1 ' ' 5 3 r . . ' . ” : T 1 2 P " 1 ‘ o " . ‘ \ P I \ ' I ‘ L W 7 M M i c h i g a n S t a t e 3 O i 0 U s . i v e r s i t y v . \ T h i s i s t o c e r t i f y t h a t t h e d i s s e r t a t i o n e n t i t l e d U L T R A S T R U C T U R A L A N D P H Y S I C O C H E M I C A L M O D I F I C A T I O N S W I T H I N A M M O N I A T R E A T E D L I G N O C E L L U L O S I C C E L L W A L L S A N D T H E I R I N F L U E N C E O N E N Z Y M A T I C D I G E S T I B I L I T Y p r e s e n t e d b y S H I S H I R P R A T A P S I N G H C H U N D A W A T h a s b e e n a c c e p t e d t o w a r d s f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e P h . D . d e g r e e i n C h e m i c a l E n g i n e e r i n l M a j o r P r o f e s s o r ’ s S i g n a t u r e D R - 1 ‘ 7 , ' L o o q D a t e M S U i s a n A f fi r m a t i v e A c t i o n / E q u a l O p p o r t u n i t y E m p l o y e r P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T o A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 5 / 0 8 K : l P r o l e c c & P r e s / C I R C / D a l a D u e . i n d d U L T R A S T R U C T U R A L A N D P H Y S I C O C H E M I C A L M O D I F I C A T I O N S W I T H I N A M M O N I A T R E A T E D L I G N O C E L L U L O S I C C E L L W A L L S A N D T H E I R I N F L U E N C E O N E N Z Y M A T I C D I G E S T I B I L I T Y V O L U M E 1 B y S h i s h i r P r a t a p S i n g h C h u n d a w a t A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y C h e m i c a l E n g i n e e r i n g 2 0 0 9 A B S T R A C T U L T R A S T R U C T U R A L A N D P H Y S I C O C H E M I C A L M O D I F I C A T I O N S W I T H I N A M M O N I A T R E A T E D L I G N O C E L L U L O S I C C E L L W A L L S A N D T H E I R I N F L U E N C E O N E N Z Y M A T I C D I G E S T I B I L I T Y B y S h i s h i r P r a t a p S i n g h C h u n d a w a t T h e d e v e l o p m e n t o f c e l l u l o s i c e t h a n o l b a s e d b i o r e f m e r i e s h a s b e e n l a r g e l y i m p e d e d d u e t o t h e n a t i v e r e c a l c i t r a n c e o f p l a n t c e l l w a l l s t o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t s a n d e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . L i g n i n - c a r b o h y d r a t e c o m p l e x ( L C C ) e s t e r l i n k a g e s a n d c e l l u l o s e c r y s t a l l i n i t y a r e m a j o r i m p e d i m e n t s t o e f fi c i e n t c e l l w a l l d e c o n s t r u c t i o n . A m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t s l i k e A F E X ( o r A m m o n i a F i b e r E x p a n s i o n ) a r e t h o u g h t t o o v e r c o m e c e l l w a l l r e c a l c i t r a n c e t h r o u g h a m m o n o l y s i s o f e s t e r l i n k a g e s a n d d e - c r y s t a l l i z a t i o n o f c e l l u l o s e . H O w e v e r , t h e m a j o r a m m o n o l y s i s e n d - p r o d u c t s a n d p r e t r e a t m e n t i n d u c e d c e l l w a l l b a s e d u l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s h a v e n e v e r b e f o r e b e e n d e t e r m i n e d f o r A F E X t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s . P r e v i o u s r e s e a r c h h a s f o c u s e d m o s t l y o n a c i d i c p r e t r e a t m e n t s t h a t e x t e n s i v e l y e x t r a c t h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n , h e n c e m i n i m i z i n g t h e r e q u i r e m e n t f o r o p t i m a l c e l l u l a s e a n d h e m i c e l l u l a s e b a s e d e n z y m e c o c k t a i l s . T h e g o a l o f t h i s s t u d y w a s t o e l u c i d a t e t h e m e c h a n i s m o f a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t s o n l i g n o c e l l u l o s i c p l a n t c e l l w a l l s ( e . g . c o r n s t o v e r , c e l l u l o s e ) a n d e x a m i n e h o w t h a t i n fl u e n c e s e n z y m a t i c a c t i v i t y . I n t h i s s t u d y , i t w a s f o u n d t h a t a m m o n o l y s i s o f c o r n s t o v e r L C C e s t e r l i n k a g e s r e s u l t e d i n t h e e x t r a c t i o n a n d r e - d e p o s i t i o n o f d e c o m p o s i t i o n p r o d u c t s ( e . g . a m i d e s , a r a b i n o x y l a n o l i g o m e r s , l i g n i n p h e n o l i c s ) o n o u t e r c e l l w a l l s u r f a c e s . T h e s e a m o r p h o u s l y s h a p e d d e p o s i t s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y c o n f o c a l fl u o r e s c e n c e , a t o m i c f o r c e a n d s c a n n i n g e l e c t r o n b a s e d m i c r o s c o p i c t e c h n i q u e s . C l e a v a g e o f L C C l i n k a g e s d u r i n g A F E X r e s u l t e d i n t h e f o r m a t i o n o f a n a n o - p o r o u s n e t w o r k t h a t l i k e l y e n h a n c e d e n z y m e a c c e s s i b i l i t y . T h e s h a p e , s i z e ( e . g . p o r e w i d t h r a n g e d b e t w e e n 1 0 - 1 0 0 0 n m ) a n d s p a t i a l d i s t r i b u t i o n o f t h e p o r o u s n e t w o r k w a s d e p e n d e n t o n c e l l w a l l c o m p o s i t i o n ( e . g . m i d d l e l a m e l l a v s . s e c o n d a r y w a l l s ) a n d a m m o n i a p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s . P r e t r e a t e d c e l l w a l l c u m u l a t i v e p o r o s i t y ( L e . p o r e s u r f a c e a r e a p e r u n i t c e l l w a l l v o l u m e ) , e s t i m a t e d v i a a n a l y s i s o f t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y b a s e d t o m o g r a m s ( 0 . 0 0 5 - 0 . 0 5 n m 2 / n m 3 ) , w a s l i n e a r l y c o r r e l a t e d t o t h e t o t a l L C C e s t e r l i n k a g e s c l e a v e d . C l o s e r e x a m i n a t i o n o f c e l l u l o s e c r y s t a l s t r u c t u r e r e v e a l e d f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I I I a l l o m o r p h u p o n t r e a t m e n t w i t h a n h y d r o u s l i q u i d a m m o n i a ( b u t n o t w i t h a m m o n i u m h y d r o x i d e ) . P u r i fi e d e n d o g l u c a n a s e I ( G l y c o s y l h y d r o l a s e o r C H f a m i l y 7 ) , i s o l a t e d f r o m T . r e e s e i , w a s f o u n d t o h a v e t w o - f o l d h i g h e r s p e c i fi c a c t i v i t y o n c e l l u l o s e 1 1 1 v e r s u s u n t r e a t e d c e l l u l o s e . C e l l u l o s e w i t h i n a m m o n i a t r e a t e d c e l l w a l l s ( A C W ) w a s m o r e r e a d i l y a c c e s s i b l e t o T . r e e s e i b a s e d c e l l o b i o h y d r o l a s e s ( G H 6 , 7 ) c o m p a r e d t o u n t r e a t e d c e l l w a l l s . F u r t h e r a d d i t i o n o f e n d o x y l a n a s e s ( G H 1 1 ) , B - x y l o s i d a s e ( G H 3 ) a n d a - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e ( G H 5 1 ) i n c r e a s e d b o t h g l u c a n a n d x y l a n d i g e s t i b i l i t y f o r A C W . F o u r t e e n c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e c r u d e e n z y m e s ( r a n g i n g i n d i v e r s e G H a c t i v i t i e s b a s e d o n p r o t e o m i c s a n a l y s i s ) w e r e o p t i m a l l y b l e n d e d , t o m a x i m i z e A C W d i g e s t i b i l i t y , u s i n g a h i g h - t h r o u g h p u t m i c r o a s s a y . T h e o p t i m a l b l e n d g a v e 9 0 % t o t a l s u g a r c o n v e r s i o n a t 2 - f o l d l o w e r e n z y m e l o a d i n g ( i . e . 1 6 . 5 m g / g g l u c a n ) c o m p a r e d t o c o m m e r c i a l c o c k t a i l s ( e . g . S p e z y m e C P + [ 3 G r i c h c o c k t a i l g a v e 5 0 % t o t a l s u g a r c o n v e r s i o n ) . I n s u m m a r y , f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I I I a l l o m o r p h c o u p l e d w i t h r a t i o n a l l y t a i l o r e d e n z y m e m i x t u r e s f o r a m m o n i a t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s c o u l d s i g n i fi c a n t l y r e d u c e c e l l u l o s i c e t h a n o l p r o d u c t i o n c o s t s . C O P Y R I G H T B Y S H I S H I R P . S . C H U N D A W A T 2 0 0 9 T h i s w o r k i s d e d i c a t e d t o t w o s p e c i a l w o m e n i n m y l i f e , m y m o t h e r a n d m y w i f e , w h o h a v e p r o v i d e d m e t h e i n s p i r a t i o n , s u p p o r t a n d c o u r a g e t o b e w h o I a m . A C K N O W L E D G E M E N T S F i r s t o f a l l , I w o u l d l i k e t o t h a n k m y a d v i s o r , D r . B r u c e D a l e , w h o m e n t o r e d m e a n d p r o v i d e d t h e p e r f e c t e n v i r o n m e n t f o r m e t o g r o w a s a n i n d e p e n d e n t r e s e a r c h e r . I a m a l s o g r a t e f u l t o h i m f o r h e l p i n g m e a d v a n c e m y p r o f e s s i o n a l c a r e e r b y p r o v i d i n g a m p l e o p p o r t u n i t i e s t o p r e s e n t m y r e s e a r c h fi n d i n g s a t v a r i o u s p r o f e s s i o n a l m e e t i n g s . T h i s p r o j e c t w a s f u n d e d b y M i c h i g a n S t a t e R e s e a r c h F o u n d a t i o n ( S P G g r a n t ) a n d D O E G r e a t L a k e s B i o e n e r g y R e s e a r c h C e n t e r ( D E - F C 0 2 - 0 7 E R 6 4 4 9 4 ) . I w o u l d l i k e t o t h a n k a l l m y c o m m i t t e e m e m b e r s , e s p e c i a l l y D r . D a n i e l J o n e s , D r . K e n n e t h K e e g s t r a a n d D r . J o n a t h a n W a l t o n f o r t h e i r b e n e v o l e n t g u i d a n c e a n d c o n s t r u c t i v e c r i t i c i s m s d u r i n g t h e c o u r s e o f m y d i s S e r t a t i o n . S p e c i a l t h a n k s t o D r . M a r k u s P a u l y , D r . D a n i e l J o n e s a n d D r . D e n n i s M i l l e r f o r p r o v i d i n g a c c e s s t o t h e i r l a b o r a t o r y e q u i p m e n t . I w o u l d l i k e t o g r a t e fi i l l y a c k n o w l e d g e t h e s u p p o r t a n d a c c e s s t o t h e T E M i m a g i n g r e l a t e d f a c i l i t i e s a t t h e N a t i o n a l R e n e w a b l e E n e r g y L a b o r a t o r y ( s p e c i a l t h a n k s t o B r y o n D o n o h o e a n d M i c h a e l H i m m e l a t C h e m i c a l a n d B i o s c i e n c e s C e n t e r ) . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k t h e s t a f f a t t h e C e n t e r o f A d v a n c e d M i c r o s c o p y ( E w a D a n i e l e w i c z , M e l i n d a F r a m e , S h i r l e y O w e n s ) f o r t h e i r h e l p a n d g u i d a n c e w h i l e u s i n g t h e S E M a n d c o n f o c a l m i c r o s c o p e s . S p e c i a l t h a n k s t o t h e s t a f f a t t h e C o m p o s i t e M a t e r i a l s a n d S t r u c t u r e s C e n t e r ( P e r A s k e l a n d ) f o r h e l p w i t h t h e E S E M , F T I R a n d E S C A i n s t r u m e n t a t i o n . T h a n k s t o T h o m a s E l d e r ( U S D A , L o u i s i a n a ) , U m e s h A g a r w a l ( U S D A , W i s c o n s i n ) a n d G e o r g e P h i l l i p s / C h r i s B i a n c h e t t i ( G L B R C , U W - M a d i s o n ) f o r c a r r y i n g o u t t h e A F M , R a m a n s p e c t r o s c o p y a n d X - R a y d i f f r a c t i o n a n a l y s i s , r e s p e c t i v e l y . P r o t e o m i c s a n a l y s i s w a s v i c a r r i e d o u t a t P a c i fi c N o r t h w e s t N a t i o n a l L a b o r a t o r y ( P N N L ) u n d e r t h e a e g i s o f M a r y L i p t o n a n d S a m u e l P u r v i n e . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k L e k h S h a n n a , K e v i n C h a m b l i s s ( B a y l o r U n i v e r s i t y ) a n d R a m i n V i s m e h f o r r u n n i n g s a m p l e s o n t h e L C - M S d u r i n g t h e c o u r s e o f m y d i s s e r t a t i o n . S p e c i a l t h a n k s t o P a u l C u r r a n , A l F r e n c h , M a r c i n N o w i c k i a n d L a r s P e e r e b o o m f o r t h e i r t i m e l y h e l p . L a s t b u t n o t t h e l e a s t , I g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e a l l m e m b e r s o f t h e B i o m a s s C o n v e r s i o n R e s e a r c h L a b ( B C R L ) w h o p r o v i d e d u s e f u l i n s i g h t s , c r i t i c i s m s a n d t e c h n i c a l s u p p o r t t o m y r e s e a r c h p r o j e c t . I w o u l d l i k e t o e s p e c i a l l y t h a n k D r . V e n k a t e s h B a l a n a n d L e o n a r d o S o u s a f o r b e i n g g r e a t c o l l e a g u e s , c o l l a b o r a t o r s a n d m e n t o r s w h e n i t m a t t e r e d m o s t . I a p p r e c i a t e i t v e r y m u c h ! I w o u l d a l s o l i k e t o e x t e n d m y g r a t i t u d e t o D a h a i G a o ( f o r h i s f e r v e n t o p t i m i s m ) , A d i t y a R a j a g o p a l a n ( f o r h i s e n t h u s i a s m ) , J a m e s H u m p u l a ( f o r a l l t h e b r e w e d , n o n - c e l l u l o s i c b e e r a m o n g m a n y o t h e r t h i n g s ) , N i r r n a l U p p u g u n d l a ( f o r t a k i n g s p e c i a l c a r e o f t h e d e v i l i s h l y u n p r e d i c t a b l e F P L C ) , D r . A l b e r t C h e ( f o r h i s i n t e l l e c t u a l l y s t i m u l a t i n g c o n v e r s a t i o n s ) a n d C h r i s t a G u n a w a n ( f o r h e r m e t i c u l o u s H P L C a n a l y s i s ) f o r a l l t h e s u p p o r t p r o v i d e d t o m e . T h i s w o r k w o u l d h a v e b e e n i n c o m p l e t e w i t h o u t h e l p f r o m a l l o f t h e a b o v e m e n t i o n e d p e r s o n n e l . I w o u l d l i k e t o fi n a l l y e x t e n d m y t h a n k s t o c l o s e f r i e n d s a n d r o o m m a t e s ( D e e p C , D e v e s h , M a d h u s u d h a n ) o v e r t h e y e a r s f o r m a k i n g m y s t a y a t M S U a t r u l y m e m o r a b l e o n e . F i n a l l y , I w o u l d l i k e t o t h a n k m y p a r e n t s ( K i s h a n , S u n i t a ) , c r a z y b r o t h e r ( A r p i t ) a n d l o v i n g w i f e ( T i t h i ) f o r t o l e r a t i n g m y h a b i t u a l i d i o s y n c r a s i e s . T h e y w e r e a l l m y s o u r c e o f i n s p i r a t i o n , j o y a n d l o v e t h a t h e l p e d m e s t e e r t h r o u g h t h i s a r d u o u s y e t e n j o y a b l e j o u r n e y i n g r a d u a t e s c h o o l . v i i T A B L E O F C O N T E N T S L I S T O F T A B L E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i i i L I S T O F F I G U R E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i x C H A P T E R 1 : I N T R O D U C T I O N 1 C H A P T E R 2 : L I T E R A T U R E R E V I E W 6 2 . 1 P L A N T C E L L W A L L S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2 . 1 . 1 M a j o r C o m p o n e n t s o f C e l l W a l l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2 . 1 . 2 C e l l W a l l A r c h i t e c t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2 . 2 T H E R M O C H E M I C A L P R E T R E A T M E N T S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 2 . 2 . 1 P h y s i c a l P r e t r e a t m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 2 . 2 . 2 S o l v e n t F r a c t i o n a t i o n B a s e d P r e t r e a t m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 2 . 2 . 2 . 1 O r g a n o s o l v p r o c e s s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 2 . 2 . 2 . 2 F r a c t i o n a t i o n u s i n g p h o s p h o r i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 2 . 2 . 2 . 3 I o n i c l i q u i d b a s e d f r a c t i o n a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 2 . 2 . 3 C h e m i c a l P r e t r e a t m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I 7 2 . 2 . 3 . 1 A c i d i c p r e t r e a t m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 2 . 2 . 3 . 2 A l k a l i n e p r e t r e a t m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 2 . 2 . 3 . 3 O x i d a t i v e p r e t r e a t m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 2 . 2 . 4 B i o l o g i c a l p r e t r e a t m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 2 . 3 E N Z Y M A T I C H Y D R O L Y S I S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 2 . 3 . 1 E n z y m e S y n e r g y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 2 . 3 . 1 . 1 E n d o - e x o b a s e d s y n e r g y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 2 . 3 . 1 . 2 H e m i c e l l u l a s e s a n d a c c e s s o r y e n z y m e b a s e d s y n e r g y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 2 . 3 . 1 . 3 H e m i c e l l u l a s e - c e l l u l a s e b a s e d s y n e r g y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 2 . 3 . 1 . 4 C e l l u l o s e b i n d i n g d o m a i n ( C B D ) b a s e d s y n e r g y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0 2 . 3 . 1 . 5 M u l t i - c a t a l y t i c d o m a i n s y n e r g y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 2 . 3 . 1 . 6 C e l l u l o s o m a l b a s e d s y n e r g y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 2 . 3 . 1 . 7 S y n e r g y d u e t o n o n - h y d r o l y t i c a d d i t i v e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 C H A P T E R 3 : P L A N T C E L L W A L L S U R F A C E T O P O G R A P H I C A L A N D C O M P O S I T I O N A L C H A N G E S A F T E R A M M O N I A B A S E D T R E A T M E N T S 3 3 3 . 1 . A M M O N I A P R E T R E A T M E N T S E V E R I T Y A N D S U B S T R A T E P A R T I C L E S I Z E I N F L U E N C E E X T E N T O F C E L L W A L L M O R P H O L O G I C A L C H A N G E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 3 . 1 . ] A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 3 . 1 . 2 B a c k g r o u n d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 3 . 1 . 2 . 1 G r o s s m o r p h o l o g y o f a m m o n i a t r e a t e d c e l l w a l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 3 . 1 . 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 3 . 1 . 4 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 3 . 1 . 4 . 1 M o d i fi c a t i o n o f e x t e r n a l c e l l w a l l m o r p h o l o g y d e p e n d s o n a m m o n i a p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 v i i i 3 . 1 . 4 . 2 E f f e c t o f b i o m a s s p a r t i c l e s i z e o n e x t r a c t i o n o f l i g n o - p h e n o l i c s d u r i n g A F E X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 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2 B a c k g r o u n d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 5 3 . 2 . 2 . 1 S u r f a c e c o m p o s i t i o n a l a n a l y s i s b y X - r a y p h o t o e l e c t r o n s p e c t r o s c o p y . . . . . 5 5 3 . 2 . 2 . 2 S u r f a c e t o p o g r a p h i c a l a n a l y s i s b y a t o m i c f o r c e m i c r o s c o p y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 5 3 . 2 . 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 6 3 . 2 . 4 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 6 3 . 2 . 4 . 1 O u t e r c e l l w a l l t o p o l o g y v i s u a l i z e d b y A F M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 6 3 . 2 . 4 . 2 O u t e r c e l l w a l l e l e m e n t a l c o m p o s i t i o n c h a r a c t e r i z e d b y E S C A . . . . . . . . . . . . . . . 6 1 C o n c l u s i o n s . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 0 C H A P T E R 4 : U L T R A S T R U C T U R A L M O D I F I C A T I O N S W I T H I N A M M O N I A T R E A T E D C E L L W A L L S A N D C R Y S T A L L I N E C E L L U L O S E 7 2 4 . 1 F O R M A T I O N O F P O R E S A N D D E L A M I N A T I O N Z O N E S W I T H I N A M M O N I A T R E A T E D C E L L W A L L S T H R O U G H D E L O C A L I Z A T I O N O F H E M I C E L L U L O S E A N D L I G N I N . . . . . . . . . . . . . . . . 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c l u s i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I 7 1 C H A P T E R 7 : M A X I M I Z I N G T O T A L S U G A R H Y D R O L Y T I C Y I E L D F O R A M M O N I A P R E T R E A T E D L I G N O C E L L U L O S I C S T H R O U G H C R U D E E N Z Y M E M I X T U R E O P T I M I Z A T I O N 1 7 3 7 . 1 . ] A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I 7 3 7 . 1 . 2 B a c k g r o u n d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 4 7 . 1 . 2 . 1 P r o t e i n c o m p o s i t i o n o f c r u d e c o m m e r c i a l e n z y m e m i x t u r e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 4 7 . 1 . 2 . 2 H y d r o l y s i s o f p r e t r e a t e d b i o m a s s u s i n g c o m m e r c i a l e n z y m e m i x t u r e s . 1 7 6 7 . 1 . 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 9 7 . 1 . 4 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 9 7 . 1 . 4 . 1 P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 9 7 . 1 . 4 . 2 P r o t e i n c o m p o s i t i o n e s t i m a t e d v i a p r o t e o m i c s a n d e n z y m e a c t i v i t y a s s a y s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 1 7 . 1 . 4 . 3 M a x i m i z i n g e n z y m e s y n e r g y u s i n g s i m p l e x c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l d e s i g n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 8 7 . 1 . 4 . 4 E i g h t - e n z y m e ( 8 c e - r e ) s i m p l e x c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l d e s i g n . . . . . . . . . . . . . . 2 0 1 7 . 1 . 4 . 5 T e n - e n z y m e ( 1 0 c e - r e ) s i m p l e x c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l d e s i g n . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 8 7 . 1 . 4 . 6 F i v e - e n z y m e ( 5 c e - r e ) s i m p l e x c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l d e s i g n . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 0 7 . 1 . 4 . 7 P r o t e i n c o m p o s i t i o n a n d h y d r o l y t i c p e r f o r m a n c e c o r r e l a t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 5 7 . 1 . 4 . 8 R o l e o f e n z y m e s y n e r g y f o r c e l l u l o s i c b i o r e f m e r i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 8 7 . 1 . 5 C o n c l u s i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 0 C H A P T E R 8 : A M M O N I A B A S E D P R E T R E A T M E N T S E N H A N C E S Y N E R G I S T I C H Y D R O L Y S I S O F C R Y S T A L L I N E C E L L U L O S E A N D L I G N O C E L L U L O S I C C E L L W A L L S T H R O U G H D I F F E R E N T M E C H A N I S M S 2 3 2 8 . 1 . 1 A b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 2 8 . 1 . 2 B a c k g r o u n d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 3 8 . 1 . 2 . 1 R o l e o f c e l l o b i o h y d r o l a s e s ( C B H ) a n d e n d o g l u c a n a s e s ( E G ) . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 3 8 . 1 . 2 . 2 R o l e o f e n d o - ( E X ) a n d e x o - x y l a n a s e s ( B X ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 7 8 . 1 . 2 . 3 R o l e o f a c c e s s o r y h e m i c e l l u l a s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 8 8 . 1 . 2 . 4 R o l e o f x y l o g l u c a n a s e s ( X G ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 8 8 . 1 . 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 0 8 . 1 . 4 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 0 8 . 1 . 4 . 1 E n z y m e p u r i fi c a t i o n a n d a c t i v i t y a s s a y s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 0 8 . 1 . 4 . 2 C o m p a r i n g h y d r o l y t i c a c t i v i t y o f c o r e c e l l u l a s e s o n c e l l u l o s e I v s . H I . . 2 4 2 8 . 1 . 4 . 3 S y n e r g i s m b e t w e e n c o r e c e l l u l a s e s o n u n t r e a t e d a n d c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 3 8 . 1 . 4 . 4 E f f e c t o f h e r r r i c e l l u l a s e s u p p l e m e n t a t i o n o n A F E X c o r n s t o v e r d i g e s t i b i l i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 5 8 . 1 . 5 C o n c l u s i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 0 C H A P T E R 9 : C O N C L U S I O N S A N D R E C O M M E N D A T I O N S F O R F U T U R E R E S E A R C H 2 6 2 A P P E N D I C E S 2 6 9 A P P E N D I X 1 - A ( C H A P T E R 3 . 1 - O U T E R W A L L M O R P H O L O G Y ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 0 A P P E N D I X 1 — B ( C H A P T E R 3 . 2 - S U R F A C E T O P O G R A P H Y - C O M P O S I T I O N ) . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 5 A P P E N D I X H — A ( C H A P T E R 4 . 1 - C E L L W A L L P O R O S I T Y ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 6 A P P E N D I X H — B ( C H A P T E R 4 . 2 - C E L L U L O S E I I I F O R M A T I O N ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 1 A P P E N D I X H I ( C H A P T E R 5 - D E G R A D A T I O N P R O D U C T S ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 3 A P P E N D I X I V ( C H A P T E R 6 - M I C R O P L A T E M E T H O D O L O G Y ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 4 A P P E N D I X V ( C H A P T E R 7 - C R U D E E N Z Y M E O P T I M I Z A T I O N ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 7 A P P E N D I X V I ( C H A P T E R 8 - P U R I F I E D E N Z Y M E S Y N E R G Y ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 8 A P P E N D I X V I I - M A T E R I A L S A N D E X P E R I M E N T A L M E T H O D S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 0 A - V 1 1 - 1 . B z o m a s s f e e d s t o c k 3 7 0 A - V I I - 2 . B i o m a s s c e n t r i fi x g a l m i l l i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 1 A - V I I - 3 . P a r t i c l e s i z e d i s t r i b u t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 1 A - V I I - 4 . A F E X p r e t r e a t m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 2 A - V I I - 5 . C o m p o s i t i o n a l a n a l y s i s o f s o l i d a n d l i q u i d s a m p l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 A - V I I - 6 . S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( S E M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 3 A - V I I - 7 . L a s e r c o n f o c a l s c a n n i n g fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y ( L C S M ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 4 A - V I I - 8 . A t o m i c f o r c e m i c r o s c o p y ( A F M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 4 x i A - V I I - 9 . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M a n d 3 D - t o m o g r a p h y ( 3 D - T o m o ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 5 A - V I I - 1 0 . C e l l w a l l i m m u n o l a b e l i n g - e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( I m m u n o - E l w . . . . . . . . . . . . . 3 7 6 A - V I I - 1 1 . D i l u t e a c i d p r e t r e a t m e n t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 6 A - V I I - 1 2 . N i t r o g e n p h y s i s o r p t i o n a n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 7 A - V I I — 1 3 . N e a r I n f r a - R e d C o m p o s i t i o n a l A n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 7 A - V I I - 1 4 . E l e c t r o n S p e c t r o s c o p y f o r C h e m i c a l A n a l y s i s ( E S C A ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 7 A - V I I - 1 5 . F o u r i e r T r a n s f o r m I n f r a - R e d S p e c t r o s c o p y ( F T I R ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 7 A - V I I - 1 6 . R a m a n S p e c t r o s c o p y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 8 A - V I I - I 7 . C e l l u l o s e I I , 1 1 1 a n d A m o r p h o u s C e l l u l o s e P r e p a r a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 8 A - V I I - 1 8 . P o w d e r X - R a y D t ' fi i ' a c t i o n ( 1 R D ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 9 A - V I I - 1 9 . S o l v e n t e x t r a c t i o n m e t h o d o l o g i e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7 9 A - V I I - Z O . G a s C h r o m a t o g r a p h y M a s s S p e c t r o m e t r y ( G C - M S ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 0 A - V I I - 2 1 . A m m o n o l y s i s B y - p r o d u c t A n a l y s i s b y L C - M S / M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 1 A - V I I - 2 2 . O t h e r D e g r a d a t i o n P r o d u c t A n a l y s i s b y L C - M S / M S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 1 A - V I I - 2 3 . H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) f o r S u g a r s . . . . . . . . . . . 3 8 4 A - V I I - 2 4 . M o d i f i e d P r u s s i a n B l u e M e t h o d ( W E ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 4 A - V I I - 2 5 . R o b o t i c D i s p e n s o r W o r k t a b l e S e t u p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 5 A - V I I - 2 6 . R e p r o d u c i b i l i t y o f S l u r r y D e l i v e r y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 6 A - V I I — 2 7 . M i c r o p l a t e H y d r o l y s i s P r o c e d u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 6 A - V I I - 2 8 . N R E L L A P - 9 E n z y m a t i c H y d r o l y s i s P r o t o c o l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . _ . . . . . . . . . . . . 3 8 8 A - V I I - 2 9 . B i o - e n z y m a t i c S u g a r A s s a y s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 8 A - V I I - 3 0 . M c r o p l a t e E v a p o r a t i o n L o s s e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 0 A - V I I - 3 1 . C o m m e r c i a l ( C E ) a n d R e s e a r c h ( R E ) E n z y m e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 1 A - V I I - 3 2 . S D S - P A G E a n d I s o e l e c t r i c G e l E l e c t r o p h o r e s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 1 A - V I I - 3 3 . E n z y m e A c t i v i t y A s s a y s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 2 A - V I I - 3 4 . P r o t e o m i c s A n a l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 3 A - V I I - 3 5 . S c h e f f é s i m p l e x - c e n t r o i d C E - R E e x p e r i m e n t a l d e s i g n a n d r e g r e s s i o n . . 3 9 4 A - V I I — 3 6 . S i m p l e x - c e n t r o i d d e s i g n f o r C E - R E c r u d e e n z y m e s y s t e m s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 5 A - V I I - 3 7 . H e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n o f A s p e r g i l l u s n i d u l a n s b a s e d fi - x y l o s i d a s e . . . 3 9 6 A - V I I - 3 8 . E n z y m e p u r i fi c a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 8 R E F E R E N C E S 3 9 9 x i i L I S T O F T A B L E S T a b l e 3 . A . l C o m p a r i s o n o f c e l l w a l l p e r i m e t e r ( L , u r n ) , a r e a e n c l o s e d w i t h i n l u m e n S p a c e ( A , u m z ) a n d i s o p e r i m e t r i c q u o t i e n t ( 4 1 t A / L 2 ) f o r u n t r e a t e d , c o n v e n t i o n a l A F E X ( R - A C S ) a n d h i g h l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g b a s e d A F E X ( H i g h - A C S ) t r e a t e d c o r n s t o v e r c e l l w a l l s . V a l u e s w i t h d i f f e r e n t a l p h a b e t i c a l s u p e r s c r i p t s i n a n i n d i v i d u a l c o l u m n w e r e s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t w i t h p < 0 . 0 5 b a s e d o n S t u d e n t t - t e s t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 8 T a b l e 3 . A . 2 C o m p o s i t i o n o f v a r i o u s p a r t i c l e s i z e f r a c t i o n s f r o m p r o - m i l l e d c o r n s t o v e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 T a b l e I - 3 . A . 3 C e l l w a l l p e r i m e t e r s ( L , u m ) , a r e a s e n c l o s e d w i t h i n l u m e n ( A , p m z ) a n d i s o p e r i m e t r i c q u o t i e n t s ( 4 1 r A / L 2 ) f o r u n t r e a t e d , r e g u l a r A F E X ( R - A C S ) a n d h i g h l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g b a s e d A F E X ( H i g h - A C S ) t r e a t e d c o r n s t o v e r c e l l w a l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 1 T a b l e 3 . B . l R M S ( r o o t m e a n s q u a r e ) r o u g h n e s s f a c t o r s f o r u n t r e a t e d ( U 1 - U 1 0 ) a n d c o n v e n t i o n a l A F E X ( R - A C S ; A l - A I O ) t r e a t e d c o r n s t o v e r A F M a m p l i t u d e i m a g e s . . . . . . 6 1 T a b l e 3 . B . 2 E S C A b a s e d a t o m i c c o m p o s i t i o n o f u n t r e a t e d ( U T ) a n d c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t e d ( A T ) c o r n s t o v e r f r a c t i o n s a n d s o m e m o d e l c o m p o u n d s ( T a b l e h a s b e e n p a r t l y r e p r o d u c e d f r o m [ 1 ] ) . N A s t a n d s f o r ‘ n o t a v a i l a b l e ’ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 5 T a b l e 3 . B . 3 E f f e c t o f w a t e r a n d s o l v e n t e x t r a c t i o n ( u s i n g N a O H , e t h a n o l a n d w a t e r ) o n A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r ( A C S ) s u r f a c e a t o m i c c o m p o s i t i o n a s c o m p a r e d t o u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ( C S ) . A l l e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d i n q u a d r u p l i c a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 9 T a b l e 4 . A . 1 V a r y i n g A F E X s e v e r i t y c o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 7 T a b l e 4 . A . 2 S u r f a c e a r e a ( S A ) t o v o l u m e ( V o l ) r a t i o s f o r i s o s u r f a c e m e s h e n c l o s i n g p o r o u s r e g i o n s w i t h i n T E M - 3 D - t o m o g r a m s o f v a r y i n g A F E X s e v e r i t y t r e a t e d c o r n s t o v e r c e l l w a l l s . W h e r e ; M : M i d d l e l a m e l l a , P : P r i m a r y w a l l , S 1 / 8 2 / S 3 : S e c o n d a r y w a l l s a n d d e l a m : D e l a m i n a t i o n z o n e s . S e e T a b l e 4 . A . 1 f o r d e s c r i p t i o n o f e a c h A F E X s e v e r i t y . . . . . 9 3 T a b l e 4 . B . l R e l a t i v e c h a n g e i n t h e a m o u n t o f c r y s t a l l i n e p o l y m o r p h s ( w i t h / w i t h o u t c h e m i c a l t r e a t m e n t ) p r e s e n t i n A v i c e l ( A V ) , c o t t o n l i n t e r s ( L I N T ) a n d n a t i v e c o t t o n ( C O T ) b a s e d o n X R D s p e c t r a p e a k i n t e n s i t i e s ( 1 2 9 ) a t r e s p e c t i v e 2 - t h e t a a n g l e s ( e . g . 2 0 = 1 2 , 1 8 , 2 0 , 2 2 ) . W h e r e f o r i n s t a n c e ; P k ( 1 8 / 2 2 ) = 1 — ( 1 1 3 / 1 2 2 ) ; % A ( 1 8 / 2 2 ) u n k n o w n = 1 0 0 * [ P k ( 1 8 / 2 2 ) ] u n k n o w n / [ P k ( 1 8 / 2 2 ) ] c o m m l a n d c o n t r o l d e p e n d s o n s u b s t r a t e t y p e ( A V - I o r L I N T - I o r C O T - I ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 6 T a b l e 4 . B . 2 R e l a t i v e c h a n g e i n t h e a m o u n t o f c r y s t a l l i n e p o l y m o r p h s p r e s e n t i n A v i c e l ( A V ) , w i t h o r w i t h o u t A F E X t r e a t m e n t ( N = a m m o n i a l o a d i n g a n d W = w a t e r l o a d i n g , w / w b a s i s ) b a s e d o n X R D s p e c t r a p e a k i n t e n s i t i e s ( 1 2 9 ) a t r e s p e c t i v e 2 - t h e t a a n g l e s ( e . g . 2 0 = 1 2 , 1 8 , 2 0 , 2 2 ) . W h e r e f o r i n s t a n c e ; P k ( 1 8 / 2 2 ) = 1 — ( 1 1 3 / 1 2 2 ) a n d % A ( 1 8 / 2 2 ) u n k n o w n = 1 0 0 * [ P k ( 1 8 / 2 2 ) l u n k n o w n / [ P k ( 1 8 / 2 2 ) ] A V _ 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 6 x i i i T a b l e 4 . B . 3 R e l a t i v e c h a n g e i n t h e a m o u n t o f c r y s t a l l i n e p o l y m o r p h s p r e s e n t i n A v i c e l ( A V ) , w i t h o r w i t h o u t A F E X t r e a t m e n t ( N = a m m o n i a l o a d i n g a n d W = w a t e r l o a d i n g , w / w b a s i s ) b a s e d o n R a m a n s p e c t r a l p e a k i n t e n s i t i e s ( I w a v e n u m b e r ) a t r e s p e c t i v e w a v e n u m b e r s ( e . g . 3 8 0 a n d 3 5 0 ; c m - 1 ) . W h e r e f o r i n s t a n c e ; P k ( 3 8 0 / 3 5 0 ) = 1 - ( 3 8 0 / 3 5 0 ) ] A V - I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 8 T a b l e 5 . 1 T o t a l w a t e r e x t r a c t i b l e s f o r u n t r e a t e d , A F E X a n d d i l u t e a c i d t r e a t e d c o r n s t o v e r c o m p a r e d t o t h e i r r e s p e c t i v e g l u c a n h y d r o l y s i s y i e l d s ( 2 4 h o u r s h y d r o l y s i s t i m e , 1 5 F P U S p e z y m e / g g l u c a n s u p p l e m e n t e d w i t h N o v o 1 8 8 ) . A l l w a t e r e x t r a c t i o n s w e r e d o n e u s i n g t h e A S E ( s e e m e t h o d s s e c t i o n f o r d e t a i l s ) a t 7 0 0 C , 1 5 0 0 p s i ( e x c e p t A c i d t r e a t e d " t h a t w a s e x t r a c t e d a t 2 5 ° C , 1 5 p s i ) . S e e T a b l e 4 . A . 1 f o r d e s c r i p t i o n o f e a c h A F E X s e v e r i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 8 T a b l e 5 . 2 S i x m a j o r a m m o n o l y s i s a n d h y d r o l y s i s b y - p r o d u c t s ( m g a n a l y t e p e r g m u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ) o f a c e t y l , c o u m a r o y l a n d f e r u l o y l b a s e d e s t e r l i n k a g e s p r o d u c e d d u r i n g A F E X a n d d i l u t e a c i d p r e t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r . S e e T a b l e 4 . A . 1 f o r d e s c r i p t i o n o f e a c h A F E X s e v e r i t y . N A — n o t a p p l i c a b l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 9 T a b l e 5 . 3 M a s s b a l a n c e s f o r m a j o r d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( m g a n a l y t e p e r g m u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ) p r o d u c e d d u r i n g A F E X ( f o r R e g u l a r a n d H i g h - N t s e v e r i t i e s ) a n d d i l u t e a c i d b a s e d p r e t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r b a s e d o n G C M S ( * ) , H P L C - M S / M S ( a m m o n o l y s i s * * b a s e d ) a n d H P L C - R I ( * * * ) a n a l y s e s . S e e T a b l e 4 . A . 1 f o r d e s c r i p t i o n o f e a c h A F E X s e v e r i t y . W h e r e ; N D a n d N A s t a n d f o r n o t d e t e c t e d a n d n o t a v a i l a b l e , r e s p e c t i v e l y . . . . . 1 3 2 T a b l e I I I - 5 . 4 T o t a l n i t r o g e n c o n t e n t ( m e a s u r e d b y K j e l d a h l m e t h o d a s g r a m s N i t r o g e n p e r 1 0 0 g r a m s s u b s t r a t e ) o f u n t r e a t e d a n d v a r y i n g A F E X s e v e r i t y t r e a t e d c e l l u l o s i c b i o m a s s . T h e s u r f a c e a t o m i c c o m p o s i t i o n o f t h e s u b s t r a t e s w a s e s t i m a t e d b y E S C A . W h e r e ; L ( l o w ) a n d H ( h i g h ) s t a n d f o r v a r y i n g A F E X t r e a t m e n t s e v e r i t i e s . A F E X - L w a s c a r r i e d i n t h e H T - A F E X r e a c t o r a t 9 0 0 C , 1 : 1 , 1 5 m i n s , 6 0 % m o i s t u r e . A F E X - H w a s c a r r i e d i n t h e H T - A F E X r e a c t o r a t 1 3 0 ° C , 3 : 1 , 1 5 m i n s , 6 0 % m o i s t u r e . M e t O H ( m e t h a n o l ) e x t r a c t i o n w a s c a r r i e d o u t a t 5 0 ° C ( 1 5 p s i ) f o r 4 3 h o u r s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 3 T a b l e 6 . 1 E f f e c t o f m a s s t r a n s f e r r e l a t e d p a r a m e t e r s ( i . e . r e a c t i o n v o l u m e , s o l i d s l o a d i n g , a g i t a t i o n s p e e d a n d m i x i n g a i d ) o n A v i c e l d i g e s t i b i l i t y f o r ( A ) 0 . 7 5 m l , a n d ( B ) 0 . 2 5 m l b a s e d r e a c t i o n v o l u m e s . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d f r o m [ 2 ] ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 1 T a b l e 7 . 1 - A P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n a s s a y d a t a f o r 1 4 c r u d e e n z y m e b l e n d s u s i n g t h r e e a n a l y t i c a l m e t h o d s ( P i e r c e B C A , B r a d f o r d a n d K j e l d a h l P r o t e i n b a s e d a s s a y s ) . . . . . . . . . . 1 8 0 T a b l e 7 . 1 - B A c t i v i t y a s s a y d a t a f o r 1 4 c r u d e e n z y m e b l e n d s o n p N P G , p N P A f , p N P A , p N P X , O S X , A v i c e l a n d C M C . O n e u n i t o f a c t i v i t y o n p N P b a s e d s u b s t r a t e s i s e q u i v a l e n t t o o n e m n o l o f p N P ( p - n i t r o p h e n o l ) r e l e a s e d / m g e n z y m e / m i n . O n e u n i t o f a c t i v i t y o n A v i c e l / X y l a n / C M C i s e q u i v a l e n t t o o n e H M g l u c o s e e q u i v a l e n t r e l e a s e d / m g e n z y m e / m i n . W h e r e ; “ - “ s t a n d s f o r n o d e t e c t a b l e a c t i v i t y ; p N P G ( p N P - B - D - g l u c o p y r a n o s i d e ) ; p N P A f x i v ( p N P - a - L - a r a b i n o f u r a n o s i d e ) ; p N P A ( p N P - a c e t a t e ) ; p N P X ( p N P - B - D - x y I O p y r a n o s i d e ) ; O S X ( O a t S p e l t x y l a n ) , C M C ( C a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 2 T a b l e 7 . 2 P r o t e o m i c s b a s e d p r o t e i n c o m p o s i t i o n a l d a t a f o r 1 4 c r u d e e n z y m e b l e n d s b a s e d o n t o t a l o b s e r v e d s p e c t r a l c o u n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 7 T a b l e V - 7 . 3 P e p t i d e I D a n d o b s e r v e d S p e c t r a l c o u n t s f o r e a c h f a m i l y o f p r o t e i n s f o r C E 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 5 T a b l e 7 . 4 D e s i g n o f e x p e r i m e n t s f o r r a n g e o f v a r y i n g c r u d e e n z y m e m i x t u r e c o m p o s i t i o n ( b a s e d o n fi x e d t o t a l p r o t e i n l o a d i n g o f 1 6 . 5 m g / g g l u c a n e q u i v a l e n t t o 1 0 0 % ) t h a t w e r e t e s t e d o n A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 5 T a b l e 7 . 5 E s t i m a t e d r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t s f o r m o d e l t e r m s ( s i n g l e , b i n a r y a n d c u b i c b a s e d i n t e r a c t i o n t e r m s ) p r e d i c t i n g % g l u c a n c o n v e r s i o n , % x y l a n c o n v e r s i o n a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( g m s u g a r / k g d r y w e i g h t b i o m a s s ) a s a f u n c t i o n o f c r u d e e n z y m e m i x t u r e ' a m o u n t c o m p o s i t i o n f o r 8 C E - R E b a s e d e x p e r i m e n t s . T h e s u m o f t o t a l e n z y m e l o a d i n g i s a l w a y s e q u a l t o 8 m g p r o t e i n / g g l u c a n . A l l e n z y m e m i x t u r e s h a v e a fi x e d l o a d i n g o f 8 . 5 m g C E 6 / g g l u c a n , w h i c h i s n o t i n c l u d e d a s a r e g r e s s o r i n t h e m o d e l . W h e r e ; V I F = v a r i a n c e i n fl a t i o n f a c t o r , P R E S S = p r e d i c t i o n e r r o r s u m o f s q u a r e s , S = fi r s t s t a n d a r d d e v i a t i o n o f r e s i d u a l s , R - S q ( p r e d ) = p r e d i c t e d R 2 ( c o e f fi c i e n t o f d e t e r m i n a t i o n ) ; R - S q ( a d j ) = a d j u s t e d R 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 2 T a b l e V - 7 . 6 E s t i m a t e d r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t s f o r m o d e l t e r m s ( s i n g l e , b i n a r y a n d c u b i c b a s e d i n t e r a c t i o n t e r m s ) p r e d i c t i n g % g l u c a n c o n v e r s i o n , % x y l a n c o n v e r s i o n a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( g m s u g a r / k g d r y w e i g h t b i o m a s s ) a s a fi m c t i o n o f c r u d e e n z y m e m i x t u r e a m o u n t c o m p o s i t i o n f o r 1 0 C E - R E b a s e d e x p e r i m e n t s . T h e s u m o f t o t a l e n z y m e l o a d i n g i s a l w a y s e q u a l t o 1 6 . 5 m g p r o t e i n / g g l u c a n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 0 T a b l e 7 . 7 E s t i m a t e d r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t s f o r m o d e l t e r m s ( S i n g l e , b i n a r y a n d c u b i c b a s e d i n t e r a c t i o n t e r m s ) p r e d i c t i n g % g l u c a n c o n v e r s i o n , % x y l a n c o n v e r s i o n a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( g m s u g a r / k g d r y w e i g h t b i o m a s s ) a s a fi m c t i o n o f c r u d e e n z y m e m i x t u r e a m o u n t c o m p o s i t i o n f o r 5 C E - R E ( C e l x i s C E 1 ) b a s e d e x p e r i m e n t s . T h e s u m o f t o t a l e n z y m e l o a d i n g i s a l w a y s e q u a l t o 1 6 . 5 m g p r o t e i n / g g l u c a n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 1 T a b l e V - 7 . 8 E s t i m a t e d r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t s f o r m o d e l t e r m s ( s i n g l e , b i n a r y a n d c u b i c b a s e d i n t e r a c t i o n t e r m s ) p r e d i c t i n g % g l u c a n c o n v e r s i o n , % x y l a n c o n v e r s i o n a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( g m s u g a r / k g d r y w e i g h t b i o m a s s ) a s a fi r n c t i o n o f c r u d e e n z y m e m i x t u r e a m o u n t c o m p o s i t i o n f o r 5 C E — R E ( C e l x i s C E 6 ) b a s e d e x p e r i m e n t s . T h e s u m o f t o t a l e n z y m e l o a d i n g i s a l w a y s e q u a l t o 1 6 . 5 m g p r o t e i n / g g l u c a n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 6 T a b l e V - 7 . 9 E s t i m a t e d r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t s f o r m o d e l t e r m s ( s i n g l e , b i n a r y a n d c u b i c b a s e d i n t e r a c t i o n t e r m s ) p r e d i c t i n g % g l u c a n c o n v e r s i o n , % x y l a n c o n v e r s i o n a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( g m s u g a r / k g d r y w e i g h t b i o m a s s ) a s a fi r n c t i o n o f c r u d e e n z y m e m i x t u r e a m o u n t c o m p o s i t i o n f o r 5 C E - R E ( C e l x i s R E 4 ) b a s e d e x p e r i m e n t s . T h e s u m o f t o t a l e n z y m e l o a d i n g i s a l w a y s e q u a l t o 1 6 . 5 m g p r o t e i n / g g l u c a n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 7 X V T a b l e V - 7 . 1 0 B i v a r i a t e c o r r e l a t i o n P e a r s o n c o e f fi c i e n t s f o r i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o n e n t s o f v a r i o u s e n z y m e m i x t u r e s ( N = 7 5 3 ) w i t h r e s p e c t t o t h e i r p r e d i c t e d % g l u c a n , % x y l a n a n d t o t a l s u g a r h y d r o l y s i s y i e l d s . V a l u e s h i g h l i g h t e d i n b o l d s i g n i f y l a c k o f s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e a t p < 0 . 0 5 l e v e l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 8 T a b l e V - 7 . l l P e a r s o n c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s f o r i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o n e n t s o f v a r i o u s e n z y m e m i x t u r e s w i t h r e s p e c t t o e a c h o t h e r w i t h i n t h e o r i g i n a l 1 4 e n z y m e m i x t u r e s . V a l u e s h i g h l i g h t e d s i g n i f y s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e a t p < 0 . 0 1 a n d p < 0 . 0 5 l e v e l s , r e s p e c t i v e l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 9 T a b l e V - 7 . 1 2 A N O V A r e s u l t s c o m p a r i n g t o p a n d b o t t o m 2 5 % q u a r t i l e g r o u p s f o r i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o n e n t s , b a s e d o n v a r y i n g % g l u c a n , % x y l a n a n d t o t a l s u g a r h y d r o l y s i s y i e l d . V a l u e s h i g h l i g h t e d i n b o l d s i g n i f y s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e a t p < 0 . 0 5 l e v e l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 7 T a b l e 7 . 1 3 - A D e s c r i p t i v e s t a t i s t i c s ( m i n i m a , m a x i m a , m e a n , s t a n d a r d d e v i a t i o n ) c o m p a r i n g t o p a n d b o t t o m 2 5 % q u a r t i l e g r o u p s f o r i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o n e n t s , b a s e d o n v a r y i n g % g l u c a n c o n v e r s i o n . V a l u e s h i g h l i g h t e d i n b o l d s i g n i f y s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e a t p < 0 . 0 5 l e v e l ( b a s e d o n T a b l e 7 . 1 2 ) , w h e r e a s v a l u e s h i g h l i g h t e d i n r e d s i g n i f y i n c r e a s e i n c o r r e s p o n d i n g p r o t e i n c o m p o n e n t i n t o p 2 5 % q u a r t i l e w i t h r e s p e c t t o b o t t o m q u a r t i l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 8 T a b l e 7 . 1 3 — B D e s c r i p t i v e s t a t i s t i c s ( m i n i m a , m a x i m a , m e a n , s t a n d a r d d e v i a t i o n ) * c o m p a r i n g t o p a n d b o t t o m 2 5 % q u a r t i l e g r o u p s f o r i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o n e n t s , b a s e d o n v a r y i n g % x y l a n c o n v e r s i o n . V a l u e s h i g h l i g h t e d i n b o l d s i g n i f y s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e a t p < 0 . 0 5 l e v e l ( b a s e d o n T a b l e 7 . 1 2 ) , w h e r e a s v a l u e s h i g h l i g h t e d i n r e d s i g n i f y i n c r e a s e i n c o r r e s p o n d i n g p r o t e i n c o m p o n e n t i n t o p 2 5 % q u a r t i l e w i t h r e s p e c t t o b o t t o m q u a r t i l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 1 T a b l e 7 . 1 3 - C D e s c r i p t i v e s t a t i s t i c s ( m i n i m a , m a x i m a , m e a n , s t a n d a r d d e v i a t i o n ) c o m p a r i n g t o p a n d b o t t o m 2 5 % q u a r t i l e g r o u p s f o r i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o n e n t s , b a s e d o n v a r y i n g t o t a l s u g a r h y d r o l y s i s y i e l d . V a l u e s h i g h l i g h t e d i n b o l d s i g n i f y s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e a t p < 0 . 0 5 l e v e l ( b a s e d o n T a b l e 7 . 1 2 ) , w h e r e a s v a l u e s h i g h l i g h t e d i n r e d s i g n i f y i n c r e a s e i n c o r r e s p o n d i n g p r o t e i n c o m p o n e n t i n t o p 2 5 % q u a r t i l e w i t h r e s p e c t t o b o t t o m q u a r t i l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 5 T a b l e V - 7 . l 4 C o m p a r i n g i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o s i t i o n o f C E 1 , C E 4 t o e n z y m e m i x t u r e s t h a t g a v e t h e t o p 5 % ( N = 7 5 5 ) r e s p o n s e f o r g l u c a n , x y l a n a n d t o t a l s u g a r h y d r o l y s i s y i e l d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3 8 T a b l e V - 7 . 1 5 R a w d a t a f o r % g l u c a n , % x y l a n a n d t o t a l s u g a r h y d r o l y s i s y i e l d f o r a l l e n z y m e m i x t u r e s t e s t e d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 1 T a b l e 8 . ] E n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f u n t r e a t e d ( c e l l u l o s e I , U A V ) a n d l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d ( c e l l u l o s e I I I , A A V ) A v i c e l b y v a r y i n g l o a d i n g s ( a s m g e n z y m e / g g l u c a n ) o f c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H I I , E G 1 , B G ) r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f g l u c o s e a n d c e l l o b i o s e . W h e r e ; % G a n d % G 2 s t a n d f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n b a s e d o n g l u c o s e a n d x v i c e l l o b i o s e y i e l d s , r e s p e c t i v e l y . C o m m e r c i a l e n z y m e ( C E ) c o n t r o l c o m p r i s e d o f S p e z y m e C P a n d N o v o 1 8 8 a t 1 5 m g / g g l u c a n l o a d i n g e a c h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 4 T a b l e 8 . 2 E n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f u n t r e a t e d ( c e l l u l o s e I , U A V ) a n d l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d ( c e l l u l o s e I I I , A A V ) A v i c e l b y v a r y i n g l o a d i n g s ( a s m g e n z y m e / g g l u c a n ) o f c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H I I , E G 1 ) r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f g l u c o s e a n d c e l l o b i o s e . W h e r e ; % G a n d % G 2 s t a n d f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n b a s e d o n g l u c o s e a n d c e l l o b i o s e y i e l d s , r e s p e c t i v e l y . C o m m e r c i a l e n z y m e ( C E ) c o n t r o l c o m p r i s e d o f S p e z y m e C P a n d N o v o 1 8 8 a t 1 5 m g / g g l u c a n l o a d i n g e a c h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 5 T a b l e 8 . 3 E n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f u n t r e a t e d ( U C S ) a n d c o n v e n t i o n a l A F E X ( A C S ) t r e a t e d c o r n s t o v e r b y v a r y i n g l o a d i n g s ( a s m g e n z y m e / g g l u c a n ) o f c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H H , E G I , B G ) r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f g l u c o s e a n d c e l l o b i o s e . W h e r e ; % G a n d % G 2 s t a n d f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n b a s e d o n g l u c o s e a n d c e l l o b i o s e y i e l d s , r e s p e c t i v e l y . C o m m e r c i a l e n z y m e ( C E ) c o n t r o l c o m p r i s e d o f S p e z y m e C P a n d N o v o 1 8 8 a t 1 5 m g / g g l u c a n l o a d i n g e a c h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 6 T a b l e 8 . 4 E n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f u n t r e a t e d ( U C S ) a n d c o n v e n t i o n a l A F E X ( A C S ) t r e a t e d c o r n s t o v e r b y v a r y i n g l o a d i n g s ( a s m g e n z y m e / g g l u c a n ) o f c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H I I , E G I ) r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f g l u c o s e a n d c e l l o b i o s e . W h e r e ; % G a n d % G 2 s t a n d f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n b a s e d o n g l u c o s e a n d c e l l o b i o s e y i e l d s , r e s p e c t i v e l y . C o m m e r c i a l e n z y m e ( C E ) c o n t r o l c o m p r i s e d o f S p e z y m e C P a n d N o v o 1 8 8 a t 1 5 m g / g g l u c a n l o a d i n g e a c h . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 7 T a b l e V I - 8 . 5 G l u c a n ( % G ) 2 4 h o u r h y d r o l y s i s y i e l d s f o r u n t r e a t e d a v i c e l ( U A V ) , l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d A v i c e l ( A A V ) , u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ( U C S ) a n d A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r ( A C S ) b y v a r y i n g c e l l u l a s e ( C B H I , C B H I I , E G I ) c o m b i n a t i o n s ( m g e n z y m e / g g l u c a n ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 8 T a b l e 8 . 6 R e g r e s s i o n m o d e l p r e d i c t i n g % g l u c a n ( % G ) d i g e s t i b i l i t y f o r u n t r e a t e d A v i c e l ( U A V ) , l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d A v i c e l ( A A V ) , u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ( U C S ) a n d A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r ( A C S ) a s a f u n c t i o n o f v a r y i n g c e l l u l a s e l o a d i n g ( C B H I , C B H H a n d E G 1 ; t o t a l p r o t e i n l o a d i n g i s 1 5 m g / g g l u c a n ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4 8 T a b l e V I - 8 . 7 G l u c a n ( % G ) a n d x y l a n ( % X ) 2 4 h o u r h y d r o l y s i s y i e l d s f o r A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r b y v a r y i n g e n z y m e ( C B H I , C B H I I , E G I , E X , B X ) c o m b i n a t i o n s ( m g e n z y m e / g g l u c a n ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 6 9 T a b l e 8 . 8 G l u c a n a n d x y l a n s a c c h a r i fi c a t i o n y i e l d s ( 2 4 h o u r s ) f o r A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r b y c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H I I , E G I ; a t fi x e d r e l a t i v e a n d t o t a l p r o t e i n l o a d i n g ) a n d h e m i c e l l u l a s e ( o r - a r a b i n o fi r r a n o s i d a s e o r A e r , E X , B - X ; v a r y i n g r e l a t i v e p r o t e i n l o a d i n g s ) c o m b i n a t i o n s ( a s m g e n z y m e / g g l u c a n ) f o r fi x e d t o t a l p r o t e i n l o a d i n g o f 1 6 . 5 m g / g g l u c a n . [ 3 G l o a d i n g w a s fi x e d a t 1 . 5 m g / g g l u c a n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 1 x v i i T a b l e 8 . 9 R e g r e s s i o n m o d e l ( b a s e d o n d a t a f r o m T a b l e 8 . 8 ) p r e d i c t i n g % x y l a n ( % X ) d i g e s t i b i l i t y f o r A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r ( A C S ) a s a f u n c t i o n o f h e m i c e l l u l a s e l o a d i n g ( E X , B X , A e r a s m g / g g l u c a n ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5 9 x v i i i L I S T O F F I G U R E S I m a g e s i n t h i s d i s s e r t a t i o n a r e p r e s e n t e d i n c o l o r F i g u r e 2 . 1 C a r t o o n d e p i c t i n g g r a s s c e l l w a l l u l t r a - s t r u c t u r a l c o m p o n e n t s a s a n i n t e r t w i n e d m a t r i x o f c e l l u l o s e , h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n . C r y s t a l l i n e ( s t r a i g h t , p a r a l l e l l i n e s ) a n d a m o r p h o u s c e l l u l o s e ( c u r v e d , w a v y l i n e s ) m i c r o fi b r i l s a r e c o m p o s e d o f B - 1 , 4 l i n k e d g l u c a n c h a i n s . H e m i c e l l u l o s e ( t h i c k , s h o r t l i n e s ) w i t h n o s i d e - c h a i n s i s h y d r o g e n - b o n d e d t o c e l l u l o s e , w h i l e b r a n c h e s w i t h s i d e — c h a i n s ( o f a r a b i n o s y l , a c e t y l , g l u c u r o n y l g r o u p s s h o w n a s c i r c l e s a n d s q u a r e s ) h e l p i n c r o s s - l i n k i n g c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s . L i g n i n c a r b o h y d r a t e c o m p l e x e s ( b e t w e e n a r a b i n o s e a n d f e r u l i c / c o u m a r i c a c i d s ) f u r t h e r r e s t r i c t a c c e s s o f e n z y m e s t o c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s . C r o s s - l i n k e d l i g n i n m o n o m e r s ( c o n s i s t i n g o f h y d r o x y p h e n y l , s y r i n g y l , g u a i c y l u n i t s ) c o n s t i t u t e t h e c o r e - l i g n i n f r a c t i o n . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d f r o m [ 3 ] ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 F i g u r e 3 . A . l S E M m i c r o g r a p h s o f u n t r e a t e d ( 1 ) , c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t e d ( H ) a n d h i g h l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g b a s e d A F E X t r e a t e d ( 1 1 1 ) c o m s t o v e r a t v a r y i n g d e g r e e s o f m a g n i fi c a t i o n ( S c a l e b a r s s h o w n a t t h e b o t t o m o f e a c h i m a g e ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 F i g u r e 3 . A . 2 L S C M m a x i m u m i n t e n s i t y p r o j e c t i o n i m a g e s o f u n t r e a t e d ( A ) a n d h i g h l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g b a s e d A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r ( B ) v a s c u l a r b u n d l e s s t a i n e d w i t h S a f r a n i n . S a m p l e s e c t i o n s w e r e e x c i t e d w i t h 5 4 3 n m a n d e m i s s i o n w a s d e t e c t e d t h r o u g h L P 5 6 0 n m e m i s s i o n fi l t e r ( fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y s h o w n i n g r e e n ) . I m a g e ( A ) a n d ( B ) a r e p r o j e c t i o n i m a g e s c o m p i l e d f r o m 2 0 a n d 1 5 o p t i c a l s e c t i o n s r e p r e s e n t i n g a t h i c k n e s s o f 1 2 2 a n d 9 0 u r n s , r e s p e c t i v e l y . P l a n - N e o fl u a r 1 0 X / 0 . 3 o b j e c t i v e w a s u s e d t o o b t a i n t h e i m a g e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 0 F i g u r e 3 . A . 3 ( a ) P h e n o l i c c o n t e n t o f A F E X t r e a t e d a n d u n t r e a t e d c o r n s t o v e r w a s h s t r e a m s ; U n t r e a t e d s t o v e r % g a l l i c a c i d ( e m p t y b a r s ) , U n t r e a t e d s t o v e r % f e r u l i c a c i d ( d o t fi l l e d b a r s ) , A F E X t r e a t e d s t o v e r % g a l l i c a c i d ( h o r i z o n t a l l i n e fi l l e d b a r s ) , a n d A F E X t r e a t e d s t o v e r % f e r u l i c a c i d ( s l a n t e d l i n e fi l l e d b a r s ) . ( b ) F e r u l i c a c i d c o n t e n t o f w a s h s t r e a m a f t e r s i n g l e w a s h ( U U - l W : U n c u t c o r n s t o v e r = > U n t r e a t e d = > S i n g l e W a s h a n d U A G - l W ( U n c u t P M c o r n s t o v e r = > A F E X = > G r o u n d t o 0 . 0 8 m m = > S i n g l e w a s h ) , m u l t i p l e w a s h ( U A G - 3 W : U n c u t c o r n s t o v e r = > A F E X = > G r o u n d t o 0 . 0 8 m m = > W a s h e d t h r e e t i m e s ) a n d a fi e r s i z e r e d u c t i o n ( G A - 1 W : G r o u n d t o 0 . 0 8 m m = > A F E X = > S i n g l e w a s h ) . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d f r o m [ 1 ] ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 0 F i g u r e 3 . A . 4 E f f e c t o f s i z e r e d u c t i o n a n d w a t e r w a s h i n g o f A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r o n 7 2 h o u r g l u c a n ( l e f t b a r , b l a c k ) a n d x y l a n ( r i g h t b a r , g r e y ) c o n v e r s i o n s . ( A b b r e v i a t i o n s : - U - G B A : U n w a s h e d g r o u n d b e f o r e A F E X , W - G B A : W a s h e d g r o u n d b e f o r e A F E X , U - G A A : U n w a s h e d g r o u n d a f t e r A F E X , W - G A A : W a s h e d g r o u n d a f t e r A F E X ) . T h e s t a n d a r d e r r o r b a r s a r e b a s e d o n d u p l i c a t e s . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d f r o m [ 1 ] ) . . . . . . . . 5 1 F i g u r e l - 3 . A . 5 ( A ) P i c t u r e s h o w i n g v a r i o u s p a r t s o f c o r n p l a n t a n d t h e i r m a s s d i s t r i b u t i o n s a r e s h o w n a s p i e c h a r t i n t h e b o t t o m l e f t . ( B ) P i c t u r e s s h o w i n g v a r i o u s f r a c t i o n s f o r g r o u n d s a m p l e . P e r c e n t m a s s d i s t r i b u t i o n s o f v a r i o u s p a r t i c l e s i z e f r a c t i o n s x i x f o r p r e - m i l l e d ( P M * ) a n d g r o u n d c o r n s t o v e r a r e s h o w n a s p i e c h a r t i n t h e b o t t o m r i g h t . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d f r o m [ 1 ] ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 0 F i g u r e 3 . B . 1 A F M a m p l i t u d e i m a g e s o f u n t r e a t e d ( A , t o p r o w ) a n d c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t e d ( B , b o t t o m r o w ) c o r n s t o v e r a t v a r y i n g d e g r e e s o f m a g n i fi c a t i o n ( A l l s c a l e b a r s r e p r e s e n t a l e n g t h s c a l e = 5 0 0 n m ) . C o l o r l e g e n d ( d a r k t o l i g h t S h a d e s ) d e p i c t s t h e a m p l i t u d e c u r r e n t s c a l e ( V , v o l t s ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 9 F i g u r e l - 3 . B . 2 U n t r e a t e d ( U l - U l O ; p a n e l I ) a n d c o n v e n t i o n a l A F E X ( A l - A 1 0 ; p a n e l 1 1 ) t r e a t e d c o r n s t o v e r A F M a m p l i t u d e ( l e f t ) a n d p h a s e ( r i g h t ) i m a g e d a t a s e t ( i m a g e s i z e i s 2 . 5 x 2 . 5 m 2 ) . B o x - p l o t o f s u r f a c e r o u g h n e s s f a c t o r s ( n m ) a l o n g w i t h d a t a p o i n t s s c a t t e r ( N = 1 0 p e r s e t ) f o r u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d a m p l i t u d e i m a g e d a t a s e t f r o m p a n e l s I - I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 5 F i g u r e 3 . B . 3 E f f e c t o f s i z e r e d u c t i o n b e f o r e a n d a f t e r A F E X p r e t r e a t m e n t o n o x y g e n t o c a r b o n ( O / C , b a r s - l e f t a x i s ) s u r f a c e a t o m i c c o m p o s i t i o n v e r s u s % p h e n o l i c a c i d e q u i v a l e n t w a t e r e x t r a c t i b l e s ( l i n e - r i g h t a x i s ) . W h e r e ; G C S : G r o u n d c o r n s t o v e r ( u n t r e a t e d ) , G C S - A F E X : G r o u n d b e f o r e A F E X , a n d A F E X - G C S : G r o u n d a f t e r A F E X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 9 F i g u r e 4 . A . 1 U n t r e a t e d c o r n s t o v e r T E M i m a g e s h o w i n g c e l l c o m e r , c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M L ) a n d s e c o n d a r y w a l l l a y e r s ( 8 1 , S 2 , S 3 ) . ( S c a l e b a r s h o w n a t t h e b o t t o m o f t h e i m a g e ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 8 F i g u r e 4 . A . 2 A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r T E M i m a g e s ( a t v a r y i n g s c a l e s o f m a g n i fi c a t i o n ) S h o w i n g c e l l c o r n e r , c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M L ) a n d s e c o n d a r y w a l l l a y e r s ( 8 1 , S 2 , S 3 ) . ( a ) L o w - N , ( b ) R e g u l a r , ( c ) H i g h - N t , ( d ) L o w - T , a n d ( e ) L o w - W b a s e d v a r y i n g A F E X s e v e r i t i e s . S e e T a b l e 4 . A . 1 f o r d e s c r i p t i o n o f e a c h A F E X s e v e r i t y . ( S c a l e b a r s s h o w n a t t h e b o t t o m o f e a c h i m a g e ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 9 F i g u r e 4 . A . 3 T o m o g r a m s l i c e s ( ~ 1 0 n m i n t h i c k n e s s ) d e p i c t i n g v a r y i n g A F E X s e v e r i t y t r e a t e d c o r n s t o v e r c e l l w a l l s . ( a ) L o w - N , ( b ) R e g u l a r , ( c ) H i g h - N t , ( d ) L o w - T , a n d ( e ) L o w - W b a s e d v a r y i n g A F E X s e v e r i t i e s . S e e T a b l e 4 . A . 1 f o r d e s c r i p t i o n o f e a c h A F E X s e v e r i t y . ( S c a l e b a r s s h o w n a t t h e b o t t o m o f e a c h i m a g e ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1 F i g u r e 4 . A . 4 I S O - s u r f a c e m e s h e n c l o s i n g p o r o u s r e g i o n s w i t h i n E M - t o m o g r a m f o r L o w - N t r e a t e d s a m p l e . ( a ) T o m o g r a m s l i c e ( 2 = 1 0 s l i c e s ) , a n d ( b ) I S O - s u r f a c e m o d e l s e n c l o s i n g p o r o u s r e g i o n s w i t h i n t o m o g r a m s l i c e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 4 F i g u r e 4 . A . 5 I m m u n o - g o l d l a b e l i n g o f a r a b i n o x y l a n s e x t r a c t e d t o o u t e r c e l l w a l l s ( a , b ) o f A F E X p r e t r e a t e d ( R e g u l a r ) c o r n s t o v e r a n d w a t e r e x t r a c t ( c ) u s i n g L M - l l b a s e d a n t i - b o d y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 7 ' F i g u r e 4 . A . 6 2 4 h o u r g l u c a n ( g r e y b a r s ) a n d x y l a n ( w h i t e b a r s ) d i g e s t i b i l i t y , a s p e r c e n t c o n v e r s i o n , f o r v a r y i n g A F E X s e v e r i t y t r e a t e d c o r n s t o v e r . E n z y m e l o a d i n g w a s 1 5 F P U / g g l u c a n ( S p e z y m e C P ) a n d 6 4 p - N P G U ( N o v o z y m e 1 8 8 ) i n 1 5 m l r e a c t i o n v o l u m e f o r q u a d r u p l i c a t e s . S e e T a b l e 4 . A . 1 f o r d e s c r i p t i o n o f e a c h A F E X s e v e r i t y . . . . . . . . . . . . . . . . 9 7 X X F i g u r e I I - 4 . A . 7 A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r T E M i m a g e s ( a t v a r y i n g s c a l e s o f m a g n i fi c a t i o n ) s h o w i n g c e l l c o m e r , c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M L ) a n d s e c o n d a r y w a l l l a y e r s ( S 1 , 8 2 , S 3 ) f o r L o w - N t r e a t e d A F E X c o r n s t o v e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 6 F i g u r e l l - 4 . A . 8 A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r T E M i m a g e s ( a t v a r y i n g s c a l e s o f m a g n i fi c a t i o n ) s h o w i n g c e l l c o m e r , c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M L ) a n d s e c o n d a r y w a l l l a y e r s ( 8 1 , S 2 , S 3 ) f o r R e g u l a r t r e a t e d A F E X c o r n s t o v e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 7 F i g u r e H — 4 . A . 9 A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r T E M i m a g e s ( a t v a r y i n g s c a l e s o f m a g n i fi c a t i o n ) s h o w i n g c e l l c o r n e r , c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M L ) a n d s e c o n d a r y w a l l l a y e r s ( S 1 , S 2 , S 3 ) f o r H i g h - N t t r e a t e d A F E X c o r n s t o v e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 8 F i g u r e I I - 4 . A . 1 0 A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r T E M i m a g e s ( a t v a r y i n g s c a l e s o f m a g n i fi c a t i o n ) s h o w i n g c e l l c o m e r , c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M L ) a n d s e c o n d a r y w a l l l a y e r s ( S 1 , S 2 , S 3 ) f o r L o w - T t r e a t e d A F E X c o r n s t o v e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 9 F i g u r e I I - 4 . A . 1 1 A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r T E M i m a g e s ( a t v a r y i n g s c a l e s o f m a g n i fi c a t i o n ) s h o w i n g c e l l c o r n e r , c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M L ) a n d s e c o n d a r y w a l l l a y e r s ( 8 1 , 8 2 , S 3 ) f o r L o w - W t r e a t e d A F E X c o r n s t o v e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 0 F i g u r e 4 . B . l P o w d e r X - r a y d i f f r a c t i o n s p e c t r a o f c e l l u l o s e ( C e l l u l o s e I ) t r e a t e d w i t h l i q u i d a m m o n i a ( C e l l u l o s e I I I ) , s o d i u m h y d r o x i d e ( C e l l u l o s e 1 1 ) , a m m o n i u m h y d r o x i d e a n d c o n c e n t r a t e d p h o s p h o r i c a c i d ( A m o r p h o u s C e l l u l o s e ) . A v i c e l w a s t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e i n a l l c a s e s . Y - a x i s a n d X - a x i s d e p i c t i n t e n s i t y c o u n t s a n d t w o - t h e t a ( 2 0 ) a n g l e s , r e s p e c t i v e l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 5 F i g u r e 4 . B . 2 P o w d e r X - r a y d i f f r a c t i o n s p e c t r a o f u n t r e a t e d ( C e l l u l o s e I ) a n d l i q u i d a m m o n i a ( C e l l u l o s e I I I ) t r e a t e d c e l l u l o s e s . A v i c e l , c o t t o n l i n t e r s a n d n a t i v e c o t t o n w e r e t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s u s e d . Y - a x i s a n d X - a x i s d e p i c t i n t e n s i t y c o u n t s a n d t w o - t h e t a ( 2 0 ) a n g l e s , r e s p e c t i v e l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 7 F i g u r e 4 . B . 3 E n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f u n t r e a t e d ( C e l l u l o s e 1 ) , l i q u i d a m m o n i a ( C e l l u l o s e I I I ) , s o d i u m h y d r o x i d e ( C e l l u l o s e I I ) , a m m o n i u m h y d r o x i d e a n d c o n c e n t r a t e d p h o s p h o r i c a c i d ( A m o r p h o u s C e l l u l o s e ) t r e a t e d c e l l u l o s e . A v i c e l w a s t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e i n a l l c a s e s . E n z y m e l o a d i n g w a s 1 . 5 F P U / g g l u c a n o f S p e z y m e C P ( s u p p l e m e n t e d w i t h N o v o 1 8 8 ) . A v i c e l w a s t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e i n a l l c a s e s . Y - a x i s d e p i c t s t o t a l g l u c a n c o n v e r s i o n a f t e r 6 o r 2 4 h o u r s o f h y d r o l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 0 F i g u r e 4 . B . 4 E n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f u n t r e a t e d ( C e l l u l o s e I ) a n d l i q u i d a m m o n i a ( C e l l u l o s e I I I ) t r e a t e d c e l l u l o s e s . A v i c e l , c o t t o n l i n t e r s a n d n a t i v e c o t t o n w e r e t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s u s e d . E n z y m e l o a d i n g w a s 1 . 5 o r 1 5 F P U / g g l u c a n o f S p e z y m e C P ( s u p p l e m e n t e d w i t h N o v o 1 8 8 ) . Y - a x i s d e p i c t s t o t a l g l u c a n c o n v e r s i o n a f t e r 6 o r 2 4 h o u r s o f h y d r o l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 2 F i g u r e 4 . B . 5 E f f e c t o f l i q u i d a m m o n i a t r e a t m e n t t e m p e r a t u r e o n t h e e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f v a r i o u s c e l l u l o s e I I I p o l y m o r p h s . E n z y m e l o a d i n g w a s 1 . 5 F P U / g g l u c a n o f S p e z y m e C P ( s u p p l e m e n t e d w i t h N o v o 1 8 8 ) . A v i c e l w a s t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e i n a l l c a s e s . Y - a x i s d e p i c t s t o t a l g l u c a n c o n v e r s i o n a f t e r 2 4 h o u r s o f h y d r o l y s i s . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 4 x x i F i g u r e I I - 4 . B . 6 P o w d e r X - r a y d i f f r a c t i o n s p e c t r a o f c e l l u l o s e ( C e l l u l o s e I ) t r e a t e d w i t h l i q u i d a m m o n i a ( C e l l u l o s e I I I ) a n d v a r y i n g A F E X s e v e r i t y . A v i c e l w a s t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e i n a l l c a s e s . T h e v a r y i n g s e v e r i t y c o n d i t i o n s a r e d e n o t e d b y 1 o r 3 - N H 3 ( a m m o n i a l o a d i n g , w / w b a s i s ) a n d 0 . 0 5 o r 0 . 6 — W ( w a t e r l o a d i n g , w / w b a s i s ) i n t h e fi g u r e l e g e n d . Y - a x i s a n d X - a x i s d e p i c t i n t e n s i t y c o u n t s a n d t w o - t h e t a ( 2 0 ) a n g l e s , r e s p e c t i v e l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 1 F i g u r e I I - 4 . B . 7 R a m a n s p e c t r a o f c e l l u l o s e ( C e l l u l o s e I ) t r e a t e d w i t h l i q u i d a m m o n i a ( C e l l u l o s e 1 1 1 d a t a f r o m [ 4 ] ) a n d v a r y i n g A F E X s e v e r i t y . A v i c e l w a s t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e i n a l l c a s e s . T h e v a r y i n g s e v e r i t y c o n d i t i o n s a r e d e n o t e d b y 1 o r 3 - N H 3 ( a m m o n i a l o a d i n g , w / w b a s i s ) a n d 0 . 0 5 o r 0 . 6 - W ( w a t e r l o a d i n g , W / w b a s i s ) i n t h e fi g u r e l e g e n d . Y - a x i s a n d X - a x i s d e p i c t i n t e n s i t y c o u n t s a n d w a v e n u m b e r ( c m - l ) , r e s p e c t i v e l y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 2 F i g u r e 5 . 1 C o r r e l a t i o n b e t w e e n e x t e n t o f e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y ( Y , 2 4 h o u r , % G l u c a n c o n v e r s i o n ) a n d t o t a l f e r u l o y l a m i d e c o n t e n t ( X , m g / g m b i o m a s s ) o f t h e v a r y i n g A F E X s e v e r i t y t r e a t e d c o r n s t o v e r s u b s t r a t e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 4 F i g u r e 5 . 2 E f f e c t o f c o n v e n t i o n a l A F E X c o r n s t o v e r d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( A S E e x t r a c t e d u s i n g h o t w a t e r ) o n c e l l u l a s e a c t i v i t y ( h y d r o l y z i n g c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e ) a s a fi m c t i o n o f h y d r o l y s i s t i m e a n d t o t a l e n z y m e l o a d i n g . C o n t r o l e x p e r i m e n t ( a ) w a s A v i c e l h y d r o l y z e d b y 1 5 F P U ( o r 2 2 m g ) S p e z y m e C P / g g l u c a n ( s u p p l e m e n t e d w i t h 3 8 m g / g g l u c a n o f N o v o 1 8 8 ) , i n t h e a b s e n c e o f A F E X s t o v e r w a t e r e x t r a c t , f o r v a r i o u s t i m e p o i n t s ( 2 4 - 1 6 8 h o u r s ) . C o n t r o l e x p e r i m e n t ( b ) w a s A v i c e l h y d r o l y z e d f o r 2 4 h o u r s , i n t h e a b s e n c e o f A F E X s t o v e r w a t e r , f o r v a r i o u s t o t a l e n z y m e l o a d i n g s ( 1 2 - 4 8 m g / g g l u c a n o f S p e z y m e / N o v o 1 8 8 i n a fi x e d m a s s r a t i o o f 3 7 : 6 3 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 2 F i g u r e 6 . 1 H i g h - t h r o u g h p u t B C R L m i c r o p l a t e b a s e d s a c c h a r i fi c a t i o n m e t h o d o l o g y f o r l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d f r o m [ 2 ] ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 8 F i g u r e 6 . 2 P a r t i c l e s i z e d i s t r i b u t i o n s f o r A v i c e l ( A V ) a n d u l t r a - c e n t r i f u g a l l y m i l l e d c o m s t o v e r ( C S ) . B a r s i n d i c a t e m e a n a n d s t a n d a r d e r r o r s f o r f o u r r e p l i c a t e s a m p l e s . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d f r o m [ 2 ] ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 9 F i g u r e I V - 6 . 3 E f f e c t o f s l u r r y s u s p e n s i o n s o l i d s l o a d i n g ( W / w ) o n d e l i v e r y a c c u r a c y b y p i p e t t i n g w o r k s t a t i o n . T h e a v e r a g e a m o u n t o f b i o m a s s ( m g ) d e l i v e r e d t o e a c h w e l l i s ' p l o t t e d o n t h e Y - a x i s f o r v a r y i n g p e r c e n t s l u r r y s o l i d s c o n c e n t r a t i o n ( X - a x i s ) . T h e b a r s i n d i c a t e s t a n d a r d d e v i a t i o n s f o r 1 2 r e p l i c a t e e x p e r i m e n t s . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d f r o m [ 2 ] ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 4 F i g 6 . 4 B o x p l o t o f g l u c a n c o n v e r s i o n s ( Y ) a l o n g w i t h d a t a p o i n t s ( N = 4 8 ) f o r e a c h s e t o f e x p e r i m e n t s ( X ) p e r f o r m e d f o r 0 . 2 5 % g l u c a n l o a d i n g A F E X c o r n s t o v e r f o r c o n v e n t i o n a l e n z y m e l o a d i n g . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d f r o m [ 2 ] ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 6 F i g I V - 6 . 5 ( A ) H y d r o l y s i s t i m e p r o fi l e f o r c o n v e n t i o n a l fl a s k b a s e d a s s a y f o r a v i c e l ( A V ) , u n - g r o u n d A F E X c o r n s t o v e r ( A C S ) a n d m i l l e d A F E X c o r n s t o v e r a t t w o d i f f e r e n t g l u c a n l o a d i n g s ( 0 . 2 5 % a n d 1 % ) . ( B ) H y d r o l y s i s t i m e p r o fi l e f o r B C R L m i c r o p l a t e b a s e d a s s a y f o r a v i c e l ( A V ) , u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ( U C S ) a n d m i l l e d A F E X c o r n s t o v e r ( A C S ) a t t w o d i f f e r e n t g l u c a n l o a d i n g s ( 0 . 2 5 % a n d 1 % ) . P e r c e n t g l u c a n c o n v e r s i o n a n d p e r i o d o f h y d r o l y s i s ( h r s ) a r e s h o w n o n t h e Y - a n d X - a x i s , r e s p e c t i v e l y . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d f r o m [ 2 ] ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 5 F i g u r e 7 . ] S D S - P A G E f o r 1 4 c r u d e e n z y m e b l e n d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8 5 F i g u r e 7 . 2 C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t s f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n ( A ) , % x y l a n c o n v e r s i o n ( B ) a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( C ) w i t h r e s p e c t t o r e f e r e n c e b l e n d a t o p t i m a l m i x t u r e c o m p o s i t i o n f o r 8 C E - R E e x p e r i m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0 7 F i g u r e V — 7 . 3 C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t s f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n ( A ) , % x y l a n c o n v e r s i o n ( B ) a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( C ) w i t h r e s p e c t t o r e f e r e n c e b l e n d a t o p t i m a l m i x t u r e c o m p o s i t i o n f o r 1 0 C E - R E e x p e r i m e n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 7 F i g u r e 7 . 4 C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t s f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n ( A ) , % x y l a n c o n v e r s i o n ( B ) a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( C ) w i t h r e s p e c t t o r e f e r e n c e b l e n d a t o p t i m a l m i x t u r e c o m p o s i t i o n f o r 5 C E - R E e x p e r i m e n t s ( C e l x i s C E 1 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 2 F i g u r e V - 7 . 5 C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t s f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n ( A ) , % x y l a n c o n v e r s i o n ( B ) a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( C ) w i t h r e s p e c t t o r e f e r e n c e b l e n d a t o p t i m a l m i x t u r e c o m p o s i t i o n f o r 5 C E - R E e x p e r i m e n t s ( C e l x i s C E 6 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 9 F i g u r e V - 7 . 6 C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t s f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n ( A ) , % x y l a n c o n v e r s i o n ( B ) a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( C ) w i t h r e s p e c t t o r e f e r e n c e b l e n d a t o p t i m a l m i x t u r e c o m p o s i t i o n f o r 5 C E - R E e x p e r i m e n t s ( C e l x i s R E 4 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 0 F i g u r e V - 7 . 7 - ( A / B ) C o m p a r i n g p r o t e i n c o m p o s i t i o n o f c o m m e r c i a l e n z y m e ( C E 1 ) t o a v e r a g e c o m p o s i t i o n o f t o p 5 % m i x t u r e s ( N = 3 7 ) , b a s e d o n % g l u c a n c o n v e r s i o n . . . . . . 2 9 1 F i g u r e V - 7 . 7 - ( C / D ) C o m p a r i n g p r o t e i n c o m p o s i t i o n o f c o m m e r c i a l e n z y m e ( C E 4 ) t o a v e r a g e c o m p o s i t i o n o f t o p 5 % m i x t u r e s ( N = 3 7 ) , b a s e d o n % x y l a n c o n v e r s i o n . . . . . . . 2 9 3 F i g u r e 7 . 7 - ( E / F ) C o m p a r i n g p r o t e i n c o m p o s i t i o n o f c o m m e r c i a l e n z y m e ( C E 1 ) t o a v e r a g e c o m p o s i t i o n o f t o p 5 % m i x t u r e s ( N = 3 7 ) , b a s e d o n % t o t a l s u g a r y i e l d . . . . . . . . 2 2 6 F i g u r e 7 . 8 C o m p a r i n g e f f e c t o f e n z y m e m i x t u r e c o m p o s i t i o n ( a t fi x e d t o t a l p r o t e i n l o a d i n g o f 1 6 . 5 m g / g g l u c a n ) o n o v e r a l l g l u c o s e ( b l u e / b o t t o m b a r ) a n d x y l o s e ( g r e e n / t o p b a r ) y i e l d , w i t h r e s p e c t t o d r y w e i g h t u n t r e a t e d c o r n s t o v e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2 9 F i g u r e 8 . 1 C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t s f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n ( A F E X c o r n s t o v e r ) w i t h r e s p e c t t o r e f e r e n c e b l e n d a t o p t i m a l m i x t u r e c o m p o s i t i o n o f C B H I ( 3 4 . 6 7 % ) , C B H I I ( 2 6 % ) a n d E G I ( 3 9 . 3 3 % ) . S u m o f a l l t h r e e c e l l u l a s e l o a d i n g s i s e q u a l t o 1 5 m g / g g l u c a n . 1 . 5 m g / g g l u c a n o f B G w a s a d d e d t o a l l m i x t u r e s t e s t e d ( S e e T a b l e V I - 8 . 5 ) . . . . . . . . . . . . . . 2 5 0 F i g u r e 8 . 2 C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t f o r % x y l a n c o n v e r s i o n ( A F E X c o r n s t o v e r o r A C S ) w i t h r e s p e c t t o r e f e r e n c e b l e n d a t o p t i m a l m i x t u r e c o m p o s i t i o n o f E X ( 2 9 . 0 7 % ) , B X x x i i i ( 4 2 . 6 7 % ) a n d A e r ( 2 8 . 2 7 % ) . S u m o f a l l t h r e e h e m i c e l l u l a s e l o a d i n g s i s e q u a l t o 3 . 7 5 m g / g g l u c a n ( S e e T a b l e 8 . 8 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 0 F i g u r e 9 . 1 M o d e l f o r g e n e r i c l i g n o c e l l u l o s i c c e l l w a l l s b e f o r e ( A ) a n d a f t e r a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t s ( B ) . F i g u r e d e p i c t s v a r i o u s l i g n i n - c a r b o h y d r a t e c o m p l e x ( L C C ) l i n k a g e s b e t w e e n n o n - c o r e l i g n i n p h e n o l i c s a n d h e m i c e l l u l o s e s i d e c h a i n s t h a t a r e m o d i fi e d d u r i n g A F E X r e s u l t i n g i n e n z y m e a c c e s s i b l e p o r o s i t y . W h e r e ; C e l l u l o s e ( g r e e n r o d s ) , H e m i c e l l u l o s e ( p u r p l e s t r i n g s w i t h b l u e d o t s ) , L i g n i n ( g r e y m a t r i x ) . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 4 x x i v A B B R E V I A T I O N S o r - A e r a — G l u B G B X A D F A . n i d u l a n s A F E X A F M A R P A X E C A C . t h e r m o c e l l u m C B D C B H C B M C B P C D C E 1 C E 2 C E 3 C E 4 o r - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e o r - g l u c u r o n i d a s e B - g l u c o s i d a s e B - x y l o s i d a s e A c i d D e t e r g e n t F i b e r A s p e r g i l l u s n i d u l a n s A m m o n i a F i b e r E x p a n s i o n A t o m i c F o r c e M i c r o s c o p y A m m o n i a R e c y c l e P e r c o l a t i o n A c e t y l X y l a n E s t e r a s e C o u m a r i c A c i d C l o s t r i d i u m t h e r m o c e l l u m C e l l u l o s e B i n d i n g D o m a i n C e l l o b i o h y d r o l a s e ( o r E x o g l u c a n a s e ) C e l l u l o s e B i n d i n g M o d u l e C o n s o l i d a t e d B i o l o g i c a l P r o c e s s i n g C a t a l y t i c D o m a i n S p e z y m e C P N o v o z y m e 1 8 8 M u l t i f e c t x y l a n a s e M u l t i f e c t p e c t i n a s e X X V C E 5 C E 6 C i p C S D P D R I F T D S E E D S E G E M E S C A E X F A F P L C F T I R % G G C G H H P L C L C L C C M S D e p o l 6 7 0 L A c c e l l e r a s e 1 0 0 0 C e l l u l o s o m e I n t e g r a t i n g P r o t e i n C o r n S t o v e r D e g r e e o f P o l y m e r i z a t i o n D i f f u s i v e R e fl e c t a n c e I n f r a - R e d F o u r i e r T r a n s f o r m S p e c t r o s c o p y D e g r e e o f S y n e r g i s m E n e r g y D i s p e r s i v e X - r a y S p e c t r o m e t e r E n d o g l u c a n a s e E l e c t r o n M i c r o s c o p y E l e c t r o n S p e c t r o s c o p y f o r C h e m i c a l A n a l y s i s E n d o x y l a n a s e F e r u l i c a c i d F a s t p r o t e i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y F o u r i e r T r a n s f o r m I n f r a - R e d G l u c a n c o n v e r s i o n G a s C h r o m a t o g r a p h y G l y c o s y l H y d r o l a s e H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y L i g n i n C a r b o h y d r a t e C o m p l e x M a s s S p e c t r o m e t r y x x v i M S / M S N R E L O / C O S X P C W p - N P A p — N P A f p - N P G p - N P X R E 1 R E 2 R E 3 R E 4 R E 5 R E 6 R E 7 R E 8 S A X S S C W S E M S S A T . r e e s e i T a n d e m M a s s S p e c t r o m e t r y N e u t r a l D e t e r g e n t F i b e r N a t i o n a l R e n e w a b l e E n e r g y L a b o r a t o r y O x y g e n t o C a r b o n R a t i o O a t S p e l t X y l a n P r i m a r y C e l l W a l l p - n i t r o p h e n o l - a c t e t a t e p - n i t r o p h e n o l - a r a b i n o fi r r a n o s i d e p - n i t r o p h e n o l - g l u c o s i d e p - n i t r o p h e n o l - x y l o s i d e N S - 2 2 0 0 2 N S - 5 0 0 1 0 N S - 5 0 0 1 2 N S - 5 0 0 1 3 N S - 5 0 0 1 4 N S - 5 0 0 2 9 N S - 5 0 0 3 0 N S - 5 0 0 5 3 S m a l l A n g l e X - r a y S c a t t e r i n g S e c o n d a r y C e l l W a l l S c a n n i n g E l e c t r o n M i c r o s c o p y S p e c i fi c S u r f a c e A r e a T r i c h o d e r m a r e e s e i x x v fi T E M % X X P S T r a n s m i s s i o n E l e c t r o n M i c r o s c o p y X y l a n c o n v e r s i o n X - r a y P h o t o e l e c t r o n S p e c t r o s c o p y X - R a y D i f f r a c t i o n x x v i i C H A P T E R 1 : I N T R O D U C T I O N T h e e c o n o m i c v i a b i l i t y o f p r o d u c i n g l i g n o c e l l u l o s i c e t h a n o l i s d e p e n d e n t o n t h e c o s t o f v a r i o u s t h e r m o c h e m i c a l a n d b i o l o g i c a l p r o c e s s i n g s t e p s i n v o l v e d . T h i s i s l a r g e l y d u e t o t h e i n h e r e n t r e c a l c i t r a n c e o f l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s [ 5 , 6 ] . D e s p i t e t r e m e n d o u s i n t e r e s t i n l i g n o c e l l u l o s i c e t h a n o l t h e r e h a v e b e e n f e w s i g n i fi c a n t c o m m e r c i a l e f f o r t s t o p r o d u c e i t . T h i s i s p r e d o m i n a n t l y d u e t o r e s e a r c h f o c u s o n e x p e n s i v e h i g h s e v e r i t y , a c i d - b a s e d p r e t r e a t m e n t s a n d e x c e s s i v e p u b l i c s c r u t i n y o f b i o - f u e l s i n r e c e n t y e a r s . A s e n s i b l e a p p r o a c h w o u l d b e t o f o c u s r e s e a r c h e f f o r t s o n s u s t a i n a b l e , l o w - s e v e r i t y t h e r m o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t s l i k e A F E X [ 7 ] t h a t c o u l d p o t e n t i a l l y c o — p r o d u c e p r e t r e a t e d f e e d s t o c k f o r t h e b i o f u e l i n d u s t r y a s w e l l a s f o r a n i m a l f e e d . T h i s w o u l d p a r t l y a d d r e s s c o n c e r n s t o t h e i m p e n d i n g f e e d v s . f u e l a r g u m e n t [ 8 , 9 ] . U n f o r t u n a t e l y , t h e e f f e c t o f A F E X p r e t r e a t m e n t o n l i g n o c e l l u l o s i c p l a n t c e l l w a l l s a n d e n z y m a t i c h y d r o l y s i s i s i n s u f fi c i e n t l y u n d e r s t o o d t o s u c c e s s f u l l y c o m m e r c i a l i z e t h i s t e c h n o l o g y . T h e e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f n a t i v e a n d p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s d e p e n d s p r i m a r i l y o n t w o f a c t o r s ; ( a ) S u b s t r a t e - r e l a t e d a n d ( b ) E n z y m e - r e l a t e d [ 1 0 , 1 1 ] . S U b s t r a t e r e l a t e d f a c t o r s a r e t y p i c a l l y c e l l u l o s e c r y s t a l l i n i t y [ 1 2 - 1 5 ] , h e m i c e l l u l o s e s i d e - c h a i n b r a n c h i n g [ 1 6 ] , l i g n i n m o n o m e r t y p e a n d c o n t e n t [ 1 7 ] , c o u m a r a t e a n d f e r u l a t e c r o s s - l i n k i n g [ 1 7 , 1 8 ] , c e l l w a l l p o r o s i t y [ 1 9 - 2 2 ] a n d p a r t i c l e s i z e [ 2 3 ] . E n z y m e r e l a t e d c h a r a c t e r i s t i c s t h a t i n fl u e n c e h y d r o l y s i s a r e S p e c i fi c a c t i v i t y [ 2 4 ] , e n z y m e s y n e r g y [ 2 5 - 3 2 ] , e n z y m e i n a c t i v a t i o n d u e t o n o n - p r o d u c t i v e p r o t e i n b i n d i n g t o l i g n i n a n d c e l l u l o s e d u r i n g h y d r o l y s i s [ 3 3 - 3 8 ] , a n d i n h i b i t i o n d u e t o e n d - p r o d u c t s o r p r e t r e a t m e n t d e g r a d a t i o n s p e c i e s [ 3 9 , 4 0 ] . P a s t s t u d i e s i n d i c a t e t h a t A F E X m o d i fi e s s e v e r a l s u b s t r a t e r e l a t e d c h a r a c t e r i s t i c s t h a t i m p r o v e e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y . T h e i m p r o v e m e n t i n h y d r o l y s i s y i e l d s a f t e r A F E X i s p r o b a b l y d u e t o d e c r y s t a l l i z a t i o n o f c e l l u l o s e [ 4 ] ] , p a r t i a l d e p o l y m e r i z a t i o n o f h e m i c e l l u l o s e [ 4 2 , 4 3 ] , x y l a n d e a c e t y l a t i o n [ 1 8 ] , c l e a v a g e o f l i g n i n c a r b o h y d r a t e c o m p l e x ( L C C ) b o n d s a n d p o s s i b l y t h r o u g h i n c r e a s e i n a c c e s s i b l e s u r f a c e a r e a [ 4 4 , 4 5 ] . H o w e v e r , t h e r e a r e s e v e r a l fi r n d a m e n t a l q u e s t i o n s t h a t s t i l l n e e d t o b e a d d r e s s e d f o r A F E X p r e t r e a t m e n t , s u c h a s ; w h a t a r e t h e p h y s i c o c h e r r r i c a l e f f e c t s o f A F E X o n c e l l u l o s e , h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n ? W h a t u l t r a - s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s a r e b r o u g h t a b o u t w i t h i n t h e c e l l w a l l d u r i n g A F E X t h a t e n h a n c e e n z y m e a c c e s s i b i l i t y ? W h a t d e g r a d a t i o n p r o d u c t s a r e f o r m e d d u r i n g p r e t r e a t m e n t a n d t h e i r p o t e n t i a l r o l e a s b i o l o g i c a l i n h i b i t o r s ? W h a t i s t h e m a t h e m a t i c a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p r e t r e a t m e n t t h e r m o d y n a m i c c o n d i t i o n s ( i . e . A F E X s e v e r i t y ) a n d e x t e n t o f b i o m a s s d i g e s t i b i l i t y f o r a d e fi n e d e n z y m e c o c k t a i l ? A l s o i n o r d e r t o o b t a i n h i g h e r c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e h y d r o l y s i s y i e l d s a t c o m m e r c i a l l y f a v o r a b l e l o w e n z y m e l o a d i n g s [ 4 6 , 4 7 ] , i t b e c o m e s n e c e s s a r y t o o p t i m i z e s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n e n z y m e s t o m a x i m i z e p r e t r e a t e d b i o m a s s d i g e s t i b i l i t y [ 4 8 ] . U n f o r t u n a t e l y , c e l l u l a s e a n d h e m i c e l l u l a s e b a s e d s y n e r g i s t i c h y d r o l y s i s o f A F E X p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s i s a l s o p o o r l y u n d e r s t o o d . T h i s i s d u e t o p r e d o m i n a n t f o c u s o n m o d e l s u b s t r a t e s ( l i k e b a c t e r i a l m i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e , a v i c e l ) a n d a c i d p r e t r e a t e d b i o m a s s w h e r e h e m i c e l l u l o s e s a r e a b s e n t o r s i g n i fi c a n t l y r e m o v e d [ 2 6 , 3 6 , 4 9 , 5 0 ] . S e v e r a l a r e a s r e l a t e d t o e n z y m e s y n e r g y o n A F E X t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s t h a t n e e d t o b e e x p l o r e d a r e ; w h a t c o m b i n a t i o n s o f c r u d e c o m m e r c i a l e n z y m e s m a x i m i z e d i g e s t i b i l i t y f o r A F E X t r e a t e d b i o m a s s ? W h a t c e l l u l a s e s ( e . g . c e l l o b i o h y d r o l a s e s , e n d o g l u c a n a s e s ) a n d h e m i c e l l u l a s e s ( e . g . e n d o x y l a n a s e s , B - x y l o s i d a s e s , o r - a r a b i n o fi r r a n o s i d a s e s ) a r e c r i t i c a l t o t h e h y d r o l y s i s o f A F E X t r e a t e d c e l l w a l l s ? W h a t a r e t h e s y n e r g i s t i c m e c h a n i s m s o f i n d i v i d u a l e n z y m e s o n p r e t r e a t e d c e l l w a l l s a n d w h a t r o l e d o e s A F E X p l a y i n m o d u l a t i n g t h i s ? I s i t p o s s i b l e t o o p t i m i z e p u r i fi e d e n z y m e c o m b i n a t i o n s a n d r e d u c e t o t a l p r o t e i n l o a d i n g ( i . e . u n i t m a s s p r o t e i n p e r u n i t m a s s p r e t r e a t e d b i o m a s s ) t o m a x i m i z e d i g e s t i b i l i t y ? H o w d o e s A F E X p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y a f f e c t s y n e r g i s t i c e n z y m e a c t i v i t y ? T h e g o a l o f t h i s d i s s e r t a t i o n w a s t o i d e n t i f y t h e m a j o r p h y s i c o c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s i n c o r p o r a t e d w i t h i n l i g n o c e l l u l o s i c c e l l w a l l s d u r i n g v a r i o u s a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t s . T h e p r o j e c t a l s o e x p l o r e s t h e e f f e c t o f a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t s o n s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n c e l l u l a s e s , h e m i c e l l u l a s e s a n d v a r i o u s o t h e r a c c e s s o r y e n z y m e s . T h i s r e s e a r c h s h o u l d h e l p m a k e s i g n i fi c a n t s t r i d e s t o w a r d s t h e d e v e l o p m e n t o f m e c h a n i s t i c , m a t h e m a t i c a l m o d e l s t h a t h e l p p r e d i c t g l u c a n a n d x y l a n d i g e s t i b i l i t y o f a m m o n i a p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c c e l l w a l l s f o r v a r y i n g p r e t r e a t m e n t s e v e r i t i e s a n d c o m p l e x h y d r o l y t i c e n z y m e c o m b i n a t i o n s . 1 . 1 O b j e c t i v e s T h e m e c h a n i s m b y w h i c h A F E X ( a t l o w e r w a t e r t o s o l i d l o a d i n g s ) h e l p s e n h a n c e e n z y m e a c c e s s i b i l i t y a n d u l t i m a t e l y i m p r o v e s t h e h y d r o l y t i c r a t e c o m p a r e d t o u n t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s , l i k e c o r n s t o v e r , i s c u r r e n t l y u n k n o w n . I t i s h y p o t h e s i z e d t h a t A F E X c r e a t e s u l t r a - s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s w i t h i n t h e p l a n t c e l l w a l l t h r o u g h c l e a v a g e o f c e r t a i n l i g n i n - c a r b o h y d r a t e b a s e d c o m p l e x l i n k a g e s a n d p o s s i b l y t h r o u g h s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n o f c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s . T h e s e p h y s i c o c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s h e l p i m p r o v e e n z y m e a c c e s s i b i l i t y a n d e n h a n c e s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n v a r i o u s e n z y m e c o m p o n e n t s . T 0 t e s t t h i s h y p o t h e s i s . i t w o u l d b e n e c e s s a r y t o fi r s t l y ‘ v i s u a l i z e ’ t h e u l t r a - s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s i n c o r p o r a t e d w i t h i n a n d o u t s i d e t h e c e l l w a l l t h r o u g h v a r i o u s m i c r o s c o p i c t e c h n i q u e s ( m i l e s t o n e # 1 ) ; s e c o n d l y , i t w o u l d b e n e c e s s a r y t o o b t a i n c o m p o s i t i o n r e l a t e d i n f o r m a t i o n f o r c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s t h a t t a k e p l a c e w i t h i n t h e c e l l w a l l a f t e r A F E X p r e t r e a t m e n t u s i n g v a r i o u s s p e c t r o s c o p i c a n d s p e c t r o m e t r i c t e c h n i q u e s ( m i l e s t o n e # 2 ) . L a s t l y , t h e e f f e c t o f p r e t r e a t m e n t o n s y n e r g i s t i c h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c s w o u l d n e e d t o b e s t u d i e d u s i n g v a r i o u s c e l l u l a s e s , h e m i c e l l u l a s e s a n d a c c e s s o r y p r o t e i n s t o d i g e s t u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d b i o m a s s ( l i k e a v i c e l a n d c o r n s t o v e r ) ( m i l e s t o n e # 3 ) . A t t h e c o n c l u s i o n o fi t h e s e s t r i d i e s , i t w o u l d b e p o s s i b l e t o i d e n t i f y t h e i m p o r t a n t s u b s t r a t e ( e . g . c e l l w a l l p o r o s i t y t h r o u g h T E M a n a l y s i s ) a n d e n z y m e ( m i n i m a l i s t e n z y m e m i x t u r e t h a t g i v e s 9 0 % o r h i g h e r g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n s ) r e l a t e d p a r a m e t e r s t h a t a f f e c t t h e u l t i m a t e d i g e s t i b i l i t y o f A F E X p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r . T h e s e s t u d i e s w o u l d a l s o p r o v e t o b e e x t r e m e l y b e n e fi c i a l i n t h e e v e n t u a l d e v e l o p m e n t o f f u n d a m e n t a l m e c h a n i s t i c m o d e l s t h a t a c c u r a t e l y p r e d i c t e f f e c t i v e n e s s o f A F E X o n b i o m a s s d i g e s t i b i l i t y a s a f u n c t i o n o f v a r y i n g p r e t r e a t m e n t s e v e r i t i e s a n d i n d i v i d u a l e n z y m e c o m p o n e n t s . T h e t h r e e o v e r - a r c h i n g o b j e c t i v e s o f t h i s t h e s i s p r o j e c t a r e a s f o l l o w s ; O b j e c t i v e 1 : T o v i s u a l i z e u l t r a - s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s i n c o r p o r a t e d w i t h i n a n d o u t s i d e c o r n s t o v e r c e l l w a l l s d u e t o v a r y i n g s e v e r i t y a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t s O b j e c t i v e 2 : T o q u a n t i f y c o m p o s i t i o n a l c h a n g e s a n d m a j o r d e g r a d a t i o n p r o d u c t s f o r m e d d u r i n g A F E X p r e t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r b a s e d l i g n o c e l l u l o s i c c e l l w a l l s O b j e c t i v e 3 : T o s t u d y t h e e f f e c t o f a m m o n i a b a s e d t r e a t m e n t s o n s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n c e l l u l a s e s , h e m i c e l l u l a s e s a n d o t h e r a c c e s s o r y e n z y m e s f o r m a x i m i z i n g c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e d i g e s t i b i l i t y C H A P T E R 2 : L I T E R A T U R E R E V I E W 2 . 1 P l a n t C e l l W a l l s i i i 2 . 1 . ] M a j o r C o m p o n e n t s o f C e l l W a l l T h e p r i m a r y c o n s t i t u e n t s o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s a r e 3 0 - 5 0 % c e l l u l o s e ( g l u c o s e p o l y m e r ) , 1 5 - 3 5 % h e m i c e l l u l o s e ( h e t e r o - s u g a r p o l y m e r ) , 1 0 - 3 0 % l i g n i n ( p h e n y l p r o p a n o i d p o l y m e r ) a n d o t h e r m i n o r c o n s t i t u e n t s t h a t i n c l u d e p r o t e i n s ( 3 - 1 0 % ) , l i p i d s ( 1 - 5 % ) , s o l u b l e s u g a r s ( 1 - 5 % ) a n d m i n e r a l s ( 5 - 1 0 % ) [ 5 1 ] . C e l l u l o s e i s a l i n e a r h o m o - p o l y s a c c h a r i d e t h a t c o n s i s t s o f g l u c o s e ( D - g l u c o p y r a n o s e ) u n i t s l i n k e d t o g e t h e r b y B - ( 1 - 4 ) g l y c o s i d i c l i n k a g e s ( B - D - g l u c a n ) . T h e d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n ( D P ) o f c e l l u l o s e v a r i e s d e p e n d i n g o n i t s s o u r c e . C e l l U l o s e fi ' o m a v i c e l h a s 3 0 - f o l d l o w e r D P c o m p a r e d t o u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ( 2 0 0 v s . 7 , 0 0 0 , r e s p e c t i v e l y ) [ 5 2 - 5 4 ] . T h e a d j a c e n t g l u c a n c h a i n s f o r m e l e m e n t a r y m i c r o fi b r i l s ( 3 - 5 n m d i a m e t e r ) o f w a t e r - i n s o l u b l e a g g r e g a t e s o f v a r y i n g l e n g t h a n d w i d t h i n t h e p r i m a r y c e l l w a l l o f c o r n s t o v e r [ 5 5 ] . T h e s e a g g r e g a t e s c o n t a i n o r d e r e d ( c r y s t a l l i n e ) a n d l e s s - o r d e r e d ( a m o r p h o u s ) r e g i o n s o f c e l l u l o s e [ 5 6 ] . T h e l a t t i c e f o r c e s r e s p o n s i b l e f o r m a i n t a i n i n g t h e c r y s t a l l i n e r e g i o n s a r e a r e s u l t o f e x t e n s i v e i n t e r - a n d i n t r a - m o l e c u l a r h y d r o g e n b o n d i n g . T h e c e l l u l o s e p o l y r n o r p h t y p i c a l l y s e e n i n h i g h e r p l a n t s i s C e l l u l o s e 1 3 , w h i c h i s a m o r e t i g h t l y p a c k e d c r y s t a l s t r u c t u r e , c o m p a r e d t o o t h e r c e l l u l o s e p o l y m o r p h s ( e . g . C e l l u l o s e I I I ) d u e t o d i f f e r e n c e s i n h y d r o g e n b o n d i n g p a t t e r n s [ 5 7 ] . l A v e r s i o n o f t h i s c h a p t e r w a s p u b l i s h e d a s C h u n d a w a t , S . P . S . , B a l a n , V . , S o u s a , L . , D a l e , B B , 2 0 0 9 . C h a r a c t e r i s t i c s o f a n i d e a l t h e r m o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t f o r r e d u c i n g r e c a l c i t r a n c e o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s t o b i o l o g i c a l p r o c e s s i n g . i n : K . W a l d r o n ( E d . ) B i o a l c o h o l p r o d u c t i o n : : B i o c h e m i c a l c o n v e r s i o n o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s ( I n P r e s s ) . W o o d h e a d P u b l i s h i n g , C a m b r i d g e . 1 1 A v e r s i o n o f t h i s c h a p t e r w a s p u b l i s h e d a s d a C o s t a S o u s a , L . , C h u n d a w a t , S . P . , B a l a n , V . , D a l e , B E , 2 0 0 9 . ' C r a d l e - t o - g r a v e ' a s s e s s m e n t o f e x i s t i n g l i g n o c e l l u l o s e p r e t r e a t m e n t t e c h n o l o g i e s . C u r r O p i n B i o t e c h n o l , 2 0 , 3 3 9 - 4 7 . H e m i c e l l u l o s e s a r e c o m p l e x h e t e r o - p o l y s a c c h a r i d e s w h o s e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n , u n l i k e c e l l u l o s e , v a r i e s b e t w e e n c e l l t i s s u e s a n d p l a n t s p e c i e s [ 5 8 , 5 9 ] . T h e s e p o l y s a c c h a r i d e s a r e f o r m e d b y a w i d e v a r i e t y o f s u g a r b u i l d i n g b l o c k s i n c l u d i n g p e n t o s e s ( x y l o s e , a r a b i n o s e ) , h e x o s e s ( g l u c o s e , m a n n o s e , g a l a c t o s e ) a n d u r o n i c a c i d s ( 4 - 0 - m e t h y l - g l u c u r o n i c , g a l a c t u r o n i c a c i d s ) [ 5 6 ] . G e n e r a l l y , h e m i c e l l u l o s e s f a l l i n t o t w o m a j o r c l a s s e s : ( a ) u n - b r a n c h e d c h a i n s s u c h a s B - ( l - 4 ) - l i n k e d x y l a n s o r m a n n a n s ; a n d ( b ) b r a n c h e d c h a i n s s u c h a s B - ( 1 - 4 ) - l i n k e d g a l a c t o g l u c o m a n n a n s a n d a r a b i n o x y l a n s ( 0 2 / 0 3 x y l o s y l l i n k a g e s ) . T h e m o s t a b u n d a n t h e m i c e l l u l o s e s f o u n d i n a g r i c u l t u r a l r e s i d u e s l i k e c o r n s t o v e r a r e a r a b i n o x y l a n s a n d a r a b i n o - ( g l u c u r o n o ) - x y l a n s [ 5 9 , 6 0 ] . T h e r a t i o o f p e n t o s a n s ( x y l o s e , a r a b i n o s e ) a n d a c i d i c s u g a r s ( u r o n i c a c i d s ) v a r i e s c o n s i d e r a b l y b e t w e e n t i s s u e s , b u t t y p i c a l l y c o r n s t o v e r c e l l w a l l s c o n t a i n a t l e a s t 2 0 - 2 5 % x y l a n , 4 - 5 % a r a b i n a n a n d 3 - 5 % u r o n i c a c i d s ( t o t a l d r y w e i g h t b a s i s ) . L i g n i n i s a p h e n y l - p r o p a n o i d b a s e d m a c r o m o l e c u l a r n e t w o r k t h a t i s p r i m a r i l y f o r m e d t h r o u g h t h e f r e e - r a d i c a l p o l y m e r i z a t i o n o f p - h y d r o x y c i n n a m y l a l c o h o l u n i t s o f v a r y i n g m e t h o x y l c o n t e n t [ 6 1 ] . T h e c h e m i c a l s t r u c t u r e o f l i g n i n i s c o m p l e x a n d i s l a r g e l y b a s e d o n i t s t h r e e p h e n o l i c p r e c u r s o r s : c o n i f e r y l a l c o h o l , s i n a p y l a l c o h o l , a n d p - c o u m a r y l a l c o h o l . T h e r a t i o s a n d a b s o l u t e a m o u n t s o f t h e s e p r e c u r s o r s v a r y s i g n i fi c a n t l y b e t w e e n S p e c i e s , p h e n o t y p e s , o r g a n s ( l e a f , s t e m , s h e a t h ) , t i s s u e s ( x y l e m , s c l e r e n c h y m a , p a r e n c h y m a , e p i d e r m i s ) a n d h e n c e t r e m e n d o u s l y a f f e c t s t h e p h y s i c o c h e m i c a l n a t u r e o f l i g n o c e l l u l o s i c c e l l w a l l s [ 1 7 ] . L i g n i fi c a t i o n o f c e l l w a l l s h e l p s p r o v i d e s t r e n g t h t o p l a n t t i s s u e s p r e v e n t i n g c o l l a p s e o f w a t e r - c o n d u c t i n g e l e m e n t s a n d p r o v i d e s d e f e n s e a g a i n s t v a r i o u s p a t h o g e n s ( fi I n g i a n d b a c t e r i a ) . T h e s e t h r e e c e l l w a l l c o m p o n e n t s a r e o r g a n i z e d t o g e t h e r i n a c o m p l e x m a t r i x ( s c h e m a t i c c a r t o o n s h o w n i n F i g u r e 2 . 1 ) d e p e n d i n g o n t h e p l a n t c l a d e ( m o n o c o t s v s . d i c o t s ) , t y p e o f c e l l ( s c l e r e n c h y m a v s . p a r e n c h y m a c e l l s ) a n d t y p e o f c e l l w a l l ( p r i m a r y v s . s e c o n d a r y ) . S e v e r a l s i m p l i fi e d m o d e l s o f t h e p r i m a r y c e l l w a l l h a v e b e e n p r e s e n t e d o v e r t h e y e a r s [ 6 2 , 6 3 ] , w i t h l i t t l e w o r k o n u n d e r s t a n d i n g t h e u l t r a — s t r u c t u r a l a r c h i t e c t u r e o f s e c o n d a r y c e l l w a l l s [ 6 4 , 6 5 ] . — — [ 3 4 , 4 l i n k e d g l u c a n — B - 1 , 4 l i n k e d x y l a n 0 a r a b i n o s e I g l u c u r o n i c a c i d U a c e t i c a c i d H f e r u l i c a c i d Q p - c o u m a r i c a c i d F i g u r e 2 . 1 C a r t o o n d e p i c t i n g g r a s s c e l l w a l l u l t r a - s t r u c t u r a l c o m p o n e n t s a s a n i n t e r t w i n e d m a t r i x o f c e l l u l o s e , h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n . C r y s t a l l i n e ( s t r a i g h t , p a r a l l e l l i n e s ) a n d a m o r p h o u s c e l l u l o s e ( c u r v e d , w a v y l i n e s ) m i c r o f i b r i l s a r e c o m p o s e d o f , 6 — 1 , 4 l i n k e d g l u c a n c h a i n s . H e m i c e l l u l o s e ( t h i c k , s h o r t l i n e s ) w i t h n o s i d e - c h a i n s i s h y d r o g e n - b o n d e d t o c e l l u l o s e , w h i l e b r a n c h e s w i t h s i d e — c h a i n s ( o f a r a b i n o s y l , a c e t y l , g l u c u r o n y l g r o u p s s h o w n a s c i r c l e s a n d s q u a r e s ) h e l p i n c r o s s - l i n k i n g c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s . L i g n i n c a r b o h y d r a t e c o m p l e x e s ( b e t w e e n a r a b i n o s e a n d f e r u l i c / c o u m a r i c a c i d s ) f u r t h e r r e s t r i c t a c c e s s o f e n z y m e s t o c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s . C r o s s - l i n k e d l i g n i n m o n o m e r s ( c o n s i s t i n g o f h y d r o x y p h e n y l , s y r i n g y l , g u a i c y l u n i t s ) c o n s t i t u t e t h e c o r e - l i g n i n f r a c t i o n . F i g u r e h a s b e e n a d a p t e d f r o m [ 3 ] . 2 . 1 . 2 C e l l W a l l A r c h i t e c t u r e T h e r e a r e t w o l e v e l s o f s t r u c t u r a l a r r a n g e m e n t w i t h i n t h e p l a n t c e l l w a l l t h a t a f f e c t s t h e r a t e o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s : ( 1 ) M a c r o - S t r u c t u r e a n d ( 2 ) U l t r a - S t r u c t u r e . T h e m a c r o s t r u c t u r a l l e v e l i s o n a s c a l e w h e r e o n e c a n i d e n t i f y t h e v a r i o u s t y p e s o f p l a n t c e l l s ( e . g . p a r e n c h y m a , s c l e r e n c h y m a ) , t i s s u e s a n d c e l l w a l l p i t s / p o r e s . T h i s i s i m p o r t a n t f r o m t h e p o i n t o f v i e w o f r e c o g n i z i n g t h e p h y s i c a l h e t e r o g e n e i t y o f p l a n t b i o m a s s a c r o s s t h e d i f f e r e n t c e l l s a n d t i s s u e s . T h e d i f f e r e n t i a l t r a n s p o r t o f p r e t r e a t m e n t c h e m i c a l s a n d e n z y m e s , t h r o u g h t h i s s u p e r s t r u c t u r e , p l a y s a c r u c i a l r o l e i n u n d e r s t a n d i n g p r e t r e a t m e n t a n d e n z y m a t i c h y d r o l y s i s [ 6 6 ] . T h e u l t r a s t r u c t u r a l l e v e l i s o n t h e m o l e c u l a r s c a l e w h e r e o r g a n i z a t i o n a n d o r i e n t a t i o n o f t h e m o l e c u l e s a f f e c t s t h e p h y s i c o - c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e s y s t e m . T h e c o m p l e x o r g a n i z a t i o n o f v a r i o u s c e l l w a l l c o n s t i t u e n t s m a k e s i t d i f fi c u l t t o u n d e r s t a n d t h e i n t e r a c t i o n s t h a t o c c u r b e t w e e n p r e t r e a t m e n t c h e m i c a l s a n d e n z y m e c o m p l e x e s o n a n u l t r a s t r u c t u r a l l e v e l . T h i s i s f u r t h e r c o m p o u n d e d b y o u r p o o r u n d e r s t a n d i n g o f c e l l w a l l b i o g e n e s i s a n d u l t r a s t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n o f t h e c e l l w a l l , w h i c h i s a s u b j e c t o f o n g o i n g r e s e a r c h [ 6 2 , 6 7 ] . S e v e r a l u l t r a s t r u c t u r a l m o d e l s h a v e b e e n p r o p o s e d t o e x p l a i n t h e p r i m a r y c e l l w a l l ( P C W ) m a t r i x [ 5 6 , 6 3 , 6 8 ] . T h e e x t e n s i v e h y d r o g e n b o n d s i n c e l l u l o s e t h r o u g h i n t e r - c h a i n ( 2 p e r a n h y d r o g l u c o p y r a n o s e ) a n d i n t r a - c h a i n ( 2 t o 3 p e r a n h y d r o g l u c o p y r a n o s e ) i n t e r a c t i o n s p r o d u c e s a s t r a i g h t , s t a b l e s u p r a m o l e c u l a r fi b e r o f g r e a t t e n s i l e s t r e n g t h c a l l e d a s a n ‘ E l e m e n t a r y M i c r o fi b r i l ’ [ 1 1 ] . S e v e r a l g l u c a n c h a i n s a r e a g g r e g a t e d i n t o a S i n g l e e l e m e n t a r y fi b r i l ( 4 — 5 n m w i d t h ) , a n d b u n c h e s o f e l e m e n t a r y fi b r i l s a r e e m b e d d e d i n a m a t r i x o f h e m i c e l l u l o s e r a n g i n g i n t h i c k n e s s f r o m 7 — 3 0 n m [ 5 7 ] . T h e n a t u r a l c o m p o s i t e t h a t r e s u l t s f r o m t h i s c l o s e a s s o c i a t i o n i s r e f e r r e d t o a s a c e l l u l o s e m i c r o f i b r i l . C e l l u l o s e m i c r o fi b r i l a r r a n g e m e n t s i n t h e P C W , s t a b i l i z e d b y h e r r r i c e l l u l o s e a n d p e c t i n c r o s s - l i n k s , a r e r a n d o m l y o r i e n t e d c o m p a r e d t o s e c o n d a r y c e l l w a l l s [ 6 9 , 7 0 ] . T h e r e a r e p r o t e i n s t h a t c a n f u n c t i o n s t r u c t u r a l l y ( e x t e n s i n ) o r p r o v i d e e n z y m a t i c a c t i v i t y ( t r a n s g l y c o l a s e s ) t o h e l p m o d i f y t h e s t r u c t u r e d u r i n g c e l l w a l l e l o n g a t i o n . T h e m a j o r d i f f e r e n c e b e t w e e n p r i m a r y a n d s e c o n d a r y c e l l w a l l s i s t h e i n c l u s i o n o f l i g n i n a n d e x c l u s i o n o f w a t e r i n t h e l a t t e r [ 7 1 ] . S e c o n d a r y c e l l w a l l s ( S C W ) c a n b e v i s u a l i z e d a s c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s e m b e d d e d i n a m a t r i x o f h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n [ 7 2 ] . T h e S C W o f w o o d y b i o m a s s a r e c o m p o s e d o f t h r e e l a m e l l a e r e f e r r e d t o a s 8 1 , S 2 a n d S 3 , w h i c h v a r y i n t h e i r h e l i c a l o r i e n t a t i o n o f c e l l u l o s e fi b r i l s a s w e l l a s t h e e x t e n t o f l i g n i fi c a t i o n [ 7 3 ] . H e m i c e l l u l o s e s a r e t y p i c a l l y r o d - s h a p e d w i t h b r a n c h e s f o l d e d b a c k t o t h e m a i n c h a i n b y m e a n s o f h y d r o g e n b o n d i n g . T h i s r o d - l i k e s t r u c t u r e f a c i l i t a t e s t h e i r i n t e r a c t i o n w i t h c e l l u l o s e , r e s u l t i n g i n a t i g h t a s s o c i a t i o n [ 7 4 ] . H e m i c e l l u l o s e m o n o l a y e r s c a n b e s a n d w i c h e d b e t w e e n c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e d o m a i n s d u r i n g t h e s y n t h e s i s o f c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s [ 7 5 ] . L i g n i n l o c a t e d p r i m a r i l y t o t h e e x t e r i o r o f c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s , w h e r e i t i s c o v a l e n t l y l i n k e d t o h e m i c e l l u l o s e s i d e - c h a i n s [ 1 4 ] , i s c a l l e d n o n - c o r e l i g n i n . F r e e r a d i c a l p o l y m e r i z a t i o n o f n o n - c o r e l i g n i n t o p h e n o l i c m o n o m e r s r e s u l t s i n a h i g h l y c o n d e n s e d c o r e l i g n i n . C o v a l e n t h e m i c e l l u l o s e - l i g n i n b o n d s i n v o l v e e s t e r a n d e t h e r l i n k a g e s t h a t f o r m t h e l i g n i n - c a r b o h y d r a t e - c o m p l e x e s ( L C C ) [ 7 6 ] . T h e c l e a v a g e o f t h e s e L C C b o n d s h a s b e e n p r o p o s e d t o b e a n i m p o r t a n t f a c t o r t h a t f a c i l i t a t e s e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . N o c l e a r r e l a t i o n s h i p h a s b e e n i d e n t i fi e d b e t w e e n b i o m a s s d i g e s t i b i l i t y a n d l i g n i n c o n t e n t d u e t o l i g n i n q u a n t i fi c a t i o n i s s u e s [ 7 7 ] a n d t y p e o f l i g n i n - h e m i c e l l u l o s e c r o s s - l i n k a g e s t h a t a r e n o t t a k e n i n t o a c c o u n t [ 1 7 , 7 8 ] . H y d r o x y c i n n a m i c a c i d s ( e . g . C o u m a r i c , 1 0 F e r u l i c ) a r e i m p o r t a n t L C C c o m p o n e n t s t h a t h e l p c r o s s - l i n k h e m i c e l l u l o s e t o l i g n i n i n x y l e m & s c l e r e n c h y m a t i s s u e s o f g r a s s e s t h r o u g h c a r b o x y l a n d h y d r o x y l g r o u p s [ 7 8 ] . C o r e l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e a r e p r i m a r i l y e s t e r i fi e d v i a f e r u l a t e ( 3 0 - 7 0 % e s t e r ) o r c o u m a r a t e ( 9 0 % e s t e r ) l i n k a g e s [ 1 7 ] . C o u m a r i c a c i d ( C A ) b a s e d e s t e r s m a k e u p t o 2 0 % o f t h e l i g n i n i n m a i z e t i s s u e s [ 7 9 - 8 2 ] . M a j o r i t y o f C A e s t e r l i n k a g e s ( ~ 8 0 % ) a r e w i t h t e r m i n a l h y d r o x y g r o u p s o f c o r e l i g n i n t h a t a l s o h e l p s b u i l d i n t e r n a l l i g n i n b r i d g e s [ 1 7 ] . U n l i k e c o u m a r a t e e s t e r s , f e r u l a t e e s t e r s ( F A ) a c y l a t e d t o p o l y s a c c h a r i d e s h a v e t h e i r c a r b o x y l g r o u p s e s t e r i fi e d t o t h e C S - h y d r o x y l s o f a r a b i n o s y l s i d e - c h a i n r e s i d u e s o f x y l a n [ 8 3 - 8 6 ] . S i g n i fi c a n t l y l o w e r a m o u n t s o f a r a b i n o s e u n i t s ( 1 i n 3 0 ) w e r e f o u n d t o b e e s t e r i fi e d t o C A c o m p a r e d t o P A ( 1 i n 1 5 ) f o r b a r l e y s t r a w [ 1 7 ] . D u r i n g S C W l i g n i fi c a t i o n n e i g h b o r i n g x y l a n s a r e f u r t h e r c r o s s - l i n k e d t h r o u g h p e r o x i d a s e m e d i a t e d o x i d a t i o n a n d c o - p o l y m e r i z a t i o n o f f e r u l a t e h y d r o x y l g r o u p s t o x y l a n a n d l i g n i n , r e s p e c t i v e l y [ 1 7 , 8 7 , 8 8 ] . P A i s d e p o s i t e d i n t h e e a r l y s t a g e s o f c e l l w a l l d e v e l o p m e n t ( i n t h e m i d d l e l a m e l l a a n d p r i m a r y c e l l w a l l ) a n d f o r m s a s c a f f o l d f o r l i g n i fi c a t i o n ; w h i l e C A i s d e p o s i t e d i n l a t e r s t a g e s o f S C W l i g n i fi c a t i o n [ 1 7 ] . F A a n d C A h a v e b e e n f o u n d t o b e t h e p r e d o m i n a n t L C C c o m p o n e n t s l i n k e d t o t h e a r a b i n o s e s i d e - c h a i n s o f x y l a n . H o w e v e r , o t h e r s t u d i e s [ 1 7 ] h a v e a l s o i n d i c a t e d p r e s e n c e o f u r o n i c a c i d r e s i d u e s o n t h e x y l a n b a c k b o n e t h a t m a y b e e s t e r i fi e d t o l i g n i n p h e n o l i c s . B e n z y l e t h e r l i n k a g e s t o u r o n i c s s h o u l d b e l e s s f r e q u e n t i n g r a s s e s c o m p a r e d t o s o m e w o o d y s p e c i e s . S t u d i e s w i t h m o d e l c o m p o u n d s a n d w o o d y s p e c i e s i n d i c a t e c r o s s - l i n k i n g o f c e l l w a l l c o m p o n e n t s w i t h l i g n i n - q u i n o n e m e t h i d e i n t e r m e d i a t e s t h r o u g h B — O - 4 c o u p l i n g o f m o n o l i g n o l s [ 8 9 ] . H o w e v e r , v e r y f e w s t u d i e s h a v e a c t u a l l y S h o w n t h e p r e s e n c e o f b e n z y l e s t e r a n d e t h e r c r o s s - l i n k a g e s e x c e p t s o m e i n d i r e c t s t u d i e s t h a t 1 1 s h o w e d i m p r o v e m e n t i n c e l l u l a s e d i g e s t i b i l i t y i n p r e s e n c e o f a m m o n i a t e d a n d h y d r o x y p r o p y l a t e d m o d e l c o m p o u n d s a t t r i b u t e d t o s u p p r e s s i o n o f q u i n i n e - m e t h i d e i n t e r m e d i a t e c r o s s - l i n k i n g [ 9 0 - 9 2 ] . G r a b b e r a n d c o l l e a g u e s h a v e s h o w n t h a t p o o r d e g r a d a b i l i t y o f D H P ( d e h y d r o g e n a t i o n p o l y m e r ) b a s e d c e l l w a l l s i s r e l a t e d t o e n h a n c e d b e n z y l e s t e r a n d e t h e r c r o s s - l i n k i n g [ 9 3 ] H y d r o x y p r o l i n e s ( g l y c o p r o t e i n s ) m a y a l s o b e c r o s s - l i n k e d t o l i g n i n t h r o u g h i s o d i t y r o s i n e b r i d g e s a n d w i t h f e r u l o y l a t e d h e t e r o x y l a n s i n g r a s s e s [ 9 4 ] . 2 . 2 T h e r m o c h e m i c a l P r e t r e a t m e n t s P r e t r e a t m e n t s c a n b e c l a s s i fi e d b a s e d o n t h e n a t u r e o f c e l l w a l l d i s r u p t i o n ( i . e . p h y s i c a l o r c h e m i c a l ) i n t o f o u r c a t e g o r i e s [ 9 5 ] ; ( a ) P h y s i c a l , ( b ) S o l v e n t fi a c t i o n a t i o n , ( 0 ) C h e m i c a l a n d , ( ( 1 ) B i o l o g i c a l p r e t r e a t m e n t . T h e r m o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s i s l m o w n t o e n h a n c e t h e r a t e o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s b y 5 - 1 0 f o l d . D e p e n d i n g o n t h e p r e t r e a t m e n t c a t a l y s t a n d s o l v e n t u s e d , i t i s p o s s i b l e t o s o l u b i l i z e , h y d r o l y z e a n d p h y s i c a l l y s e p a r a t e c e l l u l o s e , h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n [ 9 6 ] . S e v e r a l t y p e s o f p r e t r e a t m e n t c h e m i c a l s / s o l v e n t s h a v e b e e n u s e d , s u c h a s , c o n c e n t r a t e d a c i d [ 9 7 ] , d i l u t e a c i d [ 9 8 ] , c a u s t i c s o d a [ 9 9 ] , s u l p h u r d i o x i d e [ 1 0 0 ] , h y d r o g e n p e r o x i d e [ 1 0 1 ] , s t e a m [ 1 0 2 ] , l i q u i d a m m o n i a [ 1 0 3 ] , a l k a l i - p e r o x i d e [ 1 0 4 ] , l i m e [ 1 0 5 ] , l i q u i d h o t w a t e r [ 1 0 6 ] , c a r b o n d i o x i d e [ 7 ] , a n d s e v e r a l o r g a n i c s o l v e n t s [ 1 0 7 ] . M o s t p r e t r e a t m e n t s p h y s i c a l l y e x t r a c t l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e i n t o s e p a r a t e l i q u i d p r o c e s s s t r e a m s , h e n c e i m p r o v i n g c e l l u l a s e a c c e s s i b i l i t y [ 1 0 2 , 1 0 8 - 1 1 3 ] . H o w e v e r , A F E X d o e s n o t p h y s i c a l l y e x t r a c t l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e l i k e o t h e r p r e t r e a t m e n t s b u t m o d i f i e s t h e c e l l w a l l u l t r a - s t r u c t u r e t h r o u g h a m e c h a n i s m t h a t i s c u r r e n t l y p o o r l y u n d e r s t o o d . 1 2 2 . 2 . 1 P h y s i c a l P r e t r e a t m e n t s P h y s i c a l p r e t r e a t m e n t s p h y s i c a l l y d i s r u p t t h e l i g n o c e l l u l o s e s t r u c t u r e w i t h l i t t l e o r n o c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s t o t h e i n d i v i d u a l c e l l w a l l c o m p o n e n t s . S o m e t y p i c a l m e t h o d s f o r p h y s i c a l p r e t r e a t m e n t i n c l u d e b i o m a s s p a r t i c l e s i z e r e d u c t i o n t h r o u g h c o m m u n i t i o n , i n c l u d i n g d r y , w e t , v i b r a t o r y a n d c o m p r e s s i o n b a s e d b a l l m i l l i n g [ 1 1 4 — 1 1 7 ] . P h y s i c a l t r e a t m e n t s h e l p i n c r e a s e e n z y m e a c c e s s i b i l i t y b y i n c r e a s i n g b i o m a s s s u r f a c e a r e a t o v o l u m e r a t i o . I n s o m e c a s e s , e x t e n s i v e b a l l m i l l i n g r e s u l t s i n d e c r y s t a l l i z a t i o n o f c e l l u l o s e a n d r e d u c t i o n i n d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n [ 1 1 8 ] . P a r t i c l e s i z e r e d u c t i o n a l o n e i s n o t a s u f f i c i e n t p r e t r e a t m e n t t o s i g n i fi c a n t l y e n h a n c e t h e r a t e o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . T h e c o s t o f s i z e r e d u c t i o n a l s o i n c r e a s e s e x p o n e n t i a l l y b e y o n d a c e r t a i n s i z e r a n g e m a k i n g i t e c o n o m i c a l l y u n f e a s i b l e [ 1 1 9 ] . H o w e v e r , s o m e s o r t o f m i n i m a l p a r t i c l e s i z e r e d u c t i o n i s n e c e s s a r y p r i o r t o m o s t p r e t r e a t m e n t s t o i m p r o v e m a t e r i a l h a n d l i n g d u r i n g p r o c e s s i n g . 2 . 2 . 2 S o l v e n t F r a c t i o n a t i o n B a s e d P r e t r e a t m e n t s S o l v e n t f r a c t i o n a t i o n u s i n g v a r i o u s s o l v e n t s t h a t c a n s e l e c t i v e l y s o l u b i l i z e c e l l u l o s e , h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n c a n a l s o b e u s e d t o p r e t r e a t l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s . C e l l u l o s i c s o l v e n t s l i k e h y d r a z i n e , D M S O a n d c o n c e n t r a t e d m i n e r a l a c i d s c a n d i s r u p t h y d r o g e n b o n d i n g b e t w e e n c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s t o s o l u b i l i z e c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e [ 1 2 0 ] . 2 . 2 . 2 . 1 O r g a n o s o l v p r o c e s s H i s t o r i c a l l y , t h e o r g a n o s o l v p r o c e s s w a s i n v e s t i g a t e d l a r g e l y f r o m t h e p e r s p e c t i v e o f p a p e r p r o d u c t i o n ( v i a p u l p i n g ) f r o m h a r d w o o d s . O r g a n o s o l v p r o c e s s i n c l u d e s e x t r a c t i n g l i g n i n f r o m l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s u s i n g o r g a n i c s o l v e n t s l i k e a r o m a t i c a l c o h o l s ( p h e n o l s ) o r a l i p h a t i c a l c o h o l s ( e . g . e t h y l e n e g l y c o l , m e t h a n o l , e t h a n o l , b u t a n o l , g l y c e r o l ) t y p i c a l l y w i t h a n a c i d i c c a t a l y s t [ 1 2 1 - 1 2 3 ] . T h e e f f e c t o f o r g a n o s o l v b a s e d p r o c e s s 1 3 p a r a m e t e r s ( e . g . ' s o l v e n t c o m p o s i t i o n , t e m p e r a t u r e , l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g ) o n f r a c t i o n a t i o n o f t h e m a j o r c o m p o n e n t s i n w o o d y b i o m a s s h a s b e e n e x t e n s i v e l y s t u d i e d o v e r t h e y e a r s [ 1 2 4 ] . T y p i c a l e t h a n o l b a s e d o r g a n o s o l v p r e t r e a t m e n t p a r a m e t e r s h a v e t h e f o l l o w i n g r a n g e s ; t e m p e r a t u r e s ( 9 0 - 1 2 0 ° C f o r g r a s s e s a n d 1 5 5 - 2 2 0 ° C f o r h a r d / s o f t w o o d s ) , r e a c t i o n t i m e s ( 2 5 - 1 0 0 m i n ) , a c i d c a t a l y s t l o a d i n g ( 0 . 5 - 2 % ) , a n d e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n s ( Z S - 7 5 % v / v ) . C o m p a r e d t o a l i p h a t i c a l c o h o l s , a r o m a t i c a l c o h o l s w e r e f o u n d t o b e m o r e e f f e c t i v e i n s o l u b i l i z i n g l i g n i n fi ' o m d i f f e r e n t f e e d s t o c k s [ 1 2 5 ] . I n a d d i t i o n t o a l c o h o l s , v a r i o u s a m i n e s h a v e b e e n u s e d t o d e l i g n i f y l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s , b u t a m i n e s a l s o t e n d t o s o l u b i l i z e s u b s t a n t i a l a m o u n t s o f c a r b o h y d r a t e s i n a d d i t i o n t o l i g n i n . A n e t h a n o l - b a s e d o r g a n o s o l v p r o c e s s h a s b e e n c o m m e r c i a l i z e d b y L i g n o l I n n o v a t i o n C o r p o r a t i o n ( V a n c o u v e r , C a n a d a ) t o s e p a r a t e l i g n i n , h e m i c e l l u l o s e a n d c e l l u l o s e f r a c t i o n s f r o m w o o d y b i o m a s s [ 1 2 6 ] . T h e i n s o l u b l e c e l l u l o s e f r a c t i o n i s s u b j e c t e d t o e n z y m a t i c h y d r o l y s i s t o p r o d u c e f e r m e n t a b l e s u g a r s , W h i l e t h e l i q u o r f r o m t h e o r g a n o s o l v s t e p c a n b e fi r r t h e r p r o c e s s e d t o r e c o v e r l i g n i n , fi I r f u r a l , x y l o s e , a c e t i c a c i d a n d l i p o p h y l i c e x t r a c t i v e b a s e d f r a c t i o n s . E t h a n o l u s e d i n t h e p r o c e s s i s d i s t i l l e d a n d r e u s e d . T h e l i g n i n fi a c t i o n r e c o v e r e d c a n b e u s e d a s a n a d d i t i v e b i n d e r a m o n g o t h e r a p p l i c a t i o n s . I n t h e c a s e o f p o p l a r , a b o u t 8 8 % o f t h e t o t a l c e l l u l o s e i s r e c o v e r a b l e a s m o n o m e r i c g l u c o s e a f t e r 1 0 0 h o u r s o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f t h e r e s i d u a l s o l i d f r a c t i o n . 2 . 2 . 2 . 2 F r a c t i o n a t i o n u s i n g p h o s p h o r i c a c i d F r a c t i o n a t i o n o f l i g n o c e l l u l o s e s t o a m o r p h o u s c e l l u l o s e , h e m i c e l l u l o s e , l i g n i n a n d a c e t i c a c i d u s i n g c o n c e n t r a t e d p h o s p h o r i c a c i d , a c e t o n e a n d w a t e r b a s e d m i x t u r e s i s n o v e l s o l v e n t f r a c t i o n a t i o n b a s e d p r e t r e a t m e n t [ 1 2 7 ] . P h o s p h o r i c a c i d b a s e d p r e t r e a t m e n t s m a y b e c a r r i e d o u t a t m o d e r a t e r e a c t i o n c o n d i t i o n s ( i . e . 5 0 ° C , 1 b a r ) , w h i c h m i n i m i z e s a c i d 1 4 c a t a l y z e d d e g r a d a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s . T h e p r o c e s s g a v e 9 8 % a n d 8 9 % r e c o v e r y y i e l d f o r g l u c o s e a n d x y l o s e , r e s p e c t i v e l y , u p o n f r a c t i o n a t i o n o f c o r n s t o v e r . T h e s e l e c t i v e f r a c t i o n a t i o n o f c e l l w a l l c o m p o n e n t s i s p o s s i b l e d u e t o s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e i n s o l u b i l i t y o f c e l l u l o s e , h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n i n p h o s p h o r i c a c i d - a c e t o n e - w a t e r m i x t u r e s . T h e o r g a n i c s o l v e n t s a r e e a s i l y r e c o v e r a b l e d u e t o d i f f e r e n c e i n v o l a t i l i t y w i t h r e s p e c t t o p h o s p h o r i c a c i d [ 1 2 7 - 1 2 9 ] . D e s p i t e s e v e r a l a d v a n t a g e s a s s o c i a t e d w i t h t h i s p r e t r e a t m e n t m e t h o d , w h i c h i n c l u d e e n h a n c e d r a t e o f a m o r p h o u s c e l l u l o s e h y d r o l y s i s a n d l o w p r e t r e a t m e n t u t i l i t y c o s t s ( e . g . 5 0 ° C v s . 1 0 0 - 2 0 0 ° C f o r o t h e r t h e r m o c h e m i c a l t r e a t m e n t s ) ; t h e r e a r e s e v e r a l t e c h n i c a l c h a l l e n g e s ( e . g . s o l v e n t c o s t a n d r e c o v e r y , x y l o s e r e c o v e r y a n d f e r m e n t a t i o n ) t h a t n e e d t o b e a d d r e s s e d t o m a k e t h i s p r o c e s s c o m m e r c i a l l y v i a b l e . O t h e r i s s u e s i n c l u d e p h o s p h o r i c a c i d / s u g a r s e p a r a t i o n , a c i d r e c o v e r y , a n d a c i d r e - c o n c e n t r a t i o n . 2 . 2 . 2 . 