A N T IB O D Y R E S P O N S E O F T U R K E Y S V A C C IN A T E D W IT H F O R M A L IN IN A C T I V A T E D N E W C A ST L E D IS E A S E V IR U S -W S h a m s e ld in H a lfa w i R a c h e d A T h e s is S u b m it t e d to th e S c h o o l o f G r a d u a t e S t u d i e s o f M ic h ig a n S ta t e C o l l e g e o f A g r i c u l t u r e a n d A p p lie d S c i e n c e in p a r t i a l fu lfillm e n t o f th e r e q u ir e m e n ts fo r th e d e g r e e o f D o c t o r Of P h i l o s o p h y D e p a r tm e n t of B a c te r io lo g y and P u b lic H e a lth 1948 A c k n o w le d g e m e n t s T h e a u th o r i s g r a t e l u l f o r th e g e n e r o u s h e l p , g u id a n c e a n d in s t r u c t io n g iv e n to h im by D r . C . H. C u n n in g h a m , A s s o c i a t e P r o f e s s o r o f B a c t e r i o l o g y , an d D r . H. J . S t a f s e t h , P r o f e s s o r a n d H e a d o f th e D e p a r t m e n t o f B a c t e r i o l o g y an d P u b l i c H e a lth , M ic h ig a n S t a t e C o lle g e . T h e o p e r a t io n a l e x p e n s e s o f t h i s w o r k w e r e d e f r a y e d in p a r t b y a g r a n t fr o m S w ift an d C o m p a n y , C h ic a g o , I l l i n o i s . T a b le O f C o n t e n t s H i s t o r i c a l R e v i e w ........................................................................... ........................... ... . 1 N e w c a s tle d is e a s e .............................................................................. » 1 I m m u n i z a t i o n .............................; ............................................. 4 E x p e r im e n t a l P r o c e d u r e s ................................................................................................ 12 P r e p a r a t i o n o f v a c c i n e s ................. 12 V a c c i n a t i o n ....................................................................................... 13 S e r o l o g i c a l t e s t s .............................................................................................17 H e m a g g lu t in a t io n and h e m a g g lu t in a t i o n in h ib itio n t e s t s ...................... ............................................. ... . 18 P r o c e d u r e ......................... S e r u m n e u t r a liz a t io n t e s t s P rocedure R e s u l t s .......................................... D i s c u s s i o n .............................................................. 31 ................................................. 3 6 . . . . . ............................. 39 41 ....t..... . 51 S u m m a r y ...........................................................................................’ ................................... . 72 L i t e r a t u r e C i t e d ..................................................................................................................... 7 4 H IS T O R IC A L R E V IE W N e w c a s tle D is e a s e W hat i s n o w g e n e r a lly know n a s N e w c a s tle d is e a s e w a s f ir s t 1 2 r e p o r t e d b y K r a n e v e ld * in 1 9 2 6 a s a h ig h ly d i f f u s i b l e an d f a t a l in f e c t io n o f p o u lt r y p r e v a l e n t in th e D u tc h E a s t I n d i e s . K r a n e v e ld d e m o n s t r a t e d th a t th e c a u s a t i v e a g e n t w a s p r e s e n t in th e s e c r e t i o n s f r o m th e r e s p i r a t o r y t r a c t , a n d t h a t i t w a s a b s e n t f r o m t h e b lo o d a n d i n t e r n a l o r g a n s . A lth o u g h B e r k e f e l d f i l t r a t e s w e r e in n o c u o u s , K r a n e v e ld e l i m i n a t e d th e p o s s i b i l i t y th a t t h e c a u s a t i v e a g e n t w a s o f a b a c t e r i a l n a t u r e . T he sa m e d is e a s e w as a l s o s e e n in 1 9 2 6 a t N e w c a s t l e - o n - t h e - T y n e in E n g la n d a n d it w a s r e p o r t e d by D o y le 3 in 1 9 2 7 . D o y le w a s s u c c e s s f u l in d e m o n s t r a t i n g th a t t h e c a u s a ­ t i v e a g e n t w a s a f i l t e r a b l e v i r u s an d t h a t t h i s v i r u s w a s d i s t r i b u t e d in th e v a r i o u s in t e r n a l o r g a n s r a t h e r c o n s i s t e n t l y . H e c o u ld r e p r o d u c e th e d i s e a s e b y in o c u la t io n b u t n o t w ith e q u a l f a c i l i t y in a l l c a s e s a s r e g a r d s th e t y p e o f t h e in o c u lu m a n d m o d e o f in o c u la t io n . H e a l s o fo u n d t h a t th e v i r u s w a s c o m p l e t e l y n e u t r a l i z e d b y t h e h o m o lo g o u s im m u n e s e r u m . D o y le p r o p o s e d t h e n a m e N e w c a s t l e d i s e a s e a n d r e p o r t e d th a t t h e r e w a s n o c r o s s - i m m u n i t y b e t w e e n t h i s d i s e a s e a n d f o w l p la g u e . In t h e i m m e d ­ ia t e l y f o l l o w i n g y e a r s a s i m i l a r d i s e a s e a p p e a r e d in I n d ia , in C e y lo n , in K o r e a , in th e P h i l l i p i n e s , a n d in v a r i o u s o t h e r p l a c e s . In e a c h in s t a n c e a n e w n a m e w a s a p p lie d s o th a t t h e r e a p p e a r e d in th e l i t e r a t u r e a v a r i e t y o f n a m e s d e s c r i b i n g a d i s e a s e th a t h a d m a n y c h a r a c t e r i s t i c s in c o m m o n . I n v e s t i g a t o r s s o o n s u s p e c t e d t h a t p e r h a p s t h e s e d i s e a s e s m ig h t b e i d e n t i c a l T h i s s u s n i c i n n w a s nnnfirmpd affpr an n v f h ' i no-o of wimcoc i mnnr r fi-.^ 2 w o r k e r s o f th e D u tc h E a s t I n d i e s , I n d ia , E n g la n d , a n d th e P h i l l i p i n e s , w ho m a d e c r o s s - i m m u n i t y and n e u t r a liz a t io n t e s t s . T h e r e a fte r m o s t of th e v a r i o u s n a m e s u n d e r w h ic h th e d i s e a s e h a d D een d e s c r i b e d w e r e d r o p p e d f r o m th e l i t e r a t u r e . It m a y b e w e l l to r e v i e w th e g e o g r a p h ic a l^ d is t r ib u t io n o f t h i s d is e a s e . It w a s r e p o r t e d f r o m th e D u tc h E a s t I n d ie s (1 9 2 6 ) an d E n g la n d (1 9 2 7 ), In d ia and th e P h i llip in e s ( 1 9 2 8 ) , K o r e a an d J a p a n ( 1 9 2 9 ) , C e y lo n ( 1 9 3 0 ), A u s t r a l i a ( 1 9 3 1 ) , K e n y a ( 1 9 3 7 ) .th e m id d le C o n g o ( 1 9 3 9 ) , P a l e s t i n e an d Ita ly (1 9 4 0 ), G e r m a n y (1 9 4 1 ) a n d i t s o c c u r r e n c e w a s r e c o r d e d in o t h e r p a r t s o f E u r o p e d u r in g 1 9 4 2 - 1 9 4 4 . N e w c a s tle d is e a s e w a s r e c o g n iz e d fo r th e f i r s t t i m e in S o u th A f r ic a d u r in g 1 9 4 4 - 1 9 4 5 . In th e U n ite d S t a t e s , th e d i s e a s e w a s d e s c r i b e d in th e r e p o r t o f th e C a lif o r n ia S t a t e D e p a r t m e n t o f A g r ic u l t u r e o f 1 9 4 0 ° a s a n e r v o u s d i s o r d e r o c c u r r i n g a f t e r o r t o w a r d s th e en d o f o u t b r e a k s o f a d i s e a s e w h ic h w a s th o u g h t to b e c h ic k e n b r o n c h it is F u r t h e r o b s e r v a t i o n s on s y m o t o m s a n d l e s i o n s w e r e p u b lis h e d b y B e a c h ® , w ho s u g g e s t e d th a t th e s y m p t o m s m ig h t be d u e t o i n v a s i o n o f th e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m by c h ic k b r o n c h it is v i r u s , o r t o s o m e d ie t a r y d i s t u r b a n c e . A d d itio n a l w o r k b y S t o v e r ^ , w h o d e s c r i b e d th e d i s e a s e u n d e r “ r e s p i r a t o r y n e r v o u s d i s o r d e r o f c h i c k e n s , ” d e m o n s t r a t e d th a t th e d i s e a s e w a s t r a n s ­ m i s s i b l e an d w a s in d e p e n d e n t o f a n y o f th e o t h e r k n ow n d i s e a s e s o f c h ic k e n s . S to v e r Q H e r e p o r t e d th a t th e c a u s a t i v e a g e n t w a s f i l t e r a b l e . L a te r o b s e r v e d t h e d i s e a s e in p o u lt s and s u c c e e d e d in r e p r o d u c in g t y p ic a l s y m p t o m s in c h ic k s by th e in j e c t io n o f u n f ilt e r e d a i r s a c a n d lu n g e x t r a c t f r o m a f f e c t e d p o u lt s . 3 B each n in 1 9 4 2 , n a m e d t h e d i s e a s e “ a v ia n p n e u m o e n c e p h a lit is . ’ ’ H e s t a t e d th a t th e d i s e a s e h ad b e e n p r e s e n t in C a lif o r n ia a s e a r l y a s 1 9 3 5 an d p e r h a p s e a r l i e r . T h e u n u s u a lly m ild c h a r a c t e r a n d lo w m o r t a lit y r a t e w h ic h c h a r a c t e r i z e d th e m a la d y u p o n it s i n i t i a l a p p e a r a n c e in th e U n ite d S t a t e s a lla y e d th e s u s p i c i o n th a t it m ig h t b e N e w c a s t l e d i s e a s e an d d e la y e d p e r c e p t io n o f a p o s s i b l e r e l a t i o n s h i p to th e t y p ic a l, f u lm in a t in g an d h ig h ly f a t a l N e w c a s t l e d i s e a s e , a s p r e v i o u s l y s e e n in o t h e r p a r t s o f th e w o r ld . T h e id e n tity o f s e v e r a l s t r a i n s o f s o - c a l l e d “ a v ia n p n e u m o e n c e ­ p h a l i t i s ” v i r u s w ith t y p ic a l N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s , in t h is in s t a n c e th e H e r t f o r d s h ir e s t r a i n , w a s e s t a b l i s h e d on th e b a s i s o f in it ia l in v i t r o n e u t r a liz a t io n t e s t s w ith N e w c a s t l e d i s e a s e im m u n e s e r u m f r o m E n g la n d b y B e a c h ^ in 1 9 4 4 . T h e v i r u s fo u n d in t h is c o u n tr y a p p e a r s t o b e i d e n t i c a l i m m u n o lo g ic a l ly w ith th a t e n c o u n t e r e d a b r o a d , a lth o u g h th e d i s e a s e c a u s e d b y th e r e s p e c t i v e a g e n t s d i f f e r s s o m e w h a t . In t h is c o u n t r y t h e d i s e a s e is a s s o c i a t e d w ith a c o m p a r a t i v e l y lo w m o r t a lit y r a t e in a d u lt b ir d s a n d w ith a h ig h m o r t a l i t y in c h i c k s . In o t h e r c o u n t r i e s th e d i s e a s e is c h a r ­ a c t e r i s e d b y a u n if o r m ly h ig h m o r t a l i t y r a t e . T h e d i s e a s e w a s k n o w n to h a v e r e a c h e d th e e a s t c o a s t by 1 9 4 4 , w h en th e v i r u s w a s i s o l a t e d b y B e a u d e t t e ' in N e w J e r s e y . A t th e p r e s e n t t i m e th e d i s e a s e h a s b e e n d ia g n o s e d in 42 o f th e S t a t e s a n d th e D i s t r i c t o f C o lu m b ia . 19 A n o u tb r e a k in a d u lt t u r k e y s w a s d e s c r i b e d by H o ffm a n , w h o s u c c e e d e d in t r a n s m i t t in g th e d i s e a s e to c h ic k e n s a n d t u r k e y s by in o c u la t io n o f f i l t e r e d o r u n f ilt e r e d m a t e r i a l . 4 T h e d i s e a s e in t u r k e y s w a s d e s c r i b e d b y J u n g h e r r a n d T e r r e l in C o n n e c tic u t 14 in 1 9 4 5 an d th e v i r u s w a s i s o l a t e d f r o m t u r k e y s in N e w Y o r k s t a t e b y L e v in e m a c h e r e t a l. 16 15 in 1 9 4 6 an d f r o m 1 0 - d a y - o l d p o u lt s b y F e n s t e r - in M in n e s o t a in th e s a m e y e a r . Q f r o m C a lif o r n ia a s a f f e c t in g p o u lt s w a y a s it a f f e c t e d y o u n g c h i c k e n s . fro m N ew Y ork 15 T h e d is e a s e w a s r e p o r te d 1 2 a n d a d u lt t u r k e y s in m u c h t h e s a m e T h e d i s e a s e in t u r k e y s a s r e p o r t e d c a u s e d m o r e th a n 5 0 p e r c e n t m o r t a l i t y . w e r e m ild an d w e r e n o t a s e v i d e n t a s in y o u n g c h i c k s . S y m p to m s T h e a ir s a c s and t h e ir m e m b r a n e s w e r e c lo u d y a n d t h e v i r u s i s o l a t e d f r o m t u r k e y s w a s n e u t r a liz e d b y k n o w n N e w c a s t l e d i s e a s e im m u n e s e r u m . T h e s y m p t o m s in t u r k e y s a s r e p o r t e d f r o m M in n e s o t a n o t a s p r o m in e n t a s in c h i c k e n s . n erv o u s sy m p to m s. sou n d . 1 fi w ere N e a r ly m a tu r e tu r k e y s s e ld o m sh o w e d T h e c o m m o n e s t s y m p t o m w a s a s n u f f in g o r s n e e z i n g P o u l t s , 2 to 3 d a y s o l d , s h o w e d e v i d e n c e o f r e s p i r a t o r y t r o u b le b u t t h e y d id n o t s h o w n e r v o u s s y m p t o m s . T h e m o r t a l i t y a m o n g p o u lt s w a s 6 0 p e r c e n t a n d l o s s e s d id o c c u r a m o n g m a tu r e b ir d s . S eru m c o lle c te d fr o m th e s u r v iv o r s 4 m o n t h s a f t e r i n f e c t i o n h a d n o in h i b i t o r y s u b s t a n c e s a g a i n s t N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s a s d e m o n s t r a t e d b y th e h e m a g g lu t in a t i o n - in h i b it io n t e s t . I m m u n iz a t io n E a r lie r r e p o r ts of th e u s e o f p h y s ic a l o r c h e m ic a l a g e n ts in th e p r o c e s s o f a t t e n u a t io n o r m o d i f i c a t i o n o f t h e N e w c a s t l e d i s e a s e 5 v ir u s to d e v e lo p a s a t i s f a c t o r y m e th o d o f a c t i v e im m u n iz a t io n o f c h ic k e n s a g a in s t t h e d i s e a s e s h o w e d n e g a t i v e , i r r e g u l a r a n d g e n e r a l l y u n s a t i s f a c t o r y r e s u lts . o E n c o u r a g in g r e s u l t s w e r e p r o d u c e d b y th e u s e o f t i s s u e - v i r u s v a c c i n e s , in a c t iv a t e d by f o r m a l i n . T o p a c io an d C o r o n e l i7 2 in 1939 f a ile d to im m u n iz e t e s t b ir d s by th e u s e o f t i s s u e o r “ c r o p ” - v i r u s v a c c i n e t r e a t e d w ith c h l o r o f o r m , fo r m a lin , la c tic a c id , o r m e r th io la te . H ad d ow a n d Id n a n i 1 ft in 1941 r e p o r t e d e n c o u r a g in g r e s u l t s w ith t h e u s e o f a f o r m a lin t r e a t e d v ir u s a d s o r b e d o n a lu m in u m h y d r o x id e g e l an d “ m a t u r e d ” f o r 8 to 10 d a y s a t 14 C to 16 C o r f o r 1 to 4 d a y s a t 37 C b e f o r e u s e . Iy er and D o b so n 19 in 1 9 4 1 r e p o r t e d i r r e g u l a r and u n s a t i s f a c t o r y r e s u l t s f r o m th e u s e o f an in f e c t e d e m b r y o t i s s u e e m u l s i o n t r e a t e d w ith c r y s t a l v i o l e t a s a v a c c i n e a g a in s t N e w c a s t l e d i s e a s e . Iy e r 20 In a l a t e r r e p o r t , p r e s e n t e d p r o m is in g r e s u l t s o b ta in e d b y th e u s e o f t h i s s a m e v a c c in e . A t th e s a m e t i m e , h e r e p o r t e d th a t t h e r e w a s no p r o t e c t io n f o llo w in g in j e c t io n o f a f o r m a l i n i z e d e m b r y o t i s s u e v a c c i n e . H o ffm a n 13 in 1 9 4 1 a t t e m p t e d t h e u s e o f a m ix t u r e o f th e v i r u s an d i t s h o m o lo g o u s im m u n e s e r u m f o r im m u n iz a t io n o f c h i c k s a g a in s t th e “ r e s p i r a t o r y n e r v o u s d i s o r d e r . ” T h is n e u t r a liz e d v i r u s g a v e n o p r o t e c t io n w h e n t h e b ir d s w e r e in f e c t e d 3 0 d a y s a f t e r v a c c i n a t i o n . The u s e o f t h e lu n g an d a ir s a c m a t e r i a l s f r o m in f e c t e d t u r k e y s a s a s o u r c e o f a n tig e n t r e a t e d w ith c h lo r o f o r m o r f o r m a l i n p r o d u c e d i r r e g u l a r 6 B each Q in 1 9 4 2 r e p o r t e d e n c o u r a g in g r e s u l t s o b t a in e d in v a c c i n a t i o n o f c h i c k s a g a in s t “ a v ia n p n e u m o e n c e p h a l i t i s " u s in g a w h o le e m b r y o v a c c i n e w h ic h c o n t a in e d 0 .1 o r 0 .2 p e r c e n t f o r m a l i n . Two d oses o f th e v a c c i n e w e r e s l i g h t l y m o r e e f f e c t i v e th a n o n e d o s e in v a c c in a t io n o f c h i c k e n s m o r e th a n 7 d a y s o ld w h i l e c h i c k s v a c c i n a t e d a t a n a g e b e lo w 7 d a y s w e r e v e r y in a d e q u a t e ly p r o t e c t e d . B each 21 in 1 9 4 4 r e p o r t e d o n t h e u s e o f f o r m a l i n i z e d e m b r y o e m u l s i o n v a c c i n e in th e f i e l d . T h e v a c c i n e , a lt h o u g h n o t p r e v e n t in g t h e o c c u r r e n c e o f i n f e c t i o n , e n a b le d t h e c h i c k e n s t o w it h s t a n d a s e v e r e n a tu r a l i n f e c t io n w it h a r e l a t i v e l y lo w m o r t a l i t y an d a s l i g h t d e c r e a s e in e g g p r o d u c t io n . B r a n d ly e t a l . ^ in 1 9 4 6 fo u n d th a t v a c c i n e p r e p a r e d b y t h e a p p lic a t io n o f s h o r t u l t r a v i o l e t r a y s ( 1 6 0 0 to 1 8 0 0 A ) to in a c t i v a t e t h e N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s h a d n o a d v a n t a g e s o v e r th e f o r m a l i n in a c t iv a t e d p r e p a r a t io n . U n d e r p r a c t i c a l c o n d i t i o n s , pH 5 t o pH 7 w a s fo u n d to b e w ith o u t a n a p p r e c i a b l e e f f e c t o n t h e p o t e n c y o f t h e f o r m a l i n in a c t iv a t e d v a c c in e s t o r e d at 6 C fo r a p e r io d o f 4 7 1 d a y s . T h e u s e o f a m n io a l l a n t o i c f l u i d s , o f e m b r y o t i s s u e , o r o f t h e w h o le e g g w ith o u t a lb u m e n , a s v a c c i n e s in d ic a t e d th a t t h e t i s s u e s w e r e e q u a lly a s s u i t a b l e a s t h e f l u i d s p r o v id e d th a t a m in i m a l t i t e r o f ij 10 e m b r y o le t h a l d o s e s p e r 0 .0 5 c c . in o c u lu m w a s r e q u ir e d f o r a n y m a t e r i a l u s e d in t h e v a c c i n e p r e p a r a t io n . I n a c t iv a t e d v a c c i n e s p r o d u c e d a t r a n s i e n t im m u n it y . s u b s t a n t i a l im m u n it y w a s p r e s e n t up t o 4 m o n t h s in s o m e c a s e s . A In o t h e r c a s e s im m u n it y w a s n o t d e t e c t a b l e 3 w e e k s a f t e r v a c c i n a t i o n . 