e v e r , w h e n t h e r a t e s o f p u m p i n g , i n s t e a d o f a m p l i t u d e s , a r e a n a l y z e d d u r i n g t h e t i m e - f r a m e o f t h e e l e c t r o n c o n s u m p t i o n ( F i g u r e 3 . 3 a n d T a b l e 3 . 2 b o t t o m ) a 1 : 1 s t o i c h i o m e t r y ( H + / e ' ) o f p u m p i n g i s o b s e r v e d . 1 7 4 Q u a n t i fi c a t i o n o f t h e a m o u n t o f p r o t o n s t a k e n u p f r o m t h e i n s i d e o f t h e v e s i c l e s d u r i n g t h e c a t a l y t i c r e a c t i o n w a s a t t e m p t e d , u s i n g t h e s a m e i n t e r n a l s t a n d a r d c o n d i t i o n s a s w e r e u s e d w i t h p h e n o l r e d . I n t h e u n c o n t r o l l e d c o n d i t i o n , w i t h b o t h F C C P a n d v a l i n o m y c i n p r e s e n t , t h e r e i s c o m p l e t e e q u i l i b r i u m o f t h e p r o t o n c o n c e n t r a t i o n b e t w e e n t h e i n s i d e a n d t h e o u t s i d e . A s s u m i n g a l H " / e ' s t o i c h i o m e t r y u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , t h e i n t e r n a l p r o t o n c h a n g e s c a n b e q u a n t i fi e d b a s e d o n t h e i r a b s o r p t i o n a m p l i t u d e c h a n g e ( F i g u r e 3 . 3 ) . I n t h i s w a y , t h e s e m i - q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f c o u p l i n g b e t w e e n p r o t o n m o v e m e n t a n d e l e c t r o n c o n s u m p t i o n w a s o b t a i n e d ( T a b l e 3 . 2 t o p ) . T h e c a l c u l a t e d v a l u e s w e r e r e a s o n a b l e e x c e p t t h e c o n t r o l l e d s t a t e , w h e r e t h e s u m o f t h e p r o t o n s c o n s u m e d o n b o t h s i d e s o f t h e m e m b r a n e i s a p p a r e n t l y m u c h g r e a t e r t h a n t h e e x p e c t e d 1 H + / e ' , a s i f t h e t w o c o m p a r t m e n t s w e r e i n e q u i l i b r i u m ( s e e D i s c u s s i o n ) . A n a l t e r n a t i v e m e t h o d o f q u a n t i fi c a t i o n h a s b e e n d e v e l o p e d i n o r d e r t o o b t a i n a m o r e a c c u r a t e e s t i m a t i o n o f t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e i n i t i a l p r o t o n a n d e l e c t r o n c o u p l i n g ; d u r i n g t h e c a t a l y t i c r e a c t i o n , b y c o m p a r i n g r a t e s o f e l e c t r o n c o n s u m p t i o n ( c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n ) w i t h r a t e s o f p r o t o n - l i n k e d a b s o r b a n c e c h a n g e s o n b o t h t h e i n s i d e a n d o u t s i d e o f C O V s ( F i g u r e 3 . 3 D , E a n d F ) . T h e r a t e o f e l e c t r o n c o n s u m p t i o n d u r i n g t h e r e a c t i o n ( e ' / s e c , f r o m t h e a b s o r b a n c e c h a n g e s o f c y t o c h r o m e c m e a s u r e d a t 5 5 0 n m ) w a s p l o t t e d a g a i n s t t h e r a t e o f p r o t o n c o n s u m p t i o n ( H + / s e c ) a s m e a s u r e d b y a b s o r b a n c e c h a n g e s c a l i b r a t e d t o t h e u n c o n t r o l l e d c o n d i t i o n a s d e s c r i b e d a b o v e . T h e s l o p e o f t h e p l o t t e d g r a p h g i v e s t h e s t o i c h i o m e t r y b e t w e e n p r o t o n s a n d e l e c t r o n s ( H + / e ’ ) c o n s u m e d d u r i n g c a t a l y t i c t u r n o v e r s ( F i g u r e 3 . 3 D , E , F I T a b l e 3 . 2 ) . 1 7 5 ) d e l l o r t n o c n u ( c e s I P R e a c t i o n E n d p o i n t e ‘ l s e c v s . H ’ l s e c 0 . 0 3 5 1 C : c o n t r o l l e d 0 . 0 3 0 ‘ V : + v a l i n o m y c i n E 0 0 2 5 ‘ U : u n c o n t r o l l e d P y r a n i n e ” a ? " I ? ? ? “ - 2 0 - 7 P h e n o l R e d H ’ l s e c ( c o n t r o l l e d ) 0 C o n t r o l l e d ( D ) “ I P y r a n i n e “ I . 4 0 - . o ' " P h e n o l R e d - 2 0 - , I , . A “ H ‘ I s e c ( A ‘ l ’ = 0 ) O ( B ) ' 5 ° ‘ V a l i n o m y c i n ( E ) ' : I - x . 6 . , . I , ~ . - I - " a ” . . P y r a n i n e o o o 0 0 ' ° " ’ ‘ 2 0 - o ' ' P h e n o l R e d O F C C P ( F ) 0 . 0 0 3 5 1 : 0 1 1 5 1 ' 0 2 ' 0 3 ' 0 4 0 T i m e ( s e c ) e ‘ l s e c H 1 5 0 o 0 F i g u r e 3 . 3 S e m i - q u a n t i t a t i v e a n a l y s e s o f d a t a f r o m t h e O l i s - r s m s t o p p e d - fl o w m e a s u r e m e n t s . T h e s t o i c h i o m e t r y ( H + / e ' ) i s a m e a s u r e o f t h e e f fi c i e n c y o f r e c o n s t i t u t e d C c O i n t h e v e s i c l e s a n d w a s o b t a i n e d f r o m t h e i n t e r n a l s t a n d a r d c o n d i t i o n , t h e u n c o n t r o l l e d s t a t e . T h e e n d p o i n t o f t h e r e a c t i o n i n e a c h s t a t e w a s s e t t o 4 0 e l e c t r o n s c o n s u m e d a s d e t e r m i n e d f r o m t h e c y t o c h r o m e c c o m p l e t e o x i d a t i o n . T h a t e n d p o i n t i n t h e u n c o n t r o l l e d r e a c t i o n , g i v e s t h e a b s o l u t e c h a n g e i n p y r a n i n e a n d p h e n o l r e d t h a t r e p r e s e n t s 1 H + / e ’ c o n s u m e d . T h e r a t e o f e l e c t r o n c o n s u m p t i o n ( e ' / s e c ) c a n b e m e a s u r e d f r o m t h e 5 5 0 n m a b s o r b a n c e a n d u s e d a s a l t e r n a t i v e w a y o f q u a n t i fi c a t i o n , b y p l o t t i n g t h i s a g a i n s t H + / s e c , m e a s u r e d b y a b s o r b a n c e c h a n g e s o f t h e p H s e n s i t i v e d y e s . T h e s l o p e s fi ' o m t h e c o r r e l a t i o n p l o t s w e r e u s e d t o o b t a i n t h e s t o i c h i o m e t r y , w h i c h s h o w s t h e i n i t i a l r e a c t i o n d u r i n g t h e c a t a l y t i c t u r n o v e r . 1 7 6 E n d p o i n t o f r e a c t i o n ( A , B a n d C o f F i _ g y r e 3 . 3 ) I N S I D E ( P y r a n i n e ) O U T S I D E ( P h e n o l R e d ) u p t a k e p u m p i n g b a c k fl o w C o n t r o l l e d - 1 . 0 + 0 . 2 - 1 . 0 C o n t r o l l e d + z i n c - 0 . 9 + 0 . 2 - O . 4 + V a | i n o m y c i n - 2 . 0 + 0 . 5 - 0 . 2 + V a | i n o m y c i n + z i n c - 2 . 0 + 0 . 7 0 ( 3 7 : 3 3 7 3 2 ' 1 1 2 , m o 1 0 e ' l s e c v s . H * I s e c ( D , E a n d F o f F i g u r e 3 . 3 ) C o n t r o l l e d - 1 . 1 1 0 . 1 N I D - 1 . 1 1 0 . 1 C o n t r o l l e d + z i n c - 1 . 2 : 0 . 1 N I D - O . 5 1 0 . 1 + V a | i n o m y c i n 2 2 1 0 . 2 + 1 . 0 1 0 . 1 N I D + V a | i n o m y c i n + 2 i n c - 2 . 5 1 0 . 2 + 1 . 1 1 0 . 1 N I D U n c o n t r o l l e d - 0 . 8 8 1 0 . 1 N I D 0 8 1 0 . 1 U n c o n t r o l l e d + z i n c - 1 . 5 : 0 . 1 N / D - 1 . 1 1 0 . 1 T a b l e 3 . 2 T h e s t o i c h i o m e t r y t a b l e o f H + / e ’ d u r i n g t u r n o v e r s h o w i n g p r o t o n u p t a k e , p r o t o n b a c k fl o w a n d p r o t o n p u m p i n g w i t h o r w i t h o u t z i n c . F i r s t , t h e a m p l i t u d e a t t h e e n d p o i n t o f t h e fi t t e d r e a c t i o n i n t h e u n c o n t r o l l e d s t a t e ( F i g u r e 3 . 3 B & C ) w a s u s e d a s a s t a n d a r d ( 1 H + / e ' ) f o r c o m p a r i s o n w i t h t h e o t h e r fi t t e d c o n d i t i o n s , c o n t r o l l e d a n d + v a l i n o m y c i n . A l t e r n a t i v e l y , t h e d i r e c t e l e c t r o n c o n s u m p t i o n r a t e ( e ' / s e c ) w a s u s e d w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g p r o t o n c o n s u m p t i o n r a t e ( H + / s e c ) . T h e s l o p e s o f t h e c o r r e l a t i o n p l o t s ( F i g u r e 3 . 3 D , E & F ) w e r e o b t a i n e d a n d p r o d u c e d t h e r e a c t i o n s t o i c h i o m e t r y ( H + / e ' ) d u r i n g t u r n o v e r . R e d c o l o r i n d i c a t e s t h e l o s s o f p r o t o n s e i t h e r o n t h e i n s i d e o r t h e o u t s i d e . B l u e c o l o r i n d i c a t e s t h e g a i n o f p r o t o n s o n t h e o u t s i d e . N / D = n o t d e t e r m i n e d 1 7 7 T h e l i n e a r fi t t i n g r a n g e w a s r e s t r i c t e d t o t h e fi r s t 5 t u r n o v e r s , i n o r d e r t o p r e v e n t a l i m i t a t i o n d u e t o p o s s i b l e i n s u f fi c i e n t p r o t o n s u p p l y f r o m t h e v e s i c l e i n t e r i o r . F o r e x a m p l e , i n t h e p u m p i n g c o n d i t i o n w i t h v a l i n o m y c i n ( A ‘ I ’ = 0 ) , t h e s t o i c h i o m e t r y ( H ‘ V e ' ) , w h i c h w a s o b t a i n e d f r o m t h e s l o p e i n t h e d a t a a n a l y s i s , w a s n o l o n g e r l i n e a r a f t e r 5 t u r n o v e r s ( h a l f o f t h e r e a c t i o n ) . U n d e r a c t i v e p u m p i n g , t w i c e t h e a m o u n t o f p r o t o n s w a s t a k e n u p f r o m t h e i n t e r i o r , f o r o x y g e n r e d u c t i o n a n d f o r p r o t o n p u m p i n g . T h e o n e z o n e r e l a t i o n s h i p o f H + / e ' w a s r e s t o r e d b y a d d i t i o n o f F C C P , a l l o w i n g t h e p r o t o n s t o b e f u l l y e q u i l i b r a t e d a c r o s s t h e m e m b r a n e . I n t e r e s t i n g l y , i t w a s o b s e r v e d t h a t t h e r e w a s b o t h a b i p h a s i c f a s t a n d s l o w p r o t o n c o n s u m p t i o n r a t e i n t h e c o n t r o l l e d c o n d i t i o n d u r i n g t h e i n i t i a l p a r t o f t h e r e a c t i o n ( F i g u r e 3 . 3 B a n d D ) . T h i s t r a n s i t i o n p o i n t c o r r e s p o n d e d t o t h e fi r s t t u r n o v e r i n t h e r e a c t i o n ( 4 e l e c t r o n s , 4 p r o t o n s a n d o n e m o l e c u l e o f 0 2 w e r e c o n s u m e d p e r C c O ) . T h i s s u g g e s t s t h a t p r o t o n s c o u l d b e p u m p e d t o t h e o u t s i d e i n t h e i n i t i a l p h a s e o f t h e c o n t r o l l e d s t a t e b e f o r e a m e m b r a n e p o t e n t i a l w a s e s t a b l i s h e d d u r i n g a s i n g l e t u r n o v e r ( F i g u r e 3 . 4 ) . T h e r e f o r e , t h e s t o i c h i o m e t r y o f H + / e ' i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e ( w i t h a m e m b r a n e p o t e n t i a l ) w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e d a t a fi t t i n g a f t e r 1 f u l l t u r n o v e r . A s i g n i fi c a n t a m o u n t o f b a c k fl o w o f p r o t o n s f r o m t h e o u t s i d e t o t h e i n s i d e , o b s e r v e d a s a l k a l i n i z a t i o n o n t h e o u t s i d e , w a s m e a s u r e d i n t h e s e m i - q u a n t i t a t i v e a n a l y s e s i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e ( T a b l e 3 . 2 ) . T h i s p r o t o n b a c k fl o w w a s i n h i b i t e d b y t h e a d d i t i o n o f z i n c o n t h e o u t s i d e o f C O V s , e s p e c i a l l y i n t h e c o n t r o l l e d c o n d i t i o n , i n t h e a b s e n c e o f i o n o p h o r e s . T h i s r e s u l t w a s c o n s i s t e n t w i t h a p r e v i o u s r e p o r t i n d i c a t i n g t h e e x i s t e n c e o f p r o t o n b a c k fl o w u n d e r a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d p r o t o n g r a d i e n t ( M i l l s e t a l . , 2 0 0 2 ) 1 7 8 w h i c h r e s u l t e d i n ~ 5 0 % i n h i b i t i o n o f a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f z i n c . T h e p r o t o n b a c k fl o w o n t h e o u t s i d e , d u r i n g p r o t o n p u m p i n g , i s d i f fi c u l t t o m e a s u r e b e c a u s e t h e p r o t o n b a c k fl o w c o m p e t e s w i t h t h e p r o t o n p u m p i n g ( p r o t o n r e l e a s e o n t h e o u t s i d e ) d u r i n g t u r n o v e r . T h e s t o i c h i o m e t r y o f p r o t o n p u m p i n g w a s v a r i a b l e , f r o m 0 . 5 H + / e ' t o 1 H + / e ’ . I n t h e p r e s e n c e o f z i n c , t h e p r o t o n p u m p i n g s t o i c h i o m e t r y s e e m e d t o i n c r e a s e ( f r o m 0 . 5 t o 0 . 7 o r f r o m 1 . 0 t o 1 . 1 ) , p o s s i b l y b e c a u s e t h e b i n d i n g o f z i n c i n h i b i t s t h e b a c k fl o w p a t h w a y l e a d i n g t o a n a p p a r e n t i n c r e a s e i n n e t p u m p i n g . 1 7 9 ) m n 5 3 4 ( A A . 1 “ _ / " U n 1 0 ‘ 1 ( " H f 0 . 0 3 _ I 3 v 0 0 . . 0 . 0 ) m o n o 5 3 o 4 ( o ' ' . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 A o o b 3 3 1 O c o n t r o l l g e M d M ¢ ¢ H W . . 0 0 1 l ’ ' P Y r ‘ a . ” . I n ( . i C I f ~ + J n e ) m n 7 5 5 ( A A ) . 0 1 . ’ 0 0 1 7 6 5 4 : 1 1 1 3 1 . , 3 ” i 0 A p oo' ’ 5 : E W P h C o e n n t O r I o R l l e e d d 1 6 2 3 4 5 7 8 9 1 0 0 . 0 5 C h ' d I 2 . 0 . 0 4 . 1 y t o c r o m e C O X I a t l o n E £ 0 3 3 1 ~ _ I I c o n t r o l I e d 5 3 . 0 . 0 2 - 4 0 . 0 1 : . ( A ) 0 . 0 0 . ‘ " 0 ' 0 4 ? P h e n o l R e d 0 . 0 2 . c o n t r o l l e d P y r a n i n e C o n t r o l l e d ( D ) . . ‘ . I - r 0 . 0 2 - - 0 . 0 2 1 ( B ) 1 5 6 a 0 . 0 1 - 0 . 0 0 - 1 1 m e ( z e d ) E l e c t r o n s ( t u r n o v e r s ) F i g u r e 3 . 4 C o r r e l a t i o n o f t h e c o n t r o l l e d s t a t e p r o t o n m o v e m e n t s f r o m t h e i n s i d e a n d o u t s i d e o f C O V s w i t h p y r a n i n e ( t o p p a n e l ) o r p h e n o l r e d ( b o t t o m p a n e l ) . T h e b i p h a s i c f a s t a n d s l o w p r o t o n c o n s u m p t i o n r a t e s w e r e o b s e r v e d f r o m t h e i n s i d e a f t e r 1 t u r n o v e r ( A ) b l u e d a s h e d l i n e . P r o t o n p u m p i n g w a s o b s e r v e d u n t i l t h e r e a c t i o n r e a c h e d 1 t u r n o v e r b e f o r e t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l w a s b u i l t u p a t ~ 1 t u r n o v e r , ( B ) . T h i s g r a p h w a s o b t a i n e d f r o m a d i f f e r e n t s e t o f r e s u l t s w h i c h s h o w s a s l o w e r o x i d a t i o n r a t e o f c y t o c h r o m e c . A s t h e r e a c t i o n s l o w e d , t h e r a t e o f t h e t r a n s i t i o n d u e t o t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l w a s s h o w n m o r e c l e a r l y . 1 8 0 3 . 2 . 3 . E x i t ! B a c k f l o w S t u d y o f C c O w i t h Z i n c C y t o c h r o m e c o x i d a s e ( C c O ) t r a n s f e r s p r o t o n s f r o m t h e i n n e r s u r f a c e o f t h e e n z y m e t o t h e 0 2 r e d u c t i o n s i t e t h r o u g h t w o d i f f e r e n t p r o t o n p a t h w a y s , t h e K a n d D p a t h s . T h e s e p a t h w a y s c a n b e i n h i b i t e d b y m e t a l s s u c h a s z i n c , c a d m i u m , o r n i c k e l . R e c e n t s t u d i e s o n p u r i fi e d R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s C c O s h o w b o t h h i g h a n d l o w a f fi n i t y b i n d i n g s i t e s f o r Z n 2 + ( A a g a a r d a n d B r z e z i n s k i , 2 0 0 1 ) , w h i c h r e s u l t i n i n h i b i t i o n o f i n t e r m e d i a t e r e a c t i o n s t e p s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e t h a t a r e a s s o c i a t e d w i t h p r o t o n p u m p i n g , s u g g e s t i n g t h a t t h e z i n c i n h i b i t s p r o t o n u p t a k e t h r o u g h t h e D - p a t h w a y w h e r e s e v e r a l c a r b o x y l a t e s a n d h i s t i d i n e r e s i d u e s a r e f o u n d t h a t m a y c o - o r d i n a t e Z n 2 + . R e c e n t l y , a h i g h r e s o l u t i o n s t r u c t u r e o f C c O , w i t h c a d m i u m a d d e d , r e v e a l e d m e t a l b i n d i n g s i t e s o n p r o t o n d o n o r / a c c e p t o r s a t t h e e n t r a n c e o f t h e K - p a t h w a y ( Q i n e t a l . , 2 0 0 7 ) . A m u t a n t o f C c O t h a t l a c k s g l u t a m a t e ( E 1 0 1 ) a n d h i s t i d i n e ( H 9 6 ) e l i m i n a t e d m e t a l b i n d i n g a t t h i s s i t e . A n a d d i t i o n a l z i n c i n h i b i t i o n s i t e i s o b s e r v e d i n t h e r e c o n s t i t u t e d C c O v e s i c l e s , i n w h i c h a d d i t i o n o f z i n c t o t h e o u t s i d e s u r f a c e c a u s e s i n h i b i t i o n w i t h h i g h a f f i n i t y ( K 1 3 5 M ) i n t h e p r e s e n c e o f a m e m b r a n e p o t e n t i a l ( M i l l s e t a l . , 2 0 0 2 ) . F i n d i n g t h e l o c a t i o n o f p o t e n t i a l m e t a l b i n d i n g s i t e s i s d i f fi c u l t b e c a u s e i t a p p e a r s t h a t t w o o f t h e m e t a l c o o r d i n a t i n g l i g a n d s , s u c h a s h i s t i d i n e o r c a r b o x y l r e s i d u e s , m u s t b o t h b e e l i m i n a t e d t o p r e v e n t z i n c b i n d i n g . T h e s u b u n i t [ l l - d e p l e t e d d o u b l e m u t a n t , H 9 6 A / E 1 0 1 A i n t h e K - p a t h w a y , w h i c h h a s a l t e r e d b o t h D ( b y s u b u n i t H I r e m o v a l ) a n d K p a t h w a y s , i s n o t i n h i b i t e d b y z i n c w h e n a d d e d t o t h e p u r i f i e d e n z y m e , b u t i t i s s t i l l i n h i b i t e d b y t h e a d d i t i o n o f z i n c t o t h e o u t s i d e o f t h e C O V s ( F i g u r e 3 . 5 ) . T h i s r e s u l t 1 8 1 s u b s t a n t i a t e s t h e c o n c l u s i o n t h a t t h e r e i s a z i n c - b i n d i n g s i t e o n t h e e x t e r n a l s u r f a c e ( P s i d e ) o f t h e o x i d a s e t h a t i s s t r o n g l y i n h i b i t o r y i n t h e p r e s e n c e o f a m e m b r a n e p o t e n t i a l ( A W , n e g a t i v e i n s i d e ) a n d a p H g r a d i e n t . W h e n m i c r o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f z i n c i n h i b i t t h e e n z y m e a c t i v i t y i n r e c o n s t i t u t e d v e s i c l e s , a d r a m a t i c i n c r e a s e i n t h e r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o ( R C R ) i s o f t e n o b s e r v e d d u e t o d i f f e r e n t i a l i n h i b i t i o n o f t h e c o n t r o l l e d s t a t e . T h e f a c t t h a t a l o w c o n c e n t r a t i o n o f z i n c i n h i b i t s t h e c o n t r o l l e d r a t e o f C O V s u n d e r a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l g r a d i e n t p r o v i d e s e v i d e n c e f o r a s p e c i fi c p r o t o n b a c k fl o w p a t h w a y l e a d i n g t o t h e a c t i v e s i t e f r o m t h e o u t e r s u r f a c e ( M i l l s a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 2 0 0 2 a ) . I t m a y b e t h a t t h i s z i n c - i n h i b i t e d b a c k fl o w o f p r o t o n s o c c u r s b y r e v e r s a l o f t h e n o r m a l e x i t p a t h w a y f o r t h e p r o t o n p u m p , o r b y a n i n d e p e n d e n t p a t h w a y . T h e r e s u l t s s h o w n h e r e w i t h t h e w i l d - t y p e e n z y m e ( F i g u r e 3 . 2 ) a r e a g o o d e x a m p l e o f t h e z i n c i n h i b i t i o n e f f e c t . Z i n c b i n d i n g e f fi c i e n t l y i n h i b i t e d t h e r a t e o f p r o t o n b a c k fl o w , s e e n a s a s l o w e r r a t e o f a l k a l i n i z a t i o n o n t h e o u t s i d e ( F i g u r e 3 . 2 E , c o n t r o l l e d ) a l o n g w i t h t h e i n h i b i t e d r a t e o f p r o t o n u p t a k e f r o m t h e i n s i d e ( F i g u r e 3 . 2 F , c o n t r o l l e d ) . T h e b i n d i n g o f z i n c t o t h e o u t s i d e s h o w e d a s i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n o f a c t i v i t y , b u t o n l y i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e , s u p p o r t i n g t h e r o l e o f z i n c a s a n i n h i b i t o r o f t h e b a c k fl o w p a t h w a y . O t h e r m u t a n t s ( E 1 0 1 A , R 4 8 1 K , R 4 8 1 K / D 1 3 2 A ) w i t h t h e a b i l i t y t o a f f e c t t h e p r o t o n b a c k fl o w p a t h w a y w e r e s t u d i e d b y r e c o n s t i t u t i o n o f C c O i n t o C O V s b y t h e B i o b e a d m e t h o d a n d w i t h f u r t h e r p u r i fi c a t i o n . H o w e v e r , n o n e o f t h e s e w e r e a b l e t o p r o d u c e a d e q u a t e d a t a i n t h e s t o p p e d fl o w p H a n a l y s i s . T h e r e a s o n f o r t h i s i s u n c e r t a i n , b u t m a y b e d u e t o t h e l o w a c t i v i t y o f m o s t o f t h e m u t a n t C O V s u s e d . 1 8 2 F i g u r e 3 . 5 T h e e f f e c t o f z i n c b i n d i n g o n t h e o u t s i d e o f C O V s . M e a s u r e m e n t o f C O V a c t i v i t y p r e p a r e d b y t h e c h o l a t e d i a l y s i s m e t h o d i n 5 0 m M H E P E S - K O H + 2 4 m M K C ] , p H 7 . 4 . C O V s ( 0 . 1 u M a a 3 fi n a l c o n c e n t r a t i o n ) w e r e m i x e d i n t h e O l i s - r s m s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t w i t h 5 u M c y t o c h r o m e c 2 + i n S O u M H E P E S - K O H + 4 5 m M K C ] , p H 7 . 4 i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f l O O u M z i n c w i t h w i l d t y p e C O V s a n d H 9 6 A / E l O l A s u b [ [ 1 ( — ) C O V s . T h e i n t e r n a l z i n c b i n d i n g s i t e w a s e l i m i n a t e d b y a d o u b l e m u t a t i o n i n t h e a b s e n c e o f s u b u n i t H I . W h e n t h e m u t a n t w a s r e c o n s t i t u t e d , z i n c i n h i b i t i o n w a s o b s e r v e d b y t h e b i n d i n g o f z i n c o n t h e s u r f a c e o f C O V s , e s p e c i a l l y u n d e r a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l ( c o n t r o l l e d s t a t e s h o w n , b l a c k l i n e ) . » 1 8 3 0 . 1 0 4 W I ' C : c o n t r o l l e d 0 , 0 7 - H 9 6 A / E 1 0 1 A S u b l l l ( - ) A 0 . 0 3 . V : + v a l i n o m y c i n 0 - 0 5 ‘ E U : u n c o n t r o l l e d ” 5 ‘ § 0 . 0 6 ~ \ \ 0 . 0 4 - C a 0 . 0 4 , I \ 0 . 0 3 - ’ 1 . : 5 0 0 2 f 0 . 0 2 - , V \ ' ‘ 0 . 0 1 - ’ \ ~ . U . 0 . 0 0 - 0 - 0 0 - \ “ k . , . , ( 9 ) 0 - 0 7 ‘ 0 - 0 7 ‘ H 9 6 A / E 1 0 1 A S u b l l l ( — ) 0 . 0 6 - 0 . 0 6 1 + Z i n c E 0 . 0 5 - 0 . 0 5 - ‘ p § 0 . 0 4 - I 0 . 0 4 - 5 1 0 . 0 3 4 0 . 0 3 - * “ f , 0 . 0 2 4 0 . 0 2 - 0 . 0 1 4 0 . 0 1 « 0 . 0 0 4 . , , o . o o ~ , - , , , H , o 1 3 4 o 1 2 3 4 T i m e ( s e c ) A c t i v i t y ( e ‘ / s e c / a a 3 ) C o n t r o l l e d u n c o n t r o l l e d R C R W i l d T y p e 9 3 . 8 ( i 0 . 3 ) 4 2 8 . 9 ( i 4 . 7 ) 4 . 6 W T + Z i n c 1 6 . 3 ( : t O . 1 ) 2 4 6 . 7 ( i 2 . 3 ) 1 5 . 1 H 9 6 A / E 1 0 1 A 1 8 . 3 ( i 0 . 1 ) 1 1 1 . 2 ( i 1 . 7 ) 6 . 1 S u b l I l ( - ) H 9 6 A / E 1 0 1 A 4 . 4 ( i 0 . 0 1 ) 7 4 . 1 ( i 1 . 8 ) 1 6 . 8 S u b I I I ( - ) + Z i n c 1 8 4 F i g u r e 3 . 6 T h e i n h i b i t i o n o f p r o t o n u p t a k e b y t h e D 1 3 2 A m u t a t i o n a l l o w s t h e b a c k fl o w o f p r o t o n s t o c o n t r i b u t e s i g n i fi c a n t l y t o t h e o b s e r v e d r a t e u n d e r c o n t r o l l e d c o n d i t i o n s . C O V s ( 0 . 1 u M a a 3 fi n a l c o n c e n t r a t i o n ) w e r e r a p i d l y m i x e d i n t h e O l i s - r s m s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t w i t h 4 u M c y t o c h r o m e c 2 + i n S O u M H E P E S - K O H + 4 5 m M K C l , p H 7 . 4 ( A ) U n d e r t h e c o n d i t i o n s w h e r e t h e r e i s a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l a c r o s s t h e m e m b r a n e , t h e c o n t r o l l e d s t a t e o x i d a t i o n r a t e g a v e t h e f a s t e s t r e a c t i o n . ( B ) P r o t o n s w e r e s u p p l i e d f r o m t h e o u t s i d e , ( 8 . 4 : l : 0 . 1 e ' l s e c / a a 3 ) s h o w i n g a r a p i d a l k a l i n i z a t i o n , w h i c h c o r r e s p o n d e d t o t h e i n c r e a s e d a c t i v i t y i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e . ( C ) C O V s r e c o n s t i t u t e d b y t h e B i o - b e a d m e t h o d d i d n o t g i v e a s t r o n g s i g n a l - t o - n o i s e r a t i o o n t h e i n s i d e w i t h p y r a n i n e w h e n t h e r e a c t i o n w a s v e r y s l o w , d u e t o t h e D 1 3 2 A m u t a t i o n i n t h e p r o t o n u p t a k e p a t h w a y . W h e n f u r t h e r i n h i b i t e d b y I O O u M z i n c ( D ) , ( E ) , ( F ) , t h e c o n t r o l l e d r a t e w a s s l o w e d s i g n i fi c a n t l y , a n d t h e r e w a s s o m e s l i g h t e v i d e n c e o f p r o t o n p u m p i n g , i n d i c a t i n g c o m p e t i t i o n b e t w e e n b a c k fl o w a n d p u m p i n g . 1 8 5 ) m n 0 5 5 ( A A ) m n 7 5 5 ( A A D 1 3 2 A D 1 3 2 A + Z n C : c o n t r o l l e d V : + v a l i n o m y c i n U : u n c o n t r o l l e d 0 . 0 1 - T i m e ( s e c ) 1 8 6 T i m e ( s e c ) 3 . 2 . 4 . F u r t h e r S t u d y o f B a c k fl o w w i t h D 1 3 2 A M u t a n t . T h e h y d r o g e n - b o n d e d w a t e r c h a i n o f t h e D — p a t h w a y b e g i n s a t D 1 3 2 o n t h e i n n e r s u r f a c e o f C c O . S i t e d i r e c t e d m u t a n t s o f D 1 3 2 i n C c O t h a t r e m o v e a c a r b o x y l a t e r e s i d u e f r o m t h i s p o s i t i o n s t r o n g l y i n h i b i t a c t i v i t y ( < 2 % o f W T ) a n d p r o t o n p u m p i n g ( F e t t e r e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e e x i s t e n c e o f p r o t o n b a c k fl o w f r o m t h e o u t e r s u r f a c e w a s i n i t i a l l y p o s t u l a t e d o n t h e b a s i s o f s t u d i e s o n t h e D 1 3 2 A m u t a n t ( F e t t e r e t a l . , 1 9 9 6 ) , b e c a u s e t h e 0 2 r e d u c t i o n a c t i v i t y o f t h i s m u t a n t i s a c c e l e r a t e d , r a t h e r t h a n i n h i b i t e d , b y a m e m b r a n e p o t e n t i a l . I n t h e w i l d - t y p e e n z y m e , w h e r e t h e r e i s r a p i d u p t a k e o f p r o t o n s v i a t h e D - p a t h f r o m t h e i n s i d e , a p o s i t i v e - o u t s i d e m e m b r a n e p o t e n t i a l i n h i b i t s t h e r e a c t i o n . H o w e v e r , i n t h e D 1 3 2 m u t a n t w h e r e t h e D - p a t h i s b l o c k e d , p r o t o n b a c k fl o w s u p p o r t s t h e r e a c t i o n a n d i s d r i v e n b y t h e p o t e n t i a l g r a d i e n t ( p o s i t i v e o u t s i d e ) a c r o s s t h e m e m b r a n e ( M i l l s a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 1 9 9 8 ; Z h e n e t a l . , 1 9 9 9 b ) . P r o t o n b a c k fl o w w a s c o n fi r m e d b y m e a s u r e m e n t o f a l k a l i n i z a t i o n o n t h e o u t s i d e o f D 1 3 2 A v e s i c l e s u p o n i n i t i a t i o n o f t u r n o v e r ( F i g u r e 3 . 6 ) . I t a p p e a r s t h a t w h e n p r o t o n u p t a k e f r o m t h e i n s i d e i s c o m p r o m i s e d , p r o t o n s t a k e n u p f r o m t h e o u t s i d e b e c o m e i m p o r t a n t t o m a i n t a i n t h e v e r y s l o w a c t i v i t y , e s p e c i a l l y u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l . T h e c o n t r o l l e d s t a t e o x i d a t i o n r a t e ( 8 . 4 1 0 . 1 e ' l s e c / a a 3 ) w a s f a s t e r t h a n t h e r a t e i n t h e p r e s e n c e o f v a l i n o m y c i n , w h e r e t h e d r i v i n g f o r c e w a s r e m o v e d . S i m i l a r p r o t o n u p t a k e f r o m t h e o u t s i d e i s s e e n t o o c c u r i n w i l d t y p e C c O r e c o n s t i t u t e d i n t o v e s i c l e s u n d e r a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l ( A ‘ P ) , w h e r e t h e u p t a k e f r o m t h e i n s i d e i s i n h i b i t e d b y t h e p o t e n t i a l g r a d i e n t , r e s u l t i n g i n n o n e t p r o t o n p u m p i n g i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e ( F i g u r e 3 . 