3 I o n i c l i q u i d b a s e d fi ' a c t i o n a t i o n I o n i c l i q u i d s ( I L ) a r e n o n - v o l a t i l e s o l v e n t s , u n d e r a t m o s p h e r i c c o n d i t i o n s , c o m p o s e d e x c l u s i v e l y o f i o n s h e l d t o g e t h e r b y c o u l o m b i c f o r c e s . T h e fi r s t r e p o r t e d I L t h a t c o u l d s o l u b i l i z e c e l l u l o s e w a s b a c k i n 1 9 3 4 u s i n g m o l t e n N - e t h y l p y r i d i n i u r n c h l o r i d e , i n t h e p r e s e n c e o f n i t r o g e n - c o n t a i n i n g b a s e s [ 1 3 0 ] . H o w e v e r , t h e a p p l i c a t i o n o f I L a s l i g n o c e l l u l o s e p r e t r e a t m e n t c a t a l y s t h a s g a i n e d m o m e n t u m i n r e c e n t y e a r s [ 1 3 1 ] . C e l l u l o s e - d i s s o l v i n g I L u s u a l l y c o n t a i n s a n i o n s o f c h l o r i d e , f o n n a t e , a c e t a t e o r a l k y l p h o s p h o n a t e , s i n c e t h e s e i o n s f o r m s t r o n g h y d r o g e n b o n d s w i t h c e l l u l o s e . D u r i n g a t y p i c a l I L p r e t r e a t m e n t o f l i g n o c e l l u l o s i c s , t h e b i o m a s s a d d e d t o i o n i c l i q u i d s ( r a t i o o f 1 : 1 0 - 1 5 , w a t ) i s h e a t e d ( S O - 1 5 0 ° C ) t o s o l u b i l i z e t h e c e l l u l o s i c , h e m i c e l l u l o s i c a n d l i g n i n c o m p o n e n t s [ 1 3 2 ] . T h e u n - d i s s o l v e d r e s i d u e i s fi l t e r e d f r o m s o l u t i o n a n d a n t i - 1 5 s o l v e n t s ( e . g . w a t e r / m e t h a n o l / e t h a n o l ) a r e a d d e d t o t h e s o l u t i o n t o r e c o v e r t h e s o l u b i l i z e d c e l l u l o s e ( a s a m o r p h o u s c e l l u l o s e ) . T h e m a s s r e c o v e r y o f l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e i s c u r r e n t l y u n k n o w n f o r c o r n s t o v e r [ 1 3 2 ] . I L c a n b e r e c o v e r e d f r o m t h e a n t i - s o l v e n t b y fl a s h d i s t i l l a t i o n a n d r e - u s e d i n t h e p r o c e s s [ 1 3 1 - 1 3 4 ] . T y p i c a l l y , i o n i c l i q u i d s t h a t i n c o r p o r a t e a n i o n s a r e f o u n d t o b e m o r e e f f e c t i v e i n s o l u b i l i z i n g c e l l u l o s e , d u e t o s t r o n g e r h y d r o g e n b o n d i n g b e t w e e n t h e a n i o n a n d c e l l u l o s e h y d r o x y l g r o u p s . O n t h e o t h e r h a n d , I L w i t h n o n — c o o r d i n a t i n g a n i o n s a n d l o n g - c h a i n s u b s t i t u t i o n a r e p o o r c e l l u l o s e s o l v e n t s . I L w i t h c h l o r i d e a n i o n s a p p e a r t o b e t h e m o s t e f f e c t i v e s o l v e n t s , w h i l e I L w i t h a r o m a t i c s i d e c h a i n s r e q u i r e h i g h e r t e m p e r a t u r e s t o s o l u b i l i z e c e l l u l o s e , d u e t o t h e i r h i g h e r m e l t i n g p o i n t s a n d v i s c o s i t i e s [ 1 3 3 ] . W h i l e m o s t o f t h e r e p o r t s o n I L b a s e d p r e t r e a t m e n t s a r e o n p r o c e s s e d c e l l u l o s e ( e . g . A v i c e l , S i g r n a c e l l ) , t h e r e a r e r e c e n t p u b l i c a t i o n s t h a t h a v e p r e t r e a t e d w o o d y b i o m a s s [ 1 3 6 , 1 3 7 ] . T h e s o l u b i l i z a t i o n e f f i c i e n c y o f h a r d w o o d s i n I L w a s f o u n d t o v a r y i n t h e f o l l o w i n g o r d e r ; b a l l - m i l l e d w o o d p o w d e r > s a w d u s t > t h e r m o m e c h a n i c a l p u l p > w o o d c h i p . W o o d fl o u r s o l u b i l i z a t i o n w a s t e s t e d u s i n g [ E m i m ] + [ C H 3 C O O ] - ( l - e t h y l - 3 - m e t h y l i m i d a z o l i u m a c e t a t e ) b a s e d I L a s a f u n c t i o n o f p r e t r e a t m e n t t i m e a n d t e m p e r a t u r e . I n c r e a s i n g r e s i d e n c e t i m e a n d I L t r e a t m e n t t e m p e r a t u r e c a u s e d a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n c e l l u l o s e c r y s t a l l i n i t y ; w h i l e i m p r o v i n g l i g n i n s o l u b i l i t y ( 2 0 - 6 0 % s o l u b i l i z e d ) a n d e n h a n c i n g r e g e n e r a t e d b i o m a s s e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y . G r e a t e r t h a n 9 0 % g l u c a n d i g e s t i b i l i t y w a s a c h i e v e d u s i n g c o m m e r c i a l e n z y m e s a f t e r 2 4 h o u r s o f h y d r o l y s i s . T h e r e a r e s e v e r a l c o n c e r n s t h a t n e e d t o b e a d d r e s s e d t o f a c i l i t a t e c o m m e r c i a l i z a t i o n o f I L b a s e d p r e t r e a t m e n t s . T h e s e i n c l u d e c o s t o f i o n i c l i q u i d s , r e c o v e r y o f I L a f t e r p r e t r e a t m e n t , h e m i c e l l u l o s e r e c o v e r y y i e l d a n d e n z y m e / m i c r o b i a l c o m p a t i b i l i t y o f I L [ 1 3 4 ] . 1 6 R = t x e x p [ ( T _ l O O ) / l 4 . 7 5 ] 2 . 2 . 3 C h e m i c a l P r e t r e a t m e n t s 2 . 2 . 3 . 1 A c i d i c p r e t r e a t m e n t s M o s t a c i d i c b a s e d p r e t r e a t m e n t s ( l i k e d i l u t e a c i d , s t e a m e x p l o s i o n a n d l i q u i d h o t w a t e r t r e a t m e n t ) h a v e v e r y s i m i l a r c h e m i s t r i e s b u t v a r y i n t h e r m o c h e m i c a l s e v e r i t y . T h e a c i d i c c a t a l y s t i s e i t h e r s u p p l e m e n t e d e x t e r n a l l y ( a s m i n e r a l a c i d s ) o r i s f o r m e d d u e t o h y d r o l y s i s o f h e m i c e l l u l o s e a c e t y l l i n k a g e s ( f o r m i n g a c e t i c a c i d ) a n d d e g r a d a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s a n d l i g n i n t o s h o r t - c h a i n a l i p h a t i c a c i d s a n d p h e n o l i c a c i d s , r e s p e c t i v e l y . W a t e r i t s e l f b e h a v e s a s a n a c i d a t h i g h t e m p e r a t u r e s t y p i c a l l y e m p l o y e d i n m o s t p r e t r e a t m e n t s [ 1 3 5 ] . T h e a c i d i s r e s p o n s i b l e f o r h y d r o l y t i c c l e a v a g e a n d r e m o v a l o f h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n , h e n c e i m p r o v i n g e n z y m a t i c a c c e s s i b i l i t y o f c e l l u l o s e . T h e e x t e n t o f r e m o v a l o f h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n v a r i e s c o n s i d e r a b l y b e t w e e n v a r i o u s a c i d i c p r e t r e a t m e n t s d e p e n d i n g o n t h e s e v e r i t y o f p r e t r e a t m e n t . T h e s e v e r i t y o f a c i d i c p r e t r e a t m e n t s c a n b e q u a n t i fi e d u s i n g a s i m p l e r e l a t i o n s h i p w h i c h h e l p s c o u p l e t h e e f f e c t o f t i m e ( t ) , t e m p e r a t u r e ( T ) a n d a c i d i t y ( p H ) i n t o a s i n g l e f a c t o r k n o w n a s t h e ‘ c o m b i n e d s e v e r i t y f a c t o r ( S ) ’ [ 1 3 6 ] . l o g ( S ) = 1 0 g ( R ) - p H H i g h e r a c i d p r e t r e a t m e n t s e v e r i t i e s , r e f e r r i n g t o l o n g e r r e s i d e n c e t i m e s , h i g h e r t e m p e r a t u r e s a n d l o w e r p H v a l u e s , r e s u l t i n e x t e n s i v e h y d r o l y s i s o f h e m i c e l l u l o s e t o m o n o m e r i c s u g a r s . H o w e v e r , h i g h e r p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y a l s o r e s u l t s i n t h e d e g r a d a t i o n o f l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e d e r i v a t i v e s t o c o m p o u n d s l i k e f u r f u r a l , 5 - h y d r o x y m e t h y l f u r f u r a l , l e v u l i n i c a c i d , p h e n o l i c a c i d s / a l d e h y d e s a n d o t h e r a l i p h a t i c a c i d s t h a t c a n s e v e r e l y i n h i b i t d o w n s t r e a m b i o l o g i c a l p r o c e s s i n g [ 1 3 7 ] . M o s t a c i d i c b a s e d l 7 p r e t r e a t m e n t s l o o k t o o p t i m i z e s e v e r i t y b y t r a d i n g - o f f b e t w e e n e n h a n c e d c e l l u l o s e e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y , h e m i c e l l u l o s e h y d r o l y s i s y i e l d s a n d m i n i m i z i n g f o r m a t i o n o f b i o l o g i c a l i n h i b i t o r s . D i l u t e - a c i d p r e t r e a t m e n t ( u s i n g e i t h e r s u l f u r i c , h y d r o c h l o r i c o r n i t r i c a c i d ) w a s o n e o f t h e fi r s t p r e t r e a t m e n t m e t h o d s t h a t w a s i m p l e m e n t e d t o p r e t r e a t l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s t o p r o d u c e e t h a n o l [ 1 3 8 ] . T r a d i t i o n a l l y , d i l u t e a c i d b a s e d h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s h a s b e e n u s e d t o m a n u f a c t u r e f u r f u r a l t h r o u g h b r e a k d o w n o f h e m i c e l l u l o s e [ 1 3 9 ] . T h e r e m a i n i n g c e l l u l o s i c f r a c t i o n w a s t y p i c a l l y h y d r o l y z e d t o m o n o m e r i c g l u c o s e u s i n g c o n c e n t r a t e d a c i d ( I O - 3 0 % ) p r i o r t o f e r m e n t a t i o n [ 1 4 0 ] . H o w e v e r , w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f g e n e t i c a l l y m o d i fi e d m i c r o b e s t h a t c a n c o — f e r m e n t g l u c o s e a n d x y l o s e i t b e c a m e n e c e s s a r y t o p r e v e n t d e g r a d a t i o n o f h e m i c e l l u l o s e t o f u r fi r r a l t o i m p r o v e e t h a n o l y i e l d s . T h i s h a s r e s u l t e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f d i l u t e - a c i d b a s e d p r e t r e a t m e n t s , t y p i c a l l y u s i n g s u l f u r i c a c i d , c a r r i e d o u t u s i n g l o w e r a c i d c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 0 5 - 5 % ) a n d t e m p e r a t u r e s ( 1 6 0 - 2 2 0 ° C ) [ 1 4 1 , 1 4 2 ] . D i l u t e - a c i d p r e t r e a t m e n t c a n b e c a r r i e d o u t i n a s t a t i o n a r y b a t c h m o d e o r fl o w - t h r o u g h c o n t i n u o u s m o d e [ 1 4 3 , 1 4 4 ] . S t e a m e x p l o s i o n i s o n e o f t h e m o s t w i d e l y i m p l e m e n t e d p r e t r e a t m e n t m e t h o d o l o g i e s t o p r e t r e a t s e v e r a l t y p e s o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s ( e . g . a g r i c u l t u r a l r e s i d u e s , h a r d w o o d s a n d s o fi w o o d s ) . S t e a m e x p l o s i o n i s t y p i c a l l y c a r r i e d o u t b y r a p i d l y h e a t i n g l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s w i t h h i g h p r e s s u r e s a t u r a t e d s t e a m w i t h / w i t h o u t e x t e r n a l c h e m i c a l a d d i t i o n ( t y p i c a l l y a c i d s ) f o r c e r t a i n d u r a t i o n o f t i m e ( r a n g i n g fi ' o m a f e w s e c o n d s t o m i n u t e s ) , a t fi x e d t e m p e r a t u r e ( 1 6 0 - 2 9 0 ° C ) p r i o r t o e x p l o s i v e l y r e l e a s i n g t h e p r e s s u r e [ 1 1 3 , 1 4 5 , 1 4 6 ] . T h e r e h a v e b e e n s e v e r a l r e p o r t e d v a r i a n t s o f t h e s t e a m e x p l o s i o n 1 8 p r o c e s s . T h e s e v a r i a n t s t y p i c a l l y i n c o r p o r a t e p r e - i m p r e g n a t i o n w i t h a n a c i d ( l i k e s u l f u r i c a c i d , s u l f u r d i o x i d e ) o r a l k a l i ( l i k e s o d i u m h y d r o x i d e , a m m o n i a ) p r i o r t o s t e a m e x p l o s i o n [ 1 4 7 - 1 5 1 ] . L i q u i d h o t w a t e r p r e t r e a t m e n t ( a l s o k n o w n a s h y d r o t h e r m a l o r a q u a s o l v t r e a t m e n t ) i s a l o w s e v e r i t y a c i d b a s e d p r e t r e a t m e n t t h a t u s e s w a t e r a t h i g h p r e s s u r e s ( > 5 M P a ) t o m a i n t a i n i t i n t h e l i q u i d s t a t e a t e l e v a t e d t e m p e r a t u r e s ( 1 6 0 - 2 3 0 0 C ) t o p r e t r e a t l i g n o c e l l u l o s i c s [ 1 3 5 , 1 5 1 , 1 5 2 ] . T h e l i q u i d w a t e r i s c o n t a c t e d w i t h t h e b i o m a s s i n t h r e e p o s s i b l e m o d e s ; c o - c u r r e n t , c o u n t e r - c u r r e n t a n d fl o w - t h r o u g h [ 9 5 ] . R e c e n t v a r i a n t s t o t h e l i q u i d h o t w a t e r p r e t r e a t m e n t p r o c e s s a l l o w f o r b e t t e r p H c o n t r o l ( r a n g i n g f r o m p H 4 - 7 ) t h a t l i m i t s n o n - s p e c i fi c d e g r a d a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s [ 1 5 2 ] . I n a d d i t i o n t o m i n e r a l a c i d s ( l i k e s u l f u r i c a c i d , n i t r i c a c i d ) , o r g a n i c a c i d s ( c a r b o n i c , a c e t i c , s u c c i n i c , f u m a r i c , m a l e i c , c i t r i c a c i d ) h a v e b e e n u s e d a s c a t a l y s t s ( a t 5 0 m M c o n c e n t r a t i o n ) f o r p r e t r e a t m e n t o f b i o m a s s [ 1 5 3 ] . I t w a s r e p o r t e d t h a t m a l e i c a n d f u m a r i c a c i d s h a d s u p e r i o r s e l e c t i v i t y f o r t h e p r o d u c t i o n o f f e r m e n t a b l e s u g a r s f r o m c e l l u l o s e t h a n s u l f u r i c a c i d [ 1 5 4 ] . A t h i g h t e m p e r a t u r e s ( 1 5 0 ° C ) s u l fi r r i c a c i d d e g r a d e s m o n o m e r i c s u g a r s t o u n d e s i r a b l e b y - p r o d u c t s , w h i l e m a l e i c / f u m a r i c a c i d d o e s n o t . C o r n s t o v e r , a t h i g h s o l i d s l o a d i n g ( 1 5 0 - 2 0 0 g / l i t e r ) , p r e t r e a t e d b y s u l f u r i c a c i d r e s u l t e d i n 3 0 % d e g r a d a t i o n o f x y l o s e t o f u r f u r a l . W h i l e , u s i n g m a l e i c a c i d p r e s e r v e d ~ 9 5 % o f m o n o m e r i c x y l o s e a n d r e s u l t e d i n g r e a t e r t h a n 9 0 % g l u c o s e y i e l d a f t e r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s ( 1 5 F P U o f c e l l u l a s e / g o f c e l l u l o s e ) o f t h e x y l a n d e p l e t e d s u b s t r a t e . T h e u n c o n d i t i o n e d h y d r o l y z a t e w a s f e r m e n t e d b y r e c o m b i n a n t S . c e r e v i s i a e r e s u l t i n g i n 8 7 % t h e o r e t i c a l e t h a n o l y i e l d . D e t a i l e d e c o n o m i c a n a l y s i s i s n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e t h e e c o n o m i c f e a s i b i l i t y o f t h i s p r o c e s s [ 1 5 5 , 1 5 6 ] . I n f e w r e p o r t s c a r b o n i c a c i d , f o r m e d b y 1 9 d i s s o l u t i o n o f c a r b o n d i o x i d e , w a s u s e d a s a n o r g a n i c a c i d t o c a r r y o u t p r e t r e a t m e n t [ 1 5 7 ] . 2 . 2 . 3 . 2 A l k a l i n e p r e t r e a t m e n t s A l k a l i b a s e d p r e t r e a t m e n t s d i f f e r i n t h e t y p e a n d t h e r m o d y n a m i c s t a t e o f t h e c a t a l y s t - s o l v e n t s y s t e m s e m p l o y e d . A l k a l i s u s e d f o r p r e t r e a t m e n t t y p i c a l l y i n c l u d e c a l c i u m h y d r o x i d e , a m m o n i a a n d s o d i u m h y d r o x i d e . M o s t a l k a l i p r e t r e a t m e n t s h e l p l o w e r r e c a l c i t r a n c e o f l i g n o c e l l u l o s i c s t h r o u g h c l e a v a g e o f h e m i c e l l u l o s e a c e t y l a n d l i g n i n - c a r b o h y d r a t e c o m p l e x l i n k a g e s [ 1 6 , 1 8 ] . O n e o f t h e o t h e r m a j o r e f f e c t s i s t h e e x t r a c t i o n o f l i g n i n f r o m t h e b i o m a s s d u r i n g a l k a l i n e p r e t r e a t m e n t s t h a t h e l p s r e d u c e n o n - s p e c i fi c b i n d i n g o f e n z y m e s d u r i n g c e l l u l o s e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s [ 1 5 8 ] . T h e c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s a n d u l t r a - s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s i n c o r p o r a t e d w i t h i n t h e b i o m a s s a r e p o o r l y u n d e r s t o o d f o r m o s t a l k a l i n e p r e t r e a t m e n t s , c o m p a r e d t o t h e i r a c i d i c c o u n t e r p a r t s . A m m o n i a fi b e r e x p a n s i o n ( A F E X ) i s a n o v e l a l k a l i n e p r e t r e a t m e n t m e t h o d t h a t u s e s c o n c e n t r a t e d l i q u i d a m m o n i a - w a t e r m i x t u r e s t o p r e t r e a t l i g n o c e l l u l o s i c s [ 7 , 1 0 3 ] . A F E X i s a l o w e r t e m p e r a t u r e p r o c e s s ( 6 0 - 1 4 0 D e g r e e s C e l s i u s ) t h a t i s c a r r i e d o u t b y a d d i n g l i q u i d a m m o n i a ( 0 . 3 - 2 k g a m m o n i a p e r k g d r y w e i g h t b i o m a s s ) t o p r e - w e t b i o m a s s ( 0 . 0 5 - 1 k g w a t e r p e r k g d r y w e i g h t b i o m a s s ) i n a p r e s s u r i z e d r e a c t o r a n d c o o k i n g i t f o r 5 - 4 5 m i n u t e s b e f o r e e x p l o s i v e l y r e l e a s i n g t h e a m m o n i a . A F E X i s a d r y t o d r y p r o c e s s , u n l i k e m o s t o t h e r p r e t r e a t m e n t s , r e s u l t i n g i n n o s e p a r a t e l i q u i d s t r e a m a t t h e e n d o f t h e p r e t r e a t m e n t . T h e v o l a t i l i t y o f a m m o n i a a l l o w s f o r r e c o v e r y a n d r e c y c l e f o r a c o n t i n u o u s p r o c e s s [ 1 5 9 ] . A F E X r e s u l t s i n d e - a c e t y l a t i o n a n d c l e a v a g e o f l i g n i n - c a r b o h y d r a t e c o m p l e x e s t h r o u g h b a s e c a t a l y z e d h y d r o l y s i s [ 1 6 0 ] . T h e e x t e n t o f a m m o n o l y s i s o f e s t e r l i n k a g e s w i t h i n t h e b i o m a s s i s c u r r e n t l y u n k n o w n [ 1 6 1 , 1 6 2 ] . 2 0 A m m o n i a i s a l s o b e l i e v e d t o d e - c r y s t a l l i z e c e l l u l o s e a s s h o w n b y X - r a y d i f f r a c t i o n s t u d i e s [ 1 6 3 ] . O n - g o i n g r e s e a r c h i n d i c a t e s s i g n i fi c a n t m o d i fi c a t i o n o f t h e c e l l w a l l u l t r a - s t r u c t u r e d u r i n g A F E X t h a t r e s u l t s i n e n h a n c e d e n z y m a t i c a c c e s s i b i l i t y ( u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h e r e h a v e b e e n s e v e r a l d i f f e r e n t a m m o n i a t r e a t m e n t p r o c e s s e s t h a t h a v e b e e n r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e ; s u c h a s s u p e r c r i t i c a l a m m o n i a t r e a t m e n t , a m m o n i a r e c y c l e p e r c o l a t i o n ( A R P ) , s o a k i n g i n a q u e o u s a m m o n i a ( S A A ) a n d a m m o n i a - p e r o x i d e p r e t r e a t m e n t [ 1 5 8 , 1 6 2 , 1 6 4 - 1 6 7 ] . M o s t o f t h e s e p r e t r e a t m e n t s v a r y i n t h e t h e r m o d y n a m i c s t a t e o f a m m o n i a - w a t e r m i x t u r e s f o r v a r y i n g a m m o n i a c o n c e n t r a t i o n s . A R P p r e t r e a t m e n t i s c a r r i e d o u t i n a fl o w — t h r o u g h , r e c y c l e m o d e b y p e r c o l a t i n g a m m o n i a c a l s o l u t i o n s ( 5 - 1 5 % c o n c e n t r a t i o n ) t h r o u g h a c o l u m n r e a c t o r p a c k e d w i t h b i o m a s s u n d e r h i g h p r e s s u r e ( 2 - 3 M P a ) a n d a t h i g h t e m p e r a t u r e s ( 1 6 0 - 1 8 0 D e g r e e s C e l s i u s ) . A s i g n i fi c a n t a m o u n t o f l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e i s e x t r a c t e d t o t h e l i q u i d p h a s e d u r i n g A R P t r e a t m e n t . 2 . 2 . 3 . 3 O x i d a t i v e p r e t r e a t m e n t s O z o n e h a s a l s o b e e n u s e d a n o x i d i z i n g a g e n t t o b r e a k d o w n l i g n i n w i t h i n l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s t o h e l p i n c r e a s e e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y [ 1 6 8 - 1 7 0 ] . T r a d i t i o n a l l y , o z o n e h a d b e e n u s e d t o b l e a c h p u l p r e p l a c i n g c h l o r i n e a s t h e o x i d a n t [ 1 7 1 ] . O z o n o l y s i s , t y p i c a l l y c o n d u c t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d p r e s s u r e , h a s b e e n u s e d i n c o m b i n a t i o n w i t h o t h e r a l k a l i n e p r e t r e a t m e n t s t o h e l p e x t r a c t l i g n i n f r o m f o r a g e r e s i d u e s t o h e l p i m p r o v e f o r a g e d i g e s t i b i l i t y [ 1 7 1 , 1 7 2 ] . O z o n e r e a c t s s e l e c t i v e l y w i t h l i g n i n b a s e d a r o m a t i c s p r o d u c i n g s e v e r a l t y p e s o f d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( p r i m a r i l y a r o m a t i c a l d e h y d e s a n d a l i p h a t i c o r g a n i c a c i d s ) t h a t h a v e b e e n f o u n d t o i n h i b i t b i o l o g i c a l p r o c e s s i n g o f o z o n e t r e a t e d b i o m a s s [ 1 7 3 ] . O z o n o l y s i s b a s e d i n t e r m e d i a t e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( l i k e f r e e r a d i c a l s ) a r e 2 1 r e s p o n s i b l e f o r u n w a n t e d s i d e - r e a c t i o n s , l i k e p o l y s a c c h a r i d e d e g r a d a t i o n [ 1 7 4 - 1 7 6 ] . T h e r e i s a l a c k o f p u b l i s h e d d a t a o n o z o n o l y s i s b a s e d p r e t r e a t m e n t s f o r v a r i o u s a g r i c u l t u r a l r e s i d u e s [ 1 7 7 ] . T h e p o s s i b l e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f v a r i o u s o z o n o l y s i s d e g r a d a t i o n p r o d u c t s a r e a l s o p o o r l y u n d e r s t o o d . H o w e v e r , t h e b i g g e s t h u r d l e f o r a n e c o n o m i c a l l y f e a s i b l e o z o n o l y s i s b a s e d p r e t r e a t m e n t i s t h e c o s t o f o z o n e . A l k a l i n e w e t o x i d a t i v e i s a n o t h e r f o r m o f o x i d a t i v e p r e t r e a t m e n t c a r r i e d o u t t y p i c a l l y u n d e r a l k a l i n e c o n d i t i o n s a t h i g h t e m p e r a t u r e s ( 1 7 0 - 2 2 0 ° C ) u s i n g p r e s s u r i z e d a i r / o x y g e n o r h y d r o g e n p e r o x i d e a s t h e o x i d a n t [ 1 7 8 , 1 7 9 ] . T h e a l k a l i t y p i c a l l y e m p l o y e d f o r w e t o x i d a t i o n i s s o d i u m c a r b o n a t e ( 0 . 0 2 - 0 . 0 5 g N a z C O 3 / g d r y b i o m a s s ) t h a t p a r t l y s o l u b i l i z e s t h e h e m i c e l l u l o s e f r a c t i o n [ 1 7 8 , 1 8 0 ] . T h e a d v a n t a g e o f a n a l k a l i n e m e d i u m d u r i n g t r e a t m e n t a t e l e v a t e d t e m p e r a t u r e s i s i n m i n i m i z i n g t h e f o r m a t i o n o f v a r i o u s f u r a n b a s e d d e g r a d a t i o n p r o d u c t s . 2 . 2 . 4 B i o l o g i c a l p r e t r e a t m e n t s M o s t c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t s a r e c a r r i e d o u t a t h i g h t e m p e r a t u r e / p r e s s u r e b a s e d r e a c t i o n c o n d i t i o n s , a n d t h u s r e q u i r e s i g n i fi c a n t c a p i t a l i n v e s t m e n t [ 1 8 1 ] . H i g h t h e r m o c h e m i c a l s e v e r i t y a l s o r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f s e v e r a l d e g r a d a t i o n p r o d u c t s t h a t a r e i n h i b i t o r y t o d o w n s t r e a m b i o l o g i c a l p r o c e s s n g ( i . e . e n z y m a t i c h y d r o l y s i s a n d f e r m e n t a t i o n ) . C o n t r a r y t o c h e m i c a l b a s e d p r e t r e a t m e n t s , b i o l o g i c a l p r e t r e a t m e n t s ( u s i n g e n z y m e s o r m i c r o b e s a s p r e t r e a t m e n t c a t a l y s t s ) w o u l d c o n s u m e l e s s e r e n e r g y s i n c e t h e y a r e c a r r i e d o u t u n d e r m i l d e r r e a c t i o n c o n d i t i o n s [ 1 8 2 - 1 8 4 ] . H o w e v e r , m o s t b i o l o g i c a l t r e a t m e n t s a r e s l o w ( r e a c t i o n t i m e r a n g e s b e t w e e n s e v e r a l h o u r s t o m o n t h s ) a n d h a v e l o w - t h r o u g h p u t . B i o l o g i c a l p r e t r e a t m e n t s a r e t y p i c a l l y c a r r i e d o u t b y i n o c u l a t i n g t h e b i o m a s s w i t h f u n g a l s p o r e s ( e . g . w h i t e r o t b a s i d i o m y c e t e s a n d e v e n c e r t a i n a c t i n o m y c e t e s ) o r e x t e r n a l l y 2 2 s u p p l e m e n t i n g a c c e s s o r y e n z y m e s ( e . g . f e r u l i c a c i d e s t e r a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e s ) . W h i t e - r o t f u n g i h a v e b e e n f o u n d t o b e e f f e c t i v e t o d e g r a d e l i g n i n w h i l e m i n i m i z i n g p o l y s a c c h a r i d e c o n s u m p t i o n [ 1 8 5 - 1 8 8 ] . D u r i n g m i c r o b i a l p r e t r e a t m e n t s , a s u b s t a n t i a l a m o u n t o f d e l i g n i fi c a t i o n c a n t a k e p l a c e , p o s s i b l y a t t h e e x p e n s e o f p o l y s a c c h a r i d e c o n s u m p t i o n d e p e n d i n g o n t h e m i c r o b i a l s o u r c e [ 1 8 9 ] . W h i t e - r o t m i c r o b e s t y p i c a l l y s e c r e t e l i g n i n p e r o x i d a s e s , a l o n g w i t h v a r i o u s t y p e s o f g l y c o s y l h y d r o l a s e s , t h a t c l e a v e t h e C - C l i g n i n b a c k b o n e i n t h e p r e s e n c e o f h y d r o g e n p e r o x i d e . O t h e r e n z y m e s i n v o l v e d i n a e r o b i c a l l y c a t a l y z e d l i g n i n d e g r a d a t i o n i n c l u d e M n - d e p e n d e n t p e r o x i d a s e s , l a c c a s e s ( m o n o p h e n o l o x i d a s e ) a n d s u p e r o x i d e d i s m u t a s e [ 1 9 0 ] . D e t a i l s a b o u t t h e l i g n i n d e g r a d i n g m i c r o b i a l s y s t e m s h a v e b e e n s u m m a r i z e d e l s e w h e r e [ 1 9 0 ] . I n r e c e n t y e a r s , t h e u s e o f f e r u l i c a c i d e s t e r a s e s a n d o t h e r a c c e s s o r y e n z y m e s a s c a t a l y s t s t o c l e a v e L C C l i n k a g e s w i t h i n p l a n t c e l l w a l l s t o h e l p r e d u c e t h e r m o c h e m i c a l s e v e r i t y d u r i n g s u b s e q u e n t p r e t r e a t m e n t a n d / o r t o m a x i m i z e r e c o v e r y o f v a l u a b l e p h e n o l i c b y - p r o d u c t s h a v e b e e n e x p l o r e d [ 1 9 1 ] . S e v e r a l a r t i c l e s o n m i c r o b i a l p r e t r e a t m e n t s u s i n g s o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o n ( S S F ) h a v e b e e n p u b l i s h e d f o r b o t h g r a s s e s a n d h a r d w o o d s [ 1 9 2 , 1 9 3 ] . T h e e f f e c t o f s u b s t r a t e m o i s t u r e c o n t e n t , i n o r g a n i c s a l t c o n c e n t r a t i o n , c u l t u r e t i m e o n l i g n i n d e g r a d a t i o n , s o l i d s r e c o v e r y , a n d a v a i l a b i l i t y o f c a r b o h y d r a t e o n t h e b i o l o g i c a l p r e t r e a t m e n t p r o c e s s h a v e b e e n e x p l o r e d . T h e s o l i d s t a t e c u l t i v a t i o n o f c o t t o n s t a l k s u s i n g P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m , a t 7 5 % m o i s t u r e c o n t e n t w i t h o u t s a l t s w a s t h e p r e f e r a b l e p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n r e s u l t i n g i n 2 8 % l i g n i n d e g r a d a t i o n , 7 1 % s o l i d s r e c o v e r y a n d 4 2 % a v a i l a b i l i t y o f c a r b o h y d r a t e s o v e r a p e r i o d o f 1 4 d a y s [ 1 9 4 ] . A n o t h e r a p p r o a c h i s t o u s e m i n i m a l l y t r e a t e d m u s h r o o m s p e n t s t r a w ( M S S ) a s a f e e d s t o c k f o r d o w n s t r e a m t h e r m o c h e m i c a l a n d 2 3 b i o l o g i c a l p r o c e s s i n g [ 1 8 5 , 1 8 6 ] . W h e n M S S w a s u s e d w i t h o u t a n y p r e t r e a t m e n t , t h e g l u c a n d i g e s t i b i l i t y w a s a r o u n d 4 0 % , u s i n g s t a n d a r d c o m m e r c i a l c e l l u l a s e s ( 1 5 F P U / g g l u c a n ) ; a n d 2 0 % f o r u n t r e a t e d r i c e s t r a w . F u r t h e r t h e r m o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t i s n e c e s s a r y f o r g e t t i n g h i g h e r s u g a r y i e l d s f r o m M S S . B y u s i n g m i c r o b i a l p r e t r e a t e d b i o m a s s a s a f e e d s t o c k f o r t h e r m o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t s ; i t m i g h t b e p o s s i b l e t o r e d u c e p r o c e s s i n g c o s t s b y r e d u c i n g p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y a n d m i n i m i z i n g c h e m i c a l u s a g e w h i l e o b t a i n i n g h i g h e r o v e r a l l h y d r o l y s i s y i e l d s . U n f o r t u n a t e l y , t h e r e h a v e b e e n n o d e t a i l e d e c o n o m i c s t u d i e s c o m p a r i n g t h e f e a s i b i l i t y o f s c a l i n g - u p a n d i n t e g r a t i n g b i o l o g i c a l b a s e d p r e t r e a t m e n t s w i t h i n a c o n v e n t i o n a l c e l l u l o s i c b i o r e fi n e r y . 2 . 3 E n z y m a t i c H y d r o l y s i s A l l m i c r o b i a l e n z y m e s y s t e m s c a n b e b r o a d l y c l a s s i fi e d i n t o t w o c l a s s e s : N o n - C o m p l e x e d a n d C o m p l e x e d . N o n - c o m p l e x e d s y s t e m s [ 1 9 5 ] a r e c h a r a c t e r i s t i c o f a e r o b i c f u n g i ( T r i c h o d e r m a ) , w h i c h c o m p r i s e o f s e v e r a l p o l y s a c c h a r i d e d e p o l y m e r a s e s t h a t a r e s e c r e t e d i n t o t h e e x t r a c e l l u l a r m e d i u m . T h e c e l l u l a s e s y s t e m o f T . r e e s e i h a s b e e n s t u d i e d e x t e n s i v e l y a n d h a s b e c o m e t h e p a r a d i g m f o r t h i s g r o u p . C o m p l e x e d s y s t e m s a r e t y p i c a l o f a n a e r o b i c o r g a n i s m s ( C l o s t r i d i u m ) p r e s e n t i n r u m e n a n d c o m p o s t . I n t h e s e s y s t e m s t h e e n z y m e s a r e u n i q u e l y a s s e m b l e d a s a h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n c o m p l e x ( h e l d t o g e t h e r b y a s c a f f o l d i n g p r o t e i n o r C i p - C e l l u l o s o m e I n t e g r a t i n g P r o t e i n ) c a l l e d C e l l u l o s o m e . C e l l u l o s o m e s a r e e x o c e l l u l a r m a c r o m o l e c u l a r m a c h i n e s , d e s i g n e d f o r e f fi c i e n t d e g r a d a t i o n o f c e l l u l o s e a n d a s s o c i a t e d p l a n t c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s [ 1 9 6 ] . C l o s t r i d i u m s p e c i e s h a v e o n e o f t h e m o s t w e l l d o c u m e n t e d c e l l u l o s o m e s y s t e m s t h a t h a v e b e e n s t u d i e d o v e r t h e p a s t t w o d e c a d e s . 2 4 D i f f e r e n c e s i n c e l l u l o l y t i c s y s t e m s o f a e r o b e s a n d a n a e r o b e s m a y b e a t t r i b u t e d t o d i f f e r e n c e s i n t h e i r e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s a n d t h e p h y s i c a l s i z e o f t h e o r g a n i s m s . A e r o b e s e x c r e t e t h e i r e n z y m e s i n a t h i c k a q u e o u s fi h n c o v e r i n g t h e p l a n t c e l l w a l l . T h e a b s e n c e o f fl u i d c o n v e c t i o n a l l o w s f o r t h e e n z y m e t o b e i m m o b i l i z e d o n t o t h e s u b s t r a t e i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h e m i c r o b e . T h i s a l l o w s f o r a n e f fi c i e n t t r a n s p o r t o f t h e h y d r o l y s i s p r o d u c t s t o t h e m i c r o b e s . C o n t r a r y t o t h a t , a n a e r o b e s i n h a b i t l a r g e l i q u i d v o l u m e s ; w h e r e e x t r a c e l l u l a r e n z y m e s e c r e t i o n s w o u l d n o t b e e n e r g e t i c a l l y e f fi c i e n t . T h u s , t h e a n a e r o b i c c e l l u l o l y t i c s y s t e m i s e f fi c i e n t l y p a c k e d c l o s e t o t h e m i c r o b i a l c e l l s u r f a c e t o e n h a n c e t h e u p t a k e fl u x o f t h e h y d r o l y s i s p r o d u c t s . F u r t h e r m o r e , e n z y m e s m a y b e o r g a n i z e d a s p a r t o f t h e c e l l u l o s o m e , o r a s f r e e c o m p l e x e s i n t h e c u l t u r e fl u i d d e p e n d i n g o n s p e c i fi c e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s ( e . g . , p H , t e m p e r a t u r e , d i s t r i b u t i o n o f c a r b o n s o u r c e ) [ 1 9 6 , 1 9 7 ] . G l y c o s y l h y d r o l a s e s ( G H ) a n d r e l a t e d c a r b o h y d r a t e - a c t i v e e n z y m e s h a v e b e e n c l a s s i fi e d b a s e d o n t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e h o m o l o g y o f t h e i r c a t a l y t i c d o m a i n s [ 2 0 4 , 2 0 5 ] . T h i s h a s h e l p e d c l a s s i f y e n z y m e s b a s e d o n t h e i r s t r u c t u r a l a n d m e c h a n i s t i c f e a t u r e s . C e l l u l o l y t i c e n z y m e s y s t e m s a r e c o m p r i s e d o f s e v e r a l t y p e s o f p r o t e i n s . T h e r e a r e t y p i c a l l y t h r e e c l a s s e s o f e x o g e n o u s c e l l u l a s e e n z y m e s t h a t h a v e b e e n t h o r o u g h l y s t u d i e d o v e r t h e y e a r s : C e l l o b i o h y d r o l a s e o r e x o g l u c a n a s e ( C B H ) w h i c h a c t s a t t h e e n d s ( r e d u c i n g o r n o n - r e d u c i n g ) o f c e l l u l o s e , p r o c e s s i v e l y c l e a v i n g d i s a c c h a r i d e c e l l o b i o s e f r o m t h e g l u c a n c h a i n . T h e s e e n z y m e s t y p i c a l l y b e l o n g t o G H f a m i l y 6 , 7 a n d 9 . E n d o g l u c a n a s e ( E G ) w h i c h r a n d o m l y h y d r o l y z e t h e i n t e r i o r B - 1 , 4 - g l u c a n l i n k a g e s o f t h e c e l l u l o s e c h a i n , c l e a v i n g i t i n t o s m a l l e r u n i t s a n d p r o v i d i n g m o r e " e n d s " 2 5 f o r C B H t o a c t o n . T h e s e e n z y m e s t y p i c a l l y b e l o n g t o G H f a m i l y 5 , 6 , 7 , 9 , 1 2 , 4 5 a n d 6 1 . B - G l u c o s i d a s e ( c e l l o b i a s e , B G ) w h i c h h y d r o l y z e s c e l l o b i o s e a n d s h o r t c h a i n O l i g o s a c c h a r i d e s i n t o m o n o m e r i c g l u c o s e u n i t s . T h e s e e n z y m e s t y p i c a l l y b e l o n g t o G H f a m i l y 1 a n d 3 . C o m p l e t e d e g r a d a t i o n o f S i d e - c h a i n d e c o r a t e d h e m i c e l l u l o s e s r e q u i r e s t h e c o n c e r t e d a c t i o n o f s e v e r a l e n z y m e s [ 1 9 8 ] . T h e i m p o r t a n t c l a s s e s o f h e m i c e l l u l o s e d e g r a d i n g e n z y m e s a r e : E n d o x y l a n a s e s ( E X ) h y d r o l y z e i n t e r i o r B - 1 , 4 - x y l o s i d i c l i n k a g e s o f t h e x y l a n b a c k b o n e . T h e s e e n z y m e s t y p i c a l l y b e l o n g t o G H f a m i l y 1 0 ( a c i d i c p I , h i g h m o l e c u l a r w e i g h t ) a n d 1 1 ( b a s i c p I , l o w m o l e c u l a r w e i g h t ) . B - X y l o s i d a s e ( x y l o b i a s e , B X ) h y d r o l y z e s x y l o b i o s e d i m e r s a n d s h o r t c h a i n x y l o o l i g o s a c c h a r i d e s t o x y l o s e . T h e s e e n z y m e s t y p i c a l l y b e l o n g t o G H f a m i l y 3 . a — A r a b i n o f u r a n o s i d a s e ( o r - A e r ) h y d r o l y z e s t e r m i n a l n o n - r e d u c i n g o r - a r a b i n o fi r r a n o s e f r o m a r a b i n o x y l a n s i d e - c h a i n s . T h e s e e n z y m e s t y p i c a l l y b e l o n g t o G H f a m i l y 5 1 , 5 4 a n d 6 2 . a — G l u c u r o n i d a s e ( a - G l u ) r e l e a s e s g l u c u r o n i c a c i d f r o m g l u c u r o n o x y l a n s i d e - c h a i n s . T h e s e e n z y m e s t y p i c a l l y b e l o n g t o G H f a m i l y 6 7 . A c e t y l x y l a n e s t e r a s e s ( A X E ) h y d r o l y z e s a c e t y l a t e d e s t e r l i n k a g e s f r o m x y l a n b a c k b o n e . T h e s e e n z y m e s t y p i c a l l y b e l o n g t o c a r b o h y d r a t e e s t e r a s e f a m i l y 1 . 2 6 P h e n o l i c a c i d e s t e r a s e s h y d r o l y z e f e r u l o y l a n d p - c o u m a r o y l e s t e r b o n d s i n l i g n i n - h e m i c e l l u l o s e c o m p l e x e s . T h e s e e n z y m e s t y p i c a l l y b e l o n g t o c a r b o h y d r a t e e s t e r a s e f a m i l y 1 . 2 . 3 . 1 E n z y m e S y n e r g y T h e s t r u c t u r a l a n d c h e m i c a l h e t e r o g e n e i t y o f l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s d i c t a t e s t h e s y n e r g i s t i c a c t i o n o f t h e c o m p l e x e n z y m e s y s t e m s t o w a r d s i t s c o m p l e t e d i g e s t i o n [ 1 9 9 ] . S y n e r g i s m , w a s fi r s t d i s c o v e r e d o v e r 5 0 y e a r s a g o [ 2 0 0 , 2 0 1 ] , o c c u r s w h e n t h e c o m b i n e d a c t i o n o f t w o o r m o r e e n z y m e s l e a d s t o h i g h e r r a t e o f a c t i o n t h a n t h e s u m o f t h e i r i n d i v i d u a l a c t i o n s . T h e d e g r e e o f s y n e r g i s m ( D S E ) h a s b e e n f o u n d t o v a r y w i t h e n z y m e - s u b s t r a t e r a t i o ( s u b s t r a t e s i t e s a t u r a t i o n ) , r e l a t i v e e n z y m e r a t i o s a n d t h e f o r m o f c e l l u l o s i c s u b s t r a t e [ 2 0 2 , 2 0 3 ] . T h e r e h a v e b e e n s e v e r a l t y p e s o f e n z y m e s y n e r g y t h a t h a v e b e e n s t u d i e d o v e r t h e p a s t f e w d e c a d e s . 2 . 3 . 1 . 1 E n d o - e x o b a s e d s y n e r g y P r e l i m i n a r y c e l l u l a s e m o d e l s ( W o o d , 1 9 6 8 ) s o u g h t t o d e s c r i b e s y n e r g y a s t h e i n t e r a c t i o n o f e n d o g l u c a n a s e s ( s o c a l l e d C X e n z y m e s ) w i t h C 1 , a p u t a t i v e n o n - c a t a l y t i c f a c t o r r e s p o n s i b l e f o r t h e d i s r u p t i o n o f h y d r o g e n b o n d s i n c e l l u l o s e c r y s t a l s [ 2 5 ] . B u t t h i s v e r s i o n w a s a b a n d o n e d t o a d o p t a m o d e l f o r ‘ e n d o — e x o s y n e r g y ’ t h a t d e s c r i b e s t h e c o n c e r t e d a c t i o n o f e n d o g l u c a n a s e s ( E G ) a n d c e l l o b i o h y d r o l a s e ( C B H ) . T h e m o d e l s u g g e s t s t h a t t h e a c t i o n o f C B H a r e l i m i t e d b y a v a i l a b i l i t y o f c e l l u l o s e c h a i n e n d s ; w h e r e a s E G c a n n o t h y d r o l y z e c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e e f f e c t i v e l y b u t h y d r o l y z e s a m o r p h o u s c e l l u l o s e t o c r e a t e c h a i n e n d s f o r C B H t o a c t u p o n . T h i s p r o c e s s i o n o f C B H h e l p s e x p o s e d e e p e r b u r i e d a m o r p h o u s c e l l u l o s e f o r f u r t h e r a c t i o n b y E G . ‘ C r o s s — s y n e r g y ’ b e t w e e n E G o r C B H f r o m d i f f e r e n t m i c r o b i a l s p e c i e s h a s b e e n o b s e r v e d w h e r e n o t a l l i n t e r a c t i o n s 2 7 r e s u l t e d i n s y n e r g y [ 2 7 ] . O n e o f t h e r e a s o n s f o r t h i s i s t h a t i t i s s t i l l r a t h e r u n c l e a r w h i c h p a r t i c u l a r e n z y m e p r o p e r t i e s a r e p r e d o m i n a n t l y r e s p o n s i b l e f o r s y n e r g i s t i c a c t i o n . P e r h a p s s y n e r g y r e q u i r e s t h e c l o s e l y c o o r d i n a t e d a c t i o n o f e n z y m e s , s i m i l a r t o c e l l u l o s o m a l s y s t e m s , w h i c h o n l y c e r t a i n E G o r C B H s h o w d u e t o t h e f o r m a t i o n o f a p u t a t i v e e n z y m e c o m p l e x . T h e s y n e r g y b e t w e e n e n d o a n d e x o e n z y m e s c a n b e l a r g e l y e x p l a i n e d b y t h e d e g r e e o f a c c e s s i b i l i t y o f t h e a c t i v e c a t a l y t i c s i t e t o t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e [ 3 1 ] . ‘ E x o - e x o s y n e r g y ’ h a s b e e n n o t e d i n s o m e e x p e r i m e n t s [ 2 0 4 ] a n d a c o u p l e o f p l a u s i b l e m o d e l s t o t h i s e f f e c t h a v e b e e n p r o p o s e d i n t h e l i t e r a t u r e [ 2 0 5 ] . T h e s e m o d e l s s u g g e s t t h a t s o m e e x o e n z y m e s ( l i k e C B H I I ) a r e c a p a b l e o f l i m i t e d e n d o a c t i v i t y , w h i l e i n s o m e o t h e r c a s e s t h e s y n e r g i s t i c e f f e c t w a s s e e n l a r g e l y d u e t o e n d o g l u c a n a s e c o n t a m i n a t i o n . S y n e r g y b e t w e e n s t r i c t l y e x o a c t i n g e n z y m e s c o u l d a l s o b e e x p l a i n e d i f e a c h e n z y m e r e c o g n i z e s t h e t w o d i s t i n c t s t e r e o s p e c i fi c c o n fi g u r a t i o n s r e v e a l e d d u r i n g c o u r s e o f h y d r o l y s i s o f t h e c e l l u l o s e c h a i n [ 2 9 , 3 0 ] o r d u e t o d i f f e r e n t i a l b i n d i n g t o r e d u c i n g a n d n o n - r e d u c i n g e n d s o f t h e c e l l u l o s e c h a i n [ 2 0 6 - 2 0 9 ] . I n t e r e s t i n g l y , i t w a s f o u n d t h a t P e n i c i l l i u m p i n o p h i l u m e x o e n z y m e s o n l y s y n e r g i z e d t o h y d r o l y z e a v i c e l b u t n o t c o t t o n [ 2 9 ] . T h i s m i g h t h a v e t o d o w i t h t h e l o w e r d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n o f a v i c e l c o m p a r e d t o c o t t o n w h i c h r e s u l t s i n a v a i l a b i l i t y o f l a r g e r n u m b e r o f r e d u c i n g e n d s f o r t h e e x o e n z y m e s t o a c t u p o n . M o r e r e c e n t l y t h e r e h a v e b e e n e x a m p l e s o f o t h e r e n d o - e n d o s y n e r g i s t i c c o o p e r a t i o n a m o n g c e l l u l a s e s [ 2 1 0 ] . S y n e r g y b e t w e e n e n d o - e x o e n z y m e s i s s t r o n g l y d e p e n d e n t o n t h e n a t u r e o f t h e s u b s t r a t e [ 1 0 , 2 1 1 ] , r e l a t i v e p r o p o r t i o n o f e n z y m e c o m p o n e n t s [ 3 0 ] a n d d e g r e e o f s a t u r a t i o n o f t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e b y t h e e n z y m e s [ 4 6 , 4 7 ] . 2 8 2 . 3 . 1 . 2 H e m i c e l l u l a s e s a n d a c c e s s o r y e n z y m e b a s e d s y n e r g y M a n y x y l a n a s e s d o n o t c l e a v e g l y c o s i d i c l i n k a g e s b e t w e e n x y l o s e u n i t s t h a t h a v e s i d e - c h a i n s u b s t i t u t i o n s . T h e s i d e c h a i n s m u s t b e r e m o v e d b e f o r e t h e x y l a n b a c k b o n e c a n b e c o m p l e t e l y h y d r o l y z e d . T y p i c a l l y , e n d o x y l a n a s e s h a v e b e e n f o u n d t o s y n e r g i z e w i t h a c c e s s o r y e n z y m e s t h a t r e m o v e a r a b i n o s e , u r o n i c a c i d a n d f e r u l i c a c i d s i d e - c h a i n s t o e n h a n c e a c c e s s i b i l i t y t o t h e x y l a n b a c k b o n e [ 3 2 ] . H o w e v e r , s i d e - c h a i n s m i g h t b e a l s o n e c e s s a r y f o r s o m e e n d o x y l a n a s e s t o h e l p i n s u b s t r a t e r e c o g n i t i o n b y t h e e n z y m e c a t a l y t i c s i t e . T h e r e h a v e b e e n r e p o r t e d c a s e s o f a n t i - s y n e r g y ( f o r i n - v i t r o p u r i fi e d e n z y m e e x p e r i m e n t s ) w h e n a n a c c e s s o r y e n z y m e r e m o v e d s i d e - c h a i n s f r o m x y l a n b a c k b o n e t h a t r e s u l t e d i n p o o r a c t i v i t y o f a c e r t a i n e n d o x y l a n a s e o n t h e d e b r a n c h e d b a c k b o n e [ 2 1 2 ] . S e v e r a l a c c e s s o r y e n z y m e s o n l y r e m o v e s i d e c h a i n s f r o m x y l o o l i g o s a c c h a r i d e s [ 2 1 3 ] . T h e s e e n z y m e s r e q u i r e a p a r t i a l h y d r o l y s i s o f x y l a n b e f o r e t h e s i d e c h a i n s c a n b e c l e a v e d [ 2 1 4 , 2 1 5 ] . E n z y m e s f r o m G H f a m i l y 1 0 h a v e b e e n t y p i c a l l y f o u n d t o h y d r o l y z e h e t e r o x y l a n s ( w i t h g l y c o s i d i c l i n k a g e s i n c l o s e p r o x i m i t y t o s i d e - c h a i n s u b s t i t u t i o n s ) t o a h i g h e r d e g r e e t h a n f a m i l y 1 1 e n d o x y l a n a s e s , f u r t h e r r e l e a s i n g s h o r t e r c h a i n x y l o - o l i g o s a c c h a r i d e s [ 2 1 6 - 2 1 8 ] . 2 . 3 . 1 . 3 H e m i c e l l u l a s e — c e l l u l a s e b a s e d s y n e r g y E n d o g l u c a n a s e - x y l a n a s e s y s t e m s h a v e b e e n u s e d t o h e l p b o o s t b l e a c h i n g p r o p e r t i e s o f p u l p a n d r e c y c l e d p a p e r . R e m o v a l o f x y l a n f r o m t h e p u l p u s i n g c e l l u l a s e - f r e e x y l a n a s e a i d s i n t h e r e m o v a l o f l i g n i n [ 2 1 9 ] . E n d o g l u c a n a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e s h a v e a l s o b e e n u s e d t o a i d i n t h e d e i n k i n g o f m i x e d o f fi c e w a s t e s [ 2 2 0 - 2 2 3 ] . N o n i o n i c a n d c a t i o n i c s u r f a c t a n t s h a v e b e e n f o u n d t o f a c i l i t a t e t h e p r o c e s s o f d e i n k i n g [ 2 2 4 ] . T h e c e l l u l a s e s 2 9 u s e d i n t h e p a p e r a n d p u l p i n d u s t r y h a v e b e e n g e n e r a l l y l o w d o s e e n d o g l u c a n a s e s ( w i t h l i t t l e o r n o e x o a c t i v i t y ) . S y n e r g y a m O n g x y l a n a s e s a n d o t h e r a c c e s s o r y e n z y m e s h a s b e e n s h o w n i n t h o s e c a s e s a s w e l l . H o w e v e r , n o c e l l o b i o h y d r o l a s e s h a v e b e e n u s e d a s t h e y t e n d t o d e t r i m e n t a l l y a f f e c t t h e s t r e n g t h o f t h e fi b e r s . X y l a n a s e - c e l l u l a s e e n z y m e s y s t e m s h a v e a l s o b e e n u s e d i n t h e a n i m a l f e e d i n d u s t r y . X y l a n a s e s a r e u s e d i n a n i m a l f e e d s a l o n g w i t h g l u c a n a s e s , p e c t i n a s e s , c e l l u l a s e s , p r o t e a s e s , a m y l a s e s , g a l a c t o s i d a s e s a n d l i p a s e s . T h e e n z y m e c o m p l e x h e l p s t o b r e a k d o w n a r a b i n o x y l a n s i n t h e i n g r e d i e n t s o f t h e a n i m a l f e e d a n d a i d s i n r u m i n a n t d i g e s t i o n , a l s o r e d u c i n g t h e v i s c o s i t y o f t h e f e e d m a t e r i a l [ 2 2 5 ] . X y l a n a s e s a r e u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h c e l l u l a s e s , a m y l a s e s a n d p e c t i n a s e s h e l p t o i m p r o v e t h e y i e l d o f e x t r a c t e d j u i c e d u r i n g l i q u e f a c t i o n o f f r u i t s a n d v e g e t a b l e s a l s o r e d u c i n g t h e v i s c o s i t y a n d c l o u d i n e s s i n t h e c o n c e n t r a t e . 2 . 3 . 1 . 4 C e l l u l o s e b i n d i n g d o m a i n ( C B D ) b a s e d s y n e r g y I n a d d i t i o n t o t h e c a t a l y t i c d o m a i n , c e l l u l a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e s u s u a l l y c o n t a i n a t l e a s t o n e c e l l u l o s e - b i n d i n g d o m a i n ( C B D ) a n d o t h e r m o d u l a r d o m a i n s l i n k e d b y s e q u e n c e s r i c h i n h y d r o x y a m i n o a c i d s w h o s e i n t e r a c t i o n s a r e n o t w e l l u n d e r s t o o d [ 1 9 5 , 2 2 6 , 2 2 7 ] . T h e C B D s e r v e s t o d i r e c t a n d a t t a c h t h e c a t a l y t i c d o m a i n t o i n s o l u b l e c r y s t a l l i n e s u b s t r a t e s . E f fi c i e n t h y d r o l y s i s o f c r y s t a l l i n e s u b s t r a t e r e q u i r e s t h e a d s o r p t i o n o f e n z y m e s p r i o r t o h y d r o l y s i s , w h i c h i s f a c i l i t a t e d b y t h e C B D . I t h a s b e e n f o u n d t h a t C B D ’ S h a v e a s t r o n g e r b i n d i n g a f fi n i t y t o c r y s t a l l i n e , i n s o l u b l e c e l l u l o s e r a t h e r t h a n a m o r p h o u s c e l l u l o s e a n d s o l u b l e c e l l o - o l i g o m e r s [ 2 2 8 - 2 3 0 ] . T w o m a i n m e c h a n i s m s o f C B D b a s e d s y n e r g y a r e s e e n t o o p e r a t e : ( a ) i n c r e a s e l o c a l c o n c e n t r a t i o n o f e n z y m e s o n c e l l u l o s e s u r f a c e , ( b ) d i s r u p t h y d r o g e n b o n d i n g 3 0 b e t w e e n p a c k e d c e l l u l o s e c r y s t a l s , l i b e r a t i n g g l u c a n c h a i n s f o r c l e a v a g e b y t h e c a t a l y t i c d o m a i n . F u r t h e r v a l i d a t i o n o f t h i s h y p o t h e s i s h a s b e e n f o u n d d u e t o s e q u e n c e h o m o l o g y m a t c h b e t w e e n C B D a n d s w o l l e n i n / e x p a n s i n b a s e d n o n - h y d r o l y t i c p r o t e i n s t h a t s w e l l c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e . I t m i g h t b e p o s s i b l e t o i m p r o v e e n z y m a t i c a c t i v i t y o f c e l l u l a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e s b y m o d i f y i n g t h e C B D t o p r e v e n t n o n - p r o d u c t i v e b i n d i n g t o c e l l u l o s e a n d l i g n i n [ 3 2 ] . 2 . 3 . 1 . 5 M u l t i - c a t a l y t i c d o m a i n s y n e r g y S o m e m u l t i - d o m a i n e n z y m e s h a v e b e e n f o u n d t o c o n t a i n m u l t i p l e C B D s a n d / o r c a t a l y t i c d o m a i n s . T h e s t r u c t u r a l l i n k a g e o f t w o c a t a l y t i c d o m a i n s f o r t h e s e M u l t i f u n c t i o n a l P r o t e i n s r e s u l t s i n s y n e r g y b e t w e e n t h e s e c a t a l y t i c d o m a i n s . A m u l t i f u n c t i o n a l p r o t e i n ( C e l B i n C . s a c c h a r o l y t i c u m ) w a s c r e a t e d b y g e n e f u s i o n t o g i v e x y l a n a s e a n d c e l l u l a s e c a t a l y t i c d o m a i n s f u s e d t o g e t h e r b y a s i n g l e C B D , [ 2 3 1 ] . O n e p a r t i c u l a r l y i n t e r e s t i n g c o m b i n a t i o n o f m u l t i f u n c t i o n a l c a t a l y t i c m o d u l e s t h a t a p p e a r s i n t h e s a m e p o l y p e p t i d e c h a i n i s a n e n d o x y l a n a s e t o g e t h e r w i t h a f e r u l o y l e s t e r a s e [ 2 3 2 ] . S u c h a c o m b i n a t i o n w o u l d a l l o w t h e r a p i d c l e a v a g e o f h e m i c e l l u l o s e f r o m l i g n i n i n n a t u r a l s y s t e m s . I n t h i s m a n n e r , t h e x y l a n c h a i n w o u l d b e s e v e r e d b y t h e x y l a n a s e c o m p o n e n t a n d t h e l i g n i n - x y l a n a s s o c i a t i o n w o u l d b e d i s c o n n e c t e d s i m u l t a n e o u s l y b y t h e e s t e r a s e . A 2 . 3 . 1 . 6 C e l l u l o s o m a l b a s e d s y n e r g y I t i s e s t i m a t e d t h a t t h e a c t i v i t y o f p o l y c e l l u l o s o m e s y s t e m s ( f r o m C l o s t r i d i u m ) o n c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e i s a b o u t 5 0 - f o l d h i g h e r t h a n e x t r a c e l l u l a r e n z y m e s y s t e m s ( f r o m T r i c h o d e r m a ) [ 2 3 3 ] . A n i m p o r t a n t a s p e c t o f t h e c e l l u l o s o m e m o d e l p r o p o s e d i s t h a t t h e e n z y m e c o m p l e x h y d r o l y z e s c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e w i t h r e m a r k a b l e e f fi c i e n c y b e c a u s e t h e a c t i v i t i e s o f i n d i v i d u a l e n z y m e s a r e h i g h l y c o o r d i n a t e d [ 1 9 6 ] . T h i s c o o r d i n a t i o n c a n b e 3 1 v i e w e d a s a s p e c i a l i z e d f o r m o f ‘ p r o x i m i t y s y n e r g y ’ i n w h i c h t h e s p a t i a l o r g a n i z a t i o n o f e n z y m e s o n t h e c e l l u l o s e c h a i n i s c r u c i a l . T h e r e h a s a l s o b e e n s y n e r g y o b s e r v e d b e t w e e n f u n g a l ( T r i c h o d e r m a ) a n d b a c t e r i a l ( C l o s t r i d i u m ) e n z y m e s [ 2 7 ] . A r t i fi c i a l m i n i - c e l l u l o s o m e s h a v e b e e n c o n s t r u c t e d i n - v i t r o w i t h x y l a n a s e s a n d c e l l u l a s e t o e n h a n c e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f u n t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s [ 2 0 2 ] . 2 . 3 . 1 . 7 S y n e r g y d u e t o n o n - h y d r o l y t i c a d d i t i v e s A f r e q u e n t l y o b s e r v e d r a t e i n c r e a s e o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s b y a d d i t i o n o f n o n - i o n i c s u r f a c t a n t s h a s b e e n t y p i c a l l y a t t r i b u t e d t o a d e c r e a s e d n o n - s p e c i fi c b i n d i n g o f c e l l u l a s e s t o l i g n i n [ 3 8 , 2 3 4 ] . I t w a s a l s o f o u n d t h a t t h e a d d i t i o n o f b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) d e c r e a s e s t h e n o n - p r o d u c t i v e a d s o r p t i o n o f C B H a n d c o n s e q u e n t l y i n c r e a s e s t h e c o n v e r s i o n o f l i g n o c e l l u l o s e [ 3 3 ] . I t h a s b e e n g e n e r a l l y o b s e r v e d t h a t o n e p r o t e i n m a y h a v e h i g h e r a f fi n i t y f o r a p a r t i c u l a r s u r f a c e a n d m a y e v e n d i s p l a c e o t h e r p r o t e i n s f r o m t h e c o a t e d s u r f a c e . T h e r e d u c t i o n o f n o n - s p e c i fi c b i n d i n g o f c e l l u l a s e s d u e t o a d d i t i o n o f B S A o r n o n - i o n i c s u r f a c t a n t s i s m o s t p r o b a b l y d u e t o c o a t i n g o f t h e l i g n i n s u r f a c e b y t h e a d d e d s u r f a c e a c t i v e a g e n t s . 3 2 C H A P T E R 3 : P L A N T C E L L W A L L S U R F A C E T O P O G R A P H I C A L A N D C O M P O S I T I O N A L C H A N G E S A F T E R A M M O N I A B A S E D T R E A T M E N T S 3 . 1 . A m m o n i a p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y a n d s u b s t r a t e p a r t i c l e s i z e i n fl u e n c e e x t e n t o f c e l l w a l l m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s 3 . 1 . 1 A b s t r a c t i i i T h e e x t e n t o f p l a n t c e l l w a l l ( i . e . c o r n s t o v e r ) m o r p h o l o g i c a l m o d i fi c a t i o n w a s c l o s e l y r e l a t e d t o t h e t y p e o f c e l l w a l l ( e . g . p a r e n c h y m a v s . s c l e r e n c h y m a ) a n d A F E X p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s ( e . g . w a t e r a n d a m m o n i a l o a d i n g ) e m p l o y e d . A m o r p h o u s l y s h a p e d d e p o s i t s r i c h i n l i g n o - p h e n o l i c s w e r e d e p o s i t e d o n t h e o u t e r w a l l r e g i o n s a f t e r h i g h - m o i s t u r e / a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t , a s i n f e r r e d f r o m l a s e r s c a n n i n g c o n f o c a l fl u o r e s c e n c e / s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( L S C M a n d S E M ) a n d P r u s s i a n b l u e a n a l y s i s o f t h e w a l l e x t r a c t i v e s . T h e r e w a s c o n s i d e r a b l e fi b e r d i s r u p t i o n a f t e r h i g h - m o i s t u r e / a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t a s i n d i c a t e d b y s i g n i fi c a n t m o d i fi c a t i o n o f c e l l m o r p h o l o g y ( i . e . c e l l w a l l l e n g t h , l u m e n a r e a , w a l l p e r i m e t e r / l u m e n a r e a b a s e d i s o p e r i m e t r i c q u o t i e n t ) . I n c o n t r a s t t o w h a t w a s s e e n f o r h i g h - m o i s t u r e / a m m o n i a t r e a t m e n t , t h e r e w a s n o m a j o r p h y s i c a l m o d i fi c a t i o n o f s e c o n d a r y c e l l w a l l s d u r i n g c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t m e n t ( e m p l o y i n g l o w e r l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g ) . H o w e v e r , d e s p i t e t h e f a c t t h a t c o n v e n t i o n a l A F E X i s u n a b l e t o p h y s i c a l l y e x t r a c t l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e f r o m w i t h i n t h e c e l l w a l l s i n t o a s e p a r a t e l i q u i d f r a c t i o n , t h e r a t e o f e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f t r e a t e d c e l l w a l l s w a s 4 - 5 f o l d h i g h e r t h a n t h a t o f u n t r e a t e d w a l l s . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t t h e r e a r e c e r t a i n u l t r a s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s , c u r r e n t l y m A v e r s i o n o f t h i s c h a p t e r w a s p u b l i s h e d a s C h u n d a w a t S . P . S , B a l a n V . , D a l e B E . 2 0 0 6 . E fl e c t o f p a r t i c l e s i z e b a s e d s e p a r a t i o n o f m i l l e d c o r n s t o v e r o n A F E X p r e t r e a t m e n t a n d e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 9 6 ( 2 ) : 2 1 9 - 2 3 1 . 3 3 , n o t v i s i b l e t h r o u g h l o w m a g n i fi c a t i o n S E M a n d c o n f o c a l m i c r o s c o p y , w i t h i n c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t e d c e l l w a l l s t h a t e n h a n c e t h e a c c e s s i b i l i t y o f t h e w a l l p o l y s a c c h a r i d e s t o c e l l u l o l y t i c e n z y m e s . 3 . 1 . 2 B a c k g r o u n d 3 . 1 . 2 . 1 G r o s s m o r p h o l o g y o f a m m o n i a t r e a t e d c e l l w a l l s A F E X p r e t r e a t m e n t h a s b e e n f o u n d t o i n c r e a s e c e l l w a l l d e fi b r i l l a t i o n b a s e d o n s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c ( S E M ) a n a l y s i s o f p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s [ 7 , 2 3 5 ] . A m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t s h a v e b e e n t y p i c a l l y f o u n d t o d i s r u p t w o o d y fi b e r s o n a m i c r o m e t e r s c a l e b y s p l i t t i n g fi b e r s p a r a l l e l a l o n g t h e l o n g i t u d i n a l a x i s [ 2 3 6 ] . S u p e r c r i t i c a l a m m o n i a t r e a t e d h a r d w o o d e x h i b i t e d a m o r e ‘ a m o r p h o u s ’ s u r f a c e a p p e a r a n c e a n d s h o w e d a 5 0 % i n c r e a s e i n s p e c i fi c p o r e v o l u m e a f t e r p r e t r e a t m e n t , w i t h n o S i g n i fi c a n t c h a n g e i n t h e s p e c i fi c p o r e s i z e [ 1 6 2 ] . F u r t h e r m o r e , e x t e n s i v e p r e t r e a t m e n t o f h a r d w O o d s b y s u p e r - c r i t i c a l a m m o n i a r e s u l t e d i n r e d u c t i o n o f s p e c i fi c p o r e v o l u m e c o m p a r a b l e t o u n t r e a t e d s a m p l e s . T h e r e h a v e b e e n e f f o r t s i n r e c e n t y e a r s t o s t u d y t h e e f f e c t o f d i l u t e a c i d a n d s t e a m e x p l o s i o n b a s e d p r e t r e a t m e n t s o n u l t r a - s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s o f l i g n o c e l l u l o s i c g r a s s e s u s i n g h i g h r e s o l u t i o n e l e c t r o n a n d a t o m i c f o r c e m i c r o s c o p y ( A F M ) b a s e d t e c h n i q u e s [ 4 0 , 1 1 1 , 1 1 2 ] . D i l u t e - a c i d a n d s t e a m e x p l o s i o n b a s e d p r e t r e a t m e n t s h a v e b e e n S h o w n t o c a u s e l i g n i n c o a l e s c e n c e i n t o d r o p l e t s t h a t m i g r a t e o u t o f c o r n s t o v e r c e l l w a l l s . T h e d r o p l e t s r e d e p o s i t w i t h i n a n d o u t s i d e t h e c e l l w a l l s a t t h e e n d o f p r e t r e a t m e n t a n d r a n g e i n s i z e f r o m 5 n m t o 1 0 r u n s [ 1 1 2 ] . T h e s e S p h e r i c a l d r o p l e t s a r e c o m p o s e d e s s e n t i a l l y o f l i g n i n a n d a r e f o u n d t o s e v e r e l y i n h i b i t e n z y m a t i c a c t i v i t y [ 4 0 ] . L i g n i n r e - l o c a l i z a t i o n a w a y f r o m c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s h e l p s i m p r o v e c e l l u l a s e a c c e s s i b i l i t y , h o w e v e r , 3 4 c o m p l e t e l i g n i n r e m o v a l c a u s e s e x t e n s i v e c o l l a p s e o f m i c r o fi b r i l s w h i c h m a y i m p e d e f u r t h e r a c c e s s t o e n z y m e s ( P e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n w i t h B r y o n D o n o h o e a t N R E L ; [ l 6 l , 1 6 2 ] ) . A l k a l i n e e x t r a c t i o n a n d d e l i g n i fi c a t i o n o f s p r u c e b a s e d s o f t w o o d r e s u l t e d i n c o n s i d e r a b l e n a n o s t r u c t u r a l c h a n g e s o f t h e h e m i c e l l u l o s e - l i g n i n m a t r i x s u r r o u n d i n g c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s b a s e d o n t h e s e v e r i t y o f p r e t r e a t m e n t [ 2 3 7 ] . A l k a l i p u l p i n g t y p i c a l l y r e s u l t s i n s w e l l i n g o f c e l l u l o s e c r y s t a l l i t e s a s s e e n v i a A F M i m a g i n g [ 2 3 8 ] a n d s i g n i fi c a n t m o d i fi c a t i o n o f c e l l w a l l m o r p h o l o g y c a u s e d b y e x t e n s i v e fi b e r d e fi b r i l l a t i o n a n d e x t r a c t i o n o f l i g n i n / h e m i c e l l u l o s e [ 2 3 6 ] . T h e r e h a v e b e e n n o d e t a i l e d m i c r o s c o p i c s t u d i e s c o n d u c t e d f o r A F E X p r e t r e a t e d a g r i c u l t u r a l r e s i d u e s ( l i k e c o r n s t o v e r ) t o e l u c i d a t e t h e e f f e c t o f p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y o n c e l l w a l l m o r p h o l o g y a n d u l t r a - s t r u c t u r e . A d e t a i l e d a n a l y s i s o f t h e s e u l t r a - s t r u c t u r a l c h a n g e s w o u l d h e l p b e t t e r u n d e r s t a n d t h e r o l e o f p r e t r e a t m e n t o n e n h a n c i n g t h e p h y s i c a l a c c e s s i b i l i t y o f e n z y m e s t o c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s , a n d m i g h t a l s o a s s i s t i n r e d u c i n g a n y p r e t r e a t r n e n t - i n d u c e d r e c a l c i t r a n c e t o e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y . 3 . 1 . 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s S e e a p p e n d i x A - V H - l , 4 ( a ) , 6 , 7 , 1 3 , 1 5 , 1 9 ( b ) , 2 3 , 2 4 , 2 8 a n d 3 1 . 3 . 1 . 4 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 3 . 1 . 4 . 1 M o d i f i c a t i o n o f e x t e r n a l c e l l w a l l m o r p h o l o g y d e p e n d s o n a m m o n i a p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s U n l i k e A F E X , m o s t p r e t r e a t m e n t s p h y s i c a l l y e x t r a c t a s i g n i fi c a n t p o r t i o n o f t h e l i g n i n ( 2 0 - 8 5 % ) a n d h e m i c e l l u l o s e ( 3 0 - 8 0 % ) f r o m c o r n s t o v e r i n t o s e p a r a t e l i q u i d p r o c e s s s t r e a m s [ 1 8 , 5 4 , 1 1 3 , 1 5 8 , 2 3 9 - 2 4 3 ] . T h i s i s p r o b a b l y d u e t o t h e h i g h e r l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g ( 3 t o 2 0 g r n s w a t e r p e r g m b i o m a s s ) e m p l o y e d d u r i n g t h o s e p r e t r e a t m e n t s 3 5 c o m p a r e d t o c o n v e n t i o n a l A F E X ( 0 . 6 g m w a t e r + 1 g m l i q u i d a m m o n i a p e r g m b i o m a s s ) t h a t a l l o w s b e t t e r e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y f o r l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e [ 5 4 ] . I n o r d e r t o b e t t e r u n d e r s t a n d t h e m e c h a n i s m o f A F E X , t w o p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s ( p r o t o c o l A - V I I - 4 ( a ) ) w e r e e x p l o r e d t o s t u d y t h e r o l e o f l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g o n m o d i fi c a t i o n o f c o r n s t o v e r c e l l w a l l m o r p h o l o g y . C o n d i t i o n s e m p l o y e d w e r e ; ( A ) C o n v e n t i o n a l ( o r ‘ R e g u l a r ’ ) A F E X ( R - A C S ) a t 1 : 1 a m m o n i a t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 0 . 6 : 1 w a t e r t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 1 5 m i n r e s i d e n c e t i m e a t 1 0 0 ° C ; a n d ( B ) H i g h l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g b a s e d A F E X ( H i g h - A C S ) a t 2 : 1 a m m o n i a t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 2 : 1 w a t e r t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 1 5 m i n r e s i d e n c e t i m e a t 1 0 0 ° C . A m o d i fi c a t i o n t h a t i s i m m e d i a t e l y v i s i b l e t o t h e n a k e d e y e a f t e r A F E X t r e a t m e n t i s t h e c h a n g e i n c o l o r o f t h e t i s s u e f r o m y e l l o w t o b r o w n , p o s s i b l y i n d i c a t i v e o f t h e e x p o s e d l i g n i n b a s e d c o m p o n e n t s t h a t h a v e o x i d i z e d u p o n e x p o s u r e t o a i r . T h e s t e m c r o s s - s e c t i o n s s h r i v e l e d u p i m m e d i a t e l y a f t e r r e m o v a l f r o m t h e r e a c t o r d u r i n g t h e v o l a t i z a t i o n o f a m m o n i a f r o m t h e c e l l w a l l s . S E M ( p r o t o c o l A - V I I - 6 ) m i c r o g r a p h s ( F i g u r e 3 . A . l ) r e v e a l e d t h e v a r i o u s c e l l t y p e s w i t h i n t h e c o r n s t a l k i n t e m o d e c r o s s - s e c t i o n c o m p r i s i n g o f e p i d e r m a l c e l l s , v a s c u l a r b u n d l e s , p a r e n c h y m a c e l l s a n d l i g n i fi e d s c l e r e n c h y m a c e l l s . T h e s e c o n d a r y w a l l t h i c k e n e d v a s c u l a r b u n d l e c e l l s a r e t h e m o s t r e c a l c i t r a n t c e l l s t o e n z y m a t i c h y d r o l y s i s a n d c o n t r i b u t e n e a r l y 7 0 - 8 0 % o f t h e m a s s ( a l o n g w i t h o t h e r r i n d t i s s u e c e l l s ) o f t h e s t e m i n t e m o d e [ 6 6 ] . V a s c u l a r b u n d l e s a r e c o m p r i s e d o f x y l e m a n d p h l o e m b a s e d c e l l s t h a t a l l o w t r a n s p o r t o f w a t e r a n d n u t r i e n t s a l o n g t h e l e n g t h o f t h e s t e m . T h e x y l e m i s c o m p o s e d p r i m a r i l y o f s c l e r e n c h y m a d e r i v e d x y l e m v e s s e l s a n d x y l e m t r a c h e i d fi b e r c e l l s ( c o n t a i n i n g t h i c k s e c o n d a r y c e l l w a l l s ) . H e n c e , i t w a s n e c e s s a r y t o c l o s e l y s t u d y c e l l t i s s u e b e l o n g i n g t o t h i s p o r t i o n o f t h e 3 6 i n t e m o d e . I n t e r e s t i n g l y , c o n v e n t i o n a l A F E X a t l o w e r l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g r e s u l t e d i n n o o b s e r v a b l e m a j o r m o d i fi c a t i o n s o f t h e v a r i o u s t y p e s o f c e l l w a l l m o r p h o l o g i e s , a t v a r i o u s s c a l e s o f m a g n i fi c a t i o n ( F i g u r e 3 . A . l , I m a g e s e t I v s . 1 1 ) . H o w e v e r , H i g h - A C S s a m p l e s t h a t e m p l o y e d a m u c h h i g h e r l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g d u r i n g t r e a t m e n t r e s u l t e d i n S i g n i fi c a n t o b s e r v a b l e m o d i fi c a t i o n o f t h e c e l l w a l l m o r p h o l o g y . T h e p a r e n c h y m a c e l l s w e r e c o m p l e t e l y d i s r u p t e d r e s u l t i n g i n t h e c o l l a p s e a n d a g g r e g a t i o n o f v a s c u l a r b u n d l e s ( F i g u r e 3 . A . 1 , I I I - A ) . T h e v a s c u l a r b u n d l e c e l l s h a d c o l l a p s e d s i g n i fi c a n t l y w i t h c e l l w a l l e x t r a c t i v e s d e p o s i t e d o n t h e o u t e r c e l l w a l l s a n d w i t h i n t h e e m p t y l u m e n s p a c e ( F i g u r e 3 . A . 1 , I I I - C / D ) . T h e c o m p o s i t i o n o f t h e s e c e l l w a l l e x t r a c t i v e s w a s e x p l o r e d i n d e t a i l i n c h a p t e r s 3 . 2 a n d 5 . T o o b t a i n a q u a n t i t a t i v e m e a s u r e o f t h e e x t e n t o f m o d i fi c a t i o n o f t h e c e l l w a l l m o r p h o l o g y , t h e S E M m i c r o g r a p h s w e r e a n a l y z e d ( p r o t o c o l A - V I I - 6 ) t o e s t i m a t e t h e c e l l w a l l b o u n d a r y p e r i m e t e r l e n g t h ( L ) a n d c e l l l u m e n e n c l o s e d a r e a ( A ) f o r v a r i o u s t y p e s o f c e l l s ( e . g . p a r e n c h y m a c e l l s , x y l e m v e s s e l s , p h l o e m a n d fi b e r c e l l s i n t h e v a s c u l a r b u n d l e ) . M o r e t h a n 5 0 i m a g e s w e r e c o l l e c t e d p e r s a m p l e t y p e f r o m d i s t i n c t t i s s u e s e c t i o n s a n d i n t e m o d e r e g i o n . O f t h e s e i m a g e s , a d o z e n i m a g e s p e r s a m p l e t y p e w e r e i m p o r t e d i n t o t h e i m a g e a n a l y s i s s o f t w a r e f o r q u a n t i t a t i v e m e a s u r e o f c e l l w a l l p e r i m e t e r a n d a r e a e n c l o s e d w i t h i n t h e r e s p e c t i v e p e r i m e t e r S p a c e ( S e e r a w d a t a i n T a b l e I - 3 . A . 3 ) . A s u m m a r y o f t h e a v e r a g e c e l l w a l l p e r i m e t e r l e n g t h ( L ) a n d p e r i m e t e r e n c l o s e d l u m e n a r e a ( A ) f o r t h e v a r i o u s s a m p l e a n d c e l l t y p e s i s g i v e n i n T a b l e 3 . A . 1 . T h e c e l l w a l l p e r i m e t e r ( L ) c o u l d n o t b e e s t i m a t e d f o r H i g h - A C S p a r e n c h y m a c e l l s s i n c e t h e y h a d c o l l a p s e d c o m p l e t e l y . I n o r d e r t o e s t i m a t e t h e c i r c u l a r i t y o f t h e g e o m e t r i c a l c e l l w a l l . . . . . . 2 s h a p e a d i m e n s r o n a l n u m b e r k n o w n a s t h e I s o p e r r m e t r r c q u o t i e n t ( Q = 4 1 r A / L ) w a s 3 7 c a l c u l a t e d f o r e a c h d a t a p o i n t . T h e i s o p e r i m e t r i c q u o t i e n t o f a c l o s e d c u r v e i s d e fi n e d a s t h e r a t i o o f t h e c u r v e a r e a t o t h e a r e a o f a c i r c l e w i t h t h e s a m e p e r i m e t e r a s t h e c u r v e . T a b l e 3 . A . l C o m p a r i s o n o f c e l l w a l l p e r i m e t e r ( L , , u m ) , a r e a e n c l o s e d w i t h i n l u m e n s p a c e ( A , m 2 ) a n d i s o p e r i m e t r i c q u o t i e n t ( 4 7 r A / L ) f o r u n t r e a t e d , c o n v e n t i o n a l A F E X ( R - A C S ) a n d h i g h l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g b a s e d A F E X ( H i g h - A C S ) t r e a t e d c o r n s t o v e r c e l l w a l l s . V a l u e s w i t h d i fl e r e n t a l p h a b e t i c a l s u p e r s c r i p t s i n a n i n d i v i d u a l c o l u m n w e r e s t a t i s t i c a l l y d i fl e r e n t w i t h p < 0 . 0 5 b a s e d o n S t u d e n t t - t e s t . M e a n v a l u e % S t a n d a r d D e v i a t i o n S a m p l e 1 0 L A 4 N B L A 4 N L Z P a r e n c h y m a c e l l s U n t r e a t e d 3 5 9 a 9 4 8 8 3 " 0 . 8 8 5 9 8 3 3 2 2 4 4 5 R - A C S 2 5 8 b 5 3 9 5 ” D 0 . 8 7 2 3 3 3 3 4 4 8 6 H i g h - A C S - - - - - - X y l e m v e s s e l s U n t r e a t e d 2 4 1 c 4 4 0 3 ° ° 0 . 9 4 5 0 ° ° ° 1 4 2 7 7 R - A C S 1 9 8 d 2 9 5 7 d d 0 . 9 2 7 5 ° ° ° 1 7 3 5 H i g h - A C S 1 1 2 e 9 7 8 9 " 0 . 9 2 5 3 ° ° ° 2 2 4 3 V a s c u l a r b u n d l e c e l l s U n t r e a t e d 4 2 f 1 2 8 f f 0 . 8 3 3 4 f " 3 3 8 2 1 1 R - A C S 3 7 f 1 0 3 f f 0 . 8 8 3 3 m 3 4 8 1 8 H i g h - A C 8 2 2 9 3 3 9 9 0 . 7 8 5 5 9 9 9 3 8 8 3 1 3 3 8 ’ P ‘ . . . . i y b j k i f A i i r ; i a “ ) A ( I I I 3 9 F i g u r e 3 . A . l S E M m i c r o g r a p h s o f u n t r e a t e d ( 1 ) , c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t e d ( 1 1 ) a n d h i g h l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g b a s e d A F E X t r e a t e d ( 1 1 1 ) c o r n s t o v e r a t v a r y i n g d e g r e e s o f m a g n i fi c a t i o n ( S c a l e b a r s s h o w n a t t h e b o t t o m o f e a c h i m a g e ) . ‘ \ ) 0 n 5 e P r 1 h L t o c d h n d i g n e a u a t o t a b 0 r e o h 2 r t t o m d t X e o t r d E c f e F e s d t u A e e d l d s i e a s p s m w a a b w e o c v g i n n o s t i d a i c e s g e s a j o i m l i m e b o d 3 n i d . o l 0 n i o / a t s X c o e m t j 0 1 n o d r r i 3 u p a q u 4 i fl 5 e l r h a o e h t g i ) N w - B i ( h n d e d a d n t l n i P a c a x . ) ) e y A A l ( ( e e d r v e i e e g t t w c a e a e s m p r I n s t o e i r n . t u ) c , n f e s e o e s n s g e r r u e l g p a m n 0 i 9 m a n d i S w n n . o a o n h i i 2 s t 2 n c a y 1 e r t j f i f o o a s r S n e p s h t s y n t i t e i i n s e w k n d c c e i e n t h n t n e i i c a s e a m t s r u o g m s u n e l i i t f l x ( n d e a n r s m u e e b t r M l p r fi e S a l n C u o L i c r s n s s o 2 a s i . v i t A m c . ) e e 3 s B ( e m l . r n r a s e c e u v i g g 0 o t a i m 6 t p F o s 5 I 4 0 T h e u p p e r l i m i t o f Q i s 1 f o r a c i r c l e w h i l e i t d r o p s t o 0 . 7 8 6 f o r a s q u a r e . T h i s d i m e n s i o n l e s s q u a n t i t y ( Q ) h e l p e d q u a n t i f y t h e c i r c u l a r i t y o f t h e c e l l w a l l s h a p e a s f u n c t i o n o f c e l l t y p e a n d p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y . C o m p a r i n g L , A a n d Q f o r u n t r e a t e d a n d R - A C S p a r e n c h y m a c e l l w a l l s ; t h e r e w a s s i g n i fi c a n t ( b a s e d o n S t u d e n t t - t e s t , D e g r e e s o f f r e e d o m [ D F ] = 2 9 a n d p < 0 . 0 5 ) d e c r e a s e i n t h e c e l l w a l l p e r i m e t e r ( 2 8 % d r o p ) a n d l u m e n a r e a ( 4 3 % d I O p ) a f t e r c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t m e n t . H o w e v e r , n o S i g n i fi c a n t c h a n g e i n t h e s h a p e o f t h e p a r e n c h y m a c e l l s w a s s e e n a f t e r R - A C S b a s e d o n c o m p a r i n g t h e Q v a l u e t o u n t r e a t e d s t o v e r . C o m p a r i n g L , A a n d Q f o r u n t r e a t e d a n d R - A C S x y l e m v e s s e l s ; t h e r e w a s s i g n i fi c a n t ( b a s e d o n S t u d e n t t — t e s t , D e g r e e s o f f r e e d o m [ D F ] = 1 3 a n d p < 0 . 0 5 ) d e c r e a s e i n t h e c e l l w a l l p e r i m e t e r ( 1 8 % d r o p ) a n d l u m e n a r e a ( 3 3 % d r o p ) a f t e r c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t m e n t . T h e r e w a s n o s i g n i fi c a n t c h a n g e i n t h e s h a p e o f t h e x y l e m v e s s e l s a f t e r c o n v e n t i o n a l A F E X , b a s e d o n t h e Q v a l u e . C o m p a r i n g L , A a n d Q f o r u n t r e a t e d a n d H i g h - A C S x y l e m v e s s e l s ; t h e r e w a s s i g n i fi c a n t ( b a s e d o n S t u d e n t t - t e s t , D e g r e e s o f f r e e d o m [ D F ] = 2 2 a n d p < 0 . 0 5 ) d e c r e a s e i n t h e c e l l w a l l p e r i m e t e r ( 5 4 % d r o p ) a n d l u m e n a r e a ( 7 8 % d r o p ) a f t e r h i g h l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g b a s e d A F E X t r e a t m e n t . T h e r e w a s a l s o n o s i g n i fi c a n t c h a n g e i n t h e s h a p e o f t h e H i g h - A C S x y l e m v e s s e l s c o m p a r e d t o u n t r e a t e d v e s s e l s b a s e d o n t h e i r Q v a l u e . C o m p a r i n g L , A a n d Q f o r u n t r e a t e d a n d R — A C S v a s c u l a r b u n d l e c e l l s ; t h e r e w a s n o s i g n i fi c a n t ( b a s e d o n S t u d e n t t - t e s t , D e g r e e s o f f r e e d o m [ D F ] = 7 5 a n d p < 0 . 0 5 ) d e c r e a s e i n t h e c e l l w a l l p e r i m e t e r , l u m e n a r e a a n d s h a p e o f t h e c e l l s a f t e r c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t m e n t . H o w e v e r , u p o n c o m p a r i n g L , A a n d Q f o r u n t r e a t e d a n d H i g h - A C S v a s c u l a r b u n d l e c e l l s ; t h e r e w a s a s i g n i fi c a n t ( b a s e d o n S t u d e n t t - t e s t , D e g r e e s o f f r e e d o m [ D F ] = 1 5 8 a n d p < 0 . 0 5 ) d e c r e a s e i n t h e c e l l w a l l p e r i m e t e r ( 4 8 % d r o p ) , l u m e n a r e a ( 7 4 % d r o p ) a n d s h a p e o f t h e 4 1 c e l l s ( 6 % d r o p i n Q v a l u e ) a f t e r h i g h l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g b a s e d A F E X t r e a t m e n t . I t w a s i n t e r e s t i n g t o fi n d t h a t R - A C S d i d n o t s i g n i fi c a n t l y m o d i f y t h e m a c r o s c o p i c m o r p h o l o g y o f t h e t h i c k e n e d s e c o n d a r y c e l l w a l l s a s c o m p a r e d t o H i g h - A C S . T h e s e r e s u l t s h i n t a t c e r t a i n m i c r o s c o p i c b a s e d s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s t h a t m i g h t h a v e t a k e n p l a c e w i t h i n R - A C S t r e a t e d c e l l w a l l s t h a t r e s u l t i n e n h a n c i n g e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y ( S e e C h a p t e r 4 ) . T h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e c e l l w a l l e x t r a c t i v e s a n d t h e i r p h y s i c a l d i s t r i b u t i o n f o r t h e H i g h - A C S s a m p l e s w e r e s t u d i e d u s i n g a l i g n o - p h e n o l i c s e l e c t i v e s t a i n ( S a f r a n i n ) a n d i m a g e d u s i n g a l a s e r c o n f o c a l fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e ( L S C M ; p r o t o c o l A - V I I - 7 ) . I t i s p o s s i b l e t o g e t a m o r e s p e c i fi c s t a i n i n g o f l i g n i n ( u s i n g fl u o r e s c e n t O ’ S a f r a n i n ) b y u s i n g a n a r r o w r a n g e b a n d p a s s ( B P ) e m i s s i o n fi l t e r o f 5 0 5 - 5 3 0 n m [ 2 4 4 ] . S a f a r a n i n i s a c a t i o n i c fl u o r o c h r o m e r e p o r t e d t o s t a i n l i g n i n , p h e n o l i c s , s u b e r i n a n d s t a r c h . T h e p e a k a b s o r p t i o n a n d e m i s s i o n f o r S a f r a n i n h a s b e e n r e p o r t e d t o b e a r o u n d 5 3 0 a n d 5 9 0 n m , r e s p e c t i v e l y [ 2 4 5 , 2 4 6 ] . L i g n i n a u t o fl u o r e s c e n c e e m i s s i o n p e a k s a t a b o u t 3 6 0 n m w i t h e x c i t a t i o n a t w a v e l e n g t h s fi o m 2 4 0 - 3 2 0 n m [ 2 4 7 ] . H o w e v e r , i n o r d e r t o a v o i d o v e r l a p o f s a fi a n i n fl u o r e s c e n c e w i t h l i g n i n a u t o fl u o r e s c e n c e a n e x c i t a t i o n fi l t e r o f 5 4 3 n m a n d e m i s s i o n fi l t e r o f 5 6 0 n m ( l o n g p a s s , L P ) w e r e u s e d . N o l i g n i n a u t o fl u o r e s c e n c e w a s s e e n u s i n g t h e 5 4 3 n m e x c i t a t i o n fi l t e r . O n e o f t h e s t r i k i n g d i f f e r e n c e s b e t w e e n u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d s a m p l e s w a s t h e s i g n i fi c a n t l o s s i n s a f r a n i n fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y a f t e r A F E X ( i . e . n o p e r c e i v a b l e d i f f e r e n c e i n c o n t r a s t o f c e l l w a l l s w i t h r e s p e c t t o b a c k g r o u n d ) , w i t h e x a c t l y t h e s a m e d e t e c t o r g a i n ( G a i n = 6 5 0 V o l t s ) . T h i s s u g g e s t e d t h a t l i g n i n i n A F E X t r e a t e d b i o m a s s ( R - A C S a n d H i g h - A C 8 ) w a s e i t h e r d e l o c a l i z e d f r o m i t s o r i g i n a l l o c a t i o n a n d / o r h a d b e e n c h e m i c a l l y m o d i fi e d t o a f f e c t t h e 4 2 b i n d i n g o f t h e s t a i n t o i t . I n e i t h e r c a s e , i t w a s f o u n d n e c e s s a r y t o i n c r e a s e t h e d e t e c t o r g a i n b y a t l e a s t 2 0 % ( N e w G a i n = 7 8 0 V o l t s ) t o i m a g e b o t h t h e A F E X t r e a t e d s a m p l e s w i t h s u f f i c i e n t c o n t r a s t w i t h r e s p e c t t o t h e b a c k g r o u n d . T h e r e w a s n o d i s t i n c t d i f f e r e n c e i n t h e i m a g e s c o l l e c t e d f o r u n t r e a t e d a n d R - A C S A F E X s a m p l e s , c o r r o b o r a t i n g w h a t w a s s e e n t h o u g h t h e S E M a s w e l l . H o w e v e r , f o r h i g h - A C S s a m p l e s , t h e r e w e r e c e l l w a l l e x t r a c t i v e s r i c h i n l i g n i n - p h e n o l i c s d e p o s i t e d w i t h i n t h e l u m e n s p a c e ( F i g u r e 3 . A . 2 ) . T h e d e p o s i t - l i k e f o r m a t i o n s w e r e n o t e d i n p a r t i c u l a r f o r t h e l i g n i fi e d c e l l w a l l s i n t h e v a s c u l a r b u n d l e a s c o m p a r e d t o t h e p a r e n c h y m a c e l l s ( S i m i l a r t o w h a t w a s s e e n S E M i m a g e s , F i g u r e 3 . A . l ) . T h e w a l l s h a p e w a s a l s o s i g n i fi c a n t l y d i s t o r t e d f o r H i g h - A C 8 s a m p l e s a s w e l l . T h e L C S M i m a g i n g e x p e r i m e n t s v a l i d a t e t h e S E M fi n d i n g s c o m p a r i n g u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d b i o m a s s ( f o r b o t h 6 0 % a n d 2 0 0 % m o i s t u r e l o a d i n g s ) . T h e r e s o l u t i o n f o r c o n f o c a l m i c r o s c o p y w a s l i m i t e d d u e t o d i f f i c u l t i e s i n o b t a i n i n g t h i n n e r s e c t i o n s o f t h e s a m p l e f o r i m a g i n g . T h i s p r e v e n t e d u s e o f h i g h e r m a g n i fi c a t i o n o b j e c t i v e o i l - l e n s ( 6 3 X ) t h a t m i g h t h a v e s h o w n m o r e i n t e r e s t i n g d e t a i l s f o r c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t e d s a m p l e s . S i n c e , i t w a s p o s s i b l e t o o b t a i n h i g h e r m a g n i fi c a t i o n i m a g e s u s i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y t h e L S C M a p p r o a c h w a s n o t f u r t h e r i n v e s t i g a t e d . B u t t h e r e a r e s e v e r a l d i s a d v a n t a g e s a s s o c i a t e d w i t h e l e c t r o n m i c r o s c o p y b a s e d t e c h n i q u e s a s w e l l . E l e c t r o n m i c r o s c o p y c a n b e t i m e c o n s u m i n g , l a b o r i o u s , s u b j e c t t o a r t i f a c t s b e e n o b s e r v e d d u e t o s a m p l e p r e p a r a t i o n a n d s o m e t i m e s f a i l t o p r o v i d e c o m p o s i t i o n a l d e p e n d e n t m o r p h o l o g i c a l d i f f e r e n c e s . A t h i g h e r l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g s ( 5 : 1 a n d g r e a t e r ) , m a s s t r a n s f e r r e g i m e s e x p e r i e n c e d d u r i n g A F E X a r e s i m i l a r t o a m m o n i a r e c y c l e p e r c o l a t i o n ( A R P ) a n d a n a l o g o u s a l k a l i p u l p i n g p r o c e s s e s t h a t a r e e f f e c t i v e i n e x t r a c t i n g l i g n i n a n d 4 3 h e m i c e l l u l o s e . I t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t e x t r a c t i o n o f l i g n i n f r o m w o o d y b i o m a s s b y s u p e r c r i t i c a l a m m o n i a - w a t e r m i x t u r e s i s d i f f u s i o n l i m i t e d , b a s e d o n k i n e t i c m o d e l s o f w o o d d e l i g n i fi c a t i o n [ 2 4 8 ] . H o w e v e r , f r o m a c o m m e r c i a l s t a n d p o i n t i n c r e a s i n g t h e l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g ( t h r o u g h i n c r e a s e d w a t e r u s a g e ) d u r i n g A F E X w o u l d b e c o m m e r c i a l l y u n v i a b l e d u e t o t h e s i g n i fi c a n t c a p i t a l i n v e s t m e n t i n s u i t a b l e a m m o n i a - w a t e r r e c o v e r y s y s t e m s [ 1 5 9 , 1 8 1 ] . T h e r e f o r e , f u t u r e w o r k w a s f o c u s e d o n u n d e r s t a n d i n g t h e m e c h a n i s m o f c o n v e n t i o n a l A F E X ( a t l o w e r w a t e r t o s o l i d l o a d i n g s ) . 3 . 1 . 4 . 2 E fi ' e c t o f b i o m a s s p a r t i c l e s i z e a n e x t r a c t i o n o f l i g n o - p h e n o l i c s d u r i n g A F E X I n o r d e r t o b e t t e r u n d e r s t a n d t h e m a s s t r a n s f e r l i m i t a t i o n s o n e x t r a c t i o n o f l i g n o - p h e n o l i c f r a g m e n t s f r o m w i t h i n c e l l w a l l s t o t h e o u t e r w a l l s u r f a c e , t h e e f f e c t o f s u b s t r a t e p a r t i c l e s i z e o n t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y o f p h e n o l i c s w a s s t u d i e d . C o r n s t o v e r f r a c t i o n s w e r e o b t a i n e d u p o n l a b o r a t o r y b l e n d e r m i l l i n g ( p r o t o c o l A - V I I - l ( b ) ) r e s u l t i n g i n t h e f o l l o w i n g p a r t i c l e s i z e r a n g e s ; a ) F r a c t i o n 2 0 - M e s h ( > 8 5 0 m i c r o n s ) , b ) F r a c t i o n 3 5 - M e s h ( 8 5 0 - 5 0 0 m i c r o n s ) , c ) F r a c t i o n 4 0 - M e s h ( 5 0 0 - 4 2 5 m i c r o n s ) , ( 1 ) F r a c t i o n 7 0 - M e s h ( 4 2 5 - 2 1 2 m i c r o n s ) , e ) F r a c t i o n 8 0 - M e s h ( 2 1 2 - 1 8 0 m i c r o n s ) , 1 ) F r a c t i o n l O O - M e s h ( 1 8 0 - 1 5 0 m i c r o n s ) , a n d g ) F r a c t i o n 1 2 0 - M e s h ( < 1 5 0 m i c r o n s ) . T h e a v e r a g e p a r t i c l e s i z e ( 5 r e p l i c a t e s w i t h v a r i a t i o n u n d e r 1 - 2 % fi o m a v e r a g e ) d i s t r i b u t i o n o f t h e m i l l e d m a t e r i a l a s c o m p a r e d t o p r e - m i l l e d ( P M ) c o r n s t o v e r i s S h o w n i n F i g u r e I - 3 . A . 5 . T h e P M s t o v e r h a s a m o r e s k e w e d p a r t i c l e s i z e d i s t r i b u t i o n t e n d i n g t o w a r d s t h e l a r g e r s i z e s . H o w e v e r , t h e p a r t i c l e s i z e d i s t r i b u t i o n f o r t h e m i l l e d s t o v e r f r a c t i o n s i s a p p r o x i m a t e l y n o r m a l l y d i s t r i b u t e d c e n t e r e d a b o u t m i d - r a n g e m e s h c u t ( 4 2 5 - 2 1 2 m i c r o n s ) . C o r n s t o v e r p r o d u c e s a r o u n d 2 5 - 3 0 % o f l e a f y f r a c t i o n ( l e a f - h u s k — s h e a t h s ) a n d 7 0 - 7 5 % o f fi b r o u s a n d h a r d m a t e r i a l ( s t a l k a n d c o b s ) , a s s h o w n i n F i g u r e I - 3 . A . 5 . 4 4 C o m p o s i t i o n a l a n a l y s i s ( p r o t o c o l A - V I I - l 3 ) o f c o r n s t o v e r f r a c t i o n s ( T a b l e 3 . A . 2 ) g i v e s a g o o d i n d i c a t i o n o f t h e p o s s i b l e o r i g i n o f e a c h fi a c t i o n . 4 5 ) m u 0 2 0 3 0 3 1 8 9 0 3 4 . . . . . . . . . 5 2 0 2 1 1 1 2 0 4 4 1 3 2 1 1 # < ( 0 3 9 8 0 . . 1 . 7 9 3 9 5 1 1 2 8 0 3 3 3 1 2 . . . . . . 3 2 1 # 0 8 # r e v o t s n r o c d e l l i m 4 5 6 3 5 3 3 3 2 . . . 4 3 2 1 2 0 2 3 4 . . . . . . - 1 3 2 o r p m o r f s n o i t c a r f e z i s e l c 4 7 4 . . . 3 7 4 0 7 2 . . . . . . 4 4 2 1 2 0 3 2 2 3 2 1 5 5 5 0 4 7 8 3 1 i . . . . . . . . . t 3 7 2 1 1 2 0 0 2 r 3 2 1 a p s u o i r a v f . . . 6 4 3 4 7 3 9 5 1 2 3 2 1 2 0 3 3 3 . . . . . . 3 2 1 o n o i t i s s o p m o t e s s n e n n b e l l b C n a a u n n n n o a t n l i n a i u l o 2 . A . a e p S c c o n n i l t m o y u b n a S g o X a r L o r l a l i l G P a r 3 C M G A e l b a T e h t o a c W l A 4 6 # 2 0 # 3 5 P r o - m i l l e d ( > 8 5 0 u m ) ( 8 5 0 - 5 0 0 u m ) ( 5 0 0 - 4 2 5 u m ) ( 4 2 5 - 2 1 2 u m ) ( 2 1 2 - 1 8 0 p m ) ( 1 8 0 - 1 5 0 u m ) # 4 0 # 7 0 3 4 . 0 2 2 . 6 1 . 4 2 . 6 0 . 2 1 2 . 6 2 . 7 6 . 0 3 . 6 3 4 . 0 2 1 . 9 1 . 5 2 . 7 0 . 1 1 2 . 9 2 . 9 7 . 9 3 . 9 T h e l a r g e r p a r t i c l e s i z e f r a c t i o n s h a v e a h i g h e r x y l a n / m a n n a n c o n t e n t a n d l o w e r w a t e r s o l u b l e c o n t e n t c o m p a r e d t o p r e - m i l l e d ( P M ) c o r n s t o v e r . T h e fi n e r fi ' a c t i o n s a r e r i c h e r i n w a t e r - s o l u b l e c o m p o n e n t s ( i . e . p r o t e i n s , s o l u b l e s u g a r s ) a n d h a v e a l o w e r h e r r r i c e l l u l o s i c c o n t e n t . T h e l a r g e r f r a c t i o n s ( # 2 0 - 8 0 m e s h c u t s ) a r e m o r e l i k e l y t o b e d e r i v e d f r o m t h e s t e r n p o r t i o n a s c o m p a r e d t o t h e fi n e r f r a c t i o n s ( # 1 0 0 - 1 2 0 m e s h c u t s ) t h a t a r e l i k e l y f r o m t h e l e a f , b r o k e n m i d r i b a n d v e i n s o f t h e s t o v e r . H o w e v e r , t h e g l u c a n a n d l i g n i n c o n t e n t o f a l l s i z e f r a c t i o n s a r e l a r g e l y s i m i l a r ( 3 2 - 3 4 % a n d 1 2 - 1 3 % , r e s p e c t i v e l y ) . T h e v a r i o u s s t o v e r f r a c t i o n s w e r e A F E X t r e a t e d u n d e r i d e n t i c a l c o n d i t i o n s ( 1 : 1 a m m o n i a t o b i o m a s s l o a d i n g w / w , 0 . 6 : 1 w a t e r t o b i o m a s s l o a d i n g w / w , 3 0 m i n t o t a l r e s i d e n c e t i m e , 9 0 - 1 0 0 D e g r e e s ° C ) a n d e x t r a c t e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r b a s e d o n p r o t o c o l A - V I I - 1 9 ( b ) t o r e m o v e s u r f a c e b o u n d e x t r a c t i v e s . T h e t o t a l p h e n o l i c c o n t e n t o f t h e w a s h s t r e a m s w a s q u a n t i fi e d u s i n g s u i t a b l e p h e n o l i c a c i d s t a n d a r d s ( p r o t o c o l A - V I I - 2 4 ) . T h e a b s o r b a n c e r e a d i n g s w e r e h i g h l y r e p r o d u c i b l e d u e t o b e t t e r c o l o r s t a b i l i t y c o m p a r e d t o o t h e r c o l o r i m e t r i c m e t h o d s [ 2 4 9 ] . T h e A F E X w a t e r e x t r a c t s h a v e n e a r l y 6 - 8 f o l d g r e a t e r p h e n o l i c c o n t e n t t h a n t h e c o r r e s p o n d i n g u n t r e a t e d w a s h s t r e a m ( F i g u r e 3 . A . 3 - a ) f o r t h e v a r i o u s s t o v e r f r a c t i o n s . T h e w a s h e d l i g n o - p h e n o l i c s a r e l i k e l y t o b e f r o m A F E X s u r f a c e d e p o s i t s r a t h e r t h a n w i t h i n t h e c e l l w a l l u l t r a s t r u c t u r e , g i v e n t h e s h o r t e x t r a c t i o n t i m e p e r i o d ( 1 5 m i n ) a n d m i l d e x t r a c t i o n c o n d i t i o n s ( 2 0 - 2 5 ° C , 1 a t r n ) . T h e % p h e n o l i c a c i d e q u i v a l e n t e x t r a c t e d ( p e r u n i t m a s s o f s u b s t r a t e ) f r o m t h e s m a l l e r p a r t i c l e s i z e b a s e d fi a c t i o n s w a s 5 0 - 1 0 0 % h i g h e r t h a n l a r g e r p a r t i c l e s i z e b a s e d f r a c t i o n s . P a r t i c l e s i z e r e d u c t i o n a u g m e n t s e x t r a c t i o n o f l i g n o - p h e n o l i c s a n d o t h e r c e l l w a l l e x t r a c t i v e s t o t h e o u t e r w a l l s u r f a c e s d u r i n g A F E X . P M c o r n s t o v e r w a s A F E X t r e a t e d a n d m i l l e d t o 0 . 0 8 4 7 m u s i n g a c e n t r i f u g a l m i l l . T h e g r o u n d m a t e r i a l w a s w a t e r w a s h e d t o o b t a i n t h e U A G - l W ( U n c u t P M c o r n s t o v e r 9 A F E X 9 G r o u n d t o 0 . 0 8 m m 9 S i n g l e w a s h ) w a s h s t r e a m . A n o t h e r s a m p l e w a s p r e p a r e d b y m i l l i n g t h e P M c o r n s t o v e r t o 0 . 0 8 m m , f o l l o w e d b y A F E X . T h e s u b s t r a t e w a s w a s h e d t o o b t a i n t h e G A - l W ( G r o u n d t o 0 . 0 8 m m 9 A F E X 9 S i n g l e w a s h ) w a s h s t r e a m . T h e a m o u n t o f p h e n o l i c s e x t r a c t e d i n t h e G A - 1 W w a s h s t r e a m w a s f o u n d t o b e 3 0 - 3 5 % h i g h e r t h a n t h e U A G - I W w a s h s t r e a m ( F i g u r e 3 . A . 3 - b ) . U n t r e a t e d s t o v e r w a s h s t r e a m ( U U - 1 W : U n c u t c o r n s t o v e r 9 U n t r e a t e d 9 S i n g l e W a s h ) c o n t a i n e d 1 0 - 1 2 f o l d l e s s e r p h e n o l i c c o n t e n t t h a n A F E X t r e a t e d s t o v e r w a s h s t r e a m s ( U A G - l W a n d G A - l W ) . S i n g l e s t e p w a t e r e x t r a c t i o n o f A F E X t r e a t e d s u b s t r a t e s w a s f o u n d s u i t a b l e t o r e m o v e n e a r l y 8 0 - 9 0 % o f t h e t o t a l w a t e r e x t r a c t a b l e p h e n o l i c c o n t e n t . T h e w a s h s t r e a m p h e n o l i c c o n t e n t f o r t h e t r i p l y w a s h e d s u b s t r a t e ( U A G - 3 W : U n c u t c o r n s t o v e r 9 A F E X 9 G r o u n d t o 0 . 0 8 m m 9 W a s h e d t h r e e t i m e s ) w a s 7 - 8 f o l d l e s s t h a n t h a t o f t h e u n w a s h e d s u b s t r a t e ( U A G - I W a n d G A - l W ) . T h e e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y f o r t h e o n c e o r t h r i c e w a s h e d s u b s t r a t e s w a s f o u n d t o b e n e a r l y i d e n t i c a l ( d a t a n o t s h o w n ) . H e n c e , a l l e n z y m a t i c h y d r o l y s i s e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t f o r o n c e w a s h e d s u b s t r a t e s . T h e m o d i fi e d P r u s s i a n b l u e m e t h o d i s a u s e f u l s e m i - q u a n t i t a t i v e e s t i m a t e o f t h e l i g n o - p h e n o l i c c o n t e n t o f t h e A F E X e x t r a c t i v e s , a s t h e m e t h o d i s u n a b l e t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n c o n d e n s e d l i g r r i n s a n d l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t p h e n o l i c s . A l s o , s i n c e p o l y p h e n o l i c s w i t h v a r y i n g d e g r e e s o f h y d r o x y l a t i o n p a t t e r n s a n d d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n w o u l d r e a c t d i f f e r e n t l y t o t h e a s s a y r e a g e n t , t h e r e s u l t s a r e o n l y u s e f u l t o g e t r e l a t i v e e s t i m a t e s o f l i g n o - p h e n o l i c c o n t e n t i n t h e w a t e r e x t r a c t s . C o u m a r i c / f e r u l i c a c i d a n d t h e i r d e r i v a t i v e s c o m p r i s e n e a r l y 4 - 6 % ( w / w ) o f c o r n b r a n c e l l w a l l s [ 9 4 ] . A m o r e q u a n t i t a t i v e e s t i m a t e o f t h e t o t a l p - c o u m a r i c a n d f e r u l i c a c i d c o n t e n t 4 8 o f t h e c e l l w a l l e x t r a c t i v e s w e r e c a r r i e d o u t i n C h a p t e r 5 . I n s u m m a r y , b i o m a s s p a r t i c l e s i z e a f f e c t s t h e a m o u n t o f l i g n o - p h e n o l i c s e x t r a c t e d t o o u t e r c e l l w a l l s u r f a c e s d u r i n g A F E X p r e t r e a t m e n t . H o w e v e r , m o r e d e t a i l e d m a s s - t r a n s f e r r e l a t e d r e s e a r c h i s n e c e s s a r y t o e l u c i d a t e t h e e f f e c t o f s u b s t r a t e p a r t i c l e s i z e o n a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t e f fi c a c y . 3 . 1 . 4 . 3 I n h i b i t i o n o f c e l l u l o l y t i c e n z y m e s b y A F E X e x t r a c t e d l i g n o - p h e n o l i c s S e v e r a l i n v e s t i g a t o r s i n t h e p a s t h a v e f o u n d c e l l u l a s e s b e i n g i n h i b i t e d b y l i g n i n p h e n o l i c s a n d o t h e r p o l y p h e n o l i c c o m p o u n d s [ 2 5 0 - 2 5 2 ] . I t i s r e a s o n a b l e t o a s s u m e t h a t l i g n o - p h e n o l i c f r a g m e n t s e x t r a c t e d f r o m t h e c e l l w a l l d u r i n g A F E X m a y i n h i b i t c e l l u l o l y t i c e n z y m e s d i g e s t i n g c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s . E x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t t o s t u d y t h e e f f e c t o f A F E X d e g r a d a t i o n p r o d u c t s o n c e l l u l a s e a c t i v i t y . P M c o r n s t o v e r w a s A F E X t r e a t e d a n d m i l l e d t o 0 . 0 8 m u s i n g a c e n t r i f u g a l m i l l t o p r e p a r e t h e G A A s a m p l e ( G A A - G r o u n d a fi e r A F E X ) . A n o t h e r s a m p l e ( G B A - G r o u n d b e f o r e A F E X ) w a s p r e p a r e d b y m i l l i n g t h e P M c o m s t o v e r t o 0 . 0 8 m m , f o l l o w e d b y A F E X . T h e G A A a n d G B A s a m p l e s w e r e e x t r a c t e d w i t h w a t e r t o r e m o v e c e l l w a l l e x t r a c t i v e s r e l e a s e d d u r i n g A F E X . T h e r e w a s n o s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e i n g l u c a n h y d r o l y s i s y i e l d s f o r u n w a s h e d G B A a n d G A A s a m p l e s ( F i g u r e 3 . A . 4 ) . E n z y m a t i c h y d r o l y s i s f o r a l l s a m p l e s w a s c a r r i e d o u t u s i n g 1 5 F P U S p e z y m e C P / g m g l u c a n ( s u p p l e m e n t e d w i t h 6 4 p - N P G U N o v o z y m e 1 8 8 / g m g l u c a n ) i n 1 5 m l v i a l s f o r 7 2 h o u r s ( p r o t o c o l s A - V I I - 2 3 , 2 8 , 3 1 ) . T h e u n w a s h e d G A A h a d S l i g h t l y h i g h e r g l u c a n c o n v e r s i o n ( 1 . 5 - 2 % ) c o m p a r e d t o u n w a s h e d G B A f o r 7 2 h o u r d a t a . T h e d i f f e r e n c e i n g l u c a n h y d r o l y t i c y i e l d w a s m o r e p r o n o u n c e d ( I O - 1 2 % ) a t 2 4 h o u r s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e i n c r e a s e w a s f o u n d t o b e s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t ( p < 0 . 0 5 ) o n l y f o r 2 4 h o u r h y d r o l y s i s d a t a . 4 9 s t n e l a v i u q E d i c A c i l o n e h P % d i c s A t n c e i l l a o v n i e u h q P E % F i g u r e 3 . A . 3 ( a ) P h e n o l i c c o n t e n t o f A F E X t r e a t e d a n d u n t r e a t e d c o r n s t o v e r w a s h s t r e a m s ; U n t r e a t e d s t o v e r % g a l l i c a c i d ( e m p t y b a r s ) , U n t r e a t e d s t o v e r % f e r u l i c a c i d ( d o t fi l l e d b a r s ) , A F E X t r e a t e d s t o v e r % g a l l i c a c i d ( h o r i z o n t a l l i n e fi l l e d b a r s ) , a n d A F E X t r e a t e d s t o v e r % f e r u l i c a c i d ( s l a n t e d l i n e fi l l e d b a r s ) . ( b ) F e r u l i c a c i d c o n t e n t o f w a s h s t r e a m a f t e r s i n g l e w a s h ( U U - I W : U n c u t c o r n s t o v e r = > U n t r e a t e d = > S i n g l e W a s h a n d U A G - I W ( U n c u t P M c o r n s t o v e r = > A F E X = > G r o u n d t o 0 . 0 8 m m = > S i n g l e w a s h ) , m u l t i p l e w a s h ( U A G - 3 W : U n c u t c o r n s t o v e r = > A F E X = > G r o u n d t o 0 . 0 8 m m = > W a s h e d t h r e e t i m e s ) a n d a f t e r s i z e r e d u c t i o n ( G A - 1 W : G r o u n d t o 0 . 0 8 m m = > A F E X = > S i n g l e w a s h ) . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d fi o m [ 1 ] ) . 0 . 2 0 0 . 1 5 ~ 0 . 1 0 - 0 . 0 5 - 0 . 0 0 ~ # 1 2 0 # 1 0 0 # 8 0 # 7 0 # 4 0 # 3 5 # 2 0 u n c u t M e s h C u t s T y p e 0 . 1 6 — 0 . 1 2 a 0 . 0 8 ~ 0 . 0 4 - 0 . 0 0 I I I l U U - 1 W U A G - 1 W U A G - 3 W G A - 1 W F i g u r e 3 . A . 4 E f f e c t o f s i z e r e d u c t i o n a n d w a t e r w a s h i n g o f A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r o n 7 2 h o u r g l u c a n ( l e f t b a r , b l a c k ) a n d x y l a n ( r i g h t b a r , g r e y ) c o n v e r s i o n s . ( A b b r e v i a t i o n s : - U - G B A : U n w a s h e d g r o u n d b e f o r e A F E X , W - G B A : W a s h e d g r o u n d b e f o r e A F E X , U - G A A : U n w a s h e d g r o u n d a f t e r A F E X , W - G A A : W a s h e d g r o u n d a f t e r A F E X ) . T h e s t a n d a r d e r r o r b a r s a r e b a s e d o n d u p l i c a t e s . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d f r o m [ 1 ] ) . 1 0 0 8 0 - 6 0 - 4 0 - U - G B A W - G B A U - G A A W - G A A T h e d i f f e r e n c e i n g l u c a n c o n v e r s i o n w a s m o r e p r o m i n e n t a t t h e i n i t i a l h y d r o l y s i s s t a g e , b u t b e c a m e l e s s s i g n i fi c a n t a t l a t e r s t a g e s p o s s i b l y d u e t o a t w o - p r o n g e d e f f e c t . F i r s t l y , t h e a m o u n t o f l i g n o - p h e n o l i c s a n d o t h e r c e l l w a l l e x t r a c t i v e s r e m o v e d f r o m w i t h i n t h e c e l l w a l l d u r i n g A F E X w e r e f o u n d t o h a v e a g r e a t e r s u r f a c e d e n s i t y f o r t h e u n w a s h e d G B A c o m p a r e d t o t h e u n w a s h e d G A A ( F i g u r e 3 . B . 3 ; S e e s e c t i o n 3 . 2 . 4 . 2 f o r d e t a i l s ) . T h e s e A F E X e x t r a c t i v e s c o u l d p l a y a n i m p o r t a n t i n h i b i t o r y r o l e i n t h e i n i t i a l s t a g e s ( 2 4 h o u r d a t a ) o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s t h a t c o u l d e x p l a i n t h e l o w e r h y d r o l y s i s y i e l d f o r u n w a s h e d G B A v s . G A A . S e c o n d l y , e v e n t h o u g h A F E X i s p r o b a b l y m o r e e f f e c t i v e o n G B A ( d u e t o r e d u c e d m a s s - t r a n s f e r l i m i t a t i o n s f o r e x t r a c t i o n o f c e l l w a l l l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e ) , t h e l i g n o - p h e n o l i c r i c h e x t r a c t i v e s i n h i b i t e n z y m a t i c a c t i v i t y . H o w e v e r , e x t r a c t i n g t h e G B A s u b s t r a t e w i t h w a t e r ( W - G B A ) y i e l d e d a 1 0 - 1 5 % i n c r e a s e i n g l u c a n c o n v e r s i o n c o m p a r e d t o t h e w a t e r e x t r a c t e d G A A s u b s t r a t e ( W - G A A ) . T h e 5 1 e n h a n c e m e n t i n h y d r o l y s i s y i e l d a f t e r w a t e r e x t r a c t i o n i s l i k e l y d u e t o r e m o v a l o f e n z y m e i n h i b i t o r y l i g n o - p h e n o l i c f r a g m e n t s , c o n s i d e r i n g t h a t t h e r e i s a g r e a t e r p e r c e n t a g e o f w a t e r e x t r a c t i v e s p r e s e n t w i t h i n G B A b a s e d s a m p l e s c o m p a r e d t o G A A s a m p l e ( F i g u r e 3 . A . 3 - b ; S e e C h a p t e r 3 . 2 ) . H o w e v e r , t h e r e a r e s e v e r a l o t h e r w a t e r e x t r a c t i b l e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s f o r m e d d u r i n g A F E X t h a t c o u l d a l s o i n h i b i t e n z y m e a c t i v i t y . I n o r d e r t o e l u c i d a t e t h e e f f e c t o f e a c h t h e s e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s o n e n z y m a t i c a c t i v i t y , t h e i d e n t i t y o f t h e s e A F E X b a s e d c e l l w a l l e x t r a c t i v e s m u s t b e e s t a b l i s h e d . T h i s g o a l w a s p u r s u e d a s a p a r t o f C h a p t e r 5 . 3 . 1 . 5 C o n c l u s i o n s I t w a s f o u n d t h a t t h e e x t e n t o f m o d i fi c a t i o n o f t h e c e l l w a l l m o r p h o l o g y w a s c l o s e l y r e l a t e d t o t h e t y p e o f c e l l w a l l ( e . g . p a r e n c h y m a v s . s c l e r e n c h y m a ) a n d A F E X p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s ( e . g . w a t e r a n d a m m o n i a l o a d i n g ) e m p l o y e d . T h e r e w e r e d i s t i n c t a m o r p h o u s l y s h a p e d d e p o s i t s ( r i c h i n l i g n o - p h e n o l i c s ) w i t h i n t h e s e c o n d a r y c e l l w a l l l u m e n s p a c e a l o n g w i t h c o n s i d e r a b l e fi b e r d i s r u p t i o n a s i n d i c a t e d b y t h e c e l l s h a p e a n a l y s i s ( e . g . c e l l p e r i m e t e r l e n g t h , l u m e n a r e a , i s o p e r i m e t r i c q u o t i e n t ) f o r h i g h - m o i s t u r e / a m m o n i a b a s e d A F E X c e l l w a l l s . I n c o n t r a s t t o w h a t w a s e x p e c t e d , t h e r e w a s n o m a j o r p h y s i c a l m o d i fi c a t i o n o f s e c o n d a r y c e l l w a l l s d u r i n g c o n v e n t i o n a l A F E X ( l o w l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g ) a s c o m p a r e d t o h i g h - m o i s t u r e / a m m o n i a b a s e d A F E X . H o w e v e r , d e s p i t e t h e i n a b i l i t y o f c o n v e n t i o n a l A F E X t o e x t r a c t l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e f r o m t h e c e l l w a l l , t h e r a t e o f e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f t h e t r e a t e d c e l l w a l l s w a s 4 - 5 f o l d h i g h e r t h a n t h a t o f u n t r e a t e d w a l l s . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t t h e r e a r e c e r t a i n u l t r a - s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s ( c u r r e n t l y n o t v i s i b l e t h r o u g h l o w m a g n i fi c a t i o n S E M a n d c o n f o c a l m i c r o s c o p y ) w i t h i n c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t e d c e l l w a l l s t h a t e n h a n c e t h e a c c e s s i b i l i t y 5 2 o f t h e w a l l p o l y s a c c h a r i d e s t o c e l l u l o l y t i c e n z y m e s . I t w o u l d b e o f i n t e r e s t t o e x p l o r e t h e e x t e r n a l c e l l w a l l s u r f a c e s a f t e r c o n v e n t i o n a l A F E X u s i n g h i g h e r m a g n i fi c a t i o n m i c r o s c o p i c a n d s p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u e s t o b e t t e r u n d e r s t a n d t h e p h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a n g e s c a u s e d b y c o n v e n t i o n a l A F E X p r e t r e a t m e n t t h a t r e s u l t s i n r e d u c e d r e c a l c i t r a n c e o f c e l l w a l l s t o c e l l u l o l y t i c e n z y m e s . 5 3 3 . 2 C e l l w a l l s u r f a c e t o p o g r a p h y a n d a t o m i c c o m p o s i t i o n a f t e r c o n v e n t i o n a l A F E X 3 . 2 . 1 A b s t r a c t “ T h e s u r f a c e c h e m i s t r y a n d t o p o g r a p h y o f u n t r e a t e d a n d c o n v e n t i o n a l A F E X ( R - A C S ) t r e a t e d c o r n s t o v e r ( f o r v a r y i n g c e l l w a l l p a r t i c l e s i z e s ) w a s i n v e s t i g a t e d b y e l e c t r o n s p e c t r o s c o p y f o r c h e m i c a l a n a l y s i s ( E S C A ) a n d a t o m i c f o r c e m i c r o s c o p y ( A F M ) . A s v i s u a l i z e d t h r o u g h A F M a m p l i t u d e a n d p h a s e b a s e d i m a g e s , t h e o u t e r c e l l w a l l s u r f a c e s w e r e f o u n d t o b e h e t e r o g e n e o u s l y c o v e r e d w i t h a m o r p h o u s l y s h a p e d d e p o s i t s ( 2 0 - 1 0 0 0 n m i n s i z e ) a fi e r c o n v e n t i o n a l A F E X p r e t r e a t m e n t ( 1 : 1 a m m o n i a t o b i o m a s s l o a d i n g w / w , 0 . 6 : 1 w a t e r t o b i o m a s s l o a d i n g w / w , 3 0 m i n t o t a l r e s i d e n c e t i m e , 9 0 - 1 0 0 ° C ) . T h e s e n a n o s c o p i c d e p o s i t s w e r e p r e v i o u s l y n o t s e e n t h r o u g h l o w - m a g n i fi c a t i o n b a s e d s c a n n i n g e l e c t r o n a n d c o n f o c a l fl u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . T h e r e w a s a 5 - 3 0 % d e c r e a s e i n O x y g e n / C a r b o n ( O / C ) s u r f a c e a t o m i c r a t i o f o r A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r f r a c t i o n s a s c o m p a r e d t o u n t r e a t e d c o n t r o l s . E S C A a l s o r e v e a l e d t h e c o m p o s i t i o n o f t h e s e s u r f a c e d e p o s i t s t o b e r i c h i n l i g n i n ( 1 - 1 0 % i n c r e a s e i n C 1 c a r b o n a f t e r A F E X ) , m i d d l e l a m e l l a b a s e d e x t r a c t i v e s ( c a l c i u m s u r f a c e c o n t e n t w a s 0 - 0 . 2 % f o r u n t r e a t e d v s . 0 . 2 - 0 . 6 % f o r A F E X c o m s t o v e r ) a n d o t h e r p r e t r e a t m e n t b a s e d d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( I O - 6 5 % i n c r e a s e i n s u r f a c e n i t r o g e n c o n t e n t a f t e r A F E X ) . H o t w a t e r e x t r a c t i o n w a s a b l e t o r e m o v e s o m e o f t h e s e s u r f a c e d e p o s i t s ( b a s e d o n r e l a t i v e c h a n g e i n O / C r a t i o a f t e r e x t r a c t i o n ) . S o m e o f t h e s e a m o r p h o u s l y s h a p e d s u r f a c e e x t r a c t i v e s d e p o s i t e d o n t h e o u t e r w a l l s u r f a c e s a f t e r A F E X a r e t h o u g h t t o o r i g i n a t e f r o m t h e m i d d l e l a m e l l a . T h i s i s d u e t o t h e e n r i c h m e n t i n c a l c i u m c o n t e n t o f w a l l s u r f a c e s a f t e r A F E X p r e t r e a t m e n t , w h i c h i s o t h e r w i s e t y p i c a l l y w A v e r s i o n o f t h i s c h a p t e r w a s p u b l i s h e d a s C h u n d a w a t S . P . S , B a l a n V . , D a l e B E . 2 0 0 6 . E fl e c t o f p a r t i c l e s i z e b a s e d s e p a r a t i o n o f m i l l e d c o r n s t o v e r o n A F E X p r e t r e a t m e n t a n d e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 9 6 ( 2 ) : 2 1 9 - 2 3 l . 5 4 f o u n d c r o s s - l i n k e d w i t h p e c t i n i n t h e c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a r e g i o n o f u n t r e a t e d c e l l w a l l s . C e l l w a l l p a r t i c l e s i z e r e d u c t i o n p r i o r t o A F E X t r e a t m e n t r e s u l t e d i n a n i n c r e a s e d s u r f a c e d e n s i t y o f t h e s e e x t r a c t i v e s , a s i n d i c a t e d b y t h e g r e a t e r % d e c r e a s e i n O / C r a t i o c o m p a r e d t o u n - g r o u n d s u b s t r a t e s . T h i s w o u l d a l s o i n d i c a t e t h a t e x t r a c t i o n o f l i g n i n a n d o t h e r w a l l c o m p o n e n t s d u r i n g c o n v e n t i o n a l l o w l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g b a s e d A F E X i s m a s s t r a n s f e r l i m i t e d . 3 . 2 . 2 B a c k g r o u n d 3 . 2 . 2 . 1 S u r f a c e c o m p o s i t i o n a l a n a l y s i s b y X - r a y p h o t o e l e c t r o n s p e c t r o s c o p y E l e c t r o n s p e c t r o s c o p y f o r c h e m i c a l a n a l y s i s ( E S C A ) o r X - r a y p h o t o e l e c t r o n s p e c t r o s c o p y ( X P S ) h a s b e e n u s e d i n t h e p a s t t o a n a l y z e t h e s u r f a c e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f w o o d p u l p a n d fi b e r s , w i t h l i t t l e f o c u s t o w a r d s a g r i c u l t u r a l r e s i d u e s l i k e c o r n s t o v e r [ 2 5 3 - 2 5 5 ] . E S C A p r o v i d e s a t r u e s u r f a c e e l e m e n t a l a n a l y s i s u p t o d e p t h s o f a b o u t 2 0 n m , a l o n g w i t h i n f o r m a t i o n a b o u t t h e t y p e o f c h e m i c a l b o n d i n g . T h e c h e m i c a l s h i f t s f o r t h e c a r b o n p e a k ( C 1 s ) c a n b e d e c o n v o l u t e d i n t o s u b p e a l s p r o v i d i n g u s e f u l q u a n t i t a t i v e i n f o r m a t i o n a b o u t t h e r e l a t i v e a m o u n t o f e a c h t y p e o f c a r b o n b o n d a n d O x y g e n t o C a r b o n ( O / C ) r a t i o s f o r t h e s u r f a c e [ 2 5 5 ] . B a s e d o n t h e c a r b o n c o n t e n t , t h e v a r i o u s c e l l w a l l c o m p o n e n t s c a n b e l i s t e d i n a d e c r e a s i n g o r d e r o f t h e i r t h e o r e t i c a l O / C r a t i o s : C e l l u l o s e ( 0 . 8 3 ) > H e m i c e l l u l o s e ( 0 . 8 - 0 . 8 2 ) > L i g n i n ( 0 . 3 2 - 0 . 3 3 ) . I t b e c o m e s a p p a r e n t t h a t i t w o u l d b e p o s s i b l e t o m o n i t o r t h e l i g n i n / e x t r a c t i v e v s . c a r b o h y d r a t e c o n t e n t e x c l u s i v e l y o n t h e s u r f a c e o f A F E X p r e t r e a t e d b i o m a s s t h r o u g h r e l e v a n t E S C A a n a l y s i s . 3 . 2 . 2 . 2 S u r f a c e t o p o g r a p h i c a l a n a l y s i s b y a t o m i c f o r c e m i c r o s c o p y A t o m i c f o r c e m i c r o s c o p y ( A F M ) h a s p r o v e n t o b e a v a l u a b l e t o o l f o r v i s u a l i z i n g t h e s u r f a c e o f p l a n t c e l l w a l l s [ 5 5 , 2 5 6 ] , w i t h p a r t i c u l a r e m p h a s i s o n c e l l u l o s e fi b e r s , w o o d y 5 5 b i o m a s s a n d p a p e r p u l p s [ 2 1 3 , 2 3 6 , 2 3 7 ] . I n r e c e n t y e a r s , A F M h a s b e e n u s e d t o p r o b e t h e s u r f a c e o f p l a n t c e l l w a l l s ( f r o m c o r n a n d w h e a t s t a l k s ) p r e t r e a t e d b y d i l u t e a c i d a n d s t e a m e x p l o s i o n [ 4 0 , 1 1 1 ] . A c i d p r e t r e a t e d c e l l w a l l s w e r e f o u n d t o b e u n i f o r m l y c o v e r e d w i t h g l o b u l a r s h a p e d d e p o s i t s ( 2 0 - 1 0 0 n m ) t h a t w e r e e s s e n t i a l l y r i c h i n l i g n i n [ 1 1 2 ] . T h e e x t e n t o f c o v e r a g e o f o u t e r w a l l s u r f a c e s w a s d e p e n d e n t o n ' t h e s e v e r i t y o f a c i d p r e t r e a t m e n t . L i g n i n r i c h g l o b u l e s w e r e f o u n d t o s i g n i fi c a n t l y i n h i b i t c e l l u l a s e a c t i v i t y , p o s s i b l y t h r o u g h r e d u c i n g e n z y m e a c c e s s i b i l i t y [ 4 0 ] . R e s e a r c h e r s w o r k i n g w i t h w o o d y b i o m a s s i n t h e p u l p i n g i n d u s t r y h a v e a l s o c o n fi r m e d t h e d e p o s i t i o n o f fi b e r s u r f a c e s w i t h l i g n i n a n d o t h e r c e l l w a l l e x t r a c t i v e s d u r i n g t h e p u l p i n g p r o c e s s [ 2 5 5 , 2 5 7 ] . C h a r a c t e r i z i n g p r e t r e a t e d b i o m a s s s u r f a c e m o r p h o l o g i c a l ( A F M ) a n d c h e m i c a l ( E S C A ) c h a n g e s d u r i n g p r e t r e a t m e n t w o u l d y i e l d a b e t t e r i n s i g h t i n t o u n d e r s t a n d i n g t h e c o m p l e x m e c h a n i s m t h r o u g h w h i c h c o n v e n t i o n a l A F E X b a s e d p r e t r e a t m e n t s ( a t l o w e r l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g s ; R - A C S ) h e l p s e n h a n c e e n z y m a t i c a c c e s s i b i l i t y t o w a l l p o l y s a c c h a r i d e s . 3 . 2 . 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s S e e a p p e n d i x A - V I I - l , 4 , 8 , 1 4 , 1 9 ( a ) a n d 2 4 . 3 . 2 . 4 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 3 . 2 . 4 . 1 O u t e r c e l l w a l l t o p o l o g y v i s u a l i z e d b y A F M A s d i s c u s s e d i n t h e p r e v i o u s c h a p t e r ( 3 . 1 ) , t h e r e w a s n o s i g n i fi c a n t v i s i b l e m o d i fi c a t i o n o f t h e p l a n t c e l l w a l l s a f t e r R - A C S ( 1 : 1 a m m o n i a t o b i o m a s s l o a d i n g w / w , 0 . 6 : 1 w a t e r t o b i o m a s s l o a d i n g w / w , 3 0 m i n t o t a l r e s i d e n c e t i m e , 9 0 - 1 0 0 ° C ) t r e a t m e n t a s c o m p a r e d t o H i g h - A C 8 ( 2 : 1 a m m o n i a t o b i o m a s s l o a d i n g w / w , 2 : 1 w a t e r t o b i o m a s s l o a d i n g w / w , 3 0 m i n t o t a l r e s i d e n c e t i m e , 9 0 - 1 0 0 ° C ) . I t w a s t h o u g h t t h a t s a m p l e s t h a t w e r e p r e t r e a t e d 5 6 u n d e r m a s s t r a n s f e r l i m i t e d A F E X c o n d i t i o n s ( R - A C S ) , w o u l d h a v e c e l l w a l l e x t r a c t i v e s d e p o s i t e d a s fi n e r d e p o s i t s ( l e s s t h a n 1 p m i n w i d t h a n d u n d e r 1 0 0 - 5 0 0 n m i n t h i c k n e s s ) o n t h e o u t e r c e l l w a l l s . A F M a m p l i t u d e a n d p h a s e i m a g e s ( c a r r i e d o u t i n a i r t h r o u g h t a p p i n g m o d e ) w e r e c a p t u r e d s i m u l t a n e o u s l y f o r o u t e r c e l l w a l l r e g i o n s o f s e c o n d a r y w a l l t h i c k e n e d c e l l s i n t h e v a s c u l a r b u n d l e s , s i n c e t h e s e w e r e t h e m o s t r e c a l c i t r a n t t o e n z y m a t i c h y d r o l y s i s a n d c o n t r i b u t e d t h e l a r g e s t m a s s f r a c t i o n t o t h e s t e m i n t e m o d e [ 6 6 ] . T h e A F M p r o b e i n t e r a c t s w i t h t h e s a m p l e s u r f a c e t h r o u g h a t t r a c t i v e o r r e p u l s i v e f o r c e s g i v i n g a t h r e e — d i m e n s i o n a l ‘ c h e m i c a l - m a p ’ t h a t i s d e p e n d e n t o n t h e s u r f a c e m o l e c u l a r t o p o l o g y a n d e l a s t i c i t y . R e p r e s e n t a t i v e a m p l i t u d e i m a g e s f o r u n t r e a t e d ( n o t a i r - d r i e d p r i o r t o i m a g i n g ) a n d c o n v e n t i o n a l ( o r ‘ r e g u l a r ’ ) A F E X ( R - A C S , 2 4 h o u r s a i r - d r i e d a f t e r A F E X p r i o r t o i m a g i n g ) t r e a t e d c o r n s t o v e r c e l l w a l l s , f r o m a c o l l e c t i o n o f o v e r 5 0 i m a g e s p e r s a m p l e , f o r v a r y i n g s c a l e s o f m a g n i fi c a t i o n a r e s h o w n i n F i g u r e 3 . B . l . U n t r e a t e d c o r n s t o v e r o u t e r c e l l w a l l s t y p i c a l l y a p p e a r t o b e ‘ c l e a n ’ , w i t h a fi b r o u s n e t w o r k o f c e l l u l o s e m a c r o fi b r i l s v i s i b l e a t h i g h e r m a g n i fi c a t i o n s . T h e r e a p p e a r s t o b e m e m b r a n e d e b r i s , c y t o p l a s m i c r e s i d u e a n d o t h e r c e l l w a l l r e m n a n t s t h a t w e r e f o u n d o n t h e o u t e r w a l l s u r f a c e ( F i g u r e 3 . B . 1 - a ; F i g u r e I - 3 . B . 2 : U 1 , U 4 , U S ) . F o r s o m e u n t r e a t e d c e l l w a l l s u r f a c e s t h e r e w e r e d e p r e s s i o n s , c r e v i c e s a n d c r a c k s t h a t f o r m e d p a r t o f t h e n a t u r a l c e l l w a l l l a n d s c a p e ( F i g u r e I - 3 . B . 2 : U 8 , U 9 , U 1 0 ) . T h e c e l l u l o s i c m a c r o fi b r i l s w e r e c l e a r l y v i s i b l e f o r s o m e u n t r e a t e d c e l l w a l l s a t h i g h e r m a g n i fi c a t i o n s , w h i l e i n o t h e r s t h e y w e r e c o m p l e t e l y e m b e d d e d i n t h e w a l l m a t r i x . T h e c e l l u l o s e m a c r o fi b r i l s r a n g e d f r o m 2 5 - 4 0 n m i n t h i c k n e s s ( d e p e n d i n g o n w h e t h e r o r n o t t h e s a m p l e s w e r e a i r - d r i e d p r i o r t o A F M i m a g i n g ) , s l i g h t l y l a r g e r t h a n w h a t h a s b e e n r e p o r t e d f o r c e l l u l o s e fi b r i l s t y p i c a l l y s e e n i n s t r a w b a s e d p a r e n c h y m a a n d 5 7 e p i d e r m a l b a s e d c e l l w a l l s ( r a n g i n g b e t w e e n 1 5 - 2 5 n m ) [ 5 5 , 2 5 8 ] . T h e t h i c k n e s s o f t h e c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s w a s c l o s e r t o w h a t h a s b e e n r e p o r t e d f o r s e c o n d a r y c e l l w a l l t h i c k e n e d b a s e d c e l l u l o s e fi b r i l s ( 1 5 - 3 0 n m ) [ 2 5 9 ] . T h e c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s f o r s a m p l e s t h a t w e r e n e v e r a i r - d r i e d p r i o r t o i m a g i n g w e r e 4 2 i 3 . 4 n m i n t h i c k n e s s , w h i l e s a m p l e s t h a t w e r e a i r - d r i e d f o r 2 4 h o u r s p r i o r t o i m a g i n g h a d m i c r o fi b r i l s t h a t w e r e 2 3 i 3 . 1 n m i n t h i c k n e s s ( T o t a l n u m b e r o f o b s e r v a t i o n s = 1 0 ) . D i n g e t a 1 . a n d o t h e r r e s e a r c h e r s h a v e r e p o r t e d t h a t d r y i n g a n d e x t e n s i v e s a m p l e p r e p a r a t i o n ( i . e . e x t r a c t i o n o f r e s i d u a l h e m i c e l l u l o s e b y a l k a l i a n d o t h e r s o l v e n t s o r e m b e d d i n g / s e c t i o n i n g ) r e s u l t s i n m o d i fi c a t i o n o f t h e m o r p h o l o g y o f c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s [ 5 5 , 2 3 8 , 2 5 9 ] . A l l p r e t r e a t e d s a m p l e s w e r e a i r - d r i e d p r i o r t o i m a g i n g t o r e m o v e r e s i d u a l a m m o n i a fi ' o m t h e c e l l w a l l s . R o u g h n e s s f a c t o r c a l c u l a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t f o r a i r - d r i e d u n t r e a t e d a n d p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r s a m p l e s ( F i g u r e I — 3 . B . 2 ) . T h e o u t e r c e l l w a l l s u r f a c e t o p o g r a p h y a n d c h e m i c a l c o m p o s i t i o n c h a n g e s s i g n i fi c a n t l y a f t e r c o n v e n t i o n a l A F E X p r e t r e a t m e n t , a s s e e n t h r o u g h t h e A F M a m p l i t u d e a n d p h a s e i m a g e s , r e s p e c t i v e l y . F i g u r e 3 . B . 1 - b c l e a r l y i n d i c a t e s t h e a p p e a r a n c e o f a m o r p h o u s l y s h a p e d d e p o s i t s ( r a n g i n g i n w i d t h fi ' o m 2 0 - 1 0 0 0 n m ) t h a t a p p e a r o n t h e s u r f a c e o f o u t e r c e l l w a l l s a f t e r A F E X . T h e s e d e p o s i t s s e e m t o c o v e r t h e s u r f a c e n o n - u n i f o r r n l y a n d h a v e n o d i s t i n c t s h a p e , u n l i k e t h e s p h e r i c a l l y s h a p e d l i g n i n r i c h d e p o s i t s s e e n o n fi b e r s u r f a c e s a f t e r a c i d i c p r e t r e a t m e n t s [ 4 0 ] . A F M t o p o g r a p h y a n d p h a s e i m a g e s g e n e r a l l y r e v e a l e d c o m p l e m e n t a r y i n f o r m a t i o n f o r u n t r e a t e d c e l l w a l l s ( F i g u r e I - 3 . B . 2 : U 1 - U 1 0 ) , t h e s i g n i fi c a n c e o f w h i c h i s e x p l a i n e d i n s u b s e q u e n t s e c t i o n s . 5 8 5 9 F i g u r e 3 . B . l A F M a m p l i t u d e i m a g e s o f u n t r e a t e d ( A , t o p r o w ) a n d c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t e d ( B , b o t t o m r o w ) c o r n s t o v e r a t v a r y i n g d e g r e e s o f m a g n i fi c a t i o n ( A l l s c a l e b a r s r e p r e s e n t a l e n g t h s c a l e = 5 0 0 n m ) . C o l o r l e g e n d ( d a r k t o l i g h t s h a d e s ) d e p i c t s t h e a m p l i t u d e c u r r e n t s c a l e ( V , v o l t s ) . T h e A F M t i p ( s i l i c o n b a s e d ) a d h e r e s m o r e s t r o n g l y t o h y d r o p h i l i c a r e a s t h a t S h o u l d a p p e a r l i g h t e r i n c o l o r ( g r e a t e r c h a n g e i n p h a s e ) . S i n c e a l l A F M i m a g i n g w a s p e r f o r m e d u n d e r t a p p i n g - m o d e ( i n o r d e r t o m i n i m i z e s a m p l e d e f o r m a t i o n d u e t o t i p - s a m p l e fi c t i o n ) , t h e p h a s e c o n t r a s t w a s p r o b a b l y d u e t o t h e d i f f e r e n c e s i n h y d r o p h o b i c i t y o f t h e s u r f a c e d u e t o p r e s e n c e o f c e l l w a l l e x t r a c t i v e s . T h e u n t r e a t e d c o r n s t o v e r s u r f a c e w a s f o u n d t o p r e d o m i n a n t l y h y d r o p h o b i c ( i n d i c a t e d b y d a r k e r p h a s e i m a g e s ) , h o w e v e r , t h e r e w e r e h y d r o p h i l i c p a t c h e s ( l i g h t c o l o r e d ) t h a t s t o o d o u t f o r s e v e r a l u n t r e a t e d c e l l w a l l p h a s e i m a g e s . H o w e v e r , t h i s w a s n o t t h e c a s e f o r A F E X t r e a t e d c e l l w a l l s w h e r e a d i s t i n c t p h a s e c o n t r a s t w a s v i s i b l e ( F i g u r e I - 3 . B . 2 : A l - A l O ) . M o s t o f t h e A F E X t r e a t e d c e l l w a l l p h a s e i m a g e s h a d s e v e r a l l i g h t e r p a t c h e s t h a t c o r r e s p o n d e d t o h y d r o p h i l i c r i c h r e g i o n s . T h e m o r p h o l o g i c a l p a t t e r n s o f t h e p h a s e a n d a m p l i t u d e i m a g e s m a t c h e d w e l l , i n d i c a t i n g t h e d e p o s i t s e x t r a c t e d t o t h e s u r f a c e d u r i n g A F E X a r e l a r g e l y h y d r o p h i l i c ( h o w e v e r , a n a l y s i s b y E S C A a n d P r u s s i a n b l u e a l s o r e v e a l e d p r e s e n c e o f l i g n i n d e r i v e d c o m p o n e n t s ) . I n o r d e r t o o b t a i n a m o r e q u a n t i t a t i v e e s t i m a t e o f t h e e x t e n t o f s u r f a c e m o d i fi c a t i o n a f t e r A F E X , s u r f a c e r o u g h n e s s f a c t o r s ( R M S : r o o t m e a n s q u a r e b a s e d ) w e r e c a l c u l a t e d f o r a t l e a s t 1 0 i m a g e s o f u n t r e a t e d a n d R - A C S t r e a t e d a m p l i t u d e i m a g e s , r e s p e c t i v e l y ( F i g u r e I - 3 . B . 2 ) . T h e R M S s u r f a c e r o u g h n e s s f a c t o r i s a q u a n t i t y t y p i c a l l y u s e d t o a s s e s s t h e a v e r a g e v a r i a t i o n i n t o p o g r a p h y o f t h e s u r f a c e w i t h r e s p e c t t o t h e m e a n h e i g h t a c r o s s t h e e n t i r e x - y c o o r d i n a t e s o f t h e i m a g e . T h e R M S r o u g h n e s s f a c t o r ( u n i t s , n m ) w a s f o u n d n e a r l y 2 - f o l d g r e a t e r f o r A F E X t r e a t e d w a l l s u r f a c e s c o m p a r e d t o u n t r e a t e d s a m p l e s ( T a b l e 3 . B . 1 ) . 6 0 T a b l e 3 . B . l R M S ( r o o t m e a n s q u a r e ) r o u g h n e s s f a c t o r s f o r u n t r e a t e d ( U 1 - U 1 0 ) a n d c o n v e n t i o n a l A F E X ( R - A C S ; A l - A 1 0 ) t r e a t e d c o r n s t o v e r A F M a m p l i t u d e i m a g e s . I m a g e I D U n t r e a t e d ( U ) I m a g e I D A F E X t r e a t e d ( A ) U 1 7 . 7 6 A 1 3 8 . 6 5 U 2 9 . 0 3 A 2 2 5 . 2 5 U 3 2 1 . 6 9 A 3 3 3 . 7 8 U 4 2 5 . 4 3 A 4 3 7 . 5 2 U S 1 3 . 1 6 A 5 1 1 . 1 0 U 6 8 . 2 0 A 6 2 6 . 8 8 U 7 2 8 . 3 8 A 7 2 7 . 1 1 U 8 3 2 . 6 3 A 8 1 9 . 3 6 U 9 9 . 3 2 A 9 3 3 . 5 1 U 1 0 9 . 9 2 A 1 0 4 1 . 8 8 A v e r a g e 1 6 . 5 5 A v e r a g e 2 9 . 5 0 % C V 5 7 . 5 0 % C V 3 2 . 1 1 T h e a v e r a g e A F M i m a g e h e i g h t r a n g e f o r t h e u n t r e a t e d c e l l w a l l i m a g e d a t a s e t ( 2 1 7 i 1 3 5 n m ) w a s n e a r l y h a l f o f t h e a v e r a g e h e i g h t r a n g e f o r A F E X t r e a t e d c e l l w a l l s ( 4 5 8 i 1 8 3 n m ) . I n t e r e s t i n g l y , i n n o n e o f t h e i m a g e s c o l l e c t e d a f t e r A F E X w e r e a n y c e l l u l o s i c fi b r i l s v i s i b l e , i n d i c a t i n g t h a t m o s t o f t h e e x t e r n a l w a l l s u r f a c e s h a d b e e n c o v e r e d w i t h A F E X e x t r a c t i v e s , s i m i l a r t o w h a t h a s b e e n r e p o r t e d f o r a c i d i c b a s e d p r e t r e a t m e n t s [ 1 1 1 , 1 1 2 ] . H o w e v e r , u n l i k e t h e s m o o t h , g l o b u l a r d e p o s i t s s e e n a f t e r a c i d i c p r e t r e a t m e n t s t h a t a r e e s s e n t i a l l y c o m p o s e d o f o n l y l i g n i n ( h i g h l y h y d r o p h o b i c ) , t h e a m o r p h o u s l y S h a p e d d e p o s i t s s e e n a f t e r A F E X s e e m t o b e c o m p o s e d o f l e s s e r h y d r o p h o b i c c o m p o n e n t s . 3 . 2 . 4 . 2 O u t e r c e l l w a l l e l e m e n t a l c o m p o s i t i o n c h a r a c t e r i z e d b y E S C A I n o r d e r t o g a i n a c l e a r e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e s u r f a c e d e p o s i t s s e e n o n t h e o u t e r c e l l w a l l s u r f a c e s a f t e r A F E X , t h e s a m p l e s w e r e c h a r a c t e r i z e d 6 1 b y E S C A . A l l E S C A s p e c t r a w e r e t y p i c a l l y c o l l e c t e d a t a n o p t i m a l t a k e - o f f - a n g l e ( T O A ) o f 4 5 ° . H o w e v e r , s o m e m e a s u r e m e n t s w e r e a l s o c o n d u c t e d a t 1 5 ° a n d 7 5 ° t o d e t e r m i n e t h i c k n e s s o f t h e c e l l w a l l s u r f a c e e x t r a c t i v e s d e p o s i t e d a f t e r c o n v e n t i o n a l A F E X p r e t r e a t m e n t . T h e i m p o r t a n t e l e m e n t a l p e a k s o b t a i n e d d u r i n g a n a l y s i s o f a l l p l a n t b i o m a s s s a m p l e s w e r e f o u n d t o b e c a r b o n ( C , 1 s o r b i t a l ) , o x y g e n ( 0 , I s o r b i t a l ) , n i t r o g e n ( N , I s o r b i t a l ) a n d c a l c i u m ( C a , 2 p o r b i t a l ) . T h e f o u r c a r b o n p e a k s t y p i c a l l y o b t a i n e d u p o n d e c o n v o l u t i n g t h e E S C A c a r b o n s p e c t r a b e l o n g t o t h e f o l l o w i n g c a r b o n b o n d c l a s s e s ; ( i ) C l t y p e c a r b o n t h a t c o r r e s p o n d s t o c a r b o n a t o m s b o n d e d t o c a r b o n o r h y d r o g e n ( C - C ) , ( i i ) C 2 t y p e c a r b o n t h a t c o r r e s p o n d s t o c a r b o n a t o m s b o n d e d t o S i n g l e n o n — c a r b o n y l o x y g e n ( C - O ) , ( i i i ) C 3 t y p e c a r b o n t h a t c o r r e s p o n d s t o c a r b o n a t o m s b o n d e d t o a c a r b o n y l o r t w o n o n - c a r b o n y l s ( C = O o r O - C - O ) , a n d ( i v ) C 4 t y p e c a r b o n t h a t c o r r e s p o n d s t o c a r b o n a t o m s b o n d e d t o a c a r b o n y l a n d a n o n - c a r b o n y l o x y g e n ( O - C = O ) . T h e c a r b o n ( C l s ) s i g n a l c a n b e d e c o n v o l u t e d ( w i t h i n i 0 . 3 e V ) i n t o C 1 ( 2 8 4 . 7 e V ) , C 2 ( 2 8 6 . 4 e V ) , C 3 ( 2 8 8 . 1 e V ) a n d C 4 ( 2 8 9 . 8 e V ) s i g n a l s . D e c o n v o l u t i n g t h e c a r b o n p e a k h e l p s b e t t e r u n d e r s t a n d t h e c h e m i c a l s t r u c t u r e o f t h e e x t r a c t i v e s d e p o s i t e d o n t h e b i o m a s s s u r f a c e a f t e r A F E X . C e l l u l o s e c o n t r i b u t e s c l o s e t o 8 5 % o f i t s s i g n a l t o t h e C 2 p e a k w h i l e l i g n i n c o n t r i b u t e s 5 0 % o f i t s s i g n a l t o C 1 a n d t h e r e m a i n i n g S i g n a l t o C 2 . E x t r a c t i v e s c o n t r i b u t e m o s t o f t h e i r s i g n a l t o C 1 . T h e o r e t i c a l O / C v a l u e s f o r v a r i o u s c e l l w a l l c o n s t i t u e n t s s u c h a s c e l l u l o s e , h e m i c e l l u l o s e , l i g n i n a n d o t h e r a l k a l i e x t r a c t i v e s c a n b e c a l c u l a t e d b a s e d o n t h e i r e m p i r i c a l c a r b o n - o x y g e n f o r m u l a . B a s e d o n t h e a l k y l c a r b o n c o n t e n t o f t h e s e c o m p o n e n t s , o n e c a n p l a c e t h e s e c e l l w a l l c o m p o n e n t s i n a d e c r e a s i n g o r d e r o f t h e i r O / C r a t i o s : C e l l u l o s e > H e m i c e l l u l o s e > L i g n i n > E x t r a c t i v e s ( i . e . F a t t y a c i d s , H y d r o c a r b o n s ) . 6 2 T h e e f f e c t o f s u b s t r a t e p a r t i c l e s i z e o n t h e e x t r a c t i o n e f fi c i e n c y o f c e l l w a l l e x t r a c t i v e s d u r i n g c o n v e n t i o n a l A F E X ( R - A C S ) w a s s t u d i e d u s i n g c o r n s t o v e r f r a c t i o n s , a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3 . 1 . A n o t h e r r e a s o n , t o f r a c t i o n a t e t h e b i o m a s s b a s e d o n p a r t i c l e s i z e , i s t o r e d u c e t h e h e t e r o g e n e i t y i n t h e a n g u l a r o r i e n t a t i o n o f v a r i o u s s u r f a c e s w i t h r e s p e c t t o t h e s a m p l e c u p h o r i z o n t a l a x i s . T h i s h e t e r o g e n e i t y o r s u r f a c e r o u g h n e s s t e n d s t o i n c r e a s e t h e g r a z i n g a n g l e o f e l e c t r o n e s c a p e , b u t S h o u l d n o t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t t h e r e l a t i v e c o n t r i b u t i o n s o f e a c h c o m p o n e n t ( i . e . O / C s h o u l d r e m a i n u n a f f e c t e d ) [ 2 5 3 ] . S o m e s a m p l e s w e r e a l s o m i l l e d b e f o r e o r a f t e r A F E X p r e t r e a t m e n t t o s t u d y t h e e f f e c t o f p a r t i c l e s i z e o n c e l l w a l l e x t r a c t i v e s r e m o v a l d u r i n g A F E X t o h e l p v a l i d a t e p r e v i o u s fi n d i n g s ( C h a p t e r 3 . 1 ) . T h e a t o m i c c o m p o s i t i o n s o f v a r i o u s c o r n s t o v e r f r a c t i o n s b e f o r e a n d a f t e r R - A C S p r e t r e a t m e n t a r e s h o w n i n T a b l e 3 . B . 2 - a . T h e r e l a t i v e i n c r e a s e i n C I S ( a n d i t s d e c o n v o l u t e d c o m p o n e n t p e a k s ) , 0 1 s , l e , C a 2 p a n d O / C r a t i o s a r e s h o w n i n T a b l e 3 . B . 2 - b . T h e h e t e r o g e n e i t y o f t h e c e l l w a l l s u r f a c e s i s m o r e c l e a r l y v i s i b l e i n t h e ' A F M i m a g e s a s c o m p a r e d t o t h e E S C A m e a s u r e m e n t s ( w h i c h i s a n a v e r a g e r e p r e s e n t a t i o n o f s a m p l e s u r f a c e s w i t h i n a n a r e a o f 0 . 2 5 m m x 0 . 2 5 m m ) . T h e r e i s a c o n s i s t e n t i n c r e a s e ( 1 - 2 8 % i n c r e a s e ) i n t h e C 1 s i g n a l o n t h e fi b e r s u r f a c e s u p o n A F E X t r e a t m e n t f o r a l l f r a c t i o n s , a l o n g w i t h a c o n c o m i t a n t d e c r e a s e i n t h e C 2 s i g n a l ( 2 - 4 0 % d e c r e a s e ) . T h i s i n c r e a s e i n C 1 / C 2 r a t i o c o r r e s p o n d s t o t h e e n r i c h m e n t o f t h e fi b e r s u r f a c e w i t h e x t r a c t i v e s r i c h i n a l k y l b a s e d c a r b o n l i n k a g e s ( t y p i c a l l y l i g n i n , a c i d m o i e t i e s , h y d r o c a r b o n s ) a n d / o r a c o r r e s p o n d i n g d e c r e a s e i n c o m p o u n d s r i c h i n c a r b o n - o x y g e n b a s e d l i n k a g e s ( l i k e c e l l u l o s e ) . T h e r e i s a l s o a c o n s i s t e n t i n c r e a s e i n t h e c a l c i u m ( n o t d e t e c t e d t y p i c a l l y f o r u n t r e a t e d s a m p l e s b u t i n c r e a s e d t o 0 . 2 - 0 . 4 % o f t o t a l a t o m i c s u r f a c e c o n t e n t a f t e r A F E X ) a n d n i t r o g e n c o n t e n t ( 1 - 5 0 % i n c r e a s e ) o n t h e b i o m a s s s u r f a c e a f t e r 6 3 t h e A F E X . C a l c i u m i s t h o u g h t t o b i n d t h e p e c t i n r i c h p o l y s a c c h a r i d e s d u e t o c h a r g e d i n t e r a c t i o n w i t h a c i d i c s i d e c h a i n s , t y p i c a l l y f o u n d i n t h e c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a [ 7 1 ] . T h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s i n t h e c e l l w a l l ( e . g . p r o l i n e r i c h g l y c o p r o t e i n s ) , f u n c t i o n a l p r o t e i n ( e . g . R u b i s c o ) i n l e a v e s a n d o t h e r n i t r o g e n - r i c h e x t r a c t i v e s c o n t r i b u t e t o t h e s t r o n g n i t r o g e n a t o m i c S i g n a l s e e n f o r u n t r e a t e d s a m p l e s . T h e e n h a n c e d n i t r o g e n s i g n a l a fi e r A F E X w o u l d b e l a r g e l y d u e t o n i t r o g e n o u s a m m o n o l y s i s p r o d u c t s f o r m e d d u r i n g a m m o n i a b a s e d t r e a t m e n t s [ 1 6 2 ] . T h e s e t w o c o m p o n e n t s m i g h t b e r e l o c a t e d t o t h e s u r f a c e o f t h e b i o m a s s a f t e r c l e a v a g e o f t h e l i g n i n c a r b o h y d r a t e c o m p l e x ( L C C ) d u r i n g A F E X , h e n c e r e s u l t i n g i n a n i n c r e a s e i n t h e c a l c i u m a n d n i t r o g e n s i g n a l s . T h e c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M L ) m i g h t b e p a r t l y s o l u b i l i z e d d u r i n g A F E X ( a n d r e - d e p o s i t e d o n t h e o u t e r w a l l s u r f a c e ) d u e t o h i g h s o l u b i l i t y o f m i d d l e l a m e l l a c o m p o n e n t s i n a l k a l i n e s o l u t i o n s [ 2 6 0 ] . T h e C M L h a s b e e n s h o w n t o b e p a r t l y e x t r a c t e d d u r i n g w o o d y b i o m a s s d e l i g n i fi c a t i o n [ 2 6 1 ] . F u r t h e r a n a l y s i s o f t h e d e p o s i t e d e x t r a c t i v e s a n d h i g h e r r e s o l u t i o n t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p i c i m a g i n g o f t h e c o l l a p s e d m i d d l e l a m e l l a w i t h i n t h e c e l l w a l l w o u l d a d d f u r t h e r c r e d e n c e t o t h i s h y p o t h e s i s . O / C a t o m i c r a t i o ( T a b l e 3 . B . 2 - b ) i s a u s e f u l i n d i c a t o r o f t h e r e l a t i v e c o m p o s i t i o n o f o x y g e n r i c h v e r s u s c a r b o n r i c h s p e c i e s p r e s e n t o n fi b e r s u r f a c e s . T h e o r e t i c a l O / C r a t i o s f o r s o m e b i o m a s s c o m p o n e n t s ( e . g . c e l l u l o s e = 0 . 8 3 , h e m i c e l l u l o s e = 0 . 8 2 - 0 . 8 ) a r e s h o w n i n t h e t a b l e . A h i g h e r O / C r a t i o i s o b t a i n e d f o r s a m p l e s a b u n d a n t i n p o l y s a c c h a r i d e s ( e . g . A v i c e l O / C = 0 . 6 1 ) , w h i l e a l o w e r O / C r a t i o i s n o t i c e a b l e f o r s a m p l e s a b u n d a n t i n l i g n i n ( e . g . K r a f t l i g n i n = 0 . 3 2 ) . A f t e r A F E X , t h e r e i s a 5 - 3 0 % d e c r e a s e i n t h e O / C r a t i o ( w i t h r e s p e c t t o u n t r e a t e d c o n t r o l s ) i n d i c a t i v e o f d e p o s i t i o n o f c a r b o n r i c h m o l e c u l e s o n t h e b i o m a s s s u r f a c e . 6 4 T a b l e 3 . B . 2 E S C A b a s e d a t o m i c c o m p o s i t i o n o f u n t r e a t e d ( U T ) a n d c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t e d ( A T ) c o r n s t o v e r f r a c t i o n s a n d s o m e m o d e l c o m p o u n d s ( T a b l e h a s b e e n p a r t l y r e p r o d u c e d f r o m [ 1 ] ) . N A s t a n d s f o r ' n o t a v a i l a b l e ’ . ( A ) U n t r e a t e d S a m p l e N o t a t i o n % C 1 % C 2 % C 3 % O % N % C a U n g r o u n d C S 7 7 . 2 5 1 7 . 7 5 . 0 5 1 7 . 8 6 1 . 6 4 n d F r a c t i o n # 2 0 6 8 . 9 9 2 4 . 3 2 6 . 8 1 9 . 9 4 2 . 0 1 d d F r a c t i o n # 3 5 7 1 . 