7 T h e a d d itio n o f a d ju v a n ts s u c h a s l a n o l i n , m in e r a l o i l s , a n d a lu m in a g e l c a u s e d an i n c r e a s e in th e d e g r e e a n d d u r a tio n o f t h e im m u n ity r e s p o n s e . T h e p r e s e n c e o f k ille d M y c o b a c t e r iu m b u t y r ic u m a s a n a d ju v a n t d e f in i t e ly a u g m e n te d th e im m u n ity r e s p o n s e . U n f o r t u n a t e ly , t h i s a g e n t in c o m b in a ­ t io n w ith th e o i l y a d ju v a n t s , p r o d u c e d m a r k e d t i s s u e r e a c t i o n s a s w e l l a s t u b e r c u lin s e n s i t i v i t y , t h u s e l im i n a t in g it f r o m u s e in v a c c i n e s d e s i g n e d fo r fie ld u s e . T h e u s e o f c e r t a in v i r u s s t r a i n s f r o m th e e a s t e r n U n ite d S t a t e s w h ic h h a d b e e n r e n d e r e d a p a t h o g e n ic f o r c h ic k e n s th r o u g h p r o p ­ a g a t io n in s e r i a l p a s s a g e s in e m b r y o n a t e d e g g s p r o d u c e d a n e a r l i e r an d m s u b s t a n t ia l im m u n it y to c h a lle n g e i n f e c t i o n a n d a n e a r l i e r a p p e a r a n c e o f s e r u m a n tib o d y t i t e r th a n d id th e f o r m a lin i n a c t iv a t e d m a t e r i a l . S e r u m a n tib o d y t i t e r s u s e d a s a m e a n s o f e v a lu a t io n o f th e v a c c i n a l r e s p o n s e s h o w e d a f a i r d e g r e e o f c o r r e l a t i o n w ith r e f r a c t i v i t y to c h a lle n g e i n f e c t i o n e x c e p t d u r in g t h e p e r io d w h e n a c t i v e im m u n it y w a s a p p a r e n tly w a n in g . T h e a u t h o r s s u g g e s t e d th e i n i t i a l u s e o f an i n a c t ­ iv a t e d v a c c in e f o llo w e d a f t e r 1 or 2 w e e k s b y a l i v i n g , m o d if ie d , i . e . c h ic k e n - a p a t h o g e n ic , v i r u s . B r a n d ly e t a l.2 3 r e p o r t e d th a t th e d e v e lo p m e n t o f a n a c t i v e im m u n ity in r e s p o n s e to v a c c in a t io n w a s in h ib ite d b y c o n g e n it a l p a s s i v e im m u n ity p r e s e n t in y o u n g c h ic k s c o n f e r r e d b y N e w c a s t l e d i s e a s e im m u n e d a m s . P r o t e c t i o n a f fo r d e d b y v a c c i n e s p r e p a r e d f r o m t h e e n t i r e c o n t e n t , e x c l u s i v e o f a lb u m e n , o f e g g s f r o m N e w c a s t l e d i s e a s e im m u n e h e n s a p p e a r e d t o b e i n f e r i o r to th a t a f f o r d e d b y v a c c i n e s p rep a re d fr o m n o rm a l h en e g g s . 8 A c e v e d o and M en d o za w ith t h e u s e o f 2 24 in 1 9 4 7 , r e p o r t e d e n c o u r a g in g r e s u l t s v a c c i n e s p r e p a r e d f r o m a m i x t u r e o f i n f e c t e d a m n io t ic f lu id , c h o r i o a lla n t o i c m e m b r a n e , a n d t h e e m b r y o p r o p e r e m u l s i f i e d in an e q u a l v o lu m e o f g l y c e r i n a t e d p h o s p h a te b u f fe r an d in a c t iv a t e d b y th e a d d itio n o f 0 .0 5 p e r c e n t c r y s t a l v i o l e t a n d 0 .0 5 p e r c e n t f o r m a l i n , o r 0 .7 p e r c e n t s o d iu m b o r a t e a n d 0 .1 p e r c e n t f o r m a l i n . T h e a d d itio n o f 0 .5 p e r c e n t p o t a s s iu m a lu m to th e v a c c i n e t r e a t e d w ith s o d iu m b o r a t e an d f o r m a l i n e n h a n c e d th e a n tib o d y f o r m in g p r o p e r t i e s o f th e v a c c in e . V a c c in e s p r e p a r e d th e s a m e w a y fr o m d u ck e m b r y o s g a v e v a r i a b l e r e s u l t s an d th e p r o t e c t io n d e r i v e d w a s o f s h o r t d u r a t io n . S a t i s f a c t o r y r e s u l t s w e r e r e p o r t e d in 1 9 4 7 b y C o r o n e l w ho u s e d an “ a d s o r b a te ” v a c c in e . 25 T h is v a c c i n e c o n t a in e d e q u a l p a r t s o f g r o u n d in f e c t e d e m b r y o n ic t i s s u e a n d f lu i d s f r o m t h e s a m e h a r v e s t w h ic h w e r e s u s p e n d e d in a n e q u a l q u a n tity o f a lu m in a g e l e m u l s i f i e d in p h o s p h a te b u f f e r o r in d i s t i l l e d w a t e r o f pH 7 t o pH 7 .,4. p a r a tio n w a s t r e a t e d w ith p e r c e n t f o r m a lin . 0.1 V a n R o e k e l e t a l. The p re­ 0f\ in 1 9 4 8 r e p o r t e d th e u s e o f a s t r a i n o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s o f lo w v i r u l e n c e a p p lie d b y th e c u t a n e o u s “ s t o c k ” m e th o d in th e w e b o f th e w in g t o im m u n iz e c h ic k e n s w ith o u t p r o d u c in g an a c t i v e o u tb r e a k o f t h e d i s e a s e . I y e r an d D o b s o n 27 in 1 9 4 0 r e p o r t e d th a t c o n t in u e d p a s s a g e o f th e H e r t f o r d s h i r e s t r a i n o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s t h r o u g h e m b r y o n a te d c h ic k e n e g g s r e s u l t e d in th e r e c o v e r y o f a v a r ia n t a p a t h o g e n ic f o r c h ic k e n s . A t th e 3 3 r d an d s u b s e q u e n t p a s s a g e s u p to th e 5 6 th , 9 th e s t r a i n o f v i r u s c e a s e d to p r o d u c e f a t a l r e s u l t s in c h i c k e n b u t i t s im m u n iz in g p r o p e r t i e s h a d b e e n r e t a i n e d . I n o c u la t io n o f c h ic k e n s w ith t h i s v i r u s p r o t e c t e d t h e m a g a in s t a c h a l l e n g e w ith le t h a l d o s e s . 10 ^ c h ic k e n In a n o t h e r t e s t , o n ly 14 p a s s a g e s o f t h e s a m e s t r a i n w e r e e n o u g h to m o d if y th e v i r u s . Iyer^O | n 1943 c o n f ir m e d t h e s e f in d in g s an d s t a t e d t h a t t h i s m o d if ie d v i r u s p r o d u c e d a “ s i l e n t ' , in f e c t io n in in o c u la t e d c h ic k e n s f o llo w e d b y r e f r a c t i v i t y t o c h a l l e n g e w ith a c t i v e v i r u s . B r a n d ly e t a l .2 2 fo u n d th a t 3 s t r a i n s , o n e i s o l a t e d in N e w J e r s e y , th e s e c o n d in N e w Y o r k , a n d t h e t h ir d f r o m a n i n f e c t i o n o f s t o c k c h ic k e n s o f th e H u n tin g to n la b o r a t o r y a t H a r v a r d U n i v e r s i t y , a lth o u g h r e t a i n in g a h ig h an d p e r s i s t e n t d e g r e e o f p a t h o g e n ic it y f o r c h ic k e n s e m b r y o s t e n d e d to a c q u i r e a lo w p a t h o g e n ic i t y f o r c h i c k e n s a fte r on e o r a fe w e g g p a s s a g e s . A c e v e d o an d M e n d o z a ^ r e p o r t e d th a t t h e v i r u l e n c e o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s w a s n o t c h a n g e d a f t e r 5 0 p a s s a g e s in c h i c k e n , duck, and tu r k e y e m b r y o s . A h u n d red o r m o r e s e r i a l p a s s a g e s o f th e v i r u s in c h ic k e m b r y o s b y C o r o n e l 25 d id n o t a t t e n u a t e t h e v i r u s s u f f i c i e n t l y to m a k e it a s a f e v a c c i n e f o r a d u lt b i r d s . T o p a c io an d C o r o n e l ^ r e p o r t e d th a t a f t e r s e v e r a l i n t r a - c e r e b r a l p a s s a g e s in d u c k s , t h e v i r u l e n c e o f th e v i r u s w a s n o t a l t e r e d w h en t e s t e d on c h ic k e n s . 10 K o m a r o v a n d G o l d s m i t , ^ 3 le a d b y D o y l e ’s 3 r e p o r t th a t h e w a s u n a b le to i n f e c t c h ic k e n s w ith t h e m o u th e x u d a t e o f a s i c k d u c k , th o u g h t o f th e p o s s i b i l i t y o f a m o d i f i c a t i o n o f th e v i r u s th r o u g h i n t r a c e r b r a l p a s s a g e in d u c k l i n g s . w ith v i r u s m o d if ie d b y 10 C h ic k e n s in o c u la t e d in t r a d e r m a l l y i n t r a c e r e b r a l p a s s a g e s in d u c k lin g s d id n o t d e v e lo p s y m p t o m s a n d w e r e s u b s e q u e n t l y fo u n d t o b e im m u n e . A s t r a i n o f th e v i r u s w h ic h w a s s e r i a l l y p a s s e d b y K o m a r o v a n d G o l d s m i t h t h r o u g h e m b r y o n a t e d d u c k e g g s l o s t i t s a b i l i t y to p ro d u ce a s y s t e m ic r e a c tio n w h en m je c te d e ith e r s u b c u ta n e o u s ly o r in t r a m u s c u l a r l y in to s u s c e p t i b l e b ir d s a n d p r o d u c e d a s u b s t a n t i a l im m u n it y a g a i n s t t h e d i s e a s e f o r a t l e a s t 3 m o n t h s . E f f o r t s b y B r a n d ly e t a l . 99 to a t te n u a te t w o N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s s t r a i n s f o r c h i c k e n s th r o u g h “ z i g z a g ” p a s s a g e s f r o m y o u n g m i c e b y th e i n t r a c e r e b r a l r o u t e t o e m b r y o n a t e d e g g s v i a th e a lla n t o ic c h a m b e r r o u t e r e s u l t e d in n o e v i d e n c e o f a n y s i g n i f i c a n t m o d if ic a t io n in c h ic k e n p a t h o g e n ic i t y . A t t e m p t s w e r e m a d e by R e a g a n e t a l . 3 ^ , *** to a d a p t a C a lif o r n ia s t r a i n o f t h e N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s t o t h e S y r ia n h a m s t e r . T h e v i r u s w a s s u c c e s s f u l l y c a r r i e d b y t h e i n t r a c e r e b r a l r o u t e in t h i s * a n im a l in m o r e th a n 5 0 s e r i a l p a s s a g e s . T h is N e w c a s t l e - h a m s t e r - v i r u s f a i l e d to i n f e c t r a b b it s b u t in d u c e d i n f e c t i o n in w h it e S w i s s m i c e a n d g u in e a p ig s w h e n i n j e c t e d i n t r a c e r e b r a l l y . T he v ir u s w a s n ot s u c c e s s ­ f u ll y p a s s e d b e y o n d th e f i r s t p a s s a g e in g u in e a p i g s a n d t h e f i r s t 4 s u c c e s s i v e p a s s a g e s in m i c e . A m o n k e y , M a c a c a r h e s u s , w a s in f e c t e d 11 i n t r a c e r e b r a l l y w ith th e h a m s t e r a d a p te d v i r u s b u t n o t w it h th e e g g a d a p te d v i r u s . T h e s a m e a u t h o r s r e p o r t e d la t e r ^ 2 th a t t h e h a m s t e r b r a in v i r u s o f t h e 4 9 th p a s s a g e w h e n in j e c t e d in to th e b a s e o f th e w a t t le in y o u n g c h ic k e n s r e v e a l e d l i t t l e p a t h o g e n ic it y a n d a s a t i s f a c t o r y im m u n ity u p o n p e n e x p o s u r e c h a lle n g e a t th e e n d o f 3 0 d a y s . A su s­ p e n s io n o f t h e b r a in o f a s h e e p , w h ic h h a d s u c c u m b e d to t h e i n t r a ­ c e r e b r a l in j e c t io n o f h a m s t e r b r a in v i r u s , w h en i n j e c t e d in to c h ic k e n s s h o w e d n o p a t h o g e n ic it y , but t h e im m u n ity r e s p o n s e w a s n o t f u lly s a t i s f a c t o r y u p o n p e n e x p o s u r e c h a lle n g e a t th e e n d o f 3 0 d a y s . E x p e r im e n t a l P r o c e d u r e s T h e o b j e c t o f t h i s w o r k w a s to s t u d y th e a n tib o d y r e s p o n s e o f tu r k e y s th r o u g h s e r o lo g ic a l t e s t s at c e r t a in t im e in t e r v a ls a fte r v a c c in a t io n w ith f o r m a l i n in a c t i v a t e d N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s f o llo w e d b y r e f r a c t i v i t y t e s t s to c h a l l e n g e w7it h v i r u l e n t v i r u s a t th e t e r m i n a t i o n o l th e s t u d y . T w o d i f f e r e n t s t r a i n s o f th e v i r u s w e r e u s e d : c h ic k e n o r i g i n , a n d T D , t u r k e y o r i g i n . N c 4 6 -9 6 7 , S t r a in N c 4 6 - 3 6 7 w a s i s o l a t e d in t h e D e p a r t m e n t o f B a c t e r i o l o g y a n d P u b lic H e a lt h , M ic h ig a n S t a t e C o l l e g e , in M a y , 1 9 4 6 f r o m a n a t u r a ll y in f e c t e d c h ic k e n . S t r a in T D ( J o n e s s t r a i n ) w a s i s o l a t e d in th e N e w Y o r k S t a t e V e t e r i n a r y C o l l e g e , C o r n e ll U n i v e r s i t y , f r o m n a t u r a ll y in f e c t e d t u r k e y s a n d w a s r e c e i v e d t h r o u g h th e c o u r t e s i e s o f D r s . P . P . L * e v in e a n d J . F a b r ic a n t . P r e p a r a tio n of v a c c in e s . S t r a in N c 4 6 - 9 6 7 w a s i s o l a t e d o r i g i n a l l y f r o m in f e c t e d lu n g a n d t r a c h e a l m a t e r i a l b y in o c u la t io n o f e m b r y o n a t e d c h ic k e n e g g s v ia th e a lla n to ic s a c r o u te . T h i s v i r u s w a s c a p a b le o f k i l l i n g a ll in o c u la t e d e m b r y o s w it h in 72 h o u r s in t h e f i r s t a n d a l l s u b s e q u e n t p assages. A lla n t o i c f lu id w a s h a r v e s t e d f r o m e m b r y o s d e a d o n th e s e c o n d p o s t in o c u la t io n d a y a n d u s e d f o r in o c u lu m f o r t h e n e x t p assage. V a c c i n e w a s p r e p a r e d f r o m th e 1 5 th p a s s a g e o f t h i s s t r a i n (N c 4 6 - 9 6 7 —- ) w h ic h c o n t a in e d 10^*^ e m b r y o l e t h a l d o s e s p e r 0 .1 c c . in o c u lu m v ia t h e a l l a n t o i c c a v i t y in 9 - to 1 0 - d a y - o l d em b ryos. 13 S t r a in T D w a s r e c e i v e d a s an a l l a n t o i c f l u i d p r e p a r a t io n o f th e v i r u s . O th e r th a n th a t t h e v i r u s w a s o f t u r k e y o r i g i n , n o h is to r y o r o r o to c o l w a s a v a ila b le . V a c c in e w a s p r e p a r e d f r o m a l l a n t o i c f lu id h a r v e s t e d f r o m th e 3 r d p a s s a g e o f t h e v i r u s in t h i s O la b o r a t o r y * d o ses per Q O T h is p a s s a g e ( T D —) c o n t a in e d 10^*° e m b r y o le t h a l 0.1 c c . in o c u lu m v i a t h e a l l a n t o i c c a v i t y r o u t e . T h e tw o v a c c i n e s w e r e p r e p a r e d b y th e a d d it io n o f f o r m a l i n t o a f i n a l c o n c e n t r a t io n o f O .i p e r c e n t o f t h e a l l a n t o i c f lu id p r e p a r a t i o n s o f N c 4 6 -9 6 7 -1 ^ . a n d T D lL T h e fo r m a lin iz e d a l l a n t o i c f l u i d s w e r e s t o r e d a t 5 C f o r 72 h o u r s a t w h ic h t i m e th e v i r u s w a s fo u n d to b e c o m p l e t e l y i n a c t i v a t e d a s in d i c a t e d b y i t s i n a b i l i t y t o p r o d u c e m o r t a l i t y w h e n i n j e c t e d in to 1 0 -d a y -o ld e m b r y o n a t e d c h ic k e n e g g s v i a t h e a l l a n t o i c s a c r o u t e . V a c c in a t io n . S e v e n t u r k e y h e n s a b o u t 6 m o n t h s o ld w e r e u s e d f o r th e e x p e r i m e n t a l w o r k . On M a r c h 3 , 1 9 4 7 , b lo o d w a s c o l l e c t e d f r o m a l l t u r k e y s f o r d e t e r m i n a t i o n o f p r e v a c c i n a t i o n a n tib o d y l e v e l s a g a i n s t N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s b y b o th s e r u m n e u t r a l ­ iz a t io n a n d h e m a g g lu t in a t i o n - in h i b it io n t e s t s w it h t h e r e s u l t s a s s h o w n in T a b le 1. 14 T a h le l - - P r e v a c c i n ^ tiQn A n tib o d y L e v e l s T u rkey N o. S e r u m Ne u t r ^ .liz a t i° n N I 33 34 36 40 42 48 85 H e m a g g lu tin a t io n - I n h ib it io n I P ** 50 16 5 5 5 5 5 5 5 10 10 10 2 8 * N e u t r a liz a t io n in d e x ** I n h ib ito r y p o w e r T h e t u r k e y s w e r e d iv id ed in to 3 g r o u p s o f 2 t u r k e y s e a c h , o n e b ir d f o r th e N c s t r a i n and the o t h e r b ir d f o r t h e T D s t r a i n . T h e 7th t u r k e y s e r v e d a s a c o n tr o l. T h e t u r k e y s in G r o u p 1 r e c e i v e d a s i n g l e i n j e c t i o n o f th e v a c c i n e and the t \ i r k e y s in G r o u p s 2 and 3 r e c e iv e d 2 i n j e c t io n s o f th e v a c c in e w'ith w e e k s, r e s p e c tiv e ly . On M a r c h 10.1 ^ 4 7 , in t e r im o f o n e and 2 1 . 0 c c , o f t h e v a c c in e w a s in j e c t e d in t r a m u s c u l a r l y in to th e p e c t o r a l m u s c l e s o f e a c h t u r k e y . O n M a r c h 1 7 , t u r k e y s 34 a n d 4 2 o f Gr o u P 2 w e r e r e v a c c i n a t e d an d tw o w e e k s a f t e r t h e o r ig in a l v a c c in a tio n t \ i r k e y s 36 a n d 4 8 o f G r o u p 3 w e r e r e v a c c in a te d . S e e T a b le 2. b i r c is w e r e k e p t in o n e e n c l o s u r e u n d e r th e s a m e c o n d itio n s of m a n a g e m e n t . T a b le 2 - - V a c c in a t io n o f T u r k e y s T urkey N o. V a c c in e 33 N c 4 6 -9 6 7 i^ 34 36 42 48 85 ( C o n tr o l) * l.o c c . 77 7 7 7 y 77 7 7 77 7 7 7 7 TD3 40 D ose I n o c u la t io n D a te 3 - 1 0 -1 9 4 7 3 -1 0 -1 9 4 7 3 - 1 7 -1 9 4 7 3 -1 0 -1 9 4 7 3 -2 4 -1 9 4 7 R o u te im .* 77 77 9 9 79 7 7 3 -1 0 -1 9 4 7 77 7 7 >7 7 7 3 - 1 0 -1 9 4 7 3 - 1 7 -1 9 4 7 7 7 7 7 7 7 77 77 7 7 77 3 -1 0 -1 9 4 7 3 -2 4 -1 9 4 7 ------------ — — — — — — 77 77 — —■' — I n t r a m u s c u la r ly in to th e p e c t o r a l m u s c l e s . B lo o d w a s c o l l e c t e d u n d e r a s e p t i c c o n d it io n s f r o m e a c h tu r k e y a t t h e f o llo w in g p e r i o d s a f t e r t h e o r i g i n a l v a c c in a t io n : an d 3 w e e k s ; 1, lj., 2 , 2-j,, 3 , 4 , a n d 9 m o n t h s . 1, 2 T h e s a m p le s w e r e c o l l e c t e d i m m e d i a t e l y p r io r to th e in j e c t io n o f th e s e c o n d d o s e o f v a c c i n e in t u r k e y s r e v a c c i n a t e d o n e o r tw o w e e k s a f t e r th e i n i t i a l v a c c in a t io n . T h e s e r u m w a s t e s t e d f o r b a c t e r i a l s t e r i l i t y p r i o r to s t o r a g e a t - 3 5 C f o r s u b s e q u e n t t e s t s o f i t s a n tib o d y c o n t e n t . , 16 T h e v a r i o u s s a m p l e s w e r e s t o r e d f o r t h e f o llo w in g p e r i o d s : c in a t io n s a m p l e s , 12 s a m p l e s , 113 d a y s ; 113 d a y s ; d ays; o n e w e e k s a m p l e s , 106 d a y s ; 3 w e e k s a m p l e s , 120 d a y s ; 1~2 m o n t h s s a m p l e s , 176 d a y s ; 2 w eeks o n e m o n th s a m p l e s , 2 m o n t h s s a m p l e s , 169 d a y s ; 2 \ m o n t h s s a m p l e s , 168 d a y s ; 3 m o n t h s s a m p l e s , 162 d a y s ; s a m p l e s , 134 d a y s ; prevac­ 4 m o n th s 9 m o n t h s s a m p l e s , 4 d a y s a n d p o s t c h a lle n g e s a m p le s , 4 d a y s. In a f e w c a s e s t h e s e r u m w a s fo u n d to b e c o n t a m in a t e d w ith b a c t e r i a . D u e to th e s m a l l a m o u n t o f s e r u m a n d to o b v ia t e th e p o s s ib ilit y o f l o s s o f s e r u m by filtr a tio n and d e c r e a s e o f a n ti­ b o d y b y a d s o r p t io n r e s o r t w a s h ad to th e u s e o f p e n i c i l l i n . T o each 1 .0 c c . o f s e r u m , 1 0 ,0 0 0 O x fo r d u n it s o f p e n i c i l l i n w e r e a d d e d in s u f f i c i e n t d ilu e n t to g iv e a 1 0 “ ^ d ilu t io n o f th e s e r u m . In e v e r y c a s e p e n i c i l l i n w a s e f f e c t i v e in r e n d e r in g th e s e r u m b a c t e r i a f r e e . B r a n d ly e t a l. r e p o r t e d th a t th e a d d it io n o f 1 ,0 0 0 O x fo r d u n it s o f p e n i c i l l i n p e r 0 .1 c c . d o s e o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s s h o w e d no a p p r e c i a b le a l t e r a t i o n s in t i t e r o r i n f e c t i v i t y f o r e g g s o r f o r c h ic k e n s . M oses 34 r e p o r t e d th a t in s e r u m n e u t r a l i z a t i o n t e s t s on N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s a n d in t e s t i n g o f m a t e r i a l s f o r i s o l a t i o n o f t h e v i r u s , p e n i c i l l i n in c o n c e n t r a t io n s a s h ig h a s 2 5 ,0 0 0 O x fo r d u n it s p e r 1.0 c c . h a d no p a r t ic u la r e f f e c t o n th e v i r u s , th e a n tib o d y o r th e v i a b i l i t y o f th e e m b r y o s . 