2 b l a c k t r a c e i n B ) . I n t h e p r e s e n c e o f z i n c , D 1 3 2 A s h o w e d d e c r e a s e d a c t i v i t y a s o b s e r v e d f o r w i l d t y p e , d u e t o t h e b l o c k a g e o f 1 8 7 b a c k fl o w f r o m t h e o u t e r s u r f a c e o f C c O . W e d o n o t c o m p l e t e l y u n d e r s t a n d h o w t h e s e p r o t o n p a t h w a y s , i n c l u d i n g t h e u p t a k e , e x i t a n d b a c k fl o w p r o t o n p a t h w a y , a r e c o n n e c t e d d u r i n g t h e t u r n o v e r a n d h o w m a n y p r o t o n s a r e u s e d f r o m e a c h p a t h w a y d u r i n g t h e r e a c t i o n . W e h o p e d t o b e t t e r u n d e r s t a n d t h e r o l e o f t h e s e p a t h w a y s b y u s i n g s i t e - d i r e c t e d m u t a n t s o f C c O , l i k e D 1 3 2 A a n d b y b e i n g a b l e t o q u a n t i f y b o t h i n s i d e a n d o u t s i d e p H c h a n g e s . H o w e v e r , t h e i n s i d e s i g n a l c h a n g e s o f p y r a n i n e a b s o r b a n c e w e r e v e r y n o i s y , p r e v e n t i n g t h e a c c u r a t e q u a n t i fi c a t i o n o f t h e p r o t o n u p t a k e o n t h e i n s i d e . A n o t h e r i n t e r e s t i n g f e a t u r e o f t h e D 1 3 2 A m u t a n t i s t h e a b i l i t y o f m i c r o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f a r a c h i d o n i c a c i d ( A a ) t o r e s c u e t h e m u t a n t ’ s a c t i v i t y , p r e s u m a b l y b y s u p p l y i n g a c a r b o x y l a t e g r o u p i n t h e v i c i n i t y o f t h e D - p a t h w a y ( F e t t e r e t a l . , 1 9 9 6 ) . I n t h e r e c o n s t i t u t e d e n z y m e b o t h B S A a n d a r a c h i d o n i c a c i d n e e d t o b e a d d e d t o p r e v e n t e x c e s s f a t t y a c i d f r o m m a k i n g t h e v e s i c l e s l e a k y . T h e s e c o n d i t i o n s r e s t o r e e v e n m o r e a c t i v i t y ( M i l l s e t a l . , 2 0 0 3 ) , b u t p r o t o n p u m p i n g w a s n o t o b s e r v e d i n t h e p r e v i o u s a n a l y s i s . H o w e v e r , w h e n t h e C O V s w e r e m a d e b y t h e B i o - b e a d m e t h o d , p r o t o n p u m p i n g w a s o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f B S A / A r a c h i d o n i c a c i d ( F i g u r e 3 . 7 ) . T h i s i s a n i n t e r e s t i n g o b s e r v a t i o n t h a t i s n o t c o m p l e t e l y u n e x p e c t e d . P r o t o n p u m p i n g c o u l d b e e x p e c t e d w h e n a p r o t o n s u p p l y f r o m t h e i n s i d e h a s b e e n r e p a i r e d b y a n a l t e r n a t i v e p r o t o n d o n o r ( A a ) . T h e D 1 3 2 m u t a t i o n i s l o c a t e d w h e r e a r a c h i d o n i c a c i d m a y r e p l a c e t h e i m p a i r e d r e s i d u e . 1 8 8 F i g u r e 3 . 7 T h e r e s c u e d a c t i v i t y o f D 1 3 2 A b y a d d i t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d . T h e s l o w r a t e o f a c t i v i t y , m o n i t o r e d b y c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n o f D 1 3 2 A , w a s r e s c u e d b y a d d i t i o n o f t h e a r a c h i d o n i c a c i d ( A a ) i n t h e p r e s e n c e o f b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) w h i c h a c t e d a s a b u f f e r f o r t h e A a t o p r e v e n t i t f r o m m a k i n g t h e m e m b r a n e l e a k y . A 6 0 0 1 . 1 M B S A s t o c k w a s p r e p a r e d i n w a t e r a n d a 2 5 0 m M A a s t o c k w a s p r e p a r e d i n e t h a n o l . T h e s t o p p e d - fl o w m e a s u r e m e n t s w e r e t h e s a m e a s i n F i g u r e 3 . 6 . C o n t r o l l e d s t a t e , A ‘ i ’ = 0 i n t h e p r e s e n c e o f v a l i n o m y c i n a n d u n c o n t r o l l e d s t a t e w i t h F C C P w a s s h o w n i n b l a c k , b l u e a n d r e d , r e s p e c t i v e l y . T h e c o n t r o l l e d a c t i v i t y ( A ) w a s i n c r e a s e d f r o m 8 . 4 : I : 0 . l e ' l s e c / a d ; t o 1 7 : 0 3 e ' l s e c / a a 3 i n t h e p r e s e n c e o f 6 M o f B S A a n d 1 4 0 u M o f A a . ( B ) P h e n o l r e d a b s o r b a n c e s h o w s a l a c k o f s i g n i fi c a n t p r o t o n p u m p i n g f o r D 1 3 2 A ( C ) . P y r a n i n e o n t h e i n s i d e s h o w e d s o m e a l k a l i n i z a t i o n f o r a l l 3 s t a t e s . I n t h e p r e s e n c e o f B S A / A a ( D ) n o r m a l R C R w a s o b s e r v e d , w i t h t h e c o n t r o l l e d r a t e b e i n g t h e s l o w e s t a n d t h e u n c o n t r o l l e d s t a t e w a s t h e f a s t e s t . ( E ) A n o r m a l p r o t o n p u m p i n g ( ~ 1 H + / e ' ) w a s o b s e r v e d . ( F ) P y r a n i n e o n t h e i n s i d e s h o w e d a l k a l i n i z a t i o n a s e x p e c t e d i f p r o t o n s a r e t a k e n u p f r o m t h e i n s i d e f o r p u m p i n g a n d o x y g e n c h e m i s t r y . 1 8 9 ) m n 0 5 5 ( A A ) m n 7 5 5 ( A A ) m n 5 3 4 ( A A D 1 3 2 A D 1 3 2 A + B S A / A a C : c o n t r o l l e d V : + v a l i n o m y c i n U : u n c o n t r o l l e d I v 7 7 v 2 3 4 T i m e ( s e e ) T i m e ( s e c ) O a N u 0 - I - 1 9 0 3 . 3 . D i s c u s s i o n 3 . 3 . 1 . P r o b l e m s i n C u r r e n t A n a l y s i s T h e a i m o f t h e s e s t u d i e s w a s t o m e a s u r e c h a n g e s i n i n t e r n a l a n d e x t e r n a l p H t h a t c o u l d b e q u a n t i fi e d a n d c o r r e l a t e d w i t h t h e e l e c t r o n c o n s u m p t i o n i n r e c o n s t i t u t e d v e s i c l e s o f C c O . T h i s a i m w a s n o t c o m p l e t e l y a c h i e v e d , m a i n l y b e c a u s e o f t h e l o w s i g n a l - t o - n o i s e a n d o t h e r a p p a r e n t a r t i f a c t s a s s o c i a t e d w i t h m e a s u r i n g p H c h a n g e o n t h e i n t e r i o r o f t h e s e s m a l l v e s i c l e s . A b u f f e r i n g s y s t e m w i t h 2 0 m M H E P E S b u f f e r a t p H 7 . 4 w a s n e e d e d t o s u p p l y e n o u g h p r o t o n s t o m a i n t a i n p r o t o n p u m p i n g . H o w e v e r , t h e i n t e r n a l b u f f e r i n g c o n d i t i o n s m a y a l s o l e a d t o l o w s i g n a l . T h e p r o t o n p u m p i n g s t o i c h i o m e t r y a p p e a r e d t o b e m o r e a c c u r a t e l y m e a s u r e d b y u s i n g t h e r a t e o f e l e c t r o n c o n s u m p t i o n ( e ' l s e c ) c o m p a r e d t o t h e c o r r e s p o n d i n g r a t e s o f p r o t o n c h a n g e ( H ‘ V s e c ) . S i n c e i t w a s h a r d t o e s t i m a t e t h e c o r r e c t z e r o p o i n t o f t h e r e a c t i o n a n d t o k n o w w h a t a r t i f a c t s m i g h t a f f e c t t h e i n t e r n a l d y e , t h e a m p l i t u d e s o f t h e a b s o r b a n c e c h a n g e s a p p e a r e d l e s s a c c u r a t e . O n e o f t h e m o r e p u z z l i n g o b s e r v a t i o n s t h a t w a s r e p r o d u c i b l e , w a s t h a t t h e t o t a l n u m b e r o f p r o t o n c o n s u m e d f r o m b o t h t h e i n s i d e a n d o u t s i d e o f C O V s i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e , g r e a t l y e x c e e d e d ( 2 x ) t h e t o t a l e x p e c t e d n u m b e r . T h i s r e s u l t i m p l i e d t h a t u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l , t h e p y r a n i n e d y e b e h a v e s i n a n a n o m a l o u s w a y . S o m e i n t e r e s t i n g o b s e r v a t i o n s h a v e b e e n m a d e , h o w e v e r , e v e n i f t h e y a r e o n l y q u a l i t a t i v e . T h e i n h i b i t o r , z i n c , c l e a r l y i n h i b i t e d p r o t o n b a c k fl o w u n d e r a v a r i e t y o f 1 9 1 c o n d i t i o n s . A l s o , t h e D 1 3 2 A m u t a n t , i n t h e p r e s e n c e o f a r a c h i d o n i c a c i d a n d B S A , r e s t o r e d p r o t o n p u m p i n g , w h i c h w a s n o t p r e v i o u s l y o b s e r v e d . 3 . 3 . 2 . F u r t h e r A n a l y s i s o f P o s s i b i l i t i e s b y G l o b a l F i t t i n g a n d M o d e l S t u d i e s O u r p r e v i o u s m e t h o d o f a n a l y s i s , u s i n g a s i n g l e w a v e l e n g t h s e l e c t e d f r o m a c o m p l e t e s p e c t r u m r a n g e , w a s l i m i t e d d u e t o t h e s m a l l c h a n g e s i n a b s o r b a n c e a t t h e a p p r o p r i a t e i s o s o b e s t i c p o i n t s a n d t h e p r o b l e m o f h i g h b u f f e r i n g a n d l i g h t - s c a t t e r i n g f r o m t h e s m a l l l i p i d v e s i c l e s . H o w e v e r , t h e d a t a c o l l e c t e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s c o n t a i n s m u c h m o r e i n f o r m a t i o n . A c o m p l e t e s p e c t r a f r o m 3 6 5 t o 5 9 5 n m a t a r e s o l u t i o n o f l n m w i t h l m s s c a n r a t e w a s m a d e , s o t h a t t h e d a t a c a n b e u s e d b y a p p l y i n g g l o b a l a n a l y s i s a n d m o d e l i n g a p p r o a c h e s . T h e g e n e r a l p r i n c i p l e s o f t h e g l o b a l a n a l y s i s a n d s i m u l a t i o n s t u d y a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 3 . 8 . T h e i t e r a t i v e fi t t i n g a n d m o d i fi c a t i o n o f a s i m p l i fi e d m o d e l o f t h e r e a c t i o n k i n e t i c s o f c y t o c h r o m e o x i d a s e i s u s e d t o a n a l y z e t h e d a t a ( F i g u r e 3 . 9 ) . T h i s m o d e l a l l o w s f o r t h e q u a n t i t a t i v e e s t i m a t e o f t h e r a t e c o n s t a n t s f o r u p t a k e a n d r e l e a s e o f p r o t o n s , a s w e l l a s p r o t o n b a c k f l o w . T h i s a n a l y s i s i s b e i n g c a r r i e d o u t i n c o l l a b o r a t i o n w i t h D r . D e n i s P r o s h l y a k o v a n d D r . M a r t y n S h a r p e . T h e g l o b a l fi t t i n g a n a l y s i s a n d m o d e l i n g e f f o r t s w i l l a l l o w a m o r e m e a n i n g f u l i n t e r p r e t a t i o n o f t h e d a t a s e t s w h i c h i s c u r r e n t l y a v a i l a b l e , a n d p r o d u c e a t e s t a b l e m o d e l f o r f u r t h e r a n a l y s i s . 1 9 2 B a c k g r o u n d K n o w l e d g e Q u a n t i t a t i v e A n a l y s i s / K i n e t i c S i m u l a t i o n / G l o b a l F i t t i n g A n a l y s i s F i g u r e 3 . 8 Q u a n t i fi c a t i o n p r o c e s s A s c h e m e f o r v e r i fi c a t i o n o f t h e d a t a f r o m t h e p r o t o n p u m p i n g m e a s u r e m e n t s . A r a w d a t a s e t i s o b t a i n e d f r o m t h e k i n e t i c a n a l y s i s o f s t o p p e d - fl o w m e a s u r e m e n t s , i n c l u d i n g a l l w a v e l e n g t h s a n d o v e r t i m e . F r o m t h i s , a q u a n t i t a t i v e g l o b a l a n a l y s i s u s i n g I G O R d a t a p r o c e s s i n g s o f t w a r e c a n b e u s e d . A m o d e l w a s p r o p o s e d f r o m t h e k i n e t i c s i m u l a t i o n o f p r o t o n m o v e m e n t s w i t h t h e C O V s a n d w i l l b e c o m p a r e d t o t h e n e w d a t a s e t o r i g i n a l l y fi t t e d f r o m a r a w d a t a s e t . A n e w m o d e l w i l l b e e s t a b l i s h e d a f t e r m o d i fi c a t i o n o f t h e p r o t o n p u m p i n g m e c h a n i s m b a s e d o n t h e a m i n o a c i d m u t a t i o n s a n d z i n c i n h i b i t i o n o b s e r v e d i n t h e s t o p p e d - fl o w m e a s u r e m e n t s . T h i s p r o c e s s w i l l b e r e p e a t e d u n t i l t h e r e i s a g o o d a g r e e m e n t b e t w e e n t h e m o d e l a n d t h e o r i g i n a l m e a s u r e m e n t s . 1 9 3 K i n e t i c m o d e l f o r p r o t o n p u m p i n g i n C y t o c h r o m e c O x n d a s e C C \ \ ‘ / O X o x i d i z e d C c O r e d u c e d C c 2 + \ i k , [ K 1 = B i m o l e c u l a r r a t e o f e l e c t r o n ] x t r a n s f e r f r o m C c i n t o C c O o x i d i z e d c t : 3 + / C x ( _ _ , / r e d u c e d C c O ' R d ~ H “ i n k “ , . / \ . p y r a n i n e ' i / \ , [ S a ‘ m ' i ‘ t z z fi f s l ’ m ] . , . , I b a c k fl o w i n t o C c O C C O ‘ D p a t h P \ / r e d u c e d C c O P 2 l o a d i n g s i t e . \ \ L d w i t h l o a d e d . / x , / p r o t o n K 5 = r a t e o f l o a d e d K 4 = r a t e 0 f " i . p u m p p r o t o n 8 0 5 8 9 3 1 9 p r o t o n / c o n v e r s i o n i n t o t r a n s f e r i n t o C c O — K ' ' k 5 s u b s t r a t e p r o t o n o r D p a t h — c o n t r o l s k . r a t e o f p u m p p r o t o n \ H + o u t e j e c t i o n K b " A " P h e n o l r e d C c O r e a d y f o r * , . n e x t e l e c t r o n / K 6 = r a t e 0 f p r o t o n l e a k t h r o u g h o t h e r p a t h w a y s t h a n t h e N . . . ) . . . . . . . k _ g . . . . . . . . . . . . ( ” . m ’ i n t n ' n s i c b a c k f l o w i n t o l o a d i n g s i t e F i g u r e 3 . 9 K i n e t i c m o d e l f o r p r o t o n p u m p i n g i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e . A c o n c e p t u a l , m a t h e m a t i c a l m o d e l t o u n d e r s t a n d t h e p r o t o n p u m p i n g m e c h a n i s m h a s b e e n p r o p o s e d u s i n g a g l o b a l fi t t i n g a n a l y s i s ( I G O R ) u s i n g m u l t i - w a v e l e n g t h s f r o m O L I S - r s m s t o p p e d - fl o w d a t a . C a t a l y t i c t u r n o v e r s w e r e p e r f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f 2 d i f f e r e n t p H p r o b e s , b o t h i n s i d e a n d o u t s i d e o f C O V s . C c = r e d u c e d c y t o c h r o m e c . C x = o x i d i z e d c y t o c h r o m e c . C x = o x i d i z e d C c O . R d = r e d u c e d C c O . L d = r e d u c e d C c O w i t h l o a d e d p r o t o n . P l = I n s i d e o f v e s i c l e s m e a s u r e d w i t h p y r a n i n e . P 2 = O u t s i d e o f v e s i c l e s m e a s u r e d w i t h p h e n o l r e d . k 1 = b i m o l e c u l a r r a t e o f e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m C c i n t o C c O . k 2 = r a t e o f p u m p p r o t o n l o a d i n g i n t o C c O t h r o u g h t h e D - p a t h w a y . k 3 = r a t e o f p r o t o n b a c k fl o w i n t o C c O t o t h e l o a d i n g s i t e . k 4 = r a t e o f s u b s t r a t e p r o t o n t r a n s f e r i n t o C c O t h r o u g h K o r D - p a t h w a y , w h i c h c o n t r o l s t h e r a t e o f p u m p i n g p r o t o n s . k 5 = r a t e o f l o a d e d p u m p p r o t o n c o n v e r s i o n i n t o s u b s t r a t e p r o t o n . k 6 = r a t e o f p r o t o n l e a k t h r o u g h o t h e r p a t h w a y s t h a n t h e i n t r i n s i c b a c k fl o w i n t o t h e l o a d i n g s i t e . R e d t r a c e s i n d i c a t e t h e p r o t o n m o v e m e n t s . 1 9 4 C h a p t e r 4 H 9 3 M u t a t i o n a n d I t s P u t a t i v e R o l e i n P r o t o n B a c k fl o w S t u d y 4 . 1 . I n t r o d u c t i o n I n o r d e r t o u n d e r s t a n d t h e c o n t r o l o f p r o t o n s f o r b o t h p u m p i n g , a n d b a c k fl o w u n d e r a m e m b r a n e p o t e n t i a l , i t i s i m p o r t a n t t o fi n d w h e r e t h e p r o t o n s m o v e t h r o u g h t h e p r o t e i n . I t i s t h o u g h t t h a t t h e b a c k fl o w o f p r o t o n s i s i m p o r t a n t i n r e g u l a t i o n , p r o v i d i n g a m e c h a n i s m t o c o n t r o l t h e p r o t o n p u m p i n g e f fi c i e n c y i n C c O . A s e a r c h f o r p r o t o n e x i t o r b a c k fl o w r o u t e s h a s u t i l i z e d E P R t e c h n i q u e s ( S c h m i d t e t a l . , 2 0 0 3 ) a s w e l l a s m u t a t i o n a n d p r o t o n m e a s u r e m e n t s . I t i s p r o p o s e d t h a t w a t e r m o l e c u l e s p r o d u c e d a t t h e a c t i v e s i t e m o v e o u t w a r d s t o w a r d s t h e n o n - r e d o x M g m e t a l s i t e i n s u b u n i t 1 , c l o s e t o t h e s u b u n i t I / I I / I I I i n t e r f a c e . H o w e v e r , t h e a c t u a l p a t h f o r w a t e r , a n d i t s r e l a t i o n s h i p t o p a t h s f o r p r o t o n s , h a s n o t b e e n v e r i fi e d d u e t o t h e d i f fi c u l t y i n s t u d y i n g s i t e - d i r e c t e d m u t a t i o n s o f k e y r e s i d u e s i n t h i s a r e a , a s t h e y a r e i m p o r t a n t i n m a i n t a i n i n g s t a b i l i t y o f t h e s u b u n i t I - I I i n t e r f a c e . A n o t h e r t o o l t o s t u d y p r o t o n p a t h w a y s i s t h e m e t a l i o n , z i n c . A d d i t i o n o f z i n c i n m i c r o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s t o t h e o u t s i d e o f C O V s i n h i b i t s o x i d a s e a c t i v i t y ( M i l l s e t a l . , 2 0 0 2 ) , a l t h o u g h t h e a c t u a l s i t e o f z i n c b i n d i n g r e m a i n s u n k n o w n . T h e z i n c a p p e a r s t o b l o c k a p r o t o n p a t h w a y t h a t m a y b e i m p o r t a n t i n t h e r e g u l a t i o n o f p r o t o n b a c k f o w u n d e r c o n d i t i o n s o f a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l , a l l o w i n g 0 2 r e d u c t i o n a c t i v i t y t o p r o c e e d w i t h o u t p r o t o n p u m p i n g . I n t h i s t h e s i s , a m e t h o d h a s b e e n d e s c r i b e d f o r m e a s u r i n g p H c h a n g e s o n t h e i n s i d e a s w e l l a s t h e o u t s i d e o f r e c o n s t i t u t e d C c O v e s i c l e s ( C O V s ) . T h e m e a s u r e m e n t s 1 9 5 a r e m a d e w i t h a r a p i d s c a n n i n g s t o p p e d - fl o w s p e c t r o p h o t o m e t e r , w h i c h i s c a p a b l e o f r a p i d l y ( 1 s c a n / m s e c ) r e c o r d i n g s p e c t r a l c h a n g e s o v e r t i m e a n d o v e r a l a r g e w a v e l e n g t h r a n g e . S e n s i t i v e p H d y e s a r e u s e d t o m e a s u r e t h e r a t e s o f a b s o r b a n c e ( p H ) c h a n g e s d u r i n g t u r n o v e r . C o n s i d e r a b l e e f f o r t s w e r e m a d e t o e s t a b l i s h c o n d i t i o n s f o r m e a s u r i n g i n t e r n a l p H w i t h p y r a n i n e a t t h e s a m e t i m e a s m o n i t o r i n g p h e n o l r e d o n t h e o u t s i d e . T h e r e s u l t s s h o w t h a t a m e m b r a n e p o t e n t i a l ( A ‘ I ’ ) i s r a p i d l y b u i l t u p i n t h e c o n t r o l l e d c o n d i t i o n , i n t h e a b s e n c e o f i o n o p h o r e s . I t i s o b s e r v e d t h a t t h i s c o n d i t i o n i s a c c o m p a n i e d b y p r o t o n b a c k - fl o w f r o m t h e o u t s i d e o f C O V s , w h i c h a p p e a r s t o b e u s e d i n t h e o x y g e n c h e m i s t r y . A d d i t i o n a l l y , w h e n p r o t o n u p t a k e i s i n h i b i t e d b y a m u t a t i o n i n t h e D - p a t h w a y ( e . g . D 1 3 2 A ) , o r u n d e r a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l , t h e r e m a i n i n g l o w a c t i v i t y i s s u p p o r t e d b y t h e b a c k fl o w p r o t o n s . N e v e r t h e l e s s , f e w m u t a n t s t h a t i n h i b i t t h e b a c k fl o w p a t h h a v e b e e n d e s c r i b e d . I n t h e b o v i n e C c O X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e , i t w a s n o t i c e d t h a t t h e r e w a s a s t r u c t u r a l c h a n g e i n t h e o x i d i z e d c o m p a r e d t o t h e r e d u c e d C c O i n v o l v i n g D 5 1 ( b o v i n e n u m b e r i n g ) o n t h e o u t s i d e o f s u b u n i t I ( S h i m o k a t a e t a l . , 2 0 0 7 ; Y o s h i k a w a e t a l . , 1 9 9 8 ) . A p r o t o n c h a n n e l c a l l e d t h e H - p a t h w a y w a s p r o p o s e d b a s e d o n t h i s o b s e r v a t i o n ( s e e S e c t i o n 1 . 3 . 3 . 3 . f o r d e t a i l s ) . A l t h o u g h m a n y o f t h e r e s i d u e s t h a t a r e p r o p o s e d i n t h e H - c h a n n e l a r e n o t c o n s e r v e d i n t h e b a c t e r i a l C c O ( F i g u r e 4 . 1 ) , D 5 1 h a s b e e n c o n s i d e r e d a s a p o s s i b l e k e y e x i t r e s i d u e i n t h e p r o t o n p u m p i n g p a t h o f m i t o c h o n d r i a l C c O , s u p p o r t e d b y a m u t a t i o n a l s t u d y o f b o v i n e C c O . A D S l N m u t a t i o n e n g i n e e r e d i n t o H e l a c e l l s a b o l i s h e d p r o t o n p u m p i n g a c t i v i t y w h i l e m a i n t a i n i n g f u l l e l e c t r o n t r a n s f e r a c t i v i t y ( S h i m o k a t a e t a l . , 2 0 0 7 ) . 1 9 6 D 5 1 ( ( 6 9 2 ) Q 5 2 ( ( H 9 3 ) H 1 3 8 ( ( E 1 8 2 ) S 4 4 1 ( 1 4 8 4 ) Y 5 4 ( W 9 5 ) Y 3 7 1 ( Y 4 1 4 ) T 5 9 ( T 1 0 0 ) R 3 8 R 5 2 ) S 4 5 4 ( S 4 9 7 ) H 6 1 H 1 0 2 ) ‘ i fi a i g l > . H 3 7 8 ( H 4 2 1 ) M 6 5 ( M 1 0 6 ) H - P a t h w a y i n B o v i n e A l i g n e d s e q u e n c e i n R . s p P r o p o s e d p a t h w a y i n R . s p E 2 4 2 ( E 2 8 6 ) R s p h e m e a B o v i n e h e m e a F i g u r e 4 . 1 . C o m p a r i s o n b e t w e e n t h e p r o p o s e d H - p a t h w a y r e s i d u e s c l o s e t o h e m e a i n t h e m a m m a l i a n C c O , v e r s u s R c h O . C o m p a r i s o n b e t w e e n t h e p r o p o s e d H - p a t h w a y f o r p r o t o n p u m p i n g i n b o v i n e h e a r t C c O ( T s u k i h a r a e t a l . , 1 9 9 6 ) a n d a p u t a t i v e c o m p a r a b l e p r o t o n p a t h w a y i n R . s p h a e r o i d e s C c O ( L e e e t a l . , 2 0 0 0 ) . A l l b o v i n e r e s i c u e s a r e s h o w n i n y e l l o w , w h i l e a l i g n e d r e s i d u e s i n R . s p h a e r o i d e s a r e s h o w n i n c y a n . R e s i d u e s o f a p r o p o s e d p r o t o n p a t h w a y i n R . s p h a e r o i d e s a r e s h o w n i n r e d . 1 9 7 M u t a t i o n s o f a n o n - c o n s e r v e d h i s t i d i n e ( H 9 3 i n R . s p h a e r o i d e s n u m b e r i n g ) w e r e m a d e b a s e d o n t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h i s h i s t i d i n e w a s t h e c l o s e s t s p a t i a l l y a l i g n e d r e s i d u e , w i t h p r o t o n u p t a k e c a p a c i t y t o D 5 1 i n t h e b o v i n e C c O . I n t e r e s t i n g l y , h e l i x H o f s u b u n i t 1 c o n t a i n s s e v e r a l i m p o r t a n t r e s i d u e s s u c h a s T 1 0 0 , H 1 0 2 a n d D 1 3 2 ( F i g u r e 4 . 2 ) . M u t a t i o n o f T 1 0 0 i n t o l y s i n e ( T 1 0 0 L ) r e s u l t e d i n s t r o n g i n h i b i t i o n a n d a n a l t e r e d r e d o x p o t e n t i a l o f h e m e a ( S c h m i d t , 2 0 0 3 ) . H 1 0 2 i s o n e o f t h e l i g a n d s o f h e m e a a n d D 1 3 2 i s i n t h e h e l i x I I / I I I l o o p , a n d i s t h e e n t r y s i t e f o r p r o t o n u p t a k e i n t o t h e D - p a t h w a y . S e v e r a l m u t a t i o n s o f H 9 3 w e r e p r e p a r e d t o t e s t w h e t h e r i t w a s f u n c t i o n a l l y r e l a t e d t o D 5 1 i n b o v i n e C c O a n d m a y h a v e a r o l e i n t h e b a c t e r i a l o x i d a s e R c h O i n c o n t r o l l i n g p r o t o n m o v e m e n t ( L e e e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h e p o s s i b l i l i t y w a s c o n s i d e r e d t h a t t h i s r e g i o n m a y b e i n v o l v e d i n p r o t o n b a c k f l o w . T h i s c o u l d b e e x a m i n e d b y u s i n g s t o p p e d - fl o w t e c h n i q u e s a s d e s c r i b e d a b o v e . I n a p r e v i o u s s t u d y , a s i t e - d i r e c t e d m u t a n t , H 9 3 C , w a s m a d e i n o r d e r t o l o o k a t t h e e f f e c t s o f a d d i n g a fl u o r e s c e n t l a b e l , fi u o r e s c e i n m a l e i m i d e , t o C c O . I f t h e c y s t e i n e i s e x p o s e d t o s o l v e n t , fl u o r e s c e i n m a l e i m i d e h a s t h e p o s s i b i l i t y o f b i n d i n g t o t h e c y s t e i n e . I f , h o w e v e r , t h e c y s t e i n e i s b u r i e d i n t h e i n t e r i o r o f C c O , fl u o r e s c e i n m a y n o t r e a c t w i t h i t , a s m o n i t o r e d b y t h e a b s e n c e o f a fl u o r e s c e n t b a n d o n a n S D S P A G E g e l . P r e l i m i n a r y r e s u l t s s h o w e d t h a t H 9 3 C w a s l a b e l e d o n l y w h e n c y t o c h r o m e c w a s b o u n d ( S c h m i d t , 2 0 0 3 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e r e i s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e u p o n c y t o c h r o m e c b i n d i n g i n t h e r e g i o n o f H 9 3 ( F i g u r e 4 . 3 ) . H o w e v e r , m u t a t i o n o f H 9 3 d i d n o t a l t e r t h e s t e a d y — s t a t e a f fi n i t y f o r c y t o c h r o m e c . 1 9 8 F i g u r e 4 . 2 . L o c a t i o n o f H 9 3 a n d i t s n e i g h b o r r e s i d u e s . T h e p r o x i m i t y o f t h e r e s i d u e H 9 3 t o s u b u n i t 1 1 ( d a r k g r e e n ) p l a c e s i t c l o s e t o t h e c y t o c h r o m e c b i n d i n g s i t e w h e r e e l e c t r o n s a r e d e l i v e r e d f r o m a s o l u b l e c y t o c h r o m e c ( n o t s h o w n ) t o C u A ( b r o w n s p h e r e s ) a n d h e m e a ( d a r k g r e e n s t i c k ) a n d fi n a l l y t o h e m e ( 1 3 ( g r e e n s t i c k ) a n d C u } ; ( m a g e n t a s p h e r e ) a t t h e a c t i v e s i t e i n s u b u n i t I w i t h t h e i m p o r t a n t r e s i d u e s R 4 8 1 a n d R 4 8 2 , w h i c h i n t e r a c t w i t h t h e h e m e p r o p i o n a t e s . H 9 3 i s a p p r o x i m a t e l y < 9 A a w a y f r o m c y t o c h r o m e c , b a s e d o n a d o c k i n g s t u d y ( R o b e r t s a n d P i q u e , 1 9 9 9 ) . H e l i x I I o f s u b u n i t I c o n t a i n s H 9 3 , T 1 0 0 , H 1 0 2 a n d D 1 3 2 . T h e l o o p ( b l u e r i b b o n ) a t t h e e n d o f h e l i x I I c o n t a i n s D 1 3 2 , a t t h e e n t r a n c e o f t h e D p a t h w a y f o r p r o t o n u p t a k e . 1 9 9 C z ( I t i a o a i S / i t e s m c h b c m u u o e e o b n l p t n t s s i t t x a h f w a n r a e s n t I i e i t c I n o r m p n e i m o l n V o I i e h u n o o b i t o i a x t v f n a l l g m l h t e e d a s I I i m o n e u I c h e w t b / n e n u I a a a e t a n t V n l l d e i g s t u d f p 2 1 H 0 a . s f o s n o , . r e t i i f 9 0 t u t b h a h w i t . a 9 n e s u 5 h 3 H a r ) u t l e a s r s I o t b 3 t c o o v o u 1 . y u s b t h T s o r i d c e f l p s s p t e p h e e l o r r a i t l e p h e r l v o x h r i e s g u l o r d o I s a g m a I e s e a n i s i i d s p o i r g e t e g n h a n p t d 6 i r fi o a e i h u m c A h o a t d c l t a e a t t c o n r t f s t a u o h fl l m t e e m h a a R o e x i o n m o v 4 m 1 l e y o i e 8 w l d m g m i e s r a b v e n l n v u t e l a K y e t n t a m i m s u c a e n n m s i n d t t t h a t e u t t s m r h t i a s t i t o a ( d n 1 o u f E y e i y a 8 x o b m 2 o u g h m a t m a t n o e l ) t e f a , o h n t t h o p n r y s o i e a u l d e l n v b i a e b o e r e R a l e 4 s t d v a c i t 8 l w g . e k e d fl 1 o o o n o K A i , n w a p n e o p a t h w a y . 4 . 2 . M e t h o d s o f S i t e - D i r e c t e d M u t a g e n e s i s o f R c h O t o P r o d u c e H 9 3 K T h e c e n t r a l N c o l f r a g m e n t o f t h e R . s p h a e r o i d e s c o x I g e n e w a s s u b c l o n e d i n t o p U C 1 1 9 . A P C R - b a s e d m u t a g e n e s i s m e t h o d ( Q u i k C h a n g e M u t a g e n e s i s K i t , S t r a t a g e n e ) w a s u s e d t o r e p l a c e H 9 3 w i t h l y s i n e . O t h e r m u t a n t s , s u c h a s H 9 3 N , H 9 3 C , a n d H 9 3 N / E 1 8 2 A w e r e m a d e b y D r . C a r r i e H i s e r i n o u r l a b o r a t o r y . T h e m u t a g e n i c p r i m e r s w e r e s y n t h e s i z e d b y t h e M a c r o m o l e c u l a r S t r u c t u r e , S e q u e n c i n g a n d S y n t h e s i s F a c i l i t y i n t h e M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y . A f t e r s e q u e n c i n g , t h e c o x I f r a g m e n t w a s l i g a t e d b a c k i n t o t h e r e s t o f t h e g e n e s a n d t h e n c l o n e d i n t o t h e H i n d I I I s i t e i n t h e e x p r e s s i o n v e c t o r , p R K 4 1 5 ( F i g u r e 4 . 4 ) . T h e o p e r o n w h i c h c a r r i e s t h e h i s - t a g g e d s u b u n i t 1 ] a n d s u b u n i t I I I w a s t h e n a d d e d i n t o a P s t I s i t e . T h e e x p r e s s i o n p l a s m i d w a s t r a n s f o r m e d i n t o E c o l i 8 1 7 - ] c e l l s a n d t h e n t r a n s f e r r e d i n t o t h e R . s p h a e r o i d e s s t r a i n E l 1 2 3 c e l l l i n e b y b i p a r e n t a l c o n j u g a t i o n ( H i s e r e t a l . , 2 0 0 1 ) . 2 0 0 W T + W T C y t c H 9 3 6 + C y t c H 9 3 C w r + + C y t c W T C y t c H 9 3 C H 9 3 C C o o m a s i e - s t a i n e d F l u o r e s c e n c e F i g u r e 4 . 