5 4 2 2 . 0 9 6 . 3 6 1 9 . 7 2 1 . 6 8 n d F r a c t i o n # 4 0 7 3 . 3 4 2 1 5 . 6 6 1 7 . 6 6 1 . 4 9 r L d F r a c t i o n # 7 0 7 3 . 8 1 1 9 . 8 6 6 . 3 2 1 8 . 4 9 2 1 1 d F r a c t i o n # 8 0 6 8 . 3 3 2 4 . 3 3 7 . 3 4 2 0 . 3 1 2 . 2 1 n . d F r a c t i o n # 1 0 0 7 1 . 2 8 2 1 . 9 1 6 . 8 1 1 9 . 2 4 2 . 1 4 r L d F r a c t i o n # 1 2 0 6 5 . 4 3 2 6 . 2 7 8 . 3 2 1 . 1 4 2 . 2 6 r L d M i l l e d b e f o r e A F E X 5 6 . 7 1 3 4 . 7 9 8 . 5 2 6 . 7 9 1 . 8 1 1 1 d M i l l e d a f t e r A F E X - - - - - - C e l l u l o s e ( T h e o r e t i c a l ) 0 8 3 1 7 4 5 0 0 A v i c e l 2 7 . 2 9 5 9 . 9 7 1 2 . 7 3 7 . 7 0 0 X y l a n 5 6 7 2 4 N A N A N A K r a f t L i g n i n 5 2 3 8 7 N A N A N A A F E X t r e a t e d S a m p l e N o t a t i o n % C l % C 2 % C 3 % O % N % C a U n g r o u n d C S 7 7 . 2 1 1 7 . 0 6 5 . 7 4 1 6 . 3 2 . 1 4 0 . 3 3 F r a c t i o n # 2 0 7 2 . 1 6 2 1 . 5 7 6 . 2 7 1 7 . 3 2 . 6 1 0 . 5 9 F r a c t i o n # 3 5 7 3 . 3 6 2 0 . 6 3 6 . 0 1 1 7 . 7 6 2 . 0 9 0 . 5 4 F r a c t i o n # 4 0 7 5 . 8 1 1 8 . 6 6 5 . 5 3 1 7 . 8 1 1 . 8 6 0 . 3 7 F r a c t i o n # 7 0 7 4 . 8 8 1 9 . 3 7 5 . 6 6 1 7 . 8 3 2 . 0 8 0 . 3 8 F r a c t i o n # 8 0 7 2 . 0 5 2 1 . 3 5 6 . 6 1 8 . 1 3 2 . 0 6 0 . 3 7 F r a c t i o n # 1 0 0 7 2 . 2 9 2 0 . 9 8 6 . 7 3 1 8 . 7 1 2 . 3 1 1 d F r a c t i o n # 1 2 0 6 9 . 7 6 2 3 . 9 5 6 . 2 9 1 9 . 7 4 2 . 8 1 n d M i l l e d b e f o r e A F E X 7 2 . 5 2 1 6 . 5 2 0 . 1 3 1 . 8 2 0 . 4 1 M i l l e d a f t e r A F E X 5 7 . 7 2 3 3 . 9 8 8 . 3 2 5 . 6 1 2 . 6 6 0 . 2 4 C e l l u l o s e ( T h e o r e t i c a l ) - - - - - - A v i c e l - - - - - - X y l a n - - - - - - K r a f t L i g n i n - - - - - - 6 5 ) ) ) 4 4 1 9 9 8 9 9 e y y y y y y y y y y y 9 1 1 c d d d d d d d d d d d 1 ( ( u u u u u u u u u u u t . t ( t t t t t t t t t 1 s 1 s s s s s s s g a a s s s n e r e s s s s s s s i i i i i i i s s s t t r s i i e i e i e f h h h h h h h h h h b h e T T T T T T T T T T T n e o n R i ) ) ) ) ) ) ) 0 2 2 2 3 3 4 ) ) 6 5 2 2 2 2 2 2 2 2 . . . . . . ) . . 2 ) T A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( 3 C / O * * * * * * * * * * T 3 6 5 2 3 7 5 8 8 U 2 2 2 2 2 2 2 2 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 . 0 ( j i M 3 a 1 L * * * * 3 1 3 8 6 8 . . . 2 3 0 0 0 0 X 0 0 4 5 3 3 2 2 7 l 4 7 4 7 - 2 4 E F A 3 0 9 1 1 r - - - e t f a 3 C e s a e 2 4 7 r - - C - - l 1 l 1 1 C c n i % e z i 0 5 2 0 0 s ) 0 0 0 0 2 1 8 5 0 0 0 0 e 5 5 5 5 4 2 5 0 5 5 s 1 1 0 0 l 8 8 — - - — 1 1 1 1 i — 8 8 c n u 0 0 5 2 < < < < < 1 0 < < i 8 ( > > 5 0 2 1 t r a P n o 8 5 4 2 1 X E X ) l a c 0 0 E i i S 0 5 0 0 0 0 2 F t n t 2 4 7 3 8 1 1 A F e i A r o n l g n a C t d # # # # # e o n n n n n n o o o i n n o l t T # r e i # e r a e h c L e t o t t t t i i i i o o f f ( y t i i e a v X f t t b e A l c c r c c c c c d s g a a a a a a a d e o a r K . u N o o i . . d t n o C n r r r r e l l p r m F F F F U F r r F F a S ) 3 ( 2 . B . 3 e l b a T l l u l i l i M l M e C 6 6 0 N o m m m v — t h b N ° ° N E x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f c e l l w a l l s i z e r e d u c t i o n b e f o r e a n d a f t e r A F E X p r e t r e a t m e n t o n O / C r a t i o a s c o m p a r e d t o u n g r o u n d c o r n s t o v e r . T h e r e w a s a n o t i c e a b l y l a r g e r d e c r e a s e o f n e a r l y 3 0 % i n t h e O / C r a t i o f o r c o r n s t o v e r s a m p l e s t h a t w e r e fi n e l y g r o u n d ( < 8 0 m i c r o n s ) p r i o r t o A F E X t r e a t m e n t ( ‘ M i l l e d b e f o r e A F E X ’ ) a s c o m p a r e d t o s a m p l e s t h a t w e r e g r o u n d a fi e r A F E X t r e a t m e n t ( ‘ M i l l e d a f t e r A F E X ’ s a m p l e s g a v e o n l y 8 % d e c r e a s e i n O / C r a t i o w i t h r e s p e c t t o u n t r e a t e d c o n t r o l ) ( T a b l e 3 . B . 2 - b ) . F o r b o t h c a s e s , t h e c o n t r o l s a m p l e w a s m i l l e d u n t r e a t e d c o r n s t o v e r t h a t u n d e r t o o k a s i m i l a r s i z e r e d u c t i o n s t e p ( < 8 0 m i c r o n s ) . T h e e x t e n t o f r e d u c t i o n i n t h e O / C r a t i o c o r r e l a t e s w e l l t o t h e w a t e r e x t r a c t i b l e p h e n o l i c c o n t e n t ( e s t i m a t e d v i a m o d i fi e d P m s s i a n b l u e m e t h o d ) f o r s u b s t r a t e s t h a t w e r e A F E X t r e a t e d a f t e r s i z e r e d u c t i o n ( G A - 1 W : G r o u n d t o 0 . 0 8 m m = > A F E X = > S i n g l e w a s h ) a s c o m p a r e d t o s u b s t r a t e s t h a t w e r e m i l l e d a f t e r A F E X t r e a t m e n t ( U A W - 1 W : U n c u t c o r n s t o v e r = > A F E X = > G r o u n d t o 0 . 0 8 m m = > S i n g l e w a s h ) ( S e e F i g u r e 3 . A . 3 , C h a p t e r 3 . 1 f o r m o r e d e t a i l s ) . T h e r e w a s a n i n v e r s e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e s u b s t r a t e O / C r a t i o a n d t h e t o t a l w a t e r e x t r a c t i b l e p h e n o l i c c o n t e n t ( F i g u r e 3 . B . 3 ) . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t t h e l i g n o - p h e n o l i c c o m p o n e n t s d e p o s i t e d o n t h e o u t e r c e l l w a l l s u r f a c e s a f t e r A F E X a r e l i k e l y r e s p o n s i b l e f o r r e d u c t i o n i n O / C a t o m i c r a t i o . T h e r e l a t i v e l y l a r g e r r e d u c t i o n i n t h e O / C r a t i o f o r s a m p l e s A F E X p r e t r e a t e d a f t e r s i z e r e d u c t i o n c o m p a r e d t o u n m i l l e d s a m p l e s r e i t e r a t e s t h e m a s s t r a n s f e r l i m i t a t i o n s t y p i c a l l y e n c o u n t e r e d d u r i n g c o n v e n t i o n a l A F E X ( R - A C S ) f o r e f fi c i e n t e x t r a c t i o n o f c e l l w a l l c o m p o n e n t s ( l i k e l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e ) . C e r t a i n s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d t o e l u c i d a t e t h e e f f e c t o f s i m p l e h o t w a t e r a n d o r g a n i c s o l v e n t b a s e d e x t r a c t i o n s ( u s i n g 0 . 1 N N a O H , 9 5 % e t h a n o l f o l l o w e d b y w a t e r w a s h i n g t i l l n e u t r a l p H , S e e m e t h o d s s e c t i o n f o r d e t a i l s ) o n t h e O / C r a t i o ( T a b l e 3 . B . 3 ) . 6 7 T h e s u b s t r a t e w a s m i l l e d u s i n g a c e n t r i f u g a l m i l l ( < 1 5 0 u m ) p r i o r t o c o n v e n t i o n a l A F E X ( R - A C S ) . T h e r e i s 1 6 % d e c r e a s e i n t h e O / C r a t i o a fi e r A F E X . W a s h i n g t h e s a m p l e s w i t h w a t e r r e s u l t e d i n a 1 0 % d e c r e a s e i n O / C ( c o m p a r e d t o u n t r e a t e d s t o v e r ) i n d i c a t i v e t h a t s o m e o f t h e s u r f a c e d e p o s i t s c a n b e r e m o v e d b y e x t r a c t i o n w i t h w a t e r ( i . e . e x t r a c t i v e s c o n t a i n h y d r o p h i l i c a n d h y d r o p h o b i c c o m p o n e n t s ) . S o l v e n t e x t r a c t i o n w i t h a s t r o n g a l k a l i , l i k e N a O H , f o l l o w e d b y w a s h i n g w i t h e t h a n o l a n d w a t e r h e l p e d r e m o v e m o s t o f t h e s u r f a c e e x t r a c t i v e s ( a l o n g w i t h o t h e r w a l l c o m p o n e n t s l i k e l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e ) i n d i c a t e d b y t h e s i g n i fi c a n t l y h i g h e r O / C r a t i o . I n t e r e s t i n g l y , t h e O / C b a s e d t r e n d s a r e a l s o s e e n b y c o m p a r i n g t h e r a t i o o f C 1 / C 2 . S o m e r e s e a r c h e r s h a v e s u g g e s t e d C l / C 2 t o b e a b e t t e r i n d i c a t o r o f l i g n i n e x t r a c t i v e s o n t h e s u r f a c e c o m p a r e d t o O / C , d u e t o l a r g e r s c a t t e r i n O / C v a l u e s d u e t o w a t e r a d s o r p t i o n o n s a m p l e s u r f a c e [ 2 5 7 ] . A s i m i l a r t r e n d i s s e e n f o r C 1 / C 2 f o r a l l c o r n s t o v e r f r a c t i o n s b e f o r e a n d a f t e r A F E X p r e t r e a t m e n t , c o m p a r a b l e t o i n f o r m a t i o n o b t a i n e d f r o m O / C r a t i o s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e e f f e c t o f t a k e — o f ‘ f - a n g l e ( T O A ) o n E S C A s p e c t r a o b t a i n e d w a s s t u d i e d t o g e t a n e s t i m a t e d t h i c k n e s s o f t h e s u r f a c e d e p o s i t s a f t e r A F E X . E S C A t y p i c a l l y a l l o w s o n e t o a n a l y z e t h e e l e m e n t a l c o m p o s i t i o n o f v e r y t h i n s u r f a c e l a y e r s ( 5 - 1 0 n m t h i c k n e s s ) , h o w e v e r , t h e a c t u a l s a m p l i n g d e p t h d e p e n d s o n t h e a n g l e o f e m i s s i o n ( i . e . a t : a n g l e b e t w e e n s a m p l e c u p a n d a n a l y z e r ) . T h e s a m p l i n g d e p t h i s t y p i c a l l y r e d u c e d b y a f a c t o r o f S i n ( ( 1 ) , t h e r e f o r e , m a x i m u m a n a l y s i s d e p t h i s a c h i e v e d a t o r = n / 2 r a d i a n s [ 2 5 5 ] . I f t h e s u r f a c e d e p o s i t l a y e r i s g r e a t e r t h a n 1 0 n m i n t h i c l m e s s t h e n t h e r e s h o u l d b e n o e f f e c t o f t h e e m i s s i o n a n g l e o n t h e E S C A s p e c t r a l c o u n t s f o r e a c h e l e m e n t . I n t e r e s t i n g l y , t h e r e w a s n o s i g n i fi c a n t e f f e c t f o u n d o n t h e e l e m e n t a l c o m p o s i t i o n a n d O / C r a t i o s f o r b o t h u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d s a m p l e s b y v a r y i n g a n g l e o f e m i s s i o n b e t w e e n 1 5 - 7 5 ° . 6 8 . o i t a r ) C I O ( n o b r a C % d u a u o l g o e o g p a b o n t n e g y x O g A e l a u i s F i g u r e 3 . B . 3 E fl e c t o f s i z e r e d u c t i o n b e f o r e a n d a f t e r A F E X p r e t r e a t m e n t o n o x y g e n t o c a r b o n ( O / C , b a r s - l e f t a x i s ) s u r f a c e a t o m i c c o m p o s i t i o n v e r s u s % p h e n o l i c a c i d e q u i v a l e n t w a t e r e x t r a c t i b l e s ( l i n e - r i g h t a x i s ) . W h e r e ; G C S : G r o u n d c o r n s t o v e r ( u n t r e a t e d ) , G C S — A F E X : G r o u n d b e f o r e A F E X , a n d A F E X - G C S : G r o u n d a f t e r A F E X . 0 . 2 . 0 0 1 0 . 1 6 . 0 4 : i 0 . 1 2 . 0 w 0 . 0 8 . 0 M T 0 . 0 4 . 0 — L O G C S - A F E X A F E X - G C S G C S T a b l e 3 . B . 3 E fl e c t o f w a t e r a n d s o l v e n t e x t r a c t i o n ( u s i n g N a O H , e t h a n o l a n d w a t e r ) o n A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r ( A C S ) s u r f a c e a t o m i c c o m p o s i t i o n a s c o m p a r e d t o u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ( C S ) . A l l e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d i n q u a d r u p l i c a t e s . M e a n v a l u e % C V S a m p l e N o t a t i o n % C % O % N % C % O % N O / C U n t r e a t e d C S 7 1 . 3 2 6 . 6 1 . 7 1 . 0 2 . 7 9 . 3 0 . 3 7 A F E X C S 7 4 . 1 2 2 . 7 2 . 8 1 . 4 1 . 3 1 3 . 8 0 . 3 1 W a t e r e x t r a c t e d A C S 7 3 . 4 2 4 . 1 1 . 7 0 . 6 1 . 0 1 2 . 2 0 . 3 3 S o l v e n t e x t r a c t e d A C S 6 5 . 8 3 2 . 1 1 . 0 2 . 6 5 . 0 3 . 5 0 . 4 9 S a m p l e N o t a t i o n % C l % C 2 % C 3 % C 1 % C 2 % C 3 C 1 / C 2 U n t r e a t e d C S 5 6 . 3 3 4 . 1 9 . 6 2 . 7 3 . 7 2 . 5 1 . 7 A F E X C S 6 4 . 5 2 8 . 3 7 . 1 6 . 7 1 3 . 1 8 . 3 2 . 3 W a t e r e x t r a c t e d A C S 6 2 . 6 2 9 . 5 7 . 9 6 . 0 9 . 8 1 1 . 9 2 . 1 S o l v e n t e x t r a c t e d A C S 4 3 . 2 4 5 . 0 1 1 . 7 1 2 . 3 1 0 . 2 9 . 0 1 . 0 6 9 T h i s s u g g e s t s t h a t t h e l a y e r o f A F E X s u r f a c e d e p o s i t s a r e t h i c k e r t h a n 1 0 n m i n t h i c k n e s s , w h i c h a l s o r e i t e r a t e s t h e A F M fi n d i n g s w h e r e t h e R M S r o u g h n e s s f a c t o r ( c o r r e s p o n d i n g t o t h e m o d i fi c a t i o n o f t h e s u r f a c e t o p o g r a p h y d u e t o p r e s e n c e o f a m o r p h o u s l y s h a p e d d e p o s i t s a f t e r A F E X ) w a s f o u n d t o b e a t l e a s t 2 f o l d l a r g e r a f t e r A F E X c o m p a r e d t o t h e u n t r e a t e d m a t e r i a l . C o n c l u s i o n s C o m b i n a t i o n o f h i g h - r e s o l u t i o n A F M i m a g i n g w i t h s u r f a c e s p e c i fi c ( 5 - 1 0 n m ) c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n b y E S C A g a v e v a l u a b l e i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e m e c h a n i s m o f c o n v e n t i o n a l A F E X ( R - A C S ) . I t w a s f o u n d t h a t t h e e x t e r n a l c e l l w a l l s u r f a c e s w e r e c o v e r e d w i t h a m o r p h o u s l y s h a p e d d e p o s i t s ( 2 0 - 1 0 0 0 n m i n s i z e ) a f t e r c o n v e n t i o n a l A F E X p r e t r e a t m e n t t h a t h a d a d i s t i n c t c h e m i c a l c o m p o s i t i o n ( b y p h a s e i m a g i n g ) a n d t o p o g r a p h y ( b y a m p l i t u d e i m a g i n g ) c o m p a r e d t o t h e u n t r e a t e d c o n t r o l s . T h e s e d e p o s i t s r e s u l t i n a t w o - f o l d i n c r e a s e i n t h e r o o t - m e a n - s q u a r e s u r f a c e r o u g h n e s s f a c t o r a f t e r A F E X w i t h s u r f a c e t h i c k n e s s r a n g i n g b e t w e e n 1 0 - 2 0 0 n m ( b a s e d o n E S C A T O A a n a l y s i s a n d A F M h e i g h t i m a g e s c o m p a r i n g u n t r e a t e d t o A F E X t r e a t e d w a l l s u r f a c e s ) . E S C A r e v e a l e d t h a t t h e s e s u r f a c e d e p o s i t s w e r e e s s e n t i a l l y c o m p o s e d o f l i g n i n p h e n o l i c s a n d o t h e r c e l l w a l l e x t r a c t i v e s ( s o m e p o s s i b l y e x t r a c t e d f r o m t h e c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a r e g i o n b a s e d o n i n c r e a s e d c a l c i u m s u r f a c e c o n t e n t a f t e r A F E X ) . T h e o x y g e n t o c a r b o n r a t i o ( O / C ) d e c r e a s e d b y 5 - 3 0 % a f t e r A F E X , t h e e x t e n t o f d e c r e a s e w a s t y p i c a l l y d e p e n d e n t o n t h e p a r t i c l e s i z e o f t h e b i o m a s s s u b s t r a t e . T h e e x t e n t o f d e c r e a s e i n O / C w a s i n v e r s e l y c o r r e l a t e d t o t h e l i g n o - p h e n o l i c c o n t e n t o f t h e w a t e r e x t r a c t i v e s ( b a s e d o n m o d i fi e d P r u s s i a n b l u e a n a l y s i s ) . H o w e v e r , w a t e r e x t r a c t i o n o n l y r e m o v e d s o m e o f t h e s e s u r f a c e d e p o s i t s i n d i c a t i n g t h a t t h e s u r f a c e e x t r a c t i v e s a r e c o m p o s e d o f b o t h h y d r o p h i l i c a n d 7 0 h y d r o p h o b i c c o m p o n e n t s , u n l i k e w h a t i s s e e n a f t e r d i l u t e - a c i d b a s e d p r e t r e a t m e n t s ( h y d r o p h o b i c l i g n i n r i c h g l o b u l a r d e p o s i t s ) . I t w o u l d b e o f i n t e r e s t t o e x p l o r e t h e i n t e r n a l c e l l w a l l r e g i o n a fi e r c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t m e n t u s i n g o t h e r m i c r o s c o p i c ( e . g . T E M ) a n d s p e c t r o s c o p i c ( e . g . R a m a n , F T - I R ) t o o l s t o h e l p c h a r a c t e r i z e t h e p h y s i c o - c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s w i t h i n t h e c e l l w a l l t h a t g i v e r i s e t o t h e s e c h e m i c a l l y h e t e r o g e n o u s , a m o r p h o u s l y s h a p e d s u r f a c e d e p o s i t s . 7 1 C H A P T E R 4 : U L T R A S T R U C T U R A L M O D I F I C A T I O N S W I T H I N A M M O N I A T R E A T E D C E L L W A L L S A N D C R Y S T A L L I N E C E L L U L O S E 4 . 1 F o r m a t i o n o f p o r e s a n d d e l a m i n a t i o n z o n e s w i t h i n a m m o n i a t r e a t e d c e l l w a l l s t h r o u g h d e l o c a l i z a t i o n o f h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n 4 . 1 . 1 A b s t r a c t T h e i n t e r n a l c e l l w a l l u l t r a - s t r u c t u r e o f u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d c o m s t o v e r ( f o r fi v e v a r y i n g p r e t r e a t m e n t s e v e r i t i e s ) w a s i n v e s t i g a t e d b y t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M ) , d u a l - a x i s e l e c t r o n t o m o g r a p h y ( 3 D - T o m o ) a n d i m m u n o - e l e c t r o n m i c r o s c o p y . T h r e e d i s t i n c t u l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s t a k e p l a c e d u r i n g A F E X t h a t w e r e d e p e n d e n t o n t h e s e v e r i t y o f t h e p r e t r e a t m e n t ; ( a ) f o r m a t i o n o f l a r g e p o r e s w i t h i n a n i n t a c t c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M L ) , ( b ) f o r m a t i o n o f p o r e s w i t h i n o u t e r s e c o n d a r y w a l l l a y e r s ( S 3 r e g i o n ) , a n d ( c ) d e l a m i n a t i o n d u e t o r e m o v a l o f l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e w i t h i n s e c o n d a r y c e l l w a l l s . F o r c o n v e n t i o n a l A F E X ( R - A C S ) c e l l w a l l s t h e r e w e r e a m o r p h o u s l y s h a p e d d e p o s i t s f o u n d o n t h e o u t e r c e l l w a l l s u r f a c e s t h a t w e r e r i c h i n h e m i c e l l u l o s e ( b a s e d o n a r a b i n o x y l a n i m m u n o l a b e l i n g ) . T h e e x t e n t o f r e m o v a l o f l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e w a s s i g n i fi c a n t d u r i n g l o w m o i s t u r e a m m o n i a t r e a t m e n t , r e s u l t i n g i n e x t e n s i v e d e l a m i n a t i o n a n d l i g n i n c o a l e s c e n c e i n t h e o u t e r w a l l r e g i o n s . A t h i g h e r a m m o n i a l o a d i n g s ( a n d l o n g e r r e s i d e n c e t i m e s ) t h e r e w e r e l a r g e p o r e s f o r m e d i n t h e o u t e r S 3 w a l l l a y e r . C e l l u l o s e r i c h fi b r i l b u n d l e s o n t h e w a l l s u r f a c e w e r e e x p o s e d t o w a r d s t h e l u m e n d u r i n g h i g h a m m o n i a l o a d i n g s e v e r i t y b a s e d A F E X . A t l o w e r p r e t r e a t m e n t s e v e r i t i e s ( l o w a m m o n i a l o a d i n g ) t h e o v e r a l l p o r o s i t y ( s u r f a c e a r e a t o v o l u m e r a t i o , r i m . 1 o r m Z / g m a s s u m i n g d e n s i t y = 1 ) w i t h i n t h e c e l l w a l l w a s 5 - 1 0 f o l d l o w e r t h a n a t h i g h e r s e v e r i t i e s ( h i g h e r a m m o n i a / r e s i d e n c e t i m e o r l o w e r m o i s t u r e 7 2 l o a d i n g ) . T h e r e w a s a l i n e a r r e l a t i o n s h i p ( R 2 = 0 . 9 1 ) b e t w e e n t h e r a t e o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s a n d l o g ( p o r o s i t y ) f o r A F E X c e l l w a l l s t r e a t e d u n d e r d i f f e r e n t s e v e r i t i e s , i n d i c a t i n g t h e i m p o r t a n c e o f p o r o s i t y o n e n z y m e a c c e s s i b i l i t y . 4 . 1 . 2 B a c k g r o u n d 4 . 1 . 2 . 1 C r o s s - l i n k i n g m a t r i x i n c e l l w a l l s o f m o n o c o t s a n d d i c o t s a r e d i f f e r e n t T h e r e h a s b e e n e x t e n s i v e w o r k c o n d u c t e d o n d i c o t s ( t y p i c a l l y w o o d y b i o m a s s ) t o s t u d y t h e u l t r a s t r u c t u r a l a r c h i t e c t u r e o f t y p e I c e l l w a l l s ( c r o s s - l i n k i n g m a t r i x r i c h i n p e c t i n s a n d x y l o g l u c a n s ) u s i n g h i g h r e s o l u t i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y b a s e d t e c h n i q u e s [ 6 2 , 7 1 , 2 3 7 , 2 6 0 , 2 6 2 ] . H o w e v e r , t y p e 1 1 c e l l w a l l s o f c o m m e l i n o i d m o n o c o t s ( l i k e c o r n s t o v e r ) t h a t h a v e a c r o s s - l i n k i n g m a t r i x o f g l u c u r o n o a r a b i n o x y l a n s ( G A X ) a n d p o l y p h e n o l i c s , a r e r e l a t i v e l y p o o r l y u n d e r s t o o d [ 6 5 , 2 6 2 , 2 6 3 ] . I n d i c o t s , e x t r a c t i o n o f x y l o g l u c a n s a n d p e c t i n s ( u s i n g s o d i u m c a r b o n a t e o r p o t a s s i u m h y d r o x i d e ) i s t y p i c a l l y r e s p o n s i b l e f o r e n h a n c i n g t h e p o r o s i t y ( f r o m < 5 - 1 0 t o 3 0 - 4 0 m m ) o f p r i m a r y c e l l w a l l s [ 2 6 0 ] . H o w e v e r , e x t e n s i v e e x t r a c t i o n o f x y l o g l u c a n s r e s u l t s i n a g g r e g a t i o n o f c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s w i t h s i g n i fi c a n t r e d u c t i o n i n p o r o s i t y . O n t h e o t h e r h a n d , t y p e H c e l l w a l l s i n t e r s t i t i a l m a t r i c e s a r e c o m p o s e d o f h i g h l y b r a n c h e d G A X ’ s c r o s s - l i n k e d b y p h e n o l i c r e s i d u e s ; w h i l e u n s u b s t i t u t e d G A X , fi - g l u c a n s a n d g l u c o m a n n a n s f o r m t h e c e l l u l o s e fi b r i l c o a t i n g s [ 2 6 2 ] . H o w e v e r , t h e e fl e c t o f l i q u i d a m m o n i a o n t y p e [ 1 c e l l w a l l s h a s n e v e r b e f o r e b e e n s t u d i e d . 4 . 1 . 2 . 2 E fl e e t o f t h e r m o c h e m i c a l t r e a t m e n t o n m o d i fi c a t i o n o f c e l l w a l l a r c h i t e c t u r e R e c e n t s t u d i e s o n a c i d - t r e a t e d c o r n s t o v e r u s i n g h i g h r e s o l u t i o n T E M a n d 3 D - t o m o g r a p h y h a v e a l l o w e d v i s u a l i z a t i o n o f l i g n i n r e m o v a l a n d d e l o c a l i z a t i o n w i t h i n t h e c e l l w a l l a fi e r p r e t r e a t m e n t [ 1 1 2 ] . T h e l i g n i n s e e m s t o c o a l e s c e u p o n h y d r o l y s i s o f 7 3 h e m i c e l l u l o s e f o l l o w e d b y d e l o c a l i z a t i o n a s d r o p l e t s ( 2 0 - 1 0 , 0 0 0 n m i n s i z e ) t o t h e o u t e r c e l l w a l l r e g i o n s , c e l l p i t s a n d c o r n e r s . C o n f o c a l fl u o r e s c e n c e s t u d i e s h a v e a l l o w e d v i s u a l i z a t i o n o f h e m i c e l l u l o s e r e m o v a l a n d r e - d i s t r i b u t i o n d u r i n g a c i d t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r [ 2 6 4 ] . T h e s e s t u d i e s r e v e a l a d r a m a t i c l o s s i n x y l a n a n t i b o d y s i g n a l ( d u e t o h y d r o l y s i s a n d s o l u b i l i z a t i o n o f h e m i c e l l u l o s e t o x y l o s e a n d x y l o o l i g o m e r s e x t r a c t e d i n t h e l i q u i d s t r e a m ) fi ' o r n w i t h i n t h e c e l l w a l l a n d a s i g n i fi c a n t i n c r e a s e i n x y l a n c o n t e n t o n t h e o u t e r w a l l r e g i o n s p o s s i b l y d u e t o d e p o s i t i o n o f h i g h D P x y l o - o l i g o m e r s a n d h e m i c e l l u l o s e a s s o c i a t e d t o l i g n i n . H o w e v e r , u n l i k e A F E X , d i l u t e - a c i d t r e a t m e n t s a r e t y p i c a l l y c o n d u c t e d a t h i g h e r t e m p e r a t u r e s ( 1 4 0 - 1 7 0 ° C ) , h i g h e r l i q u i d t o s o l i d s l o a d i n g ( 5 - 2 0 t o 1 , w / w ) i n a n a q u e o u s - a c i d i c e n v i r o n m e n t t h a t a l l o w s n e a r c o m p l e t e h y d r o l y s i s o f h e m i c e l l u l o s e t o s o l u b l e m o n o m e r s . E x t e n s i v e h y d r o l y s i s o f h e m i c e l l u l o s e a l l o w s c o a l e s c e n c e o f l i g n i n i n t o h y d r o p h o b i c g l o b u l e s ( t h r o u g h o u t t h e c e l l w a l l ) t h a t a r e e x t r u d e d o u t o f t h e w a l l s i g n i fi c a n t l y i m p r o v i n g a c c e s s t o t h e e m b e d d e d c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s . H o w e v e r , i n a n a n h y d r o u s l i q u i d a m m o n i a o r c o n c e n t r a t e d a m m o n i u m h y d r o x i d e e n v i r o n m e n t t h e e x t e n t o f m o d i fi c a t i o n o f t h e d i f f e r e n t r e g i o n s o f t h e c e l l w a l l w o u l d b e v e r y d i f f e r e n t f r o m a c i d t r e a t m e n t . P r e l i m i n a r y T E M i m a g i n g w o r k o n a m m o n i u m h y d r o x i d e t r e a t e d a s p e n w o o d h a s r e v e a l e d k i n k i n g , c u r l i n g a n d t w i s t i n g o f t h e w a l l d u e t o p l a s t i c i z a t i o n o f w o o d [ 2 3 6 ] . T h e r e w a s a l s o p a r t i a l l a m e l l a r fi b e r s e p a r a t i o n s e e n w i t h i n t h e m i d d l e l a m e l l a a n d o u t e r l a y e r s o f t h e s e c o n d a r y c e l l w a l l , h o w e v e r , t h i s i d e a w a s n o t e x p l o r e d i n d e t a i l d u e t o l a c k o f h i g h r e s o l u t i o n i m a g e s . 4 . 1 . 2 . 3 C e l l w a l l p o r o s i t y a n d e l e c t r o n t o m o g r a p h y C e l l w a l l p o r e s i z e d i s t r i b u t i o n h a s b e e n s h o w n i n t h e p a s t t o b e a fi m d a m e n t a l f a c t o r a f f e c t i n g e n z y m e a c c e s s i b i l i t y a n d r a t e o f h y d r o l y s i s [ 2 6 5 , 2 6 6 ] . V a r y i n g p r e t r e a t m e n t 7 4 s e v e r i t i e s a r e b e l i e v e d t o p r o d u c e s u b s t r a t e s o f v a r y i n g d i g e s t i b i l i t y p o s s i b l y d u e t o v a r y i n g p o r o s i t i e s [ 2 2 ] . P o r e v o l u m e ( b a s e d o n fi b e r s a t u r a t i o n p o i n t ) o f s u p e r c r i t i c a l a m m o n i a t r e a t e d w o o d y b i o m a s s w e r e f o u n d t o b e 3 0 - 6 0 % h i g h e r t h a n t h e i r u n t r e a t e d c o u n t e r p a r t s , w i t h n o s i g n i fi c a n t c h a n g e i n m a x i m u m p o r e w i d t h [ 1 6 2 , 2 6 7 , 2 6 8 ] . H o w e v e r , t h e e fl e c t o f A F E X o n g r a s s c e l l w a l l p o r e v o l u m e a n d p o r e s i z e d i s t r i b u t i o n a s a f u n c t i o n o f l o c a t i o n w i t h i n t h e c e l l w a l l i s c u r r e n t l y u n k n o w n . T h e r e a r e t y p i c a l l y f o u r m e t h o d s f o r d e t e r m i n i n g c e l l w a l l p o r o s i t y ; ( 1 ) u l t r a s t r u c t u r a l m e t h o d s l i k e e l e c t r o n m i c r o s c o p y , ( 2 ) b u l k e x c l u s i o n m e t h o d s l i k e s o l u t e e x c l u s i o n ( S E C ) , ( 3 ) n i t r o g e n p h y s i s o r p t i o n b a s e d a n a l y s i s ( B E T ) , a n d ( 4 ) f u n c t i o n a l a s s a y s u s i n g l a b e l e d t r a c e r s d i f f u s i n g i n t o t h e c e l l w a l l [ 2 6 9 , 2 7 0 ] . B u l k m e t h o d s l i k e s o l u t e e x c l u s i o n a n d B E T - N i t r o g e n a r e c o n v e n i e n t t o u s e c o m p a r e d t o e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d f u n c t i o n a l t r a c e r b a s e d a s s a y s . H o w e v e r , t h e s e m e t h o d s a r e r e l a t i v e l y i n s e n s i t i v e a n d d e p e n d e n t o n t h e p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e p r o b e m o l e c u l e ( e . g . P E G , d e x t r a n s , n i t r o g e n ) . B E T - n i t r o g e n b a s e d a d s o r p t i o n m e t h o d o l o g i e s a r e u n a b l e t o e s t i m a t e t h e t r u e p o r o s i t y a c c e s s i b l e t o a n e n z y m e m o l e c u l e ( w h i c h i s v e r y d i f f e r e n t f r o m w h a t i s a c c e s s i b l e t o n i t r o g e n ) . M o s t c o n v e n t i o n a l m e t h o d s a l s o f a i l t o p r o v i d e a d e t a i l e d p o r e s i z e d i s t r i b u t i o n a n d s h a p e m o r p h o l o g y w i t h i n t h e c e l l w a l l a s a f u n c t i o n o f d i f f e r e n t c e l l w a l l l a y e r s ( M i d d l e l a m e l l a v s . S e c o n d a r y c e l l w a l l ) . O n t h e o t h e r h a n d , d u a l - a x i s e l e c t r o n t o m o g r a p h y i s a p o w e r f u l t e c h n i q u e t h a t c o u l d b e u s e d f o r c e l l w a l l u l t r a - s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f a r c h i t e c t u r e a n d s t r u c t u r a l d e t a i l s b e f o r e a n d a fi e r t h e r m o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t [ 1 1 2 , 2 7 1 ] . E l e c t r o n t o m o g r a p h y a l l o w s r e c o n s t r u c t i o n o f t h e i n t e r i o r o f a s p e c i m e n t h r o u g h t h e p r o j e c t i o n s c o l l e c t e d fi ' o m t i l t i n g t h e s p e c i m e n ( t y p i c a l l y a l o n g d u a l o r t h o g o n a l a x e s t o m i n i m i z e a r t e f a c t s a n d 7 5 e n h a n c e r e s o l u t i o n a l o n g s p e c i m e n d e p t h ) u n d e r t h e e l e c t r o n b e a m . A n a l y s i s o f 3 D - t o m o g r a m s w i t h r e c e n t l y d e v e l o p e d a d v a n c e d i m a g i n g s o f t w a r e l i k e I M O D a i d i n o b t a i n i n g q u a n t i t a t i v e i n f o r m a t i o n t h a t h a s b e e n d i f fi c u l t t o a c h i e v e t o d a t e [ 2 7 2 ] . T h e h i g h - r e s o l u t i o n o f e l e c t r o n m i c r o s c o p y c o u p l e d w i t h t o m o g r a p h i c r e c o n s t r u c t i o n o f t i l t - s e r i e s i m a g e s s h o u l d a l l o w d e v e l o p m e n t o f c e l l w a l l u l t r a s t r u c t u r a l m o d e l s . T h i s c o u l d l a y t h e f o u n d a t i o n f o r t e s t i n g ‘ s t r u c t u r e - fi r n c t i o n ’ b a s e d h y p o t h e s e s t o h e l p b e t t e r u n d e r s t a n d p r e t r e a t m e n t a n d e n z y m a t i c h y d r o l y s i s r e l a t e d p h e n o m e n a ( e . g . e f f e c t o f p o r o s i t y w i t h i n m i d d l e l a m e l l a o n e n z y m e d i f f u s i o n ) . 4 . 1 . 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s S e e a p p e n d i x A - V I I - l , 4 , 9 , 1 0 , 1 1 , 1 2 , 1 3 , 2 3 , 2 8 a n d 3 1 . 4 . 1 . 4 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 4 . 1 . 4 . 1 U l t r a s t r u c t u r a l m o d i f i c a t i o n o f c e l l w a l l d e p e n d s o n p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y T h e r e w e r e 5 A F E X c o n d i t i o n s t e s t e d ( p r o t o c o l A - V I I - 4 ) t o s t u d y t h e e f f e c t o f p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y o n e x t e n t o f u l t r a s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s ( S e e T a b l e 4 . A . 1 ) . A F E X c o n d i t i o n s e m p l o y e d w e r e ; ( 1 ) L o w a m m o n i a l o a d i n g ( L o w - N ) a t 0 . 5 : 1 a m m o n i a t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 0 6 : ] w a t e r t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 1 5 m i n r e s i d e n c e t i m e a t 1 3 0 ° C . ( 2 ) C o n v e n t i o n a l A F E X ( R e g u l a r ) a t 1 : 1 a m m o n i a t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 0 6 : ] w a t e r t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 1 5 m i n r e s i d e n c e t i m e a t 1 3 0 ° C . ( 3 ) H i g h a m m o n i a l o a d i n g a n d l o n g e r r e s i d e n c e t i m e b a s e d A F E X ( H i g h - N t ) a t 3 : 1 a m m o n i a t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 0 . 6 : 1 w a t e r t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 4 5 m i n r e s i d e n c e t i m e a t 1 3 0 ° C . ( 4 ) L o w e r t e m p e r a t u r e b a s e d A F E X ( L o w - T ) a t 1 : 1 a m m o n i a t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 0 6 2 1 w a t e r t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 1 5 m i n r e s i d e n c e t i m e a t 7 0 ° C . ( 5 ) L o w e r m o i s t u r e b a s e d A F E X ( L o w - W ) a t 1 : 1 a m m o n i a t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 0 . 0 5 : 1 w a t e r 7 6 t o b i o m a s s l o a d i n g ( w / w ) , 1 5 m i n r e s i d e n c e t i m e a t 1 3 0 ° C . A l l s a m p l e s w e r e e m b e d d e d , s e c t i o n e d a n d s t a i n e d ( w i t h u r a n y l a c t e t a t e a n d p o t a s s i u m p e r m a n g a n a t e ) . R e g i o n s o f t h e c e l l w a l l t h a t s t a i n e d b l a c k - d a r k g r e y a r e t y p i c a l l y e n r i c h e d i n l i g n i n [ 1 1 2 , 2 7 3 ] ; w h i l e r e g i o n s s t a i n e d d a r k g r e y - g r e y a r e t y p i c a l l y e n r i c h e d i n h e m i c e l l u l o s e [ 2 7 4 ] . T h e m i c r o s c o p i c a n a l y s i s w a s l i m i t e d t o v a s c u l a r b u n d l e b a s e d c e l l s ( i . e . x y l e m , s c l e r e n c h y m a c e l l s ) d u e t o r e a s o n s e x p l a i n e d i n p r e v i o u s c h a p t e r s . T h e v a r i o u s p a r t s o f t h e u n t r e a t e d p l a n t c e l l w a l l a r e c l e a r l y d e p i c t e d b y t h e T E M m i c r o g r a p h ( F i g u r e 4 . A . 1 ) . T h e c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M L , a p p r o x . 3 0 0 - 5 0 0 n m w i d t h ) , c o m p r i s i n g o f t h e m i d d l e l a m e l l a a n d p r i m a r y c e l l w a l l , i s s t a i n e d b l a c k i n d i c a t i n g t h a t i t i s s i g n i fi c a n t l y l i g n i fi e d . T h e s e c o n d a r y c e l l w a l l s ( S l - S 3 ) h a v e v a r y i n g a m o u n t s o f l i g n i n c o n t e n t i n d i c a t e d b y t h e i n t e n s i t y o f t h e K M n O 4 s t a i n . S 1 l a y e r s h a v e b e e n s h o w n p r e v i o u s l y t o c o n t a i n l o w e r l i g n i n c o n t e n t c o m p a r e d t o t h e s e c o n d a r y w a l l l a y e r s 3 2 a n d S 3 [ 2 7 5 ] . T h e r e i s s i g n i fi c a n t l y h i g h e r l i g n i n a n d / o r h e m i c e l l u l o s e c o n t e n t i n t h e i n t e r m e d i a t e t r a n s i t i o n z o n e s b e t w e e n t h e s e c o n d a r y c e l l w a l l l a y e r s ( S l - S 2 a n d S Z - S 3 ) , i n d i c a t e d b y t h e d a r k e r s t a i n i n g o f t h a t r e g i o n . T E M m i c r o g r a p h s f o r t h e 5 A F E X s e v e r i t i e s a t v a r y i n g d e g r e e s o f m a g n i fi c a t i o n a r e s h o w n i n F i g u r e 4 . A . 2 ( a n d F i g u r e s l I - 4 . A . 7 t o I I - 4 . A . 1 1 ) . T a b l e 4 . A . 1 V a r y i n g A F E X s e v e r i t y c o n d i t i o n s . S a m p l e I D N o t a t i o n A m m o n i a W a t e r T e m p e r a t u r e T i m e U S r a t i o L i q u i d t o s o l i d g m a r r r r n o n i a g m w a t e r p e r 0 . M r n u t e s D e g r e e s C ( g m / g m ) p e r g m b i o m a s s g m b i o m a s s 1 L o w - N 0 . 5 0 . 6 1 3 0 1 5 1 . 1 2 R e g u l a r 1 0 . 6 1 3 0 1 5 1 . 6 3 H i g h - N t 3 0 . 6 1 3 0 4 5 3 . 6 4 L o w - T l 0 . 6 7 0 1 5 1 . 6 5 L o w - W 1 0 . 0 5 1 3 0 1 5 1 . 0 5 7 7 F i g u r e 4 . A . 1 U n t r e a t e d c o r n s t o v e r T E M i m a g e s h o w i n g c e l l c o r n e r , c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M ) a n d s e c o n d a r y w a l l l a y e r s ( S I , 5 2 , S 3 ) . C e l l C o r n e r R e p r e s e n t a t i v e t o m o g r a m s l i c e s ( 1 0 n m t h i c k n e s s ) o f t h e v a r i o u s s e v e r i t y A F E X t r e a t e d c e l l w a l l s a r e s h o w n i n F i g u r e 4 . A . 3 . F o r L o w - N A F E X s a m p l e s , t h e m i d d l e l a m e l l a i s s i g n i fi c a n t l y m o d i fi e d i n d i c a t e d b y t h e l a r g e p o r e s s e e n w i t h i n t h e C M L , a s c o m p a r e d t o t h e s e c o n d a r y w a l l l a y e r s ( F i g u r e 4 . A . 2 ( a ) a n d F i g u r e I I — 4 . A . 7 ) . T h e p o r e s w i t h i n t h e m i d d l e l a m e l l a r a n g e i n s i z e f r o m 1 0 - 5 0 0 n m . T y p i c a l l y , i t i s d i f fi c u l t t o o b t a i n d e t a i l e d u l t r a s t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n a b o u t t h e m i d d l e l a m e l l a f o r n a t i v e c e l l w a l l s w i t h o u t a n y s o r t o f c h e m i c a l t r e a t m e n t d u e t o p r e s e n c e o f h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n t h a t o b s c u r e t h e u n d e r - l y i n g c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s [ 2 7 3 ] . H o w e v e r , c l o s e r i n s p e c t i o n o f t h e C M L a f t e r L o w - N A F E X r e v e a l s a u n i q u e u n d e r l y i n g a r c h i t e c t u r e . 7 8 F i g u r e 4 . A . 2 A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r T E M i m a g e s ( a t v a r y i n g s c a l e s o f m a g n i fi c a t i o n ) s h o w i n g c e l l c o r n e r , c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M ) a n d s e c o n d a r y w a l l l a y e r s ( S I , 5 2 , S 3 ) . ( a ) L o w - N , ( b ) R e g u l a r , ( c ) H i g h - N t , ( d ) L o w - T , a n d ( e ) L o w - W b a s e d v a r y i n g A F E X s e v e r i t i e s . S e e T a b l e 4 . A . 1 f o r d e s c r i p t i o n o f e a c h A F E X s e v e r i t y . ( S c a l e b a r s s h o w n a t t h e b o t t o m o f e a c h i m a g e ) 7 9 F i g u r e 4 . A . 2 C o n t d . . . 8 0 F i g u r e 4 . A . 3 T o m o g r a m s l i c e s ( ~ 1 0 n m i n t h i c k n e s s ) d e p i c t i n g v a r y i n g A F E X s e v e r i t y t r e a t e d c o r n s t o v e r c e l l w a l l s . ( a ) L o w - N , ( b ) R e g u l a r , ( c ) H i g h - N t , ( d ) L o w - T , a n d ( e ) L o w - W b a s e d v a r y i n g A F E X s e v e r i t i e s . S e e T a b l e 4 . A . 1 f o r d e s c r i p t i o n o f e a c h A F E X s e v e r i t y . ( S c a l e b a r s s h o w n a t t h e b o t t o m o f e a c h i m a g e ) 8 1 F i g u r e 4 . A . 3 C o n t d . . . 8 2 8 3 F i g u r e 4 . A . 3 C o n t d . . . F i g u r e 4 . A . 4 I s a - s u r f a c e m e s h e n c l o s i n g p o r o u s r e g i o n s w i t h i n E M - t o m o g r a m f o r L o w - N t r e a t e d s a m p l e . ( a ) T o m o g r a m s l i c e ( 2 = 1 0 s l i c e s ) , a n d ( b ) I s a - s u r f a c e m o d e l s e n c l o s i n g p o r o u s r e g i o n s w i t h i n t o m o g r a m s l i c e . ' 4 w , C 1 ) “ ( « 3 : 4 3 . I n 8 4 G r a s s c e l l w a l l b a s e d C M L a r e k n o w n t o b e c o m p o s e d o f a p o l y s a c c h a r i d e - l i g n i n n e t w o r k a s t h e m a t r i x c o m p o n e n t , w h e r e t h e c a r b o h y d r a t e ( t y p i c a l l y G A X ) a n d p h e n o l i c m o i e t i e s a r e c r o s s - l i n k e d b y f e r u l i c - o r d i f e r u l i c - a c i d b r i d g e s [ 9 4 , 2 7 6 ] . T h e c e l l u l o s i c m i c r o fi b r i l s a r e t y p i c a l l y r a n d o m l y o r i e n t e d w i t h i n t h e C M L a s c o m p a r e d t o t h e o r d e r e d , l a m e l l a r s t r u c t u r e s e e n i n t h e s e c o n d a r y w a l l l a y e r s [ 5 5 ] . T h e d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n o f c e l l u l o s e i n C M L h a s a b i p h a s i c d i s t r i b u t i o n , t y p i c a l l y 5 0 0 o r b e t w e e n 2 5 0 0 - 4 5 0 0 ; a s c o m p a r e d t o t h i c k e r m i c r o fi b n ' l s i n s e c o n d a r y w a l l s t h a t h a v e a D P r a n g i n g b e t w e e n 1 0 , 0 0 0 - 1 5 , 0 0 0 [ 2 7 7 ] . T h e p r e s e n c e o f h i g h l y b r a n c h e d m e s h l i k e n e t w o r k t h a t c a n b e s e e n w i t h i n t h e C M L i s s i m i l a r t o t h e r a n d o m c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l n e t w o r k t y p i c a l o f p r i m a r y c e l l w a l l s s e e n a f t e r e x t r a c t i o n o f h e m i c e l l u l o s e [ 2 6 0 ] . T h e t h i c k n e s s o f i n d i v i d u a l m i c r o fi b r i l s r a n g e s b e t w e e n 4 - 1 0 n m ( 5 . 8 i 1 . 3 n m ) , w h i c h i s c o m p a r a b l e t o w h a t h a s b e e n r e p o r t e d b e f o r e [ 2 6 0 ] . T h e s e fi b r i l s a r e p r o b a b l y c o a t e d w i t h a t h i c k l a y e r o f h e m i c e l l u l o s e s , i n d i c a t e d b y t h e d a r k e r s t a i n s o u t l i n i n g t h e l o n g r o d - l i k e s t r u c t u r e s . T h e l a r g e r p o r e s ( 1 0 0 - 5 0 0 n m ) h a v e b e e n c r e a t e d d u e t o t h e v o l a t i z a t i o n o f a m m o n i a f r o m l i q u i d t o g a s e o u s p h a s e d u r i n g t h e d e c o m p r e s s i o n p h a s e o f A F E X , w h i c h r e s u l t s i n c r e a t i o n o f l a r g e p o c k e t s o f e m p t y p o r o u s s p a c e s . L i g n i n s f o u n d i n t h e p r i m a r y , s e c o n d a r y w a l l , m i d d l e l a m e l l a , a n d c e l l c o m e r s a r e d i f f e r e n t i n c o m p o s i t i o n a n d u l t r a - s t r u c t u r e . T h e r e i s e v i d e n c e t h a t l i g n i fi c a t i o n i n i t i a t e s i n t h e c e l l c o m e r s a n d e v e n t u a l l y p r o c e e d s t o t h e m i d d l e l a m e l l a . T h e fi r s t t y p e o f l i g n i n s y n t h e s i z e d i s f r o m H - t y p e m o n o m e r s t h a t l e a d t o f o r m a t i o n o f c o n d e n s e d l i g n i n w i t h i n c e l l c o m e r s a n d t h e C M L , e v e n t u a l l y l e a d i n g t o l i g n i fi c a t i o n o f t h e s e c o n d a r y w a l l s t o w a r d s t h e l u m e n [ 2 7 8 , 2 7 9 ] . L i g n i n p a r t i c l e s a r e a l s o k n o w n t o h a v e a g l o b u l a r a p p e a r a n c e a n d r a n d o m d i s t r i b u t i o n i n t h e C M L , w h i l e t h e y h a v e m o r e e l o n g a t e d l a m e l l a e l i k e s t r u c t u r e i n t h e s e c o n d a r y c e l l 8 5 w a l l s w h e r e t h e o r i e n t a t i o n o f t h e c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n o r i e n t i n g l i g n i n [ 2 7 9 ] . T h e o r i e n t a t i o n a n d u l t r a - s t r u c t u r e o f l i g n i n i n t h e c e l l w a l l i s t h o u g h t t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e o n d e t e r m i n i n g w a l l e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y a s c o m p a r e d t o o v e r a l l l i g n i n c o m p o s i t i o n [ 2 8 0 ] . I t h a s a l s o b e e n s h o w n t h a t l i g n i fi e d m i d d l e l a m e l l a / p r i m a r y w a l l s a c t a s b a r r i e r s t o m i c r o b i a l a c c e s s f o r d e g r a d a t i o n o f m a i z e s t e m s [ 2 8 1 ] . E n h a n c i n g a c c e s s i b i l i t y t o g l y c o s y l h y d r o l a s e s t h r o u g h t h e m i d d l e l a m e l l a r e g i o n w o u l d h e l p i m p r o v e o v e r a l l d i g e s t i b i l i t y o f l i g n i fi e d s e c o n d a r y c e l l w a l l s . F o r c o n v e n t i o n a l A F E X ( o r R e g u l a r - A F E X ) s a m p l e s , t h e m i d d l e l a m e l l a c o l l a p s e s t y p i c a l l y a n d i s n o t a s d i s t i n c t i v e a s t h e L o w - N A F E X c e l l w a l l s ( F i g u r e 4 . A . 2 ( b ) a n d F i g u r e I I - 4 . A . 8 ) . U n l i k e t h e L o w - N A F E X c e l l w a l l s , t h e r e i s s i g n i fi c a n t l y h i g h e r d e l a m i n a t i o n w i t h i n t h e s e c o n d a r y c e l l w a l l s f o r t h e R e g u l a r - A F E X c e l l w a l l s . T h e r e i s a l s o a h e t e r o g e n e o u s l a y e r o f a m o r p h o u s l y s h a p e d d e p o s i t s ( r i c h i n l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e b a s e d o n s t a i n i n t e n s i t y a n d s u b s e q u e n t i m m u n o l a b e l i n g a n a l y s i s ) o n t h e o u t e r c e l l w a l l s u r f a c e s . T h e s e d e p o s i t s a r e 2 0 - 1 5 0 n m i n t h i c k n e s s a n d a r e d i s t r i b u t e d a c r o s s t h e o u t e r m o s t s e c o n d a r y w a l l s u r f a c e l a y e r s . T h i s h e l p s v a l i d a t e s t h e fi n d i n g s i n C h a p t e r 3 t h a t i n d i c a t e d t h a t t h e s u r f a c e o f R e g u l a r - A F E X ( R - A C S ) i s c o v e r e d i n l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e r i c h d e p o s i t s ( 1 0 - 2 0 0 n m t h i c k ) b a s e d o n t h e A F M a n d E S C A d a t a . T h e s u r f a c e d e p o s i t s m i g h t h a v e b e e n p o s s i b l y e x t r a c t e d f r o m w i t h i n t h e o u t e r s e c o n d a r y w a l l l a y e r s w h i c h m i g h t a l s o e x p l a i n t h e d e l a m i n a t i o n z o n e s t y p i c a l l y s e e n a d j a c e n t t o t h e s e a m o r p h o u s d e p o s i t s . T h e d e p o s i t s w e r e a l s o s h o w n t o b e r i c h i n c a l c i u m , i n d i c a t i n g t h a t s o m e o f t h e s e s u r f a c e d e p o s i t s m i g h t b e a r i s i n g f r o m t h e C M L , w h i c h u p o n i t s c o l l a p s e e x t r u d e d t h e r e s i d u a l e x t r a c t i v e s i n t o c e l l c o m e r s , p i t s a n d o u t e r w a l l s u r f a c e s ( S e e C M L e x t r a c t i v e s w i t h i n c e l l c o r n e r i n F i g u r e 4 . A . 2 ( b ) ) . 8 6 I m m u n e - g o l d l a b e l i n g f o r a r a b i n o x y l a n b a s e d e p i t o p e w a s c a r r i e d o u t f o r R e g u l a r - A F E X t r e a t e d c e l l w a l l s u s i n g L M - l l b a s e d r a t m o n o c l o n a l a n t i - x y l a n a n t i b o d y ( p r i m a r y a n t i b o d y ) a n d a n t i - r a t a n t i b o d y l a b e l e d w i t h g o l d p a r t i c l e s 1 5 n m i n d i a m e t e r ( s e c o n d a r y a n t i b o d y ) [ 2 8 2 ] . F i g u r e 4 . A . 5 I m m u n e - g o l d l a b e l i n g o f a r a b i n o x y l a n s e x t r a c t e d t o o u t e r c e l l w a l l s ( a , b ) o f A F E X p r e t r e a t e d ( R e g u l a r ) c o r n s t o v e r a n d w a t e r e x t r a c t ( c ) u s i n g L M - I I b a s e d a n t i - b o d y . 5 0 0 n m 3 - - ' _ L M - l l a n t i b o d y b i n d s t o b o t h s u b s t i t u t e d a r a b i n o x y l a n s a n d u n s u b s t i t u t e d h o m o x y l a n s . I m m u n o c y t o c h e m i c a l a n a l y s i s h e l p s c o n fi r m t h e i d e n t i t y o f t h e a m o r p h o u s l y s h a p e d d e p o s i t s o n t h e o u t e r w a l l s u r f a c e s . T h e i m m u n e - l a b e l i n g 8 7 e x p e r i m e n t s r e v e a l e d t h a t t h e d e n s i t y o f t h e g o l d p a r t i c l e s a r o u n d t h e a m o r p h o u s l y s h a p e d d e p o s i t s w a s r e l a t i v e l y h i g h e r ( S e e F i g u r e 4 . A . 5 ( a - b ) ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e a n t i b o d i e s w e r e a l s o f o u n d t o b e l o c a l i z e d o n t h e a m o r p h o u s l y s h a p e d s t r u c t u r e s e x t r a c t e d i n t o w a t e r f r o m t h e c e l l w a l l ( F i g u r e 4 . A . 5 ( c ) ) . T h e e x t r a c t s a r e t h o u g h t o b e r i c h i n l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e b a s e d c o m p o n e n t s . L i g n i n t y p i c a l l y s t a i n s ( w i t h K M n O 4 ) d a r k e r t h a n h e m i c e l l u l o s e , i n d i c a t i n g t h a t t h e g r e y s h a d e d e x t r a c t s a r e p r o b a b l y a b u n d a n t i n a r a b i n o x y l a n s e x t r a c t e d f r o m t h e c e l l w a l l d u r i n g A F E X . F o r H i g h - N t A F E X s a m p l e s , t h e r e i s a d i s t i n c t i v e m o d i fi c a t i o n o f t h e c e l l w a l l s t h a t r e s u l t s i n e x t e n s i v e d e l a m i n a t i o n o f s e c o n d a r y w a l l s , c o l l a p s e o f C M L a n d e x t r u s i o n o f C M L e x t r a c t i v e s t o c e l l c o r n e r s / p i t s / o u t e r w a l l s u r f a c e s , a n d f o r m a t i o n o f l a r g e p o r e s w i t h i n t h e S 3 o u t e r s e c o n d a r y w a l l r e g i o n s ( F i g u r e 4 . A . 2 ( c ) a n d F i g u r e I I - 4 . A . 9 ) . T h e l a r g e p o r e s f o r m e d w i t h i n t h e o u t e r w a l l r e g i o n a r e p r o b a b l y d u e t o v o l a t i z a t i o n o f l i q u i d a m m o n i a t o t h e g a s e o u s p h a s e a t t h e e n d o f A F E X . I n t e r e s t i n g l y , t h e s e p o r e s h a v e a n e l l i p s o i d a l s h a p e u n l i k e t h e l a r g e p o r e s s e e n w i t h i n t h e m i d d l e l a m e l l a f o r t h e L o w — N A F E X c e l l w a l l s . T h e e l l i p s o i d a l p o r e s h a v e a s e m i - m a j o r a n d s e m i - m i n o r a x e s l e n g t h s o f 1 6 2 - _ l - _ 4 7 n m a n d 7 3 j ; 2 1 n m , r e s p e c t i v e l y . T h e e c c e n t r i c i t y o f t h e e l l i p s e i s 0 . 8 8 i 0 . 0 5 u n i t s , s u g g e s t i n g a n e l o n g a t i o n a b o u t t h e m a j o r a x i s . T h e m a j o r a x i s o f t h e p o r e s w i t h i n t h e $ 3 l a y e r i s t y p i c a l l y p a r a l l e l t o t h e e d g e o f t h e o u t e r c e l l w a l l . T h i s i s s u g g e s t i v e o f t h e p a r a l l e l , l a m e l l a r o r i e n t a t i o n o f t h e c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s i n t h e o u t e r c e l l w a l l s t h a t w o u l d f o r c e t h e e x p a n s i o n o f g a s e o u s a m m o n i a p a r a l l e l t o t h e o r i e n t a t i o n o f t h e c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s [ 2 8 3 ] . A l s o , u p o n p h a s e t r a n s f e r o f l i q u i d t o t h e g a s e o u s s t a t e , t h e c e l l w a l l e x t r a c t i b l e s ( t y p i c a l l y r i c h i n h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n ) a r e d e p o s i t e d o n t h e o u t e r p e r i p h e r y o f t h e p o r e s a s s u g g e s t e d b y t h e d a r k s t a i n e d e d g e s . A n o t h e r i m p o r t a n t s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n 8 8 t h a t t a k e s p l a c e d u r i n g H i g h - N t A F E X i s o n t h e o u t e r p e r i p h e r y o f t h e s e c o n d a r y c e l l w a l l s f a c i n g t o w a r d s t h e l u m e n . D u r i n g t h e d e c o m p r e s s i o n o f t h e l i q u i d a m m o n i a , t h e p r e s s u r e d r o p s q u i t e s i g n i fi c a n t l y a fi e r A F E X w i t h i n t h e l u m e n ( t y p i c a l l y f r o m 3 - 5 M P a t o 0 . 1 M P a ) . T h i s s u d d e n d r o p i n p r e s s u r e w o u l d r e s u l t i n t h e e x p l o s i v e d e c o m p r e s s i o n o f l i q u i d a m m o n i a t o t h e g a s e o u s s t a t e , w i t h t h e p r e s s u r e d r o p b e i n g h i g h e s t a t t h e o u t e r p e r i p h e r y o f t h e c e l l w a l l . T h e s u d d e n e x p l o s i v e e x p a n s i o n o f a m m o n i a a t t h e p e r i p h e r y o f t h e w a l l c a u s e s t h e a d j a c e n t fi b r i l s t o b e b l o w n o u t w a r d s t o t h e l u m e n . T h e t h i c k n e s s o f t h e c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s e x p o s e d o n t h e o u t e r c e l l w a l l s i s a p p r o x i m a t e l y 4 . 1 i 0 . 5 n m , b a s e d o n a n a l y s i s o f t h e t o m o g r a m s c o l l e c t e d . T h e s i z e o f t h e e x p o s e d c e l l u l o s e fi b r i l c o r r e s p o n d s t o t h e e l e m e n t a r y fi b r i l s ( c o a t e d w i t h a t h i n l a y e r o f h e m i c e l l u l o s e ) t h a t a r e t h o u g h t t o e x i s t w i t h i n t h e c e l l w a l l [ 5 0 , 2 5 3 , 2 6 6 ] . T h e e l e m e n t a r y c e l l u l o s i c m i c r o fi b r i l s s e e n f o r t h e A F E X s a m p l e s s e e m t o b e a l s o c o a t e d w i t h a t h i n l a y e r o f h e m i c e l l u l o s e , a s i n d i c a t e d b y t h e g r e y s t a i n i n g o f c e r t a i n fi b r i l s . F o r L o w - T A F E X s a m p l e s , t h e r e i s n o m a j o r m o d i fi c a t i o n o f t h e c e l l w a l l s a f t e r A F E X , e x c e p t m i n i m a l d e l a m i n a t i o n t h a t i s s e e n w i t h i n s o m e o f t h e s e c o n d a r y c e l l w a l l s ( F i g u r e 4 . A . 2 ( d ) a n d F i g u r e I I - 4 . A . 1 0 ) . T h e c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a i s l a r g e l y i n t a c t a f t e r A F E X , u n l i k e w h a t w a s s e e n f o r L o w - N a n d R e g u l a r - A F E X s a m p l e s . H o w e v e r , t h e r e i s s i g n i fi c a n t d e l a m i n a t i o n t h a t i s n o t i c e a b l e f o r t h e c e l l w a l l s a f t e r A F E X , c o m p a r a b l e t o w h a t w a s s e e n f o r t h e L o w - N A F E X c e l l w a l l s . F o r L o w - W A F E X c e l l w a l l s t h e r e i s s i g n i fi c a n t m o d i fi c a t i o n t h a t i s n o t i c e a b l e a f t e r p r e t r e a t m e n t ( F i g u r e 4 . A . 2 ( e ) a n d F i g u r e I I - 4 . A . l 1 ) . T h e o u t e r s e c o n d a r y w a l l r e g i o n s s e e m t o b e d i s r u p t e d q u i t e s e v e r e l y , c a u s i n g t h e o u t e r r e g i o n o f t h e s e c o n d a r y c e l l w a l l s t o d e t a c h . T h e r e a r e a l s o d a r k s t a i n e d , g l o b u l a r l i k e s t r u c t u r e s r a n g i n g i n d i a m e t e r s 8 9 a r o u n d 1 2 8 i 2 2 n m . T h e s e g l o b u l a r l i k e s t r u c t u r e s s e e m t o b e c o m p o s e d l a r g e l y o f l i g n i n a n d / o r h e m i c e l l u l o s e b a s e d o n t h e i n t e n s i t y o f t h e K M n O 4 s t a i n i n g . I n t e r e s t i n g l y , t h e s e l i g n i n r i c h g l o b u l a r s t r u c t u r e s h a v e a n a r r o w s i z e d i s t r i b u t i o n u n l i k e w h a t h a s b e e n r e p o r t e d f o r a c i d t r e a t e d c o m s t o v e r [ 1 1 2 ] . T h e l i g n i n r i c h g l o b u l e s s e e n w i t h i n a c i d t r e a t e d c o r n s t o v e r r a n g e d i n s i z e f r o m 5 t o 1 0 , 0 0 0 n m ( m o s t a b u n d a n t d r o p l e t s r a n g i n g b e t w e e n 2 0 - 1 0 0 n m i n d i a m e t e r ) a r e c o m p o s e d e s s e n t i a l l y o f l i g n i n a n d h a v e a s m o o t h s u r f a c e t e x t u r e . H o w e v e r , f o r L o w - W A F E X c e l l w a l l s t h e l i g n i n r i c h g l o b u l e s a r e i n t e r s p e r s e d w i t h i n a g r e y s t a i n e d m a t r i x ( p o s s i b l y r i c h i n c a r b o h y d r a t e s ) a n d t y p i c a l l y h a v e a s p i k y c o a t i n g o f l i g h t l y s t a i n e d m a t e r i a l . T h e l i g h t l y s t a i n e d s t r u c t u r e s a r e p r o b a b l y c o m p o s e d o f h e m i c e l l u l o s e a n d c e l l u l o s e . I n t e r e s t i n g l y , i n s o m e i m a g e s ( F i g u r e 4 . A . 2 ( e ) ) i t i s p o s s i b l e t o s e e t h e d i s i n t e g r a t i n g s e c o n d a r y c e l l w a l l e n v e l o p i n g t h e l i g n i n r i c h d a r k g l o b u l e s . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t t h e i n t e r l a m e l l a r l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e m a t r i x p a c k e d b e t w e e n a d j a c e n t c e l l u l o s i c fi b r i l s ( t y p i c a l l y s e p a r a t e d b y 1 5 - 7 0 n m , [ 2 8 3 ] ) m a y h a v e c o a l e s c e d t o r e s u l t i n t h e f o r m a t i o n o f t h e s e g l o b u l a r l i k e s t r u c t u r e s . C l o s e i n s p e c t i o n o f t h e g l o b u l e s b y t o m o g r a p h y s u g g e s t s t h a t t h e s e s t r u c t u r e s a r e n o t h o l l o w a n d h a v e a s p i k y , l i g h t l y s t a i n e d c o a t i n g o n t h e s u r f a c e ( p o s s i b l y r i c h i n h e m i c e l l u l o s e a n d c e l l u l o s e ) . T h e C M L h a s c o l l a p s e d a n d t h e C M L e x t r a c t i v e s s e e m t o b e e x t r u d e d t o c e l l c o m e r s / p i t s / o u t e r w a l l s u r f a c e s . T h e r e i s s i g n i fi c a n t d e l a m i n a t i o n t h r o u g h o u t t h e c e l l w a l l d u e t o r e m o v a l o f m a t r i x m a t e r i a l t h a t r e s u l t s i n e x p o s u r e o f l a r g e s u r f a c e a r e a f o r e n h a n c e d e n z y m e a c c e s s i b i l i t y . I n s u m m a r y , p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y p l a y e d a n i m p o r t a n t r o l e i n d e fi n i n g t h e u l t r a - s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s t h a t r e s u l t d u r i n g A F E X . B o t h a m m o n i a l o a d i n g a n d t e m p e r a t u r e d u r i n g A F E X s e e m t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e o n t h e m o d i fi c a t i o n o f t h e c o m p o u n d 9 0 m i d d l e l a m e l l a ( C M L ) . T h e C M L w a s f o u n d t o b e l a r g e l y i n t a c t w i t h l i t t l e o r n o p o r e s b e i n g c r e a t e d f o r l o w t e m p e r a t u r e b a s e d A F E X ( L o w - T ) c o n d i t i o n s . H o w e v e r , a t h i g h e r t e m p e r a t u r e s e v e n a t l o w e r a m m o n i a l o a d i n g s t h e r e i s s i g n i fi c a n t m o d i fi c a t i o n o f t h e C M L . T h e C M L i s l a r g e l y i n t a c t a n d d i s t i n c t l y v i s i b l e ( c o n t a i n i n g l a r g e p o r e s w i t h i n i t ) d u r i n g l o w e r a m m o n i a l o a d i n g A F E X ( L o w - N ) . H o w e v e r , t h e C M L c o l l a p s e s a n d e x t r u d e s i t s c o n t e n t s i n t o c e l l c o m e r s - p i t s - o u t e r c e l l w a l l s u r f a c e s f o r a l l o t h e r A F E X c o n d i t i o n s . D e s p i t e t h e c o l l a p s e , t h e r e i s s i g n i fi c a n t p o r o s i t y ( i n d i c a t e d b y t h e l a c k o f s t a i n i n g b y b o t h K M n O 4 a n d u r a n y l a c e t a t e ) s e e n w i t h i n t h e C M L r e g i o n f o r a l l A F E X c o n d i t i o n s . O n t h e o t h e r h a n d , p r e s s u r e d r o p a c r o s s t h e l u m e n - f a c i n g s e c o n d a r y c e l l w a l l s p l a y s a c r i t i c a l r o l e i n t h e f o r m a t i o n o f l a r g e e l l i p s o i d a l s h a p e d p o r e s t h a t a r e a r e s u l t o f d e c o m p r e s s i o n o f l i q u i d a m m o n i a t o i t s g a s e o u s s t a t e a t t h e e n d o f A F E X . T h e o r i e n t a t i o n o f t h e e l l i p s o i d a l s h a p e d p o r e s s u g g e s t s t h e f o r c e d e x p a n s i o n o f g a s e o u s a m m o n i a p a r a l l e l t o t h e o r i e n t a t i o n o f t h e c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s w i t h i n t h e S 3 s e c o n d a r y c e l l w a l l s . T h e r e l a t i v e c o n c e n t r a t i o n o f a m m o n i a a n d w a t e r s e e m s t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e s o l u b i l i z a t i o n a n d c o a l e s c e n c e o f l i g n i n / h e m i c e l l u l o s e r e s i d u e s d u r i n g A F E X . L o w m o i s t u r e A F E X ( L o w - W ) t r e a t e d c e l l w a l l s ( w i t h 9 5 % c o n c e n t r a t e d a m m o n i u m h y d r o x i d e ) , a s c o m p a r e d t o a l l o t h e r A F E X c o n d i t i o n s ( r a n g i n g b e t w e e n 4 5 - 8 3 % c o n c e n t r a t e d a m m o n i u m h y d r o x i d e ) , r e s u l t s i n t h e c o a l e s c e n c e o n i n t e r - l a m e l l a r l i g n i n f r o m t h e o u t e r m o s t s e c o n d a r y c e l l w a l l s i n t o l i g n i n r i c h g l o b u l e s e n c l o s e d w i t h i n a p o l y s a c c h a r i d e r i c h m a t r i x ( a s i n d i c a t e d b y t h e r e l a t i v e i n t e n s i t y o f t h e s t a i n ) . T h e r e i s s i g n i fi c a n t d e l a m i n a t i o n i n t h e s e c o n d a r y c e l l w a l l s , d e p e n d i n g o n t h e s e v e r i t y o f p r e t r e a t m e n t . I n o r d e r t o q u a n t i f y t h e p o r o s i t y t h a t i s c r e a t e d w i t h i n t h e c e l l w a l l d u r i n g A F E X , t h e 3 D - E M - t o m o g r a m s w e r e a n a l y z e d u s i n g I M O D i m a g e a n a l y s i s s o f t w a r e . 9 1 4 . 1 . 4 . 2 Q u a n t i f y i n g p o r o s i t y w i t h i n c e l l w a l l s t h r o u g h 3 D - t o m o g r a m a n a l y s i s T h e t o m o g r a m d a t a s e t s f o r A F E X c e l l w a l l s a m p l e s w e r e c r e a t e d f r o m t h e t i l t - s e r i e s T E M i m a g e s b a s e d o n t h e R - w e i g h t e d b a c k p r o j e c t i o n a l g o r i t h m a n d t h e n a n a l y z e d b y I M O D [ 2 7 1 , 2 7 2 ] . T h e t o t a l t h i c k n e s s o f a l l t o m o g r a m s r a n g e d b e t w e e n 1 5 0 - 2 5 0 n m . R e p r e s e n t a t i v e t o m o g r a m s l i c e s ( 1 0 n m t h i c k n e s s ) o f t h e v a r i o u s s e v e r i t y A F E X t r e a t e d c e l l w a l l s a r e s h o w n i n F i g u r e 4 . A . 3 . F o r e a c h t o m o g r a m , a r e a s w i t h i n t h e c e l l w a l l c o n t a i n i n g p o r o u s s p a c e s ( i n d i c a t e d b y s p a c e s n o t s t a i n e d ) w e r e m o d e l e d b y e n c l o s i n g t h e e m p t y s p a c e s u s i n g i s o - s u r f a c e m e s h c o n t o u r s b a s e d o n t h e o p t i m u m t h r e s h o l d v a l u e ( r a n g i n g b e t w e e n 1 3 0 - 1 7 0 ) u s i n g I M O D ( S e e F i g u r e 4 . A . 4 ) . T h e t o m o g r a m d a t a s e t w a s o p e n e d w i t h o u t b i n n i n g t h e v o x e l s i n t e n s i t y ; h o w e v e r , t o g e n e r a t e t h e i s o - s u r f a c e s t h e i m a g e b i n a n d s m o o t h v a l u e s w e r e s e t b e t w e e n 3 - 4 a n d 1 0 - 1 5 , r e s p e c t i v e l y . T h e b o x e s e n c l o s i n g t h e i s o — s u r f a c e s t y p i c a l l y r a n g e d b e t w e e n x - y d i m e n s i o n s b e t w e e n 1 0 0 - 5 0 0 n m , w h i l e t h e z - s c a l e t h i c k n e s s w a s t y p i c a l l y 8 0 - 1 5 0 n m . E a c h p i x e l i s 1 . 0 8 6 6 9 n m w i d e i n t h e x - y p l a n e , w h i l e i t w a s a s s u m e d t o b e 1 n m i n t h e z - p l a n e ( w i t h i n t h e d e p t h o f t h e s a m p l e t o m o g r a m , a s s u m i n g n o b e a m - i n d u c e d s p e c i m e n t h i n n i n g [ 2 7 1 ] ) . Q u a n t i t a t i v e r e s u l t s ( i . e . s u r f a c e a r e a s o f i s o - s u r f a c e s c o v e r i n g p o r o u s r e g i o n s w i t h i n a d e fi n e d v o l u m e o f t h e c e l l w a l l ) w e r e t h e n o b t a i n e d f r o m t h e I M O D m o d e l ( S e e T a b l e 4 . A . 2 ) . T h e t o t a l p o r o s i t y w i t h i n t h e c e l l w a l l w a s e s t i m a t e d b y c o m p u t i n g t h e f r a c t i o n a l s u r f a c e a r e a t o v o l u m e c o n t r i b u t e d b y e a c h r e g i o n w i t h i n t h e c e l l w a l l t o m o g r a m . T h e r e l a t i v e f r a c t i o n a l t h i c k n e s s o f t h e v a r i o u s r e g i o n s w i t h i n t h e c e l l w a l l ( i . e . C M L , S 1 , 8 2 , S 3 , S l / S 2 / S 3 d e l a m i n a t i o n z o n e s ) w a s c a l c u l a t e d b a s e d o n t h e s i z e o f t h e c o n g r u o u s p o r o u s r e g i o n s . 9 2 f d o n s a m s a l r l g a w 0 l m y o o l V 3 r 2 a a 0 0 t / t - A o d - n t E S - E D o 3 c - , 9 5 l 6 2 F e P a . . M t 4 2 S E o T : T 3 n S i / h 2 l a t o l t t S o i / w I N S s A , P P 1 8 / 5 3 9 7 1 n , o l S F l P i g a w % e r y s r u a o m l o * 0 0 1 r o p i l r a V P t / A o g : S t n P i l L U s , a . w o a n y l o l t c i i l n t e r I = e m e a v c F l e P a h s r s F e e l X m d E d F e ) i 2 5 2 2 2 4 4 2 2 3 c 0 0 0 0 0 l 0 0 0 0 0 M A m a o - - - - - - - - - — n f B E E E E h E E E E A A E V / r : c 6 3 8 4 7 1 2 0 0 4 u M a / A 1 N N 7 8 2 2 8 8 3 5 1 3 s e ( o S . . . . . . . . . . ; P 1 f 2 3 2 4 3 5 5 3 2 s i e o r r e o h n o i f W t s p s l o . i s a i r s t e t c l n o a s k t l a r L 9 4 e 0 c 3 4 1 2 2 w 5 8 5 8 d / 1 1 1 i 3 3 2 2 2 ) L l h l r l t m o o e 0 V ( c f 0 1 % 1 r e e . A v m r . o u 4 r t s e l o l v n b e v o e v o t r a s o ) s t t e o T n s s c m e n n n 3 5 r 0 5 0 0 0 0 0 0 5 0 ) r 2 0 0 6 3 6 6 o 2 7 7 2 2 d k e ( A 1 1 o 2 c 7 3 2 6 6 4 5 8 8 e c S S t c i L ( a e . h s T X a r e e E t n r o a z y t e n i r n c o F A N X E F A r m m m m a e o a a a a a i l v i - f t e r s a t a P P u l l l l w 1 1 e e 3 e 3 e 2 2 + + g u n o S $ 8 S 8 S d d d d e S M M c X i E m o I I 2 2 L R 2 L S S S $ ) ) 1 2 ( ( a . F l A . A e D 4 g n : e i m l y a b r l a a e T v d 9 3 2 . 3 7 E — 0 3 4 . 4 0 E - 0 4 l . 7 8 E — 0 3 6 . 0 1 E — 0 5 2 . 5 0 E - 0 5 9 . 8 3 E — 0 6 3 . 7 6 E - 0 3 0 . 0 0 E + 0 0 5 . 4 1 E - 0 3 0 . 0 0 E + 0 0 8 . 3 3 E - 0 3 5 . 0 4 E - O 3 2 4 3 7 2 2 l o V l 2 a 0 / t A o S t , - E 4 l 9 F a . P t 4 o T l a t o l t o , V F / P 4 A 1 / 0 S % F P ' " 0 0 1 l o l a N t o A 0 0 0 t 3 3 3 2 2 2 S 0 0 0 L 0 0 0 0 0 0 / + + + - — - - - - l L a k n a P o i t E E E E E E E E E 9 2 0 0 0 2 4 6 3 7 4 0 6 0 0 5 1 0 . . . . . . . . . = 1 2 2 2 2 7 0 0 0 c F a r F P l 0 0 0 o — - - 2 2 2 V / A S s s e n k E E E 5 5 5 7 3 7 . . . 4 4 5 c 5 8 7 6 i h t % r e v o t s n 4 3 4 1 r e v o t s r 0 0 0 0 0 0 0 0 0 n o 7 2 2 5 3 8 7 2 0 r 0 7 o c 1 2 4 2 3 7 9 1 1 c X E F A t . . N n m m o a a X E F A W n n o o . d i t t n a - h g P P g g l l l e e 3 w 2 e e + + S S d d 8 o r r - i i o i c M M o ] 2 ] 2 H L L S $ S 8 ) ) 3 4 ( ( C 2 . A . 4 e l b a T T h i c k n e s s L ( n r n ) 1 0 0 * U L t o t a l P ( l / n m ) 9 4 1 1 2 7 4 . 7 9 E - 0 2 N A N A N A 5 . 8 2 E - 0 2 3 . 1 6 E - 0 2 O O 7 2 1 5 4 4 4 1 1 . 9 6 E - 0 2 . . . . 2 T h e r a t i o o f t h e s u r f a c e a r e a o f i s o - s u r f a c e s e n c l o s m g t h e p o r o u s r e g i o n s ( a s n m ) t o t h e v o l u m e o f t h e r e g i o n e n c l o s i n g a d e fi n e d s p a c e w i t h i n t h e c e l l w a l l ( a s m 3 ) i s s h o w n i n T a b l e 4 . A . 2 . F o r L o w - N t r e a t e d c e l l w a l l s , t h e l a r g e s t c o n t r i b u t i o n s t o w a r d s t h e o v e r a l l p o r o s i t y s e e m t o f r o m t h e C M L ( 5 1 % ) a n d d e l a m i n a t i o n z o n e ( 3 8 % ) w i t h i n t h e S 1 r e g i o n . H o w e v e r , w i t h i n c r e a s i n g A F E X s e v e r i t y ( i . e . R e g u l a r , H i g h - N t , L o w - W ) t h e l a r g e s t c o n t r i b u t i o n t o o v e r a l l p o r o s i t y s e e m s t o s h i f t t o w a r d s t h e o u t e r s e c o n d a r y c e l l w a l l r e g i o n s w i t h t h r e e - f o l d l e s s e r c o n t r i b u t i o n f r o m t h e C M L r e g i o n ( 1 4 - 1 7 % v s . 5 1 % ) . A s s u m i n g t h e d e n s i t y o f t h e c e l l w a l l t o b e u n i t y ( i . e . 1 g r a m o f c e l l w a l l o c c u p i e s 1 c m 3 v o l u m e ) , t h e s u r f a c e a r e a o f t h e p o r o u s r e g i o n s p e r g r a m o f b i o m a s s c a n b e e a s i l y c o m p u t e d . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t L o w - N , R e g u l a r , H i g h - N t a n d L o w - W A F E X t r e a t e d c e l l w a l l s g a v e a t o t a l p o r o s i t y o f 4 . 6 9 , 2 2 . 5 , 1 9 . 6 a n d 4 9 . 4 m Z / g r a m o f c e l l w a l l . U n t r e a t e d c o r n s t o v e r h a s n o d i s c e r n i b l e p o r e s w i t h i n t h e t o m o g r a m u n l i k e A F E X t r e a t e d c e l l w a l l s . H o w e v e r , i t w a s p o s s i b l e t o e s t i m a t e t h e p o r o s i t y w i t h i n t h e S 3 r e g i o n o f t h e L o w - N t r e a t e d c e l l w a l l s w h e r e t h e r e w e r e n o d i s c e r n i b l e p o r e s . T h e p o r o s i t y ( a s m 2 / g m ) f o r t h e s e n o n - p o r o u s r e g i o n s r a n g e s b e t w e e n 0 0 0 1 - 0 1 m z / g m . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e p o r o s i t y o f u n t r e a t e d c e l l w a l l s w o u l d b e e q u a l t o o r l e s s e r t h a n 0 . 0 0 1 - 0 . 1 m z / g m . P o r o s i t i e s t y p i c a l l y o b t a i n e d f o r p l a n t c e l l w a l l s w i t h a n d w i t h o u t t h e r m o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t s b a s e d o n s i z e e x c l u s i o n b a s e d m e t h o d s r a n g e b e t w e e n 2 0 - 1 0 0 m Z / g m [ 1 0 9 , 2 8 4 ] . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e p o r o s i t y e s t i m a t e s b a s e d o n t h e a n a l y s i s o f t h e p o r o u s r e g i o n s w i t h i n t h e t o m o g r a m s i s r e a s o n a b l y c o m p a r a b l e t o o t h e r c h a r a c t e r i z a t i o n m e t h o d s . N i t r o g e n b a s e d p h y s i s o r p t i o n i s a n o t h e r t e c h n i q u e t h a t w a s u s e d t o e s t i m a t e 9 5 s u r f a c e a r e a ( B E T s u r f a c e a r e a ) o f c e l l w a l l s . H o w e v e r , t h e m e t h o d s u f f e r s f r o m s e v e r a l i s s u e s , m o s t n o t a b l y d u e t o t h e c o l l a p s e o f t h e p o r e s d u r i n g s a m p l e d r y i n g b e f o r e t h e a n a l y s i s . S e c o n d l y , s i n c e N 2 m o l e c u l e i s 3 0 0 0 - 4 0 0 0 t i m e s s m a l l e r t h a n t y p i c a l c e l l u l a s e s , t h e B E T m e t h o d e s t i m a t e s t y p i c a l l y s u r f a c e a r e a t h a t i s i n a c c e s s i b l e t o e n z y m e s . L a s t l y , t h e r e i s a s u b s t a n t i a l d i f f e r e n c e i n t h e m e a s u r e m e n t s b a s e d o n t h e a d s o r p t i o n v e r s u s d e s o r p t i o n i s o t h e r m s . T y p i c a l l y , s p e c i fi c s u r f a c e a r e a m e a s u r e m e n t s h a v e b e e n r e p o r t e d t o b e 1 0 - 2 0 t i m e s l o w e r t h a n s o l u t e e x c l u s i o n b a s e d m e t h o d s [ 2 8 4 ] . A n a l y s i s o f m i l l e d u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ( U C S ) , R e g u l a r - A F E X c o r n s t o v e r a n d H i g h - N t A F E X c o r n s t o v e r b y n i t r o g e n p h y s i s o r p t i o n r e v e a l e d t h a t t h e B E T s u r f a c e a r e a s f o r a l l t h r e e s a m p l e s r a n g e d b e t w e e n 1 . 5 - 2 m z / g m . T h e B J H ( B a r r e t - J o y n e r - H a l e n d a ) a d s o r p t i o n b a s e d c u m u l a t i v e p o r e v o l u m e ( f o r p o r e s i z e s r a n g i n g b e t w e e n 2 - 3 0 0 n m ) f o r t h e t h r e e s a m p l e s ( U C S , R e g u l a r , H i g h - N t ) w e r e 0 . 0 0 5 1 3 3 , 0 . 0 0 5 2 3 7 a n d 0 . 0 0 7 0 4 c m 3 / g m , r e s p e c t i v e l y . W h i l e , t h e B J H d e s o r p t i o n b a s e d c u m u l a t i v e p o r e v o l u m e ( f o r p o r e s i z e s r a n g i n g b e t w e e n 2 - 3 0 0 n m ) f o r t h e t h r e e s a m p l e s ( U C S , R e g u l a r , H i g h - N t ) w e r e 0 . 0 0 7 4 , 0 . 0 1 1 6 3 3 a n d 0 . 0 1 0 3 8 ] c m 3 / g m , r e s p e c t i v e l y . T h e s e r e s u l t s w o u l d s u g g e s t t h a t c h a r a c t e r i z i n g p o r o s i t y w i t h i n a m m o n i a t r e a t e d c e l l w a l l s t h r o u g h n i t r o g e n a d s o r p t i o n w o u l d n o t b e a n i d e a l t e c h n i q u e . E n z y m a t i c h y d r o l y s i s y i e l d s a f t e r 2 4 h o u r s f o r v a r i o u s s u b s t r a t e s u s i n g c o m m e r c i a l e n z y m e m i x t u r e s ( 1 5 F P U / g m g l u c a n o f S p e z y m e C P , s u p p l e m e n t e d b y 6 4 p - N P G U / g g l u c a n o f N o v o z y m e 1 8 8 ) a r e s h o w n i n F i g u r e 4 . A . 6 . I n t e r e s t i n g l y , t h e r e i s a s t r o n g c o r r e l a t i o n ( R 2 = 0 . 9 7 ) b e t w e e n t h e 2 4 h o u r h y d r o l y s i s y i e l d a n d t h e i n i t i a l r a t e o f h y d r o l y s i s ( b a s e d o n h y d r o l y s i s y i e l d w i t h i n 1 - 6 h r s ; d a t a n o t s h o w n ) . T h e o v e r a l l 9 6 v a r i a n c e i n t h e h y d r o l y s i s y i e l d f o r t h e v a r i o u s s a m p l e s s e e m s t o h a v e s o m e c o r r e l a t i o n t o t h e t o m o g r a m p r e d i c t e d p o r o s i t y . T h e r e i s o b s e r v e d a l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n e l u t i o n v o l u m e a n d l o g a r i t h m o f t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e g l o b u l a r p r o t e i n , i n d i c a t i n g a r e t a r d a t i o n c a u s e d m a i n l y b y a m o l e c u l a r s i e v e a c t i o n d u r i n g g e l fi l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y [ 2 8 5 ] . A n a n a l o g o u s e f f e c t i s l i k e l y t o t a k e p l a c e d u r i n g e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f p o r o u s p l a n t c e l l w a l l s b y g l y c o s y l h y d r o l a s e s , i n d i c a t i n g t h a t t h e r e m i g h t a l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n h y d r o l y s i s r a t e a n d l o g a r i t h m o f t h e p o r e s i z e d i s t r i b u t i o n o f t h e c e l l w a l l [ 2 2 , 2 8 6 ] . F i g u r e 4 . A . 6 2 4 h o u r g l u c a n ( g r e y b a r s ) a n d x y l a n ( w h i t e b a r s ) d i g e s t i b i l i t y , a s p e r c e n t c o n v e r s i o n , f o r v a r y i n g A F E X s e v e r i t y t r e a t e d c o r n s t o v e r . E n z y m e l o a d i n g w a s 1 5 F P U / g g l u c a n ( S p e z y m e C P ) a n d 6 4 p - N P G U ( N o v o z y m e 1 8 8 ) i n 1 5 m l r e a c t i o n v o l u m e f o r q u a d r u p l i c a t e s . S e e T a b l e 4 . A . 1 f o r d e s c r i p t i o n o f e a c h A F E X s e v e r i t y . 9 0 - . , . . . . . . . . . . . 8 0 - 7 0 " 6 0 - 5 0 — I 4 o 3 0 — 2 0 — 1 0 1 1 0 _ . . U n t r e a t e d ' L o w - T L o w - N . L o w - W ‘ R e g u l a r . H i g h - N F I n o t h e r w o r d s , t h e r a t e a t w h i c h a p r o t e i n d i f f u s e s t h r o u g h t h e c e l l w a l l ( a n d e v e n t u a l l y h y d r o l y z e s a c c e s s i b l e p o l y s a c c h a r i d e s ) i s r e l a t e d t o t h e p r o p o r t i o n o f f r e e l y ‘ d i f f u s i b l e s p a c e a v a i l a b l e . I n d e e d , t h e r e i s s t r o n g c o r r e l a t i o n ( R 2 = 0 . 9 1 ) b e t w e e n t h e h y d r o l y s i s r a t e a n d t h e l o g a r i t h m o f p o r o s i t y ( b a s e d o n P F , t o t a l ) f o r u n t r e a t e d ( a s s u m i n g 9 7 p o r o s i t y = 0 . 0 1 m Z / g m ) a n d v a r y i n g s e v e r i t y A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r s a m p l e s . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t p o r o s i t y p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e o n e n h a n c i n g t h e o v e r a l l d i g e s t i b i l i t y o f p l a n t c e l l w a l l s , t h o u g h i t i s o n e a m o n g o t h e r i m p o r t a n t f a c t o r s t h a t e f f e c t e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y ( e . g . e x t e n t o f c l e a v a g e o f l i g n i n — c a r b o h y d r a t e l i n k a g e s , c e l l u l o s e D P ) . 4 . 1 . 5 C o n c l u s i o n s H i g h - r e s o l u t i o n T E M i m a g i n g a l l o w e d d e t e r m i n a t i o n o f u l t r a s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s w i t h i n t h e p l a n t c e l l w a l l d u e t o A F E X . T h e v a r y i n g p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y h a d v e r y d i s t i n c t e f f e c t s o n t h e o v e r a l l m o d i fi c a t i o n s w i t h i n t h e w a l l ; ( a ) F o r m a t i o n o f l a r g e , p o r e s w i t h i n t h e c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M L ) , ( b ) F o r m a t i o n o f e l l i p s o i d a l s h a p e d p o r e s i n t h e l u m e n f a c i n g s e c o n d a r y c e l l w a l l s , ( c ) C o a l e s c e n c e o f l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e f r o m t h e o u t e r m o s t s e c o n d a r y c e l l w a l l s , a n d ( d ) D e l a m i n a t i o n w i t h i n s e c o n d a r y c e l l w a l l s . T h e p o r o s i t y w i t h i n t h e c e l l w a l l i s b e i n g c r e a t e d d u e t o d i s s o l u t i o n a n d e x t r a c t i o n ( p o s s i b l y a f t e r h y d r o l y s i s o f c e r t a i n l i g n i n - c a r b o h y d r a t e c o m p l e x l i n k a g e s ) o f l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e f r o m i n t e r - l a m e l l a r s p a c e s ( b e t w e e n c e l l u l o s e fi b r i l s ) t o c e l l c o m e r s - p i t s - o u t e r w a l l s u r f a c e s . T h e f o r m a t i o n o f p o r e s w i t h i n t h e m i d d l e l a m e l l a s e e m s t o b e a c r i t i c a l s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n w i t h i n t h e c e l l w a l l t h a t i s r e s p o n s i b l e f o r t h e e n h a n c e d d i g e s t i o n c o m p a r e d t o u n t r e a t e d w a l l s . T h e d e p o s i t i o n o f h e m i c e l l u l o s e r i c h a m o r p h o u s l y s h a p e d d e p o s i t s o n t h e o u t e r c e l l w a l l s a f t e r R e g u l a r - A F E X w a s c o n fi r m e d b y a n t i - x y l a n i m m u n o - l a b e l i n g . T h e m o r p h o l o g y o f t h e p o r e s w a s c h a r a c t e r i z e d b y c o n s t r u c t i n g 3 D - E M - t o m o g r a m s o f t h e c e l l w a l l s , w h i c h r e v e a l e d t h e c o m p l e x n e t w o r k o f p o r o u s t u n n e l s f o r m e d d u r i n g A F E X . T h e p o r o s i t y w a s q u a n t i fi e d b y m o d e l i n g i s o — s u r f a c e s e n c l o s i n g . . . - 1 2 t h e p o r o u s r e g l o n s i n o r d e r t o c o m p u t e s u r f a c e a r e a t o v o l u m e r a t i o ( a s n m o r m / g m ) . T h e d i f f e r e n c e i n p o r o s i t y f o r t h e l o w e s t a n d h i g h e s t s e v e r i t y p r e t r e a t m e n t r a n g e d 9 8 b e t w e e n 5 - 1 0 f o l d . I n t e r e s t i n g l y , t h e r e w a s a s t r o n g l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e p o r o s i t y ( l o g s c a l e ) o f t h e c e l l w a l l a n d t h e e x t e n t o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . T h e s e s t u d i e s s u g g e s t e d t h a t p o r o s i t y w a s a n i m p o r t a n t d e t e r m i n a n t o f t h e e x t e n t o f h y d r o l y s i s o f t h e c e l l w a l l . H o w e v e r , t h e r o l e o f o t h e r f a c t o r s s u c h a s c e l l u l o s e c r y s t a l l i n i t y , e x t e n t o f a m m o n o l y s i s o f l i g n i n - c a r b o h y d r a t e l i n k a g e s , e n z y m e i n h i b i t i o n ( b y p r e t r e a t m e n t i n d u c e d c e l l w a l l d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ) a n d e n z y m e s y n e r g y o n t h e e n z y m a t i c d i g e s t i o n o f a m m o n i a t r e a t e d c e l l w a l l s i s n o t e n t i r e l y c l e a r . 9 9 4 . 2 M o d i fi c a t i o n o f n a t i v e c e l l u l o s e c r y s t a l s t r u c t u r e b y a m m o n i a b a s e d t r e a t m e n t s 4 . 2 . 1 A b s t r a c t T h e e f f e c t o f c e l l u l o s e c r y s t a l s t r u c t u r e o n e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y b y g l y c o s y l h y d r o l a s e s w a s e x p l o r e d u s i n g v a r i o u s c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s ( A v i c e l , C o t t o n L i n t e r s , C o t t o n ) . N a t i v e c e l l u l o s e I w a s t r a n s f o r m e d t o c e l l u l o s e I I I a n d c e l l u l o s e 1 1 b y t r e a t i n g t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s w i t h a n h y d r o u s l i q u i d a m m o n i a a n d s o d i u m h y d r o x i d e , r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , t h e r e w a s n o c e l l u l o s e p o l y m o r p h m o d i fi c a t i o n u p o n t r e a t m e n t w i t h 2 8 - 3 0 % a m m o n i u m h y d r o x i d e ( a t 4 ° C , 1 h o u r r e a c t i o n t i m e ) . T h e e f f e c t o f c o n v e n t i o n a l A F E X p a r a m e t e r s ( a m m o n i a / w a t e r l o a d i n g , r e s i d e n c e t i m e , t e m p e r a t u r e ) o n t h e c o n v e r s i o n o f c e l l u l o s e I t o I I I w a s s t u d i e d f o r a v i c e l . T h e e x t e n t o f c o n v e r s i o n o f c e l l u l o s e I t o i t s v a r i o u s o t h e r p o l y m o r p h s t a t e s w a s q u a n t i fi e d u s i n g X - r a y d i f f r a c t i o n ( X R D ) a n d R a m a n s p e c t r o s c o p y . I t w a s f o u n d t h a t c e l l u l o s e I t o 1 1 1 f o r m a t i o n f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h a n h y d r o u s l i q u i d a m m o n i a w a s l a r g e l y i n d e p e n d e n t o f t e m p e r a t u r e . H o w e v e r , t h e e x t e n t o f c o n v e r s i o n t o c e l l u l o s e 1 1 1 d u r i n g A F E X w a s i n v e r s e l y r e l a t e d t o t h e w a t e r l o a d i n g a n d d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e a m m o n i a l o a d i n g . N o s i g n i fi c a n t a m o u n t o f c e l l u l o s e I I I w a s f o r m e d d u r i n g c o n v e n t i o n a l A F E X p r e t r e a t m e n t ( 1 : 1 a m m o n i a l o a d i n g , 0 6 : ] w a t e r l o a d i n g , 3 0 m i n , 1 3 0 ° C ) . T h e e x t e n t o f c o n v e r s i o n o f c e l l u l o s e I t o 1 1 1 i n d e p e n d e n t l y m e a s u r e d t h r o u g h X R D a n d R a m a n s p e c t r o s c o p y s h o w e d a s t r o n g l i n e a r c o r r e l a t i o n ( R 2 = 0 . 9 8 ) . T h e a m o u n t o f c e l l u l o s e 1 1 1 f o r m e d d u r i n g a n h y d r o u s a m m o n i a t r e a t m e n t o f A v i c e l w a s c l o s e l y d e p e n d e n t o n t h e A F E X c o n d i t i o n s , w h i l e i t s e e m e d t o b e l a r g e l y i n d e p e n d e n t o f t h e c e l l u l o s e d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n ( D P ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e r a t e o f e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f c e l l u l o s e I I I w a s f o u n d t o b e a t l e a s t 2 - f o l d g r e a t e r t h a n n a t i v e c e l l u l o s e I ( 1 . 5 F P U c e l l u l a s e / g g l u c a n e n z y m e l o a d i n g ) . T h e e x t e n t o f i m p r o v e m e n t i n e n z y m a t i c 1 0 0 h y d r o l y s i s y i e l d w a s s l i g h t l y g r e a t e r f o r h i g h e r D P c e l l u l o s e ( C o t t o n v s . A v i c e l ) , b u t t h e o v e r a l l h y d r o l y s i s y i e l d w a s h i g h e r f o r t h e l o w e r D P s u b s t r a t e s . 4 . 2 . 2 B a c k g r o u n d T h e r e a r e s i x d i f f e r e n t r e p o r t e d a l l o m o r p h s o f c e l l u l o s e t h a t c a n b e i n t e r c o n v e r t e d b e t w e e n c e r t a i n s t a t e s ( I , I I , 1 1 1 1 , 1 1 1 1 1 , I V I a n d I V I I ) [ 2 8 7 , 2 8 8 ] . C e l l u l o s e I a a n d 1 1 3 a r e c o m m o n l y f o u n d p o l y m o r p h i c f o r m s o f c e l l u l o s e i n n a t u r e , w i t h t h e l a t t e r d o m i n a n t i n h i g h e r p l a n t s [ 1 4 , 2 8 9 ] . C e l l u l o s e I 0 L i s t h o u g h t t o b e l e s s s t a b l e t h a n 1 3 , a s i t c a n i r r e v e r s i b l y b e c o n v e r t e d i n t o t h e l a t t e r d u r i n g h y d r o t h e r m a l p r e t r e a t m e n t [ 2 9 0 ] . T r e a t m e n t o f n a t i v e c e l l u l o s e I w i t h a s u i t a b l e s o l v e n t c a n m o d i f y i t s c r y s t a l s t r u c t u r e . C e l l u l o s e I c a n b e c o n v e r t e d i r r e v e r s i b l y i n t o c e l l u l o s e I I d u r i n g c a u s t i c m e r c e r i z a t i o n d u e t o l o s s o f i n t e r - g l u c o s y l r e s i d u e h y d r o g e n b o n d s a n d f o r m a t i o n o f n e w i n t e r - s h e e t h y d r o g e n b o n d s [ 2 9 1 , 2 9 2 ] . L i q u i d a m m o n i a t r e a t m e n t i s a l s o k n o w n t o m o d i f y t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f c e l l u l o s e I t o c e l l u l o s e I - a m m o n i a c o m p l e x b y a c c o m m o d a t i n g a m m o n i a m o l e c u l e s ( w h i c h h a s a h i g h h y d r o g e n b o n d i n g p o t e n t i a l ) b e t w e e n h y d r o g e n b o n d e d s h e e t s t h a t c a u s e a s l i p i n t h e c e l l u l o s e s h e e t s [ 2 8 8 , 2 9 3 - 2 9 6 ] . U p o n e v a p o r a t i o n o f a m m o n i a m o l e c u l e s f r o m t h e i n t e r m e d i a t e c o m p l e x , t h e r e i s r e l a t i v e l y s m a l l s l i p p a g e o f t h e h y d r o g e n b o n d e d s h e e t s i n c o m b i n a t i o n w i t h a s m a l l c h a n g e i n c h a i n r o t a t i o n t h a t fi n a l l y r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I I I ; [ 2 9 5 ] . F i b e r d i f f r a c t i o n s t u d i e s h a v e p r o v i d e d c r y s t a l l o g r a p h i c d a t a f o r c e l l u l o s e I - a m m o n i a c o m p l e x a n d c e l l u l o s e I I I I r e v e a l i n g l a t t i c e u n i t c e l l s t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n [ 2 9 3 , 2 9 5 ] . T h e s e s t u d i e s r e v e a l t h a t t h e u n i t c e l l d i m e n s i o n s o f c e l l u l o s e I a n d 1 1 1 1 r e s u l t i n d i s t i n c t h y d r o g e n b o n d i n g a n d v a n d e r W a a l s i n t e r a c t i o n s t h a t c a u s e t h e l a t t e r t o h a v e a l o w e r p a c k i n g d e n s i t y ( 1 . 5 7 v s . 1 . 6 3 , 1 0 1 r e s p e c t i v e l y ) . T h e r e i s a n e x t e n d e d z i g — z a g h y d r o g e n b o n d i n g n e t w o r k f o r c h a i n s w i t h i n a s h e e t o f c e l l u l o s e I I I ] t h a t r e d u c e s t h e d i s t a n c e b e t w e e n n e i g h b o r i n g c h a i n s ( 0 . 8 2 t o 0 . 7 8 5 n m ) , w h i l e i n c r e a s i n g t h e i n t e r s h e e t s e p a r a t i o n ( 0 . 3 8 7 t o 0 . 4 2 9 n m ) a s c o m p a r e d t o c e l l u l o s e I . T h i s f u n d a m e n t a l d i f f e r e n c e i n c h a i n p a c k i n g i s r e s p o n s i b l e f o r t h e l a c k o f i n t e r s h e e t h y d r o g e n b o n d i n g f o r c e l l u l o s e 1 1 1 1 c o m p a r e d t o c e l l u l o s e 1 . M o l e c u l a r d y n a m i c s i m u l a t i o n s o f c e l l u l o s e I I I c r y s t a l s h a v e a l s o h e l p e d fi n t h e r v a l i d a t e t h e c r y s t a l l o g r a p h i c m o d e l d a t a [ 2 9 7 ] . T h i s d i f f e r e n c e i n c h a i n p a c k i n g m i g h t b e r e s p o n s i b l e f o r t h e r e m a r k a b l e i n c r e a s e i n h y d r o l y s i s r a t e o f c e l l u l o s e 1 1 1 v s . I [ 2 9 2 , 2 9 8 ] . C e l l u l o s e c r y s t a l s t r u c t u r e i s k n o w n t o i n fl u e n c e c e l l u l a s e a c c e s s i b i l i t y a n d s p e c i fi c a c t i v i t y [ 2 1 1 , 2 9 2 , 2 9 8 - 3 0 1 ] . T h e r e h a v e b e e n f e w s t u d i e s t h a t a l s o s h o w n t h a t a c t i v a t i o n o f c e l l u l o s e w i t h l i q u i d a m m o n i a r e s u l t s i n e n h a n c i n g t h e r a t e o f c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s o f t h e h y d r o x y g r o u p s ( e . g . s i l y l a t i o n , x a n t h o g e n a t i o n , c a r b o x y m e t h y l a t i o n , c y a n o e t h y l a t i o n ) [ 3 0 2 — 3 0 4 ] . I t h a s b e e n s h o w n t h a t t h e s p e c i fi c a c t i v i t y o f c e l l o b i o h y d r o l a s e I ( C B H I ) i s s e v e r a l f o l d h i g h e r o n c e l l u l o s e 1 1 1 t h a n c e l l u l o s e I a ( C l a d o p h o r a b a s e d c e l l u l o s e ) [ 2 9 8 ] . C o n v e r s i o n o f C e l l u l o s e I a ( i s o l a t e d f r o m C l a d o p h o r a a l g a e ) t o c e l l u l o s e I I I b y s u p e r c r i t i c a l a m m o n i u m t r e a t m e n t h a s b e e n r e p o r t e d r e c e n t l y [ 2 9 5 ] . H o w e v e r , t h e r e h a v e b e e n n o s t u d i e s d o n e u s i n g p l a n t c e l l w a l l d e r i v e d c e l l u l o s e ( t h a t h a s a s m a l l e r c r y s t a l s i z e c o m p a r e d t o a l g a l c e l l u l o s e ; 3 - 5 n m v s . 2 0 - 3 5 n m , r e s p e c t i v e l y ) t o s t u a y t h e e f f e c t o f c e l l u l o s e I I I f o r m a t i o n o n c e l l u l a s e a c t i v i t y . C e l l u l o s e I I I i s k n o w n t o r e v e r t b a c k t o 1 1 3 b y h e a t i n g a t h i g h t e m p e r a t u r e s i n a i r o r b o i l i n g i n w a t e r [ 1 6 3 , 2 9 6 ] . H o w e v e r , t h e e f f e c t o f A F E X ( s u b - c r i t i c a l c o n d i t i o n s w i t h 1 0 2 l i q u i d a m m o n i a a n d w a t e r ) p r e t r e a t m e n t o n t h e c o n v e r s i o n o f c e l l u l o s e 1 3 ( m a j o r f o r m i n h i g h e r p l a n t s ) t o c e l l u l o s e I I I h a s n e v e r b e f o r e b e e n d e t e r m i n e d . I n p a r t i c u l a r , t h e e f f e c t o f A F E X p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y o n t h e e x t e n t o f c o n v e r s i o n i s o f p r a c t i c a l i m p o r t a n c e a s i t p r o b a b l y i n fl u e n c e s c e l l u l a s e a c t i v i t y . X - r a y d i f f r a c t i o n ( X R D ) a n d R a m a n s p e c t r o s c o p y h a v e b e e n u s e d i n t h e p a s t t o i d e n t i f y s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s [ 1 , 1 8 , 1 6 0 , 3 0 5 , 3 0 6 ] . X R D i s a p o w e r f u l t e c h n i q u e u s e d t o p r o v i d e c r y s t a l l o g r a p h i c i n f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e a l l o m o r p h s d u e t o t h e d i f f r a c t i o n o f i n c i d e n t X - r a y s t h a t i s d e p e n d e n t o n t h e s p a c i n g b e t w e e n a d j a c e n t g l u c a n s h e e t s a m o n g o t h e r f a c t o r s [ 3 0 7 - 3 1 0 ] . H o w e v e r , o n e o f t h e m a j o r l i m i t a t i o n s o f X R D i s t h e u n r e l i a b i l i t y o f t h e m e t h o d ( t o m e a s u r e c r y s t a l l i n i t y u s i n g t h e C r I i n d e x ) f o r s a m p l e s t h a t h a v e a s i g n i fi c a n t c o n t r i b u t i o n d u e t o t h e i r a m o r p h o u s c o m p o n e n t s ( t y p i c a l l y h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n ) [ 3 0 8 , 3 1 1 ] . S o l i d 1 3 . . . . s t a t e C n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e ( N M R ) 1 5 a n o t h e r t e c h n i q u e t h a t h a s b e e n u s e d 1 n r e c e n t y e a r s t o q u a n t i f y t h e c r y s t a l l i n i t y i n d e x o f c e l l u l o s e a fi e r s u b t r a c t i o n o f t h e a m o r p h o u s c o n t r i b u t i o n [ 3 1 2 ] . R a m a n s p e c t r o s c o p y h a s s e v e r a l a d v a n t a g e s o v e r c o n v e n t i o n a l i n f r a - r e d ( I R ) s p e c t r o s c o p y ( w h i c h p r o v i d e d c o m p l e m e n t a r y i n f o r m a t i o n t o R a m a n ) , n a m e l y t h e h i g h s e n s i t i v i t y o f t h e m e t h o d t o t h e s k e l e t a l v i b r a t i o n s o f c e l l u l o s e ( C - C , C - O b o n d s ) t h a t h a v e h i g h R a m a n s c a t t e r i n g c o e f fi c i e n t s , w i t h l i t t l e c o n t r i b u t i o n f r o m h i g h l y p o l a r b o n d s ( l i k e O - H ) . T h i s a l l o w s R a m a n t o b e p a r t i c u l a r l y s e n s i t i v e t o i n t r a - m o l e c u l a r d i f f e r e n c e s f o r p o l a r i z a b l e c o v a l e n t b o n d s d u e t o s l i g h t c h a n g e s i n t h e c o o r d i n a t e s o f i n d i v i d u a l a t o m s , a s c o m p a r e d t o I R . T h e b a n d s i n R a m a n s p e c t r a l y i n g b e t w e e n 3 0 0 - 4 0 0 c m . 1 a r e e s p e c i a l l y s e n s i t i v e t o r i n g t o r s i o n a n g l e s [ 3 1 3 ] , w h i c h i s 1 0 3 d e p e n d e n t o n t h e r e l a t i v e o r i e n t a t i o n o f a d j a c e n t g l u c o s y l r e s i d u e s i n v a r i o u s c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e a l l o m o r p h s [ 2 9 5 ] . C l o s e r i n s p e c t i o n o f t h e R a m a n s p e c t r a f o r c e l l u l o s e I a n d I I I r e v e a l s a d i s t i n c t d i f f e r e n c e i n s p e c t r a l b a n d s a r o u n d 3 8 0 a n d 3 5 0 c m - 1 [ 4 , 3 1 4 ] . M o n i t o r i n g t h e s e s p e c t r a l p e a k s a s a f u n c t i o n o f A F E X p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y w o u l d h e l p q u a n t i f y t h e e x t e n t o f c o n v e r s i o n o f c e l l u l o s e I t o I I I , s u p p l e m e n t i n g X R D d a t a a s w e l l . T h e c r y s t a l l i n i t y o f t h e b i o m a s s ( b a s e d o n X R D m e a s u r e m e n t s ) w a s f o u n d t o d e c r e a s e a f t e r A F E X ( f o r c o r n s t o v e r ) b u t r e s i d u a l a m o r p h o u s h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n m i g h t h a v e i n t e r f e r e d w i t h t h a t a n a l y s i s [ 1 8 ] . L a u r e a n o - P e r e z a n d c o l l e a g u e s r e p o r t e d n o s i g n i fi c a n t i m p r o v e m e n t i n t h e p r e d i c t i v e p o w e r o f t h e i r r e g r e s s i o n m o d e l ( p r e d i c t i n g h y d r o l y s i s y i e l d a s a f u n c t i o n o f X R D b a s e d c r y s t a l l i n i t y , F T I R b a s e d s p e c t r a l c o m p o s i t i o n a n d R a m a n b a s e d l i g n i n c o n t e n t ) b y i n c o r p o r a t i n g R a m a n s p e c t r a l d a t a [ 1 6 0 ] . H o w e v e r , t h e a u t h o r s p r o v i d e d n o d e t a i l s o n t h e e f f e c t o f l i g n i n a u t o - fl u o r e s c e n c e o n t h e a n a l y s i s . A u t o - fl u o r e s c e n c e i s a m a j o r d e t r i m e n t t o t h e s u c c e s s f u l a n a l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c s u s i n g R a m a n s p e c t r o s c o p y [ 3 1 5 ] . 4 . 2 . 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s S e e a p p e n d i x A - V I I - l , 4 , 1 6 , 1 7 , 1 8 , 2 3 , 2 8 a n d 3 1 . 4 . 2 . 4 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 4 . 2 . 4 . 1 C e l l u l o s e I c r y s t a l s t r u c t u r e i s d i f f e r e n t i a l l y a l t e r e d b y v a r y i n g t h e r m o c h e m i c a l t r e a t m e n t s A v i c e l ( 9 7 - 9 9 % g l u c a n c o n t e n t ) w a s t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t c h e m i c a l s t o o b t a i n v a r i o u s c e l l u l o s e p o l y m o r p h s t o c o m p a r e t h e i r X R D p a t t e r n s ( F i g u r e 4 . B . l ) a n d e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y u n d e r c o m p a r a b l e e n z y m e l o a d i n g s . A v i c e l w a s t r e a t e d w i t h s o d i u m h y d r o x i d e ( 2 5 % , w / w ) a t 4 ° C f o r 1 h o u r t o o b t a i n t h e d i s t i n c t c e l l u l o s e 1 1 p a t t e r n , 1 0 4 d e p i c t e d b y t h e r e l a t i v e d e c r e a s e i n t h e X R D p e a k a t 2 2 d e g r e e t w o - t h e t a ( 2 0 ) a l s o a c c o m p a n i e d b y a n i n c r e a s e t h e p e a k s a t 2 0 a n d 1 2 d e g r e e s 2 6 . H o w e v e r , t r e a t m e n t o f c e l l u l o s e I ( A v i c e l ) w i t h a m m o n i u m h y d r o x i d e ( 2 8 - 3 0 % , w / w ) a t 4 ° C f o r 1 h o u r r e s u l t e d i n n o s i g n i fi c a n t m o d i fi c a t i o n o f t h e c r y s t a l s t r u c t u r e . T h i s r e s u l t i s n o t e n t i r e l y s u r p r i s i n g , a s s o d i u m h y d r o x i d e ( a t c o n c e n t r a t i o n s g r e a t e r t h a n 1 0 - 1 5 % , d e p e n d i n g o n s o u r c e o f c e l l u l o s e ) i s a s t r o n g e r b a s e t h a n a m m o n i u m h y d r o x i d e r e s u l t i n g i n a m u c h h i g h e r h y d r o x y l i o n c o n c e n t r a t i o n t h a t i s r e s p o n s i b l e f o r d i s r u p t i n g t h e h y d r o g e n b o n d i n g n e t w o r k i n n a t i v e c e l l u l o s e I [ 3 0 7 ] . F i g u r e 4 . 3 . 1 P o w d e r X - r a y d i fi r a c t i o n s p e c t r a o f c e l l u l o s e ( C e l l u l o s e I ) t r e a t e d w i t h l i q u i d a m m o n i a ( C e l l u l o s e I I I ) , s o d i u m h y d r o x i d e ( C e l l u l o s e 1 1 ) , a m m o n i u m h y d r o x i d e a n d c o n c e n t r a t e d p h o s p h o r i c a c i d ( A m o r p h o u s C e l l u l o s e ) . A v i c e l w a s t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e i n a l l c a s e s . Y - a x i s a n d X - a x i s d e p i c t i n t e n s i t y c o u n t s a n d t w o - t h e t a ( 2 0 ) a n g l e s , r e s p e c t i v e l y . - - U n t r e a t e d A v i c e l 7 3 5 0 0 0 ‘ — L i q u i d N H B t r e a t e d A v i c e l , 1 0 C — — N a O H t r e a t e d A v i c e l , 4 C 5 3 5 0 0 0 " — — N H 4 O H t r e a t e d A v i c e l , 4 c - - - - - - R e g e n e r a t e d A m o r p h o u s A v i c e l 5 3 5 0 0 0 ~ 4 3 5 0 0 0 * 3 3 5 0 0 0 - 2 3 5 0 0 0 ‘ 1 3 5 0 0 0 - x fi = fi fi g i z . . . . . . . . . . . . . . . “ " * \ ~ \ ? , A : - - _ \ . 3 5 0 0 0 - - - 1 1 1 1 1 m ’ . . . . . . . . . . . . . . . . . T r e a t m e n t o f c e l l u l o s e I I I w i t h a m m o n i u m h y d r o x i d e ( o f v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s ) h a s a l s o b e e n r e p o r t e d t o c a u s e r e v e r s i o n t o c e l l u l o s e I [ 3 1 6 ] . H o w e v e r , t r e a t m e n t w i t h l i q u i d a m m o n i a ( 1 0 ° , 3 0 m i n ) r e s u l t e d i n a d i s t i n c t X R D p a t t e r n f o r c e l l u l o s e , d e p i c t e d b y t h e d i s a p p e a r a n c e o f t h e p e a k a t 2 2 d e g r e e 2 0 a c c o m p a n i e d b y a p r o m i n e n t p e a k a t 2 0 1 0 5 a n d 1 2 d e g r e e s 2 0 . T h e s e r e s u l t s a r e c o m p a r a b l e t o w h a t h a v e b e e n r e p o r t e d i n l i t e r a t u r e f o r c e l l u l o s e 1 1 1 f r o m c o t t o n [ 2 9 2 ] . T r e a t m e n t o f c e l l u l o s e I w i t h c o n c e n t r a t e d p h o s p h o r i c a c i d ( > 8 1 % w / w ; 4 ° , 1 h r ) r e s u l t e d i n c o m p l e t e d i s s o l u t i o n o f t h e s o l i d , w h i c h w a s r e c o v e r e d a s a fl u f f y , l o w - d e n s i t y s o l i d b y a d d i t i o n o f e x c e s s w a t e r t h e s o l u t i o n . D i s s o l u t i o n o f c e l l u l o s e i n p h o s p h o r i c a c i d h a s b e e n k n o w n t o c o m p l e t e l y d i s r u p t t h e s u p e r - m o l e c u l a r a r c h i t e c t u r e o f t h e c e l l u l o s e s t r u c t u r e , r e s u l t i n g i n i t s t r a n s f o r m a t i o n f r o m t h e c r y s t a l l i n e t o a m o r p h o u s s t a t e w i t h n o c h a n g e i n t h e d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n [ 1 2 8 ] . T h e X R D p a t t e r n f o r t h e r e g e n e r a t e d a m o r p h o u s c e l l u l o s e d e p i c t s a r e l a t i v e l y fl a t s p e c t r u m w i t h n o d i s t i n c t p e a k s i n d i c a t i n g a n e a r l y c o m p l e t e l o s s o f c r y s t a l l i n i t y . T a b l e 4 . 3 . 1 R e l a t i v e c h a n g e i n t h e a m o u n t o f c r y s t a l l i n e p o l y m o r p h s ( w i t h / w i t h o u t c h e m i c a l t r e a t m e n t ) p r e s e n t i n A v i c e l ( A W , c o t t o n l i n t e r s ( L I N T ) a n d n a t i v e c o t t o n ( C 0 7 ) b a s e d a n M D s p e c t r a p e a k i n t e n s i t i e s ( 1 2 9 a t r e s p e c t i v e 2 - t h e t a a n g l e s ( e . g . 2 0 = 1 2 , 1 8 , 2 0 , 2 2 ) . W h e r e f o r i n s t a n c e ; P k ( 1 8 / 2 2 ) = I — ( 1 1 8 / 1 2 2 ) ; % A ( I 8 / 2 2 ) u n ] m 0 w n = 1 0 0 * [ P k ( I S / 2 2 ) ] u n k n 0 w n / [ P k ( I 8 / 2 2 ) ] c o , , m , 1 a n d c o n t r o l d e p e n d s o n s u b s t r a t e t y p e ( A V - I o r L I N T - I o r C O T - D . P k 1 8 I 2 2 P k 1 2 I 1 8 P k 1 8 l 2 0 % A ( 1 8 I 2 2 ) % A ( 1 2 I 1 8 ) % A ( 1 8 1 2 0 ) A V . 1 0 . 6 5 0 . 4 4 0 . 3 6 1 0 0 1 0 0 1 0 0 A V - n 0 . 5 3 0 . 1 2 0 . 6 0 8 2 2 8 1 6 6 A V . 1 1 1 0 . 1 6 0 . 1 6 0 . 6 2 2 5 3 7 1 7 2 A V - A r n o 0 . 2 0 0 . 4 2 0 . 2 6 3 1 9 5 7 3 A V - N H 4 O H 0 . 6 7 0 . 4 1 0 . 3 2 1 0 3 9 4 9 0 L I N T . 1 0 . 7 5 0 . 4 3 0 . 3 5 1 0 0 1 0 0 1 0 0 L I N T . 1 1 1 0 . 1 3 0 . 2 3 0 . 5 2 1 7 5 2 1 4 8 c o r . 1 0 . 6 5 0 . 4 5 0 . 3 2 1 0 0 1 0 0 1 0 0 c o r - m 0 . 1 8 0 . 2 7 0 . 5 1 2 8 5 8 1 6 0 I n o r d e r t o o b t a i n m o r e q u a n t i t a t i v e i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e c h a n g e i n t h e X R D s p e c t r a l p e a k s f o r t h e v a r i o u s c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s , t h e r e l a t i v e c h a n g e s i n p e a k i n t e n s i t y f o r v a r i o u s s p e c t r a l p e a k s ( 2 0 = 1 2 ° , 2 0 ° , 2 2 ° ) w e r e c a l c u l a t e d w i t h r e s p e c t t o t h e a m o r p h o u s p h a s e a t 2 0 = 1 8 ° . T a b l e 4 . B . 1 s u m m a r i z e s t h i s d a t a a l o n g w i t h % c h a n g e i n r e l a t i v e p e a k i n t e n s i t i e s f o r a l l s u b s t r a t e s w i t h r e s p e c t t o c e l l u l o s e I ( u n t r e a t e d A v i c e l a s 1 0 6 1 0 0 % ) . P k 1 8 / 2 2 ( S e e T a b l e 4 . B . l c a p t i o n f o r d e t a i l s ) i s a l s o c o m m o n l y k n o w n a s c r y s t a l l i n i t y i n d e x ( C r l , [ 3 1 1 ] ) t h a t i s c a l c u l a t e d f o r t h e r e l a t i v e c h a n g e i n i n t e n s i t y f o r t h e p e a k a t 2 2 ° . T h e C r I o f u n t r e a t e d a v i c e l w a s a r o u n d 0 . 6 5 , w h i l e t h a t o f a m m o n i u m h y d r o x i d e i s 3 % h i g h e r i n d i c a t i n g a s l i g h t l y m o r e c r y s t a l l i n e s u b s t r a t e . A s i m i l a r r e s u l t f o r a m m o n i u m h y d r o x i d e t r e a t e d a v i c e l h a s r e s u l t e d i n i n c r e a s e d C r I p o s s i b l y d u e t o e x t r a c t i o n / r e m o v a l o r r e s i d u a l a m o r p h o u s f r a c t i o n s f r o m n a t i v e A v i c e l [ 3 1 7 ] . H o w e v e r , t r e a t m e n t w i t h s o d i u m h y d r o x i d e r e s u l t e d i n a n 1 8 % d e c r e a s e i n C r I ( b a s e d o n t h e 2 2 ° p e a k ) a c c o m p a n i e d b y a 6 6 % i n c r e a s e i n t h e p e a k a t 2 0 ° , w h i c h w a s a t y p i c a l c h a r a c t e r i s t i c o f c e l l u l o s e I I p o l y m o r p h s . T r e a t m e n t o f n a t i v e c e l l u l o s e w i t h l i q u i d a m m o n i a r e s u l t e d i n a 7 5 % d e c r e a s e i n C r I , a c c o m p a n i e d w i t h a 7 2 % i n c r e a s e i n t h e p e a k a t 2 0 ° . T h e r e i s a s i m i l a r d e c r e a s e i n C r l ( b y 7 0 % ) f o r a m o r p h o u s c e l l u l o s e , b u t t h e r e w a s n o c o r r e s p o n d i n g i n c r e a s e i n t h e r e l a t i v e i n t e n s i t y o f t h e p e a k a t 2 0 ° w h i c h i s d u e t o t h e l a c k o f a n y s i g n i fi c a n t c r y s t a l l i n i t y i n p h o s p h o r i c a c i d t r e a t e d c e l l u l o s e [ 1 2 8 ] . F i g u r e 4 . B . 2 P o w d e r X - r a y d i fi r a c t i o n s p e c t r a o f u n t r e a t e d ( C e l l u l o s e I ) a n d l i q u i d a m m o n i a ( C e l l u l o s e 1 1 ] ) t r e a t e d c e l l u l o s e s . A v i c e l , c o t t o n l i n t e r s a n d n a t i v e c o t t o n w e r e t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s u s e d . Y - a x i s a n d X - a x i s d e p i c t i n t e n s i t y c o u n t s a n d t w o - t h e t a ( 2 Q a n g l e s , r e s p e c t i v e l y . - - U n t r e a t e d A v i c e l 7 3 5 0 0 0 ‘ — L i q u i d N H 3 t r e a t e d A v i c e l , 1 0 c — - U n t r e a t e d L i n t e r 6 3 5 0 0 0 ‘ — — L i q u i d N H s t r e a t e d L i n t e r , 1 0 C - - - - - - U n t r e a t e d C o t t o n 5 3 5 0 0 0 _ - - - - - - L i q u i d N H 3 t r e a t e d C o t t o n , 1 0 C 4 3 5 0 0 0 7 3 3 5 0 0 0 ‘ 2 3 5 0 0 0 * 1 3 5 0 0 0 r _ . . . . . . . . “ S t a r - 9 3 $ : . . . . . . . . 7 - - - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M P a g e . . . 3 5 0 0 0 . . . . . . . . . . . . . l . . . . y ’ ‘ I l - ~ n ; . 6 9 l 2 l 5 l 8 2 1 2 4 3 7 3 0 3 3 3 6 T h e r e h a v e b e e n c o n fl i c t i n g r e p o r t s o n t h e e x a c t l i q u i d a m m o n i a t r e a t m e n t c o n d i t i o n s t h a t a r e n e c e s s a r y t o f o r m c e l l u l o s e 1 1 1 , d u e t o d i f f e r e n c e s i n t h e c e l l u l o s e s o u r c e a n d m e t h o d o f a m m o n i a p r e t r e a t m e n t [ 1 6 3 , 2 9 3 , 2 9 6 , 3 1 8 ] . I n o r d e r t o s t u d y t h e e f f e c t o f c e l l u l o s e s o u r c e o n t h e e x t e n t o f t r a n s f o r m a t i o n o f n a t i v e c e l l u l o s e I t o I I I , t h r e e t y p e s o f n a t i v e c e l l u l o s e I w e r e o b t a i n e d ( i . e . A v i c e l , C o t t o n L i n t e r , C o t t o n ) . C o t t o n l i n t e r i s t h e s h o r t fi b e r o f t h e c o t t o n b o l l t h a t g r o w s b e t w e e n t h e c o t t o n s e e d s a n d t h e l o n g b o l l c o t t o n fi b e r s . T h e D P o f a v i c e l , l i n t e r a n d c o t t o n h a s b e e n r e p o r t e d t o b e i n t h e r a n g e o f 1 5 0 - 2 5 0 , 7 5 0 - 1 0 0 0 a n d 5 0 0 0 - 1 0 , 0 0 0 , r e s p e c t i v e l y [ 5 7 , 3 0 2 - 3 0 4 ] . A l l s a m p l e s w e r e t r e a t e d w i t h l i q u i d a m m o n i a a t 1 0 ° C f o r 3 0 m i n a n d w e r e d r i e d u n d e r t h e h o o d o v e r n i g h t p r i o r t o fi i r t h e r X R D a n a l y s i s . T h e X R D s p e c t r a f o r t h e v a r i o u s c e l l u l o s e s , w i t h a n d w i t h o u t a m m o n i a t r e a t m e n t , a r e s h o w n i n F i g u r e 4 . B . 2 . A s e x p e c t e d , t h e s p e c t r a f o r t h e u n t r e a t e d c e l l u l o s e s a r e i n d e p e n d e n t o f t h e c e l l u l o s e s o u r c e s a n d a r e t y p i c a l o f a c e l l u l o s e 1 1 3 c r y s t a l p o l y m o r p h . T r e a t m e n t w i t h l i q u i d a m m o n i a r e s u l t e d i n a s i m i l a r m o d i fi c a t i o n o f t h e X R D s p e c t r a f o r a l l t h r e e c e l l u l o s e s , a s d e p i c t e d b y t h e a p p e a r a n c e o f t h e p e a k a t 1 2 ° 2 0 p e a k a n d d i s a p p e a r a n c e o f t h e 2 2 ° 2 0 p e a k . T a b l e 4 . B . 1 h a s t h e q u a n t i t a t i v e d a t a r e fl e c t i n g t h i s c h a n g e i n r e l a t i v e p e a k i n t e n s i t i e s . C r l ( o r P k 1 8 / 2 2 ) d e c r e a s e b y 7 8 - 8 3 % a f t e r l i q u i d a m m o n i a t r e a t m e n t o f l i n t e r s a n d c o t t o n c e l l u l o s e , a c c o m p a n i e d b y a c o r r e s p o n d i n g i n c r e a s e o f 4 8 - 6 0 % f o r P k 1 8 / 2 0 . T h i s i s s i m i l a r t o w h a t h a s b e e n n o t e d f o r a v i c e l a s w e l l . 4 . 2 . 4 . 2 E n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f v a r i o u s c e l l u l o s e a l l o m o r p h s T h e r e h a v e b e e n n o s t u d i e s r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e r i g o r o u s l y c o m p a r i n g t h e r e l a t i v e e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f p l a n t c e l l w a l l d e r i v e d c e l l u l o s e a l l o m o r p h s ( c e l l u l o s e H 1 1 i n p a r t i c u l a r ) . T h e r e f o r e , i t w a s f o u n d n e c e s s a r y t o c o m p a r e t h e e f f e c t o f t y p e o f c h e m i c a l 1 0 8 t r e a t m e n t ( w i t h N H 4 0 H , N a O H , L i q u i d N H 3 , H 3 P O 4 ) o n t h e r e l a t i v e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s r a t e s o f p l a n t c e l l w a l l d e r i v e d c e l l u l o s e ( f r o m A v i c e l ) . T h e v a r i o u s c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s w e r e h y d r o l y z e d b y a c r u d e c e l l u l a s e c o m p l e x ( S p e z y m e C P s u p p l e m e n t e d w i t h N o v o 1 8 8 ) f o r 6 - 2 4 h o u r s a t a l o w t o t a l p r o t e i n l o a d i n g ( 6 m g / g g l u c a n ) t h a t c o r r e s p o n d e d t o 1 . 5 F P U c e l l u l a s e l o a d i n g / g g l u c a n ( F i g u r e 4 . B . 3 ) . T h e r e w a s n o i m p r o v e m e n t o n t h e g l u c a n h y d r o l y s i s y i e l d a fl e r a m m o n i u m h y d r o x i d e t r e a t m e n t , t h i s i s c o m p a r a b l e t o w h a t h a s b e e n r e p o r t e d e a r l i e r a s w e l l [ 3 1 7 ] . H o w e v e r , t r e a t m e n t o f a v i c e l w i t h s o d i u m h y d r o x i d e a n d l i q u i d a m m o n i a d i d s i g n i fi c a n t l y e n h a n c e t h e o v e r a l l h y d r o l y s i s y i e l d l i k e l y d u e t o t h e f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e 1 1 a n d 1 1 1 , r e s p e c t i v e l y . T h e o v e r a l l i m p r o v e m e n t i n t h e g l u c a n h y d r o l y s i s y i e l d a f t e r 2 4 h o u r s w a s a p p r o x i m a t e l y 1 . 5 f o l d a n d 2 f o l d f o r t h e c e l l u l o s e 1 1 a n d I I I , r e s p e c t i v e l y , c o m p a r e d t o t h e n a t i v e u n t r e a t e d c e l l u l o s e I . C e l l u l o s e 1 1 ( p r e p a r e d f r o m b a c t e r i a l c e l l u l o s e ) h a s b e e n r e c e n t l y r e p o r t e d t o h a v e 2 - 4 f o l d h i g h e r d i g e s t i o n y i e l d b y p u r i fi e d T h e r m o b i fi d a fi l S C U c e l l u l a s e s , d e p e n d i n g o n t h e t y p e o f e n z y m e e m p l o y e d [ 3 0 0 ] . W h i l e , c e l l u l o s e I I I ( p r e p a r e d f r o m C l a d o p h o r a a l g a l c e l l w a l l c e l l u l o s e ) w a s r e p o r t e d t o h a v e 4 - 5 f o l d h i g h e r d i g e s t i o n y i e l d b y c e l l o b i o h y d r o l a s e I [ 2 9 8 ] . H o w e v e r , i n e i t h e r c a s e t h e r e s u l t s a r e n o t c o m p a r a b l e d u e t o t h e d i f f e r e n c e s i n t h e s u b s t r a t e s o u r c e a n d e n z y m e s y s t e m e m p l o y e d . T h e c u r r e n t s e t s o f r e s u l t s a r e m o r e p e r t i n e n t fi ' o m a c e l l u l o s i c b i o r e f m e r y p o i n t o f v i e w w h e r e t h e s o u r c e o f c e l l u l o s e w o u l d b e f r o m p l a n t c e l l w a l l s ( e . g . A v i c e l v s . b a c t e r i a l / a l g a l c e l l w a l l c e l l u l o s e ) . 1 0 9 r s r s h r 4 h 2 6 D E s u o h p r o m A 3 H d N e t d a i e u r q t i L d e t a e r t H O a N d e t a e r t H O 4 H N d e t a e r t n U 1 1 0 F i g u r e 4 . B . 3 E n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f u n t r e a t e d ( C e l l u l o s e 1 ) , l i q u i d a m m o n i a ( C e l l u l o s e I I I ) , s o d i u m h y d r o x i d e ( C e l l u l o s e 1 1 ) , a m m o n i u m h y d r o x i d e a n d c o n c e n t r a t e d p h o s p h o r i c a c i d ( A m o r p h o u s C e l l u l o s e ) t r e a t e d c e l l u l o s e . A v i c e l w a s t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e i n a l l c a s e s . E n z y m e l o a d i n g w a s 1 . 5 F P U / g g l u c a n o f S p e z y m e C P ( s u p p l e m e n t e d w i t h N o v o 1 8 8 ) . A v i c e l w a s t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e i n a l l c a s e s . Y - a x i s d e p i c t s t o t a l g l u c a n c o n v e r s i o n a f t e r 6 o r 2 4 h o u r s o f h y d r o l y s i s . 9 0 8 O - 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 O n t h e o t h e r h a n d , t h e r e w a s a 3 - 4 f o l d i n c r e a s e i n t h e h y d r o l y s i s y i e l d o f a m o r p h o u s c e l l u l o s e ( f r o m p h o s p h o r i c a c i d t r e a t e d a v i c e l ) , c o m p a r e d t o n a t i v e c e l l u l o s e I . T h i s r e s u l t i s c o m p a r a b l e t o p r e v i o u s l y r e p o r t e d fi n d i n g s o n a m o r p h o u s c e l l u l o s e [ 1 2 8 ] . T h e s e r e s u l t s c l e a r l y d e m o n s t r a t e t h e d i f f e r e n t i a l h y d r o l y s i s k i n e t i c s f o r c e l l u l o s e d e p e n d i n g o n i t s c r y s t a l l i n e f o r m , w h i c h p r o c e e d e d i n t h e f o l l o w i n g o r d e r ; A m o r p h o u s c e l l u l o s e > C e l l u l o s e 1 H 1 > C e l l u l o s e I I > C e l l u l o s e 1 . I n t e r e s t i n g l y , s i m i l a r r e s u l t s h a v e b e e n r e p o r t e d f o r d i g e s t i o n o f c o t t o n l i n t e r s b a s e d c e l l u l o s e a l l o m o r p h s b y r u m i n a l b a c t e r i a l s y s t e m s i n t h e f o l l o w i n g o r d e r ; A m o r p h o u s c e l l u l o s e > C e l l u l o s e 1 1 1 1 > C e l l u l o s e I > C e l l u l o s e I I [ 2 9 2 ] . H o w e v e r , u n l i k e t h e fi n d i n g s i n t h a t r e p o r t , c e l l u l o s e I I w a s f o u n d t o b e m o r e d i g e s t i b l e t h a n c e l l u l o s e I . T h i s i s p o s s i b l e d u e t o d i f f e r e n c e s i n t h e s o u r c e o f t h e s u b s t r a t e a n d t h e e x a c t p r o t o c o l u s e d f o r p r e p a r i n g c e l l u l o s e H . T h e a u t h o r s a l s o f o u n d t h a t d e p e n d i n g o n t h e s o u r c e o f t h e r u m i n a l b a c t e r i a l c u l t u r e ( R u m i n o c o c c u s fl a v e f a c i e n s v s . F i b r o b a c t e r s u c c i n o g e n e s ) , t h e a b s o l u t e d i g e s t i o n k i n e t i c s v a r i e d b e t w e e n t h e d i f f e r e n t c e l l u l o s e a l l o m o r p h s b u t t h e r e l a t i v e t r e n d s w e r e s i m i l a r [ 2 9 2 ] . T h e e n h a n c e m e n t o f t h e h y d r o l y s i s y i e l d f o r c o t t o n l i n t e r s a n d c o t t o n fi b e r s a f t e r l i q u i d a m m o n i a t r e a t m e n t ( 1 0 ° C , 3 0 m i n ) w a s e x p l o r e d a s w e l l ( F i g u r e 4 . B . 4 ) . T h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s w e r e h y d r o l y z e d b y a c r u d e c e l l u l a s e c o m p l e x ( S p e z y m e C P s u p p l e m e n t e d w i t h N o v o 1 8 8 ) f o r 6 - 2 4 h o u r s a t t w o d i f f e r e n t t o t a l p r o t e i n l o a d i n g s ( 6 a n d 6 0 m g / g g l u c a n ) t h a t c o r r e s p o n d e d t o 1 . 5 a n d 1 5 F P U c e l l u l a s e l o a d i n g / g g l u c a n . T h e g l u c a n h y d r o l y s i s r e s u l t s d e p i c t a 2 - 2 . 5 f o l d i n c r e a s e i n o v e r a l l y i e l d f o r 6 m g / g g l u c a n e n z y m e l o a d i n g a f t e r 6 a n d 2 4 h o u r s o f h y d r o l y s i s f o r b o t h l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d l i n t e r a n d c o t t o n fi b e r s a s c o m p a r e d t o t h e i r u n t r e a t e d c o u n t e r p a r t s . 1 1 1 U P F 5 1 - s r h 4 2 I ‘ 7 0 0 0 6 4 3 1 1 2 F i g u r e 4 . B . 4 E n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f u n t r e a t e d ( C e l l u l o s e I ) a n d l i q u i d a m m o n i a ( C e l l u l o s e [ 1 1 ) t r e a t e d c e l l u l a s e s . A v i c e l , c o t t o n l i n t e r s a n d n a t i v e c o t t o n w e r e t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s u s e d . E n z y m e l o a d i n g w a s 1 . 5 o r 1 5 F P U / g g l u c a n o f S p e z y m e C P ( s u p p l e m e n t e d w i t h N o v o 1 8 8 ) . Y — a x i s d e p i c t s t o t a l g l u c a n c o n v e r s i o n a f t e r 6 o r 2 4 h o u r s o f h y d r o l y s i s . 8 0 r ‘ “ H u n L o g , i 1 3 6 h r s - 1 5 F P U 7 0 1 : . . . 2 4 h r s — 1 . 5 F P U ; 1 a 6 h m — 1 5 F P U 5 0 U n t r e a t e d L i n t e r L i q u i d N H 3 L i n t e r U n t r e a t e d C o t t o n L i q u i d N H 3 C o t t o n T h e r e l a t i v e i n c r e a s e i n t h e g l u c a n d i g e s t i b i l i t y a f t e r l i q u i d a m m o n i a t r e a t m e n t o f c o t t o n l i n t e r s a n d c o t t o n fi b e r s i s s i g h t l y h i g h e r c o m p a r e d t o a v i c e l a t t h e s a m e p r o t e i n l o a d i n g . T h i s i s n o t s u r p r i s i n g c o n s i d e r i n g t h a t c o t t o n l i n t e r s / fi b e r s a r e c o m p o s e d o f h i g h e r d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n ( D P ) c e l l u l o s e t h a t m i g h t p o s s i b l y b e n e fi t m o r e fi o m t h e t r a n s f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I t o 1 1 1 t o e n h a n c e a c t i v i t y o f c e l l u l a s e s o n i t . T h e e x t e n t o f d i g e s t i o n o f c o t t o n l i n t e r s a n d fi b e r s w a s s i g n i fi c a n t l y l o w e r t h a n a v i c e l , w h i c h i s a l s o p o s s i b l y d u e t o d i f f e r e n c e s i n c e l l u l o s e D P . H o w e v e r , t h e a c t u a l m e c h a n i s m b y w h i c h c e l l u l o s e I I I i s m o r e d i g e s t i b l e t h a n n a t i v e c e l l u l o s e ( f o r a n y o f t h e c e l l u l o s e s ) i s c u r r e n t l y u n c l e a r ( S e e C h a p t e r 8 f o r m o r e d e t a i l s ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e e x t e n t o f i m p r o v e m e n t i n t h e g l u c a n h y d r o l y s i s y i e l d w a s o n l y 1 . 5 - 2 f o l d h i g h e r f o r l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d c o t t o n l i n t e r / fi b e r s a t h i g h e r p r o t e i n l o a d i n g ( 6 0 m g t o t a l e n z y m e / g g l u c a n o r 1 5 F P U / g g l u c a n ) a t e i t h e r t i m e p o i n t s , c o m p a r e d t o t h e i r c o r r e s p o n d i n g n a t i v e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t t h e h y d r o l y s i s k i n e t i c s o f c e l l u l o s e I I I i s c l o s e l y c o u p l e d t o t h e i n d i v i d u a l e n z y m e f a m i l y , l o a d i n g a n d e x t e n t o f h y d r o l y s i s . S i m i l a r r e s u l t s , d e p i c t i n g d e p e n d e n c e o n e n z y m e s o u r c e a n d l o a d i n g , h a v e b e e n r e p o r t e d b e f o r e f o r c e l l u l o s e 1 1 b a s e d a l l o m o r p h s [ 3 0 0 ] . T h e e f f e c t o f l i q u i d a m m o n i a t r e a t m e n t t e m p e r a t u r e ( i . e 1 0 , 2 5 , 6 0 , 9 5 0 C ) o n t h e f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I I I w a s c l o s e l y e x a m i n e d f o r a v i c e l , b a s e d o n c o m p a r i n g t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s y i e l d s u s i n g 1 . 5 F P U c e l l u l a s e l o a d i n g p e r g r a m g l u c a n ( F i g u r e 4 . 8 5 ) . T h e r e w a s n o s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e i n t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s y i e l d f o r t h e v a r y i n g t e m p e r a t u r e l i q u i d a m m o n i a p r e t r e a t e d c e l l u l o s e . I n a l l c a s e s , t h e r e w a s a 2 - f o l d i n c r e a s e i n t h e g l u c a n y i e l d c o m p a r e d t o u n t r e a t e d c e l l u l o s e I . 1 1 3 F i g u r e 4 . 3 . 5 E fl e c t o f l i q u i d a m m o n i a t r e a t m e n t t e m p e r a t u r e o n t h e e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f v a r i o u s c e l l u l o s e 1 1 ] p o l y m o r p h s . E n z y m e l o a d i n g w a s 1 . 5 F P U / g g l u c a n o f S p e z y m e C P ( s u p p l e m e n t e d w i t h N o v o 1 8 8 ) . A v i c e l w a s t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e i n a l l c a s e s . Y - a x i s d e p i c t s t o t a l g l u c a n c o n v e r s i o n a f t e r 2 4 h o u r s o f h y d r o l y s i s . 6 0 5 0 - 4 0 — 3 0 — 2 0 - 1 0 4 o n U n t r e a t e d 1 0 C 2 5 C 6 0 C 9 5 C T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t t h e f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I I I i s l a r g e l y i n d e p e n d e n t o f t e m p e r a t u r e , a s l o n g a s s u f f i c i e n t a m o u n t o f l i q u i d a m m o n i a i s p r e s e n t t o c o m p l e t e l y s w e l l t h e c e l l u l o s e fi b r i l s . H o w e v e r , i n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e a b o v e 1 0 0 d e g r e e s r e s u l t e d i n c o n s i d e r a b l e d a r k e n i n g o f t h e t r e a t e d s a m p l e s p o s s i b l y d u e t o M a i l l a r d b a s e d r e a c t i o n s o f r e d u c i n g a l d e h y d i c e n d s o f c e l l u l o s e ( w i t h a m m o n i a ) [ 3 1 9 ] . M a i l l a r d r e a c t i o n s a r e k n o w n t o b e p r o m o t e d b y h i g h t e m p e r a t u r e s , l o w m o i s t u r e a n d h i g h a l k a l i n i t y [ 3 1 9 ] . T h e e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f t h e d a r k e n e d c e l l u l o s e s a m p l e s a f t e r t r e a t m e n t w i t h l i q u i d a m m o n i a w a s f o u n d t o g i v e s i g n i fi c a n t l y l o w e r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s y i e l d s t h a n c e l l u l o s e I I I p r e p a r e d a t t e m p e r a t u r e s b e l o w 1 0 0 ° C ( d a t a n o t s h o w n ) . I n m a n y c a s e s , t h e h y d r o l y s i s y i e l d s w e r e c o m p a r a b l e t o o r s i g n i fi c a n t l y l o w e r t h a n n a t i v e c e l l u l o s e I ( d a t a n o t s h o w n ) . T h i s i s n o t s u r p r i s i n g a s M a i l l a r d r e a c t i o n p r o d u c t s ( a n d a l k a l i i n d u c e d p e e l i n g r e a c t i o n p r o d u c t s ; [ 3 2 0 ] ) a r e k n o w n t o s e v e r e l y i n h i b i t c e l l u l a s e s a m o n g m a n y o t h e r e n z y m e s [ 3 2 1 , 3 2 2 ] . T h e e x t e n t o f M a i l l a r d b a s e d d e g r a d a t i o n r e a c t i o n s d u r i n g 1 1 4 a m m o n i a / A F E X t r e a t m e n t o f c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e w a s b r i e fl y e x p l o r e d i n C h a p t e r 5 . P r e v i o u s s t u d i e s w i t h l i q u i d a m m o n i a a n d c e l l u l o s e s ( u s i n g A v i c e l a n d L i n t e r s ) h a v e r e p o r t e d t h a t a n a c t i v a t i o n t i m e o f 3 0 m i n w a s s u f f i c i e n t i n t h e p r e s e n c e o f e x c e s s l i q u i d a m m o n i a t o c o m p l e t e l y s o a k t h e s u b s t r a t e [ 2 8 8 , 2 8 9 ] . H o w e v e r , m o r e d e t a i l e d k i n e t i c s s t u d y i n g t h e d i f f u s i o n o f a m m o n i a i n t o t h e c e l l u l o s e l a t t i c e a s a f u n c t i o n o f s u b s t r a t e a n d c e l l u l o s e c r y s t a l s i z e i s n e c e s s a r y t o b e t t e r u n d e r s t a n d t h e t r a n s f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I t o 1 H . 4 . 2 . 4 . 3 F o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I I I d u r i n g c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t m e n t T h e e f f e c t o f c o n v e n t i o n a l A F E X p a r a m e t e r s ( a m m o n i a l o a d i n g , w a t e r l o a d i n g , r e s i d e n c e t i m e ) w a s s t u d i e d t o q u a n t i f y t h e e x t e n t o f c o n v e r s i o n o f c e l l u l o s e I t o I I I ( f o r a v i c e l a s t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e ) . F o u r A F E X c o n d i t i o n s w e r e e x p l o r e d ; ( a ) ( 1 — N H 3 , 0 . 6 - W ) 1 g m a m m o n i a a n d 0 . 6 g m w a t e r l o a d i n g p e r g m o f s u b s t r a t e a t 1 0 0 ° C f o r 1 5 m i n , ( b ) ( 3 - N H 3 , 0 . 6 - W ) , 3 g m a m m o n i a a n d 0 . 6 g m w a t e r l o a d i n g p e r g m o f s u b s t r a t e a t 1 0 0 ° C f o r 4 5 m i n , ( c ) ( l - N H 3 , 0 . 0 5 - W ) 1 g m a m m o n i a a n d 0 . 0 5 g m w a t e r l o a d i n g p e r g m o f s u b s t r a t e a t 1 0 0 ° C f o r 1 5 m i n , a n d ( d ) ( 3 - N H 3 , 0 . 0 5 - W ) 3 g m a m m o n i a a n d 0 . 0 5 g m w a t e r l o a d i n g p e r g m o f s u b s t r a t e a t 1 0 0 ° C f o r 4 5 m i n . L i q u i d a m m o n i a t r e a t e d a v i c e l ( 1 0 ° C , 3 0 m i n ) w a s t h e c o n t r o l , w h e r e t h e a m m o n i a l o a d i n g e m p l o y e d r a n g e d b e t w e e n 5 - 7 g m a m m o n i a p e r g m s u b s t r a t e c o n t a i n i n g 0 . 0 5 g m w a t e r / g m s u b s t r a t e . T h e X R D s p e c t r a f o r a l l c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s a r e s h o w n i n F i g u r e I I - 4 . B . 6 . N o n e o f t h e f o u r A F E X c o n d i t i o n s g a v e c o m p l e t e c o n v e r s i o n t o c e l l u l o s e 1 1 1 . H o w e v e r , t h e e x t e n t o f c o n v e r s i o n w a s c l o s e l y d e p e n d e n t o n t h e A F E X c o n d i t i o n s e m p l o y e d . 1 1 5 T a b l e 4 . B . 2 R e l a t i v e c h a n g e i n t h e a m o u n t o f c r y s t a l l i n e p o l y m o r p h s p r e s e n t i n A v i c e l ( A 1 0 , w i t h o r w i t h o u t A F E X t r e a t m e n t ( N = a m m o n i a l o a d i n g a n d W = w a t e r l o a d i n g , w / w b a s i s ) b a s e d o n X R D s p e c t r a p e a k i n t e n s i t i e s ( 1 2 9 1 a t r e s p e c t i v e 2 - t h e t a a n g l e s ( e . g . 2 0 = 1 2 , 1 8 , 2 0 , 2 2 ) . W h e r e f o r i n s t a n c e ; P k ( 1 8 / 2 2 ) = 1 — ( 1 1 8 n m a n d % A ( 1 8 / 2 2 ) u n k n o w n = 1 0 0 * [ P k ( 1 8 / 2 2 ) ] u n k n o w n / [ P k ( 1 8 / 2 2 ) ] A V - I - X R D l P k 1 8 / 2 2 P k 1 2 / 1 8 P k 1 8 / 2 0 | % A ( 1 8 I 2 2 ) % A ( 1 2 I 1 8 ) % A ( 1 8 l 2 0 ) A V - I 0 . 6 5 0 . 4 4 0 . 3 6 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 N - 0 . 6 W 0 . 6 1 0 . 4 3 0 . 3 8 9 4 9 8 1 0 5 3 N - 0 . 6 W 0 . 6 3 0 . 4 4 0 . 3 4 9 7 1 0 0 9 4 1 N - 0 . 0 5 W 0 . 6 7 0 . 4 0 0 . 4 4 1 0 3 9 1 1 2 3 3 N - 0 . 0 5 W 0 . 5 7 0 . 3 6 0 . 4 4 8 8 8 2 1 2 3 A V - I l l 0 . 1 6 0 . 1 6 0 . 6 2 2 5 3 7 1 7 2 M o r e q u a n t i t a t i v e i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e c h a n g e i n t h e X R D s p e c t r a l p e a k s f o r t h e v a r i o u s c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s , r e l a t i v e c h a n g e i n p e a k i n t e n s i t y f o r v a r i o u s s p e c t r a l p e a k s ( 2 0 = 1 2 ° , 2 0 ° , 2 2 ° ) w e r e c a l c u l a t e d w i t h r e s p e c t t o t h e a m o r p h o u s p h a s e a t 2 0 = 1 8 ° . T a b l e 4 . B . 2 s u m m a r i z e s t h i s d a t a a l o n g w i t h % c h a n g e i n r e l a t i v e p e a k i n t e n s i t i e s f o r a l l s u b s t r a t e s w i t h r e s p e c t t o c e l l u l o s e 1 ( u n t r e a t e d A v i c e l a s 1 0 0 % ) . T h e C r I v a l u e f o r A F E X c o n d i t i o n s c o n t a i n i n g s i g n i fi c a n t m o i s t u r e ( 1 N - 0 . 6 W a n d 3 N - 0 . 6 W ) s h o w e d o n l y a 3 a n d 6 % d e c r e a s e . H o w e v e r , o n l y w h e n A F E X w a s c a r r i e d o u t i n t h e a b s e n c e o f w a t e r a n d i n p r e s e n c e o f s u f fi c i e n t a m m o n i a t o c o m p l e t e l y s o a k t h e s u b s t r a t e ( 3 N - 0 . 0 5 W ) w a s t h e r e a s i g n i fi c a n t d e c r e a s e i n t h e C r l v a l u e b y 1 2 % . A s s e e n e a r l i e r , q u a n t i f y i n g t h e e x t e n t o f c o n v e r s i o n o f c e l l u l o s e 1 1 1 t h r o u g h t h e r e l a t i v e i n c r e a s e i n t h e s p e c t r a l p e a k i n t e n s i t y a t 2 0 = 1 2 ° o r 2 0 ° w o u l d a l s o b e p o s s i b l e ( w i t h r e s p e c t t o t h e a m o r p h o u s p e a k a t 1 8 " ) . C o m p a r i n g t h e c h a n g e i n t h e r e l a t i v e p e a k i n t e n s i t y o f P k 1 2 / 1 8 d e p i c t s a 9 % a n d 1 8 % d e c r e a s e f o r 1 N - 0 . 0 5 W a n d 3 N - 0 . 0 5 W b a s e d A F E X c o n d i t i o n s . F o r l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d c e l l u l o s e w i t h 1 0 0 % c o n v e r s i o n t o c e l l u l o s e I I I , t h e r e i s 7 5 % a n d 6 3 % d e c r e a s e i n C r l a n d P k 1 2 / 1 8 , r e s p e c t i v e l y . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t a b s e n c e o f w a t e r i s c r i t i c a l d u r i n g 1 1 6 a m m o n i a t r e a t m e n t t o p r e v e n t r e v e r s i o n o f c e l l u l o s e 1 1 1 b a c k t o I d u r i n g c o n v e n t i o n a l A F E X . S i m i l a r r e s u l t s h a v e b e e n r e p o r t e d e a r l i e r , w h e r e 4 0 - 1 0 0 % r e v e r s i o n o f c e l l u l o s e I I I t o I w a s s e e n i n t h e p r e s e n c e o f a m m o n i u m h y d r o x i d e s o l u t i o n s [ 1 6 3 , 2 9 6 , 3 1 6 ] . S e c o n d l y , s o a k i n g t h e s u b s t r a t e c o m p l e t e l y i n l i q u i d a m m o n i a i s c r i t i c a l t o c o m p l e t i n g t h e t r a n s f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I t o I E . W i t h t h e c u r r e n t A F E X r e a c t o r s u s e d , t h e r e w a s n o e x t e r n a l g a s a d d i t i o n t o m a i n t a i n o v e r h e a d p r e s s u r e . T h e r e f o r e , a t 1 0 0 ° C a s i g n i fi c a n t p o r t i o n o f l i q u i d a m m o n i a c o u l d e a s i l y u n d e r g o p h a s e c h a n g e f r o m l i q u i d t o g a s , e s p e c i a l l y i n t h e a b s e n c e o f w a t e r . T h i s c o u l d e x p l a i n w h y t h e t r a n s f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I t o 1 1 1 w a s i n c o m p l e t e e v e n i n t h e a b s e n c e o f w a t e r ( i . e . 1 N - 0 . 0 5 W a n d 3 N - 0 . 0 5 W ) . F u t u r e s t u d i e s o n c e l l u l o s e I I I f o r m a t i o n s h o u l d b e c a r r i e d o u t u s i n g r e a c t o r s w i t h o v e r h e a d p r e s s u r e c o n t r o l t o e n s u r e a m m o n i a i s e n t i r e l y i n t h e l i q u i d p h a s e . T h i s w o u l d b e i d e a l t o m i n i m i z e a n d o p t i m i z e t h e a m o u n t o f l i q u i d a m m o n i a n e c e s s a r y t o m a k e c e l l u l o s e H I f r o m a c o m m e r c i a l s t a n d p o i n t . T h e e x t e n t o f f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I I I f o r v a r y i n g A F E X s e v e r i t y w a s a l s o c o n fi r m e d b y R a m a n s p e c t r o s c o p y . R a m a n s p e c t r o s c o p y i s a p o w e r f u l t e c h n i q u e t h a t h a s b e e n u s e d t o s t u d y t h e c r y s t a l s t r u c t u r e s o f v a r i o u s c e l l u l o s i c a l l o m o r p h s t o p r o v i d e i n f o r m a t i o n o n t h e i r s e c o n d a r y a n d t e r t i a r y s t r u c t u r e s [ 3 1 4 , 3 1 5 , 3 2 3 ] . R a m a n s p e c t r a f o r t h e v a r i o u s c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s a r e s h o w n i n F i g u r e l I - 4 . B . 7 . A s e x p e c t e d , b a s e d o n t h e X R D r e s u l t s , n o n e o f t h e f o u r A F E X c o n d i t i o n s r e s u l t e d i n c o m p l e t e t r a n s f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I t o 1 1 1 . T h i s c a n b e e a s i l y q u a n t i fi e d b a s e d o n t h e r e l a t i v e i n t e n s i t y o f p e a k s 3 8 0 / 3 5 0 , w h i c h h a s b e e n p r e s e n t e d i n T a b l e 4 . B . 3 . T h e r e l a t i v e c h a n g e i n t h e p e a k r a t i o s w i t h r e s p e c t t o u n t r e a t e d c e l l u l o s e I h a v e a l s o b e e n p r o v i d e d i n t h e t a b l e , d e p i c t i n g a 8 2 % d e c r e a s e i n t h e r a t i o f o r c e l l u l o s e I I I . 1 1 7 T a b l e 4 . B . 3 R e l a t i v e c h a n g e i n t h e a m o u n t o f c r y s t a l l i n e p o l y m o r p h s p r e s e n t i n A v i c e l ( A V ) , w i t h o r w i t h o u t A F E X t r e a t m e n t ( N = a m m o n i a l o a d i n g a n d W = w a t e r l o a d i n g , w / w b a s i s ) b a s e d o n R a m a n s p e c t r a l p e a k i n t e n s i t i e s ( I w a v e n u m b e r ) a t r e s p e c t i v e w a v e n u m b e r s ( e . g . 3 8 0 a n d 3 5 0 ; c m - I ) . W h e r e f o r i n s t a n c e ; P k ( 3 8 0 / 3 5 0 ) = 1 — - ( 1 3 8 0 / 1 3 5 0 ) a n d % A ( 3 8 0 / 3 5 0 ) u n k n o w n = 1 0 0 * [ P k ( 3 8 0 / 3 5 0 ) ] A V - u n k n o w n / [ P k ( 3 8 0 / 3 5 0 ) ] A V - 1 ~ R a m a n | P k 3 8 0 I 3 5 0 ] % A ( 3 8 0 1 3 5 0 L A V - I 2 . 0 7 1 0 0 1 N - 0 . 6 W 2 . 0 0 9 7 3 N - 0 . 6 W 1 . 9 2 9 3 1 N - 0 . 0 5 W 1 . 4 3 6 9 3 N - 0 . 0 5 W 1 . 2 7 6 1 A V - I l l 0 . 3 6 1 8 I n t h e c a s e o f h i g h m o i s t u r e A F E X ( I N - 0 . 6 W a n d 3 N - 0 . 6 W ) t h e r e i s a 3 % a n d 6 % d e c r e a s e i n t h e r a t i o o f 3 8 0 / 3 5 0 , r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , i n t h e a b s e n c e o f w a t e r ( 1 N - 0 . 0 5 W a n d 3 N - 0 . 0 5 W ) t h e r e i s 3 1 % a n d 3 9 % d e c r e a s e i n t h e r a t i o , r e s p e c t i v e l y . T h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e X R D fi n d i n g s ( s t r o n g c o r r e l a t i o n b e t w e e n o v e r a l l t r e n d s ) , h o w e v e r , t h e a b s o l u t e v a l u e o f t h e e x t e n t o f c o n v e r s i o n t o c e l l u l o s e I I I a r e d i f f e r e n t ( a f t e r n o r m a l i z i n g r e l a t i v e p e a k i n t e n s i t y f o r 1 0 0 % c e l l u l o s e I a n d 1 0 0 % c e l l u l o s e I I I s a m p l e s ) . R a m a n p r e d i c t s n e a r l y 1 . 5 - 2 f o l d h i g h e r c o n v e r s i o n o f c e l l u l o s e I t o H 1 ( f o r t h e f o u r A F E X c o n d i t i o n s ) c o m p a r e d t o X R D ( b a s e d o n P k 1 2 / 1 8 ) . I t s h o u l d b e p o s s i b l e t o g e t a m o r e r e l i a b l e e s t i m a t e o f t h e a b s o l u t e c o n v e r s i o n o f c e l l u l o s e I t o I I I b y t e s t i n g s e v e r a l A F E X c o n d i t i o n s ( t o s t u d y k i n e t i c s o f c e l l u l o s e H 1 f o r m a t i o n ) t o g e n e r a t e s a m p l e s o v e r t h e e n t i r e r a n g e o f c e l l u l o s e I I I f o r m a t i o n ( 0 - 1 0 0 % ) . F r o m a n i n d u s t r i a l p o i n t o f v i e w , i t w o u l d s e e m u n n e c e s s a r y t o t r a n s f o r m c e l l u l o s e I t o H 1 d u r i n g t h e c o n v e n t i o n a l A F E X p r e t r e a t m e n t p r o c e s s ( i . e . 9 0 ° C , 1 g m a m m o n i a l o a d i n g / g m s u b s t r a t e , 0 . 6 g m w a t e r l o a d i n g / g m s u b s t r a t e ) a s t h i s w o u l d b e c o u n t e r p r o d u c t i v e d u e t o p r e s e n c e o f w a t e r a n d a l s o d u e t o r e q u i r e m e n t o f h i g h p r e s s u r e 1 1 8 r a t i n g r e a c t o r s t o m a i n t a i n a m m o n i a i n t h e l i q u i d p h a s e . I t w o u l d b e p r e f e r e n t i a l t o t r a n s f o r m A F E X t r e a t e d c e l l u l o s e I r i c h s u b s t r a t e s ( a t t h e e n d o f c o n v e n t i o n a l A F E X p r e t r e a t m e n t ) t o c e l l u l o s e H I b y s o a k i n g i n e x c e s s l i q u i d a m m o n i a a t l o w t e m p e r a t u r e s ( < 2 5 ° C ) . T h i s w o u l d a v o i d i n v e s t m e n t i n c a p i t a l i n t e n s i v e h i g h e r p r e s s u r e r e a c t o r s f o r m a k i n g c e l l u l o s e 1 1 1 d u r i n g A F E X , w h i l e a l s o a v o i d i n g t h e r e v e r s i o n o f c e l l u l o s e H I t o I d u r i n g c o n v e n t i o n a l h i g h - m o i s t u r e A F E X . T r e a t m e n t w i t h l i q u i d a m m o n i a a t l o w t e m p e r a t u r e s w o u l d a l s o p o s s i b l y p r e v e n t t h e c o a l e s c e n c e o f l i g n i n ( d u e t o a g l a s s t r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e > 1 3 0 ° C ; [ 3 2 4 ] ) i n t o e n z y m e i n h i b i t o r y g l o b u l e s f r o m s e c o n d a r y c e l l w a l l s ( b a s e d o n T E M fi n d i n g s f r o m C h a p t e r 4 . 1 f o r L o w - W A F E X c o r n s t o v e r s a m p l e s ) [ 4 0 ] . 4 . 2 . 