17 T u rk ey N o . 40 d ied on M ay 12, 1 9 4 7 , fr o m in fe c tio u s e n te r o h e p a titis . T h e c o n tro l tu r k e y N o. 85 d ied on J u ly 7, 1 9 4 7 , a s a r e s u lt o f su p p u ra tiv e s i n u s i t i s and su b se q u e n t s e p t ic e m ia . T u rk ey N o. 34 d ied on O cto b er 10, 1947 fr o m in fe c tio u s e n t e r ­ o h e p a titis . D ue to the death o f t h e s e tu r k e y s on ly 5 s e r u m s a m p le s w e r e c o lle c te d fr o m N o. 4 0 , 8 s a m p le s fr o m N o. 85 and 9 s a m p le s fr o m N o. 34 . T u r k e y s N o s . 3 3 , 3 6 , 4 2 , and 48 w e r e c h a lle n g e d on Jan uary 7, 1948, 10 m on th s a fte r v a c c in a tio n , w ith 10 d o s e s in 1.0 em b ry o le th a l c c . of in ocu lu m w h ich w a s in je c te d in tr a m u s c u la r ly into ea ch b ir d . T u r k e y s 3 3 , 36, and tw o c o n tr o l tu r k e y s N o s . 29 and 58 w e r e in je c te d w ith th e 19th p a s s a g e of N c 4 6 - 9 6 7 w h ile tu r k e y s 42 and 48 and a c o n tr o l tu rk ey N o . 28 w e r e in je c te d w ith th e 5th p a s s a g e o f TD . S e r o lo g ic a l t e s t s . T he s e r u m s a m p le s w e r e te s te d f o r an tib od y co n ten t by: (1) T h e ir c a p a c ity to in h ib it h e m a g g lu tin a tio n of tu r k e y r e d blood c e l l s by N c 4 6 -9 6 7 . S e r a fr o m tu r k e y s N o s . 4 2 , 4 8 , and 85 at 2-g, 3, 4 and 9 m o n th s a fte r v a c c in a tio n and the p o s t c h a lle n g e s e r a fr o m tu r k e y s 42 and 48 w e r e te s te d fo r th e ir c a p a c ity to in hibit h e m a g g lu tin a tio n by both N c 4 6 -9 6 7 and TD v ir u s s t r a in s . 18 (2 ) T h e i r c a p a c it y t o n e u t r a l i z e N c 4 6 - 9 6 7 . S e r a fr o m t u r k e y s N o s . 4 2 , 4 8 , a n d 8 5 a t 2v>, 3 , 4 , a n d 9 m o n t h s a f t e r v a c c i n ­ a t io n an d t h e p o s t c h a l l e n g e s e r a f r o m t u r k e y s 4 2 an d 4 8 w e r e t e s t e d f o r t h e i r c a p a c i t y to n e u t r a l i z e b o th N c 4 6 - 9 6 7 a n d T D v i r u s s tr a in s . H e m a g g lu t in a t io n - in h ib it io n an d s e r u m n e u t r a liz a t io n t e s t s o f e a c h s e r u m w e r e c o n d u c te d u n d e r th e s a m e c o n d it io n s w ith no m o r e th a n o n e o r tw o d a y s b e t w e e n b o th t e s t s . H e m a g g lu t in a t io n (H ) a n d h e m a g g lu t in a t io n - in h ib it io n (H I) t e s t s . H i r s t ^ in 1 9 4 1 r e p o r t e d th a t w h e n in f e c t e d a lla n t o ic f lu id w ith in f lu e n z a v i r u s w a s m ix e d in a t e s t tu b e w ith w a s h e d n o r m a l c h ic k e n r e d b lo o d c e l l s , a v i s i b l e a g g lu t in a t io n o f th e c e l l s o c c u r r e d a f t e r 5 to 2 0 m i n u t e s . T h e c e l l s s e d i m e n t e d r a p id ly a n d f o r m e d a c h a r a c t e r i s t i c r a g g e d g r a n u la r p a t t e r n on th e b o tto m o f th e tu b e . W h en r e d b lo o d c e l l s w e r e a d d e d t o n o r m a l a l l a n t o i c f lu i d , th e c e l l s s e d im e n t e d s l o w l y w ith o u t a g g r e g a t i o n a n d f o r m e d a s h a r p r o u n d d i s c o n t h e b o t t o m o f t h e tu b e . H i r s t s h o w e d th a t t h i s h e m a g g lu t in a t io n p h e n o m e n o n w a s in h ib it e d w ith in f lu e n z a a n t i s e r u m in h ig h d ilu t io n s and th a t s u c h in h ib it io n w a s s p e c i f i c w ith r e g a r d to th e s t r a i n o f th e v ir u s u s e d . T h e s a m e p h e n o m e n o n w a s d i s c o v e r e d in d e p e n d e n t ly by oc M c C le lla n d a n d H a r e w h o s h o w e d , in a d d it io n , th a t h u m a n an d g u in e a p ig r e d b lo o d c e l l s w e r e a l s o s u s c e p t i b l e to h e m a g g lu t in a t io n an d th a t th e v i r u s w a s a d s o r b e d o n th e s e d i m e n t e d c e l l s . H ir s t 37 d em o n stra ted la te r th a t t h i s p h e n o m e n o n c o n s t it u t e d a v a lu a b le b a s i s f o r th e quantitative e s t i m a t i o n o f i n f l u e n z a v i r u s h e m a g g lu t in in and i t s co rresp o n d in g a n tib o d y . T h e r i s e o f in flu e n z a v ir u s a n tib o d y in h u m an se ru m a fter an i n f e c t i o n w it h t h e v i r u s w a s a s r e a d i l y d e m o n s t r a t e d in v itro w ith th e h e m a g g l u t i n a t i o n - i n h i b i t i o n t e s t a s w ith th e m o u s e se r u m n e u tr a liz a tio n t e s t s . N o r m a l fe r r e t, r a b b it, m o u s e , g u in e a pig and human s e r u m w o u ld a l s o i n h i b i t th e a g g lu tin a tio n of r e d b lo o d c e lls but in m u c h l o w e r d i l u t i o n s t h a n w o u ld a s p e c i f i c im m u n e s e r u m . H irst u sed 0 .5 c c . v o l u m e s o f v a r i o u s s e r u m d ilu t io n s w ith 0 .5 c c . of v ir u s (4 t i m e s t h e d e s i r e d f i n a l c o n ­ c e n t r a t io n to p r o d u c e th e end point a g g lu t in a t io n ) a n d 2 .0 p e r c e n t r e d b lo o d c e ll su sp e n sio n . 1.0 c c . of a R e a d in g s w e r e m a d e a fte r in c u b a tio n o f th e t e s t fo r one hour at r o o m t e m p e r a t u r e a t 2 2 C to 25 C . T h e en d p oirt w a s co n sid ered to b e t h e s e r u m d i l u t i o n in th e tu b e in w h ic h th e su p e r n a ta n t fluid w ould c o m p a r e t o s t a n d a r d r e d b lo o d c e l i s u s p e n s i o n s containing 0.75 p e r c e n t t o 0 .5 p e r c e n t r e d b lo o d c e l l s u s p e n s io n in s a lin e , i . e ., the s e r u m d i l u t i o n w h i c h w o u ld in h ib it h e m a g g lu tin a tio n by the v iru s of a b o u t o n e - h a l f o f t h e f i n a l c o n c e n t r a t io n o f r e d b lo o d c e ll s u s p e n s io n ( 1 . 0 p e r c e n t ) u s e d in th e t e s t . H i r s t ^ had p ointed out that v ir u s p r e p a r a t i o n s i n a c t i v a t e d at 56 C f o r 15 m in u t e s o r by sto r a g e at 23 C f o r s e v e r a l d a y s w o u ld r e t a in t h e i r h e m a g g lu tin a tio n p r o p e r tie s. I n c u b a t io n o f t h e s e r u m - v i r u s m ix t u r e w a s u n n e c e s s a r y as the a n t i g e n - a n t i b o d y r e a c t i o n s e e m e d to b e an im m e d ia te one. 20 In a l a t e r c o n t r ib u t io n , H i r s t a n d P i c k e t s 38 d e s c r ib e d th e u s e o f a p h o t o - e l e c t r i c d e n s i t o m e t e r to m e a s u r e t h e o p t i c a l d e n s i t i e s o f t h e m id d le l a y e r o f t h e r e d b lo o d c e l l s u s p e n s i o n in th e t i t r a t i o n tu b e s. G a lv a n o m e t e r r e a d i n g s w e r e c o n v e r t e d in to v a l u e s e x p r e s s i n g th e p e r c e n t a g e o f r e d b lo o d c e l l s w h ic h r e m a i n e d in s u s p e n s i o n a f t e r 75 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . H ir s t 30 d e s c r i b e d th e e f f e c t o f 0 .7 5 p e r c e n t , 1 .5 p e r c e n t , an d 3 .0 p e r c e n t s u s p e n s i o n s o f r e d b lo o d c e l l s a t 2 3 C a n d t h e a d s o r p t i o n a n d e lu t io n o f in f l u e n z a h e m a g g lu t in in s a t t e m p e r a t u r e s of 4 C , 2 7 C, and 37 C . W ith h ig h c o n c e n t r a t i o n s o f c e l l s a t 2 3 C , t h e m a x im u m a d s o r p t i o n o f in f lu e n z a h e m a g g l u t i n i n s w a s m o r e c o m p l e t e th an w it h lo w c o n c e n t r a t i o n s o f c e l l s . C o r r e s p o n d in g ly , th e s u b s e q u e n t e l u t io n o f h e m a g g lu t in in s w a s l e s s c o m p l e t e in c e n tr a tio n s of c e l l s w e r e u s e d . 6 h o u r s w h e n h ig h c o n ­ M a x im u m a d s o r p t i o n o f i n f l u e n z a h e m a g g lu t in in s to o k p la c e in 5 h o u r s a t 4 C , 2 5 m i n u t e s a t 2 7 C a n d 3 t o 5 m in u t e s a t 3 7 C . E lu t io n w a s l e s s th a n 1 .0 p e r c e n t in 18 h o u r s a t 4 C , 2 5 p e r c e n t in in 6 h o u r s at 37 C . of 0.1 6 h o u r s a t 2 7 C a n d n e a r l y 100 p e r c e n t T h e a d d it io n o f f o r m a l i n to a f i n a l c o n c e n t r a t i o n p e r c e n t d id n o t a f f e c t th e h e m a g g lu t in a t i v e c a p a c i t y w h i le t h e in fe c tiv it y of th e v ir u s w a s d e s tr o y e d . S t u a r t - H a r r i s * ^ r e p o r t e d t h a t t h e e n d p o in t o f h e m a g g l u ­ t in a t io n w a s d i f f i c u l t to d e t e c t b y in c u b a t io n a t r o o m t e m p e r a t u r e an d t h a t b e t t e r r e a d i n g s w e r e p r o d u c e d b y in c u b a t io n f o r 4 C. 2 h ou rs at H e fo u n d t h a t h e m a g g lu t in a t io n o f c e l l s b y s o m e n o r m a l s e r a 21 w a s m o r e o b v io u s a t 4 C th a n a t r o o m t e m p e r a t u r e an d f o r t h is r e a s o n h e p r e f e r r e d to in c u b a t e t h e t e s t a t r o o m t e m p e r a t u r e . H e sta te d th a t th e u s e o f r e d b lo o d c e l l s f r o m d if f e r e n t c h i c k e n s o r e v e n th e c e l l s o f th e s a m e b ir d a t d i f f e r e n t t i m e s o f th e y e a r g a v e s i g n i f i c a n t d i f f e r ­ e n c e s in h e m a g g l u t i n a t i o n - i n h i b i t i o n t e s t s w it h in f lu e n z a v i r u s . The sam e p a s s a g e o f th e v i r u s in a m n io t ic a n d a l la n t o ic f l u i d s f r o m d i f f e r e n t e g g s g a v e v a r i a t i o n s in r e s u l t s w ith t h e s a m e s e r u m . T h is w a s la te r d e s c r i b e d b y H ir s t ^ * a s d u e to a d i f f e r e n t d e g r e e o f a g g r e g a t i o n a m o n g d iffe r e n t v ir u s p r e p a r a tio n s . In th e s a m e r e p o r t , H i r s t d e ­ s c r i b e d v a r i a t i o n s in in f l u e n z a v i r u s t i t e r s d u e to a g in g o f r e d b lo o d c e lls at 4 C. M i l l e r a n d S t a n le y 42 fo u n d th a t t h e pH o f th e m e d iu m h ad o n ly a m in o r e f f e c t o n th e h e m a g g lu t in a t io n t e s t in a r a n g e o f pH to pH 8 6 a n d th a t e r r o r s w ith t h e u s e o f u n b u f f e r e d s a l i n e w e r e u n l i k e l y . M i l l e r a n d S t a n le y r e p o r t e d th a t th e t e m p e r a t u r e e x e r t e d a d i r e c t i n f l u e n c e o n th e t i t e r b u t t h a t th e m o s t r e p r o d u c i b le r e s u l t s w e r e o b t a in e d a t a b o u t 2 4 C . A 5 0 p e r c e n t l o s s in t h e a b ilit y o f r e d b lo o d c e l l s to b e a g g lu t in a t e d b y t h e v i r u s o c c u r r e d d u r in g 7 d a y s s t o r a g e at 4 C . T h e v i r u s h e m a g g lu t in in w a s l e s s s t a b l e w h e n t h e v i r u s w a s s t o r e d a t - 7 0 C th a n a t 4 C . T h e s e a u th o r s d e s ig n a te d th e t e s t a s th e C C A t e s t ( c h ic k e n c e l l a g g lu t in a t io n ) . M ille r 43 r e p o r t e d t h a t th e h e m a g g lu t in in a c t i v i t y w a s m o r e s t a b l e in c o n c e n t r a t e d th a n in d ilu t e v i r u s p r e p a r a t i o n s , m o r e s t a b l e a t 4 C th a n a t r o o m t e m p e r a t u r e , a n d a t pH 7 th a n in th e a c i d r a n g e . O th e r i n v e s t i g a t o r s ^ h a v e e m p lo y e d a v a r i a t io n o f th e m e th o d o f r e a d in g th e t e s t by u t i l i z i n g t h e p a tt e r n o f th e s e d im e n t e d c e l l s f o r e s t i m a t i n g th e d e g r e e o f h e m a g g lu t in a t io n o r h e m a g g lu t in ­ a tio n - in h ib it io n . S a lk 45 u s e d a 0 .2 5 p e r c e n t s u s p e n s i o n o f c h ic k e n r e d b lo o d c e l l s an d r e c o r d e d t h e r e s u l t s a s : -^ (c o m p le te a g g lu t in a t io n ) , 0 (no a g g lu t in a t io n ) , an d + ( p a r t ia l o r s l i g h t a g g lu t in a t io n a s s e e n in th e i n t e r m e d ia t e r e a c t i o n s ) . T h e e n d p o in t w a s c o n s i d e r e d to b e th e h ig h e s t d ilu t io n o f th e v i r u s p r o d u c in g m a x im a l h e m a g g lu t in a t io n an d th e t i t e r w a s e x p r e s s e d a s th e r e c i p r o c a l o f t h e f in a l d ilu t io n o f v i r u s a f t e r th e a d d itio n o f th e r e d b lo o d c e l l s u s p e n s i o n , h i th e h e m a g g lu t in a t io n - in h ib it io n t e s t th e s e r u m t i t e r w a s th e h i g h e s t d ilu tio n o f s e r u m c a u s in g c o m p l e t e h e m a g g lu t in a t i o n - in h i b it io n . B urnet 47 t e s t e d th e a b ilit y o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s in f e c t e d a l l a n t o i c a n d a m n io t ic f l u i d s to a g g lu t in a t e c h ic k e n r e d b lo o d c e l l s in a m a n n e r s i m i l a r to th a t a f f e c t e d b y t h e in f lu e n z a v ir u s . Aft A m o d if ic a t io n o f H i r s t ’s t e s t a s s u g g e s t e d b y L u s h ° w a s e m p lo y e d to p e r m it r e a d in g o f t h e t e s t a c c o r d in g t o t h e p a t t e r n o f th e s e d im e n t e d c e l l s r a t h e r th a n a c c o r d in g to th e r a t e an d d e g r e e o f c l e a r i n g o f th e r e d b lo o d c e l l s u s p e n s i o n . 3 5 ,3 6 ,3 8 ,3 9 L u sh ^ S p o in te d o u t th a t t h e r e w a s d e f in i t e h e m a g g lu t in a t io n w ith N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s w h ic h a f f e c t e d o n ly a s m a l l p r o p o r t io n o f th e c e l l s s o th a t t h e d e n s it y o f th e s u s p e n s i o n w a s n o t g r e a t l y r e d u c e d an d m a d e th e m o d if ic a t io n o f H i r s t ’s t e c h n ic n e c e s s a r y . 23 T h e m o d if ic a t io n b y L ush^® a s u s e d b y B u r n e t" ^ d e p e n d e d o n th e d i f f e r e n t p a t t e r n s o f a g g lu t in a t e d o r u n a g g lu t in a t e d c e l l s a t 4 C to 6 C. T h e v o lu m e o f th e r e a c t in g m a t e r i a l s w a s r e d u c e d to 0 .2 5 c c . an d a 2 .0 p e r c e n t r e d b lo o d c e l l s u s p e n s i o n w a s u s e d . m ad e a fte r 2 h o u r s. R e a d in g s w e r e M a x im a l a g g lu t in a t io n w a s d e s ig n a t e d a s + + + an d th e e n d p o in t a s + w h e r e t h e r e w a s p a r t ia l a g g lu t in a t io n o f c e l l s p e r i p h e r a l l y w ith a d e f in i t e l e n t if o r m c e n t r e o f s e d im e n t e d c e l l s . B u r n e t^ ^ d e m o n s t r a t e d d i f f e r e n t i a l h e m a g g lu t in a t iv e a c t i v i t y o f th e N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s a m o n g r e d b lo o d c e l l s o f v a r i o u s s p e c i e s o f a n im a l s ( g u in e a p ig , m o n k e y , h o r s e , m o u s e , s h e e p , r a b b it , f e r r e t ) an d m a n . H e m a g g lu t in a t io n - in h ib it io n b y s p e c i f i c N e w c a s t l e d i s e a s e im m u n e s e r u m w a s a l s o d e m o n s t r a t e d b y B u r n e t^ ? a n d L u s h .4 6 L u s h , t h r o u g h th e u s e o f th e h e m a g g lu t in a t i o n - in h i b it io n t e s t , v e r i f i e d th e a b s e n c e o f a s e r o l o g i c a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n fo w l p la g u e an d N e w c a s tle d is e a s e v ir u s e s . B u r n e t e t a l . ^ p o in t e d o u t th a t th e h e m a g g lu t in a t iv e a c t iv it y an d th e i n f e c t i v i t y o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s w e r e n o t a f f e c t e d a t 56 C f o r 3 0 m in u t e s w h e r e a s a t 6 0 C f o r 15 m in u t e s a c o m p le t e d e s t r u c t i o n o f th e i n f e c t i v i t y a n d a r e d u c t io n o f t h e h e m a g g lu t in a t iv e t i t e r b y 5 0 .0 per cent w as o b serv ed . T h e h e m a g g lu t in a t iv e a c t i v i t y w a s c o m p l e t e l y d e s t r o y e d a t 6 5 C f o r 15 m i n u t e s . T h e a d d itio n o f f r o m 0 .1 p e r c e n t to 0 .2 5 p e r c e n t f o r m a lin d e s t r o y e d t h e i n f e c t iv it y o f th e v i r u s b u t th e h e m a g g lu t in a t iv e t i t e r w a s u n a lt e r e d . T h e p h en o m en o n w a s d e s c r ib e d 24 a s a c o m p l e x r e v e r s i b l e r e a c t i o n in w h ic h b o th th e v i r u s - a n t i b o d y a n d v i r u s - r e d c e l l u n io n s w e r e r e v e r s i b l e an d th a t a f i n a l c o n c e n t r a t io n o f 0 .1 2 5 p e r c e n t o f r e d b lo o d c e l l s w a s a b o u t th e p r a c t i c a l l i m i t f o r th e t e s t t o b e e a s i l y r e a d . B r a n d ly e t a l.