3 . T h e b i n d i n g e f f e c t o f C c o n t o t h e C c O . ( A ) P r e d i c t e d d o c k i n g m o d e l b e t w e e n C c a n d C c O . T h e H 9 3 r e s i d u e i s f a i r l y c l o s e t o t h e p r e d i c t e d C c ( s h o w n a s a o r a n g e r i b b o n ) d o c k i n g s i t e b a s e d o n a d o c k i n g s i m u l a t i o n s t u d y ( R o b e r t s a n d P i q u e , 1 9 9 9 ) . T h e d i s t a n c e b e t w e e n H 9 3 ( 6 1 n i t r o g e n ) a n d t h e c l o s e s t C c r e s i d u e ( I l e 8 1 y l c a r b o n ) i s a b o u t 8 . 6 A . E 1 8 2 ( o n e c a r b o x y l o x y g e n ) i s p l a c e d e v e n c l o s e r t o I l e 8 1 ( 7 1 c a r b o n ) i n 6 . 8 A . ( B ) A c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i s p r o b e d b y a c y s t e i n s p e c i fi c F M ( fl u o r e s c e i n m a l e i m i d e ) fl u o r e s c e n t l a b e l . G e l e l e c t r o p h o r e s i s w i t h w i l d - t y p e a n d H 9 3 C w a s p e r f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f c y t o c h r o m e c . T h e l e f t p a n e l s h o w s t h e c o o m a s s i e - s t a i n e d s u b u n i t s , I , I I a n d I I I o f C c O . T h e r i g h t p a n e l s h o w s fl u o r e s c e n t b a n d s d u e t o P M ( fl u o r e s c e i n m a l e i m i d e ) b i n d i n g i n t h e a b s e n c e o f s t a i n i n g . A s t r o n g l y fl u o r e s c e n t b a n d w a s o n l y o b s e r v e d i n s u b u n i t I f o r t h e c o n d i t i o n w h e r e H 9 3 C a n d c y t o c h r o m e c w e r e p r e s e n t . T h e r e w a s s o m e b a c k g r o u n d fl u o r e s c e n c e , w h i c h w a s d u e t o t h e c y s t e i n e s o f s u b u n i t I I I . T h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e r e w a s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e w h i c h a l l o w e d H 9 3 C t o b e e x p o s e d t o t h e o u t s i d e a n d t o b e l a b l e l e d w i t h F M , b u t o n l y w h e n c y t o c h r o m e c w a s b o u n d . A n 1 8 % a c r y l a m i d e c r o s s - l i n k e d g e l w a s l o a d e d w i t h C 0 0 c o n t a i n i n g H 9 3 C w i t h a r u n n i n g b u f f e r a t p H 7 . 9 t o r e s o l v e t h e p r o t e i n b a n d s i n S D S - P A G E . I n r e s t i n g o x i d i z e d H 9 3 C , n o fl u o r e s c e n t l a b e l i n g w a s o b s e r v e d . W i l d - t y p e C c O g a v e t h e s a m e r e s u l t w i t h o r w i t h o u t c y t o c h r o m e c . T h e fl u o r e s c e n t l a b e l i n g d a t a p r e s e n t e d h e r e i s c o u r t e s y o f D r . B r y a n S c h m i d t . 2 0 1 4 . 3 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f H 9 3 K m u t a n t s 4 . 3 . 1 . S u b u n i t A n a l y s i s b y S D S - P A G E o f P u r i fi e d 0 : 0 T h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e p u r i fi e d H 9 3 m u t a n t s w a s e v a l u a t e d b y s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) ( F i g u r e 4 . 5 ) . T h e s i t e - d i r e c t e d m u t a n t s s h o w e d n o c h a n g e s i n s u b u n i t s t o i c h i o m e t r y o r p r o t e i n d e g r a d a t i o n , a s e v i d e n c e d f r o m t h e C o o m a s s i e g e l s h o w i n g t h e p r e s e n c e o f a l l f o u r s u b u n i t s , w h i c h h a v e m e a s u r e d m o l e c u l a r m a s s o f 7 4 , 4 7 , 3 5 , a n d 8 k D a ( p r e d i c t e d m o l e c u l a r m a s s e s i s 6 3 , 2 9 , 3 0 a n d 0 . 5 k D a f r o m t h e D N A - d e r i v e d a m i n o a c i d s e q u e n c e s ) f o r s u b u n i t s I , I I , I I I , a n d I V , r e s p e c t i v e l y . P o l y p e p t i d e s i z e w a s e s t i m a t e d f r o m u s i n g a l o w m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e m a r k e r f r o m B i o - R a d L a b o r a t o r i e s a l t h o u g h t h e b e h a v i o r o f m e m b r a n e p r o t e i n s i n S D S - g e l s i s u s u a l l y a n o m a l o u s . S o m e p o l y m e r i z a t i o n o f t h e s u b u n i t s w a s o b s e r v e d ( h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t b a n d s > 9 0 K ) . T h e p u r i t y o f t h e i s o l a t e d e n z y m e w a s a l s o d e t e r m i n e d b y U V - v i s i b l e s p e c t r o s c o p y . 2 0 2 — H i n d I " w i t h H 9 3 K _ & s u b u n i t l l l o p e r o n T r b A p R K 4 1 5 M u l t i p l e c l o n i n g s i t e C c O s u b u n i t l C c O s u b u n i t l l h i s t a g — H i n d I l l — F i g u r e 4 . 4 . C o n s t r u c t i o n o f e x p r e s s i o n p l a s m i d o f H 9 3 K . T h i s p l a s m i d c o n t a i n s a b r o a d h o s t r a n g e o r i g i n o f r e p l i c a t i o n a n d o r i g i n o f t r a n s f e r ( O r i T ) . I t a l s o c o n t a i n s t h e t e t r a c y c l i n e r e s i s t a n c e g e n e ( T e t A , T e t R ) , w h i c h c a n b e u s e d t o s c r e e n t h e c l o n e s . T h e c o x I g e n e w i t h H 9 3 m u t a t i o n , a n d t h e h i s - t a g g e d s u b u n i t I I a n d s u b u n i t I I I , a r e i n s e r t e d a t m u l t i p l e c l o n i n g s i t e s . 2 0 3 1 . . . . . . “ \ v " ( k D a ) 1 1 3 9 6 S u b l 5 3 3 6 S u b l l 2 8 S u b I l l 1 8 S u b I V 5 . 7 F i g u r e 4 . 5 . A n S D S - P A G E g e l o f a l l o f t h e s u b u n i t s o f C c O . T h e r e t e n t i o n o f a l l s u b u n i t s o f C 0 0 , i n c l u d i n g s u b u n i t 1 , I I , I I I a n d I V , w a s r e s o v l e d b y S D S - P A G E . S D S - P A G E u r e a g e l s w e r e r u n a s d e s c r i b e d ( P e i f f e r e t a l . , 1 9 9 0 ) a n d r u n a t r o o m t e m p e r a t u r e . A q u i c k s t a i n i n g m e t h o d w a s a p p l i e d t o t h e C c O . T h e g e l w a s s t a i n e d w i t h C o o m a s s i e b l u e f o r 2 m i n i n t h e m i c r o w a v e u n t i l i t b e g a n t o b o i l a n d w a s t h e n p u t o n a s h a k e r f o r 5 m i n . T h e g e l w a s d e - s t a i n e d w i t h a c e t i c a c i d ( 7 . 5 % ) i n a m i c r o w a v e f o r 2 m i n f o r 3 o r 4 t i m e s u n t i l c l e a r b l u e b a n d s w e r e o b s e r v e d . L a b e l i n d i c a t e s : 1 ; m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s f r o m B i o - R a d l a b o r a t o r i e s , 2 ; W i l d - t y p e C c O , 3 ; H 9 3 K , 4 ; H 9 3 N / E 1 8 2 A , 5 ; H 9 3 C , 6 ; H 9 3 N . T h e r e s o l v i n g g e l c o n t a i n s 1 8 % a c r y l a m i d e i n T r i s - H C l , p H 8 . 8 , 3 6 % U r e a , 0 . 1 % S D S , A M P S a n d T E M E D . T h e s t a c k i n g g e l c o n t a i n s 8 % a c r y l a m i d e i n T r i s - H C l p H 6 . 8 , 0 . 1 % S D S , A M P S a n d T E M E D . A l l 4 s u b u n i t s w e r e f o u n d i n b o t h w i l d t y p e a n d m u t a n t C c O s . 2 0 4 4 . 3 . 2 . S p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r i z a t i o n U V - V i s i b l e s p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r i z a t i o n N o s u b s t a n t i a l d i f f e r e n c e i n t h e s p e c t r a l p r o p e r t i e s o f t h e H 9 3 m u t a n t s , b o t h i n ‘ a s p r e p a r e d ’ a n d t h e ‘ r e d u c e d ’ c o n d i t i o n w a s o b s e r v e d a n d w a s c o m p a r a b l e t o t h e s p e c t r a o f w i l d t y p e ( F i g u r e 4 . 6 ) . B o t h w i l d t y p e a n d m u t a n t s s h o w t h e E l - p e a k a t 6 0 6 n m a n d t h e S o r e t p e a k a t 4 4 5 n m f o r r e d u c e d C c O , a n d 4 2 4 n m f o r t h e o x i d i z e d C c O , s u g g e s t i n g t h a t t h e m u t a t i o n s c a u s e d n o m a j o r c h a n g e s i n t h e o v e r a l l p r o p e r t i e s o f t h e h e m e s . E P R s p e c t r a o f H 9 3 K T h e a c t i v e s i t e o f R . s p h a e r o i d e s , w h e r e t h e o x y g e n c h e m i s t r y o c c u r s , c o n t a i n s 1 C u ( C u B ) a n d 1 F e ( a 3 ) . I t i s g e n e r a l l y a c c e p t e d t h a t C u B i s a n t i f e r r o m a g n e t i c a l l y c o u p l e d t o h e m e a 3 , s o t h a t i t s r e d u c t i o n s t a t e i s n o t e a s i l y d e t e c t e d . T h e r e i s a n E P R - d e t e c t a b l e c o p p e r s i t e , a d i n u c l e a r C u , i n s u b u n i t I I , a s w e l l a s h e m e a . I t h a s b e e n o b s e r v e d t h a t a m u t a t i o n i n H 9 3 ( H 9 3 N ) c a u s e s a c h a n g e o f a b o u t 4 0 m V i n t h e r e d o x p o t e n t i a l d i f f e r e n c e b e t w e e n h e m e a a n d C u A ( F r a n k M i l l e t t u n p u b l i s h e d d a t a ) . H o w e v e r , n o s i g n i fi c a n t c h a n g e s w e r e d e t e c t e d i n t h e E P R d e t e c t a b l e C u t a n d h e m e a r e g i o n s ( F i g u r e 4 . 7 ) . S i m i l a r i l y , t h e H 9 3 K m u t a n t i s n o t e x p e c t e d t o d i s r u p t t h e m e t a l c e n t e r s , a s o b s e r v e d i n t h e n o r m a l E P R s p e c t r u m o f H 9 3 K w i t h h e m e a g v a l u e o f g x = 2 . 8 2 , g x = 2 . 3 1 , a n d g y = 1 . 6 3 a s d e s c r i b e d ( M i l l s e t a l . , 2 0 0 8 ) . T h e d i f f e r e n c e i n C u s i g n a l b e t w e e n H 9 3 K a n d w i l d - t y p e i s v e r y s m a l l a n d n o i n c r e a s e i n h i g h s p i n h e m e a 3 i s o b s e r v e d . 2 0 5 — w r - — — H s s K — H a s c — — H a s N - — — l - E B N E 1 & A m l l l i l l l a s a m m a n s s o a n e s o m a n s m a n e s o V l b v e l e n g t h ( r m ) V l a l e l a ' g h ( r m ) F i g u r e 4 . 6 . U V - V i s i b l e s p e c t r a o f w i l d t y p e a n d H 9 3 K . U V - V i s i b l e s p e c t r a o f ‘ a s p r e p a r e d ( A ) ’ a n d ‘ r e d u c e d ( B ) ’ o f w i l d t y p e a n d H 9 3 K , H 9 3 C , H 9 3 C , H 9 3 N / E l 8 2 A m u t a n t s . H 9 3 m u t a n t s s h o w n o d e v i a t i o n s f r o m t h e w i l d t y p e C c O s p e c t r a i n b o t h t h e - p e a k s a t 6 0 6 n m ( r e d u c e d ) a n d t h e S o r e t p e a k a t 4 2 4 n m ( o x i d i z e d ) a n d 4 4 5 n m ( r e d u c e d ) . T h e m e a s u r e m e n t s w e r e t a k e n i n b u f f e r c o n t a i n i n g 1 0 0 m M H E P E S - K O H p H 7 . 4 a n d 0 . 1 % l a u r y l m a l t o s i d e w i t h s o d i u m d i t h i o n i t e a s a r e d u c t a n t i n ( B ) . 2 0 6 h e m e a 5 3 9 : 1 2 : 9 3 : 9 , = 2 . 3 1 _ n e m e s i s ? z l l / C U A 9 2 _ g Z - ' I I f " : " 1 : “ R C u A 9 X . g y 0 _ U 3 : 2 _ E . < _ . _ — — W T — — H 9 3 K J - 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 3 5 0 0 4 0 0 0 4 5 0 0 5 0 0 0 M a g n e t i c F i e l d ( G a u s s ) F i g u r e 4 . 7 . E P R s p e c t r a o f p u r i fi e d w i l d t y p e ( b l a c k l i n e ) , a n d H 9 3 K ( r e d l i n e ) R . s p h a e r o i d e s C c O . T h e g v a l u e s w e r e d e t e r m i n e d f r o m d i r e c t m e a s u r e m e n t s o f t h e m a g n e t i c fi e l d s t r e n g t h a n d m i c r o w a v e f r e q u e n c y . R e l e v a n t g v a l u e s a r e i n d i c a t e d b y t h e a r r o w s . T h e g z , g x a n d g y v a l u e s f o r h e m e a a r e 2 . 8 2 , 2 . 3 1 , a n d 1 . 6 3 , r e s p e c t i v e l y . S a m p l e s w e r e m a d e i n a b u f f e r o f 2 0 m M H E P E S - K O H p H 8 . 0 , 1 4 m M K C l , a n d 0 . 1 % l a u r y l m a l t o s i d e w i t h a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 8 0 p M ( w i l d t y p e ) a n d 6 0 p M ( H 9 3 K ) C c O . E P R e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s : m i c r o w a v e f r e q u e n c y , 9 . 4 5 8 G H z ; m i c r o w a v e p o w e r , S O u W ; m o d u l a t i o n f r e q u e n c y , 1 0 0 k H z ; m o d u l a t i o n a m p l i t u d e , 2 0 . 0 G ; c o n v e r s i o n t i m e , 3 2 7 m s ; t e m p e r a t u r e , 4 . 2 K . ( M e a s u r e m e n t s w e r e m a d e b y S h u j u a n X u ) . 2 0 7 4 . 3 . 3 . p H a n d L i p i d D e p e n d e n c e o f M u t a n t s T h e e f f e c t o f p H o n t h e s t e a d y - s t a t e a c t i v i t y o f t h e p u r i fi e d H 9 3 m u t a n t s a n d w i l d t y p e C c O w a s m e a s u r e d u s i n g a G i l s o n o x g y g r a p h w i t h c y t o c h r o m e c i n e x c e s s . C c O a c t i v i t y i n t h e w i l d t y p e i n c r e a s e s a s t h e p H i s l o w e r e d ; t h e a c t i v i t y o f H 9 3 C , H 9 3 N a n d H 9 3 N / E 1 8 2 A s h o w a s l i g h t d e c r e a s e i n a c t i v i t y b e l o w p H 7 . 0 , g i v i n g a l o c a l m a x i m u m a c t i v i t y a r o u n d p H 6 . 8 , e x c e p t f o r t h e H 9 3 K ( F i g u r e 4 . 8 ) . M o s t o f t h e m u t a n t s s h o w a d e c r e a s e i n a c t i v i t y o f a b o u t 3 0 — 4 0 % c o m p a r e d t o t h a t o f w i l d t y p e , b u t n o t f o r H 9 3 N . O b s e r v e d c h a n g e s i n t h e r e d o x p o t e n t i a l ( ~ 4 0 m V l o w e r ) o f h e m e a m a y b e a f a c t o r i n t h e d e c r e a s e i n t h e s t e a d y - s t a t e a c t i v i t y o f t h e H 9 3 m u t a n t s . A l m o s t t h e s a m e r e d o x p o t e n t i a l c h a n g e s ( ~ 4 0 m V ) w e r e o b s e r v e d u p o n t h e d e p l e t i o n o f C a 2 + b i n d i n g i n t h e b o v i n e o x i d a s e s t r u c t u r e . I t i s a y e t u n t e s t e d p o s s i b i l i t y t h a t t h e h i s t i d i n e m u t a t i o n s d e s t a b i l i z e d t h e p o s i t i o n o f t h e C a l i i n R . s p h a e r o i d e s C c O . T h e e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m C u A t o h e m e a c a n b e a r a t e - l i m i t i n g s t e p w h e n t h e r e d o x p o t e n t i a l o f h e m e a i s l o w e r e d . S i n c e i t h a s b e e n o b s e r v e d t h a t t h e D 1 3 2 A m u t a n t c a n r e c o v e r i t s a c t i v i t y w i t h t h e a d d i t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d , w h i c h s u p p l i e s a c a r b o x y l i c a c i d a s a p r o t o n a t a b l e s i t e f o r t h e D p a t h w a y , t h i s f a t t y a c i d a n d o t h e r l i p i d s w e r e t e s t e d o n t h e H 9 3 m u t a n t s . H o w e v e r , t h e d e c r e a s e d a c t i v i t y o f t h e H 9 3 m u t a n t s w a s n o t r e s c u e d u p o n a d d i t i o n o f e x t r a l i p i d s , i n c l u d i n g C h o l a t e a n d a r a c h i d o n i c a c i d . E v e n t h e a c t i v i t y o f a d o u b l e m u t a n t ( H 9 3 N / E l S 2 A ) w a s n o t i n c r e a s e d g r e a t l y b y t h e a d d i t i o n o f e x t r a l i p i d . 2 0 8 8 o h 2 ° 1 ' 3 B g 3 l 1 : 5 . - 4 1 1 0 2 0 8 5 4 2 0 0 0 0 0 o 0 0 0 0 0 o 0 ° 1 a ‘ 4 : 4 — — - _ ‘ . T ‘ 5 . 0 . - - - - 5 . 5 1 T 9 9 9 9 W H H H H 3 3 3 3 K C N N 7 . 1 8 E 0 2 7 p A H . 5 A 8 E L 3 I a O h 0 g 5 , ? ) : ' - 8 . 0 0 . 5 9 . 0 . \ ° ° “ " ° ' A A d d i t i . o . p 3 “ l - d B a l n L l _ 0 m W T 1 6 0 0 ~ . - H 9 3 K F i g u r e 4 . 8 . E f f e c t o f p H a n d l i p i d a d d i t i o n o n t h e c a t a l y t i c a c t i v i t y o f t h e f r e e e n z y m e . T h e a c t i v i t y o f w i l d t y p e a n d m u t a n t o f H 9 3 r e s i d u e s o f C c O i n c r e a s e s a s t h e p H o f t h e b u f f e r i s d e c r e a s e d ( l e fi p a n e l ) . T h e s t e a d y - s t a t e a c t i v i t y ( e ' l s e c / M 3 ) o f H 9 3 K , H 9 3 C , H 9 3 N , H 9 3 N / E 1 8 2 A a n d w i l d t y p e R . s p h a e r o d i e s C c O w a s m e a s u r e d b y O x y g r a p h w i t h a C l a r k e l e c t r o d e a n d c o m p a r e d o v e r t h e p H r a n g e o f 6 - 9 , w i t h e r r o r b a r s . T h e M E S - K O H , H E P E S - K O H , a n d C H E S - K O H b u f f e r s w e r e u s e d a t 5 0 m M w i t h a p p r o p r i a t e a m o u n t s o f K C l t o g i v e a n a p p r o x i m a t e i o n i c s t r e n g t h o f 4 5 m M w i t h r e s p e c t t o p o t a s s i u m , a n d w i t h l a u r y l m a l t o s i d e a t 0 . 1 % a s p r e p a r e d . H 9 3 N a n d H 9 3 K s h o w s i m i l a r a c t i v i t y t o w i l d t y p e . H 9 3 C a n d H 9 3 N / E 1 8 2 A d o u b l e m u t a n t s h o w s a n o v e r a l l l o w e r a c t i v i t y . B e l o w p H 7 . 0 , t h e H 9 3 m u t a n t s s h o w a n i n c r e a s e d i n h i b i t i o n o f a c t i v i t y c o m p a r e d t o w i l d - t y p e , e x c e p t f o r H 9 3 K . T h e s e d a t a a r e f o r a n a v e r a g e o f 3 d a t a s e t s . T h e a d d i t i o n o f l i p i d s ( r i g h t p a n e l ) d i d n o t c h a n g e t h e a c t i v i t y o f H 9 3 m u t a n t s ; t h e e f f e c t o f c h o l a t e ( A ) , a s o l e c t i n f r o m A v a n t i ( B ) , a n d a r a c h i n o n i c a c i d f r o m C a y m a n C h e m i c a l C o . ( C ) a r e s h o w n i n a b a r g r a p h . 2 0 9 W h e n t h e H 9 3 m u t a n t s w e r e r e c o n s t i t u t e d i n t o l i p i d v e s i c l e s , l a r g e r d i f f e r e n c e s w e r e o b s e r v e d i n c o m p a r i s o n w i t h w i l d t y p e . T h e R C R ( r e s p i r a t o r y c o n t r o l r a t i o , u n c o n t r o l l e d r a t e / c o n t r o l l e d r a t e ) c o u l d b e m e a s u r e d i n t h i s s y s t e m a s w e l l . A l l t h e m u t a n t s s h o w e d h i g h e r R C R t h a n w i l d t y p e C c O , e s p e c i a l l y a t h i g h p H , d u e t o a p r o p o r t i o n a t e l y g r e a t e r i n h i b i t i o n o f t h e c o n t r o l l e d s a t e a c t i v i t y ( F i g u r e 4 . 9 ) . T h e s e r e s u l t s s u p p o r t t h e p r o p o s a l t h a t H 9 3 m a y i n h i b i t t h e p r o t o n b a c k fl o w m o v e m e n t f r o m t h e o u t s i d e o f C c O i n t h e r e c o n s t i t u t e d v e s i c l e s i n t h e p r e s e n c e o f a m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d p r o t o n g r a d i e n t . T h e b a c k fl o w o f p r o t o n s i n t h e m u t a t e d H 9 3 m a y n o t b e a s p r o m i n e n t a s i n t h e w i l d - t y p e , a n d m a y n o t s u p p o r t a w i l d - t y p e l e v e l o f a c t i v i t y u n d e r m e m b r a n e p o t e n t i a l i n t h e C O V s . H 9 3 N s h o w s a l m o s t t h e s a m e a c t i v i t y a s w i l d t y p e i n t h e s t e a d y - s t a t e c o n d i t i o n w i t h f r e e e n z y m e b u t o n l y 5 0 % t h e a c t i v i t y i n t h e r e c o n s t i t u t e d c o n t r o l l e d s t a t e . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t t h e r e m a y b e a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n C c O w h e n t h e e n z y m e i s u n d e r t h e c o n d i t i o n o f a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l . P r e v i o u s fl u o r e s c e n c e l a b e l i n g d a t a s h o w a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n t h e H 9 3 C m u t a n t , w h e n c y t o c h r o m e c i s b o u n d ( S c h m i d t , 2 0 0 3 ) . 4 . 3 . 4 . C y t o c h r o m e c B i n d i n g S t u d y A c l u s t e r o f c o n s e r v e d l y s i n e r e s i d u e s i n t h e b a c k b o n e o f c y t o c h r o m e c ( C c ) i n t e r a c t w i t h c a r b o x y l r e s i d u e s i n s u b u n i t H o f C c O ( F i g u r e 4 . 1 0 ) w i t h h i g h a f fi n i t y ( R o b e r t s a n d P i q u e , 1 9 9 9 ) . T h e r e i s a n i o n i c s t r e n g t h d e p e n d e n t i n t e r a c t i o n b e t w e e n C c a n d C c O ( W a n g e t a l . , 1 9 9 9 ) . A t l o w i o n i c s t r e n g t h , w i l d t y p e C 0 0 i s e l e c t r o s t a t i c a l l y s t a b i l i z e d a n d i s a t t h e o p t i m a l o r i e n t a t i o n f o r r a p i d e l e c t r o n t r a n s f e r . 2 1 0 A I W T A 1 I W " ’ 1 2 ° “ I H 9 3 C M 3 0 0 - I H 9 3 C " “ ’ H 9 3 N a - I H 9 3 N N - l T 1 0 0 ‘ I H 9 3 K E 2 5 0 - I H 9 3 K § I I H 9 3 N E 1 8 2 A i n I H 9 3 N E 1 8 2 A : - s o - \ . 2 0 0 o . g - " - . 5 ' 3 5 ° " 0 1 5 0 — = ‘ E . . o 4 0 9 " 4 o 1 0 0 - ‘ E i : o 2 0 4 = O t ; 5 g . 0 . . . . , . , . , . , + . . . . . e 5 . 0 5 , 5 7 . 0 7 . 5 3 , 0 3 , 5 9 . 0 5 . 0 5 . 5 7 . 0 7 . 5 3 . 0 5 . 5 9 . 0 H 4 . 9 p H . . P I w r w r I 9 9 : : r z z fi . . . m m s 3 5 0 - l H 9 3 K 1 ‘ 1 I H 9 3 0 I ‘ I H 9 3 N E 1 8 2 A _ I H 9 3 N § 3 ° ° ‘ 1 2 I H 9 3 N E 1 8 2 A 7 ' ' 1 o - 9 ’ I ! v o 4 3 1 r 3 ‘ 2 8 - E 4 8 “ r : 2 — a l l l l l l l I l l I I 5 . 0 5 . 5 7 . 0 7 . 5 5 . 0 5 . 5 9 . 0 5 . 0 5 . 5 7 . 0 7 . 5 9 . 0 9 . 5 9 . 0 p H p H F i g u r e 4 . 9 . E f f e c t o f p H o n o x y g e n c o n s u m p t i o n a c t i v i t y a n d R C R o f C c O , r e c o n s t i t u t e d i n t h e v e s i c l e s u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s . T h e c a t a l y t i c a c t i v i t y w a s m e a s u r e d i n t h e O l i s m s t o p p e d - fl o w r a p i d s c a n n i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r w i t h a d e fi n e d a m o u n t o f c y t o c h r o m e c i n o r d e r t o h a v e ~ 1 0 t u r n o v e r s . T h e l o w e s t r a t e o f a c t i v i t y i s i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e d u e t o t h e p r e s e n c e o f a N Y a n d A p H ( t o p l e f t p a n e l ) . A d d i t i o n o f t h e i o n o p h o r e , v a l i n o m y c i n ( t o p r i g h t p a n e l ) , r e m o v e s t h e N P a n d i n c r e a s e s a c t i v i t y ( t h i s i s t h e s t a t e i n w h i c h p r o t o n p u m p i n g i s o b s e r v e d ) . A d d i t i o n o f t h e p r o t o n u n c o u p l e r , F C C P , t o t h e p u m p i n g s t a t e ( l o w e r l e f t p a n e l ) r e s u l t s i n t h e f a s t e s t a c t i v i t y d u e t o t h e l a c k o f r e s t r a i n t s ( n o N Y o r A p H ) . T h e R C R ( r e s p i r a t o r y c o n t r o l l e d r a t i o , i s d e t e r m i n e d b y d i v i d i n g t h e u n c o n t r o l l e d r a t e b y t h e c o n t r o l l e d r a t e ) i s s h o w n o v e r t h e p H r e g i o n 6 . 2 5 - 9 . 0 ( l o w e r r i g h t p a n e l ) . A l l m u t a n t f o r m s s h o w ~ 5 0 % i n h i b i t i o n w h e n t h e y a r e r e c o n s t i t u t e d i n t o v e s i c l e s . A j u m p i n t h e R C R w a s o b s e r v e d a t t h e h i g h e r p H r a n g e , p a r t i c u l a r l y w i t h t h e H 9 3 N m u t a n t . 2 1 1 C y t o c h r o m e c C y t o c h r o m e O x i d a s e F i g u r e 4 . 1 0 . M o d e l f o r t h e h i g h a f fi n i t y c o m p l e x b e t w e e n h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c a n d b o v i n e C c O . T h e c o n s e r v e d l y s i n e r e s i d u e s i n t h e C c b a c k b o n e i n t e r a c t w i t h t h e a c i d i c c a r b o x y l r e s i d u e s i n s u b u n i t I I o f C c O w i t h h i g h a f fi n i t y . T h i s i n t e r a c t i o n i s i o n i c s t r e n g t h d e p e n d e n t . T h i s fi g u r e w a s o b t a i n e d f r o m W a n g e t a l . ( W a n g e t a l . , 1 9 9 9 ) 2 1 2 T h e H 9 3 r e s i d u e i s v e r y c l o s e t o t h e p r e d i c t e d c y t o c h r o m e c d o c k i n g s i t e , l y i n g i n t h e s u r f a c e r e g i o n o f s u b u n i t 1 , b e l o w C c . T h e p r o x i m i t y o f H 9 3 t o c y t o c h r o m e c ( < 9 A a w a y ) a n d t o s u b u n i t I I o f C c O s u g g e s t s a p o t e n t i a l i n t e r a c t i o n w i t h t h e c y t o c h r o m e c d o c k i n g s i t e . T h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s b e t w e e n h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c a n d R . s p h a e r o i d e s C c O w e r e m e a s u r e d b y a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n ( F i g u r e 4 . 1 1 ) . T h e a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e i n s t r u m e n t i s fi t t e d w i t h o p t i c a l s y s t e m s d e s i g n e d t o r e c o r d t h e c o n c e n t r a t i o n o r a c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t o f t h e s e d i m e n t i n g m o l e c u l e s a s a f u n c t i o n o f t h e i r p o s i t i o n i n t h e d o u b l e s e c t o r c e n t e r p i e c e c e l l . C c , C c O a n d C c / C c O c o m p l e x , w h i c h i n i t i a l l y w e r e d i s t r i b u t e d u n i f o r m l y t h r o u g h t h e c e l l , w e r e s e d i m e n t e d a t d i f f e r e n t r a t e s t o w a r d s t h e b o t t o m o f t h e c e l l u n d e r a h i g h c e n t r i f u g a l f o r c e . D u r i n g c e n t r i f u g a t i o n , t h e c o n c e n t r a t i o n i n t h e p l a t e a u r e g i o n d e c r e a s e s , d u e t o r a d i a l d i l u t i o n . T h u s , t h e b i n d i n g a f fi n i t y o f m i x e d s a m p l e s o f C c a n d C c O c a n b e d i r e c t l y m e a s u r e d a f t e r 1 h a t 4 8 , 0 0 0 r p m . T h e c o m p l e x o f C c O a n d C c , w i t h a l a r g e r m o l e c u l a r w e i g h t , m o v e s m u c h f a s t e r t h a n f r e e C c . F r e e C c s e d i m e n t e d a t a s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y o f 1 . 7 4 S , w h i l e C c O s e d i m e n t e d a t 9 . 7 S . T h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( K 9 ) w a s m e a s u r e d f o r s e v e r a l m u t a n t s o f H 9 3 a n d w i l d t y p e C c O u n d e r d i f f e r e n t i o n i c s t r e n g t h s a s d e s c r i b e d b y W a n g e t a 1 . ( W a n g e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e a b s o r b a n c e a t 4 1 0 n m w a s m e a s u r e d d u r i n g u l t r a c e n t r i f u g a t i o n b e c a u s e t h i s w a v e l e n g t h i s a t t h e S o r e t p e a k o f o x i d i z e d C c O a n d t h e w a v e l e n g t h m a x i m u m o f o x i d i z e d c y t o c h r o m e c ( C c ) . T h e m e a s u r e d a b s o r b a n c e i s p r o p o r t i o n a l t o t h e h e m e c o n c e n t r a t i o n ( a m o u n t o f C c ) a n d g i v e s a l a r g e s i g n a l c o m p a r e d t o t h a t a t 6 0 6 n m . 2 1 3 F i g u r e 4 . l l . A n a l i t i c a l U l t r a c e n t r i f u g a t i o n m e a s u r e m e n t s o f t h e b i n d i n g a f fi n i t y o f h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e 5 b i n d i n g t o w i l d t y p e C c O . T h e u p p e r p a n e l s h o w s a s c h e m e f o r t h e a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e i n s t r u m e n t a n d t h e c o m p a r i s o n b e t w e e n w i l d - t y p e w i t h a h i s - t a g o n s u b u n i t 1 a n d s u b u n i t I I . T h e H 9 3 C , H 9 3 K a n d H 9 3 N / E 1 8 2 A m u t a n t d a t a w e r e s h o w n i n t h e l o w e r p a n e l s . A n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e w a s u s e d i n t h e s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y m o d e a t a s p e e d o f 4 8 , 0 0 0 r p m . A s c a n n i n g U V N i s d e t e c t i o n s y s t e m i s u s e d t o m e a s u r e t h e a b s o r b a n c e a t 4 1 0 n m a n d t h e s c a n s r e c o r d e d e v e r y 5 m i n t h r o u g h t h e s a m p l e c e l l ( m a x i m u m v o l u m e o f 0 . 4 5 m L , 1 2 m m b a n d p a t h ) d u r i n g t h e h i g h s p e e d c e n t r i f u g a t i o n a f t e r 1 h r i n o r d e r t o c a l c u l a t e t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f f r e e c y t o c h r o m e c . K D v a l u e s w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t o t a l C c a n d f r e e C c a f t e r 1 h r w i t h 0 - 2 5 0 m M K C l b y a B e c k m a n C o u l t e r O p t i m a X L — l a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e w i t h a n A N 6 0 T i r o t o r i n s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y m o d e . T h e s a m p l e s o l u t i o n c o n t a i n e d : 6 1 1 M C c a n d 6 . 6 u M C c O i n 5 m M T r i s - H C l a t p H 8 . 0 , 0 . 1 % l a u r y l m a l t o s i d e ; a n d 0 , 2 0 , 4 0 , 6 0 , 8 0 , 1 0 0 , a n d 2 5 0 m M N a C l ( f r o m b o t t o m t o t o p ) . T h e s h a r p s p i k e i s t h e s a m p l e m e n i s c u s ( W a n g e t a l . , 1 9 9 9 ) . 2 1 4 ) m n 1 4 4 ( e c n a b r o s b A R o t o r l l / / 2 1 5 C o u n t e r S a m p l e 1 . ~ ) \ b a l a n c i n g c e l l J c e l l . D r i v e s h a f t . O p t i c a l a n a l y z i n g s y s t e m A W T h t I E W T h t I I E . 5 : 2 5 : 4 5 1 5 5 : 5 ' ' 5 : 2 ' 5 : 4 ' 5 : 5 ' 5 : 5 ' 7 . 