5 C o n c l u s i o n s N a t i v e p l a n t c e l l w a l l c e l l u l o s e 1 1 3 w a s t r a n s f o r m e d t o c e l l u l o s e I I I ] a n d c e l l u l o s e I I I b y t r e a t i n g t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s w i t h a n h y d r o u s l i q u i d a m m o n i a a n d s o d i u m h y d r o x i d e , r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , t h e r e w a s n o c e l l u l o s e p o l y m o r p h m o d i fi c a t i o n u p o n t r e a t m e n t w i t h 2 8 - 3 0 % a m m o n i u m h y d r o x i d e . T h e e x t e n t o f c o n v e r s i o n o f c e l l u l o s e I t o i t s v a r i o u s o t h e r p o l y m o r p h s t a t e s w a s q u a n t i fi e d u s i n g X - r a y d i f f r a c t i o n ( X R D ) a n d R a m a n s p e c t r o s c o p y . I t w a s f o u n d t h a t c e l l u l o s e I t o 1 1 1 1 f o r m a t i o n f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h a n h y d r o u s l i q u i d a m m o n i a w a s l a r g e l y i n d e p e n d e n t o f t e m p e r a t u r e , i n p r e s e n c e o f e x c e s s l i q u i d a n u n o n i a a n d a b s e n c e o f w a t e r . T h e e x t e n t o f c o n v e r s i o n o f c e l l u l o s e I t o 1 1 1 1 m e a s u r e d t h r o u g h X R D a n d R a m a n s p e c t r o s c o p y s h o w e d a s t r o n g c o r r e l a t i o n ( R 2 = 0 . 9 8 ) . I t w a s f o u n d t h a t t h e c e l l u l o s e c r y s t a l s t r u c t u r e p l a y e d a s i g n i fi c a n t r o l e o n e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f v a r i o u s c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s ( i . e . A v i c e l , C o t t o n L i n t e r s , 1 1 9 C o t t o n ) . T h e o r d e r o f e n z y m a t i c d i g e s t i o n r a t e f o r t h e v a r i o u s p o l y m o r p h s o f A v i c e l w e r e f o u n d t o v a r y a s f o l l o w s ; A m o r p h o u s C e l l u l o s e > C e l l u l o s e 1 1 1 > C e l l u l o s e I I > C e l l u l o s e I . T h e r a t e o f e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f c e l l u l o s e I I I ; w a s f o u n d t o b e a t l e a s t 1 . 5 - 2 . 5 f o l d g r e a t e r t h a n n a t i v e c e l l u l o s e I , w h i c h w a s d e p e n d e n t o n t h e c e l l u l o s e s o u r c e ( A v i c e l v s . C o t t o n ) , e n z y m e l o a d i n g ( 1 . 5 v s . 1 5 F P U l o a d i n g ) a n d e x t e n t o f h y d r o l y s i s ( 6 v s . 2 4 h o u r s ) . C u r r e n t l y , t h e a c t u a l m e c h a n i s m f o r t h e e n h a n c e d d i g e s t i b i l i t y o f c e l l u l o s e 1 1 1 o v e r n a t i v e c e l l u l o s e i s u n c l e a r . S t u d i e s w i t h p u r i fi e d c e l l u l a s e s s h o u l d h e l p r e v e a l w h i c h g l y c o s y l h y d r o l a s e f a m i l i e s b e n e fi t t h e m o s t d u e t o t h e m o d i fi c a t i o n o f t h e c e l l u l o s e c r y s t a l s t r u c t u r e . L a s t l y , t h e i n h i b i t i o n o f c e l l u l a s e s d u e t o f o r m a t i o n o f M a i l l a r d a n d a l k a l i i n d u c e d p e e l i n g r e a c t i o n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s s u g g e s t a n e e d f o r b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e c e l l w a l l d e c o m p o s i t i o n p r o d u c t s f o r m e d d u r i n g A F B X . 1 2 0 C H A P T E R 5 : C O M P A R I N G M A J O R C E L L W A L L D E G R A D A T I O N P R O D U C T S F O R M E D D U R I N G A M M O N I A A N D D I L U T E A C I D B A S E D P R E T R E A T M E N T S 5 . 1 . 1 A b s t r a c t D i l u t e - a c i d p r e t r e a t m e n t o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s h a s b e e n k n o w n t o p r o d u c e v a r i o u s d e g r a d a t i o n c o m p o u n d s t h a t i n h i b i t d o w n s t r e a m b i o l o g i c a l p r o c e s s i n g . H o w e v e r , s i m i l a r s t u d i e s h a v e n e v e r b e e n c a r r i e d o u t f o r a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t s a t v a r y i n g t r e a t m e n t s e v e r i t i e s . T h e s e v e r i t y ( i . e . r e s i d e n c e t i m e , t e m p e r a t u r e a n d a m m o n i a / w a t e r l o a d i n g s ) o f A F E X p r e t r e a t m e n t i s b e l i e v e d t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n p h y s i c o c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n o f t h e L i g n i n - C a r b o h y d r a t e - C o m p l e x ( L C C ) . T h e L C C i s c o m p r i s e d o f h e m i c e l l u l o s e s i d e - c h a i n s ( e . g . u r o n i c a c i d a n d a r a b i n o s e r e s i d u e s ) c r o s s - l i n k e d t o p h e n o l i c a r o m a t i c m o i e t i e s ( e . g . f e r u l i c , c i n n a m i c , p — c o u m a r i c ) t h a t r e s u l t i n i m p e d i n g e n z y m e a c c e s s i b i l i t y . T h e c h e m i s t r y o f a m m o n i a b a s e d t r e a t m e n t s w a s b e t t e r u n d e r s t o o d t h r o u g h i d e n t i fi c a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f v a r i o u s d e g r a d a t i o n c o m p o u n d s p r o d u c e d d u r i n g A F E X t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r . S o l v e n t e x t r a c t i o n o f u n t r e a t e d , A F E X a n d d i l u t e - a c i d t r e a t e d c o r n s t o v e r w a s c a r r i e d o u t u s i n g a n a c c e l e r a t e d s o l v e n t e x t r a c t o r ( A S E ) f o r s u b s e q u e n t L C / G C - M S a n a l y s i s . T h e m a j o r c o m p o u n d s q u a n t i fi e d i n c l u d e ; ( 1 ) o r g a n i c a c i d s ( e . g . a c e t i c , l a c t i c , s u c c i n i c , l e v u l i n i c , f o r m i c ) , ( 2 ) f u r a n s ( e . g . f u r f u r a l , S - H M F , 2 - fi r r o i c a c i d ) , ( 3 ) n i t r o g e n o u s a m m n o l y s i s b y - p r o d u c t s ( e . g . a c e t a m i d e , f e r u l o y l a m i d e , c o u m a r o y l a m i d e ) , ( 4 ) a r o m a t i c a n d p h e n o l i c a c i d s ( 6 . g . p - c o u m a r i c , f e r u l i c a c i d a n d o t h e r c i n n a m y l d e r i v a t i v e s ) , a n d ( 5 ) a r o m a t i c a l d e h y d e s ( e . g . 4 - h y d r o x y - b e n z a d e h y d e , v a n i l l i n , 4 - h y d r o x y - a c e t o p h e n o n e ) . N e a r l y 2 0 - 2 5 % o f a r a b i n o x y l a n ( w / w ) b a s e d o l i g o m e r s r e l e a s e d f r o m t h e c e l l w a l l d u r i n g A F E X w e r e e x t r a c t i b l e b y h o t w a t e r . T h e s e v e r i t y o f A F E X ( e . g . e x t e n t o f a m m o n o l y s i s ) w a s c l o s e l y c o r r e l a t e d t o t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s r a t e o f 1 2 1 t r e a t e d c o r n s t o v e r c e l l w a l l s ( R 2 = 0 . 8 7 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e r e w a s s i g n i fi c a n t i n h i b i t i o n ( 4 0 - 5 0 % l o w e r h y d r o l y s i s y i e l d t h a n c o n t r o l ) o f t h e g l y c o s y l h y d r o l a s e s b y A F E X c o r n s t o v e r d e g r a d a t i o n p r o d u c t s a t h i g h i n h i b i t o r c o n c e n t r a t i o n s . U n d e s i r a b l e s i d e - r e a c t i o n s o f a m m o n i a w i t h c e l l w a l l s o l u b l e s u g a r s a n d p o l y s a c c h a r i d e s ( e . g . M a i l l a r d r e a c t i o n s ) a t h i g h e r t h e r m o c h e m i c a l s e v e r i t y p r o d u c e e n z y m e i n h i b i t o r y p r o d u c t s . O n t h e o t h e r h a n d , i t m i g h t b e p o s s i b l e t o i s o l a t e v a l u a b l e c o - p r o d u c t s ( e . g . p h e n o l i c a m i d e s ) a f t e r A F E X t o m a k e t h e p r o c e s s m o r e e c o n o m i c a l l y a t t r a c t i v e . 5 . 1 . 2 B a c k g r o u n d M o s t p r e t r e a t m e n t s h a v e b e e n f o u n d t o g e n e r a t e s o m e s o r t o f b i o l o g i c a l l y i n h i b i t o r y c o m p o u n d s d u e t o l i g n i n - c a r b o h y d r a t e d e g r a d a t i o n [ 1 3 7 , 1 8 0 ] . T h e k i n d o f i n h i b i t o r y c o m p o u n d s r e l e a s e d a f t e r a t y p i c a l t h e r m o - c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t d e p e n d s o n c e l l w a l l c o m p o s i t i o n a n d p r e t r e a t m e n t m e t h o d . T y p i c a l l y , t h e m o s t p o t e n t i n h i b i t o r y c o m p o u n d s r e l e a s e d d u e t o a l k a l i c a t a l y z e d t h e r r n o - c h e m i c a l d e g r a d a t i o n a r e p r o b a b l y l i g n i n ( e . g . G u a i a c y l , S y r i n g y l , H y d r o x y C i n n a m y l ) a n d h e m i c e l l u l o s e b a s e d [ 2 5 1 ] . G u a i a c y l l i g n i n s ( G - l i g n i n s ) a r e p r e d o m i n a n t l y p o l y r n e r i z a t e s o f c o n i f e r y l a l c o h o l f o u n d i n s o f t w o o d s ( g y m n o s p e r m s ) . G u a i a c y l - S y r i n g y l l i g n i n s ( G S - l i g n i n s ) a r e m a d e u p o f v a r y i n g p r o p o r t i o n s o f c o n i f e r y l a n d s i n a p y l a l c o h o l , t y p i c a l o f h a r d w o o d s . G S l i g n i n s i n a d d i t i o n t o s i g n i fi c a n t a m o u n t s o f p - h y d r o x y c i n n a m y l m o i e t i e s ( G S H - l i g n i n s ) a r e f o u n d c o m m o n l y i n g r a s s e s a n d m o n o c o t y l e d o n s ( i . e . c o r n s t o v e r ) . L i g n i fi c a t i o n o f x y l e m c e l l s t a k e s p l a c e b y i n t e r l a m e l l a r d e p o s i t i o n o f l i g n i n w i t h i n t h e c a r b o h y d r a t e m a t r i x o f t h e c e l l w a l l a l o n g w i t h f o r m a t i o n o f c h e m i c a l b o n d s w i t h h e m i c e l l u l o s i c s u g a r s . L i g n i fi c a t i o n i s t h o u g h t t o b e i n fl u e n c e d b y t h e c a r b o h y d r a t e m a t r i x u l t r a s t r u c t u r a l l a y o u t [ 3 2 5 ] . F o r m o n o c o t y l e d o n s ( i . e . c o r n s t o v e r ) f e r u l i c a c i d s a r e d e p o s i t e d w i t h i n t h e m i d d l e l a m e l l a 1 2 2 a n d c e l l c o m e r s d u r i n g e a r l y l i g n i fi c a t i o n w h i l e p - c o u m a r i c a n d s i n a p i c a c i d s a r e d e p o s i t e d i n t h e s e c o n d a r y w a l l s [ 3 2 6 - 3 2 8 ] . H o w e v e r , r e c e n t r e s u l t s h a v e s h o w n f e r u l a t e d e p o s i t i o n w i t h i n c o m s t o v e r i n t e m o d a l s e c o n d a r y c e l l w a l l s m e d i a t e s l i g n i n - h e m i c e l l u l o s e c r o s s - l i n k i n g [ 8 3 ] . T h e s e p h e n o l i c a c i d s a r e i n v a r i a b l y c o n n e c t e d b y a n e s t e r b o n d t o a r a b i n o x y l a n s i n g r a s s e s a n d b y a n e t h e r b o n d t o t h e l i g n i n c o r e . E n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y h a s b e e n s h o w n t o b e s t r o n g l y d e p e n d e n t o n f e r u l a t e c r o s s - l i n k i n g w i t h i n t h e c e l l w a l l [ 7 9 , 8 3 , 2 7 6 , 2 8 1 , 3 2 9 - 3 3 3 ] . I t w o u l d b e o f i n t e r e s t t o d e t e r m i n e t h e e x t e n t o f m o d i fi c a t i o n o f t h e f e r u l a t e e s t e r l i n k a g e s f o r v a r y i n g p r e t r e a t m e n t s e v e r i t i e s t o h e l p d e v e l o p b e t t e r m o d e l s t o p r e d i c t l i g n o c e l l u l o s i c d i g e s t i b i l i t y a n d p r e t r e a t m e n t r e a c t i o n k i n e t i c s . 5 . 1 . 2 . 1 D e g r a d a t i o n p r o d u c t s f o r m e d d u r i n g a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t s A F E X p r e t r e a t m e n t h a s s e v e r a l a d v a n t a g e s o v e r d i l u t e a c i d b a s e d p r e t r e a t m e n t s [ 9 5 ] . A c i d i c p r e t r e a t m e n t s d e g r a d e m o n o m e r i c s u g a r s t o b i o l o g i c a l i n h i b i t o r s ( e . g . f u r a n s , l e v u l i n i c a c i d ) t h a t d e c r e a s e o v e r a l l p r o d u c t y i e l d a n d i n c r e a s e d e t o x i fi c a t i o n r e l a t e d p r o c e s s i n g c o s t s [ 3 3 4 - 3 3 7 ] . D i l u t e — a c i d p r e t r e a t m e n t b a s e d l i g n o c e l l u l o s i c h y d r o l y s a t e s a n d h e m i c e l l u l o s e - r i c h a q u e o u s s t r e a m s h a v e b e e n w i d e l y s t u d i e d . S e v e r a l c l a s s e s o f p o t e n t i a l m i c r o b i a l i n h i b i t o r s f r o m a c i d p r e t r e a t e d b i o m a s s h a v e b e e n i d e n t i fi e d , i n c l u d i n g o r g a n i c a c i d s , p h e n o l i c s a n d a r o m a t i c a l d e h y d e s [ 1 8 0 , 3 3 4 , 3 3 6 , 3 3 8 , 3 3 9 ] . W e t - a l k a l i o x i d i z e d p r e t r e a t m e n t o f w h e a t s t r a w w a s s h o w n t o p r o d u c e s e v e r a l c a r b o x y l i c a c i d a n d p h e n o l i c b a s e d d e g r a d a t i o n p r o d u c t s [ 1 8 0 ] . A l t h o u g h , A F E X c o r n s t o v e r h y d r o l y s a t e s a r e e a s i l y f e r m e n t a b l e w i t h n o d e t o x i fi c a t i o n n e c e s s a r y [ 3 4 0 ] , o n - g o i n g r e s e a r c h h a s i n d i c a t e d i n h i b i t i o n d u r i n g x y l o s e f e r m e n t a t i o n a n d r e d u c e d c e l l u l a s e a c t i v i t y ( I O - 3 0 % l o w e r a c t i v i t y o f c o m m e r c i a l 1 2 3 e n z y m e c o c k t a i l s i n p r e s e n c e o f A F E X c o r n s t o v e r w a t e r e x t r a c t i v e s ) b y s o m e o f t h e s e u n k n o w n A F E X d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h e r e a r e a f e w p u b l i c a t i o n s t h a t h a v e i n d i c a t e d f o r m a t i o n o f p o t e n t i a l i n h i b i t o r y c o m p o u n d s d u r i n g A F E X b u t d i d n o t i d e n t i f y t h e m [ 1 6 1 , 1 6 2 , 2 3 6 , 3 4 1 ] . A F E X p r o d u c e d g r e a t e r a m o u n t s o f h o t - w a t e r a n d e t h a n o l - t o l u e n e e x t r a c t i v e s f o r s e v e r a l a g r i c u l t u r a l r e s i d u e s a n d f o r a g e s . A F E X d e g r a d a t i o n p r o d u c t b a s e d e x t r a c t i v e s w e r e a l s o f o u n d t o i n h i b i t m o n o m e r i c s u g a r f e r m e n t a t i o n b y P a c h y s o l e n t a n n o p h i l u s [ 3 4 2 ] . M e s - H a r t r e e a n d c o l l e a g u e s [ 3 4 1 ] f o u n d . t h a t w a t e r a n d m e t h a n o l e x t r a c t i o n o f A F E X t r e a t e d w h e a t s t r a w a n d a s p e n w o o d g a v e s i g n i fi c a n t l y h i g h e r s a c c h a r i fi c a t i o n r a t e s a n d e t h a n o l m e t a b o l i c y i e l d s . U n p u b l i s h e d w o r k i n d i c a t e s t h a t n e a r l y 2 - 3 g r a m s a m m o n i a p e r 1 0 0 g r a m s o f d r y c o r n s t o v e r r e m a i n s w i t h t h e t r e a t e d b i o m a s s d u e t o r e a c t i o n o f a m m o n i a w i t h v a r i o u s c e l l w a l l c o m p o n e n t s . T h e r e s i d u a l n i t r o g e n o u s c o m p o u n d s i n A F E X t r e a t e d b i o m a s s a r e b e l i e v e d t o b e a p o t e n t i a l n i t r o g e n s o u r c e d u r i n g m i c r o b i a l f e r r n e n t a t i o n s a n d f o r u s e a s a n i m a l f e e d [ 8 , 3 4 0 ] , b u t t h e i r c h e m i c a l c o m p o s i t i o n i s l a r g e l y u n k n o w n . W e i m e r a n d c o l l e a g u e s [ 1 6 2 ] n o t i c e d a s i g n i fi c a n t i n c r e a s e i n t h e n i t r o g e n c o n t e n t o f s u p e r - c r i t i c a l a m m o n i a t r e a t e d h a r d w o o d p o s s i b l y d u e t o a m m o n o l y s i s b a s e d r e a c t i o n s o f L C C e s t e r - l i n k a g e s a n d h e m i c e l l u l o s e a c e t y l g r o u p s . T h e m a j o r d e g r a d a t i o n c o m p o u n d f o r a m m o n i a t r e a t e d h a r d w o o d s i d e n t i fi e d s o f a r h a s b e e n a c e t a m i d e [ 1 6 2 , 2 3 6 ] . I n t e r e s t i n g l y , e v e n a f t e r e x t r a c t i n g t h e a c e t a m i d e f r o m a m m o n i a t r e a t e d w o o d y s a m p l e s t h e r e i s s t i l l s o m e ‘ a m i d e ’ f o u n d a s s o c i a t e d t o t h e i n s o l u b l e h e m i c e l l u l o s e . T h i s i s a t t r i b u t e d p o s s i b l y t o a m i d a t e d u r o n i c a c i d s i d e - c h a i n r e s i d u e s b o u n d t o i n s o l u b l e x y l a n [ 2 6 7 , 3 4 3 ] . D e - e s t e r i fi c a t i o n o f L C C l i n k a g e s b e t w e e n f e r u l i c a c i d - a r a b i n o s e a n d c o u m a r i c a c i d - l i g n i n a r e e x p e c t e d t o r e s u l t i n t h e f o r m a t i o n o f 1 2 4 p h e n o l i c a c i d s a n d t h e i r c o r r e s p o n d i n g a m i d e a n a l o g s . A l k a l i i n d u c e d d e g r a d a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s t o c a r b o x y l i c a c i d s i s a n o t h e r i m p o r t a n t c l a s s o f d e g r a d a t i o n r e a c t i o n s t h a t t a k e p l a c e d u r i n g a l k a l i n e p u l p i n g o f w o o d y b i o m a s s [ 3 2 0 , 3 4 4 ] , b u t h a v e n e v e r b e e n s t u d i e d f o r A F E X . O v e r a l l , t h e r e h a s n e v e r b e e n a d e t a i l e d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n y o f t h e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s f o r m e d d u r i n g A F E X p r e t r e a t m e n t t h a t m a y h a v e a s i g n i fi c a n t i n h i b i t o r y r o l e o n d o w n s t r e a m b i o l o g i c a l p r o c e s s i n g . 5 . 1 . 2 . 2 S p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f a m m o n i a p r e t r e a t e d b i o m a s s S e v e r a l s p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u e s l i k e F o u r i e r t r a n s f o r m i n f r a - r e d ( F T I R ) , X - r a y d i f f r a c t i o n ( X R D ) a n d R a m a n s p e c t r o s c o p y h a v e b e e n u s e d i n t h e p a s t t o i d e n t i f y s i g n i fi c a n t c o m p o s i t i o n a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s [ 1 , 1 8 , 1 6 0 , 3 0 5 , 3 0 6 ] . D i f f u s e r e fl e c t a n c e i n f r a - r e d F o u r i e r t r a n s f o r m ( D R I F T ) s p e c t r o s c o p y h a s b e e n u s e d t o q u a n t i f y s p e c t r o s c o p i c c h a n g e s t h a t t a k e p l a c e i n l i g n o c e l l u l o s i c s a f t e r p r e t r e a t m e n t , i n c l u d i n g A F E X [ 1 8 , 1 6 0 ] . M u l t i v a r i a t e s t a t i s t i c a l a n a l y s i s h a s b e e n c o n d u c t e d t o c o r r e l a t e c h a n g e s i n s p e c t r o s c o p i c d a t a ( c r y s t a l l i n i t y i n d i c e s b y X R D , s u r f a c e l i g n i n c o n t e n t b y fl u o r e s c e n c e , c h e m i c a l c h a n g e s i n b i o m a s s a f t e r p r e t r e a t m e n t b y D R I F T ) t o e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y f o r A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r [ 1 8 , 4 1 , 1 6 0 ] . T h e a u t h o r s f o u n d t h a t i n i t i a l a n d fi n a l r a t e s o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s w e r e s i g n i fi c a n t l y a f f e c t e d b y t h e e s t e r - c a r b o n y l c o n t e n t ( d e t e r m i n e d b y D R I F T ) o f t h e p r e t r e a t e d b i o m a s s . C l e a v a g e o f h e m i c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e - l i g n i n c o m p l e x b a s e d e s t e r l i n k a g e s ( 1 7 2 0 - 1 7 4 0 c m - l ) s e e m t o b e t h e m a j o r c h e m i c a l l i n k a g e s t h a t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t p r e t r e a t e d b i o m a s s d i g e s t i b i l i t y [ l 8 , 4 l , 1 6 0 , 1 6 2 ] . T h e c r y s t a l l i n i t y o f t h e b i o m a s s ( b a s e d o n X R D ) w a s f o u n d t o d e c r e a s e a f t e r A F E X b u t r e s i d u a l h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n m i g h t h a v e i n t e r f e r e d w i t h t h a t a n a l y s i s . T h e D R I F T p e a k i n t e n s i t y f o r a l d e h y d i c b o n d s 1 2 5 i n c r e a s e d a f t e r A F E X a n d w a s f o u n d t o s i g n i fi c a n t l y i n fl u e n c e t h e r a t e o f h y d r o l y s i s . N o a t t e m p t w a s m a d e t o d e t e r m i n e t h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s i n o r d e r t o v a l i d a t e t h e s p e c t r o s c o p i c c h a n g e s d e t e c t e d w i t h i n t h e b i o m a s s a f t e r A F E X . B a s e d o n m u l t i - c o m p o n e n t r e g r e s s i o n a n a l y s i s f o r c h a n g e s i n D R I F T s p e c t r a l i n t e n s i t i e s i t i s d i f fi c u l t t o d e t e r m i n e t h e a c t u a l c h e m i c a l a n d p h y s i c a l m o d i fi c a t i o n s t h a t t a k e p l a c e w i t h i n t h e c e l l w a l l a f t e r A F E X p r e t r e a t m e n t t o a c c u r a t e l y p r e d i c t e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y . L a u r e a n o - P e r e z a n d c o l l e a g u e s r e p o r t e d n o s i g n i fi c a n t i m p r o v e m e n t i n t h e p r e d i c t i v e p o w e r o f t h e i r r e g r e s s i o n m o d e l b y i n c o r p o r a t i n g R a m a n s p e c t r a l d a t a [ 1 6 0 ] . H o w e v e r , t h e a u t h o r s p r o v i d e d n o d e t a i l s o n t h e e f f e c t o f l i g n i n a u t o - fl u o r e s c e n c e o n t h e a n a l y s i s . A u t o - fl u o r e s c e n c e i s a m a j o r d e t r i m e n t t o t h e s u c c e s s f u l a n a l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c s u s i n g R a m a n s p e c t r o s c o p y [ 3 1 5 ] . 5 . 1 . 2 . 3 O l i g o s a c c h a r i d e s p r o d u c e d d u r i n g a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t s A F E X t r e a t m e n t h a s b e e n t h o u g h t t o d e g r a d e h e m i c e l l u l o s e s t o o l i g o m e r s a n d s i g n i fi c a n t l y r e d u c e t h e h e m i c e l l u l o s e c o n t e n t b a s e d o n c r u d e c o m p o s i t i o n a l a n a l y s i s c o n d u c t e d o n u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d f o r a g e s ( v i a a c i d / n e u t r a l d e t e r g e n t fi b e r a n a l y s i s ) [ 4 2 , 4 3 ] . T h e e x t e n t o f h e m i c e l l u l o s e b a s e d d e g r a d a t i o n p r o d u c t s i s u n c l e a r d u e t o i n h e r e n t d i s a d v a n t a g e s o f t r y i n g t o p r e d i c t h e m i c e l l u l o s e c o n t e n t u s i n g A D F / N D F ( a c i d - n e u t r a l d e t e r g e n t fi b e r ) b a s e d a n a l y t i c a l m e t h o d s . T h e x y l a n c o n t e n t o f A F E X p r e t r e a t e d s a m p l e s a r e t y p i c a l l y 0 - 3 0 % l o w e r t h a n u n t r e a t e d [ 4 2 , 4 3 , 3 4 5 ] , d e p e n d i n g o n h o w c o m p o s i t i o n a l a n a l y s i s i s c o n d u c t e d . T h i s d i s c r e p a n c y i s s e e n i f t h e a r a b i n o x y l a n b a s e d o l i g o m e r s a r e s o l v e n t e x t r a c t e d p r i o r t o a c i d h y d r o l y s i s b a s e d c o m p o s i t i o n a l a n a l y s i s ( N R E L L A P 0 0 2 , [ 3 4 6 ] ) , r e s u l t i n g i n a 2 0 - 3 0 % d e c r e a s e i n x y l a n c o n t e n t . I n c r e a s i n g a m m o n i a l o a d i n g s h a v e b e e n f o u n d t o d e c r e a s e t o t a l h e m i c e l l u l o s e c o n t e n t i n 1 2 6 s u g a r b e e t p u l p a n d p r o d u c e l o w e r a m o u n t s o f m o n o m e r i c s u g a r s ( a r a b i n o s e , g a l a c t u r o n i c a c i d ) [ 2 3 5 ] . A m m o n i a r e c y c l e p e r c o l a t i o n ( A R P ) b a s e d p r e t r e a t m e n t i s r e s p o n s i b l e f o r e x t r a c t i o n o f a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f a r a b i n o x y l a n b a s e d h e m i c e l l u l o s e s fi ' o m c o r n s t o v e r ( i n d i c a t e d b y d e c r e a s e i n x y l o s e a n d a r a b i n o s e c o n t e n t a f t e r A R P ) b u t n o d e t a i l e d a n a l y s i s h a v e b e e n c o n d u c t e d t o i d e n t i f y t h e s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s o f h e m i c e l l u l o s e d u r i n g A R P t r e a t m e n t [ 1 1 0 , 3 4 7 , 3 4 8 ] . I n t e r e s t i n g l y , i t w a s m o r e d i f fi c u l t t o e x t r a c t h e m i c e l l u l o s e o l i g o m e r s fi ' o m p o p l a r d u r i n g A R P b a s e d p r e t r e a t m e n t s c o m p a r e d t o c o r n s t o v e r , w h i c h m i g h t b e d u e t o d i f f e r e n c e s i n t h e h e m i c e l l u l o s e a n d L C C o r g a n i z a t i o n i n h a r d w o o d s c o m p a r e d t o a g r i c u l t u r a l s t r a w b a s e d r e s i d u e s [ 3 4 8 ] . T h e r e h a v e b e e n n o d e t a i l e d e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d i n t h e p a s t t o s t u d y t h e e f f e c t o f A F E X o n h e m i c e l l u l o s e a n d L C C g r o u p b a s e d m o d i fi c a t i o n s . 5 . 1 . 2 . 4 Q u a n t i t a t i v e m e t h o d s f o r l i g n o c e l l u l o s e d e g r a d a t i o n p r o d u c t a n a l y s i s Q u a n t i t a t i v e d e t e c t i o n o f c h e m i c a l c o m p o u n d s i n a c i d p r e t r e a t m e n t h y d r o l y s a t e s h a s b e e n p e r f o r m e d b y r e v e r s e d - p h a s e h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) p r o c e d u r e d e v e l o p e d f o r a v a r i e t y o f a l i p h a t i c a n d a r o m a t i c a c i d s , a l d e h y d e s a n d p h e n o l i c d e g r a d a t i o n p r o d u c t s o v e r a w i d e r a n g e o f c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 0 2 - 4 1 m M ) [ 3 3 4 ] . A m a j o r a d v a n t a g e o f t h i s t e c h n i q u e i s s i m u l t a n e o u s s e p a r a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f a l i p h a t i c a c i d s , m u l t i f u n c t i o n a l g r o u p s o f a r o m a t i c a n d p h e n o l i c a c i d s i n a s i n g l e c h r o m a t o g r a p h i c r u n . T a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y c o u p l e d w i t h U V d e t e c t i o n a l l o w s d e t e c t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f a l a r g e r a n g e o f a n a l y t e s c o m p a r e d t o o t h e r a n a l y t i c a l p r o c e d u r e s . H o w e v e r , o n e o f t h e m a j o r l i m i a t i o n s o f U V d e t e c t i o n i s t h e c o - e l u t i o n o f c o m p o u n d s t h a t c a n b e a d d r e s s e d b y q u a n t i f y i n g t h e m o l e c u l e o f i n t e r e s t b y s e l e c t e d r e a c t i o n m o n i t o r i n g ( S R M ) u s i n g M S / M S [ 3 4 9 ] . 1 2 7 5 . 1 . 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s S e e a p p e n d i x A - V I I - l , 4 , 5 , 1 1 , 1 9 , 2 0 , 2 1 , 2 2 , 2 3 , 2 8 a n d 3 1 . 5 . 1 . 4 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 5 . 1 . 4 . 1 B y - p r o d u c t s o f h y d r o l y s i s a n d a m m o n o l y s i s o f e s t e r l i n k a g e s d u r i n g A F E X E x t r a c t i n g d e g r a d a t i o n p r o d u c t s f r o m t h e A F E X t r e a t e d s u b s t r a t e w i t h h o t w a t e r g a v e i n s i g h t t o e x t e n t o f a m m o n o l y s i s a n d h y d r o l y s i s d r i v e n r e a c t i o n s d u r i n g A F E X . T h e t o t a l a m o u n t o f w a t e r e x t r a c t a b l e s d e p e n d e d o n t h e A F E X p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y e m p l o y e d ( T a b l e 5 . 1 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e r e s e e m e d t o b e l i n e a r c o r r e l a t i o n ( R 2 = 0 . 8 9 ) b e t w e e n t h e e x t e n t o f e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y a n d t o t a l % w a t e r e x t r a c i b l e s f o r u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d s u b s t r a t e s . T a b l e 5 . 1 T o t a l w a t e r e x t r a c t i b l e s f o r u n t r e a t e d , A F E X a n d d i l u t e a c i d t r e a t e d c o r n s t o v e r c o m p a r e d t o t h e i r r e s p e c t i v e g l u c a n h y d r o l y s i s y i e l d s ( 2 4 h o u r s h y d r o l y s i s t i m e , 1 5 F P U S p e z y m e / g g l u c a n s u p p l e m e n t e d w i t h N o v o 1 8 8 ) . A l l w a t e r e x t r a c t i o n s w e r e d o n e u s i n g t h e A S E ( s e e m e t h o d s s e c t i o n f o r d e t a i l s ) a t 7 0 ° C , 1 5 0 0 p s i ( e x c e p t A c i d t r e a t e d * t h a t w a s e x t r a c t e d a t 2 5 ° C , 1 5 p s 1 ) . S e e T a b l e 4 . A . 1 f o r d e s c r i p t i o n o f e a c h A F E X s e v e r i t y . % W a t e r E x t r a c t i b l e s % G l u c a n C o n v e r s i o n M e a n S t d D e v M e a n S t d D e v U n t r e a t e d 4 . 4 4 0 . 6 3 2 3 0 . 6 L o w - N 1 9 . 2 7 2 . 6 4 6 0 4 . 1 R e g u l a r 1 9 . 3 4 0 . 1 7 6 7 0 . 6 H i g h - N t 2 9 . 0 5 6 . 7 8 7 7 8 . 4 L o w - T 1 4 . 9 6 1 . 1 9 5 5 0 . 4 L o w - W 1 6 . 1 7 0 . 4 1 6 3 1 . 6 A c i d t r e a t e d 4 2 . 8 0 2 . 1 4 - - A c i d t r e a t e d * 2 9 . 7 5 * 4 5 6 * - - T h e s i x m a j o r a m m o n o l y s i s a n d h y d r o l y s i s b y - p r o d u c t s f o r m e d d u r i n g v a r y i n g A F E X s e v e r i t i e s ( S e e T a b l e 4 . A . 1 f o r d e s c r i p t i o n o f A F E X s e v e r i t i e s ) w e r e q u a n t i fi e d 1 2 8 ( a s m g a n a l y t e p e r g m o r i g i n a l s u b s t r a t e ) b y L C - M S / M S a n d a r e d e p i c t e d i n T a b l e 5 . 2 . U n t r e a t e d a n d d i l u t e - a c i d t r e a t e d c o r n s t o v e r d a t a h a v e b e e n r e p o r t e d a s w e l l . I t w a s f o u n d t h a t n e a r t h e o r e t i c a l c l e a v a g e o f t h e a c e t y l l i n k a g e s t o a c e t i c a c i d w a s o b t a i n e d f o r d i l u t e a c i d t r e a t m e n t r e s u l t i n g i n c l o s e t o 3 5 m g a c e t i c a c i d p e r g r a m o f d i l u t e a c i d t r e a t e d c o r n s t o v e r . T a b l e 5 . 2 S i x m a j o r a m m o n o l y s i s a n d h y d r o l y s i s b y - p r o d u c t s ( m g a n a l y t e p e r g m u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ) o f a c e t y l , c o u m a r o y l a n d f e r u l o y l b a s e d e s t e r l i n k a g e s p r o d u c e d d u r i n g A F E X a n d d i l u t e a c i d p r e t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r . S e e T a b l e 4 . A . 1 f o r d e s c r i p t i o n o f e a c h A F E X s e v e r i t y . N A — n o t a p p l i c a b l e A c e t i c a c i d C o u m a r i c a c i d F e r u l i c a c i d m g / g b i o m a s s M e a n S t d D e v M e a n S t d D e v M e a n S t d D e v U n t r e a t e d 1 . 6 1 0 . 0 2 0 . 4 4 0 . 0 3 0 . 1 1 7 0 . 0 0 4 L o w - N 4 . 4 5 0 . 0 6 2 . 5 7 0 . 1 8 0 . 5 0 0 . 0 4 R e g u l a r 4 . 6 1 0 . 0 2 1 . 8 9 0 . 0 9 0 . 1 6 0 . 0 1 H i g h - N t 3 . 7 8 0 . 4 9 1 . 3 0 0 . 1 2 0 . 1 8 0 . 0 2 L o w - T 3 . 0 3 0 . 1 9 1 . 8 2 0 . 1 1 0 . 1 4 0 . 0 1 L o w - W 4 . 9 0 0 . 4 3 1 . 9 0 0 . 1 0 0 . 2 1 0 . 0 1 A c i d t r e a t e d 3 4 . 7 7 6 . 3 0 . 7 4 1 0 . 0 4 5 0 . 4 2 8 0 . 0 2 3 A c e t a m i d e C o u m a r o y l a m i d e F e r u l o y l a m i d e m g / g b i o m a s s M e a n S t d D e v M e a n S t d D e v M e a n S t d D e v U n t r e a t e d N A N A N A N A N A N A L o w - N 2 1 . 8 9 1 . 7 9 2 . 9 6 0 . 0 4 1 . 5 8 0 . 0 6 R e g u l a r 2 5 . 0 4 1 . 1 0 3 . 9 1 0 . 1 4 4 . 7 0 0 . 3 9 H i g h - N t 3 2 . 9 0 2 . 1 8 6 . 9 0 0 . 3 1 7 . 6 7 0 . 4 8 L o w - T 2 4 . 1 1 3 . 6 7 2 . 2 2 0 . 0 9 2 . 4 7 0 . 0 7 L o w - W 2 8 . 0 2 4 . 1 8 2 . 4 4 0 . 0 8 2 . 5 3 0 . 1 7 A c i d t r e a t e d N A N A N A N A N A N A H o w e v e r , o n l y 1 0 - 1 5 % o f t h e t o t a l a c e t y l e s t e r l i n k a g e s w e r e h y d r o l y z e d t o a c e t i c a c i d d u r i n g A F E X ( f o r v a r y i n g A F E X s e v e n t i e s a s s u m i n g m a x i m u m a c e t y l c o n t e n t t o b e 3 5 m g / g b i o m a s s , b a s e d o n r e s u l t s f r o m d i l u t e - a c i d t r e a t e d c o r n s t o v e r a s s h o w n i n T a b l e 5 . 2 ) . M o s t o f t h e a c e t y l l i n k a g e s w e r e a m m o n o l y z e d t o a c e t a m i d e d u r i n g A F E X , w h i c h h a s b e e n r e p o r t e d e a r l i e r f o r s u p e r c r i t i c a l a m m o n i a b a s e d t r e a t m e n t s o f b i r c h w o o d [ 1 6 2 ] . 1 2 9 T h e e x t e n t o f c l e a v a g e o f t h e a c e t y l l i n k a g e s f o r L o w - N , R e g u l a r , H i g h - N t , L o w - T a n d L o w - W , b a s e d o n t h e a v e r a g e c o m p o s i t i o n , w a s f o u n d t o b e a r o u n d 7 5 % , 8 5 % , 1 0 5 % , 7 8 % a n d 9 4 % , r e s p e c t i v e l y . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t i r r e s p e c t i v e o f t h e p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y , c l o s e t o 8 0 - 1 0 0 % o f t h e a c e t y l l i n k a g e s a r e h y d r o l y z e d o r a m m o n o l y z e d d u r i n g A F E X . H i g h e r % c o n v e r s i o n s t o a c e t a m i d e a r e n o t e d f o r p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s c a r r i e d o u t a t h i g h e r a m m o n i a t o w a t e r l o a d i n g s ( 3 : 1 i n p r e s e n c e o f 0 . 6 : 1 w a t e r o r 1 : 1 i n a b s e n c e o f w a t e r ) f o r l o n g e r r e s i d e n c e t i m e s ( 4 5 m i n ) . A F E X r e a c t i o n t e m p e r a t u r e ( 7 0 v s . 1 3 0 ° C ) d o e s n o t s e e m t o p l a y a s i g n i fi c a n t r o l e i n t h e c l e a v a g e o f a c e t y l l i n k a g e s , a t s u f fi c i e n t l y l o n g r e s i d e n c e t i m e p e r i o d s ( 1 5 m i n s ) . H o w e v e r , i t w o u l d b e o f i n t e r e s t t o c a r r y o u t d e t a i l e d k i n e t i c s t u d i e s t o d e v e l o p k i n e t i c m o d e l s f o r a m m o n o l y s i s a n d h y d r o l y s i s o f a c e t y l l i n k a g e s d u r i n g A F E X . T h e e x t e n t o f a m m o n o l y s i s a n d h y d r o l y s i s o f c o u m a r o y l a n d f e r u l o y l b a s e d e s t e r l i n k a g e s w a s m o r e c l o s e l y a f f e c t e d b y A F E X p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y . T h e m a x i m u m a m o u n t o f c l e a v e d c o u m a r o y l a n d f e r u l o y l l i n k a g e s ( a s a c i d s a n d a m i d e s ) d u r i n g H i g h - N t A F E X w e r e a b o u t 8 . 2 a n d 7 . 8 5 m g / g s u b s t r a t e , r e s p e c t i v e l y . I n t e r e s t i n g l y , t h e t o t a l a m o u n t o f p h e n o l i c a c i d s ( c o u m a r i c a n d f e r u l i c ) p r e s e n t a f t e r d i l u t e a c i d t r e a t m e n t i s s i g n i fi c a n t l y l o w e r . T h i s i s m o s t l i k e l y d u e t o t h e a c i d c a t a l y z e d d e c a r b o x y l a t i o n o f t h e h y d r o l y z e d p h e n o l i c a c i d s d u r i n g d i l u t e a c i d p r e t r e a t m e n t [ 3 5 0 , 3 5 1 ] . S o m e o f t h e b y - p r o d u c t s o f t h e s e a c i d c a t a l y z e d d e g r a d a t i o n r e a c t i o n s o f p h e n o l i c a c i d s a r e s h o w n i n T a b l e 5 . 3 . T h e r a t i o o f t h e a m m o n o l y s i s t o h y d r o l y s i s p r o d u c t s w a s f o u n d t o b e c l o s e l y d e p e n d e n t o n t h e A F E X p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s e m p l o y e d ( H i g h - N t v s . L o w - N ) a n d t h e t y p e o f e s t e r l i n k a g e ( a c e t y l v s . p h e n o l i c e s t e r l i n k a g e ) . T h e r a t i o o f c o u m a r o y l a m i d e ( a n d f e r u l o y l d a t a i n p a r e n t h e s e s ) t o c o u m a r i c a c i d p r o d u c e d d u r i n g L o w - N , R e g u l a r , 1 3 0 H i g h - N t , L o w - T a n d L o w - W w a s f o u n d t o b e 1 . 1 5 ( 3 . 1 6 ) , 2 . 0 7 ( 2 9 . 3 8 ) , 5 . 3 1 ( 4 2 . 6 1 ) , 1 . 2 2 ( 1 7 . 6 4 ) a n d 1 . 2 8 ( 1 2 . 0 5 ) , r e s p e c t i v e l y . T h e e x t e n t o f a m m o n o l y s i s t o h y d r o l y s i s f o r t h e c o u m a r o y l a n d f e r u l o y l l i n k a g e s ( b a s e d o n r a t i o o f a c i d s t o a m i d e s f o r m e d ) w e r e 4 . 6 a n d 1 3 . 5 f o l d h i g h e r , r e s p e c t i v e l y , f o r H i g h - N t v e r s u s L o w - N b a s e d A F E X c o n d i t i o n . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t t h e f e r u l o y l l i n k a g e s a r e m o r e s t r o n g l y a f f e c t e d b y A F E X p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y . T h e t o t a l c o u m a r a t e a n d f e r u l a t e c o n t e n t o f a l l p r e t r e a t e d s u b s t r a t e s w a s f o u n d t o b e w i t h i n t h e r a n g e ( 1 0 - 2 0 m g p h e n o l i c a c i d s p e r g r a m o f u n t r e a t e d c e l l w a l l ) o f p r e v i o u s l y r e p o r t e d d a t a f o r m a i z e s t a l k s [ 3 3 0 , 3 5 2 ] . I t h a s b e e n p r e v i o u s l y r e p o r t e d t h a t t h e m a x i m u m a m o u n t o f c o u m a r i c a c i d a n d f e r u l i c a c i d b a s e d e s t e r l e v e l s i n m a i z e i n t e m o d e s c a n r e a c h a s h i g h a s 2 0 a n d 7 m g / g b i o m a s s , r e s p e c t i v e l y [ 8 1 ] . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e a m o u n t o f t o t a l p h e n o l i c a c i d c o n t e n t w o u l d b e h i g h e r c o n s i d e r i n g m o s t o f t h e f e r u l i c a c i d i s e t h e r l i n k e d a n d i s n o t d e t e c t e d d u r i n g c o n v e n t i o n a l s a p o n i fi c a t i o n b a s e d a s s a y s . C o u m a r i c a c i d h a s b e e n f o u n d t o b e e x t e n s i v e l y e s t e r i fi e d ( S O - 9 0 % e s t e r c o n t e n t ) t o l i g n i n , a s c o m p a r e d t o f e r u l i c a c i d t h a t i s e x t e n s i v e l y l i n k e d t o a r a b i n o s e s i d e - c h a i n s ( 3 0 - 5 0 % e s t e r c o n t e n t ) . F e r u l i c a c i d b a s e d e s t e r - e t h e r l i n k a g e s b e t w e e n l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e a r e t h o u g h t t o b e m a j o r i m p e d i m e n t s t o e n h a n c e d e n z y m e d i g e s t i b i l i t y [ 3 3 1 ] . F e r u l a t e b a s e d h e m i c e l l u l o s e e s t e r s h a v e b e e n k n o w n t o b e e s s e n t i a l n u c l e a t i o n s i t e s f o r l i g n i fi c a t i o n d u r i n g g r a s s c e l l w a l l g r o w t h [ 8 4 , 2 7 6 , 3 3 2 ] . T h e r e w a s i n d e e d a s t r o n g l i n e a r c o r r e l a t i o n ( R 2 = 0 . 8 7 ) f o u n d b e t w e e n t h e e x t e n t o f f e r u l o y l l i n k a g e c l e a v a g e d u r i n g A F E X t o t h e e n z y m a t i c d i g e s t i o n r a t e o f c e l l u l o s e a s s h o w n i n F i g u r e 5 . 1 . 1 3 1 1 3 2 T a b l e 5 . 3 M a s s b a l a n c e s f o r m a j o r d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( m g a n a l y t e p e r g m u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ) p r o d u c e d d u r i n g A F E X ( f o r R e g u l a r a n d H i g h - N t s e v e r i t i e s ) a n d d i l u t e a c i d b a s e d p r e t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r b a s e d o n G C M S ( * ) , H P L C - M S / M S ( a m m o n o l y s i s * * b a s e d ) a n d H P L C — R I ( * * * ) a n a l y s e s . W h e r e ; N D a n d N A s t a n d f o r n o t d e t e c t e d a n d n o t a v a i l a b l e , r e s p e c t i v e l y . C a t e g o r y D e g r a d a t i o n p r o d u c t s U n t r e a t e d R e g u l a r H i g h - N t A c i d t r e a t e d U n t r e a t e d R e g u l a r H i g h - N t A c i d t r e a t e d m g a n a l y t e / g m d r y w t b i o m a s s M e a n M e a n M e a n M e a n S t d D e v S t d D e v S t d D e v S t d D e v C a r b o x y l i c a c i d s m a l o n i c a c i d 0 . 0 6 1 0 . 0 5 5 0 . 0 4 5 0 . 0 2 1 0 . 0 1 3 0 . 0 0 4 0 . 0 0 6 0 . 0 1 1 l a c t i c a c i d 0 . 1 2 7 0 . 2 9 0 0 . 2 7 7 1 . 5 6 7 0 . 0 2 8 0 . 0 7 2 0 . 2 4 4 0 . 1 1 0 m a l e i c a c i d 0 . 0 0 4 0 . 0 0 6 0 . 0 1 6 0 . 0 1 9 0 . 0 0 2 0 . 0 0 5 0 . 0 2 0 0 . 0 0 7 c i s - a c o n i t i c a c i d 0 . 7 1 4 0 . 3 9 7 0 . 3 7 6 0 . 0 2 4 0 . 6 2 2 0 . 0 3 0 0 . 0 2 5 0 . 0 1 1 m e t h y l m a l o n i c a c i d 0 . 0 2 4 N D N D N D 0 . 0 4 2 - - — s u c c i n i c a c i d 0 . 2 8 4 0 . 4 9 1 0 . 3 9 7 0 . 2 1 3 0 . 0 4 5 0 . 1 1 4 0 . 0 3 0 0 . 0 2 8 f u m a r i c a c i d 0 . 2 3 0 0 . 2 4 0 0 . 1 3 5 0 . 0 4 0 0 . 1 2 6 0 . 1 9 6 0 . 0 0 3 0 . 0 0 1 t r a n s - a c o n i t i c a c i d 0 . 9 9 1 1 . 8 7 4 1 . 5 2 9 0 . 2 7 5 0 . 4 8 0 0 . 1 2 2 0 . 0 1 9 0 . 1 8 6 l e v u l i n i c a c i d 0 . 0 8 4 0 . 0 7 8 0 . 0 8 6 3 . 2 2 0 0 . 1 1 0 0 . 0 3 0 0 . 0 3 4 2 . 0 5 8 g l u t a r i c a c i d 0 . 0 0 5 0 . 0 0 7 0 . 0 1 5 0 . 0 1 2 0 . 0 0 0 0 . 0 0 2 0 . 0 0 6 0 . 0 0 5 i t a c o n i c a c i d 0 . 0 0 6 0 . 0 1 9 0 . 0 3 6 0 . 6 2 1 0 . 0 0 2 0 . 0 0 9 0 . 0 2 0 0 . 0 1 9 2 - h y d r o x y - 2 - m e t h y 1 b u t y r i c a c i d 0 . 0 0 3 0 . 0 0 3 0 . 0 0 1 0 . 0 0 1 0 . 0 0 0 5 0 . 0 0 0 4 0 . 0 0 0 2 0 . 0 0 1 g a l l i c a c i d N D N D N D 0 . 0 0 2 - - 0 . 0 0 1 a d i p i c a c i d 0 . 0 0 3 0 . 0 0 2 0 . 0 0 3 0 . 0 0 5 0 . 0 0 1 0 . 0 0 0 4 0 . 0 0 0 3 0 . 0 0 3 a c e t i c a c i d " 1 . 6 1 4 . 6 1 3 . 7 8 3 4 . 7 7 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 4 9 6 . 3 f o r m i c a c i d 0 . 3 2 4 0 . 9 1 2 N A 3 . 1 7 2 - - - - A m i d e s f e r u l o y l a m i d e “ N D 4 . 7 0 3 7 . 6 6 6 N D - 0 . 3 9 2 0 . 4 7 6 - c o u m a r o y l a m i d e " N D 3 . 9 1 6 . 9 N D - 0 . 1 4 0 . 3 1 - a c e t a m i d e " N D 2 5 . 0 4 3 2 . 9 N D - 1 . 1 2 . 1 8 - F u r a n s 2 - f u r o i c a c i d 0 . 0 0 3 0 . 0 0 5 0 . 0 0 5 0 . 1 5 8 0 . 0 0 2 0 . 0 0 0 0 . 0 0 2 0 . 0 6 4 5 - h y d r o x y m e t h y l f u r f u r a l " 0 . 0 7 0 . 6 4 N A 1 5 . 7 0 . 0 7 0 . 6 - 4 . 3 f u r f u r a l " 0 . 0 0 1 0 . 0 0 3 0 . 0 0 2 7 . 9 4 0 . 0 0 0 5 0 . 0 0 0 3 0 . 0 0 0 4 0 . 7 4 S u g a r s g l u c o s e ( m o n o m e r i c a n d o l i g o m e r i c ) * " 2 7 1 8 N A 5 9 3 . 1 1 . 5 - 5 . 5 x y l o s e ( m o n o m e r i c a n d o l i g o m e r i c ) " ” " " l 1 . 2 5 0 N A 1 8 4 0 . 1 1 0 . 5 - 1 8 . 9 a r a b i n o s e ( m o n o m e r i c a n d o l i g o m e r i c ) * * " ' 0 . 3 1 0 N A 3 0 0 . 1 2 . 8 - 3 . 3 d e t a v e e r t D 8 5 5 3 3 1 1 6 4 0 4 4 7 7 5 5 3 3 5 l 0 0 0 4 2 0 0 1 0 2 6 0 1 0 2 0 6 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . d . . d t 0 0 i S 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 c A t N v 3 e 1 1 1 1 1 5 3 3 1 6 8 4 9 0 0 3 0 - 0 0 0 0 5 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 h 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 D - - - - 0 0 g d . i t 0 H S . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 . 0 r a v 2 5 e 0 0 0 0 6 7 2 2 4 0 4 0 6 0 6 1 1 3 l 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 9 1 0 0 0 0 u 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D - - 0 0 0 0 - 0 0 g d e t R S d e t v a e . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 . . 0 0 2 0 3 2 9 0 8 3 4 0 4 0 2 4 1 3 1 e 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D - - - 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 3 r . . . . . . . . . . . . . . . . d . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 t t 0 n S U d e t a e n 8 7 2 5 5 3 5 8 6 2 9 1 1 1 1 0 9 8 8 5 r D a 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 1 1 0 0 0 4 0 0 0 4 2 8 0 1 0 1 6 3 9 6 1 3 1 0 0 4 0 0 1 8 2 0 3 3 8 8 0 8 t e . N d M 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 i c A t N 0 6 2 6 7 7 7 9 7 7 5 8 5 0 3 1 5 1 - 0 2 9 0 0 0 0 5 2 8 0 1 0 2 8 0 0 0 0 n h 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 1 0 0 a 3 D D D 6 A A g N N e . . . . . . . . . . . . . . . . . N N 2 N . 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 i M H r a l n 6 5 3 3 8 1 1 3 1 0 6 6 9 7 0 0 7 7 u a D D 8 2 9 D 8 4 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 2 0 0 9 0 9 5 1 1 0 0 1 0 6 9 0 2 4 3 g e . N N . . . . . . . . . . . . . N . . . . 1 1 3 6 e M 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 R d e t a n a 7 3 3 2 7 2 1 8 4 7 0 0 0 2 4 9 1 0 0 2 2 1 1 0 0 1 1 0 1 4 0 0 0 3 D D D D 4 4 6 8 e 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 3 4 1 7 r N e . . . . . . . . . . . . . . . . . N N N 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 t M n U s s c d d d a d i i i s c c c m y e e d t a a a o h i d n ) s s a m o i s b e s e l l g b b / u g l m o u l o c i e d ( e S u i d b d c c c h n a “ i d y o c S n i i i e l e e d r r i r d o t u d a c d d c i d o o o h a d d ” d a d c e c i E s w z z z m s i d B z l p i i a i c i i y t i a r a t c c o c h p y a a z a e e e e i i a c c c a T e z t a c i e a o l n n n c c i c u n o n e o n c r n d b b b l b c n e c c u W C M l n a d i c c i n c l l c u o i i l a y y y l i e y e i c i i r c i l y l i g m x l i x x x x i g b o y b a e a n o p o o d d s g o c f y y a z m a o t s o o o n l y n l e t p e t i i r r r a x n - u t / r f n - i v m t x x n u r n a r r i o a d d l o d v c e d o c a i a o o a e o e d h y r d y y y o c r r a s a M t y v a s r r y c s y C b f t a d r h h h m a y h d d s - h r r 0 p / r l i i i i o y o d t g d a d d d h h y y p - h h 4 e n - - - - D a 4 4 5 5 , , , , 3 2 3 - - 4 4 - 4 t “ e x x fi E E g m . . . d t n o s y C c r o i 3 t . a g 5 m e e t a C o r l A 3 n e d I l a t o T e c n a l a B s s a b M a T i t l l a a t t o o T T 1 3 3 t n e t n o c e d i m a l y o l u r e f l a t o t d n a 9 5 0 3 . 1 6 5 4 + 7 X 8 8 . 1 0 1 5 = 2 2 . R 3 = ) s l 7 s ) Y n a o i s r e v n o c n a c u l G % s e , t r a u r o t h s b 4 u 2 s r m o i b m g 1 / 6 g m , X ( t n e I 5 t n o , c Y e ( v o y t t s i l n i r b i o t c s e d g e i t d a e c r i t t y a t m i y r z e n v e e s f o X t E n e F t A x e g n n i e y e r w a t v e e b h t n o f i o t ) a l e r s s a m r o o C i b 1 . m 5 g e / r g u m g , i X F ( e d i m a l 4 l y o l u r e f l a 1 3 t o T l 2 l 1 3 4 ( . r q p z ‘ 2 0 u o r s r a i t u o g u u o n l f ) 0 / 0 O W O @ 0 0 0 0 W l \ O W O W O W O P O O W W ‘ Q ‘ V 1 I t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t d u r i n g c o n v e n t i o n a l A F E X ( o r R e g u l a r ) t h e r e i s a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f u n h y d r o l y z e d a c e t y l ( 1 5 % ) , c o u m a r o y l ( 3 0 % ) a n d f e r u l o y l ( 4 0 % ) l i n k a g e s . T h i s w o u l d s u g g e s t t h e n e c e s s i t y f o r a d d i t i o n a l e s t e r a s e a c t i v i t y i n e n z y m e c o c k t a i l s f o r e f fi c i e n t h y d r o l y s i s o f A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r ( S e e C h a p t e r 7 ) . N o n - a m m o n o l y s i s r e a c t i o n s ( 6 . g . M a i l l a r d r e a c t i o n s b e t w e e n a m m o n i a a n d r e d u c i n g s u g a r s ) d u r i n g A F E X p r e t r e a t m e n t o f c e l l w a l l s h a v e n o t b e e n s t u d i e d i n t h e p a s t . T h e e x t e n t o f n i t r o g e n i n c o r p o r a t e d w i t h i n t h e c e l l w a l l d u r i n g A F E X d u e t o r e a c t i o n o f r e d u c i n g s u g a r a l d e h y d e e n d g r o u p s w i t h a m m o n i a w a s e x p l o r e d b y c a r r y i n g o u t A F E X o n c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e ( i . e . A v i c e l ) f o r t w o p r e t r e a t m e n t s e v e r i t i e s ( A F E X - L a n d A F E X - H ) . T h e a m o u n t o f n i t r o g e n i n c o r p o r a t e d w i t h i n t h e p o l y s a c c h a r i d e w a s q u a n t i fi e d b y K j e l d a h l m e t h o d ( T a b l e I I I - 5 . 4 ) . T h e r e w a s a 2 8 0 % i n c r e a s e i n t h e t o t a l n i t r o g e n c o n t e n t o f A F E X t r e a t e d c o m s t o v e r c o m p a r e d t o u n t r e a t e d c o m s t o v e r , l a r g e l y d u e t o f o r m a t i o n o f a m m o n o l y s i s b y - p r o d u c t s ( a c e t a m i d e , f e r u l o y l a m i d e , c o u m a r o y l a m i d e ) . H o w e v e r , t h e t o t a l m e a s u r e d a m m o n o l y s i s b y - p r o d u c t s a c c o u n t f o r l e s s t h a n o n e - t h i r d o f t h e t o t a l n i t r o g e n i n c o r p o r a t e d w i t h i n t h e b i o m a s s a f t e r A F E X ( 2 6 m g t o t a l N i t r o g e n r e a c t e d p e r g m c o r n s t o v e r b a s e d o n K j e l d a h l a n a l y s i s ) . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t s i g n i fi c a n t l o s s o f a m m o n i a d u r i n g A F E X d u e t o u n w a n t e d s i d e - r e a c t i o n o f s o l u b l e s a c c h a r i d e s a n d i n s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e s w i t h a m m o n i a t h a t r e s u l t i n t h e f o r m a t i o n o f i m i d a z o l e s a n d p y r a z i n e s [ 3 5 3 ] . A r o m a t i z a t i o n o f s o l u b l e c a r b o h y d r a t e s v i a c o n d e n s a t i o n w i t h a m m o n i a / a m i n e s , d e h y d r a t i o n a n d p o l y m e r i z a t i o n h a s b e e n w e l l d o c u m e n t e d o v e r t h e y e a r s [ 3 1 9 , 3 2 1 , 3 2 2 , 3 5 3 - 3 5 6 ] . H o w e v e r , t h e fi n a l p r o d u c t s o f M a i l l a r d r e a c t i o n s h a v e b e e n p o o r l y c h a r a c t e r i z e d d u e t o e n o r m o u s c o m p l e x i t y i n t h e r e a c t i o n c h e m i s t r y . T h e r e a c t i o n o f a m m o n i a w i t h i n s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e s ( A v i c e l ) w a s b r i e fl y e x p l o r e d f o r 1 3 5 t w o A F E X c o n d i t i o n s ( A F E X - L a n d A F E X - H , S e e T a b l e I l l - 5 . 4 f o r d e t a i l s ) . I n t e r e s t i n g l y , i n c r e a s i n g t h e a m m o n i a l o a d i n g b y t h r e e - f o l d s p r o d u c e d n e a r l y t h r e e - f o l d h i g h e r n i t r o g e n c o n t e n t o f t h e t r e a t e d s a m p l e s . A s i m i l a r s t o i c h i o m e t r y ( 1 : 1 ) o f n i t r o g e n o u s a d d u c t s f o r m e d d u r i n g r e a c t i o n o f s u g a r s w i t h a m i n o a c i d s h a s b e e n s e e n f o r M a i l l a r d b a s e d r e a c t i o n s [ 3 5 4 , 3 5 6 ] . A n a l y s i s o f t h e t r e a t e d s a m p l e s b y E S C A r e v e a l e d t h a t t h e r e w a s a s i g n i fi c a n t i n c r e a s e i n t h e C l c a r b o n s i g n a l ( r e p r e s e n t a t i v e o f C - C l i n k a g e s ) a f t e r A F E X , e s p e c i a l l y a t t h e h i g h e r t r e a t m e n t s e v e r i t y ( A F E X - H ) . T h i s w o u l d s u g g e s t s i g n i fi c a n t a r o m a t i z a t i o n o f t h e i n s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e s d u e t o c o n d e n s a t i o n r e a c t i o n s w i t h a m m o n i a t h a t w o u l d r e s u l t i n a n i n c r e a s e o f t h e C 1 c a r b o n s i g n a l ( v i a r e d u c t i o n o f C - 0 l i n k a g e s d r i v e n b y d e h y d r a t i o n o f s u g a r s ) . E x t e n s i v e e x t r a c t i o n s o f t h e A F E X t r e a t e d s u b s t r a t e s w i t h m e t h a n o l ( a t 5 0 ° C ) w e r e i n s u f fi c i e n t t o c o m p l e t e l y r e m o v e t h e n i t r o g e n o u s c o m p o u n d s . N e a r l y 3 5 - 4 0 % o f t h e t o t a l n i t r o g e n o u s p r o d u c t s e e m e d t o b e c h e m i c a l l y b o u n d t o t h e i n s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e . E n z y m a t i c h y d r o l y s i s ( b y c e l l u l a s e m i x t u r e s a n d p u r i fi e d c e l l u l a s e e n z y m e s ; d a t a n o t s h o w n ) o f A F E X - L a n d A F E X - H t r e a t e d a v i c e l r e s u l t e d i n 1 0 - 2 0 % a n d 5 0 - 6 0 % l o w e r g l u c a n h y d r o l y s i s y i e l d s ( c o m p a r e d t o u n t r e a t e d c o n t r o l ) , r e s p e c t i v e l y . E x t e n s i v e h o t w a t e r a n d m e t h a n o l e x t r a c t i o n s o f t h e t r e a t e d A v i c e l s u b s t r a t e ( A F E X - H ) w e r e u n a b l e t o m i n i m i z e e n z y m e i n h i b i t i o n , w h i c h w o u l d s u g g e s t s i g n i fi c a n t m o d i fi c a t i o n o f t h e i n s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e h a s r e n d e r e d t h e s u b s t r a t e h i g h l y i n d i g e s t i b l e . E x t e n s i v e i n h i b i t i o n o f g l y c o s y l h y d r o l a s e s b y t h e M a i l l a r d b a s e d n i t r o g e n o u s p r o d u c t s ( b o t h i n s o l u b l e a n d s o l u b l e ) f o r m e d d u r i n g h i g h s e v e r i t y A F E X i s l i k e l y a n d w o u l d n e e d t o b e f u r t h e r e x p l o r e d . T h e e x t e n t o f f o r m a t i o n o f b i o l o g i c a l l y t o x i c n i t r o g e n o u s c o u m p o u n d s , l i k e 4 - m e t h y l i m i d a z o l e , d u r i n g A F E X i s c u r r e n t l y u n k n o w n . T h e s e s t u d i e s w a r r a n t f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n o f t h e n i t r o g e n o u s 1 3 6 r e a c t i o n s d u r i n g A F E X , p o s s i b l y d r i v e n d u e t o c o n d e n s a t i o n o f r e d u c i n g a l d e h y d e e n d s o f s o l u b l e a n d i n s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e s w i t h a m m o n i a . 5 . 1 . 4 . 2 D e g r a d a t i o n p r o d u c t s f o r m e d d u r i n g d i l u t e a c i d a n d A F E X p r e t r e a t m e n t O n e o f t h e l e a d i n g o b s t a c l e s i n c o m p a r i s o n o f d e g r a d a t i o n p r o d u c t s g e n e r a t e d b y d i f f e r e n t p r e t r e a t m e n t m e t h o d s i s t h e l a c k o f a c o m m o n a n a l y t i c a l b a s i s f o r c o m p a r i s o n . T h e s e c u r r e n t s t u d i e s h e l p q u a n t i f y a n d c o m p a r e s o m e o f t h e m a j o r d e g r a d a t i o n p r o d u c t s f r o m t w o l e a d i n g p r e t r e a t m e n t t e c h n o l o g i e s , A F E X a n d d i l u t e - a c i d p r e t r e a t m e n t . T h e q u a n t i fi c a t i o n o f m a j o r d e g r a d a t i o n p r o d u c t s w o u l d a l l o w f u t u r e s t u d i e s d e a l i n g w i t h a d a p t a t i o n o f e n z y m e s a n d e t h a n o l o g e n i c s t r a i n s t o v a r i o u s i n h i b i t o r y c o m p o u n d s . T h i s w o u l d b e r e l e v a n t f o r h i g h - s o l i d s l o a d i n g b a s e d h y d r o l y s i s a n d f e r m e n t a t i o n t h a t i s e x p e c t e d f o r i n d u s t r i a l b a s e d b i o r e fi n e r y p r o c e s s i n g . A d e t a i l e d m a s s b a l a n c e f o r t h e v a r i o u s c a t e g o r i e s o f d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( i . e . c a r b o x y l i c a c i d s , f u r a n s , a m i d e s , s u g a r o l i g o m e r s , a r o m a t i c s ) f o r m e d d u r i n g A F E X ( R e g u l a r a n d H i g h - N t b a s e d s e v e r i t i e s ) a n d d i l u t e a c i d p r e t r e a t m e n t i s p r o v i d e d i n T a b l e 5 . 3 . T h e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s c h o s e n f o r q u a n t i fi c a t i o n w e r e b a s e d o n p r e v i o u s l y p u b l i s h e d l i t e r a t u r e a n d e a s e o f c o m m e r c i a l a v a i l a b i l i t y . T h e m a s s b a l a n c e c l o s u r e i s 7 6 % , 1 0 5 % a n d 6 4 % ( w i t h r e s p e c t t o t o t a l A S E b a s e d w a t e r e x t r a c t i b l e s ) f o r u n t r e a t e d , d i l u t e a c i d a n d R e g u l a r - A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r b a s e d d e g r a d a t i o n p r o d u c t s , r e s p e c t i v e l y . U n l i k e A F E X , t h e r e w a s a s i g n i fi c a n t d e g r a d a t i o n o f t h e s u g a r m o n o m e r s a n d o l i g o m e r s t o f u r a n b a s e d d e r i v a t i v e s d u r i n g d i l u t e a c i d p r e t r e a t m e n t ( e . g . f u r o i c a c i d , f u r f u r a l , 5 - h y d r o x y m e t h y l f u r f u r a l ) . N e a r l y , 2 0 - 2 5 m g o f fi r r a n b a s e d c o m p o u n d s p e r g m o f d i l u t e a c i d t r e a t e d s u b s t r a t e w a s f o u n d c o m p a r e d t o n e g l i g i b l e a m o u n t s f o r m e d d u r i n g A F E X ( < 1 m g / g m s u b s t r a t e ) . F u r a n b a s e d d e r i v a t i v e s a r e k n o w n t o s i g n i fi c a n t l y i n h i b i t 1 3 7 c e l l u l a s e a n d m i c r o b i a l a c t i v i t y d u r i n g e n z y m a t i c h y d r o l y s i s a n d f e r m e n t a t i o n , r e s p e c t i v e l y [ 3 3 8 , 3 5 7 , 3 5 8 ] . F u r fi i r a l a n d S - H M F a r e t y p i c a l l y f o r m e d d u r i n g a c i d c a t a l y z e d d e h y d r a t i o n o f x y l o s e a n d g l u c o s e , r e s p e c t i v e l y [ 3 5 9 ] . F u r f u r a l a n d 5 - H M F f u r t h e r d e g r a d e t o f o r m l e v u l i n i c a n d f o r m i c a c i d s d u r i n g a c i d t r e a t m e n t . I t w a s o f i n t e r e s t t o fi n d t h a t m o s t o f t h e x y l a n a n d a r a b i n a n w a s h y d r o l y z e d d u r i n g d i l u t e - a c i d t r e a t m e n t t o m o n o m e r i c x y l o s e a n d a r a b i n o s e ( 8 5 % a n d 7 0 % o f t h e o r e t i c a l x y l a n a n d a r a b i n a n c o n t e n t , r e s p e c t i v e l y ) . T h e r e m a i n i n g 1 5 % x y l a n a n d 3 0 % a r a b i n a n w a s i n t h e o l i g o m e r i c f o r m . U n l i k e d i l u t e a c i d t r e a t m e n t , m o s t o f t h e a r a b i n o x y l a n r e l e a s e d d u r i n g A F E X f r o m c o r n s t o v e r w a s i n t h e o l i g o m e r i c f o r m . T h e t o t a l w a t e r e x t r a c t i b l e a r a b i n o x y l a n c o n t e n t f o r A F E X c o r n s t o v e r w a s r o u g h l y 2 2 % a n d 2 4 % o f t h e o r e t i c a l x y l a n a n d a r a b i n a n , r e s p e c t i v e l y . P r e v i o u s w o r k w i t h s o d i u m a n d a m m o n i u m h y d r o x i d e t r e a t e d g r a s s e s h a v e q u a n t i fi e d t h e r e l e a s e o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t b r a n c h e d a r a b i n o x y l a n o l i g o m e r s [ 3 6 0 , 3 6 1 ] . A m m o n i a c a t a l y z e d c l e a v a g e o f t h e d i f e r u l a t e b r i d g e s t h a t c r o s s - l i n k h e m i c e l l u l o s e o l i g o m e r s w o u l d b e r e s p o n s i b l e f o r t h e e n h a n c e d r e l e a s e o f t h e a r a b i n o x y l a n r i c h o l i g o m e r s f o r A F E X v e r s u s u n t r e a t e d c e l l w a l l s . A l k a l i i n d u c e d d e g r a d a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s ( t y p i c a l l y f o r x y l a n , s t a r c h a n d s o l u b l e s a c c h a r i d e s ) t o c a r b o x y l i c a c i d s i s a n o t h e r i m p o r t a n t c l a s s o f d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( v i a p e e l i n g r e a c t i o n m e c h a n i s m s , [ 3 4 4 , 3 6 2 , 3 6 3 ] ) p r o d u c e d d u r i n g a l k a l i n e p r e t r e a t m e n t s . P r e t r e a t m e n t t e m p e r a t u r e ( 1 5 0 - 2 0 0 ° C ) a n d b a s e c a t a l y s t ( 1 - 3 M N a O H ) l o a d i n g h a v e b e e n f o u n d t o s i g n i fi c a n t l y a f f e c t t h e f o r m a t i o n o f m o n o a n d d i - c a r b o x y l i c a c i d s f r o m c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e [ 3 4 4 ] . T y p i c a l c a r b o x y l i c a c i d s f o r m e d d u r i n g a l k a l i i n d u c e d p o l y s a c c h a r i d e d e g r a d a t i o n , i n o r d e r o f a b u n d a n c e , a r e l a c t i c , s u c c i n i c a n d 1 3 8 o t h e r s a c c h a r i n i c a c i d s [ 3 2 0 ] . D i v a l e n t c a t i o n s ( l i k e c a l c i u m ) a r e k n o w n t o f a v o r t h e f o r m a t i o n o f l a c t i c a c i d e v e n a t l o w e r a l k a l i n e t r e a t m e n t s e v e r i t i e s [ 3 6 2 ] , w h i c h c o u l d e x p l a i n t h e 2 - 3 f o l d i n c r e a s e i n l a c t i c a n d s u c c i n i c a c i d c o n c e n t r a t i o n w i t h i n t h e t r e a t e d c e l l w a l l s a f t e r A F E X . A l k a l i - i n d u c e d p e e l i n g , s t o p p i n g a n d t e r m i n a t i o n r e a c t i o n s a r e e x p e c t e d t o r e s u l t i n t h e f o r m a t i o n o f s e v e r a l t y p e s o f c a r b o x y l i c a c i d s d u r i n g b i o m a s s a l k a l i n e b a s e d p r e t r e a t m e n t s . T h e e x t e n t o f d e g r a d a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s t o s o m e t h e s e m o n o ( l a c t i c , f o r m i c ) a n d d i - c a r b o x y l i c ( s u c c i n i c ) a c i d s h a v e b e e n r e p o r t e d h e r e . H o w e v e r , t h e e x t e n t o f p o l y s a c c h a r i d e d e g r a d a t i o n d u r i n g A F E X i s s u b s t a n t i a l l y l o w e r t h a n s o d i u m h y d r o x i d e b a s e d p u l p i n g ( b a s e d o n t o t a l l a c t i c a c i d f o r m e d p e r g m o f o r i g i n a l s u b s t r a t e ) . S o m e o f t h e l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t c a r b o x y l i c a c i d s ( g l y c o l i c , l a c t i c ) a r e e x p e c t e d t o b e f o r m e d f o r m o r e s e v e r e p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s ( h i g h e r t e m p e r a t u r e s a n d / o r a l k a l i n i t y ) . F o r m a t i o n o f d i - c a r b o x y l i c a c i d s , l i k e s u c c i n i c , i s t y p i c a l f o r h i g h e r a l k a l i c o n c e n t r a t i o n s [ 3 4 4 ] . I n t e r e s t i n g l y , h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t r a n s - a c o n i t i c a c i d w e r e d e t e c t e d a f t e r A F E X ( 1 . 5 - 2 f o l d h i g h e r t h a n u n t r e a t e d c o n t r o l ) . T r a n s - a c o n i t i c a c i d s h a v e b e e n f o u n d i n h i g h c o n c e n t r a t i o n s ( 1 0 - 2 0 m g / g m c e l l w a l l ) i n c e r t a i n f o r a g e g r a s s e s i n e a r l i e r s t u d i e s [ 3 6 4 ] , a n d a r e p r o b a b l y m o r e e a s i l y e x t r a c t a b l e f r o m t h e c e l l w a l l a f t e r A F E X . D e s p i t e m i n o r a l k a l i i n d u c e d d e g r a d a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s d u r i n g A F E X , t h e r e w e r e s i g n i fi c a n t l y m o r e a l i p h a t i c c a r b o x y l i c a c i d s f o r m e d d u r i n g d i l u t e - a c i d ( 4 0 - 5 0 m g / g s u b s t r a t e ) p r e t r e a t m e n t . S a c c h a r i n i c a c i d s a r e e x p e c t e d t o b e t h e s i g n i fi c a n t C 6 - o r g a n i c a c i d s f o r m e d a t l o w e r t e m p e r a t u r e s f r o m c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e . H o w e v e r , g l u c o - a n d x y l o - i s o s a c c h a r i n i c a c i d s w e r e n o t q u a n t i fi e d i n t h i s s t u d y . I t w o u l d b e n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e t h e e x t e n t o f f o r m a t i o n o f s a c c h a r i n i c a c i d s d u r i n g A F E X t o a c h i e v e m a s s b a l a n c e c l o s u r e . 1 3 9 L i g n i n b a s e d d e g r a d a t i o n p r o d u c t s h a v e b e e n q u a n t i fi e d i n t h e p a s t b y c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s a n d m a s s s p e c t r o m e t r i c b a s e d m e t h o d s [ 3 3 4 , 3 4 9 , 3 6 5 ] . S e v e r a l a r o m a t i c b a s e d d e g r a d a t i o n c o m p o u n d s ( s y r i n g a l d e h y d e , 4 - h y d r o x y a c e t o p h e n o n e , p h e n o l i c a c i d s ) a r e f o r m e d d u r i n g A F E X a n d d i l u t e a c i d b a s e d p r e t r e a t m e n t s . P h e n o l i c a l d e h y d e s , l i k e s y r i n g a l d e h y d e , a r e l i k e l y p r o d u c e d u n d e r o x i d a t i v e a c i d i c c o n d i t i o n s a n d a r e o n e o f t h e m a j o r l i g n i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s f o r m e d d u r i n g a c i d p r e t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r [ 1 3 7 , 1 8 0 , 3 6 6 ] . S o m e c o m p o n e n t s s u c h a s 4 - h y d r o x y b e n z a l d e h y d e a n d 4 - h y d r o x y b e n z o i c a c i d a r e t h o u g h t t o b e m o n o m e r i c l i g n i n e x t r a c t i v e s t h a t a r e r e l e a s e d d u r i n g t h e p r e t r e a t m e n t p r o c e s s , u n l i k e o t h e r l i g n i n c l e a v a g e p r o d u c t s [ 3 6 7 , 3 6 8 ] . C o m p a r e d t o d i l u t e a c i d p r e t r e a t m e n t , 4 — h y d r o x y b e n z a l d e h y d e a n d v a n i l l i n a r e t h e o n l y c o m p o n e n t s t h a t a r e p r o d u c e d i n s i g n i fi c a n t q u a n t i t i e s d u r i n g A F E X ( c o m p a r e d t o u n t r e a t e d c o n t r o l ) . T h e c o n c e n t r a t i o n p r o fi l e s o f a r o m a t i c c o m p o u n d s f o r m e d d u r i n g R e g u l a r a n d H i g h - N t A F E X s e v e r i t i e s a r e l a r g e l y s i m i l a r , e x c e p t f o r m a t i o n o f 5 0 % h i g h e r r e l a t i v e c o n c e n t r a t i o n o f v a n i l l i n f o r t h e l a t t e r s e v e r i t y . I t i s l i k e l y t h a t t h e 4 - h y d r o x y b e n z a l d e h y d e p r o d u c e d d u r i n g a c i d p r e t r e a t m e n t i s f u r t h e r d e g r a d e d v i a h y d r o l y t i c / o x i d a t i v e c l e a v a g e r e s u l t i n g i n o v e r a l l l o w e r c o n c e n t r a t i o n s . C e r t a i n a r o m a t i c a c i d s ( e . g . s y r i n g i c a c i d ) a r e l i k e l y a l s o f o r m e d v i a o x i d a t i o n o f t h e i r c o r r e s p o n d i n g a l d e h y d e s . I t h a s b e e n s h o w n t h a t t h e m o s t i n h i b i t o r y c o m p o u n d s , a p a r t f r o m t h e f u r a n s , f o u n d i n d i l u t e a c i d t r e a t e d c o r n s t o v e r h y d r o l y z a t e s a p p e a r t o b e l i g n i n d e r i v e d a n d a r e m o s t l y f e r u l i c a n d c o u m a r i c b a s e d b a s e d c o m p o u n d s [ 3 6 9 ] . T h e r e a r e s e v e r a l o t h e r l i g n i n p o l y p h e n o l i c s a n d i n s o l u b l e l i g n i n c o m p o u n d s t h a t h a v e n o t b e e n i d e n t i fi e d f o r e i t h e r d i l u t e a c i d o r A F E X b a s e d t r e a t m e n t s . P r e v i o u s w o r k h a s s h o w n p r e s e n c e o f l i g n i n 1 4 0 o l i g o m e r s a n d o t h e r r e - p o l y m e r i z a t i o n p r o d u c t s t h a t a r e d i f f i c u l t t o i d e n t i f y d u e t o t h e h e t e r o g e n e i t y a n d c o m p l e x i t y o f t h e i r m o l e c u l a r s t r u c t u r e s [ 1 5 1 , 1 8 0 , 3 6 9 , 3 7 0 ] . 5 . 1 . 4 . 3 I n h i b i t i o n o f g l y c o s y l h y d r o l a s e s b y A F E X d e g r a d a t i o n p r o d u c t s A F E X e x t r a c t e d l i g n o - p h e n o l i c f r a g m e n t s a n d o t h e r e x t r a c t i v e s d e p o s i t e d o n t h e b i o m a s s s u r f a c e a r e p r e f e r e n t i a l l y r e m o v e d d u r i n g t h e A S E w a t e r e x t r a c t i o n s t e p . R e m o v i n g t h e s e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s h a s b e e n s h o w n t o e n h a n c e t h e r a t e o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s , b a s e d o n t h e h y d r o l y s i s d a t a f o r w a s h e d a n d u n w a s h e d A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r f r a c t i o n s [ 1 ] . T h e s u r f a c e l i g n o - p h e n o l i c f r a g m e n t s a n d o t h e r d e g r a d a t i o n p r o d u c t s m i g h t i n h i b i t g l y c o s y l h y d r o l a s e a c t i v i t y [ 2 5 0 , 2 5 1 , 3 7 l , 3 7 2 ] . A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r w a t e r A S E e x t r a c t s w e r e u s e d t o c a r r y o u t c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e ( A v i c e l ) h y d r o l y s i s a n d w e r e f o u n d t o e x e r t a s i g n i fi c a n t i n h i b i t o r y e f f e c t o n t h e c e l l u l a s e c o m p l e x ( F i g u r e 5 . 2 ) . T h e e f f e c t o f e n z y m e l o a d i n g ( 1 2 — 4 8 m g t o t a l e n z y m e / g g l u c a n ) a n d h y d r o l y s i s t i m e p e r i o d ( 2 4 - 1 6 8 h r s ) o n t h e h y d r o l y s i s k i n e t i c s o f c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e w e r e s t u d i e d i n t h e p r e s e n c e / a b s e n c e o f t h e d e g r a d a t i o n p r o d u c t e x t r a c t s . T h e p r e s e n c e o f A F E X c o r n s t o v e r d e g r a d a t i o n p r o d u c t s r e s u l t e d i n a 3 3 % l o w e r h y d r o l y t i c r a t e ( d Y / d X ) o f c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e , b a s e d o n i n i t i a l g l u c a n h y d r o l y s i s r a t e ( F i g u r e 5 . 2 ( a ) , a t X = 0 ) . I t w a s a l s o f o u n d t h a t t h e o v e r a l l r e d u c t i o n i n h y d r o l y s i s y i e l d w a s l a r g e l y i n d e p e n d e n t o f t i m e o f h y d r o l y s i s . N o t s u r p r i s i n g l y , t h e e x t e n t o f i n h i b i t i o n w a s f o u n d t o b e d e p e n d e n t o n t h e t o t a l e n z y m e l o a d i n g e m p l o y e d d u r i n g h y d r o l y s i s . T h e r e w a s 3 5 % a n d 2 5 % r e d u c t i o n i n o v e r a l l h y d r o l y s i s y i e l d f o r c e l l u l o s e i n t h e p r e s e n c e o f A F E X d e g r a d a t i o n p r o d u c t s a t 1 2 a n d 4 8 m g t o t a l e n z y m e l o a d i n g ( S p e z y m e C P + N o v o 1 8 8 a t e q u i p r o t e i n m a s s l o a d i n g ) , r e s p e c t i v e l y . P r e v i o u s l y r e p o r t e d d a t a i n d i c a t e s i m p r o v e m e n t i n h y d r o l y s i s y i e l d s f o r w a t e r w a s h e d s t e a m e x p l o s i o n a n d A F E X p r e t r e a t e d b i o m a s s [ 3 3 8 , 3 4 1 ] . 1 4 1 + _ _ _ _ _ _ _ ” _ _ _ ] I [ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 1 2 3 8 8 1 6 . . 3 0 + + l x x 2 7 0 2 3 4 3 4 1 9 5 0 9 9 . . 9 9 1 r 1 . . 0 0 _ . . _ . + + = = _ _ _ _ _ _ ” _ . . . . . . . . . . . . 2 2 2 2 x x R R 8 5 3 0 3 1 _ 0 0 _ . _ _ _ ” x , t c a r t x e r e t a w S C X l o r . ] z , , g M “ 1 ” t E n o F C A ) a 0 C I ( 0 0 - 0 = = Y 1 Y , I 1 1 1 ” 5 1 { 1 ’ , - _ 1 i ' 0 0 0 0 0 0 0 8 6 4 2 1 1 4 2 F i g u r e 5 . 2 E fl e c t o f r e g u l a r A F E X c o r n s t o v e r d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( A S E e x t r a c t e d u s i n g h o t w a t e r ) o n c e l l u l a s e a c t i v i t y ( h y d r o l y z i n g c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e ) a s a f u n c t i o n o f h y d r o l y s i s t i m e a n d t o t a l e n z y m e l o a d i n g . C o n t r o l e x p e r i m e n t ( a ) w a s A v i c e l h y d r o l y z e d b y 1 5 F P U ( o r 2 2 m g ) S p e z y m e C P / g g l u c a n ( s u p p l e m e n t e d w i t h 3 8 m g / g g l u c a n o f N o v o 1 8 8 ) , i n t h e a b s e n c e o f A F E X s t o v e r w a t e r e x t r a c t , f o r v a r i o u s t i m e p o i n t s ( 2 4 - I 6 8 h o u r s ) . C o n t r o l e x p e r i m e n t ( b ) w a s A v i c e l h y d r o l y z e d f o r 2 4 h o u r s , i n t h e a b s e n c e o f A F E X s t o v e r w a t e r , f o r v a r i o u s t o t a l e n z y m e l o a d i n g s ( 1 2 - 4 8 m g / g g l u c a n o f S p e z y m e / N o v a 1 8 8 i n a f i x e d m a s s r a t i o o f 3 7 : 6 3 ) . r I T O 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 H y d r o l y s i s T i m e ( X , h o u r s ) ( A ) u o r s x e a u o g ) n e o n “ ) % x 0 6 1 5 4 8 7 5 6 8 . . 1 0 + + X x 6 3 6 8 4 8 l 0 2 7 5 2 1 8 7 8 9 . . 9 9 2 1 . . 0 0 + + = = 2 2 2 2 ) n x x R R a 9 8 7 c u 3 l 1 l 0 3 0 4 g 0 g 0 . 0 - / = = Y Y g m , X ( g n l 0 3 i d a o L e m y z n l 0 2 E l t c a a r t x e r e t a w S . C . l . o d X t r n t E o C 2 . n ) o F 0 C A ' ( 5 1 0 : e r u ~ g i F 0 7 t o T : 1 r l 0 1 " 0 i - 0 1 4 3 ( A ) u o r s o n u o g u n a n l f ) % 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 \ 1 1 1 \ 1 1 \ 1 O \ O ‘ - : ' \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 1 1 O O I n W \ \ l o m 1 O N \ \ \ l O r — r H o w e v e r , t h e n a t u r e o f t h e i n h i b i t o r y c o m p o u n d s p r o d u c e d i n s t e a m e x p l o s i o n i s l i k e l y d i f f e r e n t f r o m t h e A F E X p r o c e s s [ 3 3 9 ] . I t w o u l d b e o f i n t e r e s t t o d e t e r m i n e t h e m a j o r d e g r a d a t i o n c o m p o u n d s ( e . g . a m i d e s , o l i g o s a c c h a r i d e s , l i g n i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ) f o r m e d d u r i n g A F E X t h a t i n h i b i t t h e c e l l u l a s e s . M i x e d l i g n i n d e r i v a t i v e s h a v e b e e n p r e v i o u s l y r e p o r t e d t o b e s u b s t a n t i a l l y d e t r i m e n t a l t o c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e c e l l u l a s e a c t i v i t y [ 9 1 ] . L i t e r a t u r e r e p o r t s s h o w t h a t c e l l u l o l y t i c e n z y m e s y s t e m s ; c o n s i s t i n g o f c e l l u l a s e s , B — g l u c o s i d a s e s a n d x y l a n a s e s , a r e v a r y i n g l y i n h i b i t e d d e p e n d i n g o n t h e i r m i c r o b i a l s o u r c e . P h e n o l i c c o m p o u n d s ( p - c o u m a r i c a c i d , f e r u l i c a c i d a n d v a n i l l i n ) r e s u l t e d i n l e s s t h a n 1 0 % r e d u c t i o n i n a c t i v i t y o f B . r u m i n i c o l a B - g l u c o s i d a s e ; w h e r e a s , B . s u c c i n o g e n e s g l u c o s i d a s e a c t i v i t y i s m o r e s e v e r e l y i n h i b i t e d ( 1 5 - 7 0 % ) d e p e n d i n g o n t h e c o n c e n t r a t i o n a n d t y p e o f p h e n o l i c c o m p o u n d s [ 3 7 3 ] . T h e c o m m e r c i a l c e l l u l a s e e n z y m e t e s t e d f o r h y d r o l y s i s o r i g i n a t e d f r o m a s t r a i n o f T r i c h o d e r m a r e e s e i , w h e r e a s t h e N o v o z y r n 1 8 8 B — g l u c o s i d a s e o r i g i n a t e d f r o m a s t r a i n o f A s p e r g i l l u s n i g e r . R e c e n t r e s e a r c h h a s s h o w n t h a t c e l l u l a s e s a n d p e c t i n a s e s f r o m T . r e e s e i a r e s e v e r e l y i n h i b i t e d b y p h e n o l i c c o m p o u n d s e x t r a c t e d f r o m fl a x b a s t t i s s u e [ 3 7 4 ] . W e t o x i d a t i o n p r e t r e a t m e n t o f w h e a t s t r a w p r o d u c e s l a r g e q u a n t i t i e s o f f o r m i c a c i d t h a t c o m p l e t e l y d e a c t i v a t e c e l l u l o l y t i c a n d x y l a n o l y t i c e n z y m e s a n d a r e s u b s t a n t i a l l y t o x i c t o S . c e r e v i s i a e f e r m e n t a t i o n [ 3 7 5 ] . P a n a g i o t o u a n d O l s s o n ( 2 0 0 6 ) a l s o r e p o r t e d s u b s t a n t i a l r e d u c t i o n ( 4 0 - 6 0 % ) i n t h e x y l a n a s e a c t i v i t y i n p r e s e n c e o f d i f f e r e n t p o t e n t i a l l y i n h i b i t o r y c o m p o u n d s [ 3 7 5 ] . M o r e r e s e a r c h i s c r i t i c a l t o e v a l u a t e t h e e f f e c t o f p o t e n t i a l i n h i b i t o r s i n A F E X h y d r o l y z a t e s o n i n d i v i d u a l e n z y m e a c t i v i t i e s . T h i s i n f o r m a t i o n w i l l b e a c r i t i c a l d e t e r m i n a n t i n d e v e l o p i n g t h e e x a c t m i x t u r e o f e n z y m e s n e c e s s a r y f o r m a x i m i z i n g g l u c a n a n d x y l a n d i g e s t i b i l i t y i n A F E X t r e a t e d c e l l w a l l s . 1 4 4 E v e n t h o u g h a c e t i c a c i d a n d o t h e r o r g a n i c a c i d s a r e p o t e n t i a l l y n o t i n h i b i t o r y t o e n z y m a t i c a c t i v i t y a t t h e i r p r e s e n t c o n c e n t r a t i o n f o r A F E X c o r n s t o v e r e x t r a c t s , t h e s e a c i d s a r e u b i q u i t o u s i n h i b i t o r s f o u n d i n s e v e r a l f e r m e n t a t i o n h y d r o l y s a t e s [ 1 3 7 ] . T h e l a g p h a s e f o r S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e w a s f o u n d t o b e e x p o n e n t i a l l y i n c r e a s e d i n p r e s e n c e o f a c e t i c ( 0 . 0 5 - 0 . 1 % , w / w ) a n d l a c t i c a c i d ( 0 . 2 - 0 . 8 % , w / w ) i n a m i n i m a l m e d i a b r o t h , i n t u r n r e d u c i n g t h e s p e c i fi c g r o w t h r a t e a s w e l l [ 3 7 6 ] . I m p o r t a n t l y , t h e d e g r e e o f m i c r o b i a l i n h i b i t i o n d u e t o o r g a n i c a c i d s i s l a r g e l y d e p e n d e n t o n t h e p H o f t h e m e d i u m , n a t u r e a n d c o n c e n t r a t i o n o f t h e i n h i b i t o r [ 3 7 7 ] . P h e n o l i c s a r e a l s o f o u n d t o i n h i b i t m i c r o b i a l a c t i v i t y t h r o u g h i n t e r f e r e n c e w i t h s o l u b l e s u g a r u p t a k e [ 3 7 3 , 3 7 8 ] . D e s p i t e t h e i n h i b i t o r y c o m p o n e n t s p r o d u c e d d u r i n g t h e A F E X p r o c e s s , t h o u g h i n m u c h l o w e r c o n c e n t r a t i o n s c o m p a r e d t o o t h e r t h e r m o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t s , i t w a s f o u n d t h a t fi n a l A F E X c o r n s t o v e r e n z y m a t i c h y d r o l y s a t e c o u l d b e e a s i l y f e r m e n t e d b y E . c o l i K 0 1 1 ( E . c o l i f e r m e n t a t i o n d a t a n o t s h o w n ) a n d S . c e r e v i s i a e 4 2 4 A ( L N H - S Y ) w i t h o u t a n y a d d i t i o n a l d e t o x i fi c a t i o n s t e p [ 3 7 9 ] . H o w e v e r , i t w a s f o u n d t h a t t h e l a g p h a s e f o r m i c r o b i a l g r o w t h w a s s l i g h t l y l o n g e r f o r t h e u n w a s h e d A F E X c o r n s t o v e r h y d r o l y z a t e c o m p a r e d t o t h e w a s h e d s u b s t r a t e h y d r o l y z a t e ( u n p u b l i s h e d d a t a ) . 5 . 1 . 5 C o n c l u s i o n s A d e t a i l e d m a s s b a l a n c e f o r v a r i o u s p l a n t c e l l w a l l ( c o r n s t o v e r ) d e g r a d a t i o n p r o d u c t s f o r m e d d u r i n g A F E X a n d d i l u t e a c i d p r e t r e a t m e n t , w i t h 6 4 % a n d 1 0 5 % m a s s c l o s u r e , w a s p r e s e n t e d i n t h i s c h a p t e r . U n l i k e d i l u t e a c i d t r e a t m e n t , a m m o n o l y s i s r e a c t i o n b y - p r o d u c t s ( a c e t a m i d e , c o u m a r o y l a m i d e , f e r u l o y l a m i d e ) w e r e t h e p r e d o m i n a n t c e l l w a l l d e g r a d a t i o n p r o d u c t s f o r m e d d u r i n g a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t s . T h e c l e a v a g e o f t h e a c e t y l l i n k a g e s d u r i n g A F E X w a s f o u n d t o b e l e s s s e n s i t i v e t o A F E X p r e t r e a t m e n t 1 4 5 s e v e r i t y ( a m m o n i a / w a t e r l o a d i n g , t e m p e r a t u r e , r e s i d e n c e t i m e ) c o m p a r e d t o a m m o n o l y s i s o f f e r u l o y l / c o u m a r o y l e s t e r l i n k a g e s . T h e r e w a s s t r o n g l i n e a r c o r r e l a t i o n ( R 2 = 0 . 8 7 ) b e t w e e n t h e t o t a l f e r u l a t e e s t e r l i n k a g e s c l e a v e d a n d t h e o v e r a l l e n z y m a t i c h y d r o l y s i s r a t e . F o r m a t i o n o f a l k a l i i n d u c e d p e e l i n g r e a c t i o n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( l a c t i c , s u c c i n i c a c i d s ) f o r A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r w a s o b s e r v e d . H o w e v e r , t h e e x t e n t o f e n d - g r o u p p e e l i n g c a t a l y z e d d e g r a d a t i o n r e a c t i o n s w e r e s i g n i fi c a n t l y l o w e r ( 1 0 0 - 2 0 0 f o l d l o w e r c o n c e n t r a t i o n s , a s m g a n a l y t e p e r g m s u b s t r a t e ) t h a n p r e v i o u s l y r e p o r t e d r e s u l t s [ 3 2 0 ] . N e a r l y 7 0 - 8 5 % o f t h e t o t a l a r a b i n o x y l a n c o n t e n t o f c o r n s t o v e r w a s a c i d h y d r o l y z e d t o m o n o m e r i c s u g a r s d u r i n g d i l u t e a c i d p r e t r e a t m e n t , w i t h t h e r e m a i n i n g a r a b i n o x y l a n w a s p r e s e n t i n t h e o l i g o m e r i c f o r m . H o w e v e r , o n l y 2 5 % o f t h e t o t a l a r a b i n o x y l a n c o n t e n t w a s r e l e a s e d f r o m t h e c e l l w a l l d u r i n g A F E X a s o l i g o m e r s . S u g a r d e g r a d a t i o n d u r i n g d i l u t e a c i d t r e a t m e n t r e s u l t e d i n 2 5 - 3 0 m g o f f u r a n b a s e d b y - p r o d u c t s p e r g m s u b s t r a t e , u n l i k e A F E X w h e r e n e g l i g i b l e f o r m a t i o n o f f u r a n s t o o k p l a c e . S y r i n g a l d e h y d e , 4 - h y d r o x y b e n z a l d e h y d e , v a n i l l i n a n d 4 - h y d r o x y a c e t o p h e n o n e w e r e t h e m a j o r l i g n i n b a s e d d e g r a d a t i o n p r o d u c t s f o r m e d d u r i n g d i l u t e a c i d a n d A F E X b a s e d t r e a t m e n t s , i n v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s . I t w a s a l s o f o u n d t h a t A F E X d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ( i . e . h o t w a t e r e x t r a c t i v e s f r o m A F E X c o r n s t o v e r ) s e v e r e l y i n h i b i t e d c e l l u l a s e a c t i v i t y o n c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e d e p e n d i n g o n h y d r o l y s i s t i m e a n d t o t a l e n z y m e l o a d i n g e m p l o y e d ( Z S - 4 0 % l o w e r t h a n c o n t r o l ) . H o w e v e r , t h e e x a c t c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e s e i n h i b i t o r y d e g r a d a t i o n p r o d u c t s i s n o t k n o w n . I t w o u l d b e n e c e s s a r y t o c o n d u c t m o r e d e t a i l e d k i n e t i c s t u d i e s i n t h e f u t u r e t o s t u d y t h e e f f e c t o f v a r i o u s A F E X p r e t r e a t m e n t p a r a m e t e r s o n t h e e x t e n t o f a m m o n o l y s i s a n d h y d r o l y s i s o f t h e L C C e s t e r l i n k a g e s . A l s o , t h e e x t e n t o f M a i l l a r d b a s e d r e a c t i o n s d u e t o r e a c t i o n o f a m m o n i a w i t h s o l u b l e s s u g a r s a n d 1 4 6 i n s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e s i s c u r r e n t l y u n c l e a r a n d n e e d s f u r t h e r e x p l o r a t i o n i n o r d e r t o c o m m e n c e a n i m a l f e e d t r i a l s t u d i e s u s i n g A F E X t r e a t e d b i o m a s s [ 9 ] . 1 4 7 C H A P T E R 6 : D E V E L O P M E N T O F A H I G H - T H R O U G H P U T M I C R O P L A T E B A S E D E N Z Y M A T I C H Y D R O L Y S I S M E T H O D O L O G Y 6 . 1 . 1 A b s t r a c t v S e v e r a l f a c t o r s i n fl u e n c e t h e v i a b i l i t y o f a b i o c h e m i c a l p l a t f o r m f o r m a n u f a c t u r i n g l i g n o c e l l u l o s i c b a s e d f u e l s a n d c h e m i c a l s ( e . g . c r o p y i e l d , p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y , e n z y m e l o a d i n g ) . P a s t r e s e a r c h o n b i o m a s s c o n v e r s i o n h a s f o c u s e d l a r g e l y o n a c i d b a s e d p r e t r e a t m e n t t e c h n o l o g i e s t h a t f r a c t i o n a t e l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e f r o m c e l l u l o s e . H o w e v e r , f o r a l k a l i n e b a s e d ( e . g . A F E X ) a n d o t h e r l o w e r s e v e r i t y p r e t r e a t m e n t s i t b e c o m e s c r i t i c a l t o c o - h y d r o l y z e c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e u s i n g a n o p t i m i z e d e n z y m e c o c k t a i l . L i g n o c e l l u l o s i c s a r e a p p r o p r i a t e s u b s t r a t e s t o a s s e s s h y d r o l y t i c a c t i v i t y o f e n z y m e m i x t u r e s c o m p a r e d t o c o n v e n t i o n a l u n r e a l i s t i c s u b s t r a t e s ( e . g . fi l t e r p a p e r , c h r o m o g e n i c a n d fl u o r i g e n i c c o m p o u n d s ) f o r s t u d y i n g s y n e r g i s t i c h y d r o l y s i s . H o w e v e r , t h e r e a r e f e w , i f a n y , h i g h - t h r o u g h p u t l i g n o c e l l u l o s i c d i g e s t i b i l i t y a n a l y t i c a l p l a t f o r m s f o r o p t i m i z i n g b i o m a s s c o n v e r s i o n . T h e “ B i o m a s s C o n v e r s i o n R e s e a r c h L a b ” ( B C R L ) m i c r o p l a t e m e t h o d i s a h i g h - t h r o u g h p u t , s m a l l s c a l e a s s a y d e v e l o p e d t o s t u d y d i g e s t i b i l i t y o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s i n a c o s t - e f f e c t i v e m a n n e r c o m p a r e d t o c o n v e n t i o n a l m e t h o d s . T h e m o s t s u i t a b l e m e t h o d f o r d e l i v e r i n g m i l l e d b i o m a s s t o t h e m i c r o p l a t e w a s t h r o u g h m u l t i - p i p e t t i n g s l u r r y s u s p e n s i o n s . R a p i d b i o - e n z y m a t i c , s p e c t r o p h o t o m e t r i c b a s e d a s s a y s w e r e d e v e l o p e d t o d e t e r m i n e f e r m e n t a b l e s u g a r s . T h e e n t i r e p r o c e d u r e w a s a u t o m a t e d u s i n g a r o b o t i c p i p e t t i n g w o r k s t a t i o n . S e v e r a l p a r a m e t e r s t h a t a f f e c t h y d r o l y s i s i n t h e m i c r o p l a t e w e r e s t u d i e d a n d o p t i m i z e d ( i . e . p a r t i c l e s i z e r e d u c t i o n , s l u r r y s o l i d s c o n c e n t r a t i o n , g l u c a n l o a d i n g , m a s s t r a n s f e r i s s u e s a n d t i m e v A v e r s i o n o f t h i s c h a p t e r w a s p u b l i s h e d a s C h u n d a w a t S . P . S , B a l a n V . , D a l e B E . 2 0 0 8 . H i g h - t h r o u g h p u t m i c r o p l a t e t e c h n i q u e f o r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g , 2 0 0 8 . 9 9 ( 6 ) : p . 1 2 8 1 - 1 2 9 4 . 1 4 8 p e r i o d f o r h y d r o l y s i s ) . T h e m i c r o p l a t e m e t h o d w a s o p t i m i z e d f o r c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e ( A v i c e l ) a n d a m m o n i a fi b e r e x p a n s i o n ( A F E X ) p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r . 6 . 1 . 2 B a c k g r o u n d A r e c e n t D e p a r t m e n t o f E n e r g y p u b l i c a t i o n [ 3 8 0 ] e n v i s i o n i n g b i o r e f m e r i e s i d e n t i fi e s s e v e r a l c r i t i c a l b i o l o g i c a l b a r r i e r s t h a t i m p e d e u t i l i z a t i o n o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s a s a b i o - f e e d s t o c k . I d e n t i fi c a t i o n o f t h e p r i m a r y b a r r i e r s t o p l a n t c e l l w a l l h y d r o l y s i s w i l l a l l o w d e v e l o p m e n t o f n e w c r o p s , e n z y m e s a n d m i c r o b e s t o f a c i l i t a t e b i o c o n v e r s i o n . M a n i p u l a t i o n o f c e l l w a l l s y n t h e s i s r e g u l a t o r y p a t h w a y s m a y a l l o w d e v e l o p m e n t o f a n e w g e n e r a t i o n o f e n e r g y c r o p s t h a t i s m o r e e a s i l y h y d r o l y z a b l e . D i s c o v e r i n g n o v e l e x t r e m o p h i l i c m i c r o b e s a n d o p t i m i z i n g e n z y m e m i x t u r e s t h a t c a n s y n e r g i s t i c a l l y b r e a k d o w n h o l o c e l l u l o s e a n d l i g n i n w o u l d h e l p g r e a t l y r e d u c e p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y . H o w e v e r , e a c h o f t h e s e r e s e a r c h i n i t i a t i v e s w o u l d f a l t e r w i t h o u t a s u i t a b l e h i g h - t h r o u g h p u t a s s a y t e c h n i q u e t o a s s e s s b i o m a s s d i g e s t i b i l i t y q u i c k l y a n d r e p r o d u c i b l y . O n e o f t h e p r i m a r y b i o f u e l r e s e a r c h a g e n d a s f o r 2 1 s t c e n t u r y a c c o r d i n g t o a r e c e n t E u r o p e a n U n i o n E P O B I O p r o j e c t r e p o r t i d e n t i fi e d a n e e d f o r a r e l i a b l e a n d h i g h - t h r o u g h p u t d i g e s t i b i l i t y a s s a y f o r l i g n o c e l l u l o s i c s [ 3 8 1 ] . R e c e n t d e v e l o p m e n t s i n m o l e c u l a r b i o l o g y a n d s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s h a v e a l l o w e d s i g n i fi c a n t a d v a n c e s i n d e s i g n i n g t a i l o r - m a d e c e l l u l o l y t i c e n z y m e s a n d m i c r o b e s [ 3 8 2 ] . H o w e v e r , c o n v e n t i o n a l e n z y m a t i c h y d r o l y s i s p r o t o c o l s t o s c r e e n p o t e n c y o f t h e s e n o v e l e n z y m e s a n d t h e i r m i x t u r e s a r e r a t h e r t e d i o u s a n d t i m e c o n s u m i n g . I n a n e f f o r t t o s t u d y b i o m a s s d i g e s t i b i l i t y o f d i v e r s e s o u r c e s ( e . g . e n e r g y c r o p s , a g r i c u l t u r a l r e s i d u e s , a n d m u n i c i p a l w a s t e ) a s a f u n c t i o n o f e n z y m e c o m b i n a t i o n s ( i . e . c e l l u l a s e s , x y l a n a s e s , p e c t i n a s e s , 1 4 9 e s t e r a s e s , g l u c o s i d a s e s ) a n d p r e t r e a t m e n t m e t h o d s ( i . e . A F E X , o r g a n o s o l v , d i l u t e - a c i d ) , i t b e c o m e s c r i t i c a l t o c o n d u c t a n d a n a l y z e a l a r g e n u m b e r o f e x p e r i m e n t s . I n o r d e r t o a c h i e v e t h i s g o a l t h e r e i s n e e d f o r a h i g h l y a u t o m a t e d , r a p i d a n d r e l i a b l e e n z y m e a s s a y t o s c r e e n e n z y m e c o m b i n a t i o n s a n d l o a d i n g s f o r a v a r i e t y o f l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s . P r e s e n t l y , c e l l u l o l y t i c e n z y m e s a r e s c r e e n e d f o r t h e i r c e l l u l a s e a c t i v i t y u s i n g t h e I n t e r n a t i o n a l U n i o n o f P u r e a n d A p p l i e d C h e m i s t s ( I U P A C ) s t a n d a r d fi l t e r p a p e r a s s a y ( F P A ) . H o w e v e r , t h e I U P A C F P A a s s a y [ 3 8 3 ] u t i l i z i n g fi l t e r p a p e r a s t h e s u b s t r a t e i s p l a g u e d b y s e v e r a l d i s a d v a n t a g e s f o r h i g h - t h r o u g h p u t a s s a y s . P r i m a r y d i s a d v a n t a g e s a r e l o n g a s s a y p e r i o d s , h i g h l a b o r i n p u t s , h i g h s e n s i t i v i t y a n d p o o r r e p r o d u c i b i l i t y [ 3 8 4 ] . P o o r r e p r o d u c i b i l i t y o f t h e F P A a s s a y i s d u e t o s e v e r a l f a c t o r s s u c h a s fi l t e r p a p e r p r o p e r t i e s ( i . e . s i z e , s h a p e a n d f o l d i n g ) a n d a c c e s s o r y e n z y m e c o m p o n e n t s ( e . g . B - g l u c o s i d a s e ) . O t h e r c e l l u l o l y t i c e n z y m e a c t i v i t i e s ( e . g . x y l a n o l y t i c , c e l l o b i a s e ) e s t i m a t e d u s i n g c o n v e n t i o n a l s u b s t r a t e a s s a y s ( e . g . fi l t e r p a p e r , c e l l o b i o s e , o a t s p e l t a n d b i r c h w o o d x y l a n ) a r e n o t r e p r e s e n t a t i v e o f t h e i r t r u e h y d r o l y t i c e f fi c i e n c y o n a r e a l i s t i c b i o r e f m e r y f e e d s t o c k , i . e . l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s . I t h a s b e e n r e c e n t l y s h o w n t h a t t h e e n z y m e c o m b i n a t i o n t h a t p r o d u c e s t h e b e s t h y d r o l y t i c y i e l d s d e p e n d s o n t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s u b s t r a t e r a t h e r t h a n o n s t a n d a r d e n z y m e - a c t i v i t i e s m e a s u r e d [ 3 8 5 ] . T h e s t a n d a r d a c t i v i t y a s s a y s f o r e n z y m e s d o n o t c o r r e l a t e w e l l w i t h t h e i r t r u e h y d r o l y t i c p o t e n t i a l f o r d i f f e r e n t l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s . S u p p l e m e n t a r y e n z y m e c o m p o n e n t s ( s u c h a s x y l a n a s e s , a c e t y l e s t e r a s e , f e r u l o y l e s t e r a s e a n d a r a b i n o fi r r a n o s i d a s e s ) f u r t h e r a i d s y n e r g i s t i c h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e b u r i e d i n a m a t r i x o f l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e i n p l a n t c e l l w a l l s . T h e r e f o r e , c o n d u c t i n g h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c s u s i n g e n z y m e m i x t u r e s 1 5 0 w o u l d a l l o w b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t r u e s y n e r g i s t i c e n z y m e i n t e r a c t i o n s f o r l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s . F l o w t h r o u g h p r e t r e a t m e n t s , s u c h a s d i l u t e - a c i d , h o t w a t e r , o r g a n o s o l v e t c . , t y p i c a l l y r e m o v e m o s t o f t h e l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e [ 1 0 8 , 1 0 9 ] i n t o a s e p a r a t e l i q u i d p r o c e s s s t r e a m . H o w e v e r , a l k a l i b a s e d p r e t r e a t m e n t s s u c h a s a m m o n i a fi b e r e x p a n s i o n ( A F E X ) c a n m o d i f y t h e c e l l w a l l u l t r a - s t r u c t u r e w i t h o u t p h y s i c a l l y e x t r a c t i n g l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e i n t o a s e p a r a t e l i q u i d s t r e a m [ 3 8 6 - 3 8 8 ] . I n g e n e r a l , t h e n a t u r e o f t h e p r e t r e a t e d b i o m a s s a n d o p t i m u m h y d r o l y t i c e n z y m e c o m b i n a t i o n v a r i e s d e p e n d i n g o n t h e c e l l w a l l c o m p o s i t i o n , t y p e a n d s e v e r i t y o f t h e r m o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t . T h e r e a r e n o t a b l y t w o c l a s s e s o f s u b s t r a t e s t h a t a r e u s e d f o r a s s a y i n g c e l l u l o l y t i c e n z y m e a c t i v i t y ; s o l u b l e a n d i n s o l u b l e . S o l u b l e s u b s t r a t e s l i k e c e l l o d e x t r i n s a n d d e r i v a t i v e s , n i t r o p h e n o l o l i g o s a c c h a r i d e s , d y e d C M C a n d l o n g c h a i n c e l l u l o s e d e r i v a t i v e s a r e e a s i e r t o a d a p t t o h i g h - t h r o u g h p u t c o n d i t i o n s . I n s o l u b l e s u b s t r a t e s , l i k e c e l l u l o s e , c o t t o n l i n t e r s , fl u o r i g e n i c a n d c h r o m o g e n i c c e l l u l o s i c s e t c . , a r e h a r d e r t o a d a p t d u e t o i r r e p r o d u c i b l e s o l i d s u b s t r a t e d e l i v e r y , m i x i n g a n d m a s s t r a n s f e r p r o b l e m s . S e v e r a l r e v i e w a r t i c l e s [ 2 4 , 3 8 9 ] d i s c u s s p r o s a n d c o n s o f a v a i l a b l e a s s a y s f o r c e l l u l o l y t i c e n z y m e s . L i t t l e w o r k h a s b e e n d o n e t o e s t a b l i s h a r e l i a b l e a n d h i g h - t h r o u g h p u t h y d r o l y s i s a s s a y p r o t o c o l f o r i n s o l u b l e l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s . T h e c o n v e n t i o n a l N R E L ( N a t i o n a l R e n e w a b l e E n e r g y L a b o r a t o r y ) L A P - 9 p r o t o c o l [ 3 4 6 ] h a s b e e n u s e d e x t e n s i v e l y b y r e s e a r c h e r s f o r s t u d y i n g b i o m a s s d i g e s t i b i l i t y . H o w e v e r , t h e m e t h o d i s l a b o r - i n t e n s i v e , l o w - t h r o u g h p u t a n d r e q u i r e s a l a r g e q u a n t i t y o f s u b s t r a t e , e n z y m e a n d c h e m i c a l s . S e v e r a l r e s e a r c h e r s h a v e d e v e l o p e d h i g h - t h r o u g h p u t s a c c h a r i fi c a t i o n a s s a y s f o r c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e a n d fi l t e r p a p e r [ 3 9 0 , 3 9 1 ] . D e c k e r e t a l . f o u n d t h a t u p o n r e p l a c i n g fi l t e r p a p e r 1 5 1 w i t h S o l k a - fl o c , S i g m a c e l l - 2 0 , A v i c e l a n d c o t t o n l i n t e r s o n e c o u l d l a r g e l y a u t o m a t e t h e a s s a y f o r a r a t h e r s i m i l a r s u b s t r a t e i n h y d r o l y t i c p r o p e r t i e s t o fi l t e r p a p e r [ 3 9 0 ] . X i a o e t a l . w e r e s u c c e s s fi r l i n s c a l i n g d o w n t h e r e a c t i o n v o l u m e t o 6 0 u l f o r fi l t e r p a p e r b a s e d a s s a y [ 3 9 1 ] . T h e s e a s s a y s w e r e h o w e v e r n o t a d a p t e d t o l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s d u e t o i n h e r e n t v a r i a b i l i t y a n d d i f fi c u l t y i n d e l i v e r i n g a s u i t a b l e b i o m a s s f r a c t i o n i n t o a m i c r 0 p l a t e . R e c e n t l y , a h i g h - t h r o u g h p u t a s s a y f o r l i g n o c e l l u l o s i c s w a s d e v e l o p e d b y B e r l i n a n d c o l l e a g u e s [ 3 9 2 ] t h a t u t i l i z e h a n d s h e e t d i s k s p r e p a r e d fi o m p r e t r e a t e d p u l p b i o m a s s f e e d s t o c k s . H o w e v e r , t h e h a n d s h e e t p r e p a r a t i o n s t e p r e q u i r e s s p e c i a l e q u i p m e n t ; m a k i n g i t i n c o n v e n i e n t a n d t i m e c o n s u m i n g f o r u t i l i z a t i o n o f s m a l l q u a n t i t i e s o f p r e t r e a t e d b i o m a s s f r o m h i g h - t h r o u g h p u t p r e t r e a t m e n t s y s t e m s . T h e d e l i v e r y o f h a n d s h e e t d i s k s t o t h e m i c r o p l a t e i s l a b o r - i n t e n s i v e f o r h i g h - t h r o u g h p u t s c r e e n i n g . T h e p u l p i n g a n d h a n d s h e e t p a p e r p r e p a r a t i o n p r o c e s s c o u l d m o d i f y t h e c e l l w a l l u l t r a s t r u c t u r a l p r o p e r t i e s ; a f f e c t i n g i t s d i g e s t i b i l i t y ( p r o b a b l y m a k i n g i t m o r e r e c a l c i t r a n t ) . W e i m e r a n d c o l l e a g u e s [ 3 9 3 ] h a v e d e m o n s t r a t e d g o o d c o r r e l a t i o n b e t w e e n d i g e s t i b i l i t y o f h e r b a c e o u s b i o m a s s m e a s u r e d b y s i m u l t a n e o u s h y d r o l y s i s a n d f e r m e n t a t i o n ( S S F ) t o t h e a m o u n t o f g a s p r o d u c e d b y r u m i n a l i n o c u l u m s . T h e m e t h o d c a n b e c a r r i e d o u t i n a s e p t i c c o n d i t i o n s a n d s h o u l d b e a d a p t a b l e t o h i g h - t h r o u g h p u t a s s a y s . O t h e r h i g h - t h r o u g h p u t a s s a y s u t i l i z e fl u o r e s c e n t c e l l u l o s i c d e r i v a t i v e s a n d c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e s t h a t a r e e x p e n s i v e a n d u n s u i t a b l e t o s t u d y d i g e s t i b i l i t y o f p r e t r e a t e d b i o m a s s [ 3 9 4 - 3 9 6 ] . W e h a v e s c a l e d d o w n t h e c o n v e n t i o n a l t e s t - t u b e ( 1 0 - 3 0 m 1 ) s a c c h a r i fi c a t i o n m e t h o d t o m i c r o - s c a l e ( 1 0 0 - 1 0 0 0 p l ) , c a r r i e d o u t i n 9 6 - w e l l p l a t e s f u l l y a d a p t a b l e t o a u t o m a t i o n . S e v e r a l i s s u e s h a v e b e e n a d d r e s s e d i n t h i s p a p e r r e g a r d i n g s o l i d d e l i v e r y t o m i c r o p l a t e s u s i n g b i o m a s s s l u r r i e s , e f f e c t o f p a r t i c l e s i z e a n d m a s s t r a n s f e r r e l a t e d 1 5 2 p a r a m e t e r s , o p t i m a l m i c r o p l a t e m e t h o d o l o g y , r e p r o d u c i b i l i t y a n d v a l i d i t y o f t h e m e t h o d c o m p a r e d t o c o n v e n t i o n a l N R E L p r o t o c o l . T h e c u r r e n t B i o m a s s C o n v e r s i o n R e s e a r c h L a b o r a t o r y ( B C R L ) m i c r o p l a t e a s s a y h e l p s s c r e e n a l a r g e r g a m u t o f v a r i a b l e s ( i . e . e n z y m e c o m b i n a t i o n s , p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y ) i n a r a p i d , r e p r o d u c i b l e a n d e f fi c i e n t w a y t h a t c a n p r o v i d e r e l i a b l e d a t a a p p l i c a b l e f o r s c a l e - u p o p e r a t i o n s ( i . e . h i g h s o l i d s l o a d i n g h y d r o l y s i s a n d f e r m e n t a t i o n ) . A h i g h - t h r o u g h p u t h y d r o l y s i s a s s a y i s a k e y l i n k i n t h e c h a i n o f h i g h - t h r o u g h p u t s c r e e n i n g e f f o r t s r a n g i n g f r o m r a p i d p r e t r e a t m e n t o f s e v e r a l f e e d s t o c k s t o s c r e e n i n g f e r m e n t a t i o n m i c r o b e s f o r b i o m a s s c o n v e r s i o n . 6 . 1 . 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s S e e a p p e n d i x A - V I I - l , 2 , 3 , 4 , 2 3 , 2 5 , 2 6 , 2 7 , 2 8 , 2 9 , 3 0 a n d 3 1 . A n o v e r v i e w t o t h e B C R L m i c r o p l a t e b a s e d h y d r o l y s i s m e t h o d o l o g y i s p r o v i d e d i n F i g u r e 6 . 1 . 6 . 1 . 4 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 6 . 1 . 4 . 1 E f f e c t o f c e l l w a l l s i z e r e d u c t i o n o n e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y O n e o f t h e p r i m a r y l i m i t a t i o n s f o r a n y h i g h - t h r o u g h p u t h y d r o l y s i s a s s a y i s t h e i n h e r e n t d i f fi c u l t y i n d e l i v e r i n g r e p r o d u c i b l e a m o u n t s o f s o l i d s u b s t r a t e t o a m i c r o - r e a c t o r a n d o v e r c o m i n g m a s s t r a n s f e r l i m i t a t i o n s d u r i n g t h e c o u r s e o f t h e h e t e r o g e n e o u s r e a c t i o n . S i z e r e d u c t i o n o f t h e s u b s t r a t e w o u l d h e l p o v e r c o m e b o t h t h e s e l i m i t a t i o n s b u t a t t h e c o s t o f a l t e r i n g t h e t i s s u e s t r u c t u r e a n d i t s r a t e o f d i g e s t i o n . E n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s i s d e p e n d e n t o n s e v e r a l f a c t o r s t h a t c a n b e l a r g e l y c l a s s i fi e d o n t w o l e v e l s ; m o l e c u l a r a n d s t r u c t u r a l . M o l e c u l a r f a c t o r s i n c l u d e c e l l u l o s e c r y s t a l l i n i t y , d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n , l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e c o n t e n t , t y p e o f h e m i c e l l u l o s e s , h e m i c e l l u l o s e b r a n c h i n g , a c e t y l c o n t e n t , s y r i n g y l t o g u i a c y l l i g n i n m o n o m e r r a t i o a n d l i g n i n m o l e c u l a r w e i g h t e t c . S t r u c t u r a l f a c t o r s i n c l u d e t h e l i g n i n - h e m i c e l l u l o s e p h y s i c a l 1 5 3 b a r r i e r t o c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s , p l a n t c a p i l l a r y p o r o s i t y , p a r t i c l e s i z e a n d s p e c i fi c s u r f a c e a r e a e t c . T h e r e i s o v e r l a p b e t w e e n t h e s e t w o c a t e g o r i e s o n t r a n s i t i o n f r o m a m o l e c u l a r t o m i c r o a n d e v e n t u a l l y m a c r o s c a l e . S t r u c t u r a l f a c t o r s a r e t h e p r i m a r y i m p e d i m e n t s t o a c c e s s o f e n z y m e s t o t h e m o l e c u l a r s u b s t r a t e . S i z e r e d u c t i o n o f b i o m a s s h a s b e e n k n o w n t o e n h a n c e d i g e s t i b i l i t y o f b i o m a s s d u e t o s e v e r a l r e a s o n s ; i m p r o v e m e n t i n p a r t i c l e s i z e / s p e c i fi c s u r f a c e a r e a b e i n g t h e p r i m a r y f a c t o r [ 1 0 ] . E x t e n s i v e b a l l m i l l i n g o f b i o m a s s w a s f o u n d t o r e d u c e c e l l u l o s e c r y s t a l l i n i t y h e n c e i m p r o v i n g h y d r o l y s i s y i e l d [ 1 6 ] . H o w e v e r , s i z e r e d u c t i o n u s i n g a c e n t r i f u g a l m i l l f o r a s h o r t p e r i o d o f t i m e ( 1 0 - 1 5 m i n ) s h o u l d l a r g e l y a l l o w p r e s e r v a t i o n o f m o l e c u l a r i n t e g r i t y o n t h e u l t r a - s t r u c t u r a l l e v e l . S i z e r e d u c t i o n a l s o i n fl u e n c e s p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y , d e p e n d i n g o n t y p e o f p r e t r e a t m e n t [ 1 , 3 9 7 , 3 9 8 ] . T e n - f o l d p a r t i c l e s i z e r e d u c t i o n o f u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ( 1 0 0 0 p m t o 1 0 0 u m ) i m p r o v e d o v e r a l l h y d r o l y s i s y i e l d b y 1 0 - 1 5 % . A F E X p r e t r e a t m e n t a f t e r s i z e r e d u c t i o n s h o w e d a 5 - 1 0 % i m p r o v e m e n t i n g l u c a n c o n v e r s i o n i f t h e s a m p l e s w e r e w a s h e d p r i o r t o h y d r o l y s i s [ 1 ] . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t s i z e r e d u c t i o n h e l p s i n c r e a s e b i o m a s s d i g e s t i b i l i t y b y e n h a n c i n g s u r f a c e a r e a t o v o l u m e r a t i o a l l o w i n g h i g h e r e n z y m e a n d p r e t r e a t m e n t c h e m i c a l a c c e s s i b i l i t y t o t h e c e l l w a l l u l t r a - s t r u c t u r e . H o w e v e r , w h e n s t u d y i n g s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n o f e n z y m e s t h a t c o - h y d r o l y z e l i g n o c e l l u l o s i c p o l y m e r s , m o l e c u l a r f a c t o r s a r e u l t i m a t e l y r a t e l i m i t i n g . 6 . 1 . 4 . 2 A d v a n t a g e s o f s i z e r e d u c t i o n t o h i g h - t h r o u g h p u t d i g e s t i b i l i t y a s s a y s S o m e o f t h e p r i m a r y a d v a n t a g e s t o s i z e r e d u c t i o n f o r h i g h - t h r o u g h p u t d i g e s t i b i l i t y a s s a y s a r e ; ( l ) h o m o g e n i z a t i o n o f t h e v a r i o u s b i o m a s s f r a c t i o n s o f v a r y i n g c o m p o s i t i o n , ( 2 ) e a s e i n d e l i v e r y o f g r o u n d s u b s t r a t e t o m i c r o p l a t e a n d ( 3 ) b e t t e r m i x i n g o f b i o m a s s d u r i n g h y d r o l y s i s i n m i c r o w e l l s . 1 5 4 T h e r e i s s u b s t a n t i a l v a r i a t i o n i n c e l l w a l l c o m p o s i t i o n b a s e d o n t i s s u e t y p e , l o c a t i o n a n d s t r u c t u r e . C o r n s t o v e r f r a c t i o n s w e r e f o u n d t o s h o w v a r i a b i l i t y i n g l u c a n , x y l a n a n d l i g n i n c o m p o s i t i o n b a s e d o n t y p e o f t i s s u e [ 1 ] . I t i s i m p o r t a n t t o h o m o g e n i z e t h e p l a n t m a t e r i a l a n d d e l i v e r a r e p r e s e n t a t i v e s a m p l e f o r d i g e s t i b i l i t y a s s a y s . S i z e r e d u c t i o n a l l o w s h o m o g e n i z a t i o n o f d i f f e r e n t p l a n t t i s s u e s i n t o a w e l l m i x e d p o w d e r t h a t a l l o w s d e l i v e r y o f t r u l y r e p r e s e n t a t i v e s a m p l e s . A u t o m a t i o n o f d i g e s t i b i l i t y a s s a y s w o u l d r e q u i r e r a p i d a n d r e p r o d u c i b l e d e l i v e r y o f s o l i d s u b s t r a t e t o e a c h m i c r o w e l l . S i z e r e d u c t i o n o f p a r t i c u l a t e b i o m a s s t o a fi n e l y g r o u n d p o w d e r i s a p r e r e q u i s i t e t o a u t o m a t i o n . T h e r e a r e t w o p o s s i b l e m e t h o d s f o r d e l i v e r y o f g r o u n d b i o m a s s ; s o l i d s d e l i v e r y o r s l u r r y d i s p e n s i o n . T h e r e a r e s e v e r a l a d v a n t a g e s a s s o c i a t e d w i t h e a c h m e t h o d ; h o w e v e r , s l u r r y d i s p e n s i o n a l l o w s i n t e g r a t i o n o f a l i q u i d d i s p e n s i n g r o b o t i c w o r k s t a t i o n t o s u b s t r a t e d e l i v e r y a l o n g w i t h o t h e r p i p e t t i n g s t e p s . P i p e t t i n g s t e p s i n v o l v e d i n h i g h - t h r o u g h p u t d i g e s t i b i l i t y a s s a y s i n c l u d e b u f f e r a n d e n z y m e d e l i v e r y , s a m p l i n g o f h y d r o l y s a t e a n d c o l o r i m e t r i c / s p e c t r o p h o t o m e t r i c s u g a r a s s a y s . C r y o g e n i c g r i n d e r s a n d s o l i d d i s p e n s i n g u n i t s a r e c u r r e n t l y m o r e e x p e n s i v e a n d t a k e m o r e t i m e t o d e l i v e r e q u i v a l e n t a m o u n t s o f s o l i d s t o m i c r o p l a t e s . T h e t w o p r i m a r y r a t e l i m i t i n g f a c t o r s o f h e t e r o g e n e o u s r e a c t i o n s a r e m a s s t r a n s f e r ( d i f f u s i o n o f e n z y m e a n d p r o d u c t s t o a n d f r o m t h e s u b s t r a t e ) a n d r e a c t i o n r a t e ( c o n v e r t i n g s u b s t r a t e t o p r o d u c t ) r e l a t e d . T h e r e a r e s e v e r a l s t a g e s i n v o l v e d i n t h e h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s t o m o n o m e r i c s u g a r s , n a m e l y ; ( 1 ) M a s s t r a n s f e r o f e n z y m e c o m p l e x fi ' o m l i q u i d p h a s e t o s o l i d s u b s t r a t e , ( 2 ) A d s o r p t i o n o f e n z y m e o n t o s o l i d s u b s t r a t e a c t i v e s i t e s ( a n d n o n - p r o d u c t i v e s i t e s l i k e l i g n i n ) , ( 3 ) H y d r o l y t i c r e a c t i o n a t s u r f a c e a n d 2 - d i m e n s i o n a l s u r f a c e p r o p a g a t i o n o f a d s o r b e d e n z y m e s , ( 4 ) 3 - 1 5 5 d i m e n s i o n a l d i f f u s i o n o f f r e e e n z y m e s t h r o u g h m i c r O p o r e s t o n e w s i t e s , ( 5 ) M a s s t r a n s f e r o f r e a c t i o n p r o d u c t s ( o l i g o s a c c h a r i d e s , c e l l o b i o s e , x y l o b i o s e ) i n t o l i q u i d p h a s e , ( 6 ) H o m o g e n e o u s l i q u i d p h a s e h y d r o l y s i s o f s h o r t c h a i n o l i g o s a c c h a r i d e s . T h e o v e r a l l r a t e o f t h e r e a c t i o n i s d e p e n d e n t o n t h e r a t e o f t h e s l o w e s t s t e p o f a l l t h e s e s t a g e s . M o s t e n z y m e k i n e t i c s t u d i e s i g n o r e c o n t r i b u t i o n o f t h e e x t e r n a l ( m a s s t r a n s f e r o f e n z y m e a n d p r o d u c t s t h r o u g h t h e s t a g n a n t fi l m s u r r o u n d i n g c e l l u l o s i c s o l i d s ) a n d i n t e r n a l ( m a s s t r a n s f e r o f e n z y m e a n d p r o d u c t s t h r o u g h l i g n o c e l l u l o s i c u l t r a s t r u c t u r e ) t r a n s f e r r e s i s t a n c e s c o m p a r e d t o t h e s l o w e r r a t e o f h y d r o l y s i s . V a n D y k e e t a l . f o u n d l i t t l e i n fl u e n c e o f a g i t a t i o n o n c e l l u l o s e h y d r o l y s i s o n c e t h e p a r t i c l e s w e r e c o m p l e t e l y s u s p e n d e d [ 3 9 9 ] . S i z e r e d u c t i o n s h o u l d f u r t h e r h e l p i m p r o v e e x t e r n a l a n d i n t e r n a l m a s s t r a n s f e r o f e n z y m e s a n d p r o d u c t s . 6 . 1 . 4 . 3 A d v a n t a g e s o f c e n t r i f u g a l m i l l i n g t o s i z e r e d u c t i o n I d e a l l y , o n e w o u l d l i k e t o c o n d u c t p a r t i c l e s i z e r e d u c t i o n u s i n g a m e t h o d t h a t m i n i m a l l y a l t e r s t h e p h y s i c a l a n d c h e m i c a l s t a t e o f p r o c e s s e d m a t e r i a l . T h e r e a r e s e v e r a l m e c h a n i s m s b y w h i c h c o m m i n u t i o n c a n b e a c h i e v e d . S t r a i n c a n b e a c h i e v e d b y a p p l i c a t i o n o f p r e s s u r e ( j a w c r u s h e r s ) , i m p a c t ( j e t i m p a c t m i l l s ) , f r i c t i o n ( m o r t a r m i l l ) , s h e a r ( r o t o r b e a t e r m i l l ) a n d c u t t i n g a c t i o n ( s h r e d d e r s ) . U l t r a c e n t r i f u g a l m i l l i n g w o r k s o n t h e p r i n c i p l e o f i m p a c t a n d s h e a r e f f e c t s b e t w e e n t h e r o t o r a n d t h e fi x e d r i n g s i e v e f o r p a r t i c l e s i z e r e d u c t i o n . T h e p r e - m i l l e d b i o m a s s ( 2 - 5 m m ) i s d r o p p e d o n t o t h e r o t o r w h e r e i t i s t h r o w n b y c e n t r i f u g a l a c c e l e r a t i o n o u t w a r d s . T h e b i o m a s s i s p r e c r u s h e d o n i m p a c t w i t h t h e w e d g e - s h a p e d r o t o r t e e t h m o v i n g a t h i g h s p e e d . T h e l a r g e r p a r t i c l e s a r e fi n e l y g r o u n d b e t w e e n t h e r o t o r a n d t h e r i n g s i e v e a n d a r e c o l l e c t e d i n t h e d o w n s t r e a m c y c l o n e . T h e p r i m a r y a d v a n t a g e s o f t h i s p r o c e s s a r e m i n i m a l a l t e r a t i o n o f m a t e r i a l c h a r a c t e r i s t i c s 1 5 6 ( i . e . c r y s t a l l i n i t y ) , m i n i m u m t h e r m a l d a m a g e , h o m o g e n e o u s c o m m i n u t i o n a n d h i g h - t h r o u g h p u t p r o c e s s i n g ( < 1 0 m i n f o r 3 0 - 5 0 g m o f b i o m a s s ) . U n l i k e o t h e r s i z e r e d u c t i o n t e c h n i q u e s l i k e b a l l m i l l i n g a n d c r y o g e n i c g r i n d i n g t h a t m i g h t a l t e r t h e c e l l u l o s i c u l t r a s t r u c t u r e a n d i n d u c e t h e r m a l s t r e s s o n t h e m a t e r i a l , c e n t r i f u g a l m i l l i n g i s a r a p i d , r e p r o d u c i b l e a n d c o m p a r a t i v e l y g e n t l e m e t h o d o l o g y f o r s i z e r e d u c t i o n . 6 . 1 . 4 . 4 F a c t o r s a f f e c t i n g m i c r o p l a t e a s s a y ( a ) P a r t i c l e s i z e d i s t r i b u t i o n T h e p e r c e n t s t a n d a r d d e v i a t i o n f o r r e p l i c a t e c e n t r i f u g a l l y m i l l e d c o r n s t o v e r s a m p l e s f o r v a r i o u s p a r t i c l e s i z e r a n g e s ( s h o w n i n F i g u r e 6 . 2 ) i s r e l a t i v e l y s m a l l ( ~ 3 - 6 % ) . T h e p a r t i c l e s i z e d i s t r i b u t i o n f o r m i l l e d c o r n s t o v e r i s a l s o f a i r l y r e p r o d u c i b l e . I t i s i m p o r t a n t t o h a v e r e p r o d u c i b i l i t y i n t h e m i l l i n g p r o c e s s t o m i n i m i z e v a r i a b i l i t y i n p a r t i c l e s i z e d i s t r i b u t i o n . M a s s t r a n s f e r l i m i t a t i o n s w i t h i n t h e a g g l o m e r a t e p a r t i c l e s t h a t m a k e u p t h e s e s u b s t r a t e s a r e r e s p o n s i b l e f o r v a r i a t i o n i n s a c c h a r i fi c a t i o n r a t e s a s a f u n c t i o n o f p a r t i c l e s i z e [ 4 0 0 ] . S e v e r a l m o d e l s f o r c e l l u l o s e a n d l i g n o c e l l u l o s e h y d r o l y s i s h a v e b e e n d e v e l o p e d o v e r t h e y e a r s t h a t i n c o r p o r a t e v a r i o u s p a r a m e t e r s i n t o t h e k i n e t i c m o d e l . E a r l i e r e m p i r i c a l m o d e l s h a v e s h o w n d i r e c t c o r r e l a t i o n b e t w e e n h y d r o l y s i s r a t e a n d s p e c i fi c s u r f a c e a r e a [ 4 0 1 ] . S i z e r e d u c t i o n w a s a l s o f o u n d t o i m p r o v e t h e i n i t i a l r a t e o f h y d r o l y s i s f o r c e l l u l o s e [ 4 0 2 ] . ( b ) S u s p e n s i o n s o l i d s c o n c e n t r a t i o n a n d s l u r r y d e l i v e r y S u s p e n d i n g b i o m a s s p a r t i c l e s i s a f u n c t i o n o f s l u r r y v i s c o s i t y a n d d e n s i t y , w e t a b i l i t y , p a r t i c l e s i z e , a n d s o l i d s c o n c e n t r a t i o n o f t h e s o l u t i o n [ 4 0 3 , 4 0 4 ] . 1 5 7 n e e b s a h e n o m s s a e i t s a n r r e u i g i F ( . p p s s a u - S i t y r l r u s u M s l S a m o i b c i s o l u l l n o g i e n c i o t t a t n t g i l r o f y g o l o d e s p k i r P o W s s y o r a r m u o l i S B h t e m n o i t a c t fi u r p r h a g h u c o c r t n e m t a e a h r s t T - e d h r e g P s i H a b e t a r e l v p o d o r c i m L R C B t e t l S l i n M r o C l a g g u n p u f i l h i g u o r l t i n M . e r ) C h ] t 2 [ - h m g o i H r d r e f n v d u o 1 . e 6 c o t r S u n g e d - n r r o o u r C U g p l e F r : - ' . - ' o i y B r r e u s l n S e p s i D x i n M o i e t m i y d d z A n E n o i e t t a a b l u P c n I e t n a o z i t y a l r o t r l i F d y H c i r e y a t s e s m A o - t o o i h B p o r r a t g c u e S p S s i e s t y a z y l o r l a n A C d G y / H C L 1 5 8 - n n o s s 0 s s g o i i t m a a u b b M M n i t e e r t s s v v i i i i D D t t a a s s l l s s u u m m a a u u M M C C % % % % S V v S A A C - C J - — Z m : Z a & E - — m 5 fi 2 1 > 1 ) m u ( e 0 9 - 5 7 g n a r e 5 z 7 i - s 3 6 e l c i t r a 3 P 6 3 5 1 5 9 F i g u r e 6 . 2 P a r t i c l e s i z e d i s t r i b u t i o n s f o r A v i c e l ( A W a n d u l t r a - c e n m ' fi l g a l l y m i l l e d c o r n s t o v e r ( C S ) . B a r s i n d i c a t e m e a n a n d s t a n d a r d e r r o r s f o r f o u r r e p l i c a t e s a m p l e s . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d f r o m [ 2 ] ) . 1 8 0 C u m u l a t i v e p a r t i c l e s i z e d i s t r i b u t i o n ( s s e w % ) u o n n q m s m a n s s l o w e d F o r s u s p e n s i o n o f c o a r s e r p a r t i c l e s ( 2 0 - 1 0 0 m m ) d i s p e r s i b i l i t y i s g e n e r a l l y a p r o b l e m , a l l e v i a t e d b y u s e o f w e t t i n g / d i s p e r s i v e a g e n t s a n d v i s c o s i t y e n h a n c e r s . S u s p e n d i n g a g e n t s , s u c h a s g l y c e r o l , c a n b e u s e d t o i n c r e a s e t h e v i s c o s i t y o f w a t e r a n d r e d u c e s e t t l i n g t i m e o f s l u r r y p a r t i c l e s [ 3 9 0 ] . H o w e v e r , t h e r e w a s n o n e e d t o a d d a n y d i s p e r s i n g a g e n t t o h e l p s u s p e n d t h e s o l i d s f o r s l u r r i e s t y p i c a l l y l e s s t h a n 5 % s o l i d s ( w t ) f o r b o t h A v i c e l a n d A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r . T h e m e a s u r e d a m o u n t o f A v i c e l d e l i v e r e d f o r s l u r r y s u s p e n s i o n s b e t w e e n 1 t o 5 w e i g h t p e r c e n t s o l i d s l o a d i n g w a s f o u n d t o b e q u i t e r e p r o d u c i b l e ( F i g u r e I V - 6 . 3 ) w i t h p e r c e n t s t a n d a r d d e v i a t i o n s w i t h i n 2 - 5 % . H o w e v e r , i n c r e a s i n g t h e s o l i d s l o a d i n g t o 1 0 w e i g h t p e r c e n t o r m o r e r e s u l t e d i n g r e a t e r v a r i a t i o n ( i . e . l a r g e r t h a n 1 0 - 1 5 % s t a n d a r d d e v i a t i o n ) i n s o l i d s d e l i v e r e d t o t h e m i c r o p l a t e . T h i s i s l a r g e l y d u e t o d i f fi c u l t y i n h o m o g e n e o u s l y s u s p e n d i n g a n d d e l i v e r i n g t h e s l u r r y a t h i g h e r s o l i d s l o a d i n g f o r t h e c u r r e n t s l u r r y d e l i v e r y p a r a m e t e r s ( S e e A p p e n d i x A - V I I - Z S , 2 6 ) . T h e o p t i m a l p a r a m e t e r s ( M e t h o d A - V I I - Z S ) f o r u n i f o r m l y a s p i r a t i n g t h e s l u r r y , p r i o r t o p i p e t t i n g a p r e - d e fi n e d a l i q u o t t o t h e m i c r o p l a t e , w e r e b a s e d o n v a r i a b i l i t y i n s o l i d s d e l i v e r y a n d h y d r o l y t i c y i e l d s b e t w e e n w e l l s b a s e d o n p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s ( d a t a n o t s h o w n ) . I t w a s f o u n d t h a t f o r b i o m a s s s l u r r i e s u n d e r 1 0 % ( w / w , 1 0 0 - 1 5 0 p m o r l e s s e r p a r t i c l e s i z e ) , 5 0 c y c l e s o f s l u r r y a g i t a t i o n / a s p i r a t i o n w e r e s u f fi c i e n t t o u n i f o r m l y s u s p e n d t h e b i o m a s s . T h e a s p i r a t i o n p a r a m e t e r s m a y n e e d t o b e a d j u s t e d b a s e d o n t h e t y p e o f b i o m a s s a n d p r e t r e a t m e n t p r o c e s s , w h i c h m i g h t a f f e c t t h e s u r f a c e t e n s i o n a n d v i s c o s i t y o f t h e s l u r r y . ( c ) A g i t a t i o n a n d m a s s t r a n s f e r M i n i m i z i n g i n t e r f e r e n c e f r o m m a s s t r a n s f e r l i m i t a t i o n s t o a p o i n t w h e r e o n l y r e a c t i o n r a t e i s t h e l i m i t i n g p a r a m e t e r a l l o w s s t u d y o f o t h e r i m p o r t a n t r a t e - d e p e n d e n t p a r a m e t e r s ( i . e . 1 6 0 e n z y m e s y n e r g y , c e l l w a l l c o m p o s i t i o n a n d p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y ) . H o w e v e r , s c a l e - u p o f l i g n o c e l l u l o s i c h y d r o l y s i s w o u l d d i c t a t e i n c o r p o r a t i o n o f m a s s t r a n s f e r i n t o t h e r a t e e q u a t i o n f o r d e s i g n p u r p o s e s . P r e v i o u s r e s e a r c h [ 3 9 9 , 4 0 5 ] i n d i c a t e s t h a t i n t e n s i t y o f a g i t a t i o n h a d l i t t l e e f f e c t o n c e t h e p a r t i c l e s w e r e c o m p l e t e l y s u s p e n d e d . T a b l e 6 . 1 E fl e c t o f m a s s t r a n s f e r r e l a t e d p a r a m e t e r s ( i . e . r e a c t i o n v o l u m e , s o l i d s l o a d i n g , a g i t a t i o n s p e e d a n d m i x i n g a i d ) o n A v i c e l d i g e s t i b i l i t y f o r ( A ) 0 . 7 5 m l , a n d ( B ) 0 . 2 5 m l b a s e d r e a c t i o n v o l u m e s . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d fi o m [ 2 ] ) . ' A : 0 . 7 5 m l r e a c t i o n v o l u m e G l u c a n L o a d i n g 0 . 2 5 % 1 % A g i t a t i o n w i t h b e a d % C o n v e r s i o n % S t d D e v % C o n v e r s i o n % S t d D e v 1 0 0 r p m 2 6 . 8 5 . 4 2 3 . 3 7 . 3 2 0 0 r p m 3 9 . 9 7 . 5 4 8 . 0 3 . 6 4 0 0 r p m 5 0 . 6 2 . 0 5 5 . 2 5 . 3 ' A g i t a t i o n w i t h o u t b e a d l O O r p m 1 . 8 1 . 1 1 1 . 6 5 . 1 2 0 0 r p m 5 . 8 3 . 3 2 2 . 3 3 . 8 4 0 0 r p m 3 2 . 2 5 . 4 3 9 . 5 2 . 8 B : 0 . 2 5 m l r e a c t i o n v o l u m e G l u c a n L o a d i n g 0 . 2 5 % 1 % A g i t a t i o n w i t h b e a d % C o n v e r s i o n % S t d D e v % C o n v e r s i o n % S t d D e v 1 0 0 r p m 4 1 . 4 6 . 8 4 1 . 1 3 . 2 2 0 0 r p m 3 5 . 3 2 . 5 4 5 . 6 1 . 7 4 0 0 r p m 5 6 . 9 3 . 0 6 0 . 8 6 . 7 A g i t a t i o n w i t h o u t b e a d 1 0 0 r p m 2 6 . 2 2 . 1 2 7 . 9 1 . 8 2 0 0 r p m 2 5 . 8 2 . 1 2 7 . 5 2 . 3 4 0 0 r p m 3 6 . 1 1 . 6 4 2 . 4 5 . 4 E n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f A v i c e l a t v a r y i n g a g i t a t i o n s p e e d s a n d i n t h e p r e s e n c e o f s t e e l b e a d s s h o w s l a r g e v a r i a t i o n i n o v e r a l l g l u c a n c o n v e r s i o n ( S e e T a b l e 6 . 1 ) . R e d u c i n g r e a c t i o n v o l u m e f u r t h e r i m p r o v e s g l u c a n c o n v e r s i o n d u e t o e a s e i n s u s p e n d i n g t h e s o l i d s . I n c r e a s i n g t h e a g i t a t i o n s p e e d i n v a r i a b l y h e l p s i m p r o v e t h e g l u c a n c o n v e r s i o n i n a l l 1 6 1 c a s e s ; e s p e c i a l l y i n t h e a b s e n c e o f s t e e l b e a d s , a t i n c r e a s e d r e a c t i o n v o l u m e s a n d h i g h e r g l u c a n l o a d i n g s . N o s i g n i fi c a n t i m p r o v e m e n t i s n o t e d u p o n i n c r e a s i n g a g i t a t i o n s p e e d s b e y o n d 4 0 0 r p m ( d a t a n o t s h o w n ) . A d d i n g a m i x i n g a i d l i k e s t e e l b e a d s h e l p s i m p r o v e g l u c a n c o n v e r s i o n f o r a l l c a s e s a t v a r y i n g d e g r e e s o f s i g n i fi c a n c e d e p e n d i n g o n r e a c t i o n v o l u m e , g l u c a n l o a d i n g a n d a g i t a t i o n s p e e d . T h e p e r c e n t d r o p i n g l u c a n c o n v e r s i o n i n t h e a b s e n c e o f s t e e l b e a d s i s s i g n i fi c a n t a t l o w e r v e r s u s h i g h e r a g i t a t i o n s p e e d s f o r 0 . 7 5 m l a s c o m p a r e d t o 0 . 2 5 m l r e a c t i o n v o l u m e , e s s e n t i a l l y d u e t o i n a d e q u a t e m i x i n g f o r l a r g e r v o l u m e s . T h e p e r c e n t c o n v e r s i o n d e c r e a s e f o r 0 . 2 5 m l s a m p l e s i s a r o u n d 3 0 - 3 5 % . H o w e v e r , f o r 0 . 7 5 m l r e a c t i o n v o l u m e t h e p e r c e n t d e c r e a s e r a n g e s f r o m 9 5 % t o 2 0 % . L a r g e r p e r c e n t d r o p s a r e s e e n a t l o w e r a g i t a t i o n s p e e d s d u e t o g r e a t e r i n h o m o g e n e i t y i n m i x i n g . ( d ) G l u c a n l o a d i n g I t s e e m s t h a t 1 % g l u c a n l o a d i n g h a s s l i g h t l y h i g h e r c o n v e r s i o n s a t l o w e r a g i t a t i o n s p e e d s c o m p a r e d t o 0 . 2 5 % g l u c a n l o a d i n g ( T a b l e 6 . 1 ) p r i m a r i l y d u e t o t h e 4 - f o l d h i g h e r s o l i d s l o a d i n g t h a t m i g h t a s s i s t i n m i x i n g , i n t h e a b s e n c e o f a s u i t a b l e m i x i n g a i d . H o w e v e r , t h e r e i s n o s i g n i fi c a n t e f f e c t o n g l u c a n c o n v e r s i o n a t h i g h e r a g i t a t i o n s p e e d s ( i . e . 3 0 0 - 4 0 0 r p m ) i n t h e p r e s e n c e o f s t e e l b e a d s . I n c r e a s i n g s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n n o r m a l l y r e s u l t s i n d e c r e a s i n g g l u c a n y i e l d d u e t o s e v e r a l f a c t o r s l i k e s u b s t r a t e i n h i b i t i o n [ 4 0 6 ] , i n c r e a s i n g i n h i b i t o r c o n c e n t r a t i o n s a n d m a s s t r a n s f e r i s s u e s . H o w e v e r , a t g l u c a n l o a d i n g s u n d e r 1 % t h e r e s h o u l d b e n o s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e i n h y d r o l y s i s y i e l d s . I t m i g h t b e a d v a n t a g e o u s t o c o n d u c t t h e m i c r o p l a t e h y d r o l y s i s e x p e r i m e n t s a t l o w e r g l u c a n / s o l i d s l o a d i n g d u e t o r e d u c e d s u b s t r a t e a n d e n z y m e r e q u i r e m e n t s . 1 6 2 ( e ) R e a c t i o n v o l u m e T w o d i f f e r e n t r e a c t i o n v o l u m e s ( 2 5 0 a n d 7 5 0 p l ) w e r e e x p l o r e d t o s t u d y t h e e f f e c t o n e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f A v i c e l ( T a b l e 6 . 1 ) . I t i s i m p o r t a n t t h a t t h e r e i s s u f fi c i e n t h e a d s p a c e i n e a c h w e l l w h e n c o n d u c t i n g t h e h i g h r p m h y d r o l y s i s d u e t o m i x i n g a n d s p i l l i n g i s s u e s . A l a r g e r q u a n t i t y o f b i o m a s s ( g m o f b i o m a s s p e r w e l l ) , f o r c o r r e s p o n d i n g l a r g e r v o l u m e s , i s h a r d e r t o s u s p e n d . R e a c t o r d e s i g n a n d p r o c e s s s c a l e a r e k n o w n t o h a v e s i g n i fi c a n t e f f e c t o n b i o m a s s d i g e s t i b i l i t y , p r i m a r i l y d u e t o m i x i n g p r o b l e m s [ 4 0 7 , 4 0 8 ] . T h e e f f e c t o f r e a c t i o n v o l u m e o n g l u c a n c o n v e r s i o n i s m o r e p r o m i n e n t a t l o w e r a g i t a t i o n s p e e d s ( i . e . 1 0 0 v s . 4 0 0 r p m ) . R e d u c i n g r e a c t i o n v o l u m e h a s n o s i g n i fi c a n t e f f e c t o n g l u c a n c o n v e r s i o n s f o r a n y R P M o r g l u c a n l o a d i n g i n t h e p r e s e n c e o f s t e e l b e a d s . H o w e v e r , i n t h e a b s e n c e o f a s u i t a b l e m i x i n g a i d ( e . g . s t e e l b e a d s ) t h e r e i s a s i g n i fi c a n t i n c r e a s e i n g l u c a n c o n v e r s i o n u p o n r e d u c i n g t h e r e a c t i o n v o l u m e . T h e r e i s h o w e v e r m o r e v a r i a b i l i t y i n t h e g l u c a n c o n v e r s i o n s f o r l o w e r r e a c t i o n v o l u m e s c o m p a r e d t o l a r g e r v o l u m e s , e s p e c i a l l y a t l o w e r a g i t a t i o n s p e e d s e v e n i n t h e p r e s e n c e o f s t e e l b e a d s . ( f ) E v a p o r a t i o n l o s s e s E a c h m i c r o p l a t e w a s h e a t e d h o m o g e n e o u s l y d u e t o c l o s e c o n t a c t w i t h a l u m i n u m s l a b s c o v e r i n g t h e t o p a n d b o t t o m o f t h e m i c r o p l a t e . T h e r e w a s n o s i g n i fi c a n t i m p r o v e m e n t i n g l u c a n c o n v e r s i o n f o r s a m p l e s t h a t w e r e p r e - i n c u b a t e d p r i o r t o a d d i t i o n o f e n z y m e s f o r h y d r o l y s i s c a r r i e d f o r 6 h r s o r m o r e ( d a t a n o t s h o w n ) . F o r c o n v e n i e n c e a n d h i g h - t h r o u g h p u t i t m i g h t b e e a s i e r t o c o n d u c t t h e 6 h r h y d r o l y s i s a s s a y s w i t h o u t p r e - i n c u b a t i n g t h e p l a t e s . E s t i m a t e d e v a p o r a t i v e l o s s f r o m t h e h e a t s e a l e d m i c r o p l a t e w a s t y p i c a l l y u n d e r 0 . 1 % a n d 0 . 5 % a t 3 a n d 2 4 h r s , r e s p e c t i v e l y . T h e t o t a l e v a p o r a t i v e l o s s e s f o r a h e a t s e a l e d m i c r o p l a t e w a s s i g n i fi c a n t l y l o w e r c o m p a r e d t o t h e 2 - 3 % ( 2 4 h r i n c u b a t i o n ) a n d < 7 % ( 1 1 6 3 h r i n c u b a t i o n , w i t h h e a t e d l i d ) l o s s e s r e p o r t e d b y B e r l i n e t a l . [ 3 9 2 ] a n d D e c k e r e t a l . [ 3 9 0 ] , r e s p e c t i v e l y . I n o r d e r t o c o m p e n s a t e f o r c o n d e n s a t i o n l o s s e s o n t h e f o i l a n d w e l l w a l l s a fi e r c h i l l i n g t h e m i c r o p l a t e s i n t h e f r e e z e r f o r 1 5 m i n , t h e p l a t e s s h o u l d b e c e n t r i fi i g e d p r i o r t o s a m p l i n g . T h i s i s m o r e c r i t i c a l i f t h e r e a c t i o n v o l u m e i s r e d u c e d t o 1 0 0 p l o r l e s s . T h e l o s s e s a r e i n s i g n i fi c a n t f o r l a r g e r v o l u m e s ( > 5 0 0 [ 4 1 ) a n d w e r e n o t c o n s i d e r e d d u r i n g c a l c u l a t i o n s . ( g ) O t h e r f a c t o r s I t w a s d i f fi c u l t t o h o m o g e n o u s l y s u s p e n d b i o m a s s s l u r r i e s b y s i m p l e s t i r r i n g a n d m a n u a l l y d i s p e n s e a l i q u o t s u s i n g m u l t i - c h a n n e l d i s p e n s e r s ( d a t a n o t s h o w n ) . H i g h - t h r o u g h p u t a n d r e p r o d u c i b l e d e l i v e r y o f s u b s t r a t e a n d r e a g e n t r e q u i r e s a u t o m a t i o n . T h e t i p s u s e d f o r d e l i v e r y o f t h e b i o m a s s s l u r r y w e r e h a n d - c u t u n i f o m l y t o p r e v e n t c l o g g i n g d u r i n g s l u r r y a s p i r a t i o n . N o s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e w a s n o t i c e d f o r b i o m a s s d e l i v e r e d b e t w e e n i n d i v i d u a l l y c u t t i p s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e p i p e t t i n g p a r a m e t e r s ( i . e . a s p i r a t i o n c y c l e s ) u s e d f o r s l u r r y s u s p e n s i o n d i d h a v e a s i g n i fi c a n t e f f e c t o n r e p r o d u c i b i l i t y o f s o l i d s d e l i v e r e d w h i c h w e r e d e p e n d e n t l a r g e l y o n t h e p e r c e n t s o l i d s s l u r r y c o n c e n t r a t i o n . I t i s i m p o r t a n t t o m u l t i - a s p i r a t e t h e s l u r r y s u s p e n s i o n t o u n i f o r m l y s u s p e n d t h e b i o m a s s i n t h e r e s e r v o i r v e s s e l b e f o r e p i p e t t i n g a l i q u o t s i n t o t h e m i c r o p l a t e . T h e s l u r r y w a s m u l t i - a s p i r a t e d p r i o r t o e a c h a l i q u o t t o p r e v e n t h e t e r o g e n e i t y i n s a m p l i n g . P i p e t t i n g p a r a m e t e r s t h a t w e r e f o u n d t o g i v e r e p r o d u c i b l e s l u r r y d e l i v e r y a r e r e p o r t e d ( S e e A p p e n d i x A - V I I - 2 5 , 2 6 ) . T h e v o l u m e o f s l u r r y i n t h e r e s e r v o i r v e s s e l m u s t n o t e x c e e d 5 0 m l f o r t h e c u r r e n t d e l i v e r y p a r a m e t e r s d u e t o i n c o m p l e t e m i x i n g f o r h i g h e r v o l u m e s . I t m i g h t b e n e c e s s a r y t o r e - o p t i m i z e t h e d e l i v e r y p a r a m e t e r s b a s e d o n t h e s u r f a c e t e n s i o n p r o p e r t i e s o f s l u r r i e s f o r d i f f e r e n t p r e t r e a t m e n t s a n d b i o m a s s . 1 6 4 T h e b i o m a s s c a n b e A F E X t r e a t e d p r i o r t o t h e m i l l i n g p r o c e s s , s i n c e A F E X i s e s s e n t i a l l y a d r y - t o - d r y p r e t r e a t m e n t . H o w e v e r , f o r o t h e r p r e t r e a t m e n t s t h a t r e s u l t i n p r e t r e a t e d b i o m a s s s l u r r i e s ( i . e . d i l u t e - a c i d b a s e d t r e a t m e n t s ) i t m i g h t b e n e c e s s a r y t o d r y t h e p r e t r e a t e d s a m p l e p r i o r t o m i l l i n g o r m i l l t h e s a m p l e p r i o r t o p r e t r e a t m e n t . T h e e f f e c t o f p a r t i c l e s i z e h a s b e e n r e p o r t e d t o b e s i g n i fi c a n t f o r m o s t p r e t r e a t m e n t s d u e t o e a s i e r a c c e s s i b i l i t y o f p l a n t b i o m a s s b y p r e t r e a t m e n t c h e m i c a l s ( i . e . a c i d o r a l k a l i ) [ 1 , 3 9 7 , 3 9 8 , 4 0 9 ] . I t m i g h t b e t h u s n e c e s s a r y t o r e - o p t i m i z e p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s f o r t h e fi n e l y g r o u n d b i o m a s s t o p r e v e n t e x c e s s i v e d e g r a d a t i o n r e a c t i o n s . H o w e v e r , f o r s c r e e n i n g p u r p o s e s i t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t t h e c u r r e n t m e t h o d o l o g y c a n b e e a s i l y a d a p t e d t o o t h e r p r e t r e a t m e n t s . 6 . 1 . 4 . 5 R e p r o d u c i b i l i t y o f m i c r o p l a t e m e t h o d o l o g y T h e r e p r o d u c i b i l i t y o f t h e m i c r o p l a t e m e t h o d o l o g y w a s t e s t e d f o r 0 . 2 5 % g l u c a n l o a d i n g A F E X c o r n s t o v e r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s u s i n g 1 5 F P U c e l l u l a s e / g m g l u c a n a n d 6 4 p - N P G U B - g l u c o s i d a s e / g m g l u c a n . T h e t i m e p e r i o d f o r h y d r o l y s i s w a s 2 h r s . F i g u r e 6 . 4 s h o w s t h e b o x p l o t s f o r g l u c a n c o n v e r s i o n s ( Y ) a l o n g w i t h t h e d i s t r i b u t i o n o f i n d i v i d u a l d a t a p o i n t s ( N = 4 8 ) f o r t w o s e t s o f e x p e r i m e n t s ( X ) t h a t w e r e c o n d u c t e d i n s e p a r a t e m i c r o p l a t e s u s i n g s e p a r a t e s l u r r y s o l u t i o n s . T h e a v e r a g e g l u c a n c o n v e r s i o n f o r e x p e r i m e n t s A a n d B w e r e 3 3 . 4 % ( S t a n d a r d D e v i a t i o n = 2 . 2 2 % ) a n d 3 1 . 8 % ( S t a n d a r d D e v i a t i o n = 2 . 1 8 % ) , r e s p e c t i v e l y . S t u d e n t ’ s t - t e s t s h o w e d n o s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o d a t a s e t s ( P < 0 . 0 5 ) . 1 6 5 3 0 — z . — - F i g 6 . 4 B o x p l o t o f g l u c a n c o n v e r s i o n s ( ) 9 a l o n g w i t h d a t a p o i n t s ( N = 4 8 ) f o r e a c h s e t o f e x p e r i m e n t s ( 1 9 p e r f o r m e d f o r 0 . 2 5 % g l u c a n l o a d i n g A F E X c o r n s t o v e r f o r c o n v e n t i o n a l e n z y m e l o a d i n g . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d fi o m [ 2 ] ) . 3 8 3 6 — . ~ — 3 4 — 6 . 1 . 4 . 6 B i o - e n z y m a t i c s u g a r a s s a y O n e o f t h e k e y l i m i t i n g b o t t l e n e c k s o f a n y h i g h - t h r o u g h p u t a s s a y s y s t e m i s c o m p o s i t i o n a n a l y s i s o f h y d r o l y s i s p r o d u c t s . T h e r e a r e s e v e r a l m e t h o d s t h a t c a n b e u s e d t o a s s a y f e r m e n t a b l e s u g a r s ; ( A ) E n z y m e b a s e d a s s a y , ( B ) Y S I g l u c o s e a n a l y z e r a s s a y , ( C ) H P L C a n a l y s i s a n d ( D ) C o l o r i m e t r i c a s s a y s . B i o - e n z y m a t i c a s s a y s a r e u s e f u l f o r r a p i d p r e l i m i n a r y s c r e e n i n g o f t h e h y d r o l y s a t e u s i n g a n e n z y m e s y s t e m t o e s t i m a t e g l u c o s e a n d 1 6 6 x y l o s e . T h e Y S I g l u c o s e a n a l y z e r c a n b e u s e d f o r r a p i d g l u c o s e e s t i m a t i o n w i t h o u t s a m p l e d i l u t i o n s a t m u c h h i g h e r d e t e c t i o n l i m i t s ( 5 - 2 5 g / l ) c o m p a r e d t o c o n v e n t i o n a l e n z y m a t i c a s s a y s ( 0 . 1 - 1 g / l ) . H P L C b a s e d m e t h o d s a r e u s e f u l t o q u a n t i f y o t h e r m o n o s a c c h a r i d e s ( i . e . x y l o s e a n d a r a b i n o s e ) a n d o l i g o m e r i c s u g a r s ( i . e . c e l l o b i o s e , x y l o b i o s e ) . G e n e r a l l y , f o r s c r e e n i n g p u r p o s e s t h e r e i s n o u t i l i t y i n e s t i m a t i n g t o t a l m o n o m e r i c s u g a r c o n t e n t d u e t o h i g h c o r r e l a t i o n b e t w e e n g l u c o s e a n d o t h e r s u g a r s p r o d u c e d d u r i n g b i o m a s s h y d r o l y s i s ( d a t a n o t s h o w n ) . F o r r a p i d s u g a r o l i g o s a c c h a r i d e a n a l y s i s f o r l a r g e n u m b e r o f s a m p l e s i t m i g h t b e u s e fi i l t o c o u p l e t h e H P L C t o a M A L D I - T O F - M S s y s t e m [ 4 1 0 ] o r d e v e l o p a r a p i d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s b a s e d m e t h o d o l o g y . H o w e v e r , i t i s i m p o r t a n t t o g e t s u f fi c i e n t p r e l i m i n a r y d a t a f o r s a m p l e s p r i o r t o a m o r e d e t a i l e d a n a l y s i s u s i n g m o r e t i m e - c o n s u m i n g c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d s l i k e H P L C , L C M S a n d C a p i l l a r y E l e c t r o p h o r e s i s . M o s t r e s e a r c h e r s h a v e c a r r i e d o u t p r e l i m i n a r y s u g a r a n a l y s i s t h r o u g h c o l o r i m e t r i c a s s a y s s u c h a s D N S m e t h o d [ 3 8 3 , 4 1 1 ] , N e l s o n - S o m o g y i m e t h o d [ 4 1 2 , 4 1 3 ] , m o d i fi e d B C A m e t h o d [ 4 1 4 ] , p h e n o l - s u l f u r i c a c i d m e t h o d [ 4 1 4 ] , a n d a n t h r o n e - s u l f u r i c a c i d m e t h o d [ 4 1 5 ] . H o w e v e r , s o m e o f t h e m a j o r l i m i t a t i o n s o f s u c h c o l o r i m e t r i c a s s a y s a r e p o o r s t o i c h i o m e t r i c c o r r e l a t i o n s b e t w e e n t h e c o l o r i m e t r i c o x i d a n t ( i . e . D N S , C u p r i c i o n s ) a n d c h a i n l e n g t h o f r e d u c i n g o l i g o s a c c h a r i d i c s u g a r [ 3 8 4 , 4 1 6 ] . T h e c o l o r i m e t r i c a s s a y s a l s o s u f f e r f r o m n o n - s p e c i fi c i n t e r f e r e n c e d u e t o p r o t e i n a n d l i g n i n p r e s e n t i n t h e b i o m a s s h y d r o l y s a t e [ 4 1 6 , 4 1 7 ] . R i v e r s a n d c o l l e a g u e s [ 4 1 8 ] f o u n d t h a t r e d u c i n g s u g a r d a t a f r o m t h e D N S a s s a y c o r r e l a t e d v e r y p o o r l y w i t h m o r e a c c u r a t e H P L C a n d e n z y m a t i c a s s a y s f o r l i g n o c e l l u l o s i c h y d r o l y s a t e . I 6 7 E n z y m e b a s e d m i c r o - a s s a y s a r e r a p i d , r e p r o d u c i b l e , m i c r o p l a t e - a d a p t a b l e a n d e c o n o m i c a l c o m p a r e d t o c o n v e n t i o n a l a n a l y t i c a l m e t h o d s ( i . e . H P L C ) . A g l u c o s e o x i d a s e b a s e d Y S I 2 3 0 0 S T A T a n a l y z e r ( Y e l l o w S p r i n g s I n s t r u m e n t s , Y e l l o w S p r i n g s , O H , U S A ) w a s u s e d f o r g l u c o s e a n a l y s i s f o r p r e l i m i n a r y h y d r o l y s i s s c r e e n i n g e x p e r i m e n t s . H y d r o l y s a t e s a m p l e s w e r e t r a n s f e r r e d i n t o 1 . 5 m l m i c r o c e n t r i f u g e t u b e s f o r p r e l i m i n a r y g l u c o s e a s s a y u s i n g t h e a u t o m a t e d Y S I g l u c o s e a n a l y z e r . T h e r e s u l t s o b t a i n e d w e r e u s e d t o p r e p a r e s u i t a b l e s a m p l e d i l u t i o n s o n t h e m i c r o p l a t e p r i o r t o m o r e c o m p r e h e n s i v e g l u c o s e a s s a y u s i n g a b i o - e n z y m a t i c a s s a y s y s t e m . T y p i c a l b i o - e n z y m a t i c a s s a y s f o r s u g a r s t h a t r e s u l t i n e v e n t u a l o x i d a t i o n / r e d u c t i o n o f N A D H / N A D ( n i c o t i n a r n i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e ) a r e s u i t a b l e f o r h i g h - t h r o u g h p u t a b s o r b a n c e b a s e d a n a l y s i s . M o s t c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e b i o - e n z y m a t i c a s s a y s a r e m a c r o s c a l e b a s e d ( 1 - 1 0 m l ) , l a b o r i n t e n s i v e a n d t i m e c o n s u m i n g . H o w e v e r , a d a p t i n g t h e s e a s s a y s t o a m i c r o s c a l e ( 1 0 0 - 3 0 0 p l ) i n o r d e r t o r e a d t h e U V a b s o r b a n c e o n a m i c r o p l a t e h e l p s i n c r e a s e t h r o u g h p u t i n a n e c o n o m i c a l m a n n e r . T h e c u r r e n t h e x o k i n a s e a n d g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e s y s t e m w a s f o u n d t o b e s u i t a b l e f o r d e t e c t i n g g l u c o s e i n t h e h y d r o l y s a t e . G l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s d e t e r m i n e d u s i n g H P L C w e r e f o u n d t o b e e s s e n t i a l l y i d e n t i c a l t o t h e b i o - e n z y m a t i c a s s a y r e s u l t s f o r A F E X c o r n s t o v e r h y d r o l y s a t e ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e r e w a s n o s i g n i fi c a n t i n t e r f e r e n c e o f t h e e n z y m a t i c a s s a y b y p h e n o l i c c o m p o u n d s g e n e r a l l y p r e s e n t i n l i g n o c e l l u l o s i c h y d r o l y s a t e s . T h i s i s l a r g e l y d u e t o t h e e f f e c t o f d i l u t i n g t h e l i g n o c e l l u l o s i c h y d r o l y s a t e ( t o l e s s t h a n 1 g / l g l u c o s e ) t o r e d u c e d e g r a d a t i o n p r o d u c t ( i . e . q u i n o n e s , c o n i f e r y l a l d e h y d e s ) c o n c e n t r a t i o n s , t h a t h a v e l i t t l e o r n o s i g n i fi c a n t U V ( 3 4 0 n m ) a b s o r p t i o n . A n y s i g n i fi c a n t a b s o r p t i o n i s a l s o c o r r e c t e d f o r b y s u b t r a c t i n g t h e s a m p l e b l a n k p l a t e ( i . e . 5 m i n p l a t e ) f r o m t h e r e a c t i o n p l a t e ( i . e . 2 0 m i n p l a t e ) . 1 6 8 6 . 1 . 4 . 7 B C R L m i c r o - a s s a y v s . c o n v e n t i o n a l m a c r o - a s s a y T h e h y d r o l y s i s t i m e p r o fi l e f o r m i l l e d A F E X c o r n s t o v e r a n d A v i c e l f o r b o t h m i c r o p l a t e a n d fl a s k a s s a y s a r e s h o w n i n F i g u r e s I V - 6 . 5 . T h e r a t e o f s a c c h a r i fi c a t i o n o f u n g r o u n d a n d m i l l e d A F E X c o r n s t o v e r v a r y s i g n i fi c a n t l y ( ~ 1 5 - 2 0 % ) d u e t o i m p r o v e d e n z y m e a c c e s s i b i l i t y ( i . e . i n c r e a s e d s u r f a c e a r e a t o v o l u m e r a t i o ) o f t h e l a t t e r . T h e p e r c e n t c o n v e r s i o n f o r 1 % a n d 0 . 2 5 % g l u c a n l o a d i n g f o r m i l l e d A F E X c o r n s t o v e r i s f a i r l y c o m p a r a b l e f o r b o t h t h e m i c r o a n d fl a s k b a s e d a s s a y . I t i s c r i t i c a l t o r e d u c e t h e t o t a l a s s a y t i m e f o r h i g h - t h r o u g h p u t e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c s . T h e c o n v e n t i o n a l N R E L L A P - 9 p r o t o c o l t a k e s 4 8 - 7 2 h o u r s t o a c h i e v e 5 0 % g l u c a n c o n v e r s i o n f o r m o s t b i o m a s s e s . T h e B C R L m i c r o p l a t e a s s a y t a k e s u n d e r 6 h o u r s t o a c h i e v e s i m i l a r c o n v e r s i o n s . T h e r e i s a 7 - 1 0 f o l d r e d u c t i o n i n r e a c t i o n t i m e p e r i o d c o m p a r e d t o o t h e r l i g n o c e l l u l o s i c h y d r o l y s i s a s s a y s t o a c h i e v e s i m i l a r y i e l d s t h a t g r e a t l y i m p r o v e t h r o u g h p u t f o r s c r e e n i n g . S a m p l i n g m i c r o p l a t e s a t 1 - 6 a n d 2 4 h r w i l l a l l o w e v a l u a t i o n o f b i o m a s s d i g e s t i b i l i t y d u r i n g t h e e x p o n e n t i a l a n d t e r m i n a l p h a s e o f t h e h y d r o l y s i s r e a c t i o n s , r e s p e c t i v e l y . C o m p l e t e d i g e s t i b i l i t y f o r o p t i m a l e n z y m e c o m b i n a t i o n s a n d u n g r o u n d p r e t r e a t e d b i o m a s s c o u l d b e c o n d u c t e d f o r a l o n g e r t i m e o n a l a r g e r s c a l e . T h e m i x i n g r e g i m e i n t h e m i c r o p l a t e w e l l i s e x p e c t e d t o b e q u i t e d i f f e r e n t f r o m t h a t o f a b a f fl e d fl a s k , a t v a r y i n g a g i t a t i o n s p e e d s . W e a l s o e x p e c t t h e v a r i o u s s u r f a c e a c t i v e c o m p o n e n t s i n t h e A C S h y d r o l y s a t e ( e . g . o r g a n i c a c i d s , l i g n i n p h e n o l i c s a n d o t h e r A F E X p r e t r e a t m e n t d e g r a d a t i o n p r o d u c t s ) w o u l d m o d i f y t h e s u r f a c e t e n s i o n a n d v i s c o s i t y d u r i n g t h e c o u r s e o f h y d r o l y s i s , a l l o w i n g e n h a n c e d m a s s t r a n s f e r c o m p a r e d t o a v i c e l ( w i t h l i t t l e o r n o s i g n i fi c a n t e x t r a c t i v e s , 9 7 - 9 9 % c e l l u l o s e ) . I t i s l i k e l y t h a t m i x i n g 1 6 9 i s m o r e v i g o r o u s i n t h e m i c r o p l a t e w e l l s c o m p a r e d t o t h e b a f fl e d fl a s k , h e n c e a l l o w i n g A C 8 t o a c h i e v e a s l i g h t l y h i g h e r g l u c a n c o n v e r s i o n i n t h e f o r m e r c a s e . T h e g l u c a n c o n v e r s i o n s f o r A C S a r e a l s o c o m p a r a b l e f o r b o t h 0 . 2 5 a n d 1 % g l u c a n l o a d i n g i n t h e m i c r o p l a t e b a s e d a s s a y . A s i m i l a r t r e n d i s a l s o n o t e d f o r t h e fl a s k a s s a y f o r v a r y i n g A C S g l u c a n l o a d i n g , i n d i c a t i n g t h a t t h e m i x i n g r e g i m e s w i t h i n t h e fl a s k a n d m i c r o p l a t e a r e s u f fi c i e n t a n d c o m p a r a b l e t o h o m o g e n e o u s l y s u s p e n d a n d m i x t h e A C S s u b s t r a t e . H o w e v e r , t h e s a m e t r e n d d o e s n ’ t s e e m t o b e o b s e r v e d f o r a v i c e l . T h e v i g o r o u s m i x i n g r e g i m e i n t h e m i c r o p l a t e g i v e s a g l u c a n c o n v e r s i o n t h a t i s l a r g e l y c o m p a r a b l e f o r b o t h 0 . 2 5 a n d 1 % g l u c a n l o a d i n g , d u r i n g t h e c o u r s e o f h y d r o l y s i s . H o w e v e r , t h e g l u c a n c o n v e r s i o n s f o r 0 . 2 5 a n d 1 % a v i c e l l o a d i n g i n t h e fl a s k a s s a y a r e s i g n i fi c a n t l y d i f f e r e n t ( a n d l o w e r i n o v e r a l l c o n v e r s i o n s c o m p a r e d t o m i c r o p l a t e a s s a y ) , i n d i c a t i n g a p o o r e r m i x i n g r e g i m e f o r a v i c e l i n t h e fl a s k . T h e r e a r e o b v i o u s d i f f e r e n c e s i n t h e d i g e s t i b i l i t y o f t h e b i o m a s s i n t h e m i c r o p l a t e a s s a y c o m p a r e d t o t h e c o n v e n t i o n a l fl a s k - b a s e d ( i . e . N R E L L A P 9 ) d u e t o s e v e r a l f a c t o r s . M o s t o f t h e d i f f e r e n c e s h a v e b e e n p o i n t e d o u t i n p r e v i o u s d i s c u s s i o n s . S o m e o f t h e m a j o r d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e t w o a s s a y s a r e b i o m a s s p a r t i c l e s i z e , m a s s t r a n s f e r d i f f e r e n c e s d u e t o a g i t a t i o n a n d r e a c t o r c o n fi g u r a t i o n . H o w e v e r , o n e s h o u l d r e m e m b e r t h a t t h e p u r p o s e o f t h e m i c r o p l a t e a s s a y i s l a r g e l y t o s c r e e n v a r i o u s p a r a m e t e r s i n a r e p r o d u c i b l e m a n n e r . T h e u n d e r s t a n d i n g g a i n e d c a n b e e a s i l y a p p l i e d f o r s c a l i n g u p t h e p r e t r e a t m e n t , h y d r o l y s i s a n d f e r m e n t a t i o n p r o c e s s e s . 6 . 1 . 4 . 8 M u l t i - p r o n g e d a p p l i c a b i l i t y o f m i c r o p l a t e b a s e d a s s a y s T h e r e a r e s e v e r a l a p p l i c a t i o n s o f u s i n g a h i g h - t h r o u g h p u t d i g e s t i b i l i t y a s s a y , s u c h a s , ( 1 ) s t u d y i n g c e l l w a l l d i g e s t i b i l i t y f o r d i f f e r e n t l i g n o c e l l u l o s i c f e e d s t o c k s , ( 2 ) u n d e r s t a n d i n g 1 7 0 e f f e c t o f p r e t r e a t m e n t p a r a m e t e r s ( i . e . t e m p e r a t u r e , c a t a l y s t l o a d i n g , m o i s t u r e , s o l i d l o a d i n g ) u s i n g s m a l l s c a l e h i g h - t h r o u g h p u t p r e t r e a t m e n t s y s t e m s , ( 3 ) O p t i m i z i n g c e l l u l a s e m i x t u r e s a n d s y n e r g i s t i c a d d i t i v e s ( i . e . c r u d e c o m m e r c i a l a n d p u r i fi e d e n z y m e s , n o v e l e n z y m e s , p r o t e i n a n d s u r f a c t a n t a d d i t i v e s ) , ( 4 ) s t u d y i n g s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n o f f r e e c e l l u l o l y t i c a n d c e l l - b o u n d c e l l u l o s o m a l e n z y m e s o n l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s , ( 5 ) s c r e e n i n g e n h a n c e d a c t i v i t y f o r e n z y m e s m o d i fi e d b y s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s a n d / o r d i r e c t e d e v o l u t i o n o n c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s , ( 6 ) s c r e e n i n g a c t i v i t y o f n o v e l h y d r o l a s e s i d e n t i fi e d f r o m f u n c t i o n a l m e t a g e n o m i c a n a l y s i s , ( 7 ) p r e l i m i n a r y a n d d e t a i l e d s c r e e n i n g o f c e l l w a l l m u t a n t s f r o m m o d e l p l a n t s ( i . e . A r a b i d o p s i s , P o p u l u s ) t o i d e n t i f y g e n e s r e s p o n s i b l e f o r c e l l w a l l r e c a l c i t r a n c e t o h y d r o l y s i s . 6 . 1 . 5 C o n c l u s i o n s T h e 9 6 - w e l l B C R L m i c r o p l a t e m e t h o d w a s d e v e l o p e d f o r c o n d u c t i n g m i c r o - s c a l e d i g e s t i b i l i t y s t u d i e s f o r u n t r e a t e d a n d p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s . A s u i t a b l e m e t h o d f o r d e l i v e r i n g t h e b i o m a s s t o t h e m i c r o p l a t e w a s t h r o u g h u l t r a - c e n t r i f u g a l m i l l i n g a n d p i p e t t i n g m i l l e d b i o m a s s s l u r r y s u s p e n s i o n s i n t o t h e m i c r o p l a t e . A h i g h - t h r o u g h p u t b i o - e n z y m a t i c a s s a y w a s a d a p t e d t o b e u s e d o n a m i c r o - s c a l e t o d e t e r m i n e f e r m e n t a b l e s u g a r s i n t h e h y d r o l y s a t e . T h e e n t i r e p r o c e d u r e w a s a u t o m a t e d u s i n g a r o b o t i c p i p e t t i n g w o r k s t a t i o n . R e p r o d u c i b l e p a r t i c l e s i z e r e d u c t i o n o f b o t h u n t r e a t e d a n d A F E X p r e t r e a t e d s t o v e r w a s p o s s i b l e u s i n g t h e u l t r a c e n t r i fi i g e m i l l . T h e B C R L m i c r o p l a t e m e t h o d w a s o p t i m i z e d f o r c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e ( A v i c e l ) a n d a m m o n i a fi b e r e x p a n s i o n ( A F E X ) p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r f o r v a r y i n g g l u c a n l o a d i n g . T h e m e t h o d i s r e p r o d u c i b l e a n d c o m p a r a b l e t o l a r g e r s c a l e fl a s k b a s e d h y d r o l y s i s a s s a y s . 1 7 1 T h e m i c r o p l a t e a s s a y c a n b e e a s i l y a d a p t e d t o s c r e e n i n g a s s a y s f o r m u l t i p l e k i n d s o f b i o m a s s m a k i n g i t a p o w e r f u l a n a l y t i c a l t o o l f o r r e s e a r c h e r s w o r k i n g i n t h e fi e l d o f b i o m a s s c o n v e r s i o n . E n z y m e p r o d u c t i o n a n d t h e r m o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t a r e p r i m a r y e c o n o m i c b a r r i e r s t o c o m m e r c i a l s c a l e - u p o f b i o r e f m e r i e s t h a t r e q u i r e fi i r t h e r c o s t r e d u c t i o n s t h r o u g h r e d u c t i o n i n e n z y m e l o a d i n g a n d p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y . C o u p l i n g h i g h - t h r o u g h p u t p r e t r e a t m e n t , h y d r o l y s i s , f e r m e n t a t i o n a n d c o m p o s i t i o n a l a n a l y s i s w i l l f a c i l i t a t e r a p i d s c r e e n i n g a n d i d e n t i fi c a t i o n o f k e y b o t t l e n e c k s t o t h e b i o m a s s c o n v e r s i o n p r o c e s s . 1 7 2 C H A P T E R 7 : M A X I M I Z I N G T O T A L S U G A R H Y D R O L Y T I C Y I E L D F O R A M M O N I A P R E T R E A T E D L I G N O C E L L U L O S I C S T H R O U G H C R U D E E N Z Y M E M I X T U R E O P T I M I Z A T I O N 7 . 1 . 1 A b s t r a c t C o m m e r c i a l e n z y m e u s a g e ( 3 0 - 1 0 0 m g p r o t e i n / g g l u c a n ) n e c e s s a r y t o a c h i e v e > 9 0 % t o t a l s u g a r h y d r o l y s i s y i e l d f o r p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s i s e c o n o m i c a l l y u n v i a b l e . M o s t c o m m e r c i a l c e l l u l a s e b l e n d s l a c k s u i t a b l e h e m i c e l l u l a s e s a n d o t h e r a c c e s s o r y e n z y m e a c t i v i t i e s t h a t r e s u l t i n h i g h e r p r o t e i n r e q u i r e m e n t s . I t w o u l d b e i d e a l t o o p t i m i z e c e l l u l a s e c o c k t a i l s b y s u p p l e m e n t a t i o n o f s u i t a b l e h e m i c e l l u l a s e s . T h i s w o u l d a l s o h e l p g a i n a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f e n z y m e s y n e r g i s m o n p r e t r e a t e d s u b s t r a t e s . T o t h i s e n d , t h i s p a p e r p r e s e n t s a n o v e l , e x t e n d a b l e m e t h o d o l o g y f o r m o d e l i n g e n z y m e s y n e r g i e s a m o n g l a r g e s y s t e m s o f c r u d e e n z y m e m i x t u r e s t o m a x i m i z e b i o m a s s d i g e s t i b i l i t y u s i n g a m i c r o p l a t e b a s e d h y d r o l y s i s a s s a y . O v e r 7 5 0 u n i q u e e n z y m e m i x t u r e s w e r e p r e p a r e d b a s e d o n a s i m p l e x - c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l d e s i g n a p p r o a c h u s i n g 1 4 c r u d e e n z y m e p r e p a r a t i o n s r a n g i n g i n v a r i o u s t y p e s o f a c t i v i t i e s ( e . g . c e l l u l a s e s , h e m i c e l l u l a s e s , p e c t i n a s e s , e s t e r a s e s ) . T h e a c t i v i t y o f s e v e r a l e n z y m e m i x t u r e s w e r e t e s t e d o n A F E X t r e a t e d c o m s t o v e r t o c r e a t e m i x t u r e r e g r e s s i o n m o d e l s p r e d i c t i n g g l u c a n a n d x y l a n h y d r o l y s i s y i e l d s . A d e t a i l e d p r o t e o m i c s a n a l y s i s w a s c a r r i e d o u t f o r a l l 1 4 c r u d e e n z y m e p r e p a r a t i o n s t o q u a n t i f y i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o n e n t s t o h e l p e x p l a i n t h e v a r i a b i l i t y i n h y d r o l y t i c p e r f o r m a n c e . T h e o p t i m a l e n z y m e c o c k t a i l m i x t u r e s p r e d i c t e d fi o m t h e s e s t u d i e s a c h i e v e d s u b s t a n t i a l l y h i g h e r g l u c a n ( 9 3 % ) a n d x y l a n ( 9 1 % ) c o n v e r s i o n s a t l o w e r t o t a l p r o t e i n l o a d i n g t h a n c o n v e n t i o n a l e n z y m e b l e n d s ( e . g . S p e z y m e C P + B G r i c h c o c k t a i l g a v e 6 2 % g l u c a n a n d 3 9 % x y l a n c o n v e r s i o n , r e s p e c t i v e l y ) . E x p l o i t i n g e n z y m e 1 7 3 s y n e r g i s m c a n h e l p m i n i m i z e e n z y m e u s a g e i n a c e l l u l o s i c b i o r e fi n e r y w h i l e i n c r e a s i n g t h e t o t a l s u g a r r e l e a s e d f r o m p r e t r e a t e d b i o m a s s . 7 . 1 . 2 B a c k g r o u n d 7 . 1 . 2 . 1 P r o t e i n c o m p o s i t i o n o f c r u d e c o m m e r c i a l e n z y m e m i x t u r e s T y p i c a l l y , m o s t s y n e r g i s t i c h y d r o l y s i s s t u d i e s o n p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s h a v e b e e n c o n d u c t e d u s i n g c r u d e c o m m e r c i a l e n z y m e m i x t u r e s f r o m s e v e r a l s o u r c e s ( e . g . N o v o z y m e , G e n e n c o r ) . I t w o u l d b e u s e f u l t o d e t e r m i n e t h e p r o t e i n c o m p o s i t i o n a n d s p e c i fi c a c t i v i t i e s o f t h e s e e n z y m e m i x t u r e s . T h i s w o u l d a l s o h e l p q u a n t i f y t h e m i n i m a l s e t o f e n z y m e s n e c e s s a r y f o r h y d r o l y z i n g s e v e r a l t y p e s o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s f o r v a r y i n g p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s ( a c i d v s . b a s e t r e a t e d ) . U n r a v e l i n g t h e c o m p l e x p h e n o m e n a o f e n z y m e s y n e r g y o n p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s w o u l d l e a d t o t h e d e v e l o p m e n t o f o p t i m a l c e l l u l a s e - h e m i c e l l u l a s e h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n s y s t e m s . I t w o u l d b e b e n e fi c i a l t o h a v e c o n t r o l l e d e x p r e s s i o n o f n e c e s s a r y e n z y m e a c t i v i t i e s b a s e d o n p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y a n d t y p e o f b i o m a s s . P r o t e i n c o m p o s i t i o n f o r c e l l u l o l y t i c a n d h e m i c e l l u l o l y t i c m i x t u r e s h a s b e e n t y p i c a l l y d e t e r m i n e d t h r o u g h t h e m e a s u r e m e n t o f i n d i v i d u a l p r o t e i n a c t i v i t i e s b y m o d e l s u b s t r a t e a s s a y s , e n z y m e i m m u n o s o r b e n t b a s e d a s s a y s , g e l e l e c t r o p h o r e s i s , c h r o m a t o g r a p h i c a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s b a s e d s e p a r a t i o n s . T h e a c t i v i t y a s s a y b a s e d m e t h o d i s l i m i t e d i n i t s a b i l i t y t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n m u l t i - f u n c t i o n a l e n z y m e s a n d i s i n c o n c l u s i v e d u e t o l a c k o f s p e c i fi c m o d e l s u b s t r a t e s [ 4 1 9 ] . E n z y m e i m m u n o s o r b e n t a s s a y s a r e l i m i t e d d u e t o c u m b e r s o m e a n t i b o d y p r e p a r a t i o n p r o c e d u r e s f o r e a c h e n z y m e i n t h e m i x t u r e w h i c h m a y b e e x p e n s i v e f o r c o m m e r c i a l e n z y m e s t h a t c o n t a i n m o r e t h a n t w o / t h r e e d o z e n g l y c o s y l h y d r o l a s e s a p a r t f r o m o t h e r f u n g a l p r o t e i n s [ 4 2 0 ] . S t a i n i n g a n d 1 7 4 r e p r o d u c i b i l i t y i s s u e s o f g e l b a s e d e l e c t r o p h o r e s i s m e t h o d s l i m i t s i t u s a g e a s w e l l [ 4 2 1 ] . C h r o m a t o g r a p h i c a n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s m e t h o d s h a v e b e e n u s e d t o v a r y i n g d e g r e e s o f s u c c e s s . T h i s i s d u e t o e x t e n s i v e m e t h o d o p t i m i z a t i o n l i m i t a t i o n s f o r e a c h e n z y m e m i x t u r e , d i f fi c u l t i e s i n i d e n t i fi c a t i o n o f i n d i v i d u a l p r o t e i n s , p o o r r e p r o d u c i b i l i t y d u e t o p r o t e i n - s u r f a c e i n t e r a c t i o n s , l o w t h r o u g h p u t a n d l i m i t e d s e p a r a t i o n e f fi c i e n c y f o r c o - e l u t i n g p r o t e i n s [ 5 0 , 4 1 9 , 4 2 2 ] . H i g h - t h r o u g h p u t p r o t e o m i c s a n a l y s i s o f e n z y m e m i x t u r e s ( o r t h e i r t r y p s i n h y d r o l y z a t e ) p r o v i d e s m o r e d e t a i l e d i n f o r m a t i o n o n s e v e r a l p r o t e i n c o m p o n e n t s [ 4 2 3 , 4 2 4 ] . T h e p r o t e o m i c c o m p o s i t i o n m i g h t b e u s e d i n a c o m p l e m e n t a r y m a n n e r t o a c t i v i t y d a t a f o r d e t e r m i n i n g c r u d e e n z y m e m i x t u r e c o m p o s i t i o n s [ 4 2 1 ] . T h e p r o t e o m i c s a p p r o a c h i s u s e f u l w h e n c o m p a r i n g a b u n d a n c e o f t h e s a m e p r o t e i n b e t w e e n d i f f e r e n t s a m p l e s ; h o w e v e r , t h e m e t h o d h a s c e r t a i n l i m i t a t i o n s w h e n c o m p a r i n g d i f f e r e n t p r o t e i n a b u n d a n c e w i t h i n t h e s a m e s a m p l e ( d u e t o v a r y i n g i o n i z a t i o n e f fi c i e n c i e s o f p e p t i d e s d u r i n g e l e c t r o - s p r a y i o n i z a t i o n ) . P r o t e i n q u a n t i fi c a t i o n b a s e d o n s p e c t r a l c o u n t s s u f f e r s f r o m i t s i n a b i l i t y t o q u a n t i f y l o w a b u n d a n c e p r o t e i n s a n d i s l e s s a c c u r a t e t h a n m e t h o d s b a s e d o n s t a b l e i s o t o p e l a b e l i n g [ 4 2 5 ] . I t i s n e v e r t h e l e s s p o s s i b l e t o q u i c k l y e s t i m a t e i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o n e n t s w i t h i n a c o m p l e x e n z y m e m i x t u r e b a s e d o n s o m e s o r t o f i d e n t i fi c a t i o n s c o r e o r e x t r a c t e d i o n c u r r e n t f o r p e p t i d e s t h a t i d e n t i f y p r o t e i n s o f i n t e r e s t ( e . g . s p e c t r a l c o u n t s ) c o m p a r e d t o m o s t o t h e r m e t h o d s [ 4 2 6 ] . S p e c t r a l c o u n t i n g h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t o b e p o w e r f u l t e c h n i q u e , c o m p a r e d t o p r o t e i n s e q u e n c e c o v e r a g e a n d p e p t i d e c o u n t i n g , t o p r e d i c t r e l a t i v e a b u n d a n c e o f p r o t e i n s w i t h i n a c o m p l e x m i x t u r e w i t h i n t w o - f o l d ( o v e r a l a r g e l i n e a r d y n a m i c r a n g e s p a n n i n g t w o - o r d e r s o f m a g n i t u d e ) o f r e l a t i v e a b u n d a n c e [ 4 2 7 - 4 2 9 ] . V e r y f e w d e t a i l e d p r o t e o m i c s c h a r a c t e r i z a t i o n h a s b e e n 1 7 5 p e r f o r m e d o n c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e c e l l u l a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e m i x t u r e s t o p r e d i c t t h e i r h y d r o l y t i c p o t e n t i a l o n p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s [ 4 3 0 ] . 7 . 1 . 2 . 2 H y d r o l y s i s o f p r e t r e a t e d b i o m a s s u s i n g c o m m e r c i a l e n z y m e m i x t u r e s C o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e e n z y m e m i x t u r e s h a v e b e e n t y p i c a l l y e v a l u a t e d f o r t h e i r h y d r o l y t i c e f fi c i e n c y o n m o d e l s u b s t r a t e s l i k e a v i c e l ( c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e ) , x y l a n e x t r a c t s ( o a t s p e l t , b i r c h w o o d ) , p — n i t r o p h e n o l b a s e d g l y c o s i d e s a n d o t h e r n o n - r e a l i s t i c s u b s t r a t e s [ 3 2 ] . H o w e v e r , r e c e n t w o r k [ 4 8 , 3 8 5 , 4 3 1 , 4 3 2 ] h a s s h o w n t h a t m o d e l c e l l u l o s i c a n d h e m i c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s d o n o t p r o v i d e a r e l i a b l e i n d i c a t i o n o f t h e i r t r u e h y d r o l y t i c p o t e n t i a l o n p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s . N o n — s p e c i fi c p r o t e i n b i n d i n g , v a r i a t i o n s i n p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f p r e t r e a t e d c e l l w a l l s a n d s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n e n z y m e s a r e t y p i c a l l y t h e c a u s e o f t h e s e s u b s t r a t e - s p e c i fi c e n z y m e a c t i v i t y b a s e d d i f f e r e n c e s . F o r p r e t r e a t e d b i o m a s s w i t h a c o m p l e x c e l l w a l l u l t r a - s t r u c t u r e , s e l e c t i n g a n e n z y m e s y s t e m t h a t i s n e c e s s a r y a n d s u f f i c i e n t i s c r i t i c a l . T h e r e f o r e , i t i s m o r e a p p r o p r i a t e t o s c r e e n a n d o p t i m i z e e n z y m e m i x t u r e s d i r e c t l y o n p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s u s i n g h i g h - t h r o u g h p u t d i g e s t i b i l i t y a s s a y s [ 2 , 3 9 2 ] . O p t i m i z a t i o n o f m u l t i - e n z y m e s y s t e m s t o m a x i m i z e m o n o m e r i c s u g a r h y d r o l y t i c y i e l d s i s u s e fi i l f r o m a n e n g i n e e r i n g p e r s p e c t i v e , r a t h e r t h a n d e t e r m i n i n g o n l y t h e d e g r e e o f s y n e r g i s m b e t w e e n v a r i o u s e n z y m e s . I n t e r e s t i n g l y , m i x t u r e s o f e n z y m e s t h a t g i v e t h e h i g h e s t s a c c h a r i fi c a t i o n r a t e d o n o t a l w a y s c o r r e s p o n d t o e n z y m e m i x t u r e s t h a t g i v e t h e h i g h e s t d e g r e e o f s y n e r g y [ 4 3 3 ] . I t h a s b e e n f o u n d t h a t m o s t c e l l u l a s e i n d u c e r s p r o m o t e t h e s y n t h e s i s o f a c o n s t a n t r a t i o o f t h r e e m a j o r c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H I I a n d E G I ) i n T r i c h o d e r m a , i n d i c a t i n g t h e c o o r d i n a t e d r e g u l a t i o n a n d e x p r e s s i o n o f c e r t a i n c e l l u l a s e g e n e s i n T r i c h o d e r m a [ 4 3 4 ] . T h e p h e n o m e n o n i s m u c h m o r e c o m p l e x f o r h e m i c e l l u l a s e s 1 7 6 a n d v a r i e s s i g n i fi c a n t l y b a s e d o n t h e s u b s t r a t e u s e d f o r i n d u c t i o n [ 3 2 ] . M o s t c o m m e r c i a l e n z y m e s ( t y p i c a l l y p r o d u c e d f r o m T r i c h o d e r m a o r A s p e r g i l l u s ) d o n o t h a v e t h e c o r r e c t p r o t e i n r a t i o s o r s u f f i c i e n t t y p e o f e n z y m e a c t i v i t i e s n e c e s s a r y t o h y d r o l y z e p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s . T h e r e h a s b e e n n o e v o l u t i o n a r y p r e s s u r e o n fi m g i t o g r o w o n p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s t o p r o d u c e c e l l u l a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e s n e c e s s a r y t o m a x i m i z e d i g e s t i b i l i t y . T h u s , c r u d e p r o t e i n m i x t u r e s s h o u l d b e o p t i m i z e d f o r t o t a l s u g a r h y d r o l y s i s y i e l d a s a f u n c t i o n o f v a r y i n g r a t i o s f o r i n d i v i d u a l p r o t e i n s . T h i s w o u l d e v e n t u a l l y h e l p c o n s t r u c t m u l t i g e n e e x p r e s s i o n s y s t e m s t o p r o d u c e b a l a n c e d e n z y m e m i x t u r e s f o r p r e t r e a t e d b i o m a s s [ 4 3 5 ] . T h e o p t i m u m e n z y m e r a t i o s c a n h e l p d e t e r m i n e c r i t i c a l e n z y m e c o m p o n e n t s a n d r a t i o n a l l y d e s i g n h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n s y s t e m s f o r c o n s o l i d a t e d b i o l o g i c a l p r o c e s s i n g ( C B P ) [ 4 3 6 , 4 3 7 ] . H o w e v e r , m u l t i - e n z y m e m i x t u r e o p t i m i z a t i o n c o u l d g e t c o m p l i c a t e d w i t h o u t t h e u s e o f s u i t a b l e m a t h e m a t i c a l t o o l s , s u c h a s f a c t o r i a l a n d m i x t u r e b a s e d s t a t i s t i c a l e x p e r i m e n t a l d e s i g n s [ 4 3 8 , 4 3 9 ] . S e v e r a l s t u d i e s h a v e l o o k e d t o o p t i m i z e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e c r u d e e n z y m e m i x t u r e s f o r a c i d p r e t r e a t e d [ 4 8 ] , s t e a m e x p l o d e d a n d o r g a n o s o l v t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s [ 4 3 1 , 4 3 2 ] . C r u d e e n z y m e m i x t u r e o p t i m i z a t i o n f o r a c i d p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r h e l p e d r e d u c e t o t a l p r o t e i n l o a d i n g b y t w o - f o l d f o r e q u i v a l e n t h y d r o l y s i s y i e l d s [ 4 8 ] . S e v e r a l c o v a l e n t l i g n i n - p o l y s a c c h a r i d e b o n d s a r e n o t e n t i r e l y c l e a v e d d u r i n g a l k a l i p u l p i n g a n d r e q u i r e a c c e s s o r y e n z y m e s t o h e l p c l e a v e t h e s e l i n k a g e s , i m p r o v i n g p u l p d i g e s t i b i l i t y [ 4 4 0 ] . S t u d i e s w i t h s t e a m e x p l o d e d w h e a t s t r a w h a v e f o u n d s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n c r u d e c e l l u l a s e s a n d a c c e s s o r y e n z y m e s ( r i c h i n x y l a n a s e s a n d e s t e r a s e s ) [ 4 4 1 ] . A c i d p r e t r e a t e d b i o m a s s h a s l i t t l e o r n o r e s i d u a l h e m i c e l l u l o s e c o m p a r e d t o a l k a l i p r e t r e a t e d b i o m a s s a n d d o e s n o t r e q u i r e h e m i c e l l u l a s e s t o s i g n i fi c a n t l y e n h a n c e 1 7 7 r a t e o f h y d r o l y s i s [ 3 7 , 1 1 0 ] . H o w e v e r , s i g n i fi c a n t e n h a n c e m e n t i n h y d r o l y s i s y i e l d s d u e t o h e m i c e l l u l a s e s u p p l e m e n t a t i o n i s e x p e c t e d f o r l o w e r s e v e r i t y a c i d [ 1 1 3 ] a n d a m m o n i a b a s e d t r e a t m e n t s [ 1 ] . C o r n fi b e r ( c o n t a i n i n g ~ 2 0 % s t a r c h , 2 0 % c e l l u l o s e a n d 3 0 % h e m i c e l l u l o s e ) , a v a l u a b l e b y - p r o d u c t o f t h e c o m - e t h a n o l i n d u s t r y , i s r i c h i n h e t e r o x y l a n s t h a t a r e n o t r e a d i l y h y d r o l y z e d b y c o m m e r c i a l c e l l u l a s e s ( m i x t u r e s o f a m y l a s e s , c e l l u l a s e s , x y l a n a s e s ) [ 4 4 2 ] . C o r n fi b e r x y l a n i s h e a v i l y b r a n c h e d ( v i a a r a b i n o s e , u r o n i c a c i d s , a n d p h e n o l i c a c i d s ) , l i m i t i n g e n z y m e a c c e s s i b i l i t y e v e n a f t e r p r e t r e a t m e n t . A m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t s h a v e r e s u l t e d i n t h e f o r m a t i o n o f h i g h - m o l e c u l a r w e i g h t a r a b i n o x y l a n s f r o m c o r n g r a i n h u s k ( a r a b i n o s e / x y l o s e r a t i o o f 0 . 6 ) [ 3 6 1 ] . T h e s e a r e n o t h y d r o l y z e d b y t y p i c a l T r i c h o d e r m a c e l l u l a s e a n d x y l a n a s e r i c h m i x t u r e s , p r o b a b l y d u e t o l a c k o f s i g n i fi c a n t a c c e s s o r y e n z y m e a c t i v i t y . D i e n a n d c o l l e a g u e s [ 4 4 3 ] h a v e b e e n a b l e t o s i g n i fi c a n t l y e n h a n c e x y l a n d i g e s t i b i l i t y o f A F E X p r e t r e a t e d d i s t i l l e r s g r a i n s b y s u p p l e m e n t i n g c r u d e c e l l u l a s e m i x t u r e s w i t h M u l t i f e c t P e c t i n a s e ( f r o m G e n e n c o r - D a n i s c o , U S A ) a n d D e p o l 7 4 0 ( f r o m B i o c a t a l y s t s , U K ) . T h e s e s u p p l e m e n t a r y e n z y m e s a r e r i c h i n a r a b i n o f u r a n o s i d a s e , e s t e r a s e b a s e d a c t i v i t i e s a n d w e r e f o u n d t o s y n e r g i z e w i t h c e l l u l a s e s a n d x y l a n a s e s . H y d r o l y s i s o f a m m o n i a t r e a t e d s u g a r b e e t b y p e c t i n a s e s w a s i n h i b i t e d i n t h e a b s e n c e o f h e m i c e l l u l a s e d e - b r a n c h i n g e n z y m e s [ 2 3 5 ] . A F E X p r e t r e a t m e n t h a s b e e n f o u n d t o e n h a n c e s y n e r g i s t i c h y d r o l y s i s o f s u g a r c a n e b a g a s s e t h r o u g h m u l t i p l e c o m b i n a t i o n s o f c o m m e r c i a l c e l l u l o l y t i c - h e m i c e l l u l o l y t i c e n z y m e s a n d x y l a n a s e r i c h fi m g a l e x t r a c t s a t l o w ( 1 % , w / v ) a n d h i g h ( 1 0 % , w / v ) g l u c a n l o a d i n g s [ 3 4 5 ] . X y l a n a s e a c t i v i t y w a s c r i t i c a l i n i m p r o v i n g x y l a n a s w e l l a s g l u c a n c o n v e r s i o n , d e p e n d i n g o n t h e s o u r c e o f t h e x y l a n a s e . H o w e v e r , t h e a c t u a l 1 7 8 a m o u n t a n d r e l a t i v e r a t i o s o f t h e e n z y m e s u s e d f o r m a x i m i z i n g h y d r o l y s i s y i e l d s w a s n o t s y s t e m a t i c a l l y v a r i e d i n t h e s e s t u d i e s . T y p i c a l l y , m o s t e n z y m a t i c h y d r o l y s i s s t u d i e s f o r A F E X o r a m m o n i a t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s h a v e b e e n c o n d u c t e d u s i n g e n z y m e c o c k t a i l s t h a t h a v e l o w x y l a n a s e a n d / o r a c c e s s o r y e n z y m e a c t i v i t i e s ( l i k e x y l o s i d a s e , e s t e r a s e , a r a b i n o f u r a n o s i d a s e ) [ 4 2 , 1 6 1 , 4 4 4 ] . M o s t c o m m e r c i a l x y l a n a s e s h a v e a p p l i c a t i o n s i n t h e p a p e r i n d u s t r y w h e r e B — x y l o s i d a s e a c t i v i t y i s n o t c r i t i c a l , w h i c h h a s r e s u l t e d i n i n h i b i t i o n o f h e m i c e l l u l a s e s b y u n - h y d r o l y z e d o l i g o s a c c h a r i d e s [ 4 4 2 ] . C u r r e n t l y , t h e r e a r e n o s u i t a b l e h i g h - t h r o u g h p u t e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y a s s a y s t h a t c a n b e u s e d r e l i a b l y a n d r e p r o d u c i b l y f o r m e a s u r i n g t h e h y d r o l y t i c p o t e n t i a l o f c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e e n z y m e s o n p r e t r e a t e d a n d n a t i v e l i g n o c e l l u l o s i c s . T h e r e h a v e a l s o b e e n n o e n z y m e o p t i m i z a t i o n s t u d i e s p e r f o r m e d o n A F E X t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s f o r v a r y i n g c o m m e r c i a l e n z y m e c o m b i n a t i o n s r i c h i n c o m p l e m e n t a r y h e m i c e l l u l a s e a c t i v i t i e s t o m a x i m i z e g l u c a n a n d x y l a n d i g e s t i b i l i t y . 7 . 1 . 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s S e e a p p e n d i x A - V I I - l , 2 , 3 , 4 , 2 3 , 2 5 , 2 7 , 2 8 , 2 9 , 3 1 - 3 6 . 7 . 1 . 4 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 7 . 1 . 4 . 1 P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n a t i o n T h e c h o i c e o f t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n a s s a y i s a n i m p o r t a n t d e c i s i o n c o n s i d e r i n g t h e v a r i a b i l i t y , a c c u r a c y a n d l e v e l o f d i f fi c u l t y a s s o c i a t e d w i t h e a c h o f t h e s e m e t h o d s [ 4 4 5 ] . T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n ( T a b l e 7 . 1 - A ; S e e f o r T a b l e 7 . 1 - B d e t a i l s ) f o r t h e v a r i o u s c r u d e e n z y m e s w a s e s t i m a t e d b y t h r e e m e t h o d s ( B r a d f o r d a s s a y , P i e r c e B C A a s s a y a n d T o t a l c r u d e p r o t e i n b y K j e l d a h l n i t r o g e n a n a l y s i s ) . T h e B r a d f o r d a s s a y ( u s i n g C o o m a s s i e B l u e d y e ) w a s f o u n d t o p r e d i c t p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s s e v e r a l f o l d l o w e r t h a n t h e o t h e r 1 7 9 t w o m e t h o d s . S i m i l a r l y , t h e B i c i n c h o n i c a c i d a s s a y ( B C A ) w a s f o u n d t o p r e d i c t s i g n i fi c a n t l y h i g h e r p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s f o r m o s t c r u d e e n z y m e m i x t u r e s . T a b l e 7 . 1 - A P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n a s s a y d a t a f o r 1 4 c r u d e e n q m e b l e n d s u s i n g t h r e e a n a l y t i c a l m e t h o d s ( P i e r c e B C A , B r a d f o r d a n d K j e l d a h l P r o t e i n b a s e d a s s a y s ) . M e a n S t d D e v _ r _ n _ g / m l P i e r c e B C A B r a d f o r d K j e l d a h l P i e r c e B C A B r a d f o r d K j e l d a h l C E 1 1 3 4 3 1 8 8 6 7 1 C E 2 2 1 7 4 2 1 5 0 4 1 2 4 3 C E 3 4 7 7 3 5 2 3 1 C E 4 1 2 8 2 5 9 0 1 1 1 0 C E 5 2 8 4 3 6 1 0 5 3 1 3 1 C E 6 9 3 2 0 8 4 1 3 1 R E 1 2 2 l l 2 0 1 2 1 . R E 2 2 6 3 5 2 1 4 4 3 7 5 8 " R E 3 2 9 4 1 6 ' 7 8 1 1 2 0 R E 4 1 3 5 4 1 9 4 8 1 3 1 R E 5 5 l 5 0 1 0 R E 6 6 5 6 0 1 0 R E 7 1 7 1 1 1 6 1 3 2 R E 8 1 4 8 4 5 9 7 8 8 6 S e v e r a l r e s e a r c h e r s i n t h e p a s t h a v e i n d i c a t e d t h e i n t e r f e r e n c e o f m o s t c o l o r i m e t r i c a s s a y s ( i . e . B r a d f o r d a n d B C A ) w i t h b a c k g r o u n d r e d u c i n g s u g a r s , b u f f e r s a n d d e t e r g e n t s [ 4 4 5 , 4 4 6 ] . B i n d i n g t o C o o m a s s i e b l u e b a s e d d y e s h a s b e e n f o u n d t o b e d e p e n d e n t o n a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f t h e p r o t e i n , t y p i c a l l y s k e w e d b y p r e s e n c e / a b s e n c e o f a r g i n i n e a n d l y s i n e [ 4 4 7 ] . O n t h e o t h e r h a n d , p r e s e n c e o f r e d u c i n g s u g a r s c a u s e s s i g n i fi c a n t i n t e r f e r e n c e w i t h t h e r e a c t i o n o f c o p p e r ( C u 2 + ) w i t h t h e p r o t e i n d u r i n g t y p i c a l l y B C A a s s a y s . T h u s , t h e p r e s e n c e o f r e d u c i n g s u g a r s r e s u l t s i n e l e v a t e d B C A b a s e d p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n r e a d i n g s . T h e m o s t e f f e c t i v e m e t h o d f o r r e s o l v i n g t h e p r e s e n c e o f i n t e r f e r i n g s u b s t a n c e s o n c o l o r i m e t r i c a s s a y s i s t h r o u g h p r o t e i n p r e c i p i t a t i o n [ 4 4 8 ] . H o w e v e r , t h e r e a r e s e v e r a l i s s u e s w i t h t h i s a p p r o a c h ( r e l a t i v e e f f i c i e n c y o f p r o t e i n 1 8 0 p r e c i p i t a t i o n , r e c o v e r y a n d h i g h - t h r o u g h p u t i s s u e s ) a s w e l l . E s t i m a t i o n o f p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n b y K j e l d a h l a n a l y s i s ( c r u d e p r o t e i n = 6 . 2 5 x % n i t r o g e n c o n t e n t ) w a s f o u n d t o b e s u i t a b l e f o r c o m m e r c i a l e n z y m e b l e n d s t h a t a r e m o r e r e a d i l y a v a i l a b l e i n l a r g e q u a n t i t i e s ( u n l i k e p u r i fi e d e n z y m e s ) . T h e c o n t r i b u t i o n b y a m m o n i a c a l s a l t s ( n o n - p r o t e i n n i t r o g e n ) t y p i c a l l y p r e s e n t i n c o m m e r c i a l e n z y m e b l e n d s w a s s u b t r a c t e d fi ' o m t h e t o t a l c r u d e p r o t e i n n i t r o g e n e s t i m a t e t o g i v e t r u e p r o t e i n e s t i m a t e f o r a l l c o m m e r c i a l e n z y m e s . A l l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s u s e d f o r f u r t h e r e x p e r i m e n t s a r e b a s e d o n t h e K j e l d a h l e s t i m a t e d t o t a l p r o t e i n c o n t e n t . I n t e r e s t i n g l y , i n t h e a b s e n c e o f r e d u c i n g s u g a r s a n d o t h e r l o w — m o l e c u l a r w e i g h t s u b s t a n c e s ( r e m o v e d b y d e s a l t i n g t h e e n z y m e s u s i n g s i z e - e x c l u s i o n c o l u m n ) t h e c o n c e n t r a t i o n p r e d i c t e d b y B C A w a s c o m p a r a b l e t o t h e K j e l d a h l m e t h o d , s i m i l a r t o p r e v i o u s r e p o r t s [ 4 4 5 , 4 4 6 ] . 7 . 1 . 4 . 2 P r o t e i n c o m p o s i t i o n e s t i m a t e d v i a p r o t e o m i c s a n d e n z y m e a c t i v i t y a s s a y s E n z y m e a c t i v i t y a s s a y s ( S e e F i g u r e 7 . 1 - B ) w e r e c a r r i e d o u t f o r a l l 1 4 d e s a l t e d c o m m e r c i a l e n z y m e b l e n d s o n s e v e r a l m o d e l s u b s t r a t e s ( A v i c e l , C a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e o r C M C , O a t s p e l t x y l a n o r O S X , p - n i t r o p h e n y l x y l o s i d e o r p N P X , p - n i t r o p h e n y l a r a b i n o s i d e o r p N P A f , p — n i t r o p h e n y l a c e t a t e o r p N P A a n d p - n i t r o p h e n y l g l y c o s i d e o r p N P G ) . A v i c e l , C M C a n d p N P G a r e m o d e l s u b s t r a t e s t h a t g i v e a r e l a t i v e e s t i m a t e o f t h e h y d r o l y t i c p e r f o r m a n c e o f c e l l u l a s e s o n c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e , a m o r p h o u s c e l l u l o s e a n d s o l u b l e d e x t r a n s ( e . g . c e l l o b i o s e ) , r e s p e c t i v e l y . A v i c e l a s e a c t i v i t y , i n o r d e r o f d e c r e a s i n g r e l a t i v e s p e c i fi c a c t i v i t y , w a s d e t e c t e d i n N S - 5 0 0 1 4 ( R E 4 ) > S p e z y m e C P ( C E 1 ) > A c c e l l e r a s e ( C E 6 ) = N S - 5 0 0 5 3 ( R E 8 ) > D e p o l 6 7 0 L ( C E 5 ) > N S - 2 2 0 0 2 ( R E 1 ) > M u l t i f e c t P e c t i n a s e ( C E 4 ) = N S - 5 0 0 1 2 ( R E 3 ) . 1 8 1 T a b l e 7 . 1 - B A c t i v i t y a s s a y d a t a f o r 1 4 c r u d e e n z y m e b l e n d s o n p N P G , p N P / 1 f p N P A , p N P X , O S X , A v i c e l a n d C M C . O n e u n i t o f a c t i v i t y o n p N P b a s e d s u b s t r a t e s i s e q u i v a l e n t t o o n e n m o l o f p N P ( p - n i t r o p h e n o l ) r e l e a s e d / m g e n z y m e / m i n . O n e u n i t o f a c t i v i t y o n A v i c e l / X y l a n / C M C i s e q u i v a l e n t t o o n e u M g l u c o s e e q u i v a l e n t r e l e a s e d / m g e n z y m e / m i n . W h e r e ; " - “ s t a n d s f o r n o d e t e c t a b l e a c t i v i t y ; p N P G ( p N P - fl - D - g l u c o p y r a n o s i d e ) ; p N P A f ( p N P - a - L - a r a b i n o fi x r a n o s i d e ) ; p N P A ( p N P — a c e t a t e ) ; p N P X ( p N P - fl - D - x y l o p y r a n o s i d e ) ; O S X ( O a t s p e l t x y l a n ) , C M C ( C a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e ) . M e a n E n z y m e S o u r c e I U / m g A v i c e l C M C O S X p N P X p N P A p N P A f p N P G S p e z y m e C P C E 1 0 . 3 0 3 . 5 3 3 . 7 9 1 5 . 2 6 5 9 . 4 5 9 . 7 9 1 0 1 . 1 8 N o v o 1 8 8 C E 2 - 0 . 0 5 0 3 3 9 4 . 3 3 6 . 2 9 2 1 2 2 4 0 2 . 7 5 M u l t i f e c t X y l a n a s e C E 3 - 0 . 0 9 6 . 6 4 3 0 . 7 7 1 8 9 . 5 3 6 . 9 2 1 6 . 3 3 M u l t i f e c t P e c t i n a s e C E 4 0 . 0 1 0 . 6 6 3 . 7 6 5 2 . 1 8 4 0 . 3 4 4 1 3 . 5 1 1 6 3 . 2 3 D e p o l 6 7 0 L C E 5 0 . 0 8 2 . 0 8 3 . 4 2 0 . 8 6 1 9 . 3 2 3 1 . 6 7 3 1 . 5 4 A c c e l l e r a s e C E 6 0 . 1 8 1 . 7 2 1 . 3 5 2 . 1 9 1 . 4 6 0 . 5 0 1 4 5 . 2 2 N o v o z y m e N S - 2 2 0 0 2 R E 1 0 . 0 4 0 . 9 7 5 . 3 8 1 1 . 7 4 6 5 . 2 6 7 . 7 7 5 2 . 0 9 N o v o z y m e N S - 5 0 0 1 0 R E 2 - 0 . 0 7 0 . 3 5 4 . 1 1 4 . 0 1 1 6 . 5 9 3 1 0 . 6 0 N o v o z y m e N S - 5 0 0 1 2 R E 3 0 . 0 1 0 . 8 9 0 . 2 1 0 . 8 8 4 5 . 5 3 4 5 . 0 6 1 9 . 8 7 N o v o z y m e N S - 5 0 0 1 3 R E 4 0 . 4 1 2 . 1 7 2 . 3 9 2 8 . 9 1 3 9 . 6 2 4 . 7 8 2 7 . 1 5 N o v o z y m e N S - 5 0 0 1 4 R E 5 - 0 . 0 3 8 7 . 8 9 0 . 3 7 1 . 3 4 0 . 2 9 3 . 5 8 N o v o z y m e N S - 5 0 0 2 9 R E 6 - 0 . 0 1 0 . 5 8 0 . 2 9 1 . 2 2 0 . 2 1 0 . 3 7 N o v o z y m e N S — 5 0 0 3 0 R E 7 - 0 . 0 1 1 6 . 1 0 2 4 . 2 3 2 . 0 1 3 . 7 2 1 . 1 0 N o v o z y m e N S - 5 0 0 5 3 R E 8 0 . 1 7 1 . 3 7 0 . 8 5 1 6 . 5 6 1 8 . 0 9 4 . 1 3 1 9 . 3 5 S t d D e v E n z y m e S o u r c e I U / m g A v i c e l C M C O S X p N P X p N P A p N P A f p N P G S p e z y m e C P C E 1 0 . 0 3 0 . 3 6 0 . 4 4 0 . 5 9 3 . 4 9 0 . 2 8 5 . 4 3 N o v o 1 8 8 C E 2 - 0 . 0 1 0 . 0 3 2 5 . 7 0 0 . 7 1 0 . 7 3 9 . 6 4 M u l t i f e c t X y l a n a s e C E 3 - 0 . 0 2 0 . 4 4 2 . 0 1 8 . 4 5 0 . 2 5 0 . 2 5 M u l t i f e c t P e c t i n a s e C E 4 - 0 . 0 2 0 . 2 0 1 . 6 1 2 . 3 7 8 . 6 8 5 . 2 8 D e p o l 6 7 0 L C E 5 0 . 0 1 0 . 0 7 0 . 2 9 0 . 0 2 5 . 2 0 0 . 3 3 5 . 8 6 A c c e l l e r a s e C E 6 0 . 0 1 0 . 1 4 0 . 1 6 0 . 0 6 0 . 1 9 0 . 2 0 7 . 2 9 N o v o z y m e N S - 2 2 0 0 2 R E 1 0 . 0 1 0 . 1 2 0 . 4 1 0 . 1 5 3 . 1 8 0 . 2 0 2 . 5 9 N o v o z y m e N S - 5 0 0 1 0 R E 2 - 0 . 0 1 0 . 0 2 0 . 0 5 0 . 4 0 0 . 4 0 7 . 3 7 N o v o z y m e N S - 5 0 0 1 2 R E 3 - 0 . 0 4 0 . 0 2 0 . 0 3 1 . 8 5 2 . 0 0 0 . 3 3 N o v o z y m e N S - 5 0 0 1 3 R E 4 0 . 0 2 0 . 0 7 0 . 2 9 0 . 0 9 3 . 8 5 0 . 0 8 0 . 3 0 N o v o z y m e N S - 5 0 0 1 4 R E 5 - 0 . 0 1 7 . 4 5 0 . 0 8 0 . 1 3 0 . 0 5 0 . 0 7 N o v o z y m e N S - 5 0 0 2 9 R E 6 - - 0 . 0 7 0 . 2 5 0 . 1 0 0 . 1 4 0 . 0 3 N o v o z y m e N S - 5 0 0 3 0 R E 7 - - 0 . 6 6 0 . 3 0 0 . 1 2 0 . 1 4 0 . 0 3 N o v o z y m e N S - 5 0 0 5 3 R E 8 0 . 0 1 0 . 1 2 0 . 1 0 0 . 2 6 0 . 4 3 0 . 2 4 0 . 1 2 C M C a s e a c t i v i t y w a s d e t e c t e d i n S p e z y m e C P ( C E 1 ) > N S - 5 0 0 1 4 ( R E 4 ) = D e p o l 6 7 0 L ( C E 5 ) > A c c e l l e r a s e ( C E 6 ) = N S - 5 0 0 5 3 ( R E 8 ) > N S - 2 2 0 0 2 ( R E 1 ) = N S - 1 8 2 5 0 0 1 2 ( R E 3 ) = M u l t i f e c t P e c t i n a s e ( C E 4 ) > M u l t i f e c t X y l a n a s e ( C E 3 ) = N S - 5 0 0 1 0 ( R E 2 ) > N S - 5 0 0 1 4 ( R E 5 ) = N o v o z y m e 1 8 8 ( C E 2 ) > N S 5 0 0 2 9 ( R E 6 ) = N S - 5 0 0 3 0 ( R E 7 ) . C e l l o b i a s e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d t h r o u g h p - N P - g l u c o s i d e ( p - N P G ) b a s e d a s s a y s a n d w a s d e t e c t e d i n N o v o z y m e 1 8 8 ( C E 2 ) > N S - 5 0 0 1 0 ( R E 2 ) > M u l t i f e c t P e c t i n a s e ( C E 4 ) = A c c e l l e r a s e ( C E 6 ) > S p e z y m e C P ( C E 1 ) > N S - 2 2 0 0 2 ( R E 1 ) = D e p o l 6 7 0 L ( C E 5 ) > M u l t i f e c t X y l a n a s e ( C E 3 ) = N S - 5 0 0 1 2 ( R E 3 ) = N S - 5 0 0 1 3 ( R E 4 ) = N S - 5 0 0 5 3 ( R E 8 ) > N S - 5 0 0 1 4 ( R E 5 ) > N S 5 0 0 2 9 ( R E 6 ) = N S - 5 0 0 3 0 ( R E 7 ) . O a t s p e l t x y l a n , p N P X , p N P A f a n d p N P A a r e m o d e l s u b s t r a t e s t h a t g i v e a r e l a t i v e e s t i m a t e o f t h e h y d r o l y t i c p e r f o r m a n c e o f h e m i c e l l u l a s e s o n a r a b i n o x y l a n b a c k b o n e c h a i n , s o l u b l e x y l o - o l i g o m e r s ( e . g . x y l o b i o s e ) , a r a b i n o s e a n d a c e t y l ( o r o t h e r e s t e r a s e b a s e d a c t i v i t i e s ) s i d e - c h a i n s , r e s p e c t i v e l y . O a t s p e l t x y l a n a s e a c t i v i t y ( O S X ) w a s d e t e c t e d i n N S - 5 0 0 1 4 ( R E 5 ) > > N S - 5 0 0 3 0 ( R E 7 ) > M u l t i f e c t X y l a n a s e ( C E 3 ) > N S - 2 2 0 0 2 ( R E 1 ) > S p e z y m e C P ( C E 1 ) = M u l t i f e c t P e c t i n a s e ( C E 4 ) = D e p o l 6 7 0 L ( C E 5 ) > N S - 5 0 0 1 3 ( R E 4 ) > A c c e l l e r a s e ( C E 6 ) = N S - 5 0 0 5 3 ( R E 8 ) > N S 5 0 0 2 9 ( R E 6 ) > N o v o z y m e 1 8 8 ( C E 2 ) = N S - 5 0 0 1 0 ( R E 2 ) = N S - 5 0 0 1 2 ( R E 3 ) . N S - 5 0 0 1 4 h a d a b n o r m a l l y h i g h a c t i v i t y o n o a t - s p e l t x y l a n c o m p a r e d t o a l l o t h e r e n z y m e m i x t u r e s . X y l o b i a s e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d t h r o u g h p - N P - x y l o s i d e ( p - N P X ) b a s e d a s s a y s a n d w a s d e t e c t e d i n N o v o z y m e 1 8 8 ( C E 2 ) > M u l t i f e c t P e c t i n a s e ( C E 4 ) > M u l t i f e c t X y l a n a s e ( C E 3 ) = N S - 5 0 0 1 3 ( R E 4 ) = N S - 5 0 0 3 0 ( R E 7 ) > S p e z y m e C P ( C E 1 ) = N S - 5 0 0 5 3 ( R E 8 ) > N S - 2 2 0 0 2 ( R E 1 ) > N S - 5 0 0 1 0 ( R E 2 ) > A c c e l l e r a s e ( C E 6 ) > D e p o l 6 7 0 L ( C E 5 ) = N S - 5 0 0 1 2 ( R E 3 ) > N S - 5 0 0 1 4 ( R E 5 ) = N 8 5 0 0 2 9 ( R E 6 ) . A r a b i n o f u r a n o s i d a s e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d t h r o u g h p - N P - a r a b i n o f u r a n o s i d e ( p - N P A f ) b a s e d a s s a y s a n d w a s d e t e c t e d i n M u l t i f e c t P e c t i n a s e ( C E 4 ) > > N S - 5 0 0 1 2 ( R E 3 ) > D e p o l 6 7 0 L ( C E 5 ) > 1 8 3 N o v o z y m e 1 8 8 ( C E 2 ) = N S - 5 0 0 1 0 ( R E 2 ) > S p e z y m e C P ( C E 1 ) = M u l t i f e c t X y l a n a s e ( C E 3 ) = N S - 2 2 0 0 2 ( R E 1 ) > N S - 5 0 0 1 3 ( R E 4 ) = N S - 5 0 0 3 0 ( R E 7 ) = N S - 5 0 0 5 3 ( R E 8 ) > A c c e l l e r a s e ( C E 6 ) = N S - 5 0 0 1 4 ( R E 5 ) = N S 5 0 0 2 9 ( R E 6 ) . M u l t i f e c t P e c t i n a s e h a d e x t r e m e l y h i g h a r a b i n o f u r a n o s i d a s e a c t i v i t y c o m p a r e d t o a l l o t h e r e n z y m e s . A c e t y l x y l a n e s t e r a s e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d t h r o u g h p - N P - a c e t a t e ( p - N P A ) b a s e d a s s a y s a n d w a s d e t e c t e d i n M u l t i f e c t X y l a n a s e ( C E 3 ) > N S - 2 2 0 0 2 ( R E 1 ) = S p e z y m e C P ( C E 1 ) > M u l t i f e c t P e c t i n a s e ( C E 4 ) = N S - 5 0 0 1 2 ( R E 3 ) = N S - 5 0 0 1 3 ( R E 4 ) > D e p o l 6 7 0 L ( C E 5 ) = N S - 5 0 0 5 3 ( R E 8 ) > N o v o z y m e 1 8 8 ( C E 2 ) = N S - 5 0 0 1 0 ( R E 2 ) > A c c e l l e r a s e ( C E 6 ) = N S - 5 0 0 1 4 ( R E 5 ) = N S 5 0 0 2 9 ( R E 6 ) = N S - 5 0 0 3 0 ( R E 7 ) . F e r u l o y l e s t e r a s e s h a v e a l s o b e e n r e p o r t e d t o h a v e s o m e a c t i v i t y o f p - N P A [ 2 1 4 , 2 1 8 ] . S D S - P A G E f o r a l l c r u d e e n z y m e b l e n d s r e v e a l e d m u l t i p l e p r o t e i n b a n d s r a n g i n g f r o m 1 0 - 1 2 0 k D a ( F i g u r e 7 . 1 ; w h e r e M s t a n d s f o r m a r k e r s t a n d a r d s ) . S D S - P A G E d o e s n o t r e v e a l t h e c o m p o s i t i o n a l c o m p l e x i t y t y p i c a l o f c r u d e c e l l u l a s e - h e m i c e l l u l a s e m i x t u r e s [ 4 2 1 ] . M o s t g l y c o s y l h y d r o l a s e s t y p i c a l l y r a n g e i n m o l e c u l a r w e i g h t b e t w e e n 3 0 - 7 0 k D a , w h i c h w o u l d b e o v e r l a p p i n g e a c h o t h e r i n o n e — d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s . P r o t e o m i c s a n a l y s i s w a s c a r r i e d o u t t o i d e n t i f y t h e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f k e y c e l l u l o l y t i c , h e m i c e l l u l o l y t i c a n d a c c e s s o r y e n z y m e s p r e s e n t i n e a c h o f t h e c o m m e r c i a l b l e n d s f r o m l e a d i n g c e l l u l o l y t i c e n z y m e c o m p a n i e s , n a m e l y , G e n e n c o r , N o v o z y m e s , a n d B i o c a t a l y s t s ( F i g u r e 7 . 2 ) . P e p t i d e s f r o m e n z y m e t r y p t i c d i g e s t s w e r e a n a l y z e d u s i n g h i g h r e s o l u t i o n r e v e r s e d - p h a s e H P L C s e p a r a t i o n c o u p l e d t o a n i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r ( L T Q , T h e r m o E l e c t r o n , S a n J o s e C A ) t h a t w a s o p e r a t e d i n a d a t a - d e p e n d e n t M S / M S m o d e [ 4 2 3 ] . M S / M S s p e c t r a w e r e a n a l y z e d u s i n g t h e S E Q U E S T a l g o r i t h m [ 4 4 9 ] i n c o n j u n c t i o n w i t h a p r o t e i n c o l l e c t i o n o f a l l fi m g a l e n t r i e s f r o m U n i p r o t ( i . e . S w i s s - P r o t a n d T r E M B L ) . 1 8 4 m a u l ! l R i i i . s d n e l b e m y z n e e d u r c 4 1 r o f E G A P - S D S 1 . 7 e r u g i F 1 8 5 M 3 fl P r e l i m i n a r y fi l t e r i n g o f i d e n t i fi e d p e p t i d e s w a s p e r f o r m e d u s i n g : a m i n i m u m c r o s s - c o r r e l a t i o n c u t - o f f ( X C o r r ) o f e i t h e r 1 . 9 , 3 . 0 , o r 3 . 2 f o r 1 + , 2 + , o r 3 + c h a r g e s t a t e s , r e s p e c t i v e l y ; p a r t i a l l y a n d f u l l y t r y p t i c p e p t i d e s ( p e p t i d e s t h a t c o n t a i n e d e i t h e r a n a r g i n i n e o r l y s i n e a t t h e s i t e o f c l e a v a g e ) ; D e l C n > = 0 . 1 . E s t i m a t i o n o f p e p t i d e F a l s e D i s c o v e r y R a t e ( F D R ) w a s c a l c u l a t e d b y d e c o y d a t a b a s e s e a r c h i n g t e c h n i q u e s [ 4 5 0 , 4 5 1 ] , r e s u l t i n g i n v a l u e s b e t w e e n 0 . 6 % a n d 1 . 9 % . O n e o f t h e m a j o r l i m i t a t i o n s o f t h e c u r r e n t a p p r o a c h i s t h a t m i n o r p r o t e i n c o m p o n e n t s ( < 1 % , w / w ) m a y n o t b e e a s i l y d e t e c t e d i n t h e b a c k g r o u n d o f t h e h i g h l y a b u n d a n t p r o t e i n s . H o w e v e r , t h i s m e t h o d n e v e r t h e l e s s p r o v e d u s e f u l t o g e t a r o u g h e s t i m a t e o f t h e m a j o r c o m p o n e n t s i n t h e v a r i o u s c o m m e r c i a l e n z y m e p r e p a r a t i o n s . A l l o b s e r v a t i o n c o u n t s f o r p e p t i d e s b e l o n g i n g t o t h e s a m e p r o t e i n f a m i l i e s w e r e s u m m e d u p t o o b t a i n r e l a t i v e a b u n d a n c e f o r i n d i v i d u a l e n z y m e f a m i l i e s ( S e e s u p p l e m e n t a r y r a w d a t a f o r C E 1 c r u d e e n z y m e b l e n d i n T a b l e - V - 7 . 3 ) . R e l a t i v e p r o t e i n a b u n d a n c e w i t h i n e a c h c o m m e r c i a l e n z y m e b l e n d w a s d e t e r m i n e d b a s e d o n a n a b s o l u t e b a s i s o f t o t a l o b s e r v e d s p e c t r a l c o u n t ( c u m u l a t i v e f o r a l l p e p t i d e s d e t e c t e d ) . T h e c l a s s i fi c a t i o n o f g l y c o s y l h y d r o l a s e s a n d r e l a t e d e n z y m e s ( p o l y s a c c h a r i d e l y a s e s a n d c a r b o h y d r a t e e s t e r a s e s ) i n t o f a m i l i e s b a s e d o n a m i n o a c i d s e q u e n c e s i m i l a r i t y w a s i n t r o d u c e d r e c e n t l y [ 4 5 2 ] . I t h a s b e e n s h o w n t h a t c a t a l y t i c d o m a i n s f o r g l y c o s y l h y d r o l a s e s b e l o n g i n g t o t h e s a m e f a m i l y h a v e t h e s a m e t h r e e - d i m e n s i o n a l f o l d a n d e x h i b i t s i m i l a r s t e r e o s p e c i fi c i t y f o r h y d r o l y t i c a c t i v i t i e s . D e s p i t e s e v e r a l l i m i t a t i o n s o f t h i s a p p r o a c h ( e . g . p o s s i b l e l a c k o f c o r r e l a t i o n b e t w e e n p r o t e i n f a m i l y a n d s p e c i fi c a c t i v i t y ) , t h e c r u d e m i x t u r e p r o t e i n c o m p o s i t i o n w a s b a s e d o n G H f a m i l i e s i n o r d e r t o u n d e r s t a n d s y n e r g i s t i c e n z y m e c o m b i n a t i o n s n e c e s s a r y f o r e f fi c i e n t h y d r o l y s i s o f p r e t r e a t e d c e l l w a l l s . 1 8 6 7 E R 3 6 . . 0 0 1 1 9 3 8 . . . 2 0 0 4 7 . . 3 4 1 3 3 9 . . 0 1 1 . 0 8 . 7 2 3 3 . . 2 2 1 4 4 . . . 0 2 2 2 . 0 1 8 . . 3 4 1 1 G B 3 X B s e s I a e e s s I I r e e t s a a d d i i s s e s s a a l l u E u o o c c u u l l g g - - l y o l u l l l l e e c c o o x x r e B B e e F 1 8 7 T a b l e 7 . 2 P r o t e o m i c s b a s e d p r o t e i n c o m p o s i t i o n a l d a t a f o r 1 4 c r u d e e n z y m e b l e n d s b a s e d o n t o t a l o b s e r v e d s p e c t r a l c o u n t s . G H f a m i l y E n z y m e D e s c r i p t i o n A c r o n y m R E l R E 2 R E 3 R E S R E 6 a c e t y l e s t e r a s e a c e t y l x y l a n e s t e r a s e I a c e t y l x y l a n e s t e r a s e 1 1 A C A X E l A X E 2 A c e t y l X y l a n E s t e r a s e s A X E f e r u l o y l e s t e r a s e F A E 0 . 2 0 . 1 F A E B G l B G 3 6 . 0 3 . 3 fl - G l u c o s i d a s e s 6 . 0 3 . 3 [ i - x y l o s i d a s e 1 . 0 0 . 2 fl - X y l o s i d a s e s B X 1 . 0 0 . 3 4 . 9 0 . 2 6 a 7 a C B H 2 C B H 1 5 . 9 1 7 . 7 1 . 6 0 . 8 C e l l o b i o h y d r o l a s e s C B H 2 3 . 6 1 . 6 4 8 . 1 3 . 7 0 . 8 1 0 1 1 e n d o x y l a n a s e I I e n d o x y l a n a s e I ( a l l f a m i l y 1 1 i n c l u d e d ) E X 2 E X l 1 5 . 2 1 2 . 7 0 . 1 7 . 5 E n d o - x y l a n a s e s E X 1 . 0 2 . 2 7 . 5 8 . 1 4 . 6 9 . 0 2 . 0 4 . 3 G G F E B A X n o e e e e s s s s a a a a e i d d d d s e s a t i a e i i i p i s s s d s o o o o d s i a i n s n n n r s n c s e D i b a r a a a a r r r o a o u u u n c n f f f o o u o o o r l r n n n i i i u g u e c m y z n E y l i m a n a b b b c o u l a a a u n l y r r r l i g x a a a b - — - - a i t r a r i i J a ( ( ( G - a 7 f 6 H G 1 8 8 T a b l e 7 . 2 C o n t d . . . A c r o n y m R E 2 R E 3 R E 4 R E S R E 6 R E 7 5 6 7 b 1 2 4 5 6 1 a 6 1 b e n d o g l u c a n a s e I I e n d o g l u c a n a s e e n d o g l u c a n a s e I e n d o g l u c a n a s e I I I e n d o g l u c a n a s e V e n d o g l u c a n a s e I V e n d o g l u c a n a s e V I I E G 2 G H 6 E G l E G 3 E G S E G 4 E G 7 0 . 7 6 . 3 2 . 2 0 . 3 E n d o - g l u c a n a s e s 1 2 . 2 8 . 5 0 . 1 0 . 3 0 . 1 4 3 5 1 5 4 6 2 A A A B F l A B F 2 A B F 3 0 . 5 0 . 5 0 . 1 1 . 8 2 . 0 A r a b i n o f u r a n o s i d a s e s 1 . 4 0 . 5 0 . 1 2 . 0 A G L U C a G L U C 2 . 3 7 4 X G 2 . 3 6 . 9 X y l o g l u c a n a s e s 2 . 3 6 . 9 8 . 0 2 . 0 6 8 2 . . E 3 4 R 4 4 S E R 2 1 3 0 . . . . 0 0 0 1 3 4 . . 1 0 7 . 6 2 1 . 6 7 9 . 3 2 5 . 1 2 m y Y n Y M o M S 2 O T 2 R 1 6 7 O N L 1 1 C E M P P W A A r B A E I H I H H A c G P T G G C C M S G A O B B ) d e d u l c n e s a r ) e o t x s e s n i e n i e s e / e t a e s o o s a l o s i e r d a l o t i e t r y e n p e n e r p t e 1 c 2 s d i e s c s s i ( a s i a e y t a e s e a l s r s d h a m n c e a d e n n c a y i l e a i a i i i s s s t n a s l s a s l s y s e e l c f l n e n l a m a o n o o y t t a y u a e n e y a a l n i l n L h n o o l n l g s D m n a p p o o o y P t a m t u n c c a e r l a m d c - o r r l o o g e l m r - w y n 3 u l u l m e - p p m h u m A a a e e , s l y c c c g i i n - c l t P i i - B ( n c r t z s a [ t o a a n E e l c l n s a e a a r p g g y e o y l h - 1 g 6 - , B 6 1 1 — B H n l G n m o i a p t o t h c e p r . . . d t n o C y l 2 i . m 7 a 3 5 f 1 1 e l b H a G T 1 8 9 R E l R E 2 R E 4 R E 7 2 . 5 4 9 . 3 0 . 1 1 . 8 0 . 4 5 . 5 1 . 6 S T A R 5 1 . 9 1 . 9 5 . 8 1 . 6 P L P M E R H A E A R H P G L 0 . 1 0 . 4 0 . 4 0 . 2 0 . 4 [ \ 0 1 ¢ ) m e 1 . 2 0 . 7 8 . 0 0 . 4 0 . 2 1 . 1 6 9 . 5 3 . 8 3 . 9 7 8 0 E . . 0 2 7 . 2 R S E R 0 . 4 8 6 . 8 4 0 . 3 1 3 2 . 0 . 9 2 7 1 . . 0 7 3 4 . 0 m 2 1 I L y 1 0 2 L C R n o r c A 3 1 C O N 5 5 O 1 L A U E I I A G R H H H G F A N 5 6 T 7 A 8 N A G L H A H H G H M H A C C G G B A G B G G G B A M A A M B G T O A e s a n ) a s l e y d x i o r n a o h r c u c c a u s e s a d i ) s o o x n o i ) e a n a o l e o t e g s n c / e s e s a n e s t ) , o s e d a s a l d e e e a e p e o i d a s s a m n a s c n a e d s r a s i s s x a n o e d a d i n f g i a u r o e a - e e d e i d g ( s n l i a c a d n s ( i s ( s i i n n g s c t o s i a t e a n a a o e o s o l u o e s t r m r o t o l d e m r e s l o n D a c c c h n g - p s a u b a t a r n a f u a l n n n a u a - 6 n e e n l o i c m i y a r e l l r l 3 , i ( a y t s c t u - m t g t s i c o u l 2 a 4 e a t , l i — g g e 1 - , h c o y h u c l g , 1 h - - - c c r a s a c t z c a B u g r - o - 1 l — o O B 3 - f a l y n E g 3 , - d a l r o B i g g , 1 , s e o o n i 1 - — B s a n a c u l g - n B n a b a r m a - 2 , 1 6 - , a 1 — B . . . d t n o C y l 2 i . m 7 a e l b f H a G T 1 9 0 R E l R E 3 R E 4 1 8 2 2 3 3 3 3 4 5 3 5 6 7 7 7 7 8 9 0 . 4 4 . 7 3 . 0 0 . 4 0 . 1 0 . 1 0 . 2 0 . 4 0 . 7 8 3 . 2 4 5 . . 0 0 6 . 5 1 2 . 1 0 0 . . 4 4 9 . 2 5 . 4 4 . 6 3 2 . 4 3 . . 0 0 1 4 5 . . 0 7 1 2 3 2 . . 4 6 C B s e s s I H a e e s a d s e a s d a e l s o a r i d l i l u s u y o l h s l l l o o l y e i l e x c y c - o X B x — B e o b x o e l l e C 4 E C 2 E C n o i t p i r c s e D e m y z n E y l i m a f H G ' 1 9 1 T a b l e 7 . 2 C o n t d . . . A c r o n y m R E 8 C E S C E 6 a c e t y l e s t e r a s e a c e t y l x y l a n e s t e r a s e I a c e t y l x y l a n e s t e r a s e 1 1 A C A X E ] A X E 2 0 . 6 0 . 2 A c e t y l X y l a n E s t e r a s e s A X E 2 . 5 0 . 2 0 . 9 f e r u l o y l e s t e r a s e F A E F e r u l o y l E s t e r a s e s F A E 0 . 2 1 . 2 B - g l u c o s i d a s e B - g l u c o s i d a s e B G l B G 3 4 . 3 4 . 1 7 . 7 4 . 6 2 . 2 B — G l u c o s i d a s e s 4 . 1 7 . 7 2 . 9 4 . 6 2 . 2 1 5 . 6 B X 3 6 . 2 3 . 0 1 . 1 6 . 5 1 . 8 B X 3 . 0 1 . 1 6 . 5 1 . 8 6 a 7 a C B H 2 C B H 1 3 1 . 8 0 . 1 0 . 3 2 . 0 0 . 8 1 3 . 0 2 3 . 0 1 2 . 7 2 5 . 1 C B H 4 1 . 3 3 7 . 9 3 . 0 1 . 0 3 6 . 1 3 7 . 8 1 0 1 1 e n d o x y l a n a s e I I e n d o x y l a n a s e I ( a l l f a m i l y 1 1 i n c l u d e d ) E X 2 E X l 0 . 3 1 . 8 1 . 3 0 . 6 3 5 . 8 2 . 6 0 . 4 4 . 1 4 . 7 E n d o — x y l a n a s e s E X 2 . 4 4 . 4 4 . 4 6 . 0 6 E C 4 E C 3 E C 0 . 2 1 9 1 . . 5 . 0 0 2 3 3 . . 1 1 2 2 2 . 0 l 8 3 . . 4 E 5 C 1 . 2 1 1 8 5 E . 4 R m y n o r c A n o i t p s i r s d o i o i n i n s s c o a o s e D e m b r n n a c u o o r a f r o u r u n n c c a i u u u l g o n l b l y l i g y a z r G b - X n E y l i m a f H G a a a - r - a a a 4 7 e e s s a a d e s e s d s i i a a d e s a n a 1 9 2 T a b l e 7 . 2 C o n t d . . . C E 2 5 6 7 b 1 2 4 5 6 1 a 6 1 b e n d o g l u c a n a s e I I e n d o g l u c a n a s e e n d o g l u c a n a s e I e n d o g l u c a n a s e I H e n d o g l u c a n a s e V e n d o g l u c a n a s e I V e n d o g l u c a n a s e V H E G 2 G H 6 E G l E G 3 E G S E G 4 E G 7 5 . 3 7 . 5 2 . 4 0 . 5 0 . 6 0 . 2 0 . 2 0 . 4 3 . 1 7 . 1 8 . 4 2 . 5 0 . 1 0 5 E n d o - g l u c a n a s e s E G 1 . 9 1 6 . 5 1 8 . 6 4 3 5 1 5 4 6 2 ( J r - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e ( J r - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e A A A B F 1 A B F 2 A B F 3 0 . 9 1 . 2 1 . 2 1 . 3 1 . 4 0 . 4 A r a b i n o f u r a n o s i d a s e s A B F 1 . 9 2 . 7 0 . 4 6 7 A G L U C 2 . 5 0 . 5 a G L U C 2 . 4 2 . 5 0 . 5 x y l o g l u c a n a s e X G 6 . 2 X G 7 . 0 1 1 . 3 0 . 7 1 2 . 0 6 . 2 0 . 2 6 . 3 4 4 . 0 Y R H L T M A C R G A T E A P G S P ) d e d u l c n e s a r ) e o t x s e s n i e e s n t a i e e / e o o l s a l i e o r y d r a s o s t t e i p e r e n e n p t 1 d l e e s a e s c 2 s e s s i c s t a ( a i r s a m e a d e n n h n c n a i a a s t d s i a e y c s e a l i i i s y l s y e e a l f n l e i a n l l c y m o n o y t t a s e s n a y u L n a o o n l o l g s D n m a h n i l a P t u o m t o n a r r l o g o e l c e a c r - l r n m i u a l u e p p l m - m o a h u e s e , l l P B t m i i ( n c - 1 g r t w n 3 y o p o p d - c y c c c - g i - c n - 6 z s 6 a B t a o a , B n l c l n e l 1 E a r s a e a p g g y e o y l h - B H n l G n m o i a p t o t h c e p r . . . d t n o y C l 2 . 7 e l b i m a f H a G T 1 9 3 A c r o n y m C E l C E 2 C E 3 C E 6 1 3 1 5 0 . 4 3 . 4 4 0 . 2 0 . 2 0 . 4 A m y l a s e s 0 . 2 0 . 5 P L P M E 0 . 2 0 . 2 N V ' i I r ) \ O l \ v — t v — t O T H E R S C I P 1 C I P 2 S W O B M A N O B M B G A L 2 G H 1 6 G H 1 7 1 . 4 0 . 7 2 7 . 4 1 . 4 1 . 3 5 . 6 2 . 1 0 . 8 1 . 5 0 . 6 0 . 7 6 3 E . 0 C S E C 3 3 E . 0 C 2 . 4 1 5 . 1 . 0 2 4 3 . 2 1 . 0 ] 5 5 2 C O 0 1 1 L 0 ] L R V C I 2 8 E R m y n L A U U E I 1 3 A G R o N 7 5 6 T 8 N r A H H G H A F H H G H H A A G U L H C C T A G B G B N G c A M A M G G G G B A B A O A e s a n ) a s l e y d x i o r n a o h r c u c c a u s e s a d i ) s o o x e s n o i l o e e t g s n e c / e a a n a o s n s ) e e e a e t ) , a s e d a l a d e o s s r s s p s i o e m n a s d c n d a a e a a i x s a s n d d d o e g n f a u i i r c s e i i ( i s i g a ( s - n l e d e a o s e ( s s i d n a t c n n g o s a n e o o o l l o i a e t u a a o n o e s t c t o a r 1 d m n e r r m r e s D c c n a u g - a p s a u b a t h u a f n n l l n - m 6 a a e e e l l r n o i y g a i 3 , - r n l c i - t t s ( a y u c 4 , l 2 e m t r c l , t s i o u a a t y c l i h J u e c o g 1 g g l - , h h ( a s - c - t c ' - - - r l z c a u B g o - 3 fi B a O a l y l - n - d a l g 3 , r l o E , - B i g g , s o n 1 i e [ o - s i n B a b n n a a r a c m a u - l 2 g - 6 , 1 - , l - a . 3 . [ . d t n o C 2 . 7 e l b a T 8 0 7 0 1 2 2 3 1 9 4 G H f a m i l y 3 1 3 2 3 5 4 7 5 3 5 5 6 5 7 1 7 2 7 6 7 9 8 1 9 2 0 . 2 0 . 1 0 . 8 0 . 3 0 . 4 3 . 9 0 . 4 0 . 1 0 . 2 0 . 1 1 7 . 1 1 2 . 0 5 . 6 % 1 f o 0 0 1 - g 0 n i d a o l n i e t o r p l a t o t d e x fi n o d e s a b ( n o i t i s o p m o . c r e e v r o u t s t x n i r m o c e m d e y t z a n e e r t e d X u E r c F g A n n i o y r d a e v t s f e o t e e g r n e a w r t r a h o t f s ) t % n 0 e m 0 i 1 r o e t p x t e n e f l o a v n i g u i q s e e n D a 4 c . u 7 l g e l g b / a g T m 1 9 5 N o t a t i o n I # E x p t s I r e l I r e 2 I r e 3 I r e 4 I r e 5 I r e 6 I r e 7 I r e 8 I c e l I c e 2 I c e 3 I c e 4 I c e S I c e 6 8 c e - r e 5 2 6 0 4 8 % 0 — 4 8 % 0 — 4 8 % 0 — 4 8 % 0 - 4 8 % 0 - 4 8 % 0 - 4 8 % 0 - 4 8 % 5 2 % 1 0 c e - r e 7 6 8 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 5 c e - r e _ A 7 2 0 — 1 0 0 % - 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 5 c e - r e _ B 7 2 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 5 c e - r e _ C 7 2 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % 0 - 1 0 0 % B a s e d o n T a b l e 7 . 2 , C B H I w a s t h e p r e d o m i n a n t c e l l u l a s e i n a l l m a j o r c o m m e r c i a l e n z y m e s r a n g i n g f r o m 0 - 3 5 % , f o l l o w e d b y C B H 1 1 ( 0 - 1 4 % ) , e n d o g l u c a n a s e I ( 0 - 9 % ) , e n d o g l u c a n a s e 1 1 ( 0 - 8 % ) , e n d o g l u c a n a s e 1 1 1 ( 0 — 3 % ) a n d [ E l - g l u c o s i d a s e ( 0 - 1 6 % , G H 3 ) . T h e m a j o r h e m i c e l l u l a s e s w e r e f o u n d t o b e G H 1 1 e n d o x y l a n a s e ( 0 - 3 6 % ) , G H 1 0 e n d o x y l a n a s e ( 0 - 1 5 % ) , B - x y l o s i d a s e ( 0 - 7 % ) , G H 5 1 ( J r - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e ( 0 - 4 % ) , G H 5 4 ( i t - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e ( 0 - 8 % ) , G H 6 2 ( J r - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e ( 0 - 3 % ) , a c e t y l x y l a n e s t e r a s e s ( 0 - 6 % ) , a n d a - g l u c u r o n i d a s e ( 0 - 3 % ) . T h e r e w a s a s i g n i fi c a n t a m o u n t o f n o n - g l y c o s y l h y d r o l y t i c p r o t e i n s ( S e e T a b l e V - 7 . 3 f o r d e t a i l s o n n o n - c e l l u l o l y t i c p r o t e i n s f o r e a c h C E l b a s e d e n z y m e b l e n d ) p r e s e n t i n s e v e r a l e n z y m e m i x t u r e s r a n g i n g f r o m 2 - 8 0 % . C E - 4 a n d R E - 3 h a d s e v e r a l p e c t i n d e g r a d i n g e n z y m e s ( 1 5 - 5 0 % , i n c l u s i v e o f p e c t i n a s e s ) t h a t m i g h t n o t p l a y a s i g n i fi c a n t r o l e i n t h e h y d r o l y s i s o f s e c o n d a r y c e l l w a l l s . S w o l l e n i n w a s p r e s e n t i n s u r p r i s i n g l y h i g h a m o u n t s i n s e v e r a l c e l l u l a s e s ( 0 - 4 % ) , a l o n g w i t h c i p p r o t e i n s ( 0 - 3 % ) . S t a r c h d e g r a d i n g a m y l a s e s w e r e a l s o p r e s e n t i n r e l a t i v e l y h i g h c o n c e n t r a t i o n s i n c e r t a i n e n z y m e s ( 0 - 5 2 % ) . X y l o g l u c a n a s e s ( G H 7 4 ) w e r e a l s o p r e s e n t i n m o s t c r u d e b l e n d s i n s u r p r i s i n g l y h i g h a m o u n t s ( 0 - 2 2 % ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e e x p r e s s i o n o f t h e s e e n z y m e s i s c l o s e l y c o o r d i n a t e d w i t h o t h e r c e l l u l a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e s . X y l o g l u c a n a s e s a r e p r o b a b l y a n i m p o r t a n t c l a s s o f e n z y m e s e x p r e s s e d b y fi m g i g r o w i n g o n p l a n t c e l l w a l l s i n t h e w i l d d u e t o h i g h a m o u n t s o f x y l o g l u c a n s p r e s e n t i n t h e p r i m a r y c e l l w a l l s t h a t t h e f u n g u s m u s t d i g e s t t o g e t t h r o u g h t o t h e s e c o n d a r y c e l l w a l l s . H o w e v e r , t h e t o t a l a m o u n t o f x y l o g l u c a n a s e s p r e s e n t i n m o s t c o m m e r c i a l e n z y m e m i x t u r e s i s n o t o p t i m i z e d f o r p r e t r e a t e d s e c o n d a r y c e l l w a l l s ( f o r g r a s s e s l i k e c o r n s t o v e r ) t h a t h a v e l i t t l e o r n o x y l o g l u c a n . 1 9 6 I t i s w o u l d b e i n t e r e s t i n g t o c o r r e l a t e s p e c i fi c a c t i v i t y d a t a ( T a b l e 7 . 1 - B ) t o i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o s i t i o n ( T a b l e 7 . 2 ) i n o r d e r t o f u r t h e r v a l i d a t e t h e t w o d a t a s e t s . H o w e v e r , t h i s c o u l d b e r e l a t i v e l y c o m p l i c a t e d d u e t o p r e s e n c e o f m u l t i - fi m c t i o n a l e n z y m e s , s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n e n z y m e s a n d l a c k o f c o r r e l a t i o n b e t w e e n a c t i v i t i e s o n c e r t a i n c h r o m o g e n i c v s . r e a l i s t i c s u b s t r a t e s [ 3 8 5 ] . A s t r o n g l i n e a r c o r r e l a t i o n w a s s e e n b e t w e e n A v i c e l a s e a n d C M C a s e a c t i v i t i e s a n d t o t a l c e l l o b i o h y d r o l a s e ( R 2 = 0 . 7 3 ; % C B H I + C B H I I v s . A v i c e l a s e a c t i v i t y ) a n d e n d o g l u c a n a s e ( R 2 = 0 . 7 9 ; % E G I + E G I I + E G 1 1 1 + E G I V + E G V + E G V I I v s . C M C a s e a c t i v i t y ) c o n t e n t , r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , t h e r e w a s a p o o r e r c o r r e l a t i o n b e t w e e n t o t a l a m o u n t s o f G H 3 B - g l u c o s i d a s e p r e s e n t v s . a c t i v i t y o n p N P G . T h i s i s l a r g e l y d u e t o c r o s s - a c t i v i t y o f s e v e r a l o t h e r g l y c o s y l h y d r o l a s e s o n p N P G [ 4 5 3 ] . N S - 5 0 0 1 4 h a d a b n o r m a l l y h i g h a c t i v i t y o n o a t - s p e l t x y l a n c o m p a r e d t o a l l o t h e r e n z y m e m i x t u r e s . T h e r e w a s n o s i g n i fi c a n t c o r r e l a t i o n b e t w e e n o a t s p e l t x y l a n a s e a c t i v i t y a n d t o t a l e n d o x y l a n a s e c o n t e n t . T h i s i s n o t s u r p r i s i n g c o n s i d e r i n g t h a t m a n y x y l a n a s e s a c t o n o n l y d e b r a n c h e d x y l a n b a c k b o n e s a n d p r e s e n c e o f o t h e r s y n e r g i s t i c a c c e s s o r y e n z y m e s w o u l d g i v e v a r i a b l e , n o n - l i n e a r c o r r e l a t i o n s . M u l t i f e c t P e c t i n a s e h a d v e r y h i g h a r a b i n o f u r a n o s i d a s e a c t i v i t y c o m p a r e d t o a l l o t h e r e n z y m e s . T h e r e w a s a r e a s o n a b l e c o r r e l a t i o n ( R 2 = 0 . 9 ) b e t w e e n p N P A f a c t i v i t y a n d t o t a l a r a b i n o f u r a n o s i d a s e c o n t e n t , h o w e v e r , t h i s c o r r e l a t i o n m i g h t b e s k e w e d d u e t o C E 4 . M u l t i f e c t x y l a n a s e ( C E 3 ) g a v e t h e h i g h e s t a c t i v i t y o n p N P A w h i c h i s n o t s u r p r i s i n g c o n s i d e r i n g t h a t i t c o n t a i n e d t h e h i g h e s t p r o p o r t i o n o f a c e t y l x y l a n e s t e r a s e s ( 6 % ) . T h e r e w a s a r e a s o n a b l e c o r r e l a t i o n ( R 2 = 0 . 6 5 ) b e t w e e n p N P A a c t i v i t y a n d t o t a l e s t e r a s e c o n t e n t , h o w e v e r , t h i s c o r r e l a t i o n m i g h t b e s k e w e d d u e t o C E 3 . 1 9 7 7 . 1 . 4 . 3 M a x i m i z i n g e n z y m e s y n e r g y u s i n g s i m p l e x c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l d e s i g n s O n e o f t h e p r i m a r y l i m i t a t i o n s o f r e g u l a r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s a s s a y s i s t h a t t h e y a r e l o w - t h r o u g h p u t , t i m e - c o n s u m i n g a n d t e d i o u s . I n o r d e r t o s c r e e n a l a r g e r c o m b i n a t i o n o f e n z y m e m i x t u r e s a m i c r o p l a t e b a s e d h y d r o l y s i s a s s a y t e c h n i q u e w a s d e v e l o p e d f o r l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s [ 2 , 4 5 3 ] . T h e m i c r o p l a t e m e t h o d o l o g y i s a u t o m a t e d , h i g h - t h r o u g h p u t a n d m o r e r e p r o d u c i b l e c o m p a r e d t o o t h e r c o n v e n t i o n a l a s s a y s [ 3 9 2 ] . L o w e n z y m e l o a d i n g t o p r o d u c e c e l l u l o s i c e t h a n o l i n a n e c o n o m i c a l l y f e a s i b l e m a n n e r l i e s i n t h e r a n g e o f 1 — 1 0 m g p r o t e i n / g m g l u c a n . P r o t e i n l o a d i n g c u r r e n t l y e m p l o y e d f o r A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r / p o p l a r h a s n o t b e e n o p t i m i z e d a n d l i e s i n t h e r a n g e o f 3 0 - 1 8 0 m g p r o t e i n / g m g l u c a n t o a c h i e v e r e a s o n a b l y h i g h t o t a l s u g a r c o n v e r s i o n s ( ~ 9 0 % g l u c a n a n d 8 0 % x y l a n c o n v e r s i o n ) [ 5 3 , 5 4 ] . M o s t c o m m e r c i a l c e l l u l a s e m i x t u r e s l a c k s u f fi c i e n t h e m i c e l l u l a s e a c t i v i t i e s n e c e s s a r y t o h y d r o l y z e A F E X t r e a t e d b i o m a s s . I n o r d e r t o o p t i m i z e c o m m e r c i a l e n z y m e m i x t u r e s f o r A F E X c o r n s t o v e r , s e v e r a l m i x t u r e o p t i m i z a t i o n e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d u s i n g 1 4 c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e c r u d e c e l l u l a s e a n d h e m i c e l l u l a s e s ( S e e T a b l e 7 . 4 ) . T h e s e e n z y m e c o c k t a i l s w e r e f o u n d t o h a v e m u l t i p l e e n z y m e a c t i v i t i e s b a s e d o n t h e m o d e l s u b s t r a t e a c t i v i t y a s s a y s , a s d i s c u s s e d i n t h e p r e v i o u s s e c t i o n . T h e c o m m e r c i a l ( S p e z y m e , M u l t i f e c t X y l a n a s e a n d P e c t i n a s e , D e p o l 6 7 0 L , A c c e l l e r a s e , N o v o z y m e 1 8 8 ; C E 1 - 6 ) a n d r e s e a r c h e n z y m e s ( N o v o z y m e N S - s e r i e s ; R B 1 - 8 ) w e r e o p t i m i z e d f o r e n h a n c i n g h y d r o l y t i c p e r f o r m a n c e o n A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r u s i n g t h e B C R L h i g h - t h r o u g h p u t m i c r o p l a t e m e t h o d o l o g y [ 2 ] . T h e s t u d y o f s y n e r g i s m a m o n g s t a v a r i e t y o f e n z y m e s r e q u i r e s t h e u s e o f c a r e f u l l y d e s i g n e d e x p e r i m e n t s c a p a b l e o f a n a l y z i n g m u l t i p l e l e v e l s o f s y n e r g y w h i l e fi x i n g t h e s u m o f a l l m i x t u r e c o m p o n e n t s ; t h i s c a n b e a c h i e v e d u s i n g t h e s i m p l e x - c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l 1 9 8 d e s i g n [ 4 3 8 ] . T h e s i m p l e x - c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l d e s i g n r e q u i r e s e x p e r i m e n t s t o b e p e r f o r m e d fi r s t o n s i n g l e - b l e n d “ p u r e ” m i x t u r e s , t h e n o n d o u b l e - b l e n d s ( t h a t i s , 5 0 % o f e a c h o f t w o c o m p o n e n t s ) , a n d s o o n ( t h u s r e q u i r i n g 2 n - 1 t r i a l s , w h e r e n i s t h e n u m b e r o f c o m p o n e n t s ) . T h i s a l l o w s t h e c a l c u l a t i o n o f a m u l t i d i m e n s i o n a l p o l y n o m i a l m i x t u r e r e g r e s s i o n e q u a t i o n , w i t h t e r m s r e p r e s e n t i n g t h e e f f e c t o f s i n g l e e n z y m e s , b i n a r y s y n e r g i e s ( t h e p r o d u c t o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f t w o e n z y m e s a n d a r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t ) , t e r n a r y s y n e r g i e s , a n d s o o n , d e p e n d i n g o n t h e o r d e r o f t h e r e g r e s s i o n e q u a t i o n ; t h e m a g n i t u d e o f t h e r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t i n d i c a t e s t h e r e l a t i v e i m p o r t a n c e o f a n y p a r t i c u l a r e n z y m e o r e n z y m e s y n e r g i e s ( S e e e q u a t i o n b e l o w ) . Y = Z fl i x i + Z fl y - x i x j + Z fl y - k x i n x k + ° ' ° l S i S q 1 . < . i < q u I S i < j < k S q W h e r e ; Y i s t h e r e s p o n s e v a r i a b l e ( e . g . % g l u c a n c o n v e r s i o n ) ; q i s t h e n u m b e r o f . . . t h . . . e n z y m e s ; x i r s t h e p r o p o r t i o n o f t h e t e n z y m e i n t h e m i x t u r e ; a n d P i j . . . m I S t h e c o e f fi c i e n t o f s y n e r g y f o r m e n z y m e s . T h e m a g n i t u d e o f e a c h [ i v - . . . , " i n d i c a t e s t h e s t r e n g t h o f a p a r t i c u l a r e n z y m e o r s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n . T h r e e s i m p l e x c e n t r o i d e x p e r i m e n t s w e r e d e s i g n e d : ( 1 ) 8 C E - R E : a d d i n g 8 m g t o t a l p r o t e i n / g g l u c a n o f e i g h t a c c e s s o r y e n z y m e s — N o v o z y m e 1 8 8 , M u l t i f e c t X y l a n a s e , M u l t i f e c t P e c t i n a s e , N S 2 2 0 0 2 , N S 5 0 0 1 2 , N S 5 0 0 1 4 , N 8 5 0 0 2 9 , a n d N S 5 0 0 3 0 — t o fi x e d 8 . 5 m g A c c e l l e r a s e / g m g l u c a n o f A F E X s t o v e r ; ( 2 ) 1 0 C E - R E : a d d i n g 1 6 . 5 m g p r o t e i n / g g l u c a n o f t e n e n z y m e s - S p e z y m e , M u l t i f e c t X y l a n a s e a n d P e c t i n a s e , D e p o l 6 7 0 L , A c c e l l e r a s e , N 8 2 2 0 0 2 , N S S O O I O , N 8 5 0 0 1 3 , N S S O O 3 0 , a n d N 8 5 0 0 5 3 ; a n d ( 3 ) 5 C E - R E : a d d i n g 1 6 . 5 m g p r o t e i n / g g l u c a n o f o n e m a j o r c e l l u l a s e ( e i t h e r o n e o f S p e z y m e , A c c e l l e r a s e , o r N S 5 0 0 1 3 ) , M u l t i f e c t P e c t i n a s e , D e p o l 6 7 0 L , N 8 2 2 0 0 2 , a n d N S 5 0 0 3 0 . 1 9 9 H y d r o l y s i s o n A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r f o r a l l e n z y m e c o m b i n a t i o n s w a s i n v e s t i g a t e d u s i n g t h e h i g h - t h r o u g h p u t B C R L m i c r o p l a t e m e t h o d o l o g y a t p H 5 , 5 0 ° C , 2 7 0 r p m , 5 0 0 p l r e a c t i o n v o l u m e a n d 0 . 2 % g l u c a n l o a d i n g . T h e A F E X c o n d i t i o n u s e d f o r a l l e x p e r i m e n t s w a s m e d i u m s e v e r i t y a t 1 : 1 a m m o n i a l o a d i n g ( d r y w e i g h t b i o m a s s ) , 1 5 m i n ( t o t a l r e s i d e n c e t i m e ) , 6 0 % m o i s t u r e ( d w b ) a n d 1 3 0 D e g r e e s ° C . D e t a i l s f o r t h e e n z y m e m i x t u r e s t e s t e d a n d t h e o b t a i n e d g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n a r e g i v e n i n T a b l e V - 7 . 1 5 . T h i r d - d e g r e e m i x e d s t e p w i s e ( a — t o - e n t e r / a - t o - l e a v e : 0 . 1 5 ) r e g r e s s i o n s w e r e p e r f o r m e d o n t h e r e s u l t s ( % g l u c a n c o n v e r s i o n , % x y l a n c o n v e r s i o n , t o t a l g l u c o s e a n d x y l o s e r e l e a s e d a s g r n s s u g a r p e r k g d r y w e i g h t b i o m a s s ) o f e a c h e x p e r i m e n t a l d a t a s e t t o g e n e r a t e m o d e l s p r e d i c t i n g r e s p o n s e a s f u n c t i o n o f e n z y m e m i x t u r e c o m p o s i t i o n , w i t h t h e s t e p w i s e r e g r e s s i o n a l g o r i t h m p r e s e r v i n g s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t i n t e r a c t i o n e f f e c t s [ 4 5 4 ] . T h e v a l i d i t y o f t h e r e g r e s s i o n m o d e l s o b t a i n e d f r o m s t e p w i s e s p e c i a l c u b i c r e g r e s s i o n s o f a l l m i x t u r e e x p e r i m e n t s w a s c o n fi r m e d b y a n a l y z i n g r e s i d u a l h i s t o g r a m s , n o r m a l d i s t r i b u t i o n c u r v e s o f r e s i d u a l s , r e s i d u a l s v e r s u s fi t s , a n d r e s i d u a l s v e r s u s o r d e r p l o t s ( d a t a n o t s h o w n ) . A n a l y s i s s u g g e s t e d t h a t q u a d r a t i c a n d q u a t e r n a r y i n t e r a c t i o n t e r m s . . . . 2 . b a s e d m o d e l r e g r e s s r o n s ( l l d n o t a c c u r a t e l y p r e d i c t t h e v a r i a n c e ( l o w R a n d h i g h 6 v a l u e s ) i n t h e d a t a a s c o m p a r e d t o s p e c i a l c u b i c i n t e r a c t i o n t e r m s b a s e d r e g r e s s i o n m o d e l s . T h e c ( s i g m a o r S ) a n d R 2 v a l u e s w e r e a l s o c l o s e l y a n a l y z e d f o r c o m p a r i n g m o d e l s ; a l l o - v a l u e s s u g g e s t e d t h a t t h e fi r s t s t a n d a r d d e v i a t i o n o f r e s i d u a l s w a s r e l a t i v e l y s m a l l ( < 5 % ) . T h e o - v a l u e s f o r x y l a n c o n v e r s i o n w e r e s l i g h t l y h i g h e r t h a n t h o s e f o r g l u c a n c o n v e r s i o n , s u g g e s t i n g p o s s i b l y t h a t t h e x y l o s e a s s a y w a s l e s s p r e c i s e t h a n t h e g l u c o s e a s s a y . H i g h R 2 a n d R 2 ( a d j o r a d j u s t e d ) v a l u e s ( > 8 0 % ) i n d i c a t e t h a t t h e m o d e l s 2 0 0 a c c o u n t f o r m a j o r i t y o f t h e v a r i a t i o n i n t h e d a t a s e t a n d w a s n o t a r e s u l t o f o v e r fi t t i n g . H i g h R 2 ( p r e d o r p r e d i c t e d ) ( > 8 0 % ) v a l u e s i n d i c a t e t h a t t h e m o d e l s h a d s i g n i fi c a n t p r e d i c t i v e c a p a b i l i t i e s . T h e r e g r e s s i o n e q u a t i o n s w e r e o p t i m i z e d , f o r r e s p o n s e o u t p u t ( u s i n g M i n i t a b r e s p o n s e o p t i m i z e r f u n c t i o n a l i t y ) , b y m a x i m i z i n g a d e s i r a b i l i t y f u n c t i o n ( w e i g h t = 1 , m i n = 0 , t a r g e t = 1 0 0 f o r g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n ; 6 3 0 f o r t o t a l s u g a r h y d r o l y t i c y i e l d ) [ 4 5 5 ] . C o x r e s p o n s e t r a c e p l o t s w e r e g e n e r a t e d t o a n a l y z e t h e e f f e c t o f v a r y i n g t h e c o m p o s i t i o n o f e n z y m e c o c k t a i l s w i t h r e s p e c t t o t h e o p t i m a l r e f e r e n c e b l e n d ( i . e . m o d e l - g e n e r a t e d o p t i m u m ) a s a m e a s u r e o f r e l a t i v e s e n s i t i v i t y o f o u t p u t t o i n p u t p a r a m e t e r s . 7 . 1 . 4 . 4 E i g h t - e n z y m e ( 8 c e - r e ) s i m p l e x c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l d e s i g n T a b l e 7 . 5 s u m m a r i z e s t h e e s t i m a t e d r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t s ( i n d e c r e a s i n g o r d e r o f m a g n i t u d e f o r e a c h c l a s s o f t e r m s ; s i n g l e - b i n a r y - t e m a r y ) f o r m o d e l s p r e d i c t i n g t h e g l u c a n / x y l a n c o n v e r s i o n a n d t o t a l s u g a r y i e l d a s a f u n c t i o n o f e n z y m e m i x t u r e c o m p o s i t i o n . I t c a n b e i n f e r r e d t h a t N S 5 0 0 3 0 ( R E 7 ) a n d N S 5 0 0 1 4 ( R E 5 ) a f f e c t e d g l u c a n c o n v e r s i o n m o s t s i g n i fi c a n t l y ( b a s e d o n r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t f o r R E 7 a n d R E 5 b a s e d i n d i v i d u a l t e r m s ) . O n t h e o t h e r h a n d , M u l t i f e c t P e c t i n a s e ( C E 4 ) a n d M u l t i f e c t X y l a n a s e ( C E 3 ) a f f e c t e d x y l a n c o n v e r s i o n m o s t s i g n i fi c a n t l y . W i t h i n t h e b i n a r y t e r m s p r e d i c t i n g g l u c a n c o n v e r s i o n , t h e t o p 4 i n t e r a c t i o n t e r m s c o n t a i n R E 7 ; w h e r e a s , b i n a r y t e r m s p r e d i c t i n g x y l a n c o n v e r s i o n a r e d o m i n a t e d b y C E 4 a n d C E 3 . 2 0 1 9 8 6 6 6 1 1 1 5 3 F 0 9 5 0 5 9 7 6 2 3 2 9 5 1 1 ) I 2 2 5 2 7 2 4 5 0 6 . . . . . 9 7 4 3 8 g . . . . . . . . . . V 4 4 6 4 3 k 7 5 5 8 8 4 4 3 3 3 / g , d l e i y r P a t g n u e s i 3 4 4 6 2 6 6 5 7 9 2 2 2 c . . . . 8 0 . . . . . . . . . l i 9 4 1 2 2 8 0 9 5 1 9 9 1 0 2 7 6 2 1 3 0 5 3 8 8 7 4 6 3 2 3 3 3 3 5 5 2 2 3 3 3 3 3 a f t f o e T o ( C s m r e T n m e e e e e e e 7 7 5 3 7 6 1 r r r r r r r * * * * * * * 4 4 4 3 3 2 3 e e c c c c c c c c c c c c F 9 9 1 1 1 1 1 3 3 1 4 9 1 4 I 6 6 1 0 0 1 0 V . . . . . . . 4 4 4 4 4 4 4 r P e v n o c t n n e a i 4 5 1 l c . . . 8 2 6 2 9 2 8 6 1 9 8 7 y i 9 6 4 8 3 6 2 6 0 3 6 9 9 5 0 . . . . . . . . . . . . f 1 1 0 X 1 1 5 5 8 2 2 2 2 9 7 6 f e % o ( C 1 1 1 s m r e T n m e e e e e e e 1 1 7 7 5 5 6 r r r r r r r * * * * * * * 4 4 4 3 3 3 3 e c e c c c c c c c c c c c 7 8 2 4 5 8 4 5 5 F 6 3 3 3 8 8 5 6 9 3 0 5 9 4 2 4 8 8 8 2 2 I 0 3 8 8 7 3 1 6 8 . . . . . . V 8 4 4 3 3 3 . . . . . . . . . 8 8 7 5 5 4 2 2 2 o r i e s T s e r g e R ) n o i s o r i e s T s e r g e R ) n o i s r e v P n o c n t n a e c i u c l i G f f e % o ( C s m r e T n m o r i e s T s e r g e R 7 S 3 4 2 6 l 3 e e e e e e e e r r r r r c c c T a b l e 7 . 5 E s t i m a t e d r e g r e s s i o n c o e f f i c i e n t s f o r m o d e l t e r m s ( s i n g l e , b i n a r y a n d c u b i c b a s e d i n t e r a c t i o n t e r m s ) p r e d i c t i n g % g l u c a n c o n v e r s i o n , % x y l a n c o n v e r s i o n a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( g m s u g a r / k g d r y w e i g h t b i o m a s s ) a s a f u n c t i o n o f c r u d e e n z y m e m i x t u r e a m o u n t c o m p o s i t i o n f o r 8 C E - R E b a s e d e x p e r i m e n t s . T h e s u m o f t o t a l e n z y m e l o a d i n g i s a l w a y s e q u a l t o 8 m g p r o t e i n / g g l u c a n . A l l e n z y m e m i x t u r e s h a v e a f i x e d l o a d i n g o f 8 . 5 m g C E 6 / g g l u c a n , w h i c h i s n o t i n c l u d e d a s a r e g r e s s o r i n t h e m o d e l . W h e r e ; V I F = v a r i a n c e i n fl a t i o n f a c t o r , P R E S S = p r e d i c t i o n e r r o r s u m o f s q u a r e s , S = fi r s t s t a n d a r d d e v i a t i o n o f r e s i d u a l s , R - S q d o r e d ) = p r e d i c t e d R 2 ( c o e f fi c i e n t o f d e t e r m i n a t i o n ) ; R - S q ( a d } ) = a d j u s t e d R 2 . 2 0 2 7 1 . 6 4 6 8 . 6 8 6 3 . 6 6 1 . 0 8 5 8 . 4 4 5 3 . 2 2 5 1 . 8 9 4 7 . 5 c e 4 c e 3 r e 7 c e 2 r e 5 r e l r e 3 r e 6 8 . 9 5 8 8 . 9 5 8 3 . 0 6 7 2 . 9 8 7 2 . 7 6 3 3 . 0 3 7 2 . 7 6 3 2 . 9 8 7 c e 4 c e 3 r e 7 r e 5 r e 1 c e 2 r e 3 r e 6 c e 2 * r e 7 r e 3 * r e 7 r e 6 * r e 7 c c 4 * r e 7 c e 2 * r e 5 c c 2 * r e 1 c c 4 * r e 1 7 5 . 7 8 6 6 . 6 7 6 3 . 6 5 6 1 . 7 7 5 9 . 5 6 5 9 . 0 9 5 1 . 4 1 : 5 : a : a t : a : a t : a t 2 | : a 0 0 O 0 0 0 0 * * * * * * * * O O O O O O O * u - x - a r - a - u - u a t o o o o o o o 7 1 5 1 1 2 . . 2 2 3 5 0 0 0 0 . . 0 0 2 5 0 5 . . 5 3 2 2 5 5 e e r r * * 1 3 e e r c . . . d t n o C 5 . 7 e l b a T 2 0 3 R e g r e s s i o n T e r m s ( % G l u c a n c o n v e r s i o n ) R e g r e s s i o n T e r m s ( % X y l a n c o n v e r s i o n ) R e g r e s s i o n T e r m s ( T o t a l s u g a r y i e l d , g / k g ) T e r m C o e f f i c i e n t P V I F T e r m C o e f f i c i e n t P V I F T e r m C o e fi i c i e n t P V I F c e 4 * r e 5 5 0 . 1 6 2 . 8 8 6 c e 3 * r e 3 6 8 . 5 0 4 . 0 4 1 c e 3 * r e 1 3 4 6 . 2 3 . 7 8 3 r e 1 * r e 7 4 9 . 4 8 3 . 1 c c 4 * r e 3 6 4 . 4 0 4 . 0 4 1 c e 3 * r e 5 3 4 5 . 8 2 . 9 7 2 r e 5 * r e 7 4 8 . 6 5 2 . 1 9 1 c e 4 * r e 6 5 4 . 4 0 . 0 0 3 4 . 0 9 1 c e 2 * c e 3 3 4 4 . 4 3 . 3 5 9 c e 3 * r e 7 4 3 . 4 5 3 . 5 7 1 c e 3 * c e 4 4 7 . 7 0 . 0 0 1 2 . 6 2 8 r e 3 * r e 7 3 2 8 . 6 3 . 3 4 1 r e 1 * r e 3 4 2 . 5 3 2 . 1 8 6 c e 2 * c e 3 4 7 . 4 0 . 0 1 4 . 0 9 1 c e 2 * r e 5 2 7 1 . 5 3 . 3 1 3 r e 1 * r e 6 4 1 . 3 6 2 . 1 8 6 c e 2 * c e 4 4 2 . 3 0 . 0 2 1 4 . 0 9 1 c e 2 * r e 1 2 6 0 . 9 2 . 5 5 5 c e 2 * c e 3 3 9 . 2 4 3 . 3 6 5 c e 3 * c e 4 2 5 4 . 3 0 2 . 5 3 6 r e 3 * r e 5 3 6 . 9 1 3 . 2 8 r e 6 * r e 7 2 3 7 . 3 0 . 0 0 2 3 . 7 3 2 c e 3 * r e 3 3 6 . 4 5 3 . 2 7 9 r e 1 * r e 7 2 1 1 . 7 0 . 0 0 4 3 . 4 4 7 r e 5 * r e 6 3 3 . 5 6 0 . 0 0 1 3 . 2 8 c e 4 * r e 3 1 9 8 . 2 0 . 0 1 4 4 . 2 0 2 c e 3 * c e 4 3 1 . 2 6 0 . 0 0 3 3 . 3 5 3 r e 5 * r e 6 1 9 2 0 . 0 0 4 2 . 8 9 3 c e 3 * r e 6 2 9 . 7 7 0 . 0 0 4 3 . 2 7 9 r e 5 * r e 7 1 8 9 . 1 0 . 0 0 6 3 . 0 4 6 c e 2 * c e 4 2 7 . 5 4 0 . 0 0 3 2 . 5 6 4 r e 3 * r e 5 1 5 4 . 7 0 . 0 2 9 3 . 2 4 3 c e 3 * r e l 2 7 . 2 5 0 . 0 0 3 2 . 6 4 1 c e 2 * c e 4 1 4 8 . 8 0 . 0 6 8 4 . 2 4 5 O O O O O O O O O O O O O O O 2 6 2 6 6 6 9 4 6 5 3 3 3 6 6 3 8 7 9 0 9 7 9 7 5 0 6 9 9 7 3 3 3 5 6 7 5 2 ) 0 0 0 0 0 8 7 5 5 9 9 9 7 7 6 7 7 7 7 g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . k 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 / g , d l e i y r a t g n u e i 1 5 7 6 9 9 6 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 5 7 5 6 2 5 4 9 3 6 6 1 8 2 3 s . 1 . . . . . . . . . . . . 3 . . 0 6 c l i a f t f o e T o ( C s m r 5 0 3 1 9 4 8 1 0 7 6 3 6 1 5 1 5 6 2 9 5 1 9 4 9 7 5 4 4 3 3 4 4 2 7 4 1 2 0 3 6 1 0 1 1 1 1 8 8 8 7 6 2 2 1 1 1 3 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 6 6 6 3 3 5 7 6 6 7 7 5 7 7 5 3 7 1 e e e e e e e e e e e e e e e e e e e e T n o i s s e r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 6 5 3 3 5 6 3 1 1 3 1 1 1 1 4 4 4 4 4 e e e e e e e e e e e e e e e e e e e r r r r r r r r r r r r r c c c c c c * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 2 2 2 2 2 2 3 3 g c c c c c c c c c c c c c c c c c c c e c c c c c c c c c c e c e c c c c c e R 8 5 5 5 5 5 8 5 5 5 5 4 4 6 6 2 6 6 5 2 2 2 2 2 5 2 4 2 2 4 2 4 2 2 2 2 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m r e T 7 6 7 7 7 5 6 7 3 5 6 6 7 5 7 3 3 5 1 e e e e e e e e e e e e e e e e e e e r r r r r r r r r r r r r r r r r r ‘ r * * * * * * * * * * * " * * * * * * * 6 3 5 5 3 3 3 5 4 4 4 4 4 1 1 1 1 1 1 e e e e e e e e e e e e e e e e e e e r r r r r r r r r r r r r r c c c c c * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 2 2 2 2 3 3 3 3 e c c c c c e c c c c c c c c e c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c 8 8 2 2 2 2 7 7 4 3 3 2 3 5 1 1 F 6 6 6 6 6 7 9 9 6 6 6 6 3 5 7 6 7 7 2 7 7 0 I . . . 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 9 4 7 4 0 V 2 . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 7 8 8 4 8 9 7 9 4 5 6 9 4 7 7 3 1 1 5 3 6 5 4 4 7 9 7 3 8 9 2 8 5 3 7 0 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 3 6 5 2 2 0 8 4 1 8 1 5 4 3 7 5 2 5 7 0 3 9 9 8 8 8 6 6 5 3 2 4 2 2 1 1 3 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m r e T 2 0 4 T a b l e 7 . 5 C o n t d . . . P R e g r e s s i o n T e r m s ( % G l u c a n c o n v e r s i o n ) C o e f f i c i e n t P R e g r e s s i o n T e r m s ( % X y l a n c o n v e r s i o n ) C o e f f i c i e n t V I F T e r m P V I F c e 2 * r e 6 * r e 7 c c 4 * r e 6 * r e 7 c c 2 * r e 3 * r e 7 c e 4 * r e 3 * r e 7 c c 4 * r e 5 * r e 6 c c 2 * r e 3 * r e 5 c c 4 * r e 3 * r e 5 c c 2 " ‘ r e 5 * r e 6 c c 2 * c e 3 * r e 6 r e 3 * r e 6 * r e 7 c c 4 * r e 3 * r e 6 c c 3 * r e 1 * r e 7 c c 3 * c e 4 * r e 6 c e 3 * c e 4 * r e 7 c c 2 * c e 3 * r e 3 c c 3 * c e 4 * r e 3 c c 2 * c e 4 " ‘ r e 7 r e 3 * r e 5 * r e 6 c c 2 * r e 3 * r e 6 0 0 0 0 . 0 0 1 0 . 0 0 2 0 . 0 0 2 0 . 0 0 3 0 . 0 0 4 0 . 0 0 4 0 . 0 0 8 0 . 0 0 4 0 . 0 2 3 0 . 0 1 8 0 . 0 5 0 . 0 4 5 0 . 0 4 7 0 . 0 7 0 . 0 6 7 0 . 0 4 8 7 5 1 . 9 7 2 4 . 6 6 9 0 . 2 6 7 1 . 2 6 4 4 6 2 3 5 6 3 . 3 5 6 1 . 3 5 4 2 . 6 5 1 6 . 5 5 0 9 . 5 4 3 2 . 5 4 0 0 . 8 3 6 3 . 5 3 4 7 . 9 3 1 6 . 7 3 1 0 . 6 2 9 4 . 7 2 9 1 . 3 O O O O O O O O O O O O O O 0 . 0 0 1 0 . 0 0 1 0 . 0 0 2 0 . 0 0 3 0 . 0 0 3 O O O O O O O O O O O O 5 6 2 2 2 7 9 2 4 7 6 3 1 F 7 0 7 2 3 5 6 6 4 5 9 9 4 7 6 I V 7 8 7 7 5 7 0 0 7 7 7 7 4 . . . . . . . . . 1 . . . . . 1 1 1 1 1 1 % 2 2 1 1 1 1 1 5 5 . 2 9 = ) 8 j 5 d 8 a 1 ( 6 q 1 S - = R S % S 4 E 5 R . P 7 8 = 8 0 ) 9 d 2 e . r 9 p 1 ( q = S - s R 2 . 4 5 0 1 3 3 4 9 6 2 9 8 9 7 6 2 8 . . . . . . . . . . . . . 2 7 8 9 3 1 1 0 5 4 1 8 8 6 5 4 2 8 7 5 4 2 5 5 3 3 9 9 9 9 8 8 8 8 8 7 7 7 6 F I V ) n o i s 1 1 0 0 1 2 2 3 1 1 1 2 0 3 4 9 4 2 6 3 5 6 9 9 4 1 7 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 . . . 0 1 0 . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 r e v n o c t n n e 4 . 4 7 1 - a i 4 9 6 9 5 2 8 2 9 1 1 1 1 l . . . . . 8 . c . . . . . . . y 2 8 1 3 6 4 9 4 8 1 i 9 3 4 5 8 6 4 5 4 2 4 1 2 1 7 4 5 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 X f f e % o ( C s m r e T n o i s s e r g e R 8 4 1 F 2 3 7 I 0 0 7 ) . . . V n 1 2 2 o % 5 i 0 7 5 1 0 9 1 P 1 1 0 . . . 0 0 0 s r e v n o c n t n . 9 8 = 9 ) 7 j . d a 9 a e c i u c l i G f f e % 7 8 9 0 ( 8 9 4 5 q . . . 3 S 7 6 4 - 0 0 0 = R 1 1 1 o S ( C % S 0 E s 8 m r 7 7 6 P 0 R . e e e e T r r r 8 = m 2 * * * n 1 3 3 o r 3 ) 4 d i s s e e e e e r c r 7 r T 7 * * * e 4 2 3 . p 2 ( r q e e e g S c c c = e — R S R 2 0 5 T a b l e 7 . 5 C o n t d . . . T e r m P T e r m P R e g r e s s i o n T e r m s ( T o t a l s u g a r y i e l d , g / k g ) C o e f f i c i e n t c e 2 * c e 3 * r e 7 c c 3 * r e 1 * r e 7 c c 3 * r e 5 * r e 6 c c 3 * r e 1 * r e 6 c c 2 * c e 3 * r e 6 c c 2 * c e 3 * r e 5 c c 3 * r e 6 * r e 7 c c 3 * r e 3 * r e 6 c e 2 * c e 3 * r e 3 c c 2 * r e 6 * r e 7 c c 3 * r e 3 * r e 5 c c 2 * c e 3 * r e 1 c c 2 * r e 1 * r e 7 r e 1 * r e 6 * r e 7 c c 3 * c e 4 * r e 1 1 . 7 5 8 1 . 7 6 1 . 7 2 5 1 . 7 4 4 1 . 7 4 2 1 . 7 2 5 1 . 7 5 8 1 . 7 2 5 1 . 7 2 5 1 . 4 1 5 1 . 7 2 5 1 . 7 4 4 1 . 4 1 5 1 . 4 1 5 2 . 0 3 1 c e 2 * r e 3 * r e 7 c c 2 * r e 3 * r e 5 c c 2 * c e 3 * r e 3 c c 3 * r e 5 * r e 7 c c 2 * c e 3 * r e 7 r e 3 * r e 6 * r e 7 r e 1 * r e 3 * r e 5 c e 3 * r e 3 * r e 6 c c 3 * r e 1 * r e 6 c c 3 * r e 1 * r e 5 r e 1 * r e 6 * r e 7 c c 2 * r e 5 * r e 6 c c 3 * c e 4 * r e 6 r e 1 * r e 3 * r e 6 0 . 0 1 6 0 . 0 2 9 0 . 0 2 9 0 . 0 4 2 0 . 0 4 8 0 . 0 4 2 0 . 0 3 4 0 . 0 4 8 0 . 0 5 3 0 . 0 5 5 0 . 0 8 2 0 . 0 8 6 0 . 0 9 2 0 . 1 0 4 s = 4 . 4 3 6 1 5 P R E S S = 9 0 1 9 . 0 1 R - S q ( p r e d ) = 9 2 . 2 1 % R - S q ( a d j ) = 9 5 . 5 5 % S i m i l a r t r e n d s c a n b e s e e n f o r t h e t e r n a r y t e r m s a s w e l l , w i t h R E 7 , C E 3 a n d C E 4 b e i n g t h e p r e d o m i n a n t c o n t r i b u t o r s t o m o s t s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s . N o t s u r p r i s i n g l y , t h e e n z y m e c o m b i n a t i o n s t h a t g a v e t h e h i g h e s t t o t a l s u g a r y i e l d s w e r e a n i n t e r m e d i a t e c o m b i n a t i o n o f t e r m s m a x i m i z i n g b o t h g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n . T h e c o m p o s i t i o n o f t h e o p t i m a l e n z y m e c o c k t a i l g i v i n g t h e h i g h e s t g l u c a n , x y l a n a n d t o t a l s u g a r y i e l d s a r e s h o w n i n F i g u r e s 7 . 2 A , 7 . 2 B a n d 7 . 2 C , r e s p e c t i v e l y , a s C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t s ( a s t e e p s l o p e o r c u r v a t u r e w i t h i n c o x - p l o t d u e t o c h a n g e i n i n p u t v a r i a b l e i n d i c a t e s a r e l a t i v e l y h i g h s e n s i t i v i t y o f r e s p o n s e ) . E a c h e n z y m e m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 8 . 5 m g / g g l u c a n o f A c c e l l e r a s e ( 5 2 % o f t o t a l e n z y m e l o a d i n g ) a n d v a r y i n g m i x t u r e r a t i o s o f o t h e r a c c e s s o r y e n z y m e s ( w i t h i n t h e r e m a i n i n g 4 8 % e n z y m e o r 8 m g o u t o f t h e t o t a l 1 6 . 5 m g / g g l u c a n ) . F o r o p t i m a l g l u c a n c o n v e r s i o n ( 9 0 . 9 3 % ) , t h e 8 m g a c c e s s o r y p r o t e i n m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 4 6 . 7 5 % R E 7 , 1 8 . 2 5 % C E 2 , 1 4 . 6 2 % R E 6 , 1 1 . 2 5 % C E 4 a n d 9 . 1 2 % R E 3 . F o r o p t i m a l x y l a n c o n v e r s i o n ( 9 3 . 6 3 % ) , t h e 8 m g a c c e s s o r y p r o t e i n m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 4 5 . 2 5 % C E 4 , 1 8 . 3 8 % R E 7 , 1 4 . 1 2 % R E 5 , 1 0 . 1 3 % R E 1 , 8 . 1 3 % R E 6 a n d 4 % R E 3 . T h e g l u c a n c o n v e r s i o n w a s f o u n d t o b e m o s t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t e d b y r e l a t i v e c h a n g e i n R E 6 , R E 7 a n d C E 2 b a s e d o n r e l a t i v e s t e e p n e s s o f C o x - t r a c e p l o t ( F i g u r e 7 . 2 - A ) , h o w e v e r , m a x i m u m r e s p o n s e w a s o n l y o b t a i n e d a t t h e r e f e r e n c e b l e n d c o m p o s i t i o n . T h e C o x - r e s p o n s e p l o t s h e l p v a l i d a t e t h e p r e d i c t e d o p t i m u m s o l u t i o n s o b t a i n u s i n g t h e d e s i r a b i l i t y f u n c t i o n s . 2 0 6 o t t c e p s e 0 0 5 x 3 0 2 8 3 r 0 0 2 1 0 1 1 3 i M 0 0 5 0 4 4 8 8 h 0 0 4 1 0 1 0 1 t . . . l . . . . . i 0 0 0 a 0 0 0 0 0 w m ) t i 2 3 7 4 5 1 3 6 C e e e e e e e e p e O c o c r r r r r ( r u d t l x — — — - — - - - - - e i — - > — - i M - — — - - — y - — — — — — — - r a g m u m u i s t l p a O t o t t r d n a w e s n ) o p s e R e s o l y X B ( n o i s r e v n o c n a l y . x s t n % e m , i ) A r ( e p 5 . 0 e r u 0 t . x 0 i M m u m i 5 t ' ; - - - - 5 o 5 . 0 p O 7 s 2 t r w e s n o p n x 0 2 0 2 5 x 5 5 0 o i e 2 2 0 0 1 0 6 7 0 . 0 5 . . 0 * - 0 0 2 - 0 0 5 i M 8 1 0 0 9 0 4 6 s s E r R e - v 1 1 0 0 0 0 1 4 l . . . . . . . . a 0 0 0 0 0 0 0 0 m i n t E 2 3 5 7 3 6 4 1 e R s r o a p s e e e C a e e e e r g O a o r r r r r e c 8 u u n S r - t - a x o - — - - — - c f — - i — — M - — — l a u — - t n - l o o l — — — — — - - T g i a t m % i i s t r o p o p O f m t s r o t c w o e l e p r u s e t n c o x a i p r t m s l e a s m n i o t p p s o e R e s o c u e r - t l a G x d o n C e l 2 b . 7 e c e n r e r u e g f i e F r 2 0 7 ( A ) ( B l 8 5 - 7 5 - 0 . 0 3 0 0 4 0 0 - O p t i m a l M i x — 0 e 2 0 . 0 2 1 3 — — — - o e 3 0 . 0 0 0 0 c e 4 0 . 3 8 3 7 - — — - - — r e l 0 . 0 5 1 2 — - — - r e 3 0 . 0 5 1 2 — — r e s 0 . 1 4 3 7 - — — - r e 6 0 . 0 7 7 5 - - - - - - - r e 7 0 . 2 7 1 2 B a s e d o n t h e p r o t e o m i c s c o m p o s i t i o n a n d a c t i v i t y a s s a y a n a l y s i s , i t i s c l e a r t h a t C E 6 h a s s i g n i fi c a n t c e l l u l a s e a c t i v i t y b u t l a c k s s e v e r a l h e m i c e l l u l a s e s . S u p p l e m e n t a t i o n o f C E 6 w i t h R E 7 a n d C E 2 h e l p e d i n c r e a s e g l u c a n c o n v e r s i o n , w h i l e a d d i t i o n o f C E 4 a n d R E 7 s i g n i fi c a n t l y e n h a n c e d t h e x y l a n c o n v e r s i o n . R E 7 a n d C E 2 a r e r i c h i n e n d o x y l a n a s e s a n d a r a b i n o f u r a n o s i d a s e s ( G H 4 3 , 5 1 , 5 4 ) , r e s p e c t i v e l y ( T a b l e 7 . 2 ) ; w h i l e , C E 4 i s r i c h i n a r a b i n o f u r a n o s i d a s e s ( G H 4 3 , 5 1 , 5 4 , 6 2 ) a n d a - g l u c u r o n i d a s e s . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t r e m o v a l o f h e m i c e l l u l o s e e m b e d d e d w i t h i n c e l l w a l l s t h r o u g h a d d i t i o n o f s u i t a b l e e n d o x y l a n a s e s h e l p s e n h a n c e c e l l u l o s e a c c e s s i b i l i t y . H o w e v e r , i n o r d e r t o a c h i e v e h i g h e r x y l o s e y i e l d , i t b e c o m e s p e r t i n e n t t o h y d r o l y z e x y l a n s i d e - c h a i n s t h r o u g h a d d i t i o n o f s u i t a b l e a c c e s s o r y e n z y m e s ( i . e . a r a b i n o f u r a n o s i d a s e s , a - g l u c u r o n i d a s e s ) . 7 . 1 . 4 . 5 T e n - e n z y m e ( 1 0 c e - r e ) s i m p l w r c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l d e s i g n T a b l e V - 7 . 6 s u m m a r i z e s t h e e s t i m a t e d r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t s ( i n d e c r e a s i n g o r d e r o f m a g n i t u d e f o r e a c h c l a s s o f t e r m s ; s i n g l e - b i n a r y - t e m a r y ) f o r m o d e l s p r e d i c t i n g t h e g l u c a n / x y l a n c o n v e r s i o n a n d t o t a l s u g a r y i e l d a s a f u n c t i o n o f I e n z y m e m i x t u r e c o m p o s i t i o n . I t c a n b e i n f e r r e d t h a t R E 8 , C E 6 , C E 1 , C E 5 a n d R E 4 a f f e c t e d g l u c a n c o n v e r s i o n m o s t S i g n i fi c a n t l y ( b a s e d o n r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t f o r i n d i v i d u a l t e r m s ) . O n t h e o t h e r h a n d , C E 4 a n d C E 3 a f f e c t e d x y l a n c o n v e r s i o n m o s t s i g n i fi c a n t l y . W i t h i n t h e b i n a r y t e r m s p r e d i c t i n g g l u c a n c o n v e r s i o n , t h e t o p i n t e r a c t i o n t e r m s c o n t a i n e i t h e r o n e o f t h e c e l l u l a s e r i c h m i x t u r e s ( i . e . C E 6 , R E 4 , C E 1 , R E 8 ) ; w h e r e a s , b i n a r y t e r m s p r e d i c t i n g x y l a n c o n v e r s i o n a r e d o m i n a t e d b y R E 1 , C E 5 o r R E 7 . S i m i l a r t r e n d s c a n b e s e e n f o r t h e t e r n a r y t e r m s a s w e l l , w i t h R E 7 , C E 3 a n d C E 4 b e i n g t h e p r e d o m i n a n t c o n t r i b u t o r s t o m o s t s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s . A S b e f o r e , t h e e n z y m e c o m b i n a t i o n s t h a t 2 0 8 g a v e t h e h i g h e s t t o t a l s u g a r y i e l d s w e r e a n i n t e r m e d i a t e c o m b i n a t i o n o f t e r m s m a x i m i z i n g b o t h g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n . T h e c o m p o s i t i o n o f t h e o p t i m a l e n z y m e c o c k t a i l g i v i n g t h e h i g h e s t g l u c a n , x y l a n a n d t o t a l s u g a r y i e l d s a r e s h o w n i n F i g u r e s V - 7 . 3 A , V - 7 . 2 B a n d V - 7 . 2 C , r e s p e c t i v e l y , a s C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t s ( a s t e e p S l o p e o r c u r v a t u r e w i t h i n C o x - p l o t d u e t o c h a n g e i n i n p u t v a r i a b l e i n d i c a t e s a r e l a t i v e l y h i g h s e n s i t i v i t y o f r e s p o n s e ) . E a c h e n z y m e m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 1 6 . 5 m g / g g l u c a n o f v a r y i n g m i x t u r e r a t i o s o f c e l l u l a s e s , h e m i c e l l u l a s e s a n d o t h e r a c c e s s o r y e n z y m e s . F o r o p t i m a l g l u c a n c o n v e r s i o n ( 8 6 . 0 6 % ) , t h e 1 6 . 5 m g p r o t e i n m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 4 0 . 1 8 % C E 6 , 1 6 . 6 7 % R E 7 , 1 3 . 1 5 % C E 5 , 1 1 . 9 4 % R E 4 , 9 . 0 9 % C E 3 a n d 8 . 9 7 % R E 1 . F o r o p t i m a l x y l a n c o n v e r s i o n ( 8 5 . 2 9 % ) , t h e p r o t e i n m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 2 9 . 2 7 % C E 5 , 1 7 . 1 5 % C E 1 , 1 6 . 7 3 % R E 7 , 1 6 % C E 3 , 9 . 0 9 % R E 1 , 6 . 8 5 % R E 4 a n d 4 . 9 1 % C E 6 . T h e g l u c a n c o n v e r s i o n w a s f o u n d t o b e m o s t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t e d b y r e l a t i v e c h a n g e i n C B 6 , R E 7 a n d C E 3 b a s e d o n r e l a t i v e s t e e p n e s s o f C o x - t r a c e p l o t ( F i g u r e V - 7 . 3 - A ) , h o w e v e r , m a x i m u m r e s p o n s e w a s o n l y o b t a i n e d a t t h e r e f e r e n c e b l e n d c o m p o s i t i o n . O n e o f t h e m a j o r i s s u e s w i t h t h e 1 0 C E - R E e x p e r i m e n t s w a s t h e h i g h m u l t i c o l l i n e a r i t y b e t w e e n r e s p e c t i v e f a c t o r s . M u l t i c o l l i n e a r i t y i s a s t a t i s t i c a l p h e n o m e n o n i n w h i c h t w o o r m o r e v a r i a b l e s i n a m u l t i d i m e n s i o n a l m o d e l h a v e s i m i l a r e f f e c t s . T h i s m a y a f f e c t t h e e x t r a p o l a t i o n o f t h e r e s u l t s o b t a i n e d f r o m t h e m o d e l . M u l t i c o l l i n e a r i t y i s i n d i c a t e d b y h i g h V a r i a n c e I n fl a t i o n F a c t o r ( V I F ) v a l u e s . V I F v a l u e s g r e a t e r t h a n 5 w e r e o b s e r v e d f o r a n u m b e r o f t h e c o e f fi c i e n t s i n t h e 1 0 - e n z y m e a n d 8 - e n z y m e e x p e r i m e n t s , i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f m u l t i c o l l i n e a r i t y . M u l t i c o l l i n e a r i t y i n t h e m o d e l m a y h a v e b e e n d u e t o t h e f a c t t h a t s e v e r a l c o m m e r c i a l a n d r e s e a r c h e n z y m e s a t t a c k s i m i l a r s u b s t r a t e s 2 0 9 ( S e e T a b l e s 7 . 1 a n d 7 . 2 ) , b u t w i t h d i f f e r i n g e f f e c t i v e n e s s . T o i m p r o v e t h e p r e d i c t i v e a b i l i t i e s o f t h e m o d e l , a n o t h e r s e t o f e x p e r i m e n t s w a s d e s i g n e d ( S e e n e x t s e c t i o n ) b y u s i n g a d i v e r s e s e t o f t h e fi v e m o s t e f f e c t i v e e n z y m e s d e t e r m i n e d f r o m t h e p r e v i o u s t w o e x p e r i m e n t s . T h e e n z y m e s w e r e s e l e c t e d t o m i n i m i z e t h e o v e r l a p s i n t h e i r s u b s t r a t e s p e c i fi c i t y . 7 . 1 . 4 . 6 F i v e - e n z y m e ( 5 c e - r e ) s i m p l e x c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l d e s i g n T h e 5 C E - R E e x p e r i m e n t s w e r e s e t u p t o c o m p a r e t h e e f f e c t i v e n e s s o f t h r e e d i f f e r e n t c e l l u l a s e s i n c o m b i n a t i o n w i t h s u i t a b l e h e m i c e l l u l a s e s a n d a c c e s s o r y e n z y m e s . T h e 3 c e l l u l a s e s c h o s e n w e r e b a s e d o n t h e i r p e r f o r m a n c e i n t h e p r e v i o u s e x p e r i m e n t s ( S p e c i fi c a c t i v i t y o n A v i c e l a n d p e r f o r m a n c e i n 8 C E - R E a n d 1 0 C E - R E e x p e r i m e n t s ) ; n a m e l y , C E 1 , C E 6 a n d R E 4 . T a b l e 7 . 7 s u m m a r i z e s t h e e s t i m a t e d r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t s ( i n d e c r e a s i n g o r d e r o f m a g n i t u d e f o r e a c h c l a s s o f t e r m s ; s i n g l e - b i n a r y - t e m a r y ) f o r m o d e l s p r e d i c t i n g t h e g l u c a n / x y l a n c o n v e r s i o n a n d t o t a l s u g a r y i e l d a s a fi m c t i o n o f e n z y m e m i x t u r e c o m p o s i t i o n ( b a s e d o n C E 1 a s b a s e c e l l u l a s e ) . I t c a n b e i n f e r r e d t h a t C E 1 a n d C E 5 a f f e c t e d g l u c a n c o n v e r s i o n m o s t s i g n i fi c a n t l y ( b a s e d o n r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t f o r i n d i v i d u a l t e r m s ) . O n t h e o t h e r h a n d , C E 4 , R E 1 a n d R E 7 a f f e c t e d x y l a n c o n v e r s i o n m o s t s i g n i fi c a n t l y . W i t h i n t h e b i n a r y t e r m s p r e d i c t i n g g l u c a n c o n v e r s i o n , t h e t o p i n t e r a c t i o n t e r m s c o n t a i n C E 4 ; w h e r e a s , b i n a r y t e r m s p r e d i c t i n g x y l a n c o n v e r s i o n a r e d o m i n a t e d b y C E 4 , R E 1 a n d R E 7 . S i m i l a r t r e n d s c a n b e s e e n f o r t h e t e r n a r y t e r m s a s w e l l , w i t h R E 7 , C E 1 a n d C E 4 b e i n g t h e p r e d o m i n a n t c o n t r i b u t o r s t o m o s t s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s . 2 1 0 n t g a n / c u n i u l g o e m t a o r % e p r g g u n t m i x t i 5 c m . i 6 d e 1 e m r o y p z t ) l n s e a m u r e e d q e t u r s n c o y i f a t w o c l a n a r o e s i t t i n c i n g u n d i f e d s a a a s o b a l c ) e i m s b y s u a z c m o n e d i n l b a a t t y r h o g t a i f n o e i w b m y r u , e d s l g e g n k h i / s T r ( a . g s s m t u r n s e e m t m g i l r ( e d d l o e m i e p x e y d r r e o a s f g a s u b t s n ) e l I i a c t i o E f t f C e d s o n i c a n n x o l o i e i s C s s ( e r g e r e v E n R r - o c E d e n C t a a m i t s l 5 y x r o % f E n , o 7 i n . o t 7 i i s . s e r n l b e a o v c p n m u a o o l T c c g 2 1 1 R e g r e s s i o n T e r m s ( % G l u c a n c o n v e r s i o n ) R e g r e s s i o n T e r m s ( % X y l a n c o n v e r s i o n ) R e g r e s s i o n T e r m s ( T o t a l s u g a r y i e l d , g / k g ) " T e r m C o e f fi c i e n t P V I F T e r m C o e f fi c i e n t P V I F T e r m C o e f fi c i e n t P V I F c e l x 4 9 . 9 9 2 . 1 8 - 9 c e 4 3 9 . 3 2 2 3 . 2 0 3 c e l x 2 1 8 . 1 3 L W c e 5 2 7 . 8 3 1 . 8 0 9 r e 7 9 . 4 6 6 1 . 7 8 8 c e 4 1 7 4 . 1 8 3 . 2 0 3 r e l 2 1 . 7 2 . 1 8 9 c e l x 8 . 4 7 5 1 . 7 3 8 0 1 3 5 1 1 4 . 6 9 1 . 8 0 7 c e 4 1 9 . 6 8 2 . 6 1 6 r e l 7 . 9 1 6 1 . 7 3 8 r e l 1 0 8 . 7 1 . 8 0 7 r e 7 7 . 1 9 1 . 6 4 8 c e 5 3 . 3 3 7 * 1 . 7 8 8 r e 7 4 8 . 0 1 * ‘ l * * * * l - l - ‘ I - { i i - i l - 1 . 8 4 5 c e l x * c e 4 9 7 . 9 4 0 2 . 6 2 7 c e l x * c e 4 1 0 4 % ? 0 . 0 0 2 2 . 6 1 4 c e l x * c e 4 6 2 1 . 1 6 0 2 . 6 3 5 c e 4 * r e l 4 8 . 5 6 0 . 0 1 5 2 . 6 2 7 c e 4 * r e l 1 0 2 . 7 3 5 0 . 0 0 2 2 . 6 1 4 c e 4 * r e 1 4 2 7 . 7 3 0 . 0 0 5 2 . 6 3 5 c e 4 * c e 5 2 8 . 3 8 0 . 1 4 2 2 . 5 6 6 c e 4 * r e 7 9 6 . 0 0 1 0 . 0 0 4 2 . 6 3 2 c e 4 * c e 5 2 9 9 . 2 8 0 . 0 4 6 2 . 6 3 5 c e l x * r e 1 2 7 . 1 0 . 1 4 3 2 . 3 6 1 c e 4 * c e 5 7 8 . 1 4 3 0 . 0 1 9 2 . 6 3 2 c e 4 * r e 7 2 3 3 . 8 4 0 . 1 1 7 2 . 6 5 c e l x * c e 4 * r e 7 1 1 5 1 . 1 3 0 1 . 4 4 5 c e l x * c e 4 * r e 7 8 7 2 . 0 5 - 8 0 1 . 6 0 1 c e l x * c e 4 * r e 7 6 5 2 7 . 8 6 0 1 . 6 1 7 c e 4 * c e 5 * r e 7 6 6 6 . 4 3 0 1 . 4 4 6 c e l x * c e 4 “ ‘ r e 1 8 0 7 . 1 7 5 0 1 . 5 8 4 c e l x * c e 4 * r e l 4 4 6 9 . 7 7 0 1 . 6 0 2 c e l x * c e 4 * r e l 5 8 6 . 5 2 0 1 . 8 4 8 c e 4 * c e 5 * r e 1 6 4 9 . 6 8 7 0 . 0 0 1 1 . 6 0 1 c e 4 * c e 5 * r e 7 4 2 0 4 . 9 4 0 1 . 6 1 7 c e 4 * r e l * r e 7 4 9 0 . 9 5 0 1 . 4 4 5 c e 4 * c e 5 * r e 7 6 4 8 . 0 3 4 0 . 0 0 2 1 . 6 1 7 c e 4 * c e 5 * r e l 3 1 6 1 . 0 2 0 . 0 0 1 1 . 6 0 2 c e 4 * c e 5 * r e 1 4 0 5 . 3 9 0 . 0 0 1 1 . 6 0 1 c e l x * c e 4 * c e 5 5 2 4 . 9 7 3 0 . 0 0 9 1 . 6 0 1 c e 4 * r e 1 * r e 7 3 0 7 9 0 . 0 0 1 1 . 6 1 7 c c l x * c e 4 * c e 5 3 8 0 . 0 6 0 . 0 0 2 1 . 6 0 1 c e 4 * r e 1 * r e 7 4 9 8 . 8 2 0 . 0 1 3 1 . 6 0 1 c e l x * c e 4 * c e 5 2 7 5 4 . 2 3 0 . 0 0 3 1 . 6 0 2 c e l x * c e 5 * r e 7 3 3 3 . 4 7 0 . 0 0 2 1 . 3 2 1 c e 5 * r e 1 * r e 7 3 1 3 . 8 1 8 0 . 0 8 1 1 . 3 2 2 c e l x * c e 5 * r e 7 1 8 9 1 . 7 8 0 . 0 2 1 1 . 3 2 6 c e l x * r e 1 * r e 7 3 0 3 0 . 0 0 8 1 . 4 4 4 c e 1 x * c e 5 * r e 7 2 6 9 . 7 6 8 0 . 1 3 2 1 . 3 2 2 c e l x * r e 1 * r e 7 1 6 4 2 . 4 3 0 . 0 4 4 1 . 3 2 6 c e 5 * r e 1 * r e 7 1 7 8 . 1 2 0 . 0 9 6 1 . 3 2 1 c e 5 * r e 1 * r e 7 1 4 0 8 . 1 3 0 . 0 8 3 1 . 3 2 6 s = 9 . 7 8 6 2 3 P R E S S = 7 5 8 6 . 9 9 s = 5 . 8 2 6 3 6 P R E S S = 2 9 7 0 . 9 1 R - S q ( p r e d ) = 8 4 . 9 3 % R — S q ( a d j ) = 8 6 . 4 9 % s = 4 4 . 2 0 0 5 P R E S S = 1 6 3 7 1 7 R - S q ( p r e d ) = 8 9 . 0 1 % R - S q ( a d j ) = 9 1 . 0 8 % R - S q ( p r e d ) = 8 6 . 3 3 % R - S q ( a d j ) = 8 8 . 4 2 % 0 . . " 1 . 5 . 0 1 x 6 3 6 i 2 0 3 M 3 6 1 9 1 0 9 1 8 l a . 3 0 1 1 0 . . . . 0 0 0 0 e m r i x 0 e p e e e e u l t 4 5 1 7 . 0 t x i M O r r c c o ~ — — — < - l - a — - « m — — — — . i t p 5 . . 0 O - * - 5 0 t 2 r w e s n o p s e R s r a 0 . 1 5 . 0 g 0 . 0 5 . ' o - u S l a t o T 0 . . 1 - 0 ) 5 C 4 ( . 5 . 0 0 . 0 5 - - - 0 5 0 5 2 5 . . 0 2 1 2 F i g u r e 7 . 4 C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t s f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n ( A ) , % x y l a n c o n v e r s i o n ( B ) a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( C ) w i t h r e s p e c t t o r e f e r e n c e b l e n d a t o p t i m a l m i x t u r e c o m p o s i t i o n f o r 5 C E - R E e x p e r i m e n t s ( C e l x i s C E I ) . ( B ) X y l o s e R e s p o n s e w r t O p t i m a l M i x t u r e O p t i m a l M i x — G e l x 0 . 2 0 0 6 - — — - 0 8 4 0 . 4 2 4 2 ( 2 5 0 . 0 7 4 5 — - — r e 1 0 . 1 3 1 5 ~ < - - - r e 7 0 . 1 6 9 1 ( A ) G l u c o s e R e s p o n s e w r t O p t i m a l M i x t u r e O p t i m a l M i x — c e l x 0 . 3 9 3 9 7 5 - — — — — c e 4 0 . 3 2 7 9 c e 5 0 . 0 0 0 0 — - — r e 1 0 . 0 8 0 6 5 0 - - - - - r e 7 0 . 1 9 7 6 7 5 ~ 3 0 0 - 1 5 0 - N o t s u r p r i s i n g l y , t h e e n z y m e c o m b i n a t i o n s t h a t g a v e t h e h i g h e s t t o t a l s u g a r y i e l d s w e r e a g a i n a n i n t e r m e d i a t e c o m b i n a t i o n o f t e r m s m a x i m i z i n g b o t h g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n . T h e c o m p o s i t i o n o f t h e o p t i m a l e n z y m e c o c k t a i l g i v i n g t h e h i g h e s t g l u c a n , x y l a n a n d t o t a l s u g a r y i e l d s a r e s h o w n i n F i g u r e s 7 . 4 A , 7 . 4 B a n d 7 . 4 C , r e s p e c t i v e l y , a s C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t s . E a c h e n z y m e m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 1 6 . 5 m g / g g l u c a n o f v a r y i n g m i x t u r e r a t i o s o f c e l l u l a s e s , h e m i c e l l u l a s e s a n d a c c e s s o r y e n z y m e s . F o r o p t i m a l g l u c a n c o n v e r s i o n ( 8 4 . 0 6 % ) , t h e p r o t e i n m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 3 9 . 3 9 % C E 1 , 3 2 . 7 9 % C E 4 , 1 9 . 7 6 % R E 7 a n d 8 . 0 6 % R E 1 . F o r o p t i m a l x y l a n c o n v e r s i o n ( 8 2 . 3 % ) , t h e p r o t e i n m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 4 2 . 4 2 % C E 4 , 2 0 . 0 6 % C E 1 , 1 6 . 9 1 % R E 7 , 1 3 . 1 5 % R E 1 a n d 7 . 4 5 % C E 5 . T h e g l u c a n c o n v e r s i o n w a s f o u n d t o b e m o s t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t e d b y r e l a t i v e c h a n g e i n C B 1 , C E 4 a n d R E 7 b a s e d o n r e l a t i v e s t e e p n e s s o f C o x - t r a c e p l o t ( F i g u r e 7 . 4 - A ) , h o w e v e r , m a x i m u m r e s p o n s e w a s o n l y o b t a i n e d a t t h e r e f e r e n c e b l e n d c o m p o s i t i o n . T a b l e V - 7 . 8 s u m m a r i z e s t h e e s t i m a t e d r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t s ( i n d e c r e a s i n g o r d e r o f m a g n i t u d e f o r e a c h c l a s s o f t e r m s ; s i n g l e — b i n a r y - t e r n a r y ) f o r m o d e l s p r e d i c t i n g t h e g l u c a n / x y l a n c o n v e r s i o n a n d t o t a l s u g a r y i e l d a s a fi m c t i o n o f e n z y m e m i x t u r e c o m p o s i t i o n ( b a s e d o n C E 6 a s b a s e c e l l u l a s e ) . I t c a n b e i n f e r r e d t h a t R E 7 a f f e c t e d g l u c a n c o n v e r s i o n m o s t s t r i k i n g l y ( b a s e d o n r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t f o r i n d i v i d u a l a n d b i n a r y t e r m s ) . O n t h e o t h e r h a n d , C E 4 , R E 1 a n d R E 7 a f f e c t e d x y l a n c o n v e r s i o n m o s t s i g n i fi c a n t l y . T h e s e r e s u l t s a r e c o m p a r a b l e t o t h e 8 C E - R E e x p e r i m e n t s f u r t h e r v a l i d a t i n g p r e v i o u s r e s u l t s . T h e c o m p o s i t i o n o f t h e o p t i m a l e n z y m e c o c k t a i l g i v i n g t h e h i g h e s t g l u c a n , x y l a n a n d t o t a l s u g a r y i e l d s a r e s h o w n i n F i g u r e s V - 7 . 5 A , V - 7 . 5 B a n d V - 7 . 5 C , r e s p e c t i v e l y , a s C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t s . E a c h e n z y m e m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 1 6 . 5 2 1 3 m g / g g l u c a n o f v a r y i n g m i x t u r e r a t i o s o f c e l l u l a s e s , h e m i c e l l u l a s e s a n d a c c e s s o r y e n z y m e s . F o r o p t i m a l g l u c a n c o n v e r s i o n ( 7 7 . 3 % ) , t h e p r o t e i n m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 5 1 . 5 2 % C E 6 , 2 5 . 8 2 % R E 7 , 2 0 . 6 7 % C E 4 a n d 2 % R E 1 . F o r o p t i m a l x y l a n c o n v e r s i o n ( 8 0 . 2 4 % ) , t h e p r o t e i n m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 4 3 . 1 5 % C E 4 , 1 7 . 3 9 % C E 6 , 1 6 . 1 8 % R E 1 , 1 6 . 1 2 % R E 7 a n d 7 . 1 5 % C E 5 . T h e g l u c a n c o n v e r s i o n w a s f o u n d t o b e m o s t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t e d b y r e l a t i v e c h a n g e i n C E 6 , C E 4 a n d R E 7 b a s e d o n r e l a t i v e s t e e p n e s s o f C o x - t r a c e p l o t ( F i g u r e V - 7 . S - A ) , h o w e v e r , m a x i m u m r e s p o n s e w a s o n l y o b t a i n e d a t t h e r e f e r e n c e b l e n d c o m p o s i t i o n . T a b l e V - 7 . 9 s u m m a r i z e s t h e e s t i m a t e d r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t s ( i n d e c r e a s i n g o r d e r o f m a g n i t u d e f o r e a c h c l a s s o f t e r m s ; s i n g l e - b i n a r y - t e m a r y ) f o r m o d e l s p r e d i c t i n g t h e g l u c a n / x y l a n c o n v e r s i o n a n d t o t a l s u g a r y i e l d a s a f i m c t i o n o f e n z y m e m i x t u r e c o m p o s i t i o n ( b a s e d o n R E 4 a s b a s e c e l l u l a s e ) . I t c a n b e i n f e r r e d t h a t C E 4 a f f e c t e d g l u c a n c o n v e r s i o n m o s t s i g n i fi c a n t l y ( b a s e d o n r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t f o r i n d i v i d u a l a n d b i n a r y t e r m s ) . O n t h e o t h e r h a n d , C E 4 , R E 1 a n d R E 7 a f f e c t e d x y l a n c o n v e r s i o n m o s t s i g n i fi c a n t l y . T h e c o m p o s i t i o n o f t h e o p t i m a l e n z y m e c o c k t a i l g i v i n g t h e h i g h e s t g l u c a n , x y l a n a n d t o t a l s u g a r y i e l d s a r e s h o w n i n F i g u r e s V - 7 . 6 A , V - 7 . 6 B a n d V - 7 . 6 C , r e s p e c t i v e l y , a s C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t s . E a c h e n z y m e m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 1 6 . 5 m g / g g l u c a n o f v a r y i n g m i x t u r e r a t i o s o f c e l l u l a s e s , h e m i c e l l u l a s e s a n d a c c e s s o r y e n z y m e s . F o r o p t i m a l g l u c a n c o n v e r s i o n ( 8 3 . 8 3 % ) , t h e p r o t e i n m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 3 8 . 3 6 % R E 4 , 3 5 . 0 9 % C E 4 , 2 3 . 5 2 % R E 7 a n d 3 . 0 3 % R E 1 . F o r o p t i m a l x y l a n c o n v e r s i o n ( 7 9 . 5 4 % ) , t h e p r o t e i n m i x t u r e i s c o m p o s e d o f 4 1 . 8 8 % C E 4 , 1 6 . 7 3 % R E 7 , 1 6 . 1 8 % R E 4 , 1 5 . 0 3 % R E 1 a n d 1 0 . 1 8 % C E 5 . T h e g l u c a n c o n v e r s i o n w a s f o u n d t o b e m o s t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t e d b y r e l a t i v e c h a n g e i n R E 4 , C E 4 a n d R E 7 b a s e d o n r e l a t i v e 2 1 4 s t e e p n e s s o f C o x - t r a c e p l o t ( F i g u r e V - 7 . 6 - A ) , h o w e v e r , m a x i m u m r e s p o n s e w a s o n l y o b t a i n e d a t t h e r e f e r e n c e b l e n d c o m p o s i t i o n . B a s e d o n t h e p r o t e o m i c s c o m p o s i t i o n a n d a c t i v i t y a s s a y a n a l y s i s , i t i s c l e a r t h a t C E 1 h a s s i g n i fi c a n t c e l l u l a s e a c t i v i t y b u t l a c k s s e v e r a l h e m i c e l l u l a s e s . B a s e d o n t h e r e s p o n s e o f t h e o p t i m a l m i x t u r e s f o r a l l t h r e e s e t s o f 5 C E - R E e x p e r i m e n t s , C E 1 i n c o m b i n a t i o n w i t h o t h e r e n z y m e s g a v e t h e h i g h e s t g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n s . S u p p l e m e n t a t i o n o f C E 1 w i t h R E 7 a n d C E 4 h e l p e d i n c r e a s e g l u c a n c o n v e r s i o n , w h i l e a d d i t i o n o f C E 4 a n d R E 7 s i g n i fi c a n t l y e n h a n c e d t h e x y l a n c o n v e r s i o n . R E 7 i s r i c h i n e n d o x y l a n a s e s ( G H 1 0 ) a n d c e r t a i n a r a b i n o f u r a n o s i d a s e s ( G H 4 3 ) ( T a b l e 7 . 2 ) ; w h i l e , C E 4 i s r i c h i n B - x y l o s i d a s e , a r a b i n o f u r a n o s i d a s e s ( G H 4 3 , 5 1 , 5 4 , 6 2 ) a n d a - g l u c u r o n i d a s e s . C E 1 i s a b u n d a n t i n e x o / e n d o — c e l l u l a s e s b u t l a c k s i n B - x y l o s i d a s e , e n d o x y l a n a s e a n d a r a b i n o f u r a n o s i d a s e a c t i v i t i e s . T h e s e e x p e r i m e n t s a g a i n v a l i d a t e t h e h y p o t h e s i s t h a t r e m o v a l o f h e m i c e l l u l o s e e m b e d d e d w i t h i n c e l l w a l l s t h r o u g h a d d i t i o n o f s u i t a b l e h e m i c e l l u l a s e s h e l p s e n h a n c e c e l l u l o s e a c c e s s i b i l i t y [ 4 5 6 - 4 5 8 ] . H o w e v e r , i t b e c o m e s p e r t i n e n t t o h y d r o l y z e x y l a n s i d e - c h a i n s t h r o u g h a d d i t i o n o f s u i t a b l e a c c e s s o r y e n z y m e s ( i . e . a r a b i n o f u r a n o s i d a s e s , a - g l u c u r o n i d a s e s ) , p o s s i b l y a v o i d i n g e n d - p r o d u c t i n h i b i t i o n [ 4 5 6 , 4 5 9 ] . 7 . 1 . 4 . 7 P r o t e i n c o m p o s i t i o n a n d h y d r o l y t i c p e r f o r m a n c e c o r r e l a t i o n s D e s p i t e t h e t r e m e n d o u s a d v a n t a g e a s s o c i a t e d w i t h o p t i m i z i n g h y d r o l y t i c p e r f o r m a n c e o f c r u d e e n z y m e m i x t u r e s t h r o u g h m i x t u r e o p t i m i z a t i o n s t u d i e s ( b y v a r y i n g t o t a l p r o t e i n l o a d i n g s ) , t h e r e i s a s i g n i fi c a n t l a c k o f f u n d a m e n t a l u n d e r s t a n d i n g o n t h e t r u e n a t u r e o f e n z y m e s y n e r g y t h a t r e s u l t s i n a n o p t i m u m e n z y m e c o c k t a i l . I t w o u l d b e i m p o r t a n t t o d e t e r m i n e w h i c h i n d i v i d u a l e n z y m e f a m i l i e s a r e t r u l y r e s p o n s i b l e f o r t h e s y n e r g i s t i c 2 1 5 i m p r o v e m e n t s e e n i n t h e a c t i v i t y o f o p t i m a l c o c k t a i l s . I t w o u l d a l s o b e i n t e r e s t i n g t o u s e t h e p r o t e o m i c s c o m p o s i t i o n a l d a t a ( T a b l e 7 . 2 ) t o d e t e r m i n e c o r r e l a t i o n s w i t h h y d r o l y t i c p e r f o r m a n c e ( 8 / 1 0 / 5 - C E / R E e x p e r i m e n t a l d a t a s e t ; T a b l e V - 7 . 1 5 ) o n p r e t r e a t e d c o m s t o v e r . T h e p r o t e i n c o m p o s i t i o n o f e a c h e n z y m e m i x t u r e c o c k t a i l t e s t e d w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e t h e o r e t i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e 1 4 c r u d e e n z y m e s ( b a s e d o n 5 6 i n d i v i d u a l c o m p o n e n t s a s l i s t e d i n T a b l e 7 . 2 ) . A l l c e l l u l o l y t i c , h e m i c e l l u l o l y t i c , o t h e r a c c e s s o r y ( e . g . S w o l l e n i n ) a n d p e c t i n d e g r a d i n g e n z y m e s w e r e i n c l u d e d i n t h i s l i s t . A l l n o n - h y d r o l y t i c p r o t e i n s ( e . g . p r o t e a s e s ) w e r e c l u b b e d t o g e t h e r i n t h e “ O T H E R S ” c a t e g o r y . T h e t o t a l n u m b e r o f t e s t e d m i x t u r e s ( 7 5 5 u n i q u e c o m b i n a t i o n s ) o f t h e 1 4 c r u d e e n z y m e s ( t o t a l p r o t e i n l o a d i n g i n a l l c a s e s = 1 6 . 5 m g e n z y m e / g g l u c a n ) , r e s u l t e d i n a 7 5 5 x 5 6 l a r g e m a t r i x i n p u t p a r a m e t e r d a t a s e t . B i v a r i a t e c o r r e l a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t f o r e a c h o f t h e 5 6 i n p u t v a r i a b l e s w i t h r e s p e c t t o t h e t h r e e r e s p o n s e s ( % g l u c a n / x y l a n c o n v e r s i o n , t o t a l s u g a r y i e l d ) t o d e t e r m i n e P e a r s o n c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s , P C C , ( T a b l e V - 7 . 1 0 ) a n d t h e i r t e s t o f s i g n i fi c a n c e ( p < 0 . 0 5 ) . O n e o f t h e m a j o r c o n c e r n s w i t h b i v a r i a t e c o r r e l a t i o n s b e t w e e n r e s p o n s e a n d i n p u t v a r i a b l e s i s t h e a s s u m p t i o n o f l i n e a r d e p e n d e n c e . H o w e v e r , t h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n h y d r o l y t i c p e r f o r m a n c e a n d a m o u n t o f e n z y m e l o a d e d i s m o s t l i k e l y t o b e n o n - l i n e a r , f u r t h e r c o n f o u n d e d b y t h e s y n e r g i s t i c a c t i o n o f e n z y m e s . N e v e r t h e l e s s , t h e b i v a r i a t e P e a r s o n c o r r e l a t i o n c o e f fi c i e n t s ( P C C ) b r i n g s s e v e r a l i n t e r e s t i n g f a c t s t o l i g h t . F i r s t l y , t h e r e s e e m s t o b e a v e r y s i g n i fi c a n t ‘ o p p o r t u n i t y c o s t ’ a s s o c i a t e d w i t h i n d i v i d u a l e n z y m e s t h a t m a x i m i z e g l u c a n v s . x y l a n c o n v e r s i o n . T h a t i s , i n d i v i d u a l e n z y m e s t h a t m a x i m i z e o n l y x y l a n c o n v e r s i o n h a v e a n e g a t i v e P e a r s o n c o e f fi c i e n t ( u p o n i n c r e a s i n g t h e a m o u n t a d d e d ) a s c o m p a r e d t o e n z y m e s t h a t m a x i m i z e 2 1 6 b o t h g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n . T h e r e f o r e , i t w o u l d b e a l s o u s e f u l t o e x a m i n e t h e P e a r s o n c o e f fi c i e n t s f o r t o t a l s u g a r y i e l d t h a t w o u l d b e m a x i m i z e d b y e n h a n c i n g b o t h g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n s . I n d i v i d u a l e n z y m e s / p r o t e i n s t h a t g i v e a l i n e a r r e l a t i o n s h i p w i t h r e s p e c t t o t o t a l s u g a r y i e l d , b a s e d o n a p o s i t i v e P e a r s o n c o e f fi c i e n t , i n c l u d e ; A X E 1 , A X E 2 , C I P 2 , S W O , B G 3 , B X 3 , E G 2 , B M , B G A L 2 , C B H 2 , E G 1 , E G 3 , A M Y , C H I 1 , P G L a n d E G 7 . H o w e v e r , d u e t o s i g n i fi c a n t c o r r e l a t i o n b e t w e e n c e r t a i n e n z y m e c o m p o n e n t s ( S e e T a b l e V - 7 . 1 1 ) , t h e t r u l y S i g n i fi c a n t e n z y m e s a r e p a r t l y c o n f o u n d e d i n t h e b i v a r i a t e a n a l y s i s . F o r e x a m p l e , A X E I h a s a f a i r l y l i n e a r c o r r e l a t i o n w i t h A C / C I P 1 / C I P 2 / B G A L 2 / X G / B X 3 / A G L U C / E G 7 / A X E I I ( P C C = 0 . 6 - 0 . 9 ) . W h i l e , A X E I I h a s a s t r o n g c o r r e l a t i o n w i t h B G A L 2 ( P C C = 0 . 8 8 ) , E G 7 ( F C C = 0 . 7 6 ) , A X E I ( P C C = 0 . 7 ) , X G ( P C C = 0 . 6 6 ) a n d C I P 2 ( P C C = 0 . 6 5 ) . B G 3 h a s a s t r o n g c o r r e l a t i o n w i t h E G 7 ( F C C = 0 . 6 8 ) a n d A X E I I ( F C C = 0 . 5 7 ) . I n o r d e r t o h e l p r e s o l v e t h i s i s s u e , t h e d a t a s e t ( N = 7 5 5 ) w a s S p l i t i n t o t h e b o t t o m a n d t o p 2 5 % q u a r t i l e , b a s e d o n t h e r e s p o n s e v a r i a b l e s ( i . e . % g l u c a n / x y l a n c o n v e r s i o n , t o t a l s u g a r y i e l d ) . T h e i d e a b e h i n d t h i s s p l i t w a s t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e b e t t e r ( t o p 2 5 % q u a r t i l e ) v s . p o o r e r ( b o t t o m 2 5 % q u a r t i l e ) p e r f o r m i n g e n z y m e c o c k t a i l s . F o r e x a m p l e , t h e b o t t o m 2 5 % b a s e d o n t o t a l s u g a r y i e l d w e r e a l l e n z y m e m i x t u r e s t h a t y i e l d e d u n d e r 2 8 7 g r n s t o t a l s u g a r / k g b i o m a s s ( < 4 0 % t o t a l s u g a r y i e l d ) ; w h i l e t h e t o p 2 5 % w e r e b a s e d o n t o t a l s u g a r y i e l d w e r e a l l e n z y m e m i x t u r e s t h a t y i e l d e d o v e r 4 3 4 g r n s t o t a l s u g a r / k g b i o m a s s ( > 7 0 % t o t a l s u g a r y i e l d ) . O n e - w a y A N O V A ’ S w e r e c a r r i e d o u t t o c o m p a r e t h e s e t w o d a t a s e t s a n d t h e r e s u l t s a r e l i s t e d i n T a b l e V — 7 . 1 2 . S t a t i s t i c a l m e a n a n d s t a n d a r d d e v i a t i o n s f o r t h e i n d i v i d u a l e n z y m e c o m p o n e n t s f o r b o t h d a t a s e t s w e r e a l s o c o m p u t e d ( T a b l e 7 . 1 3 - A , 7 . 1 3 - B , V - 7 . 1 3 - C ) . 2 1 7 2 1 8 T a b l e 7 . 