^ ^ fo u n d th a t th e a p p li c a t io n o f L u s h ’s ^ m o d if ic a t io n to d e m o n s t r a t e N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s in in f e c t e d a l l a n t o i c f l u i d s y ie ld e d i n d i f f e r e n t r e s u l t s . T h i s p r o b le m w a s o v e r ­ c o m e b y a r e d u c t io n o f t h e r e d c e l l s u s p e n s i o n f r o m 1 .0 p e r c e n t o r l e s s ; p e r c e n t to 2 .0 in c u b a t io n o f t h e t e s t a t 2 5 C r a t h e r th a n a t 6 C a n d r e a d i n g t h e t e s t a t i n t e r v a l s o f 15, 3 0 , a n d 4 5 m in u t e s in s t e a d o f 2 h ou rs. T u r k e y r e d b lo o d c e l l s w e r e a l s o a g g lu t in a t e d in t y p ic a l m anner. T h e h e m a g g lu t in a t iv e t i t e r o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s w a s r e t a i n e d w e ll a f t e r 6 0 C f o r 3 0 m i n u t e s , u l t r a - v i o l e t l i g h t ir r a d i a t i o n a t 1 6 0 0 A to 1 8 0 0 A f o r 0 .S to 1 .0 8 s e c o n d s a n d th e a d d it io n o f f o r m a l i n to a f in a l c o n c e n t r a t i o n o f f r o m 0 .2 to 0 .4 p e r c e n t . T h e s e tr e a tm e n ts w e r e s u f f i c i e n t to d e s t r o y th e i n f e c t i v i t y o f t h e v i r u s . S p e c ific N e w ­ c a s t l e d i s e a s e im m u n e s e r u m in h ib it e d h e m a g g lu t in a t io n b y s e v e r a l s tr a in s o f N e w c a s tle d is e a s e v ir u s . S o m e e v id e n c e o f s tr a in s p e c if it y w a s s e e n w it h t h i s t e s t . C unha e t a l. 49 r e p o r t e d o n t h e u s e o f th e h e m a g g lu t in a t io n t e s t in e s t i m a t i n g th e d i s t r ib u t io n o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s in p u r if ie d f r a c t i o n s o f i n f e c t e d a l l a n t o i c f lu id p r e p a r a t i o n s . T h e y fo u n d th a t t h e r e s u l t s w ith L u s h 's ^ ® m o d if ic a t io n o f t h e t e s t w e r e i n c o n s i s ­ t e n t an d th a t t h e i n t e n s i t y o f th e r e a c t i o n w a s f r e q u e n t ly t o o lo w f o r u s e . 25 T h e y o b ta in e d s a t i s f a c t o r y r e s u l t s w h en th e t e s t s w e r e c o n d u c te d a t 2 3 C to 2 7 C an d pH 7 .5 w ith a 1 .0 p e r c e n t c h ic k e n r e d b lo o d c e l l f in a l c o n c e n t r a t io n . T h e en d p o in t w a s t h e v i r u s d ilu tio n in w h ic h th e s u p e r n a t a n t flu id m a t c h e d a s t a n d a r d s u s p e n s io n o f 0 .6 3 p e r c e n t r e d b lo o d c e l l s . A f a c t o r p r e s e n t in n o r m a l a lla n t o ic f lu id w a s fo u n d to h a v e a n in h ib it o r y a c t io n on t h e h e m a g g lu t in a t io n t e s t . T h e h e m a g g lu ­ t in in o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s w a s a s s o c i a t e d o n ly w ith th e v ir a l a g e n t an d v a r i a t i o n s in th e r a t i o o f h e m a g g lu t in a t iv e a c t i v i t y an d in f e c t i v i t y w ith th e p u r if ie d v i r u s w e r e g r e a t e r th a n t h o s e s e e n w ith in f lu e n z a v i r u s e s . c a p a c ity T h e s e v a r i a t i o n s w e r e d u e to th e r e l a t i v e l y lo w 4 6 4 7 49 > > N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s to a g g lu t in a t e r e d b lo o d c e l l s and a l s o to th e g r e a t e r d if f ic u lt y in c o n t r o lli n g th e c o n d it io n s o f th e r e a c t i o n . F lo r m a n 50 in a l a t e r r e p o r t p o in te d o u t th a t a t r o o m t e m p e r a t u r e t h e r e w a s l e s s h e m a g g lu t in a t io n w ith v i r u s d ilu t io n s th a n w ith h ig h v i r u s d ilu t io n s , i . e . , p r o z o n e r e a c t i o n . c e ll s u s p e n s io n s o f 1.0 W ith c h ic k e n p e r c e n t o r l e s s a n d w ith a s h o r t e r r e a c t i o n p e r io d a s r e c o m m e n d e d b y B r a n d ly e t a l.3 3 t h i s d is t u r b in g e f f e c t p e r s i s t e d a n d th e r e a c t i o n s w e r e d if f ic u lt to r e a d an d r e p r o d u c e . F lo r m a n c a r r i e d o u t th e r e a c t i o n s a s o r i g i n a l l y m o d if ie d b y L ,ush £ 6 an d B u r n e t ^ . H e r e p o r t e d th a t t h e r e d b lo o d c e l l s o f a n o c c a s i o n a l in d iv id u a l c h ic k e n w e r e m a r k e d ly i n s e n s i t i v e to a g g lu t in a t io n b y th e v i r u s a t 4 C , and t h a t th e en d p o in t o b ta in e d w ith th e v i r u s t i t r a t i o n a t 4 C w a s u s u a l ly 2 t o 4 t i m e s l o w e r th a n w h e n th e t e s t w a s p e r f o r m e d 26 at r o o m t e m p e r a t u r e '. H is d a t a , h o w e v e r , f a ile d to s h o w s ig n if ic a n t d i f f e r e n c e s in th e t i t e r s o b ta in e d a t th e tw o t e m p e r a t u r e s . H a n s o n e t a l. 51 u s e d 4 r o u t e s to in j e c t e m b r y o n a t e d e g g s w ith N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s a n d fo u n d th a t th e o r d e r a n d t im e o f a p p e a r a n c e o f d e m o n s t r a b le h e m a g g lu t in in s w a s d i s t i n c t i v e f o r e a c h ro u te . H e m a g g lu t in in s d e v e lo p e d m o s t r a p id ly in e g g s in o c u la t e d b y th e in t r a v e n o u s , y o lk s a c an d th e a lla n t o ic s a c r o u t e s , r e s p e c t i v e l y . E m b r y o s in o c u la t e d on th e c h o r i o a l l a n t o i c m e m b r a n e f a i l e d to s h o w d e t e c t a b le h e m a g g lu t in in s in th e a lla n t o ic f lu id , a n d in c h o r i o a lla n t o i c an d a m n io n ic m e m b r a n e s u s p e n s i o n s u n t il 2 4 h o u r s a f t e r in o c u la t io n . H e m a g g lu t in a t io n t i t e r s s h o w e d a p r o g r e s s i v e i n c r e a s e f r o m th e f i r s t a p p e a r a n c e o f th e h e m a g g lu t in in s u n til th e d e a th o f th e e m b r y o . The h e m a g g lu t in a t io n t i t e r s a t th e t i m e o f d e a t h c o n f ir m e d th e f in d in g s of B u rn et 47 a n d o f B r a n d ly e t a l. ** o n th e e f f e c t o f th e r o u t e o f th e v i r u s in o c u la t io n on th e d e v e lo p m e n t o f th e h e m a g g lu t in in s in th e in f e c t e d e m b r y o f l u i d s . T h e p r e s e n c e o f a n o r m a l h e m a g g lu t in in in b o th n o r m a l an d N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s in f e c t e d y o lk s a c m e m b r a n e s w a s r e v e a le d . T h is n o r m a l h e m a g g lu t in in w a s in h ib it e d b y th e a d d itio n o f e i t h e r n o r m a l s e r u m o r N e w c a s t l e d i s e a s e im m u n e s e r u m . The e m b r y o L D g g t it r a t i o n w a s m u c h m o r e s e n s i t i v e a s a n in d ic a t o r o f th e p r e s e n c e o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s th a n w a s th e h e m a g g lu ­ tin a t io n t e s t . T h e L D 5 Q e m b r y o t i t e r w a s p r o d u c e d b y in o c u la t io n o f o n e m illio n t h o f th e a m o u n t o f v i r u s d e m o n s t r a b le b y th e h e m a g g lu ­ t in a t io n t e s t . 27 B r a n d ly e t a l. 52 c o n f ir m e d th e v a r i a t i o n s in a g g lu t i n a b ili t y o f c h ic k e n r e d b lo o d c e l l s f r o m d i f f e r e n t in d i v id u a ls a lt h o u g h t h e y h a d a n e g l i g i b l e v a r i a t io n w h e n t h e y u s e d t u r k e y c e l l s f r o m e i g h t d i f f e r e n t tu r k e y s. A tt e n u a tio n o r m o d if ic a t io n o f 2 N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s s t r a i n s o n s e r i a l t r a n s f e r s u p to 6 0 p a s s a g e s r e s u l t e d in n o c h a n g e o f h e m a g g lu t in a t iv e a c t i v i t y . pH 8 V a r i a t i o n s w it h in t h e r a n g e o f pH 6 to d id n o t c a u s e an a l t e r a t i o n in th e h e m a g g lu t in a t i o n v e l o c i t y , p a tte r n o r t it e r . 42 I s a a g g lu t in in s w e r e d e m o n s t r a t e d in o n ly 1 .0 p e r c e n t o f 2 3 c h i c k e n s o f 3 d if f e r e n t b r e e d s . H e te r o a g g lu tin in s fo r t u r k e y r e d b lo o d c e l l s w e r e p r e s e n t in 7 5 .0 p e r c e n t o f th e c h ic k e n s e r u m s a m p l e s t e s t e d w h e r e a s h e t e r o a g g l u t i n i n s f o r c h ic k e n r e d b lo o d c e l l s w e r e p r e s e n t in o n ly 5 .0 p e r c e n t o f th e t u r k e y s e r u m s a m p le s te s te d . C o m p a r is o n s w e r e m a d e o f “ a lp h a ” o r c o n v e n ­ t io n a l p r o c e d u r e f o r th e h e m a g g lu t in a t i o n - in h i b it io n t e s t w h e r e i n s e r i a l d i l u t i o n s o f th e v ir u s a r e a d m ix e d w ith a f i x e d a m o u n t o f s e r u m to t h e “ b e t a ” p r o c e d u r e w h e r e i n a n a m o u n t o f v i r u s s o l u t i o n c o n t a in in g 10 h e m a g g lu t in in u n it s i s a d m ix e d w it h a n e q u a l q u a n tity of s e r i a l s e r u m d ilu tio n s . U s in g t h e “ b e t a ” p r o c e d u r e a s a s t a n d a r d th e a u t h o r s p o in t e d o u t th a t t h e r e w a s a 9 3 .0 p e r c e n t a g r e e m e n t o f th e “ a lp h a ” a n d th e “ b e t a ” p r o c e d u r e s . I n v e s tig a t io n s o f th e r e la t io n ­ s h ip b e t w e e n h e m a g g lu t in a t i o n - in h i b it io n a n d s e r u m n e u t r a l i z a t i o n t i t e r s le a d t o th e o b s e r v a t i o n s t h a t d u r in g t h e p e r i o d o f a s c e n d in g t i t e r s f o llo w in g in f e c t io n o r v a c c in a t io n a g o o d a g r e e m e n t o f b o th t i t e r s m ig h t b e o b t a in e d . D u r in g t h e d e s c e n d i n g p h a s e , t h e s e t i t e r s 28 m ig h t s h o w e i t h e r c o r r e l a t i o n o r d i v e r g e n c e . T h e h e m a g g lu t in a t io n - in h ib it io n b o d ie s w e r e o b s e r v e d to d is a p p e a r f i r s t . R e v a c c in a t io n o r r e i n f e c t i o n c a u s e d an i n c r e a s e in t i t e r if p r e s e n t , o r if a b s e n t , th e a p p e a r a n c e o f b o th s e r u m n e u t r a liz i n g an d h e m a g g lu t in a t io n - in h ib it io n tite r s . B each 53 r e p o r t e d o n th e a p p lic a t io n o f t h e h e m a g g lu t in a t io n - in h ib itio n t e s t in t h e d i a g n o s i s o f “ a v ia n p n e u m o e n c e p h a l i t i s . I n th e h e m a g g lu t in a t io n t e s t , 0 .5 c c . o f 2 - f o ld d ilu t io n s o f t h e v i r u s w e r e a d m ix e d w ith a n e q u a l q u a n tity o f a p e n s io n . 1.0 p e r c e n t r e d b lo o d c e l l s u s ­ R e a d in g w a s m a d e b y v ie w in g th e p a tte r n o f s e d im e n t e d c e l l s a f t e r 2 5 to 3 5 m in u t e s a t 2 1 C to 2 4 C . T h e e n d p o in t w a s ta k e n a s th e f o r m a t io n o f a s m a l l c e n t r a l d is c o f u n a g g lu t in a t e d c e l l s s u r ­ r o u n d e d b y a g r a n u la r a r e a o f a g g lu t in a t e d c e l l s . T h e en d p o in t w a s d e s ig n a t e d a s + + . In th e h e m a g g lu t in a t io n - in h ib it io n t e s t , 0 .2 5 c c . o f s e r i a l 2 - f o ld d ilu t io n s o f th e s e r u m w a s a d m ix e d w ith an e q u a l q u a n tity o f v ir u s d ilu t io n c o n t a in in g 2 to 4 h e m a g g lu t in in u n it s . A f t e r 5 t o 10 m in u t e s in c u b a t io n a t 21 C to 2 4 C , 0 .5 c c . o f a 1 .0 p e r c e n t c h ic k e n r e d b lo o d c e l l s u s p e n s i o n w a s a d d e d and r e a d i n g s w e r e m a d e a t to 35 m in u t e s . 20 T h e h i g h e s t d ilu t io n o f s e r u m w h ic h in h ib ite d h e m a g ­ g lu t in a t io n , i. e . , + + , w a s t e r m e d th e h e m a g g lu t in a t io n - in h ib it io n t i t e r o f th e s e r u m . B e a c h r e p o r t e d th a t th e h e m a g g lu t in a t io n - in h ib it io n t i t e r w a s n o t a lw a y s c o r r e l a t e d w ith th e s e v e r i t y o f e x p o s u r e to th e v ir u s o r w ith t h e d e g r e e o f r e s i s t a n c e o f th e d o n o r t o th e c h a lle n g e . 29 H e s u g g e s t e d th a t in f e c t io n w ith a c t i v e v i r u s m ig h t b e r e q u i r e d f o r t h e p r o d u c t io n o f h e m a g g lu t in a t i o n - in h i b it io n a n t ib o d ie s in t h e b lo o d . s e r u m t i t e r a s lo w a s 1:10 A w h ic h c o r r e s o o n d s to a n in h ib it o r y p o w e r o f 2 0 to 4 0 u s in g th e “ a lp h a * ' o r c o n v e n t ia l m e t h o d o f th e h e m a g g lu t in a t i o n in h ib it io n t e s t w a s fo u n d t o b e o f d i a g n o s t i c s i g n i f i c a n c e . B u r n e t e t a l. 54 55 ’ r e p o r t e d th a t t y p e O h u m a n r e d b lo o d ^4 c e lls '* ^ and c h ic k e n r e d b lo o d c e l l s t r e a t e d a n d s t a b i l i z e d w ith N e w ­ c a s t l e d i s e a s e v i r u s a t 3 7 C f o r 2 h o u r s , i . e . s u b j e c t e d t o a g g lu t in a t io n f o llo w e d b y e l u t i o n , w e r e s p e c i f i c a l l y a g g lu t in a t e d b y h ig h d ilu t io n s o f e i t h e r N e w c a s t l e d i s e a s e im m u n e s e r a f r o m la b o r a t o r y a n i m a l s o r s e r a fr o m h u m a n s r e c o v e r e d fr o m in fe c tio u s m o n o n u c le o s is . T hey r e l a t e d th e c h a n g e d c h a r a c t e r o f th e c e l l s t o t h e a d s o r p t i o n to t h e ir s u r f a c e o f a c e l l s e n s i t i z i n g a g e n t (C S A ) in t h e N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s p r e p a r a t io n . It w a s s u g g e s t e d th a t t h e “ a n tig e n * * c o n c e r n e d w a s a m o d if ie d c e l l c o n s t i t u e n t a n d n ot a d i r e c t p r o d u c t o f th e v i r u s . A n d erso n 56 fo u n d th a t N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s s t a b i l i z e d c e l l s w h e n m ix e d w ith an e x c e s s o f n o r m a l c e l l s h a d th e c a p a c i t y to c a u s e s p e c i f i c a g g lu t in a t io n o f th e m i x t u r e . to a n a g g lu t in in o n s t a b l e c e l l s (A S C ). H e a s c r ib e d th is p h en o m en o n A g g lu t in a t io n b y s t a b l e c e l l s w a s fou n d to b e d u e to a f i r m a d s o r p t io n o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s p a r t i c l e s on th e s u r f a c e o f th e c e l l s . T h e a g g lu tin in o n s t a b l e c e l l s w a s n e u t r a l ­ iz e d by im m u n e N e w c a s t l e d i s e a s e s e r a . T he se r u m tite r s co rresp o n d ed c l o s e l y w ith th e d i r e c t h e m a g g lu t in a t i o n - in h i b it io n t i t e r s . It a p p e a r e d th a t in N e w c a s t l e d i s e a s e im m u n e s e r u m , t h e s a m e a n t ib o d y m o l e c u l o 30 n ig h t f u n c t io n e i t h e r a s a n a n t i- h e m a g g lu t in in o r a s an a g g lu t in in f o r s ta b iliz e d c e l l s . I n f e c t io u s m o n o n u c l e o s i s im m u n e s e r a w h ic h c a u s e d a g g lu t in a t io n o f h u m a n c e l l s s t a b i l i z e d w ith N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s had n o a c t io n a s a n a n t i- h e m a g g lu t in in . A n d e r s o n fo u n d th a t a l l o f t h e m a n if e s t a t io n s o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s a c t io n on r e d c e l l s w e r e e s s e n t i a l l y d u e to th e v i r u s p a r t i c l e s a s s u c h a n d th a t t h e C S A , A S C a n d th e s i n g l e p a r t i c l e s o f v i r u s h e m a g g lu t in in a r e id e n t i c a l. T h e N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s in in f e c t e d e m b r y o f l u i d s w a s n o t fou n d t o b e h o m o g e n o u s a n d l a r g e a g g r e g a t e s o f th e v i r u s c o u ld b e s e g r e g a t e d . A f t e r h e m a g g lu t in a t io n , e lu t io n o c c u r r e d b y t h e p a r t ia l d is r u p t io n o f t h e a g g r e g a t e s a n d o n e v i r u s p a r t i c l e r e m a i n e d a t t a c h e d to t h e r e d o lo o d c e l l . The p resen ce o f t h is p a r t i c l e o n th e r e d c e l l r e n d e r e d th e c e l l s u s c e p t i b l e to a g g lu t in a t io n (C S A ) b y N e w c a s t l e d i s e a s e im m u n e s e r u m a n d it f u n c t io n e d a s th e r e t a in e d h e m a g g lu t in in (A S C ). A h ig h e r h e m a g g lu t in a t io n t i t e r o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s w a s o b s e r v e d a t 3 7 C th a n a t 4 C . T h e h ig h e r t i t e r w a s c o n s i d e r e d to be d u e to th e d is r u p t io n o f v i r u s a g g r e g a t e s in c o n t a c t w ith r e d b lo o d c e l l s w ith th e u lt i m a t e lib e r a t io n o f s i n g l e v i r u s p a r t i c l e s . 31 P rocedure P r e l i m i n a r y t e s t s u s in g c h ic k e n r e d b lo o d c e l l s w ith t u r k e y s e r a c o n fir m e d 52 5 7 ’ th e p r e s e n c e o f a n h e t e r o a g g l u t in in in n o r m a l t u r k e y s e r a f o r c h ic k e n r e d o lo o d c e l l s , a te r ia ls (1) R e d b lo o d c e l l s : T u r k e y o lo o d w a s c o l l e c t e d in c h e m i ­ c a l l y c l e a n s t e r i l e v i a l s c o n t a in in g 1.0 c c . of 2.0 p e r c e n t s o d iu m ^ 7 c i t r a t e in s a l i n e s o l u t i o n ’^ f o r e a c h 9 .0 c c . o f o lo o d . T he c e lls w ere w a s h e d 3 t i m e s in 10 o r m o r e p a r t s o f 0 .8 5 p e r c e n t s a l i n e s o lu t io n , c e n t r i f u g in g t w i c e a t 1 3 0 0 r . p . m . f o r r .n .m . f o r 10 m i n u t e s . 8 m in u t e s a n d th e n o n c e a t 1 0 0 0 A f t e r th e t h ir d w a s h in g , th e s a l i n e w a s r e m o v e d an d t h e p a c k e d c e l l s w e r e s t o r e d in t h e r e f r i g e r a t o r f o r a s lo n g a s days 4 1 57 ’ b e f o r e b e in g u s e d . A 0 .5 o e r c e n t s u s p e n s i o n o f r e d b lo o d c e l l s in s a l i n e w a s m a d e j u s t p r i o r t o u s e w ith th e t e s t . th e e n t i r e w o r k t h e r e d b lo o d c e l l s w e r e o b ta in e d f r o m tu r k e y s. 6 T h is w a s d o n e to l i m i t v a r i a t i o n s T h roughout 2 d is e a s e -fr e e 4 0 41 4 2 ’ ’ ' r e s u l t i n g f r o m th e u s e of c e l l s fr o m d iffe r e n t d o n o r s . (2 ) V ir u s : B l o o d - f r e e a l l a n t o i c f lu id f r o m e m b r y o n a t e d c h ic k e n e g g s k i l l e d b y N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s o n th e 2n d d a y f o llo w in g in o c u la t io n v i a th e a l l a n t o i c c a v i t y . T h e v i r u s w a s in a c t iv a t e d b y th e a d d itio n o f f o r m a l i n to a f in a l c o n c e n t r a t io n o f a n d w a s s t o r e d a t 4 C to (3 ) 6 C. S a l i n e s o lu t io n : d is tille d w a te r . ’ 0.1 p e r c e n t . 