0 R a d i u s ( m m ) R a d i u s ( m m ) ” 9 3 0 h t " _ , , , ; . - . . . ; . _ , : ; ; i H 9 3 K h t n H 9 3 N I E 1 8 2 A h t I I 4 : 4 1 i i , , , - - , l ; l . 7 . 1 1 . 1 1 ' 7 fi x . g . 1 1 . . W 9 » “ ‘ ” ‘ l . l i . r i g " . ' W ” " " " ' 7 i f } ? . a . ‘ * ' r ' ' 5 : 2 ' 5 : : 5 : 5 ' 5 : 5 ' 7 : 0 ' 5 : 2 ' 5 : 4 ' 5 : 5 ' 5 : 5 ' 7 . 0 5 1 2 5 : 4 5 : 5 5 : 5 R a d i u s ( m m ) R a d i u s ( m m ) R a d i u s ( m m ) T h e 1 : 1 r a t i o o f h o r s e C c a n d C c O w a s p r e p a r e d i n 5 m M T r i s - H C l , p H 8 . 0 , 0 . 1 % L M , 0 ~ 2 5 0 m M N a C l . C c w i l l o c c u p y t h e h i g h a f fi n i t y s i t e o n C c O fi r s t i n t h i s c o n d i t i o n . T h u s , t h i s c o n d i t i o n a l l o w s m e a s u r e m e n t o f t h e K 9 f o r b i n d i n g o f h o r s e C c t o t h e h i g h a f fi n i t y s i t e o n R . s p h a e r o i d e s C c O ( Z h e n e t a l . , 1 9 9 9 a ) . T h e c h a n g e i n t h e e l e c t r o s t a t i c p o t e n t i a l o f t h e s u r f a c e o f C c O , d u e t o t h e m u t a t i o n o r i o n i c s t r e n g t h w i l l a f f e c t t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n C c a n d C c O , a n d a l t e r t h e e l e c t r o n t r a n s f e r ( Z h e n e t a l . , 1 9 9 9 a ) . A t 0 m M N a C l , a l l o f C c w a s c o m p l e x e d t o C 5 0 s h o w i n g a s i n g l e b a n d o f 1 1 . 4 S ( S v e d b e r g ) ( F i g u r e 4 . 1 1 ) . A s t h e i o n i c s t r e n g t h w a s i n c r e a s e d , a s e c o n d b a n d w h i c h h a s a p l a t e a u r e g i o n a p p e a r s w i t h a s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y o f 1 . 7 4 S , w h i c h i s d u e t o u n c o m p l e x e d C c , i n d i c a t i n g a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f d i s s o c i a t e d C c . T h e c o n c e n t r a t i o n o f u n c o m p l e x e d C c w a s d i r e c t l y q u a n t i fi e d f r o m t h e 4 1 0 n m a b s o r b a n c e a t t h e p l a t e a u o f t h e C c , a s d e s c r i b e d b y C a n n ( C a n n , 1 9 7 0 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n o f u n c o m p l e x e d C c i n c r e a s e d a s t h e i o n i c s t r e n g t h w a s i n c r e a s e d , u n t i l i t r e a c h e d t h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f C 5 i n t h e c e l l a t 2 5 0 m M N a C l . T h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f t h e c o m p l e x w a s c a l c u l a t e d f r o m E q u a t i o n 1 . K 0 : [ C c ] [ C c O ] / [ C c - C c 0 ] ( E q . 1 ) T h i s e q u a t i o n a s s u m e s t h e f o r m a t i o n o f a 1 : 1 c o m p l e x b e t w e e n C c a n d C c O . T h e p o s i t i o n o f t h e h i s t i d i n e - t a g , u s e d f o r p u r i fi c a t i o n o f C c O , m a y c a u s e a c h a n g e i n t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n C c a n d C c O b e c a u s e t h e h i s t i d i n e - t a g w a s e n g i n e e r e d o n t o t h e C - t e r m i n a l e n d o f R . s p h a e r o i d e s C c O s u b u n i t H , c l o s e t o t h e C c b i n d i n g r e g i o n . H o w e v e r , t h e r e w a s n o m a j o r c h a n g e i n b i n d i n g b e h a V i o r b e t w e e n s u b u n i t I a n d H h i s - t a g 2 1 6 w i l d t y p e C c O o n K D ( T a b l e 4 . 1 ) . T h e c a l c u l a t e d K D o f t h e m u t a n t s ( H 9 3 K a n d H 9 3 N / E l 8 2 A ) w a s s i m i l a r t o w i l d t y p e s u g g e s t i n g t h a t t h e m u t a n t s d o n o t a l t e r t h e a f fi n i t y b e t w e e n C c a n d C c O . T h e g r e a t e s t e f f e c t ( h i g h e r t h a n t h e W T a n d o t h e r H 9 3 m u t a n t , e . g . 4 - 5 f o l d l a r g e r i n 0 - 2 0 m M r a n g e ) a m o n g t h e H 9 3 m u t a n t s w a s t h a t t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t w a s a l t e r e d i n t h e H 9 3 C m u t a n t . T h e r e s u l t s o b t a i n e d f o r w i l d t y p e w e r e i n g o o d a g r e e m e n t w i t h t h o s e o f W a n g e t a l . ( W a n g e t a l . , 1 9 9 9 ) s h o w i n g a K D o f < 0 2 a t 0 - 3 0 m M , 1 . 0 a t 4 0 m M , 5 . 6 a t 6 0 m M , 1 8 a t 8 0 m M , a n d 3 5 a t l O O m M N a C l . 4 . 3 . 5 . P r o t o n p u m p i n g i n C O V s T h e H 9 3 m u t a n t s a n d w i l d t y p e C c O w e r e r e c o n s t i t u t e d i n t o l i p i d v e s i c l e s b y a B i o - b e a d m e t h o d ( s e e C h a p t e r 2 f o r d e t a i l s ) i n o r d e r t o a n a l y z e t h e i r a c t i v i t y a n d p r o t o n p u m p i n g ( F i g u r e 4 . 1 2 ) . A l l m u t a n t s o f H 9 3 s h o w a p r o t o n p u m p i n g e f fi c i e n c y o f ~ 1 H + / e ' a s c a l c u l a t e d b y t h e q u a n t i fi c a t i o n m e t h o d i n t r o d u c e d i n C h a p t e r 3 s u p p o r t i n g t h e i d e a t h a t t h e u s e o f t h e H - c h a n n e l i n p r o t o n p u m p i n g i n R . s p h a e r o i d e s i s u n l i k e l y . H o w e v e r , a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e a r o u n d H 9 3 i s p r e d i c t e d , b a s e d o n t h e b i n d i n g o f fl u o r e s c e i n t o H 9 3 C w h e n C c i s p r e s e n t , b u t n o t i n i t s a b s e n c e . S i n c e t h e b i n d i n g s i t e o f c y t o c h r o m e c i s i n t h e v i c i n i t y , i t m a y b e t h a t a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e o c c u r s i n t h i s r e g i o n t h a t m i g h t a l t e r p r o t o n b a c k fl o w b u t n o t a f f e c t t h e p r o t o n p u m p i n g . 2 1 7 K o C L O O m M N a C I 2 0 m M 4 0 m M 6 0 m M 8 0 m M 1 0 0 m M W T h t I 0 . 0 1 0 . 5 3 . 8 1 2 . 4 3 4 . 5 N / D W T M B 0 . 0 1 0 . 6 4 . 9 1 3 3 1 . 4 7 6 H 9 3 K h t I I 0 . 0 6 0 . 4 5 . 6 1 8 . 1 4 0 . 5 1 1 2 . 4 H 9 3 N / E 1 8 2 A h t I I 0 . 0 5 0 . 6 6 . 6 1 3 . 5 2 8 7 6 . 9 H 9 3 C h t I I 0 . 2 4 2 . 6 8 . 2 7 0 . 3 3 7 4 . 5 N / D T a b l e 4 . l E q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s , K n , f o r t h e b i n d i n g o f h o r s e C c t o t h e h i g h a f f m i t y s i t e o n R . s p h a e r o i d e s c y t o c h r o m e c o x i d a s e . K D ( i n 1 . 1 M ) w a s m e a s u r e d u s i n g t h e a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e i n t h e s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y m o d e f o r 1 h a t 4 8 , 0 0 0 r p m . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s a r e t h e s a m e a s F i g u r e 4 . 1 1 . 2 1 8 F i g u r e 4 . 1 2 T h e c a t a l y t i c a c t i v i t y a n d p r o t o n p u m p i n g o f C O V s o f w i l d t y p e a n d H 9 3 m u t a n t s . C y t o c h r o m e c o x i d a t i o n i s m e a s u r e d a t 5 5 0 n m ( t o p p a n e l ) u n d e r c o n t r o l l e d c o n d i t i o n s ( b l a c k l i n e ) , w i t h v a l i n o m y c i n ( b l u e l i n e ) , a n d u n d e r u n c o n t r o l l e d c o n d i t i o n s ( r e d l i n e ) f o r 5 s e c o n d s . M e a s u r e m e n t o f p r o t o n m o v e m e n t s ( u p t a k e & r e l e a s e ) i n C O V s w a s o b t a i n e d b y u s i n g t h e e x t e r n a l l y a d d e d p H - s e n s i t i v e d y e , p h e n o l r e d , o n t h e o u t s i d e o f v e s i c l e s w i t h fi n a l 1 0 0 M c o n c e n t r a t i o n i n S O u M H E P E S - K O H a t p H 7 . 4 a n d w a s m o n i t o r e d a t 5 5 7 n m ( l o w e r p a n e l ) , a t a n i s o s b e s t i c p o i n t f o r c y t o c h r o m e c . A fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f ~ 0 . 1 1 1 M M 3 w a s m i x e d w i t h a d e fi n e d a m o u n t o f C c t o g i v e 1 0 t u r n o v e r s . T h e c o n t r o l l e d s t a t e ( b l a c k t r a c e ) s h o w s a n i n c r e a s e d a b s o r b a n c e i n d i c a t i n g a l k a l i n i z a t i o n o n t h e o u t s i d e o f t h e C O V s a s a r e s u l t o f p r o t o n b a c k fl o w u n d e r a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d p r o t o n g r a d i e n t . A d d i t i o n o f v a l i n o m y c i n s h o w s a d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e d u e t o t h e p u m p i n g o f p r o t o n s t o t h e o u t s i d e , w h i c h d e c r e a s e s t h e p H a n d l e a d s t o a d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e ( l o w e r , b l u e t r a c e ) b y e l i m i n a t i n g t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l . T h e a d d i t i o n o f F C C P a n d v a l i n o m y c i n r e l i e v e s b o t h t h e N P a n d A p H a n d t h e p r o t o n s e q u i l i b r a t e a c r o s s t h e m e m b r a n e , c a u s i n g a n a l k a l i n i z a t i o n o n t h e o u t s i d e , w h i c h i s t h e u n c o n t r o l l e d s t a t e ( l o w e r , r e d t r a c e ) . ‘ 2 1 9 C : c o n t r o l l e d , A 0 - 0 3 ' V : v a l i n o m y c i n 0 . 0 2 - E ' . 5 0 _ 0 2 _ . U . u n c o n t r o l l e d g C 0 . 0 1 - : 5 0 . 0 1 - v . . W T 0 . 0 0 - U . a i : 0 . 0 0 - 0 . 0 4 - ' ' 0 - 0 2 ‘ * A 0 . 0 3 - - ; U E 0 . 0 2 ‘ U 0 _ 0 1 _ , ‘ I r fi . v , . _ ‘ i i i i ' ~ ' . l ‘ . . ' l ' , ' “ 1 1 ' 3 “ “ : 0 . 0 1 C . . C . ’ 1 7 " “ 3 0 . 0 0 . m w i t “ " ’ - 0 . 0 1 - 0 . 0 0 - , j 5 , - 0 . 0 2 - . v “ , - 0 . o 3 . V W T 0 ' 0 1 , H 9 3 K - 0 . 0 4 . . . . . . . . . . 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 0 1 2 3 4 5 T i m e ( s e c ) T i m e ( s e c ) 0 . 0 3 . 0 . 0 3 ‘ . E , 0 . 0 2 - 0 . 0 2 - C a H 9 3 N / E 1 8 2 A < 0 . 0 1 . 0 . 0 1 - , < 1 . . 0 . 0 0 - 0 . 0 0 - U ‘ ' 0 . 0 3 j ' A 0 . 0 1 ‘ U 0 . 0 2 : U 5 0 . 0 1 : C B 0 0 0 C 0 . 0 0 : 3 ' - o . o 1 : H 9 3 N / E 1 8 2 A - 0 . 0 2 - < 1 . v - 0 . o 1 V . H 9 3 0 ' ° - ° 3 ‘ . . . . 0 1 2 3 0 1 2 3 4 5 T i m e ( s e c ) T i m e ( s e c ) 2 2 0 4 . 3 . 6 . Z i n c I n h i b i t i o n S t u d y i n P u t a t i v e B a c k fi o w P a t h w a y S i n c e H 9 3 i s o n e o f t h e f e w h i s t i d i n e r e s i d u e s o n t h e e x t e r n a l s u r f a c e o f C c O , i t i s a p o t e n t i a l t a r g e t f o r z i n c b i n d i n g . T h e H 9 3 K a n d H 9 3 N / E 1 8 2 A m u t a n t C O V s w e r e p r e p a r e d i n o r d e r t o t e s t t h e i r a b i l i t y t o b i n d z i n c . Z i n c c a n o n l y b i n d t o t h e o u t s i d e s u r f a c e e x p o s e d r e s i d u e s o f C 5 0 w h e n i t i s e m b e d d e d i n v e s i c l e s . Z i n c b i n d i n g i s e x p e c t e d t o b e l o c a t e d a t t h e e n t r y p o i n t o f a p r o t o n c h a n n e l , w h e r e s e v e r a l c a r b o x y l a t e s a n d / o r h i s t i d i n e r e s i d u e s a r e c l u s t e r e d t o f a v o r h i g h a f fi n i t y z i n c b i n d i n g . I t i s o b s e r v e d t h a t z i n c b i n d i n g o n t h e o u t s i d e r e d u c e s a c t i v i t y i n w i l d - t y p e ( C h a p t e r 3 . F i g u r e 3 . 2 ) a n d t h e H 9 3 m u t a n t s ( F i g u r e 4 . 1 3 a n d 4 . 1 4 ) . T h e H 9 3 K m u t a t i o n w a s d e s i g n e d i n o r d e r t o m a i n t a i n t h e p o s i t i v e c h a r g e , b u t w o u l d b e e x p e c t e d t o r e d u c e t h e a f fi n i t y o f b i n d i n g t o Z n 2 + . T h e d o u b l e m u t a n t H 9 3 N / E 1 8 2 A m a y g i v e f u r t h e r r e d u c e d z i n c b i n d i n g e f fi c i e n c y b y e l i m i n a t i n g t h e n e a r b y c a r b o x y l g r o u p , w h i c h h a s t h e p o s s i b i l i t y o f i n t e r a c t i n g w i t h H 9 3 . H o w e v e r , m u t a t i o n o f H 9 3 d o e s n o t a l t e r z i n c i n h i b i t i o n . I n h i b i t i o n b y z i n c w a s o b s e r v e d i n b o t h H 9 3 K a n d H 9 3 N / E l 8 2 A C O V s t o t h e s a m e e x t e n t a s w i l d t y p e C O V s , e v e n t h o u g h t h e e f f e c t o n p r o t o n p u m p i n g s e e m s s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t , Z n s h o w i n g m u c h g r e a t e r i n h i b i t i o n o f p u m p i n g i n t h e m u t a n t s ( F i g u r e 4 . 1 3 a n d 4 . 1 4 ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t z i n c b i n d i n g s t i l l o c c u r s i n t h e m u t a n t s a n d t h i s i s c o n fi r m e d b y t h e f a c t t h a t H 9 3 C s h o w s a s i m i l a r i n h i b i t i o n w i t h z i n c a s o b s e r v e d w i t h w i l d t y p e C O V s ( T a b l e 4 . 2 ) . T h e s o u r c e o f t h e d i f f e r e n t e f f e c t s o f Z n i s s t i l l b e i n g i n v e s t i g a t e d . 2 2 1 F i g u r e 4 . 1 3 M o n i t o r i n g t h e p r o t o n m o v e m e n t i n H 9 3 K C O V s . T h e m o v e m e n t o f p r o t o n s f r o m t h e o u t s i d e a n d i n s i d e o f H 9 3 K C O V s i n t h e a b s e n c e ( A , B & C ) a n d p r e s e n c e o f z i n c ( D , E & F ) , a n d t h e m o v e m e n t o f p r o t o n s m o n i t o r e d b y p h e n o l r e d a b s o r b a n c e c h a n g e s ( B , E ) a n d p y r a n i n e a b s o r p t i o n c h a n g e s ( C , F ) o n t h e i n s i d e . C y t o c h r o m e c o x i d a t i o n a t 5 5 0 n m i s m e a s u r e d o v e r 5 s e c o n d s i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e ( A , b l a c k l i n e ) , b u t t h i s i s s l o w e d w i t h t h e a d d i t i o n o f z i n c ( 1 0 0 M ) ( D , b l a c k l i n e ) . Z i n c s h o w s l i t t l e i n h i b i t i o n o f C c O w h e n v a l i n o m y c i n i s a d d e d ( D , b l u e l i n e ) a n d n o i n h i b i t i o n b y z i n c u n d e r t h e u n c o n t r o l l e d s t a t e , w i t h v a l i n o m y c i n a n d F C C P ( D , r e d l i n e ) . P r o t o n b a c k fl o w w a s o b s e r v e d b y m o n i t o r i n g o u t s i d e p H c h a n g e s w i t h p h e n o l r e d i n t h e c o n t r o l l e d ( B , b l a c k l i n e ) a n d w i t h z i n c ( E ) , w i t h t h e a d d i t i o n o f v a l i n o m y c i n ( B , b l u e l i n e ) , w h i c h h a s a h i g h p r o t o n g r a d i e n t . T h e u n c o n t r o l l e d s t a t e C O V s r a p i d l y e q u i l i b r a t e t h e p r o t o n s a c r o s s t h e m e m b r a n e s a n d c a u s e a l k a l i n i z a t i o n o n t h e o u t s i d e ( B , r e d l i n e ) . Z i n c d i d n o t c o n t r i b u t e t o b l o c k i n g t h e b a c k fl o w t o a n y r e a l e x t e n t i n t h e u n c o n t r o l l e d s t a t e ( E , r e d ) . P y r a n i n e ( 2 0 m M ) w a s a d d e d t o t h e i n s i d e o f C O V s a s a m o n i t o r o f i n t e r n a l p r o t o n c h a n g e s s e e n i n ( C ) a n d w i t h a d d e d z i n c ( F ) a t 4 3 5 n m u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n . 2 2 2 O3 6 . n 5 3 4 ( A A H 9 3 K H 9 3 K + Z n 0 . 0 2 5 - ( A ) C : c o n t r o l l e d V : v a l i n o m y c i n U : u n c o n t r o l l e d 2 T i m e ( s e c ) 2 2 3 H 9 3 N / E 1 8 2 A H 9 3 N / E 1 8 2 A + Z n 0 . 0 3 0 0 . 0 3 0 _ ( A ) C : c o n t r o l l e d ( D ) 0 . 0 2 5 _ . 0 . 0 2 5 . 0 0 2 0 V : v a l i n o m y c m 1 g . A . . . 0 . 0 2 0 E U : u n c o n t r o l l e d ~ _ g 0 . 0 1 5 E 0 . 0 1 5 - i n . g 3 0 . 0 1 0 - C 5 ; 0 . 0 1 0 - ' < 0 . 0 0 5 A A ( 5 5 7 n m ) A 5 5 7 n m z i n c ) T i m e ( s e c ) T i m e ( s e c ) F i g u r e 4 . 1 4 M o n i t o r i n g t h e p r o t o n m o v e m e n t i n H 9 3 N / E 1 8 2 A C O V s . T h e m o v e m e n t o f p r o t o n s f r o m t h e o u t s i d e a n d i n s i d e o f H 9 3 N / E 1 8 2 A C O V s i n t h e a b s e n c e ( A , B , a n d C ) a n d i n t h e p r e s e n c e ( D , E , a n d F ) o f z i n c . ( s e e F i g u r e 4 . 1 3 . ) . S t r o n g i n h i b i t i o n i s o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f z i n c ( 1 0 0 M ) . T h e p r o t o n b a c k fl o w w a s o b s e r v e d b y m o n i t o r i n g o u t s i d e p H c h a n g e s w i t h p h e n o l r e d i n t h e c o n t r o l l e d s t a t e ( B , b l a c k ) , w h i c h h a s a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d p r o t o n g r a d i e n t w i t h r e c o n s t i t u t e d C O V s i n t h e a b s e n c e o f i o n o p h o r e s . P r o t o n p u m p i n g w a s n o t o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f z i n c w i t h v a l i n o m y c i n ( E , b l u e l i n e ) , a n d c y t o c h r o m e c o x i d a t i o n w a s v e r y s l o w w i t h t h e a d d i t i o n o f z i n c ( D ) . 2 2 4 T u r n o v e r r a t e ( e ' l s e c / a a a ) C O V S C o n t r o l l e d P u m p i n g U n c o n t r o l l e d R C R W T 7 6 1 0 . 4 2 1 7 1 2 . 8 3 1 3 1 5 . 5 4 . 1 W T + Z i n c 3 9 1 0 . 4 1 6 6 1 2 . 2 2 3 8 1 2 . 9 6 . 1 H 9 3 K 3 0 1 0 . 1 6 7 1 0 . 6 1 4 2 1 1 . 2 4 . 7 H 9 3 K + Z i n c 5 . 7 1 0 . 2 3 2 1 0 . 3 6 7 1 0 . 5 1 1 . 8 H 9 3 0 4 5 1 0 . 2 1 7 2 1 2 . 0 1 7 7 1 2 . 0 3 . 9 H 9 3 C + Z i n c 7 . 9 1 0 1 5 0 1 0 . 2 1 1 9 1 1 . 0 1 5 . 1 H 9 3 N / E 1 8 2 A 3 7 1 0 . 2 1 3 5 1 1 . 5 1 7 2 1 1 . 4 4 . 6 H 9 3 N / E 1 8 2 A + Z i n c 7 3 1 0 . 3 3 3 . 2 1 0 2 5 8 . 4 1 0 3 8 T a b l e 4 . 2 E f f e c t o f z i n c o n t h e t u r n o v e r a c t i v i t y o f C O V s p r e p a r e d b y t h e B i o - b e a d m e t h o d . T h e b u f f e r c o n d i t i o n s w e r e ; 2 0 m M H E P E S - K O H , 3 9 m M K C l , 5 2 m M s u c r o s e , p H 7 . 4 o n t h e i n s i d e a n d 5 0 u M H E P E S - K O H , 4 5 m M K C l o n t h e o u t s i d e . m a d e i n t h e O l i s - r s m s t o p p e d - fl o w i n s t r u m e n t . C y t o c h r o m e c o x i d a t i o n r a t e s w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e k i n e t i c t r a c e s a t 5 5 0 n m b y m u l t i p l y i n g t h e k i n e t i c r a t e ( e ' / s e c ) x [ C c ] i t M / [ a a 3 ] u M . R C R ( R e s p i r a t o r y C o n t r o l R a t i o w a s c a l c u l a t e d f r o m u n c o n t r o l l e d r a t e [ c o n t r o l l e d r a t e . E x p e r i m e n t a l C o n d i t i o n s w e r e a s i n F i g u r e 4 . l 2 . F i n a l 1 0 0 p M Z n S O 4 w a s a d d e d f o r t h e z i n c i n h i b i t i o n m e a s u r e m e n t s . 2 2 5 M e a s u r e m e n t s w e r e 4 . 4 . D i s c u s s i o n T h e H - c h a n n e l a p p e a r s a l i k e l y p r o t o n c h a n n e l i n b o v i n e C c O a s i t s p a n s t h e p r o t e i n a n d i s c l o s e t o h e m e a , w h i c h h a s b e e n s u g g e s t e d a s a s i t e f o r c o u p l i n g o f e l e c t r o n t r a n s f e r t o p r o t o n p u m p i n g ( C a p i t a n i o e t a l . , 1 9 9 6 ) . I t i s a l s o t h e o n l y a r e a o f t h e p r o t e i n t h a t d i f f e r s i n c o n f o r m a t i o n b e t w e e n t h e o x i d i z e d a n d r e d u c e d c r y s t a l s t r u c t u r e s o f b o v i n e C c O . M u t a t i o n s t u d i e s s u p p o r t t h e e x i s t e n c e a n d i m p o r t a n t r o l e o f D 5 1 , e v e n t h o u g h t h e r e i s a l a c k o f c o n s e r v a t i o n o f t h e r e s i d u e s r e p o r t e d i n b a c t e r i a l R s C c O ( L e e e t a l . , 2 0 0 0 ) . T h e s p a c i a l l y c l o s e s t , p r o t o n - a c c e p t i n g r e s i d u e , H 9 3 , i n R . s p h a e r o i d e s w a s s e l e c t e d t o t e s t t h e h y p o t h e s i s o f t h e H - p a t h w a y i n b a c t e r i a l C c O . T h e fl u o r e s c e i n - b i n d i n g d a t a s u g g e s t s t h a t t h e r e i s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e a t t h e p o s i t i o n o f H 9 3 u p o n b i n d i n g o f C c i n t h e b a c t e r i a l e n z y m e a l t h o u g h n o c h a n g e i n s t r u c t u r e i s s e e n b e t w e e n o x i d i z e d a n d r e d u c e d f o r m s o f R c h O ( ( Q i n , 2 0 0 8 ; Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ) u n p u b l i s h e d ) . H o w e v e r , v a r i o u s H 9 3 m u t a n t s s h o w c l o s e t o n o r m a l p r o t o n p u m p i n g ( ~ 1 H + / e ' s t o i c h i o m e t r y ) . T h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h i s r e s i d u e i s n o t i m p o r t a n t i n p r o t o n p u m p i n g o f R . s p h a e r o i d e s C c O . T h e m u t a t i o n o f H 9 3 t o a c y s t e i n e a l t e r e d t h e r e d o x p o t e n t i a l o f h e m e a a s m e a s u r e d b y f a s t e l e c t r o n t r a n s f e r ( M i l l e t t & S c h m i d t u n p u b l i s h e d d a t a ) . H 9 3 i s o n h e l i x I I a s i s t h e h e m e a l i g a n d H 1 0 2 . A c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e a t H 9 3 m a y a l t e r t h e l i g a n d b i n d i n g t o h e m e a w h i c h c o u l d a l t e r t h e r e d o x p o t e n t i a l . A l s o , t h e n e a r b y r e s i d u e T 1 0 0 w a s m u t a t e d t o a l y s i n e w i t h s i m i l a r r e d u c t i o n o f t h e h e m e a r e d o x p o t e n t i a l . R e s u l t s i n d i c a t e t h a t o t h e r m u t a t i o n s o f H 9 3 m a y c h a n g e i n t h e r e d o x p o t e n t i a l o f h e m e a ( ( M i l l e t t e t a l . ) u n p u b l i s h e d ) . 2 2 6 C l o s e n e s s o f H 9 3 t o E 1 8 2 a n d t h e fl e x i b i l i t y o f b o t h s u g g e s t t h i s c o u l d b e a z i n c b i n d i n g s i t e . H o w e v e r , z i n c i n h i b i t i o n i s a l s o o b s e r v e d i n b o t h s i n g l e m u t a n t s o f H 9 3 ( H 9 3 C , H 9 3 K ) a n d d o u b l e m u t a t i o n s ( H 9 3 N / E 1 8 2 A ) . T h e r e s u l t s r u l e o u t a n e s s e n t i a l r o l e o f H 9 3 i n z i n c b i n d i n g . H o w e v e r , s e v e r a l u n i q u e c h a r a c t e r i s t i c s h a v e b e e n n o t e d f o r t h i s m u t a n t . A n o r m a l e f fi c i e n c y o f p r o t o n p u m p i n g ( 1 H + / e ' ) s u g g e s t s t h a t H 9 3 i s n o t e s s e n t i a l f o r p r o t o n r e l e a s e t o t h e o u t s i d e ; h o w e v e r , i t i s s t i l l p o s s i b l e t h a t t h e H 9 3 r e s i d u e m a y e x e r t c o n t r o l o n p r o t o n b a c k fl o w . I n t h e w i l d t y p e C c O , a c t i v i t y i s i n c r e a s e d a s t h e p H i s l o w e r e d d u e t o t h e i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n o f p r o t o n s , o n e o f t h e s u b s t r a t e s o f t h e r e a c t i o n m e c h a n i s m f o r o x y g e n c o n s u m p t i o n a c t i v i t y . T h e a c t i v i t y o f t h e p u r i fi e d H 9 3 m u t a n t s ( F i g u r e 4 . 8 ) s h o w e d m u c h l e s s i n c r e a s e i n a c t i v i t y a t l o w p H , b e l o w 7 . 0 , s u g g e s t i n g t h a t s o m e t h i n g o t h e r t h a n p r o t o n s h a d b e c o m e r a t e l i m i t i n g a t l o w e r p H . T h e l o w e r e d a c t i v i t y ( b e l o w t h a t o f w i l d t y p e ) a t l o w p H f o r t h e H 9 3 m u t a n t s m i g h t s u g g e s t t h a t t h e p r o t o n a t i o n s t a t e o f H 9 3 i s i m p o r t a n t , p o s s i b l y c o n t r i b u t i n g t o a c o n f o r m a t i o n a l g a t e . T h e i n c r e a s e d R C R o b s e r v e d a t h i g h p H f o r a l l t h e H 9 3 m u t a n t s i s s i m i l a r t o t h a t o f t h e R 4 8 1 K m u t a n t ( Q i a n e t a l . , 2 0 0 4 ) . U n d e r t h e c o n t r o l l e d s t a t e , p r o t o n s u p p l y f r o m t h e o u t s i d e i s i m p o r t a n t , a n d a t h i g h p H i t m a y b e r a t e l i m i t i n g i n H 9 3 m u t a n t s . O n e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s e r e s u l t s i s t h a t H 9 3 i s a p a r t o f a p r o t o n b a c k fl o w p a t h ( t h a t a l s o i n v o l v e s R 4 8 1 ) w h i c h i s s e p a r a t e f r o m t h e p r o t o n e x i t p a t h a n d i n v o l v e s p a r t n e r s w e h a v e n o t y e t i d e n t i fi e d . F u r t h e r m u t a g e n e s i s s t u d i e s a n d X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e s w i l l b e r e q u i r e d t o d e fi n e t h i s p a t h w a y . 2 2 7 T h e l o c a t i o n o f H 9 3 o n t h e o u t s i d e s u r f a c e o f C c O r a i s e s t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e e f f e c t s o b s e r v e d a r e d u e t o c h a n g e s i n t h e b i n d i n g o f C c t o C c O . A n y c h a n g e s i n t h e o n a n d o f f r a t e s o f C c b i n d i n g c a n c h a n g e t h e e l e c t r o n t r a n s f e r r a t e a n d e f fi c i e n c y . I n d e e d , t h e p r o p o s e d d o c k i n g s i t e o f c y t o c h r o m e c ( R o b e r t s a n d P i q u e , 1 9 9 9 ) i s l e s s t h a n 9 A f r o m H 9 3 . H o w e v e r , n o s i g n i fi c a n t c h a n g e s w e r e o b s e r v e d i n t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( K D ) , m e a s u r e d i n t h e a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e f o r t h e H 9 3 K a n d d o u b l e m u t a n t s . H o w e v e r , H 9 3 C s h o w s a s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s e d K D a c r o s s a r a n g e o f i o n i c s t r e n g t h s . T h i s m u t a n t , w h i c h i s l i k e l y t o m o v e t o a n i n t e r i o r p o s i t i o n , m a y b e g i v i n g i m p o r t a n t i n f o r m a t i o n . A p o s s i b l e i n t e r a c t i o n o f C c O w i t h V D A C ( v o l t a g e - d e p e n d e n t a n i o n c h a n n e l ) w a s r e c e n t l y p r o p o s e d ( R o m a n e t a l . , 2 0 0 5 ) . V D A C , a m i t o c h o n d r i a l o u t e r m e m b r a n e c h a n n e l , i s i n v o l v e d i n t h e c o n t r o l o f t h e a p o p t o t i c p r o c e s s . T h e b i n d i n g r e g i o n t o C c O i d e n t i fi e d b y p h a g e d i s p l a y a n d d i r e c t m e a s u r e m e n t s i s o n t h e o u t e r s u r f a c e o f s u b u n i t I o f h u m a n C c O . T h i s b i n d i n g r e g i o n c o r r e s p o n d s t o t h e r e g i o n c o n t a i n i n g t h e E 1 8 2 i n R . s p h a e r o i d e s , w h i c h i n t e r a c t s w i t h t h e H 9 3 r e s i d u e n e a r b y . T h i s i d e a g i v e s a n o v e l , a n d p o t e n t i a l l y i m p o r t a n t , r e g u l a t i o n p o s s i b l y i n v o l v i n g H 9 3 . 2 2 8 C h a p t e r 5 S u m m a r y a n d P e r s p e c t i v e s T h e i m p o r t a n c e o f r e g u l a t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e a n d e n e r g y m e t a b o l i s m S t r i c t r e g u l a t i o n o f e n e r g y m e t a b o l i s m i s e s s e n t i a l f o r t h e s u r v i v a l o f a l i v i n g c e l l . H o w e v e r , t h i s i s a c o m p l e x p r o c e s s , i n v o l v i n g m a n y l e v e l s o f h o r m o n a l , n e u r o n a l , a n d m e t a b o l i c c o n t r o l , i n c l u d i n g r e g u l a t i o n a t t h e m o s t f u n d a m e n t a l l e v e l , t h e m i t o c h o n d r i a l e l e c t r o n t r a n s p o r t c h a i n . I t i s i m p o r t a n t t o f u l l y u n d e r s t a n d t h e m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n i n o r d e r t o p r o b e t h e r e a s o n s f o r d e f e c t i v e e n e r g y r e g u l a t i o n , w h i c h i s t h e c a u s e o f m a n y h u m a n d i s e a s e s . M i t o c h o n d r i a u s e o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n t o c o n v e r t d i e t a r y f o o d s o u r c e s ( p r o t e i n s , c a r b o h y d r a t e s a n d f a t s ) i n t o e n e r g y a n d h e a t t h r o u g h a p r o c e s s t h a t i s d e p e n d e n t o n a s e q u e n t i a l d r o p i n p o t e n t i a l e n e r g y , a n d b y t h e e n e r g y r e l e a s e d f r o m t h e r e d u c t i o n o f o x y g e n a t t h e a c t i v e s i t e o f C c O . T h e e n e r g y r e l e a s e d b y t h e fl o w o f e l e c t r o n s t h r o u g h t h e e l e c t r o n t r a n s p o r t c h a i n ( E T C ) i s u s e d t o p u m p p r o t o n s o u t o f t h e m i t o c h o n d r i a l i n n e r m e m b r a n e , o r t h e b a c t e r i a l m e m b r a n e , t o t h e i n t e r r n e m b r a n e s p a c e t h r o u g h c o m p l e x e s 1 , I I I , a n d I V . T h e p o t e n t i a l e n e r g y s t o r e d i n t h e e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t t h a t i s p r o d u c e d b y t h e m o v e m e n t o f p r o t o n s a n d e l e c t r o n s i s c o u p l e d t o A T P s y n t h e s i s i n c o m p l e x V . M e a n w h i l e , r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s ( R O S ) c a n b e g e n e r a t e d a s a t o x i c b y - p r o d u c t . I n h i b i t i o n o f t h e e l e c t r o n t r a n s p o r t c h a i n m a y g e n e r a t e R O S t h a t c a n d a m a g e t h e c e l l . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n p l a y s a c e n t r a l r o l e i n a w i d e r a n g e o f d i s e a s e s , s u c h a s A l z h e i m e r s a n d a g e - r e l a t e d d i s e a s e s ( W a l l a c e , 2 0 0 5 ) , s i n c e t h e m i t o c h o n d r i a l D N A e n c o d e s e s s e n t i a l g e n e s f o r e n e r g y p r o d u c t i o n ( S c h o n a n d M a n f r e d i , 2 0 0 3 ) ( F i g u r e 5 . 1 ) . 2 2 9 T h e e f fi c i e n c y o f e n e r g y c o n v e r s i o n f r o m d i e t a r y f o o d s o u r c e s , N A D H a n d s u c c i n a t e t o A T P , i s d e t e r m i n e d b y t h e c o u p l i n g e f fi c i e n c y . T h e h i g h l y e f fi c i e n t m i t o c h o n d r i a h a v e a m i n i m a l l e a k i n e s s f o r p r o t o n s i n t h e i n n e r m e m b r a n e , a l l o w i n g e f fi c i e n t g e n e r a t i o n o f A T P p e r e l e c t r o n c o n s u m e d . T h i s i s a t i g h t l y “ c o u p l e d ” c o n d i t i o n . B y c o n t r a s t , i f t h e p r o t o n p u m p i n g e f fi c i e n c y i s r e d u c e d b y a n y u n c o u p l i n g r e a c t i o n ( i n c r e a s e d p r o t o n l e a k ) , l e s s A T P w i l l b e g e n e r a t e d w h i l e p r o d u c i n g m o r e h e a t ( F i g u r e 5 . 2 ) . T h i s i s c a l l e d t h e “ u n c o u p l e d ” c o n d i t i o n . I n a n e n d o t h e r m i c a n i m a l , t h e c o u p l i n g e f fi c i e n c y d e t e r m i n e s t h e r a t i o o f c a l o r i e s t o t h e a m o u n t o f w o r k , v e r s u s t h e n e e d t o m a i n t a i n t e m p e r a t u r e t h r o u g h u n c o u p l i n g p r o c e s s e s . T h e a m o u n t o f l e a k i n e s s i n t h e e l e c t r o n t r a n s f e r c h a i n i s d e p e n d e n t o n t h e a b i l i t y o f t h e p r o t e i n s t o m o v e p r o t o n s a c r o s s t h e m e m b r a n e r a t h e r t h a n h a v i n g t h e p r o t o n s m o v e t h r o u g h t h e m e m b r a n e . T h i s w o u l d r e s u l t i n l o s s o f a p H g r a d i e n t a n d u n c o u p l i n g t h e e l e c t r o n t r a n s p o r t f r o m A T P s y n t h e s i s , a n d p r o d u c i n g h e a t . O u r d a t a s u g g e s t s t h a t C c O i t s e l f h a s a n i m p o r t a n t r o l e i n r e g u l a t i n g e f fi c i e n c y ( H V e ' ) i n a n i n t r i n s i c m a n n e r , a l l o w i n g t h e b a c k fl o w o f p r o t o n s t h r o u g h t h e p r o t e i n u n d e r c o n d i t i o n s o f a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l ( N P ) a n d p r o t o n g r a d i e n t ( A p H ) ( M i l l s a n d F e r g u s o n - M i l l e r , 2 0 0 2 b ) . R O S a r e g e n e r a t e d a s a t o x i c b y - p r o d u c t d u r i n g r e s p i r a t i o n , e s p e c i a l l y w h e n e l e c t r o n t r a n s f e r i s s l o w e d d o w n . T h e E T C c o n t i n u e s t o t r a n s f e r e l e c t r o n s a n d p u m p p r o t o n s u n t i l t h e e l e c t r o s t a t i c p o t e n t i a l g r a d i e n t b u i l d s u p a n d i n h i b i t s f u r t h e r e l e c t r o n t r a n s f e r a n d p r o t o n p u m p i n g . A t t h i s p o i n t , t h e E T C s t a l l s a n d t h e e l e c t r o n c a r r i e r s b e c o m e m a x i m a l y o c c u p i e d w i t h e l e c t r o n s ( r e d u c e d ) . 2 3 0 “ c w ; - 1 2 S V N D 6 M E L A S ‘ 6 3 - ~ k N D , L 1 N 0 1 l l H u m a n m t D N A - . 1 0 ( 1 5 . 5 k b ) M N D Z ‘ ‘ - D s t o n i a 1 % ‘ R M “ N D 4 L I N D 4 C C O I I I c c o r r f A 8 I A 6 F i g u r e 5 . 1 M a p o f t h e h u m a n m i t o c h o n d r i a l g e n o m e . P o l y p e p t i d e - c o d i n g g e n e s , w h i c h a r e i n b o l d f a c e a n d o u t s i d e o f t h e c i r c l e , s p e c i f y i n g s e v e n s u b u n i t s o f N A D H h y d r o g e n a s e - c o e n z y m e Q o x i d o r e d u c t a s e ( N D ) , o n e s u b u n i t o f c o e n z y m e Q - c y t o c h r o m e c o x i d o r e d u c t a s e ( c y t b ) , t h r e e s u b u n i t s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( C C O ) , a n d t w o s u b u n i t s o f A T P s y n t h a s e ( A ) . P r o t e i n s y n t h e s i s g e n e s ( 1 2 S a n d 1 6 S r R N A s , a n d 2 2 t R N A s ) a r e i n s i d e t h e c i r c l e . M u t a t i o n s i n m t D N A a s s o c i a t e d w i t h M E L A S a n d M E R R F , a n d m u t a t i o n s w i t h f e a t u r e s o f n e u r o d e g e n e r a t i v e d i s o r d e r s , s u c h a s a t a x i a , c h o r e a , d y s t o n i a , m o t o r n e u r o n d i s e a s e ( M N D ) , a n d p a r k i n s o n i s m , a r e b o x e d . T h e fi g u r e i s o b t a i n e d f r o m ( S c h o n a n d M a n f r e d i , 2 0 0 3 ) . 2 3 1 M a t r i x S p a c e ‘ m ‘ G e n e r a t i n g H e a t E n e r g y B a l a n c e a n d R e g u l a t i o n M i t o c h o n d r i a l M e m b r a n e O u t e r M e m b r a n e I n t r i n s i c E x t r i n s i c I n t e r m e m b r a n e s p a c e C o u p l i n g U n c o u p l i n g U n c o u p l i n g H + H " H + ‘ / N A D P + P i A T P 4 H + + 4 e ' + 0 2 Z H Z O U n c o u p l i n g p r o t e i n A T P s y n t h a s e E T C ( E l e c t r o n T r a n s p o r t C h a i n ) F i g u r e 5 . 2 E l e c t r o n t r a n s p o r t c h a i n c o m p l e x , a n d p r o t o n c o u p l i n g a n d u n c o u p l i n g . E l e c t r o n s a r e g e n e r a t e d f r o m d i e t a r y f o o d s o u r c e s , a n d a r e t r a n s f e r r e d t o t h e fi n a l e l e c t r o n a c c e p t o r , 0 2 , w h i c h i s r e d u c e d t o f o r m w a t e r . C o m p l e x 1 , I I I , a n d I V t r a n s p o r t p r o t o n s i n t o t h e i n t e r m e m b r a n e s p a c e a n d f o r m t h e e l e c t r o c h e m c i a l p o t e n t i a l g r a d i e n t p r o d u c e d b y t h e e l e c t r o n s a n d p r o t o n s . T h e b u i l d u p o f a p r o t o n g r a d i e n t , A p H , i s u s e d t o p r o d u c e A T P f r o m A D P a n d p h o s p h a t e i n t h e A T P s y n t h a s e . T h e u n c o u p l i n g p r o t e i n ( U C P ) c a u s e s t h e d i s s i p a t i o n o f a p r o t o n g r a d i e n t , a n d t h i s r e s u l t s i n t h e p r o d u c t i o n o f e n e r g y i n t h e f o r m o f h e a t . C c O i t s e l f c a n a c t a s a n i n t r i n s i c u n c o u p l i n g p r o t e i n i n t h e E T C , i n o r d e r t o d i s s i p a t e t h e h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l b y a l l o w i n g p r o t o n s t o m o v e t h r o u g h a b a c k fl o w p a t h w a y , w h i c h m a y p r e v e n t t h e p r o d u c t i o n o f R O S d u r i n g t u r n o v e r . 2 3 2 T h e s e e l e c t r o n s c a n t h e n b e t r a n s f e r r e d t o 0 2 v i a fl a v i n a n d q u i n o n e m o i e t i e s t o g e n e r a t e v a r i o u s f o r m s o f o x y g e n r a d i c a l s ( 0 2 - , H 2 0 2 , O H ' ) . A n a c t i v e , b u t p a r t i a l l y u n c o u p l e d , C c O c a n h e l p r e d u c e t h e f o r m a t i o n o f a h i g h m e m b r a n e p o t e n t i a l , b y t h e r a p i d r e d u c t i o n o f o x y g e n a t t h e a c t i v e s i t e o f C c O , p r e v e n t i n g t h e b u i l d u p o f e l e c t r o n s u p s t r e a m a n d l i m i t i n g R O S p r o d u c t i o n . T h e q u e s t i o n o f h o w p a r t i a l u n c o u p l i n g o f C c O i s a c h i e v e d a n d u n d e r w h a t c o n d i t i o n s i s a m a j o r i s s u e i n u n d e r s t a n d i n g t h e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n o f C c O . T h e h y p o t h e s i s i s t h a t p r o t o n b a c k fl o w i s a n i m p o r t a n t b i o l o g i c a l v a l v e t o c o n t r o l e n e r g y e f fi c i e n c y i n C c O , a n d R O S p r o d u c t i o n . I n t h i s d i s s e r t a t i o n , w e h a v e s t u d i e d t h e p r e s e n c e o f p r o t o n b a c k fl o w a n d i t s r e g u l a t i o n i n C c O , a s a n i n t r i n s i c u n c o u p l i n g m e c h a n i s m , b y t h e m u t a t i o n o f i m p o r t a n t r e s i d u e s , a n d b y e x a m i n i n g t h e e f f e c t o f z i n c b i n d i n g . Z i n c i s a n i n h i b i t o r o f t h e c o n t r o l l e d s t a t e , u n d e r t h e c o n d i t i o n o f a h i g h N P a n d A p H . T h e b i n d i n g o f z i n c o n t h e o u t s i d e o f r e c o n s t i t u t e d C 0 0 i n p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s a p p e a r s t o i n h i b i t p r o t o n b a c k - l e a k ( M i l l s e t a l . , 2 0 0 2 ) . P r o t o n b a c k fl o w i n C c O w a s i n i t i a l l y r e c o g n i z e d i n a D 1 3 2 A m u t a n t , w h e r e t h e p r o t o n u p t a k e t h r o u g h t h e D p a t h w a y i s g r e a t l y s l o w e d . O u r e f f o r t t o l o o k a t p H c h a n g e s , b o t h i n s i d e a n d o u t s i d e o f C O V s , u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s , i s a i m e d a t i n c r e a s i n g o u r u n d e r s t a n d i n g o f e n e r g y r e g u l a t i o n i n C c O d u r i n g t u r n o v e r . H o w e v e r , t h e s e m e a s u r e m e n t s a r e t e c h n i c a l l y v e r y d i f fi c u l t . A n a t t e m p t w a s m a d e t o c o r r e l a t e 2 3 3 t h e i n s i d e s i g n a l c h a n g e s t o t h e o u t s i d e s i g n a l c h a n g e s u s i n g d i f f e r e n t p H p r o b e s , w i t h m u l t i p l e t u r n o v e r s o f C c O , a n d w i t h a g o o d s i g n a l - t o - n o i s e r a t i o , b y i n c r e a s i n g t h e i n t e r n a l v o l u m e , a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o f d y e e n t r a p p e d i n t h e C O V s ( C h a p t e r 2 ) . H o w e v e r , t h e r e s u l t s w e r e n o t a s d e fi n i t i v e a s h o p e d , d u e t o c o n t i n u e d t e c h n i c a l d i f fi c u l t i e s i n a s s e s s i n g t h e i n t e r n a l p H . F u r t h e r , w e s t i l l d o n o t k n o w t h e l o c a t i o n o f t h e p r o t o n b a c k fl o w p a t h w a y . W e a l s o d o n o t f u l l y c o m p r e h e n d h o w t h e c o u p l i n g o f p r o t o n m o v e m e n t i s l i n k e d t o t h e e l e c t r o n m o v e m e n t . T h e p r o t o n p a t h a b o v e t h e h e m e s f o r p r o t o n p u m p i n g i n C c O i s n o t r e s o l v e d . W a t e r i s r e s o l v e d i n t h e D a n d K p r o t o n u p t a k e p a t h w a y s , w h i c h , a l o n g w i t h m u t a g e n e s i s , h e l p e d t o d e fi n e t h e r o u t e f o r p r o t o n s ( Q i n e t a l . , 2 0 0 6 ; S v e n s s o n - E k e t a l . , 2 0 0 2 ) . W a t e r i s n o t u s u a l l y o b s e r v e d e x c e p t w i t h h i g h l y r e s o l v i n g c r y s t a l s < 2 . 5 A . B y o b t a i n i n g h i g h e r X - r a y c r y s t a l d i f f r a c t i o n s t r u c t u r e s , a n d u s i n g s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s , i t i s h o p e d t h a t t h e e x i t p a t h f o r p r o t o n s , a n d t h e p r o t o n b a c k fl o w p a t h , a s w e l l a s t h e z i n c b i n d i n g s i t e , w i l l b e d e t e r m i n e d ( C h a p t e r 3 ) . V a r i o u s H 9 3 m u t a n t s , w e r e i n t e n s i v e l y s t u d i e d i n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r H 9 3 i s a n i m p o r t a n t r e s i d u e i n c o n t r o l l i n g p r o t o n b a c k fl o w i n b a c t e r i a l ( R . s p h a e r o d i e s ) o x i d a s e ( C h a p t e r 4 ) . T h i s r e s i d u e w a s s e l e c t e d b e c a u s e o f i t s p r o x i m i t y t o D 5 1 i n b o v i n e o x i d a s e t h a t i s p r o p o s e d t o b e a t a n o u t l e t o f t h e e x i t p a t h f o r p r o t o n s . T h e H 9 3 m u t a n t s s h o w e d a h e i g h t e n e d i n h i b i t i o n b y h i g h p H w h e n r e c o n s t i t u t e d i n t o v e s i c l e s , s u g g e s t i n g a p o s s i b l e r o l e i n p r o t o n m o v e m e n t . A d d i t i o n a l l y , a h i g h R C R w a s o b s e r v e d , d u e t o a l o w c o n t r o l l e d r a t e , s u g g e s t i n g t h a t p r o t o n b a c k fl o w w a s l i m i t e d . A n o t h e r p o s s i b l e r o l e o f H 9 3 h a s b e e n p r o p o s e d i n r e l a t i o n t o V D A C ( v o l t a g e - d e p e n d e n t a n i o n c h a n n e l ) , w h i c h i s 2 3 4 u q " ' . h ‘ . . - i n v o l v e d i n t h e c o n t r o l o f a p o p t o s i s a n d h a s a n i n t e r a c t i o n w i t h C c O i n t h e a r e a o f H 9 3 ( R o m a n e t a l . , 2 0 0 5 ) . F u r t h e r s t u d i e s o n t h e c o n t r o l o f C 0 0 a c t i v i t y , a n d t h e r o l e o f p r o t o n b a c k fl o w , w i l l b e c l a r i fi e d b y d e v e l o p i n g a k i n e t i c m o d e l c a p a b l e o f d e s c r i b i n g t h e r a t e s o f p r o t o n u p t a k e , b a c k fl o w , a n d e l e c t r o n t r a n s f e r u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s , t o a l l o w m o r e i n c i s i v e t e s t i n g o f t h e s t r u c t u r a l b a s i s o f t h e s e p r o c e s s e s ( C h a p t e r 3 ) . 2 3 5 B i b l i o g r a p h y A a g a a r d , A . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 1 ) . Z i n c i o n s i n h i b i t o x i d a t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e b y o x y g e n . F E B S L e t t e r s 4 9 4 , 1 5 7 - 1 6 0 . A a g a a r d , A . , G i l d e r s o n , G . , M i l l s , D . A . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 0 ) . R e d e s i g n o f t h e p r o t o n - p u m p i n g m a c h i n e r y o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e : p r o t o n p u m p i n g d o e s n o t r e q u i r e G l u ( I - 2 8 6 ) . B i o c h e m i s t r y 3 9 , 1 5 8 4 7 — 1 5 8 5 0 . A a g a a r d , A . , N a m s l a u e r , A . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 2 ) . I n h i b i t i o n o f p r o t o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e b y z i n c i o n s : d e l a y e d p r o t o n u p t a k e d u r i n g o x y g e n r e d u c t i o n . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 5 5 5 , 1 3 3 - 1 3 9 . E A b e y w a r d e n a , M . Y . , A l l e n , T . M . , a n d C h a r n o c k , 1 . 3 . ( 1 9 8 3 ) . L i p i d - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s o f r e c o n s t i t u t e d m e m b r a n e - a s s o c i a t e d a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e s . U s e o f a g e l - fi l t r a t i o n p r o c e d u r e t o e x a m i n e p h o s p h o l i p i d - a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 7 2 9 , 6 2 - 7 4 . A d e l r o t h , P . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 4 ) . S u r f a c e - m e d i a t e d p r o t o n - t r a n s f e r r e a c t i o n s i n . . m e m b r a n e - b o u n d p r o t e i n s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 6 5 5 , 1 0 2 - 1 1 5 . A d e l r o t h , P . , E k , M . S . , M i t c h e l l , D . M . , G e n n i s , R . B . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 1 9 9 7 ) . G l u t a m a t e 2 8 6 i n c y t o c h r o m e a a 3 f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s i s i n v o l v e d i n p r o t o n u p t a k e d u r i n g t h e r e a c t i o n o f t h e f u l l y - r e d u c e d e n z y m e w i t h d i o x y g e n . B i o c h e m i s t r y 3 6 , 1 3 8 2 4 - 1 3 8 2 9 . A d e l r o t h , P . , G e n n i s , R . B . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 1 9 9 8 ) . R o l e o f t h e p a t h w a y t h r o u g h K ( I — 3 6 2 ) i n p r o t o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m R . s p h a e r o i d e s . B i o c h e m i s t r y 3 7 , 2 4 7 0 - 2 4 7 6 . A d e l r o t h , P . , K a r p e f o r s , M . , G i l d e r s o n , G . , T o m s o n , F . L . , G e n n i s , R . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 0 ) . P r o t o n t r a n s f e r f r o m g l u t a m a t e 2 8 6 d e t e r m i n e s t h e t r a n s i t i o n r a t e s b e t w e e n o x y g e n i n t e r m e d i a t e s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m i c a e t B i o p h y s i c a A c t a 1 4 5 9 , 5 3 3 - 5 3 9 . A g m o n , N . ( 1 9 9 5 ) . T h e G r o t t h u s s m e c h a n i s m . C h e m P h y s L e t t 2 4 4 , 4 5 6 - 4 6 2 . A l l e n , T . M . , R o m a n s , A . Y . , K e r c r e t , H . , a n d S e g r e s t , J . P . ( 1 9 8 0 ) . D e t e r g e n t r e m o v a l d u r i n g m e m b r a n e r e c o n s t i t u t i o n . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 6 0 1 , 3 2 8 - 3 4 2 . A n t o n i n i , E . , B r u n o r i , M . , C o l o s i m o , A . , G r e e n w o o d , C . , a n d W i l s o n , M T ( 1 9 7 7 ) . O x y g e n " p u l s e d " c y t o c h r o m e c o x i d a s e : f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s a n d c a t a l y t i c r e l e v a n c e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 7 4 , 3 1 2 8 - 3 1 3 2 . 2 3 6 B a b c o c k , G T , a n d C a l l a h a n , P . M . ( 1 9 8 3 ) . R e d o x - L i n k e d H y d r o g e n B o n d S t r e n g t h C h a n g e s i n C y t o c h r o m e a : I m p l i c a t i o n s f o r a C y t o c h r o m e O x i d a s e P r o t o n P u m p . B i o c h e m i s t r y 2 2 , 2 3 1 4 - 2 3 1 9 . B a b c o c k , G T , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 2 ) . O x y g e n a c t i v a t i o n a n d t h e c o n s e r v a t i o n o f e n e r g y i n c e l l r e s p i r a t i o n . N a t u r e 3 5 6 , 3 0 1 - 3 0 9 . B a c k g r e n , C . , H u m m e r , G . , W i k s t r o m , M . , a n d P u u s t i n e n , A . ( 2 0 0 0 ) . P r o t o n t r a n s l o c a t i o n b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e c a n t a k e p l a c e w i t h o u t t h e c o n s e r v e d g l u t a m i c a c i d i n s u b u n i t 1 . B i o c h e m i s t r y 3 9 , 7 8 6 3 - 7 8 6 7 . B a i l e y , J . A . , T o m s o n , F . L . , M e c k l e n b u r g , S . L . , M a c D o n a l d , G . M . , K a t s o n o u r i , A . , E - P u u s t i n e n , A . , G e n n i s , R . B . , W o o d r u f f , W . H . , a n d D y e r , R B . ( 2 0 0 2 ) . T i m e - r e s o l v e d ' 1 s t e p - s c a n F o u r i e r t r a n s f o r m i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y o f t h e C O a d d u c t s o f b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e a n d o f c y t o c h r o m e b o ( 3 ) f r o m E s c h e r i c h i a c o l i . B i o c h e m i s t r y 4 1 , 2 6 7 5 - 2 6 8 3 . B a r e n h o l z t , Y . , A m s e l e m , S . , a n d L i c h t e n b e r g , D . ( 1 9 7 9 ) . A n e w m e t h o d f o r p r e p a r a t i o n - o f p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s ( l i p o s o m e s ) - F r e n c h p r e s s . F E B S L e t t 9 9 , 2 1 0 - 2 1 4 . I ‘ - B e h r , 1 . , H e l l w i g , P . , M a n t e l e , W . , a n d M i c h e l , H . ( 1 9 9 8 ) . R e d o x d e p e n d e n t c h a n g e s a t t h e h e m e p r o p i o n a t e s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s : d i r e c t e v i d e n c e f r o m F I ' I R d i f f e r e n c e s p e c t r o s c o p y i n c o m b i n a t i o n w i t h h e m e p r o p i o n a t e 1 3 C l a b e l i n g . B i o c h e m i s t r y 3 7 , 7 4 0 0 - 7 4 0 6 . B e h r , 1 . , M i c h e l , H . , M a n t e l e , W . , a n d H e l l w i g , P . ( 2 0 0 0 ) . F u n c t i o n a l p r o p e r t i e s o f t h e h e m e p r o p i o n a t e s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s . E v i d e n c e f r o m F T I R d i f f e r e n c e s p e c t r o s c o p y a n d s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s . B i o c h e m i s t r y 3 9 , 1 3 5 6 - 1 3 6 3 . B e l e v i c h , I . , T u u k k a n e n , A . , W i k s t r o m , M . , a n d V e r k h o v s k y , M . I . ( 2 0 0 6 ) . P r o t o n - c o u p l e d e l e c t r o n e q u i l i b r i u m i n s o l u b l e a n d m e m b r a n e - b o u n d c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s . B i o c h e m i s t r y 4 5 , 4 0 0 0 - 4 0 0 6 . B l a i r , D . F . , G e l l e s , J . , a n d C h a n , S J . ( 1 9 8 6 ) . R e d o x - l i n k e d p r o t o n t r a n s l o c a t i o n i n c y t o c h r o m e o x i d a s e : t h e i m p o r t a n c e o f g a t i n g e l e c t r o n fl o w . T h e e f f e c t s o f s l i p i n a m o d e l t r a n s d u c e r . B i o p h y s i c a l j o u r n a l 5 0 , 7 1 3 - 7 3 3 . B l o c h , D . , B e l e v i c h , I . , J a s a i t i s , A . , R i b a c k a , C . , P u u s t i n e n , A . , V e r k h o v s k y , M . I . , a n d W i k s t r o m , M . ( 2 0 0 4 ) . T h e c a t a l y t i c c y c l e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e i s n o t t h e s u m o f i t s t w o h a l v e s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 0 1 , 5 2 9 - 5 3 3 . B r a n d , M . D . , B u c k i n g h a m , J . A . , E s t e v e s , T . C . , G r e e n , K . , L a m b e r t , A . J . , M i w a , S . , M u r p h y , M . P . , P a k a y , J . L . , T a l b o t , D . A . , a n d E c h t a y , K S . ( 2 0 0 4 ) . M i t o c h o n d r i a l 2 3 7 s u p e r o x i d e a n d a g i n g : u n c o u p l i n g - p r o t e i n a c t i v i t y a n d s u p e r o x i d e p r o d u c t i o n . B i o c h e m S o c S y m p , 2 0 3 - 2 1 3 . B r a n d e n , G . , B r a n d e n , M . , S c h m i d t , B . , M i l l s , D . A . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 5 ) . T h e p r o t o n a t i o n s t a t e o f a h e m e p r o p i o n a t e c o n t r o l s e l e c t r o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 4 , 1 0 4 6 6 - 1 0 4 7 4 . B r a n d e n , G . , P a w a t e , A . S . , G e n n i s , R . B . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 6 ) . C o n t r o l l e d u n c o u p l i n g a n d r e c o u p l i n g o f p r o t o n p u m p i n g i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 0 3 , 3 1 7 - 3 2 2 . B r a n d e n , M . , S i g u r d s o n , H . , N a m s l a u e r , A . , G e n n i s , R . B . , A d e l r o t h , P . , a n d B r z e z i n s k i , P . r ( 2 0 0 1 ) . O n t h e r o l e o f t h e K - p r o t o n t r a n s f e r p a t h w a y i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t l ‘ A c a d S c i U S A 9 8 , 5 0 1 3 - 5 0 1 8 . B r a n d e n , M . , T o m s o n , F . , G e n n i s , R . B . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 2 ) . T h e e n t r y p o i n t o f t h e K - p r o t o n - t r a n s f e r p a t h w a y i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 1 , 1 0 7 9 4 — 1 0 7 9 8 . B r a t t o n , M . , P r e s s l e r , M . , a n d H o s l e r , J . ( 1 9 9 9 ) . S u i c i d e i n a c t i v a t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e : C a t a l y t i c t u r n o v e r i n t h e a b s e n c e o f s u b u n i t I I I a l t e r s t h e a c t i v e s i t e . B i o c h e m i s t r y 3 8 , 1 6 2 3 6 - 1 6 2 4 5 . B r o w n , G . C . , a n d B r a n d , M D . ( 1 9 9 1 ) . O n t h e n a t u r e o f t h e m i t o c h o n d r i a l p r o t o n l e a k . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 0 5 9 , 5 5 - 6 2 . B r u n o r i , M . , G i u f f r e , A . , a n d S a r t i , P . ( 2 0 0 5 ) . C y t o c h r o m e c o x i d a s e , l i g a n d s a n d e l e c t r o n s . J o u r n a l o f i n o r g a n i c b i o c h e m i s t r y 9 9 , 3 2 4 - 3 3 6 . B r u n o r i , M . , S a r t i , P . , C o l o s i m o , A . , A n t o n i n i , G . , M a l a t e s t a , R , J o n e s , M . G . , a n d W i l s o n , M T ( 1 9 8 5 ) . M e c h a n i s m o f c o n t r o l o f c y t o c h r o m e o x i d a s e a c t i v i t y b y t h e e l e c t r o c h e m i c a l - p o t e n t i a l g r a d i e n t . E m b o J 4 , 2 3 6 5 - 2 3 6 8 . B r z e z i n s k i , P . , a n d A d e l r o t h , P . ( 1 9 9 8 ) . P a t h w a y s o f p r o t o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J o u r n a l o f b i o e n e r g e t i c s a n d b i o m e m b r a n e s 3 0 , 9 9 - 1 0 7 . B r z e z i n s k i , P . , a n d L a r s s o n , G . ( 2 0 0 3 ) . R e d o x - d r i v e n p r o t o n p u m p i n g b y h e m e — c o p p e r o x i d a s e s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 6 0 5 , 1 - 1 3 . B u s e , G . , S o u l i m a n e , T . , D e w o r , M . , M e y e r , H E , a n d B l u g g e l , M . ( 1 9 9 9 ) . E v i d e n c e f o r a C o p p e r - C o o r d i n a t e d H i s t i d i n e - t y r o s i n e C r o s s - l i n k i n t h e A c t i v e S i t e o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e . P r o t e i n S c i e n c e 8 , 9 8 5 - 9 9 0 . 2 3 8 B u s e n l e h n e r , L . S . , a n d A r m s t r o n g , R N . ( 2 0 0 5 ) . I n s i g h t s i n t o e n z y m e s t r u c t u r e a n d d y n a m i c s e l u c i d a t e d b y a m i d e H I D e x c h a n g e m a s s s p e c t r o m e t r y . A r c h i v e s o f b i o c h e m i s t r y a n d b i o p h y s i c s 4 3 3 , 3 4 - 4 6 . B u s e n l e h n e r , L . S . , B r a n d e n , G . , N a m s l a u e r , I . , B r z e z i n s k i , P . , a n d A r m s t r o n g , R N . ( 2 0 0 8 ) . S t r u c t u r a l e l e m e n t s i n v o l v e d i n p r o t o n t r a n s l o c a t i o n b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e a s r e v e a l e d b y b a c k b o n e a m i d e h y d r o g e n - d e u t e r i u m e x c h a n g e o f t h e E 2 8 6 H m u t a n t . B i o c h e m i s t r y 4 7 , 7 3 - 8 3 . B u s e n l e h n e r , L . S . , S a l o m o n s s o n , L . , B r z e z i n s k i , P . , a n d A r m s t r o n g , R N . ( 2 0 0 6 ) . M a p p i n g p r o t e i n d y n a m i c s i n c a t a l y t i c i n t e r m e d i a t e s o f t h e r e d o x - d r i v e n p r o t o n p u m p c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 0 3 , 1 5 3 9 8 - 1 5 4 0 3 . B u t k o , P . , a n d N i c h o l l s , P . ( 1 9 9 3 ) . P r o t o n s , P u m p s , a n d P o t e n t i a l s : C o n t r o l o f C y t o c h r o m e O x i d a s e . J o u r n a l o f b i o e n e r g e t i c s a n d b i o m e m b r a n e s 2 5 , 1 3 7 . C a n n , J . R . ( 1 9 7 0 ) . I n t e r a c t i n g M a c r o m o l e c u l e s : T h e t h e o r y a n d P r a c t i c e o f T h e i r E l e c t r o p h o r e s i s , U l t r a c e n t r i f u g a t i o n , a n d C h r o m a t o g r a h y ( N e w Y o r k a n d L o n d o n , A c a d e m i c P r e s s ) . C a p i t a n i o , N . , C a p i t a n i o , G . , D e m a r i n i s , D . A . , D e N i t t o , E . , M a s s a r i , S . , a n d P a p a , S . ( 1 9 9 6 ) . F a c t o r s a f f e c t i n g t h e H - i - l e - s t o i c h i o m e t r y i n m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e c o x i d a s e : i n fl u e n c e o f t h e r a t e o f e l e c t r o n fl o w a n d t r a n s m e m b r a n e d e l t a p H . B i o c h e m i s t r y 3 5 , 1 0 8 0 0 - 1 0 8 0 6 . C a s e y , R . P . , O ' S h e a , P . S . , C h a p p e l l , J . B . , a n d A z z i , A . ( 1 9 8 4 ) . A Q u a n t i t a t i v e C h a r a c t e r i z a t i o n o f H + T r a n s l o c a t i o n b y C y t o c h r o m e c O x i d a s e V e s i c l e s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 7 6 5 , 3 0 - 3 7 . C h a n , 8 . 