1 3 - A D e s c r i p t i v e s t a t i s t i c s ( m i n i m a , m a x i m a , m e a n , s t a n d a r d d e v i a t i o n ) c o m p a r i n g t o p a n d b o t t o m 2 5 % q u a r t i l e g r o u p s f o r i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o n e n t s , b a s e d o n v a r y i n g % g l u c a n c o n v e r s i o n . V a l u e s h i g h l i g h t e d i n b o l d s i g n i j y s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e a t p < 0 . 0 5 l e v e l ( b a s e d o n T a b l e 7 . 1 2 ) , w h e r e a s v a l u e s h i g h l i g h t e d i n r e d s i g n i f y i n c r e a s e i n c o r r e s p o n d i n g p r o t e i n c o m p o n e n t i n t o p 2 5 % q u a r t i l e w i t h r e s p e c t t o b o t t o m q u a r t i l e . D e s c r i p t i v e S t a t i s t i c s ( % g l u c a n c o n v e r s i o n ) l B o t t o m 2 5 % ( N = 1 8 5 ) T o p 2 5 % ( N = 1 9 1 ) M a x i m u m M e a n S t d . D e v i a t i o n l M i n i m u m M a x i m u m M e a n S t d . 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M 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 3 4 1 1 1 1 6 . 1 ( ) 8 m s 8 c % % % % % % i 1 u % % % % % % % % % % % % % % 4 5 1 2 9 6 % t 9 4 m 9 9 7 9 0 0 6 4 0 8 2 7 s = i 6 4 2 0 9 3 8 3 8 0 7 2 2 8 i . . 3 . . . . 7 4 3 0 1 9 8 t . N x 4 5 9 1 9 0 . . . . . . . . . . . . . . a 2 8 9 3 0 3 0 3 0 0 1 1 1 1 1 ( 3 a 1 1 2 4 2 t S e M % v m 5 i 2 u t % p m m 3 i o r t i 0 0 0 3 c n . t 0 s i e o D B M l 6 1 0 7 6 1 L 1 2 5 2 3 C Y O e Y 1 1 L L 3 H 1 M A N 1 A G R H X C G X M G A G B A A A H H H F H H A G m G A C G C G A G C B E E E E P E G G M B A M 1 1 2 2 2 T a b l e 7 . 1 3 - B C o n t d . . . O O O O O O O O O O O O O O O O O 2 2 3 T a b l e 7 . 1 3 — B C o n t d . . . D e s c r i p t i v e S t a t i s t i c s ( % x y l a n c o n v e r s i o n ) B o t t o m 2 5 % ( N = 1 8 8 ) T o p 2 5 % ( N = 1 9 0 ) E n g i n e M i n m u m . M a x i m u m M e a n S t d . D e v i a t i o n M i n i m u m M a x i m u m M e a n S t d . D e v i a t i o n % I n c r e a s e . — A B F l 1 . 4 8 % 0 . 1 5 % 0 . 3 2 % 0 % 1 . 2 0 % 0 . 4 1 % 0 . 3 2 % 1 7 9 % A B G A L 2 . 0 4 % 0 . 5 5 % 0 . 4 7 % 0 % 1 % 0 . 5 6 % 0 . 2 6 % 2 % A B F 2 2 . 6 6 % 0 . 4 6 % 0 . 6 1 % 0 % 3 . 3 1 % 1 . 0 9 % 0 . 6 4 % 1 3 7 % C H 5 5 0 . 5 5 % 0 . 0 8 % 0 . 1 3 % 0 % 0 . 4 2 % 0 . 1 6 % 0 . 1 2 % 1 1 4 % E C 4 3 . 3 8 % 0 . 7 0 % 0 . 6 8 % 0 . 0 8 % 1 . 6 8 % 0 . 5 2 % 0 . 3 7 % - 2 5 % E C 7 0 . 4 6 % 0 . 1 6 % 0 . 1 0 % 0 . 0 0 % 0 . 2 8 % 0 . 1 8 % 0 . 0 8 % 1 7 % A B F 3 1 . 3 9 % 0 . 4 5 % 0 . 3 3 % 0 . 3 7 % 1 . 8 1 % 0 . 7 3 % 0 . 2 7 % 6 3 % G H 6 5 0 . 1 3 % 0 . 0 1 % 0 . 0 3 % 0 % 0 % 0 . 0 5 % 0 . 0 4 % 2 8 5 % A G L U C 3 . 3 4 % 0 . 6 7 % 0 . 7 0 % 0 . 0 0 % 2 . 0 6 % 0 . 7 5 % 0 . 3 9 % 1 3 % G H 7 1 0 . 0 5 % 0 . 0 0 % 0 . 0 1 % 0 % 0 % 0 . 0 1 % 0 . 0 1 % 3 8 3 % G T 2 . 7 4 % 0 . 4 5 % 0 . 5 6 % 0 % 1 . 1 1 % 0 . 3 7 % 0 . 2 7 % - 1 7 % X G 1 6 . 6 6 % 4 . 7 2 % 3 . 1 1 % 1 . 7 2 % 1 3 . 4 4 % 5 . 8 4 % 2 . 5 5 % 2 4 % A M A N 0 . 0 3 % 0 . 0 0 % 0 . 0 1 % 0 % 0 % 0 . 0 1 % 0 . 0 1 % 3 8 3 % B G L U C 0 . 2 7 % 0 . 0 2 % 0 . 0 6 % 0 % 0 % 0 . 0 9 % 0 . 0 7 % 3 8 3 % C H 8 1 0 . 0 5 % 0 . 0 0 % 0 . 0 1 % 0 % 0 % 0 . 0 1 % 0 . 0 1 % 3 8 3 % A M A N O 2 0 . 6 6 % 0 . 0 6 % 0 . 1 1 % 0 % 0 . 3 0 % 0 . 0 8 % 0 . 0 6 % 3 0 % O T H E R S 2 . 0 3 % 6 9 . 5 0 % 1 9 . 2 7 % 1 3 . 3 8 % 2 . 5 4 % 3 2 . 1 5 % 1 6 . 4 9 % 6 . 4 6 % - 1 4 % O O O O O O O O O O O O O O O O C o m p a r i s o n o f t h e A N O V A r e s u l t s a n d s t a t i s t i c a l d e s c r i p t i v e s f o r t h e t o p v s . b o t t o m 2 5 % p e r f o r m i n g e n z y m e c o c k t a i l s a l o n g w i t h t h e b i v a r i a t e c o r r e l a t i o n s h e l p e d r e v e a l i n t e r e s t i n g fi n d i n g s . U p o n c l o s e r i n s p e c t i o n o f t h e c a s e f o r t o t a l s u g a r y i e l d , t h e A N O V A a n a l y s i s r e v e a l e d a s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e ( p < 0 . 0 5 ) i n t h e p r o t e i n c o m p o s i t i o n o f t h e b o t t o m v s . t o p 2 5 % q u a r t i l e f o r A C , A X E I , A X E H , C I P 2 , s w o , B G 1 , B M A N O , B G 3 , B O 2 , B M , B G A L 2 , C B H 2 , G H 6 , E G l , E X 2 , E G 3 , A M Y , G A M Y , G H 1 6 , G H 1 7 , C H I 1 , C H I 2 , A G A L , P G L , E G 5 , A M A N O 1 , A B G A L , A B F 2 , E G 4 , E G 7 , A G L U C , G T , A M A N O 2 a n d O T H E R S . T h e s t a t i s t i c a l d e s c r i p t i v e s ( i . e . m e a n , s t a n d a r d d e v i a t i o n ) f r o m T a b l e V - 7 . 1 3 - C r e v e a l s t h e f o l l o w i n g p e r c e n t i n c r e a s e i n p r o t e i n c o m p o s i t i o n f o r t h e t o p 2 5 % v s . b o t t o m 2 5 % q u a r t i l e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a n d O T H E R S ( - 1 5 % ) . H o w e v e r , i n d i v i d u a l e n z y m e s / p r o t e i n s t h a t g i v e a l i n e a r r e l a t i o n s h i p w i t h r e s p e c t t o t o t a l s u g a r y i e l d , b a s e d o n a p o s i t i v e P e a r s o n c o e f fi c i e n t ( T a b l e V - 7 . 1 0 ) , i n c l u d e ; A X E 1 , A X E 2 , C I P 2 , S W O , B G 3 , B _ X _ 3 _ , E G 2 , B M , B G A L 2 , C B H 2 , E G 1 , E G 3 , A M Y , C H I 1 , P G L a n d E G 7 . E x c e p t B X 3 , t h e r e w a s a s i g n i fi c a n t % i n c r e a s e ( r a n g i n g b e t w e e n 1 0 - 1 4 1 % ) i n t h e p r o t e i n c o m p o s i t i o n f o r a l l o t h e r p r o t e i n s / e n z y m e s . T h e r e a r e t w o p o s s i b l e w a y s t o i n t e r p r e t t h e s e fi n d i n g s ; ( 1 ) t h e p r o t e i n s t h a t a r e p r e s e n t i n s i g n i fi c a n t l y ( p < 0 . 0 5 ) h i g h e r a m o u n t s ( p o s i t i v e % i n c r e a s e ) i n t h e t o p 2 5 % 2 2 4 q u a r t i l e c o m p a r e d t o t h e b o t t o m 2 5 % q u a r t i l e a r e c r i t i c a l t o e n h a n c i n g t h e o v e r a l l g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n , ( 2 ) p r o t e i n s t h a t d o n o t c h a n g e s i g n i fi c a n t l y o r d r o p i n a b s o l u t e c o m p o s i t i o n f o r t h e t o p 2 5 % v s . t h e b o t t o m 2 5 % q u a r t i l e e i t h e r h a v e l i t t l e e f f e c t o n e n h a n c i n g t h e o v e r a l l h y d r o l y s i s y i e l d o r a r e a l r e a d y p r e s e n t i n s u f fi c i e n t a m o u n t s t o h y d r o l y z e t h e p r e t r e a t e d c e l l w a l l . B a s e d o n ( 1 ) t h e e n z y m e s / p r o t e i n s t h a t i n c r e a s e s i g n i fi c a n t l y i n t h e t o p 2 5 % q u a r t i l e i n c l u d e A X E 1 , A X E 2 , C I P 2 , S W O , B G 3 , E G 2 , B M , B G A L 2 , C B H 2 , E G 1 , E G 3 , A M Y , C H I 1 , P G L a n d E G 7 . B a s e d o n ( 2 ) , t h e r e m a i n i n g e n z y m e s e i t h e r d o n o t c h a n g e s i g n i fi c a n t l y o r d e c r e a s e i n a b s o l u t e c o m p o s i t i o n w i t h r e s p e c t t o t h e b o t t o m 2 5 % q u a r t i l e . A n o t h e r w a y t o r e fl e c t t h i s w o u l d b e t o a c t u a l l y c o m p a r e t h e t o p 5 % q u a r t i l e e n z y m e c o c k t a i l s ( t h a t r e s u l t i n > 8 4 % g l u c a n , > 7 7 % x y l a n a n d > 5 0 8 g m s u g a r / k g b i o m a s s t o t a l s u g a r y i e l d ) p r o t e i n c o m p o s i t i o n t o a t y p i c a l c o m m e r c i a l e n z y m e b l e n d s t h a t g i v e s i g n i fi c a n t l y l o w e r c o n v e r s i o n s a t e q u i v a l e n t p r o t e i n l o a d i n g s ( e . g . C E 1 a n d C E 4 ) . F i g u r e s 7 . 7 c o m p a r e s t h e p r o t e i n c o m p o s i t i o n s o f c o m m e r c i a l e n z y m e s ( C E 1 a n d C E 4 ) w i t h r e s p e c t t o c o c k t a i l s o f t o p 5 % q u a r t i l e ( N = 3 7 o u t o f 7 5 5 t o t a l m i x t u r e s ) b a s e d o n g l u c a n ( F i g u r e V - 7 . 7 - A I B ) , x y l a n ( F i g u r e V - 7 . 7 - C / D ) a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( F i g u r e 7 . 7 - E / F ) . C o m p a r e d t o C E 1 , t h e t o p 5 % c o c k t a i l s c o n t a i n e d a s i g n i fi c a n t l y l o w e r a m o u n t o f a c e t y l x y l a n e s t e r a s e s ( A C + A X E 1 + A X E 2 ) , c e l l o b i o h y d r o l a s e s ( C B H l + C B H 2 ) , x y l o g l u c a n a s e , e n d o g l u c a n a s e s ( E G l + E G 2 + E G 3 + E G 4 + E G 5 + E G 7 ) , a - g l u c u r o n i d a s e ( A G L U C ) , B - x y l o s i d a s e ( B X 3 ) , C i p p r o t e i n s ( C I P 1 + C I P 2 ) , B - m a n n a s e ( B M ) , s w o l l e n i n ( S W O ) , B - g a l a c t o s i d a s e ( B G A L 1 ) , c h i t i n a s e s ( C H I 1 + C H I 2 ) a n d G H 3 0 ( S e e T a b l e V - 7 . 1 4 f o r q u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n s ) . 2 2 5 0 . 1 5 . 0 2 2 6 F i g u r e 7 . 7 - ( E / F ) C o m p a r i n g p r o t e i n c o m p o s i t i o n o f c o m m e r c i a l e n z y m e ( C E 1 ) t o a v e r a g e c o m p o s i t i o n o f t o p 5 % m i x t u r e s ( N = 3 7 ) , b a s e d o n % t o t a l s u g a r y i e l d . 1 . 5 ( E ) I S p e z y m e C P ( c e 1 ) [ : 1 T S , t o p 5 % 0 . 0 8 5 8 V 1 5 ) D V Z ’ I V D fl ’ I V D V E I W J ’ I d 7 9 3 1 I : I E I V I O N V W V I I H Z ) 3 3 : 1 8 9 9 H f ) Z T H C ) E t h l 9 H 9 0 9 H i ) Z O N V W V 3 1 1 1 9 8 S 9 H 5 ) [ 8 H i ) N V W V I L H D S 9 5 1 I E I X V 3 V Z S I X V H H V O N V W H L S E ] E I V H H ) F ( 5 0 5 0 5 0 2 2 1 1 . . . d t n o C ) F / E ( - 7 . 7 e r u g i F S U C H - 1 . 1 . 0 I H 8 3 8 3 8 Z H 8 3 3 X Z X E ! I { ) 3 Z 3 8 I X 8 A W V D ' I D J A W V O M S 5 X 8 5 { ) 8 Z J 1 3 9 I H f ) W 8 I " I V D 8 I ( 1 1 3 Z 8 8 V L I H f ) I 3 8 A . . . — 4 ( D 0 v 9 . . 0 : ( D i n E a N H O n g m r 1 3 1 - 4 I D ' I V D fl V 3 0 ’ I D V 2 2 7 O n t h e o t h e r h a n d , t h e t o p 5 % c o c k t a i l s h a d s i g n i fi c a n t a m o u n t s o f e n d o x y l a n a s e s ( E X 1 + E X 2 ) , B — g l u c o s i d a s e ( B G 3 ) , a m y l a s e s ( A M Y ) , p o l y g a l a c t u r o n a s e s ( P G L ) a n d a - g a l a c t o s i d a s e ( A G A L ) c o m p a r e d t o C E 1 . O t h e r e n z y m e s / p r o t e i n s t h a t w e r e p r e s e n t i n t h e t o p 5 % c o c k t a i l s , b u t w e r e c o m p l e t e l y a b s e n t f r o m C E 1 , i n c l u d e d t h e r e m a i n i n g o f t h e t o t a l 5 6 e n z y m e s f r o m T a b l e 7 . 2 . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t m e d i u m A F E X p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y s t o v e r r e q u i r e s s e v e r a l a c c e s s o r y e n z y m e s t o m a x i m i z e g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n . T h i s m a n d a t e s f u r t h e r e x p e r i m e n t s f o r h i g h e r A F E X p r e t r e a t m e n t s e v e r i t i e s t o f u r t h e r m i n i m i z e t o t a l p r o t e i n l o a d i n g a n d t y p e o f a c c e s s o r y e n z y m e s r e q u i r e d t o a c h i e v e t h a t l o a d i n g . I n t e r e s t i n g l y , t h e c r u d e e n z y m e t h a t h a d t h e h i g h e s t o a t s p e l t x y l a n a s e a c t i v i t y ( R E 5 ) w a s n o t a l w a y s s e e n i n t h e o p t i m u m e n z y m e m i x t u r e s . T h i s r e s u l t i s n o t s u r p r i s i n g a s i t h a s b e e n s e e n b e f o r e t h a t t h e r e i s a p o o r c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e h y d r o l y t i c e f fi c i e n c y o f e n z y m e s o n l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s a n d m o d e l s u b s t r a t e s l i k e a v i c e l a n d o a t s p e l t x y l a n [ 3 8 5 ] . 7 . 1 . 4 . 8 R o l e o f e n z y m e s y n e r g y f o r c e l l u l o s i c b i o r e fi n e r i e s T o i l l u s t r a t e t h e p o t e n t i a l e c o n o m i c a d v a n t a g e s o f e x p l o i t i n g e n z y m e s y n e r g y , a c o n v e n t i o n a l e n z y m e b l e n d w a s c o m p a r e d a g a i n s t a n u m b e r o f e n z y m e c o c k t a i l s a t e q u i v a l e n t p r o t e i n l o a d i n g s ( F i g u r e 7 . 8 ) . I t i s i m p o r t a n t t o n o t e f r o m F i g u r e 7 . 8 t h a t t h e t h e o r e t i c a l s u g a r r e l e a s e f r o m t h e o p t i m u m e n z y m e b l e n d ( m i x t u r e o f 7 c r u d e e n z y m e s ) i s v e r y c l o s e t o t h e t h e o r e t i c a l m a x i m u m ( 9 0 % t o t a l s u g a r y i e l d ) , c o m p a r e d t o a c o n v e n t i o n a l e n z y m e b l e n d s ( C E 6 + C E 2 ) a t e q u i v a l e n t p r o t e i n l o a d i n g ( 4 0 % t o t a l s u g a r y i e l d ) . 2 2 8 e s o c u l g l l a r e v o ) n s o + 7 / 6 6 / s / 4 ) a n a c m o u i l g b g t / h g g m i 5 e . . w 5 / / 2 3 / e 1 c e r 6 r / 6 1 e v y f o t r o s d g n n r g i o d c k a o d r l e e t n a i e e r p r t t a o n g r u p u t s l h a g 4 e c + 7 / 5 e r 6 / t 5 o i s t e m w d g y / 1 e e r x d ; fi e o t t s a ( t o c l n e o p y i s X t e i r + s h ) o ) s t e p i m w s s s o o c , c s a a m d m o e l u o i e c + 1 e r 6 / 4 r e i i b l u y t G b x ( ) i r y y r a r d m b m d e p u g m o g k y k m / t z / n i n e e / m m g e x g ( f r g a ( o d ( t M d l c e l e e s f o f l e y l e i a i Y c Y x i g n d t i n e r a r a o ) p e r m a h o b T C m o 8 t e e s s o o c l u y l X G I I . J 7 t o b e / r e u u 0 0 0 0 0 0 g l 5 2 1 i b F ( c + 7 e r 6 / 2 e c 2 2 9 4 0 0 3 0 0 A d d i t i o n a l l y , t h e o p t i m a l e n z y m e c o c k t a i l o b t a i n e d t h r o u g h c u r r e n t o p t i m i z a t i o n s t u d i e s a c h i e v e d s u b s t a n t i a l l y h i g h e r g l u c a n ( > 9 0 % ) a n d x y l a n ( > 9 0 % ) c o n v e r s i o n s t h a n c o n v e n t i o n a l e n z y m e c o c k t a i l s a t d o u b l e t h e t o t a l e n z y m e l o a d i n g ( 6 2 % g l u c a n a n d 3 9 % x y l a n c o n v e r s i o n s f o r 1 6 . 5 m g C E 1 + 1 6 . 5 m g R E 2 p e r g m g l u c a n ) . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t s y n e r g i s t i c e n z y m e c o c k t a i l s c a n h e l p s u b s t a n t i a l l y r e d u c e e n z y m e u s a g e w h i l e i n c r e a s i n g t h e i r s p e c i fi c a c t i v i t y t o r e d u c e o v e r a l l c o s t o f p r o d u c i n g c e l l u l o s i c e t h a n o l . 7 . 1 . 5 C o n c l u s i o n s A s y s t e m a t i c m e t h o d o l o g y w a s d e v e l o p e d t o s u b s t a n t i a l l y r e d u c e e n z y m e u s a g e a n d i n c r e a s e s p e c i fi c a c t i v i t y o f c r u d e e n z y m e m i x t u r e s o n A F E X p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s . I t w a s d e m o n s t r a t e d t h a t s i m p l e x - c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l d e s i g n s c a n b e a p p l i e d t o d e v e l o p s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t m o d e l s o f c e l l u l o l y t i c - h e m i c e l l u l o l y t i c e n z y m e s y n e r g y f o r fi x e d t o t a l p r o t e i n l o a d i n g s . T h e m o d e l s g e n e r a t e d i n t h i s s t u d y d e m o n s t r a t e d s t r o n g s y n e r g i s m s b e t w e e n c e l l u l a s e s a n d e n d o x y l a n a s e s t o m a x i m i z e b o t h c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e h y d r o l y s i s . T h e r e w a s s i g n i fi c a n t s y n e r g y b e t w e e n e n d o x y l a n a s e s a n d o t h e r d e b r a n c h i n g e n z y m e s ( e . g . B - x y l o s i d a s e , a r a b i n o f u r a n o s i d a s e , a c e t y l x y l a n e s t e r a s e s e t c ) t h a t r e s u l t i n m a x i m i z i n g h e m i c e l l u l o s e h y d r o l y s i s f o r A F E X - t r e a t e d c o r n s t o v e r . O p t i m i z e d e n z y m e c o c k t a i l s a t a fi x e d p r o t e i n l o a d i n g o f 1 6 . 5 m g p r o t e i n / g g l u c a n h a d s i g n i fi c a n t l y h i g h e r g l u c a n ( 9 0 % ) a n d x y l a n ( 9 0 % ) c o n v e r s i o n s t h a n c o n v e n t i o n a l . c e l l u l a s e c o c k t a i l s a t e q u i v a l e n t o r h i g h e r p r o t e i n l o a d i n g s ( e . g . C E 1 + R E 2 g a v e 6 2 % g l u c a n a n d 3 9 % x y l a n c o n v e r s i o n s a t 3 3 m g / g g l u c a n l o a d i n g ) . I n t e r e s t i n g l y , c e l l u l o s e i s h y d r o l y z e d m o r e e f fi c i e n t l y f o r fi x e d - p r o t e i n l o a d i n g m i x t u r e s i n w h i c h s o m e c e l l u l a s e i s r e p l a c e d b y e n d o x y l a n a s e s ( a n d o t h e r h e m i c e l l u l a s e s ) , p o s s i b l y i n c r e a s i n g 2 3 0 a c c e s s i b i l i t y o f c e l l u l o s e e m b e d d e d w i t h i n h e m i c e l l u l o s e s h e a t h s [ 5 5 ] . S i m i l a r l y , h e m i c e l l u l o s e i s m o r e e f fi c i e n t l y h y d r o l y z e d i n m i x t u r e s i n w h i c h s o m e e n d o x y l a n a s e i s r e p l a c e d w i t h c e l l u l a s e s . F u t u r e s t u d i e s m u s t a d d r e s s t o r e d u c e t h e m u l t i c o l l i n e a r i t y o b s e r v e d i n t h e m o d e l s g e n e r a t e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s . T h i s c a n b e a c h i e v e d b y s t u d y i n g h i g h s p e c i fi c i t y , p u r i fi e d e n z y m e s t o e l i m i n a t e i s s u e s w i t h h i g h c o r r e l a t i o n s b e t w e e n e n z y m e s p r e s e n t i n t y p i c a l c r u d e e n z y m e c o c k t a i l s . T h i s w o u l d a l l o w d e v e l o p m e n t o f m o r e p r e c i s e m o d e l s , a n d p o t e n t i a l l y m o r e a c t i v e e n z y m e b l e n d s . 2 3 1 M ' l l l l l l l l j l l l l fl l i l l l g l l l l l j l l l l a c t o t u . . ‘ 1 3 : . N L E B R A F i Y M i c h i g a n S t a t e U ' . . i v e r s z t P L A C E I N R E T U R N B O X t o r e m o v e t h i s c h e c k o u t f r o m y o u r r e c o r d . T O A V O I D F I N E S r e t u r n o n o r b e f o r e d a t e d u e . M A Y B E R E C A L L E D w i t h e a r l i e r d u e d a t e i f r e q u e s t e d . . D A T E D U E D A T E D U E D A T E D U E 5 / 0 8 K I P r o fl A c h r e l e l R C / D a t a o m m d d U L T R A S T R U C T U R A L A N D P H Y S I C O C H E M I C A L M O D I F I C A T I O N S W I T H I N A M M O N I A T R E A T E D L I G N O C E L L U L O S I C C E L L W A L L S A N D T H E I R I N F L U E N C E O N E N Z Y M A T I C D I G E S T I B I L I T Y V O L U M E 1 1 B y S h i s h i r P r a t a p S i n g h C h u n d a w a t A D I S S E R T A T I O N S u b m i t t e d t o M i c h i g a n S t a t e U n i v e r s i t y i n p a r t i a l f u l fi l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D O C T O R O F P H I L O S O P H Y C h e m i c a l E n g i n e e r i n g 2 0 0 9 C H A P T E R 8 : A M M O N I A B A S E D P R E T R E A T M E N T S E N H A N C E S Y N E R G I S T I C H Y D R O L Y S I S O F C R Y S T A L L I N E C E L L U L O S E A N D L I G N O C E L L U L O S I C C E L L W A L L S T H R O U G H D I F F E R E N T M E C H A N I S M S 8 . 1 . 1 A b s t r a c t V i T h e d e g r e e o f s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n c e l l u l a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e s w a s d e t e r m i n e d f o r n a t i v e a n d a m m o n i a t r e a t e d c e l l u l o s i c b i o m a s s ( e . g . A v i c e l , C o r n S t o v e r ) . T h e f o u r c e l l u l a s e s s t u d i e d i n c l u d e d c e l l o b i o h y d r o l a s e I ( C B H I ) , c e l l o b i o h y d r o l a s e I I ( C B H I I ) , e n d o g l u c a n a s e I ( E G I ) a n d B - G l u c o s i d a s e ( B G ) . T h e h e m i c e l l u l a s e s i n c l u d e d a n e n d o x y l a n a s e ( E X ) , o t - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e ( A e r ) a n d B - x y l o s i d a s e ( B X ) . S y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s a m o n g t h e c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H I I , E G I ) f o r v a r y i n g p r o t e i n l o a d i n g ( 2 5 - 3 1 5 m g e n z y m e / g g l u c a n ) d u r i n g h y d r o l y s i s o f u n t r e a t e d ( c e l l u l o s e I ) a n d l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d ( c e l l u l o s e 1 H ) A v i c e l w e r e s t u d i e d . I n t e r e s t i n g l y , t h e r e w a s a 2 - f o l d h i g h e r s p e c i fi c a c t i v i t y d e t e c t e d f o r E 6 I ( w i t h o r w i t h o u t C B H ’ s ) o n c e l l u l o s e I I I p o l y m o r p h a s c o m p a r e d t o c e l l u l o s e 1 3 ' T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t t h e o v e r a l l e n h a n c e m e n t i n t h e h y d r o l y t i c r a t e o f c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e 1 1 1 v s . 1 3 i s l a r g e l y d u e t o i n c r e a s e d a c t i v i t y o f e n d o g l u c a n a s e s . I t w a s a l s o f o u n d t h a t u n l i k e w h a t h a s b e e n r e p o r t e d e a r l i e r f o r A v i c e l ( l o w D P c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e ) , C B H I a n d C B H I I h a d l i t t l e o r n o s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n ( d e g r e e o f s y n e r g i s t i c e f f e c t = 1 ) o n A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r . A c c e s s i b i l i t y o f c r y s t a l l i n e c e l l u l o s i c m i c r o fi b r i l s w i t h i n l i g n o c e l l u l o s i c c e l l w a l l s w a s g r e a t l y e n h a n c e d a f t e r A P E X p r e t r e a t m e n t , w h i c h w a s d e d u c e d b a s e d o n t h e d i f f e r e n c e i n t h e h y d r o l y s i s b y - p r o d u c t s r e l e a s e d ( r a t i o o f c e l l o b i o s e t o g l u c o s e ) d u r i n g s a c c h a r i fi c a t i o n o f u n t r e a t e d V 1 A v e r s i o n o f t h i s c h a p t e r w a s p u b l i s h e d a s G a o D . , C h u n d a w a t S . P . S , K r i s h n a n C . , B a l a n V . , D a l e B . E . 2 0 0 9 . M i x t u r e o p t i m i z a t i o n o f s i x c o r e g l y c o s y l h y d r o l a s e s f o r m a x i m i z i n g s a c c h a r i fi c a t i o n o f a m m o n i a fi b e r e x p a n s i o n ( A F E X ) p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y ( M a n u s c r i p t I n P r e s s ) . D 0 1 : l O . l O l 6 / j . b i o r t e c h . 2 0 0 9 . 1 0 . 0 5 6 . 2 3 2 a n d A P E X t r e a t e d c o r n s t o v e r b y v a r i o u s c o m b i n a t i o n s o f C B H I , C B H I I a n d E C 1 . H e m i c e l l u l a s e s p l a y e d a c r i t i c a l r o l e i n e n h a n c i n g t h e h y d r o l y s i s o f A P E X t r e a t e d c o r n s t o v e r a s w e l l . T h e o p t i m a l c o m p o s i t i o n ( b a s e d o n % t o t a l p r o t e i n m a s s l o a d i n g ) o f t h e c o r e c e l l u l a s e c o c k t a i l t h a t m a x i m i z e d A P E X c o r n s t o v e r g l u c a n d i g e s t i b i l i t y c o n s i s t e d o f C B H I ( 3 4 . 6 7 % ) , C B H I I ( 2 6 % ) a n d E G I ( 3 9 . 3 3 % ) . T h e o p t i m a l c o m p o s i t i o n ( b a s e d o n % t o t a l h e m i c e l l u l a s e m a s s l o a d i n g ) o f t h e c o r e h e m i c e l l u l a s e c o c k t a i l ( w i t h fi x e d c o r e c e l l u l a s e l o a d i n g ) t h a t m a x i m i z e d A P E X c o r n s t o v e r x y l a n d i g e s t i b i l i t y c o n s i s t e d o f E X ( 2 9 . 0 7 % ) , [ 3 X ( 4 2 . 6 7 % ) a n d A e r ( 2 8 . 2 7 % ) . 8 . 1 . 2 B a c k g r o u n d I t i s i m p o s s i b l e t o s t u d y s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n e n z y m e s o n p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s u s i n g c r u d e c o m m e r c i a l m i x t u r e s . P u r i fi c a t i o n o f i n d i v i d u a l e n z y m e c o m p o n e n t s t o h i g h p u r i t y w o u l d h e l p e l u c i d a t e t h e r o l e o f s y n e r g y . T h e r e a r e s e v e r a l r e p o r t e d t e c h n i q u e s f o r s e p a r a t i n g c e l l u l o l y t i c a n d x y l a n o l y t i c e n z y m e s f r o m e a c h o t h e r [ 4 1 9 , 4 6 0 - 4 6 2 ] . T y p i c a l l y , s e p a r a t i o n o f c e l l o b i o h y d r o l a s e s a n d e n d o g l u c a n a s e s i s d i f fi c u l t t o a c h i e v e w i t h o u t C B D - s p e c i fi c a f f i n i t y b a s e d c h r o m a t o g r a p h y a n d h a s r e s u l t e d i n c o n fl i c t i n g r e s u l t s o v e r t h e r o l e o f C B H a n d E G s y n e r g y o n c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e i n t h e l i t e r a t u r e [ 3 0 , 3 2 ] . T h e m a j o r p a r a m e t e r s t h a t i n f l u e n c e e n z y m e s y n e r g i s m s a r e : ( a ) e n z y m e r a t i o s a n d e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n w i t h r e s p e c t t o t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e [ 2 9 , 3 0 , 4 6 , 4 7 ] ; ( b ) s u b s t r a t e r e l a t e d p h y s i c o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s [ 3 6 , 4 6 3 , 4 6 4 ] ; ( c ) c o m p e t i t i v e - s y n e r g i s t i c a d s o r p t i o n o f e n z y m e m i x t u r e s [ 4 6 5 ] . 8 . 1 . 2 . 1 R o l e o f c e l l o b i o h y d r o l a s e s ( C B H ) a n d e n d o g l u c a n a s e s ( E G ) T h e r e h a v e b e e n s e v e r a l s t u d i e s c a r r i e d o u t t o o p t i m i z e c e l l u l a s e m i x t u r e s f o r h y d r o l y z i n g m o d e l c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s l i k e a v i c e l a n d b a c t e r i a l m i c r o c r y s t a l l i n e 2 3 3 c e l l u l o s e [ 4 3 3 , 4 6 6 - 4 6 8 ] . B a k e r a n d c o l l e a g u e s [ 4 6 6 ] s t u d i e d t h e e f f e c t o f v a r y i n g e n z y m e r a t i o s f o r t e r n a r y m i x t u r e s o f p u r i fi e d e x o - a n d e n d o - c e l l u l a s e s ( f r o m s e v e r a l f u n g a l a n d b a c t e r i a l s o u r c e s ) o n m i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e a t l o w t o t a l p r o t e i n l o a d i n g s ( ~ 0 . 4 m g p r o t e i n p e r g g l u c a n ) . A t e r n a r y c o m b i n a t i o n o f C B H I : C B H 1 1 : B C I ( n a t i v e T r i c h o d e r m a e n z y m e s ) a t 6 0 : 2 0 : 2 0 ( p r o t e i n m a s s b a s i s ) g a v e t h e h i g h e s t g l u c a n c o n v e r s i o n f o r c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e ( S i g m a c e l l ) . T h e O p t i m a l r a t i o o f i n d i v i d u a l e n z y m e c o m p o n e n t s t h a t g a v e h i g h g l u c a n c o n v e r s i o n s w a s d e p e n d e n t o n t h e m i c r o b i a l s o u r c e . B o i s s e t a n d c o l l e a g u e s [ 4 3 3 ] s t u d i e d t h e e f f e c t o f v a r y i n g e x o - a n d e n d o - c e l l u l a s e s f r o m H u m i c o l a i n s o l e n s o n b a c t e r i a l c e l l u l o s e a t h i g h t o t a l p r o t e i n l o a d i n g s ( ~ 1 0 0 m g p r o t e i n p e r g g l u c a n ) . A t e r n a r y c o m b i n a t i o n o f C e l 7 A : C e l 6 A : C e l 4 5 A ( n a t i v e H u m i c o l a e n z y m e s , a n a l o g o u s t o C B H I , C B H H a n d B C 1 , r e s p e c t i v e l y ) a t 6 8 . 7 5 : 3 0 : 1 . 2 5 g a v e t h e h i g h e s t g l u c a n c o n v e r s i o n . T h e s e t w o fi n d i n g s , a m o n g m a n y o t h e r s [ 2 0 4 , 4 6 7 , 4 6 8 ] , i n d i c a t e t h e c o m p l e x n a t u r e o f s y n e r g y b e t w e e n e n d o - a n d e x o - e n z y m e s t h a t i s h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e t o t a l p r o t e i n l o a d i n g , s u b s t r a t e c h a r a c t e r i s t i c s a n d i n d i v i d u a l p r o t e i n b i n d i n g p r o p e r t i e s t o s u b s t r a t e a c t i v e s i t e s t h a t g i v e v e r y d i f f e r e n t o p t i m a l e n z y m e c o m b i n a t i o n s . F e w s t u d i e s , i f a n y , h a v e b e e n c o n d u c t e d u s i n g p u r i fi e d e n z y m e s o n p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s ( m o s t s t u d i e s h a v e f o c u s e d o n w o o d y b i o m a s s ) . E r i k s s o n a n d c o l l e a g u e s [ 3 4 ] h a v e f o u n d t h a t C B H I a n d E G I s y n e r g i z e t o h y d r o l y z e s t e a m p r e t r e a t e d s p r u c e w o o d w i t h a d e g r e e o f s y n e r g i s t i c e f f e c t ( D S E ) o f 1 . 5 - 2 ( o v e r t h e c o u r s e o f h y d r o l y s i s ) , i n d i c a t i n g a 5 0 - 1 0 0 % i n c r e a s e i n o v e r a l l d i g e s t i b i l i t y i n p r e s e n c e o f b o t h e n z y m e s a s c o m p a r e d t o w h e n p r e s e n t i n d i v i d u a l l y . S i m i l a r D S E v a l u e s h a v e b e e n r e p o r t e d f o r s y n e r g i s t i c h y d r o l y s i s o f s t e a m p r e t r e a t e d w i l l o w b y C B H I a n d B O 1 1 [ 4 9 ] . O n e w o u l d 2 3 4 e x p e c t t h e D S E t o d e c r e a s e d u r i n g t h e c o u r s e o f h y d r o l y s i s b u t i t h a s b e e n f o u n d t o r e m a i n r e l a t i v e l y c o n s t a n t i n d i c a t i n g t h a t t h e m o d e l o f c o n v e n t i o n a l e n d o - e x o s y n e r g y i s n o t c o m p l e t e . B r i k s s o n e t a l . h a v e f o u n d t h a t e n d o g l u c a n a s e s h e l p r e l e a s e n o n - p r o d u c t i v e l y b o u n d c e l l o b i o h y d r o l a s e ( b o u n d t o c e l l u l o s e ) w h i c h m i g h t h e l p e x p l a i n t h e c o n s t a n t D S E . I n o t h e r s t u d i e s o n b l e a c h e d s o fi w o o d k r a f t p u l p ( g l u c o m a n n a n r i c h p u l p ) , C B H w a s f o u n d t o s y n e r g i z e m o r e e f f e c t i v e l y w i t h B C I t h a n B O 1 1 , e v e n t h o u g h t h e l a t t e r h a d s l i g h t l y h i g h e r e n d o - s p e c i fi c a c t i v i t y [ 4 6 9 ] . R o s g a a r d e t a l . h a v e s t u d i e d s y n e r g i s t i c h y d r o l y s i s o f a c i d , s t e a m a n d h o t - w a t e r p r e t r e a t e d b a r l e y s t r a w u s i n g q u a t e r n a r y m i x t u r e s o f p u r i fi e d C B H I , C B H H , E G I a n d E G H [ 2 6 ] . T h e o p t i m a l r a t i o s o f t h e f o u r e n z y m e s r e q u i r e d f o r h i g h e r s e v e r i t y ( a c i d i m p r e g n a t i o n b a s e d s t e a m e x p l o s i o n ) p r e t r e a t e d s t r a w w a s d i f f e r e n t f r o m t h e l o w e r s e v e r i t y p r e t r e a t e d s t r a w s ( w a t e r i m p r e g n a t i o n b a s e d s t e a m e x p l o s i o n a n d h o t w a t e r fl o w - t h r o u g h e x t r a c t i o n ) . T h e h i g h e r s e v e r i t y p r e t r e a t e d s t r a w , r e q u i r e d l e s s e r a m o u n t o f E G I ( a n d g r e a t e r a m o u n t o f C B H I I , w i t h n e a r l y c o n s t a n t C B H I ) c o m p a r e d t o t h e l o w e r s e v e r i t y m a t e r i a l . T h e o p t i m a l r a t i o o f C B H I : C B H 1 1 : B O I ( T r i c h o d e r m a e n z y m e s ) f o r h i g h a n d l o w s e v e r i t y s t e a m e x p l o s i o n p r e t r e a t e d b a r l e y s t r a w w a s f o u n d t o b e 5 0 : 2 5 : 2 5 a n d 4 5 : 2 0 : 3 5 , r e s p e c t i v e l y ( p r o t e i n m a s s b a s i s ) . T h i s i s n o t s u r p r i s i n g c o n s i d e r i n g t h a t a c i d p r e t r e a t m e n t p o s s i b l y r e s u l t e d i n r e m o v a l o f a m o r p h o u s c e l l u l o s e ( a n d h e m i c e l l u l o s e ) g i v i n g m o r e c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e t h a t r e q u i r e d l e s s e r s y n e r g y b e t w e e n c e l l o b i o h y d r o l a s e ( C B H I ) a n d e n d o g l u c a n a s e s ( E G I ) [ 3 6 ] . R o s g a a r d e t a l . a l s o f o u n d s i g n i fi c a n t i n t e r a c t i o n e f f e c t s b e t w e e n E G ( E G I o r E G I I ) w i t h C B H I i n t h e h y d r o l y s i s o f l o w e r s e v e r i t y p r e t r e a t m e n t s . I n t e r e s t i n g l y , E G I I i s n o t i n c l u d e d i n t h e fi n a l c o c k t a i l d e s p i t e t h e f a c t t h a t i t h a s a h i g h e r s p e c i fi c a c t i v i t y o n a m o r p h o u s c e l l u l o s e t h a n E G I 2 3 5 [ 4 7 0 ] . T h i s m i g h t b e b e c a u s e E G I h a s s i g n i fi c a n t c r o s s - a c t i v i t y o n x y l a n b a s e d s u b s t r a t e s t h a t w o u l d p r o b a b l y r e s u l t i n h i g h e r a c t i v i t y o n l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s r i c h i n h e m i c e l l u l o s e c o m p a r e d t o E C I I . G u s a k o v e t a l . h a v e s h o w n t h a t a n a r t i fi c i a l c e l l u l a s e m i x t u r e c o m p r i s i n g o f c e l l o b i o h y d r o l a s e s , e n d o g l u c a n a s e s , x y l a n a s e a n d B - g l u c o s i d a s e f r o m C h r y s o s p o r i u m I u c k n o w e n s e w a s m o r e e f f e c t i v e t h a n c o n v e n t i o n a l c r u d e e n z y m e m i x t u r e s i n h y d r o l y s i s o f c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e a n d o r g a n o s o l v p r e t r e a t e d D o u g l a s fi r w o o d [ 4 7 1 ] . I t w a s a l s o s h o w n t h a t t h e c r u d e e n z y m e m i x t u r e f r o m C h r y s o s p o r i u m f u n g i w a s n o t a s e f f e c t i v e a s t h e a r t i fi c i a l l y o p t i m i z e d c e l l u l a s e m i x t u r e , i l l u s t r a t i n g t h e r o l e o p t i m a l p r o t e i n r a t i o s a n d a c t i v i t i e s n e c e s s a r y t o a c h i e v e h i g h e r g l u c a n c o n v e r s i o n s . T h e e x t e n t o f s y n e r g y b e t w e e n c e l l u l a s e s o n p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s i s p r o b a b l y v e r y d i f f e r e n t f r o m m o d e l c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s ( l i k e a v i c e l , b a c t e r i a l a n d m i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e ) d u e t o v a r y i n g d e g r e e s o f n o n - p r o d u c t i v e b i n d i n g t o h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n . R e s e a r c h e r s h a v e f o u n d t h a t t h e e x t e n t o f b i n d i n g o f C B H I a n d E G H t o l i g n i n e x t r a c t e d fi o m p r e t r e a t e d s o f t w o o d d e p e n d s o n t h e t y p e o f c a t a l y t i c a n d c e l l u l o s e b i n d i n g d o m a i n s ( o r C B D ) [ 4 7 2 ] . M o s t e n d o g l u c a n a s e s h a v e b e e n f o u n d t o b e a s s o c i a t e d w i t h a C B D ( e . g . B O 1 , E C 1 1 ) t h a t h e l p s i m p r o v e s u b s t r a t e r e c o g n i t i o n u n l i k e s o m e e n d o g l u c a n a s e s l i k e E G I I I [ 4 7 3 ] . I t m i g h t b e u s e f u l t o s e l e c t e n z y m e s t h a t h a v e r e d u c e d b i n d i n g t o l i g n i n ( d u e t o a b s e n c e o f C B D ) t o e n h a n c e h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s . H o w e v e r , s o m e c e l l u l a s e s ( l i k e E C 1 ) h a v e s i g n i fi c a n t h e m i c e l l u l a s e a c t i v i t y t h a t m i g h t e f f e c t t h e i r s y n e r g i s t i c r o l e f o r p r e t r e a t e d c e l l w a l l s a b u n d a n t i n h e m i c e l l u l o s e s [ 4 7 4 ] . 2 3 6 E G I a n d 1 1 m i g h t b o t h p l a y a s i g n i fi c a n t r o l e d u r i n g h y d r o l y s i s o f A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r d u e t o s i g n i fi c a n t a m o r p h o u s c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l o s e r e t a i n e d a f t e r p r e t r e a t m e n t c o m p a r e d t o a c i d / s t e a m p r e t r e a t e d b a r l e y s t r a w . A l s o , t h e s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n C B H I a n d C B H I I ( w i t h a n d w i t h o u t s u i t a b l e e n d o g l u c a n a s e s ) o n A P E X t r e a t e d c e l l u l o s e a r e c u r r e n t l y u n k n o w n . 8 . 1 . 2 . 2 R o l e o f e n d o - ( E X ) a n d e x o - x y l a n a s e s ( M ) N a t i v e c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s a r e c o m p o s e d o f a c r y s t a l l i n e g l u c a n c o r e w i t h a n a m o r p h o u s h e m i c e l l u l o s e r i c h o u t e r s u r f a c e [ 5 5 ] t h a t h e l p s d i r e c t t h e s e l f a s s e m b l y o f t h e c e l l w a l l [ 4 7 5 , 4 7 6 ] . T h e h e m i c e l l u l o s e s h e a t h a r o u n d c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s ( v i a n o n - c o v a l e n t a s s o c i a t i o n s ) h e l p s e f f e c t i v e l y t r a n s m i t s t r e s s a p p l i e d o n t h e c e l l w a l l . T h i s h e m i c e l l u l o s e s h e a t h i s n o t r e m o v e d d u r i n g a l k a l i n e p r e t r e a t m e n t s u n l i k e d i l u t e a c i d b a s e d p r e t r e a t r n e n t s . T h i s m a y i n h i b i t a c c e s s o f c e l l u l a s e s t o t h e c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s , n e c e s s i t a t i n g t h e p r e s e n c e o f h e m i c e l l u l a s e s t o m a x i m i z e d i g e s t i b i l i t y . T h e r e h a s b e e n o n l y o n e p a p e r p u b l i s h e d s o f a r a t t e m p t i n g t o i d e n t i f y e n d o x y l a n a s e a n d e x o - x y l a n a s e ( i . e . B - x y l o s i d a s e ) s y n e r g y ( u s i n g p u r i fi e d e n z y m e s ) o n A P E X p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r [ 4 7 7 ] . P u r i fi e d C B H I ( 5 0 m g / g g l u c a n ) a n d B - g l u c o s i d a s e ( 5 m g / g g l u c a n ) w e r e s u p p l e m e n t e d w i t h e n d o x y l a n a s e ( f r o m T h e r m o m y c e s I a n u g i n o s u s , 1 . 5 m g / g g l u c a n ) a n d B - x y l o s i d a s e ( f r o m A p s e r g i l l u s a w a m o r i , 0 . 5 m g / g g l u c a n ) t o h y d r o l y z e A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r . G l u c a n c o n v e r s i o n s ( t o g l u c o s e ) i n c r e a s e d f r o m 1 0 % t o 2 2 % , w h i l e x y l a n c o n v e r s i o n s ( t o x y l o s e ) i n c r e a s e d l e s s t h a n 5 % t o 2 5 % i n t h e p r e s e n c e o f b o t h h e m i c e l l u l a s e s . T h e o v e r a l l c o n v e r s i o n s a r e l o w d u e t o a b s e n c e o f s u i t a b l e e n d o g l u c a n a s e s ( l i k e E G I a n d B O 1 1 ) a n d o t h e r a c c e s s o r y e n z y m e s ( l i k e a r a b i n o f u r a n o s i d a s e s ) i n t h e e n z y m e m i x t u r e . 2 3 7 8 . 1 . 2 . 3 R o l e o f a c c e s s o r y h e m i c e l l u l a s e s E n d o x y l a n a s e s a r e n o t e f f e c t i v e i n h y d r o l y z i n g b r a n c h e d h e m i c e l l u l o s e s i n t h e a b s e n c e o f s u i t a b l e s i d e - c h a i n c l e a v i n g e n z y m e s . S o m e o f t h e i m p o r t a n t a c c e s s o r y h e m i c e l l u l a s e s i n c l u d e a c e t y l x y l a n e s t e r a s e s , p h e n o l i c e s t e r a s e s , a r a b i n o fi i r a n o s i d a s e s a n d g l u c u r o n i d a s e s . T h e o p t i m u m e n z y m e c o m b i n a t i o n s d e p e n d o n t h e c e l l w a l l c o m p o s i t i o n , t y p e a n d s e v e r i t y o f t h e r m o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t . D e p e n d i n g o n t h e p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y , s o m e a c e t y l l i n k a g e s r e m a i n b o u n d t o t h e x y l a n f r a c t i o n [ 4 7 8 ] . T h e r e f o r e , d u e t o i n c o m p l e t e c l e a v a g e o f a c e t y l a n d o t h e r L C C e s t e r l i n k a g e s , i t m i g h t b e n e c e s s a r y t o s u p p l e m e n t a c c e s s o r y h e m i c e l l u l a s e s f o r s o m e l o w e r s e v e r i t y p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c s . P u r i fi e d a c c e s s o r y h e m i c e l l u l a s e s y n e r g y s t u d i e s h a v e b e e n c o n d u c t e d f o r s o m e l o w e r s e v e r i t y h o t - w a t e r p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r [ 4 5 8 , 4 7 9 ] . I t w a s f o u n d t h a t t h e g l u c a n c o n v e r s i o n s t o c e l l o b i o s e b y C B H I ( a t 1 5 a n d 5 0 m g C B H I p r o t e i n l o a d i n g p e r g r a m g l u c a n ) i n c r e a s e d b y 1 3 - 8 4 % i n t h e p r e s e n c e o f s u i t a b l e a c e t y l x y l a n a n d f e r u l o y l e s t e r a s e s ( 2 . 5 m g / g g l u c a n ) . T h e g r e a t e s t s y n e r g i s t i c e n h a n c e m e n t s t o g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n w e r e o b s e r v e d f o r l o w e r c e l l o b i o h y d r o l a s e l o a d i n g ( 1 5 m g / g g l u c a n ) , p r o b a b l y d u e t o l e s s e r n o n - s p e c i fi c b i n d i n g o f e n z y m e s t o s u b s t r a t e a c t i v e s i t e s . D e s p i t e t h e m u c h l o w e r x y l a n c o n t e n t i n h o t - w a t e r t r e a t e d c o r n s t o v e r , s i g n i fi c a n t i m p r o v e m e n t s t o d i g e s t i b i l i t y w a s o b s e r v e d d u e t o a c c e s s o r y e n z y m e s u p p l e m e n t a t i o n . O n e w o u l d e x p e c t a m u c h m o r e s i g n i fi c a n t i m p r o v e m e n t i n d i g e s t i b i l i t y o f A F E X t r e a t e d b i o m a s s d u e t o s u b s t a n t i a l l y h i g h e r a m o u n t s o f h e m i c e l l u l o s e r e t a i n e d a fi e r p r e t r e a t m e n t . 8 . 1 . 2 . 4 R o l e o f x y l o g l u c a n a s e s ( X G ) X y l o g l u c a n i s a m a j o r h e m i c e l l u l o s e t y p i c a l l y f o u n d i n p r i m a r y c e l l w a l l s b u t t h e a m o u n t p r e s e n t v a r i e s b e t w e e n d i c o t s ( 2 0 - 2 5 % ) a n d m o n o c o t s ( 2 - 1 0 % ) . R e c e n t w o r k w i t h h i g h - 2 3 8 t e n s i o n w o o d s h a s i n d i c a t e d s i g n i fi c a n t p r e s e n c e o f x y l o g l u c a n s i n t h e g e l a t i n o u s l a y e r ( d e t a c h e d f r o m t h e 8 2 s e c o n d a r y w a l l l a y e r ) t h a t p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n s t r e s s - t r a n s f e r b e t w e e n t h e l o n g i t u d i n a l l y a r r a n g e d c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s [ 4 8 0 ] . X y l o g l u c a n a l o n g w i t h o t h e r h e m i c e l l u l o s e s i s t i g h t l y p a c k e d b e t w e e n c e l l u l o s e e l e m e n t a r y m i c r o fi b r i l s ( 3 n m d i a m e t e r ) f o r m i n g l a r g e r m a c r o fi b r i l s ( 3 0 n m d i a m e t e r ) . T h e h e m i c e l l u l o s e p l a y s t h e r o l e o f g l u e t h a t h e l p s t r a n s f e r s t r e s s b e t w e e n t h e s t i f f c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s . H i g h - r e s o l u t i o n i m a g i n g o f u n t r e a t e d m a i z e s t o v e r p r i m a r y c e l l w a l l s a l s o s u g g e s t s e x i s t e n c e o f h e m i c e l l u l o s e s h e a t h s c o v e r i n g c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s [ 5 5 ] . T h i s w o u l d p r o b a b l y b e o n e r e a s o n f o r t h e s i g n i fi c a n t a m o u n t s o f x y l o g l u c a n a s e s s e c r e t e d b y f u n g a l p a t h o g e n s . T h e s e x y l o g l u c a n a s e s ( a c c o u n t i n g c l o s e t o 1 0 - 2 0 % o f t o t a l p r o t e i n i n c o m m e r c i a l e n z y m e s , [ 2 6 ] ) m a y b e c r i t i c a l t o h e l p i m p r o v e a c c e s s i b i l i t y o f c e l l u l a s e s t o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e b u r i e d u n d e r t h e x y l o g l u c a n a n d h e m i c e l l u l o s e n e t w o r k . S t u d i e s c o n d u c t e d u s i n g p u r i fi e d x y l o g l u c a n a s e s f o r a c i d p r e t r e a t e d w o o d a n d s t r a w s h a v e s h o w n s l i g h t i m p r o v e m e n t i n b i o m a s s d i g e s t i b i l i t y [ 4 8 1 ] . H o w e v e r , m o s t o f t h e h e m i c e l l u l o s e s a r e a c i d h y d r o l y z e d a n d e x t r a c t e d d u r i n g t h e a c i d p r e t r e a t m e n t t h u s n o t r e q u i r i n g s i g n i fi c a n t a m o u n t o f x y l o g l u c a n a s e a c t i v i t y t o i m p r o v e y i e l d s . A l k a l i n e p r e t r e a t r n e n t s s h o u l d l e a v e t h e h e m i c e l l u l o s e l a r g e l y u n c h a n g e d . O n t h e o t h e r h a n d , s o m e e n d o g l u c a n a s e s ( e . g . E G I ) c a n a l s o h y d r o l y z e x y l o g l u c a n s m a k i n g t h e p r e s e n c e o f x y l o g l u c a n a s e r e d u n d a n t i n a c o m p l e x c e l l u l o l y t i c m i x t u r e [ 4 8 1 , 4 8 2 ] . A l o t o f e f f o r t h a s b e e n e x p e n d e d d e v e l o p i n g h e t e r o g e n e o u s k i n e t i c m o d e l s t o p r e d i c t c o m p l e x i n t e r a c t i o n s b e t w e e n c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s a n d p u r i fi e d e n z y m e s a s a f u n c t i o n o f s u b s t r a t e a n d e n z y m e r e l a t e d c h a r a c t e r i s t i c s [ 1 1 , 2 0 4 , 4 6 7 ] . H o w e v e r , t h e r e i s a n e e d t o d e t e r m i n e c r i t i c a l e n z y m e s n e c e s s a r y f o r h y d r o l y z i n g A P E X p r e t r e a t e d b i o m a s s 2 3 9 p r e c e d i n g t h e d e v e l o p m e n t o f s u i t a b l e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s m o d e l s . I t w i l l a l s o b e i m p o r t a n t t o c o r r e l a t e u l t r a - s t r u c t u r a l a n d c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s w i t h i n A P E X p r e t r e a t e d c e l l w a l l s t o p r e d i c t e n z y m e a c c e s s i b i l i t y a n d u l t i m a t e l y t h e h y d r o l y s i s y i e l d s . H o w e v e r , t h e r e h a v e b e e n n o a t t e m p t s t o d e t e r m i n e t h e v a r i o u s c e l l u l a s e s , h e m i c e l l u l a s e s a n d o t h e r a c c e s s o r y e n z y m e s n e c e s s a r y t o m a x i m i z e g l u c a n a n d x y l a n d i g e s t i b i l i t y o f A P E X t r e a t e d c o r n s t o v e r . 8 . 1 . 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s S e e a p p e n d i x A - V I I - l , 2 , 3 , 4 , 1 7 , 2 3 , 2 5 , 2 7 , 2 8 , 2 9 , 3 1 - 3 6 a n d 3 8 . 8 . 1 . 4 R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 8 . 1 . 4 . 1 E n z y m e p u r i fi c a t i o n a n d a c t i v i t y a s s a y s A l l c e l l u l a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e s ( e x c e p t B - x y l o s i d a s e , w h i c h w a s h e t e r o l o g o u s l y e x p r e s s e d ) w e r e p u r i fi e d f r o m c r u d e c o m m e r c i a l e n z y m e b l e n d s ( e . g . S p e z y m e C P , M u l t i f e c t X y l a n a s e , N o v o z y m e 1 8 8 ) , w i t h d e t a i l s o n t h e p u r i fi c a t i o n a n d h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n m e t h o d o l o g y p r o v i d e d e l s e w h e r e [ 4 5 3 ] . a - A r a b i n o f u r a n o s i d a s e ( G H 5 1 , E - A F A S E ) w a s p r o c u r e d f r o m M e g a z y m e ( B r a y , I r e l a n d ) . S p e z y m e C P h a s h i g h s p e c i fi c a c t i v i t y o n c e l l u l o s i c b i o m a s s ( C h a p t e r 7 ; T a b l e 7 . 1 - B ) a n d w a s t h u s t h e s o u r c e o f C B H I , C B H I I a n d E G I o b t a i n e d u s i n g s u i t a b l e c h r o m a t o g r a p h i c p u r i fi c a t i o n s t e p s ( i . e . i o n - e x c h a n g e , h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y ) . C B H I a n d C B H I I w e r e f u r t h e r p o l i s h e d u s i n g p - a m i n o p h e n y l - l - t h i o - B - D - c e l l o b i o s i d e ( A P T C ) b a s e d a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y t o r e m o v e t r a c e e n d o g l u c a n a s e c o n t a m i n a n t s [ 4 6 2 , 4 8 3 , 4 8 4 ] . T y p i c a l l y , c r u d e c e l l u l a s e m i x t u r e s a r e s u p p l e m e n t e d w i t h N o v o z y m e 1 8 8 t o p r e v e n t i n h i b i t i o n o f c e l l o b i o h y d r o l a s e b y c e l l o b i o s e [ 4 8 5 , 4 8 6 ] . N o v o z y m e 1 8 8 w a s c h o s e n a s t h e s o u r c e f o r p u r i fi c a t i o n o f B - g l u c o s i d a s e , b a s e d o n p r e v i o u s fi n d i n g s ( T a b l e 7 . 1 - B , 7 . 2 ) . M u l t i f e c t ® 2 4 0 X y l a n a s e w a s t h e s o u r c e t o p u r i f y e n d o - x y l a n a s e s b a s e d o n p r e v i o u s l y r e p o r t e d fi n d i n g s ( T a b l e 7 . 1 - B , 7 . 2 ) . S e v e r a l r e c o m b i n a n t e n z y m e s h a v e b e e n s u c c e s s f u l l y e x p r e s s e d u s i n g t h e P i c h i a p a s t o r i s e x p r e s s i o n s y s t e m [ 4 8 7 , 4 8 8 ] . I n r e c o m b i n a n t P . p a s t o r i s t h e g e n e o f i n t e r e s t i s i n t e g r a t e d i n t o i t s g e n o m e u n d e r m e t h a n o l i n d u c i b l e a l c o h o l o x i d a s e p r o m o t e r ( A O X I p ) . T h e P . p a s t o r i s e x p r e s s i o n s y s t e m w a s u s e d f o r e x p r e s s i o n o f B - x y l o s i d a s e e n c o d e d v i a g e n e f r o m A s p e r g i l l u s n i d u l a n s [ 4 8 9 ] . E n z y m e i d e n t i t y a n d g l y c o s y l h y d r o l a s e f a m i l y f o r a l l s i x p u r i fi e d p r o t e i n s w a s c o n fi r m e d t h r o u g h p r o t e o m i c s ( [ 4 5 3 ] ) . T h e s i x p u r i fi e d e n z y m e s w e r e e v a l u a t e d f o r t h e i r s p e c i fi c a c t i v i t y o n s e v e r a l s u b s t r a t e s ( e . g . A v i c e l , O a t S p e l t X y l a n o r O S X , C a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e o r C M C , c e l l o b i o s e , x y l o b i o s e ) u s i n g a m o d i fi e d B C R L m i c r o p l a t e m e t h o d ( s e e m e t h o d s s e c t i o n f o r d e t a i l s ) . O n e u n i t o f s p e c i fi c a c t i v i t y ( U ) w a s d e fi n e d a s 1 m o l ( g l u c o s e e q u i v a l e n t s ) r e d u c i n g s u g a r s r e l e a s e d b a s e d o n D N S a s s a y ( f o r A v i c e l , C M C a n d c e l l o b i o s e ) p e r m g p r o t e i n p e r m i n . F o r o a t s p e l t x y l a n a n d x y l o b i o s e , s p e c i fi c a c t i v i t y w a s d e fi n e d b a s e d o n x y l o s e e q u i v a l e n t s . E G I w a s f o u n d t o h a v e h i g h s p e c i fi c a c t i v i t y o n C M C ( 6 . 6 9 U ) a n d O S X ( 5 . 0 8 U ) . I n t e r e s t i n g l y , E G I a n d E X h a d c o m p a r a b l e a c t i v i t y o f o a t s p e l t x y l a n ( 5 . 0 8 v s . 8 . 2 4 U , r e s p e c t i v e l y ) . E n d o x y l a n a s e ( a n d x y l o - o l i g o m e r a s e ) a c t i v i t y f o r E G I h a s b e e n r e p o r t e d e a r l i e r [ 4 7 4 ] , s u g g e s t i n g t h a t t h i s e n z y m e c o u l d p l a y a d u a l r o l e i n h y d r o l y z i n g g l u c a n a n d x y l a n i n p r e t r e a t e d c e l l w a l l s , u n l i k e o t h e r e n d o g l u c a n a s e s . C B H I a n d C B H I I h a d s i g n i fi c a n t a c t i v i t y o n A v i c e l ( 0 . 0 1 9 a n d 0 . 0 2 7 U , r e s p e c t i v e l y ) , c o m p a r e d t o B C I ( 0 . 0 1 1 U ) . E G I a c t i v i t y o n A v i c e l i s n o t s u r p r i s i n g , c o n s i d e r i n g t h a t A v i c e l i s c o m p o s e d o f a s i g n i fi c a n t p r o p o r t i o n o f n e a r l y 2 0 - 3 0 % a m o r p h o u s c e l l u l o s e [ 3 1 2 ] . I t w a s a l s o f o u n d t h a t i f t h e C B H ’ s w e r e n o t e x t e n s i v e l y p o l i s h e d ( b y a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y ) , t h e y h a d d e t e c t a b l e C M C a c t i v i t y . T h e r e f o r e , e x t e n s i v e p o l i s h i n g i s c r i t i c a l t o o b t a i n h i g h p u r i t y 2 4 1 c e l l o b i o h y d r o l a s e s . B G a n d B X h a d s i g n i fi c a n t a c t i v i t y o n c e l l o b i o s e ( 1 2 4 . 9 U ) a n d x y l o b i o s e ( 5 2 . 2 U ) , r e s p e c t i v e l y . 8 . 1 . 4 . 2 C o m p a r i n g h y d r o l y t i c a c t i v i t y o f c o r e c e l l u l a s e s o n c e l l u l o s e I v s . I I I E n z y m a t i c h y d r o l y s i s ( f o r 2 4 h o u r s ) u s i n g t h e c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H I I , B O 1 , B G ) w a s c a r r i e d o u t o n u n t r e a t e d a n d a m m o n i a t r e a t e d c e l l u l o s i c b i o m a s s . T h e fi r s t s e t s o f e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d o n u n t r e a t e d a n d l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e ( i . e . A v i c e l ) . T h e s e e x p e r i m e n t s ( T a b l e 8 . 1 - 8 . 2 ) r e v e a l e d t h e n a t u r e o f s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e v a r i o u s c e l l u l a s e s t h a t a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e h i g h e r r a t e o f g l u c a n h y d r o l y s i s f o r c e l l u l o s e 1 1 1 v s 1 5 ( C h a p t e r 4 . 2 , F i g u r e 4 . B . 3 ) . T h e c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H 1 1 , B O 1 ) w e r e a d d e d i n v a r i o u s r e l a t i v e a n d t o t a l p r o t e i n l o a d i n g s ( w i t h / w i t h o u t [ 3 G s u p p l e m e n t a t i o n a t fi x e d l o a d i n g ) . I n t e r e s t i n g l y , u n l i k e t h e p r e v i o u s r e p o r t o n c e l l u l o s e I I I [ 2 9 8 ] , t h e r e w a s n o i m p r o v e m e n t i n s p e c i fi c a c t i v i t y f o r c e l l o b i o h y d r o l a s e I o r I I a t l o w a n d h i g h t o t a l p r o t e i n l o a d i n g s ( 2 . 5 - 1 0 m g / g g l u c a n ) . O n t h e c o n t r a r y , t h e r e w a s a 2 5 - 5 0 % l o w e r a c t i v i t y f o r b o t h C B H I o r I I d e t e c t e d o n c e l l u l o s e 1 1 1 v s . I . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t t h e n a t u r e o f t h e c e l l u l o s i c m i c r o fi b r i l ( e . g . A l g a l v s . P l a n t c e l l w a l l b a s e d c e l l u l o s e ) a l s o p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e o n t h e h y d r o l y s i s y i e l d o f c e l l u l o s e I I I . O n t h e o t h e r h a n d , e n d o g l u c a n a s e I r e s u l t e d i n a t w o - f o l d i n c r e a s e i n s p e c i fi c a c t i v i t y o n c e l l u l o s e 1 1 1 c o m p a r e d t o n a t i v e c e l l u l o s e ( w i t h o r w i t h o u t B G l o a d i n g ) . T h e r e s e e m e d t o b e a s l i g h t d e c r e a s e i n t h e r a t e e n h a n c e m e n t f o r E 0 I a t h i g h e r p r o t e i n l o a d i n g s ( 1 0 v s . 2 . 5 m g / g g l u c a n ) . I n b i n a r y e n z y m e s y s t e m s , w h e r e B C I w a s s u p p l e m e n t e d w i t h C B H I o r C B H I I , t h e r e w a s a s i g n i fi c a n t e n h a n c e m e n t i n t h e o v e r a l l h y d r o l y s i s y i e l d f o r b o t h c e l l u l o s e I a n d 1 1 1 . H o w e v e r , t h e r a t e o f h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e I I I r a n g e d b e t w e e n 1 . 5 - 2 f o l d , c o m p a r e d t o c e l l u l o s e I , f o r b i n a r y s y s t e m s i n c o r p o r a t i n g 2 4 2 B C I ( i n t h e p r e s e n c e o f D O ) ( T a b l e 8 . 1 ; E x p t # 5 - 6 , 1 2 - 1 3 , 1 9 - 2 0 ) . W h e r e a s , t h e r a t e o f h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e I I I w a s a l w a y s n e a r l y 2 - f o l d , c o m p a r e d t o c e l l u l o s e I , i n t h e a b s e n c e o f B G ( T a b l e 8 . 2 ; E x p t # 2 6 - 2 7 , 3 3 - 3 4 , 4 0 - 4 1 ) . I n t h e a b s e n c e o f I S O , t h e c e l l o b i o h y d r o l a s e s a r e m o r e s e v e r e l y i n h i b i t e d b y c e l l o b i o s e c o m p a r e d t o B O [ 4 9 0 ] . T h i s c o u l d e x p l a i n t h e g r e a t e r i m p r o v e m e n t i n t h e r a t e o f h y d r o l y s i s f o r c e l l u l o s e I H v s I f o r b i n a r y e n z y m e s y s t e m s i n c o r p o r a t i n g E C 1 , i n t h e a b s e n c e o f B G . F o r t e r n a r y e n z y m e s y s t e m s , i n c o r p o r a t i n g C B H I , C B H I I a n d B C I , t h e r e w a s n e a r l y a t w o - f o l d i n c r e a s e i n a c t i v i t y s e e n o n c e l l u l o s e I I I c o m p a r e d t o I ( T a b l e 8 . 1 ; E x p t # 7 , 1 4 ) . T h e s e r e s u l t s v a l i d a t e p r e v i o u s fi n d i n g s o f i m p r o v e d h y d r o l y s i s c h a r a c t e r i s t i c s o f c e l l u l o s e I I I v s . 1 c r y s t a l s t r u c t u r e ( C h a p t e r 4 . 2 ) . H o w e v e r , a n i m p o r t a n t d i s c o v e r y m a d e t h r o u g h t h e s e s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w a s t h e s i g n i fi c a n t i m p r o v e m e n t i n h y d r o l y t i c a c t i v i t y d e t e c t e d o n l y f o r e n d o g l u c a n a s e I o n p l a n t c e l l w a l l d e r i v e d c e l l u l o s e I 1 1 1 . 8 . 1 . 4 . 3 S y n e r g i s m b e t w e e n c o r e c e l l u l a s e s a n u n t r e a t e d a n d c o n v e n t i o n a l A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r E n z y m a t i c h y d r o l y s i s ( f o r 2 4 h o u r s ) u s i n g t h e c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H 1 1 , E C 1 , B C ) w a s c a r r i e d o u t o n u n t r e a t e d a n d c o n v e n t i o n a l A P E X t r e a t e d c o m s t o v e r . T h e s e e x p e r i m e n t s ( T a b l e 8 . 3 - 8 . 4 ) r e v e a l e d t h e n a t u r e o f s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e v a r i o u s c e l l u l a s e s t h a t i s r e s p o n s i b l e f o r t h e h i g h e r r a t e o f g l u c a n h y d r o l y s i s f o r p r e t r e a t e d c e l l w a l l s . T h e c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H I I , E G 1 ) w e r e a d d e d i n v a r i o u s r e l a t i v e a n d t o t a l p r o t e i n l o a d i n g s ( w i t h / w i t h o u t B G s u p p l e m e n t a t i o n a t fi x e d l o a d i n g ) . A d d i t i o n o f s i n g l e e n z y m e s ( w i t h o r w i t h o u t [ 3 G s u p p l e m e n t a t i o n ) t y p i c a l l y r e s u l t e d i n l e s s t h a n 5 - 6 % g l u c a n c o n v e r s i o n , i r r e s p e c t i v e o f t h e t o t a l p r o t e i n l o a d i n g . 2 4 3 2 . 0 9 5 . 0 2 . 0 9 0 . 2 5 2 G % ; _ _ 2 G % _ G % 4 0 4 0 0 4 4 3 6 6 6 6 9 3 3 3 2 2 1 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 1 1 1 1 1 G 3 7 8 5 0 7 8 0 8 7 % 1 3 3 8 5 5 2 7 2 6 2 4 5 7 0 9 1 9 2 2 . . . . . . . . . . 1 1 1 1 1 1 3 3 2 5 . . . . . . . . . . 5 3 5 9 9 3 9 0 4 0 _ E 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 a 2 2 2 2 2 2 7 1 1 1 3 . . . . . . 1 1 . 2 2 2 7 5 5 5 5 5 5 5 p 0 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . . . 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 I G 0 0 E I I 5 H 0 0 . 2 B C I I - I B C 5 5 . . 0 0 2 2 # t p l x E 0 1 0 0 1 1 0 1 2 2 2 4 4 T a b l e 8 . 1 E n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f u n t r e a t e d ( c e l l u l o s e I , U A W a n d l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d ( c e l l u l o s e I I I , A A I O A v i c e l b y v a r y i n g l o a d i n g s ( a s m g e n z y m e / g g l u c a n ) o f c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H I I , E G I , fl G ) r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f g l u c o s e a n d c e l l o b i o s e . W h e r e ; % G a n d % G 2 s t a n d f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n b a s e d o n g l u c o s e a n d c e l l o b i o s e y i e l d s , r e s p e c t i v e l y . C o m m e r c i a l e n z y m e ( C E ) c o n t r o l c o m p r i s e d o f S p e z y m e C P a n d N o v a I 8 8 a t 1 5 m g / g g l u c a n l o a d i n g e a c h . U n t r e a t e d A v i c e l C e l l u l o s e I I I A v i c e l G l u c o s e C e l l o b i o s e T o t a l G l u c o s e C e l l o b i o s e T o t a l M e a n S t d D e v M e a n S t d D e v m N V ? N g o g o m o n m o m o g c e e o ' 0 2 2 2 c o m o n m n o o 2 o 2 2 2 C E c o n t r o l ( 3 0 m g / g g l u c a n ) 5 2 . 7 2 . 8 5 2 . 7 8 2 . 3 4 . 6 8 2 . 3 l e c i v e v D A d I t I S I e s e o l u s n o a l e c l u M e l C G _ l a t o T e s o i b o l l e C l e c i _ v A d e t e a s e o r c t u n l U G . n a e M { I G E I I H B C I H B C # t p x E 2 4 5 T a b l e 8 . 2 E n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f u n t r e a t e d ( c e l l u l o s e I , U A V ) a n d l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d ( c e l l u l o s e I I I , A A I O A v i c e l b y v a r y i n g l o a d i n g s ( a s m g e n z y m e / g g l u c a n ) o f c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H 1 1 , E 0 1 ) r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f g l u c o s e a n d c e l l o b i o s e . W h e r e ; % G a n d % G z s t a n d f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n b a s e d o n g l u c o s e a n d c e l l o b i o s e y i e l d s , r e s p e c t i v e l y . C o m m e r c i a l e n z y m e ( C E ) c o n t r o l c o m p r i s e d o f S p e z y m e C P a n d N o v a 1 8 8 a t 1 5 m g / g g l u c a n l o a d i n g e a c h . n o 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 . 5 0 0 V ! N 0 2 . 5 0 I f ) N 0 0 V ! N 2 9 3 0 3 1 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 3 8 3 9 4 0 4 1 4 2 W W o N - N - m o o m o - n s n e o o e o 1 0 1 0 . g o n c m o m m o w o g o g g o 1 0 V i n - n . ° o N N N o o - n o m - n - n o o _ o 1 0 1 0 1 0 O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O C E c o n t r o l ( 3 0 m g / g g l u c a n ) . A « l a t o T v e G D d t S % 6 . 0 0 1 ) n a c u l g g / g m 0 3 ( l o r t n o c E C 5 5 5 . 0 0 0 . . 2 2 2 4 1 2 4 6 T a b l e 8 . 3 E n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f u n t r e a t e d ( U C S ) a n d c o n v e n t i o n a l A F E X ( A C S ) t r e a t e d c o r n s t o v e r b y v a r y i n g l o a d i n g s ( a s m g e n z y m e / g g l u c a n ) o f c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H 1 ! , E C 1 , , B G ) r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f g l u c o s e a n d c e l l o b i o s e . W h e r e ; % G a n d % 0 2 s t a n d f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n b a s e d o n g l u c o s e a n d c e l l o b i o s e y i e l d s , r e s p e c t i v e l y . C o m m e r c i a l e n z y m e ( C E ) c o n t r o l c o m p r i s e d o f S p e z y m e C P a n d N o v a 1 8 8 a t 1 5 m g / g g l u c a n l o a d i n g e a c h . E x p t # C B H I C B H [ 1 B C I [ 3 G U n t r e a t e d C o r n S t o v e r [ R e g u l a r A F E X - t r e a t e d C o r n S t o v e r G l u c o s e M e a n % G C e l l o b i o s e M e a n % G 2 S t d D e v % G 2 o — 1 0 2 . 5 0 2 . 5 I n N 0 0 V ? N 0 . 1 2 5 0 . 1 2 5 0 . 1 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 3 7 5 G l u c o s e M e a n N M V ' W O F O O O O H N . _ ‘ O O W O W W - — t o ~ ~ 0 . 2 5 0 . 2 5 0 . 2 5 - o £ o m o m ~ n o m o g o 2 2 0 “ “ 1 " ! o O N N N O O W O W W W O O H O 1 . 5 g 2 o f m 0 d s % e a s ( d i n r a p m s g n i G o d c r % e a o l l v ; o o e r t g r S t n e n i h o n y W c r r o ) a . C v e E s C d y e o ( b t i b e o a r m l e e l y v e z o c n r t t - s X d e n E n l a F r a A o e i c s c r o a r d e c l e t m u u l g a m g e e r f t o o R C [ ) n . o y S l C e i A ( t v a i m t c r X e o p E f s F e e h r 2 A t , G l n s i d % a n o l g e n i i i y t t n l e u v s e s o i n e o r b o c . ) l 1 h l d c n G c e a v a E d g D e e G ) I % , n n d S I a i t d S C U H e a s o ( B o l e C c s n d e u n o a G t I c e , a l a g c H u u % M e l r G B n l t n C u ( o g d g e / f s g s o m a e s a b s 5 l i 1 u n s y l o r l o t l i a e s c r 8 d e e 8 v 1 y r n h o o o c c c v i f o n o a N t a ) c m d n u y n a l z c a g n u E P l g % 4 C . r g 8 / o e e f m e y m d l z y n b e z a a n p t T e s S ) n a c u l g g / g m 0 3 ( l o r t n o c E C 9 0 2 3 4 5 1 2 3 3 3 3 3 3 2 4 7 U n t r e a t e d C o r n S t o v e r E x p t # C B H I C B H I I E G I B G C e l l o b i o s e M e a n 0 / 0 G 2 S t d D e v 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 . 5 0 0 " ’ 1 N 0 2 . 5 0 i n N 0 0 V ! 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P 7 8 r = n e * 4 1 ) 7 o i s s e r g e T d H B C 4 4 e 6 r . p 4 ( q = S — R S R 2 4 8 T a b l e 8 . 6 R e g r e s s i o n m o d e l ( b a s e d o n T a b l e V I - 8 . 5 ) p r e d i c t i n g % g l u c a n ( % G ) d i g e s t i b i l i t y f o r u n t r e a t e d A v i c e l ( U A I O , l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d A v i c e l ( A A 1 0 , u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ( U C S ) a n d A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r ( A C S ) a s a f u n c t i o n o f v a r y i n g c e l l u l a s e l o a d i n g ( C B H I , C B H I I a n d E G 1 ; t o t a l p r o t e i n l o a d i n g i s 1 6 . 5 m g / g g l u c a n i n c l u s i v e o f 1 . 5 m g / g g l u c a n fl G ) . T e r m C B H I 1 3 . 7 0 2 C B H 1 1 1 0 . 9 7 8 E G I 4 . 5 3 1 C B H 1 1 B O I C B H I 8 . 3 7 . 5 5 4 . 6 5 P a : a : a : C B H 1 * E G 1 7 5 . 9 6 5 0 0 C B H I I * E G I 3 7 . 1 1 3 0 . 0 8 5 . 3 C B H I * C B H I I * E G I 5 5 5 . 7 7 3 0 2 . 4 7 1 2 . 4 7 1 S = 1 1 . 2 8 8 3 P R E S S = 4 2 2 8 . 8 4 R - S q ( p r e d ) = 8 4 . 9 4 % R - S q ( a d j ) = 8 6 . 8 4 % o % 2 3 . | 2 9 7 = 2 7 ) 8 2 j . 5 d 6 a . 5 ( 9 7 q 9 8 S - = R J I S G 5 % S E 2 E * R . P 1 H 9 H = B 5 C 7 ) 7 d * e 1 I 2 r . p H ( 5 B q = S C - 8 R 5 5 5 1 7 7 7 7 3 3 3 4 . . . . 2 2 2 2 9 6 5 2 9 7 1 9 8 0 5 7 0 3 4 2 . 2 . . . . 5 . 7 1 4 2 2 1 1 1 , I I I I G G H I B ] E I E I * * C H I G I H I * B E B 1 C H H C B B C C H B C . . . d t n o C 6 . 8 e l b a T 2 4 9 T e r m R e g r e s s i o n T e r m s ( U C S % G ) C o e f fi c i e n t V I F R e g r e s s i o n T e r m s ( A C S % G ) T e r m C o e f fi c i e n t V I F 1 . 9 7 3 1 . 9 7 3 1 . 9 7 3 E G I 7 . 5 4 1 C B H 1 1 7 . 4 3 3 1 . 9 7 2 1 . 5 8 7 1 . 5 8 7 0 . C B H 1 * E G I 1 3 4 . 3 8 7 P : 1 : : 1 : C B H I 6 . 7 8 6 * 0 C B H I I * E G I 7 3 . 5 6 5 0 2 . 3 0 6 2 . 3 0 6 C B H I * C B H I I * E G I 1 0 1 . 9 0 4 P I t a . 1 1 0 0 0 0 0 | 2 . 0 6 1 S = 1 . 3 3 1 7 5 P R E S S = R - S q ( p r e d ) = 8 3 . 7 7 % R - S q ( a d j ) = 8 7 . 2 9 % 6 5 . 6 4 4 2 3 3 9 3 . 0 I G E — - . . . . . . . - o 4 2 5 0 F i g u r e 8 . 1 C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t f o r % g l u c a n c o n v e r s i o n ( A F E X c o r n s t o v e r o r A C S ) w i t h r e s p e c t t o r e f e r e n c e b l e n d a t o p t i m a l m i x t u r e c o m p o s i t i o n o f C B H I ( 3 4 . 6 7 % ) , C B H I I ( 2 6 % ) a n d E G I ( 3 9 . 3 3 % ) . S u m o f a l l t h r e e c e l l u l a s e l o a d i n g s i s e q u a l t o 1 5 m g / g g l u c a n . 1 . 5 m g / g g l u c a n o f [ 3 0 w a s a d d e d t o a l l m i x t u r e s t e s t e d ( S e e T a b l e V I - 8 . 5 f o r d e t a i l s ) . G l u c o s e R e s p o n s e w r t t o O p t i m u m M i x t u r e 6 0 - O p t i m u m M i x — C B H I 0 . 3 4 6 7 - — — - C B H I I 0 . 2 6 0 0 2 0 ‘ t n g a i / ; g e I t o m G r 5 p . E 1 e , v t I I i a t a d H l e B e r x C fi d v e g 5 3 2 7 l 2 0 7 7 0 9 3 , s I n a e D . . . . . . . . . . . i i 2 2 5 1 1 1 1 1 1 1 1 H y y w d t B g r C a n e S v i s ( o d s ; a l e X o y s fi l X 7 4 8 6 a . . . . a . . . . . . . n 9 6 0 2 2 2 0 l 6 9 9 5 e G 7 4 0 3 4 8 9 B 3 6 6 6 6 4 4 u , % , M l X l E e c . n a , y c b r u d v e l e l 7 4 9 9 9 5 8 7 2 4 0 r g e A i D . . . . . . . . . . . e v g y d o r / t o g e t S s s m e o 0 0 0 0 0 2 2 1 1 1 1 n 5 s r . a o 6 d c I i d s f c u l n 5 3 6 9 7 2 9 6 8 8 1 G a . . . . . . . . . . . 6 5 3 3 3 0 4 3 1 5 5 e o o e t n a a g % M 6 6 6 6 6 5 5 6 5 6 5 e r n r u i t f d o a X n o l r 5 5 5 5 5 5 7 2 7 7 2 2 5 E e . . i 0 O 0 6 . 6 8 8 b n F a i A . . 2 1 . . 3 1 1 0 0 A e r a t r - o a o r 5 5 7 7 2 2 5 5 5 5 5 f X 7 ( 2 p g 0 0 0 6 6 0 . 8 8 ) l n B . 3 . . 2 . 1 . . s e a r s t i 0 0 1 1 u a o l o d t a h d 5 5 u o 5 5 5 5 l l 7 7 5 2 2 4 l 0 0 6 6 0 0 . 8 8 e X 7 2 2 e n x . . E 3 . 2 . . . 1 ( c i fi 0 0 1 1 i e s m r d e o l f h e ) t o I r i G p y d n n a e E 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 5 . . . . . . . . . . 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 n c o u a i l t g ) a g v i I t I a 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 c H 5 n g l 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 fi i / e . . . . . . . . . . d e R 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 B i r a a m o y h z l C c n I c e n a i s g e t n o m 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 H 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 5 . . . . . . . . . . B 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 a C r l p a s y ( x l a d t o n s # H C l l n o t o t o a i d t n a n p x E 1 9 r r t t n n a n o o a c i u b e m l v G i o t c 8 a . l ) 8 e s r . g e n n l d i a d c b e a u a x l o T l g fi C C 2 5 1 N M V W O B O O O H o w e v e r , t h e a c t i v i t y o f t h e s i n g l e e n z y m e s ( w i t h B G s u p p l e m e n t a t i o n ) w a s s i g n i fi c a n t l y h i g h e r ( S O - 2 0 0 % i n c r e a s e ; d e p e n d i n g o n t y p e o f e n z y m e a n d t o t a l p r o t e i n l o a d i n g ) o n A P E X t r e a t e d v s . u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ( T a b l e 8 . 3 ) . I n t h e a b s e n c e o f B G , t h e a c t i v i t y o f t h e s i n g l e e n z y m e s w a s e v e n h i g h e r ( 9 0 0 - 2 0 0 0 % i n c r e a s e b a s e d o n c e l l o b i o s e r e l e a s e ) o n A F E X t r e a t e d v s . u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ( T a b l e 8 . 3 ) . T h e d i f f e r e n c e i n t h e a c t i v i t y o f p u r i fi e d e n z y m e s o n u n t r e a t e d a n d A P E X t r e a t e d c o r n s t o v e r i s l i k e l y d e p e n d e n t o n e n z y m e a c c e s s i b i l i t y . A P E X p r e t r e a t m e n t h a s b e e n s h o w n t o c r e a t e p o r e s w i t h i n t h e c e l l w a l l t h a t w o u l d s u b s t a n t i a l l y e n h a n c e c e l l u l a s e a c c e s s i b i l i t y t o e m b e d d e d c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s ( C h a p t e r 4 . 1 ) . T h e c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s a r e e m b e d d e d w i t h i n t h e c e l l w a l l s u r r o u n d e d b y h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n . I t w a s o f i n t e r e s t t o n o t e t h a t t h e p r o d u c t s o f h y d r o l y s i s f o r u n t r e a t e d v s . A P E X t r e a t e d c o r n s t o v e r ( i n t h e a b s e n c e o f B C ) w e r e v e r y d i f f e r e n t . T h e r e w a s a s i g n i fi c a n t l y h i g h e r a m o u n t o f c e l l o b i o s e r e l e a s e d b y C B H I a n d / o r C B H I I a c t i n g o n A P E X t r e a t e d c o r n s t o v e r . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t c e l l o b i o h y d r o l a s e s a r e m o r e e a s i l y a b l e t o a c t o n c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s w i t h i n A F E X t r e a t e d c e l l w a l l s , a s c o m p a r e d t o u n t r e a t e d c e l l w a l l s , p o s s i b l y d u e t o e n h a n c e d p o r o s i t y . I n t e r e s t i n g l y , i t w a s f o u n d t h a t t h e m a j o r p r o d u c t o f h y d r o l y s i s f o r u n t r e a t e d c o r n s t o v e r w a s g l u c o s e ( 8 . 3 % g l u c a n c o n v e r s i o n ; E x p t # 2 8 T a b l e 8 . 4 ) . O n t h e o t h e r h a n d , t h e m a j o r p r o d u c t o f h y d r o l y s i s f o r A F E X c o r n s t o v e r w a s c e l l o b i o s e ( 1 5 . 2 % g l u c a n c o n v e r s i o n ; E x p t # 2 8 T a b l e 8 . 4 ) . F o r b i n a r y e n z y m e s y s t e m s ( w i t h o r w i t h o u t 0 G ) , t h e h i g h e s t a c t i v i t y w a s O b t a i n e d o n l y f o r C B H I + E G I o r C B H I I + B C I b a s e d c o m b i n a t i o n s f o r b o t h A P E X a n d u n t r e a t e d c o r n s t o v e r . T h e s e r e s u l t s w e r e u n l i k e w h a t w a s s e e n f o r A v i c e l , w h e r e C B H I + C B H I ] g a v e t h e h i g h e s t a c t i v i t y c o m p a r e d t o E G I b a s e d b i n a r y c o m b i n a t i o n s . T h e s e r e s u l t s a r e n o t s u r p r i s i n g c o n s i d e r i n g A v i c e l a n d p l a n t c e l l w a l l s 2 5 2 h a v e d i f f e r i n g c o m p o s i t i o n s ( e . g . A v i c e l h a s l o w e r D P c e l l u l o s e w i t h 3 0 f o l d h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f a v a i l a b l e r e d u c i n g e n d s f o r C B H 1 a n d C B H I I t o a c t u p o n ) a n d u l t r a - s t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n o f t h o s e c o m p o n e n t s ( e . g . c o r n s t o v e r h a s h e m i c e l l u l o s e i n t e r l a c e d b e t w e e n c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s t h a t E G I c o u l d a c t u p o n ) . F o r t e r n a r y e n z y m e s y s t e m s , i n c l u d i n g a l l t h r e e c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I + C B H I I + E C 1 ) , t h e a c t i v i t y w a s 3 — 4 f o l d h i g h e r ( w i t h [ 3 6 s u p p l e m e n t a t i o n ) f o r A P E X t r e a t e d v s . u n t r e a t e d c o r n s t o v e r . T h e i m p r o v e m e n t i n % g l u c a n c o n v e r s i o n w a s 2 . 5 - 3 f o l d f o r A F E X c o r n s t o v e r , i n t h e a b s e n c e o f [ 3 6 . T h e m a j o r p r o d u c t o f h y d r o l y s i s f o r a l l t e r n a r y e n z y m e c o m b i n a t i o n s ( a t 7 . 5 , 1 5 a n d 3 0 m g t o t a l e n z y m e / g g l u c a n ) w a s m o s t l y g l u c o s e f o r u n t r e a t e d c o r n s t o v e r . O n t h e o t h e r h a n d , c e l l o b i o s e w a s t h e m a j o r e n d - p r o d u c t o f h y d r o l y s i s f o r A P E X t r e a t e d c o r n s t o v e r . T h e s e r e s u l t s a r e a n i n d i c a t i o n o f t h e e n h a n c e d a c c e s s i b i l i t y o f c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s t o c e l l o b i o h y d r o l a s e s f o r A F E X t r e a t e d c e l l w a l l s a s c o m p a r e d t o u n t r e a t e d c o r n s t o v e r . T h e d e g r e e o f s y n e r g i s t i c e f f e c t ( D S E ) b e t w e e n C B H I a n d C B H 1 1 o n u n t r e a t e d a v i c e l a n d c o r n s t o v e r r a n g e s b e t w e e n 1 . 8 - 2 . 1 a n d 0 . 6 - 1 . 2 , r e s p e c t i v e l y . I n t e r e s t i n g l y , f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I I I ( l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d A v i c e l ) r e s u l t s i n s i g n i fi c a n t e n h a n c e m e n t o f D S E b e t w e e n C B H I - C B H I I t o 2 . 7 - 3 . 5 f r o m 1 . 7 - 2 . 1 f o r n a t i v e c e l l u l o s e I . T h i s i m p r o v e m e n t i n h y d r o l y s i s y i e l d i s l i k e l y d u e t o t h e p a r t i a l e n d o - a c t i v i t y o f C B H 1 1 [ 2 0 7 , 4 9 1 ] , w h i c h m a y r e s u l t i n e n h a n c e d s y n e r g y w i t h C B H I . I t i s l i k e l y t h a t t h e o v e r a l l r a t e e n h a n c e m e n t f o r C B H I - C B H I I m i x t u r e o n c e l l u l o s e I I I i s t h r o u g h a c u r r e n t l y u n k n o w n m e c h a n i s m . H o w e v e r , u n l i k e c e l l u l o s e I I I A v i c e l , t h e r e i s n o s i g n i fi c a n t c h a n g e i n t h e D S E v a l u e s b e t w e e n u n t r e a t e d a n d A P E X t r e a t e d c o r n s t o v e r f o r C B H I - C B H I I . T h i s r e s u l t i s n o t s u r p r i s i n g , s i n c e t h e r e i s n o s i g n i fi c a n t m o d i fi c a t i o n o f 2 5 3 c e l l u l o s e c r y s t a l s t r u c t u r e ( i . e . f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e 1 1 1 ) d u r i n g c o n v e n t i o n a l A F E X p r e t r e a t m e n t ( C h a p t e r 4 . 2 ) . T h e D S E b e t w e e n C B H I a n d E G I i s t y p i c a l l y g r e a t e r t h a n C B H H a n d E C 1 ( D S E a b s o l u t e v a l u e d e p e n d s o n s u p p l e m e n t a t i o n o f [ 3 G , d u e t o i n h i b i t i o n o f C B H b y r e s i d u a l c e l l o b i o s e ) . I t w a s a l s o f o u n d t h a t t h e d i f f e r e n c e i n D S E b e t w e e n C B H I - E G I a n d C B H I I - E G I i s g r e a t e r o n a m m o n i a t r e a t e d c e l l u l o s i c b i o m a s s c o m p a r e d t o n a t i v e , u n t r e a t e d c e l l u l o s e f o r b o t h A v i c e l a n d c o r n s t o v e r . T h i s i s l a r g e l y d u e t o t h e f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I I I a n d e n h a n c e d c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l a c c e s s i b i l i t y d u r i n g a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t m e n t o f A v i c e l a n d c o r n s t o v e r , r e s p e c t i v e l y . T h e e n z y m e m i x t u r e c o m p o s i t i o n a n d % g l u c a n c o n v e r s i o n d a t a ( T a b l e V I - 8 . S ) w e r e a n a l y z e d a s fi x e d a m o u n t ( i . e . t o t a l e n z y m e l o a d i n g i s c o n s t a n t ) m i x t u r e r e g r e s s i o n t o d e v e l o p a s t a t i s t i c a l l y b a s e d p r e d i c t i v e m o d e l f o r h y d r o l y s i s o f A v i c e l a n d c o r n s t o v e r . T h e r e g r e s s i o n m o d e l t e r m s a n d c o e f fi c i e n t s a r e g i v e n i n T a b l e 8 . 6 . T h e m o d e l c o e f fi c i e n t s a r e r e p r e s e n t a t i v e o f t h e d e g r e e o f i m p o r t a n c e o f e a c h i n d i v i d u a l e n z y m e a n d i t s s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s w i t h o t h e r c e l l u l a s e s d e p e n d i n g o n t h e s u b s t r a t e . T h o u g h C B H I h a d t h e h i g h e s t s i n g l e t e r m r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t f o r u n t r e a t e d A v i c e l ; B O 1 a n d C B H 1 1 h a d h i g h e r r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t s f o r a m m o n i a t r e a t e d A v i c e l . T h i s i s n o t s u r p r i s i n g c o n s i d e r i n g C B H I I i s k n o w n t o h a v e a p a r t i a l e n d o - a c t i v i t y t h a t w o u l d s e e a s i g n i fi c a n t e n h a n c e m e n t i n h y d r o l y s i s r a t e d u e t o f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e I I I . T h e o p t i m i z e d m i x t u r e c o m p o s i t i o n ( c o m p r i s e d o f C B H I , C B H I I a n d E G I ) a n d p r e d i c t e d r e s p o n s e s f o r A P E X c o r n s t o v e r a r e s h o w n i n F i g u r e 8 . 1 ( a s a f u n c t i o n o f r e l a t i v e e n z y m e l o a d i n g w i t h r e s p e c t t o r e f e r e n c e o p t i m a l b l e n d t o d e p i c t s e n s i t i v i t y o f y i e l d t o m i x t u r e c o m p o s i t i o n ) . T h e o p t i m a l c o m p o s i t i o n ( b a s e d o n % p r o t e i n m a s s l o a d i n g ) o f t h e c o r e c e l l u l a s e c o c k t a i l ( a t 1 6 . 5 m g / g g l u c a n ; i n c l u s i v e o f 1 . 5 m g / g g l u c a n o f B C ) t h a t m a x i m i z e d A P E X c o m 2 5 4 s t o v e r g l u c a n d i g e s t i b i l i t y c o n s i s t e d o f C B H I ( 3 4 . 6 7 % ) , C B H I I ( 2 6 % ) a n d E G 1 ( 3 9 . 3 3 % ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e r e l a t i v e r a t i o s o f t h e t h r e e c e l l u l a s e s a r e c o m p a r a b l e t o t h e p r e d i c t e d o p t i m u m c o c k t a i l c o m p r i s i n g o f c e l l u l a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e s h y d r o l y z i n g A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r [ 4 5 3 ] . T h e i n c l u s i o n o f h e m i c e l l u l a s e s r e s u l t s i n s l i g h t l y h i g h e r g l u c a n c o n v e r s i o n , p o s s i b l y t h r o u g h m i n i m i z i n g x y l o - o l i g o m e r s e n d - p r o d u c t i n h i b i t i o n a n d m a x i m i z i n g c e l l u l o s e a c c e s s i b i l i t y b y h y d r o l y s i s o f i n s o l u b l e h e m i c e l l u l o s e . 8 . 1 . 4 . 4 E f f e c t o f h e m i c e l l u l a s e s u p p l e m e n t a t i o n o n A F E X c o r n s t o v e r d i g e s t i b i l i t y T h e e f f e c t o f s u p p l e m e n t a t i o n o f h e m i c e l l u l a s e s ( i . e . e n d o x y l a n a s e , B - x y l o s i d a s e , O t - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e ) o n A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r w a s t e s t e d a t a fi x e d t o t a l p r o t e i n l o a d i n g ( c o m p a r a b l e t o p r e v i o u s e x p e r i m e n t s i n C h a p t e r 7 ) . T h e t o t a l p r o t e i n l o a d i n g w a s fi x e d a t 1 6 . 5 m g / g g l u c a n w i t h [ 3 G l o a d e d a t 1 . 5 m g / g g l u c a n t o p r e v e n t c e l l o b i o s e i n h i b i t i o n . T h e i n d i v i d u a l r a t i o s o f t h e o t h e r e n z y m e s ( C B H I , C B H 1 1 , B O 1 , E X , B X , A e r ) w e r e v a r i e d t o s t u d y s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e v a r i o u s g l y c o s y l h y d r o l a s e s . F r o m T a b l e V I - 8 . 7 ( E x p e r i m e n t a l d a t a # 1 - 3 1 f r o m [ 4 5 3 ] ) a n d T a b l e 8 . 8 ( E x p e r i m e n t s # 1 - 9 ) , t h e m i x t u r e o f e n z y m e s t h a t g a v e t h e h i g h e s t g l u c a n a n d x y l a n h y d r o l y s i s y i e l d c o n t a i n e d a l l g l y c o s y l h y d r o l a s e s ( T a b l e V I - 8 . 7 # 3 1 a n d T a b l e 8 . 8 # 7 ) . R e p l a c i n g t h e c e l l u l a s e m a s s fi a c t i o n w i t h h e m i c e l l u l a s e s ( T a b l e V 1 - 8 . 7 # 2 9 ) h e l p e d i n c r e a s e x y l a n c o n v e r s i o n b y 5 0 0 - 1 0 0 0 % ( w i t h r e s p e c t t o T a b l e V 1 8 . 7 # 7 ) w i t h o u t s i g n i fi c a n t l y a f f e c t i n g t h e g l u c a n y i e l d . O n t h e c o n t r a r y , t h e r e w a s a 2 0 % i n c r e a s e i n g l u c a n c o n v e r s i o n u p o n a d d i t i o n o f a n e n d o x y l a n a s e ( T a b l e 8 . 8 C o n t r o l C v s . # 1 ) . S e l i g e t a l . r e p o r t e d 8 0 - 1 5 0 % i n c r e a s e i n x y l a n c o n v e r s i o n ( t o x y l o b i o s e ) d u e t o s u p p l e m e n t a t i o n O f C B H I w i t h a n e n d o x y l a n a s e ( f r o m T h e r m o m y c e s l a n u g i n o s u s ) a n d a 2 5 5 c o r r e s p o n d i n g 1 5 - 2 0 % i n c r e a s e i n g l u c a n c o n v e r s i o n ( t o c e l l o b i o s e ) d u r i n g h y d r o l y s i s o f h o t w a t e r t r e a t e d c o r n s t o v e r [ 4 5 8 , 4 7 7 ] . H o w e v e r , i n t h o s e e x p e r i m e n t s t h e t o t a l p r o t e i n l o a d i n g w a s 5 - 1 5 % h i g h e r f o r t h e e n d o x y l a n a s e s u p p l e m e n t a t i o n m i x t u r e u n l i k e t h e c u r r e n t s e t o f e x p e r i m e n t s w h e r e t h e t o t a l p r o t e i n l o a d i n g i s c o n s t a n t . T h e s e e x p e r i m e n t s s u g g e s t t h a t e n d o x y l a n a s e s h e l p e n h a n c e c e l l u l o s e a c c e s s i b i l i t y b a s e d o n t h e i m p r o v e m e n t s e e n i n g l u c a n d i g e s t i b i l i t y u p o n s u p p l e m e n t a t i o n o f e n d o x y l a n a s e t o C B H 1 . I n d i v i d u a l e n z y m e s ( s u p p l e m e n t e d a l o n g w i t h B G ) r e s u l t e d i n p o o r g l u c a n a n d x y l a n h y d r o l y t i c y i e l d s ( T a b l e V I - 8 . 7 # 1 v s . # 5 ) . S i g n i fi c a n t x y l a n c o n v e r s i o n w a s o b t a i n e d b y o n l y E C 1 ( T a b l e V I - 8 . 7 # 3 ) , w h i c h i s n o t u n e x p e c t e d b a s e d o n i t s s i g n i fi c a n t o a t s p e l t x y l a n a c t i v i t y . I t m a y b e p o s s i b l e t h a t b i - f u n c t i o n a l e n z y m e s l i k e E C 1 h a v e a n a d v a n t a g e o v e r e n d o g l u c a n a s e s f r o m o t h e r G H f a m i l i e s ( e . g . G H 5 , G H 1 2 , G H 6 1 ) . T h i s i s b e c a u s e c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s a r e t h o u g h t t o b e e n c l o s e d w i t h i n h e m i c e l l u l o s e r i c h s h e a t h s [ 5 5 ] t h a t w o u l d h i n d e r t h e a c t i v i t y o f m o n o - f u n c t i o n a l e n d o g l u c a n a s e s . F o r b i n a r y e n z y m e c o m b i n a t i o n s ( T a b l e V I - 8 . 7 # 6 t o # 1 5 ) , C B H I / E G I m i x t u r e ( # 7 ) g a v e t h e h i g h e s t g l u c o s e y i e l d ( 4 7 . 9 % ) a n d E X / B X m i x t u r e ( # 1 5 ) g a v e t h e h i g h e s t x y l o s e y i e l d ( 4 9 . 6 % ) f o l l o w e d b y E G I / B X ( # 1 4 , 3 6 % ) l i k e l y d u e t o E G 1 ’ s x y l a n c r o s s - a c t i v i t y . I n t e r e s t i n g l y , i t w a s p o s s i b l e t o a c h i e v e c l o s e t o 5 0 % x y l a n c o n v e r s i o n i n t h e a b s e n c e o f a n y c e l l u l a s e s ( < 2 % g l u c a n c o n v e r s i o n , # 1 5 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e c e l l w a l l u l t r a - s t r u c t u r e i s s i g n i fi c a n t l y m o d i fi e d d u r i n g A F E X p r e t r e a t m e n t ( C h a p t e r 4 . 1 ) t h a t a l l o w e d s i g n i fi c a n t e n h a n c e d e n z y m a t i c a c c e s s i b i l i t y t o b o t h g l u c a n a n d x y l a n f r a c t i o n s , u n l i k e u n t r e a t e d c e l l w a l l s ( T a b l e 8 . 2 a n d 8 . 3 ) [ 4 9 2 ] . I n t e r e s t i n g l y , e v e n t h o u g h C B H I I h a d s i g n i fi c a n t l y h i g h e r a c t i v i t y ( 4 2 % h i g h e r ) o n c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e t h a n C B H I , t h e 2 5 6 l a t t e r r e s u l t e d i n s i g n i fi c a n t l y h i g h e r c o n v e r s i o n s ( 4 5 - 5 0 % h i g h e r ) i n b i n a r y / t e m a r y / q u a r t e n a r y m i x t u r e s t h a t h a d e i t h e r o n e O f t h e C B H ’ s ( C o m p a r e # 7 v s . 1 0 ; 1 9 v s . 2 2 ; 2 9 v s . 3 0 ) . T h i s r e s u l t r e i t e r a t e s t h e i m p o r t a n c e o f o p t i m i z i n g e n z y m e c o c k t a i l s o n p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s a n d n o t a r t i fi c i a l c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s l i k e A v i c e l [ 3 8 5 ] . F o r t e r n a r y e n z y m e c o m b i n a t i o n s ( # 1 6 t o # 2 5 ) , C B H I / C B H I I / E G 1 m i x t u r e ( # 1 6 ) g a v e t h e h i g h e s t g l u c o s e y i e l d b u t v e r y l o w x y l o s e y i e l d . B i n a r y m i x t u r e s o f C B H I + B C I s y n e r g i z e d t o g e t h e r t o g i v e h i g h e r c o m b i n e d g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n ( 1 . 5 — 2 . 5 f o l d , # 7 ) c o m p a r e d t o C B H I + E X , C B H I I + B O 1 a n d C B H I I + E X . H o w e v e r , f o r t e r n a r y s y s t e m s t h a t i n c l u d e d C B H I I t h e c o m b i n e d g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n s f o r C B H I + C B H I I w i t h e i t h e r E G I o r E X a r e r e m a r k a b l y s i m i l a r . T h i s s u g g e s t s t h a t p r e s e n c e o f C B H 1 1 r e d u c e s t h e a d v a n t a g e o f E 6 I o v e r E X w h e n s y n e r g i z i n g w i t h C B H I a l o n e , p o s s i b l y d u e t o t h e m i n o r e n d o - a c t i v i t y t y p i c a l l y s e e n f o r C B H I I [ 4 9 1 ] . I n o r d e r t o g e t h i g h e r x y l o s e y i e l d s , e i t h e r a B C I - B X o r E X - B X c o m b i n a t i o n i s n e c e s s a r y . F o r q u a r t e m a r y e n z y m e c o m b i n a t i o n s ( # 2 6 t o # 3 0 ) , w i t h o u t B X , x y l a n c o n v e r s i o n d r o p p e d d r a m a t i c a l l y ( # 2 6 ) a n d w i t h o u t C B H I , g l u c a n c o n v e r s i o n d e c r e a s e d a s w e l l ( # 3 0 ) . T E M i m a g i n g r e s u l t s f r o m p r e v i o u s c h a p t e r s a l o n g w i t h o t h e r p u b l i s h e d w o r k s e e m t o s u g g e s t t h a t e l e m e n t a r y c e l l u l o s e fi b r i l s a r e c o a t e d w i t h a t h i n l a y e r o f h e m i c e l l u l o s e ( p r o b a b l y u n b r a n c h e d h e m i c e l l u l o s e s t o a l l o w s t r o n g e r h y d r o g e n b o n d i n g w i t h c e l l u l o s i c fi b r i l s ) [ 5 5 , 4 9 3 ] . H y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e w o u l d b e i m p e d e d b y s t e r i c i n h i b i t i o n d u e t o t h e h e m i c e l l u l o s e c o a t i n g t h a t m u s t b e h y d r o l y z e d i n o r d e r t o e n h a n c e c e l l u l a s e a c c e s s i b i l i t y . T h i s w o u l d r e s u l t i n s t r o n g s y n e r g y b e t w e e n c e l l u l a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e s ( T a b l e V I - 8 . 7 E x p e r i m e n t s # 2 6 , 3 1 v s . 1 6 ) . T h i s c o u l d a l s o e x p l a i n t h e s i g n i fi c a n t c r o s s - a c t i v i t y o f B O 1 o n h e m i c e l l u l o s e t h a t w o u l d e n h a n c e a c c e s s i b i l i t y o f 2 5 7 c e l l u l a s e s t o t h e u n d e r l y i n g c e l l u l o s e fi b r i l s . H y d r o l y s i s o f h e m i c e l l u l o s e w r a p p e d a r o u n d g l u c a n m i c r o fi b r i l s w o u l d h e l p i n c r e a s e c e l l u l o s e a c c e s s i b i l i t y [ 4 6 4 ] a n d p r e v e n t c e l l u l a s e i n h i b i t i o n v i a h e m i c e l l u l o s e o l i g o m e r s [ 4 5 9 ] . F r o m T a b l e V I - 8 . 7 a n d T a b l e 8 . 8 , i t i s n o t s u r p r i s i n g t o fi n d t h a t C B H I , C B H H a n d E G I a r e c r i t i c a l f o r g l u c a n h y d r o l y s i s ; w h i l e B O 1 , E X , B X a n d A e r a r e i m p o r t a n t f o r x y l a n h y d r o l y s i s . T h e h i g h e s t x y l o s e y i e l d w a s b e l o w 5 0 % i n t h e a b s e n c e o f A e r ( C o n t r o l H , T a b l e 8 . 8 ) . T h i s i s p r o b a b l y d u e t o t h e l a c k o f o t h e r a c c e s s o r y e n z y m e a c t i v i t i e s s u c h a s a - a r a b i n o fi n a n o s i d a s e , f e r u l o y l / a c e t y l x y l a n e s t e r a s e s , p e c t i n a s e s a n d a - g l u c u r o n i d a s e . S u p p l e m e n t a t i o n o f C B H I , C B H 1 1 , E C 1 , E X , B X a n d B G c o c k t a i l w i t h p u r i fi e d o r - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e r e s u l t e d i n 3 0 % i n c r e a s e i n x y l a n h y d r o l y s i s y i e l d s ( T a b l e 8 . 8 , E x p t # 6 - 8 v s . C o n t r o l H ) . T h e s e r e s u l t s ( C o n t r o l C v s . H , T a b l e 8 . 8 ) a l s o v a l i d a t e e a r l i e r fi n d i n g s t h a t h e m i c e l l u l a s e s u p p l e m e n t a t i o n c a n h e l p r e d u c e c e l l u l a s e l o a d i n g w h i l e g i v i n g h i g h e r o v e r a l l h y d r o l y s i s y i e l d s [ 4 8 , 4 5 8 , 4 7 7 , 4 7 9 , 4 9 4 , 4 9 5 ] . T h e s e r e s u l t s a l s o s u g g e s t t h a t o t h e r a c c e s s o r y e n z y m e s w o u l d b e c r i t i c a l i n f u r t h e r e n h a n c i n g t h e h e m i c e l l u l o s e h y d r o l y s i s y i e l d i n o r d e r t o m i n i m i z e t o t a l p r o t e i n l o a d i n g a n d m a x i m i z e h y d r o l y s i s y i e l d s . T h e e n z y m e m i x t u r e c o m p o s i t i o n a n d % g l u c a n c o n v e r s i o n d a t a ( T a b l e 8 . 8 ) w e r e a n a l y z e d a s fi x e d a m o u n t ( i . e . t o t a l e n z y m e l o a d i n g i s c o n s t a n t ) m i x t u r e r e g r e s s i o n t o d e v e l o p a s t a t i s t i c a l l y b a s e d p r e d i c t i v e m o d e l f o r x y l a n h y d r o l y s i s ( A P E X c o r n s t o v e r ) . T h e r e g r e s s i o n m o d e l t e r m s a n d c o e f fi c i e n t s a r e g i v e n i n T a b l e 8 . 9 . T h e m o d e l c o e f fi c i e n t s i n d i c a t e t h a t E X , B X a n d A e r w o r k s y n e r g i s t i c a l l y t o h e l p i n c r e a s e x y l a n h y d r o l y s i s y i e l d s . I n t e r e s t i n g l y , t h o u g h B X h a d t h e h i g h e s t s i n g l e t e r m r e g r e s s i o n 2 5 8 c o e f fi c i e n t ; E X a n d A e r h a d s i g n i fi c a n t s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s c o n t r i b u t i n g t o b i n a r y a n d t e r n a r y t e r m c o e f fi c i e n t s . T a b l e 8 . 9 R e g r e s s i o n m o d e l ( b a s e d o n d a t a f r o m T a b l e 8 . 8 ) p r e d i c t i n g % x y l a n ( % [ U d i g e s t i b i l i t y f o r A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r ( A C S ) a s a f u n c t i o n o f h e m i c e l l u l a s e l o a d i n g ( E X , fi X , A e r a s m g / g g l u c a n ) . R e g r e s s i o n T e r m s ( A C S % X ) T e r m C o e f f i c i e n t P V I F B X 3 5 . 5 1 * 1 . 9 7 2 E X 1 5 . 2 3 * 1 . 5 8 7 A e r 1 1 . 1 7 " ' 1 . 5 8 7 B X * A e r 1 0 3 . 5 8 0 2 . 3 0 6 E X * B X 9 9 . 9 1 0 2 . 3 0 6 m 8 9 0 . 1 4 0 2 . 0 6 1 S = 9 . 2 4 8 2 7 P R E S S = 3 6 3 4 . 2 6 R - S q ( p r e d ) = 8 2 . 6 9 % R - S q ( a d j ) = 8 4 . 1 1 % T h e o p t i m i z e d m i x t u r e c o m p o s i t i o n s ( c o m p r i s i n g o f E X , B X a n d A e r ) a n d p r e d i c t e d r e s p o n s e s f o r A F E X c o r n s t o v e r a r e s h o w n i n F i g u r e 8 . 2 ( a s a f u n c t i o n o f r e l a t i v e e n z y m e l o a d i n g w i t h r e s p e c t t o r e f e r e n c e o p t i m a l b l e n d t o d e p i c t s e n s i t i v i t y o f y i e l d t o m i x t u r e c o m p o s i t i o n ) . T h e O p t i m a l c o m p o s i t i o n ( b a s e d o n % p r o t e i n m a s s l o a d i n g ) o f t h e c o r e c e l l u l a s e c o c k t a i l ( a t 1 6 . 5 m g / g g l u c a n ; i n c l u s i v e o f 1 . 5 m g / g g l u c a n o f B G ) t h a t m a x i m i z e d A F E X c o r n s t o v e r g l u c a n d i g e s t i b i l i t y c o n s i s t e d o f C B H I ( 3 4 . 6 7 % ) , C B H I I ( 2 6 % ) a n d E C 1 ( 3 9 . 3 3 % ) . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t t h e r e l a t i v e r a t i o o f C B H I t o C B H 1 1 b a s e d o n t h e c u r r e n t p u r i fi e d e n z y m e o p t i m a l m i x t u r e i s a b o u t 1 . 3 ( b a s e d o n F i g u r e 8 . 1 ) ; w h e r e a s , t h i s r a t i o w a s a b o u t 2 b a s e d o n t h e p r o t e o m i c s c o m p o s i t i o n a l a n a l y s i s o f t h e t o p 5 % C E - R E m i x t u r e s t h a t g a v e t h e h i g h e s t g l u c a n c o n v e r s i o n s ( F i g u r e 7 . 7 ) . T h e r e l a t i v e r a t i o o f C B H I t o C B H I I r a n g e s b e t w e e n 2 . 6 - 3 f o r R E 1 , R E 4 , R E 8 a n d C E 1 ( b a s e d o n p r o t e o m i c s b a s e d c o m p o s i t i o n ; T a b l e 7 . 2 ) . I t i s 2 5 9 l i k e l y t h a t i n c l u s i o n o f o t h e r p u r i fi e d e n z y m e s t o m a x i m i z e b o t h g l u c a n a n d x y l a n c o n v e r s i o n w o u l d r e s u l t i n a d i f f e r e n t o p t i m a l e n z y m e c o m p o s i t i o n . F i g u r e 8 . 2 C o x - r e s p o n s e t r a c e p l o t f o r % x y l a n c o n v e r s i o n ( A F E X c o r n s t o v e r o r A C S ) w i t h r e s p e c t t o r e f e r e n c e b l e n d a t o p t i m a l m i x t u r e c o m p o s i t i o n o f E X ( 2 9 . 0 7 % ) , fl X ( 4 2 . 6 7 % ) a n d A e r ( 2 8 . 2 7 % ) . S u m o f a l l t h r e e h e m i c e l l u l a s e l o a d i n g s i s e q u a l t o 3 . 7 5 m g / g g l u c a n ( S e e T a b l e 8 . 8 ) . C e l l u l a s e l o a d i n g ( C B H I , C B H 1 1 , E C 1 ) w a s fi x e d a t 1 1 . 2 5 m g / g g l u c a n a l o n g w i t h 1 . 5 m g / g g l u c a n , B G . X y l o s e R e s p o n s e w r t O p t i m u m M i x t u r e 7 5 _ - O p t i m u m M i x — E X 0 . 2 9 0 7 — - — - — - b X 0 . 4 2 6 7 - ~ ~ A e r 0 . 2 8 2 7 5 0 ‘ / / I I 2 5 - I I I I I 0 - . . - 0 4 0 . 0 O 4 O 8 8 . 1 . 5 C o n c l u s i o n s S y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s a m o n g s t c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H I I , E G 1 , B G ) f o r v a r y i n g t o t a l p r o t e i n l o a d i n g ( 2 . 5 - 3 1 . 5 m g e n z y m e / g g l u c a n ) d u r i n g h y d r o l y s i s o f u n t r e a t e d ( c e l l u l o s e I ) a n d l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d c e l l u l o s e ( c e l l u l o s e I I I ) r e s u l t e d i n a 2 - f o l d h i g h e r s p e c i fi c a c t i v i t y f o r B C I ( w i t h o r w i t h o u t C B H ’ s ) o n a m m o n i a t r e a t e d c e l l u l o s e c o m p a r e d t o n a t i v e c e l l u l o s e . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t t h e o v e r a l l e n h a n c e m e n t i n t h e h y d r o l y t i c r a t e o f c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e 1 1 1 v s . 1 1 3 i s l a r g e l y d u e t o i n c r e a s e d a c t i v i t y o f 2 6 0 e n d o g l u c a n a s e s . I t w a s a l s o f o u n d t h a t u n l i k e w h a t h a s b e e n r e p o r t e d e a r l i e r f o r A v i c e l , C B H l a n d C B H I I h a d v e r y l i t t l e s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n ( D S E ~ 1 ) o n A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r . A c c e s s i b i l i t y o f c r y s t a l l i n e c e l l u l o s i c m i c r o fi b r i l s w i t h i n l i g n o c e l l u l o s i c c e l l w a l l s w a s g r e a t l y e n h a n c e d a fi e r A P E X . T h i s o b s e r v a t i o n i s b a s e d o n t h e d i f f e r e n c e i n t h e h y d r o l y s i s b y - p r o d u c t s r e l e a s e d ( r a t i o o f c e l l o b i o s e t o g l u c o s e ) d u r i n g s a c c h a r i fi c a t i o n o f u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r b y v a r i o u s c o m b i n a t i o n s o f C B H I , C B H I I a n d B O 1 . H e m i c e l l u l a s e s p l a y e d a c r i t i c a l r o l e i n e n h a n c i n g t h e g l u c a n h y d r o l y s i s o f A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r . T h e o p t i m a l c o m p o s i t i o n ( b a s e d o n % p r o t e i n m a s s l o a d i n g ) o f t h e c o r e c e l l u l a s e c o c k t a i l t h a t m a x i m i z e d A P E X c o r n s t o v e r g l u c a n d i g e s t i b i l i t y c o n s i s t e d o f C B H I ( 3 4 . 6 7 % ) , C B H I I ( 2 6 % ) a n d E G I ( 3 9 . 3 3 % ) . I n c o n t r a s t , t h e o p t i m a l c o m p o s i t i o n o f t h e c o r e h e m i c e l l u l a s e c o c k t a i l ( w i t h fi x e d e q u i m a s s c o r e c e l l u l a s e l o a d i n g ) t h a t m a x i m i z e d A P E X c o r n s t o v e r x y l a n d i g e s t i b i l i t y c o n s i s t e d o f E X ( 2 9 . 0 7 % ) , B X ( 4 2 . 6 7 % ) a n d A e r ( 2 8 . 2 7 % ) . C u r r e n t r e s u l t s s u g g e s t i n c l u s i o n o f h e m i c e l l u l a s e s a n d o t h e r c e l l u l o l y t i c e n z y m e s t o p r o d u c e a n o p t i m u m e n z y m e c o c k t a i l ( c o m p r i s e d o f C B H I , C B H 1 1 , E C 1 , E X , A e r , B C , B X ) i n o r d e r t o f u r t h e r e n h a n c e t h e o v e r a l l g l u c a n a n d x y l a n d i g e s t i b i l i t y o f A P E X p r e t r e a t e d c e l l w a l l s . 2 6 1 C H A P T E R 9 : C O N C L U S I O N S A N D R E C O M M E N D A T I O N S F O R F U T U R E R E S E A R C H T h e e f f e c t o f a m m o n i a b a s e d t r e a t m e n t s ( e . g . A P E X ) o n c o r n s t o v e r c e l l w a l l u l t r a - s t r u c t u r e a n d c h e m i c a l c o m p o s i t i o n w a s e x p l o r e d t h r o u g h s e v e r a l s p e c t r o s c o p i c , s p e c t r o m e t r i c a n d m i c r o s c o p i c t e c h n i q u e s . T h i s i s a n i m p o r t a n t s t e p t o w a r d s b r i d g i n g t h e g a p o f l i m i t e d u n d e r s t a n d i n g o f t h e r o l e o f a m m o n i a b a s e d t r e a t m e n t s o n p l a n t c e l l w a l l p h y s i c o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s t h a t u l t i m a t e l y a f f e c t t h e i r r a t e o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . C o n v e n t i o n a l A F E X ( a t 1 : 1 a n d 0 . 6 2 1 a m m o n i a a n d w a t e r l o a d i n g , r e s p e c t i v e l y ) i s n o t a h i g h l i q u i d - t o - s o l i d s l o a d i n g b a s e d fl o w - t h r o u g h p r e t r e a t m e n t ( u n l i k e d i l u t e a c i d a n d a m m o n i a r e c y c l e p e r c o l a t i o n ) t h a t c o n t i n u a l l y l e a c h t h e c e l l w a l l , p h y s i c a l l y e x t r a c t i n g l i g n i n a n d h e m i c e l l u l o s e i n t o a s e p a r a t e l i q u i d p r o c e s s s t r e a m . T h e u l t r a - s t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n s w i t h i n a m m o n i a t r e a t e d c e l l w a l l s ( F i g u r e 9 . 1 ) a r e v e r y d i f f e r e n t f r o m c o n v e n t i o n a l a c i d i c t r e a t m e n t s a n d a r e c l o s e l y d e p e n d e n t o n p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s ( a m m o n i a / w a t e r l o a d i n g , t e m p e r a t u r e , r e a c t i o n t i m e ) . L i q u i d a m m o n i a i s r e s p o n s i b l e f o r s w e l l i n g c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e I p c r y s t a l p o l y m o r p h s i n n a t i v e p l a n t c e l l w a l l s t o c e l l u l o s e I I I ] , w h i c h h a s a n e a r l y t w o - f o l d h i g h e r e n z y m a t i c d i g e s t i o n r a t e t h a n n a t i v e c e l l u l o s e . H o w e v e r , p r e s e n c e o f w a t e r d u r i n g c o n v e n t i o n a l A F E X r e s u l t s i n n e a r c o m p l e t e r e v e r s i o n o f c e l l u l o s e I I I t o I . T h e e x t e n t o f e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y f o r t h e v a r i o u s p o l y m o r p h s o f c e l l u l o s e w e r e f o u n d t o v a r y i n t h e f o l l o w i n g o r d e r ; A m o r p h o u s C e l l u l o s e > C e l l u l o s e 1 1 1 > C e l l u l o s e I I > C e l l u l o s e I . A m m o n i a w a s a l s o f o u n d t o c h e m i c a l l y m o d i f y t h e l i g n i n - c a r b o h y d r a t e c o m p l e x e s v i a c l e a v a g e o f e s t e r l i n k a g e s t h r o u g h a m m o n o l y s i s ( b y N 1 1 3 ) o r h y d r o l y s i s ( b y O H - ) . T h e v a r i o u s c e l l w a l l d e c o m p o s i t i o n p r o d u c t s a n d a l k a l i e x t r a c t i v e s l i k e a r a b i n o x y l a n o l i g o m e r s , a m m o n o l y s i s b y p r o d u c t s 2 6 2 ( a c e t a r r r i d e , p h e n o l i c a m i d e s ) , p e e l i n g r e a c t i o n p r o d u c t s ( l a c t i c a c i d ) , m i d d l e l a m e l l a c o m p o n e n t s ( p o s s i b l y b o u n d t o c a l c i u m ) a n d o t h e r l i g n i n r i c h r e s i d u e s a r e e x t r a c t e d f r o m w i t h i n t h e c e l l w a l l a n d d e p o s i t e d o n t h e t h e o u t e r w a l l s u r f a c e s , c e l l p i t s a n d c o m e r s . T h e c e l l w a l l e x t r a c t i v e s a r e d e p o s i t e d o n t h e o u t e r c e l l w a l l s u r f a c e d u e t o t h e r a p i d d e c o m p r e s s i o n o f a m m o n i a a t e n d o f A F E X p r e t r e a t m e n t . T h e s e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s d e p o s i t e d o n t h e s u r f a c e a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e d r o p i n O / C a t o m i c r a t i o a n d r e s u l t i n a m o r p h o u s l y s h a p e d s m e a r l i k e f o r m a t i o n s a s c o n fi r m e d v i a E S C A , S E M a n d A F M b a s e d a n a l y s i s . S e v e r a l d e g r a d a t i o n p r o d u c t s f o r m e d d u r i n g c o n v e n t i o n a l A F E X a n d d i l u t e - a c i d b a s e d p r e t r e a t r n e n t s ( e . g . c a r b o x y l i c a c i d s , f u r a n s , a r o m a t i c s , a m i d e s , a r a b i n o x y l a n o l i g o m e r s ) w e r e q u a n t i fi e d a n d c o m p a r e d b y L C - M S / M S a n d G C - M S b a s e d m e t h o d o l o g i e s . T h e e x t r a c t i o n o f t h e s e A F E X c e l l w a l l c o m p o n e n t s r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f a u n i q u e s e m i - c o n t i n u o u s , n a n o - p o r e ( 1 0 - 5 0 0 n m w i d t h ) b a s e d n e t w o r k t h a t i s p r o b a b l y r e s p o n s i b l e f o r m i n i m i z i n g d i f f u s i o n a l r e s i s t a n c e a n d e n h a n c i n g e n z y m e a c c e s s i b i l i t y t o w i t h i n a m m o n i a p r e t r e a t e d c e l l w a l l s . T h e n a n o - p o r e s w e r e v i s u a l i z e d t h r o u g h T E M a n d 3 D - T E M b a s e d t o m o g r a p h y t o e s t i m a t e c e l l w a l l p o r o s i t y f o r v a r y i n g . . ' - 1 2 . . . . . A F E X t r e a t m e n t s e v e n t i e s ( a s n m o r m l g m ) . E n z y m a t i c d r g e s t r o n r e s u l t s i n d i c a t e d a l i n e a r d e p e n d e n c e b e t w e e n r a t e o f h y d r o l y s i s a n d t h e l o g a r i t h m o f p r e t r e a t e d c e l l w a l l p o r o s i t y . T h e e x t e n t o f p o r o s i t y w a s a l s o f o u n d t o b e s t r o n g l y c o r r e l a t e d t o t h e a m m o n o l y s i s o f f e r u l a t e e s t e r b r i d g e s w i t h i n t h e c e l l w a l l . I n t e r e s t i n g l y , t h e e x t e n t a n d t y p e o f p o r e f o r m a t i o n ( e . g . e l l i p s o i d a l v s . s p h e r i c a l ) d e p e n d e d o n t h e l o c a t i o n w i t h i n t h e c e l l w a l l a n d A P E X p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y ( e . g . L o w t e m p e r a t u r e v s . N o - m o i s t u r e A F E X ) . 2 6 3 F i g u r e 9 . 1 M o d e l f o r g e n e r i c l i g n o c e l l u l o s i c c e l l w a l l s b e f o r e ( A ) a n d a fi e r a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t r n e n t s ( B ) . F i g u r e d e p i c t s v a r i o u s l i g n i n - c a r b o h y d r a t e c o m p l e x ( L C C ) l i n k a g e s b e t w e e n n o n - c o r e l i g n i n p h e n o l i c s a n d h e m i c e l l u l a s e s i d e c h a i n s t h a t a r e m o d i f i e d d u r i n g A F E X r e s u l t i n g i n e n z y m e a c c e s s i b l e p o r o s i t y . W h e r e ; C e l l u l o s e ( g r e e n r o d s ) , H e m i c e l l u l o s e ( p u r p l e s t r i n g s w i t h b l u e d o t s ) , L i g n i n ( g r e y m a t r i x ) . L i g n i n H e m i c e l l u l o s e C e l l u l o s e 1 ' C e l l u l o s e I l l M a n o - p o r o u s , . 1 ‘ . n e t w o r k ‘ . . \ ‘ E x t r a c t e d x y l a n 2 6 4 T h e c u r r e n t r e s e a r c h p r o j e c t i d e n t i fi e d t h e m a j o r u l t r a - s t r u c t u r a l a n d c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s i n c o r p o r a t e d w i t h i n l i g n o c e l l u l o s i c c e l l w a l l s d u r i n g A P E X . T h e l o n g - t e r r n g o a l s h o u l d b e t o d e t e r m i n e t h e v a r i o u s k i n e t i c ( e . g . r a t e o f a m m o n o l y s i s v s . h y d r o l y s i s o f d i f e r u l a t e e s t e r b r i d g e s ) a n d m a s s t r a n s f e r ( e . g . e f f e c t o f l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g a n d b i o m a s s p a r t i c l e s i z e o n p r e t r e a t m e n t k i n e t i c s ) r e l a t e d p a r a m e t e r s f o r A P E X p r e t r e a t m e n t . L i k e l y a r e a s o f f u t u r e w o r k i n c l u d e e n z y m e a d s o r p t i o n f o r a m m o n i a p r e t r e a t e d c e l l u l o s e , h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n f r a c t i o n s i s o l a t e d f r o m c o r n s t o v e r ; k i n e t i c s t u d i e s f o r a m m o n o l y s i s b a s e d r e a c t i o n s ( f o r p r e t r e a t m e n t r e a c t o r d e s i g n ) ; c e l l w a l l p o r o s i t y a n d e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y s t u d i e s f o r v a r y i n g A P E X p r e t r e a t m e n t s e v e r i t i e s ; f o r m a t i o n o f c e l l u l o s e 1 1 1 t h r o u g h m o d i fi c a t i o n o f c u r r e n t p r e t r e a t m e n t / p r o c e s s p a r a m e t e r s ; a n d s t u d y i n g e f f e c t o f v a r i o u s A F E X d e g r a d a t i o n p r o d u c t s o n e n z y m a t i c a n d m i c r o b i a l a c t i v i t i e s . A n i m p o r t a n t a r e a o f r e s e a r c h i s t o i d e n t i f y t h e m a j o r n i t r o g e n o u s c o m p o u n d s f o r m e d d u r i n g A F E X t h r o u g h n o n - a m m o n o l y s i s b a s e d r e a c t i o n s ( e . g . M a i l l a r d r e a c t i o n s , a m i n e / i m i n e f o r m a t i o n d u e t o r e a c t i o n o f a m m o n i a w i t h l i g n i n ) . T h e e f f e c t o f A F E X t h e r m o d y n a m i c p a r a m e t e r s ( e . g . P r e s s u r e ) a n d c e l l w a l l c o m p o s i t i o n o n t h e f o r m a t i o n o f p o r e s i s a n a r e a t h a t n e e d s t o b e f u r t h e r e x p l o r e d . T h e e x t e n t o f r e v e r s i o n o f c e l l u l o s e 1 1 1 b a c k t o 1 d u r i n g t h e c o u r s e o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s a s a f u n c t i o n o f p r o c e s s p a r a m e t e r s ( e . g . s o l i d s l o a d i n g , t e m p e r a t u r e , i m p e l l e r a g i t a t i o n s p e e d ) n e e d s t o b e u n d e r s t o o d t o m a x i m i z e t h e b e n e fi t o f i m p r o v e d d i g e s t i b i l i t y o f t h e f o r m e r . I t w o u l d b e i n t e r e s t i n g t o c o n d u c t s i m u l t a n e o u s s a c c h a r i fi c a t i o n a n d f e r m e n t a t i o n ( S S P ) s t u d i e s u s i n g c e l l u l o s e I I I r i c h l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s t o d e t e r m i n e e n h a n c e m e n t i n e t h a n o l p r o d u c t i v i t y r a t e v s . c u r r e n t c e l l u l o s e I b a s e d S S F . 2 6 5 O p t i m i z e d c r u d e e n z y m e c o c k t a i l s , u s i n g t h e B C R L h i g h - t h r o u g h p u t m i c r o p l a t e b a s e d h y d r o l y s i s a s s a y , a t a fi x e d p r o t e i n l o a d i n g o f 1 6 . 5 m g p r o t e i n / g g l u c a n h a d s i g n i fi c a n t l y h i g h e r g l u c a n a n d x y l a n ( ~ 9 0 % ) c o n v e r s i o n s t h a n c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e c e l l u l a s e b l e n d s a t e q u i v a l e n t o r h i g h e r p r o t e i n l o a d i n g s ( e . g . C E 1 + R E 2 g a v e 6 2 % g l u c a n a n d 3 9 % x y l a n c o n v e r s i o n s a t 3 3 m g / g g l u c a n l o a d i n g ) . I n t e r e s t i n g l y , c e l l u l o s e i s h y d r o l y z e d m o r e e f fi c i e n t l y f o r fi x e d - p r o t e i n l o a d i n g m i x t u r e s i n w h i c h c e r t a i n a m o u n t o f t h e c e l l u l a s e w a s r e p l a c e d b y e n d o x y l a n a s e s ( a n d o t h e r h e m i c e l l u l a s e s ) , p o s s i b l y i n c r e a s i n g a c c e s s i b i l i t y o f c e l l u l o s e e m b e d d e d b e t w e e n h e m i c e l l u l o s e s h e a t h s [ 5 5 ] . S i m i l a r l y , h e m i c e l l u l o s e i s m o r e e f fi c i e n t l y h y d r o l y z e d i n m i x t u r e s i n w h i c h s o m e e n d o x y l a n a s e i s r e p l a c e d w i t h c e l l u l a s e s . S y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n s a m o n g s t p u r i fi e d c o r e c e l l u l a s e s ( C B H I , C B H I I , E G 1 , B G ) f o r v a r y i n g t o t a l p r o t e i n l o a d i n g ( 2 . 5 - 3 1 . 5 m g e n z y m e / g g l u c a n ) d u r i n g h y d r o l y s i s o f u n t r e a t e d ( c e l l u l o s e I ) a n d l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d c e l l u l o s e ( c e l l u l o s e I I I ) i n d i c a t e d a 2 - f o l d h i g h e r s p e c i fi c a c t i v i t y f o r E G I ( w i t h o r w i t h o u t C B H ’ S ) o n t h e a m m o n i a t r e a t e d s u b s t r a t e c o m p a r e d t o n a t i v e c e l l u l o s e . T h i s i s a n i m p o r t a n t d i s c o v e r y t h a t c o u l d l e a d t o m o d i fi c a t i o n i n t h e w a y c o n v e n t i o n a l A P E X i s c u r r e n t l y b e i n g c o n d u c t e d . F o r m a t i o n o f c e l l u l o s e 1 1 1 w i t h i n p r e t r e a t e d p l a n t c e l l w a l l s c o u l d p o t e n t i a l l y r e s u l t i n 2 - f o l d i n c r e a s e i n t h e o v e r a l l e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y r a t e a t e q u i v a l e n t p r o t e i n l o a d i n g . A l s o t h e o p t i m a l e n z y m e c o c k t a i l m i x t u r e c o m p o s i t i o n m i g h t s k e w m o r e t o w a r d s t h e e n d o g l u c a n a s e s b a s e d o n s i g n i fi c a n t l y h i g h e r a c t i v i t y o f E C 1 v s . C B H ’ s o n c e l l u l o s e H I . I t w a s a l s o f o u n d t h a t u n l i k e w h a t h a s b e e n r e p o r t e d e a r l i e r f o r A v i c e l , C B H I a n d C B H I I h a d l i t t l e o r n o s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n o n u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d c o m s t o v e r . T h i s i s l i k e l y d u e t o t h e h i g h c e l l u l o s e d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n ( a n d h e n c e l o w e r n u m b e r o f a v a i l a b l e r e d u c i n g e n d s ) a n d p r e s e n c e o f r e s i d u a l h e m i c e l l u l o s e 2 6 6 t h a t r e s u l t s i n p o o r e x o - c e l l u l a s e a c t i v i t y o n n a t i v e a n d p r e t r e a t e d p l a n t c e l l w a l l s . T h e o p t i m a l c o m p o s i t i o n ( b a s e d o n % p r o t e i n m a s s l o a d i n g ) o f t h e c o r e c e l l u l a s e c o c k t a i l t h a t m a x i m i z e d A P E X c o r n s t o v e r g l u c a n d i g e s t i b i l i t y c o n s i s t e d o f C B H I ( 3 4 . 6 7 % ) , C B H I I ( 2 6 % ) a n d E G I ( 3 9 . 3 3 % ) . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s w i t h s u p p l e m e n t a t i o n o f 0 1 - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e a l o n g w i t h c o r e c e l l u l a s e s , E X a n d B X ( a t fi x e d t o t a l p r o t e i n l o a d i n g o f 1 5 . 7 5 m g / g g l u c a n ) r e s u l t e d i n s i g n i fi c a n t l y h i g h e r x y l a n c o n v e r s i o n s ( 6 5 % ) . T h e o p t i m a l c o m p o s i t i o n o f t h e h e m i c e l l u l a s e c o c k t a i l ( w i t h fi x e d e q u i m a s s c o r e c e l l u l a s e l o a d i n g ) t h a t m a x i m i z e d A F E X c o r n s t o v e r x y l a n d i g e s t i b i l i t y c o n s i s t e d o f E X ( 2 9 . 0 7 % ) , B X ( 4 2 . 6 7 % ) a n d A e r ( 2 8 . 2 7 % ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t s t h e l a c k o f c r i t i c a l h e m i c e l l u l a s e s a n d o t h e r c e l l u l o l y t i c e n z y m e s / p r o t e i n s ( e . g . M a n n a n a s e s , G a l a c t a n a s e s , P e c t i n a s e s , S w o l l e n i n , E s t e r a s e , G l u c u r o n i d a s e ) f r o m t h e c u r r e n t c o r e e n z y m e c o c k t a i l t h a t w o u l d n e e d t o b e i n c l u d e d t o f m ‘ t h e r e n h a n c e t h e o v e r a l l g l u c a n a n d x y l a n d i g e s t i b i l i t y o f A F E X p r e t r e a t e d c e l l w a l l s . R e c e n t r e s u l t s s u g g e s t i n c l u s i o n o f c e l l u l a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e s t o d e v e l o p a n o p t i m u m e n z y m e c o c k t a i l ( c o m p r i s i n g o f s i x m a j o r e n z y m e s , l i k e , C B H I , C B H 1 1 , E C 1 , E X , B G , B X ) i s n e c e s s a r y t o m a x i m i z e b o t h g l u c a n a n d x y l a n d i g e s t i b i l i t y o f A F E X p r e t r e a t e d c e l l w a l l s [ 4 5 3 ] . T h e s y n e r g i s t i c e n z y m e c o c k t a i l c o m p o s i t i o n f o r c e l l u l o s e I I I r i c h l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s i s c u r r e n t l y u n k n o w n . T h e e f f e c t o f p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y i s k n o w n t o m o d i f y t h e c e l l w a l l u l t r a - s t r u c t u r e d i f f e r e n t i a l l y . H o w e v e r , t h e e f f e c t o f v a r y i n g p r e t r e a t m e n t s e v e r i t y o n o p t i m u m e n z y m e c o c k t a i l c o m p o s i t i o n i s r e l a t i v e l y u n k n o w n . I t i s l i k e l y t h a t f o r l o w e r s e v e r i t y ( a n d e c o n o m i c a l l y v i a b l e p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s ) A F E X c o n d i t i o n s , t h e c l e a v a g e o f L C C e s t e r s w o u l d b e i n c o m p l e t e a f t e r p r e t r e a t m e n t . T h e r e f o r e , a n o p t i m a l e n z y m e c o c k t a i l f o r 2 6 7 l o w e r s e v e r i t y A F E X t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s e s w o u l d p r o b a b l y n e e d t o i n c l u d e v a r i o u s e s t e r a s e s ( a c e t y l x y l a n e s t e r a s e , p h e n o l i c e s t e r a s e s ) , a m o n g o t h e r a c c e s s o r y e n z y m e s . I n s u m m a r y , a f u n d a m e n t a l u n d e r s t a n d i n g o f p h y s i c o c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s i n c o r p o r a t e d w i t h i n l i g n o c e l l u l o s i c c e l l w a l l s d u r i n g a m m o n i a b a s e d p r e t r e a t r n e n t s a n d i t s e f f e c t o n e n z y m e s y n e r g y s h o u l d h e l p ‘ e n g i n e e r ’ b i o m a s s f e e d s t o c k , h y d r o l y t i c e n z y m e s a n d e t h a n o l o g e n i c m i c r o b e s s u i t a b l e f o r c e l l u l o s i c b i o r e fi n e r i e s . T h i s r e s e a r c h s h o u l d a i d i n t h e d e v e l o p m e n t o f m e c h a n i s t i c m o d e l s f o r p r e t r e a t e d c e l l w a l l s t h a t a r e d e p e n d e n t o n c e l l w a l l u l t r a - s t r u c t u r a l p r o p e r t i e s a n d i n d i v i d u a l e n z y m e c o m p o n e n t c h a r a c t e r i s t i c s . 2 6 8 A P P E N D I C E S 2 6 9 A P P E N D I X I — A ( C h a p t e r 3 . 1 - O u t e r w a l l m o r p h o l o g y ) F i g u r e I - 3 . A . 5 ( A ) P i c t u r e s h o w i n g v a r i o u s p a r t s o f c o r n p l a n t a n d t h e i r m a s s d i s t r i b u t i o n s a r e s h o w n a s p i e c h a r t i n t h e b o t t o m l e f t . ( B ) P i c t u r e s s h o w i n g v a r i o u s f r a c t i o n s f o r g r o u n d s a m p l e . P e r c e n t m a s s d i s t r i b u t i o n s o f v a r i o u s p a r t i c l e s i z e f r a c t i o n s f o r p r e - m i l l e d ( P M * ) a n d g r o u n d c o r n s t o v e r a r e s h o w n a s p i e c h a r t i n t h e b o t t o m r i g h t . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d fi o m [ 1 ] ) . A : i " l l - t a s s e l B l l i . I L - - - , # 1 2 0 1 4 ° / l e a v e s 2 5 % . 1 7 % I # 2 0 I t a s s e l ‘ I 3 # 3 5 l # 4 0 l s t a l k l D # 7 0 E l g r a i n . 1 ‘ I t 8 0 l c o b ~ 4 “ " ’ l . # 1 0 0 I s h u c k . 8 % 6 % 1 1 % l l # 1 2 0 1 % 7 % 5 % C o r n P l a n t C o m p o n e n t s P r e - m i l l e d P r e - m i l l e d a n d G r o u n d 2 7 0 2 7 1 T a b l e I - 3 . A . 3 C e l l w a l l p e r i m e t e r s ( L , m ) , a r e a s e n c l o s e d w i t h i n l u m e n ( A , m 2 ) a n d i s o p e r i m e t r i c q u o t i e n t s ( 4 7 r A / L 2 ) f o r u n t r e a t e d , r e g u l a r A F E X ( R - A C S ) a n d h i g h l i q u i d t o s o l i d l o a d i n g b a s e d A F E X ( H i g h - A C S ) t r e a t e d c o r n s t o v e r c e l l w a l l s . L A 4 1 r A / L 2 L A 4 1 r A / L 2 L A 4 n A / L 2 L A 4 1 r A / L 2 P a r e n c h y m a c e l l s X y l e m v e s s e l s V a s c u l a r b u n d l e c e l l s V a s c u l a r b u n d l e c e l l s U n t r e a t e d 4 4 0 1 4 2 6 4 0 . 9 2 7 9 U n t r e a t e d 3 0 8 7 0 5 0 0 . 9 3 6 7 U n t r e a t e d 4 0 1 1 7 0 . 9 1 5 7 U n t r e a t e d 5 9 1 7 9 0 . 6 3 8 7 4 3 9 1 2 8 7 4 0 . 8 3 9 1 2 4 1 4 0 5 5 0 . 8 8 0 5 5 2 1 9 4 0 . 9 0 0 9 4 2 1 0 1 0 . 7 0 6 3 3 5 1 8 6 2 9 0 . 8 7 9 8 2 5 6 4 7 6 8 0 . 9 1 3 8 5 6 2 3 0 0 . 9 3 6 5 5 0 1 5 6 0 . 7 7 9 3 3 0 5 6 8 1 6 0 . 9 1 8 8 2 5 0 4 5 4 8 0 . 9 1 5 6 4 2 1 3 3 0 . 9 3 4 7 4 9 1 4 4 0 . 7 3 9 5 2 4 9 4 3 7 7 0 . 8 8 4 8 ‘ 2 4 8 4 4 6 1 0 . 9 0 9 7 4 3 1 2 9 0 . 8 8 8 0 2 8 5 7 0 . 9 0 9 0 4 7 1 1 6 5 3 2 0 . 9 3 7 8 2 0 9 3 2 9 7 0 . 9 4 4 9 4 9 1 7 2 0 . 9 0 2 9 3 2 7 4 0 . 9 0 4 5 2 7 8 5 6 9 0 0 . 9 2 5 9 2 1 5 3 5 2 0 0 . 9 5 6 6 4 5 1 1 3 0 . 6 9 1 2 3 5 8 6 0 . 8 7 8 2 3 0 7 6 8 0 5 0 . 9 1 0 4 2 0 1 3 5 2 8 1 . 1 0 2 2 5 3 1 8 2 0 . 8 0 4 0 3 0 6 3 0 . 8 8 1 9 2 8 1 5 6 9 8 0 . 9 0 8 9 R - A C S 1 8 3 2 4 4 7 0 . 9 1 9 2 6 2 2 6 5 0 . 8 5 6 6 3 0 6 7 0 . 9 0 6 5 2 6 9 4 7 6 3 0 . 8 3 0 3 1 8 1 2 4 3 0 0 . 9 3 4 2 5 1 1 9 4 0 . 9 3 1 4 3 4 8 1 0 . 8 8 3 1 4 2 1 1 2 7 9 6 0 . 9 0 6 6 1 7 4 2 2 0 9 0 . 9 1 2 4 4 5 1 4 4 0 . 9 0 6 8 3 5 9 3 0 . 9 3 3 8 3 0 1 6 6 6 6 0 . 9 2 6 5 1 5 0 1 6 6 4 0 . 9 2 9 3 2 0 2 9 0 . 9 3 9 2 2 2 3 5 0 . 8 9 2 8 3 6 3 8 3 6 2 0 . 7 9 6 9 2 2 6 3 8 9 8 0 . 9 6 0 1 5 6 2 0 4 0 . 8 0 9 9 3 3 7 0 0 . 8 1 5 4 4 7 0 1 5 1 2 3 0 . 8 6 0 4 2 4 2 4 4 5 9 0 . 9 5 3 6 5 7 2 0 9 0 . 8 0 9 1 3 4 7 4 0 . 8 0 2 3 4 3 6 1 2 6 2 4 0 . 8 3 4 2 2 2 6 3 5 9 4 0 . 8 8 3 9 4 8 1 7 5 0 . 9 5 3 6 2 3 3 9 0 . 9 1 1 2 2 L 7 7 7 7 2 6 9 9 3 3 1 5 5 5 9 1 7 4 0 3 2 7 I 1 2 8 1 8 6 6 0 8 0 2 7 9 7 7 7 9 5 8 9 9 8 . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 A n 4 A s l l e c e l d L n 1 1 2 3 3 2 2 2 2 3 2 1 1 1 8 2 8 7 0 7 8 6 u b d r e a t l a u e c r t n U s a V 2 L / A r r 4 A s l l e c 8 8 2 7 2 0 4 0 0 0 9 9 5 3 1 1 0 6 0 1 6 0 3 5 6 7 6 1 9 2 7 9 2 1 4 7 8 5 7 6 0 3 7 6 0 4 5 4 9 8 8 7 6 8 7 8 6 5 8 8 9 8 8 7 . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 5 0 3 3 4 5 2 4 9 1 1 8 4 3 8 1 1 1 5 4 7 1 0 6 4 2 7 3 3 e 2 2 2 2 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 l d L n 7 4 9 0 6 7 6 8 8 5 7 4 3 9 5 5 5 5 6 6 3 7 3 5 5 5 4 4 4 4 4 4 u b d r e a t l a u e c r t n U s a V L / A r 1 4 3 3 7 7 7 4 0 6 4 2 2 7 9 9 7 5 6 6 0 8 8 8 0 5 3 1 3 3 4 0 2 9 5 6 7 3 8 5 2 8 4 4 6 9 4 6 5 1 9 9 9 8 8 8 9 9 9 9 9 9 8 8 9 9 . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 2 0 9 4 2 2 7 1 1 0 7 7 0 0 9 0 7 2 9 7 7 8 5 2 0 0 0 1 8 4 3 4 1 6 3 1 2 6 3 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 9 7 3 4 4 5 s l e s s e v m e l y X L / A r 1 4 . . . d t n o C 3 . A . 3 - l e l b a T 2 7 2 L A P a r e n c h y m a c e l l s L A R - A C S 4 4 4 2 9 4 4 1 1 1 8 3 1 3 6 2 4 2 1 8 1 4 1 9 1 9 6 2 7 9 2 4 4 4 1 9 1 2 4 1 2 9 1 4 3 2 4 6 1 4 6 3 0 6 2 4 3 1 2 4 4 3 2 0 8 1 1 3 4 9 4 1 9 5 2 3 6 4 1 3 1 2 4 2 8 5 5 4 9 7 3 3 7 8 8 1 0 4 5 1 1 0 9 1 1 1 1 4 1 3 9 0 4 2 2 8 0 . 9 3 2 4 0 . 9 0 5 7 0 . 9 2 4 9 0 . 7 7 8 7 0 . 9 1 7 2 0 . 8 9 6 8 0 . 9 1 1 6 0 . 9 4 1 1 0 . 9 3 1 7 0 . 8 0 2 4 0 . 7 9 8 2 0 . 7 4 9 4 0 . 8 8 5 3 0 . 8 4 5 0 0 . 8 5 6 9 0 . 8 8 0 4 H i g h - A C 8 1 1 5 1 1 8 1 1 6 1 0 5 1 1 5 1 2 9 9 7 1 2 7 1 5 5 1 3 7 1 3 5 1 3 7 6 9 8 1 7 6 8 4 2 9 5 6 2 0 2 3 9 4 6 0 5 6 5 2 3 3 4 7 1 9 1 3 7 8 5 5 6 8 0 0 9 3 3 5 5 3 1 1 2 1 9 3 7 6 8 7 2 4 0 0 7 6 7 7 4 2 2 1 8 8 7 4 7 4 8 9 0 7 1 4 2 3 0 6 8 8 5 7 6 7 7 9 8 4 8 7 7 8 8 8 8 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 8 5 1 6 3 4 2 4 4 1 1 1 4 5 3 3 8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 2 2 4 2 2 3 3 5 3 3 5 5 8 2 4 6 4 6 4 4 0 1 5 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l 2 2 2 2 2 2 2 8 C A - h g i H 4 0 9 6 0 0 4 4 5 3 3 7 7 6 8 8 8 5 1 2 4 1 7 4 4 5 4 0 3 5 4 2 8 7 2 5 5 8 1 2 8 9 1 8 5 2 3 1 5 4 5 8 7 8 6 9 6 8 6 9 8 8 7 7 8 7 9 8 1 2 7 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 4 2 9 2 4 8 5 9 6 4 9 2 4 1 8 3 8 2 2 7 6 4 4 5 5 8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 6 5 2 7 6 9 6 7 4 6 7 5 9 6 3 0 2 3 2 3 3 3 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 8 C A - h g i H 8 8 2 7 7 2 2 2 9 7 9 4 0 4 9 3 5 1 5 6 0 6 7 3 1 7 3 7 2 1 0 6 3 5 1 1 2 9 8 7 0 1 9 9 8 7 4 5 3 8 4 8 4 9 8 6 6 9 5 7 6 8 8 5 8 7 6 7 7 7 7 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 6 7 5 7 2 4 4 2 3 3 5 5 2 2 2 2 3 6 1 1 1 1 1 1 1 7 5 5 4 7 0 2 0 1 5 0 2 6 2 4 7 6 0 4 0 3 5 2 2 2 2 2 3 1 1 1 1 1 1 1 l 1 1 1 9 S C A - h g i H 0 6 6 0 4 7 7 0 0 4 6 7 2 1 3 3 3 3 2 5 1 9 9 6 9 1 5 5 2 0 9 5 4 7 4 0 9 2 1 9 0 9 0 2 0 4 9 5 0 2 6 0 5 4 8 7 9 9 9 7 8 8 9 8 9 8 9 8 8 8 8 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 2 8 7 2 0 4 6 3 8 1 3 1 0 0 8 4 7 2 0 6 0 3 7 5 7 1 3 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 5 6 9 3 3 4 4 4 7 9 6 6 5 2 6 7 5 3 0 6 0 4 1 1 1 4 4 4 4 4 4 2 3 3 2 2 2 2 3 5 5 5 5 S C A - R 2 7 3 T a b l e I - 3 . A . 3 C o n t d . . . L A 4 1 c A / L 2 L A 4 1 t A / L 2 L A 4 1 t A / L 2 L A 4 1 t A / L 2 V a s c u l a r b u n d l e c e l l s V a s c u l a r b u n d l e c e l l s V a s c u l a r b u n d l e c e l l s V a s c u l a r b u n d l e c e l l s 2 2 . . . d t n o C 3 . A . 3 - I e l b a T 2 7 4 L A 4 1 r A / L 2 L A 4 1 r A / L L A 4 I r A / L L A 4 1 t A / L 2 V a s c u l a r b u n d l e c e l l s V a s c u l a r b u n d l e c e l l s V a s c u l a r b u n d l e c e l l s V a s c u l a r b u n d l e c e l l s R - A C S 1 7 2 1 0 . 8 8 0 0 H i g h - A C S 2 9 3 3 0 . 4 8 3 6 H i g h - A C S 2 0 2 6 0 . 7 7 7 7 H i g h - A C 8 3 4 7 3 0 . 8 1 3 1 1 8 2 2 0 . 8 2 6 7 1 9 2 4 0 . 8 2 7 7 1 8 2 2 0 . 8 8 4 9 1 4 1 1 0 . 7 4 7 7 1 4 1 2 0 . 7 7 7 9 3 6 7 6 0 . 7 4 4 2 1 7 1 7 0 . 7 6 5 1 1 6 1 8 0 . 9 4 1 6 3 9 6 7 0 . 5 5 4 5 2 1 2 9 0 . 8 2 0 2 2 5 4 2 0 . 8 6 4 6 2 5 3 6 0 . 7 2 0 9 1 6 1 5 0 . 7 0 3 5 2 6 4 3 0 . 8 0 4 4 2 1 2 1 0 . 6 2 4 1 1 6 1 7 0 . 7 9 7 4 4 2 1 2 4 0 . 8 8 4 2 2 0 2 3 0 . 7 4 8 1 1 8 1 6 0 . 6 4 7 7 2 6 4 2 0 . 7 7 1 4 2 5 4 0 0 . 8 1 5 9 3 5 8 3 0 . 8 7 2 4 3 1 6 6 0 . 8 6 0 4 2 1 2 1 0 . 5 8 8 7 2 7 3 9 0 . 6 7 0 8 2 1 2 8 0 . 7 6 7 7 4 0 l 1 8 0 . 9 3 5 1 3 5 8 7 0 . 9 0 0 4 1 7 2 1 0 . 9 0 8 7 5 5 1 7 5 0 . 7 1 9 6 2 2 3 8 0 . 9 4 3 6 1 8 1 7 0 . 6 5 0 3 3 3 6 6 0 . 7 7 6 0 2 5 4 9 0 . 9 7 0 0 1 6 1 7 0 . 8 8 1 1 3 7 8 5 0 . 7 7 0 3 2 5 4 0 0 . 8 2 3 3 1 8 2 0 0 . 8 0 2 1 2 3 4 0 0 . 9 1 7 6 2 5 4 7 0 . 9 5 6 0 1 5 1 6 0 . 9 0 4 7 2 0 2 8 0 . 8 5 4 1 2 0 2 6 0 . 7 9 9 4 2 4 3 0 0 . 6 5 6 3 2 4 3 7 0 . 8 0 8 2 3 1 5 2 0 . 6 9 1 8 2 3 3 5 0 . 8 4 4 3 ( I ) ( I I ) ( I I I ) ’ e ‘ I A P P E N D I X 1 — B ( C h a p t e r 3 . 2 - S u r f a c e t o p o g r a p h y - c o m p o s i t i o n ) F i g u r e I - 3 . B . 2 U n t r e a t e d ( U 1 - U 1 0 ; p a n e l I ) a n d c o n v e n t i o n a l A F E X ( A 1 - A 1 0 ; p a n e l 1 1 ) t r e a t e d c o r n s t o v e r A F M a m p l i t u d e ( l e f t ) a n d p h a s e ( r i g h t ) i m a g e d a t a s e t ( i m a g e s i z e i s 2 . 5 x 2 . 5 , w n z ) . B o x - p l o t o f s u r f a c e r o u g h n e s s f a c t o r s ( n m ) a l o n g w i t h d a t a p o i n t s s c a t t e r ( N = 1 0 p e r s e t ) f o r u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d a m p l i t u d e i m a g e d a t a s e t fi o m p a n e l s 1 - 1 1 . U n t r e a t e d A F E X 4 0 — [ — C ‘ 1 E c m “ E E . h o H 0 c u 1 . 1 . I n i n o c u - _ . c c » : s o o : o 8 ‘ t 3 ( D E u . < m I l l m m m m m I n l a l a m I n I ’ - m m m m m m 2 7 5 e l d d i m d n u o p m o c , r e n r o c l l e c g n i w o h s ) n o _ . i e t v a o c t fi s ~ i n g n r o a . c m . w : f X o E s F e l A a d c e s t a g e n r i t y r N a - v w t o a ( L r s o e ) f y g t a i m ) 3 S s i o , r 2 M ‘ o 5 p E , 3 % 4 l l a T , 1 S r E ( w s ! e v r 5 1 : l o e l ' t e s y a C l n - 1 . r l . o l c a 4 w d r e y e t t r a a e d p r a t h C X n o c e ( E s A d F — 1 1 A n 7 a . A ) X t 4 . . M - I - C D I ( I ' , . ) I N a e E r l l P e u g m P i a A F l 2 7 6 l ‘ . e l d d i m d n u o p m o c , r e m o c l l e c g n i w o h s ) n . o r i e t v a o t c s i f n i r n o g c a m X f E o F s A e l d a e c t s a e g r n t i y r r a a l v u g t e a ( R r s o e f g a ) 3 m S i M , 2 S E , T 1 S r ( e v s r o e t y s a l n r l o l c a w d e y t r a a e r d t n o X c e E s F d A n 8 a . 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A . l l A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r T E M i m a g e s ( a t v a r y i n g s c a l e s o f m a g n i fi c a t i o n ) s h o w i n g c e l l c o r n e r , c o m p o u n d m i d d l e l a m e l l a ( C M ) a n d s e c o n d a r y w a l l l a y e r s ( S I , S Z , S 3 ) f o r L o w - W t r e a t e d A F E X c o r n s t o v e r . a “ I v _ . x A P P E N D I X 1 ] — B ( C h a p t e r 4 . 2 - C e l l u l o s e I l l f o r m a t i o n ) F i g u r e I I - 4 . B . 6 P o w d e r X - r a y d i fl r a c t i o n s p e c t r a o f c e l l u l o s e ( C e l l u l o s e I ) t r e a t e d w i t h l i q u i d a m m o n i a ( C e l l u l o s e I I I ) a n d v a r y i n g A F E X s e v e r i t y . A v i c e l w a s t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e i n a l l c a s e s . T h e v a r y i n g s e v e r i t y c o n d i t i o n s a r e d e n o t e d b y I o r 3 - N H 3 ( a m m o n i a l o a d i n g , w / w b a s i s ) a n d 0 . 0 5 o r 0 . 6 - W ( w a t e r l o a d i n g , w / w b a s i s ) i n t h e fi g u r e l e g e n d Y - a x i s a n d X — a x i s d e p i c t i n t e n s i t y c o u n t s a n d t w o — t h e t a ( 2 6 ) a n g l e s , r e s p e c t i v e l y . — U n t r e a t e d A v i c e l 7 3 5 0 0 0 7 — L i q u i d N H 3 t r e a t e d A v i c e l , 1 0 c — — 1 - N H 3 , 0 . 6 - W 5 3 5 0 0 0 ” - - - - - - 3 - N H 3 , 0 . 6 - W - - - - - - 1 - N H 3 , 0 . 0 5 — w 5 3 5 0 0 0 “ — — 3 . 1 0 1 1 3 , 0 . 0 5 — w 4 3 5 0 0 0 — 3 3 5 0 0 0 — 2 3 5 0 0 0 ~ 1 3 5 0 0 0 — 3 5 0 0 0 . . . . 1 . . . . 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1 2 4 2 7 3 0 3 3 3 6 2 8 1 I I I e s o l u l l e C — - _ 5 3 0 . 0 2 8 2 F i g u r e I I - 4 . B . 7 R a m a n s p e c t r a o f c e l l u l o s e ( C e l l u l o s e 1 ) t r e a t e d w i t h l i q u i d a m m o n i a ( C e l l u l o s e 1 1 1 d a t a f r o m [ 4 ] ) a n d v a r y i n g A F E X w a v e n u m b e r ( c m ' ) , r e s p e c t i v e l y . — - U n t r e a t e d s e v e r i t y . A v i c e l w a s t h e c e l l u l o s i c s u b s t r a t e i n a l l c a s e s . T h e v a r y i n g s e v e r i t y c o n d i t i o n s a r e d e n o t e d b y I o r 3 — N H 3 ( a m m o n i a l o a d i n g , w / w b a s i s ) a n d 0 . 0 5 o r 0 . 6 - W ( w a t e r l o a d i n g , w / w b a s i s ) i n t h e fi g u r e l e g e n d . Y - a x i s a n d X - a x i s d e p i c t i n t e n s i t y c o u n t s a n d 0 . 0 4 — — - 1 — N H 3 , 0 . 6 - w - - - - - - - 3 - N H 3 , 0 . 6 - W 0 . 0 3 — - - - - - - - 1 - N H 3 , 0 . 0 5 — w 3 - N H 3 , 0 . 0 5 — w 0 . 0 2 5 — I I . I , f ‘ 0 . 0 2 — . . I x . " 7 i 0 . 0 1 5 - 0 . 0 1 1 0 . 0 0 5 - . \ . I I . 2 5 0 3 5 0 3 7 5 , . 3 7 9 0 0 0 3 C . . . % 2 2 1 1 6 7 3 2 0 3 C . . 4 8 % 3 2 1 1 1 3 5 C . . 6 4 % 5 6 n A e C g S o 0 6 6 r 0 5 7 E t . . . i 0 0 4 y N b n % o i t i n s e o g p y m x 3 6 4 7 7 8 . . . 7 7 7 o O 3 3 2 % C c i m o t n A o b e r c a a f C r u % S l t n v e 1 1 e 8 t D 0 3 1 . . . 0 0 0 d t S n o c n e g o r 3 2 7 4 6 7 6 9 5 0 5 0 5 4 2 . . . . . . . . 0 3 0 0 0 0 1 0 t i N % l e c i ) ) v L H A ( ( ) l l t e e n c c U i i ( v v A A d e X X t a E E e F F A A r t n U 2 8 3 A P P E N D I X H I ( C h a p t e r 5 - D e g r a d a t i o n p r o d u c t s ) T a b l e I I I - 5 . 4 T o t a l n i t r o g e n c o n t e n t ( m e a s u r e d b y K j e l d a h l m e t h o d a s g r a m s N i t r o g e n p e r 1 0 0 g r a m s s u b s t r a t e ) o f u n t r e a t e d a n d v a r y i n g A F E X s e v e r i t y t r e a t e d c e l l u l o s i c b i o m a s s . T h e s u r f a c e a t o m i c c o m p o s i t i o n o f t h e s u b s t r a t e s w a s e s t i m a t e d b y E S C A . W h e r e ; L ( l o w ) a n d H ( h i g h ) s t a n d f o r v a r y i n g A F E X t r e a t m e n t s e v e r i t i e s . A F E X - L w a s c a r r i e d i n t h e H T - A F E X r e a c t o r a t 9 0 ” C , I : 1 , 1 5 m i n s , 6 0 % m o i s t u r e . A F E X - H w a s c a r r i e d i n t h e H T - A F E X r e a c t o r a t 1 3 0 ” C , 3 : 1 , 1 5 m i n s , 6 0 % m o i s t u r e . M e t O H ( m e t h a n o l ) e x t r a c t i o n w a s c a r r i e d o u t a t 5 0 " C ( 1 5 p s 1 ) f o r 4 3 h o u r s . S u b s t r a t e g m s N p e r 1 0 0 g m s b i o m a s s M e a n T y p e o f E l e m e n t a l C a r b o n U n t r e a t e d S t o v e r R e g u l a r A F E X S t o v e r 0 . 1 6 0 . 2 7 1 . 3 5 7 4 . 0 9 2 6 . 5 9 2 2 . 7 5 1 . 7 5 2 . 8 5 9 . 6 5 7 . 1 1 6 2 . 2 7 6 1 . 6 8 6 7 . 4 1 2 7 . 2 9 2 5 . 2 7 4 8 . 3 0 5 9 . 9 7 6 1 . 8 0 4 5 . 4 0 M e t O H E x t r a c t e d U n t A v i c e l M e t O H E x t r a c t e d A F E X A V ( L ) M e t O H E x t r a c t e d A F E X A V ( H ) 0 . 0 1 0 . 0 4 0 . 0 9 % 0 1 % 5 % 0 5 . 2 % 1 ) g m ( d e r e v i l e D s ) g s m a ( m o e i B u l a t V h g i e W d e t c e y p r x D E I ~ * - 5 0 0 . . . 8 7 8 2 8 4 A P P E N D I X I V ( C h a p t e r 6 - M i c r o p l a t e m e t h o d o l o g y ) F i g u r e I V - 6 . 3 E f f e c t o f s l u r r y s u s p e n s i o n s o l i d s l o a d i n g ( w / w ) o n d e l i v e r y a c c u r a c y b y p i p e t t i n g w o r k s t a t i o n . T h e a v e r a g e a m o u n t o f b i o m a s s ( m g ) d e l i v e r e d t o e a c h w e l l i s p l o t t e d o n t h e Y - a x i s f o r v a r y i n g p e r c e n t s l u r r y s o l i d s c o n c e n t r a t i o n ( X - a x i s ) . T h e b a r s i n d i c a t e s t a n d a r d d e v i a t i o n s f o r 1 2 r e p l i c a t e e x p e r i m e n t s . ( F i g u r e h a s b e e n r e p r o d u c e d f r o m [ 2 ] ) . 9 . 0 - 7 . 5 ~ — 6 . 5 + % 5 2 % ' . % 1 0 5 8 S % 2 . 0 C 0 1 A A 8 S % d d 0 C 5 n n 2 u u A A % . o o d d 1 0 r r e e g g l l l l V V n n i i A A U U M M — " — - 1 e fi B — { + e — - ' - _ - 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 8 6 2 7 5 3 4 1 1 2 8 5 F i g I V - 6 . 5 ( A ) H y d r o l y s i s t i m e p r o fi l e f o r c o n v e n t i o n a l fl a s k b a s e d a s s a y f o r a v i c e l ( A I O , u n — g r o u n d A F E X c o r n s t o v e r ( A C S ) a n d m i l l e d A F E X c o r n s t o v e r a t t w o d i j f e r e n t g l u c a n l o a d i n g s ( 0 . 2 5 % a n d 1 % ) . ( B ) H y d r o l y s i s t i m e p r o f i l e f o r B C R L m i c r o p l a t e b a s e d a s s a y f o r a v i c e l ( A V ) , u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ( U C S ) a n d m i l l e d A F E X c o r n s t o v e r ( A C S ) a t t w o d i fl e r e n t g l u c a n l o a d i n g s ( 0 . 2 5 % a n d 1 % ) . P e r c e n t g l u c a n c o n v e r s i o n a n d p e r i o d o f h y d r o l y s i s ( h r s ) a r e s h o w n o n t h e Y — a n d X — a x i s , r e s p e c t i v e l y . 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T h e s u m o f t o t a l e n z y m e l o a d i n g i s a l w a y s e q u a l t o 1 6 . 