0 ^*^®’^ 57 0 .8 5 p e r c e n t s o d iu m c h l o r i d e in 32 (4) Seru m : S e r u m d ilu t e d 1 in 5 w ith s a l i n e . C e r t a in s e r a w e r e p r e p a r e d in h ig h e r d ilu t io n s a s t h e o c c a s i o n d e m a n d e d . M e th o d C h e m i c a l l y c l e a n ro u n d b o tto m g l a s s t u b e s (7 5 m m . by 12 m m . in s id e d ia m e te r ) w e r e u s e d . ^ a liz e d v ir u s fr o m s a lin e . P r o g r e s s i v e 2 - f o ld d i l u t i o n s o f t h e f o r m ­ 1 in 5 t h r o u g h 1 in 5 1 2 0 w e r e p r e p a r e d in 0 .8 5 p e r c e n t T o 0 .2 5 c c . o f e a c h v i r u s d ilu t io n w a s a d d e d 0 .2 5 c c . o f t h e s e r u m to b e t e s t e d e x c e p t in th e v i r u s t i t r a t i o n t u b e s w h e r e 0 .2 5 c c . of s a lin e s o lu tio n w a s a d d e d . T h e t u b e s w e r e s h a k e n w e l l a n d 0 .2 5 c c . o f t h e 0 .5 p e r c e n t r e d c e l l s u s p e n s i o n w a s a d d e d a n d t h e t u b e s w e r e s h a k e n a g a in . T h e c o n t r o l t u b e s c o n t a in e d e i t h e r s a l i n e a n d c e l l s o r s e r u m a n d c e l l s f o r th e r e s p e c t i v e t e s t s . T h e t e s t s w e r e in c u b a t e d a t a r o o m t e m p e r a t u r e o f f r o m 22 C to 2 7 C . R e a d in g s o f t h e v i r u s t it r a t i o n t u b e s w e r e m a d e a t 1 5 , 3 0 , a n d 4 5 m in u te i n t e r v a l s , but w it h th e t u b e s c o n t a in in g s e r u m , r e a d i n g s w e r e m a d e a t 1 5 , 2 5 , an d 35 m in u t e i n t e r v a l s . T h e r e s u l t s w e r e r e a d ^ b y v ie w in g th e tu b e s fr o m th e b o tto m o f th e r a c k t h r o u g h a m i r r o r f i x e d a t a p r o p e r a n g le . D i s t i n c t p a t t e r n s o f r e d b lo o d c e l l s w e r e f o r m e d d e p e n d in g u p o n th e p r e s e n c e , a b s e n c e , o r in h ib it io n o f th e h e m a g g lu t in a t io n o f th e c e l l s b y th e v i r u s . W h e r e h e m a g g lu t in a t io n w a s m a x i m a l , a u n if o r m f i l m o f a g g lu t in a t e d r e d b lo o d c e l l s c o v e r e d th e e n t i r e b o tto m o f t h e t u b e . W h e r e t h e r e w a s n o a g g lu t i n a t io n , t h e c e l l s s e d im e n t e d in to a d i s c s h a p e at th e l o w e s t p o in t o f t h e c u r v a t u r e o f th e b o tto m o f t h e t u b e . R e a c tio n s in te r m e d ia te b e tw e e n c o m p le te a g g lu t in a t io n , in h ib itio n , o r a b s e n c e o f a g g lu t in a t io n , w e r e s e e n a s ir r e g u l; c lu m p s o f c e l l s a s s o c i a t e d w ith a r in g o f f in e ly a g g r e g a t e d o r u n a g g lu t in ­ a te d c e l l s . R e s u l t s w e r e r e c o r d e d a s + ( c o m p le t e a g g lu t in a t io n , - (no a g g lu t in a t io n o r c o m p le t e in h io it io n o f th e a g g lu tin a tio n b y th e s e r u m ) a n d + ( p a r t ia l o r s l i g h t a g g lu t in a t io n o r p a r tia l a g g lu t in a t io n - in h ib it io n ) . In th e c o n t r o l t u b e s , th e c e l l s s e d im e n t e d to th e b o tto m o f th e tu b e a n d f o r m e d a c e n t r a l , s h a r p ly d e m a r c a t e d d i s c . T h e v i r u s t i t e r w a s th e h ig h e s t d ilu tio n o f th e v i r u s in w h ic h c o m p l e t e h e m a g g lu t in a t io n w a s p r e s e n t . T h is d ilu t io n w a s c o n s i d e r e d to c o n t a in 1 h e m a g g lu t in in u n it (H A ) w h ic h w a s c a p a b le o f p r o d u c in g c o m p le t e h e m a g g lu t in a t io n o f t h e 0 .1 3 5 p e r c e n t f i n a l r e d b lo o d c e l l s u s p e n s i o n w ith in 4 5 m in u t e s a t a r o o m t e m p e r a t u r e o f f r o m 22 C to 27 C . T h e s e r u m t i t e r w a s th e l o w e s t d ilu tio n o f th e v i r u s in w h ic h c o m p le t e h e m a g g lu t in a t io n - in h ib it io n w a s p r e s e n t . T h is d ilu t io n w a s c o n s i d e r e d to c o n t a in a c o n c e n t r a t io n o f h e m a g g lu t in a t io n - in h ib it io n u n it s e q u a l to th e n u m b e r o f h e m a g g lu t in in u n it s p r e s e n t . T h e in h ib ­ it o r y powder (I P ) o f th e s e r u m w a s c o n s i d e r e d to b e th e n u m b e r o f th e h e m a g g lu t in a t io n - in h ib it io n u n it s p r e s e n t in 0 .2 5 c c . o f th e u n d ilu te d seru m . A n in h ib it o r y p o w e r o f 30 o r m o r e w a s c o n s id e r e d to be d ia g n o s t ic o f e i t h e r p r e v io u s v a c c in a t io n a g a in s t o r in f e c t io n w ith N e w c a s tle d is e a s e v i m s . ^ > ^ > ^ 34 T a b le 3 i s a r e p r e s e n t a t i v e p r o t o c o l o f h e m a g g lu t in a t i o n an d h e m a g g lu t in a t i o n - in h i b it io n t e s t s u t i l i z i n g a s s a m p l e s th e t i t r a t i o n o f s e r a c o lle c te d 1/ m o n th s a fte r v a c c in a tio n of th e tu r k e y s . T a b le 3 H e m a g g lu t in a t io n a n d H e m a g g lu t in a t io n - i n h ib it io n T e s t s . A. P rocedure V ir u s d ilu tio n M a t e r ia l u .d . H te st: V i r u s d il. ( c c .) 0 .8 5 ;6 N a C l ( c c .) O.o fo s u s p e n ­ s io n r .b .c . ( c c .) HI t e s t : V ir u s d il. (c c .) S e r u m d il. ( c c .) 0.5% s u s p e n ­ s io n r .b .c . ( c c .) ------ I 5 1 10 1 1 20 40 1 80 1 180 1 1 1 1 320 640 1280 2560 — 0 .2 5 c c . p e r tu b e -- — 0 .2 5 c c . p e r tu b e - - — 0 .2 5 c c . p e r tu b e - 1 5120 C ontr o l 0 --- - ---------- 0 .5 0 .2 5 -- 0 - - 0 .2 5 c c . p e r tu b e - --------- 0 .5 - - 0 .2 5 c c . p e r tu b e - --------- 0 .2 5 ------- — ------- ------- 0 .2 5 c c . n e r tu b e - - 35 B . R e s u lts V i r u s d ilu tio n M a t e r ia l H te st: N c 4 6 -9 6 7 — HI 33 34 36 40 42 48 85 tests: (d il 1 :2 0 ) (” ” ) (” ” ) ( d il 1 :1 0 ) (” ” ) (” ” ) (d il 1 :5 ) 1 1 l u .d . 5 10 20 + + + + ■h + + + ± + + + + - - - - - + + ± + + + + + - - - - - - — + + T ~b + -f- I n t e r p r e t a t io n : H tite r of v ir u s 320 HI tite r o f s e r a T ite r S eru m 33 320 34 320 36 160 40 10 42 20 48 80 85 10 + + + "h + + 1 1 1 m 1 1615 3 2 0 ± 1 640 1 1280 1 1 2560 5120 - - - - - - - - - - — — — C on­ tr o l - - - - — — 36 S e r u m n e u t r a liz a t t o n t e s t s Q D o y le ° r e p o r te d th a t N e w c a s tle d is e a s e v ir u s w a s c o m p le te ly n e u t r a l i z e d b y s p e c i f i c im m u n e s e r u m o b ta in e d f r o m c h i c k e n s th a t h a d s u r v i v e d in o c u la t io n o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s a t t e n u a t e d b y s t o r a g e an d h a d s u b s e q u e n t ly r e s i s t e d c o n t a c t in f e c t io n a s w e ll a s w it h th e a c t i v e v i r u s . 2 in fe c tio n s I m m u n e s e r u m a n d v i r u s i n f e c t e d m o u th e x u d a t e w e r e m ix e d in e q u a l p a r t s , k e p t a t 14 C f o r 4 d a y s in th e d a r k , an d th e n in j e c t e d in t r a v e n o u s l y in 1.0 c c . d o s e s in to s u c e p t i b l e c h i c k e n s w h ic h r e m a i n e d h e a lt h y . B u r n e t a n d F e r r y ‘S w e r e t h e f i r s t to s h o w th a t N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s m u lt ip lie d r a p id ly in th e e m b r y o n a t e d c h ic k e n egg„ A f t e r in o c u la t io n on t h e c h o r i o a l l a n t o i c m e m b r a n e , th e v i r u s c a u s e d d e a t h o f 1 0 - d a y - o l d e m b r y o s w it h in 3 0 to 4 8 h o u r s . n K eog im m u n iz e d c h ic k e n s w ith an A u s t r a l i a n s t r a i n o f N e w c a s tle d is e a s e v ir u s . H e fo u n d th a t w h e n u n d ilu te d im m u n e s e r u m w a s a d m ix e d w ith th e v i r u s in v i t r o a n d in o c u la t e d u p o n t h e c h o r i o ­ a lla n t o ic m e m b r a n e , t h e s e r u m p r o t e c t e d a g a in s t d o s e s o f th e v ir u s . 10 *^ e m b r y o le t h a l H e r e p o r t e d th a t n o t i m e e f f e c t c o u ld b e d e m o n ­ s t r a t e d in n e u t r a l i z a t i o n o f th e v i r u s b y s p e c i f i c im m u n e s e r u m . On d ilu t io n , th e v i r u s w a s r e i s o l a t e d f r o m t h e v i r u s - s e r u m m i x t u r e s , in d ic a t in g t h a t th e n e u t r a l i z a t i o n r e a c t i o n w a s c o m p l e t e l y r e v e r s i b l e . B e a c h ^ r e p o r t e d t h a t 1 0 0 m in im u m i n f e c t i n g d o s e s o f “ a v ia n p n e u m o e n c e p h a l i t i s ’ * v i r u s in lu n g t i s s u e d e s s i c a t e d in v a c u o an d s u s ­ p e n d e d in 0 .0 5 c c . o f s a l i n e o r b r o th w h e n m ix e d w ith an e q u a l q u a n tity o f h o m o lo g o u s im m u n e s e r u m a n d h e ld a t 6 C l o r 4 h o u r s f a i l e d to in f e c t c h i c k s in o c u la t e d i n t r a m u s c u l a r l y w it h 0.1 c c . o f th e m i x t u r e . B u r n e t ^ in j e c t e d N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s in to th e a l l a n t o i c c a v i t y o f e m b r y o n a t e d c h ic k e n e g g s w h ic h r e s u l t e d in f r e e m u l t i p l i ­ c a t io n o f t h e v i r u s a n d s p e c i f i c d e a t h o f t h e e m b r y o . H e p o in t e d o u t th a t t h e r e w a s no s e r o l o g i c a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s an d th e d i f f e r e n t t y p e s o f in f l u e n z a v i r u s . M in a r d an d J u n g h e r r C* 1 in o c u la t e d 8 - t o - 1 0 - d a y - o l d e m b r y o n ­ a t e d c h ic k e n e g g s v i a t h e a l l a n t o i c c a v i t y r o u t e w ith 0.1 cc. of a m ix t u r e o f e q u a l v o l u m e s o f d e c i m a l d ilu t io n s o f “ a v ia n p n e u m o e n c e ­ p h a l i t i s ” v i r u s an d u n d ilu t e d s u s p e c t e d c h ic k e n s e r u m w h ic h h a d b e e n in c u b a t e d a t 3 7 C f o r o n e h o u r . d a y s. E m b r y o s w e r e r e -in c u b a te d fo r 4 T h e d ilu t io n a t w h ic h a b o u t o n e - h a l f o f th e in o c u la t e d e m b r y o s s u r v i v e d w a s ta k e n a s th e c r i t i c a l t i t e r . T h e n e u tr a liz in g d o s e s w e r e e x p r e s s e d a s th e r e c i p r o c a l o f t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n th e t i t e r o f th e v i r u s a n d t h e t i t e r o f th e s e r u m - v i r u s m i x t u r e . T h e y p o in t e d o u t th a t in tw o i n s t a n c e s p a r a l l e l s e r u m t i t r a t i o n s b y i n t r a m u s c u la r i n j e c t i o n in c h i c k s a n d a l l a n t o i c c a v i t y in j e c t io n in e m b r y o s g a v e s im ila r r e s u lts : iz i n g d o s e s p e r o n e n e g a t iv e s e r u m an d th e o t h e r h a d 0.1 10^ n e u tr a l­ cc. B e a u d e t t e a n d B l a c k H u t i l i z e d t h e t e c h n ic o f M in a r d a n d J u n g h e r r ^ * f o r s e r u m n e u t r a l i z a t i o n t e s t s w ith th e m o d i f i c a t i o n o f th e t e s t b y in c u b a t in g t h e e m b r y o s u n t il h a t c h in g . T h e y fo u n d th a t s e r u m fr o m r e c o v e r e d b ir d s n e u tr a liz e d fr o m to 10 10 em bryo 38 le t h a l d o s e s o f th e v i r u s . In 1945 th e C o m m it t e e o n T r a n s m i s s i b l e D i s e a s e s o f P o u lt r y o f th e U .S . L i v e s t o c k S a n it a r y A s s o c i a t i o n 62 c o n s i d e r e d th e s e r u m n e u t r a liz a t io n t e s t to b e d ia g n o s t ic if th e s e r u m t e s t e d n e u t r a liz e d a t l e a s t 10 3 e m b r y o le t h a l d o s e s o f N e w c a s t l e d i s e a s e v ir u s . f* o O O B r a n d ly e t a l. ’ r e p o r t e d th a t in th e d e t e r m in a t io n o f th e n e u t r a liz a t io n c a p a c it y o f s e r u m a g a in s t N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s t h e s e r u m t i t e r i s r e p r o d u c ib le w it h in 1 0 - f o ld l i m i t s . 12 T h e ir sta n d a r d p r o c e d u r e w a s to add u n d ilu te d s e r u m to an e q u a l q u a n tity o f v a r i o u s d e c i m a l d ilu t io n s o f th e v i r u s u p to t h e e s t i m a t e d t i t e r o f th e v i r u s . C o n t r o l t i t r a t i o n s o f th e v i r u s w e r e a lw a y s m a d e in p a r a l l e l w ith th e se r u m titr a tio n s . T h e m i x t u r e s w e r e in c u b a t e d f r o m 3 0 to 9 0 m in u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e p r io r to in j e c t io n o f s e r i e s o f a t l e a s t 4 e g g s p e r d ilu t io n . T h e e g g s w e r e r e in c u b a t e d f o r 4 d a y s . T h e y fo u n d th a t t h e r e w e r e no s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s in t i t e r s o f th e s e r u m - v i r u s m ix t u r e s w ith in th e l i m i t s o f 24 h o u r s in c u b a t io n f r o m 2 2 C to 3 8 C b e f o r e in o c u la t io n . id e n tic a l. 60 61 V ir u s t i t e r s in c h ic k e n a n d in e g g s w e r e v i r t u a l l y T h e h ig h e s t v a l u e s in s e r u m n e u t r a liz a t io n t e s t s w e r e o b ta in e d w h e n c h i c k s w e r e u s e d f o r t i t r a t i o n . T h e n ex t h ig h e s t v a lu e s w e r e o b ta in e d w h e n th e a lla n t o ic c h a m b e r r o u t e w a s u s e d in e m b r y o n a te d e g g s . A n e u t r a liz i n g c a p a c it y o f a t l e a s t 10^ e m b r y o le t h a l d o s e s , ^ OO A p r e fe r a b ly 10 e m b r y o le t h a l d o s e s ’ w h en th e a l l a n t o i c c a v it y 39 ro u te w a s u s e d 58 w a s c o n s i d e r e d a s a d i a g n o s t ic t i t e r in d ic a t in g p r io r N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s i n f e c t i o n o r v a c c i n a t i o n a g a i n s t th e d is e a s e . P rocedure E m b r y o n a t e d e g g s 9 - o r 1 0 - d a y s o ld a t 3 7 .3 C in an e l e c t r i c , f o r c e d - d r a f t in c u b a t o r w e r e u s e d f o r v i r u s t i t r a t i o n s an d s e r u m n e u t r a liz a t io n t e s t s . F i v e e g g s w e r e u s e d p e r d ilu t io n . The s i t e f o r in j e c t io n in to th e a lla n t o ic s a c w a s d e t e r m in e d b y t r a n s ill u m in a t i o n o f th e e g g a n d s e l e c t i o n o f a n a r e a o f t h e c h o r i o a l l a n t o i c m e m b r a n e f r e e o f l a r g e b lo o d v e s s e l s a b o u t 3 m m . b e lo w th e b a s e o f th e a i r c e l l . A s m a l l h o le w a s d r i l l e d t h r o u g h th e s h e l l , w ith o u t p ie r c in g th e s h e ll m e m b r a n e , by m e a n s of a s m a ll m e ta l d r ill a tta c h e d to t h e c h u c k o f a n e l e c t r i c m o t o r . A n o th e r h o le w a s m a d e a t t h e u p p e r e x t r e m i t y o f th e s h e l l o v e r th e a i r c e l l to s e r v e a s an a ir v e n t a n d to a llo w e q u a l i z a t i o n o f th e p r e s s u r e p r o d u c e d by th e in o c u lu m w it h in th e e g g . T i n c t u r e o f m e t a p h e n w a s p a in te d o v e r t h e h o l e s in t h e s h e l l an d a llo w e d to d r y b e f o r e th e e g g s w e r e in o c u la t e d . D e c i m a l d ilu t io n s o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s i n f e c t e d a l l a n t o i c f lu id w e r e p r e p a r e d in s t e r i l e n u t r ie n t b r o th w h ic h c o n t a in e d no s a lt. S e r u m - v i r u s m i x t u r e s -w ere p r e p a r e d b y m ix in g e q u a l q u a n t i t ie s o f t h e d e c i m a l d i lu t io n s o f th e v i r u s w it h u n d ilu te d s e r u m w h ic h w e r e th e n in c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f r o m 2 2 C to 2 7 C f o r 30 to 6 0 m i n u t e s . Q u a n t it a t iv e d e t e r m i n a t i o n s o f v i r u s i n f e c t i v i t y w e r e m a d e b y m ix in g e q u a l p a r t s o f e a c h d e c i m a l d ilu t io n o f t h e v i r u s 40 w ith an e q u a l q u a n tity o f th e n u t r ie n t b r o th d ilu e n t . I n o c u la t io n s o f 0 .1 c c . p e r e g g w e r e m a d e w ith 1 .0 c c . t u b e r c u lin s y r i n g e s f i t t e d w ith a 2 7 g a u g e , ~ z in c h n e e d l e . T h e v ir u s t it r a t io n s e r i e s w e r e in o c u la t e d l a s t in o r d e r to t a k e in to c o n s id e r a t i o n a n y p o s s i b l e d e s t r u c t io n o f th e v i r u s d u r in g th e in c u b a tio n p e r io d . B a c t e r i a l s t e r i l i t y t e s t s w e r e m a d e o f e a c h p r e p a r a t io n . A f t e r th e e g g s w e r e i n o c u la t e d , th e h o l e s in th e s h e l l s w e r e s e a l e d w ith m e lt e d p a r a f fin a n d th e e g g s w e r e r e in c u b a t e d f o r 6 d a y s . ^ ’^ The eg g s w ere c a n d le d d a ily and e m b r y o s fo u n d d ea d d u r in g th e f i r s t 2 4 h o u r s w e r e n o t in c lu d e d in th e f i n a l r e s u l t s a s th e m o r t a lit y w a s c o n s i d e r e d to b e d u e to n o n s p e c if ic c a u s e s . T h e r e s u l t s o f th e s e r u m an d v i r u s t i t r a t i o n s w e r e e v a lu ­ a te d a c c o r d in g to th e 5 0 p e r c e n t en d p o in t f o r m u la o f R e e d an d M u en ch .