1 . , a n d L i , P . M . ( 1 9 9 0 ) . C y t o c h r o m e c O x i d a s e : U n d e r s t a n d i n g N a t u r e ' s D e s i g n o f a P r o t o n P u m p . B i o c h e m i s t r y 2 9 , 1 - 1 2 . C h e c o v e r , S . , M a r a n t z , Y . , N a c h l i e l , E . , G u t m a n , M . , P f e i f f e r , M . , T i t t o r , J . , O e s t e r h e l t , D . , a n d D e n c h e r , N A . ( 2 0 0 1 ) . D y n a m i c s o f t h e p r o t o n t r a n s f e r r e a c t i o n o n t h e c y t o p l a s m i c s u r f a c e o f b a c t e r i o r h o d o p s i n . B i o c h e m i s t r y 4 0 , 4 2 8 1 - 4 2 9 2 . C h e m y , V . , a n d D e C o u r s e y , T . ( 1 9 9 9 ) . p H - d e p e n d e n t i n h i b i t i o n o f v o l t a g e - g a t e d H + c u r r e n t s i n r a t a l v e o l a r e p i t h e l i a l c e l l s b y Z n “ a n d o t h e r d i v a l e n t c a t i o n s . J G e n P h y s i o l 1 1 4 , 8 1 9 - 8 3 8 . C l e m e n t , N R , a n d G o u l d , J . M . ( 1 9 8 1 ) . P y r a n i n e ( 8 - h y d r o x y - l , 3 , 6 - p y r e n e t r i s u l f o n a t e ) a s a p r o b e o f i n t e r n a l a q u e o u s h y d r o g e n i o n c o n c e n t r a t i o n i n p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s . B i o c h e m i s t r y 2 0 , 1 5 3 4 - 1 5 3 8 . 2 3 9 C o l l m a n , J . P . , D e v a r a j , N . K . , D e c r e a u , R . A . , Y a n g , Y . , Y a n , Y . L . , E b i n a , W . , E b e r s p a c h e r , T . A . , a n d C h i d s e y , C E . ( 2 0 0 7 ) . A c y t o c h r o m e C o x i d a s e m o d e l c a t a l y z e s o x y g e n t o w a t e r r e d u c t i o n u n d e r r a t e - l i m i t i n g e l e c t r o n fl u x . S c i e n c e 3 1 5 , 1 5 6 5 - 1 5 6 8 . C u k i e r , R I . ( 2 0 0 4 ) . Q u a n t u m m o l e c u l a r d y n a m i c s s i m u l a t i o n o f p r o t o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 6 5 6 , 1 8 9 - 2 0 2 . C u k i e r , R I . ( 2 0 0 5 ) . A m o l e c u l a r d y n a m i c s s t u d y o f w a t e r c h a i n f o r m a t i o n i n t h e p r o t o n c o n d u c t i o n K c h a n n e l o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 7 0 6 , 1 3 4 - 1 4 6 . D a r s z o n , A . , V a n d e n b e r g , C . A . , E l l i s m a n , M . H . , a n d M o n t a l , M . ( 1 9 7 9 ) . I n c o r p o r a t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s i n t o l a r g e s i n g l e b i l a y e r v e s i c l e s . A p p l i c a t i o n t o r h o d o p s i n . T h e J o u r n a l o f c e l l b i o l o g y 8 1 , 4 4 6 — 4 5 2 . D a v i s , R . B . , M i l l e r , S . , H e r r n s t a d t , C . , G h o s h , S . S . , F a h y , E . , S h i n o b u , L . A . , G a l a s k o , D . , T h a i , L . J . , B e a l , M . F . , H o w e l l , N . , e t a l . ( 1 9 9 7 ) . M u t a t i o n s i n m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e c o x i d a s e g e n e s s e g r e g a t e w i t h l a t e - o n s e t A l z h e i m e r d i s e a s e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 4 , 4 5 2 6 - 4 5 3 1 . d e G r o t t h u s s , C . J . T . ( 1 8 0 6 ) . S u r l a d e c o m p o s i t i o n d e l ' e a u e t d e s c o r p s q u ' e l l e t i e n t e n d i s s o l u t i o n a l ' a i d e d e l ' e l e c t r i c i t e g a l v a n i q u e . A n n a l e s d e C h i m i e ( P a r i s ) L V I I I , 5 4 - 7 4 . D e C o u r s e y , T . ( 2 0 0 3 ) . V o l t a g e - g a t e d c h a n n e l s a n d a n d o t h e r p r o t o n t r a n s f e r p a t h w a y s . P h y s i o l R e v 8 3 , 4 7 5 - 5 7 9 . D e l l a g o , C . , N a o r , M . M . , a n d H u m m e r , G . ( 2 0 0 3 ) . P r o t o n t r a n s p o r t t h r o u g h w a t e r - fi l l e d c a r b o n n a n o t u b e s . P h y s R e v L e t t 9 0 , 1 0 5 9 0 2 . D i o u m a e v , A . K . , R i c h t e r , H . T . , B r o w n , L . S . , T a n i o , M . , T u z i , S . , S a i t o , H . , K i m u r a , Y . , N e e d l e m a n , R . , a n d L a n y i , J . K . ( 1 9 9 8 ) . E x i s t e n c e o f a p r o t o n t r a n s f e r c h a i n i n b a c t e r i o r h o d o p s i n : p a r t i c i p a t i o n o f G l u - 1 9 4 i n t h e r e l e a s e o f p r o t o n s t o t h e e x t r a c e l l u l a r s u r f a c e . B i o c h e m i s t r y 3 7 , 2 4 9 6 - 2 5 0 6 . D o l d e r , M . , E n g e l , A . , a n d Z u l a u f , M . ( 1 9 9 6 ) . T h e m i c e l l e t o v e s i c l e t r a n s i t i o n o f l i p i d s a n d d e t e r g e n t s i n t h e p r e s e n c e o f a m e m b r a n e p r o t e i n : t o w a r d s a r a t i o n a l e f o r 2 D c r y s t a l l i z a t i o n . F E B S L e t t 3 8 2 , 2 0 3 - 2 0 8 . D u r h a m , B . , P a n , L . P . , L o n g , J . E . , a n d M i l l e t t , F . ( 1 9 8 9 ) . P h o t o i n d u c e d e l e c t r o n - t r a n s f e r k i n e t i c s o f s i n g l y l a b e l e d r u t h e n i u m b i s ( b i p y r i d i n e ) d i c a r b o x y b i p y r i d i n e c y t o c h r o m e c d e r i v a t i v e s . B i o c h e m i s t r y 2 8 , 8 6 5 9 - 8 6 6 5 . E r r e d e , B . , a n d K a m e n , M D . ( 1 9 7 8 ) . C o m p a r a t i v e k i n e t i c s t u d i e s o f c y t o c h r o m e s c i n r e a c t i o n s w i t h m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e c o x i d a s e a n d r e d u c t a s e . B i o c h e m i s t r y I 7 , 1 0 1 5 - 1 0 2 7 . 2 4 0 E s p e , M . P . , H o s l e r , 1 . P . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , B a b c o c k , G . T . , a n d M c C r a c k e n , J . ( 1 9 9 5 ) . A C o n t i n u o u s W a v e a n d P u l s e d E P R C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e M n 2 + B i n d i n g S i t e i n R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s C y t o c h r o m e c O x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 3 4 , 7 5 9 3 - 7 6 0 2 . F a b i a n , M . , W o n g , W . W . , G e n n i s , R . B . , a n d P a l m e r , G . ( 1 9 9 9 ) . M a s s s p e c t r o m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f d i o x y g e n b o n d s p l i t t i n g i n t h e " p e r o x y " i n t e r m e d i a t e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 6 , 1 3 1 1 4 - 1 3 1 1 7 . F a x e n , K . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 7 ) . T h e i n s i d e p H d e t e r m i n e s r a t e s o f e l e c t r o n a n d p r o t o n t r a n s f e r i n v e s i c l e - r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 7 6 7 , 3 8 1 - 3 8 6 . ' m F a x e n , K . , G i l d e r s o n , G . , A d e l r o t h , P . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 5 ) . A m e c h a n i s t i c p r i n c i p l e f o r p r o t o n p u m p i n g b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e . N a t u r e 4 3 7 , 2 8 6 - 2 8 9 . F e r g u s o n - M i l l e r , S . , a n d B a b c o c k , G . ( 1 9 9 6 ) . H e m e / c o p p e r t e r m i n a l o x i d a s e s . C h e m i c a l R e v i e w s 9 6 , 2 8 8 9 - 2 9 0 7 . F e r g u s o n - M i l l e r , S . , B r a u t i g a n , D . , a n d M a r g o l i a s h , E . ( 1 9 7 6 ) . C o r r e l a t i o n o f t h e K i n e t i c s o f E l e c t r o n T r a n s f e r A c t i v i t y o f V a r i o u s E u k a r y o t i c C y t o c h r o m e c w i t h B i n d i n g t o M i t o c h o n d r i a l C y t o c h r o m e c O x i d a s e . J B i o l C h e m 2 5 1 , 1 1 0 4 - 1 1 1 5 . F e r g u s o n - M i l l e r , S . , B r a u t i g a n , D . L . , a n d M a r g o l i a s h , E . ( 1 9 7 8 ) . D e fi n i t i o n o f C y t o c h r o m e c B i n d i n g D o m a i n s b y C h e m i c a l M o d i fi c a t i o n . J B i o l C h e m 2 5 3 , 1 4 9 - 1 5 9 . F e t t e r , J . , S h a r p e , M . , Q i a n , J . , M i l l s , D . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , a n d N i c h o l l s , P . ( 1 9 9 6 ) . F a t t y a c i d s s t i m u l a t e a c t i v i t y a n d r e s t o r e r e s p i r a t o r y c o n t r o l i n a p r o t o n c h a n n e l m u t a n t o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t 3 9 3 , 1 5 5 - 1 6 0 . F e t t e r , J . R . , Q i a n , J . , S h a p l e i g h , J . , T h o m a s , J . W . , G a r c i a - H o r s m a n , A . , S c h m i d t , E . , H o s l e r , J . , B a b c o c k , G . T . , G e n n i s , R . B . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 5 ) . P o s s i b l e p r o t o n r e l a y p a t h w a y s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t ] A c a d S c i U S A 9 2 , 1 6 0 4 - 1 6 0 8 . F l o r e n s , L . , S c h m i d t , B . , M c C r a c k e n , J . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 1 ) . F a s t d e u t e r i u m a c c e s s t o t h e b u r i e d m a g n e s i u m / m a n g a n e s e s i t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 0 , 7 4 9 1 - 7 4 9 7 . F o r t e , E . , S c a n d u r r a , F . , R i c h t e r , O . - M . H . , D ' I t r i , E . , S a r t i , P . , B r u n o r i , M . , L u d w i g , B . , a n d G i u f f r e , A . ( 2 0 0 4 ) . P r o t o n u p t a k e u p o n a n a e r o b i c r e d u c t i o n o f P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s c y t o c h r o m e c o x i d a s e : A k i n e t i c i n v e s t i g a t i o n o f t h e K 3 5 4 M a n d D 1 2 4 N m u t a n t s . B i o c h e m i s t r y 4 3 , 2 9 5 7 - 2 9 6 3 . 2 4 1 F r a n c i a , F . , G i a c h i n i , L . , B o s c h e r i n i , F . , V e n t u r o l i , G . , C a p i t a n i o , G . , M a r t i n o , P . L . , a n d P a p a , S . ( 2 0 0 7 ) . T h e i n h i b i t o r y b i n d i n g s i t e ( s ) o f Z n 2 + i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t 5 8 1 , 6 1 1 - 6 1 6 . G a r c i a - H o r s m a n , 1 . , B a r q u e r a , B . , R u m b l e y , J . , M a , J . , a n d G e n n i s , R B . ( 1 9 9 4 ) . T h e S u p e r f a m i l y o f H e m e - C o p p e r R e s p i r a t o r y O x i d a s e s . J B a c t e r i o l 1 7 6 , 5 5 8 7 - 5 6 0 0 . G e l l e s , J . , B l a i r , D R , a n d C h a n , S J . ( 1 9 8 6 ) . T h e p r o t o n - p u m p i n g s i t e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e : a m o d e l o f i t s s t r u c t u r e a n d m e c h a n i s m . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 8 5 3 , 2 0 5 - 2 3 6 . G e n n i s , R . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 5 ) . S t r u c t u r e o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e , E n e r g y G e n e r a t o r o f A e r o b i c L i f e . S c i e n c e 2 6 9 , 1 0 6 3 - 1 0 6 4 . [ G e n n i s , R B . ( 1 9 9 8 ) . C y t o c h r o m e o x i d a s e z o n e p r o t o n , t w o m e c h a n i s m ? S c i e n c e 2 8 0 , 1 7 1 2 - 1 7 1 3 . G e o r g i e v s k i i , Y . , M e d v e d e v , E S , a n d S t u c h e b r u k h o v , A . A . ( 2 0 0 2 ) . P r o t o n t r a n s p o r t v i a t h e m e m b r a n e s u r f a c e . B i o p h y s i c a l j o u r n a l 8 2 , 2 8 3 3 - 2 8 4 6 . G e r e n , L . M . , B e a s l e y , J . R . , F i n e , B . R . , S a u n d e r s , A . J . , H i b d o n , S . , P i e l a k , G . J . , D u r h a m , B . , a n d M i l l e t t , F . ( 1 9 9 5 ) . D e s i g n o f a r u t h e n i u m - c y t o c h r o m e c d e r i v a t i v e t o m e a s u r e e l e c t r o n t r a n s f e r t o t h e i n i t i a l a c c e p t o r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J B i o l C h e m 2 7 0 , 2 4 6 6 - 2 6 6 2 . G i l d e r s o n , G . , S a l o m o n s s o n , L . , A a g a a r d , A . , G r a y , J . , B r z e z i n s k i , P . , a n d H o s l e r , J . ( 2 0 0 3 ) . S u b u n i t I I I o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s i s r e q u i r e d t o m a i n t a i n r a p i d p r o t o n u p t a k e t h r o u g h t h e D p a t h w a y a t p h y s i o l o g i c p H . B i o c h e m i s t r y 4 2 , 7 4 0 0 - 7 4 0 9 . G o r b i k o v a , E . A . , B e l e v i c h , I . , W i k s t r o m , M . , a n d V e r k h o v s k y , M . I . ( 2 0 0 8 ) . T h e p r o t o n d o n o r f o r O - O b o n d s c i s s i o n b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 0 5 , 1 0 7 3 3 - 1 0 7 3 7 . G r e g o r y , L . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 8 9 ) . I n d e p e n d e n t c o n t r o l o f r e s p i r a t i o n i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e v e s i c l e s b y p H a n d e l e c t r i c a l g r a d i e n t s . B i o c h e m i s t r y 2 8 , 2 6 5 5 - 2 6 6 2 . G r e g o r y , L C , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 8 8 ) . E f f e c t o f S u b u n i t I I I R e m o v a l o n C o n t r o l o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e A c t i v i t y b y p H . B i o c h e m i s t r y 2 7 , 6 3 0 7 - 6 3 1 4 . G u t m a n , M . , a n d N a c h l i e l , E . ( 1 9 9 0 ) . T h e d y n a m i c a s p e c t s o f p r o t o n t r a n s f e r p r o c e s s e s . B i o c h e m B i o p h y s A c t a 1 0 1 5 , 3 9 1 - 4 1 4 . 2 4 2 H a l t i a , T . , F i n e ] , M . , H a r m s , N . , N a k a r i , T . , R a i t i o , M . , W i k s t r o m , M . , a n d S a r a s t e , M . ( 1 9 8 9 ) . D e l e t i o n o f t h e g e n e f o r s u b u n i t I I I l e a d s t o d e f e c t i v e a s s e m b l y o f b a c t e r i a l c y t o c h r o m e o x i d a s e . E m b o 1 8 , 3 5 7 1 - 3 5 7 9 . H a l t i a , T . , S a r a s t e , M . , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 1 ) . S u b u n i t I I I o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e i s n o t i n v o l v e d i n p r o t o n t r a n s l o c a t i o n : a s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s s t u d y . E m b o J 1 0 , 2 0 1 5 - 2 0 2 1 . H a n , D . , M o r g a n , J . B . , a n d G e n n i s , R B . ( 2 0 0 5 ) . G 2 0 4 D , a m u t a t i o n t h a t b l o c k s t h e p r o t o n - c o n d u c t i n g D - c h a n n e l o f t h e a a 3 - t y p e c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . B i o c h e m i s t r y 4 4 , 1 2 7 6 7 - 1 2 7 7 4 . H a n , D . , N a m s l a u e r , A . , P a w a t e , A . , M o r g a n , J . E . , N a g y , S . , V a k k a s o g l u , A . S . , B r z e z i n s k i , P . , a n d G e n n i s , R B . ( 2 0 0 6 ) . R e p l a c i n g A s n 2 0 7 b y a s p a r t a t e a t t h e n e c k o f t h e D c h a n n e l i n t h e a a 3 - t y p e c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s r e s u l t s i n d e c o u p l i n g t h e p r o t o n p u m p . B i o c h e m i s t r y 4 5 , 1 4 0 6 4 - 1 4 0 7 4 . H a n , S . H . , C h i n g , Y . C . , a n d R o u s s e a u , D . L . ( 1 9 9 0 ) . C y t o c h r o m e c o x i d a s e : d e c a y o f t h e p r i m a r y o x y g e n i n t e r m e d i a t e i n v o l v e s d i r e c t e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m c y t o c h r o m e a . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 8 7 , 8 4 0 8 - 8 4 1 2 . H a r r e n g a , A . , a n d M i c h e l , H . ( 1 9 9 9 ) . T h e c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s d o e s n o t c h a n g e t h e m e t a l c e n t e r l i g a t i o n u p o n r e d u c t i o n . 1 B i o l C h e m 2 7 4 , 3 3 2 9 6 - 3 3 2 9 9 . H i n k l e , P . C . , K i m , 1 . 1 . , a n d R a c k e r , E . ( 1 9 7 2 ) . I o n T r a n s p o r t a n d R e s p i r a t o r y C o n t r o l i n V e s i c l e s F o r m e d F r o m C y t o c h r o m e O x i d a s e a n d P h o s p h o l i p i d s . 1 B i o l C h e m 2 4 7 , 1 3 3 8 - 1 3 3 9 . H i s e r , C . , M i l l s , D . A . , S c h a l l , M . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 1 ) . C - t e r r n i n a l t r u n c a t i o n a n d h i s t i d i n e - t a g g i n g o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t I I r e v e a l s t h e n a t i v e p r o c e s s i n g s i t e , s h o w s i n v o l v e m e n t o f t h e C - t e r m i n u s i n c y t o c h r o m e c b i n d i n g , a n d i m p r o v e s t h e a s s a y f o r p r o t o n p u m p i n g . B i o c h e m i s t r y 4 0 , 1 6 0 6 - 1 6 1 5 . H o f a c k e r , I . , a n d S c h u l t e n , K . ( 1 9 9 8 ) . O x y g e n a n d p r o t o n p a t h w a y s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o t e i n s 3 0 , 1 0 0 - 1 0 7 . H o s l e r , J P . ( 2 0 0 4 ) . T h e i n fl u e n c e o f s u b u n i t I I I o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e o n t h e D p a t h w a y , t h e p r o t o n e x i t p a t h w a y a n d m e c h a n i s m - b a s e d i n a c t i v a t i o n i n s u b u n i t 1 . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 6 5 5 , 3 3 2 - 3 3 9 . H o s l e r , 1 . P . , E s p e , M . P . , Z h e n , Y . , B a b c o c k , G . T . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 5 ) . A n a l y s i s o f s i t e - d i r e c t e d m u t a n t s l o c a t e s a n o n - r e d o x - a c t i v e m e t a l n e a r t h e a c t i v e s i t e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . B i o c h e m i s t r y 3 4 , 7 5 8 6 - 7 5 9 2 . 2 4 3 H o s l e r , J . P . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , C a l h o u n , M . W . , T h o m a s , J . W . , H i l l , 1 . , L e m i e u x , L . , M a , 1 . , G e o r g i o u , C . , F e t t e r , J . , S h a p l e i g h , 1 . , e t a l . ( 1 9 9 3 ) . I n s i g h t i n t o t h e a c t i v e - s i t e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f c y t o c h r o m e o x i d a s e b y a n a l y s i s o f s i t e - d i r e c t e d m u t a n t s o f b a c t e r i a l c y t o c h r o m e a a 3 a n d c y t o c h r o m e b o . J o u r n a l o f b i o e n e r g e t i c s a n d b i o m e m b r a n e s 2 5 , 1 2 1 - 1 3 6 . H o s l e r , J . P . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , a n d M i l l s , D A . ( 2 0 0 6 ) . E n e r g y T r a n s d u c t i o n : P r o t o n T r a n s f e r T h r o u g h t h e R e s p i r a t o r y C o m p l e x e s . A n n u R e v B i o c h e m . H o s l e r , J . P . , F e t t e r , 1 . , T e c k l e n b u r g , M . M . , E s p e , M . , L e r m a , C . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 2 ) . C y t o c h r o m e a a 3 o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s a s a m o d e l f o r m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P u r i fi c a t i o n , k i n e t i c s , p r o t o n p u m p i n g , a n d s p e c t r a l a n a l y s i s . J F B i o l C h e m 2 6 7 , 2 4 2 6 4 - 2 4 2 7 2 . ‘ I w a k i , M . , P u u s t i n e n , A . , W i k s t r o m , M . , a n d R i c h , P R . ( 2 0 0 3 ) . A T R - F I ‘ I R S p e c t r o s c o p y o f t h e P ( M ) a n d F I n t e r m e d i a t e s o f B o v i n e a n d P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s C y t o c h r o m e c O x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 2 , 8 8 0 9 - 8 8 1 7 . I w a t a , S . , O s t e r m e i e r , C . , L u d w i g , B . , a n d M i c h e l , H . ( 1 9 9 5 ) . S t r u c t u r e a t 2 . 8 A i t r e s o l u t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s . N a t u r e 3 7 6 , 6 6 0 - 6 6 9 . J a s a i t i s , A . , V e r k h o v s k y , M . I . , M o r g a n , J . B . , V e r k h o v s k a y a , M . L . , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 9 ) . A s s i g n m e n t a n d c h a r g e t r a n s l o c a t i o n s t o i c h i o m e t r i e s o f t h e m a j o r e l e c t r o g e n i c p h a s e s i n t h e r e a c t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e w i t h d i o x y g e n . B i o c h e m i s t r y 3 8 , 2 6 9 7 - 2 7 0 6 . J u n e m a n n , S . , H e a t h c o t e , P . , a n d R i c h , R R . ( 2 0 0 0 ) . T h e r e a c t i o n s o f h y d r o g e n p e r o x i d e w i t h b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 4 5 6 , 5 6 - 6 6 . J u n e m a n n , S . , M e u n i e r , B . , G e n n i s , R . B . , a n d R i c h , P R . ( 1 9 9 7 ) . E f f e c t s o f M u t a t i o n o f t h e C o n s e r v e d L y s i n e - 3 6 2 i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . B i o c h e m i s t r y 3 6 , 1 4 4 5 6 - 1 4 4 6 4 . K a d e n b a c h , B . ( 2 0 0 3 ) . I n t r i n s i c a n d e x t r i n s i c u n c o u p l i n g o f o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 6 0 4 , 7 7 - 9 4 . K a d e n b a c h , B . , K u h n - N e n t w i g , L . , a n d B u g e , U . ( 1 9 8 7 ) . C u r r T o p i c s B i o e n e r g e t i c s 1 5 , 1 1 3 - 1 6 1 . K a g a w a , Y . , K a n d r a c h , A . , a n d R a c k e t , E . ( 1 9 7 3 ) . P a r t i a l r e s o l u t i o n o f t h e e n z y m e s c a t a l y z i n g o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n . X X V I . S p e c i fi c i t y o f p h o s p h o l i p i d s r e q u i r e d f o r e n e r g y t r a n s f e r r e a c t i o n s . 1 B i o l C h e m 2 4 8 , 6 7 6 - 6 8 4 . 2 4 4 K a g a w a , Y . , a n d R a c k e t , E . ( 1 9 7 1 ) . P a r t i a l R e s o l u t i o n o f t h e E n z y m e s C a t a l y z i n g O x i d a t i v e P h o s p h o r y l a t i o n : X X V R e c o n s t i t u t i o n o f V e s i c l e s C a t a l y z i n g 3 ” P i - A d e n o s i n e T r i p h o s p h a t e E x c h a n g e . 1 B i o l C h e m 2 4 6 , 5 4 7 7 - 5 4 8 7 . K a n n t , A . , L a n c a s t e r , C R , a n d M i c h e l , H . ( 1 9 9 8 3 ) . T h e c o u p l i n g o f e l e c t r o n t r a n s f e r a n d p r o t o n t r a n s l o c a t i o n : e l e c t r o s t a t i c c a l c u l a t i o n s o n P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o p h y s i c a l j o u r n a l 7 4 , 7 0 8 - 7 2 1 . K a n n t , A . , S o u l i m a n e , T . , B u s e , G . , B e c k e r , A . , B a m b e r g , E . , a n d M i c h e l , H . ( 1 9 9 8 b ) . E l e c t r i c a l c u r r e n t g e n e r a t i o n a n d p r o t o n p u m p i n g c a t a l y z e d b y t h e b a g - t y p e c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m T h e r m u s t h e r m o p h i l u s . F E B S L e t t 4 3 4 , 1 7 - 2 2 . K a r p e f o r s , M . , A d e l r o t h , P . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 0 a ) . L o c a l i z e d c o n t r o l o f p r o t o n t r a n s f e r t h r o u g h t h e D - p a t h w a y i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e : A p p l i c a t i o n o f t h e p r o t o n i n v e n t o r y t e c h n i q u e . B i o c h e m i s t r y 3 9 , 6 8 5 0 - 6 8 5 6 . K a r p e f o r s , M . , A d e l r o t h , P . , N a m s l a u e r , A . , Z h e n , Y . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 0 b ) . _ _ F o r m a t i o n o f t h e " p e r o x y " i n t e r m e d i a t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e i s a s s o c i a t e d w i t h ' i n t e r n a l p r o t o n / h y d r o g e n t r a n s f e r . B i o c h e m i s t r y 3 9 , 1 4 6 6 4 - 1 4 6 6 9 . 3 ” K a r p e f o r s , M . , A d e l r o t h , P . , Z h e n , Y . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 1 9 9 8 ) . P r o t o n u p t a k e c o n t r o l s e l e c t r o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 5 , 1 3 6 0 6 - 1 3 6 1 1 . K a s a h a r a , M . , a n d H i n k l e , R C . ( 1 9 7 6 ) . R e c o n s t i t u t i o n o f D - g l u c o s e t r a n s p o r t c a t a l y z e d b y a p r o t e i n f r a c t i o n f r o m h u m a n e r y t h r o c y t e s i n s o n i c a t e d l i p o s o m e s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 7 3 , 3 9 6 - 4 0 0 . K a s a h a r a , M . , a n d H i n k l e , R C . ( 1 9 7 7 ) . R e c o n s t i t u t i o n a n d p u r i fi c a t i o n o f t h e D - g l u c o s e t r a n s p o r t e r f r o m h u m a n e r y t h r o c y t e s . 1 B i o l C h e m 2 5 2 , 7 3 8 4 - 7 3 9 0 . K e l l , D . B . , J o h n , P . , a n d F e r g u s o n , 8 . ] . ( 1 9 7 8 ) . O n t h e c u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n s h i p s o f e n e r g y - t r a n s d u c i n g m e m b r a n e s : p h o s p h o r y l a t i n g m e m b r a n e v e s i c l e s f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s [ p r o c e e d i n g s ] . B i o c h e m i c a l S o c i e t y t r a n s a c t i o n s 6 , 1 2 9 2 - 1 2 9 5 . K i r i c h e n k o , A . , V y g o d i n a , T . , M k r t c h y a n , H . M . , a n d K o n s t a n t i n o v , A . ( 1 9 9 8 ) . S p e c i fi c c a t i o n b i n d i n g s i t e i n m a m m a l i a n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t 4 2 3 , 3 2 9 - 3 3 3 . K i t a g a w a , T . , a n d O g u r a , T . ( 1 9 9 8 ) . T i m e - r e s o l v e d r e s o n a n c e R a m a n i n v e s t i g a t i o n o f o x y g e n r e d u c t i o n m e c h a n i s m o f b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J o u r n a l o f b i o e n e r g e t i c s a n d b i o m e m b r a n e s 3 0 , 7 1 - 7 9 . 2 4 5 K o n s t a n t i n o v , A . A . , S i l e t s k y , S . , M i t c h e l l , D . , K a u l e n , A . , a n d G e n n i s , R B . ( 1 9 9 7 ) . T h e r o l e s o f t h e t w o p r o t o n i n p u t c h a n n e l s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s p r o b e d b y t h e e f f e c t s o f s i t e - d i r e c t e d m u t a t i o n s o n t i m e - r e s o l v e d e l e c t r o g e n i c i n t r a p r o t e i n p r o t o n t r a n s f e r . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 4 , 9 0 8 5 - 9 0 9 0 . K o m b l a t t , J . A . ( 1 9 9 8 ) . T h e w a t e r c h a n n e l o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e : i n f e r e n c e s f r o m i n h i b i t o r s t u d i e s . B i o p h y s i c a l j o u r n a l 7 5 , 3 1 2 7 - 3 1 3 4 . K r i s h n a m o o r t h y , G . , a n d H i n k l e , R C . ( 1 9 8 4 ) . N o n - o h m i c p r o t o n c o n d u c t a n c e o f m i t o c h o n d r i a a n d l i p o s o m e s . B i o c h e m i s t r y 2 3 , 1 6 4 0 - 1 6 4 5 . L a m , E . , a n d T u , S J . ( 1 9 8 0 ) . E f f e c t s o f m o n o v a l e n t c a t i o n s o n t h e a c t i v i t i e s a s s o c i a t e d w i t h c o u p l i n g s i t e I I I o f r a t l i v e r m i t o c h o n d r i a . B i o c h e m i c a l a n d b i o p h y s i c a l r e s e a r c h c o m m u n i c a t i o n s 9 6 , 1 9 6 - 2 0 2 . L a n c a s t e r , C . R . D . ( 2 0 0 3 ) . T h e r o l e o f e l e c t r o s t a t i c s i n p r o t o n - c o n d u c t i n g m e m b r a n e p r o t e i n c o m p l e x e s . F E B S L e t t 5 4 5 , 5 2 - 6 0 . ‘ 9 " L a n y i , J . K . ( 1 9 9 7 ) . M e c h a n i s m o f i o n t r a n s p o r t a c r o s s m e m b r a n e s . B a c t e r i o r h o d o p s i n a s a p r o t o t y p e f o r p r o t o n p u m p s . 1 B i o l C h e m 2 7 2 , 3 1 2 0 9 - 3 1 2 1 2 . L a n y i , J K a n d L u e c k e , H . ( 2 0 0 1 ) . B a c t e r i o r h o d o p s i n . C u r r e n t o p i n i o n i n s t r u c t u r a l b i o l o g y 1 1 , 4 1 5 - 4 1 9 . L e e , A . , K i r i c h e n k o , A . , V y g o d i n a , T . , S i l e t s k y , S . A . , D a s , T . K . , R o u s s e a u , D . L . , G e n n i s , R . , a n d K o n s t a n t i n o v , A . A . ( 2 0 0 2 ) . C a ( 2 + ) - b i n d i n g s i t e i n R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s c y t o c h r o m e C o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 1 , 8 8 8 6 - 8 8 9 8 . L e e , H . - M . , D a s , T . , R o u s s e a u , D . , M i l l s , D . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , a n d G e n n i s , R . ( 2 0 0 0 ) . M u t a t i o n s i n t h e p u t a t i v e H - c h a n n e l i n t h e c y t o c h r o m e c O x i d a s e f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s s h o w t h a t t h i s c h a n n e l i s n o t i m p o r t a n t f o r p r o t o n c o n d u c t i o n b u t r e v e a l m o d u l a t i o n o f t h e p r o p e r t i e s o f h e m e a . B i o c h e m i s t r y 3 9 , 2 9 8 9 - 2 9 9 6 . L e v y , D . , B l u z a t , A . , S e i g n e u r e t , M . , a n d R i g a u d , 1 . L . ( 1 9 9 0 ) . A s y s t e m a t i c s t u d y o f l i p o s o m e a n d p r o t e o l i p o s o m e r e c o n s t i t u t i o n i n v o l v i n g B i o - B e a d - m e d i a t e d T r i t o n X - 1 0 0 r e m o v a l . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 0 2 5 , 1 7 9 - 1 9 0 . L u b b e n , M . , P r u t s c h , A . , M a m a t , B . , a n d G e r w e r t , K . ( 1 9 9 9 ) . E l e c t r o n T r a n s f e r I n d u c e s S i d e - C h a i n C h a n g e s o f G l u t a m a t e - 2 8 6 f r o m C y t o c h r o m e 1 2 0 3 . B i o c h e m i s t r y 3 8 , 2 0 4 8 - 2 0 5 6 . L u d w i g , B . , B e n d e r , E . , A r n o l d , S . , H u t t e m a n n , M . , L e e , I . , a n d K a d e n b a c h , B . ( 2 0 0 1 ) . C y t o c h r o m e c o x i d a s e a n d t h e r e g u l a t i o n o f o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n . C h e m b i o c h e m 2 , 3 9 2 - 4 0 3 . 