5 m g p r o t e i n / g g l u c a n . l R e g r e s s i o n T e r m s ( % G l u c a n c o n v e r s i o n ) R e g r e s s i o n T e r m s ( % X y l a n c o n v e r s i o n ) R e g r e s s i o n T e r m s ( T o t a l s u g a r y i e l d , g / 1 T e r m C o e f fi c i e n t P V I F T e r m C o e f fi c i e n t P V I F T e r m C o e f fi c i e n t P c c l x 5 7 . 4 9 1 3 . 1 8 0 6 4 3 9 . 5 9 7 3 . 2 0 3 c c l x 2 3 8 . 8 2 c c 5 2 6 . 3 1 2 2 . 6 1 5 r e l 1 0 . 0 6 3 1 . 6 5 c c 4 1 7 8 . 4 3 r c l 2 2 . 9 2 1 2 . 2 3 9 r c 7 9 . 7 9 5 1 . 6 5 c c 5 1 2 1 . 1 6 c c 4 2 2 . 2 0 4 2 . 6 1 5 c c 5 7 . 6 3 6 1 . 6 5 r c l 1 0 7 . 7 r c 7 3 . 1 8 9 2 . 2 3 9 c c l x 5 . 3 5 2 * L g r c 7 3 6 . 5 6 * c c l x * r c 7 1 2 5 . 7 0 5 c c 4 " ' r c 7 1 0 9 . 6 5 0 . 0 0 4 2 . 5 8 9 c c 1 x * r c 7 4 4 8 . 7 1 0 . 0 0 1 c c l x * r e 1 6 6 . 9 8 5 2 . 7 0 2 c e 1 x * c c 4 8 4 . 4 5 2 0 . 0 2 5 2 . 5 8 9 c c l x * c c 4 4 0 8 . 7 8 0 . 0 0 3 c e l x * c c 4 5 4 . 5 5 2 2 . 4 2 3 c e 4 * r c l 7 7 . 8 9 2 0 . 0 3 8 2 . 5 8 9 c c 4 " ' 1 ' e 1 3 4 2 . 1 7 0 . 0 1 2 c c 4 * c c 5 4 4 . 0 6 3 0 2 . 3 5 c c 4 * c e 5 6 4 . 0 0 2 0 . 0 8 7 2 . 5 8 9 c c 4 * c c 5 3 3 2 . 8 0 . 0 1 4 c c 4 * r c l 3 3 . 1 2 4 0 . 0 0 9 2 . 6 5 1 c c 4 " ' r c 7 3 2 9 . 3 7 0 . 0 1 6 c e l x * c c 5 2 6 . 5 9 1 0 . 0 2 6 2 . 4 2 3 c e 1 x * r c l 2 7 1 . 5 4 0 . 0 3 3 c e 5 * r c 7 1 9 . 3 4 8 0 . 1 1 6 2 . 6 5 1 c c l x * c c 4 * r c 7 6 1 8 . 6 9 7 0 1 . 6 2 8 c c l x * c c 4 * r e l 8 5 6 . 1 6 2 0 1 . 5 - 8 4 c c l x * c c 4 * r c 7 4 2 2 4 . 6 7 c c 4 ‘ c c 5 * r c 7 5 0 7 . 5 7 7 0 1 . 6 2 8 c c l x ‘ c c 4 * r c 7 7 7 9 . 5 0 5 0 . 0 0 1 1 . 5 8 4 c c 4 * c c 5 * r c 7 3 2 2 9 . 0 2 c c 4 * r c 1 * r c 7 4 3 7 . 8 6 0 1 . 4 7 2 c e 4 * c c 5 * r c 1 7 5 9 . 9 2 0 . 0 0 1 1 . 5 8 4 c c l x * c c 4 * r c l 3 1 8 3 . 3 6 c c l x ‘ c c 5 * r c 7 3 5 1 . 9 0 3 0 1 . 8 4 8 c c l x ‘ c c 4 * c c 5 6 5 0 . 0 2 5 0 . 0 0 5 1 . 5 8 4 c e 4 * r e 1 * r c 7 3 1 3 3 . 1 8 c e 4 * c c 5 * r c l 3 4 3 . 4 9 8 0 1 . 6 2 8 c c 4 * r c l * r e 7 6 3 7 0 . 0 0 6 1 . 5 8 4 c c 4 * c c 5 * r c l 3 0 5 5 . 3 3 0 c c 1 x * c c 4 * r c 1 2 8 3 . 8 7 0 . 0 0 1 1 . 8 4 8 c c 4 * c c 5 * r c 7 5 6 4 . 1 7 2 0 . 0 1 3 1 . 5 8 4 c c l x * c c 5 * r c 7 2 2 7 6 . 5 0 . 0 0 4 0 6 1 x ‘ c c 5 * r c l 1 7 7 . 4 4 9 0 . 0 1 9 1 . 6 2 8 0 6 1 x * c c 4 * c c 5 1 9 0 1 . 3 6 0 . 0 2 c c 1 x * r e l * r e 7 1 4 7 . 1 3 3 0 . 0 4 9 1 . 6 2 4 S = 1 1 . 2 0 4 8 P R E S S = 9 9 3 0 . 9 3 c c l x * c e 5 * r e l 1 1 1 8 . 2 1 0 . 1 4 1 c c 5 * r c l * r e 7 1 0 3 . 2 6 6 0 . 1 4 3 1 . 4 7 2 R - S q ( p r c d ) = 8 0 . 6 2 % R - S q ( a d j ) = 8 2 . 6 1 % c c 5 * r c l * r e 7 1 0 8 7 . 9 6 0 . 1 3 4 * t i * 3 ! - * I ‘ I ' I N A c : “ . N 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 C O C O S = 3 . 6 5 0 8 6 P R E S S = 1 1 1 0 . 4 0 3 = 3 9 . 4 7 7 9 P R E S S = 1 2 4 3 2 9 R - S q ( p r e d ) = 9 5 . 2 9 % R - S q ( a d j ) = 9 5 . 9 8 % R - S q ( p r e d ) = 8 6 . 1 4 % R - S q ( a d j ) = 8 7 . 6 6 % % 3 7 . 6 8 = ) 9 j 0 d 0 a 6 ( 8 q 1 S - = R S % S 5 E 6 R . P 4 8 = 5 1 ) 0 d 6 e . r 7 p 4 ( q = S - S R % 8 6 . 5 8 = 9 ) 3 j . d 7 a 4 ( 0 q 7 S - = R S % S 1 E 1 R . P 4 8 = 4 5 ) 8 d 5 e 4 r . p 9 ( q = S - S R % 4 7 . 8 8 = 1 ) 2 j . d 7 a 0 ( 8 q 3 S — = R S % S 2 E 5 R . P 6 8 = 7 5 ) 4 d 9 e 6 r . p 6 ( q = S - 3 R 3 1 7 T a b l e V - 7 . 9 E s t i m a t e d r e g r e s s i o n c o e fl i c i e n t s f o r m o d e l t e r m s ( s i n g l e , b i n a r y a n d c u b i c b a s e d i n t e r a c t i o n t e r m s ) p r e d i c t i n g % g l u c a n c o n v e r s i o n , % x y l a n c o n v e r s i o n a n d t o t a l s u g a r y i e l d ( g m s u g a r / k g d r y w e i g h t b i o m a s s ) a s a f u n c t i o n o f c r u d e e n z y m e m i x t u r e a m o u n t c o m p o s i t i o n f o r 5 C E - R E ( C e l x i s R E 4 ) b a s e d e x p e r i m e n t s . T h e s u m o f t o t a l e n z y m e l o a d i n g i s a l w a y s e q u a l t o 1 6 . 5 m g p r o t e i n / g g l u c a n . ' 0 R e g r e s s i o n T c r m s ( % G l u c a n c o n v e r s i o n ) R e g r e s s i o n T e r m s ( % X y l a n c o n v e r s i o n ) R e g r e s s i o n T e r m s ( T o t a l s u g a r y i c l T e r m C o e f fi c i e n t P V I F T e r m C o e f fi c i e n t P V I F T e r m C o e f fi c i e n t c c l x 3 4 . 4 7 1 . 8 6 6 c c 4 4 0 . 9 5 7 3 . 2 0 3 c c l x 1 7 5 . 4 8 c c 5 2 6 . 6 5 1 . 8 6 6 c c l x 1 5 . 9 9 7 1 . 8 0 7 c c 4 1 6 7 . 3 8 r e l 2 3 . 6 6 1 . 8 6 6 r e l 8 . 4 7 2 1 . 8 0 7 r c l 1 1 5 . 4 7 c c 4 1 8 . 3 1 2 . 6 1 6 r e 7 8 . 3 7 2 1 . 8 4 5 c c 5 1 1 4 . 2 r c 7 5 . 1 1 1 . 6 4 2 c c 5 3 . 3 6 9 * 1 . 8 0 7 r c 7 3 5 . 2 4 c e l x * c c 4 1 0 9 . 7 - 8 c c 4 * r c l 1 0 8 . 9 6 2 0 . 0 0 1 2 . 6 3 5 c e l x * c c 4 6 0 7 . 3 0 c e 4 * c c 5 5 3 . 7 5 0 . 0 1 8 2 . 5 8 8 c c 4 * r e 7 9 5 . 2 6 9 0 . 0 0 4 2 . 6 5 c c 4 * r c 1 4 1 0 . 6 4 0 . 0 1 2 c e 4 * r c 1 3 7 . 4 5 0 . 0 9 4 2 . 5 8 8 c c 4 * c c 5 8 1 . 1 1 1 0 . 0 1 2 2 . 6 3 5 c c 4 * c c 5 4 0 3 . 6 2 0 . 0 1 3 c c l x * c c 4 7 6 . 9 7 6 0 . 0 1 7 2 . 6 3 5 c c 4 * r e 7 2 9 1 . 9 1 0 . 0 7 c c l x * c c 4 * r c 7 1 3 3 7 . 8 7 0 1 . 4 4 4 c c l x * c c 4 * r c 7 7 1 3 . 2 6 4 0 1 . 6 1 7 c c l x * c c 4 * r c 7 6 7 7 0 . 5 0 c c ] x * c c 4 * r c l 7 0 7 . 1 8 0 1 . 6 1 7 c e 4 * c c S * r c 7 7 0 2 . 8 1 3 0 1 . 6 1 7 c e l x * c c 4 * r e l 4 4 4 2 . 6 3 0 c c 4 * c c 5 * r c 7 6 1 7 . 9 7 0 1 . 4 4 4 c c l x * c e 4 * r c l 6 7 1 . 0 9 4 0 . 0 0 1 1 . 6 0 2 c c 4 * c e 5 * r c 7 3 9 9 5 . 6 5 0 c c 4 * r c l * r c 7 4 6 3 . 6 0 . 0 0 1 1 . 4 4 4 c c 4 * c c 5 * r c 1 6 0 5 . 0 0 5 0 . 0 0 2 1 . 6 0 2 c c l x * c c 4 * c c 5 2 8 9 9 . 7 0 . 0 0 3 c c l x * c c 4 * c c 5 4 3 3 . 7 8 0 . 0 0 2 1 . 6 1 7 c c 4 * r e l * r c 7 4 7 1 . 0 5 2 0 . 0 1 6 1 . 6 1 7 c c 4 * c c 5 * r c l 2 8 9 6 . 1 6 0 . 0 0 3 c e 4 * c c 5 * r c 1 3 4 5 . 2 1 0 . 0 1 2 1 . 6 1 7 c c 1 x * c c 4 * c c 5 4 7 0 . 4 0 . 0 1 5 1 . 6 0 2 c c 4 * r c 1 * r c 7 2 8 2 9 . 9 6 0 . 0 0 4 c c l x * c c 5 * r c 7 2 6 3 . 8 2 0 . 0 3 3 1 . 3 2 1 c e 5 * r c 1 * r c 7 2 8 7 . 2 2 2 0 . 0 9 8 1 . 3 2 6 c c l x * c c 5 * r e 7 1 7 5 3 . 6 4 0 . 0 4 6 c c l x * r c 1 * r c 7 2 5 3 . 5 6 0 . 0 4 1 . 3 2 1 c c l x * c e 5 * r c 7 2 7 5 . 2 5 1 0 . 1 1 3 1 . 3 2 6 c e l x * r e 1 * r e 7 1 6 7 9 . 8 0 . 0 5 6 c e l x * c e 5 * r e 1 1 9 1 . 9 5 0 . 1 1 8 1 . 3 2 8 c e l x * r e 1 * r e 7 2 6 1 . 3 0 5 0 . 1 3 2 1 . 3 2 6 c c 5 * r c l * r e 7 1 5 0 1 . 9 7 0 . 0 8 6 c e 5 * r c 1 * r c 7 1 9 0 . 1 2 0 . 1 2 1 1 . 3 2 1 1 ’ I m i n - 1 1 1 1 1 1 4 1 - 1 1 4 1 - 1 1 1 - * ‘ I - * * * o o o o “ 1 N o 3 1 8 T a b l e V - 7 . 1 0 B i v a r i a t e c o r r e l a t i o n P e a r s o n c o e fl i c i e n t s f o r i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o n e n t s o f v a r i o u s e n z y m e m i x t u r e s ( N = 7 5 3 ) w i t h r e s p e c t t o t h e i r p r e d i c t e d % g l u c a n , % x y l a n a n d t o t a l s u g a r h y d r o l y s i s y i e l d s . V a l u e s h i g h l i g h t e d i n b o l d s i g n i f y l a c k o f s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e a t p < 0 . 0 5 l e v e l . E n z y m e % G l u c a n % X y l a n T o t a l S u a r s E w m e % G l u c a n % X y l a n T o t a l S u g a r s A C - . 1 0 6 " ‘ * 0 . 0 5 6 - 0 . 0 3 8 C H 1 7 - . 2 8 1 ” - . 0 9 9 " ” " - . 2 3 5 * * A X E 1 . 2 2 0 " . 0 7 8 " . 1 8 4 " C H I 1 . 1 2 1 " . 1 0 9 “ . 1 3 6 " A X E 2 . 5 9 5 " . 2 1 3 “ . 4 9 8 “ C H I 2 - . 1 0 2 " - 0 . 0 2 9 - . 0 8 0 " ‘ F A E - . 1 9 8 " * . 2 1 6 “ - 0 . 0 1 3 A C A L - . 1 5 0 " 0 . 0 6 3 - 0 . 0 6 3 C W 1 . 0 8 0 “ - 0 . 0 2 0 . 0 4 1 P C L 0 . 0 4 1 . 1 3 2 ” . 0 9 6 " C I P 2 . 3 9 3 " 0 . 0 1 7 . 2 6 4 " C H 3 0 . 1 2 6 " - . 0 8 2 " 0 . 0 3 9 P L - . 2 1 8 * " ‘ . 2 3 1 " - 0 . 0 1 8 A C - . 1 7 0 * * . 1 9 4 “ l - 0 . 0 0 7 P M E - . 1 9 8 " . 2 1 9 " - 0 . 0 1 3 B F R C 0 . 0 6 4 0 . 0 1 8 0 . 0 5 2 R H A E - . 1 2 7 * " ‘ . 0 8 3 “ - 0 . 0 4 B C A L 1 - . 1 7 7 " . 2 6 8 “ l 0 . 0 2 8 A R H - . 1 3 5 " ' " . 2 0 6 " 0 . 0 2 2 A A - . 2 5 6 " " ' l . 1 4 3 ” - . 0 9 0 " ' S W O . 5 2 7 “ - 0 . 0 3 2 . 3 2 4 " E C 5 - . 3 4 5 * * - 0 . 0 6 2 - . 2 5 8 " " ’ l B C 1 - . 2 8 6 * * - . 1 6 2 ” - . 2 7 1 " A M A N O 1 - . 2 9 9 ' M I . 1 4 3 " - . 1 1 8 " " 1 B M A N O - . 2 1 8 " ” " . 1 2 4 ” - . 0 7 5 ‘ l A B F 1 - . 2 0 0 " “ " . 2 1 1 “ - 0 . 0 1 7 B C 3 . 6 6 7 “ . 1 8 1 ' “ I . 5 2 8 ” A B C A L - . 3 0 6 * * 0 . 0 3 2 - . 1 8 2 * * B X 3 0 . 0 2 1 . 1 3 7 ” . 0 8 8 “ A B F 2 - . 2 6 0 * * . 2 3 3 “ - 0 . 0 4 4 E C 2 . 3 6 5 ” 0 . 0 4 . 2 5 7 " C H 5 5 - . 1 8 5 M . 2 0 0 " - 0 . 0 1 3 B M . 1 5 8 “ l 0 . 0 4 7 . 1 2 6 M E C 4 - . 3 7 4 “ “ “ - . 1 5 1 “ " ' — . 3 2 2 " ‘ * B G A L 2 . 3 5 9 " . 2 0 1 " . 3 3 9 “ l E C 7 . 6 8 5 “ . 1 1 6 M . 5 0 5 “ C B H 2 . 3 0 0 “ K - . 0 8 8 " ' . 1 4 7 " A B F 3 - . 2 5 8 " ‘ * . 2 4 7 " - 0 . 0 3 6 C H 6 - . 3 5 6 " - . l 6 2 " - . 3 l 6 * " ‘ C H 6 5 - . 1 5 9 " ” " . 2 4 2 " 0 . 0 2 6 C B H l . 2 1 0 " - . 1 5 9 " ” ‘ 0 . 0 5 2 A C L U C - 0 . 0 5 7 0 . 0 1 7 - 0 . 0 2 7 E C 1 . 5 4 3 " - 0 . 0 4 1 . 3 2 9 " C H 7 1 - . 1 9 7 * " ' . 2 3 0 " ~ 0 . 0 0 6 E X 2 - . 1 9 8 " ” ' I - . l 4 3 " ” " - . 2 0 4 " ” " C T - . 2 5 1 M — . 0 7 3 * — . 2 0 2 * * E X 1 - . 1 8 3 " ‘ I . 1 4 2 “ - 0 . 0 4 3 X G 0 . 0 0 7 . 1 1 7 " 0 . 0 6 6 E C 3 . 1 9 4 " . 0 9 5 " . 1 7 5 " A M A N - . 1 9 7 " “ ' I . 2 3 0 " - 0 . 0 0 6 A M Y . 2 7 0 ” 0 . 0 4 1 . 1 9 7 " B C L U C - . 1 9 7 * * . 2 3 0 “ - 0 . 0 0 6 C A M Y - 0 . 0 6 9 - . 1 1 6 " " ' I - . 1 0 5 ’ M l C H 8 1 - . l 9 7 " “ " . 2 3 0 " - 0 . 0 0 6 C H 1 6 . 0 9 9 “ I - 0 . 0 2 3 0 . 0 5 2 A M A N O 2 - . 1 8 7 " ” " . 0 8 6 " - . 0 7 4 * O T H E R S - . 2 3 9 " " I - . 0 9 4 ” - . 2 0 5 ‘ * C o r r e l a t i o n s i g n i fi c a n t a t 0 . 0 1 ” o r 0 . 0 5 " l e v e l ( 2 - t a i 1 c d ) , N = 7 5 3 2 7 2 2 9 5 7 1 9 4 4 1 9 6 7 4 5 5 7 6 7 7 7 7 . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 0 7 4 9 8 3 1 2 5 8 8 6 6 . . . . 0 0 0 0 2 7 5 . 0 8 2 7 . 0 1 7 7 7 1 1 7 8 6 0 9 6 5 7 8 9 8 9 . . . . . . 0 0 0 0 0 0 9 4 3 0 1 2 6 9 7 . . . 0 0 0 6 3 8 2 8 7 . . 0 0 4 6 4 5 8 8 5 8 7 . . . 0 0 0 6 9 . 0 4 5 5 . 0 2 4 7 8 2 7 8 7 6 7 3 9 4 3 6 5 4 6 6 P 6 8 6 9 8 6 5 7 7 I . . . . . . . . . C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 l P I 7 8 7 . C 0 E A F 2 5 4 3 0 E 5 7 . . X 0 0 A l 6 9 . 0 9 8 2 2 6 7 . . 0 0 2 7 5 . 0 E 7 0 6 9 1 9 4 5 7 4 6 1 X A C 7 8 8 5 8 8 . . . . . . 0 0 0 0 0 0 6 7 4 5 7 4 8 9 3 3 3 3 9 5 8 5 6 6 8 7 7 A . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 . y l e v i t c e p s e r 3 1 9 T a b l e V - 7 . 1 1 P e a r s o n c o r r e l a t i o n c o e fl i c i e n t s f o r i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o n e n t s o f v a r i o u s e n z y m e m i x t u r e s w i t h r e s p e c t t o e a c h o t h e r w i t h i n t h e o r i g i n a l 1 4 e n z y m e m i x t u r e s . V a l u e s h i g h l i g h t e d s i g n i j y s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e a t p < 0 . 0 1 a n d p < 0 . 0 5 l e v e l s , 1 - A A C A X E 1 A X E 2 F A E C I P l C I P 2 P L P M E R H A E A R H S W O B G 1 B M A N O B G 3 B X 3 E C 2 B M B G A L 2 C B H 2 G H 6 C B H 1 E C 1 E X 2 E X 1 E 0 3 A M Y G A M Y 0 . 8 9 6 0 . 5 4 2 0 . 5 4 5 0 . 5 7 1 0 . 6 4 8 0 . 8 8 1 0 . 6 3 7 0 . 8 6 5 0 . 9 3 2 0 . 6 2 9 0 . 5 9 2 0 . 7 2 3 0 . 8 0 6 0 . 7 9 7 0 . 7 7 1 0 . 7 7 9 0 . 8 3 1 P L P M E 0 . 6 0 9 0 . 9 1 4 0 . 5 4 8 R H A E A R H S W O B G l B M A N O B G 3 B X 3 0 . 6 2 9 0 . 9 5 5 0 . 5 9 3 0 . 7 4 2 0 . 5 4 8 0 . 7 5 2 0 . 5 9 8 E G 2 Z G E 3 X B 3 G B O N A 5 1 6 . 0 8 1 4 3 3 5 9 9 0 3 1 3 0 7 7 6 6 9 6 9 5 . . . . . . . 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M B G T O A I 2 S . . . d t n o C 1 1 . 7 - v e l b a T 3 2 6 0 . 8 4 5 0 . 9 4 5 0 . 9 6 6 0 . 8 1 5 G T 0 . 8 4 5 0 . 9 4 5 0 . 9 6 6 0 . 8 1 5 0 . 7 9 7 0 . 9 4 6 0 . 6 1 9 0 . 8 4 5 0 . 9 4 5 0 . 9 6 6 0 . 8 1 5 0 . 7 9 7 0 . 9 4 6 0 . 6 5 5 0 . 6 7 6 ) s r a g u S l a t o T ( A V O N A ) n o i s r e v n o c n a l y x % ( A V O N A ) n o i s r e v n o c n a c u l g % ( A V O N A 3 2 7 T a b l e V - 7 . 1 2 A N O V A r e s u l t s c o m p a r i n g t o p a n d b o t t o m 2 5 % q u a r t i l e g r o u p s f o r i n d i v i d u a l p r o t e i n c o m p o n e n t s , b a s e d o n v a r y i n g % g l u c a n , % x y l a n a n d t o t a l s u g a r h y d r o l y s i s y i e l d . V a l u e s h i g h l i g h t e d i n b o l d s i g n i fi r s t a t i s t i c a l s i g n i fi c a n c e a t p < 0 . 0 5 l e v e l . S u m o f M e a n S u m o f M e a n S u m o f M e a n S q u a r e s d f S q u a r e F S i g . S q u a r e s d f S q u a r e F S i g . S q u a r e s d f S q u a r e F S l g . A C B / w g r o u p s 7 . 4 7 1 7 . 4 7 5 1 9 . 2 8 . 0 0 0 1 . 7 8 1 1 . 7 8 5 6 . 4 6 . 0 1 1 2 . 4 7 1 2 . 4 6 9 6 . 2 9 . 0 1 3 W i t h i n g r o u p s 1 4 4 . 9 9 3 7 4 . 3 8 8 1 0 3 . 8 1 3 7 6 . 2 7 6 1 4 6 . 8 4 3 7 4 . 3 9 3 T o t a l 1 5 2 . 4 6 3 7 5 1 0 5 . 5 9 3 7 7 1 4 9 . 3 1 3 7 5 A X E 1 B / w g r o u p s 0 . 2 8 1 . 2 8 3 1 2 . 2 6 . 0 0 1 0 . 1 8 1 . 1 7 7 1 0 . 0 4 . 0 0 2 0 . 1 9 1 . 1 8 8 7 . 6 1 . 0 0 6 W i t h i n g r o u p s 8 . 6 4 3 7 4 . 0 2 3 6 . 6 4 3 7 6 . 0 1 8 9 . 2 7 3 7 4 . 0 2 5 T o t a l 8 . 9 2 3 7 5 6 . 8 2 3 7 7 9 . 4 5 3 7 5 A X E 2 B / w g r o u p s 2 . 6 9 2 . 6 8 8 4 7 6 . 3 7 . 0 0 0 0 . 3 0 1 . 2 9 5 2 7 . 7 0 . 0 0 0 1 . 6 2 1 1 . 6 2 2 1 8 7 . 6 0 . 0 0 0 W i t h i n g r o u p s 2 . 1 1 3 7 4 . 0 0 6 4 . 0 1 3 7 6 . 0 1 1 3 . 2 3 3 7 4 . 0 0 9 T o t a l 4 . 8 0 3 7 5 4 . 3 0 3 7 7 4 . 8 6 3 7 5 F A E B / w g r o u p s 0 . 8 4 1 . 8 4 3 2 5 . 1 4 . 0 0 0 0 . 7 6 1 . 7 5 9 7 1 . 5 3 . 0 0 0 0 . 0 5 1 . 0 5 4 1 . 6 0 . 2 0 7 W i t h i n g r o u p s 1 2 . 5 4 3 7 4 . 0 3 4 3 . 9 9 3 7 6 . 0 1 1 1 2 . 5 0 3 7 4 . 0 3 3 T o t a l 1 3 . 3 8 3 7 5 4 . 7 5 3 7 7 1 2 . 5 6 3 7 5 C W 1 B / w g r o u p s 0 . 0 7 1 . 0 6 6 0 . 2 0 . 6 5 2 0 . 1 6 1 . 1 5 9 0 . 4 7 . 4 9 3 0 . 0 0 1 . 0 0 2 0 . 0 1 . 9 4 4 W i t h i n g r o u p s 1 2 0 . 0 3 3 7 4 . 3 2 1 1 2 7 . 1 1 3 7 6 . 3 3 8 1 5 1 . 8 5 3 7 4 . 4 0 6 T o t a l 1 2 0 . 1 0 3 7 5 1 2 7 . 2 7 3 7 7 1 5 1 . 8 5 3 7 5 C I P 2 B / w g r o u p s 1 5 . 4 7 1 5 . 4 6 8 5 6 . 7 6 . 0 0 0 0 . 5 0 l . 5 0 2 1 . 9 6 . 1 6 3 6 . 6 5 1 6 . 6 4 6 2 0 . 2 7 . 0 0 0 W i t h i n g r o u p s 1 0 1 . 9 2 3 7 4 . 2 7 3 9 6 . 5 7 3 7 6 . 2 5 7 1 2 2 . 6 4 3 7 4 . 3 2 8 T o t a l 1 1 7 . 3 8 3 7 5 9 7 . 0 7 3 7 7 1 2 9 . 2 9 3 7 5 P L B / w g r o u p s 1 3 . 3 9 1 3 . 3 9 3 3 1 . 7 5 . 0 0 0 1 1 . 5 5 1 1 1 . 5 5 4 9 6 . 3 3 . 0 0 0 0 . 5 4 1 . 5 4 2 1 . 3 1 . 2 5 3 W i t h i n g r o u p s 1 5 7 . 7 6 3 7 4 . 4 2 2 4 5 . 1 0 3 7 6 . 1 2 0 1 5 4 . 6 8 3 7 4 . 4 1 4 T o t a l 1 7 1 . 1 5 3 7 5 5 6 . 6 5 3 7 7 1 5 5 . 2 2 3 7 5 u — G u — n . — 8 3 8 . 4 0 . 0 9 3 . 0 3 3 5 5 . 2 9 1 e n r a a 0 5 2 9 7 4 5 2 7 1 . 7 0 0 3 e u q M S f d ) n o i s r e v n o 0 0 1 . . . 3 . . 4 4 1 1 0 0 . 0 4 4 8 8 . . 3 3 3 3 2 3 . 4 3 0 0 0 . c 6 2 5 0 7 0 1 2 n 6 1 9 0 a l y x % ( A V O . 4 . . . 3 6 1 4 6 2 . . 1 7 9 9 . . . 4 0 9 9 4 8 8 . 0 1 N 3 4 A 0 0 i 0 S . 5 3 . 6 2 6 1 6 6 6 2 2 6 0 9 1 6 . . 4 3 . 2 % 1 1 1 1 f ( d A f s V 5 6 3 o e 7 7 3 4 4 2 0 0 2 7 6 0 2 O . . 0 m a . . . 5 6 6 6 9 . 3 8 3 4 1 0 6 7 6 6 r . . . 6 6 1 . N q 3 3 2 2 u 0 0 u 1 2 6 8 4 6 S 1 1 1 2 A S s s s s s s s s p p p p p p p p u u u u u u u u o o o o o o o o r l r l r r l l r r r r g g g a a a g a g g g g t t t n n o o o n n t o w w w w i i T T T i T i h h h h / / / / t t t t B B B B i i i i W W W W E A H R O W S 3 2 8 T a b l e V - 7 . 1 2 C o n t d . . . r l u c a n c o n v e r s i o n ) A N O V A ( T o t a l S u g a r s ) M e a n S q u a r e F S u m o f S q u a r e s ( 1 1 ' M e a n S q u a r e S u m o f S q u a r e s P M E 5 . 6 7 1 8 0 . 4 3 8 6 . 1 0 5 . 6 6 6 . 2 1 5 0 . 0 2 7 7 . 8 0 7 7 . 8 2 . 0 2 2 . 2 0 8 0 . 1 1 . 9 6 0 . 0 9 0 1 0 . 6 6 . 0 0 1 0 . 1 8 3 3 . 1 0 3 3 . 2 8 2 . 0 3 . 0 0 1 . 0 9 0 0 . 0 1 . 9 1 2 A R H . 3 2 5 . 0 5 6 5 . 8 3 . 0 1 6 0 . 0 0 2 1 . 9 6 2 1 . 9 6 B / w g r o u p s W i t h i n g r o u p s T o t a l 5 8 . 4 0 1 4 3 . 6 7 2 0 2 . 0 8 v — d 5 8 . 4 0 2 . 3 8 4 1 5 2 . 0 3 . 0 0 0 0 . 0 1 1 5 5 . 9 8 1 5 5 . 9 9 . 0 0 6 . 4 1 5 0 . 0 1 2 1 . 6 8 1 9 1 . 9 2 2 1 3 . 6 0 2 1 . 6 7 9 . 5 1 3 4 2 . 2 5 B C ] 2 1 0 . 1 9 8 4 . 4 5 5 4 7 . 1 9 . 0 0 0 6 3 . 4 5 1 7 2 7 . 3 6 1 7 9 0 . 8 1 6 3 . 4 5 0 1 3 . 8 1 4 . 5 9 4 1 4 3 . 2 7 1 7 6 3 . 3 7 1 9 0 6 . 6 4 B M A N O B / w g r o u p s W i t h i n g r o u p s T o t a l 4 . 0 7 l 4 7 . 1 9 5 1 . 2 5 3 2 . 2 3 . 0 0 0 0 . 8 3 2 8 . 3 2 2 9 . 1 6 . 8 3 3 . 0 7 5 1 1 . 0 6 1 . 0 7 4 8 . 5 1 4 9 . 5 8 8 . 2 8 B C 3 B / w g r o u p s W i t h i n g r o u p s T o t a l 4 1 3 2 . 3 2 3 7 5 6 7 9 . 7 9 . 0 0 0 1 4 2 . 7 1 3 8 8 9 . 3 7 4 0 3 2 . 0 9 1 4 2 . 7 1 5 1 3 . 8 0 1 0 . 3 4 4 1 4 1 1 . 2 5 2 7 4 1 . 1 2 4 1 5 2 . 3 6 1 4 1 1 7 . 3 2 9 2 0 0 . 0 3 . 3 0 2 9 . . 0 7 3 5 0 4 9 6 8 0 7 8 0 1 1 7 4 8 . . 4 1 5 3 4 0 . . . 2 7 5 4 9 . 2 4 f s o e r m a u u 0 7 2 8 5 9 7 8 5 0 2 7 . . 2 4 . 2 6 . . . 4 7 . . 6 6 6 . . 2 4 1 8 7 3 9 5 5 . . 3 4 4 3 7 7 2 9 9 2 0 0 q 1 1 S S 6 2 3 7 7 6 6 2 2 1 1 ) n o i s r e v n o c n a l y x % ( 8 4 . 1 2 f d 7 6 . 1 ‘ 1 3 6 5 0 8 3 9 6 5 6 2 8 3 1 3 3 0 . . . 2 1 1 . . . A f s o e 0 3 7 1 1 8 2 4 8 2 V 3 6 4 7 4 4 r 7 . 3 4 8 . 8 . . 1 1 0 O m a . 3 6 . . . . 5 . . . 7 u u 2 2 2 N q 5 5 1 1 8 0 3 1 4 0 1 1 1 8 8 3 3 S 1 1 A S 0 1 1 . 6 5 . 2 6 4 7 2 8 1 . . 2 1 % ( A f s V o e r O m a N q u u A S S 1 8 . 1 0 0 . 0 5 8 5 9 9 5 1 3 4 5 . 0 . 5 . 2 5 . 2 3 2 5 7 9 5 8 . 5 4 9 3 1 . . 7 3 2 3 s s s s p p p p u u u u o o o o r r l l r r g a g a g g t t n n o o w w i T i T h h / / t t B i B i W W 2 C E 1 H B C 3 2 9 T a b l e V - 7 . 1 2 C o n t d . . . w l u c a n c o n v e r s i o n ) A N O V A ( T o t a l S u g a r s ) ( 1 1 ' M e a n S q u a r e F S i g . M e a n S q u a r e F S i g . d f M e a n S q u a r e S i g . B X 3 B / w g r o u p s W i t h i n g r o u p s T o t a l T 8 8 4 2 0 . 2 0 4 2 3 . 0 8 2 1 . 0 4 3 6 8 . 1 7 3 8 9 . 2 0 2 1 . 5 6 . 9 7 9 0 . 1 9 4 5 6 . 3 1 4 5 6 . 4 9 . 1 8 5 1 . 2 2 0 0 . 1 5 . 6 ? B / w g r o u p s W i t h i n g r o u p s T o t a l 8 1 . 3 3 5 8 7 . 0 8 6 6 8 . 4 0 8 1 . 3 2 9 1 . 5 7 0 2 . 0 3 5 4 . 7 7 6 7 6 . 1 1 7 3 0 . 8 8 B M B / w g r o u p s W i t h i n g r o u p s T o t a l 2 . 5 6 1 3 7 . 2 5 1 3 9 . 8 1 2 . 5 6 0 . 3 6 7 6 . 9 7 . 0 0 9 0 . 3 6 1 3 5 . 4 1 1 3 5 . 7 6 0 . 9 9 . 3 2 1 3 . 7 6 9 . 3 8 2 9 . 8 7 B C A L 2 2 . 6 0 1 4 . 4 3 1 7 . 0 2 6 7 . 2 8 4 0 . 9 4 2 . 3 2 1 5 . 1 4 1 7 . 4 6 C B H 2 B / w g r o u p s W i t h i n g r o u p s T o t a l 1 7 4 . 0 2 2 1 8 4 . 2 7 2 3 5 8 . 2 9 1 7 4 . 0 2 1 5 . 8 4 0 2 9 . 8 0 8 . 1 3 6 4 . 8 8 6 6 7 . 6 6 6 7 . 2 9 2 9 . 2 8 . 0 0 2 C H 6 B / w g r o u p s W i t h i n g r o u p s T o t a l 5 . 8 4 8 . 0 7 3 1 . 0 4 4 . 0 8 1 1 2 . 9 2 . 0 0 0 3 . 1 9 9 . 0 7 8 2 5 5 . 1 8 1 2 1 3 9 . 8 1 2 3 9 5 . 0 7 . 8 6 2 5 0 . 2 1 1 1 3 6 9 . 4 1 1 6 1 9 . 6 2 5 0 . 2 1 0 3 0 . 2 3 8 . 0 0 4 0 . 1 7 . 6 7 8 5 0 0 1 . 0 1 . 7 4 3 1 6 5 3 2 1 1 6 2 4 6 4 . 4 8 3 3 8 4 . . . . . 1 2 6 1 6 3 1 9 2 8 9 1 . 4 8 3 7 6 8 1 . . 4 1 f s o e 8 3 8 8 5 1 0 4 8 2 1 8 6 6 0 r 3 . . 3 . . m a . . 7 7 6 9 7 . 1 . . 9 0 u u S q S 9 2 0 1 6 3 4 7 0 6 3 8 9 5 6 0 0 2 2 7 7 1 1 1 ) n o i s r 5 4 . 1 8 7 1 0 . . 6 0 e 1 v n o 3 1 3 2 9 c 8 0 4 2 6 n 4 3 . 3 . a . 4 . 1 . . 6 1 . . 6 4 6 0 1 . 2 l 1 7 . 2 3 2 3 5 3 1 9 9 5 5 8 3 3 2 5 1 y x % ( A V O N A ) n o i s r e v n o 6 3 . 1 2 7 5 8 . . 2 3 8 8 c 3 8 9 4 0 . 0 9 . 3 3 0 . 5 1 4 n a - 2 0 9 3 6 c . 6 u 9 1 l 2 J 3 0 1 5 3 . 2 8 . 0 5 2 3 6 . 8 1 4 2 . 1 % 1 1 f ( d A f s 2 0 5 7 7 V 5 o e 3 7 2 7 7 r 0 . . . . . 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S u m o f S q u a r e s 1 1 1 ' M e a n S q u a r e C H 1 7 B / w g r o u p s W i t h i n g r o u p s T o t a l 4 . 6 2 1 1 5 0 . 1 8 1 5 4 . 8 0 4 . 6 2 3 . 4 0 2 4 . 9 4 5 . 7 6 1 5 4 . 5 5 1 6 0 . 3 0 5 . 7 3 9 r . 4 1 3 B / w g r o u p s W i t h i n g r o u p s T o t a l 0 . 0 9 1 1 . 6 0 1 . 6 9 0 . 0 3 1 1 . 5 9 1 . 6 3 . 0 3 3 . 0 0 4 0 . 0 4 1 . 7 4 1 . 7 8 . 0 4 0 . 0 0 5 8 . 6 2 0 . 2 8 l 7 . 9 8 8 . 2 6 3 7 5 . 0 1 3 . 0 2 3 0 . 5 7 . 4 5 1 0 . 2 9 8 . 2 7 8 . 5 5 . 2 8 7 . 0 2 2 B / w g r o u p s W i t h i n g r o u p s T o t a l 3 . 2 2 1 6 8 . 0 5 7 1 . 2 7 3 . 2 2 1 . 1 8 2 1 7 . 7 0 0 . 1 9 1 5 9 . 8 6 6 0 . 0 5 . 1 8 6 . 1 5 9 1 . 1 7 . 2 8 1 1 . 4 3 6 9 . 8 2 7 1 . 2 5 P C L 0 . 9 2 2 2 . 6 7 1 1 9 7 8 . 5 3 2 0 0 1 . 2 0 2 2 . 6 7 3 5 . 2 6 2 4 . 3 1 3 4 . 3 2 6 4 . 9 4 4 B / w g r o u p s W i t h i n g r o u p s T o t a l 0 . 0 4 1 3 . 0 6 3 . 1 0 . 0 3 7 . 0 0 8 0 . 0 7 1 3 . 5 1 3 . 5 8 7 . 2 0 0 . 0 0 3 . 0 5 3 . 0 5 . 0 0 0 . 0 0 8 0 . 0 4 A C B / w g r o u p s W i t h i n g r o u p s T o t a l 2 . 1 1 1 7 0 . 4 1 7 2 . 5 2 2 . 1 1 1 . 1 8 8 1 1 . 2 1 2 . 9 6 1 3 2 . 0 1 3 4 . 9 8 2 . 9 6 3 . 0 8 5 0 . 0 4 7 5 . 9 5 7 5 . 9 8 . 0 3 6 . 2 0 3 0 . 1 8 . 6 7 4 8 6 0 . g i S 7 6 0 8 . . 8 9 2 8 0 7 2 . 6 0 . 6 f d 6 7 6 7 7 7 7 7 3 3 3 3 f s o e r m a u u S q S 9 1 5 6 . 0 9 4 2 9 . . 2 2 1 1 7 9 . 1 1 4 . 5 7 8 4 6 1 5 1 5 6 1 3 8 . . . . 4 5 5 4 1 1 7 7 7 7 3 3 3 3 9 1 2 0 6 3 6 8 . . . . 7 8 0 1 1 0 2 8 2 0 . . 9 0 1 1 5 6 8 0 . 4 6 0 1 . 0 . 1 0 0 0 0 0 0 g 4 0 0 0 0 0 0 i 1 0 0 0 0 0 0 S . . . . . . . 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E n z y m e c e l M e a n t o p 5 % X , T S , t o p 5 % G , t o p 5 % X . 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M A 1 4 4 4 . . 2 . . . . . . 1 . . . . . 2 2 2 . . . . . . 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 1 4 4 4 4 4 4 1 l 1 A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A 3 6 7 T a b l e V - 7 . 1 5 C o n t d . . . r e 1 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 0 % 0 % 0 % 0 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 0 % 0 % 0 % 0 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % c c 5 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % c c 6 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 2 5 % 0 % 0 % 0 % 0 % 9 . 4 6 7 7 0 3 5 . . . . . . 9 4 9 5 1 6 3 2 4 4 4 4 9 9 3 9 5 9 1 . . . . . . . 0 0 0 3 9 7 8 1 1 1 9 9 0 0 0 5 5 . . . . . . . 8 2 3 0 0 8 4 2 2 4 8 7 7 7 2 9 7 7 8 5 9 . . . . . . . 5 6 1 1 9 6 4 2 2 4 4 3 3 1 5 5 5 5 5 5 5 7 7 7 7 7 7 7 . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5 0 . . 5 . . 7 7 2 2 0 1 5 5 5 5 0 . 5 . . 0 . 1 7 2 7 2 5 5 5 5 0 . . 5 0 . . 1 7 7 2 2 0 1 3 6 8 A P P E N D I X V I ( C h a p t e r 8 - P u r i f i e d e n z y m e s y n e r g y ) T a b l e V I - 8 . 5 G l u c a n ( % G ) 2 4 h o u r h y d r o l y s i s y i e l d s f o r u n t r e a t e d a v i c e l ( U A W , l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d A v i c e l ( A A V ) , u n t r e a t e d c o r n s t o v e r ( U C S ) a n d A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r ( A C S ) b y v a r y i n g c e l l u l a s e ( C B H I , C B H I I , E G I ) c o m b i n a t i o n s ( m g e n z y m e / g g l u c a n ) . P r o t e i n l o a d i n g ( m g / g g l u c a n ) U A V A A V U C S A C S C B H I C B H 1 1 E G I [ 3 G % G % G % G % G 1 5 0 0 0 . 7 5 1 3 . 4 4 . 5 1 . 7 5 . 0 0 1 5 0 0 . 7 5 9 . 7 4 . 2 1 . 0 5 . 2 0 0 1 5 0 . 7 5 3 . 7 5 . 9 4 . 7 7 . 8 I - - — - - — - - - - d - — - - I - - - — _ - I - - I — — - - - — - - - - — I - - . I - — - - - - I - — - - — - — - — — — - — — — _ — - — — — — - — I — - — — - b — — — — — — - — - . — — — — a t v — i m m l v - t n x o l b o o o x I l l l T a b l e V I — 8 . 7 G l u c a n ( % G ) a n d x y l a n ( % X ) 2 4 h o u r h y d r o l y s i s y i e l d s f o r A F E X t r e a t e d c o r n s t o v e r b y v a r y i n g e n z y m e ( C B H I , C B H 1 1 , E C 1 , E X , fl X ) c o m b i n a t i o n s ( m g e n z y m e / g g l u c a n ) . P r o t e i n l o a d i n g ( m g / g g l u c a n ) # C B H I C B H 1 1 E G I E X B X 1 3 G % G ° / . x 1 1 5 0 0 0 0 1 . 5 5 . 4 1 . 3 2 0 1 5 o 0 o 1 5 6 . 1 0 2 3 0 0 1 5 o 0 1 5 1 2 . 1 6 5 4 0 0 o 1 5 0 1 . 5 2 . 2 1 6 0 _ 5 0 0 0 0 1 5 1 . 5 1 . 8 8 2 ' 6 " ' " ' 7 . 5 ' " ' 7 3 " " 0 " " 0 " " ‘ 6 " " " 1 § " " 9 ‘ 7 " " 0 3 " 7 7 . 5 0 7 5 0 0 1 5 4 7 . 9 5 8 8 7 . 5 0 o 7 5 0 1 5 1 1 . 6 1 3 5 9 7 5 0 0 0 7 . 5 1 . 5 5 1 9 6 1 0 o 7 5 7 . 5 0 0 1 . 5 3 0 5 5 3 1 1 0 7 5 0 7 5 0 1 . 5 1 4 9 1 3 3 1 2 o 7 5 o 0 7 . 5 1 5 5 4 6 8 1 3 0 0 7 . 5 7 5 o 1 . 5 1 2 . 3 1 2 . 7 1 4 0 0 7 . 5 0 7 . 5 1 . 5 1 1 . 3 3 6 . 0 _ _ 1 _ 5 _ _ _ _ _ 0 _ _ _ _ 0 _ _ _ _ _ 0 _ _ _ _ 7 . 5 _ _ _ 7 . 5 1 . 5 1 . 7 4 9 - 2 - P r o t e i n l o a d i n g ( m g / g g l u c a n ) # C B H I C B H 1 1 E G I E X B X 1 3 G % G % x 1 6 4 . 9 5 4 . 9 5 4 . 9 5 0 0 1 . 5 5 6 . 8 5 . 4 1 7 4 . 9 5 4 . 9 5 0 4 . 9 5 0 1 . 5 3 6 . 7 1 0 . 5 1 8 4 . 9 5 4 . 9 5 0 0 4 . 9 5 1 . 5 9 . 3 8 . 2 1 9 4 . 9 5 0 ' 4 . 9 5 4 . 9 5 o 1 . 5 5 2 . 1 9 . 8 2 0 4 . 9 5 0 4 . 9 5 0 4 . 9 5 1 . 5 4 2 . 9 3 7 . 4 2 1 4 . 9 5 o 0 4 . 9 5 4 . 9 5 1 . 5 1 2 . 3 4 7 . 1 2 2 0 4 . 9 5 4 . 9 5 4 . 9 5 0 1 . 5 3 5 . 1 1 0 . 7 2 3 0 4 . 9 5 4 . 9 5 0 4 . 9 5 1 . 5 2 8 . 0 3 5 . 5 2 4 0 4 . 9 5 o 4 . 9 5 4 . 9 5 1 . 5 1 2 . 5 4 7 . 9 _ _ _ 5 _ _ 0 0 4 9 5 4 . 9 5 4 . 9 5 1 5 1 1 8 4 7 5 6 " 3 ‘ 7 5 “ 3 7 5 " ' 3 _ 7 5 _ " 3 . 7 _ 5 " _ 0 1 5 6 5 3 9 1 2 7 3 7 5 3 7 5 3 7 5 0 3 7 5 1 5 5 3 7 3 7 8 2 8 3 7 5 3 7 5 0 3 . 7 5 3 7 5 1 5 3 0 5 4 8 1 2 9 3 7 5 0 3 7 5 3 . 7 5 3 . 7 5 1 5 4 8 4 5 0 5 _ 0 3 7 5 3 7 5 3 7 5 3 . 7 5 1 . 5 3 1 2 4 7 8 " " ‘ " 3 ' " ' 3 ' " ’ E I I Z I 3 _ ' . Z I I E Z Z Z E E Z 2 2 6 1 3 2 2 2 2 5 3 2 2 3 6 9 A P P E N D I X V I I - M a t e r i a l s a n d E x p e r i m e n t a l M e t h o d s A - V l l - l . B i o m a s s f e e d s t o c k ( a ) P r e - m i l l e d ( P M ) c o r n s t o v e r , p a s s e d t h r o u g h a 1 0 m m s c r e e n , w a s g e n e r o u s l y p r o v i d e d b y t h e N a t i o n a l R e n e w a b l e E n e r g y L a b o r a t o r y ( N R E L ) , G o l d e n ( C o l o r a d o ) . T h e c o r n s t o v e r f e e d s t o c k w a s g r o w n f r o m P i o n e e r H y b r i d s e e d v a r i e t y ( 3 3 A 1 4 ) a n d h a r v e s t e d i n 2 0 0 2 f r o m t h e K r a m e r f a r m i n W r a y , C O . N R E L c o r n s t o v e r w a s u s e d f o r m o s t e x p e r i m e n t s , e x c e p t i n s o m e c a s e s w h e r e o t h e r s o u r c e s o f b i o m a s s w e r e u t i l i z e d . ( b ) N R E L p r e - m i l l e d c o r n s t o v e r w a s f u r t h e r m i l l e d i n a c o n v e n t i o n a l l a b o r a t o r y b l e n d e r f o r a p e r i o d o f t e n m i n u t e s , f o l l o w e d b y s i e v i n g f o r t w e n t y m i n u t e s i n a R o - T a p t e s t i n g s i e v e s h a k e r ( M o d e l B , T y l e r ) t o o b t a i n v a r i o u s c o r n s t o v e r m e s h c u t f r a c t i o n s . T h e P M c o r n s t o v e r w a s a l s o m i l l e d d o w n t o a d e s i r e d p a r t i c l e s i z e r a n g e u s i n g a c e n t r i f u g a l m i l l ( M o d e l Z M 2 0 0 , R e t s c h ) fi t t e d w i t h v a r i o u s r i n g s i e v e a t t a c h m e n t s . ( 0 ) C o r n s t o v e r w a s a l s o f r e s h l y h a r v e s t e d f r o m M S U f a r m s ( 2 h a r v e s t t i m e p o i n t s : e a r l y a n d l a t e c o r r e s p o n d i n g t o l a t e J u l y a n d e a r l y S e p t e m b e r , r e s p e c t i v e l y ) a n d u s e d f o r c e r t a i n m i c r o s c o p y e x p e r i m e n t s ( e . g . A F M , S E M , a n d L S C M ) . T h e M S U c o r n s t e m s w e r e s e c t i o n e d i n t o t h i n s l i c e s ( s l i c e t h i c k n e s s r a n g i n g f r o m 1 0 0 p m t o 1 m ) u s i n g a b l a d e p r i o r t o A F E X p r e t r e a t m e n t . ( d ) A v i c e l ( P H - 1 0 1 , S i g m a - A l d r i c h , S t - L o u i s ) , c o t t o n l i n t e r s ( L o n g fi b e r s , S i g m a - A l d r i c h , S t - L o u i s ) , o a t s p e l t x y l a n ( S i g m a - A l d r i c h , S t - L o u i s ) a n d r e g u l a r c o t t o n b a l l s ( s c o u r e d a n d b l e a c h e d ; C o u r t e s y D r . A l F r e n c h , U S D A ) w e r e p r o c u r e d f r o m r e s p e c t i v e s o u r c e s . 3 7 0 A - V l l - 2 . B i o m a s s c e n t r i f u g a l m i l l i n g T h e p r e - m i l l e d c o r n s t o v e r ( b e f o r e o r a f t e r A F E X p r e t r e a t m e n t ) w a s s i e v e d i n a R o - T a p t e s t i n g s i e v e s h a k e r ( M o d e l B , T y l e r ) t o s e p a r a t e c o r n s t o v e r f r a c t i o n s l a r g e r t h a n 1 0 0 n m s . T h e l a r g e r s t o v e r f r a c t i o n s w e r e m i l l e d u s i n g a c e n t r i f u g a l m i l l ( M o d e l Z M 2 0 0 , R e t s c h , N e w t o w n , P A ) fi t t e d w i t h a 2 5 0 p m r i n g s i e v e a t t a c h m e n t f o l l o w e d b y s i e v i n g t o s e p a r a t e s t o v e r r e s i d u a l f r a c t i o n l a r g e r t h a n 1 0 0 n m s . T h e m i l l e d f r a c t i o n s w e r e s i e v e d t o r e m o v e fi n e r p a r t i c l e s a n d h e l p s p e e d u p t h e m i l l i n g p r o c e s s . T h i s a l s o a v o i d e d e x c e s s i v e h e a t i n g o f t h e b i o m a s s d u e t o a c c u m u l a t i o n o f fi n e s w i t h i n t h e m i l l . T h e r e s i d u a l f r a c t i o n ( l a r g e r t h a n 1 0 0 u r n s ) w a s c e n t r i f u g a l l y m i l l e d w i t h a n 8 0 p m r i n g s i e v e a t t a c h m e n t . T h e m i l l e d f r a c t i o n w a s a g a i n s i e v e d t o e n s u r e p a r t i c l e s i z e w a s l e s s t h a n 1 0 0 m s . N o f r a c t i o n o f t h e o r i g i n a l s u b s t r a t e w a s l e f t o u t d u r i n g t h e m i l l i n g p r o c e s s a n d m i l l e d f r a c t i o n s ( p a r t i c l e s i z e < 1 0 0 n m s ) w e r e m i x e d a t t h e e n d t o g i v e a h o m o g e n e o u s , r e p r e s e n t a t i v e s a m p l e . R e v o l u t i o n s p e e d f o r g r i n d i n g w a s s e t a t 1 8 , 0 0 0 r p m w i t h t h e b i o m a s s f e d c o n t i n u o u s l y ( f e e d r a t e ~ 1 0 g m / m i n ) u s i n g a v i b r a t o r y f e e d e r ( D R 1 0 0 , R e t s c h ) . T h e g r o u n d m a t e r i a l w a s r e m o v e d c o n t i n u o u s l y f r o m t h e c a s s e t t e u s i n g a c y c l o n e s e p a r a t o r t o a v o i d h e a t b u i l d u p d u r i n g t h e m i l l i n g o p e r a t i o n . A - V l I - 3 . P a r t i c l e s i z e d i s t r i b u t i o n P a r t i c l e s i z e d i s t r i b u t i o n f o r c e n t r i f u g a l l y m i l l e d c o r n s t o v e r w a s d e t e r m i n e d u s i n g a s i e v e s h a k e r ( A S 2 0 0 , R e t s c h , N e w t o w n , P A ) u s i n g s t a n d a r d s i e v e s w i t h m e s h s i z e s r a n g i n g f r o m 0 . 0 3 8 t o 0 . 1 2 5 m m ( s i e v e d i a m e t e r 8 ” x 2 ” a c c o r d i n g t o A S T M E l 1 - 0 1 ) a t a m p l i t u d e 1 . 2 m m , i n t e r v a l t i m e o f 1 0 s e c a n d s i e v i n g d u r a t i o n o f 5 m i n . A fi x e d a m o u n t o f c o r n s t o v e r ( 2 5 - 3 0 g m s ) w a s m i l l e d i n 4 r e p l i c a t e b a t c h e s a n d p a r t i c l e s i z e d i s t r i b u t i o n d e t e r m i n e d f o r t h e e n t i r e q u a n t i t y o f m i l l e d s a m p l e . T h e p a r t i c l e s i z e f o r c r y s t a l l i n e 3 7 1 c e l l u l o s e ( A v i c e l ) w a s a l s o d e t e r m i n e d i n d u p l i c a t e . T h e p a r t i c l e s i z e d i s t r i b u t i o n r e s u l t s a r e r e p o r t e d i n C h a p t e r 5 . 1 . A - V I I - 4 . A F E X p r e t r e a t m e n t ( a ) A F E X p r e t r e a t m e n t o n c o r n s t e m c r o s s - s e c t i o n s f o r c e r t a i n m i c r o s c o p y e x p e r i m e n t s ( S E M , L S C M , A F M ) w a s c a r r i e d o u t i n a s m a l l 2 2 m 1 b e n c h - t o p r e a c t o r ( 3 1 6 S S , P A R R I n s t r u m e n t C o , I L ) d u e t o l i m i t e d a v a i l a b i l i t y o f s a m p l e . T h e v e s s e l w a s l o a d e d w i t h f e e d s t o c k c o n t a i n i n g t h e a p p r o p r i a t e m o i s t u r e c o n t e n t ( 6 0 % o r 2 0 0 % , d w b ) . T h e r e a c t o r w a s c l a m p e d s h u t a n d t h e r e q u i r e d a m o u n t o f a m m o n i a ( 1 : 1 o r 2 : 1 a m m o n i a t o b i o m a s s l o a d i n g , w / w ) w a s i n j e c t e d u s i n g a p r o - w e i g h e d d e l i v e r y v e s s e l . T h e r e a c t o r w a s h e a t e d u s i n g a c u s t o m m a d e a l u m i n i u m b l o c k o n a V e l a h o t p l a t e a n d w a s m a i n t a i n e d a t t h e d e s i r e d t e m p e r a t u r e f o r t h e n e c e s s a r y r e s i d e n c e t i m e . I t t o o k a p p r o x i m a t e l y 3 0 - 4 5 m i n u t e s t o c o m p l e t e a t y p i c a l A F E X r e a c t i o n . A t t h e e n d o f t h e r e s i d e n c e t i m e , t h e p r e s s u r e w a s e x p l o s i v e l y r e l e a s e d u s i n g a h a l f i n c h N a t i o n a l p i p e t h r e a t ( N P T ) s t a i n l e s s s t e e l b a l l v a l v e a n d b i o m a s s w a s r e m o v e d f r o m t h e r e a c t o r a n d l e f t i n t h e h o o d o v e r n i g h t t o r e m o v e r e s i d u a l a m m o n i a . ( b ) V a r y i n g A F E X s e v e r i t y p r e t r e a t r n e n t s w e r e c a r r i e d o u t i n a 2 l i t e r o r 3 0 0 m l P a r r r e a c t o r ( F A R R I n s t r u m e n t C o , I L ) . T h e p r o t o c o l w a s m o d i fi e d f r o m t h e c o n v e n t i o n a l A F E X p r e t r e a t m e n t a p p r o a c h f o r b e t t e r c o n t r o l o v e r r e s i d e n c e t i m e . T h e r e a c t o r v e s s e l w a s p r e h e a t e d t o t h e d e s i r e d p r e t r e a t m e n t t e m p e r a t u r e u s i n g a s u i t a b l y m o d i fi e d h e a t i n g m a n t l e . T h e b i o m a s s ( a t s u i t a b l e m o i s t u r e c o n t e n t ) w a s a d d e d t o t h e p r e h e a t e d r e a c t o r a n d c l a m p e d s h u t . T h e a m m o n i a d e l i v e r y v e s s e l w a s fi l l e d w i t h t h e n e c e s s a r y a m o u n t o f a m m o n i a ( p r e h e a t e d i n a d v a n c e ) t o d e l i v e r t o t h e r e a c t o r . T h e r a t e o f h e a t i n g w a s e m p i r i c a l l y o p t i m i z e d t h r o u g h a t r i a l a n d e r r o r a p p r o a c h b y m e a s u r i n g p r e s s u r e a n d 3 7 2 t e m p e r a t u r e o f t h e a m m o n i a d e l i v e r y v e s s e l d u r i n g t h e h e a t i n g p r o c e s s . U p o n a d d i t i o n o f t h e h e a t e d a m m o n i a t o t h e b i o m a s s t h e c o n t e n t s o f t h e r e a c t o r i n s t a n t a n e o u s l y a c h i e v e d t h e d e s i r e d t e m p e r a t u r e ( w i t h i n : 1 0 ° C ) i n t h e r e a c t o r u p o n d e l i v e r y . T h e a c t u a l r e s i d e n c e t i m e f o r t h e p r e t r e a t m e n t w a s c l o c k e d f r o m t h e t i m e o f d e l i v e r y o f a m m o n i a t o t h e r e a c t o r . A l l e x p e r i m e n t s i n C h a p t e r 6 w e r e p e r f o r m e d o n s a m p l e s t h a t w e r e A F E X t r e a t e d ( 1 : 1 a m m o n i a l o a d i n g , 6 0 % m o i s t u r e , 9 0 ° C , 3 0 m i n ) a f t e r t h e m i l l i n g p r o c e s s . W h e r e a s , e x p e r i m e n t s i n C h a p t e r s 7 - 8 w e r e c a r r i e d o u t o n s a m p l e s t h a t w e r e m i l l e d a f t e r t h e A F E X p r o c e s s . A - V l I - S . C o m p o s i t i o n a l a n a l y s i s o f s o l i d a n d l i q u i d s a m p l e s ( a ) C o m p o s i t i o n a l a n a l y s e s o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s w e r e p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o N R E L L a b o r a t o r y A n a l y t i c a l P r o c e d u r e s ( L A P s ) : ( 1 ) P r e p a r a t i o n o f s a m p l e s f o r c o m p o s i t i o n a l a n a l y s i s , ( i i ) D e t e r m i n a t i o n o f s t r u c t u r a l c a r b o h y d r a t e s a n d l i g n i n i n b i o m a s s [ 3 4 6 ] . T h e p o l y s a c c h a r i d e c o m p o s i t i o n o f u n t r e a t e d N R E L c o r n s t o v e r w a s d e t e r m i n e d ( a t N R E L ) t o b e 3 4 . 4 % g l u c a n , 2 2 . 4 % x y l a n , 4 . 2 % a r a b i n a n , 0 . 6 % m a n n a n , 1 . 4 % g a l a c t a n , 1 1 % l i g n i n , 2 . 3 % p r o t e i n , 5 . 6 % a c e t y l , 6 . 1 % a s h , 3 . 8 % u r o n i c a c i d s a n d 2 . 2 % s u c r o s e . ( b ) O l i g o s a c c h a r i d e s i n t h e w a t e r e x t r a c t s w e r e q u a n t i fi e d b y a c i d h y d r o l y s i s b a s e d o n t h e N R E L L A P p r o t o c o l ( D e t e r m i n a t i o n o f S u g a r s , B y p r o d u c t s , a n d D e g r a d a t i o n P r o d u c t s i n L i q u i d F r a c t i o n P r o c e s s S a m p l e s ) [ 3 4 6 ] . A - V I I - 6 . S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( S E M ) S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y w a s c a r r i e d o u t o n a J E O L ( J a p a n E l e c t r o n O p t i c s L a b o r a t o r i e s ) 6 4 0 0 V S E M w i t h a L a B 6 e m i t t e r . T h e b i o m a s s s a m p l e s w e r e g o l d s p u t t e r c o a t e d w i t h o u t c r i t i c a l p o i n t d r y i n g ( C P D ) , t o a v o i d p o s s i b l e e x t r a c t i o n o f A F E X s u r f a c e 3 7 3 d e p o s i t s d u r i n g C P D , a n d i m a g e d a t a c c e l e r a t i n g v o l t a g e s b e t w e e n 1 0 - 2 0 k V t o p r e v e n t e l e c t r o n b e a m i n d u c e d d a m a g e t o t h e s p e c i m e n s . C e l l w a l l l u m e n p e r i m e t e r a n d e n c l o s e d a r e a w e r e c a l c u l a t e d u s i n g Z e i s s L S M I m a g e B r o w s e r ( V e r s i o n 3 . 0 , C a r l Z e i s s I n t e r n a t i o n a l , J e n a , G e r m a n y ) . A - V I I - 7 . L a s e r c o n f o c a l s c a n n i n g f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y ( L C S M ) U n t r e a t e d a n d A F E X p r e t r e a t e d M S U c o r n s t e m s s e c t i o n s ( s l i c e t h i c k n e s s r a n g i n g f r o m 1 0 0 p m t o 1 m m ) w e r e s t a i n e d w i t h 1 % O ’ S a f r a n i n ( S i g m a , S t L o u i s , M O ) i n d i s t i l l e d w a t e r f o r 1 5 m i n u t e s . A f t e r s t a i n i n g , t h e s e c t i o n s w e r e t h o r o u g h l y r i n s e d i n f r e s h d i s t i l l e d w a t e r . T h e s t a i n e d a n d r i n s e d s a m p l e s w e r e c a r e f u l l y m o u n t e d i n d i s t i l l e d w a t e r w i t h a c o v e r s l i p a n d o b s e r v e d u s i n g a Z e i s s P a s c a l L S C M . S e v e r a l o b j e c t i v e l e n s e s ( 1 0 X / 0 . 3 N A a n d 2 0 X / 0 . 5 N A C a r l Z e i s s P l a n - N e o fl u a r l e n s e s ; N A - n u m e r i c a l a p e r t u r e ) w e r e u s e d t o i m a g e t h e t h i c k e r s a m p l e s t h a t r e q u i r e d a l a r g e r w o r k i n g d i s t a n c e . E x c i t a t i o n fi o m a 5 4 3 n m l a s e r l i n e a n d e m i s s i o n p a s s i n g t h r o u g h a l o n g p a s s ( L P ) 5 6 0 n m fi l t e r w a s u s e d f o r o b s e r v i n g fl u o r e s c e n c e ( d i g i t a l l y c o l o r e d i n g r e e n ) . S e c t i o n s o f t h e t i s s u e w e r e a l s o o b s e r v e d f o r a u t o - fl u o r e s c e n c e w i t h o u t s t a i n i n g t h e s a m p l e s . S t a c k s o f c o n f o c a l O p t i c a l s e c t i o n s w e r e t a k e n t h r o u g h o u t t h e z - d e p t h o f t h e o b s e r v e d p l a n t s t e m s e c t i o n . S e v e r a l i n d i v i d u a l c r o s s - s e c t i o n s w e r e o b s e r v e d a n d e x t e n d e d f o c u s i m a g e s o f t h e s t a c k s w e r e c o m p i l e d u s i n g t h e m a x i m u m i n t e n s i t y a l g o r i t h m s o f t w a r e ( L S M 5 P a s c a l V e r s i o n 3 , C a r l Z e i s s I n t e r n a t i o n a l , J e n a , G e r m a n y ) . A - V I l - 8 . A t o m i c f o r c e m i c r o s c o p y ( A F M ) A F M i m a g i n g w a s c o n d u c t e d u s i n g a D i m e n s i o n N a n o s c o p e 3 1 0 0 S c a n n i n g P r o b e M i c r o s c o p e ( D i g i t a l I n s t r u m e n t s ) w i t h a N a n o s c o p e I I I a c o n t r o l l e r . B o t h a m p l i t u d e a n d p h a s e i m a g e s w e r e c o l l e c t e d s i m u l t a n e o u s l y i n t a p p i n g m o d e w i t h a n M P P - 1 1 1 0 0 , e t c h e d 3 7 4 s i l i c o n p r o b e w i t h a n o m i n a l f r e q u e n c y o f 3 0 0 k H z a n d a n o m i n a l s p r i n g c o n s t a n t o f 4 0 N / m . S o m e s a m p l e s w e r e e x t r a c t e d t h r e e t i m e s , a t r o o m t e m p e r a t u r e , w i t h ( 1 : 1 0 b i o m a s s t o s o l v e n t l o a d i n g , w / w ) 0 . 1 N s o d i u m h y d r o x i d e , f o l l o w e d b y 7 5 % e t h a n o l a n d D / I w a t e r p r i o r t o i m a g i n g . R M S r o u g h n e s s f a c t o r s w e r e e s t i m a t e d a f t e r i m a g e fl a t t e n i n g a n d p l a n e fi t t i n g o f t h e h e i g h t i m a g e s u s i n g t h e s o f t w a r e t h a t c a m e a l o n g w i t h t h e i n s t r u m e n t . T h e w i d t h o f t h e c e l l w a l l m i c r o fi b r i l s a n d A F E X d e p o s i t s w e r e c a l c u l a t e d u s i n g Z e i s s L S M I m a g e B r o w s e r ( V e r s i o n 3 . 0 , C a r l Z e i s s I n t e r n a t i o n a l , J e n a , G e r m a n y ) . A - V I I - 9 . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( T E M ) a n d 3 D - t o m o g r a p h y ( 3 D - T o m o ) C o r n s t o v e r s a m p l e s w e r e p r o c e s s e d u s i n g t h e m i c r o w a v e E l e c t r o n M i c r o s c o p y ( E M ) p r o c e s s i n g m e t h o d o l o g y [ 1 1 2 ] . T h e b i o m a s s w a s fi x e d t w i c e f o r 6 m i n i n 2 . 5 % g l u t e r a l d e h y d e s o l u t i o n b u f f e r e d i n 0 . 1 M s o d i u m c a c o d y l a t e b u f f e r ( E M S , H a t fi e l d , P S ) u n d e r v a c u u m . D e h y d r a t i o n w a s c a r r i e d o u t i n g r a d e d e t h a n o l s e r i e s f o r 1 m i n e a c h ( 1 5 % , 3 0 % , 6 0 % , 9 0 % , t w i c e f o r 1 0 0 % e t h a n o l ) . S a m p l e s w e r e i n fi l t r a t e d w i t h L R W h i t e ( o r E p o n ) r e s i n i n t h e m i c r o w a v e u n d e r v a c u u m a n d i n c u b a t e d o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f t h e r e s i n ( 1 5 % , 3 0 % , 6 0 % , 9 0 % , t h r i c e f o r 1 0 0 % r e s i n , d i l u t e d i n e t h a n o l ) . T h e s a m p l e s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d t o g e l a t i n c a p s u l e s a n d t h e r e s i n w a s p o l y m e r i z e d b y h e a t i n g t o 6 0 ° C o v e r n i g h t . L R W h i t e e m b e d d e d s a m p l e s w e r e s e c t i o n e d t o ~ 1 0 0 - 2 5 0 n m w i t h a D i a t o m e d i a m o n d k n i f e o n a L e i c a E M U T C u l t r a m i c r o t o m e ( L e i c a , W e t z l a r , G e r m a n y ) . T h e s e c t i o n e d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d o n F o r m v a r c o a t e d c o p p e r o r n i c k e l s l o t g r i d s ( S P I S u p p l i e s , W e s t C h e s t e r , P A ) . G r i d s w e r e p o s t - s t a i n e d f o r 6 m i n w i t h 2 % a q u e o u s u r a n y l a c e t a t e . T h e g r i d s w e r e a l s o s t a i n e d w i t h 1 % K M n O 4 f o r 1 0 m i n t o s e l e c t i v e l y s t a i n f o r l i g n i n . I m a g e s w e r e t a k e n w i t h a G a t a n U l t r a S c a n 1 0 0 0 c a m e r a ( G a t a n , P l e a s a n t o n , C A ) o n a F E I T e c n a i 6 2 2 0 T w i n 2 0 0 k V 3 7 5 L a B 6 T E M ( F E I , H i l s b o r o , O R ) . T o m o g r a m s w e r e c r e a t e d b y c a p t u r i n g d u a l - a x i s + / — 6 0 — 6 5 ° t i l t s e r i e s u s i n g S e r i a l E M ( h t t p : / / b i o 3 d . c o l o r a d o . e d u / ) . T o m o g r a m s w e r e c o n s t r u c t e d u s i n g a n R - w e i g h t e d b a c k p r o j e c t i o n a l g o r i t h m w i t h i n t h e I M O D s o f t w a r e p a c k a g e ( h t t p : / / b 1 0 3 d . c o l o r a d o . e d u / ) . S i n g l e - a x i s t o m o g r a m s w e r e t h e n c o m b i n e d t o y i e l d d u a l - a x i s t o m o g r a m s u s i n g a w a r p i n g a l g o r i t h m w i t h i n I M O D [ 4 9 6 ] . T o m o g r a m s w e r e d i s p l a y e d a n d a n a l y z e d u s i n g t h e I M O D s o f t w a r e p a c k a g e [ 2 7 2 ] . A - V I I - l o . C e l l w a l l i m m u n o l a b e l i n g - e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( I m m u n o - E M ) A n t i - a r a b i n o x y l a n L M - l l a n t i b o d y w a s o b t a i n e d fi ' o m P l a n t p r o b e s ( L e e d s , U K ) . T h e e p i t o p e f o r L M - l l h a s f o u r x y l o s e r e s i d u e s t h a t a r e a b l e t o a c c o m m o d a t e u n - s u b s t i t u t e d a n d s u b s t i t u t e d x y l a n b a c k b o n e s [ 2 8 2 ] . F o r a n t i - x y l a n i m m u n o — E M , s a m p l e g r i d s w e r e p l a c e d o n 1 5 1 1 L d r o p s o f 1 . 5 % B S A ( b o v i n e s e r u m a l b u m i n ) i n 1 X P B S - 0 . 1 % T w e e n ( P B S T ) f o r 3 0 m i n , b l o t t e d , t h e n d i r e c t l y p l a c e d o n 1 5 1 1 L d r o p s o f r e s p e c t i v e p r i m a r y a n t i b o d i e s d i l u t e d 1 : 1 0 i n 1 % B S A - P B S T f o r 9 0 m i n . F o l l o w i n g 3 x 1 m i n r i n s e s , t h e g r i d s w e r e t h e n p l a c e d o n 1 5 u L d r o p s o f a n t i - r a t ( l g G ) s e c o n d a r y a n t i b o d y c o n j u g a t e d t o a 1 5 n m g o l d p a r t i c l e ( B r i t i s h B i o C e l l , T e d P e l l a ) d i l u t e d 1 : 1 0 0 i n P B S T . S a m p l e s w e r e t h e n r i n s e d 3 x 1 m i n w i t h P B S T a n d a g a i n i n H 2 0 . T h e g r i d s w e r e p o s t - s t a i n e d w i t h U r a n y l a c e t a t e a n d K M n O 4 f o r b e t t e r c o n t r a s t , i f n e c e s s a r y . A - V I I - l l . D i l u t e a c i d p r e t r e a t m e n t D i l u t e a c i d p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r w a s p r o c u r e d f r o m N R E L . D i l u t e a c i d p r e t r e a t m e n t w a s c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e [ 4 9 7 ] . P r e t r e a t m e n t w a s c o n d u c t e d a t 1 9 0 ° C a t a b i o m a s s s o l i d s a n d s u l f u r i c a c i d l o a d i n g o f 3 0 % ( w / w ) a n d 0 . 0 4 8 g / g d r y c o r n s t o v e r , r e s p e c t i v e l y . T h e w h o l e s l u r r y f r o m t h e r e a c t o r w a s u s e d i n t h i s s t u d y . 3 7 6 A - V I I - 1 2 . N i t r o g e n p h y s i s o r p t i o n a n a l y s i s T h e B r u n a u e r - E m m e t t — T e l l e r ( B E T ) s u r f a c e a r e a a n d p o r e . s i z e d i s t r i b u t i o n w e r e m e a s u r e d b y n i t r o g e n a d s o r p t i o n a t 7 7 K u s i n g a M i c r o m e r i t i c s A S A P 2 7 0 0 i n s t r u m e n t . A t l e a s t 2 - 3 g m s o f s a m p l e w a s u s e d f o r e a c h r u n a n d w e r e d e g a s s e d a t 6 0 ° C o v e r n i g h t . A - V I I - l 3 . N e a r I n f r a - R e d C o m p o s i t i o n a l A n a l y s i s T h e c o m p o s i t i o n a l a n a l y s i s o f t h e c o r n s t o v e r fi a c t i o n s w a s p e r f o r m e d b y t h e N e a r - I R s p e c t r o s c o p i c a n a l y s i s ( c o u r t e s y o f D r . B o n n i e H a m e s ) a t t h e N a t i o n a l R e n e w a b l e E n e r g y L a b o r a t o r y ( N R E L ) , G o l d e n ( C o l o r a d o ) [ 4 9 8 ] . A - V I l - l 4 . E l e c t r o n S p e c t r o s c o p y f o r C h e m i c a l A n a l y s i s ( E S C A ) S u r f a c e c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n w a s c a r r i e d o u t u s i n g a P h y s i c a l E l e c t r o n i c s P 1 1 1 5 4 0 0 E S C A e l e c t r o n s p e c t r o m e t e r e q u i p p e d w i t h a n o n - m o n o c h r o m a t i c M g K 0 1 ( 1 5 V , 3 0 0 W ) X - r a y s o u r c e . A n a r e a o f 2 5 0 x 2 5 0 s q u a r e m i c r o n s w i t h a t a k e o f f a n g l e o f 4 5 d e g r e e s w a s a n a l y z e d . P e a k i n t e n s i t i e s w e r e d e t e r m i n e d b y p e a k a r e a i n t e g r a t i o n . C u r v e fi t t i n g t o t h e C 1 8 a n d 0 1 8 p e a k s w a s c a r r i e d o u t w i t h a L o r e n t z i a n - G a u s s i a n c u r v e - fi t t i n g p r o g r a m . C a l c i u m a n d n i t r o g e n p e a k s w e r e d e c o n v o l u t e d a n d fi t t e d b y t h e s o f t w a r e a s w e l l . S o m e s a m p l e s w e r e e x t r a c t e d t h r e e t i m e s , a t r o o m t e m p e r a t u r e , w i t h ( 1 : 1 0 b i o m a s s t o s o l v e n t l o a d i n g , w / w ) 0 . 1 N s o d i u m h y d r o x i d e , f o l l o w e d b y 7 5 % e t h a n o l a n d D / I w a t e r p r i o r t o a n a l y s i s . A - V I I - 1 5 . F o u r i e r T r a n s f o r m I n f r a - R e d S p e c t r o s c o p y ( F T I R ) S p e c t r u m O n e F T I R s y s t e m ( P e r k i n E l m e r ) w i t h a u n i v e r s a l A T R ( A t t e n u a t e d T o t a l R e fl e c t i o n ) a c c e s s o r y w a s u s e d t o q u a l i t a t i v e l y m o n i t o r c h e m i c a l c h a n g e s i n A F E X p r e t r e a t e d b i o m a s s . T h e s a m p l e ( m i l l e d t o 1 0 0 u r n s ) w a s p r e s s e d u n i f o r m l y a n d t i g h t l y a g a i n s t t h e d i a m o n d s u r f a c e u s i n g a s p r i n g - l o a d e d a n v i l . M i d - I R s p e c t r a w e r e o b t a i n e d 3 7 7 b y a v e r a g i n g 1 6 s c a n s f r o m 4 0 0 0 t o 4 0 0 c m _ 1 a t 2 c m _ 1 r e s o l u t i o n . T h e r e g i o n b e t w e e n 1 9 0 0 a n d 2 2 0 0 c m “ 1 w a s a v o i d e d b e c a u s e o f t h e s t r o n g d i a m o n d I R a b s o r p t i o n . B a s e l i n e a n d A T R c o r r e c t i o n s f o r p e n e t r a t i o n d e p t h a n d f r e q u e n c y v a r i a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t u s i n g t h e S p e c t r u m O n e s o f t w a r e s u p p l i e d w i t h t h e e q u i p m e n t . A - V I I - 1 6 . R a m a n S p e c t r o s c o p y R a m a n s p e c t r a o f u n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d s a m p l e s w e r e o b t a i n e d u s i n g a n e a r - I R F T - R a m a n b a s e d s p e c t r o s c o p e . T h e p r o b l e m o f l a s e r - i n d u c e d fl u o r e s c e n c e w a s m i n i m i z e d u s i n g t h e n e a r I R ( 1 0 6 4 n m N s z A G d i o d e ) l a s e r f o r s a m p l e e x c i t a t i o n . S o m e s a m p l e s w e r e d e l i g n i fi e d u s i n g a c i d c h l o r i t e a n d t h e n b l e a c h e d w i t h s o d i u m b o r o h y d r i d e t o m i n i m i z e fl u o r e s c e n c e i n t e r f e r e n c e . A - V I I - l 7 . C e l l u l o s e I I , I I I a n d A m o r p h o u s C e l l u l o s e P r e p a r a t i o n C e l l u l o s e 1 1 1 ( f r o m A v i c e l , C o t t o n L i n t e r , C o t t o n ) w a s p r e p a r e d b y s o a k i n g d r y b i o m a s s i n e x c e s s a n h y d r o u s l i q u i d a m m o n i a ( > 5 : 1 g m s a m m o n i a p e r g m b i o m a s s ) a t t h e r e q u i r e d t e m p e r a t u r e ( r a n g i n g f r o m 4 t o 1 3 0 ° C ) f o r a t o t a l t r e a t m e n t t i m e o f 3 0 m i n . T h e s a m p l e s w e r e d r i e d i n t h e h o o d o v e r n i g h t t o r e m o v e r e s i d u a l a m m o n i a a n d t h e n s t o r e d i n t h e f r i d g e . C e l l u l o s e I I ( A v i c e l ) w a s p r e p a r e d b y m i x i n g A v i c e l w i t h 2 5 % N a O H a t 4 0 C , a t a l o a d i n g o f 1 : 1 0 ( g m s u b s t r a t e p e r m 1 o f s o d i u m h y d r o x i d e s o l u t i o n ) f o r 6 0 m i n . T h e s l u r r y w a s t h e n c e n t r i f u g e d , fi l t e r e d a n d w a s h e d w i t h D I w a t e r t i l l n e u t r a l p H . A v i c e l w a s a l s o s o a k e d i n 2 8 - 3 0 % a m m o n i u m h y d r o x i d e s o l u t i o n s f o r 6 0 m i n s a t 4 ° C p r i o r t o fi l t r a t i o n a n d w a s h i n g t i l l n e u t r a l p H . R e g e n e r a t e d a m o r p h o u s c e l l u l o s e f r o m A v i c e l w a s p r e p a r e d u s i n g 8 3 % p h o s p h o r i c a c i d ( a t 4 ° C f o r 6 0 m i n ) b a s e d o n a p r e v i o u s l y p u b l i s h e d p r o t o c o l [ 1 2 8 ] . 3 7 8 A - V I I - 1 8 . P o w d e r X - R a y D i f f r a c t i o n ( X R D ) D r i e d s a m p l e s w e r e p a c k e d i n t o 1 . 5 m m d i a m e t e r q u a r t z c a p i l l a r i e s ( C h a r l e s s u p p l y c o m p a n y , N a t i c k M A ) a n d m o u n t e d o n a B r u k e r A X S t h r e e c i r c l e g o n i o m e t e r . T h e q u a r t z c a p i l l a r i e s a r e f o r a l l p r a c t i c a l p u r p o s e s t r a n s p a r e n t t o C u K 0 L X - r a y s a n d d i d n o t c o n t r i b u t e a n y a p p r e c i a b l e b a c k g r o u n d s i g n a l . A l l X - r a y d i f f r a c t i o n p a t t e r n s w e r e c o l l e c t e d o n a S m a r t 6 0 0 0 C C D a r e a d e t e c t o r t h a t w a s p o s i t i o n e d 5 0 m m f r o m t h e s a m p l e w i t h a n e x p o s u r e t i m e o f 9 0 s e c o n d s . C u K 0 L r a d i a t i o n w a s g e n e r a t e d b y a M i c r o s t a r r o t a t i n g C u a n o d e g e n e r a t o r a t 4 5 k V a n d 4 5 m A ( B r u k e r A X S , M a d i s o n , W I ) w i t h a s o u r c e s i z e o f a p p r o x i m a t e l y 0 . 3 m m i n d i a m e t e r . E a c h d i f f r a c t i o n p a t t e r n i m a g e c o n t a i n e d d a t a r a n g i n g f r o m 1 t o 3 7 d e g r e e s 2 0 . T h e i m a g e s w e r e u n w a r p e d a n d c o n v e r t e d u s i n g t h e A p e x 2 v 2 0 0 9 . 3 - 0 ( B r u k e r A X S , M a d i s o n W I ) s o f t w a r e p a c k a g e . T h e c o n v e r t e d i m a g e s w e r e i n t e g r a t e d f r o m 3 t o 3 7 d e g r e e s 2 0 i n 0 . 0 4 d e g r e e s s t e p s u s i n g t h e X R D z E v a l m o d u l e i n A p e x 2 v 2 0 0 9 . 3 - 0 ( B r u k e r A X S , M a d i s o n , W I ) . A - V I I - l 9 . S o l v e n t e x t r a c t i o n m e t h o d o l o g i e s ( a ) T h e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s f r o m t h e s o l i d s a m p l e s w e r e e x t r a c t e d u s i n g a D i o n e x A S E 2 0 0 e x t r a c t o r ( D i o n e x C o r p o r a t i o n , S u n n y v a l e , C A ) a t 7 0 ° C u s i n g D I w a t e r ( o r a c e t o n e ) . T h e p r e t r e a t e d s a m p l e s u s e d f o r e a c h e x t r a c t i o n r a n g e d b e t w e e n 0 . 5 - 1 g m ( f o r a 1 1 m l c e l l ) a t 7 0 ° C , 2 e x t r a c t i o n c y c l e s , 1 5 0 0 p s i c e l l p r e s s u r e , s t a t i c t i m e o f 1 0 m i n s a n d p u r g e t i m e o f 6 0 s e c o n d s . T h e A S E e x t r a c t e d s a m p l e s w e r e k e p t a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t p r i o r t o f u r t h e r a n a l y s i s b y L C - M S / M S a n d G C - M S . T h e e x t r a c t e d s a m p l e s w e r e a n a l y z e d t h e n e x t d a y a f t e r e x t r a c t i o n t o p r e v e n t i r r e v e r s i b l e p r e c i p i t a t i o n o f c e r t a i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s u p o n l o n g - t e r m s t o r a g e ( e s p e c i a l l y a t l o w e r t e m p e r a t u r e s ) . A l l 3 7 9 s a m p l e s i n c h a p t e r 3 . 1 w e r e e x t r a c t e d f o r d e g r a d a t i o n p r o d u c t a n a l y s i s u s i n g t h i s p r o t o c o l . ( b ) U n t r e a t e d a n d A F E X t r e a t e d b i o m a s s w e r e p r e s o a k e d a n d w a s h e d i n d i s t i l l e d ( d e - i o n i z e d ) w a t e r w i t h a s u b s t r a t e t o w a t e r l o a d i n g o f 1 : 1 0 ( w / w ) . T h e s l u r r y w a s m i x e d f o r 1 5 m i n u t e s . T h e w a s h l i q u i d w a s r e m o v e d f r o m t h e s u b s t r a t e b y s q u e e z i n g t h e s l u r r y t h r o u g h a fi l t r a t i o n c l o t h ( C a l b i o c h e m , C A ) . A l l s a m p l e s i n c h a p t e r 3 . 1 w e r e w a s h e d u s i n g t h i s p r o t o c o l f o r a n a l y s i s o f l i g n o - p h e n o l i c s i n t h e w a t e r e x t r a c t . A - V I I - 2 0 . G a s C h r o m a t o g r a p h y M a s s S p e c t r o m e t r y ( G C - M S ) C e r t a i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s t h a t c o u l d n o t b e q u a n t i fi e d b y L C - M S / M S ( e . g . a c e t i c a c i d , f u r f u r a l , 5 - H M F , a n d a c e t a m i d e ) w e r e a n a l y z e d b y G C - M S . T h e l i g n o c e l l u l o s i c s a m p l e s w e r e e x t r a c t e d w i t h a c e t o n e a t 7 0 ° C u s i n g t h e a u t o m a t e d s o l v e n t e x t r a c t o r , a s m e n t i o n e d e a r l i e r , a n d w e r e a n a l y z e d d i r e c t l y . T h e i n s t r u m e n t a t i o n c o n s i s t e d o f a n A g i l e n t 6 8 9 0 N G C - M S s y s t e m e q u i p p e d w i t h a n A g i l e n t 7 6 8 3 A L S . C h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n w a s a c h i e v e d u s i n g a 3 0 m J & W D B W A X c o l u m n ( 0 . 2 5 m m I . D . , 0 . 2 5 p m fi l m t h i c k n e s s ) . T h e i n j e c t i o n v o l u m e w a s 1 [ L L i n s p l i t l e s s m o d e w i t h 2 4 0 ° C i n j e c t o r t e m p e r a t u r e . T h e i n j e c t o r s l e e v e w a s r e p l a c e d a t r e g u l a r i n t e r v a l s ( d u e t o d e p o s i t i o n o f n o n - v o l a t i l e c o m p o n e n t s o f t h e p l a n t e x t r a c t s ) t o i m p r o v e r e p r o d u c i b i l i t y o f t h e a n a l y s i s . T h e o v e n t e m p e r a t u r e p r o fi l e w a s v a r i e d a s f o l l o w s : t e m p e r a t u r e h e l d i n i t i a l l y a t 5 0 ° C f o r 1 m i n a n d t h e n i n c r e a s e d b y 3 0 ° C / m i n t o 1 0 0 ° C , t o b e h e l d a t 1 0 0 ° C f o r 1 m i n . T h e c o l u m n t e m p e r a t u r e w a s fi n a l l y i n c r e a s e d a t 3 8 ° C / m i n t o 2 4 0 ° C a n d h e l d a t 2 4 0 ° C f o r 2 m i n . D a t a w a s c o l l e c t e d b y t h e M S i n E l m o d e u s i n g s e l e c t e d i o n m o n i t o r i n g ( S I M ) , f o c u s i n g o n t h e p r i m a r y a n d s e c o n d a r y m a s s e s o f t h e c o m p o u n d s o f i n t e r e s t . T h e d a t a w a s e x p o r t e d a n d a n a l y z e d u s i n g M a s s - L y n x s o f t w a r e . 3 8 0 A - V I I - Z l . A m m o n o l y s i s B y - p r o d u c t A n a l y s i s b y L C - M S / M S T h e L C - M S s y s t e m u t i l i z e d f o r q u a n t i fi c a t i o n o f p h e n o l i c a c i d s ( f e r u l i c a n d c o u m a r i c a c i d ) a n d t h e i r c o r r e s p o n d i n g a m i d e s c o n s i s t e d o f a n A c q u i t y U P L C ® c o n n e c t e d t o a W a t e r s Q u a t t r o P r e m i e r t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r ( w i t h E S I o r e l e c t r o - s p r a y i o n i z a t i o n ) . S a m p l e s ( A S E w a t e r e x t r a c t s ) w e r e a n a l y z e d b y L C - M S u s i n g a n A s c e n t i s E x p r e s s C 1 8 ( 5 c m X 2 . 1 m m X 2 . 7 u m ) r e v e r s e d p h a s e c o l u m n ( S u p e l c o , U S A ) . G r a d i e n t e l u t i o n w a s c a r r i e d o u t u s i n g a q u e o u s 0 . 1 % f o r m i c a c i d ( v / v ; s o l v e n t A ) a n d m e t h a n o l ( s o l v e n t B ) u n d e r t h e f o l l o w i n g c o n d i t i o n s ; ( 1 ) I n i t i a l g r a d i e n t o f 9 5 % - A / 5 % - B h e l d f o r l m i n , ( 2 ) l i n e a r g r a d i e n t t o 7 0 % - A / 3 0 % - B a t 1 0 m i n a n d t h e n t o 6 5 % - A / 3 5 % B a t 1 2 m i n , ( 3 ) g r a d i e n t i s c h a n g e d i m m e d i a t e l y t o 1 0 % - A / 9 0 % - B a t 1 2 . 0 1 , h e l d f o r 2 m i n , ( 4 ) f o l l o w e d b y a l i n e a r g r a d i e n t b a c k t o t h e i n i t i a l c o n d i t i o n a t 1 4 . 0 1 m i n a n d h e l d f o r 3 m i n . I n j e c t i o n v o l u m e , c o l u m n t e m p e r a t u r e a n d fl o w r a t e s e m p l o y e d w e r e 3 1 1 L , 5 0 ° C a n d 0 . 2 5 m l / m i n , r e s p e c t i v e l y . S t a n d a r d c u r v e s w e r e g e n e r a t e d b a s e d o n t h e a r e a s u n d e r t h e p e a k ( [ M - H ] p e a k i n n e g a t i v e E S I m o d e ) f o r e a c h c o m p o u n d . A - V I I - 2 2 . O t h e r D e g r a d a t i o n P r o d u c t A n a l y s i s b y L C - M S / M S D e t a i l s o f t h e L C - M S / M S a n a l y t i c a l m e t h o d o l o g y ( f o r n o n - a m m o n o l y s i s p r o d u c t s ) h a v e b e e n r e p o r t e d e l s e w h e r e [ 3 3 4 , 3 4 9 ] a n d a r e s u m m a r i z e d b e l o w . A F E X d e g r a d a t i o n p r o d u c t s i n t h e p r e t r e a t e d b i o m a s s w e r e e x t r a c t e d w i t h h o t w a t e r ( 7 0 ° C ) u s i n g t h e a c c e l e r a t e d s o l v e n t e x t r a c t i o n a p p a r a t u s , a s m e n t i o n e d e a r l i e r . T h e p H o f t h e A F E X s t o v e r w a t e r e x t r a c t s o l u t i o n w a s f o u n d t o b e s l i g h t l y a l k a l i n e a n d w a s a c i d i fi e d t o p H 2 b e f o r e p r o c e s s i n g a c c o r d i n g t o a p r e v i o u s l y p u b l i s h e d p r o t o c o l [ 3 3 4 ] . A 5 - m l a l i q u o t o f e a c h a q u e o u s e x t r a c t w a s t h e n e x t r a c t e d t w o t i m e s w i t h m e t h y l t e r t i a r y - b u t y l e t h e r ( M T B E ) . T h e r e s u l t i n g M T B E e x t r a c t s w e r e c o m b i n e d a n d t h e s o l v e n t w a s r e m o v e d b y 3 8 1 p u r g i n g u n d e r a g e n t l e s t r e a m o f n i t r o g e n a t 5 5 ° C . A l l s a m p l e s w e r e r e c o n s t i t u t e d i n 5 m l w a t e r p r i o r t o a n a l y s i s . I n s t r u m e n t a t i o n e m p l o y e d f o r a n a l y s i s c o n s i s t e d o f a V a r i a n ( P a l o A l t o , C A , U S A ) P r o S t a r M o d e l 2 1 0 b i n a r y p u m p s y s t e m , M o d e l 4 1 0 a u t o s a m p l e r , a n d M o d e l 1 2 0 0 L t r i p l e - q u a d r a p o l e m a s s a n a l y z e r . A b i n a r y s o l v e n t g r a d i e n t c o n s i s t i n g o f t w o s o l v e n t s A a n d B . S o l v e n t A c o n s i s t s o f a q u e o u s f o r m i c a c i d ( 0 . 0 2 5 % ( v / v ) f o r m i c a c i d i n w a t e r ) a n d s o l v e n t B c o n s i s t s o f 1 0 % a q u e o u s f o r m i c a c i d a n d 9 0 % a c e t o n i t r i l e w a s u s e d t o a c h i e v e c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n o n a 1 5 0 m m x 4 . 6 m m ( S 0 3 u m , 9 9 ) Y M C C a r o t e n o i d c o l u m n ( W a t e r s , M i l f o r d , M A , U S A ) c o n n e c t e d i n s e r i e s t o a 1 m m R P C 1 8 O P T I - G u a r d c o l u m n ( A l t e c h , D e e r fi e l d , I L , U S A ) . A d d i t i o n a l c h r o m a t o g r a p h i c p a r a m e t e r s w e r e a s f o l l o w s : i n j e c t i o n v o l u m e , 5 0 1 1 L ; c o l u m n t e m p e r a t u r e , 3 0 ° C ; fl o w r a t e , 7 5 0 u L / m i n . I t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t t h e s e c h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n s a r e s i m i l a r t o t h o s e r e p o r t e d i n p r e v i o u s w o r k . T h e o n l y m a j o r d i f f e r e n c e w a s t h e s u b s t i t u t i o n o f f o r m i c a c i d f o r p h o s p h o r i c a c i d . T h i s c h a n g e w a s i m p l e m e n t e d t o i m p r o v e m o b i l e p h a s e c o m p a t i b i l i t y w i t h M S d e t e c t i o n . U p o n e x i t i n g t h e c o l u m n , t h e m o b i l e p h a s e w a s d i r e c t e d t o b o t h a U V - v i s i b l e p h o t o d i o d e a r r a y ( P D A ) d e t e c t o r a n d t h e m a s s a n a l y z e r , w h i c h w a s o p e r a t e d e x c l u s i v e l y i n n e g a t i v e e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ( — v e E S I ) m o d e . T h e m a j o r i t y o f t a r g e t a n a l y t e s w e r e a s s e s s e d b y m o n i t o r i n g a n o p t i m i z e d M S / M S f o r e a c h c o m p o u n d , w i t h p a r e n t i o n [ M — H ] _ s e l e c t e d i n t h e fi r s t q u a d r a p o l e . A fl o w - s p l i t t e r w a s i n s e r t e d b e t w e e n t h e P D A d e t e c t o r a n d t h e m a s s s p e c t r o m e t e r s u c h t h a t t h e v o l u m e o f l i q u i d p a s s i n g t h r o u g h t h e fl o w - s p l i t t e r w a s d i v e r t e d 5 0 : 5 0 b e t w e e n t h e m a s s a n a l y z e r a n d t h e w a s t e l i n e . M a s s s p e c t r o m e t r y p a r a m e t e r s w e r e h e l d c o n s t a n t d u r i n g a l l e x p e r i m e n t s a n d w e r e a s f o l l o w s : n e b u l i z i n g g a s , 0 2 a t 6 0 p s i ; d r y i n g g a s , N 2 a t 2 0 p s i ; d r y i n g g a s 3 8 2 t e m p e r a t u r e , 4 0 0 ° C ; n e e d l e v o l t a g e , 4 5 0 0 V ; c o l l i s i o n g a s , A r a t 2 . 0 m T o r r . E x c e p t i o n s i n c l u d e a c e t i c a c i d , f u r f u r a l , a n d S - h y d r o x y m e t h y l fi r r fi n a l ( 5 - H M F ) w h i c h w e r e n o t a m e n a b l e t o m a s s s p e c t r a l m o n i t o r i n g u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s a n d w e r e i n s t e a d d e t e c t e d v i a G C - M S . Q u a n t i t a t i o n o f t a r g e t a n a l y t e s b y L C - M S / M S w a s a c c o m p l i s h e d u s i n g a m u l t i p o i n t , i n t e r n a l - s t a n d a r d c a l i b r a t i o n c u r v e . C a l i b r a t i o n s t a n d a r d s w e r e p r e p a r e d b y s u c c e s s i v e d i l u t i o n s o f s t o c k s o l u t i o n s i n w a t e r . A l i q u o t s o f e a c h c a l i b r a t i o n s t a n d a r d w e r e e x t r a c t e d w i t h M T B E p r i o r t o a n a l y s i s ( a s d e s c r i b e d e a r l i e r ) . R e s p o n s e f a c t o r s w e r e d e t e r m i n e d f o r e a c h a n a l y t e b y d i v i d i n g t h e p e a k a r e a o f t h e a n a l y t e b y t h e p e a k a r e a o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d , a n d c a l i b r a t i o n c u r v e s w e r e c o n s t r u c t e d b y p l o t t i n g a l i n e a r . 2 . r e g r e s s r o n ( R 2 0 . 9 9 ) o f r e s p o n s e f a c t o r v e r s u s a n a l y t e c o n c e n t r a t 1 o n . I t h a s b e e n p r e v i o u s l y d e m o n s t r a t e d [ 3 3 4 ] t h a t t h i s a p p r o a c h t o q u a n t i t a t i o n d o e s n o t r e q u i r e i n d e p e n d e n t k n o w l e d g e o f M T B E e x t r a c t i o n e f fi c i e n c i e s i n o r d e r t o a s s e s s a n a l y t e c o n c e n t r a t i o n s . H o w e v e r , t h i s a p p r o a c h d o e s n o t t a k e i n t o a c c o u n t p o t e n t i a l m a t r i x e f f e c t s o f c o - e x t r a c t e d c o m p o n e n t s o n e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n e f fi c i e n c y . I n o r d e r t o c h a r a c t e r i z e t h e m a t r i x e f f e c t s f o r v a r i o u s d e g r a d a t i o n p r o d u c t q u a n t i fi e d b y t h e L C — M S / M S m e t h o d , m a t r i x s p i k e a n a l y s i s w a s c o n d u c t e d . C a l c u l a t e d s p i k e r e c o v e r i e s r e v e a l e d n e g l i g i b l e m a t r i x i n fl u e n c e i n s a m p l e s d e r i v e d f r o m u n t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s ( i . e . s p i k e r e c o v e r i e s w e r e e s s e n t i a l l y q u a n t i t a t i v e i n t h e s e s a m p l e s ) . M o r e s i g n i fi c a n t m a t r i x i n t e r f e r e n c e w a s i d e n t i fi e d f o r s o m e a n a l y t e s i n s a m p l e s d e r i v e d f r o m p r e t r e a t e d ( A F E X a n d d i l u t e a c i d t r e a t e d ) b i o m a s s . T h e m a t r i x e f f e c t s w e r e m o s t p r o n o u n c e d f o r a c i d p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r s a m p l e s . S p i k e r e c o v e r i e s f o r a l l a n a l y t e c o n c e n t r a t i o n s d e r i v e d f r o m c a l i b r a t i o n c u r v e s w e r e a c c u r a t e w i t h i n a 3 8 3 f a c t o r o f 1 - 3 , i n d e p e n d e n t o f s a m p l e s o u r c e , w h i c h w a s d e e m e d s u f fi c i e n t t o s u p p o r t t h e g o a l s o f t h e p r e s e n t s t u d y . A - V I l - 2 3 . H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) f o r S u g a r s A h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) s y s t e m w a s u s e d f o r a n a l y z i n g m o n o m e r i c a n d o l i g o m e r i c s u g a r s . T h e H P L C s y s t e m c o n s i s t e d o f W a t e r s ( M i l f o r d , M A ) P u m p a n d W a t e r s 4 1 0 r e f r a c t i v e i n d e x d e t e c t o r . A n A m i n e x H P X - 8 7 P c a r b o h y d r a t e a n a l y s i s c o l u m n ( B i o R a d , H e r c u l e s , C A ) e q u i p p e d w i t h a d e a s h i n g g u a r d c a r t r i d g e ( B i o R a d ) w a s u s e d f o r q u a n t i f y i n g m o n o m e r i c s u g a r s . D e g a s s e d H P L C g r a d e w a t e r w a s u s e d a s t h e m o b i l e p h a s e a t 0 . 6 m e i n a t a c o l u m n t e m p e r a t u r e o f 8 5 ° C . T h e i n j e c t i o n v o l u m e w a s 1 0 1 1 1 w i t h a r u n t i m e o f 2 0 m i n . M i x e d s u g a r s t a n d a r d s w e r e u s e d t o q u a n t i f y c e l l o b i o s e a n d o t h e r m o n o s a c c h a r i d e s ( g l u c o s e , x y l o s e , g a l a c t o s e , a r a b i n o s e a n d m a n n o s e ) . T h e m o n o m e r i c s u g a r s p r o d u c e d a f t e r a c i d h y d r o l y s i s w e r e q u a n t i fi e d b y u s i n g a B i o - R a d A m i n e x H P X - 8 7 H i o n e x c l u s i o n c o l u m n ( 6 0 ° C ; 5 m M H 2 8 0 4 ; fl o w r a t e , 0 . 6 m l m i n - l ; i n j e c t i o n v o l u m e , 1 0 u l ) a n d d i f f e r e n t i a l r e f r a c t i v e i n d e x d e t e c t o r . A - V I I - 2 4 . M o d i fi e d P r u s s i a n B l u e M e t h o d ( M P B ) P h e n o l i c c o m p o u n d s c o n t e n t o f t h e d e g r a d a t i o n p r o d u c t e x t r a c t s w a s q u a n t i fi e d b y t h e M P B m e t h o d [ 2 4 9 ] . T h e w a t e r e x t r a c t w a s c e n t r i f u g e d t o r e m o v e s u s p e n d e d s o l i d s a n d fi l t e r e d t h r o u g h a 0 . 2 - m i c r o n n y l o n m e m b r a n e fi l t e r b e f o r e c a r r y i n g o u t t h e M P B a n a l y s i s . P h o s p h o r i c a c i d ( 8 5 % ) , G u m A r a b i c , G a l l i c a c i d , F e r u l i c a c i d , K 3 F e ( C N ) 6 a n d F e C l 3 , w e r e p u r c h a s e d f r o m t h e S i g m a C h e m i c a l C o . ( S t . L o u i s , M O ) . M P B s t a b i l i z e r r e a g e n t w a s p r e p a r e d b y m i x i n g 6 p a r t s o f d i s t i l l e d w a t e r w i t h 2 p a r t s o f 8 5 % p h o s p h o r i c a c i d a n d 2 p a r t s o f 1 % g u m a r a b i c s o l u t i o n . O n e h u n d r e d m i c r o l i t e r s o f t h e u n d i l u t e d 3 8 4 w a s h e x t r a c t w a s p l a c e d i n d u p l i c a t e s e t s o f l a r g e ( 1 5 0 x 2 5 m m ) f a l c o n t u b e s . T h r e e m i l l i l i t e r s o f d i s t i l l e d ( d e i o n i z e d ) w a t e r w a s a d d e d t o t h e t u b e s a n d m i x e d w e l l w i t h t h e w a s h e x t r a c t . 1 m l o f 0 . 0 1 6 M K 3 F e ( C N ) 6 w a s a d d e d f o l l o w e d i m m e d i a t e l y b y 1 m l o f 0 . 0 2 M F e C l 3 i n 0 . 1 N H C l . T h e m i x t u r e w a s v o r t e x m i x e d a n d a l l o w e d t o s t a n d a t r o o m t e m p e r a t u r e . A f t e r 1 5 m i n , 5 m l o f t h e M P B s t a b i l i z e r r e a g e n t w a s a d d e d t o t h e c o n t e n t s o f t h e t u b e a n d v o r t e x e d a g a i n . T h e i n t e n s i t y o f t h e P r u s s i a n b l u e c o l o r d e v e l o p e d w a s m e a s u r e d a t 7 0 0 r u n a g a i n s t a r e a g e n t b l a n k u s i n g a d i g i t a l s p e c t r o p h o t o m e t e r ( B a r n s t e a d / T h e r m o l y n e S e r i e s S P - 8 0 0 ) . G a l l i c a n d f e r u l i c a c i d s w e r e u s e d a s s t a n d a r d s t o d e t e r m i n e e q u i v a l e n t p h e n o l i c c o n c e n t r a t i o n . A - V l I - 2 5 . R o b o t i c D i s p e n s o r W o r k t a b l e S e t u p L i q u i d H a n d l i n g W o r k s t a t i o n e p M o t i o n 5 0 7 0 ( E p p e n d o r f , H a m b u r g , G e r m a n y ) w a s u s e d t o d e l i v e r b i o m a s s s l u r r i e s a n d r e a g e n t s t o d e e p w e l l m i c r o p l a t e s . T h e w o r k s t a t i o n w o r k t a b l e w a s e q u i p p e d w i t h 1 0 0 0 1 1 L h a n d c u t fi l t e r t i p s ( e p T . I . P . S . ) , a r e s e r v o i r r a c k w i t h 1 0 0 m L e p M o t i o n r e a g e n t r e s e r v o i r s ( s l u r r y s u s p e n s i o n a n d b u f f e r - a n t i b i o t i c m i x t u r e ) , 9 6 d e e p - w e l l r e a c t i o n m i c r o p l a t e w i t h 2 m l c a v i t i e s ( G r e i n e r B i o - o n e , M o n r o e , N C ) a n d c o r r e s p o n d i n g 9 6 - w e l l e n z y m e m i x t u r e m i c r o p l a t e . A s l u r r y s u s p e n s i o n o f s u i t a b l e s o l i d s l o a d i n g w a s p r e p a r e d i n a 5 0 m l f a l c o n t u b e a n d t r a n s f e r r e d t o a 1 0 0 m l r e s e r v o i r . A l l s l u r r y d i s p e n s i n g s t e p s w e r e c a r r i e d o u t w i t h t h e e p M o t i o n m u l t i - c h a n n e l d i s p e n s i n g t o o l ( 1 0 0 0 1 1 L ) . A l l r e a g e n t l i q u i d l e v e l s w e r e d e t e r m i n e d v i a t h e o p t i c a l s e n s o r o n t h e W o r k s t a t i o n . T h e l a b w a r e , t o t a l n u m b e r o f t i p s a n d t y p e o f t i p r a c k w e r e c h e c k e d v i a t h e s e n s o r . T h e o p t i m a l s l u r r y d i s p e n s i o n e p M o t i o n p a r a m e t e r s a r e a s f o l l o w s ; s l u r r y a s p i r a t i o n c y c l e s ( 5 0 ) , a g i t a t i o n s p e e d ( 6 0 m m / s ) , a g i t a t i o n v o l u m e ( 0 . 6 - 3 8 5 0 . 8 m l / t i p ) , a s p i r a t i o n s p e e d ( 1 5 - 2 5 m i n / s ) , d i s p e n s i o n s p e e d ( 1 5 - 3 0 m m / s ) , d e l a y b l o w ( l s ) a n d s p e e d b l o w ( 3 0 - 9 0 m m / s ) . A - V I I - 2 6 . R e p r o d u c i b i l i t y o f S l u r r y D e l i v e r y R e p r o d u c i b i l i t y a n d a c c u r a c y o f t h e s l u r r y d e l i v e r y t o t h e m i c r o p l a t e w a s d e t e r m i n e d b y c o l l e c t i n g t h e s l u r r y d e l i v e r e d , f o r v a r y i n g a v i c e l s o l i d s l o a d i n g ( 1 - 1 0 % , w / w ) , i n a p r e - w e i g h e d p l a s t i c t r o u g h a n d t h e n e v a p o r a t e d i n a n o v e n s e t a t 6 0 ° C u n t i l c o n s t a n t w e i g h t w a s o b t a i n e d . A s l u r r y o f s u i t a b l e s o l i d s l o a d i n g ( e . g . 1 % , w / w ) w a s p r e p a r e d i n a 5 0 m 1 f a l c o n t u b e a n d t r a n s f e r r e d t o t h e r e s e r v o i r v e s s e l o n t h e w o r k t a b l e . A 1 0 0 0 u l , 8 - c h a n n e l m u l t i - d i s p e n s i n g t o o l w a s u s e d t o d e l i v e r n e c e s s a r y v o l u m e o f s l u r r y ( e . g . 7 5 0 [ . 1 1 f o r 1 % s l u r r y t o d e l i v e r 7 . 5 m g s o f s o l i d s t o e a c h w e l l ) t o e a c h c o l u m n i n t h e m i c r o p l a t e . T h e v o l u m e o f s l u r r y d i s p e n s e d w a s c a l c u l a t e d b a s e d o n t h e s o l i d s l o a d i n g i n o r d e r t o d e l i v e r 7 . 5 m g o f s o l i d s i n e a c h w e l l . S l u r r y v o l u m e e q u i v a l e n t t o 1 6 m i c r o w e l l v o l u m e s w a s c o l l e c t e d i n a s u i t a b l e c o l l e c t i o n v e s s e l ( e . g . t r o u g h ) . T h r e e r e p l i c a t e b a t c h e s ( 1 6 w e l l v o l u m e s e a c h ) o f s l u r r y w e r e d e l i v e r e d f o r e a c h 5 0 m l s t a r t i n g r e s e r v o i r v o l u m e . T h e r e s e r v o i r s l u r r y w a s r e p l a c e d w i t h a f r e s h l y p r e p a r e d s o l u t i o n a f t e r d e l i v e r y o f 4 8 w e l l v o l u m e s . T h e t i p s w e r e r e n e w e d a u t o m a t i c a l l y f o r e a c h n e w b a t c h o f r e s e r v o i r s l u r r y . T w e l v e r e p l i c a t e e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t f o r e a c h s o l i d s l o a d i n g . T h e t o t a l s o l i d s l o a d e d p e r w e l l i s b a s e d o n t h e a v e r a g e a m o u n t o f s o l i d s d i s p e n s e d i n e a c h t r o u g h ( i . e . t o t a l a m o u n t o f d r y s o l i d s / 1 6 ) . A - V l l - 2 7 . M i c r o p l a t e H y d r o l y s i s P r o c e d u r e T h e g r o u n d b i o m a s s w a s s u s p e n d e d a s s o l i d s l u r r y i n d e i o n i z e d w a t e r . T h e s o l i d s c o n c e n t r a t i o n ( t y p i c a l l y 0 . 7 2 7 % , w t s o l i d s / w t s l u r r y ) w a s d e p e n d e n t o n s e v e r a l e x p e r i m e n t a l p a r a m e t e r s ; g l u c a n l o a d i n g ( 0 . 2 5 - 1 % ) , p i p e t t i n g v o l u m e , r e a c t i o n v o l u m e 3 8 6 ( 2 5 0 - 1 5 0 0 p l ) a n d r e m a i n i n g f r e e v o l u m e f o r d e l i v e r y o f o t h e r r e a g e n t s a n d e n z y m e s . T h e s l u r r y w a s p r e p a r e d i n a 5 0 m l f a l c o n t u b e t h a t w a s m i x e d w e l l a n d t r a n s f e r r e d t o t h e e p M o t i o n 1 0 0 m l r e a g e n t r e s e r v o i r . T h e s l u r r y w a s a s p i r a t e d m u l t i p l e t i m e s b y t h e r o b o t i c d i s p e n s o r ( d i s p e n s i o n p a r a m e t e r s l i s t e d e a r l i e r ) t o e n s u r e h o m o g e n e o u s s o l i d s u s p e n s i o n f o r p i p e t t i n g s l u r r y t o a 2 m l 9 6 d e e p - w e l l r e a c t i o n m i c r o p l a t e . O n e s t e e l b e a d ( 2 m m d i a m e t e r ) w a s a d d e d t o e a c h w e l l p r i o r t o a d d i t i o n o f s l u r r y t o p r o m o t e m a s s t r a n s f e r d u r i n g h y d r o l y s i s . T h e s l u r r y w a s m u l t i - a s p i r a t e d e a c h t i m e b e f o r e p i p e t t i n g r e q u i r e d v o l u m e t o t h e m i c r o p l a t e . A f t e r a d d i t i o n o f t h e s l u r r y a b u f f e r - a n t i b i o t i c c h e m i c a l a n d s u i t a b l e e n z y m e m i x t u r e s w e r e a d d e d u s i n g t h e r o b o t i c d i s p e n s o r . T h e b u f f e r - a n t i b i o t i c m i x t u r e c o n t a i n e d c i t r a t e b u f f e r ( p H 4 . 5 - 5 . 0 , 1 M ) , c y c l o h e x i m i d e ( 0 . 5 g / l ) a n d t e t r a c y c l i n e ( 0 . 7 g / l ) . A fi x e d a m o u n t ( e . g . 5 . 7 % o f t o t a l r e a c t i o n v o l u m e ) o f b u f f e r - a n t i b i o t i c m i x t u r e w a s a d d e d t o e a c h w e l l . T h e s u b s t r a t e s w e r e h y d r o l y z e d a t d e s i r e d g l u c a n l o a d i n g s r a n g i n g f r o m 0 . 2 - 1 % ( w / v ) i n a 0 . 0 5 M c i t r a t e b u f f e r s o l u t i o n f o r g i v e n e n z y m e m i x t u r e s . S u i t a b l e e n z y m e m i x t u r e s w e r e p r e p a r e d f r e s h b e f o r e t h e s t a r t o f e a c h e x p e r i m e n t u s i n g e p M o t i o n . A t h e r r n o b l o c k w a s u s e d t o f a c i l i t a t e h e a t s e a l i n g t h e p l a t e w i t h a n a l u m i n u m f o i l u s i n g t h e E p p e n d o r f H e a t S e a l e r t o m i n i m i z e e v a p o r a t i o n l o s s e s d u r i n g h y d r o l y s i s . T h e s e a l e d m i c r o p l a t e w a s i n c u b a t e d i n a b e n c h t o p i n c u b a t o r ( C 2 4 , N e w B r u n s w i c k , E d i s o n , N J ) w i t h a m i c r o p l a t e h o l d e r a t r e q u i r e d r p m ( t y p i c a l r p m u s e d w a s 2 5 0 ) f o r a d e fi n e d t i m e p e r i o d ( 1 - 2 4 h r s ) a t 5 0 ° C . F o r d e t e r m i n i n g t h e r a t e o f h y d r o l y s i s , s e p a r a t e r e p l i c a t e p l a t e s w e r e u s e d f o r e a c h t i m e p o i n t ( i . e . 1 , 2 , 3 , 6 , 1 2 , 2 4 h ) . A t t h e e n d o f t h e h y d r o l y s i s , t h e m i c r o p l a t e w a s r a p i d l y c o o l e d d o w n b y t r a n s f e r r i n g t o a f r e e z e r ( a t - 2 0 ° C ) f o r 1 5 m i n b e f o r e t r a n s f e r r i n g t h e l i q u i d h y d r o l y s a t e t o a fi l t r a t i o n a s s e m b l y ( M u l t i s c r e e n s o l v i n e r t h y d r o p h i l i c d e e p w e l l fi l t e r p l a t e , M i l l i p o r e , B i l l e r i c a , 3 8 7 M A ) . A l t e r n a t i v e l y , a t t h e e n d o f t h e h y d r o l y s i s t h e 2 m l d e e p w e l l m i c r o p l a t e s ( R e a c t i o n p l a t e ) w e r e c e n t r i f u g e d a t 3 0 0 0 r p m ( a t 4 ° C ) f o r 1 5 m i n u t e s . 1 0 0 1 1 L o f t h e h y d r o l y s a t e s u p e r n a t a n t w a s t h e n t r a n s f e r r e d a n d m i x e d w i t h 1 0 0 1 1 L o f N a z C O 3 b u f f e r ( p H 1 1 , 2 0 0 m M ) , i n a 0 . 3 m L G r e i n e r m i c r o p l a t e ( S t o p p l a t e ) u s i n g J A N U S ( P e r k i n E l m e r , W a l t h a m ) 9 6 - c h a n n e l p i p e t t i n g s y s t e m , t o a r r e s t t h e r e a c t i o n . G l u c o s e a n d x y l o s e i n t h e s t o p p l a t e s o l u t i o n w a s e s t i m a t e d u s i n g s u i t a b l e b i o - e n z y m a t i c a s s a y s , a s m e n t i o n e d l a t e r . A - V I I - 2 8 . N R E L L A P - 9 E n z y m a t i c H y d r o l y s i s P r o t o c o l T h e N R E L s t a n d a r d p r o t o c o l ( L A P - 0 0 9 ) w a s f o l l o w e d f o r t h e c o n v e n t i o n a l h y d r o l y s i s m e t h o d . T h e s u b s t r a t e w a s h y d r o l y z e d a t d e s i r e d g l u c a n l o a d i n g ( t y p i c a l l y 1 % , w z v ) i n a 0 . 0 5 M c i t r a t e b u f f e r s o l u t i o n ( p H 4 . 5 - 5 ) a t t h e n e c e s s a r y e n z y m e l o a d i n g . S a m p l e s w e r e h y d r o l y z e d a t 5 0 ° C i n a b a f fl e d 2 5 0 m l ( 1 0 0 m 1 r e a c t i o n v o l u m e ) c o n i c a l fl a s k a t 2 0 0 r p m f o r a p e r i o d o f 2 4 h o u r s ( 1 0 0 m l r e a c t i o n v o l u m e ) . A l t e r n a t i v e l y , t h e r e a c t i o n w a s a l s o c a r r i e d o u t i n a 1 5 m l g l a s s v i a l ( f o r s m a l l e r r e a c t i o n v o l u m e s ) . T h e h y d r o l y s a t e s a m p l e w a s b o i l e d t o d e n a t u r e t h e e n z y m e s a n d fi l t e r e d t h r o u g h a 0 . 2 p m n y l o n m e m b r a n e fi l t e r a t p r e d e t e r m i n e d t i m e p e r i o d s ( i . e . 2 , 6 , 1 2 a n d 2 4 h ) . T h e s a m p l e s w e r e f r o z e n f o r s u b s e q u e n t s u g a r a n a l y s i s b y t h e H P L C . A - V I I - 2 9 . B i o - e n z y m a t i c S u g a r A s s a y s H i g h - t h r o u g h p u t b i o - a n a l y t i c a l m e t h o d s w e r e u s e d t o e s t i m a t e t h e f e r m e n t a b l e s u g a r s i n t h e h y d r o l y s a t e s i n c e H P L C b a s e d m e t h o d s w e r e f o u n d t o b e t i m e c o n s u m i n g a n d e x p e n s i v e f o r l a r g e n u m b e r o f s a m p l e s o b t a i n e d a f t e r m i c r o p l a t e b a s e d h y d r o l y s i s . A l l p i p e t t i n g s t e p s w e r e c o n d u c t e d u s i n g t h e e p M o t i o n / J A N U S r o b o t i c s y s t e m s t o a u t o m a t e t h e h i g h - t h r o u g h p u t s u g a r a s s a y . G l u c o s e b i o - e n z y m a t i c a s s a y s , u t i l i z i n g h e x o k i n a s e a n d g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e , w a s a d a p t e d t o m i c r o - l i t e r s c a l e b a s e d o n a 3 8 8 m o d i fi e d m e t h o d p r e v i o u s l y d e s c r i b e d [ 4 9 9 ] . E n z y m e k i t f o r d e t e r m i n i n g g l u c o s e w a s p u r c h a s e d f r o m R - B i o p h a r m ( R - B i o p h a r m I n c . , M a r s h a l l , M I ) . T h e b a s i c p r i n c i p l e o f t h e a s s a y i s t o u s e a n e n z y m e s y s t e m t h a t u s e s N A D / N A D H r e d u c t i o n / o x i d a t i o n s t o i c h i o m e t r i c t o t h e a m o u n t o f g l u c o s e . D - g l u c o s e i s p h o s p h o r y l a t e d t o g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e b y h e x o k i n a s e ( H K ) i n t h e p r e s e n c e o f a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ( A T P ) . T h e g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e i s t h e n o x i d i z e d b y n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e p h o s p h a t e ( N A D P ) t o D - g l u c o n a t e - 6 - p h o s p h a t e a l o n g w i t h f o r m a t i o n o f r e d u c e d n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e p h o s p h a t e ( N A D P H ) . T h e i n c r e a s e i n t h e a m o u n t o f N A D P H f o r m e d i s m e a s u r e d b y U V a b s o r b a n c e a t 3 4 0 n m . T h e e n z y m e a s s a y w a s a d a p t e d f o r r n i c r o s c a l e r e a c t i o n v o l u m e c a r r i e d o u t i n a 1 1 0 p l , 3 8 4 w e l l m i c r o p l a t e ( F i s h e r b r a n d ) . T h e s u b s t r a t e s o l u t i o n c o n t a i n i n g t r i e t h a n o l a m i n e b u f f e r ( p H 7 . 6 ) , N A D P , A T P a n d m a g n e s i u m s u l f a t e w a s p r e p a r e d f r o m t h e p o w d e r m i x t u r e p r o v i d e d i n t h e a s s a y k i t . T h e e n z y m e s o l u t i o n c o n t a i n i n g h e x o k i n a s e a n d g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e w a s p r e p a r e d b y 2 0 - f o l d d i l u t i o n o f t h e e n z y m e s u s p e n s i o n p r o v i d e d i n t h e a s s a y k i t . T h e c o n t e n t s o f b u f f e r s u b s t r a t e s o l u t i o n a r e s t a b l e f o r 2 - 4 w e e k s a t 4 ° C ; h o w e v e r , t h e d i l u t e d e n z y m e s o l u t i o n w a s p r e p a r e d f r e s h b e f o r e e a c h a s s a y . T h e h y d r o l y z a t e s u p e r n a t a n t ‘ s t o p p l a t e ’ s o l u t i o n ( s e e A - V I I - 2 7 ) w a s d i l u t e d b y 2 0 f o l d i n 1 0 0 m M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) t o p r e p a r e ‘ d i l u t i o n p l a t e s ’ . 2 5 p l o f t r i e t h a n o a m i n e c o n t a i n i n g s u b s t r a t e s o l u t i o n w a s a d d e d a l o n g w i t h 5 0 p 1 o f ‘ d i l u t i o n p l a t e ’ s a m p l e i n t o t h e w e l l s . T h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 2 5 ° C f o r 5 m i n b e f o r e m e a s u r i n g t h e a b s o r b a n c e a t 3 4 0 n m ( [ A B S ] 1 ) . 1 0 p l o f t h e d i l u t e d e n z y m e s o l u t i o n w a s t h e n a d d e d t o e a c h w e l l f o l l o w e d b y 2 0 m i n i n c u b a t i o n p r i o r t o m e a s u r i n g t h e a b s o r b a n c e a g a i n ( [ A B S ] 2 ) . D i f f e r e n c e s i n a b s o r b a n c e b e t w e e n t h e t w o t i m e p e r i o d s 3 8 9 w a s c a l c u l a t e d a s d A ( w h e r e , d A = [ A B S ] 2 - [ A B S ] 1 ) . B l a n k s w e r e s u b t r a c t e d f r o m s a m p l e d A t o o b t a i n D A ( w h e r e , D A = d A s a m p l e - d A b l a n k ) - S u i t a b l y d i l u t e d s t a n d a r d s ( c o n c e n t r a t i o n r a n g i n g b e t w e e n 0 . 1 t o 2 g / l ) w e r e a d d e d t o e a c h 3 8 4 w e l l m i c r o p l a t e a n d w e r e u s e d t o o b t a i n t h e s t a n d a r d c u r v e ( i . e . D A v s . S u g a r c o n c e n t r a t i o n ) . T h e x y l o s e b i o - a s s a y ( M e g a z y m e , B r a y , I r e l a n d ) i s b a s e d o n a n a l o g o u s t w o - s t e p r e a c t i o n s t o t h e g l u c o s e a s s a y t h a t w e r e s c a l e d d o w n t o b e c a r r i e d o u t i n a 3 8 4 w e l l m i c r o p l a t e . a - D - x y l o s e i s c o n v e r t e d t o i s o m e r i c B - D - x y l o s e b y x y l o s e m u t a r o t a s e . B - D - x y l o s e i s t h e n r e a c t e d w i t h N A D + t o f o r m D - x y l o n i c a c i d a n d N A D H . T h e c o r r e s p o n d i n g i n c r e a s e o f N A D H i s m e a s u r e d a t 3 4 0 n m t o d e t e r m i n e t h e x y l o s e c o n c e n t r a t i o n . T h e s p e c i fi c i t y o f t h e a s s a y s f o r g l u c o s e a n d x y l o s e w a s a n a l y z e d i n t h e p r e s e n c e o f l i g n i n b a s e d c o m p o n e n t s a n d o t h e r m o n o m e r i c h y d r o l y s a t e s u g a r s s u c h a s x y l o s e a n d a r a b i n o s e . Q u a l i t y c o n t r o l s t a n d a r d s ( m i x e d g l u c o s e - x y l o s e s t a n d a r d s ) w e r e i n c l u d e d i n a l l a s s a y s t h a t s h o w e d l e s s t h a n 3 - 5 p e r c e n t d e v i a t i o n f r o m t a r g e t v a l u e s . E n z y m e a n d s u b s t r a t e b l a n k r e a d i n g s w e r e s u b t r a c t e d f r o m s a m p l e r e a d i n g s b e f o r e e s t i m a t i n g h y d r o l y s i s y i e l d s . A - V I l - 3 0 . M i c r o p l a t e E v a p o r a t i o n L o s s e s T h e t o t a l e v a p o r a t i o n l o s s e s f r o m t h e s e a l e d m i c r o p l a t e w e r e e s t i m a t e d u n d e r s t a n d a r d m i c r o p l a t e a s s a y c o n d i t i o n s . T o e s t i m a t e t h e e v a p o r a t i v e l o s s d u r i n g t h e c o u r s e o f h y d r o l y s i s t h e m i c r o p l a t e s w e r e w e i g h e d b e f o r e a n d a f t e r h y d r o l y s i s f o r t w o t i m e p e r i o d s ( i . e . 3 a n d 2 4 h r s ) . A l l i n c u b a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t 5 0 ° C a n d 3 7 5 r p m . 3 9 0 A - V I I - 3 l . C o m m e r c i a l ( C E ) a n d R e s e a r c h ( R E ) E n z y m e s T h e f o l l o w i n g c o m m e r c i a l e n z y m e ( C E ) p r e p a r a t i o n s w e r e p r o v i d e d b y G e n e n c o r I n t l . ( R o c h e s t e r , N Y ) : S p e z y m e C P ( C E 1 ) , M u l t i f e c t X y l a n a s e ( C E 3 ) , M u l t i f e c t P e c t i n a s e ( C E 4 ) , a n d A c c e l l e r a s e 1 0 0 0 ( C E 6 ) . T h e c o m m e r c i a l e n z y m e D e p o l 6 7 0 L ( C E 5 ) w a s p r o v i d e d b y B i o c a t a l y s t s I n c . ( C a r d i f f , U K ) . T h e c o m m e r c i a l e n z y m e N o v o z y m e 1 8 8 ( N o v o l 8 8 , C E 2 ) w a s p r o c u r e d f r o m S i g m a . T h e f o l l o w i n g e i g h t r e s e a r c h e n z y m e s ( R E ) p r e p a r a t i o n s w e r e p r o v i d e d b y N o v o z y m e ( D a v i s , C A ) : N S 2 2 0 0 2 ( R E 1 ) , N S 5 0 0 1 0 ( R E 2 ) , N S 5 0 0 1 2 ( R E 3 ) , N S 5 0 0 1 3 ( R E 4 ) , N S 5 0 0 1 4 ( R E 5 ) , N S 5 0 0 2 9 ( R E 6 ) , N S 5 0 0 3 0 ( R E 7 ) , a n d N 8 5 0 0 5 3 ( R E 8 ) . P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n f o r a l l C E a n d R E w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e K j e l d a h l n i t r o g e n a n a l y s i s m e t h o d ( i n t r i p l i c a t e s b y D a i r y O n e C o o p e r a t i v e I n c , I t h a c a , N Y ) , B C A ( b i c i n c h o n i n i c a c i d ) a n d B r a d f o r d b a s e d a s s a y s ( T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c , R o c k f o r d , I L ) w i t h b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) a s t h e s t a n d a r d . T h e n o n - p r o t e i n p r o t e i n e q u i v a l e n t s ( e . g . U r e a a n d A m m o n i u m s a l t s e s t i m a t e d b y A O A C M e t h o d 9 4 1 . 0 4 ) w a s s u b t r a c t e d f r o m t h e K j e l d a h l t o t a l c r u d e p r o t e i n e q u i v a l e n t s ( e s t i m a t e d b y A O A C M e t h o d 2 0 0 1 . 1 1 ) t o e s t i m a t e a c t u a l p r o t e i n c o n t e n t ( 6 . 2 5 x % N i t r o g e n ) . A l l e x p e r i m e n t s i n C h a p t e r 3 . 1 , 4 . 1 a n d 6 w e r e c o n d u c t e d u s i n g C E 1 ( 1 2 3 m g / m l , 5 9 fi l t e r p a p e r u n i t s / m l ) a n d C E 2 ( 1 6 5 m g / m l , 2 5 0 p - n i t r o p h e n y l g l y c o s i d e u n i t s / m l ) . I n a l l o t h e r c h a p t e r s , t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s b a s e d o n t h e r e s u l t s f r o m K j e l d a h l a n a l y s i s ( S e e C h a p t e r 7 f o r p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s ) . A - V l l - 3 2 . S D S - P A G E a n d I s o e l e c t r i c G e l E l e c t r o p h o r e s i s S D S - P A G E a n d I s o e l e c t r i c g e l b a s e d e l e c t r o p h o r e s i s w e r e r u n o n t h e N o v e x X C e l l S u r e L o c k M i n i - C e l l s y s t e m ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A , U S A ) u s i n g p r e - c a s t g e l s f r o m N u P A G E N o v e x 4 - 1 2 % B i s - T r i s G e l a n d N o v e x p H 3 — 1 0 I E F G e l s , r e s p e c t i v e l y . A f t e r 3 9 1 c o m p l e t i o n o f t h e e l e c t r o p h o r e s i s n m , t h e g e l s w e r e fi x e d w i t h 5 0 % m e t h a n o l / 7 % a c e t i c a c i d f o r 1 5 m i n a n d s t a i n e d w i t h G e l C o d e B l u e S t a i n R e a g e n t ( T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c , R o c k f o r d , I L , U S A ) t o v i s u a l i z e p r o t e i n b a n d s . T h e g e l w a s p h o t o g r a p h e d u s i n g t h e U V P B i o D o c - I t I m a g i n g S y s t e m ( U p l a n d , C A , U S A ) . P r o t e i n p u r i t y w a s e s t i m a t e d u s i n g t h e U N - S C A N - I T g e l s o f t w a r e ( V e r s i o n 6 . 1 , O r e m , U t a h , U S A ) . A - V I I - 3 3 . E n z y m e A c t i v i t y A s s a y s T h e e n z y m e a c t i v i t y a s s a y s w e r e b a s e d o n a h i g h - t h r o u g h p u t m i c r o p l a t e b a s e d m e t h o d a s d e s c r i b e d e a r l i e r . A 2 . 2 m 1 d e e p - w e l l m i c r o p l a t e ( G r e i n e r , M o n r o e , N C ) w a s u s e d t o a d d 2 5 0 p l o f 1 % ( w / v ) s t o c k s u b s t r a t e ( C M C , A v i c e l , o a t s p e l t x y l a n , c e l l o b i o s e , x y l o b i o s e ) , 5 0 p l o f 0 . 5 M c i t r a t e b u f f e r ( p H 5 . 0 ) a n d 2 0 0 p 1 o f a p p r o p r i a t e l y d i l u t e d e n z y m e s a m p l e s ( 2 0 n g t o 1 0 0 p g / w e l l ) . T h e m i c r o p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 5 0 ° C w i t h s h a k i n g a t 2 0 0 r p m f o r 1 0 m i n ( c e l l o b i o s e ) , 6 0 m i n ( C M C , x y l a n ) o r 3 0 0 m i n ( A v i c e l ) . T h e a m o u n t o f g l u c o s e a n d x y l o s e w a s e s t i m a t e d u s i n g p r e v i o u s l y d e fi n e d e n z y m e a s s a y s . O n e u n i t o f c e l l o b i a s e w a s d e fi n e d a s o n e m i c r o m o l e o f g l u c o s e r e l e a s e d p e r m i l l i g r a m e n z y m e p e r m i n u t e u n d e r t h e a s s a y c o n d i t i o n s . F o r C M C , A v i c e l a n d x y l a n b a s e d s u b s t r a t e s t h e r e d u c i n g s u g a r s r e l e a s e d w e r e e s t i m a t e d u s i n g 3 , 5 - d i n i t r o s a l i c y l i c a c i d ( D N S ) r e a g e n t [ 4 1 1 ] . O n e u n i t o f C M C a s e , A v i c e l a s e a n d x y l a n a s e a c t i v i t y w a s d e fi n e d a s o n e m i c r o m o l e o f r e d u c i n g s u g a r s ( a s g l u c o s e e q u i v a l e n t s ) r e l e a s e d p e r m i l l i g r a m e n z y m e p e r m i n u t e u n d e r t h e r e s p e c t i v e a s s a y c o n d i t i o n s . T h e p a r a - n i t r o p h e n y l ( p N P ) b a s e d c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e s u s e d w e r e 4 - n i t r o p h e n y l - B - D - c e l l o b i o s i d e ( p N P C ) , 4 - n i t r o p h e n y l - B - D - g l u c o p y r a n o s i d e ( p N P G ) , 4 - n i t r o p h e n y l - B - D - x y l o p y r a n o s i d e ( p N P X ) , 4 - n i t r o p h e n y l - a c e t a t e ( p N P A ) a n d 4 - n i t r o p h e n y l - B - D - a r a b i n o f u r a n o s i d e ( p N P A f ) ( S i g m a - A l d r i c h , S t . L o u i s , M O ) . T h e a s s a y 3 9 2 m i x t u r e s c o n t a i n i n g 8 0 p l o f 1 m M p N P s u b s t r a t e , 1 0 p l o f 0 . 5 M c i t r a t e b u f f e r ( p H 5 . 0 ) a n d 1 0 p l o f d i l u t e d e n z y m e s ( 2 0 n g t o 1 6 u g / w e l l ) i n 3 5 0 p l m i c r o p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 5 0 ° C w i t h s h a k i n g a t 2 0 0 r p m . A f t e r 1 5 m i n r e a c t i o n t i m e , 2 0 0 p l o f 1 M N a 2 C 0 3 ( N o t e : p H 7 . 5 p h o s p h a t e b u f f e r w a s u s e d f o r p N P A a s s a y s o n l y t o p r e v e n t s u b s t r a t e h y d r o l y s i s u n d e r a l k a l i n e c o n d i t i o n s ) w a s a d d e d t o a s s a y m i x t u r e s t o a r r e s t t h e h y d r o l y t i c r e a c t i o n . T h e a m o u n t o f p N P r e l e a s e d w a s m e a s u r e d a t O D 4 2 0 n m . O n e u n i t o f e n z y m e a c t i v i t y w a s d e fi n e d a s o n e n a n o m o l e o f p - n i t r o p h e n o l r e l e a s e d p e r m i l l i g r a m e n z y m e p e r m i n u t e u n d e r t h e a s s a y c o n d i t i o n s . A - V I I - 3 4 . P r o t e o m i c s A n a l y s i s P r o t e i n s o f i n t e r e s t w e r e d e n a t u r e d a n d r e d u c e d b y a d d i n g u r e a a n d t h i o u r e a t o a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 7 M a n d 2 M , r e s p e c t i v e l y . F r e s h d i t l r i o t l r r e i t o l w a s a d d e d t o a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 5 m M , a n d s a m p l e s w e r e i n c u b a t e d a t 6 0 ° C f o r 3 0 m i n . F o l l o w i n g i n c u b a t i o n , t h e p r o t e i n s a m p l e w a s d i l u t e d l O - f o l d w i t h 1 0 0 m M N H 4 H C O 3 , p H 8 . 4 , t o r e d u c e s a l t c o n c e n t r a t i o n . A v o l u m e o f 1 M C a C l z w a s a d d e d t o t h e d i l u t e d s a m p l e t o a fi n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 m M , a n d t h e s a m p l e w a s d i g e s t e d a t 3 7 ° C u s i n g s e q u e n c i n g g r a d e t r y p s i n ( P r o m e g a , M a d i s o n , W I ) a t a r a t i o o f l u n i t / 5 0 u n i t s o f p r o t e i n ( 1 u n i t = < 1 p g o f p r o t e i n ) f o r 4 h . F o l l o w i n g i n c u b a t i o n , d i g e s t e d s a m p l e s w e r e d e s a l t e d u s i n g a n a p p r o p r i a t e l y s i z e d C - 1 8 S P E c o l u m n ( S u p e l c o , S t . L o u i s , M O ) a n d v a c u u m m a n i f o l d . T h r e e c o l u m n v o l u m e s o f m e t h a n o l w e r e p a s s e d t h r o u g h t h e c o l u m n f o l l o w e d b y 2 c o l u m n v o l u m e s o f n a n o p u r e w a t e r . A f t e r p a s s i n g t h e s a m p l e t h r o u g h t h e c o l u m n , t h e c o l u m n w a s w a s h e d w i t h 4 v o l u m e s o f a 9 5 % a c e t o n i t r i l e ( A C N ) , 0 . 1 % t r i fl u o r o a c e t i c a c i d ( T F A ) s o l u t i o n . P e p t i d e s w e r e e l u t e d u s i n g o n e c o l u m n v o l u m e o f a n 8 0 % A C N , 3 9 3 7 7 : z i fl S i q I S x i ' l ' Z i < q u I S fl i j - x i x j + Z j l S i < < k S q fi l i k x i x j x k + . . . 0 . 1 % T F A s o l u t i o n . T h e c o l l e c t e d p e p t i d e s w e r e c o n c e n t r a t e d t o a fi n a l v o l u m e o f 1 5 0 p l a n d m e a s u r e d u s i n g t h e B C A a s s a y ( P i e r c e B i o t e c h n o l o g y , R o c k f o r t , I L ) a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s i n s t r u c t i o n s . P e p t i d e s f r o m e n z y m e t r y p t i c d i g e s t s w e r e a n a l y z e d u s i n g h i g h r e s o l u t i o n r e v e r s e d - p h a s e H P L C s e p a r a t i o n c o u p l e d t o a n i o n t r a p m a s s s p e c t r o m e t e r ( L T Q , T h e r r n o E l e c t r o n , S a n J o s e C A ) t h a t w a s o p e r a t e d i n a d a t a - d e p e n d e n t M S / M S m o d e [ 4 2 3 ] . M S / M S s p e c t r a w e r e a n a l y z e d u s i n g t h e S E Q U E S T a l g o r i t h m [ 4 4 9 ] i n c o n j u n c t i o n w i t h a p r o t e i n c o l l e c t i o n o f a l l fi m g a l e n t r i e s f r o m U n i p r o t ( S w i s s - P r o t a n d T r E M B L ) . P r e l i m i n a r y fi l t e r i n g o f i d e n t i fi e d p e p t i d e s w a s p e r f o r m e d u s i n g : a m i n i m u m c r o s s - c o r r e l a t i o n c u t - o f f ( X C o r r ) o f e i t h e r 1 . 9 , 3 . 0 , o r 3 . 2 f o r 1 + , 2 + , o r 3 + c h a r g e s t a t e s , r e s p e c t i v e l y ; p a r t i a l l y a n d f u l l y t r y p t i c p e p t i d e s ( p e p t i d e s t h a t c o n t a i n e d e i t h e r a n a r g i n i n e o r l y s i n e a t t h e s i t e o f c l e a v a g e ) ; D e l C n > = 0 . 1 . E s t i m a t i o n o f p e p t i d e F a l s e D i s c o v e r y R a t e ( F D R ) w a s c a l c u l a t e d b y d e c o y d a t a b a s e s e a r c h i n g t e c h n i q u e s [ 4 4 4 , 4 4 5 ] , r e s u l t i n g i n v a l u e s b e t w e e n 0 . 5 % a n d 2 % . A - V I I - 3 5 . S c h e f f é s i m p l e x - c e n t r o i d C E - R E e x p e r i m e n t a l d e s i g n a n d r e g r e s s i o n T h e s i m p l e x - c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l d e s i g n [ 4 3 8 ] u s e d i n t h i s r e s e a r c h r e q u i r e s e x p e r i m e n t s t o b e p e r f o r m e d f r r s t o n s i n g l e - b l e n d “ p u r e ” m i x t u r e s , t h e n o n d o u b l e - b l e n d s ( 5 0 % o f e a c h o f t w o c o m p o n e n t s ) , t h e n o n t r i p l e - b l e n d s , a n d s o o n ( t h u s r e q u i r i n g 2 “ - 1 t r i a l s , w h e r e n i s t h e n u m b e r o f c o m p o n e n t s ) . T h i s a l l o w s f o r t h e c a l c u l a t i o n o f a p o l y n o m i a l m i x t u r e r e g r e s s i o n e q u a t i o n , w i t h t e r m s r e p r e s e n t i n g t h e e f f e c t o f s i n g l e e n z y m e s , b i n a r y s y n e r g i e s ( t h e p r o d u c t o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f t w o e n z y m e s a n d a r e g r e s s i o n c o e f fi c i e n t ) , t e r n a r y s y n e r g i e s , a n d s o o n , d e p e n d i n g o n t h e o r d e r o f t h e r e g r e s s i o n e q u a t i o n , a s s h o w n b e l o w : 3 9 4 W h e r e ; r ] i s t h e r e s p o n s e v a r i a b l e ; q i s t h e n u m b e r o f e n z y m e s ; x , - i s t h e p r o p o r t i o n o f t h e i t h e n z y m e i n t h e m i x t u r e ; a n d 1 3 , 1 3 0 , " i s a c o e f fi c i e n t o f s y n e r g y f o r m e n z y m e s . T h e m a g n i t u d e o f e a c h l 3 i j . . . m i n d i c a t e s t h e s t r e n g t h o f a p a r t i c u l a r e n z y m e o r s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n . G l u c a n c o n v e r s i o n , x y l a n c o n v e r s i o n , a n d t o t a l s u g a r s r e l e a s e d ( g m s u g a r s p e r k g b i o m a s s ) w e r e a n a l y z e d t o g e n e r a t e s u i t a b l e s t a t i s t i c a l l y b a s e d r e g r e s s i o n m o d e l s u s i n g M i n i t a b ( V e r s i o n 1 5 . 0 , M i n i t a b I n c , S t a t e C o l l e g e , P A ) . T h i r d - d e g r e e m i x e d s t e p w i s e ( a - t o - e n t e r / a - t o - l e a v e : 0 . 1 5 ) r e g r e s s i o n w a s p e r f o r m e d o n t h e r e s u l t s o f e a c h o f t h e e x p e r i m e n t s t o g e n e r a t e m o d e l s o f t h e i n t e r a c t i o n s a m o n g s t t h e s t u d i e d e n z y m e s , w i t h t h e s t e p w i s e s t e p p r e s e r v i n g o n l y s t a t i s t i c a l l y s i g n i fi c a n t i n t e r a c t i o n e f f e c t s . R e s i d u a l s w e r e a n a l y z e d a g a i n s t o r d e r , fi t , n o r m a l p r o b a b i l i t y , a n d d i s t r i b u t i o n t o e n s u r e q u a l i t y - o f - fi t . A n a l y s i s s u g g e s t e d t h a t q u a d r a t i c a n d q u a t e r n a r y r e g r e s s i o n s ( l o w R 2 a n d h i g h 0 v a l u e s ) d i d n o t m o d e l a s a c c u r a t e l y a s t h e s p e c i a l c u b i c r e g r e s s i o n s . T h e r e g r e s s i o n e q u a t i o n s w e r e o p t i m i z e d b y m a x i m i z i n g a d e s i r a b i l i t y f u n c t i o n ( w e i g h t = 1 , m i n = 0 , t a r g e t = t h e o r e t i c a l m a x i m u m s u g a r c o n v e r s i o n ) . C o x r e s p o n s e t r a c e p l o t s w e r e g e n e r a t e d t o a n a l y z e t h e e f f e c t o f v a r y i n g t h e c o m p o s i t i o n o f t h e e n z y m e c o c k t a i l s ( r e f e r e n c e b l e n d = m o d e l - g e n e r a t e d o p t i m u m ) . A - V I I - 3 6 . S i m p l e x - c e n t r o i d d e s i g n f o r C E - R E c r u d e e n z y m e s y s t e m s T h r e e s i m p l e x c e n t r o i d e x p e r i m e n t s w e r e d e s i g n e d : ( 1 ) a d d i n g m i x t u r e s o f 8 m g p r o t e i n / g g l u c a n o f e i g h t a c c e s s o r y e n z y m e s ( N o v o z y m e 1 8 8 , M u l t i f e c t X y l a n a s e , M u l t i f e c t P e c t i n a s e , N S 2 2 0 0 2 , N S 5 0 0 1 2 , N 8 5 0 0 1 4 , N S 5 0 0 2 9 , a n d N S 5 0 0 3 0 ) t o fi x e d 8 . 5 m g A c c e l l e r a s e / g m g l u c a n o f A F E X s t o v e r ; ( 2 ) m i x t u r e s o f 1 0 e n z y m e s ( S p e z y m e , 3 9 5 M u l t i f e c t X y l a n a s e a n d P e c t i n a s e , D e p o l 6 7 0 L , A c c e l l e r a s e , N 8 2 2 0 0 2 , N S S O O I O , N 8 5 0 0 1 3 , N 8 5 0 0 3 0 , a n d N S 5 0 0 5 3 ) a t a l o a d i n g o f 1 6 . 5 m g p r o t e i n / g g l u c a n o f A F E X s t o v e r ; a n d ( 3 ) m i x t u r e s o f 5 e n z y m e s a t 1 6 . 5 m g p r o t e i n / g g l u c a n c o n s i s t i n g o f a t l e a s t o n e m a j o r c r u d e c e l l u l a s e p r e p a r a t i o n ( e i t h e r S p e z y m e C P , A c c e l l e r a s e , o r N S 5 0 0 1 3 ) , M u l t i f e c t P e c t i n a s e , D e p o l 6 7 0 L , N S 2 2 0 0 2 , a n d N S 5 0 0 3 0 . F o r a l l e x p e r i m e n t s , g l u c o s e a n d x y l o s e r e l e a s e d w a s d e t e r m i n e d f o r e a c h u n i q u e e n z y m e m i x t u r e e m p l o y e d a s s p e c i fi e d b y t h e s i m p l e x - c e n t r o i d e x p e r i m e n t a l d e s i g n . A l l e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d u s i n g t h e m i c r o p l a t e h y d r o l y s i s m e t h o d o u t l i n e d e a r l i e r f o r 4 a n d 2 4 h o u r s i n t r i p l i c a t e s . A l l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e e s t i m a t e d b a s e d o n t h e K j e l d a h l m e t h o d . A - V I I - 3 7 . H e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n o f A s p e r g i l l u s n i d u l a n s b a s e d B - x y l o s i d a s e R e c o m b i n a n t P i c h i a p a s t o r i s s t r a i n s c o n t a i n i n g s u i t a b l e c e l l u l a s e a n d x y l a n a s e g e n e s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e F u n g a l G e n e t i c s S t o c k C e n t e r ( F G S C ) a t t h e U n i v e r s i t y o f M i s s o u r i ( K a n s a s C i t y , M O ) . T h e g e n e s e n c o d i n g c e l l w a l l d e g r a d i n g e n z y m e s w e r e i s o l a t e d fi ' o m A s p e r g i l l u s n i d u l a n s a n d i n t e g r a t e d i n t o t h e g e n o m e o f P . p a s t o r i s X - 3 3 b y B a u e r e t a l . ( 2 0 0 6 ) [ 4 8 9 ] . T h e r e c o m b i n a n t s t r a i n F G S C # 1 0 0 7 7 e x p r e s s i n g B - x y l o s i d a s e w a s u s e d f o r a l l h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n e x p e r i m e n t s . T h e p r o t o c o l s e m p l o y e d f o l l o w e d f o r c u l t u r e m e d i a c o m p o s i t i o n , s e e d c u l t u r e p r e p a r a t i o n a n d e x p r e s s i o n i n s h a k e fl a s k s w e r e b a s e d o n m e t h o d s o b t a i n e d f r o m D r C h r i s S o m e r v i l l e ( P e r s o n a l C o m m u n i c a t i o n ) . T h e r e c o m b i n a n t s t r a i n w a s m a i n t a i n e d o n Y P D p l a t e s c o n t a i n i n g y e a s t e x t r a c t ( 1 % w / v ) , p e p t o n e ( 2 % w / v ) , d e x t r o s e ( 2 % w / v ) a n d a g a r ( 2 % w / v ) . P l a t e c u l t u r e s w e r e s t o r e d a t 4 ° C f o r r o u t i n e u s e . C u l t u r e s t o c k s w e r e s t o r e d i n 4 0 % g l y c e r o l a t - 8 0 ° C f o r l o n g t e r m u s e . F o r p r e p a r a t i o n o f s e e d c u l t u r e B M G Y m e d i u m w a s u s e d . T h e B M G Y m e d i u m c o n t a i n e d ( i n I L ) 1 0 g o f y e a s t e x t r a c t , 2 0 g o f p e p t o n e , 1 0 0 m 1 o f y e a s t n i t r o g e n 3 9 6 b a s e ( Y N B ) ( 2 0 . 4 g o f y e a s t n i t r o g e n b a s e w i t h o u t a m m o n i u m s u l f a t e a n d a m i n o a c i d s a n d 6 0 g o f a m m o n i u m s u l f a t e i n 6 0 0 m l w a t e r ) , 1 0 0 m l o f 1 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r a t p H 6 . 0 , 1 0 0 m l o f 1 0 % ( v / v ) g l y c e r o l a n d 2 m l o f 0 . 0 2 % ( w / v ) b i o t i n . Y N B a n d b i o t i n w a s fi l t e r s t e r i l i z e d a n d a d d e d t o t h e s t e r i l e m e d i u m c o n t a i n i n g o t h e r c o m p o n e n t s . F o r h i g h c e l l d e n s i t y f e r m e n t a t i o n r i c h m e d i u m B M M Y w a s u s e d . T h e B M M Y m e d i u m w a s c o m p o s e d o f y e a s t e x t r a c t , p e p t o n e , y e a s t n i t r o g e n b a s e , p h o s p h a t e b u f f e r a n d b i o t i n a t c o n c e n t r a t i o n s s i m i l a r t o B M G Y m e d i u m . I n s t e a d o f g l y c e r o l , m e t h a n o l w a s a d d e d a s t h e c a r b o n s o u r c e . T h e e x p r e s s i o n o f r e c o m b i n a n t e n z y m e s w a s t e s t e d b y t h e c u l t i v a t i o n o f P . p a s t o r i s i n B M M Y m e d i u m i n s h a k e fl a s k s . B a f fl e d E r l e n m e y e r fl a s k s ( 2 5 0 m l ) w i t h 5 0 m l o f m e d i a w a s i n o c u l a t e d w i t h t h e s e e d c u l t u r e t o a n i n i t i a l O D 6 0 0 o f a p p r o x i m a t e l y 1 . 0 a n d i n c u b a t e d a t 2 8 ° C w i t h a g i t a t i o n a t 2 2 5 r p m . T h e c u l t u r e s w e r e s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 6 % m e t h a n o l e v e r y 2 4 h f o r 3 - 5 d a y s . A l a b s c a l e 1 l i t e r B I O S T A T B p l u s f e r m e n t o r ( S a r t o r i u s ) w a s u s e d f o r f e d - b a t c h f e r m e n t a t i o n . H i g h c e l l - d e n s i t y w a s a c h i e v e d b y c u l t i v a t i o n o f P . p a s t o r i s i n b a t c h p h a s e f o r 2 4 h i n g l y c e r o l m e d i u m . A f t e r s e e d c u l t u r e g r o w t h t o h i g h O D , f e d - b a t c h f e r m e n t a t i o n w a s i n i t i a t e d w i t h a u t o m a t e d f e e d i n g o f m e t h a n o l ( w h i c h w a s d e p e n d e n t o n d i s s o l v e d o x y g e n s p i k e s i n d i c a t i n g s u b s t r a t e d e p l e t i o n ) t o i n d u c e e x p r e s s i o n o f t h e r e c o m b i n a n t e n z y m e . T h e b a t c h f e r m e n t a t i o n p h a s e w a s c a r r i e d o u t u s i n g r i c h B M M Y m e d i u m w i t h 4 % ( w / v ) g l y c e r o l . T h e c u l t u r e p H a n d t e m p e r a t u r e w e r e m a i n t a i n e d a t p H 6 a n d 3 0 ° C . A f t e r r e m o v i n g t h e c e l l s b y c e n t r i f u g a t i o n t h e s u p e r n a t a n t w a s a n a l y z e d f o r e x p r e s s i o n o f fi - x y l o s i d a s e b y p N P - x y l o s i d e b a s e d a c t i v i t y a s s a y s a n d S D S - P A G E . T h e f e r m e n t a t i o n b r o t h w a s c o n c e n t r a t e d a n d p a r t i a l l y d e s a l t e d u s i n g a 1 0 k D a t a n g e n t i a l fl o w u l t r a - fi l t r a t i o n m e m b r a n e ( S a r t o r i u s ) a t 4 ° C p r i o r t o F P L C p o l i s h i n g . 3 9 7 A — V l l - 3 8 . E n z y m e p u r i fi c a t i o n E n z y m e p u r i fi c a t i o n ( S e e [ 4 5 3 ] f o r d e t a i l s ) w a s p e r f o r m e d u s i n g a f a s t p r o t e i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( F P L C ) s y s t e m ( G E H e a l t h c a r e , B u c k i n g h a m s h i r e , U n i t e d K i n g d o m ) a t r o o m t e m p e r a t u r e , w h i l e t h e fi a c t i o n c o l l e c t o r w a s k e p t a t 4 ° C . T h e f o l l o w i n g p r e - p a c k e d F P L C c o l u m n s ( G E H e a l t h c a r e , B u c k i n g h a m s h i r e , U n i t e d K i n g d o m ) w e r e u s e d : 5 1 m l H i s P r e p 2 6 / 1 0 d e s a l t i n g c o l u m n , 6 m 1 R e s o u r c e Q a n i o n e x c h a n g e c o l u m n , 1 . 7 m l M o n o S c a t i o n e x c h a n g e c o l u m n , 1 . 7 m l M o n o Q a n i o n e x c h a n g e c o l u m n a n d 1 m l P H E h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c o l u m n . T h e c r u d e e n z y m e s a m p l e s w e r e fi l t e r e d ( u s i n g 0 . 2 p m fi l t e r ) a n d b u f f e r e x c h a n g e d t o i n i t i a l b u f f e r ( b u f f e r A ) u s i n g H i s P r e p 2 6 / 1 0 d e s a l t i n g c o l u m n b e f o r e i n j e c t i n g o n t o r e s p e c t i v e c o l u m n s . P r o t e i n s a m p l e s w e r e c o n c e n t r a t e d u s i n g a t a n g e n t i a l fl o w - fi l t r a t i o n s y s t e m ( 1 0 k D a V i v a fl o w m e m b r a n e , S a r t o r i u s , B o h e m i a , N Y ) . M i l l i - Q w a t e r w a s u s e d t o p r e p a r e b u f f e r s . E l u t i o n b u f f e r s w e r e fi l t e r e d . t h r o u g h 0 . 2 p m P B S m e m b r a n e a n d d e g a s s e d u n d e r v a c u u m p r i o r t o u s e . 3 9 8 R E F E R E N C E S 3 9 9 1 . C h u n d a w a t S , B a l a n V , D a l e B : E f f e c t o f p a r t i c l e s i z e b a s e d s e p a r a t i o n o f m i l l e d c o r n s t o v e r o n A F E X p r e t r e a t m e n t a n d e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y . B i o t e c h B i o e n g 2 0 0 6 , 9 6 : 2 1 9 - 2 3 1 . 2 . C h u n d a w a t S P S , B a l a n V , D a l e B E : H i g h - t h r o u g h p u t m i c r o p l a t e t e c h n i q u e f o r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 8 , 9 9 : 1 2 8 1 - 1 2 9 4 . 3 . C h u n d a w a t S P S , B a l a n V , S o u s a L , D a l e B E : C h a r a c t e r i s t i c s o f a n i d e a l t h e r m o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t f o r r e d u c i n g r e c a l c i t r a n c e o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s t o b i o l o g i c a l p r o c e s s i n g . I n B i o a l c o h o l p r o d u c t i o n : . ° B i o c h e m i c a l c o n v e r s i o n o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s ( I n P r e s s ) . E d i t e d b y W a l d r o n K : W o o d h e a d P u b l i s h i n g ; 2 0 0 9 . 4 . Z h b a n k o v R , F i r s o v S , G r i n s h p a n D , B a r a n J , M a r c h e w k a M , R a t a j c z a k H : V i b r a t i o n a l s p e c t r a a n d n o n c o v a l e n t i n t e r a c t i o n s o f c a r b o h y d r a t e s m o l e c u l e s . J M o l S t r u c 2 0 0 3 , 6 4 5 : 9 — 1 6 . 5 . K a m m B , K a m m M : B i o r e fi n e r y - S y s t e m s . C h e m i c a l & B i o c h e m i c a l E n g i n e e r i n g Q u a r t e r l y 2 0 0 4 , 1 8 : 1 - 6 . 1 6 . H i m m e l M , D i n g S , J o h n s o n D , A d n e y W , N i m l o s M , B r a d y J , F o u s t T : B i o m a s s r e c a l c i t r a n c e : e n g i n e e r i n g p l a n t s a n d e n z y m e s f o r b i o f u e l s p r o d u c t i o n . S c i e n c e 2 0 0 7 , 3 1 5 : 8 0 4 — 8 0 7 . 7 . D a l e B , M o r e i r a M : A f r e e z e - e x p l o s i o n t e c h n i q u e f o r i n c r e a s i n g c e l l u l o s e h y d r o l y s i s . B i o t e c h n o l B i o e n g S y m p 1 9 8 2 , 1 2 : 3 1 — 4 3 . 8 . B a l s B , T e a c h w o r t h L , D a l e B , B a l a n V : E x t r a c t i o n o f P r o t e i n s f r o m S w i t c h g r a s s U s i n g A q u e o u s A m m o n i a w i t h i n a n I n t e g r a t e d B i o r e fi n e r y . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 2 0 0 7 , 1 4 3 : 1 8 7 — 1 9 8 . 9 . C a r o l a n J , J o s h i S , D a l e B : T e c h n i c a l a n d F i n a n c i a l F e a s i b i l i t y A n a l y s i s o f D i s t r i b u t e d B i o p r o c e s s i n g U s i n g R e g i o n a l B i o m a s s P r e - P r o e e s s i n g C e n t e r s . J A g r i F o o d I n d O r g 2 0 0 7 , 5 : 1 0 . 1 0 . M a n s fi e l d S D , M o o n e y C . , S a d d l e r J N : S u b s t r a t e a n d e n z y m e c h a r a c t e r i s t i c s t h a t l i m i t c e l l u l o s e h y d r o l y s i s . B i o t e c h P r o g 1 9 9 9 , 1 5 : 8 0 4 . 1 1 . Z h a n g P , L y n d R : T o w a r d s a n a g g r e g a t e d u n d e r s t a n d i n g o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e : N o n c o m p l e x e d c e l l u l a s e s y s t e m s . B i o t e c h B i o e n g 2 0 0 4 , 8 8 : 7 9 7 - 8 2 4 . 1 2 . F a n L T , L e e Y , B e a r d m o r e D R : T h e i n fl u e n c e o f m a j o r s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f c e l l u l o s e o n r a t e o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . B i o t e c h B i o e n g 1 9 8 0 , 2 2 : 1 7 7 - 1 9 0 . 1 3 . S t a l b r a n d H , M a n s fi e l d S , S a d d l e r J , K i l b u r n D , W a r r e n R , G i l k e s N : A n a l y s i s o f m o l e c u l a r s i z e d i s t r i b u t i o n s o f c e l l u l o s e m o l e c u l e s d u r i n g h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e b y 4 0 0 r e c o m b i n a n t C e l l u l o m o n a s f i m i b e t a - 1 , 4 - G l u c a n a s e s . A p p l E n v i r o n M i c r o b i o l 1 9 9 8 , 6 4 : 2 3 7 4 - 2 3 7 9 . l 4 . K l e i n G , S n o d g r a s s W : C e l l u l o s e . E d i t e d b y M a c r a e R , R o b i n s o n R , S a d d l e r M . L o n d o n : A c a d e m i c P r e s s ; 1 9 9 3 . 1 5 . R a m o s L , N a z h a d M , S a d d l e r J N : E f f e c t o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o n t h e m o r p h o l o g y a n d fi n e s t r u c t u r e o f p r e t r e a t e d c e l l u l o s i c r e s i d u e s . E n z y m e M i c r o b T e c h n o ] 1 9 9 3 , 1 5 : 8 2 1 - 8 3 1 . 1 6 . C h a n g V , H o l t z a p p l e M : F u n d a m e n t a l f a c t o r s a f f e c t i n g b i o m a s s e n z y m a t i c r e a c t i v i t y . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 2 0 0 0 , 8 4 - 8 6 z 5 - 3 7 . 1 7 . B e s l e J , C o r n u A , J o u a n y J : R o l e s o f s t r u c t u r a l p h e n y l p r o p a n o i d s i n f o r a g e c e l l w a l l d i g e s t i o n . J S c i F o o d A g r i c 1 9 9 4 , 6 4 : 1 7 1 — 1 9 0 . 1 8 . L a u r e a n o - P e r e z L , T e y m o u r i F , A l i z a d e h H , D a l e B : U n d e r s t a n d i n g f a c t o r s t h a t l i m i t e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f b i o m a s s : C h a r a c t e r i z a t i o n o f p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 2 0 0 5 , 1 2 4 : 1 0 8 1 - 1 0 9 9 . 1 9 . S t o n e J E , S c a l l a n A M : T h e e f f e c t o f c o m p o n e n t r e m o v a l u p o n t h e p o r o u s s t r u c t u r e o f t h e c e l l w a l l o f w o o d . P a r t 1 H . A C o m p a r i s i o n b e t w e e n s u l p h i t e a n d k r a f t p r o c e s s e s . P a p M a g C a n 1 9 6 9 , 6 9 : T 2 1 9 - T 2 4 0 . 2 0 . W h i t e A , B r o w n M : E n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e : V i s u a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p r o c e s s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 9 8 1 , 7 8 : 1 0 4 7 - 1 0 5 1 . 2 1 . T h o m p s o n D , C h e n H , G r e t h l e i n H : C o m p a r i s o n o f p r e t r e a t m e n t m e t h o d s o n t h e b a s i s o f a v a i l a b l e s u r f a c e a r e a . B i o r e s o u r T e c h n o l 1 9 9 2 , 3 9 : 1 5 5 - 1 6 3 . 2 2 . I s h i z a w a C I , D a v i s M F , S c h e l l D F , J o h n s o n D K : P o r o s i t y a n d i t s e f f e c t o n t h e d i g e s t i b i l i t y o f d i l u t e s u l f u r i c a c i d p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r . J A g r i c F o o d C h e m 2 0 0 7 , 5 5 : 2 5 7 5 - 2 5 8 1 . 2 3 . Z a d r a z i l F , P u n i y a A : S t u d i e s o n t h e e f f e c t o f p a r t i c l e s i z e o n s o l i d - s t a t e f e r m e n t a t i o n o f s u g a r c a n e b a g a s s e i n t o a n i m a l f e e d u s i n g w h i t e - r o t f u n g i . B i o r e s o u r T e c h n o l 1 9 9 5 , 5 4 : 8 5 - 8 7 . 2 4 . Z h a n g P , H i m m e l M , M i e l e n z J : O u t l o o k f o r c e l l u l a s e i m p r o v e m e n t : s c r e e n i n g a n d s e l e c t i o n s t r a t e g i e s . B i o t e c h n o l A d v 2 0 0 6 , 2 4 : 4 5 2 - 4 8 1 . 2 5 . R e e s e E , S i u R , L e v i n s o n H : B i o l o g i c a l d e g r a d a t i o n o f s o l u b l e d e r i v a t i v e s a n d i t s r e l a t i o n s h i p t o t h e m e c h a n i s m o f c e l l u l o s e h y d r o l y s i s . J B a c t e r i o l 1 9 5 0 , 5 9 : 4 8 5 - 4 9 7 . 2 6 . R o s g a a r d L , P e d e r s e n S , L a n g s t o n J , A k e r h i e l m D , C h e r r y J , M e y e r A : E v a l u a t i o n o f M i n i m a l T r i c h o d e r m a r e e s e i C e l l u l a s e M i x t u r e s o n D i f f e r e n t l y P r e t r e a t e d B a r l e y S t r a w S u b s t r a t e s . B i o t e c h n o l P r o g 2 0 0 7 , 2 3 : 1 2 7 0 - 1 2 7 6 . 4 0 1 2 7 . G o w L , W o o d T : B r e a k d o w n o f c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e b y s y n e r g i s t i c a c t i o n b e t w e e n c e l l u l a s e c o m p o n e n t s f r o m C l o s t r i d i u m t h e r m o c e l l u m a n d T r i c h o d e r m a k o n i n g i i . F E M S M i c r o b i o l o g y L e t t e r s 1 9 8 8 , 5 0 : 2 4 7 - 2 5 2 . 2 8 . W o o d T : C e l l u l o l y t i c e n z y m e s s y s t e m o f T r i c h o d e r m a k o n i n g i i . S e p a r a t i o n o f c o m p o n e n t s a t t a c k i n g n a t i v e c o t t o n . B i o c h e m J 1 9 6 8 , 1 0 9 : 2 1 7 - 2 2 9 . 2 9 . W o o d T , M c C r a e S : T h e c e l l u l a s e o f P e n i c i l l i u m p i n o p h i l u m . S y n e r g i s m b e t w e e n e n z y m e c o m p o n e n t s i n s o l u b i l i z i n g c e l l u l o s e w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o t h e i n v o l v e m e n t o f t w o i m m u n o l o g i c a l l y d i s t i n c t c e l l o b i o h y d r o l a s e s . B i o c h e m J 1 9 8 6 , 2 3 4 : 9 3 - 9 9 . 3 0 . W o o d T , M c r a e S , B h a t K : T h e m e c h a n i s m o f f u n g a l c e l l u l a s e a c t i o n . S y n e r g i s m b e t w e e n e n z y m e c o m p o n e n t s o f P e n i c i l l i u m p i n o p h i l u m c e l l u l a s e i n s o l u b i l i z i n g h y d r o g e n - b o n d o r d e r e d c e l l u l o s e . B i o c h e m J 1 9 8 9 , 2 6 0 : 3 7 - 4 3 . 3 1 . B h a t M , B h a t S : C e l l u l o s e d e g r a d i n g e n z y m e s a n d t h e i r p o t e n t i a l i n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n s . B i o t e c h n o l o g z A d v a n c e s 1 9 9 7 , 1 5 : 5 8 3 - 6 2 0 . 3 2 . B h a t M K , H a z l e w o o d G P : E n z y m o l o g y a n d O t h e r C h a r a c t e r i s t i c s o f C e l l u l a s e s a n d X y l a n a s e s . I n E n z y m e s i n F a r m A n i m a l N u t r i t i o n . E d i t e d b y B e d f o r d M R , P a r t r i d g e G G : C A B I P u b l i s h i n g ; 2 0 0 1 : 1 1 - 6 0 . 3 3 . E r i k s s o n T , B o r j e s s o n J , T j e m e l d F : M e c h a n i s m o f s u r f a c t a n t e f f e c t i n e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s e . E n z y m e M i c r o b T e c h n o l 2 0 0 2 , 3 1 : 3 5 3 — 3 6 4 . 3 4 . E r i k s s o n T , K a r l s s o n J , T j e m e l d F : A m o d e l e x p l a i n i n g d e c l i n i n g r a t e i n h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s e s u b s t r a t e s w i t h c e l l o b i o h y d r o l a s e I ( C e l 7 A ) a n d e n d o g l u c a n a s e I ( C e l 7 B ) o f T r i c h o d e r m a r e e s e i . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 2 0 0 2 , 1 0 1 : 4 1 - 6 0 . 3 5 . Y a n g B , W i l l i e s D , W y m a n C : C h a n g e s i n t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s r a t e o f a v i c e l c e l l u l o s e w i t h c o n v e r s i o n . B i o t e c h B i o e n g 2 0 0 6 , 9 4 : 1 1 2 2 - 1 1 2 8 . 3 6 . V a l j a m é i e P , S i l d V , N u t t A , P e t t e r s s o n G , J o h a n s s o n G : A c i d h y d r o l y s i s o f b a c t e r i a l c e l l u l o s e r e v e a l s d i f f e r e n t m o d e s o f s y n e r g i s t i c a c t i o n b e t w e e n c e l l o b i o h y d r o l a s e I a n d e n d o g l u c a n a s e 1 . E u r J B i o c h e m 1 9 9 9 , 2 6 6 : 3 2 7 - 3 3 4 . 3 7 . H o l t z a p p l e M T , R i p l e y E P , N i k o l a o u M : S a c c h a r i i i c a t i o n , f e r m e n t a t i o n , a n d p r o t e i n r e c o v e r y f r o m l o w - t e m p e r a t u r e A F E X - t r e a t e d c o a s t a l B e r m u d a g r a s s . A p p l B i o c h e m B i o t e c h 1 9 9 4 , 4 4 : 1 1 2 2 - 1 1 3 1 . 3 8 . D e L a R o s a L , R e s h a m w a l a S , L a t i m e r V , S h a w k y B , D a l e B , S t u a r t B : I n t e g r a t e d p r o d u c t i o n o f e t h a n o l f u e l a n d p r o t e i n f r o m c o a s t a l B e r m u d a g r a s s . A p p l B i o c h e m B i o t e c h 1 9 9 4 , 4 5 — 4 6 2 4 8 3 - 4 9 7 . 3 9 . G u s a k o v A , S i n i t s y n A : A t h e o r e t i c a l a n a l y s i s o f c e l l u l a s e p r o d u c t i n h i b i t i o n : e f f e c t o f c e l l u l a s e b i n d i n g c o n s t a n t , e n z y m e / s u b s t r a t e r a t i o , a n d b e t a - g l u c o s i d a s e a c t i v i t y o n t h e i n h i b i t i o n p a t t e r n . B i o t e c h B i o e n g 1 9 9 2 , 4 0 : 6 6 3 - 6 7 1 . 4 0 2 4 0 . S e l i g M , V i a m a j a l a S , D e c k e r S , T u c k e r M , H i m m e l M , V i n z a n t T : D e p o s i t i o n o f L i g n i n D r o p l e t s P r o d u c e d D u r i n g D i l u t e A c i d P r e t r e a t m e n t o f M a i z e S t e m s R e t a r d s E n z y m a t i c H y d r o l y s i s o f C e l l u l o s e . B i o t e c h n o l P r o g 2 0 0 7 , 2 3 : 1 3 3 3 - 1 3 3 9 . 4 1 . G o l l a p a l l i L , D a l e B , R i v e r s D : P r e d i c t i n g d i g e s t i b i l i t y o f a m m o n i a fi b e r e x p l o s i o n ( A F E X ) t r e a t e d r i c e s t r a w . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 2 0 0 2 , 9 8 - 1 0 0 2 2 3 - 3 5 . 4 2 . F e r r e r A , B y e r s F , S u l b a r é n - d e - F e r r e r B , D a l e B , A i e l l o C : O p t i m i z i n g a m m o n i a p r e s s u r i z a t i o n / d e p r e s s u r i z a t i o n p r o c e s s i n g c o n d i t i o n s t o e n h a n c e e n z y m a t i c s u s c e p t i b i l i t y o f d w a r f e l e p h a n t g r a s s . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 2 0 0 0 , 8 4 - 8 6 : 1 6 3 - 1 7 9 . 4 3 . F e r r e r A , B y e r s F , S u l b a r a n - d e - F e r r e r B , D a l e B , A i e l l o C : O p t i m i z i n g A m m o n i a P r o c e s s i n g C o n d i t i o n s t o E n h a n c e S u s c e p t i b i l i t y o f L e g u m e s t o F i b e r H y d r o l y s i s . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 2 0 0 2 , 9 8 : 1 2 3 - 1 3 4 . 4 4 . T u r n e r N , M c D o n o u g h C , B y e r s F , H o l t z a p p l e M , D a l e B , J u n J , G r e e n e L : D i s r u p t i o n o f f o r a g e s t r u c t u r e w i t h a n a m m o n i a f i b e r e x p l o s i o n p r o c e s s . I n P r o c e e d i n g s f o r A m e r i c a n S o c i e t y o f A n i m a l S c i e n c e s ( W e s t e r n S e c t i o n ) : A m e r i c a n S o c i e t y o f A n i m a l S c i e n c e s : 1 9 9 0 . 4 5 . S u l b a r a n d e F e r r e r B , F e r r e r A , B y e r s F , D a l e B , A r i s t i g u i e t a M : A r c h L a t i n o a m P r o d A n i m 1 9 9 7 , 5 : 1 1 2 - 1 1 4 4 6 . W o o d w a r d J , H a y e s M , L e e N : H y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e b y s a t u r a t i n g a n d n o n - s a t n r a t i n g c o n c e n t r a t i o n s o f c e l l u l a s e : i m p l i c a t i o n s f o r s y n e r g i s m . B i o / T e c h n o l o g y 1 9 8 8 , 6 : 3 0 1 - 3 0 4 . 4 7 . W o o d w a r d J , L i m a M , L e e N : T h e r o l e o f c e l l u l a s e c o n c e n t r a t i o n i n d e t e r m i n i n g t h e d e g r e e o f s y n e r g i s m i n t h e h y d r o l y s i s o f m i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e . B i o c h e m J 1 9 8 8 , 2 5 5 : 8 9 5 - 8 9 9 . 4 8 . B e r l i n A , M a x i m e n k o V , G i l k e s N , S a d d l e r J : O p t i m i z a t i o n o f E n z y m e C o m p l e x e s f o r L i g n o c e l l u l o s e H y d r o l y s i s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 7 , 9 7 : 2 8 7 - 2 9 6 . 4 9 . K a r l s s o n J , M e d v e J , T j e m e l d F : H y d r o l y s i s o f s t e a m p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s e : S y n e r g i s m a n d a d s o r p t i o n f o r C B H I a n d E C 1 1 o f T r i c h o d e r m a r e e s e i . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 1 9 9 9 , 8 2 : 2 4 3 — 2 5 8 . 5 0 . M e d v e J , L e e D , T j e m e l d F : I o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h i c p u r i f i c a t i o n a n d q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f T r i c h o d e r m a r e e s e i c e l l u l a s e s c e l l o b i o h y d r o l a s e I , I I a n d e n d o g l u c a n a s e I I b y f a s t p r o t e i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . J C h r o m a t A 1 9 9 8 , 8 0 8 : 1 5 3 — 1 6 5 . 5 1 . P a u l y M , K e e g s t r a K : C e l l W a l l C a r b o h y d r a t e s a n d t h e i r M o d i f i c a t i o n s a s a R e s o u r c e f o r B i o f u e l s . T h e P l a n t J o u r n a l 2 0 0 8 , 5 4 : 5 5 9 - 5 6 8 . 5 2 . G o r i n g D , T i m m e l T : T a p p i 1 9 6 2 , 4 5 : 4 5 4 . 4 0 3 5 3 . W y m a n C E , D a l e B E , E l a n d e r R T , H o l t z a p p l e M , L a d i s c h M R , L e e Y Y , M i t c h i n s o n C , S a d d l e r J N : C o m p a r a t i v e s u g a r r e c o v e r y a n d f e r m e n t a t i o n d a t a f o l l o w i n g p r e t r e a t m e n t o f p o p l a r w o o d b y l e a d i n g t e c h n o l o g i e s . B i o t e c h n o l o g y P r o g r e s s 2 0 0 9 , 2 5 : 3 3 3 - 3 3 9 . 5 4 . W y m a n C E , D a l e B E , E l a n d e r R T , H o l t z a p p l e M T , L a d i s c h M R , L e e Y Y : C o m p a r a t i v e s u g a r r e c o v e r y d a t a f r o m l a b o r a t o r y s c a l e a p p l i c a t i o n o f l e a d i n g p r e t r e a t m e n t t e c h n o l o g i e s t o c o r n s t o v e r . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g ) 2 0 0 5 , 9 6 : 2 0 2 6 - 2 0 3 2 . 5 5 . D i n g S , H i m m e l M : T h e m a i z e p r i m a r y c e l l w a l l m i c r o fi b r i l : a n e w m o d e l d e r i v e d f r o m d i r e c t v i s u a l i z a t i o n . J A g r i c F o o d C h e m 2 0 0 6 , 5 4 : 5 9 7 - 6 0 6 . 5 6 . F e n g e l D , W e g e n e r G : W o o d : c h e m i s t r y , u l t r a s t r u c t u r e a n d r e a c t i o n s . B e r l i n : W a l t e r d e G r u y t e r ; 1 9 8 9 . 5 7 . O ’ S u l l i v a n A : C e l l u l o s e : t h e s t r u c t u r e s l o w l y u n r a v e l s . C e l l u l o s e 1 9 9 7 , 4 : 1 7 3 — 2 0 7 . 5 8 . E b r i n g e r o v a A : S t r u c t u r a l D i v e r s i t y a n d A p p l i c a t i o n P o t e n t i a l o f H e m i c e l l u l a s e s . M a c r o m o l e c u l a r S y m p o s i a 2 0 0 6 , 2 3 2 2 1 - 1 2 . 5 9 . E b r i n g e r o v a A , H e i n z e T : X y l a n a n d x y l a n d e r i v a t i v e s - b i o p o l y m e r s w i t h v a l u a b l e p r o p e r t i e s : N a t u r a l l y o c c u r r i n g x y l a n s s t r u c t u r e s , i s o l a t i o n p r o c e d u r e s a n d p r o p e r t i e s . M a c r o m o l R a p i d C o m m u n 2 0 0 0 , 2 1 : 5 4 2 — 5 5 6 . 6 0 . B u r a n o v A , M a z z a G : L i g n i n i n s t r a w o f h e r b a c e o u s c r o p s . I n d C r o p s P r o d 2 0 0 8 , 2 8 : 2 3 7 - 2 5 9 . 6 1 . P a l o n e n H : R o l e o f l i g n i n i n t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s e [ D i s s e r t a t i o n ] . E s p o o : H e l s i n k i U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y : 2 0 0 4 . 6 2 . M c C a n n M , C a r p i t a N : D e s i g n i n g t h e d e c o n s t r u c t i o n o f p l a n t c e l l w a l l s . C u r r O p i n P l a n t B i o l 2 0 0 8 , 1 1 : 3 1 4 - 3 2 0 . 6 3 . C a r p i t a N , G i b e a u t D : S t r u c t u r a l m o d e l s o f p r i m a r y - c e l l w a l l s i n fl o w e r i n g p l a n t s — C o n s i s t e n c y o f m o l e c u l a r - s t r u c t u r e w i t h t h e p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e w a l l s d u r i n g g r o w t h . P l a n t J 1 9 9 3 , 3 : 1 - 3 0 . 6 4 . R u e l K , C h e v a l i e r - b i l l o s t a V , G u i l l e m i n F , S i e r r a J B , J o s e l e a u J - P : T h e W o o d C e l l W a l l a t t h e U l t r a s t r u c t u r a l S c a l e - F o r m a t i o n a n d T o p o c h e m i c a l O r g a n i z a t i o n . M a d e r a s : C i e n c i a y T e c h n o l o g i a 2 0 0 6 , 8 : 1 0 7 - 1 1 6 . 6 5 . B i d l a c k J , M a l o n e M , B e n s o n R : M o l e c u l a r S t r u c t u r e a n d C o m p o n e n t I n t e g r a t i o n o f S e c o n d a r y C e l l W a l l s i n P l a n t s . P r o c e e d i n g s o f t h e O k l a h o m a A c a d e m y o f S c i e n c e 1 9 9 2 , 7 2 : 5 1 - 5 6 . 4 0 4 6 6 . V i a m a j a l a S , S e l i g M , V i n z a n t T , T u c k e r M , H i m m e l M , M c M i l l a n J , D e c k e r S : C a t a l y s t T r a n s p o r t i n C o r n S t o v e r I n t e r n o d e s E l u c i d a t i n g T r a n s p o r t M e c h a n i s m s U s i n g D i r e c t B l u e - I . A p p l B i o c h e m B i o t e c h 2 0 0 6 , 1 3 0 2 5 0 9 — 5 2 7 . 6 7 . Y e Z , Y o r k W , D a r v i l l A : I m p o r t a n t n e w p l a y e r s i n s e c o n d a r y w a l l s y n t h e s i s . T r e n d s P l a n t S c i 2 0 0 6 , 1 1 : 1 6 2 - 1 6 4 . 6 8 . C a r p i t a N , M c C a n n M : T h e c e l l w a l l . E d i t e d b y B u c h a n a n B , G r u i s s e m W , J o n e s R . R o c k v i l l e , M D : A m e r i c a n S o c i e t y o f P l a n t P h y s i o l o g i s t s ; 2 0 0 0 . 6 9 . E s a u K : C e l l W a l l . N e w Y o r k : J o h n W i l e y & S o n s ; 1 9 7 7 . 7 0 . H a t fi e l d R : S t r u c t u r a l P o l y s a c c h a r i d e s i n F o r a g e s a n d T h e i r D i g e s t i b i l i t y . A g r o n J 1 9 8 9 , 1 8 : 3 9 - 4 6 . 