® T h e t i t e r o f th e v i r u s w a s th e h ig h e s t d ilu tio n o f t h e v i r u s in w h ic h th e 5 0 p e r c e n t e n d p o in t m o r t a lit y r a t e o c c u r r e d an d t h e r e w a s c o n s id e r e d t o b e o n e e m b r y o l e t h a l d o s e in th e in o c u lu m . T he num ber o f t h e e m b r y o le t h a l d o s e s in 0 .0 5 c c . o f u n d ilu te d in o c u lu m w a s th e r e c i p r o c a l o f th e lo g a r it h m o f t h e t i t e r o f t h e v i r u s . T h e t i t e r o f th e s e r u m w a s th e l o w e s t d ilu t io n o f t h e v i r u s in w h ic h th e 5 0 p e r c e n t en d p o in t s u r v i v a l r a t e o c c u r r e d . T h e d iffe r ­ e n c e b e t w e e n th e v i r u s t i t e r an d th e s e r u m t i t e r w a s th e n e u t r a liz in g in d e x (N I), t h e a n t ilo g o f w h ic h w a s th e n u m b e r o f n e u t r a liz i n g d o s e s in 0 .0 5 c c . o f th e u n d ilu te d s e r u m . Results Evaluation of the antibody response in turkeys A) Neutralization and hemagglutination-inhioition of the Nc strain of virus. Table 4 --T urkey 33 Serum Serum P re-V a cc. 1 week+ 2 weeks 3 weeks 1 month I 2 month 2 months 2 2 months+ 3 months 4 months+ 9 months+ Post Chal­ lenge Virus Titer* 3.2 3.5 8.3 8.2 7.6 8.3 8.5 8.3 8.3 8.3 8.8 8.8 10 & 10"1 10“2 10~3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3 4 5 5 4 ![ O 1 I1 Virus dilutions 5 0 2 4 4 5 5 3 5 2 1 1 3 1 1 0 10"5 1 0 '6 K f 7 10"8 10"9 Titer* 5 0 0 3 4 5 2 5 0 5 5 0 0 5 0 5 4 2 1 0 5 0 0 5 2 (This footnote applies also to tables 5 to 15) * Negative logarithm of the titer of the virus used in each titration. ** Embryos dead out of 5 inoculated per dilution. + Serum diluted 1 in 10. ++ Neutralizing index it T n h ih itn r*T 7 nrm jor* NI++ IP# 7.5 6.8 3.5 3.5 4.3 5.0 5.4 7.5 4.5 7.8 2.2 50 500 63,100 50,120 1,995 1,995 1,259 63 6,310 32 39,810,000 5 320 320 640 160 320 80 80 80 80 1,600 1.3 31,620,000 1,600 Table 5--T urkey 34 Virus dilutions Titer* 9.2 8.5 8.3 7.6 7.6 8.5 8.3 8.3 8.2 8.2 10,°* 10"1 1 0 '2 1 0 '3 1 0 '4 10~5 5 5 5 5 4 5 5 5 5 2 3 5 5 5 r* a 5 3 1 2 5 1 5 3 5 1 1 1 2 0 5 0 5 Serum 3"6 10’ 7 10"8 10~9 5 5 0 0 1 0 4 Titer* NI++ IP* 10 126 100,000 39,810 15,850 5,012 50,120 5,012 a 160 320 800 0 0 0 8.2 7.4 4.3 3.0 3.4 4.8 3.6 5.6 2 4.2 6.7 10,000 316 160 160 5 4 3 0 200 320 320 160 Table 6 - -Turkey 36 ___________________________ Virus dilutions___________________________ Serum Virus Titer* 8.5 8.5 8.2 7.6 8.5 8.5 8.3 8.3 8.3 8.8 8.8 10*°. 1 0 ' 1 10"2 1 0 '3 1 0 '4 10~5 1 0 '5 1(T7 iO '8 1 0 '9 5 5 5 5 5 5 5 r* 0 4 5 f 0 3 5 5 1 5 3 5 5 5 3 2 1 5 4 1 0 2 5 1 4 1 5 2 5 0 5 2 2 1 5 1 0 0 2 0 5 2 5 0 0 5 1 4 2 5 Titer* NI++ IP# 8.5 5.0 5.8 4.6 3.1 5.8 4.3 7.6 5.2 7.6 2.7 10 3,162 5,012 31,620 12,500 501 15,850 50 1,259 40 12,390,000 5 320 640 800 160 80 80 80 80 80 ,600 2.5 1,995,000 ,600 Table 7 --Turkey 40 __________________________ Virus dilutions___________________________ Serum____________ Serum P re-V a cc. 1 week 2 weeks+ 3 weeks+ 1 month l i months Virus Titer* 10*°* 1 0 ' 1 10‘ 2 10~3 10 '4 10"5 10"6 10‘ 7 10“8 10*9 Titer* 9.2 8.5 8.3 8.3 8.2 8.5 1 week serum sam ple diluted 1 in 25. 5 5 5 5 5 5 5 r* D 5 5 5 5 5 3 5 5 5 1 1 2 3 0 1 8.5 7.5 7.6 7.3 7.8 8.3 NI++ IP# 10 250 50 100 3 2 5 25 25 25 10 10 Table 8 --T urkey 42 __________________________ Virus dilutions___________________________Serum Virus Titer* 10ft 9.2 8.5 8.3 8.3 8.5 8.5 8.5 8.5 8.2 8.3 8.8 8.6 IQ '1 10~2 i0 ~ 3 10~4 10~5 10~6 10~7 10~8 10~a Titer* 5 5 5 5 5 5 5 5 2 2 1 5 5 4 1 5 1 5 4 4 4 5 5 4 5 5 5 1 5 3 1 4 4 2 1 5 5 5 5 0 1 2 1 0 0 1 2 2 0 0 0 1 2 0 NI++ IP# 8.5 7.0 6.5 7.5 7.5 8.8 6.5 7.7 8.8 7.8 2.8 50 32 63 59 10 50 100 63 0 32 10,000,000 5 40 40 3.5 125,900 20 40 20 20 20 20 20 Table 9 --Turkey 48 Virus dilutions Serum P r e -v a c c . 1 week 2 weeks* 3 weeks 1 month months 2 months 21 months+ 3 months 4 months* 3 months Post Chal­ lenge Virus Titer* 10*°* 10"1 10“2 10 6 10-4 1 0 -5 1 0 '6 1 0 '7 IO"8 IO"9 Titer* 8.7 8.5 8.2 7.6 8.5 8.5 8.3 8.5 8.2 8.3 8.8 8.6 Serum 5 5 5 5 5 5 5 3 6 3 5 1 0 0 9 months serum sam ple diluted 1 in 40, 5 5 2 4 3 5 5 2 5 3 5 0 2 2 3 5 5 5 1 5 1 5 0 0 1 1 5 2 5 4 0 0 0 0 0 4 1 1 0 1 0 NI++ m 8.4 6.3 7.5 4.8 5.7 5.6 6.3 8.4 7.2 7.6 4.0 2 159 50 631 631 794 100 14 10 50 2,524,000 5 160 80 320 80 80 20 20 20 40 800 1.6 10,000,000 12,800 Table 1 0 - -Turkey 05 (control) __________________________ Virus dilutions____________ Virus Titer* CO CO 8.5 8.3 8.2 0.0 10“4 10"5 IO"6 10“7 10‘ 8 10~9 5 5 5 5 5 5 5 5 r* 0 5 2 3 1 2 2 2 3 3 2 4 0 0 0 0 0 0 1 1 0 2 Titer* CO• c- 8.7 8.5 8.5 8.3 8.2 10*°* 10"1 1 0 '2 IO-3 Serum 8.2 7.6 7.8 7.8 7.8 8.3 8.3 7.8 8.6 NI++ IP# 8 2 8 3 3 3 2 1 3 25 5 5 5 5 10 10 10 10 10 5 B) Neutralization and hemagglutination-inhibition of the TD strain of virus. Table 1 1 --Turkey 42 Serum Virus dilutions Serum 2 \ months* 3 months* 4 months-t9 m onths+ P ost Chal­ lenge Virus Titer* 10** lO '1 1(T2 1 0 '3 1(T4 10"5 10"8 10“7 10"8 10“9 5 5 rD 8.7 8.5 8.7 8.7 8.8 5 5 4 0 0 0 0 0 0 0 5 1 5 2 1 2 Titer* NI++ IP# 8.8 7.7 8.8 2.4 10 63 10 19,950,000 20 20 20 12,800 0.5 199,500,000 12,800 00 Table 12--T urkey 48 V irus dilutions Serum 2 g months* 3 months 4 months* 3 months* P ost C hal­ lenge V irus T iter* Serum 10?* 10*1 10-2 10"3 10-4 10-5 1 0 '6 1 0 '7 10"8 10"9 Titer* 8.1 8.7 8.7 8.7 5 3 1 0 0 8.8 0 0 0 0 0 5 5 n d 5 4 5 2 1 5 0 0 2 0 NI++ IP# 7.8 20 20 7.5 20 16 8.8 20 10 1.3 251,200,000 12,800 0 631,000,000 12,800 Table 13--Turkey 85 (control) Serum V irus dilutions Serum Virus T iter* 2 2 months 3 m onths 4 m onths* 8.1 8.5 8.7 10?* 1 0 '1 10-2 10-3 10‘ 4 10’ 5 1 0 '6 1 0 '7 1 0 '8 10"9 T iter* 5 5 5 5 4 5 1 0 2 8.6 8.4 8.8 NI++ 0 1 0 m 10 10 10 Antibody resp on se m challenge- infection con trollsA) Neutralization and hemagglutination-inhibition of the Nc strain of viru s. Table 14 Virus dilutions Tur key Serum Virus Titer* 28 P re-C hal.+ 8.6 Post-C hal. 8,6 1 0 ft 5 Serum 10"1 1 0 '2 10"3 10"4 10“5 10‘ 6 1 0 '7 10-8 1 0 '9 0 0 0 0 0 0 1 29 P re-C hal.+ 8.6 P ost-C hal. 8.8 5 1 1 1 2 0 58 P re-C hal,+ 8.8 P ost-C hal. 8.8 5 5 5 4 5 0 3 0 1 0 0 1 0 0 Titer* NI++ IP# 0 3.5 8.1 1,259,000 640 125,900,000 51,200 0 4.2 0.9 251,200 640 79,430,000 51,200 3.3 1.4 3,162,000 1,600 25,120,000 12,800 B) Neutralization and hemagglutination-inhibition of the TD strain of viru s. Table 15 Serum Virus dilutions Tur key Serum Virus Titer* 28 P re-C h al.+ 8.8 P ost-C h al. 8.8 10*°* 10"1 10"2 1 0 '3 10~4 10"5 1 0 '6 10"7 10-8 3 5 2 5 0 5 0 1 0 0 10-9 Titer* 3.6 0.5 NI++ IP# 1,585,000 199,500,000 640 1,280 Turkey 28 was challenged with 10° embryo lethal d o ses of the NC 46-967— intram uscularly. Turkeys 29 and 58 w ere challenged with 108 embryo lethal d o ses of the TD3 intram uscularly. P o st-C h a llen ge s e r a w ere collected 12 days after inoculation. 51 D is c u s s io n T u r k e y s 3 3 , 3 6 , 4 2 , a n d 4 8 s u r v iv e d t o th e e n d o f th e e x p e r im e n t . T a b le s 4 , 6 , 8 , 9 , 1 1 , a n d 12 s h o w th e r e s u l t s o f t i t r a ­ t io n s o f th e s e r a f r o m t h e s e t u r k e y s d u r in g a p e r io d o f a f t e r v a c c in a t io n . 10 m o n th s B lo o d c o l l e c t e d a t t h e 9th m o n th s h o w e d a h ig h n e u t r a liz in g c a p a c it y an d in h ib it o r y p o w e r . T h is le a d to t h e t e s t in g o f s e v e r a l u n v a c c in a t e d t u r k e y s (a b o u t 18 m o n t h s to 2 y e a r s o ld ) w h ic h h a d b e e n h o u s e d in th e s a m e p o u lt r y b u ild in g , but in d if f e r e n t p e n s , d u r in g t h e e x p e r im e n t a l p e r i o d . S eru m fr o m th e s e tu r k e y s a ls o h ad a h ig h n e u t r a liz in g c a p a c it y a n d in h ib it o r y p o w e r . S in c e t h e r e w a s no h i s t o r y o f N e w c a s t l e d i s e a s e in th e p o u lt r y b u ild in g an d th e e x o e r i m e n t a l c o n t r o l t u r k e y N o . 85 s h o w e d no s e r o l o g i c a l e v i d e n c e o f e x p o s u r e t o th e v i r u s d u r in g t h e f i r s t 4 m o n th s o f t h e e x p e r im e n t , th e c o n c l u s i o n w a s d r a w n th a t a l l o f th e t u r k e y s in th e b u ild in g h a d b e e n e x p o s e d to a s u b c l i n i c a l in f e c t io n s o m e t i m e b e t w e e n th e 4 th an d 8 th m o n th a f t e r v a c c in a t io n . A s f u r t h e r e v i d e n c e o f th e p r e s e n c e o f N e w c a s t l e d i s e a s e in th e p o u lt r y b u ild in g d u r in g t h i s p e r i o d , s e r u m f r o m a tu r k e y w h ic h h ad b e e n r e m o v e d f r o m th e b u ild in g a t a b o u t th e 4 th m o n th an d h o u s e d in a d if f e r e n t b u ild in g f a i l e d to r e v e a l th e p r e s e n c e o f n e u t r a liz i n g an d in h ib it o r y a g e n t s a t a n y t im e d u r in g th e c o u r s e o f th e e x p e r im e n t . T h is t u r k e y w a s u s e d a s a d o n o r o f r e d b lo o d c e l l s f o r t h e h e m a g g lu ­ tin a tio n t e s t s an d a s a s o u r c e o f n e g a t iv e s e r u m . 52 T h e c o n t r o l t u r k e y N o . 85 d ie d f r o m s u p p u r a t i v e s i n u s i t i s and s e p t i c e m i a 4 m o n t h s and 2 w e e k s a f t e r t h e b e g in n in g o f t h e e x p e r im e n t. I s o l a t i o n o f th e v i r u s f r o m t u r k e y 85 w a s n o t a t t e m p t e d . T a b l e s 10 and 13 s h o w th e r e s u l t s o f t i t r a t i o n o f t h e s e r u m o f t h i s t u r k e y w ith b o th N c an d T D s t r a i n s o f th e v i r u s f o r t h e 4 m o n th p erio d . T u r k e y s 34 and 4 0 d ie d f r o m i n f e c t i o u s e n t e r o h e p a t i t i s 7 and 2 m o n t h s , r e s p e c t i v e l y , a f t e r t h e b e g in n i n g o f t h e e x p e r i m e n t . T a b l e s 5 and 7 s h o w t h e r e s u l t s o f t i t r a t i o n s o f t h e i r s e r a w ith th e N c s t r a i n o f t h e v i r u s d u r in g t h e p e r i o d o f t h e i r p a r t i c i p a t i o n in th e e x p e r im e n t. T e n m o n t h s a f t e r v a c c i n a t i o n , t u r k e y s 33 an d 3 6 , t o g e t h e r w ith t u r k e y s 29 and 58 w h ic h w e r e c h o s e n a s c o n t r o l s , w e r e c h a l l e n g e d w ith 10 e m b r y o l e t h a l d o s e s o f t h e 19th e m b r y o p a s s a g e o f t h e N c str a in . T u r k e y s 4 2 , 4 8 , t o g e t h e r w it h t u r k e y 2 8 , w h i c h w a s c h o s e n a s a c o n t r o l , w e r e c h a l l e n g e d w ith 5th p a s s a g e o f t h e T D s t r a i n . 10 ^ e m b r y o l e t h a l d o s e s o f th e T h e v i r u s w a s i n j e c t e d in 1 .0 c c . o f n u t r ie n t b r o th i n t r a m u s c u l a r l y in to e a c h o f t h e t u r k e y s . B lo o d w as c o l l e c t e d 12 d a y s a f t e r c h a l l e n g e and th e t u r k e y s w e r e k e p t f o r 5 w eek s u nd er o b se r v a tio n . T u r k e y 2 8 , h ad a s e r u m n e u t r a l i z i n g in d e x o f 10u*^ p r i o r to c h a l l e n g e b u t s h o w e d e x t e n s i v e d i a r r h e a f o r la t io n . 10 d a y s a fte r in o c u ­ T a b l e s 14 and 15 s h o w th e s e r u m n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y and in h i b i t o r y p o w e r o f t u r k e y s 2 8 , 2 9 , a n d 58 p r i o r to an d a f t e r c h a l l e n g e . 53 T h e v a c c in a te d tu r k e y s w ith sto o d th e c h a lle n g e in fe c tio n w it h n o a p p a r e n t s y s t e m i c d i s t u r b a n c e a lt h o u g h t h e r e w a s a c e s s a t i o n o f e g g p r o d u c tio n . E g g p r o d u c t i o n w a s r e s u m e d b y t u r k e y s 3 6 an d 29 t h r e e w e e k s a f t e r c h a l l e n g e but t h e o t h e r t u r k e y s h ad n o t r e s u m e d e g g p r o d u c tio n at th e te r m in a tio n of th e e x p e r im e n t 5 w e e k s a fte r th e c h a lle n g e in fe c tio n . A f t e r 5 w e e k s o f o b s e r v a t i o n , th e t u r k e y s w e r e k i l l e d an d p o stm o r te m e x a m in a tio n s w e r e m a d e. T he a ir s a c m e m b r a n e s w e r e c l e a r an d a l l o f t h e i n t e r n a l o r g a n s a p p e a r e d to b e n o r m a l on g r o s s e x a m in a tio n . I n o c u la t io n o f e m b r y o n a t e d c h i c k e n e g g s w it h y o lk m a t e r i a l f r o m a n i n f e r t i l e e g g , s p l e e n an d a i r s a c m e m b r a n e s f r o m t u r k e y s 3 3 , 3 6 , 2 8 , an d 29 f a i l e d to r e v e a l t h e p r e s e n c e o f N e w c a s t l e d ise a se v ir u s. R e s p o n s e to v a c c i n a t i o n . T u r k e y s 3 3 , 34 a n d 3 6 s h o w e d a s i g n i f i c a n t s e r o l o g i c a l r e s p o n s e t o v a c c i n a t i o n w ith th e N c s t r a i n o f t h e v i r u s . T u r k e y s 34 and 3 6 w h i c h r e c e i v e d 2 i n j e c t i o n s o f t h e N c s t r a i n o f t h e v i r u s v a c c i n e at in te r v a ls of 1 an d 2 w e e k s , r e s p e c t iv e ly , sh o w ed a s lig h tly h ig h e r but s i g n i f i c a n t s e r o l o g i c a l r e s p o n s e to v a c c i n a t i o n th a n d id t u r k e y 33 w h ic h r e c e i v e d o n l y 1 i n j e c t i o n o f t h e v a c c i n e . T h e r e s p o n s e of t u r k e y s 34 an d 3 6 w a s o f a l o n g e r d u r a t i o n t h a n th a t o f t u r k e y 3 3 . T u r k e y 34 s h o w e d a d e c i d e d l y b e t t e r r e s p o n s e th a n d id t u r k e y 3 6 . T h e m a x i m u m n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y w a s a t t a i n e d in t u r k e y s 33 a n d 34 t h e 2n d w e e k a f t e r v a c c i n a t i o n an d in t u r k e y 3 6 th e 3 r d w e e k a f t e r 54 v a c c in a tio n . T h e s e r a of t h e s e tu r k e y s sh o w ed a sig n ific a n t n e u tr a liz in g c a p a c i t y for 3 m o n t h s w h i l e t h e h e m a g g l u t i n a t i o n - i n h i b i t o r y p o w e r o f t h e s a m e s e r a r e m a i n e d at t h e p o s i t i v e l e v e l o r a b o v e f o r a t l e a s t 4 m o n t h s . S e e T a b le s 4 , 5 , 6 , and F i g u r e s 1, 2 , 3 . T u r k e y s 40 a n d 4 2 s h o w e d o n l y a s l i g h t s e r o l o g i c a l r e s p o n s e to v a c c in a tio n w i t h the T D s t r a i n o f t h e v i r u s v a c c i n e . T h e n e u tr a liz in g c a p a c i t y and i n h i b i t o r y p o w e r o f t h e s e r a o f t h e s e t u r k e y s w a s a l w a y s b e l o w the p o s i t i v e l e v e l . T u r k e y 48 w h ic h r e c e iv e d 2 in je c tio n s of th e T D s t r a in of t h e v ir u s v a c c i n e 2 w e e k s a p a r t s h o w e d a b e t t e r s e r o l o g ­ i c a l r e s p o n s e f n i n h i b i t o r y p o w e r th a n in n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y . in h ib ito r y p o w e r r e m a i n e d a t o r a b o v e t h e p o s i t i v e l e v e l f o r an d t h e n b e g a n t o w a n e . 1 -j, The m on th s In c o n t r a s t , t h e n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y o f th e s e r u m was c o n s i s t e n t l y b e l o w th e p o s i t i v e l e v e l f o r 1^ b e g a n to wane.. 6 S e e T a b le 7 , B r a m d l y et a l . ^ 8 , 9, and F ig u r e s 4 , 5, m o n t h s and t h e n . o b s e r v e d d i f f e r e n c e s in a n t i g e n i c a n d / o r im m u n o g e n ic p r o p e r t i e s a m o n g th e R O , C , E an d 11914 s t r a i n s o f N e w ­ c a s t le d ise a se v i r u s . S tr a in RO g a v e th e h ig h e s t p r o te c tio n r a te a m o n g c h i c k e n s v a c c i n a t e d w ith t h e 4 s t r a i n s , an d s t r a i n 11914 s h o w e d th e l o w e s t i i n m u n o g e n i c i t y a n d p r o v id e d o n l y f e e b l e p r o t e c t i o n . U n lik e t h e o th e r s, s t r a i n 11914 d id n o t p r o t e c t b e s t a g a i n s t h o m o l o g o u s s t r a i n c h a lle n g e . T h e l o w s e r o l o g i c a l r e s p o n s e o b s e r v e d in t u r k e y s v a c c i n ­ a t e d w ith the T D s t r a i n o f t h e v i r u s m i g h t h a v e b e e n d u e t o a lo w a n tig e n icity a n d / o r i m m u n o g e n i c i t y o f t h i s s t r a i n . 55 T h e p r e s e n c e o f lo w a n t i g e n i c s t r a i n s o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s e m p h a s i z e s th e i m p o r t a n c e o f a n a l y s i s o f s t r a i n s f o r v a c c i n e p r o d u c t io n . T h e c o n t r o l t u r k e y 85 ( T a b le 10 and 13) s h o w e d a l o w s e r u m n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y and in h i b i t o r y p o w e r f o r t h e 4 m o n t h s o f p a r t i c i ­ p a t io n in th e e x p e r i m e n t and s u b s e q u e n t t e r m i n a t i o n by d e a t h . T h e e x p o s u r e o f t u r k e y s 3 3 , 3 6 , 4 2 and 4 8 to th e N e w c a s t l e d i s e a s e in f e c t io n w h ic h w a s s u s p e c t e d o f h a v in g o c c u r r e d s o m e t i m e b e t w e e n th e 4 th an d 8 th m o n t h s a f t e r v a c c i n a t i o n r e s u l t e d in t h e a p ­ p e a r a n c e o f v e r y h ig h n e u t r a l i z i n g c a p a c i t i e s an d in h i b i t o r y p o w e r s o f th e s e r a o f t h e s e t u r k e y s . A s i m i l a r s e r o l o g i c a l r e s p o n s e w a s n o te d in t u r k e y s 42 an d 48 a lth o u g h p r i o r to th e in f e c t io n t h e y s h o w e d a lo w s e r o l o g i c a l r e s p o n s e t o v a c c i n a t i o n w it h t h e T D s t r a i n of t h e v i r u s v a c c in e . T u r k e y s 33 a n d 3 6 s h o w e d no i n c r e a s e in e i t h e r th e n e u ­ t r a l i z i n g c a p a c i t y o r in h i b i t o r y p o w e r o f t h e i r s e r a in r e s p o n s e to th e c h a lle n g e in fe ctio n . T h i s s u g g e s t s th a t t h e y w e r e h y p e r i m m u n e to N e w c a s t l e d i s e a s e i n f e c t i o n a s a r e s u l t o f v a c c i n a t i o n w ith t h e i n a c t i v ­ a t e d v i r u s a n d / o r e x p o s u r e to a n a t u r a l i n f e c t i o n . In t u r k e y 42 ( T a b le 11) t h e r e w a s a 1 0 - f o l d i n c r e a s e in th e n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y a g a i n s t th e T D s t r a i n b e t w e e n t h e p r e and p o s t ­ c h a l l e n g e s e r a b u t in t u r k e y 48 ( T a b le 12) t h e r e w a s l e s s th a n a 3 - f o l d i n c r e a s e in n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y a g a i n s t t h e s a m e s t r a i n . T h e h e t e r o g e n e i t y o f t h e N c and T D v i r u s s t r a i n s w a s o b s e r v e d in n e u t r a l i z a t i o n t e s t s o f th e p o s t c h a l l e n g e s e r u m s a m p l e s . S e r a from 56 t u r k e y s 42 and 4 8 h ad a n e u t r a l i z a t i o n c a p a c i t y 1 5 0 0 and 6 0 t i m e s g r e a t e r , r e s p e c t i v e l y , w ith t h e h o m o l o g o u s T D v i r u s s t r a i n th a n w ith th e h e t e r o l o g o u s N c v i r u s s t r a i n . in th e in h ib it o r y p o w e r o f t h e s e r a . T h is v a r ia tio n w as not co n sp ic u o u s In t u r k e y 4 8 th e i n h i b i t o r y p o w e r w a s t h e s a m e f o r th e N c and T D s t r a i n but in t u r k e y 4 2 , t h e in h ib it o r y pow er w as a 2 - f o l d g r e a t e r w it h th e h o m o l o g o u s s t r a i n th a n w it h t h e h e te r o lo g o u s s tr a in . T h e p r e c h a l l e n g e s e r u m o f t u r k e y s 4 2 an d 48 s h o w e d a h ig h e r n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y and in h i b i t o r y p o w e r a g a in s t th e T D s t r a i n th a n a g a i n s t t h e N c s t r a i n . T h e r e s p o n s e o f t u r k e y s 2 8 , 2 9 , and 58 ( T a b l e s 14 and 15) to c h a l l e n g e i n f e c t i o n w a s m a n i f e s t e d b y an 8 9 - t o 1 3 5 - f o ld i n c r e a s e in n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y an d an p o w e r o f s e r a o b ta in e d 12 8 - t o 8 0 - f o l d i n c r e a s e in in h i b i t o r y d a y s a fter c h a lle n g e . E e a c h ^ r e p o r t e d t h a t c h i c k e n s i m m u n i z e d a g a i n s t 4‘a v ia n p n e u m o e n c e p h a l i t i s ” w ith f o r m a l i n i n a c t i v a t e d v i r u s w e r e n e g a t i v e to th e h e m a g g l u t i n a t i o n - i n h i b i t i o n t e s t an d th a t i n f e c t i o n w it h a c t i v e v i r u s m ig h t b e r e q u i r e d f o r t h e p r o d u c t io n o f h e m a g g lu t i n a t io n in h ib it o r y a n t i b o d i e s . T h e “ b e ta ” m eth o d of th e h e m a g g lu tin a tio n - in h ib itio n t e s t w a s u s e d . B e a c h s t a t e d th a t r e f r a c t i v i t y t o c h a l l e n g e w ith an in h i b i t o r y t i t e r a s l o w a s 1 :1 0 w h e n 2 to 4 h e m a g g l u t i n a t i v e u n its o f t h e v i r u s w e r e u s e d in t h e t e s t a p p e a r e d to b e o f d i a g n o s t i c sig n ific a n c e . F o r m a lin in a c tiv a te d v a c c in e p rep a re d fr o m th e N c s tr a in o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s u s e d in t h e p r e s e n t s t u d y p r o d u c e d a h ig h in h ib it o r y p o w e r in t u r k e y s f o r a t l e a s t 4 m o n t h s a f t e r v a c c i n a t i o n . 