2 4 6 M a c M i l l a n , F . , B u d i m a n , K . , A n g e r e r , H . , a n d M i c h e l , H . ( 2 0 0 6 ) . T h e r o l e o f t r y p t o p h a n 2 7 2 i n t h e P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t 5 8 0 , 1 3 4 5 - 1 3 4 9 . M a d d e n , T . D . , H o p e , M . 1 . , a n d C u l l i s , P R . ( 1 9 8 4 ) . I n fl u e n c e o f v e s i c l e s i z e a n d o x i d a s e c o n t e n t o n r e s p i r a t o r y c o n t r o l i n r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e o x i d a s e v e s i c l e s . B i o c h e m i s t r y 2 3 , 1 4 1 3 - 1 4 1 8 . M a l m s t r o m , B . G . ( 1 9 8 5 ) . C y t o c h r o m e c o x i d a s e a s a p r o t o n p u m p : A t r a n s i t i o n - s t a t e m e c h a n i s m . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 8 1 1 , 1 - 1 2 . M a r a n t z , Y . , E i n a r s d o t t i r , 0 . 0 . , N a c h l i e l , E . , a n d G u t m a n , M . ( 2 0 0 1 ) . P r o t o n - c o l l e c t i n g p r o p e r t i e s o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e C o x i d a s e : k i n e t i c a n d e l e c t r o s t a t i c a n a l y s i s . F B i o c h e m i s t r y 4 0 , 1 5 0 8 6 - 1 5 0 9 7 . M a r a n t z , Y . , N a c h l i e l , E . , A a g a a r d , A . , B r z e z i n s k i , P . , a n d G u t m a n , M . ( 1 9 9 8 ) . T h e P r o t o n C o l l e c t i n g F u n c t i o n o f t h e I n n e r S u r f a c e o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 5 , 8 5 9 0 - 8 5 9 5 . . . - M i l l e t t , F . , d e J o n g , C . , P a u l s o n , L . , a n d C a p a l d i , R A . ( 1 9 8 3 ) . I d e n t i fi c a t i o n o f S p e c i fi c ' C a r b o x y l a t e G r o u p s o n C y t o c h r o m e c O x i d a s e T h a t a r e I n v o l v e d i n B i n d i n g C y t o c h r o m e c . B i o c h e m i s t r y 2 2 , 5 4 6 - 5 5 2 . M i l l e t t , F . , a n d D u r h a m , B . ( 2 0 0 2 ) . D e s i g n o f p h o t o a c t i v e r u t h e n i u m c o m p l e x e s t o s t u d y i n t e r p r o t e i n e l e c t r o n t r a n s f e r . B i o c h e m i s t r y 4 1 , 1 1 3 1 5 - 1 1 3 2 4 . M i l l e t t , F . , S c h m i d t , B . , D u r h a m , B . , G e r e n , L . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . U n p u b l i s h e d . M i l l s , D . A . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 8 ) . P r o t o n u p t a k e a n d r e l e a s e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e z s e p e r a t e p a t h w a y s i n t i m e a n d s p a c e ? B i o c h i m i c a e t B i o p h y s i c a A c t a 1 3 6 5 , 4 6 - 5 2 . M i l l s , D . A . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 2 ) . I n fl u e n c e o f s t r u c t u r e , p H a n d m e m b r a n e p o t e n t i a l o n p r o t o n m o v e m e n t i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 5 5 5 , 9 6 - 1 0 0 . M i l l s , D . A . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 3 ) . U n d e r s t a n d i n g t h e m e c h a n i s m o f p r o t o n m o v e m e n t l i n k e d t o o x y g e n r e d u c t i o n i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e : L e s s o n s f r o m o t h e r p r o t e i n s . F E B S L e t t 5 4 5 , 4 7 - 5 1 . M i l l s , D . A . , F l o r e n s , L . , H i s e r , C . , Q i a n , J . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 0 ) . W h e r e i s ' o u t s i d e ' i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e a n d h o w a n d w h e n d o p r o t o n s g e t t h e r e ? B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 4 5 8 , 1 8 0 - 1 8 7 . 2 4 7 M i l l s , D . A . , G e r e n , L . , H i s e r , C . , S c h m i d t , B . , D u r h a m , B . , M i l l e t t , F . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 5 ) . A n a r g i n i n e t o l y s i n e m u t a t i o n i n t h e v i c i n i t y o f t h e h e m e p r 0 p i o n a t e s a f f e c t s t h e r e d o x p o t e n t i a l s o f t h e h e m e s a n d a s s o c i a t e d e l e c t r o n a n d p r o t o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 4 , 1 0 4 5 7 - 1 0 4 6 5 . M i l l s , D . A . , a n d H o s l e r , J P . ( 2 0 0 5 ) . S l o w p r o t o n t r a n s f e r t h r o u g h t h e p a t h w a y s f o r p u m p e d p r o t o n s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n d u c e s s u i c i d e i n a c t i v a t i o n o f t h e e n z y m e . B i o c h e m i s t r y 4 4 , 4 6 5 6 - 4 6 6 6 . M i l l s , D . A . , S c h m i d t , B . , H i s e r , C . , W e s t l e y , E . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 2 ) . M e m b r a n e p o t e n t i a l - c o n t r o l l e d i n h i b i t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e b y z i n c . J B i o l C h e m 2 7 7 , 1 4 8 9 4 - 1 4 9 0 1 . 1 ‘ M i l l s , D . A . , T a n , 2 . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , a n d H o s l e r , J . ( 2 0 0 3 ) . A r o l e f o r s u b u n i t I I I i n p r o t o n u p t a k e i n t o t h e D p a t h w a y a n d a p o s s i b l e p r o t o n e x i t p a t h w a y i n R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 2 , 7 4 1 0 - 7 4 1 7 . M i l l s , D . A . , X u , S . , G e r e n , L . , H i s e r , C . , Q i n , L . , S h a r p e , M . A . , M c C r a c k e n , 1 . , D u r h a m , ' B . , M i l l e t t , F . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 8 ) . P r o t o n - d e p e n d e n t e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m C u A t o h e m e a a n d a l t e r e d E P R s p e c t r a i n m u t a n t s c l o s e t o h e m e a o f c y t o c h r o m e o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 7 , 1 1 4 9 9 - 1 1 5 0 9 . M i t c h e l l , R . , a n d R i c h , R R . ( 1 9 9 4 ) . P r o t o n u p t a k e b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e o n r e d u c t i o n a n d o n l i g a n d b i n d i n g . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 1 8 6 , 1 9 - 2 6 . M o o d y , A . J . , v o n G e n n a r , F . , M a n t e l e , W . , a n d R i c h , P R . ( 1 9 9 5 ) . R a p i d - s c a n F T I R s p e c t r o s c o p i c s t u d i e s o n t h e p h o t o l y s i s a n d r e c o m b i n a t i o n o f t h e c y a n i d e a d d u c t o f f u l l y r e d u c e d b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i c a l S o c i e t y t r a n s a c t i o n s 2 3 , 5 2 l S . M o r g a n , J . E . , V e r k h o v s k y , M . I . , P a l m e r , G . , a n d W i k s t r o m , M . ( 2 0 0 1 ) . R o l e o f t h e P R i n t e r m e d i a t e i n t h e r e a c t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e w i t h O 2 . B i o c h e m i s t r y 4 0 , 6 8 8 2 - 6 8 9 2 . M o r g a n , 1 . E . , V e r k h o v s k y , M . I . , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 4 ) . T h e h i s t i d i n e c y c l e : a n e w m o d e l f o r p r o t o n t r a n s l o c a t i o n i n t h e r e s p i r a t o r y h e m e - c o p p e r o x i d a s e s . J o u r n a l o f b i o e n e r g e t i c s a n d b i o m e m b r a n e s 2 6 , 5 9 9 - 6 0 8 . M o r o n e y , P . M . , S c h o l e s , T . A . , a n d H i n k l e , R C . ( 1 9 8 4 ) . E f f e c t o f m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d p H g r a d i e n t o n e l e c t r o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 2 3 , 4 9 9 1 - 4 9 9 7 . M o s e r , C . C . , F a r i d , T . A . , C h o b o t , S E , a n d D u t t o n , P L . ( 2 0 0 6 ) . E l e c t r o n t u n n e l i n g c h a i n s o f m i t o c h o n d r i a . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 7 5 7 , 1 0 9 6 - 1 1 0 9 . 2 4 8 M u r a m o t o , K . , H i r a t a , K . , S h i n z a w a - I t o h , K . , Y o k o - o , S . , Y a m a s h i t a , E . , A o y a m a , H . , T s u k i h a r a , T . , a n d Y o s h i k a w a , S . ( 2 0 0 7 ) . A h i s t i d i n e r e s i d u e a c t i n g a s a c o n t r o l l i n g s i t e f o r d i o x y g e n r e d u c t i o n a n d p r o t o n p u m p i n g b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 0 4 , 7 8 8 1 - 7 8 8 6 . M u r p h y , M P . ( 1 9 8 9 ) . S l i p a n d l e a k i n m i t o c h o n d r i a l o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 9 7 7 , 1 2 3 - 1 4 1 . M u r p h y , M . P . , a n d B r a n d , M D . ( 1 9 8 7 ) . V a r i a b l e s t o i c h i o m e t r y o f p r o t o n p u m p i n g b y t h e m i t o c h o n d r i a l r e s p i r a t o r y c h a i n . N a t u r e 3 2 9 , 1 7 0 - 1 7 2 . N a m s l a u e r , A . , A a g a a r d , A . , K a t s o n o u r i , A . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 3 ) . I n t r a m o l e c u l a r F “ p r o t o n - t r a n s f e r r e a c t i o n s i n a m e m b r a n e - b o u n d p r o t o n p u m p : t h e e f f e c t o f p H o n t h e : - p e r o x y t o f e r r y ] t r a n s i t i o n i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 2 , 1 4 8 8 - 1 4 9 8 . N a m s l a u e r , A . , B r a n d e n , M . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 2 ) . T h e r a t e o f i n t e r n a l h e m e - h e m e e l e c t r o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e C o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 1 , 1 0 3 6 9 - 1 0 3 7 4 . N a m s l a u e r , A . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 4 ) . S t r u c t u r a l e l e m e n t s i n v o l v e d i n e l e c t r o n - i c o u p l e d p r o t o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t 5 6 7 , 1 0 3 - 1 1 0 . N a m s l a u e r , A . , L e p p , H . , B r a n d e n , M . , J a s a i t i s , A . , V e r k h o v s k y , M . I . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 7 ) . P l a s t i c i t y o f p r o t o n p a t h w a y s t r u c t u r e a n d w a t e r c o o r d i n a t i o n i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . 1 B i o l C h e m 2 8 2 , 1 5 1 4 8 - 1 5 1 5 8 . N i c h o l l s , D C . ( 1 9 7 4 ) . T h e i n fl u e n c e o f r e s p i r a t i o n a n d A T P h y d r o l y s i s o n t h e p r o t o n - e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t a c r o s s t h e i n n e r m e m b r a n e o f r a t - l i v e r m i t o c h o n d r i a a s d e t e r m i n e d b y i o n d i s t r i b u t i o n . E u r o p e a n j o u r n a l o f b i o c h e m i s t r y / F E B S 5 0 , 3 0 5 - 3 1 5 . N i c h o l l s , P . ( 1 9 7 5 ) . T h e e f f e c t o f s u l p h i d e o n c y t o c h r o m e a a 3 . I s o s t e r i c a n d a l l o s t e r i c s h i f t s o f t h e r e d u c e d a l p h a - p e a k . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 3 9 6 , 2 4 - 3 5 . N i c h o l l s , P . , H i l d e b r a n d t , V . , a n d W r i g g l e s w o r t h , 1 . ( 1 9 8 0 ) . O r i e n t a t i o n a n d r e a c t i v i t y o f c y t o c h r o m e a a 3 h e m e g r o u p s i n p r o t e o l i p o s o m e s . A r c h B i o c h e m B i o p h y s 2 0 4 , 5 3 3 - 5 4 3 . N i l s s o n , T . , H a l l e n , S . , a n d O l i v e b e r g , M . ( 1 9 9 0 ) . R a p i d P r o t o n R e l e a s e D u r i n g F l a s h - i n d u c e d O x i d a t i o n o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e . F E B S L e t t 2 6 0 , 4 5 - 4 7 . N y q u i s t , R . M . , H e i t b r i n k , D . , B o l w i e n , C . , G e n n i s , R . B . , a n d H e b e r l e , J . ( 2 0 0 3 ) . D i r e c t o b s e r v a t i o n o f p r o t o n a t i o n r e a c t i o n s d u r i n g t h e c a t a l y t i c c y c l e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 0 0 , 8 7 1 5 - 8 7 2 0 . 2 4 9 O k u n o , D . , I w a s e , T . , S h i n z a w a - I t o h , K . , Y o s h i k a w a , S . , a n d K i t a g a w a , T . ( 2 0 0 3 ) . E U R d e t e c t i o n o f p r o t o n a t i o n / d e p r o t o n a t i o n o f k e y c a r b o x y l s i d e c h a i n s c a u s e d b y r e d o x c h a n g e o f t h e C u ( A ) - h e m e a m o i e t y a n d l i g a n d d i s s o c i a t i o n f r o m t h e h e m e a 3 - C u ( B ) c e n t e r o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J A m C h e m S o c 1 2 5 , 7 2 0 9 - 7 2 1 8 . O l i v e b e r g , M . , B r z e z i n s k i , P . , a n d M a l m s t r o m , B . G . ( 1 9 8 9 ) . T h e e f f e c t o f p H a n d t e m p e r a t u r e o n t h e r e a c t i o n o f f u l l y r e d u c e d a n d m i x e d - v a l e n c e c y t o c h r o m e c o x i d a s e w i t h d i o x y g e n . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 9 7 7 , 3 2 2 - 3 2 8 . O l i v e b e r g , M . , H a l l e n , S . , a n d N i l s s o n , T . ( 1 9 9 1 ) . U p t a k e a n d R e l e a s e o f P r o t o n s D u r i n g t h e R e a c t i o n B e t w e e n C y t o c h r o m e c O x i d a s e a n d M o l e c u l a r O x y g e n : A F l o w - F l a s h I n v e s t i g a t i o n . B i o c h e m i s t r y 3 0 , 4 3 6 - 4 4 0 . O l k h o v a , E . , H u t t e r , M . C . , L i l ] , M . A . , H e l m s , V . , a n d M i c h e l , H . ( 2 0 0 4 ) . D y n a m i c w a t e r n e t w o r k s i n c y t o c h r o m e C o x i d a s e f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s i n v e s t i g a t e d b y m o l e c u l a r d y n a m i c s s i m u l a t i o n s . B i o p h y s i c a l j o u r n a l 8 6 , 1 8 7 3 - 1 8 8 9 . O l s s o n , M . H . , S h a r m a , P . K . , a n d W a r s h e l , A . ( 2 0 0 5 ) . S i m u l a t i n g r e d o x c o u p l e d p r o t o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e : l o o k i n g f o r t h e p r o t o n b o t t l e n e c k . F E B S L e t t 5 7 9 , 2 0 2 6 - 2 0 3 4 . O s t e r m e i e r , C . , H a r r e n g a , A . , E r r n l e r , U . , a n d M i c h e l , H . ( 1 9 9 7 ) . S t r u c t u r e a t 2 . 7 A r e s o l u t i o n o f t h e P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s t w o - s u b u n i t c y t o c h r o m e c o x i d a s e c o m p l e x e d w i t h a n a n t i b o d y F V f r a g m e n t . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 4 , 1 0 5 4 7 - 1 0 5 5 3 . P a r a d i e s , G . , R u g g i e r o , P . M . , P e t r o s i l l o , G . , a n d Q u a g l i a r i e l l o , E . ( 1 9 9 7 ) . A g e - d e p e n d e n t d e c l i n e i n t h e c y t o c h r o m e c o x i d a s e a c t i v i t y i n r a t h e a r t m i t o c h o n d r i a : r o l e o f c a r d i o l i p i n . F E B S L e t t 4 0 6 , 1 3 6 - 1 3 8 . P a w a t e , A . S . , M o r g a n , 1 . , N a m s l a u e r , A . , M i l l s , D . , B r z e z i n s k i , P . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , a n d G e n n i s , R B . ( 2 0 0 2 ) . A m u t a t i o n i n s u b u n i t I o f c y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s r e s u l t s i n a n i n c r e a s e i n s t e a d y - s t a t e a c t i v i t y b u t c o m p l e t e l y e l i m i n a t e s p r o t o n p u m p i n g . B i o c h e m i s t r y 4 1 , 1 3 4 1 7 - 1 3 4 2 3 . P e i f f e r , W . E . , I n g l e , R T , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 0 ) . S t r u c t u r a l l y u n i q u e p l a n t c y t o c h r o m e c o x i d a s e i s o l a t e d f r o m w h e a t g e r m , a r i c h s o u r c e o f p l a n t m i t o c h o n d r i a l e n z y m e s . B i o c h e m i s t r y 2 9 , 8 6 9 6 - 8 7 0 1 . P fi t z n e r , U . , H o f f m e i e r , K . , H a r r e n g a , A . , K a n n t , A . , M i c h e l , H . , B a m b e r g , E . , R i c h t e r , O . M . , a n d L u d w i g , B . ( 2 0 0 0 ) . T r a c i n g t h e D - p a t h w a y i n r e c o n s t i t u t e d s i t e - d i r e c t e d m u t a n t s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r r fi c a n s . B i o c h e m i s t r y 3 9 , 6 7 5 6 - 6 7 6 2 . 2 5 0 P fi t z n e r , U . , O d e n w a l d , A . , O s t e r r n a n n , T . , W e i n g a r d , L . , L u d w i g , B . , a n d R i c h t e r , O M . ( 1 9 9 8 ) . C y t o c h r o m e c o x i d a s e ( h e m e a a 3 ) f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s : a n a l y s i s o f m u t a t i o n s i n p u t a t i v e p r o t o n c h a n n e l s o f s u b u n i t 1 . J o u r n a l o f b i o e n e r g e t i c s a n d b i o m e m b r a n e s 3 0 , 8 9 — 9 7 . P i c k , U . ( 1 9 8 1 ) . L i p o s o m e s w i t h a l a r g e t r a p p i n g c a p a c i t y p r e p a r e d b y f r e e z i n g a n d t h a w i n g o f s o n i c a t e d p h o s p h o l i p i d m i x t u r e s . A r c h i v e s o f b i o c h e m i s t r y a n d b i o p h y s i c s 2 1 2 , 1 8 6 - 1 9 4 . P o m e s , R . , H u m m e r , G . , a n d M , W . ( 1 9 9 8 ) . S t r u c t u r e a n d d y n a m i c s o f a p r o t o n s h u t t l e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 3 6 5 , 2 5 5 - 2 6 0 . P o p o v i c , D . M . , a n d S t u c h e b r u k h o v , A . A . ( 2 0 0 4 ) . P r o t o n p u m p i n g m e c h a n i s m a n d c a t a l y t i c c y c l e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e : C o u l o m b p u m p m o d e l w i t h k i n e t i c g a t i n g . F E B S L e t t 5 6 6 , 1 2 6 - 1 3 0 . P 0 p o v i c , D . M . , a n d S t u c h e b r u k h o v , A . A . ( 2 0 0 5 ) . P r o t o n e x i t c h a n n e l s i n b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J P h y s C h e m B 1 0 9 , 1 9 9 9 - 2 0 0 6 . P r o c h a s k a , L . J . , a n d F i n k , R S . ( 1 9 8 7 ) . O n t h e r o l e o f S u b u n i t I I I i n p r o t o n t r a n s l o c a t i o n i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J B i o e n e r g B i o m e m 1 9 , 1 4 3 - 1 6 4 . P r o s h l y a k o v , D . A . , P r e s s l e r , M . A . , D e M a s o , C . , L e y k a m , J . F . , D e W i t t , D . L . , a n d B a b c o c k , G T . ( 2 0 0 0 ) . O x y g e n a c t i v a t i o n a n d r e d u c t i o n i n r e s p i r a t i o n : i n v o l v e m e n t o f r e d o x - a c t i v e t y r o s i n e 2 4 4 . S c i e n c e 2 9 0 , 1 5 8 8 - 1 5 9 1 . P u u s t i n e n , A . , B a i l e y , J . A . , D y e r , R . B . , M e c k l e n b u r g , S . L . , W i k s t r o m , M . , a n d W o o d r u f f , W . H . ( 1 9 9 7 ) . F o u r i e r t r a n s f o r m i n f r a r e d e v i d e n c e f o r c o n n e c t i v i t y b e t w e e n C u g a n d g l u t a m i c a c i d 2 8 6 i n c y t o c h r o m e b 0 3 f r o m E s c h e r i c h i a c o l i . B i o c h e m i s t r y 3 6 , 1 3 1 9 5 - 1 3 2 0 0 . P u u s t i n e n , A . , F i n e ] , M . , V i r k k i , M . , a n d W i k s t r ? , M . ( 1 9 8 9 ) . C y t o c h r o m e 0 ( b o ) i s a P r o t o n P u m p i n P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s a n d E s c h e r i c h i a c o l i . F E B S L e t t e r s 2 4 9 , 1 6 3 - 1 6 7 . P u u s t i n e n , A . , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 9 a ) . P r o t o n e x i t f r o m t h e h e m e - c o p p e r o x i d a s e o f E s c h e r i c h i a c o l i . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 6 , 3 5 - 3 7 . P u u s t i n e n , A . , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 9 b ) . P r o t o n E x i t f r o m t h e H e m e - C o p p e r O x i d a s e o f E s c h e r i c h i a C o l i . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 6 , 3 5 - 3 7 . Q i a n , 1 . , M i l l s , D . A . , G e r e n , L . , W a n g , K . , H o g a n s o n , C . W . , S c h m i d t , B . , H i s e r , C . , B a b c o c k , G . T . , D u r h a m , B . , M i l l e t t , F . , e t a l . ( 2 0 0 4 ) . R o l e o f t h e c o n s e r v e d a r g i n i n e p a i r i n p r o t o n a n d e l e c t r o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 3 , 5 7 4 8 - 5 7 5 6 . 2 5 1 Q i n , L . ( 2 0 0 8 ) . U n p u b l i s h e d . Q i n , L . , H i s e r , C . , M u l i c h a k , A . , G a r a v i t o , R . M . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 6 ) . I d e n t i fi c a t i o n o f c o n s e r v e d l i p i d / d e t e r g e n t - b i n d i n g s i t e s i n a h i g h - r e s o l u t i o n s t r u c t u r e o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 0 3 , 1 6 1 1 7 - 1 6 1 2 2 . Q i n , L . , M i l l s , D . A . , B u h r o w , L . , H i s e r , C . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 8 ) . A c o n s e r v e d s t e r o i d b i n d i n g s i t e i n c y t o c h r o m e C o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 7 , 9 9 3 1 - 9 9 3 3 . Q i n , L . , M i l l s , D . A . , H i s e r , C . , M u r p h r e e , A . , G a r a v i t o , R . M . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , a n d H o s l e r , J . ( 2 0 0 7 ) . C r y s t a l l o g r a p h i c l o c a t i o n a n d m u t a t i o n a l a n a l y s i s o f Z n a n d C d i n h i b i t o r y s i t e s a n d r o l e o f l i p i d i c c a r b o x y l a t e s i n r e s c u i n g p r o t o n p a t h m u t a n t s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 6 , 6 2 3 9 - 6 2 4 8 . R a c k e r , E . , V i o l a n d , B . , O ' N e a l , S . , A l f o n z o , M . , a n d T e l f o r d , J . ( 1 9 7 9 ) . R e c o n s t i t u t i o n , a w a y o f b i o c h e m i c a l r e s e a r c h ; s o m e n e w a p p r o a c h e s t o m e m b r a n e - b o u n d e n z y m e s . A r c h i v e s o f b i o c h e m i s t r y a n d b i o p h y s i c s 1 9 8 , 4 7 0 - 4 7 7 . R i c h , P R . ( 1 9 9 5 ) . T o w a r d u n d e r s t a n d i n g t h e c h e m i s t r y o f o x y g e n r e d u c t i o n a n d p r o t o n t r a n s l o c a t i o n i n i r o n - c o p p e r r e s p i r a t o r y o x i d a s e s . A u s t J P l a n t P h y s i o l 2 2 , 4 7 9 - 4 8 4 . R i c h , R R , a n d B r e t o n , J . ( 2 0 0 1 ) . F T I R s t u d i e s o f t h e C O a n d c y a n i d e a d d u c t s o f f u l l y r e d u c e d b o v i n e c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 0 , 6 4 4 1 - 6 4 4 9 . R i c h , P . R . , J u n e m a n n , S . , a n d M e u n i e r , B . ( 1 9 9 8 ) . P r o t o n m o t i v e m e c h a n i s m o f h e m e - c o p p e r o x i d a s e s . J B i o e n e r g B i o m e m b 3 0 , 1 3 1 — 1 3 8 . R i c h a r d , P . , P i t a r d , B . , a n d R i g a u d , I L . ( 1 9 9 5 ) . A T P s y n t h e s i s b y t h e F O F l - A T P a s e f r o m t h e t h e r m o p h i l i c B a c i l l u s P S 3 c o - r e c o n s t i t u t e d w i t h b a c t e r i o r h o d o p s i n i n t o l i p o s o m e s . E v i d e n c e f o r s t i m u l a t i o n o f A T P s y n t h e s i s b y A T P b o u n d t o a n o n c a t a l y t i c b i n d i n g s i t e . 1 B i o l C h e m 2 7 0 , 2 1 5 7 1 - 2 1 5 7 8 . R i g a u d , J . L . , B l u z a t , A . , a n d B u s c h l e n , S . ( 1 9 8 3 ) . I n c o r p o r a t i o n o f b a c t e r i o r h o d o p s i n i n t o l a r g e u n i l a m e l l a r l i p o s o m e s b y r e v e r s e p h a s e e v a p o r a t i o n . B i o c h e m i c a l a n d b i o p h y s i c a l r e s e a r c h c o m m u n i c a t i o n s 1 I 1 , 3 7 3 - 3 8 2 . R i g a u d , J . L . , L e v y , D . , M o s s e r , G . , a n d L a m b e r t , O . ( 1 9 9 8 ) . D e t e r g e n t r e m o v a l b y n o n - p o l a r p o l y s t y r e n e b e a d s E u r B i o p h y s J 2 7 , 3 0 5 - 3 1 9 . R i g a u d , J . L . , M o s s e r , G . , L a c a p e r e , 1 . 1 . , O l o f s s o n , A . , L e v y , D . , a n d R a n c k , 1 . L . ( 1 9 9 7 ) . B i o - B e a d s : a n e f fi c i e n t s t r a t e g y f o r t w o - d i m e n s i o n a l c r y s t a l l i z a t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s . J o u r n a l o f s t r u c t u r a l b i o l o g y 1 1 8 , 2 2 6 - 2 3 5 . 2 5 2 R i g a u d , J . L . , P a t e m o s t r e , M T , a n d B l u z a t , A . ( 1 9 8 8 ) . M e c h a n i s m s o f m e m b r a n e p r o t e i n i n s e r t i o n i n t o l i p o s o m e s d u r i n g r e c o n s t i t u t i o n p r o c e d u r e s i n v o l v i n g t h e u s e o f d e t e r g e n t s . 2 . I n c o r p o r a t i o n o f t h e l i g h t - d r i v e n p r o t o n p u m p b a c t e r i o r h o d o p s i n . B i o c h e m i s t r y 2 7 , 2 6 7 7 - 2 6 8 8 . R i g a u d , J . L . , P i t a r d , B . , a n d L e v y , D . ( 1 9 9 5 ) . R e c o n s t i t u t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s i n t o l i p o s o m e s : a p p l i c a t i o n t o e n e r g y - t r a n s d u c i n g m e m b r a n e p r o t e i n s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 2 3 1 , 2 2 3 - 2 4 6 . R i i s t a m a , S . , H u m m e r , G . , P u u s t i n e n , A . , D y e r , R . B . , W o o d r u f f , W . H . , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 7 ) . B o u n d w a t e r i n t h e p r o t o n t r a n s l o c a t i o n m e c h a n i s m o f t h e h a e m - c o p p e r o x i d a s e s . F E B S L e t t 4 1 4 , 2 7 5 - 2 8 0 . 5 ; “ , R i i s t a m a , S . , P u u s t i n e n , A . , G a r c i a - H o r s m a n , A . , I w a t a , S . , M i c h e l , H . , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 6 ) . C h a n n e l l i n g o f D i o x y g e n i n t o t h e R e s p i r a t o r y E n z y m e . B i o c h i m e t B i o p h y s A c t a 1 2 7 5 , 1 - 4 . R i i s t a m a , S . , P u u s t i n e n , A . , V e r k h o v s k y , M . I . , M o r g a n , 1 E a n d W i k s t r o m , M . ( 2 0 0 0 ) . " 1 B i n d i n g o f 0 ( 2 ) a n d i t s r e d u c t i o n a r e b o t h r e t a r d e d b y r e p l a c e m e n t o f v a l i n e 2 7 9 b y w i s o l e u c i n e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s . B i o c h e m i s t r y 3 9 , 6 3 6 5 - 6 3 7 2 . R o b e r t s , V . A . , a n d P i q u e , M E . ( 1 9 9 9 ) . D e fi n i t i o n o f t h e i n t e r a c t i o n d o m a i n f o r c y t o c h r o m e c o n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . 1 ] ] . P r e d i c t i o n o f t h e d o c k e d c o m p l e x b y a c o m p l e t e , s y s t e m a t i c s e a r c h . 1 B i o l C h e m 2 7 4 , 3 8 0 5 1 - 3 8 0 6 0 . R o m a n , I . , F i g y s , 1 . , S t e u r s , G . , a n d Z i z i , M . ( 2 0 0 5 ) . I n v i t r o i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e t w o m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p r o t e i n s V D A C a n d c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 4 4 , 1 3 1 9 2 - 1 3 2 0 1 . R u i t e n b e r g , M . , K a n n t , A . , B a m b e r g , E . , F e n d l e r , K . , a n d M i c h e l , H . ( 2 0 0 2 ) . R e d u c t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e b y a s e c o n d e l e c t r o n l e a d s t o p r o t o n t r a n s l o c a t i o n . N a t u r e 4 1 7 . R u i t e n b e r g , M . , K a n n t , A . , B a m b e r g , E . , L u d w i g , B . , M i c h e l , H . , a n d F e n d l e r , K . ( 2 0 0 0 ) . S i n g l e - e l e c t r o n r e d u c t i o n o f t h e o x i d i z e d s t a t e i s c o u p l e d t o p r o t o n u p t a k e v i a t h e K p a t h w a y i n P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t ] A c a d S c i U S A 9 7 , 4 6 3 2 - 4 6 3 6 . S a a r i , H . , P e n t t i l a , T . , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 8 0 ) . I n t e r a c t i o n s o f C a 2 + a n d H + w i t h h e m e A i n c y t o c h r o m e o x i d a s e . J o u r n a l o f b i o e n e r g e t i c s a n d b i o m e m b r a n e s 1 2 , 3 2 5 - 3 3 8 . S a l o m o n s s o n , L . , F a x e n , K . , A d e l r o t h , P . , a n d B r z e z i n s k i , P . ( 2 0 0 5 ) . T h e t i m i n g o f p r o t o n m i g r a t i o n i n m e m b r a n e - r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 0 2 , 1 7 6 2 4 - 1 7 6 2 9 . 2 5 3 S a r t i , P . , J o n e s , M . G . , A n t o n i n i , G . , M a l a t e s t a , F . , C o l o s i m o , A . , W i l s o n , M . T . , a n d B r u n o r i , M . ( 1 9 8 5 ) . K i n e t i c s o f R e d o x - L i n k e d P r o t o n P u m p i n g A c t i v i t y o f N a t i v e a n d S u b u n i t I I I - D e p l e t e d C y t o c h r o m e c O x i d a s e : A S t o p p e d - F l o w I n v e s t i g a t i o n . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 8 2 , 4 8 7 6 - 4 8 8 0 . S c h m i d t , B . ( 2 0 0 3 ) . P r o t o n a n d w a t e r e x i t i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P h . D . T h e s i s ( M i c h i g a n S t a t e U n i v . E a s t L a n s i n g . M I . U S A ) . S c h m i d t , B . , H i l l i e r , W . , M c C r a c k e n , 1 . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 4 ) . T h e u s e o f s t a b l e i s o t o p e s a n d s p e c t r o s c o p y t o i n v e s t i g a t e t h e e n e r g y t r a n s d u c i n g f u n c t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 6 5 5 , 2 4 8 - 2 5 5 . S c h m i d t , B . , M c C r a c k e n , J . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 3 ) . A d i s c r e t e w a t e r e x i t p a t h w a y i n t h e m e m b r a n e p r o t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 0 0 , 1 5 5 3 9 - 1 5 5 4 2 . S c h n e i d e r , H . , L e m a s t e r s , J . J . , H o c h l i , M . , a n d H a c k e n b r o c k , C R . ( 1 9 8 0 ) . F u s i o n o f l i p o s o m e s w i t h m i t o c h o n d r i a l i n n e r m e m b r a n e s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 7 7 , 4 4 2 - 4 4 6 . S c h o n , E . A . , a n d M a n f r e d i , G . ( 2 0 0 3 ) . N e u r o n a l d e g e n e r a t i o n a n d m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n . T h e J o u r n a l o f c l i n i c a l i n v e s t i g a t i o n 1 1 ] , 3 0 3 - 3 1 2 . S c h o n f e l d , M . , a n d N e u m a n n , J . ( 1 9 7 7 ) . P r o t o n c o n d u c t a n c e o f t h e t h y l a k o i d m e m b r a n e : m o d u l a t i o n b y l i g h t . F E B S L e t t 7 3 , 5 1 - 5 4 . S e i b o l d , S . A . , M i l l s , D . A . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , a n d C u k i e r , R I . ( 2 0 0 5 ) . W a t e r c h a i n f o r m a t i o n a n d p o s s i b l e p r o t o n p u m p i n g r o u t e s i n R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s c y t o c h r o m e c o x i d a s e : A m o l e c u l a r d y n a m i c s c o m p a r i s o n o f t h e w i l d t y p e a n d R 4 8 1 K m u t a n t . B i o c h e m i s t r y 4 4 , 1 0 4 7 5 - 1 0 4 8 5 . S h a r p e , M . A . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 8 ) . A c h e m i c a l l y e x p l i c i t m o d e l f o r t h e m e c h a n i s m o f p r o t o n p u m p i n g i n h e m e - c o p p e r o x i d a s e s . J o u r n a l o f b i o e n e r g e t i c s a n d b i o m e m b r a n e s . S h a r p e , M . A . , Q i n , L . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 5 ) . B i o p h y s i c a l a n d S t r u c t u r a l A s p e c t s o f B i o e n e r g e t i c s , . I n , M . W i k s t r o m , e d . ( C a m b r i d g e , R o y a l S o c i e t y o f C h e m i s t r y ) . S h a r p e , M . A . , W r i g g l e s w o r t h , J . M . , L o e w e n , 1 . , a n d N i c h o l l s , P . ( 1 9 9 5 ) . S m a l l p H G r a d i e n t s I n h i b i t C y t o c h r o m e c O x i d a s e : I m p l i c a t i o n s f o r H + E n t r y t o t h e B i n u c l e a r C e n t e r . B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n 2 1 6 , 9 3 1 - 9 3 8 . 2 5 4 S h i m o k a t a , K . , K a t a y a m a , Y . , M u r a y a m a , H . , S u e m a t s u , M . , T s u k i h a r a , T . , M u r a m o t o , K . , A o y a m a , H . , Y o s h i k a w a , S . , a n d S h i m a d a , H . ( 2 0 0 7 ) . T h e p r o t o n p u m p i n g p a t h w a y o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . P r o c N a t ] A c a d S c i U S A 1 0 4 , 4 2 0 0 - 4 2 0 5 . S h i n z a w a - I t o h , K . , A o y a m a , H . , M u r a m o t o , K . , T e r a d a , H . , K u r a u c h i , T . , T a d e h a r a , Y . , Y a m a s a k i , A . , S u g i m u r a , T . , K u r o n o , S . , T s u j i m o t o , K . , e t a l . ( 2 0 0 7 ) . S t r u c t u r e s a n d p h y s i o l o g i c a l r o l e s o f 1 3 i n t e g r a l l i p i d s o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . E m b o 1 . S i g e l , E . , a n d C a r a f o l i , E . ( 1 9 7 8 ) . T h e p r o t o n p u m p o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e a n d i t s s t o i c h i o m e t r y . E u r o p e a n j o u r n a l o f b i o c h e m i s t r y / F E B S 8 9 , 1 1 9 - 1 2 3 . S i l e t s k y , S . A . , H a n , D . , B r a n d , S . , M o r g a n , J . E . , F a b i a n , M . , G e r e n , L . , M i l l e t t , F . , D u r h a m , B . , K o n s t a n t i n o v , A . A . , a n d G e n n i s , R B . ( 2 0 0 6 ) . S i n g l e - e l e c t r o n p h o t o r e d u c t i o n o f t h e P ( M ) i n t e r m e d i a t e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 7 5 7 , 1 1 2 2 - 1 1 3 2 . S i l e t s k y , S . A . , P a w a t e , A . S . , W e i s s , K . , G e n n i s , R . B . , a n d K o n s t a n t i n o v , A . A . ( 2 0 0 4 ) . T r a n s m e m b r a n e c h a r g e s e p a r a t i o n d u r i n g t h e f e r r y l - o x o - > o x i d i z e d t r a n s i t i o n i n a n o n p u m p i n g m u t a n t o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J B i o l C h e m 2 7 9 , 5 2 5 5 8 - 5 2 5 6 5 . S i m s , P . J . , W a g g o n e r , A . S . , W a n g , C H , a n d H o f f m a n , L P . ( 1 9 7 4 ) . S t u d i e s o n t h e m e c h a n i s m b y w h i c h c y a n i n e d y e s m e a s u r e m e m b r a n e p o t e n t i a l i n r e d b l o o d c e l l s a n d p h o s p h a t i d y l c h o l i n e v e s i c l e s . B i o c h e m i s t r y 1 3 , 3 3 1 5 - 3 3 3 0 . S i n g h , A . P . , C h a n a d y , G . A . , a n d N i c h o l l s , P . ( 1 9 8 5 ) . I n t e r a c t i o n s i n v o l v i n g t h e c y a n i n e d y e , d i S - C 3 - ( 5 ) , c y t o c h r o m e c a n d l i p o s o m e s a n d t h e i r i m p l i c a t i o n s f o r e s t i m a t i o n s o f d e l t a p s i i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e - r e c o n s t i t u t e d p r o t e o l i p o s o m e s . J M e m b r B i o l 8 4 , 1 8 3 - 1 9 0 . S i n g h , A R , a n d N i c h o l l s , P . ( 1 9 8 5 a ) . C y a n i n e a n d s a f r a n i n e d y e s a s m e m b r a n e p o t e n t i a l p r o b e s i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e r e c o n s t i t u t e d p r o t e o l i p o s o m e s . J o u r n a l o f b i o c h e m i c a l a n d b i o p h y s i c a l m e t h o d s 1 1 , 9 5 - 1 0 8 . S i n g h , A P , a n d N i c h o l l s , P . ( 1 9 8 5 b ) . C y a n i n e a n d S a f r a n i n e D y e s a s M e m b r a n e P o t e n t i a l P r o b e s i n C y t o c h r o m e c O x i d a s e R e c o n s t i t u t e d P r o t e o l i p o s o m e s . 1 B i o c h e m B i o p h y s M e t h 1 1 , 9 5 - 1 0 8 . S o a r e s , C . M . , B a p t i s t a , A . M . , P e r e i r a , M . M . , a n d T e i x e i r a , M . ( 2 0 0 4 ) . I n v e s t i g a t i o n o f p r o t o n a t a b l e r e s i d u e s i n R h o d o t h e r m u s m a r i n u s c a a 3 h a e m - c o p p e r o x y g e n r e d u c t a s e : c o m p a r i s o n w i t h P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s a a 3 h a e m - c o p p e r o x y g e n r e d u c t a s e . J B i o l I n o r g C h e m 9 , 1 2 4 - 1 3 4 . S o u l i m a n e , T . , B u s e , G . , B o u r e n k o v , G . P . , B a r t u n i k , H . D . , H u b e r , R . , a n d T h a n , M E . ( 2 0 0 0 ) . S t r u c t u r e a n d m e c h a n i s m o f t h e a b e r r a n t b a ( 3 ) - c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m t h e r m u s t h e r m o p h i l u s . E M B O J o u r n a l 1 9 , 1 7 6 6 - 1 7 7 6 . 2 5 5 S t e v e r d i n g , D . , K o h n k e , D . , L u d w i g , B . , a n d K a d e n b a c h , B . ( 1 9 9 3 ) . P r o t o n s l i p p a g e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e o f P a r a c o c c u s d e n i t r i fi c a n s . M e m b r a n e - p o t e n t i a l m e a s u r e m e n t s w i t h t h e t w o - s u b u n i t a n d t h r e e - s u b u n i t e n z y m e . E u r o p e a n j o u r n a l o f b i o c h e m i s t r y / F E B S 2 1 2 , 8 2 7 - 8 3 1 . S v e n s s o n - E k , M . , A b r a m s o n , J . , L a r s s o n , G . , T o m r o t h , S . , B r z e z i n s k i , P . , a n d I w a t a , S . ( 2 0 0 2 ) . T h e X - r a y c r y s t a l s t r u c t u r e s o f w i l d - t y p e a n d E Q ( I - 2 8 6 ) m u t a n t c y t o c h r o m e c o x i d a s e s f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . J o u r n a l o f m o l e c u l a r b i o l o g y 3 2 1 , 3 2 9 - 3 3 9 . S z o k a , F . , 1 r . , a n d P a p a h a d j o p o u l o s , D . ( 1 9 7 8 ) . P r o c e d u r e f o r p r e p a r a t i o n o f l i p o s o m e s w i t h l a r g e i n t e r n a l a q u e o u s s p a c e a n d h i g h c a p t u r e b y r e v e r s e - p h a s e e v a p o r a t i o n . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 7 5 , 4 1 9 4 - 4 1 9 8 . T a s h i r o , M . , a n d S t u c h e b r u k h o v , A . A . ( 2 0 0 5 ) . T h e r m o d y n a m i c p r o p e r t i e s o f i n t e r n a l w a t e r m o l e c u l e s i n t h e h y d r o p h o b i c c a v i t y a r o u n d t h e c a t a l y t i c c e n t e r o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e . 1 P h y s C h e m B C o n d e n s M a t t e r M a t e r S u r f I n t e r f a c e s B i o p h y s 1 0 9 , 1 0 1 5 - 1 0 2 2 . T h o m a s , J . W . , P u u s t i n e n , A . , A l b e n , J . O . , G e n n i s , R . B . , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 3 ) . S u b s t i t u t i o n o f A s p a r a g i n e f o r A s p a r t a t e - l 3 5 i n S u b u n i t I o f t h e C y t o c h r o m e b o U b i q u i n o l O x i d a s e o f E s c h e r i c h i a c o l i E l i m i n a t e s P r o t o n - P u m p i n g A c t i v i t y . B i o c h e m i s t r y 3 2 , 1 0 9 2 3 - 1 0 9 2 8 . T h o m p s o n , D . A . , G r e g o r y , L . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 8 5 ) . C y t o c h r o m e c O x i d a s e D e p l e t e d o f S u b u n i t I I I : P r o t o n - P u m p i n g , R e s p i r a t o r y C o n t r o l , a n d p H D e p e n d e n c e o f t h e M i d p o i n t P o t e n t i a l o f C y t o c h r o m e a . J I n o r g B i o c h e m 2 3 , 3 5 7 - 3 6 4 . T h o m s t r o m , P . E . , B r z e z i n s k i , P . , F r e d r i k s s o n , P . O . , a n d M a l m s t r o m , B . G . ( 1 9 8 8 ) . C y t o c h r o m e c o x i d a s e a s a n e l e c t r o n - t r a n s p o r t - d r i v e n p r o t o n p u m p : p H d e p e n d e n c e o f t h e r e d u c t i o n l e v e l s o f t h e r e d o x c e n t e r s d u r i n g t u r n o v e r . B i o c h e m i s t r y 2 7 , 5 4 4 1 - 5 4 4 7 . T i e d e , D . M . , V a s h i s h t a , A . - C . , a n d G u n n e r , M R . ( 1 9 9 3 ) . E l e c t r o n — t r a n s f e r k i n e t i c s a n d e l e c t r o s t a t i c p r o p e r t i e s o f t h e R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s r e a c t i o n c e n t e r a n d s o l u b l e c - c y t o c h r o m e . B i o c h e m i s t r y 3 2 , 4 5 1 5 - 4 5 3 1 . T s u k i h a r a , T . , A o y a m a , H . , Y a m a s h i t a , E . , T o m i z a k i , T . , Y a m a g u c h i , H . , S h i n z a w a - i t o h , K . , N a k a s h i m a , R . , Y a o n o , R . , a n d Y o s h i k a w a , S . ( 1 9 9 5 ) . S t r u c t u r e o f m e t a l s i t e s o f o x i d i z e d b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e a t 2 . 8 S c i e n c e 2 6 9 , 1 0 6 9 - 1 0 7 4 . T s u k i h a r a , T . , A o y a m a , H . , Y a m a s h i t a , E . , T o m i z a k i , T . , Y a m a g u c h i , H . , S h i n z a w a - I t o h , K . , N a k a s h i m a , R . , Y a o n o , R . , a n d Y o s h i k a w a , S . ( 1 9 9 6 ) . T h e w h o l e s t r u c t u r e o f t h e 1 3 - s u b u n i t o x i d i z e d c y t o c h r o m e c o x i d a s e a t 2 . 8 A . S c i e n c e 2 7 2 , 1 1 3 6 - 1 1 4 4 . 2 5 6 T s u k i h a r a , T . , S h i m o k a t a , K . , K a t a y a m a , Y . , S h i m a d a , H . , M u r a m o t o , K . , A o y a m a , H . , M o c h i z u k i , M . , S h i n z a w a - I t o h , K . , Y a m a s h i t a , E . , Y a o , M . , e t a l . ( 2 0 0 3 ) . T h e l o w - s p i n h e m e o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e a s t h e d r i v i n g e l e m e n t o f t h e p r o t o n p u m p i n g p r o c e s s . P r o c N a t A c a d S c i ( U S A ) 1 0 0 , 1 5 3 0 4 - 1 5 3 0 9 . V a k k a s o g l u , A . S . , M o r g a n , J . B . , H a n , D . , P a w a t e , A S , a n d G e n n i s , R B . ( 2 0 0 6 ) . M u t a t i o n s w h i c h d e c o u p l e t h e p r o t o n p u m p o f t h e c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s p e r t u r b t h e e n v i r o n m e n t o f g l u t a m a t e 2 8 6 . F E B S L e t t 5 8 0 , 4 6 1 3 - 4 6 1 7 . V a n n e s t e , W . H . ( 1 9 6 6 ) . T h e s t o i c h i o m e t r y a n d a b s o r p t i o n s p e c t r a o f c o m p o n e n t s a a n d a - 3 i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 5 , 8 3 8 - 8 4 8 . V e r k h o v s k a y a , M . L . , G a r c i a - H o r s m a n , A . , P u u s t i n e n , A . , R i g a u d , J . L . , M o r g a n , J . E . , V e r k h o v s k y , M . I . , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 7 ) . G l u t a m i c a c i d 2 8 6 i n s u b u n i t I o f c y t o c h r o m e b 0 3 i s i n v o l v e d i n p r o t o n t r a n s l o c a t i o n . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 4 , 1 0 1 2 8 - 1 0 1 3 1 . V e r k h o v s k y , M . I . , J a s a i t i s , A . , V e r k h o v s k a y a , M . L . , M o r g a n , 1 . E . , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 9 ) . P r o t o n t r a n s l o c a t i o n b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e . N a t u r e 4 0 0 , 4 8 0 - 4 8 3 . V e r k h o v s k y , M . I . , M o r g a n , J . E . , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 2 ) . I n t r a m o l e c u l a r e l e c t r o n t r a n s f e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e : a c a s c a d e o f e q u i l i b r i a . B i o c h e m i s t r y 3 1 , 1 1 8 6 0 - 1 1 8 6 3 . V e r k h o v s k y , M . I . , M o r g a n , J . E . , a n d W i k s t r o m , M . ( 1 9 9 4 ) . O x y g e n b i n d i n g a n d a c t i v a t i o n : e a r l y s t e p s i n t h e r e a c t i o n o f o x y g e n w i t h c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 3 3 , 3 0 7 9 - 3 0 8 6 . V y g o d i n a , T . V . , P e c o r a r o , C . , M i t c h e l l , D . , G e n n i s , R . , a n d K o n s t a n t i n o v , A . A . ( 1 9 9 8 ) . M e c h a n i s m o f i n h i b i t i o n o f e l e c t r o n t r a n s f e r b y a m i n o a c i d r e p l a c e m e n t K 3 6 2 M i n a p r o t o n c h a n n e l o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h e m i s t r y 3 7 , 3 0 5 3 - 3 0 6 1 . W a l l a c e , D C . ( 2 0 0 5 ) . A m i t o c h o n d r i a l p a r a d i g m o f m e t a b o l i c a n d d e g e n e r a t i v e d i s e a s e s , a g i n g , a n d c a n c e r : a d a w n f o r e v o l u t i o n a r y m e d i c i n e . A n n u a l r e v i e w o f g e n e t i c s 3 9 , 3 5 9 - 4 0 7 . W a n g , K . , Z h e n , Y . , S a d o s k i , R . , G r i n n e l l , S . , G e r e n , L . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , D u r h a m , B . , a n d M i l l e t t , F . ( 1 9 9 9 ) . D e fi n i t i o n o f t h e i n t e r a c t i o n d o m a i n f o r c y t o c h r o m e c o n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . 1 1 . R a p i d k i n e t i c a n a l y s i s o f e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m c y t o c h r o m e c t o R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s c y t o c h r o m e o x i d a s e s u r f a c e m u t a n t s . J B i o l C h e m 2 7 4 , 3 8 0 4 2 - 3 8 0 5 0 . 2 5 7 W i e r t z , F . G . , R i c h t e r , O . M . , C h e r e p a n o v , A . V . , M a c M i l l a n , F . , L u d w i g , B . , a n d d e V r i e s , S . ( 2 0 0 4 ) . A n o x o - f e r r y l t r y p t o p h a n r a d i c a l c a t a l y t i c i n t e r m e d i a t e i n c y t o c h r o m e c a n d q u i n o l o x i d a s e s t r a p p e d b y m i c r o s e c o n d f r e e z e - h y p e r q u e n c h i n g ( M H Q ) . F E B S L e t t 5 7 5 , 1 2 7 - 1 3 0 . W i k s t r o m , M . ( 1 9 8 1 ) . E n e r g y - d e p e n d e n t r e v e r s a l o f t h e c y t o c h r o m e o x i d a s e r e a c t i o n . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 7 8 , 4 0 5 1 - 4 0 5 4 . W i k s t r o m , M . ( 1 9 8 9 ) . I d e n t i fi c a t i o n o f t h e e l e c t r o n t r a n s f e r s i n c y t o c h r o m e o x i d a s e t h a t a r e c o u p l e d t o p r o t o n - p u m p i n g . N a t u r e 3 3 8 , 7 7 6 - 7 7 8 . W i k s t r o m , M . , B o g a c h e v , A . , F i n e ] , M . , M o r g a n , 1 E P u u s t i n e n , A . , R a i t i o , M . , V e r k h o v s k a y a , M . , a n d V e r k h o v s k y , M . I . ( 1 9 9 4 ) . M e c h a n i s m o f p r o t o n t r a n s l o c a t i o n b y t h e r e s p i r a t o r y o x i d a s e s . T h e h i s t i d i n e c y c l e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a I 1 8 7 , 1 0 6 - 1 1 1 . W i k s t r o m , M . , J a s a i t i s , A . , B a c k g r e n , C . , P u u s t i n e n , A . , a n d V e r k h o v s k y , M 1 . ( 2 0 0 0 ) . T h e r o l e o f t h e D - a n d K - p a t h w a y s o f p r o t o n t r a n s f e r i n t h e f u n c t i o n o f t h e h a e m - c o p p e r o x i d a s e s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 4 5 9 , 5 1 4 - 5 2 0 . W i k s t r o m , M . , K r a b , K . , a n d S a r a s t e , M . ( 1 9 8 1 a ) . C y t o c h r o m e O x i d a s e - A S y n t h e s i s ( N e w Y o r k , A c a d e m i c P r e s s ) . W i k s t r o m , M . , K r a b , K . , a n d S a r a s t e , M . ( 1 9 8 1 b ) . P r o t o n - t r a n s l o c a t i n g c y t o c h r o m e c o m p l e x e s . A n n u R e v B i o c h e m 5 0 , 6 2 3 - 6 5 5 . W i k s t r o m , M . , a n d S a a r i , H . ( 1 9 7 5 ) . A s p e c t r a l s h i f t i n c y t o c h r o m e a i n d u c e d b y c a l c i u m i o n s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 4 0 8 , 1 7 0 - 1 7 9 . W i k s t r o m , M . , a n d V e r k h o v s k y , M . I . ( 2 0 0 2 ) . P r o t o n t r a n s l o c a t i o n b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n d i f f e r e n t p h a s e s o f t h e c a t a l y t i c c y c l e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 5 5 5 , 1 2 8 - 1 3 2 . W i k s t r o m , M . , a n d V e r k h o v s k y , M 1 . ( 2 0 0 7 ) . M e c h a n i s m a n d e n e r g e t i c s o f p r o t o n t r a n s l o c a t i o n b y t h e r e s p i r a t o r y h e m e - c o p p e r o x i d a s e s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 7 6 7 , 1 2 0 0 - 1 2 1 4 . W i k s t r o m , M . , V e r k h o v s k y , M . I . , a n d H u m m e r , G . ( 2 0 0 3 ) . W a t e r - g a t e d m e c h a n i s m o f p r o t o n t r a n s l o c a t i o n b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 6 0 4 , 6 1 - 6 5 . W i k s t r o m , M K . ( 1 9 7 7 ) . P r o t o n p u m p c o u p l e d t o c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n m i t o c h o n d r i a . N a t u r e 2 6 6 , 2 7 1 - 2 7 3 . W i l s o n , D . F . , E r e c i n s k a , M . , a n d O w e n , C S . ( 1 9 7 6 ) . S o m e p r o p e r t i e s o f t h e r e d o x c o m p o n e n t s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e a n d t h e i r i n t e r a c t i o n s . A r c h i v e s o f b i o c h e m i s t r y a n d b i o p h y s i c s 1 7 5 , 1 6 0 - 1 7 2 . 2 5 8 W i l s o n , K S , a n d P r o c h a s k a , L ] . ( 1 9 9 0 ) . P h o s p h o l i p i d V e s i c l e s C o n t a i n i n g B o v i n e H e a r t M i t o c h o n d r i a l C y t o c h r o m e c O x i d a s e a n d S u b u n i t I I I - D e fi c i e n t E n z y m e : A n a l y s i s o f R e s p i r a t o r y C o n t r o l a n d P r o t o n T r a n s l o c a t i n g A c t i v i t i e s . A r c h B i o c h e m B i o p h y s 2 8 2 , 4 1 3 - 4 2 0 . W r a i g h t , C A . ( 2 0 0 6 ) . C h a n c e a n d d e s i g n - - p r o t o n t r a n s f e r i n w a t e r , c h a n n e l s a n d b i o e n e r g e t i c p r o t e i n s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 7 5 7 , 8 8 6 - 9 1 2 . W r i g g l e s w o r t h , J . M . , W o o s t e r , M . S . , E l s d e n , J . , a n d D a n n e e l , H ] . ( 1 9 8 7 ) . D y n a m i c s o f p r o t e o l i p o s o m e f o r m a t i o n . I n t e r m e d i a t e s t a t e s d u r i n g d e t e r g e n t d i a l y s i s . T h e B i o c h e m i c a l j o u r n a l 2 4 6 , 7 3 7 - 7 4 4 . W u , Y . , a n d V o t h , G A . ( 2 0 0 3 ) . A c o m p u t e r s i m u l a t i o n s t u d y o f t h e h y d r a t e d p r o t o n i n a s y n t h e t i c p r o t o n c h a n n e l . B i o p h y s i c a l j o u r n a l 8 5 , 8 6 4 - 8 7 5 . X u , 1 . , S h a r p e , M . A . , Q i n , L . , F e r g u s o n - M i l l e r , S . , a n d V o t h , G A . ( 2 0 0 7 ) . S t o r a g e o f a n E x c e s s P r o t o n i n t h e H y d r o g e n - B o n d e d N e t w o r k o f t h e D - P a t h w a y o f C y t o c h r o m e c O x i d a s e : I d e n t i fi c a t i o n o f a P r o t o n a t e d W a t e r C l u s t e r . 1 A m C h e m S o c . X u , 1 . , a n d V o t h , G A . ( 2 0 0 5 ) . C o m p u t e r s i m u l a t i o n o f e x p l i c i t p r o t o n t r a n s l o c a t i o n i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e : t h e D - p a t h w a y . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 0 2 , 6 7 9 5 - 6 8 0 0 . Y o s h i k a w a , S . , M u r a m o t o , K . , S h i n z a w a - I t o h , K . , A o y a m a , H . , T s u k i h a r a , T . , O g u r a , T . , S h i m o k a t a , K . , K a t a y a m a , Y . , a n d S h i m a d a , H . ( 2 0 0 6 a ) . R e a c t i o n m e c h a n i s m o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 7 5 7 , 3 9 5 - 4 0 0 . Y o s h i k a w a , S . , M u r a m o t o , K . , S h i n z a w a - I t o h , K . , A o y a m a , H . , T s u k i h a r a , T . , S h i m o k a t a , K . , K a t a y a m a , Y . , a n d S h i m a d a , H . ( 2 0 0 6 b ) . P r o t o n p u m p i n g m e c h a n i s m o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 7 5 7 , 1 1 1 0 - 1 1 1 6 . Y o s h i k a w a , S . , S h i n z a w a - I t o h , K . , N a k a s h i m a , R . , Y a o n o , R . , Y a m a s h i t a , E . , I n o u e , N . , Y a o , M . , F e i , M . J . , L i b e u , C . P . , M i z u s h i m a , T . , e t a l . ( 1 9 9 8 ) . R e d o x - c o u p l e d c r y s t a l s t r u c t u r a l c h a n g e s i n b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . S c i e n c e 2 8 0 , 1 7 2 3 - 1 7 2 9 . Y o s h i k a w a , S . , S h i n z a w a — I t o h , K . , a n d T s u k i h a r a , T . ( 2 0 0 0 ) . X - r a y s t r u c t u r e a n d t h e r e a c t i o n m e c h a n i s m o f b o v i n e h e a r t c y t o c h r o m e c o x i d a s e . J o u r n a l o f i n o r g a n i c b i o c h e m i s t r y 8 2 , 1 - 7 . Z a s l a v s k y , D . , K a u l e n , A . D . , S m i m o v a , I . A . , V y g o d i n a , T . , a n d K o n s t a n t i n o v , A . A . ( 1 9 9 3 ) . F l a s h - i n d u c e d m e m b r a n e p o t e n t i a l g e n e r a t i o n b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e . F E B S L e t t 3 3 6 , 3 8 9 - 3 9 3 . Z a s l a v s k y , D . , S a d o s k i , R . C . , R a j a g u k g u k , S . , G e r e n , L . , M i l l e t t , F . , D u r h a m , B . , a n d G e n n i s , R B . ( 2 0 0 4 ) . D i r e c t m e a s u r e m e n t o f p r o t o n r e l e a s e b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e i n s o l u t i o n d u r i n g t h e F - - > O t r a n s i t i o n . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 0 1 , 1 0 5 4 4 - 1 0 5 4 7 . 2 5 9 Z a s l a v s k y , D . , S a d o s k i , R . C . , W a n g , K . , D u r h a m , B . , G e n n i s , R . B . , a n d M i l l e t t , F . ( 1 9 9 8 ) . S i n g l e e l e c t r o n r e d u c t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e c o m p o u n d F : r e s o l u t i o n o f p a r t i a l s t e p s b y t r a n s i e n t s p e c t r o s c o p y . B i o c h e m i s t r y 3 7 , 1 4 9 1 0 - 1 4 9 1 6 . Z a s l a v s k y , D . L . , S m i m o v a , I . A . , S i l e t s k y , S . A . , K a u l e n , A . D . , M i l l e t t , F . , a n d K o n s t a n t i n o v , A . A . ( 1 9 9 5 ) . R a p i d k i n e t i c s o f m e m b r a n e p o t e n t i a l g e n e r a t i o n b y c y t o c h r o m e c o x i d a s e w i t h t h e p h o t o a c t i v e R u ( I I ) - t r i s - b i p y r i d y l d e r i v a t i v e o f c y t o c h r o m e c a s e l e c t r o n d o n o r . F E B S L e t t 3 5 9 , 2 7 - 3 0 . Z h a n g , L . , a n d H e r m a n s , J . ( 1 9 9 6 ) . H y d r o p h i l i c i t y o f c a v i t i e s i n p r o t e i n s . P r o t e i n s 2 S t r u c t u r e , F u n c t i o n a n d G e n e t i c s 2 4 , 4 3 3 - 4 3 8 . Z h e n , Y . , H o g a n s o n , C . W . , B a b c o c k , G . T . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 9 a ) . D e fi n i t i o n o f t h e i n t e r a c t i o n d o m a i n f o r c y t o c h r o m e c o n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . 1 . B i o c h e m i c a l , s p e c t r a l , a n d k i n e t i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f s u r f a c e m u t a n t s i n s u b u n i t i i o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s c y t o c h r o m e a a ( 3 ) . J B i o l C h e m 2 7 4 , 3 8 0 3 2 - 3 8 0 4 1 . Z h e n , Y . , M i l l s , D . , H o g a n s o n , C . W . , L u c a s , R . L . , S h i , W . , B a b c o c k , G . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 9 b ) . E l e c t r o n a n d p r o t o n t r a n s f e r i n h e m e - c o p p e r o x i d a s e s . I n F r o n t i e r s o f C e l l u l a r B i o e n e r g e t i c s : M o l e c u l a r B i o l o g y , B i o c h e m i s t r y a n d P h y s i o p a t h o l o g y , S . P a p a , F . G u e m ' e r i , a n d J . M . T a g e r , e d s . ( N e w Y o r k , K l u w e r A c a d e m i c / P l e n u m P r e s s ) , p p . 1 5 7 - 1 7 8 . Z h e n , Y . , Q i a n , J . , F o l l m a n n , K . , H o s l e r , J . , H a y w a r d , T . , N i l s s o n , T . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 1 9 9 8 ) . O v e r e x p r e s s i o n a n d p u r i fi c a t i o n o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e f r o m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . P r o t e i n E x p r e s s i o n P u r i f 1 3 , 3 2 6 - 3 3 6 . Z h e n , Y . , S c h m i d t , B . , K a n g , U . G . , A n t h o l i n e , W . , a n d F e r g u s o n - M i l l e r , S . ( 2 0 0 2 ) . M u t a n t s o f t h e C u A s i t e i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s : 1 . S p e c t r a l a n d f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s . B i o c h e m i s t r y 4 1 , 2 2 8 8 - 2 2 9 7 . Z h e n g , X . , M e d v e d e v , D . M . , S w a n s o n , J . , a n d S t u c h e b r u k h o v , A . A . ( 2 0 0 3 ) . C o m p u t e r s i m u l a t i o n o f w a t e r i n c y t o c h r o m e c o x i d a s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 5 5 7 , 9 9 - 1 0 7 . Z h u , Z . , Y a o , 1 . , J o h n s , T . , F u , K . , D e B i e , I . , M a c m i l l a n , C . , C u t h b e r t , A . P . , N e w b o l d , R . F . , W a n g , 1 . , C h e v r e t t e , M . , e t a l . ( 1 9 9 8 ) . S U R F ] , e n c o d i n g a f a c t o r i n v o l v e d i n t h e b i o g e n e s i s o f c y t o c h r o m e c o x i d a s e , i s m u t a t e d i n L e i g h s y n d r o m e . N a t u r e g e n e t i c s 2 0 , 3 3 7 - 3 4 3 . 2 6 0