7 1 . B u c h a n a n B , G r u i s s e m W , J o n e s R : B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y o f P l a n t s e d n 3 r d : C o u r i e r C o m p a n i e s I n c ; 2 0 0 1 . 7 2 . S a l i s b u r y F , R o s s C : P l a n t P h y s i o l o g y a n d P l a n t C e l l s . B e l m o n t , C A : W a d s w o r t h I n c ; 1 9 9 2 . 7 3 . G o o d w i n T , M e r c e r E : T h e P l a n t C e l l W a l l . N e w Y o r k : P e r g a r n o n P r e s s ; 1 9 8 3 . 7 4 . M c N e i l M , A l b e r s h e i m P , T a i z L , J o n e s R : P l a n t p h y s i o ] 1 9 7 5 , 5 5 : 6 4 . 7 5 . A t a l l a R , H a c k n e y J , U h l i n 1 , T h o m p s o n N : H e m i c e l l u l o s e s a s s t r u c t u r a l r e g u l a t o r s i n t h e a g g r e g a t i o n o f n a t i v e c e l l u l o s e . I n t ] J B i o l M a c r o m o l 1 9 9 3 , 1 5 : 1 0 9 - 1 1 2 . 7 6 . K o s h i j i r n a T , W a t a n a b e T , Y a k u F : S t r u c t u r e a n d p r o p e r t i e s o f t h e l i g n i n c a r b o h y d r a t e c o m p l e x p o l y m e r a s a n a m p h i p a t h i c s u b s t a n c e , v o l A C S S y m p o s i u m S e r i e s 3 9 7 : A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y ; 1 9 8 9 . 7 7 . V a n S o e s t P J : L i g n i n . I n N u t r i t i o n a l E c o l o g y o f t h e R u m i n a n t . E d i t e d b y : C o m s t o c k P u b l i s h i n g ; 1 9 9 4 : 1 7 7 - 1 9 4 . 7 8 . L a m T , I i y a m a K , S t o n e B : P r i m a r y a n d s e c o n d a r y w a l l s o f g r a s s e s a n d o t h e r f o r a g e p l a n t s , t a x o n o m i c a n d s t r u c t u r a l c o n s i d e r a t i o n s . E d i t e d b y A k i n D E , L j u n g d a h l L G , W i l s o n J R , H a r r i s P ] . N e w Y o r k : E l s e r v i e r ; 1 9 9 0 . 7 9 . H a t fi e l d R D , R a l p h J , G r a b b e r J H : C e l l w a l l c r o s s - l i n k i n g b y f e r u l a t e s a n d d i f e r u l a t e s i n g r a s s e s . J o u r n a l o f t h e S c i e n c e o f F o o d a n d A g r i c u l t u r e 1 9 9 9 , 7 9 : 4 0 3 - 4 0 7 . 8 0 . H a t fi e l d R , W i l s o n J , M e r t e n s D : C o m p o s i t i o n o f c e l l w a l l s i s o l a t e d f r o m c e l l t y p e s o f g r a i n s o r g h u m s t e m s . J S c i F o o d A g r i c 1 9 9 9 , 7 9 : 8 9 1 — 8 9 9 . 8 1 . M o r r i s o n T , J u n g H , B u x t o n D , H a t fi e l d R : C e l l - w a l l c o m p o s i t i o n o f m a i z e i n t e r n o d e s o f v a r y i n g m a t u r i t y . C r o p S c i 1 9 9 8 , 3 8 : 4 5 5 — 4 6 0 . 4 0 5 8 2 . R a l p h J , H a t fi e l d R , Q u i d e a u S , H e l m R , G r a b b e r J , J u n g H : P a t h w a y o f p - c o u m a r i c a c i d i n c o r p o r a t i o n i n t o m a i z e l i g n i n a s r e v e a l e d b y N M R . J A m C h e m S o c 1 9 9 4 , 1 1 6 : 9 4 4 8 — 9 4 5 6 . 8 3 . J u n g H : M a i z e s t e m t i s s u e s : F e r u l a t e d e p o s i t i o n i n d e v e l o p i n g i n t e r n o d e c e l l w a l l s . P h y t o c h e m i s t r y 2 0 0 3 , 6 3 : 5 4 3 — 5 4 9 . 8 4 . M a c A d a m J , G r a b b e r J : R e l a t i o n s h i p o f g r o w t h c e s s a t i o n w i t h t h e f o r m a t i o n o f d i f e r u l a t e c r o s s - l i n k s a n d p - c o u m a r o y l a t e d l i g n i n s i n t a l l f e s c u e . P l a n t a 2 0 0 2 , 2 1 5 : 7 8 5 — 7 9 3 . 8 5 . M i g n e C , P r e n s i e r G , U t i l l e J , A n g i b e a u d P , C o r n u A , G r e n e t E : I m m u n o c y t o c h e m i c a l l o c a l i s a t i o n o f p - c o u m a r i c a c i d a n d f e r u l o y l - a r a b i n o s e i n t h e c e l l w a l l s o f m a i z e s t e m . J S c i F o o d A g r i c 1 9 9 8 , 7 8 : 3 7 3 - 3 8 1 . 8 6 . M y t o n K , F r y S : I n t r a p r o t o p l a s m i c f e r u l o y l a t i o n o f a r a b i n o x y l a n s i n F e s t u c a a r u n d i n a c e a c e l l c u l t u r e s . P l a n t a 1 9 9 4 , 1 9 3 : 3 2 6 — 3 3 0 . 8 7 . F r y S : C r o s s - l i n k i n g o f m a t r i x p o l y m e r s i n t h e g r o w i n g c e l l w a l l s o f a n g i o s p e r m s . A n n u R e v P l a n t P h y s i o l 1 9 8 6 , 3 7 : 1 6 5 - 1 8 6 . 8 8 . G r a b b e r J , R a l p h J , L a p i e r r e C , B a r r i é r e Y : G e n e t i c a n d m o l e c u l a r b a s i s o f g r a s s c e l l w a l l d e g r a d a b i l i t y . ( I ) L i g n i n - c e l l w a l l m a t r i x i n t e r a c t i o n s . C o m p t e s R e n d u s B i o l 2 0 0 4 , 3 2 7 : 4 5 5 — 4 6 5 . 8 9 . K o s h i j i m a T , W a t a n a b e T : P r e p a r a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f L i g n i n - C a r b o h y d r a t e C o m p l e x e s . I n A s s o c i a t i o n b e t w e e n L i g n i n a n d C a r b o h y d r a t e s i n W o o d a n d O t h e r P l a n t T i s s u e s . E d i t e d b y ; 2 0 0 3 : 1 - 5 . S p r i n g e r S e r i e s i n W o o d S c i e n c e 9 0 . S e w a l t V , D e O l i v e r a W , G l a s s e r W , F o n t e n o t J : L i g n i n i m p a c t o n f i b e r d e g r a d a t i o n . ( 2 ) A m o d e l s t u d y u s i n g c e l l u l o s e h y d r o g e l s . J S c i F o o d A g r i c 1 9 9 6 , 7 1 : 2 0 4 - 2 0 8 . 9 1 . S e w a l t V , F o n t e n o t J , A l l e n V , G l a s s e r W : F i b e r c o m p o s i t i o n a n d i n V i t r o d i g e s t i b i l i t y o f c o r n s t o v e r f r a c t i o n s i n r e s p o n s e t o a m m o n i a t r e a t m e n t . J A g r i c F o o d C h e m 1 9 9 6 , 4 4 : 3 1 3 6 - 3 1 4 2 . 9 2 . S e w a l t V , G l a s s e r W , B e a u c h e m i n K : L i g n i n i m p a c t o n fi b e r d e g r a d a t i o n . 3 . R e v e r s a l o f i n h i b i t i o n o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s b y c h e m i c a l m o d i f i c a t i o n o f l i g n i n a n d a d d i t i v e s . J A g r i c F o o d C h e m 1 9 9 7 , 4 5 : 1 8 2 3 — 1 8 2 8 . 9 3 . G r a b b e r J , H a t fi e l d R , R a l p h J : A p o p l a s t i c p H a n d m o n o l i g n o l a d d i t i o n r a t e e f f e c t s o n l i g n i n f o r m a t i o n a n d c e l l w a l l d e g r a d a b i l i t y i n m a i z e . J A g r i c F o o d C h e m 2 0 0 3 , 5 1 : 4 9 8 4 — 4 9 8 9 . 9 4 . S a u l n i e r L , T h i b a u l t J : F e r u l i c a c i d a n d d i f e r u l i c a c i d s a s c o m p o n e n t s o f s u g a r - b e e t p e c t i n s a n d m a i z e b r a n h e t e r o x y l a n s . J S c i F o o d A g r i c 1 9 9 9 , 7 9 : 3 9 6 — 4 0 2 . 4 0 6 9 5 . M o s i e r N , W y m a n C , D a l e B , E l a n d e r R , L e e Y Y , H o l t z a p p l e M , L a d i s c h M : F e a t u r e s o f p r o m i s i n g t e c h n o l o g i e s f o r p r e t r e a t m e n t o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 9 6 : 6 7 3 - 6 8 6 . 9 6 . W e i ] J , W e s t g a t e P , K o h l m a n n K , L a d i s c h M : C e l l u l o s e p r e t r e a t r n e n t s o f l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s . E n z y m e M i c r o b T e c h n o l 1 9 9 4 , 1 6 : 1 0 0 2 — 1 0 0 4 . 9 7 . G o l d s t e i n 1 , E a s t e r J : A n i m p r o v e d p r o c e s s f o r c o n v e r t i n g c e l l u l o s e t o e t h a n o l . T a p p i 1 9 9 2 , 7 5 : 1 3 5 — 1 4 0 . 9 8 . S a h a B , B o t h a s t R : P r e t r e a t m e n t a n d e n z y m a t i c s a c c h a r i f i c a t i o n o f c o r n fi b e r . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 1 9 9 9 , 7 6 : 6 5 — 7 7 . 9 9 . K o u l l a s D , C h r i s t a k o p o u l o s P , K e k o s D , K o u k i o s E , M a c r i s B : E f f e c t o f a l k a l i d e l i g n i f i c a t i o n o n w h e a t s t r a w s a c c h a r i f i c a t i o n b y F u s a r i u m o x y s p o r u m c e l l u l a s e s . B i o m a s s B i o e n e r g y 1 9 9 3 , 4 : 9 — 1 3 . 1 0 0 . C l a r k D , M a c k i e K : S t e a m e x p l o s i o n o f t h e s o f t w o o d P i n u s r a d i a t a w i t h s u l p h u r d i o x i d e a d d i t i o n : ( 1 ) P r o c e s s o p t i m i z a t i o n . J W o o d C h e m T e c h n o l 1 9 8 7 , 7 : 3 7 3 - 4 0 3 . 1 0 1 . G o u l d J : A l k a l i n e p e r o x i d e d e l i g n i f i c a t i o n o f a g r i c u l t u r a l r e s i d u e s t o e n h a n c e e n z y m a t i c s a c c h a r i fi c a t i o n . B i o t e c h B i o e n g 1 9 8 4 , 2 6 : 4 6 — 5 2 . 1 0 2 . F e m a n d e z - B o l a f i o s J , F e l i z é n B , H e r e d i a A , R o d r i g u e z R , G u i l l e ' n R , J i m e n e z A : S t e a m - e x p l o s i o n o f o l i v e s t o n e s : h e m i c e l l u l o s e s o l u b i l i z a t i o n a n d e n h a n c e m e n t o f e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 1 , 7 9 : 5 3 - 6 1 . 1 0 3 . D a l e B , L e o n g C , P h a m T , E s q u i v e l V , R i o s I , L a t i m e r V : H y d r o l y s i s a t l o w e n z y m e l e v e l s : a p p l i c a t i o n o f t h e A F E X p r o c e s s . B i o r e s o u r T e c h n o l 1 9 9 6 , 5 6 : 1 1 1 — 1 1 6 . 1 0 4 . S c h m i d t A , T h o m s e n A : O p t i m i z a t i o n o f w e t o x i d a t i o n p r e t r e a t m e n t o f w h e a t s t r a w . B i o r e s o u r T e c h n o l 1 9 9 8 , 6 4 : 1 3 9 — 1 5 1 . 1 0 5 . K a a r W , H o l t z a p l e M : U s i n g l i m e p r e t r e a t m e n t t o f a c i l i t a t e t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f c o r n s t o v e r . B i o m a s s B i o e n e r g y 2 0 0 0 , 1 8 : 1 8 9 — 1 9 9 . 1 0 6 . L a s e r M , S c h u l m a n D , A l l e n S G , L i c h w a J , A n t a l M J , L y n d L R : A c o m p a r i s o n o f l i q u i d h o t w a t e r a n d s t e a m p r e t r e a t r n e n t s o f s u g a r c a n e b a g a s s e f o r b i o c o n v e r s i o n t o e t h a n o l . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 2 , 8 1 : 3 3 - 4 4 . 1 0 7 . C h u m H , J o h n s o n D , B l a c k S , B a k e r I , G r o h r n a n n K , S a r k a n e n K , W a l l a c e K , S c h r o e d e r H : O r g a n o s o l v p r e t r e a t m e n t f o r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f p o p l a r s : ( l ) e n z y m e h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s i c r e s i d u e s . B i o t e c h n o l B i o e n g 1 9 8 8 , 3 1 : 6 4 3 - 6 4 9 . 1 0 8 . L i u C , W y m a n C : P a r t i a l f l o w o f c o m p r e s s e d - h o t w a t e r t h r o u g h c o r n s t o v e r t o e n h a n c e h e m i c e l l u l o s e s u g a r r e c o v e r y a n d e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f c e l l u l o s e . B i o r e s o u r T e c h n o l 2 0 0 5 , 9 6 : 1 9 7 8 - 1 9 8 5 . 4 0 7 1 0 9 . C h a n d r a R , B u r a R , M a b e e W , B e r l i n A , P a n X , S a d d l e r J : S u b s t r a t e P r e t r e a t m e n t : T h e K e y t o E f f e c t i v e E n z y m a t i c H y d r o l y s i s o f L i g n o c e l l u l o s i c s ? A d v B i o c h e m E n g B i o t e c h n o l 2 0 0 7 , 1 0 8 : 6 7 - 9 3 . 1 1 0 . W u Z , L e e Y : A m m o n i a r e c y c l e d p e r c o l a t i o n a s a c o m p l e m e n t a r y p r e t r e a t m e n t t o t h e d i l u t e - a c i d p r o c e s s . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 1 9 9 7 , 6 3 - 6 5 : 2 1 - 3 4 . 1 1 1 . K r i s t e n s e n J , T h y g e s e n L , F e l b y C , J o r g e n s e n H , E l d e r T : C e l l - w a l l s t r u c t u r a l c h a n g e s i n w h e a t s t r a w p r e t r e a t e d f o r b i o e t h a n o l p r o d u c t i o n . B i o t e c h n o l o g y f o r B i o fi l e l s 2 0 0 8 , 1 : 5 . 1 1 2 . D o n o h o e B , D e c k e r S , T u c k e r M , H i m m e l M , V i n z a n t T : V i s u a l i z i n g l i g n i n c o a l e s c e n c e a n d m i g r a t i o n t h r o u g h m a i z e c e l l w a l l s f o l l o w i n g t h e r m o c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t . B i o t e c h n o l B i o e n g 2 0 0 8 , 1 0 1 : 9 1 3 - 9 2 5 . 1 1 3 . O h g r e n K , B u r a R , S a d d l e r J , Z a c c h i G : E f f e c t o f h e m i c e l l u l o s e a n d l i g n i n r e m o v a l o n e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f s t e a m p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 7 , 9 8 : 2 5 0 3 - 2 5 1 0 . 1 1 4 . M i l l e t t M A , B a k e r A J , S a t t e r L D : P r e t r e a t m e n t s t o E n h a n c e C h e m i c a l , E n z y m a t i c , a n d M i c r o b i o l o g i c a l A t t a c k o f C e l l u l o s i c M a t e r i a l s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g l 9 7 5 : 1 9 3 - 2 1 9 . 1 1 5 . S i d i r a s D , K o u k i o s E : A c i d s a c c h a r i fi c a t i o n o f b a l l m i l l e d s t r a w . B i o m a s s 1 9 8 9 , 1 9 : 2 8 9 - 3 0 6 . 1 1 6 . T a s s i n a r i T , M a c y C , S p a n o L : E n e r g y r e q u i r e m e n t s a n d p r o c e s s d e s i g n c o n s i d e r a t i o n s i n c o m p r e s s i o n - m i l l i n g p r e t r e a t m e n t o f c e l l u l o s i c w a s t e s f o r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . B i o t e c h B i o e n g 1 9 8 0 , 2 2 : 1 6 8 9 - 1 7 0 5 . 1 1 7 . A l v o P , B e l k a c e m i K : E n z y m a t i c s a c c h a r i fi c a t i o n o f m i l l e d t i m o t h y ( P h l e u m p r a t e n s e I . ) a n d a l f a l f a ( M e d i c a g o s a t i v a L . ) . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 1 9 9 7 , 6 1 : 1 8 5 - 1 9 8 . 1 1 8 . F a n L T , L e e Y H , B e a r d m o r e D R : T h e I n fl u e n c e o f M a j o r S t r u c t u r a l F e a t u r e s o f C e l l u l o s e o n R a t e o f E n z y m a t i c H y d r o l y s i s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 1 9 8 1 , 2 3 : 4 1 9 - 4 2 4 . 1 1 9 . M c M i l l a n J D : P r e t r e a t m e n t o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s . I n A C S S y m p . S e r . 5 6 6 E d i t e d b y H i m m e l M E , B a k e r J O , O v e r e n d R P : 1 9 9 4 : 2 9 2 - 3 2 4 . 1 2 0 . H e i n z e T , K o s c h e l l a A : S o l v e n t s a p p l i e d i n t h e fi e l d o f c e l l u l o s e c h e m i s t r y : a m i n i r e v i e w . P o l i m e r o s 2 0 0 5 , 1 5 : 8 4 - 9 0 . 1 2 1 . S i d i r a s D , K o u k i o s E : S i m u l a t i o n o f a c i d - c a t a l y s e d o r g a n o s o l v f r a c t i o n a t i o n o f w h e a t s t r a w . B i o r e s o u r T e c h n o l 2 0 0 4 , 9 4 : 9 1 - 9 8 . 4 0 8 1 2 2 . P a n X , G i l k e s N , K a d l a J , P y e K , S a k a S , G r e g g D , E h a r a K , X i e D , L a m D , S a d d l e r J : B i o c o n v e r s i o n o f H y b r i d P o p l a r t o E t h a n o l a n d C o - p r o d u c t s U s i n g a n O r g a n o s o l v F r a c t i o n a t i o n P r o c e s s : O p t i m i z a t i o n o f P r o c e s s Y i e l d s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 6 , 9 4 : 8 5 1 - 8 6 1 . 1 2 3 . S u n F , C h e n H : O r g a n o s o l v p r e t r e a t m e n t b y c r u d e g l y c e r o l f r o m o l e o c h e m i c a l s i n d u s t r y f o r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f w h e a t s t r a w . B i o r e s o u r T e c h n o l 2 0 0 8 , 9 9 : 5 4 7 4 - 5 4 7 9 . 1 2 4 . Z h a o X , C h e n g K , L i u D : O r g a n o s o l v p r e t r e a t m e n t o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s f o r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . A p p l M i c r o b i o l B i o t e c h n o l 2 0 0 9 , 8 2 : 8 1 5 - 8 2 7 . 1 2 5 . L e e Y H , R o b i n s o n C W , M o o - Y o u n g M : E v a l u a t i o n o f O r g a n o s o l v p r o c e s s f o r t h e f r a c t i o n a n d m o d i f i c a t i o n o f c o r n s t o v e r f o r b i o c o n v e r s i o n . B i o t e c h n o l B i o e n g 1 9 8 7 , 2 9 : 5 7 2 - 5 8 1 . 1 2 6 . A r a t o C , P y e E , G j e n n e s t a d G : T h e l i g n o l a p p r o a c h t o b i o r e fi n i n g o f w o o d y b i o m a s s t o p r o d u c e e t h a n o l a n d c h e m i c a l s . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 1 2 3 : 8 7 1 - 8 8 2 . 1 2 7 . Z h a n g Y - H P , D i n g S - Y , M i e l e n z J R , C u i J - B , E l a n d e r R T , L a s e r M , H i m m e l M E , M c M i l l a n J R , L y n d L R : F r a c t i o n a t i n g r e c a l c i t r a n t l i g n o c e l l u l o s e a t m o d e s t r e a c t i o n c o n d i t i o n s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 7 , 9 7 : 2 1 4 - 2 2 3 . 1 2 8 . Z h a n g Y H P , C u i J , L y n d L R , K u a n g L R : A T r a n s i t i o n f r o m C e l l u l o s e S w e l l i n g t o C e l l u l o s e D i s s o l u t i o n b y o - P h o s p h o r i c A c i d : E v i d e n c e f r o m E n z y m a t i c H y d r o l y s i s a n d S u p r a m o l e c u l a r S t r u c t u r e . B i o m a c r o m o l e c u l e s 2 0 0 6 , 7 : 6 4 4 - 6 4 8 . 1 2 9 . M o x l e y G , Z h u Z , Z h a n g Y H P : E f f i c i e n t S u g a r R e l e a s e b y t h e C e l l u l o s e S o l v e n t - B a s e d L i g n o c e l l u l o s e F r a c t i o n a t i o n T e c h n o l o g y a n d E n z y m a t i c C e l l u l o s e H y d r o l y s i s . J o u r n a l o f A g r i c u l t u r a l a n d F o o d C h e m i s t r y 2 0 0 8 , 5 6 : 7 8 8 5 - 7 8 9 0 . 1 3 0 . G r a e n a c h e r C : C e l l u l o s e S o l u t i o n ( U . S . P a t e n t N o . 1 , 9 4 3 , 1 7 6 ) . U S P a t e n t 1 9 3 4 . 1 3 1 . S w a t l o s k i R P , S p e a r S K , H o l b r e y J D , R o g e r s R D : D i s s o l u t i o n o f c e l l u l o s e w i t h i o n i c l i q u i d s . J o u r n a l o f t h e A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y 2 0 0 2 , 1 2 4 : 4 9 7 4 - 4 9 7 5 . 1 3 2 . S i n g h S , S i m m o n s B A , V o g e l K P : V i s u a l i z a t i o n o f b i o m a s s s o l u b i l i z a t i o n a n d c e l l u l o s e r e g e n e r a t i o n d u r i n g i o n i c l i q u i d p r e t r e a t m e n t o f s w i t c h g r a s s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 9 , 1 0 4 : 6 8 - 7 5 . 1 3 3 . Z h a o H , J o n e s C L , B a k e r G A , X i a S , O l u b a j o 0 , P e r s o n V N : R e g e n e r a t i n g c e l l u l o s e f r o m i o n i c l i q u i d s f o r a n a c c e l e r a t e d e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . J o u m a ] o f B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 9 , 1 3 9 : 4 7 - 5 4 . 1 3 4 . T u r n e r M B , S p e a r S K , H u d d l e s t o n J G , H o l b r e y J D , R o g e r s R D : I o n i c l i q u i d s a l t - i n d u c e d i n a c t i v a t i o n a n d u n f o l d i n g o f c e l l u l a s e f r o m T r i c h o d e r m a r e e s e i . G r e e n C h e m i s t r y 2 0 0 3 , 5 2 4 4 3 - 4 4 7 . 4 0 9 1 3 5 . W e i l J R , S a r i k a y a A , R a u S - L , G o e t z J , L a d i s c h C M , B r e w e r M , H e n d r i c k s o n R , L a d i s c h M R : P r e t r e a t m e n t o f c o r n fi b e r b y p r e s s u r e c o o k i n g i n w a t e r . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 1 9 9 8 , 7 3 : 1 - 1 7 . 1 3 6 . C h u m H L , J o h n s o n D K , B l a c k S K , O v e r e n d R P : P r e t r e a t m e n t - c a t a l y s t e f f e c t s a n d t h e c o m b i n e d s e v e r i t y p a r a m e t e r . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 1 9 9 0 , 2 4 / 2 5 2 1 - 1 4 . 1 3 7 . K l i n k e H B , T h o n r s e n A B , A h r i n g B K : I n h i b i t i o n o f e t h a n o l - p r o d u c i n g y e a s t a n d b a c t e r i a b y d e g r a d a t i o n p r o d u c t s p r o d u c e d d u r i n g p r e - t r e a t m e n t o f b i o m a s s . A p p l i e d M i c r o b i o l o g y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 4 , 6 6 : 1 0 - 2 6 . 1 3 8 . R u t t a n R F : E t h y l a l c o h o l f r o m s a w d u s t a n d o t h e r w o o d w a s t e . S o c i e t y o f C h e m i c a l I n d u s t r i e s 1 9 0 9 , 2 8 : 1 2 9 0 - 1 2 9 4 . 1 3 9 . Z e i t s c h K ] : T h e c h e m i s t r y a n d t e c h n o l o g y o f f u r fi r r a l a n d i t s m a n y b y - p r o d u c t s , v o l 1 3 . N e w Y o r k : E l s e v i e r ; 2 0 0 0 . 1 4 0 . H a r r i s E B , B e g l i n e r E : H y d r o l y s i s o f w o o d . T r e a t m e n t w i t h s u l f u r i c a c i d i n a s t a t i o n a r y d i g e s t e r . I n d u s t r i a l E n g i n e e r i n g C h e m i s t r y 1 9 4 6 , 3 7 : 1 2 - 2 3 . 1 4 1 . K i m J S , L e e Y Y , T o r g e t R W : C e l l u l o s e h y d r o l y s i s u n d e r e x t r e m e l y l o w s u l f u r i c a c i d a n d h i g h - t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 1 , 9 1 - 9 3 2 3 3 1 - 3 4 0 . 1 4 2 . T o r g e t R , H i m m e l M , G r o h m a n n K : D i l u t e a c i d p r e t r e a t m e n t o f t w o s h o r t r o t a t i o n h e r b a c e o u s c r o p s . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 1 9 9 2 , 3 4 / 3 5 : 1 1 5 - 1 2 3 . 1 4 3 . L l o y d T A , W y m a n C E : C o m b i n e d s u g a r y i e l d s f o r d i l u t e s u l f u r i c a c i d p r e t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r f o l l o w e d b y e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f t h e r e m a i n i n g s o l i d s . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 9 6 : 1 9 6 7 - 1 9 7 7 . 1 4 4 . L e e Y Y , I y e r P , T o r g e t R W : D i l u t e a c i d h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s . A d v a n c e s i n B i o c h e m i c a l E n g i n e e r i n g a n d B i o t e c h n o l o g y 1 9 9 9 , 6 5 : 9 3 . 1 4 5 . B a l l e s t e r o s I , O l i v a J M , N a v a r r o A A , G o n z a l e z A , C a r r a s c o J , B a l l e s t e r o s M : E f f e c t o f c h i p s i z e o n s t e a m e x p l o s i o n p r e t r e a t m e n t o f s o f t w o o d . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g z 2 0 0 0 , 8 4 - 8 6 1 9 7 - 1 1 0 . 1 4 6 . B a l l e s t e r o s I , N e g r o M J , O l i v a J M , C a b a n a s A , M a n z a n a r e s P , B a l l e s t e r o s M : E t h a n o l p r o d u c t i o n f r o m s t e a m - e x p l o s i o n p r e t r e a t e d w h e a t s t r a w . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 6 , 1 3 0 : 4 9 6 - 5 0 8 . 1 4 7 . C h e n H , L i u L , Y a n g X , L i Z : N e w p r o c e s s o f m a i z e s t a l k a m i n a t i o n t r e a t m e n t b y s t e a m e x p l o s i o n . B i o m a s s & B i o e n e r g y 2 0 0 5 , 2 8 : 4 1 1 - 4 1 7 . 1 4 8 . P l a y n e M J : I n c r e a s e d d i g e s t i b i l i t y o f b a g a s s e s b y p r e t r e a t m e n t w i t h a l k a l i s a n d s t e a m e x p l o s i o n . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 1 9 8 4 , 2 6 : 4 2 6 - 4 3 3 . 4 1 0 1 4 9 . B r o w n e l l H H , S a d d l e r J N : S t e a m e x p l o s i o n p r e t r e a t m e n t f o r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . I n B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g S y m p o s i u m 1 4 . E d i t e d b y ; 1 9 8 4 : 5 5 - 6 8 . 1 5 0 . H s u T A : P r e t r e a t m e n t o f b i o m a s s . I n H a n d b o o k o n b i o e t h a n o l , p r o d u c t i o n a n d u t i l i z a t i o n . E d i t e d b y W y m a n C E : T a y l o r a n d F r a n c i s ; 1 9 9 6 . 1 5 1 . B o b l e t e r O , B i n d e r H , C o n c i n R , B u r t s c h e r E : T h e c o n v e r s i o n o f b i o m a s s t o f u e l r a w m a t e r i a l b y h y d r o t h e r m a l p r e t r e a t m e n t . I n E n e r g y f r o m b i o m a s s . E d i t e d b y P a l z W , C h a r t i e r P , H a l l D O : A p p l i e d s c i e n c e p u b l i s h e r s ; 1 9 8 1 1 5 5 4 - 5 6 2 . 1 5 2 . M o s i e r N S , H e n d r i c k s o n R , B r e w e r M , H o N , S e d l a k M , D r e s h e l R , W e l c h G , D i e n B S , A d e n A , L a d i s c h M R : I n d u s t r i a l s c a l e - u p o f p H — c o n t r o l l e d l i q u i d h o t w a t e r p r e t r e a t m e n t o f c o r n fi b e r f o r f u e l e t h a n o l p r o d u c t i o n . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 1 2 5 : 7 7 - 9 7 . 1 5 3 . M o s i e r N S , L a d i s c h C M , L a d i s c h M R : C h a r a c t e r i z a t i o n o f a c i d c a t a l y t i c d o m a i n s f o r c e l l u l o s e h y d r o l y s i s a n d g l u c o s e d e g r a d a t i o n . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 2 , 7 9 : 6 1 0 - 6 1 8 . 1 5 4 . K o o t s t r a A M , M o s i e r N S , S c o t t E L , B e e fi i n k H H : D i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f m i n e r a l a n d o r g a n i c a c i d s o n t h e k i n e t i c s o f a r a b i n o s e d e g r a d a t i o n u n d e r l i g n o c e l l u l o s e p r e t r e a t m e n t c o n d i t i o n s . B i o c h e m . E n g . J . 2 0 0 9 , 4 3 : 9 2 - 9 7 . 1 5 5 . L u Y , M o s i e r N S : B i o m i m e t i c C a t a l y s i s f o r H e m i c e l l u l o s e H y d r o l y s i s i n C o r n S t o v e r . B i o t e c h n o l o g y P r o g r e s s 2 0 0 7 , 2 3 : 1 1 6 - 1 2 3 . 1 5 6 . L u Y , M o s i e r N S : K i n e t i c m o d e l i n g a n a l y s i s o f m a l e i c a c i d - c a t a l y z e d h e m i c e l l u l o s e h y d r o l y s i s i n c o r n s t o v e r . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 8 , 1 0 1 : 1 1 7 0 - 1 1 8 1 . 1 5 7 . P e t e r V a n W a l s u m G , G a r c i a - G i l M , C h e n S - F , C h a m b l i s s K : E f f e c t o f d i s s o l v e d c a r b o n d i o x i d e o n a c c u m u l a t i o n o f o r g a n i c a c i d s i n l i q u i d h o t w a t e r p r e t r e a t e d b i o m a s s h y d r o l y z a t e s . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 7 , 1 3 7 - 1 4 0 : 3 0 1 - 3 1 1 . 1 5 8 . K i m T H , L e e Y Y : P r e t r e a t m e n t a n d f r a c t i o n a t i o n o f c o r n s t o v e r b y a m m o n i a r e c y c l e p e r c o l a t i o n p r o c e s s . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 9 6 : 2 0 0 7 - 2 0 1 3 . 1 5 9 . S e n d i c h E , L a s e r M , K i m S , A l i z a d e h H , L a u r e a n o - P e r e z L , D a l e B , L y n d L : R e c e n t p r o c e s s i m p r o v e m e n t s f o r t h e a m m o n i a f i b e r e x p a n s i o n ( A F E X ) p r o c e s s a n d r e s u l t i n g r e d u c t i o n s i n m i n i m u m e t h a n o l s e l l i n g p r i c e . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 8 , 9 9 : 8 4 2 9 - 8 4 3 5 . 1 6 0 . L a u r e a n o - P e r e z L , D a l e B , O ’ D w y e r J , H o l t z a p p l e M : S t a t i s t i c a l C o r r e l a t i o n o f S p e c t r o s c o p i c A n a l y s i s a n d E n z y m a t i c H y d r o l y s i s o f P o p l a r S a m p l e s . B i o t e c h n o l P r o g 2 0 0 6 , 2 2 : 8 3 5 - 8 4 1 . 1 6 1 . C h o u Y : S u p e r c r i t i c a l a m m o n i a p r e t r e a t m e n t o f l i g n o c e l l u l o s i c m a t e r i a l s . B i o t e c h n o l B i o e n g S y m p 1 9 8 6 , 1 7 : 1 9 - 3 2 . 4 1 1 1 6 2 . W e i m e r P , C h o u Y , W e s t o n W , C h a s e D : E f f e c t o f s u p e r c r i t i c a l a m m o n i a o n t h e p h y s i c a l a n d c h e m i c a l s t r u c t u r e o f g r o u n d w o o d . B i o t e c h n o l B i o e n g S y m p 1 9 8 6 , 1 7 : 5 - 1 8 . 1 6 3 . L e w i n M , R o l d a n L G : T h e E f f e c t o f L i q u i d A n h y d r o u s A m m o n i a i n t h e S t r u c t u r e a n d M o r p h o l o g y o f C o t t o n C e l l u l o s e . J o u r n a l o f P o l y m e r S c i e n c e P a r t C - P o l y m e r S y m p o s i u m 1 9 7 1 : 2 1 3 - 2 2 9 . 1 6 4 . K i m S B , L e e Y Y : F r a c t i o n a t i o n o f H e r b a c e o u s B i o m a s s b y A m m o n i a - H y d r o g e n P e r o x i d e P e r c o l a t i o n T r e a t m e n t . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 1 9 9 6 , 5 7 / 5 8 : 1 4 7 - 1 5 6 . 1 6 5 . K i m T H , K i m J S , S u n w o o C , L e e Y Y : P r e t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r b y a q u e o u s a m m o n i a . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 3 , 9 0 : 3 9 - 4 7 . 1 6 6 . K i m T H , L e e Y Y : P r e t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r b y s o a k i n g i n a q u e o u s a m m o n i a . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 1 2 4 : 1 1 1 9 - 1 1 3 1 . 1 6 7 . H e n n e s s e y S M , F r i e n d J , D u n s o n J B , T u c k e r M P , E l a n d e r R T , H a m e s B : I n t e g r a t i o n o f a l t e r n a t i v e f e e d s t r e a m s f o r b i o m a s s t r e a t m e n t a n d u t i l i z a t i o n . U S P a t e n t 2 0 0 7 , U S Z O O 7 0 0 3 7 2 5 9 A 1 . 1 6 8 . P u r i V P : O z o n e p r e t r e a t m e n t t o i n c r e a s e d i g e s t i b i l i t y o f l i g n o c e l l u l o s e . B i o t e c h n o l L e t t 1 9 8 3 , 5 : 7 7 3 - 7 7 6 . 1 6 9 . Q u e s a d a J , R u b i o M , G C fi m e z D : O z o n a t i o n o f L i g n i n R i c h S o l i d F r a c t i o n s f r o m C o r n S t a l k s . J o u r n a l o f W o o d C h e m i s t r y a n d T e c h n o l o g y 1 9 9 9 , 1 9 : 1 1 5 - 1 3 7 - 1 1 5 - 1 3 7 . 1 7 0 . G a r c i a - C u b e r o M T , G o n z a l e z - B e n i t o G , I n d a c o e c h e a 1 , C o c a M , B o l a d o S : E f f e c t o f o z o n o l y s i s p r e t r e a t m e n t o n e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y o f w h e a t a n d r y e s t r a w . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 9 , 1 0 0 : 1 6 0 8 - 1 6 1 3 . 1 7 1 . R o n c e r o M B , T o r r e s A L , C o l o m J F , V i d a l T : T C F b l e a c h i n g o f w h e a t s t r a w p u l p u s i n g o z o n e a n d x y l a n a s e . P a r t A : p a p e r q u a l i t y a s s e s s m e n t . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 3 , 8 7 : 3 0 5 - 3 1 4 . 1 7 2 . A k i n D E , M o r r i s o n W H : O z o n e t r e a t m e n t o f f o r a g e : S t r u c t u r e a n d d i g e s t i b i l i t y o f d i f f e r e n t l i g n i fi e d c e l l w a l l s . C r o p S c i e n c e 1 9 8 8 , 2 8 : 3 3 7 - 3 4 2 . 1 7 3 . Q u e s a d a J , R u b i o M , G o m e z D : C h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f o z o n a t e d l i g n i n s o l u t i o n s f r o m c o r n ( Z e a m a y s ) s t a l k a n d p o p l a r ( P o p u l u s d e l t o i d e s ) w o o d b y c a p i l l a r y g a s c h r o m a t o g r a p h y . J o u r n a l o f h i g h r e s o l u t i o n c h r o m a t o g r a p h y 1 9 9 7 , 2 0 : 5 6 5 - 5 6 8 . 1 7 4 . J a b l o n s k y ’ l M , V r s k a M , K a t u s c a k S : C e l l u l o s e p r o t e c t o r s f o r i m p r o v i n g o z o n e b l e a c h i n g - R e v i e w . W o o d R e s e a r c h 2 0 0 4 , 4 9 : 7 1 - 8 6 . 4 1 2 1 7 5 . R a g n a r M , T o r d E , T o r b j c ' S r n R : R a d i c a l f o r m a t i o n i n o z o n e r e a c t i o n s w i t h l i g n i n a n d c a r b o h y d r a t e m o d e l c o m p o u n d s . H o l z f o r s c h u n g 1 9 9 9 , 5 3 : 2 9 2 - 2 9 8 . 1 7 6 . S h a t a l o v A A , P e r e i r a H : P o l y s a c c h a r i d e d e g r a d a t i o n d u r i n g o z o n e - b a s e d T C F b l e a c h i n g o f n o n - w o o d o r g a n o s o l v p u l p s . C a r b o h y d r a t e P o l y m e r s 2 0 0 7 , 6 7 : 2 7 5 - 2 8 1 . 1 7 7 . S i l v e r s t e i n R A , C h e n Y , S h a r m a - S h i v a p p a R R , B o y e t t e M D , O s b o r n e J : A c o m p a r i s o n o f c h e m i c a l p r e t r e a t m e n t m e t h o d s f o r i m p r o v i n g s a c c h a r i fi c a t i o n o f c o t t o n s t a l k s . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 7 , 9 8 : 3 0 0 0 - 3 0 1 1 . 1 7 8 . M a r t i n C , T h o m s e n A B : W e t o x i d a t i o n p r e t r e a t m e n t o f l i g n o c e l l u l o s i c r e s i d u e s o f s u g a r c a n e , r i c e , c a s s a v a a n d p e a n u t s f o r e t h a n o l p r o d u c t i o n . J o u r n a l o f C h e m i c a l T e c h n o l o g y & B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 7 , 8 2 : 1 7 4 - 1 8 1 . 1 7 9 . V a r g a E , S c h m i d t A , R é c z e y K , T h o m s e n A : P r e t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r u s i n g w e t o x i d a t i o n t o e n h a n c e e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t y . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 3 , 1 0 4 1 3 7 - 5 0 . 1 8 0 . K l i n k e H , A h r i n g B , S c h m i d t A , T h o m s e n A : C h a r a c t e r i z a t i o n o f d e g r a d a t i o n p r o d u c t s f r o m a l k a l i n e w e t o x i d a t i o n o f w h e a t s t r a w . B i o r e s o u r T e c h n o l 2 0 0 2 , 8 2 : 1 5 — 2 6 . 1 8 1 . E g g e m a n T , E l a n d e r R T : P r o c e s s a n d e c o n o m i c a n a l y s i s o f p r e t r e a t m e n t t e c h n o l o g i e s . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 9 6 : 2 0 1 9 - 2 0 2 5 . 1 8 2 . L e e J : B i o I O g i c a l c o n v e r s i o n o f l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s t o e t h a n o l . J o u r n a l o f B i o t e c h n o l o g y 1 9 9 7 , 5 6 : 1 - 2 4 . 1 8 3 . L e e J - W , G w a k K - S , P a r k J - Y , P a r k M - J , C h o i D - H , K w o n M , C h o i I - G : B i o l o g i c a l P r e t r e a t m e n t o f S o f t w o o d P i n u s d e n s i fl o r a b y T h r e e W h i t e R o t F u n g i . J . M i c r o b i o l . 2 0 0 7 , 4 5 : 4 5 5 - 4 9 1 . 1 8 4 . K e l l e r F A , H a m i l t o n J E , N g u y e n Q A : M i c r o b i a l p r e t r e a t m e n t o f b i o m a s s : P o t e n t i a l f o r r e d u c i n g s e v e r i t y o f t h e r m o c h e m i c a l b i o m a s s p r e t r e a t m e n t . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 3 , 1 0 5 : 2 7 - 4 1 . 1 8 5 . B a l a n V , d a C o s t a S o u s a L , C h u n d a w a t S P S , V i s m e h R , J o n e s A D , D a l e B E : M u s h r o o m s p e n t s t r a w : a p o t e n t i a l s u b s t r a t e f o r a n e t h a n o l - b a s e d b i o r e fi n e r y . J o u r n a l o f I n d u s t r i a l M i c r o b i o l o g y & B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 8 , 3 5 : 2 9 3 - 3 0 1 . 1 8 6 . T a n i g u c h i M , S u z u k i H , W a t a n a b e D , S a k a i K , H o s h i n o K , T a n a k a T : E v a l u a t i o n o f p r e t r e a t m e n t w i t h P l e u r o t u s o s t r e a t u s f o r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f r i c e s t r a w . J o u r n a l o f B i o s c i e n c e a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 5 , 1 0 0 2 6 3 7 - 6 4 3 . 1 8 7 . Z a d r a z i l F : I s c o n v e r s i o n o f l i g n o c e l l u l o s i c s i n t o f e e d w i t h w h i t e r o t f u n g i r e a l i z a b l e ? P r a c t i c a l p r o b l e m s o f s c a l e - u p a n d t e c h n o l o g y t r a n s f e r . I n S c i e n c e a n d C u l t i v a t i o n o f E d i b l e F u n g i . E d i t e d b y V a n G r i e n s v e n L J L D ; 2 0 0 0 : 9 1 9 - 9 2 8 . 4 1 3 1 8 8 . K a r u n a n a n d a a K , V a r g a G A , A k i n D E , R i g s b y L L , R o y s e D J : B o t a n i c a l f r a c t i o n s o f r i c e s t r a w c o l o n i z e d b y w h i t e - r o t f u n g i : c h a n g e s i n c h e m i c a l c o m p o s i t i o n a n d s t r u c t u r e . A n i m a l F e e d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y 1 9 9 5 , 5 5 : 1 7 9 - 1 9 9 . 1 8 9 . K e r e m Z , F r i e s e m D , H a d a r Y : L i g n o c e l l u l o s e D e g r a d a t i o n d u r i n g S o l i d - S t a t e F e r m e n t a t i o n : P l e u r o t u s o s t r e a t u s v e r s u s P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 1 9 9 2 , 5 8 : 1 1 2 1 - 1 1 2 7 . 1 9 0 . L e o n o w i c z A , M a t u s z e w s k a A , L u t e r e k J , Z i e g e n h a g e n D , W o j t a é - W a s i l e w s k a M , N a m - S e e k C , H o f r i c h t e r M , R o g a l s k i J : B i o d e g r a d a t i o n o f l i g n i n b y w h i t e r o t f u n g i . F u n g a l G e n e t i c s a n d B i o l o g y 1 9 9 9 , 2 7 : 1 7 5 - 1 8 5 . 1 9 1 . A k i n D E , M o r r i s o n W H , 1 H , R i g s b y L L , B a r t o n P E , 1 1 , H i m m e l s b a c h D S , H i c k s K B : C o r n S t o v e r F r a c t i o n s a n d B i o e n e r g y : C h e m i c a l C o m p o s i t i o n , S t r u c t u r e , a n d R e s p o n s e t o E n z y m e P r e t r e a t m e n t . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 6 , 1 2 9 : 1 0 4 - 1 1 6 . 1 9 2 . M e n d o n c a R , J a r a J , G o n z a l e z V , E l i s s e t c h e J , F r e e r J : E v a l u a t i o n o f t h e w h i t e - r o t f u n g i G a n o d e r m a a u s t r a l e a n d C e r i p o r i o p s i s s u b v e r m i s p o r a i n b i o t e c h n o l o g i c a l a p p l i c a t i o n s . J o u r n a l o f I n d u s t r i a l M i c r o b i o l o g y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 8 , 3 5 : 1 3 2 3 - 1 3 3 0 . 1 9 3 . L e e J - W , K i m H - Y , K o o B - W , C h o i D - H , K w o n M , C h o i I - G : E n z y m a t i c s a c c h a r i fi c a t i o n o f b i o l o g i c a l l y p r e t r e a t e d P i n u s d e n s i fl o r a u s i n g e n z y m e s f r o m b r o w n r o t f u n g i . J o u r n a l o f B i o s c i e n c e a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 8 , 1 0 6 : 1 6 2 - 1 6 7 . 1 9 4 . S h i J , C h i n n M S , S h a n n a - S h i v a p p a R R : M i c r o b i a l p r e t r e a t m e n t o f c o t t o n s t a l k s b y s o l i d s t a t e c u l t i v a t i o n o f P h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 8 , 9 9 : 6 5 5 6 - 6 5 6 4 . 1 9 5 . T o m m e P , W a r r e n R , G i l k e s N : C e l l u l o s e H y d r o l y s i s b y b a c t e r i a a n d f u n g i . A d v M i c r o b P h y s i o l 1 9 9 5 , 3 7 : 1 - 8 1 . 1 9 6 . B a y e r E , C h a n z y H , L a m e d R , S h o h a m Y : C e l l u l o s e , c e l l u l a s e s a n d c e l l u l o s o m e s . C u r r O p i n S t r u c t B i o l 1 9 9 8 , 8 : 5 4 8 — 5 5 7 . 1 9 7 . B a y e r E A , S h i m o n L J W , S h o h a m Y , L a m e d R : C e l l u l o s o m e s - S t r u c t u r e a n d u l t r a s t r u c t u r e . J o u r n a l o f S t r u c t u r a l B i o l o g l 1 9 9 8 , 1 2 4 : 2 2 1 - 2 3 4 . 1 9 8 . S a h a B : H e m i c e l l u l o s e b i o c o n v e r s i o n . J I n d M i c r o b B i o t e c h 2 0 0 3 , 3 0 : 2 7 9 - 2 9 1 . 1 9 9 . T e e r i T : T r i c h o d e r m a r e e s e i c e l l o b i o h y d r o l a s e I w i t h a n e n d o g l u c a n a s e c e l l u l o s e - b i n d i n g d o m a i n : a c t i o n o n b a c t e r i a l m i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e . J B i o t e c h n o l 1 9 9 7 , 5 7 : 4 9 - 5 7 . 2 0 0 . G i l i g a n W , R e e s e E : E v i d e n c e f o r m u l t i p l e c o m p o n e n t s i n m i c r o b i a l c e l l u l a s e s . C a n a d i a n J o u r n a l o f M i c r o b i o l o g y 1 9 5 4 , 1 2 9 0 - 1 0 7 . 4 1 4 2 0 1 . M a n d e l s M , R e e s e E : D e v I n d M i c r o b 1 9 6 4 , 5 : 5 - 1 6 . 2 0 2 . M u r a s h i m a K , K o s u g i A , D o i R H : S y n e r g i s t i c e f f e c t s o f c e l l u l o s o m a l x y l a n a s e a n d c e l l u l a s e s f r o m C l o s t r i d i u m c e l l u l o v o r a n s o n p l a n t c e l l w a l l d e g r a d a t i o n . J o u r n a l o f B a c t e r i o l o g y 2 0 0 3 , 1 8 5 : 1 5 1 8 - 1 5 2 4 . 2 0 3 . H e n r i s s a t B : C e l l u l a s e s a n d t h e i r i n t e r a c t i o n w i t h c e l l u l o s e . C e l l u l o s e 1 9 9 4 , 1 : 1 6 9 - 1 9 6 . 2 0 4 . N i d e t z k y B : S y n e r g i s m o f T r i c h o d e r m a r e e s e i c e l l u l a s e s w h i l e d e g r a d i n g d i f f e r e n t c e l l u l o s e s . B i o t e c h L e t t 1 9 9 3 , 1 5 : 7 1 - 7 6 . 2 0 5 . S t a h l b e r g J : T r i c h o d e r m a r e e s e i h a s n o t r u e e x o - c e l l u l a s e : a l l i n t a c t a n d t r u n c a t e d c e l l u l a s e s p r o d u c e n e w r e d u c i n g e n d g r o u p s o n c e l l u l o s e . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 9 9 3 , 1 1 5 7 : 1 0 7 - 1 1 3 . 2 0 6 . D i v n e C , S t a h l b e r g J , R e i n i k a i n e n T , R u o h o n e n L , P e t t e r s s o n G , K n o w l e s J , T e e r i T , J o n e s T : T h e t h r e e - d i m e n s i o n a l c r y s t a l s t r u c t u r e o f t h e c a t a l y t i c c o r e o f c e l l o b i o h y d r o l a s e I f r o m T r i c h o d e r m a r e e s e i . S c i e n c e 1 9 9 4 , 2 6 5 : 5 2 4 - 5 2 8 . 2 0 7 . R o u v i n e n J , B e r g f o r s T , T e e r i T , K n o w l e s J , J o n e s T : T h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f c e l l o b i o h y d r o l a s e I I f r o m T r i c h o d e r m a r e e s e i . S c i e n c e 1 9 9 0 , 2 4 9 : 3 8 0 - 3 8 6 . 2 0 8 . B a r r B , H s i e h Y , G a n e m B , W i l s o n D : I d e n t i fi c a t i o n o f t w o f u n c t i o n a l l y d i f f e r e n t c l a s s e s o f e x o c e l l u l a s e s . B i o c h e m i s t r y 1 9 9 6 , 3 5 : 5 8 6 - 5 9 2 . 2 0 9 . I m a i T , B o i s s e t C , S a m e j i m a M , I g a r a s h i K , S u g i y a m a J : U n i d i r e c t i o n a l p r o c e s s i v e a c t i o n o f c e l l o b i o h y d r o l a s e C e l 7 A o n V a l o n i a c e l l u l o s e m i c r o c r y s t a l s . F E B S L e t t e r s 1 9 9 8 , 4 3 2 : 1 1 3 - 1 1 6 . 2 1 0 . M a n s fi e l d S D , S a d d l e r J N , G i i b i t z G M : C h a r a c t e r i z a t i o n o f e n d o g l u c a n a s e s f r o m t h e b r o w n r o t f u n g i G l o e o p h y l l u m s e p i a r i u m a n d G l o e o p h y l l u m t r a b e u m . E n z y m e a n d M i c r o b i a l T e c h n o l o g y 1 9 9 8 , 2 3 : 1 3 3 - 1 4 0 . 2 1 1 . A m a n o Y , N o z a k i K , A r a k i T , S h i b a s a k i H , K u g a S , K a n d a T : R e a c t i v i t i e s o f c e l l u l a s e s f r o m f u n g i t o w a r d s r i b b o n - t y p e b a c t e r i a l c e l l u l o s e a n d b a n d - s h a p e d b a c t e r i a l c e l l u l o s e . C e l l u l o s e 2 0 0 2 , 8 2 2 6 7 - 2 7 4 . 2 1 2 . C o u g h l a n M , H a z e l w o o d G : H e m i c e l l u l o s e a n d h e m i c e l l u l a s e s . L o n d o n : P o r t l a n d P r e s s ; 1 9 9 3 . 2 1 3 . D e V r i e s R , K e s t e r H , P o u l s e n C , B e n e n J , V i s s e r J : S y n e r g y b e t w e e n e n z y m e s f r o m A s p e r g i l l u s i n v o l v e d i n t h e d e g r a d a t i o n o f p l a n t c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s . C a r b o h y d r R e s 2 0 0 0 , 3 2 7 : 4 0 1 - 4 1 0 . 2 1 4 . P o u t a n e n K , T e n k a n e n M , K o r t e H , P u l s J : A c c e s s o r y e n z y m e s i n v o l v e d i n t h e h y d r o l y s i s o f x y l a n s , v o l 4 6 0 . E d i t e d b y L e a t h a m G , H i m m e l , M E . W a s h i n g t o n D C : A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y ; 1 9 9 1 . 4 1 5 2 1 5 . P o u t a n e n K , P u l s J : T h e x y l a n o l y t i c e n z y m e s y s t e m o f T r i c h o d e r m a r e e s e i , v o l 3 9 9 . E d i t e d b y L e w i s G , P a i c e M . W a s h i n g t o n D C : A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y ; 1 9 8 9 . 2 1 6 . B i e l y P , V r s a n s k a M , C l a e y s s e n s M : T h e e n d o - 1 , 4 - b e t a - g l u c a n a s e I f r o m T r i c h o d e r m a r e e s e i . E u r o p e a n J o u r n a l o f B i o c h e m i s t r y 1 9 9 1 , 2 0 0 : 1 5 7 - 1 6 3 . 2 1 7 . B i e l y P , V r a n s k é a M , T e n k a n e n M , K l u e p f e l D : E n d o - B - 1 , 4 - x y l a n a s e f a m i l i e s : d i f f e r e n c e s i n c a t a l y t i c p r o p e r t i e s . J B i o t e c h n o l 1 9 9 7 , 5 7 : 1 5 1 - 1 6 6 . 2 1 8 . B i e l y P , P u c h a r t V : R e c e n t p r o g r e s s i n t h e a s s a y s o f x y l a n o l y t i c e n z y m e s . J o u r n a l o f t h e S c i e n c e o f F o o d a n d A g r i c u l t u r e 2 0 0 6 , 8 6 : 1 6 3 6 - 1 6 4 7 . 2 1 9 . K e n e a l y W , J e f f r i e s T : E n z y m e p r o c e s s e s f o r p u l p a n d p a p e r : a r e v i e w o f r e c e n t d e v e l o p m e n t s . W o o d d e t e r i o r a t i o n a n d p r e s e r v a t i o n : a d v a n c e s i n o u r c h a n g i n g w o r l d , v o l A C S s y m p o s i u m s e r i e s 8 4 5 . W a s h i n g t o n , D C : A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y : O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s ; 2 0 0 3 . 2 2 0 . G i i b i t z G M , S t e b b i n g D W , J o h a n s s o n C I , S a d d l e r J N : L i g n i n - h e m i c e l l u l o s e c o m p l e x e s r e s t r i c t e n z y m a t i c s o l u b i l i z a t i o n o f m a n n a n a n d x y l a n f r o m d i s s o l v i n g p u l p . A p p l i e d M i c r o b i o l o g y a n d B i o t e c h n o l o g y 1 9 9 8 , 5 0 : 3 9 0 - 3 9 5 . 2 2 ] . G i i b i t z G M , M a n s fi e l d S D , B d h m D , S a d d l e r J N : E f f e c t o f e n d o g l u c a n a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e s i n m a g n e t i c a n d fl o t a t i o n d e i n k i n g o f x e r o g r a p h i c a n d l a s e r - p r i n t e d p a p e r s . J o u r n a l o f B i o t e c h n o l o g y 1 9 9 8 , 6 5 : 2 0 9 - 2 1 5 . 2 2 2 . G i i b i t z G M , L i s c h n i g T , S t e b b i n g D , S a d d l e r J N : E n z y m a t i c r e m o v a l o f h e m i c e l l u l o s e f r o m d i s s o l v i n g p u l p s . B i o t e c h n o l o g y L e t t e r s 1 9 9 7 , 1 9 : 4 9 1 - 4 9 5 . 2 2 3 . G fi b i t z G M , H a l t r i c h D , L a t a l B , S t e i n e r W : M o d e o f d e p o l y m e r i s a t i o n o f h e m i c e l l u l o s e b y v a r i o u s m a n n a n a s e s a n d x y l a n a s e s i n r e l a t i o n t o t h e i r a b i l i t y t o b l e a c h s o f t w o o d p u l p . A p p l i e d M c r o b i o l o g y a n d B i o t e c h n o l o g y 1 9 9 7 , 4 7 : 6 5 8 - 6 6 2 . 2 2 4 . K a y a F , H e i t m a n n J A , J o y c e T W : I n fl u e n c e o f S u r f a c t a n t s o n t h e E n z y m a t i c H y d r o l y s i s o f X y l a n a n d C e l l u l o s e . T a p p i J o u r n a l 1 9 9 5 , 7 8 : 1 5 0 - 1 5 7 . 2 2 5 . M o r g a v i D , B e a u c h e m i n K , N s e r e k o V , R o d e L , I w a a s a A , Y a n g W , M c A l l i s t e r T , W a n g Y : S y n e r g y b e t w e e n r u m i n a l fi b r o l y t i c e n z y m e s a n d e n z y m e s f r o m T r i c h o d e r m a l o n g i b r a c h i a t u m . J D a i r y S c i 2 0 0 0 , 8 3 : 1 3 1 0 - 1 3 2 1 . 2 2 6 . F e r r e i r a L , W o o d T , W i l l i a m s o n G , F a u l d s C , H a z l e w o o d G , B l a c k G , G i l b e r t H : A m o d u l a r e s t e r a s e f r o m P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s s u b s p . c e l l u l o s a c o n t a i n s a n o n - c a t a l y t i c c e l l u l o s e - b i n d i n g d o m a i n . B i o c h e m J 1 9 9 3 , 2 9 4 : 3 4 9 — 3 5 5 . 2 2 7 . D a v i e s G , H e n r i s s a t B : S t r u c t u r e s a n d m e c h a n i s m s o f g l y c o s y l h y d r o l a s e s . S t r u c t u r e 1 9 9 5 , 3 : 8 5 3 — 8 5 9 . 2 2 8 . B o l a m D N , C i r u e l a A , M c Q u e e n - M a s o n S , S i m p s o n P , W i l l i a m s o n M P , R i x o n J E , B o r a s t o n A , H a z l e w o o d G P , G i l b e r t H J : P s e u d o m o n a s c e l l u l o s e - b i n d i n g d o m a i n s 4 1 6 m e d i a t e t h e i r e f f e c t s b y i n c r e a s i n g e n z y m e s u b s t r a t e p r o x i m i t y . B i o c h e m i c a l J o u r n a l 1 9 9 8 , 3 3 1 : 7 7 5 - 7 8 1 . 2 2 9 . C a r r a r d G , L i n d e r M : W i d e l y d i f f e r e n t o f f r a t e s o f t w o c l o s e l y r e l a t e d c e l l u l o s e - b i n d i n g d o m a i n s f r o m T r i c h o d e r m a r e e s e i . E u r o p e a n J o u r n a l o f B i o c h e m i s t r y 1 9 9 9 , 2 6 2 : 6 3 7 - 6 4 3 . 2 3 0 . L i n d e r M , T e e r i T I ‘ : T h e r o l e s a n d f u n c t i o n o f c e l l u l o s e - b i n d i n g d o m a i n s . J o u r n a l o f B i o t e c h n o l o g y 1 9 9 7 , 5 7 : 1 5 - 2 8 . 2 3 1 . S a u l D , W i l l i a m s L , G r a y l i n g R , C h a m l e y L , L o v e D , B e r g q u i s t P : C e l B , a g e n e c o d i n g f o r a b i f u n c t i o n a l c e l l u l a s e f r o m t h e e x t r e m e t h e r m o p h i l e " C a l d o c e l l u m s a c c h a r o l y t i c u m " . A p p l E n v i r o n M i c r o b 1 9 9 0 , 5 6 : 3 1 1 7 . 2 3 2 . F l i n t H ] , M a r t i n J , M c P h e r s o n C A , D a n i e l A S , J u n - X i a n Z : A b i f u n c t i o n a l e n z y m e , w i t h s e p a r a t e x y l a n a s e a n d B ( 1 , 3 - l , 4 ) - g l u c a n a s e d o m a i n s , e n c o d e d b y t h e x y n D g e n e o f R u m i n o c o c c u s f l a v e f a c i e n s . J B a c t e r i o l 1 9 9 3 , 1 7 5 : 2 9 4 3 — 2 9 5 1 . 2 3 3 . D e m a i n A L , N e w c o m b M , W u J H D : C e l l u l a s e , C l o s t r i d i a , a n d E t h a n o l . M i c r o b i o l o g z a n d M o l e c u l a r B i o l o g y R e v i e w s 2 0 0 5 , 6 9 : 1 2 4 - 1 5 4 . 2 3 4 . H o l t z a p p l e M T , R i p l e y E P , N i k o l a o u M : S a c c h a r i fi c a t i o n , F e r m e n t a t i o n , a n d P r o t e i n R e c o v e r y f r o m L o w - T e m p e r a t u r e A f e x - T r e a t e d C o a s t a l B e r m u d a g r a s s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 1 9 9 4 , 4 4 : 1 1 2 2 - 1 1 3 1 . 2 3 5 . F o s t e r B , D a l e B , D o r a n - P e t e r s o n J : E n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f a m m o n i a - t r e a t e d s u g a r b e e t p u l p . A p p l B i o c h e m B i o t e c h 2 0 0 1 , 9 1 : 2 6 9 - 2 8 2 . 2 3 6 . O ’ C o n n o r J : A m m o n i a e x p l o s i o n p u l p i n g : A n e w fi b e r s e p a r a t i o n p r o c e s s . T a p p i 1 9 7 2 , 5 5 : 3 5 3 - 3 5 8 . 2 3 7 . J u n g n i k l K , P a r i s 0 , F r a t z l P , B u r g e r t I : T h e i m p l i c a t i o n o f c h e m i c a l e x t r a c t i o n t r e a t m e n t s o n t h e c e l l w a l l n a n o s t r u c t u r e o f s o f t w o o d . C e l l u l o s e 2 0 0 8 , 1 5 : 4 0 7 - 4 1 8 . 2 3 8 . F a h l e n J , S a l m e n L : C r o s s - s e c t i o n a l s t r u c t u r e o f t h e s e c o n d a r y w a l l o f f i b e r s a s a f f e c t e d b y p r o c e s s i n g . J M a t S c i 2 0 0 3 , 3 8 : 1 1 9 - 1 2 6 . 2 3 9 . O h g r e n K , G a l b e M , Z a c c h i G : O p t i m i z a t i o n o f s t e a m p r e t r e a t m e n t o f S O ; - i m p r e g n a t e d c o r n s t o v e r f o r f u e l e t h a n o l p r o d u c t i o n . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 1 2 4 : 1 0 5 5 - 1 0 6 7 . 2 4 0 . T e y m o u r i F , L a u r e a n o - P e r e z L , A l i z a d e h H , D a l e B E : O p t i m i z a t i o n o f t h e a m m o n i a f i b e r e x p l o s i o n ( A F E X ) t r e a t m e n t p a r a m e t e r s f o r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f c o r n s t o v e r . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 9 6 : 2 0 1 4 - 2 0 1 8 . 2 4 1 . K i m S , H o l t z a p p l e M T : L i m e p r e t r e a t m e n t a n d e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f c o r n s t o v e r . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 9 6 : 1 9 9 4 — 2 0 0 6 . 4 1 7 2 4 2 . K i m S , H o l t z a p p l e M T : D e l i g n i fi c a t i o n k i n e t i c s o f c o r n s t o v e r i n l i m e p r e t r e a t m e n t . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 6 , 9 7 : 7 7 8 - 7 8 5 . 2 4 3 . M o s i e r N , H e n d r i c k s o n R , H o N , S e d l a k M , L a d i s c h M R : O p t i m i z a t i o n o f p H c o n t r o l l e d l i q u i d h o t w a t e r p r e t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 9 6 : 1 9 8 6 - 1 9 9 3 . 2 4 4 . A n g e l e s G , O w e n s S , E w e r s F : F l u o r e s e n c e s h e l l : A n o v e l v i e w o f s c l e r e i d m o r p h o l o g y w i t h t h e c o n f o c a l l a s e r s c a n n i n g m i c r o s c o p e . M i c r o s c o p y R e s e a r c h a n d T e c h n i q u e s 2 0 0 4 , 6 3 : 2 8 2 - 2 8 8 . 2 4 5 . L i l l i e R : H J C o n n ’ s B i o l o g i c a l s t a i n s e d n 9 t h . B a l t i m o r e : T h e W i l l i a m s a n d W i l k i n s C o ; 1 9 7 7 . 2 4 6 . K a s t e n F : T h e o r i g i n s o f m o d e r n f l u o r e s c e n t m i c r o s c o p y a n d fl u o r e s c e n t p r o b e s . E d i t e d b y K o h e n E , H i r s c h b e r g J . S a n D i e g o : A c a d e m i c P r e s s ; 1 9 8 9 . 2 4 7 . A l b i n s s o n B , L i S , L u n d q u i s t K , S t o m b e r g R : T h e o r i g i n o f l i g n i n fl u o r e s c e n c e . J M o l S t r u c t u r e 1 9 9 9 , 5 0 8 : 1 9 - 2 7 . 2 4 8 . B l u d w o r t h J , C a r l K n o p f F : R e a c t i v e e x t r a c t i o n o f l i g n i n f r o m w o o d u s i n g s u p e r c r i t i c a l a m m o n i a - w a t e r m i x t u r e s . T h e J o u r n a l o f S u p e r c r i t i c a l F l u i d s 1 9 9 3 , 6 : 2 4 9 - 2 5 4 . 2 4 9 . G r a h a m H D : S t a b i l i z a t i o n o f t h e P r u s s i a n B l u e C o l o r i n t h e D e t e r m i n a t i o n o f P o l y p h e n o l s . J o u r n a l o f A g r i c u l t u r a l a n d F o o d C h e m i s t r y 1 9 9 2 , 4 0 : 8 0 1 - 8 0 5 . 2 5 0 . H a r t l e y R D , J o n e s E C : P h e n o l i c C o m p o n e n t s a n d D e g r a d a b i l i t y o f t h e C e l l W a l l s o f t h e B r o w n M i d r i b M u t a n t , b m 3 , o f Z e a m a y s . J o u r n a l o f t h e S c i e n c e o f F o o d a n d A g r i c u l t u r e 1 9 7 8 , 2 9 : 7 7 7 - 7 8 2 . 2 5 1 . H a r t l e y R D : p - C o u m a r i c a n d F e r u l i c A c i d C o m p o n e n t s o f C e l l W a l l s o f R y e g r a s s a n d t h e i r R e l a t i o n s h i p s w i t h L i g n i n a n d D i g e s t i b i l i t y . J o u r n a l o f t h e S c i e n c e o f F o o d a n d A g r i c u l t u r e 1 9 7 2 , 2 3 : 1 3 4 7 - 1 3 5 4 . 2 5 2 . B e r l i n A , B a l a k s h i n M , G i l k e s N , K a d l a J , M a x i m e n k o V , K u b o S , S a d d l e r J : I n h i b i t i o n o f c e l l u l a s e , x y l a n a s e a n d b e t a - g l u c o s i d a s e a c t i v i t i e s b y s o f t w o o d l i g n i n p r e p a r a t i o n s . J o u r n a l o f B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 6 , 1 2 5 : 1 9 8 - 2 0 9 . 2 5 3 . D o r r i s G , G r a y D : T h e s u r f a c e a n a l y s i s o f p a p e r a n d w o o d f i b e r s b y E S C A , 1 1 . S u r f a c e c o m p o s i t i o n o f m e c h a n i c a l p u l p s . C e l l u l C h e m T e c h n o l 1 9 7 8 , 1 2 : 7 2 1 - 7 3 4 . 2 5 4 . M j o b e r g P : C h e m i c a l s u r f a c e a n a l y s i s o f w o o d fi b e r s b y m e a n s o f E S C A . C e l l u l C h e m T e c h n o l 1 9 8 1 , 1 5 : 4 8 1 - 4 8 6 . 2 5 5 . L a i n e J , S t e n i u s P , C a r l s s o n G , S t r o m G : S u r f a c e c h a r a c t e r i z a t i o n o f u n b l e a c h e d k r a f t p u l p s b y m e a n s o f E S C A . C e l l u l o s e 1 9 9 4 , 1 : 1 4 5 - 1 6 0 . 4 1 8 2 5 6 . Y a n L , L i W , Y a n g J , Z h u Q : D i r e c t v i s u a l i z a t o n o f s t r a w c e l l w a l l s b y A F M . M a c r o m o l B i o s c i 2 0 0 4 , 4 : 1 1 2 - 1 1 8 . 2 5 7 . K o l j o n e n K , O s t e r b e r g M , J o h a n s s o n L , S t e n i u s P : S u r f a c e c h e m i s t r y a n d m o r p h o l o g y o f d i f f e r e n t m e c h a n i c a l p u l p s d e t e r m i n e d b y E S C A a n d A F M . C o l l o i d s a n d S u r f a c e s A : P h y s i c o c h e m i c a l a n d E n g i n e e r i n g A s p e c t s 2 0 0 3 , 2 2 8 : 1 4 3 - 1 5 8 . 2 5 8 . Y u H , L i u R , S h e n D , W u Z , H u a n g Y : A r r a n g e m e n t o f c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s i n t h e w h e a t s t r a w c e l l w a l l . C a r b o h y d r a t e p o l y m e r s 2 0 0 8 , 7 2 : 1 2 2 - 1 2 7 . 2 5 9 . Z i m m e r m a n n T , T h o m m e n V , R e i r n a n n P , H u g H : U l t r a s t r u c t u r a l a p p e a r a n c e o f e m b e d d e d a n d p o l i s h e d w o o d c e l l w a l l s a s r e v e a l e d b y A F M . J S t r u c B i o l 2 0 0 6 , 1 5 6 : 3 6 3 - 3 6 9 . 2 6 0 . M c C a n n M C , W e l l s B , R o b e r t s K : D i r e c t v i s u a l i z a t i o n o f c r o s s - l i n k s i n t h e p r i m a r y p l a n t c e l l w a l l . J C e l l S c i 1 9 9 0 , 9 6 : 3 2 3 - 3 3 4 . 2 6 1 . H a f r e n J , F u j i n o T , I t o h T , W e s t e r m a r k U , T e r a s h i m a N : U l t r a s t r u c t u r a l C h a n g e s i n t h e C o m p o u n d M i d d l e L a m e l l a o f P i n u s t h u n b e r g i i D u r i n g L i g n i fi c a t i o n a n d L i g n i n R e m o v a l . H o l z f o r s c h u n g 2 0 0 5 , 5 4 : 2 3 4 - 2 4 0 . 2 6 2 . C a r p i t a N C , D e f e m e z M , F i n d l a y K , W e l l s B , S h o u e D A , C a t c h p o l e G , W i l s o n R H , M c C a n n M C : C e l l W a l l A r c h i t e c t u r e o f t h e E l o n g a t i n g M a i z e C o l e o p t i l e . P l a n t P h y s i o l o g y 2 0 0 1 , 1 2 7 : 5 5 1 - 5 6 5 . 2 6 3 . C a r p i t a N C : S t r u c t u r e a n d b i o g e n e s i s o f t h e c e l l w a l l s o f g r a s s e s . A n n u a l R e v i e w o f P l a n t P h y s i o l o g y a n d P l a n t M o l e c u l a r B i o l o g y 1 9 9 6 , 4 7 : 4 4 5 - 4 7 6 . 2 6 4 . B r u n e c k y R , V i n z a n t T B , P o r t e r S E , D o n o h o e B S , J o h n s o n D K , H i m m e l M E : R e d i s t r i b u t i o n o f x y l a n i n m a i z e c e l l w a l l s d u r i n g d i l u t e a c i d p r e t r e a t m e n t . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 9 , 1 0 2 : 1 5 3 7 - 1 5 4 3 . 2 6 5 . G r e t h l e i n H E : T h e E f f e c t o f P o r e S i z e D i s t r i b u t i o n o n t h e R a t e o f E n z y m a t i c H y d r o l y s i s o f C e l l u l o s e S u b s t r a t e s B i o / T e c h n o l o g y 1 9 8 5 , 3 : 1 5 5 - 1 6 0 . 2 6 6 . S t o n e J E , S c a l l a n A M , D o n e f e r E , A h l g r e n E : D i g e s t i b i l i t y a s a S i m p l e F u n c t i o n o f a M o l e c u l e o f S i m i l a r S i z e t o a C e l l u l a s e E n z y m e . I n C e l l u l a s e s a n d T h e i r A p p l i c a t i o n s . E d i t e d b y : A M E R I C A N C H E M I C A L S O C I E T Y ; 2 0 0 9 : 2 1 9 - 2 4 1 . A d v a n c e s i n C h e m i s t r y 2 6 7 . R o s c a I , P u h r i n g e r R , S c h m i d t H , T a n c z o s I : N e w A s p e c t s i n s t u d y i n g a n d a p p l i c a t i o n s o f a m m o n i a t r e a t m e n t o f s o f t w o o d . E d i t e d b y K u d e l a J , K u r j a t k o S . Z v o l e n , S l o v a k i a : A r b o r a P u b l i s h e r s ; 2 0 0 2 . 2 6 8 . T a r k o w H , F e i s t W C : A M e c h a n i s m f o r I m p r o v i n g t h e D i g e s t i b i l i t y o f L i g n o c e l l u l o s i c M a t e r i a l s w i t h D i l u t e A l k a l i a n d L i q u i d A m m o n i a . A d v a n c e s i n C h e m i s t r y S e r i e s 1 9 6 9 : 1 9 7 - 2 1 7 . 4 1 9 2 6 9 . R e a d S M , B a c i c A : C e l l w a l l p o r o s i t y a n d i t s d e t e r m i n a t i o n . I n M o d e r n M e t h o d s o f P l a n t A n a l y s i s . 1 7 : P l a n t C e l l W a l l A n a l y s i s . E d i t e d b y L i n s k e n s H F , J a c k s o n J F : S p r i n g e r V e r l a g ; 1 9 9 6 : 6 3 - 8 0 . v o l 1 7 . ] 2 7 0 . C h e s s o n A , G a r d n e r P T , W o o d T J : C e l l w a l l p o r o s i t y a n d a v a i l a b l e s u r f a c e a r e a o f w h e a t s t r a w a n d w h e a t g r a i n f r a c t i o n s . J o u r n a l o f t h e S c i e n c e o f F o o d a n d A g r i c u l t u r e 1 9 9 7 , 7 5 : 2 8 9 - 2 9 5 . 2 7 1 . X u P , D o n a l d s o n L , G e r g e l y Z , S t a e h e l i n L : D u a l - a x i s e l e c t r o n t o m o g r a p h y : a n e w a p p r o a c h f o r i n v e s t i g a t i n g t h e s p a t i a l o r g a n i z a t i o n o f w o o d c e l l u l o s e m i c r o fi b r i l s . W o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y 2 0 0 7 , 4 1 : 1 0 1 - 1 1 6 . 2 7 2 . K r e m e r J , M a s t r o n a r d e D , M c I n t o s h J : C o m p u t e r v i s u a l i z a t i o n o f t h r e e - d i m e n s i o n a l i m a g e d a t a u s i n g I M O D . J S t r u c t B i o l 1 9 9 6 , 1 1 6 : 7 1 — 7 6 . 2 7 3 . W i S G , S i n g h A P , L e K H , K i m Y S : T h e P a t t e r n o f D i s t r i b u t i o n o f P e c t i n , P e r o x i d a s e a n d L i g n i n i n t h e M i d d l e L a m e l l a o f S e c o n d a r y X y l e m F i b r e s i n A l f a l f a ( M e d i c a g o s a t i v a ) . A n n B o t 2 0 0 5 , 9 5 : 8 6 3 - 8 6 8 . 2 7 4 . S i n g h A , D a n i e l G , N i l s s o n T : U l t r a s t r u c t u r e o f t h e $ 2 l a y e r i n r e l a t i o n t o l i g n i n d i s t r i b u t i o n i n P i n u s r a d i a t a t r a c h e i d s . J o u r n a l o f W o o d S c i e n c e 2 0 0 2 , 4 8 : 9 5 - 9 8 . 2 7 5 . F r o m J , R o c k e l B , L a u t n e r S , W i n d e i s e n E , W a n n e r G : L i g n i n d i s t r i b u t i o n i n w o o d c e l l w a l l s d e t e r m i n e d b y T E M a n d b a c k s e a t t e r e d S E M t e c h n i q u e s . J o u r n a l o f S t r u c t u r a l B i o l o g y 2 0 0 3 , 1 4 3 : 7 7 - 8 4 . 2 7 6 . L a p i e r r e C , P o l l e t B , R a l e t M - C , S a u l n i e r L : T h e p h e n o l i c f r a c t i o n o f m a i z e b r a n : e v i d e n c e f o r l i g n i n - h e t e r o x y l a n a s s o c i a t i o n . P h y t o c h e m i s t r y 2 0 0 1 , 5 7 : 7 6 5 - 7 7 2 . 2 7 7 . M c N e i l M , D a r v i l l A G , F r y S C , A l b e r s h e i m P : S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n o f t h e P r i m a r y C e l l W a l l s o f P l a n t s . A n n u a l R e v i e w o f B i o c h e m i s t r y 1 9 8 4 , 5 3 : 6 2 5 - 6 6 3 . 2 7 8 . J o s e l e a u J P , R u e l K : S t u d y o f L i g n i fi c a t i o n b y N o n i n v a s i v e T e c h n i q u e s i n G r o w i n g M a i z e I n t e r n o d e s ( A n I n v e s t i g a t i o n b y F o u r i e r T r a n s f o r m I n f r a r e d C r o s s - P o l a r i z a t i o n - M a g i c A n g l e S p i n n i n g 1 3 C - N u c l e a r M a g n e t i c R e s o n a n c e S p e c t r o s c o p y a n d I m m u n o c y t o c h e m i c a l T r a n s m i s s i o n E l e c t r o n M i c r o s c o p y ) . P l a n t P h y s i o l . 1 9 9 7 , 1 1 4 : 1 1 2 3 - 1 1 3 3 . 2 7 9 . D o n a l d s o n L A : L i g n i f i c a t i o n a n d l i g n i n t o p o c h e m i s t r y - a n u l t r a s t r u c t u r a l v i e w . P h y t o c h e m i s t r y 2 0 0 1 , 5 7 : 8 5 9 - 8 7 3 . 2 8 0 . G r a b b e r J H , R a l p h J , H a t fi e l d R D , Q u i d e a u S : p - H y d r o x y p h e n y l , G u a i a c y l , a n d S y r i n g y l L i g n i n s H a v e S i m i l a r I n h i b i t o r y E f f e c t s o n W a l l D e g r a d a b i l i t y . J o u r n a l o f A g r i c u l t u r a l a n d F o o d C h e m i s t r y 1 9 9 7 , 4 5 : 2 5 3 0 - 2 5 3 2 . 2 8 1 . J u n g H - J G , J o r g e n s e n M A , L i n n J G , E n g e l s F M : I m p a c t o f a c c e s s i b i l i t y a n d c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o n c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e d e g r a d a b i l i t y o f m a i z e a n d l u c e r n e s t e m s . J o u r n a l o f t h e S c i e n c e o f F o o d a n d A g r i c u l t u r e 2 0 0 0 , 8 0 : 4 1 9 - 4 2 7 . 4 2 0 2 8 2 . M c C a r t n e y L , M a r c u s S E , K n o x J P : M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o p l a n t c e l l w a l l x y l a n s a n d a r a b i n o x y l a n s . J o u r n a l o f H i s t o c h e m i s t r y & C y t o c h e m i s t r y 2 0 0 5 , 5 3 : 5 4 3 - 5 4 6 . 2 8 3 . C r o w E , M u r p h y R J : M i c r o fi b r i l o r i e n t a t i o n i n d i f f e r e n t i a t i n g a n d m a t u r i n g fi b r e a n d p a r e n c h y m a c e l l w a l l s i n c u l m s o f b a m b o o ( < i > P h y l l o s t a c h y s v i r i d i - g l a u c e s c e n s < l i > ( G a r r . ) R i v . & R i v . ) . B o t a n i c a l J o u r n a l o f t h e L i n n e a n S o c i e t y 2 0 0 0 , 1 3 4 : 3 3 9 - 3 5 9 . 2 8 4 . C h a n d r a R P , E s t e g h l a l i a n A R , S a d d l e r J N : A s s e s s i n g s u b s t r a t e a c c e s s i b i l i t y t o e n z y m a t i c h y d r o l y s i s b y c e l l u l a s e s . I n C h a r a c t e r i z a t i o n o f L i g n o c e l l u l o s i c M a t e r i a l s . E d i t e d b y H u T : B l a c k w e l l ; 2 0 0 8 : 6 0 - 8 0 . 2 8 5 . A n d r e w s P : E s t i m a t i o n o f t h e m o l e c u l a r w e i g h t s o f p r o t e i n s b y S e p h a d e x g e l - fi l t r a t i o n . B i o c h e m J 1 9 6 4 , 9 1 : 2 2 2 - 2 3 3 . 2 8 6 . T e p f e r M , T a y l o r I E P : T h e P e r m e a b i l i t y o f P l a n t C e l l W a l l s a s M e a s u r e d b y G e l F i l t r a t i o n C h r o m a t o g r a p h y . S c i e n c e 1 9 8 1 , 2 1 3 : 7 6 1 - 7 6 3 . 2 8 7 . O ' S u l l i v a n A C : C e l l u l o s e : t h e s t r u c t u r e s l o w l y u n r a v e l s . C e l l u l o s e 1 9 9 7 , 4 : 1 7 3 - 2 0 7 . 2 8 8 . W a d a M , N i s h i y a m a Y , C h a n z y H , F o r s y t h T , L a n g a n P : T h e s t r u c t u r e o f c e l l u l a s e s . P o w d e r D i fi i ' a c t i o n 2 0 0 8 , 2 3 : 9 2 - 9 5 . 2 8 9 . V i n c e n t J : F r o m c e l l u l o s e t o c e l l . J E x p B i o l 1 9 9 9 , 2 0 2 : 3 2 6 3 - 3 2 6 8 . 2 9 0 . Y a m a m o t o H , H o r i i F , O d a n i H : S t r u c t u r a l c h a n g e s o f n a t i v e c e l l u l o s e c r y s t a l s i n d u c e d b y a n n e a l i n g i n a q u e o u s a l k a l i n e a n d a c i d i c s o l u t i o n s a t h i g h t e m p e r a t u r e s . M a c r o m o l e c u l e s 1 9 8 9 , 2 2 : 4 1 3 0 - 4 1 3 2 . 2 9 1 . Z u g e n m a i e r P : C o n f o r m a t i o n a n d p a c k i n g o f v a r i o u s c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e fi b e r s . P r o g r e s s i n P o l y m e r S c i e n c e 2 0 0 1 , 2 6 : 1 3 4 1 - 1 4 1 7 . 2 9 2 . W e i m e r P J , F r e n c h A D , C a l a m a r i T A , J r . : D i f f e r e n t i a l F e r m e n t a t i o n o f C e l l u l o s e A l l o m o r p h s b y R u m i n a l C e l l u l o l y t i c B a c t e r i a . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 1 9 9 1 , 5 7 : 3 1 0 1 - 3 1 0 6 . 2 9 3 . W a d a M , H e u x L , I s o g a i A , N i s h i y a m a Y , C h a n z y H , S u g i y a m a J : I m p r o v e d S t r u c t u r a l D a t a o f C e l l u l o s e I H I P r e p a r e d i n S u p e r c r i t i c a l A m m o n i a . M a c r o m o l e c u l e s 2 0 0 1 , 3 4 : 1 2 3 7 - 1 2 4 3 . 2 9 4 . C h a n z y H , H e n r i s s a t B , V i n c e n d o n M , T a n n e r S , B e l t o n P : S o l i d - s t a t e c a r b o n - l 3 N M R a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p y s t u d y o n t h e r e v e r s i b l e c e l l u l o s e I t o c e l l u l o s e I I I t r a n s f o r m a t i o n i n V a l o n i a . C a r b o h y d r R e s 1 9 8 7 , 1 6 0 2 1 - 1 1 . 4 2 1 2 9 5 . W a d a M , N i s h i y a m a Y , L a n g a n P : X - r a y S t r u c t u r e o f A m m o n i a - C e l l u l o s e I : N e w I n s i g h t s i n t o t h e C o n v e r s i o n o f C e l l u l o s e I t o C e l l u l o s e I H . M a c r o m o l e c u l e s 2 0 0 6 , 3 9 : 2 9 4 7 - 2 9 5 2 . 2 9 6 . C l a r k G L , P a r k e r E A : A n X - r a y d i f f r a c t i o n s t u d y o f t h e a c t i o n o f l i q u i d a m m o n i a o n c e l l u l o s e a n d i t s d e r i v a t i v e s . J o u r n a l o f P h y s i c a l C h e m i s t r y 1 9 3 7 , 4 1 : 7 7 7 - 7 8 6 . 2 9 7 . Y u i T , H a y a s h i S : S t r u c t u r a l s t a b i l i t y o f t h e s o l v a t e d c e l l u l o s e I l l I c r y s t a l m o d e l s : a m o l e c u l a r d y n a m i c s s t u d y . C e l l u l o s e 2 0 0 9 , 1 6 : 1 5 1 - 1 6 5 . 2 9 8 . I g a r a s h i K , W a d a M , S a m e j i m a M : A c t i v a t i o n o f c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e t o c e l l u l o s e H I r e s u l t s i n e f fi c i e n t h y d r o l y s i s b y c e l l o b i o h y d r o l a s e . F E B S J o u r n a l 2 0 0 7 , 2 7 4 1 7 8 5 - 1 7 9 2 . 2 9 9 . W e i m e r P J , L o p e z - G u i s a J M , F r e n c h A D : E f f e c t o f c e l l u l o s e fi n e s t r u c t u r e o n k i n e t i c s o f i t s d i g e s t i o n b y m i x e d r u m i n a l m i c r o o r g a n i s m s i n v i t r o . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i a l . 1 9 9 0 , 5 6 : 2 4 2 1 - 2 4 2 9 . 3 0 0 . C h e n Y , S t i p a n o v i c A , W i n t e r W , W i l s o n D , K i m Y - J : E f f e c t o f d i g e s t i o n b y p u r e c e l l u l a s e s o n c r y s t a l l i n i t y a n d a v e r a g e c h a i n l e n g t h f o r b a c t e r i a l a n d m i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e s . C e l l u l o s e 2 0 0 7 , 1 4 : 2 8 3 - 2 9 3 . 3 0 1 . S a s a k i T , T a n a k a T , N a n b u N , S a t o Y , K a i n u m a K : C o r r e l a t i o n b e t w e e n X - r a y d i f f r a c t i o n m e a s u r e m e n t s o f c e l l u l o s e c r y s t a l l i n e s t r u c t u r e a n d t h e s u s c e p t i b i l i t y t o m i c r o b i a l c e l l u l a s e . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 1 9 7 9 , 2 1 : 1 0 3 1 - 1 0 4 2 . 3 0 2 . S c h l e i c h e r H , D a n i e l s C , P h i l i p p B : C h a n g e s o f C e l l u l o s e A c c e s s i b i l i t y t o R e a c t i o n s i n A l k a l i n e M e d i u m b y A c t i v a t i o n w i t h A m m o n i a . J o u r n a l o f P o l y m e r S c i e n c e P a r t C - P o l y m e r S y m p o s i u m 1 9 7 4 : 2 5 1 - 2 6 0 . 3 0 3 . M o r m a n n W : S i l y l a t i o n o f c e l l u l o s e w i t h h e x a m e t h y l d i s i l a z a n e i n a m m o n i a - a c t i v a t i o n , c a t a l y s i s , m e c h a n i s m , p r o p e r t i e s . C e l l u l o s e 2 0 0 3 , 1 0 : 2 7 1 - 2 8 1 . 3 0 4 . M o r r n a n n W , M i c h e l U : H y d r o c e l l u l o s e s w i t h l o w d e g r e e o f p o l y m e r i s a t i o n f r o m l i q u i d a m m o n i a t r e a t e d c e l l u l o s e . C a r b o h y d r a t e P o l y m e r s 2 0 0 2 , 5 0 : 3 4 9 - 3 5 3 . 3 0 5 . M i c h e l l A : U s e f u l n e s s o f F o u r i e r - t r a n s f o r m i n f r a r e d d i f f e r e n c e s p e c t r o s c o p y f o r s t u d y i n g t h e r e a c t i o n s o f w o o d d u r i n g p u l p i n g . C e l l u l C h e m T e c h n o l 1 9 8 8 , 2 2 : 1 0 5 - 1 1 3 . 3 0 6 . S t e w a r t D , W i l s o n H , H e n d r a P , M o r r i s o n 1 : F o u r i e r - T r a n s f o r m I n f r a r e d a n d R a m a n S p e c t r o s c o p i c S t u d y o f B i o c h e m i c a l a n d C h e m i c a l T r e a t m e n t s o f O a k W o o d ( Q u e r c u s r u b r u ) a n d B a r l e y ( H o r d e u m v u l g a r e ) S t r a w . J A g r i c F o o d C h e m 1 9 9 5 , 4 3 : 2 2 1 9 - 2 2 2 5 . 3 0 7 . O k a n o T , S a r k o A : M e r c e r i z a t i o n o f c e l l u l o s e . 1 . X - r a y d i f f r a c t i o n e v i d e n c e f o r i n t e r m e d i a t e s t r u c t u r e s . J o u r n a l o f A p p l i e d P o l y m e r S c i e n c e 1 9 8 4 , 2 9 : 4 1 7 5 - 4 1 8 2 . 4 2 2 3 0 8 . T h y g e s e n A , O d d e r s h e d e J , L i l h o l t H , T h o m s e n A B , S t a h l K : O n t h e d e t e r m i n a t i o n o f c r y s t a l l i n i t y a n d c e l l u l o s e c o n t e n t i n p l a n t fi b r e s . C e l l u l o s e 2 0 0 5 , 1 2 : 5 6 3 - 5 7 6 . 3 0 9 . S e g a l L , L o e b L , C r e e l y J J : A n X - r a y S t u d y o f t h e D e c o m p o s i t i o n P r o d u c t o f t h e E t h y l a m i n e - C e l l u l o s e C o m p l e x . J o u r n a l o f P o l y m e r S c i e n c e 1 9 5 4 , 1 3 : 1 9 3 - 2 0 6 . 3 1 0 . S e g a l L , N e l s o n M L , C o n r a d C M : F u r t h e r S t u d i e s o n C o t t o n C e l l u l o s e w i t h R e d u c e d C r y s t a l l i n i t y . T e x t i l e R e s e a r c h J o u r n a l 1 9 5 3 , 2 3 : 4 2 8 - 4 3 5 . 3 1 1 . S e g a l L , C r e e l y J ] , M a r t i n A E , C o n r a d C M : A n E m p i r i c a l M e t h o d f o r E s t i m a t i n g t h e D e g r e e o f C r y s t a l l i n i t y o f N a t i v e C e l l u l o s e U s i n g t h e X - R a y D i f f r a c t o m e t e r . T e x t i l e R e s e a r c h J o u r n a l 1 9 5 9 , 2 9 : 7 8 6 - 7 9 4 . 3 1 2 . P a r k S , J o h n s o n D , I s h i z a w a C , P a r i l l a P , D a v i s M : M e a s u r i n g t h e c r y s t a l l i n i t y i n d e x o f c e l l u l o s e b y s o l i d s t a t e 1 3 C n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e . C e l l u l o s e 2 0 0 9 , 1 6 : 6 4 1 - 6 4 7 . 3 1 3 . A t a l l a R H , I s o g a i A : R e c e n t d e v e l o p m e n t s i n s p e c t r o s c o p i c a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f c e l l u l o s e . I n P o l y s a c c h a r i d e s : S t r u c t u r a l D i v e r s i t y a n d F u n c t i o n a l V e r s a t i l i t y . E d i t e d b y D u m i t r i u S : M a r c e l D e k k e r ; 1 9 9 8 . 3 1 4 . A t a l l a R , V a n d e r h a r t D : S t u d i e s o n t h e s t r u c t u r e o f c e l l u l o s e u s i n g R a m a n s p e c t r o s c o p y a n d s o l i d s t a t e l 3 C - N M R . I n I n s t i t u t e f o r P a p e r C h e m i s t r y ( I P C T e c h n i c a l P a p e r S e r i e s 2 1 7 ) . E d i t e d b y c h e m i s t r y p r ; 1 9 8 7 . v o l I P C T e c h n i c a l P a p e r S e r i e s 2 1 7 . ] 3 1 5 . A g a r w a l U , R a l p h S : F T - R a m a n S p e c t r o s c o p y o f W o o d : I d e n t i f y i n g C o n t r i b u t i o n s o f L i g n i n a n d C a r b o h y d r a t e P o l y m e r s i n t h e S p e c t r u m o f B l a c k S p r u c e ( P i c e a m a r i a n a ) . A p p l i e d S p e c t r o s c o p y 1 9 9 7 , 5 1 : 1 6 4 8 — 1 6 5 5 . 3 1 6 . B a r r y A J , P e t e r s o n F C , K i n g A J : X - R a y S t u d i e s o f R e a c t i o n s o f C e l l u l o s e i n N o n - A q u e o u s S y s t e m s . 1 . I n t e r a c t i o n o f C e l l u l o s e a n d L i q u i d A m m o n i a . J o u r n a l o f t h e A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y 1 9 3 6 , 5 8 : 3 3 3 - 3 3 7 . 3 1 7 . B o m m a r i u s A S , K a t o n a A , C h e b e n S E , P a t e l A S , R a g a u s k a s A J , K n u d s e n K , P u Y : [ C e l l u l a s e k i n e t i c s a s a f u n c t i o n o f c e l l u l o s e p r e t r e a t m e n t . M e t a b o l i c E n g i n e e r i n g 2 0 0 8 , 1 0 : 3 7 0 - 3 8 1 . 3 1 8 . H e s s K , G u n d e r m a n n J : T h e e f f e c t o f l i q u i d a m m o n i a o n c e l l u l o s e fi b e r s ( F o r m a t i o n f r o m a m m o n i a - c e l l u l o s e I , a m m o n i a - g e l l u l o s e I I a n d c e l l u l o s e 1 1 ] ) . B e r i c h t e D e r D e u t s c h e n C h e m i s c h e n G e s e l l s c h a f t 1 9 3 7 , 7 0 : 1 7 8 8 - 1 7 9 9 . 3 1 9 . N u r s t e n H : T h e M a i l l a r d R e a c t i o n . I n T h e M a i l l a r d R e a c t i o n : C h e m i s t r y , B i o c h e m i s t r y a n d I m p l i c a t i o n s . E d i t e d b y : T h e R o y a l S o c i e t y o f C h e m i s t r y ; 2 0 0 5 : 1 - 4 . 3 2 0 . d e s t r d m E : C a r b o h y d r a t e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s f r o m a l k a l i n e p r e t r e a t m e n t o f b i o m a s s . B i o m a s s B i o e n e r g y 1 9 9 1 , 1 : 6 1 - 6 4 . 4 2 3 3 2 1 . M a r o u n e k M , K o s t y u k o v s k y V , H o d r o v a B , F l i e g e r o v a K : E f f e c t o f s o l u b l e m a i l l a r d r e a c t i o n p r o d u c t s o n r u m e n m i c r o o r g a n i s m s . F o l i o M i c r o b i o l o g i c a 1 9 9 5 , 4 0 : 2 6 7 - 2 7 0 . 3 2 2 . S c h u m a c h e r D , K r o h L W : T h e E f f e c t o f M a i l l a r d R e a c t i o n P r o d u c t s o n E n z y m e R e a c t i o n s . Z e i t s c h r i f t F u r E r n a h r u n g s w i s s e n s c h a f t 1 9 9 6 , 3 5 : 2 1 3 - 2 2 5 . 3 2 3 . S c h e n z e l K , F i s c h e r S : N I R F T R a m a n S p e c t r o s c o p y — a R a p i d A n a l y t i c a l T o o l f o r D e t e c t i n g t h e T r a n s f o r m a t i o n o f C e l l u l o s e P o l y m o r p h s . C e l l u l o s e 2 0 0 1 , 8 : 4 9 - 5 7 . 3 2 4 . I r v i n e G M : T h e s i g n i fi c a n c e o f t h e g l a s s t r a n s i t i o n o f l i g n i n i n t h e r m o m e c h a n i c a l p u l p i n g . W o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y 1 9 8 5 , 1 9 : 1 3 9 - 1 4 9 . 3 2 5 . H o u t m a n C J , A t a l l a R H : C e l l u l o s e - l i g n i n i n t e r a c t i o n s . P l a n t P h y s i o l 1 9 9 5 , 1 0 7 : 9 7 7 - 9 8 4 . 3 2 6 . H e L , T e r a s h i m a N : F o r m a t i o n a n d s t r u c t u r e o f l i g n i n i n m o n o c o t y l e d o n s I . S e l e c t i v e l a b e l i n g o f t h e s t r u c t u r a l u n i t s o f l i g n i n i n r i c e p l a n t ( O r y z a s a t i v a ) w i t h 3 H a n d v i s u a l i z a t i o n o f t h e i r d i s t r i b u t i o n i n t h e t i s s u e b y m i c r o a u t o r a d i o g r a p h y . M o k u z a i G a k k a i s h i 1 9 8 9 , 3 5 : 1 1 6 - 1 2 2 . 3 2 7 . H e L T , N . : F o r m a t i o n a n d s t r u c t u r e o f l i g n i n i n m o n o c o t y l e d o n s I I . D e p o s i t i o n a n d d i s t r i b u t i o n o f p h e n o l i c a c i d s a n d t h e i r a s s o c i a t i o n w i t h c e l l w a l l p o l y m e r s i n r i c e p l a n t s ( O r y z a s a t i v a ) . M o k u z a i G a k k a i s h i 1 9 8 9 , 3 5 : 1 2 3 - 1 2 9 . 3 2 8 . H e L , T e r a s h i m a N : F o r m a t i o n a n d s t r u c t u r e o f l i g n i n i n m o n o c o t y l e d o n s . I I I . H e t e r o g e n e i t y o f s u g a r c a n e ( S a c c h a r u m o f fi c i n a r u m L . ) l i g n i n w i t h r e s p e c t t o t h e c o m p o s i t i o n o f s t r u c t u r a l u n i t s i n d i f f e r e n t m o r p h o l o g i c a l r e g i o n s . J . W o o d C h e m . T e c h n a l 1 9 9 0 , 1 0 : 4 3 5 - 4 5 9 . 3 2 9 . J u n g H G , C a s l e r M D : M a i z e S t e m T i s s u e s : I m p a c t o f D e v e l o p m e n t o n C e l l W a l l D e g r a d a b i l i t y . C r o p S c i e n c e 2 0 0 6 , 4 6 : 1 8 0 1 - 1 8 0 9 . 3 3 0 . J u n g H G , C a s l e r M D : M a i z e S t e m T i s s u e s : C e l l W a l l C o n c e n t r a t i o n a n d C o m p o s i t i o n d u r i n g D e v e l o p m e n t . C r o p S c i e n c e 2 0 0 6 , 4 6 : 1 7 9 3 - 1 8 0 0 . 3 3 1 . G r a b b e r J H , H a t fi e l d R D , R a l p h J : D i f e r u l a t e C r o s s - L i n k s I m p e d e t h e E n z y m a t i c D e g r a d a t i o n o f N o n - L i g n i fi e d M a i z e W a l l s . J o u r n a l o f t h e S c i e n c e o f F o o d a n d A g r i c u l t u r e 1 9 9 8 , 7 7 : 1 9 3 - 2 0 0 . 3 3 2 . G r a b b e r J H , R a l p h J , L a p i e r r e C , B a r r i é r e Y : G e n e t i c a n d m o l e c u l a r b a s i s o f g r a s s c e l l - w a l l d e g r a d a b i l i t y . I . L i g n i n - c e l l w a l l m a t r i x i n t e r a c t i o n s . C a m p t e s R e n d u s B i a l a g i e s 2 0 0 4 , 3 2 7 : 4 5 5 - 4 6 5 . 3 3 3 . B u n z e l M , A l l e r d i n g s E , R a l p h J , S t e i n h a r t H : C r o s s - l i n k i n g o f a r a b i n o x y l a n s v i a 8 - 8 - c o u p l e d d i f e r u l a t e s a s d e m o n s t r a t e d b y i s o l a t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f d i a r a b i n o s y l 8 - 8 ( c y c l i c ) - d e h y d r o d i f e r u l a t e f r o m m a i z e b r a n . J o u r n a l o f C e r e a l S c i e n c e 2 0 0 8 , 4 7 : 2 9 - 4 0 . 4 2 4 3 3 4 . C h e n S , M o w e r y R , C a s t l e b e r r y V , v a n W a l s u m G , C h a m b l i s s C : H i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y m e t h o d f o r s i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o n o f a l i p h a t i c a c i d , a r o m a t i c a c i d a n d n e u t r a l d e g r a d a t i o n p r o d u c t s i n b i o m a s s p r e t r e a t m e n t h y d r o l y s a t e s . J C h r o m a t A 2 0 0 6 , 1 1 0 4 : 5 4 - 6 1 . 3 3 5 . H o d g e D , K a r i m M , S c h e l l D , M c M i l l a n J : S o l u b l e a n d i n s o l u b l e s o l i d s c o n t r i b u t i o n s t o h i g h - s o l i d s e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s e . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 8 , 9 9 : 8 9 4 0 — 8 9 4 8 . 3 3 6 . L u o C , B r i n k D , B l a n c h H : I d e n t i fi c a t i o n o f p o t e n t i a l f e r m e n t a t i o n i n h i b i t o r s i n c o n v e r s i o n o f h y b r i d p o p l a r h y d r o l y z a t e t o e t h a n o l . B i o m a s s B i o e n e r g y 2 0 0 2 , 2 2 : 1 2 5 - 1 3 8 . 3 3 7 . P a l m q v i s t E , H a h n - H a g e r d a l B : F e r m e n t a t i o n o f l i g n o c e l l u l o s i c h y d r o l y s a t e s . ( 1 ) I n h i b i t i o n a n d d e t o x i fi c a t i o n . B i o r e s o u r T e c h n a l 2 0 0 0 , 7 4 : 1 7 — 2 4 . 3 3 8 . C a n t a r e l l a M , C a n t a r e l l a L , G a l l i f u o c o A , S p e r a A , A l f a n i F : E f f e c t o f i n h i b i t o r s r e l e a s e d d u r i n g s t e a m - e x p l o s i o n t r e a t m e n t o f p o p l a r w o o d o n s u b s q u e n t e n z y m a t i c h y d r o l y s i s a n d S S F . B i o t e c h n o l P r o g 2 0 0 4 , 2 0 : 2 0 0 - 2 0 6 . 3 3 9 . G a r c i a - A p a r i c i o M , B a l l e s t e r o s I , G o n z a l e z A , O l i v a J , B a l l e s t e r o s M , N e g r o M : E f f e c t o f i n h i b i t o r s r e l e a s e d d u r i n g s t e a m p r e t r e a t m e n t o f b a r l e y s t r a w o n e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n 0 1 2 0 0 6 , 1 2 9 - 1 3 2 : 2 7 8 - 2 8 8 . 3 4 0 . L a u M , D a l e B , B a l a n V : E t h a n o l i c f e r m e n t a t i o n o f h y d r o l y s a t e s f r o m a m m o n i a fi b e r e x p a n s i o n ( A F E X ) t r e a t e d c o r n s t o v e r a n d d i s t i l l e r s g r a i n w i t h o u t d e t o x i fi c a t i o n a n d e x t e r n a l n u t r i e n t s u p p l e m e n t a t i o n . B i o t e c h n o l B i o e n g 2 0 0 8 , 9 9 : 5 2 9 — 5 3 9 . 3 4 1 . M e s - H a r t r e e M , D a l e B , C r a i g W : C o m p a r i s o n o f s t e a m a n d a m m o n i a p r e t r e a t m e n t f o r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e . A p p l M i c r o b i a l B i o t e c h n o l 1 9 8 8 , 2 9 : 4 6 2 - 4 6 8 . 3 4 2 . B e l k a c e m i K , T u r c o t t e G , H a l l e u x D , S a v o i e P : E t h a n o l P r o d u c t i o n f r o m A F E X - T r e a t e d F o r a g e s a n d A g r i c u l t u r a l R e s i d u e s . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 1 9 9 8 , 7 0 - 7 2 : 4 4 1 - 4 6 2 . 3 4 3 . W a n g P , B o l k e r H , P u r v e s C : A m m o n o l y s i s o f u r o n i c e s t e r g r o u p s i n b i r c h x y l a n . C a n a d i a n J o u r n a l o f C h e m i s t r y 1 9 6 4 , 4 2 : 2 4 3 4 - 2 4 3 9 . 3 4 4 . N i e m e l a K : C o n v e r s i o n o f x y l a n , s t a r c h , a n d c h i t i n i n t o c a r b o x y l i c a c i d s b y t r e a t m e n t w i t h a l k a l i . C a r b o h y d r R e s 1 9 9 0 , 2 0 4 : 3 7 - 4 9 . 3 4 5 . P r i o r B , D a y D : H y d r o l y s i s o f A m m o n i a - p r e t r e a t e d S u g a r C a n e B a g a s s e w i t h C e l l u l a s e , B — G l u c o s i d a s e , a n d H e m i c e l l u l a s e P r e p a r a t i o n s . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 2 0 0 8 , 1 4 6 : 1 5 1 - 1 6 4 . 4 2 5 3 4 6 . S t a n d a r d B i o m a s s A n a l y t i c a l P r o c e d u r e s o n W o r l d W i d e W e b U R L : h t t p : / / w w w . n r e l . g o v / b i o n i a s s / a n a l v t i c a l p r o c e d u r e s h t m l 3 4 7 . Z h u Y , K i m T , L e e Y , C h e R , E l a n d e r R : E n z y m a t i c p r o d u c t i o n o f x y l o o l i g o s a c c h a r i d e s f r o m c o r n s t o v e r a n d c o r n c o b s t r e a t e d w i t h a q u e o u s a m m o n i a . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 2 0 0 6 , 1 2 9 - 1 3 2 : 5 8 6 - 5 9 8 . 3 4 8 . G u p t a R , K i m T , L e e Y : S u b s t r a t e D e p e n d e n c y a n d E f f e c t o f X y l a n a s e S u p p l e m e n t a t i o n o n E n z y m a t i c H y d r o l y s i s o f A m m o n i a - T r e a t e d B i o m a s s . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 2 0 0 8 , 1 4 8 : 5 9 — 7 0 . 3 4 9 . S h a n n a L N , B e c k e r C , C h a m b l i s s C K : A n a l y t i c a l C h a r a c t e r i z a t i o n o f F e r m e n t a t i o n I n h i b i t o r s i n B i o m a s s P r e t r e a t m e n t S a m p l e s U s i n g L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y , U V - V i s i b l e S p e c t r o s c o p y , a n d T a n d e m M a s s S p e c t r o m e t r y . I n B i a fi l e l s . E d i t e d b y ; 2 0 0 9 : 1 2 5 - 1 4 3 . 3 5 0 . H e r r e r a F , P u l g a r i n C , N a d t o c h e n k o V , K i w i J : A c c e l e r a t e d p h o t o - o x i d a t i o n o f c o n c e n t r a t e d p - c o u m a r i c a c i d i n h o m o g e n e o u s s o l u t i o n . M e c h a n i s t i c s t u d i e s , i n t e r m e d i a t e s a n d p r e c u r s o r s f o r m e d i n t h e d a r k . A p p l i e d C a t a l y s i s B : E n v i r o n m e n t a l 1 9 9 8 , 1 7 : 1 4 1 - 1 5 6 . 3 5 1 . M a n t z a v i n o s D , H e l l e n b r a n d R , L i v i n g s t o n A G , M e t c a l f e I S : C a t a l y t i c w e t o x i d a t i o n o f p - c o u m a r i c a c i d : P a r t i a l o x i d a t i o n i n t e r m e d i a t e s , r e a c t i o n p a t h w a y s a n d c a t a l y s t l e a c h i n g . A p p l i e d C a t a l y s i s B : E n v i r o n m e n t a l 1 9 9 6 , 7 : 3 7 9 - 3 9 6 . 3 5 2 . S u n R , S u n X F , W a n g S Q , Z h u W , W a n g X Y : E s t e r a n d e t h e r l i n k a g e s b e t w e e n h y d r o x y c i n n a m i c a c i d s a n d l i g n i n s f r o m w h e a t , r i c e , r y e , a n d b a r l e y s t r a w s , m a i z e s t e m s , a n d f a s t - g r o w i n g p o p l a r w o o d . I n d u s t r i a l C r o p s a n d P r o d u c t s 2 0 0 2 , 1 5 : 1 7 9 - 1 8 8 . 3 5 3 . A g y e i - A y e K , C h i a n M X , L a u t e r b a c h J H , M o l d o v e a n u S C : T h e r o l e o f t h e a n i o n i n t h e r e a c t i o n o f r e d u c i n g s u g a r s w i t h a m m o n i u m s a l t s . C a r b o h y d r a t e R e s e a r c h 2 0 0 2 , 3 3 7 : 2 2 7 3 - 2 2 7 7 . 3 5 4 . V a n S o e s t P J : C a r b o h y d r a t e s . I n N u t r i t i o n a l E c o l o g y o f t h e R u m i n a n t . E d i t e d b y : C o m s t o c k P u b l i s h e r s ; 1 9 9 4 : 1 5 6 - 1 7 6 . 3 5 5 . T h o m a l l e y P J : D i c a r b o n y l i n t e r m e d i a t e s i n t h e M a i l l a r d r e a c t i o n . I n M a i l l a r d R e a c t i o n : C h e m i s t r y a t t h e I n t e r f a c e o f N u t r i t i o n , A g i n g , a n d D i s e a s e . E d i t e d b y : A n n a l s o f t h e N e w Y o r k A c a d e m y o f S c i e n c e s ; 2 0 0 5 : 1 1 1 - 1 1 7 . A n n a l s o f t h e N e w Y o r k A c a d e m y o f S c i e n c e s , v o l 1 0 4 3 . ] 3 5 6 . V a n S o e s t P J , M a s o n V C : T h e i n f l u e n c e o f t h e M a i l l a r d r e a c t i o n u p o n t h e n u t r i t i v e v a l u e o f fi b r o u s f e e d s . A n i m a l F e e d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y 1 9 9 1 , 3 2 : 4 5 - 5 3 . 3 5 7 . J i n g X , Z h a n g X , B a o J : I n h i b i t i o n P e r f o r m a n c e o f L i g n o c e l l u l o s e D e g r a d a t i o n P r o d u c t s o n I n d u s t r i a l C e l l u l a s e E n z y m e s D u r i n g C e l l u l o s e H y d r o l y s i s . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 9 , 1 5 9 : 6 9 6 - 7 0 7 . 4 2 6 3 5 8 . T a h e r z a d e h M J , E k l u n d R , G u s t a f s s o n L , N i k l a s s o n C , L i d e n G : C h a r a c t e r i z a t i o n a n d F e r m e n t a t i o n o f D i l u t e - A c i d H y d r o l y z a t e s f r o m W o o d . I n d u s t r i a l & E n g i n e e r i n g C h e m i s t r y R e s e a r c h 1 9 9 7 , 3 6 : 4 6 5 9 - 4 6 6 5 . 3 5 9 . D u n l o p A P : F u r f u r a l F o r m a t i o n a n d B e h a v i o r . I n d u s t r i a l & E n g i n e e r i n g C h e m i s t r y 1 9 4 8 , 4 0 : 2 0 4 - 2 0 9 . 3 6 0 . X u F , S u n J X , G e n g Z C , L i u C F , R e n J L , S u n R C , F o w l e r P , B a i r d M S : C o m p a r a t i v e S t u d y o f W a t e r - S o l u b l e a n d A l k a l i - S o l u b l e H e m i c e l l u l a s e s f r o m P e r e n n i a l R y e g r a s s L e a v e s ( L a l i u m p e r e e ) . C a r b o h y d r a t e P o l y m e r s 2 0 0 7 , 6 7 : 5 6 - 6 5 . 3 6 1 . K u r a k a k e M , K i s a k a W , K a z u y a O u c h i K , K o m a k i T : P r e t r e a t m e n t w i t h a m m o n i a w a t e r f o r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f c o r n h u s k , b a g a s s e , a n d s w i t c h g r a s s . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 2 0 0 1 , 9 0 . 3 6 2 . K n i l l C , K e n n e d y J : D e g r a d a t i o n o f c e l l u l o s e u n d e r a l k a l i n e c o n d i t i o n s . C a r b o h y d r a t e P o l y m e r s 2 0 0 3 , 5 1 : 2 8 1 - 3 0 0 . 3 6 3 . P a v a s a r s I , H a g b e r g J , B o r e n H , A l l a r d B : A l k a l i n e D e g r a d a t i o n o f C e l l u l o s e : M e c h a n i s m s a n d K i n e t i c s . J o u r n a l o f P o l y m e r s a n d t h e E n v i r o n m e n t 2 0 0 3 , 1 1 : 3 9 - 4 7 . 3 6 4 . B u r a u R , S t o u t P : T r a n s - A c o n i t i c A c i d i n R a n g e G r a s s e s i n E a r l y S p r i n g . S c i e n c e 1 9 6 5 , 1 5 0 : 7 6 6 — 7 6 7 . 3 6 5 . M a s s e l t e r S , Z e m a n n A , B o b l e t e r 0 : A n a l y s i s o f l i g n i n d e g r a d a t i o n p r o d u c t s b y c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s . C h r o m a t o g r a p h i a 1 9 9 5 , 4 0 : 5 1 - 5 7 . 3 6 6 . K l i n k e H B , O l s s o n L , T h o m s e n A B , A h r i n g B K : P o t e n t i a l i n h i b i t o r s f r o m w e t o x i d a t i o n o f w h e a t s t r a w a n d t h e i r e f f e c t o n e t h a n o l p r o d u c t i o n o f S a c c h a r a m y c e s c e r e v i s i a e : W e t o x i d a t i o n a n d f e r m e n t a t i o n b y y e a s t . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 3 , 8 1 : 7 3 8 - 7 4 7 . 3 6 7 . B a e z a J , F r e e r J : C h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f w o o d a n d i t s c o m p o n e n t s . E d i t e d b y H o n D N S , S h i r a s h i N . N e w Y o r k : D e k k e r ; 1 9 9 7 . 3 6 8 . J d n s s o n L J , P a l m q v i s t E , N i l v e b r a n t N O , H a h n - H a g e r d a l B : D e t o x i fi c a t i o n o f w o o d h y d r o l y s a t e s w i t h l a c c a s e a n d p e r o x i d a s e f r o m t h e w h i t e - r o t f u n g u s T r a m e t e s v e r s i c a l a r . A p p l M i c r o b i o l B i o t e c h n o l 1 9 9 8 , 4 9 : 6 9 1 - 6 9 7 . 3 6 9 . A g b l e v o r F A , F u J , H a m e s B , M c M i l l a n J D : I d e n t i fi c a t i o n o f M i c r o b i a l I n h i b i t o r y F u n c t i o n a l G r o u p s i n C o r n S t o v e r H y d r o l y s a t e b y C a r b o n - l 3 N u c l e a r M a g n e t i c R e s o n a n c e S p e c t r o s c o p y . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 4 , 1 1 9 2 9 7 - 1 2 0 . 3 7 0 . F e n s k e J J , G r i f fi n D A , P e n n e r M H : C o m p a r i s o n o f a r o m a t i c m o n o m e r s i n l i g n o c e l l u l o s i c b i o m a s s p r e h y d r o l y s a t e s . J o u r n a l o f I n d u s t r i a l M i c r o b i o l o g y & B i o t e c h n o l o g y 1 9 9 8 , 2 0 : 3 6 4 - 3 6 8 . 4 2 7 3 7 1 . C h e s s o n A : E f f e c t o f s o d i u m h y d r o x i d e o n c e r e a l s t r a w s i n r e l a t i o n t o e n h a n c e d d e g r a d a t i o n o f s t r u c t u r a l p o l y s a c c h a r i d e s b y r u m e n m i c r o o r g a n i s m s . J S c i F o o d A g r i 1 9 8 1 , 3 2 : 7 4 5 - 7 5 8 . 3 7 2 . T h e o d o r o u M K , G a s c o y n e D J , A k i n D E , H a r t l e y R D : E f f e c t o f P h e n o l i c - A c i d s a n d P h e n o l i c s f r o m P l a n t - C e l l W a l l s o n R u m e n l i k e F e r m e n t a t i o n i n C o n s e c u t i v e B a t c h C u l t u r e . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 1 9 8 7 , 5 3 : 1 0 4 6 - 1 0 5 0 . 3 7 3 . M a r t i n S A , A k i n D E : E f f e c t o f P h e n o l i c M o n o m e r s o n t h e G r o w t h a n d B e t a - G l u c o s i d a s e A c t i v i t y o f B a c t e r a i d e s R u m i n i c a l a a n d o n t h e C a r b o x y m e t h y l c e l l u l a s e , B e t a - G l u c o s i d a s e , a n d X y l a n a s e A c t i v i t i e s o f B a c t e r o i d e s S u c c i n a g e n e s . A p p l i e d a n d E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 1 9 8 8 , 5 4 : 3 0 1 9 - 3 0 2 2 . 3 7 4 . G a m b l e G R , S n o o k M E , H e n r i k s s o n G , A k i n D E : P h e n o l i c c o n s t i t u e n t s i n f l a x h a s t t i s s u e a n d i n h i b i t i o n o f c e l l u l a s e a n d p e c t i n a s e . B i o t e c h n o l o g y L e t t e r s 2 0 0 0 , 2 2 : 7 4 1 - 7 4 6 . 3 7 5 . P a n a g i o t o u G , O l s s o n L : E f f e c t o f c o m p o u n d s r e l e a s e d d u r i n g p r e t r e a t m e n t o f w h e a t s t r a w o n m i c r o b i a l g r o w t h a n d e n z y m a t i c h y d r o l y s i s r a t e s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 7 , 9 6 : 2 5 0 - 2 5 8 . 3 7 6 . N a r e n d r a n a t h N V , T h o m a s K C , I n g l e d e w W M : E f f e c t s o f a c e t i c a c i d a n d l a c t i c a c i d o n t h e g r o w t h o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e i n a m i n i m a l m e d i u m . J o u r n a l o f I n d u s t r i a l M i c r o b i o l o g & B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 1 , 2 6 : 1 7 1 - 1 7 7 . 3 7 7 . Z a l d i v a r J , M a r t i n e z A , I n g r a m L O : E f f e c t o f a l c o h o l c o m p o u n d s f o u n d i n h e m i c e l l u l o s e h y d r o l y s a t e o n t h e g r o w t h a n d f e r m e n t a t i o n o f e t h a n o l o g e n i c E s c h e r i c h i a c a l i . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 0 , 6 8 : 5 2 4 - 5 3 0 . 3 7 8 . M a r t i n S A : E f f e c t o f P h e n o l i c C o m p o u n d s o n F i b e r - D e g r a d i n g E n z y m e s f r o m R u m e n B a c t e r i a . E d i t e d b y A k i n D E ; 1 9 9 0 : 2 8 9 - 3 0 0 . 3 7 9 . L a u M W , D a l e B E : C e l l u l o s i c e t h a n o l p r o d u c t i o n f r o m A F E X - t r e a t e d c o r n s t o v e r u s i n g S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e 4 2 4 A ( L N H - S T ) . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s 2 0 0 9 , 1 0 6 : 1 3 6 8 - 1 3 7 3 . 3 8 0 . H o u g h t o n J , W e a t h e r m a x S , F e r r e l l J : B r e a k i n g t h e B i o l o g i c a l B a r r i e r s t o C e l l u l o s i c E t h a n o l : A J o i n t R e s e a r c h A g e n d a . I n D e p a r t m e n t o f E n e r g y . E d i t e d b y E n e r g y D o ; 2 0 0 6 . 3 8 1 . E P O B I O : C e l l w a l l s a c c h a r i fi c a t i o n . O u t p u t s f r o m t h e E P O B I O p r o j e c t - N o v e m b e r 2 0 0 6 . h t t p : / / w w m e p o b i o . n e fl r d fl M M 1 [ C e l l l l t ’ a l l S a c c h a r ' i fi c a t i o a n p o r t _ c . p d j . 3 8 2 . T u r n e r P , M a m o G , K a r l s s o n E N : P o t e n t i a l a n d u t i l i z a t i o n o f t h e r m o p h i l e s a n d t h e r m o s t a b l e e n z y m e s i n b i o r e fi n i n g . M i c r o b i a l c e l l f a c t o r i e s 2 0 0 7 , 6 : 9 . 3 8 3 . G h o s e T : M e a s u r e m e n t o f c e l l u l a s e a c t i v i t y . I n C o m m i s s i o n o n B i o t e c h n o l o g y , I n t e r n a t i o n a l U n i o n o f P u r e a n d A p p l i e d C h e m i s t r y , N e w D e l h i , I n d i a , 1 9 8 4 . 4 2 8 3 8 4 . C o w a r d - K e l l y G , A i e l l o - M a z z a r i C , K i m S , G r a n d a C , H o l t z a p p l e M T : S u g g e s t e d i m p r o v e m e n t s t o t h e s t a n d a r d fi l t e r p a p e r a s s a y u s e d t o m e a s u r e c e l l u l a s e a c t i v i t y . B i o t e c h n o l B i o e n g 2 0 0 3 , 8 2 : 7 4 5 - 7 4 9 . 3 8 5 . K a b e l M , v a n d e r M a a r e l M , K l i p G , V o r a g e n A , S c h o l s H : S t a n d a r d a s s a y s d o n o t p r e d i c t t h e e f fi c i e n c y o f c o m m e r c i a l c e l l u l a s e p r e p a r a t i o n s t o w a r d s p l a n t m a t e r i a l s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 6 , 9 3 : 5 6 - 6 3 . 3 8 6 . A l i z a d e h H , T e y m o u r i F , G i l b e r t T I , D a l e B E : P r e t r e a t m e n t o f s w i t c h g r a s s b y a m m o n i a fi b e r e x p l o s i o n ( A F E X ) . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 1 2 4 : 1 1 3 3 - 1 1 4 1 . 3 8 7 . M u m e n H K , B a l a n V , C h u n d a w a t S P S , B a l s B , S o u s a L D , D a l e B E : O p t i m i z a t i o n o f a m m o n i a fi b e r e x p a n s i o n ( A F E X ) p r e t r e a t m e n t a n d e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f M i s c a n t h u s x g i g a n t e u s t o f e r m e n t a b l e s u g a r s . B i o t e c h n o l o g y P r o g r e s s 2 0 0 7 , 2 3 : 8 4 6 - 8 5 0 . 3 8 8 . T e y m o u r i F , L a u r e a n o - P e r e z L , A l i z a d e h H , D a l e B E : A m m o n i a fi b e r e x p l o s i o n t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 4 , 1 1 3 - 1 6 : 9 5 1 - 9 6 3 . 3 8 9 . S h a r r o c k K R : C e l l u l a s e a s s a y m e t h o d s : a r e v i e w . J o u r n a l o f B i o c h e m i c a l a n d B i o p h y s i c a l M e t h o d s 1 9 8 8 , 1 7 : 8 1 - 1 0 5 . 3 9 0 . D e c k e r S R , A d n e y W S , J e n n i n g s E , V i n z a n t T B , H i m m e l M E : A u t o m a t e d fi l t e r p a p e r a s s a y f o r d e t e r m i n a t i o n o f c e l l u l a s e a c t i v i t y . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 3 , 1 0 5 : 6 8 9 - 7 0 3 . 3 9 1 . X i a o Z , S t o r m s R , T s a n g A : M i c r o p l a t e - b a s e d fi l t e r p a p e r a s s a y t o m e a s u r e t o t a l c e l l u l a s e a c t i v i t y . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 4 , 8 8 : 8 3 2 - 8 3 7 . 3 9 2 . B e r l i n A , M a x i m e n k o V , B u r a R , K a n g K , G i l k e s N , S a d d l e r J : A r a p i d m i c r o a s s a y t o e v a l u a t e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s . B i o t e c h B i o e n g 2 0 0 6 , 9 3 : 8 8 0 — 8 8 6 . 3 9 3 . W e i m e r P J , D i e n B S , S p r i n g e r T L , V o g e l K P : I n v i t r o g a s p r o d u c t i o n a s a s u r r o g a t e m e a s u r e m e n t o f t h e f e r m e n t a b i l i t y o f c e l l u l o s i c b i o m a s s . A p p l M i c r o b i o l B i o t e c h n o l 2 0 0 5 , 6 7 : 5 2 - 5 8 . 3 9 4 . B o y e r V , F o r t S , F r a n d s e n T P , S c h fi l e i n M , C o t t a z S , D r i g u e z H : C h e m o e n z y m a t i c s y n t h e s i s o f a b i f u n c t i o n a l i z e d c e l l o h e x a o s i d e a s a s p e c i fi c s u b s t r a t e f o r t h e s e n s i t i v e a s s a y o f c e l l u l a s e b y f l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g . C h e m i s t r y ( W e i n h e i m a n d e r B e r g s t r a s s e , G e r m a n y ) 2 0 0 2 , 8 : 1 3 8 9 - 1 3 9 4 . 3 9 5 . H e l b e r t W , C h a n z y H , H u s u m T , S c h u l e i n M , E r n s t S : F l u o r e s c e n t C e l l u l o s e M i c r o fi b r i l s A s S u b s t r a t e f o r t h e D e t e c t i o n o f C e l l u l a s e A c t i v i t y . B i o m a c r o m o l e c u l e s 2 0 0 3 , 4 : 4 8 1 - 4 8 7 . 4 2 9 3 9 6 . G o d d a r d J , R e y m o n d J : E n z y m e a s s a y s f o r h i g h - t h r o u g h p u t s c r e e n i n g . C u r r O p i n B i o t e c h n o l 2 0 0 4 , 1 5 : 3 1 4 - 3 2 2 . 3 9 7 . C u l l i s I F , S a d d l e r J N , M a n s fi e l d S D : E f f e c t o f i n i t i a l m o i s t u r e c o n t e n t a n d c h i p s i z e o n t h e b i o c o n v e r s i o n e f f i c i e n c y o f s o f t w o o d l i g n o c e l l u l o s i c s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 4 , 8 5 : 4 1 3 - 4 2 1 . 3 9 8 . Z e n g M , M o s i e r N S , H u a n g C - P , S h e r m a n D M , L a d i s c h M R : M i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f c h a n g e s o f p l a n t c e l l s t r u c t u r e i n c o r n s t o v e r d u e t o h o t w a t e r p r e t r e a t m e n t a n d e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 7 , 9 7 : 2 6 5 - 2 7 8 . 3 9 9 . V a n d y k e J r H H : E n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e : a k i n e t i c s t u d y [ P h . D . T h e s i s ] . B o s t o n : M I T : 1 9 7 2 . 4 0 0 . S a n g s e e t h o n g K , M e u n i e r - G o d d i k L , T a n t a s u c h a r i t U , L i a w E , P e n n e r M H : R a t i o n a l e f o r p a r t i c l e s i z e e f f e c t o n r a t e s o f e n z y m a t i c s a c c h a r i fi c a t i o n o f m i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e . J F o o d B i o c h e m 1 9 9 8 , 2 2 : 3 2 1 - 3 3 0 . 4 0 1 . G h a r p u r a y M , L e e Y , F a n L T : S t r u c t u r a l m o d i fi c a t i o n o f l i g n o c e l l u l o s i c s b y p r e t r e a t m e n t s t o e n h a n c e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . B i o t e c h n o l B i o e n g 1 9 8 3 , 2 5 : 1 5 7 - 1 7 2 . 4 0 2 . G a n Q , A l l e n S J , T a y l o r G : K i n e t i c d y n a m i c s i n h e t e r o g e n e o u s e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e : a n o v e r v i e w , a n e x p e r i m e n t a l s t u d y a n d m a t h e m a t i c a l m o d e l i n g . P r o c B i o c h e m 2 0 0 3 , 3 8 : 1 0 0 3 - 1 0 1 8 . 4 0 3 . C o u l s o n J M , R i c h a r d s o n J F : C h e m i c a l E n g i n e e r i n g - P a r t i c l e T e c h n o l o g y & S e p a r a t i o n P r o c e s s e s , v o l 2 e d n 5 . O x f o r d : B u t t e r w o r t h - H e i n e m a n n ; 2 0 0 2 . 4 0 4 . P e r r y R H , G r e e n D W : P e r r y ’ s C h e m i c a l E n g i n e e r s ' H a n d b o o k e d n 7 . N e w Y o r k : M c G r a w - H i l l ; 1 9 9 7 . 4 0 5 . H u a n g A A : K i n e t i c s t u d i e s o n i n s o l u b l e c e l l u l o s e / c e l l u l a s e s y s t e m . B i o t e c h B i o e n g 1 9 7 5 , 1 7 : 1 4 2 1 - 1 4 3 3 . 4 0 6 . P e n n e r M H , L i a w E T : K i n e t i c c o n s e q u e n c e s o f h i g h r a t i o s o f s u b s t r a t e t o e n z y m e s a c c h a r i fi c a t i o n s y s t e m s b a s e d o n T r i c h a d e r m a c e l l u l a s e . I n E n z y m a t i c C o n v e r s i o n o f B i o m a s s f o r F u e l s P r o d u c t i o n ; W a s h i n g t o n , D C , E d i t e d b y H i m m e l M E , B a k e r J O , O v e r e n d R P : A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y : 1 9 9 4 : 3 6 3 - 3 7 1 . 4 0 7 . G u s a k o v A V , S i n i t s y n A P , D a v y d k i n I Y , D a v y d k i n V Y , P r o t a s O V : E n h a n c e m e n t o f e n z y m a t i c c e l l u l o s e h y d r o l y s i s u s i n g a n o v e l t y p e o f b i o r e a c t o r w i t h i n t e n s i v e s t i r r i n g i n d u c e d b y e l e c t r o m a g n e t i c fi e l d . A p p l B i o c h e m B i o t e c h 1 9 9 6 , 5 6 : 1 4 1 - 1 5 3 . 4 0 8 . G u t ' e r r e s B , S i n i t s y n A P , K a s t e l ‘ y a n o s O F , B e r l i n A K , K o v a l e v G V , O k u n e v O N : E n z y m a t i c s a c c h a r i fi c a t i o n o f c e l l u l o s e - b a s e d m a t e r i a l s b y t h e c e l l u l a s e c o m p l e x o f P e n i c i l l i u m v e r r u c u l a s u m i n v a r i o u s t y p r e s o f s t i r r e d r e a c t o r s . A p p l B i o c h e m M i c r o b i a l 1 9 9 8 , 3 4 : 5 6 4 - 5 6 8 . 4 3 0 4 0 9 . E l s h a f e i A M , V e g a J L , K l a s s o n K T , C l a u s e n E C , G a d d y I L : T h e s a c c h a r i fi c a t i o n o f c o r n s t o v e r b y c e l l u l a s e f r o m P e n i c i l l i u m - f u n i c u l a s u m . B i o r e s o u r T e c h n a l 1 9 9 1 , 3 5 : 7 3 - 8 0 . 4 1 0 . L e r o u x e l O , C h o c T S , S e v e n o M , U s a d e l B , F a y e L , L e r o u g e P , P a u l y M : R a p i d s t r u c t u r a l p h e n o t y p i n g o f p l a n t c e l l w a l l m u t a n t s b y e n z y m a t i c o l i g o s a c c h a r i d e fi n g e r p r i n t i n g . P l a n t P h y s i o l 2 0 0 2 , 1 3 0 : 1 7 5 4 - 1 7 6 3 . 4 1 1 . M i l l e r G L : U s e o f d i n i t r o s a l i c y l i c a c i d r e a g e n t f o r d e t e r m i n a t i o n o f r e d u c i n g s u g a r . A n a l C h e m 1 9 5 9 , 3 1 : 4 2 6 - 4 2 8 . 4 1 2 . S o m o g y i M : N o t e s o n s u g a r d e t e r m i n a t i o n . J B i o l C h e m 1 9 5 2 , 1 9 5 : 1 9 - 2 3 . 4 1 3 . G r e e n P , C l a u s e n C A , H i g h l e y T A : A d a p t a t i o n o f t h e N e l s o n - S o m o g y i r e d u c i n g - s u g a r a s s a y t o a m i c r o a s s a y u s i n g m i c r o t i t e r p l a t e s . A n a l B i o c h e m 1 9 8 9 , 1 8 2 : 1 9 7 - 1 9 9 . 4 1 4 . Z h a n g Y - H P , L y n d L R : D e t e r m i n a t i o n o f t h e n u m b e r - a v e r a g e d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n o f c e l l o d e x t r i n s a n d c e l l u l o s e w i t h a p p l i c a t i o n t o e n z y m a t i c h y d r o l y s i s . B i o m a c r o m o l e c u l e s 2 0 0 5 , 6 : 1 5 1 0 - 1 5 1 5 . 4 1 5 . R o e J H : T h e d e t e r m i n a t i o n o f s u g a r i n b l o o d a n d s p i n a l fl u i d w i t h a n t h r o n e r e a g e n t . J B i o l C h e m 1 9 5 5 , 2 1 2 : 3 3 5 - 3 4 3 . 4 1 6 . S e n g u p t a S , J a n a M L , S e n g u p t a D , N a s k a r A K : A n o t e o n t h e e s t i m a t i o n o f m i c r o b i a l g l y c o s i d a s e a c t i v i t i e s b y d i n i t r o s a l i c y l i c a c i d r e a g e n t . A p p l i e d M i c r o b i o l o g y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 0 , 5 3 : 7 3 2 - 7 3 5 . 4 1 7 . S c h w a l d W , C h a n M , B r e u i l C , S a d d l e r J D : C o m p a r i s o n o f H P L C a n d c o l o r i m e t r i c m e t h o d s f o r m e a s u r i n g c e l l u l o l y t i c a c t i v i t y . A p p l M i c r o b i o l B i o t e c h n o l 1 9 8 8 , 2 8 : 3 9 8 - 4 0 3 . 4 1 8 . R i v e r s D , G r a c h e c k S , W o o d f o r d L : L i m i t a t i o n s o f t h e D N S a s s a y f o r r e d u c i n g s u g a r s f r o m s a c c h a r i fi e d l i g n o c e l l u l o s i c . B i o t e c h n o l B i o e n g 1 9 8 4 , 2 6 : 8 0 0 - 8 0 2 . 4 1 9 . J o r g e n s e n H , K u t t e r J , O l s s o n L : S e p a r a t i o n a n d q u a n t i fi c a t i o n o f c e l l u l a s e s a n d h e m i c e l l u l a s e s b y c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s . A n a l B i o c h e m 2 0 0 3 , 3 1 7 : 8 5 - 9 3 . 4 2 0 . K o l b e J , K u b i c e k C : Q u a n t i fi c a t i o n a n d i d e n t i fi c a t i o n o f t h e m a i n c o m p o n e n t s o f t h e T r i c h o d e r m a c e l l u l a s e c o m p l e x w i t h m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s u s i n g a n e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) . A p p l M i c r o b i a l B i o t e c h n o l 1 9 9 0 , 3 4 : 2 6 — 3 0 . 4 2 1 . V i n z a n t T , A d n e y W , D e c k e r S , B a k e r J , K i n t h e r M , S h e r m a n N , F o x J , H i m m e l M : F i n g e r p r i n t i n g T r i c h o d e r m a r e e s e i h y d r o l a s e s i n a c o m m e r c i a l c e l l u l a s e p r e p a r a t i o n . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 2 0 0 1 , 9 1 - 9 3 2 9 9 - 1 0 7 . 4 2 2 . M a r k o v A , G u s a k o v A , K o n d r a t y e v a E , O k u n e v O , B e k k a r e v i c h A , S i n i t s y n A : N e w E f f e c t i v e M e t h o d f o r A n a l y s i s o f t h e C o m p o n e n t C o m p o s i t i o n o f E n z y m e C o m p l e x e s f r o m T r i c h o d e r m a r e e s e i . B i o c h e m i s t r y ( M o s c o w ) 2 0 0 5 , 7 0 : 6 5 7 - 6 6 3 . 4 3 1 4 2 3 . L i p t o n M S , P a s a - T o l i c L , G o r d o n A A , A n d e r s o n D J , A u b e r r y D L , B a t t i s t a J R , D a l y M J , F r e d r i c k s o n J , H i x s o n K K , K o s t a n d a r i t h e s H , e t a l . : G l o b a l A n a l y s i s o f t h e D e i n o c o c c u s r a d i o d u r a n s P r o t e o m e b y U s i n g A c c u r a t e M a s s T a g s . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U n i t e d S t a t e s o f A m e r i c a 2 0 0 2 , 9 9 : 1 1 0 4 9 - 1 1 0 5 4 . 4 2 4 . S t e e n H , M a n n M : T h e A B C ' s ( a n d X Y Z ' s ) o f p e p t i d e s e q u e n c i n g . N a t u r e R e v i e w s M o l e c u l a r C e l l B i o l o g y 2 0 0 4 , 5 : 6 9 9 - 7 1 1 . 4 2 5 . N e s v i z h s k i i A , V i t e k O , A e b e r s o l d R : A n a l y s i s a n d v a l i d a t i o n o f p r o t e o m i c d a t a g e n e r a t e d b y t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y . N a t u r e M e t h o d s 2 0 0 7 , 4 : 7 8 7 - 7 9 7 . 4 2 6 . O n g S , M a n n M : M a s s - s p e c t r o m e t r y b a s e d p r o t e o m i c s t u r n s q u a n t i t a t i v e . N a t u r e C h e m i c a l B i o l o g y 2 0 0 5 , 1 : 2 5 2 - 2 6 2 . 4 2 7 . L i u H , S a d y g o v R G , Y a t e s J R : A M o d e l f o r R a n d o m S a m p l i n g a n d E s t i m a t i o n o f R e l a t i v e P r o t e i n A b u n d a n c e i n S h o t g u n P r o t e o m i c s . A n a l y t i c a l C h e m i s t r y 2 0 0 4 , 7 6 : 4 1 9 3 - 4 2 0 1 . 4 2 8 . G a o J , O p i t e c k G J , F r i e d r i c h s M S , D o n g r e A R , H e fi a S A : C h a n g e s i n t h e P r o t e i n E x p r e s s i o n o f Y e a s t a s a F u n c t i o n o f C a r b o n S o u r c e . J o u r n a l o f P r o t e o m e R e s e a r c h 2 0 0 3 , 2 : 6 4 3 - 6 4 9 . 4 2 9 . P a n g J X , G i n a n n i N , D o n g r e A R , H e f t a S A , O p i t e c k G J : B i o m a r k e r D i s c o v e r y i n U r i n e b y P r o t e o m i c s . J o u r n a l o f P r o t e o m e R e s e a r c h 2 0 0 2 , 1 : 1 6 1 - 1 6 9 . 4 3 0 . N a g e n d r a n S , H a l l e n - A d a r n s H E , P a p e r J M , A s l a m N , W a l t o n J D : R e d u c e d g e n o m i c p o t e n t i a l f o r s e c r e t e d p l a n t c e l l - w a l l - d e g r a d i n g e n z y m e s i n t h e e c t o m y c o r r h i z a l f u n g u s A m a n i t a b i s p o r i g e r a , b a s e d o n t h e s e c r e t o m e o f T r i c h o d e r m a r e e s e i . F u n g a l G e n e t i c s a n d B i o l o g y 2 0 0 9 , 4 6 : 4 2 7 - 4 3 5 . 4 3 1 . B e r l i n A , G i l k e s N , K i l b u r n D , B u r a R , M a r k o v A , S k o m a r o v s k y A , O k u n e v O , G u s a k o v A , M a x i m e n k o V , G r e g g D , e t a l . : E v a l u a t i o n o f n o v e l f u n g a l c e l l u l a s e p r e p a r a t i o n s f o r a b i l i t y t o h y d r o l y z e s o f t w o o d s u b s t r a t e s - e v i d e n c e f o r t h e r o l e o f a c c e s s o r y e n z y m e s . E n z y m e a n d M i c r o b i a l T e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 3 7 : 1 7 5 - 1 8 4 . 4 3 2 . B e r l i n A , G i l k e s N , K i l b u r n D , M a x i m e n k o V , B u r a R , M a r k o v M , S k o m a r o v s k y A , G u s a k o v A , S i n i t s y n A , O k u n e v O , e t a l . : E v a l u a t i o n o f c e l l u l a s e p r e p a r a t i o n s f o r h y d r o l y s i s o f h a r d w o o d s u b s t r a t e s . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n 0 1 2 0 0 6 , 1 3 0 5 2 8 - 5 4 5 . 4 3 3 . B o i s s e t C , P e t r e q u i n C , C h a n z y H , H e n r i s s a t B , S c h u l e i n M : O p t i m i z e d m i x t u r e s o f r e c o m b i n a n t H u m i c o l a i n s o l e n s c e l l u l a s e s f o r t h e b i o d e g r a d a t i o n o f c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e . B i o t e c h B i o e n g 2 0 0 1 , 7 2 : 3 3 9 - 3 4 5 . 4 3 4 . S a l o h e i m o A , I l m e n M , A r o N , M a r g o l l e s - C l a r k E , P e n t t i l a M : R e g u l a t o r y m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n t h e e x p r e s s i o n o f e x t r a c e l l u l a r h y d r o l y t i c e n z y m e s f r o m T r i c h o d e r m a . I n C a r b o h y d r a s e s fi o m T r i c h o d e r m a r e e s e i a n d o t h e r m i c r o o r g a n i s m s — S t r u c t u r e , b i o c h e m i s t r y , g e n e t i c s a n d a p p l i c a t i o n s : P r o c e e d i n g s o f T r i c e l 1 9 9 7 m e e t i n g ; 4 3 2 C a m b r i d g e , U K , E d i t e d b y C l a e y s s e n s M , N e r i n c k x W , P i e n s K : T h e R o y a l S o c e i t y o f C h e m i s t r y : 1 9 9 8 : 2 6 7 - 2 7 3 . 4 3 5 . T h o m a s S , L a y m a n R , C h o u Y , T u c k e r M , V i n z a n t T , W i l l i a m S , B a k e r J , M i e l e n z J , H i m m e l M : I n i t i a l a p p r o a c h e s t o a r t i f i c i a l c e l l u l o s e s y s t e m s f o r c o n v e r s i o n o f b i o m a s s t o e t h a n o l , v o l 6 1 8 . E d i t e d b y S a d d l e r J , P e n n e r M . W a s h i n g t o n , D C : A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y ; 1 9 9 5 . 4 3 6 . L y n d L R , W e i m e r P J , v a n Z y l W H , P r e t o r i u s I S : M i c r o b i a l C e l l u l o s e U t i l i z a t i o n : F u n d a m e n t a l s a n d B i o t e c h n o l o g y . M c r a b i a l . M o l . B i o l . R e v . 2 0 0 2 , 6 6 : 5 0 6 - 5 7 7 . 4 3 7 . L y n d L R , Z y l W H v , M c B r i d e J E , L a s e r M : C o n s o l i d a t e d b i o p r o c e s s i n g o f c e l l u l o s i c b i o m a s s : a n u p d a t e . C u r r e n t O p i n i o n i n B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 5 , 1 6 : 5 7 7 - 5 8 3 . 4 3 8 . S c h e f f é H : T h e S i m p l e x - C e n t r o i d D e s i g n f o r E x p e r i m e n t s w i t h M i x t u r e s . J R o y a l S t a t S a c S e r B ( M e t h o d o l o g i c a l ) 1 9 6 3 , 2 5 : 2 3 5 - 2 6 3 . 4 3 9 . K i m B , I r w i n D , W a l k e r L , W i l s o n D : F a c t o r i a l o p t i m i z a t i o n o f a s i x - c e l l u l a s e m i x t u r e . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 1 9 9 8 , 5 8 : 4 9 4 - 5 0 1 . 4 4 0 . B u c h e r t J , R a n u a M , K a n t e l i n e n A , V i i k a r i L : T h e r o l e o f t w o T r i c h o d e r m a r e e s e i x y l a n a s e s i n t h e b l e a c h i n g o f k r a f t p u l p . A p p l M i c r o b B i o t e c h n o l 1 9 9 2 , 3 7 : 8 2 5 - 8 2 9 . 4 4 1 . T a b k a M , H e r p o e l - G i m b e r t I , M o n o d F , A s t h e r M , S i g o i l l o t J : E n z y m a t i c s a c c h a r i fi c a t i o n o f w h e a t s t r a w f o r b i o e t h a n o l p r o d u c t i o n b y a c o m b i n e d c e l l u l a s e , x y l a n a s e a n d f e r u l o y l e s t e r a s e t r e a t m e n t . E n z y m e a n d m i c r o b i a l t e c h n o l o g y 2 0 0 6 , 3 9 : 8 9 7 - 9 0 2 . 4 4 2 . H e s p e l l R B , O ' B r y a n P J , M o n i r u z z a m a n M , B o t h a s t R J : H y d r o l y s i s b y c o m m e r c i a l e n z y m e m i x t u r e s o f A F E X - t r e a t e d c o r n fi b e r a n d i s o l a t e d x y l a n s . A p p l B i o c h e m B i o t e c h 1 9 9 7 , 6 2 8 7 - 9 7 . 4 4 3 . D i e n B , X i m e n e s E , O ' B r y a n P , M o n i r u z z a m a n M , L i X , B a l a n V , D a l e B , C o t t a M : E n z y m e c h a r a c t e r i z a t i o n f o r h y d r o l y s i s o f A F E X a n d l i q u i d h o t - w a t e r p r e t r e a t e d d i s t i l l e r s ' g r a i n s a n d t h e i r c o n v e r s i o n t o e t h a n o l . B i o r e s o u r T e c h n a l 2 0 0 8 , 9 9 : 5 2 1 6 - 5 2 2 5 . 4 4 4 . E u n J , B e a u c h e m i n K , H o n g S , B a u e r M : E x o g e n o u s e n z y m e s a d d e d t o u n t r e a t e d o r a m m o n i a t e d r i c e s t r a w : E f f e c t s o n i n v i t r o f e r m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s a n d d e g r a d a b i l i t y . A n i m F e e d S c i T e c h n o l 2 0 0 6 , 1 3 1 : 8 6 - 1 0 1 . 4 4 5 . S a p a n C V , L u n d b l a d R L , P r i c e N C : C o l o r i m e t r i c p r o t e i n a s s a y t e c h n i q u e s . B i a t e c h n a l o g z a n d A p p l i e d B i o c h e m i s t r y 1 9 9 9 , 2 9 1 9 9 - 1 0 8 . 4 4 6 . L o v r i e n R , M a t u l i s D : A p p e n d i x 3 A : A s s a y s f o r T o t a l P r o t e i n . C u r r e n t P r o t o c o l s i n P r o t e i n S c i e n c e 1 9 9 5 , 3 : 1 - 2 4 . 4 3 3 4 4 7 . C o m p t o n S J , J o n e s C G : M e c h a n i s m o f d y e r e s p o n s e a n d i n t e r f e r e n c e i n t h e B r a d f o r d p r o t e i n a s s a y . A n a l B i o c h e m 1 9 8 5 , 1 5 1 : 3 6 9 - 3 7 4 . 4 4 8 . P e t e r s o n G L : A s i m p l i fi c a t i o n o f t h e p r o t e i n a s s a y m e t h o d o f L o w r y e t a l . w h i c h i s m o r e g e n e r a l l y a p p l i c a b l e . A n a l B i o c h e m 1 9 7 7 , 8 3 : 3 4 6 - 3 5 6 . 4 4 9 . E n g J , M c c o r r n a c k A , Y a t e s J : A n a p p r o a c h t o c o r r e l a t e t a n d e m m a s s - s p e c t r a l d a t a o f p e p t i d e s w i t h a m i n o - a c i d - s e q u e n c e s i n a p r o t e i n d a t a b a s e . J A m S o c M a s s S p e c t r o m 1 9 9 4 , 5 2 9 7 6 — 9 8 9 . 4 5 0 . Q i a n W , L i u T , M o n r o e M , S t r i t t m a t t e r E , J a c o b s J , K a n g a s L , P e t r i t i s K , C a m p D , S m i t h R : P r o b a b i l i t y - b a s e d e v a l u a t i o n o f p e p t i d e a n d p r o t e i n i d e n t i fi c a t i o n s f r o m t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y a n d S E Q U E S T a n a l y s i s : t h e h u m a n p r o t e o m e . J P r o t e o m e R e s 2 0 0 5 , 4 : 5 3 — 6 2 . 4 5 1 . E l i a s J E , G y g i S P : T a r g e t - d e c o y s e a r c h s t r a t e g y f o r i n c r e a s e d c o n fi d e n c e i n l a r g e - s c a l e p r o t e i n i d e n t i fi c a t i o n s b y m a s s s p e c t r o m e t r y . N a t M e t h 2 0 0 7 , 4 : 2 0 7 - 2 1 4 . 4 5 2 . H e n r i s s a t B , T e e r i T , W a r r e n R : A s c h e m e f o r d e s i g n a t i n g e n z y m e s t h a t h y d r o l y z e t h e p o l y s a c c h a r i d e s i n t h e c e l l w a l l s o f p l a n t s . F E B S L e t t e r s 1 9 9 1 , 4 2 5 : 3 5 2 - 3 5 4 . 4 5 3 . G a o D , C h u n d a w a t S P S , K r i s h n a n C , B a l a n V , D a l e B E : M i x t u r e o p t i m i z a t i o n o f s i x c o r e g l y c o s y l h y d r o l a s e s f o r m a x i m i z i n g s a c c h a r i fi c a t i o n o f a m m o n i a fi b e r e x p a n s i o n ( A F E X ) p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r . B i o r e s o u r c e T e c h n o l o g y 2 0 0 9 , M a n u s c r i p t I n P r e s s ( D O I : 1 0 . 1 0 1 6 / j . b i o r t e c h . 2 0 0 9 . 1 0 . 0 5 6 ) . 4 5 4 . B o x G E P , H u n t e r W G , H u n t e r J S : S t a t i s t i c s f o r E x p e r i m e n t e r s . N e w Y o r k : W i l e y ; 1 9 7 8 . 4 5 5 . D e r r i n g e r G , S u i c h R : S i m u l t a n e o u s O p t i m i z a t i o n o f S e v e r a l R e s p o n s e V a r i a b l e s . J o u r n a l o f Q u a l i t y T e c h n o l o g y 1 9 8 0 , 1 2 : 2 1 4 - 2 1 9 . 4 5 6 . K u m a r R , W y m a n C E : E f f e c t s o f c e l l u l a s e a n d x y l a n a s e e n z y m e s o n t h e d e c o n s t r u c t i o n o f s o l i d s f r o m p r e t r e a t m e n t o f p o p l a r b y l e a d i n g t e c h n o l o g i e s . B i o t e c h n o l o g y P r o g r e s s 2 0 0 9 , 2 5 : 3 0 2 - 3 1 4 . 4 5 7 . K u m a r R , W y m a n C E : E f f e c t o f e n z y m e s u p p l e m e n t a t i o n a t m o d e r a t e c e l l u l a s e l o a d i n g s o n i n i t i a l g l u c o s e a n d x y l o s e r e l e a s e f r o m c o r n s t o v e r s o l i d s p r e t r e a t e d b y l e a d i n g t e c h n o l o g i e s . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 9 , 1 0 2 : 4 5 7 - 4 6 7 . 4 5 8 . S e l i g M , K n o s h a u g E , A d n e y W , H i m m e l M , D e c k e r S : S y n e r g i s t i c e n h a n c e m e n t o f c e l l o b i o h y d r o l a s e p e r f o r m a n c e o n p r e t r e a t e d c o r n s t o v e r b y a d d i t i o n o f x y l a n a s e a n d e s t e r a s e a c t i v i t i e s . B i o r e s o u r T e c h n o l 2 0 0 8 , 9 9 : 4 9 9 7 - 5 0 0 5 . 4 5 9 . X i a o Z , Z h a n g X , G r e g g D J , S a d d l e r I N 2 E f f e c t s o f s u g a r i n h i b i t i o n o n c e l l u l a s e s a n d b e t a - g l u c o s i d a s e d u r i n g e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f s o f t w o o d s u b s t r a t e s . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 4 , 1 1 5 : 1 1 1 5 - 1 1 2 6 . 4 3 4 4 6 0 . B r o n n e n m e i e r K : S e p a r a t i o n o f t h e c e l l u l o l y t i c a n d x y l a n o l y t i c e n z y m e s o f C l o s t r i d i u m s t e r c o r a r i u m . J C h r a m 1 9 9 0 , 5 2 1 : 3 0 1 - 3 1 0 . 4 6 1 . J i n Z , Y o n g - H o n g W , J u C , Y i n g - P i n g Z , S i - L i a n g Z , P e n g Y : I d e n t i fi c a t i o n a n d p u r i fi c a t i o n o f t h e m a i n c o m p o n e n t s o f c e l l u l a s e s f r o m a m u t a n t s t r a i n o f T r i c h o d e r m a v i r i d e T 1 0 0 - 1 4 . B i o r e s T e c h n 0 1 2 0 0 8 , 9 9 : 6 8 2 6 - 6 8 3 3 . 4 6 2 . S a n g s e e t h o n g K , P e n n e r M : p - A m i n o p h e n y l - B - c e l l o b i o s i d e a s a n a f fi n i t y l i g a n d f o r e x o - t y p e c e l l u l a s e s . C a r b o h y d r R e s 1 9 9 8 , 3 1 4 : 2 4 5 - 2 5 0 . 4 6 3 . L e e S , S h i n H , R y u D : A d s o r p t i o n o f C e l l u l a s e o n C e l l u l o s e : E f f e c t o f P h y s i c o c h e m i c a l P r o p e r t i e s o f C e l l u l o s e o n A d s o p r t i o n a n d R a t e o f H y d r o l y s i s . B i o t e c h n o l B i o e n g 1 9 8 2 , 2 4 : 2 1 3 7 - 2 1 5 3 . 4 6 4 . J e o h T , I s h i z a w a C I , D a v i s M F , H i m m e l M E , A d n e y W S , J o h n s o n D K : C e l l u l a s e d i g e s t i b i l i t y o f p r e t r e a t e d b i o m a s s i s l i m i t e d b y c e l l u l o s e a c c e s s i b i l i t y . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 7 , 9 8 : 1 1 2 - 1 2 2 . 4 6 5 . J e o h T , W i l s o n D , W a l k e r L : E f f e c t o f C e l l u l a s e M o l e F r a c t i o n a n d C e l l u l o s e R e c a l c i t r a n c e o n S y n e r g i s m i n C e l l u l o s e H y d r o l y s i s a n d B i n d i n g . B i o t e c h n o l P r o g 2 0 0 6 , 2 2 : 2 7 0 - 2 7 7 . 4 6 6 . B a k e r J , E h r m a n C , A d n e y W , T h o m a s S , H i m m e l M : H y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e u s i n g t e r n a r y m i x t u r e s o f p u r i fi e d c e l l u l a s e s . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 1 9 9 8 , 7 0 - 7 2 : 3 9 5 - 4 0 3 . 4 6 7 . N i d e t z k y B , S t e r n e r W , H a y n M , C l a e y s s e n s M : C e l l u l o s e h y d r o l y s i s b y t h e c e l l u l a s e f r o m T r i c h o d e r m a r e e s e i : a n e w m o d e l f o r s y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n . B i o c h e m J 1 9 9 4 , 2 9 8 : 7 0 5 - 7 1 0 . 4 6 8 . N i d e t z k y B , S t e i n e r W , C l a e y s s e n s M : C e l l u l o s e h y d r o l y s i s b y t h e c e l l u l a s e s f r o m T r i c h o d e r m a r e e s e i : a b s o r p t i o n s o f t h e t w o c e l l o b i o h y d r o l a s e s , t w o e n d o g l u c a n a s e s a n d t h e i r c o r e p r o t e i n s o n fi l t e r p a p e r a n d t h e i r r e l a t i o n t o h y d r o l y s i s . B i o c h e m J 1 9 9 4 , 3 0 3 : 8 1 7 - 8 2 3 . 4 6 9 . R a m o s L , F i l h o A , D e s c h a m p s F , S a d d l e r J : T h e e f f e c t o f T r i c h o d e r m a c e l l u l a s e s o n t h e fi n e s t r u c t u r e o f a b l e a c h e d s o f t w o o d k r a f t p u l p . E n z y m e M i c r o b T e c h n o l 1 9 9 9 , 2 4 : 3 7 1 - 3 8 0 . 4 7 0 . K y r i a c o u A , M a c k e n z i e C , N e u f e l d R : D e t e c t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s p e c i fi c a n d n o n s p e c i fi c e n d o g l u c a n a s e s o f T r i c h o d e r m a r e e s e i : e v i d e n c e d e m o n s t r a t i n g e n d o g l u c a n a s e a c t i v i t y b y c e l l o b i o h y d r o l a s e I I . E n z y m e M i c r o b T e c h n o l 1 9 8 7 , 9 : 2 5 - 3 2 . 4 7 1 . G u s a k o v A , S a l a n o v i c h T , A n t o n o v A , U s t i n o v B , O k u n e v O , B u r l i n g a m e R , E m a l f a r b M , B a e z M , S i n i t s y n A : D e s i g n o f h i g h l y e f fi c i e n t c e l l u l a s e m i x t u r e s f o r e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 7 , 9 7 2 1 0 2 8 - 1 0 3 8 . 4 3 5 4 7 2 . P a l o n e n H , T j e m e l d F , Z a c c h i G , T e n k a n e n M : A d s o r p t i o n o f T r i c h o d e r m a r e e s e i C B H I a n d E G I I a n d t h e i r c a t a l y t i c d o m a i n s o n s t e a m p r e t r e a t e d s o f t w o o d a n d i s o l a t e d l i g n i n . J B i o t e c h n o l 2 0 0 4 , 1 0 7 : 6 5 - 7 2 . 4 7 3 . K a r l s s o n J , S i i k a - a h o M , T e n k a n e n M , T j e m e l d F : E n z y m a t i c p r o p e r t i e s o f t h e l o w m o l e c u l a r m a s s e n d o g l u c a n a s e s C e 1 1 2 A ( E G H I ) a n d C e l 4 5 A ( E G V ) o f T r i c h o d e r m a r e e s e i . J B i o t e c h n o l 2 0 0 2 , 9 9 : 6 3 - 7 8 . 4 7 4 . L a w o k o M , N u t t A , H e n r i k s s o n H , G e l l e r s t e d t G , H e n r i k s s o n G : H e m i c e l l u l a s e a c t i v i t y o f a e r o b i c f u n g a l c e l l u l a s e s . H a l z f a r s c h u n g 2 0 0 0 , 5 4 : 4 9 7 - 5 0 0 . 4 7 5 . N e v i l l e A : B i o l o g y o f fi b r o u s c o m p o s i t e s : D e v e l o p m e n t b e y o n d t h e c e l l m e m b r a n e . C a m b r i d g e : T h e U n i v e r s i t y P r e s s ; 1 9 9 3 . 4 7 6 . Z a n d o m e n i K , S c h o p f e r P : R e o r i e n t a t i o n o f m i c r o t u b u l e s a t t h e o u t e r e p i d e r m a l w a l l o f m a i z e c o l e o p t i l e s b y p h y t o c h r o m e , b l u e - l i g h t p h o t o r e c e p t o r a n d a u x i n . P r a t a p l a s m a 1 9 9 3 , 1 7 3 : 1 0 3 - 1 1 2 . 4 7 7 . S e l i g M , K n o s h a u g E , D e c k e r S , B a k e r J , H i m m e l M , A d n e y W : H e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n o f A s p e r g i l l u s n i g e r fl - D - x y l o s i d a s e ( X l n D ) : C h a r a c t e r i z a t i o n o n l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n 0 1 2 0 0 8 , 1 4 6 2 5 7 - 6 8 . 4 7 8 . K o r t e H , O f f e r m a n n W , P u l s J : H a l z f o r s c h u n g 1 9 9 1 , 4 5 : 4 1 9 . 4 7 9 . K n o s h a u g E , S e l i g M , B a k e r J , D e c k e r S , H i m m e l M , A d n e y W : H e t e r o l o g o u s E x p r e s s i o n o f T w o F e r u l i c A c i d E s t e r a s e s f r o m P e n i c i l l i u m f u n i c u l o s u m . A p p l B i o c h e m B i o t e c h n o l 2 0 0 8 , 1 4 6 : 7 9 — 8 7 . 4 8 0 . M e l l e r o w i c z E , I m m e r z e e l P , H a y a s h i T : X y l o g l u c a n : T h e M o l e c u l a r M u s c l e o f T r e e s . A n n a l s o f B o t a n y 2 0 0 8 , ( d o i : 1 0 . 1 0 9 3 / a o b / m c n l 7 0 ) . 4 8 1 . Z s u z s a B , M a t t i S , L i i s a V , K a t i R : E v a l u a t i o n o f t h e r o l e o f x y l o g l u c a n a s e i n t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c S u b s t r a t e s . E n z y m e M i c r o b T e c h n o l 2 0 0 8 , 4 3 : 1 0 9 — 1 1 4 . 4 8 2 . V i n c k e n J , B e l d m a n G , V o r a g e n A : S u b s t r a t e s p e c i fi c i t y o f e n d o g l u c a n a s e s : w h a t d e t e r m i n e s x y l o g l u c a n a s e a c t i v i t y ? C a r b o h y d r R e s 1 9 9 7 , 2 9 8 : 2 9 9 - 3 1 0 . 4 8 3 . P i y a c h o m k w a n K , G a b l e K P , P e n n e r M H : p - A m i n o p h e n y l l - t h i o - b e t a - D - c e l l o b i o s i d e : S y n t h e s i s a n d a p p l i c a t i o n i n a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f e x o - t y p e c e l l u l a s e s . C a r b o h y d r a t e R e s e a r c h 1 9 9 7 , 3 0 3 : 2 5 5 - 2 5 9 . 4 8 4 . P i y a c h o m k w a n K , P e n n e r M H : A r y l T h i o g l y c o s i d e - B a s e d A f fi n i t y P u r i fi c a t i o n o f E x o — A c t i n g C e l l u l a s e s . A n a l y t i c a l B i o c h e m i s t r y 1 9 9 8 , 2 5 5 : 2 2 3 - 2 3 5 . 4 8 5 . B r a d s h a w T C , A l i z a d e h H , T e y m o u r i F , B a l a n V , D a l e B E : A m m o n i a fi b e r e x p a n s i o n p r e t r e a t m e n t a n d e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o n t w o d i f f e r e n t g r o w t h s t a g e s o f r e e d c a n a r y g r a s s . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 7 , 1 3 7 : 3 9 5 - 4 0 5 . 4 3 6 4 8 6 . B a l s B , D a l e B E , B a l a n V : E n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f d i s t i l l e r ' s d r y g r a i n a n d s o l u b l e s ( D D G S ) u s i n g a m m o n i a fi b e r e x p a n s i o n p r e t r e a t m e n t . E n e r g y & F u e l s 2 0 0 6 , 2 0 : 2 7 3 2 - 2 7 3 6 . 4 8 7 . A y e d A , R a b h i l , D e l l a g i K , K a l l e l H : H i g h l e v e l p r o d u c t i o n a n d p u r i fi c a t i o n o f h u m a n i n t e r f e r o n a l p h a - 2 b i n h i g h c e l l d e n s i t y c u l t u r e o f P i c h i a p a s t o r i s . E n z y m e a n d M i c r o b i a l T e c h n o l o g y 2 0 0 8 , 4 2 : 1 7 3 - 1 8 0 . 4 8 8 . B r u n e l L , N e u g n o t V , L a n d u c c i L , B o z e W N , M o u l i n G , B i g e y F , D u b r e u c q E : H i g h - l e v e l e x p r e s s i o n o f C a n d i d a p a r a p s i l o s i s l i p a s e / a c y l t r a n s f e r a s e i n P i c h i a p a s t o r i s . J o u r n a l o f B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 4 , 1 1 1 : 4 1 - 5 0 . 4 8 9 . B a u e r S , V a s u P , P e r s s o n S , M o r t A , S o m e r v i l l e C : D e v e l o p m e n t a n d a p p l i c a t i o n o f a s u i t e o f p o l y s a c c h a r i d e - d e g r a d i n g e n z y m e s f o r a n a l y z i n g p l a n t c e l l w a l l s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 2 0 0 6 , 1 0 3 : 1 1 4 1 7 — 1 1 4 2 2 . 4 9 0 . G r u n o M , V é i l j a m a e P , P e t t e r s s o n G , J o h a n s s o n G : I n h i b i t i o n o f t h e T r i c h o d e r m a r e e s e i c e l l u l a s e s b y c e l l o b i o s e i s s t r o n g l y d e p e n d e n t o n t h e n a t u r e o f t h e s u b s t r a t e . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 2 0 0 4 , 8 6 : 5 0 3 - 5 1 1 . 4 9 1 . M e d v e J , S t a h l b e r g J , T j e m e l d F : A d s o r p t i o n a n d S y n e r g i s m o f C e l l o b i o h y d r o l a s e I a n d H o f T r i c h o d e r m a r e e s e i d u r i n g H y d r o l y s i s o f M i c r o c r y s t a l l i n e C e l l u l o s e . B i o t e c h n o l o g y a n d B i o e n g i n e e r i n g 1 9 9 4 , 4 4 : 1 0 6 4 - 1 0 7 3 . 4 9 2 . C h u n d a w a t S P S , D o n o h o e B S , S o u s a L , S h a r m a L , E l d e r T , A s k e l a n d P , V i s m e h R , A g a r w a l U , H u m p u l a J , G a r l o c k R , e t a l . : U l t r a - s t r u c t u r a l a n d p h y s i c o c h e m i c a l m o d i fi c a t i o n s w i t h i n a m m o n i a p r e t r e a t e d l i g n o c e l l u l o s i c c e l l w a l l s t h a t i n fl u e n c e e n z y m e a c c e s s i b i l i t y . I n 3 1 s t S y m p o s i u m o n B i a t e c h n a l o g y f o r F u e l s a n d C h e m i c a l s ( 3 - 6 M a y ) ; O r a l P r e s e n t a t i o n ( P a p e r # 9 5 3 0 ) S e s s i o n 3 ( # 0 5 ) - B i o m a s s P r e t r e a t m e n t a n d F r a c t i o n a t i o n ; S a n F r a n s i s c o , C a l i f o r n i a : 2 0 0 9 : 5 0 . 4 9 3 . F e n g e l D : I d e a s o n t h e u l t r a s t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n o f t h e c e l l w a l l c o m p o n e n t s . J o u r n a l o f P o l y m e r S c i e n c e P a r t C : P o l y m e r S y m p o s i a 1 9 7 1 , 3 6 : 3 8 3 - 3 9 2 . 4 9 4 . B e u k e s N , C h a n H , D o i R H , P l e t s c h k e B I : S y n e r g i s t i c a s s o c i a t i o n s b e t w e e n C l o s t r i d i u m c e l l u l o v o r a n s e n z y m e s X y n A , M a n A a n d E n g E a g a i n s t s u g a r c a n e b a g a s s e . E n z y m e a n d M c r o b i a l T e c h n o l o g y 2 0 0 8 , 4 2 : 4 9 2 - 4 9 8 . 4 9 5 . B e n k o Z , S i i k a - a h o M , V i i k a r i L , R e c z e y K : E v a l u a t i o n o f t h e r o l e o f x y l o g l u c a n a s e i n t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f l i g n o c e l l u l o s i c s u b s t r a t e s . E n z y m e M i c r o b T e c h n o l 2 0 0 8 , 4 3 : 1 0 9 — 1 1 4 . 4 9 6 . M a s t r o n a r d e D N : D u a l - A x i s T o m o g r a p h y : A n A p p r o a c h w i t h A l i g n m e n t M e t h o d s T h a t P r e s e r v e R e s o l u t i o n . J o u r n a l o f S t r u c t u r a l B i o l o g y 1 9 9 7 , 1 2 0 2 3 4 3 - 3 5 2 . 4 9 7 . S c h e l l D J , F a r m e r J , N e w m a n M , M c M i l l a n J D : D i l u t e - s u l f u r i c a c i d p r e t r e a t m e n t o f c o r n s t o v e r i n p i l o t - s c a l e r e a c t o r : I n v e s t i g a t i o n o f y i e l d s , k i n e t i c s , a n d e n z y m a t i c d i g e s t i b i l i t i e s o f s o l i d s . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 3 , 1 0 5 : 6 9 - 8 5 . 4 3 7 4 9 8 . H a m e s B R , T h o m a s S R , S l u i t e r A D , R o t h C J , T e m p l e t o n D W : R a p i d B i o m a s s A n a l y s i s : N e w T o o l s f o r C o m p o s i t i o n a l A n a l y s i s o f C o r n S t o v e r F e e d s t o c k s a n d P r o c e s s I n t e r m e d i a t e s f r o m E t h a n o l P r o d u c t i o n . A p p l i e d B i o c h e m i s t r y a n d B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 3 , 1 0 5 - 1 0 8 : 5 - 1 6 . 4 9 9 . W r i g h t W R , R a i n w a t e r J C , T o l l e L D : G l u c o s e A s s a y S y s t e m s : E v a l u a t i o n o f a C o l o r i m e t r i c H e x o k i n a s e P r o c e d u r e . C l i n C h e m 1 9 7 1 , 1 7 : 1 0 1 0 - 1 0 1 5 . 4 3 8