57 T h e “ b e t a ” m e t h o d t i t e r o f 1 :1 0 r e p o r t e d b y B e a c h 53 c o r r e s p o n d e d to an in h i b i t o r y p o w e r o f f r o m 2 0 t o 4 0 in t h e “ a lp h a ” m e t h o d u s e d in t h e p r e s e n t stu d y. An i n h i b i t o r y p o w e r of 2 0 to 4 0 i s e x t r e m e l y l o w and 3 u n s a f e to c o r r e l a t e w it h a n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y o f 1 0 e m b r y o le t h a l d o s e s o r m o r e w h ic h h a s b e e n g e n e r a l l y c o n s i d e r e d a s d i a g n o s t i c of p r e v io u s in fe c tio n o r of v a c c in a tio n a g a in s t N e w c a s tle d i s e a s e . C o r r e l a t i o n o f n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y and h e m a g g lu t in a t i o n - i n h i b i t o r y pow er_of s e r u m . F i g u r e s 1 to 7 s h o w t h e n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y and in h i b i t o r y p o w e r o f th e v a r i o u s s e r a at d i f f e r e n t i n t e r v a l s d u r in g th e e x p e r i m e n t . T h e i n h i b i t o r y p o w e r c o r r e l a t e d w e l l w ith th e n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y p a r t i c u l a r l y d u r in g t h e a s c e n d i n g t i t e r p e r i o d . T h e in h ib ito ry p ow er i n c r e a s e d m o r e r a p i d l y and d e c r e a s e d l a t e r than t h e n e u t r a l i z i n g ca p a city . T h e n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y m ig h t d r o p b e l o w th e p o s i t i v e le v e l 3 m o n th s after v a c c in a tio n . T h e in h ib it o r y p o w e r m ig h t r e m a i n a t t h e p o s i t i v e l e v e l f o r at l e a s t 4 m o n t h s . T h e i n h i b i t o r y p o w e r a lo n e m ig h t in d i c a t e a p r e v i o u s i n f e c ­ t i o n o r v a c c i n a t i o n w h i l e th e n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y o f th e s a m e s e r u m m i g h t f a i l to g i v e p o s i t i v e r e s u l t s . 4 m on th s; F ig u r e 2, tu r k e y 34 at 4 m on th s; 4 m o n t h s an d F i g u r e in c lu siv e . S e e F i g u r e 1, t u r k e y 33 a t 2 and 6 F i g u r e 3 , t u r k e y 3 6 at , t u r k e y 4 8 f r o m t h e 1 st w e e k to 1^ m o n t h s , T h i s w o u ld s u g g e s t t h a t th e in h i b i t o r y p o w e r o f s e r u m s h o u ld n o t b e c o n s i d e r e d a s th e s o l e c r i t e r i o n f o r t h e d i a g n o s i s of N e w c a s t l e d i s e a s e in t u r k e y s . I fc is \ a ^C ^ J» K s; | £ 51 I 'O - H* | I V’V I ’ > ‘ ' » N r « ? I & t ' § l « | ^ i | 4 £> ^ Q : ) ';,' ' s‘ cT S | o '' l v> 10480, /I? -/0 /0 Z 4 0 - 3 120 - 2 5bC-A? 1280b40320 - /60 - s — \ n 80' N ■/ * 40D ikD OCT iO ■ X 4 N £ U T R A L / 7 A T /O N /A t I t a z o A T/ML t/O u /O '’ J N H /d l/C R ^ P 0 \4 £ R / ' *) /A / t / \ / NL ) 6 8 7 9 10 X 1C . \ 7 /f ' ‘ ^ \ • f, V m CO \ J0240 - 320- 20 - /O - H £C/r#ALJZ4 T/OH /NOBX _ * /A////3JTORY POW ER T / M E JN M O N T H S * SERU M 5A M P L E5 F /6U R E 3 M O T C O LLEC TED TURKEY 3 6 D U R /M 6 TH JS P E R IO D ( n C 3 TRAIN) 61 z 0\ <*D \0 0 $ £ "N I 1 N \ 5: l , / . ■,0 " N lu J X A i. J /A 7 /O N / N V t \ / /VH I 0 / 7 1//v V - J A'Vyj-Vc J ■ / £. 3 '/ 1/ T iM ir //V M O N T H S ( H A U £/!/(?I * 7>k'KUH 5 A 7 ! P i L > N O T l O l l L c Tl U D U R I N G T N i S Ot / O C O F ) c i ‘i\t t io/\J\L \ ‘/-O i / D 0// 2 3 4 T IM E T /E U R E 7 S 6 7 8 9 /0 IN M O N T H S TU RK EY 8 S ( CONTROL) 05 65 A n in h i b i t o r y p o w e r o f 80 w a s p r o b a b ly to o lo w to c o r r e l a t e w ith a n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y o f 10 e m b r y o le t h a l d o s e s o r m o r e . An in h i b i t o r y p o w e r o f 8 0 c o r r e l a t e d w it h a s e r u m n e u t r a l i z a t i o n c a p a c i t y range from 10 1 .5 to 10 4 e m b r y o l e t h a l d o s e s but c o i n c i d e d b e s t w ith th e lo w e r p a rt of th is r a n g e . T h e s e v a r i a t i o n s m ig h t h a v e b e e n d u e to : 1) T h e u s e o f d e c i m a l d i l u t i o n s o f th e v i r u s in s e r u m n e u ­ t r a l i z a t i o n t e s t s and 2 - f o l d d i l u t i o n s o f th e v i r u s in t h e h e m a g g l u t i n ­ a tio n -in h ib itio n t e s t . 2) N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s h a s a r e l a t i v e l y lo w c a p a c i t y t o p r o d u c e h e m a g g lu t in a t i o n o f t u r k e y r e d b lo o d c e l l s , a s c o m p a r e d , f o r e x a m p l e , w it h in f l u e n z a an d f o w l p la g u e v i r u s e s w h i c h h a v e a h ig h c a p a c i t y t o p r o d u c e h e m a g g l u t i n a t i o n o f c h i c k e n r e d b lo o d c e l l s . 3) T h e d i f f i c u l t i e s in c o n t r o l l i n g t h e h e m a g g l u t i n a t i o n - in h ib it io n t e s t w ith N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s . In h e m a g g l u t i n a t i o n - i n h i b i t i o n t e s t s , v a r i a t i o n s f r o m 2 - t o 4 - f o l d in t h e h e m a g g l u t i n a t i v e a c t i v i t y o f d i f f e r e n t v i r u s p r e p a r a t i o n s u s u a l l y w e r e w it h o u t e f f e c t o n t h e c o m p u t a t io n o f th e in h i b i t o r y p o w e r of a s e r u m . In a f e w t e s t s u s i n g a s e r u m o f c o n s t a n t d i l u t i o n an d 2 v i r u s n r e p a r a t i o n s w ith 2 - o r 4 - f o l d d i f f e r e n c e s in h e m a g g l u t i n a t i v e a c t i v i t y , t h e en d p o in t s o f h e m a g g l u t i n a t i o n - i n h i b i t i o n w e r e th e s a m e f o r th e s e r u m . a c tiv ity , seru m . 2 D u e to th e d i f f e r e n c e in th e v i r u s h e m a g g l u t i n a t i v e d i f f e r e n t i n h i b i t o r y p o w e r s w e r e o b t a in e d f o r th e s a m e 66 T h e f o l l o w i n g p o in t s a r e s u g g e s t e d f o r s t a n d a r d i z a t i o n of h e m a g g lu t in a t i o n and h e m a g g l u t i n a t i o n - i n h i b i t i o n t e s t s : 1) T h e v i r u s s h o u ld b e a s e l e c t e d s t r a i n o f s t a n d a r d h e m a g ­ g lu tin a tiv e a c tiv ity . 2 ) D ilu t i o n o f s e r u m to b e u s e d in th e h e m a g g l u t i n a t i o n in h ib itio n t e s t s h o u l d n o t b e g r e a t e r than t h e m in i m u m r e q u i r e d f o r a s a t i s f a c t o r y in t e r p r e t a t i o n o f t h e h e m a g g l u t i n a t i o n - i n h i b i t o r y p o w e r of th e s e r u m . In s e v e r a l t e s t s it w a s o b s e r v e d th a t a s e r u m d ilu te d 1 in 2 0 and 1 in 25 in h ib ite d h e m a g g lu t in a t i o n w ith t h e s a m e d ilu tio n of v ir u s. W h en t h e in h ib it o r y p o w e r of th e s e r u m w a s c o m p u t e d a 2 5 . 0 p e r c e n t v a r i a t i o n w a s o b ta in e d . 3) A s t a n d a r d r e d b lo o d c e l l s u s p e n s i o n s h o u l d b e u s e d in th e t e s t s . A 0 .5 p e r c e n t t u r k e y r e d b lood c e l l s u s p e n s i o n p r o v e d to b e s a t i s f a c t o r y in th e p r e s e n t s t u d i e s . 4) T h e t u b e s u s e d in t h e t e s t s h o u ld be u n i f o r m in s i z e , d i a m e t e r a n d c u r v a t u r e o f th e b o t t o m . tu b e w a s fo u n d to b e s a t i s f a c t o r y . A 12 x 75 m m . a g g lu tin a t io n D i f f e r e n c e in th e c u r v a t u r e o f th e b o tto m o f t h e t u b e s m ig h t p r o d u c e i r r e g u l a r i t i e s in t h e a g g r e g a t i o n o f r e d b lo o d c e l l s and d i f f i c u l t i e s o f i n t e r p r e t a t i o n o f t h e t e s t s . 5) T h e t e s t s h o u ld b e c o n d u c t e d a t a s t a n d a r d t e m p e r a t u r e an d t i m e in te r v a l,, 42 In c u b a tio n w it h in th e r a n g e o f 22 C to 27 C w a s fo u n d to b e s a t i s f a c t o r y . . R e a d in g o f th e h e m a g g lu t in a t i o n t e s t at 1 5 , 30 and 45 m in u te s w a s s a t is f a c t o r y . W ith h e m a g g l u t i n a t i o n - i n h i b i t i o n t e s t 67 r e a d i n g s a t 1 5 , 2 5 a n d 35 m i n u t e s w e r e n e c e s s a r y b e c a u s e o f e a r l y e lu tio n of th e v i r u s . 6 ) I n t e r p r e t a t i o n o f t h e h e m a g g l u t i n a t i o n e n d p o in t s h b e c o n s t a n t in a l l l a b o r a t o r i e s . It i s j u s t i f i a b l e to c o n s i d e r p a r t i a l h e m a g g l u t i n a t i o n (±) a s t h e e n d p o in t , but d u e to t h e p o s s i b i l i t y o f p a r t i a l h e m a g g l u t i n a t i o n o c c u r r i n g in s u c c e s s i v e v i r u s d i l u t i o n s it i s p r e f e r r e d to u s e a s t h e e n d p o in t t h e h i g h e s t d i l u t i o n o f th e v i r u s w h ic h s h o w s c o m p l e t e h e m a g g l u t i n a t i o n . N ew ca stle d ise a s e v iru s 5 0 p e r c e n t e m b r y o l e t h a l d o s e ( L D qq ), a n d h e m a g g l u t i n a t i v e a c t i v i t y . * T a b l e 16 V ir u s Nc 4 6 - 9 6 7 1 6 h a r v e s te d on 6 - 2 1 - 4 7 Nc 4 6 -9 6 7 1 1 h a rv este d on 7 -1 9 -4 7 N c 4 6 -9 6 7 1 8 h a r v e s te d on 1 0 -2 3 -4 7 N c 4 6 - 9 6 7 IS h a r v e s te d on 1 2 -8 -4 8 N c 46-9 6 7 2 0 h a r v e ste d on 2 -2 -4 8 TDi h a r v e s t e d on 1 0 - 1 1 - 4 7 T itr a tio n d a te 7- 3 -4 7 7 -1 0 -4 7 7 -1 7 -4 7 7 -2 4 -4 7 7 -3 1 -4 7 8 - 7-4 7 10- 2 -4 7 LDjjO (0 .0 5 c c of v ir u s) 1 0 -3 .2 1 0 -8.2 1 0 -8 .3 1 0 - 8.2 1 0 -8 .3 1 0 -7 .6 1 0 "8 . 2 1 0 -1 0 -4 7 1 0 - 8n . 3o 1 0 -2 4 -4 7 1 0 -3 1 -4 7 11- 7-4 7 1 1 -1 4 -4 7 1 1 -2 1 -4 7 1 1 -2 8 -4 7 12- 5 -4 7 1 2 -1 2 -4 7 1- 1 -48 1 - 8 -4 8 1 -2 2 -4 8 1 -3 0 -4 8 2 -2 1 -4 8 1 1 -1 4 -4 7 1 1 -2 1 -4 7 1 2 -1 2 -4 7 1 0 -8 .5 1 0 -8 .5 1 0 -8 .3 1 0 -8 .5 1 0 -8.2 HA (0 .2 5 c c of T itr a tio n fo r m a lin iz e v ir u s) d a te 320 6 -2 3 -4 7 160 6 -2 6 -4 7 160 7 - 1 -47 160 7- 2-4 7 160 7 - 9 -4 7 160 7 -1 6 -4 7 7 -2 2 -4 7 8 -2 5 -4 7 10- 7 -4 7 10- 9 -4 7 1 0 -2 7 -4 7 1 1 - 4 -4 7 1 2 -1 5 -4 7 1 2 -1 7 -4 7 1 -1 6 -4 8 2 -1 3 -4 8 1 1 -1 1 -4 7 1 1 -2 5 -4 7 1 1 -2 6 -4 7 160 160 160 320 160 160 320 80 80 40 640 5120 5120 1 -2 8 -4 8 1 -2 9 -4 8 2560 2560 2 - 5 -4 8 11 -2 2 1 4 7 1 1 -2 4 -4 7 1 2 -1 7 -4 7 1 -2 7 -4 8 2 - 6 -4 8 1 -2 7 -4 8 640 320 640 640 160 160 640 10~9 10-8*3 10-9*2 1 0 - 8.8 1 0 - 8.6 1 0 - 8.8 10- 8.6 -8.6 1 0 - 8.1 1 0 -8 .5 1 0 -8 .3 10 1 0 -8 .7 1- 1 -4 8 1 0 -8 .7 1- 8 -4 8 h a rv este d on 1 2 -1 5 -4 7 10- 8.8 1 -2 2 -4 8 * T h e a c tiv e v ir u s w a s s t o r e d at -3 5 C and th e f o r m a lin iz e d v ir u s at 4 C to 6 C . T D 5 69 T h e d a t a in T a b le 16 i n d i c a t e s th a t i n f e c t e d N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s (N c 4 6 - 9 6 7 — ) a l l a n t o i c f l u i d s t o r e d a t - 3 5 C m a i n t a i n e d a s t a b l e 50 p e r c e n t e n d p o in t t i t e r f o r a t l e a s t 3 m o n t h s . T h e h e m a g g lu t in a t i o n a c t i v i t y o f f o r m a l i n i z e d a l l a n t o i c f lu id i n f e c t e d w ith t h e s a m e s t r a i n o f v i r u s (N c 4 6 - 9 6 7 —-) an d s t o r e d a t 4 C to 6 C w as sta b le fo r about 5 m o n t h s a f t e r w h i c h t h e r e w a s a d e c l i n e in t h e h e m a g g l u t i n a t i v e a c t i v i t y . A v i r u s t i t e r o f 10 O c o r r e s p o n d e d g e n e r a l l y to an h e m a g g l u - t in a t io n t i t e r o f f r o m 1 6 0 to 3 2 0 w h i le a v i r u s t i t e r o f 10 _q correspon d ed to an h e m a g g lu t in a t i o n t i t e r o f f r o m 3 2 0 to 6 4 0 o r h i g h e r . Cunha et a l. 49 w o r k e d w ith p u r i f i e d N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s and r e p o r t e d th a t th e h e m a g g l u t i n a t i v e u n it w a s of a n a v e r a g e o f r* 10 o a "cr*'34: g m . o f v i r u s and th a t 1 0 “ 13 72 * g m . o f v i r u s c o n s t i t u t e d th e 50 p e r c e n t u n it o f i n f e c t i v i t y f o r c h ic k e m b r y o s . T h e s e d a ta w o u ld in d i c a t e that o n e e m b r y o le t h a l d o s e w o u ld c o r r e s p o n d to a b o u t 24 m illio n h e m a g g lu tin a tiv e u n its. H an son e t a l. 51 r e p o r t e d th a t a 5 0 p e r c e n t m o r t a l i t y r a t e o f e m b r y o n a t e d e g g s w a s in d u c e d b y o n e m i l l i o n t h o f th e a m o u n t o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s d e m o n s t r a b l e b y t h e h e m a g g lu t in a t i o n test. F r o m T a b l e 16, it w a s c o n c l u d e d th a t o n e h e m a g g lu t in in u n it w o u ld c o r r e s p o n d to f r o m 2 to of v i r u s h a v in g a t i t e r o f f r o m 10 — - 10 f t to m i l l i o n e m b r y o le t h a l d o s e s — Q 10 em b ry o le th a l d o s e s . 70 T h e e f f e c t o f d i l u t i o n o f s e r u m on n e u tr a liz a tio n t e s t . H i r s t 8 7 r e p o r t e d th a t a d ilu t io n o f 1 in 5 o f i n f l u e n z a i m m u n e s e r u m r e s u l t e d in a 1 0 - f o l d d e c r e a s e in n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y w h e n t e s t e d in m i c e . B r a n d ly 8 7 c i t e d s o m e r e s u l t s o b t a in e d w it h n e u t r a l i z a t i o n o f f o w l p la g u e v i r u s by s p e c i f i c i m m u n e s e r u m in w h ic h a d i lu t io n o f 1 in 10 o f i m m u n e s e r u m r e s u l t e d in a 1 0 0 - f o l d d e c r e a s e in t i t e r . T h e p r o t o c o ls of B r a n d ly e t. a l. ■1o O s h o w e d th a t a d ilu t io n o f 1 in 10 o f N e w c a s t l e d i s e a s e i m m u n e s e r u m r e s u l t e d in a 1 0 0 - f o i d d e c r e a s e in n e u t r a l i z a t i o n c a p a c i t y but a d ilu t io n o f i in 5 r e s u l t e d in a 1 0 - t o 1 0 0 - f o l d d e c r e a s e in n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y . O s t e e n a n d A n d e r s o n r e p o r t e d th a t a d i l u t i o n o f 1 in 10 o f N e w c a s t l e d i s e a s e im m u n e s e r u m w it h n e g a t i v e c h i c k e n s e r u m f a i l e d to d e c r e a s e t h e n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y , b u t a d i l u t i o n o f 1 in 2 0 r e s u l t e d in a 1 0 - f o l d d e c r e a s e in t h e n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y o f t h e u n d ilu t e d serum . T a b l e 17 T urkey 33 34 36 48 48 Serum 3 w eeks 2 w eeks 2 1, m o n t h s 2 w eeks 1 m on th L D 5 0 N e w c a stle d is e a s e v ir u s n e u t r a l i z e d by 0 .0 5 c c . o f s e r u m u n d ilu t e d 1 in 10 1 0 4 .7 1 0 5 .6 102 io i-7 1 0 2 *8 1 02 *7 104 1 0 0 -7 1 0 1*7 1 0 ° .1 71 T a b l e 17 s h o w s t h e r e s u l t s o f 5 n e u t r a l i z a t i o n t e s t s u s i n g u n d i l u t e d s e r u m a n d t h e s a m e s e r u m d i l u t e d 1 in 10 in n u t r i e n t b r o t h , D i l u t i o n o f i m m u n e s e r u m 1 i n 10 d e c r e a s e d t h e n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y fr o m 2 0 - t o 1 0 0 -fo ld . 72 Sum m ary 1) T w o s t r a i n s o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s (N c 4 6 - 9 6 7 , c h i c k e n o r i g i n , a n d T D , t u r k e y o r i g i n ) i n a c t i v a t e d w it h f o r m a l i n w e r e u s e d fo r e x p e r im e n ta l v a c c in a tio n of tu r k e y s . The se r o lo g ic a l re sp o n se of th e t u r k e y s a t c e r t a in t i m e in t e r v a ls w a s e v a lu a te d by s e r u m n e u t r a l­ iz a tio n and h e m a g g lu t in a tio n - in h ib it io n t e s t s . 2) A f a i r d e g r e e o f c o r r e l a t i o n o f th e n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y a n d th e i n h i b i t o r y p o w e r o f t h e s e r u m w a s o b s e r v e d p a r t i c u l a r l y d u r in g t h e a s c e n d i n g t i t e r p e r i o d . 3) O n e h e m a g g l u t i n i n u n i t w a s f o u n d t o c o r r e s p o n d to f r o m 2 t o 10 m i l l i o n e m b r y o l e t h a l d o s e s o f a v i r u s h a v i n g a t i t e r o f f r o m 10 -8 to 1 0 -9 4) e m b r y o le th a l d o s e s . D i l u t i o n o f i m m u n e s e r u m 1 in 10 w it h n u t r i e n t b r o t h d e c r e a s e d its n e u tr a liz in g c a p a c ity fr o m 2 0 -to 1 0 0 -fo ld . 5) T u r k e y s v a c c i n a t e d w it h N c 4 6 - 9 6 7 s t r a i n s h o w e d s ig n if ic a n t n e u tr a liz in g c a p a c ity and in h ib ito r y p o w e r fo r 3 and 4 m o n th s, r e s p e c t iv e ly , a fter v a c c in a tio n . 6) S t r a i n T D w a s e i t h e r o f l o w a n t i g e n i c i t y o r v e r y s e n s i t i v e t o 0 .1 p e r c e n t f o r m a l i n i n a c t i v a t i o n a s t h e t u r k e y s v a c c i n ­ a t e d w it h t h i s s t r a i n s h o w e d o n l y a n e g l i g i b l e s e r o l o g i c a l r e s p o n s e . 7) A s u b c l i n i c a l N e w c a s t l e d i s e a s e i n f e c t i o n o f t h e t u r k e y s fr o m 4 to 8 m o n th s a fte r v a c c in a tio n p rod u ced a m a rk ed s e r o lo g ic a l 73 8) T h e t u r k e y s w e r e c h a l l e n g e d w it h an i n t r a m u s c u l a r i n j e c t i o n o f 1 0 6 e m b r y o l e t h a l d o s e s o f th e a c t i v e v i r u s 10 m o n t h s a fte r v a c c in a tio n . C lin ic a l s y m p to m s of N e w c a s tle d is e a s e w e r e not o b s e r v e d in t h e v a c c i n a t e d t u r k e y s w h i c h h ad b e e n e x p o s e d to t h e s u b c lin ic a l in fe c tio n . 9) S e r a c o l l e c t e d 12 d a y s a f t e r c h a l l e n g e r e v e a l e d t h a t 2 t u r k e y s w e r e h y p e r i m m u n e to N e w c a s t l e d i s e a s e a s t h e r e w a s no i n c r e a s e in n e u t r a l i z i n g o r i n h i b i t o r y a g e n t s . In t h e o t h e r t u r k e y s t h e r e w a s a s i g n i f i c a n t r e s p o n s e t o c h a l l e n g e a s r e v e a l e d b y an i n c r e a s e o f t h e n e u t r a l i z i n g c a p a c i t y an d i n h i b i t o r y p o w e r o f t h e s e r u m . 10) E ffo r ts to is o l a t e th e v ir u s fr o m t u r k e y s k ille d 5 w e e k s a f t e r c h a l l e n g e f a i l e d to r e v e a l t h e p r e s e n c e o f t h e v i r u s in th e s p l e e n , t h e a i r s a c m e m b r a n e s , an d t h e y o lk m a t e r i a l o f an u n fe r tile e g g . 11) V a c c in e p r e p a r e d fr o m fo r m a lin iz e d N e w c a s tle d i s e a s e v i r u s i n f e c t e d a l l a n t o i c f l u i d o f h ig h a n t i g e n i c i t y w o u ld b e e f f e c t iv e fo r im m u n iz a tio n o f tu r k e y s a g a in s t a p o te n tia l in fe c tio n w it h t h e d i s e a s e . 74 L i t e r a t u r e C it e d K r a n e v e l d , F . C .: O v e r e e n in N e d . - I n d i e h e e r s c h e n d e Z i e k t e o n d e r h et P lu im v e e . N e d e r la n d sc h -In d is c h e B la d e n v o o r D ie r g e n e e s k u n d e . 3ji, ( 1 9 2 6 ) : 4 4 8 - 4 5 0 . C i t e d b y B e a u d e t t e (2 ). o 3 4 B e a u d e t t e , F . R .: \ r e v i e w o f t h e l i t e r a t u r e o n N e w c a s t l e d i s e a s e . P r o c . 47th A n . M e e t . U . S . L i v e s t o c k S a n . A s s n . , (1 0 4 3 ): 1 2 2 - 1 7 7 . D o y l e , T . M .: A h i t h e r t o u n r e c o r d e d d i s e a s e o f f o w l s d u e to a f i l t e r p a s s in g v i r u s . J. C o m p . P a th . T h e r a p ., 4 0 , (1 9 2 7 ): 1 4 4 -1 6 9 . B r a n d l y , C . A . , M o s e s , H. E . , J o n e s , E . E . a n d J u n g h e r r , E . L . : E p i z o o t i o l o g y o f N e w c a s t l e d i s e a s e o f o o u l t r y . A m . J . V e t . R e s . , j?, (1 9 4 6 ): 2 4 3 - 2 4 9 . r* ° R e p o r t o f th e p o u ltr y p a th o lo g ic a l la b o r a t o r y , P e t a lu m a , S ta te o f C a l i ­ fo r n ia D ep t. A g r . B u ll., 2 9 , (1940): 3 6 7 -3 6 8 . B e a c h , J . R .: A n e r v o u s d i s o r d e r La c h i c k e n s . (1 9 4 1 ): 15. 7 N u - L a i d N e w s , JL8, S t o v e r , D . E .: A f i l t e r a b l e v i r u s , t h e c a u s e o f a r e s p i r a t o r y n e r v o u s d i s o r d e r o f c h i c k e n s . A m . J . V e t . R e s . , 3^, ( 1 9 4 2 ) : 2 0 7 - 2 1 3 . 8 S t o v e r , D . E .: R e s p i r a t o r y n e r v o u s d i s o r d e r in 8 m o n t h s o l d p u l l e t s . A m . J. V e t. R e s . , 3, (1 9 4 2 ): 2 3 9 - 2 4 1 . 9 B e a c h , J . R .: A v ia n p n e u m o e n c e p h a lit is . P r o c . 4 6 th A n . M e e t . U . S. L i v e s t o c k S a n . A s s n ., (1 9 4 2 ): 2 0 2 - 2 2 3 . ^ I b i d .: T h e n e u t r a l i z a t i o n in v i t r o o f a v i a n p n e u m o e n c e p h a l i t i s v i r u s b y N e w c a s t l e d i s e a s e im m u n e s e r u m . S c i e n c e , 1 0 0 , (1 9 4 4 ): 3 6 1 362. ■ ^ B e a u d e t t e , F . R . a n d B l a c k , J . J . : N e w c a s t l e d i s e a s e in N e w J e r s e y . P r o c . 49th A n , M e e t . U . S. L i v e s t o c k S a n . A s s n . , (1945): 4 9 - 5 8 . 12 13 O s te e n , O. L . and A n d e r s o n , W . A .: L a b o r a to r y d ia g n o s is o f N e w ­ c a s t l e d i s e a s e . J . A m . V e t. M e d . A s s n . , 112, (1 9 4 8 ): 4 0 - 4 4 . H o f f m a n , H. A .: R e s p i r a t o r y n e r v o u s d i s o r d e r in a d u lt t u r k e y s , C a lifo r n ia S ta te D e p t. A g r . B u ll., 3 1 , (1 9 4 2 ): 1 3 0 - 1 3 3 . 75 14 15 J u n g h e r r , Ef. a n d T e r r e l , N .: O b s e r v a t i o n s o n t h e s p r e a d o f N e w ­ c a s t l e d i s e a s e . P r o c . 5 0 th A n . M e e t ; U . S . L i v e s t o c k S a n . A s s n . , (1 9 4 6 ); 1 5 8 - 1 7 1 . L e v i n e , P . P , : . P r o c . C o n f . o n N e w c a s t l e D i s e a s e , U . S.- D e p t . A g r .-, (1 9 4 6 ): 2 7 - 2 9 . F e n s t e r m a c h e r , R . , P o m e r o y , B . S . a n d M a l m q u i s t , W . A .: N e w ­ c a s t l e d i s e a s e in M i n n e s o t a . P r o c . 5 0 th A n . M e e t . U . S . L i v e s t o c k S a n . A s s n . , (1 9 4 6 ): 1 5 1 -1 5 7 . 17 18 19 20 21 24 The P h illi- H a d d o w , J . R . a n d Id n a n i, J . A . : A p r e l i m i n a r y r e p o r t o n a m e t h o d o f v a c c in a tio n a g a in s t R a n ik h et d i s e a s e . In d . J . V e t . S c i . a n d A n i m . H u s b . , 1J., ( 1 9 4 1 ) : 1 1 3 - 1 2 1 . I y e r , S . G . and D o b s o n , N .: A r e p o r t o n im m u n iz a t io n e x p e r im e n t s a g a in st N e w c a s tle d is e a s e u sin g c r y s t a l v io le t v a c c in e . V et. R e c ., 5 3 , (1 9 4 1 ): 3 8 1 - 3 8 3 . I y e r , S . G .: S t u d i e s o n N e w c a s t l e ( R a n ik h e t ) d i s e a s e v i r u s , V e t. S c i . and A n im . H u s b ., 1 3 , (1 9 4 3 ): 1 - 2 6 . h id . J . B e a c h , J . R .: V a c c in a t io n f o r p n e u m o e n c e p h a lit is . P r o c . 4 8 th A n. M e e t . U . S . L i v e s t o c k S a n , A s s n . , (1 9 4 4 ): 1 7 7 - 1 8 4 . 22 23 T o p a c io , T . and C o r o n e l, A . B .: S tu d ie s on a v ia n p e s t . p i n e J . A n i m . I n d ., 6 , ( 1 9 3 9 ) : 4 6 7 - 4 7 6 . B r a n d ly , C . A ., M o s e s , H. E ., J o n e s , E . E . and J u n g h e r r , E . L .: Im m u n iz a tio n o f c h ic k e n s a g a in s t N e w c a s tle d is e a s e . A m . J. V et. R e s . , 7, (1 9 4 6 ): 3 0 7 - 3 3 2 . B r a n d ly , C . A ., M o s e s , H. E . and J u n g h e r r , E . L .: T r a n s m i s s i o n of a n tiv ir a l a c tiv ity v ia th e e g g and th e r o le o f c o n g e n ita l p a s s iv e i m m u n i t y to N e w c a s t l e d i s e a s e in c h i c k e n s . A m . J . V e t . R e s . , 7 , (1 9 4 6 ): 3 3 3 - 3 4 2 . A c e v e d o , R . A . an d M e n d o z a , L L .: C h ic k e n e m b r y o v a c c in e a g a in s t N e w c a stle , d i s e a s e (p n e u m o e n c e p h a litis). A m . J. V et. R e s ., 8 7 (1 9 4 7 ): 9 1 - 1 0 2 . o r? “^ C o r o n e l , A . B . : A d s o r b a t e N e w c a s t l e d i s e a s e ( a v i a n p e s t ) v a c c i n e . A m . J. V e t. R e s . , 3, (1 9 4 7 ): 1 2 0 - 1 2 7 . ^ V a n R o e k e l , H . , S p e r l i n g , F . G . , B u l l i s , K . L . a n d O l e s i u k , G . M .: Im m u n iz a tio n of c h ic k e n s a g a in s t N e w c a s tle d i s e a s e . J. A m . V e t. M e d . A s s n . , 112, (1 9 4 8 ): 1 3 1 -1 3 2 . 76 27 I y e r , S . G . a n d D o b s o n , N .: A s u c c e s s f u l m e t h o d o f i m m u n i z a t i o n a g a i n s t N e w c a s t l e d i s e a s e o f f o w l s . V e t . R e c . , 5 2 , (1 9 4 0 ): 8 8 9 894. 28 29 30 31 32 33 34 35 K o m a r o v , A . an d G o l d s m i t , L .: P r e l i m i n a r y o b s e r v a t i o n o n t h e m o d ific a tio n of a s tr a in o f N e w c a s tle d is e a s e v ir u s by in t r a c e r e ­ b r a l p a s s a g e th rou gh d u c k lin g s . V e t. J ., 1 0 2 , (1 9 4 6 ): 2 1 2 - 2 1 8 . K o m a r o v , A . an d G o l d s m i t , L .: T h e u s e o f l i v e v i r u s in P a l e s t i n e fo r th e v a c c in a tio n of p o u ltr y a g a in s t N e w c a s t le d i s e a s e . C o r n e ll V e t., 3 7 ^ (1 9 4 7 ): 3 6 8 - 3 7 2 . R e a g a n , R . L . , L i l l i e , M . G . , P o e l m a , L . J . and B r u e c k n e r , A . L .: T r a n s m i s s i o n o f t h e v i r u s o f N e w c a s t l e d i s e a s e to t h e S y r i a n h a m ­ s t e r . A m . J . V e t . R e s . , 8 , ( 1 9 4 7 ): 1 3 6 - 1 3 8 . Ib id .: T h e r e s p o n s e o f s o m e m a m m a l s to N e w c a s t l e v i r u s . V et. R e s . , 8, (1 9 4 7 ): 4 2 7 - 4 3 0 . I b id .: M o d i f i e d N e w c a s t l e v i r u s v a c c i n e s . M e e t . A m . V e t . M e d . A s s n . , (1 9 4 7 ): 13. A b st. P a p e r s . A m . J. 4 8 th A n . B r a n d l y , C . A . , M o s e s , H . E . , J u n g h e r r , E . L . an d J o n e s , E . E .: T h e is o la t io n and id e n tific a tio n o f N e w c a s t le d i s e a s e v i r u s . A m . J. V et R e s . , 7, (1 9 4 6 ): 2 8 9 -3 0 6 . M o s e s , H . E .: P r o c . C o n f. o n N e w c a s t l e D i s e a s e . U . S . D e p t . A g r . , ( 1 9 4 6 ): 5 3 - 5 4 . H i r s t , G . K .: T h e a g g l u t i n a t i o n o f r e d c e l l s b y a l l a n t o i c f lu i d o f c h i c k e m b r y o s i n f e c t e d w it h i n f l u e n z a . S c i e n c e , 9 4 , ( 1 9 4 1 ): 2 2 - 2 3 . op M c C l e l l a n d , L . an d H a r e , R .: T h e a d s o r p t i o n o f i n f l u e n z a v i r u s b y r e d c e l l s an d a n e w in v i t r o m e t h o d o f m e a s u r i n g a n t i b o d i e s f o r i n f l u e n z a v i r u s . C a n . P u b l i c H e a lt h J . , 3 2 , ( 1 9 4 1 ) : 5 3 0 - 5 3 8 . ° H i r s t , G . K .: T h e q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f i n f l u e n z a v i r u s and a n t i b o d i e s b y m e a n s o f r e d c e l l a g g l u t i n a t i o n . J . E x p t l. M e d ., 7 5 , ( 1 9 4 2 ): 4 9 - 6 4 . ^8 H i r s t , G . K . an d P i c k e l s , E . G .: A m e t h o d f o r t h e t i t r a t i o n o f i n f l u ­ e n z a h e m a g g l u t i n i n s an d i n f l u e n z a a n t i b o d i e s w it h t h e a id o f a p h o t o - e le c t r ic d e n s it o m e t e r . J . Im m u n o l., 4 5 , (1 9 4 2 ): 2 7 3 - 2 8 3 . 39 H i r s t , G . K . : A d s o r p t i o n o f i n f l u e n z a v i r u s h e m a g g l u t i n i n s and v i r u s by r e d b lo o d c e l l s . J . E x p t l . M e d . , 7 6 , ( 1 9 4 2 ): 1 9 5 - 2 0 9 . 77 40 S t u a r t - H a r r i s , C . H .: O b s e r v a t i o n s o n t h e a g g l u t i n a t i o n o f f o w l r e d c e l l s b y in flu e n z a v i r u s . B r it . J . E x p tl. P a th ., 2 4 , (1 9 4 3 ): 3 0 - 4 0 . H i r s t , G . K .: S t u d i e s o f a n t i g e n i c d i f f e r e n c e s a m o n g s t r a i n s of- i n ­ flu e n z a A b y m e a n s of r e d c e l l a g g lu tin a tio n . J . E x p tl. M e d ., 78, (1 9 4 3 ): 4 0 7 - 4 2 3 . 42 43 44 45 B o d ily , H . L . and E a to n , M . D .: S p e e if it y of th e a n tib o d y r e s p o n s e o f h u m a n b e i n g s to s t r a i n s o f i n f l u e n z a v i r u s . J . I m m u n o l . , 4 5 , (1 9 4 2 ): 1 9 3 - 2 0 4 . L u s h , D . : T h e c h i c k r e d c e l l a g g l u t i n a t i o n t e s t w it h t h e v i r u s e s o f N e w c a s t le d i s e a s e and fo w l p la g u e . J. C o m p . P a th , and T h e r a p ., 5 3 , (1 9 4 3 ): 1 5 7 -1 6 0 . 47 B u r n e t , F . M .: T h e a f f i n i t y o f N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s t o t h e i n f l u ­ e n z a v i r u s g r o u p . A u s t. J. E x p tl. B i o l, and M e d . S c i . , 2 0 , (1 9 4 2 ): 81 -8 8 . 4ft B u r n e t , F . M . , B e v e r i d g e , W . I. B . , M c E w i n , J . a n d B o a k e , W . C .: S t u d i e s o n t h e H i r s t h e m a g g l u t i n a t i o n r e a c t i o n w it h i n f l u e n z a a n d N e w c a s t le d i s e a s e v i r u s e s . A u s t. J. E x p tl. B io l, and M ed . S c i . , 2 3 , (1 9 4 5 ): 1 7 7 -1 9 2 . 4Q 51 M i l l e r , G , L .: I n f l u e n c e o f pH a n d o f c e r t a i n o t h e r c o n d i t i o n s o n t h e s t a b ilit y o f th e in fe c tiv ity and r e d c e l l a g g lu tin a tin g a c tiv ity of in flu e n z a v i r u s . J. E x p tl. M e d ., 8 0 , (1 9 4 4 ): 5 0 7 - 5 2 0 . S a lk , J. E .: A s im p lif ie d p r o c e d u r e fo r titr a tin g h e m a g g lu tin a tin g c a p a c i t y o f i n f l u e n z a - v i r u s a n d t h e c o r r e s p o n d i n g a n t ib o d y . J. I m m u n o l., 4 9 , (1 9 4 4 ): 8 7 - 8 8 . 46 50 M i l l e r , G . L . a n d S t a n l e y , W . M .: Q u a n t i t a t i v e a s p e c t s o f r e d b l o o d c e l l a g g lu tin a tio n t e s t f o r in flu e n z a v i r u s . J . E x p tl. M e d ., 7 9 , (1944): 1 8 5 -1 9 5 . C u n h a , R . , W e i l , M . L.., B e a r d , D . , T a y l o r , A . R . , S h a r p , D . G . a n d B e a r d , J . W . : P u r if a c t i o n a n d c h a r a c t e r s o f t h e N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s ( C a l i f o r n i a S t r a i n ) . J . I m m u n o l . , j55, ( 1 9 4 7 ) : 6 9 - 8 9 . F l o r m a n , A . L . : H e m a g g l u t i n a t i o n w it h N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s . P r o c . S o c . E x p tl. B io l, and M e d ., 6 4 , (19 4 7 ): 4 5 8 - 4 8 3 . H a n so n , R . P . , W in slo w , N . S . and B r a n d ly , C. A .: In flu e n c e o f th e r o u te o f in o c u la tio n o f N e w c a s t le d i s e a s e v ir u s on s e l e c t i v e i n ­ fe c tio n of th e e m b r y o n a tin g e g g . A m . J. V e t. R e s ., 8, (1 9 4 7 ): 4 1 6 -4 2 0 . 78 ro 53 54 55 56 57 58 B u r n e t, F . M ., M c C r e a , J. F . and S to n e , J. D .: M o d ific a tio n of h u ­ m a n r e d c e l l s b y v i r u s a c t i o n . I. R e c e p t o r g r a d i e n t f o r v i r u s a c t i o n i n h u m a n c e l l s . B r i t . J . E x p t l . P a t h . , 127, ( 1 9 4 6 ) : 2 2 8 - 2 3 6 . B u r n e t , F . M . and A n d e r s o n , S . G .: M o d i f i c a t i o n o f h u m a n r e d c e l l s b y v i r u s a c t i o n . n. A g g l u t i n a t i o n o f m o d i f i e d h u m a n r e d c e l l s b y s e r a fr o m c a s e s o f in fe c tio u s m o n o n u c le o s is . B r it. J . E x p tl. P a th ., 27, (1 9 4 6 ): 2 3 6 -2 4 4 . A n d e r s o n , S . G .: T h e r e a c t i o n b e t w e e n r e d c e l l s an d v i r u s e s o f t h e i n f l u e n z a g r o u p . S t u d i e s w it h N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s . A u s t . J. E x p t l . B i o l , a n d M e d . S c i . , <25, ( 1 9 4 7 ) : 1 6 4 - 1 7 4 . U . S . D e p t . A g r . , A g r . R e s . A d . , B u r e a u A n i m . I n d ., P a t h . D i v i s . : T h e h e m a g g lu tin a tio n and h e m a g g lu tin a tio n -in h ib itio n t e s t s fo r th e d ia g n o s is of N e w c a s tle d i s e a s e . C ir c u la r , (1946): 1 -4 . U. S. D ep t. A g r ., B u r n e t , F . M . an d F e r r y , J . D . : T h e d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e v i r u s e s o f fo w l p la g u e and N e w c a s t l e d i s e a s e . E x p e r im e n t s u s in g th e t e c h ­ n iq u e o f c h o r i o a l l a n t o i c m e m b r a n e i n o c u l a t i o n o f t h e d e v e l o p i n g e g g . B r i t . J . E x p t l . P a t h . , 1J5, ( 1 9 3 4 ) : 5 6 - 6 4 . f?o R1 63 B e a c h , J . R .: T h e a p p lic a tio n of th e h e m a g g lu tin a tio n -in h ib itio n t e s t in t h e d i a g n o s i s o f a v i a n p n e u m o e n c e p h a l i t i s ( N e w c a s t l e D i s ­ e a s e ) . J . A m . V e t . M ed . A s s n . , 1 1 2 , (1 9 4 8 ): 8 5 - 9 1 . B r a n d l y , C . A . : P r o c . C o n f. o n N e w c a s t l e D i s e a s e . (1 9 4 6 ): 3 5 - 3 6 . 59 62 B r a n d l y , C . A . , H a n s o n , R . P . , L e w i s , S . H ., W i n s l o w , N . S . , H o y t , H . H ., P r i t c h a r d , W . R . a n d N e r l i n g e r , C . M . : V a r i a b l e s a n d c o r r e l a t i o n s in l a b o r a t o r y p r o c e d u r e s f o r N e w c a s t l e d i s e a s e d i a g n o s i s . C o r n e l l V et'., *17, ( 1 9 4 7 ) : 3 2 4 - 3 3 6 . K e o g , E . V .: T h e i m m u n o l o g i c a l r e a c t i o n o f t h e f i l t e r a b l e v i r u s e s N e w c a s tle d is e a s e v ir u s . A u s t. J . E x p tl. B io l. M e d . S c i . , 1 5 , (1 9 3 7 ): 3 4 0 - 3 4 1 . M i n a r d , E . L . a n d J u n g h e r r ; E .: N e u t r a l i z a t i o n t e s t s w it h a v i a n p n e u m o e n c e p h a lit is v ir u s . A m . J. V e t. R e s . , 5 , (1 9 4 4 ): 1 5 4 -1 5 7 . R e p o r t o f th e C o m m itte e on T r a n s m is s ib le D i s e a s e s o f P o u ltr y . N e w c a s t l e D i s e a s e . P r o c . 4 9 th A n . M e e t . U . S . L i v e s t o c k S a n . A s s n ., (1 9 4 5 ): 6 8 - 7 0 . B r a n d l y , C . A . : P r o c . C o n f. o n N e w c a s t l e D i s e a s e . (19 4 6 ): 3 6 - 3 7 . U. S. D ep t. A g r ., 79 64 B e a u d e t t e , F . F . , B i v in s , J . A ., M ille r , B . R ., H u d so n , C . B . and B l a c k , J . J . : S t u d i e s o n t h e d i a g n o s i s o f N e w c a s t l e d i s e a s e in N e w J e r s e y . A m . J . V e t . R e s . , 9_, ( 1 9 4 8 ) : 6 9 - 7 6 . /> r B e a u d e t t e , F . R .: S y m p o s iu m o n N e w c a s t l e D i s e a s e (A v ia n p n e u ­ m o e n c e p h a litis ). R ep o rt o f th e C o m m itte e on D ia g n o s is of N e w ­ c a s t l e D i s e a s e . J . A m . V e t. M ed . A s s n ., 1 1 2 , (1 9 4 8 ): 1 2 8 - 1 3 0 . fifi R e e d , L . J . a n d M u e n c h , H .: A s i m p l e m e t h o d o f f i f t y p e r c e n t e n d ­ p o in t s . A m . J . H y g ., 2 7 , (1 9 3 8 ): 4 9 3 - 4 9 7 . B r a n d ly , C. A .: P r o c . C on f. on N e w c a s t le D i s e a s e . (1 9 4 6 ): 5 2. TJ. S . D e p t . A g r . ,